KR20200138324A - Vista 항원 결합 분자 - Google Patents

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KR20200138324A
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Abstract

VISTA 항원 결합 분자가 개시된다. 또한 VISTA 항원 결합 분자를 인코딩하는 핵산 및 발현 벡터, 이를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법이 개시된다.

Description

VISTA 항원 결합 분자
본 출원은 2018년 3월 29일자로 출원된 PCT/EP2018/058258, 2018년 9월 7일자로 출원된 제 GB 1814562.3호 및 2018년 11월 5일자로 출원된 US 16/180,949의 우선권을 주장하며, 그의 내용 및 요소들은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 분자 생물학, 보다 구체적으로 항체 기술의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의학적 치료 및 예방 방법에 관한 것이다.
골수 유래 억제 세포 (MDSC) 매개 면역 반응 억제가 다발성 고형 종양 및 림프종에서 확인되었다. MDSC는 진행성 결장직장암에서 증가한다 (문헌[Toor et al, Front Immunol. 2016; 7: 560]). MDSC는 또한 유방암에서도 관찰되며, 말초 혈액 중 MDSC 비율은 후기 유방암 환자에서 증가한다 (문헌[Markowitz et al, Breast Cancer Res Treat. 2013 Jul; 140 (1): 13-21]). MDSC 존재량은 또한 고형 종양의 불량한 예후와 상관관계가 있다 (문헌[Charoentong et al, Cell Rep. 2017 Jan 3; 18 (1): 248-262]).
MDSC는 활성 산소 종, 산화 질소 및 아르기나제의 생성을 포함하는 다중 메커니즘을 통해 T 세포에 대해 억제를 가한다. 이는 궁극적으로 DC, NK 및 T 세포 활성을 억제하고, 종양 존재량을 증가시킨다 (문헌[Umansky et al., Vaccines (Basel) (2016) 4(4): 36]). MDSC는 또한 신생 혈관 형성, 침입, 증식 및 전이를 촉진하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinase), VEGF, bFGF, TGF-β 및 S100A8/A9와 같은 가용성 인자의 생성을 통해 종양 발생 및 전이에 관여한다.
주로 MDSC에서 발현되는 면역 체크포인트 (checkpoint) 분자인 T 세포 활성화의 V-형 면역글로불린 도메인-함유 억제인자 (VISTA)의 표적화는 효과기 면역 세포 기능의 MDSC 매개 억제를 제거하기 위한 매력적인 치료 전략이다.
WO 2017/137830 A1은 항-VISTA 항체 VSTB174를 개시하고 있으며, 이는 예를 들어 항-VISTA 항체 VSTB112의 가변 영역을 포함하는 것으로 문단 [00221]에 개시되어 있다. 문단 [00362]은 VSTB123이 VSTB174의 가변 영역을 포함한다는 것을 개시한다. 문단 [0417] 및 도 42a의 WO 2017/137830 A1의 실시예 25는 MB49 종양 모델에서 mIgG2a 항체 VSTB123이 종양 성장을 억제할 수 있음을 개시한다. 문단 [0418] 및 도 42a는 VSTB124 (IgG2a LALA 형식으로 제공된 동일한 항체임; 문단 [0408] 참조)와 달리, 종양 성장을 억제하지 않았다. 이러한 결과를 기반으로 하여, 실시예 25는 항-VISTA 항체 치료에 의한 효능에는 활성 Fc가 필요할 수 있다고 문단 [0419]에서 결론지었다. 따라서, 도 47에 개략적으로 나타낸 항-VISTA 항체에 대한 제안된 작용 메커니즘 (도 47, 문단 [0053]의 범례 참조)은 NK 세포에 의해 발현되는 FcγRIII의 Fc 매개 결합을 포함한다.
문헌[Le Mercier et al. Cancer Res. (2014) 74(7):1933-44]에는 햄스터 단일클론 항-VISTA 항체 mAb13F3이 B16OVA 및 B16-BL6 흑색종 모델에서 종양 성장을 억제함이 개시되어 있다. 1942 페이지, 왼쪽 및 오른쪽 열에 걸친 문단은 VISTA mAb의 면역원성 및 FcR 결합 활성이 최적의 표적 중화 및 치료 효능을 달성하는데 중요한 제한 인자가 될 수 있음을 교시하고 있다.
제1 양상에서 본 발명은 Fc-매개 기능(Fc-mediated function)에 독립적으로, VISTA와 결합하고 VISTA-매개 신호전달(signalling)을 억제할 수 있는, 선택적으로 단리된, 항원 결합 분자를 제공한다.
또한 VISTA에 결합하고 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있는, 선택적으로 단리된, 항원 결합 분자로서, 항원 결합 분자는 Fc-매개 항체 효과기 기능을 유도할 수 없는 항원 결합 분자가 제공된다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 없고/거나, 항체-의존적 세포-매개 식세포작용 (ADCP)을 유도할 수 없고/거나, 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 유도할 수 없다.
또한 VISTA에 결합하고 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있는, 선택적으로 단리된, 항원 결합 분자로서, 항원 결합 분자는 Fcγ 수용체에 결합할 수 없고/거나, 항원 결합 분자는 C1q에 결합할 수 없는 항원 결합 분자가 제공된다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 Ig-유사 V-형 도메인에서 VISTA에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA에 대한 결합에 대해, IGN175A와 경쟁하지 않는다 (예를 들어, 실시예 8에 기재된 바와 같은, 예를 들어 에피토프 비닝 분석 (epitope binning analysis)에 의해 측정되는 바와 같음).
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 275의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 305의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 306의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 307의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 308의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 244의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 245의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 309의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 295 또는 서열번호 300의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 295의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 300의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 277의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 286의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 300의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 96의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 137의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 138의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 139의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 107의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 114의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 115의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 120의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 121의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 122의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 127의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 128의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 129의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 145의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 146의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 151의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 152의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 153의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 158의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 159의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 160의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 165의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 152의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 153의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 169의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 170의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 171의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 177의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 179의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 246의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 247의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 185의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 189의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 195의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 197의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 200의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 203의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 310의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 294, 서열번호 297 또는 서열번호 299 중 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 294의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 297의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 299의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 301의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 302의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 303의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 276의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 282의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 285의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 287의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
서열번호 32의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 40의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 52의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 57의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 62의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 66의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는.
서열번호 87의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 95의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 106의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 113의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 143의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 150의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 157의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 164의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 71의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 79의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 102의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 104의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 119의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 126의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 183의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 188의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 194의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 196의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 199의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 202의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 133의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 136의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 168의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 176의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 인간 VISTA 및 마우스 VISTA 및 시노몰구스 마카퀴 (cynomolgus macaque) VISTA 중 하나 이상에 결합할 수 있다.
또한 (i) 본 발명에 따른 항원 결합 분자, 및 (ii) VISTA 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 포함하는 선택적으로 단리된, 항원 결합 분자가 제공된다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 세포 표면에서 VISTA를 발현하는 세포에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA와 VISTA의 결합 파트너 사이의 상호작용을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 효과기 면역 세포에 의한 증식 및/또는 사이토카인 생성을 증가시킬 수 있다.
또한 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)가 제공된다.
또한 본 발명에 따른 항원 결합 분자 또는 CAR을 인코딩(encoding)하는 선택적으로 단리된 핵산 또는 다수의 핵산이 제공된다.
또한 본 발명에 따른 핵산 또는 다수의 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터가 제공된다.
또한 본 발명에 따른 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
또한 핵산(들) 또는 발현 벡터(들)로부터의 항원 결합 분자 또는 CAR의 발현에 적합한 조건 하에 본 발명에 따른 핵산 또는 다수의 핵산 또는 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 본 발명에 따른 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 VISTA 이외의 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제(agent)를 추가로 포함하고, 선택적으로 VISTA 이외의 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT 및 BTLA로부터 선택된다.
또한 의학적 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물이 제공된다.
또한 암 또는 감염성 질병의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물이 제공된다.
또한 암 또는 감염성 질병의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물의 용도가 제공된다.
또한 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 본 발명의 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질병의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 암은 VISTA를 발현하는 세포를 포함하는 암, VISTA를 발현하는 세포의 침윤을 포함하는 암, VISTA를 발현하는 암 세포를 포함하는 암, 혈액암 (hematological cancer), 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 다발성 골수종, 중피종 (mesothelioma), 고형 종양 (solid tumor), 폐암, 비 소세포 폐 암종 (non-small cell lung carcinoma), 위암, 위 암종 (gastric carcinoma), 결장직장암 (colorectal cancer), 결장직장 암종 (colorectal carcinoma), 결장직장 선암종 (colorectal adenocarcinoma), 자궁암, 자궁 체부 내막 암종 (uterine corpus endometrial carcinoma), 유방암, 삼중 음성 침습성 유방 암종 (triple negative breast invasive carcinoma), 간암, 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma), 췌장암, 췌관 선암종 (pancreatic ductal adenocarcinoma), 갑상선암, 흉선종 (thymoma), 피부암, 흑색종 (melanoma), 피부 흑색종 (cutaneous melanoma), 신장암, 신세포 암종 (renal cell carcinoma), 유두 신세포 암종 (renal papillary cell carcinoma), 두경부암 (head and neck cancer), 두경부의 편평 세포 암종 (squamous cell carcinoma of the head and neck) (SCCHN), 난소암, 난소 암종 (ovarian carcinoma), 난소 장액성 낭샘암종 (ovarian serous cystadenocarcinoma), 전립선 암 및/또는 전립선 선암종으로부터 선택된다.
또한 골수-유래 억제 세포 (MDSC)가 병리적으로 관련된 질병의 치료 또는 예방의 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물이 제공된다.
또한 질병의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물의 용도로서, 골수-유래 억제 세포 (MDSC)가 병리적으로 관련된 용도가 제공된다.
또한 골수-유래 억제 세포 (MDSC)가 병리적으로 관련되고, 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 본 발명의 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 VISTA 이외의 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제의 투여를 추가로 포함하고, 선택적으로 VISTA 이외의 면역 체크포인트 분자는 PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT 또는 BTLA로부터 선택된다.
또한 VISTA-매개 신호전달을 억제하는 방법으로서, VISTA-발현 세포와 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 골수-유래 억제 세포 (MDSC)의 활성을 억제하기 위한 방법이 제공되고, 본 방법은 MDSC와 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다.
또한 효과기 면역 세포의 수 또는 활성을 증가시키기 위한 방법이 제공되고, 본 방법은 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 사용하여 VISTA-발현 세포의 활성을 억제하는 단계를 포함한다.
또한 VISTA에 결합된 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 포함하는 선택적으로 단리된 시험관내 복합체가 제공된다.
또한 VISTA를 포함하거나 포함하는 것으로 추측되는 샘플과 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계, 및 항원 결합 분자와 VISTA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 VISTA-표적화된 제제를 사용한 치료를 위해 대상체를 선택하거나 계층화(stratifying)하는 방법이 제공되고, 본 방법은 시험관내에서, 대상체로부터의 샘플과 본 발명에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계 및 항원 결합 분자와 VISTA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다.
또한 시험관내 또는 생체내 진단제 또는 예후제로서의 본 발명에 따른 항원 결합 분자의 용도가 제공된다.
또한 암을 검출하거나, 국재화하거나 영상화하는 방법에서의 본 발명에 따른 항원 결합 분자의 용도로서, 선택적으로 암은 VISTA를 발현하는 세포를 포함하는 암, VISTA를 발현하는 세포의 침윤을 포함하는 암, VISTA를 발현하는 암 세포를 포함하는 암, 혈액암, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 다발성 골수종, 중피종, 고형 종양, 폐암, 비 소세포 폐 암종, 위암, 위 암종, 결장직장암, 결장직장 암종, 결장직장 선암종, 자궁암, 자궁 체부 내막 암종, 유방암, 삼중 음성 침습성 유방 암종, 간암, 간세포 암종, 췌장암, 췌관 선암종, 갑상선암, 흉선종, 피부암, 흑색종, 피부 흑색종, 신장암, 신세포 암종, 유두 신세포 암종, 두경부암, 두경부의 편평 세포 암종 (SCCHN), 난소암, 난소 암종, 난소 장액성 낭샘암종, 전립선 암 및/또는 전립선 선암종으로부터 선택되는 용도가 제공된다.
상세한 설명
본 발명은 공지된 항-VISTA 항체와 비교하여 신규하고/거나 개선된 특성을 갖는 신규한 VISTA-결합 분자에 관한 것이다.
본 발명자들은 VISTA의 세포외 영역의 특정 대상 영역에 결합하는 항원 결합 분자를 생성하였다. 본 발명의 VISTA 결합 분자는 종래 기술에 개시된 VISTA 결합 항원 결합 분자와 비교하여 적절한 생물물리적 및 기능적 특성의 조합을 제공한다.
특히, 본 명세서에 기재된 VISTA 결합 분자는 Fc 매개 기능이 필요하지 않은 메커니즘을 통해 VISTA 매개 신호전달에 길항작용할 수 있는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 Fcγ 수용체 및/또는 C1q에 결합하는 능력이 부재하는 Fc를 포함하는 본 명세서에 기재된 VISTA 결합 분자가 생체내에서 치료적 항암 효과를 제공할 수 있음을 입증한다.
본 발명자들은 Fc-매개 효과기 기능이 필요하지 않은 메커니즘을 통해 VISTA-매개 신호전달에 직접적으로 길항작용하는 것이 가능하다는 것을 처음으로 확립하였다 (예를 들어, VISTA-발현 세포에 대한 ADCC/ADCP/CDC).
본 개시내용의 VISTA 결합 분자는 공지된 항-VISTA 항체가 표적화하는 영역과 상이한 VISTA 영역을 표적화한다. VISTA의 특정 영역을 표적화하는 항원 결합 분자는 Fc 매개 효과기 기능의 필요 없이 VISTA 매개 신호에 길항작용할 수 있다.
따라서 본 명세서에 개시된 VISTA-결합 분자는 VISTA 발현 세포를 고갈시키지 않으면서 VISTA-매개 신호전달을 억제하는데 유용하다. 이는, VISTA가 고갈되는 것이 바람직하지 않은 세포에서 VISTA가 발현되기 때문에 중요하다. 따라서 본 명세서에 개시된 VISTA-결합 분자는 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서 VISTA 매개 신호전달을 억제할 수 있다.
본 명세서에 개시된 VISTA 결합 분자는 또한 유리하게는 VISTA 매개 억제로부터 T 세포를 방출할 수 있는 것으로 나타났다. 구체적으로, 본 명세서에 개시된 VISTA-결합 분자는 T 세포 증식 및 예를 들어 VISTA 또는 VISTA 발현 세포의 존재 하에 배양된 T 세포로부터의 IFNγ 및 TNFa의 생성을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다.
VISTA, 결합 파트너 및 VISTA-매개 신호전달
V형 면역글로불린 도메인-함유 T-세포 활성화 억제인자 (VISTA; B7-H5, SISP1, PD-1H로도 공지됨)는 UniProt Q9H7M9에 의해 확인된 단백질이며, 서열번호 1 (Q9H7M9-1, v3)에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. VISTA의 구조 및 기능이 문헌[Lines et al., Cancer Res. (2014) 74 (7): 1924-1932]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. VISTA는 면역 체크포인트로서 기능하며, C10orf54 유전자에 의해 인코딩되는 약 50 kDa 단일 패스 I형 막관통이다. VISTA의 세포외 도메인은 PD-L1과 상동성이다.
서열번호 1의 N-말단 32개 아미노산은 신호 펩타이드를 구성하므로, VISTA의 성숙한 형태 (즉, 신호 펩타이드를 제거하기 위한 처리 후)는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 서열번호 1의 위치 33 내지 194는 세포외 도메인 (서열번호 3)을 형성하고, 위치 195 내지 215는 막관통 도메인 (서열번호 4)을 형성하고, 위치 216 내지 311은 세포질 도메인 (서열번호 5)을 형성한다. 세포외 도메인은 Ig-유사 V형 도메인 (서열번호 1의 위치 33 내지 168, 서열번호 6에 제시됨)을 포함한다.
본 명세서에서, "VISTA"은 임의의 종(species)으로부터의 VISTA을 지칭하며 임의의 종으로부터의 VISTA 이소형, 단편, 변이체 (돌연변이 포함) 또는 상동체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단백질의 "단편", "변이체" 또는 "상동체"는 참조 단백질(예컨대, 참조 이소형)의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것으로 선택적으로 특징화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 참조 단백질의 단편, 변이체, 이소형 및 상동체는 참조 단백질에 의해 수행된 기능을 수행하는 능력에 의해 특징화될 수 있다.
"단편"은 참조 단백질의 분획을 일반적으로 지칭한다. "변이체"는 일반적으로 참조 단백질의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 다른 변형을 포함하는 아미노산 서열을 갖지만, 참조 단백질의 아미노산 서열에 대해 고려할만한 정도의 서열 동일성(예컨대, 적어도 60%)을 보유하는 단백질을 지칭한다. "이소형"은 일반적으로 참조 단백질의 종과 동일한 종에 의해 발현된 참조 단백질의 변이체를 지칭한다. "상동체"는 일반적으로 참조 단백질의 종과 비교하여 상이한 종에 의해 생성된 참조 단백질의 변이체를 지칭한다. 상동체는 오르소로그(orthologue)를 포함한다.
"단편"은, 선택적으로 참조 단백질(즉, 이로부터 단편이 유래된 단백질)의 길이의 적어도 20%일 수 있고 참조 단백질의 길이의 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 하나의 아미노산의 최대 길이를 가질 수 있지만, 임의의 길이(아미노산 수에 의한)일 수 있다. VISTA의 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250 또는 300개 아미노산 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있고 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250 또는 300개 아미노산 중 하나의 아미노산의 최대 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, VISTA은 포유류로부터의 VISTA (예컨대, 영장류(레서스, 시노몰구스(cynomolgus), 비-사람 영장류 또는 사람) 및/또는 설치류(예컨대, 랫트 또는 쥣과동물) VISTA)이다. VISTA의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 소정의 종, 예컨대, 사람으로부터의 미성숙 또는 성숙한 CD47 이소형의 아미노산 서열에 대해 적어도 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (아미노산 서열 동일성) 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것으로 선택적으로 특징화될 수 있다.
이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, 예를 들어 기능적 특성/활성에 대한 적절한 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 참조 VISTA의 기능적 특성/활성을 갖는 기능적 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체일 수 있다. 예를 들어, VISTA의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 예를 들어 VSIG-3 및/또는 PSGL-1과 관련성을 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, VISTA는 서열번호 1 또는 2에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, VISTA의 단편은 서열번호 2, 3 또는 6 중 하나에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
VISTA는 단백질의 B7 계열의 구성원이며, 주로 백혈구, 특히 CD14+ 단핵구 (단핵구 유래 억제 세포 (MDSC) 포함) 및 CD33+ 골수 세포에 의해 발현된다. VISTA는 또한 CD56+ NK 세포, 수지상 세포에서 발현되며, CD4+ 및 CD8+ T 세포에서는 더 작은 수준으로 발현된다. VISTA는 MDSC, 특히 종양 침윤 MDSC 및 또한 종양 침윤 골수 DC (문헌[Le Mercier et al, Cancer Res. (2014) 74 (7): 1933-44])뿐만 아니라, 종양-관련 대식세포 (TAM) 및 호중구에서 고도로 발현된다.
VISTA가 T 세포 효과기 기능을 억제하고, 말초 내성을 유지하기 위해 T 세포 상의 리간드 및 수용체 둘 다로 작용할 수 있으며; VISTA를 과발현하도록 조작된 종양은 면역 제어를 회피하고, VISTA를 과발현하지 않는 종양보다 더 빨리 성장함이 입증되었다 (문헌[Wang et al., Journal of Experimental Medicine. (2011) 208 (3): 577-92; Lines et al., Cancer Res. (2014) 74(7): 1924-1932]). VISTA는 CD4+ T 세포의 공동 억제 수용체 또는 T 세포의 공동 억제 리간드인 것으로 나타났다. VISTA-/-CD4+ T 세포는 야생형 CD4+ T 세포보다 더 강한 항원 특이적 증식 및 사이토카인 생성을 나타내는 것으로 보고되었으며, 이는 VISTA가 CD4+ T 세포에서 억제 수용체로 기능함을 시사한다. 단일클론 항-VISTA 항체를 사용한 VISTA 기능 차단은 종양 미세환경 내에서 종양 반응성 T 세포의 침윤, 증식 및 효과기 기능을 향상시키는 것으로 나타났다 (문헌[Le Mercier et al, Cancer Res. (2014) 74 (7): 1933-4}).
VISTA는 VSIG-3 (IGSF11)과 상호작용하는 것으로 제안되었고, 예를 들어, 문헌[Wang et al., J Immunol (2017), 198 (1 Supplement) 154.1]을 참조하며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 활성화된 T 세포에서 VISTA를 통한 VSIG-3의 관여는 T 세포 증식을 억제하고, 사이토카인 및 케모카인 예컨대, IFN-γ, IL-2, IL-17, CCL5/RANTES, CCL3/MIP-1a, 및 CXCL11/I-TAC의 생성을 감소시킨다.
VSIG-3은 UniProt Q5DX21에 의해 확인된 단백질이다. 인간 IGSF11 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA의 대안적인 스플라이싱은 3개의 상이한 이소형 이소형 1 (UniProt: Q5DX21-1, v3; 서열번호 7); 이소형 2 (UniProt: Q5DX21-2; 서열번호 8) (위치 1 내지 17에서 서열번호 7과 상이한 서열을 포함함) 및 이소형 3 (UniProt: Q5DX21-3; 서열번호 9) (위치 1 내지 17에서 서열번호 7과 상이한 서열을 포함하고, 또한 위치 211 내지 235에서 서열번호 7과 상이한 서열을 포함함)을 생성한다.
서열번호 7, 8 및 9의 N-말단 22개 아미노산은 신호 펩타이드를 구성하므로, 성숙한 형태의 VSIG-3 이소형 1, 2 및 3 (즉, 신호 펩타이드를 제거하기 위한 처리 후)은 각각 서열번호 10, 11 및 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 서열번호 7 및 8의 위치 23 내지 241은 VSIG-3 이소형 1 및 2의 세포외 도메인 (서열번호 13)을 형성하고, 서열번호 9의 위치 23 내지 216은 VSIG-3 이소형 3의 세포외 도메인 (서열번호 14)을 형성한다. VSIG-3의 막관통 도메인은 서열번호 15에 제시되고, 세포질 도메인은 서열번호 16에 제시된다. 세포외 도메인은 Ig-유사 V형 도메인 (서열번호 17에 제시됨)을 포함하고, VSIG-3 이소형 1 및 2의 세포외 도메인은 Ig-유사 C2형 도메인 (서열번호 18에 제시됨)을 추가로 포함한다.
본 명세서에서 "VSIG-3"은 임의의 종으로부터의 VSIG-3을 지칭하고, 임의의 종으로부터의 VSIG-3 이소형, 단편, 변이체 (돌연변이 포함) 또는 상동체를 포함한다.
VSIG-3의 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개의 아미노산 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있으며, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개의 아미노산 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, VSIG-3은 포유류 유래 VSIG-3 (예를 들어, 영장류 (레서스, 시노몰구스, 비인간 영장류 또는 인간) 및/또는 설치류 (예를 들어, 랫트 또는 쥣과동물) VSIG-3)이다. VSIG-3의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로 소정의 종, 예를 들어, 인간으로부터의 미성숙 또는 성숙 VSIG-3 이소형의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로 기능적 특성/활성에 적합한 분석에 의한 분석으로 측정된 바와 같이, 예컨대, 참조 VSIG-3의 기능적 특성/활성을 갖는 기능적 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체일 수 있다. 예를 들면, VSIG-3의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는, 예를 들어 VISTA와의 관련성을 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, VSIG-3은 서열번호 7 내지 12 중 하나에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, VSIG-3의 단편은 서열번호 10 내지 14, 17 또는 18 중 하나에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
VISTA는 또한 VSIG-8과 상호작용하는 것으로 제안되었으며, 예를 들어 WO/2016/090347 A1을 참조한다. VSIG-8은 UniProt P0DPA2에 의해 확인된 단백질 (서열번호 19)이다. 서열번호 19의 N-말단 21개의 아미노산은 신호 펩타이드를 구성하므로, 성숙한 형태의 VSIG-8 (즉, 신호 펩타이드를 제거하기 위한 처리 후)은 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 서열번호 19의 위치 22 내지 263은 VSIG-8의 세포외 도메인 (서열번호 21)을 형성한다. VSIG-8의 막관통 도메인은 서열번호 22에 제시되고, 세포질 도메인은 서열번호 23에 제시된다. 세포외 도메인은 Ig-유사 V형 도메인 1 (서열번호 24에 제시됨) 및 Ig-유사 V형 도메인 2 (서열번호 25에 제시됨)를 포함한다.
본 명세서에서 "VSIG-8"은 임의의 종으로부터의 VSIG-8을 지칭하고, 임의의 종으로부터의 VSIG-8 이소형, 단편, 변이체 (돌연변이 포함) 또는 상동체를 포함한다.
VSIG-8의 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개의 아미노산 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있으며, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개의 아미노산 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, VSIG-8은 포유류 유래 VSIG-8 (예를 들어, 영장류 (레서스, 시노몰구스, 비인간 영장류 또는 인간) 및/또는 설치류 (예를 들어, 랫트 또는 쥣과동물) VSIG-8)이다. VSIG-8의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로 소정의 종, 예를 들어, 인간으로부터의 미성숙 또는 성숙 VSIG-8 이소형의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, 예를 들어 기능적 특성/활성에 대한 적절한 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 참조 VSIG-8의 기능적 특성/활성을 갖는 기능적 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체일 수 있다. 예를 들어, VSIG-8의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 예를 들어 VISTA와 관련성을 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, VSIG-8은 서열번호 19 또는 20에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, VSIG-8의 단편은 서열번호 20, 21, 24 또는 25 중 하나에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
VISTA는 또한 PSGL-1과 상호작용하는 것으로 제한되었으며, 예를 들어 WO 2018/132476 A1을 참조한다. PSGL-1 이소형 1은 UniProt Q14242-1에 의해 확인된 단백질 (서열번호 323)이다. PSGL-1 이소형 2는 UniProt Q14242-2에 의해 확인된 단백질 (서열번호 324)이며, 서열번호 323의 위치 1 후의 추가의 16개의 아미노산을 포함한다는 점에서 PSGL-1 이소형 1과 상이하다.
서열번호 323의 N-말단 17개 아미노산은 신호 펩타이드를 구성하므로, 성숙한 형태의 PSGL-1 (즉, 신호 펩타이드를 제거하기 위한 처리 후)은 서열번호 325에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 서열번호 323의 위치 18 내지 320은 PSGL-1의 세포외 도메인 (서열번호 326)을 형성한다. PSGL-1의 막관통 도메인은 서열번호 327에 제시되고, 세포질 도메인은 서열번호 328에 제시된다. 세포외 도메인은 12, 10개의 아미노산 탠덤 반복을 포함하고; 반복 영역은 서열번호 329에 제시되어 있다.
본 명세서에서 "PSGL-1"은 임의의 종으로부터의 PSGL-1을 지칭하고, 임의의 종으로부터의 PSGL-1 이소형, 단편, 변이체 (돌연변이 포함) 또는 상동체를 포함한다.
PSGL-1의 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개의 아미노산 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있으며, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개의 아미노산 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, PSGL-1은 포유류 유래 PSGL-1 (예를 들어, 영장류 (레서스, 시노몰구스, 비인간 영장류 또는 인간) 및/또는 설치류 (예를 들어, 랫트 또는 쥣과동물) PSGL-1)이다. PSGL-1의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로 소정의 종, 예를 들어, 인간으로부터의 미성숙 또는 성숙 PSGL-1 이소형의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, 예를 들어 기능적 특성/활성에 대한 적절한 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 참조 PSGL-1의 기능적 특성/활성을 갖는 기능적 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체일 수 있다. 예를 들어, PSGL-1의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 예를 들어 VISTA와 관련성을 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, PSGL-1은 서열번호 323 또는 324에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, PSGL-1의 단편은 서열번호 325, 326 또는 329 중 하나에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
표적 분자 상의 특정 대상 영역
본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA의 특정 대상 영역을 표적화하도록 특별히 설계되었다. 2 단계 접근법에서, 예측된 항원성, 기능 및 안전성에 대한 분석 후 표적화할 VISTA 영역을 선택하였다. 그 후 표적 영역에 해당하는 펩타이드를 면역원으로 사용하여 특정 단일클론 항체를 생성하고, 후속 스크리닝을 통해 천연 상태에서 VISTA에 결합할 수 있는 항체를 확인하여, VISTA의 표적 영역에 특이적인 항체를 제조하였다. 이 접근법은 항체 에피토프에 대한 정교한 제어를 제공한다.
본 발명의 항원 결합 분자는 이들이 결합하는 VISTA 영역을 참조하여 규정할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA의 특정 대상 영역에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 인접하는 아미노산 서열 (즉, 아미노산 1차 서열)로 구성된 VISTA의 선형 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 아미노산 서열의 불연속 아미노산 서열로 구성된 VISTA의 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA의 세포외 영역 (예를 들어, 서열번호 3에 제시된 영역)에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA의 Ig-유사 V-형 도메인 (예를 들어, 서열번호 6에 제시된 영역)에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 1의 위치 61 내지 162에 해당하는 영역 (서열번호 31에 제시됨)의 VISTA에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 322에 제시된 VISTA의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 26에 제시된 VISTA의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 27에 제시된 VISTA의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 28에 제시된 VISTA의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 29에 제시된 VISTA의 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 30에 제시된 VISTA의 영역에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 271에 제시된 VISTA의 영역에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 272에 제시된 VISTA의 영역에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 273에 제시된 VISTA의 영역에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 274에 제시된 VISTA의 영역에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 275에 제시된 VISTA의 영역에 결합하지 않는다.
항체가 결합하는 펩타이드/폴리펩타이드의 영역은 항체-항원 복합체의 X-선 공결정학 분석, 펩타이드 스캐닝, 돌연변이 유발 맵핑, 질량 분석법에 의한 수소-중수소 교환 분석, 파지 디스플레이, 경쟁 ELISA 및 단백질 분해 기반 '보호' 방법을 포함하여 당 업계에 널리 공지된 다양한 방법을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌[Gershoni et al., BioDrugs, 2007, 21(3): 145-156]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA의 동일한 영역 또는 VISTA의 중첩 영역을 본 명세서에 기재된 항체 클론 4M2-C12, 4M2-B4, 4M2-C9, 4M2-D9, 4M2-D5, 4M2-A8, V4H1, V4H2, V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30, V4-C31, 2M1-B12, 2M1-D2, 1M2-D2, 13D5p, 13D5-1, 13D5-13, 5M1-A11 또는 9M2-C12 중 하나의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 VISTA의 영역에 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 단량체 사슬을 지칭한다. 펩타이드는 통상적으로 약 2 내지 50개의 아미노산 영역의 길이를 갖는다. "폴리펩타이드"는 2개 이상의 펩타이드의 중합체 사슬이다. 폴리펩타이드는 일반적으로 약 50개 아미노산보다 긴 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 서열번호 1, 2, 3, 6 또는 31 중 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 322의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 271의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 272의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 273의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 274의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 275의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없다.
소정의 펩타이드/폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 분자의 능력은 ELISA에 의한 분석, 면역블롯 (예를 들어, 웨스턴블롯), 면역침전, 표면 플라스몬 공명 (SPR; 예를 들어, 문헌[Hearty et al., Methods Mol Biol (2012) 907:411-442] 참조) 또는 생물층 간섭계 (예를 들어, 문헌[Lad et al., (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507] 참조)을 포함하여 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다.
항원 결합 분자가 참조 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있는 실시형태에서, 상기 펩타이드/폴리펩타이드는 참조 아미노산 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에 하나 이상의 추가 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 펩타이드/폴리펩타이드는 참조 아미노산 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에 예를 들어, 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 1 내지 40, 1 내지 50, 5 내지 10, 5 내지 20, 5 내지 30, 5 내지 40, 5 내지 50, 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 20 내지 30, 20 내지 40 또는 20 내지 50개의 추가의 아미노산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 참조 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단 (즉, N-말단 및 C-말단)에 제공된 추가 아미노산 (들)은 VISTA의 아미노산 서열과 관련하여 참조 서열의 말단 위치에 해당한다. 예를 들어, 항원 결합 분자가 서열번호 26의 서열 및 서열번호 26의 C-말단에 추가의 2개의 아미노산을 포함하는 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있는 경우, 추가의 2개의 아미노산은 아르기닌 및 아스파라긴일 수 있으며, 이는 서열번호 1의 위치 90 및 91에 해당한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 본 명세서에 기재된 항체 클론 4M2-C12, 4M2-B4, 4M2-C9, 4M2-D9, 4M2-D5, 4M2-A8, V4H1, V4H2, V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30, V4-C31, 2M1-B12, 2M1-D2, 1M2-D2, 13D5p, 13D5-1, 13D5-13, 5M1-A11 또는 9M2-C12 중 하나의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 펩타이드/폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
골수-유래 억제 세포 (MDSC)
골수-유래 억제 세포 (MDSC)는 면역억제 표현형을 특징으로 하는 골수 세포 계통의 이종 면역 세포 그룹이다. MDSC 생물학은 문헌[Kumar et al., Trends Immunol. (2016); 37(3): 208-220]에서 검토할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
MDSC는 성숙 골수 세포 (즉, 대식세포, 수지상 세포 및 호중구)로부터 이들 세포를 구별시키는 다수의 생화학적 및 게놈 특징, 예를 들어 NADPH 산화 효소 (Nox2)의 발현 증가, 활성 산소 종 (ROS) (예를 들어, 초산화물 음이온 (O2-), 과산화수소 (H2O2) 및 퍼옥시니트라이트 (PNT; ONOO-))의 생성 증가; 아르기나제 1 및 산화 질소 합성효소 2 (nos2)의 발현 증가 및 산화 질소 (NO) 생성 증가; c/EBPβ 및 STAT3의 발현 증가; IRF8 발현 감소; 및 S100A8/9 단백질의 생성 증가를 특징으로 한다.
MDSC에는 두 가지 상이한 유형이 있고; 다형핵 MDSC (PMN-MDSC)는 호중구와 형태 및 표현형이 유사하며, 단핵구 MDSC (M-MDSC)는 단핵구와 더 유사하다. MDSC의 형태 및 표현형 특성은 예를 들어 문헌[Marvel and Gabrilovich J Clin Invest. 2015 Sep 1; 125(9): 3356-3364]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 마우스에서 MDSC는 CD11b+Gr1+ 세포로 광범위하게 확인된다. Gr-1hi 세포는 대부분 PMN-MDSC, 및 Gr-1lo 세포는 대부분 M-MDSC이다. 이러한 하위세트는 Ly6C 및 Ly6G 마커를 기반으로 보다 정확하게 확인할 수 있고; M-MDSC는 CD11b+Ly6ChiLy6G-이며, PMN-MDSC는 CD11b+Ly6CloLy6G+이다. 인간의 경우 MDSC는 단핵 분획에서 확인된다. PMN-MDSC는 CD14-CD11b+CD33+CD15+ 또는 CD66b+ 세포이며, M-MDSC는 CD14+HLA-DR-/lo 세포이다. Lin-HLA-DR-CD33+ MDSC의 집합은 골수 전구세포가 다존재하는 혼합 세포 그룹을 나타낸다.
MDSC-매개 면역 억제와 관련된 인자는 아르기나제 (ARG1), 유도성 NOS (iNOS), TGF-β, IL-10 및 COX2의 발현, 시스테인의 제거, T 세포에 의한 l-셀렉틴 (selectin)의 발현 감소, 및 Treg의 유도를 포함한다. M-MDSC와 PMN-MDSC는 상이한 면역억제 메커니즘을 사용한다. M-MDSC는 NO 및 사이토카인의 생성을 통해 항원 특이적 및 비특이적 T 세포 반응을 둘 모두 억제하며, PMN-MDSC보다 더 강력한 면역억제력을 갖는다. PMN-MDSC는 ROS 생성을 통해 항원 특이적 방식으로 면역 반응을 억제한다.
MDSC는 암 및 감염성 질병의 발생 및 진행에 병리학적으로 관여한다. 인간 질병에서 MDSC의 역할은 예를 들어 문헌[Kumar et al., Trends Immunol. (2016); 37(3): 208-220 (본 명세서에 참조로 포함됨) 및 Greten et al., Int Immunopharmacol. (2011) 11(7):802-807]에서 검토할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. MDSC는 종양 조직에 다존재하고, 다중 메커니즘을 통해 암의 발달 및 진행에 관여하며, 이는 예를 들어, 문헌[Umansky et al., Vaccines (Basel) (2016) 4(4):36]에서 검토할 수 있다. MDSC는 케모카인 발현을 통해 종양 부위로 집합되고, 종양 미세환경의 전염증 인자는 MDSC에 의한 면역억제 기능의 유의한 상향 조절을 초래한다. MDSC는 효과기 면역 세포 기능 (예를 들어, 효과기 T 세포 및 NK 세포 기능)의 억제, 조절 T 세포 생성/활성 촉진, VEGF 및 bFGF와 같은 성장 인자 생성, 및 ECM-변형 인자, 예컨대 매트릭스 메탈로프로테이나제의 생성을 통해 종양 발생, 혈관 신생 및 전이에 관여한다.
MDSC는 VISTA의 발현과 관련하여 특성화될 수 있다. 본 발명의 다양한 양상의 실시형태에서, MDSC는 "VISTA-발현 MDSC" 또는 "VISTA+ MDSC"일 수 있다. MDSC는 세포 표면에서 VISTA를 발현할 수 있다 (즉, VISTA는 세포막 내 또는 세포막에 발현될 수 있음).
항원 결합 분자
본 발명은 VISTA에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 제공한다.
"항원-결합 분자"는 표적 항원에 결합할 수 있는 분자를 지칭하며, 관련 표적 분자(들)에 대한 결합을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다클론 항체, 단일특이적인(monospecific) 및 다중특이적인 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편(예컨대, Fv, scFv, Fab, scFab, F(ab')2, Fab2, 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody), scFv-Fc, 미니보디(minibody), 단일 도메인 항체(예컨대, VhH 등)를 포함한다.
본 발명의 항원-결합 분자는 표적 항원(들)에 결합할 수 있는 모이어티(moiety)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원에 결합할 수 있는 모이어티는 표적 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원에 결합할 수 있는 모이어티는 표적 항원에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer), 예컨대 핵산 앱타머를 포함하거나 이로 이루어진다(예를 들면, Zhou and Rossi Nat Rev Drug Discov. 2017 16(3):181-202에서 검토됨). 일부 실시형태에서, 표적 항원에 결합할 수 있는 모이어티는 항원-결합 펩타이드/폴리펩타이드, 예컨대, 펩타이드 앱타머, 티오레독신, 모노보디, 안티칼린, 쿠니츠 도메인(Kunitz domain), 아비머(avimer), 노틴(knottin), 피노머(fynomer), 아트리머(atrimer), DARPin, 아피보디(affibody), 나노보디(nanobody)(즉, 단일-도메인 항체(sdAb)) 아필린, 아르마딜로 반복 단백질(ArmRP), OBody 또는 피브로넥틴을 포함하거나 이로 이루어진다(예컨대, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 Reverdatto et al., Curr Top Med Chem. 2015; 15(12): 1082-1101에서 검토됨)(참조: 또한 예컨대, Boersma et al., J Biol Chem (2011) 286:41273-85 and Emanuel et al., Mabs (2011) 3:38-48).
본 발명의 항원-결합 분자는 일반적으로 표적 항원에 특이적 결합할 수 있는 항체의 VH 및 VL을 포함하는 항원-결합 도메인을 포함한다. VH 및 VL에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 또한 본 명세서에서 Fv 영역으로서 지칭될 수 있다.
항원-결합 분자는 항원-결합 폴리펩타이드, 또는 항원-결합 폴리펩타이드 복합체일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 항원-결합 분자는 항원-결합 도메인을 함께 형성하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 공유결합적으로 또는 비-공유결합적으로 회합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드(예컨대, VH 및 VL을 포함하는 scFv의 경우, 또는 VH-CH1 및 VL-CL을 포함하는 scFab의 경우)를 포함하는 보다 큰 폴리펩타이드의 부분을 형성한다.
항원-결합 분자는 하나 이상의 폴리펩타이드(예컨대, 2, 3, 4, 6, 또는 8 폴리펩타이드)의 비-공유결합성 또는 공유결합성 복합체, 예컨대, 2개의 중쇄 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 IgG-유사 항원-결합 분자를 지칭할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 분자는 VISTA에 결합할 수 있는 단일클론 항체(mAb)의 서열을 사용하여 설계되고, 제조될 수 있다. 항체의 항원-결합 영역, 예를 들어, 단일 사슬 가변 단편(scFv), Fab 및 F(ab')2 단편이 또한 사용/제공될 수 있다. "항원-결합 영역"은 이에 대해 소정의 항체가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항체의 임의의 단편이다.
항체는 일반적으로 6개의 상보성-결정 영역 CDR을 포함한다; 중쇄 가변(VH) 영역내 3개: HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 경쇄 가변(VL) 영역내 3개: LC-CDR1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3. 6개의 CDR은 함께 항체의 파라토프(paratope)를 정의하며, 이는 표적 항원에 결합하는 항체의 부분이다.
VH 영역 및 VL 영역은 각각의 CDR의 어느 하나의 양상의 골격 영역(FR)을 포함하며, 이는 CDR에 대한 스캐폴드(scaffold)를 제공한다. N-말단으로부터 C-말단까지, VH 영역은 다음의 구조: N 말단-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C 말단을 포함하고; VL 영역은 다음의 구조: N 말단-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C 말단을 포함한다.
