JP2023510211A - 抗ＮＫｐ３０抗体及び使用方法 - Google Patents

Abstract

ヒトＮＫｐ３０に結合する抗体及びその抗原結合性フラグメント、１種の抗原としてのＮＫｐ３０及び少なくとも１種の他の抗原を認識する多重特異性抗体、ＮＫｐ３０抗体を含む医薬組成物、並びにこの抗体の使用、癌等の疾患を治療するための多重特異性抗体又は組成物。

Description

本明細書で開示されているのは、ヒトＮＫｐ３０に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント、前記抗体を含む組成物、及び癌の治療のための使用方法である。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系に属しており、ウイルス感染及び腫瘍に対する防御の第一線として機能する（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：１８９－２２０）。ＮＫ細胞は、細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を欠いており、事前の感作なしに標的細胞を認識して除去し得る。ＮＫ細胞の機能活性（例えば、サイトカイン産生及び細胞傷害性）は、活性化シグナル及び阻害シグナルの両方を伴う複雑な機序により制御されている（Ｐｅｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８９（２）：２１６－２２４）。

ＮＫｐ３０は、３０ＫＤのＩ型膜貫通糖タンパク質であり、細胞外Ｖ様免疫グロブリンドメインを有する（Ｐｅｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９０（１０）：１５０５－１６）。ＮＫｐ３０をコードする遺伝子及びｃＤＮＡは、ヒト及びラットでクローニングされて特徴付けられた（Ｐｅｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 上記参照、Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６（８）：２１７０－８０）。マウスでは、ＮＫｐ３０は、偽遺伝子である（Ｈｏｌｌｙｏａｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ．２２（８）：１６６１－１６７２）。完全長ヒトＮＫｐ３０は、長さが２０１個のアミノ酸の配列（配列番号１）を有し、この配列では、最初の１８個のアミノ酸は、シグナルペプチドである。成熟ヒトＮＫｐ３０のアミノ酸配列は、１８３個のアミノ酸（ａａ）残基を含む（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿１４７１３０．１）。成熟ヒトＮＫｐ３０の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、１１７個のアミノ酸残基（配列番号２、配列番号１のアミノ酸１９～１３５に対応する）、続いて２１個のａａの膜貫通配列、及び４５個のａａの細胞質ドメインからなる。ＥＣＤ内では、ヒトＮＫｐ３０は、ラット及びカニクイザルそれぞれと６７％及び９５％のａａ配列同一性を共有している。細胞質ドメインでは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）等の既知の活性シグナル伝達モチーフが見出されていない。シグナル伝達のために、ＮＫｐ３０は、ＣＤ３ζ／ＦｃεＲＩγ等のＩＴＡＭ保持アダプター分子と会合する（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ ３４（４）：１８２－９１）。ＮＫｐ３０及びＣＤ３ζの相互作用は、ＮＫｐ３０膜貫通ドメイン中の荷電残基を介して起こる（Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３（５）：１２３５－４１）。

ＮＫｐ３０は、ＮＫ細胞及び「自然様」ＣＤ８^＋ Ｔ細胞上で主に発現されている（Ｐｅｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 上記参照、Ｃｏｒｒｅｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１８ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１１５（２６））。ＮＫｐ３０の発現は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＦＮ－αにより上方制御され得、ＴＧＦ－βにより下方制御され得る（Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１００（７）：４１２０－４１２５；Ｂｏｚｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４１，２９０５－１４）。ＮＫｐ３０は、腫瘍細胞上で優先的に発現されているリガンドを認識する。キメラＮＫｐ３０受容体（例えば、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８シグナル伝達ドメインに融合したＮＫｐ３０）をＴ細胞に導入することによるＮＫｐ３０の標的化は、ＮＫｐ３０リガンド陽性腫瘍細胞に対して強力な抗腫瘍活性を誘導することが示されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９（５）：２２９０－９）。

ＮＫ細胞が媒介する免疫監視及び抗腫瘍効果におけるＮＫｐ３０の重要な役割を考慮して、単剤療法又はＮＫｐ３０及び別の抗原を標的とする多重特異性抗体の抗原結合性ドメインのいずれかとして、腫瘍抗原発現腫瘍細胞に対してＮＫ細胞を再指向させる。

本開示は、ＮＫｐ３０に特異的に結合するアゴニスト抗ＮＫｐ３０抗体及びその抗原結合性フラグメントを対象とする。

一実施形態では、本開示は、ヒトＮＫｐ３０に結合するモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

本開示は、下記の実施形態を包含する。

ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント。

抗体が、少なくとも配列番号１のアミノ酸イソロイシン５０及びロイシン８６でヒトＮＫｐ３０に結合する、前記抗体。

抗体が、ＮＫｐ３０とＢ６Ｈ７リガンドとの相互作用を減少させる、前記抗体。

抗体が、ＮＫｐ３０アゴニスト活性を有する、前記抗体。

（ｉ）（ａ）配列番号１９のＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（ｉｉ）（ａ）配列番号１９のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
又は
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む
前記抗体又は抗原結合性フラグメント。

（ｉ）配列番号３０に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３２に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｉ）配列番号２１に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２３に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
又は
（ｉｉｉ）配列番号１１に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１３に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む
前記抗体又は抗原結合性フラグメント。

配列番号３０、３２、２１、２３、１１、又は１３内に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が挿入されているか、欠失しているか、又は置換されている、前記抗体又は抗原結合性フラグメント。

（ｉ）配列番号３０を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３２を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｉ）配列番号２１を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
又は
（ｉｉｉ）配列番号１１を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む
前記抗体又は抗原結合性フラグメント。

モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト工学操作抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、又はＦ（ａｂ’）_２フラグメントである、前記のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。

前記抗体が、多重特異性抗体である、前記抗体。

ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する少なくとも第１の抗原結合性ドメインと、ヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する少なくとも第２の抗原結合性ドメインとを含む多重特異性抗体。

第１の抗原結合性ドメインが、
（ｉ）（ａ）配列番号１９のＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（ｉｉ）（ａ）配列番号１９のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
又は
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領とを含み、
且つヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する少なくとも第２の抗原結合性ドメインを含む、前記多重特異性抗体。

多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、前記多重特異性抗体。

二重特異性抗体が、二重特異性四価抗体である、前記二重特異性抗体。

ＶＤ１－ＣＬ－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－ＣＨ１－Ｆｃ又はＶＤ１－ＣＨ－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－ＣＬ－Ｆｃを含み、ここで、ＶＤ１は、抗原結合性ドメインの第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、抗原結合性ドメインの第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、ＣＨ又はＣＬは、定常重ドメイン又は定常軽ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、少なくとも２個のアミノ酸からなるリンカーである、前記二重特異性四価抗体。

リンカーが、配列番号４３～配列番号８５の配列である、前記二重特異性四価抗体。

リンカーが、配列番号４４である、前記二重特異性四価抗体。

リンカーが、配列番号５０である、前記二重特異性四価抗体。

リンカーが、配列番号５５である、前記二重特異性四価抗体。

抗体又はその抗原結合性フラグメントが、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）を有する、前記のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。

抗体又はその抗原結合性フラグメントが、低減されたグリコシル化を有するか、又はグリコシル化を有しないか、又は低フコシル化されている、前記のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。

抗体又はその抗原結合性フラグメントが、増加した二分岐化ＧｌｃＮａｃ構造を含む、前記のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。

Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１のものである、前記のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。

Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４のものである、前記のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。

ＩｇＧ４が、Ｓ２２８Ｐ置換（ＥＵ番号付けシステムによる）を有する、前記抗体又は抗原結合性フラグメント。

薬学的に許容可能な担体をさらに含む、前記のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物。

癌を治療する方法であって、前記抗体又は抗原結合性フラグメントの有効量を、必要な患者に投与することを含む方法。

癌が、胃癌、結腸癌、膵癌、乳癌、頭頸部癌、腎癌、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、及び肉腫である、前記方法。

抗体又は抗原結合性フラグメントを、別の治療薬と組み合わせて投与する、前記方法。

前記治療薬が、パクリタキセル又はパクリタキセル剤、ドセタキセル、カルボプラチン、トポテカン、シスプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、レナリドマイド、又は５－アザシチジンである、前記方法。

治療薬が、パクリタキセル剤、レナリドマイド、又は５－アザシチジンである、前記方法。

前記のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合性フラグメントをコードする単離核酸。

前記核酸を含むベクター。

前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞。

抗体又はその抗原結合性フラグメントを製造する方法であって、前記宿主細胞を培養すること、及び培養物から抗体又は抗原結合性フラグメントを回収することを含む方法。

前記抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む診断薬。

標識が、放射性標識、フルオロフォア、発色団、造影剤、及び金属イオンからなる群から選択される、前記診断薬。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２９からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

他の一実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｂ）配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域を含む。

別の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、（ａ）３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域であって、この３つのＨＣＤＲは、配列番号３若しくは配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；及び配列番号５、配列番号２０、若しくは配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３である、重鎖可変領域、並びに／又は（ｂ）３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域であって、この３つのＬＣＤＲは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；配列番号７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３である、軽鎖可変領域を含む。

別の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、（ａ）３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域であって、この３つのＨＣＤＲは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３であるか、若しくは配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３であるか、若しくは配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３である、重鎖可変領域、並びに／又は（ｂ）３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域であって、この３つのＬＣＤＲは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３である、軽鎖可変領域を含む。

別の実施形態では、本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。

一実施形態では、本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。

他の一実施形態では、本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントは、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、を含む重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３と、を含む軽鎖可変領域を含む。

一実施形態では、本開示の抗体又はその抗原結合性フラグメントは、（ａ）配列番号９、配列番号１１、配列番号２１、若しくは配列番号３０のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号９、配列番号１１、配列番号２１、若しくは配列番号３０のいずれか１つに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び／又は（ｂ）配列番号１０、配列番号１３、配列番号２３、若しくは配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１０、配列番号１３、配列番号２３、若しくは配列番号３２のいずれか１つに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

他の一実施形態では、本開示の抗体又はその抗原結合性フラグメントは、（ａ）配列番号９、配列番号１１、配列番号２１、若しくは配列番号３０のアミノ酸配列、又は配列番号９、配列番号１１、配列番号２１、若しくは配列番号３０のアミノ酸配列中に１、２、若しくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列、を有する重鎖可変領域、及び／又は（ｂ）配列番号１０、配列番号１３、配列番号２３、若しくは配列番号３２のアミノ酸配列、又は配列番号１０、配列番号１３、配列番号２３、若しくは配列番号３２のアミノ酸中に１、２、３、４、若しくは５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列、を有する軽鎖可変領域を含む。他の一実施形態では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。

一実施形態では、本開示の抗体又はその抗原結合性フラグメントは、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

一実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。より具体的な実施形態では、本開示の抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１（ヒトＩｇＧ１ｗｔ又はｈｕＩｇＧ１としても参照される）又はＩｇＧ２のＦｃドメインを含む。他の一実施形態では、本開示の抗体は、Ｓ２２８Ｐ及び／又はＲ４０９Ｋ置換（ＥＵ番号付けシステムによる）を有するヒトＩｇＧ４のＦｃドメインを含む。

一実施形態では、本開示の抗体は、１×１０^－６Ｍ～１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）でＮＫｐ３０に結合する。他の一実施形態では、本開示の抗体は、約１×１０^－６Ｍ、約１×１０^－７Ｍ、約１×１０^－８Ｍ、約１×１０^－９Ｍ、又は約１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）でＮＫｐ３０に結合する。

他の一実施形態では、本開示の抗ヒトＮＫｐ３０抗体は、カニクイザルＮＫｐ３０に対する種交差結合活性を示す。

一実施形態では、本開示の抗体は、強いＦｃ媒介エフェクター機能を有する。この抗体は、ＮＫｐ３０発現標的細胞に対する抗体依存細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する。

本開示は、抗体又は抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。一実施形態では、単離された核酸は、配列番号１２、配列番号２２、若しくは配列番号３１のＶＨヌクレオチド配列、又は配列番号１２、配列番号２２、若しくは配列番号３１に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、且つ本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントのＶＨ領域をコードする。代替的又は追加的に、単離された核酸は、配列番号１４、配列番号２４、若しくは配列番号３３のＶＬヌクレオチド配列、又は配列番号１４、配列番号２４、若しくは配列番号３３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、且つ本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントのＶＬ領域をコードする。

