TW202334234A - 一種抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了一種抗體或其抗原結合蛋白。該抗體或其抗原結合蛋白可以特異性結合人CD3或人GPRC5D蛋白或MUC16或特異性結合人CD3和第二抗原。本發明進一步提供了編碼該抗體的核酸分子、用於表達該抗體的表達載體、宿主細胞及其製備方法。本發明還提供了使用本發明的抗體的診斷和治療方法。
Description
本發明提供了一種抗體或其抗原結合蛋白，以及基於其構建的非對稱性雙特異性抗體。本發明進一步提供了編碼該抗體的核酸分子、用於表達該抗體的表達載體、宿主細胞及其製備方法。本發明還提供了使用本發明的抗體的診斷和治療方法。
CD3是與T細胞受體複合物(TCR)結合的在T細胞上表達的同型二聚體或異二聚體抗原，並且是T細胞活化所需要的。功能性CD3由以下四種不同鏈中的兩種的二聚締合形成：ε、ζ、δ和γ。CD3二聚體排列包含γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。已顯示針對CD3的抗體在T細胞上聚集CD3，從而以類似於藉由肽負載的MHC分子參與TCR的方式引起T細胞活化。因此，已提出抗CD3抗體用於涉及T細胞活化的治療目的。此外，已提出能夠結合CD3和靶向腫瘤表面抗原的雙特異性抗體能夠將腫瘤細胞和T細胞銜接，從而直接活化T細胞，釋放顆粒酶、穿孔素及細胞因子殺傷腫瘤，從而達到抑制腫瘤的治療目的。
G蛋白偶聯受體家族C組5成員D(GPRC5D)作為一個孤兒受體，被發現在多發性骨髓瘤病人的漿細胞中高表達，且與病人的生存率相關(Atamaniuk,J.,et al.(2012)."Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the
bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma." Eur J Clin Invest 42(9)：953-960.)。藉由進一步的研究顯示在正常人的血細胞中GPRC5D表達於漿細胞表面，其他的血細胞表面GPRC5D表達都是陰性，從多發性骨髓瘤患者體內分離出的CD38+CD138+的漿細胞表面GPRC5D高表達(Kodama,T.,et al.(2019)."Anti-GPRC5D/CD3 Bispecific T-Cell-Redirecting Antibody for the Treatment of Multiple Myeloma." Mol Cancer Ther 18(9)：1555-1564.)，對患者多發性骨髓瘤細胞的分析發現GPRC5D與BCMA的表達不具有相關性(Smith,E.L.,et al.(2019)."GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells." Sci Transl Med 11(485).)(Pillarisetti,K.,et al.(2020)."A T-cell-redirecting bispecific G-protein-coupled receptor class 5 member D x CD3 antibody to treat multiple myeloma." Blood 135(15)：1232-1243.)，因此GPRC5D可以作為多發性骨髓瘤的一個腫瘤特異性靶點。此外，GPRC5D還可以作為其他腫瘤的腫瘤特異性靶點。
MUC16蛋白，自從發現以來一直被用做卵巢癌的特異性標記物，而且也被認為與卵巢癌的不良預後相關。MUC16是一種分子量巨大的一型跨膜糖蛋白，由胞外域、跨膜段和胞內部分組成；胞外域分為兩部分，前半段發生高度的糖基化，胞外域的後半段由約60個串聯的重複結構域組成，其中每個重複結構域有156個胺基酸。MUC16蛋白N端含有56個SEA結構域，MUC16蛋白在胞外域近膜端第一個或第二個SEA域發生截斷並釋放出游離的CA125(Das,S.and S.K.Batra(2015)."Understanding the Unique Attributes of MUC16(CA125)：Potential Implications in Targeted Therapy." Cancer Res 75(22)：4669-4674，CA125 enters the circulation by being shed from the full-length MUC16 at the cell surface，
Das,S.,et al.(2015)."Membrane proximal ectodomain cleavage of MUC16 occurs in the acidifying Golgi/post-Golgi compartments" Sci Rep 5：9759)。除了卵巢癌，CA125指標在其他腫瘤中也發現上升，如乳腺癌、胰腺癌、結直腸癌和非小細胞肺癌等。有研究顯示MUC16促進腫瘤的侵入、轉移和抑制免疫反應等，基於此MUC16可能是一個潛在的治療癌症的靶點。雖然很早就有以MUC16為靶點的療法進入臨床研究，但是臨床的結果都未能達到預期(Aithal,A.,et al.(2018)，"MUC16 as a novel target for cancer therapy"，Expert Opin Ther Targets 22(8)：675-686)，主要原因是已經開發的大部分抗體都能結合循環中游離的CA125，從而減少了抗體與膜MUC16的結合量，降低了抗體的腫瘤穿透能力。
近年來免疫檢查點抑制劑(ICI)開啟了腫瘤免疫療法的新紀元，藉由阻斷免疫檢查點分子(例如PD-1或者CTLA4)與配體的結合來解除免疫抑制，從而恢復T細胞的功能。截至目前免疫檢查點抑制劑類的藥物已經在一些適應症獲得批准上市，如黑色素瘤、非小細胞肺癌、淋巴瘤等(Pico de Coana,Y.,et al.(2015)."Checkpoint blockade for cancer therapy：revitalizing a suppressed immune system." Trends Mol Med 21(8)：482-491)(Bu,X.,et al.(2017)."Immune Checkpoint Blockade in Breast Cancer Therapy." Adv Exp Med Biol 1026：383-402)(Hargadon,K.M.,et al.(2018)."Immune checkpoint blockade therapy for cancer：An overview of FDA-approved immune checkpoint inhibitors." Int Immunopharmacol 62：29-39)。儘管如此，只有很少部分的卵巢癌患者能夠從免疫檢查點抑制劑藥物的治療中獲益(Borella,F.,et al.(2020)."Immune Checkpoint Inhibitors in Epithelial Ovarian Cancer：An Overview on Efficacy and Future Perspectives." Diagnostics(Basel)10(3))(Lorusso,D.,et al.(2020)."Emerging role of immune checkpoint inhibitors in the
treatment of ovarian cancer." Expert Opin Emerg Drugs 25(4)：445-453)。免疫系統主要藉由T細胞來清除體內的腫瘤細胞，而腫瘤細胞藉由多種方法來逃逸免疫系統的殺傷。T細胞鏈接器是一類雙特異性抗體，它可以同時結合到T細胞的CD3和腫瘤細胞的腫瘤相關性抗原(TAA)上(Labrijn,A.F.,et al.(2019)."Bispecific antibodies：a mechanistic review of the pipeline." Nat Rev Drug Discov 18(8)：585-608.)(Ellerman,D.(2019)."Bispecific T-cell engagers：Towards understanding variables influencing the in vitro potency and tumor selectivity and their modulation to enhance their efficacy and safety" Methods 154：102-117)。這種雙特異性抗體藉由同時結合到T細胞和腫瘤細胞，驅動細胞間形成免疫突觸，激活T細胞對腫瘤細胞進行殺傷。博納吐單抗(blinatumomab)作為第一個上市的T細胞鏈接器已經證實了這個理論的可行性，更多的T細胞鏈接器已經處於早期開發中而且被廣泛用於治療血液瘤和實體瘤(Goebeler,M.E.and R.C.Bargou(2020)."T cell-engaging therapies-BiTEs and beyond." Nat Rev Clin Oncol 17(7)：418-434.)。
因此，本領域存在對開發特異性結合CD3的抗體、特異性結合CD3和另一抗原抗體以及基於其構建的雙特異性抗體的需要，用於治療癌症。
本發明提供了靶向人CD3的抗CD3抗體或其抗原結合片段，其具有如下優點：
1)高特異性結合人CD3以及表達人CD3的靶細胞；
2)適合作為基因工程構件；
3)低免疫原性。
本發明還提供了靶向人MUC16的抗MUC16抗體、其具有以下一種或者多種優點：
(1)高親和力結合MUC16(例如人或猴MUC16)、表達人MUC16的靶細胞；
(2)不結合循環中游離的CA125；
(3)適合作為基因工程構件；
(4)低免疫原性；
(5)表達純度高；
(6)人源化之後仍然具有高親和力。
本發明提供了一種新型的抗GPRC5D抗體，以及應用其構建的與CD3抗體的雙特異性抗體。在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體與人GPRC5D的結合親和力很高，能夠識別人和猴(例如食蟹猴)GPRC5D。
在一些實施方案中，抗GPRC5D抗體可以以高親和力特異性結合GPRC5D(例如人GPRC5D和/或猴(例如食蟹猴)GPRC5D)，結合活性顯著優於對照抗體GC5B596。
本發明還提供基於CD3的雙特異性抗體，例如特異性結合CD3和MUC16的雙特異性抗體。
本發明的抗CD3×MUC16雙特異性抗體具有以下一種或多種特性：
(1)高特異性結合人CD3、表達人CD3的靶細胞和同時高親和力結合人MUC16、表達人MUC16的靶細胞；
(2)不結合循環中游離的CA125，同時將更多的T細胞靶向表達MUC16的癌細胞；
(3)激活T細胞，並引發對表達MUC16的癌細胞的細胞毒活性，從而有效殺傷癌細胞；
(4)低免疫原性；
(5)優異的抑瘤效果。
本發明的抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體具有以下一種或多種特性，因此在GPRC5D相關的適應症中存在光明的治療前景：
(1)在細胞(例如T細胞，例如Jurkat細胞)中，與細胞上表達的CD3結合；
(2)與人和/或猴(例如食蟹猴)GPRC5D結合，例如與細胞上表達的GPRC5D結合，例如以高親和力與GPRC5D結合；
(3)在存在表達GPRC5D的細胞時才能夠激活CD3信號通路，例如在表達GPRC5D細胞存在的前提下才能夠激活CD3信號通路；
(4)在無表達GPRC5D細胞的情況下，只有在高濃度能夠激活CD3信號通路；
(5)對CD3的信號通路具有較少的非特異性激活；例如，在不表達GPRC5D的細胞(例如HEK293T細胞)中，只在高濃度下激活信號通路，且具有濃度依賴性；
(6)更加特異性的誘導T細胞殺傷表達GPRC5D的細胞，無非特異性激活或無可見的非特異性激活；例如，僅殺傷表達GPRC5D的靶細胞而不殺傷不表達GPRC5D的細胞；
(7)具有較好的細胞因子誘導特異性；例如僅在表達GPRC5D的細胞(例如HEK293T-GPRC5D細胞)中誘導細胞釋放細胞因子，例如干擾素，如IFNγ；腫瘤壞死因子如TNFα和/或白細胞介素如IL-6；
(8)例如體外結合測定，例如Fortebio中，能夠特異性結合人和猴(例如食蟹猴)CD3蛋白，即具有種屬交叉活性；
(9)保留了最佳的CD3親和力，例如在體外結合測定中，例如Fortebio中，親和力KD在1-1000nM之間，例如與猴(例如食蟹猴)的結合親和力KD在1-100nM之間，例如在10-100nM之間，例如在50-100nM之間，例如與人的結合親和力KD在1-1000nM之間，例如在1-100nM之間，例如在10-100nM之間，例如在50-100nM之間，例如在100-1000nM之間，例如在200-1000nM之間；
(10)具有更好的腫瘤抑制作用，例如腫瘤抑制率在35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%以上，甚至能夠使得腫瘤完全消退；
(11)能夠結合細胞上表達的人和猴(例如食蟹猴)GPRC5D，和/或能夠結合細胞上表達的人和猴(例如食蟹猴)CD3，對於GPRC5D和/或CD3具有種屬交叉活性。
圖1顯示人源化抗CD3抗體Roche-CD3/017-Roche-CD3、DA023AH23L2(圖1A)和017-2(圖1B)激活Jurkat/NFAT-luc報告基因系統的結果。
圖2顯示鼠源抗GPRC5D抗體與表達人GPRC5D蛋白(上)和食蟹猴GPRC5D蛋白(下)的細胞結合。
圖3顯示人源化抗GPRC5D抗體與表達人GPRC5D蛋白的工程化細胞結合。
圖4為雙特異性分子結構示意圖。
圖5顯示抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體與穩定表達人CD3蛋白的Jurkat細胞結合。
圖6顯示A和B：抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體與穩定表達人GPRC5D蛋白的HEK293T細胞結合；C：抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體Bi-29H6-6與穩定表達食蟹猴GPRC5D蛋白的HEK293T細胞結合；D-F：抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體Bi-29H6-6不結合表達GPRC5A、GPRC5B或GPRC5C蛋白的細胞。
圖7顯示抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體能在表達人GPRC5D的細胞存在時激活CD3信號通路。
圖8顯示抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體在不表達人GPRC5D的細胞存在時不能激活CD3信號通路。
圖9顯示抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體誘導PBMC特異性的殺傷表達GPRC5D的腫瘤細胞。
圖10顯示抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體介導的PBMC對非相關靶細胞Raji的殺傷。
圖11顯示抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體在NCI-H929體系中T細胞釋放分泌因子IFNγ(A)、IL-6(B)和TNFα(C)的檢測。
圖12顯示抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體在不表達GPRC5D的Raji體系中T細胞釋放分泌因子IFNγ(A)、IL-6(B)和TNFα(C)的檢測。
圖13顯示A：抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體在人CD3E轉基因小鼠MC38-huGPRC5D模型中的抗腫瘤作用；B：抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體在NCG小鼠移植人PBMC接種NCI-H929腫瘤模型中的抗腫瘤作用。
圖14顯示鼠源抗MUC16抗體776.1及其突變體的SDS-PAGE電泳結果(左圖是非還原型SDS-PAGE電泳結果，右圖是還原型SDS-PAGE電泳結果)。
圖15顯示鼠源抗人MUC16抗體776.1及其突變體與表達人Muc16蛋白的293T細胞結合的流式細胞術檢測結果。
圖16顯示鼠源抗人MUC16抗體776.1及其突變體與表達恆河猴MUC16蛋白的293T細胞結合的流式細胞術檢測結果。
圖17顯示人源化抗MUC-16抗體Hu-L4H7與表達人MUC16蛋白的293T細胞結合的ELISA結果。
圖18顯示人源化抗MUC-16抗體Hu-L4H7不結合人CA125的ELISA結果。
圖19顯示腫瘤組織中MUC16及CD8的免疫組化檢測結果。
圖20顯示雙特異性抗體分子的結構示意圖
圖21顯示抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體結合OVCAR3細胞。
圖22顯示抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體結合293T/恆河猴MUC16細胞。
圖23顯示抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體結合Jurkat細胞。
圖24顯示抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體在OVCAR3腫瘤細胞存在時激活Jurkat/NFAT-luc細胞。
圖25顯示抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體在293T細胞存在時不激活Jurkat/NFAT-luc細胞。
圖26顯示A：抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體特異性介導T細胞殺傷腫瘤細胞；B：抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體特異性介導T細胞殺傷OVCAR3腫瘤細胞的活性，孵育72小時
圖27顯示抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體激活T細胞後誘導釋放細胞因子的結果，其中比較了分別與OVCAR3或者293T細胞共培養細胞因子IFNγ、TNFα以及IL-6因子的釋放情況。
圖28A顯示給藥後各組腫瘤體積增長結果。
圖28B顯示給藥後各組腫瘤相對體積增長結果。
圖29顯示TDCC實驗中T細胞激活、衰竭和凋亡檢測。
圖30顯示抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體特異性介導T細胞重複殺傷腫瘤細胞。
圖31顯示TDCC重複殺傷實驗中T細胞激活、衰竭和凋亡檢測。
發明詳述
應理解本發明不限於本文中描述的特定方法學、方案和試劑，因為這些可以變化。還應理解本文中使用的術語僅為了描述具體實施方案，而並不意圖限制本發明的範圍，其僅會由所附申請專利範圍限制。
I.定義
為了解釋本說明書，將使用以下定義，並且只要適當，以單數形式使用的術語也可以包括複數，並且反之亦然。除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域具有通常知識者通常的理解具有相同的含義。
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小10%的下限和比指定數字數值大10%的上限的範圍內的數字數值。
如本文所用，術語“和/或”意指可選項中的任一項或可選項的兩項或多項或全部。
如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
在本文中當提及“第一”“第二”時，僅為了區分兩個結構域或兩條鏈，而不以任何方式表明兩個結構域的位置。
本文所使用的術語“CD3”指表達在T細胞上作為多分子T細胞受體(TCR)的部分的抗原，即T細胞銜接抗原T細胞表面糖蛋白CD3，其是由下列四條受體鏈中的二條鏈所形成的同源二聚體或異源二聚體所組成：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ和CD3-γ。人類CD3-ε(hCD3ε)包含UniProtKB/Swiss-Prot：P07766中所述的胺基酸序列。人類CD3-δ(hCD3δ)包含UniProtKB/Swiss-Prot：P04234中所述的胺基酸序列。在一些實施方案中，本發明所述的CD3是指來自人或猴(例如食蟹猴)的CD3。
本文所使用的術語“結合CD3的抗體”或“抗CD3抗體”包含特異性識別單一CD3亞單元(例如ε、δ、γ或ζ)或與其結合的抗體和其抗原結合片段，以及特異性識別兩個CD3亞單元的二聚複合物(例如，γ/ε、δ/ε和ζ/ζCD3二聚體)以及與其連結的抗體和其抗原結合片段。本發明的抗體和抗原結合片段可與可溶性CD3、結合CD3和/或細胞表面表達的CD3結合。可溶性CD3包含天然的CD3蛋白以及重組的CD3蛋白變異體，例如，缺乏跨膜區或另外不與細胞膜結合的單體和二聚體CD3結構。在一個實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段(例如ScFv)或雙特異性抗體中的結合CD3中的抗原結合區可以對CD3或表達CD3的細胞(例如T細胞)具有較低的結合活性。可以藉由流式細胞術檢測或生物膜層光學干涉技術檢測，例如實施例6.5或實施例10.2中所述測定試驗，檢測抗體對CD3的結合親和力。較佳地，在本發明的雙特異性抗體分子中，結合CD3的抗原結合區對人或猴(食蟹猴)CD3的結合親和力在1-1000nM之間。在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體中的結合CD3中的抗原結合區以較低的結合親和力結合人類和/或猴(例如食蟹猴)CD3從而能夠激活人類和/或猴(例如食蟹猴)的T細胞。
效應細胞包含效應T細胞(T淋巴細胞)，例如CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、Th1、Th2和調節T細胞(Tregs)。效應細胞還可以包含自然殺傷細胞、巨噬細胞、粒細胞、漿細胞或B細胞(淋巴細胞)。
術語“GPRC5D”指腫瘤相關抗原G蛋白偶聯受體家族C組5成員D(例如，登錄號NP_061124.1下的人GPRC5D蛋白或XP_005570249.2下的食蟹猴GPRC5D蛋白)。在一個實施方案中，本發明的人GPRC5D蛋白包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，或具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成。在一個實施方案中，本發明的食蟹猴GPRC5D蛋白包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，或具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成。在一個實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段(例如Fab)或雙特異性抗體中的結合GPRC5D的抗原結合區對表達人GPRC5D的細胞具有高親和力結合活性，例如具有比對照抗體(例如GC5B596)更高的結合親和力。在一個實施方案中，藉由流式細胞術測定，例如實施6.2所述的測定實驗。在一個實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段(例如Fab)或雙特異性抗體中的結合GPRC5D中的抗原結合區對人和猴(例如食蟹猴)GPRC5D具有交叉反應性，即能結合人和猴(例如食蟹猴)GPRC5D。
術語“全抗體”、“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指天然存在的包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。在一些實施方案中，本發明的抗體重鏈恆定區HC為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區，較佳的IgG1的重鏈恆定區。在一些實施方案中，重鏈恆定區包含LALA突變。在一些
實施方案中，重鏈恆定區包含D265A和P329A突變。在一些實施方案中，重鏈恆定區包含LALA突變和D265A和P329A突變。在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體分子的重鏈恆定區包含“結入扣突變”。在一些較佳的實施方案中，本發明的抗體重鏈恆定區HC
(i)包含與選自SEQ ID NO：45或48的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：45或48的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：45或48的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些實施方案中，本發明的抗體輕鏈恆定區LC為Lambda或Kappa輕鏈恆定區。在一些實施方案中，本發明的抗體輕鏈恆定區LC
(i)包含與選自SEQ ID NO：47或50的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：47或50的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：47或50的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
術語“抗體片段”包括完整抗體的一部分。在較佳的實施方案中，抗體片段為抗原結合片段。
術語“抗原結合片段”是比完整或完全抗體的胺基酸殘基數要少的完整或完全抗體的一部分或一段，其能結合抗原或與完整抗體(即與抗原結合片段所來源的完整抗體)競爭結合抗原。可以藉由重組DNA技術、或藉由酶或化學切割完整的抗體製備抗原結合片段。抗原結合片段包括但不限於Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、單鏈Fv、雙體抗體(diabody)、單結構域抗體(sdAb)。該Fab片段是一種由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段，例如，藉由木瓜蛋白酶消化完全抗體能夠獲得Fab片段。此外，藉由胃蛋白酶在鉸鏈區的二硫鍵下面消化完全抗體產生F(ab')2，其為Fab’的二聚體，是二價的抗體片段。F(ab')2可以在中性條件下藉由破壞鉸鏈區中的二硫鍵而被還原，由此將F(ab')2二聚體轉化為Fab'單體。Fab'單體基本上是具有鉸鏈區的Fab片段(其它抗體片段的更詳細的描述請參見：基礎免疫學(Fundamental Immunology),W.E.Paul編輯，Raven Press,N.Y.(1993))。該Fv片段由抗體單臂的VL和VH結構域組成。另外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由獨立的基因編碼，但是使用重組方法，可以將它們藉由能夠使這兩個結構域作為單條蛋白鏈產生的合成性連接肽連接，在該單條蛋白鏈中VL區和VH區配對以形成單鏈Fv(scFv)。可以藉由化學方法、重組DNA方法或蛋白酶消化法獲得該抗體片段。
“Fab片段”或“Fab”在本文中可互換使用，用於指，由兩條多肽鏈組成的、包含免疫球蛋白重鏈可變結構域VH、重鏈恆定結構域CH1、輕鏈可變結構域VL和輕鏈恆定結構域CL的免疫球蛋白片段，其中，一條多肽鏈從N端到C端包含VH和選自CH1和CL的一個恆定區，另一條多肽鏈從N端到C端
包含VL和選自CL和CH1的另一恆定區，其中該VH結構域和VL結構域配對形成抗原結合位點。在本文中，包含重鏈恆定區CH1的Fab鏈也稱作“Fab重鏈”；相應地，包含輕鏈恆定區CL的Fab鏈也稱作“Fab輕鏈”。
術語“靶標”是指結合分子所針對的被結合物。靶標可以是抗原，也可以是配體或受體。
術語“抗原”是指引發免疫應答的分子。這種免疫應答可能涉及抗體產生或特異性免疫細胞的活化，或兩者兼有。所屬技術領域具有通常知識者將理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白質或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因組DNA。如本文所用，術語“表位”指抗原中與抗體分子特異性相互作用的部分。
如本文所用的術語“靶標結合區”是指多特異性結合分子，例如雙特異性結合分子的結合特定靶標或抗原的部分。靶標結合區可以是例如抗體或免疫球蛋白本身或抗體片段。這種靶標結合區可以具有或可以不具有獨立於雙特異性抗體分子的剩餘部分的三級結構，並且可以作為單獨實體結合或不結合其靶標。靶標結合區還可以是受體或配體，或受體的能夠結合配體的結構域。在多特異性抗體或雙特異性抗體時，也將“靶標結合區”稱為“抗原結合區”。在一個實施方案中，用於本發明雙特異性抗體分子的抗原結合區包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)組成的VH/VL對，該VH/VL對可以包含在單一多肽鏈(例如在scFv)中或包含在分離的兩條多肽鏈(例如分別在Fab重鏈和Fab輕鏈)中。
如本文所用，術語“單特異性”抗體指具有一個或多個結合位點的抗體，該位點中的每一個位點與相同抗原的相同表位結合。如本文所用，術語“多
特異性”抗體指具有至少兩個抗原結合位點的抗體，其中至少一個抗原位點，相對於其餘的抗原結合位點，結合不同的抗原表位，例如，相同抗原上的不同表位或不同抗原上的不同表位。例如，本發明提供了針對GPRC5D的抗體、針對CD3的抗體和針對GPRC5D和CD3的雙特異性抗體。本發明還提供了針對CD3和MUC16的雙特異性抗體。
術語“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗體的結構的蛋白質。例如，IgG類免疫球蛋白是由二硫鍵鍵合的兩條輕鏈和兩條重鏈組成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。從N端至C端，每條免疫球蛋白重鏈具有一個重鏈可變區(VH)，也稱作重鏈可變結構域，隨後是三個重鏈恆定結構域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N端至C端，每條免疫球蛋白輕鏈具有一個輕鏈可變區(VL)，也稱作輕鏈可變結構域，隨後是一個輕鏈恆定結構域(CL)。免疫球蛋白的重鏈可以歸屬5個類別之一，稱作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些類別可以進一步劃分成亞類，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列而劃分成兩種類型之一，稱作κ和λ。IgG免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白鉸鏈區連接的兩個Fab分子和兩個二聚化的Fc區(Fc二聚體)組成。
術語“可變區”或“可變結構域”是指參與抗體與抗原結合的抗體重或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變區通常具有相似的結構，其中每個結構域包含四個保守的框架區(FR)和三個互補決定區。
“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作
CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知的抗體CDR指派方案的任一種或其組合確定，該指派方案包括例如：基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，國際ImMunoGeneTics database(IMGT)(在萬維網上imgt.cines.fr/上)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。
以下為採用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT方案定義的CDR的區域範圍。
除非另有說明，否則在本發明中，術語“CDR”或“CDR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的CDR序列。CDR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。除非另有說明，否則在本發明中，當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時，是指根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的Kabat編號系統的編號位置。
在一本實施方案中，本發明抗體中的HCDR和LCDR按照Kabat方案確定。
應該注意，基於不同的指派方案獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派方案下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，該抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含該具體CDR序列，但是由於應用了
不同的方案(例如不同的指派方案規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。
術語“Fc結構域”或“Fc區”或“Fc片段”在本文中用來定義免疫球蛋白重鏈的含有至少一部分恆定區的C端區域。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。天然的免疫球蛋白“Fc結構域”包含兩個或三個恆定結構域，即CH2結構域、CH3結構域和可選的CH4結構域。例如，在天然抗體中，免疫球蛋白Fc結構域包含源自IgG、IgA和IgD類抗體的兩條重鏈的第二和第三恆定結構域(CH2結構域和CH3結構域)；或者包含源自IgM和IgE類抗體的兩條重鏈的第二、第三和第四恆定結構域(CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域)。除非本文中另外說明，否則Fc區或重鏈恆定區中的胺基酸殘基編號根據如Edelman,G.M.et al.,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)(https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/5257969/)中所述的EU編號體系(也稱作EU索引)進行編號，還參見http：//www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html。在本文中，術語“Fc結構域”或“Fc區”或“Fc片段”不包括免疫球蛋白的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL以及重鏈恆定區CH1和輕鏈恆定區CL，但在一些情況下可以包括在重鏈恆定區N端的鉸鏈區，例如EPKSS或EPKSC。在一些實施方案中，適用於本發明的重鏈恆定區Fc來自抗體重鏈恆定區，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區，較佳來自IgG1的恆定區。在一些實施方案中，Fc區包含降低與Fcγ受體結合的突變，例如LALA突變、D265A突變和/或P329A突變，較佳地包含LALA突變和D265A和P329A突變。在一些實施方案中，Fc包含SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列，或包含與
其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。在本發明的一些實施方案中，Fc片段二聚化構成Fc二聚體。在一些實施方案中，Fc片段異二聚化為Fc異二聚體。在Fc片段異二聚化為異二聚體的情況下，Fc片段可以包含用於異二聚化的突變，例如結入扣突變。
免疫球蛋白的“效應子功能”的例子包括：C1q結合和補體依賴的細胞毒性(CDC)、Fc受體結合作用、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物介導的抗原呈遞細胞攝取抗原、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)和B細胞活化。
術語“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)將恆定區或其部分改變、替換或交換，從而抗原結合位點與不同的或改變的類別、效應子功能和/或物種的恆定區或賦予嵌合抗體新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生長因子、藥物)等連接；或(b)將可變區或其部分用具有不同或改變的抗原特異性的可變區改變、替換或交換。例如，小鼠抗體可以藉由將其恆定區更換為來自人免疫球蛋白的恆定區進行修飾。由於更換為人類恆定區，該嵌合抗體可以保留其在識別抗原方面的特異性，同時如與原始小鼠抗體相比，具有在人類中降低的免疫原性。
“人源化抗體”是一種保留非人類抗體(例如小鼠單株抗體)的抗原特異性反應性，同時作為治療藥對人施用時免疫原性較低的抗體。這可以例如藉由保留非人類抗原結合位點並將抗體的剩餘部分替換成它們的人類相應部分(即，將恆定區以及可變區中不參與結合的部分替換為人類抗體的相應部分)來實現。
如本文所用，術語“抗”、“結合”或“特異性結合”意指結合作用對靶標或抗原是選擇性的並且可以與不想要的或非特異的相互作用區別。結合位點與特定靶標或抗原結合的能力可以藉由流式細胞術或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)或本領域已知的常規結合測定法如藉由放射性免疫測定(RIA)或生物膜薄層干涉測定法或MSD測定法或表面電漿共振法(SPR)測定。
“親和力”或“結合親和力”指反映結合對子的成員之間相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由解離常數(KD)表示，解離常數是解離速率常數和締合速率常數(分別是Kdis和Kon)的比例。親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的ForteBio動力學結合測定法。
胺基酸序列的“同一性百分數(%)”是指將候選序列與本說明書中所示的具體胺基酸序列進行比對並且如有必要的話為達到最大序列同一性百分數而引入空位後，並且不考慮任何保守置換作為序列同一性的一部分時，候選序列中與本說明書中所示的具體胺基酸序列的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基百分數。在一些實施方案中，本發明考慮本發明抗體分子的變體，該變體相對於在本文中具體揭露的抗體分子及其序列而言具有相當程度的同一性，例如同一性為至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%或更高。該變體可以包含保守性改變，或為保守性修飾變體。
對於多肽序列，“保守性改變”包括對多肽序列的置換、缺失或添加，但不實質性改變多肽序列的期望功能活性。例如，保守性置換常常導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸。提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。以下列出了8組含有互為保守替換的胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘
胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、谷胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、穀胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、賴胺酸(K)；5)異亮胺酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；和8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)。在一些實施方案中，術語“保守序列改變”用於指不顯著影響或改變含有胺基酸序列的本發明抗體分子或結合蛋白分子的目的抗原結合特徵的胺基酸修飾。例如保守修改變體相對於親本抗體或結合蛋白保持對目的抗原至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高，例如100-110%或更高的結合親和力。
