ES2915410T3

ES2915410T3 - Anticuerpo contra LAG-3, fragmento de unión a antígeno del mismo y aplicación farmacéutica del mismo

Info

Publication number: ES2915410T3
Application number: ES17814733T
Authority: ES
Inventors: Zhuoxiao Cao; Yayuan Fu; Qiyue Hu; Weikang Tao; Lianshan Zhang; Piaoyang Sun
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-06-23
Filing date: 2017-06-22
Publication date: 2022-06-22
Anticipated expiration: 2037-06-22
Also published as: AU2017282892A1; EP3476399A4; KR20190021248A; US20190233513A1; JP6998895B2; DK3476399T3; RU2018145852A; EP3476399A1; JP2019518459A; US20220002405A1; RU2018145852A3; CA3024359A1; UA127048C2; WO2017219995A1; EP3476399B1; HUE058657T2; TWI757304B; RU2757813C2; CN108472349B; US11155617B2

Abstract

Un anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde la región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende: HCDR1, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 12, HCDR2, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 13, y HCDR3, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 14; y en donde la región variable de cadena ligera del anticuerpo comprende: LCDR1, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 18, LCDR2, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 19, y LCDR3, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 20; en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo; en donde el anticuerpo comprende una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: 1) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30; 2) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34; 3) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35; 4) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36; 5) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37; 6) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30; 7) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34; 8) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35; 9) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36; 10) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37; 11) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30; 12) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34; 13) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35; 14) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36; 15) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37; 16) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30; 17) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34; 18) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35; 19) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36; y 20) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo contra LAG-3, fragmento de unión a antígeno del mismo y aplicación farmacéutica del mismo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo contra LAG-3 (Lymphocyte Activation Gene-3, gen 3 de activación de linfocitos) humanizado, a un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende las regiones CDR (Complementarity Determining Regions, regiones determinantes de complementariedad) del anticuerpo contra LAG-3, así como a composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo contra LAG-3 y el fragmento de unión a antígeno del mismo, así como a su uso como fármaco antineoplásico.

Antecedentes de la invención

El gen 3 de activación de linfocitos, también conocido como LAG-3 o CD223, es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, que puede actuar como represor de diversas funciones y ciclos de supervivencia de las células inmunitarias. Los estudios han demostrado que LAG-3 desempeña un papel importante en la infección vírica, las enfermedades autoinmunitarias y la disfunción del sistema inmunitario inducida por tumores. La influencia de la función de LAG-3 puede mejorar el estado de la disfunción inmunitaria durante el desarrollo de estas enfermedades, para mejorar el pronóstico de las enfermedades.

Como miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, LAG-3 comprende tres regiones: dominio extracelular, región transmembrana y dominio citoplasmático. La molécula de LAG-3 madura, que fue descubierta por primera vez por Triebel y col. en 1990 (J Exp Med, 1990, 171 [5]: 1393-405), consiste en 470 aminoácidos con un peso molecular relativo de 70 kDa. Se ha descubierto que LAG-3, como CTLA-4 y PD-1, es una molécula coestimuladora negativa, cuya activación puede actuar como represora de la función de los linfocitos. Estructuralmente, LAG-3 está estrechamente relacionado con CD4, pero tiene una función inversa a CD4. Por ejemplo, la molécula de LAG-3 tiene una alta similitud con la molécula de CD4, y ambas pueden unirse a moléculas de clase MHC-II (Major Histocompatibility Complex, complejo mayor de histocompatibilidad). Sin embargo, la avidez de unión de LAG-3 a las moléculas del MHC-II es mayor que la de CD4. Por tanto, interviene en la activación de TCR (T-Cell Receptor, receptor de linfocitos T) inducida por linfocitos T CD4+ e inhiben la activación de linfocitos T (Curr Opin Immunol, 2009, 21[2]: 179-86; Eur J Immunol, 2003, 33[4]: 970-9). En estudios in vitro, se ha demostrado que La G-3 puede inhibir la proliferación de linfocitos T inducidos por el antígeno. El bloqueo de LAG-3 mejorará la activación y la proliferación de linfocitos T, y mejorará las citocinas secretadas por los linfocitos T cooperadores de tipo 1 (Th1, type 1 T helper cells). Huang y col. han demostrado que el nivel de LAG-3 en los linfocitos Treg CD4+ activados aumentó significativamente y que LAG-3 era una condición necesaria para que los Treg CD4+ ejercieran el mayor efecto inmunosupresor (Immunity, 2004, 21[4]: 503-13). Además, el anticuerpo anti-LAG-3 también mantiene la homeostasis de los linfocitos T CD4+ y CD8+, y el bloqueo de LAG-3 mejorará significativamente la capacidad de los linfocitos T CD8+ para destruir células tumorales (J Clin Invest, 2007, 117[11 ]: 3383-92). Algunos estudios sobre enfermedades también han indicado que LAG-3 desempeña un papel importante en la progresión y desarrollo de regulación de una enfermedad. Gandhi y col., verificaron que el nivel de expresión de LAG-3 en linfocitos T del tejido de linfoma humano está asociado con la disfunción de los linfocitos T, y el aclaramiento de linfocitos T LAG-3+ puede mejorar significativamente la capacidad de eliminar la célula tumoral por parte de los linfocitos T ( Blood, 2006, 108[7]: 2280-9). Los resultados muestran que LAG-3 es una importante molécula inhibidora en la superficie de las células inmunitarias y que tiene un efecto represor significativo sobre los linfocitos T.

LAG-3 se expresa, principalmente, en linfocitos T, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos Treg y células CD (Proc Natl Acad Sci EE. UU., 1997, 94[11 ]: 5744-9. Eur J Immunol, 2005, 35[7]: 2081-8; J Immunol, 2009, 182[4]: 1885-91). LAG-3 es una clase de moléculas inmunosupresoras y es uno de los componentes que constituyen el correceptor de TCR. Interviene en la activación de TCR inducida por los linfocitos T, y desempeña un papel represor en la activación de los linfocitos T. En algunas enfermedades, se aumentó la expresión de LAG-3 y se observó la correspondiente inmunosupresión. Gandhi y col. descubrieron que los linfocitos en la sangre y los tejidos tumorales de pacientes con linfoma de Hodgkin expresaron LAG-3 a un nivel alto; y la función de linfocitos T c D8+ específicos se vio afectada evidentemente en los tejidos tumorales, y al eliminarse los linfocitos T que expresaban LAG3, se restableció la función antitumoral y se aumentó la secreción de citocinas. Se especuló que la expresión de LAG-3 está asociada con la represión de la función inmunitaria de los linfocitos T específicos, y que la inhibición de la función de la molécula de LAG-3 puede potenciar el efecto antitumoral del linfocito T, de modo que la molécula de LAG-3 puede ser una posible diana para la inmunoterapia tumoral (Blood, 2006, 108[7]: 2280-9).

Actualmente hay varias compañías farmacéuticas multinacionales, tales como BMS y Novartis, que están comprometidas con el estudio de anticuerpos monoclonales contra LAG-3, que potencian el efecto antitumoral de los linfocitos T y maximizan la respuesta inmunitaria propia de los pacientes al tumor, estimulando las respuestas de los linfocitos T específicos de antígeno y, posteriormente, logran el propósito de destruir las células tumorales. Las patentes relacionadas actualmente son las de documentos tales como WO2010019570, WO2014008218, WO9530750, WO2004078928, WO2008132601, WO2014140180, WO2015138920, WO2015042246 y WO2016028672.

La presente invención proporciona un anticuerpo contra LAG-3 con alta afinidad, alta selectividad y alta actividad biológica.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo contra LAG-3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La invención se refiere a un anticuerpo contra LAG-3 o al fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera,

en donde la región variable de cadena pesada del anticuerpo, comprende: HCDR1, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 12, HCDR2, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 13, y Hc Dr 3, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 14; y en donde la región variable de cadena ligera del anticuerpo, comprende: LCDR1, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 18, LCDR2, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 19, y Lc Dr 3, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 20. en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo;

en donde el anticuerpo comprende una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en:

1) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30; 2) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34; 3) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35; 4) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36; 5) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37; 6) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30; 7) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34; 8) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35; 9) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36; 10) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37; 11) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30; 12) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34; 13) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35; 14) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36; 15) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37; 16) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30; 17) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34; 18) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35; 19) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36; y 20) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37. En una realización, la cadena pesada del anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo según la invención, comprende: una región variable de cadena pesada, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 29, y una región constante de cadena pesada, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 38, y la cadena ligera del anticuerpo, comprende: una región variable de cadena ligera, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 34, y una región constante de cadena ligera, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 39.

En el presente documento se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una cualquiera o más de las regiones CDR seleccionadas de los siguientes puntos (i) o (ii) o secuencias con al menos el 85 % de identidad (preferiblemente el 95 %), con lo siguiente:

(i) regiones HCDR, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11; y regiones LCDR, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.

En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno, en donde la región variable de cadena pesada comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y Se Q ID NO: 11, respectivamente, o secuencias con al menos el 85 % (preferiblemente el 95 %) de identidad con estas secuencias.

En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la región variable de cadena ligera comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 tal como se muestra en la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17, respectivamente, o secuencias con al menos el 85 % (preferiblemente el 95 %) de identidad con estas secuencias;

En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se han definido anteriormente, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo murino o un fragmento del mismo.

En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se han definido anteriormente, en donde la región variable de cadena ligera del anticuerpo comprende, además, una región FR (FRamework, marco conservada) de cadena ligera derivada de la cadena k murina o una variante de la misma, o una región FR de cadena ligera derivada de la cadena A murina o una variante de la misma; en donde la región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende, además, una región FR de cadena pesada derivada de IgG1 murina o una variante de la misma, o una región FR de cadena pesada derivada de IgG2 murina o una variante de la misma, o una región FR de cadena pesada derivada de IgG3 murina o una variante de la misma.

En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, un anticuerpo contra LAG-3 murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se han definido anteriormente, en donde el anticuerpo murino comprende una región variable de cadena pesada, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 5, y una región variable de cadena ligera, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 6.

En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, un anticuerpo contra LAG-3 murino o el fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se han definido anteriormente, en donde el anticuerpo murino comprende una región variable de cadena pesada, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 7, y una región variable de cadena ligera, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 8.

En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se han definido anteriormente, en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende además una región constante de cadena ligera derivada de la cadena k murina o una variante de la misma, o una región constante de cadena ligera derivada de la cadena A murina o una variante de la misma; en donde la región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende, además, una región FR de cadena pesada derivada de IgG1 murina o una variante de la misma, o una región FR de cadena pesada derivada de IgG2 murina o una variante de la misma, o una región FR de cadena pesada derivada de IgG3 murina o una variante de la misma.

En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se han definido anteriormente, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo.

En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la secuencia de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado es tal como se muestra en la SEQ ID NO: 21, o una secuencia con al menos el 85 % (preferiblemente el 95 %) de identidad con la secuencia; preferiblemente, hay 1-10 cambios de aminoácidos en la región variable de cadena pesada. Estos cambios de aminoácidos pueden realizarse basándose en la tecnología de maduración por afinidad de la técnica.

En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, o una secuencia con al menos el 85 % (preferiblemente el 95 %) de identidad con estas secuencias.

En otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un anticuerpo contra LAG-3 humanizado o fragmentos de unión a antígeno del mismo según la presente invención, en donde la secuencia de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado es tal como se muestra en la SEQ ID NO: 29. En otra realización preferida de la presente invención, se proporciona el anticuerpo contra LAG-3 humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, en donde la secuencia de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado se selecciona de las secuencias de SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 33. En el presente documento se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado es tal como se muestra en la SEQ ID NO: 22, o una secuencia con al menos el 85 % de identidad con esta secuencia; preferiblemente, hay 1-10 cambios de aminoácidos en la región variable de cadena ligera. Estos cambios de aminoácidos pueden realizarse basándose en la tecnología de maduración por afinidad de la técnica. En el presente documento se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado se selecciona de la secuencia de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28, o una secuencia con al menos el 85 % (preferiblemente el 95 %) de identidad con estas secuencias.