別の態様では、本開示は、ＮＫｐ３０抗体又はその抗原結合性フラグメントと、任意選択的な薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物に関する。

さらに他の一態様では、本開示は、必要とする対象にＮＫｐ３０抗体又はその抗原結合性フラグメント又はＮＫｐ３０抗体医薬組成物を治療有効量で投与することを含む、対象において疾患を治療する方法に関する。他の一実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントにより治療される疾患は、癌である。

本開示は、癌等の疾患を治療するための、抗体若しくはその抗原結合性フラグメント、又はＮＫｐ３０抗体医薬組成物の使用に関する。

ＮＫｐ３０－ｍＩｇＧ２ａ（上）及びＮＫｐ３０－ｈｕＩｇＧ１（下）の模式図である。ＮＫｐ３０ ＥＣＤ：ＮＫｐ３０細胞外ドメイン。Ｎ：Ｎ末端。Ｃ：Ｃ末端。 抗ＮＫｐ３０抗体のＶＨ領域の系統樹の図である。候補抗ＮＫｐ３０抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列を、ＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇａｌｉｇｎ（商標）ソフトウェアを使用してアラインさせた。配列相同性を、系統樹で表した。 抗ＮＫｐ３０抗体のＶＬ（Ｖｋ）領域の系統樹の図である。候補抗ＮＫｐ３０抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列を、ＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇａｌｉｇｎ（商標）ソフトウェアを使用してアラインさせた。配列相同性を、系統樹で表した。 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による精製済マウス抗ＮＫｐ３０抗体の親和性決定を示す。 フローサイトメトリーによるマウス抗ＮＫｐ３０抗体結合の決定を示す。 抗ＮＫｐ３０抗体によるＩＦＮ－γの誘導を示す。図５Ａは、一晩、抗ＮＫｐ３０抗体ｍｕ１８３又はｍｕ１７の存在下で、マウスＦｃγＲ^＋ Ｐ８１５細胞と共培養したＮＫｐ３０^＋ ＮＫ９２ＭＩ細胞（ＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０）を示す。ＩＦＮ－γ産生を、ＥＬＩＳＡにより決定した。図５Ｂ～Ｃは、健康なドナーからのＰＢＭＣを３日にわたりＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で刺激した後に、一晩、Ｐ８１５細胞及び抗ＮＫｐ３０ Ａｂと共培養したことを示す。ＩＦＮ－γ産生を、ＥＬＩＳＡにより決定した。結果を、トリプリケートの平均±ＳＤで示した。 フローサイトメトリーによるヒト化抗ＮＫｐ３０ Ａｂ ＢＧＡ１８３１の結合アッセイであり、ヒト化後にＮＫｐ３０への結合が維持されていることを示す。 ヒト化抗ＮＫｐ３０ Ａｂのエピトープマッピングを示す。 Ｂ７Ｈ６との複合体でのＮＫｐ３０の分子モデリングを示す。 抗ＮＫｐ３０ Ａｂ ＢＧＡ１８３３によるＮＫｐ３０／Ｂ７－Ｈ６相互作用のブロッキングを示す。抗ＮＫｐ３０ ＡｂによるＮＫｐ３０／Ｂ７－Ｈ６相互作用の阻害を示す模式図。Ｂ７－Ｈ６発現ＨＣＴ１１６細胞（ＨＣＴ１１６／Ｂ７－Ｈ６）への可溶性ＮＫｐ３０（ＮＫｐ３０－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質）の結合を、フローサイトメトリーにより決定した。ＮＫｐ３０／Ｂ７－Ｈ６相互作用の遮断を、連続希釈したＢＧＡ１８３３／ＩｇＧ１を添加することにより、定量的に測定した。結果を、デュプリケートの平均±ＳＤで示す。 ＢＧＡ１８３３／ＩｇＧ１によるＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０細胞の活性化を示す。図９Ａは、ＢＧＡ１８３３／ＩｇＧ１の存在下でＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０細胞をＴＨＰ－１細胞と共培養したことを示す。培養物上清中のＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡにより決定した。図９Ｂは、抗ＮＫｐ３０ ＡｂによるＮＫ細胞媒介死滅の誘導を逆ＡＤＣＣアッセイで実施したことを示す。簡潔に説明すると、ＢＧＡ１８３３／ＩｇＧ１の存在下で、ＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０細胞をＴＨＰ－１細胞と共培養した。細胞傷害性のパーセンテージを、ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）放出アッセイにより決定した。全ての条件をトリプリケートで実施し、結果を平均±ＳＤで示す。 図１０Ａは、第１の抗原結合性ドメインとしてのＮＫｐ３０及び第２の抗原結合性ドメインとしての抗クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）の二重特異性抗体の単離を示す。図１０Ｂは、ＩＦＮ－ガンマ放出アッセイでの二重特異性抗体ＮＫｐ３０×抗クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）を示す。 ＩＦＮ－ガンマ放出アッセイでの、第１の抗原結合性ドメインとしてのＮＫｐ３０及び第２の抗原結合性ドメインとしての抗５Ｔ４癌胎児性抗原（５Ｔ４）の二重特異性抗体を示す。

定義
本文書中の他の箇所に具体的な定義がない限り、本明細書で用いられる他の科学技術用語はすべて、当業者により通常理解される意味を有する。

添付の特許請求の範囲を含めて、本明細書で用いられる場合、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの語の単数形は、とくに文脈上明確に規定されない限り、それらの対応する複数形の参照語を含む。

「ｏｒ（又は）」という用語は、とくに文脈上明確に規定されない限り、「ａｎｄ／ｏｒ（及び／又は）」という用語を意味するように用いられ、それと互換的に用いられる。

「抗癌剤」という用語は、本明細書で使用される場合、癌等の細胞増殖性障害を治療するために使用され得るあらゆる薬剤を指し、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、放射線療法剤及び放射線治療剤、標的抗癌剤、並びに免疫療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。

「ナチュラル細胞傷害誘発受容体（Ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」、又は「ＮＫｐ３０」、又は「ＣＤ３３７」という用語は、約２１キロダルトンのタンパク質を指す。ヒトＮＫｐ３０のアミノ酸配列（配列番号１）を、アクセッション番号Ｏ１４９３１（ＮＣＴＲ３＿ＨＵＭＡＮ）又はＮＰ＿６６７３４１．１でも見出し得る。ＮＫｐ３０の核酸配列を、配列番号２に示す。

本明細書中で使用される「ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（投与）」、「ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ（～を投与すること）」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（～を治療すること）」、及び「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」という用語は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、又は生物学的流体に適用されるとき、外因性の医薬剤、治療剤、診断剤、又は組成物と、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官、又は生物学的流体と、の接触を意味する。細胞の治療は、細胞への試薬の接触、さらには流体が細胞に接触している場合には流体への試薬の接触を包含する。「ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（投与）」及び「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」という用語は、試薬、診断剤、結合性化合物による、又は他の細胞による、細胞などのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ治療も意味する。本明細書中の「対象」という用語は、いずれかの生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（たとえば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを含む。いずれかの疾患又は障害を治療することとは、一態様では、疾患又は障害を寛解させること（すなわち、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発生を緩徐化又は停止又は低減すること）を意味する。他の一態様では、「ｔｒｅａｔ（～を治療する）」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（～を治療すること）」、又は「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」とは、患者により識別できないおそれのあるものを含めて、少なくとも１つの物理的パラメーターを軽減又は寛解することを意味する。さらに他の一態様では、「ｔｒｅａｔ（～を治療する）」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（～を治療すること）」、又は「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」とは、疾患又は障害を物理的に（たとえば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（たとえば、物理的パラメーターの安定化）、又はその両方のどれかをモジュレートすることを意味する。さらに他の一態様では、「ｔｒｅａｔ（～を治療する）」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（～を治療すること）」、又は「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」とは、疾患又は障害の発症又は発生又は進行を予防又は遅延することを意味する。

本開示との関連での「対象」という用語は、哺乳動物、たとえば霊長動物、好ましくは高等霊長動物、たとえばヒト（たとえば、本明細書に記載の障害を有する又は有するリスクのある患者）のことである。

本明細書で用いられる「親和性」という用語は、抗体と抗原との相互作用の強度を意味する。抗原内では、抗体の可変領域が非共有結合力を介して数多くの部位で抗原と相互作用する。一般的に、相互作用が大きくなるほど親和性は強くなる。

本明細書で用いられる「抗体」という用語は、対応する抗原に非共有結合で、可逆的に、且つ特異的に結合可能であるイムノグロブリンファミリーのポリペプチドを意味する。たとえば、天然に存在するＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含むテトラマーである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される）と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記される）と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が介在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域にさらに細分可能である。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端へ次の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのフレームワーク領域（ＦＲ）、すなわち、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の各種細胞（たとえばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）をはじめとする宿主組織又は因子へのイムノグロブリンの結合を媒介可能である。

「抗体」という用語は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を含む。抗体は、いずれかのアイソタイプ／クラス（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）又はサブクラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）でありうる。

いくつかの実施形態では、抗ＮＫｐ３０抗体は、少なくとも１つの抗原結合性部位、少なくとも可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫｐ３０抗体は、本明細書に記載のＮＫｐ３０抗体由来の抗原結合性フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫｐ３０抗体は、単離されているか又は組換えである。

本明細書中の「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」又は「Ｍａｂ」という用語は、実質的に均一な抗体の集団を意味する。すなわち、集団に含まれる抗体分子は、マイナー量で存在しうる天然に存在する可能性のある突然変異を除いてアミノ酸配列が同一である。これとは対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、その可変ドメインに、とくに、異なるエピトープに対して特異的であることの多いその相補性決定領域（ＣＤＲ）に、異なるアミノ酸配列を有する多種多様な抗体を含む。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特性を意味し、いかなる特定の方法による抗体の産生も必要とみなされるべきではない。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９７５ ２５６：４９５－４９７、米国特許第４，３７６，１１０号明細書、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ １９９２、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８８、及びＣｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ １９９３を参照されたい。本明細書に開示される抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡを含むいずれかのイムノグロブリンクラス、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのそれらのいずれかのサブクラスでありうる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで培養可能である。高力価のモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ産生で得ることが可能であり、この場合、個別ハイブリドーマ由来の細胞は、高濃度の所望の抗体を含有する腹水を生成するプリスティンプライムＢａｌｂ／ｃマウスなどのマウスに腹腔内注射される。アイソタイプＩｇＭ又はＩｇＧのモノクローナル抗体は、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を用いてかかる腹水から又は培養上清から精製可能である。

一般的には、基本抗体構造単位はテトラマーを含む。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一対を含み、各対は、１本の「軽鎖」（約２５ｋＤａ）と１本の「重鎖」（約５０～７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０アミノ酸又はそれ以上の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義可能である。典型的には、ヒト軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、典型的には、α、δ、ε、γ、又はμとして分類され、且つ抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭとして定義する。軽鎖内及び重鎖内では、可変領域及び定常領域は、約１２アミノ酸又はそれ以上の「Ｊ」領域により接合され、重鎖は、約１０アミノ酸以上の「Ｄ」領域も含む。

各軽／重鎖（ＶＬ／ＶＨ）対の可変領域が、抗体結合性部位を形成する。そのため、一般的に、インタクトな抗体は、２つの結合性部位を有する。二機能性抗体又は二重特異性抗体を除いて、これら２つの結合性部位は、一般的に、一次配列が同一である。