“knob-in-hole”突變或“結入扣”突變或“杵臼”在本文中用於指，利用“結入扣”技術，在第一Fc多肽和第二Fc多肽中分別引入突變，以在第一Fc多肽的界面上與在第二Fc多肽的界面上形成凸起(“結(knob)”)和互補的空穴(“扣(hole)”)。本領域已知，“結入扣”技術可在抗體分子的不同鏈之間改造界面，以促進抗體分子的各鏈正確締合。通常，該技術涉及在一條鏈的界面引入“凸起/結”，在欲與之配對的另一條鏈的界面引入相應的“空穴/扣”，使得凸起可置於空穴中。一個較佳的界面包含一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域和欲與之配對的另一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域。可藉由將來自一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域的界面的小胺基酸側鏈替換為較大的側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)來構建凸起。藉由將大胺基酸側鏈替換為較小的側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)，在欲配對的另一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域的界面構建與凸起相同或相似大小的補償性空穴。另一可選的界面是上文所述Fab片段的包含輕鏈的CL結構域和重鏈的CH1結構域，藉由構建凸起-空穴相互作用促進Fab片段的兩條鏈之間發生正確的異二聚化。
“單鏈可變片段”或“scFv”在本文中用於指，包含由接頭連接的重鏈可變結構域VH和輕鏈可變結構域VL的單鏈抗體片段，其中VH和VL配對形成抗原結合位點。
在本文中，抗體恆定區或抗體恆定結構域，包括CH1，CL和Fc結構域以及構成Fc結構域的CH2、CH3和可選的CH4結構域，可以根據抗體分子的預期功能進行選擇。例如，恆定區可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM區，尤其是人IgG的免疫球蛋白恆定結構域，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定結構域，較佳人IgG1的恆定結構域。作為一個例子，抗體的Fab片段可以包含來自IgG1的CH和CL恆定區。作為再一例子，抗體的Fc區可以包含來自IgG1的CH2和CH3結構域。免疫球蛋白恆定區可以具有天然序列或變體序列。
如本文所用的術語“接頭”是指使得能夠直接連接雙特異性結合分子的不同部分的任何分子。在不同分子部分之間建立共價連接的接頭的實例包括肽接頭和非蛋白質聚合物，包括但不限於聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇、聚丙二醇的共聚物。在一些實施方案中，接頭是肽接頭(又稱為“連接肽”)，其是指是指由胺基酸組成的短胺基酸序列，例如單獨或組合使用的甘胺酸(G)和/或絲胺酸(S)和/或蘇胺酸殘基(T)，或來自免疫球蛋白的鉸鏈區，用於將結合分子的第一部分的胺基酸序列連接至結合分子的第二部分。例如，肽接頭可以將結合分子的第一靶標結合區連接至第二靶標結合區。例如，肽接頭也可以將抗體的一部分連接至抗體的另一部分，諸如將輕鏈可變區連接至重鏈可變區。較佳地，該肽接頭具有這樣的長度，其足以連接兩個實體，其方式使得它們維持它們相對於彼此的構象，使得不妨礙期望的活性。在一個實施方案中，連接肽具有5-50個胺基酸長度，例如，10、15、20、25、30個胺基酸長度。在一個
實施方案中，連接肽包含胺基酸序列(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)nG，其中n是等於或大於1的整數，例如，n是2、3、4、5、6、7、8、9、10的整數。有用的接頭還包括甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物和其他柔性接頭。在一些實施方案中，該肽接頭是(GGGGS)n，其中n=1、2、3或4，例如SEQ ID NO：12所示的序列。
在再一實施方案中，連接肽為來自免疫球蛋白的鉸鏈區或鉸鏈區部分，包括天然的鉸鏈區或其部分，或者突變的鉸鏈區或其部分。在一個實施方案中，連接肽例如是免疫球蛋白(例如IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的鉸鏈區或其部分(例如EPKSC)或是突變的鉸鏈區或其部分，例如EPKSS。或者，可以使用計算機程序模擬蛋白和肽的三維結構，或藉由噬菌體展示方法，來合理地設計合適的柔性連接肽。
術語“半數有效濃度(EC50)”是指在特定的暴露時間後誘導在基線和最大值之間的50%的應答的藥物、抗體或毒劑的濃度。
術語“宿主細胞”指已經向其中引入外源多核苷酸的細胞，包括這類細胞的子代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”，這包括原代轉化的細胞和從其衍生的子代。宿主細胞是可以用來產生本發明抗體分子的任何類型的細胞系統，包括真核細胞，例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞；和原核細胞，例如，大腸桿菌細胞。宿主細胞包括培養的細胞，也包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物組織或動物組織內部的細胞。
術語“載體”當在本文中使用時是指能夠增殖與其相連的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體以及結合到已經引入其的宿主細胞的基因組中的載體。術語“表達載體”是指包含重組多核苷酸的載
體，其包含有效連接要表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包含足夠的用於表達的順式作用元件；用於表達的其它元件可以由宿主細胞提供或在體外表達系統中。表達載體包括本領域已知的所有那些，包括被摻入重組多核苷酸的黏粒、質粒(例如，裸的或包含在脂質體中)和病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
術語“個體”或“受試者”可互換地使用，是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如，奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。特別地，個體是人。
術語“治療”指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉疾病的症狀、併發症、或生化指症的發作、緩解症狀或阻止或抑制疾病、病狀或病症的進一步發展。
術語“預防”包括對疾病或病症或特定疾病或病症的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中，具有癌症家族病史的受試者是預防性方案的候選。通常，在癌症的背景中，術語“預防”是指在癌症的病徵或症狀發生前，特別是在具有癌症風險的受試者中發生前的藥物施用。
本文所述的術語“治療劑”涵蓋在預防或治療腫瘤，例如癌症中有效的任何物質，包括化療劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫抑制劑)。
術語“細胞毒性劑”用在本發明中指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。
“化療劑”包括在治療癌症或免疫系統疾病中有用的化學化合物。
術語“小分子藥物”是指低分子量的能夠調節生物過程的有機化合物。“小分子”被定義為分子量小於10kD、通常小於2kD和較佳小於1kD的分子。小分子包括但不限於無機分子、有機分子、含無機組分的有機分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模擬物和抗體模擬物。作為治療劑，小分子可以比大分子更能透過細胞、對降解更不易感和更不易於引發免疫應答。
本文使用的術語“免疫調節劑”指抑制或調節免疫應答的天然或合成活性劑或者藥物。免疫應答可以是體液應答或細胞應答。免疫調節劑包含免疫抑制劑。在一些實施方案中，本發明的免疫調節劑包括免疫檢查點抑制劑或免疫檢查點激動劑。
術語“有效量”指本發明的抗體或片段或組成物或組合的這樣的量或劑量，其以單一或多次劑量施用患者後，在需要治療或預防的患者中產生預期效果。
“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。治療有效量也是這樣的一個量，其中抗體或抗體片段或組成物或組合的任何有毒或有害作用不及治療有益作用。相對於未治療的對象，“治療有效量”較佳地抑制可度量參數或改善可度量參數至少約40%、甚至更佳地至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%甚至100%。
“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在對象中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量將小於治療有效量。
術語“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”、
“癌性”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。術語“腫瘤”涵蓋實體瘤和液體腫瘤。
術語“抗腫瘤作用”或“抑瘤作用”或“腫瘤抑制作用”指可以藉由多種手段展示的生物學效果，包括但不限於例如，腫瘤體積減少、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活減少。
術語“藥用輔料”指與活性物質一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、賦形劑、載體或穩定劑等。
術語“醫藥組成物”指這樣的組成物，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施用該組成物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。
術語“藥物組合或組合產品”是指非固定組合產品或固定組合產品，包括但不限於藥盒、醫藥組成物。術語“非固定組合”意指活性成分(例如，(i)本發明的免疫綴合物、以及(ii)其他治療劑)以分開的實體被同時、無特定時間限制或以相同或不同的時間間隔、依次地施用於患者，其中這類施用在患者體內提供預防或治療有效水平的兩種或更多種活性劑。術語“固定組合”意指兩種或更多種活性劑以單個實體的形式被同時施用於患者。較佳對兩種或更多種活性劑的劑量和/或時間間隔進行選擇，從而使各部分的聯合使用能夠在治療疾病或病症時產生大於單獨使用任何一種成分所能達到的效果。各成分可以各自呈單獨的製劑形式，其製劑形式可以相同也可以不同。
術語“組合療法”是指施用兩種或更多種治療劑或治療方式(例如放射療法或手術)以治療本文所述疾病。這種施用包括以基本上同時的方式共同施用這些治療劑，例如以具有固定比例的活性成分的單一膠囊。或者，這種施用
包括對於各個活性成分在多種或在分開的容器(例如片劑、膠囊、粉末和液體)中的共同施用。粉末和/或液體可以在施用前重構或稀釋至所需劑量。此外，這種施用還包括以大致相同的時間或在不同的時間以順序的方式使用每種類型的治療劑。在任一情況下，治療方案將提供藥物組合在治療本文所述的病症或病狀中的有益作用。
“受試者/患者/個體樣品”指從患者或受試者得到的細胞或流體的集合。組織或細胞樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如淚液、玻璃體液、腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自受試者的妊娠或發育任何時間的細胞。在一些實施方案中，組織樣品是腫瘤組織。組織樣品可能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物、抗生素、等等。
II.人源化CD3抗體
本發明一方面提供一種人源化的CD3抗體，其具有更佳的與CD3的結合親和力，從而更適用於構建雙特異性抗體分子中的抗原結合區。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段以所需的親和力結合CD3(例如人CD3或猴CD3例如食蟹猴CD3)。在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段能夠既結合人CD3，又結合猴CD3例如食蟹猴CD3。在一些實施方案中，藉由生物膜薄層干涉測定技術或表面電漿共振法測定抗體的親和力。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體，以下平衡解離常數(KD)與人CD3或猴CD3例如食蟹猴CD3結合，該KD在大約1nM-1000nM之
間。在一些實施方中，本發明的抗CD3抗體，以大約10nM-100nM，或20nM-100nM或50nM-100nM之間的KD與猴CD3例如食蟹猴CD3結合。在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體大約100-1000nM之間(例如大約200、300、400或500-1000nM之間)的KD與人CD3結合。
在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段與效應細胞表面的CD3結合。在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段能夠激活效應細胞。在一些實施方案中，效應細胞為T細胞。在一些實施方案中，利用流式細胞術檢測該結合。在一些實施方案中，利用報告基因檢測系統(例如Jurkat/NFAT-luc報告基因系統)檢測CD3抗體的激活作用。
在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段能夠激活效應細胞誘導對腫瘤細胞的殺傷。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)和3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)。
在一些方面中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)。在一些方面中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VH)。在一些方面中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在一些實施方案中，該重鏈可變區包含3個來
自重鏈可變區的互補決定區(CDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方案中，該輕鏈可變區包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(CDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段還包含抗體重鏈恆定區HC。在一些實施方案中，本發明抗CD3抗體或其抗原結合片段還包含抗體輕鏈恆定區LC。在一些實施方案中，本發明抗CD3抗體或其抗原結合片段還包含重鏈恆定區HC和輕鏈恆定區LC。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體重鏈可變區VH
(i)包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體輕鏈可變區VL
(i)包含與SEQ ID NO：4的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與SEQ ID NO：4的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，本發明抗CD3抗體的3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3選自
(i)如SEQ ID NO：3中任一項所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，或
(ii)相對於(i)中任一項的序列，在該三個HCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。
在一些實施方案中，本發明抗CD3抗體的3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3選自
(i)如SEQ ID NO：4中任一項所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或
(ii)相對於(i)中任一項的序列，在該三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體中，
HCDR1包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；HCDR2包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；HCDR3包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；LCDR1包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；LCDR2包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，或
由該胺基酸序列組成；和/或LCDR3包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中
該VH含有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，和該VL含有SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：3中所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：4所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段包含：如SEQ ID NO：5所示的HCDR1、如SEQ ID NO：6示的HCDR2、如SEQ ID NO：7示的HCDR3；如SEQ ID NO：8示的LCDR1、如SEQ ID NO：9示的LCDR2和如SEQ ID NO：10的LCDR3。
在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換，較佳地保守置換。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性：
(i)顯示與本發明抗體對CD3相同或相似的結合親和力和/或特異性；
(ii)抑制(例如，競爭性抑制)本發明抗體與CD3的結合；
(iii)與本發明抗體結合相同或重疊的表位；
(iv)與本發明抗體競爭結合CD3；
(v)具有本發明抗體的一個或多個生物學特性。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體是IgG1形式的抗體或IgG2形式的抗體或IgG3形式的抗體或IgG4形式的抗體，例如，為IgG1形式的抗體。在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體的輕鏈恆定區為kappa或lamda輕鏈恆定區，例如lamda輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，抗CD3抗體是單株抗體。
在一些實施方案中，抗CD3抗體是人源化的。
在一個實施方案中，本發明的抗CD3抗體還涵蓋其抗體片段(例如抗原結合片段)，較佳地選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、(Fab’)2、單結構域抗體例如VHH、dAb(domain antibody)或線性抗體。
在一個實施方案中，本發明的抗CD3抗體片段是scFv，包含本文所述的VH和VL，以及連接肽，其中例如連接肽為(GGGGS)n，其中n=1、2、3、4或5，例如n=3或4，例如SEQ ID NO：12所示的接頭。在一些實施方案中，scFv包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，或包含與其具有至少85%、90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
在一個實施方案中，本發明的抗CD3抗體是單鏈抗體，其包含抗CD3抗體片段scFv和重鏈恆定區Fc(視需要地該Fc區包含鉸鏈區)，或由scFv和重鏈恆定區Fc(視需要地該Fc區包含鉸鏈區)組成。
在一些實施方案中，本發明的抗CD3單鏈抗體包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，或包含與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
在一個方面，本發明提供了靶向人CD3的抗CD3抗體或其抗原結合片段，其具有如下優點：
1)高特異性結合人CD3以及表達人CD3的靶細胞；
2)適合作為基因工程構件；
3)低免疫原性。
在一個實施方案中，該抗CD3抗體或其抗原結合片段是人源化的。
在一個具體的實施方案中，該抗CD3抗體或其抗原結合片段包含：
1)序列如SEQ ID NO：3所述的重鏈可變區(VHCD3)或與SEQ ID NO：3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重鏈可變區；和
2)序列如SEQ ID NO：4所述的輕鏈可變區(VLCD3)或與SEQ ID NO：4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈可變區。
在另一個具體的實施方案中，該抗CD3抗體或其抗原結合片段包含：
1)序列如SEQ ID NO：1所示的重鏈(H)或與SEQ ID NO：1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重鏈；和
2)序列如SEQ ID NO：2所述的輕鏈(L)或與SEQ ID NO：2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈。
在一個實施方案中，該抗CD3抗體的抗原結合片段是Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；線性抗體；單鏈抗體(例如scFv)。在一個具體實施方案中，該抗CD3抗體的抗原結合片段是scFv，其包含如SEQ ID NO：11所示的序列或與SEQ ID NO：11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列。在另一個實施方案中，該抗CD3抗體包含scFv和Fc區，其包含如SEQ ID NO：13所示的序列或與SEQ ID NO：13具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列。
III.抗GPRC5D抗體
本發明一方面提供一種GPRC5D抗體，其具有與GPRC5D的更高的結合親和力，例如本發明的GPRC5D抗體更適用於構建雙特異性抗體分子中的抗原結合區。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段以更高的親和力結合GPRC5D(例如人GPRC5D或猴GPRC5D例如食蟹猴GPRC5D)，例如相比對照抗體如GC5B596。在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段能夠既結合人GPRC5D，又結合猴GPRC5D例如食蟹猴GPRC5D。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段與細胞表達的GPRC5D結合。在一些實施方案中，藉由流式細胞術測定抗GPRC5D抗體與細胞表達的GPRC5D的親和力。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)和3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)。
在一些方面中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)。在一些方面中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VH)。在一些方面中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在一些實施方案中，該重鏈可變區
包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(CDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方案中，該輕鏈可變區包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(CDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段還包含抗體重鏈恆定區HC。在一些實施方案中，本發明抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段還包含抗體輕鏈恆定區LC。在一些實施方案中，本發明抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段還包含重鏈恆定區HC和輕鏈恆定區LC。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體的重鏈可變區
(i)包含與SEQ ID NO：62、72、82、16、23、25、27、29、38或40的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：62、72、82、16、23、25、27、29、38或40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與SEQ ID NO：62、72、82、16、23、25、27、29、38或40的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體的輕鏈可變區
(i)包含與SEQ ID NO：63、73、83、17、19或21的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：63、73、83、17、19或21的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與SEQ ID NO：63、73、83、17、19或21的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3選自
(i)如SEQ ID NO：62、72、82、16、23、25、27、29、38或40中任一項所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，或
(ii)相對於(i)中任一項的序列，在該三個HCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列，
例如該CDR藉由Kabat方案確定。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3選自
(i)如SEQ ID NO：63、73、83、17、19或21中任一項所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或
(ii)相對於(i)中任一項的序列，在該三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列，
例如該CDR藉由Kabat方案確定。
在一些實施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO：64、74或84的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者HCDR1包含與SEQ ID NO：64、74或
84的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO：65、75、85、39或41的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者HCDR2包含與SEQ ID NO：65、75、85、39或41的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO：66、76或86的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者HCDR3包含與SEQ ID NO：66、76或86的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO：67、77或87的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者LCDR1包含與SEQ ID NO：67、77或87的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO：68或78的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者LCDR2包含與SEQ ID NO：68、78的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO：69、79或88的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者LCDR3包含與SEQ ID NO：69、79或88的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中
(i)該VH含有SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，和該VL含有SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)該VH含有SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，和該VL含有SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(iii)該VH含有SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和該VL含有SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(iv)該VH含有SEQ ID NO：16、23、25、27、29、38或40所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，和該VL含有SEQ ID NO：17、19或21所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含：
(i)如SEQ ID NO：64所示的HCDR1、如SEQ ID NO：65、39或41所示的HCDR2、如SEQ ID NO：66所示的HCDR3；如SEQ ID NO：67所示的LCDR1、如SEQ ID NO：68所示的LCDR2和如SEQ ID NO：69所示的LCDR3；
(ii)如SEQ ID NO：74所示的HCDR1、如SEQ ID NO：75所示的HCDR2、如SEQ ID NO：76所示的HCDR3；如SEQ ID NO：77所示的LCDR1、如SEQ ID NO：78所示的LCDR2和如SEQ ID NO：79所示的LCDR3；或
(iii)如SEQ ID NO：84所示的HCDR1、如SEQ ID NO：85所示的HCDR2、如SEQ ID NO：86所示的HCDR3；如SEQ ID NO：87所示的LCDR1、如SEQ ID NO：78所示的LCDR2和如SEQ ID NO：88所示的LCDR3。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成：
(i).SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63；
(ii).SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73；
(iii).SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83；
(iv).SEQ ID NO：16、23、25、27、29、38或40和SEQ ID NO：21；
(v).SEQ ID NO：16或25和SEQ ID NO：17；
(vi).SEQ ID NO：16或27和SEQ ID NO：19。
在本發明的一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含重鏈。在本發明的一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或
其抗原結合片段包含輕鏈。在本發明的一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈。
在一些具體的實施方案中，抗GPRC5D抗體的重鏈包含SEQ ID NO：60、70、80、14、22、24、26或28的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
在一些具體的實施方案中，抗GPRC5D抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：61、71、81、15、18或20的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
在一些具體的實施方案中，抗GPRC5D抗體包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含如下SEQ ID NO：14、22、24、26或28所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，且該輕鏈包含SEQ ID NO：15、18或20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
在一些具體的實施方案中，抗GPRC5D抗體包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈和輕鏈分別包含如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成：
(i).SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61；
(ii).SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71；
(iii).SEQ ID NO：80和SE QI DNO：81；
(iv).SEQ ID NO：14或24和SEQ ID NO：15；
(v).SEQ ID NO：14或26和SEQ ID NO：18；
(vi).SEQ ID NO：14、22、24、26或28和SEQ ID NO：20。
在本發明的一個實施方案中，本文所述的抗GPRC5D抗體的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換，較佳地保守置換。
在本發明的一個實施方案中，本發明所述的抗GPRC5D抗體的胺基酸改變為消除轉譯後修飾的改變，例如存在於抗GPRC5D抗體的CDR中，例如抗GPRC5D抗體的HCDR2，其包含N55S和/或G56E置換。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性：
(i)顯示與本發明抗體對GPRC5D相同或相似的結合親和力和/或特異性；
(ii)抑制(例如，競爭性抑制)本發明抗體與GPRC5D的結合；
(iii)與本發明抗體結合相同或重疊的表位；
(iv)與本發明抗體競爭結合GPRC5D；
(v)具有本發明抗體的一個或多個生物學特性。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體是IgG1形式的抗體或IgG2形式的抗體或IgG3形式的抗體或IgG4形式的抗體，例如，為IgG1
形式的抗體。在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體的輕鏈恆定區為lambda或kappa輕鏈恆定區，例如Kapppa輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，抗GPRC5D抗體是單株抗體。
在一些實施方案中，抗GPRC5D抗體是人源化的。
在一些實施方案中，抗GPRC5D抗體是嵌合抗體。
在一個實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體還涵蓋其抗體片段(例如抗原結合片段)，較佳地選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、(Fab’)2、單結構域抗體例如VHH、dAb(domain antibody)或線性抗體。
IV. MUC16抗體
本發明提供了靶向人MUC16的抗MUC16抗體、其具有以下一種或者多種優點：
(1)高親和力結合MUC16(例如人或猴MUC16)、表達人MUC16的靶細胞；
(2)不結合循環中游離的CA125；
(3)適合作為基因工程構件；
(4)低免疫原性；
(5)表達純度高；
(6)人源化之後仍然具有高親和力。
在一個實施方案中，該抗MUC16抗體或其抗原結合片段是人源化的。
在一些實施方案中，本發明的抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方案中，本發明的抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，本發明的抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)和3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)。
在一些方面中，本發明的抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)。在一些方面中，本發明的抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VH)。在一些方面中，本發明的抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在一些實施方案中，該重鏈可變區包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(CDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方案中，該輕鏈可變區包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(CDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，本發明的抗MUC16抗體或其抗原結合片段還包含抗體重鏈恆定區HC。在一些實施方案中，本發明抗MUC16抗體或其抗原結合片段還包含抗體輕鏈恆定區LC。在一些實施方案中，本發明抗MUC16抗體或其抗原結合片段還包含重鏈恆定區HC和輕鏈恆定區LC。
在一些實施方案中，本發明的抗MUC16抗體重鏈可變區VH
(i)包含與SEQ ID NO：92或113的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：92或113的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與SEQ ID NO：92或113的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，本發明的抗MUC16抗體輕鏈可變區VL
(i)包含與SEQ ID NO：96、100、102或114的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：96、100、102或114的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與SEQ ID NO：96、100、102或114的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，本發明抗MUC16抗體的3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3選自