문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))에 기재된 것과 같은, 항체 CDR 및 FR, 및 문헌[Retter et al., Nucl. Acids Res. (2005) 33 (suppl 1): D671-D674)에 기재된 바와 같은 항체 CDR 및 FR을 정의하는데 수개의 상이한 협약(convention)이 존재한다. 본 명세서에 기재된 항체 클론의 VH 영역 및 VL 영역의 CDR 및 FR은 국제 IMGT(ImMunoGeneTics) 정보 시스템(문헌[LeFranc et al., Nucleic Res. (2015) 43(데이타베이스 쟁점):D413-22])에 따라 정의되었으며, 이는 문헌[Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. (2003) 27:55-77]에 기재된 바와 같은 IMGT V-DOMAIN 번호매김 규칙을 사용한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VISTA에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VISTA에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 FR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VISTA에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 CDR 및 FR을 포함한다. 즉, 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VISTA에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 VISTA-결합 항체 클론(즉, 항-VISTA 항체 클론 4M2-C12, 4M2-B4, 4M2-C9, 4M2-D9, 4M2-D5, 4M2-A8, V4H1, V4H2, V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30, V4-C31, 2M1-B12, 2M1-D2, 1M2-D2, 13D5p, 13D5-1, 13D5-13, 5M1-A11 또는 9M2-C12)의 VH/VL 영역인, 또는 이로부터 유래된 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 하기 (1) 내지 (18) 중 하나에 따른 VH 영역을 포함한다:
(1) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-C12 유래 공통) VH 영역:
서열번호 305의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 306의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 307의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(2) 다음 CDR을 포함하는 (V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30, V4-C31) VH 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(3) 다음 CDR을 포함하는 (V4-C1) VH 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 277의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(4) 다음 CDR을 포함하는 (V4-C9) VH 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 286의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(5) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-C12/V4H1/V4H2 공통) VH 영역:
서열번호 244의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(6) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-C12, 4M2-B4, V4H2) VH 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(7) 다음 CDR을 포함하는 (V4H1) VH 영역:
서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(8) 다음 CDR을 포함하는 (2M1-B12, 2M1-D2) VH 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(9) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-C9, 5M1-A11) VH 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(10) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-D9) VH 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 107의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(11) 다음 CDR을 포함하는 (1M2-D2) VH 영역:
서열번호 120의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 121의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 122의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(12) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-D5) VH 영역:
서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 145의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 146의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(13) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-A8) VH 영역:
서열번호 158의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 159의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 160의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(14) 다음 CDR을 포함하는 (9M2-C12) VH 영역:
서열번호 169의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 170의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 171의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(15) 다음 CDR을 포함하는 (13D5 유래) VH 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 246의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(16) 다음 CDR을 포함하는 (13D5p) VH 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 185의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(17) 다음 CDR을 포함하는 (13D5-1) VH 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 195의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(18) 다음 CDR을 포함하는 (13D5-13) VH 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 200의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 하기 (19) 내지 (35) 중 하나에 따른 VH 영역을 포함한다:
(19) 다음 FR을 포함하는 (V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30, V4-C31) VH 영역:
서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 292의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 293의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 281의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(20) 다음 FR을 포함하는 (V4-C1, V4-C9) VH 영역:
서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 279의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 280의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 281의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(21) 다음 FR을 포함하는 (4M2-C12) VH 영역:
서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(22) 다음 FR을 포함하는 (4M2-B4) VH 영역:
서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(23) 다음 FR을 포함하는 (V4H1) VH 영역:
서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(24) 다음 FR을 포함하는 (V4H2) VH 영역:
서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(25) 다음 FR을 포함하는 (2M1-B12) VH 영역:
서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(26) 다음 FR을 포함하는 (4M2-C9) VH 영역:
서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(27) 다음 FR을 포함하는 (2M1-D2) VH 영역:
서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(28) 다음 FR을 포함하는 (4M2-D9) VH 영역:
서열번호 109의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 110의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 111의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 112의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(29) 다음 FR을 포함하는 (1M2-D2) VH 영역:
서열번호 123의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 124의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 125의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(30) 다음 FR을 포함하는 (5M1-A11) VH 영역:
서열번호 134의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 135의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(31) 다음 FR을 포함하는 (4M2-D5) VH 영역:
서열번호 147의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 148의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 149의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 135의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(32) 다음 FR을 포함하는 (4M2-A8) VH 영역:
서열번호 161의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 162의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 163의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 135의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(33) 다음 FR을 포함하는 (9M2-C12) VH 영역:
서열번호 172의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 173의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 174의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 175의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(34) 다음 FR을 포함하는 (13D5p, 13D5-1) VH 영역:
서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 186의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 187의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(35) 다음 FR을 포함하는 (13D5-13) VH 영역:
서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1
서열번호 186의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2
서열번호 201의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,
또는 HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 상기 (1) 내지 (18) 중 하나에 따른 CDR, 및 (19) 내지 (35) 중 하나에 따른 FR을 포함하는 VH 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (36) 내지 (57) 중 하나에 따른 VH 영역을 포함한다:
(36) (1)에 따른 CDR 및 (19), (20), (21), (22), (23) 또는 (24)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(37) (2)에 따른 CDR 및 (19)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(38) (3)에 따른 CDR 및 (20)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(39) (4)에 따른 CDR 및 (20)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(40) (5)에 따른 CDR 및 (21), (22), (23) 또는 (24)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(41) (6)에 따른 CDR 및 (21)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(42) (6)에 따른 CDR 및 (22)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(43) (6)에 따른 CDR 및 (24)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(44) (7)에 따른 CDR 및 (23)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(45) (8)에 따른 CDR 및 (25)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(46) (8)에 따른 CDR 및 (27)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(47) (9)에 따른 CDR 및 (26)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(48) (9)에 따른 CDR 및 (30)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(49) (10)에 따른 CDR 및 (28)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(50) (11)에 따른 CDR 및 (29)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(51) (12)에 따른 CDR 및 (31)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(52) (13)에 따른 CDR 및 (32)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(53) (14)에 따른 CDR 및 (33)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(54) (15)에 따른 CDR 및 (34) 또는 (35)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(55) (16)에 따른 CDR 및 (34)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(56) (17)에 따른 CDR 및 (34)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
(57) (18)에 따른 CDR 및 (35)에 따른 FR을 포함하는 VH 영역.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (58) 내지 (76) 중 하나에 따른 VH 영역을 포함한다:
(58) 서열번호 276의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(59) 서열번호 285의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(60) 서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(61) 서열번호 32의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(62) 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(63) 서열번호 52의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(64) 서열번호 62의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(65) 서열번호 71의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(66) 서열번호 87의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(67) 서열번호 102의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(68) 서열번호 106의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(69) 서열번호 119의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(70) 서열번호 133의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(71) 서열번호 143의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(72) 서열번호 157의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(73) 서열번호 168의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(74) 서열번호 183의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(75) 서열번호 194의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
(76) 서열번호 199의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (77) 내지 (96) 중 하나에 따른 VL 영역을 포함한다:
(77) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-C12 유래 공통) VL 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 308의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(78) 다음 CDR을 포함하는 (C24/C26/C27 공통) VL 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 309의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(79) 다음 CDR을 포함하는 (V4-C24, V4-C26) VL 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 295의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(80) 다음 CDR을 포함하는 (V4-C27, V4-C30, V4-C31) VL 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 300의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(81) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-C12/V4H1/V4H2 공통) VL 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 245의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(82) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-C12, 4M2-B4, V4-C1, V4-C9, V4-C28) VL 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(83) 다음 CDR을 포함하는 (V4H1) VL 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(84) 다음 CDR을 포함하는 (V4H2) VL 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(85) 다음 CDR을 포함하는 (2M1-B12, 2M1-D2) VL 영역:
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(86) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-C9) VL 영역:
서열번호 96의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(87) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-D9) VH 영역:
서열번호 114의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 115의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(88) 다음 CDR을 포함하는 (1M2-D2) VL 영역:
서열번호 127의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 128의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 129의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(89) 다음 CDR을 포함하는 (5M1-A11) VL 영역:
서열번호 137의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 138의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 139의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(90) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-D5) VL 영역:
서열번호 151의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 152의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 153의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(91) 다음 CDR을 포함하는 (4M2-A8) VL 영역:
서열번호 165의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 152의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 153의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(92) 다음 CDR을 포함하는 (9M2-C12) VL 영역:
서열번호 177의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 179;의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(93) 다음 CDR을 포함하는 (13D5p 유래) VL 영역:
서열번호 247의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(94) 다음 CDR을 포함하는 (13D5p) VL 영역:
서열번호 189의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(95) 다음 CDR을 포함하는 (13D5-1) VL 영역:
서열번호 197의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(96) 다음 CDR을 포함하는 (13D5-13) VL 영역:
서열번호 203의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3;
또는 LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (97) 내지 (120) 중 하나에 따른 VL 영역을 포함한다:
(97) 다음 FR을 포함하는 (V4-C1) VL 영역:
서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 283의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 284의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(98) 다음 FR을 포함하는 (V4-C9) VL 영역:
서열번호 288의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 283의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 284의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(99) 다음 FR을 포함하는 (V4-C24) VL 영역:
서열번호 288의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 283의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 296의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(100) 다음 FR을 포함하는 (V4-C26) VL 영역:
서열번호 288의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 298의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 284의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(101) 다음 FR을 포함하는 (V4-C27) VL 영역:
서열번호 288의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 283의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 284의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(102) 다음 FR을 포함하는 (V4-C28) VL 영역:
서열번호 288의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 283의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 296의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(103) 다음 FR을 포함하는 (V4-C30) VL 영역:
서열번호 288의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 283의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 296의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(104) 다음 FR을 포함하는 (V4-C31) VL 영역:
서열번호 288의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 283의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 304의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(105) 다음 FR을 포함하는 (4M2-C12) VL 영역:
서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(106) 다음 FR을 포함하는 (4M2-B4) VL 영역:
서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(107) 다음 FR을 포함하는 (V4H1) VL 영역:
서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(108) 다음 FR을 포함하는 (V4H2) VL 영역:
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(109) 다음 FR을 포함하는 (2M1-B12) VL 영역:
서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(110) 다음 FR을 포함하는 (4M2-C9) VL 영역:
서열번호 99의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(111) 다음 FR을 포함하는 (2M1-D2) VL 영역:
서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(112) 다음 FR을 포함하는 (4M2-D9) VL 영역:
서열번호 116의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 117의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 118의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(113) 다음 FR을 포함하는 (1M2-D2) VL 영역:
서열번호 130의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 131의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 132의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(114) 다음 FR을 포함하는 (5M1-A11) VL 영역:
서열번호 140의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 141의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 142의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(115) 다음 FR을 포함하는 (4M2-D5) VL 영역:
서열번호 154의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 155의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 156의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(116) 다음 FR을 포함하는 (4M2-A8) VL 영역:
서열번호 166의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 155의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 167의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(117) 다음 FR을 포함하는 (9M2-C12) VL 영역:
서열번호 180의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 181의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 182의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(118) 다음 FR을 포함하는 (13D5p) VL 영역:
서열번호 191의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 192의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 193의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(119) 다음 FR을 포함하는 (13D5-1) VL 영역:
서열번호 191의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 198의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 193의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
(120) 다음 FR을 포함하는 (13D5-13) VL 영역:
서열번호 191의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1
서열번호 192의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2
서열번호 204의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3
서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,
또는 LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 상기 (77) 내지 (96) 중 하나에 따른 CDR, 및 (97) 내지 (120) 중 하나에 따른 FR을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (121) 내지 (148) 중 하나에 따른 VL 영역을 포함한다:
(121) (77)에 따른 CDR 및 (97), (98), (99), (100), (101), (102), (103), (104), (105), (106), (107) 또는 (108)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(122) (78)에 따른 CDR 및 (99), (100) 또는 (101)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(123) (79)에 따른 CDR 및 (99)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(124) (79)에 따른 CDR 및 (100)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(125) (80)에 따른 CDR 및 (101)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(126) (82)에 따른 CDR 및 (97)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(127) (82)에 따른 CDR 및 (98)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(128) (82)에 따른 CDR 및 (102)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(129) (80)에 따른 CDR 및 (103)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(130) (80)에 따른 CDR 및 (104)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(131) (81)에 따른 CDR 및 (105), (106), (107) 또는 (108)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(132) (82)에 따른 CDR 및 (105)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(133) (82)에 따른 CDR 및 (106)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(134) (83)에 따른 CDR 및 (107)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(135) (84)에 따른 CDR 및 (108)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(136) (85)에 따른 CDR 및 (109)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(137) (85)에 따른 CDR 및 (111)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(138) (86)에 따른 CDR 및 (110)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(139) (87)에 따른 CDR 및 (112)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(140) (88)에 따른 CDR 및 (113)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(141) (89)에 따른 CDR 및 (114)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(142) (90)에 따른 CDR 및 (115)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(143) (91)에 따른 CDR 및 (116)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(144) (92)에 따른 CDR 및 (117)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(145) (93)에 따른 CDR 및 (118), (119) 또는 (120)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(146) (94)에 따른 CDR 및 (118)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(147) (95)에 따른 CDR 및 (119)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
(148) (96)에 따른 CDR 및 (120)에 따른 FR을 포함하는 VL 영역.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하기 (149) 내지 (173) 중 하나에 따른 VL 영역을 포함한다:
(149) 서열번호 310의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(150) 서열번호 282의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(151) 서열번호 287의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(152) 서열번호 294의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(153) 서열번호 297의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(154) 서열번호 299의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(155) 서열번호 301의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(156) 서열번호 302의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(157) 서열번호 303의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(158) 서열번호 40의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(159) 서열번호 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(160) 서열번호 57의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(161) 서열번호 66의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(162) 서열번호 79의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(163) 서열번호 95의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(164) 서열번호 104의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(165) 서열번호 113의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(166) 서열번호 126의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(167) 서열번호 136의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(168) 서열번호 150의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(169) 서열번호 164의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(170) 서열번호 176의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(171) 서열번호 188의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(172) 서열번호 196의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
(173) 서열번호 202의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 상기 (1) 내지 (76) 중 어느 하나에 따른 VH 영역, 및 상기 (77) 내지 (173) 중 어느 하나에 따른 VL 영역을 포함한다.
하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 본 발명에 따른 실시형태에서, 치환은 예를 들면, 다음 표에 따른 보존적 치환일 수 있다. 일부 실시형태에서, 중간 컬럼내 동일한 블록 내의 아미노산은 치환된다. 일부 실시형태에서, 가장 우측 컬럼의 동일한 라인 내의 아미노산은 치환된다:
Figure pct00001
일부 실시형태에서, 치환(들)은 기능적으로 보존적일 수 있다. 즉, 일부 실시형태에서, 치환은 등가의 비치환된 분자와 비교하여 치환을 포함하는 항원-결합 분자의 하나 이상의 기능적 특성(예컨대, 표적 결합)에 영향을 미치지 않을 수 있다(또는 실질적으로 영향을 미치지 않을 수 있다).
항체의 항원-결합 영역의 VH 및 VL 영역은 함께 Fv 영역을 구성한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 항원-결합 분자는 VISTA에 결합하는 Fv 영역을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Fv의 VH 및 VL 영역은 링커 영역(linker region), 즉, 단일 사슬 Fv(scFv)에 의해 결합된 단일 폴리펩타이드로서 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 면역글로불린 중쇄 불변 서열 중 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 IgG(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예컨대, IgA1, IgA2), IgD, IgE 또는 IgM의 중쇄 불변 서열이거나, 이로부터 유도된다.
일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 G 1 불변(IGHG1; UniProt: P01857-1, v1; 서열번호 205)이다. 서열번호 205의 1번 내지 98번 위치는 CH1 영역(서열번호 206)을 형성한다. 서열번호 205의 99번 내지 110번 위치는 CH1 영역과 CH2 영역 사이에 힌지 영역(서열번호 207)을 형성한다. 서열번호 205의 111번 내지 223번 위치는 CH2 영역(서열번호 208)을 형성한다. 서열번호 205의 224번 내지 330번 위치는 CH3 영역(서열번호 209)을 형성한다.
예시된 항원-결합 분자는 pFUSE-CHIg-hG1을 사용하여 제조될 수 있으며, 이는 CH3 영역내에 치환 D356E, L358M (EU 번호매김에 따라 번호매김된 위치)을 포함한다. pFUSE-CHIg-hG1에 의해 인코딩되는 CH3 영역의 아미노산 서열은 서열번호 210에 나타낸다. CH3 영역은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 분자의 Fc 영역에 대한 변형에 따라서 추가의 치환으로 제공될 수 있음을 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, CH1 영역은 서열번호 206의 서열 또는 서열번호 206의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH1-CH2 힌지 (hinge) 영역은 서열번호 207의 서열 또는 서열번호 207의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH2 영역은 서열번호 208의 서열 또는 서열번호 208의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH3 영역은 서열번호 209 또는 210의 서열 또는 서열번호 209 또는 210의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 면역글로불린 경쇄 불변 서열의 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 카파 불변(IGKC; Cκ; UniProt: P01834-1, v2; 서열번호 211)이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 람다 불변(IGLC; Cλ), 예컨대, IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 또는 IGLC7이다. 일부 실시형태에서, CL 영역은 서열번호 211의 서열, 또는 서열번호 211의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
항체의 항원-결합 영역의 VL 및 경쇄 불변(CL) 영역, 및 VH 영역 및 중쇄 불변 1(CH1) 영역은 함께 Fab 영역을 구성한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VH, CH1, VL 및 CL(예컨대, Cκ 또는 Cλ)을 포함하는 Fab 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fab 영역은 VH 및 CH1을 포함하는 폴리펩타이드(예컨대, VH-CH1 융합 폴리펩타이드), 및 VL 및 CL(예컨대, VL-CL 융합 폴리펩타이드)를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fab 영역은 VH 및 CL을 포함하는 폴리펩타이드(예컨대, VH-CL 융합 폴리펩타이드) 및 VL 및 CH를 포함하는 폴리펩타이드(예컨대, VL-CH1 융합 폴리펩타이드)를 포함하는데; 즉, 일부 실시형태에서, Fab 영역은 CrossFab 영역이다. 일부 실시형태에서, Fab 또는 CrossFab의 VH, CH1, VL 및 CL 영역은 링커 영역에 의해 결합된 단일 폴리펩타이드로서, 즉, 단일 사슬 Fab(scFab) 또는 단일 사슬 CrossFab(scCrossFab)로서 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 VISTA에 결합하는 Fab 영역을 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자는 VISTA에 결합하는 전체 항체를 포함하거나, 이로 이루어진다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "전체 항체"는 면역글로불린(Ig)의 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭한다. 상이한 종류의 면역글로불린 및 이의 구조는 예컨대, 문헌[Schroeder and Cavacini J Allergy Clin Immunol. (2010) 125(202): S41-S52]에 기재되어 있으며, 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
G형의 면역글로불린(즉, IgG)은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 약 150 kDa 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 중쇄는 VH에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 유사하게 경쇄는 VL에 이어서 CL을 포함한다. 중쇄에 따라서, 면역글로불린은 IgG(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예컨대, IgA1, IgA2), IgD, IgE, 또는 IgM로서 분류될 수 있다. 경쇄는 카파(κ) 또는 람다(λ)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자는 VISTA에 결합하는 IgG(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예컨대, IgA1, IgA2), IgD, IgE, 또는 IgM을 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA에 대해 적어도 1가 결합이다. 결합 원자가는 소정의 항원 결정기에 대한 항원 결합 분자의 결합 부위 수를 지칭한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA에 대한 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA에 대한 하나 초과의 결합 부위, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 결합 부위를 포함한다. 결합 부위는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 예를 들어 VISTA의 경우 2가, 3가 또는 4가이다.
본 발명의 실시형태는 다중특이적 항원-결합 분자에 관한 것이다. "다중특이적"이라는 것은, 항원-결합 분자가 하나 이상의 표적에 대한 특이적인 결합을 나타냄을 의미한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 이중특이적 항원-결합 분자이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 적어도 2개의 상이한 항원-결합 도메인(즉, 예컨대, 동일하지 않은 VH 및 VL을 포함하는 적어도 2개의 항원-결합 도메인)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VISTA 및 또 다른 표적 (예를 들어, VISTA 이외의 항원)에 결합하므로, 적어도 이중특이적이다. 용어 "이중특이적"은 항원-결합 분자가 적어도 2개의 명확한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 항원-결합 분자(예컨대, 다중특이적 항원-결합 분자)는 이에 대해 항원-결합 분자가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, VISTA 및 VISTA 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자는: (i) VISTA에 결합할 수 있는 항원-결합 분자, 및 (ii) VISTA 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함한다.
본 발명에 따른 항원-결합 분자(예컨대, 다중특이적 항원-결합 분자)는 이에 대해 항원-결합 분자가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항원-결합 폴리펩타이드 또는 항원-결합 폴리펩타이드 복합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항원 결합 분자는 예를 들어, (i) 경쇄 폴리펩타이드 (구조 VL-CL 포함) 및 중쇄 폴리펩타이드 (구조 VH-CH1-CH2-CH3 포함)를 포함하는 VISTA에 결합할 수 있는 항원 결합 폴리펩타이드 복합체, 및 (ii) 경쇄 폴리펩타이드 (구조 VL-CL 포함) 및 중쇄 폴리펩타이드 (구조 VH-CH1-CH2-CH3 포함)를 포함하는 VISTA 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 폴리펩타이드 복합체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 보다 큰 항원-결합 분자(예컨대, 다중특이적 항원-결합 분자)의 구성성분 항원-결합 분자는 보다 큰 항원-결합 분자의 "항원-결합 도메인" 또는 "항원-결합 영역"으로 지칭될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VISTA에 결합할 수 있는 항원-결합 분자, 및 VISTA 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, VISTA 이외의 항원은 면역 세포 표면 분자이다. 일부 실시형태에서, VISTA 이외의 항원은 암 세포 항원이다. 일부 실시형태에서, VISTA 이외의 항원은 수용체 분자, 예컨대, 세포 표면 수용체이다. 일부 실시형태에서, VISTA 이외의 항원은 세포 신호전달 분자, 예컨대, 사이토킨, 케모킨, 인터페론, 인터루킨 또는 림포킨이다. 일부 실시형태에서, VISTA 이외의 항원은 성장 인자 또는 호르몬이다.
암 세포 항원은 암 세포에 의해 발현되거나 과-발현된 항원이다. 암 세포 항원은 임의의 펩타이드/폴리펩타이드, 당단백질, 지단백질, 글리칸, 당지질, 지질, 또는 이의 단편일 수 있다. 암 세포 항원의 발현은 암과 관련될 수 있다. 암 세포 항원은 암 세포에 의해 비정상적으로 발현될 수 있거나(예컨대, 암 세포 항원은 비정상적인 국재화로 발현될 수 있다), 암 세포에 의해 비정상적인 구조로 발현될 수 있다. 암 세포 항원은 면역 반응을 유발할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 암 세포의 세포 표면에서 발현된다(즉, 암 세포 항원은 암 세포 표면 항원이다). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자에 의해 결합되는 항원의 부분이 암 세포의 외부 표면(즉, 세포외) 상에 나타난다. 암 세포 항원은 암-관련된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암 세포 항원은 이의 발현이 암의 증상의 발달, 진행 또는 중증도와 관련된 항원이다. 암-관련된 항원은 암의 원인 또는 병리학과 관련될 수 있거나, 암의 결과로서 비정상적으로 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암 세포 항원은 이의 발현이 예컨대, 비교가능한 비-암성 세포(예컨대, 동일한 조직/세포형으로부터 유래된 비-암성 세포)에 의한 이의 발현 수준과 비교하여, 암의 세포에 의해 상향조절된(예컨대, RNA 및/또는 단백질 수준에서) 항원이다. 일부 실시형태에서, 암-관련된 항원은 암성 세포에 의해 우선적으로 발현될 수 있고, 비교가능한 비-암성 세포(예컨대, 동일한 조직/세포형으로부터 유래된 비-암성 세포)에 의해 발현되지 않는다. 일부 실시형태에서, 암-관련된 항원은 돌연변이된 종양유전자 또는 돌연변이된 종양 억제인자 유전자의 생성물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암-관련된 항원은 과발현된 세포 단백질의 생성물, 종양유전자성 바이러스에 의해 생성된 암 항원, 종양태아성 항원(oncofetal antigen), 또는 세포 표면 당지질 또는 당단백질일 수 있다.
면역 세포 표면 분자는 면역 세포의 세포 표면에서 또는 위에 발현된 임의의 펩타이드/폴리펩타이드, 당단백질, 지단백질, 글리칸, 당지질, 지질, 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자에 의해 결합된 면역 세포 표면 분자의 부분은 면역 세포의 외부 표면 상에 있다(즉, 세포외이다). 면역 세포 표면 분자는 임의의 면역 세포의 세포 표면에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 조혈 기원의 세포, 예컨대, 호중구, 호산구, 호염기구, 수지 세포, 림프구, 또는 단핵구일 수 있다. 림프구는 예컨대, T 세포, B 세포, 천연 킬러(NK) 세포, NKT 세포 또는 선천성 림프구 세포(ILC), 또는 이의 전구체(예컨대, 흉선 세포 또는 프레(pre)-B 세포)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 표면 분자는 공자극 분자 (예를 들어, CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 또는 CD27) 또는 이들의 리간드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 표면 분자는 체크포인트 분자 (예를 들어, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT 또는 BTLA) 또는 이들의 리간드일 수 있다.
본 발명에 따른 다중특이적 항원-결합 분자는 문헌[Brinkmann and Kontermann MAbs (2017) 9(2): 182-212], 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다)에 기재된 양식과 같은, 임의의 적합한 양식으로 제공될 수 있다. 적합한 양식은 문헌[Brinkmann and Kontermann MAbs (2017) 9(2): 182-212]의 도 2에 나타낸 것: 항체 접합체(conjugate), 예컨대, IgG2, F(ab')2 또는 CovX-보디(Body); IgG 또는 IgG-유사 분자, 예컨대, IgG, 키메라 IgG, κλ-보디 일반적인 HC; CH1/CL 융합 단백질, 예컨대, scFv2-CH1/CL, VHH2-CH1/CL; '가변 도메인 단독" 이중특이적인 항원-결합 분자, 예컨대, 탄뎀(tandem) scFv(taFV), 트리플보디(triplebody), 디아보디(diabody: Db), dsDb, Db(kih), DART, scDB, dsFv-dsFv, tandAbs, 삼중 헤드(triple head), 탄뎀 dAb/VHH, 4가(tertravalent) dAb.VHH; 비-Ig 융합 단백질, 예컨대, scFv2-알부민, scDb-알부민, taFv-알부민, taFv-독소, 미니항체, DNL-Fab2, DNL-Fab2-scFv, DNL-Fab2-IgG-사이토킨2, ImmTAC(TCR-scFv); 변형된 Fc 및 CH3 융합 단백질, 예컨대, scFv-Fc(kih), scFv-Fc(CH3 전하 쌍), scFv-Fc(EW-RVT), scFv-fc(HA-TF), scFv-Fc(SEED보디), taFv-Fc(kih), scFv-Fc(kih)-Fv, Fab-Fc(kih)-scFv, Fab-scFv-Fc(kih), Fab-scFv-Fc(BEAT), Fab-scFv-Fc (SEED보디), DART-Fc, scFv-CH3(kih), TriFab; Fc 융합체, 예컨대, 디-디아보디(Di-diabody), scDb-Fc, taFv-Fc, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, Fab-scFv-Fc, scFv4-Ig, scFv2-Fcab; CH3 융합체, 예컨대, 디아-디아보디(Dia-diabody), scDb-CH3; IgE/IgM CH2 융합체, 예컨대, scFv-EHD2-scFv, scFvMHD2-scFv; Fab 융합 단백질, 예컨대, Fab-scFv(비보디(bibody)), Fab-scFv2(트리보디), Fab-Fv, Fab-dsFv, Fab-VHH, 직교(orthogonal) Fab-Fab; 비-Ig 융합 단백질, 예컨대, DNL-Fab3, DNL-Fab2-scFv, DNL-Fab2-IgG-사이토킨2; 비대칭 IgG 또는 IgG-유사 분자, 예컨대, IgG(kih), IgG(kih) 일반적인 LC, ZW1 IgG 일반적인 LC, 비클로닉스(Biclonics) 일반적인 LC, CrossMab, CrossMab(kih), scFab-IgG(kih), Fab-scFab-IgG(kih), 직교의 Fab IgG(kih), DuetMab, CH3 전하 쌍+CH1/CL 전하 쌍, 힌지/CH3 전하 쌍, SEED-보디, 두오보디(Duobody), 포-인-원(four-in-one)-CrossMab(kih), LUZ-Y 일반적인 LC; LUZ-Y scFab-IgG, FcFc*; 첨부되고(appended) Fc-변형된 IgG, 예컨대, IgG(kih)-Fv, IgG HA-TF-Fv, IgG(kih)scFab, scFab-Fc(kih)-scFv2, scFab-Fc(kih)-scFv, 하프(half) DVD-Ig, DVI-Ig(포-인-원), CrossMab-Fab; 변형된 Fc 및 CH3 융합 단백질, 예컨대, Fab-Fc(kih)-scFv, Fab-scFv-Fc(kih), Fab-scFv-Fc(BEAT), Fab-scFv-Fc-SEED보디, TriFab; 첨부된 IgG-HC 융합체, 예컨대, IgG-HC, scFv, IgG-dAb, IgG-taFV, IgG-CrossFab, IgG-직교의 Fab, IgG-(CαCβ) Fab, scFv-HC-IgG, 탐뎀 Fab-IgG(직교의 Fab) Fab-IgG(CαCβ Fab), Fab-IgG(CR3), Fab-힌지-IgG(CR3); 첨부된 IgG-LC 융합체, 예컨대, IgG-scFv(LC), scFv(LC)-IgG, dAb-IgG; 첨부된 IgG-HC 및 LC 융합체, 예컨대, DVD-Ig, TVD-Ig, CODV-Ig, scFv4-IgG, 지보디(Zybody); Fc 융합체, 예컨대, Fab-scFv-Fc, scFv4-Ig; F(ab')2 융합체, 예컨대, F(ab')2-scFv2; CH1/CL 융합 단백질, 예컨대, scFv2-CH1-힌지/CL; 변형된 IgG, 예컨대, DAF(투-인-원(two-in one)-IgG), DutaMab, Mab2; 및 비-Ig 융합체, 예컨대, DNL-Fab4-IgG을 포함한다.
당업자는 이중특이적인 항원-결합 분자를 설계하여 제조할 수 있다. 이중특이적 항원-결합 분자를 생성하는 방법은 항원-결합 분자 또는 항체 단편을, 예를 들면, 문헌[Segal and Bast, 2001. Production of Bispecific Antigen-binding molecules. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16], 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 환원성 이황화물 또는 비-환원성 티오에테르 결합과 화학적으로 가교결합시킴을 포함한다. 예를 들면, N-석신이미딜-3-(-2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)를 사용하여, 예컨대, 힌지 영역 SH-그룹을 통해 Fab 단편을 화학적으로 가교결합시켜 이황화물-연결된 이중특이적 F(ab)2 이종이량체를 생성할 수 있다.
이중특이적 항원-결합 분자를 생성하는 다른 방법은 항체-생성 하이브리도마를 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜과 융합시켜 예를 들면, 문헌[D. M. and Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antigen-binding molecules. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16]에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 사량체 세포(quadroma 세포)를 생성함을 포함한다.
본 발명에 따른 이중특이적 항원-결합 분자는 또한 예를 들면, 문헌[Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), at Chapter 40: Production of Bispecific Antigen-binding molecules: Diabodies and Tandem scFv(Hornig and Farber-Schwarz), or French, How to make bispecific antigen-binding molecules, Methods Mol. Med. 2000; 40:333-339], 이들 둘 다의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같이, 항원-결합 분자에 대한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물(construct)로부터의 발현에 의해 재조합적으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 2개의 항원-결합 단편에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인(즉, VISTA에 결합할 수 있는 항원-결합 단편에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원-결합 단편에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인)을 인코딩하고, 항원-결합 단편 사이에 적합한 링커 또는 이량체화 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 DNA 작제물은 분자 클로닝 기술에 의해 제조할 수 있다. 재조합 이중특이적인 항체는 이후 적합한 숙주 세포(예컨대, 포유류 숙주 세포) 내에서 작제물의 발현(예컨대, 시험관내)에 의해 생성될 수 있으며, 발현된 재조합 이중특이적인 항체는 이후 선택적으로 정제될 수 있다.
Fc 영역
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 Fc 영역을 포함한다.
IgG IgA 및 IgD 이소형에서, Fc 영역은 하나의 폴리펩타이드로부터의 CH2 및 CH3 영역, 및 다른 폴리펩타이드로부터의 CH2 및 CH3 영역으로 구성된다. 2개의 폴리펩타이드로부터의 CH2 및 CH3 영역은 함께 Fc 영역을 형성한다. IgM 및 IgE 이소형에서, Fc 영역은 3개의 불변 도메인 (CH2, CH3 및 CH4)을 포함하고, 2개의 폴리펩타이드로부터의 CH2 내지 CH4는 함께 Fc 영역을 형성한다.
Fc 영역은 기능적 효과를 유발하기 위해 Fc 수용체 및 면역계의 다른 분자와의 상호작용을 제공한다. IgG Fc 매개 효과기 기능은, 예를 들어 문헌[Jefferis et al., Immunol Rev 1998 163: 59-76] (전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)에서 검토할 수 있고, 면역 세포에 의해 발현된 Fc 영역과 Fc 수용체 사이의 상호작용, Fc 영역과 보체 단백질 C1q의 결합을 통한 보체 경로 성분의 집합, 결과적으로 보체 전달계의 활성화를 통해 Fc 매개 집합 및 면역 세포 (예를 들어, 대식세포, 수지상 세포, NK 세포 및 T 세포)의 활성화를 통해 유발된다.
Fc-매개 기능은 Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포-매개 식세포작용 (ADCP), 보체-의존성 세포독성 (CDC), 막 공격 복합체 (MAC)의 형성, 세포 탈과립화, 사이토카인 및/또는 케모카인 생성, 항원 처리 및 제시를 포함한다.
Fc-매개 기능에 영향을 미치는 항체 Fc 영역에 대한 변형은 예를 들어 문헌[Wang et al., Protein Cell (2018) 9(1):63-73]에 기재된 것과 같이 당 업계에 공지되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 특히, 항체 효과기 기능에 영향을 미치는 것으로 공지된 예시적인 Fc 영역 변형은 문헌[Wang et al., Protein Cell (2018) 9(1):63-73]의 표 1에 요약되어 있다. 항체 효과기 활성에 영향을 미치는 Fc 영역에 대한 변형은 본 명세서의 하기에 기재되어 있다.
Fc 영역/CH2/CH3이 참조 치환 (들)에 "해당하는" 변형 (들)을 포함하는 것으로 기재되는 경우, 상동성 Fc/CH2/CH3에서의 균등물 치환 (들)이 고려된다. 예를 들어, 인간 IgG1의 L234A/L235A 치환 (문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템 (EU numbering system)에 따라 넘버링됨)은 서열번호 256에 따라 넘버링된 마우스 Ig 감마-2A 사슬 C 영역, A 대립유전자의 위치 117 및 118에서 L에서 A로의 치환에 해당한다.
Fc 영역이 변형을 포함하는 것으로 기재되는 경우, 상기 변형은 함께 Fc 영역을 형성하는 폴리펩타이드 사슬 중 하나 또는 둘 모두에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 CH2 및/또는 CH3 영역 중 하나 이상에 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 Fc-매개 기능을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 ADCC를 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 ADCP를 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 CDC를 증가시키는 변형을 포함한다. Fc 매개 기능 (예를 들어, ADCC, ADCP, CDC)을 증가시키는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 해당하는 비 변형 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자와 비교하여 관련 효과기 기능의 증가된 수준을 유도한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 Fc 수용체와의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 Fcγ 수용체와의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb 중 하나 이상과의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIIa와의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIa와의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIb와의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcRn와의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 보체 단백질과의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 C1q과의 결합을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 항원 결합 분자의 6량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 항원 결합 분자 반감기를 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 공동 결합을 증가시키는 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Stavenhagen et al. Cancer Res. (2007) 67:8882-8890]에 기재된 바와 같이 치환 F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Lazar et al., Proc Natl Acad Sci USA. (2006)103:4005-4010]에 기재된 바와 같이 치환 S239D/I332E 또는 S239D/I332E/A330L의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Shields et al., J Biol Chem. (2001) 276:6591-6604]에 기재된 바와 같이, 치환 S298A/E333A/K334A의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Mimoto et al., MAbs. (2013): 5:229-236]에 기재된 바와 같이, 치환 L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A의 조합에 해당하는 중쇄 폴리펩타이드 중 하나에 대한 변형, 및 치환 D270E/K326D/A330M/K334E의 조합에 해당하는 다른 중쇄 폴리펩타이드에 대한 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Richards et al., Mol Cancer Ther. (2008) 7:2517-2527]에 기재된 바와 같이 치환 G236A/S239D/I332E의 조합에 해당하는 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Idusogie et al. J Immunol. (2001) 166(4):2571-5]에 기재된 바와 같이 치환 K326W/E333S의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Moore et al. MAbs. (2010) 2(2):181-9]에 기재된 바와 같이 치환 S267E/H268F/S324T의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Natsume et al., Cancer Res. (2008) 68(10):3863-72]에 기재된 바와 같이 치환의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Diebolder et al. Science (2014) 343(6176):1260-3]에 기재된 바와 같이 치환 E345R/E430G/S440Y의 조합에 해당하는 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Dall'Acqua et al. J Immunol. (2002) 169:5171-5180]에 기재된 바와 같이 치환 M252Y/S254T/T256E의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Zalevsky et al. Nat Biotechnol. (2010) 28:157-159]에 기재된 바와 같이 치환 M428L/N434S의 조합에 해당하는 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Chu et al., Mol Immunol. (2008) 45:3926-3933]에 기재된 바와 같이 치환 S267E/L328F의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Shang et al. Biol Chem. (2014) 289:15309-15318]에 기재된 바와 같이 치환 N325S/L328F의 조합에 해당하는 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 Fc-매개 기능을 감소/억제하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 ADCC를 감소/억제하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 ADCP를 감소/억제하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 CDC를 감소/억제하는 변형을 포함한다. Fc 매개 기능 (예를 들어, ADCC, ADCP, CDC)을 감소/억제하는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 해당하는 비 변형 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자와 비교하여, 관련 효과기 기능의 감소된 수준을 유도한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 Fc 수용체와의 결합을 감소/억제하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 Fcγ 수용체와의 결합을 감소/억제하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb 중 하나 이상과의 결합을 감소/억제하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIIa와의 결합을 감소/억제하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIa와의 결합을 감소/억제하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIb와의 결합을 감소/억제하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 보체 단백질과의 결합을 감소/억제하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 C1q와의 결합을 감소/억제하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 N297에 해당하는 아미노산 잔기의 글리코실화를 감소/억제하는 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 하나 이상의 Fc 매개 기능을 유도할 수 없다 (즉, 관련 Fc 매개 기능 (들)을 유도하는 능력이 부재함). 따라서, 이러한 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자는 관련 기능 (들)을 유도하는 능력이 또한 부재한다. 이러한 항원 결합 분자는 관련 기능 (들)이 부재하는 것으로 기재될 수 있다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 ADCC를 유도할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 ADCP를 유도할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 CDC를 유도할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 ADCC를 유도할 수 없고/거나, ADCP를 유도할 수 없고/거나, CDC를 유도할 수 없다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 Fc 수용체에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 Fcγ 수용체에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb 중 하나 이상에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIIa에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIa에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRIIb에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcRn에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 보체 단백질에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 C1q에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 N297에 해당하는 아미노산 잔기에서 글리코실화가 부재한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Leabman et al., MAbs. (2013) 5:896-903]에 기재된 바와 같이 N297A 또는 N297Q 또는 N297G에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Alegre et al., J Immunol. (1992) 148:3461-3468]에 기재된 바와 같이 L235E에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Xu et al., Cell Immunol. (2000) 200:16-26]에 기재된 바와 같이 치환 L234A/L235A 또는 F234A/L235A의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Schlothauer et al., Protein Engineering, Design and Selection (2016), 29(10):457-466]에 기재된 바와 같이 P329A 또는 P329G에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Lo et al. J. Biol. Chem (2017) 292(9):3900-3908]에 기재된 바와 같이 치환 L234A/L235A/P329G의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Rother et al., Nat Biotechnol. (2007) 25:1256-1264]에 기재된 바와 같이 치환의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Newman et al., Clin. Immunol. (2001) 98:164-174]에 기재된 바와 같이 치환 S228P/L235E의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[An et al., MAbs. (2009) 1:572-579]에 기재된 바와 같이 치환 H268Q/V309L/A330S/P331S의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Vafa et al., Methods. (2014) 65:114-126]에 기재된 바와 같이 치환 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 US 2015/0044231 A1에 기재된 바와 같이 치환 L234A/L235E/G237A/A330S/P331S의 조합에 해당하는 변형을 포함한다.
치환 "L234A/L235A" 및 해당 치환 (예를 들어, 인간 IgG4의 F234A/L235A)의 조합은 Fc의 Fcγ 수용체에 대한 결합을 방해하고, ADCC, ADCP를 억제하며 또한 C1q 결합을 감소시켜 CDC를 감소시키는 것으로 공지되어 있다 (문헌[Schlothauer et al., Protein Engineering, Design and Selection (2016), 29(10):457-466], 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨). 치환 "P329G" 및 "P329A"는 C1q 결합 (및 이에 따라 CDC)을 감소시킨다. "N297"의 "A", "G" 또는 "Q"로의 치환은 글리코실화를 제거하여 C1q 및 Fcγ 수용체와의 Fc 결합, 따라서 CDC 및 ADCC를 감소시키는 것으로 공지되어 있다. 문헌[Lo et al. J. Biol. Chem (2017) 292(9):3900-3908] (상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)은 치환 L234A/L235A/P329G의 조합이 쥣과동물 IgG2a 및 인간 IgG1 둘 모두에서 보체 결합 및 고정뿐만 아니라, Fc γ 수용체 의존성, 항체 의존성 세포 매개 세포독성을 제거하였다고 보고한다.
IgG1 Fc에서의 치환 L234A/L235E/G237A/A330S/P331S의 조합은 식세포작용의 유도, ADCC 및 CDC를 제거하는 것으로 US 2015/0044231 A1에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 문헌[Silva et al., J Biol Chem. (2015) 290(9):5462-5469]에 기재된 바와 같이 치환 S228P에 해당하는 변형을 포함한다. IgG4 Fc의 치환 S228P는 Fab-아암 교체를 감소시킨다 (Fab 아암 교체는 바람직하지 않을 수 있음).
일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 L234A/L235A의 조합에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 P329G에 해당하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 N297Q에 해당하는 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 L234A/L235A/P329G의 조합에 해당하는 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 L234A/L235A/P329G/N297Q의 조합에 해당하는 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 치환 L234A/L235E/G237A/A330S/P331S의 조합에 해당하는 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 예를 들어, IgG4에서 치환 S228P에 해당하는 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 Fc 영역의 회합을 촉진하는 CH2 및 CH3 영역 중 하나 이상에서의 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 항원-결합 분자의 구성성분 폴리펩타이드의 재조합 공-발현 및 후속적인 회합은 수개의 가능한 조합으로 이끈다. 재조합체 생성시 항원-결합 분자내 폴리펩타이드의 목적한 조합의 수율을 개선시키기 위해, 중쇄 폴리펩타이드의 목적한 조합의 회합을 촉진시키는 변형(들)을 Fc 영역 내에 도입하는 것이 유리하다. 변형은 예컨대, 상이한 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및/또는 CH3 영역 사이에 소수성 및/또는 정전기적 상호작용을 촉진할 수 있다. 적합한 변형은 예컨대, 문헌[Ha et al., Front. Immnol (2016) 7:394]에 기재되어 있으며, 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 항원-결합 분자는 문헌[Ha et al., Front. Immnol (2016) 7:394: KiH, KiHs-s, HA-TF, ZW1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTs-s, SEED 또는 A107]의 표 1에 나타낸 바와 같이, 다음의 양식 중 하나에 따라 Fc 영역의 CH3 영역내 쌍을 이룬 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 예컨대, 문헌[US 7,695,936 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재된 바와 같은, "놉-인투-홀(knob-into-hole)" 또는 "KiH" 변형을 포함한다. 이러한 실시형태에서, Fc 영역의 CH3 영역 중 하나는 "놉" 변형을 포함하고, 다른 CH3 영역은 "홀" 변형을 포함한다. "놉" 및 "홀" 변형은 각각의 CH3 영역 내에 위치함으로써 "놉"은 "홀" 내에 위치하여 폴리펩타이드의 이종이량체화를 촉진(및 이종이랑체화를 억제)하고/하거나 이종이량체를 안정화시킨다. 놉은 작은 측쇄를 갖는 아미노산을 보다 큰 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 타이로신 또는 트립토판)으로 치환시킴으로써 작제된다. 홀은 큰 측쇄를 갖는 아미노산을 보다 작은 측쇄를 갖는 것(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환시킴으로써 생성된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자의 Fc 영역의 CH3 영역 중 하나는 치환(본 명세서의 Fc, CH2 및 CH3 영역내 위치/치환의 번호매김은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 번호매김 시스템에 따른다) T366W를 포함하며, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 Y407V를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자의 Fc 영역의 CH3 영역 중 하나는 치환 T366W를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 T366S 및 L368A를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자의 Fc 영역의 CH3 영역 중 하나는 치환 T366W를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 Y407V, T366S 및 L368A를 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 예컨대, 제WO 2014/131694 A1호에 기재된 바와 같은 "DD-KK" 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 K392D 및 K409D를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 E356K 및 D399K를 포함한다. 변형은 CH3 영역 사이에 정전기적 상호작용을 촉진한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 "두오보디" 양식으로 지칭된, 문헌[Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2013) 110(13):5145-50]에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 K409R을 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 K405L을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 문헌[Strop et al., J Mol Biol. (2012) 420(3):204-19]에 기재된 바와 같은 "EEE-RRR" 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 D221E, P228E 및 L368E를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 D221R, P228R 및 K409R을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 문헌[Choi et al., Mol Cancer Ther (2013) 12(12):2748-59]에 기재된 "EW-RVT"를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 K360E 및 K409W를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 Q347R, D399V 및 F405T를 포함한다.
일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 S354C를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 Y349C를 포함한다. 이러한 시스테인 잔기의 도입은 Fc 영역의 2개의 CH3 영역 사이에 이황화물 브릿지(disulphide bridge)의 형성을 야기함으로써 이종이량체를 추가로 안정화시킨다(Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15).
