TW202307004A - 抗cea抗體及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供了結合人CEA的抗體及其抗原結合片段、包含所述抗體的藥物組成物,以及抗CEA抗體或該組成物用於治療疾病諸如癌症之用途。
Description
本文揭露了結合人CEA的抗體或其抗原結合片段以及用於治療癌症之方法。
癌胚抗原(CEA,也稱為CEACAM5或CD66e)係一種糖蛋白,其分子量為約70-100 kDa,具體取決於所存在的糖基化的量。Gold等人, J. Exp. Med. [實驗醫學雜誌], 121, 439 (1965)首先報導了與人腺癌中的癌症特異性抗原相關的CEA之存在。CEA通常在多種腺上皮組織(諸如胃腸道、呼吸道和泌尿生殖道)中表現,在該等腺上皮組織中它似乎位於細胞的頂端表面(Hammarstrom, S. Semin. Cancer Biol. [癌症生物學研討會] 9, 67-81 (1999))。例如,發現它存在於結腸的柱狀上皮細胞和杯狀細胞中(Fraengsmyr等人, Tumor Biol. [腫瘤生物學] 20:277-292(1999))。在由該等組織類型產生的腫瘤中,CEA表現從頂端膜到細胞表面增加,並且一旦從細胞表面除去,就會進入血流(Hammarstrom, S. Semin. Cancer Biol. [癌症生物學研討會] 9, 67-81;(1999),還參見Fraengsmyr等人, Tumor Biol. [腫瘤生物學] 20:277-292(1999))。在許多類型的癌症中觀察到CEA過表現,該等癌症包括結腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、胃癌、肝細胞癌、乳癌和甲狀腺癌。因此,在癌症的預後和治療中,CEA已經用作診斷性腫瘤標誌物以確定癌症患者血液中的CEA水平升高(Chevinsky, A. H. (1991) Semin. Surg. Oncol. [外科腫瘤學研討會] 7, 162-166;Shively, J. E.等人, (1985) Crit. Rev. Oncol. Hematol. [腫瘤學/血液學評論] 2, 355-399)。
CEA已被認為是用於靶向治療的有用的腫瘤相關抗原(Kuroki M等人, (2002) Anticancer Res [抗癌研究] 22:4255-64)。一種方法係產生展示抗CEA scFv的反轉錄病毒構建體,並將一氧化氮合酶(iNOS)基因遞送至表現CEA的癌細胞。(Kuroki M.等人, (2000) Anticancer Res. [抗癌研究] 20(6A): 4067-71)。另一種方法係將放射性同位素與抗CEA抗體連接,並證明放射特異性針對表現CEA的腫瘤(Wilkinson等人, PNAS USA [美國國家科學院院刊] 98, 10256-60 (2001);Goldenberg等人, Am. J. Gastroenterol. [美國胃腸病學雜誌], 86: 1392-1403 (1991);Olafsen T.等人, Protein Engineering, Design & Selection [蛋白質工程設計與選擇], 17, 21-27, (2004);Meyer等人, Clin. Cancer Res. [臨床癌症研究] 15:4484-4492 (2009);Sharkey等人, J. Nucl. Med. [核醫學雜誌] 46:620-633 (2005))。放射性同位素方法已擴展到抗CEA抗體藥物軛合物(ADC)。例如,Shinmi等人報導了一種與單甲基澳瑞他汀E(MMAE)軛合的抗CEA抗體(Shinmi等人, Cancer Med. [癌症醫學] 6(4): 798-808 (2017))。
然而,抗CEA抗體的問題之一係交叉反應性。CEA與其他CEACAM家族成員高度同源,例如,人CEA與CEACAM6顯示出84%同源性,與CECAM8顯示出77%同源性,與CEACAM1顯示出73%同一性。本揭露提供了對CEA特異的抗CEA抗體。
本揭露關於抗CEA抗體及其抗原結合片段。本揭露涵蓋以下實施方式。
一種抗CEA抗體或其抗原結合片段,其包含在SEQ ID NO: 52的胺基酸596至674處特異性結合人CEA的抗體或其結合片段。
該抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段不結合其他CEACAM家族成員。
如請求項1所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其包含:
(i) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1(重鏈互補決定區1)、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3,以及輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1(輕鏈互補決定區1)、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3;
(ii) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 24的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 25的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 26的HCDR3;以及輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(d) SEQ ID NO: 27的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 28的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 23的LCDR3;或
(iii) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 41的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 42的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 43的HCDR3;以及輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(d) SEQ ID NO: 44的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 45的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 40的LCDR3。
該抗CEA抗體或抗原結合片段,其包含:
(i) 重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 14至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列,以及輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 15至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列;
(ii) 重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 31至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列,以及輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 32至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列;或
(iii) 重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 48至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列,以及輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 49至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
該抗CEA抗體或抗原結合片段,其中SEQ ID NO: 14、15、31、32、48或49中已插入、缺失或取代一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。
該抗CEA抗體或抗原結合片段,其包含:
(i) 包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區(VL);
(ii) 包含SEQ ID NO: 31的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO: 32的輕鏈可變區(VL);或
(iii) 包含SEQ ID NO: 48的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO: 49的輕鏈可變區(VL)。
該抗CEA抗體或抗原結合片段,其為單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人工程化抗體、單鏈抗體(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab')
2片段。
該抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。
該抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段具有降低的糖基化或無糖基化或係低岩藻糖基化的。
該抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段包含增加的二等分GlcNac結構。
該抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該Fc結構域係IgG1。
該抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該抗體軛合到毒素。
一種包含該抗CEA抗體或抗原結合片段的藥物組成物,其進一步包含藥學上可接受的載劑。
一種治療癌症之方法,其包括向有需要的患者投與有效量的該抗體或抗原結合片段。
該方法,其中該癌症係胃癌、結腸癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、間皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
該方法,其中該抗體或抗原結合片段與另一種治療劑組合投與。
該方法,其中該治療劑係紫杉醇或紫杉醇藥劑、多西他賽、卡鉑、托泊替康、順鉑、伊立替康、多柔比星、來那度胺或5-氮雜胞苷。
該方法,其中該治療劑係抗PD1或抗PDL1抗體。
一種分離的核酸,其編碼該抗CEA抗體或抗原結合片段。
一種載體,其包含該核酸。
一種宿主細胞,其包含該核酸或載體。
一種用於生產抗CEA抗體或其抗原結合片段之方法,其包括培養宿主細胞以及從培養物中回收該抗體或抗原結合片段。
在一個實施方式中,該抗CEA抗體或其抗原結合片段包含一或多個互補決定區(CDR),該一或多個互補決定區包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:40。
在另一個實施方式中,該抗體或其抗原結合片段包含:(a) 包含一或多個互補決定區(HCDR)的重鏈可變區,該一或多個互補決定區包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43;和/或 (b) 包含一或多個互補決定區(LCDR)的輕鏈可變區,該一或多個互補決定區具有選自由以下組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO: 40。
在另一個實施方式中,該抗體或其抗原結合片段包含:(a) 包含三個互補決定區(HCDR)的重鏈可變區,這三個互補決定區係包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO:41的胺基酸序列的HCDR1,包含SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 42的胺基酸序列的HCDR2,以及包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 43的胺基酸序列的HCDR3,和/或 (b) 包含三個互補決定區(LCDR)的輕鏈可變區,這三個互補決定區係包含SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的LCDR1,包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 45的胺基酸序列的LCDR2,以及包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的LCDR3。
在另一個實施方式中,該抗CEA抗體或其抗原結合片段包含:(a) 包含三個互補決定區(HCDR)的重鏈可變區,這三個互補決定區係包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的HCDR1,包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的HCDR2,以及包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的HCDR3;或包含SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的HCDR1,包含SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的HCDR2,以及包含SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的HCDR3;或包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列的HCDR1,包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列的HCDR2,以及包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列的HCDR3;和/或 (b) 包含三個互補決定區(LCDR)的輕鏈可變區,這三個互補決定區係包含SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的LCDR1,包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的LCDR2,以及包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3;或包含SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的LCDR1,包含SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的LCDR2,以及包含SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的LCDR3;或包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的LCDR1,包含SEQ ID NO: 45的胺基酸序列的LCDR2,以及包含SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的LCDR3。
在另一個實施方式中,該抗CEA抗體或其抗原結合片段包含:重鏈可變區,該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3,以及輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3。
在另一個實施方式中,抗CEA抗體或其抗原結合片段包含:重鏈可變區,該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 24的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 25的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 26的HCDR3;以及輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(d) SEQ ID NO: 27的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 28的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 23的LCDR3。
在又一個實施方式中,該抗CEA抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 41的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 42的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 43的HCDR3;以及輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(d) SEQ ID NO: 44的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 45的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 40的LCDR3。
