TW202003568A - Vista抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

揭示VISTA抗原結合分子。亦揭示編碼該等VISTA抗原結合分子之核酸及表現載體、包含其等之組成物，以及使用其等之方法。

Description

VISTA抗原結合分子
此申請案主張提申日期2018年3月29日之PCT/EP2018/058258、提申日期2018年9月7日之GB 1814562.3及提申日期2018年11月5日之US 16/180,949的優先權，實際上其等的內容和要素係藉此併入本案以作為參考資料。
發明領域 本發明係有關於分子生物學領域，更特別地為抗體技術。本發明亦有關於醫學治療及預防(prophylaxis)的方法。
發明背景 骨髓衍生的抑制性細胞(MDSC)-媒介的免疫反應抑制已於多種實性腫瘤及淋巴瘤確認。MDSCs於晚期結腸直腸癌是提高的(Toor等人，Front Immunol. 2016; 7:560)。乳癌亦觀察到MDSCs，且晚期乳癌患者之末梢血液的MDSCs百分率是增高的(Markowitz等人，Breast Cancer Res Treat. 2013 Jul; 140(1):13-21)。MDSC之豐度亦與實性腫瘤預後不良有相關性(Charoentong等人，Cell Rep. 2017 Jan 3; 18(1):248-262)。
MDSCs係通過多種機轉來發揮對於T細胞的抑制作用，包括生產活性含氧物、一氧化氮及精胺酸酶。此等最終導致抑制DC、NK及T細胞活性且增高腫瘤負荷(Umansky等人，Vaccines (Basel) (2016) 4(4):36)。MDSCs亦通過生產可溶性因子而有助於腫瘤發展及轉移，諸如基質金屬蛋白酶、VEGF、bFGF、TGF-β及S100A8/A9其等促進血管新生、侵襲、增殖及轉移。
靶定一種主要表現於MDSCs之免疫查核點分子、含V型免疫球蛋白域的T細胞活化抑制子(VISTA)，是用於消除MDSC-媒介的效應子免疫細胞(effector immune cell)功能抑制之誘人的治療策略。
WO 2017/137830 A1揭示抗-VISTA抗體VSTB174，其於例如段落[00221]揭示為包含抗-VISTA抗體VSTB112的可變異區域。段落[00362]揭示VSTB123包含VSTB174的可變異區域。WO 2017/137830 A1於段落[0417]及圖42A之實施例25揭示mIgG2a抗體VSTB123能抑制MB49腫瘤模式之腫瘤生長。段落[0418]及圖42A揭示VSTB124相反地–其為以IgG2a LALA格式提供的相同抗體；參見段落[0408]–不會抑制腫瘤生長。根據此等結果實施例25於段落[0419]做出抗-VISTA抗體治療之功效可能需要活性Fc的結論。因此，於圖47(參見圖47之圖註於段落[0053])示意表示之提議的抗-VISTA抗體作用機轉涉及了NK細胞表現的FcγRIII之Fc-媒介的接合作用。
Le Mercier等人，Cancer Res. (2014) 74(7):1933-44中揭示的倉鼠單株抗-VISTA抗體mAb13F3會抑制B16OVA及B16-BL6黑色素瘤模式之腫瘤生長。第1942頁，跨越左及右欄的段落教示VISTA mAb之免疫原性及FcR結合活性可能是達成最佳標靶中和及治療功效的關鍵限制因子。
發明概要 於第一個態樣中，本發明提供一種抗原結合分子，其可選擇地為經單離的，其能與VISTA結合且獨立於與Fc-媒介的功能而抑制VISTA-媒介的訊息傳導。
亦提供一種抗原結合分子，其可選擇地為經單離的，其能與VISTA結合且抑制VISTA-媒介的訊息傳導，其中該抗原結合分子不能誘發Fc-媒介的抗體效應子功能。
於一些具體例中，該抗原結合分子不能誘發抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)及/或不能誘發抗體依賴性細胞媒介的吞噬作用(ADCP)及/或不能誘發補體依賴性細胞毒性(CDC)。
亦提供一種抗原結合分子，其可選擇地為經單離的，其能與VISTA結合且抑制VISTA-媒介的訊息傳導，其中該抗原結合分子不與Fcγ受體結合及/或其中該抗原結合分子不與C1q結合。
於一些具體例中，該抗原結合分子能與VISTA於似Ig的V型域內結合。
於一些具體例中，該抗原結合分子能與一多肽結合，該多肽包含序列辨識編號：6的該胺基酸序列或由序列辨識編號：6的該胺基酸序列所組成。
於一些具體例中，該抗原結合分子能與一多肽結合，該多肽包含序列辨識編號：31的該胺基酸序列或由序列辨識編號：31的該胺基酸序列所組成。
於一些具體例中，該抗原結合分子不與IGN175A競爭與VISTA結合(例如依表位篩選(epitope binning)分析所判定，例如實施例8中所述)。
於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：275之胺基酸序列所組成的一胜肽不能結合。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：305的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：306的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：307的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：308的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：244的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：34的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：35的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：245的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：309的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：295或序列辨識編號：300的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：295的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：300的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：277的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：42的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：286的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：42的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：42的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：300的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：34的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：35的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：42的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：34的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：35的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：67的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：53的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：34的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：35的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：58的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：73的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：74的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：80的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：81的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：82的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：88的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：89的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：90的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：96的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：97的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：98的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：88的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：89的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：90的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：137的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：138的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：139的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：107的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：108的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：114的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：67的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：115的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：120的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：121的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：122的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：127的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：128的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：129的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：144的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：145的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：146的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：151的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：152的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：153的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：158的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：159的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：160的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：165的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：152的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：153的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：169的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：170的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：171的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：177的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：179的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：246的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：247的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：185的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：189的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：195的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：197的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：200的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：203的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含： 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：310的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與下列中一者的胺基酸序列有至少70%的序列同一性：序列辨識編號：294、序列辨識編號：297或序列辨識編號：299； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：294的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：297的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：299的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：301的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：302的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：303的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：276的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：282的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：285的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：287的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：32的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：40的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：52的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：57的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：62的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：66的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：48的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：50的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：87的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：95的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：106的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：113的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：143的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：150的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：157的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：164的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：71的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：79的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：102的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：104的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：119的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：126的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：183的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：188的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：194的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：196的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：199的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：202的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：133的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：136的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：168的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：176的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性。
在一些具體例中該抗原結合分子能與人類VISTA及下列之一者或更多者結合：小鼠VISTA及食蟹獼猴(cynomolgous macaque)VISTA。
亦提供一種抗原結合分子，其可選擇地為經單離的，其包含(i)一種如本發明之抗原結合分子，及(ii)一種能與VISTA以外的抗原結合之抗原結合分子。
在一些具體例中該抗原結合分子能與細胞表面表現VISTA的細胞結合。
於一些具體例中該抗原結合分子能抑制VISTA及VISTA的一結合伙伴之間的交互作用。
在一些具體例中該抗原結合分子能抑制VISTA-媒介的訊息傳導。
在一些具體例中該抗原結合分子能增高效應子免疫細胞的增殖及/或細胞介素生產。
亦提供一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含如本發明之抗原結合分子。
亦提供一種核酸或多種核酸，其可選擇地為經單離的，其編碼如本發明之一抗原結合分子或一CAR。
亦提供一種表現載體或多種表現載體，其包含如本發明之一種核酸或多種核酸。
亦提供一種細胞，其包含如本發明的一抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體。
亦提供一種方法，其包含使一含如本發明之核酸或多種核酸或表現載體或多種表現載體的細胞，於適合從該核酸或表現載體表現該抗原結合分子或CAR的條件下予以培養。
亦提供一種組成物，其包含如本發明之一抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、或一細胞。
於一些具體例中該組成物額外包含一種能抑制VISTA以外的一免疫查核點分子媒介的訊息傳導之製劑，可選擇地其中該VISTA以外的免疫查核點抑制劑係選自於：PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT及BTLA。
亦提供如本發明之一抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、細胞或組成物供用於醫學治療或預防(prophylaxis)的方法。
亦提供本發明之一抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、細胞或組成物供用於治療或預防一癌症或一感染疾病的方法。
亦提供本發明之一抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、細胞或組成物於製備一藥物之用途，該藥物供用於治療或預防一癌症或一感染疾病的一方法。
亦提供一種治療或預防一癌症或一感染疾病之方法，其包含投予治療或預防有效量之本發明之一抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、細胞或組成物至一個體。
在一些具體例中，該癌症係選自於：一種包含表現VISTA的細胞之癌症、一種包含表現VISTA的細胞浸潤之癌症、一種包含表現VISTA的癌細胞之癌症、血液癌症、白血病、急性骨髓白血病、淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、間皮瘤、一實性腫瘤、 肺癌、非小細胞肺癌、胃癌(gastric cancer)、胃癌(gastric carcinoma)、結腸直腸癌(colorectal cancer)、結腸直腸癌(colorectal carcinoma)、結腸直腸腺癌(colorectal adenocarcinoma)、子宮癌、子宮體子宮內膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma)、乳癌(breast cancer)、三陰性侵襲性乳癌(triple negative breast invasive carcinoma)、肝癌、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、胰臟癌(pancreatic cancer)、胰臟管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma)、甲狀腺癌、胸腺瘤(thymoma)、皮膚癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、腎癌、腎臟細胞癌、腎臟乳突細胞癌(renal papillary cell carcinoma)、頭頸部癌(head and neck cancer)、頭頸部鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN))、卵巢癌(ovarian cancer)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma)、前列腺癌(prostate cancer)及/或前列腺腺癌(prostate adenocarcinoma)。
亦提供本發明之一抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、細胞或組成物供用於治療或預防一種與骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)病理上關聯的疾病之方法。
亦提供一種本發明之抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、細胞或組成物於製備一藥物之用途，該藥物供用於治療或預防一種與骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)病理上關聯的疾病之方法。
亦提供一種治療或預防一種與骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)病理上關聯的疾病之方法，該方法包含投予治療或預防有效量之本發明的抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、細胞或組成物至一個體。
於一些具體例中該方法額外包含投予一種能抑制VISTA以外的一免疫查核點分子媒介的訊息傳導之製劑，可選擇地其中該VISTA以外的免疫查核點分子係選自於PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT或BTLA。
亦提供一種抑制VISTA-媒介的訊息傳導之方法，其包含使表現VISTA的細胞與如本發明之抗原結合分子接觸。
亦提供一種抑制骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)的活性之方法，該方法包含使MDSCs與如本發明之抗原結合分子接觸。
亦提供一種用於增高效應子免疫細胞之數目或活性的方法，該方法包含以如本發明之抗原結合分子抑制表現VISTA的細胞之活性。
亦提供一種活體外 複合物，其可選擇地為經單離的，其包含與VISTA結合之如本發明的抗原結合分子。
亦提供一種方法，其包含使一種含有或懷疑含有VISTA的樣本與如本發明的抗原結合分子接觸，以及偵測該抗原結合分子與VISTA形成的複合物。
亦提供一種選擇個體或將個體分組(stratifying)以供用於以VISTA-標靶劑治療的方法，該方法包含於活體外 使來自該個體的一樣本與如本發明之抗原結合分子接觸以及偵測該抗原結合分子與VISTA的一複合物之形成。
亦提供一種如本發明之抗原結合分子作為一活體外 或活體內 診斷劑或預後劑之用途。
亦提供一種如本發明之抗原結合分子於一種用於偵測、定位或成像一癌症方法之用途，可選擇地其中該癌症係選自於：一種包含表現VISTA的細胞之癌症、一種包含表現VISTA的細胞浸潤之癌症、一種包含表現VISTA的癌細胞之癌症、血液癌症、白血病、急性骨髓白血病、淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、間皮瘤、一實性腫瘤、 肺癌、非小細胞肺癌、胃癌(gastric cancer)、胃癌(gastric carcinoma)、結腸直腸癌(colorectal cancer)、結腸直腸癌(colorectal carcinoma)、結腸直腸腺癌(colorectal adenocarcinoma)、子宮癌、子宮體子宮內膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma)、乳癌(breast cancer)、三陰性侵襲性乳癌(triple negative breast invasive carcinoma)、肝癌、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、胰臟癌(pancreatic cancer)、胰臟管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma)、甲狀腺癌、胸腺瘤(thymoma)、皮膚癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、腎癌、腎臟細胞癌、腎臟乳突細胞癌、頭頸部癌、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、卵巢癌(ovarian cancer)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、卵巢漿液性囊腺癌、前列腺癌(prostate cancer)及/或前列腺腺癌(prostate adenocarcinoma)。說明
本發明係有關於新穎的VISTA-結合分子，其與已知的抗-VISTA抗體相比具有新穎及/或改良的性質。
本發明人生產與VISTA的細胞外區域內特定感興趣的區域結合之抗原結合分子。本發明之VISTA-結合分子與先前技藝揭示的VISTA-結合抗原結合分子相比，提供所欲的生物物理及功能性質組合。
特別地，本文所述之VISTA-結合分子證實能通過一種不需要Fc-媒介的功能之機轉來拮抗VISTA-媒介的訊息傳導。本發明人證實本文所述之包含缺乏結合Fcγ受體及/或C1q能力之Fc的VISTA-結合分子能提供活體內 治療性抗癌效應。
本發明人首次確立通過不需要Fc-媒介的效應子功能(如針對表現VISTA的細胞之ADCC/ADCP/CDC)之機轉來直接拮抗VISTA-媒介的訊息傳導是有可能的。
本揭露內容之VISTA結合分子靶定的VISTA區域與已知的抗-VISTA抗體靶定的區域是不同的。靶定特定的VISTA區域之抗原結合分子能在不需要Fc-媒介的效應子功能的情況下而拮抗VISTA-媒介的訊息傳導。
本文所述之VISTA-結合分子因而在不需要耗乏表現VISTA的細胞的情況下可用於抑制VISTA-媒介的訊息傳導。這非常重要，因為VISTA表現於不希望耗乏的細胞上。本文揭示之VISTA-結合分子因而能抑制VISTA-媒介的訊息傳導同時使非所欲的副作用減到最小。
本文所述之VISTA-結合分子也有利地顯示出能解除T細胞不受VISTA-媒介的抑制。具體地說，本文揭示之VISTA-結合分子於VISTA或表現VISTA的細胞存在下，顯示出能增高T細胞增殖以及從所培養的T細胞生產例如IFNγ與TNFa。 VISTA、結合伙伴及VISTA-媒介的訊息傳導
含V型免疫球蛋白域的T細胞活化抑制子(VISTA；也被稱為例如B7-H5、SISP1、PD-1H)係確認為UniProt Q9H7M9蛋白，具有序列辨識編號：1中顯示的胺基酸序列(Q9H7M9-1, v3)。VISTA之結構及功能係描述於舉例而言Lines等人，Cancer Res. (2014) 74(7): 1924-1932之內，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。VISTA為~50 kDa單程第I型跨膜其作用為免疫查核點並且由C10orf54 基因編碼。VISTA之細胞外區域與PD-L1是同源的。
序列辨識編號：1之N端32個胺基酸構成一訊息胜肽，所以VISTA的成熟形式(即加工移去訊息胜肽之後)具有序列辨識編號：2顯示的胺基酸序列。序列辨識編號：1之位置33至194形成細胞外域(序列辨識編號：3)、位置195至215形成跨膜域(序列辨識編號：4)，以及位置216至311形成細胞質域(序列辨識編號：5)。細胞外域包含一似Ig的V型域(序列辨識編號：1之位置33至168，序列辨識編號：6內所示)。
於此說明書中，“VISTA”係指來自任何物種的VISTA且包括來自任何物種的VISTA同功型、片段、變異體(包括突變體)或同源物。
當使用於本文中，一蛋白的“片段”、“變異體”或“同源物”可選擇地特徵在於與參考蛋白(如參考同功型)的胺基酸序列，有至少60%，較佳為70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。於一些具體例中，一參考蛋白的片段、變異體、同功型或同源物可特徵在於執行參考蛋白所履行的功能之能力。
一“片段”通常係指參考蛋白的一部分。一“變異體”通常係指具有一胺基酸序列的一蛋白，該胺基酸序列相對於參考蛋白的胺基酸序列包含一或多個胺基酸取代、插入、缺失或其他修飾，但保留與參考蛋白的胺基酸序列相當程度的序列同一性(如至少60%)。一“同功型”通常係指參考蛋白的一變異體，其係由與參考蛋白物種相同的物種所表現。一“同源物”通常係指參考蛋白的一變異體，其係由與參考蛋白物種相比，不同的物種所生產者。同源物包括異種同源物(orthologues)。
一“片段”可為任何長度(按胺基酸的數量計)，雖然可選擇地為參考蛋白(即，衍生出該片段的蛋白)長度的至少20%且可具有參考蛋白長度的50%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之一者的最大長度。VISTA的片段可具有10、20、30、40、50、100、150、200、250或300個胺基酸之一者的最小長度，且可具有20、30、40、50、100、150、200、250或300個胺基酸之一者的最大長度。
在一些具體例中，VISTA為來自哺乳動物的VISTA(如靈長類動物(恆河猴(rhesus)、食蟹獼猴(cynomolgus)、非人類靈長類動物或人類)及/或囓齒動物(如大鼠或鼠類)VISTA)。VISTA之同功型、片段、變異體或同源物可選擇地特徵在於與來自特定物種，例如人類的未成熟或成熟的VISTA同功型之胺基酸序列，有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
同功型、片段、變異體或同源物可選擇地為功能同功型、片段、變異體或同源物，例如以該功能性質/活性合適的分析法予以分析測定時，具有參考VISTA的功能性質/活性。舉例而言，VISTA之同功型、片段、變異體或同源物可譬如展現與VSIG-3及/或PSGL-1之締合。
在一些具體例中，VISTA包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：1或2有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的胺基酸序列同一性。在一些具體例中，VISTA的片段包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：2、3或6中之一者有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的胺基酸序列同一性。
VISTA為B7蛋白家族的成員，且主要表現於白血球，以及特別是CD14+單核球(包括骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs))及CD33+骨髓細胞。CD56+ NK細胞、樹突細胞亦表現VISTA，以及CD4+及CD8+ T細胞亦表現較小的程度。MDSCs，特別是腫瘤浸潤型MDSCs高度表現VISTA，並且腫瘤浸潤型骨髓DCs也有表現(Le Mercier等人，Cancer Res. (2014) 74(7):1933-44)，以及表現於腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)及嗜中性球上。
有證據表明VISTA能作用為T細胞上的配體及受體二者以抑制T細胞效應子功能且維持周邊耐受性；經工程處理過度表現VISTA的腫瘤逃避免疫控制且比未過度表現VISTA的腫瘤生長得更快(Wang等人，Journal of Experimental Medicine. (2011) 208 (3): 577-92；Lines等人，Cancer Res. (2014) 74(7): 1924-1932)。VISTA已被證明是CD4+ T細胞上的共抑制受體或T細胞上的共抑制配體。VISTA−/− CD4+ T細胞已被報導會展現出比野生型CD4+ T細胞更強的抗原專一性增殖及細胞介素生產，暗示VISTA作用為CD4+ T細胞上的抑制受體。利用單株抗-VISTA抗體阻斷VISTA功能已被證明會提升腫瘤微環境內的腫瘤反應性T細胞之浸潤、增殖及效應子功能(Le Mercier等人，Cancer Res. (2014) 74(7):1933-4)。
亦已倡議VISTA會與VSIG-3(IGSF11)交互作用-參見例如Wang等人，J Immunol (2017), 198 (1 Supplement) 154.1，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。VSIG-3通過接合活化的T細胞上的VISTA而抑制T細胞增殖且降低細胞介素及趨化介素(chemokines)生產，諸如IFN-γ、IL-2、IL-17、CCL5/RANTES、CCL3/MIP-1a及CXCL11/I-TAC。
VSIG-3係確認為UniProt Q5DX21。人類IGSF11基因編碼的mRNA之選擇式剪接產出三種不同的同功型：同功型1(UniProt: Q5DX21-1, v3；序列辨識編號：7)；同功型2(UniProt: Q5DX21-2；序列辨識編號：8)，其包含位置1至17與序列辨識編號：7不同的序列；及同功型3(UniProt: Q5DX21-3；序列辨識編號：9)，其包含位置1至17與序列辨識編號：7不同的序列，且其亦包含位置211-235與序列辨識編號：7不同的序列。
序列辨識編號：7、8及9之N端22個胺基酸構成一訊息胜肽，所以VSIG-3同功型1、2及3的成熟形式(即加工移去訊息胜肽之後)分別具有序列辨識編號：10、11及12中顯示的胺基酸序列。序列辨識編號：7及8之位置23至241形成VSIG-3同功型1及2的細胞外域(序列辨識編號：13)，且序列辨識編號：9之位置23至216形成VSIG-3同功型3的細胞外域(序列辨識編號：14)。序列辨識編號：15顯示VSIG-3之跨膜域，以及序列辨識編號：16顯示細胞質域。細胞外域包含一似Ig的V型域(序列辨識編號：17內所示)，且VSIG-3同功型1及2的細胞外域額外包含一似Ig的C2型域(序列辨識編號：18內所示)。
於此說明書中，“VSIG-3”係指來自任何物種的VSIG-3且包括來自任何物種的VSIG-3同功型、片段、變異體(包括突變體)或同源物。
VSIG-3的片段可具有10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400個胺基酸之一者的最小長度，且可具有20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400個胺基酸之一者的最大長度。
在一些具體例中，VSIG-3為來自哺乳動物的VSIG-3(如靈長類動物(恆河猴(rhesus)、食蟹獼猴(cynomolgus)、非人類靈長類動物或人類)及/或囓齒動物(如大鼠或鼠類)VSIG-3)。VSIG-3之同功型、片段、變異體或同源物可選擇地特徵在於與來自特定物種，例如人類的未成熟或成熟的VSIG-3同功型之胺基酸序列，有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
同功型、片段、變異體或同源物可選擇地為功能同功型、片段、變異體或同源物，例如以該功能性質/活性合適的分析法予以分析測定時，具有參考VSIG-3的功能性質/活性。舉例而言，VSIG-3之同功型、片段、變異體或同源物可例如展現與VISTA之締合。
在一些具體例中，VSIG-3包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：7至12中之一者有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的胺基酸序列同一性。在一些具體例中，VSIG-3的片段包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：10至14、17或18中之一者有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的胺基酸序列同一性。
亦已倡議VISTA會與VSIG-8交互作用-參見例如WO/2016/090347 A1。VSIG-8係確認為UniProt P0DPA2蛋白(序列辨識編號：19)。序列辨識編號：19之N端21個胺基酸構成一訊息胜肽，所以VSIG-8的成熟形式(即加工移去訊息胜肽之後)具有序列辨識編號：20顯示的胺基酸序列。序列辨識編號：19之位置22至263形成VSIG-8的細胞外域(序列辨識編號：21)。序列辨識編號：22顯示VSIG-8之跨膜域，以及序列辨識編號：23顯示細胞質域。細胞外域包含一似Ig的V型域1(序列辨識編號：24內所示)，及一似Ig的V型域2(序列辨識編號：25內所示)。
於此說明書中，“VSIG-8”係指來自任何物種的VSIG-8且包括來自任何物種的VSIG-8同功型、片段、變異體(包括突變體)或同源物。
VSIG-8的片段可具有10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400個胺基酸之一者的最小長度，且可具有20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400個胺基酸之一者的最大長度。
在一些具體例中，VSIG-8為來自哺乳動物的VSIG-8(如靈長類動物(恆河猴(rhesus)、食蟹獼猴(cynomolgus)、非人類靈長類動物或人類)及/或囓齒動物(如大鼠或鼠類)VSIG-8)。VSIG-8之同功型、片段、變異體或同源物可選擇地特徵在於與來自特定物種，例如人類的未成熟或成熟的VSIG-8同功型之胺基酸序列，有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
同功型、片段、變異體或同源物可選擇地為功能同功型、片段、變異體或同源物，例如以該功能性質/活性合適的分析法予以分析測定時，具有參考VSIG-8的功能性質/活性。舉例而言，VSIG-8之同功型、片段、變異體或同源物可例如展現與VISTA之締合。
在一些具體例中，VSIG-8包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：19或20有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的胺基酸序列同一性。在一些具體例中，VSIG-8的片段包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：20、21、24或25中之一者有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的胺基酸序列同一性。
亦已倡議VISTA會與PSGL-1交互作用-參見例如WO 2018/132476 A1。PSGL-1同功型1係確認為UniProt Q14242-1蛋白(序列辨識編號：323)。PSGL-1同功型2係確認為UniProt Q14242-2蛋白(序列辨識編號：324)，且與PSGL-1同功型1的差異在於其於序列辨識編號：323的位置1後包含額外的16個胺基酸。
序列辨識編號：323之N端17個胺基酸構成一訊息胜肽，所以PSGL-1的成熟形式(即加工移去訊息胜肽之後)具有序列辨識編號：325顯示的胺基酸序列。序列辨識編號：323之位置18至320形成PSGL-1的細胞外域(序列辨識編號：326)。序列辨識編號：327顯示PSGL-1之跨膜域，以及序列辨識編號：328顯示細胞質域。細胞外域包含12、10個胺基酸串連重複(tandem repeats)；重複區域顯示於序列辨識編號：329。
於此說明書中，“PSGL-1”係指來自任何物種的PSGL-1且包括來自任何物種的PSGL-1同功型、片段、變異體(包括突變體)或同源物。
PSGL-1的片段可具有10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400個胺基酸之一者的最小長度，且可具有20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400個胺基酸之一者的最大長度。
在一些具體例中，PSGL-1為來自哺乳動物的PSGL-1(如靈長類動物(恆河猴、食蟹獼猴、非人類靈長類動物或人類)及/或囓齒動物(如大鼠或鼠類)PSGL-1)。PSGL-1之同功型、片段、變異體或同源物可選擇地特徵在於與來自特定物種，例如人類的未成熟或成熟的PSGL-1同功型之胺基酸序列，有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
同功型、片段、變異體或同源物可選擇地為功能同功型、片段、變異體或同源物，例如以該功能性質/活性合適的分析法予以分析測定時，具有參考PSGL-1的功能性質/活性。舉例而言，PSGL-1之同功型、片段、變異體或同源物可例如展現與VISTA之締合。
在一些具體例中，PSGL-1包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：323或324有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的胺基酸序列同一性。在一些具體例中，PSGL-1的片段包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：325、326或329中之一者有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的胺基酸序列同一性。 標靶分子上特定感興趣的區域
本發明之抗原結合分子經特別設計以靶定特定感興趣的VISTA區域。於二步驟的方法中，於預測抗原性、功能及安全性的分析後，選擇要靶定的VISTA區域。繼而使用對應靶定區域的胜肽作為免疫原來製備對VISTA標靶區域專一的抗體以增加專一性單株抗體，且隨後篩選以辨識天然狀態能結合VISTA的抗體。此方法提供抗體表位精湛的掌握。
本發明之抗原結合分子可參照其等結合的VISTA區域予以定義。本發明之抗原結合分子可與特定感興趣的VISTA區域結合。在一些具體例中，該抗原結合分子可結合由相鄰的胺基酸序列組成(即胺基酸一級序列)之VISTA的線形表位。在一些具體例中，該抗原結合分子可結合由胺基酸序列之不連續的胺基酸序列組成之VISTA的構形表位。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子與VISTA結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與VISTA的細胞外區域(例如序列辨識編號：3所示的區域)結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與VISTA的似Ig的V型域(例如序列辨識編號：6所示的區域)結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與VISTA於對應於序列辨識編號：1的位置61至162(序列辨識編號：31中所示)的區域結合。
於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：322所示的VISTA區域結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：26所示的VISTA區域結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：27所示的VISTA區域結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：28所示的VISTA區域結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：29所示的VISTA區域結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：30所示的VISTA區域結合。
於一些具體例中，該抗原結合分子不與序列辨識編號：271所示的VISTA區域結合。於一些具體例中，該抗原結合分子不與序列辨識編號：272所示的VISTA區域結合。於一些具體例中，該抗原結合分子不與序列辨識編號：273所示的VISTA區域結合。於一些具體例中，該抗原結合分子不與序列辨識編號：274所示的VISTA區域結合。於一些具體例中，該抗原結合分子不與序列辨識編號：275所示的VISTA區域結合。
一抗體與一胜肽/多肽結合的區域可由熟悉此藝者使用本技藝熟知的各種方法來判定，包括抗體-抗原複合物之X射線共結晶學分析、胜肽掃描(peptide scanning)、致突變測繪(mutagenesis mapping)、由質譜法進行之氫-氘交換分析(hydrogen-deuterium exchange analysis)、噬菌體顯示、競爭ELISA及蛋白質水解為基的‘保護’法。此等方法係於，舉例而言，Gershoni等人，BioDrugs, 2007, 21(3):145-156中說明，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。
於一些具體例中，該抗原結合分子能與一種抗體所結合VISTA區域相同的VISTA區域或重疊的VISTA區域結合，該抗體包含本文所述之抗體殖株4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8、V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12中的一者之VH及VL序列。
當使用於本文中，一“胜肽”係指一種由肽鍵所鍵聯的二或更多個胺基酸單體的鏈。一胜肽典型於該區域具有大約2至50個胺基酸的長度。一“多肽”為二或更多種胜肽的聚合物鏈。多肽典型具有超過大約50個胺基酸的長度。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能與一多肽結合，該多肽包含序列辨識編號：1、2、3、6或31中之一者的胺基酸序列或由序列辨識編號：1、2、3、6或31中之一者的胺基酸序列所組成。
於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽/多肽結合，該胜肽/多肽包含序列辨識編號：322的胺基酸序列或由序列辨識編號：322的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽/多肽結合，該胜肽/多肽包含序列辨識編號：26的胺基酸序列或由序列辨識編號：26的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽/多肽結合，該胜肽/多肽包含序列辨識編號：27的胺基酸序列或由序列辨識編號：27的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽/多肽結合，該胜肽/多肽包含序列辨識編號：28的胺基酸序列或由序列辨識編號：28的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽/多肽結合，該胜肽/多肽包含序列辨識編號：29的胺基酸序列或由序列辨識編號：29的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽/多肽結合，該胜肽/多肽包含序列辨識編號：30的胺基酸序列或由序列辨識編號：30的胺基酸序列所組成。
於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：271之胺基酸序列所組成的一胜肽不能結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：272之胺基酸序列所組成的一胜肽不能結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：273之胺基酸序列所組成的一胜肽不能結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：274之胺基酸序列所組成的一胜肽不能結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：275之胺基酸序列所組成的一胜肽不能結合。
一抗原結合分子與一特定的胜肽/多肽結合的能力可以藉由熟悉此藝者熟知的方法來分析，包括藉由ELISA、免疫墨點法(如西方墨點法)、免疫沉澱法、表面電漿子共振(SPR；參見諸如，Hearty等人，Methods Mol Biol (2012) 907:411-442)或生物層干涉術(參見諸如Lad等人，(2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507)之分析。
在該抗原結合分子能與包含一參考胺基酸序列之胜肽/多肽結合的具體例中，該胜肽/多肽可包含一或多個額外的胺基酸於該參考胺基酸序列之一或二端。在一些具體例中，該胜肽/多肽包含例如1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、5-10、5-20、5-30、5-40、5-50、10-20、10-30、10-40、10-50、20-30、20-40或20-50個額外的胺基酸於該參考胺基酸序列之一或二端。
在一些具體例中，該參考序列之一或二端(即N端及C端末端)所提供的額外胺基酸，在VISTA胺基酸序列的情況下係對應於該參考序列的末端位置。作為舉例，於該抗原結合分子與包含序列辨識編號：26的序列及額外的二個胺基酸於序列辨識編號：26的C端末端之胜肽/多肽能結合的情況中，對應於序列辨識編號：1的位置90及91之額外的二個胺基酸可以為精胺酸及天冬醯胺酸。
於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽/多肽結合，該胜肽/多肽係結合一種抗體，其包含本文所述之抗體殖株4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8、V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12中的一者之VH及VL序列。 骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)
骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)為一群骨髓譜系細胞之異質免疫細胞，特徵在於免疫抑制表現型。Kumar等人，Trends Immunol. (2016); 37(3): 208-220內回顧MDSC生物學，其係以其之全體藉此併入以作為參考資料。
MDSC特徵在於區分此等細胞與成熟骨髓細胞(即巨噬細胞、樹突細胞及嗜中性球)的一些生化及遺傳特徵譬如：NADPH氧化酶(Nox2)表現增高，活性含氧物(ROS) (如過氧化物陰離子(O2− )、過氧化氫(H2 O2 )及過氧亞硝酸根(PNT；ONOO− ))生產增加；精胺酸酶1及一氧化氮合成酶2(nos2)表現增高，及一氧化氮(NO)生產增加；c/EBPβ及STAT3表現增高；IRF8表現減少；以及S100A8/9蛋白生產增高。
有二種不同類型的MDSC；多形核MDSCs(PMN-MDSCs)，其與嗜中性球為形態及表現型上相似，以及與單核球更相似的單核球性MDSCs(M-MDSCs)。MDSCs之形態及表現型特徵係描述於舉例而言Marvel and Gabrilovich J Clin Invest. 2015 Sep 1; 125(9): 3356–3364之內，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。於小鼠方面，MDSCs廣泛認定為CD11b+ Gr1+ 細胞。Gr-1hi 細胞多數為PMN-MDSCs，以及Gr-1lo 細胞多數為M-MDSCs。此等亞群可以根據Ly6C及Ly6G標識予以更準確地識別；M-MDSCs為CD11b+ Ly6Chi Ly6G– ，以及PMN-MDSCs為CD11b+ Ly6Clo Ly6G+ )。於人類方面，MDSCs認定為單核的部分。PMN-MDSCs為CD14– CD11b+ CD33+ CD15+ 或CD66b+ 細胞，以及M-MDSCs為CD14+HLA-DR– /lo 細胞。Lin– HLA-DR– CD33+ MDSCs族群代表一種富集骨髓先驅之混合的細胞群。
MDSC-媒介的免疫抑制牽涉的因素包括表現精胺酸酶(ARG1)、可誘發的NOS(iNOS)、TGF-β、IL-10及COX2，半胱胺酸固存(sequestration of cysteine)，T細胞的l-選滯蛋白表現減少，以及誘發Tregs。M-MDSCs及PMN-MDSCs使用不同的免疫抑制機轉。M-MDSCs通過生產NO及細胞介素來抑制抗原專一性及非專一性T細胞反應二者，以及比PMN-MDSCs的免疫抑制更強。PMN-MDSCs以通過生產ROS之抗原專一性方式抑制免疫反應。
MDSCs與癌症及感染疾病之發展及進程有病理上的關聯。MDSCs於人類疾病上的角色舉例而言於Kumar等人，Trends Immunol. (2016); 37(3): 208–220 (併入於此以作為參考資料)及Greten等人，Int Immunopharmacol. (2011) 11(7):802–807內回顧，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。
腫瘤組織內有大量的MDSCs，且通過多種機轉來促進癌症之發展及進程，舉例而言於Umansky等人，Vaccines (Basel) (2016) 4(4):36內回顧。通過趨化介素表現來補給MDSCs至腫瘤位置，以及腫瘤微環境之前發炎性因子導致MDSCs之免疫抑制功能顯著的向上調節。MDSCs通過抑制效應子免疫細胞功能(例如效應子T細胞及NK細胞功能)、促進調節性T細胞生產/活性、生產生長因子例如VEGF及bFGF，以及生產ECM-修飾因子例如基質金屬蛋白酶而促成腫瘤發展、血管新生及轉移。
MDSCs可參考VISTA表現予以特徵化。在本發明的各種態樣之具體例中，MDSCs可為“表現VISTA的MDSCs”或“VISTA+ MDSCs”。MDSCs可表現VISTA於細胞表面(即VISTA可表現在細胞膜上或在細胞膜)。 抗原結合分子
本發明提供能與VISTA結合之抗原結合分子。
一種“抗原結合分子”係指一種分子，其能與標靶抗原結合且包含單株抗體、多株抗體、單專一性及多專一性抗體(如雙專一性抗體)及抗體片段(如Fv、scFv、Fab、scFab、F(ab’)2 、Fab2 、雙價抗體(diabodies)、三鏈抗體(triabodies)、scFv-Fc、微型抗體(minibodies)、單域抗體(如VhH)等等)，只要其等展現與相關的標靶分子之結合。
本發明之抗原結合分子包含能與標靶抗原結合的一部分。在一些具體例中，能與標靶抗原結合的該部分包含能與標靶抗原專一性結合的一抗體之一抗體重鏈可變異區域(VH)及一抗體輕鏈可變異區域(VL)。在一些具體例中，能與標靶抗原結合的該部分包含能與標靶抗原結合的適配體或由能與標靶抗原結合的適配體所組成，例如核酸適配體(舉例而言，於Zhou and Rossi Nat Rev Drug Discov. 2017 16(3):181-202內回顧)。在一些具體例中，能與標靶抗原結合的該部分包含抗原結合胜肽/多肽或由抗原結合胜肽/多肽所組成，例如胜肽適配體、硫氧化還原蛋白、單一體型(monobody)、抗運載蛋白(anticalin)、孔尼茲域(Kunitz domain)、厄維體(avimer)、打結素(knottin)、fynomer、atrimer、DARPin、親和體(affibody)、奈米抗體(nanobody) (即單域抗體(sdAb))阿菲林(affilin)、犰狳重複蛋白(armadillo repeat protein (ArmRP)、Obody或纖維接合素(fibronectin)-舉例而言於Reverdatto等人，Curr Top Med Chem. 2015；15(12): 1082-1101內回顧，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料(亦可參見例如Boersma等人，J Biol Chem (2011) 286:41273-85以及Emanuel等人，Mabs (2011) 3:38-48)。
本發明之抗原結合分子一般包含抗原結合域，其包含能與標靶抗原專一性結合的一抗體之VH及VL。由VH及VL形成的抗原結合域於此亦可以稱為Fv區域。
一種抗原結合分子可以為，或可包含，一種抗原結合多肽或抗原結合多肽複合物。一種抗原結合分子可以包含一起形成抗原結合域之一種以上的多肽。多肽可以共價或非共價地締合。於一些具體例中，該多肽形成包含該多肽之較大多肽的一部分(如就scFv來說包含VH及VL，或就scFab來說包含VH-CH1及VL-CL)。
一種抗原結合分子可提及一種以上的多肽(如2、3、4、6或8種多肽)之非共價或共價複合物，舉例而言一種包含二種重鏈多肽及二種輕鏈多肽之似IgG抗原結合分子。
本發明之抗原結合分子可經設計且使用能與VISTA結合之單株抗體(mAbs)的序列來製備。亦可使用/提供抗體之抗原結合區域，諸如單鏈可變異片段(scFv)、Fab及F(ab’)2 片段。“抗原結合區域”是一抗體的任何片段，其能與該特定抗體專一的標靶結合。
抗體通常包含六個互補性決定區域CDRs；三者於重鏈可變異(VH)區域：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及三者於輕鏈可變異(VL)區域：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。六個CDRs一起定義抗體之互補位(paratope)，其為抗體與標靶抗原結合的一部分。
VH區域和VL區域包含框架區域(FRs)於各CDR的任一方，其提供CDRs之架構。從N端至C端，VH區域包含下列結構：N端(term)-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C端；且VL區域包含下列結構：N端-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C端。
有幾種不同的定義抗體CDRs及FRs之規範，諸如於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Chothia等人，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)中所述的該等，以及VBASE2，如Retter等人，Nucl. Acids Res. (2005) 33 (suppl 1): D671-D674中所述。本文所述之抗體殖株的VH區域及VL區域之CDRs及FRs之定義係依據國際IMGT(ImMunoGeneTics)資訊系統(LeFranc等人，Nucleic Acids Res. (2015) 43 (Database issue):D413-22)，其使用如Lefranc等人，Dev. Comp. Immunol. (2003) 27:55-77中所述的IMGT V-DOMAIN編號規則。
在一些具體例中，該抗原結合分子包含一種能與VISTA結合之抗原結合分子的CDRs。在一些具體例中，該抗原結合分子包含一種能與VISTA結合之抗原結合分子的FRs。在一些具體例中，該抗原結合分子包含一種能與VISTA結合之抗原結合分子的CDRs及FRs。亦即，在一些具體例中，該抗原結合分子包含一種能與VISTA結合之抗原結合分子的VH區域及VL區域。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含一VH區域及一VL區域，其係或其係衍生自，本文所述之VISTA-結合抗體殖株的VH/VL區域(即抗-VISTA抗體殖株4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8、V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12)。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含如以下(1)至(18)中的一者之VH區域：
(1)(4M2-C12衍生一致的)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：305的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：306的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：307的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(2) (V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(3) (V4-C1)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：277的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(4) (V4-C9) 包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：286的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(5) (4M2-C12/V4H1/V4H2一致的)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：244的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：34的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：35的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(6) (4M2-C12、4M2-B4、V4H2) 包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：34的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：35的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(7) (V4H1) 包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：53的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：34的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：35的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(8) (2M1-B12、2M1-D2)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：73的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：74的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(9) (4M2-C9、5M1-A11)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：88的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：89的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：90的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(10) (4M2-D9)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：107的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：108的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(11) (1M2-D2)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：120的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：121的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：122的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(12) (4M2-D5)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：144的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：145的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：146的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(13) (4M2-A8)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：158的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：159的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：160的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(14) (9M2-C12)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：169的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：170的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：171的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(15) (13D5衍生的)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：246的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(16) (13D5p)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：185的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(17) (13D5-1)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：195的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(18) (13D5-13)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：200的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含如以下(19)至(35)中的一者之VH區域：
(19) (V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：63的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：292的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：293的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：281的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(20) (V4-C1、V4-C9)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：63的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：279的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：280的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：281的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(21) (4M2-C12)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：36的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：37的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：38的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：39的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(22) (4M2-B4)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：49的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：37的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：38的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：39的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(23) (V4H1)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：54的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：55的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：56的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：39的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(24) (V4H2)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：63的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：64的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：65的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：39的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(25) (2M1-B12)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：75的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：76的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：77的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：78的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(26) (4M2-C9)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：91的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：92的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：93的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：94的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(27) (2M1-D2)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：103的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：76的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：77的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：78的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(28) (4M2-D9)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：109的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：110的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：111的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：112的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(29) (1M2-D2)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：123的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：124的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：125的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：78的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(30) (5M1-A11)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：134的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：92的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：93的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：135的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(31) (4M2-D5)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：147的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：148的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：149的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：135的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(32) (4M2-A8)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：161的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：162的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：163的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：135的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(33) (9M2-C12)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：172的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：173的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：174的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：175的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(34) (13D5p，13D5-1)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：103的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：186的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：187的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(35) (13D5-13)包括有下列FRs之VH區域： 具有序列辨識編號：103的該胺基酸序列之HC-FR1 具有序列辨識編號：186的該胺基酸序列之HC-FR2 具有序列辨識編號：201的該胺基酸序列之HC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之HC-FR4， 或其之一變異體，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含如以上(1)至(18)中的一者之CDRs以及如以上(19)至(35)中的一者之FRs。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含如以下(36)至(57)中的一者之VH區域：
(36) 包含如(1)之CDRs以及如(19)、(20)、(21)、(22)、(23)或(24)之FRs的VH區域。
(37) 包含如(2)之CDRs以及如(19)之FRs的VH區域。
(38) 包含如(3)之CDRs以及如(20)之FRs的VH區域。
(39) 包含如(4)之CDRs以及如(20)之FRs的VH區域。
(40) 包含如(5)之CDRs以及如(21)、(22)、(23)或(24)之FRs的VH區域。
(41) 包含如(6)之CDRs以及如(21)之FRs的VH區域。
(42) 包含如(6)之CDRs以及如(22)之FRs的VH區域。
(43) 包含如(6)之CDRs以及如(24)之FRs的VH區域。
(44) 包含如(7)之CDRs以及如(23)之FRs的VH區域。
(45) 包含如(8)之CDRs以及如(25)之FRs的VH區域。
(46) 包含如(8)之CDRs以及如(27)之FRs的VH區域。
(47) 包含如(9)之CDRs以及如(26)之FRs的VH區域。
(48) 包含如(9)之CDRs以及如(30)之FRs的VH區域。
(49) 包含如(10)之CDRs以及如(28)之FRs的VH區域。
(50) 包含如(11)之CDRs以及如(29)之FRs的VH區域。
(51) 包含如(12)之CDRs以及如(31)之FRs的VH區域。
(52) 包含如(13)之CDRs以及如(32)之FRs的VH區域。
(53) 包含如(14)之CDRs以及如(33)之FRs的VH區域。
(54) 包含如(15)之CDRs以及如(34)或(35)之FRs的VH區域。
(55) 包含如(16)之CDRs以及如(34)之FRs的VH區域。
(56) 包含如(17)之CDRs以及如(34)之FRs的VH區域。
(57) 包含如(18)之CDRs以及如(35)之FRs的VH區域。 於一些具體例中，該抗原結合分子包含如以下(58)至(76)中的一者之VH區域：
(58) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：276的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(59) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：285的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(60) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：289的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(61) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：32的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(62) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：48的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(63) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：52的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(64) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：62的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(65) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：71的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(66) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：87的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(67) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：102的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(68) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：106的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(69) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：119的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(70) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：133的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(71) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：143的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(72) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：157的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(73) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：168的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(74) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：183的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(75) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：194的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(76) 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：199的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含如以下(77)至(96)中的一者之VL區域：
(77) (4M2-C12衍生一致的)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：308的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(78) (C24/C26/C27一致的)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：309的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(79) (V4-C24，V4-C26) 包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：295的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(80) (V4-C27，V4-C30，V4-C31)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：300的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(81) (4M2-C12/V4H1/V4H2一致的)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：245的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(82) (4M2-C12，4M2-B4，V4-C1，V4-C9，V4-C28) 包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：42的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(83) (V4H1) 包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：58的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(84) (V4H2) 包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：67的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(85) (2M1-B12，2M1-D2) 包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：80的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：81的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：82的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(86) (4M2-C9) 包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：96的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：97的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：98的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(87) (4M2-D9)包括有下列CDRs之VH區域： 具有序列辨識編號：114的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：67的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：115的該胺基酸序列之LC-CDR3， 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(88) (1M2-D2)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：127的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：128的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：129的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(89) (5M1-A11)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：137的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：138的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：139的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(90) (4M2-D5)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：151的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：152的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：153的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(91) (4M2-A8)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：165的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：152的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：153的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(92) (9M2-C12) 包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：177的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：179的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(93) (13D5p衍生的)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：247的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(94) (13D5p)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：189的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(95) (13D5-1)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：197的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(96) (13D5-13)包括有下列CDRs之VL區域： 具有序列辨識編號：203的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3； 或其之一變異體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含如以下(97)至(120)中的一者之VL區域： (97) (V4-C1)包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：59的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：283的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：284的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(98) (V4-C9)包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：288的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：283的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：284的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(99) (V4-C24)包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：288的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：283的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：296的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(100) (V4-C26)包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：288的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：298的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：284的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(101) (V4-C27)包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：288的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：283的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：284的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(102) (V4-C28)包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：288的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：283的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：296的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(103) (V4-C30)包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：288的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：283的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：296的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(104) (V4-C31)包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：288的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：283的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：304的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(105) (4M2-C12)包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：44的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：45的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：46的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(106) (4M2-B4)包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：51的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：45的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：46的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(107) (V4H1) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：59的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：60的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：61的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(108) (V4H2) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：68的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：69的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：70的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：47的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(109) (2M1-B12) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：83的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：84的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：85的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(110) (4M2-C9) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：99的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：100的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：101的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(111) (2M1-D2) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：105的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：84的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：85的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(112) (4M2-D9) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：116的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：117的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：118的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(113) (1M2-D2) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：130的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：131的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：132的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(114) (5M1-A11) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：140的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：141的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：142的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(115) (4M2-D5) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：154的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：155的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：156的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(116) (4M2-A8) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：166的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：155的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：167的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(117) (9M2-C12) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：180的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：181的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：182的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(118) (13D5p) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：191的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：192的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：193的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(119) (13D5-1) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：191的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：198的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：193的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
(120) (13D5-13) 包括有下列FRs之VL區域： 具有序列辨識編號：191的該胺基酸序列之LC-FR1 具有序列辨識編號：192的該胺基酸序列之LC-FR2 具有序列辨識編號：204的該胺基酸序列之LC-FR3 具有序列辨識編號：86的該胺基酸序列之LC-FR4， 或其之一變異體，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含一VL區域，該VL區域包含如以上(77)至(96)中的一者之CDRs之以及如以上(97)至(120)中的一者之FRs。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含如以下(121)至(148)中的一者之VL區域：
(121) 包含如(77)之CDRs以及如(97)、(98)、(99)、(100)、(101)、(102)、(103)、(104)、(105)、(106)、(107)或(108)之FRs的VL區域。
(122) 包含如(78)之CDRs以及如(99)、(100)或(101)之FRs的VL區域。
(123) 包含如(79)之CDRs以及如(99)之FRs的VL區域。
(124) 包含如(79)之CDRs以及如(100)之FRs的VL區域。
(125) 包含如(80)之CDRs以及如(101)之FRs的VL區域。
(126) 包含如(82)之CDRs以及如(97)之FRs的VL區域。
(127) 包含如(82)之CDRs以及如(98)之FRs的VL區域。
(128) 包含如(82)之CDRs以及如(102)之FRs的VL區域。
(129) 包含如(80)之CDRs以及如(103)之FRs的VL區域。
(130) 包含如(80)之CDRs以及如(104)之FRs的VL區域。
(131) 包含如(81)之CDRs以及如(105)、(106)、(107)或(108)之FRs的VL區域。
(132) 包含如(82)之CDRs以及如(105)之FRs的VL區域。
(133) 包含如(82)之CDRs以及如(106)之FRs的VL區域。
(134) 包含如(83)之CDRs以及如(107)之FRs的VL區域。
(135) 包含如(84)之CDRs以及如(108)之FRs的VL區域。
(136) 包含如(85)之CDRs以及如(109)之FRs的VL區域。
(137) 包含如(85)之CDRs以及如(111)之FRs的VL區域。
(138) 包含如(86)之CDRs以及如(110)之FRs的VL區域。
(139) 包含如(87)之CDRs以及如(112)之FRs的VL區域。
(140) 包含如(88)之CDRs以及如(113)之FRs的VL區域。
(141) 包含如(89)之CDRs以及如(114)之FRs的VL區域。
(142) 包含如(90)之CDRs以及如(115)之FRs的VL區域。
(143) 包含如(91)之CDRs以及如(116)之FRs的VL區域。
(144) 包含如(92)之CDRs以及如(117)之FRs的VL區域。
(145) 包含如(93)之CDRs以及如(118)、(119)或(120)之FRs的VL區域。
(146) 包含如(94)之CDRs以及如(118)之FRs的VL區域。
(147) 包含如(95)之CDRs以及如(119)之FRs的VL區域。
(148) 包含如(96)之CDRs以及如(120)之FRs的VL區域。 於一些具體例中，該抗原結合分子包含如以下(149)至(173)中的一者之VL區域：
(149) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：310的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(150) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：282的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(151) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：287的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(152) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：294的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(153) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：297的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。.
