JP2016510755A - 抗Ｃ−ＭＥＴタンデムＦｃ二重特異性抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、１以上の細胞表面受容体に特異的に結合する結合部位を１つまたは少なくとも２つ含有する、たとえばタンデムＦｃ二重特異性抗体（ＴＦｃＢＡ）等の、タンデムＦｃおよびタンデムＦｃ抗体（ＴＦｃＡ）を開示するものである。結合部位は、第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域を含有するＴＦｃを介して連結され、ここで、当該第一および第二のＦｃ領域は、ＴＦｃリンカーを介して連結され、連続的なポリペプチドを形成し、および、二量体化してＦｃ二量体を形成する。例示的なＴＦｃＢＡは、細胞表面受容体ｃ−ＭｅｔおよびＥｐＣａｍに結合し、当該ＴＦｃＢＡの結合部位に特異的な細胞表面受容体（複数含む）を介したシグナル伝達を阻害する。【選択図】 図３２

Description

本出願は、２０１３年３月６日に出願された米国特許出願第６１／７７３，７６４号、および、２０１３年５月６日に出願された米国特許出願第６１／７７３，７８８号（それら出願はすべて、参照により全体で援用される）の優先権を主張するものである。
腫瘍細胞は細胞の増殖を刺激する増殖因子およびサイトカインに対する受容体を発現しているため、そのような受容体（たとえば、チロシンキナーゼ受容体）に対する抗体が、増殖因子およびサイトカインに介在される細胞増殖刺激を妨害に有効であり、腫瘍細胞の増殖を阻害することが判明している。癌細胞上の受容体を標的とする市販の治療抗体としては、たとえば、乳癌治療に対するトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ。ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２としても知られる）受容体を標的とする）、および、結腸直腸癌および頭頸部癌の治療に対するセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ。上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１またはＥｒｂＢ１としても知られる）を標的とする）が挙げられる。
治療用モノクローナル抗体をただ１つのみ含有する治療剤を投与する方法（他の治療抗体が投与されることなく、これが投与される場合であり、本明細書においては単剤療法（ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ）と呼称する）が癌治療に非常に有効であることが示されている一方、そのような治療が失敗に終わる事例や、最初の阻害後、腫瘍増殖が再発する事例が多く報告されている。たとえば、ある腫瘍は、細胞増殖のために２以上の増殖因子介在性シグナル伝達経路に依存しており、そのため、１つの経路を標的としても、腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼすには不十分である可能性がある。あるいは、ある経路のみが唯一の増殖刺激経路である場合でさえも、ある腫瘍細胞は、そのオリジナル経路が抗体により妨害された際、増殖刺激の他のシグナル伝達経路を活性化することができる（治療に対する内生的抵抗性）。さらには、一部の腫瘍は、抗体単剤療法に対し初期反応を示すが、後になって、他のシグナル伝達経路を使用するよう切り替わることにより、治療に対し抵抗性を獲得する（治療に対する獲得耐性）。さらに、たとえばｃ−Ｍｅｔ受容体等の一部の受容体は、標準的な抗体（たとえば、ＩｇＧ抗体）により刺激され、それらが発現されている細胞にシグナルを伝達する。特定の機序理論に拘る意図はないが、この現象は、たとえばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ等の抗体上にある対形成された（通常は同一である）抗原結合部位による、同じ細胞上の２つの受容体のクロスリンク対形成の結果であると考えられている。そのような刺激は、治療利益とは逆の効果をもたらす可能性がある（たとえば、細胞増殖および複製は、そのような抗ｃ−Ｍｅｔ抗体により阻害よりもむしろアップレギュレートされる）。
本実施態様において、受容体（複数含む。たとえば、ｃ−Ｍｅｔ受容体）と本発明の組成物との相互作用により、アンタゴニスト活性がもたらされる。特定の実施態様においては、そのような相互作用によりアンタゴニスト活性が生じるが、アゴニスト活性は生じないか、または実質的に生じない。ある態様においては、アンタゴニスト活性は、癌を阻害する組成物および方法に有用である。
従って、抗体単剤療法の限界を超えるため、および、他の利益をもたらすための、癌治療に対するさらなる別の治療方法が必要とされている。
本明細書において、たとえば、タンデムＦｃ抗体（ＴＦｃＡｓ）等の改変抗体が開示される。例示的なＴＦｃＡｓは、たとえば、米国仮特許出願６１／５２７，８０２（２０１１年８月２６日に出願）；および同時係属されているＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５２４９０（２０１２年８月２７日に出願。国際特許出願公開ＷＯ２０１３／０３３００８Ａ２を参照のこと）に開示されている、タンデムＦｃ二重特異性抗体（ＴＦｃＢＡｓ）である。ＴＦｃＢＡは、第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域（当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域の各々はＣ末端とＮ末端を有する）を含有するポリペプチド部分であるタンデムＦｃを含有し；第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域は、Ｃ末端およびＮ末端を有するＴＦｃリンカーを介して１つのポリペプチド鎖として連結されている（すなわち、第一のＦｃ領域のＣ末端は、ＴＦｃリンカーのＮ末端にペプチド結合により連結され、同様に、そのＴＦｃリンカーのＣ末端は、第二のＦｃ領域のＮ末端にペプチド結合により連結されている）。ＴＦｃＢＡは、少なくとも２つの結合部位（少なくとも第一の結合部位と第二の結合部位）を含有することができる。そのような結合部位の各々は、細胞表面受容体の特定の部分に特異的に結合する。例示的な細胞表面受容体は、癌細胞により発現、または過剰発現されているものである。例示的な結合部位としては、細胞表面受容体の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する抗体由来の結合部位が挙げられる。ＴＦｃＡもしくはＴＦｃＢＡの第一の結合部位または第二の結合部位は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３（たとえば、米国特許第７，８４６，４４０号に開示されている結合部位）、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（αおよびβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭおよびＥｐｈＡ２からなる群から選択されるヒト受容体タンパク質に特異的に結合しても良い。通常、受容体は、受容体チロシンキナーゼである。一般的に、そのような結合は、受容体タンパク質の細胞外部分に特異的である。本明細書の有る実施態様において、ＴＦｃＢＡに包含される少なくとも２つの抗原結合部位のうちの１つは、ｃ−Ｍｅｔに特異的な結合部位である（たとえば、孔ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂ、または抗ｃ−Ｍｅｔ ｓｃＦｖ）。例示的なある実施態様において、ＴＦｃＢＡは、１つの抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位および、ｃ−Ｍｅｔに結合しない第二の結合部位（たとえば、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（αおよびβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭおよびＥｐｈＡ２に特異的な結合部位）を少なくとも１つ含有しており、ここで、当該抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位および第二の結合部位は、ＴＦｃを介して連結され、連続的なポリペプチドを形成している。ＴＦｃＢＡは、１つの受容体または２つの異なる細胞表面受容体上の２つのエピトープ（たとえば、細胞外エピトープ）に結合しており、そのような結合によって、ＴＦｃＢＡが結合する少なくとも１つの細胞表面受容体の同族リガンドにより通常であれば刺激されるシグナル伝達が強く阻害される。たとえば、抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡは、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子、Ｃ−ｍｅｔの同族リガンド）およびＥＧＦ（上皮細胞増殖因子、ＥＧＦＲの同族リガンド）のいずれかまたは両方により誘導されるシグナル伝達を阻害しうる。または、抗ｃ−Ｋｉｔ＋抗ＲＯＮ ＴＦｃＢＡは、マクロファージ刺激タンパク質（ＲＯＮの同族リガンド）および幹細胞因子（ｃ−Ｋｉｔの同族リガンド）のいずれかまたは両方により誘導されるシグナル伝達を阻害しうる。または、抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＰＣＡＭ ＴＦｃＢＡは、ＨＧＦにより誘導されるシグナル伝達を阻害し、もしくは、ＨＧＦの非存在下でｃ−Ｍｅｔ受容体によるシグナル伝達を阻害しうる（たとえば、リガンド依存性ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達）。各阻害は、１０ｎＭ以下のＩＣ５０、もしくは１ｎＭ以下のＩＣ５０、もしくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０、または、少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の最大阻害割合（ＴＦｃＢＡにより阻害されるシグナル伝達である、リガンド誘導性（または、ＨＧＦ非存在下のｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の場合には、リガンド非依存性）の受容体（複数含む）のリン酸化の阻害により示される）である。多くの実施態様において、本明細書に開示されるＴＦｃＢＡを含有する抗ｃ−Ｍｅｔは、ｃ−Ｍｅｔを発現している細胞に対し、本質的に何らの刺激作用も与えない。他の実施態様において、本明細書に開示されるＴＦｃＢＡを含有する抗ｃ−Ｍｅｔは、ｃ−Ｍｅｔを発現している細胞に対し、ｃ−Ｍｅｔ受容体のダウンレギュレートまたは分解を誘導する。他の実施態様において、本明細書の抗ＥＰＣＡＭ ＴＦｃＢＡは、低レベルのＥＰＣＡＭ（細胞当たり、わずか１００，０００±５％のＥＰＣＡＭ分子）、または非常に低レベルのＥＰＣＡＭ（細胞当たり、わずか２４，０００±５％のＥＰＣＡＭ分子）を発現している細胞に、最も強いシグナル伝達阻害効果（たとえば、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％超）を与える。ある実施態様において、細胞におけるＴＦｃＢＡの発現により、（ｉ）同じ受容体（複数含む）に結合するが、ＴＦｃを含有していない多価抗体の発現と比較し、より多くの（すなわち、より高い割合で）正しく形成されたＴＦｃＡＢ分子が産生されるか、または、（ｉｉ）正しく形成されたＴＦｃＡＢが８０％を超えて産生される（たとえば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される）。
また、本明細書において、ＴＦｃＢＡであるＡｂが開示され、ここで、当該ＴＦｃＢＡは、第一の結合部位と第二の結合部位を含有しており、ここで、当該第一の結合部位は第一の標的に結合し、および、第二の結合部位は第二の標的に結合し、ならびに、ここで、（ｉ）第一の結合部位と第二の結合部位は、ＴＦｃを介して連結されており；（ｉｉ）ＴＦｃは第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域を含有し、当該第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域はそれぞれ、Ｃ末端とＮ末端を有しており；（ｉｉｉ）第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域は、Ｃ末端とＮ末端を有するＴＦｃリンカーを介して連結され、連続的なポリペプチドを形成し；（ｉｖ）第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域は、関連（結合）してＦｃ二量体を形成し；および、（ｖ）第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、１以上のアミノ酸（ａａ）修飾を含有して、第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域の間の結合を増強または安定化させている。ＴＦｃＢＡは、第一の標的および第二の標的のいずれか、または両方を介してシグナル伝達を阻害しても良い。ある実施態様において、宿主細胞におけるＴＦｃＢＡの発現により、（ｉ）同じ受容体（複数含む）に結合するがＴＦｃを含有しない多価抗体の同等の宿主細胞における発現と比較し、より多くの正しく形成されたＴＦｃＡＢ分子が産生されるか、または、（ｉｉ）正しく形成されたＴＦｃＢＡ分子が８０％を超えて産生される（ＳＥＣにより測定）。
さらに、本明細書において、一価タンデムＦＣ抗体（ＴＦｃＡｓ）が開示される。一価ＴＦｃＡは、標的に結合する結合部位を１つ含有しても良く、ここで、当該結合部位は、第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域を含有するＴＦｃに連結されており、当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域の各々はＣ末端とＮ末端を有しており；および、（ｉ）第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域は、Ｃ末端とＮ末端を有するＴＦｃリンカーを介して連結され、連続的なポリペプチドを形成し；（ｉｉ）第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域が結合してＦｃ二量体を形成し；および、（ｉｉｉ）第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域のいずれかまたは両方が、１以上のａａ修飾を含有し、第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域の間の結合を増強または安定化させている。一価ＴＦｃＡは、標的を介してシグナル伝達を阻害しても良い。ある実施態様において、宿主細胞における一過ＴＦｃＡの発現により、（ｉ）ＴＦｃを含有していない抗体の同等の宿主細胞における発現と比較し、より多くの正しく形成されたＴＦｃＡ分子が産生されるか、または、（ｉｉ）正しく形成されたＴＦｃＢＡ分子が８０％を超えて産生される（ＳＥＣにより測定）。
たとえば、ＴＦｃＢＡ等のＴＦｃＡにより含有されるＴＦｃの第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域は、第一および第二のＣＨ３ドメインをそれぞれ含油卯しても良く、当該ＣＨ３ドメインの各々はＣ末端とＮ末端を有している。ＴＦｃＡにより含有されているＴＦｃの第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域は、それぞれ、第一のＣＨ２ドメインおよび第二のＣＨ２ドメインを含有してもよく、当該ＣＨ２ドメインの各々は、Ｃ末端とＮ末端を有している。ＴＦｃＡにより含有されているＴＦｃの第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域は、それぞれ、第一のヒンジと第二のヒンジを含有しても良く、当該第一のヒンジと第二のヒンジの各々は、Ｃ末端とＮ末端を有している。ある実施態様において、第二のヒンジは、上部ヒンジサブドメインを含有していない。ＴＦｃＡに含有されているＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有してもよい：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。ＴＦｃＡに含有されているＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有してもよい：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のヒンジ、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。第一のヒンジは、上部ヒンジサブドメイン、コアヒンジサブドメイン、および下部ヒンジサブドメインを含有しても良く、および、第二のヒンジは、コアヒンジサブドメインおよび下部ヒンジサブドメインを含有しても良いが、上部ヒンジサブドメインは含有しなくても良く、当該ヒンジサブドメインの各々はＣ末端とＮ末端を有している。ＴＦｃＡにより含有されているＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有してもよい：第一のヒンジ（そのＣ末端は、第一のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されており、次いで、そのＣ末端は第一のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結されており、次いで、そのＣ末端はＴＦｃリンカーのＮ末端に連結されており、次いで、そのＣ末端は第二のヒンジのＮ末端に連結されており、次いで、そのＣ末端は第二のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されており、次いで、そのＣ末端は第二のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結されている）。
ＴＦｃＡにより含有されているＴＦｃのＴＦｃリンカーは、２０〜５０ａａを含有しても良い。ＴＦｃリンカーは、たとえば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ等のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーであっても良く、ここで、ｎは、４、５、６、７または８である。ＴＦｃリンカーはまた、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーのａａ配列に対し、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるａａ配列、または、最大でも２０、１５、１０、５、４、３、２または１のａａ付加、欠失または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有してもよい。
ＴＦｃＡのＴＦｃは、ＩｇＧ１のＴＦｃであっても良い。ＴＦｃは、ハイブリッドＴＦｃ（たとえば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４のハイブリッドＴＦｃ）であっても良い。ＴＦｃＡのＴＦｃは、ＩｇＧ１ ＴＦｃであっても良く、および、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有してもよい：第一のＩｇＧ１ヒンジ、第一のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、第一のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＩｇＧ１ヒンジ、第二のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、および第二のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン。ハイブリッドＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有してもよい：第一のＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジ、第一のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、第一のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＩｇＧ４ヒンジ、第二のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、および第二のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン。
ＴＦｃの第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインのいずれか、または両方が、第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域の間の結合を増強させる、または安定化させるａａ修飾を１以上含有しても良い（たとえば、非変性ＳＤＳページゲル上の実質的に均一な産物（または産物）により明らかにされる）。ＴＦｃの第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインの各々が、アミノ酸修飾を含有してもよく、当該修飾はＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＡＥＭ）であり、第一のＣＨ３ドメインと第二のＣＨ３ドメインの結合を増強する。ＡＥＭは、ＡＥＭモジュール１、ＡＥＭモジュール２、ＡＥＭモジュール３およびＡＥＭモジュール４からなる群から選択されるモジュールにより含有されても良い。ＴＦｃの第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、挿入または置換としてシステインを付加するａａ修飾を含有しても良く、当該システインは、他のＦｃ領域中のシステインとジスルフィドを形成する（ＤｉＳ修飾）。ＴＦｃの第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、ＣＨ３ドメインにＤｉＳ修飾を含有する。ＤｉＳ修飾は、ＤｉＳモジュール１またはＤｉＳモジュール２により含有されても良い。ＴＦｃの第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインのいずれか、または両方が、ＡＥＭ修飾を１以上、およびＤｉＳ修飾を１以上、含有しても良い。
ＴＦｃの第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインのいずれか、または両方が、本明細書に開示されるＣＨ３ドメインのａａ配列に対し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるａａ配列を含有しても良く（たとえば、配列番号２７〜９８からなる群から選択される）、または、最大でも３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１のａａ付加、欠失または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有してもよい。ある実施態様においては、ＣＨ３ドメインのａａ配列が、配列番号２７〜９８の配列群から選択される配列と同一ではないが、それでもＣＨ３ドメインのａａ配列は、それが類似している配列の特定のＡＥＭおよび／またはＤｉＳを含有する。ＴＦｃの第一のＣＨ３ドメインまたは第二のＣＨ３ドメインが、本明細書に開示されるａａ配列（たとえば、配列番号２７〜９８からなる群から選択される配列）を含有しても良い。ＴＦｃの第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインが共に、２つの異なるメンバーの対を含有しても良く、各メンバーは、ＣＨ３のａａ配列であり、各対は、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７；ならびに、配列番号９６および９８からなる対の群（各メンバーのａａ配列は、各当該対の各配列に対し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるか、または、最大でも３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１のａａ付加、欠失または置換という点でそれらから異なっている）から選択され、ここで、当該第一のＣＨ３ドメインは、第二のＣＨ３ドメインにより含有されているものとは異なる対のメンバーを含有する。ＴＦｃの第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインは、各々、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７；ならびに、配列番号９６および９８からなる群から選択されるＣＨ３のａａ配列の対のメンバーのａａ配列と同一であるａａ配列を含有しても良い。
ＴＦｃの第一のヒンジは、たとえば配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択される、本明細書に開示されるヒンジの配列と、最大で３、４または１のａａ欠失、付加、または置換という点で異なっているａａ配列を含有しても良い。ＴＦｃの第一のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列である、ａａ配列を含有しても良い。ＴＦｃの第二のヒンジは、たとえば配列番号２３、２４、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択される、本明細書に開示されるヒンジのａａ配列と、最大で３、２または１のａａ欠失、付加または置換という点で異なっているａａ配列を含有しても良い。ＴＦｃの第二のヒンジは、配列番号２３、２４、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列である、ａａ配列を含有しても良い。
ＴＦｃのＣＨ２ドメインは、たとえば、配列番号２５、２６、２６１または、２６２等の、本明細書に開示されるＣＨ２ドメインのａａに対し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるａａ配列、または、最大で３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、または１のａａ欠失、付加または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有しても良い。
ＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有してもよい：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、第二のヒンジ、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。ここで、（ｉ）当該第一のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列を含有し；（ｉｉ）当該第一のＣＨ２ドメインは、グリコシル化されておらず、および、配列番号２５として記述されるａａ配列を含有し；（ｉｉｉ）当該第一のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに、配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列である、ａａ配列を含有し；（ｉｖ）当該第二のヒンジは、配列番号２３、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択される配列からなるａａ配列を含有し；（ｖ）当該第二のＣＨ２ドメインは、グリコシル化されておらず、および、配列番号２５において記述されるａａ配列を含有し；ならびに（ｖｉ）当該第二のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列であるａａ配列を含有し、ここで、もし第一のＣＨ３ドメインが、配列対の第一の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは、配列対の第二の配列を含有し；および、もし第一のＣＨ３ドメインが配列対の第二の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは配列対の第一の配列を含有する。
ＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有してもよい：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、第二のヒンジ、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。ここで、（ｉ）当該第一のヒンジは、配列番号２０、２１、２２、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列を含有し；（ｉｉ）当該第一のＣＨ２ドメインは、グリコシル化されておらず、および、配列番号２６に記述されるａａ配列を含有し；（ｉｉｉ）当該第一のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７ならびに配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列である、ａａ配列を含有し；（ｉｖ）当該第二のヒンジは、配列番号２４、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択される配列からなるａａ配列を含有し；（ｖ）当該第二のＣＨ２ドメインは、グリコシル化されておらず、および、配列番号２６において記述されるａａ配列を含有し；ならびに（ｖｉ）当該第二のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列であるａａ配列を含有し、ここで、もし第一のＣＨ３ドメインが、配列対の第一の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは、配列対の第二の配列を含有し；および、もし第一のＣＨ３ドメインが配列対の第二の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは配列対の第一の配列を含有する。
ＴＦｃの第一または第二のＦｃ領域は、たとえば、配列番号９９〜１６６からなる群から選択される、本明細書に開示されるＦｃ領域のａａ配列に対し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるａａ配列、または、最大で５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、もしくは１のａａ欠失、付加、または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有しても良い。第一または第二のＦｃ領域は、配列番号９９−１６６からなる群から選択されるａａ配列を含有する。第一および第二のＦｃ領域は、配列番号９９および１００、配列番号１０１および１０２、配列番号１０３および１０４、配列番号１０５および１０６、配列番号１０７および１０８、配列番号１０９および１１０、配列番号１１１および１１２、配列番号１１３および１１４、配列番号１１５および１１６、配列番号１１７および１１８、配列番号１１９および１２０、配列番号１２１および１２２、配列番号１２３および１２４、配列番号１２５および１２６、配列番号１２７および１２８、配列番号１２９および１３０、配列番号１３１および１３２、配列番号１３３および１３４、配列番号１３５および１３６、配列番号１３７および１３８、配列番号１３９および１４０、配列番号１４１および１４２、配列番号１４３および１４４、配列番号１４５および１４６、配列番号１４７および１４８、配列番号１４９および１５０、配列番号１５１および１５２、配列番号１５３および１５４、配列番号１５５および１５６、配列番号１５７および１５８、配列番号１５９および１６０、配列番号１６１および１６２、配列番号１６３および１６４、ならびに配列番号１６５および１６６からなる群から選択されるａａ配列の対の１つのａａ配列に対し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるａａ配列、または、最大で５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、もしくは１のａａ欠失、付加または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有しても良く、および、ここで、第一のＦｃ領域は、第二のＦｃ領域により含有されるものとは異なる対のメンバーを含有する。第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域はともに、２つの異なるメンバーの対を含有しても良く、各メンバーは、Ｆｃ ａａ配列であり、ここで、各対は、配列番号９９および１００、配列番号１０１および１０２、配列番号１０３および１０４、配列番号１０５および１０６、配列番号１０７および１０８、配列番号１０９および１１０、配列番号１１１および１１２、配列番号１１３および１１４、配列番号１１５および１１６、配列番号１１７および１１８、配列番号１１９および１２０、配列番号１２１および１２２、配列番号１２３および１２４、配列番号１２５および１２６、配列番号１２７および１２８、配列番号１２９および１３０、配列番号１３１および１３２、配列番号１３３および１３４、配列番号１３５および１３６、配列番号１３７および１３８、配列番号１３９および１４０、配列番号１４１および１４２、配列番号１４３および１４４、配列番号１４５および１４６、配列番号１４７および１４８、配列番号１４９および１５０、配列番号１５１および１５２、配列番号１５３および１５４、配列番号１５５および１５６、配列番号１５７および１５８、配列番号１５９および１６０、配列番号１６１および１６２、配列番号１６３および１６４ならびに配列番号１６５および１６６からなる対の群から選択され、各メンバーのａａ配列は、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるか、または、最大で５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、もしくは１のａａ付加、欠失または置換という点で、各当該対の各配列から異なっており、ここで、第一のＦｃ領域は、第二のＦｃ領域により含有されるものとは異なる対のメンバーを含有する。
ＴＦｃは、たとえば、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９および２２１からなる群から選択される、本明細書に開示されるＴＦｃのａａ配列に対し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるａａ配列、または、最大で３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、もしくは１のａａ付加、欠失または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有しても良い。ＴＦｃは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９および２２１からなる群から選択されるａａ配列を含有しても良い。
ＴＦｃＡ、たとえばＴＦｃＢＡ、たとえば抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡまたは抗ｃ−Ｋｉｔ＋抗ＲＯＮ ＴＦｃＢＡまたは抗ＦＧＦＲ２＋抗ＥＰＣＡＭ ＴＦｃＢＡは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する重鎖を含有しても良い：第一の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ＴＦｃ、連結リンカー、および第二のＶＨドメイン。重鎖は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有しても良い：第一のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、連結林家―および第二のＶＨドメイン。重鎖は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有しても良い：第一のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、連結リンカー、第二のＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー、および第二の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン。ここで、当該第二のＶＨおよびＶＬドメインは、結合し、第二の結合部位を形成している。ＴＦｃＡは、第一のＶＨドメインと二量体化し第一の結合部位を形成する第一のＶＬドメインを含有する軽鎖を含有しても良い。軽鎖は、ＶＬドメインのカルボキシル末端に連結されている軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含有しても良い。第一の結合部位は、抗ｃ−Ｍｅｔ、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥｒｂＢ４、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗ＲＯＮ、抗ＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＮＦＲ、抗ＦＧＦＲ１、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、抗ＦＧＦＲ４、抗ＰＤＧＦＲα、抗ＰＤＧＦＲβ、抗ＥＰＣＡＭ、または、抗ＥｐｈＡ２の結合部位であっても良く、および、第二の結合部位は、抗ｃ−Ｍｅｔ、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗 ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥｒｂＢ４、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗ＲＯＮ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＮＦＲ、抗ＦＧＦＲ１、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、抗ＦＧＦＲ４、抗ＰＤＧＦＲα、抗ＰＤＧＦＲβ、抗ＥｐｈＡ２、または、抗ＥＧＦＲの結合部位であっても良い。ＴＦｃＡが一価のＴＦｃＡである場合、結合部位は、抗ｃ−Ｍｅｔ、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗 ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥｒｂＢ４、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗ＲＯＮ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＮＦＲ、抗ＦＧＦＲ１、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、抗ＦＧＦＲ４、抗ＰＤＧＦＲα、抗ＰＤＧＦＲβ、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＥｐｈＡ２、または、抗ＥＧＦＲの結合部位であっても良い。例示的な抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位としては、ａ）配列番号２２３または２８７のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）３（ＶＨＣＤＲ３）のａａ配列、および、ｂ）配列番号２３１または２８９のＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含有するＶＬＣＤＲ３、のいずれか、または両方を含有するＶＨドメインを含有するものが挙げられる。他の例示的な抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位としては、ＶＨＣＤＲ１、ＶＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含有する３つのＶＨ ＣＤＲのセットを含有するＶＨドメイン（ここで、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、および、ＶＨＣＤＲ３は、配列番号２２３または２３１のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含有する）；ならびに、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、および、ＶＬＣＤＲ３を含有する３つのＶＬＣＤＲのセットを含有するＶＬドメイン（ここで、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２８７または２８９のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含有する）、を含有するものが挙げられる。例示的な抗ＥＧＦＲ結合部位としては、ａ）配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７、または２７９のＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含有するＶＨＣＤＲ３、および、ｂ）配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７、または２７９のＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含有するＶＬＣＤＲ３、のいずれか、または両方を含有するものが挙げられる。例示的な抗ＥＧＦＲ結合部位としては、ＶＨＣＤＲ１、ＶＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含有する３つのＶＨＣＤＲのセットを含有するＶＨドメイン（ここで、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３は、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７または２７９のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含有する）；ならびに、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含有する３つのＶＬＣＤＲのセットを含有するＶＬドメイン（ここで、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３は、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７、または２７９のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含有する）、を含有するものが挙げられる。抗ｃ−Ｍｅｔ、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥｒｂＢ４、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗ＲＯＮ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＮＦＲ、抗ＦＧＦＲ１、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、抗ＦＧＦＲ４、抗ＰＤＧＦＲα、抗ＰＤＧＦＲβ、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＥｐｈＡ２、または、抗ＥＧＦＲの結合部位は、重鎖のＮ末端部分および軽鎖のＮ末端部分を含有しても良い。抗ＥＧＦＲ、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗 ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥｒｂＢ４、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗ＲＯＮ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＮＦＲ、抗ＦＧＦＲ１、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、抗ＦＧＦＲ４、抗ＰＤＧＦＲα、抗ＰＤＧＦＲβ、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＥｐｈＡ２、または抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、重鎖により全体的に包含され、連続的なポリペプチドを形成するＣ末端ｓｃＦｖにより包含されても良い。
ＴＦｃＡ、たとえば、ＴＦｃＢＡの抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのいずれか、または両方に含有されてもよく、ここで、ＶＨドメインは、たとえば、配列番号２２３、２３１、２８７、または２８９に記述される抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位のＶＨドメインに対し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または、９９％同一であるａａ配列、または、最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１のａａ欠失、付加、または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有し；ＶＬドメインは、たとえば配列番号２２３、２３１、２８７または２８９に記述される、本明細書に開示される抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位のＶＬドメインに対し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または、９９％同一であるａａ配列、または、最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１のａａ欠失、付加、または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有する。
ＴＦｃＡ、たとえば、ＴＦｃＢＡの抗ＥＧＦＲ結合部位は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのいずれか、または両方に含有されてもよく、ここで、ＶＨドメインは、たとえば、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７または２７９に記述される抗ＥＧＦＲ結合部位のＶＨドメインに対し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または、９９％同一であるａａ配列、または、最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１のａａ欠失、付加、または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有し；ＶＬドメインは、たとえば配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７または２７９に記述される、本明細書に開示される抗ＥＧＦＲ結合部位のＶＬドメインに対し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または、９９％同一であるａａ配列、または、最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１のａａ欠失、付加、または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有する。
ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡであっても良く、たとえば、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、Ａ群から選択されるアミノ酸とＢ群から選択されるアミノ酸を含有する荷電アミノ酸の対（電荷相補対）を含有するＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡであり；ここで、Ａ群はすべて、７を超えるｐＩを有する天然型アミノ酸で構成され、および、Ｂ群はすべて、７未満のｐＩを有する天然型アミノ酸で構成され、または、任意選択的に、Ａ群は、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇで構成され、および、Ｂ群は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、およびＰｒｏで構成され；ならびに、当該電荷相補対は、第一アミノ酸残基と第二アミノ酸残基からなり、および、当該電荷相補対は、２９７位の電荷相補対または２９９位の電荷相補対であり、ここで、２９７位の電荷相補対は、当該第一のＦｃ領域のＥＵ２９７位に位置する当該第一アミノ酸残基および当該第二Ｆｃ領域のＥＵ２９７位に位置する当該第二アミノ酸残基を有する電荷相補対であり、および、２９９位の電荷相補対は、当該第一のＦｃ領域のＥＵ２９９位に位置する当該第一のアミノ酸残基および当該第二のＦｃ領域ＥＵ２９９位に位置する当該第二のアミノ酸残基を有する電荷相補対である。電荷相補的な対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、２９７位の電荷相補対と２９９位の電荷相補対の両方を含有しても良く、ここで、２９７位の電荷相補対の当該第一のアミノ酸残基および第二のアミノ酸残基は、２９９位の電荷相補対の第一および第二のアミノ酸残基と同じ、または異なっている。電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたは、２９７位の電荷相補対を含有しても良く、ここで、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡではないが、第一および第二のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は、両方とも、同じ電荷のアミノ酸からなり、当該同じ電荷のアミノ酸は、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの２９７位の電荷相補対のアミノ酸のうちの１つである点を除き、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡと同一であるＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡよりも安定的である。電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、２９９位の電荷相補対を含有しても良く、ここで、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡではないが、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡと同一であるＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡ（第一および第二のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は、両方とも、同じ電荷のアミノ酸からなり、当該同じ電荷のアミノ酸は、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの２９９位の電荷相補対のアミノ酸のうちの１つである点を除く）よりも安定的である。
ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの第一または第二の結合部位は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（αおよびβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭおよびＥｐｈＡ２からなる群から選択されるヒト受容体タンパク質に特異的に結合しても良い。
さらに本明細書において、ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡ、および薬学的に受容可能な担体を含有する医薬組成物が開示される。また、たとえば、ＴＦｃＡもしくはＴＦｃＢＡの重鎖または軽鎖をコードするコード配列を少なくとも１つ、含有する核酸分子が開示される。核酸分子は、少なくとも２つのコード配列を含有しても良く、この場合、一つのコード配列はＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの重鎖をコードし、第二のコード配列はＴＦｃＢＡの軽鎖をコードする。また、たとえば、本明細書に開示される核酸分子を１以上含有するベクターが開示される。さらに、たとえば本明細書に開示されるベクターおよび／または核酸分子を１以上含有する宿主細胞または単離細胞等の細胞が開示される。細胞は、ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの重鎖をコードする核酸分子およびＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの軽鎖をコードする核酸分子を含有しても良い。
また、本明細書には、核酸分子が発現される条件下で本明細書に開示される宿主細胞を培養すること、および、ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡを単離することを含有するＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡを製造する方法が包含される。ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡを製造する方法は、ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの発現に適した条件下で本明細書に開示される細胞を培養することが含まれても良い。
また、癌を有する対象を治療する方法が開示され、当該方法には、ほんめいしＴＦｃＡもしくはＴＦｃＢＡ、核酸分子、またはベクターの治療有効量を対象に投与することが含まれる。
例示的な実施態様には、限定されないが、クレームされる主題に関連し、以下の構成要素が含有される。
１．タンデムＦｃ二重特異性抗体（Ｔａｎｄｅｍ Ｆｃ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＴＦｃＢＡ）である抗体であって、ここで、ＴＦｃＢＡは、１つの抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位である第一の結合部位、および、ｃ−Ｍｅｔ以外の細胞表面受容体二特異的に結合する第二の結合部位を少なくとも１つ、含有し；任意選択的に細胞表面受容体は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ｃ−Ｋｉｔ、ＡＸＬ、ＡＬＫ、ＣＥＡ、ＣＤ４４、ＥＰＣＡＭおよびＥｐｈＡ２から選択され、ここで、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位および第二の結合部位は、タンデムＦｃ（ＴＦｃ）を介して連結されており；ＴＦｃは、第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域を含有し、当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域の各々は、Ｃ末端とＮ末端を有し；当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域は、Ｃ末端とＮ末端を有するＴＦｃリンカーを介して連結され連続的なポリペプチドを形成し；および、当該第一および第二のＦｃ領域は結合し、Ｆｃ二量体を形成する。
２．実施態様１のＴＦｃＢＡであって、ここで、
ａ．当該ＴＦｃＢＡは、１０ｎＭ以下または１ｎＭ以下または１００ｐＭ以下のＩＣ５０で、または、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％の最大阻害割合（少なくとも１つの第二の結合部位により特異的に結合されたｃ−Ｍｅｔおよび受容体のいずれか、または両方のリン酸化の阻害により示される）で、少なくとも１つの第二の結合部位により特異的に結合されるＨＧＦおよび当該受容体の関連リガンドのいずれかまたは両方により誘導されるシグナル伝達を阻害し；または、
ｂ．細胞中でＴＦｃＢＡを発現することにより（ｉ）ＴＦｃを含有しない多価抗体の発現と比較し、より正確に形成されたＴＦｃＡＢ分子、または、（ｉｉ）８０％を超える正確に形成されたＴＦｃＡＢ分子（サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により示される）、が産生される、当該ＴＦｃＢＡ。
３．当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域が、第一および第二のＣＨ３ドメインをそれぞれ含有し、当該各ＣＨ３ドメインがＣ末端およびＮ末端を有している、実施態様１または２のＴＦｃＢＡ。
４．当該第一および第二のＦｃ領域が、第一および第二のＣＨ２ドメインをそれぞれ含有し、当該各ＣＨ２ドメインがＣ末端およびＮ末端を有している、実施態様１〜３のいずれかのＴＦｃＢＡ。
５．当該第一および第二のＦｃ領域が、第一および第二のヒンジをそれぞれ含有し、当該第一のヒンジおよび当該第二のヒンジがＣ末端およびＮ末端を有している、実施態様１〜４のいずれかのＴＦｃＢＡ。
６．当該第二のヒンジが、上部ヒンジサブドメインを含有しない、実施態様１〜５のいずれかのＴＦｃＢＡ。
７．当該ＴＦｃＢＡに含有されているＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様６のＴＦｃＢＡ：第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。
８．当該ＴＦｃＢＡに含有されているＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様６のＴＦｃＢＡ：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。
９．当該ＴＦｃＢＡに含有されているＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様６のＴＦｃＢＡ：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のヒンジ、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。
１０．当該第一のヒンジが、上部ヒンジサブドメイン、コアヒンジサブドメイン、および株ヒンジサブドメインを含有し、ならびに、第二のヒンジが、コアヒンジサブドメインおよび下部ヒンジサブドメインを含有するが、上部ヒンジドメインは含有せず、当該各ヒンジサブドメインはＣ末端およびＮ末端を有している、実施態様９のＴＦｃＢＡ。
１１．当該ＴＦｃＢＡに含有されているＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様１〜１０のいずれか１つのＴＦｃＢＡ：第一のヒンジがあり、そのＣ末端で第一のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第一のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端でＴＦｃリンカーのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第二のヒンジのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第二のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第二のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結される。
１２．当該ＴＦｃリンカーが２０〜５０ａａを含有する、実施態様１〜１１のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
１３．当該ＴＦｃリンカーが、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーである、実施態様１２のＴＦｃＢＡ。
１４．当該ＴＦｃリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含有し、ここで、ｎは、４、５、６、７または８である、実施態様１３のＴＦｃＢＡ。
１５．当該ＴＦｃが、ＩｇＧ１のＴＦｃである、実施態様１〜１４のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
１６．当該ＴＦｃが、ハイブリッドＴＦｃである、実施態様１〜１４のいずれかのＴＦｃＢＡ。
１７．当該ＴＦｃが、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ ＴＦｃである、実施態様１６のＴＦｃＢＡ。
１８．当該ＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様１５のＴＦｃＢＡ：第一のＩｇＧ１ヒンジ、第一のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、第一のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＩｇＧ１ヒンジ、第二のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、および第二のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン。
１９．当該ハイブリッドＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様１７のＴＦｃＢＡ：第一のＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジ、第一のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、第一のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＩｇＧ４ヒンジ、第二のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、および第二のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン。
２０．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインのいずれか、または両方が、当該第一および第二のＦｃ領域の間の結合を増強または安定化させるａａ修飾を１以上含有する、実施態様１〜１９のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
２１．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインの各々が、アミノ酸修飾を含有し、その修飾は、当該第一のＣＨ３ドメインと第二のＣＨ３ドメインの結合を増強するＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＡＥＭ）である、実施態様２０のＴＦｃＢＡ。
２２．当該ＡＥＭは、ＡＥＭモジュール１、ＡＥＭモジュール２、ＡＥＭモジュール３およびＡＥＭモジュール４からなる群から選択されるモジュールにより含有される、実施態様２１のＴＦｃＢＡ。
２３．当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、挿入または置換としてシステインを付加するａａ修飾を含有し、当該システインは、他のＦｃ領域のシステインとジスルフィド結合を形成する（ＤｉＳ修飾）、実施態様１〜２２のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
２４．当該第一および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、ヒンジにおいてＤｉＳ修飾を含有する、実施態様２３のＴＦｃＢＡ。