在一個實施方式中,本揭露的抗體或其抗原結合片段包含:(a) 重鏈可變區,該重鏈可變區具有SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 48的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 48中的任一個至少95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列;和/或 (b) 輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 49的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 49中的任一個至少95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方式中,本揭露的抗CEA抗體或其抗原結合片段包含:(a) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 48的胺基酸序列或在SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 48的胺基酸序列中包含一個、兩個或三個胺基酸取代的胺基酸序列,和/或 (b) 輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 49的胺基酸序列或在SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 49的胺基酸序列中包含一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代的胺基酸序列。在另一個實施方式中,該等胺基酸取代係保守胺基酸取代。
在一個實施方式中,本揭露的抗體係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。在更特定的實施方式中,本揭露的抗體包含野生型人IgG1(也稱為人IgG1wt或huIgG1)或IgG2的Fc結構域。在另一個實施方式中,本揭露的抗體包含具有S228P和/或R409K取代(根據EU編號系統)的人IgG4的Fc結構域。
在一個實施方式中,本揭露的抗CEA抗體以1×10
-6M至1×10
-10M的結合親和力(K
D)結合CEA。在另一個實施方式中,本揭露的抗體以約1×10
-6M、約1×10
-7M、約1×10
-8M、約1×10
-9M或約1×10
-10M的結合親和力(K
D)結合CEA。
在另一個實施方式中,本揭露的抗人CEA抗體顯示對石蟹獼猴CEA的跨物種結合活性。
在一個實施方式中,本揭露的抗體具有強的Fc介導的效應子功能。抗體介導對表現CEA的靶細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
本揭露關於分離的核酸,該等分離的核酸包含編碼抗CEA抗體或抗原結合片段的胺基酸序列的核苷酸序列。在一個實施方式中,分離的核酸包含SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 50的VH核苷酸序列或與SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 50具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列,並且編碼本揭露的抗體或抗原結合片段的VH區。替代性地或另外地,分離的核酸包含SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 34、或SEQ ID NO: 51的VL核苷酸序列或與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 34、或SEQ ID NO: 51具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列,並且編碼本揭露的抗體或抗原結合片段的VL區。
在另一方面,本揭露關於包含抗CEA抗體或其抗原結合片段和視需要藥學上可接受的賦形劑的藥物組成物。
在又一方面,本揭露關於治療受試者的疾病之方法,該方法包括向有需要的受試者投與治療有效量的抗CEA抗體或其抗原結合片段或抗CEA抗體藥物組成物。在另一個實施方式中,待由該抗體或抗原結合片段治療的疾病係癌症。
本揭露關於抗CEA抗體或其抗原結合片段或抗CEA抗體藥物組成物用於治療疾病諸如癌症之用途。
定義
除非在本文件的其他地方具體定義,否則本文所用的所有其他技術和科學術語具有本領域的普通技術者通常理解的含義。
如本文所用,包括所附申請專利範圍,除非上下文另外明確說明,否則如「一個」、「一種」和「該」的單數形式包括它們相應的複數指代。
除非上下文另外明確說明,否則術語「或」意指術語「和/或」並且可與術語「和/或」互換使用。
如本文所用的術語「抗癌劑」係指可用於治療細胞增殖性障礙(如癌症)的任何藥劑,包括但不限於細胞毒性劑、化療劑、放射療法和放射治療劑、靶向性抗癌劑、和免疫治療劑。
術語「癌胚抗原」或「CEA」係指大約70-100 kDa的糖蛋白。CEA也稱為CEACAM5或CD66e。人CEA的胺基酸序列(SEQ ID NO: 52)也可在登錄號P06731或NM_004363.2中找到。
如本文所用的術語「投與(administration/administering)」和「治療(treating/treatment)」,當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時,意指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與該動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體接觸。細胞的處理涵蓋試劑與細胞的接觸以及試劑與流體的接觸,其中該流體與細胞接觸。術語「投與」和「治療」還意指藉由試劑、診斷劑、結合化合物或另一種細胞進行的例如細胞的體外和離體處理。本文中的術語「受試者」包括任何生物,較佳的是動物,更較佳的是哺乳動物(例如,大鼠、小鼠、狗、貓、兔),最較佳的是人。在一方面,治療任何疾病或障礙係指改善該疾病或障礙(即,減緩或阻止或減少疾病或其至少一種臨床症狀的發展)。在另一方面,「治療(treat/treating/treatment)」係指緩解或改善至少一個身體參數,包括患者可能無法辨別的那些。在又另一方面,「治療(treat/treating/treatment)」係指在身體上(例如,可辨別症狀的穩定化)、在生理上(例如,身體參數的穩定化)或兩者上調節疾病或障礙。在又另一方面,「治療(treat/treating/treatment)」係指預防或延遲疾病或障礙的發作或發展或進展。
在本揭露的上下文中,術語「受試者」係哺乳動物,例如,靈長類動物,較佳的是高等靈長類動物,例如人(例如,患有本文所述之障礙或處於患上本文所述之障礙的風險中的患者)。
如本文所用的術語「親和力」係指抗體與抗原之間相互作用的強度。在抗原內,抗體的可變區通過非共價力與抗原在許多位點相互作用。通常,相互作用越多,親和力越強。
如本文所用的術語「抗體」係指免疫球蛋白家族的多肽,其可以非共價地、可逆地和以特異性方式結合相應的抗原。例如,天然存在的IgG抗體係包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的四聚體。每條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH)和重鏈恒定區構成。重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2和CH3構成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL或Vκ)和輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區由一個結構域CL構成。VH和VL區可以進一步細分為高變區,稱為互補決定區(CDR),其間插有更保守的區域,稱為框架區(FR)。每個VH和VL由從胺基末端到羧基末端按以下順序排列的三個CDR和四個框架區(FR)構成:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(例如,效應細胞)以及經典補體系統的第一組分(Clq))的結合。
術語「抗體」包括但不限於單株抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體和抗獨特型(抗Id)抗體。抗體可為任何同種型/類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
在一些實施方式中,抗CEA抗體包含至少一個抗原結合位點,至少一個可變區。在一些實施方式中,抗CEA抗體包含來自本文所述CEA抗體的抗原結合片段。在一些實施方式中,抗CEA抗體係分離的或重組的。
本文中的術語「單株抗體」或「mAb」或「Mab」係指基本上同質的抗體的群體,即,除了可能少量存在的可能天然發生的突變外,該群體中包含的抗體分子在胺基酸序列上係相同的。相比之下,常規(多株)抗體製劑典型地包括在其可變結構域中具有不同胺基酸序列的多種不同抗體,特別地其互補決定區(CDR),它們通常對不同的表位具有特異性。修飾語「單株」指示獲得自基本上均質的抗體群體的抗體的特徵並且不應理解為要求藉由任何特定方法產生抗體。可以藉由熟悉該項技術者已知的方法獲得單株抗體(mAb)。參見,例如Kohler等人, Nature [自然] 1975 256:495-497;美國專利案號4,376,110;Ausubel等人
,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY [分子生物學現代方法] 1992
;Harlow等人, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL [抗體:實驗室手冊], Cold spring Harbor Laboratory [冷泉港實驗室] 1988;以及Colligan等人, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY [當代免疫學方案] 1993。本文揭露的抗體可為任何免疫球蛋白類別(包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA),及其任何亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。產生單株抗體的融合瘤可以在體外或在體內培養。高效價的單株抗體可以在體內產生中獲得,其中將來自單個融合瘤的細胞腹膜內注射到小鼠中,例如原始引發的Balb/c小鼠,以產生含有高濃度所需抗體的腹水。可以使用熟悉該項技術者熟知的柱層析方法從這樣的腹水,或從培養上清液中純化同種型IgM或IgG的單株抗體。
通常,基本抗體結構單元包含四聚體。每個四聚體包括兩對相同的多肽鏈,每對具有一條「輕鏈」(約25 kDa)和一條「重鏈」(約50-70 kDa)。每條鏈的胺基末端部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多個胺基酸的可變區。重鏈的羧基末端部分可以定義為主要負責效應子功能的恒定區。典型地,人輕鏈被分類為κ和λ輕鏈。此外,人重鏈典型地分類為α、δ、ε、γ或μ,並且分別將抗體的同種型定義為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在輕鏈和重鏈內,可變區和恒定區藉由約12個或更多個胺基酸的「J」區連接,重鏈還包括約10個以上胺基酸的「D」區。
每個輕鏈/重鏈(VL/VH)對的可變區形成抗體結合位點。因此,一般而言,完整抗體具有兩個結合位點。除了在雙功能或雙特異性抗體中,兩個結合位點通常在一級序列中係相同的。
典型地,重鏈和輕鏈的可變結構域包含三個高變區,也稱為「互補決定區(CDR)」,其位於相對保守的框架區(FR)之間。CDR通常由框架區對齊,使得能夠結合特異性表位。一般而言,從N-末端到C-末端,輕鏈和重鏈可變結構域兩者都包含FR-1(或FR1)、CDR-1(或CDR1)、FR-2(FR2)、CDR-2(CDR2)、FR-3(或FR3)、CDR-3(CDR3)和FR-4(或FR4)。CDR和框架區的位置可以使用本領域熟知的多種定義確定,例如Kabat、Chothia、AbM和IMGT(參見,例如Johnson等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 29:205-206 (2001);Chothia和Lesk, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 196:901-917 (1987);Chothia等人, Nature [自然], 342:877-883 (1989);Chothia等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 227:799-817 (1992);Al-Lazikani等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 273:927-748 (1997))、ImMunoGenTics(IMGT)編號(Lefranc, M.-P., The Immunologist [免疫學者], 7, 132-136 (1999);Lefranc, M.-P.等人, Dev. Comp.Immunol. [發育與比較免疫學], 27, 55-77 (2003)(「IMGT」編號方案))。抗原結合位點的定義還在以下文獻中描述:Ruiz等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 28:219-221 (2000);和Lefranc, M. P., Nucleic Acids Res. [核酸研究], 29:207-209 (2001);MacCallum等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 262:732-745 (1996);和Martin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 86:9268-9272 (1989);Martin等人, Methods Enzymol. [酶學方法], 203:121-153 (1991);和Rees等人, 在Sternberg M. J. E.(編), Protein Structure Prediction [蛋白質結構預測], Oxford University Press [牛津大學出版社], 牛津, 141-172 (1996)中。例如,根據Kabat,重鏈可變結構域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3);並且輕鏈可變結構域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根據Chothia,VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3);VL中的胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。藉由結合Kabat和Chothia的CDR定義,CDR由人VH中的胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及人VL中的胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)組成。根據IMGT,VH中的CDR胺基酸殘基編號為約26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3),VL中的CDR胺基酸殘基編號為約27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(編號根據Kabat)。根據IMGT,可以使用程式IMGT/DomainGap Align確定抗體的CDR區。
術語「高變區」係指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區包含來自「CDR」(例如輕鏈可變結構域中的LCDR1,LCDR2和LCDR3以及重鏈可變結構域中的HCDR1,HCDR2和HCDR3)的胺基酸殘基。參見Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學上感興趣的蛋白質序列], 第5版 Public Health Service [公共衛生署], National Institutes of Health [國立衛生研究院], 貝塞斯達, 馬里蘭州(藉由序列定義抗體的CDR區);還參見Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 196: 901-917(藉由結構定義抗體的CDR區)。術語「框架」或「FR」殘基意指除了本文定義為CDR殘基的高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。
