CN116685685A - Tigit单域抗体以及基于其的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种特异性结合TIGIT的单克隆抗体以及基于该TIGIT单克隆抗体构建的双特异性抗体。还提供了编码所述抗体的核酸分子、用于表达所述抗体的表达载体、宿主细胞和制备方法。本发明还提供了使用本发明的抗体的治疗方法。

Description

TIGIT单域抗体以及基于其的双特异性抗体
本发明提供了一种特异性结合TIGIT的单克隆抗体以及基于该TIGIT单克隆抗体构建的双特异性抗体。还提供了编码所述抗体的核酸分子、用于表达所述抗体的表达载体、宿主细胞和制备方法。本发明还提供了使用本发明的抗体的治疗方法。
背景技术
TIGIT(具有Ig及ITIM结构域的T细胞免疫受体T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)属于免疫球蛋白超家族成员，又称为VSTM3、WUCAM或VSIG9，是由一个细胞外免疫球蛋白V样结构域(IgV结构域)、1个I型跨膜结构域和1个基于酪氨酸的免疫受体抑制性基序(ITIM)及免疫球蛋白酪氨酸尾部(ITT)样基序组成的(Jinah Yeo，Minkyung Ko，et al.(2021).″TIGIT/CD226 Axis Regulates Anti-Tumor Immunity″Pharmaceuticals 14(3)：200.)。TIGIT主要表达于效应CD4+T细胞、滤泡辅助CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)、效应CD8+T以及NK细胞，已成为癌症免疫治疗的热门靶点。
目前已经发现TIGIT有多个配体，包括：PVR(Necl-5或CD155)、Nectin2(CD112)、Nectin3(CD113)和Nectin4(PVRL4)，但是TIGIT与CD155的相互作用最强，已有报道亲和力约1nM，与Nectin2和3亲和力非常低，与Nectin4的亲和力与CD155的亲和力接近(Reches A.，Ophir Y.，et al.(2020).″Nectin4 is a novel TIGIT ligand which combines checkpoint inhibition and tumor specificity″J.Immunother.Cancer.8.)。这些配体主要在APC细胞和多种恶性肿瘤细胞上(比如结直肠癌、黑色素瘤等)过表达。CD155通过与TIGIT、CD226、CD96相互作用发挥免疫调节作用，由于CD155对TIGIT的亲和力远远高于CD226和CD96，因此TIGIT与CD155会优先结合，激活TIGIT的细胞质尾部中存在的两个基序所介导的抑制性信号：基于酪氨酸的免疫受体抑制性基序(ITIM)及免疫球蛋白酪氨酸尾部(ITT)样基序。肿瘤细胞表面配体通过与NK细胞和T细胞表面TIGIT结合，抑制NK细胞毒性和T细胞活性，从而介导肿瘤细胞的免疫逃逸机制。Karsten Mahnke et al表明由于这条抑制信号通路存在于经典的PD1/PD-L1共抑制途径之外，因此，双特异性抗体对两种信号通路的阻断会导致黑色素瘤特异性细胞毒性T细胞的效应功能大大增强。PD1/PD-L1信号通路轴在黑色素瘤中已被确认，以TIGIT/CD155相互作用为特征的第二种抑制途径在黑色素中也是存在的(Karsten Mahnke and Alexander H.Enk(2015).″TIGIT-CD155Interactions in Melanoma：A Novel Co-Inhibitory Pathway with Potential for Clinical Intervention″Journal of Investigative Dermatology 136(1)：9-11.)。
鉴于TIGIT的抑制信号通路在不同的免疫细胞亚群中发挥强大的抑制作用，并且其配体CD155在多种实体瘤中广泛表达，因此靶向TIGIT是非常有前景的治疗策略。
由于TIGIT既高表达于T细胞表面又高表达于NK细胞表面，而其他免疫检查点如：PD1仅表达于T细胞表面，这就决定了TIGIT作为治疗靶点具有更大的优势，因此本领域存在基于TIGIT抗体开发双特异性抗体药物的需要。
发明内容
本发明提供了一种抗TIGIT单域抗体(sdAb，single domain antibody)，以及应用其构建的双特异性抗体。在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT单域抗体与人TIGIT的亲和力很高，能够识别人和食蟹猴TIGIT。
在一些实施方案中，抗TIGIT单域抗体可以有效阻断TIGIT与PVR蛋白结合，阻断活性显著优于对照抗体Tiragolumab。
本发明TIGIT单域抗体也可以有效激活T细胞释放细胞因子。
本发明中的抗PD1/TIGIT双特异性抗体对TIGIT/CD155和PD1/PD-L1均具有阻断活性，在PD1/PD-L1以及TIGIT/CD155均存在的适应症中具有较光明的治疗前景。
本发明的抗TIGIT/抗CTLA4双特异性抗体具有以下活性/功能中的一种或多种：第一，能够很好地与TIGIT和CTLA4结合，并且与TIGIT亲和力比CTLA4亲和力高(例如高一个数量级)，进而导致抗TIGIT和抗CTLA4双功能抗体能够定位至肿瘤部位，减少双抗在外周系统的停留，从而降低CTLA4抗体端的外周毒性，提高CTLA4抗体的用药剂量；第二，TIGIT和CTLA4在肿瘤内的Treg细胞上较高表达，本发明的双功能抗体可以通过Fc效应清除肿瘤内免疫抑制性的Treg细胞；第三，本发明的双功能抗体能够特异地解除效应T细胞上TIGIT和CTLA4的免疫抑制，激活T细胞，从而发挥抑制肿瘤作用，具有良好的应用前景。
在一个方面，本发明涉及以下具体实施方案：
1、特异性结合TIGIT的VHH抗体，其包含
SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)，
优选地，所述CDR序列根据IMGT定义。
2、实施方案1的VHH抗体，其包含互补决定区域(CDR)VHH CDR1、VHH CDR2和VHH CDR3，其中
(i)VHH CDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：4或23或57所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)VHH CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：4或23或57所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)VHH CDR1包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或由其组成。
3、实施方案1的VHH抗体，其包含重链可变区或由其组成，所述重链可变区
(i)包含与选自SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优 选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
4、特异性结合TIGIT的重链抗体，其包含实施方案1-3中任一项所述的VHH抗体。
5、实施方案4的重链抗体，其包含与抗体恒定区或Fc区连接的实施方案1-3中任一项所述的VHH抗体，优选地，所述抗体恒定区或Fc区来自人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4，任选地，所述VHH抗体与所述Fc区通过铰链区或其部分连接，优选地，所述铰链区部分的氨基酸序列为EPKSS(SEQ ID NO：43)。
6、实施方案4的重链抗体，其包含与抗体Fc区连接的实施方案1-3中任一项所述的VHH抗体，其中所述Fc区为来自人IgG1或IgG4的Fc区，优选地，所述Fc区
(i)包含与SEQ ID NO：40或42中所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：40或42所示的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO：40或42所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列。
7、实施方案5或6的重链抗体，其中所述Fc区包含改善Fc区效应子功能的突变，例如提高ADCC的突变，优选地，所述突变为如下突变组合：S239D、A330L和I332E(EU编号)，优选地，其包含与SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，且包含如下突变组合：S239D、A330L和I332E(EU编号)。
8、实施方案4的重链抗体，其
(i)包含与选自SEQ ID NO：2、7、10、15、17、19、20或22中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO：2、7、10、15、17、19、20或22中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO：2、7、10、15、17、19、20或22中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
9、实施方案1-3中任一项的VHH抗体，或实施方案4-8中任一项的重链抗体，其中所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
10、双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区特异性结合TIGIT，且包含实施方案1-3和9中任一项的VHH抗体，或实施方案4-9中任一项的重链抗体。
11、实施方案10的双特异性抗体，其中第二抗原结合区特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2或CTLA-4，优选地，所述第二抗原结合区特异性结合PD-1，其包含来自WO2019219064A的PD1抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段例如所述抗PD-1抗体 的单链Fv、Fab、Fab′、(Fab)2、单域抗体、VHH或重链抗体；优选地，所述第二抗原结合区特异性结合CTLA-4，其包含来自Ipilimumab抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段例如所述抗CTLA-4抗体的单链Fv、Fab、Fab′、(Fab)2、单域抗体、VHH或重链抗体。
12、实施方案10或11的双特异性抗体，其中VHH抗体连接到第二抗原结合区Fc片段的C末端，或连接在第二抗原结合区重链VH片段的N末端，或者可以插入第二抗原结合区的Fab片段(Fab片段重链)和Fc片段之间，即与Fab片段重链的C末端和Fc片段的N末端连接，任选地，第一和第二抗原结合区通过接头连接，优选地，接头包含(GGS)n氨基酸序列，n＝1，2，3，4，或5的整数，优选n＝1。
13、实施方案12的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有以下结构：
重链：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc-抗TIGIT VHH；或
从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc；或
从N端至C端，抗TIGIT VHH-第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL；
优选地，所述第二抗原选自PD-1或CTLA-4。
14、实施方案10或11的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有以下结构：
重链1：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
重链2：1个或多个(例如2个)串联的抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc
轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL；
优选地，所述第二抗原选自PD-1或CTLA-4，例如CTLA-4。
15、实施方案14的双特异性抗体，其中所述抗TIGIT-VHH通过连接肽与重链恒定区Fc的N末端连接，例如所述连接肽是来自人IgG1、2、3或4的铰链区或其部分，包括天然或突变的铰链区或其部分，例如来自人IgG1铰链区，例如所述连接肽是EPKSS(SEQ ID NO：43)。
16、实施方案14或15的双特异性抗体，其中当重链2包含多个串联的抗TIGIT单域抗体VHH时，各个串联的VHH之间可以通过接头连接，优选地，接头包含(GGGGS)n氨基酸序列，n＝1，2，3，4，或5的整数，优选n＝1。
17、实施方案10-16中任一项的双特异性抗体，其中第二抗原抗体的重链恒定区CH1来自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；优选的，所述重链恒定区CH1来自IgG1或IgG4，更优选地，所述重链恒定区CH1包含SEQ ID NO：28或31所述的氨基酸序列或由其组成。
18、实施方案10-17中任一项的双特异性抗体，其中第二重链恒定区Fc如实施方案5-7中任一项所定义。
19、实施方案14的双特异性抗体，其中重链1的Fc区与重链2的Fc区不同。
20、实施方案19的双特异性抗体，其中重链1的Fc区与重链2的Fc区中分别引入结(knob)突变和扣(Hole)突变。
21、实施方案21的双特异性抗体，其中
第一Fc区包含结突变，其
(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO：78或与其具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含与SEQ ID NO：78具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列且包含S239D、A330L和I332E突变和结突变(例如S354C和T366W)；且
第二Fc区包含扣突变，其
(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO：77与其具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含与SEQ ID NO：77具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列且包含S239D、A330L和I332E突变和扣突变。
22、实施方案13的双特异性抗体，其包含
重链：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc-抗TIGIT VHH；且
轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL，
其中所述第二抗原为PD-1；
其中重链
(i)包含SEQ ID NO：30或33的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：30、32或33所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：30或33所述的氨基酸组成；
和/或
轻链
(i)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：39所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：39所述的氨基酸组成。
23、实施方案13的双特异性抗体，其包含
重链：
从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc
轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL，
其中所述第二抗原为PD-1；
其中重链
(i)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：32所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：32所述的氨基酸组成；
和/或
轻链
(i)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：39所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：39所述的氨基酸组成。
24、实施方案13的双特异性抗体，其包含
重链：从N端至C端，抗TIGIT VHH-第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL，
其中第二抗原为CTLA-4，
其中重链
(i)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：69所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：69所述的氨基酸组成；
和/或
轻链
(i)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：68所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：68所述的氨基酸组成。
25、实施方案14的双特异性抗体，其包含
重链1：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
重链2：1个或多个(例如2个)串联的抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc
轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL，
其中重链1
(i)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：71所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：71所述的氨基酸组成；
和/或
重链2
(i)包含SEQ ID NO：72或74的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：72或74所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：72或74所述的氨基酸组成；
和/或
轻链
(i)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：68所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：68所述的氨基酸组成。
26、核酸分子，其编码实施方案1-3和9中任一项的VHH抗体，或实施方案4-9中任一项的重链抗体，或实施方案10-25中任一项的双特异性抗体中的重链和/或轻链，或由所述核酸序列组成。
27、表达载体，其包含实施方案26的核酸分子，优选地，所述表达载体为pCDNA，例如pCDNA3.1。
28、宿主细胞，其包含实施方案26所述的核酸分子或实施方案27所述的表达载体，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，例如293细胞或CHO细胞，例如293FT细胞或CHO-S细胞。
29、制备实施方案1-3和9中任一项的VHH抗体，或实施方案4-9中任一项的重链抗体，或实施方案10-25中任一项的双特异性抗体的方法，所述方法包括，在适合所述VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体的链表达的条件下，培养实施方案包含编码VHH抗体或重链抗体的核酸、或编码双特异性抗体的各条链的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体。
30、免疫缀合物，其包含实施方案1-3和9中任一项的VHH抗体，或实施方案4-9中任一项的重链抗体，或实施方案10-25中任一项的双特异性抗体。
31、药物组合物或药物或制剂，其包含实施方案1-3和9中任一项的VHH抗体，或实施方案4-9中任一项的重链抗体，或实施方案10-25中任一项的双特异性抗体，或实施方案30的免疫缀合物以及任选地药用辅料。
32、药物组合产品，其包含实施方案1-3和9中任一项的VHH抗体，或实施方案4-9中任一项的重链抗体，或实施方案10-25中任一项的双特异性抗体，或实施方案30的免疫缀合物，以及其它治疗剂。
33、在受试者中预防或治疗癌症的方法，包括向受试者施用有效量的实施方案1-3和9中任一项的VHH抗体，或实施方案4-9中任一项的重链抗体，或实施方案10-25中任一项的双特异性抗体，或实施方案30的免疫缀合物，或实施方案31的药物组合物或制剂；或实施方案32的药物组合产品。
34、实施方案33的方法，其中所述癌症是表征为具有升高的PD-1、PD-L1或PD-L2的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)和/或具有升高的TIGIT的的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)的癌症。
35、实施方案34的方法，其中所述方法还包括与其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用。
附图说明
图1显示抗人TIGIT的重链抗体阻断人TIGIT蛋白与CD155结合(EC50，nM)。
图2显示抗人TIGIT的重链抗体与HEK293-人TIGIT细胞的结合活性(EC50，nM)。
图3显示抗人TIGIT的重链抗体与HEK293-食蟹猴TIGIT细胞的结合活性(EC50，nM)。
图4显示抗人TIGIT的重链抗体激活CD8+T细胞释放IFNγ因子。
图5显示序列优化及Fc改造后的抗人TIGIT的重链抗体阻断人TIGIT蛋白与CD155结合(IC50，nM)。
图6显示本发明抗PD1/TIGIT双特异性抗体的结构示意图，图6A为E4示意图，图6B为D1和D4的示意图。
图7显示抗PD1/TIGIT双特异性抗体与人TIGIT蛋白结合活性(EC50，nM)。
图8显示抗PD1/TIGIT双特异性抗体与人PD1蛋白结合活性(EC50，nM)。
图9显示抗PD1/TIGIT双特异性抗体阻断人TIGIT蛋白与CD155结合的活性(IC50，nM)。
图10显示抗PD1/TIGIT双特异性抗体阻断人PD1蛋白与PD-L1结合的活性(IC50，nM)。
图11显示抗PD1/TIGIT双特异性抗体与HEK293-人TIGIT细胞的结合活性(EC50，nM)。
图12显示抗PD1/TIGIT双特异性抗体与Jurkat-NFAT-人PD1细胞的结合活性(EC50，nM)。
图13显示抗PD1/TIGIT双特异性抗体对激活后CD4+T或CD8+T细胞的ADCC杀伤活性(EC50，nM)。
图14显示本发明抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体的结构示意图，图14A为THC4示意图，图14B为CT1KH示意图，图14C为CT2KH示意图。
图15显示抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体阻断人TIGIT蛋白与CD155结合的活性。
图16显示抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体阻断人CTLA-4蛋白与CD80结合的活性。
图17显示抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体与HEK293-人TIGIT细胞的结合活性
发明详述
一、结合TIGIT的单域抗体(VHH抗体)、重链抗体以及包含其的双特异性抗体
本发明在第一个方面涉及一种结合TIGIT的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段结合哺乳动物TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猴TIGIT。
单域抗体
在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT抗体是单域抗体，特别是VHH抗体。