En otra realización preferida de la presente invención, se proporciona el anticuerpo contra LAG-3 humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado se muestra en la SEQ ID NO: 30.

En otra realización preferida de la presente invención, se proporciona el anticuerpo contra LAG-3 humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado se selecciona de la secuencia de la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37.

En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo humanizado comprende:

(a) la secuencia de la región variable de cadena pesada, en donde la secuencia de la región variable de cadena pesada tiene al menos el 85 % (preferiblemente el 95 %) de identidad con la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25; y

(b) la secuencia de la región variable de cadena ligera, en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera tiene al menos el 85 % de identidad con la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

En otra realización preferida de la presente invención, se proporciona el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, en donde el anticuerpo humanizado comprende:

(a) la secuencia de la región variable de cadena pesada, en donde la secuencia de la región variable de cadena pesada tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33, y

(b) la secuencia de la región variable de cadena ligera, en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37.

En el presente documento se describe, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en:

1) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 21 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22; 2) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 21 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 26; 3) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 21 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 27; 4) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 21 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 28; 5) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22; 6) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 26; 7) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 27; 8) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 28;

9) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22;

10) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 11) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 12) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24 y la región variable de cadena ligera del SEQ ID NO: 28;

13) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 25 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 14) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 25 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 15) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 25 y la región variable de cadena ligera del SEQ ID NO: 27; y

16) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 25 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 28.

En otra realización preferida de la presente invención, se proporciona el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de

unión a antígeno del mismo según la presente invención, en donde el anticuerpo comprende una combinación de una

región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en:

1) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30;

2) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34;

3) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35;

4) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36;

5) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37;

6) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30;

7) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34;

8) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35;

9) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36;

10) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 11) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 12) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 13) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 14) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 15) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la secuencia de la región variable de cadena ligera

de la SEQ ID NO: 37;

16) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 17) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 18) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 19) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID N 20) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO En otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un anticuerpo contra LAG-3 humanizado o el

fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, en donde la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende, además, una región constante de cadena pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas o una variantes de las mismas, preferiblemente, comprende una región constante de cadena pesada derivada de IgG4 humana o una variante de la misma, lo más preferiblemente, comprende una región constante de cadena pesada, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 38.

La cadena ligera de dicho anticuerpo humanizado comprende, además, una región constante de cadena ligera derivada de cadena k humana, cadena A humana o una variante de las mismas, lo más preferiblemente, comprende una región constante de cadena ligera tal como se muestra en la SEQ ID NO: 39.

La presente invención proporciona, además, una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo según la invención, y uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

La presente invención proporciona, además, un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno según la invención.

La presente invención proporciona, además, un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado, tal como se ha descrito anteriormente.

La presente invención proporciona, además, una célula hospedadora transformada con el vector de expresión, tal como se ha descrito anteriormente, en donde la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en células procariotas y células eucariotas, preferiblemente células eucariotas, más preferiblemente células de mamífero.

La presente invención proporciona, además, un método para preparar un anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo según la invención, que comprende expresar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo en la célula hospedadora, tal como se ha descrito anteriormente, y aislar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la célula hospedadora.

La presente invención proporciona, además, el anticuerpo contra LAG-3 anterior o el fragmento de unión a antígeno del mismo, o la composición farmacéutica que contiene el mismo, para su uso en la inhibición del crecimiento de células tumorales en un sujeto.

La presente invención proporciona, además, el uso de dicho anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, o la composición farmacéutica que contiene el mismo, en la preparación de un medicamento para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto.

La presente invención proporciona, además, el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, o la composición farmacéutica que comprende el mismo, o el ácido nucleico descrito anteriormente, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o una afección asociada con la participación de células inmunitarias, en donde la enfermedad o la afección es, preferiblemente, un cáncer. El cáncer descrito en el presente documento incluye, aunque no de forma limitativa, cáncer de ovario, melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastásico), cáncer de próstata, cáncer intestinal (por ejemplo, cáncer de colon e intestino delgado), cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de páncreas, cáncer de útero, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer bucal, cáncer de cerebro, cáncer de testículo, cáncer de piel, cáncer de tiroides y tumores malignos hemáticos, incluyendo el mieloma y la leucemia crónica/aguda.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: el anticuerpo anti-LAG-3 humanizado potencia la secreción de la citocina IL-2, a partir de los linfocitos T activados por SEB. Los resultados muestran que los candidatos a anticuerpo contra LAG-3 humanizado, Hu229-013 y Hu303-005, pueden mejorar la secreción de citocina IL-2, a partir de los linfocitos T activados, y con el efecto de la dosis de la concentración de fármaco.

Figura 2: efecto del anticuerpo anti-LAG-3 humanizado sobre el volumen tumoral de ratones portadores de tumores U-87MG. Los resultados muestran que, tanto el anticuerpo contra LAG-3 Hu229-0136mpk como Hu303-0056mpk, tienen determinados efectos antitumorales, y las tasas de inhibición tumoral fueron del 27,25 % (p < 0,05) y el 34,94 % (p < 0. 01), respectivamente, y hubo diferencias significativas en comparación con el grupo de control (p < 0,001 frente a hIgG).

Descripción detallada de la invención

1. Términos

Para comprender más fácilmente la invención, se definen específicamente a continuación determinados términos técnicos y científicos. A menos que se defina lo contrario en otra parte en este documento, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende, habitualmente, un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención.

Tal como se usa en el presente documento, el código de una sola letra y el código de tres letras para los aminoácidos son tal como se describen en J. Biol. Chem, 243, (1968), pág. 3558.

El término “ LAG-3” se refiere al gen 3 de activación de linfocitos. El término “ LAG-3” incluye variantes, isoformas, homólogos, ortólogos y parálogos. La expresión “ LAG-3 humano” se refiere a la secuencia de LAG-3 humano, tal como la secuencia de aminoácidos completa de LAG-3 humano con n.° de Uniprot P18627. LAG-3 también se conoce en la técnica, por ejemplo, como CD223. La secuencia de LAG-3 humano puede diferir de LAG-3 humano del n.° de Uniprot P18627 en que, por ejemplo, LAG-3 humano tiene mutaciones o mutaciones conservadas en regiones no conservadas y tiene, esencialmente, la misma función biológica que el LAG-3 humano del n.° de Uniprot P18627. Por ejemplo, una función biológica del LAG-3 humano es un epítopo en el dominio extracelular de LAG-3 que está unido específicamente por el anticuerpo descrito en el presente documento, o una función biológica del LAG-3 humano es la unión a moléculas de clase II del MHC.

Una secuencia de LAG-3 humano particular tendrá, generalmente, al menos el 90 % de identidad en la secuencia de aminoácidos con LAG-3 humano del n.° de Uniprot P18627 y contiene residuos de aminoácidos que se identifican como secuencias de aminoácidos humanas cuando se comparan con las secuencias de aminoácidos de LAG-3 de otras especies (por ejemplo, murino). En determinados casos, un LAG-3 humano puede tener al menos el 85 %, o incluso al menos el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad en la secuencia de aminoácidos con LAG-3 del n.° de Uniprot P18627. En determinadas realizaciones, una secuencia de LAG-3 humano mostrará no más de 10 diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de LAG-3 del n.° de Uniprot P18627. En determinadas realizaciones, el LAG-3 humano puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de LAG-3 del n.° de Uniprot P18627. El porcentaje de identidad puede determinarse tal como se describe en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, “ identidad de secuencia” indica el grado de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o dos secuencias de aminoácidos cuando se alinean de manera óptima y se comparan en el caso de tener mutaciones tales como sustituciones, inserciones o deleciones apropiadas. La identidad de secuencia entre la secuencia descrita en la presente invención y la secuencia correspondiente, es de al menos el 85 %, el 90 % o el 95 %, preferiblemente al menos el 95 %. Los ejemplos representativos incluyen, aunque no de forma limitativa, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, el 100 %.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas / número total de posiciones multiplicado por 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias, pueden lograrse usando los ajustes por defecto del algoritmo BLASTN/BLASTP disponible en el sitio web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica.

Tal como se usa en el presente documento, “ anticuerpo” se refiere a inmunoglobulina, una estructura de cadena de cuatro péptidos conectados entre sí por enlaces disulfuro entre dos cadenas pesadas de identidad y dos cadenas ligeras de identidad. Las diferentes regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina presentan diferentes composiciones de aminoácidos y órdenes de rango, presentando, por tanto, diferentes tipos de antigenicidad. En consecuencia, las inmunoglobulinas pueden dividirse en cinco categorías, o denominarse isotipos de inmunoglobulina, concretamente, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, siendo sus cadenas pesadas cadena p, cadena ó, cadena y , cadena a y cadena £, respectivamente. Según su composición de aminoácidos de la región bisagra, y el número y la ubicación de los enlaces disulfuro de cadena pesada, el mismo tipo de Ig puede dividirse en diferentes subcategorías, por ejemplo, la IgG puede dividirse en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La cadena ligera puede dividirse en cadena k o A considerando una región constante diferente. Cada uno de los cinco tipos de IgG puede tener una cadena k o A.

En la presente invención, la cadena ligera del anticuerpo mencionada en el presente documento comprende, además, una región constante de cadena ligera, que comprende una cadena k, A humana o murina, o una variante de las mismas.

En la presente invención, la cadena pesada del anticuerpo mencionada en el presente documento comprende, además, una región constante de cadena pesada, que comprende IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humanas o murinas, o una variante de las mismas.

Cerca de la secuencia N-terminal de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, aproximadamente 110 de aminoácidos cambian en gran medida, y es lo que se conoce como región variable (región Fv); el resto de la secuencia de aminoácidos, cerca del extremo C-terminal, es relativamente estable, conocido como región constante. La región variable comprende tres regiones hipervariables (HVR, HyperVariable Regions) y cuatro regiones marco conservadas (FR) de secuencia relativamente conservadas. Tres regiones hipervariables determinan la especificidad del anticuerpo, también conocidas como regiones determinantes de complementariedad (CDR). Cada región variable de cadena ligera (LCVR, Light Chain Variable Región) y cada región variable de cadena pesada (HCVR, Heavy Chain Variable Región) comprende tres regiones CDR y cuatro regiones FR, con orden secuencial desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Tres CDR de cadena ligera se refieren a LCDR1, LCDR2 y LCDR3; tres CDR de cadena pesada se refieren a HCDR1, HCDR2 y HCDR3. El número y la ubicación de los residuos de aminoácidos de la región CDR en regiones LCVR y HCVR del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el presente documento cumplen con los criterios de numeración de Kabat conocidos (LCDR1-3, HCDE2-3), o cumplen con los criterios de numeración de Kabat y Chothia (HCDR1).

El anticuerpo de la presente invención comprende un anticuerpo humanizado.

La expresión “ anticuerpo murino” se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 humano, preparado según el conocimiento y las habilidades del campo. Durante la preparación, se le inyectó a un sujeto de prueba el antígeno de LAG-3, y después se separó el hibridoma que expresa el anticuerpo que posee una secuencia deseada o características funcionales. Se describe en el presente documento, pero no se reivindica, el anticuerpo contra LAG-3 murino o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende, además, una región constante de cadena ligera de la cadena k, A murina o una variante de las mismas, o comprende, además, una región constante de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3 murinas o una variante de las mismas.

