BR112012025730B1 - anticorpo isolado que se liga ao erbb3 humano, seus usos, seu processo de produção e vetor de expressão - Google Patents

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Abstract

ANTICORPOS ANTI-ERBB3, SEUS USOS E SEU PROCESSO DE PRODUÇÃO, ÁCIDOS NUCLEICOS, VETORES DE EXPRESSÃO, CÉLULAS HOSPEDEIRAS, BEM COMO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO. A invenção refere-se a anticorpos monoclonais que se ligam e inibem a ativação do membro ErbB3/HE3 relacionado com o receptor do fator de crescimento epidermal. Os anticorpos podem ser utilizados para tratar doenças e distúrbios proliferativos das células, incluindo certas formas de câncer, associados à ativação do ErbB3/HER3.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] A presente invenção reivindica prioridade do pedido provisório U.S., número de série 61/322.712, depositado em 9 de abril de 2010, cujo teor integral é aqui incorporado por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] O campo da invenção é a biologia molecular, imunologia e oncologia. Mais particularmente, o campo são anticorpos humanizados que se ligam ao ErbB3/HER3 humano.
ANTECEDENTES
[0003] O HER3/c-ErbB3 (aqui referido como ErbB3) é um membro da família de receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFR). O ErbB3 liga-se à neuregulina/heregulina (NRG/HRG). Os receptores da família do EGFR são receptores transmembranas individuais com um domínio tirosina cinase intracelular. Enquanto os outros membros da família do EGFR, i.e., EGFR/HER1/ErbB1, HER2/ErbB2, e HER4/ErbB4, cada um tem atividade tirosina cinase, o ErbB3 tem pouca ou nenhuma atividade tirosina cinase e, portanto, é "cinase- morto."
[0004] O domínio extracelular (ECD) da família do EGFR contém quatro domínios. Os domínios 1 e 3 (também conhecidos como domínios L1 e L2) são responsáveis pela ligação do ligante. Os domínios ricos em cisteína 2 e 4 (também conhecidos como domínios C1 e C2) estão envolvidos na dimerização com parceiros do receptor. Quando da ligação do ligante, o ECD sofre alterações conformacionais. A interação dos domínios 2 e 4, que mantém a conformação amarrada (inativa) do receptor, é aliviada e é adotada uma conformação estendida (ativa). A conformação estendida favorece a dimerização com outros parceiros do receptor. O HER2/ErbB2 é a única exceção a esta regra geral, isto é, o HER2- ECD encontra-se constitutivamente na conformação estendida. Não foi identificado um ligante para HER2 até o momento.
[0005] Como o ErbB3 carece de uma atividade cinase intrínseca, deve dimerizar com outro receptor tirosina cinase ativo para ser ativado por fosforilação da tirosina. A dimerização pode ocorrer entre dois receptores diferentes (heterodimerização), por exemplo, ErbB3 e EGFR/HER1/ErbB1, HER2/ErbB2, ou HER4/ErbB4. Recentemente, o ErbB3 também demonstrou dimerizar com MET. Aquando da associação com outro receptor tirosina cinase, o ErbB3 é ativado por fosforilação de, pelo menos, nove resíduos de tirosina no domínio intracelular ErbB3 e depois rapidamente se associa a adaptadores ou moléculas de sinalização a jusante. Seis dos resíduos de tirosina fosforilada ErbB3 associam-se diretamente com a subunidade p85 da fosfatidilinositol-3-cinase (PIK3), que resulta na ativação da via celular de sobrevivência controlada pelo eixo PI3K/Akt. A ativação constitutiva do ErbB3 por dimerização não regulada e/ou a fosforilação não regulada do ErbB3 pode levar a certos cânceres.
[0006] A superexpressão do ErbB3 está associada ao mau prognóstico em vários carcinomas (por exemplo,cânceres da mama, do ovário, da próstata, colorretal, do pâncreas, do estômago, da cabeça e do pescoço). A superexpressão do ErbB3 também se correlaciona com o local para as metástases distais nos cânceres do pulmão, do estômago e colorretal e invasão do osso no câncer de próstata (Sithanandam et al ., 2008, CANCER GENE THERAPY 15:413). A superexpressão do ErbB3 tem sido associada à resistência a vários tratamentos de câncer, incluindo o tratamento com da tirosina quinase do EGFR em não pequenas células do câncer de pulmão (CPNPC) e nos cânceres da cabeça e do pescoço, tratamento com inibidor Her2 no câncer de mama, e o tratamento com radioterapia nos cânceres pancreáticos. Além disso, a superexpressão do NRG, um ligante para o ErbB3, também foi associado à resistência ao tratamento com inibidor da tirosina cinase do EGFR. Chen et al. descrevem o uso de anticorpos monoclonais anti-ErbB3 que inibem a função NRG e mostram o crescimento da atividade inibitória contra os cânceres de mama e ovário (Chen et al., 1996, J. BIOL. CHEM. 271: 7620).
[0007] Há necessidade de ter anticorpos anti-ErbB3 melhores que possam ser utilizados como agentes terapêuticos.
SUMÁRIO
[0008] A invenção é baseada na descoberta de uma família de anticorpos que especificamente se ligam ao ErbB3 humano. Os anticorpos contêm sítios ligantes ao ErbB com base em CDRs que se ligam especificamente ao ErbB3 humano. Quando utilizados como agentes terapêuticos, os anticorpos são concebidos, por exemplo, humanizados, para reduzir ou eliminar uma resposta imune quando administrados a um paciente humano.
[0009] Os anticorpos aqui divulgados impedem ou inibem a ativação do ErbB3 humano. Em algumas modalidades, os anticorpos impedem o ErbB3 de se ligar a um ligante, por exemplo, o NRG/HRG, neutralizando assim a atividade biológica do ErbB3. Em outras modalidades, os anticorpos anti-ErbB3 inibem a dimerização do ErbB3, assim neutralizando a atividade biológica do ErbB3. Os anticorpos aqui divulgados podem ser usados para inibir a proliferação de células tumorais in vitro ou in vivo. Quando administrados a um paciente humano com câncer (ou um modelo animal, como um modelo de ratinho), os anticorpos inibem ou reduzem o crescimento do tumor no paciente humano (ou no modelo animal).
[00010] Estes e outros aspetos e vantagens da invenção são ilustrados pelas seguintes figuras, descrição pormenorizada e reivindicações. Tal como usado nesse documento, o termo "incluindo" significa sem limitação e os exemplos citados são não-limitantes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00011] A presente invenção poderá ser mais bem entendida por referência às figuras seguintes.
[00012] A figura 1 (estado da técnica) é uma representação esquemática de um anticorpo típico.
[00013] A figura 2 é um diagrama esquemático apresentando a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina completa dos anticorpos, denotada como 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05. As sequências de aminoácidos para cada anticorpo estão alinhadas umas contra as outras, e as sequências complementares (CDR) (definição de Kabat), CDR1, CDR2 e o CDR3, são identificados em caixas. As sequências sem caixa representam sequências (FR) framework.
[00014] A figura 3 é um diagrama esquemático apresentando as sequências CDR1, CDR2 e o CDR3 (definição de Kabat) para cada uma das sequências de região variável da cadeia pesada de imunoglobulina na figura 2.
[00015] A figura 4 é um diagrama esquemático apresentando a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de imunoglobulina completa dos anticorpos 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05. As sequências de aminoácidos para cada anticorpo estão alinhadas umas contra as outras e as sequências (definição de Kabat) CDR1, CDR2 e CDR3, são identificadas em caixas. As sequências sem caixa representam sequências (FR) framework.
[00016] A figura 5 é um diagrama esquemático apresentando as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 (definição de Kabat) para cada uma das sequências de região variável da cadeia leve de imunoglobulina na figura 4.
[00017] As figuras 6A e 6B são gráficos que resumem os resultados de um ensaio para medir a atividade de "neutralização"do controle negativo (IgG murina (Δ)) e anticorpos monoclonais anti-ErbB3 04D01 (■), 12A07 (^), 18H02 (o), 22A02 (•) e 24C05 (T) para inibir a ligação de NRG1-β1 ao hErbB3 (figura 6A) e a medida da ligação melhorada de NRG1-β1 ao rhErbB3 pelo anti-ErbB3 mAb 09D03 (▲) e 11G01 (♦) (figura 6B).
[00018] A figura 7 é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade de "neutralização"do controle negativo (IgG murina) e anticorpos monoclonais anti-ErbB3 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 and 24C05 para inibir a ligação de NRG1-α1 ao rhErbB3.
[00019] A figura 8 é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir o reconhecimento da superfície celular dos anticorpos anti-ErbB3 da proteína quimérica Her2/3d2 expressos na superfície das células CHO.
[00020] A figura 9 é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade antiproliferação do controle negativo IgG (IgG murina (Δ)) e dos anticorpos monoclonais anti-ErbB3 04D01 (■), 09D03 (▼), 11G01 (♦), 12A07 (<z), 18H02 (o), 22A02 (•) e 24C05 (T) em células BaF/3 expressando Her2 e ErbB3 na presença de NRG1- β1.
[00021] A figura 10 é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade antiproliferação dos anticorpos monoclonais anti-ErbB3 04D01 (■), 09D03 (▼), 11G01 (♦), 12A07 (^), 18H02 (o), 22A02 (•) e 24C05 (T) em células MCF7 na presença de NRG1-β1.
[00022] A figura 11 é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade de antiproliferação do controle negativo (IgG murina) e dos anticorpos monoclonais anti-ErbB3 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 em células SKBR-3 tratadas com 5Qμg/mL de anticorpos na presença de soro.
[00023] A figura 12 é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade inibidora do controle negativo IgG e dos anticorpos monoclonais anti-ErbB3 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 na fosforilação do ErbB3 induzida por NRG em células SKBR-3. Nenhum controle de anticorpo/ligante e nenhum controle de anticorpos é também apresentado.
[00024] As figuras 13A e 13B são gráficos que representam resultados de um ensaio para medir a atividade inibitória dos anticorpos monoclonais anti-ErbB3 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 sobre a fosforilação da Akt em resposta a NRG1- β1 em células MCF7 (figura 13A) e em células DU145 (figura 13B) como determinado por ELISA. Nenhum controle de anticorpo/ligante e nenhum controle de anticorpos é também apresentado.
[00025] A figura 14 é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade inibitória do tumor dos anticorpos anti- ErbB3 04D01 (Δ), 09D03 (♦), 11G01 (Y), 12A07 (▲), 18H02 (•), 22A02 (■), 24C05 (^) e o controlo da IgG humana ( - - ■ - - ) doseada em 20 mg/kg em um modelo de xenoenxerto tumoral do pâncreas BxPC3 em ratinhos CB17 SCID (controlo do veículo, PBS (♦)).
[00026] A figura 15 é um diagrama esquemático mostrando as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada completa de 24C05 e as regiões variáveis de cadeia pesada humanizadas completas denotadas como Sh24C05 Hv3-7, Sh24C05 Hv3-11, Sh24C05 Hv3-11 N62S, Sh24C05 Hv3-21, Sh24C05 Hv3-23, Sh24C05 Hv3-30 e do Hu24C05 HvA. As sequências de aminoácidos para cada região variável de cadeia pesada estão alinhadas umas contra as outras, e as sequências determinantes da complementaridade (CDR) (definição de Kabat), CDR1, CDR2 e CDR3, são identificadas em caixas. As sequências sem caixa representam sequências (FR) framework.
[00027] A figura 16 é um diagrama esquemático apresentando as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve completa de 24C05 e as regiões variáveis de cadeia leve humanizadas completas denotadas como Sh24C05 Kv1-9, Sh24C05 Kv1-16, Sh24C05 Kv1-17, Sh24C05 Kv1-33, Sh24C05 Kv1-39 e Hu24C05 KvA. As sequências de aminoácidos para cada região variável de cadeia leve estão alinhadas umas contra as outras e as sequências (definição de Kabat) CDR1, CDR2 e CDR3, são identificadas em caixas. As sequências sem caixa representam sequências (FR) framework.
[00028] A figura 17 são sensogramas Biacore que representam resultados de um ensaio para medir os valores cinéticos de anticorpos monoclonais anti-ErbB3, Sh24C05-31 N62S-IgG1, Ab#6, U1-53 e U1- 59.
[00029] A figura 18A é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade de neutralização do controle negativo (IgG humana (Y)) e anticorpos monoclonais anti-ErbB3 Sh24C05-25 N62S-IgG1 (▲), Sh24C05-25 N62S-IgG2 (Δ), Sh24C05-31 N62S-IgG1 (•) e Sh24C05-31 N62S-IgG2 (^). A figura 18B é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade de neutralização da IgG humana (Y) e dos anticorpos monoclonais anti- ErbB3 Ab#6 IgG2 (▼) , U1-53 (o) e U1-59 (■).
[00030] A figura 19A é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade inibitória do controle negativo (IgG humana (Y)) e anticorpos monoclonais anti-ErbB3 Sh24C05-25 N62S- IgG1 (▲), Sh24C05-25 N62S-IgG2 (Δ), Sh24C05-31 N62S-IgG1 (•) e Sh24C05-31 N62S-IgG2 (^) em células BaF/3 expressando Her2 e ErbB3 na presença de NRG1-β1. A figura 19B é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade inibitória da IgG humana (Y) e dos anticorpos monoclonais anti-ErbB3 Sh24C05-31 N62S-IgG1 (•), Ab#6 IgG2 (V), U1-53 (2) and U1-59 (■) em células BaF/3 expressando Her2 e ErbB3 na presença de NRG1-β1.
[00031] A figura 20 é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade inibitória do controle negativo (IgG humana) e anticorpos monoclonais anti-ErbB3 Sh24C05-25 N62S- IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1 e Sh24C05- 31 N62S-IgG2 sobre a fosforilação no estado estacionário de ErbB3 em células SKBR-3 em crescimento.
[00032] A figura 21 é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a degradação do receptor ErbB3 por controle negativo (IgG humana) e dos anticorpos monoclonais anti-ErbB3 Sh24C05-25 N62S-IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1 e Sh24C05-31 N62S-IgG2 em células SKBR-3 em crescimento.
[00033] A figura 22 é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade inibitória do tumor de uma IgG humana, IgG murina, ou anticorpos monoclonais anti-ErbB3 doseados em 2 mg/kg em um modelo de xenoenxerto do pâncreas BxPC3 CB17 em ratinhos SCID (24C05 murina (Δ), Sh24C05-31 N62S IgG1 (•), Sh24C05-31 N62S IgG2 (♦), Sh24C05-25 N62S IgG1 (▲), Sh24C05- 25 N62S IgG2 (■), veículo controle (Y), IgG murina (x) e IgG humana (2)).
[00034] A figura 23A é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade inibitória do tumor de uma IgG murina ou anticorpos monoclonais anti-ErbB3 doseados a 5 mg/kg, em um modelo de xenoenxerto Calu-3 de câncer do pulmão das não pequenas células em ratinhos NCR nus (veículo controlo (Y), IgG murina (x), Sh24C05-31 N62S IgG1 (▲), Ab#6 IgG2 (•), e U1-59 (■)).
[00035] A figura 23B é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade inibitória do tumor de uma IgG murina ou anticorpos monoclonais anti-ErbB3 doseados a 10 mg/kg, em um modelo de xenoenxerto Calu-3 de câncer do pulmão das não pequenas células em ratinhos NCR nus (veículo controlo (Y), IgG murina (x), Sh24C05-31 N62S IgG1 (▲), Ab#6 IgG2 (•), e U1-59 (■)).
[00036] A figura 23C é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade inibitória do tumor de uma IgG murina ou anticorpos monoclonais anti-ErbB3 doseados a 20 mg/kg, em um modelo de xenoenxerto Calu-3 de câncer do pulmão das não pequenas células em ratinhos NCR nus (veículo controlo (Y), IgG murina (x), Sh24C05-31 N62S IgG1 (▲), Ab#6 IgG2 (•), e U1-59 (■)).
[00037] A figura 24 é um gráfico que resume os resultados de um ensaio para medir a atividade inibitória do tumor de uma IgG humana, murina ou anticorpos monoclonais anti-ErbB3 em um modelo xenoenxerto de câncer de mama MDA-MB-453 em ratinhos NOD SCID (veículo controle (Y), IgG humana (x), Sh24C05-31 N62S IgG1 doseada a 5 mg/kg (o), Sh24C05-31 N62S IgG1 doseada a 10 mg/kg (Δ), Sh24C05-31 N62S IgG1 doseada a 20 mg/kg (▲), Ab#6 IgG2 doseada a 10 mg/kg (•) e U1-59 doseada a 10 mg/kg (■).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00038] Os anticorpos do ErbB3 divulgados aqui são baseados nos sítios de ligação ao antígeno de determinados anticorpos monoclonais selecionados pela sua capacidade de neutralizar a atividade biológica dos polipeptídeos humanos de ErbB3. Os anticorpos contêm de regiões variáveis de imunoglobulinas CDR que definem um sítio de ligação a ErbB3. Em algumas modalidades, os anticorpos impedem o ErbB3 de se ligar a um ligante, por exemplo, o NRG/HRG, neutralizando assim a atividade biológica do ErbB3. Em outras modalidades, os anticorpos anti-ErbB3 inibem a dimerização do ErbB3, assim neutralizando a atividade biológica do ErbB3. Em ainda outras modalidades, os anticorpos anti-ErbB3 inibem a fosforilação do ErbB3 e a sinalização a jusante.
[00039] Devido à atividade neutralizante desses anticorpos, eles são úteis para inibir o crescimento e/ou a proliferação de certas células do câncer e tumores. Os anticorpos podem ser concebidos de forma a minimizar ou eliminar uma resposta imunitária quando administrados a um paciente humano. Em algumas modalidades, os anticorpos são fundidos ou conjugados com outras porções, tais como marcadores detectáveis ou moléculas efetoras, tais como pequenas moléculas de toxinas.
Os anticorpos que se ligam a ErbB3
[00040] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a estrutura CDRH1-CDRH2-CDRH3 e (b) região variável de cadeia leve de imunoglobulina, em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve, em conjunto, definem um único sítio de ligação para ligar ao ErbB3 humano. Uma CDRH1 é composta por uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 5 (04D01), SEQ ID NO:15 (09D03), SEQ ID NO: 25 (11G01), SEQ ID NO: 34 (12A07), SEQ ID NO: 41 (18H02), SEQ ID NO: 51 (22A02), SEQ ID NO: 57 (24C05), e SEQ ID NO: 75 (24C05); uma CDRH2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 6 (04D01), SEQ ID NO:16 (09D03), SEQ ID NO: 26 (11G01), SEQ ID NO: 35 (12A07), SEQ ID NO: 42 (18H02), SEQ ID NO: 52 (22A02), SEQ ID NO: 58 (24C05), e SEQ ID NO: 148 (Sh24C05 Hv3- 11 N62S); e uma CDRH3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 7 (04D01), SEQ ID NO: 17 (09D03), SEQ ID NO: 27 (11G01), SEQ ID NO: 36 (12A07, 22A02), SEQ ID NO: 43 (18H02), e SEQ ID NO: 59 (24C05). Ao longo da descrição, uma determinada SEQ ID N° é seguida, entre parênteses, pelo anticorpo que foi a origem dessa sequência. Por exemplo, "SEQ ID NO: 5 (04D01)", SEQ ID NO: 5 provém do anticorpo 04D01.
[00041] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (04D01), uma CDR H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (04D01), e uma CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (04D01).
[00042] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 (09D03), uma CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 (09D03), e uma CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 (09D03).
[00043] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25 (11G01), uma CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 (11G01), e uma CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 (11G01).
[00044] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34 (12A07), uma CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35 (12A07), e uma CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 (12A07, 22A02).
[00045] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 (18H02), uma CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 (18H02), e uma CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 (18H02).
[00046] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 (22A02), uma CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 (22A02), e uma CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 (12A07, 22A02).
[00047] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57 (24C05), ou SEQ ID NO: 75 (24C05), uma CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 (24C05), e uma CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59 (24C05).
[00048] Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57 (24C05), uma CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 (24C05), e uma CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59 (24C05).
[00049] Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75 (24C05), uma CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 (24C05), e uma CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59 (24C05).
[00050] Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57 (24C05), ou SEQ ID NO: 75 (24C05), uma CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 148 (Sh24C05 Hv3-11 N62S), e uma CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59 (24C05).
[00051] Preferencialmente, as sequências CDRH1, CDRH2 e CDRH3 se interpõem entre FRs de imunoglobulinas humanas ou humanizadas. O anticorpo pode ser um anticorpo intacto ou um fragmento de anticorpo para ligação ao antígeno.
[00052] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a estrutura CDRL1-CDRL2-CDRL3 e (b) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, em que a região variável de cadeia leve da IgG e a região variável de cadeia pesada da IgG, em conjunto, definem um único sítio de ligação para ligar ao ErbB3 humano. Uma CDRL1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 8 (04D01, 12A07, 22A02), SEQ ID NO: 18 (09D03), SEQ ID NO: 28 (11G01), SEQ ID NO: 44 (18H02), e SEQ ID NO: 60 (24C05); uma CDRL2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 9 (04D01, 11G01, 12A07, 22A02), SEQ ID NO: 19 (09D03), SEQ ID NO: 45 (18H02), e SEQ ID NO: 61 (24C05); e uma CDRL3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 10 (04D01, 12A07, 22A02), SEQ ID NO: 20 (09D03), SEQ ID NO: 29 (11G01), SEQ ID NO: 46 (18H02), e SEQ ID NO: 62 (24C05).
[00053] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulinas compreendendo: uma CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 (04D01, 12A07, 22A02), uma CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (04D01, 11G01, 12A07, 22A02); e uma CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 (04D01, 12A07 e 22A02).
[00054] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulinas compreendendo: uma CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 (09D03), uma CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 (09D03), e uma CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 (09D03).
[00055] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulinas compreendendo: uma CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 (11G01), uma CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (04D01, 11G01, 12A07, 22A02); e uma CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 (11G01).
[00056] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulinas compreendendo: uma CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 (18H02), uma CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 (18H02); e uma CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 (18H02).
[00057] Em uma modalidade de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulinas compreendendo: uma CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 (24C05), uma CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 (24C05), e uma CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62 (24C05).
[00058] Preferencialmente, as sequências CDRL1, CDRL2 e CDRL3 se interpõem entre FRs de imunoglobulinas humanas ou humanizadas. O anticorpo pode ser um anticorpo intacto ou um fragmento de anticorpo para ligação ao antígeno.
[00059] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada de IgG compreendendo a estrutura CDRH1-CDRH2-CDRH3 e (b) uma região variável de cadeia leve de IgG compreendendo a estrutura CDRL1-CDRL2-CDRL3, em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve, em conjunto, definem um único sítio de ligação para ligar ao ErbB3 humano. A CDRH1 é uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 5 (04D01), SEQ ID NO:15 (09D03), SEQ ID NO: 25 (11G01), SEQ ID NO: 34 (12A07), SEQ ID NO: 41 (18H02), SEQ ID NO: 51 (22A02), SEQ ID NO: 57 (24C05), e SEQ ID NO: 75 (24C05); uma CDRH2 é uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 6 (04D01), SEQ ID NO:16 (09D03), SEQ ID NO: 26 (11G01), SEQ ID NO: 35 (12A07), SEQ ID NO: 42 (18H02), SEQ ID NO: 52 (22A02), SEQ ID NO: 58 (24C05), e SEQ ID NO: 148 (Sh24C05 Hv3- 11 N62S); e a CDRH3 é uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 7 (04D01), SEQ ID NO: 17 (09D03), SEQ ID NO: 27 (11G01), SEQ ID NO: 36 (12A07, 22A02), SEQ ID NO: 43 (18H02), e SEQ ID NO: 59 (24C05). A CDRL1 é uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 8 (04D01, 12A07, 22A02), SEQ ID NO: 18 (09D03), SEQ ID NO: 28 (11G01), SEQ ID NO: 44 (18H02), e SEQ ID NO: 60 (24C05); uma CDRL2 é uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 9 (04D01, 11G01, 12A07, 22A02), SEQ ID NO: 19 (09D03), SEQ ID NO: 45 (18H02), e SEQ ID NO: 61 (24C05); e a CDRL3 é uma sequência de aminoácidos selecionados a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 10 (04D01, 12A07, 22A02), SEQ ID NO: 20 (09D03), SEQ ID NO: 29 (11G01), SEQ ID NO: 46 (18H02), e SEQ ID NO: 62 (24C05).
[00060] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO: 2 (04D01), SEQ ID NO: 12 (09D03), SEQ ID NO: 22 (11G01), SEQ ID NO: 31 (12A07), SEQ ID NO: 38 (18H02), SEQ ID NO: 48 (22A02), SEQ ID NO: 54 (24C05), e SEQ ID NO: 154 (Sh24C05 Hv3-11 N62S), e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina selecionada a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 4 (04D01), SEQ ID NO: 14 (09D03), SEQ ID NO: 24 (11G01), SEQ ID NO: 33 (12A07), SEQ ID NO: 40 (18H02), SEQ ID NO: 50 (22A02), SEQ ID NO: 56 (24C05), SEQ ID NO: 166 (Sh24C05 Kv1-16), e SEQ ID NO: 168 (Sh24C05 Kv1-17).