(i)如SEQ ID NO：92或113中任一項所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，或
(ii)相對於(i)中任一項的序列，在該三個HCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。
在一些實施方案中，本發明抗MUC16抗體的3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3選自
(i)如SEQ ID NO：96、100、102或114中任一項所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或
(ii)相對於(i)中任一項的序列，在該三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。
在一些實施方案中，本發明的抗MUC16抗體中，
HCDR1包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；HCDR2包含SEQ ID NO：94的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；HCDR3包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；LCDR1包含SEQ ID NO：97、101或103的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；LCDR2包含SEQ ID NO：98的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；和/或LCDR3包含SEQ ID NO：99的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中
該VH含有SEQ ID NO：92或113所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，和該VL含有SEQ ID NO：96、100、102或114所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：92或113中所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：96、100、102或114所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含：如SEQ ID NO：93所示的HCDR1、如SEQ ID NO：94示的HCDR2、如SEQ ID NO：95示的HCDR3；如SEQ ID NO：97、101或103示的LCDR1、如SEQ ID NO：98示的LCDR2和如SEQ ID NO：99的LCDR3。
在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換，較佳地保守置換。
在一些實施方案中，本發明的抗MUC16抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性：
(i)顯示與本發明抗體對MUC16相同或相似的結合親和力和/或特異性；
(ii)抑制(例如，競爭性抑制)本發明抗體與MUC16的結合；
(iii)與本發明抗體結合相同或重疊的表位；
(iv)與本發明抗體競爭結合MUC16；
(v)具有本發明抗體的一個或多個生物學特性。
在一些實施方案中，本發明的抗MUC16抗體是IgG1形式的抗體或IgG2形式的抗體或IgG3形式的抗體或IgG4形式的抗體，例如，為IgG1形式的抗體。在一些實施方案中，本發明的抗MUC16抗體的輕鏈恆定區為kappa或lamda輕鏈恆定區，例如lamda輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，抗MUC16抗體是單株抗體。
在一些實施方案中，抗MUC16抗體是人源化的。
在一個實施方案中，本發明的抗MUC16抗體還涵蓋其抗體片段(例如抗原結合片段)，較佳地選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、(Fab’)2、單結構域抗體例如VHH、dAb(domain antibody)或線性抗體。
在一個具體的實施方案中，該抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中：
1)該VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，該VL包含如SEQ ID NO：97所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；或
2)該VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，該VL包含如SEQ ID NO：101所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；或
3)該VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，該VL包含如SEQ ID NO：103所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；或
在一個具體的實施方案中，該抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含：
1)序列如SEQ ID NO：92所述的VH或與SEQ ID NO：92具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具
有相同CDR的VH；和序列如SEQ ID NO：96所述的VL或與SEQ ID NO：96具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL；或
2)序列如SEQ ID NO：92所述的VH或與SEQ ID NO：92具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VH；和序列如SEQ ID NO：100所述的VL或與SEQ ID NO：100具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL；或
3)序列如SEQ ID NO：92所述的VH或與SEQ ID NO：92具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VH；和序列如SEQ ID NO：102所述的VL或與SEQ ID NO：102具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL；或
4)序列如SEQ ID NO：113所述的VH或與SEQ ID NO：113具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VH；和序列如SEQ ID NO：114所述的VL或與SEQ ID NO：114具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL。
在另一個具體的實施方案中，該抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含：
1)序列如SEQ ID NO：106所示的重鏈(H)或與SEQ ID NO：106具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具
有相同CDR的重鏈，和序列如SEQ ID NO：107所述的輕鏈(L)或與SEQ ID NO：107具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈；或
2)序列如SEQ ID NO：106所示的重鏈(H)或與SEQ ID NO：106具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重鏈，和序列如SEQ ID NO：108所述的輕鏈(L)或與SEQ ID NO：108具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈；或
3)序列如SEQ ID NO：106所示的重鏈(H)或與SEQ ID NO：106具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重鏈，和序列如SEQ ID NO：109所述的輕鏈(L)或與SEQ ID NO：109具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈；或
4)序列如SEQ ID NO：115所示的重鏈(H)或與SEQ ID NO：115具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重鏈，和序列如SEQ ID NO：116所述的輕鏈(L)或與SEQ ID NO：116具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈。
在一些實施方案中，該抗體包含胺基酸改變。在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳
地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換，較佳地保守置換。
在某些實施方案中，本發明的抗體可以是經半胱胺酸工程改造的抗體，例如“硫代mAb”，其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基置換。
V.雙特異性抗體
在一些實施方案中，本發明的抗CD3抗體是雙特異性抗體或多特異性抗體，其例如包含CD3的第一結合特異性和針對一種或多種的分子(例如腫瘤相關抗原，例如GPRC5D或MUC16)的其他結合特異性。
在一些實施方案中，本發明的抗GPRC5D抗體是雙特異性抗體或多特異性抗體，其例如包含針對GPRC5D的第一結合特異性和針對一種或多種的分子(例如CD3)的其他結合特異性。
在一些實施方案中，本發明的抗MUC16抗體是雙特異性抗體或多特異性抗體，其例如包含針對MUC16的第一結合特異性和針對一種或多種的分子(例如CD3)的其他結合特異性。
因此，本發明的一個方面涉及一種雙特異性抗體，其包含
第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中第一抗原結合區特異性結合腫瘤相關抗原，和/或第二抗原結合區特異性結合CD3。
本文所述的“腫瘤相關抗原”是指與腫瘤相關的抗原，例如在腫瘤中高表達的蛋白，例如GPRC5D或MUC16。
因此，本發明的一個方面涉及一種雙特異性抗體，其包含
第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中第一抗原結合區特異性結合GPRC5D或MUC16，和/或第二抗原結合區特異性結合CD3。
在一些實施方案中，第一抗原結合區來自本文所述的抗GPRC5D抗體，例如是抗GPRC5D抗體的Fab片段。在一些實施方案中，第一抗原結合區來自本文所述的抗MUC16抗體，例如是抗MUC16抗體的Fab片段。
在一些實施方案中，第二抗原結合區來自抗CD3抗體，例如SP34抗體或其人源化抗體，例如本文所述的抗CD3人源化抗體，例如是抗CD3抗體的scFv片段。
適用於本發明的雙特異性抗體的第一抗原結合區可以包含本發明的抗GPRC5D或MUC16全長抗體或其抗原結合片段，或由其組成，只要其能夠特異性結合GPRC5D或MUC16即可，包括但不限於，例如特異性結合GPRC5D的全長抗體、單鏈Fv、Fab、Fab'、(Fab)2、單域抗體、VHH或重鏈抗體等。
適用於本發明的雙特異性抗體的第二抗原結合區可以包含抗CD3全長抗體或其抗原結合片段，或由其組成，只要其能夠特異性結合CD3即可，包括但不限於，例如特異性結合CD3的全長抗體、單鏈Fv、Fab、Fab'、(Fab)2、單域抗體、VHH或重鏈抗體等。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體是IgG樣雙特異性抗體。本文所述的“IgG樣雙特異性抗體”是指包含Fc二聚體的雙特異性抗體。因此，在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體包含Fc二聚體。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體是IgG樣雙特異性抗體，其包含Fab片段作為一個抗原結合區和scFv片段作為另一個抗原結合區。在一些實施方案中，該IgG樣雙特異性抗體包含特異性結合GPRC5D或MUC16
的Fab片段作為第一抗原結合區，且包含特異性結合CD3的scFv作為第二抗原結合區。
在一些實施方案中，本發明提供了一種雙特異性抗體，其包含一個或兩個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中
(1)特異性結合第一抗原的Fab片段在Fab重鏈的CH1的C末端融合特異性結合第二抗原的scFv片段的N末端(例如VH或VL的N末端)，且該scFv片段的C末端(例如VL或VH的C末端)融合至Fc異二聚體的Fc區之一(例如包含結的Fc區或包含扣的Fc區)的CH2或鉸鏈區，例如如圖4A所示的結構；
(2)特異性結合第一抗原的第一Fab片段在Fab重鏈的CH1的C末端融合至Fc異二聚體的Fc區之一(例如包含扣的Fc區或包含結的Fc區)的CH2或鉸鏈區；特異性結合第一抗原的第二Fab片段在Fab重鏈的CH1的C末端融合特異性結合第二抗原的scFv片段的N末端(例如VH或VL的N末端)，且該scFv片段的C末端(例如VL或VH的C末端)融合至Fc異二聚體的另一Fc區(例如包含結的Fc區或包含結的Fc區)的CH2或鉸鏈區；例如如圖4B或圖20A所示的結構；
(3)特異性結合第一抗原的Fab片段在Fab重鏈的CH1的C末端融合至Fc異二聚體的Fc區之一(例如包含扣的Fc區或包含結的Fc區)的CH2或鉸鏈區；特異性結合第二抗原的scFv片段的C末端(例如VL或VH的C末端)融合至Fc異二聚體的另一Fc區(例如包含結的Fc區或包含扣的Fc區)的CH2或鉸鏈區；例如如圖4C或圖20B所示的結構；或
(4)特異性結合第一抗原的第一Fab片段在Fab重鏈的CH1的C末端融合至特異性結合第一抗原的第二Fab片段的VH的N末端，且該第二Fab片段在Fab重鏈的CH1的C末端融合至Fc異二聚體的Fc區之一(例如包含結的Fc區或包含扣的Fc區)的CH2或鉸鏈區；特異性結合第二抗原的scFv片段的C末端(例如VL或VH的C末端)融合至Fc異二聚體的另一Fc區(例如包含扣的Fc區或包含結的Fc區)的CH2或鉸鏈區；例如如圖20C所示的結構。
在一些實施方案中，融合包括直接融合或藉由接頭融合。
因此，在一些實施方案中，本發明涉及一種雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含一個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中
該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，
第一Fc區構成第一重鏈；
該Fab片段的CH1的C末端融合該scFv片段的N末端，且該scFv片段的C末端融合至第二Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該Fab片段的VL-CL構成輕鏈。
在另一些實施方案中，本發明涉及一種雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含兩個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中
該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，
第一Fab片段的CH1的C末端融合至包含第一Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；
第二Fab片段的CH1的C末端融合該scFv片段的VH的N末端，且該scFv片段的C末端融合至第二Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該第一和第二Fab片段的VL-CL分別構成兩條輕鏈；
其中該第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
在另一些實施方案中，本發明涉及一種雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含一個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中
該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，
該Fab片段的CH1的C末端融合至第一Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；
該scFv片段的C末端融合至包含第二Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該Fab片段的VL-CL構成輕鏈。
在另一些實施方案中，本發明涉及一種雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含兩個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中
該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，
第一Fab片段的CH1的C末端融合至第二Fab片段的VH的N末端，且第二Fab片段的CH1的C末端融合至第一Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；
該scFv片段的C末端融合至第二Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；且
該第一和第二Fab片段的VL-CL分別構成兩條輕鏈；
其中該第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
在一些實施方案中，第一抗原選自GPRC5D或MUC16(例如人GPRC5D或人MUC16)。在一些實施方案中，第二抗原為CD3。
在一些實施方案中，第一Fc區包含結突變，且第二Fc區包含扣突變。在一些實施方案中，第一Fc區包含扣突變，且第二Fc區包含結突變。
在一些實施方案中，該scFv片段的C末端為ScFv片段的VL的C末端。在一些實施方案中，該scFv片段的N末端為ScFv片段的VH的N末端。
在一些實施方案中，作為雙特異性抗體抗原結合區之一的Fab片段由包含抗體VH、CH1、VL和CL結構域的兩條多肽鏈組成，其中該VH與VL配對且該CH1與CL配對以形成抗原結合區。在一些實施方案中，在Fab中，一條鏈從N端到C端包含VH和CH1(即，VH-CH1)，另一條鏈從N端到C端包含VL和CL(即，VL-CL)。
在一些實施方案中，在該雙特異性抗體中，Fab可以藉由包含VH的鏈的C端融合在抗體的Fc結構域的N端或藉由另一抗原結合區例如scFv片段融合在抗體的Fc結構域的N端，其中Fc結構域可以包含或不包含鉸鏈區(例如EPKSS或EPKSC)。較佳地，該Fab包含VH-CH1鏈和VL-CL鏈，並藉由VH-CH1鏈的CH1的C末端與抗體Fc結構域融合，其中Fc結構域可以包含或不包含鉸鏈區(例如EPKSS或EPKSC)。在本文中，與Fc二聚體連接的Fab鏈也稱作Fab重鏈，而未與Fc二聚體連接的Fab鏈也稱作Fab輕鏈。在一些實施方案中，該融合是直接融合，或藉由接頭融合。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體中包含的Fab片段特異性結合GPRC5D。在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體中包含的Fab片段來自本發明的抗GPRC5D抗體，其包含本發明的抗GPRC5D抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL。
在一些實施方案中，該Fab重鏈包含VH和CH1，其中VH為本發明的抗GPRC5D抗體的VH。在一些實施方案中，該CH1是來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1，較佳地來自IgG1的CH1。在一些實施方案中，該CH1
(i)包含與選自SEQ ID NO：44的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：44的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：44的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些實施方案中，該Fab輕鏈包含VL-CL，其中VL為本發明的抗GPRC5D抗體的VL。在一些實施方案中，該CL是來自抗體kappa或lamda輕鏈的輕鏈恆定區，較佳地來自Kappa輕鏈的輕鏈恆定區。在一些實施方案中，該CL為本發明的抗GPRC5D抗體的輕鏈恆定區。在一些實施方案中，該Fab輕鏈為本發明的抗GPRC5D抗體的輕鏈。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體中包含的Fab片段特異性結合MUC16。在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體中包含的Fab片段來自本發明的抗MUC16抗體，其包含本發明的抗MUC16抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL。
在一些實施方案中，該Fab重鏈包含VH和CH1，其中VH為本發明的抗MUC16抗體的VH。在一些實施方案中，該CH1是來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1，較佳地來自IgG1的CH1。在一些實施方案中，該CH1
(i)包含與選自SEQ ID NO：44的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：44的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：44的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些實施方案中，該Fab輕鏈包含VL-CL，其中VL為本發明的抗MUC16抗體的VL。在一些實施方案中，該CL是來自抗體kappa或lamda輕鏈的輕鏈恆定區，較佳地來自Kappa輕鏈的輕鏈恆定區。在一些實施方案中，
該CL為本發明的抗MUC16抗體的輕鏈恆定區。在一些實施方案中，該Fab輕鏈為本發明的抗MUC16抗體的輕鏈。
在一些實施方案中，作為雙特異性抗體結合區之一的scFv片段由包含抗體VH和VL結構域的一條多肽鏈組成，其中該VH和VL連接(例如藉由接頭)以配對形成抗原結合位點。在一些實施方案中，該scFv為反式構型，從N端到C端包含：VH、接頭、和VL(VH-接頭-VL)。在另一些實施方案中，該scFv為順式構型，從N端到C端包含：VL、接頭、和VH(VL-接頭-VH)。在一些實施方案中，接頭為由胺基酸殘基組成的肽接頭。適宜的肽接頭是所屬技術領域具有通常知識者已知的。在一個實施方案中，接頭為5-50個胺基酸長度，例如5-30個胺基酸長，例如15個胺基酸或20個胺基酸長度。在一個實施方案中，接頭包含胺基酸序列(G4S)n，其中n=1、2、3、4或5，較佳地，n=3或4，更佳地，n=3。
在一些較佳的實施方案中，包含在本發明抗體分子中的scFv抗原結合位點為二硫鍵穩定的scFv。
在一些實施方案中，在該雙特異性抗體中，scFv可以藉由鏈C端融合在抗體的Fc結構域的N端。在一些實施方案中，在該雙特異性抗體中，scFv在鏈的N端融合在另一抗原結合區(例如Fab重鏈)的C端，且在鏈的C端融合在抗體Fc結構域的N端。
在一些實施方案中，在該雙特異性抗體中，scFv可以藉由包含VL的鏈C端融合在抗體的Fc結構域的N端。在一些實施方案中，在該雙特異性抗體中，scFv在VH鏈的N端融合在另一抗原結合區(例如Fab重鏈)的C端，且在VL鏈的C端融合在抗體Fc結構域的N端。
在一些實施方案中，在該雙特異性抗體中，scFv可以藉由包含VH的鏈C端融合在抗體的Fc結構域的N端。在一些實施方案中，在該雙特異性抗體中，scFv在VL鏈的N端融合在另一抗原結合區(例如Fab重鏈)的C端，且在VH鏈的C端融合在抗體Fc結構域的N端。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體中包含的scFv特異性結合CD3。在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體中包含的scFv來自本發明的抗CD3抗體，其包含本發明的抗CD3抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL。
在一個實施方案中，本發明雙特異性抗體中的兩個Fc區二聚化形成二聚Fc。較佳地，兩個Fc區異二聚化形成異二聚Fc。
在一些實施方案中，第一和第二Fc區相同。在另一些實施方案中，第一Fc區和第二Fc區不同，兩者配對並異二聚化。
適用於本發明抗體分子的Fc區片段可以是任何抗體Fc區。Fc區可以包括天然序列Fc區和變體Fc區。天然序列Fc結構域涵蓋天然存在的各種免疫球蛋白Fc序列，例如各種Ig亞型以及其同種異型的Fc區(Gestur Vidarsson等，IgG subclasses and allotypes：from structure to effector functions，20 October 2014,doi：10.3389/fimmu.2014.00520.)。例如，本發明抗體的Fc區可以包含兩個或三個恆定結構域，即CH2結構域、CH3結構域和可選的CH4結構域。在一些實施方案中，抗體Fc區還可以在N端帶有IgG鉸鏈區或部分IgG鉸鏈區，例如，IgG1鉸鏈區或部分IgG1鉸鏈區。在該鉸鏈區中可以含有突變。在一些實施方案中，鉸鏈區可以是EPKSS或EPKSC。
較佳地，本發明抗體的Fc區從N端到C端包含：CH2-CH3，或從N端到C端包含：鉸鏈區-CH2-CH3。在一些實施方案中，適用於本發明抗體或雙特異性抗體的Fc區為人的IgG Fc，例如，人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3或人IgG4 Fc。在一個實施方案中，Fc區包含胺基酸序列SEQ ID NO：49或與其具有至少90%同一性，例如95%，96%，97%，99%或更高的同一性的胺基酸序列或由其組成。
可以將本發明的抗體或雙特異性抗體中的Fc區進行突變以獲得所需的特性。本領域已知對Fc區的突變。
在一個實施方案中，在Fc區的效應子功能(例如Fc區的補體激活功能)的特性上修飾Fc區。在一個實施方案中，該效應子功能相對於野生同種型Fc區已經被降低或消除。在一個實施方案中，藉由選自以下的方法來降低或消除效應子功能：使用天然具有降低或消除的效應子功能的Fc同種型、和Fc區修飾。
在一個較佳的實施方案中，Fc區具有減少的由Fc區介導的效應子功能，例如減少的或消除的ADCC或ADCP或CDC效應子功能，例如包含實現上述功能的突變。
如所屬技術領域具有通常知識者理解的，根據本發明抗體分子的預期用途，本發明抗體分子也可以在Fc結構域中包含改變對一種或多種Fc受體的結合親和力的修飾。在一個實施方案中，該Fc受體是Fcγ受體，特別地是人Fcγ受體。在一些實施方案中，該Fc區包含降低與Fcγ受體結合的突變。例如，在一些實施方案中，用於本發明的Fc區具有降低與Fcγ受體結合的L234A/L235A突變、D265A突變或P329A突變中的一個或多個。在一些實施方
案中，用於本發明的Fc區具有降低與Fcγ受體結合的L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變。在再一較佳的實施方案中，Fc片段可以具有導致增加的血清半衰期的突變，例如改善Fc片段與FcRn結合的突變。在一些實施方案中，包含降低與Fcγ受體結合的突變的Fc區包含胺基酸序列SEQ ID NO：46或與其具有至少90%同一性，例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性的胺基酸序列或由其組成。在一些實施方案中，該Fc區包含與SEQ ID NO：46具有至少90%同一性，例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性的胺基酸序列且包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變。
如所屬技術領域具有通常知識者理解的，為了促進本發明的雙特異性抗體作為異二聚體的形成，本發明雙特異性抗體所包含的Fc區可以包含利於異二聚化的突變。在一個實施方案中，在兩個Fc區的CH3區中引入突變。
本領域已知促進Fc區異二聚化的方法。例如，第一Fc區的CH3區和第二Fc區的CH3區以互補方式進行工程化改造使得每個CH3區(或包含它的重鏈)不再能與其自身同二聚化但被迫與互補工程化改造的其它CH3區異二聚化(使得第一和第二CH3區異二聚化且兩個第一CH3區或兩個第二CH3區之間不形成同二聚體)。
較佳地，基於結入扣(Knob-in-Hole)技術，在第一單體Fc區和第二單體Fc區中分別引入相應的結(knob)突變和扣(Hole)突變。此技術參見例如Merchant,A.M.,et al.(1998)."An efficient route to human bispecific IgG." Nat Biotechnol 16(7)：677-681。
在一個特定的實施方案中，在一個Fc區的CH3區中，第366位的蘇胺酸殘基用色胺酸殘基替換(T366W)(結突變)；而在另一個Fc區的CH3區
中，第407位的酪胺酸殘基用纈胺酸殘基替換(Y407V)(扣突變)，視需要地366位的蘇胺酸殘基用絲胺酸殘基替換(T366S)且第368位的亮胺酸殘基用丙胺酸殘基替換(L368A)(編號方式依照EU索引)。
在又一個實施方案中，在一個Fc區的CH3區中，結突變包括或由下述組成：第366位的蘇胺酸殘基用色胺酸殘基替換(T366W)且第354位的絲胺酸殘基用半胱胺酸殘基替換(S354C)或第356位的谷胺酸殘基用半胱胺酸殘基替換(E356C)(特別是，第354位的絲胺酸殘基用半胱胺酸殘基替換)；而在另一個Fc區的CH3區中，扣突變包括或由下述組成：第407位的酪胺酸殘基用纈胺酸殘基替換(Y407V)，視需要地366位的蘇胺酸殘基用絲胺酸殘基替換(T366S)且第368位的亮胺酸殘基用丙胺酸殘基替換(L368A)(編號方式依照EU索引)，視需要地第349位的酪胺酸殘基用半胱胺酸殘基替換(Y349C)(編號方式依照EU索引)。
在一個具體的實施方案中，一個Fc區包含胺基酸替代S354C和T366W(結突變)，且另一個Fc區包含胺基酸替代Y349C、T366S、L368A和Y407V(扣突變)(編號方式依照EU索引)。
因此，在一個具體的實施方案中，本發明的雙特異性抗體包含的兩個Fc區異二聚化，其中
a)一個Fc-區多肽包含突變T366W，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A和Y407V，或
b)一個Fc-區多肽包含突變T366W和Y349C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一個Fc-區多肽包含突變T366W和S354C，而另一個Fc-區多肽包含突變
T366S、L368A、Y407V和Y349C；
視需要地，該Fc區還包含降低與Fcγ受體結合的突變，例如，L234A/L235A突變、D265A突變或P329A突變中的一個或多個；例如L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變。
在一些實施方案中，Fc區還包含其他利於異二聚體純化的突變。例如，可以將H435R突變(Eric J.Smith,，Scientific Reports｜5：17943｜DOI：10.1038/srep17943)引入異二聚體的Fc區之一中(例如，帶Hole突變的Fc區)，以利於使用蛋白A純化異二聚體。在另一些實施方案中，對於包含鉸鏈區的異二聚體單體，也可以在鉸鏈區中引入突變，例如C220S，以利於異二聚體的形成。
在一個具體的實施方案中，本發明的雙特異性抗體的兩個Fc區異二聚化，其中
第一Fc區包含結突變，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：43或89或與其具有至少90%同一性，例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性的胺基酸序列或由其組成；在一些實施方案中，該Fc區包含與SEQ ID NO：43或89具有至少90%同一性，例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性的胺基酸序列且包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變和結突變(例如S354C和T366W)；在一些實施方案中，該Fc區包含或不包含鉸鏈區EPKSS或EPKSC；
第二Fc區包含扣突變，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：30、42或59與其具有至少90%同一性，例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性的胺基酸序列或由其組成。在一些實施方案中，該Fc區包含與SEQ ID NO：30、42或59具有至少90%同一性，例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性的胺基酸序列且
包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變和結突變；在一些實施方案中，該Fc區包含或不包含鉸鏈區EPKSS或EPKSC。
(I)特異性結合GPRC5D和CD3的雙特異性抗體
在一些較佳的實施方案中，本發明提供了一種雙特異性抗體，其包含一個或兩個抗GPRC5D抗體的Fab片段、一個抗CD3抗體的scFv和Fc異二聚體，其中
(1)抗GPRC5D的Fab片段在Fab重鏈的CH1的C末端融合抗CD3抗體scFv片段的VH的N末端，且該scFv片段的VL的C末端融合至Fc異二聚體的Fc區之一(例如包含結的Fc區)的CH2或鉸鏈區，例如如圖4A所示的結構；
(2)第一GPRC5D的Fab片段在Fab重鏈的CH1的C末端融合至Fc異二聚體的Fc區之一(例如包含扣的Fc區)的CH2或鉸鏈區；第二抗GPRC5D的Fab片段在Fab重鏈的CH1的C末端融合抗CD3抗體scFv片段的VH的N末端，且該scFv片段的VL的C末端融合至Fc異二聚體的另一Fc區(例如包含結的Fc區)的CH2或鉸鏈區；例如如圖4B所示的結構；
(3)GPRC5D的Fab片段在Fab重鏈的CH1的C末端融合至Fc異二聚體的Fc區之一(例如包含扣的Fc區)的CH2或鉸鏈區；抗CD3抗體的scFv片段的VL的C末端融合至Fc異二聚體的另一Fc區(例如包含結的Fc區)的CH2或鉸鏈區；例如如圖4C所示的結構。
在一些實施方案中，融合包括直接融合或藉由接頭融合。
因此，在一些實施方案中，本發明涉及一種雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含一個抗GPRC5D抗體的Fab片段、一個抗CD3抗體的scFv和Fc異二聚體，其中
該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL，
包含扣突變的Fc區構成第一重鏈；
該Fab片段的CH1的C末端融合該scFv片段的VH的N末端，且該scFv片段的VL的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該Fab片段的VL-CL構成輕鏈。
在一些實施方案中，第一重鏈包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
第二中重鏈包含SEQ ID NO：31、34或35所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；和/或
輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成。
在另一些實施方案中，本發明涉及一種雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含兩個抗GPRC5D抗體的Fab片段、一個抗CD3抗體的scFv和Fc異二聚體，其中
該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL，
第一Fab片段的CH1的C末端融合至包含扣突變的Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；
第二Fab片段的CH1的C末端融合該scFv片段的VH的N末端，且該scFv片段的VL的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該第一和第二Fab片段的VL-CL分別構成兩條輕鏈；
其中該第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
在一些實施方案中，第一重鏈包含SEQ ID NO：32、33或36所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
第二中重鏈包含包含SEQ ID NO：31、34或35所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；和/或
輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成。
在一些實施方案中，第一重鏈包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
第二中重鏈包含包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；和/或
輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成。
在一些實施方案中，第一重鏈包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
第二中重鏈包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；和/或
輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成。
在一些實施方案中，第一重鏈包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
第二中重鏈包含包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；和/或
輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成。
在另一些實施方案中，本發明涉及一種雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含一個抗GPRC5D抗體的Fab片段、一個抗CD3抗體的scFv和Fc異二聚體，其中
該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL，
該Fab片段的CH1的C末端融合至包含扣突變的Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；
該scFv片段的VL的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該Fab片段的VL-CL構成輕鏈。
在一些實施方案中，第一重鏈包含SEQ ID NO：32、33或36所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
第二中重鏈包含包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；和/或
輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成。
(II)特異性結合CD3和MUC16的雙特異性抗體