除非另外說明,否則「抗原結合片段」係指抗體的抗原結合片段,即保留與全長抗體結合的抗原特異性結合的能力的抗體片段,例如保留一或多個CDR區的片段。抗原結合片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段;雙抗體;線性抗體;單鏈抗體分子(例如,單鏈Fv(ScFv));奈米抗體以及從抗體片段形成的抗體。
如本文所用,抗體「特異性結合」靶蛋白,係指與其他蛋白相比,抗體表現出優先結合靶蛋白,但這種特異性不需要絕對的結合特異性。在描述抗原(例如蛋白質)與抗體或抗原結合抗體片段之間的相互作用的上下文中使用的抗體「特異性結合」或「選擇性結合」係指決定抗原在蛋白質和其他生物製劑的異質群體中(例如在生物樣本、血液、血清、血漿或組織樣本中)的存在的結合反應。因此,在某些指定的免疫測定條件下,抗體或其抗原結合片段與特定抗原特異性結合係背景水平的至少兩倍,並且不以顯著量與樣本中存在的其他抗原特異性結合。在一方面,在指定的免疫測定條件下,抗體或其抗原結合片段與特定抗原的特異性結合係背景結合水平的至少十(10)倍,並且不以顯著量與樣本中存在的其他抗原特異性結合。
本文中的術語「人抗體」意指僅包含人免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。如果在小鼠、小鼠細胞或源自小鼠細胞的融合瘤中產生,人抗體可以含有鼠碳水化合物鏈。類似地,「小鼠抗體」或「大鼠抗體」意指分別僅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。
術語「人源化」或「人源化抗體」意指含有來自非人(例如鼠)抗體以及人抗體的序列的抗體形式。此類抗體含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常,人源化抗體將包含基本上至少一個、並且典型地兩個可變結構域的全部,其高變環的全部或基本上全部對應於非人免疫球蛋白的那些,並且FR的全部或基本上全部係人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體還將視需要包含免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少一部分,典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。當有必要區分人源化抗體與親本齧齒動物抗體時,將前綴「hum」、「hu」、「Hu」或「h」添加到抗體殖株名稱中。人源化形式的齧齒動物抗體會通常包含親本齧齒動物抗體的相同CDR序列,但是可包括某些胺基酸取代以增加親和力,增加人源化抗體的穩定性,除去翻譯後修飾或出於其他原因。
術語「相應的人種系序列」係指編碼人可變區胺基酸序列或亞序列的核酸序列,與由人種系免疫球蛋白可變區序列編碼的所有其他已知可變區胺基酸序列相比,其與參考可變區胺基酸序列或亞序列具有最高確定的胺基酸序列同一性。相應的人種系序列也可以指與所有其他評估的可變區胺基酸序列相比,與參考可變區胺基酸序列或亞序列具有最高胺基酸序列同一性的人可變區胺基酸序列或亞序列。相應的人種系序列可以僅是框架區,僅互補決定區,框架和互補決定區,可變區段(如上定義),或包含可變區的序列或亞序列的其他組合。可以使用本文所述之方法確定序列同一性,例如使用BLAST、ALIGN或本領域已知的另一種比對演算法比對兩個序列。相應的人種系核酸或胺基酸序列可以與參考可變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、91、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。此外,如果抗體含有恒定區,則恒定區也衍生自此類人序列,例如人種系序列,或突變形式的人種系序列或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗體,例如Knappik等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 296:57-86, 2000中所述。
術語「平衡解離常數(K
D,M)」係指解離速率常數(kd,時間
-1)除以締合速率常數(ka,時間
-1,M
-l)。平衡解離常數可以使用本領域任何已知的方法測量。本揭露的抗體通常將具有小於約10
-7或10
-8M,例如小於約10
-9M或10
-10M,在一些方面,小於約10
-11M、10
-12M或10
-13M的平衡解離常數。
本文中的術語「癌症」或「腫瘤」具有如本領域理解的最廣泛的含義,並且係指哺乳動物中典型地以不受調控的細胞生長為特徵的生理病症。在本揭露的上下文中,癌症不限於某個類型或位置。
在本揭露的上下文中,當提及胺基酸序列時,術語「保守取代」意指用新胺基酸取代原始胺基酸,該新胺基酸基本上不改變抗體或片段的化學、物理和/或功能性質,例如其與CEA的結合親和力。具體地,胺基酸的常見保守取代係本領域熟知的。
如本文所用的術語「杵臼(knob-into-hole)」技術係指胺基酸在體外或體內藉由在它們相互作用的介面上將空間突起(杵)引入一個多肽並將穴袋或空腔(臼)引入另一個多肽從而引導將兩條多肽配對在一起。例如,杵臼已經被引入了抗體的Fc: Fc結合介面、C
L: C
HI介面、或V
H/V
L介面(參見例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人, 1997, Protein Science [蛋白質科學] 6:781-788)。在一些實施方式中,杵臼確保了抗體製備期間兩個不同重鏈正確配對在一起。例如,在其Fc區中具有杵臼胺基酸的抗體還可包含與每個Fc區連接的單個可變結構域,或者進一步包含與相似或不同輕鏈可變結構域配對的不同重鏈可變結構域。杵臼技術還可在VH或VL區中使用,以確保正確配對。
如本文在「杵臼」技術的上下文中所用的術語「杵」係指向多肽在該多肽與另一多肽相互作用的介面處引入突起(杵)的胺基酸改變。在一些實施方式中,另一多肽具有臼突變。
如本文在「杵臼」的上下文中所用的術語「臼」係指向多肽在該多肽與另一多肽相互作用的介面處引入穴袋或空腔(臼)的胺基酸改變。在一些實施方式中,另一多肽具有杵突變。
適用於確定百分比序列同一性和序列相似性的演算法之實例係BLAST演算法,其分別描述於Altschul等人, Nuc.Acids Res. [核酸研究] 25:3389-3402, 1977和Altschul等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 215:403-410, 1990中。用於進行BLAST分析的軟體可通過國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)揭露獲得。此演算法包括首先藉由鑒定查詢序列中短字長W鑒定高得分序列對(HSP),當與數據庫序列中相同字長比對時,其匹配或滿足一些正值閾值得分T。T被稱為鄰域字得分閾值。該等初始鄰域字命中作為開始搜索以找到包含它們的較長HSP的值。字命中沿著每個序列在兩個方向上延伸,直到累積比對得分可以增加為止。對於核苷酸序列,使用參數M(一對匹配殘基的獎勵得分;始終 > 0)和N(錯配殘基的罰分;始終 < 0)來計算累積得分。對於胺基酸序列,使用得分矩陣來計算累積得分。在以下情況下,將停止字命中在每個方向上的延伸:累積比對得分從其最大實現值下降了數量X;由於一或多個負得分殘基比對的累積,累積得分趨於零或更低;或者到達任一序列的末端。BLAST演算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)默認使用字長(W)11,期望值(E)10,M = 5,N = -4並比較兩條股。對於胺基酸序列,BLAST程式預設使用字長3,期望值(E)10和BLOSUM62得分矩陣(參見Henikoff和Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 89: 10915)比對(B)50,期望值(E)10,M = 5,N = -4並比較兩條股。
BLAST演算法還對兩個序列之間的相似性進行統計分析(參見例如Karlin和Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 90:5873-5787, 1993)。BLAST演算法提供的一種相似性度量係最小總和概率(P(N)),其提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如,如果測試核酸與參考核酸的比較中最小總和概率小於約0.2,更較佳的是小於約0.01,最較佳的是小於約0.001,則認為該核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列之間的同一性百分比還可使用以下的演算法來確定:E. Meyers和W. Miller, Comput. Appl. Biosci. [生物科學中的電腦應用] 4: 11-17, (1988),其已併入ALIGN程式(2.0版本),使用PAM120權重殘基表,空位長度罰分為12,空位罰分為4。此外,可以使用以下確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分比:Needleman和Wunsch, J.Mol.Biol. [分子生物學雜誌] 48:444-453 (1970) 的演算法,其已併入GCG套裝軟體中的GAP程式中,使用BLOSUM62矩陣或PAM250矩陣,空位權重為16、14、12、10、8、6或4,並且長度權重為1、2、3、4、5或6。
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用,並且係指單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知的核苷酸類似物或經修飾的主鏈殘基或連接的核酸,它們係合成的,天然存在的和非天然存在的,具有與參考核酸相似的結合特性,並且以與參考核苷酸相似的方式代謝。此類類似物之實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
在核酸的上下文中,術語「可操作地連接」係指兩個或更多個多核苷酸(例如DNA)區段之間的功能關係。典型地,它係指轉錄調節序列與轉錄序列的功能關係。例如,啟動子或強化子序列如果在合適的宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列的轉錄,則可操作地連接至編碼序列。通常,可操作地連接至轉錄序列的啟動子轉錄調節序列與轉錄序列在物理上鄰接,即它們係順式作用的。然而,一些轉錄調節序列(如強化子)不需要在物理上鄰接或緊鄰它們增強其轉錄的編碼序列。
在一些方面,本揭露提供了組成物,例如藥學上可接受的組成物,其包含與至少一種藥學上可接受的賦形劑一起配製的如本文所述之抗CEA抗體。如本文所用,術語「藥學上可接受的賦形劑」包括生理學上相容的任何和所有溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。賦形劑可適於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、直腸、脊柱或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。
本文揭露的組成物可為多種形式。該等包括例如液體、半固體和固體劑型,如液體溶液(例如可注射和輸注溶液)、分散液或懸浮液、脂質體和栓劑。合適的形式取決於預期的投與方式和治療應用。典型的合適組成物係可注射或輸注溶液的形式。一種合適的投與方式係腸胃外(例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌內)。在一些實施方式中,該抗體藉由靜脈內輸注或注射來投與。在某些實施方式中,該抗體藉由肌內或皮下注射來投與。
如本文所用的術語「治療有效量」係指當投與於受試者以治療疾病、或疾病或障礙的至少一種臨床症狀時,足以影響該疾病、障礙或症狀的治療的抗體之量。「治療有效量」可以隨抗體,疾病,障礙,和/或疾病或障礙的症狀,疾病、障礙、和/或疾病或障礙的症狀的嚴重程度,待治療的受試者的年齡,和/或待治療的受試者的體重而變化。在任何給定情況下的合適量對於熟悉該項技術者而言係顯而易見的,或者可以藉由常規實驗確定。在組合療法的情況下,「治療有效量」係指用於有效治療疾病、障礙或病症的組成對象的總量。
術語「組合療法」係指投與兩種或更多種治療劑以治療本揭露中所述之治療病症或障礙。這種投與涵蓋以基本上同時的方式共同投與該等治療劑。這種投與也涵蓋在多個容器中或在每種活性成分的獨立容器(例如,膠囊、粉末和液體)中共同投與。可以將粉末和/或液體在投與之前重構或稀釋到所需劑量。此外,這種投與也涵蓋在大致相同的時間或在不同的時間以順序方式使用每種類型的治療劑。在任何一種情況下,治療方案將在治療本文所述之病症或障礙方面提供藥物組合的有益作用。
如本文所用,短語「與…組合」意指將抗CEA抗體在投與另外的治療劑的同時、就在該投與前或就在該投與後投與於受試者。在某些實施方式中,將抗CEA抗體作為與另外的治療劑的共同配製物來投與。
術語「毒素」或「有效負荷」或「細胞毒性劑」在本文中用作抑制或減少細胞中的分子表現、細胞功能、誘導細胞凋亡和/或引起細胞破壞的分子。該術語包括放射性同位素、化療劑和毒素諸如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素,包括其片段和/或變體。細胞毒性劑之實例包括但不限於奧瑞他汀類(auristatins)(例如,奧瑞他汀E、奧瑞他汀F、MMAE和MMAF)、金黴素類(auromycins)、美登素類(maytansinoids)、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、蓖麻毒素、蓖麻毒素A鏈、康普瑞汀(combrestatin)、倍癌黴素類(duocarmycins)、朵拉司他汀類(dolastatins)、阿黴素、道諾黴素、紫杉醇、順鉑、絲裂黴素、依託泊苷、替諾泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、二羥基蒽二酮、放線菌素、白喉毒素、假單胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-八疊球菌素(alpha-sarcin)、白樹毒素(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)、局限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)、麻瘋樹逆境蛋白(curicin)、巴豆毒素(crotin)、卡利奇黴素(calicheamicin)以及放射性同位素諸如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32和Lu177。
本揭露提供了抗CEA抗體及其抗原結合片段。此外,本揭露提供了具有所需的藥物動力學特徵和其他期望的屬性的抗體,並且因此可用於降低癌症的可能性或治療癌症。本揭露進一步提供了包含抗體的藥物組成物以及製備和使用此類藥物組成物用於預防和治療癌症和相關障礙之方法。
抗 CEA 抗體
本揭露提供了特異性結合CEA的抗體或其抗原結合片段。本揭露的抗體或抗原結合片段包括但不限於如下所述產生的抗體或其抗原結合片段。
本揭露提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段,其中所述抗體或抗體片段(例如,抗原結合片段)包含具有SEQ ID NO: 14、31或48的胺基酸序列(表1)的VH結構域。本揭露還提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段,其中所述抗體或抗原結合片段包含具有表1中列出的HCDR中的任一個的胺基酸序列的HCDR。在一方面,本揭露提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段,其中所述抗體包含(或替代性地,由其組成)具有表1中列出的HCDR中的任一個的胺基酸序列的一個、兩個、三個或更多個HCDR。
本揭露提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段,其中所述抗體或抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 15、32或49的胺基酸序列(表1)的VL結構域。本揭露還提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段,其中所述抗體或抗原結合片段包含具有表1中列出的LCDR中的任一個的胺基酸序列的LCDR。具體地,本揭露提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段,所述抗體或抗原結合片段包含(或替代性地,由其組成)具有表1中列出的LCDR中的任一個的胺基酸序列的一個、兩個、三個或更多個LCDR。
本揭露的其他抗體或其抗原結合片段包括已被改變,但在CDR區中與表1中揭露的CDR區具有至少60%、70%、80%、90%、95%或99%百分比同一性的胺基酸。在一些方面,其包括胺基酸改變,其中當與表1中描述的序列中描繪的CDR區相比時,在CDR區中改變不超過1、2、3、4或5個胺基酸。
本揭露的其他抗體包括其中胺基酸或編碼胺基酸的核酸已被改變,但與表1中描述的序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%或99%百分比同一性的那些。在一些方面,其包括胺基酸序列的改變,其中當與表1中描述的序列中描繪的可變區相比時,在可變區中改變不超過1、2、3、4或5個胺基酸,同時保持基本上相同的治療活性。
本揭露還提供了編碼特異性結合CEA的抗體的VH、VL、全長重鏈和全長輕鏈的核酸序列。可以優化此類核酸序列以在哺乳動物細胞中表現。
[ 表 1].