일부 실시형태에서, Fc 영역은 "KiHS-S" 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 T366W 및 S354C를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 문헌[Davis et al., Protein Eng Des Sel (2010) 23(4):195-202]에 기재된 바와 같은 "SEED" 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 인간 IgG1 CH3 및 IgA CH3의 β-가닥 절편(β-strand segment)은 교환된다.
일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 S364H 및 F405A를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 Y349T 및 T394F를 포함한다(참조: 예컨대, Moore et al., MAbs (2011) 3(6):546-57).
일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 T350V, T366L, K392L 및 T394W를 포함한다(참조: 예컨대, Von Kreudenstein et al., MAbs (2013) 5(5):646-54).
일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 K360D, D399M 및 Y407A를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 E345R, Q347R, T366V 및 K409V를 포함한다(참조: 예컨대, Leaver-Fay et al., Structure (2016) 24(4):641-51).
일부 실시형태에서, CH3 영역 중 하나는 치환 K370E 및 K409W를 포함하고, Fc 영역의 다른 CH3 영역은 치환 E357N, D399V 및 F405T를 포함한다(참조: 예컨대, Choi et al., PLoS One (2015) 10(12):e0145349).
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 Fc γ 수용체에 결합하지 않는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb 중 하나 이상에 결합하지 않는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIa 중 하나 이상에 결합하지 않는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcγRIIa 및 FcγRIIb 중 하나 또는 둘 모두에 결합하지 않는 Fc 영역을 포함한다.
참조 단백질 (예를 들어, Fc 수용체)에 결합하는 Fc 영역 또는 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 능력은 ELISA, 면역블롯, 면역침전, 표면 플라스몬 공명 (SPR; 예를 들어, 문헌[Hearty et al., Methods Mol Biol (2012) 907:411-442] 참조) 또는 생물층 간섭계 (BLI; 예를 들어, 문헌[Lad et al., (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507] 참조)과 같은 당 업계에 널리 공지된 방법에 따라 분석될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 참조 단백질에 "결합하지 않는" Fc 영역은 참조 단백질에 대한 결합을 실질적으로 나타내지 않을 수 있으며, 이는, 예를 들어 ELISA, 면역블롯 (예를 들어, 웨스턴블롯), 면역침전, SPR 또는 BLI)에 의해 측정되는 바와 같다. "실질적으로 결합하지 않음"은 소정의 분석에서 서로 결합하지 않는 단백질에 대해 측정된 상호작용 수준보다 유의하게 더 크지 않은 상호작용 수준일 수 있다. "실질적으로 결합하지 않음"은 소정의 분석에서 서로 결합하지 않는 단백질에 대해 측정된 상호작용 수준의 ≤ 5배, 예를 들어 ≤ 4배, ≤ 3배, ≤ 2.5배, ≤ 2배 또는 ≤ 1.5 배의 상호작용 수준일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcRn에 결합하는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcRn에 결합하고, FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIa 중 하나 이상에 결합하지 않는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcRn에 결합하고, FcγRIIa 및 FcγRIIb 중 하나 또는 둘 모두에 결합하지 않는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 ADCC를 유도하지 않는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 ADCP를 유도하지 않는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 CDC를 유도하지 않는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 ADCC, ADCP 또는 CDC를 유도하지 않는 Fc 영역을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, ADCC/ADCP/CDC를 유도하지 않는 (즉 유도할 수 없음) Fc 영역/항원 결합 분자는 실질적으로 ADCC/ADCP/CDC 활성을 유도하지 않으며, 이는 관련 활성에 대한 적절한 분석에서 분석에 의해 측정되는 바와 같다. "실질적으로 ADCC/ADCP/CDC 활성이 없음"은 소정의 분석에서 적절한 음성 대조군 분자에 대해 측정된 ADCC/ADCP/CDC보다 유의하게 더 크지 않은 ADCC/ADCP/CDC의 수준을 지칭한다 (예를 들어, Fc 영역이 부재하는 항원 결합 분자, 또는 '침묵' Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자, (예를 들어, 문헌[Schlothauer et al., Protein Engineering, Design and Selection (2016), 29(10):457-466]에 기재된 바와 같음, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함됨)). "실질적으로 활성이 없음"은 소정의 분석에서 적절한 음성 대조군 분자에 대해 측정된 활성 수준의 ≤ 5배, 예를 들어 ≤ 4배, ≤ 3배, ≤ 2.5배, ≤ 2배 또는 ≤ 1.5 배의 관련 활성 수준일 수 있다.
ADCC를 유도하는 Fc 영역 또는 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 능력은 예를 들어, 문헌[Yamashita et al., Scientific Reports (2016) 6:19772] (상기 문헌은 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 분석 또는 예를 들어, 문헌[Jedema et al., Blood (2004) 103: 2677-82] (상기 문헌은 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 51Cr 방출 분석에 따라 분석될 수 있다. ADCP를 유도하는 Fc 영역 또는 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 능력은 예를 들어, 문헌[Kamen et al., J Immunol (2017) 198 (1 Supplement) 157.17] (상기 문헌은 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 방법에 따라 분석될 수 있다. CDC를 유도하는 Fc 영역 또는 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 능력은 예를 들어, 문헌[Schlothauer et al., Protein Engineering, Design and Selection (2016), 29(10):457-466] (상기 문헌은 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 예를 들어 C1q 결합 분석을 사용하여 분석될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 254의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 257의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 259의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 260의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 Fc 영역이 부재한다.
Fc 수용체
Fc 수용체는 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하는 폴리펩타이드이다. Fc 수용체 구조 및 기능은 예를 들어, 문헌[Masuda et al., Inflamm Allergy Drug Targets (2009) 8(1): 80-86, 및 Bruhns, Blood (2012) 119:5640-5649]에서 검토할 수 있으며, 상기 문헌 둘 모두는 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함된다.
Fc 수용체는 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 호염기구, 비만 세포 및 NK 세포를 포함하는 조혈 세포의 표면에서 발현된다. 이는 IgG 결합 Fc γ 수용체, IgE에 대한 고 친화도 수용체 (FcεRI), IgA 수용체, IgA 및 IgM에 대한 중합체 Ig 수용체를 포함한다. 신생아 Fc 수용체 (FcRn)는 IgG에 대한 추가 Fc 수용체이며, 상피 장벽 (트랜스사이토시스 (transcytosis))을 통한 IgG 수송, 분해로부터 IgG 보호 및 항원 제시에 관여한다. 인간은 6 가지 상이한 부류의 Fc γ 수용체 (마우스 오르소로그는 괄호 안에 제시됨): FcγRI (mFcγRI), FcγRIIa (mFcγRIII), FcγRIIb (mFcγRIIb), FcγRIIc, FcγRIIIa (mFcγRIV) 및 FcγRIIIb를 갖는다.
FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc 및 FcγRIIIa는 세포내 도메인에 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하며, Fc에 의한 결찰은 수용체를 발현하는 세포의 활성화를 야기한다. FcγRIIb는 세포내 도메인에 면역 수용체 티로신 기반 억제 모티프 (ITIM)를 포함하고, Fc에 의한 결찰시 세포 활성화 및 탈과립화, 세포 증식, 세포내 이입 및 식세포작용을 음성적으로 조절한다.
본 명세서에서 "Fcγ 수용체"는 임의의 종으로부터 유래될 수 있으며, 임의의 종으로부터의 이소형, 단편, 변이체 (돌연변이 포함) 또는 상동체를 포함한다. 유사하게, "FcγRI", "FcγRIIa", "FcγRIIb", "FcγRIIc", "FcγRIIIa" 및 "FcγRIIIb"는 각각 임의의 종으로부터의 FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb를 지칭하며, 임의의 종으로부터의 이소형, 단편, 변이체 (돌연변이 포함) 또는 상동체를 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc γ 수용체 (예를 들어, FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb)는 포유류 (예를 들어, 영장류 (레서스, 시노몰구스, 비인간 영장류 또는 인간) 및/또는 설치류 (예를 들어, 랫트 또는 마우스)로부터 유래된 것이다. 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로 소정의 종, 예를 들어, 인간으로부터의 Fc γ 수용체 (예를 들어, FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb)의 미성숙 또는 성숙 이소형의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, 예를 들어 기능적 특성/활성에 대한 적절한 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 참조 Fcγ 수용체의 기능적 특성/활성을 갖는 기능적 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체일 수 있다. 예를 들어, FcγRI의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 예를 들어 인간 IgG1 Fc와의 관련성을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 "FcRn 수용체"는 임의의 종으로부터 유래될 수 있으며, 임의의 종으로부터의 이소형, 단편, 변이체 (돌연변이 포함) 또는 상동체를 포함한다.
일부 실시형태에서, FcRn 수용체는 포유류 (예를 들어, 영장류 (레서스, 시노몰구스, 비인간 영장류 또는 인간) 및/또는 설치류 (예를 들어, 랫트 또는 마우스)로부터 유래될 수 있다. 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로 소정의 종, 예를 들어, 인간으로부터의 FcRn 수용체의 미성숙 또는 성숙 이소형의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, 예를 들어 기능적 특성/활성에 대한 적절한 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 참조 FcRn의 기능적 특성/활성을 갖는 기능적 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체일 수 있다. 예를 들어, FcRn의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 예를 들어, 인간 IgG1 Fc과의 관련성을 나타낼 수 있다.
폴리펩타이드
본 발명은 또한 항원-결합 분자의 폴리펩타이드 구성성분을 제공한다. 폴리펩타이드는 단리되거나 실질적으로 정제된 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 항원-결합 분자는 폴리펩타이드의 복합체일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드가 하나 이상의 도메인 또는 영역을 포함하는 본 명세서에서, 다수의 도메인/영역은 바람직하게는 동일한 폴리펩타이드 사슬내에 존재 하는 것으로 인식될 것이다. 즉, 폴리펩타이드는 하나 이상의 도메인을 포함하거나 영역은 도메인/영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 VH를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 VL을 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 중쇄 불변 영역(CH)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 면역글로불린(Ig)의 CH1, CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 면역글로불린 중쇄 불변 서열 중 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH1 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH1-CH2 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH2 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH3 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 치환/아미노산 치환의 조합 중 어느 하나를 포함하는 CH2 및/또는 CH3 영역을 포함한다: F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L; S239D/I332E; S239D/I332E/A330L; S298A/E333A/K334A; L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A; D270E/K326D/A330M/K334E; G236A/S239D/I332E; K326W/E333S; S267E/H268F/S324T; E345R/E430G/S440Y; M252Y/S254T/T256E; M428L/N434S; S267E/L328F; N325S/L328F; N297A; N297Q; N297G; L235E; L234A/L235A; F234A/L235A; P329A; P329G; L234A/L235A/P329G; H268Q/V309L/A330S/P331S; 및 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 치환/아미노산 치환의 조합 중 어느 하나를 포함하는 CH3 영역을 포함한다(예컨대, 상기 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Ha et al., Front. Immnol (2016) 7:394]의 표 1에 나타남): T366W; T366S, L368A 및 Y407V; T366W 및 S354C; T366S, L368A, Y407V 및 Y349C; S364H 및 F405A; Y349T 및 T394F; T350V, L351Y, F405A and Y407V; T350V, T366L, K392L 및 T394W; K360D, D399M 및 Y407A; E345R, Q347R, T366V 및 K409V; K409D 및 K392D; D399K 및 E356K; K360E 및 K409W; Q347R, D399V 및 F405T; K360E, K409W 및 Y349C; Q347R, D399V, F405T 및 S354C; K370E 및 K409W; 및 E357N, D399V 및 F405T.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드의 CH2 및/또는 CH3 영역은 폴리펩타이드와 CH2 및/또는 CH3 영역을 포함하는 다른 폴리펩타이드의 회합을 촉진시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 면역글로불린 경쇄 불변 서열 중 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 면역글로불린 중쇄 불변 서열 중 하나 이상의 영역이 부재한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 CH2 영역이 부재한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 CH3 영역이 부재한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 CH2 영역이 부재하고, 또한 CH3 영역이 부재한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 다음 중 하나에 따른 N-말단으로부터 C-말단까지의 구조를 포함한다:
(i) VH
(ii) VL
(iii) VH-CH1
(iv) VL-CL
(v) VL-CH1
(vi) VH-CL
(vii) VH-CH1-CH2-CH3
(viii) VL-CL-CH2-CH3
(ix) VL-CH1-CH2-CH3
(x) VH-CL-CH2-CH3
또한, 본 발명의 폴리펩타이드로 구성된 항원-결합 분자가 본 발명에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 폴리펩타이드의 다음의 조합 중 하나를 포함한다:
(A) VH+VL
(B) VH-CH1+VL-CL
(C) VL-CH1+VH-CL
(D) VH-CH1-CH2-CH3+ VL-CL
(E) VH-CL-CH2-CH3+ VL-CH1
(F) VL-CH1-CH2-CH3+ VH-CL
(G) VL-CL-CH2-CH3+ VH-CH1
(H) VH-CH1-CH2-CH3+ VL-CL-CH2-CH3
(I) VH-CL-CH2-CH3+ VL-CH1-CH2-CH3
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 상기 (A) 내지 (I)에 나타낸 조합의 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함한다. 예로써, 상기 (D)를 참조로, 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 구조 VH-CH1-CH2-CH3를 포함하는 2개의 폴리펩타이드, 및 구조 VL-CL를 포함하는 2개의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 다음의 폴리펩타이드의 조합 중 하나를 포함한다:
(J) VH (항-VISTA)+VL (항-VISTA)
(K) VH (항-VISTA)-CH1+VL (항-VISTA)-CL
(L) VL (항-VISTA)-CH1+VH (항-VISTA)-CL
(M) VH (항-VISTA)-CH1-CH2-CH3+ VL (항-VISTA)-CL
(N) VH (항-VISTA)-CL-CH2-CH3+ VL (항-VISTA)-CH1
(O) VL (항-VISTA)-CH1-CH2-CH3+ VH (항-VISTA)-CL
(P) VL (항-VISTA)-CL-CH2-CH3+ VH (항-VISTA)-CH1
(Q) VH (항-VISTA)-CH1-CH2-CH3+ VL (항-VISTA)-CL-CH2-CH3
(R) VH (항-VISTA)-CL-CH2-CH3+ VL (항-VISTA)-CH1-CH2-CH3
여기서: "VH(항-VISTA)"는 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예컨대, (1) 내지 (76) 중 하나에 정의된 바와 같은 VISTA에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 VH를 지칭하며; "VL(항-VISTA)"은 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예컨대, (77) 내지 (173) 중 하나에 정의된 바와 같은 VISTA에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 VL을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 212 내지 243, 248 내지 250, 258, 266 또는 311 내지 321 중 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
링커 및 추가의 서열
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 CH1 영역과 CH2 영역 사이에 제공된다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 CL 영역과 CH2 영역 사이에 제공된다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 서열번호 207의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 아미노산 서열번호 사이에 하나 이상의 링커 서열을 포함한다. 링커 서열은 항원-결합 분자/폴리펩타이드의 VH, VL, CH1-CH2 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역 중 하나 이상의 한쪽 또는 양쪽 말단에 제공될 수 있다.
링커 서열은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369]에 기재되어 있고, 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 가요성(flexible) 링커 서열일 수 있다. 가요성 링커 서열은 링커 서열에 의해 연결된 아미노산 서열의 상대적인 이동을 허용한다. 가요성 링커는 당업자에게 공지되어 있으며, 몇개는 문헌[Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369]에서 확인된다. 가요성 링커 서열은 흔히 고 비율의 글리신 및/또는 세린 잔기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커 서열은 적어도 하나의 글리신 잔기 및/또는 적어도 하나의 세린 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 또는 1-10개의 아미노산의 길이를 갖는다.
본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 추가의 아미노산 또는 아미노산의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 아미노산 서열(들)을 포함함으로써 항원-결합 분자/폴리펩타이드의 발현, 접힘(folding), 트래피킹(trafficking), 프로세싱, 정제 또는 검출을 촉진한다. 예를 들면, 항원-결합 분자/폴리펩타이드는 선택적으로 항원-결합 분자/폴리펩타이드의 N-또는 C-말단에서 His, (예컨대, 6XHis), Myc, GST, MBP, FLAG, HA, E, 또는 바이오틴 태그를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자/폴리펩타이드는 검출가능한 모이어티(moiety), 예컨대, 형광성, 발광성, 면역-검출가능한, 방사선, 화학적, 핵산 또는 효소 표지(enzyme label)를 포함한다.
본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 신호 펩타이드(또한 리더 서열 또는 신호 서열로서 공지됨)를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 일반적으로 5 내지 30개의 소수성 아미노산의 서열로 이루어지며, 이는 단일 알파 나선을 형성한다. 분비된 단백질 및 세포 표면에서 발현된 단백질은 흔히 신호 펩타이드를 포함한다.
신호 펩타이드는 항원-결합 분자/폴리펩타이드의 N-말단에 존재할 수 있으며, 새로이 합성된 항원-결합 분자/폴리펩타이드 내에 존재할 수 있다. 신호 펩타이드는 항원-결합 분자/폴리펩타이드의 효율적인 트래피킹 및 분비를 위해 제공된다. 신호 펩타이드는 흔히 절단(cleavage)에 의해 제거되므로, 항원-결합 분자/폴리펩타이드를 발현하는 세포로부터 분비된 성숙한 항원-결합 분자/폴리펩타이드 내에 포함되지 않는다.
신호 펩타이드는 많은 단백질의 경우 알려져 있으며, 데이타베이스, 예를 들면, GenBank, UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL, 단백질 정보 공급원(Protein Information Resource), 단백질 데이타 뱅크(Protein Data Bank), Ensembl, 및 InterPro에 기록되어 있고/있거나 예컨대, 아미노산 서열 분석 도구, 예를 들면, SignalP (Petersen et al., 2011 Nature Methods 8: 785-786) 또는 Signal-BLAST (Frank and Sippl, 2008 Bioinformatics 24: 2172-2176)를 사용하여 확인/예측할 수 있다.
표지 및 접합체
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 검출가능한 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 검출가능한 모이어티, 예컨대, 형광성 표지, 인광성 표지, 발광성 표지, 면역-검출가능한 표지(예컨대, 에피토프 태그), 방사표지, 화학적, 핵산 또는 효소적 표지를 포함한다. 항원-결합 분자는 검출가능한 모이어티로 공유결합적으로 또는 비-공유결합적으로 표지될 수 있다.
형광성 표지는 예컨대, 플루오레세인, 로다민, 알로피코시아닌, 에오신 및 NDB, 희토류의 녹색 형광성 단백질(GFP) 킬레이트, 예를 들면, 유로퓸(Eu), 테르븀(Tb) 및 사마륨(Sm), 테트라메틸 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 4-메틸 움벨리페론, 7-아미노-4-메틸 쿠마린, Cy3, 및 Cy5를 포함한다. 방사표지는 방사선동위원소, 예를 들면, 요오드123, 요오드125, 요오드126, 요오드131, 요오드133, 브롬77, 테크네튬99m, 인듐111, 인듐113m, 갈륨67, 갈륨68, 루테늄95, 루테늄97, 루테늄103, 루테늄105, 수은207, 수은203, 레늄99m, 레늄101, 레늄105, 스칸듐47, 텔루륨121m, 텔루륨122m, 텔루륨125m, 툴륨165, 툴륨l167, 튤륨168, 구리67, 불소18, 이트륨90, 팔라듐100, 비스무쓰217 및 안티모니211를 포함한다. 발광성 표지는 방사발광성, 화학발광성(예컨대, 아크리디늄 에스테르, 루미놀, 이소루미놀) 및 생물발광성 표지를 포함한다. 면역-검출성 표지는 합텐(hapten), 펩타이드/폴리펩타이드, 항체, 수용체 및 리간드, 예를 들면, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 디곡시게닌을 포함한다. 핵산 표지는 앱타머를 포함한다. 효소 표지는 예컨대, 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, 글루코즈 옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 루시퍼라제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 화학 모이어티에 접합된다. 화학 모이어티는 치료 효과를 제공하기 위한 모이어티일 수 있다. 항체-약물 접합체는 예컨대, 문헌[Parslow et al., Biomedicines. 2016 Sep; 4(3):14]에서 검토된다. 일부 실시형태에서, 화학적 모이어티는 약물 모이어티(예컨대, 세포독성제)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 모이어티는 화학치료제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 모이어티는 칼리체아미신(calicheamicin), DM1, DM4, 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), SN-38, 독소루비신, 두오카르마이신, D6.5 및 PBD로부터 선택된다.
항원-결합 분자의 특수한 예시적인 실시형태
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 212의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 213의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 214의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 215의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 216의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 217의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 218의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 219의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 220의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 221의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 222의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 223의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 224의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 225의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 226의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 227의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 228의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 229의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 230의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 231의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 232의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 233의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는:
(i) 서열번호 234의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 235의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 236의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 237의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 238의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 239의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 240의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 241의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 242의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 243의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 248의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 250의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 249의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 250의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 258의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 250의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 266의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 250의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 다음을 포함하거나, 이로 이루어진다:
(i) 서열번호 330의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드; 및
(ii) 서열번호 213의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 2개의 폴리펩타이드.
항원-결합 분자의 기능적 특성
본 명세서에 기재된 항원-결합 분자는 특정의 기능적 특성을 참조로 특성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자는 다음의 특성 중 하나 이상을 지닐 수 있다:
VISTA (예를 들어, 인간, 쥣과동물 및/또는 시노몰구스 마카퀴 VISTA)에 결합한다;
PD-L1 및/또는 HER3에 결합하지 않는다;
Fcγ 수용체에 결합하지 않는다;
C1q에 결합하지 않는다;
ADCC를 유도하지 않는다;
ADCP를 유도하지 않는다;
CDC를 유도하지 않는다;
FcRn 수용체에 결합한다;
VISTA-발현 세포에 결합한다;
VISTA 및 VISTA의 결합 파트너 (예를 들어, PSGL-1, VSIG-3 또는 VSIG-8) 사이의 상호작용을 억제한다;
VISTA-매개 신호전달을 억제한다;
Fc-매개 기능에 독립적으로 VISTA-매개 신호전달을 억제한다;
VISTA-발현 세포의 사멸을 증가시킨다;
VISTA-발현 세포의 사멸을 유도/증가시키지 않는다;
VISTA-발현 세포의 수/비율을 감소시킨다;
VISTA-발현 세포의 수/비율을 감소시키지 않는다;
효과기 면역 세포 수/활성을 증가시킨다;
억제 면역 세포 수/활성을 감소시킨다;
억제 면역 세포 증식을 감소시킨다;
VISTA-발현 세포에 의해 매개되는 면역억제를 감소시킨다;
항원-제시 세포에 의한 항원 제시를 증가시킨다;
면역 세포에 의한 IL-6의 생성을 증가시킨다;
혼합 림프구 반응 (MLR) 분석에서 IFN-γ, IL-2 및/또는 IL-17의 생성을 증가시킨다;
T 세포 증식, IFN-γ 생성 및/또는 TNFa 생성을 증가시킨다; 및
생체내에서 암의 발달 및/또는 진행을 억제한다.
본 명세서에 기재된 항원-결합 분자는 바람직하게는 VISTA에 대해 특이적인 결합을 나타낸다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "특이적인 결합"은 항원에 대해 선택적이며, 비-표적 항원에 대해 비-특이적인 결합으로부터 구별될 수 있는 결합을 지칭한다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자는 바람직하게는 표적에 고 친화성, 및/또는 이것이 다른 비-표적 분자에 결합하는 것보다 더 긴 기간으로 결합한다.
소정의 분자에 특이적으로 결합하는 소정의 폴리펩타이드이 능력은 당해 분야에 공지된 방법에 따른 분석, 예를 들면, ELISA, 표면 플라스몬 공명(SPR; 참조: 예컨대, Hearty et al., Methods Mol Biol (2012) 907:411-442), 생물-층 간섭계(생물층 간섭계)(참조: 예컨대, Lad et al., (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507), 유동 세포분석법, 또는 방사표지된 항원-결합 분석(RIA) 효소-표지된 면역흡착성 분석에 의해 측정될 수 있다. 이러한 분석을 통해 소정의 분자에 대한 결합은 측정되고, 정량화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합은 소정의 분석에서 검출된 반응일 수 있다.
일부 실시형태에서, 비-표적 분자에 대한 항원-결합 분자의 결합 정도는 예컨대, ELISA, SPR, 생물-층 간섭계 또는 RIA에 의해 측정된 바와 같이 표적 분자에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 대안적으로, 결합 특이성은 결합 친화성 양상에서 반영될 수 있으며 여기서 항원-결합 분자는 비-표적 분자에 대한 항원-결합 분자의 KD보다 적어도 0.1 자릿수(즉, 0.1 x 10n, 여기서 n은 자릿수를 나타내는 정수이다) 더 큰 해리 상수(KD)로 결합한다. 이는 선택적으로 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 또는 2.0 중 하나일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 인간 VISTA, 쥣과동물 (예를 들어, 마우스) VISTA 및/또는 시노몰구스 마카퀴 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis)) VISTA와의 결합을 나타낸다. 즉, 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 인간 VISTA 및 쥣과동물 VISTA 및/또는 시노몰구스 마카퀴 VISTA에 대해 교차 반응성이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 비인간 영장류의 VISTA와 교차 반응성을 나타낸다. 모델 종에서 VISTA에 대한 교차 반응을 통해 대용 분자에 의존하지 않고도 동계 모델에서 효능을 생체내에서 탐색할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 PD-L1 (예를 들어, 인간 PD-L1)에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 HER3 (예를 들어, 인간 HER3)에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 단백질의 B7 계열의 또 다른 구성원에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는다 (즉, 교차 반응하지 않음). 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 PD-L1, PD-L2 CD80, CD86, ICOSLG, CD276, VTCN1, NCR3LG1, HHLA2 및/또는 CTLA4에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 PD-1, PD-L1, B7H3, VTCN1 (B7H4), NCR3LG1 (B7H6), HHLA2 (B7H7) 및/또는 CTLA4에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 Fc-매개 기능 (즉, 관련된 Fc-매개 기능(들)을 유도하는 능력이 부재함)을 유도할 수 없다. 이러한 항원 결합 분자는 관련 기능 (들)이 부재하는 것으로 기재될 수 있다.
전술한 바와 같이, ADCC/ADCP/CDC를 유도하지 않는 (즉 유도할 수 없는) Fc 영역/항원 결합 분자는 실질적으로 ADCC/ADCP/CDC 활성을 유도하지 않으며, 이는 관련 활성에 대한 적절한 분석에서 분석에 의해 측정되는 바와 같다. 유사하게, 참조 단백질 (예를 들어 소정의 Fc 수용체 또는 보체 단백질)에 "결합하지 않는" 항원 결합 분자는 적절한 분석에서 참조 단백질에 대한 결합을 실질적으로 나타내지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 ADCC를 유도할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 ADCP를 유도할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 CDC를 유도할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 ADCC를 유도할 수 없고/거나, ADCP를 유도할 수 없고/거나, CDC를 유도할 수 없다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 Fc 수용체에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 Fcγ 수용체에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb 중 하나 이상에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcγRIIIa에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcγRIIa에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcγRIIb에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcRn에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 보체 단백질에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 C1q에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 N297에 해당하는 아미노산 잔기에 글리코실화가 부재한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 인간 VISTA, 쥣과동물 VISTA 및/또는 시노몰구스 마카퀴 VISTA에 결합하고; PD-L1, PD-1, B7H3, VTCN1 (B7H4), NCR3LG1 (B7H6), HHLA2 (B7H7) 및/또는 CTLA4 (예를 들어, 인간 PD-L1/PD-1/B7H3/VTCN1/NCR3LG1/HHLA2/CTLA4)에 결합하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 분자는 VISTA (예를 들어, 인간 VISTA, 마우스 VISTA)에 결합하며, KD는 10 μM 이하, 바람직하게는 ≤5 μM, ≤2 μM, ≤1 μM, ≤500 nM, ≤100 nM, ≤75 nM, ≤50 nM, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤12.5 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM, ≤6 nM, ≤5 nM, ≤4 nM ≤3 nM, ≤2 nM, ≤1 nM 또는 ≤500 pM 중 하나이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA (예를 들어, 인간 VISTA, 마우스 VISTA)에 결합하고, 친화도 KD는 ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM 또는 ≤6 nM, ≤5 nM, ≤4 nM, ≤3 nM, ≤2 nM 또는 ≤1 nM이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA (예를 들어, 인간 VISTA, 마우스 VISTA)에 결합하고, 친화도 KD = ≤500 pM, ≤100 pM, ≤90 pM, ≤80 pM, ≤70 pM 또는 ≤60 pM, ≤50 pM, ≤40 pM, ≤30 pM, ≤20 pM, ≤10 pM, ≤9 pM, ≤8 pM, ≤7 pM 또는 ≤6 pM, ≤5 pM, ≤4 pM, ≤3 pM, ≤2 pM 또는 ≤1 pM이다.
본 발명의 항원-결합 분자는 목적한 VISTA의 특수한 영역에 결합할 수 있다. 본 도메인에 따른 항원-결합 분자의 항원-결합 영역은 아미노산의 연속된 서열(즉, 아미노산 1차 서열)로 이루어진 VISTA의 선형 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 영역 분자는 아미노산 서열의 아미노산의 불연속 서열로 이루어진 VISTA의 구조적 에피토프에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA의 세포외 영역에서 VISTA에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 Ig-유사 V-형 도메인에서 VISTA에 결합할 수 있다 (예를 들어, 서열번호 6에 제시된 영역). 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 31에 제시된 영역에서 VISTA에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 322에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자 IGN175A (예를 들어, WO 2014/197849 A2에 기재됨)에 의해 결합된 VISTA의 영역에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 267의 서열로 이루어진 폴리펩타이드 및 서열번호 268의 서열로 이루어진 폴리펩타이드로 구성된 항원 결합 분자에 의해 결합된 VISTA의 영역에 결합하지 않는다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA에 대한 결합에 대해, IGN175A (예를 들어, WO 2014/197849 A2에 기재됨)와 경쟁하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA에 대한 결합에 대해, 서열번호 267의 서열로 이루어진 폴리펩타이드 및 서열번호 268의 서열로 이루어진 폴리펩타이드로 구성된 항원 결합 분자와 경쟁하지 않는다.
VISTA에 대한 결합에 대해, 소정의 항원 결합 분자가 IGN175A 또는 서열번호 267의 서열로 이루어진 폴리펩타이드 및 서열번호 268의 서열로 이루어진 폴리펩타이드로 이루어진 항원 결합 분자와 경쟁하는 능력은, 예를 들어 문헌[Abdiche et al., J Immunol Methods (2012) 382(--2):101-116] (상기 문헌은 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 경쟁 ELISA에 의해, 또는 에피토프 비닝에 의해 분석될 수 있다. 에피토프 비닝은 예를 들어 본 출원의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 예를 들어 BLI 분석에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 275에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 단량체의 사슬을 지칭한다. 펩타이드는 통상적으로 약 2 내지 50개 아미노산의 영역내 길이를 갖는다. "폴리펩타이드"는 2개 이상의 펩타이드의 중합체 사슬이다. 폴리펩타이드는 통상적으로 약 50개 아미노산 이상의 길이를 갖는다.
소정의 펩타이드/폴리펩타이드에 결합하는 항원-결합 분자의 능력은 당업자에게 잘 공지된 방법, 예를 들면, ELISA, 면역블롯(예컨대, 웨스턴블롯), 면역침전, 표면 플라스몬 공명 및 생물층 간섭법에 의해 분석될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VISTA의 동일한 영역, 또는 VISTA의 오버랩핑 영역(overlapping region)을 클론 4M2-C12, 4M2-B4, 4M2-C9, 4M2-D9, 4M2-D5, 4M2-A8, V4H1, V4H2, V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30, V4-C31, 2M1-B12, 2M1-D2, 1M2-D2, 13D5p, 13D5-1, 13D5-13, 5M1-A11 또는 9M2-C12 중 하나의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체가 결합된 VISTA의 영역에 결합시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 IGN175A에 의해 결합된 VISTA의 영역과 상이한 VISTA의 영역에 결합할 수 있다 (예를 들어, WO 2014/197849 A2에 기재됨). 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 267의 서열로 이루어진 폴리펩타이드 및 서열번호 268의 서열로 이루어진 폴리펩타이드로 구성된 항원 결합 분자에 의해 결합된 VISTA의 영역과 상이한 VISTA의 영역에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 IGN175A에 의해 결합된 VISTA의 영역과 중첩되지 않는 VISTA의 영역에 결합할 수 있다 (예를 들어, WO 2014/197849 A2에 기재됨). 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 267의 서열로 이루어진 폴리펩타이드 및 서열번호 268의 서열로 이루어진 폴리펩타이드로 구성된 항원 결합 분자에 의해 결합된 VISTA의 영역과 중첩되지 않는 VISTA의 영역에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VSTB112에 의해 접촉된 VISTA의 잔기와 동일하지 않은 VISTA의 잔기와의 접촉을 통해 VISTA에 결합한다 (예를 들어, WO 2015/097536 A2에 기재됨). 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 269의 서열로 이루어진 폴리펩타이드 및 서열번호 270의 서열로 이루어진 폴리펩타이드로 구성된 항원 결합 분자에 의해 접촉된 VISTA의 잔기와 동일하지 않은 VISTA의 잔기와의 접촉을 통해 VISTA에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자에 대한 에피토프는 VSTB112에 대한 에피토프와 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자에 대한 에피토프는 서열번호 269의 서열로 이루어진 폴리펩타이드 및 서열번호 270의 서열로 이루어진 폴리펩타이드로 구성된 항원 결합 분자에 대한 에피토프와 동일하지 않다.
항체가 결합하는 펩타이드/폴리펩타이드의 영역은 당해 분야에 잘 공지된 다양한 방법, 예를 들면, 항체-항원 복합체의 X-선 공-결정학 분석, 펩타이드 스캐닝, 돌연변이유발 맵핑, 질량 분광법에 의한 수소-중소수 교환 분석, 파아지 디스플레이, 경쟁 ELISA 및 단백질분해-기반 '보호' 방법을 사용하여 당업자에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 문헌[Gershoni et al., BioDrugs, 2007, 21(3):145-156]에 기재되어 있으며, 이는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 VISTA가 세포 표면에서(즉, 세포막 내 또는 세포막에서) 발현된 경우 항원-결합 분자(즉, 세포외 항원-결합 분자)에 접근가능한 영역내 VISTA에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VISTA을 발현하는 세포의 세포 표면에서 발현된 VISTA에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA-발현 세포 (예를 들어, CD14+ 단핵구 (예컨대, 단핵구-유래 억제 세포 (MDSC)) 및/또는 CD33+ 골수 세포, 종양 관련 대식세포 (TAM), 및 호중구)에 결합할 수 있다.
소정의 세포형에 결합하는 항원-결합 분자의 능력은 세포를 항원-결합 분자와 접촉시키고, 예컨대, 결합하지 않은 항원-결합 분자를 제거하기 위한 세척 단계 후에 세포에 결합된 항원-결합 분자를 검출함으로써 분석할 수 있다. 면역 세포 표면 분자-발현 세포 및/또는 암 세포 항원-발현 세포에 결합하는 항원-결합 분자의 능력은 유동 세포분석법 및 면역형광 현미경 검사법과 같은 방법으로 분석할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 분자는 VISTA의 길항제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VISTA 및/또는 VISTA의 결합 파트너 (예를 들어, PSGL-1, VSIG-3, VSIG-8)에 의해 매개된 기능 또는 공정(예컨대, 상호작용, 신호전달 또는 다른 활성)을 억제할 수 있다. 본 명세서에서, '억제'는 대조군 상태에 비해 감소, 축소 또는 약화를 지칭한다.
VISTA-결합 본 명세서에 기재된 항원 결합 분자는 Fc-매개 기능 예컨대, ADCC, ADCP 및 CDC가 필요하지 않은 메커니즘에 의해 VISTA-매개 기능/과정을 억제할 수 있다. 즉, VISTA-결합 본 명세서에 기재된 항원 결합 분자는 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 유도할 필요없이 VISTA-발현 세포의 면역억제 활성을 억제할 수 있다.
특히, VISTA-결합 본 명세서에 기재된 항원 결합 분자는 Fcγ 수용체와의 결합 및/또는 C1q와의 결합이 필요하지 않은 메커니즘을 통해 VISTA를 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA와 VISTA의 결합 파트너 (예를 들어, PSGL-1, VSIG-3, VSIG-8) 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA 및 PSGL-1 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA 및 VSIG-3 사이의 상호작용을 억제할 수 있다.
2개의 인자 사이의 상호작용을 억제하는 항원-결합 분자의 능력은 예를 들면, 항체/단편의 존재 하에서 상호작용의 분석, 또는 상호작용 파트너 중 하나 또는 둘 다와 항체/단편의 인큐베이션(incubation)에 의해 측정할 수 있다. 소정의 항원-결합 분자가 2개의 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제할 수 있는지를 측정하기 위한 분석에는 경쟁 ELISA 분석이 있다.
소정의 상호작용(예컨대, VISTA 및 VISTA의 결합 파트너 사이)을 억제할 수 있는 항원-결합 분자는 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재) 하에서의 상호작용의 수준과 비교하여, 항원-결합 분자의 존재 하에서-또는 상호작용 파트너 중 하나 또는 둘 다와 항원-결합 분자의 인큐베이션 후-상호작용 파트너 사이의 상호작용 수준의 감소/축소의 관찰에 의해 확인된다. 적합한 분석은 시험관내에서, 예컨대, 재조합 상호작용 파트너를 사용하여 또는 상호작용 파트너를 발현하는 세포를 사용하여 수행할 수 있다. 상호작용 파트너를 발현하는 세포는 이렇게 내인성적으로 발현할 수 있거나 세포내로 도입된 핵산으로부터 이렇게 발현할 수 있다. 이러한 분석의 목적을 위해, 상호작용 파트너 중 하나 또는 둘 다 및/또는 항원-결합 분자는 상호작용 수준을 검출하고/하거나 측정할 목적을 위한 검출가능한 실체로 표지될 수 있거나 이와 함께 사용될 수 있다.
2개의 결합 파트너 사이의 상호작용을 억제하는 항원-결합 분자의 능력은 또한 이러한 상호작용의 하부 기능적 결과의 분석으로 측정할 수 있다. 예를 들면, VISTA와 VISTA의 결합 파트너 사이의 상호작용의 하부 기능적 결과는 VISTA-매개된 신호전달을 포함할 수 있다. 예를 들면, VISTA와 VISTA의 결합 파트너의 상호작용을 억제하는 항원-결합 분자의 능력은 MLR 분석에서 IL-2, IFN-γ 및/또는 IL-17의 생성 분석에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 VISTA와 VISTA의 결합 파트너 (예를 들어, PSGL-1, VSIG-3, VSIG-8) 사이의 상호작용을 항원-결합 분자의 부재하에서(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재 하에서) VISTA 및 VISTA의 결합 파트너 사이의 상호작용의 수준의 1배, 예컨대, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배, 또는 ≤0.01배 미만까지 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA-매개 신호전달을 억제한다. VISTA-매개 신호전달은 본 명세서의 실험 실시예에 기재된 바와 같이, 효과기 면역 세포 수/활성의 분석, 예컨대, MLR 분석을 사용하여 분석될 수 있다. VISTA-매개 신호전달의 억제는 예를 들어, IL-2, IFN-γ 및/또는 IL-17의 생성의 증가에 의해 측정되는 바와 같이, 효과기 면역 세포의 수 및/또는 활성의 증가의 검출에 의해 확인될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 Fc-매개 기능이 필요하거나 관여하지 않는 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 Fc-매개 기능에 독립적으로 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 즉, 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 Fc 영역-독립적 방식으로 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다.
예를 들면, Fc 매개 기능이 필요/수반되지 않는 메커니즘에 의해 VISTA 매개 신호전달을 억제하는 항원 결합 분자의 능력은, 예를 들어 기능적 Fc 영역이 부재하는 형식으로 제공된 항원 결합 분자가 VISTA 매개 신호전달을 억제하는 능력을 분석함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, '침묵' Fc 영역 (예를 들어 LALA PG 치환 포함)을 포함하는 항원 결합 분자를 사용하거나, Fc 영역이 부재하는 형식 (예를 들어, scFv, Fab 등)으로 제공된 항원 결합 분자를 사용하여 VISTA 매개 신호전달에 대한 효과를 조사할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 ADCC가 수반되지 않는 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 ADCP가 수반되지 않는 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 CDC가 수반되지 않는 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 항원 결합 분자와 Fc 수용체의 결합이 필요하지 않은 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체의 결합이 필요하지 않은 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 항원 결합 분자와 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb 중 하나 이상의 결합이 필요하지 않은 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcγRIIIa의 결합이 필요하지 않은 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcγRIIa의 결합이 필요하지 않은 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 FcγRIIb의 결합이 필요하지 않은 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 보체 단백질의 결합이 필요하지 않은 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 C1q의 결합이 필요하지 않은 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 N297 글리코실화가 필요하지 않은 메커니즘에 의해 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA-발현 세포의 사멸을 증가시킬 수 있다. VISTA-발현 세포의 사멸은 항원 결합 분자의 효과기 기능을 통해 증가될 수 있다. 항원 결합 분자가 Fc 영역을 포함하는 실시형태에서, 항원 결합 분자는 보체 의존적 세포독성 (CDC), 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 항체-의존적 세포 식세포작용 (ADCP) 중 하나 이상을 통해 VISTA-발현 세포의 사멸을 증가시킬 수 있다.
VISTA-발현 세포의 사멸을 증가시킬 수 있는 항원-결합 분자는 적절한 분석에서 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에서 검출된 세포 사멸의 수준과 비교하여, 항원-결합 분자의 존재 하에서 VISTA-발현 세포의 세포 사멸의 증가된 수준을 관찰하거나, 이후 VISTA-발현 세포와 항원-결합 분자의 인큐베이션에 의해 확인된다. CDC, ADCC 및 ADCP의 분석은 당업자에 널리 공지되어 있다. VISTA-발현 세포의 사멸 수준은 또한 상이한 처리 조건에의 노출 후 생존 및/또는 비생존 VISTA-발현 세포의 수/특성을 측정함으로써, 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 VISTA-발현 세포 (예를 들어, VISTA-발현 MDSC)의 사멸을 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재) 하에서 관찰된 사멸 수준의 1배 초과, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배로 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA-발현 세포 (예를 들어, VISTA-발현 MDSC)의 수를 항원-결합 분자의 부재 하의 인큐베이션 (또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재하의 인큐베이션) 후 관찰된 VISTA-발현 세포 (예를 들어, VISTA-발현 MDSC, TAM, 호중구)의 수의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배 또는 ≤0.01배로 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 비고갈 항원 결합 분자이다. 즉, 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA-발현 세포의 실질적 고갈을 유발하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA-발현 세포에 대한 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 유도/증가시키지 않는다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 항원 결합 분자가 Fc 영역이 부재하는 실시형태 또는 항원 결합 분자가 Fc-매개 항체 효과기 기능을 유도할 수 없는 Fc 영역을 포함하는 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자 VISTA-발현 세포의 사멸을 유도/증가시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자 VISTA-발현 세포의 수/비율을 감소시키지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 (i) VISTA-매개 신호전달을 억제하고, (ii) VISTA-발현 세포의 사멸을 유도/증가시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 (i) VISTA-매개 신호전달, 및 (ii) VISTA-발현 세포의 수/비율을 감소시키지 않는다.
이는 VISTA가 고갈되는 것이 바람직하지 않은 세포에 의해 VISTA가 발현되기 때문에 특히 유리할 수 있다. 예를 들어, VISTA는 면역 세포 (예를 들어, 특정 유형의 T 세포 및 수지상 세포)에 의해 낮은 수준으로 발현되므로, 그 수/비율을 사멸시키거나 감소시키는 것이 바람직하지 않다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 예를 들어 적절한 시험관내 분석 또는 생체내에서 음성 대조군 조건에 비해, 효과기 면역 세포의 수 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 기재으로서, 본 발명의 항원 결합 분자는 효과기 면역 세포 증식 및 기능의 MDSC-매개 억제로부터 효과기 면역 세포를 방출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 효과기 면역 세포는 예를 들어, CD8+ T 세포, CD8+ 세포독성 T 림프구 (CD8+ CTL), CD4+ T 세포, CD4+ T 헬퍼 세포, NK 세포, IFNγ 생성 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 항원 경험 T 세포 또는 CD45RO+ T 세포일 수 있다.