[00061] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (04D01), e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 (04D01).
[00062] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 (09D03), e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 (09D03).
[00063] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 (11G01), e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 (11G01).
[00064] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 (12A07), e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 (12A07).
[00065] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38 (18H02), e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 (18H02).
[00066] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 (22A02), e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 (22A02).
[00067] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 (24C05), e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56 (24C05).
[00068] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154 (Sh24C05 Hv3-11 N62S), e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 166 (Sh24C05 Kv1-16).
[00069] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154 (Sh24C05 Hv3-11 N62S), e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 168 (Sh24C05 Kv1-17).
[00070] Em outras modalidades, o anticorpo compreende (i) uma cadeia pesada de imunoglobulina selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO: 109 (04D01), SEQ ID NO: 113 (09D03), SEQ ID NO: 117 (11G01), SEQ ID NO: 121 (12A07), SEQ ID NO: 125 (18H02), SEQ ID NO: 129 (22A07), SEQ ID NO: 133 (24C05), SEQ ID NO: 190 (Sh24C05 Hv3-11 N62S IgG1), e SEQ ID NO: 192 (Sh24C05 Hv3-11 N62S IgG2), e (ii) uma cadeia leve de imunoglobulina selecionada a partir de um grupo consistindo nas SEQ ID NO: 111 (04D01), SEQ ID NO: 115 (09D03), SEQ ID NO: 119 (11G01), SEQ ID NO: 123 (12A07), SEQ ID NO: 127 (18H02), SEQ ID NO: 131 (22A07), SEQ ID NO: 135 (24C05), SEQ ID NO: 204 (Sh24C05 Kv1-16 capa), e SEQ ID NO: 206 (Sh24C05 Kv1-17 capa).
[00071] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 109 (04D01), e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111 (04D01).
[00072] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113 (09D03), e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115 (09D03).
[00073] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 117 (11G01), e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 119 (11G01).
[00074] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 121 (12A07), e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 123 (12A07).
[00075] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 125 (18H02), e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 (18H02).
[00076] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 129 (22A02), e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 (22A02).
[00077] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 (24C05), e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 135 (24C05).
[00078] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190 (Sh24C05 Hv3-11 N62S IgG1), e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 204 (Sh24C05 Kv1-16 capa).
[00079] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 192 (Sh24C05 Hv3-11 N62S IgG2), e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 204 (Sh24C05 Kv1-16 capa).
[00080] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190 (Sh24C05 Hv3-11 N62S IgG1), e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 206 (Sh24C05 Kv1-17 capa).
[00081] Em outra modalidade de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 192 (Sh24C05 Hv3-11 N62S IgG2), e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 206 (Sh24C05 Kv1-17 capa).
[00082] Tal como é utilizado neste documento, exceto quando indicado em contrário, o termo "anticorpo" significa um anticorpo intacto (por exemplo, um anticorpo monoclonal intacto) ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno (por exemplo, um fragmento de anticorpo monoclonal para ligação ao antígeno), incluindo um anticorpo intacto ou um fragmento de ligação ao antígeno que foi modificado, desenhado, ou quimicamente conjugado. Os exemplos de anticorpos que foram modificados ou desenhados incluem anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos). Os exemplos de fragmentos de ligação aos antígenos incluem Fab Fab', (Fab')2, Fv, anticorpos de cadeia linear (por exemplo, scFv), minicorpos e diacorpos. Um exemplo de um anticorpo quimicamente conjugado é um anticorpo conjugado com uma porção de toxina.
[00083] A figura 1 mostra uma representação esquemática de um anticorpo monoclonal intacto que contém quatro cadeias polipeptídicas. Duas das cadeias polipeptídicas são designadas cadeias pesadas de imunoglobulina (cadeias H), e duas das cadeias polipeptídicas são designadas cadeias leves de imunoglobulina (cadeias L). As cadeias pesada e leve das imunoglobulinas são ligadas por uma ligação dissulfídica intercadeia. As cadeias pesadas das imunoglobulinas são ligadas por ligações dissulfídicas intercadeia. Uma cadeia leve consiste em uma região variável (VL na figura 1) e em uma região constante (CL na figura 1). Uma cadeia pesada consiste em uma região variável (VH na figura 1) e, pelo menos, três regiões constantes (CH1, CH2 e CH3 na figura 1). As regiões variáveis determinam a especificidade do anticorpo.
[00084] Cada região variável contém três regiões hipervariáveis conhecidas como regiões determinantes da complementaridade (CDRs) ladeadas por quatro regiões relativamente conservadas, conhecidas como regiões framework (FRs). As três CDRs, referidas como CDR1, CDR2 e CDR3 , contribuem para a especificidade de ligação ao anticorpo.
[00085] Em certas modalidades, um anticorpo isolado que se liga ao ErbB3 humano compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99%, idêntica a toda a sequência da região variável ou da região framework SEQ ID NO: 2 (04D01), SEQ ID NO: 12 (09D03), SEQ ID NO: 22 (11G01), SEQ ID NO: 31 (12A07), SEQ ID NO: 38 (18H02), SEQ ID NO: 48 (22A02), SEQ ID NO: 54 (24C05), e SEQ ID NO: 154 (Sh24C05 Hv3-11 N62S).
[00086] Em certas modalidades, um anticorpo isolado que se liga ao ErbB3 humano compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99%, idêntica a toda a sequência da região variável ou da região framework SEQ ID NO: 4 (04D01), SEQ ID NO: 14 (09D03), SEQ ID NO: 24 (11G01), SEQ ID NO: 33 (12A07), SEQ ID NO: 40 (18H02), SEQ ID NO: 50 (22A02), SEQ ID NO: 56 (24C05), SEQ ID NO: 166 (Sh24C05 Kv1-16), e SEQ ID NO: 168 (Sh24C05 Kv1-17).
[00087] Em cada uma das modalidades anteriores, é contemplado neste documento que as sequências da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e/ou as sequências de região variável de cadeia leve, que juntas se ligam ao ErbB3 humano, podem conter alterações de aminoácidos (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, ou 10 substituições, deleções ou adições de aminoácidos) nas regiões framework das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve.
[00088] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado une o hErbB3 com um KD de 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 75 pM, 50 pM, 20 pM, 10 pM ou inferior. A não ser quando especificado em contrário, os valores KD são determinados pelos métodos de ressonância do plásmon de superfície. Os métodos de ressonância do plásmon de superfície podem ser executados usando as condições descritas, por exemplo, nos exemplos 3 e 12, onde as medições foram realizadas a 25 °C e a 37 °C, respetivamente.
[00089] Em algumas modalidades, os anticorpos inibem a ligação do hErbB3 a NRG1-β1. Por exemplo, os anticorpos podem ter uma CI50 (concentração a 50% de inibição máxima) de cerca de 5 nM, 2 nM ou inferior, quando doseado utilizando os protocolos descritos nos exemplos 4 e 13.
II. Produção de anticorpos
[00090] Os métodos para produzir anticorpos divulgados neste documento são conhecidos na técnica. Por exemplo, as moléculas de DNA que codificam para regiões variáveis de cadeia leve e para regiões variáveis de cadeia pesada podem ser quimicamente sintetizadas usando a informação da sequência aqui fornecida. As moléculas sintéticas de DNA podem ser ligadas a outras sequências de nucleotídeos adequadas, incluindo, por exemplo, sequências de codificação da região constante e sequências de controle de expressão, para produzir construtos com uma expressão de genes convencionais que codificam para os anticorpos desejados. A produção dos construtos de genes definidos está incluída na práticas de rotina previstas na técnica. Em alternativa, as sequências aqui fornecidas podem ser clonadas a partir de hibridomas por técnicas de hibridização convencionais ou técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR), usando sondas de ácido nucleico sintéticas, cujas sequências são baseadas na informação de sequência aqui fornecida, ou na informação de sequência do estado da técnica considerando genes que codificam para as cadeias pesada e leve de anticorpos murínicos em células de hibridoma.
[00091] Os ácidos nucleicos codificando para os anticorpos divulgados neste documento podem ser incorporados (ligados) em vetores de expressão, que podem ser introduzidos em células hospedeiras através de técnicas convencionais de transfeção ou transformação. As células hospedeiras exemplares são células de E. coli, células do ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células do rim de hamster bebé (BHK), células do rim de macaco (COS), células do carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e células do mieloma que não produzem de outro modo proteínas de IgG. As células hospedeiras transformadas podem ser cultivadas em condições que permitem que as células hospedeiras expressem os genes que codificam para as regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada.
[00092] As condições específicas de expressão e purificação irão variar, dependendo do sistema de expressão empregue. Por exemplo, se um gene for expresso em E. coli, em primeiro lugar, é clonado no vetor de expressão, posicionando o gene modificado a jusante de um promotor bacteriano adequado, p.ex ., Trp ou Tac, e uma sequência sinal procariótica. A proteína secretada expressa acumula-se em corpos refrácteis ou de inclusão, e pode ser captada após ruptura das células pela prensa francesa ou sonicação. Os corpos refrácteis são então solubilizados, e as proteínas rearranjadas e clivadas por métodos conhecidos na técnica.
[00093] Se um construto de DNA que codifica para um anticorpo divulgado aqui for expresso em células hospedeiras eucariotas, por exemplo,células CHO, é introduzido pela primeira vez em um vetor de expressão contendo um promotor eucariota adequado, um sinal de secreção, potenciadores de IgG, e vários íntrons. Este vetor de expressão opcionalmente contém sequências que codificam para a totalidade ou parte de uma região constante, permitindo que a totalidade, ou uma parte de uma cadeia pesada e/ou leve seja expressa. Em algumas modalidades, um único vetor de expressão contém as regiões variáveis de ambas as cadeias leve e pesada para serem expressas.
[00094] O construto de genes pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas usando técnicas convencionais. As células hospedeiras expressam os fragmentos VL ou VH, os heterodímeros VL- VH, os polipeptídeos de cadeia linear VH-VL ou VL-VH, as cadeias de imunoglobulina completa pesadas ou leves, ou suas porções, cada uma das quais pode ser associada a uma porção tendo outra função (e.g., citotoxicidade). Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é transfectada com um único vetor expressando um polipeptídeo expressando a totalidade, ou parte, de uma cadeia pesada (por exemplo, uma região variável da cadeia pesada) ou uma cadeia leve (por exemplo, uma região variável de cadeia leve). Em outras modalidades, uma célula hospedeira é transfectada com um único vetor codificando para (a) um polipeptídeo compreendendo uma região variável de cadeia pesada e um polipeptídeo compreendendo uma região variável de cadeia leve, ou (b) a totalidade de uma cadeia pesada de imunoglobulina e a totalidade de uma cadeia leve de imunoglobulina. Ainda em outras modalidades, uma célula hospedeira é co-transfectada com mais do que um vetor de expressão (por exemplo, um vetor de expressão expressando um polipeptídeo compreendendo a totalidade, ou uma parte, da região variável da cadeia pesada ou da cadeia pesada, e outro vetor de expressão expressando um polipeptídeo compreendendo a totalidade, ou parte, da região variável da cadeia leve ou da cadeia leve).
[00095] Um método de produção de um polipeptídeo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina ou um polipeptídeo compreendendo uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina pode compreender o crescimento de uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo compreendendo a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina ou o polipeptídeo compreendendo a região variável de cadeia leve da imunoglobulina. O polipeptídeo compreendendo uma região variável de cadeia pesada ou o polipeptídeo compreendendo a região variável da cadeia leve pode então ser purificado através de técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo, marcadores de afinidade tais como a glutationa-S-transferase (GST) e marcadores de histidina.
[00096] Um método de produzir um anticorpo monoclonal que se liga ao ErbB3 humano, ou um fragmento do anticorpo de ligação ao antígeno, pode incluir o crescimento da célula hospedeira transfectada com: (a) um vector de expressão que codifica para uma cadeia pesada completa ou parcial de imunoglobulina, e um vetor de expressão separado que codifica para uma cadeia leve completa ou parcial de imunoglobulina; ou (b) um único vetor de expressão que codifica para ambas as cadeias (por exemplo, cadeias completas ou parciais), em condições que permitam a expressão de ambas as cadeias. O anticorpo intacto (ou fragmento de ligação ao antígeno) pode ser captado e purificado usando técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo,Proteína A, Proteína G, marcadores de afinidade tais como glutationa-S-transferase (GST) e marcadores de histidina. A expressão da cadeia pesada e da cadeia leve a partir de um único vetor de expressão ou de dois vetores distintos de expressão está compreendida no estado da técnica corrente.
III. Modificações nos Anticorpos
[00097] Os métodos para reduzir ou eliminar a antigenicidade dos anticorpos e fragmentos de anticorpos são conhecidos na técnica. Quando os anticorpos se destinam a ser administrados a um ser humano, os anticorpos preferencialmente são "humanizados" para reduzir ou eliminar a antigenicidade em humanos. Preferencialmente, um anticorpo humanizado tem a mesma ou substancialmente a mesma afinidade para o antígeno que o anticorpo não humanizado de rato a partir do qual é derivado.
[00098] Em uma abordagem de humanização, as proteínas quiméricas são criadas nas quais as regiões constantes de imunoglobulina de rato são substituídas com regiões constantes das imunoglobulinas humanas. Ver, por exemplo, Morrison et al.,1984, PROC. NAT. ACAD.
[00099] SCI. 81:6851-6855, Neuberger et al., 1984, NATURE 312:604-608 ; Patente U.S. N° 6.893.625 (Robinson); 5.500.362 (Robinson); e 4.816.567 (Cabilly).
[000100] Numa abordagem conhecida como enxertamento CDR, as CDRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada são enxertadas em frameworks a partir de outras espécies. Por exemplo, as CDRs murínicas podem ser enxertadas em FRs humanas. Em algumas modalidades, as CDRs das regiões variáveis da cadeia leve e pesada do anticorpo anti-ErbB3 são enxertadas nas FRs humanas ou nas FRs humanas de consenso. Para criar FRs humanas de consenso, as FRs de várias sequências de aminoácidos de cadeia pesada ou cadeia leve humanas são alinhadas para identificar uma sequência de aminoácidos de consenso. O enxertamento de CDR é descrito na Patente U. S. NO 7.022.500 (Queen); 6.982.321 (Winter); 6.180.370 (Queen); 6.054.297 (Carter); 5.693.762 (Queen); 5.859.205 (Adair); 5.693.761 (Queen); 5.565.332 (Hoogenboom); 5.585.089 (Queen); 5.530.101 (Queen); Jones et al . (1986) NATURE 321: 522-525 ; Riechmann et al . (1988) NATURE 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) SCIENCE 239: 1534-1536; e Winter (1998) FEBS LETT 430: 9294.
[000101] Em uma abordagem chamada "SUPERHUMANIZA-TION™,"sequências humanas CDR são selecionadas de genes humanos de linha germinativa, com base na similaridade estrutural das CDRs humanas com aquelas do anticorpo de rato a ser humanizado. Ver, por ex., Patente U.S. N° 6.881.557 (Foote); e Tan et al., 2002, J. IMMUNOL 169:1119-1125 .
[000102] Outros métodos para reduzir a imunogenicidade incluem a "reformação", "hiperquimerização"e "folheamento/recapeamento". Ver, por exemplo, Vaswami et al.,1998, Annals OF ALLERGY, ASTHMA,&IMMUNOL. 81:105; Roguska et al., 1996, PROT. ENGINEER 9:895-904; e Patente U.S. N° 6.072.035 (Hardman). Na abordagem de folheamento/recapeamento, os resíduos de aminoácidos acessíveis à superfície do anticorpo murínico são substituídos por resíduos de aminoácidos mais frequentemente encontrados nas mesmas posições em um anticorpo humano. Este tipo de recapeamento de anticorpo é descrito, por exemplo, na Patente U.S. N° 5.639.641 (Pedersen).
[000103] Uma outra abordagem para converter um anticorpo de rato em uma forma adequada para uso médico em humanos é conhecida como tecnologia ACTIVMAB TM (Vaccinex, Inc., Rochester, NY), que envolve um vetor baseado no vírus vaccinia para expressar anticorpos nas células de mamíferos. Os altos níveis de diversidade combinatorial de cadeias pesada e leve de IgG são referidos como sendo produzidos. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.706.477 (Zauderer); 6.800.442 (Zauderer); e 6.872.518 (Zauderer).
[000104] Uma outra abordagem para converter um anticorpo de rato em uma forma adequada para uso em seres humanos é a tecnologia praticada comercialmente por KaloBios Pharmaceuticals, Inc. (Palo Alto, CA). Esta tecnologia envolve a utilização de uma biblioteca "aceitadora" humana proprietária, para produzir uma biblioteca "focalizada no epitopo" para seleção de anticorpos.
[000105] Uma outra abordagem para modificar um anticorpo de rato em uma forma adequada para uso médico em humanos é a tecnologia HUMAN ENGINEERINGTM, que é praticada comercialmente por XOMA (US) LLC. Ver, p. ex., a publicação PCT N° WO 93/11794 e das Patentes U.S. N° 5.766.886; 5.770.196; 5.821.123; e 5.869.619 .
[000106] Qualquer abordagem adequada, incluindo qualquer uma das abordagens acima referidas, pode ser utilizada para reduzir ou eliminar a imunogenicidade humana de um anticorpo divulgado aqui.
[000107] Os métodos de fabricar anticorpos multi-específicos são conhecidos na técnica. Os anticorpos multi-específicos incluem anticorpos bi-específicos. Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades de ligação para, pelo menos, dois epítopos diferentes. Os anticorpos bi-específicos exemplares ligam-se a dois epítopos diferentes do antígeno de interesse. Os anticorpos bi- específicos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos e diacorpos biespecíficos F(ab')2) como descrito, por exemplo, em Milstein et al., NATURE 305:537-539 (1983), WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991), WO 94/04690, Suresh et al., METHODS IN ENZYMOLOGY, 121:210 (1986), WO96/27011, Brennan et al., SCIENCE, 229: 81 (1985), Shalaby et al., J. EXP. MED., 175: 217-225 (1992), Kostelny et al., J. IMMUNOL., 148(5):1547-1553 (1992), Hollinger et al., PNAS, 90:6444-6448, Gruber et al., J. IMMUNOL., 152:5368 (1994), Wu et al., NAT. BIOTECHNOL., 25(11): 1290-1297, Publicação de Patente U.S. NO 2007/0071675, e Bostrom et al., SCIENCE 323:1640-1644 (2009).
[000108] Em algumas modalidades, o anticorpo é conjugado com um agente efetor tal como uma toxina de uma pequena molécula ou um radionuclídeo utilizando químicas de conjugação in vitropadrão. Se o agente de efetor é um polipeptídeo, o anticorpo pode ser quimicamente conjugado com o efetor ou unido ao efetor como uma proteína de fusão. A construção de proteínas de fusão está incluída na práticas de rotina previstas na técnica.
IV. Utilização dos anticorpos
[000109] Os anticorpos divulgados neste documento podem ser utilizados para tratar várias formas de câncer, por exemplo, câncer de mama, ovário, próstata, cervical, colorretal, pulmão (por exemplo, câncer de pulmão das células não-pequenas), pancreático, gástrico, de pele, rim, cabeça e pescoço e schwannoma. As células do câncer são expostas a uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo para inibir ou reduzir a proliferação das células de câncer. Em algumas modalidades, os anticorpos inibem a proliferação de células de câncer em pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100%.
[000110] Em algumas modalidades, o anticorpo inibe ou reduz a proliferação de células tumorais por inibir a ligação do ErbB3 humano a um ligante ErbB3, por exemplo, Neuregulina/Heregulina especialmente NRGβ1/NRG1-β1/NRGβ1/HRGβ1 e NRGα1/NRG1- α1/NRGα1/HRGα1. O anticorpo pode ser utilizado em um método para inibir o crescimento do tumor em um paciente humano. O método compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo.
[000111] Os cânceres associados à superexpressão e/ou ativação do ErbB3 incluem câncer de mama, câncer de ovário, câncer da próstata, câncer cervical, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de não pequenas células), algumas formas de câncer no cérebro (por exemplo, schwannoma), melanomas, cânceres da pele, rim e do trato gastrointestinal (por exemplo, colorretal, pancreático, gástrico, da cabeça e pescoço).
[000112] Conforme utilizados aqui, os termos "tratar, "tratando" e "tratamento" significam o tratamento de uma doença em um mamífero, por ex., em um ser humano. Isso inclui: (a) inibição da doença, isto é, suspender o seu desenvolvimento; e (b) atenuar a doença, isto é, causar regressão do estado da doença; e (c) cura da doença.
[000113] Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz do componente ativo está compreendida entre 0,1 mg/kg e 100 mg/kg, por exemplo, 1 mg/kg a 100 mg/kg, 1 mg/kg a 10 mg/kg, A quantidade administrada vai depender de variáveis tais como o tipo e extensão da doença ou a indicação para ser tratada, da saúde geral do paciente, da potência in vivo do anticorpo, da formulação farmacêutica e da via de administração. A dose inicial pode ser aumentada para além do nível superior a fim de se alcançar rapidamente o nível desejado no ou nos tecidos. Em alternativa, a dose inicial pode ser menor do que a considerada ótima, e a dose diária pode ser aumentada progressivamente durante o curso do tratamento. A dose humana pode ser otimizada, por exemplo, em um estudo convencional do escalonamento de dose na Fase I, desenhado para correr de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. A frequência de dosagem pode variar, dependendo de fatores tais como a via de administração, a posologia e a doença a ser tratada. As frequências doseadoras exemplares são uma vez por dia, uma vez por semana e uma vez a cada duas semanas. Uma via preferencial de administração é a via parenteral, por exemplo,infusão intravenosa. A formulação de fármacos com base em anticorpos monoclonais está incluída na práticas de rotina previstas na técnica. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal é liofilizado e reconstituído em solução salina no momento da administração.
[000114] Para uso terapêutico, um anticorpo preferencialmente é combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme utilizado aqui, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável"significa tampões, veículos e excipientes adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcional a uma razão benefício/risco razoável. O(s) veículo(s) devem ser "aceitável(is)"no sentido de ser compatível com os outros ingredientes das formulações e não prejudicial para o destinatário. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem tampões, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes retardadores isotônicos e de absorção, e semelhantes, que são compatíveis com a administração farmacêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.
[000115] As composições farmacêuticas contendo anticorpos divulgados neste documento podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer método adequado. Uma composição farmacêutica deve ser formulada de modo a ser compatível com a sua via de administração prevista. Os exemplos de vias de administração são a via intravenosa (IV), intradérmica, inalação, transdérmica, tópica, transmucosa, e administração retal. Uma via preferencial de administração de anticorpos monoclonais é a infusão IV. Formulações úteis podem ser preparadas por métodos bem conhecidos na técnica da indústria farmacêutica. Consultar, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Mack Publishing Company, 1990). Os componentes adequados da formulação para administração parenteral incluem um diluente estéril, tais como água para injeção, solução salina, óleos de fixação, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como o álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes, tais como o ácido ascórbico ou o bissulfato de sódio; agentes quelantes, tais como o EDTA; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentes para o ajuste da tonicidade, tais como o cloreto de sódio ou dextrose.
[000116] Para administração intravenosa, os veículos adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou tampão de fosfato salino (PBS). O veículo deve ser estável nas condições de fabrico e de armazenagem e deve ser preservada contra microrganismos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido), e suas misturas adequadas.
[000117] As formulações farmacêuticas preferencialmente são estéreis. A esterilização pode ser realizada, por exemplo, por filtração através de membranas estéreis de filtração. Quando a composição é liofilizada, a esterilização do filtro pode ser realizada antes ou depois da liofilização e da reconstituição.
EXEMPLOS
[000118] Os exemplos seguintes são meramente ilustrativos e não são destinados a limitar o âmbito ou conteúdo da invenção em qualquer forma.
