TWI721457B - 全人源的抗lag-3抗體及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及特異性結合LAG-3的新型抗體和抗體片段以及含有所述抗體或抗體片段的組合物。此外,本發明涉及編碼所述抗體或其抗體片段的核酸及包含其的宿主細胞,以及其治療和診斷用途。
Description
本發明涉及特異性結合LAG-3的新型抗體和抗體片段以及含有所述抗體或抗體片段的組合物。此外,本發明涉及編碼所述抗體或其抗體片段的核酸及包含其的宿主細胞,以及相關用途。此外,本發明涉及這些抗體和抗體片段的治療和診斷用途。特別地,本發明涉及這些抗體和抗體片段與其它療法,例如治療方式或治療劑,例如抗PD-1或抗PD-L1抗體的聯合治療。
淋巴細胞激活基因3(LAG-3),也稱為CD223,是由LAG3基因在人體中編碼的I型跨膜蛋白。LAG-3的分子性質和生物學功能已經有充分的表徵和描述,參見例如Sierro等人,Expert Opin Ther Targets(2011)15(1):91-101。LAG-3是一種CD4樣蛋白,在T細胞(特別是活化的T細胞)、自然殺傷細胞、B細胞和類漿細胞樹突狀細胞表面表達。已顯示LAG-3是負共刺激受體,即抑制性受體。
已經提出,LAG-3與MHC II類分子的結合在下調CD4+T淋巴細胞的抗原依賴性刺激中起作用(Huard等,(1994)Eur.J.Immunol.24:
3216-3221)。還認為LAG3和II類MHC之間的相互作用在調節樹突細胞功能中起作用(Andreae等人.J Immunol 168:3874-3880,2002)。近期的臨床前研究也已經記錄了LAG-3在CD8 T-細胞耗竭中的作用(Blackburn等人.Nat Immunol 10:29-37,2009)。
研究表明,慢性病毒感染後耗盡的CD8+T細胞表達多種抑制性受體(如PD-1,CD160和2B4)。LAG-3在LCMV感染後以高水平表達,並且顯示阻斷PD-1/PD-L1途徑與阻斷LAG-3顯著降低慢性感染小鼠中的病毒載量(Blackburn等人,Nat Immunol(2009)10:29-37)。還顯示PD-1/PD-L1途徑和LAG-3阻斷劑的聯合抑制提供了抗腫瘤功效(Jing等人,Journal for ImmunoTherapy of Cancer(2015)3:2)。
鑒於LAG-3的上述重要作用,需要開發調節其活性的新的抗LAG-3抗體,特別是全人源抗體。這類抗體能夠更好地用於治療腫瘤以及其它疾病如感染。此外,也希望獲得能夠與其他療法(例如治療劑,例如抗PD-1或抗PD-L1抗體)聯合用於治療腫瘤或者感染的新抗LAG-3抗體。
本發明提供了全人源的抗人LAG-3抗體及其編碼基因與應用。藉由基因工程手段和酵母表面展示技術,本發明人從展示在酵母表面的人抗體庫中篩選出抗人LAG-3的全人源抗體,在此基礎上進一步獲得經親和力成熟的高親和力抗人LAG-3抗體。本發明的全人源抗體分子能夠有效地阻斷LAG-3與主要組織相容性(MHC)II類分子的結合,結合激活的人CD4+ T細胞上表達的LAG-3,並且在體內施用時抑制腫瘤生長,尤其是在與抗PD-1抗體聯用時,抑瘤效果尤為顯著。因此,本發明的抗體可以
用於多種用途,包括但不限於檢測LAG-3蛋白和在攜帶腫瘤的受試者中抑制腫瘤生長。
因此,一個方面,本發明提供特異性地結合LAG-3(較佳人LAG-3蛋白質)的抗體或其抗原結合片段。
在一個實施方案中,本發明特異性結合人LAG-3的抗體或其抗原結合片段包含:(i)如SEQ ID NO:33或34所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及如SEQ ID NO:39所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR,或者(ii)如SEQ ID NO:35或36所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及如SEQ ID NO:40或41所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR;或者(iii)如SEQ ID NO:37或38所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及如SEQ ID NO:42或43所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。
再一方面,本發明也提供具有以下一個或多個特性的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段:(i)抑制(例如,競爭性抑制)表3所列的任一抗體與人LAG-3的結合;(ii)與表3所示的任一抗體結合相同或重疊的表位;(iii)與表3所示的任一抗體競爭結合人LAG-3。
在一些實施方案中,本發明的抗體表現出以下一個或多個生物學活性:(i)以高親和力與人LAG-3結合;(ii)以小於100×10-4,例如0.5×10-4至50×10-4的解離常數(Kd)與人LAG-3結合;(iii)以高親和力與細胞表面表達的人LAG-3結合;(iv)阻斷人LAG-3與細胞表面MHCII分子的結
合;(v)結合表達人LAG-3的激活的CD4+和/或CD8+ T細胞;(vi)刺激免疫應答,較佳抗腫瘤免疫應答;(vii)抑制表達人LAG-3的腫瘤細胞,尤其是與抗PD1抗體聯用時。較佳地,抗體表現出上述性質中的至少二個、更佳地至少三個、四個、五個,甚至更佳地上述所有性質。
再一方面,本發明提供編碼本發明抗體或其片段的核酸,包含所述核酸的載體,包含所述載體的宿主細胞。本發明也提供製備本發明抗體或其片段的方法。
再一方面,本發明提供包含本發明抗體的免疫綴合物、多特異性抗體和醫藥組成物。
本發明還提供在受試者中刺激免疫應答的方法,以及預防或治療癌症或感染的方法。
本發明還涉及在樣品中檢測LAG-3的方法。
第1圖顯示,藉由流式細胞術檢測,母抗體(ADI-26818、ADI-26822和ADI-26836)與HEK293細胞上表達的hLAG-3的結合能力。25F7是參考抗體。
第2圖顯示,藉由流式細胞術檢測,親和力優化的抗hLAG-3抗體與HEK293細胞上表達的hLAG-3的結合能力。25F7是參考抗體。
第3圖顯示,藉由流式細胞術檢測,抗LAG-3抗體阻斷人MHCII(HLA-DR)和LAG-3的相互作用。
第4圖顯示,藉由流式細胞術檢測,流式細胞術檢測抗LAG-3抗體和激活的人CD4+ T細胞的結合能力。
第5圖顯示,抗LAG-3抗體在A375-人PBMC模型中的腫瘤抑制效果。ADI-31798為本發明抗體。Antibody D為PCT/CN2016/094122中公開的抗PD-1抗體(“抗體D”)。
第6圖顯示,本發明示例性抗體VL區的比較。
第7圖顯示,本發明示例性抗體VH區的比較。
除非另有定義,否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本領域一般技術人員通常所理解的含義相同的含義。為了本發明的目的,下文定義了以下術語。
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
術語“和/或”應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或多項的組合。
如本文中所用,術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟,但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中,當使用術語“包含”或“包括”時,除非另有指明,否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如,當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時,也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
在本文中,術語“抗體”是指至少包含輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區的多肽,所述免疫球蛋白可變區特異性識別並結合抗原。該術語涵
蓋各種抗體結構,包括、但不限於單株抗體、多株抗體、單鏈抗體或多鏈抗體、單特異性或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、全人源抗體或嵌合抗體或人源化抗體、全長抗體和抗體片段,只要它們呈現期望的抗原結合活性即可。
本領域技術人員明瞭,“全抗體”(在本文中可與“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”互換使用)包含至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。可變區是抗體的重鏈或輕鏈中參與抗體與其抗原的結合的結構域。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合,但是顯示出多種效應子功能。抗體的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列歸入兩種類型(稱為kappa(κ)和lambda(λ))中的一種。抗體的重鏈可以取決於其重鏈恆定區的胺基酸序列而劃分為主要5種不同的類型:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,並且這些類型中的幾種可以進一步劃分成亞類,如,IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。對應於不同抗體類型的重鏈恆定區分別稱作α、δ、ε、γ和μ。術語“同種型”是指由抗體重鏈恆定區確定的抗體類型。參見例如Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.編輯,第二版,Raven Press,N.Y.(1989))(其為所有目的以其整體在此引作參考)。
術語抗體的“抗原結合部分”(在本文中可與“抗體片段”和“抗原結合片段”互換使用),是指並非完整抗體的分子,其包含完整抗體中用於結合該完整抗體所結合的抗原的部分。如本領域技術人員理解的,抗
體的抗原結合部分通常包含來自“互補決定區”或“CDR”的胺基酸殘基。可以藉由重組DNA技術、或藉由酶或化學切割完整的抗體製備抗原結合片段。抗原結合片段包括但不限於Fab、scFab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、單鏈Fv、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、微抗體(minibody)、單結構域抗體(sdAb)。關於抗體片段的更詳細的描述,可以參見:基礎免疫學(Fundamental Immunology),W.E.Paul編輯,Raven Press,N.Y.(1993);邵榮光等人(編輯),抗體藥物研究與應用,人民衛生出版社(2013);Hollinger等人,PNAS USA 90:6444-6448(1993);Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。
術語“人抗體”或“全人源抗體”在本文中可以互換使用,指包括其中構架區和CDR區二者均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。而且,如果抗體含有恆定區,恆定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸序列(例如,藉由體外隨機或點特異誘變或體內體細胞突變引入的突變),例如在CDR──尤其在CDR3中。然而,如本文所使用的,術語“人抗體”不包括其中的CDR序列衍生自其他哺乳動物物種(如,小鼠)的種系而移植入人構架序列的抗體。
如本文所用,術語“重組人抗體”包括所有藉由重組方式製備、表達、產生或分離的人抗體,例如,(a)自用人免疫球蛋白基因進行轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤分離的抗體,(b)自轉化成表達人抗體的宿主細胞例如轉染瘤分離的抗體,(c)自重組、組合人抗體文庫例如酵母展示文庫分離的抗體,和(d)藉由包括剪接人免疫球蛋白基因至其他DNA序列的任意其他方式製備、表達、產生或分離的抗體。這些重組人抗體具有構架區和CDR區源自人種系免疫球蛋白序列的可變區。
然而,在某些實施方案中,可以對重組人抗體進行體外誘變(或使用人Ig序列轉基因動物時為體內體細胞誘變),由此得到的重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列,儘管源自人種系VH和VL序列並與之相關、但是並不天然存在於體內的人抗體種系庫中。
術語“單株抗體”在本文中指,得自基本上同質的抗體群體的抗體,即,除了通常以很少量存在的可能變體抗體(例如,含有天然突變或在單株抗體製品的生產過程中產生的變體抗體)以外,構成所述群體的各個抗體是相同的和/或結合相同表位。
術語“嵌合抗體”是指可變區序列源自一物種、恆定區序列源自另一物種的抗體,例如,其中可變區序列源自小鼠抗體、恆定區序列源自人抗體的抗體。
術語“人源化抗體”是指將源自其他哺乳動物物種例如小鼠種系的CDR序列接到人構架序列上的抗體。可以在人構架序列內進行額外的構架區修飾。
“分離的”抗體是已經與它的天然環境中的組分分離的抗體。在一些實施方案中,將抗體純化至大於95%或99%純度,所述純度藉由例如電泳(例如,SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或色譜(例如,離子交換或反相HPLC)確定。關於評價抗體純度的方法的綜述,參見,例如,Flatman,S.等,J.Chrom.B 848(2007)79-87。
術語“表位”是指抗體所結合的抗原區域。表位可以由連續的胺基酸形成或者藉由蛋白的三級折疊而並置的非連續胺基酸形成。
術語“淋巴細胞活化基因-3”和“LAG-3”可互換使用,包括LAG-3的變體、同種型、同源物、和物種同源物。術語“人LAG-3”指的是人序列LAG-3,例如,Genbank登錄號NP_002277下的人LAG-3的完整
胺基酸序列。人LAG-3序列可以不同於Genbank登錄號NP_002277的人LAG-3,在序列上具有例如保守突變或在非保守區中的突變,但仍具有基本上相同的生物功能,例如,在胞外域中具有與本發明抗體特異結合的表位,或具有與MHC II類分子結合的功能。一般而言,人LAG-3序列與Genbank登錄號NP_002277的人LAG-3胺基酸序列具有至少90%同一性,並且含有當與其它物種(鼠)的LAG-3胺基酸序列進行比較時可以將其鑒定為人的胺基酸序列的胺基酸殘基。在一些實施方案中,人LAG-3序列與Genbank登錄號NP_002277的人LAG-3胺基酸序列具有至少95%,甚至至少96%,97%,98%,或99%胺基酸序列同一性。LAG-3蛋白也可包括LAG-3的片段,諸如包含胞外結構域以及胞外結構域的片段,例如保持與本發明任何抗體結合能力的片段,例如可溶性LAG-3分子。