La expresión “anticuerpo quimérico” es un anticuerpo que se forma fusionando la región variable de un anticuerpo murino con la región constante de un anticuerpo humano, pudiendo el anticuerpo quimérico aliviar la respuesta inmunitaria inducida por anticuerpos murinos. Para establecer un anticuerpo quimérico, en primer lugar, se establece un hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal murino específico, a continuación, se clona un gen de región variable a partir de células de hibridoma de ratón, después se clona un gen de región constante de un anticuerpo humano según se desee, se une el gen de región variable de ratón con el gen de región constante humana, para formar un gen quimérico que puede insertarse en un vector humano y, finalmente, la molécula de anticuerpo quimérico se expresa en el sistema eucariota o procariota. En el presente documento, se describe, pero no se reivindica, la cadena ligera del anticuerpo quimérico contra LAG-3 que comprende, además, las regiones constantes de cadena ligera de la cadena k, A humana o una variante de las mismas. La cadena pesada del anticuerpo quimérico contra LAG-3 comprende, además, las regiones constantes de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3, igG4 humanas o una variante de las mismas, preferiblemente, comprende una región constante de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas, o comprende, preferiblemente, una región constante de cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG4 humanas, o una variante de las mismas con mutaciones de aminoácidos (por ejemplo, mutaciones YTE).

La expresión “ anticuerpo humanizado” , también conocido como anticuerpo injertado con CDR, se refiere a un anticuerpo generado injertando secuencias de CDR murinas en un armazón de región variable de un anticuerpo humano, concretamente, un anticuerpo producido entre diferentes tipos de secuencias estructurales del anticuerpo de estirpe germinal humana. El anticuerpo humanizado supera la respuesta heterogénea inducida por el anticuerpo quimérico que porta una gran cantidad de componentes de proteínas murinas. Tales secuencias estructurales pueden obtenerse a partir de bases de datos de ADN públicas que cubren secuencias genéticas de anticuerpos de estirpe germinal o de referencias publicadas. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la estirpe germinal de los genes de la región variable de cadena ligera y pesada humana, pueden encontrarse en la base de datos de secuencias de la estirpe germinal humana “ Vbase” (disponible en la página web www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), así como también pueden encontrarse en Kabat, EA, y col., 1991 “ Sequences of Proteins of Immunological Interest” , 5a ed. Para evitar la disminución de la actividad durante la reducción de la inmunogenicidad, la secuencia estructural de la región variable del anticuerpo humano se somete a una retromutación mínima para mantener la actividad. El anticuerpo humanizado de la presente invención, también comprende un anticuerpo humanizado que se somete adicionalmente a la maduración por afinidad de CDR mediante presentación en fago. El armazón de la región variable del anticuerpo humano está diseñado para ser seleccionado, en donde la secuencia estructural de cadena pesada de la región variable de cadena pesada del anticuerpo deriva de la secuencia de combinación de las cadenas pesadas de la estirpe germinal humana IGKV1-39*01y hjk4.1; en donde la secuencia estructural de cadena ligera de la región variable de cadena ligera del anticuerpo, deriva de la secuencia de combinación de las cadenas pesadas de la estirpe germinal humana IGHV3-23*04 y hjh6.1. Para evitar la disminución de la actividad provocada por la disminución de la inmunogenicidad, la región variable del anticuerpo humano descrito en el presente documento, puede someterse a retromutaciones mínimas para mantener la actividad del anticuerpo.

El injerto de CDR puede producir una disminución en la afinidad del anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo por el antígeno, debido al cambio de residuos del armazón en contacto con el antígeno. Tales interacciones pueden ser el resultado de mutaciones muy somáticas. Por tanto, todavía puede ser necesario implantar tales aminoácidos del armazón donante al armazón de anticuerpos humanizados. Los residuos de aminoácidos implicados en la unión a antígeno de un anticuerpo contra LAG-3 no humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, pueden identificarse examinando la secuencia de la región variable y la estructura del anticuerpo monoclonal murino. Cada uno de los residuos del armazón donante de CDR que es diferente de la estirpe germinal, puede considerarse relevante. Si no es posible determinar la especie más estrechamente relacionada, la secuencia puede compararse con una secuencia consenso de una secuencia consenso subtipo o una secuencia murina con un alto porcentaje de similitud. Se cree que los residuos del armazón raros son el resultado de una mutación celular muy somática que desempeña un papel importante en la unión.

La expresión “ fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo (o para abreviar, “ fragmento de anticuerpo” ), se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, una proteína LAG-3). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por un fragmento de anticuerpo completo. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión “ fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')², un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd, que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv, que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; (v) un dominio único o un fragmento dAb (Ward y col., [1989], Nature 10 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) independiente o (vii) opcionalmente, una combinación de dos o más CDR independientes unidas por un conector sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que les permite prepararse como una única cadena proteica en la que se emparejan las regiones VL y VH para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario [scFv, single chain Fv]; véanse, por ejemplo, Bird y col. [1988], Science 242:423-426; y Huston y col., [1988], Proc. Natl. Acad. Sci., EE. UU., 85:5879-5883). Tales anticuerpos monocatenarios también pretenden estar abarcados dentro de la expresión “ fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan para su utilidad de la misma manera que para anticuerpos intactos. El resto de unión a antígeno puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de diferentes isoformas, por ejemplo, anticuerpos IgG (por ejemplo, subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM.

La expresión “anticuerpo monocatenario” , “ Fv monocatenario” o “scFv” , pretende referirse a una molécula que comprende un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (o región; VH) y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo (o región; VL) conectados por un conector. Tales moléculas de scFv pueden tener las estructuras generales: NH²-VL-conector-VH-COOH o NH²-VH-conector-VL-COOH. Un conector adecuado en la técnica anterior comprende una secuencia de aminoácidos repetitiva GGGGS o una variante de la misma, por ejemplo, una variante con una repetición de 1-4 (Holliger y col., [1993], Proc. Natl. Acad. Sci., EE. UU., 90: 6444-6448). Otros conectores que pueden usarse en la presente invención son los descritos por Alfthan y col., Protein Eng., 8:725-731, Choi y col., (2001), Eur. J. Immuno, 1.31:94-106, Hu y col., (1996), Cancer Res., 56:3055-3061, Kipriyanov y col., (1999), J. Mol. Biol., 293:41-56 y Roovers y col., (2001), Cancer Immunol.

El término “ CDR” se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión a antígeno. Una de las definiciones más comúnmente usadas para las seis CDR es la proporcionada por Kabat E. A. y col., (1991), “ Sequences of proteins of immunological interest” . NIH Publication 91-3242). Tal como se usa en el presente documento, la definición de Kabat de las CDR solo se aplica para CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3 o L1, L2, L3), así como para CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena pesada (HCDR2, HCDR3 o H2, H3).

La expresión “ armazón de anticuerpo” , tal como se usa en el presente documento, se refiere a la parte del dominio variable, bien VL o VH, que sirve como estructura base para los bucles de unión a antígeno (CDR) de este dominio variable. En esencia, es el dominio variable sin las CDR.

El término “ epítopo” o la expresión “ determinante antigénico” , se refiere a un sitio de un antígeno (por ejemplo, sitios particulares en la molécula de LAG-3) al que se une específicamente una inmunoglobulina o un anticuerpo. Un epítopo incluye, normalmente, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos consecutivos o no consecutivos, en una conformación espacial única. Véase, por ejemplo, “ Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology” , vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Las expresiones “ unión específica” , “ unión selectiva” , “ se une selectivamente” y “ se une específicamente” , se refieren a la unión de un anticuerpo a un epítopo en un antígeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad (KD) de aproximadamente menos de 10'7 M, tal como aproximadamente menos de 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M o incluso menor.

La expresión “ unión competitiva” se refiere a un anticuerpo que reconoce el mismo epítopo (también denominado, determinante antigénico) o una parte del mismo epítopo en la región extracelular del LAG-3 humano y se une al antígeno como el anticuerpo monoclonal de la presente invención. Un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal de la presente invención, se refiere a un anticuerpo que reconoce y se une a la secuencia de aminoácidos del LAG-3 humano reconocida por el anticuerpo monoclonal de la presente invención.

El término “ KD” o “ Kd” , se refiere a la constante en equilibrio de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Normalmente, los anticuerpos de la invención se unen a LAG-3 con una constante en equilibrio de disociación (KD) de menos de aproximadamente 10'7 M, tal como menos de aproximadamente 10'8 M, 10'9 M o 10' 10 M o incluso menor, por ejemplo, según se determina usando tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR, Surface Plasmon Resonance) en un instrumento BIACORE.

La expresión “ molécula de ácido nucleico” , tal como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero, preferiblemente, es ADN bicatenario. Un ácido nucleico se “ une de manera eficaz” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador se une de manera eficaz a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia.

El término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. En una realización, el vector es un “ plásmido” , que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en el que pueden unirse segmentos de ADN adicionales. En otra realización, el vector es un vector vírico, en donde pueden unirse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. En la presente invención, los vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero), o pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora, tras la introducción en la célula hospedadora, y replicarse, de ese modo, junto con el genoma del hospedador (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero).

Los métodos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno, son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en “Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor” , capítulos 5-8 y 15. Por ejemplo, los ratones pueden inmunizarse con LAG-3 humano, o fragmentos del mismo, y los anticuerpos resultantes pueden volver a renaturalizarse, purificarse y secuenciarse mediante el uso de métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Los fragmentos de unión a antígeno también pueden prepararse mediante métodos convencionales. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la presente invención, se genomodifica para introducir una o más regiones marco conservadas (FR) humanas en una CDR derivada no humana. Las secuencias estructurales de estirpe germinal humanas pueden obtenerse de ImMunoGeneTics (IMGT) a través de su sitio web http://imgt.cines.fr o de “ The Immunoglobulin Facts Book” , 2001, ISBN012441351.

La expresión “ célula hospedadora” se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión. Las células hospedadoras pueden incluir células bacterianas, microbianas, vegetales o animales. Las bacterias, que son susceptibles de transformarse, incluyen miembros de las enterobacterias, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillacaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus y Haemophilus influenzae. Los microorganismos adecuados incluyen Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Las estirpes de células hospedadoras animales adecuadas incluyen células CHO (Chinese Hamster Ovary, estirpes de ovario de hámster chino) y células NSO.

El anticuerpo genomodificado o el fragmento de unión a antígeno de la presente invención, puede prepararse y purificarse usando métodos convencionales. Por ejemplo, las secuencias de ADNc que codifican una cadena pesada y una cadena ligera, pueden clonarse y recombinarse en un vector de expresión GS. El vector de expresión de inmunoglobulina recombinante puede transfectar, entonces, de manera estable, células CHO. Como un método más recomendado bien conocido en la técnica, el sistema de expresión de mamíferos producirá glicosilación, normalmente, en el extremo N-terminal muy conservado de la región FC. Los clones estables se obtienen a través de la expresión de un anticuerpo que se une específicamente al LAG-3 humano. Los clones con expresión pueden expandirse en un medio de cultivo sin suero para la producción de anticuerpos en biorreactores. El medio de cultivo, en el que se ha secretado un anticuerpo, puede purificarse mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, el medio puede aplicarse de manera conveniente a una columna de proteína A o G Sepharose FF que se ha equilibrado con un tampón compatible. La columna se lava para eliminar componentes de unión no específicos. El anticuerpo unido se eluye por gradiente de pH y los fragmentos de anticuerpo se detectan mediante SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) y después se agrupan. El anticuerpo puede filtrarse y concentrarse usando técnicas comunes. La mezcla soluble y el agregado pueden eliminarse, de manera eficaz, mediante técnicas comunes, incluyendo exclusión molecular o intercambio iónico. El producto obtenido puede congelarse inmediatamente, por ejemplo a -70 °C, o puede liofilizarse.

La “ administración” y el “tratamiento” , tal como se aplica a un animal, ser humano, sujeto experimental, célula, tejido, órgano o líquido biológico, se refiere a poner en contacto un agente farmacéutico, terapéutico, de diagnóstico exógenos, o una composición con el animal, ser humano, sujeto, célula, tejido, órgano o líquido biológico. La “ administración” y el “tratamiento” pueden referirse, por ejemplo, a métodos terapéuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, de investigación y experimentales. El tratamiento de una célula abarca poner en contacto un reactivo con la célula, así como poner en contacto un reactivo con un líquido, donde el líquido está en contacto con la célula. “Administración” y “tratamiento” también significa tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una célula, por un reactivo, compuesto de diagnóstico, compuesto de unión, o por otra célula. “Tratamiento” , tal como se aplica a un ser humano, sujeto veterinario o a un sujeto que va a estudiarse, se refiere al tratamiento terapéutico, medidas profilácticas o preventivas, a aplicaciones de investigación y diagnóstico.