Exemplo 1 - Produção de Anticorpos Monoclonais Anti- hErbB3
[000119] Imunizações, fusões, e análises primárias foram conduzidas na Maine Biotechnology Services Inc. de acordo com o protocolo de Imunização Repetitiva de Múltiplos Sites (RIMMS). Três ratos AJ e três ratos Balb/c foram imunizados com ErbB3/Fc recombinante humano (R&D Systems, Cat. N° 348-RB). Dois conjuntos de imunização foram realizados com quer rhErbB3 clivado (imunização A) ou com rhErbB3 clivado com ligação cruzada ao seu ligante, o domínio recombinante humano NRG1- 1/HRG1- 1-EGF (R&D Systems, Cat. N° 396-HB) (Imunização B). Dois ratos AJ por imunização com soros apresentando atividade elevada anti-ErbB3 pelo ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) foram escolhidos para a fusão subsequente. Baços e nódulos linfáticos dos ratos adequados foram colhidos. As células B então foram colhidas e fundidas com uma linha de mieloma. Os produtos de fusão foram diluídos em série em quarenta placas de 96 poços até se aproximarem da clonalidade. Um total de 5.280 sobrenadantes das fusões resultantes foram avaliadas para ligação ao rhErbB3/Fc recombinante, usando ELISA. Os mesmos sobrenadantes foram também avaliados quanto à sua ligação ao ErbB3 humano sobre-expresso em células CHO (por ensaio de eletroquimioluminescência Mesoscale). Trezentos sobrenadantes identificados como contendo anticorpos contra o ErbB3 foram ainda caracterizados por ensaios bioquímicos e celulares in vitro, como discutido abaixo. Um painel de hibridomas foi selecionado e os hibridomas foram subclonados e expandidos. As linhas celulares de hibridoma foram transferidas para BioXCell (anteriormente BioExpress) para a expressão e purificação de anticorpos por cromatografia de afinidade na resina da proteína G sob condições padrão.
[000120] O anticorpo monoclonal anti-hErbB3 04D01 foi gerado a partir da Imunização A descrita acima. Os anticorpos monoclonais anti.hErb3 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 foram gerados pela imunização B descrita acima.
Exemplo 2 - Análise de Sequência dos Anticorpos Monoclonais anti-hErbB3
[000121] O isótipo de cadeia leve e o isotipo de cadeia pesada de cada anticorpo monoclonal no Exemplo 1 foi determinado utilizando o conjunto IsoStrip™ Mouse Monoclonal Antibody Isotyping de acordo com as instruções do fabricante (Roche Applied Science). Todos os anticorpos foram determinados como sendo de cadeia leve Capa e IgG de cadeia pesada, IgG1 ou IgG2b.
[000122] As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos monoclonais de rato foram sequenciadas usando 5' RACE (Amplificação Rápida de Extremidades do cDNA). O RNA total foi extraído a partir de cada linha de células do hibridoma monoclonal usando o conjunto RNeasy® Miniprep de acordo com as instruções do fornecedor (Qiagen). Foi gerada uma primeira cadeia de cDNA com comprimento total e contendo terminações 5' usando quer o conjunto GeneRacerTM (Invitrogen) ou o conjunto de Amplificação do cDNA SMARTerTM RACE (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante utilizando iniciadores aleatórios para 5' RACE.
[000123] As regiões variáveis das cadeias de IgG Capa e pesada (IgG1ou IgG2b) foram amplificadas por PCR, usando uma polimerase KOD Hot Start (Novagen) ou Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante. Para a amplificação das extremidades 5' cDNA em conjunção com o conjunto GeneRacerTM o GeneRacerTM iniciador 5', 5' cgactggagcacgaggacactga 3' (SEQ ID NO: 136) (Invitrogen) foi utilizado como iniciador 5'. Para amplificação das terminações 5' do cDNA em conjunção com o conjunto de amplificação SMARTerTM RACE cDNA, o primer A da Mistura de Iniciadores Universal (Clontech), uma mistura de 5'CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T 3' (SEQ ID NO: 137) e 5' CTAATACGACTCACTATAGGGC 3' (SEQ ID NO: 138) foi utilizado como um iniciador 5'. As regiões variáveis de cadeia pesada foram amplificadas usando os iniciadores 5' acima e um iniciador específico de Região Constante 3' IgG1, quer seja 5' TATGCAAGGCTTACAACCACA 3' (SEQ ID NO: 139) ou 5' GCCAGTGGATAGACAGATGGGGGTGTCG 3' (SEQ ID NO: 140). Sequências IgG2b foram amplificadas quer com 5' AGGACAGGGGTTGATTGTTGA 3' (SEQ ID NO: 141) ou 5'GGCCAGTGGATAGACTGATGGGGGTGTTGT 3' (SEQ ID NO: 142) ou 5' GGAGGAACCAGTTGTATCTCCACACCCA 3' (SEQ ID NO: 143). As regiões variáveis de cadeia capa foram amplificadas usando os iniciadores 5' acima e um iniciador específico de Região Constante 3' capa, quer seja 5' CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT 3' (SEQ ID NO: 144) ou 5' CGACTGAGGCACCTCCAGATGTT 3' (SEQ ID NO: 145).
[000124] Os produtos de PCR individuais foram isolados por eletroforese em gel de agarose e purificados utilizando o conjunto de Gel de Purificação Qiaquick® de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). Os produtos de PCR foram clonados subsequentemente no plasmídeo pCR®4Blunt usando o Conjunto de Clonagem Zero Blunt® TOPO® PCR de acordo com instruções do fabricante (Invitrogen) e transformados em bactérias DH5-α (Invitrogen) mediante técnicas de biologia molecular standardizadas. O DNA Plasmídio isolado de clones bacterianos transformados foi sequenciado usando iniciadores M13 Direto (5' GTAAAACGACGGCCAGT 3') (SEQ ID NO: 146) e M13 Inverso (5' CAGGAAACAGCTATGACC 3') (SEQ ID NO: 147) pela Beckman Genomics, usando métodos padronizados de sequenciamento do didesoxi DNA para identificar a sequência das sequências de região variável. As sequências foram analisadas usando o programa Vetor NTI (Invitrogen) e o programa IMGT/V-Quest para identificar e confirmar as sequências da região variável.
[000125] As sequências dos ácidos nucleicos que codificam e a sequências de proteínas que definem as regiões variáveis dos anticorpos monoclonais murínicos são resumidas abaixo (as sequências aminoterminais de peptídeo sinal não são apresentadas). As sequências CDR (definição de Kabat) são apresentadas a negrito/ sublinhado nas sequências de aminoácidos. Sequência de Ácido Nucleico codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 04D01 (SEQ ID NO: 1) 1 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagttg 61 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agccactggt tgcactgggt gaagcagagg 121 cctggacaag gccttgagtg gatcggagtg cttgatcctt ctgattttta tagtaactac 181 aatcaaaact tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 241 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc acgaggccta 301 ctatccgggg actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 04D01 (SEQ ID NO: 2) 1 qvqlqqpgae lvrpgtsvkl sckasgytft shwlhwvkqr pgqglewigv Idpsdfysny 61 nqnfkgkatl tvdtssstay mqlssltsed savyycargl Isgdyamdyw gqgtsvtvss Sequência de ÁcidoNuclei co que Codifica para a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 04D01 (SEQ ID NO: 3) 1 gatgttttga tgacccaaat tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 61 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 121 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag tccctgatct acaaagtttc taaccgattt 181 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 241 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc atatgttccg 301 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 04D01 (SEQ ID NO: 4) 1 dvlmtqipls Ipvslgdqas iscrssqsiv hsngntylew ylqkpgqspk sliykvsnrf 61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yycfqgsyvp wtfgggtkle ik Sequência de Ácido N uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 09D03 (SEQ ID NO: 11) 1 caggttactc taaaagagtc tggccctggg atattgcggc cctcccagac cctcagtctg 61 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttttggtt tgagtgtagg ctggattcgt 121 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 181 tataacccag cccttaagag tcggctcaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta 241 ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaata 301 ggggcggacg cccttccttt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 09D03 (SEQ ID NO: 12) 1 qvtlkesgpg ilrpsqtlsl tcsfsgfsls tfglsvgwir qpsgkglewl ahiwwdddky 61 ynpalksrlt iskdtsknqv flkianvdta dtatyycari gadalpfdyw gqgttltvss Sequência de Ácido N uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 09D03 (SEQ ID NO: 13) 1 gatattgtgt tgactcagac tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 61 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 121 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 181 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 241 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatcct 301 ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 09D03 (SEQ ID NO: 14) 1 divltqtaps vpvtpgesvs iscrssksll hsngntylyw flqrpgqspq lliyrmsnla 61 sgvpdrfsgs gsgtaftlri srveaedvgv yycmqhleyp ftfgsgtkle ik Sequência de Ácido N uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 11G01 (SEQ ID NO: 21) 1 caggttcagc tgcaacagtc tgacgctgag ttggtgaaac ctggagcttc agtgaagata 61 tcctgcaagg tttctggcta caccttcact gaccatatta ttcactggat gaagcagagg 121 cctgaacagg gcctggaatg gattggatat atttatccta gagatggtta tattaagtac 181 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 241 atgcaggtca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aaggggttac 301 tattatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 11G01 (SEQ ID NO: 22) 1 qvqlqqsdae lvkpgasvki sckvsgytft dhiihwmkqr peqglewigy iyprdgyiky 61 nekfkgkatl tadkssstay mqvnsltsed savyfcargy yyamdywgqg tsvtvss Sequência de ÁcidoN uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 11G01 (SEQ ID NO: 23) 1 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 61 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtattg gaaacaccta tttagaatgg 121 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 181 tctggggtcc cagagaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 241 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca 301 ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 11G01 (SEQ ID NO: 24) 1 dvlmtqtpls Ipvslgdqas iscrssqsiv hsigntylew ylqkpgqspk lliykvsnrf 61 sgvperfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yycfqgshvp ftfgsgtkle ik Sequência de ÁcidoN uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 12A07 (SEQ ID NO: 30) 1 caggtccaac tgctgcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagttg 61 tcctgcaaga cttctggcta caccttctcc agctactgga tgcactgggt aaagcagagg 121 cctggacaag gccttgagtg gatcggaatg attgatcctt ctgatgttta tactaactac 181 aatccaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca catcctccag cacagcctac 241 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaactac 301 tctggggact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 12A07 (SEQ ID NO: 31) 1 qvqllqpgae lvrpgtsvkl scktsgytfs sywmhwvkqr pgqglewigm idpsdvytny 61 npkfkgkatl tvdtssstay mqlssltsed savyycarny sgdywgqgtt ltvss Sequência de Ácido N uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 12A07 (SEQ ID NO: 32) 1 gatgttttga tgacccaaat tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 61 atctcttgta gatctagtca gagcattgtc catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 121 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 181 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 241 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc atatgttccg 301 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 12A07 (SEQ ID NO: 33) 1 dvlmtqipls Ipvslgdqas iscrssqsiv hsngntylew ylqkpgqspk lliykvsnrf 61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yycfqgsyvp wtfgggtkle ik Sequência de ÁcidoN uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 18H02 (SEQ ID NO: 37) 1 cagatccagt tggtacagtc tggacctgaa ctgaagaagc ctggagaggc agtcaagatc 61 tcctgcaagt cttctgggta taccttcaca acctatggaa tgagctgggt gaaacaggct 121 ccaggaaggg ctttaaagtg gatgggctgg ataaacacct actctggagt gccaacatat 181 gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaat cctctgccag cactgcctat 241 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagagggagg 301 gatggttacc aagtggcctg gtttgcttac tggggccaag ggacgctggt cactgtctct 361 gca Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 18H02 (SEQ ID NO: 38) 1 qiqlvqsgpe lkkpgeavki sckssgytft tygmswvkqa pgralkwmgw intysgvpty 61 addfkgrfaf slessast ay lqinnlkned tatyfcargr dgyqvawfaywgqgtlvtvs 121 a Sequência de Ácido N uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 18H02 (SEQ ID NO: 39) 1 gaaacaactg tgacccagtc tccagcatcc ctgtccatgg ctataggaga taaagtcacc 61 atcagatgca taaccagcac tgatattgat gatgatatga actggttcca gcagaagcca 121 ggggaacctc ctaagctcct tatttcagaa ggcaatactc ttcgtcctgg agtcccatcc 181 cgattctccg gcagtggcta tggtacagat tttattttta caattgaaaa catgctctct 241 gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataact tgccgtacac gttcggaggg 301 gggaccaagc tggaaataaa a Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 18H02 (SEQ ID NO: 40) 1 ettvtqspas Ismaigdkvt ircitstdid ddmnwfqqkp geppkllise gntlrpgvps 61 rfsgsgygtd fiftienmls edvadyyclq sdnlpytfgg gtkleik Sequência de Ácido N uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 22A02 (SEQ ID NO: 47) 1 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagttg 61 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactactgga tgcactgggt aaagcagagg 121 cctggacaag gccttgagtg gatcggaatg attgatcctt ctgatagtta tactaactac 181 aatccaaagt tcaagggtaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 241 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaactac 301 tctggggact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 22A02 (SEQ ID NO: 48) 1 qvqlqqpgae lvrpgtsvkl sckasgytft nywmhwvkqr pgqglewigm idpsdsytny 61 npkfkgkatl tvdtssstay mqlssltsed savyycarny sgdywgqgtt ltvss Sequência de Ácido N uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 22A02 (SEQ ID NO: 49) 1 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 61 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 121 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 181 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 241 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattattgct ttcaaggttc atatgttccg 301 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 22A02 (SEQ ID NO: 50) 1 dvlmtqtpls Ipvslgdqas iscrssqsiv hsngntylew ylqkpgqspk lliykvsnrf 61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yycfqgsyvp wtfgggtkle ik Sequência de Ácido N uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 24C05 (SEQ ID NO: 53) 1 gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 61 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 121 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtactta cacctactat 181 ccagacaatg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtac 241 ctgcaaatga gccatctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagagaatgg 301 ggtgattacg acggatttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcg Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada do Anticorpo 24C05 (SEQ ID NO: 54) 1 evqlvesggg lvkpggslkl scaasgftfs dyamswvrqt pekrlewvat isdggtytyy 61 pdnvkgrfti srdnaknnly Iqmshlksed tamyycarew gdydgfdywg qgttltvss Sequência de Ácido N uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 24C05 (SEQ ID NO: 55) 1 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 61 ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca 121 gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa 181 aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcggcag ccttgagtct 241 gaagatcttg cagactatta ctgtctacaa tatgatagtt atccgtacac gttcggaggg 301 gggaccaagc tggaaataaa a Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa do Anticorpo 24C05 (SEQ ID NO: 56) 1 diqmtqspss Isaslgervs Itcrasqeis gylswlqqkp dgtikrliya astldsgvpk 61 rfsgsrsgsd ysltigsles edladyyclq ydsypytfgg gtkleik
[000126] As sequências de aminoácidos definindo as regiões variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina para os anticorpos produzidos no Exemplo 1, são alinhadas na figura 2. As sequências de peptídeo sinal aminoterminais (para a expressão/secreção adequadas) não são apresentadas. As CDR1, CDR2 e a CDR3 (definição de Kabat) são identificadas por caixas. A figura 3 apresenta um alinhamento das sequências separadas da CDR1, CDR2 e CDR3 para cada anticorpo.
[000127] As sequências de aminoácidos definindo as regiões variáveis da cadeia leve da imunoglobulina para os anticorpos produzidos no Exemplo 1, são alinhadas na figura 4. As sequências de peptídeo sinal aminoterminais (para a expressão/secreção adequadas) não são apresentadas. As CDR1, CDR2 e CDR3 são identificadas por caixas. A figura 5 apresenta um alinhamento das sequências separadas da CDR1, CDR2 e CDR3 para cada anticorpo.
[000128] A Tabela 1 é um gráfico de concordância apresentando a SEQ ID N° de cada sequência discutida nesse Exemplo. Tabela 1
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[000129] Sequências CDR de cadeia pesada do anticorpo monoclonal de rato (Kabat, Chothia, e definições de IMGT) são apresentadas na Tabela 2. Tabela 2
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[000130] Sequências CDR de cadeia leve capa do anticorpo monoclonal de rato (Kabat, Chothia, e definições de IMGT) são apresentadas na Tabela 3. Tabela 3
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[000131] Nas Tabelas 2 e 3, as sequências CDR mais longas para a cadeia pesada e cadeia leve da imunoglobulina são apresentados em negrito.
[000132] Para criar as sequências de anticorpo completas, com cadeia pesada ou capa, cada sequência variável acima é combinada com a sua respetiva região constante. Por exemplo, uma cadeia pesada completa compreende uma sequência pesada variável seguida pela sequência constante de cadeia pesada da IgG1 e IgG2b murínicas e uma cadeia capa completa compreende uma sequência variável capa seguida da sequência constante da cadeia leve capa murínica. Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Constante da Cadeia Pesada da IgG1 Murínica (SEQ ID N: 102) 1 gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 61 tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 121 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 181 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc 241 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 301 gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 361 cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 421 gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 481 gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 541 agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 601 aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 661 aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 721 agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 781 aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 841 tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 901 acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 961 tctcctggta aa Sequência de Proteína Definindo a Região Constante da Cadeia Pesada da IgG1 Murínica (SEQ ID NO: 103) 1 akttppsvyp lapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt wnsgslssgv htfpavlqsd 61 lytlsssvtv psstwpsqtv tcnvahpass tkvdkkivpr dcgckpcict vpevssvfif 121 ppkpkdvlti tltpkvtcvv vdiskddpev qfswfvddve vhtaqtqpre eqfnstfrsv 181 selpimhqdw lngkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp kapqvytipp pkeqmakdkv 241 sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs yfvysklnvq ksnweagntf 301 tcsvlheglh nhhtekslsh spgk Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Constante da Cadeia Pesada da IgG2b Murínica (SEQ ID NO: 104) 1 gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca ctggcccctg ggtgtggaga tacaactggt 61 tcctctgtga ctctgggatg cctggtcaag ggctacttcc ctgagtcagt gactgtgact 121 tggaactctg gatccctgtc cagcagtgtg cacaccttcc cagctctcct gcagtctgga 181 ctctacacta tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggccaag tcagaccgtc 241 acctgcagcg ttgctcaccc agccagcagc accacggtgg acaaaaaact tgagcccagc 301 gggcccattt caacaatcaa cccctgtcct ccatgcaagg agtgtcacaa atgcccagct 361 cctaacctcg agggtggacc atccgtcttc atcttccctc caaatatcaa ggatgtactc 421 atgatctccc tgacacccaa ggtcacgtgt gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca 481 gacgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac gtggaagtac acacagctca gacacaaacc 541 catagagagg attacaacag tactatccgg gtggtcagca ccctccccat ccagcaccag 601 gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc aaggtcaaca acaaagacct cccatcaccc 661 atcgagagaa ccatctcaaa aattaaaggg ctagtcagag ctccacaagt atacatcttg 721 ccgccaccag cagagcagtt gtccaggaaa gatgtcagtc tcacttgcct ggtcgtgggc 781 ttcaaccctg gagacatcag tgtggagtgg accagcaatg ggcatacaga ggagaactac 841 aaggacaccg caccagtcct agactctgac ggttcttact tcatatatag caagctcaat 901 atgaaaacaa gcaagtggga gaaaacagat tccttctcat gcaacgtgag acacgagggt 961 ctgaaaaatt actacctgaa gaagaccatc tcccggtctc cgggtaaa Sequência de Proteína Definindo a Região Constante da Cadeia Pesada da IgG2b Murínica (SEQ ID NO: 105) 1 akttppsvyp lapgcgdttg ssvtlgclvk gyfpesvtvt wnsgslsssv htfpallqsg 61 lytmsssvtv psstwpsqtv tcsvahpass ttvdkkleps gpistinpcp pckechkcpa 121 pnleggpsvf ifppnikdvl misltpkvtc vvvdvseddp dvqiswfvnn vevhtaqtqt 181 hredynstir vvstlpiqhq dwmsgkefkc kvnnkdlpsp iertiskikg lvrapqvyil 241 pppaeqlsrk dvsltclvvg fnpgdisvew tsnghteeny kdtapvldsd gsyfiyskln 301 mktskwektd sfscnvrheg lknyylkkti srspgk Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Constante da Cadeia Leve Capa Murínica (SEQ ID NO: 106) 1 cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 61 ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccagagacat caatgtcaag 121 tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggtgtcctga acagttggac tgatcaggac 181 agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacat tgaccaagga cgagtatgaa 241 cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 301 agcttcaaca ggaatgagtg t Sequência de Proteína Definindo a Região Constante da Cadeia Leve Capa Murínica (SEQ ID NO: 107) 1 radaaptvsi fppsseqlts ggasvvcfln nfyprdinvk wkidgserqn gvlnswtdqd 61 skdstysmss tltltkdeye rhnsytceat hktstspivk sfnrnec
[000133] As seguintes sequências representam as sequências completas de cadeia pesada e leve, reais ou contempladas (isto é, contendo ambas as sequências das regiões variáveis e constantes) para cada anticorpo descrito nesse exemplo. As sequências de sinal para secreção adequada dos anticorpos são também incluídas na extremidade 5' das sequências de DNA ou na extremidade aminoterminal das sequências de proteínas. As sequências da região variável podem ser ligadas a outras sequências da região constante, para produzir cadeias pesadas e leves IgG heavy completas e ativas. Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Váriável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG1) de 04D01 (SEQ ID NO: 108) 1 atgggatgga gctgtatcat tgtcctcttg gtatcaacag ctacaggtgt ccactcccag 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggacttcagt gaagttgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc cactggttgc actgggtgaa gcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat cggagtgctt gatccttctg atttttatag taactacaat 241 caaaacttca agggcaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 301 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcacg aggcctacta 361 tccggggact atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagcc 421 aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 481 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 541 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 601 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcca gaccgtcacc 661 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 721 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 781 ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 841 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 901 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 961 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1021 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1081 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1141 ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1201 gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1261 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1321 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1381 cctggtaaa Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG1) de 04D01 (SEQ ID NO: 109) 1 mgwsciivll vstatgvhsq vqlqqpgael vrpgtsvkls ckasgytfts hwlhwvkqrp 61 gqglewigvl dpsdfysnyn qnfkgkatlt vdtssstaym qlssltseds avyycargll 121 sgdyamdywg qgtsvtvssa kttppsvypl apgsaaqtns mvtlgclvkg yfpepvtvtw 181 nsgslssgvh tfpavlqsdl ytlsssvtvp sstwpsqtvt cnvahpasst kvdkkivprd 241 cgckpcictv pevssvfifp pkpkdvltit ltpkvtcvvv diskddpevq fswfvddvev 301 htaqtqpree qfnstfrsvs elpimhqdwl ngkefkcrvn saafpapiek tisktkgrpk 361 apqvytippp keqmakdkvs ltcmitdffp editvewqwn gqpaenyknt qpimdtdgsy 421 fvysklnvqk snweagntft csvlheglhn hhtekslshs pgk Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 04D01 (SEQ ID NO: 110) 1 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 61 gttttgatga cccaaattcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 121 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 181 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagtcc ctgatctaca aagtttctaa ccgattttct 241 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 301 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcata tgttccgtgg 361 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 421 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 481 aacaacttct accccagaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 541 aatggtgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 601 agcaccctca cattgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 661 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgt Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 04D01 (SEQ ID NO: 111) 1 mklpvrllvl mfwipasssd vlmtqiplsl pvslgdqasi scrssqsivh sngntylewy 61 lqkpgqspks liykvsnrfs gvpdrfsgsg sgtdftlkis rveaedlgvy ycfqgsyvpw 121 tfgggtklei kradaaptvs ifppsseqlt sggasvvcfl nnfyprdinv kwkidgserq 181 ngvlnswtdq dskdstysms stltltkdey erhnsytcea thktstspiv ksfnrnec Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG2b) de 09D03 (SEQ ID NO: 112) 1 atgggcaggc ttacttcttc attcctgtta ctgattgtcc ctgcatatgt cctgtcccag 61 gttactctaa aagagtctgg ccctgggata ttgcggccct cccagaccct cagtctgact 121 tgttctttct ctgggttttc actgagcact tttggtttga gtgtaggctg gattcgtcag 181 ccttcaggga agggtctgga gtggctggca cacatttggt gggatgatga taagtactat 241 aacccagccc ttaagagtcg gctcacaatc tccaaggata cctccaaaaa ccaggtattc 301 ctcaagatcg ccaatgtgga cactgcagat actgccacat actactgtgc tcgaataggg 361 gcggacgccc ttccttttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 421 aaaacaacac ccccatcagt ctatccactg gcccctgggt gtggagatac aactggttcc 