单域抗体或VHH抗体具有人IgG分子大约十分之一的分子量，以及仅几纳米的物理直径。由于小的分子尺寸，单域单抗相比常规的四链抗体具有如下优势：高稳定性和溶解性，以及能够识别隐藏抗原性位点。此外，单域抗体在制备上也比常规的四链抗体更为便宜。除了作为单独分子应用外，单域抗体也是构建多特异性分子的适宜组件。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体是包含重链可变区或由所述重链可变区组成的VHH抗体，所述重链可变区通常具有以下结构：FR1-VHH CDR1-FR2-VHH CDR2-FR3-VHH CDR3-FR4，其中FR1至FR4指构架区1至4；VHH CDR1至VHH CDR3指互补决定区1-3。VHH可变区中的CDR序列可以按照“定义”部分描述的任何CDR定义方案进行确定，优选可以通过IMGT来定义VHH序列中的三个CDR的边界。
在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT的VHH抗体包含
(i)SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)，或
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列；
优选地，所述CDR序列根据IMGT定义。
在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT的VHH抗体包含重链可变区或由其组成，所述重链可变区包含
(i)SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)，或
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列；
优选地，所述CDR序列根据IMGT定义。
在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT的VHH抗体包含互补决定区域(CDR)VHH CDR1、VHH CDR2和VHH CDR3。在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT的VHH包含重链可变区或由其组成，所述重链可变区包含互补决定区域(CDR)VHH CDR1、VHH CDR2和VHH CDR3。
在一些实施方案中，VHH CDR1包含选自SEQ ID NO：3、8或11的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者VHH CDR1包含与选自SEQ ID NO：3、8或11的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VHH CDR2包含SEQ ID NO：4、12或23的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者VHH CDR2包含与SEQ ID NO：4、12或23的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VHH CDR3包含选自SEQ ID NO：5或13的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者VHH CDR3包含与选自SEQ ID NO：5或13的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT的VHH抗体包含重链可变区或由其组成，所述重链可变区包含
互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR3包含选自SEQ ID NO：5或13的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR3包含与选自SEQ ID NO：5或13的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT的VHH抗体的VHH CDR2包含如下氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：
ITTSXSA，优选地，X选自D或S(SEQ ID NO：57)。
在一个实施方案中，本发明的抗TIGIT的VHH抗体包含互补决定区域(CDR)VHH CDR1、VHH CDR2和VHH CDR3，其中
(i)VHH CDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：4或23或57所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)VHH CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：4或23或57所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)VHH CDR1包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明的抗TIGIT VHH抗体包含重链可变区或由其组成，其中所述重链可变区包含互补决定区域(CDR)VHHCDR1、VHHCDR2和VHHCDR3，其中
(i)VHH CDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：4或23或57所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)VHH CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：4或23或57所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)VHH CDR1包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT的VHH抗体包含重链可变区或由其组成，所述重链可变区
(i)包含与选自SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT的VHH抗体包含选自SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的VHH抗体包含源自通过免疫驼科动物(例如羊驼)产生的驼科重链抗体的CDR氨基酸序列和/或构架(FR)氨基酸序列。在一些实施方案中，源自驼科重链抗体的本发明VHH单抗可以进行工程化，例如，以包含源自人氨基酸序列(即，人抗体)或其他非驼科哺乳动物物种的构架区序列。在一个实施方案中，为进一步改善工程化抗体的性质(例如亲和力)，可以在工程化抗体中，在一个或多个位置(例如构架区)，通过回复突变，引入在亲本驼源抗体中位于相应位置的驼源氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明的VHH抗体是嵌合抗体。
在一个实施方案中，本发明的VHH抗体是人源化抗体。人源化可以通过如下方式实现：将非人源的天然VHH序列(例如来自驼科动物或羊驼免疫的VHH序列)中的一个或多个氨基酸残基，尤其是构架区序列，置换成来自人的常规抗体的重链VH相应位置的残基。人源化VHH的方法在本领域中是熟知的，例如实施例3中所述的方法。通常，人源化置换以保持单域抗体的有利结合性质的方式进行。本领域熟知用于确定人源化单域抗体的生物学性质，例如结合亲和力等的试验，以确定和选择适宜的人源化残基突变或突变组合。
在一些实施方案中，可以通过包括如下步骤的方法，获得本发明人源化的单域抗体：
①确定亲本单域抗体(例如来自噬菌体展示文库筛选的驼源VHH抗体)的CDR环结构；
②在人种系序列数据库为每个V/J区域找到最接近的同源序列作为模板，例如通过比对IMGT人类抗体重链可变区种系基因数据库(http：//www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)，挑选与VHH抗体同源性高的重链可变区种系基因作为模板；
③将VHH抗体的CDR分别移植到挑选的相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CR3-FR4的可变区序列，优选，用于替代的构架序列，与待人源化抗体的构架序列，具有结构相似性，例如，具有的序列同一性至少为80％，85％，90％，或95％、96％、97％、98％、99％以上；
④根据需要，将FR区中关键氨基酸回复突变为纳米抗体(VHH抗体)对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，即得到人源化抗TIGIT VHH抗体，任选地测序VHH抗体。
在一些实施方案中，回复突变位点选自T28、L78、W103、R83、V37、G44、L45、W47中的一个或多个。在一些实施方案中，回复突变选自T28P；L78V；W103K；R83K；V37F；G44E；L45R；W47F中的一个或多个。在一些实施方案中，人源化VHH抗体中的回复突变的位点组合选自：
(1)T28、L78和W103；
(2)L78、R83和W103；或
(3)V37、G44、I45和W47。
在一些实施方案中，人源化VHH抗体中的回复突变组合选自：
(1)T28P、L78V和W103K(例如针对重链模板IGHJ4*01)；
(2)L78V、R83K和W103K(例如针对重链模板IGHV3-48*01)；或
(3)V37F、G44E、L45R和W47F(例如针对重链模板IGHV3-23*01)。
在一些实施方案中，适用于本发明VHH抗体人源化的重链可变区种系基因选自IGHJ4*01、IGHV3-48*01或IGHV3-23*01。
在一些实施方案中，本发明也提供本发明单域抗体(特别是VHH抗体)的功能性变体。所述功能性变体可以采用本发明熟知的方法，例如通过随机或定点诱变，将突变引入本发明的示例性单域抗体的编码核酸序列中，例如引入CDR序列和/或FR序列中，并随后筛选(例如通过噬菌体展示文库筛选)保持期望性质的变体，来获得功能性变体。通常，功能性变体保持与亲本单域抗体(或VHH)显著的序列的同一性。优选地，功能性变体保持亲本单域抗体(或VHH)的期望生物学性质，例如，相对于亲本的生物活性，变体具有相当(例如，至少50％，60％，70％，80％，优选地90％以上)的生物活性，或改善的生物活性(例如110-150％或更高)。所述的期望生物学性质包括例如，但不限于，目的抗原(例如CD155)结合亲和力(如通过KD值量度)，阻断目的抗原与受体结合的活性(例如通过IC50值量度)，在体外或体内实验中激活T细胞的活性(例如通过释放的细胞因子量度)，在体外或体内实验中抑制肿瘤生长/存活。
在一些实施方案中，本发明提供本发明VHH多肽的亲和力变体。优选地，所述亲和 力变体表现出相对于其来源亲本单域抗体在氨基酸序列上的一个或多个氨基酸变化，其中亲和力变体相比亲本抗体具有改变的对目的抗原的结合亲和力。
在一些实施方案中，还可以针对抗体的稳定性进行工程化，例如为消除脱酰胺作用而突变抗体中的天冬酰胺。在一个实施实施方案中，本发明的VHH抗体的CDR2中包含D63S突变，以消除脱酰胺作用。
重链抗体
在本发明的另一方面中，本发明也提供了包含本发明的VHH抗体重链可变区的重链抗体。
在一些实施方案中，可以将本发明的单域抗体或VHH(例如驼源VHH或其人源化形式)，与人抗体的恒定区或其一部分例如Fc区连接，以产生包含VHH-恒定区或VHH-CH1-Fc或VHH-Fc的重链抗体。在一个实施方案中，所述重链抗体包含本发明的VHH抗体和位于其C端的Fc区。在一些实施方案中，通过铰链区或其一部分，例如来自IgG的铰链区(例如IgG1、2、3或4的铰链区)或其部分连接VHH与Fc。
在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT重链抗体包含如本文定义的VHH或其中的重链可变区，以及重链恒定区或重链恒定区的Fc区。在一些实施方案中，在VHH或其重链可变区与重链恒定区或Fc区之间包含连接肽，例如抗体铰链区或其部分，例如来自IgG的铰链区或其部分(包括天然或突变的IgG铰链区或其部分)。
在一些实施方案中，所述连接肽是来自人IgG1、2、3或4的铰链区或其部分，包括天然或突变的铰链区或其部分，例如来自人IgG1铰链区，例如所述连接肽是EPKSS(SEQ ID NO：43)。
在一个实施方案中，所述重链抗体包含来自驼科动物(例如羊驼)的Fc部分。在一个实施方案中，通过免疫所述驼科动物例如羊驼产生并分离所述的重链抗体。本领域已知多种方式可用于免疫驼科动物和分离产生的针对目的抗原的VHH抗体或重链抗体。
在一些实施方案中，所述重链抗体包含来自人或非人灵长类动物(例如食蟹猴)抗体的恒定区，例如来自人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的恒定区。
在一些实施方案中，所述重链抗体包含来自人或非人灵长类动物(例如食蟹猴)的Fc部分。在再一实施方案中，所述重链抗体包含人IgG Fc区，例如人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4 Fc区，优选地人IgG1或人IgG4Fc区，如人IgG1 Fc区。
在一个实施方案中，根据本发明的重链抗体可以通过Fc区，与包含Fc区的另一多肽链(例如相同或不同的另一重链抗体)二聚化。因此，在一个实施方案中，本发明也提供了包含本发明重链抗体的同源或异源多聚体蛋白质。在一个优选的实施方案中，优选所述蛋白包括两条相同重链抗体链配对形成的重链抗体。
可以将本发明的Fc区进行突变以获得所需的特性。本领域已知对Fc区的突变。在一个实施方案中，在Fc区的效应子功能的特性上修饰Fc区。在一个实施方案中，所述效应子功能相对于野生同种型Fc区已经被提高。在一个实施方案中，通过对Fc区进行突变来改善Fc区的效应子功能，例如ADCC，例如通过在以下一个或多个位点进行突变S239、A330和I332(根据EU编号)。在一个实施方案中，通过以下位点组合的突变来改善ADCC：S239、A330和I332(根据EU编号)。在一个实施方案中，所述突变选自 S239D、A330L和I332E中的1、2或3个。在一个实施方案中，所述改变效应子功能的突变为如下突变组合：S239D、A330L和I332E(参考文献“Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.Proc Natl Acad Sci USA.2006 Mar 14；103(11)：4005-10.”)。
在一些实施方案中，所述Fc区是来自IgG1的Fc区，其含有突变S239D、A330L和I332E(根据EU编号)。
在一些实施方案中，所述Fc区：
(i)包含与SEQ ID NO：40、41或42中所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：40、41或42所示的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO：40、41或42所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述Fc区来自IgG1，其包含与SEQ ID NO：40或41所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述Fc区来自IgG1，其包含与SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，且包含如下突变组合：S239D、A330L和I332E(EU编号)。
在一些实施方案中，所述Fc区来自IgG4，其包含与SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗体TIGIT抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含重链可变区、Fc区，以及连接重链可变区和Fc区的连接肽。优选地，连接肽包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含重链或由其组成，所述重链包含本发明VHH的重链可变区、连接肽和Fc区或由其组成，其中所述重链
(i)包含与选自SEQ ID NO：2、7、10、15、17、19、20或22中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO：2、7、10、15、17、19、20或22中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO：2、7、10、15、17、19、20或22中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
双特异性抗体或多特异性抗体
在某些实施方案中，本发明还涵盖包含本发明的VHH或重链抗体或其片段的多特异性分子，例如双特异性抗体。多特异性抗体分子例如可以是三特异性抗体分子，其包含针对TIGIT的第一结合特异性和针对一种或多种的分子的第二及第三结合特异性。
因此，本发明的另一个方面涉及一种双特异性抗体，其包含
第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中第一抗原结合区特异性结合TIGIT，第二抗原结合区特异性结合肿瘤相关抗原或免疫检查点分子，例如PD-1、PD-L1或PD-L2或CTLA4。
在一些实施方案中，第一抗原结合区包含本文所述的抗TIGTI VHH抗体或重链抗体，特别是VHH抗体。优选地，第一抗原结合区包含或由本发明的抗TIGIT VHH组成，更优选地所述VHH是人源化的VHH。
在一些实施方案中，第二抗原结合区包含来自WO2019219064A的PD1抗体或其抗原结合片段或结构域，例如包含WO2019219064A的PD1抗体的片段或结构域。适用于本发明的双特异性抗体的第二抗原结合区可以包含抗PD-1全长抗体或其抗原结合片段，或由其组成，只要其能够特异性结合PD-1即可，包括但不限于，例如特异性结合PD-1的全长抗体、单链Fv、Fab、Fab′、(Fab)2、单域抗体、VHH或重链抗体等。
在一些实施方案中，第二抗原结合区包含来自Ipilimumab抗体或其抗原结合片段或结构域，例如包含Ipilimumab抗体的片段或结构域。适用于本发明的双特异性抗体的第二抗原结合区可以包含抗CTLA-4全长抗体或其抗原结合片段，或由其组成，只要其能够特异性结合CTLA-4即可，包括但不限于，例如特异性结合CTLA-4的全长抗体、单链Fv、Fab、Fab′、(Fab)2、单域抗体、VHH或重链抗体等。
在根据本发明的双特异性抗体中，本发明的抗TIGIT VHH作为第一抗原结合区，可以连接在第二抗原结合区的N末端或C末端，例如连接在第二抗原结合区Fc片段的C末端，或连接在第二抗原结合区重链VH片段的N末端，或者可以插入第二抗原结合区的Fab片段(Fab片段重链)和Fc片段之间，即与Fab片段重链的C末端和Fc片段的N末端连接。在一些是实施方案中，第一和第二抗原结合区通过接头连接(例如在抗TIGIT VHH插入第二抗原抗体的Fab片段和Fc片段之间时)。在一个实施方案中，接头是大约3个至大约20个氨基酸长度的肽。优选地，接头包含(GGS)n氨基酸序列，n＝1，2，3，4，或5的整数，优选n＝1。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体具有以下结构：
重链：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc-抗TIGIT VHH；或
从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc；或
从N端至C端，抗TIGIT VHH-第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL。
在一些实施方案中，第二抗原是PD-1，例如人PD-1。在一些实施方案中，第二抗原 是CTLA-4，例如人CTLA-4。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体具有两条重链和两条轻链，优选地相同的两条重链和两条轻链。
优选地，所述双特异性抗体的结构如图6A或图6B或图14A所示。
在另一些实施方案中，抗TIGIT单域抗体VHH通过接头与重链恒定区Fc部分在N端或C端连接。在一个实施方案中，接头是大约3个至大约20个氨基酸长度的肽。优选地，接头包含(GGS)n氨基酸序列，n＝1，2，3，4，或5的整数，优选n＝1。
在根据本发明的双特异性抗体中，本发明的抗TIGIT VHH作为第一抗原结合区，可以与Fc组合成重链抗体，与第二抗原结合区异二聚化形成双特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体具有以下结构：
重链1：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
重链2：1个或多个(例如2个)串联的抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc
轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体具有1条重链1、1条重链2和1条轻链。
优选地，所述双特异性抗体的结构如图14B或14C所示。
在一些实施方案中，抗TIGIT单域抗体VHH通过连接肽与重链恒定区Fc的N末端连接。在一些实施方案中，所述连接肽是来自人IgG1、2、3或4的铰链区或其部分，包括天然或突变的铰链区或其部分，例如来自人IgG1铰链区，例如所述连接肽是EPKSS(SEQ ID NO：43)。
在一些实施方案中，当重链2包含多个串联的抗TIGIT单域抗体VHH时，各个串联的VHH之间可以通过接头连接。在一个实施方案中，接头是大约3个至大约20个氨基酸长度的肽。优选地，接头包含(GGGGS)n氨基酸序列，n＝1，2，3，4，或5的整数，优选n＝1。
在一些实施方案中，第二抗原是CTLA-4，例如人CTLA-4。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗TIGIT VHH如上文所述定义。
在本发明的一个实施方案中，本发明的双特异性抗体中的抗PD1抗体的重链可变区和/或轻链可变区来自WO2019219064A的PD1抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗PD1抗体的重链可变区VH包含3个互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。在一些实施方案中，本发明的抗PD1抗体的轻链可变区包含3个互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
在一些实施方案中，本发明的3个重链可变区的互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3来自包含如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的重链可变区VH，优选地，所述CDR通过Kabat定义。
在一些实施方案中，本发明的3个轻链可变区的互补决定区VLCDR1、VLCDH2和VLCDR3来自包含如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的轻链可变区VL，优选地，所述CDR通过Kabat定义。
在一些实施方案中，本发明的抗PD1抗体的互补决定区VHCDR1包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗PD1抗体的互补决定区VHCDR2包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗PD1抗体的互补决定区VHCDR3包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗PD1抗体的互补决定区VLCDR1包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗PD1抗体的互补决定区VLCDR2包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗PD1抗体的互补决定区VLCDR3包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，抗PD1抗体的重链可变区VH包含VHCDR1，VHCDR2和VHCDR3，其中VHCDR1包含SEQ ID NO：25所示的序列或由其组成；VHCDR2包含SEQ ID NO：26所示的序列或由其组成；和/或VHCDR3包含SEQ ID NO：27所示的序列或由其组成。