세포 수 및 비율은 예를 들어 항체를 사용하여, 세포 유형을 검출할 수 있는 유세포 분석을 통해 측정될 수 있다. 세포 분열은 예를 들어 문헌[Fulcher and Wong, Immunol Cell Biol (1999) 77(6): 559-564]에 기재된 바와 같이, 3H-티미딘의 혼입의 시험관내 분석 또는 CFSE 희석 분석에 의해 분석될 수 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 효과기 면역 세포 활성은 이러한 활성의 상관관계를 측정하여 분석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효과기 면역 세포 활성은 예를 들어 IL-2, IFN-γ 및/또는 IL-17의 생성 분석에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 효과기 면역 세포 유형의 수를 항원 결합 분자의 부재 하 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 존재 하)에서 관찰된 수의 1배 초과, 예를 들어 ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배로 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 효과기 면역 세포 활성의 상관관계 수준을 항원 결합 분자의 부재 하 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 존재 하)에서 관찰된 수준의 1배 초과, 예를 들어 ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8시간, ≥1.9배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배로 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 VISTA 발현 세포에 의해 매개되는 면역 억제 수준을 감소시킬 수 있다. 면역 억제 수준의 변화는, 예를 들어 문헌[Ochoa et al., Ann Surg. 2001 Mar; 233(3): 393-399 및 Dikalov and Harrison Antioxid Redox Signal. 2014 Jan 10; 20(2): 372-382]에 기재된 바와 같이, 아르기나제 1의 발현 및/또는 VISTA-발현 세포에 의한 활성 산소 종 (ROS)의 생성을 측정하는 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 항원-제시 세포에 의한 항원 제시를 증가시킬 수 있으며, 이는 예를 들어, 적합한 항원 제시 분석을 사용하여 측정되는 바와 같다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 식세포작용 세포 (예를 들어, 호중구, 단핵구, 대식세포, 비만 세포, 및/또는 수지상 세포)에 의해 식세포작용을 증가시킬 수 있으며, 이는 예를 들어 적합한 식세포작용 수준 분석을 사용하여 측정되는 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 면역 세포에 의한 IL-6의 생성을 증가시킬 수 있다. 면역 세포는 예를 들어, PBMC, 림프구, T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 단핵구. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 예를 들어, LPS에 의한 자극 후 면역 세포에 의한 IL-6의 생성을 증가시킬 수 있다. 항원 결합 분자가 면역 세포에 의한 IL-6의 생성을 증가시키는 능력은 예를 들어, 본 명세서의 실시예 10에 기재된 바와 같은 시험관내 분석으로 분석될 수 있다. 이러한 방법은 단핵구 (예를 들어, THP1 세포)를 LPS에 의해 자극하는 단계, 및 항원 결합 분자와 자극된 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 면역 세포 (예를 들어, LPS-자극된 THP1 세포)에 의한 IL-6 생성을 항원 결합 분자의 부재 하 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 존재 하)에서 관찰된 수준의 1배 초과, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배로 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석에서 T 세포 증식, IL-2 생성, IFN-γ 생성 및/또는 IL-17 생성을 증가시킬 수 있다. MLR 분석은 문헌[Bromelow et al J.Immunol Methods, 2001 Jan 1;247(1-2):1-8] (상기 문헌은 본 명세성에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바 또는 본 명세서의 실험 실시예에 기재된 바와 같이, 수행될 수 있다. IL-2, IFNγ 및/또는 IL-17 생성은 예를 들어 당업자에게 널리 공지된 항체 기반 방법, 예컨대 웨스턴블롯, 면역조직화학, 면역세포화학, 유세포 분석, ELISA, ELISPOT 또는 리포터 기반 방법에 의해 분석될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 MLR 분석에에서 T 세포 증식, IL-2 생성, IFN-γ 생성 및/또는 IL-17 생성을 항원 결합 분자의 부재 하 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 존재 하)에서 관찰된 수준의 1배 초과, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배로 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 예를 들어, VISTA/VISTA 발현 세포의 존재 하에 T 세포 증식, IFN-γ 생성 및/또는 TNFa 생성을 증가시킬 수 있다. 항원 결합 분자는 예를 들어, 본 명세서의 실험 실시예에 기재된 바와 같이, 시험관내 분석에서 이러한 ㅌ특성에 대해 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 (예를 들어, VISTA/VISTA 발현 세포의 존재 하에) T 세포 증식, IFN-γ 생성 및/또는 TNFa 생성을 항원 결합 분자의 부재 하 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 존재 하)에서 관찰된 수준의 1배 초과, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배로 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 T 세포 (예를 들어, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포) 증식을 종래 기술에 개시된 VISTA-결합 항체 (예를 들어, VSTB112, 예를 들어, WO 2015/097536 A2에 기재됨)보다 더 큰 정도로 증가시킬 수 있다. T 세포 증식은 예를 들어, 본 명세서의 실시예 9에 기재된 바와 같은 시험관내 분석으로 평가될 수 있으며, 작용제 항-CD3 항체의 존재 하에 배양함으로써, T 세포 증식을 자극하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 이러한 분석에서 T 세포 증식을 종래 기술의 VISTA-결합 항체 (예를 들어, VSTB112)에 의해 유도되는 증식 수준의 1배 초과, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배로 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 THP1 세포에 의한 IL-6 생성을 종래 기술에 개시된 VISTA-결합 항체 (예를 들어, VSTB112, 예를 들어, WO 2015/097536 A2에 기재됨)보다 더 큰 정도로 증가시킬 수 있다. THP1 세포에 의한 IL-6 생성은 예를 들어, 본 명세서의 실시예 10에 기재된 바와 같은 시험관내 분석으로 평가될 수 있으며, LPS에 의해 THP1 세포를 자극하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 이러한 분석에서 IL-6 생성을 종래 기술의 VISTA-결합 항체 (예를 들어, VSTB112)에 의해 유도되는 수준의 1배 초과, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배로 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 억제 면역 세포의 수 및/또는 활성을 감소시킬 수 있고/거나, 억제 면역 세포의 증식을 억제시킬 수 있고/거나, 세포 집합 내의 억제 면역 세포 (예를 들어, 종양으로부터 획득된 CD45+ 세포, 예를 들어, CD45+ 세포)의 비율을 감소시킬 수 있으며, 이는 적절한 시험관내 분석 또는 생체내에서 측정되는 바와 같다.
억제 면역 세포는 예를 들어, VISTA-발현 세포, Arg1-발현 세포, MDSC, 과립세포 MDSC (g-MDSC) 또는 단핵구 MDSC (m-MDSC)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 수/활성/증식/비율의 감소는 항원 결합 분자의 존재 하 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 존재 하)에 관찰되는 수/활성/증식/비율의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배 또는 ≤0.01배이다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 Fc-매개 기능을 수반하지 않는 메커니즘에 의해 억제 면역 세포의 수/활성/증식/비율을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 Fc-매개 기능에 독립적으로 (즉, Fc 영역 독립적 방식) 억제 면역 세포의 수/활성/증식/비율을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 수반하지 않는 메커니즘에 의해 억제 면역 세포의 수/활성/증식/비율을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA-발현 세포의 고갈을 수반하지 않는 메커니즘에 의해 억제 면역 세포의 수/활성/증식/비율을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 생체내에서 암의 발달 및/또는 진행을 억제한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 예를 들어, 효과기 면역 세포에 의한 암세포 사멸의 증가를 야기한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 예를 들어, 적절한 대조군 조건과 비교하여, 생체내 암세포 수의 감소를 야기한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 종양 성장을 억제하며, 이는, 예를 들어 시간 경과에 따라 종양 크기/부피를 측정함으로써 결정되는 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 항원 결합 분자로 처리된 마우스에서, IFN-γ 및/또는 IL-23의 혈청 수준을 증가시킬 수 있다. IFN-γ 및/또는 IL-23의 혈청 수준은, 예를 들어 마우스로부터 획득된 혈액 샘플로부터 유래된 혈청의 ELISA에 의해 분석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자의 투여는 IFN-γ 및/또는 IL-23의 혈청 수준을 항원 결합 분자의 투여의 부재 하에 관찰된 수준 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 투여 후 관찰되는 수준)의 1배 초과, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배로 증가시킨다.
본 발명의 항원 결합 분자는 적절한 생체내 모델, 예를 들어, 세포주 유래 이종접합 모델 예컨대, CT26 세포-유래 모델, 4T-1 세포-유래 모델, LL2 세포-유래 모델, B16 세포-유래 모델 또는 EL4 세포-유래 모델에서 암의 발달 및/또는 진행을 억제하는 능력에 대해 분석될 수 있다. 암은 VISTA-발현 세포 및/또는 MDSC (예를 들어, VISTA-발현 MDSC, TAM, 호중구)가 병리적으로 관련된 암일 수 있다. MDSC가 '병리학적으로 관련된' 암에는 MDSC 또는 MDSC의 증가된 수/비율이 암의 발병, 발달 또는 진행 및/또는 암의 하나 이상의 증상의 중증도와 양성적으로 관련되어 있는 암 또는 MDSC 또는 MDSC의 수/비율이 암의 발병, 발달 또는 진행의 위험 인자인 암이 포함된다. 상기 암은 질병에 의해 영향을 받는 기관/조직 (예를 들어, 질병/병태의 증상이 나타나는 기관/조직) 또는 종양에서 MDSC를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 항원-결합 분자의 투여는 예컨대, CT26 세포, 4T-1 세포, LL2 세포, B16 세포 또는 EL4 세포-유래된 이종이식체 모델에서 측정된 바와 같이, 암의 발달/진행의 억제, 암의 발달의 지연/예방, 종양 성장에 있어서의 감소/이에 대한 지연/이의 예방, 전이에 있어서의 감소/이에 대한 지연/이의 예방, 암의 증상의 중증도에 있어서의 감소, 암 세포의 수에 있어서의 감소, 종양 크기/용적에 있어서의 감소, 및/또는 생존(예컨대, 진행이 없는 생존)에 있어서의 증가 중 하나 이상을 유발할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자의 투여는 항원 결합 분자의 투여의 부재 하 (또는 적절한 대조군 항원 결합 분자의 투여 후) 관찰된 종양 성장의 5% 초과, 예를 들어, ≥10%, ≥15%, ≥20%, ≥25%, ≥30%, ≥35%, ≥40%, ≥45%, ≥50%, ≥55%, ≥60%, ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90% 또는 ≥95%를 억제할 수 있다.
키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor: CAR)
본 발명은 또한 본 발명의 항원-결합 분자 또는 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.
CAR은 항원-결합 및 T 세포 활성화 기능 둘 다를 제공하는 재조합 수용체이다. CAR 구조 및 가공(engineering)은 예를 들면, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Dotti et al., Immunol Rev (2014) 257(1))에서 검토된다. CAR은 세포 막 앵커(anchor) 영역에 연결된 항원-결합 영역 및 신호전달 영역을 포함한다. 임의의 힌지 영역은 항원-결합 영역과 세포막 앵커 영역 사이에 분리를 제공할 수 있으며, 가요성 링커로서 작용할 수 있다.
본 발명의 CAR은 본 발명의 항원-결합 분자를 포함하거나 이로 이루어지거나, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 항원-결합 영역을 포함한다.
세포막 앵커 영역은 CAR의 항원-결합 영역과 신호전달 영역 사이에 제공되며 CAR을 세포외 공간내 항원-결합 영역, 및 세포내부의 신호전달 영역을 사용하여, CAR을 발현하는 세포의 세포막에 앵커시키기 위해 제공한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD3-ζ, CD4, CD8 또는 CD28 중 하나에 대한 막관통 영역 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로부터 유래된 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 세포막 앵커 영역을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 참조 아미노산 서열'로부터 유래된' 영역은 참조 서열에 대해 적어도 60%, 예컨대, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
CAR의 신호전달 영역은 T 세포의 활성화를 허용한다. CAR 신호전달 영역은 CD3-ζ의 세포내 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 CAR-발현 T 세포의 인산화 및 활성화를 위한 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(motif)(ITAM)를 제공한다. 다른 ITAM-함유 단백질, 예를 들면, FcγRI을 포함하는 신호전달 영역은 또한 CAR에 사용되었다(Haynes et al., 2001 J Immunol 166(1):182-187). CAR의 신호전달 영역은 또한 공-자극성 분자의 신호전달 영역으로부터 유래된 공-자극성 서열을 포함함으로써 표적 단백질에 대한 결합시 CAR-발현 T 세포의 활성화를 촉진시킬 수 있다. 적합한 공-자극성 분자는 CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 및 CD27을 포함한다. 일부 경우에 CAR을 가공하여 상이한 세포내 신호전달 경로의 공-자극을 위해 제공한다. 예를 들면, CD28 공자극과 관련된 신호전달은 포스파티딜이노시톨 3-키나제(P13K) 경로를 우선적으로 활성화시키는 반면, 4-1BB-매개된 신호전달은 TNF 수용체 관련 인자(TRAF) 어댑터(adaptor) 단백질을 통한다. 따라서 CAR의 신호전달 영역은 때때로 하나 이상의 공-자극성 분자의 신호전달 영역으로부터 유래된 공-자극성 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 및 CD27 중 하나 이상의 세포내 도메인의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로부터 유래된 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 하나 이상의 공-자극성 서열을 포함한다.
임의의 힌지 영역은 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 분리를 제공할 수 있으며, 가요성 링커로서 작용할 수 있다. 힌지 영역은 IgG1으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 IgG1의 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 힌지 영역을 포함한다.
또한 본 발명에 따른 CAR을 포함하는 세포가 제공된다. 본 발명에 따른 CAR을 사용하여 CAR-발현 면역 세포, 예컨대, CAR-T 또는 CAR-NK 세포를 생성할 수 있다. CAR의 면역 세포로의 가공은 시험관내에서, 배양 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 CAR의 항원-결합 영역은 임의의 적합한 양식, 예컨대, scFv, scFab 등과 함께 제공될 수 있다.
핵산 및 벡터
본 발명은 본 발명에 따른 항원-결합 분자, 폴리펩타이드 또는 CAR을 인코딩하는, 핵산, 또는 다수의 핵산을 제공한다.
일부 실시형태에서, 핵산은 예컨대, 다른 핵산, 또는 천연적으로 존재 하는 생물학적 물질로부터 정제되거나 단리된다. 일부 실시형태에서, 핵산(들)은 DNA 및/또는 RNA를 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 다수의 핵산을 포함하는, 벡터, 또는 다수의 벡터를 제공한다.
뉴클레오타이드 서열은 벡터, 예컨대, 발현 벡터내에 함유될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "벡터"는 외인성 핵산을 세포내로 전달하기 위한 비히클(비히클)로서 사용된 핵산 분자이다. 벡터는 세포내에서 핵산의 발현을 위한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 발현될 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 종결 코돈(termination codon) 및 발현 인핸서(expression enhancer)를 포함한다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈을 사용하여 본 발명에 따른 벡터로부터 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현할 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된"은 선택된 핵산 서열 및 조절성 핵산 서열(예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서)가 조절 서열의 영향 또는 제어 하에서 핵산 서열의 발현을 대체하는(함으로써 발현 카세트를 형성하는) 방식으로 공유결합으로 연결된다. 따라서, 조절 서열이 핵산 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우 조절 서열을 선택된 핵산 서열에 작동적으로 연결시킨다. 이후에, 획득되는 전사체(들)을 목적한 펩타이드(들)/폴리펩타이드(들)로 해독시킬 수 있다.
적합한 벡터는 플라스미드, 이원 벡터(binary vector), DNA 벡터, mRNA 벡터, 바이러스 벡터(예컨대, 감마레트로바이러스 벡터(예컨대, 쥣과동물 백혈병 바이러스(MLV)-유래된 벡터), 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 박시니아 바이러스 벡터 및 헤르페스바이러스 벡터), 트랜스포존(transposon)-기반 벡터, 및 인공 염색체(예컨대, 효모 인공 염색체)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 진핵세포 벡터, 예컨대, 진핵 세포내에서 벡터로부터 단백질의 발현에 필수적인 성분을 포함하는 벡터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 예컨대, 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 SV40 프로모터를 포함함으로써 단백질 발현을 구동하는 포유류 벡터일 수 있다.
본 발명에 따른 항원-결합 분자의 구성적 폴리펩타이드는 다수의 핵산의 상이한 핵산에 의해, 또는 다수의 벡터의 상이한 벡터에 의해 인코딩될 수 있다.
항원-결합 분자 및 폴리펩타이드를 포함/발현하는 세포
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항원-결합 분자, 폴리펩타이드 또는 CAR을 포함하거나 이를 발현하는 세포를 제공한다. 또한 본 발명에 따른 핵산, 다수의 핵산, 벡터 또는 다수의 벡터를 포함하거나 이를 발현하는 세포가 제공된다.
세포는 진핵 세포, 예컨대, 포유류 세포일 수 있다. 포유류은 영장류(레서스(레서스), 시노몰구스(시노몰구스), 비-인간 영장류 또는 인간) 또는 비-인간 포유류(예컨대, 토끼, 기니아 피그, 랫트, 마우스 또는 다른 설치류(로덴티아(설치류ia) 목(order)의 임의의 동물 포함), 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 소(암소, 예를 들면, 낙농 암소, 또는 보스(Bos) 목의 임의의 동물), 말(에퀴다에(Equidae) 목의 임의의 동물 포함), 당나귀, 및 비-인간 영장류)일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산, 다수의 핵산, 벡터 또는 다수의 벡터를 세포내로 도입시키는 단계를 포함하여, 본 발명에 따른 핵산(들) 또는 벡터(들)을 포함하는 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 단리된 핵산(들) 또는 벡터(들)을 세포내로 도입시키는 단계는 형질전환, 형질감염, 전기천공 또는 형질도입(예컨대, 레트로바이러스 형질도입)을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산, 다수의 핵산, 벡터 또는 다수의 벡터를 세포내로 도입시키는 단계를 포함하여, 본 발명에 따른 항원-결합 분자, 폴리펩타이드 또는 CAR을 발현하는/포함하는 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포에 의한 핵산(들) 또는 벡터(들)의 발현에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 시험관내에서 수행된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 획득되거나 획득가능한 세포를 제공한다.
항원-결합 분자 및 폴리펩타이드의 생성
본 발명에 따른 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 폴리펩타이드의 생성 방법에 따라 제조할 수 있다.
폴리펩타이드는 화학적 합성, 예컨대, 액체 또는 고체상 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 펩타이드/폴리펩타이드는 예를 들면, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된, 문헌[Chandrudu et al., Molecules (2013), 18: 4373-4388)에 기재된 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
대안적으로, 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 재조합 발현에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩타이드의 재조합 생성에 적합한 분자 생물학 기술은 둘 다 이의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된, 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Edition), Cold Spring Harbor Press, 2012, 및 Nat Methods. (2008); 5(2): 135-146]에 제시된 것과 같이, 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 항원-결합 분자의 재조합 생성 방법은 또한 둘 다 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Frenzel et al., Front Immunol. (2013); 4: 217 및 Kunert and Reinhart, Appl Microbiol Biotechnol. (2016) 100: 3451-3461]에 기재되어 있다.
일부 경우에, 본 발명의 항원-결합 분자는 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬로 구성된다. 이러한 경우에, 항원-결합 분자의 생성은 하나 이상의 폴리펩타이드의 전사 및 해독, 및 항원-결합 분자를 형성하기 위한 폴리펩타이드 사슬의 후속적인 회합을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 생성을 위해, 폴리펩타이드의 발현에 적합한 임의의 세포를 사용할 수 있다. 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 원핵 세포, 예를 들면, 아르카에아(archaea) 또는 박테리아의 세포이다. 일부 실시형태에서, 박테리아은 그람-음성 박테리아, 예를 들면, 엔테로박테리아세아에 과(family)의 박테리아, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포 예컨대, CHO, HEK(예컨대, HEK293), HeLa 또는 COS 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 폴리펩타이드를 일시적으로 또는 안정하게 발현하는 CHO 세포이다.
일부 경우에, 일부 원핵 세포는 진핵 세포와 동일한 접힘 또는 해독 후 변형을 허용하지 않으므로, 세포는 원핵 세포가 아니다. 또한, 매우 높은 발현 수준은 진핵세포내에서 가능하며 단백질은 적절한 태그를 사용하여 진핵세포로부터 정제하기에 보다 용이할 수 있다. 단백질의 배지내로의 분비를 향상시키는 구체적인 플라스미드를 또한 이용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 예컨대, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된, 문헌[Zemella et al. Chembiochem (2015) 16(17): 2420-2431]에 기재된 시스템을 사용하는 것에 따라 세포-유리된-단백질 합성(CFPS)에 의해 제조될 수 있다.
생성은 목적한 폴리펩타이드(들)을 발현하도록 변형된 진핵세포의 배양 또는 발효를 포함할 수 있다. 배양 또는 발효는 영양분, 공기/산소 및/또는 성장 인자의 적절한 공급물 제공하는 생물반응기 속에서 수행할 수 있다. 분비된 단백질은 세포로부터 배양 배지/발효 부유액(fermentation broth)을 분배하는 단계, 단백질 내용물을 추출하는 단계, 및 개개 단백질을 분리하여 분비된 폴리펩타이드(들)을 단리하는 단계에 의해 수집될 수 있다. 배양, 발효 및 분비 기술은 당해 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, (문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(4th Edition)]; 상기 본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
생물반응기는 하나 이상의 용기를 포함하며 여기서 세포가 배양될 수 있다. 생물반응기 속의 배양은 반응기 내로의 반응물의 연속적인 유동, 및 반응기로부터 배양된 세포의 연속적인 유동과 함께 연속적으로 일어날 수 있다. 또한, 배양은 뱃치(batch)에서 일어날 수 있다. 생물반응기는 환경 조건, 예를 들면, pH, 산소, 용기 내로 및 외로의 유동 속도, 및 용기내에서의 교반을 모니터하고, 제어함으로써 최적의 조건을 배양되는 세포에 대해 제공한다.
목적한 항원-결합 분자/폴리펩타이드(들)을 발현하는 세포를 배양한 후, 목적한 폴리펩타이드(들)을 단리할 수 있다. 당해 분야에 공지된 세포로부터 단백질을 분리하기 위한 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 폴리펩타이드를 단리하기 위하여, 영양 배지로부터 세포를 분리하는 것이 필수적일 수 있다. 폴리펩타이드(들)이 세포로부터 분비된 경우, 세포를 분비된 목적한 폴리펩타이드(들)을 함유하는 배양 배지로부터 원심분리하여 분리하는 것이 필요할 수 있다. 목적한 폴리펩타이드(들)이 세포내에서 수집되는 경우, 단백질 단리를 세포 배양 배지로부터 세포를 분리하기 위한 원심분리, 분해 완충액을 사용한 세포 펠렛(pellet)의 처리, 및 예컨대, 초음파파쇄(sonification), 신속한 동결-해동 또는 삼투압 분리에 의한 세포 파괴를 포함할 수 있다.
다른 단백질 및 비-단백질 구성성분을 함유할 수 있는, 상청액 또는 배양 배지로부터 목적한 폴리펩타이드(들)를 단리하는 것이 바람직할 수 있다. 상청액 또는 배양 배지로부터 단백질 구성성분을 분리하기 위한 일반적인 접근법은 침전에 의한다. 상이한 용해도의 단백질은 황산암모늄과 같은 상이한 농도의 침전제에서 침전된다. 예를 들면, 저농도의 침전제에서, 수용성 단백질이 추출된다. 따라서, 상이한 증가하는 농도의 침전제를 가함으로써, 상이한 용해도의 단백질이 구별될 수 있다. 투석을 후속적으로 사용하여 분리된 단백질로부터 황산암모늄을 제거할 수 있다.
상이한 단백질을 구별하는 다른 방법, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 크로마토그래피가 당해 분야에 공지되어 있다. 이는 침전에 대한 대안으로서 사용될 수 있거나, 침전에 대해 후속적으로 수행될 수 있다.
목적한 폴리펩타이드(들)이 배양물로부터 단리되면, 폴리펩타이드(들)을 농축시키는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 단백질을 농축시키는 다수의 방법, 예를 들면, 한외여과 또는 동결건조가 당해 분야에 공지되어 있다.
조성물
본 발명은 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산, 발현 벡터 및 세포를 포함하는 조성물을 또한 제공한다.
본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산, 발현 벡터 및 세포는 임상 용도를 위한 약제학적 조성물 또는 의약으로서 제형화될 수 있으며 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 애주번트 (adjuvant)를 포함할 수 있다. 조성물은 주사 또는 주입을 포함할 수 있는 국소, 비경구, 전신계, 강내(intracavitary), 정맥내, 동맥내, 근육내, 척추강내, 안내(intraocular), 결막내, 종양내, 피하, 피내, 척추강내, 경구 또는 경피 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다.
적합한 제형은 멸균 또는 등장성 매질 속에 항원-결합 분자를 포함할 수 있다. 의약 및 약제학적 조성물은 겔을 포함하는 유체 형태로 제형화될 수 있다. 유체 제형은 인체 또는 동물체의 선택된 영역에 주사 또는 주입(예컨대, 카테터(catheter)를 통해)에 의해 투여용으로 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 예컨대, 혈관 또는 종양내로 주사 또는 주입을 위해 제형화된다.
본 명세서에 기재된 발명에 따라서 방법은 또한 약제학적으로 유용한 조성물의 생성을 위해 제공되며, 이러한 생성 방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다: 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수) 또는 세포를 생성하는 단계; 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수) 또는 세포를 단리하는 단계; 및/또는 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수) 또는 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트, 부형제 또는 희석제와 혼합시키는 단계.
예를 들면, 본 명세서에 기재된 본 발명의 추가의 실시형태는 질병/병태(예컨대,암)의 치료시 사용하기 위한 의약 또는 약제학적 조성물을 제형화하거나 생성하는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수) 또는 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트, 부형제 또는 희석제와 혼합시킴으로써 약제학적 조성물 또는 의약을 제형화하는 단계를 포함한다.
치료학적 및 예방학적 적용
본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 조성물은 치료학적 및 예방학적 방법에서의 용도가 발견된다.
본 발명은 의학적 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물을 제공한다. 또한 질병 또는 상태의 치료 또는 예방용 의약의 제조시 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산 (또는 이의 다수), 발현 벡터 (또는 이의 다수), 세포 또는 조성물의 용도가 제공된다. 대상체에게 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양의 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산 (또는 이의 다수), 발현 벡터 (또는 이의 다수), 세포 또는 조성물을 투여함을 포함하는, 질병 또는 상태의 치료 또는 예방 방법이 또한 제공된다.
방법은 질병/병태의 발달 또는 진행을 감소시키거나, 질병/병태의 증상의 완화 또는 질병/병태의 병리학에 있어서의 감소에 효과적일 수 있다. 방법은 질병/병태의 진행을 예방하는데, 예컨대, 질병/병태의 악화를 예방하거나 이의 발달 속도를 지연시키는데 효과적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 질병/병태에 있어서의 개선, 예컨대, 질병/병태의 증상에 있어서의 감소 또는 질병/병태의 중증도/활성의 일부 다른 관련성에 있어서의 감소를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 후기 단계(예컨대, 만성 단계 또는 전이)로의 질병/병태의 발달을 예방할 수 있다.
본 발명의 대상은 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 수 및/또는 활성의 감소로부터 치료 또는 예방적 이점을 유도할 수 있는 임의의 질병/병태의 치료/예방을 위해 사용될 수 있음을 인지하게 될 것이다. 본 발명의 치료 및 예방적 유용성은 필수적으로 MDSC 및/또는 VISTA를 발현하는 다른 세포, 예를 들어, 종양-관련 대식세포 (TAM) 및 호중구의 수 또는 활성의 감소로부터 이점을 획득할 수 있는 임의의 질병/병태로 연장됨이 또한 명백할 것이다. VISTA의 길항작용은 MDSC 및/또는 VISTA를 발현하는 다른 세포에 의한 억제로부터 효과기 면역 세포를 효과적으로 방출시킨다.
예를 들어, 질병/병태는 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)가 병리학적으로 관련된 질병/병태, 예를 들어 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 증가된 수/비율이 질병/병태의 발병, 발달 또는 진행 및/또는 질병/병태의 하나 이상의 증상의 중증도와 양성적으로 관련되거나, VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 증가된 수/비율이 질병/병태의 발병, 발달 또는 진행에 대한 위험 인자인 질병/병태일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따라서 치료될/예방될 질병/병태는 예컨대, 질병/병태의 부재하에서 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 수/비율/활성과 비교하여, VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 수/비율/활성에 있어서의 증가에 의해 특징화된 질병/병태이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 예를 들어, 종양에서 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC 또는 종양-관련 대식세포)의 존재 또는 질병/병태에 의해 영향을 받는 기관/조직 (예를 들어, 질병/병태의 증상이 나타나는 기관/조직) 또는 말초부에서 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 수/비율/활성의 증가의 검출을 기반으로 하여, 본 명세서에 기재된 치료를 위해 선택될 수 있다. 질병/병태는 모든 조직이나 기관 또는 기관계에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 질병/병태는 다수의 조직/기관/기관계에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체에 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)를 포함하는 종양이 있다는 결정을 기반으로 하거나, 건강한 대상체에서 대상체가 이러한 세포의 수/비율/활성에 비해 말초부 또는 기관/조직에서 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 수/비율/활성이 증가한다는 결정을 기반으로 하여, 본 발명에 따른 치료/예방을 위해 대상체를 선택할 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료/예방될 질병/병태는 암이다.
본 발명의 항원 결합 분자는 MDSC 매개 억제 또는 VISTA를 발현하는 세포에 의한 억제로부터 효과기 면역 세포를 방출시킴으로써, 항암 면역 반응을 향상시키는데 유용하기 때문에, 항원 결합 분자는 일반적으로 암 치료에 유용하다는 것이 이해될 것이다.
암은 임의의 원치않는 세포 증식(또는 원치않는 세포 증식에 의해 자체적으로 나타나는 임의의 질병), 신생물 또는 종양일 수 있다. 암은 양성 또는 악성일 수 있으며, 1차 또는 2차(전이성)일 수 있다. 신생물 또는 종양은 세포의 임의의 비정상적인 성장 또는 증식일 수 있으며 임의의 조직내에 위치할 수 있다. 암은 예컨대, 부신, 부신 수질, 항문, 맹장, 방광, 혈액, 골, 골수, 뇌, 유방, 맹장, 중추 신경계(뇌를 포함하거나 배제함), 소뇌, 자궁경관, 결장, 십이지장, 자궁내막, 상피 세포(예컨대, 신장 상피), 담낭, 식도, 교질 세포, 심장, 회장, 공장(jejunum), 신장, 누선(lacrimal glad), 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 림프모구, 턱, 종격, 장간막, 자궁근, 비인두, 장막, 구강, 난소, 췌장, 귀밑 샘, 말초 신경계, 복막, 흉막, 전립샘, 타액선, S상 결장(sigmoid 결장), 피부, 소장, 연조직, 비장, 위, 고환, 가슴샘, 갑상선, 혀, 편도선, 기도(trachea), 자궁, 음문, 및/또는 백혈구로부터 유래된 조직/세포일 수 있다.
치료될 종양은 신경 또는 비-신경계 종양일 수 있다. 신경계 종양은 중추 또는 말초 신경계, 예컨대, 신경교종, 수모세포종, 수막종, 신경섬유종, 뇌질피복 세포종(ependymoma), 신경집종, 신경섬유육종, 성상세포종 및 희소돌기아교세포종에서 기원할 수 있다. 비-신경계 암/종양은 임의의 다른 비-신경 조직에서 기원할 수 있으며, 예를 들면, 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종, 백혈병, 비-호지킨 림프종(비Hodgkin's lymphoma: NHL), 호지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome: MDS), 피하 T-세포 림프종(CTCL), 만성 림프성 백혈병(CLL), 간종양, 표피모양 암종(epidermoid carcinoma), 전립선 암종, 유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 췌장암, 흉선 암, NSCLC, 혈액 암 및 육종을 포함한다.
MDSC는 진행성 결장직장암에서 증가한다 (문헌[Toor et al, Front Immunol. 2016; 7:560]). MDSC는 유방암에서도 관찰되며, 말초 혈액의 MDSC 비율은 후기 유방암 환자에서 증가한다 (문헌[Markowitz et al, Breast Cancer Res Treat. 2013 Jul; 140 (1):13-21]). MDSC 존재량은 고형 종양에서 불량한 예후와 관련이 있으며 (문헌[Charoentong et al, Cell Rep. 2017 Jan 3; 18(1): 248-262]), MDSC는 간암 모델에서 다존재한다 (문헌[Connolly et al., J Leukoc Biol. (2010) 87(4): 713-25]). 전립선 및 유방암종, 흑색종, 결장직장암 및 루이스 폐암종은 MDSC를 유도하고, 면역억제에 관여하는 케모카인을 생성하는 것으로 보고되었으며 (문헌[Umansky et al., Vaccines (Basel) (2016) 4(4): 36]), 췌장암 환자의 MDSC는 종양 존재량과 양의 상관관계가 있다 (문헌[Xu et al., Hepatobiliary Pancreat Dis Int. (2016) 15(1): 99-105]). VISTA는 또한 난소암 (예를 들어, US 9,631,018 B2 참조) 및 림프종 (예를 들어, WO 2017/023749 A1 참조)의 치료를 위한 표적으로 보고되었다.
문헌[Blando et al. Proc Natl Acad Sci US A. (2019) 116(5): 1692-1697]은 최근 췌장암에서 VISTA 발현 골수 세포의 유의한 침윤이 보고되었으며, 흑색종에서 PD-L1 길항제 치료 전 및 후 두 경우 모두 및 전립선에서 CTLA4 길항제 치료 후 VISTA 발현 골수 세포의 확장이 관찰되었다.
일부 실시형태에서, 암은 VISTA를 발현하는 세포를 포함하는 암, VISTA를 발현하는 세포의 침윤을 포함하는 암, VISTA를 발현하는 암 세포를 포함하는 암, 혈액암, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 다발성 골수종, 중피종, 고형 종양, 폐암, 비 소세포 폐 암종, 위암, 위 암종, 결장직장암, 결장직장 암종, 결장직장 선암종, 자궁암, 자궁 체부 내막 암종, 유방암, 삼중 음성 침습성 유방 암종, 간암, 간세포 암종, 췌장암, 췌관 선암종, 갑상선암, 흉선종, 피부암, 흑색종, 피부 흑색종, 신장암, 신세포 암종, 유두 신세포 암종, 두경부암, 두경부의 편평 세포 암종 (SCCHN), 난소암, 난소 암종, 난소 장액성 낭샘암종, 전립선 암 및/또는 전립선 선암종으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 암은 결장직장 암 (예를 들어, 결장 암종, 결장 선암종), 췌장암, 유방암, 간암, 전립선암, 난소암, 두경부암, 백혈병 (예를 들어, T 세포 백혈병), 림프종, 흑색종, 흉선종, 폐암, 비 소세포 폐 암 (NSCLC) 및/또는 고형 종양이다.
치료/예방은 다음 중 하나 이상을 목표로할 수 있다: 암의 증상의 발병/진행의 지연/예방, 암의 증상의 중증도의 감소, 암의 세포의 생존/성장/침입/전이의 감소, 암 세포의 수의 감소 및/또는 대상체의 생존 증가.
일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 VISTA를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 VISTA를 발현하는 암 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, VISTA를 발현하는 세포는 MDSC (예를 들어, g-MDSC 및/또는 m-MDSC)이다. 일부 실시형태에서, 암은 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)를 포함하는 종양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 MDSC를 포함하는 종양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 침윤을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 침윤을 나타내는 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료/예방될 암은 1% 초과, 예를 들어 ≥2%, ≥5%, ≥10%, ≥15%, ≥20%, ≥25% 또는 ≥30% MDSC (예를 들어, 종양의 면역 프로파일링에 의해 측정됨)를 포함하는 CD45+ 세포 집합을 포함하는 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 예를 들어, 대상체로부터 획득된 샘플에서 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)를 포함하는 암의 검출, 또는 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)를 포함하는 종양의 검출를 기반으로 하여, 본 명세서에 기재된 치료를 위해 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, VISTA-발현 세포가 병리학적으로 관련된 질병/병태는 감염성 질병, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 감염이 T 세포 기능 장애 또는 T 세포 고갈과 관련되는 만성/지속성 감염을 치료하는 것이 특히 바람직할 수 있다. T 세포 고갈은 많은 만성 감염 (바이러스, 박테리아 및 기생충 포함)과 암에서 발생하는 T 세포 기능 장애 상태라는 것은 잘 공지되어 있다 (문헌[Wherry Nature Immunology Vol.12, No.6, p492-499, June 2011]).
치료될 수 있는 박테리아 감염의 예는 바실러스 종 (Bacillus spp.), 보데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis), 클로스트리디움 종 (Clostridium spp.), 코리네박테리움 종 (Corynebacterium spp.), 비브리오 클로에라에 (Vibrio chloerae), 스타필로코쿠스 종 (Staphylococcus spp.), 스트렙토코쿠스 종 (Streptococcus spp.), 에세리키아 (Escherichia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 에르시니아 (Yersinia), 에르위나 (Erwina), 살모넬라 (Salmonella), 리스테리아 종 (Listeria sp), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori), 미코박테리아 (mycobacteria) (예를 들어, 미코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)) 및 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)에 의한 감염을 포함한다. 예를 들어, 박테리아 감염은 패혈증 또는 결핵일 수 있다. 치료될 수 있는 바이러스 감염의 예로는 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 메아슬레스 바이러스 (measles virus), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 단순 포진 바이러스 및 인간 유두종 바이러스 (HPV)에 의한 감염이 포함된다. 치료될 수 있는 진균 감염의 예로는 알터나리아 종 (Alternaria sp), 아스퍼길루스 종 (Aspergillus sp), 칸디다 종 (Candida sp) 및 히스토플라스마 종 (Histoplasma sp)에 의한 감염이 포함된다. 진균 감염은 진균 패혈증 또는 히스토플라스마증일 수 있다. 치료될 수 있는 기생충 감염의 예로는 플라스모디움 종 (Plasmodium specie) (예를 들어, 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모디움 이오엘리 (Plasmodium yoeli), 플라스모디움 오발레 (Plasmodium ovale), 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax) 또는 플라스모디움 카바우디 카바우디 (Plasmodium chabaudi chabaudi))에 의한 감염이 포함된다. 기생충 감염은 말라리아, 레슈마니아증 (leishmaniasis) 및 톡소플라스마증 (toxoplasmosis)과 같은 질병일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 Fc 영역-매개 효과기 기능 (예를 들어, ADCC, ADCP, CDC)을 수반하지 않는 분자 메커니즘을 통해 치료/예방 효과를 가한다. 일부 실시형태에서, 분자 메커니즘은 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb 중 하나 이상)의 결합을 수반하지 않는다. 일부 실시형태에서, 분자 메커니즘은 항원 결합 분자와 보체 단백질 (예를 들어, C1q)의 결합을 수반하지 않는다.
일부 실시형태 (예를 들어, 항원 결합 분자가 Fc 영역이 부재하는 실시형태 또는 항원 결합 분자가 Fc-매개 항체 효과기 기능을 유도할 수 없는 Fc 영역을 포함하는 실시형태)에서, 상기 치료는 VISTA-발현 세포의 사멸을 유도/증가시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 치료는 VISTA-발현 세포의 수/비율을 감소시키지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 치료는 (i) VISTA-매개 신호전달을 억제하고, (ii) VISTA-발현 세포의 사멸을 유도/증가시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 치료는 (i) VISTA-매개 신호전달을 억제하고, (ii) VISTA-발현 세포의 수/비율을 감소시키지 않는다.
본 발명의 물품의 투여는 바람직하게는 "치료학적으로 유효한" 또는 "예방학적으로 유효한" 양이며, 이는 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 이점을 나타내기 위해 충분하다. 투여된 실제 양, 및 투여 속도 및 기간은 질병/병태의 특성 및 중증도 및 투여된 특수한 물품에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예컨대, 투여량에 있어서의 결정 등은 일반 숙련가 및 다른 의사의 책임하에 있으며 통상적으로 치료될 질병/장애, 개인 대상체의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 숙련의에게 공지된 다른 인자를 고려한다. 상기 언급한 기술 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams&Wilkins)에서 찾을 수 있다.
투여는 단독으로 또는 다른 치료(treatment)와 함께 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자 또는 조성물 및 치료제(therapeutic agent)는 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 예컨대, 암의 치료/예방을 위한 추가의 치료적 또는 예방적 개입(intervention)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료적 또는 예방적 개입은 화학치료요법, 면역치료요법, 방사선치료요법, 수술, 예방접종 및/또는 호르몬 치료요법으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 치료적 또는 예방적 개입은 백혈구성분채집술을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료적 또는 예방적 개입은 줄기세포 이식을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 VISTA 이외의 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 분자는 예를 들어, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT 또는 BTLA이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉진할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 공자극 수용체는 예를 들어, CD28, CD80, CD40L, CD86, OX40, 4-1BB, CD27 또는 ICOS이다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 대상 (예를 들어, 본 발명에 따른 항원 결합 분자) 및 VISTA 이외의 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 대상 및 공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉진할 수 있는 제제를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 본 명세서에 기재된 질병/병태의 의학적 치료 및 예방 방법에서의 이러한 조성물의 용도가 제공된다.
또한 본 명세서에 기재된 질병/병태의 치료/예방 방법으로서, 본 발명의 대상인 본 발명에 따른 대상 (예를 들어, 본 발명에 따른 항원 결합 분자) 및 VISTA 이외의 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 또한 본 명세서에 기재된 질병/병태의 치료/예방 방법으로서, 본 발명의 대상인 본 발명에 따른 대상 (예를 들어, 본 발명에 따른 항원 결합 분자) 및 공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉진할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 면역 체크포인트 분자 또는 그의 리간드에 결합하여, 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 항체를 포함한다. 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 다른 제제는 면역 체크포인트 분자 또는 면역 체크포인트 분자의 리간드의 유전자/단백질 발현을 감소시킬 수 있는 제제 (예를 들어, 면역 체크포인트 분자/리간드를 인코딩하는 유전자 (들)의 전사의 억제, 면역 체크포인트 분자/리간드를 인코딩하는 RNA의 전사 후 가공의 억제, 면역 체크포인트 분자/리간드를 인코딩하는 RNA의 안정성의 감소, 면역 체크포인트 분자/리간드를 인코딩하는 RNA의 분해의 촉진, 면역 체크포인트 분자/리간드의 전사 후 가공의 억제, 면역 체크포인트 분자/리간드의 안정성의 감소 또는 면역 체크포인트 분자/리간드의 분해의 촉진에 의함) 및 소 분자 억제제를 포함한다.
공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉진할 수 있는 제제는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 공자극 수용체에 결합하여, 공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉발하거나 증가시킬 수 있는 작용제 항체를 포함한다. 공자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 촉진할 수 있는 다른 제제는 공자극 수용체 또는 공자극 수용체의 리간드의 유전자/단백질 발현을 증가시킬 수 있는 제제 (예를 들어, 공자극 수용체/리간드를 인코딩하는 유전자 (들)의 전사의 촉진, 공자극 수용체/리간드를 인코딩하는 RNA의 전사 후 가공의 촉진, 공자극 수용체/리간드를 인코딩하는 RNA의 안정성의 증가, 공자극 수용체/리간드를 인코딩하는 RNA의 분해의 억제, 공자극 수용체/리간드의 전사 후 가공의 촉진, 공자극 수용체/리간드의 안정성의 증가 또는 공자극 수용체/리간드의 분해의 억제에 의함) 및 소 분자 작용제를 포함한다.