本發明提供了一種同時靶向人CD3和人MUC16的雙特異性抗體(抗CD3×MUC16雙特異性抗體)，其具有以下優點：
(1)高特異性結合人CD3、表達人CD3的靶細胞和同時高親和力結合人MUC16、表達人MUC16的靶細胞；
(2)不結合循環中游離的CA125，同時將更多的T細胞靶向表達MUC16的癌細胞；
(3)激活T細胞，並引發對表達MUC16的癌細胞的細胞毒活性，從而有效殺傷癌細胞；
(4)低免疫原性；
(5)優異的抑瘤效果。
在一個實施方案中，本發明提供了一種抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其包含：
(i)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點；或
(ii)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點；或
(iii)1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1
結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點。
在一個實施方案中，本發明提供了一種抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其包含：
(i)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：97所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含識別CD3的VH(為了與識別MUC16的VH相區別，在本文稱為VHCD3)和識別CD3的VL(為了與識別MUC16的VL相區別，在本文稱為VLCD3)，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；或
1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：101所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98
所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；或
1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：103所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；
或者
(ii)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含
如SEQ ID NO：97所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；或
1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：101所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；或
1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：103所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該
VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；
或者
(iii)1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：97所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3，或
1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：101所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含
VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3，或
1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：103所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3。
在一個具體的實施方案中，本發明提供了一種抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其包含：
(i)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含選自SEQ ID NO：92或113的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID NO：96、100、102或114的序列；
識別CD3分子的scFv包含識別CD3的VH(為了與識別MUC16的VH相區別，在本文稱為VHCD3)和識別CD3的VL(為了與識別MUC16的VL相區別，在本文稱為VLCD3)，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列。
(ii)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含選自SEQ ID NO：92或113的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID NO：96、100、102或114的序列；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列；或
(iii)1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含選自SEQ ID NO：92或113的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID NO：96、100、102或114的序列；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列。
在一個實施方案中，上述雙特異性抗體中所包含的2個識別MUC16分子的抗原識別位點可以具有相同的VH/VL序列，或不同的VH/VL序列。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其包含：
(i)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含SEQ ID NO：113的序列或者包含與SEQ ID NO：113具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID NO：114的序列或者包含與SEQ ID NO：114具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列或者包含與SEQ ID NO：3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列，並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列或者包含與SEQ ID NO：4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列；或
(ii)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含選自SEQ ID NO：113的序列或者包含與SEQ ID NO：113具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID
NO：114的序列或者包含與SEQ ID NO：114具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列或者包含與SEQ ID NO：3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列，並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列或者包含與SEQ ID NO：4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列；或
(iii)1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含選自SEQ ID NO：113的序列或者包含與SEQ ID NO：113具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID NO：114的序列或者包含與SEQ ID NO：114具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列或者包含與SEQ ID NO：3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列，並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列或者包含與SEQ ID NO：4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列。
在一個實施方案中，如本發明上述所提供的一種抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其中該Fc區可以選自現有技術中已知的任何IgG、IgA、IgM類抗體的天然Fc區，例如共有或者胚系IgG Fc區。在一個具體實施方案中，IgG Fc區可以來自同種型人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一個具體實施方案中，IgG Fc區是人IgG1的Fc序列。在進一步的實施方案中，該Fc區包含突變，例如增加雙特異性抗體二聚體穩定性的突變(例如杵入臼結構)、減少或者增加效應子功能的突變。
在以上任一個實施方案中，本發明抗CD3×MUC16雙特異性抗體的scFv藉由接頭與Fc或CH1連接，該接頭可以是本領域已知或者將來獲得的任何通用的柔性序列，通常是短的柔性胺基酸序列，例如，GGGSG；GGSGG；GSGGG；SGGGG；GGTGS；GTSPGG；GNGGGS；G4S-GGSGG-G4S-SGGGG；GGG；DGGGS；TGEKP；GGRR；EGKSSGSGSESKVD；KESGSVSSEQLAQFRSLD；GGRRGGGS；LRQRDGERP；LRQKDGGGSERP；GSTSGSGKPGSGEGSTKG等。在一個具體實施方案中，該接頭是(G4S)n，其中n是等於或大於1的整數，例如，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9的整數。在一個具體實施方案中，接頭選自(G4S)3。
在再一個實施方案中，本發明提供了一種抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其包含：
(i)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗
原識別位點，其中重鏈1包含SEQ ID NO：118所示的序列，重鏈2包含SEQ ID NO：121所示的序列，並且輕鏈包含SEQ ID NO：116所示的序列。
(ii)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中重鏈1包含SEQ ID NO：118所示的序列，重鏈2包含SEQ ID NO：117所示的序列，並且輕鏈包含SEQ ID NO：116所示的序列；或
(iii)1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中重鏈1包含SEQ ID NO：119所示的序列，重鏈2包含SEQ ID NO：117所示的序列，並且輕鏈包含SEQ ID NO：116所示的序列。
VI.編碼抗體的核酸以及包含其的宿主細胞
在一方面，本發明提供了編碼以上任何抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或MUC16或雙特異性抗體或其任一條鏈的核酸。
例如，本發明的核酸包含編碼選自SEQ ID NO：1、2、3、4、11、13、14-29、31-38、40、60-63、70-73、80-83、92、96、100、102、106-109、113-119或121中任一項所示胺基酸序列的核酸，或編碼與選自SEQ ID NO：1、2、3、4、11、13、14-29、31-38、40、60-63、70-73、80-83、92、96、100、102、106-109、113-119或121中任一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列的核酸。
如所屬技術領域具有通常知識者明瞭的，因為密碼子簡並性，每一個抗體或多肽胺基酸序列可以由多種核酸序列編碼。編碼本發明分子的核酸序列可以採用本領域熟知的方法，例如藉由從頭固相DNA合成，或藉由PCR擴增而產生。
在一方面，本發明提供編碼以上任何抗體或任何抗體鏈的核酸。當從適宜的表達載體表達時，由該核酸編碼的多肽能夠顯示人CD3和/或GPRC5D和/或MUC16抗原(和/或猴(例如恆河猴或食蟹猴))結合能力。
在再一方面，本發明提供編碼以上任何雙特異性抗體的核酸。當從適宜的表達載體表達時，由該核酸編碼的多肽能夠顯示人或猴(例如恆河猴或食蟹猴)CD3和另一抗原(例如人或猴(例如恆河猴或食蟹猴)GPRC5D或MUC16抗原)的結合能力。在一個實施方案中，編碼雙特異性抗體的各條鏈的核酸可以在相同的載體中或在不同的載體中。在再一實施方案中，編碼雙特異性抗體的各條鏈的核酸可以引入相同或不同的宿主細胞以表達。因此，在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體的生產方法包括步驟：在適於表達該分子的各條鏈的條件下，培養包含編碼該各條鏈的核酸的宿主細胞，產生本發明雙特異性抗體。
在一個實施方案中，提供包含該核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體，例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。在一個實施方案中，載體是例如pcDNA載體，例如pcDNA3.1。
在一個實施方案中，提供包含該核酸或該載體的宿主細胞，例如用於選殖或表達編碼抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體的載體。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，
宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞例如CHO細胞(例如CHO-S，如ExpiCHO-S)或293細胞(例如293F或HEK293細胞))或適用於製備抗體或其片段的其它細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是原核的，例如是細菌，例如大腸桿菌。
在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其片段的其它細胞。例如，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母是關於編碼抗體的載體的合適選殖或表達宿主。例如，糖基化途徑已經進行“人源化”的真菌和酵母菌株導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體。適於表達糖基化抗體的宿主細胞也衍生自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。也可以將脊椎動物細胞用作宿主。例如，可以使用被改造以適合於懸浮生長的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的其它實例是用SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(HEK293、293F或293T細胞)等。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞、CHO-S細胞、ExpiCHO等；以及骨髓瘤細胞系如Y0、NS0和Sp2/0。本領域已知適合產生抗體的哺乳動物宿主細胞系。
VII、本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體的生產和純化
在一個實施方案中，提供了製備本發明抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體的方法，其中該方法包括，在適合抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體或其鏈表達的條件下，培養包含編碼該抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體(例如任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈)的核酸或包含該核酸的表達載體的宿主細胞，
如上文所提供的，和視需要地從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體。
可以將編碼本發明抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體的多肽鏈的多核苷酸插入一個或多個載體中以便進一步在宿主細胞中選殖和/或表達。可以使用所屬技術領域具有通常知識者熟知的方法來構建表達載體。一旦已經製備了用於表達的包含本發明的一種或多種核酸分子的表達載體，則可以將表達載體轉染或引入適宜的宿主細胞中。多種技術可以用來實現這個目的，例如，原生質體融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、逆轉錄病毒的轉導、病毒轉染、基因槍、基於脂質體的轉染或其他常規技術。
如本文所述製備的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體可以藉由已知的現有技術如高效液相色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、尺寸排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對所屬技術領域具有通常知識者是顯而易見的。
可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度，該熟知分析方法包括尺寸排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。
VIII、對抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或雙特異性抗體的測定法。
可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體進行鑑定，篩選，或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。
一方面，對本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體測試其靶標(例如抗原，例如游離的抗原或在細胞上表達的抗原)結合活性，例如藉由已知的方法諸如生物膜薄層干涉技術、ELISA、流式細胞術等來進行。可使用本領域已知方法來測定對CD3和/或GPRC5D和/或抗MUC16抗體(或細胞上表達的CD3和/或GPRC5D和/或MUC16)的結合，本文中揭露了例示性方法。在一些實施方案中，使用放射性免疫測定(RIA)或生物膜薄層干涉測定法(BLI)或電化學發光(ECL)或表面電漿共振法(SPR)或流式細胞術(FACS)測量。
本發明還提供了用於鑑定抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體的生物學活性的測定法。生物學活性選自本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體的性質。
例如，對於本發明的抗體分子對表達CD3和/或GPRC5D和/或MUC16的細胞的結合活性，可以藉由本領域已知的方法，例如螢光報導分子和流式細胞術，或本文實施例揭露的示例性方法測定，例如藉由如實施例5或6或7或8或10所示的方法測定本發明的抗體分子與細胞上表達的CD3和/或GPRC5D和/或MUC16的結合。
例如，對於本發明的抗體分子對T細胞的激活活性，可以藉由本領域已知的方法，例如T細胞激活試驗系統，例如NFAT-luc報告基因系統如Jurkat/NFAT-luc報告基因系統測定，例如藉由實施1或6或10或12或13或14所示的方法，藉由檢測T細胞中的CD3信號通路或藉由檢測激活T細胞後細胞因子(例如干擾素，如IFNγ；腫瘤壞死因子如TNFα和/或白細胞介素如IL-6)的釋放來測定。
例如，對於本發明抗體分子對腫瘤的抑制活性或結構安全性，可以藉由本領域已知的方法，例如針對小鼠腫瘤模型進行腫瘤抑制實驗，例如藉由實施例7或11所示的方法來測定。
供任何上述體外測定法使用的細胞為原代細胞或細胞系，包括天然表達或過表達CD3(例如人或猴(例如食蟹猴))或GPRC5D(例如人或猴(例如食蟹猴)GPRC5D)或MUC16(例如人或猴(例如食蟹猴)MUC16)的細胞，例如過表達CD3或GPRC5D或MUC16的細胞，例如T細胞或293細胞或CHO細胞或Jurkat細胞或骨髓瘤細胞，例如HEK293或CHO-K1或Jurkat/NFAT-Luc細胞或NCI-H929。
可以理解的是，能夠使用本發明的抗體和別的活性劑的組合來進行任何上述測定法。
IX、本發明抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體的免疫綴合物、醫藥組成物、藥物組合產品和試劑盒
在一些實施方案，本發明提供了包含本文所述的任何抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體的免疫綴合物。較佳地，該免疫綴合物包含一種或多種其他治療劑(例如細胞毒素或小分子化合物)或標記物。
在一些實施方案中，本發明提供包含本文所述的任何抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體的組成物或藥物或製劑，較佳地組成物為醫藥組成物。
在一個實施方案中，該組成物還包含藥用輔料。在一個實施方案中，組成物，例如，醫藥組成物，包含本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體，以及一種或多種其它治療劑的組合。
本發明的該組成物或藥物或製劑還可以包含合適的藥用輔料，如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑，包括緩衝劑。
如本文所用，“藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。
對於藥用輔料的使用及其用途，亦參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第八版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
本發明的組成物或藥物或製劑可以處於多種形式。這些形式例如包括液體、半固體和固體劑型，如液態溶液劑(例如，注射液或滴眼液)、散劑或混懸劑、脂質體劑和栓劑。較佳的形式取決於預期的施用模式和治療用途。
可以藉由將具有所需純度的本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體與一種或多種視需要的藥用輔料混合來製備包含本文所述的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或雙特異性抗體的藥物或製劑，例如以凍乾製劑或水溶液的形式。
本發明的組成物或藥物或製劑還可以包含超過一種活性成分，該活性成分是被治療的特定適應證所需的，較佳具有不會不利地彼此影響的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還提供其它治療劑。
本發明還提供了藥物組合或藥物組合產品，其包含本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體，以及一種或多種其它治療劑。
本發明還提供了包含該藥物組合的成套藥盒，例如該成套藥盒在同一包裝內包含：
- 含有包含本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體的醫藥組成物的第一容器；
- 含有包含其它治療劑的醫藥組成物的第二容器。
在一些實施方案中，該其他治療劑例如化療劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫抑制劑)。
X、抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體的用途和應用其的方法。
本發明一方面提供了在受試者中預防或治療疾病的方法，包括向受試者施用本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體，或包含其的免疫綴合物、組成物或藥物或製劑。在一些實施方案中，本發明提供了在受試者中特異性激活T細胞(例如進而增強、刺激或增加受試者中的免疫反應)的方法，包括向受試者施用本發明的雙特異性抗體，或包含其的免疫綴合物、組成物或藥物或製劑。
在一些實施方案中，該疾病例如腫瘤，例如癌症。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。在一些實施方案中，癌症可以是實體腫瘤或血液腫瘤。在一些實施方案中，該癌症是卵巢癌、骨髓瘤、結腸癌、直腸癌或結直腸癌。
在一些實施方案中，該卵巢癌症是與卵巢細胞異常增殖相關的癌症，其包含一組異質性病變，最常見的是源自上皮細胞類型的那些病變。在一個實施方案中，卵巢癌症例如是卵巢癌，尤其是漿液性卵巢癌，例如卵巢漿液性囊腺癌、卵巢癌漿液性腺癌、卵巢癌黏液腺癌、子宮內膜樣腺癌、卵巢癌透明細胞腺癌。
在一些實施方案中，該疾病治療將受益於激活CD3信號通路和/或激活T細胞。
在一些實施方案中，該癌症是表徵為具有升高的GPRC5D的蛋白質水平和/或核酸水平(例如表達升高)的癌症，例如，該癌症的腫瘤細胞中具有升高的GPRC5D的蛋白質水平和/或核酸水平(例如表達升高)，例如相比健康受試者的相同組織中的GPRC5D的蛋白質水平和/或核酸水平，或相比患者腫瘤組織相鄰的健康組織中的GPRC5D的蛋白質水平和/或核酸水平。
在一些實施方案中，該癌症是表徵為具有升高的MUC16的蛋白質水平和/或核酸水平(例如表達升高)的癌症，例如，該癌症的腫瘤細胞中具有升高的MUC16的蛋白質水平和/或核酸水平(例如表達升高)，例如相比健康受試者的相同組織中的MUC16的蛋白質水平和/或核酸水平，或相比患者腫瘤組織相鄰的健康組織中的MUC16的蛋白質水平和/或核酸水平。
患者或受試者可以是哺乳動物，例如，靈長類，較佳地，高級靈長類，例如，人類(例如，患有本文所述癌症或具有患有本文所述癌症的風險的患者)。在某些實施方案中，受試者接受或已經接受過其它治療，例如化療治療和/或放射療法。
在一個實施方案中，本文揭露的抗MUC16抗體不結合循環中的游離CA125分子，僅結合細胞表面表達的與細胞膜結合的MUC16分子。已知MUC16分子是卵巢癌症特異性表達的分子，因此治療有效量的抗MUC16抗體或抗CD3×MUC16雙特異性抗體可以特異性地結合表達MUC16分子的卵巢癌症細胞，有助於提高免疫系統對癌細胞的殺傷，從而達到治療目的。
因此，本發明提供了抗MUC16抗體或抗CD3×MUC16雙特異性抗體在製備用於治療腫瘤(例如卵巢癌症)的藥物中的用途。
在另一方面，本發明涉及預防或治療受試者的腫瘤(例如卵巢癌症)的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的本文揭露的抗MUC16抗體或抗CD3×MUC16雙特異性抗體或包含其的醫藥組成物。
在一個實施方案中，本文揭露的抗GPRC5D抗體或抗GPRC5D×CD3雙特異性抗體可以用於治療癌症例如骨髓瘤、結腸癌、直腸癌或結直腸癌。因此，本發明提供了抗MUC16抗體或抗GPRC5D×CD3雙特異性抗體在製備用於治療癌症例如骨髓瘤、結腸癌、直腸癌或結直腸癌的藥物中的用途。
在另一方面，本發明涉及預防或治療受試者的腫瘤(例如癌症例如骨髓瘤、結腸癌、直腸癌或結直腸癌)的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的本文揭露的抗GPRC5D抗體或抗CD3×GPRC5D雙特異性抗體或包含其的醫藥組成物。
本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體(以及包含其的免疫綴合物、組成物、醫藥組成物、製劑、組合產品等)可以藉由任何合適的方法給藥，包括腸胃外給藥，肺內給藥和鼻內給藥，並且，如果局部治療需要，病灶內給藥。腸胃外注射或輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下注射或輸注。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程，包括，但不限於，單次給藥或在多個時間點多次給藥、推注給藥及脈衝輸注。
為了預防或治療疾病，本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體(以及包含其的免疫綴合物、組成物、醫藥組成物、製劑、組合產品等)的合適劑量(當單獨或與一種或多種其他的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重性和進程、以預防目的施用還是以治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對該抗體的應答，和主治醫師的判斷力。該抗體以一次治療或經過一系列治療合適地施用於患者。在其他方面，本發明提供本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體或包含其的免疫綴合物或組成物或組合產品在生產或製備藥物中的用途，該藥物用於本文所述的用途，例如用於預防或治療本文提及的相關疾病或病症。
在一些實施方案中，抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體(以及包含其的免疫綴合物、組成物、醫藥組成物、製劑等)還能與一種或多種其它療法例如治療方式和/或其它治療劑組合施用，用於本文所述的用途，例如用於預防和/或治療本文提及的相關疾病或病症。
在一些實施方案中，該治療方式例如手術或放療。
在一些實施方案中，該其他治療劑例如化療劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫抑制劑)。
XI、診斷和檢測
在一個方面，本發明還涉及對抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或MUC16或雙特異性抗體的用於診斷和檢測(例如用於診斷或非診斷目的)的方法和包含其的用於診斷和檢測的組成物。
在某些實施方案中，本文中提供的抗GPRC5D抗體可以用於檢測GPRC5D在生物樣品中的存在。在某些實施方案中，本文中提供的雙特異性抗體可以用於檢測CD3和/或GPRC5D在生物樣品中的存在。
在某些實施方案中，本文中提供的抗MUC16抗體可以用於檢測MUC16在生物樣品中的存在。在某些實施方案中，本文中提供的雙特異性抗體可以用於檢測CD3和/或MUC16在生物樣品中的存在。
在某些實施方案中，本文中提供的雙特異性抗體可以用於檢測第一抗原和/或第二抗原在生物樣品中的存在。在某些實施方案中，本文中提供的雙特異性抗體可以用於檢測第一抗原和/或第二抗原在生物樣品中的存在。
術語“檢測”用於本文中時，包括定量或定性檢測，示例性的檢測方法可以涉及免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術(例如，FACS)、抗體分子複合的磁珠、ELISA測定法、PCR-技術(例如，RT-PCR)。在某些實施方案中，生物樣品是體液，例如血液、血清或血漿。
在某些實施方案中，該方法包括將生物樣品與如本文所述的抗GPRC5D抗體或雙特異性抗體在允許其與GPRC5D結合的條件下接觸，並檢測在該抗GPRC5D抗體或雙特異性抗體和GPRC5D之間是否形成複合物。複合物的形成表示存在GPRC5D。該方法可以是體外或體內方法。
在某些實施方案中，該方法包括將生物樣品與如本文所述的抗MUC16抗體或雙特異性抗體在允許其與MUC16結合的條件下接觸，並檢測在該抗MUC16抗體或雙特異性抗體和MUC16之間是否形成複合物。複合物的形成表示存在MUC16。該方法可以是體外或體內方法。
在某些實施方案中，提供標記的抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或雙特異性抗體。標記包括但不限於，被直接檢測的標記或部分(如螢光標記、發色團標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記)，以及被間接檢測的部分，如酶或配體，例如，藉由酶促反應或分子相互作用。在一些實施方案中，該標記例如生物素或hFc等標記物。
在本文中提供的一些實施方案中，樣品是在用本發明的抗CD3抗體或抗GPRC5D抗體或抗MUC16抗體或或雙特異性抗體治療之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用其他療法之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用其他療法治療過程中，或者用其他療法治療後獲得的。
在一些實施方案中，在治療之前，例如，在起始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測GPRC5D或MUC16。
在一些實施方案中，在治療之前，例如，在起始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測第一抗原和/或第二抗原。
XII.具體實施方案
在一些方面，本發明涉及以下具體的實施方案：
1、一種雙特異性抗體，其包含
第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中第一抗原結合區特異性結合腫瘤相關抗原，和/或第二抗原結合區特異性結合CD3，
其中該第二抗原結合區是抗CD3抗體的scFv，該scFv包含VH和VL，視需要地，該VH和VL經由接頭連接，該接頭例如包含胺基酸序列(G4S)n，其中n=1、2、3、4或5，較佳地，n=3或4，更佳地，n=3。
2、實施方案1的雙特異性抗體，其中該scFv包含的VH包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該scFv包含的VL包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
(i)HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：3中所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，且LCDR1、LCDR2和LCDR3選自如SEQ ID NO：4中所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(ii)HCDR1由SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列組成，HCDR2由SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列組成，HCDR3由SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列組成，LCDR1由SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列組成，LCDR2由SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列組成，且LCDR3由SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列組成。
3、實施方案2的雙特異性抗體，其中
該VH含有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，
和/或該VL含有SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
4、實施方案1-3中任一項的雙特異性抗體，其中該第一抗原結合區是特異性結合第一抗原的Fab。
5、實施方案4的雙特異性抗體，其中該Fab包含CH1，其中該CH1是來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1，較佳地來自IgG1的CH1。
6、實施方案5所述的雙特異性抗體，其中該CH1包含(i)包含與SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或
(ii)包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
7、實施方案1至6中任一項所述的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體是包含Fc二聚體的IgG樣雙特異性抗體，其中構成該Fc二聚體的兩個Fc區相同或不同。
8、實施方案7所述的雙特異性抗體，其中該Fc區之一或二者包含降低與Fcγ受體結合的突變，例如包含L234A/L235A突變、D265A突變或P329A突變中的一個或多個，例如包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變。
9、實施方案8所述的雙特異性抗體，其中該Fc區之一或二者包含胺基酸序列SEQ ID NO：46或49所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同一性的胺基酸序列或由其組成。
10、實施方案7至9中任一項所述的雙特異性抗體，其中該兩個Fc區不同，較佳地，在第一單體Fc區和第二單體Fc區中分別引入相應的結(knob)突變和扣(Hole)突變。
11、實施方案10所述的雙特異性抗體，其中
a)一個Fc-區多肽包含結突變T366W，而另一個Fc-區多肽包含扣突變
T366S、L368A和Y407V，或
b)一個Fc-區多肽包含結突變T366W和Y349C，而另一個Fc-區多肽包含扣突變T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一個Fc-區多肽包含結突變T366W和S354C，而另一個Fc-區多肽包含扣突變T366S、L368A、Y407V和Y349C；
視需要地，該Fc區還包含降低與Fcγ受體結合的突變，例如，L234A/L235A突變、D265A突變或P329A突變中的一個或多個；例如L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變。
12、實施方案7至11中任一項所述的雙特異性抗體，其中該Fc區之一或二者包含鉸鏈區，例如EPKSS或EPKSC。
13、實施方案12所述的雙特異性抗體，其中
(i)第一Fc區包含結突變，其
a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：43或89或由其組成；或
b)包含與SEQ ID NO：43或89具有至少90%同一性，例如95%，96%，97%，99%或更高的同一性且包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變和結突變(例如S354C和T366W)的胺基酸序列或由其組成；和/或
(ii)第二Fc區包含扣突變，其
a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30、42或59或由其組成；或
b)包含與SEQ ID NO：30、42或59具有至少90%同一性，例如95%，96%，97%，99%或更高的同一性且包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變和扣突變(例如Y349C,T366S,L368A和Y407V)的胺基酸序列或由其組成。
14、實施方案1至13中任一項的雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含一個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中