“ Tratar” significa administrar un agente terapéutico, tal como una composición que comprende cualquiera de los compuestos de unión de la presente invención, interna o externamente a un paciente que tiene uno o más síntomas de enfermedad, para los que el agente tiene actividad terapéutica conocida. Normalmente, el agente se administra en una cantidad eficaz para aliviar uno o más síntomas de la enfermedad en el paciente o población tratados, ya sea mediante la inducción de la regresión o inhibición de la progresión de tal(es) síntoma(s) en cualquier grado clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de enfermedad particular (también denominada, “ cantidad terapéuticamente eficaz” ) puede variar según factores, tales como el estado patológico, la edad y el peso del paciente, y la capacidad del fármaco para provocar una respuesta deseada en el paciente. Puede evaluarse si un síntoma de enfermedad ha sido aliviado mediante cualquier medición clínica usada normalmente por médicos u otros profesionales sanitarios con experiencia para evaluar la gravedad o el estado de progresión de ese síntoma. Si bien una realización de la presente invención (por ejemplo, un método de tratamiento o artículo manufacturado) puede no ser eficaz para aliviar el/los síntoma(s) de la enfermedad de interés en cada paciente, debe aliviar el/los síntoma(s) de la enfermedad objetivo de interés en un número estadísticamente significativo de pacientes, tal como se determina mediante cualquier prueba estadística conocida en la técnica, tal como la prueba de la t de Student, la prueba de ji cuadrado, la prueba de la U según Mann y Whitney, la prueba de Kruskal-Wallis (prueba de la H), la prueba de Jonckheere-Terpstra y la prueba de Wilcoxon.

Las “ modificaciones conservativas” o “ reemplazo o sustitución conservativa” , se refieren a sustituciones de aminoácidos en una proteína con otros aminoácidos que tienen características similares (por ejemplo, carga, tamaño de cadena lateral, hidrofobia/hidrofilia, conformación y rigidez de la estructura principal, etc.), de manera que los cambios pueden hacerse con frecuencia sin alterar la actividad biológica de la proteína. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido, no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson y col. [1987], “ Molecular Biology of The Gene” , The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 [4a ed]). Además, es menos probable que las sustituciones con aminoácidos estructural o funcionalmente similares alteren la actividad biológica.

“ Cantidad eficaz” abarca una cantidad suficiente para mejorar o prevenir un síntoma o signo de una afección médica. La cantidad eficaz también significa una cantidad suficiente para permitir o facilitar el diagnóstico. Una cantidad eficaz para un paciente o un sujeto veterinario particular, puede variar dependiendo de factores, tales como la afección que se está tratando, la salud general del paciente, la vía y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios. Una cantidad eficaz puede ser la dosis máxima o el protocolo de dosificación que evita efectos secundarios significativos o efectos tóxicos.

“ Exógeno” se refiere a sustancias que se producen fuera de un organismo, célula o cuerpo humano, dependiendo del contexto. “ Endógeno” se refiere a sustancias que se producen dentro de una célula, organismo o cuerpo humano, dependiendo del contexto.

“ Homología” se refiere a la similitud de secuencia entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos polipéptidos. Cuando una posición en ambas de las dos secuencias que van a compararse está ocupada por la misma base o subunidad de monómero de aminoácido, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las dos secuencias, dividido entre el número de posiciones comparadas, multiplicado por 100. Por ejemplo, si 6 de las 10 posiciones en dos secuencias coinciden o son homólogas cuando las secuencias están alineadas de manera óptima, entonces las dos secuencias son homólogas al 60 %. Si 95 de las 100 posiciones en dos secuencias coinciden o son homólogas cuando las secuencias están alineadas de manera óptima, entonces las dos secuencias son homólogas al 95 %. Generalmente, la comparación se realiza cuando dos secuencias se alinean para dar un porcentaje máximo de homología.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones “ célula” , “ estirpe celular” y “ cultivo celular” , se usan indistintamente, y todas estas designaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras “ transformantes” y “ células transformadas” incluyen la célula objeto primaria y los cultivos derivados de la misma, sin considerar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente la identidad en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la seleccionada en la célula originalmente transformada. Cuando se pretendan hacer designaciones distintas, será evidente a partir del contexto.

Tal como se usa en el presente documento, “ reacción en cadena de la polimerasa” o “ PCR, Polymerase Chain Reaction” , se refiere a un procedimiento o técnica en el que cantidades diminutas de un resto específico de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican tal como se describe en, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° US-4.683.195. Generalmente, es necesario que esté disponible la información de secuencia de los extremos de, o más allá de la región de interés, de modo que puedan diseñarse los cebadores de oligonucleótidos; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas correspondientes del molde que se van a amplificar. Los nucleótidos terminales en 5' de los dos cebadores pueden ser idénticos a los extremos del material que va a amplificarse. La PCR puede usarse para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas a partir del ADN genómico total y ADNc transcrito a partir de ARN celular total, secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Véase, en general, Mullis y col., (1987), Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989), “ PCR TECHNOLOGY” (Stockton Press, N.Y.). Tal como se usa en el presente documento, la PCR se considera uno, pero no el único, ejemplo de un método de reacción de la polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de prueba de ácido nucleico, que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un resto específico del ácido nucleico.

“ Opcional” u “ opcionalmente” , significa que el acontecimiento o la situación que sigue puede, pero no se produce necesariamente, y la descripción incluye los casos en los que el acontecimiento o la circunstancia se produce o no. Por ejemplo, “ opcionalmente comprende 1-3 regiones variables de cadena pesada del anticuerpo” , significa que la región variable de cadena pesada del anticuerpo con secuencia específica puede estar, pero no necesariamente, presente.

“ Composición farmacéutica” se refiere a una mezcla que contiene uno o más compuestos según la presente invención, o una sal o profármaco fisiológica/farmacéuticamente aceptable del mismo y otros componentes químicos, tales como portadores y excipientes fisiológica/farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica tiene como objetivo promover la administración a un organismo, facilitar la absorción del principio activo y ejercer de ese modo un efecto biológico.

Ejemplo y prueba

En los ejemplos de la presente invención, cuando no se describen condiciones específicas, los experimentos se realizan, generalmente, en condiciones convencionales, tal como se describe en “Antibody Technology Laboratory Manual” y “ Molecular Cloning Manual” de Cold Spring Harbor, o en condiciones propuestas por los fabricantes de los materiales o productos. Cuando la fuente de los reactivos no se proporciona específicamente, los reactivos son reactivos convencionales disponibles en el mercado.

Ejemplo 1. Preparación de antígeno de LAG-3 y anticuerpo contra LAG-3

1. Diseño y expresión de proteínas

La proteína del gen 3 de activación de linfocitos de Uniprot (LAG-3 humano, Uniprot: P18627) se usó como molde del LAG-3, y se diseñaron las secuencias de aminoácidos del antígeno y la proteína que se usaron para la detección, opcionalmente, se fusionaron diferentes marcadores a la proteína LAG-3 y después se clonaron en el vector pHr (producido internamente) o vector pTT5 (Biovector, n.° de cat.: 102762) o vector pTargeT (Promega, A1410). La proteína antigénica y la proteína de detección de la presente invención se expresaron transitoriamente en células 293 o se expresaron de manera estable en CHO-S, se purificaron y se obtuvieron.

Los siguientes antígenos de LAG-3 se denominan LAG-3 humano, si no se describe específicamente.

Dominio extracelular de LAG-3 con un marcador Flag: LAG-3-Flag, para la inmunización de ratones.

M W E AOFLGLLFLOP LW VAP V K PLQPG A E VP V V WA O EG A PA O LPCS PT1P LO D

LSLLRR A G VTW QHQFDSGPPA A APGHPLAPGPHPA A PSS WGPRPRRYTV L$ V

GPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDR

ALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQ

GRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGC1LTYRDGFNVSIMYNLTVLG

LEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCR LPA GVGTRSFLTA K WTPPGG GP DLLVTGDNG

DFTLRLED VSQ AQ AGTYTCH [HLQEQQLN ATVTLAHT VTPKSFGSPGS LG KLL

CEVTPVSOQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERL

U jAAVYFTELSSPGDYKDDDDK

SEQ ID NO: 1 NOTA: La secuencia subrayada representa un péptido señal y la parte en cursiva se refiere a la secuencia del marcador Flag.

La secuencia completa de LAG-3: se usa para construir la estirpe celular que sobreexpresa LAG-3, para la inmunización de ratones y detección

MWEAOFLGLLFLOPLWVAPVKPLOPGAEVPVVWAÜEGAPAOLPCSPTtPLOD

LSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSV

GFGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDR

ALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQ

GRVPVRESPHHHLAESFLFLFQVSPMD5GPWGCILTYRDGFNVS1MYNLTVLG

LEPPT PLTV YAG AG S RVGLPCRLPAGVGTRS FUTA KWT PPG GGPDLLVTGDNG

DFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLADTVTPKSFGSPGSLGKLL

CEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERL

LG ^{AAVYFTELSSPG AQRSGRA PGALPAGH}LLLFLi ^{LG V LS LLLLVTGAFGFrtLW}

RRQ WRPRRFSALEQQIHPPQA QSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL

5EQ ID NO: 2

NOTA: Péptido señal dominio extracelular región transmembrana dominio intracelular

Una proteína de fusión del dominio extracelular de LAG-3 y Fc de hIgG1: LAG-3-Fc, para la detección MWEAQFLGLLFLOPLWVAPVKPLOPGAEVPVVWAÜEGAPAOLPCSPTtPLÜD

LS LLRRAGVTW QHQPE>S G PPAAAPG HPLA PGPHPAAP S SWGPRPRRYTV LS V

GPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDrSLWLRPARRADAGQYRAAVHLRDR

ALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQ

GRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVS1M YNLTVLG

[ ,EPPTPLTV YAG AGSRVGLPCRLPAGVGTRS F1JAKWTPPG GGPDLLVTGDNG

DFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAI1TVTPKSFGSPGSLGKLL

CE VT P VS G QE RF V\V SS L DT PS Q RS FS G PWLE A Q E A Q LLS QFWQOQ LY QGER L

LG AAV Y FT ELS S PG Ü D D D K G S GS G EPKS CDK'Í'H 7 'C P PCPA PELLO GPS VFLF’PP

R VVS VL f VLHQD WLNGKE YKCK VSNKALPAPIEK1ISKA K GQPREPQ VY t LPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDlAVEWESNGQPENmKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSR WQQ G V VFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEO ID NO: 3

NOTA: La secuencia subrayada representa un péptido señal, la secuencia con doble subrayado representa un conector y la parte en cursiva representa Fc.

Una proteína de fusión del dominio extracelular de LAG-3 y Fc de mIgG2a: LAG-3-mFc, para la detección

MWEAOFLGLLFLOPLWVAPVKPLOPGAEVPVVWAOEGAPAOLPCSPTIPLOD

LSLLRRAGVTWQIIQPDSGPPAAAPGHPLA PGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSV

GPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDR

ALSCRERLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQ

GRVPVRES PHHHLAESFLFLPQVSPMDS GPWGCILTYR DGFNVSIMYNLTVLXj

LEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNG

DFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAHTVTPKSFGSPGSLGKLL

CEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERL

LGAAV YFTELS S PG ÜDD D KGS G S Q.EPR GPÍ 1KPCPP CKCPÁ PNLLGGPSVFIFPP

K1KD VLMISLSPI V'I VWVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVIITA QTQTHREDYNSTLRV

VSA LPIQHQD WMSGKEFKCKVNNKDLPA PÍER TISKPKGS VRA PQVYVLPPPEEEM

TKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVE

KKN W VERNSYSCS V VHtGLHNHHI 7 KSFSRT FGK

SEG ID NO: 4 NOTA: La secuencia subrayada representa un péptido señal, la secuencia con doble subrayado representa un conector y la parte en cursiva representa Fc.