VISTA-발현 MDSC에 의한 면역 억제는 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제에 의한 치료의 실패 및 내성 발생과 관련된다. 문헌[Gao et al., Nature Medicine (2017) 23: 551-555]은 최근에 VISTA가 이필리무맙 (ipilimumab) (즉, 항-CTLA-4 항체) 요법 후 전립선 종양에서 보완적 억제 경로가 될 수 있다고 제안하였다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 PD-1에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. PD-1에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 PD-1-또는 PD-L1-표적화된 제제일 수 있다. PD-1에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어, PD-1 또는 PD-L1에 결합하여, PD-1-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제제는 길항제 항-PD-1 항체이다. 일부 실시형태에서, 제제는 길항제 항-PD-L1 항체이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 CTLA-4에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. CTLA-4에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 CTLA-4-표적화된 제제 또는 CTLA-4의 리간드, 예컨대, CD80 또는 CD86에 대해 표적화된 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, CTLA-4에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 CTLA-4, CD80 또는 CD86에 결합하여, CTLA-4-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 LAG-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. LAG-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 LAG-3-표적화된 제제 또는 LAG-3 리간드, 예컨대, MHC 클래스 II에 대해 표적화된 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, LAG-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 LAG-3 또는 MHC 클래스 II에 결합하여, LAG-3-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 TIM-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. TIM-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 TIM-3-표적화된 제제 또는 TIM-3 리간드, 예컨대, 갈렉틴 9 (Galectin 9)에 대해 표적화된 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, TIM-3에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 TIM-3 또는 갈렉틴 9에 결합하여, TIM-3-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 TIGIT에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. TIGIT에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 TIGIT-표적화된 제제 또는 TIGIT의 리간드, 예컨대, CD113, CD112 또는 CD155에 대해 표적화된 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, TIGIT에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 TIGIT, CD113, CD112 또는 CD155에 결합하여, TIGIT-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 BTLA에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제와 조합하여 투여된다. BTLA에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 BTLA-표적화된 제제 또는 BTLA 리간드 예컨대, HVEM에 대해 표적화된 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, BTLA에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 예를 들어 BTLA 또는 HVEM에 결합하여, BTLA-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자 및 면역 체크포인트 분자 (예를 들어, PD-1 및/또는 PD-L1)에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제의 조합을 사용하는 방법은 제제가 단일요법으로 사용될 때 관찰되는 효과와 비교하여 개선된 치료 효과를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 분자 및 면역 체크포인트 분자 (예를 들어, PD-1 및/또는 PD-L1)에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제의 조합은 상승적 (즉, 초 부가적) 치료 효과를 제공한다.
일부 실시형태에서, (i) 본 발명의 항원 결합 분자 및 (ii) 면역 체크포인트 분자 (예를 들어, PD-1 및/또는 PD-L1)에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 조합에 의한 치료는 다음 중 하나 이상과 관련될 수 있다:
단독으로 사용된 조합의 어느 한 성분으로 관찰된 치료 효과와 비교하여 개선된 치료 효과;
단독으로 사용되는 조합의 어느 한 성분으로 관찰된 치료 효과와 비교하여 상승작용적 (즉, 초 부가적)인 치료 효과;
단독으로 사용되는 조합의 어느 한 성분에 의한 종양 성장 억제와 비교하여 종양 성장 억제 증가;
단독으로 사용되는 조합의 어느 한 성분에 의한 종양 성장 억제와 비교하여 상승작용적 (즉, 초 부가적)인 종양 성장 억제;
단독으로 사용된 조합의 어느 한 성분에 의한 억제 면역 세포의 수/활성의 감소와 비교하여 억제 면역 세포의 수/활성의 더 큰 감소;
단독으로 사용되는 조합의 어느 한 성분에 의한 억제 면역 세포의 수/활성의 감소와 비교하여 상승작용적 (즉, 초 부가적)인 억제 면역 세포의 수/활성의 감소;
단독으로 사용된 조합의 어느 한 성분에 의한 억제 면역 세포의 증식 감소와 비교하여 억제 면역 세포의 증식의 더 큰 감소
단독으로 사용된 조합의 어느 한 성분에 의한 억제 면역 세포의 증식 감소와 비교하여 상승작용적 (즉, 초 부가적)인 억제 면역 세포의 증식 감소;
단독으로 사용되는 조합의 어느 한 성분에 의한 억제 면역 세포의 비율 감소와 비교하여 세포 집합 (예를 들어 CD45+ 세포, 예를 들어 종양에서 획득된 CD45+ 세포) 내 억제 면역 세포의 비율의 더 큰 감소; 및
단독으로 사용되는 조합의 어느 한 성분에 의한 억제 면역 세포의 비율의 감소와 비교하여 상승작용적 (즉, 초 부가적)인 세포 집합 (예를 들어, CD45+ 세포, 예를 들어 종양에서 획득된 CD45+ 세포) 내 억제 면역 세포의 비율의 감소.
동시 투여는 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물 및 치료제를 함께, 예를 들면, 제제(조합된 제제) 둘 다를 함유하는 약제학적 조성물로서, 또는 서로 및 선택적으로 동일한 투여 경로를 통해, 예컨대, 동일한 동맥, 정맥 또는 다른 혈관으로 투여 직후의 투여를 지칭한다. 순차적인 투여는 다른 제제의 별도의 투여에 의한 소정의 시간 간격 후 항원-결합 분자/조성물 또는 치료제 중 하나의 투여를 지칭한다. 이것은 일부 실시형태에서의 경우이지만, 2개의 제제를 동일한 경로에 의해 투여하는 것을 필요하지 않다. 시간 간격은 임의의 시간 간격일 수 있다.
화학치료요법 및 방사선치료요법 각각은 약물 또는 이온화 방사선(예컨대, X-선 또는 γ-선을 사용하는 방사선치료요법)을 사용한 암의 치료를 지칭한다. 약물은 화학적 실체, 예컨대, 소 분자 약제, 항생제, DNA 인터컬레이터(intercalator), 단백질 억제제(예컨대, 키나제 억제제), 또는 생물학적 제제, 예컨대, 항체, 항체 단편, 앱타머(aptamer), 핵산(예컨대, DNA, RNA), 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질일 수 있다. 약물은 약제학적 조성물 또는 의약으로서 제형화될 수 있다. 제형은 하나 이상의 약물(예컨대, 하나 이상의 활성제)과 함께 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
치료는 하나 이상의 약물의 투여를 포함할 수 있다. 약물은 단독으로 또는 다른 치료와 함께 치료될 상태에 따라 동시에 또는 후속적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 화학치료요법은 2개의 약물의 투여를 포함하는 공-치료요법일 수 있으며, 이들 중 하나 이상은 암 치료를 위해 의도될 수 있다.
화학치료요법은 하나 이상의 투여 경로, 예컨대, 비경구, 정맥내 주사, 경구, 피하, 피내 또는 종양내로 투여될 수 있다.
화학치료요법은 치료 요법에 따라 투여될 수 있다. 치료 요법은 의사 또는 의학 전문가에 의해 제조될 수 있고 치료를 필요로 하는 환자에 맞도록 조정될 수 있는 화학치료요법 투여의 예정된 시간표, 계획, 설계 또는 스케쥴일 수 있다. 치료 요법은 다음 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 환자에게 투여하기 위한 화학치료요법의 유형; 각각의 약물 또는 방사선의 투여량; 투여 사이의 시간 간격; 각각의 치료의 길이; 임의의 치료 휴일의 수 및 특성 등. 동시-치료요법의 경우, 각각의 약물이 투여되어야 하는 방법을 나타내는 단일 치료 요법이 제공될 수 있다.
화학치료요법 약물은 다음으로부터 선택될 수 있다: 아베마시클립, 아비라테론 아세테이트, 아비트렉세이트(메토트렉세이트), 아브락산(파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제형), ABVD, ABVE, ABVE-PC, AC, 아칼라브루티닙, AC-T, 아드세트리스(브렌툭시맙 베도틴), ADE, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 아드리아마이신(독소루비신 하이드로클로라이드), 아파티닙 디말레에이트, 아피니토르(에베롤리무스), 아킨제오(네투피탄트 및 팔로노세트론 하이드로클로라이드), 알다라(이미퀴모드), 알데슬레우킨, 알레켄사(알렉티닙), 알렉티닙, 알렘투주맙, 알림타(페메트렉세드 이나트륨), 알리쿠파(코판리십 하이드로클로라이드), 주사용 알케란(멜팔란 하이드로클로라이드), 알케란 정제(멜팔란), 알록시(팔로노세트론 하이드로클로라이드), 알룬브리그(브리가티닙), 암보클로린(클로람부실), 암보클로린(클로람부실), 아미포스틴, 아미노레불린산, 아나스트로졸, 아프레피탄, 아레디아(파미드로네이트 이나트륨), 아리미덱스(아나스트로졸), 아로마신(엑세메스탄), 아라논(넬라라빈), 삼산화비소, 아르제라(오파투무맙), 아스파라기나제 에르위니아 크리산테미, 아테졸리주맙, 아바스틴(베바키주맙), 아벨루맙, 악시캅타젠 실로루셀, 악시티닙, 아자티티딘, 바벤키오(아벨루맙), BEACOPP, 베세눔(카르무스틴), 벨레오닥(벨리노스타트), 벨리노스타트, 벤다무스틴 하이드로클로라이드, BEP, 베스폰사(이노투주맙 오조가미신), 베바키주맙, 벡사로텐, 벡스사르(Bexxar)(토시투모맙 및 요오드 I 131 노시투모맙), 비칼루타미드, BiCNU(카르무스틴), 블레오마이신, 블리나투모맙, 블린사이토(Blincyto)(블리나투모맙), 보르테조밉, 보설리프(보수티닙), 보수티닙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리가티닙, BuMel, 부설판, 부설펙스(부설판), 카바지탁셀, 카보메틱스(카보잔티닙-S-말레이트), 카보잔티닙-S-말레이트, CAF, 칼??스(아칼라브루티닙), 캄패쓰(Campath)(알렘투주맙), 캄프토사르(이리노테칸 하이드로클로라이드), 카펙시타빈, CAPOX, 카락(플루오로우라실-국소), 카르보플라틴, 카르보플라틴-탁솔(CARBOPLATIN-TAXOL), 카르필조밉, 카르무브리스(카르무스틴), 카르무스틴, 카르무스틴 이식체, 카소덱스(비칼루타미드), CEM, 세리티닙, 세루비딘(독소루비신 하이드로클로라이드), 세르바릭스(재조합 HPV 2가 백신), 세툭시맙, CEV, 클로람부실, 클로람부실-프레드니손(CHLORAMBUCIL-PREDNISONE), CHOP, 시스플라틴, 클라드리빈, 클라펜(사이클로포스파미드), 클로파라빈, 클로파렉스(클로파라빈), 클로라르(Clolar)(클로파라빈), CMF, 코비메티닙, 코메트리크(카보잔티닙-S-말레이트), 코판리십 하이드로클로라이드, COPDAC, COPP, COPP-ABV, 코스메겐(닥티노마이신), 코텔릭(코비메티닙), 크리조티닙, CVP, 사이클로포스파미드, 사이포스(Cyfos)(이포스파미드), 사이람자(라무시루맙), 사이타라빈, 사이타라빈 리포좀, 사이토사르-U(사이타라빈), 사이톡산(사이클로포스파미드), 다브라페닙, 다카르바진, 다코겐(데시타빈), 닥티노마이신, 다라투무맙, 다르젤렉스(다라누무맙), 다사티닙, 다우노루비신 하이드로클로라이드, 다우노루비신 하이드로클로라이드 및 사이타라빈 리포좀, 덱시타빈, 데피브로티드 나트륨, 데피텔리오(데피브로타이드 나트륨), 데가렐릭스, 데니류킨 디프티톡스, 데노수맙, 데포시트(DepoCyt)(사이타라빈 리포좀), 덱사메타손, 덱스라족산 하이드로클로라이드, 디누툭시맙, 도세탁셀, 독실(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 독소루비신 하이드로클로라이드, 독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀, Dox-SL(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), DTIC-도메(Dome)(다카르바진), 두르발루맙, 에푸덱스(플루오로우라실-국소), 엘릭텍(라스부리카제), 엘렌스(에피루비신 하이드로클로라이드), 엘로투주맙, 엘록사틴(옥살리플라틴), 엘트롬보팩 올라민(Eltrombopag Olamine), 에멘드(아프레피탄), 엠플리시티(엘로투주맙), 에나시데닙 메실레이트, 엔줄루타미드, 에피루비신 하이드로클로라이드, EPOCH, 에르비툭스(세툭시맙), 에리불린 메실레이트, 에리벳지(Erivedge)(비스모데깁), 에를로티닙 하이드로클로라이드, 에르위나제(Erwinaze)(아스파라기나제 에르위니아 크리산테미), 에티올(아미포스틴), 에토포포스(에토포시드 포스페이트), 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 에바세트(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 에베롤리무스, 에VISTA(락록시펜 하이드로클로라이드), 에보멜라(멜팔란 하이드로클로라이드), 엑세메스탄, 5-FU(플루오로우라실 주사), 5-FU(플루오로우라실-국소), 파레스톤(토레미펜), 파리닥(파노비노스타트), 파슬로덱스(풀베스트란트), FEC, 페마라(레트로졸), 필그라스팀, 플루다라(플루다라빈 포스페이트), 플루다라빈 포스페이트, 플루오로플렉스(플루오로우라실-국소), 플루오로우라실 주사, 플루오로우라실-국소, 플루타미드, 폴렉스(메토트렉세이트), 폴렉스 PFS(메토트렉세이트), 폴피리(FOLFIRI), 폴피리-베바키주맙(FOLFIRI-BEVACIZUMAB), 폴피리-세툭시맙(FOLFIRI-CETUXIMAB), 폴피리녹스(FOLFIRINOX), 폴폭스(FOLFOX), 폴로틴(프랄라트렉세이트), FU-LV, 풀베스트란트, 가르다실(재조합 HPV 4가 백신), 가르다실 9(재조합 HPV 9가 백신), 가지바(오비누투주맙), 게피티닙, 겜시타빈 하이드로클로라이드, 겜시타빈-시스플라틴(GEMCITABINE-CISPLATIN), 겜시타빈-옥살리플라틴(GEMCITABINE-OXALIPLATIN), 겜투주맙 오조가미신, 겜자르(겜시타빈 하이드로클로라이드), 길로트리프(아파티닙 디말레에이트), 글리벡(이마티닙 메실레이트), 글리아델(카르무스틴 이식체), 글리아델 웨이퍼(Gliadel wafer)(카르무스틴 이식체), 글루카르피다제, 고세렐린 아세테이트, 할라벤(에리불린 메실레이트), 헤만게올(프로프라놀롤 하이드로클로라이드), 헤르셉틴(트라스투주맙), HPV 2가 백신, 재조합체, HPV 9가 백신, 재조합체, HPV 4가 백신, 재조합체, 하이캄틴(토포테칸 하이드로클로라이드), 하이드레아(하이드록시우레아), 하이드록시우레아, 하이퍼-CVAD, 이브란스(팔보키클립), 이브리투모맙 티욱세탄, 이브루티닙, ICE, 이클루식(Iclusig)(포나티닙 하이드로클로라이드), 이다마이신(이다루비신 하이드로클로라이드), 이다루비신 하이드로클로라이드, 이델랄리십, 이드히파(에나시데닙 메실레이트), 이펙스(이포스파미드), 이포스파미드, 이포스파미둠(이포스파미드), IL-2(알데슬류킨), 이마티닙 메실레이트, 임브루비카(이브루티닙), 임핀지(두르발루맙), 이미퀴모드, 임믈리긱(Imlygic)(칼리모겐 라헤르파레프벡(Talimogene Laherparepvec)), 인라이타(Inlyta)(악시티닙), 이노투주납 오조가미신, 인터페론 알파-2b, 재조합체, 인터루킨-2(알데스류킨), 인트론 A(재조합 인터페론 알파-2b), 요오드 I 131 토시투모맙 및 토시투모맙, 이필리무맙, 이레싸(Iressa)(게피티닙), 이리노테칸 하이드로클로라이드, 이리노테칸 하이드로클로라이드 리포좀, 이스토닥스(로미뎁신), 익사베필론, 익사조닙 시트레이트, 익셈프라(익사베필론), 자카피(Jakafi)(룩솔리티닙 포스페이트), JEB, 제브타나(카바지탁셀), 카드실라(Kadcyla)(아도-트라스투주맙 엠탄신), 케옥시펜(랄록시펜 하이드로클로라이드), 케피반스(팔리페르민), 키트루다(펨브롤리주맙), 키스콸리(Kisqali)(리보키클립), 킴리아흐(Kymriah)(티사겐레클류셀), 카이프롤리스(카르필조밉), 란레오타이드 아세테이트, 라파티닙 디토실레이트, 라르트루보(올라라투맙), 레날리도미드, 렌바티닙 메실레이트, 렌비마(렌바티닙 메실레이트), 레트로졸, 류코보린 칼슘, 류케란(클로람부실), 류프롤라이드 아세테이트, 류스타틴(클라드리빈), 레불란(아미노레불린산), 린폴리진(클로람부실), 리포독스(LipoDox)(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 로무스틴, 론수르프(트리플루리딘 및 티피라실 하이드로클로라이드), 루프론(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포트(depot)(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포트-페드(Lupron Depot-Ped)(류프롤라이드 아세테이트), 린파르자(올라파립), 마르퀴보(빈크리스틴 설페이트 리포좀), 마툴란(프로카르바진 하이드로클로라이드), 메클로르에타민 하이드로클로라이드, 메게스트롤 아세테이트, 메키니스트(트라메티닙), 멜팔란, 멜팔란 하이드로클로라이드, 머캅토푸린, 메스나, 메스넥스(메스나), 메타졸라스톤(테모졸로마이드), 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 LPF(메토트렉세이트), 메틸날트렉손 브로마이드, 멕세이트(메토트렉세이트), 멕세이트(Mexate)-AQ(메토트렉세이트), 미도스타우린, 미토마이신 C, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 미토지트렉스(미토마이신 C), MOPP, 모조빌(플레릭사포르), 무스타르겐(메클로르에타민 하이드로클로라이드), 무타마이신(미토마이신 C), 마일레란(부설판), 마이로사르(아자시티딘), 마일로타르그(Mylotarg)(겜투주맙 오조가미신), 나노입자 파클리탁셀(파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제형), 나벨빈(비노렐빈 타르트레이트), 니시투무맙, 넬라라빈, 네오사르(사이클로스포파미드), 네라티닙 말레에이트, 네릴린스(Nerlynx)(네라티닙 말레에이트), 네투피탄트 및 팔로노세트론 하이드로클로라이드, 뉼라스타(페그필그라스팀), 뉴포겐(필그라스팀), 넥사바르(소라페닙 토실레이트), 닐란드론(닐루타미드), 닐로티닙, 닐루타미드, 닌라로(Ninlaro)(익사조밉 시트레이트), 니라파립 토실레이트 일수화물, 니볼루맙, 놀바덱스(타목시펜 시트레이트), 엔플레이트(Nplate)(로미프로스팀), 오비누투주맙, 오돔조(소니데깁), OEPA, 오파투무맙, OFF, 올라파립, 올라라투맙, 오마세탁신 메페석시세이트, 온카스파르(페가스파르가제), 온단세트론 하이드로클로라이드, 오니바이드(Onivyde)(이리노테칸 하이드로클로라이드 리포좀), 온탁(데니류킨 디프티톡스), 옵디보(니볼루맙), OPPA, 오시메르티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제형, PAD, 팔보시클립, 팔리페르민, 팔로노세트론 하이드로클로라이드, 팔로노세트론 하이드로클로라이드 및 네투피탄트, 파미드로네이트 이나트륨, 파니투무맙, 파노비노스타트, 파라플라트(카르보플라틴), 파라플라틴(카르보플라틴), 파조파닙 하이드로클로라이드, PCV, PEB, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, 페그인터페론 알파-2b, PEG-인트론(페그인터페론 알파-2b), 펨브롤리주맙, 페메트렉세드 이나트륨, 페르제타(Perjeta)(페르투주맙), 페르투주맙, 플라티놀(시스플라틴), 플라티놀-AQ(시스플라틴), 플레릭시포르, 포말리도미드, 포말리스트(포말리도미드), 포나티닙 하이드로클로라이드, 포르트라짜(Portrazza)(네시투무맙), 프랄라트렉세이트, 프레드니손, 프로카르바진 하이드로클로라이드, 프롤류킨(알데스루킨), 프롤리아(데노수맙), 프로막타(엘트롬보팩 올라민), 프로프로파놀롤 하이드로클로라이드, 프로벤지(시풀류셀-T), 푸리네톨(머캅토푸린), 푸릭산(머캅토푸린), [항목 없음(No Entries)], 라듐 223 디클로라이드, 랄록시펜 하이드로클로라이드, 라무시루맙, 라스부리카제, R-CHOP, R-CVP, 재조합 인간 파필로마바이러스(HPV) 2가 백신, 재조합 인간 파필로마바이러스(HPV) 9가 백신, 재조합 인간 파필로마바이러스(HPV) 4가 백신, 재조합 인터페론 알파-2b, 레고라페닙, 렐리스토르(메틸날프렉손 브로마이드), R-EPOCH, 레블리미드(레날리도미드), 류마트렉스(메토트렉세이트), 리보키클립, R-ICE, 리툭산(리툭시맙), 리툭산 하이셀라(리툭시맙 및 하이알루로니다제 인간), 리툭시맙, 리툭시맙 및 하이알루로니다제 인간, 롤라피탄트 하이드로클로라이드, 로미뎁신, 로미플로스팀, 루비도마이신(다우노루비신 하이드로클로라이드), 루브라카(루카파립 캄실레이트), 루카파립 캄실레이트, 룩솔리티닙 포스페이트, 라이답트(미도스타우린), 스클레로솔 흉막내 에어로졸(Sclerosol Intrapleural Aerosol)(활석), 실툭시맙, 시풀레우셀-T, 소마툴린 데포트(란레오타이드 아세테이트), 소니데깁, 소라페닙 토실레이트, 스프라이셀(Sprycel)(다사티닙), 스탠포드(STANFORD) V, 멸균 활석 분말(활석), 스테리탈크(Steritalc)(활석), 스티바르가(Stivarga)(레고라페닙), 수니티닙 말레이트, 수텐트(수니티닙 말레이트), 실라트론(페그인터페론 알파-2b), 실반트(실툭시맙), 신리보(오마세탁신 메페석시네이트), 타블로이드(티오구아닌), TAC, 타핀라르(다브라페닙), 타그리쏘(Tagrisso)(오시메르티닙), 활석, 탈리모겐 라헤르파레프벡, 타목시펜 시트레이트, 타라빈 PFS(사이타라빈), 타르세바(에를로니팁 하이드로클로라이드), 타르그레틴(벡사로텐), 타시그나(닐로티닙), 탁솔(파클리탁셀), 탁소테레(도세탁셀), 테센트리크(아테졸리주맙), 테모다르(테모졸로마이드), 테모졸로마이드, 템시롤리무스, 탈리도마이드, 탈로미드(탈리도마이드), 티오구아닌, 티오테파, 티사겐레클류셀, 톨락(플루오로우라실-국소), 토포테칸 하이드로클로라이드, 토레미펜, 토리셀(템시롤리무스), 토시투모맙 및 요오드 I 131 토시투모맙, 토텍트(덱스라족산 하이드로클로라이드), TPF, 트라벡테딘, 트라메티닙, 트라스투주맙, 트레안다(벤다무스틴 하이드로클로라이드), 트리플루리딘 및 티피라실 하이드로클로라이드, 트리세녹스(삼산화비소), 타이케르브(Tykerb)(라파티닙 디토실레이트), 유니툭신(디누툭시맙), 우리딘 트리아세테이트, VAC, 발루비신, 발스타(발루비신), 반데타닙, VAMP, 바루비(롤라피탄트 하이드로클로라이드), 벡티빅스(파니투무맙), VeIP, 벨반(빈블라스틴 설페이트), 벨케이드(보르테조밉), 벨사르(빈블라스틴 설페이트), 베무라페닙, 벤클렉타(베네토클락스), 베네토클락스, 베르제니오(아베마키클립), 비아두르(류플롤라이드 아세테이트), 비다자(아자시티딘), 빈블라스틴 설페이트, 빈카사르 PFS(빈크리스틴 설페이트), 빈크리스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트 리포좀, 비노렐빈 타르트레이트, VIP, 비스모데깁, 비스토가르드(우리딘 트리아세테이트), 보락사제(글루카르피다제), 보리노스타트, 보트리엔트(파조파닙 하이드로클로라이드), 바익세오스(Vyxeos)(다우노루비신 하이드로클로라이드 및 사아타라빈 리포좀), 웰코보린(류코보린 칼슘), 크살코리(Xalkori)(크리조티닙), 크셀로다(카펙시타빈), XELIRI, XELOX, 크세게바(Xgeva)(데노수맙), 크소피고(라듐 223 디클로라이드), 크탄디(Xtandi)(엔잘루타미드), 예르보이(Yervoy)(이필리무맙), 예르스카르타(Yescarta)(악시카브타겐 실로류셀), 욘델리스(트라벡테딘), 잘트랩(지브-아플리베르셉트), 자륵시오(Zarxio)(필그라스팀), 제줄라(Zejula)(니라파립 토실레이트 일수화물), 젤보라프(베무라페닙), 제발린(이브리투모맙 티욱세탄), 지네카르드(덱스라족산 하이드로클로라이드), 지브-아플리베르셉트, 조프란(온단세트론 하이드로클로라이드), 졸라덱스(고세렐린 아세테이트), 졸레드론산, 졸린자(보리노스타트), 조메타(졸렌드론산), 자이델리그(이델랄리십), 자이카디아(세리티닙) 및 자이티가(아비라테론 아세테이트).
항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물의 다회의 투여량이 또한 제공될 수 있다. 투여량 중 하나 이상, 또는 각각은 다른 치료제의 동시 투여 또는 후속적 투여에 의해 동반될 수 있다.
다수의 투여량은 예정된 시간 간역으로 분리될 수 있으며, 이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 중 하나가 되도록 선택될 수 있다. 예로써, 투여량은 7, 14, 21 또는 28일마다(플러스(+) 또는 마이너스(-) 3분, 2, 또는 1일) 1회 제공될 수 있다.
검출 방법
본 발명은 또한 VISTA 또는 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)를 검출하거나, 국재화하거나 영상화하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 물품을 제공한다. 본 명세서에 기재된 항원 결합 분자는 VISTA에 대한 항원 결합 분자를 포함하는 방법에 사용된다. 이러한 방법은 결합된 항원 결합 분자 및 VISTA의 복합체의 검출을 포함할 수 있다.
특히, VISTA의 검출은 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)가 병리적으로 관련된 질병/병태의 진단/예후, 이러한 질병/병태의 발달 위험이 있는 대상체의 확인 방법에 유용할 수 있고/거나, 치료 개입에 대한 대상체의 반응의 예측 방법에 유용할 수 있다.
이와 같이, VISTA를 포함하거나 포함하는 것으로 추측되는 샘플과 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계, 및 항원 결합 분자 및 VISTA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 또한 VISTA를 발현하는 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 추측되는 샘플과 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계 및 항원 결합 분자 및 VISTA를 발현하는 세포의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
샘플은 임의의 조직 또는 체액으로부터 취할 수 있다. 샘플은 혈액의 양; 피브린 응괴 및 혈액 세포의 제거 후 획득된 혈액의 유체 부위를 포함할 수 있는 개의l 혈액으로부터 유래된 혈청의 양; 조직 샘플 또는 생검(biposy); 늑막 유액(pleural fluid); 뇌척수 유액(CSF); 또는 상기 개인으로부터 단리된 세포를 포함할 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 질병/병태(예컨대, 질병의 증상이 나타나거나, 질병/병태의 발병에 포함된 조직 또는 조직들)에 의해 영향받는 조직 또는 조직들로부터 획득되거나 유래될 수 있다.
면역분석, 예를 들면, 샌드위치 분석, 예컨대, ELISA를 포함하는, 적합한 방법 양식이 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 방법은 항원-결합 분자, 또는 표적(들), 또는 둘다를 본 명세서에 기재된 바와 같은 검출가능한 모이어티, 예컨대, 형광성 표지, 인광성 표지, 발광성 표지, 면역-검출가능한 표지, 방사선표지, 화학물질, 핵산 또는 효소 표지로 표지하는 단계를 포함할 수 있다. 검출 기술은 당해 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있으며 표지제와 해당하도록 선택할 수 있다.
이러한 유형의 방법은 질병 또는 상태, 예컨대, 암의 진단 및/또는 예후적 평가를 위한 방법을 기준으로 제공할 수 있다. 이러한 방법은 환자 샘플에서 시험관내에서, 또는 환자 샘플의 프로세싱 후 수행될 수 있다. 일단 샘플이 수집되면, 환자는 수행될 시험관내 방법에 대해 존재될 필요가 없으므로, 이러한 방법은 인체 또는 동물체에서 실시되지 않는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 생체내에서 수행된다.
샘플 속의 검출은 질병/병태(예컨대,암)의 진단, 질병/병태에 대한 경향의 목적을 위해, 또는 질병/병태, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 질병/병태에 대한 예후(예측)을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 진단 또는 예후는 기존(이미 진단된) 질병/병태에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 또한 VISTA-표적화된 제제에 의한 치료를 위해 대상체의 선택/계층화 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 본 발명에 따른 치료/예방을 위해 선택되거나, 예를 들어 대상체로부터 획득된 샘플에서 VISTA 또는 VISTA를 발현하는 세포의 검출/정량화를 기반으로 하여, 이러한 치료/예방으로부터 이점을 얻을 수 있는 대상체로서 확인된다.
이러한 방법은 VISTA 및/또는 VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)를, 예컨대, 환자 샘플에서 검출하거나 정량화하는 단계를 포함할 수 있다. 방법이 관련 인자를 정량화하는 단계를 포함하는 경우, 이러한 방법은 진단 또는 예후 평가의 일부로서 표준 또는 참조 값에 대해 예정된 양을 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 진단/예후 시험을 본 명세서에 기재된 것과 함께 사용함으로써 진단 또는 예후의 정확성을 향상시키거나 본 명세서에 기재된 시험을 사용함으로써 획득된 결과를 확인할 수 있다.
증가된 수준의 VISTA가 검출되거나, VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 존재 - 또는 증가된 수/비율 -가 대상체로부터 획득된 샘플에서 검출되는 경우, 대상체는 MDSC가 병리학적으로 관련된 질병/병태가 있거나, 그러한 질병/병태가 발생할 위험이 있는 것으로 진단될 수 있다. 이러한 방법에서, 세포의 발현 수준 또는 수/비율의 "증가"는 예를 들어 건강한 대상체로부터 획득된 유사한 샘플 (예를 들어, 동일한 유체, 조직, 기관 등으로부터 획득된, 예를 들어 동일한 종류의 샘플)에서 검출된 수준/수/비율과 같이, 적절한 대조군 조건에서 측정된 수준/수/비율보다 더 큰 수준/수/비율을 지칭한다.
증가된 수준의 VISTA가 검출되거나, VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 존재 - 또는 증가된 수/비율 -가 대상체로부터 획득된 샘플에서 검출되는 경우, 대상체는 유사한 샘플 (예를 들어, 동일한 유체, 조직, 기관 등으로부터 획득된, 예를 들어 동일한 종류의 샘플)에서 VISTA의 수준이 더 낮거나, VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 수/비율이 감소된 것으로 측정된 대상체와 비교하여, 불량한 예후를 나타내는 것으로 측정될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자는 면역요법에 대한 반응을 예측하는 방법에도 유용하다. "면역요법"은 일반적으로 질병/병태를 치료하기 위해 면역계를 이용하는 것을 목적으로 하는 치료적 개입을 지칭한다. 면역요법은 대상체에서 효과기 면역 세포 (예를 들어, 효과기 T 세포 (예를 들어, 항원-특이적 T 세포, CAR-T 세포), NK 세포)의 수/비율/활성을 증가시키기 위한 치료적 개입을 포함한다. 효과기 면역 세포의 수/비율/활성을 증가시키기 위한 면역요법에는 효과기 면역 세포의 증식 및/또는 생존의 촉진, 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달 억제, 공동 자극 수용체에 의해 매개되는 신호전달 촉진, 항원 제시 세포에 의한 항원 제시 향상 등을 위한 치료적 개입이 포함된다. 효과기 면역 세포의 수/비율/활성을 증가시키기 위한 면역요법은 또한 대상체에서 입양 세포 전달 (ACT)을 통해 적절한 특이성 또는 활성을 나타내는 효과기 면역 세포의 빈도를 증가시키기 위한 개입을 포함한다. ACT는 일반적으로 면역 세포가 단리되는 혈액 샘플을 채혈하여 대상체로부터 면역 세포를 획득하는 단계를 포함한다. 그 후, 세포를 일반적으로 어떤 방식으로든 처리 또는 변이시킨 다음, 동일한 대상체 또는 상이한 대상체에게 투여한다. ACT는 일반적으로 대상체에게 적절한 특정 특성을 가진 면역 세포 집합을 제공하거나, 해당 대상체에서 그러한 특성을 가진 면역 세포의 빈도를 증가시키는 것을 목적으로 한다. 일부 실시형태에서 ACT는 예를 들어 표적 항원 또는 대상 세포 유형에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 세포의 것일 수 있다. 면역요법은 또한 대상체에서 억제 면역 세포 (예를 들어, 조절 T 세포, MDSC)의 수/비율/활성을 감소시키기 위한 치료적 개입을 포함한다. 억제 면역 세포의 수/비율/활성을 감소시키기 위한 면역요법에는 억제 면역 세포의 세포 사멸을 유발하거나 강화하고, 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제하기 위한 개입이 포함된다.
증가된 수준의 VISTA가 검출되거나, VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 존재 - 또는 증가된 수/비율 -가 대상체로부터 획득된 샘플에서 검출되는 경우, 대상체는 유사한 샘플 (예를 들어, 동일한 유체, 조직, 기관 등으로부터 획득된, 예를 들어 동일한 종류의 샘플)에서 VISTA의 수준이 더 낮거나, VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 수/비율이 감소된 것으로 측정된 대상체와 비교하여, 대상체에서 효과기 면역 세포의 수/비율/활성을 증가시키기 위한 면역요법에 더 불량한 반응을 나타낼 것으로 예측될 수 있다. 증가된 수준의 VISTA가 검출되거나, VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 존재 - 또는 증가된 수/비율 -가 대상체로부터 획득된 샘플에서 검출되는 경우, 대상체는 유사한 샘플 (예를 들어, 동일한 유체, 조직, 기관 등으로부터 획득된, 예를 들어 동일한 종류의 샘플)에서 VISTA의 수준이 더 낮거나, VISTA를 발현하는 세포 (예를 들어, MDSC)의 수/비율이 감소된 것으로 측정된 대상체와 비교하여, 대상체에서 억제 면역 세포의 수/비율/활성을 감소시키기 위한 면역요법에 더 개선된 반응을 나타낼 것으로 예측될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 억제 면역 세포 구획 및 효과기 면역 세포 구획의 상대적 크기/활성을 측정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 방법은 VISTA-발현 세포 (예를 들어, MDSC, TAM, 호중구) 대 효과기 면역 세포의 비율을 측정하기 위한 방법에서 본 명세서에 기재된 항원 결합 분자를 사용한다. 증가된 비율을 나타내는 대상체는 비율이 더 낮은 것으로 측정된 대상체와 비교하여, 억제 면역 세포의 수/비율/활성을 감소시키기 위한 면역요법에 개선된 반응을 나타낼 것으로 예측될 수 있고/거나, 효과기 면역 세포의 수/비율/활성을 증가시키기 위한 면역요법에 더 불량한 반응을 나타낼 것으로 예측될 수 있다.
본 발명의 진단 및 예후 방법은 질병 및/또는 치료 과정 전반에 걸쳐 다수의 시점에서 대상체로부터 획득된 샘플에 대해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 대상체에 투여된 치료에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 질병/병태의 발달을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 본 방법에 따른 특성화 결과는 대상체에 투여할 요법의 시기 및 종류에 대한 임상 결정의 정보에 사용될 수 있다.
진단 또는 예후 방법은 대상체로부터 획득된 샘플에 대해 시험관내에서 수행되거나 대상체로부터 획득된 샘플을 처리한 후에 수행될 수 있다. 샘플이 수집된 경우, 환자는 시험관내 진단 또는 예후 방법을 수행하기 위해 참석할 필요가 없으므로, 본 방법은 인간 또는 동물 신체에서 실행되지 않는 방법일 수 있다.
대상체
본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태에 따른 대상체는 임의의 동물 또는 인간일 수 있다. 대상체는 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 비-인간 포유류일 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있다. 대상체는 치료를 필요로 하는 질병 또는 상태(예컨대,암)으로 진단될 수 있거나, 이러한 질병/병태를 가진 것으로 예측될 수 있거나, 이러한 질병/병태가 발달할/걸릴(contracting) 위험에 처해 있을 수 있다.
본 발명에 따른 실시형태에서, 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서의 발명의 치료학적 또는 예방학적 방법에 따라 치료될 대상체는 암을 가지거나 암으로 발달할 위험이 있는 대상체이다. 본 발명에 따른 실시형태에서, 대상체는 이러한 질병/병태의 특정 마커(마커)에 대한 특성화를 기반으로 하는 방법에 따른 치료를 위해 선택될 수 있다.
키트(Kit)
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시형태에서, 부품의 키트(kit of parts)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 예정된 양의 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물을 갖는 적어도 하나의 용기를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물을 생성하기 위한 물질을 포함할 수 있다.
키트는 명시된 질병/병태를 치료하기 위하여 환자에게 투여하기 위한 기재서와 함께, 항원-결합 분자, 폴리펩타이드, CAR, 핵산(또는 이의 다수), 발현 벡터(또는 이의 다수), 세포 또는 조성물을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 예정된 양의 다른 치료제(예컨대, 항-감염제 또는 화학치료요법제)를 갖는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 키트는 또한 제2의 의약 또는 약제학적 조성물을 포함함으로써 2개의 의약 또는 약제학적 조성물이 동시에 또는 별도로 투여되어 이들은 특수한 질병 또는 상태에 대한 조합된 치료를 제공할 수 있다. 치료제는 또한 종양 또는 혈액에 주사 또는 주입하는데 적합하도록 제형화할 수 있다.
서열 동일성
본 명세서에 사용된 바와 같이, "서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭(gap)을 도입한 후, 서열 사이에 서열 동일성의 최대 퍼센트를 달성하기 위해, 참조 서열내 뉴클레오타이드/아미노산 잔기와 동일한 대상체 서열내 뉴클레오타이드/아미노산 잔기의 퍼센트를 지칭한다. 2개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 동일성 퍼센트를 측정할 목적을 위한 쌍식 및 다중 서열 정렬은 당해 분야의 당업자에게 공지된 다양한 방식으로, 예를 들면, 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, ClustalOmega(문헌[Soeding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960]), T-coffee (문헌[Notredame et al. 2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217]), Kalign (문헌[Lassmann and Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298)]) 및 MAFFT (문헌[Katoh and Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772-780]) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 소프트웨어를 사용하는 경우, 예컨대, 갭 패널티 및 연장 패널티에 대한 디폴트 매개변수(default parameter)를 바람직하게 사용한다.
서열
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일련의 번호의 항목
다음의 일련의 번호의 항목 (항)은 본 발명과 관련하여 고려되는 특징 및 특징의 조합에 대한 추가 설명을 제공한다:
1. Fc-매개 기능에 독립적으로, VISTA와 결합하고 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있는, 선택적으로 단리된, 항원 결합 분자.
2. 제1항에 있어서, Ig-유사 V-형 도메인에서 VISTA에 결합할 수 있는 항원 결합 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 결합 분자는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항원 결합 분자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항원 결합 분자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 VISTA에 대한 결합에 대해 와 경쟁하지 않는 항원 결합 분자.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 서열번호 275의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 결합할 수 없는 항원 결합 분자.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 305의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 306의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 307의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 308의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 309의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 295의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 300의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 277의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 286의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 300의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
19. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 96의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
20. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 137의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 138의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 139의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
21. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 107의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상의 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이들의 변이체; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 114의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 115의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
22. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 120의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 121의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 122의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 127의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 128의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 129의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
23. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 145의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 146의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 151의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 152의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 153의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
24. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 158의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 159의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 160의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 165의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 152의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 153의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
25. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 169의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 170의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 171의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 177의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 179의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
26. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 246의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 247의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
27. 제1항 내지 제6항 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 185의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 189의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
28. 제1항 내지 제6항 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 195의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 197의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
29. 제1항 내지 제6항 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
(i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 200의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
서열번호 203의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 178의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 190의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원 결합 분자.
30. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 310의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 294의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 297의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 299의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 301의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 302의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 303의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 276의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 282의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 285의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 287의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
서열번호 32의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 40의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 52의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 57의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 62의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 66의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는.
서열번호 87의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 95의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 106의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 113의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 143의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 150의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 157의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 164의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 71의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 79의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 102의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 104의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 119의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 126의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 183의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 188의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 194의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 196의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 199의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 202의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 133의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 136의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
또는
서열번호 168의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 176의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
을 포함하는, 항원 결합 분자.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 인간 VISTA 및 마우스 VISTA 및 시노몰구스 마카퀴 VISTA 중 하나 이상에 결합할 수 있는 항원 결합 분자.
32. (i) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 및 (ii) VISTA 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 포함하는, 선택적으로 단리된, 항원 결합 분자.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 세포 표면에 VISTA를 발현하는 세포에 결합할 수 있는 항원 결합 단편.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 VISTA와 VISTA의 결합 파트너 사이의 상호작용을 억제할 수 있는, 항원 결합 분자.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있는 항원 결합 분자.
36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는 효과기 면역 세포에 의한 증식 및/또는 사이토카인 생성을 증가시킬 수 있는 항원 결합 분자.
37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR).
38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 제37항에 따른 CAR을 인코딩하는 선택적으로 단리된 핵산 또는 다수의 핵산.
39. 제38항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터.
40. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제37항에 따른 CAR, 제38항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산 또는 제39항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포.
41. 핵산(들) 또는 발현 벡터(들)로부터의 항원 결합 분자 또는 CAR의 발현에 적합한 조건 하에 제38항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산 또는 제39항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
42. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제37항에 따른 CAR, 제38항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제39항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터 또는 제40항에 따른 세포를 포함하는 조성물.
43. 제42항에 있어서, VISTA 이외의 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제를 추가로 포함하고, 선택적으로 VISTA 이외의 면역 체크포인트 분자는 PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT 및 BTLA로부터 선택되는 조성물.
44. 의학적 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제37항에 따른 CAR, 제38항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제39항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제40항에 따른 세포 또는 제42항 또는 제43항에 따른 조성물.
45. 암 또는 감염성 질병의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제37항에 따른 CAR, 제38항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제39항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제40항에 따른 세포 또는 제42항 또는 제43항에 따른 조성물.
46. 암 또는 감염성 질병의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제37항에 따른 CAR, 제38항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제39항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제40항에 따른 세포 또는 제42항 또는 제43항에 따른 조성물의 용도.
47. 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제37항에 따른 CAR, 제38항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제39항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제40항에 따른 세포 또는 제42항 또는 제43항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질병의 치료 또는 예방 방법.
48. 암은 결장직장암, 췌장암, 유방암, 간암, 전립선암, 난소암, 두경부암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 흉선종, 폐암, 비 소세포 폐 암 (NSCLC) 및 고형 종양으로부터 선택되는 제45항에 따른 사용하기 위한 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물, 제46항에 따른 용도 또는 제47항에 따른 방법.
49. 골수-유래 억제 세포 (MDSC)가 병리적으로 관련된 것인 질병의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제37항에 따른 CAR, 제38항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제39항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제40항에 따른 세포 또는 제42항 또는 제43항에 따른 조성물.
50. 질병의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제37항에 따른 CAR, 제38항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제39항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제40항에 따른 세포 또는 제42항 또는 제43항에 따른 조성물의 용도로서, 골수-유래 억제 세포 (MDSC)가 병리적으로 관련된 것인 용도.
51. 골수-유래 억제 세포 (MDSC)가 병리적으로 관련되고, 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제37항에 따른 CAR, 제38항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제39항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제40항에 따른 세포 또는 제42항 또는 제43항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료 또는 예방 방법.
52. 본 방법은 VISTA 이외의 면역 체크포인트 분자에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제의 투여를 추가로 포함하고, 선택적으로 VISTA 이외의 면역 체크포인트 분자는 PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT 또는 BTLA로부터 선택되는 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물, 용도 또는 방법.