(154) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：299的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(155) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：301的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(156) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：302的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(157) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：303的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(158) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：40的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(159) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：50的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(160) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：57的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(161) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：66的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(162) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：79的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(163) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：95的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(164) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：104的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(165) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：113的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(166) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：126的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(167) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：136的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(168) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：150的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(169) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：164的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(170) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：176的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(171) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：188的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(172) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：196的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
(173) 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：202的胺基酸序列有至少70%的序列同一性更佳為至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含如以上(1)至(76)中的一者之VH區域以及如以上(77)至(173)中的一者之VL區域。
在如本發明之一或更多個胺基酸係由另一個胺基酸取代的具體例中，該等取代可以為舉例而言如下表之保留式取代。在一些具體例中，中間欄位同一塊內的胺基酸為經取代的。在一些具體例中，最右邊的欄位同一行的胺基酸為經取代的：
Figure 108111311-A0304-0001
在一些具體例中，取代可以為功能上保留型。亦即，在一些具體例中包含該取代的抗原結合分子的一或更多種功能性質(如標靶結合)與等效未經取代的分子相比，可能不受該取代影響(或可能不實質影響)。
一種抗體之抗原結合區域的VH及VL區域一起構成Fv區域。在一些具體例中，如本發明之抗原結合分子包含與VISTA結合之Fv區域或由與VISTA結合之Fv區域所組成。在一些具體例中，該Fv的VH及VL區域係提供為由一鏈接子區域連結的單一多肽，即單鏈Fv(scFv)。
在一些具體例中本發明之抗原結合分子包含一種免疫球蛋白重鏈恆定序列的一或多個區域。在一些具體例中該免疫球蛋白重鏈恆定序列為，或衍生自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM之重鏈恆定序列。
於一些具體例中，該免疫球蛋白重鏈恆定序列為人類免疫球蛋白G 1恆定(IGHG1；UniProt: P01857-1，v1；序列辨識編號：205)。序列辨識編號：205之位置1至98形成CH1區域(序列辨識編號：206)。序列辨識編號：205之位置99至110形成CH1與CH2區域之間的一鉸鏈區域(序列辨識編號：207)。序列辨識編號：205之位置111至223形成CH2區域(序列辨識編號：208)。序列辨識編號：205之位置224至330形成CH3區域(序列辨識編號：209)。
製備例示性抗原結合分子可使用pFUSE-CHIg-hG1，其於CH3區域包含取代D356E、L358M(根據EU編號所編號的位置)。pFUSE-CHIg-hG1所編碼的CH3區域之胺基酸序列顯示於序列辨識編號：210內。將可以理解的是可以依照本文所述之抗原結合分子的Fc區域之修飾來提供CH3區域進一步的取代。
於一些具體例中，一CH1區域包含下列或由下列所組成：序列辨識編號：206的序列，或與序列辨識編號：206的胺基酸序列有至少60%，較佳為70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性的一序列。於一些具體例中，一CH1-CH2鉸鏈區域包含下列或由下列所組成：序列辨識編號：207的序列，或與序列辨識編號：207的胺基酸序列有至少60%，較佳為70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性的一序列。於一些具體例中，一CH2區域包含下列或由下列所組成：序列辨識編號：208的序列，或與序列辨識編號：208的胺基酸序列有至少60%，較佳為70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性的一序列。於一些具體例中，一CH3區域包含下列或由下列所組成：序列辨識編號：209或210的序列，或與序列辨識編號：209或210的胺基酸序列有至少60%，較佳為70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性的一序列。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含一免疫球蛋白輕鏈恆定序列之一或多個區域。在一些具體例中，免疫球蛋白輕鏈恆定序列為人類免疫球蛋白κ恆定(IGKC；Cκ；UniProt: P01834-1，v2；序列辨識編號：211)。在一些具體例中，免疫球蛋白輕鏈恆定序列為人類免疫球蛋白λ恆定(IGLC；Cλ)，例如IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6或IGLC7。於一些具體例中，一CL區域包含下列或由下列所組成：序列辨識編號：211的序列，或與序列辨識編號：211的胺基酸序列有至少60%，較佳為70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性的一序列。
一種抗體之抗原結合區域的VL及輕鏈恆定(CL)區域，以及VH區域及重鏈恆定1(CH1)區域一起構成Fab區域。在一些具體例中，該抗原結合分子包含一Fab區域其包含VH、CH1、VL及CL(如Cκ或Cλ)。在一些具體例中，該Fab區域包含一種包含VH及CH1之多肽(如VH-CH1融合多肽)，以及一種包含VL及CL之多肽(如VL-CL融合多肽)。在一些具體例中，該Fab區域包含一種包含VH及CL之多肽(如VH-CL融合多肽)以及一種包含VL及CH之多肽(如VL-CH1融合多肽)；亦即在一些具體例中，該Fab區域為CrossFab區域。在一些具體例中，該Fab或CrossFab之VH、CH1、VL及CL區域係提供為由鏈接子區域連結的單一多肽，即如一單鏈Fab(scFab)或單鏈CrossFab (scCrossFab)。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含與VISTA結合之Fab區域或由與VISTA結合之Fab區域所組成。
在一些具體例中，本文所述之抗原結合分子包含與VISTA結合之整個抗體或由與VISTA結合之整個抗體所組成。當使用於本文中，“整個抗體”係指一種抗體其具有與一免疫球蛋白(Ig)實質相似的結構之結構。不同種類的免疫球蛋白及其等之結構係描述於舉例而言Schroeder and Cavacini J Allergy Clin Immunol. (2010) 125(202): S41-S52之內，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。
G類型的免疫球蛋白(即IgG)為~150 kDa醣蛋白，其包含二重鏈及二輕鏈。從N-至C-端，重鏈包含一VH接著包含三個恆定域(CH1、CH2及CH3)之重鏈恆定區域，以及同樣地輕鏈包含一VL接著一CL。免疫球蛋白取決於重鏈而可以分類為IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM。輕鏈可以為卡帕(kappa) (κ)或拉目達(lambda)(λ)。
在一些具體例中，本文所述之抗原結合分子包含下列或由下列所組成：一種與VISTA結合之IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子對於VISTA為至少單價的結合。結合價係指抗原結合分子上關於特定的抗原決定位之結合位址的數量。因此，於一些具體例中該抗原結合分子包含至少一個VISTA結合位址。
在一些具體例中，該抗原結合分子包含一個以上的VISTA結合位址，如2、3或4個結合位址。該結合位址可以是相同或不同的。在一些具體例中，該抗原結合分子對於VISTA為例如為二價、三價或四價的。
本發明之態樣係有關於多專一性抗原結合分子。按“多專一性”其係意指該抗原結合分子展現出專一性結合一種以上的標靶。在一些具體例中，該抗原結合分子是雙專一性的抗原結合分子。在一些具體例中，該抗原結合分子包含至少二種不同的抗原決定域(即至少二種抗原決定域，例如包含非同一的VHs及VLs)。
在一些具體例中，該抗原結合分子與VISTA及另一種標靶結合(例如VISTA以外的抗原)，所以至少是雙專一性的。術語“雙專一性”意指該抗原結合分子能與至少二種不同的抗原決定位專一性結合。
將可以理解的是如本發明之抗原結合分子(例如多專一性抗原結合分子)可包含能與抗原結合分子專一的標靶結合之抗原結合分子。舉例而言，能與VISTA及VISTA以外的抗原結合之抗原結合分子可包含：(i)一種能與VISTA結合的抗原結合分子，以及(ii)一種能與VISTA以外的抗原結合的抗原結合分子。
亦可以理解的是如本發明之抗原結合分子(例如多專一性抗原結合分子)可包含能與抗原結合分子專一的標靶結合之抗原結合多肽或抗原結合多肽複合物。舉例而言，如本發明之抗原結合分子可包含例如(i)一種能與VISTA結合的抗原結合多肽複合物，其包含一輕鏈多肽(包含結構VL-CL)及一重鏈多肽(包含結構VH-CH1-CH2-CH3)，以及(ii)一種能與VISTA以外的抗原結合的抗原結合多肽複合物，其包含一輕鏈多肽(包含結構VL-CL)及一重鏈多肽(包含結構VH-CH1-CH2-CH3)。
於一些具體例中，一種較大的抗原結合分子(例如一種多專一性抗原結合分子)之組分抗原結合分子可以稱為較大的抗原結合分子之例如一“抗原結合域”或“抗原結合區域”。
在一些具體例中，該抗原結合分子包含一種能與VISTA結合的抗原結合分子，以及能與VISTA以外的抗原結合的一抗原結合分子。在一些具體例中，該VISTA以外的抗原為免疫細胞表面分子。在一些具體例中，該VISTA以外的抗原為癌細胞抗原。在一些具體例中該VISTA以外的抗原為受體分子，例如細胞表面受體。在一些具體例中該VISTA以外的抗原為細胞訊息傳導分子，例如細胞介素、趨化介素(chemokines)、干擾素、介白素或淋巴激素。在一些具體例中該VISTA以外的抗原為生長因子或激素。
癌細胞抗原為癌細胞表現或過度表現的抗原。癌細胞抗原可為任何胜肽/多肽、醣蛋白、脂蛋白、聚醣、醣脂、脂質或其片段。癌細胞抗原表現可能與癌症有關連。癌細胞抗原可能由癌細胞異常表現(譬如癌細胞抗原可能以異常的局部化(localisation)表現)，或可能以癌細胞的異常結構表現。癌細胞抗原可能能夠引發免疫反應。在一些具體例中，該抗原表現於癌細胞之細胞表面(即癌細胞抗原為癌細胞表面抗原)。在一些具體例中，本文所述之抗原結合分子所結合之該抗原的一部份係顯現於癌細胞之外表面上(即細胞外的)。癌細胞抗原可為癌症相關的抗原。在一些具體例中，癌細胞抗原為一種抗原其之表現與癌症的發展、進程或症狀嚴重性有相關。癌症相關的抗原可能與癌症的肇因或病理有相關，或可能為癌症造成的異常表現。在一些具體例中，該癌細胞抗原為一種抗原，癌症細胞所表現的該抗原舉例來說與可比較的非癌細胞(譬如由相同組織/細胞類型衍生的非癌細胞)表現的位準相比之下，為向上調節的(譬如於RNA及/或蛋白位準)。在一些具體例中，該癌症相關的抗原可能優先由癌細胞表現，且可比較的非癌細胞(譬如由相同組織/細胞類型衍生的非癌細胞)不表現。在一些具體例中，該癌症相關的抗原可為突變的致癌基因或突變的抑瘤基因之產物。在一些具體例中，該癌症相關的抗原可為過度表現的細胞蛋白之產物、致癌病毒生產的癌抗原、瘤胎抗原或細胞表面醣脂或醣蛋白。
免疫細胞表面分子可為免疫細胞之細胞表面或細胞表面上表現之任何胜肽/多肽、醣蛋白、脂蛋白、聚醣、醣脂、脂質或其片段。在一些具體例中，本發明之抗原結合分子所結合之免疫細胞表面分子的一部份係位於免疫細胞之外表面上(即細胞外的)。免疫細胞表面分子可表現於任何免疫細胞之細胞表面。在一些具體例中，免疫細胞可以是一種造血來源的細胞，諸如嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、樹突細胞、淋巴球或單核球。淋巴球可以是諸如T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、NKT細胞或先天性淋巴細胞(ILC)，或其之前驅物(諸如胸腺細胞或前-B(pre-B)細胞)。在一些具體例中，免疫細胞表面分子可以為共刺激分子(諸如CD28、OX40、4-1BB、ICOS或CD27)或其配體。在一些具體例中，免疫細胞表面分子可以為免疫查核點分子(諸如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA、TIGIT或BTLA)或其配體。
如本發明之多專一性抗原結合分子可以呈任何合適的格式提供，諸如Brinkmann and Kontermann MAbs (2017) 9(2): 182-212之內所述的該等格式，其之整體內容藉此被併入以作為參考資料。適合的格式包括Brinkmann and Kontermann MAbs (2017) 9(2): 182-212之圖2內所示的該等：抗體複合物，例如IgG2 、F(ab’)2 或CovX-Body；IgG或似IgG分子，例如IgG、嵌合IgG、κλ-體共同重鏈(κλ-body common HC)；CH1/CL融合蛋白，例如scFv2-CH1/CL、VHH2-CH1/CL；‘只有可變異域’雙專一性抗原結合分子，例如串連(tandem)scFv (taFV)、三價抗體(triplebodies)、雙價抗體(diabodies) (Db)、dsDb、Db(kih)、DART、scDB、dsFv-dsFv、tandAbs、三頭(triple head)、串連dAb/VHH、四價dAb.VHH；非Ig融合蛋白，例如scFv2 -白蛋白、scDb-白蛋白、taFv-白蛋白、taFv-毒素、迷你抗體(miniantibody)、DNL-Fab2 、DNL-Fab2 -scFv、DNL-Fab2 -IgG-細胞介素2 、ImmTAC (TCR-scFv)；經修飾的Fc及CH3融合蛋白，例如scFv-Fc(kih)、scFv-Fc(CH3電荷對(charge pair))、scFv-Fc (EW-RVT)、scFv-fc (HA-TF)、scFv-Fc(種子小體(SEEDbody))、taFv-Fc(kih)、scFv-Fc(kih)-Fv、Fab-Fc(kih)-scFv、Fab-scFv-Fc(kih)、Fab-scFv-Fc(BEAT)、Fab-scFv-Fc(種子小體)、DART-Fc、scFv-CH3(kih)、TriFabs；Fc融合，例如Di-雙價抗體、scDb-Fc、taFv-Fc、scFv-Fc-scFv、HCAb-VHH、Fab-scFv-Fc、scFv4 -Ig、scFv2 -Fcab；CH3融合，例如Dia-雙價抗體、scDb-CH3；IgE/IgM CH2融合，例如scFv-EHD2-scFv、scFvMHD2-scFv；Fab融合蛋白，例如Fab-scFv(雙抗體(bibody))、Fab-scFv2 (三抗體(tribody))、Fab-Fv、Fab-dsFv、Fab-VHH、正交性Fab-Fab；非Ig融合蛋白，例如DNL-Fab3 、DNL-Fab2 -scFv、DNL-Fab2 -IgG-細胞介素2 ；不對稱IgG或似IgG分子，例如IgG(kih)、IgG(kih)共同輕鏈(common LC)、ZW1 IgG共同輕鏈、Biclonics共同輕鏈、CrossMab、CrossMab(kih)、scFab-IgG(kih)、Fab-scFab-IgG(kih)、正交性Fab IgG(kih)、DuetMab、CH3電荷對+CH1/CL電荷對、鉸鏈/CH3電荷對、鏈交換結構域小體(SEED-body)、Duobody、四合一-CrossMab(kih)、LUZ-Y共同輕鏈；LUZ-Y scFab-IgG、FcFc*；附加及Fc-經修飾的IgGs，例如IgG(kih)-Fv、IgG HA-TF-Fv、IgG(kih)scFab、scFab-Fc(kih)-scFv2、scFab-Fc(kih)-scFv、半DVD-Ig、DVI-Ig(四合一)、CrossMab-Fab；經修飾的Fc及CH3融合蛋白，例如Fab-Fc(kih)-scFv、Fab-scFv-Fc(kih)、Fab-scFv-Fc(BEAT)、Fab-scFv-Fc-種子小體、TriFab；附加的IgGs-HC融合，例如IgG-HC、scFv、IgG-dAb、IgG-taFV、IgG-CrossFab、IgG-正交性Fab、IgG-(CαCβ) Fab、scFv-HC-IgG、串連Fab-IgG(正交性Fab) Fab-IgG(CαCβ Fab)、Fab-IgG(CR3)、Fab-鉸鏈-IgG(CR3)；附加的IgGs - LC融合，例如IgG-scFv(LC)、scFv(LC)-IgG、dAb-IgG；附加的IgGs-Hc及LC融合，例如DVD-Ig、TVD-Ig、CODV-Ig、scFv4 -IgG、Zybody；Fc融合，例如Fab-scFv-Fc、scFv4 -Ig；F(ab’)2融合，例如F(ab’)2 -scFv2 ；CH1/CL融合蛋白諸如scFv2 -CH1-鉸鏈/CL；經修飾的IgGs，例如DAF(二合一-IgG)、DutaMab、Mab2 ；及非Ig融合，例如DNL-Fab4 -IgG。
熟習此項技術者能設計及製備雙專一性抗原結合分子。生產雙專一性抗原結合分子的方法包括例如，用可還原的雙硫或非可還原的硫醚鍵進行抗原結合分子或抗體片段之化學交聯作用，舉例而言，如Segal and Bast, 2001. Production of Bispecific Antigen-binding molecules. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1–2.13.16之內所述者，其之整體內容藉此被併入以作為參考資料。舉例而言，可以使用N -琥珀醯亞胺-3-(-2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)、經由鉸鏈區域SH-基團予以化學交聯諸如Fab片段，以創造雙硫鍵聯的雙專一性F(ab)2 異二聚體。
其他生產雙專一性抗原結合分子的方法包括融合生產抗體的融合瘤，諸如用聚乙二醇生產能分泌雙專一性抗體的四源雜交瘤細胞(quadroma cell)，舉例而言如D. M. and Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antigen-binding molecules. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1–2.13.16之內所述者。
如本發明之雙專一性抗原結合分子亦可以從諸如，一種編碼抗原結合分子的多肽之核酸建構物予以表現而重組地生產，舉例而言如Antibody Engineering: Methods and Protocols，第二版(Humana Press, 2012)，於第40章:Production of Bispecific Antigen-binding molecules: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Färber-Schwarz)，或法國，How to make bispecific antigen-binding molecules, Methods Mol. Med. 2000；40:333-339之內所述者，該等二者之整體內容藉此併入以作為參考資料。舉例而言，一種編碼二種抗原結合片段之輕及重鏈可變異域的DNA建構物(即，能結合VISTA的抗原結合片段之輕及重鏈可變異域，以及能結合另一種標靶蛋白的抗原結合片段之輕及重鏈可變異域)，且於抗原結合片段之間包括編碼一合適的鏈接子或二聚合域之序列，可藉由分子選殖的技術予以製備。重組雙專一性抗體之後能藉由於一合適的宿主細胞(諸如一種哺乳動物宿主細胞)內表現建構物(諸如於活體外 )來生產，以及表現的重組雙專一性抗體繼而能可選擇地予以純化。 Fc區域
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含一Fc區域。
於IgG IgA及IgD同型中，Fc區域包含來自一種多肽的CH2及CH3區域，以及來自另一種多肽的CH2及CH3區域。來自二種多肽的CH2及CH3區域一起形成Fc區域。於IgM及IgE同型中，Fc區域包含三種恆定域(CH2、CH3及CH4)，以及來自二種多肽的CH2至CH4一起形成Fc區域。
提供Fc區域用於與Fc受體及其他免疫系統分子交互作用以引起功能效應。IgG Fc-媒介的效應子功能係於舉例而言，Jefferis等人，Immunol Rev 1998 163:59-76內被回顧(以其之全體藉此併入於此以作為參考資料)，以及其之實現係通過Fc區域與免疫細胞表現的Fc受體之間的交互作用、透過Fc-媒介的免疫細胞補給及活化(例如巨噬細胞、樹突細胞、NK細胞及T細胞)引起，透過Fc區域與補體蛋白C1q結合來補給補體途徑組分，以及隨後的補體級聯(cascade)活化。
Fc媒介的功能包括Fc受體結合、抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞媒介的吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、形成膜攻擊複合物(MAC)、細胞去顆粒作用、生產細胞介素及/或趨化介素(chemokines)，以及抗原加工與呈現。
影響Fc媒介的功能之抗體Fc區域之修飾為本技藝已知的，諸如例如於Wang等人，Protein Cell (2018) 9(1):63-73中所述的該等，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。特別地，已知會影響抗體效應子功能的例示性Fc區域修飾係摘要於Wang等人，Protein Cell (2018) 9(1):63-73的表1中。於下文中說明影響抗體效應子活性的Fc區域之修飾。
於描述Fc區域/CH2/CH3為包含“對應於”參考取代之修飾的情況中，可預期同源的Fc/CH2/CH3之等效取代。作為說明，人類IgG1的L234A/L235A取代(根據如下列所述之EU編號系統所編號：Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)對應於根據序列辨識編號：256所編號的小鼠Ig γ-2A鏈C區域，A對偶基因，於位置117及118之L由A取代。
於描述Fc區域為包含修飾的情況中，該修飾可存在於一起形成Fc區域的一或二種多肽鏈內。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含含有修飾之一Fc區域。在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含一Fc區域，其於CH2及/或CH3區域之一者或多者內含有修飾。
在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加Fc媒介的功能。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增強ADCC。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增強ADCP。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增強CDC。一種包含含有會增強Fc媒介的功能(如ADCC、ADCP、CDC)之修飾的抗原結合分子，與包含對應的未修飾的Fc區域之抗原結合分子相比，誘發增高位準的相關效應子功能。
在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加與Fc受體的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加與Fcγ受體的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加與FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb之一者或多者的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加與FcγRIIIa的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加與FcγRIIa的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加與FcγRIIb的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加與FcRn的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加與補體蛋白的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加與C1q的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以促進抗原結合分子之六聚體化。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加抗原結合分子半生期。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以增加共接合(co-engagement)。
在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Stavenhagen等人之Cancer Res. (2007) 67:8882-8890中所述的取代F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L之組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Lazar等人，Proc Natl Acad Sci USA. (2006)103:4005-4010中所述的取代S239D/I332E或S239D/I332E/A330L之組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Shields等人，J Biol Chem. (2001) 276:6591-6604中所述的取代S298A/E333A/K334A之組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對重鏈多肽中一者之修飾、對應於取代L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A之組合，及對另一重鏈多肽之修飾、對應於取代D270E/K326D/A330M/K334E之組合，如Mimot等人，MAbs. (2013): 5:229-236中所述。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Richards等人，Mol Cancer Ther. (2008) 7:2517-2527中所述的取代G236A/S239D/I332E之組合的修飾。
在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Idusogie等人之Immunol. (2001) 166(4):2571-5中所述的取代K326W/E333S組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Moore等人之MAbs. (2010) 2(2):181-9中所述的取代S267E/H268F/S324T組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Natsume等人，Cancer Res. (2008) 68(10):3863-72中所述的取代組合之修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Diebolder等人之Science (2014) 343(6176):1260-3中所述的取代E345R/E430G/S440Y組合的修飾。
在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Dall’Acqua等人之J Immunol. (2002) 169:5171-5180中所述的取代M252Y/S254T/T256E組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Zalevsky等人之Nat Biotechnol. (2010) 28:157-159中所述的取代M428L/N434S組合的修飾。
在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Chu等人，Mol Immunol. (2008) 45:3926-3933中所述的取代S267E/L328F組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Shang等人之Biol Chem. (2014) 289:15309-15318中所述的取代N325S/L328F組合的修飾。
在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止Fc媒介的功能。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止ADCC。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止ADCP。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止CDC。一種包含含有會降低/防止Fc媒介的功能(如ADCC、ADCP、CDC)之修飾的抗原結合分子，與包含對應的未修飾的Fc區域之抗原結合分子相比，誘發降低的相關效應子功能位準。
在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止與Fc受體的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止與Fcγ受體的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止與FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb之一者或多者的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止與FcγRIIIa的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止與FcγRIIa的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止與FcγRIIb的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止與補體蛋白的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止與C1q的結合。在一些具體例中該Fc區域包含修飾以降低/防止對應於N297之胺基酸殘基的醣化。
於一些具體例中，該Fc區域不能誘發一或更多種Fc媒介的功能(即缺乏引發相關的Fc媒介的功能之能力)。因此，包含此等Fc區域之抗原結合分子也缺乏誘發相關功能的能力。此等抗原結合分子可描述為沒有相關功能。
於一些具體例中，該Fc區域不能誘發ADCC。於一些具體例中，該Fc區域不能誘發ADCP。於一些具體例中，該Fc區域不能誘發CDC。於一些具體例中，該Fc區域不能誘發ADCC及/或不能誘發ADCP及/或不能誘發CDC。
在一些具體例中該Fc區域不能與Fc受體結合。在一些具體例中該Fc區域不能與Fcγ受體結合。在一些具體例中該Fc區域不能與FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb之一者或多者結合。在一些具體例中該Fc區域不能與FcγRIIIa結合。在一些具體例中該Fc區域不能與FcγRIIa結合。在一些具體例中該Fc區域不能與FcγRIIb結合。在一些具體例中該Fc區域不能與FcRn結合。在一些具體例中該Fc區域不能與補體蛋白結合。在一些具體例中該Fc區域不能與C1q結合。在一些具體例中該Fc區域在對應於N297之胺基酸殘基處不予以醣化。
在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Leabman等人，MAbs. (2013) 5:896-903中所述的N297A或N297Q或N297G的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Alegre等人，J Immunol. (1992) 148:3461-3468中所述的L235E的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Xu等人，Cell Immunol. (2000) 200:16-26中所述的取代L234A/L235A或F234A/L235A組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Schlothaue等人，Protein Engineering, Design and Selection (2016), 29(10):457-466中所述的P329A或P329G修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Lo等人之J. Biol. Chem (2017) 292(9):3900-3908中所述的取代L234A/L235A/P329G組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Rother等人，Nat Biotechnol. (2007) 25:1256-1264中所述的取代組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Newman等人，Clin. Immunol. (2001) 98:164-174中所述的取代S228P/L235E組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如An等人，MAbs. (2009) 1:572-579中所述的取代H268Q/V309L/A330S/P331S組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Vafa等人，Methods. (2014) 65:114-126中所述的取代V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如US 2015/0044231 A1中所述的取代L234A/L235E/G237A/A330S/P331S組合的修飾。
已知取代“L234A/L235A”組合及對應的取代(例如舉例而言人類IgG4之F234A/L235A)會破壞Fc與Fcγ受體之結合且抑制ADCC、ADCP，並且降低C1q之結合且從而降低CDC(Schlothauer等人，Protein Engineering, Design and Selection (2016), 29(10):457-466，藉此全體併入以作為參考資料)。取代“P329G”及“P329A”降低C1q結合(且從而降低CDC)。已知以“A”、“G”或“Q”取代“N297”會消除醣化，且從而降低Fc與C1q及Fcγ受體之結合，且從而降低CDC及ADCC。Lo等人之J. Biol. Chem (2017) 292(9):3900-3908(以其全體併入以作為參考資料)報導取代L234A/L235A/P329G組合於鼠類IgG2a及人類IgG1二者會消除補體結合及固定以及Fc γ受體依賴性、抗體依賴性、細胞媒介的細胞毒性。
US 2015/0044231 A1內揭示的IgG1 Fc之取代L234A/L235E/G237A/A330S/P331S組合會徹底破壞吞噬作用、ADCC及CDC之誘發作用。
在一些具體例中，該Fc區域包含對應於如Silva等人，J Biol Chem. (2015) 290(9):5462-5469中所述的取代S228P的修飾。IgG4 Fc之取代S228P會降低Fab-臂交換(Fab臂交換可能是非所欲的)。
在一些具體例中，該Fc區域包含相應於對應於取代L234A/L235A組合的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含相應於對應於取代P329G的修飾。在一些具體例中，該Fc區域包含相應於對應於取代N297Q的修飾。
在一些具體例中，該Fc區域包含相應於對應於取代L234A/L235A/P329G組合的修飾。
在一些具體例中，該Fc區域包含相應於對應於取代L234A/L235A/P329G/N297Q組合的修飾。
在一些具體例中，該Fc區域包含相應於對應於取代L234A/L235E/G237A/A330S/P331S組合的修飾。
在一些具體例中，該Fc區域包含相應於對應於取代S228P的修飾，例如於IgG4內。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含一Fc區域，其包含CH2及CH3區域之一者或多者內的修飾促進Fc區域的締合。一種抗原結合分子的組分多肽之重組共表現以及隨後的締合導致數種可能的組合。為了改良重組生產的抗原結合分子內所欲的多肽組合的產量，導入Fc區域修飾以促進所欲的重鏈多肽組合之締合是有利的。修飾可促進不同的多肽鏈之CH2及/或CH3區域之間的疏水及/或靜電交互作用。合適的修飾為舉例而言於Ha等人，Front. Immnol (2016) 7:394之內所述，其係以其之全體藉此併入以作為參考資料。
在一些具體例中本發明之抗原抗原結合分子包含一Fc區域，其包含如下列格式之一者成對的取代於Fc區域的CH3區域，如Ha等人，Front. Immnol (2016) 7:394之表1所示：KiH、KiHs-s 、HA-TF、ZW1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s 、鏈交換結構域或A107。
在一些具體例中，Fc區域包含“旋鈕至孔洞(knob-into-hole)”或“KiH”修飾，舉例而言如例如US 7,695,936及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)之內所述。在此等具體例中，Fc區域的CH3區域中之一者包含一“旋鈕”修飾，且另一CH3區域包含一“孔洞”修飾。該“旋鈕”及“孔洞”修飾係座落於各自的CH3區域內以便該“旋鈕”可以放在“孔洞”內俾以促進多肽的異質二聚合(並抑制同質二聚合)及/或穩定異二聚體。藉由用具有較大側鏈的胺基酸(例如酪胺酸或色胺酸)取代具有較小鏈的該等來建構旋鈕。藉由用具有較小側鏈的胺基酸(例如丙胺酸或蘇胺酸)取代具有較大側鏈的該等來創造孔洞。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子之Fc區域的CH3區域中之一者包含取代(本文之Fc、CH2及CH3區域的位置/取代編號係根據如下列所述之EU編號系統：Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)T366W，且Fc區域的另一CH3區域包含取代Y407V。在一些具體例中，該抗原結合分子之Fc區域的CH3區域中之一者包含取代T366W，且Fc區域的另一CH3區域包含取代T366S及L368A。在一些具體例中，該抗原結合分子之Fc區域的CH3區域中之一者包含取代T366W，且Fc區域的另一CH3區域包含取代Y407V、T366S及L368A。
在一些具體例中，Fc區域包含如舉例而言於WO 2014/131694 A1之內所述的“DD-KK”修飾。在一些具體例中，CH3區域中之一者包含取代K392D及K409D，且Fc區域之另一CH3區域包含取代E356K及D399K。該修飾促進CH3區域之間的靜電交互作用。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含如於Labrijn等人，Proc Natl Acad Sci U S A. (2013) 110(13):5145-50之內所述予以修飾的Fc區域，稱為‘Duobody’格式。在一些具體例中，CH3區域中之一者包含取代K409R，且Fc區域之另一CH3區域包含取代K405L。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含一Fc區域，其含有如於Strop等人，J Mol Biol. (2012) 420(3):204-19之內所述的“EEE-RRR”修飾。在一些具體例中CH3區域中之一者包含取代D221E、P228E及L368E，且Fc區域之另一CH3區域包含取代D221R、P228R及K409R。
在一些具體例中，該抗原結合分子包含一Fc區域，其包含如於Choi等人，Mol Cancer Ther (2013) 12(12):2748-59之內所述的“EW-RVT”修飾。在一些具體例中，CH3區域中之一者包含取代K360E及K409W，且Fc區域之另一CH3區域包含取代Q347R、D399V及F405T。
在一些具體例中，CH3區域之一者包含取代S354C，且Fc區域的另一CH3區域包含取代Y349C。導入此等半胱胺酸殘基導致Fc區域的二個CH3區域之間形成雙硫鍵，進一步穩定異二聚體(Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15)。
在一些具體例中，Fc區域包含“KiHS-S ”修飾。在一些具體例中CH3區域中之一者包含取代T366W及S354C，且Fc區域之另一CH3區域包含取代T366S、L368A、Y407V及Y349C。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含一Fc區域，其包含如於Davis等人，Protein Eng Des Sel (2010) 23(4):195-202之內所述的“鏈交換結構域”修飾，其中人類IgG1 CH3及IgA CH3的β-股節段有交換。
在一些具體例中，CH3區域中之一者包含取代S364H及F405A，且Fc區域之另一CH3區域包含取代Y349T及T394F(參見諸如Moore等人，MAbs (2011) 3(6):546-57)。
在一些具體例中，CH3區域中之一者包含取代T350V、L351Y、F405A及Y407V，且Fc區域之另一CH3區域包含取代T350V、T366L、K392L及T394W(參見諸如Von Kreudenstein等人，MAbs (2013) 5(5):646-54)。