２５．当該第一および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、ＣＨ３ドメインにＤｉＳ修飾を含有する、実施態様２３のＴＦｃＢＡ。
２６．当該ＤｉＳ修飾は、ＤｉＳモジュール１またはＤｉＳモジュール２により含有される、実施態様２３〜２５のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
２７．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインの各々が、１以上のＡＥＭおよび１以上のＤｉＳ修飾を含有する、実施態様１〜２６のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
２８．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインのいずれか、または両方が、配列番号２７〜９８からなる群から選択されるａａ配列に少なくとも７０％同一であるか、または、最大で３０ａａの付加、欠失または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有する、実施態様１〜２７のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
２９．当該第一のＣＨ３ドメインまたは第二のＣＨ３ドメインが、配列番号２７〜９８からなる群から選択されるａａ配列を含有する、実施態様２８のＴＦｃＢＡ。
３０．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインが共に、２つの異なるメンバーの対を含有し、各メンバーは、ＣＨ３のａａ配列であり、各対は、配列番号３１および３５配列番号３３および３７配列番号３９および４３配列番号４１および４５配列番号４７および５１配列番号４９および５３配列番号５５および５９配列番号５７および６１配列番号６３および６７配列番号６５および６９配列番号７１および７３配列番号７２および７４配列番号７５および７９配列番号７７および８１配列番号８３および８５配列番号８４および８６配列番号８７および８９配列番号８８および９０配列番号９１および９３配列番号９２および９４配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなる対の群から選択され、各メンバーのａａ配列は、各当該対の各配列と少なくとも７０％同一であるか、または、最大で３０のａａ付加、欠失または置換という点で各当該対の各配列から異なっており、ここで、当該第一のＣＨ３ドメインは、第二のＣＨ３ドメインにより含有される対とは異なるメンバーを含有する、実施態様１〜２８のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
３１．当該第一および第二のＣＨ３ドメインはそれぞれ、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに、配列番号９６および９８からなる群から選択されるＣＨ３のａａ配列の対のメンバーのａａ配列と同一であるａａ配列を含有する、実施態様３０のＴＦｃＢＡ。
３２．当該第一のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列から、最大で３のａａ欠失、付加、または置換という点において異なっているａａ配列を含有する、実施態様１〜３１のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
３３．当該第一のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列である、配列を含有する、実施態様３２のＴＦｃＢＡ。
３４．当該第二のヒンジは、配列番号２３、２４、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列から、最大で３のａａ欠失、付加または置換という点において異なっているａａ配列を含有する、実施態様１〜３３のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
３５．当該第二のヒンジは、配列番号２３、２４、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａであるａａ配列を含有する、実施態様３４のＴＦｃＢＡ。
３６．配列番号２５、２６、２６１または２６２と少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で３０のａａ欠失、付加、または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有するＣＨ２ドメインを含有する、実施態様１〜３５のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
３７．当該ＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様１〜３６のいずれか１つのＴＦｃＢＡ：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、第二のヒンジ、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン、であって、ここで、
ａ．当該第一のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列を含有し；
ｂ．当該第一のＣＨ２ドメインは、グリコシル化されておらず、および、配列番号２５として記述されるａａ配列を含有し；
ｃ．当該第一のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列であるａａ配列を含有し；
ｄ．第二のヒンジは、配列番号２３、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択される配列からなるａａ配列を含有し；
ｅ．第二のＣＨ２ドメインはグリコシル化されておらず、および、配列番号２５において記述されるａａ配列を含有し；ならびに、
ｆ．第二のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列であるａａ配列を含有し、ここで、もし第一のＣＨ３ドメインが、配列対の第一の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは、配列対の第二の配列を含有し；および、もし第一のＣＨ３ドメインが配列対の第二の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは配列対の第一の配列を含有する。
３８．ＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様１〜３６のいずれか１つのＴＦｃＢＡ：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、第二のヒンジ、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン、ここで、
ａ．第一のヒンジは、配列番号２０、２１、２２、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列を含有し；
ｂ．第一のＣＨ２ドメインは、グリコシル化されておらず、および、配列番号２６に記述されるａａ配列を含有し；
ｃ．第一のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列であるａａ配列を含有し；
ｄ．第二のヒンジは、配列番号からなるａａ配列を含有し；
ｅ．第二のＣＨ２ドメインは、グリコシル化されておらず、および、配列番号２６に記述されるａａ配列を含有し；ならびに、
ｆ．第二のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列であるａａ配列を含有し、ここで、もし第一のＣＨ３ドメインが、配列対の第一の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは、配列対の第二の配列を含有し；および、もし第一のＣＨ３ドメインが配列対の第二の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは配列対の第一の配列を含有する。
３９．当該第一または第二のＦｃ領域は、配列番号９９−１６６からなる群から選択されるａａ配列に対し少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で５０ａａの欠失、付加または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有する、実施態様１〜３８のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
４０．当該第一または第二のＦｃ領域が、配列番号９９〜１６６からなる群から選択されるａａ配列を含有する、実施態様３９のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
４１．当該第一および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、配列番号９９および１００、配列番号１０１および１０２、配列番号１０３および１０４、配列番号１０５および１０６、配列番号１０７および１０８、配列番号１０９および１１０、配列番号１１１および１１２、配列番号１１３および１１４、配列番号１１５および１１６、配列番号１１７および１１８、配列番号１１９および１２０、配列番号１２１および１２２、配列番号１２３および１２４、配列番号１２５および１２６、配列番号１２７および１２８、配列番号１２９および１３０、配列番号１３１および１３２、配列番号１３３および１３４、配列番号１３５および１３６、配列番号１３７および１３８、配列番号１３９および１４０、配列番号１４１および１４２、配列番号１４３および１４４、配列番号１４５および１４６、配列番号１４７および１４８、配列番号１４９および１５０、配列番号１５１および１５２、配列番号１５３および１５４、配列番号１５５および１５６、配列番号１５７および１５８、配列番号１５９および１６０、配列番号１６１および１６２、配列番号１６３および１６４、ならびに配列番号１６５および１６６からなる群から選択されるａａ配列の対の１つのａａ配列に対し少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で５０のａａ欠失、付加または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有し、ここで、当該第一のＦｃ領域は、第二のＦｃ領域により含有されるものとは異なる対のメンバーを含有する、実施態様３９のＴＦｃＢＡ。
４２．当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域はともに、２つの異なるメンバーの対を含有し、各メンバーは、Ｆｃのａａ配列である実施態様４０のＴＦｃＢＡであって、ここで、各対は、配列番号９９および１００、配列番号１０１および１０２、配列番号１０３および１０４、配列番号１０５および１０６、配列番号１０７および１０８、配列番号１０９および１１０、配列番号１１１および１１２、配列番号１１３および１１４、配列番号１１５および１１６、配列番号１１７および１１８、配列番号１１９および１２０、配列番号１２１および１２２、配列番号１２３および１２４、配列番号１２５および１２６、配列番号１２７および１２８、配列番号１２９および１３０、配列番号１３１および１３２、配列番号１３３および１３４、配列番号１３５および１３６、配列番号１３７および１３８、配列番号１３９および１４０、配列番号１４１および１４２、配列番号１４３および１４４、配列番号１４５および１４６、配列番号１４７および１４８、配列番号１４９および１５０、配列番号１５１および１５２、配列番号１５３および１５４、配列番号１５５および１５６、配列番号１５７および１５８、配列番号１５９および１６０、配列番号１６１および１６２、配列番号１６３および１６４、ならびに配列番号１６５および１６６からなる対の群から選択され、各メンバーのａａ配列は、当該各対の各配列に対し少なくとも７０％同一であるか、または当該各対の各配列から最大で３０のａａ付加、欠失または置換という点で異なっており、ここで、当該第一のＦｃ領域は、第二のＦｃ領域により含有されるものとは異なる対のメンバーを含有する、ＴＦｃＢＡ。
４３．配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９および２２１からなる群から選択されるａａ配列に対し少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で３０のａａ付加、欠失、または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有するＴＦｃを含有する、実施態様１〜４２のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
４４．配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９および２２１からなる群から選択されるａａ配列を含有するＴＦｃを含有する実施態様４３のＴＦｃＢＡ。
４５．アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する重鎖を含有する実施態様１〜４４のいずれか１つのＴＦｃＢＡ：第一の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ＴＦｃ、連結リンカー、および第二のＶＨドメイン。
４６．当該重鎖が、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する実施態様４５のＴＦｃＢＡ：第一のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、連結リンカー、および第二のＶＨドメイン。
４７．当該重鎖が、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する実施態様４６のＴＦｃＢＡ：第一のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、連結リンカー、第二のＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー、および第二の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、ここで、当該第二のＶＨおよびＶＬドメインは、結合して、第二の結合部位を形成する。
４８．第一のＶＨドメインと二量体化して第一の結合部位を形成する第一のＶＬドメインを含有する軽鎖を含有する、実施態様４７のＴＦｃＢＡ。
４９．当該軽鎖がＶＬドメインのカルボキシ末端に連結されている軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含有する、実施態様４８のＴＦｃＢＡ。
５０．当該第一の結合部位が、Ｎ末端結合部位であり、当該第二の結合部位が、Ｃ末端結合部位である、実施態様１〜４９のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
５１．当該抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位が、ａ）配列番号２２３または２８７のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）３（ＶＨＣＤＲ３）のａａ配列、および、ｂ）配列番号２３１または２８９のＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含有するＶＬＣＤＲ３、のいずれかまたは両方を含有するＶＨを含有する、実施態様１〜５０のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
５２．当該抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位が、ＶＨＣＤＲ１、ＶＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含有する３つのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含有するＶＨドメインを含有し、ここで、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３は、配列番号２２３または２３１のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含有し；および、ＶＬドメインは、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含有する３つのＶＬＣＤＲのセットを含有し、ここで、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２８７または２８９のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含有する、実施態様１〜５１のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
５３．当該第二の結合部位が、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７または２７９のＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含有するＶＨＣＤＲ３、および、ｂ）配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７または２７９のＶＬＣＤＲ３のａａの配列を含有するＶＬＣＤＲ３、のいずれかまたは両方を含有する抗ＥＧＦＲ結合部位である、実施態様１〜５２のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
５４．当該第二の結合部位が、ＶＨＣＤＲ１、ＶＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含有する３つのＶＨＣＤＲのセットを含有するＶＨドメインを含有する抗ＥＧＦＲ結合部位であり、ここで、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３は、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７または２７９のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含有し；および、ＶＬドメインは、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含有する３つのＶＬＣＤＲのセットを含有し、ここで、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７または２７９のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含有する、実施態様１〜５３のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
５５．当該抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位が、重鎖のＮ末端部分および軽鎖のＮ末端部分を含有する、実施態様１〜５４のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
５６．当該第二の結合部位が、当該重鎖により完全に含有されているＣ末端ｓｃＦｖにより含有されている、実施態様１〜５５のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
５７．当該抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位が、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのいずれか、または両方により包含されており、ここで、当該ＶＨドメインが、配列番号２２３、２３１、２８７または２８９に記述されているＶＨドメインに対し少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で１０ａａの欠失、付加または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有し；および、ＶＬドメインは、配列番号２２３、２３１、２８７または２８９に記述されているＶＬドメインに対し少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で１０ａａの欠失、付加または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有する、実施態様１〜５６のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
５８．当該第二の結合部位が、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのいずれか、または両方により含有される抗ＥＧＦＲ結合部位であり、ここで、当該ＶＨドメインは、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７または２７９に記述されているＶＨドメインに対し少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で１０ａａの欠失、付加または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有し；および、ＶＬドメインは、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７または２７９に記述されているＶＬドメインに対し少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で１０ａａの欠失、付加または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有する、実施態様１〜５７のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
５９．ＴＦｃＢＡであるＡｂであって、ここで、当該ＴＦｃＢＡは第一の結合部位および第二の結合部位を含有し、ここで、当該第一の結合部位は第一の標的に結合し、および、第二の結合部位は第二の標的に結合し、ならびに、ここで、当該第一および第二の結合部位はＴＦｃを介して連結されており；当該ＴＦｃは、第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域を含有し、当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域の各々は、Ｃ末端およびＮ末端を有し；当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域は、Ｃ末端およびＮ末端を有するＴＦｃリンカーを介して連結し連続的なポリペプチドを形成し；当該第一および第二のＦｃ領域は結合してＦｃ二量体を形成し；ならびに、当該第一および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方は、１以上のａａ修飾を含有して、当該第一および第二のＦｃ領域の間の結合を増強または安定化させる、Ａｂ。
６０．実施態様５９のＴＦｃＢＡであって、ここで、
ａ．当該ＴＦｃＢＡは、第一および第二の標的のいずれか、または両方を介してシグナル伝達を阻害するか；または、
ｂ．細胞でのＴＦｃＢＡの発現により、（ｉ）ＴＦｃを含有していない多価抗体の発現と比較し、より多くの正しく形成されたＴＦｃＢＡ分子が産生されるか、または、（ｉｉ）正しく形成されたＴＦｃＢＡ分子が８０％を超えて産生される（ＳＥＣにより測定）、ＴＦｃＢＡ。
６１．実施態様５９または６０のＴＦｃＢＡであって、ここで、当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域は、それぞれ、第一および第二のＣＨ３ドメインを含有し、当該ＣＨ３ドメインの各々は、Ｃ末端およびＮ末端を有している、ＴＦｃＢＡ。
６２．実施態様５９〜６１のいずれか１つのＴＦｃＢＡであって、ここで、当該第一および第二のＦｃ領域は、ぞれぞれ、第一および第二のＣＨ２ドメインを含有し、当該ＣＨ２ドメインの各々は、Ｃ末端およびＮ末端を有している、ＴＦｃＢＡ。
６３．実施態様５９〜６２のいずれか１つのＴＦｃＢＡであって、ここで、当該第一および第二のＦｃ領域は、ぞれぞれ、第一および第二のヒンジを含有し、当該第一および第二のヒンジの各々は、Ｃ末端およびＮ末端を有している、ＴＦｃＢＡ。
６４．当該第二のヒンジが、上部ヒンジサブドメインを含有しない、実施態様５９〜６３のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
６５．ＴＦｃＢＡに含有されているＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有している、実施態様６４のＴＦｃＢＡ：第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。
６６．ＴＦｃＢＡに含有されているＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有している、実施態様６４のＴＦｃＢＡ：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。
６７．ＴＦｃＢＡに含有されているＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有している、実施態様６４のＴＦｃＢＡ：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のヒンジ、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。
６８．当該第一のヒンジが、上部ヒンジサブドメイン、コアヒンジサブドメイン、および下部ヒンジサブドメインを含有し、ならびに、第二のヒンジが、コアヒンジサブドメインおよび下部ヒンジサブドメインを含有するが、上部ヒンジドメインは含有せず、当該各ヒンジサブドメインはＣ末端およびＮ末端を有している、実施態様６７のＴＦｃＢＡ。
６９．当該ＴＦｃＢＡに含有されているＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様５９〜６８のいずれか１つのＴＦｃＢＡ：第一のヒンジがあり、そのＣ末端で第一のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第一のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端でＴＦｃリンカーのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第二のヒンジのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第二のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第二のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結される、ＴＦｃＢＡ。
７０．当該ＴＦｃリンカーが、２０〜５０ａａを含有する、実施態様５９〜６９のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
７１．当該ＴＦｃリンカーが、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーである、実施態様７０のＴＦｃＢＡ。
７２．当該ＴＦｃリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含有し、ここで、ｎは、４、５、６、７または８である、実施態様７１のＴＦｃＢＡ。
７３．当該ＴＦｃが、ＩｇＧ１ ＴＦｃである、実施態様５９〜７２のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
７４．当該ＴＦｃが、ハイブリッドＴＦｃである、実施態様５９〜７２のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
７５．当該ＴＦｃが、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ ＴＦｃである、実施態様７４のＴＦｃＢＡ。
７６．当該ＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様７３のＴＦｃＢＡ：第一のＩｇＧ１ヒンジ、第一のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、第一のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＩｇＧ１ヒンジ、第二のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、および第二のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン。
７７．当該ハイブリッドＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様７５のＴＦｃＢＡ：第一のＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジ、第一のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、第一のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＩｇＧ４ヒンジ、第二のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、および第二のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン。
７８．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインのいずれか、または両方が、当該第一および第二のＦｃ領域の間の結合を増強または安定化させるａａ修飾を１以上含有する、実施態様５９〜７７のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
７９．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインの各々が、アミノ酸修飾を含有し、その修飾は、当該第一のＣＨ３ドメインと第二のＣＨ３ドメインの結合を増強するＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＡＥＭ）である、実施態様７８のＴＦｃＢＡ。
８０．当該ＡＥＭは、ＡＥＭモジュール１、ＡＥＭモジュール２、ＡＥＭモジュール３およびＡＥＭモジュール４からなる群から選択されるモジュールにより含有される、実施態様７９のＴＦｃＢＡ。
８１．当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、挿入または置換としてシステインを付加するａａ修飾を含有し、当該システインは、他のＦｃ領域のシステインとジスルフィド結合を形成する（ＤｉＳ修飾）、実施態様１〜８０のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
８２．当該第一および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、ヒンジにおいてＤｉＳ修飾を含有する、実施態様８１のＴＦｃＢＡ。
８３．当該第一および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、ＣＨ３ドメインにＤｉＳ修飾を含有する、実施態様８１のＴＦｃＢＡ。
８４．当該ＤｉＳ修飾は、ＤｉＳモジュール１またはＤｉＳモジュール２により含有される、実施態様８０〜８３のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
８５．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインの各々が、１以上のＡＥＭおよび１以上のＤｉＳ修飾を含有する、実施態様５９〜８４のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
８６．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインのいずれか、または両方が、配列番号２７〜９８からなる群から選択されるａａ配列に少なくとも７０％同一であるａａ配列か、または、最大で３０ａａの付加、欠失または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有する、実施態様１〜８５のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
８７．当該第一のＣＨ３ドメインまたは第二のＣＨ３ドメインが、配列番号２７〜９８からなる群から選択されるａａ配列を含有する、実施態様２８のＴＦｃＢＡ。
８８．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインが共に、２つの異なるメンバーの対を含有し、各メンバーは、ＣＨ３のａａ配列であり、各対は、配列番号３１ ａｎｄ ３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなる対の群から選択され、各メンバーのａａ配列は、各当該対の各配列と少なくとも７０％同一であるか、または、最大で３０のａａ付加、欠失または置換という点で各当該対の各配列から異なっており、ここで、当該第一のＣＨ３ドメインは、第二のＣＨ３ドメインにより含有されるものとは異なる対のメンバーを含有する、実施態様１〜８６のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
８９．当該第一および第二のＣＨ３ドメインはそれぞれ、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなる群から選択されるＣＨ３のａａ配列の対のメンバーのａａ配列と同一であるａａ配列を含有する、実施態様８８のＴＦｃＢＡ。
９０．当該第一のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列から、最大で３のａａ欠失、付加、または置換という点において異なっているａａ配列を含有する、実施態様５９〜８９のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
９１．当該第一のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列である、配列を含有する、実施態様９０のＴＦｃＢＡ。
９２．当該第二のヒンジは、配列番号２３、２４、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列から、最大で３のａａ欠失、付加または置換という点において異なっているａａ配列を含有する、実施態様５９〜９１のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
９３．当該第二のヒンジは、配列番号２３、２４、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａであるａａ配列を含有する、実施態様９２のＴＦｃＢＡ。
９４．配列番号２５、２６、２６１または２６２と少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で３０のａａ欠失、付加、または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有するＣＨ２ドメインを含有する、実施態様５９〜９３のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
９５．当該ＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様１〜９４のいずれか１つのＴＦｃＢＡ：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、第二のヒンジ、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン、であって、ここで、
ａ．当該第一のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列を含有し；
ｂ．当該第一のＣＨ２ドメインは、グリコシル化されておらず、および、配列番号２５として記述されるａａ配列を含有し；
ｃ．当該第一のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列であるａａ配列を含有し；
ｄ．第二のヒンジは、配列番号２３、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択される配列からなるａａ配列を含有し；
ｅ．第二のＣＨ２ドメインはグリコシル化されておらず、および、配列番号２５において記述されるａａ配列を含有し；ならびに、
ｆ．第二のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列であるａａ配列を含有し、ここで、もし第一のＣＨ３ドメインが、配列対の第一の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは、配列対の第二の配列を含有し；および、もし第一のＣＨ３ドメインが配列対の第二の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは配列対の第一の配列を含有する。
９６．ＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様５９〜９４のいずれか１つのＴＦｃＢＡ：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、第二のヒンジ、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン、ここで、
ａ．第一のヒンジは、配列番号２０、２１、２２、２６３−２６５および２６７−２７３からなる群から選択されるａａ配列を含有し；
ｂ．第一のＣＨ２ドメインは、グリコシル化されておらず、および、配列番号２６に記述されるａａ配列を含有し；
ｃ．第一のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列であるａａ配列を含有し；
ｄ．第二のヒンジは、配列番号からなるａａ配列を含有し；
ｅ．第二のＣＨ２ドメインは、グリコシル化されておらず、および、配列番号２６に記述されるａａ配列を含有し；ならびに、
ｆ．第二のＣＨ３ドメインは、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される配列対のいずれか配列であるａａ配列を含有し、ここで、もし第一のＣＨ３ドメインが、配列対の第一の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは、配列対の第二の配列を含有し；および、もし第一のＣＨ３ドメインが配列対の第二の配列を含有する場合、第二のＣＨ３ドメインは配列対の第一の配列を含有する。
９７．当該第一または第二のＦｃ領域は、配列番号９９−１６６からなる群から選択されるａａ配列に対し少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で５０ａａの欠失、付加または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有する、実施態様５９〜９６のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
９８．当該第一または第二のＦｃ領域が、配列番号９９〜１６６からなる群から選択されるａａ配列を含有する、実施態様９７のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
９９．当該第一および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、配列番号９９および１００、配列番号１０１および１０２、配列番号１０３および１０４、配列番号１０５および１０６、配列番号１０７および１０８、配列番号１０９および１１０、配列番号１１１および１１２、配列番号１１３および１１４、配列番号１１５および１１６、配列番号１１７および１１８、配列番号１１９および１２０、配列番号１２１および１２２、配列番号１２３および１２４、配列番号１２５および１２６、配列番号１２７および１２８、配列番号１２９および１３０、配列番号１３１および１３２、配列番号１３３および１３４、配列番号１３５および１３６、配列番号１３７および１３８、配列番号１３９および１４０、配列番号１４１および１４２、配列番号１４３および１４４、配列番号１４５および１４６、配列番号１４７および１４８、配列番号１４９および１５０、配列番号１５１および１５２、配列番号１５３および１５４、配列番号１５５および１５６、配列番号１５７および１５８、配列番号１５９および１６０、配列番号１６１および１６２、配列番号１６３および１６４、ならびに配列番号１６５および１６６からなる群から選択されるａａ配列の対の１つのａａ配列に対し少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で５０のａａ欠失、付加または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有し、ここで、当該第一のＦｃ領域は、第二のＦｃ領域により含有されるものとは異なる対のメンバーを含有する、実施態様９７のＴＦｃＢＡ。
１００．当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域はともに、２つの異なるメンバーの対を含有し、各メンバーは、Ｆｃのａａ配列である実施態様９９のＴＦｃＢＡであって、ここで、各対は、配列番号９９および１００、配列番号１０１および１０２、配列番号１０３および１０４、配列番号１０５および１０６、配列番号１０７および１０８、配列番号１０９および１１０、配列番号１１１および１１２、配列番号１１３および１１４、配列番号１１５および１１６、配列番号１１７および１１８、配列番号１１９および１２０、配列番号１２１および１２２、配列番号１２３および１２４、配列番号１２５および１２６、配列番号１２７および１２８、配列番号１２９および１３０、配列番号１３１および１３２、配列番号１３３および１３４、配列番号１３５および１３６、配列番号１３７および１３８、配列番号１３９および１４０、配列番号１４１および１４２、配列番号１４３および１４４、配列番号１４５および１４６、配列番号１４７および１４８、配列番号１４９および１５０、配列番号１５１および１５２、配列番号１５３および１５４、配列番号１５５および１５６、配列番号１５７および１５８、配列番号１５９および１６０、配列番号１６１および１６２、配列番号１６３および１６４、ならびに配列番号１６５および１６６からなる対の群から選択され、各メンバーのａａ配列は、当該各対の各配列に対し少なくとも７０％同一であるか、または当該各対の各配列から最大で３０のａａ付加、欠失または置換という点で異なっており、ここで、当該第一のＦｃ領域は、第二のＦｃ領域により含有されるものとは異なる対のメンバーを含有する、ＴＦｃＢＡ。
１０１．配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９および２２１からなる群から選択されるａａ配列に対し少なくとも７０％同一であるａａ配列、または、最大で３０のａａ付加、欠失、または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有するＴＦｃを含有する、実施態様５９〜１００のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
１０２．配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９および２２１からなる群から選択されるａａ配列を含有するＴＦｃを含有する実施態様１０１のＴＦｃＢＡ。
１０３．アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する重鎖を含有する実施態様５９〜１０２のいずれか１つのＴＦｃＢＡ：第一の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ＴＦｃ、連結リンカー、および第二のＶＨドメイン。
１０４．当該重鎖が、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する実施態様１０３のＴＦｃＢＡ：第一のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、連結リンカー、および第二のＶＨドメイン。
１０５．当該重鎖が、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する実施態様１０４のＴＦｃＢＡ：第一のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、連結リンカー、第二のＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー、および第二の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、ここで、当該第二のＶＨおよびＶＬドメインは、結合して、第二の結合部位を形成する。
１０６．第一のＶＨドメインと二量体化して第一の結合部位を形成する第一のＶＬドメインを含有する軽鎖を含有する、実施態様１０５のＴＦｃＢＡ。
１０７．当該軽鎖がＶＬドメインのカルボキシ末端に連結されている軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含有する、実施態様１０６のＴＦｃＢＡ。
１０８．当該第一の結合部位が、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位であり、および当該第二の結合部位が、抗ＥＧＦＲ結合部位である、実施態様５９〜１０７のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
１０９．ＴＦｃリンカーを介して連結されている第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域を含有するＴＦｃに連結されている結合部位を含有する一価ＴＦｃＡであって、ここで、当該第一および第二のＦｃ領域は結合してＦｃを形成し、および、ここで、当該第一および第二のＦｃ領域のいずれか、または両方が、当該第一および第二のＦｃ領域の間の結合を増強または安定化させるａａ修飾を１つ以上含有する、一価ＴＦｃＡ。
１１０．電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡである実施態様１〜１０９のいずれか１つのＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡであって、ここで、
電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、Ａ群から選択されるアミノ酸とＢ群から選択されるアミノ酸を含有する荷電アミノ酸の対（電荷相補対）を含有し、ここで、Ａ群は、７を超えるｐＩを有するすべての天然型アミノ酸が含まれ、および、Ｂ群は、７未満のｐＩを有する全ての天然型アミノ酸が含まれ、または、任意選択的に、Ａ群はＨｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含み、ならびに、Ｂ群は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、およびＰｒｏを含有し；ならびに、
当該電荷相補対は、第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸残基からなり、および、
当該電荷相補対は、２９７位の電荷相補対または２９９位の電荷相補対であり、ここで、
２９７位の電荷相補対は、当該第一のＦｃ領域の２９７ＥＵ位に位置する当該第一アミノ酸残基および当該第二のＦｃ領域の２９７ＥＵ位に位置する当該第二のアミノ酸残基を有する電荷相補対であり、および、２９９位の電荷相補対は、当該第一のＦｃ領域の２９９ＥＵ位に位置する当該第一アミノ酸残基および当該第二のＦｃ領域の２９９ＥＵ位に位置する当該第二のアミノ酸残基を有する電荷相補対である。
１１１．当該電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、２９７位の電荷相補対および２９９位の電荷相補対の両方を含有し、ここで、２９７位の電荷相補対の当該第一および第二のアミノ酸残基は、２９９位の電荷相補対の当該第一および第二のアミノ酸残基と同一、または異なっている、実施態様１１０の電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡ。
１１２．当該電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、２９７位の電荷相補対を含有し、および、ここで、当該電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡではないＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡよりも安定であるが、第一および第二のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は両方とも、同じ荷電アミノ酸からなる残基であることを除き、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡと同一であり、当該同じ荷電アミノ酸は、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの２９７位の電荷相補対のアミノ酸のうちの１つである、実施態様１１０または１１１の電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡ。
１１３．当該電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、２９９位の電荷相補対を含有し、および、ここで、当該電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡではないＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡよりも安定であるが、第一および第二のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は両方とも、同じ荷電アミノ酸からなる残基であることを除き、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡと同一であり、当該同じ荷電アミノ酸は、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの２９９位の電荷相補対のアミノ酸のうちの１つである、実施態様１１０、１１１または１１２の電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡ。
１１４．当該第一または第二の結合部位は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、Ｒｏｎ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１ ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、 ＦＧＦＲ４、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭおよびＥｐｈＡ２からなる群から選択されるヒトタンパク質二特異的に結合する、実施態様５９〜１１３のいずれか１つのＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡ。
１１５．実施態様１〜１１４のいずれか１つのＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡ、および薬学的に受容可能な担体を含有する医薬組成物。
１１６．少なくとも１つのコード配列を含有する核酸分子であって、当該少なくとも１つのコード配列は、実施態様１〜１１４のいずれか１つのＴＦｃＡもしくはＴＦｃＢＡの重鎖または軽鎖をコードする、核酸分子。
１１７．少なくとも２つのコード配列を含有する核酸分子であって、ここで、１つのコード配列は、実施態様１〜１１４のいずれか１つのＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの重鎖をコードし、および、第二のコード配列は、ＴＦｃＢＡの軽鎖をコードする、核酸分子。
１１８．実施態様１１６または１１７の核酸分子を１つ以上含有するベクター。
１１９．実施態様１１６または１１７の核酸分子、または実施態様１１８のベクターを１以上含有する細胞。
１２０．実施態様１〜１１４のいずれか１つのＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの重鎖をコードする核酸分子、および、ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの軽鎖をコードする核酸分子を含有する細胞。
１２１．核酸が発現される条件下で実施態様１１９または１２０の宿主細胞を培養すること、および、ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡを単離すること、を含む、ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡを製造する方法。
１２２．ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの発現に適した条件下で実施態様１１９または１２０の細胞を培養することを含む、ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡを製造する方法。
１２３．癌を有する対象を治療する方法であって、実施態様１〜１２０のいずれか１つのＴＦｃＡもしくはＴＦｃＢＡ、核酸分子、またはベクターの治療有効量を対象に投与することを含む、方法。
さらなる例示的な実施態様には、限定されないが、包含されうる本発明の主題に関連し、以下の構成要素が含まれる。
Ａ１´． ２つのポリペプチド鎖（大きな鎖とＦａｂ軽鎖であり、各鎖はＣ末端とＮ末端を有する）を含有するタンデムＦｃ二重特異性抗体（ＴＦｃＢＡ）であり、当該ＴＦｃＢＡは、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖を含有するＦａｂ部分により包含される第一の結合部位を含有し、当該Ｆａｂ重鎖は、大きな鎖のＮ末端であり、当該Ｆａｂ部分は、ｃＭＥＴに特異的に結合し、および、当該ＴＦｃＢＡはさらに、大きな鎖のＣ末端で一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）により包含される第二の結合部位を含有し、当該ｓｃＦｖはＥｐＣＡＭに特異的に結合し、ここで：
（ａ）Ｆａｂ重鎖およびｓｃＦｖ部分は、タンデムＦｃを介して連結され（ＴＦｃ）；
（ｂ）ＴＦｃは、大きな鎖により含有され、および、第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域を有し、それらは、ＴＦｃリンカーを介して連結され、連続的なポリペプチドを形成し；および、
（ｃ）第一および第二のＦｃ領域は結合してＦｃ二量体を形成し、および、さらに、ここで、
（ｄ）Ｆａｂ軽鎖は、配列番号４００にある３つの軽鎖ＣＤＲを含有するアミノ酸配列を含有し；および、
（ｅ）Ｆａｂ重鎖は、配列番号４２３にある３つの重鎖ＣＤＲを含有するアミノ酸配列を含有する。
Ａ２´． 当該ｓｃＦｖ部分が、配列番号４８８のアミノ酸配列を含有する、実施態様Ａ１´のＴＦｃＢＡ。
Ａ３´． 当該ＴＦｃＢＡの大きな鎖が、Ｎ末端からＣ末端へ、以下の順で含有する実施態様Ａ１´またはＡ２´のＴＦｃＢＡ：
（ｉ）Ｆａｂ重鎖可変領域ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン；
（ｉｉ）ＩｇＧ１上部ヒンジならびにＩｇＧ４中部および下部ヒンジを含有するハイブリッドヒンジ；
（ｉｉｉ）Ｔ２９９Ｋ変異を含有する第一のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン；
（ｉｖ）Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を含有する第一のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン；
（ｖ）第一のジスルフィド架橋モチーフ（ＫＳＣＤＫＴ）；
（ｖｉ）任意選択的に、ａａ配列（Ｇ４Ｓ）８を含有するリンカーである、タンデムＦｃリンカー、；
（ｖｉｉ）ＩｇＧ４中部ヒンジおよび下部ヒンジ；
（ｖｉｉｉ）Ｔ２９９Ｄ変異を含有する第二のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン；
（ｉｘ）Ｔ３６６Ｗ変異を含有する第二のＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン；
（ｘ）第二のジスルフィド架橋モチーフ（ＧＥＣ）；
（ｘｉ）連結リンカー；および、
（ｘｉｉ）ｓｃＦｖ
Ａ４´． ＴＦｃＢＡが、約１０ｅ−８、１０ｅ−９、１０ｅ−１０、１０ｅ−１１、１０ｅ−１２、または１０ｅ−１３Ｍ未満のｃＭＥＴに対する結合のＫｄを示す、実施態様Ａ１´〜Ａ３´のＴＦｃＢＡ。
Ａ５´． ＴＦｃＢＡが、３．０ｘ１０ｅ−８〜２．５ｘ１０ｅ−９ＭのｃＭＥＴに対する結合のＫｄを示す、実施態様Ａ４´のＴＦｃＢＡ。
Ａ６´． ＴＦｃＢＡが、約１０ｅ−７もしくは１０ｅ−８、または任意選択的に１０ｅ−９ＭのＥｐＣＡＭに対する結合のＫｄを示す、実施態様Ａ１´〜Ａ３´のＴＦｃＢＡ。
Ａ７´． ＴＦｃＢＡが、１０ｅ−８〜１０ｅ−１１ＭのｃＭＥＴに対する結合のＫｄを示す、実施態様Ａ６´のＴＦｃＢＡ。
Ａ８´． ＴＦｃリンカー配列が、配列番号１６９のアミノ酸配列を含有する、実施態様Ａ１´〜Ａ３´のいずれかのＴＦｃＢＡ。
Ａ９´． ＴＦｃが、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、および、配列番号１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、実施態様Ａ１´〜Ａ３´のいずれかのＴＦｃＢＡ。
Ａ１０´． 配列番号４８９のアミノ酸配列を含有する大きな鎖を含有するＴＦｃＢＡ分子。
Ａ１１´． 上述の実施態様のうちのいずれか１つのＴＦｃＢＡの治療有効量を患者に投与することを含む、癌患者の治療方法であって、ここで、任意選択的に、当該治療有効量は、１００ｎｇ／ｋｇ（患者体重）〜１５ｍｇ／ｋｇ（患者体重）であり、および、ここで、さらに任意選択的に、当該治療有効量は、１ｍｇ／ｋｇ（患者体重）〜２５ｍｇ／ｋｇ（患者体重）である、治療方法。
Ａ１２´． 当該癌が、本明細書に開示されるタイプの癌であり、および、ここで、任意選択的に、当該治療有効量は、１ｍｇ／ｋｇ（患者体重）〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者体重）である、実施態様Ａ１１´の方法。
Ａ１３´． 癌患者における腫瘍の増殖を阻害する方法であって、当該方法は、実施態様Ａ１´〜Ａ１０´のいずれか１つのＴＦｃＢＡの治療有効量を患者に投与することを含み、および、ここで、任意選択的に、当該治療有効量は、１００ｎｇ／ｋｇ（患者体重）〜１５ｍｇ／ｋｇ（患者体重）、１ｍｇ／ｋｇ（患者体重）〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者体重）、または、１ｍｇ／ｋｇ（患者体重）〜２５ｍｇ／ｋｇ（患者体重）である、方法。
Ａ１４´． 腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、当該方法は、実施態様Ａ１´〜Ａ１０´のいずれか１つのＴＦｃＢＡの濃縮物を含有する液体と、腫瘍細胞を接触させることを含み、当該ＴＦｃＢＡの濃縮物は、腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効である、方法。
Ａ１５´． 実施態様Ａ１´〜Ａ１０´のいずれか１つのＴＦｃＢＡと、医薬担体を含有する医薬組成物。
Ａ１６´． 当該製剤は、注射、静脈注射、および／または、点滴に適した滅菌製剤である、実施態様Ａ１５´の医薬組成物。
Ａ１７´． 当該製剤が、薬学的に受容可能な容器にパッケージされている、実施態様Ａ１５´または実施態様Ａ１６´の医薬組成物。
Ａ１８´． 実施態様Ａ１´〜Ａ１０´のいずれか１つタンパク質アミノ酸配列をコードする核酸分子。
Ａ１９´． 実施態様Ａ１８´の核酸分子を含有するベクター。
Ａ２０´． 実施態様Ａ１８´の核酸分子を含有するベクターを含有する宿主細胞。
Ａ２１´． 当該宿主細胞は、当該コードされたタンパク質を発現する、実施態様Ａ２０´の宿主細胞。
Ａ２２´． ＴＦｃＢＡが細胞表面ｃ−Ｍｅｔおよび細胞表面ＥＰＣＡＭの両方を発現する細胞に接触している場合、接触後に細胞中で測定されるｃ−Ｍｅｔの総量は、接触前に同等の細胞で測定されたｃ−Ｍｅｔの総量よりも低い、実施態様Ａ１´〜Ａ１０´のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
Ａ２３´． ＴＦｃＢＡが細胞表面ｃ−Ｍｅｔおよび細胞表面ＥＰＣＡＭの両方を発現する細胞に接触している場合、細胞中で測定されるＥＰＣＡＭの総量は、実施的に変化しない、実施態様Ａ２２´のＴＦｃＢＡ。
抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲタンデムＦｃ二重特異性抗体（ＴＦｃＢＡ）の例示的な概略図（図１Ａ）および、タンデムＦｃ（ＴＦｃ）のドメインの各々における例示的な変異の概略図（図１Ｂ）である。図１Ａは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の３つのモジュールを含有する抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの例示的な概略図である：１）抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位からなる第一のモジュール；２）ＴＦｃからなる第二のモジュール；および、３）抗ＥＧＦＲ結合部位からなる第三のモジュール。例示されたＴＦｃＢＡにおいて、第一のモジュールは、抗ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂであり、第三のモジュールは、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖである。当該ＴＦｃは、ＴＦｃリンカーを介して連結されている２つのＦｃ領域を含有している。例示されたＴＦｃＢＡにおいて、第一のＦｃ領域は、全長ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジ、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含有し、および、第二のＦｃ領域は、ＩｇＧ４のコアヒンジおよび下部ヒンジ（しかし、上部ヒンジは含有しない）、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含有する。例示されたＴＦｃＢＡにおいて、ＣＨ３ドメインは、１以上のＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＡＥＭ）を含有し、それらは、２つのＣＨ３ドメインまたは２つのＦｃ領域の間の結合を増強させる。ＴＦｃＢＡはまた、修飾（ＤｉＳ）を形成するジスルフィド結合を１つ以上含有してもよく、それらはシステインを導入し、２つのＦｃ領域間のジスルフィド結合の形成を可能とする。図１Ｂは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で示すＴＦｃの構造の概略図である：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のヒンジ、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。これらドメインの各々に対する例示的な配列およびドメインの修飾は、以下の概略図に示す。各ＡＥＭまたはＤｉＳにおける第一または第二のＣＨ３修飾の名称は、修飾名の後のカッコ内に示され、「ＡＥＭ」または「Ｄｉｓ」の後の最初の数字は、それぞれ、ＡＥＭまたはＤｉＳのモジュール番号を指し、および、２番目の数字は、２つのＣＨ３ドメインの１つめ、または２つ目を指す。たとえば、「ＡＥＭ１．１」は、「Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ」置換の後に示されており、それら置換は、ＡＥＭモジュール１における修飾対の２つのＣＨ３ドメインのうちの１つにおける置換の組み合わせである。ＴＦｃのＣＨ３ドメインのうちの１つが、ＡＥＭおよび／またはＤｉＳの２つの修飾のうちの１つを含有し、他方のＣＨ３ドメインが第二（すなわち、適合性のある）のＡＥＭおよび／またはＤｉＳの修飾（複数含む）を含有している限りは、ＴＦｃが、これらドメインの各々の任意の組み合わせを含有しても良い。たとえば、もしＴＦｃのうちの１つのＣＨ３ドメインが、ＡＥＭ１．１を含有する場合、他方のＣＨ３ドメインは、ＡＥＭ１．２を含有する。「Ｃ末端システイン」とは、ＣＨ３の最後の３つのａａを、図中に示されるものと置換することによる、ＣＨ３ドメインにＣ末端システインを付加する修飾を指す。この図および他の図におけるａａ残基番号は、完全な抗体重鎖におけるものである（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）。 野生型および変異型のヒンジのａａ配列のアライメントである。ある位置でのダッシュ「−」は、その位置での図の最初の線におけるａａと同じａａを表す。Ａ）野生型（配列番号１−４および２３）または修飾型（配列番号１６−１９および２６３−２６５）の、ＩｇＧ１ヒンジの全長ａａ配列（配列番号４、１８および１９）または部分ａａ配列（配列番号１、２、３、１６、１７、２３および２６３−２６５）である。Ｂ）野生型（配列番号１、１３、１４、２０および２４）または修飾型（配列番号２１および２２）のＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドヒンジの全長ａａ配列（配列番号２０、２１および２２）または部分配列（配列番号１、１３、１４および２４）。Ｃ）全長野生型ｍＩｇＧ１ヒンジ（配列番号２６６）およびハイブリッドｍＩｇＧ１／ｍＩｇＧ２Ａヒンジ（配列番号２６７）のａａ配列。Ｄ）全長、野生型のｈＩｇＧ２ヒンジ（配列番号７）と修飾型ｈＩｇＧ２ヒンジ（配列番号２６８および２６９）のａａ配列。Ｅ）全長野生型ｈＩｇＡ２ヒンジ（配列番号２７０）および修飾型ｈＩｇＡ２ヒンジ（配列番号２７１〜２７３）のａａ配列。 ＩｇＧ１ ＣＨ３と、様々なａａ修飾有りおよび修飾無しとのアライメント。各線は、異なるＣＨ３ドメインのａａ配列である。ある位置でのダッシュ「−」は、その位置での図の最初の線におけるａａと同じａａを表す。ＣＨ３修飾は、そのモジュール（たとえば、ＡＥＭモジュール１）に従って体系化されている。各モジュールは、２つの群に分けられている（２つの数字を用いて識別される）：たとえば、ＡＥＭモジュール１は、「ＡＥＭ１１」と「ＡＥＭ１２」の群に分けられ、ＡＥＭ１１は、モジュールＡＥＭ１の１つのＣＨ３ドメイン（ドメイン「１」）に修飾が為されたことを表し、ＡＥＭ１２は、そのモジュールの第二のＣＨ３ドメイン（ドメイン「２」）に修飾が為されたことを表す。モジュール内の各線は、他の修飾を有する、または有しないモジュールの修飾を有するＣＨ３ドメインを表す。１つのモジュール内のＣＨ３のａａ配列は互いに異なっている（たとえば、カルボキシ末端のリシンの有無、および／または、Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍ置換の有無）。 ＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的なアライメント。各線は、異なるＦｃ領域のａａ配列である。ある位置でのダッシュ「−」は、その位置での図の最初の線におけるａａと同じａａを表す。各Ｆｃ領域はヒンジ（最初の配列の太字）、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ドメインは最初の配列の下線部分）を含有する。この図における各Ｆｃのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３の配列番号は、表８に示す。Ｆｃは、対で体系化され、それらは線で他の対から分けられ、ここで、各対は、適合性のあるＦｃ（すなわち、互いに結合してＦｃ二量体を形成することができる）を表す。 ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃ領域の例示的なアライメント。各線は、異なるＦｃ領域のａａ配列である。ある位置でのダッシュ「−」は、その位置での図の最初の線におけるａａと同じａａを表す。各Ｆｃ領域は、ヒンジ（最初の配列の太字）、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ドメインは最初の配列の下線部分）を含有する。この図における各Ｆｃのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３の配列番号は、表９に示す。Ｆｃは、対で体系化され、それらは線で他の対から分けられ、ここで、各対は、適合性のあるＦｃ（すなわち、互いに結合してＦｃ二量体を形成することができる）を表す。 以下のＩｇＧ１ ＴＦｃのａａ配列である：２３（配列番号１７１）、２３Ａ（配列番号１７３）、２３Ｂ（配列番号１７５）、２３Ｃ（配列番号１７７）、２３Ｄ（配列番号１７９）、２３Ｅ（配列番号１８１）、２３Ｆ（配列番号１８３）、２３Ｅ（３５Ｌ）（配列番号１８５）、２３Ｅ（３５Ｌ、逆転）（配列番号１８７）、２３Ｅ（３０Ｌ）（配列番号１８９）、２３Ｅ（２５Ｌ）（配列番号１９１）、２３Ｉ（配列番号１９３）、および、２３Ｊ（配列番号１９５）。これら配列の各々は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下のドメインからなっている：第一のＩｇＧ１ヒンジ（二重下線）、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線）、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（斜体）、第二のＩｇＧ１ヒンジ（二重下線、および、コアヒンジと下部ヒンジのみからなる）、第二のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、および第二のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線）。これら分子の各々に特有のａａ変化は、太字で示され、配列の上に名称がある。 以下のＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃのａａ配列である：３９（配列番号１９７）、３９Ａ（配列番号１９９）、３９Ｂ（配列番号２０１）、３９Ｃ（配列番号２０３）、３９Ｄ（配列番号２０５）、３９Ｅ（配列番号２０７）、３９Ｆ（配列番号２０９）、３９Ｅ（３５Ｌ）（配列番号２１１）、３９ Ｅ（３５Ｌ、逆転）（配列番号２１３）、３９Ｅ（３０Ｌ）（配列番号２１５）、３９Ｅ（２５Ｌ）（配列番号２１７）、３９Ｉ（配列番号２１９）、３９Ｊ（配列番号２２１）。これら配列の各々は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下のドメインからなっている：ＩｇＧ１上部ヒンジならびにＩｇＧ４コアヒンジおよび下部ヒンジからなる第一のＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジ（二重下線）、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線）、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（斜体）、第二のＩｇＧ４ヒンジ（二重下線、および、コアヒンジと下部ヒンジのみからなる）、第二のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、および第二のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線）。ＩｇＧ１配列は、大文字であり、ＩｇＧ４配列は小文字である。これら分子の各々に特有のａａ変化は、太字で示され、配列の上に名称がある。 Ａ）非還元、または、Ｂ）還元条件下で、４−１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離されたＴＦｃ ２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｄ、２３Ｅ、３９Ｂおよび３９Ｇのサンプルである。レーン１の分子量マーカー（Ｂｉｏｒａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｍａｒｋｅｒ）の分子量（キロダルトン）は、ゲルの左に示されている。 以下の例示的な抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖ａａ配列：ヒト化５Ｄ５ＶＨドメインを含有するＴＦｃＢＡ、および、Ａ）、Ｂ）、Ｃ）、Ｄ）、Ｅ）、Ｌ）、ならびに、Ｍ）パニムムマブ（ｐａｎｉｍｕｍｕｍａｂ）（配列番号２３５）；Ｆ）２２２４（配列番号２３９）；Ｇ）セツキシマブＨ１Ｌ１（配列番号２６０）；Ｈ）セツキシマブＨ１Ｌ２（配列番号２８１）；Ｉ）セツキシマブＨ２Ｌ１（配列番号２８３）；およびＪ）セツキシマブＨ２Ｌ２（配列番号２８５）のＶＨドメインおよびＶＬドメインのａａ配列を含有する抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ。Ｋ）抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２およびヒト化抗ＥＧＦＲセツキシマブｓｃＦｖＨ１Ｌ１のＶＨドメインを含有する抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列。ヒト化を行うためにセツキシマブのＶＨドメインへと導入されたａａは、小文字で示されている。抗ｃ−Ｍｅｔ ＦａｂのＣＤＲは、点線の下線で示されている。ＣＨ１ドメインは、波線の下線で示されている。ヒンジは二重下線で示されている。ＴＦｃリンカーは斜体で示されている。ＣＨ３ドメインは下線で占めされている。ＣＨ３ドメインのＡＥＭおよびＤｉＳ修飾は、太字で示されている。ｓｃＦｖリンカーは、斜体と下線で示されている。連結リンカーは斜体と二重下線で示されている。 図および明細書に記述されているａａ配列をコードするヌクレオチド配列。 実施例１および２で用いられたヌクレオチドおよびａａの配列。ａａ配列の各々は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下のドメインからなっている：シグナルペプチド（下線と太字）、第一のＩｇＧ１ヒンジ（二重下線）、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線）、ＴＦｃリンカー（斜体）、第二のＩｇＧ１ヒンジ（二重下線、および、コアヒンジと下部ヒンジのみからなる）、第二のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、および第二のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線）。ＩｇＧ１のａａは大文字で、ＩｇＧ４のａａは小文字で示されている。これら分子の各々に固有のａａ変化（たとえば、ＡＥＭおよびＤｉＳ修飾）は、太字で示され、配列の上に名称を示す。 Ａは、オナルツズマブ（オナルツズマブ）（ＯＴＺＭ）細胞株の選択：レーン１＝サイズ標準、レーン２−１２；２＝ＯＴＺＭ株１、３＝ＯＴＺＭ株２、４＝ＯＴＺＭ株３、５＝ＯＴＺＭ株４、６＝ＯＴＺＭ株５、７＝ＯＴＺＭ株６、８＝ＯＴＺＭ株７、９＝ＯＴＺＭ株８、１０＝ＯＴＺＭ株９、１１＝ＯＴＺＭ株１０、１２＝ＯＴＺＭ株１１。Ｂは、オナルツズマブ（オナルツズマブ）（ＯＴＺＭ）細胞株の選択：レーン１＝サイズ標準、レーン２−９；２＝ＯＴＺＭ株１２、３＝ＯＴＺＭ株１３、４＝ＯＴＺＭ株１４、５＝ＯＴＺＭ株１５、６＝ＯＴＺＭ株１６、７＝ＯＴＺＭ株１７、８＝ＯＴＺＭ株１８、９＝ＯＴＺＭ株１９。 Ａは、荷電グリコシル化変異体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：レーン１＝サイズ標準、レーン２−８；２＝ｇｌｙｃｏ野生型、３＝ｇｌｙｃｏ１、４＝ｇｌｙｃｏ２、５＝ｇｌｙｃｏ３、６＝ｇｌｙｃｏ４、７＝ｇｌｙｃｏ５、８＝ｇｌｙｃｏ６。Ｂは、荷電グリコシル化変異体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：レーン１＝サイズ標準、レーン２−８；＝ｇｌｙｃｏ野生型、３＝ｇｌｙｃｏ１、４＝ｇｌｙｃｏ２、５＝ｇｌｙｃｏ３、６＝ｇｌｙｃｏ４、７＝ｇｌｙｃｏ５、８＝ｇｌｙｃｏ６。 ＴＦｃＢＡ例のヌクレオチドおよびａａの配列。 ３９Ｅ糖型４主鎖、オナルツズマブ抗体および、２２２４またはパニツムマブ抗体のいずれかを含有するＴＦｃＢＡのｃＭｅｔ−ＦｃおよびＥＧＦＲ−ｈｉｓへの結合を示すグラフ。 オナルツズマブ抗体および、２３、２３Ｅ、３９、３９Ｅ糖型４主鎖を含む様々な主鎖を含有するＴＦｃ、ならびに、３９Ｅ糖型４主鎖および２２２４、セツキシマブまたはパニツムマブ抗体のいずれかを含有するＴＦｃＢＡによる、ｐＭｅｔの阻害を示すグラフ。 表２３に示されるＴＦｃＢＡ例のグリコシル化変異のヌクレオチドおよびａａの配列。 抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体（ＴＦｃＢＡ）例の概略図。実施態様において、ＣＨ２は、たとえば相補性領域等の静電領域を含有しても良い。 抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃１〜Ａｂ＃１３の構造的特徴を示す表。 抗体ＯＡ−５Ｄ５（ＩｇＧ）変異体のＳＤＳゲル。 抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３のＳＤＳゲル。 抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３を用いて得られた二特異性結合アッセイデータ。 一価（ＯＡ−５Ｄ５）、二価抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、ＨＧＦ、または培地のみの対照とのインキュベーションにより誘導されたＭｅｔリン酸化の比較。 一価（ＯＡ−５Ｄ５）、二価抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、ＨＧＦ、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、またはＡｂ＃１３、または培地のみの対照とＡ５４９とのインキュベーションにより誘導されたＭｅｔリン酸化の比較。 Ａは、ＨＧＦ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、またはＡｂ＃１３と、Ａ５４９とのインキュベーションにより誘導された増殖の比較。Ｂは、ＨＧＦ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、またはＡｂ＃１３と、Ｈ４４１とのインキュベーションにより誘導された増殖の比較。Ｃは、ＨＧＦ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、またはＡｂ＃１３と、ＨＣＣ８２７とのインキュベーションにより誘導された増殖の比較。 Ａ５４９細胞およびＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞における、一価抗ｃ−Ｍｅｔ ＯＡ−５Ｄ５、ならびに、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３による、ＡＫＴのＨＧＦ誘導性リン酸化の阻害比較。 Ｕ−８７ＭＧ細胞およびＨ４４１細胞における、一価抗ｃ−Ｍｅｔ ＯＡ−５Ｄ５、および、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃５による、ＨＧＦ誘導性増殖の阻害比較。 Ａ５４９細胞およびＨ４４１細胞における、一価抗ｃ−Ｍｅｔ ＯＡ−５Ｄ５、および、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃７による、ＨＧＦ誘導性増殖の阻害比較。 抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃５によりＡ５４９細胞およびＨ２１７０細胞においてｃＭｅｔレベルが下方制御されるが、一価抗ｃ−Ｍｅｔ ＯＡ−５Ｄ５では下方制御されない。 Ａ：マウスにおける薬物動態−抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃５の終末相半減期。Ｂ：マウスにおける薬物動態−抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃７の終末相半減期。Ｃ：マウスにおける薬物動態−抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃１３の終末相半減期。 腫瘍体積に対する剤の効果を経時的に検証した結果を示す。抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣａｍタンデムＦｃ二重特異性抗体Ａｂ＃７および一価抗ｃ−Ｍｅｔ ＯＡ−５Ｄ５はそれぞれ、ヌードマウスにおいて、Ｕ８７ＭＧ細胞の異種移植片の腫瘍増殖を減少させ、腫瘍退縮をもたらした。Ａｂ＃７およびＯＡ−５Ｄ５の両方とも、同程度に皮下移植されたＵ−８７ＭＧ腫瘍の退縮を示すことができた。 ヌードマウスに移植されたＵ−８７ＭＧ腫瘍に対する抗体活性の用量応答分析の結果を示すグラフである（移植後腫瘍体積により測定）。Ｕ−８７ＭＧ腫瘍を皮下移植し、マウスを毎週、ＰＢＳ対照、または、Ａｂ＃７（１ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、または２４ｍｇ／ｋｇ）で処置した。結果から、Ａｂ＃７は、用量応答相関的に腫瘍体積を減少させ、Ａｂ＃７の用量を増加させると、腫瘍体積減少の程度も増加したことが示された。 腫瘍細胞から分泌されたＨＧＦの定量結果を示す棒グラフである。ＨＧＦは、Ｕ−８７ ＭＧ細胞、ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞（“親”）、ＮＣＩ−Ｈ３５８モックトランスフェクト細胞、および、ＨＧＦをトランスフェクトされたＮＣＩ−Ｈ３５８細胞由来の上清中で測定され、総タンパク質に対して標準化された。 ヌードマウスに移植されたＨＧＦリガンド依存性ＨＣＣ８２７−ＨＧＦ腫瘍に対する抗体活性の用量応答分析の結果を示すグラフである（移植後腫瘍体積により測定）。腫瘍増殖後、マウスを毎週、ＰＢＳ対照、Ａｂ＃７（１ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｇ／ｋｇのＯＡ−５Ｄ５と等モル）、または２５ｍｇ／ｋｇ）、または１０ｍｇ／ｋｇのＯＡ−５Ｄ５で処置した。結果から、等モル用量のＯＡ−５Ｄ５よりも、大きく腫瘍体積の減少をもたらしたことが示された。 ヌードマウスに移植されたＨＧＦリガンド依存性Ｈ３５８−ＨＧＦ腫瘍に対する抗体活性の結果を示すグラフである（移植後腫瘍体積により測定）。腫瘍増殖後、マウスを毎週、ＰＢＳ対照、Ａｂ＃７（１２ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｇ／ｋｇのＯＡ−５Ｄ５と等モル））、または１０ｍｇ／ｋｇのＯＡ−５Ｄ５で処置した。結果から、等モル用量のＯＡ−５Ｄ５よりも、大きく腫瘍体積の減少をもたらしたことが示された。 二重特異性抗体で処置した後の細胞溶解物における、ｃ−ＭｅｔおよびＥｐＣＡＭ分解のイムノブロット分析を行った後の、タンパク質定量を示す５つのグラフである。タンパク質は、培地のみ、２００ｎｍ ＯＡ−５Ｄ５、および２００ｎＭ Ａｂ＃７で処置された細胞において測定された。（Ａ）は、Ａ５４９細胞におけるｃ−Ｍｅｔの定量を示す；ＥｐＣＡＭは本実験のこの細胞株では検出できなかった。（Ｂ）は、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞におけるｃ−Ｍｅｔの定量を示し、（Ｄ）は、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞におけるＥｐＣＡＭの定量を示す。（Ｃ）は、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞におけるｃ−Ｍｅｔの定量を示し、（Ｅ）は、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞におけるＥｐＣＡＭの定量を示す。結果から、Ａｂ＃７は、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞およびＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞における総ｃ−Ｍｅｔの減少をもたらしたが、ＯＡ−５Ｄ５は減少させず、また、Ａ５４９細胞においても減少しなかったが、一方で、これら抗体のいずれもが、これら細胞のいずれのＥＰＣＡＭレベルの減少を生じさせなかった。
配列の簡単な説明
本明細書に言及され、および配列表に列記されるアミノ酸（ａａ）配列を以下に特定する。
配列番号１、２および３はそれぞれ、野生型ＩｇＧ１の上部、中部（またはコア）、および下部のヒンジのａａ配列である（表２を参照）。
配列番号４は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、連続した配列にある配列番号１、２および３からなる、完全な野生型ＩｇＧ１ヒンジのａａ配列である（表２を参照）。
配列番号５および６は、それぞれ、野生型ＩｇＧ１の上部、および下部ヒンジのａａ配列である（表２を参照）。ＩｇＧ２中部ヒンジは、ＩｇＧ１と同じ（すなわち、配列番号２）である。
配列番号７は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、連続した配列にある配列番号５、２および６からなる、完全な野生型ＩｇＧ２ヒンジのａａ配列である（表２を参照）。
配列番号８、９および１０は、それぞれ、野生型ＩｇＧ３の上部、中部（またはコア）、および下部のヒンジのａａ配列である（表２を参照）。
配列番号１１は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、連続した配列にある配列番号８、９および１０からなる、完全な野生型ＩｇＧ３ヒンジのａａ配列である（表２を参照）。
配列番号１２、１３および１４は、それぞれ、野生型ＩｇＧ４の上部、中部（またはコア）、および下部のヒンジのａａ配列である（表２を参照）。
配列番号１５は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、連続した配列にある配列番号１２、１３および１４からなる、全長ＩｇＧ４ヒンジのａａ配列である（表２を参照）。
配列番号１６は、Ｈ２２４ＣおよびＴ２２５Ｃのａａ置換を含有するＩｇＧ１上部ヒンジ（配列番号１）のａａ配列である（表４および図２を参照）。
配列番号１７は、Ｔ２２３Ｃのａａ置換を含有するＩｇＧ１上部ヒンジ（配列番号１）のａａ配列である（表４および図２を参照）。
配列番号１８は、Ｈ２２４ＣおよびＴ２２５Ｃのａａ置換を含有する全長ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号４）のａａ配列である（表４および図２を参照）。
配列番号１９は、Ｔ２２３Ｃのａａ置換を含有する全長ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号４）のａａ配列である（表４および図２を参照）。
配列番号２０は、ＩｇＧ１の上部ヒンジ（配列番号１）ならびにＩｇＧ４の中部および下部ヒンジ（それぞれ、配列番号１３および１４、表４および図２を参照のこと）からなる、全長ハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジのａａ配列である。
配列番号２１は、Ｈ２２４ＣおよびＴ２２５Ｃのａａ置換を含有するＩｇＧ１の上部ヒンジ（配列番号１６）ならびにＩｇＧ４の中部および下部ヒンジ（それぞれ、配列番号１３および１４、表４および図２を参照のこと）からなる、全長ハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジのａａ配列である。
配列番号２２は、Ｔ２２３Ｃのａａ置換を含有するＩｇＧ１の上部ヒンジ（配列番号１７）ならびにＩｇＧ４の中部および下部ヒンジ（それぞれ、配列番号１３および１４、表４および図２を参照のこと）からなる、全長ハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジのａａ配列である。
配列番号２３は、中部および下部ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号２および３）を含有するが、上部ヒンジを含有しない部分ＩｇＧ１ヒンジのａａ配列である（表４および図２を参照のこと）。
配列番号２４は、中部および下部ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号１３および１４）を含有するが、上部ヒンジを含有しない部分ＩｇＧ４ヒンジのａａ配列である（表４および図２を参照のこと）。
配列番号２５は、ａａ２９７でのグリコシル化を低下させるＮ２９７Ｑのａａ置換を有する全長ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインのａａ配列である。
配列番号２６は、ａａ２９７でのグリコシル化を低下させるＴ２９９Ｋのａａ置換を有する野生型全長ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのａａ配列である。
配列番号２７は、野生型全長ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６および図３を参照のこと）。
配列番号２８は、配列番号２７を有するが、Ｃ末端リシンを欠く野生型ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６および図３を参照のこと）。
配列番号２９は、Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍの置換を伴う配列番号２７を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６および図３を参照のこと）。
配列番号３０は、Ｃ末端リシンを欠く配列番号２９を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６および図３を参照のこと）。
配列番号３１は、「穴（ｈｏｌｅ）」を生み出すＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４７０Ｖの置換を伴う配列番号２７を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎまたは「ＡＥＭ」１．１；表６および図３を参照のこと）。
配列番号３２は、Ｃ末端リシンを欠く配列番号３１を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６および図３を参照のこと）。
配列番号３３は、「穴（ｈｏｌｅ）」を生み出すＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４７０Ｖの置換を伴う配列番号２９を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（ＡＥＭ１．１；表６および図３を参照のこと）。
配列番号３４は、Ｃ末端リシンを欠く配列番号３３を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６および図３を参照のこと）。
配列番号３５は、「穴（ｈｏｌｅ）」または「ノブ（ｋｎｏｂ）」を生み出すＴ３６６Ｗの置換を伴う配列番号２７を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（ＡＥＭ１．２；表６および図３を参照のこと）。
配列番号３６は、Ｃ末端リシンを欠く配列番号３５を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６および図３を参照のこと）。
配列番号３７は、「穴（ｈｏｌｅ）」または「ノブ（ｋｎｏｂ）」を生み出すＴ３６６Ｗの置換を伴う配列番号２９を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（ＡＥＭ１．２；表６および図３を参照のこと）。
配列番号３８は、Ｃ末端リシンを欠く配列番号３７を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６および図３を参照のこと）。
配列番号３９〜９８は、配列番号２７、２８、２９または３０を有するＩｇＧ１ ＣＨ３と比較して、ＡＥＭおよび／またはジスルフィド結合形成（ＤｉＳ）修飾を１以上含有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６および図３を参照のこと）。
配列番号９９〜１３２は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、連続的に以下を含有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域例のａａ配列である：（ａ）ＩｇＧ１ヒンジ、１以上のａａ置換を含有するＩｇＧ１ヒンジ、および部分ＩｇＧ１ヒンジからなる群から選択されるヒンジ；（ｂ）Ｎ２９７Ｑを有するＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン（配列番号２５）；および（ｃ）配列番号２９、ならびに、ＡＥＭおよび／またはＤｉＳ修飾を１以上含有する配列番号２９、からなる群から選択されるＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（図４）。ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインは、介在配列無しに、共有結合されている。配列番号９９〜１３２の各ドメインの配列番号は、表８に示す。
配列番号１３３〜１６６は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、連続的に以下を含有するＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃ領域例のａａ配列である：（ａ）ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジ、１以上のａａ置換を含有するＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッド、および部分ＩｇＧ４ヒンジ、からなる群から選択されるヒンジ；（ｂ）Ｔ２９９Ｋを有するＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン（配列番号２６）；および、（ｃ）配列番号２９、ならびに、ＡＥＭおよび／またはＤｉＳ修飾を１以上含有する配列番号２９、からなる群から選択されるＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン。ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインは、介在配列無しに、共有結合されている。配列番号１３３〜１６６の各ドメインの配列番号は、表９に示す。
配列番号１６７は、ＫＳＣＤＫＴであり、システインを導入するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインの修飾型カルボキシ末端部分の例である。
配列番号１６８は、ＧＥＣであり、システインを導入するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインの修飾型カルボキシ末端部分の例である。
配列番号１６９は、非Ｇｌｙ−Ｓｅｒ ＴＦｃリンカー配列の例である。
配列番号１７０〜１９５は、図６に記述されている、ＩｇＧ１ ＴＦｃのヌクレオチド配列（偶数）とａａ配列（奇数）の例である。これらＩｇＧ１ ＴＦｃの各々を構成するドメインの配列番号は表１２に記述されている。
配列番号１９６〜２２１は、図７に記述されている、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含有するＴＦｃのヌクレオチド配列（偶数）とａａ配列（奇数）の例である。これらＩｇＧ１ ＴＦｃの各々を構成するドメインの配列番号は表１３に記述されている。
配列番号２２２〜２２３は、それぞれ、シグナルペプチドを有していない抗ｃ−Ｍｅｔ Ａｂ ５Ｄ５の重鎖Ｆａｂドメインのヌクレオチド配列とａａ配列である。
配列番号２２４〜２２５は、それぞれ、抗ｃ−Ｍｅｔ ５Ｄ５ ＶＨドメイン、ＩｇＧ１ ＴＦｃ（ＡＥＭ１を有する）、およびパニツムマブｓｃＦｖを含有するＩｇＧ１ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド配列とａａ配列である（図９）。
配列番号２２６〜２２７は、それぞれ、抗ｃ−Ｍｅｔ ５Ｄ５ ＶＨドメイン、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃ（ＡＥＭ１を有する）、およびパニツムマブｓｃＦｖを含有するＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド配列とａａ配列である（図９）。
配列番号２３０および２３１は、それぞれ、たとえば、ヒト化５Ｄ５抗ｃ−Ｍｅｔ ＶＨドメインを含有する重鎖（たとえば、配列番号２２５、２２７、２２９、２４４または３４３を含有する重鎖）との使用のための、ヒト化５Ｄ５抗ｃ−Ｍｅｔ ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含有する軽鎖のヌクレオチド配列およびａａ配列である。
配列番号２３２および２３３は、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）の可変領域を含有する抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖのヌクレオチド配列およびａａ配列である。
配列番号２３４および２３５は、それぞれ、（ａ）ヒト化５Ｄ５由来の抗ｃ−Ｍｅｔ可変ドメイン；（ｂ）ＡＥＭ１およびＤｉＳ２を伴うＴＦｃ（配列番号１８１）；および（ｃ）パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）の可変領域を含有する抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（配列番号２３３）、を含有する、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド配列およびａａ配列である（それぞれ、図９および図１０に示されている）。
配列番号２３６および２３７は、それぞれ、Ａｂ２２２４の可変領域を含有する抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖのヌクレオチド配列およびａａ配列である。
配列番号２３８および２３９は、それぞれ、（ａ）ヒト化５Ｄ５由来の抗ｃ−Ｍｅｔ可変ドメイン；（ｂ）ＡＥＭ１およびＤｉＳ２を伴うＴＦｃ（配列番号１８１）；および（ｃ）Ａｂ２２２４の可変領域を含有する抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（配列番号２３７）、を含有する、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド配列およびａａ配列である（それぞれ、図９および図１０に示されている）。
配列番号２４０および２４１は、それぞれ、シグナルペプチド例のヌクレオチド配列およびａａ配列である。
配列番号２４２および２４３は、それぞれ、シグナルペプチド例のヌクレオチド配列およびａａ配列である。
配列番号２４４および２４５は、それぞれ、配列番号２４１を有するシグナルペプチドを伴う、配列番号２３１を有する軽鎖のヌクレオチド配列およびａａ配列である。
配列番号２４８〜２５４は、本明細書に開示される変異ヒンジのａａ配列である。
配列番号２５５および２５６は、それぞれ、配列番号２４１からなるシグナルペプチドを伴う抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位の重鎖Ｆａｂ領域（配列番号２８７）のヌクレオチド配列およびａａ配列であり、実施例３に示されている。
配列番号２５７および２５８は、それぞれ、ヒト化セツキシマブＨ１Ｌ１の可変領域を含有する抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖのヌクレオチド配列およびａａ配列である。
配列番号２５９および２６０は、それぞれ、（ａ）ヒト化５Ｄ５由来の抗ｃ−Ｍｅｔ可変ドメイン；（ｂ）ＡＥＭ１およびＤｉＳ２を伴うＴＦｃ（配列番号１８１）；および（ｃ）ヒト化セツキシマブＨ１Ｌ１の可変領域を含有する抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（配列番号２５８）、を含有する、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド配列およびａａ配列である（それぞれ、図９および図１０に示されている）。
配列番号２６１は、野生型全長ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインのａａ配列である。
配列番号２６２は、野生型全長ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのａａ配列である。
配列番号２６３、２６４および２６５は、変異ｈＩｇＧ１ヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２６６は、野生型マウスＩｇＧ１ヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２６７は、マウスＩｇＧ１／ＩｇＧ２Ａハイブリッドヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２６８および２６９は、変異ｈＩｇＧ２ヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２７０は、野生型ｈＩｇＡ２ヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２７１〜２７３は、変異ｈＩｇＡ２ヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２７４〜２７９は、ヒト化セツキシマブＡｂｓ Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１およびＨ２Ｌ２の可変ドメインを含有するｓｃＦｖのヌクレオチド配列（奇数）およびａａ配列（偶数）である（実施例３に記述される）。
配列番号２８０〜２８５は、（ａ）ヒト化５Ｄ５由来の抗ｃ−Ｍｅｔ可変ドメイン；（ｂ）ヒト化セツキシマブＡｂｓ Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１およびＨ２Ｌ２を含有する抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（それぞれ、配列番号２７５、２７７または２７９）；および（ｃ）ＡＥＭ１およびＤｉＳ２を伴うＴＦｃ（配列番号１８１）、を含有する、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド配列（奇数）およびａａ配列（偶数）である（図９）。
配列番号２８６および２８７は、それぞれ、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２の重鎖Ｆａｂドメインのヌクレオチド配列およびａａ配列である（実施例３に記述される）。
配列番号２８８および２８９は、それぞれ、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２の軽鎖Ｆａｂドメインのヌクレオチド配列およびａａ配列である（実施例３に記述される）。
配列番号２９０および２９１は、それぞれ、（ａ）抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２由来の抗ｃ−Ｍｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン（配列番号２８７）；（ｂ）ＡＥＭ１およびＤｉＳ２を伴うＴＦｃ（配列番号１８１）；および（ｃ）ヒト化セツキシマブＨ１Ｌ１の可変領域を含有する抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（配列番号２５８）、を含有する、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド配列およびａａ配列である（それぞれ、図９および図１０に示されている）。配列番号２９１のａａ配列は、配列番号２６０を有するものと同じであり、抗ｃ−Ｍｅｔ結合ドメインが、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２と置き換えられている。
配列番号２９２〜３４１は、実施例１および２に用いられたＴＦｃのヌクレオチド配列（奇数）およびａａ配列（偶数）であり、図１１に示されている。
配列番号３４２および３４３は、それぞれ、抗ｃ−Ｍｅｔ ５Ｄ５ ＶＨドメイン、ＩｇＧ１ ＴＦｃ（ＡＥＭ１および逆転ＤｉＳを伴う）、およびパニツムマブｓｃＦｖを含有するＩｇＧ１ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド配列およびａａ配列である（図９）。
配列番号３４４および３４５は、それぞれ、配列番号２４３からなるシグナルペプチドを伴う抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２の軽鎖Ｆａｂ領域（配列番号２８９）のヌクレオチド配列およびａａ配列である（実施例３に示されている）。
配列番号３４６および３４７は、それぞれ、ＩｇＧ１ ＴＦｃを有する、ヒト化５Ｄ５抗ｃ−Ｍｅｔおよび抗ＥＧＦＲパニツムマブｓｃＦｖを伴う抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド配列およびａａ配列である（ＡＥＭ１および配列番号１６９を有する４０ａａのＴＦｃリンカーを伴う；図９）。
配列番号３４８および３４９は、それぞれ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃを有する、ヒト化５Ｄ５抗ｃ−Ｍｅｔおよび抗ＥＧＦＲパニツムマブｓｃＦｖを伴う抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド配列およびａａ配列である（ＡＥＭ１および配列番号１６９を有する４０ａａのＴＦｃリンカーを伴う；図９）。
配列番号３５０は、抗ＲＯＮ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ２２２４、およびＴＦｃ２３Ｅ（配列番号３０３）を含有する抗ＲＯＮ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３５１は、抗ＲＯＮ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ２２２４、およびＴＦｃ３９Ｅｇｙ４（３９Ｅ糖型４）（配列番号３９４）を含有する抗ＲＯＮ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３５２は、抗ＲＯＮ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ２３Ｅ（配列番号３０３）を含有する抗ＲＯＮ／抗ＣＥＡ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３５３は、抗ＲＯＮ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ３９Ｅｇｙ４（配列番号３９４）を含有する抗ＲＯＮ／抗ＣＥＡ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３５４は、抗ＣＥＡ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ｃ−Ｍｅｔ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ２３Ｅ（配列番号３０３）を含有する抗ＣＥＡ／抗ｃＭｅｔ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３５５は、抗ＣＥＡ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ＲＯＮ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ２３Ｅ（配列番号３０３）を含有する抗ＣＥＡ／抗ＲＯＮ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３５６は、抗ＣＥＡ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ｃＭｅｔ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ３９Ｅｇｙ４（配列番号３９４）を含有する抗ＣＥＡ／抗ｓｃＭｅｔ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３５７〜３５８は、ＴＦｃ野生型ＣＨ２配列；および、ＣＨ３ドメインにおける、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＧＥＣのａａ配列ならびにヌクレオチド配列である（図１７）。
配列番号３５９は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ２３Ｅ（配列番号３０３）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＣＥＡ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３６０は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ３９Ｅｇｙ４（配列番号３９４）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＣＥＡ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３６１は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ＣＤ４４ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ３９Ｅｇｙ４（配列番号３９４）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＣＥＡ ＣＤ４４の重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３６２は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ＣＤ４４ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ２３Ｅ（配列番号３０３）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＣＥＡ ＣＤ４４の重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３６３は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ＣＤ４４ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ２３Ｅ（配列番号３０３）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＣＥＡ ＣＤ４４の重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３６４は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、抗ＣＤ４４ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ３９Ｅｇｙ４（配列番号３９４）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＣＥＡ ＣＤ４４の重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３６５は、抗ＣＤ４４重鎖Ｆａｂドメイン、抗ｃＭｅｔ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ２３Ｅ（配列番号３０３）を含有する抗ＣＤ４４／抗ｃＭｅｔの重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３６６は、抗ＣＤ４４重鎖Ｆａｂドメイン、抗ｃＭｅｔ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ３９Ｅｇｙ４（配列番号３９４）を含有する抗ＣＤ４４／抗ｃＭｅｔの重鎖のａａ配列である（図１４）。
配列番号３６７は、抗ＣＤ４４ ＡＲＨ６０−１６−２軽鎖のａａ配列である。
配列番号３６８〜３６９は、抗ｃＭｅｔ抗体オナルツズマブおよびＴＦｃ２３軽鎖のａａ配列ならびにヌクレオチド配列である（図１４）。
配列番号３７０〜３７１は、抗ｃＭｅｔ抗体オナルツズマブおよびＴＦｃ３９重鎖のａａ配列ならびにヌクレオチド配列である（図１４）。
配列番号３７２〜３７３は、抗ｃＭｅｔ抗体オナルツズマブおよびＴＦｃ２３Ｅ重鎖のａａ配列ならびにヌクレオチド配列である（図１４）。
配列番号３７４〜３７５は、抗ｃＭｅｔ抗体オナルツズマブおよびＴＦｃ３９Ｅｇｙ４重鎖のａａ配列ならびにヌクレオチド配列である（図１４）。
配列番号３７６〜３７７は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、セツキシマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ２３Ｅ（配列番号３０３）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＥＧＦＲのａａ配列およびヌクレオチド配列である（図１４）。
配列番号３７８〜３７９は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、パニツムマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ２３Ｅ（配列番号３０３）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＥＧＦＲのａａ配列およびヌクレオチド配列である（図１４）。
配列番号３８０〜３８１は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、２２２４抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ２３Ｅ（配列番号３０３）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＥＧＦＲのａａ配列およびヌクレオチド配列である（図１４）。
配列番号３８２〜３８３は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、セツキシマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ３９Ｅｇｙ４（配列番号３９４）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＥＧＦＲのａａ配列およびヌクレオチド配列である（図１４）。
配列番号３８４〜３８５は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、パニツムマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ３９Ｅｇｙ４（配列番号３９４）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＥＧＦＲのａａ配列およびヌクレオチド配列である（図１４）。
配列番号３８６〜３８７は、抗ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、２２２４抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、およびＴＦｃ３９Ｅｇｙ４（配列番号３９４）を含有する抗ｃＭｅｔ／抗ＥＧＦＲのａａ配列およびヌクレオチド配列である（図１４）。
図１７に開示される配列に関しては、二重下線はヒンジであり、下線はＣＨ３ドメインであり、第二の二重下線は第二のヒンジであり、第二の下線は第二のＣＨ３である。
配列番号３８８〜３８９は、ＣＨ２ドメインにおいてＮ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｓ：：Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｓのアミノ酸変異（下線、太字）、および、ＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＧＥＣ、を含有するグリコシル化変異体１のａａ配列およびヌクレオチド配列であり（図１７）、配列番号３９０〜３９１は、ＣＨ２ドメインにおいてＴ２９９Ｋ：：Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｓのアミノ酸変異（下線、太字）、およびＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３ Ｃ末端システイン ＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＧＥＣ、を含有するグリコシル化変異体２のａａ配列およびヌクレオチド配列である（図１７）。
配列番号３９２〜３９３は、ＣＨ２ドメインにおいて、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｓ：：Ｔ２９９Ｋのアミノ酸変異（下線、太字）、および、ＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＧＥＣ、を含有するグリコシル化変異体３のａａ配列およびヌクレオチド配列である（図１７）。
配列番号３９４〜３９５は、ＣＨ２ドメインにおいて、Ｔ２９９Ｋ：：Ｔ２９９Ｄのアミノ酸変異（下線、太字）、および、ＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＧＥＣ、を含有するグリコシル化変異体４のａａ配列およびヌクレオチド配列である（図１７）。
配列番号３９６〜３９７は、ＣＨ２ドメインにおいて、Ｔ２９９Ｄ：：Ｔ２９９Ｋのアミノ酸変異（下線、太字）、および、ＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＧＥＣ、を含有するグリコシル化変異体５のａａ配列およびヌクレオチド配列である（図１７）。
配列番号３９８〜３９９は、ＣＨ２ドメインにおいて、Ｔ２９９Ｄ：：Ｔ２９９Ｄのアミノ酸変異（下線、太字）、および、ＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３ Ｃ末端システインＧＥＣ、を含有するグリコシル化変異体６のａａ配列およびヌクレオチド配列である（図１７）。
配列番号４００〜４８９は、以下に記述する。
ここに提供されるのは、タンデムＦＣ抗体（「ＴＦｃＡ」）、例えば、タンデムＦＣ二重特異性抗体（「ＴＦｃＢＡ」）である。分子は、細胞増殖性疾患、例えば癌を治療するために使用されることとしてもよい。
。
定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付のクレームで使用される所定の用語およびフレーズの意味が以下に提供される。
「ａａ修飾」または「ａａ変化」は、ａａ配列に対する１以上のアミノ酸（ａａ）欠失、付加、または置換を指す。ａａ配列挿入は、１つの残基から１００またはそれより多くの残基を含むポリペプチドまでの長さでの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のａａ残基のシーケンス内挿入を含む。シーケンス内挿入は、概して、約１から１０の残基、例えば、１から５、例えば、１から３の範囲であることとしてもよい。
「ＡＥＭ」または「関連性増強変更（association enhancing modification）」は、別のＣＨ３ドメインとの関連性を増強するためにＣＨ３ドメインになされる変更を指す。ＡＥＭは、ＴＦｃの１つまたは両方のＦｃに、１以上のａａ置換、欠失、または付加を含むこととしてもよい。ＡＥＭは、モジュール、例えば、モジュール１（「ＡＥＭ１」）で分類され、２つのＣＨ３ドメインの１つに対する変更はＡＥＭ１．１として言及され、残りのＣＨ３ドメインに対する変更はＡＥＭ１．２として言及される。例えば、ＡＥＭ１．１は、置換Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの組み合わせからなり、ＡＥＭ１．２は、ａａ置換Ｔ３６６Ｗからなる。ＣＨ３ドメインが、２以上のａａ修飾、例えばａａ置換を含む場合、変更は「／」によって互いに区切られる。２つのＣＨ３ドメインにおける変更に関する場合、ＣＨ３ドメインのそれぞれにおける変更は「：：」により区切られる。
「抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位」は、ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する結合部位を指す。
「抗ＥＧＦＲ結合部位」は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する結合部位を指す。
「抗原結合部位」は、抗体のＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン、または少なくとも１つのそのＣＤＲを含む結合部位を指し、抗原結合部位その標的抗原に特異的に結合することを提供する。例えば、抗原結合部位は、ＶＨＣＤＲ３単独、またはＶＨＣＤＲ２とともに、および任意にＶＨＣＤＲ１を含む、主成分とする、またはからなることとしてもよい。ある実施形態では、抗原結合部位はＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらは同じポリペプチドまたは２つの異なるポリペプチドに存在することとしてもよく、例えば、ＶＨドメインは重鎖に存在し、ＶＬドメインは軽鎖に存在する。
抗体の「抗原結合部位」は、抗原（例えば、ｃ−ＭｅｔまたはＥＧＦＲ）に特異的に結合する性能を保持する抗体の１以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体のフラグメントにより保持され得ることが示された。抗体の用語「抗原結合部位」内に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合される２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント、（ｖｉ）分離された相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含む。さらに、ＶＬおよびＶＨは、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるが、ＶＬおよびＶＨは遺伝子を区切ることによりコードされ、それらが単一タンパク質鎖として作成されることを可能にする合成リンカーにより、組換え方法を用いて、それらは結合され得、ＶＬおよびＶＨ領域は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ)として知られる一価のタンパク質を形成するために対になる（例えば、米国特許第５，８９２，０１９号）。このような単鎖抗体は、また、抗体の用語「抗原結合部位」内に包含されることが意図される。二重特異性抗体のような単鎖抗体の他の形態もまた包含される。二重特異性抗体は、二価の二重特異性抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインは、単一のポリペプチド鎖で発現されるが、短すぎるために同じ鎖で２つのドメイン間で対にならないリンカーを用い、これにより、ドメインが他の鎖の相補的ドメインと対になることを強制し、２つの抗原結合部位を作成する。
「結合親和性」は、結合相互作用の強度を指し、現実の結合親和性並びに見かけ上の結合親和性の両方を含む。現実の結合親和性は、分離速度にわたる会合速度の割合である。見かけ上の親和性は、例えば、多価相互作用からもたらされる結合活性を含み得る。解離定数（Ｋｄ）は、典型的には、結合親和性の相反性であり、（例えば、分析物としての組換えｃ−Ｍｅｔおよびリガンドとしての抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を用いて、例えば、ForteBio Octetプラットフォーム（Pall ForteBio Corp.）またはBIACORE 3000機器（GE Healthcare)を用いて測定されるような）表面プラスモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイを用いて簡便に測定されることとしてもよく、アッセイの例は、米国特許第７，８４６，４４０号の実施例３に記載される。
「結合部分」、「結合ドメイン」、または「結合部位」は、結合ポリペプチド、またはそのように特定される場合、標的分子（つまり、抗原）に抗体の特異的結合を媒介する際に直接伴われるその重鎖もしくは軽鎖の部分、領域、または部位を指す。代表的な結合ドメインは、抗原結合部位、リガンドのレセプター結合ドメイン、レセプターのリガンド結合ドメイン、または酵素的ドメインを含む。好ましい実施形態では、結合ドメインは、（例えば、可変重（ＶＨ）鎖配列および可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む、抗原結合部位、または代替的なフレームワーク領域に配置される抗体由来の６つのＣＤＲ（例えば、任意に１以上のａａ置換を含むヒトフレームワーク領域）を含むまたはからなる。所定の実施形態では、結合部位は、ＶＨまたはＶＬ鎖配列のみを本質的に含むこととしてもよい。結合部位は、完全に１つの種由来であることとしてもよく、例えば、１つの種の生殖細胞系配列由来の配列のみを有する。例えば、結合部位は、ヒト(つまり、ヒト種由来）、マウス、またはラットであることとしてもよい。結合部位はまたヒト化されることとしてもよく、つまり、ＣＤＲは１つの種由来であり、フレームワーク（ＦＲ）は別の種由来である。例えば、結合部位は、ヒト種由来であるマウス抗体およびＦＲから得られたＣＤＲを有することとしてもよい。所定のヒト化結合部位は、ＣＤＲをドナー抗体のＣＤＲのようにより見えさせるように、１以上のＣＤＲにおける突然変異を含む。所定のヒト化抗体は、１以上のＦＲにおける突然変異を含むこととしてもよい。結合部位における突然変異は、概して、その標的抗原に対する結合部位の結合の親和性を増強することとしてもよく、および／またはそれらが結合部位を、例えば、その半減期を延ばすために安定化することとしてもよい。
「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内でみられる非隣接の抗原結合部位を指す。これらの具体的な領域は、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)および Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991)、およびChothiaらによる、J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)およびMacCallumらによる、J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)により記載され、定義は、互いに対して比較される場合に、ａａ残基のサブセットまたは重複を含む。上記に挙げられた参考文献のそれぞれにより定義されるＣＤＲを包含するａａ残基は、比較のために述べられる。本明細書で使用されるように、および別途特定されていない場合、「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔにより定義されるものである。ＣＤＲ（例えば、ＶＨまたはＶＬ ＣＤＲ）が、本明細書でより大きな配列内に記載される場合、それらは常にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のように、Ｎ末端からＣ末端の順に配置され、フレームワークアミノ酸配列により区切られる。
「ＣＨ１ドメイン」は、ＶＨドメインおよびヒンジ間に配置される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。それはＥＵポジション１１８〜２１５にわたる。ＣＨ１ドメインは天然由来のＣＨ１ドメインまたは１以上のアミノ酸（「ａａ」）が置換され、追加され、欠失された天然由来のＣＨ１ドメインであることとしてもよく、ＣＨ１ドメインが所望の生物学的特性を有することを提供する。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然由来の配列に対して増強された生物学的活性または低減された生物学的活性であることとしてもよい。