53. VISTA-매개 신호전달을 억제하는 방법으로서, VISTA-발현 세포와 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
54. 골수-유래 억제 세포 (MDSC)의 활성을 억제하기 위한 방법으로서, 본 방법은 MDSC와 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
55. 효과기 면역 세포의 수 또는 활성을 증가시키기 위한 방법으로서, 본 방법은 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 사용하여 VISTA-발현 세포의 활성을 억제하는 단계를 포함하는 방법.
56. VISTA에 결합된 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 포함하는 선택적으로 단리된 시험관내 복합체.
57. VISTA를 포함하거나 포함하는 것으로 추측되는 샘플과 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계, 및 항원 결합 분자와 VISTA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
58. VISTA-표적화된 제제를 사용한 치료를 위해 대상체를 선택하거나 계층화하는 방법으로서, 본 방법은 시험관내에서, 대상체로부터의 샘플과 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계 및 항원 결합 분자와 VISTA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
59. 시험관내 또는 생체내 진단제 또는 예후제로서의 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자의 용도.
60. 암을 검출하거나, 국재화하거나 영상화하는 방법에서의 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자의 용도로서, 선택적으로 암은 결장직장암, 췌장암, 유방암, 간암, 전립선암, 난소암, 두경부암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 흉선종, 폐암, 비 소세포 폐 암 (NSCLC) 및 고형 종양으로부터 선택되는 용도.
***
본 발명은 이러한 조합이 명확하게 허용될 수 없거나 명백히 피해지는 경우를 제외하고는 기재된 실시형태 및 바람직한 특징의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용된 문단 제목은 조직화 목적만을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 실시형태 및 실시형태는 첨부된 도면을 참조로, 예로써 이제 나타낼 것이다. 추가의 실시형태 및 실시형태는 당해 분야의 당업자에게 명백할 것이다. 본 내용에서 언급된 모든 문헌은 참조로 본 명세서에 포함된다.
후속되는 청구범위를 포함하는, 본 명세서 전반에 걸쳐서, 내용이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 기재된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함 뿐만 아니라, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 배제도 암시하는 것으로 이해될 것이다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "하나"("a", "an"), 및 "그"("the")는 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 범위는 본 명세서에서 "약" 하나의 특수 값, 및/또는 "약" 다른 특수 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현된 경우, 다른 실시형태는 하나의 특수한 값으로부터 및/또는 다른 특수한 값까지를 포함한다. 유사하게, 값을 근사치로 표현하는 경우, 선행사 "약"의 사용에 의해, 특수한 값이 다른 실시형태를 형성하는 것으로 이해될 것이다.
핵산 서열이 본 명세서에 개시된 경우, 이의 역 상보체가 또한 명백히 고려된다.
본 명세서에 기재된 방법은 바람직하게는 시험관내에서 수행될 수 있다. 용어 "시험관내"는 배양물 속에서 세포로 수행된 과정을 포함하는 것으로 의도되는 반면, 용어 "생체내"는 완전한 다-세포 유기체를 사용하여/상에서의 과정을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 원리를 기재하는 실시형태 및 실험은 첨부된 도면을 참조로 이제 논의될 것이다.
도 1a 내지 도 1d. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-VISTA 항체에 의한 세포 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 항-VISTA 항체 클론 (도 1a) VSTB112 (양성 대조군; WO 2015/097536), (도 1b) 4-M2-D5, (도 1c) 9M2-C12 또는 (도 1d) 4M2-C12 (또한 본 명세서에서 "V4"로 지칭됨)에 의한 HEK293 세포 (VISTA를 발현하지 않음) 또는 HEK293 VISTA 과발현 세포 (HEK293 VISTA O/E)의 염색을 보여준다.
도 2. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-VISTA 항체에 의한 세포 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 항-VISTA 항체 클론 9M2C12, V4 및 클론 VSTB112 또는 이소형 대조군 항체에 의한 HEK293 세포 (VISTA를 발현하지 않음) 또는 HEK293 VISTA 과발현 세포 (HEK293 VISTA O/E)의 염색을 보여준다. 비염색 세포를 음성 대조군으로 분석하였다.
도 3a 내지 도 3c. 항-VISTA 항체 클론 V4에 의한 인간, 시노몰구스 원숭이 및 쥣과동물 VISTA에 대한 결합 친화도 분석 결과를 보여주는 센소그램. (도 3a)는 인간 VISTA에 대한 결합을 보여주고, (도 3b)는 시노몰구스 원숭이 VISTA에 대한 결합을 보여주고, (도 3c)는 쥣과동물 VISTA에 대한 결합을 나타낸다. Kon, Koff 및 KD가 제시된다.
도 4a 내지 도 4b. 상이한 단백질에 대한 항-VISTA 항체의 결합 분석 결과를 보여주는 그래프. 도 4a는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 항-VISTA 항체 클론 V4에 의한 인간, 시노몰구스 원숭이 및 쥣과동물 VISTA, 인간 PD-L1 및 인간 HER3에 대한 결합을 보여준다. 도 4b는 인간 VISTA, PD-1, PD-L1, B7H3, B7H4, B7H6, B7H7, CTLA4 및 비관련 항원에 대한 항-VISTA 항체 클론 V4의 결합을 보여준다.
도 5. VISTA와 VSIG-3 사이의 결합 분석 결과를 보여주는 센소그램.
도 6. 항-VISTA 항체 클론 5M1-A11 및 9M2-C12에 의한 VISTA와 VSIG-3 사이의 결합 억제 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 7a 및 도 7b. 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석에서 IFN-γ, IL-2 및 IL-17A의 생성에 대한 항-VISTA 항체 클론 13D5p 처리 효과 분석 결과를 보여주는 그래프 및 막대 차트. (도 7a)는 분석 종료시 세포 배양 상청액에서 검출된 사이토카인의 수준을 보여주고, (도 7b)는 소정의 사이토카인의 수준에서 변화 배수 ("FC")를 보여준다.
도 8a 및 도 8b. 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석에서 IFN-γ, IL-2 및 IL-17A 생성에 대한 항-PD-L1 항체 클론 MIH5 (ThermoFisher Scientific)의 처리 효과 분석 결과를 보여주는 그래프 및 막대 차트. (도 8a)는 분석 종료시 세포 배양 상청액에서 검출된 사이토카인의 수준을 보여주고, (도 8b)는 소정의 사이토카인의 수준에서 변화 배수 ("FC")를 보여준다.
도 9. 시차 주사 형광 분석에 의한 항-VISTA 항체 클론 V4의 안정성 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 10. 크기 배제 크로마토그래피에 의한 항-VISTA 항체 클론 V4의 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 11. SDS-PAGE 및 웨스턴블롯에 의한 항-VISTA 항체 클론 V4 발현 분석 결과를 보여주는 이미지. 레인: M1 = TaKaRa 단백질 마커 Cat. No. 3452; M2 = GenScript 단백질 마커 Cat. No. M00521; 1 = 감소 조건; 2 = 비감소 조건; P = 양성 대조군: 마우스 IgG1, 카파 (Sigma Cat. No. M9269). 웨스턴블롯의 경우 사용된 1차 항체는 염소 항-마우스 IgG (H+L) 항체 (LI-COR, Cat. No. 926-32210)였다.
도 12. 항체 혈청의 ELISA 분석에 의한 항-VISTA 항체 클론 V4의 약동학 분석 결과를 보여주는 그래프 및 표.
도 13. 결장암종의 동계 세포주 유래 마우스 모델에서 항-VISTA 항체 클론 V4의 생체내 항암 활성 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 14. 소정의 체크포인트 분자를 표적화하는 단일요법 또는 조합요법으로 처리한 후 결장 암종의 동계 세포주 유래 마우스 모델에서 15일째에 종양 성장의 억제를 보여주는 막대 차트. 이 연구에 사용된 항체는 다음과 같다: 항-VISTA = 클론 V4, 항-PD-L1 = 클론 10F.9G2, 항-TIGIT = 클론 1G9, 항-LAG-3 = 클론 C9B7W, 및 항-TIM-3 = 클론 RMT3-23.
도 15. 항-VISTA 항체 클론 V4 단독, 항-PD-L1 항체 클론 10F.9G2 단독에 의한 처리, 항-VISTA 항체 클론 V4 및 항-PD-L1 항체 클론 10F.9G2에 의한 조합 처리 또는 PBS (음성 대조군)에 의한 처리 후, 대형 종양의 RNA-Seq 분석에 의해 측정된 바와 같이, 결장 암종의 동계 세포주 유래 마우스 모델의 대형 종양에서 100,000개 세포당 MDSC의 수 및 CD8+ T 세포: Treg의 비율을 보여주는 막대 차트.
도 16. 루이스 폐암종의 동계 세포주 유래 마우스 모델에서 생체내 항-VISTA 항체 클론 V4의 항암 활성 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 17. 항-PD-1 항체 RMP1-14 (Bio X 세포)와 조합하여 또는 단일요법으로서, 흑색종의 동계 세포주 유래 마우스 모델에서, 항-VISTA 항체 클론 V4의 생체내 항암 활성 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 18. 단일 투여량의 900 μg의 항-VISTA 항체 클론 V4, 또는 음성 대조군으로서 동일한 부피의 비히클 (PBS)을 투여한 후 백혈구의 수 또는 상이한 유형을 보여주는 막대 차트.
도 19a 및 도 19b. 단일 투여량의 900 μg의 항-VISTA 항체 클론 V4 또는 음성 대조군으로서 동일한 부피의 비히클 (PBS)을 투여한 후 (도 9a) 간 및 (도 9b) 신장 기능의 상관관계를 평가하여, 간독성 및 신독성 분석을 보여주는 막대 차트. (도 9a)는 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 아스파테이트 트랜스아미나제 (AST)의 수준을 보여주며, (도 9b)는 혈액 요소 질소 (BUN) 및 크레아티닌 (CREA)의 수준을 보여준다.
도 20. ELISA에 의해 측정되는 바와 같은 항-VISTA 항체 클론 13D5-1에 의한 인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스 VISTA 및 인간 PD-L1에 대한 결합 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 21. 항-VISTA 항체 클론 13D5-13에 의한 ELISA에 의해 측정되는 바와 같은 인간 및 마우스 VISTA에 대한 결합 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 22. 결장 암종의 세포주 유래 마우스 모델에서 항-VISTA 항체 클론 13D5-1, 단독 또는 항-PD-L1과의 조합의 생체내 항암 활성 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 23. 유선 암종의 세포주 유래 마우스 모델에서 항-VISTA 항체 클론 13D5-1의 생체내 항암 활성 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 24. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-VISTA 항체에 의한 세포의 염색을 보여주는 히스토그램. 히스토그램은 항-VISTA 항체 클론 4M2-B4, 2M1-B12, 4M2-C9, 2M1-D2, 4M2-D9, 1M2-D2, 5M1-A11, 4M2-D5, 4M2-A8 및 9M2-C12에 의한 HEK293 세포 (VISTA를 발현하지 않음) 또는 HEK293 VISTA 과발현 세포 (HEK293 VISTA O/E)의 염색을 보여준다.
도 25a 내지 도 25d. 4M2-C12 mIgG1과 (도 25a) 마우스 FcγRIV, (도 25b) 마우스 FcγRIII, (도 25c) 마우스 FcγRIIb, 및 (도 25d) 마우스 FcRn의 결합 분석 결과를 보여주는 센소그램.
도 26a 내지 도 26d. 4M2-C12 mIgG2a와 (도 26a) 마우스 FcγRIV, (도 26b) 마우스 FcγRIII, (도 26c) 마우스 FcγRIIb, 및 (도 26d) 마우스 FcRn의 결합 분석 결과를 보여주는 센소그램.
도 27a 내지 도 27d. 4M2-C12 mIgG2a LALA PG와 (도 27a) 마우스 FcγRIV, (도 27b) 마우스 FcγRIII, (도 27c) 마우스 FcγRIIb, 및 (도 27d) 마우스 FcRn의 결합 분석 결과를 보여주는 센소그램.
도 28a 내지 도 28d. 4M2-C12 mIgG2a NQ와 (도 28a) 마우스 FcγRIV, (도 28b) 마우스 FcγRIII, (도 28c) 마우스 FcγRIIb, 및 (도 28d) 마우스 FcRn의 결합 분석 결과를 보여주는 센소그램.
도 29a 내지 도 29c. 4M2-C12 mIgG1, 4M2-C12 mIgG2a, 4M2-C12 mIgG2a LALA PG 및 4M2-C12 mIgG2a와 마우스 FcγRIV, 마우스 FcγRIII, 마우스 FcγRIIb, 및 마우스 FcRn의 결합 분석 결과를 요약한 표. 도 29a는 계산된 Kon 값을 보여주고, 도 29b는 계산된 Kdis 값을 보여주고, 도 29c는 계산된 KD 값을 보여준다.
도 30a 내지 도 30c. T 세포 림프종의 세포주 유래 마우스 모델에서 mIgG2a 및 mIgG2a LALA PG 형식에서 항-VISTA 항체 클론 4M2-C12의 생체내 항암 활성 분석 결과를 보여주는 그래프. 도 30a는 상이한 처리 그룹에 대한 데이터를 보여주고, 도 30b는 비히클 대조군 및 4M2-C12 mIgG2a 처리 그룹에서 개별 마우스에 대해 획득된 데이터를 보여주고, 도 30c는 비히클 대조군 및 4M2-C12 mIgG2a LALA PG 처리 그룹에서 개별 마우스에 대해 획득된 데이터를 보여준다.
도 31a 및 도 31b. BLI에 의한 인간 VISTA 결합에 대한 상이한 항-VISTA 항체 간의 경쟁 분석 결과를 보여주는 센소그램.
도 32. 항-VISTA 항체 4M2-C12에 의한 VISTA와 VSIG-3 사이의 결합 억제 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 33a 내지 도 33d. CFSE 희석 분석에 의해 측정된 바와 같이, VISTA-Ig로 처리된 T 세포에 의한 T 세포 증식을 회복시키는 항-VISTA 항체의 능력 분석 결과를 보여주는 막대 차트. 도 33a 및 도 33c는 1:1 비율의 작용제 항-CD3 항체 및 VISTA-Ig로 코팅된 웰을 사용한 조건에서 획득된 결과를 보여주고, 도 33b 및 33d는 2:1 비율의 작용제 항-CD3 항체 및 VISTA-Ig로 코팅된 웰을 사용한 조건에서 획득된 결과를 보여준다. 도 33a 및 도 33b는 CFSE-저 CD4+ T 세포의 백분율을 보여주고, 도 33c 및 도 33d는 CFSE-저 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다.
도 34a 및 도 34b. LPS로 자극된 THP-1 세포에 의한 IL-6 생성을 촉진하는 항-VISTA 항체의 능력 분석 결과를 보여주는 막대 차트. 도 34a는 4M2-C12를 사용하여 획득된 결과를 보여주고, 도 34b는 VSTB112를 사용하여 획득된 결과를 보여준다.
도 35. 항-VISTA 항체 4M2-C12를 투여하기 2시간 전 및 투여하고 0.5시간, 6시간, 24시간 및 96시간 후에 항-VISTA 항체 4M2-C12를 투여한 마우스로부터 획득된 혈액 샘플에서 검출된 IL-6의 수준을 보여주는 막대 차트.
도 36a 및 도 36b. 결장 암종의 세포주 유래 마우스 모델에서 항-VISTA 항체 4M2-C12 mIgG2a (V4), 항-PD-1 항체 (PD1) 또는 4M2-C12 mIgG2a 및 항-PD-1 항체에 의한 조합 처리의 생체내 항암 활성 분석 결과를 보여주는 그래프. 도 36a는 상이한 처리 그룹에 대한 데이터를 보여주고, 도 36b는 비히클 대조군 및 4M2-C12 mIgG2a+항-PD-1 처리 그룹에서 개별 마우스에 대해 획득된 데이터를 보여준다.
도 37. PBS (비히클), 항-VISTA 항체 4M2-C12 mIgG2a (V4), 항-PD-1 항체 (항-PD1) 또는 4M2-C12 mIgG2a 및 항-PD-1 항체 (Combo)에 의한 조합 처리로 처리된 마우스로부터 획득된 결장 암종의 세포주 유래 마우스 모델의 22일째 종양의 g-MDSC인 종양-침윤 CD45+ 세포의 백분율을 보여주는 막대 차트.
도 38a 내지 도 38e. PBS (비히클), 항-VISTA 항체 4M2-C12 mIgG2a (V4), 항-PD-1 항체 (PD1) 또는 4M2-C12 mIgG2a 및 항-PD-1 항체 (V4+PD1)에 의한 조합 처리로 처리된 마우스로부터 획득된 결장 암종의 세포주 유래 마우스 모델의 18일째에 획득된 혈청 중 (도 38a) IFNγ, (도 38b) IL-23, (도 38c) IL-10, (도 38d) IL-4, 및 (도 38e) IL-5의 수준을 보여주는 막대 차트.
도 39. PBS (비히클), 항-VISTA 항체 4M2-C12 mIgG2a (V4), 항-PD-L1 항체 (PDL1) 또는 4M2-C12 mIgG2a 및 항-PD-1 항체 (V4+ PDL1)에 의한 조합 처리로 처리된 마우스로부터 획득된 결장 암종의 세포주 유래 마우스 모델의 21일째 종양에서의 Arg1 RNA 발현 수준을 보여주는 막대 차트.
도 40a 및 도 40b. 흑색종의 세포주 유래 마우스 모델에서 항-VISTA 항체 4M2-C12 mIgG2a (V4), 항-PD-1 항체 (PD1) 또는 4M2-C12 mIgG2a 및 항-PD-1 항체에 의한 조합 처리의 생체내 항암 활성 분석 결과를 보여주는 그래프. 도 40a는 상이한 처리 그룹에 대한 데이터를 보여주고, 도 40b는 비히클 대조군 및 4M2-C12 mIgG2a+항-PD-1 처리 그룹에서 개별 마우스에 대해 획득된 데이터를 보여준다.
도 41. PBS (비히클), 항-VISTA 항체 4M2-C12 mIgG2a (V4), 항-PD-1 항체 (항-PD1) 또는 4M2-C12 mIgG2a 및 항-PD-1 항체 (Combo)에 의한 조합 처리로 처리된 마우스로부터 획득된 흑색종의 세포주 유래 마우스 모델의 18일째 종양의 g-MDSC인 종양-침윤 CD45+ 세포의 백분율을 보여주는 막대 차트.
도 42. T 세포 백혈병/림프종의 세포주 유래 마우스 모델에서 항-VISTA 항체 4M2-C12 mIgG2a (V4), 항-PD-1 항체 (항-PD1) 또는 4M2-C12 mIgG2a 및 항-PD-1 항체 (V4+ 항-PD1)에 의한 조합 처리의 생체내 항암 활성 분석 결과를 보여주는 그래프
도 43. PBS (비히클), 항-VISTA 항체 4M2-C12 mIgG2a (V4), 항-PD-1 항체 (항-PD1) 또는 4M2-C12 mIgG2a 및 항-PD-1 항체 (Combo)에 의한 조합 처리로 처리된 마우스로부터 획득된 T 세포 백혈병/림프종의 세포주 유래 마우스 모델의 16일째 종양의 g-MDSC인 종양 침윤 CD45+ 세포의 백분율을 보여주는 막대 차트.
도 44. PBS (비히클), 항-VISTA 항체 4M2-C12 mIgG2a (V4), 항-PD-L1 항체 (항-PDL1) 또는 4M2-C12 mIgG2a 및 항-PD-1 항체 (V4+ 항-PDL1)에 의한 조합 처리에 의한 결장 암종의 세포주 유래 마우스 모델의 처리 과정 동안 마우스의 중량을 보여주는 그래프.
도 45a 내지 도 45d. 생물-층 간섭계에 의해 측정된 바와 같이, 상이한 항-VISTA 항체와 인간 VISTA (도 45a) 마우스 VISTA (도 45b) 및 인간 PD-L1 (도 45c)의 결합 분석 결과를 보여주는 센소그램 및 표. 도 45d는 도 45a 및 도 45b의 센소그램에서 계산된 운동 및 열역학적 상수를 요약한다.
도 46a 및 도 46b. 생물-층 간섭계에 의해 측정된 바와 같은 상이한 항-VISTA 항체와 마우스 VISTA의 결합 분석 결과를 보여주는 센소그램 및 표. 도 45b는 도 46a의 센소그램으로부터 계산된 운동 및 열역학적 상수를 요약한다.
도 47a 내지 47c. 생물-층 간섭계에 의해 측정된 바와 같이, 상이한 항-VISTA 항체와 인간 VISTA (도 47a) 및 마우스 VISTA (도 47b)의 결합 분석 결과를 보여주는 센소그램 및 표. 도 47c는 도 47a 및 도 47b의 센소그램에서 계산된 운동 및 열역학적 상수를 요약한다.
도 48a 및 도 48b. 생물-층 간섭계에 의해 측정된 바와 같이, 상이한 항-VISTA 항체와 인간 VISTA, 및 마우스 VISTA 및 인간 CD47의 결합 분석 결과를 보여주는 센소그램 및 표. 도 48b는 도 48a의 센소그램으로부터 계산된 운동 및 열역학적 상수를 요약한다.
도 49a 내지 도 49c. ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 상이한 항체와 인간 VISTA (도 49a) 또는 마우스 VISTA (도 49b)의 결합 분석 결과를 보여주는 농도-반응 그래프 및 표. 도 49c는 상이한 항체와 소정의 단백질의 결합에 대한 EC50 값 (nM)을 보여준다.
도 50a 내지 도 50c. ELISA에 의해 측정된, 인간 VISTA (도 50a) 및 마우스 VISTA (도 50b)에 대한 상이한 항체의 결합 분석 결과를 보여주는 농도-반응 그래프 및 표. 도 50c는 소정의 단백질에 대한 상이한 항체의 결합에 대한 EC50 값 (nM)을 보여준다.
도 51a 내지 도 51c. ELISA에 의해 측정된, 인간 VISTA (도 51a) 및 마우스 VISTA (도 51b)에 대한 상이한 항체의 결합 분석 결과를 보여주는 농도-반응 그래프 및 표. 도 51c는 소정의 단백질에 대한 상이한 항체의 결합에 대한 EC50 값 (nM)을 보여준다.
도 52a 내지 도 52j. 시차 주사 형광 분석에 의한 다양한 항-VISTA 항체의 안정성 분석 결과를 보여주는 용해 그래프 및 표. 도 52a 내지 도 52i는 3중 반복 실험된 것으로 시험 항체 제조물 및 비 단백질 대조군 (NPC) 제조물에 대해 획득된 미가공 데이터의 제1 유도체를 나타낸다. 도 52j는 도 52a 내지 도 52i의 결과를 요약한다.
도 53. 안전성 및 면역원성에 대한 상이한 항-VISTA 항체의 인실리코 분석 (in silico analysis) 결과를 요약한 표.
도 54. 항-VISTA 항체 4M2-C12에 의한 VISTA와 VSIG-3 사이의 결합 억제 분석 결과를 보여주는 그래프.
도 55. 항-VISTA 항체 클론 4M2-C12 (V4)에 의한 VISTA와 PSGL-1 사이의 결합 억제 분석 결과를 보여주는 막대 차트.
도 56a 내지 도 56g. ELISA에 의해 측정되는 바와 같이, (도 56a) V4, (도 56b) V4-C24, (도 56c) V4-C26, (도 56d) V4-C27, (도 56e) V4-C28, (도 56f) V4-C30 및 (도 56g) V4-C31과 인간 VISTA, PD-L1, B7H3, B7H4, B7H6, B7H7, PD-1 및 CTLA-4의 결합 분석 결과를 보여주는 농도-반응 그래프.
도 57a 내지 도 57i. ELISA에 의해 측정되는 바와 같이, (도 57a) V4, (도 57b) V4-C24, (도 57c) V4-C26, (도 57d) V4-C27, (도 57e) V4-C28, (도 57f) V4-C30 (도 57g) V4-C31 및 (도 57h) 이소형-매칭 대조군 항체와 인간 VISTA, 마우스 VISTA, 랫트 VISTA 및 시노몰구스 VISTA의 결합 분석 결과를 보여주는 농도-반응 그래프. 도 57i는 소정의 단백질과 상이한 항체의 결합에 대한 EC50 값 (M)을 보여준다.
도 58a 내지 도 58c. 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 상이한 항-VISTA 항체 또는 이소형 대조군 항체에 의한 세포의 염색을 보여주는 히스토그램. 도 58a는 야생형, 비 형질감염 HEK293-6E 세포에 대한 항체의 결합을 보여준다. 도 58b는 인간 VISTA 단백질을 과발현하는 HEK293-6E 세포에 대한 항체의 결합을 보여준다. 도 58c는 마우스 VISTA 단백질을 과발현하는 HEK293-6E 세포에 대한 항체의 결합을 보여준다. 1 = 무 항체 (염색되지 않음), 2 = 인간 IgG1 이소형 대조군 항체, 3 = VSTB112 IgG1, 4 = 4M2-C12 IgG1, 5 = V4-C24 IgG1, 6 = V4-C26 IgG1, 7 = V4-C27 IgG1, 8 = V4-C28 IgG1, 9 = V4-C30 IgG1, 및 10 = V4-C31 IgG1.
도 59a 및 도 59b. 항-VISTA 항체를 사용한 인간 조직의 면역조직화학 염색을 보여주는 이미지. 도 59a는 4M2-C12 mIgG2a에 의한 정상 인간 비장 조직의 염색을 보여주고, 도 59b는 소정의 배율에서 4M2-C12 mIgG2a에 의한 정상 인간 난소 조직의 염색을 보여준다.
도 60a 내지 도 60d. VISTA 발현 세포에 의한 억제로부터 활성화된 T 세포를 방출시키는 항-VISTA 항체 4M2-C12-hIgG1 (V4) 또는 VSTB112의 능력 분석 결과를 보여주는 히스토그램 및 막대 차트. 도 60a 및 도 60b는 5일 동안 VISTA-발현 세포 및 소정의 양의 항-VISTA 항체의 존재 하에 T 세포 증식의 CFSE 희석 분석의 결과를 보여준다. 도 60c 및 도 60d는 5일 후 세포 배양 상청액에서 검출된 IFNγ (60c) 및 TNFa (60d)의 농도를 보여준다.
도 61a 내지 도 61c. LPS 자극 THP-1 세포에 의한 사이토카인 생성을 촉진하는 항-VISTA 항체 4M2-C12-hIgG1 (V4) 또는 VSTB112의 능력 분석 결과를 보여주는 막대 차트. 도 61a는 세포 배양 상청액에서 검출된 IL-6의 농도를 보여주고, 도 61b는 소정의 양의 항-VISTA 항체의 존재 하에 24시간 동안 세포의 세포 배양 상청액에서 검출된 TNFa의 농도를 보여준다. 도 61c는 THP1 세포가 VISTA-발현 세포임을 보여주고; VISTA를 발현하는 것으로 측정된 배양 세포의 백분율을 보여준다. 1 = 염색되지 않음, 2 = 이소형 매칭 대조군 항체로 염색된 세포, 3 = 20 μg V4로 염색된 세포, 4 = 40 μg V4로 염색된 세포, 5 = 20 μg VSTB112로 염색된 세포.
도 62. LPS-자극된 THP-1 세포에 의한 IL-6의 생성을 촉진하는 항-VISTA 항체 4M2-C12-hIgG1 또는 4M2-C12-hIgG4의 능력 분석 결과를 보여주는 막대 차트. 세포 배양 상청액에서 검출된 IL-6의 농도를 보여준다.
도 63a 내지 도 63d. 항체 혈청의 ELISA 분석에 의한 항-VISTA 항체 4M2-C12-hIgG1 및 4M2-C12-hIgG4의 약동학 분석 결과를 보여주는 그래프 및 표. 결과는 (도 63a) 10 mg/kg, (도 63b) 25 mg/kg, (도 63c) 100 mg/kg, 또는 (도 63d) 250 mg/kg의 항체의 투여 후를 보여준다.
도 64a 내지 도 64c. 50 mg/kg 4M2-C12-hIgG1 또는 동일한 부피의 PBS를 투여한지 96시간 후에 BALB/C 마우스에서 대표적인 혈액학적 프로파일을 보여주는 표. 도 64a는 적혈구 구획 분석 결과를 보여주고, 도 64b는 백혈구 구획 분석 결과를 보여주고, 도 64c는 간 및 신장 기능의 상관관계 분석 결과를 보여준다. RBC = 적혈구, MVC = 평균 적혈구 부피, MCH = 평균 적혈구 헤모글로빈, MCHC = 평균 적혈구 헤모글로빈 농도, WBC = 백혈구, ALT = 알라닌 아미노트랜스퍼라제, ALP = 알칼리성 포스파타제, CREA = 크레아티닌, BUN = 혈액 요소 질소.
도 65a 내지 도 65c. 250 mg/kg 4M2-C12-hIgG1, 250 mg/kg 4M2-C12-hIgG4 또는 동일한 부피의 PBS를 투여한 후 SD 랫트의 대표적인 혈액학적 프로파일을 보여주는 표. 도 65a는 적혈구 구획 분석 결과를 보여주고, 도 65b는 백혈구 구획 분석 결과를 보여주고, 도 65c는 간, 신장 및 췌장 기능과 전해질 수준의 상관관계 분석 결과를 보여준다. RBC = 적혈구, MVC = 평균 적혈구 부피, MCH = 평균 적혈구 헤모글로빈, MCHC = 평균 적혈구 헤모글로빈 농도, WBC = 백혈구, ALT = 알라닌 아미노트랜스퍼라제, ALP = 알칼리 포스파타제, CREA = 크레아티닌, BUN = 혈액 요소 질소, GLU = 글루카곤, AMY = 아밀라아제, NA = 나트륨, K = 칼륨, P = 인 및 CA = 칼슘.
실시예
다음의 실시예에서, 본 발명자들은 VISTA 분자에서 목적한 특이적인 영역에 대해 표적화된 신규한 항-VISTA 항체 클론의 생성, 및 생물물리학적 및 기능적 특성화 및 이러한 항원-결합 분자의 치료학적 평가를 기술한다.
실시예 1: VISTA 표적 설계 및 항-VISTA 항체 하이브리도마 생성
본 발명자들은 VISTA-결합 단일클론 항체를 생성시키기 위해 인간 VISTA (서열번호 3)의 세포외 영역 내의 영역을 선택하였다.
VISTA의 FG 루프 영역이 VISTA의 억제 기능에 중요한 것으로 제안되었기 때문에 이 영역을 표적화하였다 (문헌[Vigdorovich et al., Structure. 2013; 21 (5): 707-717]). VISTA의 전면 β-시트 영역을 또한 표적화하였다.
1.1 하이브리도마 생성
대략 6주령의 암컷 BALB/c 마우스를 InVivos(싱가포르 소재)로부터 구입하였다. 동물을 특수한 무 병원체 조건 하에 수용하고 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC) 가이드라인에 부합하게 처리하였다.
하이브리도마 생성을 위해, 항원 펩타이드, 재조합 표적 단백질 또는 표적 단백질을 발현하는 세포의 시판 혼합물로 마우스를 면역화시켰다.
융합을 위한 비장을 수거하기 전에, 마우스를 3일 연속일 동안 항원 혼합물로 부스트(boost)하였다. 최종 부스트 후 24시간 째에, 총 비장세포를 단리하고, 흑색종 세포주 P3X63.Ag8.653(ATCC, USA)와, PEG로 ClonaCell-HY 하이브리도마 클로닝 키트를 사용하여 제조업자의 기재서(Stemcell Technologies, 캐나다)에 따라 융합시켰다.
융합된 세포를 ClonaCell-HY 배지 C(StemCell Technologies, 캐나다 소재) 속에서 37℃에서 5% CO2 인큐베이션기 속에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 융합된 세포를 원심분리하고, 10 ml의 ClonaCell-HY 배지 C 속에 재현탁시킨 다음, HAT 구성성분을 함유하는 반고체 메틸셀룰로즈-기반 ClonaCell-HY 배지 D(StemCell Technologies, 캐나다 소재) 90 ml와 온화하게 혼합하였으며, 이는 하이브리도마 선택과 클로닝을 한 단계로 합한다.
융합된 세포를 이후에 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이션기 속에서 성장하도록 한다. 7 내지 10일 후에, 단일 하이브리도마 클론을 단리하고, 항체 생성 하이브리도마를 효소-연결된 면역흡착성 분석(ELISA) 및 형광성-활성화된 세포 분류(FACs)로 상청액을 스크리닝함으로써 선택하였다.
1.2 항체 가변 영역 증폭 및 서열분석
총 RNA를 하이브리도마세포로부터 TRIzol 시약(Life Technologies, Inc., USA)을 사용하여 제조업자의 프로토콜을 사용하여 추출하였다. 이중-가닥 cDNA를 SMARTer RACE 5'/3' 키트(Clontech™, USA)를 사용하여 제조업자의 기재서에 따라 합성하였다. 요약하면, 1 μg의 총 RNA를 사용하여 완전한 길이의 cDNA를 5'-RACE CDS 프라이머(키트내에서 제공됨)를 사용하여 생성시키고, 5' 어댑터(SMARTer II A 프라이머)를 이후에 각각의 cDNA 내로 제조업자의 기재서에 따라 혼입시켰다. cDNA 합성 반응은 다음을 함유하였다: 5X 제1-가닥 완충액, DTT(20 mM), dNTP 혼합물(10 mM), RNase 억제제(40 U/μl) 및 SMARTScribe 역박향 전사효소(100 U/μl).
혈통별-준비된(race-ready) cDNA를 SeqAmp DNA 폴리머라제(Clontech™, USA)를 사용하여 증폭시켰다. 증폭 반응물은 SeqAmp DNA 폴리머라제, 2X Seq AMP 완충액, 어댑터 서열에 대해 상보성인, 5' SMARTer Race 키트내에 제공된 5' 일반적인(universal) 프라이머, 및 각각의 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 프라이머에 대해 어닐링(annealing)된 3' 프라이머를 함유하였다. 5' 불변 영역을 앞서 보고된 프라이머 혼합물을 기반으로 문헌[Krebber et al. J. Immunol. Methods 1997; 201: 35-55, Wang et al. Journal of Immunological Methods 2000, 233; 167-177 또는 Tiller et al. Journal of Immunological Methods 2009; 350:183-193]에 의해 설계하였다. 다음의 열 프로토콜을 사용하였다: 94℃에서 1분 동안의 예비-변성 주기; 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 45초 동안의 35회 주기; 및 72℃에서 3분 동안의 최종 연장.
대략 550 bp의 획득되는 VH 및 VL PCR 생성물을 pJET1.2/평활말단(blunt) 벡터 내로 CloneJET PCR 클로닝 키트(Cloning Kit)(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 클로닝하고, 매우 충분한(competent) E. 콜라이(E. coli) DH5α를 형질전환시키는데 사용하였다. 획득되는 형질전환체로부터, 플라스미드 DNA를 Miniprep 키트(Qiagene, 독일 소재)을 사용하여 제조하고, 서열분석하였다. DNA 서열분석은 AITbiotech가 수행하였다. 이러한 서열분석 데이타를 국제 IMGT(ImMunoGeneTics) 정보 시스템(문헌[LeFranc et al., Nucleic Res. (2015) 43(데이타베이스 쟁점): D413-22])을 사용하여 분석함으로써 개개 CDR 및 골격 서열을 특성화하였다. VH 및 VL의 5' 말단에서의 신호 펩타이드를 SignalP (v 4.1; 문헌[Nielsen, in Kihara, D (ed): Protein Function Prediction (Methods in Molecular Biology vol. 1611) 59-73, Springer 2017])으로 확인하였다.
이어서, 추가 개발 및 특성화를 위해 단일클론 항-VISTA 항체 클론을 선택하였다. 또한 항체의 CDR을 인간 항체 프레임워크 영역을 포함하는 VH 및 VL로 클로닝함으로써 표준 방법에 따라 항체 클론 4M2-C12 (또한 본 명세서에서 "V4"로 지칭됨)의 인간화 버전을 제조하였다.
Figure pct00052
실시예 2: 항체 생성 및 정제
2.1 VH 및 VL의 발현 벡터 내로의 클로닝:
항-VISTA 항체 클론의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 인간-마우스 키메라 항체의 작제를 위해 pmAbDZ_IgG1_CH 및 pmAbDZ_IgG1_CL (InvivoGen, USA) 진핵생물 발현 벡터로 서브클로닝 (subcloning)하였다.
대안적으로, 항-VISTA 항체 클론의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 인간-마우스 키메라 항체의 작제를 위한 pFUSE-CHIg-hG1 및 pFUSE2ss-CLIg-hk(InvivoGen, USA) 진핵세포 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. pFUSE-CHIg-hG1에 의해 인코딩되는 인간 IgG1 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역(IGHG1; UniProt:P01857-1, v1; 서열번호 210)에 대해 CH3 영역내 치환 D356E, L358M(EU 번호매김에 따라 번호매김된 위치)를 포함한다. pFUSE2ss-CLIg-hk는 인간 IgG1 경쇄 카파 불변 영역(IGCK; UniProt: P01834-1, v2)을 인코딩한다.
신호 펩타이드를 따르는 가변 영역을 클로닝 벡터로부터 SeqAmp 효소(Clontech™, USA)를 사용하여 제조업자 프로토콜에 따라 증폭시켰다. VH 또는 VL내 적절한 영역과 15 내지 20bp 오버랩 및 제한 부위로서 5' 말단에서 6 bp를 갖는 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머를 사용하였다. DNA 삽입체 및 pFuse 벡터를 제조업자가 추천한 제한 효소로 분해하여 골격이 도입되지 않도록 보증하고(예컨대, VH의 경우 EcoRI 및 NheI, VL의 경우 AgeI 및 BsiWI) 이의 각각의 플라스미드내로 T4 리가제 효소(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 연결시켰다. 3:1의 몰 비의 DNA 삽입체 대 벡터를 연결에 사용하였다.
2.2 포유류 세포내에서 항체의 발현
항체를 1) Expi293 일시적인 발현 시스템 키트(Transient Expression System Kit)(Life Technologies, USA), 또는 2) HEK293-6E 일시적인 발현 시스템(CNRC-NRC, Canada)을 사용하여 제조업자의 기재서에 따라 발현시켰다.
1) Expi293 일시적인 발현 시스템:
세포주 유지:
HEK293F 세포(Expi293F)를 Life Technologies, Inc(USA)로부터 획득하였다. 세포를 50 IU/ml 페니실린 및 50 μg/ml 스트렙토마이신(Gibco, USA)이 보충된 혈청-유리된, 단백질-유리된, 화학적으로 정의된 배지(Expi293 발현 배지, Thermo Fisher, USA) 속에서 37℃에서 8% CO2 및 80% 습윤화된, 진탕 플랫폼이 장착된 인큐베이션기 속에서 배양하였다.
형질감염:
Expi293F 세포를 발현 플라스미드로 ExpiFectamine 293 시약 키트(Reagent kit)(Gibco, USA)를 사용하여 이의 제조업자의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 요약하면, 유지시 세포를 배지 교환에 적용시켜 배양물을 회전시켜 항생제를 제거하고, 세포 펠렛을 형질감염 1일 전에 항생제의 부재하에서 새로운 배지 속에 재-현탁시켰다. 형질감염일에, 2.5 x 106/ml의 생존가능한 세포를 각각의 형질감염을 위해 진탕기 플라스크내에 시딩(seeding)하였다. DNA-ExpiFectamine 복합체를 혈청-감소된 배지인, Opti-MEM(Gibco, USA) 속에서, 25분 동안 실온에서 형성시킨 후 세포에 가하였다. 인핸서를 형질감염된 세포에 형질감염 후 16 내지 18 시간째에 가하였다. 동량의 배지를 형질감염 4일 후에 형질감염체에 채워 세포 응집을 방지하였다. 형질감염체를 7일째에 4000 x g에서 15분 동안 원심분리함으로써 수거하고, 0.22 μm 멸균 여과기 유닛(unit)을 통해 여과하였다.
2) HEK293-6E 일시적인 발현 시스템
세포주 유지:
HEK293-6E 세포를 National Research Council Canada로부터 구입하였다. 세포를 0.1% 콜리포(Kolliphor)-P188 및 4 mM L-글루타민(Gibco, USA) 및 25 μg/ml G-418가 보충된 혈청-유리된, 단백질-유리된, 화학적으로 정의된 Freestyle F17 배지(Invitrogen, USA) 속에서 37℃에서 5% CO2 및 80% 습윤화된, 진탕 플랫폼이 장착된 인큐베이션기 속에서 배양하였다.
형질감염:
HEK293-6E 세포를 발현 플라스미드로 PEIproTM(Polyplus, USA)을 사용하여 이의 제조업자의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 요약하면, 유지시 세포를 배지 교환에 적용시켜 원심분리로 항생제를 제거하고, 세포 펠렛을 항생제가 들어 있지 않은 신선한 배지로 형질감염 1일 전에 재-현탁시켰다. 형질감염 당일에, 1.5 내지 2 x 106개의 세포/ml의 생존가능한 세포를 각각의 형질감염을 위한 진탕기 플라스크 속에 시딩하였다. DNA 및 PEIproTM을 1:1의 비로 혼합하고, 복합체가 세포에 가하기 전 실온에서 5분 동안 F17 배지 속에서 형성하도록하였다. 0.5% (w/v)의 트립톤 N1을 형질전환체에 형질감염 후 24 내지 48시간 째에 가하였다. 형질전환체를 4000 x g에서 15분 동안 원심분리에 의해 6-7일째에 수거하고, 상청액을 0.22 μm 멸균 여과기 유닛을 통해 여과하였다.
세포를 다음의 폴리펩타이드의 조합을 인코딩하는 벡터로 형질감염시켰다:
Figure pct00053
2.3 항체 정제
친화성 정제, 완충액 교환 및 저장:
형질감염된 세포에 의해 배양 상청액내로 분비된 항체를 액체 크로마토그래피 시스템 AKTA Start(GE Healthcare, 영국 소재)을 사용하여 정제하였다. 구체적으로, 상청액을 HiTrap 단백질 G 컬럼(GE Healthcare, 영국 소재) 상에 5 ml/min의 결합 속도에서 로딩(loading)한 다음, 컬럼을 10개 컬럼 용적의 세척 완충액(20 mM 인산나트륨, pH 7.0)로 세척하였다. 결합된 mAb를 용출 완충액(0.1 M 글리신, pH 2.7)으로 용출시키고 용출제를 적절한 양의 중화 완충액(1 M 트리스, pH 9)를 함유하는 수집 튜브내로 분획화하였다. 정제된 mAb를 함유하는 중화된 용출 완충액를 PBS 내로 30K MWCO 단백질 농축제(Thermo Fisher, USA 소재) 또는 3.5K MWCO 투석 카세트(Thermo Fisher, USA)를 사용하여 교환하였다. 단일클론 항체를 0.22 μm 여과기를 통과시켜 멸균시키고, 등분(aliquoting)하고, -80℃에서 저장을 위해 순간 동결(snap-freezing)시켰다.
2.4 항체-순도 분석
크기 배제 크로마토그래피(SEC):
항체 순도를 PBS 구동 완충액 중에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 슈퍼덱스(Superdex) 200 10/30 GL 컬럼(GE Healthcare, 영국 소재)을 사용하여 AKTA Explorer 액체 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare, 영국 소재)을 사용하여 수행하였다. 500μl PBS pH 7.2 중 150μg의 항체를 실온에서 0.75ml/min의 유속으로 컬럼에 주입하였다. 단백질을 분자량에 따라 용출시켰다.
항-VISTA 항체 클론 V4 (실시예 2.2의 [1])에 대한 결과를 도 10에 나타낸다.
나트륨-도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE):
항체 순도를 SDS-PAGE에 의해 환원 및 비-환원 조건 하에서 표준 방법에 따라 분석하였다. 요약하면, 4% 내지 20% TGX 단백질 겔(Bio-Rad, USA)을 사용하여 단백질을 Mini-Protean 전기영동 시스템(Bio-Rad, USA)을 사용하여 용해하였다. 비-환원 조건을 위해, 단백질 샘플을 2x 램믈리(Laemmli) 샘플 완충액(Bio-Rad, USA)와 혼합함으로써 변성시키고 95℃에서 5 내지 10분 동안 비등시킨 후 겔에 로딩시켰다. 환원 조건을 위해, 5%의 β-머캅토에탄올(βME), 또는 40 mM DTT(디티오트레이톨)을 함유하는 2x 샘플 완충액를 사용하였다. 전기영동을 150V의 고정 전압에서 1시간 동안 SDS 작동 완충액(25 mM 트리스, 192 mM 글리신, 1% SDS, pH 8.3) 속에서 수행하였다.