在一些实施方案中，抗PD1抗体的轻链可变区VL包含VLCDR1，VLCDR2和VLCDR3，其中VLCDR1包含SEQ ID NO：35所示的序列或由其组成；VLCDR2包含SEQ ID NO：36所示的序列或由其组成；和/或VLCDR3包含SEQ ID NO：37所示的序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗PD1抗体的重链可变区VH包含SEQ ID NO：24所述的氨基酸序列，或包含与所述SEQ ID NO：24所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：24所述的氨基酸组成。在一些实施方案中，所述重链可变区VH包含与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失或添加，优选地置换，例如保守置换。在一些优选的实施方案中，所述突变不存在于CDR，例如VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3中。
在一些实施方案中，本发明的抗PD1抗体的轻链可变区VL包含SEQ ID NO：34所述的氨基酸序列，或包含与所述SEQ ID NO：34所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：34所述的氨基酸组成。在一些实施方案中，所述轻链可变区VL包含与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失或添加，优选地置换，例如保守置换。在一些优选的实施方案中，所述突变不存在于CDR，例如VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3中。
在本发明的一个实施方案中，本发明的双特异性抗体中的抗CTLA-4抗体的重链可变区和/或轻链可变区来自Ipilimumab。
在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的重链可变区VH包含3个互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的轻链可变区包含3个互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
在一些实施方案中，本发明的3个重链可变区的互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3来自包含如SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的重链可变区VH，优选地，所述CDR通过Kabat定义。
在一些实施方案中，本发明的3个轻链可变区的互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3来自包含如SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的轻链可变区VL，优选地，所述CDR通过Kabat定义。
在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的互补决定区VHCDR1包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的互补决定区VHCDR2包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的互补决定区VHCDR3包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的互补决定区VLCDR1包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的互补决定区VLCDR2包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的互补决定区VLCDR3包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体的重链可变区VH包含VHCDR1，VHCDR2和VHCDR3，其中VHCDR1包含SEQ ID NO：59所示的序列或由其组成；VHCDR2包含SEQ ID NO：60所示的序列或由其组成；和/或VHCDR3包含SEQ ID NO：61所示的序列或由其组成。
在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体的轻链可变区VL包含VLCDR1，VLCDR2和VLCDR3，其中VLCDR1包含SEQ ID NO：64所示的序列或由其组成；VLCDR2包含SEQ ID NO：65所示的序列或由其组成；和/或VLCDR3包含SEQ ID NO：66所示的序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的重链可变区VH包含SEQ ID NO：62所述的氨基酸序列，或包含与所述SEQ ID NO：62所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：62所述的氨基酸组成。在一些实施方案中，所述重链可变区VH包含与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失或添加，优选地置换，例如保守置 换。在一些优选的实施方案中，所述突变不存在于CDR，例如VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3中。
在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的轻链可变区VL包含SEQ ID NO：67所述的氨基酸序列，或包含与所述SEQ ID NO：67所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：67所述的氨基酸组成。在一些实施方案中，所述轻链可变区VL包含与SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失或添加，优选地置换，例如保守置换。在一些优选的实施方案中，所述突变不存在于CDR，例如VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3中。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体中的第二抗原抗体的重链恒定区CH1来自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。优选的，所述重链恒定区CH1来自IgG1或IgG4。
在一些实施方案中，所述重链恒定区CH1
(i)包含SEQ ID NO：28或31所述的氨基酸序列，或
(ii)其来自IgG1且包含与所述SEQ ID NO：28所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其来自IgG4且包含与所述SEQ ID NO：31所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：28或31所述的氨基酸组成；或
(iv)与SEQ ID NO：28或31所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失或添加，优选地置换，例如保守置换。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体中的重链恒定区CH1和Fc区来自相同的IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选地，都来自IgG1或IgG4。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体轻链恒定区CL为Lambda或Kappa轻链恒定区，优选的Kappa轻链恒定区。在一些实施方案中，所述轻链恒定区CL
(i)包含与选自SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO：38的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO：38的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，适用于本发明的重链抗体的Fc区同样适用于本发明的双特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体中的重链恒定区Fc来自IgG，例如 IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，所述Fc区来自IgG1或来自IgG4。
在一个实施方案中，本发明双特异性抗体中的两个Fc区二聚化形成二聚Fc。
在一些实施方案中，例如在双特异性抗体包含相同的重链时，第一和第二Fc区相同。在另一些实施方案中，例如在双特异性抗体包含不同重链时，第一Fc区和第二Fc区不同，两者配对并异二聚化。
适用于本发明抗体分子的Fc区片段可以是任何抗体Fc区。Fc区可以包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然序列Fc结构域涵盖天然存在的各种免疫球蛋白Fc序列，例如各种Ig亚型以及其同种异型的Fc区(Gestur Vidarsson等，IgG subclasses and allotypes：from structure to effector functions，20 October 2014，doi：10.3389/fimmu.2014.00520.)。例如，本发明抗体的Fc区可以包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。在一些实施方案中，抗体Fc区还可以在N端带有IgG铰链区或部分IgG铰链区，例如，IgG1铰链区或部分IgG1铰链区。在所述铰链区中可以含有突变。在一些实施方案中，铰链区可以是EPKSS或EPKSC。
优选地，本发明抗体的Fc区从N端到C端包含：CH2-CH3，或从N端到C端包含：铰链区-CH2-CH3。在一些实施方案中，适用于本发明抗体或双特异性抗体的Fc区为人的IgG Fc，例如，人IgG1 Fc，人IgG2 Fc，人IgG3或人IgG4 Fc。在一些实施方案中，所述Fc区：
(i)包含与SEQ ID NO：40或42中所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)包含SEQ ID NO：40或42所示的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO：40或42所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列。
可以将本发明的Fc区进行突变以获得所需的特性。本领域已知对Fc区的突变。在一个实施方案中，在Fc区的效应子功能的特性上修饰Fc区。在一个实施方案中，所述效应子功能相对于野生同种型Fc区已经被提高。在一个实施方案中，通过对Fc区进行突变来改善Fc区的效应子功能，例如ADCC，例如通过在以下一个或多个位点进行突变S239、A330和I332(根据EU编号)。在一个实施方案中，通过以下位点组合的突变来改善ADCC：S239、A330和I332(根据EU编号)。在一个实施方案中，所述突变选自S239D、A330L和I332E中的1、2或3个。在一个实施方案中，所述改变效应子功能的突变为如下突变组合：S239D、A330L和I332E。
如本领域技术人员理解的，为了促进本发明的双特异性抗体作为异二聚体的形成，本发明双特异性抗体所包含的Fc区可以包含利于异二聚化的突变。在一个实施方案中，在两个Fc区的CH3区中引入突变。
本领域已知促进Fc区异二聚化的方法。例如，第一Fc区的CH3区和第二Fc区的CH3区以互补方式进行工程化改造使得每个CH3区(或包含它的重链)不再能与其自身同二聚化但被迫与互补工程化改造的其它CH3区异二聚化(使得第一和第二CH3区异二聚化且两个第一CH3区或两个第二CH3区之间不形成同二聚体)。
优选地，基于结入扣(Knob-in-Hole)技术，在第一单体Fc区和第二单体Fc区中分别引入相应的结(knob)突变和扣(Hole)突变。此技术参见例如Merchant，A.M.，et al.(1998).″An efficient route to human bispecific IgG.″Nat Biotechnol 16(7)：677-681。
在一个特定的实施方案中，在一个Fc区的CH3区中，第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)(结突变)；而在另一个Fc区的CH3区中，第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)(扣突变)，任选地366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照EU索引)。
在又一个实施方案中，在一个Fc区的CH3区中，结突变包括或由下述组成：第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)且第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或第356位的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换)；而在另一个Fc区的CH3区中，扣突变包括或由下述组成：第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)，任选地366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照EU索引)，任选地第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照EU索引)。
在一个具体的实施方案中，一个Fc区包含氨基酸替代S354C和T366W(结突变)，且另一个Fc区包含氨基酸替代Y349C，T366S，L368A和Y407V(扣突变)(编号方式依照EU索引)。
因此，在一个具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含的两个Fc区异二聚化，其中
a)一个Fc-区多肽包含突变T366W，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或
b)一个Fc-区多肽包含突变T366W和Y349C，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一个Fc-区多肽包含突变T366W和S354C，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C。
在一些实施方案中，Fc区还包含其他利于异二聚体纯化的突变。例如，可以将H435R突变(Eric J.Smith，，Scientific Reports|5：17943|DOI：10.1038/srep17943)引入异二聚体的Fc区之一中(例如，带Hole突变的Fc区)，以利于使用蛋白A纯化异二聚体。在另一些实施方案中，对于包含铰链区的异二聚体单体，也可以在铰链区中引入突变，例如C220S，以利于异二聚体的形成。
在一个具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的两个Fc区异二聚化，其中
第一Fc区包含结突变，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：54或与其具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成；在一些实施方案中，所述Fc区包含与SEQ ID NO：54具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列且包含结突变(例如S354C和T366W)；在一些实施方案中，所述Fc区包含或不包含铰链区EPKSS或EPKSC；
第二Fc区包含扣突变，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：75与其具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案 中，所述Fc区包含与SEQ ID NO：75具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列且包含扣突变；在一些实施方案中，所述Fc区包含或不包含铰链区EPKSS或EPKSC。
在一个具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的两个Fc区异二聚化，其中
第一Fc区包含结突变，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：78或与其具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成；在一些实施方案中，所述Fc区包含与SEQ ID NO：78具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列且包含S239D、A330L和I332E突变和结突变(例如S354C和T366W)；在一些实施方案中，所述Fc区包含或不包含铰链区EPKSS或EPKSC；
第二Fc区包含扣突变，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：77与其具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述Fc区包含与SEQ ID NO：77具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列且包含S239D、A330L和I332E突变和扣突变；在一些实施方案中，所述Fc区包含或不包含铰链区EPKSS或EPKSC。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体中的抗TIGIT单域抗体VHH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3来自SEQ ID NO：18或21所示的VHH。在一些实施方案中，所述HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO：4或23或57所示的氨基酸序列或由其组成，HCDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体中的抗TIGIT单域抗体VHH包含重链可变区VH或由重链可变区VH组成，所述重链可变区VH包含SEQ ID NO：18或21所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含
重链：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc-抗TIGIT VHH；或
从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc
轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL，
其中所述第二抗原为PD-1；
其中重链
(i)包含SEQ ID NO：30、32或33的氨基酸序列，或
(ii)包含与SEQ ID NO：30、32或33所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：30、32或33所述的氨基酸组成，或
(iv)包含与SEQ ID NO：30、32或33所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失 或添加，优选地置换，例如保守置换，优选地，所述突变不存在于抗TIGIT VHH的CDR中，或不存在于抗TIGIT的VHH中，或不存在于抗PD1抗体的重链可变区CDR中，或优选不存在于重链可变区中；
和/或
轻链
(i)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：39所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：39所述的氨基酸组成，或
(iv)包含与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失或添加，优选地置换，例如保守置换，优选地，所述突变不存在于抗PD1抗体的轻链可变区CDR中，或优选不存在于轻链可变区中。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含
(1)重链，其包含SEQ ID NO：30、32或33的氨基酸序列，或包含与所述SEQ ID NO：30、32或33所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由所述序列组成；和
(2)轻链，其包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列，或包含与所述SEQ ID NO：39所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含
重链：从N端至C端，抗TIGIT VHH-第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL，
其中第二抗原为CTLA-4，
其中重链
(i)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列，或
(ii)包含与SEQ ID NO：69所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：69所述的氨基酸组成，或
(iv)包含与SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失或添加，优选地置换，例如保守置换，优选地，所述突变不存在于抗TIGIT VHH的CDR中，或不 存在于抗TIGIT的VHH中，或不存在于抗CTLA-4抗体的重链可变区CDR中，或优选不存在于重链可变区中；
和/或
轻链
(i)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：68所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：68所述的氨基酸组成，或
(iv)包含与SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失或添加，优选地置换，例如保守置换，优选地，所述突变不存在于抗CTLA-4抗体的轻链可变区CDR中，或优选不存在于轻链可变区中。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含
(1)重链，其包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列，或包含与所述SEQ ID NO：69所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由所述序列组成；和
(2)轻链，其包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列，或包含与所述SEQ ID NO：68所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含
重链1：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
重链2：1个或多个(例如2个)串联的抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc
轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL，
其中第二抗原为CTLA-4，
其中重链1
(i)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列，或
(ii)包含与SEQ ID NO：71所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：71所述的氨基酸组成；或
(iv)包含与SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失或添加，优选地置换，例如保守置换，优选地，所述突变不存在于抗CTLA-4抗体的重链可变区CDR中，或优选不存在于重链可变区中；
和/或
重链2
(i)包含SEQ ID NO：72或74的氨基酸序列，或
(ii)包含与SEQ ID NO：72或74所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：72或74所述的氨基酸组成；或