術語“免疫應答”是指,例如淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞、和上述細胞或肝臟產生的可溶性大分子(包括抗體、細胞因子和補體)的作用,該作用導致選擇性的損傷、破壞、或清除入侵的病原體、感染了病原體的細胞或組織、或癌細胞。
術語“特異性結合”表示抗體選擇性地或優先地結合抗原。如果在生物光干涉測量中,抗體以大約5x 10-7M或更低、大約1x 10-7M或更低、大約5x 10-8M或更低、大約1x 10-8M或更低、大約5x 10-9M或更低的KD,與人LAG-3結合,則該抗體是“與人LAG-3特異性結合”的抗體。然而,特異性結合人LAG-3的抗體可以與來自其它物種的LAG-3蛋白具有交叉反應性。例如,特異於人LAG-3的抗體,在一些實施方案中,可以與非人物種的LAG-3蛋白交叉反應。在另一些實施方案中,特異於人LAG-3的抗體可以完全特異於人LAG-3而不表現出物種或其它類型的交叉反應性,或僅表現出對某些物種的LAG-3的交叉反應性。
“親和力”或“結合親和力”指反映結合對子的成員之間相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由平衡解離常數(KD)代表,平衡解離常數是解離速率常數和結合速率常數(分別是kdis和kon)的比值。親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的ForteBio動力學結合測定法。
術語“高親和力”對於IgG抗體指,該抗體以1x 10-7M或更低、較佳地5x 10-8M或更低、更佳地大約1x 10-8M或更低、甚至更佳地大約5x 10-9M或更低的KD,與靶抗原結合。然而,“高親和力”結合可以隨抗體同種型而變。例如對於IgM同種型,“高親和力”指抗體具有1x 10-6M或更低、較佳地1x 10-7M或更低、更佳地大約1x 10-8M或更低的KD。
與結合例如LAG-3的抗原的參考抗體“競爭結合的抗體”是指這樣的抗體,所述抗體在競爭檢驗中阻斷參考抗體與抗原(例如LAG-3)結合的50%或更多,並且反過來,參考抗體在競爭檢驗中阻斷該抗體與抗原(例如LAG-3)結合的50%或更多。示例性競爭檢驗描述於:“Antibodies”,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)。競爭結合的抗體可以與參考抗體結合相同的表位區,例如相同表位、相鄰表位或重疊表位。
本文中的術語“Fc區”用於定義含有至少一部分的恆定區的免疫球蛋白重鏈的C-端區域。該術語包括天然序列Fc-區和變體Fc-區。在一個實施方案中,人IgG重鏈Fc-區從重鏈的Cys226或從Pro230延伸至羧基端。然而,Fc-區的C-端賴胺酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外指出,Fc-區或恆定區中的胺基酸殘基的編號根據EU編號
系統,也稱為EU索引,如Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所述。
與抗體相關的術語“變體”在本文中指,與參考抗體相比,包含已經藉由至少1個,例如1-30,或1-20或1-10個,例如1或2或3或4或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的目標抗體區域的抗體,其中變體基本上保持改變之前的抗體分子的至少一個生物學特性(例如,抗原結合能力)。目標抗體區域可以是抗體全長、或重鏈可變區或輕鏈可變區或其組合、或(一個或多個)重鏈CDR區或(一個或多個)輕鏈CDR區或其組合。在本文中,相對於參考抗體區域具有胺基酸改變的抗體區域,也稱作該抗體區域的“變體”。
在本文中,“序列同一性”是指在比較窗中以逐個核苷酸或逐個胺基酸為基礎的序列相同的程度。可以藉由以下方式計算“序列同一性百分比”:將兩條最佳比對的序列在比較窗中進行比較,確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如,A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如,Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目,將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即,窗大小),並且將結果乘以100,以產生序列同一性百分比。為了確定序列同一性百分數而進行的最佳比對,可以按本領域已知的多種方式實現,例如,使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技
術人員可以確定用於比對序列的適宜參數,包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。
在本發明中,就抗體序列而言,胺基酸序列同一性百分數藉由將候選抗體序列與參考抗體序列最佳比對後,在一個較佳方案中按照Kabat編號規則進行最佳比對後,予以確定。比對後,將參考抗體上的目標抗體區域(例如,重鏈或輕鏈的整個可變區、或其部分例如一個或多個CDR區)與候選抗體上的對應區域進行比較。候選抗體區域和參考抗體區域之間的序列同一性百分數為:在候選抗體區域和參考抗體區域兩者中被相同胺基酸佔據的位置的數目除以兩個區域的比對位置總數(空位不計入)並乘以100得到的百分數。因此,在本文中,如果一個候選抗體與參考抗體經比對後在與參考抗體的目標抗體區域相對應的區域上具有X%的序列同一性時,則視為所述候選抗體為與參考抗體在目標抗體區域上具有X%序列同一性的抗體。在本文中,在不指定目標抗體區域的情況下,將適用於在參考抗體序列的全長上進行比對。在一些實施方案中,就抗體而言,序列同一性可以分佈在整個重鏈可變區和/或整個輕鏈可變區上,或序列百分數同一性可以僅限定於構架區,而對應CDR區的序列保持100%相同。
類似地,就抗體序列而言,基於比對,可以確定相對於參考抗體在目標抗體區域具有胺基酸改變的候選抗體。因此,在本文中,如果一個候選抗體與參考抗體經比對後在與參考抗體的目標抗體區域(如CDR區)相對應的區域上具有X個胺基酸改變時,則視為所述候選抗體是與參考抗體在目標抗體區域上具有X個胺基酸改變的抗體。當X為0時,則視為所述候選抗體與參考抗體具有相同的目標抗體區域,例如,當目標抗體區
域為CDR序列時,則視為候選抗體是與參考抗體具有相同CDR序列的抗體。
在本發明中,“保守性取代”是指導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸的胺基酸改變。可以藉由本領域已知的標準方法,例如定點誘變和PCR介導的誘變,將胺基酸修飾如取代引入本發明的抗體中。
提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。在一個較佳的方面,保守取代殘基來自以下的保守替代表A,較佳地為表A中所示的較佳保守取代殘基。
本發明的各方面將在下面各小節中進一步詳述。
本發明一方面提供特異性地結合LAG-3,較佳人LAG-3蛋白質的抗體或其抗原結合片段,尤其是全人源抗體或其片段。在一些實施方案中,本發明抗體的抗原結合片段是選自以下的抗體片段:Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體例如scFv、(Fab’)2片段、單結構域抗體、雙抗體(dAb)或線性抗體。
抗體的有利生物性質
在一些實施方案中,本發明的抗LAG-3抗體或其片段以高親和力與人LAG-3結合,例如,解離平衡常數(KD)小於約100nM,小於或等於大約50nM,更佳地小於或等於大約20nM、15nM或10nM,例如0.1-20nM,更佳地小於或等於大約5nM、4nM、3nM或2nM,較佳0.5-3nM,甚至更佳地,小於或等於大約1nM、0.5nM。較佳地,KD藉由使用生物光干涉測定法(例如Fortebio親和測量法)測定。
在一些實施方案中,本發明抗體或其片段與人LAG-3結合的解離常數(Kdis)小於100×10-4、60×10-4、例如0.5×10-4至50×10-4,較佳1×10-4至10×10-4,或1×10-4至6×10-4s-1,例如約5×10-4s-1。在一些實施方案中,抗LAG-3抗體分子與人LAG-3結合的結合常數(Kon)大於0.5×105、1×105、2×105、3×105、4×105或5×105M-1s-1,例如以約5×105M-1s-1的Kon與人LAG-3結合。較佳地,Kdis和Kon藉由使用生物光干涉測定法(例如Fortebio親和測量法)測定。
在一些實施方案中,本發明抗體或其片段以高親和力結合表達LAG-3的細胞。在一個實施方案中,表面表達人LAG-3的細胞是293
細胞,例如HEK293細胞。較佳地,以流式細胞術(例如FACS)測定,抗體與表達人LAG-3的HEK293細胞結合的EC50值小於大約50nM、30nM或10M,例如0.1-10nM,較佳地,小於或等於大約8nM、5nM、3nM、或2nM,更佳地小於或等於大約1.5nM、1.2nM或1nM,甚至更佳地小於或等於大約0.8nM、0.6nM、0.3M或0.2nM。
在一些實施方案中,本發明抗體或其片段抑制LAG-3的相關活性,例如IC50值小於或等於大約20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM或5nM,更佳IC50小於或等於大約1-7nM、1-5nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、或3nM。在一些實施方案中,LAG-3的相關活性是MHC II類分子與LAG-3的結合。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段以小於或等於大約20nM、10nM,例如1-9nM、如1-8nM,更較佳大約1-7nM、1-2nM、例如,小於或等於6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM或3nM的IC50,阻斷人LAG-3與表達MHCII類分子的細胞上的MHCII類分子的結合。在一些實施方案中,MHCII類分子是HLA-DR。在一些實施方案中,細胞為CHO細胞。在一些實施方案中,用流式細胞術(例如FACS)測量本發明抗體或其片段對LAG-3的相關活性的抑制。
在一些實施方案中,本發明抗體或其片段結合表面表達人LAG-3的激活的CD4+和/或CD8+ T細胞。較佳地,以流式細胞術(例如FACS)測定,抗體與激活的人CD4+ T細胞結合的EC50值小於或等於大約35pM、30pM、25pM、20pM、15pM、或10pM,較佳大約1-20pM、6-15pM、6-10pM,例如小於或等於大約12pM、11pM、10pM、9pM、8pM、7pM、6pM或5pM。在一些實施方案中,在Accuri C6系統中進行流式細胞術。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段抑制LAG-3的一種或多種活性,例如,導致以下一種或多種:CD4+ T淋巴細胞的抗原依賴性刺激增加;T細胞增殖增加;活化抗原(例如,CD25)的表達增加;細胞因子(例如,干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)或白介素-4(IL-4))的表達增加;趨化因子(例如,CCL3、CCL4或CCL5)的表達增加;Treg細胞的阻抑活性減少;T細胞穩態增加;腫瘤浸潤型淋巴細胞增加;或癌細胞的免疫逃避減少。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段抑制表達人LAG-3的腫瘤細胞的生長。在一個實施方案中,腫瘤細胞是皮膚癌細胞,較佳人皮膚癌細胞。例如,在體內腫瘤移植模型中,例如NOG小鼠中,抑制人皮膚癌細胞的生長。在一些實施方案中,本發明抗體與抗PD1抗體聯用,獲得顯著好於單獨一種抗體施用時的抗腫瘤效果。
較佳地,本發明抗體或其抗原結合片段表現出上述性質中的至少一個、更佳地至少二個、更佳地至少三個、四個、或五個,甚至更佳地上述所有性質。
抗體CDR區
“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”(在本文中與超變區“HVR”可以互換使用),是抗體可變區中主要負責與抗原表位結合的胺基酸區域。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3,從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3,而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本領域公知多種用於在一個給定的VH或VL胺基酸序列中確定其CDR序列的方案。例如,Kabat互補決定區(CDR)是基於序列變異性確定的並且是最常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia指的是結構環的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR是Kabat HVR和Chothia結構環之間的折中,並且由Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體使用。“接觸性”(Contact)HVR基於對可獲得的複雜晶體結構的分析。根據不同的CDR確定方案,這些HVR中的每一個HVR/CDR的殘基如下所述。
HVR也可以是根據Kabat編號系統位於如下Kabat殘基位置的HVR序列:VL中的位置24-36或24-34(LCDR1),位置46-56或50-56(LCDR2),和位置89-97或89-96位置(LCDR3);和VH中的位置26-35或27-35B(HCDR1),位置50-65或49-65(HCDR2),和位置93-102、94-102或95-102(HCDR3)。
在一個實施方案中,本發明抗體的HVR是根據Kabat編號系統位於如下Kabat殘基位置的HVR序列:VL中的位置24-34(LCDR1)、位置50-56(LCDR2)、和位置89-97(LCDR3),以及VH中的位置27-35B(HCDR1)、位置50-65(HCDR2)、和位置93-102(HCDR3)。
在一個實施方案中,本發明抗體的HVR是根據Kabat編號系統位於如下Kabat殘基位置的HVR序列:VL中的位置24-34(LCDR1)、位置50-56(LCDR2)、和位置89-97(LCDR3),以及VH中的位置26-35B(HCDR1)、位置50-65(HCDR2)、和位置95-102(HCDR3)。
HVR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。
除非另有說明,否則在本發明中,術語“CDR”或“CDR序列”或“HVR”或“HVR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的HVR或CDR序列。
除非另有說明,否則在本發明中,當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時,是指根據Kabat編
號系統(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的編號位置。
在一個較佳的實施方案中,本發明CDR序列如表1所示。
