TWI754157B - 抗ｔｉｇｉｔ抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及特異性結合TIGIT的新型抗體和抗體片段以及含有所述抗體或抗體片段的組合物。此外，本發明涉及編碼所述抗體或其抗體片段的核酸及包含其的宿主細胞，以及相關用途。此外，本發明涉及這些抗體和抗體片段的治療和診斷用途。
Description
本發明涉及特異性結合TIGIT的新型抗體和抗體片段以及含有所述抗體或抗體片段的組合物。此外，本發明涉及編碼所述抗體或其抗體片段的核酸及包含其的宿主細胞，以及相關用途。此外，本發明涉及這些抗體和抗體片段的治療和診斷用途。
TIGIT(含Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體，也稱為WUCAM、Vstm3或Vsig9)最初是利用生物信息學比對的方法作為CD28家族成員之一被發現。TIGIT是一種表達於多種免疫細胞(自然殺傷細胞/激活的T細胞/記憶T細胞/調節性T細胞/濾泡性T輔助細胞等)膜表面的一種共抑制受體，為免疫球蛋白超家族成員之一。據認為，TIGIT分子可能藉由以下三種機制對免疫系統發揮調節作用：1)TIGIT與一種共刺激受體CD226競爭性結合表達於樹突狀細胞或癌細胞表面的共享配體CD155/CD112，向表達TIGIT的細胞傳遞抑制信號，抑制這類細胞的激活；2)TIGIT與共刺激受體CD226直接相互作用，破壞CD226的同源二聚化進而阻斷其向下游傳遞的激活信號；3)TIGIT與表達於樹突狀細胞的CD155結合後，胞內段ITIM序列傳導抑制信號進而表達免疫抑制細胞因子抑制免疫系統的激活。TIGIT可能在腫瘤微環境中的多種細胞中發揮作
用。這些細胞可能是腫瘤浸潤的CD8陽性T細胞，可能是調節性T細胞，也可能是NK細胞。總體來說，眾多研究都表明第一種機制可能是TIGIT發揮其免疫抑制性作用的最關鍵機制。
已經證實，結合人TIGIT的抗體可用於治療癌症。參見例如WO 2006/124667。在小鼠模型中，PD-L1和TIGIT二者的抗體阻斷可以導致協同提高CD8+ T細胞介導的腫瘤排斥。Grogan et al.(2014)J.Immunol.192(1)Suppl.203.15；Johnston et al.(2014)Cancer Cell 26：1-15。在黑色素瘤的動物模型中得到類似結果。Inozume et al.(2014)J.Invest.Dermatol.134：S121-Abstract 693。
鑒於TIGIT在免疫反應中的作用，TIGIT被認為是一個有吸引力的癌症免疫治療靶點。因此，本領域存在著開發新的TIGIT抗體的需求，尤其是靶向TIGIT的CD155/CD112阻斷型抗體，特別是人抗TIGIT抗體，及其組合療法，用於疾病治療，尤其是癌症治療。
本發明提供了抗TIGIT抗體及其編碼基因與應用。藉由基因工程手段和酵母表面展示技術，本發明人從展示在酵母表面的人抗體庫中篩選出抗人TIGIT的全人源抗體，在此基礎上進一步獲得經親和力成熟的高親和力抗人TIGIT抗體。本發明的全人源抗體分子能夠有效地阻斷TIGIT與其配體CD155的結合，減少或消除傳遞至細胞的抑制性信號，增加IL-2產生，並且在體內施用時抑制腫瘤生長，尤其是在與抗PD-1抗體聯用時，抑瘤效果尤為顯著。因此，本發明的抗體可以用於多種用途，包括但不限於增強免疫反應、抑制腫瘤生長、抗感染和檢測TIGIT蛋白。
本發明因此提供了一種新的結合人TIGIT的全人源抗體，以及其抗原結合片段。
在一些實施方案中，本發明的抗TIGIT抗體具有以下一個或多個特性：(i)以高親和力與人TIGIT結合；(ii)具有與猴和/或鼠TIGIT的交叉免疫反應性；(iii)與細胞表面的TIGIT有效結合；(iv)阻斷TIGIT與其配體CD155的結合；(v)解除CD155與TIGIT的結合對TIGIT下游IL-2信號通路的抑制作用；(vi)增加T細胞中的IL-2產生；(vii)具有抗腫瘤活性，例如抑制腫瘤的生長；(viii)與抗PD-1抗體組合具有更好的腫瘤抑制作用，例如能夠更好地抑制腫瘤生長。
在一些實施方案中，本發明提供了結合TIGIT的抗體或其抗原結合片段，包含：SEQ ID NO：84-103所示的重鏈可變區之一的HCDR1、2和3序列，和/或SEQ ID NO：1O4-110所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列，或所述CDR序列組合的變體。
在一些實施方案中，本發明也提供抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，所述抗體與本發明示例性抗體(如具有表B所列抗體VH和VL序列組合的抗體)結合相同或重疊的表位和/或競爭結合TIGIT、和/或抑制(例如，競爭性抑制)本發明示例性抗體。
在一些實施方案中，本發明提供了編碼本發明抗體或其抗原結合片段的核酸，包含所述核酸的載體，包含所述載體的宿主細胞。
在一些實施方案中，本發明提供了製備本發明抗體或其抗原結合片段的方法。
在一些實施方案中，本發明提供了包含本發明抗體的免疫綴合物、藥物組合物和組合產品。
本發明還提供了利用本發明抗體在個體中阻斷TIGIT與CD155的結合(例如，樹突細胞或癌細胞表面表達的CD155)的方法。在一些實施方案中，藉由所述方法，在表達TIGIT的細胞(尤其是T細胞、自然殺傷細胞)中降低或消除TIGIT介導的抑制信號傳導，刺激T細胞和NK細胞的激活。在一些實施方案中，藉由所述方法，增加T細胞中IL-2的產生。在一些實施方案中，藉由所述方法，在表達CD155的細胞(例如樹突細胞)中減少由CD155介導的抑制信號傳導，減少免疫抑制細胞因子的表達。在一些實施方案中，藉由所述方法，促進免疫系統的激活。因此，本發明也提供了利用本發明抗體預防或治療癌症或感染的方法。
本發明還涉及在樣品中檢測TIGIT的方法。
在下面的圖式和具體實施方案中進一步說明本發明。然而，這些圖式和具體實施方案不應被認為限制本發明的範圍，並且本領域技術人員容易想到的改變將包括在本發明的精神和所附申請專利範圍的保護範圍內。
第1A圖至第1F圖顯示了親和力成熟前後酵母表達的抗體對表達於CHO細胞表面的人TIGIT的結合。
第2圖顯示了CHO細胞表達的7個候選抗體對表達於CHO細胞表面的人TIGIT的結合。
第3A圖至第3F圖顯示了親和力成熟前後酵母表達的抗體對CD155的阻斷能力。
第4圖顯示了CHO細胞表達的7個候選抗體對CD155的阻斷能力。
第5A圖至第5E圖顯示了親和力成熟前後酵母表達的抗體的MOA生物學活性檢測
第6圖顯示了CHO細胞表達的7個候選抗體的MOA生物學活性檢測
第7圖顯示了候選分子ADI-30293和ADI-30278單獨給藥(10mg/kg)在人TIGIT敲入-MC38小鼠模型中的藥效學研究。
第8A圖及第B圖顯示了候選分子ADI-30293和ADI-30278與抗PD1抗體antibody C(WO2017133540A1)聯合給藥(10+1mg/kg)在人TIGIT敲入-MC38小鼠模型中的藥效學研究。
第9圖顯示了用於本發明實施例中的示例性人TIGIT序列。
定義
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本領域一般技術人員通常所理解的含義相同的含義。為了本發明的目的，下文定義了以下術語。
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
術語“和/或”應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或多項的組合。
如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
在本文中，術語“抗體”是指至少包含輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區的多肽，所述免疫球蛋白可變區特異性識別並結合抗原。該術語涵蓋各種抗體結構，包括、但不限於單株抗體、多株抗體、單鏈抗體或多鏈抗體、單特異性或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、全人源抗體或嵌合抗體或人源化抗體、全長抗體和抗體片段，只要它們呈現期望的抗原結合活性即可。
本領域技術人員明瞭，“全抗體”(在本文中可與“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”互換使用)包含至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。可變區是抗體的重鏈或輕鏈中參與抗體與其抗原結合的結構域。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。抗體的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列歸入兩種類型(稱為kappa(κ)和lambda(λ))
中的一種。抗體的重鏈可以取決於其重鏈恆定區的胺基酸序列而劃分為主要5種不同的類型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些類型中的幾種可以進一步劃分成亞類，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。對應於該5種不同抗體類型的重鏈恆定區分別稱作α、δ、ε、γ和μ。術語“同種型”是指由抗體重鏈恆定區確定的抗體類型。參見例如Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.編輯，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))(其為所有目的以其整體在此引作參考)。
術語抗體的“抗原結合部分”(在本文中可與“抗體片段”和“抗原結合片段”互換使用)，是指並非完整抗體的分子，其包含完整抗體中用於結合該完整抗體所結合的抗原的部分。如本領域技術人員理解的，抗體的抗原結合部分通常包含來自“互補決定區”或“CDR”的胺基酸殘基。可以藉由重組DNA技術、或藉由酶或化學切割完整的抗體製備抗原結合片段。抗原結合片段包括但不限於Fab、scFab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、單鏈Fv、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、微抗體(minibody)、單結構域抗體(sdAb)。關於抗體片段的更詳細的描述，可以參見：基礎免疫學(Fundamental Immunology),W.E.Paul編輯，Raven Press,N.Y.(1993)；邵榮光等人(編輯)，抗體藥物研究與應用，人民衛生出版社(2013)；Hollinger等人，PNAS USA 90：6444-6448(1993)；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。
術語“人抗體”或“全人源抗體”在本文中可以互換使用，指包括其中構架區和CDR區二者均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。而且，如果抗體含有恆定區，恆定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸序列(例
如，藉由體外隨機或點特異誘變或體內體細胞突變引入的突變)，例如在CDR--尤其在CDR3中。然而，如本文所使用的，術語“人抗體”不包括其中的CDR序列衍生自其他哺乳動物物種(如，小鼠)的種系而移植入人構架序列的抗體。
如本文所用，術語“重組人抗體”包括所有藉由重組方式製備、表達、產生或分離的人抗體，例如，(a)自用人免疫球蛋白基因進行轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤分離的抗體，(b)自轉化成表達人抗體的宿主細胞例如轉染瘤分離的抗體，(c)自重組、組合人抗體文庫例如酵母展示文庫分離的抗體，和(d)藉由包括剪接人免疫球蛋白基因至其他DNA序列的任意其他方式製備、表達、產生或分離的抗體。這些重組人抗體具有構架區和CDR區源自人種系免疫球蛋白序列的可變區。然而，在某些實施方案中，可以對重組人抗體進行體外誘變(或使用人Ig序列轉基因動物時為體內體細胞誘變)，由此得到的重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列，儘管源自人種系VH和VL序列並與之相關、但是並不天然存在於體內的人抗體種系庫中。
術語“嵌合抗體”是指可變區序列源自一物種、恆定區序列源自另一物種的抗體，例如，其中可變區序列源自小鼠抗體、恆定區序列源自人抗體的抗體。
術語“人源化抗體”是指將源自其他哺乳動物物種例如小鼠種系的CDR序列接到人構架序列上的抗體。可以在人構架序列內進行額外的構架區修飾。
“分離的”抗體是已經與它的天然環境中的組分分離的抗體。在一些實施方案中，將抗體純化至大於95%或99%純度，所述純度藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或色譜(例
如，離子交換或反相HPLC)確定。關於評價抗體純度的方法的綜述，參見，例如，Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
術語“表位”是指抗體所結合的抗原區域。表位可以由連續的胺基酸形成或者藉由蛋白的三級折疊而並置的非連續胺基酸形成。
在本文中，TIGIT是指"含Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體"。該表述也包括TIGIT的變體、同種型、同源物、和物種同源物。術語“人TIGIT”指的是人序列TIGIT。一個具體的人TIGIT序列示於SEQ ID NO：208中。在一些實施方案中，人TIGIT序列與SEQ ID NO：208的人TIGIT胺基酸序列具有至少95%，甚至至少96%,97%,98%，或99%胺基酸序列同一性。TIGIT蛋白也可包括TIGIT的片段，諸如包含胞外結構域的片段，例如保持與本發明任何抗體結合能力的片段。在本文中，CD155，也稱作PVR(脊髓灰質炎病毒受體)；PVS；HVED；CD155；NECL5；TAGE4；Necl-5，其與TIGIT相互作用誘導免疫抑制信號。
術語“特異性結合”表示抗體選擇性地或優先地結合抗原。如果在生物光干涉測量中，抗體以大約5x 10-7M或更低、大約1x 10-7M或更低、大約5x 10-8M或更低、大約1x 10-8M或更低、大約5x 10-9M或更低的KD，與人TIGIT結合，則該抗體是“與人TIGIT特異性結合”的抗體。然而，特異性結合人TIGIT的抗體可以與來自其它物種的TIGIT蛋白具有交叉反應性。例如，特異於人TIGIT的抗體，在一些實施方案中，可以與非人物種的TIGIT蛋白交叉反應。在另一些實施方案中，特異於人TIGIT的抗體可以完全特異於人TIGIT而不表現出物種或其它類型的交叉反應性，或僅表現出對某些物種的TIGIT的交叉反應性。
如本文所用的，術語“交叉反應”是指抗體結合來自不同物種的TIGIT的能力。例如，本文所述的結合人TIGIT的抗體還可結合來自其
它物種的TIGIT(例如，猴和/鼠TIGIT)。測定交叉反應性的方法包括實施例中所述的方法以及本領域已知的標準測定法，例如藉由使用生物光干涉，或流式細胞術技術。
“親和力”或“結合親和力”指反映結合對子的成員之間相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由平衡解離常數(KD)代表，平衡解離常數是解離速率常數和結合速率常數(分別是kdis和Kon)的比值。親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的ForteBio動力學結合測定法。
術語“高親和力”對於IgG抗體指，該抗體以1x 10-7M或更低、較佳地5x 10-8M或更低、更佳地大約1x 10-8M或更低、甚至更佳地大約5x 10-9M或更低的KD，與靶抗原結合。然而，“高親和力”結合可以隨抗體同種型而變。例如對於IgM同種型，“高親和力”指抗體具有1x 10-6M或更低、較佳地1x 10-7M或更低、更佳地大約1x 10-8M或更低的KD。
與結合例如TIGIT的抗原的參考抗體“競爭結合的抗體”是指這樣的抗體，所述抗體在競爭檢驗中阻斷參考抗體與抗原(例如TIGIT)結合的50%或更多，並且反過來，參考抗體在競爭檢驗中阻斷該抗體與抗原(例如TIGIT)結合的50%或更多。示例性競爭檢驗描述於：“Antibodies”,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)。競爭結合的抗體可以與參考抗體結合相同的表位區，例如相同表位、相鄰表位或重疊表位。
抑制(例如競爭性抑制)參照抗體與其抗原的結合的抗體是指這樣的抗體，其抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的所述參照抗體與其抗原的結合。反言之，參照抗體抑制50%、60%、70%、80%、
90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。抗體與其抗原的結合可以親和力(例如平衡解離常數)衡量。測定親和力的方法是本領域已知的。
與參照抗體顯示相同或相似的結合親和力和/或特異性的抗體是指這樣的抗體，其能夠具有參照抗體的至少50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的結合親和力和/或特異性。這可以藉由本領域已知的任何測定結合親和力和/或特異性的方法進行測定。
本文中的術語“Fc區”用於定義含有至少一部分的恆定區的免疫球蛋白重鏈的C-端區域。該術語包括天然序列Fc-區和變體Fc-區。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fc-區從重鏈的Cys226或從Pro230延伸至羧基端。然而，Fc-區的C-端賴胺酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外指出，Fc-區或恆定區中的胺基酸殘基的編號根據EU編號系統，也稱為EU索引，如Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。
與抗體相關的術語“變體”在本文中指，與參考抗體相比，包含已經藉由至少1個，例如1-30，或1-20或1-10個，例如1或2或3或4或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的目標抗體區域的抗體，其中變體基本上保持改變之前的抗體分子的至少一個生物學特性(例如，抗原結合能力)。目標抗體區域可以是抗體全長、或重鏈可變區或輕鏈可變區或其組合、或(一個或多個)重鏈CDR區或(一個或多個)輕鏈CDR區或其組合。在本文中，相對於參考抗體區域具有胺基酸改變的抗體區域，也稱作該抗體區域的“變體”。
在本文中，“序列同一性”是指在比較窗中以逐個核苷酸或逐個胺基酸為基礎的序列相同的程度。可以藉由以下方式計算“序列同一性百分比”：將兩條最佳比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸堿基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同一性百分比。為了確定序列同一性百分數而進行的最佳比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。
在本發明中，就抗體序列而言，胺基酸序列同一性百分數藉由將候選抗體序列與參考抗體序列最佳比對後，在一個較佳方案中按照Kabat編號規則進行最佳比對後，予以確定。在本文中，在不指定比較窗(即待比較的目標抗體區域)的情況下，將適用於在參考抗體序列的全長上進行比對。在一些實施方案中，就抗體而言，序列同一性可以分佈在整個重鏈可變區和/或整個輕鏈可變區上，或序列百分數同一性可以僅限定于構架區，而對應CDR區的序列保持100%相同。
類似地，就抗體序列而言，基於比對，可以確定相對於參考抗體在目標抗體區域具有胺基酸改變的候選抗體。
在本發明中，“保守性取代”是指導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸的胺基酸改變。可以藉由本領域已知的標準方法，例如定點誘變和PCR介導的誘變，將胺基酸修飾如取代引入本發明的抗體中。