(iv)包含与SEQ ID NO：72或74所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失或添加，优选地置换，例如保守置换；优选地，所述突变不存在于抗TIGIT VHH的CDR中，或不存在于抗TIGIT的VHH中；
和/或
轻链
(i)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列，或
(ii)包含与所述SEQ ID NO：68所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
(iii)由SEQ ID NO：68所述的氨基酸组成；或
(iv)包含与SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列相比具有一个或几个(优选不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)突变的氨基酸序列，所述突变例如置换、缺失或添加，优选地置换，例如保守置换，优选地，所述突变不存在于抗CTLA-4抗体的轻链可变区CDR中，或优选不存在于轻链可变区中。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含
(1)重链1，其包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列，或包含与所述SEQ ID NO：71所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由所述序列组成；和
(2)重链2，其包含SEQ ID NO：72或74的氨基酸序列，或包含与所述SEQ ID NO：72或74所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由所述序列组成；和
(2)轻链，其包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列，或包含与所述SEQ ID NO：68所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的VHH或重链抗体或双特异性抗体包含一个或多个氨基酸突变。在一些实施方案中，氨基酸突变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。
在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸突变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。在一些实施方案中，本发明所述的氨基酸突变发生在抗体重链恒定区，例如Fc区 上，在优选的实施方案中，所述Fc区上的氨基酸突变增强了抗体的ADCC作用。
在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸突变，以此产生Fc区变体，以改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合和/或抗体依赖性细胞毒性。Fc区变体可包括在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸突变(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中，可能需要对抗体的可变区进行突变以防止脱酰胺作用，例如将可变区，例如CDR中的1个或2个易于脱酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)突变。
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合所述衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
本发明VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体具有以下一种或多种性质。
在一些实施方案中，本发明抗TIGIT VHH或重链抗体具有一种或多种以下特性
(i)能够特异性结合TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猴TIGIT；
(ii)能够特异性结合人TIGIT，例如以高亲和力，例如，如Fortebio检测系统所测定的，例如如实施例4所描述的方法所测定的，K D小于1nM，例如小于0.9nM或0.8nM，还例如小于0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM，还例如小于5×10 -12M、4×10 -12M、3×10 -12M、2×10 -12M、或1×10 -12M；
(iii)能够特异性结合食蟹猴TIGIT，例如以高亲和力，例如，如Fortebio检测系统所测定的，例如如实施例4所描述的方法所测定的，K D小于6、5、4、3、2或1nM，还例如小于0.9nM或0.8nM，还例如小于5×10 -12M、4×10 - 12M、3×10 -12M、2×10 -12M、或1×10 -12M；
(iv)抑制TIGIT(例如人TIGIT)与CD155的结合，例如人CD155，阻断活性高于已知的TIGIT抗体，例如WO2017053748A2的Tiragolumab analog；
(v)与表达TIGIT(例如人或食蟹猴TIGIT)的细胞结合，结合活性高于已知的TIGIT抗体，例如WO2017053748A2的Tiragolumab analog；
(vi)有效激活T细胞(例如原代T细胞，例如CD8+T细胞)，例如激活T细胞释放细胞因子，例如IFNγ；
(vii)具有较好的抑制肿瘤的效果；
(viii)具有较低的毒性。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体能够特异性结合TIGIT和PD-1，例如人TIGIT和人PD-1，例如以高亲和力。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体能够特异性结合TIGIT和CTLA-4，例如人CTLA-4和人TIGIT，例如以高亲和力。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合TIGIT和PD-1的双特异性抗体具有一种或多种以下性质：
(i)能够特异性结合TIGIT，例如人和/或食蟹猴TIGIT，例如以高亲和力；
(ii)能够特异性结合PD1，例如人PD1，例如以高亲和力；
(iii)抑制TIGIT(例如人TIGIT)与CD155的结合，例如人CD155，阻断活性高于已知的TIGIT抗体，例如WO2017053748A2的Tiragolumab analog；
(iv)阻断PD1与PD-L1的结合，例如阻断人PD1蛋白与人PD-L1的结合；
(v)与表达TIGIT(例如人或食蟹猴TIGIT)的细胞结合
(vi)与表达TIGIT(例如人或食蟹猴TIGIT)的细胞结合，同时与表达PD1(例如人PD1)的细胞结合；
(vii)具有较好的结构安全性，例如对杀伤T细胞(例如CD4+T和CD8+T细胞)杀伤不明显，优选地不能明显诱导NK细胞杀伤激活后的CD4+T和CD8+T细胞，ADCC杀伤活性与已知的TIGIT抗体，例如WO2017053748A2的Tiragolumab analog相当；
(viii)具有良好的药代动力学特征，成药性(例如稳定性)较好；
(ix)具有PD1抗体，例如已知的PD1抗体(例如WO2019219064A公开的PD1抗体)的活性；具有本发明的TIGIT VHH或重链抗体的活性；
(x)具有较好的抑制肿瘤的效果；
(xi)具有较低的毒性。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合TIGIT和CTLA-4的双特异性抗体具有一种或多种以下性质：
特异性结合TIGIT和CTLA-4的双特异性抗体具有一种或多种以下性质：
(i)能够特异性结合TIGIT，例如人和/或食蟹猴TIGIT，例如以高亲和力；
(ii)能够特异性结合CTLA-4，例如人CTLA-4，例如以高亲和力；
(iii)与TIGIT的结合亲和力高于与CTLA-4的结合亲和力(例如高1个数量级)
(iv)抑制TIGIT(例如人TIGIT)与CD155的结合，例如人CD155，阻断活性高于已知的TIGIT抗体，例如WO2017053748A2的Tiragolumab analog；
(v)阻断CTLA-4与CD80的结合，例如阻断人CTLA-4与人CD80的结合；
(vi)与表达TIGIT(例如人或食蟹猴TIGIT)的细胞结合
(vii)具有较好的结构安全性，例如对杀伤T细胞(例如CD4+T和CD8+T细胞)杀伤不明显，优选地不能明显诱导NK细胞杀伤激活后的CD4+T和 CD8+T细胞，ADCC杀伤活性与已知的TIGIT抗体，例如WO2017053748A2的Tiragolumab analog相当；
(viii)具有良好的药代动力学特征，成药性(例如稳定性)较好；
(ix)具有抗CTLA-4抗体，例如已知的CTLA-4抗体(例如Ipilimumab)的活性；
(x)具有本发明的TIGIT VHH或重链抗体的活性；
(xi)具有较好的抑制肿瘤的效果；
(xii)具有较低的毒性。
二、编码抗体的核酸以及包含其的宿主细胞
在一方面，本发明提供了编码以上任何VHH或重链抗体或双特异性抗体或其任一条链的核酸。
例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO：1、2、6、7、8、9、10、14-22、30、32、33、69、71、72或74中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO：1、2、6、7、8、9、10、14-22、30、32、33、69、71、72或74中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。
如本领域技术人员明了的，因为密码子简并性，每一个抗体或多肽氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。编码本发明分子的核酸序列可以采用本领域熟知的方法，例如通过从头固相DNA合成，或通过PCR扩增而产生。
在一方面，本发明提供编码以上任何单域抗体或VHH的核酸。当从适宜的表达载体表达时，由所述核酸编码的多肽能够显示人TIGTI抗原(和/或食蟹猴)结合能力。在一些实施方案中，所述核酸在读框中与编码另一肽/多肽的核酸可操作连接，从而当从适宜的表达载体表达时，产生包含所述单域抗体或VHH与另一肽/多肽的融合蛋白或嵌合多肽。例如，在一些实施方案中，所述核酸在读框中与编码Fc区(例如人Fc区)的核酸可操作连接，从而当从适宜的表达载体表达时，产生包含所述单域抗体或VHH与Fc区的重链抗体。
为了便于生产和纯化，单域抗体或VHH可以在N端融合分泌性信号肽，和/或利于纯化的标签肽，如六组氨酸标签或生物素标记或hFc标记。
在再一方面，本发明提供编码以上任何双特异性抗体的核酸。当从适宜的表达载体表达时，由所述核酸编码的多肽能够显示人TIGIT和第二抗原(例如人PD-1或人CTLA-4)结合能力。在一个实施方案中，编码双特异性抗体的重链和轻链的核酸可以在相同的载体中或在不同的载体中。在再一实施方案中，编码双特异性抗体的重链和轻链的核酸可以引入相同或不同的宿主细胞以表达。因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体的生产方法包括步骤：在适于表达所述分子的重链和轻链的条件下，培养包含编码所述重链和轻链的核酸的宿主细胞，产生本发明双特异性抗体。
在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中，载体是例如pcDNA载体，例如pcDNA3.1。
在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞，例如用于克隆或表达编码VHH或重链抗体或双特异性抗体的载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞(例如CHO-S)或293细胞(例如293F或HEK293细胞))或适用于制备抗体或其片段的其它细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核的，例如是细菌，例如大肠杆菌。
在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其片段的其它细胞。例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。例如，糖基化途径已经进行“人源化”的真菌和酵母菌株导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK293、293F或293T细胞)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞、CHO-S细胞、ExpiCHO等；以及骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。本领域已知适合产生抗体的哺乳动物宿主细胞系。
三、本发明的VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体的生产和纯化
在一个实施方案中，提供了制备本发明VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体的方法，其中所述方法包括，在适合VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体或其链表达的条件下，培养包含编码所述VHH或重链抗体或双特异性抗体(例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述VHH或重链抗体或双特异性抗体。
可以将编码本发明VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体的多肽链的多核苷酸插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。一旦已经制备了用于表达的包含本发明的一种或多种核酸分子的表达载体，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质体的转染或其他常规技术。
如本文所述制备的VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、尺寸排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。
可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括尺寸排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
四、对VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体的测定法。
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的VHH或重链抗体或双特异性抗体进行鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
一方面，对本发明的VHH或重链抗体或双特异性抗体测试其靶标(例如抗原)结合活性，例如通过已知的方法诸如生物膜薄层干涉技术、ELISA，等来进行。可使用本领域已知方法来测定对TIGIT和/或PD1的结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中，使用放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法(BLI)或电化学发光(ECL)或表面等离子体共振法(SPR)或流式细胞术(FACS)测量。
本发明还提供了用于鉴定VHH或重链抗体或双特异性抗体的生物学活性的测定法。生物学活性选自本发明的VHH或重链抗体或双特异性抗体的性质。
例如，对于本发明的抗体分子对表达TIGIT和/或第二抗原(例如PD-1或CTLA-4)的细胞的结合活性，可以通过本领域已知的方法，例如荧光报道分子和流式细胞术，或本文实施例公开的示例性方法测定，例如通过如实施例6所示的方法测定本发明的抗体分子与细胞上表达的TIGIT和/或PD-1的结合。
例如，对于本发明抗体分子对TIGIT和/或第二抗原(例如PD-1或CTLA-4)的抑制活性，可以通过本领域已知的方法，例如ELISA阻断试验，受体荧光报道分子激活试验，细胞增殖试验，或本文实施例公开的例示性方法来测定。例如，可以使用ELISA阻断试验，例如实施例5或14所示的方法，测定分子阻断人TIGIT和/或人PD-1与其相关受体结合的阻断活性，例如实施例21或22所示的方法，测定分子阻断人TIGIT和/或人CTLA-4与其相关受体结合的阻断活性
例如，对于本发明的抗体分子对T细胞的激活活性，可以通过本领域已知的方法，例如T细胞激活试验系统，例如原代T细胞激活试验系统测定，例如通过实施7所示的方法，通过检测T细胞(例如CD8+T细胞)释放的细胞因子(例如IFNγ)的量。
例如，对于本发明抗体分子对细胞的杀伤活性或结构安全性，可以通过本领域已知的方法，例如细胞毒性试验系统，例如NK细胞依赖的细胞毒性试验系统，例如通过实施例17所示的方法来测定。
供任何上述体外测定法使用的细胞为原代细胞或细胞系，包括天然表达或过表达TIGIT(例如人或食蟹猴)或CD155或第二抗原(PD1或PDL1(例如人或食蟹猴PD1或PDL1)或CTLA-4(例如人CTLA-4)的细胞，例如过表达TIGIT和/或CD155和/或PD1和/或PDL1的细胞，例如293细胞或CHO细胞或Jurkat细胞，例如HEK293或CHO-K1或Jurkat/NFAT-Luc细胞。
本发明还提供了用于检测本发明的抗体分子的成药性的方法，例如通过检测抗体分子的药代动力学特征，可以通过本领域已知的方法，例如实施例18所示的方法获得动物模型(例如大鼠模型)中抗体分子的药代动力学参数。
可以理解的是，能够使用本发明的抗体和别的活性剂的组合来进行任何上述测定法。
五、本发明VHH或重链抗体或双特异性抗体的融合蛋白或免疫缀合物、药物组合物、药物联合和试剂盒
在一些实施方案中，本发明还提供了包含本文所述的任何VHH或重链抗体或双特异性抗体的融合蛋白，例如其包含本发明的VHH或重链抗体或双特异性抗体，以及与其连接的其他分子(例如其他蛋白，例如用于治疗的蛋白质)。
在一些实施方案，本发明提供了包含本文所述的任何VHH或重链抗体或双特异性抗体的免疫缀合物。优选地，所述免疫缀合物包含一种或多种其他治疗剂(例如细胞毒素或小分子化合物)或标记物。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何VHH或重链抗体或双特异性抗体的组合物或药物或制剂，优选地组合物为药物组合物。
在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物，例如，药物组合物，包含本发明的VHH或重链抗体或双特异性抗体，以及一种或多种其它治疗剂的组合。
本发明的所述组合物或药物或制剂还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。
对于药用辅料的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第八版，R.C.Rowe，P.J.Seskey和S.C.Owen，Pharmaceutical Press，London，Chicago。
本发明的组合物或药物或制剂可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，注射液或滴眼液)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。
可以通过将具有所需纯度的本发明的VHH或重链抗体或双特异性抗体与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的VHH或重链抗体或双特异性抗体的药物或制剂，例如以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的组合物或药物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂。
本发明还提供了药物组合或药物组合产品，其包含本发明的VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体，以及一种或多种其它治疗剂。
本发明还提供了包含所述药物组合的成套药盒，例如所述成套药盒在同一包装内包含：
-含有包含本发明的VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体的药物组合物的第一容器；
-含有包含其它治疗剂的药物组合物的第二容器。
六、VHH或重链抗体或双特异性抗体的用途和应用其的方法。
本发明一方面提供了在受试者中预防或治疗疾病的方法，包括向受试者施用本发明的抗TIGIT VHH或重链抗体或双特异性抗体，或包含其的免疫缀合物、组合物或药物或制剂。
在一些实施方案中，所述疾病例如肿瘤，例如癌症。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。在一些实施方案中，癌症可以是实体肿瘤或血液肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤是对已知药物，例如已知抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体具有耐受性的肿瘤或癌症，例如难治性肿瘤或癌症。
在一些实施方案中，所述患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)PD1或PDL1或PDL2或CTLA-4，和/或TIGIT(例如与健康个体的相同组织相比，或与患者相邻的健康组织相比)。
在一些实施方案中，所述疾病治疗将受益于抑制核酸或蛋白质水平的PD1或PDL1或PDL2或CTLA-4，和/或TIGIT。
在一些实施方案中，所述癌症是表征为具有升高的PD-1、PD-L1或PD-L2或CTLA-4的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)和/或具有升高的TIGIT的的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)的癌症，例如，所述癌症的肿瘤细胞中具有升高的PD-1、PD-L1和/或PD-L2或CTLA-4的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)，和/或升高的TIGIT的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)(例如与健康个体的相同组织相比，或与患者相邻的健康组织相比)。
本发明的抗TIGIT VHH或重链抗体或双特异性抗体(以及包含其的免疫缀合物、组合物、药物组合物、制剂、组合产品等)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病灶内给药。肠胃外注射或输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下注射或输注。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗TIGIT VHH或重链抗体或双特异性抗体(以及包含其的免疫缀合物、组合物、药物组合物、制剂、组合产品等)的合适剂量(当单独或与一种或多种其他的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。在其他方面，本发明提供本发明的抗TIGIT VHH或重链抗体或双特异性抗体或包含其的免疫缀合物或组合物在生产或制备药物中的用途，所述药物用于本文所述的用途，例如用于预防或治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一些实施方案中，抗TIGIT VHH或重链抗体或双特异性抗体(以及包含其的免疫缀合物、组合物、药物组合物、制剂等)还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的用途，例如用于预防和/或治疗本文提及的相关疾病或病症。
七、诊断和检测
在一个方面，本发明还涉及对VHH或重链抗体或双特异性抗体的用于诊断和检测的方法和包含其的用于诊断和检测的组合物。