典型的には、重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）間に位置する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常はフレームワーク領域によりアライメントされ、特異的エピトープへの結合を可能にする。一般的には、Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖及び重鎖可変ドメインは両方とも、ＦＲ－１（又はＦＲ１）、ＣＤＲ－１（又はＣＤＲ１）、ＦＲ－２（ＦＲ２）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ２）、ＦＲ－３（又はＦＲ３）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ３）、及びＦＲ－４（又はＦＲ４）を含む。ＣＤＲ及びフレームワーク領域の位置を、当技術分野で公知の様々な定義を使用して決定し得、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、及びＩＭＧＴを使用して決定し得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２０５－２０６（２００１）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８８３（１９８９）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７９９－８１７（１９９２）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－７４８（１９９７）ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２－１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５－７７（２００３）（“ＩＭＧＴ” ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）を参照されたい）。抗原結合性部位の定義もまた、次のＲｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１９－２２１（２０００）、及びＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２０７－２０９（２００１）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２－７４５（１９９６）、及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９２６８－９２７２（１９８９）、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０３：１２１－１５３（１９９１）、及びＲｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１４１－１７２（１９９６）に記載されている。例えば、Ｋａｂａｔでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けられており；軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けられている。Ｃｈｏｔｈｉａでは、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸は、２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けられており；ＶＬ中のアミノ酸残基は、２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けられている。ＫａｂａｔのＣＤＲ定義及びＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ定義の両方を組み合わせることにより、ヒトＶＨ中では、ＣＤＲは、２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けられており、ヒトＶＬ中では、アミノ酸残基は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けられている。ＩＭＧＴでは、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸残基は、約２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５１～５７（ＨＣＤＲ２）、及び９３～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けられており、ＶＬ中のＣＤＲアミノ酸残基は、約２７～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けられている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）。ＩＭＧＴでは、抗体のＣＤＲ領域を、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎというプログラムを使用して決定し得る。

「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（たとえば、軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びに重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含む。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（配列により抗体のＣＤＲ領域を定義する）を参照されたい。また、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（構造により抗体のＣＤＲ領域を定義する）も参照されたい。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基という用語は、ＣＤＲ残基として本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を意味する。

とくに指示がない限り、「抗原結合性フラグメント」とは、抗体の抗原結合性フラグメント、すなわち、全長抗体により結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント、たとえば、１つ以上のＣＤＲ領域を保持するフラグメントを意味する。抗原結合性フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、ダイアボディー、線状抗体、一本鎖抗体分子、たとえば、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）、ナノボディー、並びに抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体が挙げられる。

本明細書で使用される場合、抗体が標的タンパク質に「特異的に結合する」ということは、この抗体が、他のタンパク質と比較した場合にこの標的への優先的な結合を示すが、この特異性は絶対的な結合特異性を必要とするものではないことを意味する。抗体が「特異的に結合する」又は「選択的に結合する」は、抗原（例えばタンパク質）と抗体又は抗原結合性抗体フラグメントとの間の相互作用を説明する文脈で使用され、タンパク質及び他の生物製剤の不均一な集団（例えば、生体サンプル、血液、血清、血漿、又は組織サンプル）中での抗原の存在を決定する結合反応を指す。そのため、ある特定の指定の免疫アッセイ条件下では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、バックグラウンドレベルと比較した場合に少なくとも２倍強く特定の抗原に特異的に結合し、且つサンプル中に存在する他の抗原には有意な量で特異的に結合しない。一態様では、指定の免疫アッセイ条件下では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、結合のバックグラウンドレベルと比較した場合に少なくとも１０倍強く特定の抗原に特異的に結合し、且つサンプル中に存在する他の抗原には有意な量で特異的に結合しない。

本明細書中の「ヒト抗体」という用語は、ヒトイムノグロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。ヒト抗体は、マウスで、マウス細胞で、又はマウス細胞に由来するハイブリドーマで産生されるのであれば、ネズミ炭水化物鎖を含有可能である。同様に、「マウス抗体」又は「ラット抗体」とは、それぞれ、マウス又はラットのイムノグロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。

「ヒト化」又は「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト（たとえばネズミ）抗体さらにはヒト抗体に由来する配列を含有する抗体の形態を意味する。かかる抗体は、非ヒトイムノグロブリンに由来する最小限の配列を含有する。一般的には、ヒト化抗体は、超可変ループのすべて又は実質的にすべてが非ヒトイムノグロブリンものに対応し、且つＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてがヒトイムノグロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むであろう。ヒト化抗体はまた、任意に、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒトイムノグロブリンのものを含むであろう。接頭辞「ｈｕｍ」、「ｈｕ」、「Ｈｕ」、又は「ｈ」は、親齧歯動物抗体からヒト化抗体を区別する必要があるときに抗体クローン指定に付加される。齧歯動物抗体のヒト化形態は、一般に、親齧歯動物抗体と同一のＣＤＲ配列を含むであろうが、ヒト化抗体の親和性の増加、安定性の増加、翻訳後修飾の除去のために、又は他の理由で、ある特定のアミノ酸置換を含むことが可能である。

「対応するヒト生殖系配列」という用語は、ヒト生殖系イムノグロブリン可変領域配列によりコードされるすべての他の既知の可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列又はサブ配列に対して最高の決定されたアミノ酸配列同一性を共有するヒト可変領域アミノ酸配列又はサブ配列をコードする核酸配列を意味する。対応するヒト生殖系配列はまた、すべての他の評価された可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列又はサブ配列に対して最高アミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列又はサブ配列も意味しうる。対応するヒト生殖系配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワーク及び相補性決定領域、可変セグメント（以上に定義される）、又は可変領域を構成する配列又はサブ配列の他の組合せでありうる。配列同一性は、本明細書に記載の方法を用いて、たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又は当技術分野で公知の他のアライメントアルゴリズムを用いて２つの配列をアライメントすることにより決定可能である。対応するヒト生殖系核酸又はアミノ酸配列は、参照可変領域核酸又はアミノ酸配列に対して、少なくとも約９０％、９１、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有することが可能である。加えて、抗体が定常領域を含む場合には、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７－８６，２０００で説明されているように、この定常領域も、そのようなヒト配列に由来しており、例えば、ヒト生殖系配列、又はヒト生殖系列配列の変異バージョン、又はヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列を含む抗体に由来する。

「平衡解離定数」（Ｋ_Ｄ、Ｍ）という用語は、解離速度定数（ｋｄ、時間^－１）を会合速度定数（ｋａ、時間^－１、Ｍ^－１）で除算したものを意味する。平衡解離定数は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて測定可能である。本開示の抗体は、一般に、約１０^－７又は１０^－８Ｍ未満、たとえば、約１０^－９Ｍ又は１０^－１０Ｍ未満、いくつかの態様では、約１０^－１１Ｍ、１０^－１２Ｍ、又は１０^－１３Ｍ未満の平衡解離定数を有するであろう。

本明細書中の「癌」又は「腫瘍」という用語は、当技術分野で理解される最広義の意味を有し、典型的には無制御の細胞成長により特徴付けられる哺乳動物の生理学的状態を意味する。本開示との関連では、癌は、ある特定のタイプ又は位置に制限されない。

本開示との関連において、アミノ酸配列に言及される場合には、「保存的置換」という用語は、抗体又はフラグメントの化学的な、物理的な、及び／又は機能的な特性（例えば、ＮＫｐ３０に対する結合親和性）を実質的に変更しない新たなアミノ酸による元のアミノ酸の置換を意味する。アミノ酸の一般的な保存的置換は、当技術分野で公知である。

パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴアルゴリズムが挙げられ、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９７７、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して一般公開されている。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同一長さのワードにアライメントとしたときになんらかの正値の閾値スコアＴにマッチするか又はそれを満足するかのどちらかであるクエリー配列中の長さＷのショートワードを同定することにより、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することが関与する。Ｔは、近傍ワードスコア閾値といわれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見いだす検索を開始するための値として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加可能である限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメーターＭ（マッチング残基対に対するリワードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチング残基に対するペナルティースコア、常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列では、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスが使用される。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下したとき、１つ以上の負スコアリング残基アライメントの蓄積に起因して累積スコアがゼロ以下に移行したとき、又はどちらの配列も末端に達したとき、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及びスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対して）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴプログラムは、ワード長３、及び期待値（Ｅ）１０、並びにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も実施する（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７，１９９３を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間又はアミノ酸配列間のマッチが偶然に発生する確率の指標を提供する最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。たとえば、試験核酸と参照核酸との比較の最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば、核酸は参照配列に類似してみなされる。

２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性をまた、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているアルゴリズムを使用しても決定し得る（Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１－１７，（１９８８））。加えて、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性を、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのどちらと、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、及び長さ重み１、２、３、４、５、又は６とを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれているアルゴリズムを使用して決定し得る（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３，（１９７０））。

「核酸」という用語は、本明細書では「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及び一本鎖又は二本鎖のどちらかの形態のそれらのポリマーを意味する。この用語は、合成の、天然に存在する、及び天然に存在しない、参照核酸と類似の結合性を有する、並びに参照ヌクレオチドに類似した形で代謝される、公知のヌクレオチドアナログ又は修飾骨格残基又は連結を含有する核酸を包含する。かかるアナログの例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。

核酸との関連での「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を意味する。典型的には、それは、転写配列に対する転写レギュラトリー配列の機能的関係を意味する。たとえば、プロモーター配列又はエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞又は他の発現システムでコード配列の転写を刺激又はモジュレートするならば、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写配列に作動可能に結合されたプロモーター転写レギュラトリー配列は、転写配列に物理的に連続する。すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写レギュラトリー配列は、その転写を増強するコード配列に物理的に連続する必要もなければ密に近接して位置する必要もない。

いくつかの態様では、本開示は、組成物、たとえば、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に製剤化された、本明細書に記載の抗ＮＫｐ３０抗体を含む薬学的に許容可能な組成物を提供する。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、生理学的に適合可能であるいかなる溶媒、分散媒、等張化剤、及び吸収遅延剤もすべて含む。賦形剤は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与、又は表皮投与（たとえば、注射又は注入による）に好適でありうる。

本明細書に開示される組成物は、さまざまな形態でありうる。こうしたものとしては、たとえば、液状、半固形、及び固形製剤、たとえば、液状溶液剤（たとえば、注射用及び注入用溶液剤）、ディスパージョン剤又はサスペンジョン剤、リポソーム剤、及び坐剤が挙げられる。好適な形態は、意図される投与モード及び治療用途に依存する。典型的な好適な組成物は、注射用又は注入用溶液剤の形態である。１つの好適な投与モードは非経口である（たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）。いくつかの実施形態では、抗体は、静脈内注入又は注射により投与される。ある特定の実施形態では、抗体は、筋肉内又は皮下注射により投与される。

本明細書で用いられる「治療有効量」という用語は、疾患又は疾患若しくは障害の臨床症状の少なくとも１つを治療するために対象に投与するときに、疾患、障害、又は症状に対してかかる治療を行うのに十分な抗体量を意味する。「治療有効量」は、抗体、疾患、障害、及び／又は疾患若しくは障害の症状、疾患、障害、及び／又は疾患若しくは障害の症状の重症度、治療される対象の年齢、及び／又は治療される対象の体重によって異なりうる。いずれの所与の場合の適切量も、当業者には明らかでありうるか、又はルーチンの実験により決定可能である。組合せ療法の場合には、「治療有効量」は、疾患、障害、又は病態の有効治療に見合った組合せ対象物の合計量を意味する。

「組合せ療法」という用語は、本開示で説明されている治療対象の病態又は障害を治療するための２種以上の治療薬の投与を指す。そのような投与は、実質的に同時のこれらの治療薬の共投与を包含する。そのような投与はまた、複数回での共投与、又は各活性成分に関して個別容器（例えば、カプセル、粉末、及び液体）での共投与も包含する。粉末及び／又は液体を、投与前に所望の用量に再構築し得るか、又は希釈し得る。加えて、そのような投与はまた、おおよそ同時か又は異なる時点のどちらかでの各タイプの治療薬の逐次的使用も包含する。いずれの場合でも、治療レジメンにより、本明細書で説明されている病態又は障害の治療での薬物の組合せの有効な効果がもたらされるであろう。

本明細書で使用される場合、「との組合せ」という語句は、抗ＮＫｐ３０抗体、抗原結合性フラグメント、又は多重特異性抗体を、追加の治療薬の投与と同時に、この投与の直前に、又はこの投与の直後に、対象に投与することを意味する。ある特定の実施形態では、抗ＮＫｐ３０抗体、抗原結合性フラグメント、又は多重特異性抗体を、追加の治療薬との共製剤として投与する。

詳細な説明
本開示は、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体、抗原結合性フラグメント、又は多価抗体を提供する。さらに、本開示は、望ましい薬物動態特性及び他の望ましい属性を有し、そのため、癌の可能性を低減するか又は癌を治療するために使用され得る抗体を提供する。本開示は、抗体又は抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物、そのような医薬組成物を製造する方法、並びに癌及び関連する障害の予防及び治療のために、そのような医薬組成物を使用する方法をさらに提供する。