481 tccgtgacct ctgggtgcct ggtcaagggg tacttccctg agccagtgac tgtgacttgg 541 aactctggat ccctgtccag cagtgtgcac accttcccag ctctcctgca gtctggactc 601 tacactatga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggccaagtca gaccgtcacc 661 tgcagcgttg ctcacccagc cagcagcacc acggtggaca aaaaacttga gcccagcggg 721 cccatttcaa caatcaaccc ctgtcctcca tgcaaggagtgtcacaaatg cccagctcct 781 aacctcgagg gtggaccatc cgtcttcatc ttccctccaa atatcaagga tgtactcatg 841 atctccctga cacccaaggt cacgtgtgtg gtggtggatg tgagcgagga tgacccagac 901 gtccagatca gctggtttgt gaacaacgtg gaagtacaca cagctcagac acaaacccat 961 agagaggatt acaacagtac tatccgggtg gtcagcaccc tccccatcca gcaccaggac 1021 tggatgagtg gcaaggagtt caaatgcaag gtgaacaaca aagacctccc atcacccatc 1081 gagagaacca tctcaaaaat taaagggcta gtcagagctc cacaagtata cactttgccg 1141 ccaccagcag agcagttgtc caggaaagat gtcagtctca cttgcctggt cgtgggcttc 1201 aaccctggag acatcagtgt ggagtggacc agcaatgggc atacagagga gaactacaag 1261 gacaccgcac cagttcttga ctctgacggt tcttacttca tatatagcaa gctcaatatg 1321 aaaacaagca agtgggagaa aacagattcc ttctcatgca acgtgagaca cgagggtctg 1381 aaaaattact acctgaagaa gaccatctcc cggtctccgg gtaaa Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG2b) de 09D03 (SEQ ID NO: 113) 1 mgrltssfll livpayvlsq vtlkesgpgi lrpsqtlslt csfsgfslst fglsvgwirq 61 psgkglewla hiwwdddkyy npalksrlti skdtsknqvf lkianvdtad tatyycarig 121 adalpfdywg qgttltvssa kttppsvypl apgcgdttgs svtsgclvkg yfpepvtvtw 181 nsgslsssvh tfpallqsgl ytmsssvtvp sstwpsqtvt csvahpasst tvdkklepsg 241 pistinpcpp ckechkcpap nleggpsvfi fppnikdvlm isltpkvtcv vvdvseddpd 301 vqiswfvnnv evhtaqtqth redynstirv vstlpiqhqd wmsgkefkck vnnkdlpspi 361 ertiskikgl vrapqvytlp ppaeqlsrkd vsltclvvgf npgdisvewt snghteenyk 421 dtapvldsdg syfiysklnm ktskwektds fscnvrhegl knyylkktis rspgk Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 09D03 (SEQ ID NO: 114) 1 atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg agccattggg 61 gatattgtgt tgactcagac tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 121 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 181 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 241 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 301 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatcct 361 ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaacggg ctgatgctgc accaactgta 421 tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 481 ttgaacaact tctaccccag agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 541 caaaatggtg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 601 agcagcaccc tcacattgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 661 gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacaggaa tgagtgt Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 09D03 (SEQ ID NO: 115) 1 mrclaeflgl lvlwipgaig divltqtaps vpvtpgesvs iscrssksll hsngntylyw 61 flqrpgqspq lliyrmsnla sgvpdrfsgs gsgtaftlri srveaedvgv yycmqhleyp 121 ftfgsgtkle ikradaaptv sifppsseql tsggasvvcf lnnfyprdin vkwkidgser 181 qngvlnswtd qdskdstysm sstltltkde yerhnsytce athktstspi vksfnrnec Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Váriável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG1) de 11G01 (SEQ ID NO: 116) 1 atggaatgga gctgggtctc tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 61 gttcagctgc aacagtctga cgctgagttg gtgaaacctg gagcttcagt gaagatatcc 121 tgcaaggttt ctggctacac cttcactgac catattattc actggatgaa gcagaggcct 181 gaacagggcc tggaatggat tggatatatt tatcctagag atggttatat taagtacaat 241 gagaagttca agggcaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caggtcaaca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag gggttactat 361 tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc caaaacgaca 421 cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc 481 ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga 541 tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg 601 agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcc agaccgtcac ctgcaacgtt 661 gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga ttgtggttgt 721 aagccttgca tatgtacagt cccagaagta tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc 781 aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc 841 aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct 901 cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc 961 atcatgcacc aggactggct caatggcaag gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct 1021 ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag 1081 gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc 1141 atgataacag acttcttccc tgaagacatt actgtggagt ggcagtggaa tgggcagcca 1201 gcggagaact acaagaacac tcagcccatc atggacacag atggctctta cttcgtctac 1261 agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg gaggcaggaa atactttcac ctgctctgtg 1321 ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact gagaagagcc tctcccactc tcctggtaaa Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG1) de 11G01 (SEQ ID NO: 117) 1 mewswvslff lsvttgvhsq vqlqqsdael vkpgasvkis ckvsgytftd hiihwmkqrp 61 eqglewigyi yprdgyikyn ekfkgkatlt adkssstaym qvnsltseds avyfcargyy 121 yamdywgqgt svtvssaktt ppsvyplapg saaqtnsmvt lgclvkgyfp epvtvtwnsg 181 slssgvhtfp avlqsdlytl sssvtvpsst wpsqtvtcnv ahpasstkvd kkivprdcgc 241 kpcictvpev ssvfifppkp kdvltitltp kvtcvvvdis kddpevqfsw fvddvevhta 301 qtqpreeqfn stfrsvselp imhqdwlngk efkcrvnsaa fpapiektis ktkgrpkapq 361 vytipppkeq makdkvsltc mitdffpedi tvewqwngqp aenykntqpi mdtdgsyfvy 421 sklnvqksnw eagntftcsv lheglhnhht ekslshspgk Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 11G01 (SEQ ID NO: 118) 1 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagaagtgat 61 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 121 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtattggaa acacctattt agaatggtac 181 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 241 ggggtcccag agaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 301 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttccattc 361 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 421 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 481 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 541 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 601 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 661 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgt Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 11G01 (SEQ ID NO: 119) 1 mklpvrllvl mfwipasrsd vlmtqtplsl pvslgdqasi scrssqsivh signtylewy 61 lqkpgqspkl liykvsnrfs gvperfsgsg sgtdftlkis rveaedlgvy ycfqgshvpf 121 tfgsgtklei kradaaptvs ifppsseqlt sggasvvcfl nnfypkdinv kwkidgserq 181 ngvlnswtdq dskdstysms stltltkdey erhnsytcea thktstspiv ksfnrnec Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Váriável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG1) de 12A07 (SEQ ID NO: 120) 1 atgggatgga gctgtatcat tgtcctcttg gtatcaacag ctacatgtgt ccactcccag 61 gtccaactgc tgcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagttgtcc 121 tgcaagactt ctggctacac cttctccagc tactggatgc actgggtaaa gcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat cggaatgatt gatccttctg atgtttatac taactacaat 241 ccaaagttca agggcaaggc cacattgact gttgacacat cctccagcac agcctacatg 301 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactactct 361 ggggactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct cagccaaaac gacaccccca 421 tctgtctatc cactggcccc tggatctgct gcccaaacta actccatggt gaccctggga 481 tgcctggtca agggctattt ccctgagcca gtgacagtga cctggaactc tggatccctg 541 tccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc 601 tcagtgactg tcccctccag cacctggccc agccagaccg tcacctgcaa cgttgcccac 661 ccggccagca gcaccaaggt ggacaagaaa attgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct 721 tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat 781 gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat 841 gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg 901 caaccccggg aggagcagtt caacagcact ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg 961 caccaggact ggctcaatgg caaggagttc aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct 1021 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac 1081 accattccac ctcccaagga gcagatggcc aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata 1141 acagacttct tccctgaaga cattactgtg gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag 1201 aactacaaga acactcagcc catcatggac acagatggct cttacttcgt ctacagcaag 1261 ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat 1321 gagggcctgc acaaccacca tactgagaag agcctctccc actctcctgg taaa Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG1) de 12A07 (SEQ ID NO: 121) 1 mgwsciivll vstatcvhsq vqllqpgael vrpgtsvkls cktsgytfss ywmhwvkqrp 61 gqglewigmi dpsdvytnyn pkfkgkatlt vdtssstaym qlssltseds avyycarnys 121 gdywgqgttl tvssakttpp svyplapgsa aqtnsmvtlg clvkgyfpep vtvtwnsgsl 181 ssgvhtfpav lqsdlytlss svtvpsstwp sqtvtcnvah passtkvdkk ivprdcgckp 241 cictvpevss vfifppkpkd vltitltpkv tcvvvdiskd dpevqfswfv ddvevhtaqt 301 qpreeqfnst frsvselpim hqdwlngkef kcrvnsaafp apiektiskt kgrpkapqvy 361 tipppkeqma kdkvsltcmi tdffpeditv ewqwngqpae nykntqpimd tdgsyfvysk 421 lnvqksnwea gntftcsvlh eglhnhhtek slshspgk Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 12A07 (SEQ ID NO: 122) 1 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 61 gttttgatga cccaaattcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 121 tcttgtagat ctagtcagag cattgtccat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 181 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 241 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 301 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcata tgttccgtgg 361 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 421 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 481 aacaacttct accccagaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 541 aatggtgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 601 agcaccctca cattgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 661 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgt Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 12A07 (SEQ ID NO: 123) 1 mklpvrllvl mfwipasssd vlmtqiplsl pvslgdqasi scrssqsivh sngntylewy 61 lqkpgqspkl liykvsnrfs gvpdrfsgsg sgtdftlkis rveaedlgvy ycfqgsyvpw 121 tfgggtklei kradaaptvs ifppsseqlt sggasvvcfl nnfyprdinv kwkidgserq 181 ngvlnswtdq dskdstysms stltltkdey erhnsytcea thktstspiv ksfnrnec Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Váriável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG1) de 18H02 (SEQ ID NO: 124) 1 atgggttggc tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtgc ccaagcacag 61 atccagttgg tacagtctgg acctgaactg aagaagcctg gagaggcagt caagatctcc 121 tgcaagtctt ctgggtatac cttcacaacc tatggaatga gctgggtgaa acaggctcca 181 ggaagggctt taaagtggat gggctggata aacacctact ctggagtgcc aacatatgct 241 gatgacttca agggacggtt tgccttctct ttggaatcct ctgccagcac tgcctatttg 301 cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaag agggagggat 361 ggttaccaag tggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga cgctggtcac tgtctctgca 421 gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 481 tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 541 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 601 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc 661 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 721 gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 781 cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 841 gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 901 gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 961 agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 1021 aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 1081 aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 1141 agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 1201 aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 1261 tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 1321 acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 1381 tctcctggta aatga Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG1) de 18H02 (SEQ ID NO: 125) 1 mgwlwnllfl maaaqsaqaq iqlvqsgpel kkpgeavkis ckssgytftt ygmswvkqap 61 gralkwmgwi ntysgvptya ddfkgrfafs lessastayl qinnlknedt atyfcargrd 121 gyqvawfayw gqgtlvtvsa akttppsvyp lapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt 181 wnsgslssgv htfpavlqsd lytlsssvtv psstwpsqtv tcnvahpass tkvdkkivpr 241 dcgckpcict vpevssvfif ppkpkdvlti tltpkvtcvv vdiskddpev qfswfvddve 301 vhtaqtqpre eqfnstfrsv selpimhqdw lngkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp 361 kapqvytipp pkeqmakdkv sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs 421 yfvysklnvq ksnweagntf tcsvlheglh nhhtekslsh spgk Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 18H02 (SEQ ID NO: 126) 1 atgttctcac tagctcttct cctcagtctt cttctcctct gtgtctctga ttctagggca 61 gaaacaactg tgacccagtc tccagcatcc ctgtccatgg ctataggaga taaagtcacc 121 atcagatgca taaccagcac tgatattgat gatgatatga actggttcca gcagaagcca 181 ggggaacctc ctaagctcct tatttcagaa ggcaatactc ttcgtcctgg agtcccatcc 241 cgattctccg gcagtggcta tggtacagat tttattttta caattgaaaa catgctctct 301 gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataact tgccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccagagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggtgtcctg 541 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ttgagtggat cggaatgatt gatccttctg atagttatac taactacaat 241 ccaaagttca agggtaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 301 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactactct 361 ggggactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct cagccaaaac gacaccccca 421 tctgtctatc cactggcccc tggatctgct gcccaaacta actccatggt gaccctggga 481 tgcctggtca agggctattt ccctgagcca gtgacagtga cctggaactc tggatccctg 541 tccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc 601 tcagtgactg tcccctccag cacctggccc agccagaccg tcacctgcaa cgttgcccac 661 ccggccagca gcaccaaggt ggacaagaaa attgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct 721 tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat 781 gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat 841 gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg 901 caaccccggg aggagcagtt caacagcact ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg 961 caccaggact ggctcaatgg caaggagttc aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct 1021 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac 1081 accattccac ctcccaagga gcagatggcc aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata 1141 acagacttct tccctgaaga cattactgtg gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag 1201 aactacaaga acactcagcc catcatggac acagatggct cttacttcgt ctacagcaag 1261 ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat 1321 gagggcctgc acaaccacca tactgagaag agcctctccc actctcctgg taaa Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG1) de 22A02 (SEQ ID NO: 129) 1 mgwsciivll vstatgvhsq vqlqqpgael vrpgtsvkls ckasgytftn ywmhwvkqrp 61 gqglewigmi dpsdsytnyn pkfkgkatlt vdtssstaym qlssltseds avyycarnys 121 gdywgqgttl tvssakttpp svyplapgsa aqtnsmvtlg clvkgyfpep vtvtwnsgsl 181 ssgvhtfpav lqsdlytlss svtvpsstwp sqtvtcnvah passtkvdkk ivprdcgckp 241 cictvpevss vfifppkpkd vltitltpkv tcvvvdiskd dpevqfswfv ddvevhtaqt 301 qpreeqfnst frsvselpim hqdwlngkef kcrvnsaafp apiektiskt kgrpkapqvy 361 tipppkeqma kdkvsltcmi tdffpeditv ewqwngqpae nykntqpimd tdgsyfvysk 421 lnvqksnwea gntftcsvlh eglhnhhtek slshspgk Sequência de Ácido Nucle i co Codificando para a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 22A02 (SEQ ID NO: 130) 1 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 61 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 121 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 181 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 241 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 301 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tattgctttc aaggttcata tgttccgtgg 361 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 421 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 481 aacaacttct accccagaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 541 aatggtgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 601 agcaccctca cattgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 661 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgt Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 22A02 (SEQ ID NO: 131) 1 mklpvrllvl mfwipasssd vlmtqtplsl pvslgdqasi scrssqsivh sngntylewy 61 lqkpgqspkl liykvsnrfs gvpdrfsgsg sgtdftlkis rveaedlgvy ycfqgsyvpw 121 tfgggtklei kradaaptvs ifppsseqlt sggasvvcfl nnfyprdinv kwkidgserq 181 ngvlnswtdq dskdstysms stltltkdey erhnsytcea thktstspiv ksfnrnec Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Váriável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG1) de 24C05 (SEQ ID NO: 132) 1 atgaacttcg ggctcagctt gatgttcctt taaaaggtgt ccagtgtgag 61 gtgcagctgg tggaatctgg gggaggctta gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac cttgggttcg ccagactccg 181 gaaaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt gtacttacac ctactatcca 241 gacaatgtaa agggccgatt caccatctcc ccaagaacaa cctgtacctg 301 caaatgagcc atctgaagtc 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agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1321 tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1381 ggtaaa Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa de Cadeia Pesada (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante da IgG1) de 24C05 (SEQ ID NO: 133) 1 mnfglslmfl vlvlkgvqce vqlvesgggl vkpggslkls caasgftfsd yamswvrqtp 61 ekrlewvati sdggtytyyp dnvkgrftis rdnaknnlyl qmshlksedt amyycarewg 121 dydgfdywgq gttltvssak ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn 181 sgslssgvht fpavlqsdly tlsssvtvps stwpsqtvtc nvahpasstk vdkkivprdc 241 gckpcictvp evssvfifpp kpkdvltitl tpkvtcvvvd iskddpevqf swfvddvevh 301 taqtqpreeq fnstfrsvse lpimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka 361 pqvytipppk eqmakdkvsl tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf 421 vysklnvqks nweagntftc svlheglhnh htekslshsp gk Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 24C05 (SEQ ID NO: 134) 1 atggacatga gggttcctgc tcacgttttt ggcttcttgt tgctctggtt tccaggtacc 61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccttat ctgcctctct gggagaaaga 121 gtcagtctca cttgtcgggc aagtcaggaa attagtggtt acttaagctg gcttcagcag 181 aaaccagatg gaactattaa acgcctgatc tacgccgcat ccactttaga ttctggtgtc 241 ccaaaaaggt tcagtggcag taggtctggg tcagattatt ctctcaccat cggcagcctt 301 gagtctgaag atcttgcaga ctattactgt ctacaatatg atagttatcc gtacacgttc 361 ggagggggga ccaagctgga aataaaacgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 421 ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac 481 ttctacccca gagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggt 541 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 601 ctcacattga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac 661 aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgt Sequência de Proteína Definindo a Sequência Completa da Cadeia Leve (Região Variável e Região Constante da Cadeia Capa) de 24C05 (SEQ ID NO: 135) 1 mdmrvpahvf gflllwfpgt rcdiqmtqsp sslsaslger vsltcrasqe isgylswlqq 61 kpdgtikrli yaastldsgv pkrfsgsrsg sdysltigsl esedladyyc lqydsypytf 121 gggtkleikr adaaptvsif ppsseqltsg gasvvcflnn fyprdinvkw kidgserqng 181 vlnswtdqds kdstysmsst ltltkdeyer hnsytceath ktstspivks fnrnec
[000134] Para uma maior comodidade, a Tabela 4 fornece um gráfico de concordância mostrando a correspondência entre as sequências completas dos anticorpos discutidos nesse Exemplo com aquelas apresentadas na Listagem de Sequências. Tabela 4
Figure img0007
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Exemplo 3 - Afinidades de Ligação
[000135] As afinidades e cinética de ligação para a ligação dos anticorpos monoclonais 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 à proteína de fusão recombinante humana ErbB3/Fc (rhErbB3-Fc) foram medidas por ressonância do plásmon de superfície usando um equipamento Biacore® T100 (Biacore).
[000136] IgGs antirrato de Coelho (Biacore, Cat. N° BR-1008-38) foram imobilizados sobre chips sensores CM4 de dextrano carboximetilado (Biacore, Cat. NO BR-1005-34) por ligação amina (BIAcore, Cat. N° BR-1000-50) usando um protocolo padrão de ligação de acordo com as instruções do fornecedor. As análises foram realizadas a 25°C, usando PBS (Invitrogen, Cat. NO 14040-133) contendo 0,05% de tensioativos P20 (Biacore, Cat. N° BR-1000-54) como tampão de corrida.
[000137] Os anticorpos foram capturados em células individuais de fluxo com uma taxa de fluxo de 10 μL/minuto. O tempo de injeção foi variado para cada anticorpo de modo a render um Rmax entre 30 e 60 RU. O tampão ou o rhErbB3-Fc diluído em tampão de corrida foi injetado sequencialmente ao longo de uma superfície de referência (sem anticorpos capturados) e a superfície ativa (anticorpo a ser testado) durante 300 segundo a 60 μL/minuto. A fase de dissociação foi monitorada durante mais de 3.600 segundos. A superfície foi depois regenerada com duas injeções de 60 segundos com 10 mM de Glicina-HCl, pH 1,7 (feito de Glicina pH 1,5 (Biacore, Cat. N° BR-1003- 54) e pH 2,0 (Biacore, Cat. N° BR-1003-55)), a uma taxa de fluxo de 60 μL/minuto. O intervalo de concentrações do rhErbB3-Fc testado foi de 0,125 nM a 20 nM.
[000138] Os parâmetros cinéticos foram determinados utilizando a função cinética do software BIAevaluation (Biacore) com subtração de dupla referência. Os parâmetros cinéticos para cada anticorpo, ka (constante da velocidade de associação), kd (constante da velocidade de dissociação) e KD (constante de dissociação no equilíbrio) foram determinadas. Valores cinéticos dos anticorpos monoclonais no rhErbB3-Fc a 25 °C estão resumidos na Tabela 5. Tabela 5
Figure img0009
[000139] Os dados da Tabela 5 demonstram que os anticorpos se ligam ao rhErbB3 com um KD de cerca de 350 pM ou inferior, 250 pM ou inferior, 200 pM ou inferior, 150 pM ou inferior, 100 pM ou inferior, 50 pM ou inferior, ou 10 pM ou inferior.
Exemplo 4 - Atividade de Neutralização
[000140] Nesse exemplo, os anticorpos produzidos no Exemplo 1 foram testados quanto à sua capacidade para inibir a ligação do rhErbB3 a NRG1-β1 e NRG1-α1. Os anticorpos foram testados em um ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) para inibição da ligação do hErbB3 a NRG1-β1. Placas de ligação standardizada MA2400 de 96 poços (Meso Scale Discovery, Cat. N° L15XA-6) foram revestidas com 50 μL de rhErbB3/Fc 0,5 μg/mL (R&D systems, Cat. N° 348-RB) em PBS (Invitrogen, Cat. NO 14040-133) durante a noite a 4 °C sem agitação. As placas foram então lavadas 3 vezes com PBS+0,1% de Tween 20 (Sigma P5927) e bloqueadas com 200 μL de PBS contendo BSA 5% (Sera Care Life Sciences, Cat. NO AP-4510-80) durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Após lavar as placas 3 vezes com PBS, 25 μL das diluições do anticorpo foram adicionados às placas durante outra hora à temperatura ambiente, com agitação. O ligante NRG1-β1 (R&D Systems, Cat. N° 377-HB, 26kDa) foi adicionado aos poços à concentração final de 0,25 μg/mL. As placas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas com 25 μL de anticorpo biotinilado 1 μg/mL contra NRG1- 1 humano (R&D systems, Cat. NO BAF377) pré- incubado durante uma hora com estreptavidina SULTO-TAG (Meso Scale Discovery, Cat. NO R32AD-5) durante uma hora à temperatura ambiente, com agitação. As placas foram então lavadas 3 vezes com PBS e 150 μL de tampão de leitura 1X (Meso Scale Discovery, Cat. NO R92TC-1) foram adicionados a cada poço antes das placas serem analisadas em um equipamento Sector® Imager 2400 (Meso Scale Discovery).
[000141] A interação de NRG1-β1 com o ErbB3 foi inibida por anticorpos 04D01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 (figura 6A). A interação de NRG1-β1 com rhErbB3 foi reforçada pelo anticorpo 09D03, mas não tão bem como por anticorpos 11G01 (figura 6B).
[000142] Os valores CI50 do anticorpo ErbB3 murínico anti-humano para neutralização da ligação de NRG1-β1 ao rhErbB3 aos anticorpos (isto é,04D01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05) foram calculados e estão resumidos na Tabela 6. Tabela 6
Figure img0010
[000143] Os resultados mostram que os anticorpos 04D01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 neutralizaram com eficiência a ligação de NRG1-β1 ao rhErbB3. Os anticorpos 09D03 e 11G01 reforçaram a ligação do hNRG1-β1 ao hErbB3.
[000144] Os anticorpos foram testados em um ensaio ECL para inibição da ligação do hErbB3 a um segundo ligante ErbB3, o NRG1- α1. Para testar a inibição da ligação do NRG1-α1 ao rhErbB3, o mesmo método usado para NRG1-β1 foi utilizado, exceto para as seguintes alterações: as concentrações de rhErbB3/Fc plaqueado (R&D 4518-RB) e do ligante NRG1-α1 (Thermo Scientific, RP-317- P1AX) foram 1 μg/mL e 1,5 μg/mL, respetivamente.
[000145] A interação do NRG1-α1 com rhErbB3 foi inibida por IgG1 11G01, 12A07, 18H02, 22A02, e 24C05 e foi reforçada pelo anticorpo 09D03 (figura 7).
Exemplo 5 - Ligação ao domínio II do ErbB3
[000146] Nesse exemplo, os anticorpos produzidos no Exemplo 1 foram testados quanto à sua capacidade para se ligar ao domínio de dimerização (domínio 2) do hErbB3-ECD. O domínio 2 do hErbB3 (118 aminoácidos, posição 210-327) foi clonado no lugar do domínio 2 do Her2 (119 aminoácidos, posição AA220-338) no comprimento total do receptor Her2. O construto híbrido Her2/3d2 foi clonado em pLenti6.3 e embalado por transfeção transiente de células 293T em um lentivírus usando o ViraPower™ Lentiviral Support Kit (Invitrogen, Cat. N° K497000). As células CHO foram infetadas com os lentivírus expressando a sua proteína híbrida Her2/3d2. As ligações dos sobrenadantes do hibridoma anti-ErbB3 ao Her2/3d2 foram testadas sobre essas células CHO desenhadas, por ECL com anticorpos antirrato sulfo-marcados. Os dados sobre a ligação dos sobrenadantes do hibridoma à proteína quimérica Her2/3d2 expressos sobre a superfície celular de células CHO são resumidos na figura 8. Estes resultados demonstram que os anticorpos 09D03 e 11G01 se ligaram ao domínio II ErbB3, AA210-327.
Exemplo 6 - Atividade Antiproliferativa
[000147] Esse exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos produzidos no Exemplo 1, relativamente à sua capacidade para inibir a proliferação dependente de NRG1-β1. Os anticorpos foram testados no sistema de células BaF/3 concebido para expressar ambos Her2 e ErbB3 humanos e em células do câncer de mama MCF7 que naturalmente expressam ambos Her2 e ErbB3 e crescem em resposta à estimulação NRG1-β1.