2. Purificación de proteína recombinante relacionada con LAG-3, así como anticuerpo de hibridoma y anticuerpo recombinante

1. Etapas de purificación para la proteína recombinante LAG-3-Flag con un marcador Flag

La muestra se centrifugó a alta velocidad para eliminar las impurezas y se concentró hasta un volumen apropiado. Después de eso, la columna de afinidad del marcador se equilibró con 0,5 x PBS y se lavó con 2-5 volúmenes de columna. Las muestras de sobrenadante se cargaron en la columna después de retirar la impureza. Se lavó la columna con 0,5 x PBS hasta que la lectura de A280 se redujo hasta el valor inicial. Luego la columna se lavó con PBS, y la proteína de la impureza se eliminó por lavado y después se recogió. La proteína diana se eluyó con glicina 100 mM, pH 3,0 y se recogió para una activación y purificación adicionales in vitro.

2. Etapas de purificación para anticuerpo de hibridoma, anticuerpo recombinante y proteína de fusión de Fc El sobrenadante que expresa células se centrifugó a alta velocidad para eliminar las impurezas, el sobrenadante que expresa el hibridoma se purificó por columna de proteína G, el anticuerpo recombinante y la proteína de fusión de Fc se purificaron por columna de proteína A. Se lavó la columna con 0,5 x PBS hasta que la lectura de A280 se redujo hasta el valor inicial. Después de eso, la proteína diana se eluyó con ácido acético 100 mM (pH 3,0) y se neutralizó con Tris-HCl 1 M, pH 8,0. La muestra eluida se concentró adecuadamente y se purificó adicionalmente usando cromatografía en gel Superdex200 (GE), que se equilibró con PBS, se excluyó el pico de apareamiento erróneo y se tomaron alícuotas de la muestra correcta para su uso.

Ejemplo 2. Preparación del anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 humano

1. Inmunización

El anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 humano se produjo inmunizando ratones. Ratones blancos SJL de experimentación, hembras, 6 semanas de edad (Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., número de licencia de producción de animal: SCXK [Pekín], 2012-0001). Entorno de alimentación: nivel SPF. Después de adquirirse los ratones, los animales se mantuvieron en el laboratorio durante 1 semana, con un ciclo de luz/oscuridad 12/12 horas, a una temperatura de 20-25 °C, y con una humedad del 40-60 %. Se inmunizó a los ratones que se habían adaptado al entorno, según los siguientes esquemas. El antígeno inmunitario fue el dominio extracelular de LAG-3 con marcador Flag (SEQ ID NO: 1).

Esquema A: se inmunizó de manera cruzada a los ratones con adyuvante TiterMax® Gold (n.° de lote de sigma: T2684) y alumbre Imject® de Thermo (n.° de lote de Thremo: 77161). La proporción del antígeno con respecto al adyuvante (adyuvante TiterMax® Gold) fue de 1:1, y la proporción del antígeno con respecto al adyuvante (alumbre Imject® de Thermo) fue de 3:1, con una dosis de 50 pg/ratón (primera inmunización) y 25 pg/ratón (inmunización de refuerzo). Después de emulsionarse el antígeno, se inoculó a los ratones en el día 0, 7, 14, 21, 28, 35 y 42. En el día 0. se les inyectó a los ratones por vía subcutánea (s.c.), en varias ubicaciones, antígeno emulsionado, 50 pg/ratón. En el día 7, se les inyectó a los ratones por vía intraperitoneal (i.p.) 25 pg/ratón. En los días 14, 28, 35 y 42, se seleccionó una inyección bien en el lomo o intraperitoneal de antígeno según los bultos del lomo y las condiciones de inflamación del abdomen. Se recogieron muestras de sangre en los días 21, 35, 49, y los títulos de anticuerpos en suero de ratón se determinaron mediante ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, enzimoinmunoanálisis de adsorción). Después de 7 inmunizaciones, se seleccionaron ratones con título de anticuerpos más alto y con el título tendiendo a ser constante en su suero para la fusión de esplenocitos, se realizó una inmunización de refuerzo mediante inyección 1. p. de solución de antígeno formulada con solución salina, 50 pg/ratón, 3 días antes de la fusión de esplenocitos.

Esquema B: se inmunizó a los ratones con QuickAntibody-Mouse5W (KX0210041). La proporción del antígeno con respecto al adyuvante fue de 1:1, 25 pg/ratón (primera inmunización/inmunización de refuerzo). El antígeno y el adyuvante se mezclaron rápidamente y se usaron para la inoculación. Se inoculó a los ratones en los días 0, 21 y 35. En el día 0, se le inyectó al ratón antígenos a través de los músculos gemelares posteriores (i. m.), 25 pg/ratón, los días 21 y 35, se repitió la misma forma de inyección, 25 pg/ratón, (si la tercera inmunización se realizó o no, depende del título de anticuerpos). Se recogieron muestras de sangre en los días 28 y 42. El título de anticuerpos en suero de ratón se determinó mediante ELISA. Se seleccionaron ratones con título de anticuerpos más alto y con el título tendiendo a ser constante en su suero para la fusión de esplenocitos, se realizó una inmunización de refuerzo mediante inyección i.p. de solución de antígeno formulada con solución salina, 50 pg/ratón, 3 días antes de la fusión de esplenocitos.

2. Fusión de esplenocitos

Se obtuvieron células de hibridoma fusionando linfocitos esplénicos con células Sp2/0 de mieloma (ATCC® CRL-8287™) usando un procedimiento de fusión mediada por PEG optimizado. Las células de hibridoma obtenidas se resuspendieron en un medio completo (medio DMEM, que contenía FBS al 20 %, 1 x HAT y 1 x OPI) a una densidad de 0,5-1 x 106/ml, y se incubaron en placas de cultivo celular de 96 pocillos, 100 pl/pocillo. Después de la incubación a 37 °C, CO²al 5 %, durante 3-4 días, 100 pl/pocillo del medio completo HAT se complementó y el cultivo continuó durante 3-4 días, para formar un clon similar a una aguja. Se retiró el sobrenadante y se añadieron 200 pl/pocillo de medio completo HT (medio RPMI-1640, que contenía FBS al 20 %, 1 x HAT, 1 x OPI), se cultivó en CO²al 5 %, 37 °C durante tres días y después se detectó mediante ensayo ELISA.

3. Selección para células de hibridoma

El sobrenadante del cultivo de hibridoma se detectó mediante ELISA de unión (véase el ejemplo de prueba 1), según la densidad de crecimiento de las células de hibridoma. Y se realizaron experimentos de bloqueo de células con pocillos positivos de ELISA (véase el ejemplo de prueba 3). Las células que dieron positivo en los experimentos tanto de unión como de bloqueo, se expandieron y se almacenaron congeladas en el momento oportuno, y las células se subclonaron de dos veces a tres veces hasta que se obtuvo un clon de células individuales.

Después de cada procedimiento de subclonación, las células se sometieron a ELISA de unión a LAG-3 y ensayo de bloqueo celular (véase el ejemplo de prueba 1 y el ejemplo de prueba 3). Los clones de hibridoma se obtuvieron mediante los experimentos de selección anteriores, y el anticuerpo se preparó adicionalmente mediante un método de cultivo celular sin suero, y después el anticuerpo se purificó según un ejemplo de purificación para su uso en el ejemplo de prueba.

4. Secuenciación del clon de hibridoma positivo

El procedimiento de clonación de la secuencia del hibridoma positivo fue el siguiente: se recogieron las células de hibridoma en fase de crecimiento logarítmico, y se extrajo el ARN con Trizol (n.° de cat. de Invitrogen 1559-0018) según las instrucciones del kit, y después se realizó la transcripción inversa con el kit de transcriptasa inversa PrimeScript™ (Takara, n.° de cat. 2680 A). Los ADNc obtenidos por transcripción inversa se amplificaron por PCR usando el conjunto de cebador de Ig de ratón (Novagen, TB326 Rev.B 0503) y la secuenciación se realizó en una compañía de secuenciación. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera correspondientes a las secuencias de ADN del clon de hibridoma mAb229 y mAb303, se muestran en las SEQ ID NO: 5, 6 y las SEQ ID NO: 7, 8, respectivamente.

mAb229-VH

OIQLVQS GPE LKKPGETVKISCKASGYTFTTSGMS WVKOAPGKGLKWMG W ]

NTYSOVPTYADDHK(jRKAtJSLbTSASTAYLQlNNI.KNI£DTATYh'C:ARI>NY[3AR

DVYYYAMDYWGOCfTSVTVSS

SEO ID NÜ: 5

mAb229-VL

DIQMTOSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSWLAWYOQKOGKSPOLLVYAATN LADGV PS R FSGSGSGTQYSl JCI NSLÜSEDPGSYYCOHFWTTFWTFGGGTKLEI

K SEQ JD NU: 6

mAb303-VH

EVQLQOSGPVLVKPGASVKMSCKASGYTLTDYYMNWYKQSHGKSLEWIGVI NPYNGDTAYNOKFKGKATLTVDKSSNTAYMEIN5LTSEDS AV Y YCTRDDÜ Y Y

DYYFDVWGTGTTVTVS S SEQ ID NO: 7

mAb303-VL

DIOMTOS PSSLS ASU3ERVLLTCR ASODIGS RLNWLOOGPDGTFK-RLIYATSTL

DSGVFKRFSGSRSGSDFSLTISSLESEDFVDYYCLOLASSPPTFGGGTKLEIK SEO ID NO: 8

Tabla 1 secuencias de la región CDR de cadena pesada y cadena ligera

Los clones positivos obtenidos se sometieron a un ensayo ELISA de unión al LAG-3 humano (ejemplo de prueba 1, los resultados del valor de CE50 para la actividad de unión a proteína, se muestran en la Tabla 2), un ensayo ELISA de unión a células CHO-S que sobreexpresan LAG-3 humano (ejemplo de prueba 2, los resultados de los valores de CE50 para la actividad de unión a células se muestran en la Tabla 2) y un ensayo para bloquear la unión de antígeno de LAG-3 a células Daudi (ejemplo de prueba 3, los resultados del valor de Ce 50 para la actividad de bloqueo se muestran en la Tabla 2), y un ensayo para determinar su afinidad con la proteína LAG-3 humana (véase el ejemplo de prueba 4, los resultados se muestran en la Tabla 3).

Tabla 2 Actividad in vitro del anticuerpo contra LAG-3 murino

Tabla 3 Afinidad del anticuerpo contra LAG-3 murino

Los resultados mostrados en la Tabla 2 demuestran que, tanto el anticuerpo contra LAG-3 mAb229 como el mAb303, mostraron una excelente actividad de unión a la proteína LAG-3 humana, y los dos también mostraron una excelente actividad de unión a las células CHO-S que sobreexpresan la proteína LAG-3 humana completa. Tanto el anticuerpo contra LAG-3 mAb229 como mAb303, bloquearon significativamente la unión del antígeno de LAG-3 humano con células Daudi. Los resultados mostrados en la Tabla 3 demuestran que el anticuerpo contra LAG-3 mAb229 y el mAb303 mostraron una actividad de unión y afinidad más fuertes a la proteína LAG-3 humana.

Ejemplo 3. Humanización del anticuerpo monoclonal murino de hibridoma anti-LAG-3 humano mAb229

A través de la comparación en la base de datos de IMGT de genes de la región variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano y el software MOE, los genes de la estirpe germinal de la región variable de cadena pesada y ligera con alta homología con respecto a mAb229, se seleccionaron como moldes, las CDR derivadas de anticuerpos murinos se injertaron en el molde de fuente humana correspondiente, para formar una secuencia de región variable con el orden en FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. En donde, los residuos de aminoácidos se identificaron y anotaron según el sistema de numeración de Kabat.