提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。在一個較佳的方面，保守取代殘基來自以下的保守替代表A，較佳地為表A中所示的較佳保守取代殘基。
本發明的各方面將在下面各小節中進一步詳述。
I．本發明的抗TIGIT抗體
本發明一方面提供特異性地結合TIGIT，較佳人TIGIT蛋白質(例如SEQ ID NO：208的人TIGIT序列)的抗體或其抗原結合片段，尤其是全人源抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，本發明抗體的抗原結合片段是選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體例如scFv、(Fab’)2片段、單結構域抗體、雙抗體(dAb)或線性抗體。
抗體的有利生物性質
在一些實施方案中，本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段以高親和力與人TIGIT結合，例如，解離平衡常數(KD)小於100 x 10-9M，小於或等於大約50 x 10-9M，更佳地大約1-30 x 10-9M，更佳地小於或等於大約1 x 10-9M，更佳地大約1-10 x 10-10M。較佳地，KD藉由使用生物光干涉測定法(例如Fortebio親和測量法)測定。在一些實施方案中，KD值藉由測量抗體Fab形式(例如酵母表達的Fab)與人TIGIT的單價親和力來確定，較佳地單價KD值為1-100 x 10-10M，更佳1-50 x 10-10
M，更佳1-10x 10-10M或2-5x 10-10M。在另一些實施方案中，KD值藉由測量完整抗體(例如CHO細胞表達的完整抗體)與人TIGIT的單價親和力來確定，較佳地單價KD值為1-50 x 10-10M，更佳1-30x 10-10M或1-10x 10-10M。
在一些實施方案中，本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段與猴TIGIT交叉反應。在一些實施方案中，抗體以高親和力與猴TIGIT結合，其中KD值(例如藉由測量完整抗體與猴TIGIT的單價親和力來確定)為大約0.1-100x 10-9M，更佳0.1-50x 10-9M或1-30x 10-10M。在一些實施方案中，抗體與鼠TIGIT交叉反應，其中KD值(例如藉由測量完整抗體與鼠TIGIT的單價親和力來確定)為大約1-100x 10-9M，例如1-10x 10-7M或1-10x 10-8M，或1-10x 10-9M。在另一些實施方案中，本發明抗TIGIT抗體不與鼠TIGIT交叉反應。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段以高親和力結合細胞表面表達的TIGIT。在一個實施方案中，表面表達人TIGIT的細胞是CHO細胞。較佳地，以流式細胞術(例如FACS)測定，抗體與表達人TIGIT的細胞結合的EC50值。在一些實施方案中，抗體為酵母表達的完整抗體，EC50值小於大約10nM，例如0.1-1nM，較佳地，小於或等於大約1nM，更佳地大約0.2-0.9nM，如0.9nM、0.6M或0.4nM。在另一些實施方案中，抗體為CHO細胞表達的完整抗體形式，EC50值小於大約10nM，例如0.1-1nM，較佳地，大約0.1-0.3nM，如約0.3nM、0.2M或0.1nM。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段抑制TIGIT的相關活性。在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段阻斷TIGIT與其配體CD155的結合。較佳地，以流式細胞術(例如FACS)測
定抗體阻斷人TIGIT(細胞上表達的TIGIT)與人CD155結合的能力(如IC50值)。在一些實施方案中，抗體為酵母表達的完整抗體，IC50值小於大約10nM，例如0.1-2nM，較佳地，大約0.1-1.0nM，如0.8nM、0.6M、0.4nM或0.2nM。在另一些實施方案中，抗體為CHO細胞表達的完整抗體形式，EC50值小於大約1nM，例如0.1-0.5nM，較佳地，約0.3nM、0.2M或0.1nM。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段減少或消除由TIGIT結合CD155引起的抑制性信號傳導。在一些實施方案中，本發明抗體或片段在表達TIGIT的細胞(尤其是T細胞)中降低或消除TIGIT介導的抑制性信號傳導。在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段誘導T細胞中IL2啟動子下游基因的表達，在一些實施方案中增加T細胞的IL-2產生。在一些實施方案中，藉由螢光報告基因試驗(如實施例5的MOA試驗)，檢測抗體減少或消除由TIGIT結合CD155引起的抑制性信號傳導的能力(如EC50值)。在一些實施方案中，抗體為酵母表達的完整抗體，EC50值較佳小於大約10nM，例如0.1-5nM，較佳地，大約0.1-3.0nM，如約2.nM、1.5nM、1.0nM、或0.5nM。在另一些實施方案中，抗體為CHO細胞表達的完整抗體，EC50值較佳地小於5nM，例如大約0.1-3.0nM，如約1.6nM、1.2nM、1.0nM、或約0.18-0.5nM。
在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段抑制含有表達人TIGIT的浸潤淋巴細胞的腫瘤的生長。在一個實施方案中，腫瘤細胞是胃腸道腫瘤，較佳結腸直腸癌。例如，在體內腫瘤移植模型中，例如MC38小鼠中，抑制結腸癌細胞的生長。在一些實施方案中，本發明抗體與抗PD1抗體聯用，獲得顯著好於單獨一種抗體施用時的抗腫瘤效果。
較佳地，本發明抗體或其抗原結合片段表現出上述性質中的至少一個、更佳地至少二個、更較佳地至少三個、四個、或五個，甚至更佳地上述所有性質。
抗體CDR區
“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”(在本文中與超變區“HVR”可以互換使用)，是抗體可變區中主要負責與抗原表位結合的胺基酸區域。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。
下表B中給出了本發明的一些示例性抗體的VH和VL序列組合：
本領域公知多種用於在一個給定的VH或VL胺基酸序列中確定其CDR序列的方案。例如，Kabat互補決定區(CDR)是基於序列變異性確定的並且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of
Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia指的是結構環的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR是Kabat HVR和Chothia結構環之間的折中，並且由Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件使用。“接觸性”(Contact)HVR基於對可獲得的複雜晶體結構的分析。根據不同的CDR確定方案，這些HVR中的每一個HVR/CDR的殘基如下所述。
HVR也可以是根據Kabat編號系統位於如下Kabat殘基位置的HVR序列：
VL中的位置24-36或24-34(LCDR1)，位置46-56或50-56(LCDR2)，和位置89-97或89-96位置(LCDR3)；和VH中的位置26-35或27-35B(HCDR1)，位置50-65或49-65(HCDR2)，和位置93-102、94-102或95-102(HCDR3)。
在一個實施方案中，本發明抗體的HVR是根據Kabat編號系統位於如下Kabat殘基位置的HVR序列：VL中的位置24-34(LCDR1)、位置50-56(LCDR2)、和位置89-97(LCDR3)，以及VH中的位置27-35B(HCDR1)、位置50-65(HCDR2)、和位置93-102(HCDR3)。
在一個實施方案中，本發明抗體的HVR是根據Kabat編號系統位於如下Kabat殘基位置的HVR序列：VL中的位置24-34(LCDR1)、位置50-56(LCDR2)、和位置89-97(LCDR3)，以及VH中的位置26-35B(HCDR1)、位置50-65(HCDR2)、和位置95-102(HCDR3)。
HVR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。
除非另有說明，否則在本發明中，術語“CDR”或“CDR序列”或“HVR”或“HVR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的HVR或CDR序列。
除非另有說明，否則在本發明中，當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時，是指根據Kabat編號系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological
Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的編號位置。
在一個較佳的實施方案中，本發明CDR序列如表2所示，其中HCDR1為根據AbM方案確定的CDR序列；其餘CDR為根據Kabat方案確定的CDR序列。
在另一個較佳的實施方案中，本發明CDR序列如表1所示。
下表C給出了本發明的一些示例性CDR序列組合：
下表D給出了本發明的另一些示例性CDR序列組合：
具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat,Chothia,AbM和Contact方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如本領域技術人員明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如，在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。
在一些實施方案中，本發明的抗體有至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR與表B所列任一抗體的可變區序列中的對應CDR相同，或是其變體。在一些實施方案中，本發明的抗體有至少一個、兩個、或三個HCDR與表B所列任一抗體的可變區序列中的對應重鏈CDR相
同，或是其變體。在一些實施方案中，本發明的抗體有至少一個、兩個、或三個LCDR與表B所列任一抗體的可變區序列中的對應輕鏈CDR相同，或是其變體。在本文中，“對應CDR”是指，在最佳比對後，在候選抗體的可變區胺基酸序列中與參考抗體的CDR位於最相似位置上的CDR。在本文中，CDR變體是已經藉由至少一個，例如1或2或3個胺基酸取代、缺失和/或插入而修飾的CDR，其中包含CDR變體的抗原結合分子基本上保持包含未修飾CDR的抗原結合分子的生物學特性，例如，保持至少60%,70%,80%,90%，或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。可以理解，各CDR可以單獨修飾或組合修飾。較佳地，胺基酸修飾為胺基酸取代，尤其是保守胺基酸取代，例如表A中列出的較佳保守胺基酸置換。在一些實施方案中，胺基酸取代較佳發生在與本文提供的共有CDR序列(例如，SEQ ID NO：5、10,15、21、24、30、33、37、40、47、52、56、62、65、68、74、77、80)的X殘基相對應的胺基酸位置上。
此外，本領域已知，CDR3區，獨立於CDR1和/或CDR2區，單獨可以確定抗體對關聯抗原的結合特異性。並且，可以基於共同CDR3序列，產生具有相同結合特異性的多種其它抗體。參見例如，US Patents Nos.6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。所有這些參考文獻併入本文作為參考。
因此，在一個實施方案中，本發明抗體包含來自表B所示任一抗體的重鏈和/或輕鏈可變區序列的CDR3序列，其中所述抗體能夠特異地結合人TIGIT。在再一實施方案中，所述抗體還可以包含來自同一抗體的重鏈和/或輕鏈可變區的CDR2，或來自不同的TIGIT抗體的重鏈和/或輕鏈可變區的CDR2。在再一實施方案中，所述抗體還可以包含來自同一
抗體的重鏈和/或輕鏈可變區的CDR1，或來自不同的TIGIT抗體的重鏈和/或輕鏈可變區的CDR1。可以藉由本文描述的測定方法，表徵這些抗體的活性，包括與人TIGIT的結合活性、阻斷TIGIT與CD155分子結合的活性、和/或抑制腫瘤生長的活性。
再一方面，考慮到抗原結合特異性主要由CDR1、2和3區提供，在一些實施方案中，可以將VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列“混合並匹配”(即，可以混合並匹配來自結合同一TIGIT抗原的不同抗體的CDR，不過每種抗體較佳地含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3)，以產生結合TIGIT的本發明其他分子。可以使用本領域已知的結合測定法(例如，ELISA、SET、Biacore)和實施例中描述的那些測定法，測試這類“混合和匹配的”抗體與TIGIT的結合。當混合並匹配VH CDR序列時，來自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列較佳地替換為結構上相似的CDR序列。同樣，當混合並匹配VL CDR序列時，來自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列較佳地替換為結構上相似的CDR序列。可以在本發明表3所示抗體之間進行CDR的“混合和匹配”。此外，本領域技術人員明瞭，也可以藉由用來自其它不同抗體的一個或多個VH和/或VL CDR區序列，置換本文中所示抗體的結構上相似的CDR序列，以產生本發明的其它抗體。
因此，在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含重鏈互補決定區3(HCDR3)，所述HCDR3：(i)與表B列出的任一抗體的重鏈可變區的HCDR3相同；或(ii)與表C或D所列任一HCDR3序列相同；或
(iii)相對於(i)或(ii)的HCDR3，包含至少1個(較佳1-2個或更佳1個)胺基酸改變(較佳取代、更佳保守取代)。
在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，且所述抗體的重鏈互補決定區3(HCDR3)和輕鏈互補決定區3(LCDR3)：(i)與表B列出的任一抗體的重鏈和輕鏈可變區序列的HCDR3和LCDR3相同；或(ii)與表C或D所列任一組合中的HCDR3和LCDR3序列相同；或(iii)相對於(i)或(ii)的HCDR3和LCDR3，共包含至少1個(較佳1-2個或更佳1個)胺基酸改變(較佳取代、更佳保守取代)。
在一個實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，其中所述VH包含：(i)表B所列任一抗體的VH序列中所含的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；或(ii)表C或D所列任一組合中的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；或(iii)相對於(i)或(ii)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2、或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的序列。
在另一個實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)，其中所述VL包含：(i)表B所列任一抗體的VL序列中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或
(ii)表C或D所列任一組合中的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或(iii)相對於(i)或(ii)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2、或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的序列。
在另一個實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述抗體包含：(i)表B所列任一抗體的VH和VL序列中所含的6個CDR序列；或(ii)表C或D所列任一組合中的6個CDR序列；或(iii)相對於(i)或(ii)的序列，在6個CDR區上共包含至少一個且不超過10或5、4、3、2、1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的序列。
在一個實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含：(i)如SEQ ID NO：84、85、86、或87所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：104所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列，或者(ii)如SEQ ID NO：88、89或90所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：105或106所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列，或者(iii)如SEQ ID NO：91、92或93所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：107所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列，或者
(iv)如SEQ ID NO：94、95、96或97所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：108所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列，或者(v)如SEQ ID NO：98、99或100所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：109所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列，或者(vi)如SEQ ID NO：101、102或103所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：110所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列。
在一個較佳實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區的3個互補決定區HCDR，以及輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR，其中(i)HCDR1包含選自SEQ ID NO：1-5和178-181的胺基酸序列或由其組成，HCDR2包含選自SEQ ID NO：6-10的胺基酸序列或由其組成，HCDR3包含選自SEQ ID NO：11-15和182-185的胺基酸序列或由其組成，LCDR1包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列或由其組成，LCDR2包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列或由其組成，且LCDR3包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列或由其組成；或者(ii)HCDR1包含選自SEQ ID NO：19-21和186-187的胺基酸序列或由其組成，HCDR2包含選自SEQ ID NO：22-24的胺基酸序列或由其組成，HCDR3包含SEQ ID NO：25和188的胺基酸序列或由其組成，LCDR1包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列或由其組成，LCDR2包含SEQ