在一些具體例中，CH3區域中之一者包含取代K360D、D399M及Y407A，且Fc區域之另一CH3區域包含取代E345R、Q347R、T366V及K409V(參見諸如Leaver-Fay等人，Structure (2016) 24(4):641-51)。
在一些具體例中，CH3區域中之一者包含取代K370E及K409W，且Fc區域之另一CH3區域包含取代E357N、D399V及F405T(參見諸如Choi等人，PLoS One (2015) 10(12):e0145349)。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含一Fc區域，其不與Fc γ受體結合。在一些具體例中，該抗原結合分子包含一Fc區域，其不與FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb之一者或多者結合。在一些具體例中，該抗原結合分子包含一Fc區域，其不與FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIIIa之一者或多者結合。在一些具體例中，該抗原結合分子包含一Fc區域，其不與FcγRIIa及FcγRIIb之一者或二者結合。
一種Fc區域或包含一Fc區域的抗原結合分子與一參考蛋白(如Fc受體)結合的能力可以依據本技藝熟知的方法來分析，諸如ELISA、免疫墨點法、免疫沉澱法、表面電漿子共振(SPR；參見諸如，Hearty等人，Methods Mol Biol (2012) 907:411-442)或生物層干涉術(BLI；參見諸如Lad等人，(2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507)。
當使用於本文中，“不結合”參考蛋白的Fc區域如以例如ELISA、免疫墨點法(如西方墨點法)、免疫沉澱法、SPR或BLI)測定時，可能展現出實質不結合參考蛋白。“實質不結合”可能為交互作用的位準，其沒有比於特定的分析中彼此不結合的蛋白所測定的交互作用位準明顯更大。“實質不結合”可為交互作用的位準，其為特定的分析中彼此不結合的蛋白測定的交互作用位準之≤ 5倍，例如≤ 4倍、≤ 3倍、≤ 2.5倍、≤ 2倍或≤ 1.5倍。
在一些具體例中，該抗原結合分子包含與FcRn結合之Fc區域。
在一些具體例中，該抗原結合分子包含與FcRn結合之Fc區域，且其不與FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIIIa之一者或多者結合。在一些具體例中，該抗原結合分子包含與FcRn結合之Fc區域，且其不與FcγRIIa及FcγRIIb之一者或二者結合。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含不誘發ADCC的Fc區域。在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含不誘發ADCP的Fc區域。在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含不誘發CDC的Fc區域。在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含不誘發ADCC、ADCP或CDC的Fc區域。
當使用於本文中，一種不誘發(即不能誘發)ADCC/ADCP/CDC之Fc區域/抗原結合分子例如以合適相關活性的分析法予以分析測定時，實質沒有引發ADCC/ADCP/CDC活性。“實質沒有ADCC/ADCP/CDC活性”係指ADCC/ADCP/CDC的位準，其沒有比於特定的分析中合適的陰性對照分子(例如缺少Fc區域的抗原結合分子，或包含‘靜默’Fc區域的抗原結合分子(例如於Schlothauer等人，Protein Engineering, Design and Selection (2016), 29(10):457-466中所述，其係併入上文以作為參考資料))所測定的ADCC/ADCP/CDC位準明顯更大。“實質沒有活性”可為相關活性的位準，其為特定的分析中合適的陰性對照分子測定的活性位準之≤ 5倍，例如≤ 4倍、≤ 3倍、≤ 2.5倍、≤ 2倍或≤ 1.5倍。
一種Fc區域或包含一Fc區域的抗原結合分子誘發ADCC的能力之分析可以舉例而言依據Yamashita等人，Scientific Reports (2016) 6:19772(以其全體併入以作為參考資料)之內如所述的方法，或藉由如舉例而言於Jedema等人，Blood (2004) 103: 2677-82(以其全體併入以作為參考資料)之內所述的51 Cr釋放分析法來進行。一種Fc區域或包含一Fc區域的抗原結合分子誘發ADCP的能力之分析可以舉例而言依據Kamen等人，J Immunol (2017) 198 (1 Supplement) 157.17(以其全體併入以作為參考資料)之內如所述的方法來進行。一種Fc區域或包含一Fc區域的抗原結合分子誘發CDC的能力之分析可以舉例而言使用Schlothauer等人，Protein Engineering, Design and Selection (2016), 29(10):457-466(併入上文以作為參考資料)之內所述的C1q結合分析法來進行。
在一些具體例中，該抗原結合分子包含一種含有一種多肽的Fc區域，該多肽具有一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：254有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。在一些具體例中，該抗原結合分子包含一種含有一種多肽的Fc區域，該多肽具有一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：257有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。在一些具體例中，該抗原結合分子包含一種含有一種多肽的Fc區域，該多肽具有一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：259有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。在一些具體例中，該抗原結合分子包含一種含有一種多肽的Fc區域，該多肽具有一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：260有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子缺少Fc區域。 Fc受體
Fc受體為與免疫球蛋白的Fc區域結合之多肽。Fc受體之結構及功能係於舉例而言Masuda等人，Inflamm Allergy Drug Targets (2009) 8(1): 80-86及Bruhns, Blood (2012) 119:5640-5649中回顧，其等二者係以其等之全體藉此併入於此以作為參考資料。
Fc受體表現於造血細胞的表面上，包括巨噬細胞、嗜中性球、樹突細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、肥胖細胞及NK細胞。其等包括IgG-結合Fc γ受體、IgE之高親和力受體(FcεRI)、IgA受體以及IgA及IgM之聚合Ig受體。新生兒的Fc受體(FcRn)為另外的IgG之Fc受體，且涉及IgG輸送橫過上皮障壁(胞吞轉送作用)、防止IgG降解以及抗原呈現。
人類有六個不同種類的Fcγ受體(括號內顯示小鼠異種同源物)：FcγRI(mFcγRI)、FcγRIIa(mFcγRIII)、FcγRIIb(mFcγRIIb)、FcγRIIc、FcγRIIIa(mFcγRIV)及FcγRIIIb。
FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc及FcγRIIIa包含免疫受體酪胺酸的活化模體(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) (ITAMs)於其等之細胞內域，以及通過Fc連接會導致表現該受體的細胞活化。FcγRIIb包含免疫受體酪胺酸的抑制模體(ITIMs)於其等之細胞內域，以及負面調節細胞活化及去顆粒作用、細胞增殖、胞吞作用及通過Fc連接後之吞噬作用。
於此說明書中，“Fcγ受體”可來自任何物種，且包括來自任何物種的同功型、片段、變異體(包括突變體)或同源物。同樣地，“FcγRI”、“FcγRIIa”、“FcγRIIb”、“FcγRIIc"、“FcγRIIIa”及“FcγRIIIb”分別指來自任何物種的FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb，且包括來自任何物種的同功型、片段、變異體(包括突變體)或同源物。
在一些具體例中，Fcγ受體(如FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb)係來自哺乳動物(如靈長類動物(恆河猴(rhesus)、食蟹獼猴(cynomolgus)、非人類靈長類動物或人類)及/或囓齒動物(如大鼠或小鼠)。同功型、片段、變異體或同源物可選擇地特徵在於與來自特定物種，例如人類的未成熟或成熟的Fcγ受體(如FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb)同功型之胺基酸序列，有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
同功型、片段、變異體或同源物可選擇地為功能同功型、片段、變異體或同源物，例如以該功能性質/活性合適的分析法予以分析測定時，具有參考Fc γ受體的功能性質/活性。舉例而言，FcγRI之同功型、片段、變異體或同源物可例如展現與人類IgG1 Fc之締合。
於此說明書中，“FcRn受體”可來自任何物種，且包括來自任何物種的同功型、片段、變異體(包括突變體)或同源物。
在一些具體例中，FcRn受體係來自哺乳動物(如靈長類動物(恆河猴(rhesus)、食蟹獼猴(cynomolgus)、非人類靈長類動物或人類)及/或囓齒動物(如大鼠或小鼠)。同功型、片段、變異體或同源物可選擇地特徵在於與來自特定物種，例如人類的未成熟或成熟的FcRn受體同功型之胺基酸序列，有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
同功型、片段、變異體或同源物可選擇地為功能同功型、片段、變異體或同源物，例如以該功能性質/活性合適的分析法予以分析測定時，具有參考FcRn的功能性質/活性。舉例而言，FcRn之同功型、片段、變異體或同源物可例如展現與人類IgG1 Fc之締合。 多肽
本發明亦提供抗原結合分子的多肽組分。該多肽可以以經單離或實質純化的形式來提供。
本發明之抗原結合分子可以為，或可包含，一種多肽複合物。
在本說明書於一種多肽包含一種以上域或區域之處，將可以理解的是複數個域/區域較佳存在於同一個多肽鏈內。即，該包含一種以上域或區域之多肽為一種包含該等域/區域之融合多肽。
在一些具體例中，如本發明之多肽包含如本文所述之VH或由如本文所述之VH所組成。在一些具體例中，如本發明之多肽包含如本文所述之VL或由如本文所述之VL所組成。
在一些具體例中，該多肽額外包含一種或多種抗體重鏈恆定區域(CH)。在一些具體例中，該多肽額外包含一種或多種抗體輕鏈恆定區域(CL)。在一些具體例中，該多肽包含一免疫球蛋白(Ig)的CH1、CH2區域及/或CH3區域。
在一些具體例中，該多肽包含一種免疫球蛋白重鏈恆定序列的一或多個區域。在一些具體例中，該多肽包含一種如本文所述之CH1區域。在一些具體例中，該多肽包含一種如本文所述之CH1-CH2鉸鏈區域。在一些具體例中，該多肽包含一種如本文所述之CH2區域。在一些具體例中，該多肽包含一種如本文所述之CH3區域。
在一些具體例中，該多肽包含一種CH2及/或CH3區域，其包含下列胺基酸取代/胺基酸取代組合中任一者：F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L；S239D/I332E；S239D/I332E/A330L；S298A/E333A/K334A；L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A；D270E/K326D/A330M/K334E；G236A/S239D/I332E；K326W/E333S；S267E/H268F/S324T；E345R/E430G/S440Y；M252Y/S254T/T256E；M428L/N434S；S267E/L328F；N325S/L328F；N297A；N297Q；N297G；L235E；L234A/L235A；F234A/L235A；P329A；P329G；L234A/L235A/P329G；H268Q/V309L/A330S/P331S；及V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S。
在一些具體例中，該多肽包含一種CH3區域，其包含下列胺基酸取代/胺基酸取代組合中任一者(顯示於Ha等人，Front. Immnol (2016) 7:394之表1中，併入上文以作為參考資料)：T366W；T366S、L368A及Y407V；T366W及S354C；T366S、L368A、Y407V及Y349C；S364H及F405A；Y349T及T394F；T350V、L351Y、F405A及Y407V；T350V、T366L、K392L及T394W；K360D、D399M及Y407A；E345R、Q347R、T366V及K409V；K409D及K392D；D399K及E356K；K360E及K409W；Q347R、D399V及F405T；K360E、K409W及Y349C；Q347R、D399V、F405T及S354C；K370E及K409W；以及E357N、D399V及F405T。
在一些具體例中，該多肽之CH2及/或CH3區域包含一或多個胺基酸取代用於促進該多肽與包含CH2及/或CH3區域之另一多肽之締合。
在一些具體例中，該多肽包含一種免疫球蛋白輕鏈恆定序列之一或多個區域。在一些具體例中，該多肽包含一種如本文所述之CL區域。
在一些具體例中，該多肽缺少一種免疫球蛋白重鏈恆定序列之一或多個區域。在一些具體例中，該多肽缺少一CH2區域。在一些具體例中，該多肽缺少一CH3區域。在一些具體例中，該多肽缺少一CH2區域並且也缺少一CH3區域。
在一些具體例中，如本發明之多肽包含一種如下列之一者從N-至C-端的結構： (i) VH (ii) VL (iii) VH-CH1 (iv) VL-CL (v) VL-CH1 (vi) VH-CL (vii) VH-CH1-CH2-CH3 (viii) VL-CL-CH2-CH3 (ix) VL-CH1-CH2-CH3 (x) VH-CL-CH2-CH3
本發明亦提供包含本發明之多肽的抗原結合分子。在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含下列多肽組合中的一者： (A) VH + VL (B) VH-CH1 + VL-CL (C) VL-CH1 + VH-CL (D) VH-CH1-CH2-CH3 + VL-CL (E) VH-CL-CH2-CH3 + VL-CH1 (F) VL-CH1-CH2-CH3 + VH-CL (G) VL-CL-CH2-CH3 + VH-CH1 (H) VH-CH1-CH2-CH3 + VL-CL-CH2-CH3 (I) VH-CL-CH2-CH3 + VL-CH1-CH2-CH3
在一些具體例中，該抗原結合分子包含以上的(A)至(I)之中所示的一種以上的多肽組合。作為舉例，參照以上的(D)，在一些具體例中，該抗原結合分子包含二種包含結構VH-CH1-CH2-CH3的多肽，以及二種包含結構VL-CL的多肽。 在一些具體例中，本發明之抗原結合分子包含下列多肽組合中的一者： (J) VH(抗-VISTA)+VL(抗-VISTA) (K) VH(抗-VISTA)-CH1+VL(抗-VISTA)-CL (L) VL(抗-VISTA)-CH1+VH(抗-VISTA)-CL (M) VH(抗-VISTA)-CH1-CH2-CH3+VL(抗-VISTA)-CL (N) VH(抗-VISTA)-CL-CH2-CH3+VL(抗-VISTA)-CH1 (O) VL(抗-VISTA)-CH1-CH2-CH3+VH(抗-VISTA)-CL (P) VL(抗-VISTA)-CL-CH2-CH3+VH(抗-VISTA)-CH1 (Q) VH(抗-VISTA)-CH1-CH2-CH3+VL(抗-VISTA)-CL-CH2-CH3 (R) VH(抗-VISTA)-CL-CH2-CH3+VL(抗-VISTA)-CH1-CH2-CH3
其中：“VH(抗-VISTA)”係指一種如本文所述能與VISTA結合的抗原結合分子之VH，例如於(1)至(76)中的一者所定義；“VL(抗-VISTA)”係指一種如本文所述能與VISTA結合的抗原結合分子之VL，例如於(77)至(173)中的一者所定義。
於一些具體例中，該多肽包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：212至243、248至250、258、266或311至321之一者的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。 鏈接子及額外的序列
於一些具體例中本發明之抗原結合分子及多肽包含一鉸鏈區域。於一些具體例中於CH1區域與CH2區域之間提供一鉸鏈區域。於一些具體例中於CL區域與CH2區域之間提供一鉸鏈區域。於一些具體例中該鉸鏈區域包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：207的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子及多肽於胺基酸序列之間包含一或多個鏈接子序列。可以於該抗原結合分子/多肽的VH、VL、CH1-CH2鉸鏈區域、CH2區域及CH3區域之一者或多者的一或二端提供鏈接子序列。
鏈接子序列為熟悉此藝者已知的，且於，舉例而言Chen等人，Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369之內說明，其係以其之全體藉此併入以作為參考資料。在一些具體例中，一鏈接子序列可以為撓性鏈接子序列。撓性鏈接子序列允許鏈接子序列鏈接的胺基酸序列之相對運動。撓性鏈接子為熟悉此藝者已知的，且於Chen等人，Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369內確認出數種。撓性鏈接子序列通常包含高比例的甘胺酸及/或絲胺酸殘基。
在一些具體例中，鏈接子序列包含至少一甘胺酸殘基及/或至少一絲胺酸殘基。在一些具體例中，鏈接子序列係由甘胺酸及絲胺酸殘基所組成。在一些具體例中，鏈接子序列具有1-2、1-3、1-4、1-5或1-10個胺基酸的長度。
本發明之抗原結合分子及多肽可額外包含另外的胺基酸或胺基酸序列。舉例而言，該抗原結合分子及多肽可包含胺基酸序列以促進該抗原結合分子/多肽之表現、折疊、運輸、加工、純化或偵測。舉例而言，該抗原結合分子/多肽可選擇地於該抗原結合分子/多肽之N-或C-端處包含一種序列，其編碼His、(如6XHis)、Myc、GST、MBP、FLAG、HA、E或生物素標籤。在一些具體例中該抗原結合分子/多肽包含一種可偵測的部分，例如螢光、發光、免疫可偵測的、放射、化學、核酸或酵素標記。
本發明之抗原結合分子及多肽可額外包含一訊息胜肽(也被稱為前導序列或訊息序列)。訊息胜肽通常由5-30個疏水胺基酸的序列組成，其形成一單一α螺旋。分泌的蛋白及細胞表面表現的蛋白通常包含訊息胜肽。
訊息胜肽可存在於抗原結合分子/多肽的N端，以及可存在於新合成的抗原結合分子/多肽內。提供訊息胜肽用於有效的運輸及分泌抗原結合分子/多肽。訊息胜肽通常藉由裂解來移除，因此從表現抗原結合分子/多肽的細胞分泌的成熟抗原結合分子/多肽不含有訊息胜肽。
已知許多蛋白的訊息胜肽，且記錄於資料庫中例如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、Protein Information Resource、Protein Data Bank、Ensembl及InterPro，及/或可以舉例而言使用胺基酸序列分析工具例如SignalP(Petersen等人，2011 Nature Methods 8: 785-786)或Signal-BLAST(Frank and Sippl, 2008 Bioinformatics 24: 2172-2176)來辨識/預測。 標記及複合物(conjugate)
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子額外包含一種可偵測的部分。
在一些具體例中，該抗原結合分子包含一種可偵測的部分，例如螢光標記、磷光標記、發光標記、免疫可偵測的標記(如表位標籤)、放射標記、化學、核酸或酵素標記。抗原結合分子可能以可偵測的部分予以共價或非共價地標記。
螢光標記包括舉例而言螢光素、玫瑰紅、異藻藍蛋白、曙紅及NDB、稀土族如銪(Eu)、鋱(Tb)及釤(Sm)之綠螢光蛋白(GFP)螯合物、四甲基玫瑰紅、紅色螢光染劑(Texas Red)、4-甲基繖形酮、7-胺基-4-甲基香豆素、Cy3及Cy5。放射標記包括放射性同位素舉例而言碘123 、碘125 、碘126 、碘131 、碘133 、溴77 、鎝99m 、銦111 、銦113m 、鎵67 、鎵68 、釕95 、釕97 、釕103 、釕105 、汞207 、汞203 、錸99m 、錸101 、錸105 、鈧47 、碲121m 、碲122m 、碲125m 、銩165 、銩(Thuliuml)167 、銩168 、銅67 、氟18 、釔90 、鈀100 、鉍217 及銻211 。發光標記包括如放射發光、化學發光(例如吖啶酯(acridinium ester)、發光胺(luminol)、異發光胺)及生物發光標記。免疫可偵測的標記包括不全抗原、胜肽/多肽、抗體、受體及配體例如生物素、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白或長葉毛地黃配質。核酸標記包括適配體。酵素標記包括舉例而言過氧化物酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶及螢光素酶。
在一些具體例中本發明之抗原結合分子與一化學部分複合。該化學部分可以為提供治療效應的部分。於Parslow等人，Biomedicines. 2016 Sep; 4(3):14乙文中回顧抗體-藥物複合物。在一些具體例中，該化學部分可為一藥物部分(如細胞毒性劑)。在一些具體例中，該藥物部分可為一化學治療劑。在一些具體例中，該藥物部分係選自於卡奇黴素(calicheamicin)、DM1、DM4、一甲基澳瑞他汀E(monomethylauristatin E)(MMAE)、一甲基澳瑞他汀F(monomethylauristatin F)(MMAF)、SN-38、多柔比星(doxorubicin)、倍癌黴素(duocarmycin)、D6.5及PBD。 抗原結合分子之特定的例示性具體例
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：212的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：213的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：214的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：215的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：216的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：217的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：218的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：219的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：220的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：221的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：222的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：223的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：224的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：225的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：226的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：227的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：228的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：229的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：230的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：231的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：232的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：233的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：234的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：235的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：236的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：237的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：238的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：239的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：240的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：241的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：242的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：243的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：248的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：250的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：249的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：250的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：258的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：250的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：266的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：250的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。
於一些具體例中，該抗原結合分子包含下列或由下列所組成： (i)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：330的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性；及 (ii)二種多肽，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與序列辨識編號：213的胺基酸序列有至少70%，較佳為75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列同一性。 抗原結合分子之功能性質
本文所述之抗原結合分子可參考某些功能性質予以特徵化。在一些具體例中，本文所述之抗原結合分子可擁有一種或更多種下列性質： 與VISTA結合(例如人類、鼠類及/或食蟹獼猴(cynomolgus macaque)VISTA)； 不與PD-L1及/或HER3結合； 不與Fcγ受體結合； 不與C1q結合； 不誘發ADCC； 不誘發ADCP； 不誘發CDC； 不與FcRn受體結合； 與表現VISTA的細胞結合； 抑制VISTA及VISTA的一結合伙伴(例如PSGL-1、VSIG-3或VSIG-8)之間的交互作用； 抑制VISTA-媒介的訊息傳導； 獨立於Fc-媒介的功能而抑制VISTA-媒介的訊息傳導； 增高表現VISTA的細胞之殺滅； 不誘發/增高表現VISTA的細胞之殺滅； 降低表現VISTA的細胞之數目/比例； 不降低表現VISTA的細胞之數目/比例； 增高效應子免疫細胞的數目/活性； 降低抑制性免疫細胞的數目/活性； 降低抑制性免疫細胞增殖； 減少表現VISTA的細胞媒介的免疫抑制； 增高抗原呈現細胞之抗原呈現作用等等； 增高免疫細胞生產的IL-6； 增高混合淋巴球反應(MLR)分析中的IFN-γ、IL-2及/或IL-17生產； 增高T細胞增殖、IFN-γ生產及/或TNFa生產；以及 抑制活體內 癌症的發展及/或進程。
本文所述之抗原結合分子較佳展現出與VISTA專一性結合。當使用於本文中，術語“專一性結合”係指對抗原有選擇性的結合作用，且其與非標靶抗原之非專一性結合是可區別的。一種與標靶分子專一性結合的抗原結合分子較佳以其與其他非標靶分子結合更大的親和力，及/或更長的持續時間與標靶結合。
一特定的多肽與一特定的分子專一性結合的能力可以藉由本技藝已知的分析法來測定，諸如ELISA、表面電漿子共振(SPR；參見諸如，Hearty等人，Methods Mol Biol (2012) 907:411-442)、生物層干涉術(參見諸如，Lad等人，(2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507)、流動式細胞測量術，或藉由放射性標記抗原結合分析(RIA)酶聯免疫吸附分析。與一特定的分子之結合作用可透過此分析來測量並定量。在一些具體例中，結合作用可以為特定的分析偵測到的反應。
在一些具體例中，當以諸如ELISA、SPR、生物層干涉術或RIA測量時，該抗原結合分子與非標靶分子結合的程度係小於該抗體與標靶分子結合的程度之大約10%。任擇地，結合專一性可反映在結合親和力上，其中該抗原結合分子係以比該抗原結合分子對非標靶分子的解離常數(KD )更大至少0.1數量級數(即，0.1 x 10n ，n為表示數量級數的整數)之KD 進行結合。此可選擇地可為至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0中之一者。
於一些具體例中，該抗原結合分子與人類VISTA、鼠類(如小鼠)VISTA及/或食蟹獼猴(cynomolgus macaque) (食蟹獼猴(Macaca fascicularis ))VISTA展現出結合作用。亦即，於一些具體例中該抗原結合分子為人類VISTA及鼠類VISTA及/或食蟹獼猴(cynomolgus macaque)VISTA交叉反應性的。於一些具體例中本發明之抗原結合分子與非人類靈長類動物VISTA展現出交叉反應性。VISTA於模式物種之交叉反應性允許能以同基因模式活體內 探索功效而不倚賴代用分子。
於一些具體例中，該抗原結合分子與PD-L1(如人類PD-L1)沒有顯示專一性結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與HER3(如人類HER3)沒有顯示專一性結合。於一些具體例中，該抗原結合分子與B7蛋白家族另一成員沒有顯示專一性結合(即沒有交叉反應)。於一些具體例中，該抗原結合分子與PD-L1、PD-L2 CD80、CD86、ICOSLG、CD276、VTCN1、NCR3LG1、HHLA2及/或CTLA4沒有顯示專一性結合。
於一些具體例中，該抗原結合分子與PD-1、PD-L1、B7H3、VTCN1(B7H4)、NCR3LG1(B7H6)、HHLA2(B7H7)及/或CTLA4沒有顯示專一性結合。
於一些具體例中該抗原結合分子不能誘發一或更多種Fc媒介的功能(即缺乏引發相關的Fc媒介的功能之能力)。此等抗原結合分子可描述為沒有相關功能。
如上文所說明，一種不誘發(即不能誘發)ADCC/ADCP/CDC之Fc區域/抗原結合分子舉例而言以合適相關活性的分析法予以分析測定時，實質不引發ADCC/ADCP/CDC活性。同樣地，一種“不結合”參考蛋白(諸如一特定Fc受體或補體蛋白)的抗原結合分子於合適的分析法中，實質不展現出與參考蛋白之結合。
於一些具體例中該抗原結合分子不能誘發ADCC。於一些具體例中該抗原結合分子不能誘發ADCP。於一些具體例中該抗原結合分子不能誘發CDC。於一些具體例中該抗原結合分子不能誘發ADCC及/或不能誘發ADCP及/或不能誘發CDC。
在一些具體例中該抗原結合分子不能與Fc受體結合。在一些具體例中該抗原結合分子不能與Fcγ受體結合。在一些具體例中該抗原結合分子不能與FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb之一者或多者結合。在一些具體例中該抗原結合分子不能與FcγRIIIa結合。在一些具體例中該抗原結合分子不能與FcγRIIa結合。在一些具體例中該抗原結合分子不能與FcγRIIb結合。在一些具體例中該抗原結合分子不能與FcRn結合。在一些具體例中該抗原結合分子不能與補體蛋白結合。在一些具體例中該抗原結合分子不能與C1q結合。在一些具體例中該抗原結合分子在對應於N297之胺基酸殘基處不予以醣化。
於一些具體例中，該抗原結合分子與人類VISTA、鼠類VISTA及/或食蟹獼猴VISTA結合；且不與PD-L1、PD-1、B7H3、VTCN1(B7H4)、NCR3LG1(B7H6)、HHLA2(B7H7)及/或CTLA4(如人類PD-L1/PD-1/B7H3/VTCN1/NCR3LG1/HHLA2/CTLA4)結合。
於一些具體例中，本文所述之抗原結合分子係以10 µM或更小的KD ，較佳為≤5 µM、≤2 µM、≤1 µM、≤500 nM、≤100 nM、≤75 nM、≤50 nM、≤40 nM、≤30 nM、≤20 nM、≤15 nM、≤12.5 nM、≤10 nM、≤9 nM、≤8 nM、≤7 nM、≤6 nM、≤5 nM、≤4 nM ≤3 nM、≤2 nM、≤1 nM或≤500 pM中的一者之KD ，與VISTA(如人類VISTA、小鼠VISTA)結合。於一些具體例中，該抗原結合分子係以KD =≤10 nM、≤9 nM、≤8 nM、≤7 nM或≤6 nM、≤5 nM、≤4 nM、≤3 nM、≤2 nM或≤1 nM之親和力，與VISTA(如人類VISTA、小鼠VISTA)結合。於一些具體例中，該抗原結合分子係以KD = ≤500 pM、≤100 pM、≤90 pM、≤80 pM、≤70 pM或≤60 pM、≤50 pM、≤40 pM、≤30 pM、≤20 pM、≤10 pM、≤9 pM、≤8 pM、≤7 pM或≤6 pM、≤5 pM、≤4 pM、≤3 pM、≤2 pM或≤1 pM之親和力，與VISTA(如人類VISTA、小鼠VISTA)結合。
本發明之抗原結合分子可與特定感興趣的VISTA區域結合。如本文件之抗原結合分子的抗原結合區域可結合由相鄰的胺基酸序列組成(即胺基酸一級序列)之VISTA的線形表位。在一些具體例中，該抗原結合區域分子可結合由胺基酸序列之不連續的胺基酸序列組成之VISTA的構形表位。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能與VISTA結合。於一些具體例中，該抗原結合分子能於VISTA的細胞外區域與VISTA結合。於一些具體例中，該抗原結合分子能與VISTA於似Ig的V型域(例如序列辨識編號：6所示的區域)結合。於一些具體例中，該抗原結合分子能與VISTA於序列辨識編號：31所示的區域結合。
於一些具體例中，該抗原結合分子能與一多肽結合，該多肽包含序列辨識編號：6所示的胺基酸序列或由序列辨識編號：6所示的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一多肽結合，該多肽包含序列辨識編號：31所示的胺基酸序列或由序列辨識編號：31所示的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽或多肽結合，該胜肽或多肽包含序列辨識編號：322所示的胺基酸序列或由序列辨識編號：322所示的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽或多肽結合，該胜肽或多肽包含序列辨識編號：26所示的胺基酸序列或由序列辨識編號：26所示的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽或多肽結合，該胜肽或多肽包含序列辨識編號：27所示的胺基酸序列或由序列辨識編號：27所示的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽或多肽結合，該胜肽或多肽包含序列辨識編號：28所示的胺基酸序列或由序列辨識編號：28所示的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽或多肽結合，該胜肽或多肽包含序列辨識編號：29所示的胺基酸序列或由序列辨識編號：29所示的胺基酸序列所組成。於一些具體例中，該抗原結合分子能與一胜肽或多肽結合，該胜肽或多肽包含序列辨識編號：30所示的胺基酸序列或由序列辨識編號：30所示的胺基酸序列所組成。
於一些具體例中，該抗原結合分子不與VISTA的一區域結合，該區域係IGN175A(舉例而言於WO 2014/197849 A2之內所述)結合VISTA的區域。於一些具體例中，該抗原結合分子不與VISTA的一區域結合，該區域係一種包含序列辨識編號：267的序列所組成的多肽及序列辨識編號：268的序列所組成的多肽之抗原結合分子結合VISTA的區域。
於一些具體例中，該抗原結合分子不與IGN175A(舉例而言於WO 2014/197849 A2之內所述)競爭與VISTA結合。於一些具體例中，該抗原結合分子不與一種包含序列辨識編號：267的序列所組成的多肽及序列辨識編號：268的序列所組成的多肽之抗原結合分子，競爭與VISTA之結合。
特定的抗原結合分子與IGN175A或包含序列辨識編號：267的序列所組成的多肽及序列辨識編號：268的序列所組成的多肽之抗原結合分子，競爭與VISTA結合的能力可以藉由諸如競爭ELISA或藉由依表位篩選來分析，如Abdiche等人，J Immunol Methods (2012) 382(--2):101-116中所述(以其全體併入以作為參考資料)。表位篩選可例如藉由BLI分析來執行，例如如本申請案的實施例8中所述。
於一些具體例中，該抗原結合分子與序列辨識編號：275所示之胺基酸序列所組成的一胜肽不能結合。
當使用於本文中，一“胜肽”係指一種由肽鍵所鍵聯的二或更多個胺基酸單體的鏈。一胜肽典型於該區域具有大約2至50個胺基酸的長度。一“多肽”為二或更多種胜肽的聚合物鏈。多肽典型具有超過大約50個胺基酸的長度。
一抗原結合分子與一特定的胜肽/多肽結合的能力可以藉由熟悉此藝者熟知的方法來分析，包括藉由ELISA、免疫墨點法(如西方墨點法)、免疫沉澱法、表面電漿子共振及生物層干涉術之分析。
於一些具體例中，該抗原結合分子能與一種抗體所結合VISTA區域相同的VISTA區域或重疊的VISTA區域結合，該抗體包含殖株4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8、V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12中的一者之VH及VL序列。
於一些具體例中，該抗原結合分子能與VISTA的一區域結合，該區域與IGN175A(舉例而言於WO 2014/197849 A2之內所述)所結合的VISTA區域是不同的。於一些具體例中，該抗原結合分子能與VISTA的一區域結合，該區域與一種包含序列辨識編號：267的序列所組成的多肽及序列辨識編號：268的序列所組成的多肽之抗原結合分子所結合VISTA的區域是不同的。
於一些具體例中，該抗原結合分子能與VISTA的一區域結合，該區域與IGN175A(舉例而言於WO 2014/197849 A2之內所述)所結合的VISTA區域不是重疊的。於一些具體例中，該抗原結合分子能與VISTA的一區域結合，該區域與一種包含序列辨識編號：267的序列所組成的多肽及序列辨識編號：268的序列所組成的多肽之抗原結合分子所結合VISTA的區域是不同的。
於一些具體例中，該抗原結合分子通過接觸VISTA的殘基而與VISTA結合，該等殘基與VSTB112(舉例而言於WO 2015/097536 A2之內所述)所接觸VISTA的殘基非同一的。於一些具體例中，該抗原結合分子通過接觸VISTA的殘基而與VISTA結合，該等殘基與一種包含序列辨識編號：269的序列所組成的多肽及序列辨識編號：270的序列所組成的多肽之抗原結合分子，所接觸VISTA的殘基非同一的。
於一些具體例中，該抗原結合分子之表位與VSTB112之表位非同一的。於一些具體例中，該抗原結合分子之表位與一種包含序列辨識編號：269的序列所組成的多肽及序列辨識編號：270的序列所組成的多肽之抗原結合分子之表位非同一的。
一抗體與一胜肽/多肽結合的區域可藉由熟悉此藝者使用本技藝熟知的各種方法來判定，包括抗體-抗原複合物之X射線共結晶學分析、胜肽掃描(peptide scanning)、致突變測繪(mutagenesis mapping)、由質譜法進行之氫-氘交換分析(hydrogen-deuterium exchange analysis)、噬菌體顯示、競爭ELISA及蛋白質水解為基的‘保護’法。此等方法係於，舉例而言，Gershoni等人，BioDrugs, 2007, 21(3):145-156中說明，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。
在一些具體例中，當VISTA表現於細胞表面(即在細胞膜上或在細胞膜)時，本發明之抗原結合分子於一抗原結合分子(即，細胞外抗原結合分子)可接近的區域與VISTA結合。於一些具體例中該抗原結合分子能與表現VISTA的細胞之細胞表面所表現的VISTA結合。於一些具體例中該抗原結合分子能與表現VISTA的細胞(諸如CD14+單核球(如骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs))及/或CD33+骨髓細胞、腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)及嗜中性球)結合。
可以分析抗原結合分子與特定細胞類型結合的能力，其係藉由接觸帶有抗原結合分子的細胞，以及例如於移去未結合的抗原結合分子之清洗步驟之後，偵測與細胞結合的抗原結合分子。抗原結合分子與表現免疫細胞表面分子的細胞及/或表現癌細胞抗原的細胞結合的能力可以藉由例如流動式細胞測量術及免疫螢光顯微鏡的方法予以分析。
本發明之抗原結合分子可為VISTA之拮抗劑。於一些具體例中，該抗原結合分子能抑制VISTA及/或VISTA的結合伙伴(例如PSGL-1、VSIG-3、VSIG-8)所媒介的一功能或過程(例如交互作用、訊息傳導或其他活性)。於此，‘抑制’係指相對於對照條件的降低、減少或減輕。
本文所述之VISTA-結合抗原結合分子能透過不需要Fc媒介的功能例如ADCC、ADCP及CDC之機轉來抑制VISTA-媒介的功能/過程。亦即，本文所述之VISTA-結合抗原結合分子能在不需要引發ADCC、ADCP及/或CDC的情況下抑制表現VISTA的細胞之免疫抑制活性。
特別地，本文所述之VISTA-結合抗原結合分子能經由不需要結合Fcγ受體及/或結合C1q之機轉來抑制VISTA。
於一些具體例中本發明之抗原結合分子能抑制VISTA及VISTA的結合伙伴(例如PSGL-1、VSIG-3、VSIG-8)之間的交互作用。於一些具體例中本發明之抗原結合分子能抑制VISTA及PSGL-1之間的交互作用。於一些具體例中本發明之抗原結合分子能抑制VISTA及VSIG-3之間的交互作用。
抗原結合分子抑制二種因子之間交互作用的能力可以舉例而言於該抗體/片段存在下，或用該抗體/片段孵育交互作用伙伴的一或二者之後，藉由分析交互作用來判定。判定一特定抗原結合分子是否能抑制二種交互作用伙伴之間交互作用的分析法包括競爭ELISA分析法及藉由SPR之分析。
能抑制一特定的(例如VISTA及VISTA的結合伙伴之間的)交互作用之抗原結合分子係於該抗原結合分子存在下或用該抗原結合分子孵育交互作用伙伴的一或二者之後，藉由觀察交互作用伙伴之間的交互作用位準，在與抗原結合分子不存在下(或於合適的對照抗原結合分子存在下)交互作用的位準相比之下，降低/減少來確認。合適的分析能，例如使用重組交互作用伙伴或使用表現交互作用伙伴的細胞於活體外 執行。表現交互作用伙伴的細胞可內生地進行此作用，或可由導入細胞的核酸進行此作用。為了此等分析的目的，交互作用伙伴的一或二者及/或抗原結合分子可予以標記或聯合一種可偵測的實體使用用於偵測及/或測量交互作用位準。
抗原結合分子抑制二種結合伙伴之間的交互作用的能力亦可以藉由分析此等交互作用的下游功能性結果來判定。舉例而言，VISTA與VISTA的結合伙伴之間交互作用之下游功能性結果可包括VISTA-媒介的訊息傳導。舉例而言，抗原結合分子抑制VISTA與VISTA的結合伙伴之間交互作用的能力之分析可以藉由以MLR分析中的IL-2、IFN-γ及/或IL-17生產來判定。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能抑制VISTA及VISTA的結合伙伴(例如PSGL-1、VSIG-3、VSIG-8)之間的交互作用達到比，抗原結合分子不存在下(或於合適的對照抗原結合分子存在下)VISTA與VISTA結合伙伴之間之交互作用的位準，更少小於1倍例如 ≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍。