「ＣＨ２ドメイン」は、ヒンジおよびＣＨ３ドメイン間に配置される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。本明細書で定義されるように、それはＥＵポジション２３７〜３４０にわたる。ＣＨ２ドメインは、天然由来のＣＨ２ドメイン、または１以上のａａが置換され、追加され、欠失された天然由来のＣＨ２ドメインであることとしてもよく、ＣＨ２ドメインが所望の生物学的特性を有することを提供する。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然由来の配列のそれに対して増強された生物学的活性または低減された生物学的活性であることとしてもよい。
「ＣＨ３ドメイン」は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に配置される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指し、ＣＨ２ドメインのＮ末端から約１１０残基、例えば、約３４１〜４４６位置（ＥＵ番号付けシステム）にわたる。ＣＨ３ドメインは、天然由来のＣＨ３ドメイン、または１以上のａａが置換され、追加され、欠失された天然由来のＣＨ３ドメインであることとしてもよく、ＣＨ３ドメインが所望の生物学的特性を有することを提供する。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然由来の配列のそれに対して増強された生物学的活性または低減された生物学的活性であることとしてもよい。ＣＨ３ドメインは、Ｃ末端リジンを含むこととしてもよく、または含まないこととしてもよい。
「ＣＨ４ドメイン」は、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体におけるＣＨ３ドメインのＣ末端に配置される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。ＣＨ４ドメインは、天然由来のＣＨ４ドメイン、または１以上のａａが置換され、追加され、欠失された天然由来のＣＨ４ドメインであることとしてもよく、ＣＨ４ドメインが所望の生物学的特性を有することを提供する。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然由来の配列のそれに対して増強された生物学的活性または低減された生物学的活性であることとしてもよい。
「ＣＬドメイン」は、ＶＬドメインのＣ末端に配置される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。それはＫａｂａｔの約１０７Ａ〜２１６位置にわたる。ＣＬドメインは、天然由来のＣＬドメイン、または１以上のａａが置換され、追加され、欠失された天然由来のＣＬドメインであることとしてもよく、ＣＬドメインが所望の生物学的特性を有することを提供する。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然由来の配列のそれに対して増強された生物学的活性または低減された生物学的活性であることとしてもよい。ＣＬドメインは、Ｃ末端リジンを含むこととしてもよく、または含まないこととしてもよい。
「ｃ−Ｍｅｔ」または「ｃ−ＭＥＴ」は、肝細胞増殖因子レセプター（ＨＧＦＲ）、スキャッター因子（Scatter Factor）（ＳＦ）レセプター、ＡＵＴＳ９、ＲＣＣＰ２としても知られる、遺伝子ＩＤ４２３３に対応する、間葉−上皮移行（ＭＥＴ）因子を指し、チロシンキナーゼ活性を有する。主要な単鎖前駆体タンパク質は、翻訳後に切断されて、アルファおよびベータサブユニットを産生し、それらは成熟したレセプターを形成するためにジスルフィド結合される。異なるアイソフォームをコードする２つの転写変異体は、この遺伝子についてみられた。ＨＧＦは、ｃ−Ｍｅｔについての唯一の既知のリガンドである。ヒトｃ−Ｍｅｔアイソフォームａ前駆体のａａ配列は、ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００１１２０９７２．１で提供され、アイソフォームｂ前駆体は、ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿０００２３６．２で提供される。
「定常領域」または免疫グロブリンの軽鎖のドメインは、「ＣＬ」、「軽鎖定常領域ドメイン」、「ＣＬ領域」、または「ＣＬドメイン」として互換的に言及される。免疫グロブリンの重鎖での定常ドメイン（例えば、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン）は、「ＣＨ」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域、または「ＣＨ」ドメインとして互換的に言及される。免疫グロブリン軽鎖での可変ドメインは、「ＶＬ」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ領域」、または「ＶＬドメイン」として互換的に言及される。免疫グロブリン重鎖での可変ドメインは、「ＶＨ」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ領域」、または「ＶＨドメイン」として互換的に言及される。
「ＤｉＳ」は、別のシステインとジスルフィド結合を形成し得る、システインの付加をもたらすドメイン、例えば、ヒンジまたはＣＨ３ドメインの変更を指す。ＤｉＳは、ＴＦｃの１つまたは両方のＦｃにおける１以上のａａ置換、欠失、または付加を含むこととしてもよい。ＤｉＳは、モジュール、例えば、モジュール１（「ＤｉＳ１」）で分類され、２つのうち１つのＦｃに対する変更はＤｉＳ１．１として言及され、他のＦｃに対する変更はＤｉＳ１．２として言及される。例えば、ＤｉＳ１．１は、置換Ｙ３４９Ｃからなり、ＤｉＳ１．２はａａ置換Ｓ３５４Ｃからなる。
「ドメイン」は、概して、例えば、β−プリーツシートおよび／または鎖内のジスルフィド結合により安定化される、ペプチドループ（例えば、１から４のペプチドループ）を含むこととしてもよい、重または軽鎖ポリペプチドの、領域、例えば、独立して折り畳まれる球状領域または非球状領域（例えば、リンカードメイン）を指す。免疫グロブリン重および軽鎖の定常および可変領域は、典型的には、ドメイン内に折り畳まれる。特に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、ＣＬ、ＶＨ、およびＶＬドメインのそれぞれの１つが、典型的には、ループ構造を形成する。
「ＥＣ５０」または「ＥＣ５０」は、結合アッセイまたはシグナル伝達経路のような特定のシステムで、タンパク質の最大効果の５０％を提供する分子、例えばＴＦｃＡの濃度を指す。
「ＥＧＦＲ」は、ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ−１、ｍＥＮＡ、およびＰＩＧ６１としても知られる、表皮成長因子レセプターを指す。ＥＧＦＲは、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧｆ−α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ベタセルリン、エピレグリンを含むリガンドに結合することが知られており、遺伝子ＩＤ１９５６を有する（Herbst, R. S., and Shin, D. M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Mendelsohn, J., and Baselga, J., Oncogene 19 (2000) 6550-6565）。ＥＧＦＲは、細胞増殖、分化、細胞生存、アポプトーシス、血管新生、有糸分裂誘発、および転移を制御するシグナル伝達経路の活性化を含むがこれらに限定されない、チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路を介して多数の細胞プロセスを調節するプロテインキナーゼスーパーファミリーのメンバーである膜貫通グリコプロテインである（Atalay, G., et al., Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Tsao, A. S., and Herbst, R. S., Signal 4 (2003) 4-9; Herbst, R. S., and Shin, D. M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235）。ＥＧＦＲに対するリガンドの結合は、細胞増殖へと導くレセプター二量体化およびチロシン自己リン酸化を誘導する。異なるタンパク質アイソフォームをコードする複数の代替的なスプライスされた転写変異体が、この遺伝子についてみられる。ヒトＥＧＦＲアイソフォームａ−ｄ前駆体についてのａａ配列は、ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００５２１９．２、ＮＰ＿９５８４３９．１、ＮＰ＿９５８４４０．１、およびＮＰ＿９５８４４１．１で提供される。
「ＥｐＣＡＭ」は、ヒトにおいてＥＰＣＡＭ遺伝子によりコードされる上皮細胞接着分子、タンパク質を指す。また、ＥｐＣＡＭは、「ＴＡＣＳＴＤ１」（腫瘍関連カルシウムシグナルトランストランスデューサ（tumor-associated calcium signal transducer））、ＣＤ３２６（分化３２６のクラスター）、および１７−１Ａ抗原として示された。ＥｐＣＡＭは、ほとんどのカルシノーマにより発現されるパン（pan）−上皮分化抗原である。
「ＥｒｂＢ２」または「ＨＥＲ２」は、推定上のチロシンキナーゼ成長因子レセプターＥＧＦＲ２、ＥＧＦレセプターに類似するｐ１８５ ＨＥＲ２／ＮＥＵ抗原を指す。ＥｒｂＢ２アイソフォームについてのａａ配列は、ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００４４３９．２およびＮＰ＿００１００５８６２．１で提供され、ヌクレオチド配列は、遺伝子ＩＤ２０６４を有する。
「ＥｒｂＢ３」または「ＨＥＲ３」は、ヒトＥＲＢＢ３遺伝子によりコードされるレセプターチロシン−プロテインキナーゼを指し、タンパク質アミノ酸リン酸化における役割を有する。ＥｒｂＢ３アイソフォームについてのａａ配列は、ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ００１９７３．２およびＮＰ＿００１００５９１５．１で提供され、ヌクレオチド配列は遺伝子ＩＤ２０６５で提供される。
「ＥｒｂＢ４」または「ＨＥＲ４」は、細胞増殖および分化を調節するレセプターチロシンキナーゼシグナル変換における役割を果たす。ＥｒｂＢ３アイソフォームについてのａａ配列が、ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ００１９７３．２およびＮＰ＿００１００５９１５．１で提供され、ヌクレオチド配列は遺伝子ＩＤ２０６６を有する。
ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、およびＥＲＢＢ４遺伝子は、ヘレグリン／ニューレグリンレセプター、ＥＧＦＲ関連タイプＩレセプターチロシンキナーゼサブファミリーのメンバーをコードする。コードされたタンパク質は、ホモおよびヘテロダイマーを形成し、ＥＲＢＢ２ホモダイマーはヘレグリンに結合しないが、ＥＲＢＢ２／ＥＲＢＢ３ヘテロダイマーと結合する、機能の配分を複雑にする。ハースタチンは、ｐ１８５ＥＲＢＢ２に結合する細胞外ドメインの分泌された代替的なＥＲＢＢ２産生物であり、ＥＲＢＢ２ダイマーを崩壊させ、ｐ１８５リン酸化を低減し、成長を阻害する。ヒトＥＲＢＢ２遺伝子は、１７ｐ１２−２１で配置される。ＨＥＲ−２の過剰発現は、乳癌における乏しい予後と相互に関連する。
「ＩＧＦ１Ｒ」は、インスリン様成長因子１レセプターを指す。代表的なヒトＩＧＦ１Ｒ核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ３４８０およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿０００８６６．１でそれぞれ述べられる。
「ＩＧＦ２Ｒ」は、インスリン様成長因子２レセプターを指す。代表的なヒトＩＧＦ２Ｒ核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ３４８２およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿０００８６７．２でそれぞれ述べられる。
「インスリンレセプター」は、インスリンについての細胞レセプターを指す。代表的なヒトインスリンレセプター核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ３６４３およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿０００１９９．２でそれぞれ述べられる。
「ＲＯＮ」は、マクロファージ刺激タンパク質レセプターについてのレセプターを指す。代表的なヒトＲＯＮ核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ４４８６およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００２４３８．２でそれぞれ述べられる。
「ｃ−Ｋｉｔ」は、ｖ−ｋｉｔ Ｈａｒｄｙ−Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ４ネコ肉腫ウィルスの癌遺伝子相同体を指す。代表的なヒトｃ−Ｋｉｔ核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ３８１５およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００１０８７２４１．１でそれぞれ述べられる。
「ＶＥＧＦＲ１」は、血管内皮成長因子１を指す。代表的なトＶＥＧＦＲ１核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ２３２１およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００２０１０．２でそれぞれ述べられる。
「ＶＥＧＦＲ２」は、血管内皮成長因子２を指す。代表的なヒトＶＥＧＦＲ２核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ３７９１およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００２２４４．１でそれぞれ述べられる。
「ＴＮＦＲ」は、腫瘍壊死因子レセプターを指す。代表的なヒトＴＮＦＲ核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ７１３２およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００１０５６．１でそれぞれ述べられる。
「ＦＧＦＲ１」は、線維芽細胞増殖因子レセプター１を指す。代表的なヒトＦＧＦＲ１核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ２２６０およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００１１６７５３７．１でそれぞれ述べられる。
「ＦＧＦＲ２」は、線維芽細胞増殖因子レセプター２を指す。代表的なヒトＦＧＦＲ２核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ２２６３およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００１１３８３９０．１でそれぞれ述べられる。
「ＦＧＦＲ３」は、線維芽細胞増殖因子レセプター３を指す。代表的なヒトＦＧＦＲ３核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ２２６１およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿０００１３３．１でそれぞれ述べられる。
「ＦＧＦＲ４」は、線維芽細胞増殖因子レセプター４を指す。代表的なヒトＦＧＦＲ４核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ２２６４およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿０７５２５２．２でそれぞれ述べられる。
「ＰＤＧＦＲアルファ」は、血小板由来成長因子レセプターアルファを指す。代表的なヒトＰＤＧＦＲアルファ核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ５１５６およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００６１９７．１でそれぞれ述べられる。
「ＰＤＧＦＲベータ」は、血小板由来成長因子レセプターベータを指す。代表的なヒトＰＤＧＦＲベータ核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ５１５９およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００２６００．１でそれぞれ述べられる。
「ＥｐＣＡＭ」は、上皮細胞接着分子を指す。代表的なヒトＥｐＣＡＭ核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ４０７２およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００２３４５．２でそれぞれ述べられる。
「ＥｐｈＡ２」は、ＥＰＨレセプターＡ２を指す。代表的なヒトＥｐｈＡ２核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ１９６９およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００４４２２．２でそれぞれ述べられる。
「ＣＥＡ」は、癌胎児性の抗原関連細胞接着分子５を指す。代表的なヒトＣＥＡ核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ１０４８およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００４３５４．２でそれぞれ述べられる。
「ＣＤ４４」は、細胞表面糖タンパク質ＣＤ４４を指す。代表的なヒトＣＤ４４核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene 遺伝子ＩＤ９６０およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００１１８９４８６．１でそれぞれ述べられる。
「ＡＬＫ」は、未分化リンパ腫レセプターチロシンキナーゼを指す。代表的なヒトＡＬＫ核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ２３８およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００４２９５．２でそれぞれ述べられる。
「ＡＸＬ」は、ＡＸＬレセプターチロシンキナーゼを指す。代表的なヒトＡＸＬ核酸およびタンパク質配列は、RefSeqGene遺伝子ＩＤ５５８およびジェンバンク受け入れ番号ＮＰ＿０６８７１３．２でそれぞれ述べられる。
「ＥＵ」は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインにおけるａａ位置を含む、重鎖定常領域を含むａａ位置が、ＥＵインデックス番号付けシステムに従って本明細書で番号付けられることを示す（“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, U.S. Dept. Health and Human Services, 5th edition, 1991におけるKabat et al.参照）。
「Ｆａｂ」は、２つの鎖：ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む第１の鎖並びにＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む第２の鎖を含む、抗体の抗原結合部位を指す。Ｆａｂは、典型的には、パパインで治療されてヒンジ領域の一部を含む抗体のＮ末端フラグメントとして記載されるが、重鎖がヒンジの一部を含まない結合ドメインを指すものとして本明細書でも使用される。
「Ｆｃ領域」は、パパイン切断部位のちょうど上流のヒンジ領域で開始し（つまり、１１４である重鎖定常領域の最初の残基をとる、ＩｇＧにおける残基２１６）、抗体のＣ末端で終了する単一の免疫グロブリン重鎖の一部を指す。従って、完全なＦｃ領域は、少なくともヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。二量体化される２つのＦｃ領域は、「Ｆｃ」または「Ｆｃダイマー」として言及される。Ｆｃ領域は、は、天然由来のＦｃ領域、または１以上のａａが置換され、追加され、欠失された天然由来のＦｃ領域であることとしてもよく、Ｆｃ領域が所望の生物学的特性を有することを提供する。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然由来のドメインのそれに対して増強された生物学的活性または低減された生物学的活性であることとしてもよい。
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」または「ＦＲ領域」は、可変領域の一部であるａａ残基を含むが、ＣＤＲの一部ではない（例えば、ＣＤＲのＫａｂａｔの定義を用いる）。よって、可変領域フレームワークは約１００〜１２０ａａの間の長さであるが、ＣＤＲの外側にそれらのａａのみを含む。重鎖可変領域の特定の例について、およびKabat et al., 1991, ibid.により定義されるＣＤＲについて、フレームワーク領域１はａａ１〜３０を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域２はａａ３６〜４９を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域３はａａ６６〜９４を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域４はａａ１０３から可変領域の最後までの可変領域のドメインに対応する。軽鎖についてのフレームワーク領域は、同様に、軽鎖可変領域ＣＤＲのそれぞれにより区切られる。同様に、Chothia et al.またはMcCallum et al.によるＣＤＲの定義を用いて、フレームワーク領域の境界は、上記のようなそれぞれのＣＤＲ末端により区切られる。好ましい実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔにより定義される。
「全長抗体」または「全長Ａｂ」は、任意に結合されることとしてもよい、１以上の重鎖および１以上の軽鎖を含む抗体（「Ａｂ」）である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨとして本明細書で省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨｌ、ＣＨ２、およびＣＨ３、並びに任意に４つ目のドメイン、ＣＨ４を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬとして省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）とよばれる超可変性の領域に細分化され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存される領域で分散され得る。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含み、以下のＦＲｌ、ＣＤＲｌ、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシル末端まで配置される。免疫グロブリンタンパク質は、あらゆるタイプまたはクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ、およびＩｇＡ２）であり得る。
「Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー」または「Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチド」は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。代表的なＧｌｙ−Ｓｅｒペプチドはａａ配列（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多い数を含む。所定の実施形態では、ｎは１から５の間の数であり、ｎは６から１０の間の数であり、ｎは１１から１５の間の数であり、ｎは１６から２０の間の数であり、ｎは２１から２５の間の数であり、またはｎは２６から３０の間の数である。
「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインとの間に配置される重鎖の柔軟な部分を指す。それは約２５ａａ長であり、「上部ヒンジ」、「中部ヒンジ」、「コアヒンジ」、および「下部ヒンジ」に分けられる。ヒンジは、天然由来のヒンジ、または１以上のａａが置換され、追加され、欠失された天然由来のヒンジであることとしてもよく、ヒンジが所望の生物学的特性を有することを提供する。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然由来の配列に対して増強された生物学的活性または低減された生物学的活性であることとしてもよい。
「ヒンジサブドメイン」は、上部ヒンジ、中部（またはコア）ヒンジ、または下部ヒンジを指す。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のヒンジサブドメインのａａ配列は、表２で述べられる。
完全ヒンジは、アミノからカルボキシ末端の順で、介在性の配列なしに、上部ヒンジサブドメイン、中部ヒンジサブドメイン、および下部ヒンジサブドメインからなる。
「ＩＣ５０」または「ＩＣ５０」は、最大活性（例えば、刺激または構成的活性に対する反応）の５０％抑制を提供する、つまり、最大活性とベースラインとの間の中間のレベルに活性を低減させる濃度、例えば、ＴＦｃＡの濃度を指す。ＩＣ５０値は、例えば、Cheng-Prusoffの式を用いて絶対的な抑制定数（Ｋｉ）に換算されることとしてもよい。本明細書で提供される抗体またはＴＦｃＡのような結合剤により阻害されるシステムにおいて、ＩＣ５０は、ＥＣ５０と識別不能であることとしてもよい。
結合タンパク質による生物学的活性の「抑制」は、結合タンパク質により媒介される生物学的活性におけるあらゆる再現性のある検出可能な低減を指す。いくつかの実施形態では、抑制は、生物学的活性における統計的に有意な低減、例えば、結合タンパク質の不存在下で測定される生物学的活性に対し、生物学的活性における約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低減を提供する。
免疫グロブリンａａ配列の位置の指定を伴う「Ｋａｂａｔ」は、軽鎖定常領域（例えば、ＣＬドメイン）におけるアミノ酸位置が、Ｋａｂａｔインデックス番号付けシステムにより番号付けられる（Kabat et al., 1991., op. cit.参照）ことを示す。
「結合」は、アミノ酸またはヌクレオチドについての直接または間接的な結合または連結を指す。「間接的な結合」は、例えば、１以上のａａまたはヌクレオチドを含む、リンカーまたはドメインにより媒介される結合を指す。２つのポリペプチドセグメントに言及する場合、「直接結合」または「直接的な結合」は、２つのポリペプチドセグメント間の共有結合の存在を指し、例えば、２つのポリペプチドセグメントが介在性の配列なしに隣接して連結される。
「リンカー」は、２つのドメインまたは領域とともに結合する１以上のａａを指す。必要とされる生物学的活性を有することができるようにすることにより適切な三次元構造を形成するために、ドメインがリンカーにより結合できるようにリンカーが柔軟であることとしてもよい。ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬと結合するリンカーは、「ｓｃＦｖリンカー」として本明細書で言及される。ＶＨドメインのＮ末端またはＣＨ３ドメインのＣ末端を第２のＶＨまたはＶＬドメイン、例えば、ｓｃＦｖのそれに結合するリンカーは、「結合リンカー」として言及される。
「モジュール」は、結合部位（例えば、ｓｃＦｖドメインまたはＦａｂドメイン）およびＴＦｃのような、ＴＦｃＡの構造的および／または機能的に別個の部分を指す。本明細書で提供されるモジュールは、例えば、本明細書で開示されるような広範のＴＦｃＡを産生するための他のモジュールとともに、多数の組み合わせにおいて（核酸を組み換えることによってまたは新たなポリヌクレオチドの完全もしくは分画のデノボ合成によって、それらをコードする配列を組み換えることにより）再配列され得る。「モジュール」は、また、ＡＥＭまたはＤｉＳ変更のタイプを指すために使用される。これに関連して、本明細書に記載されるように、「モジュール」は、これらの変更を含むＦｃ領域の会合または二量体化を増強するまたは助けるためになされる１または２以上のａａ置換、付加、または欠失の組み合わせである。
「％同一性」は、２つの配列が最大の一致または比較されるために整列される場合、同じであるヌクレオチドまたはａａ残基の同じ（１００％同一）であるまたは特定されたパーセンテージを有する２以上の核酸またはポリペプチド配列またはサブシーケンスを指す。最大の一致のために整列させるために、ギャップが比較される配列の１つの中に導入されることとしてもよい。対応する位置でのａａ残基またはヌクレオチドがその後比較されて定量化される。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置として同じ残基により占められる場合、そのとき配列はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一の位置の数の関数である（例えば、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数（例えば、重複位置）×１００）。所定の実施形態では、２つの配列は、同じ長さである。１つの配列が別の配列との％同一性を測定される測定は、数学的アルゴリズムを用いて測定され得る。２つの配列のこのような比較について利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＧＣＧ配列の整列ソフトウェアパッケージの一部である整列（ＡＬＩＧＮ）プログラム（バージョン２．０）で組み込まれる。例えば、ａａ配列を比較するための整列プログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を用いることとしてもよい。配列分析についての付加アルゴリズムは、当該技術分野でよく知られており、多くがオンラインで利用可能である。
参照部分の（例えば、ドメインの）「一部」または「フラグメント」は、少なくともまたは最大で、参照部分のサイズの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％である、全体の参照部分（例えば、ドメイン、例えば、天然由来のドメイン）の個別の部分を指す。
「ｓｃＦｖリンカー」は、ｓｃＦｖのＶＬとＶＨドメインの間に挿入されるペプチドまたはポリペプチドドメインを指す。ｓｃＦｖリンカーは、好ましくは、抗原結合コンフォメーションにおけるＶＬおよびＶＨドメインの方向づけを可能にする。一実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、グリシンおよびセリン（「Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー」）のみを含むペプチドまたはポリペプチドリンカーを含むまたはからなる。所定の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、ジスルフィド結合を含む。
「特異的な結合」、「特異的に結合する」、「選択的に結合すること」、および「選択的結合」、並びに「特異的に結合する」、「選択的に結合する」は、その標的エピトープへの結合部位の結合またはそれらの標的エピトープへの結合部位の組み合わせを指す場合、結合部位（複数を含む）が標的エピトープ（複数を含む）に免疫特異的に結合することを呈することを意味する。エピトープに特異的に結合する結合部位は、標的エピトープについての明らかな親和性を呈し、概して、他のエピトープとの交差反応性を示さず、標的エピトープについての親和性と同じ、これより高い、または２桁の規模以内でより低いあらゆる非関連エピトープに対する明らかな親和性を示さず、好ましくはあらゆる非関連エピトープに対する親和性を示さない。「明らかな」または好ましい結合は、１０−８、１０−９Ｍ、１０−１０、１０−１１、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍの解離定数（Ｋｄ）またはさらにより低いＫｄ値を有する結合を含む。また、Ｋｄ値は、１０ｅ−８、１０ｅ−９Ｍ等として示され得る。Ｋｄ値（解離定数）のより低い値が、より高い親和性を示し、よって、１０−７のＫｄは１０−８のＫｄより高いＫｄ値であるが、１０−８のＫｄより低い結合親和性を示すことに留意する。約１０−７の値を有する、および約１０−８Ｍと同じぐらい低いとしても、解離定数は、治療の抗体のために適する解離定数のハイエンドである。結合親和性は、例えば、１０−６から１０−１２Ｍ、１０−７から１０−１２Ｍ、１０−８から１０−１２Ｍ、またはよりよい（つまり、またはより低い値の解離定数）のような解離定数の範囲により示されることとしてもよい。ナノモル（１０−９Ｍ）からピコモル（１０−１２Ｍ）の範囲におけるまたはより低い解離定数は、典型的に治療の抗体について最も有用である。適切な解離定数は、５０ｎＭまたはより低く（つまり、５０ｎＭまたはより高い結合親和性、例えば、４５ｎＭのＫｄ）、または４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭもしくは１ｐＭまたはより低いＫｄである。特異的または選択的結合は、例えば、スキャチャード解析および／または競合結合測定法によるものを含む、このような結合を測定するためのあらゆる技術‐認識された手段に従って測定され得る。
「ＴＦｃ」または「タンデムＦＣ」は、アミノからカルボキシル末端の順に、第２のＦｃ領域のＮ末端にそのＣ末端で結合されるＴＦｃリンカーのＮ末端に、そのＣ末端で結合される第１のＦｃ領域を含むエンティティを指し、第１および第２のＦｃ領域はＦｃを形成するために結合（associate）する。
「ＴＦｃＡ」は、タンデムＦＣ抗体を指す。ＴＦｃＡは、例えば、単一の結合部位を含む一価のまたは単一特異性のＴＦｃＡであることとしてもよい。ＴＦｃＡは、また、ＴＦｃＢＡとして本明細書で言及される二重特異性ＴＦｃＡであることとしてもよい。ＴＦｃＡはモノクローナルであることとしてもよい。
「ＴＦｃＢＡ」は、タンデムＦＣ二重特異性抗体、少なくとも２つの異なる結合部分またはドメイン、よって少なくとも２つの異なる結合部分（例えば、２つの異なる抗体結合部位）を含む人工のハイブリッドタンパク質を指し、１以上の複数の結合部位は、例えばペプチド結合を介して互いに共有結合的に結合される。本明細書に記載される代表的なＴＦｃＢＡは、抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡであり、例えばヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質のようなｃ−Ｍｅｔタンパク質に特異的に結合する第１の結合部位および例えばヒトＥＧＦＲタンパク質のようなＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する１以上の第２の結合部位を含む多価二重特異性抗体である。ＴＦｃＢＡの名称がプラスサイン（＋）により区切られた２つの抗原を含む場合、このことは、２つの抗原についての結合部位が、分子における相対的なアミノからカルボキシの方向づけのいずれかであるということを示し、一方では、ＴＦｃＢＡの名称がスラッシュ（／）により区切られた２つの抗原結合部位の名称を含む場合、スラッシュの左側の抗原結合部位が、スラッシュの右側の抗原結合部位に対するアミノ末端である。ＴＦｃＢＡは、二価の結合タンパク質、三価の結合タンパク質、四価の結合タンパク質、または４結合部位よりも多い結合タンパク質であることとしてもよい。代表的なＴＦｃＢＡは、二価の二重特異性抗体、つまり、２結合部位を有し、異なる抗原またはエピトープにそれぞれ結合する抗体である。所定の実施形態では、ＴＦｃＢＡのＮ末端結合部位はＦａｂであり、Ｃ末端結合部位はｓｃＦｖである。
タンデムＦＣ Ａｂ
本明細書で提供されるのは、タンデムＦＣ抗体（「ＴＦｃＡ」）であり、一価または多価、例えば、二価、三価、または四価であることとしてもよい。多価であるＴＦｃＡは、単一特異性、二重特異性(「タンデムＦＣ二重特異性Ａｂ」または「ＴＦｃＢＡ」）三重特異性または四重特異性ＴＦｃＢＡであることとしてもよい。ＴＦｃＢＡが多重特異性である場合、１以上の特異性について一価であることとしてもよい。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡはＴＦｃＢＡである。代表的なＴＦｃＢＡは、ＴＦｃＢＡにより標的とされるレセプターの１つまたは両方により、リガンドに誘導されるシグナル変換を阻害し、これにより腫瘍の細胞増殖または腫瘍の増殖を阻害することとしてもよい。ＴＦｃＢＡは、また、レセプターの下方制御を誘導し、またはレセプターの二量体化をブロックすることとしてもよい。代表的な抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡは、単一の抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位（抗ｃ−Ｍｅｔについて一価）および１以上の抗ＥＧＦＲ結合部位（抗ＥＧＦＲについて一価または多価）を含む。ＴＦｃは、典型的には、ＴＦｃリンカーにより第１のＦｃ領域に結合される第１のＦｃ領域を含み、第１および第２のＦｃ領域は、Ｆｃを形成するために二量体化する。
図１は、分子の種々の構成部分を示す代表的なＴＦｃＢＡの図を示す。図に示されるように、ＴＦｃＢＡは、第１の結合部位（例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂ）、第２の結合部位（例えば、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ）、およびともに第１のおよび第２の結合部位に結合するタンデムＦＣ（「ＴＦｃ」）を含む。ＴＦｃＢＡは、３つのモジュールを含むように記載されることとしてもよく、第１のモジュールは第１の結合部位を含み、第２のモジュールはＴＦｃを含み、第３のモジュールは第２の結合部位を含む。ＴＦｃは、概して、連続するａａ配列において、第１のＦｃ領域、ＴＦｃリンカー、および第２のＦｃ領域を含み、ＴＦｃリンカーは、第１のＦｃ領域を第２のＦｃ領域に結合し、２つのＦｃ領域の会合を可能にする。図１における代表的なＴＦｃＢＡに示されるように、ＴＦｃの２つのＦｃ領域はそれぞれ、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むこととしてもよい。これらの領域のそれぞれは、同じ免疫グロブリンアイソタイプ由来、または異なるアイソタイプ由来であることとしてもよい。例えば、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインがすべてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４由来であることとしてもよく、または、所定のドメインもしくはその部分が１つの免疫グロブリンアイソタイプ由来であることとしてもよく、別のドメインもしくはその部分が別の免疫グロブリンアイソタイプであることとしてもよい。例えば、図１に示されるＴＦｃＢＡは、ＩｇＧ１由来のすべてのドメインを含み、代替的には、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジ、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含むこととしてもよい。Ｆｃ領域は、好ましくは、ヒトＦｃドメインを含むが、他の哺乳類または動物由来の配列が使用されることとしてもよく、ＴＦｃＢＡがその生物学的活性を保持することを提供し、それは好ましくはヒト対象において有意な免疫原性ではない。
好ましい実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃ領域は、それらの会合を増強するためのおよび／またはそのような会合を安定化するための１以上の変更を含む。所定の実施形態では、ＴＦｃＡの第１のおよび／または第２のＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメインの会合を増強するための１以上の変更またはそのようなものを含むＦｃを含む。このような変更は、関連性増強変更（Associaton Enhancing Modification）または「ＡＥＭ」として本明細書で言及される。代表的な変更は、それらの相互作用、例えば、ノブ（knob）／ホール（hole）突然変異を増強するために両方のＣＨ３ドメインにおけるａａ置換を含む。
所定の実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃ領域は、Ｆｃ領域に１以上のシステインの付加をもたらし、これにより、ＴＦｃの他のＦｃ領域とジスルフィド結合を形成するａａ修飾を含む。このような変更は、ジスルフィド形成変更または「ＤｉＳ変更」として本明細書で言及される。ＤｉＳ変更は、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインに存在することとしてもよい。
ＴＦｃは、１以上のＡＥＭおよび／または１以上のＤｉＳ変更を含むこととしてもよい。図１Ｂは、ＣＨ３領域またはヒンジのいずれかを作成し得る代表的な変更を示す。また、Ｆｃ領域は、例えば、ＡＤＣＣのような、Ｆｃ領域により媒介される生物学的活性を調節する変更のような、付加的変更を含むこととしてもよい。
概して、第１のおよび第２のＦｃ領域はヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むが、所定の実施形態では、Ｆｃ領域がＣＨ３ドメインおよびＣＨ２ドメインを含むがヒンジを含まないこととしてもよい。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメインおよびヒンジを含むがＣＨ２ドメインを含まないこととしてもよい。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインを含むがＣＨ２ドメインとヒンジを含まないこととしてもよい。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＣＨ２ドメインを含むがヒンジを含まないこととしてもよい。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ヒンジを含むがＣＨ２ドメインを含まないこととしてもよい。所定の実施形態では、１以上のドメインの一部が欠けていることとしてもよい。
所定の実施形態では、第１のＦｃ領域は、１以上のａａ付加、欠失、または置換（「ヘテロダイマーＦｃ」）において第２のＦｃ領域のそれと異なるａａ配列を含む。これは、第１のおよび第２のＦｃ領域への異なる変更を典型的に導入するＡＥＭおよびＤｉＳ変更としてよくあることである。他の実施形態では、第１のＦｃ領域は第２のＦｃ領域（「ホモダイマーＦｃ」）として同じａａ配列を含む。
所定の実施形態では、Ｆｃドメイン（ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン）は、別のＦｃドメインに直接結合される。例えば、ヒンジは、ＣＨ２ドメインに直接結合されることとしてもよく、および／またはＣＨ２ドメインはＣＨ３ドメインに直接結合されることとしてもよい。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、１以上のａａ長さであるリンカーにより別のＦｃドメイン結合され、これらのドメインを含むＴＦｃＡが所望の生物学的活性および安定性並びにあらゆる他の所望の特性を有することを提供する。
所定の実施形態では、結合部位は、例えば、重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合部位である。ＶＨおよびＶＬドメインは、概して、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をそれぞれ含むが、所定の実施形態では、６より少ないＣＤＲが抗原に特異的に結合することを提供するために十分であることとしてもよい。所定の実施形態では、ＶＨドメインはＦａｂの一部であり、その場合、概して、自然の秩序では、ＶＨドメインはＣＨ１ドメインに結合され、つまりＶＨドメインがＣＨ１のＮ末端に結合される。抗原結合部位がＦａｂの一部である場合に、概して、自然の秩序では、ＶＬドメインは軽鎖定常（ＣＬ）ドメインに結合されることとしてもよく、つまり、ＶＬドメインはＣＬドメインのＮ末端に結合される。
可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）は、定常ドメイン（ＣＨ１およびＣＬ）に直接的または間接的に、例えば、１以上のａａ長さであるリンカーにより結合されることとしてもよく、これらのドメインを含むＴＦｃＡが所望の生物学的活性および安定性並びにあらゆる他の所望の特性を有することを提供する。
所定の実施形態では、ＶＨドメインはｓｃＦｖの一部であり、その場合、ＶＨドメインは、ｓｃＦｖリンカーによりＶＬドメインに結合され、ｓｃＦｖはＴＦｃのＮおよび／またはＣ末端に結合される。結合部位がｓｃＦｖである場合、可変領域は概してＣＨ１またはＣＬドメインに結合されない。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡが一価のおよび単一特異性である。一価のＴＦｃＡは、ＴＦｃのアミノ末端またはＣ末端で結合部位を含むこととしてもよい。一価のＴＦｃＡの結合部位は、ＦａｂまたはｓｃＦｖであることとしてもよい。代表的な一価のＴＦｃＡの重鎖は、
ｉ）ＶＨドメインおよびＴＦｃ；
ｉｉ）ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＴＦｃ；
ｉｉｉ）ＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー、ＶＬドメイン、およびＴＦｃ；
ｉｖ）ＴＦｃ、結合リンカー、およびＶＨドメイン；
ｖ）ＴＦｃ、結合リンカー、ＶＨドメイン、およびＣＨ１ドメイン；並びに
ｖｉ）ＴＦｃ、結合リンカー、ＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびＶＬドメインを、アミノからカルボキシル末端の順において含む。
ＴＦｃＡがＦａｂを含む場合、ＴＦｃＡは、また、ＦａｂのＶＬドメインおよび任意にＣＬドメインを含む軽鎖を含む。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡはＴＦｃＢＡである。ＴＦｃＢＡは、第１の抗原に特異的に結合する１つのＦａｂおよび第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含むこととしてもよい。ＴＦｃＢＡは、また、第１の抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖおよび第２の抗原に特異的に結合する第２のｓｃＦｖを含むこととしてもよい。ＴＦｃＢＡは、また、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂおよび第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖを含むこととしてもよい。所定の実施形態では、ＴＦｃのアミノ末端はＦａｂに結合され、ＴＦｃのカルボキシル末端はｓｃＦｖに結合される。代替的には、ＴＦｃのアミノ末端はｓｃＦｖに結合され、ＴＦｃのカルボキシル末端はＦａｂに結合される。代表的な分子は、以下のフォーマットを有する：Ｆａｂ−ＴＦｃ−ｓｃＦｖ；Ｆａｂ−ＴＦｃ−Ｆａｂ；ｓｃＦｖ−ＴＦｃ−ｓｃＦｖ；およびｓｃＦｖ−ＴＦｃ−Ｆａｂ。
一実施形態では、ＴＦｃＢＡは、
（ｉ）第１のＶＨドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、および第２のＶＨドメイン；
（ｉｉ）第１のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、および第２のＶＨドメイン；
（ｉｉｉ）第１のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、第２のＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよび第２のＶＬドメインであって、第２のＶＨおよびＶＬドメインが第２の結合部位を形成するために会合し；
（ｉｖ）第１のＶＨドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、第２のＶＨドメイン、およびＣＨ１ドメイン；
（ｖ）第１のＶＨドメイン、第１のＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、第２のＶＨドメイン、および第２のＣＨ１ドメイン；
（ｖｉ）第１のＶＨドメイン、第１のｓｃＦｖリンカー、第１のＶＬドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、および第２のＶＨドメインであって、第１のＶＬおよびＶＨドメインが第１の結合部位を形成するために会合し；
（ｖｉｉ）第１のＶＨドメイン、第１のｓｃＦｖリンカー、第１のＶＬドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、第２のＶＨドメイン、およびＣＨ１ドメインであって、第１のＶＬおよびＶＨドメインが第１の結合部位を形成するために会合し；並びに
（ｖｉｉｉ）第１のＶＨドメイン、第１のｓｃＦｖリンカー、第１のＶＬドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、第２のＶＨドメイン、第２のｓｃＦｖリンカー、および第２のＶＬドメイン、であって第１のＶＨおよびＶＬドメインが第１の結合部位を形成し、かつ第２のＶＨおよびＶＬドメインが第２の結合部位を形成するものを、アミノからカルボキシル末端の順において含む重鎖を含む。
（ｉ）から（ｖ）のＴＦｃＢＡは、さらに、第１のＶＬドメインおよび任意にＶＬドメインのＣ末端に位置されるＣＬドメインを含む軽鎖を含むこととしてもよく、第１のＶＨおよびＶＬドメインは、第１の結合部位を形成するために会合する。（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）のＴＦｃＢＡは、第２のＶＬドメインおよび任意にＶＬドメインのＣ末端に位置されるＣＬドメインを含む軽鎖を含むこととしてもよく、第１のＶＨおよびＶＬドメインは、第２の結合部位を形成するために会合する。
所定の実施形態では、重鎖は、第１のＶＨドメインを含み、そのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、そのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合される。所定の実施形態では、重鎖は、第１のＶＨドメインを含み、そのＣ末端でＣＨ１ドメインのＮ末端に結合され、そのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、そのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合される。所定の実施形態では、重鎖は、第１のＶＨドメインを含み、そのＣ末端でＣＨ１ドメインのＮ末端に結合され、そのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、そのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合され、そのＣ末端でｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＶＬドメインのＮ末端に結合され、第２のＶＨおよびＶＬドメインは、第２の結合部位を形成するために会合する。所定の実施形態では、重鎖は、第１のＶＨドメインを含み、そのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、そのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＶＬドメインのＮ末端に結合され、そのＣ末端でＣＨ１ドメインのＮ末端に結合される。所定の実施形態では、重鎖は、第１のＶＨドメインを含み、そのＣ末端で第１のＣＨ１ドメインのＮ末端に結合され、そのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、そのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に結合される。所定の実施形態では、重鎖は、第１のＶＨドメインを含み、そのＣ末端で第１のｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第１のＶＬドメインのＮ末端に結合され、そのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、そのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合され、第１のＶＨおよびＶＬドメインは、第１の結合部位を形成するために会合する。所定の実施形態では、重鎖は、第１のＶＨドメインを含み、そのＣ末端で第１のｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第１のＶＬドメインのＮ末端に結合され、そのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、そのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合され、そのＣ末端でＣＨ１ドメインのＮ末端に結合され、第１のＶＨおよびＶＬドメインは、第１の結合部位を形成するために会合する。所定の実施形態では、重鎖は、第１のＶＨドメインを含み、そのＣ末端で第１のｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第１のＶＬドメインのＮ末端に結合され、そのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、そのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＶＬドメインのＮ末端に結合され、第１のＶＨおよびＶＬドメインが第１の結合部位を形成し、第２のＶＨおよびＶＬドメインが第２の結合部位を形成する。
所定の実施形態では、上記の構成で、ＶＬドメインはＶＨドメインに置換され、ＶＨドメインはＶＬドメインに置換される。
重鎖が、第１のまたは第２のＶＬドメインのいずれかを含まない場合、ＶＬドメインは軽鎖により提供されることとしてもよい。軽鎖は、第１のまたは第２のＶＬドメインおよび任意にＣＬドメインを含むこととしてもよい。例えば、ｓｃＦｖは、アミノからカルボキシ末端の順において、ＶＬドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびＶＨドメインを含むこととしてもよい。
所定の実施形態では、ＴＦｃＢＡは、第１のレセプターに特異的に結合する第１の抗原結合部位および第２のレセプターに特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む。所定の実施形態では、第１のレセプターに特異的に結合する第１の抗原結合部位はＦａｂであり、第２のレセプターに特異的に結合する第２の抗原結合部位はｓｃＦｖである。結合部位の代表的な組み合わせは、表３で述べられ、「イエス」は可能な組み合わせを示し、抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡは可能な組み合わせを示すために使用される。
所定の実施形態では、ＴＦｃＢＡは、２以上の結合部位を含む。ＴＦｃＢＡは、３、４、５、６、またはそれより多い結合部位を含むこととしてもよい。付加的な結合部位が、例えば、ＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡのＮおよび／またはＣ末端に結合されることとしてもよい。例えば、重鎖は、ＴＦｃのアミノまたはカルボキシル末端に１以上のＦａｂおよび／またはｓｃＦｖを含むこととしてもよい。
代表的なＴＦｃＢＡのドメインは、さらに以下に記載される。
代表的なヒンジ
一実施形態では、ＴＦｃＡの第１のおよび／または第２のＦｃ領域、例えば、ＴＦｃＢＡは、ＩｇＧ上部ヒンジ、ＩｇＧ中部ヒンジおよび／またはＩｇＧ下部ヒンジを含む。例えば、Ｆｃ領域は、１以上のＩｇＧ１上部、中部、および下部ヒンジを含むこととしてもよく、例えば、配列番号１、２、および３でそれぞれ述べられる（表２参照）。また、Ｆｃ領域は、１以上のＩｇＧ２上部、中部、および下部ヒンジを含むこととしてもよく、例えば、配列番号５、２、および６でそれぞれ述べられる（ＩｇＧ１とＩｇＧ２の中部ヒンジは同じ配列を有する／表２参照）。また、Ｆｃ領域は、１以上のＩｇＧ３上部、中部、および下部ヒンジを含むこととしてもよく、例えば、配列番号８、９、および１０でそれぞれ述べられる（表２参照）。また、Ｆｃ領域は、１以上のＩｇＧ４上部、中部、および下部ヒンジを含むこととしてもよく、例えば、配列番号１２、１３、および１４でそれぞれ述べられる（表２参照）。また、Ｆｃ領域は、１以上のマウスＩｇ配列またｈＩｇＡ１またはＩｇＡ２配列を含むこととしてもよい。
また、ＴＦｃＡの第１のおよび／または第２のＦｃ領域は、例えば、ａａ置換、欠失、または付加のような１、２、３、４、または５ａａまでの変更を含む、本明細書で述べられる配列（例えば、配列番号１〜１４）のような、天然由来の配列と異なるａａ配列を有する上部、中部、および下部ヒンジの配列を含むこととしてもよい。例えば、以下のＩｇＧ１上部ヒンジが使用されることとしてもよい。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＣＣ（配列番号１６；ａａ置換Ｈ２２４ＣおよびＴ２２５Ｃ（下線）を有する配列番号１に対応する）。
ＥＰＫＳＣＤＫＣＨＴ（配列番号１７；ａａ置換Ｔ２２３Ｃ（下線）を有する配列番号１に対応する）。
本明細書で言及されるヒンジ残基のアミノ酸番号付けは、全長抗体におけるそれらの番号付けによる（ＥＵ番号付け；図２参照）。
一実施形態では、ＴＦｃＡの第１のおよび／または第２のヒンジは、以下のａａ配列を含む全長野生型ＩｇＧ１ヒンジである。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号４）
また、ＴＦｃＢＡの第１のおよび／または第２のヒンジは、例えば、配列番号４に対するａａ置換、欠失、または付加のような、１、２、３、４、または５までのａａ修飾を含むＩｇＧ１ヒンジからなることとしてもよい。例えば、以下のＩｇＧ１ヒンジが使用されることとしてもよい。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＣＣＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１８；ａａ置換Ｈ２２４ＣおよびＴ２２５Ｃを有する配列番号４に対応する）；および
ＥＰＫＳＣＤＫＣＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１９；ａａ置換Ｔ２２３Ｃを有する配列番号４に対応する）。
一実施形態では、ＴＦｃＡの第１のおよび／または第２のヒンジは、ハイブリッドヒンジ、つまり、ＩｇＧサブクラスとは異なる部分を含むヒンジである。一実施形態では、ヒンジは、ＩｇＧ１由来の上部ヒンジ並びにＩｇＧ４由来の中部および下部ヒンジを含み、例えば、以下のａａ配列からなることとしてもよい。。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴｃｐｓｃｐａｐｅｆｌｇ（配列番号２０；大文字の残基はＩｇＧ１配列を表し、小文字の残基はＩｇＧ４配列を表す）。
ＴＦｃＢＡの第１のおよび／または第２のヒンジは、また、ａａ置換、欠失、または付加のような、１、２、３、４、または５までのａａ修飾を含む、配列番号２０で述べられるａａ配列を含むハイブリッドヒンジであることとしてもよい。例えば、以下のＩｇＧ１/ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジが使用されることとしてもよい。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＣＣｃｐｓｃｐａｐｅｆｌｇ（配列番号２１；ａａ置換Ｈ２２４ＣおよびＴ２２５Ｃを有する配列番号２０に対応する；大文字の残基はＩｇＧ１配列を表し、小文字の残基はＩｇＧ４配列を表す）；および
ＥＰＫＳＣＤＫＣＨＴｃｐｓｃｐａｐｅｆｌｇ（配列番号２２；ａａ置換Ｔ２２３Ｃ有する配列番号２０に対応する）。
所定の実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃ領域は、全長ヒンジに代えてヒンジの一部を含む。例えば、ＴＦｃＢＡの第１のおよび／または第２のＦｃ領域は、上部、中部、および／または下部ヒンジを欠くヒンジを含むこととしてもよい。所定の実施形態では、Ｆｃ領域は、中部および下部ヒンジを含むが、上部ヒンジを含まない。代表的なＩｇＧ１中部および下部ヒンジのａａ配列は以下の通りである。
ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号２３）
代表的なＩｇＧ４中部および下部ヒンジのａａ配列は以下の通りである。
ＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号２４）
上記で提供されたヒンジおよびその一部のａａ数の概要は、表４で述べられる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジの配列は、図２で述べられる。
システインは、また、ヒンジにおけるＴ２２３、Ｈ２２４、およびＴ２２５以外の位置で、例えば、ＷＯ２０１０／０６４０９０に記載される、置換Ｋ２２２Ｃにより導入されることとしてもよい。
ＴＦｃＡで使用される付加的なヒンジは、以下のａａ配列の１つを含むｈＩｇＧ１ヒンジ変異体を含む（図２）。
ＰＰＰＰＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２６３；ｈＩｇＧ１エクストラプロリンｖ１）
ＥＰＫＳＣＰＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号２６４；ｈＩｇＧ１エクストラプロリンｖ２）
ＥＰＫＳＣＰＰＣＰＣＰＰＣＰ（配列番号２６５；ｈＩｇＧ１様ダブルコア）
また、ＴＦｃＡで使用されるヒンジは、例えば、ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２配列、並びにそのハイブリッドのようなマウスヒンジ配列を含むこととしてもよい。代表的なｍＩｇＧ１／ｍＩｇＧ２Ａヒンジは、ａａ配列ＶＰＲＤＣＴＩＫＰＣＰＰＣＰ（配列番号２６７）含む。
ＴＦｃＡで使用される他のヒンジは、以下のアミノ酸の１つを含む変異体のようなＩｇＧ２ヒンジまたはその変異体を含む（図２）。
ＥＲＫＰＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２６８；ｈＩｇＧ２ Ｃ２３２Ｐ）
ＥＲＫＣＰＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２６９；ｈＩｇＧ２ Ｃ２３３Ｐ）
所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、ＩｇＡ、例えばＩｇＡ２、ヒンジ、またはその変異体を含む。代表的なＩｇＡ２ヒンジ変異体は、以下のａａ配列の１つを含むものを含む（図２）。
ＥＰＫＳＣＰＣＰＰＰＰＰＣＣＰ（配列番号２７１；ｈＩｇＡ２変更ｖ１）
ＥＰＫＳＣＰＣＰＰＰＰＣＣＰ（配列番号２７２；ｈＩｇＡ２変更ｖ２）
ＥＰＫＳＣＰＶＰＰＰＰＰＣＣＰ（配列番号２７３；ｈＩｇＡ２変更ｖ３）
他のバリエーション、例えば、ａａ修飾は、また、ヒンジ内に導入されることとしてもよい。例えば、置換Ｓ２２８Ｐは、ＩｇＧ４中部ヒンジを含む２つのＦｃ領域間での相互作用を安定化するためにＩｇＧ４の中部ヒンジで作成されることとしてもよい。
そのＦａｂドメインにおいて、ＩｇＧ２配列を含むＴＦｃＡは、通常、重鎖を軽鎖に結合するシステインの突然変異である、Ｆａｂドメインの重鎖部分に突然変異Ｃ１２９Ｓを含むこととしてもよい。このような突然変異は、軽鎖システインと重鎖におけるＣ２３２間のジスルフィド架橋形成を促進し、Ｃ２３３は（ＣＰＰＣＰモチーフにおける２つのジスルフィドに加えて）近接するヒンジのＣ２３３と対になるであろう。
