EA045547B1 - Антитела к ox40 и способы применения - Google Patents

Антитела к ox40 и способы применения Download PDF

Info

Publication number
EA045547B1
EA045547B1 EA202092460 EA045547B1 EA 045547 B1 EA045547 B1 EA 045547B1 EA 202092460 EA202092460 EA 202092460 EA 045547 B1 EA045547 B1 EA 045547B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
antibody
antigen
binding fragment
variable region
Prior art date
Application number
EA202092460
Other languages
English (en)
Inventor
Е Лю
Тун Чжан
Цзобай Ван
Кан Ли
Original Assignee
Бейджин, Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бейджин, Лтд. filed Critical Бейджин, Лтд.
Publication of EA045547B1 publication Critical patent/EA045547B1/ru

Links

Description

В данном документе раскрыты антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с человеческим ОХ40, композиция, содержащая указанное антитело, а также способы применения для лечения рака.
Предшествующий уровень техники
ОХ40 (также известный как АСТ35, CD134 или TNFRSF4) представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I приблизительно 50 кДа, и член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNFRSF - tumor necrosis factor receptor super family) (Croft, 2010; Gough and Weinberg, 2009). Зрелый человеческий ОХ40 состоит из 249 аминокислотных (а.к.) остатков, с цитоплазматическим хвостом из 37 а.к. и внеклеточной областью из 185 а.к. Внеклеточный домен ОХ40 содержит три полных и один неполный цистеин-богатый домен (CRD - cysteine-rich domain). Внутриклеточный домен ОХ40 содержит один консервативный мотив QEE, связанный с сигнализацией, который опосредует связывание с несколькими TNFR-ассоциированными факторами (TRAF), включая TRAF2, TRAF3 и TRAF5, делая возможным связывание ОХ40 с внутриклеточными киназами (Arch and Thompson, 1998; Willoughby et al., 2017).
OX40 исходно был раскрыт на активированных CD4 Т-клетках крысы, и мышиные и человеческие гомологи впоследствии клонировали из Т-клеток (al-Shamkhani et al., 1996; Calderhead et al., 1993). Помимо экспрессии на активированных CD4+ T-клетках, включая клетки Т-хэлперы (Th) 1, клетки Th2, клетки Th17, а также регуляторные Т (Treg)-клетки, экспрессия ОХ40 также была обнаружена на поверхности активированных CD8+ Т-клеток, естественных Т-клеток-киллеров (NK - Natural Killer), нейтрофилов и NK-клеток (Croft, 2010). Напротив, низкий уровень экспрессии ОХ40 обнаружен на наивных CD4 и CD8 Т-клетках, а также большинстве покоящихся Т-клеток памяти (Croft, 2010; Soroosh et al., 2007). Экспрессия ОХ40 на поверхности наивных Т-клеткок является временной. После активации TCR (T cell receptor - Т-клеточный рецептор) уровень экспрессии ОХ40 на Т-клетках значительно повышается за 24 часа и с пиками через 2~3 суток, продолжаясь в течение 5-6 суток (Gramaglia et al., 1998).
Лиганд для ОХ40 (OX40L, также известный как gp34, CD252 или TNFSF4) представляет собой один единственный лиганд для ОХ40. Аналогично другим членам TNFSF (суперсемейство факторов некроза опухолей), OX40L представляет собой гликопротеин типа II, который содержит 183 а.к. с внутриклеточным доменом из 23 а.к. и внеклеточным доменом из 133 а.к. (Croft, 2010; Gough and Weinberg, 2009). В природе OX40L образует гомомерный тримерный комплекс на поверхности клетки. Лиганд-тример взаимодействует с тремя копиями ОХ40 на поверхности контакта мономер-мономер лиганда главным образом посредством CRD1, CRD2 и частично CRD3 областей рецептора, но без участия CRD4 (Compaan and Hymowitz, 2006). OX40L главным образом экспрессируется на активированных антигенпрезентирующих клетках (АРС - antigen presenting cell), включая активированные В-клетки (Stuber et al, 1995), зрелые обычные дендритные клетки (DC - dendritic cell) (Ohshima et al., 1997), плазмацитоидные DC (pDC) (Ito et al., 2004), макрофаги (Weinberg et al., 1999) и клетки Лангерганса (Sato et al., 2002). Кроме того, было обнаружено, что OX40L экспрессируется на других типах клеток, таких как NK, тучные клетки, субпопуляция активированных Т-клеток, а так же эндотелиальные клетки сосудов и гладкомышечные клетки (Croft, 2010; Croft et al., 2009).
Тримеризация ОХ40 в результате лигирования посредством тримерного OX40L или димеризация посредством агонистических антител способствует рекрутированию и причаливанию адаптерных молекул TRAF2, TRAF3 и/или TRAF5 к их внутриклеточному мотиву QEE. (Arch and Thompson, 1998; Willoughby et al., 2017) Рекрутирование и причаливание TRAF2 и TRAF3 могут дополнительно приводить к активации как канонического NF-kB1, так и неканонического NF-kB2 путей, которые играют ключевые роли в регуляции выживаемости, дифференциации, размножении, продукции цитокинов и эффекторных функций Т-клеток (Croft, 2010; Gramaglia et al., 1998; Huddleston et al., 2006; Rogers et al., 2001; Ruby and Weinberg, 2009; Song et al., 2005a; Song et al., 2005b; Song et al., 2008).
В нормальных тканях уровень экспрессии ОХ40 является низким и главным образом она происходит на лимфоцитах в лимфоидных органах (Durkop et al., 1995). Однако, повышающая регуляция экспрессии ОХ40 на иммунных клетках часто наблюдалась как в животных моделях, так и у пациентов, являющихся человеком, с патологическими состояниями (Redmond and Weinberg, 2007), такими как аутоиммунные заболевания (Carboni et al., 2003; Jacquemin et al., 2015; Szypowska et al., 2014) и раковые заболевания (Kjaergaard et al., 2000; Vetto et al., 1997; Weinberg et al., 2000). Примечательно, повышенный уровень экспрессии ОХ40 ассоциирован с более длительной выживаемостью у пациентов с раком толстой и прямой кишки и меланомой кожи, и обратно пропорционально коррелирует с возникновением удаленных метастазов и признаков опухолей более поздних стадий (Ladanyi et al., 2004; Petty et al., 2002; Sarff et al., 2008). Также было показано, что лечение антителами к ОХ40 могло вызывать противоопухолевую эффективность в разных мышиных моделях (Aspeslagh et al, 2016), указывая на потенциал ОХ40 в качестве иммунотерапевтической мишени. В первом клиническом испытании у пациентов с раком, проводимом Curti et al., наблюдали подтверждение противоопухолевой эффективности и активации опухолеспецифичных Т-клеток с агонистическими моноклональными антителами к ОХ40, что указывало на то, что антитела к ОХ40 полезны в стимулировании противоопухолевых Т-клеточных ответов (Curti et al., 2013).
- 1 045547
Механизм действия агонистических антител к ОХ40 в посредничестве противоопухолевой эффективности исследован главным образом в мышиных моделях опухолей (Weinberg et al., 2000). До недавнего времени механизм действия агонистических антител к ОХ40 в опухолях объясняли их способностью запускать костимулирующий сигнальный путь в эффекторных Т-клетках, а также ингибирующим действием на дифференциацию и функции клеток Treg (Aspeslagh et al., 2016; Ito et al., 2006; St Rose et al., 2013; Voo et al., 2013). Недавние исследования показали, что как в животных моделях опухолей, так и у пациентов с раком, Treg, инфильтрирующие опухоль, экспрессируют ОХ40 на более высоких уровнях, чем эффекторные Т-клетки (как CD4+ , так и CD8+) и Treg периферической крови (Lai et al., 2016; Marabelle et al., 2013b; Montler et al., 2016; Soroosh et al., 2007; Timperi et al., 2016). Вследствие этого, вторичные эффекты, посредством которых антитела к ОХ40 запускают противоопухолевые ответы, обусловлены их Fc-опосредованными эффекторными функциями в истощении внутриопухолевых ОХ40 Tregклеток посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC - antibody-dependent cytotoxicity) и/или антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP - antibody-dependent cellular phagocytosis) (Aspeslagh et al., 2016; Bulliard et al., 2014; Marabelle et al., 2013a; Marabelle et al., 2013b; Smyth et al., 2014). Данная работа демонстрирует, что агонистические антитела к ОХ40 с эффекторной функцией, опосредованной Fc, могли предпочтительно истощать внутриопухолевые Treg и улучшать отношения CD8 эффекторных Т-клеток к Treg в микроокружении опухоли (ТМЕ - tumor microenvironment), приводя к улучшенным противоопухолевым иммунным ответам, увеличенной регрессии опухоли и улучшенной выживаемости (Bulliard et al., 2014; Carboni et al., 2003; Jacquemin et al., 2015; Marabelle et al., 2013b). Как следует из этих данных, существует неудовлетворенная медицинская потребность в разработке агонистических антител к ОХ40 как с агонистическими активностями, и так и эффекторными функциями, опосредованными Fc.
На настоящий момент агонистические антитела к ОХ40 в лечебном учреждении представляют собой главным образом лиганд-конкурентные антитела, которые блокируют взаимодействие OX40-OX40L (например, WO2016196228A1). Поскольку взаимодействие OX40-OX40L является существенным для усиления эффективного противоопухолевого иммунитета, блокада OX40-OX40L ограничивает эффективность данных лиганд-конкурентных антител. Таким образом, антитела-агонисты к ОХ40, которые специфично связываются с ОХ40, одновременно не препятствуя взаимодействию ОХ40 с OX40L, обладают полезностью в лечении рака и аутоиммунных расстройств.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение направлено на агонистические антитела к ОХ40 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые активируют ОХ40 и индуцируют сигнализацию в иммунных клетках, стимулируя, таким образом, противоопухолевый иммунитет.
В одном воплощении согласно изобретению предложены моноклональные антитела, которые связываются с человеческим ОХ40, или их антигенсвязывающие фрагменты. В одном аспекте антитело по настоящему изобретению не конкурирует с OX40L или не мешает связыванию ОХ40 с его лигандом OX40L.
Настоящее изобретение охватывает следующие воплощения.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с человеческим ОХ40 и содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR (определяющая комплементарность область тяжелой цепи) 1 с SEQ ID NO: 3, (b) HCDR2 с SEQ ID NO: 24, (с) HCDR3 с SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит: (d) LCDR (определяющая комплементарность область легкой цепи) 1 с SEQ ID NO: 25, (е) LCDR2 с SEQ ID NO: 19 и (f) LCDR3 с SEQ ID NO: 8; (ii) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 с SEQ ID NO: 3, (b) HCDR2 с SEQ ID NO: 18, (с) HCDR3 с SEQ ID NO: 5; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит: (d) LCDR1 с SEQ ID NO: 6, (е) LCDR2 с SEQ ID NO: 19 и (f) LCDR3 с SEQ ID NO: 8; (iii) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (а) HCDR1 с SEQ ID NO: 3, (b) HCDR2 с SEQ ID NO: 13, (с) HCDR3 с SEQ ID NO: 5; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит: (d) LCDR1 с SEQ ID NO:6, (е) LCDR2 с SEQ ID NO: 7, и (f) LCDR3 с SEQ ID NO: 8; или (iv) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 с SEQ ID NO: 3, (b) HCDR2 с SEQ ID NO: 4, (с) HCDR3 с SEQ ID NO: 5; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит: (d) LCDR1 с SEQ ID NO: 6, (е) LCDR2 с SEQ ID NO: 7 и (f) LCDR3 с SEQ ID NO: 8.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичную SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичную SEQ ID NO: 28; (ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичную SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичную SEQ ID NO: 22; (iii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичную SEQ ID NO: 14, и вариабельную область
- 2 045547 легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичную SEQ ID NO: 16; или (iv) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичную SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичную SEQ ID NO: 11.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где в SEQ ID NO: 26, 28, 20, 22, 14, 16, 9, и/или 11 имеются инсерции, делеции или замены одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислот.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит SEQ ID NO: 28; (ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит SEQ ID NO: 22; (iii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит SEQ ID NO: 14, и вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит SEQ ID NO: 16; или (iv) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит SEQ ID NO: 9, вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит SEQ ID NO: 11.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое представляет собой моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое сконструированное антитело, одноцепочечное антитело (scFv), Fab фрагмент, Fab' фрагмент или F(ab')2 фрагмент.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое обладает ОХ40-агонистической активностью.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим ОХ40 на эпитопе, содержащем один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из H153D170 человеческого ОХ40.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим ОХ40 на уровне эпитопа, содержащего один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Н153, Т154,Н65, Е167 и D170 человеческого ОХ40.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим ОХ40 на уровне эпитопа, содержащего один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Н153, I165 и Е167 человеческого ОХ40. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим ОХ40 на уровне эпитопа, содержащего один аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Н153,Н65 и Е167 человеческого ОХ40.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим ОХ40 на или в пределах SEQ ID NO. 30.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим ОХ40 при равновесной константе диссоциации (KD), равной или более высокой, чем 7,28 нМ, 9,47 нМ, 13,5 нМ или 17,1 нМ, как измерено посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR - surface plasmon resonance).
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC -complement-dependent cytotoxicity).
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет пониженный уровень гликозилирования или не имеет гликозилирование или является гипофукозилированным.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет повышенное содержание структур, имеющих ветвление в точках GlcNac.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где домен Fc принадлежит к IgG1.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где домен Fc принадлежит к IgG4.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где IgG4 имеет замену S228P (в соответствии с системой нумерации EU).
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где IgG4 имеет замены S228P и R409K (в соответствии с системой нумерации EU).
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое имеет одно или более из следующих свойств:
(i) способно вступать в перекрестную реакцию с cynoOX40;
(ii) не препятствует взаимодействию OX40-OX40L;
(iii) способно стимулировать Т-клетку, в частности, при ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация), равной или превышающей 0,06 нг/мл;
(iv) способно активировать CD4+ Т-клетки, в частности, как измерено в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR - mixed lymphocyte reaction);
(v) способно опосредовать ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность), в частности, как измерено в анализе ADCC на основе высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH - lactate dehydrogenase);
- 3 045547 (vi) способно истощать CD4+ Treg;
(vii) способно увеличивать отношение CD8 Teff (эффекторная Т-клетка)/Тгед; или (viii) способно опосредовать частичную регрессию опухоли в животной модели опухоли.
Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
Способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента.
Способ, где рак включает рак молочной железы, рак головы и шеи, рак желудка, рак почки, рак печени, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак яичника, рак кожи, мезотелиому, лимфому, лейкоз, миелому, саркому и т.д., но не ограничивается ими.
Способ, где антитело или фармацевтическую композицию вводят в комбинации с другим терапевтическим средством.
Способ, где терапевтическое средство представляет собой паклитаксел или средство на основе паклитаксела, доцетаксел, карбоплатин, топотекан, цисплатин, иринотекан, доксорубицин, леналидомид, 5азацитидин.
Способ, где терапевтическое средство представляет собой средство на основе паклитаксела, леналидомид или 5-азацитидин.
Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту.
Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту.
Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина и выделение из культуры антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в лечении или снижения вероятности: рака молочной железы, рака головы и шеи, рака желудка, рака почки, рака печени, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака яичника, рака кожи, мезотелиомы, лимфомы, лейкоза, миеломы и саркомы.
Диагностический реагент, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое мечено.
Диагностический реагент, где метка выбрана из группы, состоящей из радиоактивной метки, флуорофора, хромофора, визуализирующего средства и иона металла.
В одном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит одну или определяющих комплементарность более областей (CDR), имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25.
В другом воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую одну или более определяющих комплементарность областей (HCDR), имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 5; и/или (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую одну или более определяющих комплементарность областей (LCDR), имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 8.
В другом воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три определяющие комплементарность области (HCDR), которые представляют собой HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 24; и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и/или (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую три определяющие комплементарность области (LCDR), которые представляют собой LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 25; LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 19; и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
В другом воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три определяющие комплементарность области (HCDR), которые представляют собой HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; или HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; или HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; или HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;
- 4 045547 и/или (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую три определяющие комплементарность области (LCDR), которые представляют собой LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; или LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; или LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
В другом воплощении антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
В одном воплощении антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
В другом воплощении антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
В другом воплощении антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
В одном воплощении антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 26, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную любой из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 26; и/или (b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 28, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную любой из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 28.
В другом воплощении антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 26, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две или три аминокислотные замены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 26; и/или (b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 28, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен в аминокислоте SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 28. В другом воплощении аминокислотные замены представляют собой консервативные аминокислотные замены.
В одном воплощении антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; или (b) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; или
- 5 045547 (c) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID
NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID
NO: 22; или (d) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
В одном воплощении антитело по настоящему изобретению принадлежит к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В более конкретном воплощении антитело по настоящему изобретению содержит домен Fc человеческого IgG1 дикого типа (также называемого человеческим IgG1wt или hulgG1) или IgG2. В другом воплощении антитело по настоящему изобретению содержит домен Fc человеческого IgG4 с заменами S228P и/или R409K (в соответствии с системой нумерации EU).
В одном воплощении антитело по настоящему изобретению связывается с ОХ40 с аффинностью связывания (KD) от 1х10-6 М до 1х10-10 М. В другом воплощении антитело по настоящему изобретению связывается с ОХ40 с аффинностью связывания (KD) примерно 1х10-6 М, примерно 1х10-7 М, примерно 1х10-8 М, примерно 1х10-9 М или примерно 1х10-10М.
