CN115397854A - 抗NKp30抗体及使用方法 - Google Patents

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Abstract

与人NKp30结合的抗体及其抗原结合片段，识别作为一种抗原的NKp30和至少一种其他抗原的多特异性抗体，包含NKp30抗体的药物组合物，以及所述抗体、多特异性抗体或组合物用于治疗疾病如癌症的用途。

Description

抗NKp30抗体及使用方法
技术领域
本文公开了结合人NKp30的抗体或其抗原结合片段，包含所述抗体的组合物，以及用于治疗癌症的方法。
背景技术
天然杀伤(NK)细胞属于先天免疫系统，作为针对病毒感染和肿瘤的第一道防线(Biron等人,1999Annu Rev Immunol.[免疫学年鉴]117:189-220)。NK细胞在细胞表面缺乏T细胞受体(TCR)，并且可以识别和消除靶细胞而无需事先致敏。NK细胞的功能活性(包括细胞因子产生和细胞毒性)由涉及激活信号和抑制信号的复杂机制调节(Pegram等人,2011Immunol Cell Biol.[免疫学与细胞生物学]89(2):216-224)。
NKp30是30KD I型跨膜糖蛋白，其具有细胞外V-样免疫球蛋白结构域(Pende等人,1999J Exp Med.[实验医学杂志]190(10):1505-16)。在人和大鼠中克隆并表征编码NKp30的基因和cDNA(Pende等人,1999同上，Hsieh等人,2006Eur J Immunol.[欧洲免疫学杂志]36(8):2170-80)。在小鼠中，NKp30是假基因(Hollyoake等人,2005Mol Biol Evol.[分子生物学与进化]22(8):1661-1672)。全长人NKp30的长度为201个氨基酸的序列(SEQ ID NO:1)，其中前18个氨基酸是信号肽。成熟人NKp30的氨基酸序列含有183个氨基酸(aa)残基(NCBI登录号：NM_147130.1)。成熟人NKp30的细胞外结构域(ECD)由117个氨基酸残基(SEQID NO:2，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸19-135)，随后21个氨基酸的跨膜序列和45个氨基酸的细胞质结构域组成。在ECD中，人NKp30与大鼠和食蟹猴分别具有67％和95％氨基酸序列同一性。在细胞质结构域中没有发现已知的激活信号传导基序，例如基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。对于信号传导，NKp30与携带ITAM的衔接分子如CD3ζ/Fc∈RIγ缔合(Koch等人,2013Trends Immunol.[免疫学趋势]2013 34(4):182-91)。NKp30和CD3ζ的相互作用通过NKp30跨膜结构域中的带电残基发生(Augugliaro等人,2003Eur J Immunol.[欧洲免疫学杂志]33(5):1235-41)。
NKp30主要在NK细胞和“先天性”CD8+T细胞上表达(Pende等人,1999同上，Correia等人,2018Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院学报]115(26))。其表达可通过IL-2、IL-15和IFN-α上调；以及通过TGF-β下调(Castriconi等人,2003,Proc Natl AcadSci U S A.[美国国家科学院学报]100(7):4120-4125；Bozzano等人,2011Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志],41,2905-14)。NKp30识别优先在肿瘤细胞上表达的配体。通过将嵌合NKp30受体(例如，与CD3ζ和CD28信号传导结构域融合的NKp30)导入T细胞来靶向NKp30已显示诱导对NKp30配体阳性肿瘤细胞的有效抗肿瘤活性(Zhang等人,2012J Immunol.[免疫学杂志]189(5):2290-9)。
鉴于NKp30在NK细胞介导的免疫监视和抗肿瘤作用中的关键作用，将NK细胞作为单一疗法或作为靶向NKp30和另一种抗原的多特异性抗体的抗原结合结构域重新导向表达肿瘤抗原的肿瘤细胞。
发明内容
本公开涉及特异性结合NKp30的激动性抗NKp30抗体及其抗原结合片段。
在一个实施例中，本公开提供结合人NKp30的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本公开包括以下实施例。
一种特异性结合人NKp30的抗体或其抗原结合片段。
所述抗体，其中所述抗体至少在SEQ ID NO:1的氨基酸异亮氨酸50和亮氨酸86处结合人NKp30。
所述抗体，其中所述抗体降低NKp30与B6H7配体的相互作用。
所述抗体，其中所述抗体具有NKp30激动剂活性。
所述抗体或其抗原结合片段，包含：
(i)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:19的HCDR1(重链互补决定区1)，(b)SEQ IDNO:4的HCDR2，(c)SEQ ID NO:29的HCDR3和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1(轻链互补决定区1)，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3；
(ii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:19的HCDR1，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，(c)SEQ ID NO:20的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3；或
(iii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:3的HCDR1，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，(c)SEQ ID NO:5的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3。
所述抗体或抗原结合片段，包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:30至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:32至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(ii)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:21至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:23至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或
(iii)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:11至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:13至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
所述抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:30、32、21、23、11或13中已插入、缺失或取代一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸。
所述抗体或抗原结合片段，包含：
(i)包含SEQ ID NO:30的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:32的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:21的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:23的轻链可变区(VL)；或
(iii)包含SEQ ID NO:11的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:13的轻链可变区(VL)。
上述任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。
所述抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。
一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含特异性结合人NKp30的至少第一抗原结合结构域和特异性结合人肿瘤相关抗原(TAA)的至少第二抗原结合结构域。
所述多特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域包含：
(i)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:19的HCDR1(重链互补决定区1)，(b)SEQ IDNO:4的HCDR2，(c)SEQ ID NO:29的HCDR3和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1(轻链互补决定区1)，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3；
(ii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:19的HCDR1，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，(c)SEQ ID NO:20的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3；或
(iii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:3的HCDR1，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，(c)SEQ ID NO:5的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3，
和特异性结合人肿瘤相关抗原(TAA)的至少第二抗原结合结构域。
所述多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
所述双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是双特异性四价抗体。
所述双特异性四价抗体，其包含VD1-CL-(X1)n-VD2-CH1-Fc或VD1-CH-(X1)n-VD2-CL-Fc，其中VD1是抗原结合结构域的第一可变结构域，VD2是抗原结合结构域的第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，CH或CL是恒定重链或恒定轻链结构域，并且(X1)n是至少2个氨基酸的接头。
所述双特异性四价抗体，其中所述接头是SEQ ID NO:43至SEQ ID NO 85的序列。
所述双特异性四价抗体，其中所述接头是SEQ ID NO:44。
所述双特异性四价抗体，其中所述接头是SEQ ID NO:50。
所述双特异性四价抗体，其中所述接头是SEQ ID NO:55。
上述任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
上述任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有降低的糖基化或无糖基化或低岩藻糖基化。
上述任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含增加的二等分GlcNac结构。
上述任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc结构域是IgG1的Fc结构域。
上述任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc结构域是IgG4的Fc结构域。
所述抗体或抗原结合片段，其中所述IgG4具有S228P取代(根据EU编号系统)。
一种药物组合物，其包含上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段，还包含药学上可接受的载剂。
一种治疗癌症的方法，其包括向需要的患者施用有效量的所述抗体或其抗原结合片段。
所述方法，其中所述癌症是胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
所述方法，其中所述抗体或抗原结合片段与另一种治疗剂组合施用。
所述方法，其中所述治疗剂是紫杉醇或紫杉醇药剂、多西他赛、卡铂、托泊替康、顺铂、伊立替康、多柔比星、来那度胺或5-氮杂胞苷。
所述方法，其中所述治疗剂是紫杉醇药剂、来那度胺或5-氮杂胞苷。
一种分离的核酸，其编码上述任一项所述的抗体或抗原结合片段。
一种包含所述核酸的载体。
一种包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。
一种生产抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养宿主细胞和从培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。
一种包含所述抗体或其抗原结合片段的诊断试剂。
所述诊断试剂，其中标记选自由放射性标记、荧光团、发色团、成像剂和金属离子组成的组。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含一个或多个互补决定区(CDR)，所述互补决定区包含选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含一个或多个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，所述重链互补决定区包含选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列；和/或(b)包含一个或多个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，所述轻链互补决定区包含选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，所述重链互补决定区是包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR1；包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR2；和包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR3和/或(b)包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，所述轻链互补决定区是包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR3。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，所述重链互补决定区是包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQID NO:20的氨基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR3；和/或(b)包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，所述轻链互补决定区是包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR3。
在另一个实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其含有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQID NO:5的氨基酸序列的HCDR3；和轻链可变区，其含有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其含有包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQID NO:20的氨基酸序列的HCDR3；和轻链可变区，其含有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR3。
在另一个实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其含有包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQID NO:29的氨基酸序列的HCDR3；和轻链可变区，其含有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施例中，本公开的抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:30中的任一个至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和/或(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQID NO:23或SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:32中的任一个至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本公开的抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或在SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:30的氨基酸序列中具有一个、两个或三个氨基酸取代的氨基酸序列；和/或(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQID NO:23或SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:32的氨基酸序列中具有一个、两个、三个、四个、或五个氨基酸取代的氨基酸序列。在另一个实施例中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。
在一个实施例中，本公开的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区；或
(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链可变区；或
(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施例中，本公开的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在一个更具体的实施例中，本公开的抗体包含野生型人IgG1(也称为人IgG1wt或huIgG1)或IgG2的Fc结构域。在另一个实施例中，本公开的抗体包含具有S228P和/或R409K取代(根据EU编号系统)的人IgG4的Fc结构域。
在一个实施例中，本公开的抗体以1x10-6M至1x10-10M的结合亲和力(KD)结合NKp30。在另一个实施例中，本公开的抗体以约1x10-6M、约1x10-7M、约1x10-8M、约1x10-9M或约1x10-10M的结合亲和力(KD)结合NKp30。
在另一个实施例中，本公开的抗人NKp30抗体显示对食蟹猴NKp30的种间结合活性。
在一个实施例中，本公开的抗体具有强Fc介导的效应子功能。所述抗体介导对表达NKp30的靶细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