抗ＮＫｐ３０抗体
本開示は、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントとして、下記で説明するように生成された抗体又はその抗原結合性フラグメントが挙げられるが、これに限定されない。

本開示は、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体又は抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又は抗体フラグメント（例えば、抗原結合性フラグメント）は、配列番号９、配列番号１１、配列番号２１、又は配列番号３０（表１）のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、抗体又は抗原結合性フラグメントを提供する。本開示はまた、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体又は抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又は抗原結合性フラグメントは、表１で列挙されたＨＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ（重鎖相補性決定領域）を含む、抗体又は抗原結合性フラグメントも提供する。一態様では、本開示は、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体又は抗原結合性フラグメントであって、前記抗体は、表１で列挙されているＨＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を含む１つ、２つ、３つ、又はより多くのＨＣＤＲを含む（或いはからなる）。

本開示は、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体又は抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又は原結合性フラグメントは、配列番号１０、配列番号１３、配列番号２３、又は配列番号３２（表１）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、抗体又は抗原結合性フラグメントを提供する。本開示はまた、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体又は抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又は抗原結合性フラグメントは、表１で列挙されたＬＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ（軽鎖相補性決定領域）を含む、抗体又は抗原結合性フラグメントも提供する。具体的には、本開示は、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体又は抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又は抗原結合性フラグメントは、表１で列挙されているＬＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を含む１つ、２つ、３つ、又はより多くのＬＣＤＲを含む（或いはからなる）。

本開示の他の抗体又はその抗原結合性フラグメントは、変化しているが、表１に記載のＣＤＲ領域に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％のＣＤＲ領域パーセント同一性を有する、アミノ酸を含む。いくつかの態様では、それは、表１に記載の配列に表されるＣＤＲ領域と比較したときにＣＤＲ領域で１、２、３、４、又は５アミノ酸以下が変化している、アミノ酸変化を含む。

本開示の他の抗体は、アミノ酸又はアミノ酸をコードする核酸が変化しているが、表１に記載の配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％のパーセント同一性を有するものを含む。いくつかの態様では、それは、実質的に同一の治療的活性を保持しつつ、表１に記載の配列に表される可変領域と比較したときに可変領域で１、２、３、４、又は５アミノ酸以下が変化されている、アミノ酸配列の変化を含む。

本開示はまた、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、及び全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。かかる核酸配列は、哺乳動物細胞で発現させるように最適化可能である。

エピトープ及び同一エピトープに結合する抗体の同定
本開示は、ヒトＮＫｐ３０のエピトープに結合する抗体及びその抗原結合性フラグメントを提供する。ある特定の態様では、抗体及び抗原結合性フラグメントは、ＮＫｐ３０の同一エピトープに結合可能である。

本開示はまた、表１に記載の抗ＮＫｐ３０抗体が結合するのと同一のエピトープに結合する抗体及びその抗原結合性フラグメントを提供する。したがって、追加の抗体及びその抗原結合性フラグメントは、結合アッセイで他の抗体と交差競合する（たとえば、統計的に有意にその結合を競合阻害する）それらの能力に基づいて同定可能である。ＮＫｐ３０への本開示の抗体及びその抗原結合性フラグメントの結合を阻害する試験抗体の能力は、ＮＫｐ３０への結合に関してその抗体又はその抗原結合性フラグメントと試験抗体が競合可能であることを実証する。かかる抗体は、いかなる一理論にも拘束されるものではないが、それが競合する抗体又は抗原結合性フラグメントとＮＫｐ３０上の同一の又は関連する（たとえば、構造的に類似した又は空間的に近接した）エピトープに結合可能である。ある特定の態様では、本開示の抗体又はその抗原結合性フラグメントとＮＫｐ３０上の同一のエピトープに結合する抗体は、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。かかるヒト又はヒト化モノクローナル抗体は、本明細書に記載のように調製及び単離が可能である。

Ｆｃ領域の改変
さらに他の態様では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を改変するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることにより改変される。たとえば、抗体がエフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが親抗体の抗原結合能を保持するように、１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置き換えることが可能である。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、たとえば、Ｆｃレセプター又はＣ１補体成分でありうる。このアプローチは、たとえば、両方ともＷｉｎｔｅｒらにより米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び同第５，６４８，２６０号明細書に記載されている。

他の一態様では、抗体が改変されたＣ１ｑ結合及び／又は低減若しくは消失された補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、１つ以上のアミノ酸残基を１つ以上の異なるアミノ酸残基と置き換えることが可能である。このアプローチは、たとえば、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらにより米国特許第６，１９４，５５１号明細書に記載されている。

さらに他の一態様では、１つ以上のアミノ酸残基を変化することにより、補体を固定する抗体の能力を改変する。このアプローチは、たとえば、ＢｏｄｍｅｒらによりＰＣＴ国際公開第９４／２９３５１号パンフレットに記載されている。具体的態様では、ＩｇＧ１サブクラス及びカッパアイソタイプに対して、本開示の抗体又はその抗原結合性フラグメントの１つ以上のアミノ酸を１つ以上のアロタイプアミノ酸残基と置き換える。アロタイプアミノ酸残基はまた、限定されるものではないが、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．１：３３２－３３８（２００９）に記載されるように、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３サブクラスの重鎖の定常領域、さらにはカッパアイソタイプの軽鎖の定常領域を含む。

他の一態様では、抗体依存細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるために及び／又はＦｃγレセプターに対する抗体の親和性を増加させるために、１つ以上のアミノ酸を修飾することによりＦｃ領域を修飾する。このアプローチは、たとえば、ＰｒｅｓｔａによりＰＣＴ国際公開第００／４２０７２号パンフレットに記載されている。そのうえ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合性部位がマッピングされており、改善された結合を有する変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４，２００１）。

さらに他の一態様では、ＮＫｐ３０抗体又はその抗原結合性フラグメントのグリコシル化が修飾される。たとえば、アグリコシル化抗体を作製可能である（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠如するか、又は低減されたグリコシル化を有する）。グリコシル化は、たとえば、「抗原」への抗体の親和性を増加させるように改変可能である。かかる炭水化物修飾は、たとえば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することにより、達成可能である。たとえば、１つ以上のアミノ酸置換を行って、結果として、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を排除することにより、その部位でグリコシル化を排除することが可能である。かかるアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させることが可能である。かかるアプローチは、たとえば、Ｃｏらにより米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書に記載されている。

加えて、又は或いは、グリコシル化の改変タイプを有する抗体（例えば、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体、又は二分岐化ＧｌｃＮａｃ構造が増加している抗体）を製造し得る。そのような改変グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような炭水化物修飾を、例えば、改変グリコシル化経路を有する宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成し得る。改変グリコシル化経路を有する細胞は、当技術分野で説明されており、且つ組換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が改変されている抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。たとえば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞系が記載されており、その結果として、かかる細胞系で発現される抗体は低フコシル化を呈する。Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットには、Ａｓｎ（２９７）連結炭水化物にフコースを装着する能力が低減された変異体ＣＨＯ細胞系Ｌｅｃｌ３細胞が記載されており、これもまた、その宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化をもたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照されたい）。Ｕｍａｎａらによる国際公開第９９／５４３４２号には、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（たとえば、ベータ（１，４）－ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように工学操作された細胞系が記載されており、その結果として、工学操作細胞系で発現される抗体は、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす増加した二分岐化ＧｌｃＮａｃ構造を呈する（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０，１９９９も参照されたい）。

他の一態様では、ＡＤＣＣの低減が望まれる場合、ヒト抗体サブクラスＩｇＧ４は、ごく限られたＡＤＣＣを有し且つほとんどＣＤＣエフェクター機能を有しないことが多くの既報で示された（Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．２０１０ ＭＡｂｓ，２：１８１－１８９）。しかしながら、天然ＩｇＧ４は、酸性緩衝液中や昇温下などのストレス条件でそれほど安定でないことが判明した（Ａｎｇａｌ，１９９３ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０：１０５－１０８、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，ｅｔ ａｌ，１９９８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：９２６６－９２７３、Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０５：９－１９）。ＡＤＣＣの低減は、ＦｃγＲ結合又はＣ１ｑ結合活性を低減する改変の組合せによりＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター機能を低減又は排除するように工学操作されたＩｇＧ４Ｆｃに抗体を作動可能に連結することにより達成可能である。生物学的薬剤として抗体の物理化学的性質を考慮すると、それほど望ましくないＩｇＧ４固有の性質の１つは、半抗体を形成する溶液中でのその２本の重鎖の動的分離であり、これは「Ｆａｂアーム交換」と呼ばれるプロセスを介してｉｎ ｖｉｖｏで発生する二重特異的抗体をもたらす（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．２００７ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１７：１５５４－１５７）。位置２２８（ＥＵ番号付けシステム）でのセリンからプロリンへの突然変異は、ＩｇＧ４重鎖分離に対して阻害的であるように思われた（Ａｎｇａｌ，１９９３ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０：１０５－１０８、Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０５：９－１９）。ヒンジ及びγＦｃ領域のアミノ酸残基のいくつかは、Ｆｃγレセプターとの抗体相互作用に影響を及ぼすと報告された（Ｃｈａｐｐｅｌ， ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９０３６－９０４０、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ，９：１１５－１１９、Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２９：２６１３－２６２４、Ｃｌｙｎｅｓ，ｅｔ ａｌ，２０００ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６：４４３－４４６、Ａｒｎｏｌｄ ２００７ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ ｉｍｍｕｎｏｌ，２５：２１－５０）。さらに、ヒト集団で稀に発生するいくつかＩｇＧ４アイソフォームもまた、異なる物理化学的性質を誘発可能である（Ｂｒｕｓｃｏ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ，２５：３４９－５５、Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０５：９－１９）。ＡＤＣＣ及びＣＤＣは低いが安定性が良好なＮＫｐ３０抗体を生成するために、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域及びＦｃ領域を修飾し、且ついくつかの改変を導入することが可能である。この修飾ＩｇＧ４ Ｆｃ分子を、配列番号８３～８８、Ｌｉ他への米国特許第８，７３５，５５３号明細書で見出し得る。

ＮＫｐ３０抗体の製造
抗ＮＫｐ３０抗体、抗原結合性フラグメント、及び多重特異性抗体を、当技術分野で既知の任意の手段（例えば、限定されないが、組換え発現、化学合成、及び抗体テトラマーの酵素消化）により製造し得、完全長モノクローナル抗体を、例えば、ハイブリドーマ又は組換え産生により得ることができる。組換え発現は、当技術分野で既知の任意の適切な宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞等）からであり得る。

本開示は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、たとえば、本明細書に記載の相補性決定領域を含む重鎖又は軽鎖の可変領域又はセグメントをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。いくつかの態様では、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２、２２、又は３１からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対して、少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの態様では、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４、２４、又は３３からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対して、少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の核酸配列同一性を有する。

本開示のポリヌクレオチドは、抗ＮＫｐ３０抗体の可変領域配列をコード可能である。それはまた、抗体の可変領域及び定常領域の両方をコード可能である。ポリヌクレオチド配列のいくつかは、例証された抗ＮＫｐ３０抗体の１つの重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。

本開示ではまた、抗ＮＫｐ３０抗体を産生するための発現ベクター及び宿主細胞も提供される。発現ベクターの選択は、ベクターが発現されることが意図される宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、抗ＮＫｐ３０抗体鎖又は抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター及び他のレギュラトリー配列（たとえばエンハンサー）を含有する。いくつかの態様では、誘導条件の制御下以外では挿入配列の発現を防止するように、誘導性プロモーターが採用される。誘導性プロモーターは、たとえば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、又は熱ショックプロモーターを含む。トランスフォーム生物の培養物は、宿主細胞が発現産物に十分な耐容性のあるコード配列の集団をバイアスすることなく非誘導条件下で拡大可能である。プロモーターのほか、他のレギュラトリーエレメントもまた、抗ＮＫｐ３０抗体又は抗原結合性フラグメントの効率的発現のために必要とされたり又は望まれたりすることがある。こうしたエレメントは、典型的には、ＡＴＧ開始コドン及び近接リボソーム結合部位又は他の配列を含む。そのほか、発現の効率は、使用時に細胞システムに適したエンハンサーを含めることにより増強可能である（たとえば、Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４、及びＢｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７を参照されたい）。たとえば、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞内での発現を増加させることが可能である。