В другом воплощении антитело к человеческому ОХ40 по настоящему изобретению демонстрирует межвидовую активность связывания с ОХ40 яванского макака.
В одном воплощении антитело к ОХ40 по настоящему изобретению связывается с эпитопом человеческого ОХ40 за пределами зоны взаимодействия OX40-OX40L. В другом воплощении антитело к ОХ40 по настоящему изобретению не конкурирует с лигандом ОХ40, связывающимся с ОХ40. В еще одном воплощении антитело к ОХ40 по настоящему изобретению не блокирует взаимодействие ОХ40 с его лигандом OX40L.
Антитела по настоящему изобретению являются агонистическими и значительно усиливают иммунный ответ. Согласно изобретению предложен способ анализа агонистической способности антител к ОХ40. В одном воплощении антитело по настоящему изобретению может значимо стимулировать продукцию первичными Т-клетками IL-2 (интерлейкин-2) в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR).
В одном воплощении антитела по настоящему изобретению имеют сильные Fc-опосредованные эффекторные функции. Антитела опосредуют антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) к ОХ40И1 клеткам-мишеням, таких как регуляторные Т-клетки (клетки Treg), под действием NK-клеток. В одном аспекте согласно изобретению предложен способ оценки опосредованного антителом к ОХ40 in vitro истощения конкретных Т-клеточных субпопуляций в зависимости от разных уровней экспрессии ОХ40.
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению не блокируют взаимодействие OX40-OX40L. Кроме того, антитела к ОХ40 демонстрируют дозозависимую противоопухолевую активность in vivo, как показано на животных моделях. Дозозависимая активность отличается от профиля активности антител к ОХ40, которые блокируют взаимодействие OX40-OX40L.
Настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность антитела или антигенсвязывающего фрагмента. В одном воплощении выделенная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность VH SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 27, или нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную любой из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 27, и кодирует область VH антитела или антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению. В качестве альтернативы или дополнительно, выделенная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 29, или нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 29, и кодирует область VL антитела или антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело к ОХ40 или его антигенсвязывающий фрагмент и возможно фармацевтически приемлемый эксципиент.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у субъекта, который включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40 или его антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции на основе антитела к ОХ40 в терапевтически эффективном количестве. В другом воплощении заболевание, подлежащее лечению антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, представляет собой рак или аутоиммунное заболевание.
Настоящее изобретение относится к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции на основе антитела к ОХ40 для лечения заболевания, такого как рак или аутоиммунные заболевания.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение конструкций OX40-mIgG2a, OX40-huIgG1 и
- 6 045547
OX40-His. ECD OX40: внеклеточный домен ОХ40. N: N-конец. С: С-конец.
На фиг. 2 показано определение аффинности очищенных химерных (ch445) и гуманизированных (445-1, 445-2, 445-3 и 445-3 IgG4) антител к ОХ40 посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
На фиг. 3 продемонстрировано определение связывания ОХ40 посредством проточной цитометрии. ОХ40-позитивные HuT78/OX40 клетки инкубировали с разными антителами к ОХ40 (антитела ch445, 445-1, 445-2, 445-3 и 445-3 IgG4) и подвергали анализу FACS (fluorescence-activated cell sorting - сортировка клеток с активированной флуоресценцией). Результат показан посредством средней интенсивности флуоресценции (MFI - mean fluorescence intensity, ось Y).
На фиг. 4 показано связывание антител к ОХ40 посредством проточной цитометрии. HuT78/OX40и HuT78/cynoOX40-kлетки окрашивали антителом 445-3, и посредством проточной цитометрии определяли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI, показано по оси Y).
На фиг. 5 изображено определение аффинности Fab 445-3 в отношении ОХ40 дикого типа и точечные мутации посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
На фиг. 6 подробно показаны взаимодействия между антителом 445-3 и его эпитопами на ОХ40. Антитело 445-3 и ОХ40 изображены светло-серым и черным, соответственно. Водородные связи или солевой мостик, π-π-стэкинг и ван-дер-ваальсово (VDW - Van der Waals) взаимодействие показаны пунктирными, двойными пунктирными и сплошными линиями, соответственно.
На фиг. 7 показано, что антитело 445-3 не препятствует связыванию OX40L. Перед окрашиванием HEK293/OX40L-клеток, слитый белок ОХ40-мышиный IgG2a (ОХ40-mIgG2a) предварительно инкубировали с человеческим IgG (+HuIgG), антителом 445-3 (+445-3) или антителом lA7.grl (+lA7.grl, см. США 2015/0307617) в молярном соотношении 1:1. Связывание OX40L с комплексом ОХ40-mIgG2а/антитело к ОХ40 определяли посредством совместной инкубации HEK293/ОХ40L-клеток с комплексом ОХ40mIgG2а/антитело к ОХ40 с последующим взаимодействием с вторичным Ab к мышиному IgG и посредством проточной цитометрии. Результаты показаны в следующем виде: среднее плюс/минус SD (Standard Deviation - стандартное отклонение) двух повторностей. Статистическая значимость: *: Р меньше 0,05; **: Р меньше 0,01.
На фиг. 8 показано структурное выравнивание OX40/Fab 445-3 с описанным комплексом OX40/OX40L (код PDB (Protein Data Bank - банк данных трехмерных структур белков и нуклеиновых кислот): 2HEV). OX40L показан белым, Fab 445-3 показано серым и ОХ40 показан черным.
На фиг. 9А, В показано, что антитело к ОХ40 445-3 вызывает продукцию IL-2 совместно со стимуляцией TCR. ОХ40-позитивные HuT78/OX40 клетки (фиг. 9А) совместно культивировали с линией искусственных антигенпрезентирующих клеток (АРС) (HEK293/OS8Low-FcyRI) в присутствии антител к ОХ40 в течение ночи, и продукцию IL-2 использовали в качестве регистрируемой величины для стимуляции Т-клеток (фиг. 9В). IL-2 в супернатанте культуры выявляли посредством ELISA. Результаты показаны следующим образом: среднее плюс/минус SD трех повторностей.
На фиг. 10 показано, что антитела к ОХ40 усиливают ответы MLR. In vitro дифференцированные дендритные клетки (DC) совместно культивировали с аллогенными CD4+ Т-клетками в присутствии антител к ОХ40 (0,1-10 мкг/мл) в течение 2 суток. IL-2 в супернатанте выявляли посредством ELISA. Все анализы проводили в четырех повторностях, и результаты показывали в следующем виде: среднее плюс/минус SD. Статистическая значимость: *: Р меньше 0,05; **: Р меньше 0,01.
На фиг. 11 показано, что антитело к ОХ40 445-3 вызывает ADCC. Анализ ADCC проводили с использованием клеток NK92MI/CD16V в качестве эффекторных клеток и HuT78/ОХ40-kлеток в качестве клеток-мишеней в присутствии антител к ОХ40 (0,004-3 мкг/мл) или контролей. Равные количества эффекторных клеток и клеток-мишеней совместно культивировали в течение 5 часов перед выявлением высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH). Процент цитотоксичности (ось Y) рассчитывали на основе протокола от производителя, как описано в примере 12. Результаты показаны следующим образом: среднее плюс/минус SD трех повторностей.
На фиг. 12А-12С показано, что антитело к ОХ40 445-3 в комбинации с NK-клетками увеличивает отношения CD8 эффекторных Т-клеток к Treg в активированных РВМС (human peripheral blood mononuclear cell - мононуклеарные клетки периферической крови человека) in vitro. Человеческие РВМС предварительно активировали PHA-L (1 мкг/мл) и затем совместно культивировали с клетками NK92MI/CD16V в присутствии антител к ОХ40 или контроля. Процентные содержания разных субпопуляций Т-клеток определяли посредством проточной цитометрии. Дополнительно рассчитывали отношения CD8+ эффекторных Т-клеток к Treg. На фиг. 12А показано отношение CD8 /общее число Т-клеток. Фиг. 12В представляет собой отношение Treg/Общее число Т-клеток. На фиг. 12С показано отношение CD8 /Treg. Данные показаны в виде среднего плюс/минус SD двух повторностей. Показана статистическая значимость между 445-3 и lA7.gr1 при указанных концентрациях. *: Р меньше 0,05; **: Р меньше 0,01.
На фиг. 13А, 13В показано, что антитело к ОХ40 445-3, а не 1 A7.gr1, обнаруживает дозозависимую противоопухолевую активность на сингенной модели рака толстой и прямой кишки МС38 у ОХ40- 7 045547 гуманизированных мышей. Мышиные клетки карциномы толстой кишки МС38 (2х107) подкожно имплантировали самкам мышей, трансгенных по человеческому ОХ40. После рандомизации в соответствии с объемом опухоли животным внутрибрюшинно инъецировали либо антитела к ОХ40, либо изотипический контроль один раз в неделю три раза, как указано. На фиг. 13А проведено сравнение возрастающих доз антитела 445-3 с возрастающими дозами антитела 1A7.gr1 и уменьшения роста опухоли. На фиг. 13В представлены данные по всем мышам, обработанным той конкретной дозой. Данные представлены, как средний объем опухоли плюс/минус стандартная ошибка среднего (SEM - standard error of the mean) с 6 мышами на группу. Статистическая значимость: *: Р меньше 0,05, в сравнении с изотипическим контролем.
Фиг. 14А, 14В представляет собой таблицу изменений аминокислотного состава, которые были сделаны в антителах к ОХ40.
Определения
Если особым образом не определено еще где-либо в данном документе, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понятные рядовому специалисту в данной области.
В том виде, в котором они используются в данном документе, включая прилагаемую формулу изобретения, слова в единственном числе включают соответствующие ссылки на них во множественном числе, если контекстом явно не продиктовано иное.
Термин или используется для обозначения и используется взаимозаменяемо с термином и/или, если контекстом явно не продиктовано иное.
Термин противораковое средство, в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к любому средству, которое можно использовать для лечения нарушения пролиферации клеток, такого как рак, включая цитотоксические средства, химиотерапевтические средства, лучевую терапию и радиотерапевтические средства, противораковые средства направленного действия и иммунотерапевтические средства, но, не ограничиваясь ими.
Термин ОХ40 относится к трансмембранному гликопротеину типа I приблизительно 50 кДа, члену суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли. ОХ40 также известен как АСТ35, CD134 или TNFRSF4. Аминокислотную последовательность человеческого ОХ40 (SEQ ID NO: 1) можно также обнаружить с учетным номером NP_003318, и нуклеотидная последовательность, кодирующая белок ОХ40, представляет собой учетный номер: Х75962.1. Термин лиганд ОХ40 или OX40L относится к одному единственному лиганду ОХ40 и является взаимозаменяемым с gp34, CD252 или TNFSF4.
Термины введение, осуществление введения, лечение и обработка, в данном документе, при применении к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости, означают приведение экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции в контакт с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. Обработка клетки охватывает приведение реагента в контакт с клеткой, а также приведение реагента в контакт с жидкостью, где данная жидкость находится в контакте с клеткой. Термин введение и обработка также означает обработки in vitro или ex vivo, например клетки, реагентом, диагностическим, связывающим соединением или другой клеткой. Термин субъект в данном документе включает любой организм, предпочтительно животное, более предпочтительно млекопитающее (например, крысу, мышь, собаку, кошку, кролика) и наиболее предпочтительно человека. Лечение любого заболевания или расстройства относится в одном аспекте к улучшению состояния при заболевании или расстройстве (а именно, замедлению или купированию или уменьшению развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом аспекте термин лечить, лечение или обработка относится к облегчению или улучшению по меньшей мере одного физического параметра, включая параметры, которые могут не быть заметны пациенту. В еще одном аспекте термин лечить, лечение или обработка относится к модулированию заболевания или расстройства, или физически (например, стабилизация выраженного симптома) или физиологически (например, стабилизация физического параметра), или и так и так. В еще одном аспекте термин лечить, лечение или обработка относится к предотвращению или задержке возникновения или развития или прогрессирования заболевания или расстройства.
Термин субъект в контексте настоящего изобретения представляет собой млекопитающее, например, примата, предпочтительно высшего примата, например, человека (например, пациента, имеющего или подвергающегося риску иметь расстройство, описанное в данном документе).
Термин аффинность, в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном. В пределах антигена вариабельная область плеча антитела взаимодействует за счет нековалентных сил с антигеном на множестве участков; чем больше взаимодействий, тем сильнее аффинность.
Термин антитело, в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полипептиду семейства иммуноглобулинов, который может связывать соответствующий антиген нековалентно, обратимо и специфичным образом. Например, встречающееся в природе антитело IgG представляет собой тетрамер, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две (L) легкие цепи, взаимосвя
- 8 045547 занные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно в данном документе VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов CH1, CH2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно в данном документе VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередующиеся с областями, которые более консервативны, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая разные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.
Термин антитело включает моноклональные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела к идиотипическим антителам (anti-Id), но не ограничивается ими. Антитела могут принадлежать к любому изотипу/классу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY) или подклассу (например, IgG1, IgG2,IgG3,IgG4,IgA1 и IgA2).
В некоторых воплощениях антитела к ОХ40 содержат по меньшей мере один антигенсвязывающий участок или по меньшей мере вариабельную область. В некоторых воплощениях антитела к ОХ40 содержат антигенсвязывающий фрагмент от антитела к ОХ40, описанного в данном документе. В некоторых воплощениях антитело к ОХ40 является выделенным или рекомбинантным.
Термин моноклональное антитело или mAb или Mab в данном документе означает популяцию по существу однородных антител, а именно молекулы антитела, содержащиеся в данной популяции, являются идентичными по аминокислотной последовательности за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Напротив, традиционные препараты (поликлональных) антител обычно включают множество разных антител, имеющих разные аминокислотные последовательности в своих вариабельных доменах, особенно в своих определяющих комплементарность областях (CDR), которые часто являются специфичными в отношении разных эпитопов. Определение моноклональный указывает на характер антитела, получаемого по существу из однородной популяции антител, и его не следует рассматривать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Моноклональные антитела (mAb) могут быть получены способами, известными специалистам в данной области. См., например, Kohler et al, Nature 1975 256:495497; Пат. США № 4376110; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992; Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988; и Colligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993. Антитела, раскрытые в данном документе, могут принадлежать к классу иммуноглобулинов, включающему IgG, IgM, IgD, IgE, IgA, и любому его подклассу, как например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Гибридому, продуцирующую моноклональное антитело, можно культивировать in vitro или in vivo. Высокие титры моноклональных антител можно получать при продукции in vivo, при которой клетки от отдельных гибридом инъецируют внутрибрюшинно мышам, таким как в первозданном виде премированные мыши Balb/c, с получением свободной жидкости брюшной полости, содержащей высокие концентрации желательных антител. Моноклональные антитела изотипа IgM или IgG могут быть очищены из таких свободных жидкостей брюшной полости или супернатантов культуры, используя методы колоночной хроматографии, хорошо известные специалистам в данной области.
В общем, основная структурная единица антитела содержит тетрамер. Каждый тетрамер включает две идентичные пары полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну легкую цепь (примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (примерно 50-70 кДа). N-концевая часть каждой цепи включает вариабельную область примерно 100-110 или более аминокислот, главным образом ответственную за распознавание антигена. С-концевая часть тяжелой цепи может определять константную область, главным образом ответственную за эффекторную функцию. Обычно, человеческие легкие цепи относятся к легким цепям каппа и лямбда. Кроме того, человеческие тяжелые цепи обычно относятся к α, δ, ε, γ или μ, и определяют изотипы антитела как IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно. В пределах легкой и тяжелой цепей вариабельные и константные области соединены J областью из примерно 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также включает D область из еще примерно 10 аминокислот.
Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи (VL/VH) образуют связывающий сайт антитела. Таким образом, в общем, интактное антитело имеет два связывающих сайта. За исключением бифункциональных или биспецифичных антител, данные два связывающих сайта обычно являются одинаковыми.
Обычно, вариабельные домены как тяжелой, так и легкой цепей содержат три гипервариабельные области, также называемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые расположены между относительно консервативными каркасными областями (FR). CDR обычно выравнены по каркасным областям, что обеспечивает связывание с конкретным эпитопом. В общем, от N-конца к С
- 9 045547 концу вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепей содержат FR-1 (или FR1), CDR-1 (или CDR1), FR-2 (FR2), CDR-2 (CDR2), FR-3 (или FR3), CDR-3 (CDR3) и FR-4 (или FR4). Положения CDR и каркасных областей можно определять, используя разные хорошо известные определения в данной области, например, Kabat, Chothia и AbM (см., например, Johnson et al, Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol, 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997)). Определения антигенсвязывающих сайтов также описаны в следующих источниках: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); и Lefranc, M. P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); и Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol, 203:121-153 (1991); и Rees et al., In Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996). В комбинированной схеме нумерации Кабата и Чотиа в некоторых воплощениях CDR соответствуют аминокислотным остаткам, которые являются частью CDR Кабат, CDR Чотиа или и того и другого. Например, CDR соответствуют аминокислотным остаткам 26-35 (НС CDR1), 50-65 (НС CDR2) и 95-102 (НС CdR3) в VH, например, VH млекопитающего, например, VH человека; и аминокислотным остаткам 24-34 (LC CDR1), 50-56 (LC CDR2) и 89-97 (LC CDR3) в VL, например, VL млекопитающего, например, VL человека.