[000148] As células Baf/3 foram infetadas por dois lentivírus concebidos para expressar ambos Her2 humano ou ErbB3 humano. As células infetadas foram selecionadas com blasticidina (15 μg/mL; Invitrogen, Cat. N° R21001) e as colônias individuais foram isoladas e testadas no que se refere à expressão de ambos os receptores. Os clones de expressão de Her2/ErbB3 foram mantidos em cultura sob seleção de blasticidina com [Meio RPMI 1640 80% (GIBCO, Cat. NO 11875-093), soro fetal bovino 10% (GIBCO, Cat. NO 10438-026) e meio com restrição de células WEHI 10% {Meio Dulbecco Modificado ISCOVE 90% (GIBCO, Cat. NO 12440053), soro fetal bovino 10% (GIBCO, Cat. NO 10438-026) + L-glutamina 2 mM (GIBCO, Cat. NO 25030-081) + mercaptoetanol 0,0025 mM (Invitrogen, Cat. N° 21985023)}]. Para analisar anticorpos antagonistas do ErbB3, as células foram lavadas com PBS e cultivadas na ausência de meios com restrição em blasticidina e WEHI. Os ensaios foram conduzidos em uma placa de 96-poços (5.000 células/poço) na presença de NRG1-β1 (100 ng/mL) e várias concentrações de anticorpos (0,018-5000 ng/mL, num volume final de 100 μL). Os ensaios MTT (Brometo de 3-(4,5- Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) foram conduzidos 3-4 dias após a estimulação NRG1-β1.
[000149] Um exemplo da inibição dependente da dose da proliferação das células Her2/ErbB3-BaF/3 dependentes de NRG1-β1 por anticorpos ErbB3 murínicos anti-humanos é apresentado na figura 9. Os dados de inibição da proliferação da linha celular Her2/ErbB3- BaF/3 dependente de NRG1-β1 com anticorpos monoclonais (isto é, 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05) estão resumidos na Tabela 7. Tabela 7
Figure img0011
[000150] Os resultados na Tabela 7 mostram que os anticorpos 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 inibiram fortemente a proliferação das células BaF/3 induzidas por NRG1-β1, expressando Her2/ErbB3.
[000151] As células MCF7 (ATCC, Cat. NO HTB-22) foram mantidas como recomendado pela ATCC. As células foram plaqueadas a 5.000 células/poço em placas de 96 poços. As células foram privadas de nutrientes durante a noite, na ausência de soro. No dia seguinte, NRG1-β1 (40 ng/mL) e várias concentrações de anticorpos (12,8 pg/mL-20 μg/mL em um volume final de 100 μL) foram adicionados às células. Os ensaios MTT (Brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio) foram conduzidos três dias após a estimulação NRG1- β1.
[000152] Um exemplo da inibição dependente da dose da proliferação das células MCF7 dependentes de NRG1-β1 por anticorpos ErbB3 murínicos anti-humanos é apresentado na figura 10. Os dados de inibição da proliferação da linha celular MCF7 dependente de NRG1-β1 com anticorpos 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05) estão resumidos na Tabela 8. Tabela 8
Figure img0012
[000153] Os resultados na Tabela 8 demonstram que os anticorpos 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 inibiram fortemente a proliferação das células MCF7 induzida por NRG1-β1.
[000154] Os anticorpos produzidos no Exemplo 1 foram também testados quanto à sua capacidade para inibir a proliferação das células de câncer humano expressando ErbB3. As células do câncer da mama SKBR-3 superexpressam Her2 e são sensíveis aos seus anticorpos inibidores específicos do Her2.
[000155] As células SKBR-3 (ATCC, Cat. NO HTB-30) foram mantidas como recomendado pela ATCC. As células foram plaqueadas a 5.000 células/poço em uma placa de 96-poços na presença de 5 μg/mL de anticorpos mas sem NRG1-β1 exógeno. Os ensaios MTT (Brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) foram conduzidos após três dias em cultura.
[000156] Um exemplo de inibição da proliferação das células SKBR- 3 por anticorpos ErbB3 murínicos anti-humanos é apresentado na figura 11. Os resultados na figura 11 demonstram que os anticorpos 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 inibiram a proliferação das células SKBR-3.
Exemplo 7 - Inibição da sinalização a jusante
[000157] Este exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos produzidos no Exemplo 1, relativamente à sua capacidade para inibir a fosforilação do ErbB3 dependente de NRG1-β1 e a Akt cinase a jusante, como a leitura para a ativação PI3K. Esses anticorpos também foram testados quanto à sua capacidade para inibir a fosforilação no estado estacionário do ErbB3 e do Akt em células com crescimento exponencial.
[000158] As células do câncer de mama SKBR-3 e MCF7 e as células de câncer da próstata DU145 foram mantidas como recomendado pela ATCC. As células foram privadas de nutrientes durante a noite em FBS 0%, tratadas durante uma hora com 5 μg/mL de anticorpo seguido por estimulação NRG1-β1. Os lisados foram analisados por ELISA com o conjunto Phospho-ErbB3 da R&D Systems (Cat. NO DYC1769) ou com o conjunto Phospho-Akt ELISA de Sinalização Celular (Cat. NO 7143).
[000159] Um exemplo de inibição da fosforilação do ErbB3 em células SKBR-3, induzida por NRG1-β1, por anticorpos ErbB3 murínicos anti-humanos é apresentado na figura 12. Os resultados apresentados na Fig. 12 demonstraram que anticorpos 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 inibiram pelo menos 50% da fosforilação do ErbB3 induzida por NRG1-β1 em células SKBR-3.
[000160] Um exemplo de inibição da fosforilação do Akt em células MCF7 e DU145, induzida por NRG1-β1, por anticorpos ErbB3 murínicos anti-humanos é apresentado na figura 13A e na figura 13B, respetivamente. Os resultados nas figuras 13A e 13B demonstraram que os anticorpos 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 inibiram pelo menos 80% da fosforilação do Akt em resposta ao NRG1-β1 em ambas as células MCF7 e DU145.
[000161] As capacidades dos anticorpos anti-ErbB3 para inibir o estado da fosforilação em estado estacionário do ErbB3 e do Akt em uma linha celular SKBR-3 de câncer de mama e em uma linha celular BxPC3 de câncer pancreático, foram testadas pelo tratamento destas células crescendo exponencialmente durante uma hora na presença de anticorpos a 5 μg/mL.
[000162] A análise por Western blot destes ensaios mostrou que os anticorpos 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 inibiu o nível de fosforilação no estado estacionário do Akt e do ErbB3 em ambas as células SKBR-3 e BxPC3.
Exemplo 8 - Inibição da fosforilação do EGFR induzida por NRG1-β1
[000163] Nesse exemplo, os anticorpos produzidos no Exemplo 1 foram testados quanto à sua capacidade para inibir fosforilação do EGFR, dependente de NRG1-β1, em linhas de células de câncer de ovário NIC/ADR-RES. As células NIC/ADR-RES (DTP/DCTD NIC do repositório de tumores) foram privadas de nutrientes durante a noite em FBS 0%, pré-tratadas com anticorpo (5 μg/mL) durante uma hora seguida de estimulação NRG1-β1 (20 ng/mL) durante 15 minutos. A fosforilação do EGFR na tirosina 1068 foi analisada por Western blot. Os resultados deste ensaio demonstraram que os anticorpos 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 inibiram a fosforilação do EGFR em resposta a NRG1-β1 nas células NIC/ADR-RES.
Exemplo 9 - Inibição da fosforilação do ErbB3 induzida pelo EGF
[000164] Nesse exemplo, os anticorpos produzidos no Exemplo 1 foram testados quanto à sua capacidade para inibir a fosforilação do ErbB3 dependente do EGF, em linhas de células de câncer epidermoide A431, superexpressando o EGFR. As células A431 (ATCC, Cat. NO CRL-1555) foram privadas de nutrientes durante a noite em FBS 0%, pré-tratadas com anticorpo (5 μg/mL) durante uma hora, seguido de estimulação por EGF (R&D Systems, Cat. NO 236- EG) (50 ng/mL) durante 15 minutos. A fosforilação do ErbB3 foi analisada por Western blot. Os resultados deste ensaio demonstraram que os anticorpos 04D01, 09D03, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 inibiram a vários níveis a fosforilação do ErbB3 em resposta ao EGF em células A431.
Exemplo 10 - Inibição da formação do heterodímero Her2/ErbB3 induzida por NRG1-β1
[000165] Esse exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos produzidos no Exemplo 1, no que se refere à sua capacidade para inibir a formação do dímero Her2/ErbB3 em resposta a NRG1-β1 em células SKBR-3. As células de câncer de mama SKBR-3 foram privadas de nutrientes durante a noite em FBS 0%, tratadas durante uma hora com 5 μg/mL de anticorpo seguido por estimulação com NRG1-β1 (30 ng/ml, 30 min). Os lisados foram imunoprecipitados com anticorpo anti-Her2 (R&D Systems, Cat. N° BAF1129) e analisados por Western blot com anticorpo policlonal anti-ErbB3 (Santa Cruz, Cat. NO SC285).
[000166] Os resultados desse ensaio demonstraram que os anticorpos 04D01, 09D03, 11G01, 12A07, 18H02, 22A02 e 24C05 inibiram a formação do dímero Her2/ErbB3 induzida por NRG1-β1 em células SKBR-3.
Exemplo 11 - Inibição do crescimento do xenoenxerto do tumor BxPC3
[000167] A capacidade dos anticorpos monoclonais murínicos produzidos no Exemplo 1 para inibir o crescimento do tumor foi testada em um modelo de xenoenxerto BxPC3 pancreático. As células pancreáticas humanas BxPC3 foram cultivadas em meio de cultura a 37 °C em uma atmosfera contendo CO2 a 5%, utilizando-se o meio RMPI contendo 10% de soro fetal bovino. As células BxPC3 foram inoculadas por via subcutânea, no flanco de uma fêmea CB.17 de rato SCID com 8 semanas de idade (Taconic Labs) com 10 x 106 células por rato em matrigel 50% (BD Biosciences, Cat n° 356237). As medições do tumor foram realizadas duas vezes por semana utilizando um paquímetro. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: largura x largura x comprimento/2. Quando os tumores atingiram aproximadamente 200 mm3, os ratos foram aleatoriamente distribuídos por 9 grupos de 10 ratos cada. Um grupo recebeu PBS e outro recebeu controle IgG humana (huIgG). Cada um dos outros oito grupos recebeu um dos anticorpos, 04D01, 09D03, 18H02, 11G01, 24C05, 22A02, ou 12A07. Todos os anticorpos foram doseados a 20 mg/kg do peso corporal, duas vezes por semana, por injeção intraperitoneal durante 6 semanas. Os volumes do tumor e os pesos corporais do rato foram registados duas vezes por semana. A inibição do crescimento do tumor foi analisada utilizando-se ANOVA e é expressa como percentagem de inibição comparada com o controle PBS.
[000168] Os resultados na figura 14 mostraram que o anticorpo 24C05 inibiu o crescimento tumoral em 76% nesse modelo (p<0,001). Os anticorpos 04D01, 18H02 e 11G01 também inibiram o crescimento tumoral nesse modelo a, respetivamente, 64%, 71% e 72%, respetivamente (p<0,001). Os anticorpos 12A07 e 22A02 demonstraram a atividade mínima, isto é, próximo de 40% da inibição do crescimento do tumor, enquanto o anticorpo 09D03 proporcionou 60% de inibição do crescimento do tumor, nesse modelo.
Exemplo 12 - Humanização dos Anticorpos Anti-ErbB3 Construção dos Anticorpos Anti-ErbB3 Humanizados e Quiméricos
[000169] Esse exemplo descreve a humanização do anticorpo murínico designado por 24C05, e a caracterização dos anticorpos humanizados resultantes. Os anticorpos humanizados anti-ErbB3 foram desenhados utilizando o método SUPERHUMANIZATIONTM (Arana Therapeutics Ltd. e Hwang, W. Y. et al. (2005) METHODS 36:35-42) ou pelo método de enxertia de CDR com mutações posteriores (alguns resíduos humanos de framework foram alterados para resíduos murínicos) (Ver por exemplo, as Patentes U.S. N° 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; 6,180,370; 7,022,500). Com a exceção da cadeia pesada CDR1, as definições CDR de Kabat foram utilizadas para enxertia de CDR em frameworks humanas. Uma combinação das definições de Kabat e Chothia foi utilizada para enxertia da CDR1 pesada. As sequências de aminoácidos desenhadas foram convertidas nas sequências de DNA códon-otimizadas e sintetizadas por DNA2.0, Inc. para incluir (na seguinte ordem): sítio de restrição 5' HindIII, sequência consenso de Kozak, sequência sinal aminoterminal, região variável humanizada, região constante da IgG1 humana ou Capa, códon de parada e um sítio de restrição 3' EcoRI. Adicionalmente, uma cadeia pesada humanizada, a Sh24C05 Hv3-11 Pesada IgG1, foi mutada usando PCR para extensão por sobreposição para melhorar a humanização, resultando na cadeia pesada da IgG1 Sh24C05 Hv3-11 N62S. Uma versão da IgG2 humana da cadeia pesada Sh24C05 Hv3-11 N62S foi também construída.
[000170] As cadeias de anticorpo anti-ErbB humanizado de acordo com o método SUPERHUMANIZATIONTM, tal como aqui descrito, são designadas com o prefixo "Sh" antes do nome da cadeia do anticorpo. As cadeias de anticorpo anti-ErbB3 humanizado pelo método de enxertia da CDR com mutações reversas, tal como aqui descrito, são designadas com o prefixo "Hu" antes do nome da cadeia do anticorpo.
[000171] As cadeias quimérica (região variável murínica e região constante humana) 24C05 pesada (IgG1 humana) e leve (Capa humana) também foram construídas. As regiões variáveis murínicas foram fundidas com a região constante humana usando PCR de extensão por sobreposição, incluindo (na seguinte ordem): O sítio de restrição 5' HindIII, a sequência consenso de Kozak, a sequência sinal aminoterminal, a região variável de rato, a região constante da IgG1 humana ou Capa, o códon de parada e um sítio de restrição 3' EcoRI.
[000172] As cadeias pesadas humanizadas e quiméricas foram subclonadas em pEE6.4 (Lonza Biologics) via HindIII e locais de EcoRI usando clonagem por PCR In-FusionTM (Clontech). As cadeias leves Capa humanizadas e quiméricas foram subclonadas em pEE14.4 (Lonza Biologics) via HindIII e locais de EcoRI usando clonagem por PCR In-FusionTM (Clontech).
[000173] As cadeias de anticorpo humanizado ou as cadeias de anticorpo quiméricas foram transitoriamente transfectadas em células 293T para produzir anticorpos. O anticorpo foi purificado ou utilizado em sobrenadantes dos meios de cultura de células para posterior análise in vitro. A ligação dos anticorpos quiméricos e humanizados ao ErbB3 humano foi medida como descrito abaixo. Os resultados estão resumidos na Tabela 15.
[000174] Além disso, algumas combinações de cadeias pesada e leve de anticorpo humanizado foram expressas de um modo estável em células CHOK1SV utilizando o GS SystemTM (Lonza Biologics) de modo a produzir grandes quantidades de anticorpo humanizado purificado. Um único vetor de expressão foi construído pela combinação vetores baseados em pEE6.4 e pEE14.4. Em primeiro lugar, o cDNA de cadeia pesada humanizada completa contendo pEE6.4 foi digerido com NotI e SalI para isolar o promotor hCMV-MIE + cDNA de cadeia pesada humanizada completa + fragmento poliA SV40. Este fragmento foi inserido no vetor pEE14.4 já contendo cDNA de cadeia leve humanizada completa via locais NotI/SalI, criando assim um vetor de expressão que simultaneamente expressa cadeias pesada e leve. O vetor de cadeia pesada e leve combinada foi linearizado e transfectado em células CHOK1SV. Os clones estáveis foram selecionados na presença de sulfoximina metionina.
[000175] Cada uma das combinações possíveis das regiões variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina humanizada e da cadeia leve da imunoglobulina é estabelecida abaixo na Tabela 9. Tabela 9
Figure img0013
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Figure img0015
[000176] As sequências dos ácidos nucleicos que codificam e a sequências de proteínas que definem as regiões variáveis dos anticorpos 24C05 humanizados são resumidos abaixo (as sequências aminoterminais do peptídeo sinal não são apresentadas). As sequências CDR (definição de Kabat) são apresentadas a negrito e são sublinhadas nas sequências de aminoácidos. Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada da Sh24C05 Hv3-7 (SEQ ID NO: 149) 1 gaggttcagc tggtggaatc tggcggtggg cttgtacaac caggaggctc cctcagactg 61 agttgtgccg cttcagggtt cacattctcc gactatgcga tgtcatgggt gcgccaagca 121 cccgggaaag gactggagtg ggttgccact atcagcgatg gcggaacgta tacctattac 181 cctgacaatg tgaagggtcg gttcaccatt tccagggata acgcaaagaa cagtctctac 241 ctgcagatga acagcctgag ggctgaggac accgccgtct actactgcgc ccgagaatgg 301 ggagattatg atgggtttga ctattggggc cagggcactt tggtgacagt cagttct Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-7 (SEQ ID NO: 150) 1 evqlvesggg lvqpggslrl scaasgftfs dyamswvrqa pgkglewvat isdggtytyy 61 pdnvkgrfti srdnaknsly Iqmnslraed tavyycarew gdydgfdywg qgtlvtvss Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-11 (SEQ ID NO: 151) 1 caagttcagc tggtggaatc tggcggtggg cttgtaaagc caggaggctc cctcagactg 61 agttgtgccg cttcagggtt cacattctcc gactatgcga tgtcatggat caggcaagca 121 cccgggaaag gactggagtg ggttagcact atcagcgatg gcggaacgta tacctattac 181 cctgacaatg tgaagggtcg gttcaccatt tccagggata acgcaaagaa cagtctctac 241 cttcagatga acagcctgag ggctgaggac accgccgtct actactgcgc ccgagaatgg 301 ggagattatg atgggtttga ctattggggc cagggcactt tggtgacagt cagttct Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-11 (SEQ ID NO: 152) 1 qvqlvesggg lvkpggslrl scaasgftfs dyamswirqa pgkglewvst isdggtytyy 61 pdnvkgrfti srdnaknsly Iqmnslraed tavyycarew gdydgfdywg qgtlvtvss Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-11 N62S (SEQ ID NO: 153) 1 caagttcagc tggtggaatc tggcggtggg cttgtaaagc caggaggctc cctcagactg 61 agttgtgccg cttcagggtt cacattctcc gactatgcga tgtcatggat caggcaagca 121 cccgggaaag gactggagtg ggttagcact atcagcgatg gcggaacgta tacctattac 181 cctgactccg tgaagggtcg gttcaccatt tccagggata acgcaaagaa cagtctctac 241 cttcagatga acagcctgag ggctgaggac accgccgtct actactgcgc ccgagaatgg 301 ggagattatg atgggtttga ctattggggc cagggcactt tggtgacagt cagttct Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-11 N62S (SEQ ID NO: 154) 1 qvqlvesggg lvkpggslrl scaasgftfs dyamswirqa pgkglewvst isdggtytyy 61 pdsvkgrfti srdnaknsly Iqmnslraed tavyycarew gdydgfdywg qgtlvtvss Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-21 (SEQ ID NO: 155) 1 gaggttcagc tggtggaatc tggcggtggg cttgtaaagc caggaggctc cctcagactg 61 agttgtgccg cttcagggtt cacattctcc gactatgcga tgtcatgggt gcgccaagca 121 cccgggaaag gactggagtg ggttagcact atcagcgatg gcggaacgta tacctattac 181 cctgacaatg tgaagggtcg gttcaccatt tccagggata acgcaaagaa cagtctctat 241 ttgcagatga acagcctgag ggctgaggac accgccgtct actactgcgc ccgagaatgg 301 ggagattatg atgggtttga ctattggggc cagggcactt tggtgacagt cagttct Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-21 (SEQ ID NO: 156) 1 evqlvesggg lvkpggslrl scaasgftfs dyamswvrqa pgkglewvst isdggtytyy 61 pdnvkgrfti srdnaknsly Iqmnslraed tavyycarew gdydgfdywg qgtlvtvss Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-23 (SEQ ID NO: 157) 1 gaggttcagc ttctggaatc tggcggtggg cttgtacagc caggaggctc cctcagactg 61 agttgtgccg cttcagggtt cacattctcc gactatgcga tgtcatgggt gcgccaagca 121 cccgggaaag gactggagtg ggtttcaact atcagcgatg gcggaacgta tacctattac 181 cctgacaatg tgaagggtcg gttcaccatt tccagggata acagcaagaa cacactctat 241 ctccagatga acagcctgag ggctgaggac accgccgtct actactgcgc ccgagaatgg 301 ggagattatg atgggtttga ctattggggc cagggcactt tggtgacagt cagttct Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-23 (SEQ ID NO: 158) 1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs dyamswvrqa pgkglewvst isdggtytyy 61 pdnvkgrfti srdnskntly Iqmnslraed tavyycarew gdydgfdywg qgtlvtvss Sequência de Ácido N uclei co Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-30 (SEQ ID NO: 159) 1 caggttcagc tggtggaatc tggcggtggg gtagtacaac caggacggtc cctcagactg 61 agttgtgccg cttcagggtt cacattctcc gactatgcga tgtcatgggt gcgccaagca 121 cccgggaaag gactggagtg ggttgccact atcagcgatg gcggaacgta tacctattac 181 cctgacaatg tgaagggtcg gttcaccatt tccagggata actcaaagaa caccctctat 241 ctccaaatga gtagcctgag ggctgaggac accgccgtct actactgcgc ccgagaatgg 301 ggagattatg atgggtttga ctattggggc cagggcactt tggtgacagt cagttct Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-30 (SEQ ID NO: 160) 1 qvqlvesggg vvqpgrslrl scaasgftfs dyamswvrqa pgkglewvat isdggtytyy 61 pdnvkgrfti srdnskntly Iqmsslraed tavyycarew gdydgfdywg qgtlvtvss Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Pesada Hu24C05 HvA (SEQ ID NO: 161) 1 gaggttcagc tggtggaatc tggcggtggg cttgtaaagc caggaggctc cctcagactg 61 agttgtgccg cttcagggtt cacattctcc gactatgcga tgtcatgggt gcgccaagca 121 cccgggaaag gactggagtg ggttgccact atcagcgatg gcggaacgta tacctattac 181 cctgacaatg tgaagggtcg gttcaccatt tccagggata acgcaaagaa cagtctctac 241 cttcagatga acagcctgag ggctgaggac accgccgtct actactgcgc ccgagaatgg 301 ggagattatg atgggtttga ctattggggc cagggcactt tggtgacagt cagttct Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Pesada Hu24C05 HvA (SEQ ID NO: 162) 1 evqlvesggg lvkpggslrl scaasgftfs dyamswvrqa pgkglewvat isdggtytyy 61 pdnvkgrfti srdnaknsly Iqmnslraed tavyycarew gdydgfdywg qgtlvtvss Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa Sh24C05 Kv1-9 (SEQ ID NO: 163) 1 gatattcagt tgacccaatc acctagcttc ctctcagctt ccgtgggcga cagagttacc 61 ataacctgtc gggcaagcca ggagatttct gggtacctgt cctggtacca acagaagccc 121 ggaaaagccc ctaagctgtt gatctatgct gcgtcaacct tggatagcgg tgtcccgagt 181 cgattctccg gttctggctc cggaacagag ttcactctga caatttctag ccttcagcca 241 gaagatttcg ccacgtacta ttgcctccag tacgacagct atccctatac atttgggcag 301 ggcactaaac tggagatcaa a Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa Sh24C05 Kv1-9 (SEQ ID NO: 164) 1 diqltqspsf Isasvgdrvt itcrasqeis gylswyqqkp gkapklliya astldsgvps 61 rfsgsgsgte ftltisslqp edfatyyclq ydsypytfgq gtkleik Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa Sh24C05 Kv1-16 (SEQ ID NO: 165) 1 gatattcaga tgacccaatc acctagcagt ctctcagctt ccgtgggcga cagagttacc 61 ataacctgtc gggcaagcca ggagatttct gggtacctgt cctggtttca acagaagccc 121 ggaaaggccc cgaagagctt gatctatgct gcgtcaacct tggatagcgg tgtcccgagt 181 cgattctccg gttctggctc cggaaccgac tttactctga caatttctag ccttcagcca 241 gaagatttcg ccacgtacta ttgcctccag tacgacagct atccctatac atttgggcag 301 ggcactaaac tggagatcaa a Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa Sh24C05 Kv1-16 (SEQ ID NO: 166) 1 diqmtqspss Isasvgdrvt itcrasqeis gylswfqqkp gkapksliya astldsgvps 61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyyclq ydsypytfgq gtkleik Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa Sh24C05 Kv1-17 (SEQ ID NO: 167) 1 gatattcaga tgacccaatc acctagcagt ctctcagctt ccgtgggcga cagagttacc 61 ataacctgtc gggcaagcca ggagatttct gggtacctgt cctggtatca acagaagccc 121 ggaaaagccc caaagaggtt gatctatgct gcgtcaacct tggatagcgg tgtcccgagt 181 cgattctccg gttctggctc cggaaccgag ttcactctga caatttctag ccttcagcca 241 gaagatttcg ccacgtacta ttgcctccag tacgacagct atccctatac atttgggcag 301 ggcactaaac tggagatcaa a Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa Sh24C05 Kv1-17 (SEQ ID NO: 168) 1 diqmtqspss Isasvgdrvt itcrasqeis gylswyqqkp gkapkrliya astldsgvps 61 rfsgsgsgte ftltisslqp edfatyyclq ydsypytfgq gtkleik Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa Sh24C05 Kv1-33 (SEQ ID NO: 169) 1 gatattcaga tgacccaatc acctagcagt ctctcagctt ccgtgggcga cagagttacc 61 ataacctgtc gggcaagcca ggagatttct gggtacctgt cctggtacca acagaagccc 121 ggaaaggccc ccaagctgtt gatctatgct gcgtcaacct tggatagcgg tgtcccgagt 181 cgattctccg gttctggctc cggaacagac tttactttta caatttctag ccttcagcca 241 gaggacatcg ccacgtacta ttgcctccag tacgacagct atccctatac atttgggcag 301 ggcactaaac tggagatcaa a Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa Sh24C05 Kv1-33 (SEQ ID NO: 170) 1 diqmtqspss Isasvgdrvt itcrasqeis gylswyqqkp gkapklliya astldsgvps 61 rfsgsgsgtd ftftisslqp ediatyyclq ydsypytfgq gtkleik Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa Sh24C05 Kv1-39 (SEQ ID NO: 171) 1 gatattcaga tgacccaatc acctagcagt ctctcagctt ccgtgggcga cagagttacc 61 ataacctgtc gggcaagcca ggagatttct gggtacctgt cctggtatca acagaagccc 121 ggaaaagccc ctaagctgtt gatctatgct gcgtcaacct tggatagcgg tgtcccgagt 181 cgattctccg gttctggctc cggaactgac ttcactctga caatttctag ccttcagcca 241 gaagatttcg ccacgtacta ttgcctccag tacgacagct atccctatac atttgggcag 301 ggcactaaac tggagatcaa a Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa Sh24C05 Kv1-39 (SEQ ID NO: 172) 1 diqmtqspss Isasvgdrvt itcrasqeis gylswyqqkp gkapklliya astldsgvps 61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyyclq ydsypytfgq gtkleik Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Variável da Cadeia Capa Hu24C05 KvA (SEQ ID NO: 173) 1 gatattcaga tgacccaatc acctagcagt ctctcagctt ccgtgggcga cagagttacc 61 ataacctgtc gggcaagcca ggagatttct gggtacctgt cctggctgca acagaagccc 121 ggaggcgcca tcaagaggtt gatctatgct gcgtcaacct tggatagcgg tgtcccgagt 181 cgattctccg gttctggctc cggaagtgac tacactctga caatttctag ccttcagcca 241 gaagatttcg ccacgtacta ttgcctccag tacgacagct atccctatac atttgggcag 301 ggcactaaac tggagatcaa a Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Capa Hu24C05 KvA (SEQ ID NO: 174) 1 diqmtqspss Isasvgdrvt itcrasqeis gylswlqqkp ggaikrliya astldsgvps 61 rfsgsgsgsd ytltisslqp edfatyyclq ydsypytfgq gtkleik
[000177] As sequências de aminoácidos definindo as regiões variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina para os anticorpos produzidos no Exemplo 12, são alinhadas na figura 15. As sequências de peptídeo sinal aminoterminais (para a expressão/secreção adequadas) não são apresentadas. As CDR1, CDR2 e a CDR3 (definição de Kabat) são identificadas por caixas.