ID NO：27的胺基酸序列或由其組成，且LCDR3包含選自SEQ ID NO：28-30的胺基酸序列或由其組成；或者(iii)HCDR1包含選自SEQ ID NO：31-33和189-190的胺基酸序列或由其組成，HCDR2包含選自SEQ ID NO：34-37的胺基酸序列或由其組成，HCDR3包含選自SEQ ID NO：38-40和191-192的胺基酸序列或由其組成，LCDR1包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列或由其組成，LCDR2包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列或由其組成，且LCDR3包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列或由其組成；或者；(iv)HCDR1包含選自SEQ ID NO：44-47和193-195的胺基酸序列或由其組成，HCDR2包含選自SEQ ID NO：48-52的胺基酸序列或由其組成，HCDR3包含選自SEQ ID NO：53-56和196-198的胺基酸序列或由其組成，LCDR1包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列或由其組成，LCDR2包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列或由其組成，且LCDR3包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列或由其組成；或者(v)HCDR1包含選自SEQ ID NO：60-62和199-200的胺基酸序列或由其組成，HCDR2包含選自SEQ ID NO：6和63-65的胺基酸序列或由其組成，HCDR3包含選自SEQ ID NO：66-68和201-202所示的胺基酸序列或由其組成，LCDR1包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列或由其組成，LCDR2包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列或由其組成，且LCDR3包含SEQ ID NO：70的胺基酸序列或由其組成；或者(vi)HCDR1包含選自SEQ ID NO：71-74和203-205的胺基酸序列或由其組成，HCDR2包含選自SEQ ID NO：22和75-77的胺基酸序列或由其組成，HCDR3包含選自SEQ ID NO：78-80和206-207所示的胺基酸序列或由其組成，LCDR1包含SEQ ID NO：81的胺基酸序列或由其組
成，LCDR2包含SEQ ID NO：82的胺基酸序列或由其組成，且LCDR3包含SEQ ID NO：83的胺基酸序列或由其組成。
在一個較佳實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含表C所列組合之一的6個CDR序列。
在另一個較佳實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含表D所列組合之一的6個CDR序列。
抗體可變區
“可變區”或“可變結構域”是抗體的重鏈或輕鏈中參與抗體與其抗原的結合的結構域。重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)可以進一步再劃分為高變區(HVR，又稱作互補決定區(CDR))，其間插有較保守的區域(即，構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。在一些情況下，單個VH或VL結構域足以賦予抗原-結合特異性。此外，結合特定抗原的抗體可以使用來自結合所述抗原的抗體的VH或VL結構域篩選互補VL或VH結構域文庫而分離(參見，例如，Portolano，S.等，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等，Nature 352(1991)624-628)。
本領域已知，可以對兩個可變區之一或兩者(即VH和/或VL)中的一個或多個殘基進行修飾，例如，對一個或多個CDR區和/或對一個或多個構架區進行殘基修改，尤其是保守殘基取代，而修飾後的抗體仍基本上保持改變之前的抗體分子的至少一個生物學特性(例如，抗原結合能力)。例如，可以突變CDR區的殘基，改善抗體的一種或多種結合性質(例如親和性)。可以在體外或體內測定試驗中，評估突變後的抗體的抗體結合
性質或其它功能性質。較佳地，引入保守替代。較佳地，在CDR區中引入的殘基改變不超過1個、2個、3個、4個或5個。此外，可以突變構架區殘基，例如以改善抗體的性質。例如，可以將一個或多個構架殘基“回復突變”為對應的種系序列殘基。
CDR移植是本領域已知的另一種抗體可變區修飾方式。由於CDR序列負責大多數抗體-抗原相互作用，故可以構建模擬已知抗體的性質的重組抗體變體。在該抗體變體中，來自已知抗體的CDR序列被移植到具有不同性質的不同抗體的構架區上。因此，在一個實施方案中，本發明涉及這樣的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，所述抗體包含來自表B抗體之一的重鏈和輕鏈可變區的CDR序列，但具有不同的構架區序列。可以從公共DNA數據庫，包括種系抗體基因序列，或從公開文獻報導的TIGIT抗體序列，獲得用於替換的構架區序列。例如，可以從GenBank數據庫獲得編碼人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA。可以將抗體蛋白序列與數據庫中的蛋白序列，使用序列相似性檢索工具，例如Gapped BLAST，進行比較。較佳，用於替代的構架序列，與選擇進行改變的本發明抗體的構架序列，具有結構相似性，例如，具有序列同一性至少80%，85%，90%，或95%、96%、97%、98%、99%以上的構架序列。
在再一實施方案中，可以“混合並匹配”來自本發明示例性抗體(表B所示抗體之一)與其它不同抗TIGIT抗體(較佳地，表B所示另一抗體)的VH和VL序列，以產生結合TIGIT的本發明其他抗體。在混合和匹配這些鏈時，較佳地，將來自具體VH/VL配對的VH序列替換為結構相似的VH序列。同樣，來自特定VH/VL配對的VL序列較佳地替換為結構上相似的VL序列。可以使用本領域已知的結合測定法(例如，ELISA，和
實施例部分中描述的其他測定法)測試這類“混合和匹配的”抗體與TIGIT的結合。
因此，在一個實施方案中，本發明的抗體包含表B所列任一抗體的重鏈可變區VH序列，或由所述胺基酸序列組成。在再一實施方案中，本發明的抗體包含所述VH序列的變體。
在另一個實施方案中，本發明的抗體包含表B所列任一抗體的輕鏈可變區VL序列，或由所述胺基酸序列組成。在再一實施方案中，本發明的抗體包含所述VL序列的變體。
在再一實施方案中，本發明的抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：84或85或86或87所示的胺基酸序列的VH序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列的VL序列或其變體，或者(ii)包含SEQ ID NO：88或89或90所示的胺基酸序列的VH序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：105或106所示的胺基酸序列的VL序列或其變體，或者(iii)包含SEQ ID NO：91或92或93所示的胺基酸序列的VH序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：107所示的胺基酸序列的VL序列或其變體，或者(iv)包含SEQ ID NO：94或95或96或97所示的胺基酸序列的VH序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列的VL序列或其變體，或者(v)包含SEQ ID NO：98或99或100所示的胺基酸序列的VH序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列的VL序列或其變體；
(vi)包含SEQ ID NO：101或102或103所示的胺基酸序列的VH序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列的VL序列或其變體。
在一個實施方案中，VH序列的變體在胺基酸序列上，與參考VH序列相比，(較佳地，在全長上或在CDR1、2和3三個區域上)，具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，VH序列的變體在胺基酸序列上，與參考VH序列相比，(較佳地，在全長上或在CDR1、2和3三個區域上)，包含至少一個且不超過30個、10個、或5、4、3、2、1、0胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。較佳地序列差異不發生在CDR區中。
在一個較佳的實施方案中，VL序列的變體在胺基酸序列上，與參考VL序列相比，(較佳地，在全長上或在CDR1、2和3三個區域上)，具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個較佳的實施方案中，VL序列的變體在胺基酸序列上，與參考VL序列相比，(較佳地，在全長上或在CDR1、2和3三個區域上)，包含至少一個且不超過30個、10個、或5、4、3、2、1、0胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。較佳地序列差異不發生在CDR區中。
在一個較佳的實施方案中，本發明的抗體包含表B所列任一抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區VH/VL序列對，或由所述胺基酸序列對組成。本發明也提供該抗體的變體，例如在VH、VL或VH和VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在上述任一實施方案中，較佳地，相對於參考抗體，抗體變體的重鏈可變區在1個或多個CDR(較佳全部3個CDR)區域上包含不超
過10個，較佳不超過5個(例如，3、2、1或0個)胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。
在上述任一實施方案中，較佳地，相對於參考抗體，抗體變體的輕鏈可變區VL在1個或多個CDR(較佳全部3個CDR)區域上包含不超過10個，較佳不超過5個(例如，3、2、1或0個)胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。
抗體重鏈和輕鏈
在一些實施方案中，本發明抗體包含重鏈Fc區，例如IgG1,IgG2或IgG4同種型的Fc區。在一個實施方案中，本發明抗體含有IgG4-Fc區，其中在胺基酸殘基228位置(EU編號)具有絲胺酸至脯胺酸突變(S228P)。在再一較佳實施方案中，本發明抗體包含IgG4-PAA Fc部分。該IgG4-PAA Fc部分在位置228具有絲胺酸至脯胺酸突變(S228P)，並且在位置234(EU編號)具有苯丙胺酸至丙胺酸突變，在位置235(EU編號)具有亮胺酸至丙胺酸突變。S228P突變是腫瘤恆定區的鉸鏈區的突變，可以減少或消除重鏈間二硫橋異質性。F234A和L235A突變可以進一步降低(已經具有低效應子功能的)人IgG4同種型的效應子功能。在一些實施方案中，本發明抗體含有去除了重鏈C末端賴胺酸(des-Lys)的IgG4-PAA Fc部分。在一些實施方案中，本發明抗體包含κ輕鏈恆定區，例如人κ輕鏈恆定區。
在再一較佳的實施方案中，Fc區包含SEQ ID NO：177的胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO：177的胺基酸序列包含至少一個，兩
個或三個，但不超過20個，10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：177的胺基酸序列具有至少95-99%同一性的序列。
在一個較佳的實施方案中，本發明抗體包含輕鏈恆定區。在一個較佳實施方案中，輕鏈恆定區為人κ輕鏈恆定區。在再一較佳實施方案中，輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：209的胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO：209的胺基酸序列包含至少一個，兩個或三個，但不超過20個，10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：209的胺基酸序列具有至少95-99%同一性的序列。
在一些較佳的實施方案中，本發明抗體包含重鏈，並且所述重鏈包含選自SEQ ID NO：111-130的胺基酸序列、或相對於其包含至少一個，兩個或三個，但不超過20個，10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。較佳地，胺基酸改變不發生在CDR區中，更佳地，不發生在可變區中。
在一些較佳的實施方案中，本發明抗體包含輕鏈，並且所述輕鏈包含選自SEQ ID NO：137-143的胺基酸序列、或相對於其包含至少一個，兩個或三個，但不超過20個，10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。較佳地，胺基酸改變不發生在CDR區中，更佳地，不發生在可變區中。
在一個較佳實施方案中，本發明的抗體包含選自以下的重鏈序列和/或輕鏈序列：(a)包含選自SEQ ID NO：111-114的胺基酸序列的重鏈序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體；
(b)包含選自SEQ ID NO：115-117的胺基酸序列的重鏈序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：138或139的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體；(c)包含選自SEQ ID NO：118-120的胺基酸序列的重鏈序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：140的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體；(d)包含選自SEQ ID NO：121-124的胺基酸序列的重鏈序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：141的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體；(e)包含選自SEQ ID NO：125-127的胺基酸序列的重鏈序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：142的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體；(d)包含選自SEQ ID NO：128-130的胺基酸序列的重鏈序列或其變體，和/或包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體，其中所述變體與對應的參考序列相比包含至少一個，兩個或三個，但不超過20個，10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列，或具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。較佳地，胺基酸改變不發生在CDR區，更佳地不發生在可變區。
在一個實施方案中，在抗體的恆定區中進行殘基修飾，以例如改變抗體的性質，例如效應子功能。
在一些實施方案中，本發明抗TIGIT抗體或其片段的重鏈和/或輕鏈還包含信號肽序列，例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG。
示例性抗體序列
本發明提供如實施例中分離並表徵的特異性結合TIGIT(例如人TIGIT)的全人源抗體。下表3中列出了本發明這些示例性抗體的抗體可變區VH和VL序列。下表1和2中列出了抗體的示例性CDR序列。序
列表顯示了本發明示例性抗體的重鏈和輕鏈胺基酸序列和本發明示例性抗體可變區VH和VL的編碼核苷酸序列。
抗體變體
在一方面，本發明提供在本文中所述及的任何抗體，尤其是表B所列示例性抗體的變體。在一個實施方案中，抗體變體保持改變前抗體的至少60%,70%,80%,90%，或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。在一些實施方案中，所述改變不導致抗體變體喪失對抗原的結合，但視需要地可以賦予諸如提高的抗原親和力和不同的效應子功能等性質。
可以理解的，抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區、或各CDR區可以單獨改變或組合改變。在一些實施方案中，在一個或多個或全部三個重鏈CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個。較佳地，所述胺基酸改變為胺基酸取代，較佳保守取代。在一些實施方案中，在一個或多個或全部三個輕鏈CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個。在一些實施方案中，在一個或多個或全部6個CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個。較佳地，所述胺基酸改變為胺基酸取代，較佳保守取代。在一些實施方案中，抗體變體與參考抗體在目標抗體序列區域上具有至少80%、85%、90%或95%或99%或更高的胺基酸同一性。例如，在一個實施方案中，本發明抗體，與參考抗體(例如表3所列抗體之一)相比，在3個重鏈CDR區域上具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的同一性。在一個實施方案中，本發明抗體，與參考抗體(例如表3所列抗體之一相比)，在3個輕鏈CDR區域上具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的同一性。在另一實
施方案中，本發明抗體，與參考抗體(例如表3所列抗體之一相比)，在6個CDR區域上具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的同一性。在再一實施方案中，本發明抗體，與參考抗體(例如表3所列抗體之一)相比，在重鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。在再一實施方案中，本發明抗體，與參考抗體(例如表3所列抗體之一)相比，在輕鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。在再一實施方案中，本發明抗體，與參考抗體(例如表3所列抗體之一)相比，在重鏈可變區和/或輕鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。
此外，可以對抗體的Fc區進行改變。Fc區的改變可以單獨進行，或與上述對構架和/或CDR區的改變相組合。可以改變Fc區，例如，以改變抗體的一種或多種功能，例如血清半衰期，補體固定、Fc受體結合、和/或抗原依賴性細胞毒性。此外，還可以對本發明抗體進行化學修飾(例如，與PEG連接)或改變其糖基化模式。
在某些實施方案中，Fc區可以包含具有一個或多個提高ADCC活性的胺基酸置換的Fc-區，例如，Fc-區的位置298、333和/或334的置換(殘基的EU編號)。在一些實施方案中，也可以對Fc-區進行改變，以導致改變的(即，提高的或降低的)C1q結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)(參見，例如，US6,194,551、WO99/51642和Idusogie，E.E.等，J.Immunol.164(2000)4178-4184)。
在另一些實施方案中，可以對Fc進行改變以增加或降低其糖基化程度和/或改變其糖基化模式。對Fc的糖基化位點的添加或缺失可
藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點而方便地實現。舉例而言，可實施一或多種胺基酸取代以消除一或多個糖基化位點，由此消除該位點處的糖基化。可製備具有改變類型的糖基化的抗體，例如具有減小量的岩藻糖基殘基的低或無岩藻糖化抗體或具有增加的等分GlcNac結構的抗體。這類改變的糖基化模式已顯示可增加抗體的ADCC能力。本發明也考慮在與Fc區連接的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。這些抗體變體可具有提高的CDC功能。
在某些實施方案中，本發明也考慮具有一些但非所有效應子功能的抗體變體，這使其成為某些應用的理想候選物，在所述應用中抗體的體內半衰期是重要的，但某些效應子功能(如補體和ADCC)是不必要或有害的。例如，Fc區可以包含消除或減弱效應子功能的突變，例如具有突變P329G和/或L234A和L235A的人IgG1 Fc區，或具有突變P329G和/或S228P和L235E的人IgG4 Fc區。
在某些實施方案中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造的抗體，例如“硫代MAb”，其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基置換。例如，可以改變抗體鉸鏈區中的半胱胺酸殘基數目，以例如利於輕鏈和重鏈的裝配或增加或降低抗體的穩定性。參見例如美國專利號5,677,425。
在某些實施方案中，本文中所提供的抗體可進一步經修飾為含有非蛋白質部分。適合抗體衍生的部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)，以例如增加抗體的(例如血清)半衰期。用於蛋白質PEG化的方法是本領域已知的，可以將其應用于本發明的抗體。參見例如EP 0154 316和EP 0401384。
II. 多核苷酸、載體和宿主
本發明提供編碼以上任何抗TIGIT抗體或其片段的核酸。還提供包含所述核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體。還提供包含所述核酸或所述載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞或293細胞)。在另一個實施方案中，宿主細胞是原核的。
在一方面，本發明提供編碼以上任何抗TIGIT抗體或其片段的核酸。所述核酸可以包含編碼抗體的輕鏈可變區和/或重鏈可變區的胺基酸序列的核酸，或包含編碼抗體的輕鏈和/或重鏈的胺基酸序列的核酸。示例性的編碼抗體重鏈可變區的核酸序列包含與選自SEQ ID NO：150-169的核酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的核酸序列，或者包含選自SEQ ID NO：150-169的核酸序列。示例性的編碼抗體輕鏈可變區的核酸序列包括與選自SEQ ID NO：170-176的核酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的核酸序列，或者包含選自SEQ ID NO：170-176的核酸序列。從適宜的表達載體表達時，由這些多核苷酸編碼的多肽能夠顯示TIGIT抗原結合能力。
本發明中還提供多核苷酸，所述多核苷酸編碼來自上文所述的結合TIGIT的抗體的重鏈VH或輕鏈VL序列的至少一個CDR區和通常全部三個CDR區。一些進一步的實施方案中，多核苷酸編碼上文所述的結合TIGIT的抗體的重鏈和/或輕鏈的完整或基本上完整可變區序列。
如本領域技術人員明瞭的，因為密碼子簡並性，每一個抗體或多肽胺基酸序列可以由多種核酸序列編碼。
在一個較佳實施方案中，編碼抗體的本發明核酸還包含編碼重鏈Fc區的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：177中所示的Fc區序列或與其基本相同的序列。
在一個較佳實施方案中，編碼抗體的本發明核酸還包含編碼輕鏈恆定區序列的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：209中所示的序列或與其基本相同的序列。
可以採用本領域熟知的方法，藉由從頭固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼結合TIGIT的抗體或其抗原結合片段的現有序列(例如，SEQ ID NO：150-169中所示的VH DNA序列，SEQ ID NO：170-176中所示的VL DNA序列)，產生這些多核苷酸序列。
在一個實施方案中，提供包含本發明核酸的一個或多個載體。在一個實施方案中，載體是表達載體，例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、粘粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。在較佳的實施方案中，本發明的表達載體是pTT5表達載體。
在一個實施方案中，提供包含所述載體的宿主細胞。用於選殖或表達編碼抗體的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，特別當不需要糖基化和Fc效應子功能時。對於抗體片段和多肽在細菌中的表達，見，例如，美國專利號5,648,237，5,789,199和5,840,523，還見Charlton，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，編輯，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254頁，其描述抗體片段在大腸桿菌中的表達。在表達後，在可溶級分中的抗體可以與細菌細胞糊狀物分離，並且可以進一步純化。
在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其抗原結
合片段的其它細胞。例如，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母是用於編碼抗體的載體的合適純株或表達宿主。例如，糖基化途徑已經進行“人源化”的真菌和酵母菌株導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體。參見Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，和Li等，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。適於表達糖基化抗體的宿主細胞也可以衍生自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。也可以將脊椎動物細胞用作宿主。例如，可以使用被改造以適合於懸浮生長的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的一些實例是用SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(293HEK或293細胞，如例如Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977)中所描述的)等。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：216(1980))；以及骨髓瘤細胞系如Y0，NS0和Sp2/0。關於適合產生抗體的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述見例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268頁(2003)。
III. 抗體的製備
在一個實施方案中，提供了製備抗TIGIT抗體的方法，其中所述方法包括，在適合抗體表達的條件下，培養包含編碼所述抗體的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從所述宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收所述抗體。為了重組產生抗TIGIT抗體，分離編碼抗體(例如上文所描述的抗體)的核酸，並將其插入一個或多個載體，用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸易於使用常規規程分離和測序(例如藉
由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針進行)。
IV. 測定法
可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗TIGIT抗體鑒定，篩選，或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。
一方面，對本發明的抗體測試其抗原結合活性。例如，可以藉由本領域已知的方法，諸如ELISA，Western印跡等，或本文實施例公開的例示性方法，來測定與人TIGIT的結合。例如，可以使用流式細胞術進行測定，其中抗體與表達人TIGIT的細胞系，例如經轉染在細胞表面上表達人TIGIT的CHO細胞，進行反應。其它的細胞也適用於流式細胞術，包括表達天然TIGIT的T細胞。備選地，抗體的結合，包括結合動力學(例如KD值)，可以使用重組TIGIT蛋白，在生物光干涉測定法中測定。在一些實施方案中，使用例如Fortebio親和測量法。
另一方面，可使用競爭測定法來鑒定與本文中公開的任何抗TIGIT抗體競爭結合TIGIT的抗體。在某些實施方案中，此類競爭性抗體結合與本文中公開的任何抗TIGIT抗體所結合表位相同或重疊的表位(例如線性或構象表位)。用於定位抗體所結合表位的詳細例示性方法見Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。
本發明還提供了用於鑒定具有生物學活性的抗TIGIT抗體的測定法。生物學活性可以包括例如結合TIGIT(例如人TIGIT)，阻斷TIGIT(例如人TIGIT)與CD155分子的結合、阻斷TIGIT介導的抑制性信號傳導、增加T細胞的IL2產生、和/或抑制腫瘤生長。例如，在體內腫瘤
抑制模型中(參見例如實施例6)，測試抗體抑制腫瘤生長的能力。在本發明也提供在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。
可以理解的是，能夠使用本發明的免疫綴合物或多特異性抗體替換或補充抗TIGIT抗體來進行任何上述測定。
V．多特異性抗體
在再一方面，本發明提供特異性地結合TIGIT(較佳人TIGIT)的多特異性(包括雙特異性)抗體分子。在一個實施方案中，在多特異性抗體中，本發明的抗體(或其抗原結合片段)形成針對TIGIT的第一結合特異性。在再一實施方案中，所述多特異性抗體還具有第二特異性、或在再一實施方案中還包含第二和第三結合特異性。在再一實施方案中，所述多特異性抗體是雙特異性抗體。
在一個實施方案中，結合特異性由抗體的“結合位點”或“抗原結合位點”(抗體分子中與抗原實際結合的區域)提供。在一個較佳的實施方案中，抗原結合位點由抗體輕鏈可變結構域(VL)和抗體重鏈可變結構域(VH)組成的VH/VL對構成。因此，在一個實施方案中，“多特異性”抗體是具有至少兩個抗原結合位點的抗體，所述至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點可以與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。
有關多特異性抗體及其製備，可以參見例如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793中的描述。
VI．免疫綴合物
再一方面，本發明提供藉由將本發明抗體綴合于異源分子而產生的免疫綴合物。在一個實施方案中，在免疫綴合物中，本發明的抗體(或其抗原結合片段)與治療劑或診斷劑綴合。在一些實施方案中，本發明抗體可以以全長抗體或抗體片段的形式與異源分子綴合。例如，以Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、單鏈scFab抗體、單鏈scFv等片段形式進行綴合。
在一些實施方案中，本發明的抗體與治療性分子綴合。可以使用接頭來共價連接抗體與治療性分析。適宜的接頭包括化學接頭或肽接頭。
在另一些實施方案中，本發明的抗體可以與診斷劑或可檢測劑綴合。這類綴合物可以作為臨床檢驗方法的部分(如確定特定療法的效力)，用於監測或預測疾病或病症的發作、形成、進展和/或嚴重性。可以藉由將抗體與可檢測劑偶聯實現這類診斷和檢測。
VII. 藥物組合物和藥物製劑
本發明還包括包含抗TIGIT抗體或其免疫綴合物或多特異性抗體的組合物(包括藥物組合物或藥物製劑)和包含編碼抗TIGIT抗體或其免疫綴合物或多特異性抗體的多核苷酸的組合物。這些組合物還可以視需要地包含合適的藥用輔料，如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑，包括緩衝劑。
在一個實施方案中，組合物還包含第二治療劑。所述第二治療劑可以選自包括但不限於：例如抗-PD-1抗體和抗-PD-L1抗體。較佳地，第二治療劑是PD-1拮抗劑，尤其是抗PD-1抗體。
適用于本發明的藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括來自石油、動物、植物或合成起源的那些，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥物組合物時，水是較佳的載體。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載體，特別是用於可注射溶液。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途，亦參見“Handbook of PharmaceuticalExcipients”，第五版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的話，所述組合物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、持續釋放配製劑等的形式。口服製劑可以包含標準載體，如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精。
可以藉由將具有所需純度的本發明抗TIGIT抗體、免疫綴合物或多特異性抗體，與一種或多種視需要的藥用輔料(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.編(1980))混合，來製備包含本發明的藥物製劑，較佳地以凍乾製劑或水溶液的形式。
示例性的凍乾抗體製劑描述於美國專利號6,267,958。水性抗體製劑包括美國專利號6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，後一種製劑包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本發明的藥物組合物或製劑還可以包含一種或多種其它活性成分，所述活性成分是被治療的特定適應症所需的，較佳具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還提供其它抗癌活性成分，例如PD-1結合拮抗劑或PD-L1結合拮抗劑，例如抗PD-1抗
體或抗PD-L1抗體。所述活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質，所述基質呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
關於藥物製劑的其它組分，還可以參見WO2015/153513中公開的那些。
VIII. 組合產品
在一方面，本發明還提供了組合產品，其包含本發明的抗體或其抗原結合片段，雙特異性抗體或免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑等)。本發明的組合產品可用于本發明的治療方法中。
在一些實施方案中，本發明提供組合產品，其中所述其它治療劑為例如有效刺激免疫反應從而進一步增強、刺激或上調個體的免疫反應的治療劑如抗體。在一些實施方案中，其它抗體為例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。
在一些實施方案中，所述組合產品用於預防或治療腫瘤。在一些實施方案中，腫瘤為癌症，例如胃腸道癌症，例如胃癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌等；或皮膚癌，例如惡性黑素瘤。在一些實施方案中，所述組合產品用於預防或治療感染，例如細菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染等。
IX. 治療方法和用途
在本文中，術語“個體”或“個體”可互換地使用，是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如，奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈
長類(例如，人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。特別地，個體是人。
在本文中，術語“治療”指意欲改變正在接受治療的個體中疾病之天然過程的臨床介入。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態，以及緩解或改善預後。
在一方面中，本發明涉及在個體中增強機體的免疫應答的方法，所述方法包括向所述個體施用有效量的本文所述的任何抗TIGIT抗體或其片段，或包含所述抗體或片段的免疫綴合物、多特異性抗體，或藥物組合物。在一些實施方案，將本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合部分施用於攜帶腫瘤的個體，刺激抗腫瘤免疫應答。在另一些實施方案中，將本發明的抗體或其抗原結合部分施用於攜帶感染的個體，刺激抗感染免疫應答。
在另一方面中，本發明涉及治療個體腫瘤，例如癌症的方法，所述方法包括向所述個體施用有效量的本文所述的任何抗TIGIT抗體或其片段，或包含所述抗體或片段的免疫綴合物、多特異性抗體，或藥物組合物。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。
已經證實，TIGIT在人腫瘤浸潤性CD8+ T細胞上高表達。在一些實施方案中，本發明方法用於治療癌症，尤其是表達TIGIT的腫瘤浸潤性淋巴細胞浸潤的實體腫瘤。
在一個實施方案中，癌症是胃腸道癌症如結腸癌。
在一些實施方案中，腫瘤或腫瘤細胞可以選自結直腸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腺腫瘤、肺腫瘤、肺腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸腫瘤、黑素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、成膠質細胞瘤和頭
頸部腫瘤。在一些實施方案中，癌症可以選自結直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、成膠質細胞瘤和頭頸癌。
在一些實施方案中，本文提供了治療腫瘤(如癌症)的方法，包括給予個體本發明的抗-TIGIT抗體和拮抗性抗PD-1抗體。在一些實施方案中，用於治療共表達TIGTI和PD-1的腫瘤，例如，共表達TIGIT和PD-1的黑素瘤(Chauvin et al.(2015)J.Clin.Invest.125：2046)，和非小細胞肺癌(NSCLC)和腎細胞癌(RCC)。
在另一方面中，本發明涉及治療個體感染性疾病，例如慢性感染的方法，所述方法包括向所述個體施用有效量的本文所述的任何抗TIGIT抗體或其片段，或包含所述抗體或片段的免疫綴合物、多特異性抗體，或藥物組合物。在一個實施方案中，所述感染是病毒感染。
在一些實施方案中，所述感染性疾病是由於病毒感染引起的。致病性病毒的一些例子包括(A型、B型和C型)肝炎病毒、(A型、B型和C型)流感病毒、HIV、皰疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV、艾斯頓-巴爾(Epstein Barr)病毒+)、腺病毒、黃病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞體病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革病毒、乳頭狀瘤、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和蟲媒腦炎病毒。