在一些具體例中該抗原結合分子抑制VISTA-媒介的訊息傳導。VISTA-媒介的訊息傳導可以例如使用效應子免疫細胞數目/活性分析法來分析，舉例而言如本文的實驗實施例中所述之MLR分析。抑制VISTA-媒介的訊息傳導可藉由偵測效應子免疫細胞數目及/或活性之增高予以確認，依舉例而言IL-2、IFN-γ及/或IL-17生產之增高來判定。
在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不需要或涉及Fc-媒介的功能之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。在一些具體例中該抗原結合分子能獨立於Fc-媒介的功能而抑制VISTA-媒介的訊息傳導。亦即，在一些具體例中該抗原結合分子能以Fc區域獨立方式抑制VISTA-媒介的訊息傳導。
一種抗原結合分子藉由不需要/涉及Fc-媒介的功能之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導之能力可以舉例而言藉由以缺乏功能性Fc區域的格式提供之抗原結合分子抑制VISTA-媒介的訊息傳導之能力分析來評估。舉例而言，能使用包含‘靜默’Fc區域(譬如包含LALA PG取代)的抗原結合分子，或使用以缺乏Fc區域的格式提供之的抗原結合分子(譬如scFv、Fab等)來研究對於VISTA-媒介的訊息傳導之效應。
在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不涉及ADCC之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不涉及ADCP之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不涉及CDC之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。
在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不需要該抗原結合分子與Fc受體結合之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不需要該抗原結合分子與Fcγ受體結合之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不需要該抗原結合分子與FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb之一者或多者結合之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不需要結合FcγRIIIa之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不需要結合FcγRIIa之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不需要結合FcγRIIb之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不需要結合補體蛋白之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不需要結合C1q之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。在一些具體例中該抗原結合分子能藉由不需要N297醣化之機轉來抑制VISTA-媒介的訊息傳導。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能增高表現VISTA的細胞之殺滅。可通過該抗原結合分子之效應子功能來增高表現VISTA的細胞之殺滅。於抗原結合分子包含Fc區域的具體例中，該抗原結合分子可通過下列之一或更多者來增高表現VISTA的細胞之殺滅：補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞的吞噬作用(ADCP)。
一種能增高表現VISTA的細胞之殺滅的抗原結合分子能於合適的分析中、在該抗原結合分子存在下或用該抗原結合分子孵育表現VISTA的細胞之後，藉由觀察表現VISTA的細胞之殺滅位準，在與抗原結合分子不存在下(或於合適的對照抗原結合分子存在下)偵測到的細胞殺滅位準相比之下，增高而予以確認。CDC、ADCC及ADCP之分析法為熟悉此藝者熟知的。表現VISTA的細胞之殺滅位準亦可以於暴露於不同的治療條件後，藉由測量活及/或非活的表現VISTA的細胞之數目/比例來判定。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能增高表現VISTA的細胞(諸如表現VISTA的MDSCs)之殺滅達到比，抗原結合分子不存在下(或於合適的對照抗原結合分子存在下)觀察到的殺滅位準更大1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子於一可比較的分析中能降低表現VISTA的細胞(諸如表現VISTA的MDSCs)之數目達到比，抗原結合分子不存在下孵育之後(或於合適的對照抗原結合分子存在下孵育之後)偵測到的表現VISTA的細胞(諸如表現VISTA的MDSCs、TAMs、嗜中性球)之數目，少於小於1倍例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍。
於一些具體例中該抗原結合分子為非耗乏性抗原結合分子。即，於一些具體例中該抗原結合分子不會造成表現VISTA的細胞之實質耗乏。於一些具體例中該抗原結合分子不會引發/增高對表現VISTA的細胞之ADCC、ADCP及/或CDC。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子不誘發/增高表現VISTA的細胞之殺滅，例如於缺乏Fc區域的抗原結合分子之具體例中，或於該抗原結合分子包含不能誘發Fc-媒介的抗體效應子功能之Fc區域的具體例中。於一些具體例中，本發明之抗原結合分子不降低表現VISTA的細胞之數目/比例。
於一些具體例中本發明之抗原結合分子(i)抑制VISTA-媒介的訊息傳導，及(ii)不誘發/增高表現VISTA的細胞之殺滅。於一些具體例中本發明之抗原結合分子(i)抑制VISTA-媒介的訊息傳導，及(ii)不降低表現VISTA的細胞之數目/比例。
這可能是特別有利的，因為VISTA表現於不希望耗乏的細胞上。舉例而言，免疫細胞(譬如某些類型的T細胞及樹突細胞)表現非常低位準的VISTA而其等之殺滅或數目/比例之降低是非所欲的。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子舉例而言於合適的活體外 分析或於活體內 ，相對於陰性對照條件，能增高效應子免疫細胞的數目及/或活性。作為解釋，本發明之抗原結合分子可能能夠解除效應子免疫細胞之效應子免疫細胞增殖及功能不受MDSCs-媒介的抑制作用。於一些具體例中效應子免疫細胞可能為例如CD8+ T細胞、CD8+胞毒型T淋巴細胞(CD8+ CTLs)、CD4+ T細胞、CD4+ T輔助細胞、NK細胞、產生IFNγ的細胞、記憶T細胞、中央記憶T細胞、已接觸抗原型T細胞或CD45RO+ T細胞。
細胞的數目及比例舉例而言可藉由流動式細胞測量術分析、使用能偵測細胞類型的抗體來判定。細胞分裂可舉例而言，藉由3 H-胸腺嘧啶之嵌入或藉由CFSE稀釋分析之活體外 分析法予以分析，譬如Fulcher and Wong, Immunol Cell Biol (1999) 77(6): 559-564中所述，全體併入以作為參考資料。效應子免疫細胞活性可藉由測量此等活性的關聯值來判定。於一些具體例中效應子免疫細胞活性可藉由分析IL-2、IFN-γ及/或IL-17生產來判定。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能增高效應子免疫細胞類型的數目達到比，抗原結合分子不存在下(或於合適的對照抗原結合分子存在下)觀察到的數目，更大1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能增高效應子免疫細胞活性關聯值的位準達到比，抗原結合分子不存在下(或於合適的對照抗原結合分子存在下)觀察到的位準，更大1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能減少表現VISTA的細胞媒介的免疫抑制位準。免疫抑制位準的改變可使用測量表現VISTA的細胞之精胺酸酶1表現及/或活性含氧物(ROS)的生產之方法來判定，舉例而言於Ochoa等人，Ann Surg. 2001 Mar; 233(3): 393-399及Dikalov and Harrison Antioxid Redox Signal. 2014 Jan 10; 20(2): 372-382之內所述。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子例如使用抗原呈現作用合適的分析法予以測定時，能增高抗原呈現細胞之抗原呈現作用。於一些具體例中，本發明之抗原結合分子例如使用吞噬作用位準合適的分析法予以測定時，能增高吞噬細胞(如嗜中性球、單核球、巨噬細胞、肥胖細胞及/或樹突細胞)之吞噬作用。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能增高免疫細胞的IL-6生產。免疫細胞可能為譬如PBMCs、淋巴細胞、T細胞、B細胞、NK細胞或單核球。在一些具體例中免疫細胞為單核球。於一些具體例中，該抗原結合分子於例如用LPS刺激後，能增高免疫細胞的IL-6生產。抗原結合分子增高免疫細胞的IL-6生產之能力能以譬如如本文的實施例10中所述之活體外 分析法來分析。此等方法可包含用LPS刺激單核球(如THP1細胞)，以及用該抗原結合分子孵育經刺激的細胞。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能增高免疫細胞(如LPS-刺激的THP1細胞)的IL-6生產達到比，抗原結合分子不存在下(或於合適的對照抗原結合分子存在下)觀察到的位準，更大1倍例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能增高混合淋巴球反應(MLR)分析中的T細胞增殖、IL-2生產、IFN-γ生產及/或IL-17生產。MLR分析可如Bromelow等人之J.Immunol Methods, 2001 Jan 1;247(1-2):1-8，(以其全體併入以作為參考資料)中所述，或是如本文的實驗實施例中所述者來完成。IL-2、IFN-γ及/或IL-17生產可藉由譬如本技藝眾所周知的抗體為基的方法來分析，例如西方墨點法、免疫組織化學、免疫細胞化學、流動式細胞測量術、ELISA、ELISPOT或是報告者為基的方法。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能增高MLR分析的T細胞增殖、IL-2生產、IFN-γ生產及/或IL-17生產達到比，抗原結合分子不存在下(或於合適的對照抗原結合分子存在下)觀察到的位準，更大1倍例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子於VISTA/表現VISTA的細胞存在下能增高T細胞增殖、IFN-γ生產及/或TNFa生產。抗原結合分子可舉例而言於如本文的實驗實施例中所述之活體外 分析法中評估此等性質。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能(例如於VISTA/表現VISTA的細胞存在下)增高T細胞增殖、IFN-γ生產及/或TNFa生產達到比，抗原結合分子不存在下(或於合適的對照抗原結合分子存在下)觀察到的位準，更大1倍例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能增高T細胞(如CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞)增殖達到比先前技藝所揭示的VISTA-結合抗體(例如VSTB112，舉例而言於WO 2015/097536 A2之內所述)更大的程度。T細胞增殖可以舉例而言於如本文的實施例9中所述之活體外 分析法來評估，且可涉及在促效劑抗-CD3抗體存在下培養以刺激T細胞增殖。於一些具體例中，本發明之抗原結合分子於此分析中能增高T細胞增殖達到比先前技藝VISTA-結合抗體(如VSTB112)所誘發的增殖位準更大達1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能增高THP1細胞生產的IL-6達到比先前技藝所揭示的VISTA-結合抗體(例如VSTB112，舉例而言於WO 2015/097536 A2之內所述)更大的程度。THP1細胞生產的IL-6可以舉例而言於如本文的實施例10中所述之活體外 分析法來評估，且可涉及用LPS刺激THP1細胞。於一些具體例中，本發明之抗原結合分子於此分析中能增高IL-6生產達到比先前技藝VISTA-結合抗體(如VSTB112)所誘發的位準更大達1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子舉例而言於合適的活體外 分析或於活體內 ，相對於陰性對照條件，能：降低抑制性免疫細胞的數目及/或活性、抑制抑制性免疫細胞的增殖，及/或降低抑制性免疫細胞於一族群細胞(譬如CD45+細胞，例如從腫瘤獲得的CD45+細胞)中的比例。
抑制性免疫細胞可以為譬如表現VISTA的細胞、表現Arg1的細胞、MDSCs、顆粒球性MDSCs(g-MDSCs)或單核球性MDSCs(m-MDSCs)。
於一些具體例中，於數目/活性/增殖/比例上的降低達到比，抗原結合分子不存在下(或於合適的對照抗原結合分子存在下)觀察到的數目/活性/增殖/比例，更少1倍例如 ≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍。
於一些具體例中，該抗原結合分子能藉由不涉及Fc-媒介的功能之機轉來降低抑制性免疫細胞的數目/活性/增殖/比例。於一些具體例中，該抗原結合分子能獨立於Fc-媒介的功能(即以Fc區域獨立方式)而降低抑制性免疫細胞的數目/活性/增殖/比例。於一些具體例中，該抗原結合分子能藉由不涉及ADCC、ADCP及/或CDC之機轉來降低抑制性免疫細胞的數目/活性/增殖/比例。於一些具體例中，該抗原結合分子能藉由不涉及耗乏表現VISTA的細胞之機轉來降低抑制性免疫細胞的數目/活性/增殖/比例。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子抑制活體內 癌症的發展及/或進程。
於一些具體例中，該抗原結合分子造成殺滅癌細胞之增高，例如透過效應子免疫細胞來進行。於一些具體例中，該抗原結合分子例如在與合適的對照條件相比之下，造成活體內 癌細胞的數目降低。於一些具體例中，該抗原結合分子抑制了腫瘤生長，例如依照藉由測量腫瘤隨著時間的尺寸/體積予以判定。
於一些具體例中，本發明之抗原結合分子能於以該抗原結合分子治療的小鼠內使IFN-γ及/或IL-23的血清位準增高。IFN-γ及/或IL-23的血清位準能例如藉由從小鼠獲得的血液樣本衍生的血清ELISA予以分析。於一些具體例中，投予本發明之抗原結合分子使IFN-γ及/或IL-23的血清位準增高比沒有投予抗原結合分子之下觀察到的位準(或投予合適的對照抗原結合分子之後觀察到的位準)更大1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
可以合適的活體內 模式，例如細胞株衍生的異種移植模式來分析本發明之抗原結合分子抑制癌症發展及/或進程之能力，舉例而言CT26細胞衍生的模式、4T-1細胞衍生的模式、LL2細胞衍生的模式、B16細胞衍生的模式、或EL4細胞衍生的模式。癌症可以為病理上與表現VISTA的細胞及/或MDSCs(例如表現VISTA的MDSCs、TAMs、嗜中性球)關聯的癌症。與MDSCs‘病理上關聯的’癌症包括MDSCs或MDSCs數目/比例增高與該癌症之開始、發展或進程，及/或該癌症之一或更多症狀的嚴重性有正相關，或是MDSCs或MDSCs數目/比例增高為該癌症開始、發展或進程之風險因子的癌症。該癌症可包含受該疾病影響的器官/組織(例如表現出該疾病/病況症狀的器官/組織)內或腫瘤內的MDSCs。
在一些具體例中，投予如本發明之抗原結合分子可造成下列之一者或更多者：抑制癌症發展/進程、延遲/預防癌症發病、減少/延遲/預防腫瘤生長、減少/延遲/預防轉移、降低該癌症症狀的嚴重性、減少癌細胞的數目、縮小腫瘤尺寸/體積及/或提高存活(例如無惡化存活期)，例如以CT26細胞、4T-1細胞、LL2細胞、B16細胞或EL4細胞衍生的異種移植模式來判定。
於一些具體例中，投予本發明之抗原結合分子能抑制腫瘤生長達到比，沒有投予抗原結合分子之下(或投予合適的對照抗原結合分子之後)觀察到的腫瘤生長更大5%，例如≥10%、≥15%、≥20%、≥25%、≥30%、≥35%、≥40%、≥45%、≥50%、≥55%、≥60%、≥65%、≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥90%或≥95%。 嵌合抗原受體(CARs)
本發明亦提供包含本發明之抗原結合分子或多肽之嵌合抗原受體(CARs)。
CARs為重組受體，其提供抗原結合及T細胞活化功能二者。CAR結構及工程處理係舉例而言，於Dotti等人，Immunol Rev (2014) 257(1)內被回顧，其之整體藉此被併入以作為參考資料。CARs包含一種抗原結合區域，其與一細胞膜錨定區域及一訊息傳導區域鍵聯。一種可選擇的鉸鏈區域可以於抗原結合區域與細胞膜錨定區域之間提供分隔，以及可以作用為一種撓性鏈接子。
本發明的CAR包含一抗原結合區域，其包含本發明之抗原結合分子或由本發明之抗原結合分子所組成，或其包含如本發明之多肽或由如本發明之多肽所組成。
CAR的抗原結合區域與訊息傳導區域之間有細胞膜錨定區域且提供用於使CAR錨定至一種表現CAR的細胞之細胞膜，以及抗原結合區域錨定於細胞外空間及訊息傳導區域錨定於細胞內部。於一些具體例中，該CAR包含一種細胞膜錨定區域，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列包含下列、由下列所組成，或是衍生自下列：CD3-ζ、CD4、CD8或CD28中一者的跨膜區域胺基酸序列。當使用於本文中，一種‘衍生自’一參考胺基酸序列之區域包含一胺基酸序列，其與參考序列有至少60%的序列同一性，例如下列中之一者：至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。
一種CAR的訊息傳導區域允許T細胞之活化。CAR的訊息傳導區域可以包含CD3-ζ的細胞內域之胺基酸序列，其提供表現CAR的T細胞之磷酸化及活化作用之免疫受體酪胺酸的活化模體(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) (ITAMs)。包含其他含ITAM蛋白的序列之訊息傳導區域諸如FcγRI亦已經使用於CARs(Haynes等人，2001 J Immunol 166(1):182-187)。CARs的訊息傳導區域亦可包含衍生自共刺激分子之訊息傳導區域的共刺激序列，一旦與標靶蛋白結合便用以促進表現CAR的T細胞之活化。合適的共刺激分子包括CD28、OX40、4-1BB、ICOS及CD27。於一些情況中，CARs係予以工程處理以提供不同的細胞內訊息傳導途徑共刺激。舉例而言，與CD28共刺激有關連的訊息傳導優先活化磷脂酸肌醇3-激酶(P13K)的途徑，而4-1BB-媒介的訊息傳導係經由TNF受體相關因子(TRAF)轉接蛋白。CARs之訊息傳導區域因而有時含有衍生自超過一個共刺激分子的訊息傳導區域之共刺激序列。於一些具體例中，本發明的CAR包含一種或更多種共刺激序列，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列包含下列、由下列所組成或是衍生自下列：CD28、OX40、4-1BB、ICOS及CD27之一者或更多者的細胞內域之胺基酸序列。
一種可選擇的鉸鏈區域可以於抗原結合域與跨膜域之間提供分隔，以及可以作用為一種撓性鏈接子。鉸鏈區域可以衍生自IgG1。於一些具體例中，本發明的CAR包含一種鉸鏈區域，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列包含下列、由下列所組成或是衍生自下列：IgG1之鉸鏈區域的胺基酸序列。
亦提供一種包含如本發明的CAR之細胞。如本發明的CAR可以使用來產生表現CAR的免疫細胞，例如CAR-T或CAR-NK細胞。經工程處理使CARs進入免疫細胞可以在活體外 培養的期間執行。
本發明之CAR的抗原結合區域可以呈任何合適的格式提供，例如scFv、scFab等等。 核酸及載體
本發明提供一種編碼如本發明之抗原結合分子、多肽或CAR的核酸或多種核酸。
於一些具體例中，該核酸為從例如其他的核酸或天然存在的生物材料予以純化或單離的。於一些具體例中該核酸包含DNA及/或RNA或由DNA及/或RNA組成。
本發明亦提供一種載體或多種表現載體，其包含如本發明之核酸或多種核酸。
核苷酸序列可以被包含於一載體內，如一表現載體內。當使用於本文中，一種"載體"為一種核酸分子使用作為將外來的核酸轉移至一細胞內的媒介物(vehicle)。載體可以為一載體用於表現核酸於細胞內。此載體可以包括一種啟動子序列，其可操縱地鏈接至編碼待表現的序列之核苷酸序列。一種載體亦可以包括一終止密碼子及表現增強子。本技藝已知的任何合適的載體、啟動子、增強子及終止密碼子均可以用於從本發明之載體來表現胜肽或多肽。
術語"可操縱地鏈接"可以包括一選擇的核酸序列及調節性核酸序列(諸如啟動子及/或增強子)共價鍵聯的情況，以這樣的方式以使核酸序列表現處於調節序列的影響或控制之下(藉此形成一表現匣)。因而，設若一種調節序列能夠影響核酸序列的轉錄，則該調節序列係可操縱地鏈接至選擇的核酸序列。形成的轉錄本繼而可以轉譯成所欲的胜肽/多肽。
合適的載體包括質體、二元載體(binary vector)、DNA載體、mRNA載體、病毒載體(諸如，γ反轉錄病毒載體(如鼠類白血病病毒(MLV)-衍生的載體)、慢病毒(lentiviral)載體、腺病毒載體、腺病毒相關病毒載體、牛痘病毒載體及疱疹病毒載體)、轉位子基(transposon-based)載體以及人工染色體(如酵母人工染色體)。
於一些具體例中，載體可以為一真核載體，例如包含於真核細胞內從該載體表現蛋白所需的元素之一種載體。在一些具體例中，載體可以為一哺乳動物載體，例如包含巨細胞病毒(CMV)或SV40啟動子以驅動蛋白表現。
多種核酸之不同的核酸，或多種載體之不同的載體可編碼如本發明之抗原結合分子的組分多肽。 包含/表現該抗原結合分子及多肽的細胞
本發明亦提供一種包含或表現如本發明之抗原結合分子、多肽或CAR的細胞。亦提供一種包含或表現如本發明之一核酸、多種核酸、一載體或多種載體的細胞。
細胞可以為一種真核細胞，例如哺乳動物細胞。哺乳動物可以為靈長類動物(恆河猴(rhesus)、食蟹獼猴(cynomolgus)、非人類靈長類動物或人類)或非人類哺乳動物(諸如兔、天竺鼠、大鼠、小鼠或其他的囓齒動物(包括囓齒目的任何動物)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛(包括乳牛，例如乳用母牛或牛屬目(orderBos )的任何動物)、馬(包括馬科目(orderEquidae )的任何動物)、驢以及非人類靈長類動物。
本發明亦提供一種用於生產一細胞之方法，該細胞包含如本發明之核酸或載體，該方法包含導入如本發明之一核酸、多種核酸、一載體或多種載體至一細胞內。於一些具體例中，導入如本發明之一單離的核酸或載體至一細胞內包含轉形、轉染、電穿孔或轉導(例如反轉錄病毒轉導)。
本發明亦提供一種用於生產一細胞之方法，該細胞表現/包含如本發明之抗原結合分子、多肽或CAR，該方法包含導入如本發明之一核酸、多種核酸、一載體或多種載體至一細胞。於一些具體例中，該方法額外包含於適合該細胞表現該核酸或載體的條件下培養該細胞。於一些具體例中，該方法係於活體外 執行。
本發明亦提供透過如本發明之方法所獲得或可獲得的細胞。 生產抗原結合分子及多肽
如本發明之抗原結合分子及多肽可依據熟悉此藝者已知的生產多肽的方法予以製備。
多肽可以藉由化學合成方法來製備，如液相或固相合成。舉例而言，可以使用例如，Chandrudu等人，Molecules (2013), 18: 4373-4388中所述的方法來合成胜肽/多肽，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。
任擇地，抗原結合分子及多肽可以藉由重組表現來生產。合適重組生產多肽的分子生物學技術為本技藝眾所周知的，諸如於Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第4版), Cold Spring Harbor Press, 2012，以及於Nat Methods. (2008); 5(2): 135-146內闡述的該等，其等二者係以其等之全體藉此併入於此以作為參考資料。重組生產抗原結合分子的方法亦於Frenzel等人，Front Immunol. (2013); 4: 217以及Kunert and Reinhart, Appl Microbiol Biotechnol. (2016) 100: 3451-3461之內說明，其等二者係以其等之全體藉此併入於此以作為參考資料。
於一些情況中本發明之抗原結合分子包含一種以上的多肽鏈。於此等情況中，該抗原結合分子之生產可包含一種以上的多肽之轉錄及轉譯，以及多肽鏈隨後締合以形成該抗原結合分子。
可以使用合適多肽表現的任何細胞，用於如本發明之重組生產。細胞可以為一種原核細胞或真核細胞。在一些具體例中細胞為一種原核細胞，諸如古菌或細菌細胞。在一些具體例中細菌可以為革蘭氏陰性細菌諸如腸細菌科細菌，舉例而言大腸桿菌。在一些具體例中，細胞可以為一種真核細胞諸如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，例如CHO、HEK(如HEK293)、HeLa或COS細胞。在一些具體例中，細胞為一種暫時或穩定表現多肽的CHO細胞。
於一些情況中細胞不是原核細胞，因為一些原核細胞不允許如真核細胞一般的折疊或轉譯後修飾。此外，真核細胞可有非常高的表現位準以及能使用適當的標籤而容易地從真核細胞純化蛋白。亦可以使用會提升蛋白分泌至培養基內的特異性質體。
在一些具體例中多肽可以藉由無細胞蛋白質合成法(CFPS)來製備，舉例而言依據使用Zemella等人之Chembiochem (2015) 16(17): 2420-2431中所述的系統，其係以其之全體藉此併入於此作為參考資料。
生產可涉及培養或發酵一種經修飾以表現感興趣的多肽的真核細胞。培養或發酵可以於一生物反應器內執行，該生物反應器提供適當的營養、空氣/氧及/或生長因子之供應。透過從細胞分區培養培養基/發酵肉湯、萃取蛋白內含物，以及分離個別的蛋白以單離分泌的多肽，而可收集分泌的蛋白。培養、發酵及分離的技術為熟悉此藝者眾所周知的，且舉例而言，於Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第4版；併入上文以作為參考資料)中說明。
生物反應器包括一種或更多種可以培養細胞的器皿。藉著反應物持續流入反應器，及所培養的細胞持續流出反應器，可在生物反應器中持續進行培養。任擇地，可分批進行培養。監測與控制生物反應器的環境條件，諸如器皿內的pH值、氧氣、流入與流出的流速及攪拌作用，使得以提供最佳的細胞培養條件。
表現抗原結合分子/多肽的細胞於培養後，可單離感興趣的多肽。可以使用本技藝已知從細胞分離蛋白之任何合適的方法。為了單離多肽，可能必須從營養培養基分離細胞。設若多肽係從細胞分泌，則可以藉由離心而使細胞與含有分泌的感興趣的多肽之培養基分離。設若感興趣的多肽聚集於細胞內，則蛋白單離可包含離心以從細胞培養基分離細胞，以溶解緩衝液處理細胞丸粒，以及舉例而言藉由超音波處理、快速的凍融或滲透溶解來進行細胞破碎。
繼而可能希望從上清液或培養基單離感興趣的多肽，上清液或培養基可能含有其他的蛋白及非蛋白組份。從上清液或培養基分離蛋白組份的一般做法係透過沉澱。不同溶解度的蛋白係以不同濃度的沉澱劑諸如硫酸銨予以沉澱。舉例而言，於低濃度的沉澱劑下，萃取出水溶性蛋白。因而，透過添加不同漸增濃度的沉澱劑，可以區分出不同溶解度的蛋白。隨後可以使用透析以從分離的蛋白移除硫酸銨。
其他區分不同蛋白的方法為本技藝已知的，舉例而言離子交換層析法及粒徑層析法(size chromatography)。此等方法可以使用作為沉澱之替代方案，或是可以於沉澱後執行。
一旦已經自培養物單離感興趣的多肽，可能希望或需要使多肽濃縮。一些濃縮蛋白的方法為本技藝已知的，諸如超過濾或冷凍乾燥法。 組成物
本發明亦提供包含本文所述之抗原結合分子、多肽、CARs、核酸、表現載體及細胞之組成物。
本文所述之抗原結合分子、多肽、CARs、核酸、表現載體及細胞可以調配為供臨床使用之藥學組成物或藥物，以及可以包含一種藥學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑。該組成物可以予以調配供局部、非經腸、全身性、體腔內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內、眼內、結膜內、腫瘤內、皮下的、皮內、鞘內、口服或經皮之投予途徑，經皮之投予途徑可包括注射或灌注(infusion)。
適宜的調配物可包含無菌或等滲透壓性介質中的抗原結合分子。可將藥物與藥學組成物調配成液態形式包括凝膠、泡沫。可調配液態調配物供藉由注射或灌注(例如經由導管)投予至人類或動物身體的所選區域。
在一些具體例中，組成物係予以調配供注射或灌注，例如至血管或腫瘤內。
依據本文所述之本發明亦提供用於生產藥學上有用的組成物之方法，此等生產方法可以包含選自於下列的一或多個步驟：生產本文所述之抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)或細胞；單離本文所述之抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)或細胞；及/或混合本文所述之抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)或細胞以及一藥學上可接受的載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑。
舉例而言，本文所述之本發明另外的態樣係有關於一種調配或生產一藥物或藥學組成物之方法，該藥物或藥學組成物係供用於治療一疾病/病況(如癌症)，該方法包含藉由混合本文所述之抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)或細胞，與一藥學上可接受的載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑來調配一藥學組成物或藥物。 治療及預防應用
本文所述之抗原結合分子、多肽、CARs、核酸、表現載體、細胞及組成物於治療及預防方法上得到應用。
本發明提供本文所述之抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)、細胞或組成物供用於醫學治療或預防的方法。亦提供本文所述之抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)、細胞或組成物於製備供用於治療或預防一疾病或病況的藥物之用途。亦提供治療或預防一疾病或病況之方法，其包含投予治療或預防有效量之本文所述之抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)、細胞或組成物至一個體。
該方法可以有效減少疾病/病況的發展或進程、緩解疾病/病況的症狀或減少疾病/病況的病理。該方法可有效預防該疾病/病況的進程，例如預防該疾病/病況之惡化或減緩發展速度。在一些具體例中該方法可導致該疾病/病況的改善，例如減少該疾病/病況的症狀或減少其他一些與該疾病/病況的嚴重性/作用關聯值。在一些具體例中該方法可預防該疾病/病況發展成晚期(例如慢性階段或轉移)。
將可以理解的是本發明之物件可用於治療/預防能從表現VISTA的細胞(如MDSCs)之數目及/或活性下降得到治療或預防益處的任何疾病/病況。也很清楚本發明之治療及預防效益實質上擴及會從MDSCs及/或其他表現VISTA的細胞，例如腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)及嗜中性球之數目或活性下降而獲益的任何疾病/病況。VISTA之拮抗作用有效解除效應子免疫細胞不受MDSCs及/或其他表現VISTA的細胞的抑制。
舉例而言，該疾病/病況可為與表現VISTA的細胞(如MDSCs)病理上關聯的一種疾病/病況，例如表現VISTA的細胞(如MDSCs)之數目/比例的增高與該疾病/病況之開始、發展或進程，及/或該疾病/病況之一或更多症狀的嚴重性有正相關，或是表現VISTA的細胞(如MDSCs)數目/比例增高為該疾病/病況開始、發展或進程之風險因子的一種疾病/病況。
在一些具體例中，如本發明要治療/預防的疾病/病況係特徵在於表現VISTA的細胞(如MDSCs)之數目/比例/活性增高之疾病/病況，舉例來說與沒有該疾病/病況之表現VISTA的細胞(如MDSCs)之數目/比例/活性相比之下。
在一些具體例中，根據偵測到表現VISTA的細胞(如MDSCs)之數目/比例/活性增高，例如於末梢或受該疾病/病況影響的器官/組織內(例如表現出該疾病/病況症狀的器官/組織)，或是腫瘤內存在表現VISTA的細胞(如MDSCs或腫瘤相關巨噬細胞)，可以選擇供本文所述之治療的個體。該疾病/病況可影響任何組織或器官或器官系統。在一些具體例中該疾病/病況可影響數種組織/器官/器官系統。
在一些具體例中，根據測定到一個體的末梢或器官/組織內表現VISTA的細胞(如MDSCs)之數目/比例/活性，相對於健康個體此等細胞之數目/比例/活性有增高，或是根據測定到該個體有一種包含表現VISTA的細胞(如MDSCs)之腫瘤，可以選擇供用於依據本發明之療法/預防的個體。
在一些具體例中該要治療/預防的疾病/病況係一癌症。
將會明瞭的是該抗原結合分子一般而言可用於治療癌症，因為本發明之抗原結合分子可用於解除效應子免疫細胞不受MDSCs-媒介的抑制或表現VISTA的細胞之抑制，且藉此提升抗癌免疫反應。
癌症可以為任何不想要的細胞增殖(或其自身表現出不想要的細胞增殖之任何疾病)、贅生物或腫瘤。癌症可能是良性或惡性的以及可能為原發性或是繼發性(轉移的)。贅生物或是腫瘤可能為任何異常的細胞生長或增殖以及可能位於任何的組織內。癌症可以為衍生自例如下列的組織/細胞：腎上腺、腎上腺髓質、肛門、闌尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、腦、胸、盲腸、中樞神經系統(包括或是排除腦)小腦、子宮頸、結腸、十二指腸、子宮內膜、上皮細胞(例如腎臟上皮)、膽囊、食道、神經膠細胞、心臟、迴腸、空腸、腎臟、淚腺(lacrimal glad)、喉、肝臟、肺臟、淋巴、淋巴結、淋巴母細胞、上頜骨、縱膈、腸繫膜、子宮肌層、鼻咽、網膜、口腔、卵巢、胰臟、腮腺、周邊神經系統、腹膜、胸膜、前列腺、唾腺、乙狀結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臟、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、舌、扁桃腺、氣管、子宮、女陰及/或白血球細胞。
要治療的腫瘤可以為神經或非神經系統腫瘤。神經系統腫瘤可以發源於中樞或周邊神經系統，例如神經膠質瘤、神經管胚細胞瘤、腦脊髓膜瘤、神經纖維瘤、室管膜瘤、神經鞘瘤、神經纖維肉瘤、星細胞瘤及寡樹突神經膠細胞瘤。非神經系統癌症/腫瘤可以發源於任何其他非神經組織，實例包括黑色素瘤、間皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma) (NHL)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(myelodysplastic syndrome)(MDS)、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、肝癌、表皮樣癌、前列腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、胰臟癌、胸腺癌、NSCLC、血液癌症及肉瘤。
MDSCs於晚期結腸直腸癌是提高的(Toor等人，Front Immunol. 2016; 7:560)。乳癌亦觀察到MDSCs，且晚期乳癌患者之末梢血液的MDSCs百分率是增高的(Markowitz等人，Breast Cancer Res Treat. 2013 Jul; 140(1):13-21)。MDSC之豐度亦與實性腫瘤預後不良有相關性(Charoentong等人，Cell Rep. 2017 Jan 3; 18(1):248-262)，以及MDSCs於肝癌模式是富集的(Connolly等人，J Leukoc Biol. (2010) 87(4):713-25)。已有報導前列腺及乳癌(breast carcinoma)、黑色素瘤、結腸直腸癌(colorectal cancer)及路易士肺癌(Lewis lung carcinoma)會生產吸引MDSCs之趨化介素及有助於免疫抑制(Umansky等人，Vaccines (Basel) (2016) 4(4):36))，以及胰臟癌(pancreatic cancer)患者的MDSCs與腫瘤負荷有正相關(Xu等人，Hepatobiliary Pancreat Dis Int. (2016) 15(1):99-105)。亦有報導VISTA為卵巢癌(ovarian cancer)(參見諸如US 9,631,018 B2)及淋巴瘤(參見諸如WO 2017/023749 A1)之治療標靶。
Blando等人之Proc Natl Acad Sci U S A. (2019) 116(5):1692-1697乙文近來報導胰臟癌(pancreatic cancer)內表現VISTA的骨髓細胞顯著的浸潤，且在用CTLA4拮抗劑治療前列腺癌後，以及黑色素瘤用PD-L1拮抗劑治療黑色素瘤之前及之後都已觀察到表現VISTA的骨髓細胞之擴增。
在一些具體例中，癌症係選自於：一種包含表現VISTA的細胞之癌症、一種包含表現VISTA的細胞浸潤之癌症、一種包含表現VISTA的癌細胞之癌症、血液癌症、白血病、急性骨髓白血病、淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、間皮瘤、一實性腫瘤、 肺癌、非小細胞肺癌、胃癌(gastric cancer)、胃癌(gastric carcinoma)、結腸直腸癌(colorectal cancer)、結腸直腸癌(colorectal carcinoma)、結腸直腸腺癌(colorectal adenocarcinoma)、子宮癌、子宮體子宮內膜癌、乳癌(breast cancer)、三陰性侵襲性乳癌、肝癌、肝細胞癌、胰臟癌(pancreatic cancer)、胰臟管腺癌、甲狀腺癌、胸腺瘤、皮膚癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、腎癌、腎臟細胞癌、腎臟乳突細胞癌、頭頸部癌、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、卵巢癌(ovarian cancer)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、卵巢漿液性囊腺癌、前列腺癌(prostate cancer)及/或前列腺腺癌(prostate adenocarcinoma)。
在一些具體例中該癌症係結腸直腸癌(colorectal cancer) (如結腸癌、結腸腺癌)、胰臟癌(pancreatic cancer)、乳癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌(ovarian cancer)、頭頸部癌、白血病(如T細胞白血病)、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及/或實性腫瘤。
治療/預防可能是針對下列之一者或更多者：延遲/預防該癌症症狀的開始/進程、減少該癌症的症狀嚴重性、減少該癌症細胞的存活/生長/侵襲/轉移、減少該癌症細胞的數目及/或增高個體的存活。
在一些具體例中，要治療/預防的癌症包含表現VISTA的細胞。在一些具體例中，要治療/預防的癌症包含表現VISTA的癌症細胞。在一些具體例中，表現VISTA的細胞為MDSCs(例如g-MDSCs及/或m-MDSCs)。在一些具體例中，該癌症包含含有表現VISTA的細胞(例如MDSCs)之腫瘤。在一些具體例中，要治療/預防的癌症包含含有MDSCs之腫瘤。在一些具體例中，要治療/預防的癌症包含表現VISTA(例如MDSCs)的細胞之浸潤。在一些具體例中，要治療/預防的癌症包含一腫瘤，其展現出表現VISTA的細胞(例如MDSCs)之浸潤。
在一些具體例中，要治療/預防的癌症包含一腫瘤，其包含的CD45+細胞族群含有大於1%，例如≥2%、≥5%、≥10%、≥15%、≥20%、≥25%或≥30%的MDSCs(例如依腫瘤之免疫剖析來判定)。
在一些具體例中，根據舉例而言從一個體獲得的樣本內偵測到包含表現VISTA的細胞(如MDSCs)之癌症，或偵測到包含表現VISTA的細胞(如MDSCs)之腫瘤，可以選擇供本文所述之治療的個體。
在一些具體例中，與表現VISTA的細胞病理上關聯的疾病/病況為一感染疾病，例如細菌、病毒、真菌或寄生蟲感染。在一些具體例中，可能特別希望治療慢性/持續性感染，例如此等與T細胞官能不良或或T細胞衰竭有關連的感染。T細胞衰竭為許多慢性感染(包括病毒、細菌及寄生蟲)以及癌症的整個期間出現的T細胞官能不良狀態，是很明確的(Wherry Nature Immunology Vol.12, No.6, p492-499，2011年六月)。
可以治療的細菌感染之實例包括由於下列之感染：芽胞桿菌屬物種(Bacillus spp.)、百日咳博德氏桿菌(Bordetella pertussis)、梭菌屬物種(Clostridium spp.)、棒狀桿菌屬物種(Corynebacterium spp.)、霍亂弧菌(Vibrio chloerae)、葡萄球菌屬物種(Staphylococcus spp.)、鏈球菌屬物種(Streptococcus spp.)、大腸桿菌屬(Escherichia)、克留氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、耶氏桿菌屬(Yersinia)、伊文氏桿菌屬(Erwina)、沙門氏桿菌屬(Salmonella)、李氏菌屬物種(Listeria sp)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、分枝桿菌(mycobacteria) (諸如結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。舉例而言，細菌感染可以是敗血症或結核病。可以治療的病毒感染之實例包括由於下列之感染：流行性感冒病毒、麻疹病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人類免疫不全病毒(HIV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、單純疱疹病毒以及人類乳頭瘤病毒(HPV)。可以治療的真菌感染之實例包括由於下列之感染：鏈隔孢菌屬物種(Alternaria sp)、麴菌屬物種(Aspergillus sp)、念珠菌屬物種(Candida sp)及組織漿菌屬物種(Histoplasma sp.)。真菌感染可以是真菌敗血症或組織漿菌病。可以治療的寄生蟲感染之實例包括瘧原蟲(Plasmodium)物種的感染(諸如惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、約氏瘧原蟲(Plasmodium yoeli)、卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)，或是狨瘧蟲(Plasmodium chabaudi chabaudi)。寄生蟲感染可以為諸如瘧疾、萊什曼病及弓蟲症的疾病。
於一些具體例中，該抗原結合分子經由不涉及Fc區域媒介的效應子功能(如ADCC、ADCP、CDC)之分子機轉來發揮其之治療/預防性效應。在一些具體例中該分子機轉不涉及該抗原結合分子與Fcγ受體(如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb之一者或多者)結合。在一些具體例中該分子機轉不涉及該抗原結合分子與補體蛋白結合(如C1q)。
於一些具體例中(例如於缺乏Fc區域的抗原結合分子之具體例，或於該抗原結合分子包含不能誘發Fc-媒介的抗體效應子功能之Fc區域的具體例)，該治療不誘發/增高表現VISTA的細胞之殺滅。於一些具體例中，該治療不降低表現VISTA的細胞之數目/比例。
於一些具體例中該治療(i)抑制VISTA-媒介的訊息傳導，及(ii)不誘發/增高表現VISTA的細胞之殺滅。於一些具體例中該治療(i)抑制VISTA-媒介的訊息傳導，及(ii)不降低表現VISTA的細胞之數目/比例。
本發明之物件較佳以"治療有效"或"預防有效"量投予，此量係足以對個體顯示治療或預防益處。投予的實際量及投予的速率及時間過程會取決於疾病/病況的本質及嚴重性及投予的特定物件。治療的處方，例如決定劑量等等，係在普通科醫生及其他醫生的責任範圍內，並且典型地要考慮要治療的疾病/障礙、個別個體的狀況、遞送的位置、投予的方法以及開業醫生已知的其他因素。以上提及的技術與程序之實例可以於Remington's Pharmaceutical Sciences，第20版，2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins內找到。
可以單獨投予或是組合以其他的治療同時或相繼投予，取決於待治療的病況。本文所述之抗原結合分子或組成物及一治療劑可以同時或相繼投予。
於一些具體例中，該方法包含額外的治療或預防性介入，舉例而言用於治療/預防一癌症。於一些具體例中，該治療或預防性介入係選自於化學療法、免疫療法、放射療法、外科手術、疫苗接種及/或激素療法。於一些具體例中，該治療或預防性介入包含白血球分離術(leukapheresis)。於一些具體例中，該治療或預防性介入包含幹細胞移植。
於一些具體例中，該抗原結合分子係組合以一種能抑制VISTA以外的一免疫查核點分子媒介的訊息傳導之製劑來投予。於一些具體例中，該免疫查核點分子係例如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT或BTLA。於一些具體例中，該抗原結合分子係組合以一種能促進一共刺激受體媒介的訊息傳導之製劑來投予。於一些具體例中，該共刺激受體係例如CD28、CD80、CD40L、CD86、OX40、4-1BB、CD27或ICOS。