Под термином гипервариабельная область подразумеваются аминокислотные остатки антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки от CDR (а именно, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 в вариабельном домене легкой цепи и VHCDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 в вариабельном домене тяжелой цепи). См., Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (определение областей CDR антитела по последовательности); см. также Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (определение областей CDR антитела по структуре). Термин FR остатки или остатки каркасной области означают остатки вариабельного домена, отличные от остатков гиперариабельной области, определенных в данном документе, как остатки CDR.
Если особым образом не указано иное, термин антигенсвязывающий фрагмент означает антигенсвязывающие фрагменты антител, а именно фрагменты антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном, который связывается полноразмерным антителом, например фрагменты, которые сохраняют одну или более областей CDR. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают, но не ограничиваются фрагментами Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диателами; линейными антителами; молекулами одноцепочечных антител, например, одноцепочечным Fv (ScFv); нанотелами и мультиспецифичными антителами, образованными из фрагментов антител.
Антитело специфично связывается с белком-мишенью, означая, что антитело демонстрирует предпочтительное связывание с той мишенью, в отличие от других белков, но данная специфичность не требует абсолютной специфичности связывания. Антитело считается специфичным в отношении его предполагаемой мишени, если ее связывание определяет наличие белка-мишени в образце, например, без получения нежелательных результатов, таких как ложно-положительные. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, полезные в настоящем изобретении, будут связываться с белком-мишенью с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза больше, предпочтительно по меньшей мере в 10 раз больше, более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз больше и наиболее предпочтительно по меньшей мере в 100 раз больше, чем аффинность с белками, не являющимися мишенью. Говорят, что антитело в данном документе специфично связывается с полипептидом, содержащим данную аминокислотную последовательность, например, аминокислотную последовательность молекулы человеческого ОХ40, если оно связывается с полипептидами, содержащими ту последовательность, но не связывается с белками, не содержащими той последовательности.
Термин человеческое антитело в данном документе означает антитело, которое содержит только человеческие последовательности белка - иммуноглобулина. Человеческое антитело может содержать мышиные углеводные цепи при продуцировании в мыши, в клетке мыши или в гибридоме, происходящей из мышиной клетки. Аналогично, термины мышиное антитело или крысиное антитело обозначают антитело, которое содержит только последовательности белка - иммуноглобулина мыши или крысы, соответственно.
Термин гуманизированное антитело означает формы антител, которые содержат последовательности от антител, не являющихся человеческими (например, мышиных), а также человеческие антитела. Такие антитела содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одной и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из гипервариабельных петлей соответствуют гипервариабельным петлям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все из FR областей представляют собой FR области человеческой последовательности иммуноглобулина. Гуманизированное антитело возможно также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно константной области иммуноглобулина человека. Префикс hum, hu, Hu или h добавляют к обозначениям клонов антитела, когда необходимо провести различие между гуманизированными антителами и исходными антите- 10 045547 лами грызунов. Гуманизированные формы антител грызунов обычно будут содержать те же последовательности CDR исходных антител грызунов, хотя определенные аминокислотные замены могут быть включены для повышения аффинности, повышения стабильности гуманизированного антитела, удаления посттрансляционной модификации или по другим причинам.
Термин соответствующая последовательность зародышевой линии человека относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческую аминокислотную последовательность вариабельной области, или подпоследовательности, которая разделяет наивысшую определенную идентичностью аминокислотных последовательностей с референсной аминокислотной последовательностью или подпоследовательностью вариабельной области, в сравнении со всеми другими известными аминокислотными последовательностями вариабельной области, кодируемыми последовательностями вариабельной области иммуноглобулина зародышевой линии человека. Соответствующая последовательность зародышевой линии человека может также относиться к аминокислотной последовательности или подпоследовательности вариабельной области человека с наиболее высокой идентичностью аминокислотных последовательностей с референсной аминокислотной последовательностью или подпоследовательностью вариабельных областей, в сравнении со всеми другими оцениваемыми аминокислотными последовательностями вариабельных областей. Соответствующая последовательность зародышевой линии человека может представлять собой только каркасные области, только определяющие комплементарность области, каркасные области и определяющие комплементарность области, вариабельный сегмент (как определено выше) или другие комбинации последовательностей или подпоследовательностей, которые содержат вариабельную область. Идентичность последовательностей можно определять, используя способы, описанные в данном документе, например, выравнивая две последовательности с использованием BLAST, ALIGN или другого алгоритма выравнивания, известного в данной области. Соответствующая нуклеотидная или аминокислотная последовательность зародышевой линии человека может по меньшей мере примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательностям с референсной нуклеотидной или аминокислотной последовательностью вариабельной области.
Термин равновесная константа диссоциации (KD, М) относится к константе скорости диссоциации (kd, время-1), деленной на константу скорости ассоциации (ka, время-1, М-1). Равновесные константы диссоциации могут быть измерены, используя любой известный способ в данной области. Антитела по настоящему изобретению обычно будут иметь равновесную константу диссоциации меньше чем примерно 10-7 или 10-8 М, например, меньше чем примерно 10-9 М или 10-10 М, в некоторых аспектах меньше чем примерно 10-11 М, 10-12 М или 10-13 М.
Термины рак или опухоль в данном документе имеют самое широкое значение, которое подразумевается в данной области, и относятся к физиологическому состоянию у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. В контексте настоящего изобретения рак не ограничивается определенным типом или локализацией.
Термин комбинированная терапия относится к введению двух или более терапевтических средств для лечения терапевтического состояния или расстройства, описанного в настоящем изобретении. Такое введение охватывает совместное введение данных терапевтических средств по существу одновременно. Такое введение также охватывает совместное введение в многосоставных или в отдельных контейнерах (например, капсулах, порошках и жидкостях) для каждого активного ингредиента. Порошки и/или жидкости могут быть восстановлены или разведены до желательной дозы перед введением. Кроме того, такое введение также охватывает применение каждого типа терапевтического средства последовательно, или приблизительно в одно и то же время, или в разные моменты времени. В любом случае схема лечения будет обеспечивать полезное действие комбинации лекарственных средств при лечении состояний или расстройств, описанных в данном документе.
В контексте настоящего изобретения, когда ссылаются на аминокислотную последовательность, термин консервативная замена означает замену исходной аминокислоты новой аминокислотой, которая по существу не меняет химических, физических и/или функциональных свойств антитела или фрагмента, например, его аффинности связывания с ОХ40. Конкретно, часто встречающиеся консервативные замены аминокислот показаны в следующей таблице и хорошо известны в данной области.
Иллюстративные консервативные аминокислотные замены.
Исходный аминокислотный остаток Однобуквенный и трехбуквенный коды Консервативная замена
Аланин А или Ala Gly; Ser
- 11 045547
Аргинин R или Arg Lys; His
Аспарагин N или Asn Gin; His
Аспарагиновая кислота D или Asp Gin; Asn
Цистеин С или Cys Ser; Ala
Г лутамин Q или Gin Asn
Г лутаминовая кислота Е или Glu Asp; Gin
Глицин G или Gly Ala
Г истидин Н или His Asn; Gin
Изолейцин I или Не Leu; Vai
Лейцин L или Leu He; val
Лизин К или Lys Arg; His
Метионин М или Met Leu; He; Tyr
Фенилаланин F или Phe Tyr; Met; Leu
Пролин Р или Pro Ala
Серин S или Ser Thr
Треонин Т или Thr Ser
Триптофан W или Тгр Tyr; Phe
Тирозин Y или Туг Trp; Phe
Валин V или Vai He; Leu
Примеры алгоритмов, которые подходят для определения выраженных в процентах идентичности последовательностей и сходства последовательностей, представляют собой алгоритмы BLAST, которые описаны в Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; и Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, соответственно. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST находится в открытом доступе через Национальный центр биотехнологической информации. Данный алгоритм включает сначала идентификацию пар последовательностей с высоким показателем сходства (HSP - high scoring sequence pair) посредством идентификации коротких слов длинной W в искомой последовательности, которые подходят под пару или соответствуют некому пороговому показателю сходства с положительным значением Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности базы данных. Т называют порогом показателя совпадения соседних слов. Данные исходные совпадения соседних слов действуют в качестве значений для начала поиска для нахождения более длинных содержащих их HSP. Совпадения слов продолжают в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока совокупный показатель выравнивания может быть увеличен. Совокупные показатели рассчитывают, используя, в случае нуклеотидных последовательностей, параметры М (поощрительный балл для пары совпадающих остатков; всегда больше 0) и N (штрафной балл для несовпадающих остатков; всегда меньше 0). В случае аминокислотных последовательностей для расчета совокупного показателя используют весовую матрицу. Расширение совпадений слов в каждом направлении прекращают, когда: совокупный показатель выравнивания снижается на количественную величину X со своего максимально достигаемого значения; совокупный показатель приближается к нулю или ниже вследствие накопления одного или более выравниваний остатков с отрицательным показателем; или достигается конец одной из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину слова (W) 11, ожидание (Е) 10, М равен 5, N равен минус 4 и сравнение обеих нитей. В случае аминокислотных последовательностей программа BLAST использует по умолчанию длину слова 3 и ожидание (Е) 10, и весовую матрицу BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915), число выравниваний (В) 50, ожидание (Е) 10, М равен 5, N равен -4, и сравнение обеих нитей.
Алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Одним критерием сходства, предложенным алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая обеспечивает показатель вероятности, с которой совпадение двух нуклеотидных или аминокис- 12 045547 лотных последовательностей случайно произойдет. Например, нуклеиновая кислота считается похожей на референсную последовательность, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении анализируемой нуклеиновой кислоты с референсной нуклеиновой кислотой, меньше чем примерно 0,2, более предпочтительно меньше чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше чем примерно 0,001.
Выраженная в процентах идентичность двух аминокислотных последовательностей может быть определена с использованием алгоритма Е. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17, (1988), который включен в программу ALIGN (версия 2.0) с использованием таблицы весов замен остатков РАМ120, штрафом за удлинение гэпа 12 и штрафом за гэп 4. Кроме того, выраженная в процентах идентичность двух аминокислотных последовательностей может быть определена с использованием Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, (1970), алгоритма, который включен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG с использованием или матрицы BLOSUM62, или матрицы РАМ250 и штрафа за гэп 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за удлинение 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Термин нуклеиновая кислота используется в данном документе взаимозаменяемо с термином полинуклеотид и относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам или в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты, включая известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки остова или связи, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе, которые имеют похожие свойства связывания, как у референсной нуклеиновой кислоты, и которые метаболизируются путем, аналогичным референсным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, без ограничения, фосфотиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды, пептидонуклеиновые кислоты (PNA - peptide-nucleic acid).
Термин функционально связанный в контексте нуклеиновых кислот относится к функциональной связи между двумя или более сегментами полинуклеотидов (например, ДНК). Обычно, он относится к функциональной связи последовательности регуляции транскрипции с транскрибируемой последовательностью. Например, промоторная или энхансерная последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью, если она стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в соответствующей клетке-хозяине или другой экспрессионной системе. Обычно, промоторные последовательности, регулирующие транскрипцию, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, физически прилегают к транскрибируемой последовательности, а именно, они являются цис-действующими. Однако, некоторые регуляторные последовательности, регулирующие транскрипцию, такие как энхансеры, не обязательно должны физически прилегать или располагаться в непосредственной близости к кодирующим последовательностям, чью транскрипцию они усиливают.
В некоторых аспектах согласно настоящему изобретению предложены композиции, например, фармацевтически приемлемые композиции, которые включают антитело к ОХ40, описанное в данном документе, составленные вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин фармацевтически приемлемый эксципиент включает любой или все растворители, дисперсионные среды, изотонические агенты и агенты, замедляющие поглощение, и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Эксципиент может подходить для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, ректального, спинального или эпидермального введения (например, посредством инъекции или инфузии).
Композиции, раскрытые в данном документе, могут находиться в самых разных формах. Данные формы включают, например, жидкие, полужидкие и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъецируемые и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, липосомы и суппозитории. Подходящая форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Типичные подходящие композиции находятся в форме инъецируемых или инфузионных растворов. Одним подходящим способом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В некоторых воплощениях антитело вводят посредством внутривенной инфузии или инъекции. В некоторых воплощениях антитело вводят посредством внутримышечной или подкожной инъекции.
Термин терапевтически эффективное количество, в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к количеству антитела, которое, при введении субъекту для лечения заболевания или по меньшей мере одного из клинических симптомов заболевания или расстройства, является достаточным для осуществления такого лечения заболевания, расстройства или симптома. Терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от антитела, заболевания, расстройства и/или симптомов заболевания или расстройства, тяжести заболевания, расстройства и/или симптомов заболевания или расстройства, возраста субъекта, подлежащего лечению, и/или массы субъекта, подлежащего лечению. Соответствующее количество в любом приведенном примере может быть очевидным специалистам в данной области или может быть определено общепринятыми экспериментами. В случае комбинированной терапии терапевтически эффективное количество относится к общему количеству объектов комбинации для эффективного лечения заболевания, расстройства или состояния.
- 13 045547
Подробное описание
Согласно настоящему изобретению предложены антитела, антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связывают человеческий ОХ40. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены антитела, которые имеют желательные фармакокинетические характеристики и другие желательные признаки, и, таким образом, могут быть использованы для снижения вероятности или лечения рака. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела и способы получения и использования таких фармацевтических композиций для предупреждения и лечения рака и ассоциированных расстройств.
Антитела к ОХ40.
Согласно настоящему изобретению предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с ОХ40. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, образованными, как описано ниже.
Согласно настоящему изобретению предложены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с ОХ40, где указанные антитела или фрагменты антител (например, антигенсвязывающие фрагменты) содержат VH домен, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, 20 или 26 (табл. 3). Согласно настоящему изобретению также предложены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связывают ОХ40, где указанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR VH, содержащую аминокислотную последовательность любой из CDR VH, перечисленных в табл. 3. В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с ОХ40, где указанные антитела содержат (или в качестве альтернативы состоят из) одну, две, три или более CDR VH, имеющих аминокислотную последовательность любой из CDR VH, перечисленных в табл. 3.
Согласно настоящему изобретению предложены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с ОХ40, где указанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты содержат домен VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, 22 или 28 (табл. 3). Согласно настоящему изобретению также предложены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с ОХ40, где указанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR VL, имеющую аминокислотную последовательность любой из CDR VL, перечисленных в табл. 3. В частности, согласно изобретению предложены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с ОХ40, причем указанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты содержат (или в качестве альтернативы состоят из) одну, две, три или более CDR VL, имеющих аминокислотную последовательность любой из CDR VL, перечисленных в табл. 3.
Другие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению включают аминокислоты, которые были мутированы, еще обладают выраженной в процентах идентичностью по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95 или 99% в областях CDR с областями CDR, изображенными в последовательностях, описанных в табл. 3. В некоторых аспектах включены мутантные аминокислотные последовательности, где не больше чем 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот были мутированы в областях CDR, по сравнению с областями CDR, изображенными в последовательности, описанной в табл. 3.
Другие антитела по настоящему изобретению включают антитела, в которых аминокислоты или нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислоты, мутированы; еще обладают выраженной в процентах идентичностью по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95 или 99 % с последовательностями, описанными в табл. 3. В некоторых аспектах включены мутантные аминокислотные последовательности, где не больше чем 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот мутированы в вариабельных областях при сравнении с вариабельными областями, изображенными в последовательности, описанными в табл. 3, сохраняя по существу ту же терапевтическую активность.
Согласно настоящему изобретению также предложены последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют VH, VL, полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь антител, которые специфично связываются с ОХ40. Такие последовательности нуклеиновых кислот могут быть оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих.
Идентификация эпитопов и антител, которые связываются с одним и тем же эпитопом
Согласно настоящему изобретению предложены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с эпитопом человеческого ОХ40. В некоторых аспектах антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут связываться с одним и тем же эпитопом ОХ40.
Согласно настоящему изобретению также предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом, как и антитела к ОХ40, описанные в табл. 3. Дополнительные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут, таким образом, быть идентифицированы в зависимости от их способности перекрестно конкурировать (например, конкурентно ингибировать связывание статистически значимым образом) с другими антителами в анализах связывания. Способность анализируемого антитела ингибировать связывание антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению с ОХ40 демонстрирует то, что анализируемое антитело может конкурировать с тем антителом или его антигенсвязывающим фрагментом за связывание с ОХ40. Такое антитело может,
- 14 045547 не будучи связанными какой-либо одной теорией, связываться с тем же или родственным (например, структурно похожим или пространственно близким) эпитопом на ОХ40, как и антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, с которыми оно конкурирует. В конкретном аспекте антитело, которое связывается с тем же эпитопом на ОХ40, как и антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению, представляет собой человеческое или гуманизированное моноклональное антитело. Такие человеческие или гуманизированные моноклональные антитела могут быть получены и выделены, как описано в данном документе.
Дополнительное изменение каркаса области Fc
В еще одних аспектах область Fc изменена посредством замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка отличным аминокислотным остатком с изменением эффекторных функций антитела. Например, одну или более аминокислот можно заменить отличным аминокислотным остатком, таким образом, чтобы антитело обладало измененным сродством в отношении эффекторного лиганда, но сохраняло антигенсвязывающую способность исходного антитела. Эффекторный лиганд, в отношении которого изменена аффинность, может представлять собой, например, Fc-рецептор или компонент С1 комплемента. Данный подход описан, например, в пат. США №№ 5624821 и 5648260, оба принадлежат Winter et al.