所定の実施形態では、以下の変異体ヒンジ、ＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴ（配列番号２４８）、ＰＫＳＣＧＣＫＰＣＩＣＴ（配列番号２４９）、ＰＫＳＣＧＣＫＰＣＩＣＰ（配列番号２５０）、ＰＲＤＣＧＣＫＰＣＰＰＣＰ（配列番号２５１）、ＰＲＤＣＧＣＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２５２）、ＰＫＳＣＤＣＨＣＰＰＣＰ（配列番号２５３）、およびＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２５４）が使用される。
所定の実施形態では、ＴＦｃＢＡは、第１のまたは第２のヒンジを含まない。例えば、第１のヒンジに代えて、ＴＦｃＢＡは、第１の結合部位を第１のＣＨ２ドメインに結合する結合リンカーを含むこととしてもよい。このようなリンカーは、ＴＦｃリンカーについて本明細書でさらに記載されるように、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーであることとしてもよい。所定の実施形態では、結合リンカーは、（Ｇ４Ｓ）２または（Ｇ４Ｓ）３または（Ｇ４Ｓ）４配列を含む。他のペプチド配列は、また、それらがリンカーの所定の部分の必要とされる柔軟性および剛性を提供することを提供する結合リンカーとして使用されることとしてもよい。所定の実施形態では、ＴＦｃＢＡは、第２のヒンジを含まないが、代わりに結合リンカーを含み、ＴＦｃリンカーのそれに類似するＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーであることとしてもよい。
代表的なＣＨ２ドメイン
所定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来またはその組み合わせ（「ハイブリッド」ＣＨ２ドメイン）由来であることとしてもよい。代表的な全長野生型ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインは、以下の配列からなる。
ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２６１）
哺乳類の細胞において発現される場合に、変異体が実質的にアグリコシル化されるように、その残基でグリコシル化を低減するためにＮ２９７Ｑ置換を有する代表的な全長ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインは、以下のアミノ酸配列からなる。
ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２５）
代表的な全長野生型ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインは、以下のａａ配列を含む。
ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２６２）
哺乳類の細胞において発現される場合に、変異体が実質的にアグリコシル化されるように、残基２９７でのグリコシル化を低減するために、Ｔ２９９Ｋ置換を有する、代表的な全長ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインは、以下のアミノ酸配列からなる。
ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＫＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２６）
また、ＣＨ２ドメインは、例えば、ａａ欠失、付加、または置換のような１以上のａａ修飾において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のそれと異なるａａ配列を含むこととしてもよい。。所定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、天然由来の（または野生型）ＣＨ２ドメイン（例えば、配列番号２６１および２６２）または多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または３０ａａにおいて配列番号２５または２６のそれとは異なるａａ配列を含む。所定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、天然由来のＣＨ２ドメイン（例えば、配列番号２６１および２６２）のそれまたは配列番号２５もしくは２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一性または類似であるａａ配列を含む。代表的な変更は、ａａ２９７でのグリコシル化を低減または除去するための他の変更を含む。概して、変更は、哺乳類の細胞において発現される場合に、変異体が実質的にアグリコシル化されるように、ＥＵ位置２９７〜２９９（ａａモチーフＮＸＴ）のいずれかにおけるアミノ酸置換を含むこととしてもよい。Ｔ２９９Ｋに加えて、ａａ２９７でグリコシル化を低減するためにａａ２９９でなされる他の置換は、例えば、ＷＯ／２００５／０１８５７２に記載されるように、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｃ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｗ、およびＴ２９９Ｖを含む。
他のａａ変化は、例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ、または安定性もしくは他に所望の抗体特性のような抗体エフェクタ機能に影響を及ぼすこととしてもよい。例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に結合するＦｃγＲＩは、Ｌｅｕ２３５および／またはＧｌｙ２３７を変更することにより調節されることとしてもよい。ＣＤＣについてのＣ１ｑへの結合は、Ａｌａ３３０および／またはＰｒｏ３３１の置換により調節されることとしてもよい。エフェクタ機能を調節するためにＣＨ２ドメインになされる他の変更は、位置２３４から２３８、２５３、２７９、３１０、３１８、３２０、および３２２での１以上のａａで置換を含む。
代表的なＣＨ３ドメイン
所定の実施形態では、例えば、ＴＦｃＢＡのようなＴＦｃＡの第１のおよび／または第２のＦｃ領域は、ＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインが、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のようなヒト免疫グロブリン由来またはその組み合わせ由来（「ハイブリッド」ＣＨ３ドメイン）であることとしてもよい。代表的な全長野生型ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインは、以下のａａ配列を含む。
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２７）
所定の実施形態では、種々の配列番号２７が使用されることとしてもよい。例えば、ＣＨ３ドメインのＣ末端リジンが欠失されることとしてもよい（図３における配列番号２８参照）。他の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ａａ置換Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍを含み、Ｃ末端リジンは、存在または不存在であることとしてもよい（それぞれ配列番号２９および３０、図３に示される）。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡの第１のおよび／または第２のＣＨ３ドメインは、ぞれぞれ第１のおよび第２のＣＨ３ドメインを含む第１のおよび第２のＦｃの会合を増強するために変更されることとしてもよい。このようなＣＨ３変更は、関連性増強変更として本明細書で言及される（「ＡＥＭ」）。実施例においてさらに記載されるように、Ａｂの２つのＦｃ領域に結合するＴＦｃリンカーの付加が適正に会合し、それらの安定性を増加させるためにＡＥＭを有するＡｂの性能をさらに増強することが予期せず発見された。
使用され得る代表的なＡＥＭ変更は、「ノブからホール（knobs-into-holes）」を作成する変更であり、例えば、米国特許第７，１８３，０７６号に記載される。このストラテジーにおいて、ＣＨ３ドメインは、突出する「ノブ」または「バンプ（bump）」および他の相補的「ホール」を付与することを操作するにより、ＣＨ３ドメインの会合を補助する。「ホール」を作成するＣＨ３ドメインに対する代表的なａａ修飾は、（例えば、図３の配列番号３１〜３４における）ａａ置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの組み合わせである。このような「ホール」を有するＣＨ３ドメインは、例えば、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（例えば、図３の配列番号３５〜３８）を含むＣＨ３ドメインのような「ノブ」または「バンプ」を有するＣＨ３ドメインを有利に二量体化するであろう。このノブ／ホール突然変異の対は、「ＡＥＭモジュール１」または「ＡＥＭ１」として本明細書で言及され、第１のおよび第２のＣＨ３ドメインは「ＡＥＭ１．１」および「ＡＥＭ１．２」としてそれぞれ言及される。
別の実施形態では、ＴＦｃＡの２つのＣＨ３ドメインの１つは、（例えば、図３の配列番号３９〜４２における）置換Ｙ４０７Ｔにより作成されたホールを含み、他のＣＨ３ドメインは置換Ｔ３６６Ｙ（例えば、図３の配列番号４３〜４６における）により作成されたノブを含む。ノブ／ホール突然変異の第２の対は、「ＡＥＭモジュール２」および「ＡＥＭ２」として言及され、第１のおよび第２のＣＨ３ドメインは、それぞれ「ＡＥＭ２．１」および「ＡＥＭ２．２」として言及される。
２つのＣＨ３ドメイン間の会合は、また、例えば、静電の変更により、典型的なノブ／ホールを作成するもの以外のメカニズムにより増強されることとしてもよい。一実施形態では、ＴＦｃＡの２つのＣＨ３ドメインの１つが、（例えば、図３の配列番号４７〜５０における）置換Ｓ３６４ＨおよびＦ４０５Ａの組み合わせを含み、他のＣＨ３ドメインは、（例えば、図３の配列番号５１〜５４における）置換Ｙ３４９ＴおよびＴ３９４Ｆの組み合わせを含む。この変更の第３の対は、「ＡＥＭモジュール３」または「ＡＥＭ３」として本明細書で言及され、第１のおよび第２のＣＨ３ドメインは、それぞれ「ＡＥＭ３．１」および「ＡＥＭ３．２」として言及される。
一実施形態では、ＴＦｃＡの２つのＣＨ３ドメインの１つは、（例えば、図３の配列番号５５〜５８における）置換Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、およびＫ４０９Ｄの組み合わせを含み、他のＣＨ３ドメインは、（例えば、図３の配列番号５９〜６２における）置換Ｅ（またはＤ）３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｋ、およびＤ３９９Ｋの組み合わせを含む。この第４の変更のペアは、本明細書では「ＡＥＭモジュール４」または「ＡＥＭ４」として言及され、第１のおよび第２のＣＨ３ドメインはそれぞれ「ＡＥＭ４．１」および「ＡＥＭ４．２」として言及される。位置３５６でのａａは、使用される配列に応じてＥまたはＤのいずれかであることとしてもよく、よって、その位置での置換は、「Ｅ（またはＤ）３５６」として言及される。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡの第１のおよび／または第２のＣＨ３ドメインは、２つのＣＨ３またはＦｃドメイン間の１以上のジスルフィド結合の形成を可能にする、１以上のシステインの付加をもたらす１以上のａａ修飾を含む。一実施形態では、ＴＦｃＡの２つのＣＨ３ドメインの１つは、（例えば、図３の配列番号６３〜６６における）置換Ｙ３４９Ｃを含み、残りのＣＨ３ドメインは、（例えば、図３の配列番号６７〜７０における）置換Ｓ３５４Ｃを含む。変更を形成するジスルフィドのこのペアは、「ＤｉＳモジュール１」または「ＤｉＳ１」として本明細書で言及され、第１のおよび第２のＣＨ３ドメインはそれぞれ「ＤｉＳ１．１」および「ＤｉＳ１．２」として言及される。
他の実施形態では、システインは、ＴＦｃＡの２つのＣＨ３ドメインのそれぞれのＣ末端に添加され、これにより２つのＣＨ３ドメイン間のジスルフィド結合を形成する。例えば、２つのＣＨ３ドメインの１つが、カルボキシル末端ａａ「ＰＧＫ」の「ＫＳＣＤＫＴ」（例えば、図３の配列番号７１〜７２における）による置換を含むこととしてもよく、他のＣＨ３ドメインは、カルボキシル−末端ａａ「ＰＧＫ」の「ＧＥＣ」（例えば、図３の配列番号７３〜７４における）による置換を含むこととしてもよい。
所定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、２以上のａａ変化の組み合わせを含む。例えば、１以上のＡＥＭは、１以上のＤｉＳ変更により組み合わされることとしてもよい。代表的な実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ホール突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよびジスルフィド結合生成突然変異Ｙ３４９Ｃ（ＡＥＭ１．１＋ＤｉＳ１．１）を含む。このようなＣＨ３ドメインは、ノブ突然変異Ｔ３６６Ｗおよびジスルフィド結合生成突然変異Ｓ３５４Ｃ（ＡＥＭ１．２＋ＤｉＳ１．２）含むＣＨ３ドメインとＴＦｃを組み合わせることとしてもよい。この置換の組み合わせを含む代表的なａａ配列は、配列番号７５〜８２（図３）を含む。
これらを含むＣＨ３ドメインまたはＦｃ領域の会合を補助するためにＣＨ３ドメインで作成されるＡＥＭおよびＤｉＳの代表的な組み合わせは、表５で述べられ、「イエス」は使用される組み合わせを示す。
ＡＥＭおよび／またはＤｉＳを有する代表的なＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列は、配列番号３１〜９８を含む。これらのａａ配列の配置は、図３で提供され、これらの配列の記載は、表６で提供される。表６および表３におけるＣＨ３ドメインは、それらのＡＥＭモジュール（番号１、２、３、または４）およびそれらのＤｉＳモジュール（番号１または２）により組織される。互換性のあるＣＨ３ドメインは、モジュール番号により先行して「１」および「２」として挙げられる。
ＴＦｃＡで使用される他のＣＨ３ ＡＥＭは、以下の部分のａａ修飾を含み、一対のＡＥＭ変更の第１のおよび第２の部分に対する置換（複数を含む）は、「および」により区切られる。
１）Ｆ４０５ＡおよびＴ３９４Ｆ；Ｓ３６４ＤおよびＹ３４９Ｋ；Ｓ３６４ＥおよびＬ３６８Ｋ；Ｓ３６４Ｅ Ｙ３４９Ｋ；Ｓ３６４ＦおよびＫ３７０Ｇ；Ｓ３６４ＨおよびＹ３４９Ｋ；Ｓ３６４ＨおよびＹ３４９Ｔ；Ｓ３６４ＹおよびＫ３７０Ｇ；Ｔ４１１ＫおよびＫ３７０Ｅ；Ｖ３９７Ｓ／Ｆ４０５ＡおよびＴ３９４Ｆ；Ｋ３７０Ｒ／Ｔ４１１ＫおよびＫ３７０Ｅ／Ｔ４１１Ｅ；Ｌ３５１Ｅ／Ｓ３６４ＤおよびＹ３４９Ｋ／Ｌ３５１Ｋ；Ｌ３５１Ｅ／Ｓ３６４ＥおよびＹ３４９Ｋ／Ｌ３５１Ｋ；Ｌ３５１Ｅ／Ｔ３６６ＤおよびＬ３５１Ｋ／Ｔ３６６Ｋ；Ｐ３９５Ｔ／Ｖ３９７Ｓ／Ｆ４０５ＡおよびＴ３９４Ｆ；Ｓ３６４Ｄ／Ｋ３７０ＧおよびＳ３６４Ｙ／Ｋ３７０Ｒ；Ｓ３６４Ｄ／Ｔ３９４ＦおよびＹ３４９Ｋ／Ｆ４０５Ａ；Ｓ３６４Ｅ／Ｆ４０５ＡおよびＹ３４９Ｋ／Ｔ３９４Ｆ；Ｓ３６４Ｅ／Ｆ４０５ＳおよびＹ３４９Ｋ／Ｔ３９４Ｙ；Ｓ３６４Ｅ／Ｔ４１１ＥおよびＹ３４９Ｋ／Ｄ４０１Ｋ；Ｓ３６４Ｈ／Ｄ４０１ＫおよびＹ３４９Ｔ／Ｔ４１１Ｅ；Ｓ３６４Ｈ／Ｔ３９４ＦおよびＹ３４９Ｔ／Ｆ４０５Ａ；Ｙ３４９Ｃ／Ｓ３６４ＥおよびＹ３４９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ；Ｌ３５１Ｅ／Ｓ３６４Ｄ／Ｆ４０５ＡおよびＹ３４９Ｋ／Ｌ３５１Ｋ／Ｔ３９４Ｆ；Ｌ３５１Ｋ／Ｓ３６４Ｈ／Ｄ４０１ＫおよびＹ３４９Ｔ／Ｌ３５１Ｅ／Ｔ４１１Ｅ；Ｓ３６４Ｅ／Ｔ４１１Ｅ／Ｆ４０５ＡおよびＹ３４９Ｋ／Ｔ３９４Ｆ／Ｄ４０１Ｋ；Ｓ３６４Ｈ／Ｄ４０１Ｋ／Ｆ４０５ＡおよびＹ３４９Ｔ／Ｔ３９４Ｆ／Ｔ４１１Ｅ；Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａ／Ｔ４１１ＥおよびＹ３４９Ｔ／Ｔ３９４Ｆ／Ｄ４０１Ｋ（ＷＯ２０１１／０２８９５２）。
２）Ｔ３６６ＷおよびＹ４０７Α；Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ；Ｌ３６８ΑおよびＹ４０７Ｙ；Ｋ４０９ＥおよびＤ３９９Ｋ；Ｋ４０９ＥおよびＤ３９９Ｒ；およびＫ４０９ＤおよびＤ３９９Ｋ；Ｋ４０９ＤおよびＤ３９９Ｒ；Ｋ３９２ＥおよびＤ３９９Ｒ；Ｋ３９２ＥおよびＤ３９９Ｋ；Ｋ３９２ＤおよびＤ３９９Ｒ；並びにＫ３９２ＤおよびＤ３９９Ｒ（ＷＯ２００９／０８９００４）。
３）Ｔ３６６ＷおよびＹ４０７Ａ；Ｆ４０５ＡおよびＴ３９４Ｗ；Ｙ４０７ＴおよびＴ３６６Ｙ；Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５ＡおよびＴ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ；Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５ＷおよびＴ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ；Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７ＡおよびＴ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ；並びにＦ４０５ＷおよびＴ３９４Ｓ（米国特許第７，６４２，２２８号）。
概して、当該技術分野で記載されるあらゆる他のＡＥＭまたはＤｉＳが使用されることとしてもよい。
ＣＨ３ドメインは、また、本明細書で提供されるＣＨ３ａａ配列のそれとは異なるａａ配列、例えば、配列番号２７〜９８、多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または３０ａａを含むこととしてもよい。所定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、例えば、配列番号２７〜９８のような、本明細書で提供されるＣＨ３ａａ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるａａ配列を含む。いくつかの抗体エフェクタ機能、例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣは、ＣＨ３ドメインにおける領域により少なくとも部分的に媒介され、ＣＨ３ドメインを作成し得るａａ変化は、Ｆｃ領域のエフェクタ機能（複数を含む）に影響を及ぼす変化を含む。ＣＨ３ドメインになされる代表的な変更は、さらに本明細書に記載される。
代表的なＦｃ領域
ＴＦｃＡのＦｃ領域は、１以上のヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびＣＨ４ドメインを含み、全長またはそうではないこととしてもよく、野生型またはａａ修飾を有することとしてもよい。Ｆｃドメインは、ヒト免疫グロブリン（「Ｉｇｓ」）または例えば、マウスＩｇｓのような非ヒトＩｇｓであることといてもよく、あらゆるタイプまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）のようなＩｇのアイソタイプまたはＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）由来であることとしてもよい。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、例えば、ＩｇＧ１のようなヒト免疫グロブリン由来の第１のおよび／または第２のＦｃ領域を含むＴＦｃを含む。Ｆｃ領域は、好ましくは、連続するアミノからカルボキシル末端の順で、ＩｇＧ１ ヒンジまたはその一部（例えば、コアおよび下部ヒンジ）、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、本明細書で述べられるＩｇＧ１ヒンジ（またはその一部）、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのあらゆる組み合わせを含むこととしてもよく、ＴＦｃＡが所望の活性および安定性を有することを提供する。
所定の実施形態では、ＴＦｃは、ハイブリッドＦｃ領域である第１のおよび／または第２のＦｃ領域を含む。ハイブリッドＦｃ領域は、２以上のＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４由来のＦｃドメインを含むこととしてもよい。一実施形態では、ハイブリッドＦｃ領域は、連続するアミノからカルボキシル末端の順で、ＩｇＧ１上部ヒンジ、ＩｇＧ４中部および下部ヒンジ、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む。代表的なＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃ領域は、本明細書で述べられるＩｇＧ１上部ヒンジ、ＩｇＧ４コアヒンジ、ＩｇＧ４下部ヒンジ、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインあらゆる組み合わせを含むこととしてもよく、ＴＦｃを含むＴＦｃＡが所望の活性および安定性を有することを提供する。
所定の実施形態では、Ｆｃ領域は全長ヒンジを含まない。例えば、ＴＦｃＢＡは、全長ヒンジを含む第１のＦｃ領域およびコアおよび／または下部ヒンジからなり上部ヒンジを含まないヒンジを含む第２のＦｃ領域を含むこととしてもよい。
所定の実施形態では、ＴＦｃは、他のＦｃ領域における別のシステインとジスルフィド結合を形成するためのシステインを含むように、これによりＴＦｃを安定化するように変更されたヒンジを含む。一実施形態では、ＩｇＧ１ヒンジは、置換Ｈ２２４ＣおよびＴ２２５Ｃ（例えば、配列番号１８、図２）を含む。別の実施形態では、ヒンジは置換Ｔ２２３Ｃ（例えば、配列番号１９、図２）を含む。
一実施形態では、ＴＦｃＡは、アミノからカルボキシル末端の順において、ｉ）配列番号４（全長ＩｇＧ１ヒンジ）、配列番号１８（Ｈ２２４Ｃ／Ｔ２２５Ｃを有する配列番号４）、配列番号１９（Ｔ２２３Ｃを有する配列番号４）、および配列番号２３（中部および下部ＩｇＧ１ヒンジのみ）で述べられるａａ配列からなるヒンジの群から選択されるＩｇＧ１ヒンジ、ｉｉ）配列番号２６１または２５を含むＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、およびｉｉｉ）配列番号３１〜９８で述べられるａａ配列からなるＣＨ３ドメインの群から選択されるａａ配列を含むＣＨ３ドメイン（図３）、を含む、ＩｇＧ１ ＴＦを含む。他の実施形態では、ＴＦｃＡは、アミノからカルボキシル末端の順において、ｉ）配列番号２０（ＩｇＧ１上部ヒンジ並びにＩｇＧ４コアおよび下部ヒンジ）、配列番号２１（Ｈ２２４Ｃ／Ｔ２２５Ｃを有する配列番号２０）、配列番号２２（Ｔ２２３Ｃを有する配列番号２０）および配列番号２４（中部および下部ＩｇＧ４ヒンジのみ）において述べられるａａ配列からなるヒンジの群から選択されるヒンジ、ｉｉ）配列番号２６２または２６を含むＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、およびｉｉｉ）ａａ配列の配列番号３１〜９８からなるＣＨ３ドメインの群から選択されるａａ配列を含むＣＨ３ドメイン（図３）、を含むＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃを含む。ヒンジとＣＨ３ドメインの代表的な組み合わせが表７で述べられ、「イエス」は使用されることとしてもよい組み合わせを示し、互換的な変更は、空欄の行により他から区切られる。
一実施形態では、ＴＦｃＡは、配列番号４を含むヒンジを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域、配列番号２５を含むＣＨ２ドメイン、および配列番号２９を含むＣＨ３ドメインを含むＴＦｃを含み、例えば、配列番号９９を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を形成することとしてもよい（表８および図４）。ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインの他の組み合わせおよびこのような組み合わせにより作成される代表的なＩｇＧ１ Ｆｃが表８で提供される。表８に挙げられる代表的なＩｇＧ１ Ｆｃのａａ配列（配列番号９９〜１３２）が図４で提供される。表８における互換性のあるＩｇＧ１ Ｆｃは、空欄の行により他のＩｇＧ１ Ｆｃと区切られる。
一実施形態では、ＴＦｃＡは、配列番号２０を含むヒンジ、配列番号２６を含むＣＨ２ドメイン、および配列番号２９を含むＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１／ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む、ＴＦｃを含み、例えば、配列番号１３３を含むＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃ領域を形成することとしてもよい（表９および図４参照）。ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインの他の組み合わせおよびこのような組み合わせにより作成される代表的なＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃは、表９に提供される。表９に挙げられる代表的なＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃのａａ配列（配列番号１３３〜１６６）は、図５で提供される。表９における互換性のあるＩｇＧ１ Ｆｃは、空欄の行により他のＩｇＧ１ Ｆｃと区切られる。
ＴＦｃＡにおいて使用されるＦｃ領域は、また、例えば、ａａ欠失、付加、または置換のような１以上のａａ修飾における、例えば、配列番号９９〜１６６のような本明細書に記載されるものとは異なるａａ配列を含むこととしてもよい。所定の実施形態では、Ｆｃ領域は、多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ａａにおいて、例えば、配列番号９９〜１６６からなる群から選択される配列のような、本明細書で述べられる配列とは異なるａａ配列を含む。所定の実施形態では、Ｆｃ領域は、例えば、配列番号９９〜１６６かならる群から選択される配列のような、本明細書で述べられる配列のそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるａａ配列を含む。例えば、配列番号９９〜１６６からなる群から選択されるａａ配列からなるＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、Ｃ末端リジンおよび／またはＥ３５６Ｄおよび／またはＭ３５８Ｌの欠失を含むこととしてもよい。例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣのような、いくつかの抗体エフェクタ機能は、Ｆｃ領域により媒介され、Ｆｃ領域をなし得るａａ変化は、Ｆｃ領域のエフェクタ機能（複数を含む）に影響を及ぼす変化を含む。これらのドメインに対する代表的な突然変異が本明細書で述べられる。これらのａａ修飾のいくつかは、Ｆｃ領域が、例えば、生物学的活性、安定性、および低免疫原性のような所望の特性を保持することを提供することを可能にする。
エフェクタ活性に影響を及ぼす代表的なＦｃ変更
ＴＦｃＡは、Ｆｃ領域のエフェクタ活性に影響を及ぼすａａ修飾を含むＴＦｃを含むこととしてもよい。代表的なａａ修飾は以下に述べられる。
抗体エフェクタ機能を変更するＦｃ部分におけるａａ残基の置換は、当該技術分野でよく知られる（米国特許第５，６４８，２６０号および第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、例えば、サイトカイン誘導、抗体依存性細胞傷害活性（「ＡＤＣＣ」）、食作用、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、および抗体の半減期／クリアランス率、および抗原−抗体複合体のような、いくつかの重要なエフェクタ機能を媒介する。いくつかの場合には、これらのエフェクタ機能は、治療の抗体のために望ましいが、他の場合には、治療上の対象に応じて、不必要または有害でさえあるかもしれない。所定のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧｌおよびＩｇＧ３は、それぞれＦｃγＲおよび補体ＣＩｑに対する結合を介してＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する。新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要な成分である。
一実施形態では、ＴＦｃＡは、１以上のおよび好ましくはすべての以下の属性、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、および抑制性ＦｃγＲＩＩｂレセプターを活性化することによる相互作用により測定される、ヒトにおけるＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）；補体システムの成分への抗体結合によりトリガーされるＣＤＣ；および新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）による活性化リサイクルを介して媒介される長い半減期を保持する。所望の場合には、これらの機能のすべてが、抗癌治療の有効性を最適化するために調整され得る。
所定のａａ修飾、例えば、１以上のａａの付加、欠失および／または置換が、上記に述べられるもののような定常ドメインの天然の生物活性を低減または増加させるための免疫グロブリン定常領域を作成することとしてもよい。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡ（例えば、ＴＦｃＢＡ）は、例えば、ドメインを含むタンパク質の循環半減期のような、ドメインの１以上の抗原依存性エフェクタ機能を変化させるＦｃ領域におけるａａ修飾（例えば、ａａ置換、付加、または欠失）を含む。代表的な抗体は、このようなａａ変化を欠く抗体と比較される場合に、ＦｃＲｎへの結合の増加または減少を示し、よって、血清における増加または減少した半減期をそれぞれ有する。ＦｃＲｎについての向上された親和性を有するＦｃ変異体を含む抗体は、より長い血清半減期を有することが予期され、一方、減少されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃ変異体を含むものが、より短い半減期を有することが期待される。一実施形態では、変更されたＦｃＲｎ結合を有するＴＦｃＡは、Ｆｃ領域の「ＦｃＲｎ結合ループ」内の１以上のａａ変化を有する少なくとも１つのＦｃ領域を含む。ＦｃＲｎ結合ループは、野生型、全長のＦｃのａａ残基２８０〜２９９（ＥＵ）を含む。所定の実施形態では、変更されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＴＦｃＡは、１５ÅＦｃＲｎ「コンタクトゾーン」内に１以上のａａ置換を有する少なくとも１つのＦｃ領域を含む。用語１５ÅＦｃＲｎ「コンタクトゾーン」は、野生型、全長Ｆｃドメインの以下の位置、２４３〜２６１、２７５〜２８０、２８２〜２９３、３０２〜３１９、３３６〜３４８、３６７、３６９、３７２〜３８９、３９１、３９３、４０８、４２４〜４４０（ＥＵ）で残基を含む。所定の実施形態では、変更されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＴＦｃＡは、以下のＥＵ位置、２５６、２７７〜２８１、２８３〜２８８、３０３〜３０９、３１３、３３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４（例えば、Ｎ４３４ＡまたはＮ４３４Ｋ）、および４３８のいずれか１つに対応する位置で、１以上のａａ変化を有する少なくとも１つのＦｃ領域（例えば、１または２のＦｃ部分）を含む。ＦｃＲｎ結合活性を変化させる代表的なａａ変化は、国際出願公開第ＷＯ０５／０４７３２７号に開示される。
ＦｃＲｎ結合を増強する付加的なＦｃ変更は、位置２５９、３０８、４２８、および４３４、例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、４３４Ｍ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、および２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌでの置換を含む。ＦｃＲｎへのＦｃ結合を増加させる他の変異体は、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001 , 276(9):6591-6604）、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ（Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281 :23514-23524）を含む。ＦｃＲｎ結合を調節するための他の変更は、Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671に記載される。
いくつかの実施形態において、ＴＦｃＡは、例えば、野生型Ｆｃ領域と比較してポリペプチドの抗原依存性エフェクタ機能、特にＡＤＣＣまたは補体活性を変化させるａａ変化を含むＦｃ変異体を含む。代表的な実施形態では、前記抗体は、Ｆｃガンマレセプター（例えば、ＣＤ１６）に対する変化した結合を示す。このような抗体は、野生型ポリペプチドと比較した場合に、ＦｃγＲｎ対する増加したまたは減少した結合を示し、よって、増強されたまたは低減されたエフェクタ機能をぞれぞれ媒介する。ＦｃγＲについての改善された親和性を有するＦｃ変異体は、エフェクタ機能を増強することが予想され、このようなタンパク質が、例えば、腫瘍治療のような、標的分子の破壊が所望される哺乳類を治療する方法における有用なアプリケーションを有することとしてもよい。これに対して、減少したＦｃγＲ結合親和性を有するＦｃ変異体は、エフェクタ機能を低減することが期待される。一実施形態では、ＴＦｃＡが、野生型Ｆｃ領域を含むＴＦｃＡと比較して、最適化、食作用、補体依存性細胞障害、抗原依存性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)、またはエフェクタ細胞調整からなる群から選択される、少なくとも１つの変更された抗原依存性エフェクタ機能を含む。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、活性化ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、またはＦｃγＲＩＩＩａ）に対する変更された結合を示す。所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、抑制性ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩｂ）に対する変更された結合親和性を示す。他の実施形態では、増加されたＦｃγＲ結合親和性（例えば、増加されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性）を有するＴＦｃＡは、１以上の、以下の位置２３９、２６８、２９８、３３２、３３４、および３７８（ＥＵ）に対応するａａ位置でａａ変化を有する少なくとも１つのＦｃドメインを含む。所定の実施形態では、減少されたＦｃγＲ結合親和性（例えば、減少された、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性）を有するＴＦｃＡは、１以上の、以下の位置２３４、２３６、２３９、２４１、２５１、２５２、２６１、２６５、２６８、２９３、２９４、２９６、２９８、２９９、３０１、３２６、３２８、３３２、３３４、３３８、３７６、３７８、および４３５（ＥＵ）に対応するａａ位置で、ａａ置換を有する少なくとも１つのＦｃドメインを含む。
所定の実施形態では、増加された補体結合親和性（例えば、増加されたＣ１ｑ結合親和性）を有するＴＦｃＡは、１以上の、以下の位置２５１、３３４、３７８、および４３５（ＥＵ）に対応するａａ位置で、ａａ変化を有するＦｃドメインを含む。所定の実施形態では、減少された補体結合親和性（例えば、減少されたＣ１ｑ結合親和性）を有するＴＦｃＡは、１以上の、以下の位置２３９、２９４、２９６、３０１、３２８、３３３、および３７６（ＥＵ）に対応するａａ位置で、ａａ置換を有するＦｃドメインを含む。ＦｃγＲまたは補体結合活性を変化させる代表的ａａ変化は、国際出願公開第ＷＯ０５／０６３８１５号に開示される。所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、１以上の、以下の特定のＦｃ領域置換、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｍ２５２Ｔ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｎ４３４Ａ、およびＮ４３４Ｋ（ＥＵ）を含むこととしてもよい。
ＦｃγＲおよび／または補体への結合を低減する他のＦｃ変異体は、１以上の以下のａａ置換、３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、３２８Ｒ、２３６Ｒ／３２８Ｒ、２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐ、および２３４Ｖを含む変異体を含む。位置２９７（以下を参照）でのグリコシル化の除去は、また、ＦｃｙＲに対する結合を低減する。
ＦｃγＲｓおよび／または補体への結合を向上されるＦｃ変更は、１以上の、以下のａａ置換、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄ、および３３２Ｅを含む変異体を含む。好ましい変異体は、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔ、および２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔを含むがこれらに限定されない。ＦｃγＲおよび補体相互作用を高める他の変更は、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉ、および３９６Ｌを含むがこれらに限定されない。
ＦｃγＲｌｌｂへの結合を向上させる変異体は、１以上の、以下のａａ置換、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅ、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、および２６７Ｅ／３２８Ｆを含む変異体を含む。
Ｆｃを調整するＦｃ変更は、Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に記載される。
また、ＴＦｃＡは、ＴＦｃＡのグリコシル化を変化させるａａ置換を含む。例えば、ＴＦｃＡの免疫グロブリン定常領域は、低減されたグリコシル化（例えば、ＮまたはＯ結合グリコシル化）を導く突然変異を有するＦｃドメインを含むこととしてもよく、または、野生型Ｆｃドメインの変更されたグリコフォーム（例えば、低フコースまたはフコースを含まないグリカン）を含むこととしてもよい。「操作されたグリコフォーム」は、Ｆｃ領域に共有結合的に結合された炭水化物組成物を指し、前記炭水化物組成物は、親Ｆｃ領域のそれとは化学的に異なる。操作されたグリコフォームは、エフェクタ機能を促進または低減することを含むがこれに限定されない、種々の目的について有用であることとしてもよい。操作されたグリコフォームは、当該技術分野で知られる種々の方法により生成されることとしてもよい（米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願公開第２０１０−０２５５０１３号；米国特許出願公開第２００３−０００３０９７号；ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＷＯ０１／２９２４６Ａ１；ＷＯ０２／３１１４０Ａ１；ＷＯ０２／３０９５４Ａ１）；（Potelligent technology (Biowa, Inc., Princeton, NJ);および GlycoMAb glycosylation engineering technology (Glycart Biotechnology AG, Zurich, Switzerland）。多くのこれらの技術が、例えば、操作されたまたは他の方法で種々の生物または細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）におけるＦｃポリペプチドを発現することにより、グリコシル化経路を伴う酵素を調節することにより（例えば、ＦＵＴ８［ａ１，６−フコシルトランスフェラーゼ（fucosyltranserase）］および／または（３１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニル、トランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩｌｌ］）、またはＦｃポリペプチドが発現された後に炭水化物（複数を含む）を変更することにより、Ｆｃ領域に共有結合的に結合されたフコシル化および／または２分オリゴ糖のレベルを制御することに基づく。
代表的な実施形態では、ａａ変化、例えば、ａａ置換は、ａａ位置２９７（ＥＵ）で通常みられるＮ結合グリカンの低減されたグリコシル化を含むＦｃ領域をもたらす。また、Ｆｃ領域は、ａａ位置２９７（ＥＵ）で低フコースグリカンまたはフコースを含まないグリカンを含むこととしてもよい。。所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、例えば、ａａ配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含むＮ結合グリコシル化モチーフのようなグリコシル化モチーフ内またはその付近でａａ置換を有する。具体的な実施形態では、ＴＦｃＡは、本明細書でさらに記載されるように、Ｆｃ（ＥＵ）の２９７または２９９に対応するａａ位置でａａ置換を含む。グリコシル化を低減または変化させる代表的なａａ置換は、国際出願公開第ＷＯ０５／０１８５７２号および米国特許出願公開第２００７／０１１１２８１号に開示される。
他の実施形態では、ＴＦｃＡは、溶媒曝露の表面に配置される１以上の操作されたシステイン残基またはその類似体を有する少なくとも１つのＦｃドメインを含む。好ましくは、操作されたシステイン残基またはその類似体は、ＴＦｃＡの所望の生物学的活性を妨げない。例えば、変更が、Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）または補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に結合するための、または免疫エフェクタ機能（例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、またはＣＤＣ）の引き金を引くためのＦｃの性能を妨げないことが望ましいこととしてもよい。所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、第２のシステイン残基との実質的なジスルフィド結合を含まない、少なくとも１つの操作された遊離システイン残基またはその類似体を含むＦｃドメインを含む。ＴＦｃＡは、ＣＨ３ドメインにおける１以上の以下の位置、３４９〜３７１、３９０、３９２、３９４〜４２３、４４１〜４４６、および４４６ｂ（ＥＵ）、およびより具体的な位置３５０、３５５、３５９、３６０、３６１、３８９、４１３、４１５、４１８、４２２、４４１、４４３、およびＥＵ位置４４６ｂで、操作されたシステイン残基またはその類似体を有するＦｃ領域を含むこととしてもよい。
また、所望のエフェクタ機能が、特定の免疫グロブリンクラスもしくサブクラスからＦｃを選択することにより、または、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等のような、特定の免疫グロブリン（immoglobulin）クラスまたはサブクラスから特定の領域を組み合わせることにより、得られることとしてもよい。例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ（ＦｃγＲおよびＣ１ｑへのＩｇＧのそれぞれの結合による）が、ヒンジおよびＣＨ２ドメインに配置される残基により媒介されるため、ＩｇＧ４がエフェクタ機能を本質的に欠くため、ＩｇＧ４およびＩｇＧ１のＣＨ３ドメインのヒンジおよびＣＨ２ドメインの組み合わせにより構成されるＦｃが、かなり低減されたエフェクタ機能を有する。ｌｇＧ１／ｌｇＧ３ハイブリッド変異体は、２つのアイソタイプが異なる位置でｌｇＧ３由来のアミノ酸で、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるｌｇＧ１位置を置換することにより構成されることとしてもよい。よって、ハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体は、１以上の、以下の置換、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒ、および４３６Ｆを含むように構成されることとしてもよい。所定の実施形態では、ｌｇＧ１／ｌｇＧ２ハイブリッド変異体は、２つのアイソタイプが異なる位置でｌｇＧ１由来のアミノ酸で、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるｌｇＧ２位置を置換することにより構成されることとしてもよい。よって、ハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体は、１以上の、以下のアミノ酸置換、２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（位置２３６でのグリシンの挿入を指す）、および３２７Ａを含んで構成されることとしてもよい。
代表的なＴＦｃリンカー
ＴＦｃＡは、ＴＦｃリンカーによる第２のＦｃ領域に結合される第１のＦｃ領域を含むＴＦｃを含むこととしてもよい。広範囲のリンカーは、それらがＴＦｃのおよびＴＦｃを含むＴＦｃＡの適切な折り畳みを可能にするために十分に柔軟であるように提供されて使用されることとしてもよい。所定の実施形態では、例えば、リンカーは、例えば、免疫反応のような、生物学的反応を誘導することがほとんどできないように、生物学的に不活性である。
ＴＦｃリンカーは、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または少なくとも９０〜１００のａａ長さであることとしてもよい。ＴＦｃリンカーのサイズは、第２のＦｃ領域が、ヒンジを含むか、その一部を含むか、または全く含まないかどうかに依存する。例えば、第２のＦｃ領域がヒンジを含む場合、より短いＦｃリンカーが、第２のＦｃ領域がヒンジを含まない場合よりも使用されることとしてもよい。例えば、第２のＦｃ領域がヒンジを含まない場合に、ＴＦｃリンカーがヒンジの長さに対応するａａの数より長いこととしてもよい。第２のＦｃ領域が上部ヒンジを含まない場合に、ＴＦｃリンカーが上部ヒンジの長さに対応するａａの数より長いこととしてもよい。好ましい実施形態では、ＴＦｃＡ、例えば、中および下部ヒンジからなる第２のヒンジを含むＴＦｃＡは、３７から４３のａａのような、３８から４２のａａのような、３９から４１のａａのような、３５から４５のａａ、より好ましくは４０のａａを含むＴＦｃリンカーを含む。
ＴＦｃリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含むこととしてもよい。「Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー」は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。代表的なＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーは、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを有するａａ配列を含み、ｎは正の整数である（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）。例えば、 所定の実施形態では、ＴＦｃリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３もしくは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４もしくは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５もしくは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６もしくは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７もしくは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８を含むまたはこれからなる。好ましい実施形態では、ＴＦｃリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８である。
使用される他のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ構造を含まないがＧｌｙおよびＳｅｒを含むものを含む。例えば、リンカーは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎまたは（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎを含むこととしてもよく、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多い。他のリンカーは、ＰｒｏまたはＴｈｒを含むこととしてもよい。適切なリンカーは、http://partsregistry.org/Protein_domains/LinkerのRegistry of Standard Biological Partsでみられることとしてもよい（また、例えば、Crasto CJ and Feng JA. LINKER: a program to generate linker sequences for fusion proteins. Protein Eng 2000 May; 13(5) 309-12 and George RA and Heringa J. An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding. Protein Eng 2002 Nov; 15(11) 871-9を参照）。
所定の実施形態では、ＴＦｃリンカーが以下のａａ配列を含む：
ＴＲＰＡＰＰＳＴＡＴＴＡＧＳＴＰＱＰＥＳＡＳＰＳＧＫＥＰＡＡＳＳＰＳＳＴＮＴＧＳ（配列番号１６９）
また、配列番号１６９または多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ａａにおける（Ｇ４Ｓ）ｎ配列とは異なるａａ配列を含むＴＦｃリンカーが使用されることとしてもよい。
また、ＴＦｃリンカーは、非ペプチドポリマーのような、非ペプチドリンカーであることとしてもよい。用語「非ペプチドポリマー」は、ペプチド結合を除く共有結合により互いに結合される２以上の繰返し単位を含む生体適合性ポリマーを指す。非ペプチドポリマーの例は、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエーテル、ＰＬＡ（ポリ（乳酸）およびＰＬＧＡ（ポリ（乳酸−グリコール酸）のような生物分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン質、およびヒアルロン酸を含む。最も好ましいのはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。
代表的なＴＦｃ
ＴＦｃＡは、ＴＦｃリンカーにより第２のＦｃ領域に結合される第１のＦｃ領域を含むＴＦｃを含むこととしてもよい。所定の実施形態では、ＴＦｃは、互いに同一である第１のおよび第２のＦｃ領域を含む。他の実施形態では、第１のおよび第２のＦｃ領域は、少なくとも１つのａａにおいて互いに異なる（「ヒアルロン酸ＴＦｃ」）。第１のおよび第２のＦｃ領域は、本明細書で開示されるあらゆるＦｃ領域またはそのバリエーションであることとしてもよい。例えば、ＴＦｃは、例えば、全長ＩｇＧ１またはＩｇＧ１/ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジのような全長ヒンジを含む第１のＦｃ領域、および例えば、上部ヒンジのないヒンジのような部分的なヒンジを含む第２のＦｃ領域を含むこととしてもよい。
第１および第２のＦｃ領域は、本明細書で記載されるあらゆるＴＦｃリンカーと組み合わされることとしてもよい。上記で述べられるように、概して、ＴＦｃリンカーの長さは、第２のＦｃ領域がヒンジを含む、その一部を含む、または全くヒンジを含まないかどうかに依存することとしてもよい。
所定の実施形態では、ＩｇＧ１ ＴＦｃは、配列番号９９を含む第１のＦｃ領域および配列番号１００を含む第２のＦｃ領域を含む。ＩｇＧ１ ＴＦｃで使用される第１および第２のＦｃ領域の組み合わせが、表１０で述べれられる。
所定の実施形態では、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃは、配列番号１３３を含む第１のＦｃ領域および配列番号１３４を含む第２のＦｃ領域を含む。ＩｇＧ１/ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃで使用される第１および第２のＦｃ領域の組み合わせは、表１１で述べられる。
ＴＦｃは、表１０または１１で述べられる２つのＦｃの組み合わせを含むこととしてもよく、アミノからカルボキシル末端の順で、第１のＦｃ領域を含み、それはそのＣ末端でＴＦｃリンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端で第２のＦｃ領域のＮ末端に結合される、連続的なポリペプチドを形成するためにＴＦｃリンカーによりともに結合される。ＴＦｃリンカーは、２０から５０のアミノ酸の長さを含むまたはからなることとしてもよい。
代表的ＴＦｃは、ｉ）配列番号４を含むヒンジを含む第１のＦｃ領域、配列番号２５を含むＣＨ２ドメイン、配列番号３３を含むＣＨ３ドメイン；ｉｉ）（Ｇ４Ｓ）８を含むＴＦｃリンカー；およびｉｉｉ）配列番号２３を含むヒンジを含む第２のＦｃ領域、配列番号２５を含むＣＨ２ドメイン、および配列番号３７を含むＣＨ３ドメインを含むこととしてもよい。構成部分のこのセットを含む代表的なＩｇＧ１ ＴＦｃは、配列番号１７１を含むＴＦｃである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃを形成するドメインまたは構成部分の付加的な組み合わせは、表１２および１３でそれぞれ提供される。表１２および１３におけるそれぞれの構成部分またはドメインは、その配列番号およびそれを含む特定のＡＥＭおよび／またはＤｉＳにより言及される。表１２および１３におけるそれぞれのドメインまたは構成部分は、直接または間接的に結合されることとしてもよい。
表１２に挙げられるＴＦｃのそれぞれのａａ配列（配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、および１９５）は、図６に提供される。表１３に挙げられるＴＦｃのそれぞれのａａ配列（配列番号１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、および２２１）は、図７に提供される。表１２および１３にの第１列は、対応する表の行においてあげられる構成部分を含む代表的なＴＦｃの配列番号および名称を挙げている。
所定の実施形態では、ＴＦｃは、例えば、多くて１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、または３００ａａにおいて、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、および２２１からなる群から選択され得るａａ配列のような、本明細書に記載されるＴＦｃのそれとは異なるａａ配列をＴＦｃ含み、ＴＦｃが所望の生物学的活性、例えば、エフェクタ機能またはその欠如、適切な折り畳み、十分な安定性および可溶性を有することを提供する。差異は、１以上のａａ挿入、欠失、および／または置換であることとしてもよい。所定の実施形態では、ＴＦｃは、例えば、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、および２２１からなる群から選択されるａａ配列のように、本明細書で記載されるＴＦｃのそれと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるａａ配列を含み、ＴＦｃを含むＴＦｃＡが所望の生物学的活性、例えば、エフェクタ機能またはその欠如、適切な折り畳み、十分な安定性および十分な可溶性を有することを提供する。
代表的結合部位
ＴＦｃＡは、単一の結合部位を含む一価のＴＦｃＡであることとしてもよい。単一の結合部位は、ＴＦｃのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置されることとしてもよい。単一の結合部位は、ＦａｂまたはｓｃＦｖであることとしてもよい。単一の結合部位がＦａｂである場合、一価のＴＦｃＡは、ＶＨドメインおよび任意にＣＨ１ドメインを含む重鎖、並びにＶＬドメインおよび任意にＣＬドメインを含む軽鎖を含む。
また、ＴＦｃＡは、例えば、各結合部位が同じまたは異なるエピトープまたは抗原（二重特異性ＴＦｃＡの二価の単一特異性）に結合する、２つの結合部位を含むＴＦｃＢＡであることとしてもよい。ＴＦｃＢＡの結合部位は、同じタイプまたは異なるタイプのものであることとしてもよい。例えば、両方の結合部位がＴＦｃであることとしてもよく、両方の結合部位がＦａｂであることとしてもよく、１つの結合部位がＦａｂであることとしてもよく、残りの結合部位がｓｃＦｖであることとしてもよい。また、単一のドメイン結合部位が使用されることとしてもよい。Ｆａｂは、概してＶＨドメインを含み、それは重鎖のＴＦｃＢＡおよびＶＬドメインでＣＨ１ドメインに結合されることとしてもよく、それは分子の軽鎖でＣＬドメインと結合されることとしてもよい。ｓｃＦｖは、概して、ＶＬドメインに結合されるｓｃＦｖリンカーに結合されるＶＨドメインを含む。
ｓｃＦｖは、結合リンカーによりＴＦｃに接続されることとしてもよい。結合リンカーは、約１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０ａａ長さ、またはそれより長いこととしてもよい。結合リンカーは、好ましくは化学的に不活性、非免疫原性であり、ｓｃＦｖを含むＴＦｃＢＡの適切なコンフォメーションを可能にするために必要とされる柔軟性および剛性を有する。一実施形態では、結合リンカーが、例えばａａ配列（Ｇ４Ｓ）ｎのようなＧｌｙ−Ｓｅｒ配列を含み、ｎは、１、２、３、４、もしくは５、またはそれより多い。一実施形態では、結合リンカーは（Ｇ４Ｓ）２を含む（例えば、図９参照）。
ｓｃＦｖは、ＶＨおよびＶＬドメインとともに結合するｓｃＦｖリンカーを含む。ｓｃＦｖリンカーは、１５〜３０または２０〜２５ａａ長さであることとしてもよい。ｓｃＦｖ リンカーは、好ましくは化学的に不活性、非免疫原性であり、ｓｃＦｖを含むＴＦｃＢＡの適切なコンフォメーションを可能にするために必要とされる柔軟性および剛性を有する。一実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、例えばａａ配列（Ｇ４Ｓ）ｎのようなＧｌｙ−Ｓｅｒ配列を含み、ｎは、１、２、３、４、もしくは５、またはそれより多い。しかしながら、他の配列もまた使用されることとしてもよい。所定の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、ヒンジの部分または全長ヒンジ単体もしくは例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ配列のような他のａａとともに含むこととしてもよい。所定の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、例えば、（Ｇ４Ｓ）４のようなＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーのようなペプチドリンカーの上流に配列「ＡＳＴ」（ＣＨ１ドメインの第１の３ａａ）を含む（例えば、図９参照）。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、第１のおよび／または第２のヒンジを含まない。ヒンジに代えて、ＴＦｃＡは結合リンカーを含むこととしてもよい。このようなリンカーは、ＴＦｃリンカーに関して本明細書にさらに記載されるＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーであることとしてもよい。代表的な結合リンカーは、ＴＦｃリンカーより短いこととしてもよい。所定の実施形態では、結合リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３または（Ｇ４Ｓ）４配列を含む。所定の実施形態では、結合リンカーは、例えば、上部ヒンジ、中部ヒンジ、下部ヒンジ、またはその組み合わせのようなヒンジの一部、（Ｇ４Ｓ）ｎ配列のようなこれらの１つおよび別のペプチド配列の一部を含み、ｎは１、２、３、４、または５である。また、他のペプチド配列は、結合リンカーとして使用されることとしてもよく、それらはリンカーの所定の部分の必要とされる柔軟性および剛性を提供する。
所定の実施形態では、結合部位は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、または単一のドメインのような抗原結合部位である。代表的ＴＦｃＡは、本明細書で提供される１以上の可変領域由来のもののような１以上のＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲを含む。所定の実施形態では、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、ヒト化抗体５Ｄ５（ＵＳ２００６／０１３４１０４）の可変ドメインまたは抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２（実施例３参照）のもののような、図９で述べられるＶＨＣＤＲ３および／またはＶＬＣＤＲ３配列を含む。所定の実施形態では、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、図９で述べられるＶＨドメインの１つの１、２、もしくは３ＣＤＲおよび／または図９で述べられるＶＬドメインの１、２、もしくは３ＣＤＲを含む。所定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ結合部位は、図９で述べられるＶＨＣＤＲ３および／またはＶＬＣＤＲ３配列を含む。所定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ結合部位は、図９で述べられるＶＨドメインの１つの１、２、もしくは３ＣＤＲおよび／または図９で述べられるＶＬドメインの１つの１、２、もしくは３ＣＤＲを含む。また、結合部位は、図９で述べられる１以上のＣＤＲを含み、１、２、または３のａａが、例えば、置換、追加、または欠失のように変化され、結合部位がそれらの標的に特異的になお結合できることを提供する。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、図９で述べられる１以上の可変ドメインを含む。例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、ヒト化抗体５Ｄ５（ＵＳ２００６／０１３４１０４）または抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２の可変ドメインのような、図９で述べられるＶＨおよび／またはＶＬ配列を含むこととしてもよい。代表的な抗ＥＧＦＲ結合部位は、パニツムマブ、２２２４、セツキシマブまたはヒト化セツキシマブＨ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、またはＨ２Ｌ２のもののような（実施例３参照）、図９で述べられるＶＨおよび／またはＶＬ配列を含む。
所定の実施形態では、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＡは、抗ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂおよび抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを含む。表１４は、ＴＦｃＡを形成するために使用される、それぞれの以下の抗ｃ−Ｍｅｔおよび抗ＥＧＦＲ ａａ配列のＣＤＲまたは可変ドメインの組み合わせを示す。表は、本明細書で配列が提供される場合に配列番号を、または組み合わせが可能である場合に「イエス」を提供するが、得られたａａ配列は特異的に提供されない。当業者は、このようにコードされるこのようなタンパク質およびヌクレオチド配列の構成部分のすべてが本明細書で提供されるという事実に基づいて不要な実験をすることなくこのような分子を作成することができるであろう。