因此，本發明提供組成物，其包含如本發明之物件(舉例而言如本發明之抗原結合分子)及一種能抑制VISTA以外的一免疫查核點分子媒介的訊息傳導之製劑。亦提供組成物，其包含本發明之物件及一種能促進一共刺激受體媒介的訊息傳導之製劑。亦提供此等組成物於本文所述之疾病/病況之醫學治療及預防方法中之用途。
亦提供用於治療/預防本文所述之疾病/病況之方法，其包含投予如本發明之物件的本發明物件(舉例而言如本發明之抗原結合分子)及一種能抑制VISTA以外的一免疫查核點分子媒介的訊息傳導之製劑。亦提供用於治療/預防本文所述之疾病/病況之方法，其包含投予如本發明之物件的本發明物件(舉例而言如本發明之抗原結合分子)及一種能促進一共刺激受體媒介的訊息傳導之製劑。
能抑制免疫查核點分子媒介的訊息傳導的製劑為本技藝已知的，且包括例如能與免疫查核點分子或其等之配體結合並抑制免疫查核點分子媒介的訊息傳導的抗體。其他能抑制免疫查核點分子媒介的訊息傳導的製劑包括能降低免疫查核點分子或免疫查核點分子的配體之基因/蛋白表現的製劑(如通過抑制編碼免疫查核點分子/配體的基因之轉錄、抑制編碼免疫查核點分子/配體的RNA之轉錄後加工、降低編碼免疫查核點分子/配體的RNA之穩定性、促進編碼免疫查核點分子/配體的RNA之降解、抑制免疫查核點分子/配體的轉譯後加工、降低免疫查核點分子/配體的穩定性、或促進免疫查核點分子/配體的降解)，以及小分子抑制劑。
能促進共刺激受體媒介的訊息傳導之製劑為本技藝已知的，且包括例如能與共刺激受體結合並觸發或增高該共刺激受體媒介的訊息傳導的促效劑抗體。其他能促進共刺激受體媒介的訊息傳導的製劑包括能增高共刺激受體或共刺激受體的配體之基因/蛋白表現的製劑(如通過促進編碼共刺激受體/配體的基因之轉錄、促進編碼共刺激受體/配體的RNA之轉錄後加工、增高編碼共刺激受體/配體的RNA之穩定性、抑制編碼共刺激受體/配體的RNA之降解、促進共刺激受體/配體的轉譯後加工、增高共刺激受體/配體的穩定性、或抑制共刺激受體/配體的降解)，以及小分子促效劑。
用能抑制免疫查核點分子媒介的訊息傳導之製劑之治療的失敗及抗性發展已經牽涉到表現VISTA的MDSCs之免疫抑制。Gao等人，Nature Medicine (2017) 23: 551-555乙文近來建議VISTA可能為前列腺腫瘤於伊匹單抗(ipilimumab) (即抗-CTLA-4抗體)療法之後的代償性抑制途徑。
在特定的具體例中本發明之抗原結合分子係組合以一種能抑制PD-1媒介的訊息傳導的製劑來投予。能抑制PD-1媒介的訊息傳導的製劑可以為PD-1-或PD-L1-靶定的製劑。能抑制PD-1媒介的訊息傳導的製劑可以為例如一種能與PD-1或PD-L1結合並抑制PD-1媒介的訊息傳導的抗體。在一些具體例中該製劑為拮抗劑抗-PD-1抗體。在一些具體例中該製劑為拮抗劑抗-PD-L1抗體。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子係組合以一種能抑制CTLA-4媒介的訊息傳導的製劑來投予。能抑制CTLA-4媒介的訊息傳導的製劑可以為CTLA-4-靶定的製劑，或靶定CTLA-4的配體例如CD80或CD86的製劑。在一些具體例中，能抑制CTLA-4媒介的訊息傳導的製劑可以為舉例而言一種能與CTLA-4、CD80或CD86結合並抑制CTLA-4媒介的訊息傳導的抗體。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子係組合以一種能抑制LAG-3媒介的訊息傳導的製劑來投予。能抑制LAG-3媒介的訊息傳導的製劑可以為LAG-3-靶定的製劑，或靶定LAG-3的配體例如第二型MHC的製劑。在一些具體例中，能抑制LAG-3媒介的訊息傳導的製劑可以為舉例而言一種能與LAG-3或第二型MHC結合並抑制LAG-3媒介的訊息傳導的抗體。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子係組合以一種能抑制TIM-3媒介的訊息傳導的製劑來投予。能抑制TIM-3媒介的訊息傳導的製劑可以為TIM-3-靶定的製劑，或靶定TIM-3的配體例如乳醣凝集素9的製劑。在一些具體例中，能抑制TIM-3媒介的訊息傳導的製劑可以為舉例而言一種能與TIM-3或乳醣凝集素9結合並抑制TIM-3媒介的訊息傳導的抗體。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子係組合以一種能抑制TIGIT媒介的訊息傳導的製劑來投予。能抑制TIGIT媒介的訊息傳導的製劑可以為TIGIT-靶定的製劑，或靶定TIGIT的配體例如CD113、CD112或CD155的製劑。在一些具體例中，能抑制TIGIT媒介的訊息傳導的製劑可以為舉例而言一種能與TIGIT、CD113、CD112或CD155結合並抑制TIGIT媒介的訊息傳導的抗體。
在一些具體例中，本發明之抗原結合分子係組合以一種能抑制BTLA媒介的訊息傳導的製劑來投予。能抑制BTLA媒介的訊息傳導的製劑可以為BTLA-靶定的製劑，或靶定BTLA的配體例如HVEM的製劑。在一些具體例中，能抑制BTLA媒介的訊息傳導的製劑可以為舉例而言一種能與BTLA或HVEM結合並抑制BTLA媒介的訊息傳導的抗體。
在一些具體例中，使用本發明之抗原結合分子與一種能抑制免疫查核點分子(例如PD-1及/或PD-L1)媒介的訊息傳導的製劑之組合的方法與任一製劑使用作為單方療法時觀察到的效應相比，提供了改良的治療效應。在一些具體例中，本發明之抗原結合分子與一種能抑制免疫查核點分子(例如PD-1及/或PD-L1)媒介的訊息傳導的製劑之該組合提供了增效性(即優加性(super-additive))治療效應。
在一些具體例中，用一種包含(i)本發明之抗原結合分子與(ii)一種能抑制免疫查核點分子(例如PD-1及/或PD-L1)媒介的訊息傳導的製劑之組合的治療，可能與下列之一者或更多者有關連： •當與該組合之任一組份單獨使用時觀察到的治療效應相比，治療效應有改良； •當與該組合之任一組份單獨使用時觀察到的治療效應相比，治療效應為增效性的(即優加性)； •當與該組合之任一組份單獨使用時的腫瘤生長抑制相比，腫瘤生長抑制為增高的； •當與該組合之任一組份單獨使用時的腫瘤生長抑制相比，腫瘤生長抑制為增效性的(即優加性)； •當與該組合之任一組份單獨使用時抑制性免疫細胞的數目/活性的降低相比，抑制性免疫細胞的數目/活性的降低更大； •當與該組合之任一組份單獨使用時抑制性免疫細胞的數目/活性的降低相比，抑制性免疫細胞的數目/活性的降低為增效性的(即優加性)； •當與該組合之任一組份單獨使用時抑制性免疫細胞增殖的降低相比，抑制性免疫細胞增殖的降低更大 •當與該組合之任一組份單獨使用時抑制性免疫細胞增殖的降低相比，抑制性免疫細胞增殖的降低為增效性的(即優加性)； •當與該組合之任一組份單獨使用時抑制性免疫細胞比例的降低相比，抑制性免疫細胞於一族群細胞(譬如CD45+細胞，例如從腫瘤獲得的CD45+細胞)中的比例降低更大；以及 •當與該組合之任一組份單獨使用時抑制性免疫細胞比例的降低相比，抑制性免疫細胞於一族群細胞(譬如CD45+細胞，例如從腫瘤獲得的CD45+細胞)中的比例降低為增效性的(即優加性)。
同時投予係指一起投予該抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)、細胞或組成物及治療劑，舉例而言作為一種含有二製劑的藥學組成物(組合製備物)，或是彼此緊密相連地投予以及可選擇地經由相同的投予途徑，例如至相同的動脈、靜脈或其他血管。相繼投予係指投予該抗原結合分子/組成物或治療劑中之一者，接著於特定的時間間隔之後分開投予另一種製劑。二種製劑不需要以相同的途徑投予，雖然於一些具體例中是這種情況。時間間隔可以為任何的時間間隔。
化學療法及放射療法分別指用一種藥物或游離輻射(諸如利用X射線或γ射線之放射療法)來治療一癌症。藥物可以為一化學實體，例如小分子藥品、抗生素、DNA嵌入劑、蛋白抑制劑(諸如激酶抑制劑)，或是一生物製劑，例如抗體、抗體片段、適配體、核酸(諸如DNA、RNA)、胜肽、多肽，或蛋白質。藥物可以調配成一藥學組成物或藥物。調配物可以包含一種或更多種藥物(諸如一種或更多種活性製劑)連同一或更多藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑或載劑。
治療可以涉及超過一種藥物的投予。一種藥物可以單獨投予或組合以其他的治療同時或相繼投予，取決於待治療的病況。舉例而言，化學療法可以為涉及投予二種藥物的共療法，其等之一者或更多者可能是打算要治療癌症者。
化學療法可以藉由一種或更多種投予途徑予以投予，例如非經腸、靜脈內注射、口腔、皮下、皮內或腫瘤內。
化學療法可以依據一種治療攝生法(regime)來投予。治療攝生法可以是預定的化學療法投予之時刻表、計畫、方案或時間表，其可由醫師或開業醫生予以製備且可以修改以適合需要治療的患者。治療攝生法可以表示下列之一者或更多者：患者被投予的化學療法類型；各藥物或放射線的劑量；投予之間的時間間隔；各治療的長度；若有任何治療假期(treatment holiday)，則其次數及本質等等。於共療法方面可以提供指示各藥物如何被投予之單一治療攝生法。
化學治療藥物可以選自於：玻瑪西林(Abemaciclib)、醋酸阿比特龍(Abiraterone Acetate)、必除癌(Abitrexate) (胺甲喋呤(Methotrexate))、亞伯杉(Abraxane)(紫杉醇(Paclitaxel)白蛋白穩定的奈米粒子調配物)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、阿卡替尼(Acalabrutinib)、AC-T、雅詩力(Adcetris) ((本妥昔單抗(Brentuximab Vedotin))、ADE、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛(Ado-Trastuzumab Emtansine)、阿德力黴素(Adriamycin)(鹽酸多柔比星(Doxorubicin Hydrochloride))、二馬來酸阿法替尼(Afatinib Dimaleate)、癌伏妥(Afinitor)(依維莫司(Everolimus))、嘔可舒(Akynzeo) (奈妥吡坦和鹽酸帕洛諾司瓊(Netupitant and Palonosetron Hydrochloride))、樂得美(Aldara) (咪喹莫特(Imiquimod))、阿地白介素(Aldesleukin)、安立適(Alecensa)(阿雷替尼(Alectinib))、阿雷替尼(Alectinib)、阿來組單抗(Alemtuzumab)、愛寧達(Alimta) (培美曲塞二鈉(Pemetrexed Disodium))、Aliqopa(鹽酸庫潘尼西(Copanlisib Hydrochloride))、注射用威克瘤(Alkeran for Injection)(鹽酸黴法蘭(Melphalan Hydrochloride))、威克瘤錠(Alkeran Tablets)(黴法蘭(Melphalan))、嘔立舒(Aloxi)(鹽酸帕洛諾司瓊(Palonosetron Hydrochloride))、布吉替尼(Alunbrig) (布吉替尼(Brigatinib))、苯丁酸氮芥(Ambochlorin)(苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、苯丁酸氮芥(Amboclorin) (苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、氨磷汀(Amifostine)、胺基乙醯丙酸(Aminolevulinic Acid)、阿那曲唑(Anastrozole)、阿瑞吡坦(Aprepitant)、雷狄亞(Aredia)(帕米膦酸二鈉(Pamidronate Disodium))、安美達(Arimidex)(阿那曲唑(Anastrozole))、諾曼癌素(Aromasin) (依西美坦(Exemestane))、阿倫恩(Arranon)(奈拉濱(Nelarabine))、三氧化二砷、亞舍拉(Arzerra)(奧法木單抗(Ofatumumab))、天門冬醯胺酶酸菊歐文氏桿菌 (Asparaginase Erwinia chrysanthemi))、阿特珠單抗(Atezolizumab)、癌思停(Avastin)(貝伐單抗(Bevacizumab))、阿維魯單抗(Avelumab)、西卡思羅(Axicabtagene Ciloleucel)、阿西替尼(Axitinib)、阿扎胞苷(Azacitidine)、巴文西歐(Bavencio)(阿維魯單抗(Avelumab))、BEACOPP、卡莫司汀(Becenum) (卡莫司汀(Carmustine))、貝利司他(Beleodaq)(貝利司他(Belinostat))、貝利司他(Belinostat)、鹽酸苯達莫司汀(Bendamustine Hydrochloride)、BEP、沛斯博(Besponsa) (奥英妥珠單抗(Inotuzumab Ozogamicin))、貝伐單抗(Bevacizumab)、貝沙羅汀(Bexarotene)、百克沙(Bexxar)(托西莫單抗(Tositumomab)及碘I 131托西莫單抗)、比卡魯胺(Bicalutamide)、BiCNU(卡莫司汀(Carmustine))、博萊黴素(Bleomycin)、博納吐單抗(Blinatumomab)、百利妥(Blincyto) (博納吐單抗)、硼替佐米(Bortezomib)、伯舒替尼(Bosulif) (伯舒替尼(Bosutinib))、伯舒替尼(Bosutinib)、本妥昔單抗(Brentuximab Vedotin)、布吉替尼(Brigatinib)、BuMel、硫酸布他卡因(Busulfan)、補束剋(Busulfex)(硫酸布他卡因(Busulfan))、卡巴他賽(Cabazitaxel)、卡博替尼(Cabometyx) (卡博替尼-S-蘋果酸(Cabozantinib-S-Malate))、卡博替尼-S-蘋果酸、CAF、阿卡替尼(Calquence) (阿卡替尼(Acalabrutinib))、坎帕斯(Campath)(阿來組單抗(Alemtuzumab))、開普拓(Camptosar)(鹽酸伊立替康(Irinotecan Hydrochloride))、卡培他濱(Capecitabine)、CAPOX、Carac(氟尿嘧啶--局部(Fluorouracil--Topical))、卡鉑(Carboplatin)、卡鉑-紫杉醇(CARBOPLATIN-TAXOL)、卡非佐米(Carfilzomib)、卡莫司汀(Carmubris) (卡莫司汀(Carmustine))、卡莫司汀、卡莫司汀植入劑、可蘇多(Casodex) (比卡魯胺(Bicalutamide))、CEM、色瑞替尼(Ceritinib)、司比定(Cerubidine) (鹽酸道諾黴素(Daunorubicin Hydrochloride))、保蓓(Cervarix) (重組型HPV二價疫苗)、西妥昔單抗(Cetuximab)、CEV、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、苯丁酸氮芥-強體松(CHLORAMBUCIL-PREDNISONE)、CHOP、順鉑(Cisplatin)、克拉屈濱(Cladribine)、環磷醯胺(Clafen) (環磷醯胺(Cyclophosphamide))、氯伐拉濱(Clofarabine)、氯伐拉濱(Clofarex)(氯伐拉濱(Clofarabine))、氯伐拉濱(Clolar)(氯伐拉濱(Clofarabine))、CMF、考比替尼(Cobimetinib)、卡博替尼(Cometriq)(卡博替尼-S-蘋果酸(Cabozantinib-S-Malate)、鹽酸庫潘尼西(Copanlisib Hydrochloride)、COPDAC、COPP、COPP-ABV、可美淨(Cosmegen) (放線菌素(Dactinomycin))、可泰利(Cotellic) (考比替尼(Cobimetinib))、里唑蒂尼(Crizotinib))、CVP、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、異環磷醯胺(Cyfos)(異環磷醯胺(Ifosfamide))、欣銳擇(Cyramza) (雷莫司單抗(Ramucirumab))、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷脂質體(Cytarabine Liposome)、賽德薩-U(Cytosar-U) (阿糖胞苷)、環磷醯胺(Cytoxan)(環磷醯胺(Cyclophosphamide)、達拉菲尼(Dabrafenib)、達卡巴嗪(Dacarbazine)、達克金(Dacogen)(地西他濱(Decitabine))、放線菌素(Dactinomycin)、達雷木單抗(Daratumumab)、達雷木單抗(Darzalex) (達雷木單抗(Daratumumab))、達沙替尼(Dasatinib)、鹽酸道諾黴素(Daunorubicin Hydrochloride)、鹽酸道諾黴素及阿糖胞苷脂質體(Daunorubicin Hydrochloride and Cytarabine Liposome)、地西他濱(Decitabine)、去纖苷鈉(Defibrotide Sodium)、去纖苷鈉(Defitelio) (去纖苷鈉(Defibrotide Sodium))、加瑞克(Degarelix)、地尼白介素(Denileukin Diftitox)、地諾單抗(Denosumab)、阿拉伯糖苷胞嘧啶脂質體(DepoCyt)(阿糖胞苷脂質體(Cytarabine Liposome))、地塞米松(Dexamethasone)、鹽酸右雷佐生(Dexrazoxane Hydrochloride)、丹尼托昔單抗(Dinutuximab)、多烯紫杉醇(Docetaxel)、多柔比星脂質體(Doxil) (鹽酸多柔比星脂質體(Doxorubicin Hydrochloride Liposome))、鹽酸多柔比星、鹽酸多柔比星脂質體、Dox-SL(鹽酸多柔比星脂質體)、DTIC-Dome (達卡巴嗪(Dacarbazine))、德瓦魯單抗(Durvalumab)、艾欣宜膚(Efudex)(氟尿嘧啶--局部(Fluorouracil--Topical))、埃立特(Elitek)(拉布立酶(Rasburicase))、艾倫斯(Ellence) (鹽酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride))、埃羅妥珠單抗(Elotuzumab)、益樂鉑(Eloxatin)(奥沙利鉑(Oxaliplatin))、艾曲波帕乙醇胺(Eltrombopag Olamine)、止敏吐(Emend)(阿瑞吡坦(Aprepitant))、恩必喜(Empliciti)(埃羅妥珠單抗(Elotuzumab))、甲磺酸恩西地平(Enasidenib Mesylate)、恩雜魯胺(Enzalutamide)、鹽酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride)、EPOCH、愛必妥(Erbitux) (西妥昔單抗(Cetuximab))、甲磺酸艾日布林(Eribulin Mesylate)、愛維德(Erivedge) (維莫德吉(Vismodegib))、鹽酸厄洛替尼(Erlotinib Hydrochloride)、天門冬醯胺酶(Erwinaze)(天門冬醯胺酶酸菊歐文氏桿菌(Asparaginase Erwinia chrysanthemi))、益護爾氨磷汀(Ethyol) (氨磷汀(Amifostine))、依託泊苷(Etopophos) (依託泊苷磷酸(Etoposide Phosphate))、依託泊苷(Etoposide)、依託泊苷磷酸(Etoposide Phosphate)、鹽酸多柔比星脂質體(Evacet)((鹽酸多柔比星脂質體)、依維莫司(Everolimus)、鈣穩(Evista)(鹽酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride))、優維寧(Evomela)(鹽酸黴法蘭(Melphalan Hydrochloride))、依西美坦(Exemestane)、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、5-FU(氟尿嘧啶--局部)、弗瑞斯(Fareston)(托瑞米芬(Toremifene))、髓力達(Farydak) (帕比司他(Panobinostat))、法洛德(Faslodex)(氟維司群(Fulvestrant))、FEC、復乳納(Femara) (來曲唑(Letrozole))、非格司亭(Filgrastim)、福達樂(Fludara) (磷酸氟達拉濱(Fludarabine Phosphate))、磷酸氟達拉濱(Fludarabine Phosphate)、氟尿嘧啶(Fluoroplex) (氟尿嘧啶--局部)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶--局部、氟他胺(Flutamide)、胺甲喋呤(Folex)(胺甲喋呤(Methotrexate))、胺甲喋呤PFS(Folex PFS) (胺甲喋呤(Methotrexate))、FOLFIRI、FOLFIRI-貝伐單抗、FOLFIRI-西妥昔單抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、服瘤停(Folotyn) (普拉曲沙(Pralatrexate))、FU-LV、氟維司群(Fulvestrant)、嘉喜(Gardasil) (重組型HPV四價疫苗)、嘉喜9(Gardasil 9) (重組型HPV九價疫苗)、癌即瓦(Gazyva) (奥濱尤妥珠單抗(Obinutuzumab))、吉菲替尼(Gefitinib)、鹽酸吉西他汀(Gemcitabine Hydrochloride)、吉西他汀-順鉑(GEMCITABINE-CISPLATIN)、吉西他汀-奥沙利鉑(GEMCITABINE-OXALIPLATIN)、吉妥珠單抗奥佐米星(Gemtuzumab Ozogamicin)、健擇(Gemzar)(鹽酸吉西他汀)、妥復克(Gilotrif) (二馬來酸阿法替尼(Afatinib Dimaleate))、基利克(Gleevec) (甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate))、格立得(Gliadel) (卡莫司汀植入劑(Carmustine Implant))、格立得植入劑(Gliadel wafer) (卡莫司汀植入劑(Carmustine Implant))、谷卡匹酶(Glucarpidase)、醋酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate))、賀樂維(Halaven) (甲磺酸艾日布林(Eribulin Mesylate))、普潘奈(Hemangeol)(鹽酸普潘奈(Propranolol Hydrochloride)、賀癌平(Herceptin) (曲妥珠單抗(Trastuzumab))、HPV二價疫苗、重組型、HPV九價疫苗、重組型、HPV四價疫苗、重組型、癌康定(Hycamtin)(鹽酸托普迪肯(Topotecan Hydrochloride))、羥基脲(Hydrea)(羥基脲(Hydroxyurea))、羥基脲(Hydroxyurea)、Hyper-CVAD、愛乳適(Ibrance) (帕博西尼(Palbociclib))、替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)、依魯替尼(Ibrutinib)、ICE、英可欣(Iclusig) (鹽酸普納替尼(Ponatinib Hydrochloride))、伊達比星(Idamycin)(鹽酸伊達比星(Idarubicin Hydrochloride))、鹽酸伊達比星(Idarubicin Hydrochloride)、艾代拉里斯(Idelalisib)、恩西地平(Idhifa)(甲磺酸恩西地平(Enasidenib Mesylate)、異環磷醯胺(Ifex) (異環磷醯胺(Ifosfamide))、異環磷醯胺(Ifosfamide)、異環磷醯胺(Ifosfamidum) (異環磷醯胺(Ifosfamide))、IL-2(阿地白介素(Aldesleukin))、甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)、億珂(Imbruvica) (依魯替尼(Ibrutinib))、恩慈(Imfinzi)(德瓦魯單抗(Durvalumab))、咪喹莫特(Imiquimod)、伊姆利基(Imlygic)(拉他莫金(Talimogene Laherparepvec))、抑癌特(Inlyta) (阿西替尼(Axitinib)、奥英妥珠單抗奥佐米星(Inotuzumab Ozogamicin)、干擾素α-2b、重組型、介白素-2(阿地白介素)、因治隆A(Intron A) (重組型干擾素α-2b)、碘I 131托西莫單抗及托西莫單抗、伊匹單抗(Ipilimumab)、艾瑞莎(Iressa) (吉菲替尼(Gefitinib))、鹽酸伊立替康(Irinotecan Hydrochloride)、鹽酸伊立替康脂質體(Irinotecan Hydrochloride Liposome)、羅米地辛(Istodax)(羅米地辛(Romidepsin))、伊沙匹隆(Ixabepilone)、檸檬酸埃沙佐米(Ixazomib Citrate)、易莎平(Ixempra)(伊沙匹隆(Ixabepilone))、捷可衛(Jakafi) (磷酸鹽魯索利替尼(Ruxolitinib Phosphate))、JEB、去癌達(Jevtana) (卡巴他賽(Cabazitaxel))、賀癌寧(Kadcyla) (阿多-曲妥珠單抗艾坦辛(Ado-Trastuzumab Emtansine))、鹽酸雷洛昔芬(Keoxifene)(鹽酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride))、凱望斯(Kepivance)(帕利夫明(Palifermin))、吉舒達(Keytruda)(派姆單抗(Pembrolizumab))、擊癌利(Kisqali)(瑞柏司可里布 (Ribociclib))、Kymriah (Tisagenlecleucel)、凱博斯(Kyprolis)(卡非佐米(Carfilzomib))、蘭雷歐肽乙酯(Lanreotide Acetate)、二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate)、拉特沃(Lartruvo)(奥拉妥單抗(Olaratumab))、雷利度胺(Lenalidomide)、甲磺酸樂伐替尼(Lenvatinib Mesylate)、樂衛瑪(Lenvima)(甲磺酸樂伐替尼(Lenvatinib Mesylate))、來曲唑(Letrozole)、甲醯四氫葉酸鈣(Leucovorin Calcium)、瘤克寧(Leukeran) (苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)、祿斯得停(Leustatin)(克拉屈濱(Cladribine))、聚果糖(Levulan)(胺基乙醯丙酸(Aminolevulinic Acid)、苯丁酸氮芥(Linfolizin)(苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、力得微脂體(LipoDox) (鹽酸多柔比星脂質體)、洛莫司汀(Lomustine)、朗斯弗(Lonsurf)(曲氟尿苷及鹽酸替比拉西(Trifluridine and Tipiracil Hydrochloride))、柳菩林(Lupron)(醋酸亮丙瑞林))、柳菩林持續性藥效皮下注射劑(Lupron Depot)((醋酸亮丙瑞林))、柳菩林持續性藥效皮下注射劑(Lupron Depot-Ped)(醋酸亮丙瑞林)、利普卓(Lynparza)(奧拉帕尼(Olaparib))、硫酸長春新鹼脂質體(Marqibo) (硫酸長春新鹼脂質體(Vincristine Sulfate Liposome))、甲基苄肼(Matulane)(鹽酸丙卡巴肼(Procarbazine Hydrochloride))、鹽酸甲基二(氯乙基)胺(Mechlorethamine Hydrochloride)、醋酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)、麥欣霓(Mekinist)(曲美替尼(Trametinib))、黴法蘭(Melphalan)、鹽酸黴法蘭(Melphalan Hydrochloride)、巰嘌呤(Mercaptopurine)、美司鈉(Mesna)、美司鈉(Mesnex)(美司鈉(Mesna))、替莫唑胺(Methazolastone)(替莫唑胺(Temozolomide))、胺甲喋呤(Methotrexate)、胺甲喋呤LPF(胺甲喋呤)、溴化甲基納曲酮(Methylnaltrexone Bromide)、胺甲喋呤(Mexate)(胺甲喋呤(Methotrexate))、胺甲喋呤-AQ(Mexate-AQ) (胺甲喋呤(Methotrexate))、米哚妥林(Midostaurin)、絲裂黴素C(Mitomycin C)、鹽酸雙羥蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)、絲裂黴素C(Mitozytrex)(絲裂黴素C(Mitomycin C))、MOPP、總動原(Mozobil)(普樂沙福(Plerixafor))、氮芥(Mustargen)(鹽酸甲基二(氯乙基)胺(Mechlorethamine Hydrochloride))、排多癌(Mutamycin) (絲裂黴素C(Mitomycin C))、邁樂寧(Myleran) (硫酸布他卡因(Busulfan))、阿扎胞苷(Mylosar)(阿扎胞苷(Azacitidine))、麥羅塔(Mylotarg) (吉妥珠單抗奥佐米星(Gemtuzumab Ozogamicin))、紫杉醇(Paclitaxel)奈米粒子(紫杉醇(Paclitaxel)白蛋白穩定的奈米粒子調配物)、溫諾平(Navelbine)(酒石酸長春瑞賓(Vinorelbine Tartrate))、耐昔妥珠單抗(Necitumumab)、奈拉濱(Nelarabine)、環磷醯胺(Neosar)(環磷醯胺(Cyclophosphamide))、馬來酸來那替尼(Neratinib Maleate)、來那替尼(Nerlynx)(馬來酸來那替尼(Neratinib Maleate)、奈妥吡坦和鹽酸帕洛諾司瓊(Netupitant and Palonosetron Hydrochloride))、倍血添(Neulasta)(培非格司亭(Pegfilgrastim))、優保津(Neupogen)(非格司亭(Filgrastim))、蕾莎瓦(Nexavar)(甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib Tosylate))、尼魯米特(Nilandron)(尼魯米特(Nilutamide))、尼洛替尼(Nilotinib)、尼魯米特(Nilutamide)、免瘤諾(Ninlaro)(檸檬酸埃沙佐米(Ixazomib Citrate))、甲苯磺酸尼拉帕尼一水物(Niraparib Tosylate Monohydrate)、納武單抗(Nivolumab)、諾瓦得士(Nolvadex)(檸檬酸泰莫西芬(Tamoxifen Citrate))、恩沛板(Nplate)(羅米司亭(Romiplostim))、奥濱尤妥珠單抗(Obinutuzumab)、索尼得吉(Odomzo) (索尼得吉(Sonidegib))、OEPA、奧法木單抗(Ofatumumab)、OFF、奧拉帕尼(Olaparib)、奥拉妥單抗(Olaratumab)、高三尖杉酯鹼(Omacetaxine Mepesuccinate)、昂卡司帕(Oncaspar)(培門冬酶(Pegaspargase))、鹽酸昂丹司瓊(Ondansetron Hydrochloride)、安能得(Onivyde) (鹽酸伊立替康脂質體(Irinotecan Hydrochloride Liposome))、地尼白介素-2(Ontak)(地尼白介素(Denileukin Diftitox))、保疾伏(Opdivo)(納武單抗(Nivolumab))、OPPA、奥希替尼(Osimertinib)、奥沙利鉑(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、紫杉醇(Paclitaxel)白蛋白穩定的奈米粒子調配物、PAD、帕博西尼(Palbociclib)、帕利夫明(Palifermin)、鹽酸帕洛諾司瓊、鹽酸帕洛諾司瓊和奈妥吡坦、帕米膦酸二鈉(Pamidronate Disodium)、帕尼單抗(Panitumumab)、帕比司他(Panobinostat)、卡鉑(Paraplat) (卡鉑(Carboplatin))、伯爾定(Paraplatin) (卡鉑(Carboplatin))、鹽酸帕唑帕尼(Pazopanib Hydrochloride)、PCV、PEB、培門冬酶(Pegaspargase)、培非格司亭(Pegfilgrastim)、聚乙二醇干擾素α-2b(Peginterferon Alfa-2b)、PEG-因治隆(PEG-Intron)(聚乙二醇干擾素α-2b(Peginterferon Alfa-2b)、派姆單抗(Pembrolizumab)、培美曲塞二鈉(Pemetrexed Disodium)、賀疾妥(Perjeta)(帕妥珠單抗(Pertuzumab))、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、普拉汀諾(Platinol)(順鉑)、普拉汀諾-AQ(Platinol-AQ)(順鉑)、普樂沙福(Plerixafor)、泊馬度胺(Pomalidomide)、鉑美特(Pomalyst)(泊馬度胺(Pomalidomide))、鹽酸普納替尼(Ponatinib Hydrochloride)、搏癌莎(Portrazza)(耐昔妥珠單抗(Necitumumab))、普拉曲沙(Pralatrexate)、強體松(Prednisone)、鹽酸丙卡巴肼(Procarbazine Hydrochloride)、普留淨(Proleukin) (阿地白介素)、保骼麗(Prolia) (地諾單抗(Denosumab))、艾曲波帕(Promacta) (艾曲波帕乙醇胺(Eltrombopag Olamine))、鹽酸普潘奈(Propranolol Hydrochloride)、普羅文奇(Provenge)(西普魯塞-T(Sipuleucel-T)、巰嘌呤(Purinethol)(巰嘌呤(Mercaptopurine))、巰嘌呤(Purixan)(巰嘌呤(Mercaptopurine))、沒有項目([No Entries])、二氯化鐳223(Radium 223 Dichloride)、鹽酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride)、雷莫司單抗(Ramucirumab)、拉布立酶(Rasburicase)、R-CHOP、R-CVP、重組型人類乳突病毒(HPV)二價疫苗(Recombinant Human Papillomavirus (HPV) Bivalent Vaccine)、重組型人類乳突病毒(HPV)九價疫苗、重組型人類乳突病毒(HPV)四價疫苗、重組型干擾素α-2b、瑞格菲尼(Regorafenib)、溴化甲基納曲酮(Relistor)(溴化甲基納曲酮(Methylnaltrexone Bromide))、R-EPOCH、瑞復美(Revlimid)(雷利度胺(Lenalidomide))、胺甲喋呤(Rheumatrex)(胺甲喋呤(Methotrexate))、瑞柏司可里布(Ribociclib)、R-ICE、利妥昔單抗(Rituxan)(利妥昔單抗(Rituximab))、利妥昔單抗玻尿酸酶(Rituxan Hycela)(利妥昔單抗及玻尿酸酶人類(Rituximab and Hyaluronidase Human))、利妥昔單抗(Rituximab)、利妥昔單抗及玻尿酸酶人類(Rituximab and Hyaluronidase Human))、鹽酸羅拉吡坦(Rolapitant Hydrochloride)、羅米地辛(Romidepsin)、羅米司亭(Romiplostim)、紅比黴素(Rubidomycin)(鹽酸道諾黴素(Daunorubicin Hydrochloride))、瑞卡帕布(Rubraca)(瑞卡帕布樟腦磺酸鹽(Rucaparib Camsylate))、瑞卡帕布樟腦磺酸鹽(Rucaparib Camsylate)、磷酸鹽魯索利替尼(Ruxolitinib Phosphate)、雷德帕斯(Rydapt)(米哚妥林(Midostaurin))、司蘭索胸腔內氣霧劑(Sclerosol Intrapleural Aerosol(滑石(Talc))、司妥昔單抗(Siltuximab)、西普魯塞-T(Sipuleucel-T)、舒得寧(Somatuline Depot)(蘭雷歐肽乙酯(Lanreotide Acetate))、索尼得吉(Sonidegib)、甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib Tosylate)、柏萊(Sprycel)(達沙替尼(Dasatinib))、STANFORD V、無菌滑石粉(Sterile Talc Powder(滑石))、無菌滑石(Steritalc)(滑石)、癌瑞格(Stivarga)(瑞格菲尼(Regorafenib))、蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib Malate)、紓癌特(Sutent)(蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib Malate))、聚乙二醇干擾素α-2b(Sylatron) (聚乙二醇干擾素α-2b(Peginterferon Alfa-2b))、薩溫珂(Sylvant)(司妥昔單抗(Siltuximab))、高三尖杉酯鹼(Synribo)(高三尖杉酯鹼(Omacetaxine Mepesuccinate))、硫鳥嘌呤(Tabloid)(硫鳥嘌呤(Thioguanine))、TAC、泰伏樂(Tafinlar) (達拉菲尼(Dabrafenib))、泰格莎(Tagrisso)(奥希替尼(Osimertinib))、滑石、拉他莫金(Talimogene Laherparepvec)、檸檬酸泰莫西芬(Tamoxifen Citrate)、阿糖胞苷(Tarabine PFS) (阿糖胞苷(Cytarabine))、得舒緩(Tarceva)(鹽酸厄洛替尼(Erlotinib Hydrochloride))、塔革雷汀(Targretin)(貝沙羅汀(Bexarotene))、泰息安(Tasigna)(尼洛替尼(Nilotinib))、紫杉醇(Taxol)(紫杉醇(Paclitaxel))、剋癌易(Taxotere)(多烯紫杉醇(Docetaxel))、癌自禦(Tecentriq)(阿特珠單抗(Atezolizumab))、泰道(Temodar)(替莫唑胺(Temozolomide))、替莫唑胺(Temozolomide)、坦羅莫司(Temsirolimus)、沙利竇邁(Thalidomide)、沙利度胺(Thalomid)(沙利竇邁(Thalidomide))、硫鳥嘌呤(Thioguanine)、塞替派(Thiotepa)、Tisagenlecleucel、托拉克(Tolak)(氟尿嘧啶--局部)、鹽酸托普迪肯(Topotecan Hydrochloride)、托瑞米芬(Toremifene)、特癌適(Torisel)(坦羅莫司(Temsirolimus))、托西莫單抗及碘I 131托西莫單抗、鹽酸右雷佐生(Totect)(鹽酸右雷佐生(Dexrazoxane Hydrochloride))、TPF、他比特定(Trabectedin)、曲美替尼(Trametinib)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、普癌汰(Treanda)(鹽酸苯達莫司汀(Bendamustine Hydrochloride))、曲氟尿苷及鹽酸替比拉西(Trifluridine and Tipiracil Hydrochloride)、萃克森(Trisenox)(三氧化二砷)、泰嘉(Tykerb)(二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate))、丹尼托昔單抗(Unituxin)(丹尼托昔單抗(Dinutuximab))、尿苷三乙酸酯(Uridine Triacetate)、VAC、戊柔比星(Valrubicin)、瓦爾斯塔爾(Valstar)(戊柔比星(Valrubicin))、凡德他尼(Vandetanib)、VAMP、羅拉吡坦(Varubi) (鹽酸羅拉吡坦(Rolapitant Hydrochloride))、維必施(Vectibix)(帕尼單抗(Panitumumab))、VeIP、長春鹼(Velban)(硫酸長春鹼(Vinblastine Sulfate))、萬科(Velcade) (硼替佐米(Bortezomib))、硫酸長春鹼(Velsar)(硫酸長春鹼(Vinblastine Sulfate))、威羅菲尼(Vemurafenib)、唯可來(Venclexta)(維奈克拉(Venetoclax))、維奈克拉(Venetoclax)、玻瑪西林(Verzenio)(玻瑪西林(Abemaciclib))、醋酸亮丙瑞林植入劑(Viadur)(醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate))、委丹扎(Vidaza)(阿扎胞苷(Azacitidine))、硫酸長春鹼(Vinblastine Sulfate)、硫酸長春新鹼注射劑(Vincasar PFS)(硫酸長春新鹼)、硫酸長春新鹼(Vincristine Sulfate)、硫酸長春新鹼脂質體(Vincristine Sulfate Liposome)、酒石酸長春瑞賓(Vinorelbine Tartrate)、VIP、維莫德吉(Vismodegib)、尿苷三乙酸酯(Vistogard)(尿苷三乙酸酯(Uridine Triacetate))、谷卡匹酶(Voraxaze) (谷卡匹酶(Glucarpidase))、伏立諾他(Vorinostat)、福退癌(Votrient)(鹽酸帕唑帕尼(Pazopanib Hydrochloride))、道諾黴素及阿糖胞苷複方注射液(Vyxeos)(鹽酸道諾黴素及阿糖胞苷脂質體(Daunorubicin Hydrochloride and Cytarabine Liposome))、爾可福(Wellcovorin)(甲醯四氫葉酸鈣(Leucovorin Calcium))、截剋瘤(Xalkori) (里唑蒂尼(Crizotinib))、截瘤達(Xeloda)(卡培他濱(Capecitabine))、XELIRI、XELOX、癌骨瓦(Xgeva) (地諾單抗(Denosumab))、鐳治骨(Xofigo)(二氯化鐳223 (Radium 223 Dichloride)、安可坦(Xtandi) (恩雜魯胺(Enzalutamide))、益伏(Yervoy) (伊匹單抗(Ipilimumab))、Yescarta(西卡思羅(Axicabtagene Ciloleucel))、友待(Yondelis)(他比特定(Trabectedin))、柔癌捕(Zaltrap)(Ziv-阿柏西普(Ziv-Aflibercept))、非格司亭生物類似藥(Zarxio) (非格司亭(Filgrastim))、則樂(Zejula)(甲苯磺酸尼拉帕尼一水物(Niraparib Tosylate Monohydrate))、日沛樂(Zelboraf)(威羅菲尼(Vemurafenib))、澤娃靈(Zevalin)(替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan))、右雷佐生(Zinecard)(鹽酸右雷佐生(Dexrazoxane Hydrochloride))、Ziv-阿柏西普(Ziv-Aflibercept)、卓弗蘭(Zofran)(鹽酸昂丹司瓊(Ondansetron Hydrochloride))、諾雷德(Zoladex)(醋酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate))、唑來磷酸(Zoledronic Acid)、伏立諾他(Zolinza)(伏立諾他(Vorinostat))、卓骨祂(Zometa)(唑來磷酸(Zoledronic Acid))、思得適(Zydelig)(艾代拉里斯(Idelalisib))、立克癌(Zykadia) (色瑞替尼(Ceritinib))及澤珂(Zytiga) (醋酸阿比特龍(Abiraterone Acetate))。
可以提供多重劑量的抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)、細胞或組成物。一或更多劑量或是各劑量可以伴隨著另一種治療劑之同時或相繼投予。
多重的劑量可以相隔預定的時間間隔，時間間隔可以選自於下列中之一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天，或是1、2、3、4、5或6個月。作為舉例，可以每7、14、21或28天(加或減3、2或1天)給予劑量一次。 偵測方法
本發明亦提供本發明之物件供用於偵測、定位或成像VISTA或表現VISTA的細胞(如MDSCs)之方法的用途。本文所述之抗原結合分子可用於涉及該抗原結合分子與VISTA之方法中。此等方法可涉及偵測該抗原結合分子與VISTA所結合的複合物。
特別地，偵測VISTA可用於診斷/預後與表現VISTA的細胞(如MDSCs)病理上關聯的一疾病/病況，確定處於發展此疾病/病況的風險中的個體，及/或可用於預測個體對治療性介入之回應。
因此，提供一種方法，其包含使一種含有或懷疑含有VISTA的樣本與本文所述之抗原結合分子接觸，以及偵測該抗原結合分子與VISTA形成的複合物。亦提供一種方法，其包含使一種含有或懷疑含有表現VISTA的細胞的樣本與本文所述之抗原結合分子接觸，以及偵測該抗原結合分子與表現VISTA的細胞形成的複合物。
一樣本可以取自於任何組織或身體的流體。樣本可以包含或可以衍生自：一分量的血液；一分量衍生自個體血液的血清，其可以包含所獲得的血液移除纖維蛋白凝塊及血液細胞後的流體部分；一組織樣本或活體組織切片；胸水；腦脊髓液(CSF)；或自該個體單離的細胞。在一些具體例中，該樣本可得自或衍生自受該疾病/病況影響的一或多種組織(例如顯現該疾病的症狀之一或多種組織，或涉及該疾病/病況的致病機轉之一或多種組織)。