抗ＮＫｐ３０抗体鎖を保有及び発現するための宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞のどちらかでありうる。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本開示のポリヌクレオチドのクローニング及び発現に有用な原核宿主の１つである。使用に好適な他の微生物宿主としては、桿菌、たとえば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び他のエンテロバクテリア科細菌、たとえば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種が挙げられる。こうした原核宿主では、典型的には宿主細胞に適合可能な発現制御配列（たとえば複製起点）を含有する発現ベクターを作製することも可能である。そのほか、いずれかの数のさまざまな周知のプロモーター、たとえば、ラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、ベータラクタマーゼプロモーターシステム、又はファージラムダ由来のプロモーターシステムが存在するであろう。プロモーターは、典型的には、任意にオペレーター配列とともに発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び終了するためのリボソーム結合部位配列を有する。他の微生物たとえば酵母もまた、抗ＮＫｐ３０ポリペプチドを発現するように採用可能である。バキュロウイルスベクターとの組合せで昆虫細胞を使用することも可能である。

他の態様では、本開示の抗ＮＫｐ３０ポリペプチドを産生するために、哺乳動物宿主細胞が使用される。たとえば、それは、内因性イムノグロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞系又は外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞系のどちらかでありうる。こうしたものとしては、いずれかの正常可死性又は異常若しくは正常不死性の動物細胞又はヒト細胞が挙げられる。たとえば、ＣＨＯ細胞系、各種ＣＯＳ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞、骨髄腫細胞系、トランスフォームＢ細胞、及びハイブリドーマを含めて、インタクトイムノグロブリンを分泌する能力のあるいくつかの好適な宿主細胞系が開発されてきた。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養の使用は、たとえば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，１９８７で一般に考察されている。哺乳動物宿主細胞用の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列（たとえば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９－６８，１９８６を参照されたい）、及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列などの必要な情報処理部位を含みうる。こうした発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、ステージ特異的、及び／又はモジュレート可能若しくはレギュレート可能でありうる。有用なプロモーターとしては、限定されるものではないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（たとえばヒト前初期ＣＭＶプロモーター）、構成的ＣＭＶプロモーター、及び当技術分野で公知のプロモーター－エンハンサー組合せが挙げられる。

ＮＫｐ３０多重特異性抗体
一実施形態では、本明細書で開示されている抗ＮＫｐ３０抗体を、抗ＮＫｐ３０×ＴＡＡ多重特異性抗体に組み込み得、ここで、ＴＡＡは、任意のヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。抗体分子は、多重特異性分子（例えば、いくつかの抗原結合性ドメインを含む）であり、少なくとも１つ抗原結合性ドメイン配列は、第１のエピトープとしてのＮＫｐ３０に特異的に結合し、別の抗原結合性ドメイン配列は、第２のエピトープとしてのＴＡＡに特異的に結合する。一実施形態では、この多重特異性抗体は、第３、第４、又は第５の抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、この多重特異性抗体は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、又は四重特異性抗体である。各例では、この多重特異性抗体は、少なくとも１つの抗ＮＫｐ３０抗原結合性ドメインと、少なくとも１つの抗ＴＡＡ抗原結合性ドメインとを含む。

一実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。本明細書で使用される場合、二重特異性抗体は、２種の抗原のみに特異的に結合する。この二重特異性抗体は、ＮＫｐ３０に特異的に結合する第１の抗原結合性ドメインと、ＴＡＡに特異的に結合する第２の抗原結合性ドメインとを含む。これとして、第１のエピトープとしてのＮＫｐ３０に特異的に結合する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインと、第２のエピトープとしてのＴＡＡに特異的に結合する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインとを含む二重特異性抗体が挙げられる。別の実施形態では、この二重特異性抗体は、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体の抗原結合性フラグメントと、ＴＡＡに特異的に結合する抗原結合性フラグメントとを含む。二重特異性抗体は抗原結合性フラグメントを含み、この抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）若しくはｓｃＦｖであり得る。

以前の実験（Ｃｏｌｏｍａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１５９－１６３（１９９７））により、一本鎖抗ダンシル抗体Ｆｖ（ｓｃＦｖ）をコードするＤＮＡをＩｇＧ抗ダンシル抗体のＣ末端（ＣＨ３－ｓｃＦｖ）又はヒンジ（ヒンジ－ｓｃＦｖ）の後ろに融合させることにより工学操作されている四価二重特異性抗体が説明されていた。本開示は、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に産生され得る、少なくとも２つの抗原結合ドメインを有する多価抗体（例えば四価抗体）を提供する。本明細書における多価抗体は、３～８個であるが好ましくは４個の抗原結合性ドメインを含み、この抗原結合性ドメインは、少なくとも２種の抗原に特異的に結合する。

本開示は、ＶＤ１－ＣＬ－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－ＣＨ１－Ｆｃ又はＶＤ１－ＣＨ－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－ＣＬ－Ｆｃ（式中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１本のポリペプチド鎖であり、ＣＨ又はＣＬは、定常重ドメイン又は定常軽ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、少なくとも２つのアミノ酸からなるリンカーである）を含む二重特異性四価抗体を提供する。

一実施形態では、二重特異性四価抗体は、４本のポリペプチド鎖（即ち、それぞれが第１のＶＨドメイン（ＶＨ１）、第１のＣＨ１ドメイン、第２のＶＨドメイン（ＶＨ２）、第２のＣＨ１を含むＦｃ領域、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３を含む２本の重鎖、並びに２本の軽鎖であって、各軽鎖が、第１のＶＬドメイン（ＶＬ１）、第１のＣＬ領域、第２のＶＬドメイン（ＶＬ２）、及び第２のＣＬ領域を含む、２本の軽鎖）の多量体であり得る。別の実施形態では、二重特異性四価は、単一のＦｃドメインに一緒に連結されている複数の抗体Ｆａｂフラグメントを含み得る。例えば、Ｆａｂ１は、ポリペプチドリンカーを介してＦａｂ２に連結され得、このＦａｂ２は、Ｆａｂの１つのＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、次いでＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３を含む。例えば、抗ＴＡＡ Ｆａｂは、リンカーを介して、抗ＴＡＡ ＦａｂのＣＬドメインから抗ＮＫｐ３０ ＦａｂのＶＨドメインへと連結され得、且つ抗Ｎｋｐ３０ ＦａｂのＣＨ１ドメインからヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインへと連結され得る。別の例では、抗Ｎｋｐ３０ Ｆａｂは、リンカーを介して、抗Ｎｋｐ３０ ＦａｂのＣＬドメインから抗ＴＡＡ ＦａｂのＶＨドメインへと連結され得、且つ抗ＴＡＡ ＦａｂのＣＨ１ドメインからヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨドメインへと連結され得る。

リンカー
二重特異性四価抗体のポリペプチド鎖のドメイン及び／又は領域を様々な長さのリンカー領域により分離し得ることも理解される。一部の実施形態では、エピトープ結合性ドメインは、リンカー領域により、互いに、ＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、又はＦｃ領域全体から分離されている。例えば、ＶＬ１－ＣＬ－（リンカー） ＶＨ２－ＣＨ１。そのようなリンカー領域は、アミノ酸のランダムな組合わせを含み得るか、又はアミノ酸の制限されたセットを含み得る。そのようなリンカー領域は、柔軟であり得るか、又は剛性であり得る（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１５５２７５号明細書を参照されたい）。

多重特異性抗体は、二量体化デバイス（例えば、ロイシンジッパー（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２１４８：１５４７－５３；ｄｅ Ｋｒｕｉｆｅｔａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６ ２７１：７６３０－４）、及びＩｇ Ｃ／ＣＨ１ドメイン（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２２：２５９－６４））により、柔軟なリンカー（Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４ ２６９：１９９－２０６；Ｍａｃｋｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９５ ９２：７０２１－５；Ｚａｐａｔａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９５ ８．１０５７－６２）を使用するか又は使用することなく、２つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はＦａｂフラグメントを遺伝子的に融合させることにより構築されており；二特異性抗体（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８ ９０：６４４４－８；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１９９６ １４：１９２－６）により構築されており；Ｆａｂ－ｓｃＦｖ融合（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ １６５：７０５０－７）により構築されており；且つミニ抗体形式（Ｐａｃｋｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２．３１：１５７９－８４；Ｐａｃｋｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９３ １１：１２７１－７）により構築されている。

本明細書で開示されている二重特異性四価抗体は、エピトープ結合性ドメイン、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はＦｃ領域の内の１つ又は複数の間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５個、又はより多くのアミノ酸残基からなるリンカー領域を含む。一部の実施形態では、アミノ酸グリシン及びセリンが、リンカー領域内のアミノ酸を構成する。別の実施形態では、リンカーは下記であり得る：ＧＳ（配列番号４３）、ＧＧＳ（配列番号４４）、ＧＳＧ（配列番号４５）、ＳＧＧ（配列番号４６）、ＧＧＧ（配列番号４７）、ＧＧＧＳ（配列番号４８）、ＳＧＧＧ（配列番号４９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号５０）、ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号５１）、ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号５２）、ＧＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号５３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号５６）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号５７）、ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号５８）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号５９）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号６０）、ＳＡＫＴＴＰ（配列番号６１）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号６２）、ＲＡＤＡＡＰ（配列番号６３）、ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号６４）、ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号６５）、ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号６６）、ＳＡＫＴＴＰ（配列番号６７）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号６８）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号６９）、ＡＤＡＡＰ（配列番号７０）、ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号７１）、ＴＶＡＡＰ（配列番号７２）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号７３）、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号７４）、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号７５）、ＡＫＴＴＰＰ（配列番号７６）、ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号７７）、ＡＫＴＴＡＰ（配列番号７８）、ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号７９）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号８０）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号８１）、ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号８２）、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号８３）、及びＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号８４）、又はこれらの任意の組合せ（国際公開第２００７／０２４７１５号パンフレットを参照されたい）。例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号５０）をＳＡＫＴＴＰ（配列番号６７）と組み合わせて、ＧＧＧＧＳＳＡＫＴＴＰ（配列番号８５）を形成し得た。

二量体化特異的アミノ酸
一実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも１つの二量体化特異的アミノ酸変化を含む。二量体化特異的アミノ酸変化により、「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）」相互作用が生じ、正しい多重特異性抗体の構築が増加する。二量体化特異的アミノ酸は、ＣＨ１ドメイン内であり得るか、ＣＬドメイン内であり得るか、又はこれらの組合せであり得る。二量体化特異的アミノ酸を使用して、ＣＨ１ドメインと他のＣＨ１ドメインとを対にし（ＣＨ１－ＣＨ１）、ＣＬドメインと他のＣＬドメインとを対にし（ＣＬ－ＣＬ）、且つ少なくとも国際公開第２０１４０８２１７９号パンフレット、同第２０１５１８１８０５号パンフレット、及び同第２０１７０５９５５１号パンフレットの開示で見出され得る。二量体化特異的アミノ酸はまた、Ｆｃドメイン内でもあり得、且つＣＨ１ドメイン又はＣＬドメイン内の二量体化特異的アミノ酸と組み合わされ得る。

検出及び診断の方法
本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントは、限定されるものではないが、ＮＫｐ３０の検出方法をはじめとするさまざまな用途に有用である。一態様では、抗体又は抗原結合性フラグメントは、生物学的サンプル中のＮＫｐ３０の存在を検出するのに有用である。本明細書で用いられる「ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ（～を検出すること）」という用語は、定量的又は定性的な検出を含む。ある特定の態様では、生物学的サンプルは、細胞又は組織を含む。他の態様では、かかる組織は、他の組織と比べてより高レベルのＮＫｐ３０を発現する正常組織及び／又は癌性組織を含む。

一態様では、本開示は、生物学的サンプル中のＮＫｐ３０の存在を検出する方法を提供する。ある特定の態様では、本方法は、抗原への抗体の結合を許容する条件下で生物学的サンプルと抗ＮＫｐ３０抗体とを接触させることと、抗体と抗原との間に複合体が形成されるかを検出することと、を含む。生態学的サンプルとして、尿サンプル、組織サンプル、痰サンプル、又は血液サンプルが挙げられ得るが、これらに限定されない。