В другом аспекте один или более аминокислотных остатков можно заменить одним или более отличными аминокислотными остатками, таким образом, чтобы антитело имело измененное Clq связывание и/или уменьшенную или аннулированную комплементзависимую цитотоксичность (CDC). Данный подход описан, например, в пат. США № 6194551 Idusogie et al.
В еще одном аспекте один или более аминокислотных остатков изменены с изменением, вследствие этого, способности антитела фиксировать комплемент. Данный подход описан, например, в РСТ публикации WO 94/29351 Bodmer et al. В конкретном аспекте одна или более аминокислот антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению заменены одним или более аллотипическими аминокислотными остатками, в случае подкласса IgG1 и изотипа каппа. Аллотипические аминокислотные остатки также включают константную область тяжелой цепи подклассов IgG1, IgG2 и IgG3, а также константную область легкой цепи изотипа каппа, как описано Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009), но не ограничиваются ими.
В другом аспекте область Fc модифицирована для увеличения способности антитела опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или повышать аффинность антитела к Fcyрецептору посредством модификации одной или более аминокислот. Данный подход описан, например, в РСТ Публикации WO 00/42072 Presta. Кроме того, сайты связывания на человеческом IgG1 для FcyRI, FcyRII, FcyRIII и FcRn были картированы, и описаны варианты с улучшенным связыванием (см. Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001).
В еще одном аспекте модифицировано гликозилирование антитела. Например, может быть получено агликозилированное антитело (а именно, антитело не имеет или обладает пониженным уровнем гликозилирования). Гликозилирование может быть изменено, например, с повышением аффинности антитела в отношении антигена. Такие углеводные модификации могут быть выполнены, например, посредством изменения одного или более сайтов гликозилирования в пределах последовательности антитела. Например, может быть сделана одна или более аминокислотных замен, которые приводят к устранению одного или более сайтов гликозилирования каркаса вариабельной области с устранением, таким образом, гликозилирования в данном сайте. Такое агликозилирование может повышать аффинность антитела к антигену. Такой подход описан, например, в пат. США № 5714350 и № 6350861 Со et al.
Кроме того или в качестве альтернативы может быть получено антитело, которое имеет измененный тип гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, имеющее уменьшенные количества фукозильных остатков, или антитело, имеющее повышенное содержание структур, имеющих ветвление в точках GlcNac. Такие измененные профили гликозилирования продемонстрированы для увеличения ADCC-способности антител. Такие углеводные модификации могут быть выполнены, например, посредством экспрессирования антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования описаны в данном области и могут быть использованы в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируются рекомбинантные антитела с продукцией, вследствие этого, антитела с измененным гликозилированием. Например, в ЕР 1176195 Hang et al. описана клеточная линия с функционально нарушенным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, таким образом, что антитела, экспрессируемые в такой клеточной линии, демонстрируют гипофукозилирование. В РСТ публикации WO 03/035835 Presta описан вариант линии клеток СНО (Chinese Hamster Ovary - яичник китайского хомяка), клетки Lecl3, с пониженной способностью присоединять фукозу к Asn (297)-связанным углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессируемых в той клетке-хозяине (см. также Shields et al, (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). В РСТ публикации WO 99/54342 Umana et al. описаны клеточные линии, сконструированные для экспрессии гликопротеинмодифицирующих гликозилтрансфераз (например, бета(1,4)-N ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII)), таким образом, чтобы антитела, экспрессируемые в сконструированных клеточных линиях,
- 15 045547 демонстрировали повышенное содержание структур, имеющих ветвление в точках GlcNac, что приводит к повышенной ADCC активности антител (см. также Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999).
В другом аспекте, если желательно уменьшение ADCC, подкласс человеческого антитела IgG4, как было показано во многих предыдущих отчетах, обладает лишь умеренной ADCC и у него почти отсутствует CDC-эффекторная функция (Moore G L, et al. 2010 MAbs, 2:181-189). С другой стороны, природный IgG4, как было обнаружено, менее стабилен в стрессовых условиях, как например, в кислотном буфере или при возрастании температуры (Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108; Dall'Acqua, W. et al, 1998 Biochemistry, 37:9266-9273; Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19). Пониженная ADCC может быть достигнута посредством функционального связывания антитела с IgG4, сконструированного с комбинациями изменений для снижения или исключения активностей связывания FcyR или Clq, таким образом, снижая или устраняя эффекторные функции ADCC и CDC. Рассматривая физико-химические свойства антитела в качестве биологического лекарственного средства, одним из менее желательных внутренних свойств IgG4 является динамическое разделение его двух тяжелых цепей в растворе с образованием полуантитела, что приводит к получению биспецифичных антител, образованных vivo посредством процесса, называемого обменом Fab-фрагментами (Van der Neut Kolfschoten M, et al. 2007 Science, 317:1554-157). Мутация серина до пролина в положении 228 (система нумерации EU) оказалась ингибиторной для разделения тяжелых цепей IgG4 (Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108; Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19). Сообщалось, что некоторые из аминокислотных остатков в шарнирной области и области yFc влияют на взаимодействие антитела с Fcy-рецепторами (Chappel S M, et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9036-9040; Mukherjee, J. et al., 1995 FASEB J, 9:115-119; Armour, K. L. et al. 1999 Eur J Immunol, 29:2613-2624; Clynes, R. A. et al, 2000 Nature Medicine, 6:443-446; Arnold J. N., 2007 Annu Rev immunol, 25:21-50). Кроме того, некоторые редко встречающиеся изоформы IgG4 в человеческой популяции могут также вызывать разные физико-химические свойства (Brusco, A. et al. 1998 Eur J Immunogenet, 25:349-55; Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19). Для получения антител к ОХ40 с низкой ADCC, CDC и нестабильностью возможно модифицировать шарнирную область и область Fc человеческого IgG4 и вводить целый ряд изменений. Данные модифицированные молекулы Fc IgG4 могут быть обнаружены в SEQ ID NO: 83-88, Патент США № 8735553 Li et al.
Получение антител к ОХ40.
Антитела к ОХ40 и их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены любыми средствами, известными в данной области, включая, но, не ограничиваясь рекомбинантной экспрессией, химическим синтезом и ферментативным расщеплением тетрамеров антител, тогда как полноразмерные моноклональные антитела могут быть получены посредством, например, гибридомы или рекомбинантной продукции. Рекомбинантная экспрессия может происходить из любых соответствующих клеток-хозяев, известных в данной области, например, клеток-хозяев млекопитающего, бактериальных клеток-хозяев, дрожжевых клеток-хозяев, клеток-хозяев насекомого и т. д.
Согласно изобретению дополнительно предложены полинуклеотиды, кодирующие антитела, описанные в данном документе, например, полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области тяжелой или легкой цепей или сегменты, содержащие определяющие комплементарность области, как описано в данном документе. В некоторых аспектах полинуклеотид, кодирующий вариабельные области тяжелой цепи по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 идентичен нуклеотидным последовательностям с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 21 или 27. В некоторых аспектах полинуклеотид, кодирующий вариабельные области легкой цепи по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичен нуклеотидным последовательностям с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:17, 23 или 29.
Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут кодировать последовательность вариабельной области антитела к ОХ40. Они могут также кодировать как вариабельную область, так и константную область антитела. Некоторые из полинуклеотидных последовательностей кодируют полипептид, который содержит вариабельные области как тяжелой цепи, так и легкой цепи одного из иллюстративных антител к ОХ40. Некоторые другие полинуклеотиды кодируют два сегмента полипептида, которые соответственно по существу идентичны вариабельным областям тяжелой цепи и легкой цепи одного из мышиных антител.
Также в настоящем изоретении предложены экспрессионные векторы и клетки-хозяева для получения антител к ОХ40. Выбор экспрессионного вектора зависит от предполагаемых клеток-хозяев, в которых должен экспрессироваться вектор. Обычно, экспрессионные векторы содержат промотор и другие регуляторные последовательности (например, энхансеры), которые функционально связаны с полинуклеотидами, кодирующими цепь антитела к ОХ40 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых аспектах индуцируемый промотор используется для предотвращения экспрессии вставленных последовательностей за исключением тех, которые находятся под контролем индуцирующих условий. Индуцируемые промоторы включают, например, промотор арабинозы, lacZ, металлотионеина или промотор теплового шока. Культуры трансформированных организмов могут быть размножены в неиндуцирующих условиях, не оказывая влияния на популяцию в отношении кодирующих последовательностей, чьи про- 16 045547 дукты экспрессии лучше переносятся клетками-хозяевами. Помимо промоторов, другие регуляторные элементы также могут требоваться или быть желательными для эффективной экспрессии антитела к ОХ40 или антигенсвязывающего фрагмента. Данные элементы обычно включают старт-кодон ATG и соседний сайт связывания рибосомы или другие последовательности. Кроме того, эффективность экспрессии может быть усилена включением энхансеров, свойственных используемой клеточной системе (см., например, Scharf et al, Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; и Bittner et al, Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Например, энхансер SV40 или энхансер CMV может использоваться для повышения уровня экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающего.
Клетки-хозяева для переноса и экспрессии цепей антитела к ОХ40 могут являться или прокариотическими, или эукариотическими. Е. coli является одним прокариотическим хозяином, полезным для клонирования и экспрессии полинуклеотидов по настоящему изобретению. Другие хозяева-микробы, подходящие для применения, включают бациллы, такие как Bacillus subtilis, и другие энтеробактерии, такие как Salmonella, Serratia и разные виды Pseudomonas. В данных прокариотических хозяевах можно также создавать экспрессионные векторы, которые обычно содержат последовательности контроля экспрессии, совместимые с клеткой-хозяином (например, точка начала репликации). Кроме того, будет присутствовать любое число из множества хорошо известных промоторов, таких как система лактозного промотора, система триптофанового промотора (trp), система бета-лактамазного промотора или система промоторов от фага лямбда. Промоторы обычно контролируют экспрессию, необязательно посредством последовательности - оператора, и имеют последовательности сайта связывания рибосомы и т.п. для инициации и завершения транскрипции и трансляции. Другие микробы, такие как дрожжи, могут также использоваться для экспрессии полипептидов к ОХ40. Также можно использовать клетки насекомых в комбинации с векторами на основе бакуловирусов.
В других аспектах клетки-хозяева млекопитающего используются для экспрессии и продукции полипептидов к ОХ40 по настоящему изобретению. Например, они могут представлять собой или линию клеток гибридомы, экспрессирующую гены эндогенного иммуноглобулина, или линию клеток млекопитающего, несущую экзогенный экспрессионный вектор. Данные клетки включают любую нормальную мортализованную или нормальную или ненормальную иммортализованную клетку животного или человека. Например, был разработан целый ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных секретировать интактные иммуноглобулины, включая линии клеток СНО, разные линии клеток COS (клетки почки обезьяны, трансформированные вирусом SV-40), клетки HEK 293, линии клеток миеломы, трансформированные В-клетки и гибридомы. Применение культуры клеток ткани млекопитающего для экспрессии полипептидов обычно обсуждается, например, в Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, N.Y., 1987. Экспрессионные векторы для клеток-хозяев млекопитающего могут включать последовательности контроля экспрессии, такие как точка начала репликации, промотор и энхансер (см., например, Queen et al, Immunol. Rev. 89:49-68, 1986), и необходимые сайты процессинга информационной РНК, такие как сайты связывания рибосомы, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминации транскрипции. Данные экспрессионные векторы обычно содержат промоторы, происходящие из генов млекопитающих или вирусов млекопитающих. Подходящие промоторы могут быть конститутивными, специфичными в отношении типа клетки, специфичными в отношении стадии развития и/или модулируемыми или регулируемыми. Полезные промоторы включают, но не ограничиваются промотором металлотионеина, конститутивным аденовирусным главным поздним промотором, дексаметазон-индуцибельным промотором MMTV (mouse mammary tumor virus - вирус опухоли молочной железы мыши), промотором SV40, промотором MRP polIII, конститутивным промотором MPSV (myeloproliferative sarcoma virus - миелопролиферативный вирус саркомы), тетрациклин-индуцибельным промотором CMV (cytomegalovirus цитомегаловирус) (таким как человеческий промотор гена немедленного - раннего ответа CMV), конститутивным промотором CMV и комбинациями промотора-энхансера, известными в данной области.
Способы выявления и диагностики.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению полезны во множестве применений, включая способы выявления ОХ40, но, не ограничиваясь ими. В одном аспекте антитела или антигенсвязывающие фрагменты полезны для выявления наличия ОХ40 в биологическом образце. Термин выявление, в том виде, в котором он используется в данном документе, включает количественное или качественное выявление. В некоторых аспектах биологический образец содержит клетку или ткань. В других аспектах такие ткани включают нормальные и/или раковые ткани, которые экспрессируют ОХ40 на более высоких уровнях, относительно других тканей.
В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ выявления наличия ОХ40 в биологическом образце. В некоторых аспектах способ включает приведение биологического образца в контакт с антителом к ОХ40 в условиях, являющихся пермиссивными в отношении связывания антитела с антигеном, и выявление того, образуется ли комплекс между антителом и антигеном. Биологический образец может включать, без ограничения, образцы мочи или крови.
Также включен способ диагностирования расстройства, ассоциированного с экспрессией ОХ40. В некоторых аспектах способ включает приведение анализируемой клетки в контакт с антителом к ОХ40;
- 17 045547 определение уровня экспрессии (или количественно или качественно) ОХ40 в анализируемой клетке посредством выявления связывания антитела к ОХ40 с полипептидом ОХ40; и сравнение уровня экспрессии в анализируемой клетке с уровнем экспрессии ОХ40 в контрольной клетке (например, нормальной клетке того же тканевого происхождения, как и в случае анализируемой клетки или клетки, не экспрессирующей ОХ40), где более высокий уровень экспрессии ОХ40 в анализируемой клетке, по сравнению с контрольной клеткой, указывает на наличие расстройства, ассоциированного с экспрессией ОХ40.
Способы лечения.
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению полезны в большом количестве применений, включая, но, не ограничиваясь способами лечения ОХ40-ассоциированного расстройства или заболевания. В одном аспекте ОХ40-ассоциированное расстройство или заболевание представляет собой рак.
В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака. В некоторых аспектах способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела к ОХ40 или антигенсвязывающего фрагмента. Рак может включать, без ограничений, рак молочной железы, рак головы и шеи, рак желудка, рак почки, рак печени, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак яичника, рак кожи, мезотелиому, лимфому, лейкоз, миелому и саркому.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно вводить любым подходящим средством, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, при необходимости для местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование может осуществляться любым подходящим путем, например, посредством инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, частично, в зависимости от того, является ли введение кратковременным или постоянным. В данном документе рассматриваются разные схемы дозирования, включающие, но не ограничивающиеся одиночным или многократным введениями на протяжении разных моментов времени, болюсным введением и импульсной инфузией.
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могли бы быть приготовлены, дозированы и введены путем, согласующимся с хорошей медицинской практикой. Факторы, рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное расстройство, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело не обязательно должно быть, но возможно приготовлено посредством одного или более агентов, используемых в настоящее время для предупреждения или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество других таких агентов зависит от количества антитела, находящегося в препарате, типа расстройства или лечения и других факторов, обсуждаемых выше. Данные агенты обычно используются в таких же дозировках и посредством путей введения, как описано в данном документе, или примерно от 1 до 99% дозировок, описанных в данном документе, или в любой дозировке и посредством любого пути, который эмпирически/клинически определен как целесообразный.
Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая дозировка антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли антитело в целях предупреждения или с терапевтической целью, предыдущей терапии, клинического анамнеза пациента и ответа на антитела и усмотрения лечащего врача. Антитело подходящим образом вводят пациенту один раз или на протяжении целого ряда курсов лечения. В зависимости от типа и тяжести заболевания, примерно от 1 до 100 мг/кг антитела может являться исходной возможной дозировкой для введения пациенту, будь то, например, посредством одного или более отдельных введений или посредством непрерывной инфузии. Одна типичная ежесуточная дозировка могла бы находиться в интервале от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг и больше, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Для повторных введений на протяжении нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение обычно будет продолжаться до наступления желательного подавления симптомов заболевания. Такие дозы могут быть введены с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, что пациент получает от примерно двух до примерно двадцати или, например, примерно шесть доз антитела). Можно вводить исходную более высокую нагрузочную дозу с последующей одной или более низкими дозами. Однако, могут быть полезны другие схемы дозировки. Результативность данной терапии с легкостью отслеживали посредством традиционных методик и анализов.
Комбинированная терапия.