在一個最佳的實施方案中,本發明CDR序列如表2所示。
具有不同特異性(即,針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而,儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的,但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat,Chothia,AbM和Contact方法中的至少兩種,可以確定最小重疊區域,從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如本領域技術人員明瞭,藉由抗體的結構和蛋白折疊,可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此,本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如,在一個CDR的變體中,最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變,而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。
在一些實施方案中,本發明的抗體有至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR與表3所列任一抗體的對應CDR相同,或是其變體。在一些實施方案中,本發明的抗體有至少一個、兩個、或三個HCDR與表3所列任一抗體的對應重鏈CDR相同,或是其變體。在一些實施方案中,本發明的抗體有至少一個、兩個、或三個LCDR與表3所列任一抗體的對應輕鏈CDR相同,或是其變體。在本文中,“對應CDR”是指,在最佳比對後,在候選抗體的可變區胺基酸序列中與參考抗體的CDR位於最相似位置上的CDR。在本文中,CDR變體是已經藉由至少一個,例如1或2
或3個胺基酸取代、缺失和/或插入而修飾的CDR,其中包含CDR變體的抗原結合分子基本上保持包含未修飾CDR的抗原結合分子的生物學特性,例如,保持至少60%,70%,80%,90%,或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。可以理解,各CDR可以單獨修飾或組合修飾。較佳地,胺基酸修飾為胺基酸取代,尤其是保守胺基酸取代,例如表A中列出的較佳保守胺基酸置換。在一些實施方案中,胺基酸取代較佳發生在與本文提供的共有CDR序列(例如,SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,30,31,32)的X殘基相對應的胺基酸位置上。
此外,本領域已知,CDR3區,獨立於CDR1和/或CDR2區,單獨可以確定抗體對關聯抗原的結合特異性。並且,可以基於共同CDR3序列,可產生具有相同結合特異性的多種其它抗體。參見例如,US Patents Nos.6,951,646;6,914,128;6,090,382;6,818,216;6,156,313;6,827,925;5,833,943;5,762,905和5,760,185。所有這些參考文獻併入本文作為參考。
因此,在一個實施方案中,本發明抗體包含來自表3所示抗體之一的重鏈和/或輕鏈可變區的CDR3,其中所述抗體能夠特異地結合人LAG-3。在再一實施方案中,所述抗體還可以包含來自同一抗體的重鏈和/或輕鏈可變區的CDR2,或來自不同的LAG-3抗體的重鏈和/或輕鏈可變區的CDR2。在再一實施方案中,所述抗體還可以包含來自同一抗體的重鏈和/或輕鏈可變區的CDR1,或來自不同的LAG-3抗體的重鏈和/或輕鏈可變區的CDR1。可以藉由本文描述的測定方法,表徵這些抗體的活性,包括與人LAG-3的結合活性、阻斷LAG-3與MHC II類分子結合的活性、抑制腫瘤生長的活性。
再一方面,考慮到抗原結合特異性主要由CDR1、2和3區提供,在一些實施方案中,可以將VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列“混合並匹配”(即,可以混合並匹配來自結合同一LAG-3抗原的不同抗體的CDR,不過每種抗體較佳地含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3),以產生結合LAG-3的本發明其他分子。可以使用本領域已知的結合測定法(例如,ELISA、SET、Biacore)和實施例中描述的那些測定法,測試這類“混合和匹配的”抗體與LAG-3的結合。當混合並匹配VH CDR序列時,來自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列較佳地替換為結構上相似的CDR序列。同樣,當混合並匹配VL CDR序列時,來自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列較佳地替換為結構上相似的CDR序列。可以在本發明表3所示抗體之間進行CDR的“混合和匹配”。此外,本領域技術人員明瞭,也可以藉由用來自其它不同抗體的一個或多個VH和/或VL CDR區序列,置換本文中所示抗體的結構上相似的CDR序列,以產生本發明的其它抗體。
因此,在一些實施方案中,本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區,所述重鏈可變區包含重鏈互補決定區3(HCDR3),所述HCDR3:(i)與表3列出的任一抗體的重鏈可變區的HCDR3相同;或(ii)相對於(i)的HCDR3,包含至少1個且不超過3個(較佳1-2個或更佳1個)胺基酸改變(較佳取代、更佳保守取代)。較佳地,所述HCDR3包含選自SEQ ID NO:3,6,9,12,15,18和21的胺基酸序列,或由其組成。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,且所述抗體的重鏈互補決定區3(HCDR3)和輕鏈互補決定區3(LCDR3):(i)與表3列出的任一抗體的重鏈和輕鏈可變區序列的HCDR3和LCDR3相同;或(ii)相對於(i)的HCDR3和LCDR3,共包含至少1個且不超過3個(較佳1-2個或更佳1個)胺基酸改變(較佳取代、更佳保守取代)。較佳地,所述HCDR3和LCDR3包含選自以下的胺基酸序列組合:SEQ ID NO:3/24、6/24、18/24、9/25、9/26、9/30、12/28、15/29和21/32的胺基酸序列。
在一個實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH),其中所述VH包含:(i)表3所列任一抗體的VH序列中所含的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列;或(ii)相對於(i)的序列,在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過10或5、4、3、2、1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)的序列。
在另一個實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL),其中所述VL包含:(i)表3所列任一抗體的VL序列中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列;或(ii)相對於(i)的序列,在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過10或5、4、3、2、1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)的序列。
在另一個實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中所述抗體包含:(i)與表3所列任一抗體的VH和VL序列中所含的6個CDR序列分別相同的6個CDR序列;或(ii)相對於(i)的序列,在6個CDR區上共包含至少一個且不超過20、10或5、4、3、2、1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)的序列。
在一個實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:(i)如SEQ ID NO:33或34所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及如SEQ ID NO:39所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR,或者(ii)如SEQ ID NO:35或36所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及如SEQ ID NO:40或41所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR;或者(iii)如SEQ ID NO:37或38所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及如SEQ ID NO:42或43所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含來自SEQ ID NO:33的重鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列,且輕鏈可變區包含來自SEQ ID NO:39的輕鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含來自SEQ ID NO:34的重鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列,且輕鏈可變區包含來自SEQ ID NO:39的輕鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含來自SEQ ID NO:35的重鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列,且輕鏈可變區包含來自SEQ ID NO:40的輕鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含來自SEQ ID NO:36的重鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列,且輕鏈可變區包含來自SEQ ID NO:41的輕鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含來自SEQ ID NO:37的重鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列,且輕鏈可變區包含來自SEQ ID NO:42的輕鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含來自SEQ ID NO:38的重
鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列,且輕鏈可變區包含來自SEQ ID NO:43的輕鏈可變區的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列。
在一個實施方案中,本發明抗LAG-3抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH),其中所述VH包含(i)選自以下胺基酸序列組合的重鏈HCDR組合(按順序分別為HCDR1、HCDR2和HCDR3):SEQ ID NOs:1/2/3、SEQ ID NOs:4/5/6、SEQ ID NOs:16/17/18、SEQ ID NOs:7/8/9、SEQ ID NOs:10/11/12、SEQ ID NOs:13/14/15,和SEQ ID NOs:19/20/21;或(ii)選自以下胺基酸序列組合的重鏈HCDR組合(按順序分別為HCDR1、HCDR2和HCDR3):SEQ ID NOs:70/2/71、SEQ ID NOs:72/5/73、SEQ ID NOs:74/8/75、SEQ ID NOs:76/11/77和SEQ ID NOs:78/14/79;或(iii)(i)或(ii)的HCDR組合的變體,所述變體在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過10或5、4、3、2、1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。
在另一個實施方案中,本發明抗LAG-3抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL),其中所述VL包含:(i)選自以下胺基酸序列組合的輕鏈LCDR組合(按順序分別為LCDR1、LCDR2和LCDR3):
SEQ ID NOs:22/23/24、SEQ ID NOs:31/23/24、SEQ ID NOs:22/23/25、SEQ ID NOs:22/23/26、SEQ ID NOs:31/23/30、SEQ ID NOs:27/23/28、SEQ ID NOs:27/23/29和SEQ ID NOs:31/23/32;(ii)(i)的LCDR組合的變體,所述變體在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過10或5、4、3、2、1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。