本公开涉及分离的核酸，其包含编码所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施例中，分离的核酸包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22、或SEQ ID NO:31的VH核苷酸序列，或与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22、或SEQ ID NO:31具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，并且编码本公开的抗体或抗原结合片段的VH区。可替代地或另外地，分离的核酸包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:33的VL核苷酸序列，或与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:33具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，并且编码本公开的抗体或抗原结合片段的VL区。
在另一方面，本公开涉及包含NKp30抗体或其抗原结合片段和任选地药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在又另一方面，本公开涉及治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向有其需要的受试者施用治疗有效量的NKp30抗体或其抗原结合片段或NKp30抗体药物组合物。在另一个实施例中，所述抗体或抗原结合片段治疗的疾病是癌症。
本公开涉及所述抗体或其抗原结合片段或NKp30抗体药物组合物用于治疗疾病如癌症的用途。
附图说明
图1是NKp30-mIgG2a(顶部)和NKp30-huIgG1(底部)的示意图。NKp30 ECD：NKp30胞外结构域。N：N末端。C：C末端。
图2A-B是抗NKp30抗体VH(图2A)和VL(Vk)(图2B)区域的系统发生树的图示。使用DNASTAR的MegalignTM软件对候选抗NKp30抗体的VH和VL序列进行比对。序列同源性在系统发生树中显示。
图3A-D显示通过表面等离子共振(SPR)测定纯化的鼠抗NKp30抗体的亲和力。
图4描述了通过流式细胞术测定鼠抗NKp30抗体的结合。
图5A-C证明抗NKp30抗体诱导IFN-γ。图5A显示在抗NKp30抗体mu183或mu17存在下与小鼠FcγR+P815细胞共培养过夜的NKp30+NK92MI细胞(NK92MI/NKp30)。通过ELISA测定IFN-γ产生。图5B-C显示来自健康供体的PBMC在与P815细胞加抗NKp30 Ab共培养过夜前用IL-2(1000U/ml)刺激3天。通过ELISA测定IFN-γ产生。结果以三次重复的平均值±SD表示。
图6是通过流式细胞术进行的人源化抗NKp30 Ab BGA1831的结合测定，其表明在人源化后保持与NKp30的结合。
图7A显示人源化抗NKp30 Ab的表位作图，图7B显示与B7H6复合的NKp30的分子模型。
图8显示抗NKp30 Ab BGA1833对NKp30/B7-H6相互作用的阻断。示意图显示抗NKp30 Ab对NKp30/B7-H6相互作用的抑制。通过流式细胞术测定可溶性NKp30(NKp30-mIgG2a融合蛋白)与表达B7-H6的HCT116细胞(HCT116/B7-H6)的结合。对NKp30/B7-H6相互作用的阻断通过加入连续稀释的BGA1833/IgG1定量测定。结果以两次重复的平均值±SD表示。
图9A-9B显示BGA1833/IgG1对NK92MI/NKp30细胞的激活。图9A显示在BGA1833/IgG1存在下将NK92MI/NKp30细胞与THP-1细胞共培养。通过ELISA测定培养上清液中的IFN-γ。图9B显示在反向ADCC测定中通过抗NKp30 Ab诱导NK细胞介导的杀伤。简言之，将NK92MI/NKp30细胞与THP-1细胞在BGA1833/IgG1存在下共培养。通过LDH(乳酸脱氢酶)释放测定法测定细胞毒性百分比。所有条件一式三份进行，结果显示为平均值±SD。
图10A显示作为第一抗原结合结构域的NKp30和作为第二抗原结合结构域的抗紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)的双特异性抗体的分离。图10B显示IFN-γ释放测定中的双特异性抗体NKp30 x抗紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)。
图11显示了在IFN-γ释放测定中作为第一抗原结合结构域的NKp30和作为第二抗原结合结构域的抗5T4癌胚抗原(5T4)的双特异性抗体。
定义
除非在本文件的其他地方具体定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文所用，包括所附权利要求，除非上下文另外明确说明，否则例如“一个”、“一种”和“该”的单数形式包括它们相应的复数指代。
除非上下文另外明确说明，否则术语“或”意指术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。
如本文所用的术语“抗癌剂”是指可用于治疗细胞增殖性障碍(如癌症)的任何药剂，包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向性抗癌剂、和免疫治疗剂。
术语“天然细胞毒性触发受体”或“NKp30”或“CD337”是指约21千道尔顿蛋白。人NKp30的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)也可在登录号O14931(NCTR3_HUMAN)或NP_667341.1中找到。NKp30的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
如本文所用的术语“施用(administration/administering)”和“治疗(treating/treatment)”，当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，意指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与所述动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。细胞的处理涵盖试剂与细胞的接触以及试剂与流体的接触，其中该流体与细胞接触。术语“施用”和“治疗”还意指例如通过试剂、诊断剂、结合化合物或另一种细胞进行的细胞的体外和离体处理。本文中的术语“受试者”包括任何生物，优选动物，更优选哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、狗、猫、兔)，最优选人。在一个方面，治疗任何疾病或障碍是指改善该疾病或障碍(即，减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个方面，“治疗(treat/treating/treatment)”是指缓解或改善至少一个身体参数，包括患者可能无法辨别的那些。在又另一个方面，“治疗(treat/treating/treatment)”是指在身体上(例如，可辨别症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)或两者上调节疾病或障碍。在又另一个方面，“治疗(treat/treating/treatment)”是指预防或延迟疾病或障碍的发作或发展或进展。
在本公开的上下文中，术语“受试者”是哺乳动物，例如，灵长类动物，优选高等灵长类动物，例如人(例如，患有本文所述的障碍或处于患有本文所述的障碍的风险的患者)。
本文所用的术语“亲和力”是指抗体和抗原之间相互作用的强度。在抗原内，抗体的可变区通过非共价力与抗原在许多位点相互作用。通常，相互作用越多，亲和力越强。
本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白家族的多肽，其可以非共价地、可逆地和以特异性方式结合相应的抗原。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间插有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个框架区(FR)组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体。抗体可以是任何同种型/类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
在一些实施例中，抗NKp30抗体包含至少一个抗原结合位点，至少一个可变区。在一些实施例中，抗NKp30抗体包含来自本文所述的NKp30抗体的抗原结合片段。在一些实施例中，抗NKp30抗体是分离的或重组的。
本文中的术语“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”是指基本上同质的抗体的群体，即，除了可能少量存在的可能天然发生的突变外，该群体中包含的抗体分子在氨基酸序列上是相同的。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂典型地包括在其可变结构域中包含不同氨基酸序列的多种不同抗体，特别地其互补决定区(CDR)，它们通常对不同的表位具有特异性。修饰语“单克隆”指示获得自基本上均质的抗体群体的抗体的特征并且不应理解为要求通过任何具体方法产生抗体。可以通过本领域技术人员已知的方法获得单克隆抗体(mAb)。参见例如Kohler等人,Nature[自然]1975256:495-497；美国专利号4,376,110；Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY[分子生物学现代方法]1992；Harlow等人,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold spring Harbor Laboratory[抗体：实验室手册，冷泉港实验室]1988；和Colligan等人,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY[免疫学现代方法]1993。本文公开的抗体可以是任何免疫球蛋白类别(包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA)，及其任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。产生单克隆抗体的杂交瘤可以在体外或在体内培养。高效价的单克隆抗体可以在体内产生中获得，其中将来自单个杂交瘤的细胞腹膜内注射到小鼠中，例如原始引发的Balb/c小鼠，以产生含有高浓度所需抗体的腹水。可以使用本领域技术人员熟知的柱层析方法从这样的腹水，或从培养上清液中纯化同种型IgM或IgG的单克隆抗体。
通常，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对包含一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可以定义为主要负责效应子功能的恒定区。典型地，人轻链被分类为κ和λ轻链。此外，人重链典型地分类为α、δ、ε、γ或μ，并且分别将抗体的同种型定义为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。
每个轻链/重链(VL/VH)对的可变区形成抗体结合位点。因此，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点通常在一级序列中是相同的。
典型地，重链和轻链的可变结构域包含三个高变区，也称为“互补决定区(CDR)”，其位于相对保守的框架区(FR)之间。CDR通常由框架区对齐，使得能够结合特异性表位。一般而言，从N末端到C末端，轻链和重链可变结构域两者都包含Fr-1(或FR1)、CDR-1(或CDR1)、FR-2(FR2)、CDR-2(CDR2)、FR-3(或FR3)、CDR-3(CDR3)和FR-4(或FR4)。CDR和框架区的位置可以使用本领域公知的各种定义来确定，例如Kabat、Chothia、AbM和IMGT(参见例如，Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature[自然],342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],273:927-748(1997)ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist[免疫学家],7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学],27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案))。抗原结合位点的定义也描述于如下中：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],28:219-221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院学报],86:9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.[酶学方法],203:121-153(1991)；和Rees等人,Sternberg M.J.E.(编著),Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford[蛋白质结构预测，牛津大学出版社，牛津],141-172(1996)。例如，根据Kabat，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia的CDR定义，CDR在人VH中编号为26-35(HCDR1)，50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)，在人VL中编号为24-34(LCDR1)，50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基编号为约26-35(HCDR1)，51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号为约27-32(LCDR1)，50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(编号根据Kabat)。根据IMGT，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR区。
术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“CDR”(例如轻链可变结构域中的LCDR1，LCDR2和LCDR3以及重链可变结构域中的HCDR1，HCDR2和HCDR3)的氨基酸残基。参见，Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学上感兴趣的蛋白质序列],第5版Public Health Service[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州(通过序列定义抗体的CDR区)；还参见Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(通过结构定义抗体的CDR区)。术语“框架”或“FR”残基意指除了本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
除非另外说明，否则“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段，即保留与全长抗体结合的抗原特异性结合的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，单链Fv(ScFv))；纳米抗体以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，抗体“特异性结合”靶蛋白，是指与其他蛋白相比，抗体表现出优先结合靶蛋白，但这种特异性不需要绝对的结合特异性。在描述抗原(例如蛋白质)与抗体或抗原结合抗体片段之间的相互作用的上下文中使用的抗体“特异性结合”或“选择性结合”是指决定抗原在蛋白质和其他生物制剂的异质群体中(例如在生物样品、血液、血清、血浆或组织样品中)的存在的结合反应。因此，在某些指定的免疫测定条件下，抗体或其抗原结合片段与特定抗原的特异性结合比背景水平高至少两倍，并且不以显著量特异性结合样品中存在的其他抗原。在一方面，在指定的免疫测定条件下，抗体或其抗原结合片段与特定抗原的特异性结合比背景结合水平高至少十(10)倍，并且不以显著量与样品中存在的其他抗原特异性结合。
本文中的术语“人抗体”意指仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，人抗体可以含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”意指分别仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。
术语“人源化”或“人源化抗体”意指含有来自非人(例如鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。此类抗体含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含基本上至少一个、并且典型地两个可变结构域的全部，其高变环的全部或基本上全部对应于非人类免疫球蛋白的那些，并且FR的全部或基本上全部是人类免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。当有必要区分人源化抗体与亲本啮齿动物抗体时，将前缀“hum”、“hu”、“Hu”或“h”添加到抗体克隆名称中。人源化形式的啮齿动物抗体会通常包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列，但是可包括某些氨基酸取代以增加亲和力，增加人源化抗体的稳定性，除去翻译后修饰或出于其他原因。
术语“相应的人种系序列”是指编码人可变区氨基酸序列或亚序列的核酸序列，与由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的所有其他已知可变区氨基酸序列相比，其与参考可变区氨基酸序列或亚序列具有最高确定的氨基酸序列同一性。相应的人种系序列也可以指与所有其他评估的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或亚序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或亚序列。相应的人种系序列可以仅是框架区，仅互补决定区，框架和互补决定区，可变区段(如上定义)，或包含可变区的序列或亚序列的其他组合。可以使用本文所述的方法确定序列同一性，例如使用BLAST、ALIGN或本领域已知的另一种比对算法比对两个序列。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自此类人序列，例如人种系序列，或突变形式的人种系序列或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如Knappik等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]296:57-86,2000中所述。
术语“平衡解离常数(KD，M)”是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1，M-l)。平衡解离常数可以使用本领域任何已知的方法测量。本公开的抗体通常具有小于约10-7或10-8M，例如小于约10-9M或10-10M，在一些方面，小于约10-11M、10-12M或10- 13M的平衡解离常数。
本文中的术语“癌症”或“肿瘤”具有如本领域理解的最广泛的含义，并且是指哺乳动物中典型地以不受调控的细胞生长为特征的生理病症。在本公开的上下文中，癌症不限于某个类型或位置。
在本发明的上下文中，当提及氨基酸序列时，术语“保守取代”意指用新氨基酸取代原始氨基酸，所述新氨基酸基本上不改变抗体或片段的化学、物理和/或功能性质，例如其与NKp30的结合亲和力。氨基酸的常见保守取代是本领域熟知的。