В одном аспекте антитела к ОХ40 по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с другими терапевтическими средствами. Другие терапевтические средства, которые можно использовать с антителами к ОХ40 по настоящему изобретению, включают: химиотерапевтическое средство (например, паклитаксел или средство на основе паклитаксела; (например, Абраксан®), доцетаксел; карбоплатин; топотекан; цисплатин; иринотекан, доксорубицин, леналидомид, 5-азацитидин, ифосфамид, оксалиплатин, пеметрексед динатрия, циклофосфамид, этопосид, децитабин, флударабин, винкристин, бендамустин, хлорамбуцил, бусульфан, гемцитабин, мелфалан, пентостатин, митоксантрон, пеметрексед ди
- 18 045547 натрия), ингибитор тирозинкиназы (например, ингибитор EGFR (epidermal growth factor receptor - рецептор эпидермального фактора роста) (например, эрлотиниб), ингибитор мультикиназ (например, MGCD265, RGB-286638), средство, нацеленное на CD-20 (например, ритуксимаб, офатумумаб, RO5072759, LFB-R603), средство, нацеленное на CD52 (например, алемтузумаб), преднизолон, дарбепоэтин альфа, леналидомид, ингибитор Вс1-2 (например, облимерсен натрия), ингибитор аврора-киназы (например, MLN8237, TAK-901), ингибитор протеасом (например, бортезомиб), средство, нацеленное на CD-19 (например, MEDI-551, MOR208), ингибитор MEK (например, АВТ-348), ингибитор JAK-2 (например, INCB018424), ингибитор mTOR (например, темсиролимус, эверолимус), ингибитор BCR/ABL (например, иматиниб), антагонист рецептора ЕТ-А (например, ZD4054), агонист рецептора TRAIL 2 (TR2) (например, CS-1008), ингибитор HGF/SF (например, AmG 102), EGEN-001, ингибитор Polo-подобной киназы 1 (например, BI 672), но не ограничиваются ими.
Фармацевтические композиции и препараты.
Также предложены композиции, включая фармацевтические препараты, содержащие антитело к ОХ40 или антигенсвязывающий фрагмент, или полинуклеотиды, содержащие последовательности, кодирующие антитело к ОХ40 или антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых воплощениях композиции содержат одно или более антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с ОХ40, или один или более полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие одно или более антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с ОХ40. Данные композиции могут дополнительно содержать подходящие носители, такие как фармацевтически приемлемые эксципиенты, включая буферы, которые хорошо известны в данной области.
Фармацевтические препараты антитела к ОХ40 или антигенсвязывающих фрагментов, как описано в данном документе, получают посредством смешивания такого антитела или антигенсвязывающего фрагмента, обладающего желательной степенью чистоты, с одним или более необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители обычно являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, и включают, но не ограничиваются следующими носителями: буферы, такие как фосфатный, цитратный и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; пирокатехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (меньше чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Иллюстративные фармацевтически приемлемые носители в данном документе дополнительно включают средства диспергирования лекарственных средств в интерстициальном пространстве, такие как растворимые нейтральноактивные гликопротеины - гиалуронидазы (sHASEGP), например, человеческие растворимые гликопротеины - гиалуронидазы РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Некоторые иллюстративные sHASEGP и способы применения, включающие rHuPH20, описаны в Патенте США № 7871607 и № 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP объединяют с одной или более дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.
Иллюстративные лиофилизированные препараты антитела описаны в Патенте США № 6267958. Водные препараты антитела включают препараты, описанные в патенте США № 6171586 и WO2006/044908, причем последние препараты включают гистидин-ацетатный буфер.
Могут быть получены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, матрицы которых находятся в форме частиц, имеющих определенную форму, например, пленок или микрокапсул.
Препараты, подлежащие применению для введения in vivo, обычно являются стерильными. Стерильность может быть легко реализована, например, посредством фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны.
Примеры
Пример 1. Получение моноклонального антитела к ОХ40.
Моноклональные антитела к ОХ40 получали на основе общепринятой гибридомной технологии на основе слияния (de StGroth and Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35:1; Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378:1) с незначительными модификациями. Антитела с высокой активностью связывания в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA) и анализе сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS - fluorescence-activated cell sorting) отбирали для осуществления дальнейшей характери
- 19 045547 зации.
Рекомбинантные белки ОХ40 для анализов иммунизации и связывания кДНК, кодирующую полноразмерный человеческий ОХ40 (SEQ ID NO: 1), синтезировали посредством Sino Biological (Пекин, Китай) на основе последовательности GenBank (учетный номер: Х75962.1). Кодирующую область сигнального пептида и внеклеточный домен (ECD - extracellular domain), состоящий из аминокислот (а.к.) 1-216 ОХ-40 (SEQ ID NO: 2), амплифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) и клонировали в самостоятельно разработанные экспрессионные векторы с С-концом, слитым с доменом Fc мышиного IgG2a, доменом Fc тяжелой цепи человеческого IgG1 дикого типа или His-меткой, что приводило к получению трех экспрессионных плазмид рекомбинантных слитых белков, OX40-mIgG2a, OX40huIgG1 и OX40-His, соответственно. Схематичное изображение слитых белков ОХ40 показано На фиг. 1. Для получения рекомбинантных слитых белков OX40-mIgG2a, OX40-huIgG1 и OX40-His осуществляли временную трансфекцию клеток 293G экспрессионными плазмидами и культивировали в течение 7 суток в инкубаторе СО2, оснащенном вращающимся шейкером. Супернатант, содержащий рекомбинантный белок, собирали и осветляли посредством центрифугирования. OX40-mIgG2a и OX40-huIgG1 очищали, используя колонку с белком А (кат.№: 17-5438-02, GE Life Sciences). OX40-His очищали, используя колонку с Ni-сефарозой (кат.№: 17-5318-02, GE Life Science). Осуществляли диализ белков OX40-mIgG2a, OX40-huIgG и OX40-His против фосфатно-солевого буферного раствора (PBS - phosphate buffered saline) и хранили в морозилке при минус 80°С в маленьких аликвотах.
Клеточные линии со стабильной экспрессией.
Для получения стабильных клеточных линий, которые экспрессируют полноразмерный человеческий ОХ40 (ОХ40) или ОХ40 яванского макака (cynoOX40), данные гены клонировали в ретровирусный вектор pFB-Neo (кат. №: 217561, Agilent, США). Ретровирусную трансдукцию проводили на основе ранее описанного протокола (Zhang et al, 2005). Осуществляли ретровирусную трансдукцию клеток HuT78 и HEK293 вирусом, содержащим человеческий ОХ40 или cynoOX40, соответственно, с получением клеточных линий HuT78/OX40, HEK293/OX40 и HuT78/cynoOX40.
Иммунизация, слияние с получением гибридомы и клонирование Мышей Balb/c в возрасте от восьми до двенадцати недель (от FIFK BIOSCIENCE CO., LTD, Пекин, Китай) иммунизировали внутрибрюшинно 200 мкл антигена в смеси, содержащей 10 мкг OX40-mIgG2a и Quick-Antibody Immuno-Adjuvant (кат. №: KX0210041, KangBiQuan, Пекин, Китай). Процедуру повторяли через три недели. Спустя две недели после 2-ой иммунизации, мышиные сыворотки оценивали на связывание ОХ40 посредством ELISA и FACS. Через десять суток после осуществления скрининга сыворотки мышей с самыми высокими титрами антител к ОХ40 в сыворотке повторно иммунизировали посредством в.б. (внутрибрюшинной) инъекции 10 мкг OX40-mIgG2a. Трое суток после повторной иммунизации спленоциты выделяли и сливали с линией клеток миеломы мыши, клетками SP2/0 (АТСС, Manassas VA), используя стандартные методики (Somat Cell Genet, 1977 3:231).
Оценка активности связывания ОХ40 антителами посредством ELISA и FACS.
Осуществляли первоначальный скрининг супернатантов клонов гибридомы посредством ELISA, как описано в (Methods in Molecular Biology (2007) 378:33-52) с некоторыми модификациями. Кратко, осуществляли покрытие 96-луночных планшетов белком OX40-His при 4°С в течение ночи. После промывки PBS/0,05 % Твин-20 планшеты блокировали PBS/3 % БСА (бычьим сывороточным альбумином) в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем, планшеты промывали PBS/0,05 % Твин-20 и инкубировали с клеточными супернатантами при комнатной температуре в течение 1 часа. HRP (horse-radish peroxidase - пероксидаза хрена)-связанное антитело к мышиному IgG (кат. №: 115035-008, Jackson ImmunoResearch Inc, антитела козы, меченные пероксидазой, к мышиному IgG AffmiPure, специфичный Fcyфрагмент) и субстрат (кат. №: 00-4201-56, eBioscience, США) использовали для проявления сигнала поглощения при длине волны 450 нм, который измеряли посредством использования планшет-ридера (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices/PHERAstar, BMG LABTECH). Позитивные исходные клоны отбирали из слияния, осуществляя скрининг посредством непрямого ELISA. ELISA-позитивные клоны дополнительно проверяли посредством FACS, используя клетки HuT78/OX40 и HuT78/cynoOX40, описанные выше. ОХ40-экспрессирующие клетки (10 клеток/лунка) инкубировали с ELISA-позитивными супернатантами гибридомных клеток с последующим связыванием с антителами к мышиному IgG eFluor® 660 (кат. №: 50-4010-82, eBioscience, США). Флуоресценцию клеток количественно оценивали, используя проточный цитометр (Guava easyCyte 8HT, Merck-Millipore, США).
Кондиционированные среды из гибридом, которые демонстрировали положительные сигналы как при ELISA-, так и FACS-скрининге, подвергали функциональным анализам для идентификации антител с хорошей функциональной активностью в анализах на основе человеческих иммунных клеток (см. следующие разделы). Антитела с желательными функциональными активностями дополнительно субклонировали и характеризовали.
Субклонирование и адаптация гибридом к среде, не содержащей сыворотку, или с низким содержанием сыворотки.
После первичного скрининга посредством ELISA, FACS и функциональных анализов, как описано
- 20 045547 выше, позитивные клоны гибридомы субклонировали посредством предельного разведения с обеспечением клональности. Лучшие субклоны антител проверяли посредством функциональных анализов и адаптировали для роста в среде CDM4MAb (кат. №: SH30801.02, Hyclone, США) с 3 % FBS (Fetal Bovine
Serum - фетальная телячья сыворотка).
Экспрессия и очистка моноклональных антител.
Клетки гибридомы, экспрессирующие лучшие клоны антител, культивировали в среде CDM4MAb (кат. №: SH30801.02, Hyclone) и инкубировали в инкубаторе СО2 в течение 5-7 суток при 37°С. Кондиционированную среду собирали посредством центрифугирования и фильтровали посредством пропускания через 0,22 мкм мембрану перед очисткой. Мышиные антитела в супернатантах наносили на и осуществляли связывание с колонкой с Белком А (кат. №: 17-5438-02, GE Life Sciences) в соответствии с руководством от производителя. В результате данной процедуры обычно получали антитела с чистотой выше 90%. Антитела, очищенные посредством колонки для аффинной хроматографии с белком А, или подвергались диализу против PBS, или, при необходимости, дополнительно очищались с использованием колонки HiLoad 16/60 Superdex 200 (кат. №: 28-9893-35, GE Life Sciences) для удаления агрегатов. Концентрации белка определяли посредством измерения поглощения при 280 нм. Конечные препараты антител хранили в аликвотах в морозилке при минус 80°С.
Пример 2. Клонирование и анализ последовательностей антител к ОХ40.
Мышиные клоны гибридомы собирали для получения тотальной клеточной РНК, используя набор Ultrapure RNA (кат. №: 74104, QIAGEN, Германия) на основе протокола производителя. Одноцепочечные кДНК синтезировали, используя набор для синтеза кДНК от Invitrogen (кат. №: 18080-051), и ПЦРамплификацию VH и VL антител гибридомы проводили, используя набор для ПНР (кат. №: CW0686, CWBio, Пекин, Китай). Олигопраймеры, используемые для клонирования кДНК антитела вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL), синтезировали в Invitrogen (Пекин, Китай) на основе последовательностей, приведенных ранее (Brocks et al. 2001 Mol Med 7:461). ПЦРпродукты использовали непосредственно для секвенирования или субклонировали в клонирующий вектор pEASY-Blunt (кат. №: СВ101 TransGen, Китай), затем секвенировали с помощью Genewiz (Пекин, Китай). Аминокислотные последовательности областей VH и VL устанавливали на основе результатов секвенирования ДНК.
Определяющие комплементарность области, (CDR) мышиных антител определяли на основе системы Kabat (Wu and Kabat 1970 J. Exp. Med. 132:211-250) посредством аннотации последовательностей и посредством компьютерной программы для анализа последовательностей. Аминокислотные последовательности репрезентативного самого главного клона Mu445 (VH и VL) перечислены в табл. 1 (SEQ ID NO. 9 и 11). Последовательности CDR Mu445 перечислены в табл. 2 (SEQ ID NO. 3-8).
Таблица 1
Аминокислотные последовательности областей VH и VL Mu445
VH Ми445 SEQ ID NO: 9 EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFT SYIIHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTRY NEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEYSSLTSEDS AVYYC ARGY YGS S YAMD YWGQGT S VT VS S
VL Mu445 SEQ ID NO: 11 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNY LNWYQQKPDGTIKLLIYDTSTLYSGVPSRFS GSGSGTDYFLTISNLEPEDIATYYCQQYSKL PYTFGGGTKLEKK
Таблица 2
Последовательности CDR (аминокислоты) областей VH и VL мышиного моноклонального антитела Mu445
Антитело SEQ ID NO CDR Последовательность
Mu445 SEQ ID NO: 3 HCDR1 (Kabat) SYIIH
SEQ ID NO: 4 HCDR2 (Kabat) YINPYNDGTRYNEKFKG
SEQ ID NO: 5 HCDR3 (Kabat) GYYGSSYAMDY
SEQ ID NO: 6 LCDR1 (Kabat) SASQGISNYLN
SEQ ID NO: 7 LCDR2 (Kabat) DTSTLYS
SEQ ID NO: 8 LCDR3 (Kabat) QQYSKLPYT
Пример 3. Гуманизация мышиного антитела к человеческому ОХ40 445.
Гуманизация и конструирование антитела.
Для гуманизации Mu445 гены IgG зародышевой линии человека исследовали в отношении последо- 21 045547 вательностей, которые разделяют высокие степени гомологии с последовательностями кДНК вариабельных областей Mu445, посредством сравнения последовательностей с базой данных генов иммуноглобулина человека в IMGT. Человеческие гены IGHV и IGKV, которые находятся в репертуаре антител человека с высокими частотами (Glanville et al, 2009 PNAS 106:20216-20221) и являются высоко гомологичными Mu445, отбирали в качестве матриц для гуманизации.
Гуманизацию проводили посредством CDR-прививки (Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering, Methods and Protocols, Vol 248: Humana Press), и конструировали гуманизированные антитела в формате человеческого IgG1 дикого типа посредством использования самостоятельно разработанного экспрессионного вектора. В исходном раунде гуманизации мутациями аминокислотных остатков в каркасных областях с превращением из мышиных в человеческие управляли посредством анализа смоделированной 3D структуры, и остатки мышиной каркасной области с важностью структуры для сохранения канонических структур CDR сохранялись в первой версии гуманизированного антитела 445 (см. 445-1, табл. 3). Шесть CDR 445-1 имеют аминокислотные последовательности HCDR1 (SEQ ID NO: 3), HCDR2 (SEQ ID NO:13), HCDR3 (SEQ ID NO:5) и LCDR1 (SEQ ID NO: 6), LCDR2 (SEQ ID NO:7) и LCDR3 (SEQ ID NO:8). Вариабельная область тяжелой цепи 445-1 имеет аминокислотную последовательность (VH) SEQ ID NO: 14, которая кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 15, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность (VL) SEQ ID NO: 16, которая кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17. Конкретно, LCDR Mu445 (SEQ ID NO: 6-8) прививали на каркас гена вариабельной области зародышевой линии человека IGVK1-39 с сохранением двух остатков мышиной каркасной области (I44 и Y71) (SEQ ID NO: 16). HCDR1 (SEQ ID NO: 3), HCDR2 (SEQ ID NO: 13) и HCDR3 (SEQ ID NO: 5) прививали на каркас гена вариабельной области зародышевой линии человека IGHV1-69 с сохранением двух остатков мышиной каркасной области (L70 и S72) (SEQ ID NO: 14). В вариантах гуманизации 445 (445-1) прививали только N-концевую половину HCDR2 Kabat, поскольку прогнозировали, что только N-концевая половина была важной для связывания антигена в соответствии со смоделированной 3D структурой.
445-1 конструировали в виде гуманизированного полноразмерного антитела с использованием самостоятельно разработанных экспрессионных векторов, которые содержат константные области человеческого IgG1 дикого типа (IgG1wt) и цепь каппа, соответственно, с легкой адаптацией сайтов субклонирования. Антитело 445-1 экспрессировали посредством совместной трансфекции клеток 293G двумя приведенными выше конструкциями и очищали, используя колонку с белком А (кат. №: 17-5438-02, GE Life Sciences). Очищенное антитело концентрировали до 0,5-10 мг/мл в PBS и хранили в аликвотах в морозильной камере при минус 80°С.
Используя антитело 445-1, делали несколько одиночных аминокислотных замен, превращая оставшиеся мышиные остатки в каркасной области VH и VL в соответствующие остатки зародышевой линии человека, такие как I44P и Y71F в VL и L70I и S72A в VH. Кроме того, несколько одиночных аминокислотных замен были сделаны в CDR для уменьшения риска возможной изомеризации и для повышения уровня гуманизации. Например, в LCDR2 были сделаны изменения Т51А и D50E и в HCDR2 были сделаны изменения D56E, G57A и N61A. Все изменения при гуманизации были сделаны с использованием праймеров, содержащих мутации в конкретных положениях, и набора для сайтнаправленного мутагенеза (кат. №: АР231-11, TransGen, Пекин, Китай). Желательные замены проверяли посредством секвенирования.