一些實施方案中，本文所述的方法還包括向所述個體聯合施用一種或多種療法(例如治療方式和/或其它治療劑)。在一些實施方案中，治療方式包括手術治療和/或放射療法。
在一些實施方案中，可藉由本發明的抗-TIGIT抗體和一種或多種治療劑的組合，刺激T細胞反應。在一些實施方案中，除了施用本發明抗體外，本發明方法還包括施用至少一種其它的免疫刺激性抗體，例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體，這些抗體可以是例如全人源的、嵌合的、或人源化的抗體。
在另一些實施方案中，可以與本發明抗體聯合使用的其它治療劑選自PD-1結合拮抗劑和PD-L1結合拮抗劑。"PD-1"的備選名稱包括CD279和SLEB2。"PD-L1"的備選名稱包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。在一些實施方案中，PD-1、PD-L1是人PD-1、PD-L1。在一些實施方案中，PD-1結合拮抗劑是抑制PD-1結合其配體結合配偶的分子。在一個具體方面，PD-1配體結合配偶是PD-L1。在另一個實施方案中，PD-L1結合拮抗劑是抑制PD-L1結合其結合配偶的分子。在一個具體方面，PD-L1結合配偶是PD-1。拮抗劑可以是抗體，抗原結合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。在一些實施方案中，PD-1結合拮抗劑是抗PD-1抗體(例如人抗體，人源化抗體，或嵌合抗體)。在一些實施方案中，抗PD-1抗體選自下組：IBI308(信迪利單抗，WO2017/025016A1)，MDX-1106(nivolumab，OPDIVO)，Merck 3475(MK-3475，pembrolizumab，KEYTRUDA)和CT-011(Pidilizumab)。在一些實施方案中，抗PD-1抗體是MDX-1106。在一些實施方案中，抗PD-1抗體是nivolumab(CAS註冊號：946414-94-4)。在較佳的實施方案中，抗PD-1抗體是本文所述的“Antibody C”。
在進一步的一些實施方案中，單獨或與PD-1結合拮抗劑或與PD-L1結合拮抗劑組合的抗TIGIT抗體或其片段，還能與一種或多種其它療法例如治療方式和/或其它治療劑組合施用。在一些實施方案中，治療
方式包括外科手術(例如腫瘤切除術)；放射療法(例如，外粒子束療法，它涉及其中設計照射區域的三維適形放射療法)、局部照射(例如，指向預選靶或器官的照射)或聚焦照射等。
在一些實施方案中，本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段可以與化療或化療劑聯合施用。在一些實施方案中，本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段可以與放療或放療劑聯合施用。在一些實施方案中，本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段可以與靶向療法或靶向治療劑聯合施用。在一些實施方案中，本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段可以與免疫療法或免疫治療劑，例如單株抗體聯合施用。
本發明的抗體(以及包含其的藥物組合物或免疫綴合物，以及任何另外的治療劑)可以藉由任何合適的方法給藥，包括腸胃外給藥，肺內給藥和鼻內給藥，並且，如果局部治療需要，病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程，包括，但不限於，單次給藥或在多個時間點多次給藥、推注給藥及脈衝輸注。
為了預防或治療疾病，本發明的抗體的合適劑量(當單獨或與一種或多種其他的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重性和進程、所述抗體是以預防目的施用還是以治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對所述抗體的應答，和主治醫師的判斷力。所述抗體以一次治療或經過一系列治療合適地施用于患者。
在上述本發明方法中，可以替代本發明抗體或抗原結合部分，施用本發明的組合物、多特異性抗體或免疫綴合物。或者，在這些方
法中，除了施用本發明抗體或抗原結合部分，還可以進一步施用本發明的組合物、多特異性抗體或免疫綴合物。
再一方面，本發明提供本發明抗TIGIT抗體、組合物、免疫綴合物、多特異性抗體在製備用於前述方法(例如用於治療)的藥物中的用途。
X. 用於診斷和檢測的方法和組合物
再一方面，本發明涉及檢測樣品中TIGIT的方法和試劑盒，其中所述方法包括：(a)將所述樣品與本發明抗體或其抗原結合片段或免疫綴合物接觸；和(b)檢測所述抗體或其抗原結合片段或免疫綴合物和TIGIT蛋白之間複合物的形成。在一些實施方案中，樣品來自癌症患者，例如皮膚癌患者。所述檢測可以是體外的或體內的。
術語“檢測”用於本文中時，包括定量或定性檢測，示例性的檢測方法可以涉及免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術(例如，FACS)、抗體分子複合的磁珠、ELISA測定法、PCR-技術(例如，RT-PCR)。在某些實施方案中，生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。在某些實施方案中，生物樣品包含細胞或組織。在一些實施方案中，生物樣品來自過度增生性或癌性病灶。在某些實施方案中，待檢測的TIGIT是人TIGIT。
在一個實施方案中，抗TIGIT抗體被用於選擇適合利用抗TIGIT抗體的治療的個體，例如其中TIGIT是用於選擇所述個體的生物標記物。在一個實施方案中，可以使用本發明抗體診斷癌症或腫瘤，例如評價(例如，監測)對象中本文所述疾病(例如，過度增生性或癌性疾病)的治療或進展、其診斷和/或分期。
在某些實施方案中，提供標記的抗TIGIT抗體。標記包括但不限於，被直接檢測的標記或部分(如螢光標記、發色團標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記)，以及被間接檢測的部分，如酶或配體，例如，藉由酶促反應或分子相互作用。示例性標記包括但不限於，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，螢光團如稀土螯合物或螢光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹醯(dansyl)，傘形酮(umbelliferone)，螢光素酶(luceriferase)，例如，螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利號4,737,456)，螢光素，2,3-二氫酞嗪二酮，辣根過氧化物酶(HR)，鹼性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖澱粉酶，溶解酶，糖類氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，雜環氧化酶如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，以及利用過氧化氫氧化染料前體的酶如HR，乳過氧化物酶，或微過氧化物酶(microperoxidase)，生物素/親和素，自旋標記，噬菌體標記，穩定的自由基等等。
描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。
本發明下面實施例涉及的20個示例性抗體(ADI-27238,ADI-30263,ADI-30267,ADI-30268，ADI-27243,ADI-30302,ADI-30336,ADI-27278,ADI-30293,ADI-30296,ADI-27291，ADI-30283,ADI-30286,ADI-30288,ADI-27297,ADI-30272,ADI-30278，ADI-27301，ADI-30306，ADI-30311)、以及這些抗體的CDR區、輕鏈可變區和重鏈可變區、輕鏈和重鏈的胺基酸序列，以及對應的核苷酸序列在本申請的表1至3和序列表部分列出，並且其對應序列編號匯總在表4中。
實施例
實施例1：抗體的製備
酵母展示技術篩選抗TIGIT全人源抗體
基於酵母的抗體展示文庫(Adimab)，按照現有的方法(WO2009036379；WO 2010105256；W02012009568)進行擴增，其中每個庫的多樣性達到1×109。簡言之，前兩輪的篩選使用Miltenyi公司的MACS系統進行磁珠細胞分選。首先，將文庫的酵母細胞(~1×1010細胞/文庫)分別在FACS洗滌緩衝液中(磷酸鹽緩衝液，含有0.1%牛血清蛋白)室溫孵化15分鐘，緩衝液中含有100nM生物素標記的人TIGIT抗原(Acro Biosystems，TIT-H52H3)。使用50ml預冷的FACS洗滌緩衝液洗一次，再用40ml相同洗滌緩衝液重懸細胞，並加入500μl鏈黴親和素微珠(Miltenyi LS)於4℃孵化15分鐘。1000rpm離心5min棄去上清後用5ml FACS洗滌緩衝液重懸細胞，將細胞溶液加到Miltenyi LS管柱中。加樣完成後，用FACS洗滌緩衝液洗管柱3次，每次3ml。從磁性區域取下Miltenyi LS管柱，用5ml生長培養基洗脫，收集洗脫的酵母細胞並在37℃過夜生長。
使用流式細胞儀進行下一輪的分選：將經過MACS系統篩選獲得的大約1×108的酵母細胞用FACS緩衝液洗三次，於含有低濃度生物素(100-1nM)標記的TIGIT抗原中室溫下培養。棄去培養液，細胞用FACS洗滌緩衝液洗兩次之後，將細胞與LC-FITC(FITC標記的抗人免疫球蛋白kappa輕鏈抗體，Southern Biotech)(1：100稀釋)混合，並與SA-633(鏈黴親和素-633,Molec ular Probes)(1：500稀釋)或SA-PE(鏈黴親和素-PE,Sigma)(1：50稀釋)試劑混合，4℃下培養15分鐘。用預冷的FACS洗滌緩衝液洗脫兩次，並重懸於0.4ml緩衝液中，將細胞轉移到帶濾器的分離管中。使用FACS ARIA(BD Biosciences)分選細胞。
將藉由篩選獲得的表達抗TIGIT抗體的酵母細胞在30℃下震盪誘導48小時以表達抗TIGIT的抗體。誘導結束之後，1300rpm離心10min去除酵母細胞，收穫上清液。使用Protein A對上清液中的抗TIGIT抗體進行純化，pH2.0醋酸溶液洗脫，收穫抗TIGIT抗體，抗體純度>95%。使用木瓜蛋白酶消化並用KappaSelect(GE生命醫療集團)進行純化可獲得相應的Fab片段。本次篩選獲得抗TIGIT抗體ADI-27301，ADI-27238，ADI-27278，ADI-27243，ADI-27297，ADI-27291。
抗人TIGIT抗體的親和力優化
為了獲得更高親和力的抗人TIGIT抗體，我們藉由以下方法對抗體ADI-27301，ADI-27238，ADI-27278，ADI-27243，ADI-27297，ADI-27291進行了優化。
VHmut篩選
該方法是藉由常規的錯配PCR的方法向抗體重鏈區域引入突變。PCR過程中，藉由使用1uM高突變的堿基類似物dPTP和8-oxo-dGTP，從而將堿基錯配概率提高至約0.01bp。
獲得的錯配PCR的產物藉由同源重組的方法構建入含有重鏈恆定區的載體中。藉由這種方法，在包括TIGIT抗原滴度、未標記抗原競爭以及使用母抗體競爭的篩選壓力下，我們獲得了庫容量為1×107的次級庫。藉由FACS方法進行了3輪成功篩選。
CDRH1/CDRH2篩選
把VHmut方法獲得的子代抗體的CDRH3基因構建入1×108多樣性的CDRH1/CDRH2基因庫中，並對其進行了3輪篩選。第一輪使用MACS方法，而第二、三輪使用FACS方法，對抗體抗原結合物進行親和力加壓，篩選出最高親和力的抗體。
經過以上對6株親本抗體的親和力成熟過程，我們獲得了14株親和力提高的抗人TIGIT單株抗體ADI-30263/ADI-30267/ADI-30268(ADI-27238子代)、ADI-30302/ADI-30336(ADI-27243子代)、ADI-30293/ADI-30296(ADI-27278子代)、ADI-30283/ADI-30286/ADI-30288(ADI-27291子代)、ADI-30272/ADI-30278(ADI-27297子代)、ADI-30306/ADI-30311(ADI-27301子代)。
將藉由篩選獲得的表達抗TIGIT抗體的酵母細胞在30℃下震盪誘導48小時以表達抗TIGIT的抗體。誘導結束之後，1300rpm離心10min去除酵母細胞，收獲上清液。使用Protein A對上清液中的抗TIGIT抗體進行純化，pH2.0醋酸溶液洗脫，收穫抗TIGIT抗體，抗體純度>95%。使用木瓜蛋白酶消化並用KappaSelect(GE生命醫療集團)進行純化可獲得相應的Fab片段。
抗體的表達及純化
本申請涉及的各個抗人TIGIT抗體的序列信息及編號如表1-9所示，其中親本以及親和力成熟後的子代抗體均以上述方法由酵母表達純化。
在HEK293細胞中表達並且純化實施例中使用的下述對照抗體：22G2是在HEK293細胞中瞬時表達的來自百時美施貴寶公司的抗人TIGIT抗體，其輕重鏈可變區序列與專利申請WO2016/106302 A1中的抗體“22G2”的序列相同。31C6是在HEK293細胞中瞬時表達的來自默沙東的抗人TIGIT抗體，其輕重鏈可變區序列與專利申請WO2016/028656 A1中的抗體“31C6”的序列相同。10A7和1F4均是在HEK293細胞中瞬時表達的來自基因泰克公司的抗人TIGIT抗體，其輕重鏈可變區序列與專利申請WO2015009856A2中的抗體“10A7”、“1F4”的序列分別相同。4個對照抗體的恆定區均採用野生型IgG4序列。
對於HEK293細胞中抗體的瞬時表達，使用載體pTT5。首先將抗體的重鏈和輕鏈分別選殖到單獨的pTT5載體中。使用化學轉染的方法將帶有抗體分子重鏈和輕鏈的pTT5載體轉入HEK293細胞中。採用的化學轉染試劑為PEI(購自Polysciences)，按照生產產商提供的方案瞬時轉染培養的HEK293細胞。首先在超淨工作臺中準備質粒DNA和轉染試劑，將F17培養基(Gibco)(體積為轉染體積的1/5)各一半加入50ml離心管中，一份加入已過濾的質粒(130μg/100ml)，另一半加入已過濾的PEI(1g/L,Polysciences)(質量比(質粒：PEI)=1：3)，混勻5min，將二者輕柔混勻20次，靜置15-30min，不要超過30min。將DNA/PEI混合物輕柔倒入HEK293細胞並混勻，在37℃，8%CO2的條件下培養細胞7天，每48小時流加新鮮培養基。7天後或者連續培養至細
胞活力
60%時，13000rpm離心20min。取上清液，用Protein A純化上清液，使抗體的純度>95%。
此外，在CHO細胞中表達並且純化完整抗體ADI-30268,ADI-30278,ADI-30286,ADI-30288,ADI-30293,ADI-30306,ADI-30336。
CHO細胞中表達和純化：根據製造商的說明書，使用Horizon的HD-BIOP1(GS Null CHO-K1)產生表達抗體的CHO細胞系。首先將抗體分子重鏈和輕鏈的DNA序列分別插入到來自ATUM公司的pD2531質粒中。之後採用電轉染法將構建的質粒轉入CHO細胞系，轉染24小時之後利用ForteBio檢測抗體產量以判斷轉染效率。轉染後的細胞經過加壓篩選得到高表達抗體的細胞池(pool)。之後擴增細胞池，大量表達抗體，並收集細胞上清用Protein A以及凝膠過濾純化上清液，使抗體的純度>95%。
實施例2 抗體親和力測定
採用生物光干涉測量(ForteBio)測定法測定本發明上述20個示例抗體結合人TIGIT的平衡解離常數(KD)。
ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2)：p.270-8)進行。
測量候選抗體Fab與TIGIT-FC的單價親和力：傳感器在分析緩衝液中線下平衡20分鐘，然後線上檢測120秒建立基線。加載人TIGIT-FC至AHQ傳感器(ForteBio)上進行ForteBio親和測量。將已加載抗原的傳感器置於含100nM Fab的溶液中直至平臺期，之後將傳感
器轉移至分析緩衝液解離至少2分鐘用於解離速率測量。使用1：1結合模型進行動力學的分析。
測量完整候選抗體與人(ACRO,TIT-H52H3)、鼠(ACRO,TIT-M52E6)、猴TIGIT-his(ACRO,TIT-C5223)的單價親和力：傳感器在分析緩衝液中線下平衡20分鐘，然後線上檢測120秒建立基線，加載經純化的抗體至AHQ傳感器(ForteBio)上至厚度為1奈米進行ForteBio親和測量。將已加載抗體的傳感器於100nM的TIGIT-his抗原中作用至平臺期，之後將傳感器轉移至分析緩衝液解離至少2分鐘用於解離速率測量。使用1：1結合模型進行動力學的分析。
在如以上測定法所述進行的實驗中，20個酵母表達的候選抗體(Fab)的KD值如表5所示。
在如以上測定法所述進行的實驗中，7個CHO表達的候選完整抗體的人、鼠、猴TIGIT單價KD如表6所示。
由以上表結果可見：(1)親和力成熟後，各子代抗體與其親代抗體相比，與人TIGIT的親和力均有顯著提高；(2)親和力成熟後選取的7株CHO表達的抗體與人TIGIT的親和力與對照抗體相比類似或更高；7株候選抗體均能與猴TIGIT交叉反應；7株候選抗體中有4株(ADI-30268/ADI-30286/ADI-30288/ADI-30293)能與小鼠交叉反應。
實施例3 抗TIGIT抗體與表達於細胞上的人TIGIT的結合
基於流式細胞術測定法測量本發明的上述20個示例抗體與表達於CHO細胞表面的人TIGIT的結合能力。藉由比較不同抗體與表達於CHO細胞表面的人TIGIT的結合曲線來測定其結合能力。
具體地，在親和力成熟後，使用酵母表達親代及子代抗體。得到抗體後(純度約70%)，進行這些抗體與表達於CHO細胞表面的人TIGIT結合實驗。具體實驗過程為：(1)使用構建於pCHO1.0的人TIGIT質粒轉染CHOS細胞，使用胺甲喋呤以及嘌呤黴素篩選轉染後的細胞得到穩定細胞pool。(2)使用不同濃度的候選抗體與穩定細胞pool於4℃孵育30分鐘。PBS清洗三次後，使用PE標記的鼠抗人二抗與之4℃孵育30分鐘。PBS再次清洗三次後，使用100ul PBS重懸細胞。(3)使用流式細胞儀測定其二通道中位螢光度值。以抗體濃度以10為底的對數為橫坐標，以二通道中位螢光度值為縱坐標作圖，比較其EC50及曲線峰值。結果如下表和第1圖所示(EC50：nM)。
由上面的實驗結果可以得出如下結論：(1)親和力成熟後，各子代抗體與表達於CHO細胞表面的人TIGIT的結合能力較其親代抗體有增強(表現為結合曲線上平臺更高)。(2)親和力成熟後的子代抗體與表達於CHO細胞表面的人TIGIT的結合能力均強于來自基因泰克公司的兩個分子10A7和1F4，與來自百時美施貴寶公司的分子22G2以及來自默沙東的分子31C6的結合能力相當。
此外，在親和力成熟後，對篩選出來的7個分子使用CHO系統表達純化得到高純度的抗體，進行與表達於CHO細胞表面的人TIGIT的結合實驗。在如以上測試法所述進行的實驗中，ADI-30268、ADI-30336、ADI-30293、ADI-30286、ADI-30288、ADI-30278和ADI-30306結合CHO細胞上過表達的人TIGIT，EC50值分別為0.1392nM、0.1300nM、0.2288nM、0.1758nM、0.1860nM、0.1321nM和0.1999nM，高於對照抗體22G2、1F4與CHO細胞上過表達的人TIGIT的結合能力(對照抗體22G2及1F4的EC50值分別為0.7249nM和0.6073nM)，與對照抗體31C6類似(EC50值為0.1846nM)。雖然對照抗體10A7與7個候選抗體有著類似的EC50值(0.1949nM)，但是觀察該抗體的結合曲線可知：與其他7個候選抗體相比，其曲線的上平臺較低。一般認為這是由其較快的解離特性導致(參見第2圖)。因此也認為7個候選抗體與表達於CHO細胞表面的人TIGIT結合能力強於10A7。
實施例4 抗TIGIT抗體對其配體CD155的阻斷