适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST算法，其分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410,1990中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)披露获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中短字长W鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同字长比对时，其匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值。这些初始邻域字命中作为开始搜索以找到包含它们的较长HSP的值。字命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积比对得分可以增加为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的罚分；始终<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，将停止字命中在每个方向上的延伸：累积比对得分从其最大实现值下降了数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分趋于零或更低；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4并比较两条链。对于氨基酸序列，BLAST程序默认使用字长3，期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院学报]89:10915)比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4并比较两条链。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院学报]90:5873-5787,1993)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)的算法，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12和空位罚分4(E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci.[计算机在生物科学中的应用]4:11-17,(1988))确定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用已并入GCG软件包中的GAP程序中的算法，使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵，空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:444-453,(1970))确定。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括含有已知的核苷酸类似物或经修饰的主链残基或连接的核酸，它们是合成的，天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
在核酸的上下文中，术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。通常，它是指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，启动子或增强子序列如果在合适的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接至转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列(例如增强子)不需要在物理上邻接或紧邻它们增强其转录的编码序列。
在一些方面，本公开提供组合物，例如药学上可接受的组合物，其包含与至少一种药学上可接受的赋形剂一起配制的如本文所述的抗NKp30抗体。如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。赋形剂可适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。
本文公开的组合物可以是多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射和输注溶液)、分散液或悬浮液、脂质体和栓剂。合适的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。典型的合适组合物是可注射或输注溶液的形式。一种合适的施用方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一些实施例中，抗体通过静脉内输注或注射来施用。在某些实施例中，抗体通过肌内或皮下注射来施用。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病、或疾病或障碍的至少一种临床症状时，足以影响该疾病、障碍或症状的治疗的抗体的量。“治疗有效量”可以随抗体、疾病、障碍、和/或疾病或障碍的症状、疾病、障碍、和/或疾病或障碍的症状的严重程度、待治疗的受试者的年龄、和/或待治疗的受试者的体重而变化。在任何给定情况下的合适量对于本领域技术人员而言是显而易见的，或者可以通过常规实验确定。在组合疗法的情况下，“治疗有效量”是指用于有效治疗疾病、障碍或病症的组合对象的总量。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗本公开中所述的治疗病症或障碍。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂。这种施用也涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，胶囊、粉末和液体)中共同施用。可以将粉末和/或液体在施用之前重构或稀释到所期望的剂量。此外，这种施用也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间以顺序方式使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文描述的病症或障碍方面提供药物组合的有益作用。
如本文所用，短语“与…组合”是指抗NKp30抗体、抗原结合片段或多特异性抗体在施用另外的治疗剂的同时、之前或之后施用给受试者。在某些实施例中，将抗NKp30抗体、抗原结合片段或多特异性抗体作为与另外的治疗剂的共同制剂来施用。
具体实施方式
本公开提供特异性结合人NKp30的抗体、抗原结合片段或多价抗体。此外，本公开提供了具有期望的药代动力学特征和其他期望的属性的抗体，其因此可用于降低癌症的可能性或治疗癌症。本公开还提供了包含抗体或抗原结合片段的药物组合物以及制备和使用此类药物组合物用于预防和治疗癌症和相关障碍的方法。
抗NKp30抗体
本公开提供特异性结合NKp30的抗体或其抗原结合片段。本公开的抗体或抗原结合片段包括但不限于如下所述产生的抗体或其抗原结合片段。
本公开提供特异性结合NKp30的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:21或SEQ ID NO:30的氨基酸序列(表1)。本公开还提供特异性结合NKp30的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含HCDR(重链互补决定区)，所述HCDR包含表1中所列的任一个HCDR的氨基酸序列。在一方面，本公开提供特异性结合NKp30的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含(或替代地，由其组成)一个、两个、三个或更多个HCDR，所述HCDR包含表1中所列的任一个HCDR的氨基酸序列。
本公开提供特异性结合NKp30的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:23或SEQID NO:32的氨基酸序列(表1)。本公开还提供特异性结合NKp30的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含LCDR(轻链互补决定区)，所述LCDR包含表1中所列的任一个LCDR的氨基酸序列。具体地，本公开提供特异性结合NKp30的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含(或替代地，由其组成)一个、两个、三个或更多个LCDR，所述LCDR包含表1中所列的任一个LCDR的氨基酸序列。
本公开的其他抗体或其抗原结合片段包括已经改变，但在CDR区中具有与表1中公开的CDR区至少60％、70％、80％、90％、95％或99％百分比同一性的氨基酸。在一些方面，其包括氨基酸改变，其中当与表1中描述的序列中描绘的CDR区相比时，在CDR区中改变不超过1、2、3、4或5个氨基酸。
本公开的其他抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已经改变；但与表1中所述的序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％百分比同一性的那些。在一些方面，其包括氨基酸序列的改变，其中与表1中描述的序列中描绘的可变区相比，在可变区中改变不超过1、2、3、4或5个氨基酸，同时保持基本上相同的治疗活性。
本公开还提供编码特异性结合NKp30的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。可以优化这些核酸序列用于在哺乳动物细胞中表达。
表1
Figure BDA0003742102820000201
Figure BDA0003742102820000211
Figure BDA0003742102820000221
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表位和结合相同表位的抗体的鉴定
本公开提供了结合人NKp30的表位的抗体及其抗原结合片段。在某些方面，抗体和抗原结合片段可以结合NKp30的相同表位。
本公开还提供了与表1中所述的抗NKp30抗体结合相同表位的抗体及其抗原结合片段。因此，其他抗体及其抗原结合片段可以基于它们在结合测定中与其他抗体交叉竞争(例如，以统计学显著的方式竞争性抑制其结合)的能力来鉴定。测试抗体抑制本公开的抗体及其抗原结合片段与NKp30结合的能力证明测试抗体可与该抗体或其抗原结合片段竞争结合NKp30。不受任一种理论的束缚，这样的抗体可以与其竞争的抗体或其抗原结合片段结合NKp30上的相同或相关(例如，在结构上相似或在空间上邻近)表位。在某些方面，与本公开的抗体或其抗原结合片段结合NKp30上的相同表位的抗体是人或人源化单克隆抗体。这种人或人源化单克隆抗体可以如本文所述制备和分离。
Fc区的改变
在其他方面，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法描述于例如Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中。
在另一方面，可以用一个或多个不同的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法描述于例如Idusogie等人的美国专利号6,194,551中。
另一方面，改变一个或多个氨基酸残基从而改变抗体固定补体的能力。该方法描述于例如Bodmer等人的公开WO 94/29351中。在一个具体方面，本公开的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸被IgG1亚类和κ同种型的一个或多个同种异型氨基酸残基替换。同种异型氨基酸残基还包括但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链恒定区以及κ同种型的轻链恒定区，如Jefferis等人,MAbs[单克隆抗体].1:332-338(2009)所述。
在另一方面，通过修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力。这种方法在例如Presta的公开WO 00/42072中进行了描述。此外，已经绘制了人IgG1上与FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(Shields等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]276:6591-6604,2001)。
在另一方面，NKp30抗体或抗原结合片段的糖基化被修饰。例如，可以制备无糖基化抗体(即，抗体缺乏或具有降低的糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对“抗原”的亲和力。这种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这种方法描述于例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
另外地或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如包含减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或包含增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化途径的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化途径的细胞已经在本领域中描述并且可以用作宿主细胞，在其中表达重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。Presta的公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其具有降低的将岩藻糖连接至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740)。Umana等人的WO 99/54342描述了被工程化以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在工程化的细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人,Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-180,1999)。
在另一方面，如果期望ADCC的降低，许多先前的报道显示人抗体亚类IgG4仅具有适度的ADCC并且几乎没有CDC效应子功能(Moore等人,2010MAbs[单克隆抗体],2:181-189)。然而，发现天然IgG4在应激条件下(如在酸性缓冲液中或在升高的温度下)较不稳定(Angal,1993Mol Immunol[分子免疫学],30:105-108；Dall'Acqua等人,1998Biochemistry[生物化学],37:9266-9273；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。降低的ADCC可以通过将抗体可操作地连接至用降低FcγR结合或C1q结合活性的改变的组合工程化的IgG4 Fc，从而降低或消除ADCC和CDC效应子功能来实现。考虑到抗体作为生物药物的物理化学性质，IgG4的较不期望的固有特性之一是其两条重链在溶液中动态分离以形成半抗体，这导致通过称为“Fab臂交换”的过程在体内产生双特异性抗体(Van der NeutKolfschoten M等人,2007Science[科学],317:1554-157)。228位(EU编号系统)丝氨酸突变为脯氨酸表现出对IgG4重链分离的抑制作用(Angal,1993Mol Immunol[分子免疫学],30:105-108；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。据报道，铰链区和γFc区中的一些氨基酸残基对抗体与Fcγ受体的相互作用具有影响(Chappel等人,1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院学报],88:9036-9040；Mukherjee等人,1995FASEB J[美国实验生物学学会联合会杂志],9:115-119；Armour等人,1999Eur JImmunol[欧洲免疫学杂志],29:2613-2624；Clynes等人,2000Nature Medicine[自然医学],6:443-446；Arnold,2007Annu Rev immunol[免疫学年鉴],25:21-50)。此外，在人群中一些罕见的IgG4同种型也可引起不同的物理化学特性(Brusco等人,1998Eur JImmunogenet[欧洲免疫遗传学杂志],25:349-55；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。为了产生具有低ADCC和CDC但具有良好稳定性的NKp30抗体，可以修饰人IgG4的铰链区和Fc区并引入许多改变。这些修饰的IgG4 Fc分子可在SEQ ID NO:83-88，Li等人的美国专利号8,735,553中找到。
NKp30抗体生产
抗NKp30抗体、抗原结合片段和多特异性抗体可通过本领域已知的任何方法产生，包括但不限于抗体四聚体的重组表达、化学合成和酶消化，而全长单克隆抗体可通过例如杂交瘤或重组产生获得。重组表达可以来自本领域已知的任何合适的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本公开还提供了编码本文所述抗体的多核苷酸，例如编码包含本文所述的互补决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些方面，编码重链可变区的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:31组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码轻链可变区的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:33组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
本公开的多核苷酸可以编码抗NKp30抗体的可变区序列。它们还可以编码抗体的可变区和恒定区。一些多核苷酸序列编码包含示例性抗NKp30抗体之一的重链和轻链的可变区的多肽。
本公开还提供了用于产生抗NKp30抗体的表达载体和宿主细胞。表达载体的选择取决于表达载体的预期宿主细胞。通常，表达载体含有可操作地连接至编码抗NKp30抗体链或抗原结合片段的多核苷酸的启动子和其他调节序列(例如增强子)。在一些方面，除了在诱导条件的控制下，使用诱导型启动子来防止插入序列的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除启动子外，其他调节元件也可以是有效表达抗NKp30抗体或抗原结合片段所需要或期望的。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子，可以提高表达效率(参见例如，Scharf等人,ResultsProbl.Cell Differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
用于携带并表达抗NKp30抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆并表达本披露多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，如枯草芽孢杆菌，和其他肠杆菌属，如沙门氏菌属、沙雷氏菌属和各种假单胞菌属。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，将存在任何数量的多种熟知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常任选地用操纵子序列控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其他微生物如酵母也可用于表达抗NKp30多肽。也可以使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。