該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，
包含扣突變的Fc區構成第一重鏈；
該Fab片段的CH1的C末端融合該scFv片段的N末端，且該scFv片段的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該Fab片段的VL-CL構成輕鏈。
15、實施方案1至13中任一項的雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含兩個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中
該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，
第一Fab片段的CH1的C末端融合至包含扣突變的Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；
第二Fab片段的CH1的C末端融合該scFv片段的N末端，且該scFv片段的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該第一和第二Fab片段的VL-CL分別構成兩條輕鏈；
其中該第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
16、實施方案1至13中任一項的雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含一個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中
該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，
該Fab片段的CH1的C末端融合至包含扣突變的Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；
該scFv片段的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該Fab片段的VL-CL構成輕鏈。
17、實施方案1至13中任一項的雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含兩個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中
該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，
第一Fab片段的CH1的C末端融合至第二Fab片段的VH的N末端，且第二Fab片段的CH1的C末端融合至包含扣突變的Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；
該scFv片段的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；且
該第一和第二Fab片段的VL-CL分別構成兩條輕鏈；
其中該第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
18、實施方案1至18中任一項的雙特異性抗體，其中第一抗原為腫瘤相關抗原，例如選自GPRC5D或MUC16(例如人GPRC5D或人MUC16)。
19、實施方案18的雙特異性抗體，其中第一抗原為人GPRC5D，第一抗原結合區包含重鏈可變區VH的3個CDR，HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區VL的3個CDR，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
(i)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：62、38或40中任一項所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：63所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(ii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：72所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：73所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(iii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：82所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：83所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
20、實施方案19的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含
(i)如SEQ ID NO：64所示的HCDR1、如SEQ ID NO：65、39或41所示的HCDR2、如SEQ ID NO：66所示的HCDR3；如SEQ ID NO：67所示的LCDR1、如SEQ ID NO：68所示的LCDR2和如SEQ ID NO：69所示的LCDR3；
(ii)如SEQ ID NO：74所示的HCDR1、如SEQ ID NO：75所示的HCDR2、如SEQ ID NO：76所示的HCDR3；如SEQ ID NO：77所示的LCDR1、如SEQ ID NO：78所示的LCDR2和如SEQ ID NO：79所示的LCDR3；或
(iii)如SEQ ID NO：84所示的HCDR1、如SEQ ID NO：85所示的HCDR2、如SEQ ID NO：86所示的HCDR3；如SEQ ID NO：87所示的LCDR1、如SEQ ID NO：78所示的LCDR2和如SEQ ID NO：88所示的LCDR3。
21、實施方案19或20的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH，其中該重鏈可變區
(i)包含與SEQ ID NO：62、72、82、16、23、25、27、29、38或40的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：62、72、82、16、23、25、27、29、38或40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
22、實施方案19至21中任一項的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含輕鏈可變區VL，其中該輕鏈可變區
(i)包含與SEQ ID NO：63、73、83、17、19或21的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：63、73、83、17、19或21的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
23、實施方案19至22中任一項的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中
(i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或
(iv)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：16、23、25、27、29、38或40所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17、19或21所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
24、實施方案19至23中任一項的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成：
(i).SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63；
(ii).SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73；
(iii).SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83；
(iv).SEQ ID NO：16、23、25、27、29、38或40和SEQ ID NO：21；
(v).SEQ ID NO：16或25和SEQ ID NO：17；
(vi).SEQ ID NO：16或27和SEQ ID NO：19。
25、實施方案18的雙特異性抗體，其中第一抗原為人MUC16，第一抗原結合區包含重鏈可變區VH的3個CDR，HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區VL的3個CDR，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：92或113中所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：96、100、102或114所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR。
26、實施方案25的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含
如SEQ ID NO：93所示的HCDR1、如SEQ ID NO：94示的HCDR2、如SEQ ID NO：95示的HCDR3；如SEQ ID NO：97、101或103示的LCDR1、如SEQ ID NO：98示的LCDR2和如SEQ ID NO：99的LCDR3。
27、實施方案25或26的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH，其中該重鏈可變區
包含與SEQ ID NO：92或113的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者包含SEQ ID NO：92或113的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
28、實施方案25至27中任一項的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含輕鏈可變區VL，其中該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：96、100、102或114的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者包含SEQ ID NO：96、100、102或114的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
29、實施方案25至28中任一項的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中
該重鏈可變區包含SEQ ID NO：92或113所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：96、100、102或114所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
30、實施方案25至29中任一項的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中VH包含SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且該VL包含SEQ ID NO：96、100或102所示的胺基酸序列或由其組成；或
第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中VH包含SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且該VL包含SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列或由其組成。
31、核酸分子，其編碼實施方案1至30中任一項的雙特異性抗體中的任一條鏈，或由該核酸序列組成。
32、表達載體，其包含實施方案31的核酸分子，較佳地，該表達載體為pCDNA，例如pCDNA3.1。
33、宿主細胞，其包含實施方案31所述的核酸分子或實施方案32該表達載體，較佳地，該宿主細胞是原核的或真核的，例如293細胞或CHO細胞，例如293F細胞或293T細胞或CHO-S細胞。
34、製備實施方案1至30中任一項所述的雙特異性抗體的方法，該方法包括，在適合該抗體的鏈表達的條件下，培養實施方案31所述的核酸分子或實施方案32所述的表達載體的宿主細胞，和視需要地從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
35、免疫綴合物，其包含實施方案1至30中任一項所述的雙特異性抗體。
36、醫藥組成物或藥物或製劑，其包含實施方案1至30中任一項所述的雙特異性抗體，或實施方案35的免疫綴合物以及視需要地藥用輔料。
37、藥物組合產品，其包含實施方案1至30中任一項所述的雙特異性抗體，或實施方案35的免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑)。
38、在受試者中預防或治療癌症的方法，包括向受試者施用有效量的實施方案1至30中任一項所述的雙特異性抗體，或實施方案35的免疫綴合物，或實施方案36的醫藥組成物或製劑；或實施方案37的藥物組合產品。
39、實施方案38的方法，其中該癌症的腫瘤細胞中具有升高的第一抗原的蛋白質水平和/或核酸水平(例如表達升高)。
40、實施方案38的方法，其中該第一抗原選自GPRC5D或MUC16。
41、實施方案38至40中任一項的方法，其中該癌症是實體腫瘤或血液腫瘤，例如卵巢癌(例如漿液性卵巢癌，例如卵巢漿液性囊腺癌、卵巢癌漿液性腺癌、卵巢癌黏液腺癌、子宮內膜樣腺癌、卵巢癌透明細胞腺癌)、骨髓瘤、結腸癌、直腸癌或結直腸癌。
42、實施方案38至41中任一項的方法，其中該方法還包括與其它療法例如治療方式(例如手術或放療)和/或其它治療劑(例如化療劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑)組合施用。
43、檢測第一抗原在生物樣品中的存在的方法，其包括
(i)將生物樣品與實施方案1至30中任一項所述的雙特異性抗體在允許其與第一抗原結合的條件下接觸，
(ii)檢測在該抗體或雙特異性抗體和第一抗原之間是否形成複合物，
其中複合物的形成表示存在第一抗原。
在一些方面，本發明涉及以下具體的實施方案：
1.一種特異性結合人CD3的抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含：
1)序列如SEQ ID NO：3所述的重鏈可變區(VHCD3)或與SEQ ID NO：3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重鏈可變區；和
2)序列如SEQ ID NO：4所述的輕鏈可變區(VLCD3)或與SEQ ID NO：4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈可變區。
2.實施方案1的抗CD3抗體或其抗原結合片段包含：
1)序列如SEQ ID NO：1所示的重鏈(H)或與SEQ ID NO：1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重鏈；和
2)序列如SEQ ID NO：2所述的輕鏈(L)或與SEQ ID NO：2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈。
3.一種特異性結合人MUC16的抗MUC16抗體或其抗原結合片段，其包含VH和VL，其中：
1)該VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，該VL包含如SEQ ID NO：97所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；或
2)該VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，該VL包含如SEQ ID NO：101所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；或
3)該VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，該VL包含如SEQ ID NO：103所示
的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；或
4.實施方案3所述的特異性結合人MUC16的抗MUC16抗體或其抗原結合片段，其包含：
1)序列如SEQ ID NO：92該VH或與SEQ ID NO：92具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VH；和序列如SEQ ID NO：96該VL或與SEQ ID NO：96具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL；或
2)序列如SEQ ID NO：92該VH或與SEQ ID NO：92具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VH；和序列如SEQ ID NO：100該VL或與SEQ ID NO：100具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL；或
3)序列如SEQ ID NO：92該VH或與SEQ ID NO：92具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VH；和序列如SEQ ID NO：102該VL或與SEQ ID NO：102具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL；或
4)序列如SEQ ID NO：113該VH或與SEQ ID NO：113具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VH；和序列如SEQ ID NO：114該VL或與SEQ ID NO：114具有至少
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL。
5.實施方案3或4該抗MUC16抗體或其抗原結合片段包含：
1)序列如SEQ ID NO：106所示的重鏈(H)或與SEQ ID NO：106具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重鏈，和序列如SEQ ID NO：107該輕鏈(L)或與SEQ ID NO：107具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈；或
2)序列如SEQ ID NO：106所示的重鏈(H)或與SEQ ID NO：106具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重鏈，和序列如SEQ ID NO：108該輕鏈(L)或與SEQ ID NO：108具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈；或
3)序列如SEQ ID NO：106所示的重鏈(H)或與SEQ ID NO：106具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重鏈，和序列如SEQ ID NO：109該輕鏈(L)或與SEQ ID NO：109具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈；或
4)序列如SEQ ID NO：115所示的重鏈(H)或與SEQ ID NO：115具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重鏈，和序列如SEQ ID NO：116該輕鏈(L)或與SEQ ID NO：116
具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的輕鏈。
6.實施方案1或2所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段或實施方案3至5中任一項所述的抗MUC16抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段是Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；線性抗體；scFv。
7.實施方案6所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該scFv包含如SEQ ID NO：11所示的序列或與SEQ ID NO：11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列。
8.一種抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其包含：
(i)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：96所示的LCDR1，如SEQ ID NO：97所示的LCDR2和如SEQ ID NO：98所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3，並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；或
1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：101所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3，並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；或
1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：103所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR和2如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3，並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；
或者
(ii)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：97所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；或
1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：101所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；或
1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：103所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3；
或者
(iii)1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：97所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3，或
1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：101所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3，或
1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1，如SEQ ID NO：94所示的HCDR2和如SEQ ID NO：95所示的HCDR3，識別MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO：103所示的LCDR1，如SEQ ID NO：98所示的LCDR2和如SEQ ID NO：99所示的LCDR3；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的HCDR2和如SEQ ID NO：7所示的HCDR3並且VLCD3包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR1，如SEQ ID NO：9所示的LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3。
9.實施方案8該一種抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其包含：
(i)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含選自SEQ ID NO：92或113的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID NO：96、100、102或114的序列；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列。
(ii)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含選自SEQ ID NO：92或113的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID NO：96、100、102或114的序列；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列；或
(iii)1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含選自SEQ ID NO：92或113的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID NO：96、100、102或114的序列；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列。
10.實施方案8或9該抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其包含：
(i)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含SEQ ID NO：113的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID NO：114的序列；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列。
(ii)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含選自SEQ ID NO：113的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID NO：114的序列；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列；或
(iii)1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中識別MUC16分子的VH包含選自SEQ ID NO：113的序列，識別MUC16分子的VL包含選自SEQ ID NO：114的序列；識別CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3，其中該VHCD3包含SEQ ID NO：3所示的序列並且VLCD3包含SEQ ID NO：4所示的序列。
11.實施方案8至10中任一項所述的抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其中所包含的2個識別MUC16分子的抗原識別位點可以具有相同的VH/VL序列，或不同的VH/VL序列。
12.實施方案8至11中任一項所述的抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其中該Fc區選自IgG類抗體的Fc區，例如來自同種型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區，較佳地該Fc區包含突變，例如增加雙特異性抗體二聚體穩定性的突變(例如杵入臼結構)、減少或者增加效應子功能的突變。
13.實施方案8至12中任一項所述的抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其中該scFv藉由接頭與Fc或CH1連接，例如柔性肽接頭。
14.實施方案8至13中任一項所述的抗CD3×MUC16雙特異性抗體，其包含：
(i)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為VH-CH1-scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1和2的VH-CH1結構配對形成2個識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中重鏈1包含SEQ ID NO：118所示的序列，重鏈2包含SEQ ID NO：121所示的序列，並且輕鏈包含SEQ ID NO：116所示的序列。
(ii)1條結構為VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和1條結構為VL-CL的輕鏈，其中輕鏈與重鏈1的VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中重鏈1包含SEQ ID NO：118所示的序列，重鏈2包含SEQ ID NO：117所示的序列，並且輕鏈包含SEQ ID NO：116所示的序列；或
(iii)1條結構為VH-CH1-VH-CH1-Fc的重鏈1，1條結構為scFv-Fc的重鏈2，和2條結構為VL-CL的輕鏈，其中2條輕鏈分別與重鏈1中的2個VH-CH1結構配對形成識別MUC16分子的2個抗原識別位點，scFv形成識別CD3分子的抗原識別位點，其中重鏈1包含SEQ ID NO：119所示的序列，重鏈2包含SEQ ID NO：117所示的序列，並且輕鏈包含SEQ ID NO：116所示的序列。
15.一種編碼如實施方案1至2或6至7中任一項所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段，編碼如實施方案3至6中任一項所述的抗MUC16抗體或其抗原結合片段，或編碼如實施方案8-13中任一項該抗CD3×MUC16雙特異性抗體的核酸。
16.包含實施方案15所述核酸的載體，較佳地該載體是表達載體。
17.包含實施方案15所述核酸或實施方案16所述載體的宿主細胞。
18.一種用於產生如實施方案1至2或6至7中任一項所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段，如實施方案3至中任一項所述的抗MUC16抗體或其抗原結合片段，或如實施方案8至13中任一項所述的抗CD3×MUC16雙特異性抗體的方法，包括步驟：
(i)在適於表達本發明抗CD3抗體、抗MUC16或抗CD3×MUC16雙特異性抗體的條件下培養本發明的宿主細胞，視需要地，
(ii)回收本發明的抗CD3抗體、抗MUC16或抗CD3×MUC16雙特異性抗體。
19.一種醫藥組成物，其包含如實施方案1至2或6至7中任一項所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段，如實施方案3至6中任一項所述的抗
MUC16抗體或其抗原結合片段，或如實施方案8至13中任一項所述的抗CD3×MUC16雙特異性抗體，以及可藥用載體。
20.實施方案19所述的醫藥組成物，其還包含其它治療劑，較佳地，該其它治療劑選自化療劑、細胞毒性劑。
21.如實施方案1至2或6至7中任一項所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段，如實施方案3至6中任一項所述的抗MUC16抗體或其抗原結合片段，或如實施方案8至13中任一項所述的抗CD3×MUC16雙特異性抗體或如實施方案19至20中任一項所述的醫藥組成物在製備用於治療、預防和/或診斷卵巢癌症的藥物中的用途。
22.一種治療、預防和/或診斷卵巢癌症的方法，包括將治療有效量或診斷有效量的如實施方案1至2或6至7中任一項所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段，如實施方案3至6中任一項所述的抗MUC16抗體或其抗原結合片段，或如實施方案8至13中任一項所述的抗CD3×MUC16雙特異性抗體、或如實施方案19至20中任一項所述的醫藥組成物施用給有需要的受試者。
23實施方案21所述的用途或實施方案22所述的方法，其中所述卵巢癌症是卵巢癌，例如是漿液性卵巢癌，例如卵巢漿液性囊腺癌、卵巢癌漿液性腺癌、卵巢癌黏液腺癌、子宮內膜樣腺癌、卵巢癌透明細胞腺癌。
在一些方面，本發明涉及以下具體的實施方案：
1、抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區VH的3個CDR，HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區VL的3個CDR，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
(i)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：62、38或40中任一項所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：63所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(ii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：72所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：73所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(iii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：82所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：83所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2、抗GPRC5D抗體或其抗原結合片段，其包含
(i)如SEQ ID NO：64所示的HCDR1、如SEQ ID NO：65、39或41所示的HCDR2、如SEQ ID NO：66所示的HCDR3；如SEQ ID NO：67所示的LCDR1、如SEQ ID NO：68所示的LCDR2和如SEQ ID NO：69所示的LCDR3；
(ii)如SEQ ID NO：74所示的HCDR1、如SEQ ID NO：75所示的HCDR2、如SEQ ID NO：76所示的HCDR3；如SEQ ID NO：77所示的LCDR1、如SEQ ID NO：78所示的LCDR2和如SEQ ID NO：79所示的LCDR3；或
(iii)如SEQ ID NO：84所示的HCDR1、如SEQ ID NO：85所示的HCDR2、如SEQ ID NO：86所示的HCDR3；如SEQ ID NO：87所示的LCDR1、如SEQ ID NO：78所示的LCDR2和如SEQ ID NO：88所示的LCDR3。
3、實施方案1或2的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區VH，其中該重鏈可變區
(i)包含與SEQ ID NO：62、72、82、16、23、25、27、29、38或40的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：62、72、82、16、23、25、27、29、38或40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
4、實施方案1-3中任一項的抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區VL，其中該輕鏈可變區
(i)包含與SEQ ID NO：63、73、83、17、19或21的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：63、73、83、17、19或21的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
5、實施方案1或2的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中
(i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或
(iv)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：16、23、25、27、29、38或40所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17、19或21所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
6、實施方案1或2的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成：
(i).SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63；
(ii).SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73；
(iii).SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83；
(iv).SEQ ID NO：16、23、25、27、29、38或40和SEQ ID NO：21；
(v).SEQ ID NO：16或25和SEQ ID NO：17；
(vi).SEQ ID NO：16或27和SEQ ID NO：19。
7、實施方案1至6中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其還包含重鏈恆定區HC，例如，該抗體重鏈恆定區HC為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區，較佳的IgG1的重鏈恆定區。
8、實施方案7的抗體或其抗原結合片段，其包含
(i)包含與選自SEQ ID NO：45或48的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或
(ii)包含選自SEQ ID NO：45或48的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
9、實施方案7或8的抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈恆定區包含降低與Fcγ受體結合的突變，例如LALA突變、D265A突變和/或P329A突變，較佳地包含LALA突變和D265A和P329A突變。
10、實施方案1至9中任一項的抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈恆定區，例如該輕鏈恆定區為lambda或kappa輕鏈恆定區。
11、實施方案10的抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈恆定區
(i)包含與選自SEQ ID NO：47或50的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或
(ii)包含選自SEQ ID NO：47或50的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
12、實施方案1至11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO：60、70、80、14、22、24、26或28的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