表１４で重鎖とともに使用される軽鎖は、ＴＦｃＡで使用される特定の抗ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂの軽鎖である。例えば、配列番号２２５、２２７、２２９、２３５、２３９、２６０、２８１、２８３、２８５、および３４２のいずれか１つを含むＴＦｃＡのような、例えば、ヒト化５Ｄ５由来のＶＨドメインを含むＴＦｃＡは、ヒト化５Ｄ５、つまり配列番号２３１のＶＬドメインを含む軽鎖とともに使用されることとしてもよい。例えば、配列番号２９１を含むＴＦｃＡのような、例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２由来のＶＨドメインを含むＴＦｃＡは、例えば、配列番号２８９のＶＬドメインのような抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２のＶＨドメインを含む軽鎖とともに使用されることとしてもよい。
例えば、本明細書で記載されるもののような、抗原結合部位は、増強された安定性、低減された不均質性、増強された発現、増強された可溶性、または他の所望の特性のために操作されることとしてもよい。増強された安定性および増加された発現を有するｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、およびＦａｂのような抗体フラグメントの操作のための方法は、例えば、ＵＳ２００６／０１２７８９３ ＵＳ２００９／００４８１２２、およびそこでの参照に記載される。
可変ドメインは、多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００ａａでまたは、本明細書で述べられるものと異なることとしてもよく、変更された可変領域を有する結合部位が、例えば、ｃ−Ｍｅｔ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリンレセプター、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（アルファおよびベータ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ、およびＥｐｈＡ２から選択されるヒト抗原のような、その標的抗原に特異的に結合するその性能を保持することを提供する。例えば、ＴＦｃＢＡのような、ＴＦｃＡにおける使用のための可変ドメインは、また、図９で述べられるＶＨまたはＶＬａａ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるＶＨまたはＶＬａａ配列を含み、変更された可変ドメインを有する結合部位が、その標的抗原に特異的に結合するその性能を保持することを提供する。
また、抗ｃ−Ｍｅｔおよび／または抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡは、図９で述べられる配列を有するもののような、本明細書で提供される結合部位と同じヒトｃ−ＭｅｔまたはヒトＥＧＦＲでのエピトープに結合する結合部位を含むこととしてもよい。本明細書で包含される結合部位は、また、図９で述べられる配列を有するもののような、本明細書で提供される結合部位の結合を競合的にブロックしまたは競い合うこととしてもよい。標的抗原またはエピトープに結合するための本明細書に記載される結合部位と競い合う結合部位を含むＴＦｃＡは、例えば、参照結合部位の後にＥＬＩＳＡで追加される場合に、参照結合部位（例えば、本明細書に記載されるように）を置換することができる結合部位、並びに結合部位がＥＬＩＳＡへの参照結合部位の後に追加される場合に、参照結合部位が結合することを防ぐ結合部位を含む。
ＴＦｃＡは、また、当該技術分野で知られる抗ｃ−Ｍｅｔ、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥｒｂＢ４、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリンレセプター、抗ＲＯＮ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＮＦＲ、抗ＦＧＦＲ１、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、抗ＦＧＦＲ４、抗ＰＤＧＦＲアルファ、抗ＰＤＧＦＲベータ、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＥｐｈＡ２または抗ＥＧＦＲ抗体由来の可変ドメインを含むこととしてもよい。既知の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、米国特許第５，６８６，２９２号、米国特許第７，４７６，７２４号、ＷＯ２００４／０７２１１７、ＷＯ２００４／１０８７６６、ＷＯ２００５／０１６３８２、ＷＯ２００５／０６３８１６、ＷＯ２００６／０１５３７１、ＷＯ２００６／１０４９１１、ＷＯ２００７／１２６７９９、およびＷＯ２００９／００７４２７で述べられる。代表的な既知の抗ＥＧＦＲ抗体は、ＡＢＸ−ＥＧＦ(Abgenix)(Yang, X. D., et al., Crit. Rev. Oncol./Hematol. 38 (2001) 17-23)およびヒト化ＩＣＲ６２（ＷＯ２００６／０８２５１５）を含む。代表的な抗ｃ−Ｋｉｔ抗体は、ＵＳ７９１５３９１およびＥＰ０５８６４４５Ｂ１で述べられる。代表的な抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＵＳ５８２１３３７およびＵＳ７５６０１１１で述べられる。代表的な抗ＥｒｂＢ３抗体は、ＵＳ７７０５１３０、ＵＳ７８４６４４０、およびＷＯ２０１１／１３６９１１で述べられる。代表的な抗ＥｒｂＢ４抗体は、ＵＳ７３３２５７９およびＵＳ２０１０／０１９０９６４で述べられる。代表的な抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＵＳ７８７１６１１およびＵＳ７７００７４２で述べられる。代表的な抗インスリンレセプター抗体は、Bhaskar V. et al, Diabetes. 2012 May;61(5):1263-71で述べられる。代表的な抗ＲＯＮ抗体は、ＷＯ２０１２／００６３４１、ＵＳ２００９／０２２６４４２、およびＵＳ７９４７８１１で述べられる。代表的な抗ＶＥＧＦＲ１抗体は、ＷＯ２００５／０３７２３５で述べられる。代表的な抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、ＵＳ８０５７７９１およびＵＳ６３４４３３９で述べられる。代表的な抗ＴＮＦＲ１抗体は、ＥＰ１９７２６３７Ｂ１およびＵＳ２００８／０００８７１３で述べられる。代表的な抗ＦＧＦＲ１抗体は、Ronca R et al, Mol Caner Ther; 9(12); 3244-53, 2010、およびＷＯ２００５／０３７２３５で述べられる。代表的な抗ＦＧＦＲ２抗体は、ＷＯ２０１１／１４３３１８で述べられる。代表的な抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＷＯ２０１０／００２８６２およびＥＰ１４２３４２８Ｂ１で述べられる。代表的な抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＷＯ０３／０６３８９３、ＷＯ２００８／０５２７９６、およびＵＳ２０１０／０１６９９９２で述べられる。代表的な抗ＰＤＧＦＲアルファ抗体は、ＵＳ８１２８９２９およびＷＯ１９９５／０００６５９で述べられる。代表的な抗ＰＤＧＦＲベータ抗体は、ＵＳ７７４０８５０で述べられる。代表的な抗ＥＰＣＡＭ抗体は、ＵＳ７９７６８４２、ＵＳ２００３／０１５７０５４、およびＷＯ２００１／００７０８２で述べられる。代表的な抗ＥｐｈＡ２抗体は、ＥＰ１５７５５０９Ｂ１、ＵＳ７４０２２９８、およびＵＳ７７７６３２８で述べられる。代表的なＣＤ−４４ｍ抗体は、ＵＳ８０７１０７２、ＷＯ２００８／０７９２４６、ＵＳ６９７２３２４で述べられる。代表的なＣＥＡ抗体は、ＵＳ７６２６０１１で述べられる。代表的なＡＬＫ抗体は、ＵＳ６６９６５４８、ＵＳ７９０２３４０、およびＷＯ２００８／１３１５７５で述べられる。代表的なＡＸＬ抗体は、ＵＳ２０１０／０３３００９５、ＵＳ２０１２／０１２１５８７、およびＷＯ２０１１／１５９９８０で述べられる。
別の実施形態では、結合部位は、結合ペプチドである。ｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドは、例えば、Matzke, A., et al., Cancer Res 65 (14) (2005) 6105-10. And Tam, Eric, M., et al., J. Mol. Biol. 385 (2009)79-90から知られる。
結合部位は、例えば、表面プラスモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステムを用いて）により測定されるように、好ましくは、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９Ｍ、もしくは１０−１０ＭのＫｄまたはさらに低いＫｄ値を有するそれらの標的に特異的に結合する。
ＴＦｃＡは、例えば、可溶性または膜ヒト標的タンパク質のような、あらゆる標的タンパク質に特異的に結合することとしてもよい。代表的な標的タンパク質は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリンレセプター、ＲＯＮ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（アルファおよびベータ）、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＰＣＡＭ、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択されるヒトレセプタータンパク質を含む。
代表的な重鎖および軽鎖
一実施形態では、ＴＦｃＡは、重鎖および軽鎖を含む。一実施形態では、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡは、図９で述べられるａａ配列を含む重鎖および／または実施例３で述べられるａａ配列を含む軽鎖を含む。
また、ＴＦｃＢＡは、多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、または３００ａａで、または図９で述べられるａａ配列とは異なるａａ配列を含む重鎖および／または軽鎖を含むこととしてもよく、本明細書でさらに記載されるように、ＴＦｃＢＡが所望の生物学的特性を有することを提供する。また、ＴＦｃＢＡは、図９の重鎖または軽鎖のａａ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるａａ配列を含む重鎖および／または軽鎖を含み、ＴＦｃＢＡは所望の生物学的特性（複数を含む）を有する。
また、ＴＦｃＢＡは、２以上の結合部位を含むこととしてもよく、その場合、重鎖は１、２、３、４またはそれより多いＶＨドメインを含み、それは、以下の分子、Ｆａｂ−ＴＦｃ−ｓｃＦｖ；Ｆａｂ−ＴＦｃ−Ｆａｂ；ｓｃＦｖ−ＴＦｃ−ｓｃＦｖ；およびｓｃＦｖ−ＴＦｃ−Ｆａｂのいずれか１つのＮおよび／またはＣ末端に結合されることとしてもよい。付加的な結合部位は、ＦａｂｓおよびｓｃＦｖのいずれかであることとしてもよい。
ＴＦｃＡの生物学的活性
所定の実施形態では、ＴＦｃＡ、例えば、ＴＦｃＢＡは、１以上の標的タンパク質に結合し、１以上の標的タンパク質により媒介されるシグナル変換を阻害する。例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡは、ｃ−ＭｅｔおよびＥＧＦＲのいずれかまたは両方により媒介されたシグナル変換を阻害することとしてもよい。シグナル変換の抑制は、例えば、ＥＧＦＲおよびＥＲＫのリン酸化の抑制により証明されることとしてもよい。所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、例えば、実施例で述べられるように、例えば、実験の最後で測定される場合に、ＴＦｃＡのないリン酸化に対して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれより多く、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲおよび／またはＥＲＫのリン酸化を阻害する。好ましいＴＦｃＡは、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％により、ほぼ完全に、例えば、ｃ−ＭｅｔおよびＥＧＦＲのリン酸化の抑制により測定される、ｃ−Ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲシグナル変換を阻害する。
このセクションに記載される生物学的特性は、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡに関して主に記載されるが、この記載は他のＴＦｃＢＡ並びに一価のＴＦｃＡにも適用する。
ａ）ｃ−Ｍｅｔのリガンド媒介リン酸化、およびｂ）ＥＧＦＲのリガンド媒介リン酸化の抑制は、ａ）ＨＧＦファミリーリガンドにより誘導されたｃ−Ｍｅｔ、ｂ）例えば、ＥＧＦのようなＥＧＦＲリガンドにより誘導されたＥＧＦＲ、またはｃ）ｃ−ＭｅｔまたはＥＧＦＲリガンドにより誘導されるＥＲＫのリン酸化のレベルを再現性よく減少させるためのＴＦｃＢＡの性能により論証され得、それぞれはＴＦｃＢＡと接触しない対照細胞におけるリン酸化に関する。ｃ−Ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲを発現する細胞は、天然由来の細胞もしくは細胞株の細胞であり得、または宿主細胞内にｃ−Ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲをコードする核酸を誘導することにより組み換えで産生され得る。所定の実施形態では、ＴＦｃＢＡは、実施例で述べられるように、例えばＥＬＩＳＡにより測定されおよび算出されるように、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれより多くにより、ｃ−ＭｅｔのＨＧＦファミリーのリガンド媒介リン酸化を阻害する。所定の実施形態では、ＴＦｃＢＡは、実施例で述べられるように、例えばＥＬＩＳＡにより測定されおよび算出されるように、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれより多くにより、ＥＧＦＲのＥＧＦ媒介リン酸化を阻害する。所定の実施形態では、ＴＦｃＢＡは、実施例で述べられるように、例えばＥＬＩＳＡにより測定されおよび算出されるように、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれより多くにより、ＥＲＫのＥＧＦおよび／またはｃ−Ｍｅｔ媒介リン酸化を阻害する。
ＴＦｃＢＡは、少なくとも７０％または８０％によりｃ−Ｍｅｔのリガンド誘導リン酸化を、少なくとも８５％、９０％または９５％によりＥＧＦＲのリガンド誘導リン酸化を、および任意に少なくとも５％または１０％によりＥＲＫのリガンド誘導リン酸化を阻害することとしてもよい。また、ＴＦｃＢＡは、少なくとも８５％によりｃ−Ｍｅｔのリガンド誘導リン酸化を、少なくとも８５％によりＥＧＦＲのリガンド誘導リン酸化を、および任意に少なくとも５％によりＥＲＫのリガンド誘導リン酸化を阻害することとしてもよい。所定の実施形態では、ＴＦｃＢＡは、少なくとも５０％によりｃ−Ｍｅｔのリガンド誘導リン酸化を、少なくとも９０％によりＥＧＦＲのリガンド誘導リン酸化を、および任意に少なくとも５％によりＥＲＫのリガンド誘導リン酸化を阻害する。
ＴＦｃＢＡは、また、１以上のｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、およびＥＲＫのそれらのリン酸化の抑制のＥＣ５０（つまり、最大抑制の５０％が得られるＴＦｃＢＡの濃度）により定義されることとしてもよく、ＥＣ５０は本明細書でさらに記載されるように測定されることとしてもよい。例えば、本明細書で開示されるＴＦｃＢＡは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、またはそれより低いＥＣ５０でｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害することとしてもよい。それらは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、またはそれより低いＥＣ５０でＥＧＦＲのリン酸化を阻害することとしてもよい。それらは、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、またはそれより低いＥＣ５０でＥＲＫのリン酸化を阻害することとしてもよい。本明細書に開示されるいくつかのＴＦｃＢＡは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、またはそれより低いＥＣ５０で、少なくとも８０％または８５％によりｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害し；１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、またはそれより低いＥＣ５０で、少なくとも８０％または８５％によりＥＧＦＲのリン酸化を阻害し；および任意に１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、またはそれより低いＥＣ５０で、少なくとも５％によりＥＲＫのリン酸化を阻害する。いくつかの場合には、ＥＧＦＲのｃ−Ｍｅｔのリン酸化およびＥＧＦＲのリン酸化のいずれかまたは両方の実質的に完全なブロックが、本明細書に開示されるＴＦｃＢＡにより得られるであろう。
所定の実施形態では、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ｍｇ／ｍｌまたはそれより多い濃度（またはこれらのあらゆる２つの数字の間の濃度の範囲）でＴＦｃＡを含む溶液は、例えば、以下の、下記安定性試験のような、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ（ＥＳＣ）により測定され得るように、非凝集形態（モノマーとして本文脈で言及される）で７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より多くのＴＦｃＢＡを含む。モノマーのパーセンテージは、以下の安定性試験、ａ）１、２、３、４、５、もしくは６日、または１、２、３週間、もしくはそれより長い間４℃でインキュベーション、ｂ）１、２、３、４、５、もしくは６日、または１、２、３週間、もしくはそれより長い間室温でインキュベーション、ｃ）１、２、３、４、５、もしくは６日、または１、２、３週間、もしくはそれより長い間３７℃でインキュベーション、ｄ）１、２、３、４、５サイクルの凍結／溶解、およびｅ）例えば、１、２、３、４、５時間またはそれより長く、例えば、室温で軌道シェーカーでの穏やかな撹拌のような撹拌、の１つの後の溶液で測定されることとしてもよい。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、０日でのその安定性に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の３７℃での血清での１、２、３、４、５日間のインキュベーション後の安定性を示し、タンパク質の安定性は、インキュベーション後の１以上のその標的抗原に結合するその性能を測定することにより、または例えば、ＳＥＣにより測定される。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡは、実施例で記載されるように、例えば、少なくとも５０℃、５５℃、５８℃、または６０℃の示差走査蛍光測定（Differential Scanning Fluorimetry）（ＤＳＦ）により測定される溶解温度（Ｔｍ）を有する。
ＴＦｃＡは、本明細書で述べられる２以上の特性の組み合わせを有することとしてもよい。例えば、ＴＦｃＢＡは、少なくとも７０％によるｃ−Ｍｅｔのリガンド誘導リン酸化を、および少なくとも７０％によりＥＧＦＲのリガンド誘導リン酸化を阻害することとしてもよく、また、１以上の以下の特性、（ｉ）少なくとも５５または６０℃のＤＳＦにより測定されるＴｍ、および（ｉｉ）室温で５日またはそれより長く、４℃で２週間、１以上の凍結‐溶解サイクルまたは穏やかな撹拌後に、１０ｍｇ／ｍＬでＰＢＳに少なくとも７０％、８０％、または９０％の単量体とする、を示す。所定の実施形態では、ＴＦｃＢＡは、少なくとも６０℃のＴｍ、および少なくとも９０％（単量体の最初の濃度に対するこれらの条件下でのインキュベーション後の単量体の濃度）の室温、４℃、または３７℃での安定性を有する。
所定の実施形態では、ＴＦｃＡ組成物は、１以上の、以下の特徴、１）少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多いタンパク質が、タンパク質での精製後のＳＤＳＰＡＧＥで目に見える、２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで観察される種の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多くが正しい分子量である、３）示差走査蛍光測定により測定される熱安定性プロファイルが溶解した球状の挙動を示さない、４）ＳＥＣにより可視化される５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、またはそれより多い単量体を含まない、および５）ｐＥＧＦＲ抑制により測定される外因性のＥＧＦリガンドの付加により活性化されたＥＧＦレセプターシグナルの９５％より多くを阻害する、を含む。
標準的なアッセイは、ＴＦｃＢＡのようなＴＦｃＡの生物学的活性および特性を測定するために使用されることとしてもよい。代表的アッセイは実施例に提供される。
核酸、発現ベクターおよび宿主細胞
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡである。本明細書で提供される代表的なヌクレオチド配列は、図で述べられるａａ配列をコードするものである。所定の実施形態では、ＴＦｃＡの重または軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、タンパク質を産生するための細胞におけるヌクレオチド配列の発現を増強するまたは促進する配列に結合する。このような核酸は、ベクター、例えば、発現ベクター内に包含されることとしてもよい。
分泌される目的のために、ＴＦｃＡの重および／または軽鎖は、好ましくは、成熟したポリペプチドを提供するための分泌後に、通常カットオフされるシグナル配列を含む。以下のシグナル配列が使用されることとしてもよい。
例えば、発現している重鎖における使用のための、ＭＧＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号２４１）および
例えば、発現している軽鎖における使用のための、ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２４３）。
配列番号２４１をコードする代表的なヌクレオチド配列は、ａｔｇｇｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｇｔｃｇｔｇｇｃｔｔｔｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇａｔｔｃｔｔａａｇｇｇｇｇｔｃｃａｇｔｇｃ（配列番号２４０）であり、および配列番号２４３をコードする代表的なヌクレオチド配列は、ａｔｇｇｇｃａｃｃｃｃｃｇｃａｃａｇｃｔｃｔｔｇｔｔｃｔｔｇｃｔｇｃｔｔｃｔｔｔｇｇｃｔｃｃｃｔｇａｃａｃａａｃｔｇｇｔ（配列番号２４２）である。
本明細書に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または本明細書で述べられるヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であり、明細書でさらに記載されるＴＦｃＡの重および／もしくは軽鎖またはその一部をコードする、ヌクレオチド配列を含む、核酸、例えば、ＤＮＡは、また、本明細書に包含される。このようなヌクレオチド配列は、本明細書で述べられるタンパク質をコードすることとしてもよく、または、図面のいずれか１つで述べられるａａ配列のような、本明細書で述べられるタンパク質またはその一部（例えば、ドメイン）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一または類似であるタンパク質をコードすることとしてもよい。
本明細書で提供される核酸またはベクターを含む、例えば、宿主細胞のような細胞もまた、本明細書に包含される。
本明細書に記載されるＴＦｃＡは、組換え手段により産生されることとしてもよい。組換え産生についての方法は、当該技術分野の状態において広く知られ、その後の抗体の単離および薬学的に許容可能な純度への通常の精製とともに、原核および真核細胞におけるタンパク質発現を含む。宿主細胞におけるＴＦｃＡの発現に関し、例えば、軽および重鎖のような、それぞれのポリペプチドをコードする核酸は、標準的な方法により発現ベクター内に挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、または大腸菌細胞のような適切な原核または真核宿主細胞で行われ、ＴＦｃＡは細胞から回収される（上清または溶解後の細胞）。抗体の組換え産生物のための一般的な方法は、当該技術分野の状態で十分に知られ、および例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif 17 183-202 (1999); Geisse, S., et al, Protein Expr. Purif. 8 271-282 (1996); Kaufman, R.J., MoI. Biotechnol. 16 151-161 (2000); Werner, R.G., Drug Res. 48 870-880 (1998)の総説に記載される。
ＴＦｃＡは、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、または親和性クロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製法により培地から適切に分離することとしてもよい。ＴＦｃＡをコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、容易に分離されて、従来の手順を用いてシーケンスされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡおよびＲＮＡのソースとして作用し得る。いったん分離されると、ＤＮＡは発現ベクターに挿入され、その後、一方で免疫グロブリンタンパク質を産生しない、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、またはミエローマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされ、宿主細胞で組換えＴＦｃＡの合成を得る。
ＴＦｃＡのａａ配列変異体（または突然変異）は、ＴＦｃＡ ＤＮＡへ適切なヌクレオチド変化を導入することによりまたはヌクレオチド合成により調製されることとしてもよい。
「宿主細胞」は、本明細書に記載されるＴＦｃＡを生成するために操作され得るあらゆる種類の細胞システムを示す。一実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ細胞は、宿主細胞として使用される。ＮＳＯ細胞における発現は、例えば、Barnes, L. M., et al, Cytotechnology 32 109-123 (2000); Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 261-270 (2001)により記載される。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 E9 (2002）により記載される。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 3833-3837 (1989); Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285 - 4289 (1992);およびNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 77-87 (1997)により記載される。代表的な一過性発現システム（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E. -J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 71-83 (1999)およびby Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 191-199 (1996)により記載される。
原核生物についての適切な対照配列は、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られる。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係で配置される場合に「操作可能に結合」される。例えば、プレ配列または分泌リーダー（secretory leader）についてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現される場合のポリペプチドについて操作可能にＤＮＡに結合され、配列の転写に影響を及ぼす場合にプロモーターまたはエンハンサーがコード配列に操作可能に結合され、または翻訳を促進するように配置される場合にリボソーム結合がコード配列と操作可能に結合される。概して、「操作可能に結合」は、結合されるＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的かつリーディングフレーム内であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的であってはならない。結合は近くの制限部位でライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来の手順に従って使用される。
ＴＦｃＡの精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動法、および当該技術分野で十分に知られる他のものを含む従来の技術により、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質のような、細胞組成または他の混入物を除くために行われることとしてもよい。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照。微生物タンパク質による親和性クロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（カルボキシルメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）および混合モード交換）、チオフィリック吸着（thiophilic adsorption）（例えば、ベータメルカプトエタノールおよび他のＳＨリガンドで）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース、アザ−アレノホビック（aza-arenophilic）樹脂、またはｍアミノフェニルボロン酸で）、金属キレート親和性クロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）親和性物質で）、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動的方法のような(ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動のような)タンパク質精製のために使用される異なる方法が十分に確立されて普及している（Vijayalakshmi, M.A. Appl. Biochem. Biotech. 75 93-102 (1998)）。
ＴＦｃＡを用いる方法
本明細書で提供されるのは、ＴＦｃＡ、例えばＴＦｃＢＡを用いる方法である。ＴＦｃＢＡは、種々の癌を含む、レセプター依存シグナリングと関連する疾病または疾患を治療するために使用され得る。
一実施形態では、方法は、例えば、ｃ−Ｍｅｔ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリンレセプター、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（アルファおよびベータ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭおよび／またはＥｐｈＡ２のような、ＴＦｃＡの標的を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害するために提供される。方法は、腫瘍細胞の増殖が阻害、遅延、もしくは停止するように、または腫瘍細胞が死滅するようにＴＦｃＡで腫瘍細胞と接触することを含むこととしてもよい。
本明細書で提供されるのは、疾病または疾患を治療するために有効な量でＴＦｃＢＡを患者に投与することにより、例えば、ｃ−Ｍｅｔ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリンレセプター、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（アルファおよびベータ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭおよび／またはＥｐｈＡ２のようなＴＦｃＢＡの標的のシグナル経路と関連する疾病または疾患を治療する方法である。適切な疾病または疾患は、例えば、乳癌および以下に述べられるものを含む種々の癌を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、癌のような増殖性疾病を有する対象を治療するための方法は、それを必要とする対象に、治療上有効な量の１以上のＴＦｃＡを投与することを含む。
また、患者において、例えば、ｃ−Ｍｅｔ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリンレセプター、ＲＯＮ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（アルファおよびベータ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２および／またはＥＧＦＲのような、例えば、ＴＦｃＢＡのような、ＴＦｃＡの標的（複数を含む）を発現する腫瘍を治療するための方法（またはＴＦｃＡ、例えば、薬剤）が提供され、方法は、腫瘍の成長を遅延もしくは停止するために、腫瘍を停止するためもしくは縮小させるために、または腫瘍の侵襲性（invasivness）もしくは腫瘍の転移を遅延もしくは停止させるために有効なＴＦｃＡの量を投与することを含む。）ｃ−Ｍｅｔ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリンレセプター、ＲＯＮ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（アルファおよびベータ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２および／またはＥＧＦＲを発現する腫瘍は、以下の癌、胃、食道、大腸、非小細胞肺、膵臓、前立腺、腎臓、および甲状腺癌、肝細胞性カルシノーマ、神経膠腫／神経膠芽細胞腫、および乳癌（基底／三種陰性およびＨＥＲ２＋）の腫瘍を含んで治療されることとしてもよい。
腫瘍または腫瘍を有する対象を治療する方法は、ＴＦｃＡと組み合わせて第２の抗癌剤を投与することをさらに含み得る。よって、新規な組成物は、典型的には、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体または賦形剤とともに生物学的薬剤、第２の抗癌剤とともにＴＦｃＡを含むことが考慮される。
１以上のＴＦｃＡを含むキットもまた提供される。キットは、キットの内容の意図された使用を示す標識を含むこととしてもよく、任意に、例えば、ＥＧＦＲおよび／またはｃ−Ｍｅｔ依存性シグナリングのような、標的のＴＦｃＡ依存性シグナリングに関連する疾病または疾患を治療することにおけるキットの使用のための指示を含む。用語のラベルは、キットに、もしくはキットとともに、またはそうでなければキットと一緒に供給される、あらゆる記載、宣伝物、または記録物を含む。
薬学的組成物
他の態様では、組成物、例えば、薬学的な組成物、並びに患者における腫瘍を治療するためのこのような組成物のそれぞれの使用の方法は、患者における腫瘍の治療のために提供される。本明細書で提供される組成物は、薬学的に許容可能な担体とともに処方される、本明細書に開示される１以上の抗体、例えば、ＴＦｃＡを含む。本明細書で使用されるように、「薬学的に許容可能な担体」は、あらゆるおよびすべての溶剤、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤、並びに生理的に適合性のあるものを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または表皮投与に適する（例えば、注入によるまたは融合における）。投与の経路に応じて、抗体は、酸の作用からそれを保護する材料およびタンパク質を不活性にする他の天然の条件でコートされることとしてもよい。
薬学的組成物は、単体でまたは併用療法、つまり他の薬剤とともに投与されることとしてもよい。例えば、併用療法は、抗癌剤のような、少なくとも１つの付加的な治療上の薬剤とともに本開示の抗体を含み得る。また、薬学的組成物は、放射線治療および／または手術のような、別の抗癌治療方式とともに投与され得る。
本開示の組成物は、当該技術分野で知られる種々の方法により投与され得る。当業者により理解されるように、投与の経路および／またはモードは、所望の結果によって変化するであろう。
所定の投与経路により、本明細書で提供される組成物を投与するために、その不活性化を防止するための材料により、抗体をコートすること、または抗体を同時投与するが必要または望ましいこととしてもよい。例えば、抗体は、適切な担体で、例えば、リポソームまたは希釈剤で、患者に投与されることとしてもよい。薬学的に許容可能な希釈剤は、生理食塩水および水性緩衝液を含む。リポソームは、油中水中水型（water-in-oil-in-water）ＣＧＦ並びに従来のリポソームを含む。
薬学的に許容可能な担体は、無菌水溶液または分散液および無菌注射剤または分散液の即座の調剤のための無菌粉末を含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で知られる。活性化合物と適合しないあらゆる賦形剤、希釈剤、または薬剤に関するものを除いて、本明細書で提供される薬学的組成物におけるその使用が考慮される。捕捉の活性化合物（例えば、付加的抗癌剤）は、また、組成物に組み込まれ得る。
治療上の組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬物濃度に適する他の規則構造として処方され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、およびその適切な混合物を含む溶剤または分散液の媒体であり得る。生理食塩水の溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、特に注射剤のための液体の担体として採用され得る。また、組成物は、所望であれば、少量の湿潤性または可溶性促進剤、安定化剤、防腐剤、または緩衝薬を含み得る。多くの場合には、それは、等張剤、例えば、塩化ナトリウム、糖、ポリアルコール、例えばマンニット、ソルビット、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールを組成物に含むために有用であろう。注入組成物の持続的な吸収は、組成物に、吸収を遅らせる媒体、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによりもたらされ得る。
以下の実施例は、本発明範囲を限定するものとはみなされない。
実施例全体を通じて、他で述べられない限り、以下の材料と方法が用いられている。概して、本発明の本技術の実施には、他で指定されない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、たとえば抗体技術）、薬理学、調剤学の標準的な技術、およびポリペプチド調製における標準的な技術が用いられている。
実施例１．安定的なタンデムＦｃ構造の特定
本実施例は、安定定期な多価Ａｂ形式の特定を記述するものである。本実施例および実施例２において、結合部位を含有しないタンパク質構築物が用いられた。いくつかの形式が比較され、および、これら形式のそれぞれは、以下の２つのタンデムＦｃ構築部のいずれか１つから由来するものである。
１）ＩｇＧ１ヒンジを含有するＩｇＧ１ ＴＦｃ；Ｎ２９７Ｑ置換を含有するＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン；T366S/L368A/Y407V置換を含有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン；（Ｇ４Ｓ）８からなるＴＦｃリンカー、上部ヒンジを含有しないＩｇＧ１ヒンジ；Ｎ２９７Ｑ置換を含有するＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン；および、Ｔ３６６Ｗ置換を含有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、を含有する、ＴＦｃ「２３」または「ＩｇＧ１ ＴＦｃ」。この構築物は、配列番号２９３（図１１参照）に記述されるａａ配列を含有する；および、
２）ＩｇＧ１上部ヒンジならびにコアＩｇＧ４ヒンジおよび下部ＩｇＧ４ヒンジを含有するハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジを含有するＩｇＧ１／ＩｇＧ４タンデムＴＦｃ；Ｔ２９９Ｋ置換を含有するＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン；T366S/L368A/Y407V置換を含有するＩｇＧ１ ＣＨ３；（Ｇ４Ｓ）８からなるＴＦｃリンカー；上部ヒンジを含有しないＩｇＧ４ヒンジ；Ｔ２９９Ｋ置換を含有するＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン；および、Ｔ３６６Ｗ置換を含有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、を含有する、ＴＦｃ「３９」または「ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ ＴＦｃ」。この構築物は、配列番号３１９（図１１参照）に記述されるａａ配列を含有する
ＴＦｃ２３および３９の６の修飾型を作製し、それらを表１５に記述する。簡潔に述べると、第一の修飾は、ノブ（ｋｎｏｂ）または穴（ｈｏｌｅ）の近傍のジスルフィド結合の付加である（ＴＦｃ２３Ａ）。他の修飾は、２３Ａのノブ穴をより小さなノブ／穴（ＴＦｃ２３Ｂ）へと変えることであった。他の修飾は、第一のヒンジの上部ヒンジに１または２のシステインを導入し、ＴＦｃ内にジスルフィド結合を作ることであった（それぞれ、ＴＦｃ２３ＤおよびＣ）。他の修飾は、ＣＨ３ドメインにＣ末端システインを導入することであった（ＴＦｃ２３Ｅ）。ＴＦｃにおける他の修飾は、ＴＦｃリンカーの長さを２０ａａまで減少させることであった（ＴＦｃ２３Ｆ、または、「２３Ｇ」との呼称される）。これら新たな修飾型ＴＦｃのａａ配列は、本実施例で用いられたＴＦｃが上部ヒンジ部分（すなわち、アミノ酸ＥＰＫＳＣ）を含有せず、シグナルペプチドを含有したという点を除き、図６および７に記述されるものと同一である。これらＴＦｃのヌクレオチド配列およびａａ配列は図１１に示されており、および、ＴＦｃのドメインまたは構成要素の各々の同一性は、表１２および１３に記述されている（唯一の違いは、第一のヒンジがそのＮ末端にＥＰＫＳＣを含有しないという点である）。
異なる核酸（配列番号２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、または、３２８を有する）を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと一過性にトランスフェクトし、原則的に以下の通りに、ワンステップのプロテインＡ精製を用いて精製した。タンパク質をコードする核酸を、１つのタンパク質として、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて発現プラスミドへとクローニングした。用いた発現プラスミドは、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。発現プラスミドを、ポエチレンイミン（２．５μｇ／ｍｌ培養物）およびＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ細胞培養物）を用いてトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２で６日間インキュベートして回収した。すべてのタンパク質を、メーカーの説明書に従いプロテインＡアフィニティプロトコールを用いて精製した。プロテインＡアフィニティ工程を用いて、回収した細胞培養液（ＨＣＣＦ）から融合タンパク質を選択的に、効率的に結合させた。これにより、９５％を超える不純物を一回の工程で除去し、高い収率と高いスループットを得ることができる。この工程の後、融合タンパク質として所望される分子形態の分画は、６０〜９８パーセントの範囲にあった。ＧＥのＭＡＢＳＥＬＥＣＴを、プロテインＡアフィニティ樹脂として用いる。精製した物質を濃縮し、ＰＢＳへと透析した。
Ａ） モノマーの割合
ＴＦｃ溶液を、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により、最初の溶液、または、４℃、３７℃でのインキュベーションの後、凍結再融解後、もしくは室温でオービタルシェーカー上、緩やかに攪拌した後のいずれかに存在するモノマーの割合を測定した。ＳＥＣは、原則的に以下のように行った。ＳＥＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステムを用いて行われる。各分子を５０μｇ、ＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ３０００ゲルカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐ／Ｎ １８６７５）上に注入する。ＰＢＳを、０．３５ｍｌ／分の流速でランニング緩衝液および平衡緩衝液として用いる。
表１６は、指定された濃度で当初溶液中にあるＴＦｃのモノマー例の割合を示す。
他の実験においては、モノマーの割合は、原則的に上記のとおり分子を濃縮した後の当初溶液中で測定された。表１７に、結果を示す。
表１６および１７を合せたものを以下の表１８に示す。
表１９は、様々な条件下に曝された後に測定された溶液中のＴＦｃ３９Ｅと２３Ｃのモノマー割合を示す。
結果から、ＴＦｃは、０日目と様々な検証条件下では、溶液中で非常に異なる安定性を有していることが示された。３９Ｅおよび２３Ｇは、他よりも安定性が良いと思われる。
Ｂ）ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
ＴＦｃは、非変性条件下で、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、クマシン染色により可視化した。結果を図８に示す。
実施例２：第二世代のＴＦｃの合成
さらにＴＦｃ分子の特性を改良するために、さらなる修飾を施した。修飾は、（ｉ）ＴＦｃリンカーの長さを変えるもの（「２３Ｅ（３５Ｌ）」、「３９Ｅ（３５Ｌ）」、「２３Ｅ（３０Ｌ）」、「３９Ｅ（３０Ｌ）」、「２３Ｅ（２５Ｌ）」および「３９Ｅ（２５Ｌ）」）；（ｉｉ）２つのＣＨ３ドメインの各々の内での、ＡＥＭおよびＣ末端システイン修飾の組み合わせの変更（「逆転２３Ｅ（３５Ｌ）」および（「逆転３９Ｅ（３５Ｌ）」）；および、（ｉｉｉ）ＣＨ３結合を増強させる変異の変更（「２３Ｉ」、「３９Ｉ」、「２３Ｊ」および「３９Ｊ」）。これら修飾は表２０に要約する。これら新たな修飾ＴＦｃのａａ配列は、図１１に記述し、そのドメインまたは構成要素の各々の同一性は表１２および表１３に記述する。
第二世代ＴＦｃは、原則的に実施例１に記述されるように発現および精製された。
Ａ）モノマーの割合
ＴＦｃ溶液は、ＳＥＣにより、当初溶液中または、４℃で７日間のいずれかに存在しているモノマー割合を測定した。ＳＥＣは、原則的に実施例１に記述されているように行われた。
表２１は、当初溶液および、４℃で７日後における、第二世代のＴＦｃのモノマー例の割合を示す。
結果から、たとえば、２３Ｅおよび３９Ｅにおいて、４０ａａのリンカーにより、短いリンカーよりもＴＦｃの安定性が増加したことが示された。
実施例３：抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの例
Ａ）抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位の例
ＴＦｃＢＡは、ヒト化５Ｄ５ Ａｂ（米国特許第７，４７６，７２４号）を含有する、または、ヒト化５Ｄ５ Ａｂからなる抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位を含有しても良い。重鎖は、以下のＦａｂドメインまたはそのＶＨドメインを含有しても良い。
軽鎖は、以下のＦａｂドメインまたはそのＶＨドメインを含有しても良い。
ＴＦｃＢＡはまた、以下の重鎖部分と軽鎖部分からなる、または以下の重鎖部分と軽鎖部分を含有する抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位を含有しても良く、本明細書において、「抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２」と呼称される。重鎖は、以下のＦａｂドメインまたはそのＶＨドメインを含有しても良い。
軽鎖は、以下のＦａｂドメインまたはそのＶＨドメインを含有しても良い。
アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下を含有する例示的な成熟型ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列：ｉ）抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位５Ｄ５のＦａｂドメイン（配列番号２２３）；ｉｉ）ＡＥＭ１およびＤｉＳ２を含有するＴＦｃ（配列番号１８１）；および、ｉｉｉ）配列番号２３３を有するパニツムマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖＨ１Ｌ１（以下を参照）が、配列番号２３５に記述されている（図９）。アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下を含有する例示的な成熟型ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列：ｉ）抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２のＦａｂドメイン（配列番号２８７）；ｉｉ）ＡＥＭ１およびＤｉＳ２を含有するＴＦｃ（配列番号１８１）；および、ｉｉｉ）配列番号２５８を有するセツキシマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖＨ１Ｌ１（以下を参照）が、配列番号２９１に記述されている（図９）。概して、本明細書に開示される例示的な抗ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂ重鎖は、本明細書に開示される任意のＴＦｃ、またはＴＦｃを含有する構築物に連結されても良い。これらタンパク質は、シグナルペプチド（配列番号２４１からなるシグナル配列であっても良い）と共に発現されてもよい。
Ｂ）例示的な抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ
ＴＦｃＢＡは、以下の項ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（またはその可変ドメインもしくはＣＤＲ）のいずれかを含有しても良い。
１）パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）ｓｃＦｖ
パニツムマブのＶＨドメインおよびＶＬドメインのａａ配列は、米国特許第６，２３５，８８３号に開示されており、以下のａａ配列を有するｓｃＦｖへとアセンブルされる。
２）２２２４ｓｃＦｖ
Ａｂ２２２４のＶＨドメインおよびＶＬドメインのａａ配列は、米国特許公開２０１０／０００９３９０号に開示されており、以下のａａ配列を有するｓｃＦｖへとアセンブルされる。
３）ヒト化セツキシマブｓｃＦｖ
セツキシマブの可変領域はヒト化されており、以下のｓｃＦｖの構築に用いられた。ここで、ＣＤＲは点線で下線が引かれており、ｓｃＦｖリンカーは斜体、および、ヒト化により生じたａａ修飾は小文字である。
ヒト化セツキシマブＡｂのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の他の形式のＡｂ（たとえば、２つの重鎖と２つの軽鎖を含有する天然型構造を有するＡｂ）で用いられても良い。
ｉ）ヒト化５Ｄ５抗ｃ−Ｍｅｔ ＶＨドメイン（配列番号２２３）；ｉｉ）ＡＥＭ１およびＤｉＳ２を含有するＴＦｃ（配列番号１８１）；および、ｉｉｉ）配列番号２３３を有するパニツムマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、を含有する抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列は、配列番号２３５に記述されている（図９）。配列番号２３５にあるものと同じ結合部位を含有するが、ＴＦｃは異なっている抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列は、配列番号３４３、２２５、２２７および２２９に記述されている（図９）。ｉ）ヒト化５Ｄ５抗ｃ−Ｍｅｔ ＶＨドメイン（配列番号２２３）；ｉｉ）ＡＥＭ１およびＤｉＳ２を含有するＴＦｃ（配列番号１８１）；および、ｉｉｉ）配列番号２３３を有する２２２４抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、を含有する抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列は、配列番号２３９に記述されている（図９）。ｉ）ヒト化５Ｄ５抗ｃ−Ｍｅｔ ＶＨドメイン（配列番号２２３）；ｉｉ）ＡＥＭ１およびＤｉＳ２を含有するＴＦｃ（配列番号１８１）；および、ｉｉｉ）配列番号２５８、２７５、２７７または２７９からなるセツキシマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、を含有する抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列は、それぞれ、配列番号２６０、２８１、２８３および２８５に記述されている（図９）。概して、本明細書に開示されるいずれかの抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、またはその可変配列もしくはＣＤＲ配列は、本明細書に開示されるＴＦｃ、またはＴＦｃを含有する構築物のいずれかに連結されていても良い。
Ｆａｂドメイン、ｓｃＦｖおよびＴＦｃＢＡをコードするヌクレオチド配列を、図１０に示す。
他の例示的な抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡを、表２１に記述する。ここで、当該配列の各々は、介在配列無しで、アミノ末端からカルボキシ末端の順で隣接する配列に連結されている。
実施例４：ＴＦｃＡまたはＴＦｃを調製および特徴解析する方法
Ａ）タンパク質発現および精製
安定的なトランスフェクション：１：１（：１）のプラスミド比率を用いて核酸をＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスターの卵巣；ＡＴＣＣ ｃａｔ ＃ ＣＣＬ−６１）へとトランスフェクトし、たとえば以下のプロトコールに従いワンステッププロテインＡ精製法を用いて精製する。ＴＦｃＡまたはＴＦｃをコードする核酸を、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて発現プラスミドへと、１つタンパク質としてクローニングする。用いた例示的な発現ベクターは、ｐＭＰ １０Ｋ（ＳＥＬＥＸＩＳ）である。発現プラスミドを直線化させ、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞へと共トランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＨａｍ‘ｓＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、２日間、選択圧をかけずに回復させ、次いで、４日間、選択圧をかける。４日後、選択圧と共に、グルタミンを含有する血清フリー培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）へと変える。１週間後、細胞を、発現に関してチェックし、所望される用量へとスケールアップする。全てのタンパク質を、プロテインＡアフィニティプロトコールを用いて、メーカーの説明書に従い精製する。プロテインＡアフィニティ工程を用いて、培養された細胞培養液（ＨＣＣＦ）から、ＴＦｃＡまたはＴＦｃタンパク質を選択的および効率的に結合させる。これにより、９５％を超える不純物を一回の工程で除去し、高い収率と高いスループットを得ることができる。この工程の後、ＴＦｃＡまたはＴＦｃとして所望される分子形態の分画は、６０〜９８パーセントの範囲にあると予測される。ＧＥのＭＡＢＳＥＬＥＣＴを、プロテインＡアフィニティ樹脂として用いる。精製した物質を濃縮し、ＰＢＳへと透析する。
一過性のトランスフェクション：核酸を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと一過性にトランスフェクトし、原則的に以下の通りに、ワンステップのプロテインＡ精製を用いて精製する。タンパク質をコードする核酸を、１つのタンパク質として、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて発現プラスミドへとクローニングする。用いた例示的な発現プラスミドは、ｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ ＃ Ｒ７９０−０７）である。発現プラスミドを、ポエチレンイミン（２．５μｇ／ｍｌ培養物）およびＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ細胞培養物）を用いてトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２で６日間インキュベートして回収する。すべてのタンパク質を、メーカーの説明書に従いプロテインＡアフィニティプロトコールを用いて精製する。プロテインＡアフィニティ工程を用いて、培養した細胞培養液（ＨＣＣＦ）から融合タンパク質を選択的に、効率的に結合させた。これにより、９５％を超える不純物を一回の工程で除去し、高い収率と高いスループットを得ることができる。ＧＥのＭＡＢＳＥＬＥＣＴを、プロテインＡアフィニティ樹脂として用いる。精製した物質を濃縮し、ＰＢＳへと透析する。
Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ＴＦｃＢＡまたはＴＦｃを、非変性条件下で、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、クマシン染色により可視化する。この方法を用いて、ＴＦｃＡまたはＴＦｃが正確に形成されているか、またはアセンブリされているかを測定しても良い。
Ｃ）ＤＳＦによる熱安定性測定
ＴＦｃＡまたはＴＦｃが展開される（アンフォールディングされる）温度を、原則的に以下の通りに示差走査式蛍光法（ＤＳＦ）により測定する。ＤＳＦアッセイは、ＩＱ５ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で行われる。１５ｕＭ ＴＦｃＡまたはＴＦｃ、１ｘ Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１ｘＰＢＳの溶液を２０μｌ、９６ウェルプレートのウェルに添加する。プレートを、１℃／分の加熱速度で２０℃から９０℃へと加熱する。データは、分析のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍへと転送される。
Ｄ）ｐＥＧＦＲ阻害
ＴＦｃＢＡによる、ＥＧＦＲを介したシグナル伝達（たとえば、リガンド誘導性シグナル伝達）の阻害を、ＥＧＦＲのリン酸化に対する特定のＴＦｃＡの効果を測定することにより決定しても良い。
以下のプロトコールを用いて、ＥＧＦＲの阻害を測定する。細胞（たとえば、Ａ４３１細胞（ＡＴＣＣ ｃａｔ ＃ＣＲＬ−１５５５）またはＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））を、１０％のウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ培地中で維持する。シグナル伝達実験に対しては、３．５ｘ１０４細胞を９６ウェルの組織培養プレートにおいて、完全培地中に播種する。翌日、完全培地を血清フリー培地と置き換え、細胞を一晩、３７℃で培養する。細胞を２時間、３００ｎＭの開始濃度で前処置し、ＴＦｃＡまたはＴＦｃの各々に対し、１１の濃度用量のために３倍希釈し、次いで、８ｎＭのＥＧＦ（ヒト組換えＥＧＦ；Ｃａｔ＃ ＡＦ−１００−１５； ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて１０分間刺激する。細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害物質（ＥＡＳＹパック中に備えられているｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔ、ｃａｔ ＃４６９３１２４００１、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ；ＰｈｏｓＳＴＯＰ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ、ｃａｔ ＃ ４９０６８３７００１， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ）を補充したＭＰＥＲ緩衝液で溶解させる（ｃａｔ ＃ ＰＩ７８５０５， ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。ホスホ−ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）に対するＥＬＩＳＡは、メーカーのプロトコールに従い行う（ｐＥＧＦＲ ＥＬＩＳＡ Ｒ＆Ｄキット（ｃａｔ＃：ＤＹＣ１０９５−Ｃ））（ただし、捕捉ＡｂがＥＧＦＲ Ａｂ−１１、クローン：１９９．１２ （Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃ ＭＳ３９６Ｐ１ＡＢＸ）である点は除く）。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （ｃａｔ＃ ＰＩ３７０６９、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーでプレートを読み取らせる。ＴＦｃＡまたはＴＦｃの最低濃度での観測シグナルに対して標準化した後、発光値をプロットする。データ分析に対しては、二重試料を平均し、エラーバーを用いて、２つの複製物間の標準偏差を表す。阻害曲線および、対応ＩＣ５０値は、４パラメーターロジスティック方程式へのデータ回帰を介したＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を用いて算出する。阻害割合を算出するために、最大（ｍａｘ）および最小（ｍｉｎ）阻害効力の回帰値を、以下のように用いることができる。
curve_span = max - min;
baseline_span = max;
percent_inhibition = 100*curve_span/baseline_span.