在其他方面，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本公开的抗NKp30多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或携带外源性表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常死亡或正常或异常永生化动物或人细胞。例如，已经开发了几种能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HEK293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽一般在例如Winnacker,From Genes to Clones[从基因到克隆],VCH出版社,NY,N.Y.,1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(参见例如Queen等人,Immunol.Rev.[免疫学综述]89:49-68,1986)和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的、和/或可调控的或可调节的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
NKp30多特异性抗体
在一个实施例中，可以将本文公开的抗NKp30抗体掺入抗NKp30xTAA多特异性抗体中，其中TAA是任何人肿瘤相关抗原(TAA)。抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个抗原结合结构域，其中至少一个抗原结合结构域序列特异性结合作为第一表位的NKp30，第二抗原结合结构域序列特异性结合作为第二表位的TAA。在一个实施例中，多特异性抗体包含第三、第四或第五抗原结合结构域。在一个实施例中，多特异性抗体是双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。在每个实例中，多特异性抗体包含至少一个抗NKp30抗原结合结构域和至少一个抗TAA抗原结合结构域。
在一个实施例中，多特异性抗体是双特异性抗体。如本文所用，双特异性抗体仅特异性结合两种抗原。双特异性抗体包含特异性结合NKp30的第一抗原结合结构域和特异性结合TAA的第二抗原结合结构域。这包括双特异性抗体，其包含特异性结合作为第一表位的NKp30的重链可变结构域和轻链可变结构域以及特异性结合作为第二表位的TAA的重链可变结构域和轻链可变结构域。在另一个实施例中，双特异性抗体包含特异性结合NKp30的抗体的抗原结合片段和特异性结合TAA的抗原结合片段。包含抗原结合片段的双特异性抗体、抗原结合片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv(ScFv)或scFv。
先前的实验(Coloma和Morrison Nature Biotech.[自然生物技术]15:159-163(1997))描述了四价双特异性抗体，其通过在IgG3抗丹磺酰基抗体的C末端(CH3-scFv)之后或铰链(铰链-scFv)之后融合编码单链抗丹磺酰基抗体Fv(scFv)的DNA进行工程化。本公开提供了具有至少两个抗原结合结构域的多价抗体(例如四价抗体)，其可通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达容易地产生。本文的多价抗体包含三至八个，但优选四个抗原结合结构域，其特异性结合至少两种抗原。
本公开提供了包含VD1-CL-(X1)n-VD2-CH1-Fc或VD1-CH-(X1)n-VD2-CL-Fc的双特异性四价抗体，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，CH或CL是恒定重链或恒定轻链结构域，并且(X1)n是至少2个氨基酸的接头。
在一个实施例中，双特异性四价抗体可以是四条多肽链的多聚体，两条重链各自包含第一VH结构域(VH1)，第一CH1结构域，第二VH结构域(VH2)，包含第二CH1、铰链、CH2、CH3的Fc区和两条轻链，每条轻链包含第一VL结构域(VL1)，第一CL区，第二VL结构域(VL2)和第二CL区。在另一个实施例中，双特异性四价抗体可包含与单个Fc结构域连接在一起的多个抗体Fab片段。例如，Fab1可以通过多肽接头与Fab2连接，所述Fab2包含Fab之一的CH1结构域、铰链区和Fc结构域的CH2和CH3。例如，可以通过接头将抗TAA Fab从抗TAA Fab的CL结构域连接到抗NKp30 Fab的VH结构域和从抗Nkp30 Fab的CH1结构域、铰链区、CH2和CH3结构域。在另一个实例中，可以通过接头将抗Nkp30 Fab从抗Nkp30 Fab的CL结构域连接到抗TAA Fab的VH结构域和从抗TAA Fab的CH1结构域、铰链区、CH2和CH3结构域。
接头
还应理解，双特异性四价抗体的多肽链的结构域和/或区域可被各种长度的接头区域分开。在一些实施例中，表位结合结构域通过接头区与彼此、CL、CH1、铰链、CH2、CH3或整个Fc区分开。例如，VL1-CL-(接头)VH2-CH1这种接头区可以包含随机分类的氨基酸，或一组受限的氨基酸。此类接头区可以是柔性的或刚性的(参见US 2009/0155275)。
多特异性抗体已经通过使用或不使用柔性接头将两个单链Fv(scFv)或Fab片段遗传融合(Mallender等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]1994 269:199-206；Macket等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.[美国国家科学院学报]1995 92:7021-5；Zapata Protein Eng.[蛋白质工程]1995 8.1057-62)，通过二聚化装置如亮氨酸拉链(Kostelny等人,J.Immunol.[免疫学杂志]1992148:1547-53；de Kruifetal J.Biol.Chem.[生物化学杂志]1996 271:7630-4)和Ig C/CH1结构域(Muller等人,FEBS Lett.[欧州生物化学会通讯]422:259-64)；通过双抗体(Holliger等人,(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA.[美国国家科学院学报]1998 90:6444-8；Zhu等人,Bio/Technology[生物/技术](NY)1996 14:192-6)；Fab-scFv融合(Schoonjans等人,J.Immunol.[免疫学杂志]2000 165:7050-7)；和迷你抗体格式(Pack等人,Biochemistry[生物化学]1992.31:1579-84；Pack等人,Bio/Technology[生物/技术]1993 11:1271-7)来构建。
本文公开的双特异性四价抗体在其一个或多个表位结合结构域、CL结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域或Fc区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多个氨基酸残基的接头区。在一些实施例中，氨基酸甘氨酸和丝氨酸包含接头区内的氨基酸。在另一个实施例中，接头可以是GS(SEQ ID NO:43)、GGS(SEQ ID NO:44)、GSG(SEQ ID NO:45)、SGG(SEQ IDNO:46)、GGG(SEQ ID NO:47)、GGGS(SEQ ID NO:48)、SGGG(SEQ ID NO:49)、GGGGS(SEQ IDNO:50)、GGGGSGS(SEQ ID NO:51)、GGGGSGS(SEQ ID NO:52)、GGGGSGGS(SEQ ID NO:53)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:54)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQID NO:56)、AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:57)、AKTTPKLGG(SEQ ID NO:58)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:59)、AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:60)、SAKTTP(SEQ ID NO:61)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:62)、RADAAP(SEQ ID NO:63)、RADAAPTVS(SEQ ID NO:64)、RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO:65)、RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO:66)、SAKTTP(SEQ ID NO:67)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:68)、SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:69)、ADAAP(SEQ ID NO:70)、ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO:71)、TVAAP(SEQ ID NO:72)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:73)、QPKAAP(SEQ ID NO:74)、QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO:75)、AKTTPP(SEQ ID NO:76)、AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO:77)、AKTTAP(SEQ ID NO:78)、AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:79)、ASTKGP(SEQ ID NO:80)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:81)、GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO:82)、GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:83)和GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO:84)或其任何组合(参见WO2007/024715)。例如，GGGGS(SEQ ID NO:50)可以与SAKTTP(SEQ ID NO:67)组合形成GGGGSSAKTTP(SEQ ID NO:85)。
二聚化特异性氨基酸
在一个实施例中，多特异性抗体包含至少一个二聚化特异性氨基酸改变。二聚化特异性氨基酸改变导致“突起到孔中”相互作用，并增加正确多特异性抗体的组装。二聚化特异性氨基酸可以在CH1结构域或CL结构域或其组合内。用于将CH1结构域与其他CH1结构域(CH1-CH1)和CL结构域与其他CL结构域(CL-CL)配对的二聚化特异性氨基酸至少可以在WO 2014082179、WO 2015181805和WO 2017059551的公开内容中找到。二聚化特异性氨基酸也可以在Fc结构域内，并且可以与CH1或CL结构域内的二聚化特异性氨基酸组合。
检测和诊断方法
本公开的抗体或抗原结合片段可用于多种应用，包括但不限于检测NKp30的方法。在一方面，抗体或抗原结合片段可用于检测生物样品中NKp30的存在。本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些方面，生物样品包括细胞或组织。在其他方面，这些组织包括相对于其他组织以更高水平表达NKp30的正常和/或癌性组织。
在一方面，本公开提供了一种检测生物样品中NKp30的存在的方法。在某些方面，该方法包括在允许抗体与抗原结合的条件下，将生物样品与抗NKp30抗体接触，并检测抗体和抗原之间是否形成复合物。生物样品可以包括但不限于尿液、组织、痰或血液样品。
还包括一种诊断与NKp30表达相关的障碍的方法。在某些方面，所述方法包括使测试细胞与抗NKp30抗体接触；通过检测抗NKp30抗体与NKp30多肽的结合，测定测试细胞表达的NKp30的表达水平(定量或定性)；以及将测试细胞的表达水平与对照细胞(例如，与测试细胞相同组织来源的正常细胞或非NKp30表达细胞)中的NKp30表达水平进行比较，其中与对照细胞相比，测试细胞中较高水平的NKp30表达表明存在与NKp30表达相关的障碍。
治疗方法
本公开的抗体或抗原结合片段可用于多种应用，包括但不限于治疗NKp30相关障碍或疾病的方法。在一方面，NKp30相关障碍或疾病是癌症。在NKp30xTAA多特异性抗体的情况下，癌症可能对TAA具有特异性，其中NKp30用于将NK细胞募集到表达TAA的肿瘤。
在一方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法。在某些方面，该方法包括向有需要的患者施用有效量的抗NKp30抗体、抗原结合片段或含NKp30的多特异性抗体。癌症可包括但不限于胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
本文公开的抗体或抗原结合片段可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要用于局部治疗、病灶内或肿瘤内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了多种给药方案，包括但不限于单次施用或在不同时间点的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本公开的抗体或抗原结合片段可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。关于这点要考虑的因素包括治疗的特定障碍、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的起因、药剂的递送位点、施用方法、施用方案、和医疗从业者已知的其他因素。抗体不需要但任选地与目前用于预防或治疗所研究的障碍的一种或多种药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于配制品中存在的抗体的量、障碍或治疗的类型、以及上文讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％-99％使用，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
为预防或治疗疾病，本公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的合适的剂量将取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体是用于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对抗体的反应、以及主治医生的判断。抗体适当地以一次或经一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至100mg/kg的抗体可以是用于向患者施用的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，还是通过连续输注。取决于上述因素，一个典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间内的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直到出现所需的疾病症状抑制。这样的剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2至约20次施用)。可以施用初始高负载剂量，随后施用一个或多个较低剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的，并且通过常规技术和测定容易地监测治疗的进展。
组合治疗
在一方面，本公开的NKp30抗体、抗原结合片段或多特异性抗体可以与其他治疗剂组合使用。可与本公开的NKp30抗体一起使用的其他治疗剂包括但不限于化疗剂(例如紫杉醇或紫杉醇药剂；(例如，
Figure BDA0003742102820000391
)、多西他赛；卡铂；拓扑替康；顺铂；伊立替康、多柔比星、来那度胺、5-氮杂胞苷、异环磷酰胺、奥沙利铂、培美曲塞二钠、环磷酰胺、依托泊苷、地西他滨、氟达拉滨、长春新碱、苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、白消安、吉西他滨、美法仑、喷司他丁、米托蒽醌、培美曲塞二钠)、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如厄洛替尼)、多激酶抑制剂(例如MGCD265、RGB-286638)、CD-20靶向剂(例如利妥昔单抗、奥法木单抗、RO5072759、LFB-R603)、CD52靶向剂(例如阿仑单抗)、泼尼松龙、达贝泊汀α、来那度胺、Bcl-2抑制剂(例如奥利默森钠)、极光激酶抑制剂(例如MLN8237、TAK-901)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、CD-19靶向剂(例如MEDI-551、MOR208)、MEK抑制剂(例如ABT-348)、JAK-2抑制剂(例如INCB018424)、mTOR抑制剂(例如坦罗莫司、依维莫司)、BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼)、ET-A受体拮抗剂(例如ZD4054)、TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如CS-1008)、EGEN-001、Polo样激酶1抑制剂(例如BI 672)。
药物组合物和配制品
还提供了包含抗NKp30抗体或其抗原结合片段、或包含编码抗NKp30抗体或抗原结合片段的序列的多核苷酸的组合物，包括药物配制品。在某些实施例中，组合物包含与NKp30结合的一种或多种抗体或抗原结合片段，或包含编码与NKp30结合的一种或多种抗体或抗原结合片段的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物还可包含合适的载剂，例如本领域熟知的药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂。
通过将具有所需纯度的这种抗体或抗原结合片段与一种或多种任选的药学上可接受的载剂混合来制备本文所述的抗NKp30抗体或抗原结合片段的药物配制品(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition[雷明顿药物科学第16版],Osol,A.编(1980))，呈冻干配制品或水溶液的形式。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载剂还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003742102820000401
百特国际有限公司(Baxter International,Inc.))。在美国专利号US 7,871,607和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体配制品描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体配制品包括美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品的形式，例如膜或微胶囊。用于体内施用的配制品通常是无菌的。无菌可以例如通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
实例
实例1抗NKp30单克隆抗体的产生
基于常规杂交瘤融合技术产生抗NKp30单克隆抗体(mAb)(de St Groth和Sheidegger,1980J Immunol Methods[免疫学方法杂志]35:1；Mechetner,2007MethodsMol Biol[分子生物学方法]378:1)。选择在酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选(FACS)测定中具有高结合活性的mAb用于进一步表征。
用于免疫和结合测定的NKp30重组蛋白