13、實施方案1至12中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈，其中該輕鏈包含SEQ ID NO：61、71、81、15、18或20的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
14、實施方案12或13所述的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈和輕鏈，其中
(i)該重鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；
(ii)該重鏈包含SEQ ID NO：70的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；
(iii)該重鏈包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一
性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：81的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；
(iv)該重鏈包含SEQ ID NO：14、22、24、26或28所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，且該輕鏈包含SEQ ID NO：15、18或20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；
(v)該重鏈包含SEQ ID NO：14或24所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，且該輕鏈包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；
(vi)包含如下SEQ ID NO：14或26所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，且該輕鏈包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；
(vii)包含如下SEQ ID NO：14、22、24、26或28所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，且該輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
15、實施方案14所述的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈和輕鏈分別包含如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列，或由該如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列組成：
(i).SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61；
(ii).SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71；
(iii).SEQ ID NO：80和SE QI DNO：81；
(iv).SEQ ID NO：14或24和SEQ ID NO：15；
(v).SEQ ID NO：14或26和SEQ ID NO：18；
(vi).SEQ ID NO：14、22、24、26或28和SEQ ID NO：20。
16、實施方案1至15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體或嵌合抗體。
17、實施方案1至16中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單株抗體。
18、實施方案1至17中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體
(例如scFv)、(Fab’)2、單結構域抗體例如VHH、dAb(domain antibody)或線性抗體。
19、實施方案1至6中任一項的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是雙特異性抗體或多特異性抗體，其包含針對GPRC5D的第一結合特異性和針對一種或多種的分子的其它結合特異性。
20、實施方案19的抗體或其抗原結合片段，其為雙特異性抗體，其包含針對GPRC5D的第一結合特異性和針對CD3的第二結合特異性。
21、實施方案20的雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，
其中第一抗原結合區特異性結合GPRC5D，且包含VH和VL，其中
該VH包含如實施方案1或2所定義的HCDR1、HCDR2、HCDR3且該VL包含實施方案1或2所定義的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
該VH和VL為如實施方案3至6中任一項所定義的VH和VL；
第二抗原結合區特異性結合CD3。
22、實施方案21所述的雙特異性抗體，其中該第二抗原結合區包含VH和VL，該VH包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該VL包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
(i)HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：3中任一項所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，且LCDR1、LCDR2和LCDR3選自如SEQ ID NO：4中任一項所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(ii)HCDR1由SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列組成，HCDR2由SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列組成，HCDR3由SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列組成，LCDR1由SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列組成，LCDR2由SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列組成，且LCDR3由SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列組成。
23、實施方案22所述的雙特異性抗體，其中第二抗原結合區包含VH和VL，其中
該VH含有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，
和/或該VL含有SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
24、實施方案21至23中任一項的雙特異性抗體，其中該第一抗原結合區為實施方案1-18中任一項所定義的抗GPRC5D抗體的Fab。
25、實施方案24所述的雙特異性抗體，該Fab包含CH1，其中該CH1是來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1，較佳地來自IgG1的CH1。
26、實施方案25所述的雙特異性抗體，其中該CH1包含(i)包含與選自SEQ ID NO：44的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或
(ii)包含選自SEQ ID NO：44的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
27、實施方案21至26中任一項所述的雙特異性抗體，其中該第二抗原結合區為scFv。
28、實施方案27所述的雙特異性抗體，其中該scFv包含接頭，該接頭例如包含胺基酸序列(G4S)n，其中n=1、2、3、4或5，較佳地，n=3或4，更佳地，n=3。
29、實施方案21至28中任一項所述的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體是包含Fc二聚體的IgG樣雙特異性抗體，其中構成該Fc二聚體的兩個Fc區相同或不同。
30、實施方案29所述的雙特異性抗體，其中該Fc區之一或二者包含降低與Fcγ受體結合的突變，例如包含L234A/L235A突變、D265A突變或P329A突變中的一個或多個，例如包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變。
31、實施方案30所述的雙特異性抗體，其中該Fc區之一或二者包含胺基酸序列SEQ ID NO：46或49所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性，例如95%，96%，97%，99%或更高的同一性的胺基酸序列或由其組成。
32、實施方案29至31中任一項所述的雙特異性抗體，其中該兩個Fc區不同，較佳地，在第一單體Fc區和第二單體Fc區中分別引入相應的結(knob)突變和扣(Hole)突變。
33、實施方案32所述的雙特異性抗體，其中
a)一個Fc-區多肽包含結突變T366W，而另一個Fc-區多肽包含扣突變T366S、L368A和Y407V，或
b)一個Fc-區多肽包含結突變T366W和Y349C，而另一個Fc-區多肽包含扣
突變T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一個Fc-區多肽包含結突變T366W和S354C，而另一個Fc-區多肽包含扣突變T366S、L368A、Y407V和Y349C；
視需要地，該Fc區還包含降低與Fcγ受體結合的突變，例如，L234A/L235A突變、D265A突變或P329A突變中的一個或多個；例如L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變。
34、實施方案29至33中任一項所述的雙特異性抗體，其中該Fc區之一或二者包含鉸鏈區，例如EPKSS或EPKSC。
35、實施方案33所述的雙特異性抗體，其中
(i)第一Fc區包含結突變，其
a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：43或89或由其組成；或
b)包含與SEQ ID NO：43或89具有至少90%同一性，例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性且包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變和結突變(例如S354C和T366W)的胺基酸序列或由其組成；和/或
(ii)第二Fc區包含扣突變，其
a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30、42或59或由其組成；或
b)包含與SEQ ID NO：30、42或59具有至少90%同一性，例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性且包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變和扣突變(例如Y349C,T366S,L368A和Y407V)的胺基酸序列或由其組成。
36、實施方案21至35中任一項的雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區、第二抗原結合區和Fc二聚體，其中第一抗原結合區為特異性結合GPRC5D的Fab片段，第二抗原結合區為特異性結合CD3的scFv。
37、實施方案36的雙特異性抗體，其包含一個第一抗原結合區Fab，一個第二抗原結合區scFv和Fc二聚體，其中該Fab包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL，Fc二聚體中的一個Fc區包含扣突變，且另一個包含結突變；其中
包含扣突變的Fc區構成第一重鏈；
該Fab片段的CH1的C末端融合至該scFv片段的VH的N末端，且該scFv片段的VL的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該Fab片段的VL-CL構成輕鏈。
38、實施方案37所述的雙特異性抗體，其中該
第一重鏈包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
第二中重鏈包含SEQ ID NO：31、34或35所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；和/或
輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成。
39、實施方案36的雙特異性抗體，其包含兩個第一抗原結合區Fab，一個第二抗原結合區scFv和Fc二聚體，其中該Fab包含VH-CH1和VL-
CL，該scFv包含VH-接頭-VL，Fc二聚體中的一個Fc區包含扣突變且另一個包含結突變；
第一Fab片段的CH1的C末端融合至包含扣突變的Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；
第二Fab片段的CH1的C末端融合至該scFv片段的VH的N末端，且該scFv片段的VL的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該第一和第二Fab片段的VL-CL分別構成兩條輕鏈；
其中該第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
40、實施方案39的雙特異性抗體，其中
(i)第一重鏈包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
第二中重鏈包含包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；和/或
輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
(ii)第一重鏈包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
第二中重鏈包含包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；和/或
輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；或
(iii)第一重鏈包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
第二中重鏈包含包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；和/或
輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成。
41.利要求36的雙特異性抗體，其包含一個第一抗原結合區Fab，一個第二抗原結合區scFv和Fc二聚體，其中該Fab包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL，Fc二聚體中的一個Fc區包含扣突變且另一個包含結突變；
該Fab片段的CH1的C末端融合至包含扣突變的Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；
該scFv片段的VL的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；
且
該Fab片段的VL-CL構成輕鏈。
42.實施方案41的雙特異性抗體，其中
第一重鏈包含SEQ ID NO：32、33或36所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；
第二中重鏈包含包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成；和/或
輕鏈包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列，或由該序列組成。
43、核酸分子，其編碼實施方案1至20中任一項的所述的抗體或其抗原結合片段的任一條鏈，或實施方案21至42中任一項的雙特異性抗體中的任一條鏈，或由該核酸序列組成。
44、表達載體，其包含實施方案43的核酸分子，較佳地，該表達載體為pCDNA，例如pCDNA3.1。
45、宿主細胞，其包含實施方案43所述的核酸分子或實施方案44所述的表達載體，較佳地，該宿主細胞是原核的或真核的，例如293細胞或CHO細胞，例如293F細胞或293T細胞或CHO-S細胞。
46、製備實施方案1至20中任一項的所述的抗體或其抗原結合片段或實施方案21至42中任一項所述的雙特異性抗體的方法，該方法包括，在適合該抗體的鏈表達的條件下，培養實施方案43所述的核酸分子或實施方案44所述的表達載體的宿主細胞，和視需要地從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
47、免疫綴合物，其包含實施方案1至20中任一項的所述的抗體或其抗原結合片段或實施方案21至42中任一項所述的雙特異性抗體。
48、醫藥組成物或藥物或製劑，其包含實施方案1至20中任一項的所述的抗體或其抗原結合片段或實施方案21至42中任一項所述的雙特異性抗體，或實施方案47的免疫綴合物以及視需要地藥用輔料。
49、藥物組合產品，其包含實施方案1至20中任一項的所述的抗體或其抗原結合片段或實施方案21至42中任一項所述的雙特異性抗體，或實施方案47的免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑)。
50、在受試者中預防或治療癌症的方法，包括向受試者施用有效量的實施方案1至20中任一項的所述的抗體或其抗原結合片段或實施方案21至42中任一項所述的雙特異性抗體，或實施方案47的免疫綴合物，或實施方案48的醫藥組成物或製劑；或實施方案49的藥物組合產品。
51、實施方案50的方法，其中該癌症的腫瘤細胞中具有升高的GPRC5D的蛋白質水平和/或核酸水平(例如表達升高)。
52、實施方案50或51的方法，其中該癌症是實體腫瘤或血液腫瘤，例如骨髓瘤、結腸癌、直腸癌或結直腸癌。
53、實施方案50至52中任一項的方法，其中該方法還包括與其它療法例如治療方式(例如手術或放療)和/或其它治療劑(例如化療劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑)組合施用。
54、檢測GPRC5D在生物樣品中的存在的方法，其包括
(i)將生物樣品與實施方案1至20中任一項的所述的抗體或其抗原結合片段或實施方案21至42中任一項所述的雙特異性抗體在允許其與GPRC5D結合的條件下接觸，
(ii)檢測在該抗體或雙特異性抗體和GPRC5D之間是否形成複合物，
其中複合物的形成表示存在GPRC5D。
[實施例]
實施例1：人源化CD3抗體的製備和表徵
1.1 CD3抗體人源化準備
SP34抗體是特異性結合CD3epsilon亞基(CD3ε)的鼠源抗體，其與人、猴具有種屬交叉活性(Pessano,S.,et al.(1985)."The T3/T cell receptor complex：antigenic distinction between the two 20-kd T3(T3-delta and T3-epsilon)subunits." EMBO J 4(2)：337-344.)。本實施例以抗體SP34作為候選分子進行人源化的構建。
採用CDR移植技術(CDR grafting technology)對鼠抗SP34進行人源化。簡言之：藉由將上述SP34 VH及SP34 VL序列在IMGT數據庫中檢索比
對，分別獲得與SP34重鏈可變區和輕鏈可變區同源性較高的人胚系基因序列IGHV3-73*01和IGLV7-46*01，將其作為人源化抗體可變區的框架；分別將鼠抗SP34的CDR移植到相應的人源化抗體重輕鏈可變區框架中，形成人源化的抗CD3抗體可變區。為了維持鼠源抗體SP34的親和力，需要對獲得的人源化抗體可變區進行回復突變。
由此分別獲得了SP34抗體的人源化重鏈可變區序列(hu34H1)和輕鏈可變區序列(hu34L2)，並進而獲得了SP34抗體人源化抗體，具體序列參見表1。
人源化的對照抗體(Roche-CD3/017-Roche-CD3)序列來自專利US 2016/0075785 A1，其重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：51，輕鏈為SEQ ID NO：52，具體參見序列表。
將表1以及對照抗體Roche-CD3的可變區胺基酸序列送至通用生物系統(安徽)有限公司(General Biology System(Anhui)Co.,Ltd.)進行密碼子優化和基因合成。將編碼Roche-CD3抗體的VH區和VL區的基因依次插入含有人IgG1重鏈恆定區(胺基酸序列SEQ ID NO：45)編碼基因和lambda輕鏈恆定區(胺基酸序列SEQ ID NO：47)編碼基因的表達載體pcDNA3.1(+)中，以獲得表達抗CD3人源化抗體017-2全長重鏈hu34H1(SEQ ID NO：1)的質粒和表達全長輕鏈hu34L2(SEQ ID NO：2)的質粒。同時將合成的VH區(hu34H1)和VL區(hu34L2)藉由(G4S)3連接肽SEQ ID NO：12組成單鏈抗體23L2(23L2ScFv)(SEQ ID NO：11)，插入含有人IgG1重鏈恆定區Fc區(胺基酸序列SEQ ID NO：46)編碼基因的表達載體pcDNA3.1(+)中，獲得表達DA023AH23L2(scFv-Fc)(SEQ ID NO：13)的質粒。使用的重鏈恆定區均含有L234A、L235A、D265A和P329A(根據Eu編碼)位點的突變，以消除效應功能。
單鏈抗體(23L2)命名為23L2ScFv，胺基酸序列如下SEQ ID NO：11所示。合成的包含恆定區Fc結構域的抗CD3單鏈抗體命名為DA023AH23L2(VH-連接肽-VL-Fc)，其序列為SEQ ID NO：13，其中VH-連接肽-VL的胺基酸序列為SEQ ID NO：11，Fc區的胺基酸序列為SEQ ID NO：46。
依據製造商產品手冊說明，使用ExpiCHOTM表達系統(ThermoFisher,Cat#A29133)將上文獲得的質粒共轉染ExpiCHO-S細胞表達對照抗體Roche-CD3、017-2及DA023AH23L2。轉染後培養細胞10-12天，當細胞
存活率下降到60%至70%時，收集上清液，使用MabSelect Sure蛋白A親和層析系統(GE healthcare)純化表達在上清液中的抗體。濃縮純化的抗體，無菌過濾，藉由SDS-PAGE和分子排阻檢測抗體蛋白的純度，結果表明抗體的純度符合要求，可以用於下一步實驗。
1.2 檢測人源化CD3抗體的激活作用
採用Jurkat/NFAT-luc(螢光素酶)報告基因系統檢測CD3抗體的激活作用。按照廠商說明，藉由Gene Pul Ser X Cell TM(BIO-RAD)電轉方式將NFAT-luc2P(質粒：Promega,Cat# E8481)中的報告基因元件轉染到Jurkat(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，Cat# SCSP-513)細胞中，然後用潮黴素B(Invitrogen,Cat#10687010)篩選得到NFAT-luc2P多株細胞株，多株細胞有限稀釋後得到穩定且高表達NFAT-luc2P的單株細胞株Jurkat/NFAT-luc。
收集細胞，離心後去上清，用測試緩衝液(99%1640培養基+1%FBS)重新懸浮細胞，使得細胞密度為5×105/mL。接種細胞於384孔板(Corning,Cat#3570)中，每孔40μl。然後加入梯度系列稀釋的人源化抗CD3抗體DA023AH23L2、Roche-CD3(終濃度為起始20nM，3倍稀釋，8個梯度)，每孔10μl。將384孔板放置在37℃培養箱中，6小時後，每孔加入30μl One-Glo(Promega,Cat#E6130)試劑，最後用多功能酶標儀(Tecan Infinite F200PRO)檢測發光信號，螢光素酶的表達情況直接反映了CD3抗體的激活作用。結果如圖1所示，表明017-2和DA023AH23L2有激活作用。
實施例2：免疫原
由於難以產生重組的GPRC5D抗原，使用標準方法產生GPRC5D[human和cyno]的轉染細胞系，以用作全細胞抗原用於抗體產生和表徵研究(表2)。
人GPRC5D蛋白(NP_061124.1(NCBI序列號)，sp|Q9NZD1(Uniprot序列號)，SEQ ID NO：57)基因序列由通用生物系統(安徽)有限公司進行密碼子優化和基因合成。使用LipofectamineTM 2000(Invitrogen,Cat#11668019)轉染試劑將編碼人GPRC5D蛋白基因序列分別轉染到CHO-K1(ACTT,Cat#CCL-61)和HEK293T(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，Cat# SCSP-502)細胞中。食蟹猴GPRC5D蛋白(XP_005570249.2(NCBI序列號)，SEQ ID NO：58)基因序列由通用生物系統(安徽)有限公司進行密碼子優化和基因合成。使用LipofectamineTM 2000將編碼食蟹猴GPRC5D蛋白基因序列轉染到HEK293T細胞中。轉染後的細胞經過0.3μg/mL嘌呤黴素(Gibco,Cat#A1113802)篩選和單株鋪板，得到了高表達人GPRC5D的CHO-K1(CHO-K1-HuGPRC5D)和HEK293T工程化單株細胞(HEK293T-HuGPRC5D)以及高表達食蟹猴的GPRC5D的HEK293T多株細胞(HEK293T-CynoGPRC5D)(表2)。編碼人GPRC5D和食蟹猴GPRC5D蛋白的胺基酸序列見序列表。
表2：GPRC5D表達型細胞系
實施例3. 抗人GPRC5D抗體的產生
3.1 融合瘤
3.1.1 動物免疫
採用CHO-K1-HuGPRC5D細胞系(表2)免疫5隻BALB/c小鼠(浙江維通利華實驗動物技術有限公司)。對小鼠進行兩週一次為期四次的交替注射(表3)。分別在第一次免疫後7天和第二次加強免疫後7天對小鼠進行靜脈採血，採用HEK293T-HuGPRC5D細胞系和HEK293T-CynoGPRC5D細胞系(表2)對小鼠免疫血清進行流式細胞術(FACS)測定，選擇兩隻小鼠用於動物融合。在最後一次加強免疫後四天，取小鼠脾臟，將從脾臟中分離的淋巴細胞用於融合以產生融合瘤。
表3. 小鼠免疫程序
3.1.2 融合瘤篩選
來自249個融合瘤的組織培養上清液藉由FACS檢測法進行初級篩選測試，在此測定中，選取對HEK293T-HuGPRC5D細胞系或HEK293T-CynoGPRC5D細胞系有結合的31個株進行下一輪確認測試。利用篩選的抗原再測試陽性培養物以確認分泌。
3.1.3 亞選殖
將選擇的融合瘤細胞系(親本株)亞選殖以確保單株性。藉由使用單步選殖系統再次鋪板親本株來進行亞選植。將24個亞株轉移至96孔培養板。藉由FACS法篩選亞株，篩選同時結合HuGPRC5D和CynoGPRC5D的抗體。
3.1.4 融合瘤測序
藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增技術獲得鼠源抗GPRC5D抗體輕鏈和重鏈可變區序列。用RNAprep pure Cell Kit(TIANGEN,Cat#DP430)分離24個抗體的總RNA，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，K1622)反轉錄成cDNA。用PCR方法選殖了重鏈和輕鏈可變區，所有PCR均採用高保真聚合酶進行。將PCR擴增到的抗體重鏈和輕鏈可變域序列片段送到蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。測定編碼生成的抗體的輕鏈可變域和重鏈可變域的胺基酸序列，抗體的Kabat輕鏈和重鏈可變區序列示於表4中。
實施例4：藉由融合瘤技術獲得的GPRC5D抗體的表徵
4.1 抗GPRC5D嵌合抗體的合成與表達
表4中3個鼠源抗體的DNA序列由通用生物系統(安徽)有限公司進行密碼子優化和基因合成。將編碼抗體的VH區和VL區的基因依次插入含有編碼人
IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：48)和kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO：50)的基因的表達載體pcDNA3.1(+)中以獲得鼠源嵌合抗體。
人源化的對照抗體GPRC5D(株號GC5B596，重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：55，輕鏈胺基酸序列為SEQ I DNO：56)和CD3(株號CD3B219，重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：53，輕鏈胺基酸序列為SEQ I DNO：54)序列來自專利WO2018017786A2。
將編碼抗GPRC5D抗體的重輕鏈的質粒共轉染ExpiCHO-S細胞以表達如表5所述鼠源嵌合抗體及對照抗體GC5B596和CD3B219，並進行相應純化。依據製造商產品手冊說明，使用ExpiCHOTM表達系統(ThermoFisher,Cat#A29133)將表5所述的編碼抗GPRC5D抗體的重輕鏈的質粒共轉染ExpiCHO-S細胞以表達抗GPRC5D嵌合抗體，以及類似的表達對照抗體GC5B596和CD3B219。轉染後培養細胞10-12天，當細胞存活率下降到60%至70%時，收集上清液，使用MabSelect Sure蛋白A親和層析系統(GE healthcare)純化表達在上清液中的抗體。濃縮純化的抗體，無菌過濾，藉由SDS-PAGE和分子排阻檢測抗體蛋白的純度，結果表明抗體的純度>90%，可以用於下一步實驗。
表5：嵌合抗體名稱以及對應重輕鏈的組合
4.2 抗GPRC5D嵌合抗體與表達人GPRC5D蛋白或食蟹猴GPRC5D蛋白的細胞結合
藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的抗GPRC5D嵌合抗體能否與穩定表達在細胞表面的人GPRC5D蛋白或食蟹猴GPRC5D蛋白結合。
酶解消化表2所示的HEK293T-HuGPRC5D細胞系和HEK293T-CynoGPRC5D後得到兩種細胞的單細胞懸液，室溫400×g離心後棄培養基。得到的細胞沉澱用PBS洗一遍後用梯度稀釋的表5所示的抗GPRC5D嵌合抗體和對照抗體GC5B596(初始濃度為133.3nM，4倍等比梯度稀釋共8個濃度)重新懸浮，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞一遍後加入1：200稀釋的螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson TmmunoResearch,Cat# 109-116-098)，4℃避光孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後重新懸浮細胞，最後用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式細胞儀檢測二通道螢光信號。
從圖2所示的結果可知結果顯示，鼠源嵌合抗GPRC5D抗體可以與表達人GPRC5D蛋白(圖2A)和食蟹猴GPRC5D蛋白(圖2B)的細胞結合，嵌合抗體29H12C9和嵌合抗體39A9F1株結合能力優於對照抗體(GC5B596)和細胞的結合。
實施例5：鼠源抗GPRC5D抗體人源化及其表徵
5.1 鼠源抗GPRC5D抗體人源化
對抗體29H12C9進行人源化，方法如實施例1所述。將29H12C9的序列分別在IMGT數據庫中檢索比對，分別獲得與29H12C9重鏈可變區同源性較高的人胚系基因序列IGHV1-46*01作為重鏈可變區人源化框架，選擇與輕鏈可變區同源性較高的人胚系基因序列IGKV4-1*01作為輕鏈可變區人源化框架，將
29H12C9重輕鏈可變區的CDR移植到相應的人源化框架中，形成人源化的29H12C9抗體可變區。為了維持抗體GPRC5D的親和力，需要對獲得的人源化抗體可變區進行回復突變。
由此分別獲得人源化重鏈可變區和人源化輕鏈可變區序列，表6列出鼠源抗體29H12C9人源化可變區胺基酸序列。
將可變區胺基酸序列送至通用生物系統(安徽)有限公司進行密碼子優化和基因合成。將編碼抗體的VH區和VL區的基因依次插入含有人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：48)編碼基因和kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO：50)的編碼基因的表達載體pcDNA3.1(+)中，以獲得表達抗GPRC5D人源化抗體全長重鏈的質粒和編碼全長輕鏈的質粒。表6列出了各個抗體的名稱、可變區序列以及重鏈和輕鏈序列。
表6：人源化抗體名稱以及對應的序列的SEQ ID NO。
此外，還可以對抗體CDR2的55位和56位胺基酸進行突變，獲得如下抗體：
5.2 人源化抗GPRC5D抗體表達及純化
如實施例4.1所述將編碼重輕鏈的質粒組合(表6)共轉染ExpiCHO-S細胞以表達抗GPRC5D人源化抗體，並如實施例1.1所述進行相應純化。濃縮純化的抗體，無菌過濾，藉由SDS-PAGE和分子排阻色譜(SEC)檢測抗體純度。
5.3 人源化抗GPRC5D抗體物理化學分析
對於獲得的人源化抗GPRC5D抗體，藉由分子排阻色譜確認了抗體的純度。具體而言，使用100mM磷酸鈉+100mM Na2SO4(pH 7.0)作為運行緩衝液，將20μg抗體樣品注入到TSK G3000SWXL管柱上。運行30分鐘。收集的流出液採用Agilent 1220 HPLC進行測量，並使用OpenLAB軟體分析數據。結果表明抗體的純度>90%，可以用於下一步實驗。
5.4 人源化抗GPRC5D抗體與表達人GPRC5D蛋白的工程化細胞結合
藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的抗GPRC5D人源化抗體能否與穩定表達在細胞表面的人GPRC5D蛋白結合。
酶解消化表2所示的HEK293T-HuGPRC5D細胞系後得到HEK293T-huGPRC5D細胞的單細胞懸液，室溫400×g離心後棄培養基。細胞沉澱用PBS洗一遍後用梯度稀釋的抗GPRC5D人源化抗體和鼠源嵌合抗體29H12C9(初始濃度為166.67nM，4倍等比梯度稀釋共8個濃度點)重新懸浮，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞一遍後加入1：200稀釋的螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch,Cat# 109-116-098)，4℃避光孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後重新懸浮細胞，最後用Beckman Cytoflex流式細胞儀檢測二通道螢光信號。
從圖3所示的結果可知結果顯示，抗GPRC5D人源化抗體可以與表達人GPRC5D蛋白的細胞結合，抗體結合能力與鼠抗對照抗體(29H12C9)接近。
實施例6：抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體
6.1 構建雙特異性抗體
本發明構建了如圖4所示的三種不同非對稱結構的雙特異性抗體，其中各個雙特異性抗體的抗GPRC5D的抗原結合區來源於上述實施例5產生的人源化GPRC5D抗體，抗CD3的抗原結合區來源於實施例1產生的人源化CD3抗體，雙特異性抗體恆定區均包含結入扣結構(knob-in-hole,KIH)(Merchant,A.M.,et al.(1998)."An efficient route to human bispecific IgG." Nat Biotechnol 16(7)：677-681.)，並含有L234A、L235A、D265A和P329A(根據Eu編碼)位點的突變，以消除效應功能。這類雙特異性抗體在本文中也稱為“抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體”或“抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體”，有時簡稱為“雙特異性抗體分子”、“雙抗”。
抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體的抗GPRC5D部分靶向表達GPRC5D的細胞，而抗CD3部分活化T細胞。雙抗同時結合腫瘤細胞上的GPRC5D和T細胞的CD3有助於藉由經活化的T細胞定向殺傷腫瘤細胞。
本發明使用標準構建方法獲得了如圖4所示結構的三種抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體，其胺基酸序列在下表7中列出。其中雙特異性抗體的重鏈按照從N端到C端的順序依次以來源序列進行命名，例如23L2-Rknob(又名Hu34Scfv-Rknob)表示該序列從N段到C端依次包括來源於23L2的ScFv和含有結突變的恆定區；29H6-Rhole表示該序列從N段到C端依次包括來源於29H6的序列和含有扣突變的恆定區。為了消除29H6重鏈分子的轉譯後修飾(PTM)位點，對29H6重鏈55位天冬醯胺(N)或56位甘胺酸(G)進行突變，分別突變為絲胺酸(S)或谷胺酸(E)，突變後在分子中簡稱NS或GE(Kabat)。
下表7總結了各個雙特異性抗體的構建以及相關序列：
表7：本發明雙特異性抗體分子的構建以及序列
如下構建各個雙特異性抗體分子的各條鏈：
23L2-Rknob(又名Hu34Scfv-Rknob)：將編碼抗CD3單鏈抗體23L2的核苷酸序列選殖到帶有Fc(Knob)的pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得23L2-Knob分子。
29H6-23L2-Rknob：以人源化抗GPRC5D抗體重鏈編碼序列為模板擴增編碼重鏈可變區和重鏈恆定區CH1段的核苷酸序列，並採用重疊PCR技術將該序列與編碼完整的23L2-Rknob的核苷酸序列直接拼接(兩段序列之間沒有連接肽)，將拼接完成的核苷酸序列選殖到表達載體pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得29H6-23L2-Rknob分子。
29H6NS-23L2-Rknob：以構建好的29H6-23L2-Knob為模板，採用重疊PCR技術將第55位的天冬醯胺(N)突變為絲胺酸(S)，並選殖到表達載體pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得29H6NS-23L2-Rknob分子。
29H6GE-23L2-Rknob：以構建好的29H6-23L2-Rknob為模板，採用重疊PCR技術將第56位的甘胺酸(G)突變為谷胺酸(E)，並選殖到表達載體pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得29H6GE-23L2-Rknob分子。
29H6-Rhole：將編碼人源化抗GPRC5D抗體重鏈可變區和重鏈恆定區CH1段的核苷酸序列選殖到帶有Fc(Hole)的pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得29H6-Rhole分子。
29H6NS-Rhole：以構建好的29H6-Rhole為模板，採用重疊PCR技術將第55位的天冬醯胺(N)突變為絲胺酸(S)，並選殖到表達載體pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得29H6NS-Rhole分子。
29H6GE-Rhole：以構建好的29H6-Hole為模板，採用重疊PCR技術將第56位的甘胺酸(G)突變為谷胺酸(E)，並選殖到表達載體pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得29H6GE-Rhole分子。
29HL3：將編碼人源化抗29H6抗體輕鏈的核苷酸序列選殖到pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得29HL3分子。
根據表7所示的具體組成，將上述各個表達載體相應組合，在合適的條件下表達獲得圖4中的雙特異性抗體。
雙特異性抗體的構建、表達、純化、初步分析步驟同實施例1.1或4.1。
6.2 雙特異性抗體與表達人CD3蛋白、人GPRC5D蛋白和食蟹猴GPRC5D的細胞的結合實驗