採用流式細胞術的方法測定候選抗體的配體阻斷能力。具體方法為：構建穩定過表達人TIGIT的CHOS細胞pool，將50nM的帶小鼠IgG2aFC段的人CD155蛋白(ACRO,TIT-H5253-1MG)以及不同濃度的抗體與細胞於4攝氏度共孵育30分鐘。PBS清洗三遍後，使用1%濃度的
羊抗鼠FC、帶APC螢光素標記的二抗(Biolegend,405308)染色細胞上殘留的配體CD155。PBS再次清洗3遍後，上流式細胞儀檢測相應通道(C6，4通道)的中間螢光度值。以抗體濃度(nM)的以10為底的對數為橫坐標，以各抗體濃度點對應的中間螢光度值為縱坐標作圖。藉由分析曲線的IC50區分不同抗體對CD155的阻斷能力。
以IgG1為陰性對照抗體，以10A7、22G2、31C6為陽性對照抗體，做親和力成熟前後的候選分子對CD155的阻斷能力檢測。第3圖和下表顯示了親和力成熟前後酵母表達的抗體對CD155的阻斷能力(IC50：nM)。
從實驗結果可得出：大部分親和力成熟後的子代抗體較其親本對CD155的阻斷能力有提高，與對照抗體22G2和31C6類似且強於10A7。
使用7株CHO表達的高純度抗體做CD155與TIGIT的阻斷實驗。在如以上測試法所述進行的實驗中，以IgG4為陰性對照，22G2、31C6以及10A7為陽性對照。由實驗結果可得出：ADI-30268、ADI-30336、ADI-30278的IC50分別為0.1402nM、0.1219nM、0.1164nM，低於22G2(0.6069nM)、31C6(0.1659nM)、10A7(0.3252nM)三個對照抗體，表明這三株抗體有較對照抗體更強的配體(CD155)阻斷能力；其他4個候選抗體ADI-30293、ADI-30286、ADI-30288、ADI-30306的IC50分別為0.2510nM、0.1893nM、0.2238nM、0.2420nM，分別都小於對照抗體22G2和10A7但大於31C6，表明這四株抗體有較22G2和10A7更強但較31C6弱的配體(CD155)阻斷能力。結果如下表和第4圖所示(IC50：nM)。
實施例5 MOA方法檢測候選抗體的生物學活性
抗TIGIT抗體能夠藉由阻斷TIGIT和CD155的結合，從而解除CD155對下游IL2信號通路的抑制作用。本實施例使用Promega公司提供的MOA檢測細胞株(J2201)，藉由檢測螢光報告基因的表達，反映IL2信號的激活情況，從而檢測抗體對TIGIT與CD155結合的抑制作用。按照Promega提供的標準方法進行該檢測，過程如下：穩定表達人TIGIT以及IL2啟動子控制下的螢光素酶報告基因的Jurkat細胞，與穩定表達人CD155以及T細胞激活元件的CHO-K1細胞、以及不同濃度梯度的抗人TIGIT抗體，於37℃二氧化碳細胞培養箱共同孵育，6小時後檢測螢光信號。
實驗結果表明：親和力成熟後的子代分子(由酵母直接表達，純度約70%)較親代分子在體外生物學活性上有顯著提升，大都達到與22G2和31C6兩個對照抗體類似的水平。結果如下表和第5圖所示(EC50：nM)。
使用7株CHO表達的高純度抗體做MOA生物學活性實驗。在如以上測試法所述進行的實驗中，以IgG4為陰性對照，31C6為陽性對照。由實驗結果可得出：候選抗體ADI-30278在該實驗中的EC50為0.1856nM，較其他候選抗體以及對照抗體31C6(0.3424nM)更小，顯示出其更高的體外生物學活性；ADI-30268、ADI-30286、ADI-30288、ADI-30306的EC50分別為0.5065nM、0.3963nM、0.3844nM、0.3984nM，顯示出與對照抗體31C6類似的生物學活性；ADI-30336以及ADI-30293的EC50分別為1.274nM和1.624nM，顯示出其較弱的生物學活性。結果如下表和第6圖所示(EC50：nM)。
實施例6 動物體內藥效試驗
本實驗利用人TIGIT敲入-MC38小鼠腫瘤模型研究抗TIGIT抗體的抗腫瘤活性。
研究了候選分子ADI-30293和ADI-30278單獨給藥(10mg/kg)在人TIGIT敲入-MC38小鼠模型中的藥效學。小鼠結腸癌MC38細胞(上海和元生物，HYC0116)被移植到雌性TIGIT轉基因小鼠(北京百奧賽圖基因生物技術有限公司)。細胞移植後的第6天，第10天，第13天，第17天，給各組小鼠分別經皮下注射抗體，移植後第6天、第10天、第13天、第17天、第21天、第25天測量腫瘤體積，之後對小鼠實施安樂死。結果如第7圖所示。
觀察第7圖實驗結果，可見本申請的抗TIGIT單株抗體ADI-30293和ADI-30278與Ig4陰性對照抗體相比，在單獨使用時對腫瘤的生長有一定的抑制作用。與31C6陽性對照相比，兩個候選抗體單獨使用時其腫瘤抑制作用均與31C6無明顯區別。
進一步，研究了候選分子ADI-30293和ADI-30278與抗PD1抗體antibody C(WO2017133540A1)聯合給藥(10+1mg/kg)在人TIGIT敲入-MC38小鼠模型中的藥效學。
小鼠結腸癌細胞MC38(上海和元生物，HYC0116)用DMEM培養基培養。在0.2ml DMEM基礎培養基懸液中的1×106 MC38細胞被移植到雌性TIGIT轉基因小鼠(上海南方模式生物科技股份有限公司)的右側。腫瘤大小和體重在整個研究週期中每週測定2次，腫瘤細胞移植8天後，使用遊標卡尺測量腫瘤長度和寬度，根據如下公式計算腫瘤體積：寬2×長/2(mm3)；腫瘤體積平均約為71mm3的小鼠按每組6只隨機分組，當腫瘤體積達到檢測終點或小鼠體重降低20%以上時即對小鼠實施安樂死。細胞移植後的第8天，第12天，第15天，第19天，給各組小鼠分別經皮下注射h-IgG(10mg/kg)，antibody C(1mg/kg)以及10mg/kg的anti-TIGIT抗體或其同型抗體。終點腫瘤平均體積在細胞移植後的第29天測定，之後對實驗小鼠實施安樂死。結果如第8圖所示。
觀察第8圖實驗結果可知：當使用抗TIGIT抗體ADI-30293與抗PD1抗體antibody C聯合用藥時，表現出了較抗TIGIT抗體或抗PD1抗體單獨給藥時更強的腫瘤抑制效果，且ADI-30293+anti-PD1抗體的聯用效果好於31C6+anti-PD1抗體的聯用效果。同樣的，ADI-30278與anti-PD1抗體聯合用藥的效果好於31C6+anti-PD1抗體antibody C的聯用效果。
本研究中所有組小鼠在接種後29天，小鼠體重均無明顯變化。
<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司(INNOVENT BIOLOGICS(SUZHOU)CO.,LTD.)
<120> 抗TIGIT抗體及其用途
<160> 209
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列1 ADI-27238 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列2 ADI-30263 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列5共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自T、L或R或G或其保守取代殘基
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自S或N或G或其保守取代殘基
<400> 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> 抗體序列10共有序列
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
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<212> PRT
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<223> 抗體序列15共有序列
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<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自Y或T或其保守取代殘基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
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<212> PRT
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<212> PRT
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<222> (7)..(7)
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<213> 人工序列
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<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自S或G或其保守取代殘基
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 抗體序列25 ADI-27243,ADI-30302,ADI-30336 HCDR3 Kabat H93-102
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 抗體序列26 ADI-27243,ADI-30302,ADI-30336 LCDR1 Kabat L24-34
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<213> 人工序列
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<223> 抗體序列27 ADI-27243,ADI-30302,ADI-30336 LCDR2 Kabat L50-56
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<213> 人工序列
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<223> 抗體序列28 ADI-27243,ADI-30302 LCDR3 Kabat L89-97
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列29 ADI-30336 LCDR3 Kabat L89-97
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列30共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自F或H或其保守取代殘基
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列31 ADI-27278,ADI-30293 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列32 ADI-30296 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
<400> 32
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列33共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳第3位Xaa選自F或I或其保守取代殘基，第4位Xaa選自S或G或其保守取代殘基，第5位Xaa選自S或G或其保守取代殘基
<400> 33
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列34 ADI-27278 HCDR2 KABAT H50-65
<400> 34
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列35 ADI-30293 HCDR2 KABAT H50-65
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列36 ADI-30296 HCDR2 KABAT H50-65
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<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列37共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳第3位Xaa選自 囮或S或其保守取代殘基，第4位Xaa選自G或S或其保守取代殘基
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自S或G或其保守取代殘基
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自Y、N或H或其保守取代殘基
<400> 37
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列38 ADI-27278,ADI-30293 HCDR3 Kabat H93-102
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列39 ADI-30296 HCDR3 Kabat H93-102
<400> 39
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列40共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳第6位Xaa選自A或G或其保守取代殘基，第7位Xaa選自D或R或其保守取代殘基
<400> 40
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列41 ADI-27278,ADI-30293,ADI-30296 LCDR1 Kabat L24-34
<400> 41
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列42 ADI-27278,ADI-30293,ADI-30296 LCDR2 Kabat L50-56
<400> 42
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列43 ADI-27278,ADI-30293,ADI-30296 LCDR3 Kabat L89-97
<400> 43
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列44 ADI-27291 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
<400> 44
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列45 ADI-30283 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
<400> 45
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列46 ADI-30286,ADI-30288 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
<400> 46
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列47共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳第4位Xaa選自S或G或其保守取代殘基，第5位Xaa選自S或P或其保守取代殘基
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自A或G或其保守取代殘基
<400> 47
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列48 ADI-27291 HCDR2 KABAT H50-65
<400> 48
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列49 ADI-30283 HCDR2 KABAT H50-65
<400> 49
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列50 ADI-30286 HCDR2 KABAT H50-65
<400> 50
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列51 ADI-30288 HCDR2 KABAT H50-65
<400> 51
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列52共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自A或S或其保守取代殘基
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳第7位Xaa選自G或A或其保守取代殘基，第8位Xaa選自S或R或其保守取代殘基
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳第10位Xaa選自Y或W或其保守取代殘基，第11位Xaa選自Y或H或其保守取代殘基
<400> 52
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列53 ADI-27291,ADI-30283 HCDR3 Kabat H93-102
<400> 53
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列54 ADI-30286 HCDR3 Kabat H93-102
<400> 54
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列55 ADI-30288 HCDR3 Kabat H93-102
<400> 55
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列56共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(9)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳第7位Xaa選自D或H或其保守取代殘基，第8位Xaa選自S或Y或其保守取代殘基，第9位Xaa選自S或T或其保守取代殘基
<400> 56
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列57 ADI-27291,ADI-30296,ADI-30286,ADI-30288 LCDR1 Kabat L24-34
<400> 57
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列58 ADI-27291,ADI-30283,ADI-30286,ADI-30288 LCDR2 Kabat L50-56
<400> 58
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列59 ADI-27291,ADI-30283,ADI-30286,ADI-30288 LCDR3 Kabat L89-97
<400> 59
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列60 ADI-27297 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
<400> 60
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列61 ADI-30272,ADI-30278 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
<400> 61