编码全长人NKp30(SEQ ID NO:1)的cDNA基于其GenBank序列(登录号：NM_147130.1)购自义翘神州公司(Sino Biological)(中国北京)。PCR扩增对应于SEQ ID NO:1的氨基酸(AA)19-135的全长人NKp30的细胞外结构域(ECD)的编码区，并克隆到基于pcDNA3.1的表达载体(英杰公司(Invitrogen),卡尔斯巴德,加利福尼亚州,美国)中，其中C末端融合到小鼠IgG2a的Fc结构域或人IgG1重链的Fc结构域，其分别产生两种重组融合蛋白表达质粒NKp30-mIgG2a和NKp30-huIgG1。NKp30融合蛋白的示意图如图1所示。为了产生重组融合蛋白，将NKp30-mIgG2a和NKp30-huIgG1质粒瞬时转染到293G细胞(内部开发)中，并在装备有旋转振荡器的CO2培养箱中培养7天。收集含有重组蛋白的上清液并离心澄清。使用蛋白A柱(目录号17127901，通用生命科学公司(GE Life Sciences))纯化NKp30-mIgG2a和NKp30-huIgG1。将NKp30-mIgG2a和NKp30-huIgG1蛋白用磷酸盐缓冲盐水(DPBS)透析，并以小等分试样保存在-80℃冰箱中。
稳定表达细胞系
为了建立表达全长人NKp30(huNKp30)或食蟹猴NKp30(mkNKp30，登录号：AJ278389.1(SEQ ID NO:42)，购自义翘神州公司，中国)的稳定细胞系，克隆到逆转录病毒载体pFB-Neo(目录号217561，美国安捷伦公司)。根据先前的方案(Zhang等人,2005Blood[血液]106,1544-1551)产生双嗜性逆转录病毒载体。将含有huNKp30和mkNKp30的载体分别转导到NK92MI细胞(ATCC,美国弗吉尼亚洲马纳萨斯(马纳萨斯(Manassas),弗吉尼亚州,美国))中，以产生细胞系NK92MI/huNKp30和NK92MI/mkNKp30。使用G418和FACS结合测定通过在培养基中培养来选择高表达细胞系。
免疫、杂交瘤融合和克隆
用100μL含有10μg NKp30-mIgG2a和水溶性佐剂(目录号KX0210041，KangBiQuan，中国北京)的抗原混合物腹膜内(i.p.)免疫8-12周龄Balb/c小鼠(来自北京华阜康生物科技有限公司(HFK BIOSCIENCE CO.),LTD，中国北京)。3周后重复该过程。第二次免疫后两周，通过ELISA和FACS评价小鼠血清的NKp30结合。血清筛选后十天，通过i.p.注射50μgNKp30-mIgG2a加强具有最高抗NKp30抗体血清滴度的小鼠。加强后三天，使用标准技术(Gefter等人,Somat Cell Genet[体细胞遗传学],1977 3(2):231-6)，分离脾细胞并将其与鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞(ATCC)融合。
通过ELISA和FACS评估抗体的NKp30结合活性
杂交瘤克隆的上清液最初通过改进的ELISA进行筛选，其基础技术描述于(Methods in Molecular Biology[分子生物学方法](2007)378:33-52)中。将NKp30-huIgG1蛋白包被在96孔板中。使用HRP-连接的抗小鼠IgG抗体(目录号7076S，细胞传导技术公司(Cell Signaling Technology)，美国)和底物(目录号00-4201-56，伊生物技术公司(eBioscience)，美国)来产生波长为450nm的颜色吸收信号，其通过使用读板器(SpectraMax ParadigmTM，分子设备公司(Molecular Devices)，美国)来测量。使用上述NK92MI/huNKp30或NK92mi/mkNKp30细胞通过FACS进一步验证ELISA阳性克隆。将表达NKp30的细胞(105细胞/孔)与ELISA阳性杂交瘤上清液一起孵育，然后与Alexa Fluro-647标记的山羊抗小鼠IgG抗体(目录号A0473，碧云天生物技术公司(Beyotime Biotechnology)，中国)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，默克密理博公司(Merck-Millipore)，美国)定量细胞荧光。
对来自杂交瘤的在ELISA和FACS筛选中显示阳性信号的条件培养基进行功能测定，以鉴定在基于人免疫细胞的测定中具有良好功能活性的抗体(参见以下部分)。对具有所需功能活性的抗体进一步亚克隆和表征。
杂交瘤亚克隆和对无血清或低血清培养基的适应
如上所述通过ELISA、FACS和功能测定进行初步筛选后，通过有限稀释亚克隆阳性杂交瘤克隆。从每块板基于ELISA和FACS筛选选择三个阳性亚克隆并通过功能测定表征。通过功能测定验证的靠前抗体亚克隆适于在含3％FBS的CDM4MAb培养基(目录号SH30801.02,Hyclone,美国)中生长。
单克隆抗体的表达和纯化
将用抗体表达质粒(目录号R79007,英杰公司)瞬时转染的杂交瘤细胞或293G细胞在CDM4MAb培养基(目录号SH30801.02,Hyclone)中或在FreestyleTM293表达培养基(目录号12338018,英杰公司)中培养，并在CO2培养箱中在37℃孵育5至7天。通过离心收集条件培养基并在纯化前通过0.22μm膜过滤。依照制造商的指导应用含有鼠或重组抗体的上清液并结合到蛋白A柱(目录号17127901，通用生命科学公司)。该步骤产生纯度水平高于90％的抗体。将蛋白A亲和纯化的抗体用PBS透析或使用HiLoad 16/60Superdex200TM柱(目录号17531801，通用生命科学公司)进一步纯化以除去聚集体。通过测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。将最终的抗体制剂以等分试样储存在-80℃冰箱中。
实例2NKp30抗体的克隆和序列分析
根据制造商的方案，使用Ultrapure RNA试剂盒(目录号74104，凯杰公司(QIAGEN)，德国)收获鼠杂交瘤克隆以制备总细胞RNA。使用来自英杰公司的cDNA合成试剂盒(目录号18080-051)合成第一条链cDNA，并使用PCR试剂盒(目录号CW0686，CWBio，中国北京)进行编码鼠mAb的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的核苷酸序列的PCR扩增。根据先前报道的序列(Brocks等人,2001Mol Med[分子医学]7:461)通过英杰公司(中国北京)合成用于VH和VL的抗体cDNA克隆的寡核苷酸引物。然后将PCR产物亚克隆到pEASY-Blunt克隆载体(目录号C B101-02，全式金公司(TransGen)，中国)中，并通过金唯智公司(Genewiz)(中国北京)测序。从DNA测序结果推导出VH和VL区的氨基酸序列。
通过比较序列同源性分析鼠mAb，并基于序列相似性分组，如图2所示。根据Kabat(Wu和Kabat 1970J.Exp.Med.[实验医学杂志]132:211-250)和IMGT(Lefranc 1999NucleicAcids Research[核酸研究]27:209-212)系统通过序列注释和通过序列分析来定义互补决定区(CDR)。代表性靠前克隆(mu183)的氨基酸序列在上表1中列出。
实例3通过SPR测定纯化的鼠抗NKp30抗体的亲和力
通过使用BIAcoreTM T-200(通用生命科学公司)进行SPR测定，表征在ELISA和FACS中具有高结合活性以及在基于细胞的测定中具有有效功能活性的NKp30抗体(如上文实例1中所述)的结合动力学。简言之，将抗小鼠IgG抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(目录号:BR100530，通用生命科学公司)上。使纯化的NKp30鼠抗体流过芯片表面并被抗小鼠IgG抗体捕获。然后使his-标记的人NKp30的连续稀释液(0.098nM至25nM)流过芯片表面，并通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA评估软件，通用生命科学公司)分析表面等离子体共振信号的变化以计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。包括mu183、mu17和mu191的所选抗体的结合亲和力谱图示于图3和表3中。
表3.通过SPR测定杂交瘤抗体的结合亲和力
抗体 k<sub>on</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>off</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(nM)
mu183 1.59x10<sup>6</sup> 2.10x10<sup>-4</sup> 0.132
mu17 1.42x10<sup>6</sup> 1.23x10<sup>-3</sup> 0.977
mu191 8.49x10<sup>5</sup> 5.07x10<sup>-4</sup> 0.597
实例4鼠抗人NKp30 mAb mu183的人源化
mAb人源化和工程化
对于mu183的人源化，通过针对IMGT和NCBI中的人免疫球蛋白基因数据库运行BLAST算法，搜索人种系IgG基因中与mu183可变区的cDNA序列具有高度同源性的序列。选择以高频率存在于人抗体库(Glanville等人,2009PNAS 106:20216-20221)中并且与mu183高度同源的人IGVH和IGVL基因作为人源化的模板。
通过CDR移植进行人源化(Methods in Molecular Biology,Vol 248:AntibodyEngineering,Methods and Protocols[分子生物学方法，第248卷：抗体工程，方法和方案],Humana出版社)和使用内部开发的表达载体将人源化抗体(BGA1831-BGA1833)工程化为人IgG1mf(SEQ ID NO:41)形式。在第一轮的人源化中，框架区中从鼠到人氨基酸残基的突变由模拟的3D结构指导，在最初的人源化抗体BGA1831(SEQ ID NO:3-8)中保留了具有结构重要性的鼠框架残基，以维持CDR的规范结构。具体地，将mu183 VH的CDR(SEQ ID NO:3-5)移植到保留了9个鼠框架(V10、V12、T30、A37、I48、A68、L70、V72和A79)残基的人种系可变基因IGVH1-46的框架(SEQ ID NO:11)中。将mu183 VL的CDR(SEQ ID NO:6-8)移植到保留了5个鼠框架残基(Q1、V3、L4、S43和F73)的人种系可变基因IGVL 1-39的框架(SEQ ID NO:13)中。
使用内部开发的表达载体将BGA1831构建为人全长抗体形式，所述表达载体含有分别称为IgG1mf(SEQ ID NO:41)和轻链的人IgG1变体的恒定区，具有容易适应的亚克隆位点。通过将上述两种构建体共转染到293G细胞中并使用蛋白A柱(目录号17543802，通用生命科学公司)纯化来实现BGA1831抗体的表达和制备。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-5mg/mL并以等分试样储存在-80℃冰箱中。
在BGA1831中进行了几个单氨基酸改变，将VL框架区中保留的鼠残基转化为相应的人种系残基。所得人源化形式均具有相似的结合和功能活性。使用在特定位置含有突变的引物和定点诱变试剂盒(目录号FM111-02，全式金公司，中国北京)进行所有人源化突变。通过测序分析验证所需的突变，并如前所述在结合和功能测定中测试变体抗体。
通过在CDR和框架区中引入突变以改善用于人类治疗用途的分子和生物物理特性来进一步工程化其他抗体。考虑因素包括氨基酸组成、热稳定性(Tm)、表面疏水性和等电点(pI)，同时保持功能活性。
人源化单克隆抗体的其他工程化形式衍生自如上描述的突变过程，并进行了详细表征。工程化抗体的分析显示BGA1832(SEQ ID NO:19、4、20,6-8)和BGA1831(SEQ ID NO:3-8)在结合亲和力和功能活性如引发NKp30介导的下游信号传导方面是非常相似的。在该过程中，将工程化抗体的亲和力调整为期望的亲和力，因为这导致BGA1833(SEQ ID NO:19、4、29、6-8)具有比初始抗体低约10倍的亲和力。对于亲和力测定，抗体被抗人Fc表面捕获，并用于基于表面等离子体共振(SPR)技术的亲和力测定。抗NKp30抗体的SPR测定的结合谱图的结果总结于表4中。还证实了以上所示的所有人源化抗体对分离自健康供体的原代人免疫细胞的功能活性(在以下实例7中描述)。
表4.通过SPR比较抗体结合亲和力
Figure BDA0003742102820000451
*ch183由与人IgG1mf/κ恒定区融合的mu183可变结构域构成
实例5不同形式的抗NKp30抗体与天然NKp30的结合活性
为了评估抗NKp30抗体与活细胞上的天然NKp30的结合活性，转染NK92MI细胞以过表达人NKp30。将表达NK92mi/NKp30的活细胞接种在96孔板中，并与连续稀释的抗NKp30抗体一起孵育。将山羊抗人IgG用作二抗来检测抗体与细胞表面的结合。与人天然NKp30的剂量依赖性结合的EC50值通过用GraphPad PrismTM将剂量反应数据与四参数逻辑模型拟合来确定。如图6和表6所示，人源化抗NKp30抗体BGA1831和BGA1833都表现出对活细胞上的天然NKp30的高结合亲和力。
表6.人源化、工程化抗体与天然NKp30的剂量依赖性结合的EC50
Figure BDA0003742102820000452
Figure BDA0003742102820000461
实例6BGA1833的表位作图
为了表征BGA1833的结合表位，基于来自先前报道的NKp30的晶体结构的信息(Li等人,J Exp Med.[实验医学杂志]2011 208:703-714)，将NKp30的10个氨基酸残基单独突变为丙氨酸以产生10个单突变NKp30变体。分析了BGA1833对突变型NKp30蛋白和野生型NKp30蛋白的识别和结合。另一种人源化抗NKp30抗体BGA1913也在同一ELISA测定中分析用于比较。在该测定中，将各50ng野生型或突变型Nkp30-Fc包被在ELISA板中。封闭后，向板中加入100μl浓度为20nM的BGA1833或BGA1913抗体，并通过HRP-连接的二抗检测各抗体的结合信号。所有ELISA结果用野生型NKp30-Fc结合信号的ELISA读数平均值作为标准进行标准化。为了简化数据分析，如果特异性突变型NKp30的抗体的ELISA结合信号下降到或低于25％，则该位点的氨基酸被认为对于表位是关键的。在使用野生型或突变型NKp30的ELISA结合测定中，氨基酸I50A和L86A(从WT Nkp30的aa1编号)显著削弱NKp30和BGA1833的结合(图7A)。相反，I50A和L86A改变都不破坏抗体BGA1913与NKp30的结合，这表明BGA1913和BGA1833具有不同的表位。该数据表明I50和L86是抗体BGA1833的表位中的关键氨基酸。图7B所示的与B7H6复合的NKp30的分子模型显示，当处于折叠构象时，L86和I50在NKp30和B7H6的结合界面上彼此接近。
实例7抗NKp30抗体降低NKp30与其配体B7-H6的相互作用
NKp30以约2.5-3.5μM的Kd以弱亲和力与其主要配体B7-H6结合。(Joyce等人,2011PNAS 108:6223-6228)。上述实例6中的表位作图结果显示NKp30的氨基酸残基I50和L86是构成BGA1833抗体的表位的一部分的关键氨基酸残基。此外，先前在结构研究中确定这两个残基对于NKp30/B7-H6相互作用是重要的(Li等人,J Exp Med.[实验医学杂志]2011208:703-714)。基于该数据，假设BGA1833抗体可以阻断NKp30/B7-H6相互作用。对于该测定，将B7-H6稳定转导的细胞系HCT116/B7-H6与NKp30-mIgG2a在连续稀释的BGA1833存在下孵育，然后用山羊抗人IgG-APC检测。如图8所示，BGA1833抗体可以以剂量依赖性方式竞争性阻断NKp30/B7-H6相互作用。
实例8抗NKp30抗体对NKp30+NK细胞系NK92MI/NKp30的激活
首先通过将NK92MI/NKp30与FcγR+THP-1细胞共培养过夜来评估BGA1833抗体的功能活性。将IFN-γ产生用作读数。将仅人IgG和培养基用作阴性对照。如图9A所示，BGA1833在THP-1细胞存在下以剂量依赖性方式诱导NK92MI/NKp30细胞分泌IFN-γ(EC50：0.0049μg/ml)。接下来，在“反向”ADCC测定中测试BGA1833介导的杀伤。在该测定中，将NK92MI/NKp30细胞与THP-1细胞以5:1的E:T比率在BGA1833存在下共培养5小时。使用CytoToxTM96非放射性细胞毒性测定试剂盒(普洛麦格公司(Promega)，威斯康星州麦迪逊)测量上清液中LDH的量，并根据制造商的说明书计算特异性裂解的百分比。如图9B所示，抗NKp30抗体BGA1833可诱导NK92MI/NKp30以剂量依赖性地裂解靶THP-1细胞(EC50：0.0026μg/ml)。
实例9含有抗NKp30的多特异性抗体对NKp30+NK细胞系NK92MI/NKp30的激活
在与上述实验类似的功能实验中，检查包含NKp30作为抗原结合结构域之一的多特异性抗体(例如双特异性抗体)诱导IFN-γ释放的能力。产生了具有NKp30作为第一抗原结合结构域并且具有抗紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)作为第二抗原结合结构域的双特异性抗体。还产生了具有NKp30作为第一抗原结合结构域并且具有抗5T4癌胚抗原(5T4)作为第二抗原结合结构域的另一种双特异性抗体。
通过将NK92MI/NKp30与CLDN18.2+肿瘤细胞(KATO III)或5T4+肿瘤细胞(MDA-MB-468，U-87-MG或T-47D)共培养过夜来评估抗NKp30 x CLDN18.2和NKp30 x 5T4的双特异性抗体。将IFN-γ产生用作读数。将仅人IgG和培养基用作阴性对照。如图10B和11所示，包含NKp30作为抗原结合结构域的双特异性抗体在TAA+肿瘤细胞存在下以剂量依赖性方式诱导NK92MI/NKp30细胞分泌IFN-γ。这也证明用NKp30作为抗原结合结构域之一产生的多特异性抗体不干扰第二抗原结合结构域的结合。这也表明NKp30多特异性抗体是完全功能性的，允许通过多特异性抗体的NKp30部分募集NK细胞，并允许TAA部分的结合/功能发生。这表明NKp30作为第一抗原结合结构域可用于产生任何多特异性抗体。
序列表
<110> 百济神州有限公司
<120> 抗NKp30抗体及使用方法
<130> F21W0761PCT
<160> 85
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 全长人NKp30
<400> 1
Met Ala Trp Met Leu Leu Leu Ile Leu Ile Met Val His Pro Gly Ser
1 5 10 15
Cys Ala Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly
20 25 30
Ser Ser Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu
35 40 45
Ala Ile Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Val Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu
65 70 75 80
Ala Ser Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg
85 90 95
Asp Val Arg Gly His Asp Ala Ser Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val
100 105 110
Leu Gly Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val Val Glu
115 120 125
Lys Glu His Pro Gln Leu Gly Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu Arg Ala
130 135 140
Gly Phe Tyr Ala Val Ser Phe Leu Ser Val Ala Val Gly Ser Thr Val
145 150 155 160
Tyr Tyr Gln Gly Lys Cys Leu Thr Trp Lys Gly Pro Arg Arg Gln Leu
165 170 175
Pro Ala Val Val Pro Ala Pro Leu Pro Pro Pro Cys Gly Ser Ser Ala
180 185 190
His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Gly
195 200
<210> 2
<211> 606