Аминокислотные замены в антителе 445-1 оценивали в отношении их связывания с ОХ40 и термостабильности. Антитело 445-2, содержащее HCDR1 с SEQ ID NO: 3, HCDR2 с SEQ ID NO: 18, HCDR3 с SEQ ID NO: 5, LCDR1 с SEQ ID NO: 6, LCDR2 с SEQ ID NO: 19 и LCDR3 с SEQ ID NO: 8 (см. табл. 3), конструировали на основе комбинации конкретных замен, описанных выше. При сравнении двух антител результаты показали, что оба антитела 445-2 и 445-1 демонстрировали сопоставимую аффинность связывания (см. ниже в табл. 4 и 5).
Начиная с антитела 445-2, делали несколько дополнительных аминокислотных замен в каркасной области VL для дополнительного улучшения аффинности/кинетики связывания, например, замену аминокислот G41D и K42G. Кроме того, делали несколько одиночных аминокислотных замен в CDR как VH, так и VL, для снижения риска иммуногенности и повышения термостабильности, например, S24R в LCDR1 и A61N в HCDR2. Полученные замены демонстрировали или улучшенные активности связывания, или улучшенную термостабильность, в сравнении с 445-2.
Гуманизированные антитела 445 дополнительно конструировали посредством введения конкретных аминокислотных замен в CDR и каркасные области для улучшения молекулярных и биофизических свойств для терапевтического применения у людей. Критерии включали удаление вредных посттрансляционных модификаций, улучшенную термостабильность (Tm), поверхностную гидрофобность и изоэлектрические точки (pI) при одновременном сохранении активностей связывания.
Гуманизированное моноклональное антитело, 445-3, содержащее HCDR1 с SEQ ID NO: 3, HCDR2 с SEQ ID NO: 24, HCDR 3 с SEQ ID NO: 5, LCDR1 с SEQ ID NO: 25, LCDR2 с SEQ ID NO: 19 и LCDR3 с SEQ ID NO: 8 (см. табл. 3), конструировали на основе способа созревания, описанного выше, и подробно характеризовали. Антитело 445-3 также превращали в версию IgG2 (IgG2 445-3), содержащую домен Fc
- 22 045547 тяжелой цепи дикого типа человеческого IgG2, и версию IgG4, содержащую домен Fc человеческого
IgG4 с мутациями S228P и R409K (IgG4 445-3). Результаты показали, что 445-3 и 445-2 демонстрировали сопоставимую аффинность связывания (см. табл. 4 и 5).
Т аблица 3
Последовательности антител 445
Антитело SEQ ID NO Последовательность
445-1 SEQ ID NO: 3 HCDR1 (Kabat) SYIIH
SEQ ID NO: 13 HCDR2 (Kabat) YINPYNDGTRYNQKFQG
SEQ ID NO: 5 HCDR3 (Kabat) GYYGSSYAMDY
SEQ ID NO: 6 LCDR1 (Kabat) SASQGISNYLN
SEQ ID NO: 7 LCDR2 (Kabat) DTSTLYS
SEQ ID NO: 8 LCDR3 (Kabat) QQYSKLPYT
SEQ ID NO: 14 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGY KFTSYIIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYN DGTRYNQKFQGRVTLTSDKSTSTAYMEL S SLRSEDT AVYYC ARGYYGS S Y AMD YW GQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 16 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGIS NYLNWYQQKPGKAIKLLIYDTSTLYSGV PSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC QQYSKLPYTFGGGTKVEIK
445-2 SEQ ID NO: 3 HCDR1 (Kabat) SYIIH
SEQ ID NO: 18 HCDR2 (Kabat) YINPYNEGTRYAQKFQG
SEQ ID NO: 5 HCDR3 (Kabat) GYYGSSYAMDY
SEQ ID NO: 6 LCDR1 (Kabat) SASQGISNYLN
SEQ ID NO: 19 LCDR2 (Kabat) DASTLYS
SEQ ID LCDR3 QQYSKLPYT
- 23 045547
NO: 8 (Kabat)
SEQ ID NO: 20 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGY KFTSYIIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYN EGTRYAQKFQGRVTLTADKSTSTAYMEL S SLRSEDT AVYYC ARGYYGS S YAMD YW GQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 22 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGIS NYLNWYQQKPGKAIKLLIYDASTLYSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYSKLPYTFGGGTKVEIK
445-3 SEQ ID NO: 3 HCDR1 (Kabat) SYIIH
SEQ ID NO: 24 HCDR2 (Kabat) YINPYNEGTRYNQKFQG
SEQ ID NO: 5 HCDR3 (Kabat) GYYGSSYAMDY
SEQ ID NO: 25 LCDR1 (Kabat) RASQGISNYLN
SEQ ID NO: 19 LCDR2 (Kabat) DASTLYS
SEQ ID NO: 8 LCDR3 (Kabat) QQYSKLPYT
SEQ ID NO: 26 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGY KFTSYIIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYN EGTRYNQKFQGRVTLTADKSTSTAYMEL S SLRSEDT AVYYC ARGYYGS S YAMD YW GQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 28 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIS NYLNWYQQKPDGAIKLLIYDASTLYSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYSKLPYTFGGGTKVEIK
Пример 4. Определение кинетики и аффинности связывания антител к ОХ40 посредством SPR.
Антитела к ОХ40 характеризовали в отношении их кинетики и аффинности связывания посредством анализов SPR с использованием BIAcore™ T-200 (GE Life Sciences). Кратко, осуществляли иммобилизацию антитела к человеческому IgG на активированном биосенсорном чипе СМ5 (кат. №: BR100530, GE Life Sciences). Антитело с областью Fc человеческого IgG пропускали через поверхность чипа и проводили захват антителом к человеческому IgG. Затем, серийное разведение рекомбинантного белка ОХ40 с His-меткой (кат. №: 10481-Н08Н, Sino Biological) пропускали через поверхность чипа, и изменения в сигналах поверхностного плазмонного резонанса анализировали с расчетом скоростей ассоциации (ka) и скоростей диссоциации (KD) посредством использования 1:1 модели связывания Ленгмюра (ознакомительное программное обеспечение BIA, GE Life Sciences). Равновесную константу диссоциации (KD) рассчитывали в виде отношения kd/ka. Результаты SPR-определенных профилей связывания антител к ОХ40 кратко обобщены на фиг. 2 и в табл. 4. Профиль связывания со средней KD антитела 445-3 (9,47 нМ) немного лучше, чем у антитела 445-2 (13,5 нМ) и 445-1 (17,1 нМ), и похож на профиль связывания ch445. Профиль связывания IgG4 445-3 был похож на 445-3 (с Fc IgG1), указывая на то, что изменение в Fc между IgG4 и IgG1 не изменяло специфичное связывание антитела 445-3.
- 24 045547
Таблица 4
Аффинности связывания антител к ОХ40 согласно SPR
Анализируемые параметры ch445* 445-1 445-2 445-3 IgG4 445-3
Тест 1 ка (M'V1) 1,74^105 1,56χ105 2,76χ105 1,82χ105 Ι,όΙχΙΟ5
kd (с'1) 1,43 χ ΙΟ'5 2,77χ10'5 3,90χ10'5 1,67χ10'5 1,61 X1OJ
KD (нМ) 8,26 17,8 14,2 9,16 10,0
КА (М-1) 1,22x10s 0,56x10s 0,71x10s 1,09x10s 1,00x10s
Тест 2 ка (М’А1) 2,65χ105 2,37χ105 2,06χ105 1,63χ105 -
kd (с'1) 1,67χ10'5 3,89χ10'5 2,64χ10'5 1,59χ10'5 -
KD(hM) 6,3 16,4 12,8 9,77 -
КА (М-1) 1,59x10s 0,61x10s 0,78x10s 1,03x10s -
Среднее KD(hM) 7,28 17,1 13,5 9,47 10,0
КА (М-1) 1,41x10s 0,59x10s 0,75x10s 1,06x10s 1,00x10s
*ch445 состоит из вариабельных доменов Mu445, слитых с константными областями IgG1wt/kаnnа человека
Пример 5. Определение аффинности связывания антител к ОХ40 с ОХ40, экспрессируемым на клетках HuT78.
Для оценки активности связывания антител к ОХ40 с ОХ40, экспрессируемым на поверхности живых клеток, клетки HuT78 трансфицировали человеческим ОХ40, как описано в примере 1, с созданием ОХ40-экспрессирующей линии. Живые клетки HuT78/OX40 высевали в 96-луночный планшет и инкубировали с серийным разведением разных антител к ОХ40. Антитело козы к человеческому IgG-FITC (Cat: A0556, Beyotime) использовали в качестве вторичного антитела для выявления антитела, связывающегося с клеточной поверхностью. Значения EC50 для дозозависимого связывания с человеческим ОХ40 определяли посредством подгонки данных по зависимости доза-ответ к четырехпараметрической логистической модели посредством GraphPad Prism. Как показано на фиг. 3 и табл. 5, антитела к ОХ40 обладали высокой аффинностью в отношении ОХ40. Также обнаружили, что антитела к ОХ40 по настоящему изобретению имели относительно более высокий верхний уровень интенсивности флуоресценции, измеряемой посредством проточной цитометрии (см. последний столбец табл. 5), что указывает на более медленную диссоциацию антитела от ОХ40, что является более желательным профилем связывания.
Таблица 5
ЕС50 дозозависимого связывания гуманизированных вариантов 445 с ОХ40
Антитело ECso (мкг/мл) Верхний уровень (MFI)
Тест 1 Тест 2 Среднее Среднее
ch445 0,321 0,277 0,299 725
445-1 0,293 0,278 0,285 525
445-2 0,323 0,363 0,343 620
445-3 0,337 0,319 0,328 910
IgG4 445-3 0,263 н./д. 0,263 892
Пример 6. Определение перекрестной реактивности антител к ОХ40.
Для оценки перекрестной реактивности антитела 445-3 в отношении человеческого ОХ40 и ОХ40 яванского макака (cyno) OX40, клетки, экспрессирующие человеческий ОХ40 (HuT78/OX40) и cyno OX40 (HuT78/cynoOX40), высеивали в 96-луночные планшеты и инкубировали с серией разведений антител к ОХ40. Антитело козы к человеческому IgG-FITC (кат. №: А0556, Beyotime) использовали в качестве вторичного антитела для выявления. Значения EC50 для дозозависимого связывания с нативными ОХ40 человека и яванского макака определяли посредством подгонки данных по зависимости доза-ответ к четырехпараметрической логистической модели посредством GraphPad Prism. Результат показан на фиг. 4 и в следующей ниже табл. 6. Антитело 445-3 дает перекрестную реакцию как с человеческим ОХ40, так и с ОХ40 яванского макака, с похожими значениями ЕС50, как показано ниже.
- 25 045547
Таблица 6
EC50 связывания антитела 445-3 с ОХ40 человека и яванского макака
Клеточная линия ЕС50 (мкг/мл) 445-3 Верхний уровень (MFI)
НиТ78/ОХ40 0,174 575
HuT78/cynoOX40 0,171 594
Пример 7. Определение совместной кристаллизации и структуры ОХ40 с Fab 445-3.
Для понимания механизма связывания ОХ40 с антителами по настоящему изобретению расшифровывали сокристаллическую структуру ОХ40 и Fab 445-3. Мутации в положениях Т148 и N160 вводили для блокирования гликозилирования ОХ40 и для улучшения однородности белка. ДНК, кодирующую мутантный человеческий ОХ40 (остатки M1-D170 с двумя мутантными сайтами, Т148А и N160A) клонировали в экспрессионный вектор с включением метки гекса-His, и данной конструкцией временно трансфицировали клетки 293G для экспрессии белка при 37°С в течение 7 суток. Клетки собирали, и супернатант собирали и инкубировали со смолой, аффинной в отношении His-метки, при 4°С в течение 1 часа. Смолу три раза промывали буфером, содержащим 20 мМ Tris, рН 8,0, 300 мМ NaCl и 30 мМ имидазол. Затем белок ОХ40 элюировали буфером, содержащим 20 мМ Tris, рН 8,0, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазол с последующей дополнительной очисткой посредством Superdex 200 (GE Healthcare) в буфере, содержащем 20 мМ Tris, рН 8,0, 100 мМ NaCl.
Кодирующие последовательности тяжелой цепи и легкой цепи Fab 445-3 клонировали в экспрессионный вектор с включением гекса-His-метки на С-конце тяжелой цепи, и осуществляли временную совместную трансфекцию клеток 293G данным вектором для экспрессии белка при 37°С в течение 7 суток. Стадии очистки Fab 445-3 были такими же, как использовались выше в случае мутантного белка ОХ40.
Очищенные ОХ40 и Fab 445-3 смешивали в молярном соотношении 1:1 и инкубировали в течение 30 минут на льду с последующей дополнительной очисткой с помощью Superdex 200 (GE Healthcare) в буфере, содержащем 20 мМ Tris, pH 8,0, 100 мМ NaCl. Пик комплекса собирали и концентрировали до приблизительно 30 мг/мл.
Скрининг сокристалла проводили посредством смешивания белкового комплекса с резервуарным раствором в объемном соотношении 1:1. Сокристаллы получали из висячей капли, культивируемой при 20°С посредством диффузии пара с помощью резервуарного раствора, содержащего 0,1 М HEPES, рН 7,0, 1 % ПЭГ 2000 ММЕ и 0,95 М сукцинат натрия.
Нейлоновые петли использовали для сбора сокристаллов, и данные кристаллы погружали в резервуарный раствор с добавлением 20% глицерина на 10 секунд. Данные по дифракции собирали на BL17U1, устройство с синхротронным излучением, Шанхай, и обрабатывали посредством программы XDS. Фазу расшифровывали посредством программы PHASER, используя структуру Fab IgG (цепи С и D PDB: 5CZX) и структуру ОХ40 (цепь R PDB: 2HEV) в качестве моделей исследования молекулярного замещения. Графический интерфейс Phenix.refine использовали для выполнения твердого тела, TLS, и ограниченного уточнения на основании данных рентгенографического исследования с последующей корректировкой с помощью программы COOT и дополнительным уточнением в программе Phenix.refine. Совокупность данных рентгенографического исследования и статистика уточнения кратко обобщены в табл. 7.
- 26 045547
Таблица 7
Совокупность данных и статистика уточнения
Совокупность данных
Канал пучка BL17U1, SSRF
Пространственная группа Р 31 2 1
Размер ячейки (А) а=183,96 Ь=183,96 с=79,09
Углы (°) а=90,00 β=90,00 γ=120,00
Разрешение (А) 159,3-2,55 (2,63-2,55)
Общее число отражений 988771 (81305)
Число характерных отражений 50306 (4625)
Завершенность (%) 99,9 (99,9)
Средняя избыточность 19,7 (17,6)
Яслияниеа 0,059 (0,962)
Ι/сигма (I) 29,4 (3,5)
Фактор Уилсона В (А) 73,9
Уточнение
Разрешение (А) 60,22-2,55
Число отражений 50008
rmsd (среднеквадратическое отклонение) длин связи (А) 0,010
rmsd углов связи (°) 0,856
Крабоч (%) 19,27
Ксвободн (%) 21,60
Средние В-факторы белка 97,10
Карты Рамачандрана (%)
предпочтительные 96,34
допустимые 3,48
Выбросы 0,17
Значения в скобках относятся к оболочке самого высокого разрешения.
aRcnHMHHe=£Sil/(A)i - №)>Ι/ΣΣΦ(Α)ίΙ, где </(Л.)> представляет собой среднюю интенсивность эквивалента.
%a6<^|Fo-Fc|^|Fo|, где Fo и Fc представляют собой наблюдаемые и рассчитанные амплитуды структурного фактора, соответственно.
рассчитывали с использованием набора данных анализа, 5 % суммарных данных, случайным образом выбранных из наблюдаемых отражений.
Пример 8. Идентификация эпитопа антитела 445-3 посредством SPR.
Исходя из сокристаллической структуры ОХ40 и антитела Fab 445-3, авторы изобретения выбирали и получали целый ряд одиночных мутаций в человеческом белке ОХ40 для дополнительной идентификации ключевых эпитопов антител к ОХ40 по настоящему изобретению. Одиночные точечные мутации создавали в слитой конструкции человеческого OX40/IgG1 посредством набора для сайт-направленного
- 27 045547 мутагенеза (кат. №: АР231-11, TransGen). Желательные мутации проверяли посредством секвенирования.
Экспрессии и получения мутантов ОХ40 достигали посредством трансфекции клеток 293G и очищали, используя колонку с белком А (кат. №: 17-5438-02, GE Life Sciences).
Аффинность связывания точечных мутаций ОХ40 в отношении Fab 445-3 характеризовали посредством анализов SPR, используя BIAcore 8K (GE Life Sciences). Кратко, осуществляли иммобилизацию мутантов ОХ40 и ОХ40 дикого типа на биосенсорном чипе СМ5 (кат. №: BR100530, GE Life Sciences), используя EDC и NHS. Затем серийное разведение Fab 445-3 в HBS-EP+буфере (кат. №: BR-1008-26, GE Life Sciences) пропускали через поверхность чипа, используя время контакта 180 с и время диссоциации 600 с при 30 мкл/мин. Изменения в сигналах поверхностного плазмонного резонанса анализировали для расчета скоростей ассоциации (ka) и скоростей диссоциации (KD) посредством использования 1: 1 модели связывания Ленгмюра (пробный выпуск программы BIA, GE Life Sciences). Равновесную константа диссоциации (KD) рассчитывали как отношение kd/ka. Кратность сдвига KD мутанта рассчитывали как отношение KD мутанта/KDWT. Профили идентификации эпитопа, определенные посредством SPR, кратко обобщены на фиг. 5 и в табл. 8. Результаты показали, что мутация остатков Н153, 1165 и Е167 до аланина в ОХ40 значимо уменьшала связывание антитела 445-3 с ОХ40, и мутация остатков Т154 и D170 до аланина приводила к умеренному уменьшению связывания антитела 445-3 с ОХ40.