在另一個實施方案中,本發明抗LAG-3抗體或其抗原結合片段包含:(i)選自以下胺基酸序列組合的重鏈和輕鏈CDR組合(按順序分別為HCDR1、HCDR2和HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3):SEQ ID NOs:1/2/3/22/23/24、SEQ ID NOs:4/5/6/22/23/24、SEQ ID NOs:16/17/18/31/23/24、SEQ ID NOs:7/8/9/22/23/25,SEQ ID NOs:7/8/9/22/23/26、SEQ ID NOs:7/8/9/31/23/30、SEQ ID NOs:10/11/12/27/23/28、SEQ ID NOs:13/14/15/27/23/29和SEQ ID NOs:19/20/21/31/23/32;或(ii)選自以下胺基酸序列組合的重鏈和輕鏈CDR組合(按順序分別為HCDR1、HCDR2和HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3):SEQ ID NOs:70/2/71/22/23/24、SEQ ID NOs:72/5/73/22/23/24、SEQ ID NOs:74/8/75/22/23/25、SEQ ID NOs:74/8/75/22/23/26、SEQ ID NOs:74/8/75/31/23/30、SEQ ID NOs:76/11/77/27/23/28、和SEQ ID NOs:78/14/79/27/23/29;(ii)(i)的重鏈和輕鏈CDR組合的變體,所述變體在所述六個CDR區上共包含至少一個且不超過10或5、4、3、2、1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR,其中(i)HCDR1包含SEQ ID NO:1或4或16或70或72所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:2或5或17所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:3或6或18或71或73所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:22或31所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:24所示的胺基酸序列;或者(ii)HCDR1包含SEQ ID NO:7或74所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:9或75所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:22或31所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:25或26或30所示的胺基酸序列;或者(iii)HCDR1包含SEQ ID NO:10或13或19或76或78所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:11或14或20所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:12或15或21或77或79所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:27或31所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:28或29或32所示的胺基酸序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:1的HCDR1序列;SEQ ID NO:2的HCDR2序列;
SEQ ID NO:3的HCDR3序列;SEQ ID NO:22的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:24的LCDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:70的HCDR1序列;SEQ ID NO:2的HCDR2序列;SEQ ID NO:71的HCDR3序列;SEQ ID NO:22的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:24的LCDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:4的HCDR1序列;SEQ ID NO:5的HCDR2序列;SEQ ID NO:6的HCDR3序列;SEQ ID NO:22的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:24的LCDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:72的HCDR1序列;SEQ ID NO:5的HCDR2序列;SEQ ID NO:73的HCDR3序列;SEQ ID NO:22的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:24的LCDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:7的HCDR1序列;SEQ ID NO:8的HCDR2序列;SEQ ID NO:9的HCDR3序列;SEQ ID NO:22的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:25的LCDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:74的HCDR1序列;SEQ ID NO:8的HCDR2序列;SEQ ID NO:75的HCDR3序列;SEQ ID NO:22的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:25的LCDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:7的HCDR1序列;SEQ ID NO:8的HCDR2序列;SEQ ID NO:9的HCDR3序列;SEQ ID NO:22的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:26的LCDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:74的HCDR1序列;SEQ ID NO:8的HCDR2序列;SEQ ID NO:75的HCDR3序列;SEQ ID NO:22的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:26的LCDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:10的HCDR1序列;SEQ ID NO:11的HCDR2序列;SEQ ID NO:12的HCDR3序列;SEQ ID NO:27的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:28的LCDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:76的HCDR1序列;SEQ ID NO:11的HCDR2序列;SEQ ID NO:77的HCDR3序列;SEQ ID NO:27的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:28的LCDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:13的HCDR1序列;SEQ ID NO:14的HCDR2序列;SEQ ID NO:15的HCDR3序列;SEQ ID NO:27的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:29的LCDR3序列。
在一個較佳實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含:SEQ ID NO:78的HCDR1序列;SEQ ID NO:14的HCDR2序列;
SEQ ID NO:79的HCDR3序列;SEQ ID NO:27的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:29的LCDR3序列。
抗體可變區
“可變區”或“可變結構域”是抗體的重鏈或輕鏈中參與抗體與其抗原的結合的結構域。重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)可以進一步再劃分為高變區(HVR,又稱作互補決定區(CDR)),其間插有較保守的區域(即,構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成,從胺基端到羧基端以如下順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在一些情況下,單個VH或VL結構域足以賦予抗原-結合特異性。此外,結合特定抗原的抗體可以使用來自結合所述抗原的抗體的VH或VL結構域篩選互補VL或VH結構域文庫而分離(參見,例如,Portolano,S.等,J.Immunol.150(1993)880-887;Clackson,T.等,Nature 352(1991)624-628)。
本領域已知,可以對兩個可變區之一或兩者(即VH和/或VL)中的一個或多個殘基進行修飾,例如,對一個或多個CDR區和/或對一個或多個構架區進行殘基修改,尤其是保守殘基取代,而修飾後的抗體仍基本上保持改變之前的抗體分子的至少一個生物學特性(例如,抗原結合能力)。例如,可以突變CDR區的殘基,改善抗體的一種或多種結合性質(例如親和性)。可以在體外或體內測定試驗中,評估突變後的抗體的抗體結合性質或其它功能性質。較佳地,引入保守替代。較佳地,在CDR區中引入的殘基改變不超過1個、2個、3個、4個或5個。此外,可以突變構架區殘基,例如以改善抗體的性質。例如,可以將一個或多個構架殘基“回復突變”為對應的種系序列殘基。
CDR移植是本領域已知的另一種抗體可變區修飾方式。由於CDR序列負責大多數抗體-抗原相互作用,故可以構建模擬已知抗體的性質的重組抗體變體。在該抗體變體中,來自已知抗體的CDR序列被移植到具有不同性質的不同抗體的構架區上。因此,在一個實施方案中,本發明涉及這樣的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段,所述抗體包含來自表3抗體之一的重鏈和輕鏈CDR序列,但具有不同的構架區序列。可以從公共DNA數據庫,包括種系抗體基因序列,或從公開文獻導的LAG-3抗體序列,獲得用於替換的構架區序列。例如,可以從GenBank數據庫獲得編碼人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA。可以將抗體蛋白序列與數據庫中的蛋白序列,使用序列相似性檢索工具,例如Gapped BLAST,進行比較。較佳,用於替代的構架序列,與選擇進行改變的本發明抗體的構架序列,具有結構相似性,例如,具有序列同一性至少80%、85%、90%、或95%、96%、97%、98%、99%以上的構架序列。
在再一實施方案中,可以“混合並匹配”來自本發明示例性抗體(表3所示抗體之一)與其它不同抗LAG-3抗體(較佳地,表3所示另一抗體)的VH和VL序列,以產生結合LAG-3的本發明其他抗體。在混合和匹配這些鏈時,較佳地,將來自具體VH/VL配對的VH序列替換為結構相似的VH序列。同樣,來自特定VH/VL配對的VL序列較佳地替換為結構上相似的VL序列。可以使用本領域已知的結合測定法(例如,ELISA,和實施例部分中描述的其他測定法)測試這類“混合和匹配的”抗體與LAG-3的結合。
因此,在一個實施方案中,本發明的抗體包含重鏈可變區VH序列,所述VH序列包含選自SEQ ID NOs:33、34、35、36、37和
38所示的胺基酸序列,或由所述胺基酸序列組成。在再一實施方案中,本發明的抗體包含所述VH序列的變體。
在另一個實施方案中,本發明的抗體包含輕鏈可變區VL序列,所述VL序列包含選自SEQ ID NOs:39、40、41、42和43所示的胺基酸序列,或由所述胺基酸序列組成。在再一實施方案中,本發明的抗體包含所述VL序列的變體。
在再一實施方案中,本發明的抗體包含重鏈和輕鏈可變區VH/VL序列對,其中VH序列(i)包含選自SEQ ID NOs:33、34、35、36、37和38所示的胺基酸序列,或由所述胺基酸序列組成,或(ii)是(i)的VH序列的變體;且VL序列包含(i)選自SEQ ID NOs:39、40、41、42和43所示的胺基酸序列,或由所述胺基酸序列組成,或(ii)是(i)的VL序列的變體。
在一個較佳的實施方案中,本發明的抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區序列對:(a)包含SEQ ID NO:33的胺基酸序列的VH序列或其變體,和包含SEQ ID NO:39的胺基酸序列的VL序列或其變體;(b)包含SEQ ID NO:34的胺基酸序列的VH序列或其變體,和包含SEQ ID NO:39的胺基酸序列的VL序列或其變體;(c)包含SEQ ID NO:35的胺基酸序列的VH序列或其變體,和包含SEQ ID NO:40的胺基酸序列的VL序列或其變體;(d)包含SEQ ID NO:36的胺基酸序列的VH序列或其變體,和包含SEQ ID NO:41的胺基酸序列的VL序列或其變體;(e)包含SEQ ID NO:37的胺基酸序列的VH序列或其變體,和包含SEQ ID NO:42的胺基酸序列的VL序列或其變體;
(f)包含SEQ ID NO:38的胺基酸序列的VH序列或其變體,和包含SEQ ID NO:43的胺基酸序列的VL序列或其變體。
在一個實施方案中,VH序列的變體在胺基酸序列上,與參考VH序列相比,(較佳地,在全長上或在CDR1、2和3三個區域上),具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,VH序列的變體在胺基酸序列上,與參考VH序列相比,(較佳地,在全長上或在CDR1、2和3三個區域上),包含至少一個且不超過30個、10個、或5、4、3、2、1、0個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。較佳地序列差異不發生在CDR區中。
在一個較佳的實施方案中,VL序列的變體在胺基酸序列上,與參考VL序列相比,(較佳地,在全長上或在CDR1、2和3三個區域上),具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個較佳的實施方案中,VL序列的變體在胺基酸序列上,與參考VL序列相比,(較佳地,在全長上或在CDR1、2和3三個區域上),包含至少一個且不超過30個、10個、或5、4、3、2、1、0個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。較佳地序列差異不發生在CDR區中。
在一個較佳的實施方案中,本發明的抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區VH/VL序列對,所述VH/VL序列對包含選自以下的胺基酸序列對:SEQ ID NOs:33/39、34/39、35/40、36/41、37/42、和38/43,或由所述胺基酸序列對組成。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH、VL或VH和VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在上述任一實施方案中,較佳地,相對於參考抗體,抗體變體的重鏈可變區在1個或多個CDR(較佳全部3個CDR)區域上包含不超
過10個,較佳不超過5個(例如,3、2、1或0個)胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。
在上述任一實施方案中,較佳地,相對於參考抗體,抗體變體的輕鏈可變區VL在1個或多個CDR(較佳全部3個CDR)區域上包含不超過10個,較佳不超過5個(例如,3、2、1或0個)胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。