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全长人NKp30
<400> 2
atggcctgga tgctgttgct catcttgatc atggtccatc caggatcctg tgctctctgg 60
gtgtcccagc cccctgagat tcgtaccctg gaaggatcct ctgccttcct gccctgctcc 120
ttcaatgcca gccaagggag actggccatt ggctccgtca cgtggttccg agatgaggtg 180
gttccaggga aggaggtgag gaatggaacc ccagagttca ggggccgcct ggccccactt 240
gcttcttccc gtttcctcca tgaccaccag gctgagctgc acatccggga cgtgcgaggc 300
catgacgcca gcatctacgt gtgcagagtg gaggtgctgg gccttggtgt cgggacaggg 360
aatgggactc ggctggtggt ggagaaagaa catcctcagc taggggctgg tacagtcctc 420
ctccttcggg ctggattcta tgctgtcagc tttctctctg tggccgtggg cagcaccgtc 480
tattaccagg gcaaatgtct gacctggaaa ggtccaagaa ggcagctgcc ggctgtggtc 540
ccagcgcccc tcccaccacc atgtgggagc tcagcacatc tgcttccccc agtcccagga 600
ggctaa 606
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR1 (Kabat)
<400> 3
Ser Ser Trp Met His
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2 (Kabat)
<400> 4
Glu Ile His Pro Asn Arg Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3 (Kabat)
<400> 5
Ser Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly Ala Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR1 (Kabat)
<400> 6
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR2 (Kabat)
<400> 7
Ala Ala Ser Tyr Arg His Ile
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3 (Kabat)
<400> 8
Gln Gln His Tyr Ser Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mu183 VH
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asn Arg Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly Ala Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mu183 VL
<400> 10
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Arg His Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Asn Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1831 VH
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Val Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asn Arg Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly Ala Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1831 VH DNA
<400> 12
caagttcagc tggtgcagag cggagccgtg gtggtgaagc ccggtgcctc tgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc tccagctgga tgcactgggc cagacaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatcggcgag atccacccca atcgtgacaa caccaactac 180
aacgagaagt tcaagggtcg tgccacttta accgtggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gctctttaag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtagctac 300
tacgactacg gcggcgccta cttcgacagc tggggacaag gtactttagt gaccgtgagc 360
agc 363
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1831 VL
<400> 13
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Arg His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Asn Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1831 VL DNA
<400> 14
cagatcgtgc tgacccagag ccctagctct ttaagcgctt ccgtgggcga tcgtgtcacc 60
atcacttgta aggccagcca agatgtcagc acagccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120
ggaaagagcc ccaagctgct gatctacgcc gccagctatc gtcacatcgg cgtgcccagc 180
agatttagcg gcagcggcag cggaaccgac ttcaccttca ccatcagctc tttacagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacagca accccttcac cttcggcggc 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 15
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1831 HC
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Val Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asn Arg Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly Ala Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 16
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1831 HC DNA
<400> 16
caagttcagc tggtgcagag cggagccgtg gtggtgaagc ccggtgcctc tgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc tccagctgga tgcactgggc cagacaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatcggcgag atccacccca atcgtgacaa caccaactac 180
aacgagaagt tcaagggtcg tgccacttta accgtggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gctctttaag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtagctac 300
tacgactacg gcggcgccta cttcgacagc tggggacaag gtactttagt gaccgtgagc 360
agcgctagca caaagggacc aagcgtgttc ccactggcac ctagctccaa gtctaccagc 420
ggaggaacag ccgccctggg atgtctggtg aaggattatt tccctgagcc agtgaccgtg 480
agctggaact ccggcgccct gacctctgga gtgcacacat ttccagccgt gctgcagtct 540
agcggcctgt actccctgtc ctctgtggtg accgtgccca gctcctctct gggcacccag 600
acatatatct gcaacgtgaa tcacaagcca tctaatacaa aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gtgataagac ccacacatgc ccaccttgtc ctgcaccacc agcagcaggc 720
ccaagcgtgt tcctgtttcc tccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct 780
gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgtct cacgaggatc ccgaggtgaa gttcaactgg 840
tacgtggatg gcgtggaggt gcacaatgcc aagaccaagc ctagggagga gcagtacaat 900
agcacctatc gcgtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtataagt gcaaggtgag caataaggcc ctggccgccc ctatcgagaa gaccatctcc 1020
aaggcaaagg gacagccaag ggagccacag gtgtacacac tgccccctag cagagacgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacatgt ctggtgaagg gcttctatcc ctccgatatc 1140
gccgtggagt gggagtctaa tggccagcct gagaacaatt acaagaccac accacccgtg 1200
ctggactctg atggcagctt ctttctgtat tctaagctga ccgtggataa gagcagatgg 1260
cagcagggca acgtgttttc ctgttctgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacaca 1320
cagaagagcc tgtccctgtc tcccggcaag tga 1353
<210> 17
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1831 LC
<400> 17
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Arg His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Asn Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 18
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1831 LC DNA
<400> 18
cagatcgtgc tgacccagag ccctagctct ttaagcgctt ccgtgggcga tcgtgtcacc 60
atcacttgta aggccagcca agatgtcagc acagccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120
ggaaagagcc ccaagctgct gatctacgcc gccagctatc gtcacatcgg cgtgcccagc 180
agatttagcg gcagcggcag cggaaccgac ttcaccttca ccatcagctc tttacagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacagca accccttcac cttcggcggc 300
ggcaccaagg tggagatcaa gagaaccgtg gccgctccta gcgtgttcat cttccctccc 360
agcgacgagc agctgaaaag cggaacagcc agcgtcgtct gcctgctgaa caacttctac 420
cccagggagg ccaaggtcca gtggaaggtg gacaacgctc tgcagagcgg caactctcag 480
gagagcgtga cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag cacactgacc 540
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgctt gcgaagtgac ccaccaggga 600
ctgtctagcc cagtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gttag 645
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR1 (Kabat)
<400> 19
Ser Ser Tyr Met His
1 5
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3 (Kabat)
<400> 20
Ser Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly Ala Tyr Phe Asp Ala
1 5 10
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1832 VH
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asn Arg Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly Ala Tyr Phe Asp Ala Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1832 VH DNA
<400> 22
caagttcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ccggtgcctc tgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc tccagctaca tgcactgggt cagacaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atccacccca atcgtgacaa caccaactac 180
aacgagaagt tcaagggtcg tgtcactatg accgtggaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gctctttaag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtagctac 300
tacgactacg gcggcgccta cttcgacgcc tggggacaag gtactttagt gaccgtgagc 360
agc 363
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1832 VL
<400> 23
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Arg His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Asn Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1832 VL DNA
<400> 24
gacatccagc tgacccagag ccctagctct ttaagcgctt ccgtgggcga tcgtgtcacc 60
atcacttgta aggccagcca agatgtcagc acagccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120
ggaaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagctatc gtcacatcgg cgtgcccagc 180
agatttagcg gcagcggcag cggaaccgac ttcaccttaa ccatcagctc tttacagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacagca accccttcac cttcggcggc 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 25
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1832 HC
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asn Arg Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly Ala Tyr Phe Asp Ala Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 26
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1832 HC DNA
<400> 26
caagttcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ccggtgcctc tgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc tccagctaca tgcactgggt cagacaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atccacccca atcgtgacaa caccaactac 180
aacgagaagt tcaagggtcg tgtcactatg accgtggaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gctctttaag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtagctac 300
tacgactacg gcggcgccta cttcgacgcc tggggacaag gtactttagt gaccgtgagc 360
agcgctagca caaagggacc aagcgtgttc ccactggcac ctagctccaa gtctaccagc 420
ggaggaacag ccgccctggg atgtctggtg aaggattatt tccctgagcc agtgaccgtg 480