1. Selección de un armazón para humanizar el clon mAb229 de hibridoma

El molde de cadena ligera para humanizar el anticuerpo murino mAb229 es IGKV1-39*01 y hjk4.1, el molde de cadena pesada para la humanización es IGHV7-4-1*01 y hjh6.1, las secuencias de la región variable humanizada, son las siguientes: Injerto Hu229VH-CDR

QVQLVQSGSELKKPGASVK VSC KASGYTF1 T.SG.Y1S W VRQA PGQGLE HAÍC'W1NJ

YSG V PTYA1JIÍHKC \RFYFSLDTS VSTA YLQISSLKA EDTA VYYCA ffDN YDARDV Y Y YAM DY WGQGTTVTVSS

SllQ ID NO: 21 Injerto Hu229VL-CDR

GVPSRFSGSGSGTDFTLriSSLOPEDE/mYCOHFWTTFWTFGGGTKVEIK

ÍSBQ ID NO: 22

NOTA: El orden es FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, la secuencia en cursiva representa la secuencia estructural y la secuencia subrayada representa la secuencia de CDR.

2. Selección de molde y diseño de retromutación para el clon de hibridoma mAb229, véase la Tabla 4 a continuación:

NOTA: Por ejemplo, I48V indica una retromutación desde I hasta V en la posición 48 según el sistema de numeración de Kabat. Injertado indica que la CDR del anticuerpo murino se implantó en secuencias estructurales de estirpe germinal humana.

Tabla 5: combinaciones de secuencias para humanizar el anticuerpo murino mAb229

NOTA: Esta tabla muestra diversas combinaciones de secuencias de diferentes mutaciones. Por ejemplo, Hu229-005 indica que dos mutaciones (HumAb229_VL.1A, de cadena ligera, y HumAb229_VH.1, de cadena pesada) están presentes en el anticuerpo murino humanizado Hu229-005, y así sucesivamente.

Las secuencias del anticuerpo humanizado mAb229 son las siguientes:

Hu229VH.1 (idéntico al injerto Hu229VH-CDR)

Q VQLV QSGS ELKK PG A S VK VSC K A S G YTFTTSGMS W VRQ A PGQGLEWMG W

I NT Y S G V PT YA DDF KGRFVF5LDTS VS TA YI ,Q ISS LK A R DTAV Y Y C A R DN Y D A

RDVYYYAMDYWGQGTTVTVSS SEO ID NO: 21

Hu229VH.1A

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVRQAPGQGLKWMGW

INTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDNYDA

RDVYYYAMDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 23

Hu229VH.1B QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVKQAFGQGLKWMGW INTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYYCARDNYDA RDVYYYAMDYW GQGTTVTVSS SEQ ID NO: 24

Hu229VH.1C

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVKQAPGQGLKWMGW

rNTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARDNYDAR DVYYYAMDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 25

Hu229VL.1 (idéntico al injerto Hu229VL-CDR)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYAATN'L

ADGVPSRFSGSGSGTDFTLTÍSSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVE1K

SEQ ID NO: 22 Hu229VL.1 A

DTQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAATN

LADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO; 26 Hu229VL.1B

DTQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAATN

l a d g v p s r f s g s g s g t o y t l t j s s l q p e d f a t y y c q h f w j t p w t f g g g t k v e ik SEO ID NO: 21 Hu229VL.1C

DTQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAATN

l a d g v p s r f s g s g s g t o y t l t is s l q p e d f a t y y c q h f w it p w t f g g g t k v e ik SEO ID NO: 28 Ejemplo 4. Humanización del anticuerpo monoclonal murino de hibridoma anti-LAG-3 humano mAb303

A través de la comparación en la base de datos de IMGT de genes de la región variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano y el software MOE, los genes de la estirpe germinal de la región variable de cadena pesada y ligera con alta homología con respecto a mAb303, se seleccionaron como moldes, las CDR derivadas de anticuerpos murinos se injertaron en el molde de fuente humana correspondiente, para formar una secuencia de región variable con el orden en FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. En donde, los residuos de aminoácidos se identificaron y anotaron según el sistema de numeración de Kabat.

1. Selección de un armazón para humanizar el clon mAb303 de hibridoma

El molde de cadena ligera para humanizar anticuerpo murino mAb303 es IGKV1-39*01 y hjk4.1, el molde de cadena pesada para la humanización es iGh V1-3*01 y hjh6.1, las secuencias de la región variable humanizada, son las siguientes:

Injerto

Injerto Hu303VL-CDR

DIQM TOSPSSLSASVGDR V77JCR ASODtGSRt J j WYQQKPGKAPKLLI KATSTLDS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLO PEPEA 7YPCLQLAS SFFYFGCrGTKVE1K

SEO ID NO: 30 NOTA: El orden es FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, la secuencia en cursiva representa la secuencia estructural y la secuencia subrayada representa la secuencia de CDR.

2. Selección de molde y diseño de retromutación para el clon de hibridoma mAb303, véase la Tabla 6, a continuación:

NOTA: Por ejemplo, L46R indica una retromutación desde L hasta R en la posición 46, según el sistema de numeración de Kabat. Injertado indica que la CDR del anticuerpo murino se implantó en secuencias estructurales de estirpe germinal humana.

Las combinaciones de secuencias de diferentes mutaciones son las siguientes:

Tabla 7: combinaciones de secuencias para la humanización del anticuerpo murino mAb303

NOTA: Esta tabla muestra diversas combinaciones de secuencias de diferentes mutaciones. Por ejemplo, Hu303-005 indica que dos mutaciones (HumAb303_VL.1A, de cadena ligera, y HumAb303_VH.1, de cadena pesada) están presentes en el anticuerpo murino humanizado Hu303-005, y así sucesivamente.

Las secuencias del anticuerpo humanizado mAb303 son las siguientes:

Hu303_VH.1 (idéntico al injerto Hu303VH-CDR)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQRLEWMC^jVINPYNGDTAYNQKFKGRVnTRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGY

YDYYFDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 29

Hu303_VH.1 A QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQRLEWMiG

VINPYNGDTAYNQKFKGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRDDGY

YDYYFDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 31

Hu303_VH.1 B

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTDYYMNWVRQAPGQRLEWMG

V1N P YNGDTAYNQ KFKGRVT1T VD KS ASTAYMELSSLRSEDTAV Y Y CTRDDGY

YDYYFDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 32

Hu303_VH.1C

QVQLV QSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTLTD Y YMNW VRQ APGQRLEWTG VI

NPYNGDTAYNQKFKGRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRDDGYY

DYYFDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 33

Hu303_VL.1 (idéntico al injerto Hu303VL-CDR)

DIQMT QSPSS LS AS VGDRVTTTCRAS QDIGSRLNW Y QQKPGKAPKLLIYATSTL

DSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPCDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 30 Hu303_VL.1A

DIQMTQSPSSLSASVGDRVT1TCRASQDIGSRLNWYQQKPGKAPKRL1YATSTL

DSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 34 Hu303_VL.1B dtqmtqspsslsasvgdrvtjtcrasqdigsrlnwyqqkpgkapkrliyatstl

DSGVPKRFSGSRSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK

SEO ID NO: 35 Hu303_VL.1C

DIQMTQS PSSLS AS VGDRVTITCR AS QDT GS RLN WLQQ K PG K AFK R LIYATS TL

DSGVPKRESGSRSGTDFTLTiSSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVElK SEO ID NO: 36 Hu303_VL.1D DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQD1GSRLNWLQQKPGGAFKRL1YATSTL DSGV P K RFSGS RSGTDFTLT JSSLQPEDFAD Y YC LQL ASSPPTFGGGTK VE IK SEQ ID NO: 37

Ejemplo 5. Preparación de recombinación y anticuerpo humanizado

El anticuerpo se construyó con una región constante derivada de la cadena pesada de IgG4/cadena ligera k humanas en combinación con cada región variable, y se realizó una mutación S228P en Fc para aumentar la estabilidad del anticuerpo IgG4. Las otras mutaciones conocidas en la técnica también pueden usarse para aumentar su rendimiento. Región constante de cadena pesada:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

AVLQSSGLYS LSS VVT VPSSSLGTKT YTCNVDH K PSNTK VDKRVES K YGPPCP

PCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISETPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD

GVEVHNA KTKPREE QFN S T Y R W S VLTV LHQDWLN GKEY KC KV S NKG LPS S1

EKTLSKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG

Q P EN N Y KTTPP V L D S DG S FF LY S R LTV D K S RWQE GN V FSCS V M H E A LH N H YT

QKSLSLSLGK SEQ ID NO: 38 Región constante de cadena ligera:

RT VA A PS V F1FPPS D EQLKS GTAS V V CLLN N F Y PRE A K V Q W K V DN A LQS G N S

QFS VTEQDSKDST YSLSST1JESK ADYEK H K V YACE VT H QGESS P VTKSFNRG

EC SEO JD NO: 39 1. Clonación molecular del anticuerpo recombinante

Las secuencias codificantes de la región variable se obtuvieron secuenciando las moléculas de anticuerpo positivas obtenidas a partir de la selección del hibridoma. Los cebadores se diseñaron según la secuencia obtenida, el gen de secuenciación se usó como molde, y se construyeron diversos fragmentos de genes VH/VK de anticuerpo mediante PCR, y después se reconstituyeron con el vector de expresión pHr (con un péptido señal y un fragmento de la región constante [CH1-FC/CL] de IgG4/K humanas) para construir un plásmido de expresión VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr para el anticuerpo recombinante de longitud completa.

2. Clonación molecular del anticuerpo humanizado

La secuencia del anticuerpo humanizado diseñada se sometió a optimización de codones y se generó una secuencia codificante con preferencia de codón humano. Los cebadores se diseñaron y varios fragmentos de genes VH/VK de los anticuerpos se construyeron mediante PCR, y se reconstituyeron con el vector de expresión pHr (con un péptido señal y un fragmento de la región constante [CH1-FC/CL] de IgG4/K humanas) para construir un plásmido de expresión VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr para el anticuerpo humanizado completo.

3. Expresión y purificación de recombinación y anticuerpo humanizado

Los plásmidos para la expresión independiente de la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo, se cotransfectaron en células HEK293E, en una proporción de 1:1,2. Se recogió el sobrenadante de expresión tras 6 días, y se retiraron las impurezas mediante centrifugación a alta velocidad y después se purificaron mediante columna de proteína A. La columna se lavó con PBS hasta que la lectura de A280 se redujo al valor inicial. La proteína diana se eluyó con tampón de elución ácido, pH 3,0-pH 3,5, y se neutralizó con Tris-HCl 1 M, pH 8,0-9,0. El eluyente se concentró adecuadamente y se purificó adicionalmente mediante cromatografía en gel Superdex200 (GE), que se equilibró con PBS. Se excluyó el pico de apareamiento erróneo y se recogió el pico de elución. Luego se tomaron alícuotas de la muestra correcta para su uso.

El rendimiento y los beneficios del anticuerpo de la presente invención se verifican mediante métodos de prueba bioquímica, a continuación.

Ejemplo de prueba 1. Ensayo ELISA para determinar la unión de anticuerpo contra LAG-3 a proteína LAG-3 humana

La capacidad de unión del anticuerpo anti-LAG-3 a la proteína LAG-3 humana se detectó mediante ensayo ELISA. La proteína de fusión de LAG-3 con marcador mFc o Fc se inmovilizó en una placa de microtitulación de 96 pocillos, uniéndose al anticuerpo anti-Fc o mFc recubierto en la placa de microtitulación, la resistencia de la señal después de la adición del anticuerpo se usó para determinar la actividad de unión del anticuerpo a LAG-3, siendo el método experimental específico el siguiente.