在某些实施方案中，本文中提供的抗TIGIT VHH或重链抗体抗体可以用于检测TIGIT在生物样品中的存在。在某些实施方案中，本文中提供的抗双特异性抗体可以用于 检测TIGIT和/或PD1在生物样品中的存在。在某些实施方案中，本文中提供的抗双特异性抗体可以用于检测TIGIT和/或CTLA-4在生物样品中的存在。
术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在某些实施方案中，生物样品是体液，例如血液、血清或血浆。
在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的VHH或重链抗体在允许其与TIGIT结合的条件下接触，并检测在该VHH或重链抗体和TIGIT之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在TIGIT。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，本发明的抗体用于选择适合利用本发明的VHH或重链抗体治疗的受试者，例如其中TIGIT是用于选择所述受试者的生物标记物。
在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的双特异性抗体在允许其与TIGIT和/或PD-1结合的条件下接触，并检测在该抗体与TIGIT和/或PD-1之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在TIGIT和/或PD-1。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，本发明的抗体用于选择适合利用本发明的双特异性抗体治疗的受试者，例如其中TIGIT和/或PD-1是用于选择所述受试者的生物标记物。
在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的双特异性抗体在允许其与TIGIT和/或CTLA-4结合的条件下接触，并检测在该抗体与TIGIT和/或CTLA-4之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在TIGIT和/或CTLA-4。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，本发明的抗体用于选择适合利用本发明的双特异性抗体治疗的受试者，例如其中TIGIT和/或CTLA-4是用于选择所述受试者的生物标记物。
在某些实施方案中，提供标记的VHH或重链抗体或双特异性抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。在一些实施方案中，所述标记例如生物素或hFc等标记物。
在本文中提供的一些实施方案中，样品是在用本发明的VHH或重链抗体或双特异性抗体治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法治疗过程中，或者用其他疗法治疗后获得的。
在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测TIGIT和/或PD1。在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测TIGIT和/或CTLA-4。
在一些实施方案中，提供了一种治疗本发明疾病的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，受试者样品)检验TIGIT的存在，因而确定TIGIT值，将TIGIT值与对照值(例如正常个体中的值)比较，并且如果TIGIT值大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的本发明所述的VHH抗体或重链抗体，因而治疗所述疾病。
在一些实施方案中，提供了一种治疗本发明疾病的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，受试者样品)检验TIGIT和/或PD1的存在，因而确定TIGIT和/或PD1值，将TIGIT和/或PD1值与对照值(例如正常个体中的值)比较，并且如果TIGIT 和/或PD1值大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的本发明所述的双特异性抗体，因而治疗所述疾病。
在一些实施方案中，提供了一种治疗本发明疾病的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，受试者样品)检验TIGIT和/或CTLA-4的存在，因而确定TIGIT和/或PD1值，将TIGIT和/或CTLA-4值与对照值(例如正常个体中的值)比较，并且如果TIGIT和/或CTLA-4值大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的本发明所述的双特异性抗体，因而治疗所述疾病。
八、发明定义
应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项或全部。
如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
如本文中使用的，术语“TIGIT”或“具有Ig和ITIM域的T细胞免疫受体”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人或食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然TIGIT，除非另有说明。TIGIT在本领域也称作含有V集和免疫球蛋白域的蛋白9，含有V集和跨膜域的蛋白3，VSIG9，VSTM3，和WUCAM。该术语涵盖“全长”、未加工的TIGIT以及因细胞中的加工所致的任何形式的TIGIT。该术语还涵盖TIGIT的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性的人TIGIT的氨基酸序列可以见UniProt登录号Q495A1。在本发明的一些实施方案中，人TIGIT包含如SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。在本发明的一些实施方案中，食蟹猴TIGIT包含如SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。
术语″PD-1″是指程序性细胞死亡蛋白1。术语″PD-1″包含变体、同种型、同源物、直系同源物和旁系同源物。举例来说，在某些情况下，特异性针对人PD-1蛋白的抗体可与来自除人以外的物种(例如食蟹猴)的PD-1蛋白交叉反应。在其它实施方案中，特异性针对人PD-1蛋白的抗体可完全特异性针对人PD-1蛋白且不展现与其它物种或其它类型的交叉反应性，或可与来自某些其它物种但不是所有其它物种的PD-1交叉反应。
术语″人PD-1″指人PD-1序列，如具有Genbank登录号.NP_005009.2的人PD-1的完整氨基酸序列。
术语“细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4)”或“CTLA-4”是在T细胞上上调的抑制性受体(A1egre等人，2001，《自然·免疫学综述》(Nat Rev Immunol)1：220-8)。CTLA-4以几种方式抑制免疫反应：它与T细胞共刺激受体CD28竞争其配体CD80和CD86，并由此阻断共刺激；它发出负信号以抑制T细胞活化；并且它还可以通过反式内吞作用从相对的细胞中捕获CD80和CD86，导致通过CD28的T细胞共刺激减弱。它在Treg细胞上组成型表达，只在激活后的传统T细胞上表达，CTLA4是T细胞的关键负调节因子，与CD28有相同的B7配体(CD80、CD86)，但是CTLA4与B7分子亲和力更高，因此CTLA4与T细胞上的CD28竞争性地与APC细胞上的B7分子结合，从而抑制T细胞的激活(Shunsuke Chikuma.(2017).″CTLA-4，an Essential Immune-Checkpoint for T-Cell Activation″Curr Top Microbiol Immunol 410：99-126.)。CTLA4也可以介导Treg细胞对APC细胞表面的B7分子进行反式内吞，从而降低APC细胞表面B7分子的表达来减少对T细胞上CD28的激活。在肿瘤微环境中，抑制CTLA4可以通过两种独立却互补的机制来恢复抗肿瘤免疫应答，第一是促进肿瘤浸润T细胞的增殖和活化，第二是减弱免疫抑制性Treg细胞的功能。伊匹木单抗可阻断细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，但是临床上有很多治疗相关的不良事件，特别是在较高剂量下的剂量限制毒性阻止了其最大的抗肿瘤活性潜力。目前的研究报道表明伊匹木单抗产生irAE可能的机制包括：阻断CTLA4会激活对自身抗原有反应的T细胞克隆，导致自身免疫性疾病样症状；伊匹木单抗的Fc效应会导致组织驻留Treg细胞的耗竭从而阻碍外周耐受性，使患者在CTLA4抗体治疗后更容易发生irAE；CTLA4抗体治疗会导致CTLA4受体内吞降解，伊匹木单抗会显著下调细胞表面的CTLA4受体。
“单域抗体”(single domain antibody，sdAb)在本文中用于指，通过单个可变抗体结构域，例如单个VH或单个VL，来识别并结合目的抗原的抗体多肽。单域抗体的单个可变抗体结构域无需与另一抗体可变结构域配对，即能够识别和结合目的抗原。在本文中，包含重链可变结构域的单域抗体也称作VHH。
术语“VHH”或“VHH抗体”在本文中可以互换使用，通常指这样的抗体，其仅包含一个重链可变区或由其组成，具有与抗原结合的活性。VHH通常包含三个CDR与高度保守的4个构架区中，并且通常具有下式的结构：FR1-CDR-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4指构架区1至4；CDR1至CDR3指互补决定区1-3。VHH可变区中的CDR序列可以按照“定义”部分描述的任何CDR定义方案进行确定，优选可以通过IMGT来定义可变区序列中的三个CDR的边界。VHH通常仅包括从缺乏轻链的重链抗体衍生的重链可变结构域，也称作纳米抗体。本发明中使用的VHH优选来自骆驼科动物，例如羊驼，或是其人源化形式或序列优化形式(例如，以增加结合亲和力的亲和力成熟形式)。在一些实施方案中，本发明的VHH为由或基本上由单个重链可变区(例如重链抗体的重链可变区)组成的单价单特异性多肽分子。
本发明的单域抗体或VHH也可以包含在更大的多肽/蛋白中。包含本发明VHH的多肽/蛋白例子包括但不限于，重链抗体(HcAb)或双特异性抗体或融合蛋白。本发明所述的“重链抗体”是指不具有轻链的抗体，例如其从N段到C段可以包含VH-Fc或VH-CH2-CH3或VH-铰链区-CH2-CH3，或可以包含VH-CH1-CH2-CH3；可以涵盖同型二聚体，例如不具有轻链的重链二聚体抗体。本发明的重链抗体中可以包含来自标准抗体的VH或者来自单域抗体的VH。例如，本发明的重链抗体中的VH可以就是VHH。在一些实施方案中，本发明的重链抗体可以是具有源自骆驼科动物(美洲驼、骆驼，尤其是羊驼)的构架区和/或重链恒定区的重链抗体，其人源化形式或其序列优化形式(亲和力成熟形式)、或其片段(例如包含至少部分恒定区的片段)。本发明的重链抗体还涵盖将重链可变区或 VHH与Fc区(例如人IgG Fc区，例如人IgG1或IgG4Fc区)融合后形成的抗体。当在重链抗体或双特异性抗体或融合蛋白的背景下提及“VHH”时，应当理解，其为双特异性抗体中的一部分，而不作为一个单独的分子。
如本文所用，术语“单特异性”指，具有一个或多个抗原结合位点的多肽/蛋白分子，所述位点中的每一个位点与相同抗原的相同表位结合。
如本文所用，术语“多特异性”抗体指具有至少两个抗原结合位点的抗体，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。多特异性抗体是对至少两个不同抗原表位具有结合特异性的抗体。在一个实施方案中，本文提供了这样的双特异性抗体，其具有针对第一抗原和第二抗原的结合特异性。
术语“多特异性结合分子”是指至少是双特异性的多特异性结合分子，例如双特异性结合分子，即所述分子包含至少第一靶标结合区和第二靶标结合区，其中所述第一靶标结合区结合一种靶标或抗原且所述第二靶标结合区结合另一抗原或靶标。因此，根据本发明的分子包含对于至少两种不同的抗原或靶标的特异性。根据本发明的分子也涵盖包含多个靶标结合区/结合位点的多特异性分子，诸如三特异性结合分子。在一些实施方案中，本发明的双特异性结合分子是双特异性抗体。
如本文所用的术语“接头”是指使得能够直接连接双特异性结合分子的不同部分的任何分子。在不同分子部分之间建立共价连接的接头的实例包括肽接头和非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇、聚丙二醇的共聚物。在一些实施方案中，接头是肽接头(又称为“连接肽”)，其是指是指由氨基酸组成的短氨基酸序列，例如单独或组合使用的甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)和/或苏氨酸残基(T)，或来自免疫球蛋白的铰链区，用于将结合分子的第一部分的氨基酸序列连接至结合分子的第二部分。例如，肽接头可以将结合分子的第一靶标结合区连接至第二靶标结合区。例如，肽接头也可以将抗体的一部分连接至抗体的另一部分，诸如将轻链可变区连接至重链可变区。优选地，所述肽接头具有这样的长度，其足以连接两个实体，其方式使得它们维持它们相对于彼此的构象，使得不妨碍期望的活性。在一个实施方案中，连接肽具有5-50个氨基酸长度，例如，10，15，20，25，30个氨基酸长度。在一个实施方案中，连接肽包含氨基酸序列(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)nG，其中n是等于或大于1的整数，例如，n是2、3、4、5、6、7、8、9、10的整数。有用的接头还包括甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。在一些实施方案中，所述肽接头是(GGS)n，其中n＝1、2、3或4，例如SEQ ID NO：44所示的序列。
在再一实施方案中，连接肽为来自免疫球蛋白的铰链区或铰链区部分，包括天然的铰链区或其部分，或者突变的铰链区或其部分。在一个实施方案中，连接肽例如是免疫球蛋白(例如IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的铰链区或其部分(例如EPKSC)或是突变的铰链区或其部分，例如EPKSS。或者，可以使用计算机程序模拟蛋白和肽的三维结构，或通过噬菌体展示方法，来合理地设计合适的柔性连接肽。
如本文所用的术语“靶标结合区”是指多特异性结合分子，例如双特异性结合分子的结合特定靶标或抗原的任何部分。靶标结合区可以是例如抗体或免疫球蛋白本身或抗体片段。这种靶标结合区可以具有或可以不具有独立于BsAB的剩余部分的三级结构，并且可以作为单独实体结合或不结合其靶标。靶标结合区还可以是受体或配体，或受体的能够结合配体的结构域。在多特异性抗体或双特异性抗体时，也将“靶标结合区”称为“抗原结合区”。
术语“全抗体”或“全长抗体”在本文中可互换使用，是指具有天然免疫球蛋白分子结构的抗体分子。在常规四链IgG抗体的情况下，全长抗体包含由二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链(L)。在仅具有重链而缺乏轻链的重链抗体情况下，全长抗体包含由二硫键相互连接的两条重链(H)。对于常规四链IgG抗体，全长抗体重链通常由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成，其中重链恒定区至少包含3个结构域CH1、CH2和CH3。全长抗体轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成，其中轻链恒定区由一个结构域CL组成。每个重链可变区VH和每个轻链可变区都由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分。在优选的实施方案中，抗体片段为抗原结合片段。
术语抗体的“抗原结合片段”是与全长抗体不同的分子，其包含全长抗体的一部分，但其能结合全长抗体的抗原或与全长抗体(即与抗原结合片段所来源的全长抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、双体抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、纳米抗体。例如，通过木瓜蛋白酶消化全长抗体能够获得Fab片段。此外，通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体产生F(ab′)2，其为Fab’的二聚体，是二价的抗体片段。F(ab′)2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原，由此将F(ab′)2二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体基本上是具有铰链区的Fab片段。Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。Fv片段的两个结构域VL和VH可以由独立的基因编码，但是也可以使用重组方法，使用合成性连接肽连接这两个结构域以使其作为单条蛋白链产生，并且在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单链Fv(scFv)。
“Fab片段”或“Fab”在本文中可互换使用，用于指，由两条多肽链组成的、包含免疫球蛋白重链可变结构域VH、重链恒定结构域CH1、轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL的免疫球蛋白片段，其中，一条多肽链从N端到C端包含VH和选自CH1和CL的一个恒定区，另一条多肽链从N端到C端包含VL和选自CL和CH1的另一恒定区，其中所述VH结构域和VL结构域配对形成抗原结合位点。在本文中，包含重链恒定区CH1的Fab多肽链也称作“Fab重链”；相应地，包含轻链恒定区CL的Fab多肽链也称作“Fab轻链”。
术语“靶标”是指结合分子所针对的被结合物。靶标可以是抗原，也可以是配体或受体。
术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化，或两者兼有。技术人员将理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。如本文所用，术语“表位”指抗原中与抗体分子特异性相互作用的部分。“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派方案的任一种或其组合确定，所述指派方案包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，A1-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”，Journal of Molecular Biology，273，927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health(1987))，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。
以下为采用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT方案定义的CDR的区域范围。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR，”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))的编号位置。
在一本实施方案中，本发明的VHH或重链抗体中的CDR按照IMGT确定。本发明的抗PD1抗体中的VHCDR和VLCDR按照Kabat确定。
应该注意，基于不同的指派方案获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派方案下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派方案规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR(在同一指派方案下)。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量 的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat，Chothia，AbM、Contact和North方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”或“Fc区”包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如，在天然抗体中，免疫球蛋白Fc结构域包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的重链的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域)；或者包含源自IgM和IgE类抗体的两条重链的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。除非本文中另外说明，否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Edelman，G.M.et a1.，Proc.Natl.Acad.USA，63，78-85(1969)(https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/5257969/)中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号，还参见http：//www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html。在本文中，术语“Fc区”、“Fc部分”和“Fc片段”不包括免疫球蛋白的重链可变区VH和轻链可变区VL以及重链恒定区CH1和轻链恒定区CL，但在一些情况下可以包括在重链恒定区N端的铰链区。
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分进行改变、替换或交换，从而抗原结合位点与具有不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种来源的恒定区连接、或与赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，驼源重链抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时与原始驼源抗体相比，具有在人类中降低的抗原性。
如本文所用，“人源化抗体”是一种保留非人类抗体(例如羊驼单克隆抗体)的抗原特异反应性，同时作为治疗药对人施用时免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人抗原结合位点并将抗体的剩余部分替换成它们的人类相应部分(即，将恒定区以及可变区中不参与结合的部分替换为人类抗体的相应部分)来实现。
如本文所用，术语“抗”、“结合”或“特异性结合”意指结合作用对靶标或抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。结合位点与特定靶标或抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)测定。
术语“有效量”指本发明的抗体或片段或组合物或组合的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数或改善可度量参数至少约40％、甚至更优选地至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％甚至100％。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。在一些实施方案中，标记是hFc或生物素。
“个体”或“受试者”可以互换的使用，包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体或分子是这样的抗体或分子，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体或分子纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。
氨基酸序列的“同一性百分数(％)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80％，85％，90％，95％，97％，98％或99％或更高。所述变体可以包含保守性改变。