agctggaact ccggcgccct gacctctgga gtgcacacat ttccagccgt gctgcagtct 540
agcggcctgt actccctgtc ctctgtggtg accgtgccca gctcctctct gggcacccag 600
acatatatct gcaacgtgaa tcacaagcca tctaatacaa aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gtgataagac ccacacatgc ccaccttgtc ctgcaccacc agcagcaggc 720
ccaagcgtgt tcctgtttcc tccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct 780
gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgtct cacgaggatc ccgaggtgaa gttcaactgg 840
tacgtggatg gcgtggaggt gcacaatgcc aagaccaagc ctagggagga gcagtacaat 900
agcacctatc gcgtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtataagt gcaaggtgag caataaggcc ctggccgccc ctatcgagaa gaccatctcc 1020
aaggcaaagg gacagccaag ggagccacag gtgtacacac tgccccctag cagagacgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacatgt ctggtgaagg gcttctatcc ctccgatatc 1140
gccgtggagt gggagtctaa tggccagcct gagaacaatt acaagaccac accacccgtg 1200
ctggactctg atggcagctt ctttctgtat tctaagctga ccgtggataa gagcagatgg 1260
cagcagggca acgtgttttc ctgttctgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacaca 1320
cagaagagcc tgtccctgtc tcccggcaag tga 1353
<210> 27
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1832 LC
<400> 27
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Arg His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Asn Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 28
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1832 LC DNA
<400> 28
gacatccagc tgacccagag ccctagctct ttaagcgctt ccgtgggcga tcgtgtcacc 60
atcacttgta aggccagcca agatgtcagc acagccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120
ggaaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagctatc gtcacatcgg cgtgcccagc 180
agatttagcg gcagcggcag cggaaccgac ttcaccttaa ccatcagctc tttacagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacagca accccttcac cttcggcggc 300
ggcaccaagg tggagatcaa gagaaccgtg gccgctccta gcgtgttcat cttccctccc 360
agcgacgagc agctgaaaag cggaacagcc agcgtcgtct gcctgctgaa caacttctac 420
cccagggagg ccaaggtcca gtggaaggtg gacaacgctc tgcagagcgg caactctcag 480
gagagcgtga cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag cacactgacc 540
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgctt gcgaagtgac ccaccaggga 600
ctgtctagcc cagtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gttag 645
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3 (Kabat)
<400> 29
Ser Tyr Tyr Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Phe Asp Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1833 VH
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asn Arg Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Phe Asp Ala Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1833 VH DNA
<400> 31
caagttcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ccggtgcctc tgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc tccagctaca tgcactgggt cagacaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atccacccca atcgtgacaa caccaactac 180
aacgagaagt tcaagggtcg tgtcactatg accagggaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gctctttaag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtagctac 300
tacgagtacg gcggcgccta cttcgacgcc tggggacaag gtactttagt gaccgtgagc 360
agc 363
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1833 VL
<400> 32
Gln Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Arg His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Asn Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1833 VL DNA
<400> 33
cagatccagc tgacccagag ccctagctct ttaagcgctt ccgtgggcga tcgtgtcacc 60
atcacttgta aggccagcca agatgtcagc acagccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120
ggaaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagctatc gtcacatcgg cgtgcccagc 180
agatttagcg gcagcggcag cggaaccgac ttcaccttaa ccatcagctc tttacagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacagca accccttcac cttcggcggc 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 34
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1833 HC
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asn Arg Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Phe Asp Ala Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 35
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1833 HC DNA
<400> 35
caagttcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ccggtgcctc tgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc tccagctaca tgcactgggt cagacaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atccacccca atcgtgacaa caccaactac 180
aacgagaagt tcaagggtcg tgtcactatg accagggaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gctctttaag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtagctac 300
tacgagtacg gcggcgccta cttcgacgcc tggggacaag gtactttagt gaccgtgagc 360
agcgctagca caaagggacc aagcgtgttc ccactggcac ctagctccaa gtctaccagc 420
ggaggaacag ccgccctggg atgtctggtg aaggattatt tccctgagcc agtgaccgtg 480
agctggaact ccggcgccct gacctctgga gtgcacacat ttccagccgt gctgcagtct 540
agcggcctgt actccctgtc ctctgtggtg accgtgccca gctcctctct gggcacccag 600
acatatatct gcaacgtgaa tcacaagcca tctaatacaa aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gtgataagac ccacacatgc ccaccttgtc ctgcaccacc agcagcaggc 720
ccaagcgtgt tcctgtttcc tccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct 780
gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgtct cacgaggatc ccgaggtgaa gttcaactgg 840
tacgtggatg gcgtggaggt gcacaatgcc aagaccaagc ctagggagga gcagtacaat 900
agcacctatc gcgtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtataagt gcaaggtgag caataaggcc ctggccgccc ctatcgagaa gaccatctcc 1020
aaggcaaagg gacagccaag ggagccacag gtgtacacac tgccccctag cagagacgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacatgt ctggtgaagg gcttctatcc ctccgatatc 1140
gccgtggagt gggagtctaa tggccagcct gagaacaatt acaagaccac accacccgtg 1200
ctggactctg atggcagctt ctttctgtat tctaagctga ccgtggataa gagcagatgg 1260
cagcagggca acgtgttttc ctgttctgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacaca 1320
cagaagagcc tgtccctgtc tcccggcaag tga 1353
<210> 36
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1833 LC
<400> 36
Gln Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Arg His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Asn Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 37
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGA1833 LC DNA
<400> 37
cagatccagc tgacccagag ccctagctct ttaagcgctt ccgtgggcga tcgtgtcacc 60
atcacttgta aggccagcca agatgtcagc acagccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120
ggaaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagctatc gtcacatcgg cgtgcccagc 180
agatttagcg gcagcggcag cggaaccgac ttcaccttaa ccatcagctc tttacagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacagca accccttcac cttcggcggc 300
ggcaccaagg tggagatcaa gagaaccgtg gccgctccta gcgtgttcat cttccctccc 360
agcgacgagc agctgaaaag cggaacagcc agcgtcgtct gcctgctgaa caacttctac 420
cccagggagg ccaaggtcca gtggaaggtg gacaacgctc tgcagagcgg caactctcag 480
gagagcgtga cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag cacactgacc 540
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgctt gcgaagtgac ccaccaggga 600
ctgtctagcc cagtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gttag 645
<210> 38
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1wt
<400> 38
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 39
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有wt IgG1 HC的BGA1833
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asn Arg Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Phe Asp Ala Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 40
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有wt IgG1 HC DNA的BGA1833
<400> 40
caagttcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ccggtgcctc tgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc tccagctaca tgcactgggt cagacaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atccacccca atcgtgacaa caccaactac 180
aacgagaagt tcaagggtcg tgtcactatg accagggaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gctctttaag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtagctac 300
tacgagtacg gcggcgccta cttcgacgcc tggggacaag gtactttagt gaccgtgagc 360
agcgctagca ccaaggggcc ctcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagtacttct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1356
<210> 41
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1mf
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Ala Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 42
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴NKp30
<400> 42
Met Ala Trp Met Leu Leu Leu Ile Leu Ile Met Val Tyr Pro Gly Ser
1 5 10 15
Cys Ala Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly
20 25 30
Ser Ser Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu
35 40 45
Ala Ile Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Val Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Phe Leu Arg Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Trp
85 90 95
Asp Val Arg Gly His Asp Ala Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val
100 105 110
Leu Gly Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val Val Glu
115 120 125
Lys Glu Tyr Pro Gln Leu Gly Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu Arg Ala