El anticuerpo de cabra anti-Fc humano (Jackson Immuno Research, n.° de cat. 109-005-008) o anticuerpo de cabra anti-Fc de ratón (Sigma, n.° de cat. M3534-1ML) se diluyó a una concentración de 2 pg/ml con tampón PBS a pH 7,4, y se añadió a una placa de 96 pocillos a un volumen de 50 pl/pocillo y después, la placa se incubó en la estufa de incubación a 37 °C durante 2 horas. Después de descartar el líquido, las placas se bloquearon con 200 pl/pocillo de solución de bloqueo que contenía leche desnatada al 5 % (leche desnatada de Guangming) en PBS, y se incubaron en la estufa de incubación a 37 °C durante 2,5 horas o durante la noche a 4 °C (16-18 horas). Después del bloqueo, la solución de bloqueo se desechó y la placa se lavó 5 veces con tampón PBST (pH 7,4, PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %). Se diluyó la proteína de fusión LAG-3-Fc (SEQ ID NO: 3, producida internamente) o proteína de fusión LAG-3-mFc (SEQ ID NO: 4, producido internamente) con dilución de muestra (pH 7,4, PBS que contenía ASB al 1 %) hasta 1 pg/ml y se añadió a cada pocillo, 50 pl/pocillo. A continuación, la placa se incubó en la estufa de incubación a 37 °C durante 1 h o durante la noche a 4 °C. Después de la incubación, la solución de reacción en la placa se desechó, y la placa se lavó con PBST 6 veces, y después se añadieron 50 pl de diversas concentraciones del anticuerpo de prueba (anticuerpo purificado de hibridoma o anticuerpo humanizado) diluido con dilución de la muestra y la placa se incubó a 37 °C durante 1 h. Las placas se lavaron 5 veces con PBST después de la incubación, y se añadieron 100 pl/pocillo de anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón (Jackson Immuno Research, n.° de cat. 115-035-003) o anticuerpo secundario de cabra anti-IgG humana (Jackson Immuno Research, n.° de cat. 109-035-003) marcado con HRP, diluido en dilución de muestra y la placa se incubó a 37 °C durante 1 h. Después de lavar las placas 6 veces con PBST, se añadieron 50 pl/pocillo de sustrato cromogénico TMB (KPL, n.° de cat. 52-00-03) a cada pocillo, y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-15 min, y la reacción se detuvo mediante la adición de 50 pl/pocillo de H²SO⁴1 M a cada pocillo. Se leyó el valor de DO a una longitud de onda de 450 nm en un lector de microplacas NOVOStar y, a continuación, se calcularon los valores de CE⁵⁰de la unión del anticuerpo contra LAG-3 a LAG-3 humano. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Los datos mostraron que todos los anticuerpos humanizados obtenidos por el método de selección en la presente invención, mostraron excelentes actividades de unión a la proteína LAG-3 humana.

Tabla 8 Determinación del valor de CE50 para el anticuerpo candidato en el ensayo de unión

Ejemplo de prueba 2. Ensayo de unión del anticuerpo contra LAG-3 con células CHO-S que sobreexpresan LAG-3 humano

La capacidad de unión de anticuerpo anti-LAG-3 a células CHO-S que sobreexpresan proteína LAG-3, se detectó mediante ensayo de unión. El plásmido de LAG-3 de longitud completa (producido internamente, SEQ ID NO: 2) se transfectó en células CHO-S mediante electroporación, y el nivel de expresión de LAG-3 se detectó después de dos semanas de cribado posterior a la presión. Las células que sobreexpresan LAG-3 se fijaron a la parte inferior de la placa de 96pocillos, y la resistencia de la señal después de la adición del anticuerpo se usó para determinar la actividad de unión del anticuerpo a células CHO-S que sobreexpresan LAG-3 humano, siendo el método experimental específico el siguiente.

Se sembraron 100 pl/pocillo de células en una placa de 96 pocillos, con una densidad de 4 x 105/ml, y se incubaron durante la noche. El sobrenadante se desechó y la placa se lavó tres veces con PBS, se añadió PFA al 4 %, 100 pl/pocillo, para fijar durante media hora a temperatura ambiente, y después la placa se lavó tres veces con PBS. Tras desechar el líquido, la placa se bloqueó con 200 pl/pocillo de solución de bloqueo que contenía leche desnatada al 5 % (leche desnatada de Guangming) diluida en PBS, y se incubó a 37 °C durante 2,5 horas. Después del bloqueo, la solución de bloqueo se desechó y la placa se lavó 5 veces con tampón PBST (pH 7,4 PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %), se añadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo de prueba (anticuerpo purificado de hibridoma o anticuerpo humanizado) con diferentes concentraciones diluidas con dilución de muestra, y después se incubó en estufa de incubación a 37 °C durante 1 h. La placa se lavó 5 veces con PBST después de la incubación, se añadieron 100 pl/pocillo de anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón (Jackson Immuno Research, n.° de cat. 115-035-003) o anticuerpo secundario de cabra anti-IgG humana (Jackson Immuno Research, n.° de cat. 109-035-003) marcado con HRP, diluido en dilución de muestra y la placa se incubó a 37 °C durante 1 h. Después de lavar las placas 6 veces con PBST, se añadieron 50 pl de sustrato cromogénico TMB (KPL, n.° de cat. 52-00-03) a cada pocilio, y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-15 min, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 pl de H²SO⁴1 M a cada pocilio. Se leyó el valor de DO a una longitud de onda de 450 nm en un lector de microplacas NOVOStar y después se calcularon los valores de CE⁵⁰de la unión del anticuerpo contra LAG-3 a la célula CHO que sobreexpresaba LAG-3.

Ejemplo de prueba 3. Ensayo para determinar el anticuerpo anti-LAG-3 en el bloqueo de la unión de antígeno de LAG-3 a células Daudi

Se sembraron células Daudi (células de leucemia humana, adquiridas en el banco celular de la Academia China de las Ciencias) en una placa de 96 pocillos, con una densidad de 3 x 105/pocillo. Después de la centrifugación a 1000 rpm, se desechó el sobrenadante, y después se añadió a la placa PFA al 4 %, para fijar durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó 4 veces con PBS después de desecharla solución fijada, y la placa se bloqueó con 200 pl/pocillo de solución de bloqueo que contenía leche desnatada al 5 % (leche desnatada de Guangming) diluida en PBS, y se incubó a 37 °C durante 2,5 horas. Después del bloqueo, la solución de bloqueo se desechó y la placa se lavó 5 veces con tampón PBST (pH 7,4 PBS, que contenía Tween-20 al 0,05 %), se añadieron 50 pl/pocillo de mezcla de proteína de fusión LAG-3-Fc marcada con biotina (producida internamente, SEQ ID NO: 3), se diluyó con solución de dilución (pH 7,4 PBS que contenía ASB al 1 %) a una concentración final de 0,4 pg/ml, en donde la biotina (kit de marcaje con biotina, Dojindo Chemical, n.° de cat. LK03) se mezcló previamente durante una hora, y se determinaron las concentraciones en gradiente del anticuerpo que iba a someterse a prueba, y después la placa se incubó a 37 °C durante 1 h. La solución de reacción se desechó y la placa se lavó 5 veces con PBST después de la incubación, se añadieron 50 pl/pocillo de estreptavidina marcada con HRP (Sigma, n.° de cat. S2438) que se diluyó con dilución de la muestra, y la placa se incubó a 37 °C durante 1 h. Después de lavar las placas 5 veces con PBST, se añadieron 50 pl/pocillo de sustrato cromogénico TMB (KPL, n.° de cat.52-00-03) a cada pocillo, y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-15 min, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 pl de H²SO⁴1 M a cada pocillo. Se leyó el valor de DO a una longitud de onda de 450 nm en un lector de microplacas NOVOStar y después se calculó la actividad del anticuerpo contra LAG-3 en el bloqueo de la unión del antígeno a las células Daudi. Los resultados se muestran en la Tabla 9. Los datos muestran que todos los anticuerpos humanizados obtenidos por el método de selección en la presente invención, bloquearon significativamente la unión de antígeno de LAG-3 humano a células Daudi.

Tabla 9 Determinación del valor de CI⁵⁰del anticuerpo candidato en el ensayo de bloqueo

Ejemplo de prueba 4. Ensayo BIAcore para determinar la afinidad del anticuerpo contra LAG-3

1. El anticuerpo anti-captura de ratón se unió covalentemente al biochip CM5 (n.° de cat. BR-1000-12, GE) según el método descrito en el kit de anticuerpo anti-captura de ratón (n.° de cat. BR-1008-38, GE), de modo que el anticuerpo de prueba se capturó mediante afinidad. A continuación, el antígeno de LAG-3-Flag (producido internamente, SEQ ID NO: 1) se hizo fluir a través de la superficie del biochip, y la señal de reacción se detectó en tiempo real usando un instrumento Biacore para obtener las curvas de unión y disociación, y se obtuvo el valor de afinidad mediante el ajuste, véase la Tabla 2 anterior. Después de finalizar cada ciclo de disociación en el experimento, el biochip se lavó y se regeneró con una solución de regeneración proporcionada en el kit de anticuerpo anti-captura de ratón. Los resultados demuestran que el anticuerpo contra LAG-3 mAb229 y mAb303 mostraron una excelente actividad y afinidad de unión a la proteína LAG-3 humana.

2. El anticuerpo anti-captura humano se unió covalentemente al biochip CM5 (n.° de cat. BR-1000-12, GE) según el método descrito en el kit de anticuerpo anti-captura humano (n.° de cat. BR-1008-39, GE), de modo que el anticuerpo de prueba se capturó mediante afinidad. A continuación, el antígeno de LAG-3-Flag (producido internamente, SEQ ID NO: 1) se hizo fluir a través de la superficie del biochip, y la señal de reacción se detectó en tiempo real usando un instrumento Biacore para obtener las curvas de unión y disociación, y se obtuvo el valor de afinidad mediante el ajuste, véase la Tabla 10, a continuación. Después de finalizar cada ciclo de disociación en el experimento, el biochip se lavó y se regeneró con una solución de regeneración proporcionada en el kit de anticuerpo anti-captura humano. Los resultados demuestran que los anticuerpos obtenidos por el método de selección en la presente invención, mostraron una excelente actividad de unión y afinidad a la proteína LAG-3 humana.

Tabla 10. Afinidad del anticuerpo anti-LAG-3

Ejemplo de prueba 5. Activación de linfocitos T de PBMC

Para estudiar el efecto del anticuerpo contra LAG-3 sobre la activación de los linfocitos T, se recogieron y purificaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) humanas. El nivel de secreción de citocinas IL-2 se midió después de estimular con superantígeno de enterotoxina B (SEB) de Staphylococcus aureus in vitro durante 72 h. El procedimiento experimental se describe brevemente a continuación:

Las PBMC recién aisladas y purificadas se sembraron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos, con una densidad celular de aproximadamente 1 x 105/pocillo, y se añadieron 100 ng/ml de estímulo de superantígeno SEB, y se añadieron al mismo tiempo muestras de anticuerpos diluidas en gradiente (diluidas con medio) o medio como control en blanco. A continuación, la placa se incubó a 37 °C, CO²al 5 % durante 72 h, y se recogió el sobrenadante del cultivo celular. El nivel de IL-2 secretada en el sobrenadante del cultivo se midió mediante ELISA (BD, n.° de cat. 550611). Los procedimientos detallados se indican en el manual del fabricante. Los resultados se muestran en la Figura 1. Ambos anticuerpos contra LAG-3 humanizados, Hu229-013 y Hu303-005, pueden mejorar los niveles de citocina IL-2 secretada por los linfocitos T activados hasta un grado diferente, y esto tiene un efecto dependiente de la dosis de la concentración de fármaco.