抗體 | SEQ ID NO | 序列 | |
BGA113K (IMGT) | SEQ ID NO: 1 | HCDR1 (IMGT) | GYIFTSYY |
SEQ ID NO: 2 | HCDR2 (IMGT) | INPQTGKT | |
SEQ ID NO: 3 | HCDR3 (IMGT) | AREYGNYNYPLDY | |
SEQ ID NO: 4 | LCDR1 (IMGT) | ENQYGY | |
SEQ ID NO: 5 | LCDR2 (IMGT) | NY | |
SEQ ID NO: 6 | LCDR3 (IMGT) | QHHLGTPYT | |
BGA113K (Kabat) | SEQ ID NO: 7 | HCDR1 (Kabat) | SYYLH |
SEQ ID NO: 8 | HCDR2 (Kabat) | YINPQTGKTSYAQKFQG | |
SEQ ID NO: 9 | HCDR3 (Kabat) | EYGNYNYPLDY | |
SEQ ID NO: 10 | LCDR1 (Kabat) | RASENQYGYLA | |
SEQ ID NO: 11 | LCDR2 (Kabat) | NYKNLVE | |
SEQ ID NO: 6 | LCDR3 (Kabat) | QHHLGTPYT | |
BGA113K (Chothia) | SEQ ID NO: 12 | HCDR1 (Chothia) | GYIFTSY |
SEQ ID NO: 13 | HCDR2 (Chothia) | NPQTGK | |
SEQ ID NO: 9 | HCDR3 (Chothia) | EYGNYNYPLDY | |
SEQ ID NO: 10 | LCDR1 (Chothia) | RASENQYGYLA | |
SEQ ID NO: 11 | LCDR2 (Chothia) | NYKNLVE | |
SEQ ID NO: 6 | LCDR3 (Chothia) | QHHLGTPYT | |
BGA113K | SEQ ID NO: 14 | VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSY YLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQK FQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYY CAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSS |
SEQ ID NO: 15 | VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYL AWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTF GQGTKVEIK | |
SEQ ID NO: 16 | VH DNA | CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAA GTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTG AGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCA GCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCC GGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGC GATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAAC TGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCAC CCTGGTGACCGTGAGCAGC | |
SEQ ID NO: 17 | VL DNA | GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCC TGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCAT TACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGC TATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCA AAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTA GCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCT GACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTG GCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCAC CCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTG GAAATTAAA | |
BGA190 (IMGT) | SEQ ID NO: 18 | HCDR1 (IMGT) | GFTFSSFG |
SEQ ID NO: 19 | HCDR2 (IMGT) | ISIGSDII | |
SEQ ID NO: 20 | HCDR3 (IMGT) | TRRSYRSYWYFDV | |
SEQ ID NO: 21 | LCDR1 (IMGT) | ENIYSY | |
SEQ ID NO: 22 | LCDR2 (IMGT) | NA | |
SEQ ID NO: 23 | LCDR3 (IMGT) | QHHFLSPWM | |
BGA190 (Kabat) | SEQ ID NO: 24 | HCDR1 (Kabat) | SFGMH |
SEQ ID NO: 25 | HCDR2 (Kabat) | YISIGSDIIYYADTVKG | |
SEQ ID NO: 26 | HCDR3 (Kabat) | RSYRSYWYFDV | |
SEQ ID NO: 27 | LCDR1 (Kabat) | RTSENIYSYLA | |
SEQ ID NO: 28 | LCDR2 (Kabat) | NAKTLAE | |
SEQ ID NO: 23 | LCDR3 (Kabat) | QHHFLSPWM | |
BGA190 (Chothia) | SEQ ID NO: 29 | HCDR1 (Chothia) | GFTFSSF |
SEQ ID NO: 30 | HCDR2 (Chothia) | SIGSDI | |
SEQ ID NO: 26 | HCDR3 (Chothia) | RSYRSYWYFDV | |
SEQ ID NO: 27 | LCDR1 (Chothia) | RTSENIYSYLA | |
SEQ ID NO: 28 | LCDR2 (Chothia) | NAKTLAE | |
SEQ ID NO: 23 | LCDR3 (Chothia) | QHHFLSPWM | |
BGA190 | SEQ ID NO: 31 | VH | DVQLVESGGGLVQPGGSRELSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPERGLEWVAYISIGSDIIYYADTVK GRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAVYYCTRRSYRSYWYFDVWGAGTTVTVSS |
SEQ ID NO: 32 | VL | DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYSYLAWYQQKQGKSPHLLVYNAKTLAEGVPSRFSGS GSGTQFSLKIISLQPEDFGTYYCQHHFLSPWMF GGGTKLEIK | |
SEQ ID NO: 33 | VH DNA | GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGGAACTCTC CTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGA GAGGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTATTGGCAGTGATATCATCTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGA CCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTA TTACTGTACAAGAAGGTCTTATAGGTCCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA | |
[0001] | SEQ ID NO: 34 | VL DNA | GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCC TATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAACAAGTGAGAATATTTACAGTT ATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCATCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAGGGTGTGCCATCAAGGTTCAG TGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTG AAGATCATCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTG GGACTTATTACTGTCAGCATCATTTTCTTAGT CCGTGGATGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA |
BGA288 (IMGT) | SEQ ID NO: 35 | HCDR1 (IMGT) | GYTFTDYN |
SEQ ID NO: 36 | HCDR2 (IMGT) | IGPNYGGT | |
SEQ ID NO: 37 | HCDR3 (IMGT) | ARRGSIPRAVDY | |
SEQ ID NO: 38 | LCDR1 (IMGT) | QDIHNY | |
SEQ ID NO: 39 | LCDR2 (IMGT) | RA | |
SEQ ID NO: 40 | LCDR3 (IMGT) | LQYDEFPYT | |
BGA288 (Kabat) | SEQ ID NO: 41 | HCDR1 (Kabat) | DYNID |
SEQ ID NO: 42 | HCDR2 (Kabat) | DIGPNYGGTIYNQKFKG | |
SEQ ID NO: 43 | HCDR3 (Kabat) | RGSIPRAVDY | |
[0001] | SEQ ID NO: 44 | LCDR1 (Kabat) | KASQDIHNYLS |
[0001] | SEQ ID NO: 45 | LCDR2 (Kabat) | RANRLVD |
[0001] | SEQ ID NO: 40 | LCDR3 (Kabat) | LQYDEFPYT |
BGA288 (Chothia) | SEQ ID NO: 46 | HCDR1 (Chothia) | GYTFTDY |
[0001] | SEQ ID NO: 47 | HCDR2 (Chothia) | GPNYGG |
[0001] | SEQ ID NO: 43 | HCDR3 (Chothia) | RGSIPRAVDY |
[0001] | SEQ ID NO: 44 | LCDR1 (Chothia) | KASQDIHNYLS |
[0001] | SEQ ID NO: 45 | LCDR2 (Chothia) | RANRLVD |
[0001] | SEQ ID NO: 40 | LCDR3 (Chothia) | LQYDEFPYT |
BGA288 | SEQ ID NO: 48 | VH | EVLLQQSGPELVKPGASVKIFCKASGYTFTDY NIDWVQQSHGKSLEWIGDIGPNYGGTIYNQKF KGKATLTVAKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARRGSIPRAVDYWGQGTSVTVSS |
[0001] | SEQ ID NO: 49 | VL | DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIHNYL SWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGS GSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK |
[0001] | SEQ ID NO: 50 | VH DNA | GAGGTCCTGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGC TGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATTTT CTGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATAGACTGGGTGCAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTGGTCCTAATTATGGTGGTACTATCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGCCAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCC GCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTA TTACTGTGCAAGACGCGGTAGCATCCCGAGGGCTGTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA |
[0001] | SEQ ID NO: 51 | VL DNA | GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATC ACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTCATAACTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAG TGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGA AATAAAA |
本揭露提供了結合人CEA的表位的抗體及其抗原結合片段。在某些方面,抗體和抗原結合片段可以結合CEA的相同表位。