Ｅ）ｐＥＲＫ阻害
ＴＦｃＢＡによる、ｃ−Ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲを介したシグナル伝達（たとえば、リガンド誘導性シグナル伝達）の阻害を、ＥＲＫのリン酸化に対する特定のＴＦｃＡの効果を測定することにより決定しても良い。以下のプロトコールを用いて、ＥＲＫの阻害を測定する。１日目：活性のある中間対数期（約８０％のコンフルエンシー）の増殖細胞（たとえば、Ａ４３１細胞）を、ＤＭＥＭ培地（＋１０％ＦＢＳ＋Ｌ／グルタミン＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に播種する。９６ウェルプレート中に、およそ３５，０００細胞を播種／ウェルする。２日目、培地を１０％ＦＢＳから血清フリー培地−０．５％ＦＢＳ（＋Ｌ／グルタミン＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）へと変える。３日目：阻害物質／抗体を血清培地の適量へと希釈する。各濃度に対し、各阻害物質を１００μＬ添加／ウェルする。阻害物質を２時間、３７℃でインキュベートさせる。２時間の最後、最終濃度の８ｎＭ ＥＧＦ（ヒト組換えＥＧＦ； Ｃａｔ＃ ＡＦ−１００−１５； ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ， Ｉｎｃ．）を各阻害物質および阻害物質濃度の各々に１０分間添加する。細胞を冷却したＰＢＳで２回洗浄し、その後、４０μＬ／ウェルのＳｕｒｅＦｉｒｅＬｙｓｉｓ緩衝液（水でストックを１：５希釈）中で溶解させる。溶解後、溶解物を通常５分以内に−８０℃に置く。４日目、ＳｕｒｅＦｉｒｅ ｐＥＲＫ １／２ ＥＬＩＳＡ実施に関するプロトコールは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒのウェブサイト上にある（ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ ＰＲＯＴＥＩＮ Ａ １０Ｋ ＰＴＳ ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． Ｃａｔ ＃： ６７６０６１７Ｍ； ＴＧＲ Ｓｕｒｅｆｉｒｅ ＥＲＫ１ ３８４ Ｋｉｔ ｆｏｒ １０，０００ Ａｓｓ； ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． Ｃａｔ ＃：ＴＧＲＥＳ１０Ｋ）。原則的に、−８０℃の溶解物は、室温で溶解させる。その間に、反応緩衝液を調製する（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅｒおよびＲｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをプロトコールに従い混合する）。プロテインＡ検出キット試薬を、３８４ウェルプレートに添加する前に、反応緩衝液に最後に添加する。４μＬの溶けた溶解物を、白くて浅いウェルプレートであるＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ３８４（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ； ｃａｔ ＃ ６００８２８０）に移す。プロテインＡ検出キット試薬を添加した後、７μＬの最終反応緩衝液を各ウェル（すでに４μＬの溶解物が入っている）に移す。プレートをアルミニウム箔でしっかりと封をする。プレートを１分間、１８００ｒｐｍで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機でスピンダウンする。プレートを２時間、室温で穏やかに振とうする。次いで、プレートをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒで読み取る。ｐＥＧＦＲで述べた様に、発光データの標準化およびＩＣ５０の算出を行う。
実施例５：ＥＬＩＳＡプレートベースの抗体結合測定プロトコール
可溶性ｃＭｅｔ−ＦｃおよびＥＧＦＲ−ｈｉｓへの二重特異性抗体の結合
Ｒｅａｃｔｉ結合プレート（９６ウェル）を、５０μＬのｃＭｅｔ−Ｆｃ（ＰＢＳに２μｇ／ｍＬで溶解）を用いてコートし、４℃で一晩インキュベートする。翌日、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて洗浄し、室温で１時間、１００μＬのブロッキング緩衝液を用いてブロッキングし、再度、ＰＢＳ−Ｔを用いて洗浄する。プレートを、５０μＬの二重特異性抗体とともに、２時間、室温でインキュベートし次いで、ＰＢＳ−Ｔで洗浄する。抗体濃度は５００ｎＭ（ＰＢＳ−Ｔに溶解）で開始し、さらに１０の２倍希釈と１つのブランク（ＰＢＳ−Ｔのみ）を含む。次いで、プレートを５０μＬのＥＧＦＲ−ｈｉｓ（ＰＢＳ−Ｔに１μｇ／ｍｌで溶解）と共に室温で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中で１：１０，０００に希釈した抗ｈｉｓ−ＨＲＰ抗体と共に室温で１時間インキュベートし、再度、ＰＢＳ−Ｔで洗浄する。プレートを１００μＬのＴＭＢ基質と共に室温で５〜１０分間インキュベートし、１００μＬのストップ溶液を添加することにより反応を停止させる。吸光度を４５０ｎｍで測定し、得られたデータはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。
上述の方法において、ＴＦｃＢＡを用いて得られた結果の例を図１５に示し、オナルツズマブ−３９Ｅｇｙ−２２２４（四角）およびオナルツズマブ−３９Ｅｇｙ４−パニツムマブ（円）の結合親和性を示す。
実施例６：非対称Ｆｃドメインに関する最新技術により、分子量の不均質性がもたらされる
ＣＨＯ−Ｋ１細胞の安定的なトランスフェクション
懸濁液に適合させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、８ｍＭのＬグルタミンを補充したＨｙｃｌｏｎｅ培地中で２百万／ｍＬの密度まで増殖させる。トランスフェクションを行う日に、細胞を血清フリー培地中に８０，０００細胞／ｍＬの密度で再懸濁する。次いで、細胞（５００μＬ）を１μｇのトータルＤＮＡ（ジェネテシン選択マーカーを担持するｉｎ−ｈｏｕｓｅベクターであるｐＮｅｏベクター １０ｎｇを含む）と共に、２．７５μＬのリポフェクタミンを用いて、２４ウェルプレート中でトランスフェクトする。３時間後、１ｍＬのリカバリー培地（ＨＡＭＳ−Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ）を添加し、トランスフェクトした細胞を４８時間回復させる。次いで、細胞を９６ウェルプレートへと播種し、選択マーカーのジェネテシンを５００μｇ／ｍｌでリカバリー培地に添加した。さらに４日後、培地を血清フリーのＨｙｃｌｏｎｅ培地（Ｌグルタミンを補充）と置き換え、トランスフェクトした細胞を馴化させた。１週後、選択された細胞はコロニーを形成し、上清からウェスタンブロットを行って、所望される特徴を有しているかウェルを検証する。希望通りのクローンを２４ウェルプレートで増殖させ、次いで、Ｔ−２５フラスコへと移し、最終的にはフラスコを振とうさせる。所望されるクローンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、所望量へとスケールアップする。生存能力が８０％を下回ったときに、細胞を遠心（６０００ｇ、３０分）して回収し、上清を、０．２２μｍのフィルターを用いてろ過する。
細胞は、上述のようにトランスフェクトされ、以下のように分析された。結果は、以下の表２２に示す。
Ａ）ウェスタンブロットのプロトコール
オナルツズマブを発現する細胞上清を、非変性条件下で、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに泳動した。タンパク質は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｌｏｔを用いてニトロセルロース紙に転写された。ブロットはＰＢＳ−Ｔで洗浄され、次いで、ＩＲＤ７００が結合した抗ヒト−ＦＣと共に１時間インキュベートした。ブロットをＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄し、次いで、Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙを用いて画像撮影した。結果は図１２に示す。
Ｂ）モノマーの割合
溶液は、ＳＥＣによる、当初溶液中に存在するモノマーの割合測定に供された。ＳＥＣは、原則的に、実施例１に記述されるとおりに行われた。表２２に、当初溶液中の例示的な第二世代のモノマーの割合を示す。
実施例７．荷電非グリコシル化変異体の産生および分析
安定的な多価Ａｂ形式の特定は、以下に記述する。結合部位を含有しないタンパク質構築物を用いた。数種の形式を、表２３および図１７に示されるように比較した。
核酸（配列番号３５７および、３８９〜３９９（奇数）を有する）は、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトされ、ワンステップのプロテインＡ精製を用いて精製され、次いで、実施例４に記述されるようにＤＳＦを行った。
Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ＴＦｃは、変性条件下で、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、クマシン染色により可視化した。結果は、図１３Ａ（非還元）および図１３Ｂ（還元）に示す。
Ｃ）ＤＳＦによる温度安定性の測定
ＴＦｃＡまたはＴＦｃが展開される（アンフォールディングされる）温度を、原則的に以下の通りに示差走査式蛍光法（ＤＳＦ）により測定する。ＤＳＦアッセイは、ＩＱ５ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で行われる。１５ｕＭ ＴＦｃＡまたはＴＦｃ、１ｘ Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１ｘＰＢＳの溶液を２０μｌ、９６ウェルプレートのウェルに添加する。プレートを、１℃／分の加熱速度で２０℃から９０℃へと加熱する。データは、分析のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍへと転送される。グリコシル化部位変異体に対するＤＳＦによる温度安定性測定の結果の例を、表２５に示す。
実施例８：主鎖変異体のＤＳＦ分析
ＤＳＦによる温度安定性の測定
ＴＦｃＡまたはＴＦｃが展開される温度を、上述のように示差走査蛍光法（ＤＳＦ）により測定する。
結果を、以下の表２６に示す。これらデータから、たとえば、ジスルフィド架橋の付加およびグリコシル化変異等の主鎖変異により、温度安定性が改善されうることが示される。
実施例９：オナルツズマブ結合部位を用いた、一価および二特異性ｔＦｃ分子の産生および分析
サイズ排除クロマトグラフィを用いたモノマー割合の測定
５０μｇの試料を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（＋３００ｍＭ ＮａＣｌ）を泳動緩衝液として用いて、ＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ３０００ゲルカラム（４．６ｍｍＩＤｘ３０ｃｍ）上に注入する。全ての測定は、オートサンプラー、バイナリーポンプ、およびダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣで行われる。モノマーの割合は、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアにおいてデータを分析することにより測定される。通常、全ての試料は、プロテインＡ精製のみが行われ、１ｘＰＢＳ中で５ｍｇ／ｍＬの濃度にある。
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ結合プロトコール
必要な材料 ９６ウェルの、黒く、丸くて平底のポリプロピレンマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ ＃ ６５５２０９）。Ｏｃｔｅｔ機器およびソフトウェア（バージョン３．０）。プロテインＡセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ， ＃１８−５０１０）。１ｘＰＢＳ、抗原（ｈｉｓタグ化ｃＭＥＴ）、抗体。
プロトコール 全ての試薬を平衡化し、試料を室温に戻す。プロテインＡセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ， ＃１８−５０１０）を、１０分間、１ｘＰＢＳ中で水和させる。動的分析は、Ｏｃｔｅｔソフトウェアを用いてメーカーの説明書の手順に従い行う。分析工程は、通常、以下を含む：１〜２分間、１ｘＰＢＳ中で平衡化し、４分間、抗体（濃度は、１ｘＰＢＳ中に５０μｇ／ｍＬ）をローディングし、１〜２分間、ベースラインを安定化させ、４分間、抗体：抗原を結合させ、そして、４分間、抗体：抗原を解離させる。全体を通して１ｘＰＢＳをマトリクスとして使用する。データは、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて分析、処理し、１：１の結合モデルを用いた曲線にフィットさせ、動態パラメータ（Ｋｄ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）を決定する。
実施例１０：オナルツズマブおよび二特異性変異体によるシグナル伝達阻害
表２８の構築物のｐＭｅｔを阻害する能力を検証するために、ＴＦｃ変異体を、ＨＧＦ誘導型ＳＷ６２０細胞（ＡＴＣＣ ｃａｔ＃：ＣＣＬ−２２７）を以下の様に検証した：１日目、活性のある中間対数期（約８０％のコンフルエンス）の増殖細胞（たとえば、ＳＷ６２０細胞）を、ＲＰＭＩ培地（＋１０％ＦＢＳ＋Ｌ／グルタミン（２ｍＭ）＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に播種する。９６ウェルプレート中に、およそ２０，０００細胞を播種／ウェルする。２日目、培地を１０％ＦＢＳから血清フリー培地−ＲＰＭＩ＋０．５％ＦＢＳ（＋Ｌ／グルタミン＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）へと変える。３日目：ＨＧＦ（刺激対照）および様々な阻害物質／抗体を、適量の血清フリー培地へと希釈する。各濃度に対し、各阻害物質を１００μＬ添加／ウェルする。阻害物質を２時間、３７℃でインキュベートさせる。次いで、細胞を２回、冷却したＰＢＳで洗浄し、その後、５０μＬ／ウェルのＭＰＥＲ（ｃａｔ ＃ ＰＩ７８５０５， ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害物質緩衝液（ＥＡＳＹパックに備わっているｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔ、ｃａｔ＃ ４６９３１２４００１、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ；ＰｈｏｓＳＴＯＰ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ、ｃａｔ＃ ４９０６８３７００１、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ）中で溶解させる。溶解後、溶解物を通常５分以内に−８０℃に置く。
ｐＭｅｔシグナルの計測に関しては、ＥＬＩＳＡキットを用いた（Ｈｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＧＦ Ｒ／ｃ−ＭＥＴ ＤｕｏＳｅｔ ＩＣ Ｅｃｏｎｏｍｙ Ｐａｃｋ， ｃａｔ ＃ ＤＹＣ２４８０Ｅ， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。３８４ウェルのＨｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｌａｃｋ Ｓｏｌｉｄプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの捕捉抗ＭＥＴ抗体（ＰＢＳ緩衝液中、４μｇ／ｍＬ／ウェルの最終濃度）を用いてコートする。プレートを一晩、室温に置く。４日目、−８０℃の溶解物を室温で溶かす。次いで、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０入りのＰＢＳ）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーにおいて、５０μｌ／ウェルで３回、洗浄する。３８４ウェルプレートを、２％ＢＳＡ／ＰＢＳを５０μＬウェルで１時間、室温でブロッキングする。２つの溶解物を１つのウェルにプールし、２％ ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／２５％ＭＰＥＲ／ＰＢＳで２倍希釈する。組換え標準曲線は、２％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／２５％ＭＰＥＲ／ＰＢＳで１０回の２倍連続希釈を作製することにより準備する。ＥＬＩＳＡプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄する。２０μＬの溶解物を、９６ウェルプレートから４倍の３８４プレートへと移す。プレートを室温で２時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで３回洗浄する。一次検出の抗ホスホチロシン抗体である４Ｇ１０（ｃａｔ＃ ０５−３２１， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｕｐｓｔａｔｅ）を２０μＬ、ＥＬＩＳＡプレートに１：１０００希釈で添加し、１時間室温でインキュベートする。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （ｃａｔ ＃ ＰＩ３７０６９， ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を２０μＬ、メーカーの説明書に従い添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取る。データ分析に関しては、２つの試料の平均をとり、エラーバーを用いて２つの複製物間の標準偏差を表す。阻害曲線および対応ＩＣ５０値は、４パラメーターのロジスティック方程式へのデータ回帰を介したＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を用いて算出する。
図１６に示されるように、検証されたすべての分子が、ＴＦｃコア領域の同一性に関わらず、同じようにｐＭｅｔシグナル伝達を阻害した。二価オナルツズマブ＿３９Ｅｇｙ４＿２２２４、オナルツズマブ＿３９Ｅｇｙ４＿パニツムマブ、および、オナルツズマブ＿３９Ｅｇｙ４＿セツキシマブ変異体は、一価のオナルツズマブ＿３９Ｅｇｙ４変異体と同程度にまで、阻害した。
均等物
当業者であれば、日常的な実験の範囲内で、本明細書に開示される特定の実施態様の多くの均等物を認識し、または確認および実行することができるであろう。そのような均等物は以下のクレームに包含されることが意図される。独立項に開示される実施態様の任意の組み合わせも、本開示範囲内であることが予期される。
参照による援用
本明細書に言及される各々、および、すべての米国ならびに外国の特許ならびに係属中の特許出願および公表文献は、その全体において、本明細書に参照により具体的に援用される。
さらなる実施例：Ａ−１項
以下の実施例は、本開示範囲を限定するものとはみなされない。
実施例全体を通して、他で述べられない限り、以下の材料と方法が用いられている。概して、本発明の本技術の実施には、他で指定されない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、たとえば抗体技術）、薬理学、調剤学の標準的な技術、およびポリペプチド調製における標準的な技術が用いられている。
これら実施例および図において、「ＨＧＦ」とは、肝細胞増殖因子（場合によって、分散因子（ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ）と言及される）（たとえば、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ＃１００−３９）を指す。
以下に開示される技術および実施例において用いられたヒト細胞株は、記述のとおり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から得ても良い。実施例において用いられた細胞株は、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）； ＮＣＩ−Ｈ４４１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１７４）；ＨＣＣ８２７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２８６８）；ＮＣＩ−Ｈ２１７０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５９２８）；およびＵ−８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１４）である。
ヒト化された、抗ヒトｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体ＯＡ−５Ｄ５（米国特許第８，３６１，７４４号において配列番号４５（重鎖）および配列番号４６（軽鎖）、ならびに、米国特許出願公開２０１１０３００１４６において配列番号１９６（ノブ（ｋｎｏｂ））で開示されている）を、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体対照として用いる。一部の実施態様において、抗ｃ−Ｍｅｔ重鎖およびｋｎｏｂ配列の各々は、ＣＨ２グリコシル化部位を除去するために１つの変異（配列番号４５および配列番号１９６）を有している。たとえば、米国特許第７，４７６，７２４号を参照のこと。
本開示の抗体は、以下の記号で略されている：たとえば、抗体＃１は、Ａｂ＃１、抗体＃２は、Ａｂ＃２、抗体＃１３は、Ａｂ＃１３等。
実施例Ａ−１：タンデムＦｃ二重特異性抗体の形式
本明細書に開示される二重特異性抗体の全体構造は、ｃ−Ｍｅｔに対する１つのＦａｂ、「タンデムＦｃ」（ＴＦｃ）主鎖構造（ＰＣＴ係属出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／５２４９０のたとえば配列番号３９４および３９５に開示されている）、およびＥｐＣＡＭに対する１つのｓｃＦｖ抗体断片を有する二価抗体を含有する。二重特異性抗体の重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ以下のドメインを含有する１つのポリペプチドを含有する：
（ｉ）ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂの重鎖
（ｉｉ）ＩｇＧ１ 上部ヒンジならびにＩｇＧ４中部ヒンジおよび下部ヒンジを含有するハイブリッドヒンジ
（ｉｉｉ）Ｔ２９９Ｋ変異を伴うＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン＃１
（ｉｖ）Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを伴うＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン＃１
（ｖ） ジスルフィド架橋モチーフ＃１（ＫＳＣＤＫＴ）
（ｖｉ）（Ｇ４Ｓ）８ポリペプチドリンカー
（ｖｉｉ）ＩｇＧ４の中部ヒンジおよび下部ヒンジ
（ｖｉｉｉ）Ｔ２９９Ｄ変異を伴うＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン＃２
（ｉｘ）Ｔ３６６Ｗ変異を伴うＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン＃２
（ｘ）ジスルフィド架橋モチーフ＃２（ＧＥＣ）
（ｘｉ）連結ポリペプチドリンカー
（ｘｉｉ）抗ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖ
抗体ドメイン構造の概略図は図１８に示されている。
実施例Ａ−２：抗ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖのヒト化
構造誘導法を用いて、マウスの親配列（配列番号４８６および４８７）から１３のヒト化抗ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖ変異体のパネルを作製した。ｓｃＦｖの最初の相同性モデルは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインに対する独立ゼロギャップ鋳型を用いたＭｏｌＩＤＥにより構築され、ＳＣＷＲＬを用いてエネルギー改良された。ＭｏｌＩＤＥおよびＳＣＷＲＬの概要は開示されている（たとえば、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ３：１８３２−１８４７（２００８））。候補変異の安定性に対する潜在的効果は、ＰｙＭＯＬを用いた外観検査またはＥｒｉｓを用いたエネルギー差異の算出により行われた。これらｓｃＦｖ変異体は、１３に二重特異性抗体に組み込まれた（Ａｂ＃１、Ａｂ＃２、Ａｂ＃３、Ａｂ＃４、Ａｂ＃５、Ａｂ＃６、Ａｂ＃７、Ａｂ＃８、Ａｂ＃９、Ａｂ＃１０、Ａｂ＃１１、Ａｂ＃１２、およびＡｂ＃１３）。用いられた置換は、３つの異なる抗体フレームワーク、ＣＤＲ配列中の脱アミド化部位または酸化部位の除去、ＶＨ／ＶＬ配列の方向性、ジスルフィド架橋の付加、および、ｓｃＦｖタンパク質内部のリンカー配列が挙げられる。検証された置換デザインの概要は図２に示す。
実施例Ａ−３：タンパク質発現および抗体の精製
Ａ）一過性のトランスフェクション
抗体は、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用した一過性トランスフェクションプロトコールを用いて発現される。タンパク質をコードする核酸は、１つのタンパク質として、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて発現プラスミドにクローニングされる。用いられた発現ベクターの例は、ｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃Ｒ７９０−０７）である。抗体の重鎖配列と軽鎖配列は別々のベクターにクローニングされる。発現プラスミドは、ポリエチレンイミン（２．５μｇ／細胞培養物ｍｌ）およびＤＮＡ（総量で１μｇ／細胞培養物ｍｌと共に。重鎖と軽鎖の比率は１：１）を用いてトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、６日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされ、３０分間、６０００ｇで遠心することにより回収され、次いで、上清を０．２μＭでろ過する。
Ｂ）安定的トランスフェクション
抗体は、原則的に以下のように、懸濁的に適合させたＣＫＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスターの卵巣；ＡＴＣＣ カタログ＃ＣＣＬ−６１）へと安定的にトランスフェクションされ、発現される。抗体をコードする核酸は、１つのタンパク質として、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて発現プラスミドにクローニングされる。用いられた発現ベクターの例は、ｐＭＰ １０Ｋ（ＳＥＬＥＸＩＳ）である。抗体の重鎖配列と軽鎖配列は別々のベクターにクローニングされる。重鎖と軽鎖の発現プラスミドは直線化され、ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製され、以下のように１：１の比率で共トランスフェクトされる。
懸濁液に適合させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、８ｍＭのＬグルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃２５０３０−０８１）を補充したＨｙｃｌｏｎｅ培地（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ＃ＳＨ３０５４８．０２）中で２百万／ｍＬの密度まで増殖させる。トランスフェクションを行う日に、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ血清フリー培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃３１９８５−０６２）中に８０，０００細胞／ｍＬの密度で再懸濁する。次いで、細胞（５００μＬ）を１μｇのトータル直線化ＤＮＡ（ジェネテシン選択マーカーを担持するｉｎ−ｈｏｕｓｅベクターであるｐＮｅｏベクター １０ｎｇを含む）と共に、２．７５μＬのリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１５３３８−１００）を用いて、２４ウェルプレート中でトランスフェクトする。３時間後、１ｍＬのリカバリー培地（ＨＡＭＳ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ）を添加し、トランスフェクトした細胞を４８時間回復させる。次いで、細胞を９６ウェルプレートへと播種し、選択マーカーのジェネテシンを５００μｇ／ｍｌでリカバリー培地に添加した。さらに４日後、培地を血清フリーのＨｙｃｌｏｎｅＳＦＭ４ＣＨＯ培地（Ｌグルタミンを補充）と置き換え、トランスフェクトした細胞を馴化させた。１週後、選択された細胞はコロニーを形成し、および、上清からウェスタンブロットを行って、所望される特徴を有しているか、シングルコロニーを含有するウェルを検証する。希望通りのクローンを２４ウェルプレートで増殖させ、次いで、Ｔ−２５フラスコへと移し、最終的には１２５ｍｌの振とうフラスコへと移す。所望されるクローンによる抗体の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、所望量へとスケールアップする。生存能力が８０％を下回ったときに、細胞を遠心（６０００ｇ、３０分）して回収し、上清を、０．２２μｍのフィルターを用いてろ過する。細胞の活性は、トリパンブルー排出アッセイを用いて評価し、Ｖｉ−ＣＥＬＬ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて自動的に測定される。
Ｃ）精製
すべてのタンパク質は、メーカーの説明書に従い、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィのプロトコールを用いて精製される（プロテインＡアフィニティ樹脂としてＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる）。プロテインＡアフィニティ工程を用いて、回収された細胞培養液から抗体を選択的におよび効率的に結合させる。これにより、９５％を超える不純物を一回の工程で除去し、高い収率と高いスループットを得ることができる。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製された物質を濃縮し、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＰＢＳへと透析される（両方ともメーカーの説明書に従う）。
実施例Ａ−４：発現された抗体の生物物理的特徴
Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、発現された抗体の分子量を評価し、抗体が正確に形成またはアセンブリされているかどうかを測定する。抗体（各々、２μｇ）を、非還元条件下、または還元条件下のいずれかで、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに泳動させ、クマシンブリリアントブルー染色により可視化する。
ＯＡ−５Ｄ５は、安定的トランスフェクションを用いて発現され、上述のように精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて可視化された。図３は、還元条件下および非還元条件下での、５つの異なるクローン由来のＯＡ−５Ｄ５の結果を示す。非還元条件下では、すべてのＯＡ−５Ｄ５クローンが、およそ１００キロダルトン（適切に結合された一価抗体に相当する）の分子量のバンドを有することが観察された。また、ＯＡ−５Ｄ５クローンは、およそ２５キロダルトンのバンドも示し、これは、過剰な軽鎖またはＦｃドメインに相当する可能性がある。還元条件下では、すべてのＯＡ−５Ｄ５クローンが、およそ２５と５０キロダルトンの２つのバンドを示し、これは、ＯＡ−５Ｄ５の軽鎖およびＦｃドメイン（２５ｋＤａ）および重鎖（５０ｋＤａ）に相当する可能性がある。
Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３は、安定的トランスフェクションを用いて発現され、上述のように精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて可視化された。図４は、還元条件下または非還元条件下でのＡｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３に対する結果を示す。両条件下において、Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３は、予想された分子量に泳動されたことが観察された。非還元条件下では、Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３は、およそ１２５キロダルトンの分子量を有する大きな１つのバンドを有することが観察され、これは、適切に結合された抗体軽鎖と重鎖に相当する。非還元条件下では、およそ２５および１００キロダルトンの２つのバンドが観察され、これは、抗体の軽鎖と重鎖に相当する。
Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィを用いたモノマー割合の測定
サイズ排除クロマトグラフィを用いて、凝集物の存在または抗体断片の存在を解析することにより、発現された抗体の純度を評価しても良い。抗体単量体の割合を評価するために、５０μｇの試料を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（＋３００ｍＭ ＮａＣｌ）を泳動緩衝液として用いて、ＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ３０００ゲルカラム（４．６ｍｍＩＤｘ３０ｃｍ；Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））上に注入する。全ての測定は、オートサンプラー、バイナリーポンプ、およびダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣで行われる。単量体の割合は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアにおいてデータを分析することにより測定される。通常、全ての試料は、プロテインＡ精製のみが行われ、１ｘＰＢＳ中で５ｍｇ／ｍＬの濃度にある。
Ａｂ＃１、Ａｂ＃２、Ａｂ＃３、Ａｂ＃４、Ａｂ＃５、Ａｂ＃６、Ａｂ＃７、Ａｂ＃８、Ａｂ＃９、Ａｂ＃１０、Ａｂ＃１１、Ａｂ＃１２、およびＡｂ＃１３は、一過性トランスフェクションを用いて発現され、上述のように精製され、および、ＯＡ−５Ｄ５は、安定的トランスフェクションにより発現され、上述のように精製された。全ての分子がサイズ排除クロマトグラフィを介して分析された。プロテインＡ精製抗体に対する、モノマー特性の近似割合に関するデータは、以下の表１に示す。
実施例５：組換えｃ−ＭｅｔおよびＥｐＣＡＭに対する抗体の結合親和性
たとえば、分子標的ｃ−ＭｅｔおよびＥｐＣＡＭに対する抗体の結合速度、解離速度、および結合親和性を測定するための動的アッセイは、メーカーの説明書に従い、Ｏｃｔｅｔプラットフォーム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて測定されても良い。必要とされる材料は以下である：
９６ウェルの黒い平底ポリプロピレンマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ ＃６５５２０９）
Ｏｃｔｅｔ機器およびソフトウェア（バージョン３）
プロテインＡセンサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，＃１８−５０１０）
１ｘＰＢＳ
組換えポリヒスチジンタグ化ｃ−Ｍｅｔ
組換えポリヒスチジンタグ化ＥｐＣＡＭ−Ｆｃ
Ｏｃｔｅｔ分析に関しては、全ての試薬および試料を室温に戻しておく。プロテインＡセンサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，＃１８−５０１０）を１ｘＰＢＳ中で水和させる。分析工程は、以下を含む：１〜２分間、１ｘＰＢＳ中で平衡化し、４分間、抗体（濃度は、１ｘＰＢＳ中に５０μｇ／ｍＬ）をローディングし、１〜２分間、ベースラインを安定化させ、４分間、抗体：抗原を結合させ、そして、４分間、抗体：抗原を解離させる。全体を通して１ｘＰＢＳをマトリクスとして使用する。データは、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて分析、処理し、１：１の結合モデルにフィットさせ、動態パラメータ（Ｋｄ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）を決定する。
表Ａ−２に、Ａｂ＃１、Ａｂ＃２、Ａｂ＃３、Ａｂ＃４、Ａｂ＃５、Ａｂ＃６、Ａｂ＃７、Ａｂ＃８、Ａｂ＃９、Ａｂ＃１０、Ａｂ＃１１、Ａｂ＃１２、およびＡｂ＃１３に対して測定された、おおよそのＥｐＣＡＭ結合親和性および解離速度を示す。
表Ａ−３に、Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３に対する繰り返し分析を示す。繰り返し実験に関し、Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３に対するＫｄおよびＫｄｉｓｓの値は、実質的に、最初の実験でＡｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３に対して測定されたものと同等である。
表Ａ−４は、Ａｂ＃５およびＡｂ＃７に対して測定された大よそのｃ−Ｍｅｔ結合親和性および解離速度である。
実施例Ａ−６：プレートベースの二重特異性抗体結合アッセイ
本明細書に開示される抗体は、ＥｐＣＡＭとｃ−Ｍｅｔの両方に同時に結合するよう設計されている。プレートベースのサンドイッチ型アッセイを用いて、抗体の共結合を示しても良い。アッセイは以下のように行う。Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃１５０４１）を、ＰＢＳに溶解した２μｇ／ｍｌのｃＭｅｔ−Ｆｃ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ） ５０μＬを用いてコートし、４℃で一晩インキュベートする。翌日、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いてプレートを洗浄し、１００μＬのＰｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃３７５７２）を用いて室温で１時間ブロッキングし、再度、ＰＢＳ−Ｔで洗浄する。プレートは次に、１００μＬのＰＢＳ−Ｔ＋１０％ＦＢＳに溶解した抗体（最も高い抗体濃度が５００ｎＭで、それに続く１０の３倍希釈、および、バックグラウンド差引のための１つのブランクウェル）を用いて室温で２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔに溶解した５０μｌのＥｐＣＡＭ−Ｆｃ−Ｈｉｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（１μｇ／ｍｌ）を添加し、室温で１時間置く。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、５０μｌの抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ、カタログ＃ａｂ１１８７；ＰＢＳ−Ｔ中に１：２０，０００）を加え、室温で１時間、インキュベート（覆う）する。再度、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで、１００μｌの３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃７００４）を加え、室温で５〜１５分、インキュベートする。基質反応は、１００μｌの停止溶液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃７００２）で停止する。ウェルの吸光度を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍで計測し、および、得られたデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を用いて分析およびプロットする。
上述の方法を用いて、ｃ−ＭｅｔおよびＥｐＣＡＭの両方に同時に結合する能力に関し、ＯＡ−５Ｄ５、Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３を評価した。アッセイの代表的な結果を図２２に示す。検証された３つの二重特異性抗体は、吸光度において用量依存性の増加を示し、このことから、ｃ−ＭｅｔおよびＥｐＣＡＭの両方に結合する能力が確認された一方で、一特異性対照抗体は、本アッセイにおいて有意なシグナルを示さなかった。
実施例Ａ−７：ｃ−ＭｅｔおよびＥｐＣＡＭの細胞表面発現に対する定量的フローサイトメトリー評価
たとえば、ｃＭｅｔおよびＥｐＣＡＭレベル等の細胞表面発現の測定に対し、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒキット（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた定量的フローサイトメトリーを行う。
細胞は、標準的な細胞培養培地（１０％ＦＢＳ含有）を用いて対数増殖期に増殖させ、実験を開始する前に少なくとも２回、継代する。実験当日、細胞を顕微鏡下で視覚評価し、６０〜８０％のコンフルエンスにあることを確認する。２０μｌのトリプシンを加えることにより細胞を培養プレートから剥し、細胞の大多数が剥がれた時点（顕微鏡により視覚的に評価）で、１０％ＦＢＳを含有する細胞培養培地を用いてトリプシンを不活化する。細胞を５００ｇで遠心し、フローサイトメトリー緩衝液（２％ＦＢＳ＋０．１％のアジ化ナトリウム（ＰＢＳに溶解））に再懸濁し、９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルの密度で播種する。
別々の９６ウェルプレートにおいて、２滴のＱｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ抗マウスＩｇＧコートビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ＃８１５）、または、抗ヒトＩｇＧコートビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ＃８１６）をウェルごとに添加する。各ビーズキットは、５つのビーズ群（１つのブランクと、Ｆｃ特異的捕捉抗体のレベルが増加している４つのビーズ）を含有している。各コート群は、適切な種類のモノクローナル抗体の特定の数に結合し（「ＡＢＣ」値）、それゆえに、細胞表面タンパク質を標識するために用いられたものと同じモノクローナル抗体にビーズが飽和するまで標識された場合には、各コート群は定量のための標準曲線として用いることができる。
ＡＰＣが結合した抗ｃＭｅｔヒト抗体（ｈ２２４Ｇ１１−ＴＨ７クローン）または抗ＥｐＣＡＭマウス抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃３４７２００）を細胞とビーズに添加する（８０μｌのフローサイトメトリー緩衝液に対し、２００ｎＭの抗体濃度）。抗体を４℃で３０分間、インキュベートする。プレートを遠心し、氷冷したフローサイトメトリー緩衝液１００μＬを用いて２度洗浄する。２度目の洗浄後、細胞とビーズを遠心し、１００μＬの氷冷したフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁し、適切なフローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ）の蛍光フィルターを用いて読み取る。ビーズ群に対するチャンネル値を、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒキットに備えられているビーズロット特異的ＱｕｉｃｋＣａｌテンプレートに記録する。蛍光シグナルとビーズのＡＢＣ値とを相関させる回帰を実行する。この標準曲線を用いて染色細胞試料にＡＢＣ値を割り当てる。もし一価抗体−細胞表面受容体の結合が推測される場合、ＡＢＣ値は、表面受容体の数と等しくなる。
表５に、上述のプロトコールを用いて測定された、細胞株におけるＥｐＣＡＭおよびｃ−Ｍｅｔ細胞表面発現レベルを列記する。Ｕ−８７ＭＧおよびＡ５４９細胞は、ＥｐＣＡＭ発現レベルが低く、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＨＣＣ８２７、およびＮＣＩ−Ｈ２１７０はＥｐＣＡＭ発現レベルが高い。
実施例Ａ−８：基礎的なｃ−Ｍｅｔ経路活性化の評価
Ａ）抗体誘導性のｃ−Ｍｅｔ介在性細胞シグナル伝達の活性化
ｃ−Ｍｅｔ経路シグナル伝達の活性化は、ｃ−Ｍｅｔに対する二価性抗体で観測可能な特徴である。ｃ−Ｍｅｔ介在性シグナル伝達を活性化する抗体の能力は、原則的に、以下の通りにホスホ−ｃ−Ｍｅｔ（ｐＭｅｔ）酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）を用いて評価することができる。
実験の１日目、活性のある中間対数期（６０〜８０％のコンフルエンス）のＡ５４９細胞を、ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ含有、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２ｍＭのｌ−グルタミン補充）を用いて９６ウェルプレートに、およそ２０，０００／ウェルで播種する。２日目、培地を吸引し、低血清ＲＰＭＩ培地（０．５％ＦＢＳ含有、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびｌ−グルタミン補充）と置き換え、一晩、細胞をインキュベートする。３日目、ＨＧＦ（陽性対照として使用、開始濃度は４０ｎＭで、３倍連続希釈）および抗体（開始濃度は３００ｎＭで３倍連続希釈）の両方の連続希釈を、低血清培地を用いて準備する。次いで、各連続希釈濃度から１００μＬをプレートのウェルに添加し、３７℃、１０分間細胞をインキュベートする。次いで、細胞を２度、冷却ＰＢＳで洗浄し、Ｍ−ＰＥＲ溶液（カタログ＃ＰＩ７８５０５， ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋プロテアーゼとホスファターゼ阻害物質（ＥＡＳＹパックに備えられているｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔ、カタログ＃４６９３１２４００１， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ； ＰｈｏｓＳＴＯＰ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ、カタログ＃４９０６８３７００１， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ）の５０μＬ／ウェル中で細胞を溶解させる。細胞溶解物は、溶解後、およそ５分以内に−８０℃で保存する。
ｐＭｅｔシグナルの測定に関しては、ＥＬＩＳＡキットを用いる（Ｈｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＧＦ Ｒ／ｃ−ＭＥＴ ＤｕｏＳｅｔ ＩＣ Ｅｃｏｎｏｍｙ Ｐａｃｋ、カタログ＃ＤＹＣ２４８０Ｅ， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。３日目、捕捉抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を最終濃度４μｇ／ｍｌ（２０μｌ／ウェルのＰＢＳに溶解）で用いて、３８４−ｗｅｌｌ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｌａｃｋ Ｓｏｌｉｄプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をコートする。プレートは一晩、室温に置く。４日目、−８０℃の溶解物を室温で溶かす。３８４ウェルプレートは、ＰＢＳに溶解した２％ＢＳＡ溶液を５０μＬ／ウェルで１時間室温においてブロッキングする。２つの溶解物を１つのウェルにプールし、２％ ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／２５％Ｍ−ＰＥＲ／ＰＢＳの溶液で２倍希釈する。組換えｐＭｅｔの標準曲線は、２％ ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／２５％Ｍ−ＰＥＲ／ＰＢＳで１０の２倍連続希釈（開始濃度は４０ｎＭ）を作製することにより準備する。緩衝液のみを含有するウェルは、プレートのバックグラウンドシグナルに対する対照として用いる。ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳに溶解した０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０の溶液を用いて洗浄し、２０μＬの溶解物または組換え標準曲線は、二重で、９６ウェルプレートから３８４ウェルプレートへと移す。プレートを、２時間、室温でインキュベートし、ＰＢＳに溶解した０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０の溶液を用いて洗浄する。次に、セイヨウワサビペルオキシダーゼが結合した一次検出抗体 ２０μＬをウェルごとにプレートへ添加し、２時間室温でインキュベートする。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （カタログ＃ＰＩ３７０６９， ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）をメーカーの指示書に従い添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取る。データ分析に関しては、二つの試料の平均をとり、エラーバーを用いて２つの複製物間の標準偏差を表す。データはバックグラウンドを差し引き、組換え標準曲線に対して回帰させる。実質的にＭｅｔ刺激曲線および対応するＥＣ５０値は、４パラメーターのロジスティック方程式へのデータ回帰を介したＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を用いて算出する。
上述のプロトコールを用いて、ホスホ−Ｍｅｔ（ｐＭｅｔ）を産生するＭｅｔの抗体誘導性の活性化を、二価ＩｇＧに対して検証した。この実験の結果は図６に示す。ＨＧＦでの処置により、予想されたとおり、強いｐＭｅｔシグナルが生じた。二価ＩｇＧでの処置もまた、天然型ｃ−ＭｅｔリガンドＨＧＦのおよそ半分のレベルにまでｃ−Ｍｅｔリン酸化をもたらした。対照的に、ＯＡ−５Ｄ５の一価抗体はｃ−Ｍｅｔリン酸化をもたらさなかった。
Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、Ａｂ＃１３、およびＯＡ−５Ｄ５は、ｃ−Ｍｅｔリン酸化をもたらす能力に関し、原則的に上記の分析のように検証した。この実験の結果は図７に示す。再度、ＨＧＦ処置により、強いｐＭｅｔ用量応答性のシグナルがもたらされた一方、ＯＡ−５Ｄ５の一価抗体はｃ−Ｍｅｔリン酸化をもたらさなかった。二重特異性抗体の処置は、ｃ−Ｍｅｔリン酸化をもたらさなかった。
Ｂ）抗体誘導性の細胞増殖活性化
ｃ−Ｍｅｔ受容体を標的とする抗体は多くの場合、ＤＮＡ合成および細胞増殖を刺激する能力を有しており、これは、ヒトの悪性腫瘍を標的とする薬剤開発にとって有害なものである。
本抗体の、細胞増殖を誘導する能力について測定するために、０．５％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ）を５０μｌ用いて、細胞を３８４ウェルプレートに最初に播種する。Ａ５４９細胞は、８００細胞／ウェルで播種し、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞は２５００細胞／ウェルで播種し、および、ＨＣＣ８２７細胞は１５００細胞／ウェルで播種する。プレートを一晩インキュベートした後、培地を吸引し、０．５％ＦＢＳおよび、２．５ｎＭのＨＧＦ単独（陽性対照）または５００ｎＭの対象抗体のいずれかを含有するＲＰＭＩ培地１６４０ ５０μｌと置き換える。次いで、プレートを３７℃でインキュベートし、Ｉｎｃｕｃｙｔｅリアルタイムイメージングシステム（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞増殖をモニターする。プレートウェルの画像は、４日間、６時間毎に位相差顕微鏡を用いて記録し、細胞のコンフルエンス（パーセンテージとして報告される）を、メーカーのソフトウェアを用いて算出する。コンフルエンスのデータは、作図および可視化のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）へと転送する。
上述の実験プロトコールを用いて、Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３を、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４４１、およびＨＣＣ８２７細胞において検証した。これら実験から得られたデータは、図８Ａ（Ａ５４９細胞）、図８Ｂ（ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞）および図８Ｃ（ＨＣＣ８２７細胞）にプロットされている。示されている各データポイントは、４つの複製プレートウェルにおける、細胞が中間コンフルエンス状態であることを表す。これら細胞株のすべてに対し、ＨＧＦ刺激により、低血清対照と比較し、細胞のコンフルエンス、すなわち、細胞増殖が増加した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞およびＨＣＣ８２７細胞においては、検証された二重特異性抗体は、細胞コンフルエンスに対し、低血清対照よりも大きな影響をもたらさなかった。Ａ５４９細胞においては、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３は、低血清対照を超える細胞コンフルエンス増殖を示さなかったが、Ａｂ＃５は、低血清対照を超える細胞コンフルエンスを多少増加させた。
実施例Ａ−９：ＨＧＦ誘導性ｃ−Ｍｅｔ経路活性化阻害の評価
Ａ）抗体介在型のＨＧＦ誘導性細胞シグナル伝達の阻害
ＨＧＦ誘導性の、ｃ−Ｍｅｔ介在性シグナル伝達を阻害する抗体の能力について、ホスホ−ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）ＥＬＩＳＡを用いて、Ａ５４９細胞およびＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞において評価しても良い。
実験の１日目、活性のある中間対数期（６０〜８０％のコンフルエンス）の細胞を、ＲＰＭＩ培地（＋１０％ＦＢＳ含有＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋２ｍＭのｌ−グルタミン）を用いて９６ウェルプレートに、およそ２０，０００／ウェルで播種する。２日目、培地を吸引し、低血清ＲＰＭＩ培地（０．５％ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋ｌ−グルタミン補充）と置き換え、一晩、細胞をインキュベートする。３日目、抗体（開始濃度は３００ｎＭで３倍連続希釈）の連続希釈を、低血清培地を用いて準備する。次いで、各連続希釈濃度から１００μＬをプレートのウェルに添加し、３７℃、２時間細胞をインキュベートする。次に、抗体含有培地を吸引し、さらに１ｎＭのＨＧＦを含有する抗体含有培地１００μＬと置き換える。細胞を、ＨＧＦ含有培地と１０分間、３７℃でインキュベートさせる。次いで、細胞を２度、冷却ＰＢＳで洗浄し、Ｍ−ＰＥＲ溶液（カタログ＃ＰＩ７８５０５， ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋プロテアーゼとホスファターゼ阻害物質（ＥＡＳＹパックに備えられているｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔ、カタログ＃４６９３１２４００１， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ； ＰｈｏｓＳＴＯＰ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ、カタログ＃４９０６８３７００１， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ）の５０μＬ／ウェル中で細胞を溶解させる。細胞溶解物は、溶解後、およそ５分以内に−８０℃で保存する。