同様に含まれるのは、ＮＫｐ３０の発現と関連する障害を診断する方法である。ある特定の態様では、この方法は、試験細胞と抗ＮＫｐ３０抗体とを接触させること；抗ＮＫｐ３０抗体のＮＫｐ３０ポリペプチドへの結合を検出することにより、この試験細胞により発現されたＮＫｐ３０の発現のレベルを（定量的か又は定性的かのいずれかで）決定すること；及びこの試験細胞による発現のレベルと、コントロール細胞（例えば、試験細胞と同一の組織起源の正常細胞、又は非ＮＫｐ３０発現細胞）中でのＮＫｐ３０発現のレベルとを比較することであって、このコントロール細胞と比較した試験細胞中でのＮＫｐ３０発現の高いレベルは、ＮＫｐ３０の発現と関連する障害の存在を示す、比較することを含む。

治療方法
本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＮＫｐ３０に関連する障害又は疾患の治療方法が挙げられるがこれに限定されない様々な用途で有用である。一態様では、ＮＫｐ３０に関連する障害又は疾患は、癌である。ＮＫｐ３０×ＴＡＡ多重特異性抗体の場合には、癌は、ＴＡＡに対して特異的であり得、ＮＫｐ３０は、ＴＡＡ発現腫瘍にＮＫ細胞を動員するように作用する。

一態様では、本開示は、癌を治療する方法を提供する。ある特定の態様では、この方法は、抗ＮＫｐ３０抗体、抗原結合性フラグメント、又はＮＫｐ３０含有多重特異性抗体の有効量を、必要とする患者に投与することを含む。この癌として下記が挙げられ得るが、これらに限定されない：胃癌、結腸癌、膵癌、乳癌、頭頸部癌、腎癌、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、及び肉腫。

本明細書で開示されている抗体又は抗原結合性フラグメントを、任意の好適な手段により投与し得、例えば、非経口投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、並びに局所治療が望まれている場合には病巣内投与又は腫瘍内投与により投与し得る。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投与は、部分的には投与が短期であるか長期であるかに依存して、いずれかの好適な経路、たとえば、静脈内注射や皮下注射などの注射によることが可能である。限定されるものではないが、単回投与又は各種時間点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入をはじめとする各種投与スケジュールが本明細書で企図される。

本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントは、適正医療規範に準拠して、製剤化、用量設定、及び投与されるであろう。これとの関連での考慮因子としては、治療される特定障害、治療される特定哺乳動物、個々の患者の臨床病態、障害の原因、作用剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、及び医師に公知の他の因子が挙げられる。抗体は、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１種以上の作用剤とともに製剤化される必要はないが、任意にそのように製剤化される。かかる他の作用剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療のタイプ、及び以上で考察された他の因子に依存する。これらは、本明細書に記載のものと同一の投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１～９９％で、又は経験的／臨床的に適切であると決定されたいずれかの投与量及びいずれかの経路で、一般に使用される。

疾患の予防又は治療では、本開示の抗体、抗原結合性フラグメント又は多重特異性抗体の適切投与量は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴及び抗体に対する反応、並びに担当医の自由裁量に依存するであろう。抗体は、好適には、１回で又は一連の治療にわたり患者に投与される。たとえば、１回以上の個別投与によるか又は連続注入によるかにもかかわらず、疾患のタイプ及び重症度に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの抗体は、患者に投与するための初期候補投与量でありうる。典型的な一日投与量は、以上に挙げた因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲内でありうる。数日間以上にわたる繰返し投与では、病態に依存して、治療は、一般に疾患症状の所望の抑制を生じるまで継続されるであろう。そのような用量を断続的に投与し得、例えば、（例えば、患者が約２～約２０回の投与を受けるように）週１回又は３週間に１回投与し得る。初期の高いローディン用量、続いて１回又は複数回のより低い用量を、投与し得る。しかしながら、他の投与レジメンが有用であり得、この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。

組合せ療法
一態様では、本開示のＮＫｐ３０抗体、抗原結合性フラグメント、多重特異性抗体を、他の治療薬と組み合わせて使用し得る。本開示のＮＫｐ３０抗体とともに使用可能な他の治療剤としては、限定されるものではないが、化学療法剤（たとえば、パクリタキセル又はパクリタキセル剤、（たとえば、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ドセタキセル、カルボプラチン、トポテカン、シスプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、レナリドマイド、５－アザシチジン、イホスファミド、オキサリプラチン、ペメトレキセド二ナトリウム、シクロホスファミド、エトポシド、デシタビン、フルダラビン、ビンクリスチン、ベンダムスチン、クロラムブシル、ブスルファン、ゲムシタビン、メルファラン、ペントスタチン、マイトキサントロン、ペメトレキセド二ナトリウム）、チロシンキナーゼ阻害剤（たとえばＥＧＦＲ阻害剤（たとえばエルロチニブ）、マルチキナーゼ阻害剤（たとえば、ＭＧＣＤ２６５、ＲＧＢ－２８６６３８）、ＣＤ－２０標的化剤（たとえば、リツキシマブ、オファツムマブ、ＲＯ５０７２７５９、ＬＦＢ－Ｒ６０３）、ＣＤ５２標的化剤（たとえばアレムツズマブ））、プレドニゾロン、ダルベポエチンアルファ、レナリドマイド、Ｂｃｌ－２阻害剤（たとえばオブリマーセンナトリウム）、オーロラキナーゼ阻害剤（たとえば、ＭＬＮ８２３７、ＴＡＫ－９０１）、プロテアソーム阻害剤（たとえばボルテゾミブ）、ＣＤ－１９標的化剤（たとえば、ＭＥＤＩ－５５１、ＭＯＲ２０８）、ＭＥＫ阻害剤（たとえばＡＢＴ－３４８）、ＪＡＫ－２阻害剤（たとえばＩＮＣＢ０１８４２４）、ｍＴＯＲ阻害剤（たとえばテムシロリムス、エベロリムス）、ＢＣＲ／ＡＢＬ阻害剤（たとえば、イマチニブ）、ＥＴ－Ａレセプターアンタゴニスト（たとえばＺＤ４０５４）、ＴＲＡＩＬレセプター２（ＴＲ－２）アゴニスト（たとえばＣＳ－１００８）、ＥＧＥＮ－００１、Ｐｏｌｏ様キナーゼ１阻害剤（たとえばＢＩ６７２）が挙げられる。

医薬組成物及び製剤
また、抗ＮＫｐ３０抗体若しくはその抗原結合性フラグメントを含む医薬製剤又は抗ＮＫｐ３０抗体若しくは抗原結合性フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含めて、組成物も提供される。ある特定の実施形態では、組成物は、ＮＫｐ３０に結合する１種以上の抗体若しくは抗原結合性フラグメント、又はＮＫｐ３０に結合する１種以上の抗体若しくは抗原結合性フラグメントをコードする配列を含む１種以上のポリヌクレオチドを含む。こうした組成物は、好適な担体、たとえば、当技術分野で周知の緩衝剤を含む薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含みうる。

本明細書に記載の抗ＮＫｐ３０抗体又は抗原結合性フラグメントの医薬製剤は、所望の純度を有するかかる抗体又は抗原結合性フラグメントと、１種以上の任意の薬学的に許容可能な担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と、を混合することにより、凍結乾燥製剤又は水性溶液剤の形態で調製される。薬学的に許容可能な担体は、採用された投与量及び濃度でレシピエントに対して一般に非毒性であり、限定されるものではないが、緩衝剤、たとえば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸、抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）、保存剤（たとえば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ヘキサメトニウムクロライド、ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、アルキルパラベン、たとえば、メチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、たとえば、血清アルブミン、ゼラチン、又はイムノグロブリン、親水性ポリマー、たとえば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、たとえば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン、単糖、二糖、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む）、キレート化剤、たとえば、ＥＤＴＡ、糖、たとえば、スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール、塩形成性カウンターイオン、たとえば、ナトリウム、金属複合体（たとえばＺｎタンパク質複合体）、及び／又は非イオン性界面活性剤、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。本明細書中の模範的な薬学的に許容可能な担体としては、間質薬剤分散剤、たとえば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、たとえば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、たとえば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）がさらに挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の模範的ｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許第７，８７１，６０７号明細書及び米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号明細書に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１種以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。

模範的凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号明細書に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号明細書及び国際公開第２００６／０４４９０８号パンフレットに記載のものを含み、後者の製剤は、ヒスチジン酢酸緩衝剤を含む。

持続放出製剤を調製可能である。持続放出製剤の好適例は、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、フィルムや又はマイクロカプセルなどの造形品の形態である。

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般に無菌である。無菌性は、たとえば、滅菌濾過膜に通して濾過することによる簡単に達成可能である。

実施例１： 抗ＮＫｐ３０モノクローナル抗体の発生
従来のハイブリドーマ融合技術（ｄｅ Ｓｔ Ｇｒｏｔｈ ａｎｄ Ｓｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，１９８０ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１、Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒ，２００７ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７８：１）に基づいて、抗ＮＫｐ３０モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を発生させた。酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイで高い結合活性を有するｍＡｂｓを選択し、さらなる特徴付けに供した。

免疫化及び結合アッセイのためのＮＫｐ３０組換えタンパク質
ＧｅｎＢａｎｋ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿１４７１３０．１）に基づいて、完全長ヒトＮＫｐ３０をコードするｃＮＤＡ（配列番号１）を、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）から購入した。配列番号１のアミノ酸（ＡＡ）１９～１３５に対応する完全長ヒトＮＫｐ３０の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のコード領域を、ＰＣＲにより増幅させ、マウスＩｇＧ２ａのＦｃドメイン又はヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃドメインのいずれかに融合したＣ末端と共にｐｃＤＮＡ３．１ベースの発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にクローニングして、２種の組換え融合タンパク質発現プラスミドＮＫｐ３０－ｍＩｇＧ２ａ及びＮＫｐ３０－ｈｕＩｇＧ１それぞれを得た。ＮＫｐ３０融合タンパク質の模式図を、図１に示す。組換え融合タンパク質産生のために、ＮＫｐ３０－ｍＩｇＧ２ａプラスミド及びＮＫｐ３０－ｈｕＩｇＧ１プラスミドを２９３Ｇ細胞（インハウスで開発した）に一過的にトランスフェクトし、回転シェーカーを備えたＣＯ_２インキュベーター中で７日にわたり培養した。組換えタンパク質を含む上清を回収し、遠心分離により清浄化した。ＮＫｐ３０－ｍＩｇＧ２ａ及びＮＫｐ３０－ｈｕＩｇＧ１を、プロテインＡカラム（カタログ番号１７１２７９０１，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。ＮＫｐ３０－ｍＩｇＧ２ａタンパク質及びＮＫｐ３０－ｈｕＩｇＧ１タンパク質の両方を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、少量のアリコートで－８０℃フリーザー中にて保存した。

安定発現細胞系
完全長ヒトＮＫｐ３０（ｈｕＮＫｐ３０）又はカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＮＫｐ３０（ｍｋＮＫｐ３０、アクセッション＃：ＡＪ２７８３８９．１（配列番号４２）、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃｈｉｎａから購入）を発現する細胞系を確立するために、レトロウイルスベクターｐＦＢ－Ｎｅｏ（カタログ番号２１７５６１，Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）にクローニングした。以前のプロトコル（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｂｌｏｏｄ １０６，１５４４－１５５１）に従って、デュアルトロピックレトロウイルスベクター（ｄｕａｌ－ｔｒｏｐｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）を生成した。ｈｕＮＫｐ３０を含むベクター及びｍｋＮＫｐ３０を含むベクターを、それぞれ、ＮＫ９２ＭＩ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）に形質導入して、細胞系ＮＫ９２ＭＩ／ｈｕＮＫｐ３０及びＮＫ９２ＭＩ／ｍｋＮＫｐ３０を生成した。Ｇ４１８を含む培地中での培養、及びＦＡＣＳ結合アッセイにより、高発現細胞系を選択した。