在上述任一實施方案中,較佳地,本發明抗體或其抗原結合片段包含選自以下的CDR序列組合(按順序分別為HCDR1、HCDR2和HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3):SEQ ID NOs:1/2/3/22/23/24、SEQ ID NOs:4/5/6/22/23/24、SEQ ID NOs:16/17/18/31/23/24、SEQ ID NOs:7/8/9/22/23/25、SEQ ID NOs:7/8/9/22/23/26、SEQ ID NOs:7/8/9/31/23/30、SEQ ID NOs:10/11/12/27/23/28、SEQ ID NOs:13/14/15/27/23/29和SEQ ID NOs:19/20/21/31/23/32。
抗體重鏈和輕鏈
在一些實施方案中,本發明抗體包含重鏈Fc區,例如IgG1,IgG2或IgG4同種型的Fc區。在一個實施方案中,本發明抗體含有IgG4-Fc區,其中在胺基酸殘基228位置(EU編號)具有絲胺酸至脯胺酸突變(S228P)。在再一較佳實施方案中,本發明抗體包含IgG4-PAA Fc部分。該IgG4-PAA Fc部分在位置228具有絲胺酸至脯胺酸突變(S228P),並且在位置234(EU編號)具有苯丙胺酸至丙胺酸突變,在位置235(EU編號)具有亮胺酸至丙胺酸突變。S228P突變是腫瘤恆定區的鉸鏈區的突變,可以減少或消除重鏈間二硫橋異質性。F234A和L235A突變可以進一步降低
(已經具有低效應子功能的)人IgG4同種型的效應子功能。在一些實施方案中,本發明抗體含有去除了重鏈C末端賴胺酸(des-Lys)的IgG4-PAA Fc部分。在一些實施方案中,本發明抗體包含κ輕鏈恆定區,例如人κ輕鏈恆定區。
在再一較佳的實施方案中,Fc區包含SEQ ID NO:68的胺基酸序列,或相對於SEQ ID NO:68的胺基酸序列包含至少一個,兩個或三個,但不超過20個、10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列,或與SEQ ID NO:68的胺基酸序列具有至少95-99%同一性的序列。
在一個較佳的實施方案中,本發明抗體包含輕鏈恆定區。在一個較佳實施方案中,輕鏈恆定區為人κ輕鏈恆定區。在再一較佳實施方案中,輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:69的胺基酸序列,或相對於SEQ ID NO:69的胺基酸序列包含至少一個,兩個或三個,但不超過20個、10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列,或與SEQ ID NO:68的胺基酸序列具有至少95-99%同一性的序列。
在一些較佳的實施方案中,本發明抗體包含重鏈,並且所述重鏈包含選自SEQ ID NO:44、45、46、47、48和49的胺基酸序列、或相對於其包含至少一個,兩個或三個,但不超過20個,10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列,或與其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。較佳地,胺基酸改變不發生在CDR區中,更佳地,不發生在可變區中。
在一些較佳的實施方案中,本發明抗體包含輕鏈,並且所述輕鏈包含選自SEQ ID NO:63、64、65、66和67的胺基酸序列、或相對於其包含至少一個,兩個或三個,但不超過20個,10個或5個胺基酸改
變的胺基酸序列,或與其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。較佳地,胺基酸改變不發生在CDR區中,更佳地,不發生在可變區中。
在一個較佳實施方案中,本發明的抗體包含選自以下的重鏈序列和/或輕鏈序列:(a)包含SEQ ID NO:44的胺基酸序列的重鏈序列或其變體,和/或包含SEQ ID NO:50的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體;(b)包含SEQ ID NO:45的胺基酸序列的重鏈序列或其變體,和/或包含SEQ ID NO:50的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體;(c)包含SEQ ID NO:46的胺基酸序列的重鏈序列或其變體,和/或包含SEQ ID NO:51的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體;(d)包含SEQ ID NO:47的胺基酸序列的重鏈序列或其變體,和/或包含SEQ ID NO:52的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體;(e)包含SEQ ID NO:48的胺基酸序列的重鏈序列或其變體,和/或包含SEQ ID NO:53的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體;(d)包含SEQ ID NO:49的胺基酸序列的重鏈序列或其變體,和/或包含SEQ ID NO:54的胺基酸序列的輕鏈序列或其變體,其中所述變體與對應的參考序列相比包含至少一個,兩個或三個,但不超過20個,10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列,或具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。較佳地,胺基酸改變不發生在CDR區,更佳地不發生在可變區。
在一個實施方案中,在抗體的恆定區中進行殘基修飾,以例如改變抗體的性質,例如效應子功能。
示例性抗體序列
本發明提供了如實施例中分離並表徵的特異性結合LAG-3(例如人LAG-3)的全人源抗體。下表3中列出了本發明這些示例性抗體的抗體可變區VH和VL序列。下表1和2中列出了抗體的示例性CDR序列。
抗體變體
在一方面,本發明提供在本文中所述及的任何抗體,尤其是表3所列示例性抗體,的變體。在一個實施方案中,抗體變體保持改變前抗體的至少60%,70%,80%,90%,或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。在一些實施方案中,所述改變不導致抗體變體喪失對抗原的結合,但視需要地可以賦予諸如提高的抗原親和力和不同的效應子功能等性質。
可以理解的,抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區、或各CDR區可以單獨改變或組合改變。在一些實施方案中,在一個或多個或全部三個重鏈CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個。較佳地,所述胺基酸改變為胺基酸取代,較佳保守取代。在一些實施方案中,在一個或多個或全部三個輕鏈CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個。在一些實施方案中,在一個或多個或全部6個CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個。較佳地,所述胺基酸改變為胺基酸取代,較佳保守取代。在一些實施方案中,抗體變體與參考抗體在目標抗體序列區域上具有至少80%、85%、90%或95%或99%或更高的胺基酸同一性。例如,在一個實施方案中,本發明抗體,與參考抗體(例如表3所列抗體之一)相比,在3個重鏈CDR區域上具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的同一性。在一個實施方案中,本發明抗體,與參考抗體(例如表3
所列抗體之一相比),在3個輕鏈CDR區域上具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的同一性。在另一實施方案中,本發明抗體,與參考抗體(例如表3所列抗體之一相比),在6個CDR區域上具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的同一性。在再一實施方案中,本發明抗體,與參考抗體(例如表3所列抗體之一)相比,在重鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。在再一實施方案中,本發明抗體,與參考抗體(例如表3所列抗體之一)相比,在輕鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。在再一實施方案中,本發明抗體,與參考抗體(例如表3所列抗體之一)相比,在重鏈可變區和/或輕鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。
此外,可以對抗體的Fc區進行改變。Fc區的改變可以單獨進行,或與上述對構架和/或CDR區的改變相組合。可以改變Fc區,例如,以改變抗體的一種或多種功能,例如血清半衰期,補體固定、Fc受體結合、和/或抗原依賴性細胞毒性。此外,還可以對本發明抗體進行化學修飾(例如,與PEG連接)或改變其糖基化模式。
在某些實施方案中,Fc區可以包含具有一個或多個提高ADCC活性的胺基酸置換的Fc-區,例如,Fc-區的位置298、333和/或334的置換(殘基的EU編號)。在一些實施方案中,也可以對Fc-區進行改變,以導致改變的(即,提高的或降低的)C1q結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)(參見,例如,US6,194,551、WO99/51642和Idusogie,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184)。
在另一些實施方案中,可以對Fc進行改變以增加或降低其糖基化程度和/或改變其糖基化模式。對Fc的糖基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點而方便地實現。舉例而言,可實施一或多種胺基酸取代以消除一或多個糖基化位點,由此消除該位點處的糖基化。可製備具有改變類型的糖基化的抗體,例如具有減小量的岩藻糖基殘基的低或無岩藻糖化抗體或具有增加的等分GlcNac結構的抗體。這類改變的糖基化模式已顯示可增加抗體的ADCC能力。本發明也考慮在與Fc區連接的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。這些抗體變體可具有提高的CDC功能。
在某些實施方案中,本發明也考慮具有一些但非所有效應子功能的抗體變體,這使其成為某些應用的理想候選物,在所述應用中抗體的體內半衰期是重要的,但某些效應子功能(如補體和ADCC)是不必要或有害的。例如,Fc區可以包含消除或減弱效應子功能的突變,例如具有突變P329G和/或L234A和L235A的人IgG1 Fc區,或具有突變P329G和/或S228P和L235E的人IgG4 Fc區。
在某些實施方案中,可能需要產生經半胱胺酸工程改造的抗體,例如“硫代MAb”,其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基置換。例如,可以改變抗體鉸鏈區中的半胱胺酸殘基數目,以例如利於輕鏈和重鏈的裝配或增加或降低抗體的穩定性。殘基例如美國專利號5,677,425。
在某些實施方案中,本文中所提供的抗體可進一步經修飾為含有非蛋白質部分。適合抗體衍生的部分包括,但不限於,水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括,但不限於,聚乙二醇(PEG),以例如增
加抗體的(例如血清)半衰期。用於蛋白質PEG化的方法是本領域已知的,可以將其應用於本發明的抗體。參見例如EP 0154 316和EP 0401384。
本發明提供編碼以上任何抗LAG-3抗體或其片段的核酸。還提供包含所述核酸的載體。在一個實施方案中,載體是表達載體。還提供包含所述核酸或所述載體的宿主細胞。在一個實施方案中,宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中,宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞或293細胞)。在另一個實施方案中,宿主細胞是原核的。
在一方面,本發明提供編碼以上任何抗LAG-3抗體或其片段的核酸。所述核酸可以包含編碼抗體的輕鏈可變區和/或重鏈可變區的胺基酸序列的核酸,或包含編碼抗體的輕鏈和/或重鏈的胺基酸序列的核酸。示例性的編碼抗體重鏈可變區的核酸序列包含與選自SEQ ID NO:57、58、59、60、61或62的核酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的核酸序列,或者包含選自57、58、59、60、61或62的核酸序列。示例性的編碼抗體輕鏈可變區的核酸序列包括與選自SEQ ID NO:50,51,52,53、或54的核酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的核酸序列,或者包括選自SEQ ID NO:50、51、52、53、或54的核酸序列。從適宜的表達載體表達時,由這些多核苷酸編碼的多肽能夠顯示LAG-3抗原結合能力。
本發明中還提供多核苷酸,所述多核苷酸編碼來自上文所述的結合LAG-3的抗體的重鏈VH或輕鏈VL序列的至少一個CDR區和通常全部三個CDR區。一些進一步的實施方案中,多核苷酸編碼上文所述的結合LAG-3的抗體的重鏈和/或輕鏈的完整或基本上完整可變區序列。
如本領域技術人員明瞭的,因為密碼子簡並性,每一個抗體或多肽胺基酸序列可以由多種核酸序列編碼。
在一個較佳實施方案中,編碼抗體的本發明核酸還包含編碼重鏈Fc區的核苷酸序列,例如SEQ ID NO:68中所示的Fc區序列或與其基本相同的序列。
在一個較佳實施方案中,編碼抗體的本發明核酸還包含編碼輕鏈恆定區序列的核苷酸序列,例如SEQ ID NO:69中所示的序列或與其基本相同的序列。
可以採用本領域熟知的方法,藉由從頭固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼結合LAG-3的抗體或其結合片段的現有序列(例如,SEQ ID NO:57-67中所示的序列),產生這些多核苷酸序列。
在一個實施方案中,提供包含本發明核酸的一個或多個載體。在一個實施方案中,載體是表達載體,例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、粘粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。在較佳的實施方案中,本發明的表達載體是pTT5表達載體。
在一個實施方案中,提供包含所述載體的宿主細胞。用於選殖或表達編碼抗體的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如,抗體可在細菌中產生,特別當不需要糖基化和Fc效應子功能時。對於抗體片段和多肽在細菌中的表達,見,例如,美國專利號5,648,237,5,789,199和5,840,523,還見Charlton,Methods in Molecular Biology,卷248(B.K.C.Lo,編輯,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254頁,其描述抗體片段在大腸桿菌中的表達)。在表達後,抗體可以從可溶級分中的細菌細胞糊狀物分離,並且可以進一步純化。