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列62共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自S或E或其保守取代殘基
<400> 62
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列63 ADI-30272 HCDR2 KABAT H50-65
<400> 63
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列64 ADI-30278 HCDR2 KABAT H50-65
<400> 64
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列65共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自N或S或其保守取代殘基
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自G或A或其保守取代殘基
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自S或K或其保守取代殘基
<400> 65
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列66 ADI-27297,ADI-30272 HCDR3 Kabat H93-102
<400> 66
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列67 ADI-30278 HCDR3 Kabat H93-102
<400> 67
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列68共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳第7位Xaa選自A或R或其保守取代殘基，第8位Xaa選自A或L或其保守取代殘基
<400> 68
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列69 ADI-27297,ADI-30272,ADI-30278 LCDR1 Kabat L24-34
<400> 69
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列70 ADI-27297,ADI-30272,ADI-30278 LCDR3 Kabat L89-97
<400> 70
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列71 ADI-27301 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
<400> 71
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列72 ADI-30306 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
<400> 72
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列73 ADI-30311 HCDR1 KABAT編號位置H27-35B
<400> 73
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列74共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自A或S或其保守取代殘基
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自S、L或V或其保守取代殘基
<400> 74
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列75 ADI-30306 HCDR2 KABAT H50-65
<400> 75
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列76 ADI-30311 HCDR2 KABAT H50-65
<400> 76
<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列77共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自Y或F或W或其保守取代殘基
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳選自L或F或其保守取代殘基
<400> 77
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列78 ADI-27301,ADI-30306 HCDR3 Kabat H93-102
<400> 78
<210> 79
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列79 ADI-30311 HCDR3 Kabat H93-102
<400> 79
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列80共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳第7位Xaa選自G或T或其保守取代殘基，第8位Xaa選自T或G或其保守取代殘基
<400> 80
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列81 ADI-27301,ADI-30306,ADI-30311 LCDR1 Kabat L24-34
<400> 81
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列82 ADI-27301,ADI-30306,ADI-30311 LCDR2 Kabat L50-56
<400> 82
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列83 ADI-27301,ADI-30306,ADI-30311 LCDR3 Kabat L89-97
<400> 83
<210> 84
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列84 ADI-27238 VH
<400> 84
<210> 85
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列85 ADI-30263 VH
<400> 85
<210> 86
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列86 ADI-30267 VH
<400> 86
<210> 87
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列87 ADI-30268 VH
<400> 87
<210> 88
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列88 ADI-27243 VH
<400> 88
<210> 89
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列89 ADI-30302 VH
<400> 89
<210> 90
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列90 ADI-30336 VH
<400> 90
<210> 91
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列91 ADI-27278 VH
<400> 91
<210> 92
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列92 ADI-30293 VH
<400> 92
<210> 93
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列93 ADI-30296 VH
<400> 93
<210> 94
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列94 ADI-27291 VH
<400> 94
<210> 95
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列95 ADI-30283 VH
<400> 95
<210> 96
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列96 ADI-30286 VH
<400> 96
<210> 97
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列97 ADI-30288 VH
<400> 97
<210> 98
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列98 ADI-27297 VH
<400> 98
<210> 99
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列99 ADI-30272 VH
<400> 99
<210> 100
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列100 ADI-30278 VH
<400> 100
<210> 101
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列101 ADI-27301 VH
<400> 101
<210> 102
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列102 ADI-30306 VH
<400> 102
<210> 103
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列103 ADI-30311 VH
<400> 103
<210> 104
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列104 ADI-27238,ADI-30263,ADI-30267,ADI-30268 VL
<400> 104
<210> 105
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列105 ADI-27243,ADI-30302 VL
<400> 105
<210> 106
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列106 ADI-30336 VL
<400> 106
<210> 107
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列107 ADI-27278,ADI-30293,ADI-30296 VL
<400> 107
<210> 108
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列108 ADI-27291,ADI-30283,ADI-30286,ADI-30288 VL
<400> 108
<210> 109
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列109 ADI-27297,ADI-30272,ADI-30278 VL
<400> 109
<210> 110
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列110 ADI-27301,ADI-30306,ADI-30311 VL
<400> 110
<210> 111
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列111 ADI-27238 HC
<400> 111
<210> 112
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列112 ADI-30263 HC
<400> 112
<210> 113
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列113 ADI-30267 HC
<400> 113
<210> 114
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列114 ADI-30268 HC
<400> 114
<210> 115
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列115 ADI-27243 HC
<400> 115
<210> 116
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列116 ADI-30302 HC
<400> 116
<210> 117
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列117 ADI-30336 HC
<400> 117
<210> 118
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列118 ADI-27278 HC
<400> 118
<210> 119
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列119 ADI-30293 HC
<400> 119
<210> 120
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列120 ADI-30296 HC
<400> 120
<210> 121
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列121 ADI-27291 HC
<400> 121
<210> 122
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列122 ADI-30283 HC
<400> 122
<210> 123
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列123 ADI-30286 HC
<400> 123
<210> 124
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列124 ADI-30288 HC
<400> 124
<210> 125
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列125 ADI-27297 HC
<400> 125
<210> 126
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列126 ADI-30272 HC
<400> 126
<210> 127
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列127 ADI-30278 HC
<400> 127
<210> 128
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列128 ADI-27301 HC
<400> 128
<210> 129
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列129 ADI-30306 HC
<400> 129
<210> 130
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列130 ADI-30311 HC
<400> 130
<210> 131
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列131 陽性對照抗體10A7-IgG4(Genentech)HC
<400> 131
<210> 132
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列132 陽性對照抗體22G2-IgG4(BMS)HC
<400> 132
<210> 133
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列133 陽性對照抗體31C6--IgG4(MSD)HC
<400> 133
<210> 134
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列134 陽性對照抗體1F4 HC
<400> 134
<210> 135
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列135 陰性對照IgG1 HC
<400> 135
<210> 136
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列136 陰性對照IgG4 HC
<400> 136
<210> 137
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列137 ADI-27238,ADI-30263,ADI-30267,ADI-30268 LC
<400> 137
<210> 138
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列138 ADI-27243,ADI-30302 LC
<400> 138
<210> 139
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列139 ADI-30336 LC
<400> 139
<210> 140
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列140 ADI-27278,ADI-30293,ADI-30296 LC
<400> 140
<210> 141
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列141 ADI-27291,ADI-30283,ADI-30286,ADI-30288 LC
<400> 141
<210> 142
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列142 ADI-27297,ADI-30272,ADI-30278 LC
<400> 142
<210> 143
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列143 ADI-27301,ADI-30306,ADI-30311 LC
<400> 143
<210> 144
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列144 陽性對照抗體10A7-IgG4 LC
<400> 144
<210> 145
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列145 陽性對照抗體22G2-IgG4(BMS)LC
<400> 145
<210> 146
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列146 陽性對照抗體31C6-IgG4(MSD)LC
<400> 146
<210> 147
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列147 陽性對照抗體1F4 LC
<400> 147
<210> 148
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列148 陰性對照IgG1 LC