免疫化、ハイブリドーマ融合、及びクローニング
８～１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（ＨＦＫ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＣＯ．，ＬＴＤ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ製）を、ＮＫｐ３０－ｍＩｇＧ２ａ １０μｇ及び水溶性アジュバント（カタログ番号ＫＸ０２１００４１，ＫａｎｇＢｉＱｕａｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）を含む抗原混合物 １００μＬで腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫化した。この手順を、３週間後に繰り返した。２回目の免疫化の２週間後に、マウス血清を、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによりＮＫｐ３０結合に関して評価した。血清スクリーニングの１０日後、抗ＮＫｐ３０抗体血清中力価が最高のマウスを、ＮＫｐ３０－ｍＩｇＧ２ａ ５０μｇでｉ．ｐ．注射によりブーストした。ブーストの３日後、脾細胞を単離し、標準的技術（Ｇｅｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ，１９７７ ３（２）：２３１－６）を使用して、マウス骨髄腫細胞系ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ）に融合した。

ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによる抗体のＮＫｐ３０結合活性の評価
ハイブリドーマクローンの上清を、（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）３７８：３３－５２）で説明されている基本的技術による修正ＥＬＩＳＡにより最初にスクリーニングした。ＮＫｐ３０－ｈｕＩｇＧ１タンパク質を、９６ウェルプレート中でコーティングした。ＨＲＰ連結抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号７０７６Ｓ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）及び基質（カタログ番号００－４２０１－５６，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を使用して、４５０ｎｍの波長で色吸光度シグナルを発生させ、このシグナルを、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍ（商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を使用することにより測定した。上記で説明したＮＫ９２ＭＩ／ｈｕＮＫｐ３０細胞又はＮＫ９２ｍｉ／ｍｋＮＫｐ３０細胞のいずれかを使用して、ＦＡＣＳによりＥＬＩＳＡ陽性クローンをさらに検証した。ＮＫｐ３０発現細胞（１０^５個の細胞／ウェル）をＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマ上清と共にインキュベートし、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ－６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号Ａ０４７３，Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ）と結合させた。細胞蛍光を、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴ、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を使用して定量した。

ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳスクリーニングの両方で陽性シグナルを示すハイブリドーマからの馴化培地を機能アッセイに付して、ヒト免疫細胞ベースのアッセイで良好な機能活性を有する抗体を同定した（下記のセクションを参照されたい）。所望の機能活性を有する抗体をさらにサブクローニングし、特徴付けた。

ハイブリドーマのサブクローニング及び血清フリー培地又は低血清培地への適応
上記で説明したＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、及び機能アッセイによる一次スクリーニングの後、陽性ハイブリドーマクローンを、限外希釈によりサブクローニングした。各プレートからのＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳスクリーニングに基づく３つの陽性サブクローンを選択し、機能アッセイにより特徴付けた。トップ抗体サブクローンを機能アッセイにより検証し、３％ＦＢＳを含むＣＤＭ４ＭＡｂ培地（カタログ番号ＳＨ３０８０１．０２，Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）での増殖に適合させた。

モノクローナル抗体の発現及び精製
抗体発現プラスミド（カタログ番号Ｒ７９００７，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一過的にトランスフェクトしたハイブリドーマ細胞又は２９３Ｇ細胞を、ＣＤＭ４ＭＡｂ培地（カタログ番号ＳＨ３０８０１．０２，Ｈｙｃｌｏｎｅ）又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（カタログ番号１２３３８０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかで培養し、３７℃で５～７日にわたりＣＯ_２インキュベーター中でインキュベートした。馴化培地を遠心分離により回収し、０．２２μｍ膜に通してろ過した後に精製した。マウス抗体又は組換え抗体を含む上清を、製造業者の手引書に従ってプロテインＡカラム（カタログ番号１７１２７９０１，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライして結合させた。この手順により、９０％を超える純度で抗体が得られた。プロテインＡ親和性精製抗体を、ＰＢＳに対して透析したか、又はＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（商標）カラム（カタログ番号１７５３１８０１，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してさらに精製して凝集物を除去した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。最終抗体調製物を、－８０℃フリーザー中においてアリコートで保存した。

実施例２ ＮＫｐ３０抗体のクローニング及び配列解析
マウスハイブリドーマクローンを採取して、製造業者のプロトコルに基づいてＵｌｔｒａｐｕｒｅ ＲＮＡキット（カタログ番号７４１０４，ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して全細胞ＲＮＡを調製した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号１８０８０－０５１）を使用して、第１の鎖のｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲキット（カタログ番号ＣＷ０６８６，ＣＷＢｉｏ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）を使用して、マウスｍＡｂの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅を実施した。ＶＨ及びＶＬの抗体ｃＤＮＡクローニングに使用するオリゴプライマーを、既に報告されている配列（Ｂｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７：４６１）に基づいてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）により合成した。次いで、ＰＣＲ産物を、ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（カタログ番号Ｃ Ｂ１０１－０２，ＴｒａｎｓＧｅｎ，Ｃｈｉｎａ）にサブクローニングし、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）によりシーケンシングした。ＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列を、ＤＮＡシーケンシング結果から推測した。

マウスｍＡｂを、配列相同性を比較することにより分析し、図２に示す配列類似性に基づいて分類した。相補性決定領域（ＣＤＲ）を、配列アノテーション及び配列解析により、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ １９７０ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１－２５０）及びＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ １９９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：２０９－２１２）システムに基づいて定義した。代表的なトップクローン（ｍｕ１８３）のアミノ酸配列を、上記の表１に列挙する。

実施例３ ＳＰＲによる精製済マウス抗ＮＫｐ３０抗体の親和性決定
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳにおいて高い結合活性を有し且つ細胞ベースのアッセイ（上記実施例１で説明されている）において強力な機能活性を有するＮＫｐ３０抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ－２００（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＳＰＲアッセイにより、結合速度論に関して特徴付けた。簡潔に述べると、抗マウスＩｇＧ抗体を、活性化ＣＭ５バイオセンサーチップ（カタログ番号ＢＲ１００５３０，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で固定した。このチップの表面上で精製済Ｎｋｐ３０マウス抗体を流し、抗マウスＩｇＧ抗体で捕捉した。次いで、このチップの表面上で、ヒスタグを有するヒトＮＫｐ３０の段階希釈物（０．０９８ｎＭ～２５ｎＭ）を流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化を解析して、１対１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することにより会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、比ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして算出した。選択された抗体（例えば、ｍｕ１８３、ｍｕ１７、及びｍｕ１９１）の結合親和性プロファイルを、図３及び表３に示す。

実施例４ マウス抗ヒトＮＫｐ３０ ｍＡｂ ｍｕ１８３のヒト化
ｍＡｂのヒト化及び工学操作
ｍｕ１８３のヒト化のために、ＩＭＧＴ及びＮＣＢＩでのヒトイムノグロブリン遺伝子データベースに対してＢＬＡＳＴアルゴリズムを実行することにより、ｍｕ１８３可変領域のｃＤＮＡ配列に対して高度の相同性を共有する配列に関して、ヒト生殖系ＩｇＧ遺伝子を探索した。高頻度でヒト抗体レパートリー中に存在し（Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００９ ＰＮＡＳ １０６：２０２１６－２０２２１）、且つｍｕ１８３に対して高度に相同的であるヒトＩＧＶＨ及びＩＧＶＬ遺伝子を、ヒト化のためのテンプレートとして選択した。

ヒト化を、ＣＤＲ移植により行ない（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ２４８：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ヒト化抗体（ＢＧＡ１８３１～ＢＧＡ１８３３）を、インハウスで開発された発現ベクターを使用して、ヒトＩｇＧ１ｍｆ（配列番号４１）フォーマットとして工学操作した。ヒト化の初期ラウンドでは、シミュレートされた３Ｄ構造により、フレームワーク領域中でのマウスからヒトのアミノ酸残基への変異がガイドされ、ＣＤＲのカノニカル構造を維持するのに構造上重要なマウスフレームワーク残基は、最初にヒト化された抗体ＢＧＡ１８３１（配列番号３～８）で保持された。具外的には、ｍｕ１８３ ＶＨのＣＤＲ（配列番号３～５）を、保持された９つのマウスフレームワーク（Ｖ_１０、Ｖ_１２、Ｔ_３０、Ａ_３７、Ｉ_４８、Ａ_６８、Ｌ_７０、Ｖ_７２、及びＡ_７９）残基を有するヒト生殖系可変遺伝子ＩＧＶＨ １－４６のフレームワーク（配列番号１１）に移植した。ｍｕ１８３ ＶＬのＣＤＲ（配列番号６～８）を、５つのマウスフレームワーク残基（Ｑ_１、Ｖ_３、Ｌ_４、Ｓ_４３、及びＦ_７３）が保持されているヒト生殖系可変遺伝子ＩＧＶＬ １－３９のフレームワーク（配列番号１３）に移植した。

ＢＧＡ１８３１を、容易に適応するサブクローニング部位をそれぞれ有する、ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号４１）と呼ばれるヒトＩｇＧ１変異体の定常領域及び軽鎖を含む、インハウスで開発された発現ベクターを使用して、ヒト完全長抗体フォーマットとして構築した。ＢＧＡ１８３１抗体の発現及び調製を、上記２種の構築物の２９３Ｇ細胞への共トランスフェクション、及びプロテインＡカラム（カタログ番号１７５４３８０２，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する精製により達成した。精製済抗体を、ＰＢＳ中で０．５～５ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、－８０℃フリーザー中にてアリコートで保存した。

ＢＧＡ１８３１において、いくつかの単一アミノ酸変化を行ない、ＶＬのフレームワーク領域中の保持されているマウス残基を、対応するヒト生殖系残基へと変換した。得られたヒト化バージョンは全て、同様の結合活性及び機能活性を有した。全てのヒト化変異を、特定の部位で変異を含むプライマーと、部位特異的変異誘発キット（カタログ番号ＦＭ１１１－０２，ＴｒａｎｓＧｅｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）とを使用して行なった。所望の変異を、シーケンシング解析により検証し、変異体抗体を、既に説明している結合アッセイ及び機能アッセイで試験した。

他の抗体を、ＣＤＲ及びフレームワーク領域に変異を導入することによりさらに工学操作して、ヒトにおける治療的使用に関する分子的性質及び生物物理的性質を改善した。考慮すべきこととして、アミノ酸組成、熱安定性（Ｔ_ｍ）、表面疎水性、及び等電点（ｐＩ）、さらには機能活性の維持が挙げられる。

ヒト化モノクローナル抗体のさらに工学操作されたバージョンを、上記で説明されている変異プロセスから得て、詳細に特徴付けた。工学操作された抗体の解析により、ＢＧＡ１８３２（配列番号１９、４、２０、６～８）及びＢＧＡ１８３１（配列番号３～８）の両方は、結合親和性及び機能活性（例えば、ＮＫｐ３０媒介下流シグナル伝達の誘発）が非常に類似していることが示された。工学操作された抗体の親和性は、このプロセス中の所望の親和性へと調整され、その結果、ＢＧＡ１８３３（配列番号１９、４、２９、６～８）は、最初の抗体と比べて親和性が約１０倍低い。親和性の決定のために、抗体を、抗ヒトＦｃ表面により捕捉し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術に基づく親和性アッセイで使用した。抗ＮＫｐ３０抗体のＳＰＲにより決定された結合プロファイルの結果の概要を、表４に示す。上記で示した全てのヒト化抗体を、健康なドナーから単離された初代ヒト免疫細胞に対する機能活性に関しても確認した（下記の実施例７で説明されている）。

実施例５ 天然ＮＫｐ３０に対する抗ＮＫｐ３０抗体の様々なバージョンの結合活性
生細胞上の天然ＮＫｐ３０に対する抗ＮＫｐ３０抗体の結合活性を評価するために、ＮＫ９２ＭＩ細胞を、ヒトＮＫｐ３０を過剰発現するようにトランスフェクトした。生きているＮＫ９２ｍｉ／ＮＫｐ３０発現細胞を、９６ウェルプレートに播種し、抗ＮＫｐ３０抗体の連続希釈物と共にインキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧを二次抗体として使用して、細胞表面への抗体の結合を検出した。ヒト天然ＮＫｐ３０への用量依存結合のＥＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）により用量－反応データを４パラメータロジスティックモデルに当てはめることにより決定した。図６及び表６で示されているように、ヒト化抗ＮＫｐ３０抗体ＢＧＡ１８３１及びＢＧＡ１８３３の両方が、生細胞上の天然ＮＫｐ３０に対して高い結合親和性を示した。