合適的方法形式為本技藝眾所周知的，包括免疫分析諸如三明治分析，如ELISA。該方法可以涉及用如本文所述之可偵測的部分，例如螢光標記、磷光標記、發光標記、免疫可偵測的標記、放射標記、化學、核酸或酵素標記來標示抗原結合分子或標靶，或是二者。偵測技術為熟悉此藝者熟知的且可對應標示劑來選擇。
此種方法可以提供用於診斷及/或預後評估一疾病或病況，如癌症的方法之基礎。此等方法可以於一患者樣本或是在處理一患者樣本後，於活體外 執行。一旦收集樣本，活體外 方法執行時並不需要患者在場，且因而該方法可以為一種不於人類或動物體實施的方法。於一些具體例中該方法係於活體內 執行。
偵測一樣本可用於診斷一疾病/病況(如癌症)、一疾病/病況的素因或提供一疾病/病況的預後(預示(prognosticating))的目的，例如本文所述之疾病/病況。診斷或預後可能與現存的(先前診斷的)疾病/病況有關。
本發明亦提供用於選擇個體/將個體分組以供用於以VISTA-標靶劑治療的方法。於一些具體例中，根據本發明來選擇治療/預防的個體或根據譬如從個體得到的樣本內偵測/定量到VISTA或表現VISTA的細胞而確定為能從此種治療/預防得到好處的個體。
此等方法可涉及偵測或定量，譬如一患者樣本內的VISTA及/或表現VISTA的細胞(如MDSCs)。於該方法包含定量相關因子的情況中，該方法可進一步包含將所測定量與一標準或參考值相比來作為診斷或預後評估的一部分。可以使用其他的診斷/預後測試來與本文所述之該等聯合使用以提升診斷或預後的準確度或用於證實使用本文所述之測試所獲得的結果。
從個體得到的樣本內偵測到增高的VISTA位準的情況中，或偵測到表現VISTA的細胞(如MDSCs)存在–或數目/比例增高–的情況中，診斷該個體為具有與MDSCs病理上關聯的一疾病/病況，或處於發展此疾病/病況的風險中。於此方法中，“增高的”表現位準或細胞數目/比例係指位準/數目/比例比合適的對照條件判定的位準/數目/比例更大，例如舉例而言從健康個體得到的可比較的樣本(如同類的樣本，例如從同樣的流體、組織、器官等)內偵測到的位準/數目/比例。
當與可比較的樣本(如同類的樣本，例如從同樣的流體、組織、器官等)內判定具有較低的VISTA位準或降低的表現VISTA的細胞(如MDSCs)數目/比例之個體相比之下，從個體得到的樣本內偵測到增高的VISTA位準的情況中，或偵測到表現VISTA的細胞(如MDSCs)存在–或數目/比例增高–的情況中，判定該個體可能為預後較差。
本發明之抗原結合分子亦可用於預測對免疫療法之回應的方法中。“免疫療法”通常係指目的在於利用免疫系統的動力以治療疾病/病況的治療性介入。免疫療法包括增高個體的效應子免疫細胞(譬如效應子T細胞(如抗原專一性T細胞、CAR-T細胞)、NK細胞)的數目/比例/活性的治療性介入。增高效應子免疫細胞的數目/比例/活性的免疫療法包括下列介入：促進效應子免疫細胞之增殖及/或存活、抑制免疫查核點分子媒介的訊息傳導、促進共刺激受體媒介的訊息傳導、提高抗原呈現細胞之抗原呈現作用等等。增高效應子免疫細胞的數目/比例/活性的免疫療法也包含例如通過授受性細胞轉移(ACT)來增加個體內具有所欲專一性或活性之效應子免疫細胞的頻率之介入。ACT通常涉及從個體獲得免疫細胞，典型為抽取血液樣本而由血液樣本單離免疫細胞。該等細胞一般接著在某些方面予以處理或改變，然後投予至同一個體或不同的個體。ACT通常旨在提供具有某些所欲特徵的免疫細胞族群給個體，或增加該個體內具有此等特徵之免疫細胞的頻率。於一些具體例中ACT可以是例如包含一種對標靶抗原或感興趣的細胞類型專一的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。免疫療法也包括減少個體的抑制性免疫細胞(如調節性T細胞、MDSCs)的數目/比例/活性之治療性介入。減少抑制性免疫細胞的數目/比例/活性之免疫療法包括引致或加强抑制性免疫細胞之細胞殺滅，及抑制免疫查核點分子媒介的訊息傳導之介入。
當與可比較的樣本(如同類的樣本，例如從同樣的流體、組織、器官等)內判定具有較低的VISTA位準或表現VISTA的細胞(如MDSCs)的數目/比例降低之個體相比之下，從一個體得到的樣本內偵測到增高的VISTA位準的情況中，或偵測到表現VISTA的細胞(如MDSCs)存在–或數目/比例增高–的情況中，預測該個體可能對增高個體內效應子免疫細胞的數目/比例/活性之免疫療法的回應較差。當與可比較的樣本(如同類的樣本，例如從同樣的流體、組織、器官等)內判定具有較低的VISTA位準或表現VISTA的細胞(如MDSCs)的數目/比例降低之個體相比之下，從一個體得到的樣本內偵測到增高的VISTA位準的情況中，或偵測到表現VISTA的細胞(如MDSCs)存在–或數目/比例增高–的情況中，預測該個體可能對針對降低個體內抑制性免疫細胞的數目/比例/活性之免疫療法的回應有改良。
於一些具體例中該方法包含判定抑制性免疫細胞區劃及效應子免疫細胞區劃之相對大小/活性。舉例而言，於一些具體例中該方法使用本文所述之抗原結合分子於判定表現VISTA的細胞(如MDSCs、TAMs、嗜中性球)對效應子免疫細胞之比率。當與判定具有較低的比率之個體相比之下，具有較高比率的個體可能預測為對於針對降低抑制性免疫細胞的數目/比例/活性之免疫療法的回應有改良，及/或可能預測為對於增高效應子免疫細胞的數目/比例/活性之免疫療法的回應較差。
本發明的診斷及預後方法可於整個疾病及/或治療過程期間的多個時間點從一個體獲取的樣本上執行，並且可用於監測疾病/病況隨著時間，例如對投予個體的治療之回應的發展。依據該方法特徵化的結果可用於告知關於何時投予及投予何種療法給個體之臨床決策。
診斷或預後方法可於從一個體獲取的樣本上或是在處理一個體獲取的樣本後，於活體外 執行。一旦收集樣本，執行活體外 診斷或預後方法並不需要患者在場且因而該方法可以為一種不於人類或動物體實施的方法。 個體
依據本文所述之本發明的態樣的個體可以為任何動物或人類。個體較佳為哺乳動物，更佳為人類。個體可以為非人類哺乳動物，但更佳為人類。個體可以為雄性或雌性。個體可以為一患者。一個體可能業已診斷有需要治療的疾病或病況(如癌症)，可能懷疑具有此一疾病/病況，或可能處於發展/感染此一疾病/病況的風險。
於如本發明之具體例中，個體較佳為人類個體。在一些具體例中，依據本文之本發明的治療或預防方法要治療的個體為具有或處於發展癌症的風險中的個體。於如本發明之具體例中，可以根據此疾病/病況的某些標誌的特徵化來選擇依據該方法治療的個體。 套組
於本文所述之本發明的一些態樣中提供一種部件之套組(a kit of parts)。於一些具體例中該套組可具有至少一容器，其具有預定量之本文所述之抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)、細胞或組成物。
於一些具體例中，該套組可包含供用於生產本文所述之抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)、細胞或組成物的材料。
該套組可提供該抗原結合分子、多肽、CAR、核酸(或多種核酸)、表現載體(或多種表現載體)、細胞或組成物與投予使用說明一起給患者俾以治療一種特定的疾病/病況。
於一些具體例中該套組可進一步包含至少一容器，其具有預定量的另一治療劑(例如抗感染劑或化學治療劑)。於此等具體例中，該套組亦可包含第二藥物或藥學組成物以使得該二種藥物或藥學組成物可同時或分開投予，其等從而針對該特定疾病或病況提供組合治療。該治療劑亦可予以調配以便供注射或灌注至腫瘤或血管。 序列同一性
使用於本文中，“序列同一性”係指一種受試序列的核苷酸/胺基酸殘基與一參考序列的核苷酸/胺基酸殘基，於排比序列之後的序列同一性百分比，且若需要，則導入空格以達到序列之間最大的序列同一性百分比。可按本技術領域的嫻熟技術人員所知的各種方法，來完成用於測定二或更多個胺基酸或核酸序列之間的序列同一性百分比之成對與多重序列排比，舉例而言使用可公開取得的電腦軟體諸如ClustalOmega (Söding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960)、T-coffee (Notredame等人2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217)、Kalign (Lassmann and Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298))及MAFFT(Katoh and Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772–780之軟體。當使用此軟體時，較佳採用預設參數，例如空格(gap)罰分或擴展罰分。 序列 編號段落
下列編號段落(paras)提供與本發明有關所預期的特徵及特徵組合之進一步說明：
1. 一種抗原結合分子，其可選擇地為經單離的，其能與VISTA結合且獨立於與Fc-媒介的功能而抑制VISTA-媒介的訊息傳導。
2. 如段落1之抗原結合分子，其能與VISTA於似Ig的V型域內結合。
3. 如段落1或段落2之抗原結合分子，其中該抗原結合分子能與一多肽結合，該多肽包含序列辨識編號：6的該胺基酸序列或由序列辨識編號：6的該胺基酸序列所組成。
4. 如段落1至3中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子能與一多肽結合，該多肽包含序列辨識編號：31的該胺基酸序列或由序列辨識編號：31的該胺基酸序列所組成。
5. 如段落1至4中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子不與IGN175A競爭與VISTA之結合。
6. 如段落1至5中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子與序列辨識編號：275之胺基酸序列所組成的一胜肽不能結合。
7. 如段落1至6中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：305的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：306的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：307的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：308的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
8. 如段落1至7中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：309的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
9. 如段落1至8中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：295的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
10. 如段落1至8中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：300的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
11. 如段落1至8中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：277的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：42的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
12. 如段落1至8中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：286的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：42的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
13. 如段落1至8中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：42的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
14. 如段落1至8中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：300的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
15. 如段落1至7中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：34的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：35的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：42的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
16. 如段落1至7中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：34的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：35的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：67的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
17. 如段落1至7中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：53的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：34的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：35的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：58的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的該胺基酸序列之LC-CDR3。
18. 如段落1至6中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：73的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：74的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：80的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：81的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：82的該胺基酸序列之LC-CDR3。
19. 如段落1至6中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：88的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：89的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：90的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：96的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：97的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：98的該胺基酸序列之LC-CDR3。
20. 如段落1至6中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：88的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：89的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：90的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：137的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：138的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：139的該胺基酸序列之LC-CDR3。
21. 如段落1至6中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：33的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：107的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：108的該胺基酸序列之HC-CDR3， 或其之一變異體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3之一者或多者的一或二或三個胺基酸係以另一個胺基酸取代；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：114的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：67的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：115的該胺基酸序列之LC-CDR3。
22. 如段落1至6中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：120的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：121的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：122的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：127的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：128的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：129的該胺基酸序列之LC-CDR3。
23. 如段落1至6中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：144的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：145的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：146的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：151的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：152的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：153的該胺基酸序列之LC-CDR3。
24. 如段落1至6中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：158的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：159的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：160的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：165的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：152的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：153的該胺基酸序列之LC-CDR3。
25. 如段落1至6中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：169的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：170的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：171的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：177的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：179的該胺基酸序列之LC-CDR3。
26. 如段落1至6中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：246的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：247的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3。
27. 如段落1至6或段落26中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：185的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：189的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3。
28. 如段落1至6或段落26中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：195的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：197的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3。
29. 如段落1至6或段落26中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：72的該胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：184的該胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：200的該胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：203的該胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：178的該胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：190的該胺基酸序列之LC-CDR3。
30. 如段落1至6中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：310的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：294的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：297的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：299的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：301的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：302的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：289的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：303的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：276的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：282的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：285的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：287的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：32的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：40的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：52的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：57的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：62的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：66的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：48的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：50的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或. 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：87的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：95的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：106的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：113的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：143的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：150的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：157的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：164的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：71的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：79的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：102的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：104的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：119的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：126的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：183的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：188的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：194的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：196的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：199的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：202的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：133的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：136的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性； 或 一VH區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：168的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：176的該胺基酸序列有至少70%的序列同一性。
31. 如段落1至30中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子能與人類VISTA及下列之一者或更多者結合：小鼠VISTA及食蟹獼猴(cynomolgous macaque)VISTA。
32. 一種抗原結合分子，其可選擇地為經單離的，其包含(i)一種如段落1至31中任一段落之抗原結合分子，及(ii)一種能與VISTA以外的抗原結合之抗原結合分子。
33. 如段落1至32中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子能與細胞表面表現VISTA的細胞結合。
34. 如段落1至33中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子能抑制VISTA及VISTA的一結合伙伴之間的交互作用。
35. 如段落1至34中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子能抑制VISTA-媒介的訊息傳導。
36. 如段落1至35中任一段落之抗原結合分子，其中該抗原結合分子能增高效應子免疫細胞的增殖及/或細胞介素生產。
37. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含如段落1至36中任一段落之抗原結合分子。
38. 一種核酸或多種核酸，其可選擇地為經單離的，其編碼如段落1至36中任一段落之抗原結合分子或如段落37之CAR。
39. 一種表現載體或多種表現載體，其包含如段落38之核酸或多種核酸。
40. 一種細胞，其包含如段落1至36中任一段落之抗原結合分子、如段落37之CAR、如段落38之核酸或多種核酸、或如段落39之表現載體或多種表現載體。
41. 一種方法，其包含使一含如如段落38之核酸或多種核酸、或如段落39之表現載體或多種表現載體的細胞，於適合從該核酸或該表現載體表現該抗原結合分子或CAR的條件下予以培養。
42.一種組成物，其包含如段落1至36中任一段落之抗原結合分子、如段落37之CAR、如段落38之核酸或多種核酸、如段落39之表現載體或多種表現載體、或如段落40之細胞。
43. 如段落42之組成物，額外包含一種能抑制VISTA以外的一免疫查核點分子媒介的訊息傳導之製劑，可選擇地其中該VISTA以外的免疫查核點分子抑制劑係選自於PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT及BTLA。
44. 一種如段落1至36中任一段落之抗原結合分子、如段落37之CAR、如段落38之核酸或多種核酸、如段落39之表現載體或多種表現載體、如段落40之細胞，或如段落42或段落43之組成物，供用於醫學治療或預防的方法。
45. 一種如段落1至36中任一段落之抗原結合分子、如段落37之CAR、如段落38之核酸或多種核酸、如段落39之表現載體或多種表現載體、如段落40之細胞，或如段落42或段落43之組成物，供用於治療或預防一癌症或一感染疾病的一方法。
46. 一種如段落1至36中任一段落之抗原結合分子、如段落37之CAR、如段落38之核酸或多種核酸、如段落39之表現載體或多種表現載體、如段落40之細胞，或如段落42或段落43之組成物於製備一藥物之用途，該藥物供用於治療或預防一癌症或一感染疾病的一方法。
47. 一種治療或預防一癌症或一感染疾病之方法，其包含投予治療或預防有效量之如段落1至36中任一段落之抗原結合分子、如段落37之CAR、如段落38之核酸或多種核酸、如段落39之表現載體或多種表現載體、如段落40之細胞，或如段落42或段落43之組成物至一個體。
48. 如段落45之供使用的抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、細胞或組成物、如段落46之用途或如段落47之方法，其中該癌症係選自於：結腸直腸癌(colorectal cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、乳癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌(ovarian cancer)、頭頸部癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及實性腫瘤。
49. 如段落1至36中任一段落之抗原結合分子、如段落37之CAR、如段落38之核酸或多種核酸、如段落39之表現載體或多種表現載體、如段落40之細胞，或如段落42或段落43之組成物，供用於治療或預防一種與骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)病理上關聯的疾病之方法。
50. 一種如段落1至36中任一段落之抗原結合分子、如段落37之CAR、如段落38之核酸或多種核酸、如段落39之表現載體或多種表現載體、如段落40之細胞，或如段落42或段落43之組成物於製備一藥物之用途，該藥物供用於治療或預防一種與骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)病理上關聯的疾病之方法。
51. 一種治療或預防一種與骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)病理上關聯的疾病之方法，其包含投予治療或預防有效量之如段落1至36中任一段落之抗原結合分子、如段落37之CAR、如段落38之核酸或多種核酸、如段落39之表現載體或多種表現載體、如段落40之細胞，或如段落42或段落43之組成物至一個體。
52. 如段落45至51中任一段落之供使用的抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、細胞或組成物、用途或方法，其中該方法額外包含投予一種能抑制VISTA以外的一免疫查核點分子媒介的訊息傳導之製劑，可選擇地其中該VISTA以外的免疫查核點分子係選自於PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT或BTLA。
53. 一種抑制VISTA-媒介的訊息傳導之方法，其包含使表現VISTA的細胞與如段落1至36中任一段落之抗原結合分子接觸。
54. 一種抑制骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)的活性之方法，該方法包含使MDSCs與如段落1至36中任一段落之抗原結合分子接觸。
55. 一種用於增高效應子免疫細胞之數目或活性的方法，該方法包含以如段落1至36中任一段落之抗原結合分子抑制表現VISTA的細胞之活性。
56. 一種活體外 複合物，其可選擇地為經單離的，其包含與VISTA結合之如段落1至36中任一段落之抗原結合分子。
57.一種方法，其包含使一種含有或懷疑含有VISTA的樣本與如段落1至36中任一段落的抗原結合分子接觸，以及偵測該抗原結合分子與VISTA形成的複合物。
58. 一種選擇個體或將個體分組以供用於以VISTA-標靶劑治療的方法，該方法包含於活體外使來自該個體的一樣本與如段落1至36中任一段落之抗原結合分子接觸以及偵測該抗原結合分子與VISTA的複合物之形成。
59. 一種如段落1至36中任一段落之抗原結合分子作為一活體外 或活體內 診斷劑或預後劑之用途。
60. 一種如段落1至36中任一段落之抗原結合分子於一種用於偵測、定位或成像一癌症方法之用途，可選擇地其中該癌症係選自於：結腸直腸癌(colorectal cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、乳癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌(ovarian cancer)、頭頸部癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及實性腫瘤。 ***
本發明包括所述之態樣與較佳特徵之組合，除非此組合係顯然不允許或明確表示需避免者。
本文中使用之節標題僅僅係為了編制的目的以及不被解釋為限制所說明的主題。
本發明的態樣及具體例現在將參照附圖予以闡釋，以作為例證。進一步的態樣與具體例對於本技藝中具有技術者會是明顯的。本文中提及的全部文件係併入本文中以作為參考資料。
貫穿本說明書，包括隨後的申請專利範圍，除非上下文另外要求，否則應理解用字「包含(comprise)」及變體例如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」，是暗示含括所述的整數或步驟或是整數或步驟組，但是不排除任何其他的整數或步驟或是整數或步驟組。
必須注意到，當使用於本說明書及隨附的申請專利範圍中，除非上下文另外明確指定，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」，以及「該」包括複數的指示對象。於本文中範圍可以表達為由「大約」一特定的數值及/或至「大約」另一特定的數值。當表達此一範圍時，另一具體例會包括由該一特定的數值及/或至其他的特定數值。同樣地，當用先行詞「大約」、以近似值表達數值時，會瞭解到該特定的數值構成另一具體例。
於本文揭示一核酸序列之處，亦明確預期其反向互補物。
本文所述之方法較佳可於活體外 執行。術語「活體外 」打算包含以培養物內的細胞進行的程序，而術語「活體內 」打算包含以/於完整的多細胞生物進行的程序。
較佳實施例之詳細說明實施例 在下列實施例中，本發明人說明靶定VISTA分子內感興趣的特定區域之新穎的抗-VISTA抗體殖株之產生，以及此等抗原結合分子之生物物理學和功能特徵化及治療評估。 實施例1：VISTA標靶設計及抗-VISTA抗體融合瘤生產
本發明人選擇人類VISTA的細胞外區域的區域(序列辨識編號：3)用於提高VISTA-結合單株抗體。
因為此VISTA區域已被提議對於VISTA的抑制功能很重要，所以靶定FG環區域(Vigdorovich等人，Structure. 2013;21(5):707-717)。亦靶定VISTA的前向β褶板區域。1.1 融合瘤生產
從InVivos(新加坡)獲得大約6週大的雌性BALB/c小鼠。動物安置於無特定病原條件下且遵照機構動物護理和使用委員會(IACUC)的指導方針來對待。
於融合瘤生產方面，用抗原胜肽、重組標靶蛋白或表現標靶蛋白的細胞之專有的混合物來免疫小鼠。
於收穫脾臟供融合之前，用抗原混合物增強小鼠連續三天。最後的增強後24 h，單離所有的脾細胞且依據製造商的指示(Stemcell Technologies，加拿大)使用ClonaCell-HY融合瘤選殖套組，用PEG而與骨髓瘤細胞株P3X63.Ag8.653(ATCC, USA)融合。
在37℃的5% CO2 孵化器內以ClonaCell-HY培養基C(Stemcell Technologies，加拿大)培養融合的細胞過夜。隔天，離心融合的細胞且再懸浮於10 ml的ClonaCell-HY培養基C內而後與90 ml、含HAT組分的半固體甲基纖維素為基的ClonaCell-HY培養基D(StemCell Technologies，加拿大)溫和地混合，此結合了融合瘤選擇與選殖於一個步驟內。
融合的細胞繼而於96孔平盤內平盤培養且允許在37℃的5% CO2 孵化器內生長。7-10天後，單離單一融合瘤殖株並藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)及螢光激發細胞分選(FACs)來篩選上清液而選擇生產抗體的融合瘤。1.2 抗體 可變異區域擴增及定序
使用製造商的程序、用TRIzol試劑(Life Technologies, Inc., USA)從融合瘤細胞萃取總RNA。依據製造商的指示、使用SMARTer RACE 5'/3'套組(Clontech™, USA)來合成雙股cDNA。簡言之，依據製造商的指示、利用5'-RACE CDS引子(套組提供)、使用1 μg總RNA來產生全長cDNA，且繼而使5'轉接子(SMARTer II A引子)併入各cDNA之內。cDNA合成反應含有：5X第一股緩衝液、DTT(20 mM)、dNTP混合物(10 mM)、核糖核酸酶抑制劑(40 U/µl)及SMARTScribe反轉錄酶(100 U/µl)。
利用SeqAmp DNA聚合酶(Clontech™, USA)來擴增race-ready cDNAs。擴增反應含有SeqAmp DNA聚合酶、2X Seq AMP緩衝液、與轉接子序列互補之5’ SMARTer Race套組提供的5'通用引子，以及與個別的重鏈或輕鏈恆定區域引子黏著的3'引子。根據先前由Krebber等人之J. Immunol. Methods 1997；201：35-55, Wang等人之Journal of Immunological Methods 2000, 233；167-177或Tiller等人之Journal of Immunological Methods 2009；350:183-193所報導的引子混合物來設計5’恆定區域。使用下列熱程序：預變性循環於94℃歷時1 min；94℃，30 s，55℃，30 s及72℃, 45 s的35個循環；最終的延長於72℃歷時3 min。
生成的VH及VL PCR產物，大約550 bp，係使用CloneJET PCR選殖套組(Thermo Scientific, USA)予以選殖至pJET1.2/鈍端載體之內且用來轉形高度勝任的大腸桿菌 DH5α。使用Miniprep套組(Qiagene，德國)從生成的轉形體來製備質體DNA且定序。藉由AITbiotech來進行DNA定序。使用國際IMGT(ImMunoGeneTics)資訊系統來分析此等定序資料(LeFranc等人，Nucleic Acids Res. (2015) 43 (Database issue):D413-22)以特徵化個別的CDRs及框架序列。藉由SignalP來辨識VH及VL之5’端的訊息胜肽(v 4.1；Nielsen，於Kihara, D (ed)：Protein Function Prediction (Methods in Molecular Biology vol. 1611) 59-73, Springer 2017)。
繼而選擇單株抗-VISTA抗體殖株用於進一步開發及特徵化。亦依據標準方法、藉由選殖抗體的CDRs至包含人類抗體框架區域的VH及VL之內來製備抗體殖株4M2-C12(於此亦稱為“V4”)之人化版本。
Figure 108111311-A0304-0002
 實施例2：抗體生產及純化2.1 選殖VH 及VL 至表現載體內 ：
編碼抗-VISTA抗體殖株之重及輕鏈可變異區域的DNA序列予以亞選殖至pmAbDZ_IgG1_CH及pmAbDZ_IgG1_CL(InvivoGen, USA)真核表現載體內用於建構人類-小鼠嵌合抗體。
任擇地，編碼抗-VISTA抗體殖株之重及輕鏈可變異區域的DNA序列予以亞選殖至pFUSE-CHIg-hG1及pFUSE2ss-CLIg-hk(InvivoGen, USA)真核表現載體內用於建構人類-小鼠嵌合抗體。相對於人類IgG1恆定區域(IGHG1；UniProt:P01857-1, v1；序列辨識編號：210)，pFUSE-CHIg-hG1編碼的人類IgG1恆定區域包含取代D356E、L358M於CH3區域(根據EU編號所編號的位置)。pFUSE2ss-CLIg-hk編碼人類IgG1輕鏈κ恆定區域(IGCK；UniProt：P01834-1, v2)。
可變異區域連同訊息胜肽遵循製造商的程序、使用SeqAmp酵素(Clontech™, USA)從選殖載體予以擴增。使用具有與VH或VL內合適區域重疊的15-20bp加上5’端之6 bp作為限制位的順向及反向引子。用製造商推薦的限制酵素來消化DNA插入子及pFuse載體以確保不會導入框移(例如，EcoRI及NheI用於VH，AgeI及BsiWI用於VL，)且使用T4連接酶酵素(Thermo Scientific, USA)與其個別質體連接。連接使用莫耳比率3:1之DNA插入子及載體。2.2 於 哺乳動物細胞 表現 抗體
遵循製造商的指示、使用1) Expi293暫時表現系統套組(Life Technologies, USA)或2) HEK293-6E暫時表現系統(CNRC-NRC，加拿大)來表現抗體。 1) Expi293暫時表現系統： 細胞株維持：
從Life Technologies, Inc(USA)獲得HEK293F細胞(Expi293F)。用搖動平台、在37℃、8% CO2 及80%增濕的孵化器內、以增補50 IU/ml青黴素及50 µg/ml鏈黴素(Gibco, USA)之無血清、無蛋白、化學性界定培養基(Expi293表現培養基, Thermo Fisher, USA)來培養細胞。 轉染：
依據其製造商的程序、使用ExpiFectamine 293試劑套組(Gibco, USA)以表現質體來轉染Expi293F細胞。簡言之，維持中的細胞藉由旋轉降下培養物以替換培養基而移去抗生素，於轉染前1天將細胞丸粒再懸浮於沒有抗生素的新鮮培養基內。於轉染當天，每次轉染播種2.5 x 106 /ml活細胞於搖動器燒瓶內。於室溫下25 min形成DNA-ExpiFectamine複合物於血清減少的培養基內，Opti-MEM (Gibco, USA)內，然後添加給細胞。轉染後16-18 h添加增強劑給轉染的細胞。於轉染後第4天將等量的培養基加滿轉染子以防止細胞聚集。於第7天藉由4000 xg 離心15 min收穫轉染子，且過濾通過0.22 µm無菌濾器單元。 2) HEK293-6E暫時表現系統 細胞株維持：
從National Research Council Canada獲得HEK293-6E細胞。用搖動平台、在37℃、5% CO2 及80%增濕的孵化器內以增補0.1%泊洛沙姆(Kolliphor)-P188及4 mM L-麩醯胺酸(Gibco, USA)及25 µg/ml G-418之無血清、無蛋白、化學性界定Freestyle F17培養基(Invitrogen, USA)來培養細胞。 轉染：