(1)藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體能否與內源性表達在Jurkat細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，Cat# SCSP-513)上的CD3蛋白結合。
本實驗採用流式細胞術進行測定。離心收集Jurkat細胞，PBS重新懸浮細胞後接種至96孔板(Corning,Cat#3799)，每孔1×105個細胞，96孔板離心後棄上清，將100μL梯度稀釋的待測雙特異性抗體(最高濃度為166.67nM，4倍等比梯度稀釋，共8個濃度點)加入到Jurkat細胞中，4℃孵育30分鐘。室溫400×g離心後棄上清後，用PBS將細胞洗兩遍後離心棄上清。細胞沉澱用1：200稀釋的螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch,Cat#109-116-098)重新懸浮，4℃避光孵育30分鐘。細胞用PBS洗兩遍後每孔加入100μL的PBS重新懸浮細胞，用Beckman Cytoflex流式細胞儀檢測螢光信號。
從圖5所示的結果可知，測試的雙特異性抗體在高濃度下可以與Jurkat細胞上表達的CD3蛋白結合。
(2)藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體能否與穩定表達人GPRC5D蛋白的HEK293T細胞結合。流式細胞術參見上文，將100μL梯度稀釋的待測雙特異性抗體(最高濃度為166.67nM，4倍等比梯度稀釋，共8個濃度點)加入到表2所述的293T-huGPRC5D細胞中，4℃孵育30分鐘。室溫400×g離心後棄上清後，用PBS將細胞洗兩遍後離心棄上清。細胞沉澱用1：200稀釋的螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch,Cat#109-116-098)重新懸浮，4℃避光孵育30分鐘。細胞用PBS洗兩遍後每孔加入100μL的PBS重新懸浮細胞，用Beckman Cytoflex流式細胞儀檢測螢光信號。
圖6A和6B所示的結果可知，測試的雙特異性抗體可以與表達人GPRC5D蛋白的HEK293T細胞結合。
(3)藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的抗GPRC5D/CD3雙功能抗體能否與穩定表達在細胞表面的食蟹猴GPRC5D蛋白結合。
酶解消化表2所示的HEK293T-CynoGPRC5D細胞系後得到單細胞懸液，室溫400×g離心後棄培養基。細胞沉澱用PBS洗一遍後用梯度稀釋的表5所示的雙功能抗體(初始濃度為115.6nM，4倍等比梯度稀釋共8個濃度點)重新懸浮，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞一遍後加入1：200稀釋的螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch,Cat# 109-116-098)，4℃避光孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後重新懸浮細胞，最後用Beckman Cytoflex流式細胞儀檢測二通道螢光信號。
結果如圖6C顯示，Bi-29H6-6能特異地結合表達食蟹猴GPRC5D的細胞。
(4)抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體與表達人GPRC5同家族蛋白的細胞的結合實驗
GPRC5D屬G蛋白偶聯受體中的GPRC5家族成員，同家族還有GPRC5A、GPRC5B，GPRC5C。在本實驗中分別測試了抗GPRC5D/CD3雙功能抗體對過表達人GPRC5A、GPRC5B，GPRC5C的293T細胞結合，以確認抗GPRC5D/CD3雙功能抗體對GPRC5D的結合特異性。
酶解消化293T-huGPRC5A、293T-huGPRC5B和293T-huGPRC5C細胞系(將人GPRC5A(UniProtKB/Swiss-Prot：Q8NFJ5)、人GPRC5B(UniProtKB/Swiss-Prot：Q9NZH0)和人GPRC5C(UniProtKB/Swiss-Prot：Q9NQ84)分別轉染293T細胞經過0.3μg/mL嘌呤黴素(Gibco,Cat#A1113802)加壓篩選後獲得)後得到單細胞懸液，室溫400×g離心後棄培養基。細胞沉澱用PBS洗一遍後用梯度稀釋的雙功能抗體(初始濃度為10μg/mL，10倍等比梯度稀釋共2個濃度點)重新懸浮，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞一遍後加入1：200稀釋的螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch,Cat# 109-116-098)，4℃避光孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後重新懸浮細胞，最後用Beckman Cytoflex流式細胞儀檢測二通道螢光信號。
結果如圖6D、6E和6F所示，分別以anti-GPRC5A(R&D,MAB5239)、anti-GPRC5B(R&D,MAB10253)和anti-GRPC5C(R&D,MAB6594)作為陽性對照(R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(subclasses 1+2a+2b+3),Fcγ Fragment Specific(min X Hu,Bov,Rb Sr Prot)(Jackson ImmunoResearch，115-115-164)作為二抗)以陰性對照IgG control(Sino，MA16SE3081)作為參照，抗
GPRC5D/CD3雙功能抗體Bi-29H6-6對GPRC5A，GPRC5B和GPRC5C表達細胞均不結合，證明了其對GPRC5D的結合具有特異性。
6.3 抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體對T細胞的激活以及對腫瘤細胞的殺傷活性
本實施例檢測抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體依賴結合GPRC5D抗原激活Jurkat/NFAT-luc報告基因系統(螢光素酶，Promega,Cat#E8481)的激活作用。檢測系統中的靶細胞為內源性表達人GPRC5D的NCI-H929(南京科佰生物科技有限公司，CBP60243)腫瘤細胞株或者HEK293T陰性細胞株。
抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體同時與NCI-H929細胞表面的GPRC5D和Jurkat細胞表面的CD3結合，藉由結合GPRC5D抗原依賴性的抗體交聯，激活Jurkat細胞CD3下游信號。螢光素酶的表達情況直接反映了抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體對Jurkat/NFAT-luc細胞的激活作用。
收集Jurkat/NFAT-luc細胞(效應細胞，如實施例1.2所述製備)，離心後去上清，用測試緩衝液(99% 1640培養基+1% FBS)重新懸浮細胞，使得效應細胞密度為1E6/mL。消化收集NCI-H929腫瘤細胞株以及293T陰性細胞株(靶細胞)，離心後去上清，用測試緩衝液重新懸浮細胞，使得靶細胞密度為5E5/mL。然後分別將效應細胞和靶細胞懸液接種於384孔檢測白板(Corning,Cat#3570)中，每孔接種20μL效應細胞和20μL靶細胞，加入梯度稀釋(最高檢測濃度為116nM，4倍等比梯度稀釋，共9個濃度點)的待測雙特異性抗體，每孔20μL。。將384孔板放置在37℃培養箱中，6小時後，每孔加入25μL One-Glo(Promega,Cat#E6130)試劑，最後用多功能酶標儀(Tecan,Cat#F200)檢測自發光信號。
結果在圖7中示出，結果表明抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體能在表達人GPRC5D的細胞(NCI-H929細胞)存在時激活CD3信號通路，且具有抗體的濃度依賴性。
圖8表明當檢測體系中沒有GPRC5D存在時(HEK293T陰性細胞株)，抗CD3/GPRC5D雙特異性抗體只在高濃度下能激活CD3信號通路。因此，本發明的雙特異性抗體對CD3信號通路的激活有濃度依賴，具有較少的非特異性激活，表明本發明的雙特異性抗體能夠特異性激活CD3信號通路。
為了檢測抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體介導T細胞殺傷腫瘤細胞的活性，我們建立了原代T細胞依賴的細胞毒性試驗系統，以內源性表達人GPRC5D的NCI-H929為靶細胞，人外周血單個核細胞PBMC(取自健康人血)為效應細胞。
復蘇PBMC細胞，用1640完全培養基(添加10% FBS)調整細胞密度至1~2×106/mL，加入終濃度為100IU/mL IL2(江蘇金絲利藥業有限公司)激活過夜。靶細胞NCI-H929以及GPRC5D陰性細胞Raji(中科院典型培養物保藏委員會細胞庫，Cat# TCHu 44)，400×g離心5min收集細胞棄上清。用含1% FBS(Gibco，Cat#10099-141)和100IU/mL IL2的MEM-α(Gibco，Cat#41061-029)測試緩衝液調整靶細胞密度至2×105/mL，按每孔50μL(即每孔10,000個細胞)鋪到96孔板(Corning,Cat#3599)中。
準備等比梯度稀釋的待測抗體稀釋液(待測抗體最高檢測濃度為30nM，5倍等比梯度稀釋，共8個濃度點)，每孔加入50μL。實驗同時設置靶細胞最大殺傷(靶細胞中加2% Triton100裂解液)、最小殺傷(靶細胞中加測試緩衝液)及自然殺傷(靶細胞中加效應細胞)對照，每孔加入50μL。最終效應細胞E
和靶細胞T的比例為10：1，然後放置於細胞培養箱繼續孵育24h。孵育結束後，取出實驗板，400×g離心3min使所有細胞沉到板底，小心吸取50μL上清至新的96孔板，加入50μL LDH檢測液(Roche，Cat#11644793001)室溫孵育，顏色變化時在F50酶標儀上讀板，檢測波長為492nm，參比波長為650nm，當最大殺傷孔的OD492值介於0.4~1.0之間時進行檢測分析。
結果見圖9和圖10，表明抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體能夠特異性誘導T細胞殺傷NCI-H929腫瘤細胞，而在低濃度下對GPRC5D陰性細胞Raji完全沒有殺傷效應，僅在抗體高濃度下有輕微殺傷效應。因此，本發明的雙特異性抗體能夠特異性地誘導表達GPRC5D的T細胞殺傷，無可見的非特異性激活。
6.4 抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體激活T細胞後誘導細胞因子釋放
為了檢測抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體介導T細胞殺傷腫瘤細胞同時的對因子分泌誘導的情況，我們建立了原代T細胞依賴的細胞毒性試驗系統，以內源性表達人GPRC5D的NCI-H929為靶細胞，人外周血單核細胞PBMCs為效應細胞。如6.3所示進行殺傷孵育。在殺傷終點，取上清檢測體系裡的IL-6、TNF-α和IFN-γ。
殺傷孵育結束後，取出實驗板，400×g離心3min使所有細胞沉到板底，小心吸取100μL上清至新的96孔板，分別檢測上清中的人IFNγ(檢測試劑盒：Cisbio，Cat#62HIFNGPEH)、人TNFα(檢測試劑盒：R&D，Cat#DY210)以及人IL-6(檢測試劑盒：R&D，Cat#DY206)因子水平。
結果見圖11，表明抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體在NCI-H929體系中能夠誘導T細胞釋放人IFNγ(圖11A)、人TNFα(圖11B)以及人IL-6因子(圖11C)。圖12表明，在不表達GPRC5D的Raji體系中抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體在低濃度下不能誘導IL-6的釋放，僅在抗體高濃度下能誘導IFNγ、TNFα和IL-6的少量釋放(圖12A-C)，因此表明抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體具有較好的誘導特異性。
綜上，在T細胞介導的對陰性細胞殺傷及因子分泌實驗中，Bi-29H6-6誘導PBMC對非相關靶細胞Raji的殺傷活性較弱，誘導免疫細胞產生的細胞因子的水平較低，提示抗CD3/抗GPRC5D雙功能抗體引起細胞因子風暴的風險較低，安全性更好。
6.5 雙特異性抗體與人/猴CD3蛋白的親和力實驗
在本實驗中，根據廠商說明，利用ForteBio Octet RED96檢測了雙特異抗體與人CD3D & CD3E異源二聚蛋白(Sino Biological Cat#CT038-H2508H)、猴CD3D & CD3E異源二聚蛋白(Acro biosystems,Cat#CDD-C52W4)的結合親和力。
簡要地，將AHC傳感器(ForteBio,Cat#18-5060)放進Running Buffer(1 X PBS Hyclone,Cat#SH30256.01，包含0.02% Tween20，pH7.0)，在室溫條件下進行預平衡10min。在96孔板中，動力學實驗方法按照以下步驟進行：
a)用Running Buffer平衡基線100s，
b)加入用Running Buffer稀釋的雙特異抗體，終濃度5μg/mL，固化200s，
c)用Running buffer平衡基線300s，
d)向各孔中加入100nM用Running Buffer稀釋的人/猴CD3蛋白，結合200s，解離600s。
實驗數據使用Fortebio Data Analysis軟體1：1結合模型進行擬合併計算。表8總結了雙特異性抗體Bi-29H6-6與人/猴CD3蛋白結合親和力。
表8：Bi-29H6-6與人/猴CD3蛋白結合親和力
表8表明本申請構建的雙特異性抗體可以特異地結合來自人/猴CD3蛋白，具有種屬交叉活性。
通常針對CD3蛋白的親和力較佳低於針對其他靶標的親和力，這樣有助於藉由產生瀑布效應以形成成簇的T細胞，從而指數式地引起下游信號通路的變化。可見，本申請獲得的抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體保留了適當的CD3親和力。
實施例7. 抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體體內抑制腫瘤
實施例7.1 本實施例藉由在攜帶小鼠結腸癌細胞系MC38的C57BL/6-hCD3e轉基因小鼠中評價了抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體對小鼠皮下移植瘤的抑制作用。
首先，構建高表達人GPRC5D的小鼠結腸癌細胞系MC38。採用慢病毒感染方法將編碼人GPRC5D蛋白(NP_061124.1(NCBI序列號)，sp|Q9NZD1(Uniprot序列號)，SEQ ID NO：57)的核苷酸(由通用生物合成)感染到MC38細胞中。然後用添加了4μg/mL嘌呤黴素(Gibco,Cat#A1113802)培養基篩
選和鋪單選殖，得到了高表達人GPRC5D的多株細胞，進而藉由有限稀釋法獲得高表達人GPRC5D的單株MC38細胞株，命名為MC38-huGPRC5D。
收集並計數MC38-huGPRC5D細胞，按1：1體積比添加基質膠(Matrigel)混勻後放在濕冰盒內低溫保存使用。實驗動物為6-8週齡的C57BL/6-hCD3e小鼠(百奧賽圖生物科技有限公司)。將含2×106細胞的PBS混懸液100μL和等體積Matrigel混勻後，接種於35隻小鼠背部皮下，接種體積為200μL。接種前用3-4%異氟烷將小鼠麻醉。其中5隻小鼠接種腫瘤細胞當天同時給藥(G5)。當腫瘤生長到平均約60-80mm3左右時，將25隻小鼠根據腫瘤大小和體重隨機分3組(G1、G3和G4：每組5隻)，分組給藥當天定義為第0天。分組情況和給藥方案如表9所示：
表9：分組和給藥方案
每天觀察記錄小鼠的外觀及行為，自分組開始連續觀察最多4週。分組後每週測量腫瘤體積兩次。
腫瘤體積(V)的計算方法如下：
腫瘤體積(mm3)=1/2×(a×b2)(其中a表示長徑，b表示短徑)
每隻小鼠相對腫瘤體積(RTV)的計算方法是：RTV=Vt/V0，其中Vt為每次的測量體積，V0為治療開始時的體積。分組後每週測量並記錄老鼠體
重兩次。結果以平均值±S.E.M的方式呈現。使用Dunnett’s multi-comparison test進行兩組間比較，如果p<0.05則認為有統計學顯著性差異。
結果見圖13A，相對於陰性對照(G1組)，G3、G4和G5組都具有良好的抑瘤作用，差異性極其顯著。G4和G5組小鼠的荷瘤有完全消退的個體。
表25：
a 腫瘤數據的呈現為平均值±標准偏差
b 腫瘤抑制率=(1-給藥組的相對體積/PBS組的相對體積)*100%
c 對比G1組
實施例7.2 抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體在人源骨髓瘤NCI-H929細胞株NCG小鼠Mixeno模型中的抗腫瘤作用
本實施例藉由在移植PBMC的NCG小鼠上接種人源骨髓瘤NCI-H929腫瘤模型上評價了抗CD3/抗GPRC5D雙特異性抗體對小鼠皮下移植瘤的抑制作用。
首先在合適週齡(7-9週)的NCG(江蘇集萃藥康生物技術有限公司)小鼠背部右邊靠近腋下接種人源骨髓瘤NCI-H929細胞株，細胞用PBS重新
懸浮(5×106/mice/100μL)與100μL基質膠(Matrigel)1：1等體積混合後接種。在腫瘤接種的當天，腹腔移植PBMC(供體Z0080)1×107/小鼠/100μL。當腫瘤生長到平均約70-90mm3左右時(約7天)，將18隻小鼠根據腫瘤大小和體重隨機分3組(G1~G3：每組6隻)，分組給藥當天定義為第0天。分組情況和給藥方案如表22所示：
表22：分組和給藥方案
腫瘤細胞接種後，常規監測包括了腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。試驗過程中觀察到的臨床症狀均記錄在原始數據中。
開始給藥後，每週測量兩次小鼠的體重和腫瘤的大小。腫瘤體積計算公式：
腫瘤體積(mm3)=1/2×(a×b2)(其中a表示長徑，b表示短徑)。
實驗中使用StudyDirectorTM(版本號3.1.399.19，供應商StudylogSystem,Inc.)軟體收集數據，包括腫瘤的長短徑的測量和動物體重的稱量，原始數據由天平和游標卡尺測量後直接導入軟體，數據的任何變動都將被記錄在此軟體中。給藥、腫瘤測量及體重稱量等全部過程都在生物安全櫃或超淨工作臺中進行。
圖13B顯示在實驗第5次給藥前，G2組陽性對照抗體Talquetamab(GC5B596+CD3B219)(WO2018017786A2)和G3組待測抗體Bi-29H6-6都能使腫瘤完全消退，觀察一週也未發現腫瘤有增長。對比G1組PBS，G2組和G3組具有極其顯著的抑瘤效果。G2組和G3組之間的抑瘤效果並沒有顯著性差異。
表23：
a 腫瘤數據的呈現為平均值±標准偏差
b 腫瘤抑制率=(1-給藥組的相對體積/PBS組的相對體積)*100%
c 對比G1組
實施例8. 人源化MUC16抗體的製備和表徵
8.1 製備鼠源抗MUC16抗體及序列優化
鼠源MUC16抗體776.1的序列揭露於專利US 7429382 B2，776.1可以結合到人MUC16蛋白胞外域的C末端，並且具有人猴交叉反應。藉由分析專利US 7429382 B2中FIG.8C及FIG.8D的序列，發現在776.1輕鏈中有一個未配對的半胱胺酸(C)，重鏈的第三個框架區含有一個N糖基化位點。在序列優化階段，
將輕鏈第33位(kabat編碼)的半胱胺酸(C)選擇性的突變成絲胺酸(S)或丙胺酸(A)，獲得相應的輕鏈776.1LC(C33S)和776.1LC(C33A)。它們的DNA序列由通用生物系統(安徽)有限公司進行密碼子優化和基因合成。表24給出上述獲得的各個鼠源抗MUC16抗體的可變區序列。
表24：MUC16抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區胺基酸序列
kappa輕鏈恆定區：SEQ ID NO：50
將編碼上述VH區和VL區的基因依次插入含有編碼人IgG1重鏈恆定區和kappa輕鏈恆定區的基因的表達載體pcDNA3.1(+)中以獲得相應的抗體重鏈和輕鏈。使用的重鏈恆定區均含有L234A、L235A、D265A和P329A(根據Eu編碼)位點的突變，以消除效應功能。
將上文該編碼抗MUC16抗體的重輕鏈的質粒按照表25組合，共轉染ExpiCHO-S細胞以表達如表25該抗體，之後進行相應純化(具體方法參見實施例1.1)。濃縮純化的抗體，無菌過濾，藉由SDS-PAGE和分子排阻檢測抗體蛋白的純度。
表25抗體名稱以及對應重輕鏈的組合
根據還原型SDS-PAGE和非還原型SDS-PAGE確認了重鏈的N糖基化，在還原條件下所有抗體的重鏈在50kDa上下都有兩個條帶，見圖14，結果說明重鏈第三個框架區N糖基化位點具有發生糖基化的可能性。
將人、食蟹猴和恆河猴MUC16蛋白胞外區近膜端胺基酸序列送至通用生物系統(安徽)有限公司進行基因合成，並使得各個蛋白在C末端融合了6 x His標簽。下表給出各個C末端具有His標簽的融合蛋白的胺基酸序列。
表26重組MUC16胺基酸序列
將包含編碼表26所述人、食蟹猴或恆河猴MUC16蛋白胞外區近膜端蛋白的質粒分別轉染ExpiCHO-S細胞以表達如表26所述抗原(具體方法參見實施例1.1)並用HisTrapTM excel(GE,Cat#29048586)根據廠商說明進行純化。濃縮純化的蛋白，無菌過濾，藉由SDS-PAGE檢測純化的蛋白純度。
8.2 抗MUC-16抗體對人和恆河猴MUC16蛋白的結合親和力
利用ForteBio Octet RED96分別檢測了抗MUC-16抗體對人MUC16蛋白胞外區近膜端(人MUC16-His，表26)和恆河猴MUC16蛋白胞外區近膜端(恆河猴MUC16-His，表26)結合親和力。根據製造商的說明，將AHC傳感器(ForteBio,Cat#18-5060)放進Running Buffer(1 X PBS Hyclone,Cat#SH30256.01，含有0.02% Tween20，pH7.0)，在室溫下預平衡10min。在96孔板中，動力學實驗方法按照以下步驟進行：a)用Running Buffer平衡基線100s，b)用Running Buffer稀釋抗MUC-16抗體至5μg/mL，固化200s停止，c)用Running buffer平衡基線300s，d)人或恆河猴MUC16蛋白用Running Buffer稀釋至50nM，結合200s，解離600s。實驗數據使用Fortebio Data Analysis軟體1：1結合模型進行擬合併計算。
結果如下表27所示。
8.3 抗人MUC16抗體與表達在293T細胞表面的人MUC16蛋白或恆河猴MUC16蛋白的結合
藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的抗人MUC16抗體能否與穩定表達在293T細胞表面的人或猴的MUC16蛋白結合。首先採用LipofectamineTM
2000(Invitrogen,Cat#11668019)轉染試劑將編碼人MUC16蛋白(ECT_TM huMuc16：SEQ ID NO：127，包含近膜端、跨膜區以及胞內區，由通用生物系統(安徽)有限公司進行密碼子優化和基因合成，並選殖到穩轉載體中)和恆河猴MUC16蛋白(ECT_TM RhMuc16：SEQ ID NO：128，包含近膜端、跨膜區以及胞內區，由通用生物系統(安徽)有限公司進行密碼子優化和基因合成，並選殖到穩轉載體中)分別轉染到293T細胞中，然後用0.3μg/mL嘌呤黴素(Gibco,Cat#A1113802)篩選，得到了高表達人MUC16的293T細胞(也稱為293T/hMUC16細胞)或高表達恆河猴MUC16的293T細胞(也稱為293T/恆河猴MUC16細胞，或稱為293T/rhesus MUC16細胞)。將梯度稀釋的本申請獲得的抗人MUC16抗體(初始濃度為200nM，4倍稀釋，共8個點)加入到細胞中，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後加入螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch,Cat#109-116-098)，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後重新懸浮細胞，最後用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式細胞儀檢測螢光信號。
從圖15-16所示的結果可知，776.1(C33A)、776.1(C33S)結合293T細胞上表達的人Muc16蛋白和恆河猴Muc16蛋白，其與未修飾抗體(776.1)具有相當的結合能力。
8.4 MUC16抗體人源化
對鼠抗體776.1(C33S)進行人源化，方法如實施例1所述。簡言之：將776.1(C33S)的序列在IMGT數據庫中檢索比對，分別獲得與776.1(C33S)重鏈可變區同源性較高的人胚系基因序列IGHV1-18*01作為重鏈可變區人源化框架，選擇與輕鏈可變區同源性較高的人胚系基因序列IGKV1-39*01作為輕鏈可變區
人源化框架，將776.1(C33S)重輕鏈可變區的CDR移植到相應的人源化框架中，形成人源化的抗MUC16抗體可變區。為了維持鼠源抗體776.1(C33S)的親和力，需要對獲得的人源化抗體可變區進行回復突變。為了消除潛在的N糖基化位點，在第三個框架區引入N73T(kabat編碼)。
由此分別獲得相應人源化重鏈可變區和人源化輕鏈可變區序列，如表28所示。
將重鏈可變區胺基酸序列送至蘇州金唯智生物科技有限公司和將輕鏈可變區胺基酸序列送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行密碼子優化和基因合成。將編碼抗體的VH區和VL區的基因依次插入含有人IgG1重鏈恆定區編碼基因和kappa輕鏈恆定區的編碼基因的表達載體pcDNA3.1(+)中，以獲得表達抗MUC16人源化抗體全長重鏈的質粒和編碼全長輕鏈的質粒。人源化後的MUC16抗體使用的重鏈恆定區均含有L234A、L235A、D265A和P329A(根據Eu編碼)位點的突變，以消除效應功能。
將編碼重輕鏈的質粒組合共轉染ExpiCHO-S細胞以表達抗MUC16人源化抗體(Hu-L4H7，其重鏈序列如SEQ ID NO：115所示，輕鏈序列如SEQ ID NO：116所示)，並進行相應純化(具體方法參見實施例1.1)。濃縮純化的抗體，無菌過濾，藉由SDS-PAGE和分子排阻色譜(SEC)檢測蛋白純度。
8.5 人源化抗MUC16抗體物理化學分析以及親和力檢測
對於獲得的人源化抗MUC16抗體(Hu-L4H7)，藉由分子排阻色譜確認了抗體的純度。具體而言，使用100mM磷酸鈉+100mM Na2SO4(pH 7.0)作為運行緩衝液，將20μg樣品注入到TSK G3000SWXL管柱上。運行30分鐘。收集的流出液採用Agilent 1220 HPLC進行測量，並使用OpenLAB軟體分析數據。
表29結果顯示，人源化抗MUC16抗體Hu-L4H7在SEC上的主峰高於99%，而對照776.1(C33S)的主峰為56.9%，這表明純化的人源化抗體具有更高的純度和完整性，這也顯示了人源化的抗體已經成功的去除了N糖基化。
表29人源化抗體純度
利用ForteBio Octet RED96分別檢測了人源化抗MUC-16抗體對人和恆河猴MUC16蛋白結合親和力。檢測分析方法參見實施例8.1，檢測結果參見表30。
表30. 人源化的抗MUC-16抗體與人和恆河猴MUC16蛋白結合親和力
藉由細胞結合實驗來判斷本發明的人源化抗MUC16抗體能否與穩定表達在293T細胞表面的人MUC16蛋白結合。具體檢測分析步驟參見實施例8.1。圖17顯示了人源化MUC-16抗體能夠與表達在293T細胞表面的人MUC16蛋白結合。
為了進一步驗證人源化的抗MUC16抗體能夠特異性的結合到MUC16近膜端而不與游離CA125結合，將4000U/mL的人CA125(桂林英美特生物技術有限公司，Cat#KAY0023，病人腹水提取的CA125)以50μL/孔包被在96孔板上，4℃孵育過夜。用封閉緩衝液(含有1%BSA的PBS溶液)將板在37℃孵育，封閉1h。封閉後，用PBST溶液(含有0.05%吐溫20的PBS溶液)將板洗滌1次。用稀釋液梯度稀釋生物素化的Hu-L4H7、Sofituzumab(重鏈：SEQ ID NO：125；輕鏈：SEQ ID NO：126，陽性對照)、IgG(陰性對照)，加入板中，在37℃孵育1h。孵育結束後用PBST溶液洗板。用稀釋液稀釋二抗(辣根過氧化物酶HRP標記鏈黴親和素，Jackson Immuno Research,Cat# 016-030-084)，加入板中在37℃孵育1h，孵育結束後再次清洗，用TMB顯色，之後用1M H2SO4終止，之後於酶標儀中讀取OD450nm-OD620nm的吸光值，結果見圖18。結果顯示人源化抗體Hu-L4H7不結合人CA125。
實施例9：腫瘤組織中MUC16及CD8的免疫組化檢測
卵巢癌組織切片(百意欣，Cat#FOV1006)藉由二甲苯以及乙醇進行脫蠟，並複水5分鐘。將組織切片浸沒在抗原修復液(賽維爾，Cat#G1202-250ML)中煮沸15分鐘。冷卻組織切片，並加入3%雙氧水室溫孵育10分鐘，然後在PBS溶液(索萊寶，Cat#P1010)中洗滌兩次，在5%BSA封閉液(索萊寶，Cat#SW3015)中室溫封閉1小時。然後將組織切片在封閉緩衝液中與8.7ug/mL Hu-L4H7或1：300倍稀釋的CD8抗體(Abcam,Cat#ab209775)4℃孵育過夜。用PBS溶液洗滌3次後，將組織切片與1：3000在封閉液中稀釋的山羊抗人IgG Fc特異性(Jackson ImmunoReasearch，Cat#109-035-098)抗體室溫孵育1小時。然後用PBS溶液洗滌組織切片兩次，在室溫下利用DAB(賽維爾，Cat#G1212-200T)進行檢測，顯色時間10分鐘。然後用蘇木素(賽維爾，Cat#G1004-100ML)對組織切片進行複染。再藉由乙醇和二甲苯進行脫水處理，中性樹膠(賽維爾，Cat#WG10004160)封片覆蓋蓋玻片，最後進行掃描。
結果如圖19所示，其中圖19A、19B為來自卵巢癌漿液性腺癌的切片樣品(T1aN0M0，Grade3)，圖19C、19D為來自卵巢癌黏液腺癌的切片樣品(T3aN0M0，Grade 3)，圖19E、19F為來自子宮內膜樣腺癌的切片樣品(T1aN0M0，Grade3)，圖19G、19H為來自卵巢癌透明細胞腺癌的切片樣品(T1aN0M0，Grade2)。圖19A、19C、19E及19G採用CD8抗體進行染色，圖19B、19D、19F及19H採用本申請獲得的Hu-L4H7抗體進行染色，陽性結果如箭頭所示。圖19的結果說明卵巢癌中存在一定數量的CD8 T細胞，以及本申請獲得的Hu-L4H7抗體可與卵巢癌中表達MUC16的細胞結合。由此預測基於本申請獲得的Hu-L4H7與CD3抗體的雙特異性抗體在卵巢癌中可藉由橋聯作用提高腫瘤細胞殺傷效率，從而達到抑制腫瘤生長的效果。
實施例10：抗CD3/MUC16雙特異性抗體
10.1 構建雙特異性抗體
本發明構建了如圖20所示的三種不同非對稱結構的雙特異性抗體，其中各個雙特異性抗體的抗MUC16部分來源於上述人源化MUC16抗體，抗CD3部分來源於上述人源化CD3抗體，雙特異性抗體恆定區均包含杵臼結構(knob-in-hole,KIH)(Merchant,A.M.,et al.(1998)."An efficient route to human bispecific IgG." Nat Biotechnol 16(7)：677-681.)。這類雙特異性抗體在本文中也稱為“抗CD3/MUC16雙特異性抗體”或“抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體”，有時簡稱為“雙特異性抗體分子、雙抗”。抗CD3/MUC16雙特異性抗體的抗MUC16部分靶向表達MUC16的細胞，而抗CD3部分活化T細胞。雙抗同時結合腫瘤細胞上的MUC16和T細胞的CD3有助於藉由經活化的T細胞定向殺傷腫瘤細胞。
本申請使用標準構建方法獲得了如圖20所示結構的3種抗CD3/MUC16雙特異性抗體，其胺基酸序列在下表31中列出。其中雙特異性抗體的重鏈按照從N端到C端的順序依次以來源序列進行命名，例如23L2ScFv-Hole表示該序列從N段到C端依次包括來源於23L2的ScFv和含有臼結構的恆定區；2MCH7-KIH-Knob表示該序列從N段到C端依次包括2個來源於MCH7的序列和含有杵結構的恆定區。
如下構建各個雙特異性抗體分子：
23L2ScFv-Hole：將編碼抗CD3單鏈抗體23L2的核苷酸序列選殖到帶有Fc(Hole)的pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得23L2ScFv-Hole分子。
MCH7-23L2ScFv-Hole：以人源化抗MUC16抗體重鏈編碼序列為模板擴增編碼重鏈可變區和重鏈恆定區CH1段的核苷酸序列，並採用重疊PCR技術將該序列
與編碼完整的23L2ScFv-Hole的核苷酸序列直接拼接(兩段序列之間沒有連接肽)，將拼接完成的核苷酸序列選殖到表達載體pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得MCH7-23L2ScFv-Hole分子。
MCH7-KIH-Knob：將編碼人源化抗MUC16抗體重鏈可變區和重鏈恆定區CH1段的核苷酸序列選殖到帶有Fc(Knob)的pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得MCH7-KIH-Knob分子。
MCL4 LC：將編碼人源化抗MUC16抗體輕鏈的核苷酸序列選殖到pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得MCL4 LC分子。
2MCH7-KIH-Knob：採用重疊PCR技術，將2個編碼人源化抗MUC16抗體重鏈可變區和重鏈恆定區CH1段的核苷酸序列直接串聯拼接(2個編碼片段之間沒有連接肽)，再將拼接好的序列選殖到帶有Fc(Knob)的pcDNA3.1(+)載體中，表達獲得2MCH7-KIH-Knob分子。
根據表31所示的具體組成，將上述各個表達載體相應組合，在合適的條件下表達獲得圖8中的雙特異性抗體。
對照抗體REGN4018來自於專利US20190389966A1，由通用生物系統(安徽)有限公司進行密碼子優化和基因合成並選殖到表達載體中。
雙特異性抗體的構建、表達、純化、初步分析步驟同實施例1.1。
表31抗CD3/MUC16雙特異性抗體的組成
10.2 雙特異性抗體與人/食蟹猴CD3蛋白、MUC16蛋白的親和力實驗
在本實驗中，根據廠商說明，利用ForteBio Octet RED96檢測了雙特異抗體與人CD3蛋白(Cat#CT038-H2508H，Sinobiological)、食蟹猴CD3蛋白(Cat#CDD-C52W4,Acrobiosystems)、人MUC16蛋白(人MUC16全長、MUC16胞外區近膜端(表26))和食蟹猴MUC16蛋白(食蟹猴MUC16全長、MUC16胞外區近膜端(表26))的結合親和力。
簡要地，將AHC傳感器(ForteBio,Cat#18-5060)放進Running Buffer(1 X PBS Hyclone,Cat#SH30256.01，包含0.02% Tween20，pH7.0)，在室溫條件下進行預平衡10min。在96孔板中，動力學實驗方法按照以下步驟進行：a)用Running Buffer平衡基線100s，b)加入用Running Buffer稀釋的抗人CD3和MUC-16雙特異抗體，終濃度5μg/mL，固化200s，c)用Running buffer平衡基線300s，d)向各孔中加入如下濃度的用Running Buffer稀釋的人和食蟹猴的
CD3和MUC16蛋白：100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM，結合200s，解離600s。實驗數據使用Fortebio Data Analysis軟體1：1結合模型進行擬合併計算。
表32總結了雙特異性抗體MCH7-23L2-MCH7與人和食蟹猴CD3蛋白結合親和力。表33總結了雙特異性抗體MCH7-23L2-MCH7與人和食蟹猴MUC16蛋白結合親和力。
表33 MCH7-23L2-MCH7與人和食蟹猴MUC16蛋白結合親和力
表32-33表明本申請構建的雙特異性抗體可以特異地結合來自人或者食蟹猴的CD3蛋白和MUC16蛋白，具有種屬交叉活性。本申請獲得的雙特異性抗體針對CD3蛋白的KD值比針對MUC16蛋白低一個數量級。
目前業內共識CD3抗體對CD3複合體ε鏈的親和力強弱是CD3雙抗是否構建成功的關鍵因素，最佳的CD3親和力應維持在1-100nM的範圍內，且對T細胞的激活處於合適的範圍。通常針對CD3蛋白的親和力較佳低於針對其他靶標的親和力。可見，本申請獲得的抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體保留了最佳的CD3親和力，符合上述要求。
10.3 雙特異性抗體與表達人CD3蛋白、MUC16蛋白的細胞的結合實驗
(1)藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體能否與內源性表達在人類卵巢癌細胞(OVCAR3)(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，Cat#TCHu228)上的MUC16蛋白結合。
本實驗採用流式細胞術進行測定。消化離心收集OVCAR3細胞，PBS溶液重新懸浮細胞後接種至96孔板(Corning,Cat#3799)，每孔1×105個細胞，96孔板離心後棄上清，將100μl梯度稀釋的待測雙特異性抗體(最高濃度為200nM，隨後從100nM開始，5倍稀釋，總共9個濃度點)加入到OVCAR3細胞中，4℃孵育30分鐘後離心(1000rpm,5分鐘)棄上清。每孔加入100μl PBS溶液將細胞洗兩遍後再加入100μl 1：200稀釋的螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch,Cat#109-116-098)，4℃孵育30分鐘。用PBS溶液將細胞洗兩遍後每孔加入100μl PBS溶液重新懸浮細胞，最後用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式細胞儀根據廠商說明檢測螢光信號。採用REGN4018作為陽性對照。
從圖21所示的結果可知，測試的雙特異性抗體可以與OVCAR3細胞上表達的MUC16分子結合。測試的雙特異性抗體在高濃度條件下與OVCAR3細胞上表達的MUC16分子的結合強度優於對照REGN4018。
(2)藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體能否與穩定表達在293T細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，Cat# SCSP-502)表面的食蟹猴MUC16蛋白結合。首先採用LipofectamineTM 2000(Invitrogen,Cat#11668019)轉染試劑，根據廠商說明，將編碼食蟹猴的MUC16蛋白(ECT_TM cyMuc16：SEQ ID NO：120)，包含近膜端、跨膜區以及胞內區，由通用生物系統(安徽)有限公司進行密碼子優化和基因合成，並選殖到穩轉載體pIRESpuro3中)的真核表達載體轉染到293T細胞中，轉染後48小時用0.3μg/mL嘌呤黴素(Puromycin Dihydrochloride，Gibco,Cat#A1113802)篩選3~5天，得到了高表達食蟹猴MUC16蛋白的293T細胞。流式細胞術參見上文，將梯度稀釋的待測雙特異性抗體(初始濃度為100nM，5倍稀釋，9個點)加入到細胞中，4℃孵育30分鐘。用PBS將細胞洗兩遍後加入螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific，4℃孵育30分鐘。用PBS將細胞洗兩遍後重新懸浮細胞，最後用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式細胞儀檢測螢光信號。
從圖22所示的結果可知，測試的雙特異性抗體可以與293T細胞上表達的食蟹猴MUC16蛋白質結合。
(3)藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體能否與內源性表達在Jurkat細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，Cat# SCSP-513)上的CD3蛋白結合。採用上文描述的流式細胞術進行檢測，區別如