実施例６ ＢＧＡ１８３３のエピトープマッピング
ＢＧＡ１８３３の結合エピトープを特徴付けるために、既に報告されているＮＫｐ３０の結晶構造からの情報に基づいて、ＮＫｐ３０の１０個のアミノ酸残基を個別にアラニンへと変異させて、１０種の単一変異ＮＫｐ３０変異体を生成した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０１１ ２０８：７０３－７１４）。変異体ＮＫｐ３０タンパク質を、野生型ＮＫｐ３０タンパク質と共に、ＢＧＡ１８３３による認識及び結合に関して分析した。比較のために、別のヒト化抗ＮＫｐ３０抗体ＢＧＡ１９１３も、同一のＥＬＩＳＡアッセイで分析した。このアッセイでは、野生型又は変異体Ｎｋｐ３０－Ｆｃのそれぞれ ５０ｎｇを、ＥＬＩＳＡプレート中でコーティングした。ブロッキング後、このプレートに、２０ｎＭの濃度のＢＧＡ１８３３抗体又はＢＧＡ１９１３抗体 １００μｌを添加し、各抗体の結合シグナルを、ＨＲＰ連結二次抗体により検出した。全てのＥＬＩＳＡ結果を、標準として野生型ＮＫｐ３０－Ｆｃ結合シグナルのＥＬＳＡ読み取りの平均値を使用して正規化した。データ解析を単純化するために、特定の変異体ＮＫｐ３０に関する抗体のＥＬＩＳＡ結合シグナルが２５％以下に低下した場合には、この部位でのアミノ酸をエピトープに重要であると見なした。野生型ＮＫｐ３０又は変異体ＮＫｐ３０を使用するＥＬＩＳＡ結合アッセイでは、アミノ酸Ｉ５０Ａ及びＬ８６Ａ（ＷＴ Ｎｋｐ３０のａａ１からの番号付け）により、ＮＫｐ３０及びＢＧＡ１８３３の結合が著しく損なわれた（図７Ａ）。対照的に、Ｉ５０Ａの変化もＬ８６Ａの変化も、ＮＫｐ３０への抗体ＢＧＡ１９１３の結合を妨害せず、このことは、ＢＧＡ１９１３及びＢＧＡ１８３３は異なるエピトープを有することを示した。このデータから、Ｉ５０及びＬ８６は抗体ＢＧＡ１８３３のエピトープで重要なアミノ酸であることが示された。図７Ｂで示されているＢ７Ｈ６との複合体でのＮＫｐ３０の分子モデリングから、折り畳まれた構造では、Ｌ８６及びＩ５０は、ＮＫｐ３０及びＢ７Ｈ６の結合界面で互いに近接していることを示す。

実施例７ 抗ＨＫｐ３０抗体は、ＮＫｐ３０のそのリガンドＢ７－Ｈ６との相互作用を減少させる
ＮＫｐ３０は、２．５～３．５μＭのおおよそのＫｄで弱い親和性にて主要なリガンドＢ７－Ｈ６に結合する（Ｊｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ ＰＮＡＳ １０８：６２２３－６２２８）。上記実施例６でのエピトープマッピング結果から、ＮＫｐ３０のアミノ酸残基Ｉ５０及びＬ８６が、ＢＧＡ１８３３抗体のエピトープの一部を構成する重要なアミノ酸残基であることを示す。加えて、これら２つの残基は、構造研究において、ＮＫｐ３０／Ｂ７－Ｈ６相互作用に重要であることが既に決定されていた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０１１ ２０８：７０３－７１４）。このデータに基づいて、ＢＧＡ１８３３抗体がＮＫｐ３０／Ｂ７－Ｈ６相互作用をブロックし得ると仮定した。このアッセイのために、Ｂ７－Ｈ６が安定的に導入された細胞系ＨＣＴ１１６／Ｂ７－Ｈ６を、連続希釈されたＢＧＡ１８３３の存在下でＮＫｐ３０－ｍＩｇＧ２ａと共にインキュベートし、続いてヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣで検出した。図８に示すように、ＢＧＡ１８３３抗体は、用量依存的な形で、ＮＫｐ３０／Ｂ７－Ｈ６相互作用を競合的にブロックし得た。

実施例８ 抗ＮＫｐ３０抗体によるＮＫｐ３０^＋ ＮＫ細胞系ＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０の活性化
ＢＧＡ１８３３抗体の機能活性を、ＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０とＦｃγＲ^＋ ＴＨＰ－１細胞との一晩にわたる共培養により最初に評価した。ＩＦＮ－γ産生を、読み取りとして使用した。ヒトＩｇＧ及び培地のみを、陰性コントロールとして使用した。図９Ａに示すように、ＢＧＡ１８３３は、用量依存的に、ＴＨＰ－１細胞の存在下で、ＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０細胞にＩＦＮ－γを分泌させた（ＥＣ_５０：０．００４９μｇ／ｍｌ）。次に、ＢＧＡ１８３３媒介死滅を、「逆」ＡＤＣＣアッセイで試験した。このアッセイでは、ＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０細胞を、５時間にわたり、ＢＧＡ１８３３の存在下にて、５：１のＥ：Ｔ比でＴＨＰ－１細胞と共培養した。上清中のＬＤＨの量を、ＣｙｔｏＴｏｘ（商標）９６ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して測定し、特異的溶解のパーセンテージを、製造業者の指示に従って算出した。図９Ｂに示すように、抗ＮＫｐ３０抗体ＢＧＡ１８３３は、用量依存的に、ＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０細胞に標的ＴＨＰ－１を溶解させた（ＥＣ５０：０．００２６μｇ／ｍｌ）。

実施例９ 抗ＮＫｐ３０含有多重特異性抗体によるＮＫｐ３０^＋ ＮＫ細胞系ＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０の活性化
上記で説明されているものと同様の機能実験では、抗原結合性ドメインの１つとしてＮＫｐ３０を含む多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）を、ＩＦＮ－ガンマ放出を誘導する能力に関して調べた。第１の抗原結合性ドメインとしてのＮＫｐ３０及び第２の抗原結合性ドメインとしての抗クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）を有する二重特異性抗体を生成した。第１の抗原結合性ドメインとしてのＮＫｐ３０及び第２の抗原結合性ドメインとしての抗５Ｔ４癌胎児性抗原（５Ｔ４）を有する別の二重特異性抗体も生成した。

ＮＫｐ３０×ＣＬＤＮ１８．２及びＮＫｐ３０×５Ｔ４に対する二重特異性抗体を、ＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０と、ＣＬＤＮ１８．２^＋腫瘍細胞（ＫＡＴＯ ＩＩＩ）又は５Ｔ４^＋腫瘍細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ｕ－８７－ＭＧ、又はＴ－４７Ｄ）との一晩にわたる共培養により評価した。ＩＦＮ－γ産生を、読み取りとして使用した。ヒトＩｇＧ及び培地のみを、陰性コントロールとして使用した。図１０Ｂ及び図１１に示すように、抗原結合性ドメインとしてＮＫｐ３０を含む二重特異性抗体は、用量依存的に、ＴＡＡ^＋腫瘍細胞の存在下で、ＮＫ９２ＭＩ／ＮＫｐ３０細胞にＩＦＮ－γを分泌させた。このことはまた、ＮＫｐ３０を抗原結合性ドメインの１つとして作製された多重特異性抗体が、第２の抗原結合性ドメインの結合を妨げないことも示した。このことはまた、ＮＫｐ３０多重特異性抗体が完全に機能し、この多重特異性抗体のＮＫｐ３０部分を介したＮＫ細胞の動員を可能にし、且つＴＡＡ部分の結合／機能の発生を可能にすることも示した。このことは、最初の抗原結合性ドメインとしてのＮＫｐ３０は、任意の多重特異性抗体の作製に有用であるだろうことを示す。

Claims (37)

1. ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント。
2. 前記抗体が、少なくとも配列番号１のアミノ酸イソロイシン５０及びロイシン８６でヒトＮＫｐ３０に結合する、請求項１に記載の抗体。
3. 前記抗体が、ＮＫｐ３０とＢ６Ｈ７リガンドとの相互作用を減少させる、請求項２に記載の抗体。
4. 前記抗体が、ＮＫｐ３０アゴニスト活性を有する、請求項３に記載の抗体。
5. （ｉ）（ａ）配列番号１９のＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
   （ｉｉ）（ａ）配列番号１９のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
   又は
   （ｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
   を含む請求項１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
6. （ｉ）配列番号３０に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３２に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
   （ｉｉ）配列番号２１に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２３に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
   又は
   （ｉｉｉ）配列番号１１に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１３に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
   を含む請求項１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
7. 配列番号３０、３２、２１、２３、１１、又は１３内に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が挿入されているか、欠失しているか、又は置換されている、請求項２に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
8. （ｉ）配列番号３０を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３２を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
   （ｉｉ）配列番号２１を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
   又は
   （ｉｉｉ）配列番号１１を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
   を含む請求項１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
9. モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト工学操作抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、又はＦ（ａｂ’）_２フラグメントである請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
10. 前記抗体が、多重特異性抗体である、請求項１に記載の抗体。
11. ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する少なくとも第１の抗原結合性ドメインと、ヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する少なくとも第２の抗原結合性ドメインとを含む多重特異性抗体。
12. 前記第１の抗原結合性ドメインが、
    （ｉ）（ａ）配列番号１９のＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
    （ｉｉ）（ａ）配列番号１９のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
    又は
    （ｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
    を含み、
    且つヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する少なくとも第２の抗原結合性ドメインを含む、請求項１１に記載の多重特異性抗体。
13. 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項１２に記載の多重特異性抗体。
14. 前記二重特異性抗体が、二重特異性四価抗体である、請求項１３に記載の二重特異性抗体。
15. ＶＤ１－ＣＬ－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－ＣＨ１－Ｆｃ又はＶＤ１－ＣＨ－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－ＣＬ－Ｆｃを含み、ここで、ＶＤ１は、抗原結合性ドメインの第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、抗原結合性ドメインの第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、ＣＨ又はＣＬは、定常重ドメイン又は定常軽ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、少なくとも２個のアミノ酸からなるリンカーである、請求項１４に記載の二重特異性四価抗体。
16. 前記リンカーが、配列番号４３～配列番号８５のいずれかの配列である、請求項１５に記載の二重特異性四価抗体。
17. 前記リンカーが、配列番号４４である、請求項１６に記載の二重特異性四価抗体。
18. 前記リンカーが、配列番号５０である、請求項１６に記載の二重特異性四価抗体。
19. 前記リンカーが、配列番号５５である、請求項１６に記載の二重特異性四価抗体。
20. 前記抗体又はその抗原結合性フラグメントが、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）を有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
21. 前記抗体又はその抗原結合性フラグメントが、低減されたグリコシル化を有するか、又はグリコシル化を有しないか、又は低フコシル化されている、請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
22. 前記抗体又はその抗原結合性フラグメントが、増加した二分岐化ＧｌｃＮａｃ構造を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
23. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１のものである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
24. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４のものである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
25. 前記ＩｇＧ４が、Ｓ２２８Ｐ置換（ＥＵ番号付けシステムによる）を有する、請求項２４に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
26. 薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物。
27. 癌を治療する方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメントの有効量を、必要な患者に投与することを含む方法。
28. 前記癌が、胃癌、結腸癌、膵癌、乳癌、頭頸部癌、腎癌、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、及び肉腫である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記抗体又は抗原結合性フラグメントを、別の治療薬と組み合わせて投与する、請求項２７に記載の方法。
30. 前記治療薬が、パクリタキセル又はパクリタキセル剤、ドセタキセル、カルボプラチン、トポテカン、シスプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、レナリドマイド、又は５－アザシチジンである、請求項２８に記載の方法。
31. 前記治療薬が、パクリタキセル剤、レナリドマイド、又は５－アザシチジンである、請求項３０に記載の方法。
32. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメントをコードする単離核酸。
33. 請求項３２に記載の核酸を含むベクター。
34. 請求項３２に記載の核酸又は請求項３３に記載のベクターを含む宿主細胞。
35. 抗体又はその抗原結合性フラグメントを製造する方法であって、請求項３５に記載の宿主細胞を培養すること、及び培養物から前記抗体又は抗原結合性フラグメントを回収することを含む方法。
36. 請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む診断薬。
37. 標識が、放射性標識、フルオロフォア、発色団、造影剤、及び金属イオンからなる群から選択される、請求項３６に記載の診断薬。

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