本揭露還提供了結合與表1中描述的抗CEA抗體相同的表位的抗體及其抗原結合片段。因此,其他抗體及其抗原結合片段可以基於它們在結合測定中與其他抗體交叉競爭(例如,以統計學顯著的方式競爭性抑制其結合)的能力來鑒定。測試抗體抑制本揭露的抗體及其抗原結合片段結合CEA的能力證明測試抗體可與該抗體或其抗原結合片段競爭結合CEA。不受任何一種理論的束縛,這種抗體可以結合CEA上的與其競爭的抗體或其抗原結合片段相同或相關(例如,在結構上相似或在空間上鄰近)的表位。在某些方面,結合CEA上的與本揭露的抗體或其抗原結合片段相同的表位的抗體係人或人源化單株抗體。這種人或人源化單株抗體可以如本文所述製備和分離。
連接子
還應理解,抗體的多肽鏈的結構域和/或區可被各種長度的連接子區分開。在一些實施方式中,抗原結合結構域藉由連接子區與彼此CL、CH1、鉸鏈、CH2、CH3或整個Fc區分開。例如,VL1-CL-(連接子)VH2-CH1這種連接子區可以包含隨機分類的胺基酸,或一組受限的胺基酸。此類連接子區可為柔性的或剛性的(參見US2009/0155275)。
在不同的實施方式中,連接子可用於將化合物軛合在毒素與抗體之間,在一些實施方式中,連接子在細胞內條件下可裂解,使得連接子的裂解在細胞內環境中從抗體釋放毒素。在其他實施方式中,連接子單元係不可裂解的,毒素例如藉由抗體降解而釋放。連接子可為但不限於可裂解的連接子、不可裂解的連接子、親水性連接子、預先帶電荷的連接子和基於二羧酸的連接子。
二聚化特異性胺基酸
在一個實施方式中,抗體包含至少一個二聚化特異性胺基酸改變。二聚化特異性胺基酸改變導致「突起到孔中」相互作用,並增加正確抗體的組裝。二聚化特異性胺基酸可以在CH1結構域或CL結構域或其組合內。用於將CH1結構域與其他CH1結構域(CH1-CH1)和CL結構域與其他CL結構域(CL-CL)配對的二聚化特異性胺基酸至少可以在WO 2014082179、WO 2015181805家族和WO 2017059551的揭露內容中找到。二聚化特異性胺基酸也可以在Fc結構域內,並且可以與CH1或CL結構域內的二聚化特異性胺基酸組合。在一個實施方式中,本揭露提供了包含至少一個二聚化特異性胺基酸對的抗體。
對 Fc 區框架的進一步改變
在其他方面,藉由用不同的胺基酸殘基替代至少一個胺基酸殘基來改變Fc區,以改變抗體的效應子功能。例如,可以用不同的胺基酸殘基替代一或多個胺基酸,使得抗體對效應配體具有改變的親和力,但保留親本抗體的抗原結合能力。親和力改變的效應子配體可為例如Fc受體或補體的C1組分。此方法描述於例如Winter等人的美國專利案號5,624,821和5,648,260中。
在另一方面,可以用一或多個不同的胺基酸殘基替代一或多個胺基酸殘基,使得抗體具有改變的C1q結合和/或降低的或消除的補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法描述於例如Idusogie等人的美國專利案號6,194,551中。
另一方面,改變一或多個胺基酸殘基從而改變抗體固定補體的能力。此方法描述於例如Bodmer等人的公開WO 94/29351中。在特定的方面,本揭露的抗體或其抗原結合片段的一或多個胺基酸被IgG1亞類和κ同種型的一或多個同種異型胺基酸殘基替代。同種異型胺基酸殘基還包括但不限於IgG1、IgG2和IgG3亞類的重鏈恒定區以及κ同種型的輕鏈恒定區,如Jefferis等人, MAbs. [單株抗體] 1:332-338 (2009)所述。
在另一方面,藉由修飾一或多個胺基酸來修飾Fc區以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗體對Fcγ受體的親和力。此方法描述於例如Presta的公開WO 00/42072中。此外,已經繪製了在人IgG1上與FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結合位點,並且已經描述了具有改善的結合的變體(參見Shields等人, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 276:6591-6604, 2001)。
在另一方面,抗體的糖基化被修飾。例如,可以製備無糖基化抗體(即,抗體缺乏或具有降低的糖基化)。例如,可以改變糖基化以增加抗體對「抗原」的親和力。這種碳水化合物修飾可以藉由例如改變抗體序列內的一或多個糖基化位點來實現。例如,可以進行一或多個胺基酸取代,其導致消除一或多個可變區框架糖基化位點,從而消除該位點的糖基化。這種無糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。此方法描述於例如Co等人的美國專利案號5,714,350和6,350,861中。
另外地或替代性地,可以製備具有改變的糖基化類型的抗體,如具有減少量的岩藻糖基殘基的低岩藻糖基化抗體或具有增加的二等分GlcNac結構的抗體。已經證明此類改變的糖基化模式增加抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可藉由例如在具有改變的糖基化途徑的宿主細胞中表現抗體來實現。具有改變的糖基化途徑的細胞已經在本領域中描述並且可以用作宿主細胞,在其中表現重組抗體從而產生具有改變的糖基化的抗體。例如,Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能性破壞的FUT8基因的細胞系,其編碼岩藻糖基轉移酶,使得在這種細胞系中表現的抗體表現出低岩藻糖基化。Presta的公開WO 03/035835描述了變體CHO細胞系Lecl3細胞,其具有降低的將岩藻糖連接至Asn(297)-連接的碳水化合物的能力,也導致在該宿主細胞中表現的抗體的低岩藻糖基化(也參見Shields等人, (2002) J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 277:26733-26740)。Umana等人的WO 99/54342描述了被工程化以表現糖蛋白修飾的糖基轉移酶(例如,β(1,4)-N乙醯胺基葡萄糖轉移酶III(GnTIII))的細胞系,使得在工程化的細胞系中表現的抗體表現出增加的二等分GlcNac結構,這導致抗體的ADCC活性增加(還參見Umana等人, Nat. Biotech. [自然生物技術] 17:176-180, 1999)。
在另一方面,如果所需的ADCC降低,許多先前的報導顯示人抗體亞類IgG4僅具有適度的ADCC並且幾乎沒有CDC效應子功能(Moore G L等人, 2010 MAbs [單株抗體], 2:181-189)。然而,發現天然IgG4在應激條件下(如在酸性緩衝劑中或在升高的溫度下)較不穩定(Angal, S. 1993 Mol Immunol [分子免疫學], 30:105-108;Dall'Acqua, W.等人, 1998 Biochemistry [生物化學], 37:9266-9273;Aalberse等人, 2002 Immunol [免疫學], 105:9-19)。降低的ADCC可以藉由將抗體可操作地連接至用降低FcγR結合或C1q結合活性的改變的組合工程化的IgG4 Fc,從而降低或消除ADCC和CDC效應子功能來實現。考慮到抗體作為生物藥物的物理化學性質,IgG4的較不期望的固有特性之一係其兩條重鏈在溶液中動態分離以形成半抗體,這導致通過稱為「Fab臂交換」的過程在體內產生雙特異性抗體(Van der Neut Kolfschoten M等人, 2007 Science [科學], 317:1554-157)。228位(EU編號系統)絲胺酸突變為脯胺酸表現出對IgG4重鏈分離的抑制作用(Angal, S. 1993 Mol Immunol [分子免疫學], 30:105-108;Aalberse等人, 2002 Immunol [免疫學], 105:9-19)。據報導,鉸鏈區和γFc區中的一些胺基酸殘基對抗體與Fcγ受體的相互作用具有影響(Chappel S M等人, 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院學報], 88:9036-9040;Mukherjee, J.等人, 1995 FASEB J [美國實驗生物學學會聯合會雜誌], 9:115-119;Armour, K. L.等人, 1999 Eur J Immunol [歐洲免疫學雜誌], 29:2613-2624;Clynes, R. A.等人, 2000 Nature Medicine [自然醫學], 6:443-446;Arnold J. N., 2007 Annu Rev immunol [免疫學年鑒], 25:21-50)。此外,在人群中一些罕見的IgG4同種型也可引起不同的物理化學特性(Brusco, A.等人, 1998 Eur J Immunogenet [歐洲免疫遺傳學雜誌], 25:349-55;Aalberse等人, 2002 Immunol [免疫學], 105:9-19)。為了產生具有低ADCC和CDC但具有良好穩定性的抗體,可以修飾人IgG4的鉸鏈區和Fc區並引入許多改變。該等經修飾的IgG4 Fc分子可在SEQ ID NO: 83-88,Li等人的美國專利案號8,735,553中找到。
抗體產生
抗體及其抗原結合片段可藉由本領域已知的任何方法產生,包括但不限於抗體四聚體的重組表現、化學合成和酶消化,而全長單株抗體可藉由例如融合瘤或重組產生獲得。重組表現可以來自本領域已知的任何合適的宿主細胞,例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。
本揭露還提供了編碼本文所述抗體的多核苷酸,例如編碼包含本文所述之互補決定區的重鏈或輕鏈可變區或區段的多核苷酸。在一些方面,編碼重鏈可變區的多核苷酸與選自由SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 50組成之群組的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。在一些方面,編碼輕鏈可變區的多核苷酸與選自由SEQ ID NO: 17、34或51組成之群組的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。
本揭露的多核苷酸可以編碼抗CEA抗體的可變區序列。它們還可以編碼抗體的可變區和恒定區。一些多核苷酸序列編碼包含示例性抗CEA抗體的重鏈和輕鏈的可變區的多肽。
本揭露還提供了用於產生抗CEA抗體的表現載體和宿主細胞。表現載體的選擇取決於表現載體的預期宿主細胞。通常,表現載體含有可操作地連接至編碼抗CEA抗體鏈或抗原結合片段的多核苷酸的啟動子和其他調節序列(例如,強化子)。在一些方面,除了在誘導條件的控制下,使用誘導型啟動子來防止插入序列的表現。誘導型啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱激啟動子。可以在非誘導條件下、而不在偏向宿主細胞更好耐受其表現產物的編碼序列的群體的情況下擴大經轉化的生物體的培養。除啟動子外,其他調節元件也可為有效表現抗CEA抗體或抗原結合片段所需要或期望的。該等元件典型地包括ATG起始密碼子和相鄰的核糖體結合位點或其他序列。此外,藉由包含適合於使用中的細胞系統的強化子,可以提高表現效率(參見,例如,Scharf等人, Results Probl. Cell Differ. [細胞分化中的結果和問題] 20:125, 1994;以及Bittner等人, Meth. Enzymol. [酶學方法], 153:516, 1987)。例如,SV40強化子或CMV強化子可以用來增加哺乳動物宿主細胞中的表現。
用於攜帶並表現抗CEA抗體鏈的宿主細胞可為原核或真核的。大腸桿菌係一種可用於選殖和表現本揭露多核苷酸的原核宿主。其他適用的微生物宿主包括桿菌,如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae),如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在該等原核宿主中,還可以製備表現載體,其典型地含有與宿主細胞相容的表現控制序列(例如複製起點)。此外,將存在任何數量的多種熟知的啟動子,如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子典型地視需要用操縱子序列控制表現,並具有核糖體結合位點序列等,用於啟動和完成轉錄和翻譯。其他微生物如酵母也可用於表現抗CEA抗體。也可以使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體的組合。
在其他方面,哺乳動物宿主細胞用於表現和產生本揭露的抗CEA抗體。例如,它們可為表現內源性免疫球蛋白基因的融合瘤細胞系或攜帶外源性表現載體的哺乳動物細胞系。該等包括任何正常死亡或正常或異常永生化動物或人細胞。例如,已經開發了幾種能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞系,包括CHO細胞系、各種COS細胞系、HEK 293細胞、骨髓瘤細胞系、轉化的B細胞和融合瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物來表現多肽一般在例如Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, N.Y. [從基因到殖株,紐約VCH出版社,紐約市], 1987中討論。用於哺乳動物宿主細胞的表現載體可以包括表現控制序列,如複製起點、啟動子和強化子(參見例如Queen等人, Immunol. Rev. [免疫學綜述] 89:49-68, 1986)和必要的加工資訊位點,如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉錄終止子序列。該等表現載體通常含有衍生自哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子。合適的啟動子可為組成型的、細胞類型特異性的、階段特異性的、和/或可調控的或可調節的。有用的啟動子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導型MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素誘導型CMV啟動子(如人立即早期CMV啟動子)、組成型CMV啟動子和本領域已知的啟動子-強化子組合。
檢測和診斷方法
本揭露的抗體或抗原結合片段可用於多種應用,包括但不限於檢測CEA之方法。在一方面,抗體或抗原結合片段可用於檢測生物樣本中CEA的存在。如本文所用的術語「檢測」包括定量或定性檢測。在某些方面,生物樣本包括細胞或組織。在其他方面,此類組織包括相對於其他組織以更高水平表現CEA的正常和/或癌性組織。
在一方面,本揭露提供了檢測生物樣本中CEA的存在之方法。在某些方面,該方法包括在允許抗體與抗原結合的條件下,將生物樣本與抗CEA抗體接觸,並檢測抗體與抗原之間是否形成複合物。生物樣本可以包括但不限於尿液、組織、痰或血液樣本。
還包括診斷與CEA表現相關的障礙之方法。在某些方面,該方法包括使測試細胞與抗CEA抗體接觸;藉由檢測抗CEA抗體與CEA多肽的結合來測定測試細胞表現的CEA的表現水平(定量或定性);以及將測試細胞的表現水平與對照細胞(例如,與測試細胞相同組織來源的正常細胞或非CEA表現細胞)中的CEA表現水平進行比較,其中與對照細胞相比,測試細胞中較高水平的CEA表現表明存在與CEA表現相關的障礙。