在一個實施方案中,宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中,宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。例如,真核微生物諸如絲狀真菌或酵母是關於編碼抗體的載體的合適純株或表達宿主。例如,糖基化途徑已經進行“人源化”的真菌和酵母菌株導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體。參見Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。適於表達糖基化抗體的宿主細胞也衍生自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。也可以將脊椎動物細胞用作宿主。例如,可以使用被改造以適合於懸浮生長的哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系的其它實例是用SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7);人胚腎系(293HEK或293細胞,如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所描述的)等。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:216(1980));以及骨髓瘤細胞系如Y0,NS0和Sp2/0。關於適合產生抗體的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述見例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,卷248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268頁(2003)。
在一個實施方案中,提供了製備抗LAG-3抗體的方法,其中所述方法包括,在適合抗體表達的條件下,培養包含編碼所述抗體的核酸的宿主細胞,如上文所提供的,和視需要地從所述宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收所述抗體。為了重組產生抗LAG-3抗體,分離編碼抗體(例如上文所描述的抗體)的核酸,並將其插入一個或多個載體,用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸易於使用常規規程分離和測序(例如藉
由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針進行)。
可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗LAG-3抗體鑒定,篩選,或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。
一方面,對本發明的抗體測試其抗原結合活性。例如,可以藉由本領域已知的方法,諸如ELISA,Western印跡等,或本文實施例公開的例示性方法,來測定與人LAG-3的結合。例如,可以使用流式細胞術進行測定,其中抗體與表達人LAG-3的細胞系,例如經轉染在細胞表面上表達人LAG-3的HEK293細胞,進行反應。其它的細胞也適用於流式細胞術,包括表達天然LAG-3的激活的CD4+ T細胞。備選地,抗體的結合,包括結合動力學(例如KD值),可以使用重組LAG-3蛋白,在生物光干涉測定法中測定。在一些實施方案中,使用生物光干涉測定法(例如Fortebio親和測量)。
另一方面,可使用競爭測定法來鑒定與本文中公開的任何抗LAG-3抗體競爭對LAG-3的結合的抗體。在某些實施方案中,此類競爭性抗體結合與本文中公開的任何抗LAG-3抗體所結合表位相同或重疊的表位(例如線性或構象表位)。用於定位抗體所結合表位的詳細例示性方法見Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。
本發明還提供了用於鑒定具有生物學活性的抗LAG-3抗體的測定法。生物學活性可以包括例如結合LAG-3(例如結合人LAG-3),阻斷LAG-3(例如結合人LAG-3)與細胞表面MHC II類分子結合、結合激活的CD4+和/或CD8+ T細胞、抑制腫瘤生長。例如,在體內腫瘤抑制模型
中(參見例如實施例8),測試抗體抑制腫瘤生長的能力。在本發明也提供在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。
可以理解的是,能夠使用本發明的免疫綴合物或多特異性抗體替換或補充抗LAG-3抗體來進行任何上述測定。
在再一方面,本發明提供特異性地結合LAG-3(較佳人LAG-3)的多特異性(包括雙特異性)抗體分子。在一個實施方案中,在多特異性抗體中,本發明的抗體(或其抗原結合片段)形成針對LAG-3的第一結合特異性。在再一實施方案中,所述多特異性抗體還針對以下一種的第二特異性、或還包含針對以下兩種分子的第二和第三結合特異性:PD-1、TIM-3、CEACAM(例如、CEACAM-1或CEACAM-5)、PD-L1或PD-L2。在再一實施方案中,所述多特異性抗體是結合LAG-3和PD-1、結合LAG-3和PD-L1、或結合LAG-3和PD-L2的雙特異性抗體。
在一個實施方案中,結合特異性由抗體的“結合位點”或“抗原結合位點”(抗體分子中與抗原實際結合的區域)提供。在一個較佳的實施方案中,抗原結合位點由抗體輕鏈可變結構域(VL)和抗體重鏈可變結構域(VH)組成的VH/VL對構成。因此,在一個實施方案中,“多特異性”抗體是具有至少兩個抗原結合位點的抗體,所述至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點可以與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。
有關多特異性抗體及其製備,可以參見例如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793中的描述。
再一方面,本發明提供藉由將本發明抗體綴合於異源分子而產生的免疫綴合物。在一個實施方案中,在免疫綴合物中,本發明的抗體(或其抗原結合片段)與治療劑或診斷劑。在一些實施方案中,本發明抗體可以以全長抗體或抗體片段的形式與異源分子綴合。例如,以Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、單鏈scFab抗體、單鏈scFv等片段形式進行綴合。
可以使用接頭來共價連接綴合物的不同實體。適宜的接頭包括化學接頭或肽接頭。有利地的是,接頭是利於多肽在遞送至靶位點後釋放的“可裂解接頭”。例如,可以使用酸不穩定性接頭、肽酶敏感性接頭、光不穩定性接頭、二甲基接頭或含二硫化物的接頭(Chari等,Cancer Research 52(1992)127-131;US 5,208,020)。
適用於綴合物中的治療劑包括但不限於細胞毒素(例如細胞生長抑制劑或細胞殺傷劑),藥物或放射性同位素。適合於形成免疫綴合物的細胞毒性劑(例如化療劑)的例子是本領域中已知的,參見例如WO05/103081。例如,細胞毒性劑包括但不限於:放射性同位素;生長抑制劑;酶及其片段如核酸水解酶;抗生素;毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物起源的酶促活性毒素,包括其片段和/或變體;和已知的各種抗腫瘤或抗癌劑。
再一方面,本發明的抗體可以與診斷劑或可檢測劑綴合。這類綴合物可以作為臨床檢驗方法的部分(如確定特定療法的效力),用於監測或預測疾病或病症的發作、形成、進展和/或嚴重性。可以藉由將抗體與可檢測劑偶聯實現這類診斷和檢測,所述可檢測劑包括但不限於多種酶,如但不限於辣根過氧化物酶;輔基,如但不限於鏈黴親和素/生物素和抗生
物素蛋白/生物素;螢光物質;發光物質;放射性物質;和用於各種正電子發射成像術中的正電子發射金屬和非放射性順磁金屬離子。
本發明還包括包含抗LAG-3抗體或其免疫綴合物或多特異性抗體的組合物(包括醫藥組成物或藥物製劑)和包含編碼抗LAG-3抗體或其免疫綴合物或多特異性抗體的多核苷酸的組合物。這些組合物還可以視需要地包含合適的藥用輔料,如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑,包括緩衝劑。在一個實施方案中,組合物還包含第二治療劑,較佳地,抗PD-1抗體。
適用於本發明的藥用載體可以是無菌液體,如水和油,包括那些具有石油、動物、植物或合成起源的,如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用醫藥組成物時,水是較佳的載體。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載體,特別是用於可注射溶液。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途,亦參見“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的話,所述組合物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑,或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、持續釋放配製劑等的形式。口服配製劑可以包含標準載體,如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精。
可以藉由將具有所需純度的本發明的抗LAG-3抗體、免疫綴合物或多特異性抗體,與一種或多種視需要的藥用輔料(Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.編(1980))混合,來製備包含本發明的藥物製劑,較佳地以凍乾製劑或水溶液的形式。
示例性的凍乾抗體製劑描述於美國專利號6,267,958。水性抗體製劑包括美國專利號6,171,586和WO2006/044908中所述的那些,後一種製劑包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含一種或多種其它活性成分,所述活性成分是被治療的特定適應症所需的,較佳具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。例如,理想的是還提供其它抗癌活性成分,例如化療劑、PD-1軸結合拮抗劑(例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體)或者抗血管發生劑(例如貝伐珠單抗)。所述活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質,所述基質呈成形物品,例如薄膜或微囊形式。
關於藥物製劑的其它組分,還可以參見WO2015/153513中公開的那些。
在一些實施方案中,本發明還提供了組合產品,其包含本發明的抗體或其抗原結合片段,以及或其片段或其免疫綴合物,以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑等)。在一些實施方案中,其它抗體例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體。
在一些實施方案中,所述組合產品用於預防或治療腫瘤。在一些實施方案中,腫瘤為癌症,例如胃腸道癌症,例如胃癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌等;或皮膚癌,例如惡性黑素瘤。在一些實施方案中,所述組合產品用於預防或治療感染,例如細菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染等。
在本文中,術語“個體”或“對象”可互換地使用,是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如,奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如,人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如,小鼠和大鼠)。特別地,對象是人。
在本文中,術語“治療”指意欲改變正在接受治療的個體中疾病之天然過程的臨床介入。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態,以及緩解或改善預後。
在一方面中,本發明涉及在受試者中增強機體的免疫應答的方法,所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文所述的任何抗LAG-3抗體或其片段,或包含所述抗體或片段的免疫綴合物、多特異性抗體,或醫藥組成物。在一些實施方案,將本發明的抗LAG-3抗體或其抗原結合部分施用於攜帶腫瘤的受試者,刺激抗腫瘤免疫應答。在另一些實施方案中,將本發明的抗體或其抗原結合部分施用於攜帶感染的受試者,刺激抗感染免疫應答。
在另一方面中,本發明涉及治療受試者腫瘤,例如癌症的方法,所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文所述的任何抗LAG-3抗
體或其片段,或包含所述抗體或片段的免疫綴合物、多特異性抗體,或醫藥組成物。
在一些實施方案中,本文所述的腫瘤,例如癌症,包括但不限於實體瘤、血液學癌(例如,白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)及其轉移性病灶。在一個實施方案中,癌症是實體瘤。實體瘤的例子包括惡性腫瘤,例如,多個器官系統的肉瘤和癌(例如,腺癌),如侵襲肺、乳腺、淋巴、胃腸道或結直腸、生殖器和生殖泌尿道(例如,腎細胞、膀胱細胞、膀胱細胞)、咽、CNS(例如,腦細胞、神經細胞或神經膠質細胞)、皮膚(例如,黑素瘤)、頭部和頸部(例如,頭頸鱗狀細胞癌(HNCC))和胰的那些。例如,黑素瘤、結腸癌、胃癌、直腸癌、腎細胞癌、乳腺癌(例如,不表達一種、兩種或全部雌激素受體、孕酮受體或Her2/neu的乳腺癌,例如,三陰性乳腺癌)、肝癌、肺癌(例如,非小細胞肺癌(NSCLC)(例如,具有鱗狀和/或非鱗狀結構的NSCLC)或小細胞肝癌)、前列腺癌、頭部或頸部癌(例如,HPV+鱗狀細胞癌)、小腸癌和食道癌。血液學癌的例子包括但不限於白血病(例如,髓樣白血病、淋巴樣白血病或慢性淋巴細胞白血病(CLL))、淋巴瘤(例如,霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、T細胞淋巴瘤或套細胞淋巴瘤(MCL))和骨髓瘤,例如,多發性骨髓瘤。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。
在一個實施方案中,癌症是胃腸道癌症如結腸癌,或皮膚癌如惡性黑素瘤等。
在另一方面中,本發明涉及治療受試者感染性疾病,例如慢性感染的方法,所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文所述的任何抗LAG-3抗體或其片段,或包含所述抗體或片段的免疫綴合物、多特異性抗體,或醫藥組成物。在一個實施方案中,所述感染是病毒感染。