Ejemplo de prueba 6. Inhibición del tumor U87MG inoculado por vía subcutánea por el anticuerpo contra LAG-3

En este estudio, se midió el efecto del anticuerpo anti-LAG-3 humanizado en el volumen tumoral de ratones portadores de tumor U-87 MG.

Se inocularon por vía subcutánea 100 pl de células U87 MG de glioma humano (3,5 x 106 células) en las costillas derechas de ratones NOD-SCID (adquiridos de Changzhou Cavion Experimental Animal Co., Ltd ). Cuando el tumor creció hasta 40 mm3 después de 10 a 14 días, los ratones, excluyendo aquellos con un peso corporal o un volumen tumoral demasiado grande o demasiado pequeño, se dividieron aleatoriamente en tres grupos: un grupo de control con hIgG de isotipo emparejado, un grupo con anticuerpos candidatos contra LAG-3 Hu229-013 y un grupo con anticuerpos candidatos contra LAG-3 Hu303-005, según el volumen tumoral (véanse el agrupamiento y la dosificación en la Tabla 1), cada grupo de 8 ratones (D0). Las PBMC estimuladas por anticuerpo contra CD3 se inyectaron en los tejidos tumorales a 5 x 105 células/60 pl, y la inyección del anticuerpo de prueba se inició mediante inyección i.p., tres veces a la semana durante el total de 6 veces. Se midió a los ratones para determinar el volumen tumoral dos veces a la semana, y se registraron los datos. El volumen tumoral (V) se calculó como:

Volumen tumoral (VT) = 1/2 * a * b2, en donde a y b representan la longitud y la anchura, respectivamente.

El volumen tumoral de cada grupo se expresó como la media ± error típico (media ± ETM), y se representó gráficamente con el software Graphpad Prism 5, se analizó con análisis estadístico ANOVA de dos vías, y la tasa de inhibición del tumor se calculó según la siguiente fórmula:

Tasa de proliferación tumoral (% de T/C) = (T - T⁰/ C - C⁰) * 100 %

% de tasa de inhibición tumoral ICT = 1 - % de T/C

El resultado se muestra en la Tabla 11 y la Figura 2, lo que indica que los 14 días posteriores a la administración, los anticuerpos contra LAG-3 Hu229-013 6mpk y Hu303-005 6mpk tienen determinado efecto antitumoral, y las tasas de inhibición del tumor fueron del 27,25 % (p < 0,05) y del 34,94 % (p < 0,01), respectivamente. Hubo una diferencia significativa en comparación con el grupo de control (p < 0,001 frente a hIgG).

Tabla 11. Efecto del anticuerpo anti-LAG-3 humanizado sobre el tumor U-87MG inoculado por vía subcutánea en ratones.

D0: Primer tiempo de administración; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 frente a hIgG mediante ANOVA de dos vías.

Ejemplo de prueba 7. Ensayo de farmacocinética (FC) de anticuerpos anti-LAG-3 humanizados Hu229-013 y Hu303-005 en ratón

Se adquirieron dieciocho ratones ICR, macho, que pesaban de 18 a 22 g, de West Poole-Bikai Experimental Animal Co., Ltd. Durante el periodo de alimentación, se permitió a los ratones el acceso al agua y a la comida a voluntad, la duración de la adaptación en el entorno del laboratorio no es inferior a 3 días, con una regulación de ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas, a la temperatura de 16-26 °C y humedad relativa del 40-70 %. Los ratones ICR se numeraron y se dividieron aleatoriamente en diferentes grupos un día antes de comenzar el experimento, siendo cada grupo de 3 ratones. El día del experimento, se les inyectó por vía intravenosa a dos grupos de ratones anticuerpo candidato humanizado (Hu229-013) a una dosis de 3 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente; A los otros dos grupos de ratones se les inyectó por vía intravenosa anticuerpo candidato humanizado (Hu303-005) a una dosis de 3 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente. El volumen para inyección intravenosa es de 20 ml/kg.

Las muestras de sangre se recogieron en el punto de tiempo de 15 min, 8 h, 1 d, 2 d, 7 d, 10 d, 14 d, 21 d, 28 d y 35 d después de la administración. Cada vez se tomaron aproximadamente 0,1 ml de sangre completa en el tubo de centrífuga sin anticoagulante, se colocaron a 4 °C durante 30 min, y después se centrifugaron a 1000 g durante 15 min. Después de eso, se pipeteó el sobrenadante en el tubo EP y se almacenó a -80 °C.

La concentración de fármaco en suero se midió mediante ELISA, y el T1/2 y otros parámetros principales se calcularon mediante el software Winnolin. Los principales parámetros farmacocinéticos se muestran en la Tabla 12:

Tabla 12. Parámetros farmacocinéticos de Hu229-013 y Hu303-005 en ratones

Las ABC de los anticuerpos contra LAG-3 humanizados Hu229-013 y Hu303-005 en ratones, fueron similares, y las ABC y las concentraciones máximas de estos dos anticuerpos a la dosis de 3 y 10 mg/kg, se correlacionaron linealmente con la dosis creciente y mostraron una característica farmacocinética lineal.

Ejemplo de prueba 8. Estabilidad física del anticuerpo

Este ejemplo de prueba se usó para detectar la estabilidad física de los anticuerpos anti-LAG-3 humanizados Hu229-013 y Hu303-005.

La estabilidad térmica de diferentes anticuerpos se detectó mediante CDB (Calorimetría Diferencial de Barrido), y se comparó la estabilidad del anticuerpo en diferentes sistemas tampón y diferentes condiciones de pH. Los sistemas tampón correspondientes a diferentes valores de pH son, por ejemplo, PBS (pH 7,4), His 10 mM/NaCl 135 mM (pH 6,0), acetato 10 mM/NaCl 135 mM (pH 5,2).

La muestra se disolvió en el tampón correspondiente, y la concentración de la muestra se controló a aproximadamente 1 mg/ml, y se detectó usando CDB capilar MicroCal*VP (Malvern). Antes de la prueba, cada muestra y tampón de blanco se desgasificaron con un dispositivo de desgasificación al vacío durante de 1 a 2 min. Se añadieron 400 pl de muestra o tampón de blanco a cada pocillo (la cantidad de carga fue de 300 pl). Finalmente, se añadieron a los dos pares de pocillos Decon 90 al 14 % y ddhhO, respectivamente, para lavar. Después de cargar la placa con la muestra, la placa se selló con una cubierta de plástico. El barrido se inició a partir de la temperatura de 25 °C a 100 °C y la velocidad de barrido fue de 60 °C/h. Los resultados se muestran en la Tabla 13, que indican que ambos anticuerpos, Hu229-013 y Hu303-005, mostraron una excelente estabilidad térmica en varios sistemas de prueba.

Tabla 13:

La pureza de las muestras se controló mediante SEC-HPLC (Size Exclusión Chromatography-High Performance Liquid Chromatography, cromatografía de exclusión por tamaño-cromatografía líquida de gran rendimiento), y se investigó la estabilidad periódica en determinadas condiciones. Las condiciones, a modo de ejemplo, son, por ejemplo, controlar la concentración de la muestra a aproximadamente 50 mg/ml y comparar la estabilidad de los diferentes anticuerpos que se congelaron y descongelaron repetidamente a -80 °C durante 5 veces en un sistema de PBS (pH 7,4) y se almacenaron a 4 °C y 40 °C durante un mes. La columna de HPLC Xbridge protein BEH SEC 200A (Waters) se usó para la detección. Los resultados se muestran en la Tabla 14, que indican que ambos anticuerpos mostraron una mejor estabilidad.

Tabla 14

NOTA: El % de A indica la tasa de la pureza de HPLC reducida

Ejemplo de prueba 9. Estabilidad química del anticuerpo

La desamidación es una modificación química común de anticuerpos que pueden afectar a la estabilidad en la etapa posterior y, especialmente, es generalmente deseable evitar un alto grado de modificación por desamidación en los residuos de aminoácidos en la región CDR o intentar reducir las mutaciones. Se disolvieron 500 pg del anticuerpo de prueba en 500 pl de PBS a pH 7,4, y después se colocaron en un baño de agua a 40 °C. Las muestras se tomaron el día 0, 3, 7 para el ensayo enzimático. Se disolvieron 100 pg de cada muestra que se tomó en diferentes puntos de tiempo en 100 pl de His-HCl 0,2 M, solución de Gpa-HCl 8 M, pH 6,0 y se añadieron 3 pl de 0,1 g/ml de DTT, y después se colocó la muestra en un baño de agua a 50 °C durante 1 h. Después de la ultrafiltración dos veces con His-HCl 0,02 M, pH 6,0, se añadieron 3 pl de 0,25 mg/ml de tripsina para digestión enzimática en un baño de agua a 37 °C durante la noche. La modificación por desamidación se examinó usando CL-EM (Q-TOF [Quadrupole Time of Flight, tiempo de vuelo de cuadrupolo] Agilent 6530), y los resultados se muestran en la Tabla 15.

Tabla 15:

NOTA: N representa la asparagina modificada que se detectó, y el número representa la posición contada desde el extremo N-terminal de la cadena ligera o la cadena pesada. El porcentaje representa la proporción de la modificación por desamidación con respecto a la señal de péptido total en este sitio detectada por CL-EM.

Los resultados de la espectrometría de masas muestran que no hubo una alta proporción obvia de sitios de modificación por desamidación en los anticuerpos detectados, lo que sugiere que la estabilidad química del anticuerpo es buena en la etapa posterior.

Claims

REIVINDICACIONESUn anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera,en donde la región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende: HCDR1, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 12, HCDR2, tal como se muestra en la Se Q ID NO: 13, y HCDR3, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 14; yen donde la región variable de cadena ligera del anticuerpo comprende: LCDR1, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 18, LCDR2, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 19, y LCDR3, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 20;en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo;en donde el anticuerpo comprende una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en:

10) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37;

11) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30;

12) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34;

13) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35;

14) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36;

15) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37;

16) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30;

17) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34;

18) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35;

19) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36; y

20) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37.

El anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende, además, una región constante de cadena pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas, o una variante de la mismas.

3. El anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según las reivindicaciones 1 o 2, en donde la cadena pesada de anticuerpo comprende, además, una región constante de cadena pesada derivada de IgG4 humana o una variante de la misma.

4. El anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la región constante de cadena pesada es tal como se muestra en la SEQ ID NO: 38.

5. El anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende, además, una región constante de cadena ligera derivada de cadena k humana, cadena A humana o una variante de las mismas.

6. El anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la región constante de cadena ligera es tal como se muestra en la SEQ ID NO: 39.

7. El anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 29, y una región constante de cadena pesada, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 38, y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende: una región variable de cadena ligera, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 34, y una región constante de cadena ligera, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 39.

8. Una composición farmacéutica, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

9. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 9.

11. Una célula hospedadora transformada con el vector de expresión según la reivindicación 10, en donde la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en células procariotas y células eucariotas.

12. Una célula hospedadora según la reivindicación 11, en donde la célula hospedadora es una célula de mamífero.

13. Un método para preparar un anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el método comprende expresar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo en la célula hospedadora, según las reivindicaciones 11 o 12, y aislar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la célula hospedadora.

14. El anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según las reivindicaciones 1 a 7, o la composición farmacéutica según la reivindicación 8, o el ácido nucleico según la reivindicación 9, para su uso en la inhibición del crecimiento tumoral en el sujeto.

15. El anticuerpo contra LAG-3 o el fragmento de unión a antígeno, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la composición farmacéutica según la reivindicación 8, o el ácido nucleico según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o una afección asociada con la participación de linfocitos T patógenos, en donde la enfermedad o la afección es, preferiblemente, cáncer; siendo el cáncer seleccionado del grupo que consiste en: cáncer de ovario, melanoma, cáncer de próstata, cáncer intestinal, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de páncreas, cáncer de útero, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer bucal, cáncer de cerebro, cáncer de testículo, cáncer de piel, cáncer de tiroides y tumores malignos hemáticos, incluyendo mieloma, y leucemia crónica y aguda.