治療方法
本揭露的抗體或抗原結合片段可用於多種應用,包括但不限於治療CEA相關障礙或疾病之方法。在一方面,CEA相關障礙或疾病係癌症。
在一方面,本揭露提供了治療癌症之方法。在某些方面,該方法包括向有需要的患者投與有效量的抗CEA抗體或抗原結合片段。癌症可包括但不限於胃癌、結腸癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、間皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
本文揭露的抗體或抗原結合片段可以藉由任何合適的方式投與,包括腸胃外、肺內和鼻內,並且如果需要用於局部治療、病灶內投與。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。給藥可以藉由任何合適的途徑,例如藉由注射,如靜脈內或皮下注射,這部分取決於投與是短暫的還是長期的。本文考慮了多種給藥方案,包括但不限於單次投與或在不同時間點的多次投與、推注投與、和脈衝輸注。
本揭露的抗體或抗原結合片段可以以符合良好醫學實踐的方式配製、給藥和投與。關於這點要考慮的因素包括治療的特定障礙、治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的起因、藥劑的遞送位點、投與方法、投與方案、和醫療從業者已知的其他因素。抗體不需要但視需要與目前用於預防或治療所研究的障礙的一或多種藥劑一起配製。此類其他藥劑的有效量取決於配製物中存在的抗體的量、障礙或治療的類型、以及上文討論的其他因素。該等通常以與如本文所述相同的劑量和投與途徑使用,或以本文所述劑量的約1%-99%使用,或以經驗/臨床確定為合適的任何劑量和任何途徑使用。
為預防或治療疾病,本揭露的抗體或抗原結合片段的合適的劑量將取決於待治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重程度和病程、投與抗體是用於預防還是治療目的、先前療法、患者的臨床病史和對抗體的響應、以及主治醫生的判斷。抗體適當地以一次或經一系列治療投與於患者。取決於疾病的類型和嚴重性,約1 μg/kg至100 mg/kg的抗體可為用於向患者投與的初始候選劑量,無論是例如藉由一次或多次分開投與,還是藉由連續輸注。取決於上述因素,一個典型的日劑量可以為約1 μg/kg至100 mg/kg或更多。對於幾天或更長時間內的重複投與,取決於病症,治療通常會持續直到出現疾病症狀的期望抑制。此類劑量可以間歇地投與,例如每週或每三週(例如使得患者接受約兩個至約二十個,或例如約六個劑量的抗體)。投與初始較高負載劑量,隨後投與一或多個較低劑量。但是,其他給藥方案可為有用的。藉由常規技術和測定可以容易地監測此療法的進展。
組合療法
在一方面,本揭露的抗CEA抗體可與其他治療劑組合使用。可以與本揭露的抗CEA抗體一起使用的其他治療劑包括:但不限於化療劑(例如,紫杉醇或紫杉醇藥劑;(例如Abraxane®)、多西他賽;卡鉑;拓撲替康;順鉑;伊立替康、多柔比星、來那度胺、 5-氮雜胞苷、異環磷醯胺、奧沙利鉑、培美曲塞二鈉、環磷醯胺、依託泊苷、地西他濱、氟達拉濱、長春新鹼、苯達莫司汀、苯丁酸氮芥、白消安、吉西他濱、黴法蘭、噴司他丁、米托蒽醌、培美曲塞二鈉)、酪胺酸激酶抑制劑(例如EGFR抑制劑(例如厄洛替尼)、多激酶抑制劑(例如MGCD265、RGB-286638)、CD-20靶向劑(例如利妥昔單抗、奧法木單抗、RO5072759、LFB-R603)、CD52靶向劑(例如阿侖單抗)、普賴蘇穠、達貝泊汀α、來那度胺、Bcl-2抑制劑(例如奧利默森鈉)、極光激酶抑制劑(例如MLN8237、TAK-901)、蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米)、CD-19靶向劑(例如MEDI-551、MOR208)、MEK抑制劑(例如ABT-348)、JAK-2抑制劑(例如INCB018424)、mTOR抑制劑(例如坦羅莫司、依維莫司)、BCR/ABL抑制劑(例如伊馬替尼)、ET-A受體拮抗劑(例如ZD4054)、TRAIL受體2(TR-2)促效劑(例如CS-1008)、EGEN-001、Polo樣激酶1抑制劑(例如BI 672)。
在另一方面,抗CEA抗體可與抗PD1抗體組合使用。抗PD1抗體可包括但不限於替雷利珠單抗、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)或納武利尤單抗(Nivolumab)。替雷利珠單抗揭露於US 8,735,553中。由默克公司(Merck)揭露於US 8,354,509和US 8,900,587中的帕博利珠單抗(以前稱為MK-3475)係人源化lgG4-K免疫球蛋白,其靶向PD1受體並抑制PD1受體配體PD-L1和PD-L2的結合。帕博利珠單抗已被批准用於轉移性黑色素瘤和轉移性非小細胞肺癌(NSCLC)的適應症,並且正在進行用於治療頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)和難治性何杰金氏淋巴瘤(cHL)的臨床研究。納武利尤單抗(如由百時美施貴寶公司(Bristol-Meyers Squibb)所揭露的)係全人lgG4-K單株抗體。納武利尤單抗(殖株5C4)揭露於美國專利案號US 8,008,449和WO 2006/121168中。納武利尤單抗被批准用於治療黑色素瘤、肺癌、腎癌、和何杰金氏淋巴瘤。
藥物組成物和配製物
還提供了包含抗CEA抗體或其抗原結合片段或包含編碼抗CEA抗體或抗原結合片段的序列的多核苷酸的組成物,包括藥物配製物。在某些實施方式中,組成物包含一或多種抗CEA抗體或抗原結合片段,或包含編碼一或多種抗CEA抗體或抗原結合片段的序列的一或多種多核苷酸。該等組成物還可包含合適的載劑,如本領域熟知的藥學上可接受的賦形劑,包括緩衝劑。
藉由將具有所需純度的這種抗體或抗原結合片段與一或多種視需要的藥學上可接受的載劑混合來製備本文所述之抗CEA抗體或抗原結合片段的藥物配製物(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition [雷明頓藥物科學第16版], Osol, A. 編 (1980)),呈凍乾配製物或水溶液的形式。藥學上可接受的載劑在所採用的劑量和濃度下對於接受者通常是無毒性的,並且包括但不限於:緩衝劑,如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸和甲硫胺酸;防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨;氯化六甲雙銨;苯紮氯銨;氯化本索寧;苯酚、丁醇或苯甲醇;對羥基苯甲酸烷基酯,如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;和間甲酚);低分子量(少於約10個殘基)的多肽;蛋白質,如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,如聚乙烯吡咯啶酮;胺基酸,如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸;單糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,如EDTA;糖,如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成鹽反離子,如鈉;金屬絡合物(例如Zn-蛋白絡合物);和/或非離子型界面活性劑,如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性藥學上可接受的載劑進一步包括間質藥物分散劑,例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如人可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白,如rHuPH20(HYLENEX
®,百特國際有限公司(Baxter International, Inc.))。在美國專利案號US 7,871,607和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法,包括rHuPH20。在一方面,將sHASEGP與一或多種另外的糖胺聚糖酶如軟骨素酶組合。
示例性凍乾抗體配製物描述於美國專利案號6,267,958中。水性抗體配製物包括美國專利案號6,171,586和WO 2006/044908中所述的那些,後者的配製物包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
可以製備緩釋製劑。緩釋製劑之合適實例包括含有該抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質,該基質為成形製品的形式,例如膜或微膠囊。
用於體內投與的配製物通常是無菌的。無菌性可以例如通過無菌過濾膜過濾而容易地實現。
實例 實例 1 :抗 CEA 單株抗體的產生 用於免疫和結合測定的 CEA 重組蛋白
為了發現在含有結構域B3(SEQ ID NO: 52的胺基酸596-674,參見Beauchemin等人, Mol. Cell Bio. [分子細胞生物學], 1987, 7(9):3321-3330)的膜周圍區域與人和獼猴CEA發生交叉反應但不與其他人CEACAM成員脫靶結合的針對CEA的新抗體,設計並表現了幾種重組蛋白用於抗體篩選(參見
表 2)。
將全長人CEA(SEQ ID NO: 52)、獼猴CEA(SEQ ID NO: 53)和全長人CEACAM6(SEQ ID NO: 54)的cDNA編碼區根據GenBank序列排序。對於人CEA(登錄號:NM_004363.2),該基因可獲自Sinobio,目錄號HG11077-UT。對於獼猴CEA(登錄號:NM_001047125),該基因可獲自Genscript,目錄號OMb23865D。對於人CEACAM6(登錄號:NM_002483.4),該基因可獲自Sinobio,目錄號HG10823-UT。CEA融合蛋白之示意圖如
圖 1所示。據報導,人CEA的剪接變體與全長CEA在腫瘤上同時表現(Peng等人, PloS one [公共科學圖書館:綜合], 7, e36412-e36412 (2012)),並且因此製備了變體(CEA-v)。為了產生此構建體,將由huCEA(SEQ ID NO: 55)的胺基酸(AA)1-687組成的細胞外結構域(ECD)的編碼區、猴CEA(SEQ ID NO: 56)的胺基酸(AA)1-690的區域和CEACAM6(SEQ ID NO: 57)的胺基酸(AA)1-320的區域進行PCR擴增。將CEA胺基酸(AA)1-78(SEQ ID NO: 58)和CEA的胺基酸398-687(SEQ ID NO: 59)的區域進行PCR擴增,然後藉由重疊PCR軛合以製備CEA變體(CEA-v)(SEQ ID NO: 60)。替代性地,將CEACAM6胺基酸(AA)1-273(SEQ ID NO: 61)的區域和含有CEA胺基酸(AA)596-687的結構域B3(SEQ ID NO: 62)的膜周圍區域進行PCR擴增,然後藉由重疊PCR軛合以製備嵌合構建體(CHIM)(SEQ ID NO: 63)。然後將所有構建體選殖到基於pcDNA3.1的表現載體(美國加利福尼亞州卡爾斯巴德的英傑公司(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA))中,其C末端分別與6xHis標籤融合,從而產生五個重組融合蛋白表現質體CEA、猴CEA、CEACAM6、CEA-v和CHIM。為了產生重組融合蛋白,將CEA、猴CEA、CEACAM6、CEA-v和CHIM質體瞬時轉染到基於HEK293的哺乳動物細胞表現系統(內部產生)中,並在裝備有旋轉振盪器的CO
2培養箱中培養5-7天。收集含有重組蛋白的上清液並離心澄清。使用Ni-NTA瓊脂糖(目錄號R90115,英傑公司)純化重組蛋白。將所有重組蛋白用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)透析,並以小等分試樣保存在-80°C冰箱中。
在細胞系中穩定表現
為了建立表現全長人CEA的穩定細胞系(登錄號:NM_004363.2),將表現CEA的cDNA選殖到反轉錄病毒載體pFB-Neo(目錄號217561,美國的安捷倫公司(Agilent, USA))中。根據先前的方案(Zhang等人, Blood. [血液] 2005 106(5):1544-51)產生雙嗜性反轉錄病毒載體。將含有人CEA的病毒載體轉導到L929(美國維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心(ATCC, Manassas, VA, USA))和CT26細胞(美國維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心)中,以產生人CEA表現細胞系。藉由在含有10% FBS和G418的完全RPMI1640培養基中培養來選擇高表現細胞系,然後藉由FACS結合測定來驗證。
免疫、融合瘤融合和選殖
用500 µl含有或不含水溶性佐劑(目錄號KX0210041,中國北京的康碧泉公司(KangBiQuan, Beijing, China))的1 × 10
7個L929/huCEA細胞腹膜內(i.p.)免疫八至十二週齡Balb/c小鼠(中國北京的華阜康生物科技有限公司(HFK BIOSCIENCE CO., LTD, Beijing, China))。兩週後重複該過程以促進抗體產生。第三次免疫後兩週,藉由ELISA和FACS評估小鼠血清的可溶性CEA(sCEA)結合。使用標準技術(Colligan JE等人, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY [免疫學實驗手冊], 1993)分離脾細胞並與鼠骨髓瘤細胞系SP2/0細胞(美國維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心)融合。
藉由 ELISA 和 FACS 評估抗體的 CEA 結合活性
為了篩選結合人CEA但不結合CEACAM6或sCEA的抗體,篩選並反篩選結合CHIM但不結合sCEA、CEACAM6和CEA-v的抗體,以及結合CHIM、sCEA和CEA-v但不結合CEACAM6的抗體。融合瘤殖株的上清液最初藉由(Methods in Molecular Biology [分子生物學方法] (2007) 378:33-52)中所述的ELISA(略作修改)進行篩選。簡而言之,將sCEA、CHIM、CEACAM6或CEA-v分別以3 µg/ml的低濃度包被在96孔板中。使用HRP-連接的抗小鼠IgG抗體(目錄號7076S,美國的細胞傳導技術公司(Cell Signaling Technology, USA))和底物(目錄號00-4201-56,美國的伊生物技術公司(eBioscience, USA))進行顯色,並使用酶標儀(SpectraMax Paradigm™,美國的分子設備公司(Molecular Devices, USA))測量450 nm波長處的吸光度信號。使用L929/huCEA和/或MKN45細胞(ATCC)藉由FACS進一步驗證ELISA陽性殖株。MKN45細胞來源於人胃癌。將表現CEA的細胞(10