ＡＫＴシグナルの測定に関しては、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。捕捉抗ＡＫＴ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃０５−５９１Ｍ）を最終濃度４μｇ／ｍｌ（２０μｌ／ウェルのＰＢＳに溶解）で用いて、３８４−ｗｅｌｌ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｌａｃｋ Ｓｏｌｉｄプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をコートする。プレートは一晩、室温に置く。４日目、−８０℃の溶解物を室温で溶かす。３８４ウェルプレートは、ＰＢＳに溶解した２％ＢＳＡ溶液を５０μＬ／ウェルで１時間室温においてブロッキングする。２つの溶解物を１つのウェルにプールし、２％ ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／２５％Ｍ−ＰＥＲ／ＰＢＳの溶液で２倍希釈する。組換えｐＡＫＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃１４−２７６）の標準曲線は、２％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／２５％Ｍ−ＰＥＲ／ＰＢＳで１０の２倍連続希釈（開始濃度は６０ｎＭ）を作製することにより準備する。緩衝液のみを含有するウェルは、プレートのバックグラウンドシグナルに対する対照として用いる。ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳに溶解した０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０の溶液を用いて洗浄し、２０μＬの溶解物または組換え標準曲線は、二重で、９６ウェルプレートから３８４ウェルプレートへと移す。プレートを、２時間、室温でインキュベートし、ＰＢＳに溶解した０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０の溶液を用いて洗浄する。次に、ビオチニル化二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ＃５１０２）の１：１０００希釈を２０μＬ、ウェルごとにＥＬＩＳＡプレートへ添加し、１時間室温でインキュベートする。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳに溶解した０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０の溶液を用いて洗浄する。希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジンを２０μＬ、ＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で３０分間、インキュベートする。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （カタログ＃ＰＩ３７０６９，ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）をメーカーの指示書に従い添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取る。データ分析に関しては、二つの試料の平均をとり、エラーバーを用いて２つの複製物間の標準偏差を表す。データはバックグラウンドを差し引き、組換え標準曲線に対して回帰させる。実質的にｐＡＫＴ刺激曲線および対応するＥＣ５０値は、４パラメーターのロジスティック方程式へのデータ回帰を介したＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を用いて算出する。
上述の実験プロトコールを用いて、Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、Ａｂ＃１３およびＯＡ−５Ｄ５の、ＨＧＦ誘導性ｐＡＫＴを阻害する能力を、Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞の両方で検証した。これら実験から得られた典型的なデータは、図９に示す。低レベルのＥｐＣＡＭ発現であるＡ５４９細胞においては、Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３は、ＯＡ−５Ｄ５と比較して、実質的に同等の阻害効果を有していた。高レベルのＥｐＣＡＭ発現を有するＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞においては、Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３は、ＯＡ−５Ｄ５と比較して、ｐＡＫＴ ＩＣ５０においておよそ１０倍〜２０倍の改善を示した。
Ｂ）抗体介在性のＨＧＦ誘導性細胞増殖の阻害
ＨＧＦ誘導性の、ｃ−Ｍｅｔ介在性細胞増殖を阻害する抗体の能力を、たとえば、以下のようにＵ−８７ＭＧ、Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において評価しても良い。
抗体の、ＨＧＦ誘導性ｃ−Ｍｅｔ介在性細胞増殖を阻害する能力を測定するために、細胞は、０．５％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ）を５０μｌ用いて、３８４ウェルプレートに最初に播種する。Ａ５４９細胞は、８００細胞／ウェルで播種し、Ｕ−８７ＭＧ細胞は１５００細胞／ウェルで播種し、および、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞は３０００細胞／ウェルで播種する。
プレートを一晩インキュベートした後、培地を吸引し、０．５％ＦＢＳおよび、２．５ｎＭのＨＧＦ単独（陽性対照）または５００ｎＭの対象抗体のいずれかを含有するＲＰＭＩ培地１６４０ ５０μｌと置き換える。次いで、プレートを３７℃でインキュベートし、Ｉｎｃｕｃｙｔｅリアルタイムイメージングシステム（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞増殖をモニターする。プレートウェルの画像は、４日間、６時間毎に位相差顕微鏡を用いて記録し、細胞のコンフルエンス（パーセンテージとして報告される）を、メーカーのソフトウェアを用いて算出する。コンフルエンスのデータは、作図および可視化のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）へと転送する。
Ａ５４９細胞およびＮＣＩ−Ｈ４４１細胞に関しては、プレートを一晩インキュベートした後、培地を吸引し、０．５％ＦＢＳのみを含有するＲＰＭＩ培地１６４０（陰性対照）、０．５％ＦＢＳ＋０．６２５ｎＭ ＨＧＦを含有するＲＰＭＩ培地１６４０（陽性対照）、または、０．５％ ＦＢＳ＋０．６２５ｎＭ ＨＧＦと対象の抗体５００ｎＭを含有するＲＰＭＩ培地１６４０の５０μｌで置き換える
オートクラインＨＧＦを分泌するＵ８７−ＭＧ細胞に関しては、プレートを一晩インキュベートした後、培地を吸引し、０．５％ＦＢＳのみ（陰性対照）、または、０．５％ＦＢＳ＋５００ｎＭの対象断片のいずれかを含有するＲＰＭＩ培地１６４０の５０μｌで置き換える。
次いで、プレートを３７℃でインキュベートし、Ｉｎｃｕｃｙｔｅリアルタイムイメージングシステム（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞増殖をモニターする。プレートウェルの画像は、４日間、６時間毎に位相差顕微鏡を用いて記録し、細胞のコンフルエンス（パーセンテージとして報告される）を、メーカーのソフトウェアを用いて算出する。コンフルエンスのデータは、作図および可視化のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）へと転送する。
上述の実験プロトコールを用いて、Ａｂ＃５およびＯＡ−５Ｄ５を、Ｕ−８７ＭＧおよびＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を用いて検証した。代表的な実験から得た結果を図１０に示す。示されている各データポイントは、４つの複製プレートウェルにおける、細胞が中間コンフルエンス状態であることを表す。ＥｐＣＡＭ発現が低レベルであるＵ−８７ＭＧ細胞においては、Ａｂ＃５およびＯＡ−５Ｄ５の両方が実質的に等しく細胞コンフルエンスを減少させることができた。ＥｐＣＡＭ発現が高レベルであるＮＣＩ−Ｈ４４１細胞においては、Ａｂ＃５はＨＧＦ誘導性細胞コンフルエンスを、基準の０．５％血清条件よりも下に減少させることができたが、ＯＡ−５Ｄ５は出来なかった。
上述の実験プロトコールを用いて、Ａｂ＃７およびＯＡ−５Ｄ５を、ＵＡ５４９細胞およびＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を用いて検証した。代表的な実験から得た結果を図１１に示す。示されている各データポイントは、４つの複製プレートウェルにおける、細胞が中間コンフルエンス状態であることを表す。ＥｐＣＡＭ発現が低レベルであるＡ５４９細胞においては、Ａｂ＃７およびＯＡ−５Ｄ５の両方が、０．５％血清対照のレベルにまでＨＧＦ誘導性細胞コンフルエンスを阻害することができた。ＥｐＣＡＭ発現が高レベルであるＮＣＩ−Ｈ４４１細胞においては、Ａｂ＃５は細胞コンフルエンスを基準の０．５％血清対照近くまで減少させることができたが、ＯＡ−５Ｄ５による、細胞コンフルエンス阻害の能力は低かった。
実施例Ａ−１０：抗体誘導性ｃ−Ｍｅｔ分解の評価
ｃ−Ｍｅｔ受容体の分解を誘導する抗体の能力を評価するために、Ａ５４９細胞を７，０００個、またはＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞を１５，０００個、ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳを含有し、ペニシリン／ストレプトマイシンとｌ−グルタミンを補充）を用いて、９６ウェル平底プレートに播種する。翌日、培地を低血清ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）（０．５％ＦＢＳを含有し、ペニシリン／ストレプトマイシンとｌ−グルタミンを補充）１００μｌと置き換える。一晩インキュベートした後、低血清培地を吸引し、対象抗体をさらに含有する低血清培地と置き換える。細胞を、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。２４時間のインキュベーションが完了した時点で、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害物質（ＥＡＳＹパックに備わっているｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔ、カタログ＃０４６９３１５９００１， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ；ＰｈｏｓＳＴＯＰ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ、カタログ＃４９０６８３７００１、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ）を含有するＭ−ＰＥＲ（哺乳類タンパク質抽出試薬；Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃７８５０５）を用いて溶解する。
細胞溶解物を、メーカーの説明書に従い、総ｃ−Ｍｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＫＨＯ０２５１）により二重で評価する。シグナルは、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出した。各細胞株に対し、総ｃ−Ｍｅｔ発現を、阻害物質の無い培地対照で検出された量に対して標準化し、細胞株間での比較を行った。
上述の方法を用いて、ＯＡ−５Ｄ５およびＡｂ＃５の、ｃ−Ｍｅｔ受容体を低下させる能力について、Ａ５４９細胞およびＨ２１７０細胞において検証した。得られた結果を図１２に示す。低ＥｐＣＡＭ Ａ５４９細胞においては、ＯＡ−５Ｄ５もＡｂ＃５も、２０％を超えるｃ−Ｍｅｔの低下を誘導しなかった。高ＥｐＣＡＭ ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞においては、ＯＡ−５Ｄ５はおよそ３０％までｃ−Ｍｅｔの発現を減少させ、一方で、Ａｂ＃５は、およそ６５％までｃ−Ｍｅｔの発現を減少させた。
実施例Ａ−１１：マウスにおける抗体の薬物動態特性
抗体の最終排出半減期を測定するために、Ｎｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、静脈内ボーラス投与により抗体を投与し、０．２５、１、４、８、２４、４８、７２、９６、１４４、１９２、２４０、および２８８時間で、血液を採取した。時点毎に３匹のマウスから採血し（伏在静脈または末端出血のいずれかを用いて）、個々の動物から血清を採取した（１０〜２００μｌ）血清試料分析に関し、ＰＢＳに溶解したヤギ抗Ｆｃ抗体（１μｇ／ｍｌ）（Ａｂｃａｍ、カタログ＃ａｂ９８６１６）の５０μｌを用いて、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ ９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）をコートし、一晩、４℃でインキュベートする。翌日、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いてプレートを洗浄し、１時間、室温で１００μｌのＰｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃３７５７２）を用いてブロッキングし、再度、ＰＢＳ−Ｔで洗浄する。次いで、プレートを室温で２時間、１００μＬの試料および標準曲線と共にインキュベートする。標準曲線に関しては、対象の抗体を、ＰＢＳ−Ｔで１２μｇ／ｍｌの当初濃度にまで希釈し、さらに１０の３倍希釈および最終ウェルブランクを作製する。血清試料は、ＰＢＳ−Ｔで１：５０に希釈し、さらに１０の３倍希釈、および最終ウェルブランクを作製する。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、１００μｌの抗Ｆｃ−ＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ＃ａｂ９９７５９；ＰＢＳ−Ｔ中で１：２０，０００）を添加し、室温で１時間（覆って）インキュベートする。再度、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで、１００μｌの３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃７００４）を加え、室温で５〜１５分間インキュベートする。基質反応は、１００μｌの停止溶液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃７００２）で停止する。ウェルの吸光度を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍで計測し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ．を用いて戻り算出した値を作製する。薬物動態曲線へのフィッティングは、ＭＡＴＬＡＢ（Ｔｈｅ ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）において、２コンパートメント二重指数関数モデルの非線形回帰分析を用いて行った：
濃度＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔ
非線形回帰に関しては、データは、比例的誤差モデルに従うと仮定され、ゆえに、回帰に関して、モデルおよびデータは、データの大きさの逆数を用いて重みづけされる。最終排出半減期は以下のように算出される：
Ａｂ＃５、Ａｂ＃７、およびＡｂ＃１３は、上述の方法を用いて評価され、得られた平均および標準偏差（各時点に対する６つのデータポイントは、３匹のマウスと、１匹のマウスごとに２つの複製ウェルを表す）を、図１３Ａ（Ａｂ＃５）、図１３Ｂ（Ａｂ＃７）、および図１３Ｃ（Ａｂ＃１３）に示す。データに適合させたモデルは実線で示されている。最終半減期データは、以下の表６に示す。
実施例Ａ−１２：ヌードマウスへと移植されたＵ−８７ＭＧ腫瘍に対する抗体活性の評価
Ａｂ＃７およびＯＡ−５Ｄ５のｉｎ ｖｉｖｏ活性を以下のように評価する。６〜７週齢のメスＮｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、２００μｌのＰＢＳの注射容量で、５ｘ１０６Ｕ−８７ＭＧ細胞／マウス（ＡＴＣＣ）を皮下注射する。注射７日後に、当初腫瘍容積を、以下の式を用いて測定する：（π／６）＊Ｌ＊Ｗ２。マウスを１０群に分け、続いて、３日毎に腹腔内注射によりＰＢＳ対照、二重特異性抗体、またはＯＡ−５Ｄ５を用いて処置する。二重特異性抗体の投与量は、体重に基づき、およそ３０ｍｇ／ｋｇであり、ＯＡ−５Ｄ５の投与量は、およそ２４ｍｇ／ｋｇ（等モルレベルである）であった。腫瘍測定は、実験期間を通して、週に２度行われる。腫瘍サイズのプロットデータは、平均と、各測定に対する平均の標準誤差を表す。
上述のプロトコールを用いた代表的な実験データを図３１に示す。Ａｂ＃７およびＯＡ−５Ｄ５の両方とも、皮下移植されたＵ−８７ＭＧ腫瘍を同程度にまで退縮させることができた。
実施例Ａ−１３：さらなる実施態様の配列情報
アミノ酸（ａａ）配列およびヌクレオチド（ｎｔ）配列
下線：ＣＤＲ
太字の配列：安定化変異
実施例Ａ−１４：ＴＦｃＢＡ
ある実施態様において、二重特異性抗体（抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥｐＣＡＭ）が提示される。そのような実施態様において、二重特異性抗体は、ｃ−Ｍｅｔ二特異的な結合部位があるＦａｂ部分、および、ＥｐＣＡＭ二特異的な結合部位があるｓｃＦｖ部分、を含有する。
特定の実施態様において、我々は、ｓｃＦｖにある安定化特性を導入した：（１）ＣＤＲＬ１から潜在的な脱アミド化（ＮＧ）部位を除去し、ＤＧで置き換えた；（２）ＣＤＲＬ２から潜在的なメチオニン酸化部位を除去し、ロイシンで置き換えた；（３）ジスルフィド架橋を導入し、ＶＨ−ＶＬ接合面をさらに安定化させた。
さらなる実施例：Ｂ項
実施例Ｂ−１：二重特異性抗体抗原の細胞表面発現の定量的フローサイトメトリー評価
たとえば、ｃＭｅｔ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４４、およびＣＥＡのレベル等の細胞表面発現の測定のために、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒキット（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた定量的フローサイトメトリーを行う。
細胞を、１０％ＦＢＳを含有する標準的な細胞培養培地を用いて指数関数増殖期に増殖させ、実験を開始する前に少なくとも２回継代する。実験の日に、細胞を顕微鏡下で視覚的に評価し、６０〜８０％のコンフルエンスにあることを確認する。０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を加えることにより細胞を培養プレートから剥し、細胞の大多数が剥がれた時点（顕微鏡により視覚的に評価）で、１０％ＦＢＳを含有する細胞培養培地を用いてトリプシンを不活化する。細胞を５００ｇで遠心し、フローサイトメトリー緩衝液（２％ＦＢＳ＋０．１％のアジ化ナトリウム（ＰＢＳに溶解））に再懸濁し、９６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃６２４０６−０１５）に５０，０００細胞／ウェルの密度で播種する。
別々の９６ウェルプレートにおいて、２滴のＱｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ抗マウスＩｇＧコートビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ＃８１５）、または、抗ヒトＩｇＧコートビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ＃８１６）をウェルごとに添加する。各ビーズキットは、５つのビーズ群（１つのブランクと、Ｆｃ特異的捕捉抗体のレベルが増加している４つのビーズ）を含有している。各コート群は、適切な種類のモノクローナル抗体の特定の数に結合し（「ＡＢＣ」値）、それゆえ、細胞表面タンパク質を標識するために用いられたものと同じモノクローナル抗体にビーズが飽和するまで標識された場合に、定量のための標準曲線として用いることができる。
細胞表面標的に対する抗体を、表Ｂ−１に示す。ｃ−Ｍｅｔ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＣＥＡに対する抗体については、メーカーの説明書に従い、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃Ａ−２０００６）が結合されている。ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４４に対する抗体は、前もってＡＰＣが結合したものが入手可能である。
適切なフルオロフォア結合抗体を細胞およびビーズに添加する（８０μｌのフローサイトメトリー緩衝液中に２００ｎＭの抗体濃度）。抗体を４℃で３０分間インキュベートする。プレートを遠心し、１００μＬの氷冷フローサイトメトリー緩衝液を用いて２回洗浄する。２度目の洗浄後、細胞とビーズを遠心し、１００μＬの氷冷したフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁し、適切なフローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ）の蛍光フィルターを用いて読み取る。ビーズ群に対するチャンネル値を、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒキットに備えられているビーズロット特異的ＱｕｉｃｋＣａｌテンプレートに記録する。蛍光シグナルとビーズのＡＢＣ値とを相関させる回帰を実行する。この標準曲線を用いて染色細胞試料にＡＢＣ値を割り当てる。もし一価抗体−細胞表面受容体の結合が推測される場合、ＡＢＣ値は、表面受容体の数と等しくなる。
表Ｂ−２に、上述のプロトコールを使用して測定された結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、胃癌、前立腺癌、および膵臓癌由来の細胞株のパネルにおける細胞表面発現のレベルを列記する。表Ｂ−３において、様々な細胞表面標的とｃ−Ｍｅｔの間の発現比率を列記する。ＥｐＣＡＭは、任意の測定標的の最も高いメジアン発現レベルを有し、また、ｃ−Ｍｅｔと比較しても最も高いメジアン発現比率を有していることから、ｃ−Ｍｅｔに結合する強力な二重特異性抗体に対する標的部分としてＥｐＣＡＭを選択することが支持される。
以下の２つの表において、腫瘍型は以下のとおりである：１＝結腸直腸、２＝卵巣、３＝非小細胞肺、４＝腎臓、５＝胸部、６＝グリオーマ、７＝三重陰性胸部、８＝胃、９＝扁平上皮、１０＝前立腺、および１１＝膵臓。示されている細胞株は、市販されている（たとえば、ＡＴＣＣ）。
実施例Ｂ−２：ヌードマウスへ移植されたＵ−８７ＭＧ腫瘍に対する抗体活性の用量応答性分析
異なる用量の抗体に対するＵ−８７ＭＧ腫瘍の応答を検証する実験を介して、Ａｂ＃７のｉｎ ｖｉｖｏ活性を、Ｕ−８７オートクラインＨＧＦモデルにおいてさらに検証しても良い。用量応答性評価は、実施例Ａ−１２に開示されるプロトコールに従い行うことができる（７日毎に薬物を投与することを除く）。以下の群を処置する：
（１）ＰＢＳ対照
（２）Ａｂ＃７、個々のマウスの体重に基づき、およそ２４ｍｇ／ｋｇ
（３）Ａｂ＃７、およそ１２ｍｇ／ｋｇ
（４）Ａｂ＃７、およそ４ｍｇ／ｋｇ
（５）Ａｂ＃７、およそ１ｍｇ／ｋｇ
上述のプロトコールを用いて行われた代表的な実験のデータを、図３２に示す。Ａｂ＃７を用いた処置により、皮下移植されたＵ−８７ＭＧ腫瘍に対し１ｍｇ／ｋｇの投与レベルで増殖停止をもたらし、４ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇおよび２４ｍｇ／ｋｇの投与レベルで腫瘍退縮をもたらした。１２ｍｇ／ｋｇと等しい、または１２ｍｇ／ｋｇよりも高い投与レベルを７日毎に与えることにより、本実験において、最も高い抗腫瘍活性が得られた。
実施例Ｂ−３：ヒトＨＧＦを分泌するＮＣＩ−Ｈ３５８細胞株変異体の作製（Ｈ３５８−ＨＧＦ細胞）
ヒトＨＧＦ導入遺伝子のＮＣＩ−Ｈ３５８肺癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５８０７）へのトランスフェクトは、レンチウイルス粒子（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ カタログ＃ＬＰ−Ａ０８２０＿Ｌｖ１０５−０２００）を用いて、以下のプロトコールに従い行われても良い。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充された標準的な細胞培養培地を用いて増殖させたＮＣＩ−Ｈ３５８細胞をトリプシン処理し、計数し、９６ウェルプレートに、１０，０００細胞／ウェルの密度で播種する（最終容積は１００μｌ）。３μｌのレンチウイルス粒子をウェルごとに添加する。プレートを２時間、３７℃、２０００ｒｐｍで遠心し、次いで、遠心機から取り出し、３７℃のインキュベーターに４日間置く。４日後、培地を吸引し、レンチウイルスの入っていない新しい増殖培地と交換する。さらに２４時間インキュベートした後、細胞をトリプシン処理し、２４ウェルプレートに移す。８０％コンフルエンスまで増殖した後、細胞を再度トリプシン処理し、６ウェルプレートに移す。８０％コンフルエンスまで増殖した後、培地を吸引し、ピューロマイシン選択抗生物質（最終濃度は１μｇ／ｍｌ）を含有する培地と交換する。細胞を再び８０％コンフルエンスになるまで選択培地中で増殖させ、その後、細胞をトリプシン処理し、増殖および後の実験のためにプールしておく。
実施例Ｂ−４：Ｈ３５８−ＨＧＦ細胞株におけるルミネックスベースのＨＧＦ分泌の定量
細胞からのヒトＨＧＦの分泌は、以下に記述するように、抗ＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ２９４）に連結された、ビーズベースのサンドイッチイムノアッセイシステム（ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ））を用いて測定されてもよい。ビーズの調製は、以下のように行われても良い。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ ＣＯＯＨビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ＃１７１−５０６０５２）を３０秒間ボルテックスし、次いで、浴槽型のソニケーションをさらに３０秒間行う。１００μｌのビーズをエッペンドルフチューブに置き、４分間、１２，０００ＲＰＭで遠心する。上清を除去した後、１００μｌのビーズ洗浄緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ、カタログ＃１７１−４０６００１）を添加する。エッペンドルフチューブに、ボルテックスおよびソニケーションを、それぞれ１０秒間行い、次いで、さらに１２，０００ＲＰＭで４分間遠心する。上清を除去した後、８０μｌのビーズ活性化緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ、カタログ＃１７１−４０６００１）中にビーズのペレットを再懸濁する。エッペンドルフチューブに、ボルテックスおよびソニケーションをそれぞれ３０秒間行う。
使用する直前に、ＥＤＣカルボキシル／アミン架橋剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃２２９８０）およびＳｕｌｆｏ−ＮＨＳエステル転換試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃２４５１０）の両方の５０ｍｇ／ｍｌ溶液を調製する。エッペンドルフチューブにＥＤＣ溶液１０μｌを加え、次いで、スルホ−ＮＨＳ溶液を１０μｌ加える。エッペンドルフチューブを３０秒間ボルテックスし、アルミニウムホイルでチューブを覆って遮光し、回転機でビーズを２０分間、室温で攪拌する。１５０μｌのＰＢＳを加え、１０秒間活性化ビーズをボルテックスし、次いで、４分間、１２，０００ＲＰＭで遠心する。上清を除去し、５００μｌのＰＢＳで２回洗浄する。１００μｌの抗体（１ｍｇ／ｍｌ）中で活性化ビーズを再懸濁し、次いで、２時間、室温で遮光しながら回転させる。磁石を用いてビーズを沈殿させることにより、ビーズを乱すことなく注意深く緩衝液を除去することができる。次に、ビーズを１ｍｌのＰＢＳ−ＴＢＮ（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０５％アジド、ｐＨ７．４）中で再懸濁することにより、使用するまで暗所にて４℃で保存することができる。
ビーズを使用する前に、４分間、１２，０００ｒｐｍで遠心する。上清を除去し、廃棄して、ＰＢＳで１回洗浄し、２５０μｌのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡをＰＢＳに溶解）と上清を置き換える。ビーズを１５秒間穏やかにボルテックスし、次いで、回転器を用いて遮光しながら室温で３０分間、攪拌する。組換えタンパク質（開始濃度は５ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ２９４）の２倍連続希釈を用いて、ＨＧＦに対する標準物を調製する。ビーズに組換え標準溶液および細胞株上清を加え、遮光した振とう器上にて、４℃で一晩インキュベートする。検出抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ２９４）をＰＢＳに溶解したストレプトアビジン−ＰＥ＋１％ＢＳＡで希釈し、０．００１ｍｇ／ｍｌのワーキング溶液を得る。磁石プレート上にて、４℃で５分間、ビーズを沈殿させる。しっかりと磁石上に試料を含有するプレートを固定し、シンクの中にプレートを逆さまにして入れ、穏やかにブロットし、過剰な水分を除去する。少しだけプレートを遠心し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを２００μｌ、各ウェルに加える。ビーズを遮光しながら１〜２分間、磁石上に沈殿させる。プレートを磁石にしっかりと固定し、シンクに逆さまにし、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを添加しながら、上述の洗浄工程を繰り返す（トータルで３回の洗浄）。検出抗体の調製済みワーキング溶液１００μｌをウェルごとに加える。遮光しながら１時間、穏やかに振とうする。検出抗体とのインキュベーションが完了した時点で、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて洗浄工程をトータルで３回繰り返す。１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ １００μｌ中に試料を再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＦｌｅｘＭＡＰ３Ｄプレートリーダーで読み取る。すべてのデータを、組換えタンパク質を用いて作製された標準曲線に回帰させ、次いで、細胞培養上清を作製するために用いられた細胞のタンパク質含量に対して標準化する。全ての細胞のタンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（カタログ＃２３２２５）を用いて、メーカーの推奨通りに測定されても良い。
上述のプロトコールを用いて、Ｈ３５８−ＨＧＦおよびＵ−８７ＭＧ細胞に対する、細胞培養培地の上清中のＨＧＦの濃度を測定し、次いで、細胞のタンパク質濃度に対して標準化した。Ｈ３５８−ＨＧＦ細胞は、Ｕ−８７ＭＧ細胞（自然に、オートクライン型のＨＧＦを発現している）と比較し、高レベルのＨＧＦ分泌を示した（図３３）が、元の細胞およびモックをトランスフェクトしたＨ３５８細胞は検出可能なレベルのＨＧＦを発現しなかった。
実施例Ｂ−５：ヌードマウスに移植されたＥｐＣＡＭ発現腫瘍細胞株における二重特異性抗体活性
Ａｂ＃７のｉｎ ｖｉｖｏ活性促進における、腫瘍ＥｐＣＡＭ発現の役割を解明するために、当該分子を、ｃ−Ｍｅｔよりも有意に高いレベルでＥｐＣＡＭを発現しているｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍モデルで評価しても良い。マウスＨＧＦはヒトｃ−Ｍｅｔを活性化しないことが知られており、ＨＧＦ−リガンド依存性腫瘍モデルに対しては、細胞株は、ヒトＨＧＦのオートクライン分泌が必要である。
ヒトＨＧＦをトランスフェクトされたＨＣＣ８２７細胞（ＨＣＣ８２７−ＨＧＦ細胞）は、モックをトランスフェクトされたＨＣＣ８２７細胞と共に、Ｄｒ． Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ． Ｅｎｇｅｌｍａｎより譲り受け、Okamoto et al., Mol. Cancer Ther. 9(10):2785-92に開示されるプロトコールに従い作製された。ヒトＨＧＦをトランスフェクトされたＮＣＩ−３５８細胞（Ｈ３５８−ＨＧＦ細胞）、およびモックをトランスフェクトされた細胞については、実施例Ｂ−３のプロトコールに従い作製された。
ＨＣＣ８２７細胞株変異体の定量的フローサイトメトリー測定により、ｃ−Ｍｅｔのレベルは、モックをトランスフェクトされた元の細胞と比較し、ＨＧＦをトランスフェクトされた細胞において減少している（３．８ｘ１０５／細胞に対し、１．２ｘ１０５／細胞）が、ＥｐＣＡＭのレベルは影響を受けなかった（２．２ｘ１０６／細胞に対し、２．２ｘ１０６／細胞）ことが示された。
Ｈ３５８細胞株変異体の定量的フローサイトメトリー測定により、ｃ−Ｍｅｔのレベルは、モックをトランスフェクトされた元の細胞と比較し、ＨＧＦをトランスフェクトされた細胞において一定に保たれている（４．５ｘ１０５／細胞に対し、４．６ｘ１０５／細胞）が、ＥｐＣＡＭのレベルは増加した（３．４ｘ１０７／細胞に対し、４．９ｘ１０７／細胞）ことが示された。
ｉｎ ｖｉｖｏ実験に関しては、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）中で、５％ＣＯ２、３７℃の加湿環境下で、Ｔ７５フラスコにおいて培養する。細胞は、０．２５％のトリプシンに曝すことにより回収する。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳに溶解した増殖因子減少Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に、１：１の比率で再懸濁する。次いで、細胞数を、トリパンブルー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１５２５０−０６１）を用いて計数し、もし９０％未満の活性である場合、マウスに移植しない。
Ａｂ＃７およびＯＡ−５Ｄ５のこれらの主要モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性を、原則的に以下のように評価することができる：６〜７週齢のメスのＮｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、２００μｌのＰＢＳの注射容量で、５ｘ１０６Ｈ３５８−ＨＧＦ細胞／マウスまたは５ｘ１０６ＨＣＣ８２７−ＨＧＦ細胞／マウスのいずれかを皮下注射する。注射後に腫瘍を採取し、当初腫瘍体積を、以下の式を用いて測定する：（π／６）＊Ｌ＊Ｗ２。マウスを体重で分け、２００±５０ｍｍ３の範囲にある当初腫瘍体積を無作為抽出し、その時点で、動物を、処置群（８匹／群）へと分ける。マウスを、７日ごとに腹腔内注射することにより、ＰＢＳ対照、二重特異性抗体、またはＯＡ−５Ｄ５で処置する。
二重特異性抗体の投与量は体重に基づき、およそ１ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、および２４ｍｇ／ｋｇであり、ＯＡ−５Ｄ５の投与量はおよそ１０ｍｇ／ｋｇ（１２ｍｇ／ｋｇの二重特異性抗体の投与量と等モルのレベル）である。腫瘍測定値および体重は、実験期間を通して週に２回、測定される。腫瘍体積は、細かなノギスを用いて２方向で測定され、以下の式を用いて算出される腫瘍体積＝（（π／６）＊Ｌ＊Ｗ２）。腫瘍サイズのプロットデータは、各測定に対する平均および平均の標準誤差を表している。実験が終了した時点で、マウスを安楽死させ、全ての動物から腫瘍を切除し、液体窒素中で急速凍結させ、−８０℃のの冷凍庫に保存する。
上述のプロトコールにおいて、リガンド依存性ＨＣＣ８２７−ＨＧＦ細胞を用いた代表的な実験データを図３４に示す。それぞれ、１０ｍｇ／ｋｇおよび１２ｍｇ／ｋｇのＯＡ−５Ｄ５ならびにＡｂ＃７の等モル用量レベルで、二重特異性抗体は、ＯＡ−５Ｄ５を超える活性を改善した。さらに、Ａｂ＃７の用量応答性の相関関係から、１２ｍｇ／ｋｇと等しい、または超える投与量レベルで、本実験において最大の抗腫瘍活性を有したことが示された。この結果は、実施例Ｂ−２で開示したＵ−８７ＭＧモデルでの結果と一致した。
上述のプロトコールにおいて、リガンド依存性Ｈ３５８−ＨＧＦ細胞を用いた代表的な実験データを図３５に示す。それぞれ、１０ｍｇ／ｋｇおよび１２ｍｇ／ｋｇのＯＡ−５Ｄ５ならびにＡｂ＃７の等モル用量レベルで、二重特異性抗体は腫瘍の退縮をもたらしたが、ＯＡ−５Ｄ５は、対象と比較し、有意な腫瘍増殖の減速はもたらさなかった。
実施例Ｂ−６：二重特異性抗体により介在された細胞溶解物におけるｃ−ＭｅｔおよびＥｐＣＡＭ分解のイムノブロット分析
抗体の、細胞性ｃ−ＭｅｔおよびＥｐＣＡＭを分解する能力は、以下のように、イムノブロッティングを用いて、細胞溶解試料で評価しても良い。Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４４１、およびＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ＃１０１Ｈ１）、２ｍＭ Ｌグルタミン（ＧＩＢＣＯ、カタログ＃ ２５０３０−０８１）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（ＣｅｌｌＧｒｏ、カタログ＃ ３０−００２−ＣＩ）を含有するＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ、カタログ＃１１８７−０８５）の入った１２ウェルプレートにおいて、７０〜８０パーセントのコンフルエンスまで増殖させる。
次いで、細胞を１００ｎＭのＯＡ−５Ｄ５またはＡｂ＃７と共に、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。インキュベーションが終了した時点で、細胞を冷却ＰＢＳで２回洗浄し、Ｍ−ＰＥＲ溶液（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ＃ＰＩ７８５０５）＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害物質（ＥＡＳＹパックに備えられているｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、カタログ＃４６９３１２４００１；ＰｈｏｓＳＴＯＰ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、カタログ＃４９０６８３７００１）２００μＬ／ウェル中で溶解させる。
タンパク質濃度は、推奨プロトコールに従い、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ （カタログ＃２３２２５）を用いて推定する。簡潔に述べると、等量のタンパク質標準物と細胞溶解物を、３０分間、３７℃で、１：２０の比率でインキュベートし、次いで、吸光度を５６２ｎｍで計測する。タンパク質濃度は、直線適合を用いた標準物の回帰および細胞溶解物の連続希釈物の線形性により推測する。
ウェスタンブロット分析に関しては、各細胞株および条件でのタンパク質１０μｇを、１０％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分離させる。次いで、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、総ｃ−Ｍｅｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃８１９８、１：１００希釈）、ＥｐＣＡＭ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃２９２９、１：１００希釈）、または、β−アクチン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃４９７０、１：１００希釈）を用いてブロッティングする（用いたものすべて、メーカーの推奨に従う）。ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０およびヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、二次抗体として用いる。イムノブロットを画像化し、タンパク質レベルを定量し、Ｏｄｙｓｓｅｙ ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてβアクチンレベルに対して標準化する。
図３６に示されるように、Ａ５４９細胞（Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ４４１（ＢおよびＤ）、およびＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞（ＣおよびＥ）を増殖させ、上述のように、１００ｎＭのＯＡ−５Ｄ５またはＡｂ＃７とインキュベートし、ｃ−Ｍｅｔ（図３６、Ａ−Ｃ）またはＥｐＣＡＭ（Ｄ−Ｅ）の相対タンパク質濃度を測定した。ＥｐＣＡＭは、この分析において、Ａ５４９細胞では検出不可能であった。図１９Ｂおよび１９Ｃに示されるように、Ａｂ＃７とのインキュベーションによりＮＣＩ−Ｈ４４１およびＨＣＩ−Ｈ２１７０細胞において、ｃ−Ｍｅｔの分解がもたらされたが、ＯＡ−５Ｄ５ではなかった。ＥｐＣＡＭは、抗体処置に関わらず、ＮＣＩ−Ｈ４４１またはＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞において分解されなかった。
実施例Ｂ−７：二重特異性抗体により介在される、異種移植腫瘍中のｃ−ＭｅｔおよびＥｐＣＡＭ分解のイムノブロット分析
抗体の、細胞性ｃ−ＭｅｔおよびＥｐＣＡＭを分解する能力は、イムノブロッティングを用いて、異種移植腫瘍試料において評価しても良い。これを行うために、実施例Ｂ−３で記述された実験からの実験終了時の腫瘍からの腫瘍試料を外科的に得て、メーカーの説明書に従い、組織管の試料を粉砕バッグに置き、液体窒素を用いて瞬間凍結し、インパクトレベル３で乾燥粉砕することによりＣｒｙｏＰｒｅｐシステム（Ｃｏｖａｒｉｓ）を用いて粉砕する。凍結および粉砕工程を、組織のサイズに応じて３〜５回繰り返す。組織バッグの粉砕試料をひっくり返し、低温保存バイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）へとフリックしながら移し、次いで、試料あたり、約１〜２ｍｇの最終腫瘍重量を秤量する。秤量した試料を、次いで、組織タンパク質抽出試薬（ＴＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、新鮮なプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害物質カクテルタブレット（ＲＯＣＨＥ）を、試料あたり最終濃度約２００ｍｇ／ｍｌで補充）中で、氷冷しながら１０分間溶解させる。さらに、前処置の遠心（１０分間、１４，０００ｒｐｍ）を、４℃でＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行う。遠心された上清を取り出し、その総タンパク質濃度を、メーカーの推奨に従いＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（カタログ＃２３２２５）を用いて推定する。簡潔に述べると、等量のタンパク質標準物および細胞溶解物を、３０分間、３７℃で、１：２０の比率でインキュベートし、次いで、吸光度を５６２ｎｍで計測する。タンパク質濃度は、直線適合を用いた標準物の回帰および、細胞溶解物の連続希釈の線形性により推定する。
各イムノブロットに対し、等量の総タンパク質を、個々の腫瘍溶解試料から採取し、３０ｍｇの総タンパク質量に対し、各処置群で混合され、ロードし、ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ １０−１２ウェルゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で、１ｘＸＴ ＭＥＳ泳動緩衝液（ＢＩＯ−ＲＡＤ）中で泳動する。ゲル上のタンパク質試料を、ｉＢｌｏｔゲルトランスファーシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてニトロセルロース膜に移す。膜を、室温で１時間ブロッキングし、様々な１次抗体で一晩プローブし、１時間、二次抗体を反応させる。次いで、全てのイムノブロットを、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＴＢＳ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて３回洗浄する。イムノブロットを画像撮影し、タンパク質レベルを定量し、Ｏｄｙｓｓｅｙ ｉｍａｇｅｒ （ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてβアクチンレベルに対し標準化する。
本実験に用いられる抗体としては以下が挙げられる：ｃ−Ｍｅｔ（Ｄ１Ｃ２）ＸＰウサギｍＡｂ ＃８１９８、ＥｐＣＡＭ（Ｄ１Ｂ３）ウサギｍＡｂ ＃２６２６、βアクチン（１３Ｅ５）ウサギｍＡｂ ＃４９７０（すべて、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから販売）（すべて、メーカーの推奨に従い使用される）。ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ ６８０およびヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ ８００ （ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、二次抗体として用いられる。
実施例Ｂ−７に上述のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験の結果と同様に、Ａｂ＃７で処置したマウス由来の腫瘍は、ｃ−Ｍｅｔの分解増加を示したが、ＯＡ−５Ｄ５で処置したマウス由来の腫瘍は示されない。同様に、ＥｐＣＡＭの分解は、Ａｂ＃７またはＯＡ−５Ｄ５のいずれの処置マウス由来の腫瘍でも認められない。
参照文献による組み込みおよび改変に関する付記
本出願全体を通して、引用されているすべての参照文献（たとえば、交付済み特許または許可された特許またはその均等物を含む特許書類；特許出願公開；および、非特許文献書類または他の原資料）は、その全体において、参照により個々に援用されているかのように、参照により本明細書に援用される。すべての配列表および配列表の情報は、本明細書との開示物の一部とみなされる。
マーカッシュグループまたは構成要素または項目の他のグループが本明細書において用いられた場合、当該グループの全ての個々のメンバーおよび、当該グループで可能性のある全てのコンビネーションおよびサブコンビネーションは、本開示に個々に含まれることが意図されている。
本明細書において、「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、他で明確に指定されない限り、複数形を含む。ゆえに、たとえば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」と言及された場合、複数のそのような細胞、および当業者公知の均等物等が含まれる。同様に、「１つの（ａまたはａｎ）」「１以上」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において相互交換可能に用いることができる。また、「含有する」、「含む」、および「包含する」という用語は、相互交換可能に用いることが出来ることに注意されたい。「請求項ＸＸ〜ＹＹのいずれかの」（ＸＸおよびＹＹは、請求項の番号を指す）とは、選択式で、多項従属クレームを示すことが意図されており、一部の実施態様においては、「請求項ＸＸ〜ＹＹのいずれか１つにある」という表現と相互交換可能である。
値の範囲が明細書に提示されている場合（たとえば、温度範囲、時間の範囲、または組成、濃度もしくは他の値の範囲）すべての中間範囲および部分的な範囲、ならびに、当該所与の範囲に含まれるすべての個々の値は、本開示に含まれることが意図されている。本明細書において、範囲は、当該範囲のエンドポイント値として提示されている値を明確に含有している。たとえば、１〜１００の範囲は、１および１００のエンドポイントの値を明確に含有している。本明細書の開示に含まれている当該範囲もしくは部分的範囲の任意の部分範囲または個々の値を、本明細書の請求の範囲から除外することもできる。
本明細書において、「含有する」は、「含む」、「包含する」または「により特徴付けられる」と同義語であり、料率的または無制限であり、追加の、列挙されていない構成要素または方法の工程を除外しない。本明細書において、「からなる」とは、当該請求項の構成要素に明確に記述されていない任意の構成要素、工程または成分を除外する。本明細書において、「本質的に、〜からなる」は、当該クレームの基礎的なおよび新規の特性に実質的に影響を与えない物質または工程を除外しない。本明細書の各例において、任意の「含有する」、「本質的に、〜からなる」および「からなる」という用語は、任意選択的に、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができ、それにより、本発明範囲の別の態様を開示するものである。本明細書に実例的に開示された本発明は、本明細書に明確に開示されていない任意の構成要素（複数含む）または限定（複数含む）が無くとも、実施することができる。
当業者であれば、開始物質、生物学的物質、化学的物質、生物学的試薬、化学的試薬、合成方法、精製方法、分析方法、アッセイ方法、および、明確に例示されたもの以外の生物学的方法を、必要以上の実験を行うことなく、本発明の実施に用いることができる。任意のそのような物質および方法の、当分野公知の機能的均等物はすべて、本発明に含まれることが意図される。
本明細書に用いられている用語および表現は、記述のための用語として用いられており、限定ではなく、そのような用語および表現の使用に、示され、開示されている、またはその一部である特性の任意の均等物を除外する意図はないが、様々な修飾が本発明の範囲に可能であることを認識されたい。ゆえに、本発明の態様が、好ましい実施態様、例示的な実施態様および任意選択的な特性を含む様々な実施態様により具体的に開示されているが、当業者により本明細書の概要の改変および変更が行われ得る。そのような改変および変更は、開示され、および添付の請求項に定義されるように、本発明の実施態様の範囲内にあるとみなされる。

Claims (23)

  1. 大きな鎖とＦａｂ軽鎖の、２つのポリペプチド鎖を含有するタンデムＦｃ二重特異性抗体（ＴＦｃＢＡ）であって、各鎖はＣ末端およびＮ末端を有し、前記ＴＦｃＢＡは、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖を含有するＦａｂ部分に含有される第一の結合部位を含有し、前記Ｆａｂ重鎖は、前記大きな鎖のＮ末端にあり、前記Ｆａｂ部分は、ｃＭＥＴに特異的に結合し、および、前記ＴＦｃＢＡはさらに、大きな鎖のＣ末端で一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）部分に含有される第二の結合部位を含有し、前記ｓｃＦｖ部分は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合し、ここで、
    （ａ）前記Ｆａｂ重鎖および前記ｓｃＦｖ部分は、タンデムＦｃ（ＴＦｃ）を介して連結されており；
    （ｂ）前記ＴＦｃは、大きな鎖により含有され、および、ＴＦｃリンカーを介して連結され、連続的なポリペプチドを形成する第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域を有しており；および、
    （ｃ）第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域が結合しＦｃ二量体を形成しており；ならびに、さらにここで、
    （ｄ）前記Ｆａｂ軽鎖は、配列番号４００にある３つの軽鎖ＣＤＲを含有するアミノ酸配列を含有し；および、
    （ｅ）前記Ｆａｂ重鎖は、配列番号４２３にある３つの重鎖ＣＤＲを含有するアミノ酸配列を含有する、前記ＴＦｃＢＡ。
  2. 前記ｓｃＦＶ部分が、配列番号４８８であるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載のＴＦｃＢＡ。
  3. 前記ＴＦｃＢＡの大きな鎖が、Ｎ末端からＣ末端へ、以下の順で含有する、請求項１または２に記載のＴＦｃＢＡ：
    （ｉ）Ｆａｂ重鎖可変領域ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン；
    （ｉｉ）ＩｇＧ１上部ヒンジならびにＩｇＧ４中部および下部ヒンジを含有するハイブリッドヒンジ；
    （ｉｉｉ）Ｔ２９９Ｋ変異を含有する第一のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン；
    （ｉｖ）Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を含有する第一のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン；
    （ｖ）第一のジスルフィド架橋モチーフ（ＫＳＣＤＫＴ）；
    （ｖｉ）任意選択的に、ａａ配列（Ｇ４Ｓ）８を含有するリンカーである、タンデムＦｃリンカー；
    （ｖｉｉ）ＩｇＧ４中部ヒンジおよび下部ヒンジ；
    （ｖｉｉｉ）Ｔ２９９Ｄ変異を含有する第二のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン；
    （ｉｘ）Ｔ３６６Ｗ変異を含有する第二のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン；
    （ｘ）第二のジスルフィド架橋モチーフ（ＧＥＣ）；
    （ｘｉ）連結リンカー；および、
    （ｘｉｉ）ｓｃＦｖ。
  4. 前記ＴＦｃＢＡが、約１０ｅ−８、１０ｅ−９、１０ｅ−１０、１０ｅ−１１、１０ｅ−１２、または１０ｅ−１３Ｍ未満のｃＭＥＴに対する結合のＫｄを示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  5. 前記ＴＦｃＢＡが、３．０ｘ１０ｅ−８〜２．５ｘ１０ｅ−９ＭのｃＭＥＴに対する結合のＫｄを示す、請求項４に記載のＴＦｃＢＡ。
  6. 前記ＴＦｃＢＡが、約１０ｅ−７もしくは１０ｅ−８Ｍ、または任意選択的に１０ｅ−９Ｍ未満のＥｐＣＡＭに対する結合のＫｄを示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  7. 前記ＴＦｃＢＡが、１０ｅ−８〜１０ｅ−１１ＭのｃＭＥＴに対する結合のＫｄを示す、請求項６に記載のＴＦｃＢＡ。
  8. 前記ＴＦｃリンカー配列が、配列番号１６９のアミノ酸配列を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  9. 前記ＴＦｃが、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、および、配列番号１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  10. 配列番号４８９であるアミノ酸配列を含有する大きな鎖を含有するＴＦｃＢＡ分子。
  11. 癌患者を治療する方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡの治療有効量を前記患者に投与することを含み、ここで、任意選択的に、前記治療有効量は、１００ｎｇ／患者体重ｋｇ〜１５ｍｇ／患者体重ｋｇであり、および、さらに任意選択的に、前記治療有効量は、１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜２５ｍｇ／患者体重ｋｇである、前記治療方法。
  12. 前記癌が、本明細書に開示される癌型であり、および、ここで任意選択的に、前記治療有効量は、１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜１０ｍｇ／患者体重ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
  13. 癌患者における腫瘍増殖を阻害する方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡの治療有効量を前記患者に投与することを含み、ここで、任意選択的に、前記治療有効量は、１００ｎｇ／患者体重ｋｇ〜１５ｍｇ／患者体重ｋｇ、１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜１０ｍｇ／患者体重ｋｇ、または、１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜２５ｍｇ／患者体重ｋｇである、前記方法。
  14. 腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、腫瘍細胞と、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡの濃縮物を含有する液体とを接触させることを含み、前記ＴＦｃＢＡの濃縮物は、前記腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効である、前記方法。
  15. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ、および薬学的担体を含有する医薬組成物。
  16. 前記組成物が、注射、静脈内注射、および／または、点滴に適した滅菌組成物である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記組成物が、薬学的に受容可能な容器にパッケージされている、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
  18. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸分子。
  19. 請求項１８に記載の核酸分子を含有するベクター。
  20. 請求項１８に記載の核酸分子を含有するベクターを含有する宿主細胞。
  21. 前記宿主細胞は、前記コードされたタンパク質を発現する、請求項２０に記載の宿主細胞。
  22. 前記ＴＦｃＢＡが、細胞表面ｃ−Ｍｅｔおよび細胞表面ＥＰＣＡＭの両方を発現している細胞と接触した際に、接触後に細胞中で測定される総ｃ−Ｍｅｔの量が、接触前に同等の細胞で計測された総ｃ−Ｍｅｔの量よりも低い、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  23. 前記ＴＦｃＢＡが、細胞表面ｃ−Ｍｅｔおよび細胞表面ＥＰＣＡＭの両方を発現している細胞と接触した際に、細胞中で測定される総ＥＰＣＡＭの量が、本質的に変化しない、請求項２２に記載のＴＦｃＢＡ。
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