在一些實施方案中,所述感染性疾病是由於病毒感染引起的。致病性病毒的一些例子包括(甲型、乙型和丙型)肝炎病毒、(甲型、乙型和丙型)流感病毒、HIV、皰疹病毒(例如,VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV、Epstein Barr病毒+)、腺病毒、黃病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞體病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革病毒、乳頭狀瘤、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和蟲媒腦炎病毒。
適於用本發明的抗LAG-3的抗體或其片段、免疫綴合物和多特異性抗體預防或治療的疾病可進一步參見WO2015/138920、WO2016/028672、WO2015/042246等。
一些實施方案中,本文所述的方法還包括向所述受試者聯合施用一種或多種療法(例如治療方式和/或其它治療劑)。在一些實施方案中,治療方式包括手術治療和/或放射療法。
在一些實施方案中,除了施用本發明抗體外,本發明方法還包括施用至少一種其它的免疫刺激性抗體,例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、和/或抗CTLA-1抗體,這些抗體可以是例如全人源的、嵌合的、或人源化的抗體。
在另一些實施方案中,其它治療劑選自化療劑、PD-1軸結合拮抗劑(例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體)或者抗血管發生劑(例如貝伐珠單抗)。
在一些實施方案中,PD-1軸結合拮抗劑包括但不限於PD-1結合拮抗劑,PD-L1結合拮抗劑和PD-L2結合拮抗劑。"PD-1"的備選名稱包括CD279和SLEB2。"PD-L1"的備選名稱包括B7-H1、B7-4、CD274
和B7-H。"PD-L2"的備選名稱包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些實施方案中,PD-1、PD-L1和PD-L2是人PD-1、PD-L1和PD-L2。在一些實施方案中,PD-1結合拮抗劑是抑制PD-1結合其配體結合配偶的分子。在一個具體方面,PD-1配體結合配偶是PD-L1和/或PD-L2。在另一個實施方案中,PD-L1結合拮抗劑是抑制PD-L1結合其結合配偶的分子。在一個具體方面,PD-L1結合配偶是PD-1和/或B7.1。在另一個實施方案中,PD-L2結合拮抗劑是抑制PD-L2結合其結合配偶的分子。在一個具體方面,PD-L2結合配偶是PD-1。拮抗劑可以是抗體,其抗原結合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。在一些實施方案中,PD-1結合拮抗劑是抗PD-1抗體(例如人抗體,人源化抗體,或嵌合抗體)。
在一些實施方案中,抗PD-1抗體選自下組:MDX-1106(納武單抗(nivolumab),OPDIVO),Merck 3475(MK-3475,匹博利珠單抗(pembrolizumab),KEYTRUDA)和CT-011(匹地利珠單抗(Pidilizumab))。在一些實施方案中,抗PD-1抗體是MDX-1106。在一些實施方案中,抗PD-1抗體是納武單抗(CAS註冊號:946414-94-4)。在較佳的實施方案中,抗PD-1抗體是本文所述的“Antibody D”。
在進一步的一些實施方案中,單獨或與PD-1軸結合拮抗劑組合的抗LAG-3抗體或其片段還能與一種或多種其它療法例如治療方式和/或其它治療劑組合施用。在一些實施方案中,治療方式包括外科手術(例如腫瘤切除術);放射療法(例如,外粒子束療法,它涉及其中設計照射區域的三維適形放射療法)、局部照射(例如,指向預選靶或器官的照射)或聚焦照射等。
在一些實施方案中,本發明的抗LAG-3抗體或其片段可以與化療或化療劑聯合施用。在一些實施方案中,本發明的抗LAG-3抗體或
其片段可以與放療或放療劑聯合施用。在一些實施方案中,本發明的抗LAG-3抗體或其片段可以與靶向療法或靶向治療劑聯合施用。在一些實施方案中,本發明的抗LAG-3抗體或其片段可以與免疫療法或免疫治療劑,例如單株抗體聯合施用。
本發明的抗體(以及包含其的醫藥組成物或免疫綴合物,以及任何另外的治療劑)可以藉由任何合適的方法給藥,包括腸胃外給藥,肺內給藥和鼻內給藥,並且,如果局部治療需要,病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定,可藉由任何適合途徑,例如藉由注射,例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程,包括,但不限於,單次給藥或在多個時間點多次給藥、推注給藥及脈衝輸注。
為了預防或治療疾病,本發明的抗體的合適劑量(當單獨或與一種或多種其他的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重性和進程、所述抗體是以預防目的施用還是以治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對所述抗體的應答,和主治醫師的判斷力。所述抗體以一次治療或經過一系列治療合適地施用於患者。
在上述本發明方法中,可以替代本發明抗體或抗原結合部分,施用本發明的組合物、多特異性抗體或免疫綴合物。或者,在這些方法中,除了施用本發明抗體或抗原結合部分,還可以進一步施用本發明的組合物、多特異性抗體或免疫綴合物。
再一方面,本發明提供本發明抗LAG-3抗體、組合物、免疫綴合物、多特異性抗體在製備用於前述方法(例如用於治療)的藥物中的用途。
再一方面,本發明涉及檢測樣品中LAG-3的方法和試劑盒,其中所述方法包括:(a)將所述樣品與本發明抗體或其抗原結合片段或免疫綴合物接觸;和(b)檢測所述抗體或其抗原結合片段或免疫綴合物和LAG-3蛋白之間複合物的形成。在一些實施方案中,樣品來自癌症患者,例如皮膚癌患者。所述檢測可以是體外的或體內的。
術語“檢測”用於本文中時,包括定量或定性檢測,示例性的檢測方法可以涉及免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術(例如,FACS)、抗體分子複合的磁珠、ELISA測定法、PCR-技術(例如,RT-PCR)。在某些實施方案中,生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。在某些實施方案中,生物樣品包含細胞或組織。在一些實施方案中,生物樣品來自過度增生性或癌性病灶。在某些實施方案中,待檢測的LAG-3是人LAG-3。
在一個實施方案中,抗LAG-3抗體被用於選擇適合利用抗LAG-3抗體的治療的對象,例如其中LAG-3是用於選擇所述對象的生物標記物。在一個實施方案中,可以使用本發明抗體診斷癌症或腫瘤,例如評價(例如,監測)對象中本文所述疾病(例如,過度增生性或癌性疾病)的治療或進展、其診斷和/或分期。
在某些實施方案中,提供標記的抗LAG-3抗體。標記包括但不限於,被直接檢測的標記或部分(如螢光標記、發色團標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記),以及被間接檢測的部分,如酶或配體,例如,藉由酶促反應或分子相互作用。示例性標記包括但不限於,放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I,螢光團如稀土螯合物或螢光素及其衍生物,羅丹明及其衍生物,丹醯(dansyl),傘形酮(umbelliferone),螢光素酶(luceriferase),例如,螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利號
4,737,456),螢光素,2,3-二氫酞嗪二酮,辣根過氧化物酶(HR),鹼性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,葡糖澱粉酶,溶解酶,糖類氧化酶,例如,葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶,雜環氧化酶如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶,以及利用過氧化氫氧化染料前體的酶如HR,乳過氧化物酶,或微過氧化物酶(microperoxidase),生物素/親和素,自旋標記,噬菌體標記,穩定的自由基等等。
描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。
本發明下面實施例涉及6個示例性抗體(ADI-26818,ADI-26822,ADI-26836,ADI-31798,ADI-31815及ADI-31836),這些抗體的CDR區、輕鏈可變區和重鏈可變區、輕鏈和重鏈的胺基酸序列,以及對應的核苷酸序列在本申請的表1-3和序列表中列出。另外,上述本發明示例抗體的輕鏈恆定區、重鏈恆定區、輕鏈可變區和重鏈可變區的序列編號如表5所示。
酵母展示技術篩選抗LAG-3全人源抗體
基於酵母的抗體展示(yeast-based antibody presentation)文庫(Adimab),按照現有的方法(WO2009036379;WO2010105256;WO2012009568)進行擴增,其中每個庫的多樣性達到1×109。簡言之,前兩輪的篩選使用Miltenyi公司的MACS系統進行磁性激活細胞分選。首先,將文庫的酵母細胞(~1×1010細胞/文庫)分別在FACS洗滌緩衝液中(磷酸鹽緩衝液,含有0.1%牛血清蛋白)室溫孵化15分鐘,緩衝液中含有100nM生物素標記的人LAG-3抗原(Aero Biosystems,目錄號LA3-H5255-1mg)。使用50ml預冷的FACS洗滌緩衝液洗一次,再用40ml相同洗滌緩衝液重懸細胞,並加入500μl鏈黴親和素微珠(Miltenyi LS)於4℃孵化15分鐘。1000rpm離心5min棄去上清後用5ml FACS洗滌緩衝液重懸細胞,將細胞溶液加到Miltenyi LS管柱中。加樣完成後,用FACS洗滌緩衝液洗管柱3次,每次3ml。從磁性區域取下Miltenyi LS
管柱,用5ml生長培養基洗脫,收集洗脫的酵母細胞並在37℃過夜生長。
使用流式細胞儀進行下一輪的分選:將經過MACS系統篩選獲得的大約1×108的酵母細胞用FACS緩衝液洗三次,於含有低濃度生物素(100-1nM)標記的人LAG-3抗原中室溫下培養。棄去培養液,細胞用FACS洗滌緩衝液洗兩次之後,將細胞與LC-FITC(FITC標記的抗人免疫球蛋白kappa輕鏈抗體,Southern Biotech)(1:100稀釋)混合,並與SA-633(鏈黴親和素-633,Molecular Probes)(1:500稀釋)或SA-PE(鏈黴親和素-PE,Sigma)(1:50稀釋)試劑混合,4℃下培養15分鐘。用預冷的FACS洗滌緩衝液洗脫兩次,並重懸於0.4ml緩衝液中,將細胞轉移到帶濾器的分離管中。使用FACS ARIA(BD Biosciences)分選細胞。
將藉由篩選獲得的表達抗人LAG-3抗體的酵母細胞在30℃下震盪誘導48小時以表達抗人LAG-3的抗體。誘導結束之後,1300rpm離心10min去除酵母細胞,收獲上清液。使用Protein A對上清液中的抗人LAG-3抗體進行純化,pH2.0醋酸溶液洗脫,收獲抗人LAG-3抗體,抗體純度>95%。
經篩選獲得抗體ADI-26818、ADI-26822及ADI-26836。
為了獲得更高親和力的抗人LAG-3抗體,我們藉由以下方法對抗體ADI-26818、ADI-26822及ADI-26836進行了優化。
VHmut篩選
該方法是藉由常規的錯配PCR的方法向抗體重鏈區域引入突變。PCR過程中,藉由使用1uM高突變的鹼基類似物dPTP和8-oxo-dGTP,從而將鹼基錯配概率提高至約0.01bp。
獲得的錯配PCR的產物藉由同源重組的方法構建入含有重鏈恆定區的載體中。藉由這種方法,在包括LAG-3抗原滴度、未標記抗原競爭以及使用母抗體競爭的篩選壓力下,我們獲得了庫容量為1×107的次級庫。藉由FACS方法進行了3輪成功篩選。
CDRH1/CDRH2篩選
把VHmut方法獲得的子代抗體的CDRH3基因構建入1×108多樣性的CDRH1/CDRH2基因庫中,並對其進行了3輪篩選。第一輪使用MACS方法,而第二、三輪使用FACS方法,對抗體抗原結合物進行親和力加壓,篩選出最高親和力的抗體。
經過以上親和力成熟過程,我們獲得了親和力提高的抗人LAG-3單株抗體ADI-31798、ADI-31815和ADI-31836。
根據本領域常規方法,從表達上述抗人LAG-3抗體的酵母細胞獲得編碼抗LAG-3抗體的基因DNA,並根據常規方法將該基因DNA選殖到新的表達載體(pTT5)。
將含有目標抗體基因的上述表達載體與轉染試劑PEI(Polysciences)按照生產產商提供的方案瞬時轉染培養的人腎胚細胞293細胞(Invitrogen)。轉染後,棄去培養基並用新鮮的培養基把細胞稀釋到4×106/ml。在37℃,5% CO2的條件下培養細胞7天,每48小時流
加新鮮培養基。7天後,1300rpm離心20min。取上清液,用Protein A純化上清液,使抗體的純度>95%。獲得具有IgG4-PAA Fc部分(SEQ ID No:68)的IgG4抗體。
25F7是在HEK293細胞中瞬時表達的人LAG-3抗體,其序列與美國專利US20170137514A1中的抗體“25F7”的序列相同。具有IgG4-PAA Fc部分(SEQ ID No:68)的25F7抗體的全長重鏈和輕鏈如SEQ ID No:55和SEQ ID NO:56所示。
採用生物光干涉測量(ForteBio)測定法測定本發明上述6個示例抗體結合人LAG-3(hLAG-3)的平衡解離常數(KD)。
ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人,High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)進行。簡言之,傳感器在分析緩衝液中線下平衡30分鐘,然後線上檢測60秒建立基線,在線加載如上所述獲得的經純化的抗體至AHQ傳感器(ForteBio)上進行ForteBio親和測量。再將具有加載的抗體的傳感器暴露於100nM的LAG-3抗原中作用5分鐘,之後將傳感器轉移至分析緩衝液解離5分鐘用於解離速率測量。使用1:1結合模型進行動力學的分析。
在如以上測定法所述進行的實驗中,ADI-26818、ADI-26822、ADI-26836、ADI-31798、ADI-31815、ADI-31836以及參考抗體25F7親和力如表6所示。
可見,本發明上述6個示例抗體均顯示極高的親和力,其中ADI-31798、ADI-31815及ADI-31836具有比25F7更高的親和力。
在基於流式細胞術的測定法中測量本發明的上述6個示例抗體與人LAG-3的結合。
藉由轉染攜帶純株至多選殖位點MCS的人LAG-3 cDNA(Sino Biological)的pCHO1.0載體(Invitrogen),產生過表達人LAG-3的293細胞(293-hLAG-3細胞)。