对于多肽序列，“保守性改变”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，但不实质性改变多肽序列的期望功能活性。例如，保守性置换常常导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。以下列出了8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，术语“保守序列改变”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的本发明抗体分子或结合蛋白分子的目的抗原结合特征的氨基酸修饰。例如保守修改变体相对于亲本抗体或结合蛋白保持对目的抗原至少80％，85％，90％，95％，98％，99％或更高，例如100-110％或更高的结合亲和力。
术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有 效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药物组合或组合产品”是指非固定组合产品或固定组合产品，包括但不限于药盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，(i)本发明的免疫缀合物、以及(ii)其他治疗剂)以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于患者，其中这类施用在患者体内提供预防或治疗有效水平的两种或更多种活性剂。术语“固定组合”意指两种或更多种活性剂以单个实体的形式被同时施用于患者。优选对两种或更多种活性剂的剂量和/或时间间隔进行选择，从而使各部分的联合使用能够在治疗疾病或病症时产生大于单独使用任何一种成分所能达到的效果。各成分可以各自呈单独的制剂形式，其制剂形式可以相同也可以不同。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂或治疗方式(例如放射疗法或手术)以治疗本文所述疾病。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
如本文中使用的，“肿瘤相关抗原”指靶细胞的表面上呈现的抗原性决定簇，其中靶细胞是肿瘤中的细胞，诸如癌细胞、肿瘤基质的细胞。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转疾病的症状、并发症、或生化指征的发作、缓解症状或阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。
用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
“受试者/患者/个体样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样 品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如泪液、玻璃体液、脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。在一些实施方案中，组织样品是肿瘤组织。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。
本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
具体实施方式
实施例
实施例1：羊驼免疫
选择健康强壮、精神状态良好、体型适中的A和B两只羊驼(成都阿帕克生物科技有限公司)开始免疫，免疫前各采血10mL，收集阴性血清作为免疫效价检测使用。免疫时，将完全弗氏佐剂与0.5mg抗原hTIGIT-Fc(ACRO，货号TIT-H5254)混合，乳化后皮下多点注射。第一次免疫后21天进行第二次免疫，将0.25mg抗原hTIGIT-Fc(ACRO，货号TIT-H5254)与不完全弗氏佐剂混合，乳化后皮下多点注射。总共进行7次免疫，每次免疫间隔3周，其中第五次和第七次采用纯化的食蟹猴TIGIT-11maFc蛋白(SEQ ID NO：47)与不完全弗氏佐剂混合免疫。
从第二次免疫开始，每次免疫后间隔7天采集10mL外周血，监测免疫反应。多次免疫后获得可用于建库的羊驼PBMC。
实施例2：羊驼免疫文库构建
用Trizol法从羊驼外周血中提取总RNA，将5μg RNA反转录，应用PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，货号6210A)，获得cDNA。将反转录获得cDNA进行巢氏PCR扩增，第一轮PCR获得VH和VHH产物，通过琼脂糖凝胶割胶回收750bp左右的VHH片段，再通过第二轮PCR获得大小约500bp的VHH片段，用DNA产物纯化试剂盒纯化VHH片段。将VHH片段利用酶切连接技术(NheI和NotI进行酶切)连接到噬菌体载体中(连接摩尔比例为载体∶VHH＝1∶3)。共进行了10次电击转化，电击之后立即向电击杯中加入1mL 2YT培养基(37℃预热)复苏，吸出电击产物并用2YT培养基洗净电击杯，共计获得10mL复苏产物，37℃，180rpm复苏60min，取100μL梯度稀释至10-3和10-4测定库转化子数目，涂布于90mr的平板上，其余涂布于10块200mm的平板上。第二天测定库容，经检测构建的文库库容为6×107CFU，文库插入率为100％。
随后利用噬菌体展示技术进行文库筛选，经3轮液相筛选，第一轮用20μg生物素标记(EZ-Link TM Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂盒，Thermo，货号A39257)的cynoTIGIT蛋白(ACRO，货号TIT-C5223)吸附，0.1％PBST洗涤15次，最终再用1mL 100mM的三乙胺进行洗脱，取500μL的1M pH7.4的Tris-Hcl进行中和。取750μL洗脱噬菌体侵染5mL处于对数期的TG1，37℃静置30分钟，然后5000g离心5分钟，取1mL菌液涂布2YT(50 mg/mL羧苄青霉素+2％葡萄糖)固体平板。37℃倒置过夜培养，次日用10mL 2YT液体培养基刮下平板上所有菌落，取1mL菌液加入100mL 2YT(50μg/mL羧苄青霉素+2％葡萄糖)液体培养基中，培养至对数期，加入MOI比20∶1的辅助噬菌体M13K07(NEB，货号：N0315S)，37℃侵染30分钟，然后5000rpm离心10min，弃尽上清，用等体积2YT+Car+K(Car：50μg/mL、Kan：50μg/mL)培养基重悬沉淀，30℃，220rpm过夜。过夜培养物4℃，10000rpm离心20min，收取上清，弃沉淀。更换离心筒，4℃，10000rpm，离心20min，收取上清。
按上清体积的1/5加入PEG8000/NaCl，混匀，冰浴沉淀2小时以上。4℃，10000rpm，离心20min，弃上清，空离一次除尽上清。1mL 1×PBS悬起沉淀，加入1/5体积的PEG8000/NaCl二次沉淀1h。4℃，12000rpm，离心10min弃上清，空离一次除尽上清。根据沉淀的量，加入1×PBS重悬沉淀。取10μL库噬菌体用2YT梯度稀释，从10-8和10-9管中取10μL加到90μL的TG1菌液中，轻柔混匀。37℃静置30min，分别涂布羧苄抗性平板，过夜培养。次日数平板上克隆，计算噬菌体文库滴度。第二轮筛选采用10μg生物素标记的huTIGIT蛋白吸附，0.1％PBST洗涤15次，最终再用1mL 100mM的三乙胺进行洗脱，取500μL的1M pH7.4的Tris-Hcl进行中和。此后再按第一轮的方法进行扩增，获得第三轮筛选所需的噬菌体亚库，第三轮筛选采用10μg生物素标记的cynoTIGIT蛋白吸附，0.1％PBST洗涤15次，最终再用1mL 100mM的三乙胺进行洗脱，取500μL的1M pH7.4的Tris-Hcl进行中和。
三轮筛选结束后，将洗脱的噬菌体稀释之后侵染处于对数期的TG1，涂布2YT(50μg/mL羧苄青霉素+2％葡萄糖)平板，37℃，过夜培养，次日，挑取平板上单克隆，进入含有400μL的2YT(50μg/mL羧苄青霉素)液体培养基的深孔板中培养，37℃，220rpm培养至对数期，加入1mM的IPTG，30℃，低温诱导过夜。第二日，将深孔板500g，离心5分钟，取上清待ELISA检测。
用pH7.4的PBS缓冲液将huTIGIT-his(ACRO，货号TIT-H52H3)，cynoTIGIT-his(ACRO，货号TIT-C5223)稀释至4μg/mL浓度，以50μL/孔的体积加入96孔酶标板中，于4℃放置过夜，次日，弃去液体后，加入用PBS稀释的1％脱脂牛奶封闭液200μL/孔，37℃孵育箱孵育1小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.005％tween-20)洗板2次后，加入50μL/孔诱导上清，置37℃孵育箱孵育1小时，孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板2次后，加入50ul/孔稀释过的HRP标记的鼠抗HA标签的二抗(Sinobiological，货号100028-MM10)，7℃孵育1小时，用PBST洗板2次后，加入50μL/孔1M H2SO4终止反应，用酶标仪在波长450nm处读取吸收值，计算对huTIGIT，cynoTIGIT结合的克隆个数。将获得的阳性克隆全部进行测序鉴定，所有序列不同的抗体均作为候选对象，获得1G3-VHH、6F6-VHH、5H2-VHH核苷酸序列。
将编码1G3-VHH、6F6-VHH、5H2-VHH和EPKSS连接肽分别插入含有人IgG1重链恒定区Fc序列(SEQ ID NO：40)的编码基因的表达载体pcDNA3.1(+)中，以获得表达抗TIGIT重链抗体(1G3、6F6、5H2)的质粒。
抗TIGIT的重链抗体1G3氨基酸序列如下(SEQ ID NO：7)，其中连接肽以粗体加下划线表示，恒定区Fc以斜体表示。
抗TIGIT的重链抗体6F6氨基酸序列如下(SEQ ID NO：2)，其中连接肽以粗体加下划线表示，恒定区Fc以斜体表示。
抗TIGIT的重链抗体5H2氨基酸序列如下(SEQ ID NO：10)，其中连接肽以粗体加下划线表示，恒定区Fc以斜体表示。
实施例3：抗TIGIT抗体的人源化和表达纯化
通过比对IMGT人类抗体重链可变区种系基因数据库(http：//www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)，分别挑选与实施例2中筛选的单域抗体1G3、6F6和5H2同源性高的重链可变区种系基因作为模板，将单域抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CR3-FR4的可变区序列。根据需要，将FR区中关键氨基酸回复突变为纳米抗体(VHH抗体)对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，即得到人源化抗TIGIT VHH抗体。其中CDR区氨基酸残基的确定由IMGT编号系统确定并注释。
抗体1G3人源化重链模板为IGHJ4*01，经人源化后得到人源化抗体1G3-H1，人源化可变区序列如下：
表1列出所述序列，并列出了相应的回复突变位点。
抗体6F6人源化重链模板为IGHV3-48*01，经人源化后得到人源化抗体6F6-H1，人源化可变区序列如下：
表2列出所述序列，并列出了相应的回复突变位点。
抗体5H2人源化重链模板为IGHV3-23*01，经人源化后得到人源化抗体5H2-H1V2，人源化可变区序列如下：
表3列出所述序列，并列出了相应的回复突变位点。
将编码1G3-H1-VH、6F6-H1-VH、5H2-H1V2-VH加EPKSS连接肽的核酸分别插入含有人IgG1重链恒定区Fc序列的编码基因的表达载体pcDNA3.1(+)中，以获得表达抗 TIGIT全长人源化重链抗体(1G3-H1、6F6-H1、5H2-H1V2)的质粒。依据制造商产品手册说明，使用ExpiCHO TM表达系统(ThermoFisher，货号A29133)
将实施例2和3上文获得的编码1G3；6F6；5H2；1G3-H1；6F6-H1；5H2-H1V2的质粒转染ExpiCHO-S细胞以表达TIGIT抗体。转染后培养细胞10-12天，当细胞存活率下降到60％至70％时，收集上清液，使用MabSelect Sure蛋白A亲和层析系统(GE healthcare)纯化表达在上清液中的抗体，获得抗TIGIT重链抗体的同源二聚体重链抗体。浓缩纯化的抗体，无菌过滤，通过SDS-PAGE和分子排阻检测抗体蛋白的纯度大于95％，结果表明抗体的纯度符合要求，可以用于下一步实验。
对照抗体Tiragolumab的序列来自于专利WO2017053748A2，由通用生物系统(安徽)有限公司进行密码子优化和基因合成并克隆到表达载体pcDNA3.1(+)中。之后应用上述表达和纯化技术获得该对照抗体，在本文中后文称为Tiragolumab analog。
实施例4：抗人TIGIT的重链抗体与人TIGIT蛋白、食蟹猴TIGIT蛋白的亲和力实验
在本实验中，根据厂商说明，利用ForteBio Octet RED96e检测了抗体与人TIGIT-his(ACRO，货号TIT-H52H3)、食蟹猴TIGIT蛋白(ACRO，货号TIT-C5223)的结合亲和力。
简要地，将AHC传感器(ForteBio，货号18-5060)放进Running Buffer(1X PBS Hyclone，货号SH30256.01，包含0.02％Tween20，pH7.0)，在室温条件下进行预平衡10min。在96孔板中，动力学实验方法按照以下步骤进行：a)用Running Buffer平衡基线100s，b)加入用Running Buffer稀释的抗人TIGIT的重链抗体，终浓度5μg/mL，固化200s，c)用Running buffer平衡基线300s，d)向各孔中加入用Running Buffer稀释的100nM人TIGIT蛋白和食蟹猴TIGIT蛋白，结合200s，解离600s。实验数据使用Fortebio Data Ahalysis软件1∶1结合模型进行拟合并计算。
表4总结了本发明的抗人TIGIT的重链抗体与人TIGIT蛋白、食蟹猴TIGIT蛋白的结合亲和力
表4
表4表明本申请构建的抗人TIGIT的重链抗体可以特异地结合人TIGIT蛋白和食蟹猴TIGIT蛋白并具有较高的结合活性。
实施例5：ELISA方法检测抗人TIGIT的重链抗体抑制人TIGIT蛋白与CD155结合
将0.5μg/mL的人TIGIT(M22-P141)-Fc蛋白(SEQ ID NO：45)以50μL/孔包被在96孔板上，4℃孵育过夜。用封闭缓冲液(含有1％BSA的PBS溶液)将板在37℃孵育，封闭1h。封闭后，用PBST溶液(含有0.05％吐温20的PBS溶液)将板洗涤三次。用稀释液梯度稀释抗TIGIT抗体(起始终浓度为14nM，3倍稀释，7个浓度点)，并以1∶1的体积比与1.1μg/mL(混合前浓度)CD155-mFc(ACRO，货号CD5-H5254)混合，加入板中，在37℃孵育1h。孵育结束后用PBST溶液洗板。用稀释液稀释二抗(辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG，Fcγ，Jackson Immuno Research，货号115-035-164)，加入板中在37℃孵育1h，孵育结束后再次清洗，TMB显色15分钟，之后用1M H 2SO 4终止，之后于酶标仪中读取OD450m-OD620nm的吸光值，结果见图1。
结果显示抗人TIGIT的重链抗体能够阻断人TIGIT蛋白与CD155结合，并且人源化TIGIT抗体阻断活性比阳性对照抗体Tiragolumab analog(来自于专利WO2017053748A2，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51)更强。
实施例6：抗TIGIT重链抗体与人、猴TIGIT细胞的结合活性
(1)通过细胞结合实验来判断本发明中的抗TIGIT重链抗体能否与稳定表达在HEK293细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号GNHu 43)上的人TIGIT蛋白结合。
本实验采用流式细胞术进行测定。首先采用Lipofectamine TM 2000(Invitrogen，货号11668019)转染试剂，根据厂商说明，将编码人的TIGIT全长蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO：46)的核苷酸构建到真核表达载体，然后转染到HEK293胞中，转染后48小时用0.3μg/mL嘌呤霉素(Puromycin Dihydrochloride，Gibco，货号A1113802)筛选3～5天，得到了高表达人TIGIT蛋白的细胞(即HEK293/人TIGIT细胞)。消化离心收集HEK293/人 TIGIT细胞，PBS重悬细胞后接种至96孔板(Corning，货号3799)，每孔1×10 5个细胞，96孔板离心后弃上清，将100μL梯度稀释的待测抗体(实施例3制备的1G3、6F6、5H2、1G3-H1、6F6-H1重链抗体，最高浓度为150nM，4倍稀释，总共8个浓度点)加入到HEK293/人TIGIT细胞中，4℃孵育30分钟后离心(1000rpm，5分钟)弃上清。每孔加入100μLPBS将细胞洗两遍后再加入100μl 1∶200稀释的荧光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG，FcγFragment Specific(Jackson ImmunoResearch，货号109-116-098)，4℃孵育30分钟。用PBS将细胞洗两遍后每孔加入100μL PBS重悬细胞，最后用Cytoflex(Beckman)流式细胞仪检测荧光信号。采用上文制备的Tiragolumab analog作为阳性对照。
从图2所示的结果可知，测试的TIGIT重链抗体都能和HEK293/人TIGIT细胞结合，EC50在0.6386nM-0.7873nM，并且结合活性比阳性对照Tiragolumab更强(EC50为1.605nM)。
(2)通过细胞结合实验来判断本发明中的抗TIGIT重链抗体能否与稳定表达在HEK293细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号GNHu 43)表面的食蟹猴TIGIT蛋白结合。首先采用Lipofectamine TM 2000(Invitrogen，货号11668019)转染试剂，根据厂商说明，将编码食蟹猴的TIGIT蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO：48)的核苷酸构建到真核表达载体上，然后转染到HEK293细胞中，转染后48小时用0.3μg/mL嘌呤霉素(Puromycin Dihydrochloride，Gibco，货号A1113802)筛选3～5天，得到了高表达食蟹猴TIGIT蛋白的细胞。流式细胞术参见上文，将梯度稀释的待测抗体(实施例3制备的1G3、6F6、5H2、1G3-H1、6F6-H1重链抗体，初始浓度为150nM，4倍稀释，8个点)加入到细胞中，4℃孵育30分钟。用PBS将细胞洗两遍后加入荧光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG，FcγFragment Specific，4℃孵育30分钟。用PBS将细胞洗两遍后重悬细胞，最后用Cytoflex(Beckman)流式细胞仪检测荧光信号。采用Tiragolumab analog作为阳性对照。
从图3所示的结果可知，测试的TIGIT重链抗体可以与HEK293细胞上表达的食蟹猴TIGIT蛋白结合，并且结合活性比阳性对照Tiragolumab更强。
实施例7：抗人TIGIT的重链抗体激活原代T细胞活性
为了检测抗TIGIT抗体激活T细胞释放细胞因子的活性，我们建立了原代T细胞激活试验系统，以CHO-K1/OKT3/CD155细胞为靶细胞，人外周血单核细胞PBMCs(上海儒百生物科技有限公司)中分离的CD8+T为效应细胞。
CHO-K1/OKT3/CD155靶细胞构建：采用Lipofectamine TM 2000(Invitrogen，货号11668019)转染试剂，根据厂商说明，将编码人CD155蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO：49)的核苷酸构建到真核表达载体上，然后转染到CHO-K1细胞(ATCC，货号CCL-61)中，转染后48小时用4μg/mL嘌呤霉素(Puromycin Dihydrochloride，Gibco，货号A1113802)筛选3～5天，得到了稳定表达CD155蛋白的CHO-K1/CD155稳定细胞株。再将编码人OKT3蛋白的核苷酸(氨基酸序列SEQ ID NO：53)构建到真核表达载体上，采用相同方法转染到已构建的CHO-K1/CD155稳定细胞株上，转染后48小时用500μg/mL G418(Gibco，货号10131027)筛选10～14天，得到了高表达人OKT3蛋白的CHO-K1/CD155稳定细胞株(CHO-K1/OKT3/CD155细胞)。
复苏PBMC细胞，参考美天旎细胞分选试剂盒说明书分离CD8+T细胞(Miltenyi Biotec，货号130-096-495)，用含10％FBS(Gibco，货号10099-141C)的1640完全培养基(Gibco，货号22400-071)重悬后，调整细胞密度至1E6/mL，按每孔100μL(即每孔100,000个细胞)铺到96孔板(Corning，货号3599)中。
胰蛋白酶消化培养的靶细胞CHO-K1/OKT3/CD155，1000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用含10％FBS(Gibco，货号10099-141)的1640完全培养基(Gibco，货号22400-071)重悬，调整靶细胞密度至1×105/ml，按每孔50μL(即每孔5,000个细胞)铺到96孔板(Corning，货号3599)中。准备4倍于最终检测浓度的实施例3制备的待测抗体6F6-H1和对照抗体Tiragolumab analog，待测抗体最终检测浓度为50nM和5nM，每孔50μL加到96孔板中，然后在放细胞培养箱继续孵育72h。孵育结束后，取出实验板，2000rpm离心3min使所有细胞沉到板底，小心吸取100μL上清至新的96孔板，检测上清中的人IFNγ(Cisbio，货号62HIFNGPEH)因子水平。结果见图4，表明抗TIGIT抗体能够激活CD8+T细胞释放细胞因子。
实施例8：抗人TIGIT重链序列优化及Fc改造
以6F6-H1序列为模板，PCR扩增VHH序列并连接至IgG1-Fc恒定区N端，同时对该Fc区域进行以下位点突变：S239D、A330L、I332E(根据EU编号)，最终构建的载体经真核细胞表达得到抗体6F6-DLE(制备方法如实施例3)，其氨基酸序列如SEC ID NO：20所示。经在线工具Abysis(http：//www.abysis.org/abysis/)分析可知6F6-H1序列CDR2区的D63位天冬酰胺易发生酰胺位点变化，为消除脱酰胺作用影响，进行D63S(根据IMGT编码)突变，将6F6(D63S)的可变区序列按照前述方法构建至IgG1-Fc恒定区的N端，该Fc区域同时含有突变位点S239D、A330L、I332E(根据Kabat编码)，形成的载体经真核细胞表达，得到抗体6F6-DS-DLE，其氨基酸序列为SEC ID NO：22。
应用实施例3中的方法表达上述优化后抗体。
实施例9：序列优化及Fc改造后的TIGIT重链抗体与人TIGIT蛋白、食蟹猴TIGIT 蛋白的亲和力实验
在本实验中，根据厂商说明，利用ForteBio Octet RED96e检测了抗体与人TIGIT-his(ACRO，货号TIT-H52H3)、食蟹猴TIGIT蛋白(ACRO，货号TIT-C5223)的结合亲和力。
简要地，将AHC传感器(ForteBio，货号18-5060)放进Running Buffer(1 X PBS Hyclone，货号SH30256.01，包含0.02％Tween20，pH7.0)，在室温条件下进行预平衡10min。在96孔板中，动力学实验方法按照以下步骤进行：a)用Running Buffer平衡基线180s，b)加入用Running Buffer稀释的抗人TIGIT的重链抗体(6F6-DS-DLE、6F6DLE和6F6-H1)，终浓度5μg/mL，固化200s，c)用Running buffer平衡基线300s，d)向各孔中加入用Running Buffer稀释的100nM人TIGIT蛋白和食蟹猴TIGIT蛋白，结合200s，解离600s。实验数据使用Fortebio Data Analysis软件1∶1结合模型进行拟合并计算。
表5总结了序列优化及Fc改造后的抗人TIGIT的重链抗体与人TIGIT蛋白、食蟹猴TIGIT蛋白的结合亲和力
表5
表5表明本申请构建的PTM修饰及Fc改造后的抗人TIGIT的VHH抗体可以特异地结合人TIGIT蛋白和食蟹猴TIGIT蛋白，并且活性与改造前无明显差异。