[000178] As sequências de aminoácidos definindo as regiões variáveis da cadeia leve da imunoglobulina para os anticorpos produzidos no Exemplo 12, são alinhadas na figura 16. As sequências de peptídeo sinal aminoterminais (para a expressão/secreção adequadas) não são apresentadas. As CDR1, CDR2 e CDR3 são identificadas por caixas.
[000179] A Tabela 10 é um gráfico de concordância apresentando a SEQ ID NO de cada sequência discutida nesse Exemplo. Tabela 10
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Figure img0018
[000180] Sequências CDR de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humanizado (Kabat, Chothia e definições de IMGT) são apresentadas na Tabela 11. Tabela 11
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[000181] Sequências CDR de cadeia leve capa do anticorpo monoclonal humanizado (Kabat, Chothia e definições de IMGT) são apresentadas na Tabela 12. Tabela 12
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Figure img0023
[000182] Nas Tabelas 11 e 12, as sequências CDR mais longas para a cadeia pesada e cadeia leve da imunoglobulina são apresentados em negrito.
[000183] Para criar as sequências de anticorpo completas, com cadeia pesada ou capa, quiméricas e humanizadas, cada sequência variável acima é combinada com a sua respetiva região constante humana. Por exemplo, uma cadeia pesada completa compreende uma sequência variável pesada seguida por uma sequência constante de cadeia pesada da IgG1 humana ou por uma sequência constante de cadeia pesada IgG2 humana. Uma cadeia capa completa compreende uma sequência variável capa seguida pela sequência constante de cadeia leve capa humana. Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Constante da Cadeia Pesada da IgG1 Humana (SEQ ID NO: 175) 1 gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag tacatccggg 61 ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc cagagccagt aaccgtgagc 121 tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct 181 ggcctgtact cactcagctc cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc 241 tacatctgta atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc 301 aagagctgcg acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact tctgggcggt 361 cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc tgatgataag tagaacaccc 421 gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg 481 tacgttgatg gagtcgaagt acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat 541 agtacatacc gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa 601 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa gactattagt 661 aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc tgccacccag tagagaggaa 721 atgacaaaga accaagtctc attgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc 781 gccgttgagt gggagagtaa cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg 841 ctggatagtg acgggtcttt ctttctgtac agtaagctga ctgtggacaa gtcccgctgg 901 cagcagggta acgtcttcag ctgttccgtg atgcacgagg cattgcacaa ccactacacc 961 cagaagtcac tgagcctgag cccagggaag Sequência de Proteína Definindo a Região Constante da Cadeia Pesada da IgG1 Humana (SEQ ID NO: 176) 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree 241 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Constante da Cadeia Pesada da IgG2 Humana (SEQ ID NO: 177) 1 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 61 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 121 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 181 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 241 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 301 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 361 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 421 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 481 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 541 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 601 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 661 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 721 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 781 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 841 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 901 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 961 tccctgtctc cgggtaaa Sequência de Proteína Definindo a Região Constante da Cadeia Pesada da IgG2 Humana (SEQ ID NO: 178) 1 astkgpsvfp lapcsrstse staalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssnfgtqt ytcnvdhkps ntkvdktver kccvecppcp appvagpsvf 121 lfppkpkdtl misrtpevtc vvvdvshedp evqfnwyvdg vevhnaktkp reeqfnstfr 181 vvsvltvvhq dwlngkeykc kvsnkglpap iektisktkg qprepqvytl ppsreemtkn 241 qvsltclvkg fypsdiavew esngqpenny kttppmldsd gsfflysklt vdksrwqqgn 301 vfscsvmhea lhnhytqksl slspgk Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Região Constante da Cadeia Leve Capa Humana (SEQ ID NO: 179) 1 cgcacagttg ctgcccccag cgtgttcatt ttcccaccta gcgatgagca gctgaaaagc 61 ggtactgcct ctgtcgtatg cttgctcaac aacttttacc cacgtgaggc taaggtgcag 121 tggaaagtgg ataatgcact tcaatctgga aacagtcaag agtccgtgac agaacaggac 181 agcaaagact caacttattc actctcttcc accctgactc tgtccaaggc agactatgaa 241 aaacacaagg tatacgcctg cgaggttaca caccagggtt tgtctagtcc tgtcaccaag 301 tccttcaata ggggcgaatg t Sequência de Proteína Definindo a Região Constante da Cadeia Leve Capa Humana (SEQ ID NO: 180) 1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd 61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec
[000184] As seguintes sequências representam as sequências completas de cadeia pesada e leve, reais ou contempladas (isto é, contendo ambas as sequências das regiões variáveis e constantes) para cada anticorpo descrito nesse exemplo. As sequências de sinal para secreção adequada dos anticorpos são também incluídas na extremidade 5' das sequências de DNA ou na extremidade aminoterminal das sequências de proteínas. Também é aqui contemplado que as sequências da região variável podem ser ligadas a outras sequências da região constante, para produzir cadeias pesadas e leves IgG completas e ativas. Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Cadeia Pesada 24C05 Quimérica Completa (Região Váriável da Cadeia Pesada de Rato e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 181) 1 atgaacttcg ggctcagctt gatgttcctt gtccttgtct taaaaggtgt ccagtgtgag 61 gtgcagctgg tggaatctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tatgccatgt cttgggttcg ccagactccg 181 gaaaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtgatggtg gtacttacac ctactatcca 241 gacaatgtaa agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacaa cctgtacctg 301 caaatgagcc atctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag agaatggggt 361 gattacgacg gatttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcggcctca 421 acaaaaggac caagtgtgtt cccactcgcc cctagcagca agagtacatc cgggggcact 481 gcagcactcg gctgcctcgt caaggattat tttccagagc cagtaaccgt gagctggaac 541 agtggagcac tcacttctgg tgtccatact tttcctgctg tcctgcaaag ctctggcctg 601 tactcactca gctccgtcgt gaccgtgcca tcttcatctc tgggcactca gacctacatc 661 tgtaatgtaa accacaagcc tagcaatact aaggtcgata agcgggtgga acccaagagc 721 tgcgacaaga ctcacacttg tcccccatgc cctgcccctg aacttctggg cggtcccagc 781 gtctttttgt tcccaccaaa gcctaaagat actctgatga taagtagaac acccgaggtg 841 acatgtgttg ttgtagacgt ttcccacgag gacccagagg ttaagttcaa ctggtacgtt 901 gatggagtcg aagtacataa tgctaagacc aagcctagag aggagcagta taatagtaca 961 taccgtgtag tcagtgttct cacagtgctg caccaagact ggctcaacgg caaagaatac 1021 aaatgcaaag tgtccaacaa agcactccca gcccctatcg agaagactat tagtaaggca 1081 aaggggcagc ctcgtgaacc acaggtgtac actctgccac ccagtagaga ggaaatgaca 1141 aagaaccaag tctcattgac ctgcctggtg aaaggcttct accccagcga catcgccgtt 1201 gagtgggaga gtaacggtca gcctgagaac aattacaaga caaccccccc agtgctggat 1261 agtgacgggt ctttctttct gtacagtaag ctgactgtgg acaagtcccg ctggcagcag 1321 ggtaacgtct tcagctgttc cgtgatgcac gaggcattgc acaaccacta cacccagaag 1381 tcactgagcc tgagcccagg gaag Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Pesada 24C05 Quimérica Completa (Região Váriável da Cadeia Pesada de Rato e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 182) 1 mnfglslmfl vlvlkgvqce vqlvesgggl vkpggslkls caasgftfsd yamswvrqtp 61 ekrlewvati sdggtytyyp dnvkgrftis rdnaknnlyl qmshlksedt amyycarewg 121 dydgfdywgq gttltvssas tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn 181 sgaltsgvht fpavlqssgl yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks 241 cdkthtcppc papellggps vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv 301 dgvevhnakt kpreeqynst yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska 361 kgqprepqvy tlppsreemt knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld 421 sdgsfflysk ltvdksrwqq gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Cadeia Leve 24C05 Quimérica Completa (Região Váriável da Cadeia Capa de Rato e Região Constante Capa Humana) (SEQ ID NO: 183) 1 atggacatga gggttcctgc tcacgttttt ggcttcttgt tgctctggtt tccaggtacc 61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccttat ctgcctctct gggagaaaga 121 gtcagtctca cttgtcgggc aagtcaggaa attagtggtt acttaagctg gcttcagcag 181 aaaccagatg gaactattaa acgcctgatc tacgccgcat ccactttaga ttctggtgtc 241 ccaaaaaggt tcagtggcag taggtctggg tcagattatt ctctcaccat cggcagcctt 301 gagtctgaag atcttgcaga ctattactgt ctacaatatg atagttatcc gtacacgttc 361 ggagggggga ccaagctgga aataaaacgc acagtcgccg ctccctccgt gttcatcttt 421 ccaccaagtg atgagcaact gaagtctggt actgcttcag tcgtgtgtct gctgaacaat 481 ttctaccctc gagaagccaa agtccaatgg aaggtagaca acgcactgca gtccggcaat 541 agccaagaat cagttaccga acaggattca aaggacagta catattccct gagcagcact 601 ctgaccctgt caaaggccga ttacgagaaa cacaaggtct atgcttgcga agtgacacat 661 cagggactgt ccagcccagt gacaaaatct tttaaccgtg gggagtgt Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Leve 24C05 Quimérica Completa (Região Variável da Cadeia Capa de Rato e Região Constante Capa Humana) (SEQ ID NO: 184) 1 mdmrvpahvf gflllwfpgt rcdiqmtqsp sslsaslger vsltcrasqe isgylswlqq 61 kpdgtikrli yaastldsgv pkrfsgsrsg sdysltigsl esedladyyc lqydsypytf 121 gggtkleikr tvaapsvfif ppsdeqlksg tasvvcllnn fypreakvqw kvdnalqsgn 181 sqesvteqds kdstyslsst ltlskadyek hkvyacevth qglsspvtks fnrgec Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Cadeia Pesada sh24C05 Hv3-7 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 185) 1 atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct 61 aggtgcgagg ttcagctggt ggaatctggc ggtgggcttg tacaaccagg aggctccctc 121 agactgagtt gtgccgcttc agggttcaca ttctccgact atgcgatgtc atgggtgcgc 181 caagcacccg ggaaaggact ggagtgggtt gccactatca gcgatggcgg aacgtatacc 241 tattaccctg acaatgtgaa gggtcggttc accatttcca gggataacgc aaagaacagt 301 ctctacctgc agatgaacag cctgagggct gaggacaccg ccgtctacta ctgcgcccga 361 gaatggggag attatgatgg gtttgactat tggggccagg gcactttggt gacagtcagt 421 tctgcctcaa caaaaggacc aagtgtgttc ccactcgccc ctagcagcaa gagtacatcc 481 gggggcactg cagcactcgg ctgcctcgtc aaggattatt ttccagagcc agtaaccgtg 541 agctggaaca gtggagcact cacttctggt gtccatactt ttcctgctgt cctgcaaagc 601 tctggcctgt actcactcag ctccgtcgtg accgtgccat cttcatctct gggcactcag 661 acctacatct gtaatgtaaa ccacaagcct agcaatacta aggtcgataa gcgggtggaa 721 cccaagagct gcgacaagac tcacacttgt cccccatgcc ctgcccctga acttctgggc 781 ggtcccagcg tctttttgtt cccaccaaag cctaaagata ctctgatgat aagtagaaca 841 cccgaggtga catgtgttgt tgtagacgtt tcccacgagg acccagaggt taagttcaac 901 tggtacgttg atggagtcga agtacataat gctaagacca agcctagaga ggagcagtat 961 aatagtacat accgtgtagt cagtgttctc acagtgctgc accaagactg gctcaacggc 1021 aaagaataca aatgcaaagt gtccaacaaa gcactcccag cccctatcga gaagactatt 1081 agtaaggcaa aggggcagcc tcgtgaacca caggtgtaca ctctgccacc cagtagagag 1141 gaaatgacaa agaaccaagt ctcattgacc tgcctggtga aaggcttcta ccccagcgac 1201 atcgccgttg agtgggagag taacggtcag cctgagaaca attacaagac aaccccccca 1261 gtgctggata gtgacgggtc tttctttctg tacagtaagc tgactgtgga caagtcccgc 1321 tggcagcagg gtaacgtctt cagctgttcc gtgatgcacg aggcattgca caaccactac 1381 acccagaagt cactgagcct gagcccaggg aag Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-7 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 186) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcevqlvesg gglvqpggsl rlscaasgft fsdyamswvr 61 qapgkglewv atisdggtyt yypdnvkgrf tisrdnakns lylqmnslra edtavyycar 121 ewgdydgfdy wgqgtlvtvs sastkgpsvf plapssksts ggtaalgclv kdyfpepvtv 181 swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv tvpssslgtq tyicnvnhkp sntkvdkrve 241 pkscdkthtc ppcpapellg gpsvflfppk pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn 301 wyvdgvevhn aktkpreeqy nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk alpapiekti 361 skakgqprep qvytlppsre emtknqvslt clvkgfypsd iavewesngq pennykttpp 421 vldsdgsffl yskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg k Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-11 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 187) 1 atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct 61 aggtgccaag ttcagctggt ggaatctggc ggtgggcttg taaagccagg aggctccctc 121 agactgagtt gtgccgcttc agggttcaca ttctccgact atgcgatgtc atggatcagg 181 caagcacccg ggaaaggact ggagtgggtt agcactatca gcgatggcgg aacgtatacc 241 tattaccctg acaatgtgaa gggtcggttc accatttcca gggataacgc aaagaacagt 301 ctctaccttc agatgaacag cctgagggct gaggacaccg ccgtctacta ctgcgcccga 361 gaatggggag attatgatgg gtttgactat tggggccagg gcactttggt gacagtcagt 421 tctgcctcaa caaaaggacc aagtgtgttc ccactcgccc ctagcagcaa gagtacatcc 481 gggggcactg cagcactcgg ctgcctcgtc aaggattatt ttccagagcc agtaaccgtg 541 agctggaaca gtggagcact cacttctggt gtccatactt ttcctgctgt cctgcaaagc 601 tctggcctgt actcactcag ctccgtcgtg accgtgccat cttcatctct gggcactcag 661 acctacatct gtaatgtaaa ccacaagcct agcaatacta aggtcgataa gcgggtggaa 721 cccaagagct gcgacaagac tcacacttgt cccccatgcc ctgcccctga acttctgggc 781 ggtcccagcg tctttttgtt cccaccaaag cctaaagata ctctgatgat aagtagaaca 841 cccgaggtga catgtgttgt tgtagacgtt tcccacgagg acccagaggt taagttcaac 901 tggtacgttg atggagtcga agtacataat gctaagacca agcctagaga ggagcagtat 961 aatagtacat accgtgtagt cagtgttctc acagtgctgc accaagactg gctcaacggc 1021 aaagaataca aatgcaaagt gtccaacaaa gcactcccag 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keykckvsnk alpapiekti 361 skakgqprep qvytlppsre emtknqvslt clvkgfypsd iavewesngq pennykttpp 421 vldsdgsffl yskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg k Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Cadeia Pesada de IgG1 Sh24C05 Hv3-11 N62S Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 189) 1 atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct 61 aggtgccaag ttcagctggt ggaatctggc ggtgggcttg taaagccagg aggctccctc 121 agactgagtt gtgccgcttc agggttcaca ttctccgact atgcgatgtc atggatcagg 181 caagcacccg ggaaaggact ggagtgggtt agcactatca gcgatggcgg aacgtatacc 241 tattaccctg actccgtgaa gggtcggttc accatttcca gggataacgc aaagaacagt 301 ctctaccttc agatgaacag cctgagggct gaggacaccg ccgtctacta ctgcgcccga 361 gaatggggag attatgatgg gtttgactat tggggccagg gcactttggt gacagtcagt 421 tctgcctcaa caaaaggacc aagtgtgttc ccactcgccc ctagcagcaa gagtacatcc 481 gggggcactg cagcactcgg ctgcctcgtc aaggattatt ttccagagcc agtaaccgtg 541 agctggaaca 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gagcccaggg aag Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Pesada de IgG1 Sh24C05 Hv3-11 N62S Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 190) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcqvqlvesg gglvkpggsl rlscaasgft fsdyamswir 61 qapgkglewv stisdggtyt yypdsvkgrf tisrdnakns lylqmnslra edtavyycar 121 ewgdydgfdy wgqgtlvtvs sastkgpsvf plapssksts ggtaalgclv kdyfpepvtv 181 swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv tvpssslgtq tyicnvnhkp sntkvdkrve 241 pkscdkthtc ppcpapellg gpsvflfppk pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn 301 wyvdgvevhn aktkpreeqy nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk alpapiekti 361 skakgqprep qvytlppsre emtknqvslt clvkgfypsd iavewesngq pennykttpp 421 vldsdgsffl yskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg k Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Cadeia Pesada de IgG2 Sh24C05 Hv3-11 N62S Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG2 Humana) (SEQ ID NO: 191) 1 atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct 61 aggtgccaag ttcagctggt ggaatctggc ggtgggcttg taaagccagg aggctccctc 121 agactgagtt gtgccgcttc agggttcaca ttctccgact atgcgatgtc atggatcagg 181 caagcacccg ggaaaggact ggagtgggtt agcactatca gcgatggcgg aacgtatacc 241 tattaccctg actccgtgaa gggtcggttc accatttcca gggataacgc aaagaacagt 301 ctctaccttc agatgaacag cctgagggct gaggacaccg ccgtctacta ctgcgcccga 361 gaatggggag attatgatgg gtttgactat tggggccagg gcactttggt gacagtcagt 421 tctgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 481 gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 541 tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctacagtcc 601 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag 661 acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gacagttgag 721 cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg 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tggggccagg gcactttggt gacagtcagt 421 tctgcctcaa caaaaggacc aagtgtgttc ccactcgccc ctagcagcaa gagtacatcc 481 gggggcactg cagcactcgg ctgcctcgtc aaggattatt ttccagagcc agtaaccgtg 541 agctggaaca gtggagcact cacttctggt gtccatactt ttcctgctgt cctgcaaagc 601 tctggcctgt actcactcag ctccgtcgtg accgtgccat cttcatctct gggcactcag 661 acctacatct gtaatgtaaa ccacaagcct agcaatacta aggtcgataa gcgggtggaa 721 cccaagagct gcgacaagac tcacacttgt cccccatgcc ctgcccctga acttctgggc 781 ggtcccagcg tctttttgtt cccaccaaag cctaaagata ctctgatgat aagtagaaca 841 cccgaggtga catgtgttgt tgtagacgtt tcccacgagg acccagaggt taagttcaac 901 tggtacgttg atggagtcga agtacataat gctaagacca agcctagaga ggagcagtat 961 aatagtacat accgtgtagt cagtgttctc acagtgctgc accaagactg gctcaacggc 1021 aaagaataca aatgcaaagt gtccaacaaa gcactcccag cccctatcga gaagactatt 1081 agtaaggcaa aggggcagcc tcgtgaacca caggtgtaca ctctgccacc cagtagagag 1141 gaaatgacaa agaaccaagt ctcattgacc tgcctggtga aaggcttcta ccccagcgac 1201 atcgccgttg agtgggagag taacggtcag cctgagaaca attacaagac aaccccccca 1261 gtgctggata gtgacgggtc tttctttctg tacagtaagc tgactgtgga caagtcccgc 1321 tggcagcagg gtaacgtctt cagctgttcc gtgatgcacg aggcattgca caaccactac 1381 acccagaagt cactgagcct gagcccaggg aag Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Pesada 24C05 Hv3-21 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 194) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcevqlvesg gglvkpggsl rlscaasgft fsdyamswvr 61 qapgkglewv stisdggtyt yypdnvkgrf tisrdnakns lylqmnslra edtavyycar 121 ewgdydgfdy wgqgtlvtvs sastkgpsvf plapssksts ggtaalgclv kdyfpepvtv 181 swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv tvpssslgtq tyicnvnhkp sntkvdkrve 241 pkscdkthtc ppcpapellg gpsvflfppk pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn 301 wyvdgvevhn aktkpreeqy nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk alpapiekti 361 skakgqprep qvytlppsre emtknqvslt clvkgfypsd iavewesngq pennykttpp 421 vldsdgsffl yskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg k Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-23 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 195) 1 atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct 61 aggtgcgagg ttcagcttct ggaatctggc ggtgggcttg tacagccagg aggctccctc 121 agactgagtt gtgccgcttc agggttcaca ttctccgact atgcgatgtc atgggtgcgc 181 caagcacccg ggaaaggact ggagtgggtt tcaactatca gcgatggcgg aacgtatacc 241 tattaccctg acaatgtgaa gggtcggttc accatttcca gggataacag caagaacaca 301 ctctatctcc agatgaacag cctgagggct gaggacaccg ccgtctacta ctgcgcccga 361 gaatggggag attatgatgg gtttgactat tggggccagg gcactttggt gacagtcagt 421 tctgcctcaa caaaaggacc aagtgtgttc ccactcgccc ctagcagcaa gagtacatcc 481 gggggcactg cagcactcgg ctgcctcgtc aaggattatt ttccagagcc agtaaccgtg 541 agctggaaca gtggagcact cacttctggt gtccatactt ttcctgctgt cctgcaaagc 601 tctggcctgt actcactcag ctccgtcgtg accgtgccat cttcatctct gggcactcag 661 acctacatct gtaatgtaaa ccacaagcct agcaatacta aggtcgataa gcgggtggaa 721 cccaagagct gcgacaagac tcacacttgt cccccatgcc ctgcccctga acttctgggc 781 ggtcccagcg tctttttgtt cccaccaaag cctaaagata ctctgatgat aagtagaaca 841 cccgaggtga catgtgttgt tgtagacgtt tcccacgagg acccagaggt taagttcaac 901 tggtacgttg atggagtcga agtacataat gctaagacca agcctagaga ggagcagtat 961 aatagtacat accgtgtagt cagtgttctc acagtgctgc accaagactg gctcaacggc 1021 aaagaataca aatgcaaagt gtccaacaaa gcactcccag cccctatcga gaagactatt 1081 agtaaggcaa aggggcagcc tcgtgaacca