130 135 140
Gly Phe Tyr Ala Val Ser Phe Leu Ser Val Ala Val Gly Ser Thr Leu
145 150 155 160
Tyr Tyr Gln Gly Lys Cys His Cys His Met Gly Thr His Cys His Ser
165 170 175
<210> 43
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 43
Gly Ser
1
<210> 44
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 44
Gly Gly Ser
1
<210> 45
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 45
Gly Ser Gly
1
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 46
Ser Gly Gly
1
<210> 47
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 47
Gly Gly Gly
1
<210> 48
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 48
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 49
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 49
Ser Gly Gly Gly
1
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 50
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 51
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 53
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 54
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 55
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 56
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 56
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg
1 5 10 15
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 57
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg
1 5 10 15
Val
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 58
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1 5
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 59
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1 5 10
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 60
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg
1 5 10 15
Val
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 61
Ser Ala Lys Thr Thr Pro
1 5
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 62
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1 5 10
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 63
Arg Ala Asp Ala Ala Pro
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 64
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
1 5
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 65
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser
1 5 10
<210> 66
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 66
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 67
Ser Ala Lys Thr Thr Pro
1 5
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 68
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1 5 10
<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 69
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala
1 5 10 15
Arg Val
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 70
Ala Asp Ala Ala Pro
1 5
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 71
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 72
Thr Val Ala Ala Pro
1 5
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 73
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 74
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 74
Gln Pro Lys Ala Ala Pro
1 5
<210> 75
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 75
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 76
Ala Lys Thr Thr Pro Pro
1 5
<210> 77
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 77
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 78
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 78
Ala Lys Thr Thr Ala Pro
1 5
<210> 79
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 79
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 80
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
1 5
<210> 81
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 81
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 82
Gly Glu Asn Lys Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Met Ala Leu Ser
1 5 10 15
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 83
Gly Pro Ala Lys Glu Leu Thr Pro Leu Lys Glu Ala Lys Val Ser
1 5 10 15
<210> 84
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 84
Gly His Glu Ala Ala Ala Val Met Gln Val Gln Tyr Pro Ala Ser
1 5 10 15
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 85
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro
1 5 10

Claims (37)

1.一种特异性结合人NKp30的抗体或其抗原结合片段。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体至少在SEQ ID NO:1的氨基酸异亮氨酸50和亮氨酸86处结合人NKp30。
3.如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体降低NKp30与B6H7配体的相互作用。
4.如权利要求3所述的抗体，其中所述抗体具有NKp30激动剂活性。
5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(i)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:19的HCDR1(重链互补决定区1)，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，(c)SEQ ID NO:29的HCDR3和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1(轻链互补决定区1)，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3；
(ii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:19的HCDR1，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，(c)SEQID NO:20的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3；或
(iii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:3的HCDR1，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，(c)SEQID NO:5的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3。
6.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:30至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:32至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(ii)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:21至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:23至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或
(iii)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:11至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:13至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
7.如权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:30、32、21、23、11或13中已插入、缺失或取代一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸。
8.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含：
(i)包含SEQ ID NO:30的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:32的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:21的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:23的轻链可变区(VL)；或
(iii)包含SEQ ID NO:11的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:13的轻链可变区(VL)。
9.如权利要求1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。
10.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。
11.一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含特异性结合人NKp30的至少第一抗原结合结构域和特异性结合人肿瘤相关抗原(TAA)的至少第二抗原结合结构域。
12.如权利要求11所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域包含：
(i)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:19的HCDR1(重链互补决定区1)，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，(c)SEQ ID NO:29的HCDR3和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1(轻链互补决定区1)，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3；
(ii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:19的HCDR1，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，(c)SEQID NO:20的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3；或
(iii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:3的HCDR1，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，(c)SEQID NO:5的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3，
和特异性结合人肿瘤相关抗原(TAA)的至少第二抗原结合结构域。
13.如权利要求12所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
14.如权利要求13所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是双特异性四价抗体。
15.如权利要求14所述的双特异性四价抗体，所述双特异性四价抗体包含VD1-CL-(X1)n-VD2-CH1-Fc或VD1-CH-(X1)n-VD2-CL-Fc，其中VD1是抗原结合结构域的第一可变结构域，VD2是抗原结合结构域的第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，CH或CL是恒定重链或恒定轻链结构域，并且(X1)n是至少2个氨基酸的接头。
16.如权利要求15所述的双特异性四价抗体，其中所述接头是SEQ ID NO:43至SEQ IDNO 85的序列。
17.如权利要求16所述的双特异性四价抗体，其中所述接头是SEQ ID NO:44。
18.如权利要求16所述的双特异性四价抗体，其中所述接头是SEQ ID NO:50。
19.如权利要求16所述的双特异性四价抗体，其中所述接头是SEQ ID NO:55。
20.如权利要求1至19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
21.如权利要求1至19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有降低的糖基化或无糖基化或低岩藻糖基化。
22.如权利要求1至19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含增加的二等分GlcNac结构。
23.如权利要求1至19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc结构域是IgG1的Fc结构域。
24.如权利要求1至19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc结构域是IgG4的Fc结构域。
25.如权利要求24所述的抗体或抗原结合片段，其中所述IgG4具有S228P取代(根据EU编号系统)。
26.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，还包含药学上可接受的载剂。
27.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要的患者施用有效量的如权利要求1或权利要求11所述的抗体或抗原结合片段。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症是胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段与另一种治疗剂组合施用。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述治疗剂是紫杉醇或紫杉醇药剂、多西他赛、卡铂、托泊替康、顺铂、伊立替康、多柔比星、来那度胺或5-氮杂胞苷。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述治疗剂是紫杉醇药剂、来那度胺或5-氮杂胞苷。
32.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如权利要求1至19中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
33.一种载体，所述载体包含如权利要求32所述的核酸。
34.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求32所述的核酸或如权利要求33所述的载体。
35.一种生产抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养如权利要求35所述的宿主细胞和从培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。
36.一种诊断试剂，所述诊断试剂包含如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段。
37.如权利要求36所述的诊断试剂，其中标记选自由放射性标记、荧光团、发色团、成像剂和金属离子组成的组。
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