实施例10：序列优化及Fc改造后的TIGIT重链抗体抑制人TIGIT蛋白与CD155结合 的ELISA方法
将0.5μg/mL的人TIGIT(M22-P141)-Fc(SEQ ID NO：45)以50μL/孔包被在96孔板上，4℃孵育过夜。用封闭缓冲液(含有1％BSA的PBS溶液)将板在37℃孵育，封闭1h。封闭后，用PBST溶液(含有0.05％吐温20的PBS溶液)将板洗涤三次。用稀释液梯度稀释抗TIGIT抗体(起始浓度为14nM，3倍梯度稀释)，并以1∶1的体积比与1.1μg/mL(混合前浓度)CD155-mFc(ACRO，货号CD5-H5254)混合，加入板中，在37℃孵育1h。孵育结束后用PBST溶液洗板。用稀释液稀释二抗(辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG，Fcγ，Jackson Immuno Research，货号115-035-164)，加入板中在37℃孵育1h，孵育结束后再次清洗，TMB显色15分钟，之后用1M H 2SO 4终止，之后于酶标仪中读取OD450nm-OD620nm的吸光值，结果见图5。
结果显示PTM修饰及Fc改造后的抗人TIGIT的重链抗体能够阻断人TIGIT蛋白与CD155结合，并且阻断能力与改造前无明显差异。
实施例11：抗PD1/TIGIT双特异性抗体构建
本发明构建了如图6所示的两种结构的双特异性抗体，其中各个双特异性抗体的抗TIGIT抗体部分来源于上述人源化的6F6-H1抗体；抗PD1部分来源于专利WO2019219064A中的PD1抗体1B12，双特异性抗体恒定区分为IgG1和IgG4两种形式。这类双特异性抗体在本文中也称“抗PD1/TIGIT双特异性抗体”，在实施例中有时简称“双特异性抗体、双抗”。
本申请使用标准构建方法构建如图6所示结构的三种双抗D1、D4和E4，其中
双特异性抗体D1的重链(D1-H)从N端到C端的顺序为抗PD1抗体重链可变区VH、CH1恒定区、抗TIGIT抗体VHH以及IgG1 Fc恒定区，其氨基酸序列为SEQ ID NO：30；双特异性抗体D1的轻链(D1-L)从N端至C端顺序为抗PD1轻链抗体可变区VL和轻链恒定区CL，其氨基酸序列为SEC ID NO：39；
双特异性抗体D4的重链(D4-H)从N端到C端的顺序为抗PD1重链抗体可变区VH、CH1恒定区、抗TIGIT抗体VHH以及IgG4 Fc恒定区，其氨基酸序列为SEQ ID NO：32；双特异性抗体D4的轻链(D4-L)从N端至C端顺序为抗PD1抗体可变区VH和轻链恒定区CL，其氨基酸序列为SEC ID NO：39；
双特异性抗体E4的重链从N端到C端的顺序为抗PD1抗体可变区、CH1恒定区、IgG4 Fc恒定区以及抗TIGIT抗体VHH，其氨基酸序列为SEC ID NO：33；双特异性抗体E4轻链从N端至C端顺序为抗PD1抗体可变区和轻链恒定区CL，其氨基酸序列为SEC ID NO：39。
如下方法构建各个双特异性抗体表达载体：
D1-H：以专利申请公开号WO2019219064A中PD1抗体重链编码序列(SEQ ID NO：56，对应于WO2019219064A中的SEQ ID NO：23)为模板，扩增PD1重链可变区和恒定区CH1段的核苷酸序列；以6F6-H1为模板扩增TIGIT抗体可变区VHH的核苷酸序列，并采用重叠PCR技术将以上两段序列通过接头GGS拼接，并直接连接于含有人IgG1恒定区CH2-CH3的表达载体上，表达获得D1-H分子。
D1-L：以WO2019219064A中PD1抗体轻链编码的序列(SEQ ID NO：39，对应于WO2019219064A的SEQ ID NO：39)为模板，扩增PD1轻链可变区和恒定区CL段的核苷酸序列，并连接于表达载体上，表达获得D1-L分子。
D4-H以WO2019219064A中PD1抗体重链编码序列(SEQ ID NO：55，对应于WO2019219064A中的SEQ ID NO：24)为模板，扩增PD1重链可变区和恒定区CH1段的核苷酸序列；以6F6-H1为模板扩增TIGIT抗体可变区VHH的核苷酸序列，并采用重叠PCR技术将以上两段序列通过连接肽GGS拼接；以人IgG4重链为模板扩增CH2-CH3段恒定区序列，采用重叠PCR技术将以上两段序列连接至表达载体上(两段序列之间没有连接肽)，表达获得D4-H分子。
D4-L：以WO2019219064A中PD1抗体轻链编码的序列(SEQ ID NO：39，对应于WO2019219064A的SEQ ID NO：39)为模板，扩增PD1轻链可变区和恒定区CL段的核苷酸序列，并连接于表达载体上，表达获得D4-L分子。
E4-H：以专利申请公开号WO2019219064A中PD1抗体重链编码序列(SEQ ID NO：56，对应于WO2019219064A中的SEQ ID NO：23)为模板，扩增PD1重链可变区和恒定区的核苷酸序列；以6F6-H1为模板扩增TIGIT抗体可变区VHH的核苷酸序列，并采用重叠PCR技术将以上两段序列拼接，并直接连接于表达载体上，表达获得E4-H分子。
E4-L：以WO2019219064A中PD1抗体轻链编码的序列(SEQ ID NO：39，对应于WO2019219064A的SEQ ID NO：39)为模板，扩增PD1轻链可变区和恒定区CL段的核苷酸序列，并连接于表达载体上，表达获得E4-L分子。
将上述各组编码重链和轻链的表达载体分别转染到ExpiCHO-S细胞以表达双抗。转 染后培养细胞10-12天，当细胞存活率下降到60％至70％时，收集上清液，使用MabSelect Sure蛋白A亲和层析系统(GE healthcare)纯化表达在上清液中的抗体，获得D1、D4和E4双抗。浓缩纯化的双抗，无菌过滤，通过SDS-PAGE和分子排阻检测抗体蛋白的纯度大于95％，结果表明抗体的纯度符合要求，可以用于下一步实验。
实施例12：抗PD1/TIGIT双特异性抗体与人TIGIT蛋白结合活性实验
用ELISA的方法测定抗PD1/TIGIT双特异性抗体对人TIGIT蛋白的相对结合活性。
人TIGIT-his(ACRO，货号TIT-H52H3)用PBS(HyClone，货号SH30256.01)稀释至0.5μg/ml包被于96孔板，50μL/孔，4℃孵育过夜。通过在37℃与包含1％的BSA的PBS一起孵育1小时来封闭非特异性结合位点。封闭结束后，PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗板三次。用结合缓冲液(含0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)稀释实施例11制备的抗PD1/TIGIT双特异性抗体和Tiragolumab analog(对照)(起始浓度为1.5nM，3倍梯度稀释，7个浓度点)，并与已包被的蛋白在37℃孵育1小时。孵育结束后PBST洗板三次，将过氧化物酶标记的羊抗人Fc二抗(Jackson Immuno Research，109-035-098)用结合缓冲液稀释至1：25000，37℃孵育1小时，再次洗涤，TMB显色15分钟后用1M H2SO4终止。
测定了在450nm-620nm的吸光度，抗PD1/TIGIT双特异性抗体与人TIGIT蛋白的结合曲线见图7。
结果表明所有抗PD1/TIGIT双特异性抗体与人类TIGIT蛋白均有结合，其中D1与对照活性相当。
实施例13：抗PD1/TIGIT双特异性抗体与人PD1蛋白结合活性实验
用ELISA的方法测定抗PD1/TIGIT双特异性抗体对人类PD1蛋白的相对结合活性。
人PD1-his蛋白(Sino，货号10377-H08H-100)用PBS(HyClone，SH30256.01)稀释至0.2μg/ml，包被于96孔板，50μl/孔，4℃孵育过夜。通过在37℃与包含1％的BSA的PBS一起孵育1小时来封闭非特异性结合位点。封闭结束后，PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗板三次。用结合缓冲液(含0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)稀释实施例11制备的抗PD1/TIGIT双特异性抗体和1B12PD1(IgG1mut)(对照)(WO2019219064A的1B12PD1的IgG1突变体，序列为SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：58)(起始浓度为1.5nM，3倍梯度稀释，7个浓度点)，并与已包被的蛋白在37℃孵育1小时。孵育结束后PBST洗板三次，将过氧化物酶标记的羊抗人Fc二抗(Jackson Immuno Research，109-035-098)用结合缓冲液稀释至1：25000，37℃孵育1小时，再次洗涤，TMB显色15分钟后用1M H2SO4终止。
测定了在450nm-620nm的吸光度，抗PD1/TIGIT双特异性抗体与人PD1的结合曲线见图8。
结果表明所有抗PD1/TIGIT双特异性抗体与人类PD1蛋白均有结合，其中D1与对照活性相当。
实施例14：抗PD1/TIGIT双特异性抗体抑制人TIGIT蛋白与CD155蛋白结合活性
将0.5μg/mL的人TIGIT-人IgG1 Fc蛋白(SEQ ID NO.45)以50μL/孔包被在96孔板上，4℃孵育过夜。用封闭缓冲液(含有1％BSA的PBS溶液)将板在37℃孵育，封闭1h。封闭后，用PBST溶液(含有0.05％吐温20的PBS溶液)将板洗涤三次。用稀释液梯度稀释抗PD1/TIGIT双特异性抗体、对照Tiragolumab ahalog和1B12PD1(IgG1mut)(起始浓度为28nM，3倍梯度稀释，7个浓度点)，并分别与CD155(ACRO，货号CD5-H5254)混合，加入板中，在37℃孵育1h。孵育结束后用PBST溶液洗板。用稀释液稀释二抗(辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG，Fcγ，Jackson Immuno Research，货号115-035-164)，加入板中在37℃孵育1h，孵育结束后再次清洗，TMB显色15分钟，之后用1M H 2SO 4终止，之后于酶标仪中读取OD450nm-OD620nm的吸光值，结果见图9。采用Tiragolumab analog作为阳性对照，PD1单抗1B12PD1(IgG1mut)作为阴性对照。
结果显示D1、D4和E4均可阻断TIGIT蛋白与CD155蛋白结合，D1和D4阻断能力比阳性对照样品更好。
实施例15：抗PD1/TIGIT双特异性抗体阻断人类PD1与PD-L1相互作用
为了评估抗PD1/TIGIT双特异性抗体阻断人类PD1蛋白与PD-L1结合的能力，用ELISA的方法测定抗PD1/TIGIT双特异性抗体对人类PD1蛋白的相对抑制活性。
人PD1(M1-V170)-人IgG1 Fc蛋白(SEQ ID NO：52)用PBS(HyClone，SH30256.01)稀释至0.5μg/ml包被于96孔板，50μl/孔，4℃孵育过夜。通过在37℃与包含1％的BSA的PBS一起孵育1小时来封闭非特异性结合位点。封闭结束后，PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗板三次。用结合缓冲液(含0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)稀释抗PD1/TIGIT双特异性抗体(其浓度为22.5nM，3倍梯度稀释，7浓度点)，分别与稀释成0.8μg/ml的PD-L1蛋白(Sino，货号10084-H05H)按1∶1混合后与已包被的蛋白在37℃孵育1小时。采用PD1单抗1B12PD1(IgG1mut)作为阳性对照，IgG(SinoBiological货号HG1K)为阴性对照。孵育结束后PBST洗板三次，将过氧化物酶标记的羊抗小鼠Fc二抗(Jackson Immuno Research，115-035-164)用结合缓冲液稀释至1：10000，37℃孵育1小时，再次洗涤，TMB显色15分钟后用1M H2SO4终止。
测定了在450nm-620nm的吸光度，抗人类PD1/TIGIT双特异性抗体PD1的抑制曲线，见图10。
结果表明所有抗PD1/TIGIT双特异性抗体均能阻断人类PD1蛋白与PD-L1的相互作用，并且所有抗体抑制活性与对照相当。
实施例16：抗PD1/TIGIT双特异性抗体与人TIGIT、人PD1细胞结合活性
(1)通过细胞结合实验来判断抗PD1/TIGIT双特异性抗体能否与稳定表达在HEK293细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号GNHu 43)上的人TIGIT蛋白结合。实验过程和方法如实施例6(1)，采用Tiragolumab ahalog作为阳性对照，PD1单抗1B12PD1(IgG1 mut)作为阴性对照。
从图11所示的结果可知，测试的PD1/TIGIT双特异性抗体都能和HEK293/人TIGIT 细胞结合。
(2)通过细胞结合实验来判断抗PD1/TIGIT双特异性抗体能否与稳定表达在Jurkat/NFAT-Luc细胞(稳定表达NFAT-Luc报告基因元件的Jurkat细胞，构建方法参见WO2019219064A)表面的人PD1蛋白结合。实验过程和方法如实施例6(1)，采用PD1单抗1B12PD1(IgG1 mut)作为阳性对照，Tiragolumab analog作为阴性对照。
从图12所示的结果可知，测试的PD1/TIGIT双特异性抗体可以与Jurkat/NFAT-Luc/hPD1细胞结合。
实施例17：抗PD1/TIGIT双特异性抗体对激活后CD4+T和CD8+T细胞的ADCC杀 伤活性
为了检测抗PD1/TIGIT IgG1亚型的双特异性抗体是否介导NK细胞杀伤激活后的CD4+T和CD8+T细胞的活性，我们建立了原代NK细胞依赖的细胞毒性试验系统，分别以激活后的CD4+T和CD8+T为靶细胞，人外周血单核细胞PBMCs为效应细胞。
靶细胞准备：用预冷的PBS配制含1μg/mL OKT3(Invitrogen，货号16-0037-85)和1μg/mL anti-CD28(Biolegend，货号302934)的包板悬液，取5mL加入至10cm细胞培养皿中，4度孵育过夜。第二天，弃去包板液，用预冷的PBS洗涤一次备用。复苏PBMC细胞，参考美天旎细胞分选试剂盒说明书分别分离CD4+T(Miltenyi Biotec，货号130-096-533)或者CD8+T细胞(Miltenyi Biotec，货号130-096-495)，用含10％FBS(Gibco，货号10099-141C)的1640完全培养基(Gibco，货号22400-071)将CD4+T细胞或CD8+T细胞重悬后，调整细胞密度至5E5/mL，然后加入包被好的10cm细胞培养皿中，放入细胞培养箱培养72小时。
复苏PBMC细胞，用含10％FBS的1640完全培养基调整细胞密度至1～2E6/mL，加入IL2(江苏金丝利药业有限公司)激活过夜(体系中终浓度为100IU/mL)，作为效应细胞悬液。
第二天上午分别离心收集激活后的CD4+T和CD8+T靶细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用含1％FBS(Gibco，货号10099-141)的MEM-α测试缓冲液(Gibco，货号41061-029)调整靶细胞密度至2×10 5/ml，按每孔50μL(即每孔10,000个细胞)铺到96孔板(Corning，货号3599)中。准备4×最终检测浓度的待测抗体D1和对照Tiragolumab analog，抗体最高检测浓度为50nM，进行5倍梯度系列稀释共获得8个浓度点，每孔加入50μL。
实验同时设置靶细胞最大杀伤(靶细胞中加2％Triton100裂解液)、最小杀伤(靶细胞中加测试缓冲液)及自然杀伤(靶细胞中仅加效应细胞悬液)对照。
PBMC效应细胞悬液中含有200IU/mL IL2(江苏金丝利药业有限公司)。在上述各个包含靶细胞的孔中，最后加入100μL的含IL2的PBMC效应细胞悬液，使得最终细胞密度至1×10 6/mL(效应细胞E∶靶细胞T＝10∶1)，然后在细胞培养箱继续孵育24h。孵育结束后，取出实验板，2000rpm离心3min使所有细胞沉到板底，小心吸取50μL上清至新的96孔板，加入50μLLDH检测液(Roche，货号11644793001)室温孵育，颜色变化时在F50酶标仪上读板，检测波长为OD492nm，背景波长为OD650m。结果见图13，表明D1不能特异性诱导NK细胞杀伤激活后的CD4+T和CD8+T细胞，和Tiragolumab analog ADCC杀伤活性相当，提示D1结构安全性较好。
实施例18：抗PD1/TIGIT双特异性抗体在大鼠中的药代动力学
在大鼠模型中评价D1、D4与E4的药代动力学特征。
在本研究中，D1、D4与E4分别以10mg/kg的剂量静脉注射到大鼠(澎立生物医药技术)体内，在0～336h(0～14day)的不同时间点(给药前，给药后10min，30min，1h，4h，8h，24h，48h，7day，10day，14day)采集血样。所有样品处理成血浆，在-70～-86℃冰冻保存直至分析。
人TIGIT-his(ACRO，货号TIT-H52H3)蛋白用PBS(Biosharp，货号BL302A)稀释至0.3μg/mL，50μL/孔加入酶标板中(Costar，货号42592)4℃孵育过夜。然后用含1％牛血清白蛋白(上海生工，货号：A500023-0025g)的PBS溶液中在37℃孵育1小时。封闭结束后，用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)清洗3次。
D1、D4或E4在含血清的稀释缓冲液(含0.05％吐温-20、0.5％牛血清白蛋白、2％v/v大鼠血清)中稀释，起始浓度为50n扣L，2倍倍比稀释6个浓度点，共7个浓度点的抗体溶液为标准曲线。
同时用含血清的稀释缓冲液稀释D1、D4或E4至浓度分别为30ng/mL、6ng/mL和1.5ng/mL，作为高、中、低质控。所有大鼠血清均用空白混合大鼠血清和稀释缓冲液(含0.05％吐温-20和0.5％牛血清白蛋白的PBS)稀释，使抗体最终浓度保持在30～1.5ng/mL。
将标准曲线、质控和血浆样品加入酶标板中，37℃孵育1h。
然后用PBST洗涤3次，将山羊抗人IgG Fc特异性抗体(Jackson ImmunoReasearch，货号109-035-098)在稀释缓冲液中稀释40000倍或20000倍，加入酶标板中37℃孵育1h，然后用PBST再次洗涤。在酶标板中加入50μL/孔TMB(Thermo，货号34029)，13分钟后，用1M H2SO4终止反应，测定450～620nm的吸光度。并通过软件计算药代动力学参数，列于表6、表7和表8中。
人PD1-mFc蛋白(Sino，货号10377-H05H)用PBS(Biosharp，货号：BL302A)稀释至0.2μg/mL，50μL/孔加入酶标板中(Costar，货号42592)4℃孵育过夜。然后用含1％牛血清白蛋白(上海生工，货号：A500023-0025g)的PBS溶液中在37℃孵育1小时。封闭结束后，用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)清洗3次。D1、D4和E4在含血清的稀释缓冲液(含0.05％吐温-20、0.5％牛血清白蛋白、2％v/v大鼠血清)稀释，起始浓度为50ng/mL，2倍倍比稀释6个浓度点，共7个浓度点的抗体溶液为标准曲线。
同时用含血清的稀释缓冲液稀释D1、D4或E4至浓度分别为30ng/mL、6ng/mL和1.5ng/mL，作为高、中、低质控。所有大鼠血清均用空白混合大鼠血清和稀释缓冲液(含0.05％吐温-20和0.5％牛血清白蛋白的PBS)稀释，使最终浓度保持在30～1.5ng/mL。
将标准曲线、质控和血浆样品加入酶标板中，37℃孵育1h。然后用PBST洗涤3次，将驴抗人IgG重轻链特异性抗体(Jackson ImmunoReasearch，货号709-035-149)在稀释缓冲液中稀释10000倍，加入酶标板中37℃孵育1h，然后用PBST再次洗涤。在酶标板中加入50μL/孔TMB(Thermo，货号34029)，13分钟后，用1M H2SO4终止反应，测定450～620nm的吸光度。并通过软件计算药代动力学参数，列于表9、表10和表11中。
表6 D1 TIGIT药代动力学特性汇总
表7 D4 TIGIT药代动力学特性汇总
表8 E4 TIGIT药代动力学特性汇总
表9 D1 PD-1药代动力学特性汇总
表10 D4 PD-1药代动力学特性汇总
表11 E4 PD-1药代动力学特性汇总
上述药代动力学实验表明，本发明的抗体在大鼠机体内具有一般抗体的药代动力学特征，稳定性和成药性好，适于成药。
实施例19：构建TIGIT/CTLA4双特异性抗体
本发明构建了如图14所示的三种结构的TIGIT/CTLA4双特异性抗体，其中各个双特异性抗体的抗TIGIT抗体可变区部分来源于6F6-D63S，抗CTLA4抗体可变区部分来源于伊匹单抗(Ipilimumab)。双特异性抗体恒定区为IgG1(DLE)形式。
本申请使用标准构建方法构建如图示14结构的三种双抗THC4、CT1KH、CT2KH，其中双特异性抗体THC4的重链(命名为HTC)从N端到C端的顺序为抗TIGIT抗体重链可变区VHH、抗CTLA4抗体重链可变区VH、IgG1恒定区CH1以及IgG1 Fc恒定区，其中Fc恒定区进行(S239D、A330L、I332E)简称“DLE”的突变(参考文献“Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.Proc Natl Acad Sci USA.2006 Mar 14；103(11)：4005-10.”)，重链HTC氨基酸序列为SEC ID NO：69。双特异性抗体THC4的轻链(命名为ipilimumab LC)从N端至C端顺序为抗CTLA4抗体轻链抗体可变区VL和轻链恒定区CL，其氨基酸序列为SEC ID NO：68。
双特异性抗体CT1KH的重链1(命名为CK)从N端到C端的顺序为抗CTLA4抗体重链可变区VH、IgG1恒定区CH1以及IgG1 Fc恒定区，其中Fc恒定区进行点突变(S239D、A330L、I332E、T366W、S354C)形成ADCC增强型的IgG1“knob”链(参考文献“Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.Proc Nat1Acad Sci USA.2006 Mar 14；103(11)：4005-10.”和Merchant，A.M.，et al.(1998).″An efficient route to human bispecific IgG.″Nat Biotechnol 16(7)：677-681.“Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function”)，重链CK的氨基酸序列为SEQ ID NO：71；双特异性抗体CT1KH的重链2(命名为TH)从N端到C端的顺序为抗TIGIT抗体的可变区VHH和恒定区IgG1Fc，其中恒定区IgG1 Fc区进行点突变(S239D、A330L、I332E、Y349C、T366S、L368A、Y407V)以形成ADCC增强型IgG1 Fc“hole”链(参考文献“Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.Proc Natl Acad Sci USA.2006Mar 14；103(11)：4005-10.”和Merchant，A.M.，et al.(1998).″An efficient route to human bispecific IgG.″Nat Biotechnol 16(7)：677-681.)，重链TH的氨基酸序列详见SEQ ID NO：72。双特异性抗体CT1KH的轻链(命名为ipilimumab LC)其氨基酸序列为SEQ ID NO：68。
双特异性抗体CT2KH的重链1(命名为CK)，详细氨基酸序列为SEQ ID NO：71；重链2(命名为2TH)，从N端到C端的顺序为抗TIGIT抗体的可变区VHH、接头(SEQ ID NO：73)、抗TIGIT抗体的可变区VHH、接头(SEQ ID NO：70)和恒定区IgG1Fc，其中恒定区Fc进行点突变(S239D、A330L、I332E、Y349C、T366S、L368A、Y407V)以形成ADCC增强型IgG1 Fc“hole”链(参考文献“Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.Proc Natl Acad Sci USA.2006Mar 14；103(11)：4005-10.”和Merchant，A.M.，et al.(1998).″An efficient route to human bispecific IgG.″Nat Biotechnol 16(7)：677-681.)，2TH氨基酸序列为SEQ ID NO：74。双特异性抗体CT2KH的轻链(命名为ipilimumab LC)其氨基酸序列为SEQ ID NO：68。
如下方法构建各个双特异性抗体表达载体：