5個細胞/孔)與ELISA陽性融合瘤上清液一起孵育,隨後與Alexa Fluro-647標記的山羊抗小鼠IgG抗體(目錄號A0473,中國的碧雲天生物技術公司(Beyotime Biotechnology, China))結合。使用流式細胞儀(Guava easyCyte™ 8HT,美國的默克密理博公司(Merck-Millipore, USA))定量細胞螢光。
對來自融合瘤的在FACS篩選中表現出陽性信號並且與CHIM而不是CEACAM6和sCEA結合的條件培養基進行功能測定,以評估sCEA的存在對CEA抗體與CEA表現細胞的結合的影響(參見下面的實例)。對具有所需結合特異性和功能活性的抗體進一步亞選殖和表徵。
融合瘤亞選殖和對無血清或低血清培養基的適應
主要藉由ELISA、FACS和功能測定進行初步篩選後,藉由有限稀釋亞克選殖性融合瘤殖株。通過功能測定而驗證的靠前抗體亞殖株在含3% FBS的CDM4MAb培養基(目錄號SH30801.02,美國的海殖株公司(Hyclone, USA))中適應生長。
單株抗體的表現和純化
將融合瘤細胞在CDM4MAb培養基(目錄號SH30801.02,海殖株公司)中培養,並在37°C下、在CO
2培養箱中孵育5至7天。通過離心收集條件培養基並在純化前通過0.22 µm膜過濾。依照製造商的指導中的方案應用含有鼠抗體的上清液並結合到蛋白A柱(目錄號17127901,通用生命科學公司(GE Life Sciences))。該程序通常產生純度高於90%的抗體。將蛋白A親和純化的抗體用PBS透析或使用HiLoad 16/60 Superdex™ 200柱(目錄號17531801,通用生命科學公司)進一步純化以去除聚集物。藉由測量280 nm處的吸光度來確定蛋白質濃度。將最終的抗體製劑以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。
[ 表 2] :胺基酸和核酸序列
實例 2. CEA 抗體的選殖和序列分析
SEQ ID NO : | 構建體 | 序列 |
SEQ ID NO: 52 | 全長人CEA | MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLN RTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASN PPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGH SRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGI QNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLAT GRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI |
SEQ ID NO: 53 | 獼猴CEA | MGSPSAPLHRWCIPWQTLLLTASLLTFWNPPTTAQLTIESRPFNVAEGKEVLLLAHNVSQNLFGYIWYKGERVDASRRIGSCVIRTQQITPGPAHSGRETIDFNASLLIHNVTQSDTGSYTIQVIKEDLVNEEATGQFRVYPELPKPYISSNNSNPVEDKDAVALTCEPETQDTTYLWWVNNQSLPVSPRLELSSDNRTLTVFNIPRNDTTSYKCETQNPVSVRRSDPVTLNVLYGPDAPTISPLNTPYRAGENLNLTCHAASNPTAQYFWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTAITVYAELPKPYITSNNSNPIEDKDAVTLTCEPETQDTTYLWWVNNQSLSVSSRLELSNDNRTLTVFNIPRNDTTFYECETQNPVSVRRSDPVTLNVLYGPDAPTISPLNTPYRAGENLNLSCHAASNPAAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATG LNRTTVTAITVYVELPKPYISSNNSNPIEDKDAVTLTCEPVAENTTYLWWVNNQSLSVSPRLQLSNGNRILTLLSVTRNDTGPYECGI QNSESAKRSDPVTLNVTYGPDTPIISPPDLSYRSGANLNLSCHS DSNPSPQYSWLINGTLRQHTQVLFISKITSNNSGAYACFVSNLATGRNNSIVKNISVSSGDSAPGSSGLSARATVGIIIGMLVGVALM |
SEQ ID NO: 54 | 全長人CEACAM6 | MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQN PASANRSDPVTLNVLYGPDVPTISPSKANYRPGENLNLSCHAASNPPAQYSWFINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTMITVSGSAPVLSAVATVGITIGVLARVALI |
SEQ ID NO: 55 | huCEA的1-687 | MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLN RTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASN PPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGH SRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGI QNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLAT GRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGAHHHHHH |
SEQ ID NO: 56 | 猴CEA的1-690 | MGSPSAPLHRWCIPWQTLLLTASLLTFWNPPTTAQLTIESRPFNVAEGKEVLLLAHNVSQNLFGYIWYKGERVDASRRIGSCVIRTQQITPGPAHSGRETIDFNASLLIHNVTQSDTGSYTIQVIKEDLVNEEATGQFRVYPELPKPYISSNNSNPVEDKDAVALTCEPETQDTTYLWWVNNQSLPVSPRLELSSDNRTLTVFNIPRNDTTSYKCETQNPVSVRRSDPVTLNVLYGPDAPTISPLNTPYRAGENLNLTCHAASNPTAQYFWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTAITVYAELPKPYITSNNSNPIEDKDAVTLTCEPETQDTTYLWWVNNQSLSVSSRLELSNDNRTLTVFNIPRNDTTFYECETQNPVSVRRSDPVTLNVLYGPDAPTISPLNTPYRAGENLNLSCHAASNPAAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATG LNRTTVTAITVYVELPKPYISSNNSNPIEDKDAVTLTCEPVAENTTYLWWVNNQSLSVSPRLQLSNGNRILTLLSVTRNDTGPYECGI QNSESAKRSDPVTLNVTYGPDTPIISPPDLSYRSGANLNLSCHS DSNPSPQYSWLINGTLRQHTQVLFISKITSNNSGAYACFVSNLATGRNNSIVKNISVSSGDSAPGSSGLSARAHHHHHH |
SEQ ID NO: 57 | CEACAM6的1-320 | MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQN PASANRSDPVTLNVLYGPDVPTISPSKANYRPGENLNLSCHAASNPPAQYSWFINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTMITVSGHHHHHH |
SEQ ID NO: 58 | huCEA的1-78 | MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQN |
SEQ ID NO: 59 | huCEA的398-687 | ELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAAS NPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASG HSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLAT GRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGA |
SEQ ID NO: 60 | CEA-v | MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQ ELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSIS SNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHT QVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGAHHHHHH |
SEQ ID NO: 61 | CEACAM6的1-273 | MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQN PASANRSDPVTLNVLYGPDVPTIS |
SEQ ID NO: 62 | huCEA的596-687 | PIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGA |
SEQ ID NO: 63 | CHIM | MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQN PASANRSDPVTLNVLYGPDVPTISPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLA TGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGAHHHHHH |
SEQ ID NO: 64 | CEACAM1 | MGHLSAPLHRVRVPWQGLLLTASLLTFWNPPTTAQLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIG TQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDL VNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQDTTYLWWINNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDTPTISPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCHANNSV TGCNRTTVKTIIVTELSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNTTLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENGLSPGAIAGIVIGVVALVALIAVALACFLHFGKTGSSGPLQ |
SEQ ID NO: 65 | CEACAM3 | MGPPSASPHRECIPWQGLLLTASLLNFWNPPTTAKLTIESMPLSVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGAAYSGRETIYTNASLLIQNVTQNDIGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYQENAPGLPVGAVAGIVTGVLVGVALVAALVCFLLLAKTGRTSIQRDLKEQQPQALAPGRGPSHSSAFSMSPLSTAQAPLPNPRTAASIYEELLKHDTNIYCRMDHKAEVAS |
SEQ ID NO: 66 | CEACAM7 | MGSPSACPYRVCIPWQGLLLTASLLTFWNLPNSAQTNIDVVPFNVAEGKEVLLVVHNESQNLYGYNWYKGERVHANYRIIGYVKNI SQENAPGPAHNGRETIYPNGTLLIQNVTHNDAGIYTLHVIKENLVNEEVTRQFYVFSEPPKPSITSNNFNPVENKDIVVLTCQPETQNTTYLWWVNNQSLLVSPRLLLSTDNRTLVLLSATKNDIGPYECEIQNPVGASRSDPVTLNVRYESVQASSPDLSAGTAVSIMIGVLAGM ALI |
SEQ ID NO: 67 | CEACAM8 | MGPISAPSCRWRIPWQGLLLTASLFTFWNPPTTAQLTIEAVPSNAAEGKEVLLLVHNLPQDPRGYNWYKGETVDANRRIIGYVISNQQ ITPGPAYSNRETIYPNASLLMRNVTRNDTGSYTLQVIKLNLMSE EVTGQFSVHPETPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLLSVTRNDVGPYECEIQNPASANFSDPVTLNVLYGPDAPTISPSDTYYHAGVNLNLSCHAAS NPPSQYSWSVNGTFQQYTQKLFIPNITTKNSGSYACHTTNSATGRNRTTVRMITVSDALVQGSSPGLSARATVSIMIGVLARVALI |
SEQ ID NO: 68 | 全長人CEA DNA | |
SEQ ID NO: 69 | 猴CEA DNA | |
SEQ ID NO: 70 | 全長人CEACAM6 DNA | |
SEQ ID NO: 71 | huCEA DNA的1-687 | |
SEQ ID NO: 72 | 猴CEA DNA的1-690 | |
SEQ ID NO: 73 | CEACAM6 DNA的1-320 | |
SEQ ID NO: 74 | huCEA DNA的1-78 | |
SEQ ID NO: 75 | huCEA DNA的398-687 | |
SEQ ID NO: 76 | CEA-v DNA | |
SEQ ID NO: 77 | CEACAM6 DNA的1-273 | |
SEQ ID NO: 78 | huCEA DNA的596-687 | |
SEQ ID NO: 79 | CHIM DNA |