caggtgtaca ctctgccacc cagtagagag 1141 gaaatgacaa agaaccaagt ctcattgacc tgcctggtga aaggcttcta ccccagcgac 1201 atcgccgttg agtgggagag taacggtcag cctgagaaca attacaagac aaccccccca 1261 gtgctggata gtgacgggtc tttctttctg tacagtaagc tgactgtgga caagtcccgc 1321 tggcagcagg gtaacgtctt cagctgttcc gtgatgcacg aggcattgca caaccactac 1381 acccagaagt cactgagcct gagcccaggg aag Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-23 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 196) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcevqllesg gglvqpggsl rlscaasgft fsdyamswvr 61 qapgkglewv stisdggtyt yypdnvkgrf tisrdnsknt lylqmnslra edtavyycar 121 ewgdydgfdy wgqgtlvtvs sastkgpsvf plapssksts ggtaalgclv kdyfpepvtv 181 swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv tvpssslgtq tyicnvnhkp sntkvdkrve 241 pkscdkthtc ppcpapellg gpsvflfppk pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn 301 wyvdgvevhn aktkpreeqy nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk alpapiekti 361 skakgqprep qvytlppsre emtknqvslt clvkgfypsd iavewesngq pennykttpp 421 vldsdgsffl yskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg k Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-30 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 197) 1 atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct 61 aggtgccagg ttcagctggt ggaatctggc ggtggggtag tacaaccagg acggtccctc 121 agactgagtt gtgccgcttc agggttcaca ttctccgact atgcgatgtc atgggtgcgc 181 caagcacccg ggaaaggact ggagtgggtt gccactatca gcgatggcgg aacgtatacc 241 tattaccctg acaatgtgaa gggtcggttc accatttcca gggataactc aaagaacacc 301 ctctatctcc aaatgagtag cctgagggct gaggacaccg ccgtctacta ctgcgcccga 361 gaatggggag attatgatgg gtttgactat tggggccagg gcactttggt gacagtcagt 421 tctgcctcaa caaaaggacc aagtgtgttc ccactcgccc ctagcagcaa gagtacatcc 481 gggggcactg cagcactcgg ctgcctcgtc aaggattatt ttccagagcc agtaaccgtg 541 agctggaaca gtggagcact cacttctggt gtccatactt ttcctgctgt cctgcaaagc 601 tctggcctgt actcactcag ctccgtcgtg accgtgccat cttcatctct gggcactcag 661 acctacatct gtaatgtaaa ccacaagcct agcaatacta aggtcgataa gcgggtggaa 721 cccaagagct gcgacaagac tcacacttgt cccccatgcc ctgcccctga acttctgggc 781 ggtcccagcg tctttttgtt cccaccaaag cctaaagata ctctgatgat aagtagaaca 841 cccgaggtga catgtgttgt tgtagacgtt tcccacgagg acccagaggt taagttcaac 901 tggtacgttg atggagtcga agtacataat gctaagacca agcctagaga ggagcagtat 961 aatagtacat accgtgtagt cagtgttctc acagtgctgc accaagactg gctcaacggc 1021 aaagaataca aatgcaaagt gtccaacaaa gcactcccag cccctatcga gaagactatt 1081 agtaaggcaa aggggcagcc tcgtgaacca caggtgtaca ctctgccacc cagtagagag 1141 gaaatgacaa agaaccaagt ctcattgacc tgcctggtga aaggcttcta ccccagcgac 1201 atcgccgttg agtgggagag taacggtcag cctgagaaca attacaagac aaccccccca 1261 gtgctggata gtgacgggtc tttctttctg tacagtaagc tgactgtgga caagtcccgc 1321 tggcagcagg gtaacgtctt cagctgttcc gtgatgcacg aggcattgca caaccactac 1381 acccagaagt cactgagcct gagcccaggg aag Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-30 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 198) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcqvqlvesg ggvvqpgrsl rlscaasgft fsdyamswvr 61 qapgkglewv atisdggtyt yypdnvkgrf tisrdnsknt lylqmsslra edtavyycar 121 ewgdydgfdy wgqgtlvtvs sastkgpsvf plapssksts ggtaalgclv kdyfpepvtv 181 swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv tvpssslgtq tyicnvnhkp sntkvdkrve 241 pkscdkthtc ppcpapellg gpsvflfppk pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn 301 wyvdgvevhn aktkpreeqy nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk alpapiekti 361 skakgqprep qvytlppsre emtknqvslt clvkgfypsd iavewesngq pennykttpp 421 vldsdgsffl yskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg k Sequência de ÁcidoNuclei co Codificando para a Cadeia Pesada Hu24C05 HvA Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 199) 1 atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct 61 aggtgcgagg ttcagctggt ggaatctggc ggtgggcttg taaagccagg aggctccctc 121 agactgagtt gtgccgcttc agggttcaca ttctccgact atgcgatgtc atgggtgcgc 181 caagcacccg ggaaaggact ggagtgggtt gccactatca gcgatggcgg aacgtatacc 241 tattaccctg acaatgtgaa gggtcggttc accatttcca gggataacgc aaagaacagt 301 ctctaccttc agatgaacag cctgagggct gaggacaccg ccgtctacta ctgcgcccga 361 gaatggggag attatgatgg gtttgactat tggggccagg gcactttggt gacagtcagt 421 tctgcctcaa caaaaggacc aagtgtgttc ccactcgccc ctagcagcaa gagtacatcc 481 gggggcactg cagcactcgg ctgcctcgtc aaggattatt ttccagagcc agtaaccgtg 541 agctggaaca gtggagcact cacttctggt gtccatactt ttcctgctgt cctgcaaagc 601 tctggcctgt actcactcag ctccgtcgtg accgtgccat cttcatctct gggcactcag 661 acctacatct gtaatgtaaa ccacaagcct agcaatacta aggtcgataa gcgggtggaa 721 cccaagagct gcgacaagac tcacacttgt cccccatgcc ctgcccctga acttctgggc 781 ggtcccagcg tctttttgtt cccaccaaag cctaaagata ctctgatgat aagtagaaca 841 cccgaggtga catgtgttgt tgtagacgtt tcccacgagg acccagaggt taagttcaac 901 tggtacgttg atggagtcga agtacataat gctaagacca agcctagaga ggagcagtat 961 aatagtacat accgtgtagt cagtgttctc acagtgctgc accaagactg gctcaacggc 1021 aaagaataca aatgcaaagt gtccaacaaa gcactcccag cccctatcga gaagactatt 1081 agtaaggcaa aggggcagcc tcgtgaacca caggtgtaca ctctgccacc cagtagagag 1141 gaaatgacaa agaaccaagt ctcattgacc tgcctggtga aaggcttcta ccccagcgac 1201 atcgccgttg agtgggagag taacggtcag cctgagaaca attacaagac aaccccccca 1261 gtgctggata gtgacgggtc tttctttctg tacagtaagc tgactgtgga caagtcccgc 1321 tggcagcagg gtaacgtctt cagctgttcc gtgatgcacg aggcattgca caaccactac 1381 acccagaagt cactgagcct gagcccaggg aag Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Pesada Hu24C05 HvA Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 200) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcevqlvesg gglvkpggsl rlscaasgft fsdyamswvr 61 qapgkglewv atisdggtyt yypdnvkgrf tisrdnakns lylqmnslra edtavyycar 121 ewgdydgfdy wgqgtlvtvs sastkgpsvf plapssksts ggtaalgclv kdyfpepvtv 181 swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv tvpssslgtq tyicnvnhkp sntkvdkrve 241 pkscdkthtc ppcpapellg gpsvflfppk pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn 301 wyvdgvevhn aktkpreeqy nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk alpapiekti 361 skakgqprep qvytlppsre emtknqvslt clvkgfypsd iavewesngq pennykttpp 421 vldsdgsffl yskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg k Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-9 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 201) 1 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct 61 cgttgcgata ttcagttgac ccaatcacct agcttcctct cagcttccgt gggcgacaga 121 gttaccataa cctgtcgggc aagccaggag atttctgggt acctgtcctg gtaccaacag 181 aagcccggaa aagcccctaa gctgttgatc tatgctgcgt caaccttgga tagcggtgtc 241 ccgagtcgat tctccggttc tggctccgga acagagttca ctctgacaat ttctagcctt 301 cagccagaag atttcgccac gtactattgc ctccagtacg acagctatcc ctatacattt 361 gggcagggca ctaaactgga gatcaaacgc acagttgctg cccccagcgt gttcattttc 421 ccacctagcg atgagcagct gaaaagcggt actgcctctg tcgtatgctt gctcaacaac 481 ttttacccac gtgaggctaa ggtgcagtgg aaagtggata atgcacttca atctggaaac 541 agtcaagagt ccgtgacaga acaggacagc aaagactcaa cttattcact ctcttccacc 601 ctgactctgt ccaaggcaga ctatgaaaaa cacaaggtat acgcctgcga ggttacacac 661 cagggtttgt ctagtcctgt caccaagtcc ttcaataggg gcgaatgt Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-9 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 202) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcdiqltqsp sflsasvgdr vtitcrasqe isgylswyqq 61 kpgkapklli yaastldsgv psrfsgsgsg teftltissl qpedfatyyc lqydsypytf 121 gqgtkleikr tvaapsvfif ppsdeqlksg tasvvcllnn fypreakvqw kvdnalqsgn 181 sqesvteqds kdstyslsst ltlskadyek hkvyacevth qglsspvtks fnrgec Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-16 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 203) 1 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct 61 cgttgcgata ttcagatgac ccaatcacct agcagtctct cagcttccgt gggcgacaga 121 gttaccataa cctgtcgggc aagccaggag atttctgggt acctgtcctg gtttcaacag 181 aagcccggaa aggccccgaa gagcttgatc tatgctgcgt caaccttgga tagcggtgtc 241 ccgagtcgat tctccggttc tggctccgga accgacttta ctctgacaat ttctagcctt 301 cagccagaag atttcgccac gtactattgc ctccagtacg acagctatcc ctatacattt 361 gggcagggca ctaaactgga gatcaaacgc acagttgctg cccccagcgt gttcattttc 421 ccacctagcg atgagcagct gaaaagcggt actgcctctg tcgtatgctt gctcaacaac 481 ttttacccac gtgaggctaa ggtgcagtgg aaagtggata atgcacttca atctggaaac 541 agtcaagagt ccgtgacaga acaggacagc aaagactcaa cttattcact ctcttccacc 601 ctgactctgt ccaaggcaga ctatgaaaaa cacaaggtat acgcctgcga ggttacacac 661 cagggtttgt ctagtcctgt caccaagtcc ttcaataggg gcgaatgt Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-16 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 204) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcdiqmtqsp sslsasvgdr vtitcrasqe isgylswfqq 61 kpgkapksli yaastldsgv psrfsgsgsg tdftltissl qpedfatyyc lqydsypytf 121 gqgtkleikr tvaapsvfif ppsdeqlksg tasvvcllnn fypreakvqw kvdnalqsgn 181 sqesvteqds kdstyslsst ltlskadyek hkvyacevth qglsspvtks fnrgec Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-17 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 205) 1 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct 61 cgttgcgata ttcagatgac ccaatcacct agcagtctct cagcttccgt gggcgacaga 121 gttaccataa cctgtcgggc aagccaggag atttctgggt acctgtcctg gtatcaacag 181 aagcccggaa aagccccaaa gaggttgatc tatgctgcgt caaccttgga tagcggtgtc 241 ccgagtcgat tctccggttc tggctccgga accgagttca ctctgacaat ttctagcctt 301 cagccagaag atttcgccac gtactattgc ctccagtacg acagctatcc ctatacattt 361 gggcagggca ctaaactgga gatcaaacgc acagttgctg cccccagcgt gttcattttc 421 ccacctagcg atgagcagct gaaaagcggt actgcctctg tcgtatgctt gctcaacaac 481 ttttacccac gtgaggctaa ggtgcagtgg aaagtggata atgcacttca atctggaaac 541 agtcaagagt ccgtgacaga acaggacagc aaagactcaa cttattcact ctcttccacc 601 ctgactctgt ccaaggcaga ctatgaaaaa cacaaggtat acgcctgcga ggttacacac 661 cagggtttgt ctagtcctgt caccaagtcc ttcaataggg gcgaatgt Sequência de Proteína Definindo a Cadeia LeveSh24C05 Kv1-17 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 206) Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 206) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcdiqmtqsp sslsasvgdr vtitcrasqe isgylswyqq 61 kpgkapkrli yaastldsgv psrfsgsgsg teftltissl qpedfatyyc lqydsypytf 121 gqgtkleikr tvaapsvfif ppsdeqlksg tasvvcllnn fypreakvqw kvdnalqsgn 181 sqesvteqds kdstyslsst ltlskadyek hkvyacevth qglsspvtks fnrgec Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Cadeia Leve sh24C05 Kv1-33 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 207) 1 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct 61 cgttgcgata ttcagatgac ccaatcacct agcagtctct cagcttccgt gggcgacaga 121 gttaccataa cctgtcgggc aagccaggag atttctgggt acctgtcctg gtaccaacag 181 aagcccggaa aggcccccaa gctgttgatc tatgctgcgt caaccttgga tagcggtgtc 241 ccgagtcgat tctccggttc tggctccgga acagacttta cttttacaat ttctagcctt 301 cagccagagg acatcgccac gtactattgc ctccagtacg acagctatcc ctatacattt 361 gggcagggca ctaaactgga gatcaaacgc acagttgctg cccccagcgt gttcattttc 421 ccacctagcg atgagcagct gaaaagcggt actgcctctg tcgtatgctt gctcaacaac 481 ttttacccac gtgaggctaa ggtgcagtgg aaagtggata atgcacttca atctggaaac 541 agtcaagagt ccgtgacaga acaggacagc aaagactcaa cttattcact ctcttccacc 601 ctgactctgt ccaaggcaga ctatgaaaaa cacaaggtat acgcctgcga ggttacacac 661 cagggtttgt ctagtcctgt caccaagtcc ttcaataggg gcgaatgt Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-33 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 208) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcdiqmtqsp sslsasvgdr vtitcrasqe isgylswyqq 61 kpgkapklli yaastldsgv psrfsgsgsg tdftftissl qpediatyyc lqydsypytf 121 gqgtkleikr tvaapsvfif ppsdeqlksg tasvvcllnn fypreakvqw kvdnalqsgn 181 sqesvteqds kdstyslsst ltlskadyek hkvyacevth qglsspvtks fnrgec Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-39 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 209) 1 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct 61 cgttgcgata ttcagatgac ccaatcacct agcagtctct cagcttccgt gggcgacaga 121 gttaccataa cctgtcgggc aagccaggag atttctgggt acctgtcctg gtatcaacag 181 aagcccggaa aagcccctaa gctgttgatc tatgctgcgt caaccttgga tagcggtgtc 241 ccgagtcgat tctccggttc tggctccgga actgacttca ctctgacaat ttctagcctt 301 cagccagaag atttcgccac gtactattgc ctccagtacg acagctatcc ctatacattt 361 gggcagggca ctaaactgga gatcaaacgc acagttgctg cccccagcgt gttcattttc 421 ccacctagcg atgagcagct gaaaagcggt actgcctctg tcgtatgctt gctcaacaac 481 ttttacccac gtgaggctaa ggtgcagtgg aaagtggata atgcacttca atctggaaac 541 agtcaagagt ccgtgacaga acaggacagc aaagactcaa cttattcact ctcttccacc 601 ctgactctgt ccaaggcaga ctatgaaaaa cacaaggtat acgcctgcga ggttacacac 661 cagggtttgt ctagtcctgt caccaagtcc ttcaataggg gcgaatgt Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-39 Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 210) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcdiqmtqsp sslsasvgdr vtitcrasqe isgylswyqq 61 kpgkapklli yaastldsgv psrfsgsgsg tdftltissl qpedfatyyc lqydsypytf 121 gqgtkleikr tvaapsvfif ppsdeqlksg tasvvcllnn fypreakvqw kvdnalqsgn 181 sqesvteqds kdstyslsst ltlskadyek hkvyacevth qglsspvtks fnrgec Sequência de Ácido Nucleico Codificando para a Cadeia Leve Hu24C05 KvA Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 211) 1 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct 61 cgttgcgata ttcagatgac ccaatcacct agcagtctct cagcttccgt gggcgacaga 121 gttaccataa cctgtcgggc aagccaggag atttctgggt acctgtcctg gctgcaacag 181 aagcccggag gcgccatcaa gaggttgatc tatgctgcgt caaccttgga tagcggtgtc 241 ccgagtcgat tctccggttc tggctccgga agtgactaca ctctgacaat ttctagcctt 301 cagccagaag atttcgccac gtactattgc ctccagtacg acagctatcc ctatacattt 361 gggcagggca ctaaactgga gatcaaacgc acagttgctg cccccagcgt gttcattttc 421 ccacctagcg atgagcagct gaaaagcggt actgcctctg tcgtatgctt gctcaacaac 481 ttttacccac gtgaggctaa ggtgcagtgg aaagtggata atgcacttca atctggaaac 541 agtcaagagt ccgtgacaga acaggacagc aaagactcaa cttattcact ctcttccacc 601 ctgactctgt ccaaggcaga ctatgaaaaa cacaaggtat acgcctgcga ggttacacac 661 cagggtttgt ctagtcctgt caccaagtcc ttcaataggg gcgaatgt Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Leve Hu24C05 KvA Humanizada Completa (Região Variável da Cadeia Capa Humanizada e Região Constante Humana) (SEQ ID NO: 212) 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcdiqmtqsp sslsasvgdr vtitcrasqe isgylswlqq 61 kpggaikrli yaastldsgv psrfsgsgsg sdytltissl qpedfatyyc lqydsypytf 121 gqgtkleikr tvaapsvfif ppsdeqlksg tasvvcllnn fypreakvqw kvdnalqsgn 181 sqesvteqds kdstyslsst ltlskadyek hkvyacevth qglsspvtks fnrgec
[000185] Para conveniência, a Tabela 13 fornece um gráfico de concordância apresentando a SEQ ID NO de cada sequência discutida nesse Exemplo. Tabela 13
Figure img0024
Figure img0025
[000186] A Tabela 14 abaixo mostra os anticorpos contendo cadeias pesada e leve de imunoglobulinas quiméricas e cada uma das combinações possíveis das cadeias pesada e leve das imunoglobulinas humanizadas completas. Tabela 14
Figure img0026
Figure img0027
Figure img0028
[000187] O construto do anticorpo contendo as cadeias pesada e leve quiméricas completas é designado abaixo:
[000188] 24C05 Quimérica = Cadeia Pesada 24C05 Quimérica Completa (região Variável de Rato e Região Constante da IgG1 Humana) (SEQ ID NO: 182) mais Cadeia Leve 24C05 Quimérica Completa (região Variável de Rato e Região Constante Capa Humana) (SEQ ID NO: 184)
[000189] Quatro dos construtos possíveis de anticorpo contendo as cadeias pesada e leve de imunoglobulina completa, contendo regiões variáveis humanizadas são designados abaixo:
[000190] Sh24C05-25 N62S IgG1 = Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-11 N62S Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana (SEQ ID NO: 190) mais a Região Variável de Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-16 e a Região Constante Capa Humana) (SEQ ID NO: 204)
[000191] Sh24C05-25 N62S IgG2 = Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-11 N62S Humanizada e Região Constante da IgG2 Humana (SEQ ID NO: 192) mais a Região Variável de Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-16 e a Região Constante Capa Humana) (SEQ ID NO: 204)
[000192] Sh24C05-31 N62S IgG1 = Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-11 N62S Humanizada e Região Constante da IgG1 Humana (SEQ ID NO: 190) mais a Região Variável de Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-17 e a Região Constante Capa Humana) (SEQ ID NO: 206)
[000193] Sh24C05-31 N62S IgG2 = Região Variável da Cadeia Pesada Sh24C05 Hv3-11 N62S Humanizada e Região Constante da IgG2 Humana (SEQ ID NO: 192) mais a Região Variável de Cadeia Leve Sh24C05 Kv1-17 e a Região Constante Capa Humana) (SEQ ID NO: 206)
B. Afinidades de Ligação dos Anticorpos Monoclonais AntiErb B3 Humanizados e Quiméricos
[000194] As afinidades de ligação e a cinética de interação dos anticorpos monoclonais produzidos no Exemplo 12 contra a proteína monomérica ErbB3 humana recombinante (rhErbB3 clivada) foram medidas por ressonância do plásmon de superfície usando um equipamento Biacore® T100 (Biacore). A ErbB3 monomérica foi obtida por clivagem com proteases de rhErbB3-Fc (R&D Systems, Cat. N° 348-RB).
[000195] Um Fc de IgG anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch, Número de Catálogo 109-005-098) foi imobilizado sobre chips sensores de dextrano carboximetilado CM4 (Biacore, NO de Catálogo BR-1005-34) por acoplamento com amina (Biacore, NO de Catálogo BR-1000-50) utilizando um protocolo de acoplamento standardizado de acordo com as instruções do comerciante. As análises foram realizadas a 37 °C utilizando PBS (Invitrogen, NO de Catálogo 14040-133) contendo tensioativo P20 0,05 % (Biacore, NO de Catálogo BR-1000-54) como tampão de corrida.
[000196] Os anticorpos foram capturados em células individuais de fluxo com uma taxa de fluxo de 60 μL/minuto. O tempo de injeção foi variado para cada anticorpo de modo a render um Rmax entre 30 e 60 RU. O tampão ou o rhErbB3 clivado diluído em tampão de corrida foi injetado sequencialmente ao longo de uma superfície de referência (sem anticorpos capturados) e a superfície ativa (anticorpo a ser testado) durante 300 segundo a 60 μL/minuto. A fase de dissociação foi monitorada durante mais de 1.200 segundos. A superfície foi depois regenerada com duas injeções de 60 segundos de glicina pH 2,25 (feita de glicina pH 2,0 (Biacore, NO de Catálogo BR-1003-55) e pH 2,5 (Biacore, NO de Catálogo BR-1003-56)) a 60 μL/minuto. Para a triagem inicial, apenas uma ou duas concentrações de rhErbB3 foram testadas, tipicamente 5,0 e 1,25 nM (os resultados encontram-se resumidos na Tabela 15).
[000197] Os parâmetros cinéticos foram determinados utilizando a função cinética do software BIAevaluation (Biacore) com subtração de dupla referência. Os parâmetros cinéticos para cada anticorpo, ka (constante da velocidade de associação), kd (constante da velocidade de dissociação) e KD (constante de dissociação no equilíbrio) foram determinadas. Os anticorpos monoclonais iniciais foram rastreados utilizando o sobrenadante do meio de cultura das células contendo anticorpos secretados e valores cinéticos dos anticorpos monoclonais em rhErbB3 clivados a 37 °C são resumidos na Tabela 15. Tabela 15
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[000198] Os resultados na Tabela 15 demonstram que o anticorpo quimérico e cada um dos anticorpos humanizados 24C05 têm taxas rápidas de associação (ka), taxas de dissociação muito lentas (kd) e afinidades muito elevadas (KD). Em particular, os anticorpos têm afinidades compreendidas entre cerca de 87 pM a cerca de 1 nM.
[000199] As afinidades de ligação e a cinética de determinados anticorpos monoclonais purificados foram também determinados. Para melhor caracterizar determinados anticorpos, os ensaios da ressonância do plásmon de superfície acima descritos foram conduzidos utilizando concentrações de rhErbB3 clivados entre 0,3125 nM e 5,0 nM (uma diluição seriada 2X).
[000200] Os valores cinéticos de certos anticorpos monoclonais purificados (isto é,Sh24C05-1, Sh24C05-25, Sh24C05-25 N62S IgG1, Sh24C05-25 N62S IgG2, Sh24C05-31, Sh24C05-31 N62S IgG1, and Sh24C05-31 N62S IgG2) em rhErbB3 clivados a 37 °C são resumidos na Tabela 16. Tabela 16
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[000201] Os resultados apresentados na Tabela 16 demonstram que os anticorpos purificados têm afinidades variando de cerca de 63 pM a cerca de 160 pM quando testados a 37 °C.