HTC：以6F6-DS-DLE质粒为模板，扩增6F6-D63S VHH片段，以ipilimumab-HC为模板扩增ipilimumab VH-CH1，采用重叠PCR技术将以上两段序列通过接头GGS拼接，并重组于含Fc的(Fc包含S239D、A330L、I332E点突变)表达载体上，形成HTC完整重链表达载体。
CK：以ipilimumab-HC为模板，扩增ipilimumab VHCH1，以ipilimumab-H IgG1wt Rknob(该恒定区含有T366W、S354C点突变形成knob结构)为模板扩增IgG1 Fc恒定区，并将Fc恒定区进行“DLE”点突变(S239D、A330L、I332E)，将以上片段重组于表达载体上，形成重链CK表达载体。
TH和2TH表达载体为通用生物(安徽)股份有限公司基因合成得到。
实施例20：抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体的结合亲和力
在该实施例中，使用ForteBio Octet RED 96e(生物层干涉测量法)测定抗TIGIT//CTLA-4双特异性抗体与人TIGIT蛋白、人CTLA-4蛋白的结合亲和力(KD)。
简要地，将AHC(IgG Fc捕获)传感器尖端(ForteBio，货号18-5060)在室温下PBST(PBS，0.02％Tween20，pH7.0)中预平衡10分钟。动力学实验在96孔板中进行，按以下步骤进行：a)在PBST中平衡基线180秒，b)分别加载5ug/mL抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体(THC4、CT2KH和CT1KH)和对照单抗(6F6-H1和Ipilimumab)200s停止，c)平衡基线300秒，d)与带有His标签的人TIGIT(SEC ID NO：)或人CTLA-4(Sino Biological，货号11159-H08H)以浓度为100nM分别缔合200秒，和e)在PBST中解离600秒。使用Fortebio Data Analysis软件对数据集进行1∶1局部拟合模型拟合。
表12总结了抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体(THC4、CT2KH和CT1KH)和对照单抗(6F6-H1和Ipilimumab analog)与人TIGIT蛋白、人CTLA-4蛋白的结合亲和力。
表12
结果表明THC4、CT2KH、CT1KH均可与人TIGIT及CTLA-4特异性结合，并且与单抗相比TIGIT和CTLA4结合活性没有明显变化。
实施例21：抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体抑制人TIGIT蛋白与人CD155蛋白结合活性
高结合透明聚苯乙烯96孔板用在磷酸盐缓冲液PBS中的0.5μg/mL人TIGIT(M22-P141)-Fc(SEQ ID NO：45)以50μL/孔在4℃孵育过夜包被。然后使用PBST溶液(含有0.05％吐温20的PBS溶液)在自动洗板机上洗涤板一次。每孔加入200μL封闭缓冲液(含有1％BSA的PBS溶液)，37℃孵育1小时。用稀释缓冲液(PBS+0.5％牛血清白蛋白+0.05％吐温20)制备逐级稀释抗体(6F6-H1、THC4、CT2KH和CT1KH)和阴性对照抗体(Ipilimumab analog)(起始浓度：100nM(混合前浓度)，3倍稀释)并以1∶1的体积比与1.1μg/mL(混合前浓度)CD155-mFc((Acro Biosystem，货号CD5-H5254)混合，然后将混合稀释液加入96孔板中在37℃孵育1小时。在自动洗板机上用洗涤缓冲液PBST将板洗涤两次。然后将用稀释缓冲液稀释的HRP偶联山羊抗小鼠Fc抗体(Jackson Immuno Research，货号115-035-164)以50μL/孔加入板的每个孔中。之后，将ELISA板在37℃孵育1小时，然后使用洗涤缓冲液PBST在自动洗板机上洗涤板两次。最后，每孔加入50μL/孔的TMB，用1M H 2SO4终止反应。测定在450nm-620nm处的吸光度值，结果见图15。
结果显示6F6-H1、THC4、CT2KH和CT1KH可以阻断TIGIT与CD155的结合。且THC4、CT2KH和CT1KH阻断活性与6F6-H1相比无明显差异。
实施例22：抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体抑制人CTLA-4蛋白与人CD80蛋白结合活性
高结合透明聚苯乙烯96孔板用在磷酸盐缓冲液PBS中的2μg/mL人CTLA-4-his(Acro Biosystem，货号CT4-H5229)以50μL/孔在4℃孵育过夜包被。然后使用洗涤缓冲液PBST(含有0.05％吐温20的PBS溶液)在自动洗板机上洗涤板一次。每孔加入200μL封闭缓冲液(含有1％BSA的PBS溶液)，室温孵育1小时。用稀释缓冲液(PBS+0.5％牛血清白蛋白+0.05％吐温20)制备逐级稀释抗体(THC4、CT2KH和CT1KH、Ipilimumab analog)和阴性对照抗体(6F6-H1)(起始浓度：100nM(混合前浓度)，3倍稀释)并以1∶1的体积比与0.02μg/mL(混合前浓度)CD80-mFc(Acro Biosystem，货号B71-H52A4)混合，然后将混合稀释液加入96孔板中并在37℃孵育1小时。在自动洗板机上用洗涤缓冲液PBST将板洗涤两次。然后将用稀释缓冲液稀释的HRP偶联山羊抗小鼠Fc抗体(Jackson Immunoresearch，Cat#115-035-164)以50μL/孔加入板的每个孔中。之后，将96孔板在37℃孵育1小时，然后使用洗涤缓冲液PBST在自动洗板机上洗涤板两次。最后，每孔加入50μL/孔的TMB，用1M H 2SO4终止反应。测定在450nm-620nm处的吸光值，结果见图16。
结果显示Ipilimumab analog、THC4、CT2KH和CT1KH可以阻断CTLA-4和CD80的结合。
实施例23：抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体与人TIGIT细胞结合活性
通过细胞结合实验来判断抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体能否与稳定表达在HEK293细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号GNHu 43)上的人TIGIT蛋白结合。实验过程和方法如实施例6(1)，采用TIGIT单抗6F6-H1作为对照。
从图17所示的结果可知，测试的TIGIT/CTLA-4双特异性抗体THC4、CT2KH和CT1KH都能和HEK293/hTIGIT细胞结合。
序列信息：

Claims (35)

  1. 特异性结合TIGIT的VHH抗体，其包含
    SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)，
    优选地，所述CDR序列根据IMGT定义。
  2. 权利要求1的VHH抗体，其包含互补决定区域(CDR)VHH CDR1、VHH CDR2和VHH CDR3，其中
    (i)VHH CDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：4或23或57所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成；或
    (ii)VHH CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：4或23或57所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成；或
    (iii)VHH CDR1包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR2包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成，VHH CDR3包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或由其组成。
  3. 权利要求1的VHH抗体，其包含重链可变区或由其组成，所述重链可变区
    (i)包含与选自SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
    (ii)包含选自SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者
    (iii)包含与选自SEQ ID NO：1、6、9、14、16、18和21中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
  4. 特异性结合TIGIT的重链抗体，其包含权利要求1-3中任一项所述的VHH抗体。
  5. 权利要求4的重链抗体，其包含与抗体恒定区或Fc区连接的权利要求1-3中任一项所述的VHH抗体，优选地，所述抗体恒定区或Fc区来自人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4，任选地，所述VHH抗体与所述Fc区通过铰链区或其部分连接，优选地，所述铰链区部分的氨基酸序列为EPKSS(SEQ ID NO：43)。
  6. 权利要求4的重链抗体，其包含与抗体Fc区连接的权利要求1-3中任一项所述的VHH抗体，其中所述Fc区为来自人IgG1或IgG4的Fc区，优选地，所述Fc区
    (i)包含与SEQ ID NO：40或42中所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
    (ii)包含SEQ ID NO：40或42所示的氨基酸序列或由其组成；或者
    (iii)包含与SEQ ID NO：40或42所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列。
  7. 权利要求5或6的重链抗体，其中所述Fc区包含改善Fc区效应子功能的突变，例如提高ADCC的突变，优选地，所述突变为如下突变组合：S239D、A330L和I332E(EU编号)，优选地，其包含与SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，且包含如下突变组合：S239D、A330L和I332E(EU编号)。
  8. 权利要求4的重链抗体，其
    (i)包含与选自SEQ ID NO：2、7、10、15、17、19、20或22中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
    (ii)包含选自SEQ ID NO：2、7、10、15、17、19、20或22中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者
    (iii)包含与选自SEQ ID NO：2、7、10、15、17、19、20或22中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
  9. 权利要求权利要求1-3中任一项的VHH抗体，或权利要求4-8中任一项的重链抗体，其中所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
  10. 双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区特异性结合TIGIT，且包含权利要求1-3和9中任一项的VHH抗体，或权利要求4-9中任一项的重链抗体。
  11. 权利要求10的双特异性抗体，其中第二抗原结合区特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2或CTLA-4，优选地，所述第二抗原结合区特异性结合PD-1，其包含来自WO2019219064A的PD1抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段例如所述抗PD-1抗体的单链Fv、Fab、Fab′、(Fab)2、单域抗体、VHH或重链抗体；优选地，所述第二抗原结合区特异性结合CTLA-4，其包含来自Ipilimumab抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段例如所述抗CTLA-4抗体的单链Fv、Fab、Fab′、(Fab)2、单域抗体、VHH或重链抗体。
  12. 权利要求10或11的双特异性抗体，其中VHH抗体连接到第二抗原结合区Fc片段的C末端，或连接在第二抗原结合区重链VH片段的N末端，或者可以插入第二抗原结合区的Fab片段(Fab片段重链)和Fc片段之间，即与Fab片段重链的C末端和Fc片段的N末端连接，任选地，第一和第二抗原结合区通过接头连接，优选地，接头包含(GGS)n氨基酸序列，n＝1，2，3，4，或5的整数，优选n＝1。
  13. 权利要求12的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有以下结构：
    重链：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc-抗TIGIT VHH；或
    从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc；或
    从N端至C端，抗TIGIT VHH-第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
    轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL；
    优选地，所述第二抗原选自PD-1或CTLA-4。
  14. 权利要求10或11的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有以下结构：
    重链1：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
    重链2：1个或多个(例如2个)串联的抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc
    轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL；
    优选地，所述第二抗原选自PD-1或CTLA-4，例如CTLA-4。
  15. 权利要求14的双特异性抗体，其中所述抗TIGIT-VHH通过连接肽与重链恒定区Fc的N末端连接，例如所述连接肽是来自人IgG1、2、3或4的铰链区或其部分，包括天然或突变的铰链区或其部分，例如来自人IgG1铰链区，例如所述连接肽是EPKSS(SEQ ID NO：43)。
  16. 权利要求14或15的双特异性抗体，其中当重链2包含多个串联的抗TIGIT单域抗体VHH时，各个串联的VHH之间可以通过接头连接，优选地，接头包含(GGGGS)n氨基酸序列，n＝1，2，3，4，或5的整数，优选n＝1。
  17. 权利要求10-16中任一项的双特异性抗体，其中第二抗原抗体的重链恒定区CH1来自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；优选的，所述重链恒定区CH1来自IgG1或IgG4，更优选地，所述重链恒定区CH1包含SEQ ID NO：28或31所述的氨基酸序列或由其组成。
  18. 权利要求10-17中任一项的双特异性抗体，其中第二重链恒定区Fc如权利要求5-7中任一项所定义。
  19. 权利要求14的双特异性抗体，其中重链1的Fc区与重链2的Fc区不同。
  20. 权利要求19的双特异性抗体，其中重链1的Fc区与重链2的Fc区中分别引入结(knob)突变和扣(Hole)突变。
  21. 权利要求21的双特异性抗体，其中
    第一Fc区包含结突变，其
    (i)包含氨基酸序列SEQ ID NO：78或与其具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成；或
    (ii)包含与SEQ ID NO：78具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列且包含S239D、A330L和I332E突变和结突变(例如S354C和T366W)；且
    第二Fc区包含扣突变，其
    (i)包含氨基酸序列SEQ ID NO：77与其具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成；或
    (ii)包含与SEQ ID NO：77具有至少90％同一性，例如95％，96％，97％，99％或更高的同一性的氨基酸序列且包含S239D、A330L和I332E突变和扣突变。
  22. 权利要求13的双特异性抗体，其包含
    重链：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc-抗TIGIT VHH；且
    轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL，
    其中所述第二抗原为PD-1；
    其中重链
    (i)包含SEQ ID NO：30或33的氨基酸序列，或
    (ii)包含与所述SEQ ID NO：30、32或33所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
    (iii)由SEQ ID NO：30或33所述的氨基酸组成；
    和/或
    轻链
    (i)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列，或
    (ii)包含与所述SEQ ID NO：39所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
    (iii)由SEQ ID NO：39所述的氨基酸组成。
  23. 权利要求13的双特异性抗体，其包含
    重链：
    从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc
    轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL，
    其中所述第二抗原为PD-1；
    其中重链
    (i)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或
    (ii)包含与所述SEQ ID NO：32所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
    (iii)由SEQ ID NO：32所述的氨基酸组成；
    和/或
    轻链
    (i)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列，或
    (ii)包含与所述SEQ ID NO：39所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
    (iii)由SEQ ID NO：39所述的氨基酸组成。
  24. 权利要求13的双特异性抗体，其包含
    重链：从N端至C端，抗TIGIT VHH-第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
    轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL，
    其中第二抗原为CTLA-4，
    其中重链
    (i)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列，或
    (ii)包含与所述SEQ ID NO：69所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
    (iii)由SEQ ID NO：69所述的氨基酸组成；
    和/或
    轻链
    (i)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列，或
    (ii)包含与所述SEQ ID NO：68所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
    (iii)由SEQ ID NO：68所述的氨基酸组成。
  25. 权利要求14的双特异性抗体，其包含
    重链1：从N端至C端，第二抗原抗体的重链可变区VH-重链恒定区CH1-重链恒定区Fc；
    重链2：1个或多个(例如2个)串联的抗TIGIT VHH-重链恒定区Fc
    轻链：从N端至C端，第二抗原抗体的轻链可变区-轻链恒定区CL，
    其中重链1
    (i)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列，或
    (ii)包含与所述SEQ ID NO：71所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
    (iii)由SEQ ID NO：71所述的氨基酸组成；
    和/或
    重链2
    (i)包含SEQ ID NO：72或74的氨基酸序列，或
    (ii)包含与所述SEQ ID NO：72或74所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
    (iii)由SEQ ID NO：72或74所述的氨基酸组成；
    和/或
    轻链
    (i)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列，或
    (ii)包含与所述SEQ ID NO：68所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或
    (iii)由SEQ ID NO：68所述的氨基酸组成。
  26. 核酸分子，其编码权利要求1-3和9中任一项的VHH抗体，或权利要求4-9中任一项的重链抗体，或权利要求10-25中任一项的双特异性抗体中的重链和/或轻链，或由所述核酸序列组成。
  27. 表达载体，其包含权利要求26的核酸分子，优选地，所述表达载体为pCDNA，例如pCDNA3.1。
  28. 宿主细胞，其包含权利要求26所述的核酸分子或权利要求27所述的表达载体，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，例如293细胞或CHO细胞，例如293FT细胞或CHO-S细胞。
  29. 制备权利要求1-3和9中任一项的VHH抗体，或权利要求4-9中任一项的重链抗体，或权利要求10-25中任一项的双特异性抗体的方法，所述方法包括，在适合所述VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体的链表达的条件下，培养权利要求包含编码VHH抗体或重链抗体的核酸、或编码双特异性抗体的各条链的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述VHH抗体或重链抗体或双特异性抗体。
  30. 免疫缀合物，其包含权利要求1-3和9中任一项的VHH抗体，或权利要求4-9中任一项的重链抗体，或权利要求10-25中任一项的双特异性抗体。
  31. 药物组合物或药物或制剂，其包含权利要求1-3和9中任一项的VHH抗体，或权利要求4-9中任一项的重链抗体，或权利要求10-25中任一项的双特异性抗体，或权利要求30的免疫缀合物以及任选地药用辅料。
  32. 药物组合产品，其包含权利要求1-3和9中任一项的VHH抗体，或权利要求4-9中任一项的重链抗体，或权利要求10-25中任一项的双特异性抗体，或权利要求30的免疫缀合物，以及其它治疗剂。
  33. 在受试者中预防或治疗癌症的方法，包括向受试者施用有效量的权利要求1-3和9中任一项的VHH抗体，或权利要求4-9中任一项的重链抗体，或权利要求10-25中任一项的双特异性抗体，或权利要求30的免疫缀合物，或权利要求31的药物组合物或制剂；或权利要求32的药物组合产品。
  34. 权利要求33的方法，其中所述癌症是表征为具有升高的PD-1、PD-L1或PD-L2的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)和/或具有升高的TIGIT的的蛋白质水平和/或 核酸水平(例如表达升高)的癌症。
  35. 权利要求34的方法，其中所述方法还包括与其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用。
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