將293-hLAG-3細胞(0.2×106個細胞)與不同濃度的實驗抗體(ADI-26818、ADI-26822、ADI-26836、ADI-31798、ADI-31815、ADI-31836及參考抗體25F7)混合(抗體稀釋方法為:最高抗體濃度為500nM,三倍稀釋在含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中,總共測試了8個濃度)。冰上孵育30分鐘。然後將細胞洗滌至少兩次,加入1:100稀釋的二抗(PE標記的羊抗人IgG抗體,SouthernBiotech,終濃度為5μg/ml),冰上(避光)孵育30分鐘。將細胞洗滌至少兩次並藉由流式細胞術進行分析。在Accuri C6系統(BD Biosciences)上進行流式細胞術檢測,並根據其MFI擬合濃度依賴的曲線。
ADI-26818、ADI-26822和ADI-26836結合HEK293細胞上過表達的hLAG-3,EC50值分別為1.181nM、1.500nM和1.437nM,與參考抗體25F7與HEK293細胞上過表達的hLAG-3的結合能力相當(參考抗體25F7的EC50值為3.339nM)(參見第1圖)。
在如以上測試法所述進行的實驗中,親和力優化的抗hLAG-3抗體ADI-31798、ADI-31815及ADI-31836結合HEK293細胞上過表達的hLAG-3,EC50值分別為0.201nM、1.293nM和0.562nM,優於參考抗體25F7與HEK293細胞上過表達的hLAG-3的結合能力(EC50值3.339nM)。(參見第2圖)
藉由流式細胞術測量ADI-31798、ADI-31815及ADI-31836
阻斷人LAG-3與細胞表面的MHCII(HLA)結合的能力。
藉由轉染攜帶純株至MCS的人HLA-DR(Sino Biological)的pCHO1.0載體(Invitrogen),產生過表達人HLA-DR的CHO細胞(CHO-DR細胞)。
將抗原rhLAG3蛋白(huFc)(Sino Biological)稀釋至40nM,50μl/孔。加入不同濃度的抗體(ADI-31798、ADI-31815及ADI-31836和參考抗體25F7,從最高濃度80nM開始進行3倍梯度稀釋,共8個稀釋梯度),50μl/孔,於PBS冰上孵育30min,抗原終濃度20nM,抗體最高終濃度40nM。將CHO-DR細胞調節至3×105cell/孔,100μl/孔。細胞於300g離心5min,棄上清,重懸於抗原抗體混合液。冰上孵育30min,加PBS 100μl/孔,300g離心5min,PBS清洗1次,加1:100稀釋的100μl山羊抗人IgG-PE(Southern Biotech)/孔,冰浴20min,加PBS 100μl/孔,300g離心5min,PBS清洗1次。用100μl PBS重懸,細胞流式儀檢測細胞螢光信號值。
實驗結果表明,ADI-31798、ADI-31815及ADI-31836均可以有效阻斷LAG-3和其配體MHCII(HLA-DR)的結合,其阻斷能力和參考抗體25F7相當。具體而言,ADI-31798、ADI-31815及ADI-31836阻斷人LAG-3與MHCII(HLA-DR)的結合的能力的IC50分別為4.701nM、3.575nM及6.657nM。參考抗體25F7阻斷人LAG-3與MHCII(HLA-DR)的結合的能力的IC50為5.141nM。(參見第3圖)
人CD4+ T細胞被激活後其表面會表達LAG-3蛋白,本研
究藉由流式細胞術測量ADI-31798、ADI-31815、ADI-31836和激活的人CD4+ T細胞的結合能力。
按照磁珠/CD4+ T細胞=1:1的比例向CD4+ T細胞中加入抗CD3/CD28磁珠(Gibco)刺激3天,調節細胞密度至1×106個/ml,分裝第一孔150μl/孔,其他孔100μl/孔,第一列孔加抗體,終濃度10nM,混勻,吸取50μl入下一列孔,以此類推。每個樣品做3個複孔。冰浴30min,400g離心5min,PBS清洗2次,添加1:100稀釋的PE-抗人Fc抗體50μl,冰浴30min,400g離心5min,PBS清洗2次,用60μl PBS重懸,藉由流式細胞術進行分析。在Accuri C6系統(BD Biosciences)上進行流式細胞術,並根據其MFI擬合濃度依賴的曲線。
實驗結果表明,ADI-31798、ADI-31815及ADI-31836能和激活的人CD4+T細胞結合,EC50值分別為0.00595nM、0.0128nM和0.0127nM,結合能力優於參考抗體25F7(參考抗體的EC50值為0.0356nM)(參見第4圖)。
本研究採用A375(ATCC)人的惡性黑素瘤皮膚癌細胞在NOG小鼠上測定抗LAG-3抗體的抗腫瘤作用。預先靜脈注射人的PBMC(AllCells),然後採用皮下接種的方式建立A375荷瘤小鼠模型,成瘤後分組,給予不同抗體的治療,監測給藥期間各組小鼠腫瘤體積和體重變化,給藥頻率為2次/週,給藥2週,共給藥5次。監測頻率均為2次/週,連續監測4週,給藥劑量和方式如下所述。給藥結束後計算相對腫瘤抑制率(TGI%),計算公式如下:TGI%=100% *(h-IgG對照組腫瘤體積-治療
組腫瘤體積)/(h-IgG對照組腫瘤體積-h-IgG對照組給藥前腫瘤體積),其中h-IgG對照組給藥前腫瘤體積平均值為71mm3。
小鼠:NOG小鼠,雌性,7-8週(腫瘤細胞接種時的小鼠週齡),體重17.6-24.2g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠在到達後馴化7天,隨後開始研究。
細胞:人的皮膚癌細胞A375(ATCC# CRL-1619)購自ATCC,並嚴格按照ATCC要求進行常規傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞,在無菌PBS中重懸細胞並調整細胞密度為30×106個/ml。NOG小鼠已經靜脈注射了人的PBMC後,右側背部剃毛,皮下注射A375細胞0.2ml/只。腫瘤細胞接種7天後檢測各隻小鼠瘤體積,挑選出瘤平均體積在70-71mm3範圍內的小鼠按瘤體積隨機分組。按如下給藥方式,檢測抗LAG-3抗體單獨使用或與抗PD-1抗體聯合使用的抗腫瘤活性。
給藥:將小鼠分為四組(每組6隻小鼠),每組分別皮下注射如下劑量的抗體:(1)人IgG,20mg/kg;(2)抗PD-1抗體(Antibody D,PCT/CN2016/094122),10mg/kg;(3)LAG-3(ADI-31798),10mg/kg;(4)LAG-3(ADI-31798),10mg/kg+抗PD-1抗體(Antibody D),10mg/kg。
抗PD-1抗體“Antibody D”為PCT/CN2016/094122中公開的抗人抗PD-1抗體。人IgG為獲自Equitech-Bio的人IgG製備物。
在腫瘤細胞接種後的第7天、第10天、第14天、第17天和第21天,分別用如上四組抗體為每組小鼠按如上劑量給藥。
分析:在整個研究期間每週測量兩次腫瘤和體重,當腫瘤達到端點時(腫瘤體積>3000mm3)或當小鼠具有>20%體重減輕時,使小鼠安樂死。採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W),腫瘤體積按如下公式計算:V=L×W2/2。將來自每組的小鼠的腫瘤尺寸與時間作圖。使用方差分析(ANOVA)來確定統計顯著性。<0.05的P值被視為在所有分析中具有統計顯著性。
實驗結果見表7和第5圖,可見本申請的抗LAG-3單株抗體ADI-31798和抗PD-1單株抗體“Antibody D”聯合使用時與IgG對照(equitech-Bio)及這兩個抗體分別使用相比,能顯著抑制腫瘤的生長。
<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司(INNOVENT BIOLOGICS(SUZHOU)CO.,LTD.)
<120> 全人源的抗LAG-3抗體及其應用
<150> CN 201810629554.6
<151> 2018/06/19
<160> 79
<170> PatentIn版本3.3
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<222> (327)..(327)
<223> Xaa可以是任何天然胺基酸
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成序列
Claims (21)
- 一種特異性結合人LAG-3的抗體或其抗原結合片段,其包含(a)SEQ ID NO:4的HCDR1序列,SEQ ID NO:5的HCDR2序列,SEQ ID NO:6的HCDR3序列,SEQ ID NO:22的LCDR1序列,SEQ ID NO:23的LCDR2序列,和SEQ ID NO:24的LCDR3序列;或(b)SEQ ID NO:7的HCDR1序列,SEQ ID NO:8的HCDR2序列,SEQ ID NO:9的HCDR3序列,SEQ ID NO:22的LCDR1序列,SEQ ID NO:23的LCDR2序列,和SEQ ID NO:26的LCDR3序列:或(c)SEQ ID NO:13的HCDR1序列,SEQ ID NO:14的HCDR2序列,SEQ ID NO:15的HCDR3序列,SEQ ID NO:27的LCDR1序列,SEQ ID NO:23的LCDR2序列,和SEQ ID NO:29的LCDR3序列;或(d)SEQ ID NO:72的HCDR1序列;SEQ ID NO:5的HCDR2序列:SEQ ID NO:73的HCDR3序列;SEQ ID NO:22的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:24的LCDR3序列;或(e)SEQ ID NO:74的HCDR1序列;SEQ ID NO:8的HCDR2序列;SEQ ID NO:75的HCDR3序列;SEQ ID NO:22的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:26的LCDR3序列;或(f)SEQ ID NO:78的HCDR1序列;SEQ ID NO:14的HCDR2序列;SEQ ID NO:79的HCDR3序列;SEQ ID NO:27的LCDR1序列;SEQ ID NO:23的LCDR2序列;SEQ ID NO:29的LCDR3序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區: (a)包含SEQ ID NO:34的胺基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:39的胺基酸序列的VL;(b)包含SEQ ID NO:36的胺基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:41的胺基酸序列的VL;(c)包含SEQ ID NO:38的胺基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:43的胺基酸序列的VL。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體是IgG1、IgG2、或IgG4形式的抗體或其抗原結合片段。
- 如申請專利範圍第3項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體具有S228P、F234A和L235A突變的IgG4 Fc區`.
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體是全人源抗體抗體、或人源化抗體、或嵌合抗體。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗原結合片段是選自以下的抗體片段:Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、(Fab’)2片段、單結構域抗體、雙抗體(dAb)或線性抗體。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體具有以下一個或多個特性:(i)以0.5-3nM的KD值,與人LAG-3結合;(ii)與人LAG-3結合的解離常數(Kd)為1×10-4至6×10-4s-1;(iii)以小於1nM或0.5nM的EC50值,與細胞表面表達的人LAG-3結合;(iv)阻斷人LAG-3與細胞表面MHCII分子的結合,且IC50值小於5nM; (v)結合表達人LAG-3的激活的CD4+和/或CD8+ T細胞,且抗體與激活的人CD4+ T細胞結合的EC50值為1-20pM或6-15pM;(vi)刺激抗腫瘤免疫應答;(vii)抑制表達人LAG-3的腫瘤細胞的生長。
- 一種分離的核酸,其編碼如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 一種載體,其包含如申請專利範圍第8項所述的核酸。
- 一種宿主細胞,其包含如申請專利範圍第8項所述的核酸或如申請專利範圍第9項所述的載體,。
- 一種製備抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包括在適於表達編碼如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的核酸的條件下培養包含該核酸的宿主細胞,分離該抗體或其抗原結合片段。
- 一種免疫綴合物,其包含與治療劑或診斷劑綴合的如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 一種包含如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的多特異性抗體。
- 如申請專利範圍第13項所述的抗體或其抗原結合片段的多特異性抗體,其中,該多特異性抗體是結合LAG-3和PD-1,或結合LAG-3和PD-L1,或結合LAG-3和PD-L2的雙特異性抗體。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第12項所述的免疫綴合物或如申請專利範圍第13或14項所述的多特異性抗體,以及藥用載體或藥用賦形劑。
- 如申請專利範圍第15項所述的醫藥組成物,其包含第二治療劑。
- 如申請專利範圍第16項所述的醫藥組成物,其中,該第二治療劑選自抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體
- 一種如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或如申請專利範圍第12項所述的免疫綴合物、或如申請專利範圍第13或14項所述的多特異性抗體、或如申請專利範圍第15至17項中任一項項所述的醫藥組成物的用途,其用於製備預防或治療腫瘤或感染性疾病藥物。
- 如申請專利範圍第18項所述的用途,其中,該腫瘤是皮膚癌。
- 如申請專利範圍第19項所述的用途,其中,該皮膚癌是惡性黑色素瘤。
- 一種檢測樣品中LAG-3的方法,該方法包括(a)將樣品與如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段接觸;和(b)檢測抗LAG-3抗體或其抗原結合片段和LAG-3間的複合物的形成。
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TW201726730A (zh) * | 2015-10-09 | 2017-08-01 | 再生元醫藥公司 | 抗lag3抗體及其用途 |
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