C. Comparação de outros Anticorpos Anti-ErbB3
[000202] Três anticorpos humanos que inibem a função do ErbB3 humano foram construídos e expressos utilizando as informações publicadas. Um anticorpo, referido como Ab #6, foi construído como um anticorpo IgG2/Lambda humano baseado na divulgação de Schoeberl et al., US 2009/0291085 (Merrimack Pharmaceuticals, Inc.). Dois anticorpos adicionais, referidos como U1-53 e U1-59, foram construídos como anticorpos humanos IgG1/Capa baseados na divulgação de Rothe et al., US 2008/0124345 (U3 Pharma AG e Amgen Inc.).
[000203] Os parâmetros cinéticos para os anticorpos Ab#6, U1-53 e U1-59 foram determinados pelo Biacore a 37 °C utilizando rhErbB3 clivados (monômero) tal como acima descrito (ver Secção B. Afinidades de Ligação de Anticorpos Monoclonais Anti-ErbB3 Humanizados e Quiméricos). Ambos os sensogramas Biacore (figura 17) e valores cinéticos (Tabela 17) são apresentados para cada anticorpo. Tabela 17
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[000204] Os resultados na Tabela 17 demonstram que a constante de dissociação global no equilíbrio (KD) para o Sh24C05-31 N62S IgG1 (76 pM) foi menor (isto é, maior afinidade) que a KD para os anticorpos Ab#6 e U1-59 (230 pmM(p<0,01) e 530 pM (p<0,0005), respetivamente). A constante de dissociação no equilíbrio (KD) para U1-53 não pôde ser determinada devido ao ajuste da curva ser insuficiente (ver figura 17, que apresenta uma velocidade Koff mais rápida de U1-53). O KD dos anticorpos Ab #6, U1-53 e U1-59 também pode ser comparado com outras variantes 24C05 humanizadas, comparando as Tabelas 16 e 17.
[000205] Por conseguinte, a afinidade da IgG1 Sh24C05-31 N62S é significativamente maior que a afinidade da Ab#6 e U1-59 como aqui divulgada.
Exemplo 13 - Atividade de Neutralização dos Anticorpos Anti-ErbB3 humanizados
[000206] Nesse exemplo, os anticorpos humanizados produzidos no Exemplo 12 foram testados quanto à sua capacidade para inibir a ligação do rhErbB3 a NRG1-β1 por um ensaio ECL. Placas de ligação standardizada multi-array de 96 poços (Meso Scale Discovery, Cat. N° L15XA-6) foram revestidas com 50 μL de rhErbB3/Fc 0,5 μg/mL (R&D systems, Cat. N° 348-RB) em PBS (Invitrogen, Cat. NO 14040-133) durante uma hora à temperatura ambiente, sem agitação. As placas foram então lavadas três vezes com PBS+0,1% de Tween 20 (Sigma P5927) e bloqueadas com 200 μL de Soro de Cavalo 100%, inativadas por calor (GIBCO, Cat. NO 26050-088) durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Após lavar as placas três vezes com PBS+Tween 0,1%, 25 μL das diluições do anticorpo foram adicionados às placas durante outra hora à temperatura ambiente, com agitação. O ligante NRG1-β1 (R&D Systems, Cat. N° 377-HB, 26kDa) foi adicionado aos poços à concentração final de 0,25 μg/mL. As placas foram lavadas três vezes com PBS+Tween 0,1% e incubadas com 25 μL de anticorpo biotinilado 1 μg/mL contra NRG1-β1 humano (R&D systems, Cat. NO BAF377) pré-incubado durante uma hora com estreptavidina SULTO-TAG (Meso Scale Discovery, Cat. NO R32AD- 5) durante uma hora à temperatura ambiente, com agitação. As placas foram então lavadas três vezes com PBS+Tween 0,1% e 150 μL de tampão de leitura 1X (Meso Scale Discovery, Cat. NO R92TC-1) foram adicionados a cada poço antes das placas serem analisadas em um equipamento Sector® Imager 2400 (Meso Scale Discovery).
[000207] A interação de NRG1-β1 com rhErbB3 foi inibida pelos anticorpos Sh24C05-25 N62S-IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1, e Sh24C05-31 N62S-IgG2 (figura 18A). O anticorpo Ab#6 IgG2 como descrito em Schoeberl et al. (acima) e os anticorpos U1-53 e U1-59 como descrito em Rothe et al. (acima) foram também testados quanto à sua capacidade de inibir a ligação do ErbB3 a NRG1-β1. Tal como mostrado na figura 18B, cada um dos anticorpos Ab#6 IgG2, U1-53, e U1-59 inibiram a ligação do ErbB3 a NRG1-β1.
[000208] Os valores CI50 para neutralização da ligação do NRG1-β1 ao hErbB3 para os anticorpos humanizados 24C05 (isto é,Sh24C05- 25 N62S-IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1, e Sh24C05-31 N62S-IgG2) foram calculados e estão resumidos na Tabela 18. Os valores CI50 para a atividade de neutralização NRG1-β1 dos anticorpos humanos anti-ErbB3 Ab#6 IgG2, U1-53 e U1-59 também são mostrados na Tabela 18. Tabela 18
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[000209] Os resultados apresentados na Tabela 18 demonstram que os anticorpos Sh24C05-25 N62S-IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1, e Sh24C05-31 N62S-IgG2 neutralizaram eficazmente a ligação do NRG1-β1 ao rhErbB3. Enquanto os anticorpos humanos anti-ErbB3 Ab#6 IgG2, U1-53 e U1-59 mostraram também atividade de neutralização, os anticorpos humanizados Sh24C05 (isto é,Sh24C05-25 N62S-IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1, e Sh24C05-31 N62S-IgG2) tiveram uma capacidade superior de neutralização do que U1-59 ou Ab#6 IgG2.
Exemplo 14 - Atividade Antiproliferativa
[000210] Neste exemplo, os anticorpos humanizados produzidos no Exemplo 12, foram testados quanto à sua capacidade para inibir a proliferação dependente de NRG1- β1, das células no sistema de células BaF/3 concebido para expressar ambos Her2 e ErbB3 humanos.
[000211] As células BaF/3 expressando receptores Her2 e ErbB3 são descritos no Exemplo 6 como tendo sido tratados com anticorpos anti-ErbB3 na ausência de mio com restrições WEHI mas na presença de NRG1-β1 (100 ng/mL). Os ensaios foram conduzidos em uma placa de 96-poços (5.000 células/poço) na presença de NRG1-β1 (100 ng/mL) e várias concentrações de anticorpos (0,018-5000 ng/mL, num volume final de 100 μL). Os ensaios MTT (Brometo de 3-(4,5- Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) foram conduzidos 3-4 dias após a estimulação NRG1-β1.
[000212] Os resultados demonstram que a Sh24C05-25 N62S-IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1, e Sh24C05-31 N62S-IgG2 inibiu a proliferação celular induzida por NRG em células Her2/ErbB3-BaF/3 de um modo dependente da dose (figura 19A).
[000213] Os valores CI50 para a inibição da proliferação dependente de NRG1-β1 da linha celular Her2/ErbB3-BaF/3 com anticorpos humanizados 24C05 (isto é, Sh24C05-25 N62S-IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1, Sh24C05-31 N62S-IgG2) foram calculados e estão resumidos na Tabela 19. Tabela 19
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[000214] Os resultados na Tabela 19 demonstram que os anticorpos Sh24C05-25 N62S-IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1, e Sh24C05-31 N62S-IgG2 inibiram fortemente a proliferação induzida por NRG1-β1 das células BaF/3, expressando Her2/ErbB3.
[000215] As atividades inibitórias dos anticorpos IgG2 Ab#6 anti- ErbB3, U1-53 e U1-59 também foram testadas no ensaio de proliferação das células Her2/ErbB3-BaF/3, dependente de NRG1-β1. Tal como mostrado na figura 19B, os resultados demonstram que os anticorpos Ab#6 IgG2, U1-53 e U1-59 inibiram a proliferação celular induzida por NRG em células Her2/ErbB3-BaF/3 de uma forma dependente da dose. Os dados de inibição da proliferação da linha celular Her2/ErbB3-BaF/3 dependente de NRG1-β1 com os anticorpos monoclonais Ab#6 IgG2, U1-53 e U1-59, estão resumidos na Tabela 19. Os resultados na Tabela 19 demonstram que os anticorpos Ab#6 IgG2, U1-53 e U1-59 inibiram a proliferação induzida por NRG1-β1 das células Her2/ErbB3-BaF/3. Uma comparação da atividade inibitória dos anticorpos testados anti-ErbB3 no ensaio de proliferação, dependente de NRG1-β1, das células Her2/ErbB3-BaF/3 indica que a atividade inibitória dos anticorpos Sh24C05 humanizados é superior à atividade inibitória dos anticorpos Ab#6 IgG2, U1-53 e U1-59 anticorpos (por exemplo, o CI50 foi 0,1245 nM para Sh24C05-31 N62S- IgG1 comparado com 0,8128 nM para U1-53).
Exemplo 15 - Inibição da sinalização a jusante em Células SKBR-3
[000216] Este exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos humanizados produzidos no Exemplo 12 no que se refere à sua capacidade para degradar o ErbB3 total e inibir a fosforilação do ErbB3 na fase exponencial de crescimento de células SKBR-3.
[000217] As células SKBR-3 de câncer de mama foram mantidas como recomendado pela ATCC. As células mantidas na íntegra com soro foram tratadas durante 1, 2, 4 ou 6 horas com 40 μg/mL de anticorpo anti-ErbB3 (isto é, Sh24C05-25 N62S-IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1, e Sh24C05-31 N62S-IgG2). Os lisados foram analisados por ELISA com o Total-ErbB3 e o conjunto Phospho-ErbB3 da R&D Systems (Cat. NO DYC234 e Cat. NO DYC1769, respetivamente).
[000218] Os resultados demonstram que os anticorpos anti-ErbB3 Sh24C05-25 N62S-IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1 e Sh24C05-31 N62S-IgG2 inibem pelo menos a 50% da fosforilação do ErbB3 na fase exponencial do crescimento das células SKBR-3 (figura 20).
[000219] Os resultados também demonstram que os anticorpos anti- ErbB3 Sh24C05-25 N62S-IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1 e Sh24C05-31 N62S-IgG2 degradaram pelo menos 50% do receptor ErbB3 total na fase exponencial do crescimento das células SKBR-3 (figura 21).
Exemplo 16 - Inibição do Crescimento do Xenoenxerto do Tumor BxPC3
[000220] A capacidade dos anticorpos monoclonais humanizados produzidos no Exemplo 12 para inibir o crescimento do tumor foi testada em um modelo de xenoenxerto BxPC3 pancreático. As células pancreáticas humanas BxPC3 foram cultivadas em meio de cultura a 37 °C em uma atmosfera contendo CO2 a 5%, utilizando-se o meio RMPI contendo 10% de soro fetal bovino. As células BxPC3 foram inoculadas por via subcutânea, no flanco de uma fêmea CB.17 de rato SCID com 8 semanas de idade (Taconic Labs) com 10 x 106células por rato em matrigel 50% (BD Biosciences, Cat n° 356237). As medições do tumor foram realizadas duas vezes por semana utilizando um paquímetro. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: largura x largura x comprimento/2. Quando os tumores atingiram aproximadamente 200 mm3, os ratos foram aleatoriamente distribuídos por 8 grupos de 10 ratos cada. Um grupo recebeu PBS, outro recebeu controle huIgG, e outro recebeu controle muIgG. Cada um dos restantes cinco grupos recebeu um dos anticorpos (i.e ., 24C05 murínico, Sh24C05-25 N62S- IgG1, Sh24C05-25 N62S-IgG2, Sh24C05-31 N62S-IgG1 ou Sh24C05- 31 N62S-IgG2). Todos os anticorpos foram doseados a 2 mg/kg do peso corporal, duas vezes por semana, por injeção intraperitoneal durante 7 semanas. Os volumes do tumor e os pesos corporais do rato foram registados duas vezes por semana. A inibição do crescimento do tumor foi analisada utilizando-se ANOVA e é expressa como percentagem de inibição comparada com o controle PBS.
[000221] Os anticorpos humanizados testados permaneceram ativos in vivo. Todos os quatro anticorpos anti-ErbB3 humanizados tinham eficácia semelhante no modelo BxPC3 quando doseados em 2 mg/kg, variando de 75-80% de inibição do crescimento tumoral (p<0,001) (isto é,Sh24C05-25 N62S-IgG1, 75%; Sh24C05-25 N62S-IgG2, 76%; Sh24C05-31 N62S-IgG1, 79%; e Sh24C05-31 N62S-IgG2, 80%) ao dia 28 do estudo (figura 22). O anticorpo murínico demonstrou 65% de inibição do crescimento do tumor no presente estudo (p<0,05). Esses resultados sugerem potência e atividade semelhantes dos quatro anticorpos humanizados nesse modelo.
[000222] As capacidades dos anticorpos monoclonais humanizados U1-53, U1-59 e Ab#6 IgG2 para inibir o crescimento do tumor também foram testadas em um modelo de xenoenxerto BxPC3. Usando o protocolo descrito acima, os tumores BxPC3 foram gerados em ratos CB.17 SCID. Quando os tumores atingiram aproximadamente 200 mm3, os ratos foram aleatoriamente distribuídos por 11 grupos de 10 ratos cada. Um grupo recebeu PBS e outro recebeu controle huIgG. Cada um dos outros nove grupos recebeu um dos anticorpos humanizados (isto é,Sh24C05-31 N62S-IgG1, U1-53, U1-59, ou Ab#6 IgG2). Todos os anticorpos foram doseados a 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, ou 5 mg/kg do peso corporal, duas vezes por semana, por injeção intraperitoneal durante 7 semanas. Os volumes do tumor e os pesos corporais do rato foram registados duas vezes por semana. A inibição do crescimento do tumor foi analisada utilizando-se ANOVA e é expressa como percentagem de inibição comparada com o controle PBS.
[000223] Os dados da inibição do crescimento tumoral determinados no dia 29 após o tratamento com um dos anticorpos humanizados (isto é,Sh24C05-31 N62S-IgG1, U1-59, ou Ab#6 IgG2) é mostrado na Tabela 20. Tabela 20
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[000224] Os resultados demonstram que a Sh24C05-31 N62S-IgG1 apresentou a maior inibição do crescimento tumoral ao dia 29 (76,5 %, p<0,001 ) para uma dose de 5 mg/kg no modelo de xenoenxerto pancreático BxPC3. Os anticorpos U1-59 e Ab#6 IgG2 demonstraram aproximadamente 60% e 41% de inibição do crescimento tumoral para uma dose de 5 mg/kg no modelo BxPC3, respetivamente (P < 0,001).
[000225] Os resultados demonstram também que a Sh24C05-31 N62S-IgG1 apresentou a maior inibição do crescimento tumoral ao dia 29 para uma dose de 0,5 mg/Kg e (63,3%, p<0,001 ) para uma dose de 1 mg/kg (75.0%, p<0,001) no modelo de xenoenxerto pancreático BxPC3. Os anticorpos U1-59 e Ab#6 IgG2 demonstraram aproximadamente 33% (p < 0,01) e 31% (p < 0,05) de inibição do crescimento tumoral para uma dose de 0,5 mg/kg no modelo BxPC3, respetivamente. Os anticorpos U1-59 e Ab#6 IgG2 demonstraram aproximadamente 53% (p < 0,001) e 2% (não significativo) de inibição do crescimento tumoral para uma dose de 1,0 mg/kg no modelo BxPC3, respetivamente.
Exemplo 17 - Inibição do Crescimento do Xenoenxerto do Tumor Calu-3
[000226] A capacidade dos anticorpos monoclonais humanizados produzidos no Exemplo 12 para inibir o crescimento do tumor foi testada em um modelo de xenoenxerto Calu-3 do câncer do pulmão nas não-pequenas células. A capacidade dos anticorpos monoclonais humanizados U1-59 e Ab#6 IgG2, como descrito no Exemplo 12, para inibir o crescimento do tumor foram também testados no mesmo modelo.
[000227] As células Calu-3 humanas de câncer do pulmão das não- pequenas células foram cultivadas em meio de cultura a 37 °C em uma atmosfera contendo CO2 a 5%, utilizando-se o meio EMEM contendo 10% de soro fetal bovino. As células Calu-3 foram inoculadas por via subcutânea, no flanco de uma fêmea de rato NCR de 8 semanas (Taconic Labs) com 10 x 106células por rato em matrigel 50% (BD Biosciences, Cat n° 356237). As medições do tumor foram realizadas duas vezes por semana utilizando um paquímetro. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: largura x largura x comprimento/2.
[000228] Quando os tumores atingiram aproximadamente 200 mm3, os ratos foram aleatoriamente distribuídos por 11 grupos de 10 ratos cada. Um grupo recebeu PBS e outro recebeu controle muIgG. Cada um dos outros nove grupos receberam um dos anticorpos humanizados (isto é,Sh24C05-31 N62S-IgG1, U1-59, ou Ab#6 IgG2) na dose de 5 mg/kg, 10 mg/kg ou 20 mg/kg de peso corporal, duas vezes por semana, por injeção intraperitoneal durante 4 semanas. Os volumes do tumor e os pesos corporais do rato foram registados duas vezes por semana. A inibição do crescimento do tumor foi analisada utilizando-se ANOVA e é expressa como percentagem de inibição comparada com o controle PBS.
[000229] Os dados da inibição do crescimento tumoral determinados no dia 26 após o tratamento com um dos anticorpos humanizados (i.e ., Sh24C05-31 N62S-IgG1, U1-59, ou Ab#6 IgG2) é mostrado na Tabela 21. Tabela 21
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Figure img0039
[000230] Os resultados utilizando o modelo xenoenxerto Calu-3 do câncer do pulmão das não-pequenas células demonstram que a Sh24C05-31 N62S-IgG1 apresentou a maior inibição do crescimento tumoral ao dia 26 para todas as doses testadas (isto é,5 mg/kg, 10mg/kg e 20 mg/kg de peso corporal).
[000231] Por exemplo, para a dose de 10mg/kg, a Sh24C05-31 N62S-IgG1 apresentou a maior inibição do crescimento tumoral ao dia 26 (62%, P<0,001 ) quando comparado com o Ab#6 IgG2 (36%, NS) ou U1-59 (57 %, P<0,001). Para a dose de 20 mg/kg, a Sh24C05-31 N62S-IgG1 apresentou a maior inibição do crescimento tumoral ao dia 26 (69%, P<0,001) quando comparado com o Ab#6 IgG2 (48%, P<0,001) ou U1-59 (58%, P<0,001).
Exemplo 18 - Inibição do Crescimento do Xenoenxerto do Tumor MDA-MB-453
[000232] A capacidade dos anticorpos monoclonais humanizados produzidos no Exemplo 12 para inibir o crescimento do tumor foi testada em um modelo de xenoenxerto do câncer de mama MDA-MB- 453 (o qual é um modelo de câncer de mama positivo para HER2). A capacidade dos anticorpos monoclonais humanizados U1-59 e Ab#6 IgG2, como descrito no Exemplo 12, para inibir o crescimento do tumor foram também testados no mesmo modelo.
[000233] As células MDA-MB-453 de câncer de mama humanas foram cultivadas em meio de cultura a 37 °C em uma atmosfera contendo CO2 a 0%, utilizando-se o meio Leibovitz ATCC (NO Cat. 30-2008) contendo 10% de soro fetal bovino. As células MDA-MB-453 foram inoculadas por via subcutânea, no flanco de uma fêmea de rato NOD SCID com 8 semanas (Taconic Labs) com 20 x 106células por rato em matrigel 50% (BD Biosciences, Cat n° 356237). As medições do tumor foram realizadas duas vezes por semana utilizando um paquímetro. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: largura x largura x comprimento/2.
[000234] Quando os tumores atingiram aproximadamente 200 mm3, os ratos foram aleatoriamente distribuídos por 7 grupos de 10 ratos cada. Um grupo recebeu PBS e outro recebeu controle huIgG. Cada um dos outros nove grupos recebeu um dos anticorpos humanizados (isto é, Sh24C05-31 N62S-IgG1, U1-59, ou Ab#6 IgG2). A 24C05-31 N62S-IgG1 foi doseada quer a 5 mg/kg, 10 mg/kg ou 20 mg/kg de peso corporal, duas vezes por semana, por injeção intraperitoneal durante mais de 10 semanas; o U1-59, ou Ab#6 foram doseados a 10 mg/kg com a mesma frequência. Os volumes do tumor e os pesos corporais do rato foram registados duas vezes por semana. A inibição do crescimento do tumor foi analisada utilizando-se ANOVA e é expressa como percentagem de inibição comparada com o controle PBS.
[000235] Os dados da inibição do crescimento tumoral determinados no dia 71 após o tratamento com um dos anticorpos humanizados (isto é,Sh24C05-31 N62S-IgG1, U1-59, ou Ab#6 IgG2) é mostrado na Tabela 22. Tabela 22
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Figure img0041
[000236] Os resultados utilizando o modelo de xenoenxerto MDA- MB-453 demonstra que o Sh24C05-31 N62S-IgG1 apresentou uma inibição potente do crescimento tumoral ao dia 71 para todas as doses testadas (isto é,5 mg/kg, 10mg/kg e 20 mg/kg de peso corporal).
[000237] Os resultados também demonstraram que para a dose de 10mg/kg, o Sh24C05-31 N62S-IgG1 apresentou a maior inibição do crescimento tumoral ao dia 71 (84%, P<0,001 ) quando comparado com o Ab#6 IgG2 (62%, P<0,001). O Sh24C05-31 N62S-IgG1 apresentou uma inibição do crescimento do tumor equivalente à do U1-59 para a mesma dose.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[000238] A divulgação completa de cada um dos documentos de patentes e artigos científicos aqui referidos é incorporada por referência para todos os fins.
EQUIVALENTES
[000239] A invenção pode ser realizada em outros formas específicas sem que estas saiam fora do seu âmbito ou das suas características essenciais. As modalidades anteriores devem, por conseguinte, ser consideradas em todos os aspetos como ilustrativas em vez de limitar a invenção descrita neste documento. O âmbito da invenção é assim indicado pelas reivindicações anexas em vez de o ser pela descrição precedente, e todas as alterações que são previstas no significado e alcance da equivalência das reivindicações destinam- se a ser nele englobadas.

Claims (20)

1. Anticorpo isolado que se liga ao ErbB3 humano, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDRH1 consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 75; uma CDRH2 consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 148, e uma CDRH3 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59; e (ii) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo uma CDRL1 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, uma CDRL2 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma CDRL3 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma CDRH1 consistindo na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 75, uma CDRH2 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 148, e uma CDRH3 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59; e em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende uma CDRL1 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, uma CDRL2 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma CDRL3 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma CDRH1 consistindo na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 75, uma CDRH2 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, e uma CDRH3 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59; e em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende uma CDRL1 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, uma CDRL2 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma CDRL3 consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62.
4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as sequências CDR são interpostas entre sequências framework humanas ou humanizadas.
5. Anticorpo isolado que se liga ao ErbB3 humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina, selecionado a partir de um grupo consistindo em: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 154, e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168; e (b) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 154, e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 166.
6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 154, e a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168.
7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina, selecionadas a partir de um grupo consistindo em: (a) uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; e (b) uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 204.
8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, e a cadeia leve de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206.
9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina, selecionadas a partir de um grupo consistindo em: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 152, e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168; e (b) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 152, e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 166.
10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina, selecionadas a partir de um grupo consistindo em: (a) uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188, e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; e (b) uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188, e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 204.
11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma KD de 200 pM ou inferior, quando medida por ressonância do plásmon de superfície.
13. Uso de uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição farmacêutica para inibir ou reduzir a proliferação de uma célula tumoral.
14. Uso de uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição farmacêutica para inibir ou reduzir o crescimento do tumor em um mamífero.
15. Uso de uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição farmacêutica para tratar câncer em um mamífero.
16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo em cânceres de mama, do ovário, da próstata, cervical, colorretal, do pulmão, do pâncreas, do estômago, de pele, do rim, e da cabeça e do pescoço e schwannoma.
17. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e uma sequência de nucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 153, e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 167; (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 153, e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 165; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 151, e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 165; e (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 151, e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 167.
18. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina e uma sequência de nucleotídeo que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 189, e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 203; (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 189, e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 205; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 187, e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 203; e (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 187, e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 205.
19. Processo de produção de um anticorpo que se liga ao ErbB3 humano ou um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina como definida qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 sob condições em que a célula hospedeira expressa o polipeptídeo compreendendo a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e/ou um polipeptídeo compreendendo a região variável da cadeia leve de imunoglobulina, produzindo assim o anticorpo ou o fragmento de anticorpo para ligação ao antígeno; e (b) purificar o anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo.
20. Método para produzir um anticorpo que liga o ErbB3 humano ou um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo (i) um vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e (ii) um vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, sob condições pelas quais a célula hospedeira expressa um polipeptídeo compreendendo a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e um polipeptídeo compreendendo a região variável da cadeia leve da imunoglobulina, produzindo desse modo o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo; e (b) purificar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo.
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