下：待測雙特異性抗體的稀釋梯度為：最高濃度為200nM，隨後第二個濃度從100nM開始，5倍稀釋，10個點)加入到Jurkat細胞中，4℃孵育30分鐘。用PBS將細胞洗兩遍後加入螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific，4℃孵育30分鐘。用PBS將細胞洗兩遍後重新懸浮細胞，最後用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式細胞儀檢測螢光信號。
從圖23所示的結果可知，測試的雙特異性抗體可以與細胞表達的人CD3分子結合。
10.4 抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體對T細胞的激活以及對腫瘤細胞的殺傷活性
本實施例檢測抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體MUC16抗原依賴的對Jurkat/NFAT-luc報告基因系統(質粒：Promega,Cat# E8481)的激活作用。檢測系統中的靶細胞為內源性表達人MUC16的OVCAR3腫瘤細胞株或者293T陰性細胞株(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，Cat# SCSP-502)。
抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體同時與OVCAR3細胞表面的MUC16和Jurkat T細胞表面的CD3結合，藉由MUC16抗原依賴性的CD3交聯，激活T細胞，螢光素酶的表達情況直接反映了抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體對Jurkat/NFAT-luc細胞的激活作用。
根據廠商說明，收集Jurkat/NFAT-luc細胞，離心後去上清，用測試緩衝液(90%1640培養基+10%FBS)重新懸浮細胞，使得效應細胞密度為1E6/mL。消化收集OVCAR3腫瘤細胞株以及293T陰性細胞株，離心後去上清，用測試緩衝液(90% 1640培養基+10% FBS)重新懸浮細胞，使得靶細胞密度為5E5/mL。然後分別將效應細胞和靶細胞懸液接種於384孔板(Corning,Cat#3570)
中，每孔接種20μl效應細胞和20μl靶細胞，加入梯度稀釋(最高檢測濃度為30nM，依次往下3倍稀釋，總共9個濃度點)的待測雙特異性抗體，每孔10μl。將384孔板放置在37℃培養箱中，6小時後，每孔加入30μl One-Glo(Promega,Cat#E6130)試劑，最後用多功能酶標儀(Tecan,Cat#F200)檢測發光信號。
結果在圖24及圖25中示出，結果表明所有抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體均能在表達人MUC16的細胞(OVCAR3細胞)存在時激活CD3信號通路。
圖25表明當檢測體系中沒有MUC16存在時(293T陰性細胞株)，所有抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體均不能激活CD3信號通路。
為了檢測抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體介導T細胞殺傷腫瘤細胞的活性，我們建立了原代T細胞依賴的細胞毒性試驗系統，以內源性表達人MUC16的OVCAR3為靶細胞，人外周血單個核細胞PBMCs為效應細胞。
(1)復蘇PBMC細胞，用1640+10%FBS完全培養基調整細胞密度至1~2E6/mL，加入終濃度為100IU/mL IL2激活過夜。第二天上午胰蛋白酶消化培養的靶細胞OVCAR3以及MUC16陰性細胞293T，1000rpm離心5min收集細胞，棄上清，用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)測試緩衝液調整靶細胞密度至2×105/ml，按每孔50μL(即每孔10,000個細胞)鋪到96孔板(Corning,Cat#3599)中。準備4倍終檢測濃度的待測抗體，待測抗體最高檢測濃度為10nM，進行3倍梯度系列稀釋共獲得8個濃度點，每孔加入50μL。實驗同時設置靶細胞最大殺傷(靶細胞中加2%Triton100裂解液)、最小殺傷(靶細胞中加測試緩衝液)及自然殺傷(靶細胞中加效應細胞)對照，每孔加入50μL。最後加入100μL的含IL2的PBMC效應細胞懸液，使得最終細胞密
度至1×106/mL(效應細胞E：靶細胞T=10：1)，然後在細胞培養箱繼續孵育24h，其中PBMC效應細胞懸液中含有200IU/mL的IL2(江蘇金絲利藥業有限公司)。孵育結束後，取出實驗板，2000rpm離心3min使所有細胞沉到板底，小心吸取50μL上清至新的96孔板，加入50μL LDH檢測液(Roche,Cat#11644793001)室溫孵育，顏色變化時在F50酶標儀上讀板，檢測波長為OD492nm，背景波長為OD650nm，當最大殺傷孔的OD492nm值介於0.4~1.0之間時進行檢測分析。結果見圖26A，表明抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體能夠特異性誘導T細胞殺傷OVCAR3腫瘤細胞，而對MUC16陰性細胞293T完全沒有ADCC效應。
(2)復蘇PBMC細胞，用1640+10%FBS完全培養基調整細胞密度至1~2E6/mL，加入終濃度為100IU/mL IL2激活過夜。第二天上午收集PBMC細胞懸液，按T細胞分離試劑盒(Stemcell，Cat#17951RF)操作分選出所有T細胞備用。胰蛋白酶消化培養的靶細胞OVCAR3，1000rpm離心5min收集細胞，棄上清，用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)測試緩衝液調整靶細胞密度至2×105/ml，按每孔50μL(即每孔10,000個細胞)鋪到96孔板(Corning,Cat#3599)中。準備4倍終檢測濃度的待測抗體，待測抗體最高檢測濃度為10nM，進行5倍梯度系列稀釋共獲得8個濃度點，每孔加入50μL。實驗同時設置靶細胞最大殺傷(靶細胞中加2%Triton100裂解液)、最小殺傷(靶細胞中加測試緩衝液)及自然殺傷(靶細胞中加效應細胞)對照，每孔加入50μL。最後加入100μL的含IL2的T效應細胞懸液，使得最終細胞密度至1×105/mL(效應細胞E：靶細胞T=1：1)，然後在細胞培養箱繼續孵育72h，其中T效應細胞懸液中含有200IU/mL的IL2(江蘇金絲利藥業有限公司)。孵育結束後，取出實驗板，2000rpm離心3min使所有細胞沉到板底，小心吸取50μL上清至新的96孔
板，加入50μL LDH檢測液(Roche,Cat#11644793001)室溫孵育，顏色變化時在F50酶標儀上讀板，檢測波長為OD492nm，背景波長為OD650nm，當最大殺傷孔的OD492nm值介於0.4~1.0之間時進行檢測分析。結果見圖26B，表明抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體在低E：T，延長孵育時間條件下仍然能夠特異性誘導T細胞殺傷OVCAR3腫瘤細胞。
10.5 抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體激活T細胞後誘導細胞因子釋放
為了檢測抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體介導T細胞殺傷腫瘤細胞同時的因子分泌情況，我們建立了原代T細胞依賴的細胞毒性試驗系統，以內源性表達人MUC16的OVCAR3為靶細胞，人外周血單核細胞PBMCs為效應細胞。
復蘇PBMC細胞，用1640+10%FBS完全培養基調整細胞密度至1~2E6/mL，加入終濃度為100IU/mL IL2激活過夜。第二天上午胰蛋白酶消化培養的靶細胞OVCAR3以及MUC16陰性細胞293T，1000rpm離心5min收集細胞，棄上清，用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)測試緩衝液調整靶細胞密度至2×105/ml，按每孔50μL(即每孔10,000個細胞)鋪到96孔板(Corning,Cat#3599)中。準備4倍最終檢測濃度的待測抗體，待測抗體最高檢測濃度為10nM，進行3倍梯度系列稀釋共獲得8個濃度點。PBMC效應細胞懸液中加入200IU/mL IL2(江蘇金絲利藥業有限公司)，最後每孔加入100μL含IL2的PBMC效應細胞懸液，使得最終細胞密度至1×106/mL(效應細胞E：靶細胞T=10：1)，然後在細胞培養箱繼續孵育24h。孵育結束後，取出實驗板，2000rpm離心3min使所有細胞沉到板底，小心吸取100μL上清至新的96孔板，分別檢測上清中的人IFNγ(Cisbio,Cat#62HIFNGPEH)、人TNFα(R & D,Cat#DY210)
以及人IL-6(R & D,Cat#DY206)因子水平。結果見圖27，表明抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體以及陽性對照抗體REGN4018在OVCAR3或者293T體系中能夠誘導T細胞釋放不同水平的人IFNγ、人TNFα以及人IL-6因子，其中人IFNγ因子在兩個批次PBMC(Lot2104200250和Lot2110210241)和293共培養體系中釋放水平低於檢測下限，未顯示圖譜。
實施例11. 抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體體內抑制腫瘤
本實施例藉由在攜帶小鼠結腸癌細胞系MC38的C57BL/6-hCD3轉基因小鼠中評價了抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體對小鼠皮下移植瘤的抑制作用。
首先，構建高表達人MUC16的小鼠結腸癌細胞系MC38。採用慢病毒感染方法將編碼人MUC16蛋白的核苷酸(ECT_TM huMuc16由通用生物合成)感染到MC38細胞中，然後用4μg/mL Puromycin Dihydrochloride(Gibco,Cat#A1113802)篩選，得到了高表達人MUC16的多株細胞，進而藉由有限稀釋法獲得高表達人MUC16的單株MC38細胞株，命名為MC38-hMUC16。
收集並計數MC38-hMUC16細胞，按1：1體積比添加基質膠(Matrigel)混勻後放在濕冰盒內低溫保存使用。實驗動物為42隻6-8週齡的C57BL/6-hCD3小鼠(Biocytogen,Cat#110008)，接種前用3-4%異氟烷將小鼠麻醉。然後以200μL的接種體積，按每隻小鼠1.5×106個MC38-hMUC16細胞，皮下注射(i.v.)接種於小鼠背部右邊靠近腋下。其中5隻小鼠接種腫瘤細胞當天同時給藥(G6組)。選取荷腫瘤體積生長至約60-80mm3左右的小鼠共25隻，將25隻小鼠根據腫瘤大小和體重隨機分5組(G1~G5：每組5隻)，分組給藥當天定義為第0天。分組情況和給藥方案如表34所示：
表34. 分組和給藥方案
每天觀察記錄小鼠的外觀及行為，自分組開始連續觀察最多4週。分組後每週測量腫瘤體積兩次。腫瘤體積(V)的計算方法如下：V=(長×寬2)/2。每隻小鼠相對腫瘤體積(RTV)的計算方法是：RTV=Vt/V0，其中Vt為每次的測量體積，V0為治療開始時的體積。結果以平均值±S.E.M的方式呈現。使用Dunnett’s multi-comparison test進行兩組間比較，如果p<0.05則認為有統計學顯著性差異。
結果見圖28A和圖28B，相對於陰性對照(G1組)，各組都具有良好的抑瘤作用，其中G3組(MCH7-23L2-MCH7 5mg/kg)在第21天時相比G1組有顯著差異(P<0.05)，此外G3組的抑瘤作用好於G5組(相對腫瘤抑制率TGITV：41.52% vs 28.32%)。G2~G6組在第11天時相比G1組有顯著差異(P<0.05)，G3~G6組在第14天時相比G1組有顯著差異(P<0.05)。
實施例12. 抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體在TDCC實驗中對T細胞功能的影響
為了檢測抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體在TDCC殺傷體系中對T細胞功能的影響，我們測試了殺傷實驗中T細胞表達CD25(Biolegend，Cat#302612)、CD69(Biolegend，Cat#310904)、PD1(Biolegend，Cat#329908)、TIM3(Biolegend，Cat#345006)以及T細胞凋亡(Biolegend，Cat#423114)指標。
復蘇PBMC細胞，用1640+10%FBS完全培養基調整細胞密度至1~2E6/mL，加入終濃度為100IU/mL IL2激活過夜。第二天上午收集PBMC細胞懸液，按T細胞分離試劑盒(Stemcell，Cat#17951RF)操作分選出所有T細胞備用。胰蛋白酶消化培養的靶細胞OVCAR3，1000rpm離心5min收集細胞，棄上清，用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)測試緩衝液調整靶細胞密度至2×105/ml，按每孔50μL(即每孔10,000個細胞)鋪到96孔板(Corning,Cat#3599)中。準備4倍終檢測濃度的待測抗體，待測抗體最高檢測濃度為10nM，進行5倍梯度系列稀釋共獲得8個濃度點，每孔加入50μL。最後加入100μL的含IL2的T效應細胞懸液，使得最終細胞密度至1×105/mL(效應細胞E：靶細胞T=1：1)，然後在細胞培養箱繼續孵育72h，其中T效應細胞懸液中含有200IU/mL的IL2(江蘇金絲利藥業有限公司)。孵育結束後，取出實驗板，收集每孔細胞進行流式分析，測試T細胞激活(CD25和CD69表達)、T細胞功能衰竭(PD1和TIM3表達)以及T細胞凋亡指標變化情況。結果見圖29，表明抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體在低E：T，延長孵育時間條件下相比對照抗體REGN4018，對T細胞激活更弱，但誘導T細胞功能衰竭和誘導T細胞凋亡活性也更弱。
實施例13. 抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體對腫瘤細胞的重複殺傷活性
為了檢測抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體介導T細胞重複殺傷腫瘤細胞的活性，我們建立了原代T細胞依賴的細胞毒性試驗系統，以內源性表達人MUC16的OVCAR3為靶細胞，人外周血單核細胞PBMCs中分離的T細胞為效應細胞。
復蘇PBMC細胞，用1640+10%FBS完全培養基調整細胞密度至1~2E6/mL，加入終濃度為100IU/mL IL2激活過夜。第二天上午收集PBMC細胞懸液，按T細胞分離試劑盒(Stemcell，Cat#17951RF)操作分選出所有T細胞備用。胰蛋白酶消化培養的靶細胞OVCAR3，1000rpm離心5min收集細胞，棄上清，用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)測試緩衝液調整靶細胞密度至2×105/ml，按每孔50μL(即每孔10,000個細胞)鋪到96孔板(Corning,Cat#3599)中。準備4倍終檢測濃度的待測抗體，待測抗體最高檢測濃度為10nM，進行5倍梯度系列稀釋共獲得8個濃度點，每孔加入50μL。實驗同時設置靶細胞最大殺傷(靶細胞中加2%Triton100裂解液)、最小殺傷(靶細胞中加測試緩衝液)及自然殺傷(靶細胞中加效應細胞)對照，每孔加入50μL。最後加入100μL的含IL2的T效應細胞懸液，使得最終細胞密度至5×105/mL(效應細胞E：靶細胞T=5：1)，然後在細胞培養箱繼續孵育24h，其中T效應細胞懸液中含有200IU/mL的IL2(江蘇金絲利藥業有限公司)。孵育結束後，取出2塊相同的實驗板，2000rpm離心3min使所有細胞沉到板底，其中一塊小心吸取50μL上清至新的96孔板，加入50μL LDH檢測液(Roche,Cat#11644793001)室溫孵育，顏色變化時在F50酶標儀上讀板，檢測波長為OD492nm，背景波長為OD650nm，當最大殺傷孔的OD492nm值介於0.4~1.0之間時進行檢測分析。另
一塊板棄去板內100μL上清，然後按前面的實驗條件每孔再次加入50μL OVCAR3細胞懸液(每孔10,000個細胞)和50μL待測抗體，孵育48h後收集上清檢測殺傷。
結果見圖30，表明抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體可以誘導T細胞連續殺傷OVCAR3腫瘤細胞，高E：T條件下，第一輪殺傷強度比陽性對照抗體弱，但第二輪殺傷強度比陽性對照REGN4018略強。
實施例14. 抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體在TDCC重複殺傷實驗中對T細胞功能的影響
為了檢測抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體在TDCC重複殺傷體系中對T細胞功能的影響，我們測試了殺傷實驗中T細胞表達CD25(Biolegend，Cat#302612)、PD1(Biolegend，Cat#367604或Cat#329908)、TIM3(Biolegend，Cat#345006)以及T細胞凋亡(Biolegend，Cat#423114)指標。
復蘇PBMC細胞，用1640+10%FBS完全培養基調整細胞密度至1~2E6/mL，加入終濃度為100IU/mL IL2激活過夜。第二天上午收集PBMC細胞懸液，按T細胞分離試劑盒(Stemcell，Cat#17951RF)操作分選出所有T細胞備用。胰蛋白酶消化培養的靶細胞OVCAR3，1000rpm離心5min收集細胞，棄上清，用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)測試緩衝液調整靶細胞密度至2×105/ml，按每孔50μL(即每孔10,000個細胞)鋪到96孔板(Corning,Cat#3599)中。準備4倍終檢測濃度的待測抗體，待測抗體最高檢測濃度為10nM，進行5倍梯度系列稀釋共獲得8個濃度點，每孔加入50μL。最後加入100μL的含IL2的T效應細胞懸液，使得最終細胞密度至5×105/mL(效應細胞E：靶細胞T=5：1)，然後在細胞培養箱繼續孵育24h，其中T效應細胞懸
液中含有200IU/mL的IL2(江蘇金絲利藥業有限公司)。孵育結束後，取出2塊相同的實驗板，收集其中一塊板中的細胞進行流式分析，另一塊板每孔棄去100μL上清，然後按前面的實驗條件每孔再次加入50μL OVCAR3細胞懸液(每孔10,000個細胞)和50μL待測抗體，孵育48h後收集每孔細胞進行流式分析。測試指標為T細胞激活(CD25表達)、T細胞功能衰竭(PD1和TIM3表達)以及T細胞凋亡。結果見圖31，表明抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體在兩輪殺傷實驗中相比對照抗體REGN4018，對T細胞激活更弱，但誘導T細胞功能衰竭和誘導T細胞凋亡活性也更弱，這可能是導致其在第二輪殺傷中比對照抗體殺傷更強的原因。
本文所提及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻藉由引用的方式完整地併入。上文以及整個本申請中所論述的任何或所有特徵可以在本發明的各種實施方案中組合。此外，本文中所述的材料、方法和例子僅是說明性的並且不意在是限制性的。本發明的其他特徵、目的和優點將從本說明書及附圖並且從後附的申請專利範圍中顯而易見。
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Claims (43)
- 一種雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中第一抗原結合區特異性結合腫瘤相關抗原，和/或第二抗原結合區特異性結合CD3，其中該第二抗原結合區是抗CD3抗體的scFv，該scFv包含VH和VL，視需要地，該VH和VL經由接頭連接，該接頭例如包含胺基酸序列(G4S)n，其中n=1、2、3、4或5，較佳地，n=3或4，更佳地，n=3。
- 如請求項1所述的雙特異性抗體，其中該scFv包含的VH包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該scFv包含的VL包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(i)HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：3中所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，且LCDR1、LCDR2和LCDR3選自如SEQ ID NO：4中所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(ii)HCDR1由SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列組成，HCDR2由SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列組成，HCDR3由SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列組成，LCDR1由SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列組成，LCDR2由SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列組成，且LCDR3由SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列組成。
- 如請求項2所述的雙特異性抗體，其中該VH含有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，和/或該VL含有SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項1至3中任一項所述的雙特異性抗體，其中該第一抗原結合區是特異性結合第一抗原的Fab。
- 如請求項4所述的雙特異性抗體，其中該Fab包含CH1，其中該CH1是來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1，較佳地來自IgG1的CH1。
- 如請求項5所述的雙特異性抗體，其中該CH1包含(i)包含與SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或(ii)包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項1至6中任一項所述的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體是包含Fc二聚體的IgG樣雙特異性抗體，其中構成該Fc二聚體的兩個Fc區相同或不同。
- 如請求項7所述的雙特異性抗體，其中該Fc區之一或二者包含降低與Fcγ受體結合的突變，例如包含L234A/L235A突變、D265A突變或P329A突變中的一個或多個，例如包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變。
- 如請求項8所述的雙特異性抗體，其中該Fc區之一或二者包含胺基酸序列SEQ ID NO：46或49所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同一性的胺基酸序列或由其組成。
- 如請求項7至9中任一項所述的雙特異性抗體，其中該兩個Fc區不同，較佳地，在第一單體Fc區和第二單體Fc區中分別引入相應的結(knob)突變和扣(Hole)突變。
- 如請求項10所述的雙特異性抗體，其中d)一個Fc-區多肽包含結突變T366W，而另一個Fc-區多肽包含扣突變T366S、L368A和Y407V，或e)一個Fc-區多肽包含結突變T366W和Y349C，而另一個Fc-區多肽包含扣突變T366S、L368A、Y407V和S354C，或f)一個Fc-區多肽包含結突變T366W和S354C，而另一個Fc-區多肽包含扣突變T366S、L368A、Y407V和Y349C；視需要地，該Fc區還包含降低與Fcγ受體結合的突變，例如，L234A/L235A突變、D265A突變或P329A突變中的一個或多個；例如L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變。
- 如請求項7至11中任一項所述的雙特異性抗體，其中該Fc區之一或二者包含鉸鏈區，例如EPKSS或EPKSC。
- 如請求項12所述的雙特異性抗體，其中(i)第一Fc區包含結突變，其a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：43或89或由其組成；或b)包含與SEQ ID NO：43或89具有至少90%同一性，例如95%，96%，97%，99%或更高的同一性且包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變和結突變(例如S354C和T366W)的胺基酸序列或由其組成；和/或(ii)第二Fc區包含扣突變，其a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30、42或59或由其組成；或b)包含與SEQ ID NO：30、42或59具有至少90%同一性，例如95%，96%，97%，99%或更高的同一性且包含L234A/L235A突變、D265A突變和P329A突變和扣突變(例如Y349C、T366S、L368A和Y407V)的胺基酸序列或由其組成。
- 如請求項1至13中任一項所述的雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含一個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，包含扣突變的Fc區構成第一重鏈；該Fab片段的CH1的C末端融合該scFv片段的N末端，且該scFv片段的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；且該Fab片段的VL-CL構成輕鏈。
- 如請求項1至13中任一項所述的雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含兩個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，第一Fab片段的CH1的C末端融合至包含扣突變的Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；第二Fab片段的CH1的C末端融合該scFv片段的N末端，且該scFv片段的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；且該第一和第二Fab片段的VL-CL分別構成兩條輕鏈；其中該第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
- 如請求項1至13中任一項所述的雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含一個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，該Fab片段的CH1的C末端融合至包含扣突變的Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；該scFv片段的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；且該Fab片段的VL-CL構成輕鏈。
- 如請求項1至13中任一項所述的雙特異性抗體，其為IgG樣雙特異性抗體，其包含兩個特異性結合第一抗原的Fab片段、一個特異性結合第二抗原的scFv和Fc異二聚體，其中該Fab片段包含VH-CH1和VL-CL，該scFv包含VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，第一Fab片段的CH1的C末端融合至第二Fab片段的VH的N末端，且第二Fab片段的CH1的C末端融合至包含扣突變的Fc區的CH2或鉸鏈區構成第一重鏈；該scFv片段的C末端融合至包含結突變的Fc區的CH2或鉸鏈區，構成第二重鏈；且該第一和第二Fab片段的VL-CL分別構成兩條輕鏈；其中該第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
- 如請求項1至18中任一項所述的雙特異性抗體，其中第一抗原為腫瘤相關抗原，例如選自GPRC5D或MUC16(例如人GPRC5D或人MUC16)。
- 如請求項18所述的雙特異性抗體，其中第一抗原為人GPRC5D，第一抗原結合區包含重鏈可變區VH的3個CDR，HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區VL的3個CDR，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(i)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：62、38或40中任一項所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該 LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：63所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；(ii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：72所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：73所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(iii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：82所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：83所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項19所述的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含(i)如SEQ ID NO：64所示的HCDR1、如SEQ ID NO：65、39或41所示的HCDR2、如SEQ ID NO：66所示的HCDR3；如SEQ ID NO：67所示的LCDR1、如SEQ ID NO：68所示的LCDR2和如SEQ ID NO：69所示的LCDR3；(ii)如SEQ ID NO：74所示的HCDR1、如SEQ ID NO：75所示的HCDR2、如SEQ ID NO：76所示的HCDR3；如SEQ ID NO：77所示的LCDR1、如SEQ ID NO：78所示的LCDR2和如SEQ ID NO：79所示的LCDR3；或(iii)如SEQ ID NO：84所示的HCDR1、如SEQ ID NO：85所示的HCDR2、如SEQ ID NO：86所示的HCDR3；如SEQ ID NO：87所示的LCDR1、如SEQ ID NO：78所示的LCDR2和如SEQ ID NO：88所示的LCDR3。
- 如請求項19或20所述的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH，其中該重鏈可變區(i)包含與SEQ ID NO：62、72、82、16、23、25、27、29、38或40的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者(ii)包含SEQ ID NO：62、72、82、16、23、25、27、29、38或40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項19至21中任一項所述的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含輕鏈可變區VL，其中該輕鏈可變區(i)包含與SEQ ID NO：63、73、83、17、19或21的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者(ii)包含SEQ ID NO：63、73、83、17、19或21的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項19至22中任一項所述的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中(i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；(ii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：73所示的胺基酸 序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；(iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或(iv)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：16、23、25、27、29、38或40所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17、19或21所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項19至23中任一項所述的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成：(vii).SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63；(viii).SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73；(ix).SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83；(x).SEQ ID NO：16、23、25、27、29、38或40和SEQ ID NO：21；(xi).SEQ ID NO：16或25和SEQ ID NO：17；(xii).SEQ ID NO：16或27和SEQ ID NO：19。
- 如請求項18所述的雙特異性抗體，其中第一抗原為人MUC16，第一抗原結合區包含重鏈可變區VH的3個CDR，HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區VL的3個CDR，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：92或113中所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：96、100、102或114所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR。
- 如請求項25所述的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含如SEQ ID NO：93所示的HCDR1、如SEQ ID NO：94示的HCDR2、如SEQ ID NO：95示的HCDR3；如SEQ ID NO：97、101或103示的LCDR1、如SEQ ID NO：98示的LCDR2和如SEQ ID NO：99的LCDR3。
- 如請求項25或26所述的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH，其中該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：92或113的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者包含SEQ ID NO：92或113的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項25至27中任一項所述的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含輕鏈可變區VL，其中該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：96、100、102或114的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者包含SEQ ID NO：96、100、102或114的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項25至28中任一項所述的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：92或113所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：96、100、102或114所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項25至29中任一項所述的雙特異性抗體，其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中VH包含SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且該VL包含SEQ ID NO：96、100或102所示的胺基酸序列或由其組成；或第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中VH包含SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且該VL包含SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列或由其組成。
- 一種核酸分子，其編碼如請求項1至30中任一項所述的雙特異性抗體中的任一條鏈，或由該核酸序列組成。
- 一種表達載體，其包含如請求項31所述的核酸分子，較佳地，該表達載體為pCDNA，例如pCDNA3.1。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項31所述的核酸分子或如請求項32所述的表達載體，較佳地，該宿主細胞是原核的或真核的，例如293細胞或CHO細胞，例如293F細胞或293T細胞或CHO-S細胞。
- 一種製備如請求項1至30中任一項所述的雙特異性抗體的方法，該方法包括，在適合該抗體的鏈表達的條件下，培養如請求項31所述的核酸分子或如請求項32所述的表達載體的宿主細胞，和視需要地從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
- 一種免疫綴合物，其包含如請求項1至30中任一項所述的雙特異性抗體。
- 一種醫藥組成物或藥物或製劑，其包含如請求項1至30中任一項所述的雙特異性抗體或如請求項35所述的免疫綴合物，以及視需要地藥用輔料。
- 一種藥物組合產品，其包含如請求項1至30中任一項所述的雙特異性抗體或如請求項35所述的免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑)。
- 一種在受試者中預防或治療癌症的方法，包括向受試者施用有效量的如請求項1至30中任一項所述的雙特異性抗體、或如請求項35所述的免疫綴合物、或如請求項36所述的醫藥組成物或藥物或製劑、或如請求項37所述的藥物組合產品。
- 如請求項38所述的方法，其中該癌症的腫瘤細胞中具有升高的第一抗原的蛋白質水平和/或核酸水平(例如表達升高)。
- 如請求項38所述的方法，其中該第一抗原選自GPRC5D或MUC16。
- 如請求項38至40中任一項所述的方法，其中該癌症是實體腫瘤或血液腫瘤，例如卵巢癌(例如漿液性卵巢癌，例如卵巢漿液性囊腺癌、卵巢 癌漿液性腺癌、卵巢癌黏液腺癌、子宮內膜樣腺癌、卵巢癌透明細胞腺癌)、骨髓瘤、結腸癌、直腸癌或結直腸癌。
- 如請求項38至41中任一項所述的方法，其中該方法還包括與其它療法例如治療方式(例如手術或放療)和/或其它治療劑(例如化療劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑)組合施用。
- 一種檢測第一抗原在生物樣品中的存在的方法，其包括(i)將生物樣品與如請求項1至30中任一項所述的雙特異性抗體在允許其與第一抗原結合的條件下接觸，(ii)檢測在該抗體或雙特異性抗體和第一抗原之間是否形成複合物，其中複合物的形成表示存在第一抗原。
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