Подробные взаимосвязи антитела 445-3 и остатков Н153, Т154, 1165, Е167 и D170 ОХ40 показаны на фиг. 6. Боковая цепь H153 на ОХ40 была окружена маленьким карманом 445-3 на поверхности взаимодействия, образуя водородные связи с тяжS31 и тяжG102 и π-π-стэкинг стяжY101. Боковая цепь Е167 образовывала водородные связи с тяжУ50 и тяжN52, в то время как D170 образовывал водородную связь и солевой мостик с тяжS31 и тяжК28, соответственно, которые могут дополнительно стабилизировать комплекс. Ван-дер-ваальсовы (VDW) взаимодействия Т154 с тяжY105, I165 и тяжR59 способствовали высокой аффинности антитела 445-3 в отношении ОХ40.
В заключение, остатки Н153, I165 и Е167 ОХ40 идентифицировали как важные остатки для взаимодействия с антителом 445-3. Кроме того, аминокислоты Т154 и D170 ОХ40 также являются важными для контакта остатками в отношении антитела 445-3. Эти данные показали, что эпитопы антитела 445-3 представляют собой остатки Н153, Т154, I165, Е167 и D170 ОХ40. Данные эпитопы расположены в последовательности HTLQPASNSSDAICEDRD (SEQ ID NO: 30), причем важные для контакта остатки выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.
Таблица 8 Идентификация эпитопа антитела 445-3, определяемого посредством SPR
Мутанты Kd мутанта/KDWT
Н153А Не выявляли связывания
Т154А 8
Q156A 1,9
S161A 1,1
S162A 0,6
I165A 28
Е167А 135
D170A 8
Значимое влияние: связывания не выявляли, или значение KD мутанта/KD WT было больше, чем 10. Умеренное влияние: значение KD мутанта/KD WT составляло от 5 до 10. Незначимое влияние: значение KD мутанта/KD WT составляло меньше 5.
Пример 9. Антитело к ОХ40 445-3 не блокирует взаимодействие OX40-OX40L.
Для определения того, препятствует ли антитело 445-3 взаимодействию OX40-OX40L, проводили анализ проточной цитометрии на клетках. В данном анализе антитело 445-3, референсное антитело lA7.grl, контрольное huIgG или отдельно среду предварительно инкубировали со слитым белком человеческого ОХ40 с мышиным Fc IgG2a (OX40-mIgG2a). Антитело и комплекс слитого белка затем добавляли к OX40L-экспрессирующим клеткам HEK293. Если антитело к ОХ40 не препятствует взаимодействию OX40-OX40L, тогда комплекс антитело к ОХ40-ОХ40 mIgG2a будет еще связываться с поверхностью OX40L, и данное взаимодействие выявляется с использованием вторичного антитела к мышиного Fc.
Как показано на фиг. 7, антитело 445-3, даже при высокой концентрации, не уменьшало связывания ОХ40 с OX40L, указывая на то, что 445-3 не мешает взаимодействию OX40-OX40L. Это указывает на то, что 445-3 не связывается в сайте связывания OX40L или не связывается достаточно тесно, чтобы пространственно затруднять связывание OX40L. Напротив, антитело положительного контроля, 1A7.gr1, полностью блокирует связывание ОХ40 с OX40L, как показано на фиг. 7.
- 28 045547
Кроме того, сокристаллическую структуру ОХ40 в комплексе с Fab 445-3 расшифровывали и выравнивали с комплексом OX40/OX40L (код PDB: 2HEV), как показано на фиг. 8. Тример лиганда ОХ40 взаимодействует с ОХ40 главным образом через CRD1 (цистеин-богатый домен), CRD2 и частичные области CRD3 ОХ40 (Compaan and Hymowitz, 2006), в то время как антитело 445-3 взаимодействует с ОХ40 только через область CRD4. В итоге, антитело 445-3 и тример OX40L связываются на уровне разных соответствующих областей ОХ40, и антитело 445-3 не препятствует взаимодействию OX40/OX40L. Данный результат коррелирует с данными картирования эпитопов, описанными в вышеприведенных Примерах. CRD4 ОХ40 находится на уровне аминокислот 127-167, и эпитоп антитела 445-3 частично перекрывается с данной областью. Последовательность CRD4 ОХ40 (аминокислоты 127-167) показана ниже, и частичное перекрывание эпитопа 445-3 выделено жирным шрифтом и подчеркнуто: PCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICE (SEQ ID NO: 31).
Пример 10. Агонистическая активность антитела к ОХ40 445-3.
Для исследования агонистических функций антитела 445-3 линию ОХ40-позитивных Т-клеток, HuT78/OX40, совместно культивировали с линией искусственных антигенпрезентирующих клеток (АРС) (HEK293/OS8low-FcyRI) в присутствии или отсутствии 445-3 или lA7.gr1 в течение ночи, и продукцию IL2 использовали в качестве регистрируемой величины для стимуляции Т-клеток. В клетках HEK293/OS8Low-FcyRI гены, кодирующие мембраносвязанное антитело к CD3 OKT3 (OS8) (как раскрыто в патенте США № 8735553), и человеческий FcyRI (CD64), стабильно совместно трансдуцировали в клетки HEK293. Поскольку активация иммунной системы, индуцируемая антителом к ОХ40, зависит от перекрестного связывания антитела (Voo et al, 2013), FcyRJ на HEK293/OS8Low-FcyRI обеспечивает основу для опосредованного антителом к ОХ40 перекрестного связывания ОХ40 при двойственном взаимодействии антитела к ОХ40 с ОХ40 и FcyRI. Как показано на фиг. 9, антитело к ОХ40 445-3 оказалось высокоактивным в усилении TCR-сигнализации дозозависимым образом с EC50 на уровне 0,06 нг/мл. Также наблюдали несколько более слабые активности референсного Ab lA7.gr1. Напротив, контрольный человеческий IgG (10 мкг/мл) иди холостая проба не демонстрировали воздействия на продукцию IL-2.
Пример 11. Антитело к ОХ40 445-3 стимулировало иммунные ответы в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR).
Для определения того, может ли антитело 445-3 стимулировать Т-клеточную активацию, анализ реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR) проводили, как описано ранее (Tourkova et al., 2001). Кратко, зрелые DC были индуцированы из человеческих РВМС-происходящих CD14 -миелоидных клеток посредством культивирования с GM-CSF и IL-4 с последующей стимуляцией LPS (lipopolyssacharide -липополисахарид). Далее, DC, обработанные митомицином С, совместно культивировали с аллогенными CD4 Т-клетками в присутствии антитела к ОХ40 445-3 (0,1-10 мкг/мл) в течение 2 суток. Продукцию IL-2 в сокультуре выявляли посредством ELISA в качестве регистрируемого показателя MLR ответа.
Как показано на фиг. 10, антитело 445-3 значимо стимулировало продукцию IL-2, указывая на способность 445-3 активировать CD4+ Т-клетки. Напротив, референсное антитело 1A7.gr1 демонстрировало значимо (Р меньше 0,05) более слабые активности в анализе MLR.
Пример 12. Антитело к ОХ40 445-3 демонстрировало ADCC-активность.
Анализ ADCC на основе высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH - lactate dehydrogenase) проводили для исследования того, могло антитело 445-3 уничтожать OX40Hi - экспрессирующие клеткимишени. Линию клеток NK92MI/CD16V генерировали в качестве эффекторных клеток посредством совместной трансдукции генов CD16v158 (аллель V158) и FcRy в линию NK-клеток, NK92MI (АТСС, Manassas VA). Линию ОХ40-экспрессирующих Т-клеток, HuT78/OX40, использовали в качестве клетокмишеней. Равные количества (3х104) клеток-мишеней и эффекторных клеток совместно культивировали в течение 5 ч в присутствии антитела к ОХ40 (0,004-3 мкг/мл) или контрольных Ab. Цитотоксичность оценивали по высвобождению LDH, используя набор для нерадиоактивного анализа цитотоксичности CytoTox 96 (Promega, Madison, WI). Специфичный лизис рассчитывали по формуле, показанной ниже.
Экспериментал. - Эффектор, спонтанн. - Мишень, спонтанн.
%, Специфичный лизис =--------------------------------------------- х 100
Мишень, максимум -Мишень, спонтанн.
Как показано на фиг. 11, антитело 445-3 демонстрировало высокую активность в уничтожении OX40Hi мишеней посредством ADCC дозозависимым образом (ЕС50: 0,027 мкг/мл). ADCC-эффект антитела 445-3 был похож на эффект контрольного антитела 1 A7.grl. Напротив, 445-3 с форматом Fc IgG4 с мутациями S228P и R409K (445-3-IgG4) не демонстрировало каких-либо значимых ADCC-эффектов, по сравнению с контрольным человеческим IgG или холостой пробой. Результаты согласуются с предыдущими результатами, которые свидетельствуют о том, что Fc IgG4 является слабым или молчит в отношении ADCC (An Z, et al. mAbs 2009).
Пример 13. Антитело к ОХ40 445-3 предпочтительно истощает CD4+ Treg и увеличивает отношения CD8+ Teff/Treg in vitro.
В нескольких животных моделях опухоли показано, что антитела к ОХ40 могли истощать OX40Hi Treg, инфильтрирующие опухоль, и увеличивать отношения CD8+ T-клеток к Treg (Bulliard et al., 2014; Carboni et al, 2003; Jacquemin et al, 2015; Marabelle et al., 2013b). Следовательно, иммунный ответ усили
- 29 045547 вался, приводя к регрессии опухоли и улучшенной выживаемости.
Учитывая тот факт, что in vitro активированные или внутриопухолевые CD4+Foxp3+ Treg экспрессируют ОХ40 предпочтительнее других субпопуляций Т-клеток (Lai et al., 2016; Marabelle et al., 2013b; Montler et al., 2016; Soroosh et al., 2007; Timperi et al., 2016), анализ на основе человеческих РВМС проводили для исследования способности антитела 445-3 уничтожать OX40Hi-клетки, в частности Treg. Кратко, РВМС предварительно активировали в течение 1 суток PHA-L (1 мкг/мл) для индукции экспрессии ОХ40 и использовали в качестве клеток-мишеней. Затем эффекторные клетки NK92MI/CD16V (как описано в примере 12, 5x104) совместно культивировали с равным количеством клеток-мишеней в присутствии антител к ОХ40 (0,001-10 мкг/мл) или плацебо в течение ночи. Процент каждой субпопуляции Тклеток определяли посредством проточной цитометрии. Как показано на фиг. 12А и 12В, обработка антителом 445-3 вызывала увеличение процента CD8 Т-клеток и уменьшение процента CD4 Foxp3 Treg дозозависимым образом. В результате, отношения CD8 Т-клеток к Treg значительно улучшались (фиг. 12С). Результаты более слабого улучшения получали в случае обработки 1A7.gr1. Данный результат демонстрирует терапевтические применения 445-3 в индукции противоопухолево иммунитета посредством стимулирования CD8+ Т-клеточных функций, но в то же время ограничения Treg-опосредованной иммунологической толерантности.
Пример 14. Антитело к ОХ40 445-3 обнаруживает дозозависимую противоопухолевую активность в мышиной опухолевой модели.
Эффективность антитела к ОХ40 445-3 демонстрировали в мышиной опухолевой модели. Мышиные клетки опухоли толстой кишки МС38 подкожно имплантировали мышам С57, трансгенным по человеческому ОХ40 (Biocytogen, Пекин, Китай). После имплантации опухолевых клеток объемы опухоли измеряли два раза в неделю и рассчитывали в мм3, используя формулу: V=0,5 (аxb2), где а и b представляли собой размеры опухоли по длинной и короткой осям, соответственно. Когда опухоли достигали среднего объема приблизительно 190 мм3 в размере, мышей случайным образом распределяли по 7 группам и внутрибрюшинно инъецировали или антитело 445-3 или антитело 1A7.gr1 один раз в неделю на протяжении трех недель. Человеческий IgG вводили в качестве изотипического контроля. Частичную регрессию (PR - Partial regression) определяли, как объем опухоли, составляющий меньше чем 50 % исходного объема опухоли в первые сутки дозирования в трех последовательных измерениях. Ингибирование роста опухоли (TGI - tumor growth inhibition) рассчитывали, используя следующую формулу:
. Λ /(обработ. t) - (обработ. t0) \\
Ингибирование роста,% = ЮО х I 1 - I -------—----------r . I г \ ((плацебо t) - (плацебо Q J) обработ. t означает объем обработанной опухоли в момент времени t; обработ. t0 означает объем обработанной опухоли в момент времени 0; плацебо t означает объем опухоли в присутствии плацебо в момент времени t; плацебо t0 означает объем опухоли в присутствии плацебо в момент времени 0. Результаты продемонстрировали, что 445-3 обладало дозозависимой противоопухолевой эффективностью в виде внутрибрюшинной инъекции с дозами 0,4, 2 и 10 мг/кг. Введение 445-3 приводило к 53%-ому (0,4 мг/кг), 69%-ому (2 мг/кг) и 94%-ому (10 мг/кг) ингибированию роста опухоли и приводило к 0%-ной (0,4 мг/кг), 17%-ной (2 мг/кг) и 33%-ной (10 мг/кг) частичной регрессии по сравнению с исходным уровнем. Напротив, частичной регрессии под действием антитела 1A7.gr1 не наблюдали. Данные in vivo показывают, что лиганд-неблокирующее антитело 445-3 лучше подходит для противоопухолевой терапии, чем антитело, блокирующее OX40-OX40L, 1A7.gr1 (фиг. 13А и 13В, табл. 9).
Таблица 9
Э ф фективность 445-3 и 1A7.gr1 в мышиной модели опухоли толстой кишки МС38 мыши
Обработка QW (еженедельная) Доза (мг/кг) N Степень частичной регрессии Средний объем опухоли в сутки 21 (мм3) TGI в сутки 21 (%)
445-3 0,4 6 0% 953 53
2 6 17% 696 69
10 6 33 % 280 94
lA7.grl 0,4 6 0% 886 57
2 6 0% 1163 41
10 6 0% 1030 49
Пример 1. Изменения аминокислотного состава антител к ОХ40.
Несколько аминокислот выбирали для изменения с целью улучшения антител к ОХ40. Аминокислотные замены осуществляли для улучшения аффинности или для повышения уровня гуманизации. Наборы ПЦР-праймеров конструировали для соответствующих изменений аминокислотного состава, синтезировали и использовали для модификации антител к ОХ40. Например, замена К28Т в тяжелой цепи и
- 30 045547 замена S24R в легкой цепи приводили к 1,7-кратному увеличению EC50, определяемой посредством
FACS, по сравнению с исходным антителом 445-2. Замена Y27G в тяжелой цепи и замена S24R в легкой цепи приводили к 1,7-кратному увеличению KD, определяемой посредством Biacore, по сравнению с исходным антителом 445-2. Данные изменения кратко обобщены на фиг. 14А, 14В.
Ссылки.
al-Shamkhani, A., Birkeland, M.L., Puklavec, М., Brown, M.H., James, W., and Barclay,
A.N. (1996). 0X40 is differentially expressed on activated rat and mouse T cells and is the sole receptor for the 0X40 ligand. European journal of immunology 26, 1695-1699.
An Z, Forrest G, Moore R, Cukan M, Haytko P, Huang L, Vitelli S, Zhao JZ, Lu P, Hua
J, Gibson CR, Harvey BR, Montgomery D, Zaller D, Wang F, Strohl W. (2009). IgG2m4, an engineered antibody isotype with reduced Fc function. MAbs. 1,572-579.
Arch, R.H., and Thompson, C.B. (1998). 4-1BB and 0x40 are members of a tumor necrosis factor (TNF)-nerve growth factor receptor subfamily that bind TNF receptor-associated factors and activate nuclear factor kappaB. Molecular and cellular biology 18, 558-565.
Aspeslagh, S., Postel-Vinay, S., Rusakiewicz, S., Soria, J.C., Zitvogel, L., and Marabelle,
A. (2016). Rationale for anti-OX40 cancer immunotherapy. Eur J Cancer 52, 50-66.
Bulliard, Y., Jolicoeur, R., Zhang, J., Dranoff, G., Wilson, N.S., and Brogdon, J.L.
(2014) . OX40 engagement depletes intratumoral Tregs via activating FcgammaRs, leading to antitumor efficacy. Immunology and cell biology 92, 475-480.
Calderhead, D.M., Buhlmann, J.E., van den Eertwegh, A.J., Claassen, E., Noelle, R.J., and Fell, H.P. (1993). Cloning of mouse 0x40: a T cell activation marker that may mediate T-B cell interactions. J Immunol 151, 5261-5271.
Carboni, S., Aboul-Enein, F., Waitzinger, C., Killeen, N., Lassmann, H., and Pena-Rossi,
C. (2003). CD134 plays a crucial role in the pathogenesis of EAE and is upregulated in the CNS of patients with multiple sclerosis. Journal of neuroimmunology 145, 1-11.
Compaan, D.M., and Hymowitz, S.G. (2006). The crystal structure of the costimulatory
OX40-OX40L complex. Structure 14, 1321-1330.