依據其製造商的程序、使用PEIproTM (Polyplus, USA)以表現質體來轉染HEK293-6E細胞。簡言之，維持中的細胞藉由離心以替換培養基而移去抗生素，於轉染前1天以沒有抗生素的新鮮培養基使細胞丸粒再懸浮。於轉染當天，每次轉染播種1.5-2 x 106 個細胞/ml的活細胞於搖動器燒瓶內。混合DNA與PEIproTM成比率1:1且於RT歷時5 min以允許複合物於F17培養基內形成，然後添加給細胞。於轉染24-48 h後提供0.5%(w/v)胰化蛋白N1給轉染子。於第6-7天藉由4000 xg 離心15 min收穫轉染子且上清液過濾通過0.22 µm無菌濾器單元。 用編碼下列多肽組合的載體轉染細胞：
Figure 108111311-A0304-0003
 2.3 抗體純化 親和力純化、緩衝液交換及儲存：
轉染細胞分泌至培養上清液的抗體係使用液相層析法系統AKTA Start(GE Healthcare, UK)予以純化。具體地說，以結合速率5 ml/min加載上清液至HiTrap蛋白G管柱(GE Healthcare, UK)上，接著用10倍管柱體積的清洗緩衝液(20 mM磷酸鈉，pH 7.0)來清洗管柱。結合的mAbs係用溶析緩衝液(0.1 M甘胺酸，pH 2.7)來溶析並將溶析液分量至含適量中和緩衝液(1 M Tris, pH 9)之收集管。含純化的mAb之經中和的溶析緩衝液係使用30K MWCO蛋白濃縮器(Thermo Fisher, USA)或3.5K MWCO透析夾(Thermo Fisher, USA)交換至PBS內。單株抗體係藉由通過0.22 µm濾器予以無菌化、等分且快速冷凍於-80℃供儲存。2.4 抗體純度分析 粒徑篩析層析法(SEC)：
藉由粒徑篩析層析法(SEC)進行抗體純度分析，其係使用Superdex 200 10/30 GL管柱(GE Healthcare, UK)配於PBS電泳緩衝液，於AKTA Explorer液相層析術系統(GE Healthcare, UK)上進行。配於pH 7.2的500 μl PBS之150 μg的抗體係於室溫下以0.75 ml/min的流速注入至管柱。依據蛋白的分子量使其等溶析。
抗-VISTA抗體殖株V4(實施例2.2之[1])的結果顯示於圖10內。 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：
抗體純度亦依據標準方法、藉由還原及非還原條件之SDS-PAGE來分析。簡言之，使用Mini-Protean電泳系統(Bio-Rad, USA)、利用4%-20% TGX蛋白凝膠(Bio-Rad, USA)來分離蛋白。在非還原條件方面，藉由混合蛋白樣本與2x Laemmli樣本緩衝液(Bio-Rad, USA)予以變性且於95℃煮沸5-10 min然後裝載至凝膠。在還原條件方面，使用含5%的β-巰乙醇(βME)或40 mM DTT(二硫蘇糖醇)的2x樣本緩衝液。電泳係以SDS電泳緩衝液(25 mM Tris，192 mM甘胺酸，1% SDS，pH 8.3)，150V恒電壓進行1 h。 西方墨點法：
蛋白樣本(30 µg)係如以上所述藉由SDS-PAGE予以分級且移至硝化纖維素膜。繼而將膜封阻並用抗體於4℃進行免疫墨點過夜。以PBS-吐溫清洗三次之後接著用辣根過氧化物酶(HRP)-複合的二級抗體於室溫下孵育膜歷時1 h。經由化學發光劑Pierce ECL基質西方墨點偵測系統(Thermo Scientific, USA)及自動放射攝影術底片(Kodak XAR底片)曝光來使結果顯現。
偵測使用的初級抗體為山羊抗-小鼠IgG (H+L)抗體(LI-COR,商品目錄號926-32210)。
抗-VISTA抗體殖株V4(實施例2.2之[1])結果顯示於圖11內。高濃度的V4為容易表現、純化及加工的。 實施例3：生物物理學的特徵化3.1 藉由流動式細胞測量術分析細胞表面 抗原 - 結合
野生型HEK293T細胞(沒有表現高位準的VISTA)及轉染編碼人類VISTA的載體之HEK293T細胞的細胞(即HEK 293 HER O/E細胞)係用20 μg/ml的抗-VISTA抗體或同型對照抗體於4℃孵育1 hr。分析中含括抗-VISTA抗體殖株VSTB112，如WO 2015/097536內所述，作為陽性對照。
用FACS緩衝液(PBS加上5mM EDTA及0.5% BSA)清洗細胞三次並再懸浮於2-8℃之FITC-複合的抗-FC抗體(Invitrogen, USA)歷時40 min。再次清洗細胞並再懸浮在200 μL FACS流動緩衝液(PBS加上5mM EDTA)中用於使用MACSQuant 10(Miltenyi Biotec，德國)之流式細胞測量術分析。於取得後，使用Flowlogic軟體來分析所有的原始資料。使用前與側散射的散布圖剖析來圈選細胞且判定天然及過度表現細胞族群之螢光強度中位數(MFI)值。
結果顯示於圖1A至1D、圖2及圖24內。抗-VISTA抗體顯示係以高專一性與人類VISTA結合。
於一單獨的實驗中分析13D5p(實施例2.2之[14])其與轉染編碼食蟹獼猴VISTA或鼠類VISTA的載體之細胞的結合能力。發現13D5p展現與食蟹獼猴VISTA及鼠類VISTA之交叉反應性。3.2 使用Octet QK384 系統之整體親和力研究
生物層干涉術(BLI)實驗係使用Octet QK384系統(ForteBio)來執行。使用抗-五-HIS(HIS1K)塗覆的生物感應器尖端(Pall ForteBio, USA)來捕獲His-標記的人類、食蟹獼猴或鼠類VISTA(270 nM)。於25℃執行所有的測量伴隨1000 rpm攪拌。藉由裝載不同濃度的抗-VISTA抗體(如圖所示)120 s，接著藉由將生物感應器移至含分析緩衝液的孔內120 s的解離時間來執行抗原結合之動力學測量。感應圖譜參照緩衝效應然後用Octet QK384使用者軟體(Pall ForteBio, USA)予以擬合。動力學反應係使用一位址結合模式予以整體擬合以獲得締合(K締合)、解離(K解離)速率常數及平衡解離常數(KD)。本分析只含括能與軟體可靠擬合的曲線(R2 >0.90)。
圖3A至3C顯示抗-VISTA抗體殖株V4(即實施例2.2之[1])之結合分析的代表感應圖譜。
發現抗-VISTA抗體殖株V4係以KD =>1 pM的親和力與人類及食蟹獼猴VISTA結合，以及以KD =113 nM的親和力與鼠類VISTA結合。3.3 判定抗體專一性 之ELISAs
使用ELISAs來判定抗體之結合專一性。分析抗-VISTA抗體與人類VISTA多肽、個別的小鼠及食蟹獼猴同源物，以及人類PD-L1及人類HER3(Sino Biological Inc.，中國)之結合。
根據標準程序來進行ELISA。簡言之，用配於磷酸鹽緩衝型鹽水(PBS)之1 μg/ml的標靶蛋白於37℃塗覆96孔平盤(Nunc，丹麥)歷時2 h。於室溫下以配於Tris緩衝型鹽水(TBS)之10 % BSA封阻1 h之後，連續稀釋(連續稀釋12點)最高濃度為30 μg/ml的測試抗體以及添加至平盤。於室溫下孵育1 h後，用含0.05%吐溫20之TBS(TBS-T)清洗平盤三次然後用HRP-複合的抗-小鼠IgG抗體(Life Technologies, Inc., USA)於室溫下孵育1 h。於清洗之後，平盤用比色偵測基質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(Turbo-TMB；Pierce, USA)於室溫下顯色15 min。用2M H2 SO4 來停止反應，以及於30 min內測量450 nM的OD。
抗-VISTA抗體殖株V4(實施例2.2之[1])獲得的結果顯示於圖4A內。發現殖株V4能與人類、食蟹獼猴及鼠類VISTA結合，但是與人類PD-L1或人類HER3未展現出交叉反應性(即使是非常高濃度)。
抗-VISTA抗體殖株13D5-1(實施例2.2之[15])獲得的結果顯示於圖20內。發現殖株13D5-1能與人類、食蟹獼猴及鼠類VISTA結合。
抗-VISTA抗體殖株13D5-13(實施例2.2之[16])獲得的結果顯示於圖21內。發現殖株13D5-13能與人類及小鼠VISTA結合。
於另外的實驗中，以ELISA分析抗-VISTA抗體殖株V4(實施例2.2之[1])與人類VISTA、PD-1、PD-L1、B7H3、B7H4、B7H6、B7H7及CTLA4的結合能力。結果顯示於圖4C內。發現殖株V4不會與PD-1、PD-L1、B7H3、B7H4、B7H6、B7H7或CTLA4之任一者交叉反應。3.4 以 微差掃描螢光分析法進行之 熱穩定性 分析
簡言之，0.2 mg/mL之三複本抗體反應混合物及SYPRO Orange染料(ThermoFisher)係製備於25 μL的PBS內，移至MicroAmp光學96孔反應平盤(ThermoFisher)的孔內，並用MicroAmp光學黏著膜(ThermoFisher)予以密封。熔化曲線係以7500快速即時PCR系統(Applied Biosystems)進行，其選擇TAMRA作為報告者及ROX作為被動參考。熱剖析包括25℃之起始步驟2 min及99℃之最終步驟2 min，加上1.2%之升降溫速率。繪製原始資料之第一導數為溫度之函數的圖以獲得導數熔化曲線。從導數曲線的峰提取抗體的熔化溫度(Tm)。
圖9顯示抗體殖株V4 IgG1格式(即實施例2.2之[1])之熱穩定性微差掃描螢光分析法獲得的原始資料之第一導數。判定Tm為67.5℃。 實施例4：功能特徵化4.1 VISTA 與VSIG-3 之間的交互作用
本發明人使用Octet QK384系統(ForteBio)、藉由生物層干涉術(BLI)分析來研究VSIG-3是否表現為VISTA的配體。簡言之，使用濃度100 nM之抗-人類Fc捕獲生物感應器來捕獲Fc-標記的VSIG-3，且測量捕獲的VSIG-3與使用濃度從3000 nM開始接著3倍連續稀釋的VISTA之締合作用，並與PBS對照比較。
圖5顯示代表感應圖譜。VSIG-3及VISTA之間的締合親和力經計算為~KD =5.28 μM。
本發明人接著分析抗-VISTA抗體抑制VISTA與VSIG-3之間交互作用的能力。
簡言之，用配於1x PBS之1 μg/ml的未標記或Fc-標記的VSIG-3(R&D Systems, USA)於4℃塗覆96孔平盤(Nunc，丹麥)歷時16 h。於室溫下以配於TBS之1 % BSA封阻1 h之後，於漸增濃度的抗-VISTA抗體存在或不存在下、添加15μg/ml的VISTA/人類His-標記的融合蛋白(Sinobiological Inc，中國)，以及於室溫下孵育1 h。隨後用TBS-T清洗平盤三次且用HRP-複合的抗-his二級抗體於室溫下孵育1 h。於清洗之後，平盤用比色偵測基質Turbo-TMB(Pierce, USA)顯色。用2M H2 SO4 來停止反應，以及測量450 nM的OD。
圖6顯示抗-VISTA抗體殖株5M1-A11及9M2-C12(實施例2.2之[10]及[13])獲得的結果。抗-VISTA抗體展現出劑量依賴性抑制VISTA與VSIG-3之間的交互作用。
於另外的實驗中，分析4M2-C12 IgG1(實施例2.2之[1])對於VISTA與VSIG-3之間交互作用之抑制。亦分析對不相干標靶抗原專一的抗體及人類IgG1同型對照對於VISTA:VSIG-3交互作用的抑制作為對照條件。結果顯示於圖32內。發現4M2-C12 IgG1係以劑量依賴的方式抑制VISTA:VSIG-3的交互作用。
於另外的實驗中，以使用VISTA-Fc作為捕獲劑之分析來分析4M2-C12 IgG1(實施例2.2之[1])對於VISTA與VSIG-3之間交互作用之抑制。簡言之，用30 μl的0.5 μg/ml的VISTA-Fc於室溫下塗覆384孔平盤的孔歷時1 h。用PBS-T清洗平盤且以配於TBS之1 % BSA於室溫下封阻1 h。連續稀釋的4M2-C12 IgG1或人類IgG1同型對照抗體與0.3 μg/ml的VISG3-His一起添加至平盤。於室溫下孵育1 h後，用PBS-T清洗平盤五次，以及用山羊抗-HIS-HRP於室溫下孵育1 h。用PBS-T清洗平盤五次以及，用Turbo-TMB顯色。用2M H2 SO4 來停止反應，以及測量450 nM的OD。
結果顯示於圖54內。發現4M2-C12 IgG1係以劑量依賴的方式抑制VISTA:VSIG-3之間的交互作用。4.2 VISTA 與PSGL-1 之間的交互作用
本發明人接著以流動式細胞測量術為基的分析來研究PSGL-1是否表現為VISTA的配體。
簡言之，經修飾以過度表現人類VISTA蛋白(藉由轉染編碼人類VISTA的建構物)的100,000個HEK293T細胞係與濃度20 μg/ml、40 μg/ml或80 μg/ml的4M2-C12-hIgG1(實施例2.2之[1])或同型匹配的對照抗體於4℃，於含HBSS、0.5% BSA及2mM EDTA pH 6.0之緩衝液內共孵育15 min。繼而添加15 μg/ml的Fc-標記的人類PSGL1(R&D Systems, Cat No：3345-PS)或等量的Fc-標記的不相干抗原至細胞，其等接著於4℃孵育另外的45 min。隨後用緩衝液清洗細胞三次，然後添加稀釋因數(1:11)之FITC-複合的抗-PSGL1抗體(Miltenyi Biotec Cat No：130-104-706)或添加稀釋因數1:200之Alex488-複合的抗-Fc抗體，以及於4℃孵育細胞15 min。繼而用緩衝液清洗細胞三次且藉由流動式細胞測量術分析。
結果顯示於圖55內。發現4M2-C12-hIgG1係以劑量依賴的方式抑制PSGL-1與VISTA的結合作用。4.3 VISTA- 媒介的 訊息傳導之 抑制
本發明人研究抗-VISTA抗體殖株13D5p是否會抑制VISTA-媒介的訊息傳導，其係藉由使用混合淋巴球反應(MLR)分析法來分析。
簡言之，使用Septamate套組(Stemcell Technologies，加拿大)、依據製造商的指示、從非相關的供給者單離PBMCs(以獲得刺激者及效應子族群)。用50 μg/mL的絲裂黴素C(Sigma Aldrich, USA)於37℃治療刺激者細胞20分鐘且於1x PBS清洗5次後使用。於從最高濃度為20 μg/ml開始、漸增濃度的測試抗體存在或不存在下、刺激者族群以0.5 x 105 個細胞/孔及反應者族群以每孔1.0 x 105 個細胞播種。於5天後，收穫上清液且遵照標準程序藉由ELISA來判定IL-17、IL-2A及IFN-γ位準。
結果顯示於圖7A及7B內。發現抗-VISTA抗體13D5p導致IL-17、IL-2及IFN-γ位準增加。圖8A及8B顯示相同分析使用抗-PD-L1抗體殖株MIH5(ThermoFisher Scientific)獲得的結果。 實施例5：活體內 分析
於活體內 研究方面，生產小鼠IgG2a格式的4M2-C12。該分子為具有序列辨識編號：248所示的序列之重鏈多肽及具有序列辨識編號：250所示的序列之輕鏈多肽的異聚體(heteromer)。藉由共表現編碼重及輕鏈多肽的核酸於CHO細胞內，以及隨後純化來生產4M2-C12 mIgG2a。
Figure 108111311-A0304-0004
 5.1 藥物動力學分析
大約6-8週大的C57BL/6小鼠係安置於無特定病原條件下且遵照機構動物護理和使用委員會(IACUC)的指導方針來對待。
投予600 µg抗-VISTA抗體且於投予後基線(- 2 hr)、0.5 hr、6 hr、24 hr、96 hr、168 hr及336 hr藉由心臟穿刺從3隻小鼠取得血液。藉由ELISA來定量血清內的抗體。
藥物動力學分析參數係衍生自非隔間模型： 最大濃度(C最大 )、AUC(0-336hr)、AUC(0-無限大)、半生期(t½ )、廓清(CL)、穩態分佈體積(Vss )。
抗-VISTA抗體殖株V4(實施例5的[17])獲得的結果顯示於圖12內。發現此抗體殖株的半生期為11.7天。5.2 活體內治療癌症之功效 分析
大約6-8週大的雌性BALB/c或C57BL/6小鼠係購自InVivos(新加坡)。動物安置於無特定病原條件下且遵照機構動物護理和使用委員會(IACUC)的指導方針來對待。
研究使用的細胞株包括從ATCC獲得之LL2細胞(路易士肺癌)、4T1細胞(乳癌)、CT26細胞(結腸癌)、殖株-M3細胞(黑色素瘤)及EL4細胞(T細胞白血病/淋巴瘤)。B16-BL6細胞(黑色素瘤)係從Creative Bioarray獲得。依據供應者的指示來維持細胞株；LL2細胞、B16-BL6細胞及EL4細胞培養於增補10%胎牛血清(FBS)及1% Pen/Strep之DMEM，以及4T1細胞及CT26細胞培養於增補10% FBS及1及1% Pen/Strep之RPMI-1640內。殖株-M3細胞生長於增補2.5% FBS、15%馬血清及1% Pen/Strep之F12-K培養基內。在37℃於5% CO2 孵化器內培養所有的細胞。
藉由皮下注射LL2(2x105 )、4T1(5x105 )、CT26(1x105 -1x106 )、殖株-M3(5x105 )、EL4(2x105 )或B16-BL6(1x105 )細胞至小鼠右側來產生同基因的腫瘤模式。
於植入後3天以腹膜內每3天投予抗-VISTA抗體總共6次劑量。對照組以相同的劑量間隔接受媒介物治療。
一週使用數位卡尺來測量3次並用式[L x W2/2]來計算腫瘤體積。一旦對照組腫瘤長度測得>1.5 cm時認為已經達到研究終點。 5.2.1 CT26細胞模式
圖13顯示比較CT26細胞株衍生的同基因小鼠結腸癌模式中抗-VISTA抗體殖株V4(實施例5的[17])的抗癌效應與抗-PD-L1抗體殖株10F.9G2的抗癌效應之實驗所獲得的結果。藉由皮下注射100,000個CT26細胞至Balb/c小鼠右側來建立該模式(每治療組n=8隻小鼠)。
從第3天開始每3天投予每劑量300 μg的V4或抗-PD-L1抗體。該分析亦包括每劑量300 μg V4 + 300 μg抗-PD-L1抗體之組合治療。
發現抗-VISTA抗體殖株V4於此模式為非常有力的，且能抑制腫瘤生長達~60%。
於第21天收穫腫瘤且根據Newman等人之Nat Methods. (2015) 12(5):453-457中所述的方法，以RNA-Seq分析法來評估Arg1 RNA表現。結果顯示於圖39內。4M2-C12之治療與第21天腫瘤之Arg1表現顯著降低有關。
於另一實驗中藉由皮下注射100,000個CT26細胞至Balb/c小鼠右側(每治療組n=8隻小鼠)來建立CT26細胞株衍生的同基因小鼠結腸癌模式，以及該分析亦包括藉由從第3天開始每3天每劑量投予300 μg的同型對照抗體、抗-PD-L1抗體殖株10F.9G2、抗-VISTA抗體殖株V4(實施例5的[17])、抗-TIGIT抗體殖株1G9、抗-LAG-3抗體殖株C9B7W、抗-TIM-3抗體殖株RMT3-23，或每劑量300 μg的抗-PD-L1抗體殖株10F.9G2加上300 μg另外的每個抗體之組合治療來治療小鼠。
圖14顯示第15天偵測到的腫瘤生長經計算的抑制之結果。於此實驗中發現抗-VISTA抗體殖株V4為比任何其他針對免疫查核點分子之單方療法更有力的腫瘤生長抑制劑，且發現與抗-PD-L1療法組合的表現更好。
本發行人執行另外以相同的方式建立CT26腫瘤之實驗，以及小鼠繼而兩週一次投予300 μg抗-VISTA抗體殖株V4、200 μg抗-PD-L1抗體殖株10F.9G2、300 μg抗-VISTA抗體殖株V4+200 μg抗-PD-L1抗體殖株10F.9G2或PBS作為對照條件。於實驗終點根據Newman等人之Nat Methods. (2015) 12(5):453-457中所述的方法、以RNA-Seq予以分析腫瘤以判定MDSCs、CD8+ T細胞及Tregs的相對數目，該文係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。
結果顯示於圖15內。發現抗-VISTA抗體殖株V4(單獨或與抗-PD-L1治療組合)之治療會降低MDSCs的數目，及增加CD8 T細胞：Tregs之比率。與抗-VISTA抗體治療有關之腫瘤微環境之基因表現變化的分析亦顯示涉及吞噬過程的基因表現之向上調節(例如肌動蛋白纖維為基的運動)，以及精胺酸酶1表現之向下調節(導致免疫抑制較少的環境)。
於另外的實驗中，如以上所述於Balb/C小鼠內建立CT26細胞株衍生的同基因小鼠結腸癌模式，以及小鼠係從第3天投予且每3天投予(i)600 μg抗-VISTA抗體殖株13D5-1、(ii)200 μg抗-PD-L1抗體殖株10F.9G2、(iii)600 μg抗-VISTA抗體殖株13D5-1+200 μg抗-PD-L1抗體殖株10F.9G2或(iv)等體積的PBS(作為陰性對照)。
結果顯示於圖22內。發現抗-VISTA抗體殖株13D5-1(單獨或與抗-PD-L1治療組合)於此模式能抑制腫瘤生長。 5.2.2 LL2細胞模式
藉由皮下注射200,000個LL2細胞至Balb/c小鼠右側來建立LL2模式(每治療組n=8隻小鼠)，以及小鼠隨後兩週一次投予600 μg抗-VISTA抗體殖株V4(實施例5的[17])或等體積的媒介物作為陰性對照。
實驗結果顯示於圖16內。發現抗-VISTA抗體殖株V4於此模式為非常有力的—能抑制腫瘤生長達~44%。 5.2.3 B16-BL6細胞模式
藉由皮下注射200,000個B16-BL6細胞至C57BL/6小鼠右側來建立B16-BL6模式(每治療組n=8隻小鼠)，且小鼠隨後兩週一次投予(總共6次劑量) 600 μg抗-VISTA抗體殖株V4(實施例5的[17])、200 μg抗-PD-1抗體RMP1-14(Bio X Cell)、600 μg抗-VISTA抗體殖株V4+200 μg抗-PD-1抗體或等體積媒介物作為陰性對照。
實驗結果顯示於圖17內。發現抗-VISTA抗體殖株V4組合抗-PD-1抗體治療於此模式為非常有力的。 5.2.4 4T1細胞模式
藉由皮下注射250,000個4T1細胞至右側以於Balb/c小鼠建立4T1細胞株衍生的同基因小鼠乳癌模式。
小鼠隨後從第3天投予且每3天投予(總共6次劑量)300或600 μg抗-VISTA抗體殖株13D5-1、同型對照抗體或等體積的媒介物作為陰性對照。
實驗結果顯示於圖23內。發現抗-VISTA抗體殖株13D5-1於此模式為非常有力的—能抑制腫瘤生長達~70%。5.3 安全藥理學、毒物學及免疫毒性
使用IMGT DomainGapAlign(Ehrenmann等人，Nucleic Acids Res., 38, D301-307 (2010))及IEDB去免疫(Dhanda等人，Immunology. (2018) 153(1):118-132)工具來電腦模擬 分析抗-VISTA抗體殖株V4及人化版本V4H1及V4H2之安全性及免疫原性。
抗-VISTA抗體殖株V4H1及V4H2與人類重及輕鏈有足夠的同源性被認為是人化的(即>85%)，具有的可能免疫性胜肽數目很少而足以被認為是安全的，並且沒有造成可能的可發展性問題之任何其他的性質。
本發明人亦於實施例5.2所述的實驗過程期間秤重並分析小鼠大體屍體解剖的症狀；用抗-VISTA抗體殖株V4治療的小鼠與PBS-治療的對照小鼠沒有顯現出任何差異。圖44顯示實施例5.2.1.所述的研究過程期間得到的結果。
本發明人進一步於實驗中研究血液毒性，該實驗係以單一劑量900 μg的抗-VISTA抗體殖株V4或等體積的PBS注射小鼠。
獲取血液樣本且使用HM5血液分析器來分析不同類型白血球的數目。結果顯示於圖18內；不同細胞類型的數目係落在查爾斯河(Charles River)參考範圍之內且V4與PBS治療組之間沒有差異，且不同組之間偵測到的臨床症狀、大體屍體解剖或重量沒有差異。
亦分析小鼠之肝毒性及腎毒性關聯值，且結果顯示於圖19內。偵測到的位準落在查爾斯河參考範圍之內且V4與PBS治療組之間沒有差異。5.4 晚期 實性腫瘤之治療 首先於人類
患有晚期或轉移性實性腫瘤、且於標準療法治療後有疾病惡化或治療不耐性以及合格的器官功能及ECOG狀態的患者，係以依據安全性調整‘最小期望生物效應位準’ (MABEL)方法所算出的劑量、藉由靜脈內注射抗-VISTA抗體V4(實施例2.2之[1])、V4H1(實施例2.2之[3])或V4H2(實施例2.2之[4])來治療。投予後監測患者28天。
繼而依據常見不良事件評價標準(CTCAE)來評估患者，以判定治療之安全及可耐受性，且判定分子之藥物動力學。
發現以抗-VISTA抗體治療是安全且可耐受的。 劑量遞增—單方療法
患有晚期或轉移性實性腫瘤、且於標準療法治療後有疾病惡化或治療不耐性以及合格的器官功能及ECOG狀態的患者(n=18-24)之治療係藉由靜脈內注射抗-VISTA抗體V4(實施例2.2之[1])、V4H1(實施例2.2之[3])或V4H2(實施例2.2之[4])，依據3+3模式型遞增加上超劑量對照(EWOC)劑量遞增。
繼而依據常見不良事件評價標準(CTCAE)來評估患者以判定治療之安全及可耐受性，以及評估分子之藥物動力學與治療之功效。亦判定最大耐受劑量(MTD)及最大投予劑量(MAD)。 劑量遞增—組合療法
患有晚期或轉移性實性腫瘤、且於標準療法治療後有疾病惡化或治療不耐性以及合格的器官功能及ECOG狀態的患者(n=9)之治療係用抗-VISTA抗體V4(實施例2.2之[1])、V4H1(實施例2.2之[3])或V4H2(實施例2.2之[4])，依據3+3模式型遞增加上抗-PD-1或抗-PD-L1抗體(3 mg/kg)。
繼而依據常見不良事件評價標準(CTCAE)來評估患者以判定治療之安全及可耐受性，以及評估分子之藥物動力學與治療之功效。 劑量擴張
分析經治療患者的整體存活期、腫瘤標識表現、循環腫瘤細胞、無惡化存活期、整體存活期、安全性及可耐受性。
發現抗-VISTA抗體是安全且可耐受的、能降低癌細胞的數目/比例、降低腫瘤細胞標識表現、增加無惡化存活期及增加整體存活期。5.5 淋巴瘤之治療 首先於人類
患有淋巴瘤(NHL及HL)、沒有從1線化學療法受益、尚未接受同種異體幹細胞移植及可能對利妥昔單抗(rituximab)(NHL)與納武單抗(nivolumab)或派姆單抗(pembrolizumab) (HL)有反應的患者，係以依據安全性調整‘最小期望生物效應位準’(MABEL)方法所算出的劑量、藉由靜脈內注射抗-VISTA抗體V4(實施例2.2之[1])、V4H1(實施例2.2之[3])或V4H2(實施例2.2之[4])來治療。投予後監測患者28天。
繼而依據常見不良事件評價標準(CTCAE)來評估患者，以判定治療之安全及可耐受性，且判定分子之藥物動力學。
發現以抗-VISTA抗體治療是安全且可耐受的。 劑量遞增—單方療法
患有淋巴瘤(NHL及HL)、沒有從1線化學療法受益、尚未接受同種異體幹細胞移植及可能對利妥昔單抗(rituximab)(NHL)與納武單抗(nivolumab)或派姆單抗(pembrolizumab) (HL)有反應的患者之治療係藉由靜脈內注射抗-VISTA抗體V4(實施例2.2之[1])、V4H1(實施例2.2之[3])或V4H2(實施例2.2之[4])，依據3+3模式型遞增加上超劑量對照(EWOC)劑量遞增。
繼而依據常見不良事件評價標準(CTCAE)來評估患者以判定治療之安全及可耐受性，以及評估分子之藥物動力學與治療之功效。亦判定最大耐受劑量(MTD)及最大投予劑量(MAD)。 劑量遞增—組合療法
患有淋巴瘤(NHL及HL)、沒有從1線化學療法受益、尚未接受同種異體幹細胞移植及可能對利妥昔單抗(rituximab)(NHL)與納武單抗(nivolumab)或派姆單抗(pembrolizumab) (HL)有反應的患者之治療係藉由靜脈內注射抗-VISTA抗體V4(實施例2.2之[1])、V4H1(實施例2.2之[3])或V4H2(實施例2.2之[4])，依據3+3模式型遞增加上抗-PD-L1抗體。
繼而依據常見不良事件評價標準(CTCAE)來評估患者以判定治療之安全及可耐受性，以及評估分子之藥物動力學與治療之功效。 劑量擴張
分析經治療患者的整體存活期、癌細胞標識表現、循環癌細胞、無惡化存活期、整體存活期、安全性及可耐受性。
發現抗-VISTA抗體是安全且可耐受的、能降低癌細胞的數目/比例、降低腫瘤細胞標識表現、增加無惡化存活期及增加整體存活期。實施例6 ：包含不同的Fc 區域之VISTA- 結合 抗體 之生產與特徵化 6.1 包含不同的Fc 區域之VISTA- 結合 抗體 之生產與特徵化
生產小鼠IgG2a LALA PG格式的4M2-C12。該分子為具有顯示於序列辨識編號：249的序列之重鏈多肽及具有顯示於序列辨識編號：250的序列之輕鏈多肽的異聚體。重鏈序列於CH2區域內包含根據序列辨識編號：253所編號的位置4及5之白胺酸(L)由丙胺酸(A)取代，以及根據序列辨識編號：253所編號的位置99之脯胺酸(P)由甘胺酸(G)取代。此等取代於文獻中稱為L234A、L235A及P329G，以及描述於小鼠IgG2a Fc，例如於Lo等人之J. Biol. Chem (2017) 292(9):3900-3908內所述，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。4M2-C12 mIgG2a LALA PG之生產係藉由編碼重及輕鏈多肽的核酸於CHO細胞內共表現，以及隨後純化。
Figure 108111311-A0304-0005
亦生產小鼠IgG2a NQ格式的4M2-C12。該分子為具有顯示於序列辨識編號：258的序列之重鏈多肽及具有顯示於序列辨識編號：250的序列之輕鏈多肽的異聚體。重鏈序列於CH2區域內包含根據序列辨識編號：253的位置67之天冬醯胺酸(N)由麩醯胺酸(Q)取代。此取代於文獻中稱為N297Q，以及描述於小鼠IgG2a Fc，例如於Lo等人之J. Biol. Chem (2017) 292(9):3900-3908內所述。4M2-C12 mIgG2a NQ之生產係藉由編碼重及輕鏈多肽的核酸於CHO細胞內共表現，以及隨後純化。
Figure 108111311-A0304-0006
生產小鼠IgG1格式的4M2-C12。該分子為具有顯示於序列辨識編號：266的序列之重鏈多肽及具有顯示於序列辨識編號：250的序列之輕鏈多肽的異聚體。4M2-C12 mIgG1之生產係藉由編碼重及輕鏈多肽的核酸於CHO細胞內共表現，以及隨後純化。
Figure 108111311-A0304-0007
 6.2 包含不同的Fc 區域之VISTA- 結合 抗體 與Fc 受體之結合 分析
不同抗體格式的4M2-C12與人類、食蟹獼猴及鼠類VISTA蛋白之結合係經由ELISA來評估，以及與小鼠Fcγ受體及小鼠FcRn之結合係藉由BLI、使用Pall ForteBio Octet QK 384系統來評估。
從Sino Biological獲得組胺酸-標記的mFcγRIV(50036-M08H)、mFcγRIII(50326-M08H)、mFcγRIIb(50030-M08H)，及mFcRn(CT009-H08H)。抗-五-HIS(HIS1K)生物感應器係購自Forte Bio(18-5120)。
於動力學的實驗中，孵育抗-五-HIS生物感應器於PBS緩衝液(pH 7.2)歷時60 sec以獲得第一基線，以及隨後裝載200 nM mFcγRIV(hFcγRIIIa之異種同源物)、160 nM mFcγRIII(hFcγRIIa之異種同源物)、75 nM mFcγRIIb(hFcγRIIb之異種同源物)或120 nM mFcRn配於PBS(pH 7.2)歷時120 sec。於裝載後，以PBS緩衝液(Fcγ受體為pH 7.2且FcRn為pH 5.8)孵育生物感應器60 sec以獲得第二基線，以及以6點、2倍連續稀釋的測試抗體(mFcγ受體結合為2000 nM–62.5 nM，及FcRn結合為500 nM–15.6 nM)配於PBS(Fcγ受體為pH 7.2且FcRn為pH 5.8)歷時60 sec以獲得締合曲線。最終，生物感應器於PBS(mFcγR為pH 7.2且mFcRn為pH 5.8)孵育歷時120 sec以獲得解離曲線。藉由整體擬合締合及解離資料至1:1結合模式來計算動力學及親和力常數。
圖25A至25D顯示4M2-C12 mIgG1與不同的小鼠Fcγ受體及小鼠FcRn的結合作用之分析結果。
圖26A至26D顯示4M2-C12-mIgG2a與不同的小鼠Fcγ受體及小鼠FcRn的結合作用之分析結果。執行二個單獨的實驗(1及2；參見圖29A至29C)；圖26A至26D顯示實驗2獲得的結果。不同Fcγ受體偵測到的結合位準可比得上科學文獻中報導的位準。
圖27A至27D顯示4M2-C12-mIgG2a LALA PG與不同的小鼠Fcγ受體及小鼠FcRn的結合作用之分析結果。mFcγRIV、mFcγRIII及mFcγRIIb的結合位準是微不足道/不可偵測的，以及與mFcRn的結合位準與4M2-C12-mIgG2a與mFcRn的結合位準相似。
圖28A至28D顯示4M2-C12-mIgG2a NQ與不同的小鼠Fcγ受體及小鼠FcRn的結合作用之分析結果。
圖29A至29C的表總結4M2-C12 mIgG1、4M2C12 mIgG2a、4M2-C12-mIgG2a LALA PG及4M2-C12-mIgG2a NQ與不同的Fc受體結合經判定的k結合 、Kdis 及KD 值。實施例7 ：包含不同的Fc 區域之VISTA- 結合 抗體 之活體內 分析
評估4M2-C12-mIgG2a及4M2-C12-mIgG2a LALA PG(見實施例6.1)於一種同基因的EL4 T細胞白血病/淋巴瘤模式中活體內 治療癌症之功效。
EL4細胞培養於增補10%馬血清(FBS)及1% Pen/Strep之DMEM內。在37℃的5% CO2 孵化器內培養細胞。
從InVivos(新加坡)獲得大約6週大的C57BL/6小鼠。動物安置於無特定病原條件下且遵照機構動物護理和使用委員會(IACUC)的指導方針來對待。接種2 × 105 個EL4 T細胞白血病/淋巴瘤細胞於C57BL/6小鼠右側。腫瘤植入後，當腫瘤尺寸達到350至400 mm3 時，隨機將小鼠分成下列的治療組：a)媒介物對照(PBS)、b)4M2C12 mIgG2a(實施例5的[17])或c)4M2-C12 mIgG2a-LALA PG(實施例6之[18])，劑量為25 mg/kg。每3天以腹膜內投予治療總共5次劑量。
一週使用數位卡尺來測量3次並用式[L x W2/2]來計算腫瘤體積。一旦媒介物對照治療組腫瘤長度測得>1.5 cm時認為已經達到研究終點。
結果顯示於圖30A至30C內。到研究最後一天(植入後第23天)，4M2-C12 IgG2a及4M2-C12 IgG2a LALA PG治療組二者的平均腫瘤體積低於可靠測量的尺寸(>30mm3 )。相比之下，媒介物(PBS)治療組的小鼠平均腫瘤體積於第18天超出2000mm3 且對所有動物實施安樂死。
因而發現呈IgG2a及IgG2a LALA PG格式二者的4M2-C12展現出有力的腫瘤生長抑制。
發現用抗-VISTA抗體4M2-C12治療高度成熟的患EL4腫瘤小鼠作為單方療法是非常有效的，且導致腫瘤清除。
發現4M2-C12的生物活性不依賴鼠類Fcγ受體之接合，強烈暗示4M2-C12係通過抑制VISTA媒介的訊息傳導而發揮其生物活性。實施例8 ：該等抗體結合之VISTA 表位之分析
評估抗-VISTA抗體以判定其等是否會彼此競爭與VISTA結合。
先前已建議VSTB112會在幾個區域與VISTA結合。已提議主要表位對應至序列辨識編號：1之位置59至68及位置86至97(即序列辨識編號：271及272)。已提議次要表位對應至序列辨識編號：1之位置71至84及位置150至166(即序列辨識編號：273及274)；參見例如WO 2017/137830 A1，例如於[0302]段落。舉例而言於WO 2015/097536 A2內已描述VSTB112，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。
IGN175A被認為會與成熟蛋白最先的32個核酸之內的(即序列辨識編號：1之位置33至64之內(即序列辨識編號：275))VISTA結合。於舉例而言WO 2014/197849 A2之內已描述IGN175A，其係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。
藉由BLI、使用Octet QK384系統(ForteBio)來執行表位篩選(Epitope binning)實驗。簡言之，使人類VISTA-His重組蛋白配於PBS(4.7 μg/ml)固定於抗-五His感應器(HIS1K, ForteBio)，歷時5 mins。測量PBS之基線訊號30s然後裝載400 nM飽和抗體配於PBS歷時10 mins，且以搖動速度1000 rpm進行，接著進行使用PBS之120 s解離步驟。隨後生物感應器以搖動速度1000 rpm，用300 nM競爭抗體配於PBS予以處理歷時5 mins，接著進行使用PBS之120 s解離步驟。
在實驗中分析下列抗原結合分子： •呈IgG1格式之4M2-C12(V4)(實施例2.2之[1]) •呈IgG1格式之人化及親和力成熟的4M2-C12變異體(V4-C1) (實施例13之[21]) •IGN175A IgG1(包含IGN175A HC(序列辨識編號：267)+IGN175A LC(序列辨識編號：268)) •VSTB112 IgG1(包含VSTB112 HC(序列辨識編號： 269)+VSTB112 LC(序列辨識編號： 270))
研究下列抗原/飽和抗體/競爭抗體組合：
Figure 108111311-A0304-0008
結果顯示於圖31A及31B內。
發現V4及V4-C1 IgG1不會與IGN175A競爭與VISTA結合。發現VSTB112與V4、V4-C1及IGN175A部分競爭與VISTA結合。添加競爭抗體後反應的變化(呈nm)顯示如下。
Figure 108111311-A0304-0009
結果表示4M2-C12及IGN175A與VISTA結合的區域於局部上是很遙遠的，以及VSTB112與VISTA結合的區域和4M2-C12及IGN175A結合的區域很接近。
一併考慮V1-C1及IGN175A不會競爭與VISTA結合以及VSTB112會與IGN175A競爭與VISTA結合之觀察，表示包含4M2-C12之CDRs的抗體所結合的VISTA表位與IGN175A所結合的VISTA表位是非同一的，以及與VSTB112所結合的VISTA表位也是非同一的。
從用於提升4M2-C12的免疫原，VISTA的序列分析及及物種交叉反應性資料，本發明人得出4M2-C12及其衍生物會與序列辨識編號：322(其對應至序列辨識編號：1之位置76至81)所示的序列結合的結論。實施例9 ：VISTA- 結合 抗體 救援 T 細胞 增殖不受VISTA- 媒介的抑制 之能力 分析
以活體外 分析法來分析抗-VISTA抗體救援VISTA-媒介的訊息傳導之抑制效應的能力。
簡言之，用濃度比率1:1(2.5 μg/ml抗-CD3:2.5 μg/ml的VISTA/對照Ig)或2:1(2.5 μg/ml抗-CD3：1.25 μg/ml VISTA/對照Ig)之抗-CD3及VISTA-Ig或對照-Ig塗覆96孔平盤。不相干抗原-Ig係用作為對照條件。於4℃孵育平盤過夜。
從新收集的血液樣本純化PBMCs且使用人類泛T細胞單離套組(Miltenyi Biotec)以進一步富集T細胞。用CFSE標記富集的T細胞族群。
用PBS清洗孔三次，且於終濃度20 μg/ml或50 μg/ml的4M2-C12 IgG1(實施例2.2之[1])存在下，或於終濃度20 μg/ml的VSTB 1 12存在下或於缺少添加的抗體的情況下，各孔添加100,000個CFSE-標記的T細胞，於增補10% FBS之完整RPMI 1640培養基內。
於5天後，收穫細胞、用螢光複合的抗-CD4及抗-CD8抗體予以標記，且使用Macsquant分析儀10藉由流動式細胞測量術來分析。
實驗結果顯示於圖33A至33D內。發現4M2-C12會回復CD4+T細胞及CD8+ T細胞增殖的能力。
重要的是，發現4M2-C12比VSTB112更有效地回復T細胞增殖作用。實施例10 ：VISTA- 結合 抗體促進THP1 細胞回應LPS 而生產IL-6 之能力 分析
以活體外 分析來分析抗-VISTA抗體促進THP-1細胞回應LPS刺激而生產IL-6之能力。
簡言之，未分化的THP1細胞以二複本播種於96孔平盤內(100,000個細胞/孔)，於沒有FBS或pen/strep的RPMI培養基內。繼而在範圍落在2000 μg/ml至7.8 μg/ml的不同濃度4M2-C12 IgG1(實施例2.2之[1])存在下，或範圍落在1000 μg/ml至7.8 μg/ml的不同濃度VSTB112存在下，用LPS(終濃度100 μg/ml)及MnCl2 (100 μM)治療細胞。於3天之後，收集細胞培養上清液且藉由ELISA來分析以使用IL-6人類ELISA套組(Invitrogen)來判定IL-6位準。
結果顯示於圖34A及34B內。發現4M2-C12會比VSTB112促進LPS刺激的THP1細胞生產更多的IL-6。實施例11 ：VISTA- 結合 抗體促進 活體內 IL-6 生產 之能力 分析
研究活體內 對4M2-C12治療回應之IL-6生產。
簡言之，C57BL/6小鼠(n=3)投予單一600 μg劑量的4M2-C12 mIgG2a(實施例5的[17])，且於投予前2h，及投予後0.5 hr、6 hr、24 hr、96 hr、168 hr及336 hr從小鼠獲得血液樣本。
使用小鼠IL-6 ELISA套組(Abcam, ab100712)來分析血清的IL-6含量。
結果顯示於圖35內。於4M2C12 mIgG2a投予0.5 hr後偵測到血清內的IL-6。實施例12 ：VISTA- 結合 抗體 單獨或與抗-PD1/PD-L1 抗體組合 之 活體內 分析 12.1 CT26細胞模式
藉由皮下注射1x105 個CT26細胞至Balb/c小鼠右側來產生一種同基因的T細胞白血病/淋巴瘤模式。
每3天腹膜內投予下列給小鼠(每治療組7隻)總共7次劑量： •600 μg的4M2-C12 IgG2a(實施例5的[17]) •200 μg的抗-PD-1抗體(殖株RMP1-14(Bioxcell)) •600 μg的4M2-C12 IgG2a+200 μg的抗-PD-1抗體 •只有PBS
一週使用數位卡尺來測量3次並用式[L x W2/2]來計算腫瘤體積。一旦對照組腫瘤長度測得>1.5 cm時認為已經達到研究終點。
結果顯示於圖36A及36B內。抗-VISTA抗體4M2-C12及抗-PD-1之組合療法比單獨使用的任一製劑會達到更大程度的腫瘤生長抑制。
進行腫瘤浸潤型CD45+細胞之免疫剖析。簡言之，於實驗第22天收穫腫瘤、加工成單一細胞懸浮液並用對免疫細胞表面蛋白(CD45、CD4、CD8、CD25、CD11b、Ly6G及Ly6C)專一性的抗體予以染色。
藉由流動式細胞測量術來分析樣本，且根據其等不同的免疫細胞表面蛋白之染色而分類為下列免疫細胞亞群如下： •CD4細胞：CD45+ CD4+ ； •CD8 T細胞：CD45+ CD8+ ； •Treg細胞：CD45+ CD4+ CD25+ ； •顆粒球性MDSC(g-MDSC)：CD45+ CD11b+ Ly6G+ Ly6Clo/- •單核球性MDSC(m-MDSC)： CD45+ CD11b+ Ly6G- Ly6Chi/+
具有所示表現型的腫瘤浸潤型CD45+細胞之百分率總結如下：
Figure 108111311-A0304-0010
圖37顯示為g-MDSC的腫瘤浸潤型CD45+細胞的百分率。用4M2-C12治療(單獨或與抗-PD-1組合)顯著降低浸潤型CD45+細胞中g-MDSCs的比例。
於第18天從小鼠獲得血液，以及使用小鼠之MACSPlex細胞介素10套組(Miltenyi Biotec)之分析法來分析血清各種不同的細胞介素位準。
結果顯示於圖38A至38E內。 12.2 B16-BL6細胞模式
圖40A及40B顯示以上實施例5.2.3(結果顯示於圖17內)所述的研究之結果，延長至18天。抗-VISTA抗體4M2-C12及抗-PD-1之組合療法比單獨使用的任一製劑達到更大程度的腫瘤生長抑制。
進行腫瘤浸潤型CD45+細胞之免疫剖析。簡言之，於實驗第18天收穫腫瘤、加工成單一細胞懸浮液、用對免疫細胞表面專一性的抗體染色、藉由流動式細胞測量術來分析且如以上的實施例12.1中所述將細胞分類為免疫細胞亞群。
具有所示表現型的腫瘤浸潤型CD45+細胞之百分率總結如下：
Figure 108111311-A0304-0011
圖41顯示g-MDSC的腫瘤浸潤型CD45+細胞的百分率。 12.3 EL4細胞模式
藉由皮下注射2x105 個EL4細胞至C57BL/6小鼠右側來建立一種同基因的T細胞白血病/淋巴瘤模式。
每3天腹膜內投予下列給小鼠(每治療組7隻)總共5次劑量： •600 μg的4M2-C12 IgG2a(實施例5的[17]) •200 μg的抗-PD-1抗體(殖株RMP1-14(Bioxcell)) •600 μg的4M2-C12 IgG2a+200 μg的抗-PD-1抗體 •只有PBS
一週使用數位卡尺來測量3次並用式[L x W2/2]來計算腫瘤體積。一旦對照組腫瘤長度測得>1.5 cm時認為已經達到研究終點。
結果顯示於圖42內。抗-VISTA抗體4M2-C12及抗-PD-1之組合療法比單獨使用的任一製劑達到更大程度的腫瘤生長抑制。
進行腫瘤浸潤型CD45+細胞之免疫剖析。簡言之，於實驗第16天收穫腫瘤、加工成單一細胞懸浮液、用對免疫細胞表面專一性的抗體染色、藉由流動式細胞測量術來分析且如以上的實施例12.1中所述將細胞分類為免疫細胞亞群。
具有所示表現型的腫瘤浸潤型CD45+細胞之百分率總結如下：
Figure 108111311-A0304-0012
圖43顯示g-MDSC的腫瘤浸潤型CD45+細胞的百分率。用4M2-C12治療(單獨或與抗-PD-1組合)顯著降低浸潤型CD45+細胞中g-MDSCs的比例。 12.4 結論
抑制PD-1/PD-L1的訊息傳導會使CT26、B16-BL6及EL4模式之腫瘤浸潤型CD45+細胞中g-MDSCs的比例增高，而用4M2-C12治療會抑制g-MDSC的擴增。實施例13 ：VISTA- 結合 抗體 之進一步 特徵化
生產另外的VISTA-結合抗原結合分子：
Figure 108111311-A0304-0013
使用IMGT DomainGapAlign(Ehrenmann等人，Nucleic Acids Res., 38, D301-307 (2010))及IEDB去免疫(Dhanda等人，Immunology. (2018) 153(1):118-132)工具來電腦模擬 分析V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30及V4-C31之安全性及免疫原性。
V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30及V4-C31與人類重及輕鏈有足夠的同源性被認為是人化的(即>85%)，具有的可能免疫性胜肽數目很少而足以被認為是安全的(參見圖53)，並且沒有造成可能的可發展性問題之任何其他的性質。13.1 藉由BLI 進行的 結合 親和力 分析
藉由BLI、使用Pall ForteBio Octet QK 384系統來評估V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30及V4-C31(即[21]至[28])與人類及小鼠VISTA蛋白及人類PD-L1之結合。