웨스턴블롯:
단백질 샘플 (30 μg)을 전술한 바와 같이 SDS-PAGE로 분획하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 그런 다음 막을 차단하고, 4℃에서 밤새 항체로 면역블롯팅하였다. PBS-Tween에서 3회 세척한 후 막을 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-접합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 화학발광 Pierce ECL 기질 웨스턴블롯 검출 시스템 (Thermo Scientific, USA) 및 오토래디오그래피 필름 (autoradiography film) (Kodak XAR 필름)에 대한 노출을 통해 결과를 시각화하였다.
검출에 사용된 1차 항체는 염소 항-마우스 IgG (H+L) 항체 (LI-COR, Cat. No. 926-32210)였다.
항-VISTA 항체 클론 V4 (실시예 2.2의 [1])에 대한 결과를 도 11에 나타낸다. V4는 고농도에서 쉽게 발현, 정제 및 처리되었다.
실시예 3: 생물물리적 특성화
3.1 유세포 분석에 의한 세포 표면 항원 결합 분석
야생형 HEK293T 세포 (높은 수준의 VISTA를 발현하지 않음) 및 인간 VISTA를 인코딩하는 벡터로 형질감염된 HEK293T 세포 (즉, HEK 293 HER O/E 세포)의 세포를 4℃에서 1시간 동안 20 μg/ml의 항-VISTA 항체 또는 이소형 대조군 항체와 함께 인큐베이션하였다. WO 2015/097536에 기재된 항-VISTA 항체 클론 VSTB112를 양성 대조군으로 분석에 포함시켰다.
세포를 FACS 완충액(5mM EDTA 및 0.5% BSA가 들어 있는 PBS)로 3회 세척하고, FITC-접합된 항-FC 항체(Invitrogen, USA 소재) 속에서 40분 동안 2 내지 8℃에서 재현탁시켰다. 세포를 다시 세척하고, 유동 세포 분석을 위해 MACSQuant 10(Miltenyi Biotec, 독일 소재)을 사용하여 200 μL의 FACS 유동 완충액(5mM EDTA가 들어 있는 PBS) 속에 재현탁시켰다. 획득 후, 모든 미가공 데이타(raw data)를 Flowlogic 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 세포를 전방 및 양상 스캐터 프로파일(side scatter profile)을 사용하여 게이팅(gating)시키고 형광성 강도의 메디안(Median of Fluorescence Intensity: MFI) 값을 천연 및 과발현 세포 집합에 대해 측정하였다.
결과는 도 1a 내지 도 1d, 도 2 및 도 24에 제시되어 있다. 항-VISTA 항체는 높은 특이성으로 인간 VISTA에 결합하는 것으로 나타났다.
별도의 실험에서 13D5p (실시예 2.2의 [14])를 시노몰구스 마카퀴 VISTA 또는 쥣과동물 VISTA를 인코딩하는 벡터로 형질감염된 세포에 결합하는 능력에 대해 분석하였다. 13D5p는 시노몰구스 마카퀴 VISTA 및 쥣과동물 VISTA와 교차 반응을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
3.2 Octet QK384 시스템을 사용한 전반적인 친화도 연구
생물층 간섭계 (BLI) 실험을 Octet QK384 시스템 (ForteBio)을 사용하여 수행하였다. 항-Penta-HIS (HIS1K) 코팅된 바이오센서 팁 (Pall ForteBio, USA)을 사용하여 His 태그가 붙은 인간, 시노몰구스 마카퀴 또는 쥣과동물 VISTA (270 nM)를 포획하였다. 모든 측정을 1000 rpm에서 교반하면서 25℃에서 수행하였다. 항-VISTA 항체를 120초 동안 다른 농도 (도면에 제시됨)로 로딩하여 항원 결합에 대한 동적 측정을 수행한 다음, 바이오센서를 웰을 포함하는 분석 완충액으로 옮겨 120초 해리 시간을 가하였다. 완충액 효과에 대해 센소그램을 참조한 다음, Octet QK384 사용자 소프트웨어 (Pall ForteBio, USA)를 사용하여 근사 (fitting)시켰다. 결합 (kon), 해리 (koff) 속도 상수 및 평형 해리 상수 (KD)에 대한 값을 획득하기 위해 하나의 부위 결합 모델을 사용하여 동적 반응을 전반적인 근사에 적용하였다. 소프트웨어 (R2>0.90)에 의해 안정적으로 근사될 수 있는 곡선만을 분석에 포함시켰다.
항-VISTA 항체 클론 V4 (즉, 실시예 2.2의 [1])에 의한 결합 분석을 위한 대표적인 센소그램이 도 3a 내지 도 3c에 제시되어 있다.
항-VISTA 항체 클론 V4는 KD = <1 pM의 친화도로 인간 및 시노몰구스 마카퀴 VISTA에 결합하고, KD = 113 nM의 친화도로 쥣과동물 VISTA에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
3.3 항체 특이성을 측정하기 위한 ELISA
ELISA를 사용하여 항체의 결합 특이성을 측정하였다. 항-VISTA 항체를 인간 VISTA 폴리펩타이드, 각각의 마우스 및 시노몰구스 마카퀴 상동체뿐만 아니라, 인간 PD-L1 및 인간 HER3 (Sino Biological Inc., China)에 대한 결합에 대해 분석하였다.
ELISA를 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 요약하면, 96-웰 플레이트 (Nunc, 덴마크)를 인산염-완충된 염수(PBS) 속에서 1 μg/ml의 표적 단백질로 2시간 동안 37℃에서 코팅하였다. 1시간 동안 트리스 완충액 염수(TBS) 중 10% BSA로 실온에서 차단시킨 후, 시험 항체를 최고 농도를 10 μg/ml로 하여, 일련 희석 (12포인트 일련 희석)시키고, 이를 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 0.05% 트윈 20(TBS-T)을 함유하는 TBS로 3회 세척한 다음, HRP-접합된 항-마우스 IgG 항체 (Life Technologies, Inc., USA)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 비색 검출 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(Turbo-TMB; Pierce, USA)을 사용하여 전개시켰다. 반응을 2M H2SO4로 정지시키고 OD를 450 nM에서 30분 동안 측정하였다.
항-VISTA 항체 클론 V4 (실시예 2.2의 [1])로 획득된 결과를 도 4a에 나타냈다. 클론 V4는 인간, 시노몰구스 마카퀴 및 쥣과동물 VISTA에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌지만, 인간 PD-L1 또는 인간 HER3 (매우 높은 농도에서도)과 교차 반응을 나타내지 않았다.
항-VISTA 항체 클론 13D5-1 (실시예 2.2의 [15])으로 획득된 결과를 도 20에 나타냈다. 클론 13D5-1은 인간, 시노몰구스 마카퀴 및 마우스 VISTA에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항-VISTA 항체 클론 13D5-13 (실시예 2.2의 [16])으로 획득된 결과를 도 21에 나타내었다. 클론 13D5-13은 인간 및 마우스 VISTA에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
추가 실험에서, 항-VISTA 항체 클론 V4 (실시예 2.2의 [1])를 인간 VISTA, PD-1, PD-L1, B7H3, B7H4, B7H6, B7H7 및 CTLA4에 결합하는 능력에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 결과는 도 4c에 제시된다. 클론 V4는 PD-1, PD-L1, B7H3, B7H4, B7H6, B7H7 또는 CTLA4와 교차 반응하지 않는 것으로 밝혀졌다.
3.4 시차 주사 형광 측정에 의한 열 안정성 분석
간략히 말하면, 0.2 mg/mL의 항체와 SYPRO Orange 염료 (ThermoFisher)의 3중 반복 실험 반응 혼합물을 25μL의 PBS에서 제조하고, MicroAmp Optical 96-웰 반응 플레이트 (ThermoFisher)의 웰로 옮기고, MicroAmp Optical 접착 필름 (ThermoFisher)으로 밀봉하였다. TAMRA를 리포터로 선택하고, ROX를 수동 참조로 선택하여 7500 고속 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)에서 용해 곡선을 작성하였다. 열 프로파일에는 25℃에서 2분의 초기 단계와 99℃에서 2분의 최종 단계가 포함되었으며, 램프 속도는 1.2%였다. 미가공 데이터의 제1 유도체를 온도 함수로 그래프화하여, 변화율 용해 곡선을 획득하였다. 항체의 용해 온도 (Tm)를 유도체 곡선의 피크로부터 추출하였다.
항체 클론 V4 IgG1 형식 (즉, 실시예 2.2의 [1])의 열 안정성에 대한 시차 주사 형광 측정 분석을 위해 획득된 미가공 데이터의 제1 유도체를 도 9에 나타낸다. Tm은 67.5℃인 것으로 측정되었다.
실시예 4: 기능 특성화
4.1 VISTA와 VSIG-3 간의 상호작용
본 발명자들은 Octet QK384 시스템 (ForteBio)을 사용한 생물층 간섭계 (BLI) 분석에 의해 VSIG-3이 VISTA에 대한 리간드로 작용하는지를 조사하였다. 간단히 말해서, 항-인간 Fc 포획 바이오센서를 사용하여 100 nM 농도에서 Fc 태그가 붙은 VSIG-3을 포획하고, 3000 nM에서 시작하여 3회의 일련의 희석을 거친 농도에서 적용된 VISTA와 포획된 VSIG-3의 결합을 측정하여, PBS 대조군과 비교하였다.
대표적인 센소그램이 도 5에 제시되어 있다. VSIG-3과 VISTA 사이의 결합 친화도는 약 KD = 5.28 μM인 것으로 계산되었다.
다음으로 본 발명자들은 VISTA와 VSIG-3 사이의 상호작용을 억제하는 항-VISTA 항체의 능력을 분석하였다.
간단히 말해서, 96-웰 플레이트 (Nunc, Denmark)를 4℃에서 16시간 동안 1x PBS에서 태그가 붙지 않았거나 Fc-태그가 붙은 VSIG-3 (R&D Systems, USA) 1μg/ml로 코팅하였다. 실온에서 TBS에서 1% BSA로 1시간 동안 차단한 후, 증가하는 농도의 항-VISTA 항체의 존재 또는 부재하에 15μg/ml의 VISTA/인간 His-태그가 붙은 융합 단백질 (Sinobiological Inc, China)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 TBS-T로 3회 세척하고, HRP-접합된 항-his 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 비색 검출 기질 Turbo-TMB (Pierce, USA)로 플레이트를 전개시켰다. 2M H2SO4로 반응을 정지시키고, 450 nM에서 OD를 측정하였다.
항-VISTA 항체 클론 5M1-A11 및 9M2-C12 (실시예 2.2의 [10] 및 [13])에 대해 획득된 결과를 도 6에 나타낸다. 항-VISTA 항체는 VISTA 및 VSIG-3 간의 상호작용의 투여량 의존적 억제를 나타내었다.
추가 실험에서, VISTA와 VSIG-3 사이의 상호작용의 4M2-C12 IgG1 (실시예 2.2의 [1])에 의한 억제를 분석하였다. 비관련 표적 항원에 특이적인 항체와 인간 IgG1 이소형 대조군에 의한 VISTA:VSIG-3 상호작용의 억제를 또한 대조군 조건으로 분석하였다. 결과는 도 32에 제시되어 있다. 4M2-C12 IgG1은 투여량 의존적 방식으로 VISTA:VSIG-3 상호작용을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
추가 실험에서, 4M2-C12 IgG1 (실시예 2.2의 [1])에 의한 VISTA와 VSIG-3 사이의 상호작용 억제를 VISTA-Fc를 포획 제제로 사용하는 분석에서 분석하였다. 간단히 말해서, 384-웰 플레이트의 웰을 실온에서 1시간 동안 0.5μg/ml의 VISTA-Fc 30μl로 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하고, 실온에서 TBS 중 1% BSA로 1시간 동안 차단하였다. 4M2-C12 IgG1 또는 인간 IgG1 이소형 대조군 항체의 일련의 희석액을 0.3μg/ml의 VISG3-His와 함께 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 인큐베이션한 후 플레이트를 PBS-T로 5회 세척하고, 염소 항-HIS-HRP와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 5회 세척하고, Turbo-TMB로 전개시켰다. 2M H2SO4로 반응을 정지시키고, 450 nM에서 OD를 측정하였다.
결과가 도 54에 제시되어 있다. 4M2-C12 IgG1은 투여량 의존적 방식으로 VISTA:VSIG-3 상호작용을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
4.2 VISTA와 PSGL-1 간의 상호작용
본 발명자들은 다음으로 PSGL-1이 유세포 분석 기반 분석에서 VISTA에 대한 리간드로 작용하는지를 조사하였다.
간략히 말하면, 인간 VISTA 단백질을 과발현하도록 변형된 100,000개의 HEK293T 세포 (인간 VISTA를 인코딩하는 작제물로의 형질감염에 의함)를 HBSS, 0.5% BSA 및 2mM EDTA pH 6.0을 포함하는 완충액에서 4℃에서 15분 동안 20μg/ml, 40μg/ml 또는 80μg/ml의 농도의 이소형 매칭 대조군 항체 또는 4M2-C12-hIgG1 (실시예 2.2의 [1])과 함께 공동 인큐베이션하였다. 15 μg/ml의 Fc-태그가 붙은 인간 PSGL1 (R&D Systems, Cat No: 3345-PS) 또는 동일한 양의 Fc-태그가 붙은 비관련 항원을 세포에 첨가한 다음, 4℃에서 추가 45분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 완충액으로 3회 세척한 다음, FITC-접합된 항-PSGL1 항체 (Miltenyi Biotec Cat No: 130-104-706)를 (1:11)의 희석 배수로 첨가하거나, Alex488-접합된 항-Fc 항체를 1:200의 희석 배수로 첨가하고, 세포를 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 완충액으로 3회 세척하고, 유세포 분석으로 분석하였다.
결과가 도 55에 제시되어 있다. 4M2-C12-hIgG1은 투여량 의존적 방식으로 PSGL-1의 VISTA에 대한 결합을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
4.3 VISTA 매개 신호전달의 억제
본 발명자들은 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석을 사용한 분석에 의해 항-VISTA 항체 클론 13D5p가 VISTA 매개 신호전달을 억제할 수 있는지를 조사하였다.
간략히 말하면, 제조업체의 지침에 따라 Septamate 키트 (Stemcell Technologies, 캐나다)를 사용하여 비관련 공여체로부터 PBMC를 단리하였다 (자극인자 및 효과기 집합을 획득하기 위함). 자극인자 세포를 50 μg/mL의 미토마이신 C (Sigma Aldrich, USA)로 20분 동안 37℃에서 처리하고, 1x PBS로 5회 세척한 후 사용하였다. 자극인자 집합을 최고 농도 20μg/ml에서 시작하여 증가하는 농도의 시험 항체의 존재 또는 부재하에 0.5 x 105 세포/웰 및 반응인자 집합을 1.0 x 105 세포/웰로 시딩하였다. 5일 후, 상청액을 수확하고, IL-17, IL-2A 및 IFN-γ의 수준을 표준 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 측정하였다.
결과는 도 7a 및 도 7b에 제시되어 있다. 항-VISTA 항체 13D5p는 IL-17, IL-2 및 IFN-γ의 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 도 8a 및 도 8b는 항-PD-L1 항체 클론 MIH5 (ThermoFisher Scientific)를 사용한 동일한 분석에서 획득된 결과를 보여준다.
실시예 5: 생체내 분석
생체내 연구를 위해, 4M2-C12를 마우스 IgG2a 형식으로 생성하였다. 분자는 서열번호 248에 제시된 서열을 갖는 중쇄 폴리펩타이드와 서열번호 250에 제시된 서열을 갖는 경쇄 폴리펩타이드의 헤테로머이다. 4M2-C12 mIgG2a를 CHO 세포에서 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 동시 발현에 의해 생성하였으며, 이후 정제하였다.
Figure pct00054
5.1 약동학적 분석
대략 6 내지 8주령의 C57BL/6 마우스를 특수한 무 병원체 조건하에 수용하고, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침에 따라 처리하였다.
600μg의 항-VISTA 항체를 투여하고, 기준선 (-2시간), 투여한지 0.5시간, 6시간, 24시간, 96시간, 168시간 및 336시간 후에 심장 천공에 의해 3마리 마우스로부터 혈액을 채혈하였다. 혈청 내 항체를 ELISA로 정량화하였다.
약동학적 분석을 위한 매개변수는 비 구획 모델에서 파생되었다:
최대 농도 (C max), AUC (0-336hr), AUC (0-무한대), 반감기 (t½), 제거율 (CL), 정상 상태에서의 분포 부피 (Vss).
항-VISTA 항체 클론 V4 (실시예 5의 [17])에 대해 획득된 결과를 도 12에 나타냈다. 이 항체 클론은 11.7일의 반감기를 갖는 것으로 밝혀졌다.
5.2 생체내 암 치료 효능 분석
대략 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 또는 C57BL/6 마우스를 InVivos (Singapore)에서 구입하였다. 동물을 특수한 무 병원체 조건하에 수용하고, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침에 따라 처리하였다.
연구에 사용된 세포주는 LL2 세포 (루이스 폐암종), 4T1 세포 (유방암), CT26 세포 (결장 암종), 클론-M3 세포 (흑색종) 및 EL4 세포 (T 세포 백혈병/림프종)를 포함하였으며, 이는 ATCC로부터 획득하였다. B16-BL6 세포 (흑색종)를 Creative Bioarray로부터 획득하였다. 세포주는 공급업체의 지침에 따라 유지하였고; LL2 세포, B16-BL6 세포 및 EL4 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% Pen/Strep이 보충된 DMEM에서 배양하였으며, 4T1 세포 및 CT26 세포를 10% FBS 및 1% Pen/Strep이 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다. 클론-M3 세포를 2.5% FBS, 15% 말 혈청 및 1% Pen/Strep이 보충된 F12-K 배지에서 성장시켰다. 모든 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다.
마우스의 오른쪽 옆구리에 LL2 (2x105), 4T1 (5x105), CT26 (1x105-1x106), 클론-M3 (5x105), EL4 (2x105) 또는 B16-BL6 (1x105) 세포를 피하 주사하여 동계 종양 모델을 생성하였다.
이식 3일 후 항-VISTA 항체를 총 6회 투여량으로 3일마다 복강내 투여하였다. 대조군에는 동일한 투여 간격으로 비히클 처리를 제공하였다.
종양 부피를 디지털 캘리퍼를 사용하여 주 3회 측정하고, 공식 [L x W2/2]를 사용하여 계산하였다. 대조군 아암의 종양의 길이가 1.5 cm를 초과하는 것으로 측정되면 연구 종점에 도달한 것으로 간주하였다.
5.2.1 CT26 세포 모델
도 13은 CT26 세포주 유래 동계 마우스 결장 암종 모델에서 항-VISTA 항체 클론 V4 (실시예 5의 [17])의 항암 효과를 항-PD-L1 항체 클론 10F.9G2의 항암 효과와 비교한 실험에서 획득된 결과를 보여준다. 상기 모델을 Balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 100,000개의 CT26 세포를 피하 주사함으로써 확립하였다 (n = 8 마우스/처리 그룹).
V4 또는 항-PD-L1 항체를 3일째부터 3일마다 투여량당 300μg으로 투여하였다. 투여량당 300μg V4+ 300μg의 항-PD-L1 항체의 조합 처리를 또한 분석에 포함시켰다.
항-VISTA 항체 클론 V4는 이 모델에서 매우 강력하고, 종양 성장을 약 60%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
21일째에 종양을 수확하고, 문헌[Newman et al. Nat Methods. (2015) 12(5):453-457]에 기재된 방법에 따라 RNA-seq 분석에 의해 Arg1 RNA 발현에 대해 평가하였다. 결과는 도 39에 제시되어 있다. 4M2-C12 처리는 21일째에 종양에서 Arg1 발현의 현저한 감소와 관련되었다.
다른 실험에서, Balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 100,000개의 CT26 세포를 피하 주사하여 CT26 세포주 유래 동계 마우스 결장 암종 모델을 확립하고 (n = 8 마우스/처리 그룹) 마우스를 3일째로부터 3일마다 투여량당 300 μg의 이소형 대조군 항체, 항-PD-L1 항체 클론 10F.9G2, 항-VISTA 항체 클론 V4 (실시예 5의 [17]), 항-TIGIT 항체 클론 1G9, 항-LAG-3 항체 클론 C9B7W, 항-TIM-3 항체 클론 RMT3-23 또는 투여량당 300 μg 항-PD-L1 항체 클론 10F.9G2와 300 μg의 각각의 다른 항체의 조합 처리의 투여에 의해 처리하고, 이를 또한 분석에 포함시켰다.
15일째에 검출된 계산된 종양 성장 억제 결과는 도 14에 제시되어 있다. 이 실험에서 항-VISTA 항체 클론 V4는 면역 체크포인트에 대해 유도된 임의의 다른 단일요법보다 종양 성장의 더 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌으며, 항 PD-L1 요법과 조합하여 더 잘 수행되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명자들은 CT26 종양을 동일한 방식으로 확립한 다음, 마우스에 300 μg 항-VISTA 항체 클론 V4, 200 μg 항-PD-L1 항체 클론 10F.9G2, 300 μg 항-VISTA 항체 클론 V4 + 200 μg 항-PD-L1 항체 클론 10F.9G2 또는 대조군 조건으로서의 PBS를 격주로 처리한 추가의 실험을 수행하였다. 실험 종료시 문헌[Newman et al. Nat Methods. (2015) 12(5):453-457]에 기재된 방법에 따라 종양을 RNA-Seq로 분석하여 MDSC, CD8+ T 세포 및 Treg의 상대적인 수를 측정하였으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
결과는 도 15에 제시되어 있다. 항-VISTA 항체 클론 V4 (단독으로 또는 항-PD-L1 처리와 조합한) 처리는 MDSC의 수를 감소시키고, CD8 T 세포:Treg 비율을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 항-VISTA 항체 처리와 관련된 종양 미세환경에서 유전자 발현의 변화를 분석한 결과 식세포작용 과정 (예를 들어, 액틴 필라멘트 기반 운동)과 관련된 유전자 발현의 상향 조절 및 아르기나제 1 발현의 하향 조절 (결과적으로 면역억제 환경 감소)이 밝혀졌다.
추가 실험에서, CT26 세포주 유래 동계 마우스 결장 암종 모델을 상기 기재된 바와 같이 Balb/C 마우스에서 확립하였고, 마우스를 3일째부터 3일마다 (i) 600 μg 항-VISTA 항체 클론 13D5-1, (ii) 200 μg 항-PD-L1 항체 클론 10F.9G2, (iii) 600 μg 항-VISTA 항체 클론 13D5-1+200 μg 항-PD-L1 항체 클론 10F.9G2 또는 (iv) 동일한 부피의 PBS (음성 대조군)를 투여하였다.
결과는 도 22에 제시되어 있다. 항-VISTA 항체 클론 13D5-1 (단독 또는 항-PD-L1 처리와 조합)은 이 모델에서 종양 성장을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
5.2.2 LL2 세포 모델
200,000개의 LL2 세포를 Balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하여 LL2 모델을 확립하고 (n = 8 마우스/처리 그룹), 이 후, 마우스에 600μg 항-VISTA 항체 클론 V4 (실시예 5의 [17]) 또는 음성 대조군으로 동일한 부피의 비히클을 격주로 투여하였다.
실험의 결과는 도 16에 제시되어 있다. 항-VISTA 항체 클론 V4는 이 모델에서 매우 강력하고 - 종양 성장을 약 44%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
5.2.3 B16-BL6 세포 모델
200,000개의 B16-BL6 세포를 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사함으로써 B16-BL6 모델을 확립하였고 (n = 8 마우스/처리 그룹), 마우스에 이후 600 μg 항-VISTA 항체 클론 V4 (실시예 5의 [17]), 200 μg의 항-PD-1 항체 RMP1-14 (Bio X 세포), 600 μg 항-VISTA 항체 클론 V4+ 200 μg 항-PD-1 항체 또는 음성 대조군으로서 동일한 부피의 비히클을 격주로 투여하였다 (총 6회 투여량).
실험 결과가 도 17에 제시되어 있다. 항-VISTA 항체 클론 V4는 이 모델에서 항-PD-1 항체 처리와 조합하여 매우 강력한 것으로 밝혀졌다.
5.2.4 4T1 세포 모델
Balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 250,000개의 4T1 세포를 피하 주사함으로써 4T1 세포주 유래 동계 마우스 유선 암종 모델을 확립하였다.
이후에 마우스에 3일째부터 3일마다 (총 6회 투여량) 300 또는 600 μg의 항-VISTA 항체 클론 13D5-1, 이소형 대조군 항체 또는 음성 대조군으로 동일한 부피의 비히클을 투여하였다.
실험의 결과가 도 23에 제시되어 있다. 항-VISTA 항체 클론 13D5-1은 이 모델에서 매우 강력하였으며 - 종양 성장을 약 70%까지 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
5.3 안전성 약리학, 독성학 및 면역독성
항-VISTA 항체 클론 V4 및 인간화 버전 V4H1 및 V4H2를 IMGT DomainGapAlign (문헌[Ehrenmann et al., Nucleic Acids Res., 38, D301-307 (2010)]) 및 IEDB 탈면역화 (문헌[Dhanda et al., Immunology. (2018) 153 (1): 118-132]) 툴을 사용하여 안전성 및 면역원성에 대해 인실리코 분석하였다.
항-VISTA 항체 클론 V4H1 및 V4H2는 인간 중쇄 및 경쇄에 대해 충분한 상동성을 가져서, 인간화된 것으로 고려하였고 (즉 85% 초과), 잠재적 면역원성 펩타이드의 수가 충분히 적어 안전한 것으로 고려되었으며, 잠재적인 발생 가능성 문제를 일으킬 수 있는 임의의 다른 특성을 보유하지 않았다.
본 발명자들은 또한 실시예 5.2에 기재된 실험 과정 동안 마우스의 중량을 측정하고, 육안 괴사 검사의 징후에 대해 분석하였으며; 항-VISTA 항체 클론 V4로 처리된 마우스는 PBS 처리된 대조군 마우스와 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 도 44는 실시예 5.2.1에 기재된 연구 과정에서 획득된 결과를 보여준다.
본 발명자들은 마우스에 900μg의 항-VISTA 항체 클론 V4 또는 동일한 부피의 PBS를 단일 투여량으로 주사한 실험에서 혈독성을 추가로 조사하였다.
혈액 샘플을 채혈하고, HM5 혈액 분석기를 사용하여 상이한 유형의 백혈구의 수에 대해 분석하였다. 결과는 도 18에 제시하였고; 상이한 세포 유형의 수가 Charles River 기준 범위 내에 있었고, V4 및 PBS 처리 그룹간에 차이가 없었으며, 상이한 그룹 간에 임상 징후, 육안 괴사 검사 또는 중량의 차이가 없었다.
마우스를 또한 상관관계의 간독성 및 신독성에 대해 분석하였고, 결과는 도 19에 제시되어 있다. 검출된 수준은 Charles River 기준 범위 내에 있었고, V4 및 PBS-처리된 그룹 간에 차이가 없었다.
5.4 진행성 고형 종양의 치료
제1 인체 실험
표준 요법에 의한 치료 후 질병 진행 또는 치료 불내성이 있고, 적절한 기관 기능 및 ECOG 상태의 진행성 또는 전이성 고형 종양 환자를 안전 조정 '최소 예상 생물학적 효과 수준'(MABEL) 접근법에 따라 계산된 투여량의 항-VISTA 항체 V4 (실시예 2.2의 [1]), V4H1 (실시예 2.2의 [3]) 또는 V4H2 (실시예 2.2의 [4])의 정맥내 주사에 의해 처리한다. 환자를 투여 후 28일 동안 모니터링한다.
그런 다음, 환자를 이상사례 공통용어기준 (Common Terminology Criteria for Adverse Events) (CTCAE)에 따라 평가하여, 치료의 안전성 및 내성을 측정하고, 분자의 약동학을 측정한다.
항-VISTA 항체에 의한 치료는 안전하고, 내성인 것으로 밝혀졌다.
투여량 증가-단일요법
표준 요법에 의한 치료 후 질병 진행 또는 치료 불내성이 있고, 적절한 기관 기능 및 ECOG 상태의 진행성 또는 전이성 고형 종양 환자 (n = 18 내지 24)를 과투여량 제어 (EWOC) 투여량 증가를 통한 3+3 모델 기반 증가에 따라 항-VISTA 항체 V4 (실시예 2.2의 [1]), V4H1 (실시예 2.2의 [3]) 또는 V4H2 (실시예 2.2의 [4])의 정맥내 주사에 의해 처리한다.
그런 다음 환자를 이상사례 공통용어기준 (CTCAE)에 따라 평가하여, 치료의 안전성 및 내성을 측정하고, 분자의 약동학 및 치료 효능을 평가한다. 최대 내성 투여량 (MTD) 및 최대 투여 투여량 (MAD)을 또한 측정한다.
투여량 증가-조합 요법
표준 요법에 의한 치료 후 질병 진행 또는 치료 불내성이 있고, 적절한 기관 기능 및 ECOG 상태의 진행성 또는 전이성 고형 종양 환자 (n = 9)를 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체 (3 mg/kg)에 의한 3+3 모델 기반 증가에 따라 항-VISTA 항체 V4 (실시예 2.2의 [1]), V4H1 (실시예 2.2의 [3]) 또는 V4H2 (실시예 2.2의 [4])로 처리한다.
그런 다음 환자를 이상사례 공통용어기준 (CTCAE)에 따라 평가하여, 치료의 안전성 및 내성을 측정하고, 분자의 약동학 및 치료 효능을 평가한다.
투여량 확장
치료된 환자를 전체 반응률, 종양 마커의 발현, 순환 종양 세포, 무 진행 생존, 전체 생존, 안전성 및 내성에 대해 분석한다.
항-VISTA 항체는 암 세포의 수/비율을 감소시키고, 종양 세포 마커 발현을 감소시키고, 무 진행 생존을 증가시키고, 전체 생존을 증가시킬 수 있는 안전하고 내성인 것으로 밝혀졌다.
5.5 림프종의 치료
제1 인체 실험
동종이계 줄기세포 이식을 받지 않았고, 리툭시맙 (NHL) 및 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 (HL)에 반응할 가능성이 있으며, 1회 화학요법으로부터 이점을 얻지 못한 림프종 (NHL 및 HL) 환자를 안전 조정 '최소 예상 생물학적 효과 수준'(MABEL) 접근법에 따라 계산된 투여량의 항-VISTA 항체 V4 (실시예 2.2의 [1]), V4H1 (실시예 2.2의 [3]) 또는 V4H2 (실시예 2.2의 [4])로 처리하였다. 환자를 투여 후 28일 동안 모니터링한다.
그 다음, 환자를 이상사례 공통용어기준 (CTCAE)에 따라 평가하여, 치료의 안전성 및 내성을 측정하고, 분자의 약동학을 측정한다.
항-VISTA 항체에 의한 치료는 안전하고, 내성인 것으로 밝혀졌다.
투여량 증가-단일요법
동종이계 줄기세포 이식을 받지 않았고, 리툭시맙 (NHL) 및 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 (HL)에 반응할 가능성이 있으며, 1회 화학요법으로부터 이점을 얻지 못한 림프종 (NHL 및 HL) 환자를 과투여량 제어 (EWOC) 투여량 증가를 통한 3+3 모델 기반 증가에 따라 항-VISTA 항체 V4 (실시예 2.2의 [1]), V4H1 (실시예 2.2의 [3]) 또는 V4H2 (실시예 2.2의 [4])의 정맥내 주사에 의해 처리한다.
그런 다음 환자를 이상사례 공통용어기준 (CTCAE)에 따라 평가하여, 치료의 안전성 및 내성을 측정하고, 분자의 약동학 및 치료 효능을 평가한다. 최대 내성 투여량 (MTD) 및 최대 투여 투여량 (MAD)을 또한 측정한다.
투여량 증가-조합 요법
동종이계 줄기세포 이식을 받지 않았고, 리툭시맙 (NHL) 및 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 (HL)에 반응할 가능성이 있으며, 1회 화학요법으로부터 이점을 얻지 못한 림프종 (NHL 및 HL) 환자를 항-PD-L1 항체에 의한 3+3 모델 기반 증가에 따라 항-VISTA 항체 V4 (실시예 2.2의 [1]), V4H1 (실시예 2.2의 [3]) 또는 V4H2 (실시예 2.2의 [4])의 정맥내 주사에 의해 처리한다.
그런 다음 환자를 이상사례 공통용어기준 (CTCAE)에 따라 평가하여, 치료의 안전성 및 내성을 측정하고, 분자의 약동학 및 치료 효능을 평가한다.
투여량 확장
치료된 환자를 전체 반응률, 암 세포 마커의 발현, 순환 암 세포, 무 진행 생존, 전체 생존, 안전성 및 내성에 대해 분석한다.
항-VISTA 항체는 암 세포의 수/비율을 감소시키고, 종양 세포 마커 발현을 감소시키고, 무 진행 생존을 증가시키고, 전체 생존을 증가시킬 수 있는 안전하고, 내성인 것으로 밝혀졌다.
실시예 6: 상이한 Fc 영역을 포함하는 VISTA 결합 항체의 생성 및 특성화
6.1 상이한 Fc 영역을 포함하는 VISTA 결합 항체의 생성 및 특성화
4M2-C12를 마우스 IgG2a LALA PG 형식으로 생성하였다. 상기 분자는 서열번호 249에 제시된 서열을 갖는 중쇄 폴리펩타이드와 서열번호 250에 제시된 서열을 갖는 경쇄 폴리펩타이드의 헤테로머이다. 중쇄 서열은 서열번호 253에 따라 넘버링된 위치 4 및 5의 CH2 영역에서 류신 (L)에서 알라닌 (A)으로의 치환 및 서열번호 253에 따라 넘버링된 위치 99의 프롤린 (P)에서 글리신 (G)으로의 치환을 포함한다. 이러한 치환은 문헌에서 L234A, L235A 및 P329G로 지칭되고, 예를 들어 문헌[Lo et al. J. Biol. Chem (2017) 292(9):3900-3908]에서 마우스 IgG2a Fc에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 4M2-C12 mIgG2a LALA PG를 CHO 세포에서 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 공동 발현에 의해 생성하였으며, 이후 정제하였다.
Figure pct00055
4M2-C12를 또한 마우스 IgG2a NQ 형식으로 생성하였다. 상기 분자는 서열번호 258에 나타낸 서열을 갖는 중쇄 폴리펩타이드와 서열번호 250에 나타낸 서열을 갖는 경쇄 폴리펩타이드의 헤테로머이다. 중쇄 서열은 서열번호 253에 따른 위치 67의 CH2 영역에서 아스파라긴 (N)에서 글루타민 (Q)으로의 치환을 포함한다. 이러한 치환은 문헌에서 N297Q로 지칭되며, 예를 들어 문헌[Lo et al. J. Biol. Chem (2017) 292(9):3900-3908]에서 마우스 IgG2a Fc에 기재되어 있다. 4M2-C12 mIgG2a NQ를 CHO 세포에서 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 동시 발현에 의해 생성하였으며, 이후 정제하였다.
Figure pct00056
4M2-C12를 마우스 IgG1 형식으로 생성하였다. 상기 분자는 서열번호 266에 나타낸 서열을 갖는 중쇄 폴리펩타이드와 서열번호 250에 나타낸 서열을 갖는 경쇄 폴리펩타이드의 헤테로머이다. 4M2-C12 mIgG1을 CHO 세포에서 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 동시 발현에 의해 생성하였으며, 이후 정제하였다.
Figure pct00057
6.2 Fc 수용체에 대한 상이한 Fc 영역을 포함하는 VISTA 결합 항체의 결합 분석
인간, 시노몰구스 및 쥣과동물 VISTA 단백질에 대한 상이한 항체 형식의 4M2-C12의 결합을 ELISA를 통해 평가하고, 마우스 Fcγ 수용체 및 마우스 FcRn에 대한 결합을 Pall ForteBio Octet QK 384 시스템을 사용하여 BLI에 의해 평가하였다.
히스티딘 태그가 붙은 mFcγRIV (50036-M08H), mFcγRIII (50326-M08H), mFcγRIIb (50030-M08H), 및 mFcRn (CT009-H08H)을 Sino Biological에서 구입하였다. 항-Penta-HIS (HIS1K) 바이오센서를 Forte Bio (18-5120)에서 구입하였다.
동역학 실험을 위해, 항-Penta-HIS 바이오센서를 PBS 완충액 (pH 7.2)에서 60초 동안 인큐베이션하여, 제1 기준선을 획득한 다음, PBS (pH 7.2) 중 200 nM mFcγRIV (hFcγRIIIa의 오르소로그), 160 nM mFcγRIII (hFcγRIIa의 오르소로그), 75 nM mFcγRIIb (hFcγRIIb의 오르소로그) 또는 120 nM mFcRn으로 120초 동안 로딩하였다. 로딩 후, 바이오센서를 PBS 완충액 (Fcγ 수용체의 경우 pH 7.2, FcRn의 경우 pH 5.8)에서 60초 동안 인큐베이션하여 제2 기준선을 획득하고, PBS (Fcγ 수용체의 경우 pH 7.2, FcRn의 경우 pH 5.8)에서 시험 항체의 6포인트 2배 일련 희석 (2000 nM)으로 60초 동안 인큐베이션하여 결합 곡선을 획득하였다. 마지막으로 PBS (mFcγR의 경우 pH 7.2, mFcRn의 경우 pH 5.8)에서 바이오센서를 120초 동안 인큐베이션하여, 해리 곡선을 획득하였다. 동적 및 친화도 상수를 1:1 결합 모델에 대한 결합 및 해리 데이터의 전반적인 근사에 의해 계산하였다.
상이한 마우스 Fcγ 수용체 및 마우스 FcRn에 대한 4M2-C12-mIgG1의 결합 분석 결과를 도 25a 내지 도 25d에 나타낸다.
상이한 마우스 Fcγ 수용체 및 마우스 FcRn에 대한 4M2-C12-mIgG2a의 결합 분석 결과를 도 26a 내지 도 26d에 나타낸다. 두 개의 개별 실험을 수행하였으며 (1 및 2; 도 29a 내지 도 29c 참조); 도 26a 내지 도 26d는 실험 2에서 획득된 결과를 보여준다. 상이한 Fcγ 수용체에 대해 검출된 결합 수준은 과학 문헌에 보고된 수준과 유사하였다.
상이한 마우스 Fcγ 수용체 및 마우스 FcRn에 대한 4M2-C12-mIgG2a LALA PG의 결합 분석 결과를 도 27a 내지 도 27d에 나타낸다. mFcγRIV, mFcγRIII 및 mFcγRIIb에 대한 결합 수준은 매우 근소하였고/검출할 수 없었으며, mFcRn에 대한 결합 수준은 4M2-C12-mIgG2a에 의한 mFcRn에 대한 결합 수준과 유사하였다.
4M2-C12-mIgG2a NQ의 상이한 마우스 Fcγ 수용체 및 마우스 FcRn에 대한 결합 분석 결과를 도 28a 내지 도 28d에 나타낸다.
4M2-C12-mIgG1, 4M2-C12-mIgG2a, 4M2-C12-mIgG2a LALA PG 및 4M2-C12-mIgG2a NQ에 대해 측정된 상이한 Fc 수용체에 대한 결합에 대한 Kon, Kdis 및 KD 값은 도 29a 내지 도 29c의 표에 요약되어 있다.
실시예 7: 상이한 Fc 영역을 포함하는 VISTA 결합 항체의 생체내 분석
4M2-C12-mIgG2a 및 도 4M2-C12-mIgG2a LALA PG (실시예 6.1 참조)를 동계 EL4 T-세포 백혈병/림프종 모델에서 생체내 암을 치료하는 효능에 대해 평가하였다.
10% 말 혈청 (FBS) 및 1% Pen/Strep이 보충된 DMEM에서 EL4 세포를 배양하였다. 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다.
약 6주령의 C57BL/6 마우스를 InVivos (Singapore)에서 구입하였다. 동물을 특수한 무 병원체 조건하에 수용하였고, 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라 처리하였다. C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 2 x 105 EL4 T-세포 백혈병/림프종 세포를 접종하였다. 종양 이식 후, 종양의 크기가 350 내지 400 mm3에 도달하면, 마우스를 다음 처리 그룹으로 무작위 배정하였다: a) 비히클 대조군 (PBS), b) 4M2-C12 mIgG2a (실시예 5의 [17]) 또는 c) 4M2-C12 mIgG2a-LALA PG (실시예 6의 [18]), 25mg/kg 투여량. 상기 처리를 총 5회 투여량으로 3일마다 복강내 투여하였다.
종양 부피를 디지털 캘리퍼를 사용하여 주 3회 측정하고, 공식 [L x W2/2]를 사용하여 계산하였다. 비히클 대조군 처리 그룹의 종양의 길이가 1.5cm를 초과하는 것으로 측정되면, 연구 종점에 도달한 것으로 간주하였다.
결과는 도 30a 내지 도 30c에 나타낸다. 연구 마지막 날 (이식 후 23일)까지, 4M2-C12 IgG2a 및 도 4M2-C12 IgG2a LALA PG 처리 그룹 둘 모두의 평균 종양 부피는 신뢰할 수 있는 측정 크기 미만 (30mm3 미만)이었다. 이와 달리, 비히클 (PBS) 처리 그룹에서 마우스의 평균 종양 부피는 18일까지 2000mm3를 초과했고, 모든 동물을 안락사시켰다.
따라서 4M2-C12는 IgG2a 및 IgG2a LALA PG 형식 둘 모두에서 종양 성장의 강력한 억제를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
고도로 확립된 EL4 종양-보유 마우스를 항-VISTA 항체 4M2-C12의 처리는 단일요법으로서 매우 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 종양 제거를 초래하였다.
4M2-C12의 생물학적 활성은 쥣과동물 Fcγ 수용체의 결합에 독립적인 것으로 밝혀졌으며, 이는 4M2-C12가 VISTA 매개 신호전달의 억제를 통해 생물학적 활성을 발휘한다는 것을 강력하게 시사한다.
실시예 8: 항체에 의해 결합된 VISTA의 에피토프 분석
항-VISTA 항체를 평가하여, VISTA에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하는지를 측정하였다.
VSTB112는 이전에 다수의 영역에서 VISTA와 결합하는 것으로 제시되었다. 주 에피토프는 서열번호 1의 위치 59 내지 68 및 위치 86 내지 97 (즉, 서열번호 271 및 272)에 해당하는 것으로 제시되었다. 부 에피토프는 서열번호 1의 위치 71 내지 84 및 위치 150 내지 166 (즉, 서열번호 273 및 274)에 해당하는 것으로 제시되었고; 예를 들어, WO 2017/137830 A1, 예를 들어, 문단 [0302]를 참조한다. VSTB112는 예를 들어, WO 2015/097536 A2에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
IGN175A는 성숙 단백질의 처음 32개 아미노산 내 (즉, 서열번호 1의 위치 33 내지 64 (즉, 서열번호 275) 내)에서 VISTA에 결합하는 것으로 고려된다. IGN175A는 예를 들어 WO 2014/197849 A2에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
에피토프 비닝 실험을 Octet QK384 시스템 (ForteBio)을 사용하여 BLI에 의해 수행하였다. 요약하면, PBS 중 인간 VISTA-His 재조합 단백질 (4.7μg/ml)을 항-Penta His 센서 (HIS1K, ForteBio)에 5분 동안 고정하였다. PBS의 기준선 신호를 30초 동안 측정한 후, 교반 속도 1000rpm에서 10분 동안 PBS에 400 nM 포화 항체를 로딩하고, PBS를 사용하여 120초 해리 단계를 수행하였다. 이어서 바이오센서를 교반 속도 1000rpm에서 PBS에서 300 nM 경쟁 항체로 5분 동안 처리한 다음, PBS를 사용하여 120초 해리 단계를 수행하였다.
실험에서 분석된 항원 결합 분자는 다음과 같다.