- 31 045547
Croft, Μ. (2010). Control of immunity by the TNFR-related molecule 0X40 (CD 134). Annual review of immunology 28, 57-78.
Croft, M., So, T., Duan, W., and Soroosh, P. (2009). The significance of OX40 and OX40L to T-cell biology and immune disease. Immunological reviews 229, 173-191.
Curti, B.D., Kovacsovics-Bankowski, M., Morris, N., Walker, E., Chisholm, L., Floyd, K., Walker, J., Gonzalez, I., Meeuwsen, T., Fox, B.A., et al. (2013). OX40 is a potent immunestimulating target in late-stage cancer patients. Cancer research 73, 7189-7198.
Durkop, H., Latza, U., Himmelreich, P., and Stein, H. (1995). Expression of the human OX40 (hOX40) antigen in normal and neoplastic tissues. British journal of haematology 91, 927931.
Gough, M.J., and Weinberg, A.D. (2009). OX40 (CD134) and OX40L. Advances in experimental medicine and biology 647, 94-107.
Gramaglia, I., Weinberg, A.D., Lemon, M., and Croft, M. (1998). Ox-40 ligand: a potent costimulatory molecule for sustaining primary CD4 T cell responses. J Immunol 161, 65106517.
Guo, Z., Cheng, D., Xia, Z., Luan, M., Wu, L., Wang, G., and Zhang, S. (2013). Combined TIM-3 blockade and CD 137 activation affords the long-term protection in a murine model of ovarian cancer. Journal of translational medicine 11,215.
Hori, S., Nomura, T., and Sakaguchi, S. (2003). Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science 299, 1057-1061.
Huddleston, C.A., Weinberg, A.D., and Parker, D.C. (2006). OX40 (CD134) engagement drives differentiation of CD4+ T cells to effector cells. European journal of immunology 36, 1093-1103.
Ito, T., Amakawa, R., Inaba, M., Hori, T., Ota, M., Nakamura, K., Takebayashi, M., Miyaji, M., Yoshimura, T., Inaba, K., and Fukuhara, S. (2004). Plasmacytoid dendritic cells regulate Th cell responses through OX40 ligand and type I IFNs. J Immunol 172, 4253-4259.
Ito, T., Wang, Y.H., Duramad, 0., Hanabuchi, S., Perng, O.A., Gilliet, M., Qin, F.X., and Liu, Y.J. (2006). OX40 ligand shuts down IL-10-producing regulatory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 13138-13143.
Jacquemin, C., Schmitt, N., Contin-Bordes, C., Liu, Y., Narayanan, P., Seneschal, J., Maurouard, T., Dougall, D., Davizon, E.S., Dumortier, H., et al. (2015). OX40 Ligand Contributes to Human Lupus Pathogenesis by Promoting T Follicular Helper Response. Immunity 42, 1159-1170.
- 32 045547
Kjaergaard, J., Tanaka, J., Kim, J.A., Rothchild, K., Weinberg, A., and Shu, S. (2000). Therapeutic efficacy of OX-40 receptor antibody depends on tumor immunogenicity and anatomic site of tumor growth. Cancer research 60, 5514-5521.
Ladanyi, A., Somlai, B., Gilde, K., Fejos, Z., Gaudi, I., and Timar, J. (2004). T-cell activation marker expression on tumor-infiltrating lymphocytes as prognostic factor in cutaneous malignant melanoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 10, 521-530.
Lai, C., August, S., Albibas, A., Behar, R., Cho, S.Y., Polak, M.E., Theaker, J., MacLeod, A.S., French, R.R., Glennie, M.J., et al. (2016). OX40+ Regulatory T Cells in Cutaneous Squamous Cell Carcinoma Suppress Effector T-Cell Responses and Associate with Metastatic Potential. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 22, 4236-4248.
Marabelle, A., Kohrt, H., and Levy, R. (2013a). Intratumoral anti-CTLA-4 therapy: enhancing efficacy while avoiding toxicity. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 19, 5261-5263.
Marabelle, A., Kohrt, H., Sagiv-Barfi, 1., Ajami, B., Axtell, R.C., Zhou, G., Rajapaksa, R., Green, M.R., Torchia, J., Brody, J., et al. (2013b). Depleting tumor-specific Tregs at a single site eradicates disseminated tumors. The Journal of clinical investigation 123, 2447-2463.
Montier, R., Bell, R.B., Thalhofer, C., Leidner, R., Feng, Z., Fox, B.A., Cheng, A.C., Bui, T.G., Tucker, C., Hoen, H., and Weinberg, A. (2016). OX40, PD-1 and CTLA-4 are selectively expressed on tumor-infiltrating T cells in head and neck cancer. Clinical & translational immunology 5, e70.
Morris, N.P., Peters, C., Montier, R., Hu, H.M., Curti, B.D., Urba, W.J., and Weinberg, A.D. (2007). Development and characterization of recombinant human Fc:OX40L fusion protein linked via a coiled-coil trimerization domain. Molecular immunology 44, 3112-3121.
Ohshima, Y., Tanaka, Y., Tozawa, H., Takahashi, Y., Maliszewski, C., and Delespesse, G. (1997). Expression and function of OX40 ligand on human dendritic cells. J Immunol 159, 3838-3848.
Petty, J.K., He, K., Corless, C.L., Vetto, J.T., and Weinberg, A.D. (2002). Survival in human colorectal cancer correlates with expression of the T-cell costimulatory molecule OX-40 (CD134). American journal of surgery 183, 512-518.
Redmond, W.L., and Weinberg, A.D. (2007). Targeting OX40 and OX40L for the treatment of autoimmunity and cancer. Critical reviews in immunology 27, 415-436.
- 33 045547
Rogers, P.R., Song, J., Gramaglia, I., Killeen, N., and Croft, M. (2001). 0X40 promotes Bcl-xL and Bcl-2 expression and is essential for long-term survival of CD4 T cells. Immunity 15, 445-455.
Ruby, C.E., and Weinberg, A.D. (2009). OX40-enhanced tumor rejection and effector T cell differentiation decreases with age. J Immunol 182, 1481-1489.
Sarff, M., Edwards, D., Dhungel, B., Wegmann, K.W., Corless, C., Weinberg, A.D., and Vetto, J.T. (2008). OX40 (CD 134) expression in sentinel lymph nodes correlates with prognostic features of primary melanomas. American journal of surgery 195, 621-625; discussion 625.
Sato, T., Ishii, N., Murata, K., Kikuchi, K., Nakagawa, S., Ndhlovu, L.C., and Sugamura, K. (2002). Consequences of 0X40-0X40 ligand interactions in langerhans cell function: enhanced contact hypersensitivity responses in OX40L-transgenic mice. European journal of immunology 32, 3326-3335.
Smyth, M.J., Ngiow, S.F., and Teng, M.W. (2014). Targeting regulatory T cells in tumor immunotherapy. Immunology and cell biology 92, 473-474.
Song, A., Tang, X., Harms, K.M., and Croft, M. (2005a). OX40 and Bcl-xL promote the persistence of CD8 T cells to recall tumor-associated antigen. J Immunol 175, 3534-3541.
Song, J., So, T., Cheng, M., Tang, X., and Croft, M. (2005b). Sustained survivin expression from OX40 costimulatory signals drives T cell clonal expansion. Immunity 22, 621631.
Song, J., So, T., and Croft, M. (2008). Activation of NF-kappaBl by OX40 contributes to antigen-driven T cell expansion and survival. J Immunol 180, 7240-7248.
Soroosh, P., Ine, S., Sugamura, K., and Ishii, N. (2007). Differential requirements for OX40 signals on generation of effector and central memory CD4+ T cells. J Immunol 179, 50145023.
St Rose, M.C., Taylor, R.A., Bandyopadhyay, S., Qui, H.Z., Hagymasi, A.T., Vella, A.T., and Adler, A.J. (2013). CD134/CD137 dual costimulation-elicited IFN-gamma maximizes effector T-cell function but limits Treg expansion. Immunology and cell biology 91, 173-183.
Stuber, E., Neurath, M., Calderhead, D., Fell, H.P., and Strober, W. (1995). Cross-linking of OX40 ligand, a member of the TNF/NGF cytokine family, induces proliferation and differentiation in murine splenic В cells. Immunity 2, 507-521.
Szypowska, A., Stelmaszczyk-Emmel, A., Demkow, U., and Luczynski, W. (2014). High expression of OX40 (CD 134) and 4-IBB (CD 137) molecules on CD4(+)CD25(high) cells in children with type 1 diabetes. Advances in medical sciences 59, 39-43.
Timperi, E., Pacella, I., Schinzari, V., Focaccetti, C., Sacco, L., Farelli, F., Caronna, R., Del Bene, G., Longo, F., Ciardi, A., et al. (2016). Regulatory T cells with multiple suppressive
- 34 045547 and potentially pro-tumor activities accumulate in human colorectal cancer. Oncoimmunology 5, el 175800.
Tourkova, I.L., Yurkovetsky, Z.R., Shurin, M.R., and Shurin, G.V. (2001). Mechanisms of dendritic cell-induced T cell proliferation in the primary MLR assay. Immunology letters 78, 75-82.
Vetto, J.T., Lum, S., Morris, A., Sicotte, M., Davis, J., Lemon, M., and Weinberg, A. (1997). Presence of the T-cell activation marker OX-40 on tumor infiltrating lymphocytes and draining lymph node cells from patients with melanoma and head and neck cancers. American journal of surgery 174, 258-265.
Voo, K.S., Bover, L., Harline, M.L., Vien, L.T., Facchinetti, V., Arima, K., Kwak, L.W., and Liu, Y.J. (2013). Antibodies targeting human OX40 expand effector T cells and block inducible and natural regulatory T cell function. J Immunol 191, 3641-3650.
Weinberg, A.D., Rivera, M.M., Prell, R., Morris, A., Ramstad, T., Vetto, J.T., Urba, W.J., Alvord, G., Bunce, C., and Shields, J. (2000). Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity. J Immunol 164, 2160-2169.
Weinberg, A.D., Wegmann, K.W., Funatake, C., and Whitham, R.H. (1999). Blocking OX-40/OX-40 ligand interaction in vitro and in vivo leads to decreased T cell function and amelioration of experimental allergic encephalomyelitis. J Immunol 162, 1818-1826.
Willoughby, J., Griffiths, J., Tews, I., and Cragg, M.S. (2017). OX40: Structure and function - What questions remain? Molecular immunology 83, 13-22.
Zander, R.A., Obeng-Adjei, N., Guthmiller, J.J., Kulu, D.I., Li, J., Ongoiba, A., Traore, B., Crompton, P.D., and Butler, N.S. (2015). PD-1 Co-inhibitory and OX40 Co-stimulatory Crosstalk Regulates Helper T Cell Differentiation and Anti-Plasmodium Humoral Immunity. Cell host & microbe 17, 628-641.
Zhang, T., Lemoi, B.A., and Sentman, C.L. (2005). Chimeric NK-receptor-bearing T cells mediate antitumor immunotherapy. Blood 106, 1544-1551.

Claims (31)

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с человеческим ОХ40 и содержит:
(i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR (определяющая комплементарность область тяжелой цепи) 1 с SEQ ID NO: 3, (b) HCDR2 с SEQ ID NO: 24, (с) HCDR3 с SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит: (d) LCDR (определяющая комплементарность область легкой цепи) 1 с SEQ ID NO: 25, (е) LCDR2 с SEQ ID NO: 19 и (f) LCDR3 с SEQ ID NO: 8;
(ii) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 с SEQ ID NO: 3, (b) HCDR2 с SEQ ID NO:18, (с) HCDR3 с SEQ ID NO: 5; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит: (d) LCDR1 с SEQ ID NO: 6, (е) LCDR2 с SEQ ID NO: 19 и (f) LCDR3 с SEQ ID NO: 8;
(iii) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 с SEQ ID NO: 3, (b) HCDR2 с SEQ ID NO: 13, (с) HCDR3 с SEQ ID NO: 5; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит: (d) LCDR1 с SEQ ID NO:6, (е) LCDR2 с SEQ ID NO: 7 и (f) LCDR3 с SEQ ID NO: 8; или (iv) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 с SEQ ID NO: 3, (b) HCDR2 с SEQ ID NO: 4, (с) HCDR3 с SEQ ID NO: 5; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит: (d) LCDR1 с SEQ ID NO: 6, (е) LCDR2 с SEQ ID NO: 7 и (f) LCDR3 с SEQ ID NO: 8.
2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее:
(i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 28;
(ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичную SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 22;
- 35 045547 (iii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 14, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90,
91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 16; или (iv) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 11.
3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где (i) в SEQ ID NO: 26 и/или 28 имеются инсерции, делеции или замены одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислот;
(ii) в SEQ ID NO: 20 и/или 22 имеются инсерции, делеции или замены одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислот;
(iii) в SEQ ID NO: 14 и/или 16 имеются инсерции, делеции или замены одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислот; или (iv) в SEQ ID NO: 9 и/или 11 имеются инсерции, делеции или замены одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислот.
4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее:
(i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую SEQ ID NO: 28;
(ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую SEQ ID NO: 22;
(iii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую SEQ ID NO: 14, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую SEQ ID NO: 16; или (iv) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VH), содержащую SEQ ID NO: 11.
5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, представляющее собой моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое сконструированное антитело, одноцепочечное антитело (scFv), фрагмент Fab, фрагмент Fab' или фрагмент F(ab')2.
6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, обладающее агонистической активностью в отношении ОХ40.
7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, связывающееся с человеческим ОХ40 на эпитопе, содержащем один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из H153-D170 человеческого ОХ40.
8. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, связывающееся с человеческим ОХ40 на эпитопе, содержащем один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Н153, Т154, I165, Е167 и D170 человеческого ОХ40.
9. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, связывающееся с человеческим ОХ40 на эпитопе, содержащем один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Н153, I165 и Е167 человеческого ОХ40.
10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, связывающееся с человеческим ОХ40 на или в пределах SEQ ID NO. 30.
11. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичностью (CDC).
12. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет пониженный уровень гликозилирования, или не имеет гликозилирования, или является гипофукозилированным.
13. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет повышенное содержание структур, имеющих ветвление в точках GlcNac.
14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где домен Fc принадлежит к IgG1.
15. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где домен Fc принадлежит к IgG4.
16. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.15, где IgG4 имеет замену S228P (в соответствии с системой нумерации EU).
17. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.16, где IgG4 имеет замены S228P и R409K (в соответствии с системой нумерации EU).
18. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-17, которое имеет одно или более из следующих свойств:
(i) способно вступать в перекрестную реакцию с cynoOX40;
(ii) не препятствует взаимодействию OX40-OX40L;
- 36 045547 (iii) способно совместно стимулировать Т-клетки с продукцией IL-2;
(iv) способно совместно активировать CD4+ Т-клетки, в частности, как измерено в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR);
(v) способно опосредовать ADCC, в частности, как измерено в анализе ADCC на основе высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH);
(vi) способно истощать CD4+ Treg (регуляторная Т-клетка);
(vii) способно увеличивать отношение CD8+ Teff (эффекторная Т-клетка)/Тгед; или (viii) способно опосредовать частичную регрессию опухолей в животной модели опухоли.
19. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-18, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
20. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-18.
21. Способ по п.20, где рак представляет собой рак молочной железы, рак головы и шеи, рак желудка, рак почки, рак печени, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак яичника, рак кожи, мезотелиому, лимфому, лейкоз, миелому и саркому.
22. Способ по п.21, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент вводят в комбинации с другим терапевтическим средством.
23. Способ по п.22, где терапевтическое средство представляет собой паклитаксел или средство на основе паклитаксела, доцетаксел, карбоплатин, топотекан, цисплатин, иринотекан, доксорубицин, леналидомид или 5-азацитидин.
24. Способ по п.23, где терапевтическое средство представляет собой средство на основе паклитаксела, леналидомид или 5-азацитидин.
25. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-18.
26. Вектор для кодирования антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-18, содержащий нуклеиновую кислоту по п.25.
27. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.25 или вектор по п.26.
28. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина по п.27 и выделение антитела или антигенсвязывающего фрагмента из культуры.
29. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-18 для лечения или снижения вероятности рака молочной железы, рака головы и шеи, рака желудка, рака почки, рака печени, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака яичника, рака кожи, мезотелиомы, лимфомы, лейкоза, миеломы и саркомы.
30. Диагностический реагент, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-18, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является меченым.
31. Диагностический реагент по п.30, где метка выбрана из группы, состоящей из радиоактивной метки, флуорофора, хромофора, визуализирующего средства и иона металла.
EA202092460 2018-05-23 2019-05-22 Антитела к ox40 и способы применения EA045547B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2018/088101 2018-05-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA045547B1 true EA045547B1 (ru) 2023-12-05

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7489922B2 (ja) 抗ｏｘ４０抗体及び使用方法
WO2021098757A1 (en) Methods of cancer treatment using anti-ox40 antibodies in combination with anti-tigit antibodies
CN114728063B (zh) 用抗ox40抗体和多重激酶抑制剂治疗癌症
WO2021098748A1 (en) Methods of cancer treatment with anti-ox40 antibody in combination with chemotherapeutic agents
CN114641500B (zh) 使用抗ox40抗体与抗tim3抗体的组合治疗癌症的方法
WO2021098774A1 (en) Methods of cancer treatment using anti-ox40 antibodies in combination with anti-pd1 or anti-pdl1 antibodies
EA045547B1 (ru) Антитела к ox40 и способы применения