簡言之，抗-五-HIS生物感應器於PBS緩衝液(pH 7.2)孵育歷時60 sec以獲得第一基線，以及隨後裝載180 nM hVISTA、180 nM mVISTA或250 nM hPD-L1配於PBS(pH 7.2)歷時120 sec。於裝載後，以pH 7.2之PBS緩衝液孵育生物感應器60 sec以獲得第二基線，以及以6點、2倍連續稀釋測試抗體(500 nM–15.6 nM)配於PBS pH 7.2歷時120 sec或900 sec以獲得締合曲線。最終，生物感應器於pH 7.2之PBS孵育歷時120 sec以獲得解離曲線。藉由整體擬合締合及解離資料至1:1結合模式來計算動力學及親和力常數。
V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30或V4-C31中無一者與人類PD-L1展現出明顯的結合(圖45C)。
此實驗中V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4C27、V4-C28、V4-C30及V4-C31與人類VISTA及小鼠VISTA的結合作用、經計算而來的動力學及熱力學常數顯示於圖45D內。
於一單獨的實驗中分析V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30及V4-C31與小鼠VISTA蛋白之結合，其含括評估VSTB112 IgG1(包含VSTB112 HC(序列辨識編號：269)+VSTB112 LC(序列辨識編號：270))。
VSTB112與小鼠VISTA沒有展現出明顯的結合(圖46A)。此實驗中V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30及V4-C31與小鼠VISTA的結合作用、經計算而來的動力學及熱力學常數顯示於圖46B內。
於另外的實驗中，分析V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27及VSTB112 IgG1與人類VISTA及小鼠VISTA蛋白之結合，且經計算的動力學及熱力學常數顯示於圖47C內。
於另一實驗中，分析V4(實施例2.2之[1])及VSTB112 IgG1(包含VSTB112 HC(序列辨識編號：269)+VSTB112 LC(序列辨識編號：270))與人類VISTA、小鼠VISTA及人類CD47之結合。抗-五-HIS生物感應器於PBS緩衝液(pH 7.2)孵育歷時60 sec以獲得第一基線，以及隨後裝載180 nM hVISTA、180 nM mVISTA或300 nM hCD47配於PBS(pH 7.2)歷時120 sec。於裝載後，以pH 7.2之PBS緩衝液孵育生物感應器60 sec以獲得第二基線，以及以連續稀釋的測試抗體(1500 nM-46.9 nM)配於pH 7.2之PBS歷時120 sec以獲得締合曲線。最終，生物感應器於pH 7.2之PBS孵育歷時120 sec以獲得解離曲線。藉由整體擬合締合及解離資料至1:1結合模式來計算動力學及親和力常數。
V4或VSTB112都沒有顯示出與人類CD47結合。VSTB112與小鼠VISTA蛋白沒有展現出明顯的結合，而V4有。經計算的動力學及熱力學常數顯示於圖48B內。13.2 藉由ELISA 進行的 結合 親和力 分析
使用ELISAs來評估不同的抗體與人類VISTA及小鼠VISTA之結合。如以上的實施例3.3中所述來執行ELISAs。
在實驗中分析下列抗原結合分子： •4M2-C12 IgG1(實施例2.2之[1]；圖中稱為"V4pr") •V4-C1 IgG1(實施例13之[21]) •V4-C9 IgG1(實施例13之[22]) •V4-C24 IgG1(實施例13之[23]) •V4-C26 IgG1(實施例13之[24]) •V4-C27 IgG1(實施例13之[25]) •V4-C28 IgG1(實施例13之[26]) •V4-C30 IgG1(實施例13之[27]) •V4-C31 IgG1(實施例13之[28]) •VSTB112 IgG1(包含VSTB112 HC(序列辨識編號：269)+VSTB112 LC(序列辨識編號：270)) •阿替珠單抗(Atezolizumab) •人類IgG1同型對照
獲得的結果顯示於圖49A及49B內，以及圖49C總結從ELISAs計算而來的抗體與所示蛋白結合之EC50(nM)值。
執行另外的實驗，其中分析V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、VSTB112及同型對照抗體與人類VISTA或小鼠VISTA之結合。結果顯示於圖50A及50B內，以及圖50C總結從ELISAs計算而來的抗體與所示蛋白結合之EC50(nM)值。
執行另外的實驗，其中分析V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、VSTB112及同型對照抗體與人類VISTA或小鼠VISTA之結合。結果顯示於圖51A及51B內，以及圖51C總結從ELISAs計算而來的抗體與所示蛋白結合之EC50(nM)值。
執行另外的實驗，其中分析V4、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30及V4-C31及同型對照抗體與人類VISTA、PD-L1、B7H3、B7H4、B7H6、B7H7、PD-1及CTLA-4之結合。結果顯示於圖56A至56G內。V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30及V4-C31之各者展現與人類VISTA強大的結合作用，以及與B7蛋白家族的其他成員沒有交叉反應性。
於另外的實驗中，分析V4(圖57中稱為“V4P”)、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4C30及V4-C31與人類VISTA、小鼠VISTA、大鼠VISTA及食蟹獼猴VISTA的結合作用。獲得的結果顯示於圖57A至57H內，以及圖57I總結從ELISAs計算而來的抗體與所示蛋白結合之EC50(M)值。
發現V4及所有V4-衍生的殖株V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4C30及V4-C31都會與人類VISTA、小鼠VISTA、大鼠VISTA及食蟹獼猴VISTA結合。13.3 藉由流動式細胞測量術分析與 表現VISTA 的細胞之 結合作用
基本上如以上的實施例3.1中所述來分析抗-VISTA抗體其等與表現VISTA的細胞之結合能力。
簡言之，轉染細胞或轉染編碼人類VISTA或小鼠VISTA的載體之HEK293細胞，係以1 μg/ml的抗-VISTA抗體或同型對照抗體於4℃孵育1 hr。繼而清洗細胞，以及用10 μg/ml FITC-複合的抗-人類Fc抗體於4℃孵育1 hr。再次清洗細胞，然後藉由流動式細胞測量術來分析。
在實驗中分析下列抗原結合分子： •4M2-C12 IgG1(實施例2.2之[1]；圖中稱為"V4P") •V4-C24 IgG1(實施例13之[23]) •V4-C26 IgG1(實施例13之[24]) •V4-C27 IgG1(實施例13之[25]) •V4-C28 IgG1(實施例13之[26]) •V4-C30 IgG1(實施例13之[27]) •V4-C31 IgG1(實施例13之[28]) •VSTB112 IgG1(包含VSTB112 HC(序列辨識編號：269)+VSTB112 LC(序列辨識編號：270)) •人類IgG1同型對照
結果顯示於圖58A至58C內。13.4 以 微差掃描螢光分析法進行之 熱穩定性 分析
不同抗體的熱穩定性係藉由微差掃描螢光分析法予以評估，如以上實施例3.4中所述。
圖52A至52I顯示V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31(即[21]至[28])及VSTB112(以三複本)之熱穩定性微差掃描螢光分析法獲得的原始資料之第一導數，且結果總結於圖52J內。
發現V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30及V4-C31與V4(67.5℃)相比之下，有較高的Fab區域熔化溫度(Tm)，且因而改良熱穩定性。實施例14 ：VISTA- 結合 抗體於 免疫組織化學之用途
評估抗-VISTA抗體4M2-C12 mIgG2a(實施例5的[17])其要使用於免疫組織化學供用於偵測人類VISTA蛋白的能力。
使用Bond試劑(Leica Biosystems)來執行切片加工。來自正常人類脾臟或正常人類卵巢之商業石蠟切片以Bond脫蠟溶液予以脫蠟，以及使用再水合。切片繼而接受下列處理伴隨步驟之間以1x Bond Wash沖洗4-5次：(i)於100℃用Bond表位提取溶液(Epitope Retrieval Solution)處理40 min以進行抗原暴露，(ii)藉由室溫下用3.5%(v/v)H2 O2 處理15 min以進行內生的過氧化酶封阻，(iii)藉由室溫下用10%山羊血清處理30 min以進行封阻，(iv)於4℃用4M2-C12 mIgG2a以1:50稀釋的9.37 mg/mL溶液孵育過夜，(v)於室溫下用HRP-聚合物複合的山羊抗小鼠抗體孵育5 min，以及(vi)於室溫下用Bond Mixed DAB Refine顯影7 min，接著用去離子水沖洗來停止反應。
於室溫下用蘇木素複染切片5 min且用去離子水及1x Bond清洗溶液來沖洗，然後再水合、以合成封固劑封固且以高解析度予以掃描。
結果顯示於圖59A及59B內。抗-VISTA抗體會染色脾臟細胞之細胞質，但是不會染色正常卵巢切片(對照)。實施例15 ：VISTA- 結合 抗體 救援 T 細胞 增殖 及生產前發炎性細胞介素 不受VISTA- 媒介的抑制之 能力 的進一步 分析
界定抗-VISTA抗體解除T細胞不受VISTA-媒介的抑制之能力之特徵。
用濃度2.5 μg/ml的抗-CD3塗覆96孔平盤且於4℃孵育過夜。從血液樣本單離PBMCs、從PBMCs富集T細胞且用如上之CFSE予以標記，以及CFSE-標記的T細胞繼而以2:1比率與編碼人類VISTA之建構物轉染的HEK293-6E細胞共培養於增補2% FBS之RPMI 1640培養基內。
繼而用0 μg/ml(對照)、20 μg/ml或50 μg/ml濃度之4M2-C12-hIgG1(實施例2.2之[1])或VSTB112來治療細胞。
於5天後，收穫細胞且藉由流動式細胞測量術來分析以透過CSFE稀釋剖析來測定細胞增殖。亦收穫細胞培養上清液，且藉由ELISA來分析INFγ及TNFa位準。
結果顯示於圖60A至60D內。圖60A及60B顯示4M2-C12-hIgG1係以劑量依賴的方式解除T細胞增殖不受VISTA-媒介的抑制。圖60C及60D顯示4M2-C12-hIgG1解除T細胞生產INFγ及TNFa不受VISTA-媒介的抑制。
於另外的實驗中，未分化的THP1細胞以二複本播種於96孔平盤的孔內，於沒有FBS或pen/strep的RPMI培養基(100,000個細胞/孔)內，且在濃度範圍落在2000 μg/ml至7.8 μg/ml的連續稀釋濃度的4M2-C12-hIgG1(實施例2.2之[1])或VSTB112存在下，用LPS(100 μg/ml)來刺激細胞。
於24 h後收集細胞培養上清液且藉由ELISA來分析IL-6及TNFa。細胞亦固定且透化，以及經由流動式細胞測量術來分析VISTA之存在。
結果顯示於圖61A至61C內。發現4M2-C12-hIgG1係以劑量依賴的方式使LPS-刺激的THP1細胞生產的IL-6及TNFa增加，且達比VSTB112更大的程度。
於另外的實驗中，未分化的THP1細胞以二複本播種於96孔平盤的孔內，於沒有FBS或pen/strep的RPMI培養基(100,000個細胞/孔)內，且在濃度範圍落在2000 μg/ml至7.8 μg/ml的4M2-C12-hIgG1(實施例2.2之[1])或4M2-C12-hIgG4(以下所示的[29])存在下，用LPS(100 μg/ml)及MnCl2 (100 μM)來刺激細胞。於24 h後收集細胞培養上清液且藉由ELISA來分析IL-6。
Figure 108111311-A0304-0014
結果顯示於圖62內。發現LPS-刺激的THP1細胞生產的IL-6增加與Fc無關，因觀察到人類IgG1或IgG4格式的4M2-C12治療誘發的IL6位準之間沒有顯著差異。實施例16 ：藥理學、毒物學及免疫毒性之進一步分析
於一急性劑量研究中，以單一劑量10 mg/kg、25 mg/kg、100 mg/kg或250 mg/kg的4M2-C12-hIgG1(實施例2.2之[1])或4M2-C12-hIgG4(實施例15之[29])投予大鼠。
於投予後基線(- 2 hr)、0.5 hr、6 hr、24 hr、96 hr、168 hr及336 hr時從大鼠取得血液。藉由ELISA來定量血清內的抗體。
藥物動力學分析的參數係衍生自非隔間模型： 最大濃度(C最大 )、AUC(0-336hr)、AUC(0-無限大)、半生期(t½ )、廓清(CL)、穩態分佈體積(Vss )。
結果顯示於圖63A至63D內。
於單獨的實驗中，以單一劑量50 mg/kg 4M2-C12hIgG1(實施例2.2之[1])或等體積的PBS投予BALB/C小鼠。於96小時後獲取血液樣本，且使用HM5血液分析器來分析不同類型白血球的數目。亦分析血液樣本之肝毒性及腎毒性關聯值。
代表結果顯示於圖64A至64C的表內。
於另外的實驗中，以單一劑量250 mg/kg 4M2C12-hIgG1(實施例2.2之[1])或等體積的PBS投予史－道二氏大鼠。於6、24、96及168小時獲得血液樣本，且使用HM5血液分析器來分析不同類型白血球的數目。亦分析血液樣本之肝毒性、腎毒性及胰毒性關聯值。
代表結果顯示於圖65A至65C的表內。
沒有發現投予4M2-C12-hIgG1與顯著毒性有關連，以及不會顯著改變血液內細胞類型的數目。
現在將參照附圖來討論具體例及實驗以闡釋本發明之原理。圖1A 至1D 。直方圖(histograms)顯示依流動式細胞測量術所判定的抗-VISTA抗體染色的細胞。直方圖顯示抗-VISTA抗體殖株(1A )VSTB112(陽性對照；WO 2015/097536)、(1B )4-M2-D5、(1C )9M2-C12或(1D )4M2-C12(於此亦稱為“V4”)染色的HEK293細胞(沒有表現VISTA)或HEK293 VISTA過度表現細胞(HEK293 VISTA O/E)。圖2 。 直方圖顯示依流動式細胞測量術所判定的抗-VISTA抗體染色的細胞。直方圖顯示抗-VISTA抗體殖株9M2C12、V4及殖株VSTB112或同型對照抗體染色的HEK293細胞(沒有表現VISTA)或HEK293 VISTA過度表現細胞(HEK293 VISTA O/E)。未染色的細胞予以分析作為陰性對照。圖3A 至3C 。 感應圖譜顯示抗-VISTA抗體殖株V4與人類、食蟹獼猴(cynomolgus macaque)及鼠類VISTA的結合親和力分析的結果。(3A )顯示與人類VISTA、(3B )顯示與食蟹獼猴VISTA，以及(3C )顯示與鼠類VISTA的結合作用。顯示k結合 、k解離 及KD 。圖4A 至4B 。 圖表顯示抗-VISTA抗體與不同蛋白的結合分析。4A 顯示抗-VISTA抗體殖株V4與人類、食蟹獼猴及鼠類VISTA、人類PD-L1及人類HER3的結合作用，依ELISA來判定。4B 顯示抗-VISTA抗體殖株V4與人類VISTA、PD-1、PD-L1、B7H3、B7H4、B7H6、B7H7、CTLA4及不相干抗原的結合作用。圖5 。感應圖譜顯示VISTA及VSIG-3之間的結合分析結果。圖6 。圖表顯示抗-VISTA抗體殖株5M1-A11及9M2-C12抑制VISTA與VSIG-3之間的結合作用之分析結果。圖7A 至7B 。 圖表及長條圖顯示抗-VISTA抗體殖株13D5p治療於混合淋巴球反應(MLR)分析中對於IFN-γ、IL-2及IL-17A生產的效應之分析結果。(7A )顯示於分析終點之細胞培養上清液內偵測到的細胞介素位準，以及(7B )顯示所示的細胞介素位準之倍數變化(“FC”)。圖8A 至8B 。 圖表及長條圖顯示抗-PD-L1抗體殖株MIH5(ThermoFisher Scientific)治療於混合淋巴球反應(MLR)分析中對於IFN-γ、IL-2及IL-17A生產的效應之分析結果。(8A )顯示於分析終點之細胞培養上清液內偵測到的細胞介素位準，以及(8B )顯示所示的細胞介素位準之倍數變化(“FC”)。圖9 。圖表顯示以微差掃描螢光分析法進行之抗-VISTA抗體殖株V4的穩定性分析的結果。圖10 。圖表顯示以粒徑篩析層析法進行之抗-VISTA抗體殖株V4的分析結果。圖11 。影像顯示以SDS-PAGE及西方墨點法進行之抗-VISTA抗體殖株V4表現的分析結果。道：M1=TaKaRa蛋白質標識商品目錄號3452；M2=GenScript蛋白質標識商品目錄號M00521；1=還原條件；2=非還原條件；P=陽性對照：小鼠IgG1，κ(Sigma商品目錄號M9269)。於西方墨點法方面，使用的初級抗體為山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(LI-COR,商品目錄號926-32210)。圖12 。圖表及表顯示依抗體血清的ELISA分析之抗-VISTA抗體殖株V4之藥物動力學分析的結果。圖13 。圖表顯示同基因的細胞株衍生的小鼠結腸癌模式活體內 之抗-VISTA抗體殖株V4的抗癌活性分析結果。圖14 。長條圖顯示同基因的細胞株衍生的小鼠結腸癌模式於靶定所示免疫查核點分子的單方療法或組合療法治療後，第15天之腫瘤生長抑制。此研究使用的抗體如下：抗-VISTA=殖株V4、抗-PD-L1=殖株10F.9G2、抗-TIGIT=殖株1G9、抗-LAG-3=殖株C9B7W及抗-TIM-3 =殖株RMT3-23。圖15 。長條圖顯示在用抗-VISTA抗體殖株V4單獨治療、抗-PD-L1抗體殖株10F.9G2單獨治療、用抗-VISTA抗體殖株V4及抗-PD-L1抗體殖株10F.9G2組合治療，或用PBS(陰性對照)治療後，依整塊腫瘤RNA-Seq分析法所判定，同基因的細胞株衍生的小鼠結腸癌模式之整塊腫瘤內每100,000個細胞的MDSCs的數目及CD8+ T細胞：Tregs之比率。圖16 。圖表顯示同基因的細胞株衍生的小鼠路易士肺癌模式活體內 之抗-VISTA抗體殖株V4的抗癌活性分析結果。圖17 。圖表顯示同基因的細胞株衍生的小鼠黑色素瘤模式活體內 之抗-VISTA抗體殖株V4，作為單方療法或與抗-PD-1抗體RMP1-14(Bio X Cell)組合，的抗癌活性分析結果。圖18 。 長條圖顯示投予單一劑量900 μg的抗-VISTA抗體殖株V4或等體積的媒介物(PBS)作為陰性對照之後不同類型白血球的數目。圖19A 及19B 。 長條圖顯示投予單一劑量900 μg的抗-VISTA抗體殖株V4或等體積的媒介物(PBS)作為陰性對照後，藉由評估(9A )肝及(9B )腎功能關聯值進行之肝毒性及腎毒性的分析。(9A )顯示丙胺酸轉胺酶(ALT)及天門冬胺酸轉胺酶(AST)的位準，以及(9B )顯示血脲氮(BUN)及肌酸酐(CREA)位準。圖20 。圖表顯示抗-VISTA抗體殖株13D5-1與人類、食蟹獼猴及小鼠VISTA及人類PD-L1的結合作用之分析結果，依ELISA來判定。圖21 。圖表顯示抗-VISTA抗體殖株13D5-13與人類及小鼠VISTA的結合作用之分析結果，依ELISA來判定。圖22 。圖表顯示一細胞株衍生的小鼠結腸癌模式活體內 之抗-VISTA抗體殖株13D5-1，單獨或與抗-PD-L1組合，的抗癌活性分析結果。圖23 。圖表顯示一細胞株衍生的小鼠乳癌模式活體內 之抗-VISTA抗體殖株13D5-1的抗癌活性分析結果。圖24 。 直方圖顯示依流動式細胞測量術所判定的抗-VISTA抗體染色的細胞。直方圖顯示抗-VISTA抗體殖株4M2-B4、2M1-B12、4M2-C9、2M1-D2、4M2-D9、1M2-D2、5M1-A11、4M2-D5、4M2-A8及9M2-C12染色的HEK293細胞(沒有表現VISTA)或HEK293 VISTA過度表現細胞(HEK293 VISTA O/E)。圖25A 至25D 。感應圖譜顯示4M2-C12 mIgG1與(25A )小鼠FcγRIV、(25B )小鼠FcγRIII、(25C )小鼠FcγRIIb及(25D )小鼠FcRn的結合作用之分析結果。圖26A 至26D 。感應圖譜顯示4M2-C12 mIgG2a與(26A )小鼠FcγRIV、(26B )小鼠FcγRIII、(26C )小鼠FcγRIIb及(26D )小鼠FcRn的結合作用之分析結果。圖27A 至27D 。感應圖譜顯示4M2-C12 mIgG2a LALA PG與(27A )小鼠FcγRIV、(27B )小鼠FcγRIII、(27C )小鼠FcγRIIb及(27D )小鼠FcRn的結合作用之分析結果。圖28A 至28D 。感應圖譜顯示4M2-C12 mIgG2a NQ與(28A )小鼠FcγRIV、(28B )小鼠FcγRIII、(28C )小鼠FcγRIIb及(28D )小鼠FcRn的結合作用之分析結果。圖29A 至29C 。表總結4M2-C12 mIgG1、4M2C12 mIgG2a、4M2-C12 mIgG2a LALA PG及4M2-C12 mIgG2a與小鼠FcγRIV、小鼠FcγRIII、小鼠FcγRIIb及小鼠FcRn的結合作用之分析結果。29A 顯示計算的k結合 值、29B 顯示計算的Kdis 值以及29C 顯示計算的KD 值。圖30A 至30C 。 圖表顯示一細胞株衍生的小鼠T細胞淋巴瘤模式內呈mIgG2a及mIgG2a LALA PG格式的抗-VISTA抗體殖株4M2-C12活體內 的抗癌活性分析結果。30A 顯示不同治療組的資料，30B 顯示媒介物對照及4M2-C12 mIgG2a治療組之個別小鼠獲得的資料，以及30C 顯示媒介物對照及4M2-C12 mIgG2a LALA PG治療組之個別小鼠獲得的資料。圖31A 及31B 。感應圖譜顯示由BLI分析、不同的抗-VISTA抗體之間競爭與人類VISTA結合的結果。圖32 。圖表顯示抗-VISTA抗體4M2-C12抑制VISTA與VSIG-3之間的結合作用之分析結果。圖33A 至33D 。 長條圖顯示用VISTA-Ig治療的T細胞，依CFSE稀釋分析來判定之抗-VISTA抗體回復T細胞增殖能力之分析結果。圖33A及33C顯示從使用塗覆1:1比率的促效劑抗-CD3抗體及VISTA-Ig孔的條件獲得的結果，以及圖33B及33D顯示從使用塗覆2:1比率的促效劑抗-CD3抗體及VISTA-Ig孔的條件獲得的結果。圖33A及33B顯示CFSE-低CD4+ T細胞的百分率，以及圖33C及33D顯示CFSE-低CD8+ T細胞的百分率。圖34A 及34B 。 長條圖顯示抗-VISTA抗體促進LPS-刺激的THP-1細胞生產IL-6能力之分析結果。圖34A顯示使用4M2-C12獲得的結果，以及圖34B顯示使用VSTB112獲得的結果。圖35 。 長條圖顯示從投予抗-VISTA抗體4M2-C12的小鼠，於投予前2h，及投予後0.5 hr、6 hr、24 hr及96 hr獲得的血液樣本偵測到的IL-6位準。圖36A 及36B 。 圖表顯示一細胞株衍生的小鼠結腸癌模式活體內 之抗-VISTA抗體4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗-PD-1抗體(PD1)或4M2C12 mIgG2a及抗-PD-1抗體之組合治療的抗癌活性分析結果。36A 顯示不同治療組的資料，36B 顯示媒介物對照及4M2-C12 mIgG2a +抗-PD-1治療組之個別小鼠獲得的資料。圖37 。 長條圖顯示一細胞株衍生的小鼠結腸癌模式內，從用PBS(媒介物)、抗-VISTA抗體4M2-C12 mIgG2a (V4)、抗-PD-1抗體(抗-PD1)或4M2-C12 mIgG2a及抗-PD-1抗體(組合)組合治療所治療的小鼠獲得的第22天腫瘤之g-MDSCs的腫瘤浸潤型CD45+細胞的百分率。圖38A 至38E 。 長條圖顯示一細胞株衍生的小鼠結腸癌模式，從用PBS(媒介物)、抗-VISTA抗體4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗-PD-1抗體(PD1)或4M2-C12 mIgG2a及抗-PD-1抗體(V4+PD1)組合治療所治療的小鼠獲得的第18天血清得到的(38A )IFNγ、(38B )IL-23、(38C )IL-10、(38D )IL-4及(38E)IL-5位準。圖39 。圖表顯示一細胞株衍生的小鼠結腸癌模式，從用PBS(媒介物)、抗-VISTA抗體4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗-PD-L1抗體(PDL1)或4M2-C12 mIgG2a及抗-PD-1抗體(V4+PDL1)組合治療所治療的小鼠獲得的第21天腫瘤之Arg1 RNA表現位準。圖40A 及40B 。 圖表顯示一細胞株衍生的小鼠黑色素瘤模式活體內 之抗-VISTA抗體4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗-PD-1抗體(PD1)或4M2C12 mIgG2a及抗-PD-1抗體組合治療的抗癌活性分析結果。40A 顯示不同治療組的資料，40B 顯示媒介物對照及4M2-C12 mIgG2a+抗-PD-1治療組之個別小鼠獲得的資料。圖41 。 長條圖顯示一細胞株衍生的小鼠黑色素瘤模式內，從用PBS(媒介物)、抗-VISTA抗體4M2-C12 mIgG2a (V4)、抗-PD-1抗體(抗-PD1)或4M2-C12 mIgG2a及抗-PD-1抗體(組合)組合治療所治療的小鼠獲得的第18天腫瘤之g-MDSCs的腫瘤浸潤型CD45+細胞的百分率。圖42 。 圖表顯示於一細胞株衍生的小鼠T細胞白血病/淋巴瘤模式活體內 之抗-VISTA抗體4M2-C12 mIgG2a (V4)、抗-PD-1抗體(抗-PD1)或4M2-C12 mIgG2a及抗-PD-1抗體(V4+抗-PD1)組合治療的抗癌活性分析結果。圖43 。 長條圖顯示一細胞株衍生的小鼠T細胞白血病/淋巴瘤模式，從用PBS(媒介物)、抗-VISTA抗體4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗-PD-1抗體(抗-PD1)或4M2-C12 mIgG2a及抗-PD-1抗體(組合)組合治療所治療的小鼠獲得的第16天腫瘤之g-MDSCs的腫瘤浸潤型CD45+細胞的百分率。圖44 。圖表顯示一細胞株衍生的小鼠結腸癌模式用PBS(媒介物)、抗-VISTA抗體4M2-C12 mIgG2a(V4)、抗-PD-L1抗體(抗-PDL1)或4M2-C12 mIgG2a及抗-PD-1抗體(V4+抗-PDL1)組合治療之治療過程期間的小鼠重量。圖45A 至45D 。 感應圖譜及表顯示不同的抗-VISTA抗體與人類VISTA(45A )小鼠VISTA(45B )及人類PD-L1(45C )的結合作用之分析結果，依生物層干涉術來判定。45D 總結從感應圖譜45A 及45B 計算而來的動力學及熱力學常數。圖46A 及46B 。 感應圖譜及表顯示不同的抗-VISTA抗體與小鼠VISTA的結合作用之分析結果，依生物層干涉術來判定。45B 總結從感應圖譜46A 計算而來的動力學及熱力學常數。圖47A 至47C 。 感應圖譜及表顯示不同的抗-VISTA抗體與人類VISTA(47A )及小鼠VISTA(47B )的結合作用之分析結果，依生物層干涉術來判定。47C 總結從感應圖譜47A 及47B 計算而來的動力學及熱力學常數。圖48A 及48B 。 感應圖譜及表顯示不同的抗-VISTA抗體與人類VISTA及小鼠VISTA及人類CD47的結合作用之分析結果，依生物層干涉術來判定。48B 總結從感應圖譜48A 計算而來的動力學及熱力學常數。圖49A 至49C 。 濃度-反應圖表及表顯示不同的抗體與人類VISTA(49A )或小鼠VISTA(49B )的結合作用之分析結果，依ELISA來判定。49C 顯示不同的抗體與所示的蛋白之結合EC50值(nM)。圖50A 至50C 。 濃度-反應圖表及表顯示不同的抗體與人類VISTA(50A )及小鼠VISTA(50B )的結合作用之分析結果，依ELISA來判定。50C 顯示不同的抗體與所示的蛋白之結合EC50值(nM)。圖51A 至51C 。 濃度-反應圖表及表顯示不同的抗體與人類VISTA(51A )及小鼠VISTA(51B )的結合作用之分析結果，依ELISA來判定。51C 顯示不同的抗體與所示的蛋白之結合EC50值(nM)。圖52A 至52J 。 熔化圖表及表顯示以微差掃描螢光分析法進行之不同的抗-VISTA抗體的穩定性分析的結果。52A 至52I 顯示以三複本之測試抗體製備物及無蛋白對照(NPC)製備物獲得的原始資料之第一導數(derivate)。52J 總結52A 至52I 的結果。圖53 。表總結不同的抗-VISTA抗體之安全性及免疫原性的電腦模擬 分析結果。圖54 。圖表顯示抗-VISTA抗體4M2-C12抑制VISTA與VSIG-3之間的結合作用之分析結果。圖55 。長條圖顯示抗-VISTA抗體殖株4M2-C12(V4)抑制VISTA與PSGL-1之間的結合作用之分析結果。圖56A 至56G 。 濃度-反應圖表顯示(56A )V4、(56B )V4-C24、(56C )V4-C26、(56D )V4-C27、(56E )V4-C28、(56F )V4-C30及(56G )V4-C31與人類VISTA、PD-L1、B7H3、B7H4、B7H6、B7H7、PD-1及CTLA-4的結合作用之分析結果，依ELISA來判定。圖57A 至57I 。 濃度-反應圖表顯示(57A )V4、(57B )V4-C24、(57C )V4-C26、(57D )V4-C27、(57E )V4-C28、(57F )V4-C30 (57G )V4-C31及(57H )同型匹配的對照抗體與人類VISTA、小鼠VISTA、大鼠VISTA及食蟹獼猴VISTA的結合作用之分析結果，依ELISA來判定。57I 顯示不同的抗體與所示的蛋白之結合EC50值(M)。圖58A 至58C 。 直方圖顯示依流動式細胞測量術所判定的不同抗-VISTA抗體或同型對照抗體染色的細胞。58A 顯示抗體與野生型、未轉染的HEK293-6E細胞之結合。58B 顯示抗體與過度表現人類VISTA蛋白的HEK293-6E細胞之結合。58C 顯示抗體與過度表現小鼠VISTA蛋白的HEK293-6E細胞之結合。1=無抗體(未染色)、2=人類IgG1同型對照抗體、3=VSTB112 IgG1、4=4M2-C12 IgG1、5=V4-C24 IgG1、6=V4-C26 IgG1、7=V4-C27 IgG1、8=V4-C28 IgG1、9=V4-C30 IgG1及10=V4-C31 IgG1。圖59A 及59B 。 影像顯示人類組織使用抗-VISTA抗體之免疫組織化學染色。59A 顯示由4M2-C12 mIgG2a之正常人類脾臟組織染色，及59B 顯示由4M2-C12 mIgG2a之正常人類卵巢組織染色，於所示的放大倍數下。圖60A 至60D 。 直方圖及長條圖顯示抗-VISTA抗體4M2-C12-hIgG1(V4)或VSTB112解除活化的T細胞不被表現VISTA的細胞抑制的能力之分析結果。60A 及60B 顯示在表現VISTA的細胞及所示量的抗-VISTA抗體存在下，歷時5天之T細胞增殖之CFSE稀釋分析結果。60C 及60D 顯示於5天後細胞培養上清液內偵測到的IFNγ(60C )及TNFa(60D )濃度。圖61A 至61C 。 長條圖顯示抗-VISTA抗體4M2-C12-hIgG1(V4)或VSTB112促進LPS-刺激的THP-1細胞生產細胞介素的能力之分析結果。61A 顯示細胞培養上清液內偵測到的IL-6濃度，以及61B 顯示在所示量的抗-VISTA抗體存在下歷時24小時之細胞的細胞培養上清液內偵測到的TNFa濃度。61C 顯示THP1細胞為表現VISTA的細胞；顯示出培養內判定表現VISTA的細胞之百分率。1=未染色的，2=同型匹配的對照抗體染色的細胞，3=20 μg V4染色的細胞，4=40 μg V4染色的細胞，以及5=20 μg VSTB112染色的細胞。圖62 。 長條圖顯示抗-VISTA抗體4M2-C12hIgG1或4M2-C12-hIgG4促進LPS-刺激的THP-1細胞生產IL-6的能力之分析結果。顯示出細胞培養上清液內偵測到的IL-6濃度。圖63A 至63D 。 圖表及表顯示依抗體血清的ELISA分析之抗-VISTA抗體殖株4M2-C12-hIgG1及4M2-C12-hIgG4之藥物動力學分析的結果。所示為(63A )10 mg/kg、(63B )25 mg/kg、(63C )100 mg/kg或(63D )250 mg/kg抗體投予後的結果。圖64A 至64C 。 表顯示50 mg/kg 4M2-C12-hIgG1或等體積的PBS投予96小時之後，BALB/c小鼠之代表血液剖析。64A 顯示紅血球區劃的分析結果，64B 顯示白血球區劃的分析結果，以及64C 顯示肝及腎功能關聯值的分析結果。RBC=紅血球，MVC=紅血球平均體積，MCH=平均血球血紅素，MCHC=平均血球血紅素濃度，WBC=白血球，ALT=丙胺酸轉胺酶，ALP=鹼性磷酸酶，CREA=肌酸酐，及BUN=血脲氮。圖65A 至65C 。 表顯示250 mg/kg 4M2-C12-hIgG1、250 mg/kg 4M2-C12-hIgG4或等體積的PBS投予後，SD大鼠之代表血液剖析。65A 顯示紅血球區劃的分析結果，65B 顯示白血球區劃的分析結果，以及65C 顯示肝、腎及胰功能關聯值及電解質位準的分析結果。RBC=紅血球，MVC=紅血球平均體積，MCH=平均血球血紅素，MCHC=平均血球血紅素濃度，WBC=白血球，ALT=丙胺酸轉胺酶，ALP=鹼性磷酸酶，CREA=肌酸酐，BUN=血脲氮，GLU=升糖素，AMY=澱粉酶，NA=鈉，K=鉀，P=磷及CA=鈣。
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Claims (34)

  1. 一種抗原結合分子，其可選擇地為經單離的，其能與VISTA結合且獨立於與Fc-媒介的功能而抑制VISTA-媒介的訊息傳導。
  2. 如請求項1之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：305的胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：306的胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：307的胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：308的胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的胺基酸序列之LC-CDR3。
  3. 如請求項1或請求項2之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：309的胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的胺基酸序列之LC-CDR3。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：295的胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的胺基酸序列之LC-CDR3。
  5. 如請求項1至3中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： (i)一包括有下列CDRs之重鏈可變異(VH)區域： 具有序列辨識編號：290的胺基酸序列之HC-CDR1 具有序列辨識編號：291的胺基酸序列之HC-CDR2 具有序列辨識編號：278的胺基酸序列之HC-CDR3；及 (ii)一包括有下列CDRs之輕鏈可變異(VL)區域： 具有序列辨識編號：41的胺基酸序列之LC-CDR1 具有序列辨識編號：300的胺基酸序列之LC-CDR2 具有序列辨識編號：43的胺基酸序列之LC-CDR3。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：289的胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：310的胺基酸序列有至少70%的序列同一性。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：289的胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：294的胺基酸序列有至少70%的序列同一性。
  8. 如請求項1至6中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：289的胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：297的胺基酸序列有至少70%的序列同一性。
  9. 如請求項1至6中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含： 一VH區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：289的胺基酸序列有至少70%的序列同一性；及 一VL區域，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與序列辨識編號：299的胺基酸序列有至少70%的序列同一性。
  10. 一種抗原結合分子，其可選擇地為經單離的，其包含(i)一如請求項1至9中任一項之抗原結合分子，及(ii)一能與VISTA以外的一抗原結合之抗原結合分子。
  11. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含如請求項1至10中任一項之抗原結合分子。
  12. 一種核酸或多種核酸，其可選擇地為經單離的，其編碼如請求項1至10中任一項之抗原結合分子或如請求項11之CAR。
  13. 一種表現載體或多種表現載體，其包含如請求項12之核酸或多種核酸。
  14. 一種細胞，其包含如請求項1至10中任一項之抗原結合分子、如請求項11之CAR、如請求項12之核酸或多種核酸、或如請求項13之表現載體或多種表現載體。
  15. 一種方法，其包含使一包含如請求項12之核酸或多種核酸、或如請求項13之表現載體或多種表現載體的細胞，於適合從該(等)核酸或該(等)表現載體表現該抗原結合分子或CAR的條件下予以培養。
  16. 一種組成物，其包含如請求項1至10中任一項之抗原結合分子、如請求項11之CAR、如請求項12之核酸或多種核酸、如請求項13之表現載體或多種表現載體、或如請求項14之細胞。
  17. 如請求項16之組成物，其額外包含一能抑制VISTA以外的一免疫查核點分子所媒介的訊息傳導之製劑，可選擇地其中該VISTA以外的免疫查核點分子係選自於PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT及BTLA。
  18. 一種如請求項1至10中任一項之抗原結合分子、如請求項11之CAR、如請求項12之核酸或多種核酸、如請求項13之表現載體或多種表現載體、如請求項14之細胞或如請求項16或請求項17之組成物，其供用於一醫學治療或預防(prophylaxis)的方法。
  19. 一種如請求項1至10中任一項之抗原結合分子、如請求項11之CAR、如請求項12之核酸或多種核酸、如請求項13之表現載體或多種表現載體、如請求項14之細胞，或如請求項16或請求項17之組成物，其供用於一治療或預防一癌症或一感染疾病的方法。
  20. 一種如請求項1至10中任一項之抗原結合分子、如請求項11之CAR、如請求項12之核酸或多種核酸、如請求項13之表現載體或多種表現載體、如請求項14之細胞或如請求項16或請求項17之組成物於製備一藥物之用途，該藥物供用於一治療或預防一癌症或一感染疾病的方法。
  21. 一種治療或預防一癌症或一感染疾病之方法，其包含投予一治療或預防有效量之如請求項1至10中任一項之抗原結合分子、如請求項11之CAR、如請求項12之核酸或多種核酸、如請求項13之表現載體或多種表現載體、如請求項14之細胞或如請求項16或請求項17之組成物至一個體。
  22. 如請求項19之供使用的抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、細胞或組成物、如請求項20之用途或如請求項21之方法，其中該癌症係選自於：一包含表現VISTA的細胞之癌症、一包含表現VISTA的細胞浸潤之癌症、一包含表現VISTA的癌細胞之癌症、一血液癌症、白血病、急性骨髓白血病、淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、間皮瘤、一實性腫瘤、 肺癌、非小細胞肺癌、胃癌(gastric cancer)、胃癌(gastric carcinoma)、結腸直腸癌(colorectal cancer)、結腸直腸癌(colorectal carcinoma)、結腸直腸腺癌(colorectal adenocarcinoma)、子宮癌、子宮體子宮內膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma)、乳癌(breast cancer)、三陰性侵襲性乳癌(triple negative breast invasive carcinoma)、肝癌、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、胰臟癌(pancreatic cancer)、胰臟管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma)、甲狀腺癌、胸腺瘤(thymoma)、皮膚癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、腎癌、腎臟細胞癌、腎臟乳突細胞癌(renal papillary cell carcinoma)、頭頸部癌(head and neck cancer)、頭頸部鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN))、卵巢癌(ovarian cancer)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma)、前列腺癌(prostate cancer)及/或前列腺腺癌(prostate adenocarcinoma)。
  23. 一種如請求項1至10中任一項之抗原結合分子、如請求項11之CAR、如請求項12之核酸或多種核酸、如請求項13之表現載體或多種表現載體、如請求項14之細胞或如請求項16或請求項17之組成物，其供用於一治療或預防一與骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)病理上關聯的疾病之方法。
  24. 一種如請求項1至10中任一項之抗原結合分子、如請求項11之CAR、如請求項12之核酸或多種核酸、如請求項13之表現載體或多種表現載體、如請求項14之細胞或如請求項16或請求項17之組成物於製備一藥物之用途，該藥物供用於一治療或預防一與骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)病理上關聯的疾病之方法。
  25. 一種治療或預防一與骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)病理上關聯的疾病之方法，該方法包含投予一治療或預防有效量之如請求項1至10中任一項之抗原結合分子、如請求項11之CAR、如請求項12之核酸或多種核酸、如請求項13之表現載體或多種表現載體、如請求項14之細胞或如請求項16或請求項17之組成物至一個體。
  26. 如請求項19至25中任一項之供使用的抗原結合分子、CAR、核酸或多種核酸、表現載體或多種表現載體、細胞或組成物、用途或方法，其中該方法額外包含投予一能抑制VISTA以外的一免疫查核點抑制劑所媒介的訊息傳導之製劑，可選擇地其中該VISTA以外的免疫查核點抑制劑係選自於PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT或BTLA。
  27. 一種抑制VISTA-媒介的訊息傳導之方法，其包含使表現VISTA的細胞與如請求項1至10中任一項之抗原結合分子接觸。
  28. 一種抑制骨髓衍生的抑制性細胞(MDSCs)的活性之方法，該方法包含使MDSCs與如請求項1至10中任一項之抗原結合分子接觸。
  29. 一種用於增高效應子免疫細胞(effector immune cells)之數目或活性的方法，該方法包含以如請求項1至10中任一項之抗原結合分子抑制表現VISTA的細胞之活性。
  30. 一種活體外複合物，其可選擇地為經單離的，其包含與VISTA結合之如請求項1至10中任一項之抗原結合分子。
  31. 一種方法，其包含使一含有或懷疑含有VISTA的樣本與如請求項1至10中任一項之抗原結合分子接觸，以及偵測該抗原結合分子與VISTA的複合物之形成。
  32. 一種選擇個體或將個體分組(stratifying)以供用於以一VISTA-標靶劑治療的方法，該方法包含於活體外使來自該個體的一樣本與如請求項1至10中任一項之抗原結合分子接觸以及偵測該抗原結合分子與VISTA的複合物之形成。
  33. 一種如請求項1至10中任一項之抗原結合分子作為一活體外或活體內診斷劑或預後劑之用途。
  34. 一種如請求項1至10中任一項之抗原結合分子於一用於偵測、定位或成像一癌症的方法之用途，可選擇地其中該癌症係選自於：一包含表現VISTA的細胞之癌症、一包含表現VISTA的細胞浸潤之癌症、一包含表現VISTA的癌細胞之癌症、一血液癌症、白血病、急性骨髓白血病、淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、間皮瘤、一實性腫瘤、 肺癌、非小細胞肺癌、胃癌(gastric cancer)、胃癌(gastric carcinoma)、結腸直腸癌(colorectal cancer)、結腸直腸癌(colorectal carcinoma)、結腸直腸腺癌(colorectal adenocarcinoma)、子宮癌、子宮體子宮內膜癌、乳癌(breast cancer)、三陰性侵襲性乳癌、肝癌、肝細胞癌、胰臟癌(pancreatic cancer)、胰臟管腺癌、甲狀腺癌、胸腺瘤、皮膚癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、腎癌、腎臟細胞癌、腎臟乳突細胞癌、頭頸部癌、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、卵巢癌(ovarian cancer)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、卵巢漿液性囊腺癌、前列腺癌(prostate cancer)及/或前列腺腺癌(prostate adenocarcinoma)。
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