IgG1 형식의 4M2-C12 (V4) (실시예 2.2의 [1])
IgG1 형식의 4M2-C12의 인간화 및 친화도 성숙된 변이체 (V4-C1) (실시예 13의 [21])
IGN175A IgG1 (IGN175A HC (서열번호 267)+IGN175A LC (서열번호 268) 포함)
VSTB112 IgG1 (VSTB112 HC (서열번호 269)+VSTB112 LC (서열번호 270) 포함)
다음 항원/포화 항체/경쟁 항체 조합을 조사하였다:
Figure pct00058
결과는 도 31a 및 도 31b에 제시되어 있다.
V4 및 V4-C1 IgG1은 VISTA에 대한 결합에 대해 IGN175A와 경쟁하지 않는 것으로 밝혀졌다. VSTB112는 VISTA에 대한 결합을 위해 V4, V4-C1 및 IGN175A와 일부 경쟁하는 것으로 밝혀졌다. 경쟁 항체의 첨가에 따른 반응의 변화 (nm)는 하기에 제시된다.
Figure pct00059
결과는 4M2-C12 및 IGN175A가 VISTA의 국소 원위 영역에 결합하고, VSTB112가 4M2-C12 및 IGN175A에 근접한 영역에서 VISTA에 결합함을 나타낸다.
V1-C1 및 IGN175A가 VISTA에 대한 결합에 대해 경쟁하지 않는다는 사실을 VSTB112가 VISTA에 대한 결합에 대해 IGN175A와 경쟁한다는 관찰과 종합하면, IGN175A에 의해 결합된 VISTA의 에피토프와 동일하지 않으며, 또한 VSTB112에 의해 결합된 VISTA의 에피토프와 동일하지 않은 VISTA의 에피토프에 4M2-C12의 CDR을 포함하는 항체가 결합함을 시사한다.
4M2-C12 및 종 교차 반응성 데이터를 생성하는데 사용되는 면역원인 VISTA의 서열 분석으로부터, 본 발명자들은 4M2-C12 및 이의 유도체가 서열번호 322에 제시된 서열 (서열번호 1의 위치 76 내지 81에 해당)에 결합한다는 결론을 내렸다.
실시예 9: VISTA-매개된 T 세포 증식 억제를 구제(rescue)하는 VISTA-결합 항체의 능력 분석
VISTA 매개 신호전달의 억제 효과를 구제하는 항-VISTA 항체의 능력을 시험관내 분석에서 분석하였다.
간단히 말해서, 96-웰 플레이트를 1:1 (2.5μg/ml 항-CD3: 2.5μg/ml VISTA/대조군 Ig) 또는 2:1 (2.5μg/ml 항-CD3: 1.25μg/ml VISTA/대조군 Ig)의 농도 비율로 항-CD3 및 VISTA-Ig 또는 대조군-Ig로 코팅하였다. 비관련 항원-Ig를 대조군 조건으로 사용하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
새로 채혈된 혈액 샘플로부터 PBMC를 정제하고, 인간 Pan T 세포 단리 키트 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 T 세포에 대해 추가로 농축시켰다. 농축된 T 세포 집합을 CFSE로 표지하였다.
웰을 PBS로 3회 세척하고, 첨가된 항체의 부재 하 또는 20 μg/ml의 최종 농도의 VSTB 1 12의 존재 하 또는 20 μg/ml 또는 50 μg/ml의 최종 농도의 4M2-C12 IgG1 (실시예 2.2의 [1])의 존재 하에 10% FBS가 보충된 완전한 RPMI 1640 배지에서 100,000개의 CFSE-표지된 T 세포를 각 웰에 첨가하였다.
5일 후, 세포를 수확하고, 형광 접합된 항-CD4 및 항-CD8 항체로 표지하고, Macsquant Analyzer 10을 사용하여 유세포 분석으로 분석하였다.
실험 결과는 도 33a 내지 도 33d에 제시되어 있다. 4M2-C12는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 증식 능력을 회복시키는 것으로 밝혀졌다.
중요하게도, 4M2-C12는 VSTB112보다 T 세포의 증식 회복에 더 효과적인 것으로 밝혀졌다.
실시예 10: LPS에 반응하여 THP1 세포에 의한 IL-6의 생성을 촉진하는 VISTA-결합 항체의 능력 분석
LPS 자극에 반응하여 THP-1 세포에 의한 IL-6의 생성을 촉진하는 항-VISTA 항체의 능력을 시험관내 분석에서 분석하였다.
간단히 말해서, 미분화 THP1 세포를 FBS 또는 pen/strep이 부재하는 RPMI 배지에서 96웰 플레이트에 2중 반복 실험으로 시딩하였다 (100,000 세포/웰). 이어서 세포를 2000 μg/ml 내지 7.8 μg/ml 범위의 상이한 농도의 4M2-C12 IgG1 (실시예 2.2의 [1]) 또는 1000 μg/ml 내지 7.8 μg/ml 범위의 상이한 농도의 VSTB112 존재 하에 LPS (최종 농도 100 μg/ml) 및 MnCl2 (100 μM)로 처리하였다. 3일 후, 세포 배양 상청액을 수집하고, IL-6 인간 ELISA 키트 (Invitrogen)를 사용하여 ELISA로 분석하여 IL-6의 수준을 측정하였다.
결과는 도 34a 및 도 34b에 제시되어 있다. 4M2-C12는 VSTB112보다 LPS 자극 THP1 세포에 의해 더 많은 IL-6의 생성을 촉진하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 11: 생체내에서 IL-6의 생성을 촉진하는 VISTA-결합 항체의 능력 분석
4M2-C12 처리에 대한 반응으로의 IL-6 생성을 생체내에서 조사하였다.
간단히 말하면, C57BL/6 마우스 (n = 3)에 단일 600 μg 투여량의 4M2-C12 mIgG2a (실시예 5의 [17])를 투여하고, 투여하기 2시간 전 및 투여한지 0.5시간, 6시간, 24시간, 96시간, 168시간 및 336시간 후에 마우스로부터 혈액 샘플을 채혈하였다.
마우스 IL-6 ELISA 키트 (Abcam, ab100712)를 사용하여 혈청을 IL-6 함량에 대해 분석하였다.
결과는 도 35에 제시되어 있다. IL-6은 4M2-C12 mIgG2a의 투여한지 0.5시간 후에 혈청에서 검출되었다.
실시예 12: VISTA-결합 항체 단독 또는 항-PD-1/PD-L1 항체와의 조합의 생체내 분석
12.1 CT26 세포 모델
1x105개의 CT26 세포를 Balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하여 T 세포 백혈병/림프종의 동계 모델을 생성하였다.
마우스 (7/처리 그룹)를 다음과 함께 총 7회 투여량으로 3일마다 복강내 투여하였다.
600 μg의 4M2-C12 IgG2a (실시예 5의 [17])
200 μg의 항-PD-1 항체 (클론 RMP1-14 (Bioxcell))
600 μg의 4M2-C12 IgG2a+200 μg의 항-PD-1 항체
PBS 단독
디지털 캘리퍼를 사용하여 주 3회 종양 부피를 측정하고, 공식 [L x W2/2]를 사용하여 계산하였다. 대조군 아암의 종양의 길이가 1.5cm를 초과하는 것으로 측정되면, 연구 종점에 도달한 것으로 간주하였다.
결과는 도 36a 및 도 36b에 제시되어 있다. 항-VISTA 항체 4M2-C12 및 항-PD-1과의 조합 요법은 단독으로 사용된 제제보다 종양 성장을 더 큰 정도로 억제하였다.
종양-침윤 CD45+ 세포의 면역 프로파일링을 수행하였다. 간단히 말해서, 실험 22일째에 종양을 수확하고, 단일 세포 현탁액으로 처리하고, 면역 세포 표면 단백질 (CD45, CD4, CD8, CD25, CD11b, Ly6G 및 Ly6C)에 특이적인 항체로 염색하였다.
샘플을 유세포 분석에 의해 분석하고, 다음과 같이 상이한 면역 세포 표면 단백질에 대한 그의 염색을 기반으로 하여, 다음 면역 세포 하위세트로 분류하였다:
CD4 세포: CD45+CD4+;
CD8 T 세포: CD45+CD8+;
Treg 세포: CD45+CD4+CD25+;
과립세포 MDSC (g-MDSC): CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Clo/-
단핵구 MDSC (m-MDSC): CD45+CD11b+Ly6G-Ly6Chi/+
소정의 표현형을 갖는 종양-침윤 CD45+ 세포의 백분율을 다음에 요약하였다:
Figure pct00060
g-MDSC였던 종양 침윤 CD45+ 세포의 백분율은 도 37에 제시되어 있다. 4M2-C12 (단독 또는 항-PD-1과 조합)로 처리하면 종양 침윤 CD45+ 세포 중 g-MDSC의 비율이 유의하게 감소하였다.
18일째에 마우스로부터 혈액을 채혈하고, 마우스용 MACSPlex 사이토카인 10 키트 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 분석하여 다양한 상이한 사이토카인의 수준에 대해 혈청을 분석하였다.
결과는 도 38a 내지 도 38e에 나타낸다.
12.2 B16-BL6 세포 모델
도 40a 및 도 40b는 상기 실시예 5.2.3에 기재된 연구 (도 17에 나타난 결과)를 18일째까지 연장한 결과를 보여준다. 항-VISTA 항체 4M2-C12 및 항-PD-1과의 조합 요법은 단독으로 사용된 제제보다 종양 성장을 더 큰 정도로 억제하였다.
종양-침윤 CD45+ 세포의 면역 프로파일링을 수행하였다. 간단히 말해서, 실험 18일째에 종양을 수확하고, 단일 세포 현탁액으로 처리하고, 면역 세포 표면에 특이적인 항체로 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하고, 세포를 상기 실시예 12.1에 기재된 바와 같이 면역 세포 하위세트로 분류하였다.
소정의 표현형을 갖는 종양-침윤 CD45+ 세포의 백분율을 다음에 요약하였다:
Figure pct00061
g-MDSC인 종양-침윤 CD45+ 세포의 백분율은 도 41에 제시되어 있다.
12.3 EL4 세포 모델
2x105개의 EL4 세포를 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하여 T 세포 백혈병/림프종의 동계 모델을 확립하였다.
마우스 (7/처리 그룹)를 다음과 함께 총 5회 투여량으로 3일마다 복강내 투여하였다:
600 μg의 4M2-C12 IgG2a (실시예 5의 [17])
200 μg의 항-PD-1 항체 (클론 RMP1-14 (Bioxcell))
600 μg의 4M2-C12 IgG2a+200 μg의 항-PD-1 항체
PBS 단독
종양 부피를 디지털 캘리퍼를 사용하여 주 3회 측정하고, 공식 [L x W2/2]를 사용하여 계산하였다. 대조군 아암의 종양의 길이가 1.5cm를 초과하는 것으로 측정되면 연구 종점에 도달한 것으로 간주하였다.
결과는 도 42에 제시되어 있다. 항-VISTA 항체 4M2-C12 및 항-PD-1과의 조합 요법은 단독으로 사용된 제제보다 더 큰 정도로 종양 성장을 억제하였다.
종양-침윤 CD45+ 세포의 면역 프로파일링을 수행하였다. 간단히 말해서, 실험 16일째에 종양을 수확하고, 단일 세포 현탁액으로 처리하고, 면역 세포 표면에 특이적인 항체로 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하고, 세포를 상기 실시예 12.1에 기재된 바와 같이 면역 세포 하위세트로 분류하였다.
소정의 표현형을 갖는 종양-침윤 CD45+ 세포의 백분율을 다음에 요약하였다:
Figure pct00062
g-MDSC인 종양-침윤 CD45+ 세포의 백분율이 도 43에 제시되어 있다. 4M2-C12 (단독 또는 항-PD-1과 조합)로 처리하면 종양 침윤 CD45+ 세포 중 g-MDSC의 비율이 유의하게 감소하였다.
12.4 결론
PD-1/PD-L1 신호전달의 억제는 CT26, B16-BL6 및 EL4 모델에서 종양-침윤 CD45+ 세포 중 g-MDSC의 비율을 증가시키며, 4M2-C12로 처리하면 g-MDSC 확장이 억제된다.
실시예 13: VISTA-결합 항체의 추가 특성화
추가로 VISTA 결합 항원 결합 분자를 생성하였다:
Figure pct00063
V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 및 V4-C31을 IMGT DomainGapAlign (문헌[Ehrenmann et al., Nucleic Acids Res., 38, D301-307 (2010)]) 및 IEDB 탈면역화 (문헌[Dhanda et al., Immunology. (2018) 153(1):118-132]) 툴을 사용하여 안전성 및 면역원성에 대해 인실리코에서 분석하였다.
V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 및 V4-C31은 인간 중쇄 및 경쇄에 대해 충분한 상동성을 가져서, 인간화된 것으로 고려하였고 (즉 85% 초과), 잠재적 면역원성 펩타이드의 수가 충분히 적어 안전한 것으로 고려되었으며(도 53 참고), 잠재적인 발생 가능성 문제를 일으킬 수 있는 임의의 다른 특성을 보유하지 않았다.
13.1 BLI에 의한 결합 친화도 분석
V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 및 V4-C31 (즉, [21] 내지 [28])과 인간 및 마우스 VISTA 단백질 및 인간 PD-L1의 결합을 Pall ForteBio Octet QK 384 시스템을 사용하여 BLI에 의해 평가하였다.
요약하면, 항-Penta-HIS 바이오센서를 PBS 완충액 (pH 7.2)에서 60초 동안 인큐베이션하여 제1 기준선을 획득한 다음, PBS (pH 7.2) 중 180 nM hVISTA, 180 nM mVISTA 또는 250 nM hPD-L1로 120초 동안 로딩하였다. 로딩 후, 바이오센서를 PBS 완충액 pH 7.2에서 60초 동안 인큐베이션하여 제2 기준선을 획득하고, PBS pH 7.2에서 시험 항체의 6포인트 2배 일련 희석 (500 nM 내지 15.6 nM)으로 120초 또는 900초 동안 인큐베이션하여 결합 곡선을 획득하였다. 마지막으로 PBS pH 7.2에서 바이오센서를 120초 동안 인큐베이션하여, 해리 곡선을 획득하였다. 동적 및 친화도 상수를 1:1 결합 모델에 대한 결합 및 해리 데이터의 전반적인 근사에 의해 계산하였다.
V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 또는 V4-C31 중 어느 것도 인간 PD-L1에 대해 유의한 결합을 나타내지 않았다 (도 45c).
이 실험에서 V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 및 V4-C31과 인간 VISTA 및 마우스 VISTA의 결합에 대해 계산된 동적 및 열역학적 상수는 도 45d에 제시되어 있다.
마우스 VISTA 단백질과 V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 및 V4-C31의 결합을 VSTB112 IgG1 (VSTB112 HC (서열번호 269)+VSTB112 LC (서열번호 270) 포함)의 평가를 포함하는 별도의 실험에서 분석하였다.
VSTB112는 마우스 VISTA 단백질에 대한 유의한 결합을 나타내지 않았다 (도 46a). 이 실험에서 V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 및 V4-C31과 마우스 VISTA의 결합에 대해 계산된 동적 및 열역학적 상수는 도 46b에 제시되어 있다.
추가 실험에서, V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27 및 VSTB112 IgG1과 인간 VISTA 및 마우스 VISTA의 결합을 분석하였고, 계산된 동적 및 열역학적 상수는 도 47c에 제시되어 있다.
또 다른 실험에서, V4 (실시예 2.2의 [1]) 및 VSTB112 IgG1 (VSTB112 HC (서열번호 269)+VSTB112 LC (서열번호 270) 포함)과 인간 VISTA, 마우스 VISTA 및 인간 CD47의 결합을 분석하였다. 항-Penta-HIS 바이오센서를 PBS 완충액 (pH 7.2)에서 60초 동안 인큐베이션하여 제1 기준선을 획득하고, 이어서 PBS (pH 7.2)에서 180 nM hVISTA, 180 nM mVISTA 또는 300 nM hCD47로 120초 동안 로딩하였다. 로딩 후, 바이오센서를 PBS 완충액 pH 7.2에서 60초 동안 인큐베이션하여 제2 기준선을 획득하고, PBS pH 7.2에서 시험 항체의 일련의 희석 (1500 nM 내지 46.9 nM)을 120초 동안 인큐베이션하여 결합 곡선을 획득하였다. 마지막으로 바이오센서를 PBS pH 7.2에서 120초 동안 인큐베이션하여 해리 곡선을 획득하였다. 동적 및 친화도 상수를 1:1 결합 모델에 대한 결합 및 해리 데이터의 전반적인 근사에 의해 계산하였다.
V4 및 VSTB112는 인간 CD47에 대한 결합을 나타내지 않았다. VSTB112는 마우스 VISTA 단백질에 대한 유의한 결합을 나타내지 않았으며, V4는 유의한 결합을 나타내었다. 계산된 동적 및 열역학적 상수는 도 48b에 제시되어 있다.
13.2 ELISA에 의한 결합 친화도 분석
ELISA를 사용하여 상이한 항체와 인간 VISTA 및 마우스 VISTA의 결합을 평가하였다. ELISA를 상기 실시예 3.3에 기재된 바와 같이 수행하였다.
실험에서 다음 항체를 분석하였다:
4M2-C12 IgG1 (실시예 2.2의 [1]; 도면에서 "V4pr"로 지칭됨)
V4-C1 IgG1 (실시예 13의 [21])
V4-C9 IgG1 (실시예 13의 [22])
V4-C24 IgG1 (실시예 13의 [23])
V4-C26 IgG1 (실시예 13의 [24])
V4-C27 IgG1 (실시예 13의 [25])
V4-C28 IgG1 (실시예 13의 [26])
V4-C30 IgG1 (실시예 13의 [27])
V4-C31 IgG1 (실시예 13의 [28])
VSTB112 IgG1 (VSTB112 HC (서열번호 269)+VSTB112 LC (서열번호 270) 포함)
에테졸리주맙
인간 IgG1 이소형 대조군
획득된 결과는 도 49a 및 도 49b에 나타내며, 항체와 소정의 단백질의 결합에 대한 ELISA로부터 계산된 EC50 (nM) 값은 도 49c에 요약되어 있다.
추가 실험을 수행하여, V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30, V4-C31, VSTB112 및 이소형 대조군 항체와 인간 VISTA 또는 마우스 VISTA의 결합을 분석하였다. 결과는 도 50a 및 도 50b에 나타내며, 소정의 단백질에 대한 항체의 결합에 대한 ELISA로부터 계산된 EC50 (nM) 값은 도 50c에 요약되어 있다.
추가 실험을 수행하여, V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, VSTB112 및 이소형 대조군 항체와 인간 VISTA 또는 마우스 VISTA의 결합을 분석하였다. 결과는 도 51a 및 도 51b에 나타내며, 소정의 단백질에 대한 항체의 결합에 대한 ELISA로부터 계산된 EC50 (nM) 값은 도 51c에 요약되어 있다.
추가 실험을 수행하여, V4, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 및 V4-C31 및 이소형 대조군 항체와 인간 VISTA, PD-L1, B7H3, B7H4, B7H6, B7H7, PD-1 및 CTLA-4의 결합을 분석하였다. 결과는 도 56a 내지 도 56g에 도시되어 있다. 각각의 V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 및 V4-C31은 인간 VISTA에 대한 강한 결합을 나타내었으며, B7 단백질 계열의 다른 구성원에 대해 교차 반응성을 나타내지 않았다.
추가 실험에서, V4 (도 57에서 "V4P"로 지칭됨), V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 및 V4-C31을 인간 VISTA, 마우스 VISTA, 랫트 VISTA 및 시노몰구스 VISTA에 대한 결합에 대해 분석하였다. 획득된 결과는 도 57a 내지 도 57h에 나타내며, 소정의 단백질에 대한 항체의 결합에 대한 ELISA로부터 계산된 EC50 (M) 값은 도 57i에 요약되어 있다.
V4 및 모든 V4 유래 클론 V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 및 V4-C31은 인간 VISTA, 마우스 VISTA, 랫트 VISTA 및 시노몰구스 VISTA에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
13.3 유세포 분석에 의한 VISTA 발현 세포에 대한 결합 분석
항-VISTA 항체를 필수적으로 상기 실시예 3.1에 기재된 바와 같이 VISTA-발현 세포에 결합하는 능력에 대해 분석하였다.
요약하면, 인간 VISTA 또는 마우스 VISTA를 인코딩하는 벡터로 형질감염된 HEK293 세포 또는 형질감염 세포를 1 μg/ml의 항-VISTA 항체 또는 이소형 대조군 항체와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 세척하고, 10 μg/ml FITC-접합 항-인간 Fc 항체와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 세척한 다음, 유세포 분석으로 분석하였다.
실험에서 다음 항체를 분석하였다:
· 4M2-C12 IgG1 (실시예 2.2의 [1]; 도면에서 "V4P"로 지칭됨)
· V4-C24 IgG1 (실시예 13의 [23])
· V4-C26 IgG1 (실시예 13의 [24])
· V4-C27 IgG1 (실시예 13의 [25])
· V4-C28 IgG1 (실시예 13의 [26])
· V4-C30 IgG1 (실시예 13의 [27])
· V4-C31 IgG1 (실시예 13의 [28])
· VSTB112 IgG1 (VSTB112 HC (서열번호 269)+VSTB112 LC (서열번호 270) 포함)
· 인간 IgG1 이소형 대조군
결과는 도 58a 내지 도 58c에 제시되어 있다.
13.4 시차 주사 형광 측정에 의한 열 안정성 분석
상이한 항체의 열 안정성을 상기 실시예 3.4에 기재된 바와 같이 시차 주사 형광 분석법에 의해 평가하였다.
V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30, V4-C31 (즉, [21] 내지 [28]) 및 VSTB112의 열 안정성에 대한 시차 주사 형광 측정 분석 (3중 반복 실험)에 대해 획득된 미가공 데이터의 제1 유도체는 도 52a 내지 도 52i에 나타내며, 그 결과는 도 52j에 요약되어 있다.
V4-C1, V4-C9, V4-C24, V4-C26, V4-C27, V4-C28, V4-C30 및 V4-C31은 V4 (67.5℃)와 비교하여, Fab 영역에 대해 더 높은 용해 온도 (Tm)를 가짐으로써, 열 안정성이 향상된 것으로 밝혀졌다.
실시예 14: 면역조직화학에서 VISTA-결합 항체의 용도
항-VISTA 항체 4M2-C12 mIgG2a (실시예 5의 [17])를 그 능력에 대해 평가하고, 인간 VISTA 단백질의 검출을 위한 면역조직화학에서 사용하였다.
결합 시약 (Leica Biosystems)을 사용하여 절편 처리를 수행하였다. 정상 인간 비장 또는 정상 인간 난소의 시판 파라핀 절편을 결합 Dewax 용액에서 탈파라핀화하고, 이를 사용하여 재수화하였다. 그런 다음 절편을 단계 사이에 1x Bond 세척액의 4 내지 5회 세정하고, 다음 처리를 수행하였다: (i) 100℃에서 40분 동안 결합 에피토프 회수 용액 처리에 의한 항원 노출, (ii) 실온에서 15분 동안 3.5% (v/v) H2O2 처리에 의한 내인성 과산화효소 차단, (iii) 30분 동안 실온에서 10% 염소 혈청 처리에 의한 차단, (iv) 4℃에서 밤새 9.37 mg/mL 용액의 1:50 희석의 4M2-C12 mIgG2a와의 인큐베이션, (v) 실온에서 5분 동안 HRP-중합체 접합 염소 항-마우스 항체와의 인큐베이션, 및 (vi) 실온에서 7분 동안 Bond Mixed DAB Refine에 의한 전개 후 반응을 정지시키기 위한 탈 이온수 세정.
절편을 실온에서 5분 동안 헤마톡실린 (haematoxylin)으로 대조 염색하고, 탈이온수 및 1x 결합 세척 용액으로 세정한 다음, 탈수화하고, 합성 봉입 매질에 봉입하고, 고해상도로 스캔하였다.
결과는 도 59a 및 도 59b에 제시되어 있다. 항-VISTA 항체는 비장 세포의 세포질을 염색시켰으며, 정상 난소 절편 (대조군)의 세포를 염색시키지 않았다.
실시예 15: VISTA-매개된 T 세포 증식 억제 및 전 염증성 사이토카인 생성을 구제하는 VISTA 결합 항체의 능력에 대한 추가 분석
항-VISTA 항체를 VISTA 매개 억제로부터 T 세포를 방출하는 능력에 대해 특성화하였다.
96-웰 플레이트를 2.5 μg/ml 농도의 항-CD3으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBMC를 혈액 샘플로부터 단리하고, T 세포를 PBMC로부터 농축하고, 상기와 같이 CSFE로 표지한 다음, 2% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지에서 인간 VISTA를 인코딩하는 작제물로 형질감염된 HEK293-6E 세포와 CFSE 표지된 T 세포를 2:1의 비율로 공동 배양하였다.
이어서 세포를 0 μg/ml (대조군), 20 μg/ml 또는 50 μg/ml 농도의 4M2-C12-hIgG1 (실시예 2.2의 [1]) 또는 VSTB112로 처리하였다.
5일 후, 세포를 수확하고, 유세포 분석으로 분석하여, CSFE 희석 프로파일에 의한 세포 증식을 측정하였다. 세포 배양 상청액을 또한 수확하고, INFγ 및 TNFa 수준을 ELISA로 분석하였다.
결과는 도 60a 내지 도 60d에 도시되어 있다. 도 60a 및 도 60b는 4M2-C12-hIgG1이 투여량 의존적 방식으로 VISTA 매개 증식 억제로부터 T 세포를 방출시킴을 보여준다. 도 60c 및 도 60d는 4M2-C12-hIgG1이 INFγ 및 TNFa의 생성의 VISTA 매개 억제로부터 T 세포를 방출시킴을 보여준다.
추가 실험에서, 미분화 THP1 세포를 96웰 플레이트의 웰에 FBS 또는 pen/strep이 부재하는 RPMI 배지에서 2중 반복 실험으로 시딩 (100,000 세포/웰)하고, 2000 μg/ml 내지 7.8 μg/ml의 범위의 농도의 VSTB112 또는 일련 희석된 농도의 4M2-C12-hIgG1 (실시예 2.2의 [1])의 존재 하에 LPS (100 μg/ml)로 세포를 자극하였다.
24시간 후 세포 배양 상청액을 수집하고, IL-6 및 TNFa에 대해 ELISA로 분석하였다. 세포를 고정하고, 투과시키고, 유세포 분석을 통해 VISTA의 존재를 분석하였다.
결과는 도 61a 내지 도 61c에 제시되어 있다. 4M2-C12-hIgG1은 LPS 자극 THP1 세포로부터 IL-6 및 TNFa 생성을 투여량 의존적 방식으로 VSTB112보다 훨씬 더 큰 정도로 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
추가 실험에서, 미분화 THP1 세포를 96웰 플레이트의 웰에 FBS 또는 pen/strep이 부재하는 RPMI 배지에서 2중 반복 실험으로 시딩 (100,000 세포/웰)하고, 2000 μg/ml 내지 7.8 μg/ml의 범위의 농도의 4M2-C12-hIgG1 (실시예 2.2의 [1]) 또는 4M2-C12-hIgG4 (하기에 제시된 [29])의 존재 하에 LPS (100 μg/ml) 및 MnCl2 (100 μM)로 세포를 자극하였다. 24시간 후에 세포 배양 상청액을 수집하고, IL-6에 대해 ELISA로 분석하였다.
Figure pct00064
결과는 도 62에 나타낸다. LPS 자극된 THP1 세포에 의한 IL-6 생성의 증가는 인간 IgG1 또는 IgG4 형식에서 4M2-C12에 의한 처리에 의해 유도된 IL6의 수준 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았기 때문에, Fc 독립적인 것으로 밝혀졌다.
실시예 16: 약리학, 독성학 및 면역독성의 추가 분석
급성 투여량 연구에서, 랫트에 단일 투여량의 10 mg/kg, 25 mg/kg, 100 mg/kg 또는 250 mg/kg의 4M2-C12-hIgG1 (실시예 2.2의 [1]) 또는 4M2-C12-hIgG4 (실시예 15의 [29])를 투여하였다.
기준선 (-2시간), 투여한지 0.5시간, 6시간, 24시간, 96시간, 168시간 및 336시간 후에 랫트로부터 혈액을 채혈하였다. 혈청 내 항체를 ELISA로 정량화하였다.
약동학적 분석의 매개변수는 비 구획 모델로부터 파생되었다:
최대 농도 (C max), AUC (0 내지 336hr), AUC (0-무한대), 반감기 (t½), 제거율 (CL), 정상 상태에서의 분포 부피 (Vss).
결과는 도 63a 내지 도 63d에 제시된다.
별도의 실험에서, BALB/C 마우스에 단일 투여량의 50 mg/kg 4M2-C12-hIgG1 (실시예 2.2의 [1]) 또는 동일한 부피의 PBS를 투여하였다. 96시간 후에 혈액 샘플을 채혈하여, HM5 혈액 분석기를 사용하여 상이한 유형의 백혈구의 수를 분석하였다. 혈액 샘플을 또한 간독성과 신독성의 상관관계에 대해 분석하였다.
대표적인 결과가 도 64a 내지 도 64c의 표에 제시되어 있다.
추가 실험에서, Sprague Dawley 랫트에 단일 투여량의 250 mg/kg 4M2-C12-hIgG1 (실시예 2.2의 [1]) 또는 동일한 부피의 PBS를 투여하였다. 혈액 샘플을 6, 24, 96 및 168시간째에 채혈하였으며, HM5 혈액 분석기를 사용하여 상이한 유형의 백혈구의 수를 분석하였다. 혈액 샘플을 또한 간독성, 신독성 및 췌장 독성의 상관관계에 대해 분석하였다.
대표적인 결과가 도 65a 내지 도 65c의 표에 제시되어 있다.
4M2-C12-hIgG1의 투여는 유의한 독성과 관련이 있는 것으로 밝혀지지 않았으며, 혈액 내 다수의 세포 유형을 유의하게 변이시키지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> Hummingbird Bioscience Holdings Pte. Ltd. (All states) Clegg, Richard (LS only) <120> VISTA Antigen-Binding Molecules <130> IPA201272-GB <150> PCT/EP2018/058258 <151> 2018-03-29 <150> US 16/180,949 <151> 2018-11-05 <150> GB 1814562.3 <151> 2018-09-07 <160> 330 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 311 <212> PRT <213> Homo sapiens VISTA <400> 1 Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser 1 5 10 15 Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala 20 25 30 Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln 35 40 45 Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His 50 55 60 Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val 65 70 75 80 Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp 85 90 95 Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp 100 105 110 Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn 115 120 125 Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr 130 135 140 Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val 145 150 155 160 His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser 165 170 175 Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Asn Ile Thr 180 185 190 Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu 195 200 205 Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Ala Ala Ser Asn 210 215 220 Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Ile Gln Gly Ile 225 230 235 240 Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala Ser Pro Pro Ala Gln Gly Ile Pro Glu 245 250 255 Ala Lys Val Arg His Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser 260 265 270 Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro 275 280 285 Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp 290 295 300 Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile 305 310 <210> 2 <211> 279 <212> PRT <213> Homo sapiens VISTA <400> 2 Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln 1 5 10 15 Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His 20 25 30 Asp Val Thr 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Leu Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro 245 250 255 Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp 260 265 270 Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile 275 <210> 3 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens extracellular domain <400> 3 Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln 1 5 10 15 Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His 20 25 30 Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val 35 40 45 Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp 50 55 60 Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp 65 70 75 80 Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn 85 90 95 Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr 100 105 110 Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val 115 120 125 His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser 130 135 140 Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Asn Ile Thr 145 150 155 160 Ala Ala <210> 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<211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens VSIG-8 Ig-like V-type domain <400> 24 Val Arg Ile Asn Gly Asp Gly Gln Glu Val Leu Tyr Leu Ala Glu Gly 1 5 10 15 Asp Asn Val Arg Leu Gly Cys Pro Tyr Val Leu Asp Pro Glu Asp Tyr 20 25 30 Gly Pro Asn Gly Leu Asp Ile Glu Trp Met Gln Val Asn Ser Asp Pro 35 40 45 Ala His His Arg Glu Asn Val Phe Leu Ser Tyr Gln Asp Lys Arg Ile 50 55 60 Asn His Gly Ser Leu Pro His Leu Gln Gln Arg Val Arg Phe Ala Ala 65 70 75 80 Ser Asp Pro Ser Gln Tyr Asp Ala Ser Ile Asn Leu Met Asn Leu Gln 85 90 95 Val Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Glu Cys Arg Val Lys Lys Thr Thr Met 100 105 110 Ala Thr Arg Lys Val Ile Val Thr 115 120 <210> 25 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens VSIG-8 Ig-like V-type domain <400> 25 Pro Ala Val Pro Met Cys Trp Thr Glu Gly His Met Thr Tyr Gly Asn 1 5 10 15 Asp Val Val Leu Lys Cys Tyr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Pro Leu Ser 20 25 30 Tyr Lys Trp Ala Lys Ile Ser Gly His His Tyr Pro Tyr Arg Ala Gly 35 40 45 Ser Tyr Thr Ser Gln His Ser Tyr His Ser Glu Leu Ser Tyr Gln 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by anti-VISTA antibody clone 5M1-A11 <400> 29 Asp Lys Gly His Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr 1 5 10 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope recognised by anti-VISTA antibody clone 9M2-C12 <400> 30 Arg His His His Ser Glu His Arg Val His Gly 1 5 10 <210> 31 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Positions 61 to 162 of human VISTA (Q9H7M9-1, v3) <400> 31 Asp Lys Gly His Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser 1 5 10 15 Arg Gly Glu Val Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu 20 25 30 Thr Phe Gln Asp Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn 35 40 45 Thr Ser His Asp Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp 50 55 60 His His Gly Asn Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp 65 70 75 80 Ser Gly Leu Tyr Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser 85 90 95 Glu His Arg Val His Gly 100 <210> 32 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4M2-C12 heavy chain variable region <400> 32 Glu Val Lys 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region <400> 40 Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Ala Ile Leu Ser Thr Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Asn Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys 100 105 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4M2-C12, 4M2-B4, V4H1, V4H2 light chain CDR1 <400> 41 Ser Ser Val Gly Tyr 1 5 <210> 42 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4M2-C12, 4M2-B4 light chain CDR2 <400> 42 Ala Thr Ser 1 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4M2-C12, 4M2-B4, V4H1, V4H2 light chain CDR3 <400> 43 Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 44 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4M2-C12 light chain FR1 <400> 44 Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Ala Ile Leu Ser Thr Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 20 25 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4M2-C12, 4M2-B4 light chain FR2 <400> 45 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 46 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4M2-C12, 4M2-B4 light chain FR3 <400> 46 Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Ser Asn Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4M2-C12, 4M2-B4, V4H1, V4H2 light chain FR4 <400> 47 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4M2-B4 heavy chain variable region <400> 48 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 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light chain variable region <400> 57 Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys 100 105 <210> 58 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V4H1 light chain CDR2 <400> 58 Asp Thr Ser 1 <210> 59 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V4H1 light chain FR1 <400> 59 Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 20 25 <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V4H1 light chain FR2 <400> 60 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 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<220> <223> V4H2 heavy chain FR1 <400> 63 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V4H2 heavy chain FR2 <400> 64 Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 15 Tyr <210> 65 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V4H2 heavy chain FR3 <400> 65 Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr 1 5 10 15 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Asp Cys 35 <210> 66 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V4H2 light chain variable region <400> 66 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Leu 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 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Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala Thr 100 105 110 Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Val Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro 115 120 125 Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala 130 135 140 Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala 145 150 155 160 Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr 165 170 175 Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met 180 185 190 Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln 195 200 205 Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala 210 215 220 Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala 225 230 235 240 Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser 245 250 255 Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu Phe Ile Pro Phe Ser Val Ser 260 265 270 Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val 275 280 285 Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His Ile Ser Val Lys Gln Cys 290 295 300 <210> 327 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSGL-1 transmembrane domain (Q14242-1, v1 positions 321 to 341) <400> 327 Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu Val Ala Thr Ile Phe Phe Val 1 5 10 15 Cys Thr Val Val Leu 20 <210> 328 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSGL-1 cytoplasmic domain (Q14242-1, v1 positions 342 to 412) <400> 328 Ala Val Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr 1 5 10 15 Ser Pro Thr Glu Met Val Cys Ile Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly 20 25 30 Glu Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser 35 40 45 Pro Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu 50 55 60 Thr Leu His Ser Phe Leu Pro 65 70 <210> 329 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSGL-1 extracellular domain repeat region (Q14242-1, v1 positions 122 to 261) <400> 329 Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Val 1 5 10 15 Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr 20 25 30 Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr 35 40 45 Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln 50 55 60 Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala 65 70 75 80 Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala 85 90 95 Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr 100 105 110 Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr 115 120 125 Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Met Glu Ala 130 135 140 <210> 330 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4M2-C12 VH-CH1-CH2-CH3 IgG4 <400> 330 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Ile Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445

Claims (34)

  1. Fc-매개 기능(Fc-mediated function)에 독립적으로, VISTA와 결합하고 VISTA-매개 신호전달을 억제할 수 있는, 선택적으로 단리된, 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 항원 결합 분자는
    (i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
    서열번호 305의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
    서열번호 306의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
    서열번호 307의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
    (ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
    서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
    서열번호 308의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
    서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 결합 분자는
    (i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
    서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
    서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
    서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
    (ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
    서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
    서열번호 309의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
    서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
    (i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
    서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
    서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
    서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
    (ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
    서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
    서열번호 295의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
    서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
    (i) 다음 CDR을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역:
    서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
    서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
    서열번호 278의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
    (ii) 다음 CDR을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역:
    서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
    서열번호 300의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
    서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
    서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
    서열번호 310의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
    서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
    서열번호 294의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
    서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
    서열번호 297의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자는
    서열번호 289의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
    서열번호서열번호노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
    을 포함하는, 항원 결합 분자.
  10. (i) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 및 (ii) VISTA 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 포함하는, 선택적으로 단리된, 항원 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR).
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 제11항에 따른 CAR을 인코딩(encoding)하는, 선택적으로 단리된, 핵산 또는 다수의 핵산.
  13. 제12항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제11항에 따른 CAR, 제12항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산 또는 제13항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포.
  15. 핵산(들) 또는 발현 벡터(들)로부터 항원 결합 분자 또는 CAR의 발현에 적합한 조건 하에, 제12항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산 또는 제13항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제11항에 따른 CAR, 제12항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제13항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 또는 제14항에 따른 세포를 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, VISTA 이외의 면역 체크포인트 (checkpoint) 분자에 의해 매개되는 신호전달(signalling)을 억제할 수 있는 제제를 추가로 포함하고, 선택적으로 VISTA 이외의 면역 체크포인트 분자는 PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT 및 BTLA로부터 선택되는 조성물.
  18. 의학적 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제11항에 따른 CAR, 제12항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제13항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제14항에 따른 세포, 또는 제16항 또는 제17항에 따른 조성물.
  19. 암 또는 감염성 질병의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제11항에 따른 CAR, 제12항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제13항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제14항에 따른 세포, 또는 제16항 또는 제17항에 따른 조성물.
  20. 암 또는 감염성 질병의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조 시의, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제11항에 따른 CAR, 제12항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제13항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제14항에 따른 세포, 또는 제16항 또는 제17항에 따른 조성물의 용도.
  21. 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제11항에 따른 CAR, 제12항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제13항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제14항에 따른 세포, 또는 제16항 또는 제17항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 감염성 질병의 치료 또는 예방 방법.
  22. 암은 VISTA를 발현하는 세포를 포함하는 암, VISTA를 발현하는 세포의 침윤을 포함하는 암, VISTA를 발현하는 암 세포를 포함하는 암, 혈액암 (hematological cancer), 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 다발성 골수종, 중피종 (mesothelioma), 고형 종양 (solid tumor), 폐암, 비 소세포 폐 암종 (non-small cell lung carcinoma), 위암, 위 암종 (gastric carcinoma), 결장직장암 (colorectal cancer), 결장직장 암종 (colorectal carcinoma), 결장직장 선암종 (colorectal adenocarcinoma), 자궁암, 자궁 체부 내막 암종 (uterine corpus endometrial carcinoma), 유방암, 삼중 음성 침습성 유방 암종 (triple negative breast invasive carcinoma), 간암, 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma), 췌장암, 췌관 선암종 (pancreatic ductal adenocarcinoma), 갑상선암, 흉선종 (thymoma), 피부암, 흑색종 (melanoma), 피부 흑색종 (cutaneous melanoma), 신장암, 신세포 암종 (renal cell carcinoma), 유두 신세포 암종 (renal papillary cell carcinoma), 두경부암 (head and neck cancer), 두경부의 편평 세포 암종 (squamous cell carcinoma of the head and neck) (SCCHN), 난소암, 난소 암종 (ovarian carcinoma), 난소 장액성 낭샘암종 (ovarian serous cystadenocarcinoma), 전립선 암 및/또는 전립선 선암종으로부터 선택되는 제19항에 따른 사용하기 위한 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물, 제20항에 따른 용도 또는 제21항에 따른 방법.
  23. 골수-유래 억제 세포 (MDSC)가 병리적으로 관련된 것인, 질병의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제11항에 따른 CAR, 제12항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제13항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제14항에 따른 세포, 또는 제16항 또는 제17항에 따른 조성물.
  24. 질병의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조 시의, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제11항에 따른 CAR, 제12항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제13항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제14항에 따른 세포, 또는 제16항 또는 제17항에 따른 조성물의 용도로서, 골수-유래 억제 세포 (MDSC)가 병리적으로 관련된 것인 용도.
  25. 골수-유래 억제 세포 (MDSC)가 병리적으로 관련되고, 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자, 제11항에 따른 CAR, 제12항에 따른 핵산 또는 다수의 핵산, 제13항에 따른 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 제14항에 따른 세포, 또는 제16항 또는 제17항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질병의 치료 또는 예방 방법.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 본 방법은 VISTA 이외의 면역 체크포인트 억제제에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 제제(agent)의 투여를 추가로 포함하고, 선택적으로 VISTA 이외의 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT 또는 BTLA로부터 선택되는, 사용하기 위한, 항원 결합 분자, CAR, 핵산 또는 다수의 핵산, 발현 벡터 또는 다수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물, 용도 또는 방법.
  27. VISTA-매개 신호전달을 억제하는 방법으로서, VISTA-발현 세포와 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  28. 골수-유래 억제 세포 (MDSC)의 활성을 억제하기 위한 방법으로서, 본 방법은 MDSC와 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  29. 효과기 면역 세포의 수 또는 활성을 증가시키기 위한 방법으로서, 본 방법은 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 사용하여 VISTA-발현 세포의 활성을 억제시키는 단계를 포함하는 방법.
  30. VISTA에 결합된 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 포함하는, 선택적으로 단리된, 시험관내 복합체.
  31. VISTA를 포함하거나 포함하는 것으로 추측되는 샘플과 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계, 및 항원 결합 분자와 VISTA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  32. VISTA-표적화된 제제를 사용한 치료를 위해 대상체를 선택하거나 계층화(stratifying)하는 방법으로서, 본 방법은 시험관내에서, 대상체로부터의 샘플과 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자를 접촉시키는 단계 및 항원 결합 분자와 VISTA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 시험관내 또는 생체내 진단제 또는 예후제로서의, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자의 용도.
  34. 암을 검출하거나, 국재화하거나 영상화하는 방법에서의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자의 용도로서, 선택적으로 암은 VISTA를 발현하는 세포를 포함하는 암, VISTA를 발현하는 세포의 침윤을 포함하는 암, VISTA를 발현하는 암 세포를 포함하는 암, 혈액암, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 다발성 골수종, 중피종, 고형 종양, 폐암, 비 소세포 폐 암종, 위암, 위 암종, 결장직장암, 결장직장 암종, 결장직장 선암종, 자궁암, 자궁 체부 내막 암종, 유방암, 삼중 음성 침습성 유방 암종, 간암, 간세포 암종, 췌장암, 췌장 유관 선암종, 갑상선암, 흉선종, 피부암, 흑색종, 피부 흑색종, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 유두 세포 암종, 두경부암, 두경부의 편평 세포 암종 (SCCHN), 난소암, 난소 암종, 난소 장액성 낭샘암종, 전립선 암 및/또는 전립선 선암종으로부터 선택되는 용도.
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