<400> 148
<210> 149
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列149 陰性對照IgG4 LC
<400> 149
<210> 150
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列150 ADI-27238 VH DNA
<400> 150
<210> 151
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列151 ADI-30263 VH DNA
<400> 151
<210> 152
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列152 ADI-30267 VH DNA
<400> 152
<210> 153
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列153 ADI-30268 VH DNA
<400> 153
<210> 154
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列154 ADI-27243 VH DNA
<400> 154
<210> 155
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列155 ADI-30302 VH DNA
<400> 155
<210> 156
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列156 ADI-30336 VH DNA
<400> 156
<210> 157
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列157 ADI-27278 VH DNA
<400> 157
<210> 158
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列158 ADI-30293 VH DNA
<400> 158
<210> 159
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列159 ADI-30296 VH DNA
<400> 159
<210> 160
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列160 ADI-27291 VH DNA
<400> 160
<210> 161
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列161 ADI-30283 VH DNA
<400> 161
<210> 162
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列162 ADI-30286 VH DNA
<400> 162
<210> 163
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列163 ADI-30288 VH DNA
<400> 163
<210> 164
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列164 ADI-27297 VH DNA
<400> 164
<210> 165
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列165 ADI-30272 VH DNA
<400> 165
<210> 166
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列166 ADI-30278 VH DNA
<400> 166
<210> 167
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列167 ADI-27301 VH DNA
<400> 167
<210> 168
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列168 ADI-30306 VH DNA
<400> 168
<210> 169
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列169 ADI-30311 VH DNA
<400> 169
<210> 170
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列170 ADI-27238,ADI-30263,ADI-30267,ADI-30268 VL DNA
<400> 170
<210> 171
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列171 ADI-27243,ADI-30302 VL DNA
<400> 171
<210> 172
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列172 ADI-30336 VL DNA
<400> 172
<210> 173
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列173 ADI-27278,ADI-30293,ADI-30296 VL DNA
<400> 173
<210> 174
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列174 ADI-27291,ADI-30283,ADI-30286,ADI-30288 VL DNA
<400> 174
<210> 175
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列175 ADI-27297,ADI-30272,ADI-30278 VL DNA
<400> 175
<210> 176
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列176 ADI-27301,ADI-30306,ADI-30311 VL DNA
<400> 176
<210> 177
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列177 重鏈恆定區(IgG4_PAA)
<220>
<221> misc_feature
<222> (327)..(327)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸，較佳Xaa是賴胺酸或缺失
<400> 177
<210> 178
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列178 ADI-27238 HCDR1-AbM
<400> 178
<210> 179
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列179 ADI-30263 HCDR1-AbM
<400> 179
<210> 180
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列180 ADI-30267 HCDR1-AbM
<400> 180
<210> 181
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列181 ADI-30268 HCDR1-AbM
<400> 181
<210> 182
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列182 ADI-27238 HCDR3-Kabat
<400> 182
<210> 183
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列183 ADI-30263 HCDR3-Kabat
<400> 183
<210> 184
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列184 ADI-30267 HCDR3-Kabat
<400> 184
<210> 185
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列185 ADI-30268 HCDR3-Kabat
<400> 185
<210> 186
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列186 ADI-27243,ADI-30336 HCDR1-AbM
<400> 186
<210> 187
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列187 ADI-30302 HCDR1-AbM
<400> 187
<210> 188
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列188 ADI-27243,ADI-30302,ADI-30336 HCDR3-Kabat
<400> 188
<210> 189
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列189 ADI-27278,ADI-30293 HCDR1-AbM
<400> 189
<210> 190
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列190 ADI-30296 HCDR1-AbM
<400> 190
<210> 191
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列191 ADI-27278,ADI-30293 HCDR3-Kabat
<400> 191
<210> 192
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列192 ADI-30296 HCDR3-Kabat
<400> 192
<210> 193
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列193 ADI-27291 HCDR1-AbM
<400> 193
<210> 194
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列194 ADI-30283 HCDR1-AbM
<400> 194
<210> 195
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列195 ADI-30286,ADI-30288 HCDR1-AbM
<400> 195
<210> 196
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列196 ADI-27291,ADI-30283 HCDR3-Kabat
<400> 196
<210> 197
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列197 ADI-30286 HCDR3-Kabat
<400> 197
<210> 198
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列198 ADI-30288 HCDR3-Kabat
<400> 198
<210> 199
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列199 ADI-27297 HCDR1-AbM
<400> 199
<210> 200
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列200 ADI-30272,ADI-30278 HCDR1-AbM
<400> 200
<210> 201
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列201 ADI-27297,ADI-30272 HCDR3-Kabat
<400> 201
<210> 202
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列202 ADI-30278 HCDR3-Kabat
<400> 202
<210> 203
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列203 ADI-27301 HCDR1-AbM
<400> 203
<210> 204
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列204 ADI-30306 HCDR1-AbM
<400> 204
<210> 205
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列205 ADI-30311HCDR1-AbM
<400> 205
<210> 206
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列206 ADI-27301,ADI-30306 HCDR3-Kabat
<400> 206
<210> 207
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列207 ADI-30311 HCDR3-Kabat
<400> 207
<210> 208
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列208人TIGIT序列
<400> 208
<210> 209
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列209 輕鏈恆定區(篕棺？)
<400> 209
Claims (20)
- 一種結合TIGIT的抗體或其抗原結合片段，其包含選自以下組合之一的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR以及輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR，其中：
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含選自以下組合之一的重鏈可變區和輕鏈可變區：
- 如申請專利範圍第1項的所述抗體或其抗原結合片段，其包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區(i)包含SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，或者(ii)包含SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：106所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，或者(iii)包含SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：107所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，或者(iv)包含SEQ ID NO：96或97所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列的輕鏈可變區；(v)包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列的輕鏈可變區；(vi)包含SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第1至3中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是IgG1、IgG2、或IgG4形式的抗體或其抗原結合片段。
- 如申請專利範圍第4項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是具有S228P、F234A和L235A突變的IgG4 Fc。
- 如申請專利範圍第1至3中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是全人源抗體、或人源化抗體、或嵌合抗體。
- 如申請專利範圍第1至3中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段是選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、 Fv、單鏈抗體、scFv、(Fab’)2片段、單結構域抗體、雙抗體(dAb)或線性抗體。
- 如申請專利範圍第1至3中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體具有以下一個或多個特性：(i)以高親和力與人TIGIT結合；(ii)具有與猴和/或鼠TIGIT的交叉免疫反應性；(iii)與細胞表面的TIGIT有效結合；(iv)阻斷TIGIT與其配體CD155的結合；(v)解除TIGIT與CD155結合對下游IL-2信號通路的抑制作用；(vi)增加T細胞中的IL-2產生；(vii)具有抗腫瘤活性或抑制腫瘤的生長；(viii)相對於單獨使用，與抗PD-1抗體組合具有更好的腫瘤抑制作用。
- 一種分離的核酸，其編碼如申請專利範圍第1至8中任一項所述的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段。
- 一種載體，其包含申請專利範圍第9項所述的核酸。
- 一種宿主細胞，其包含申請專利範圍第9項所述的核酸或申請專利範圍第10項所述的載體。
- 一種製備抗TIGIT抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括在適於表達編碼申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的核酸的條件下培養申請專利範圍第11項所述的宿主細胞，從所述宿主細胞回收所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段。
- 一種免疫綴合物，其包含與治療劑或診斷劑綴合的前述申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 一種包含前述申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的多特異性抗體。
- 一種藥物組合物，其包含前述申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，以及視需要地藥用輔料。
- 如申請專利範圍第15項所述的藥物組合物，其包含第二治療劑；所述第二治療劑選自抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。
- 一種申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段、或申請專利範圍第15或16項所述的藥物組合物的用途，其用於製備在受試者中預防或治療腫瘤或感染性疾病的藥物。
- 如申請專利範圍第17項所述的用途，其中所述腫瘤是胃腸道癌症或結腸癌。
- 一種申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段、或申請專利範圍第15或16項所述的藥物組合物的用途，其用於製備在受試者中阻斷TIGIT與CD155的結合以降低或消除TIGIT的免疫抑制作用的藥物。
- 一種檢測樣品中TIGIT的方法，所述方法包括(a)將樣品與前述申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段或可檢測地標記的所述抗體或其抗原結合片段接觸；和(b)檢測所述抗體或其抗原結合片段和TIGIT間的複合物的形成。
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