根據製造商的方案,使用Ultrapure RNA套組(kit)(目錄號74104,德國的凱傑公司(QIAGEN, Germany))收穫鼠融合瘤細胞以製備總RNA。使用來自英傑公司的cDNA合成套組(目錄號18080-051)合成第一條股cDNA,並使用PCR套組(目錄號CW0686,中國北京的康為世紀公司(CWBio, Beijing, China))進行鼠單株抗體的VH和VL基因的PCR擴增。基於先前報導的序列(Brocks等人, Mol Med. [分子醫學] 2001 7(7):461-9)合成用於重鏈可變區(VH)和κ輕鏈可變區(VL)的抗體cDNA選殖的寡核苷酸引物。然後將PCR產物亞選殖到pEASY-Blunt選殖載體(目錄號CB101-02,中國的全式金公司(TransGen, China))中,並定序。從DNA定序結果確定VH和VL區的胺基酸序列。
單株抗體藉由比較序列同源性來分析,並基於序列相似性分組(
圖 2)。根據IMGT(Lefranc等人, 1999 Nucleic Acids Research [核酸研究] 27:209-212)系統藉由序列注釋來定義互補決定區(CDR)。代表性殖株BGA13的胺基酸序列在
表 3中列出。
[ 表 3] :胺基酸序列
實例 3. 純化的鼠抗 CEA 抗體之結合概況測定
BGA13 (IMGT) | SEQ ID NO: 80 | HCDR1 (IMGT) | GYIFTSYW |
SEQ ID NO: 81 | HCDR2 (IMGT) | INPNTGYT | |
SEQ ID NO: 3 | HCDR3 (IMGT) | AREYGNYNYPLDY | |
SEQ ID NO: 82 | LCDR1 (IMGT) | ENIYGY | |
SEQ ID NO: 83 | LCDR2 (IMGT) | NA | |
SEQ ID NO: 84 | LCDR3 (IMGT) | QHHYGTPYT | |
BGA13 | SEQ ID NO: 85 | VH | QVQLQQSGAELAKSGASVKMSCKASGYIFT SYWLHWVKQRPGQGLEWIGYINPNTGYTNYSQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTSVTVSS |
[0001] | SEQ ID NO: 86 | VL | DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYGY LAWYQQKQGKSPQLLVFNAKNLVEGVPSRF SGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYG TPYTFGGGTKLEIK |
藉由使用BIAcore
TMT-200(通用生命科學公司)的SPR測定,表徵了具有CEA特異性結合(如藉由ELISA和FACS顯示的)以及沒有sCEA干擾的CEA抗體的結合動力學(
圖 3A)。簡言之,將抗鼠IgG抗體固定在活化的CM5生物感測器晶片(目錄號BR100530,通用生命科學公司)上。使純化的鼠抗體流過晶片表面並被抗鼠IgG抗體捕獲。然後使純化的CHIM、CEA-v、CEA或猴CEA重組蛋白的連續稀釋液(6.0 nM至2150 nM)流過晶片表面,並藉由使用一對一Langmuir結合模型(BIA評估軟體,通用生命科學公司)分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率(
k on)和解離速率(
k off)。將平衡解離常數(
K D)計算為比率
k off/
k on。BGA13的結合親和力概況在下
表 4中示出。
通過抗原ELISA檢查BGA13的結合概況,觀察到純化的BGA13與huCEA和猴CEA的結合,這表明BGA13對可溶性huCEA和猴CEA係弱結合劑,或者可溶性CEA在固定時具有不同的構象(
圖 3B)。對於該實驗,將sCEA、CHIM、猴CEA、CEA-v和BSA以10 µg/ml的高濃度在4°C下包被在96孔板中過夜。BGA13或對照抗體ab4451(目錄號ab4451,美國的艾博抗公司(abcam, USA))以2 µg/ml的濃度孵育1小時。使用HRP-連接的抗小鼠IgG抗體(目錄號7076S,美國的細胞傳導技術公司)和底物(目錄號00-4201-56,美國的伊生物技術公司)進行顯色,並使用酶標儀(SpectraMax Paradigm,美國的分子設備公司)測量450 nm波長處的吸光度信號。
[ 表 4] :藉由 SPR 比較 BGA13 結合親和力
實例 4. 重組可溶性 CEA 對 BGA13 與 CEA 表現細胞的結合之影響
抗原 | KD (M) |
sCEA | ND |
sCEA-v | 1.50E-07 |
CHIM | 1.20E-07 |
猴CEA | ND(由於結合較弱,無法檢測到) |
通過流式細胞術評估可溶性CEA的存在對各種CEA抗體與CEA表現細胞的特異性結合之影響。簡言之,在20 µg/ml額外的重組可溶性CEA蛋白的存在下,將表現人CEA的細胞(10
5個細胞/孔)與2 µg/ml純化的CEA鼠單株抗體一起孵育,隨後與Alexa Fluro-647標記的山羊抗小鼠IgG抗體(目錄號A0473,中國的碧雲天生物技術公司)結合。使用流式細胞儀(Guava easyCyte™ 8HT,美國的默克密理博公司)定量細胞螢光。如
圖 4A 和圖 4B所示,BGA13與CEA表現細胞的結合不受可溶性CEA存在的影響。
實例 5. 鼠抗人 CEA 抗體的人源化 mAb 人源化和工程化
對於BGA13的人源化,藉由在IMGT和NCBI的人免疫球蛋白基因數據庫中進行序列比較,搜索人種系IgG基因中與BGA13可變區的cDNA序列具有高度同源性的序列。選擇以高頻率存在於人抗體庫(Glanville等人,2009 PNAS [美國國家科學院院刊] 106:20216-20221)中並且與BGA13高度同源的人IGVH和IGVL基因作為人源化的模板。在人源化之前,將BGA13重鏈和輕鏈可變結構域分別與命名為人IgG1wt的野生型人IgG1恒定區(SEQ ID NO: 87)和人κ恒定(CL)區(SEQ ID NO: 88)融合。
[ 表 5] :胺基酸序列
SEQ ID NO: 87 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | IgG1wt |
SEQ ID NO: 88 | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC | CL |
藉由CDR移植進行人源化(Methods in Molecular Biology [分子生物學方法], 第248卷: Antibody Engineering, Methods and Protocols [抗體工程、方法和方案], Humana Press [胡馬納出版社])並將BGA13抗體以人IgG1形式工程化。在第一輪人源化中,框架區中從鼠到人胺基酸殘基的突變由模擬的3D結構指導,並且在人源化抗體BGA13的第一版本BGA131中保留了對於維持CDR的規範結構具有結構重要性的鼠框架殘基(重鏈和輕鏈的胺基酸序列在SEQ ID NO: 89和90中示出)。
[ 表 6] :胺基酸序列
SEQ ID NO: 89 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYWLHWVRQAPGQGL EWIGYINPNTGYTNYSQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | BGA131重鏈 |
SEQ ID NO: 90 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNAKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHYGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | BGA131輕鏈 |
具體地,將BGA13 VL的CDR移植到保留了2個鼠框架殘基(N66和V68)的人種系可變基因IGVK1-27的框架中(輕鏈可變結構域的胺基酸序列在SEQ ID NO: 92中示出)。將BGA13 VH的CDR移植到保留了5個鼠框架(L39、I53、Y55、N66、S68)殘基的人種系可變基因IGVH1-46的框架中(重鏈可變結構域的胺基酸序列在SEQ ID NO: 91中示出)。
[ 表 7] :胺基酸序列
SEQ ID NO: 91 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYWLHWVRQAPGQGL EWIGYINPNTGYTNYSQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSS | BGA131 VH |
SEQ ID NO: 92 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNAKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHYGTPYTFGQGTKVEIK | BGA131 VL |
使用內部開發的表現載體將BGA13-1構建為人全長抗體形式,該等表現載體含有野生型人IgG1的恒定區,具有容易適應的亞選殖位點。藉由將上述兩種構建體共轉染到293G細胞中並使用蛋白A柱(目錄號17543802,通用生命科學公司)純化來實現BGA13-1抗體的表現和製備。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-5 mg/mL並以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。
使用BGA131,進行額外數量的單個或多個胺基酸改變,將VH和VL框架區中的人殘基轉化為相應的鼠種系殘基,其分別包括VH中的V68A、R72A和V79A以及VL中的V43S。這產生BGA132(VH中的V68A、R72A)、BGA133(VH中的V79A)、BGA134(VH中的V68A、R72A、V79A)、BGA135(VL中的V43S)、BGA136(VH中的V68A、R72A和VL中的V43S)、BGA137(VH中的V79A、VL中的V43S)和BGA138(VH中的V68A、R72A、V79A和VL中的V43S)。所有含有修飾的抗體都具有與BGA131相似的結合活性,並且沒有一種改變消除結合。
為了去除翻譯後修飾(PTM)位點,藉由基於BGA131序列在CDR和框架區中引入突變來進行進一步工程化,該等突變包括VH區中的N52T、N54Q、N59S、N102G、N104Q和S61A胺基酸改變。這產生BGA131A(N52T(VH))、BGA131B(N54Q(VH))、BGA131C(N59S(VH))、BGA131D(N102G(VH))、BGA131E(N104Q(VH))和BGA131F(N54Q、N59S、S61A(VH)),並且所有抗體都具有與BGA131相似的結合特異性,沒有一種改變消除結合。在保持特異性的同時,還考慮了胺基酸組成和表現水平。使用在特定位置含有突變的引物和定點誘變套組(目錄號FM111-02,中國北京的全式金公司)進行所有人源化突變。藉由序列分析驗證所需的突變。與BGA13-1相比,BGA13-1F具有顯著降低的結合親和力,沒有糖基化位點,但具有高表現水平(
表 8)。
[ 表 8] :胺基酸序列
實例 6. 親和力成熟文庫的產生
SEQ ID NO: 93 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNAKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHYGTPYTFGQGTKVEIK | BGA13-1 VL |
SEQ ID NO: 94 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYWLHWVRQAPGQGL EWIGYINPQTGYTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSS | BGA13-1F VH |
藉由標準分子生物學技術使用噬菌粒載體pCANTAB 5E(通用電氣醫療集團(GE Healthcare))構建噬菌粒,該噬菌粒被設計成在M13噬菌體的表面上展示BGA13-1F Fab片段作為與基因-3次要外殼蛋白片段的N末端的融合體。在基因-3序列之前有一個琥珀終止密碼子,以允許直接從噬菌粒殖株表現Fab片段。使用噬菌粒作為模板來構建含有10
8個獨特成員的噬菌體展示文庫。
構建兩個文庫(H-AM、L-AM),分別隨機化重鏈和輕鏈中的CDR位置。所有三個CDR在每個文庫中隨機化,但每個CDR在每個殖株中具有最多一個突變,HCDR3除外,其可具有兩個同時突變。每個位置用編碼任何胺基酸的NNK密碼子(IUPAC編碼)或琥珀終止密碼子隨機化。組合的重鏈和輕鏈文庫設計具有5.0 × 10
6個獨特全長殖株的潛在多樣性,沒有終止密碼子或半胱胺酸密碼子,並且預期分佈分別為約0.02%、1.1%、17%和82%的殖株分別具有0、1、2和3個突變。由於HCDR3區域中的引物設計,預期一小部分重鏈殖株具有4個突變。作為第一步,使用pCANTAB 5E(作為模板)和含有隨機化CDR3位置的引物擴增DNA片段(參見
圖 5A 和圖 5B)。然後將PCR產物凝膠純化並與含有隨機化CDR2位置的引物組裝。用針對隨機CDR1位置的引物重複該過程。然後藉由重疊PCR將所得的重鏈或輕鏈的PCR產物與其相應的CH片段或CL片段組裝。藉由重疊PCR將片段進一步與沒有突變的輕鏈或重鏈組裝。然後將所得片段凝膠純化,並在NcoI/NotI消化後與pCANTAB 5E連接。藉由電穿孔將純化的連接物轉化到TG1細菌中。來自每個文庫的48個殖株的定序證實了每個位置的隨機化(數據未示出),儘管由於取樣深度有限,並非在每個位置都觀察到所有的胺基酸突變。約52%和55%的輕鏈和重鏈文庫具有全長隨機殖株,足以覆蓋設計的所有潛在多樣性,即使在寡核苷酸合成和文庫構建中存在適度的摻入偏差,也會產生10
8個獨立殖株。
實例 7. 親和力成熟的人源化 BGA13 變體的產生 文庫選擇和篩選
使用標準方案藉由噬菌體展示進行親和力成熟的人源化BGA13 Fab的產生(Silacci等人, (2005) Proteomics [蛋白質組學], 5, 2340-50;Zhao等人, (2014) PLoS One [公共科學圖書館:綜合], 9, e111339)。對於第一輪和第二輪選擇,在免疫管(目錄號470319,賽默飛世爾科技公司(ThermoFisher))中對固定化的CHIM進行競爭選擇。簡言之,免疫管用1 ml CHIM(5 µg/ml的PBS溶液)在4°C下包被過夜。在各種濃度的BGA13-1F IgG(第1輪,1 µg/ml;第2輪,5 µg/ml)存在下,將所有親和力成熟文庫與包被的免疫管一起孵育1小時。對於第三輪和第四輪選擇,使用L929/huCEA細胞(第3輪)或LOVO細胞(ATCC CCL-229)(第4輪)進行細胞淘選,其中HEK293細胞作為耗竭細胞。在四輪選擇之後,挑選單個殖株並使用標準方案製備含有噬菌體的上清液。對ELISA陽性殖株定序,並分析突變位點。
CDR 中的突變頻率分析
在四輪選擇之後,每個CDR中的突變頻率相對較高,範圍從HCDR3中的17%到LCDR2中的95%。關於重鏈,在H-AM文庫中鑒定的大約一半殖株與親本殖株相同。其他殖株在HCDR2中的Q54N處含有一個回復突變。
在分析輕鏈時,突變更加多樣化。兩個位點分別在LCDR1的幾乎所有殖株中都發生了突變。輕鏈殘基29和31分別在47.09%和35.29%的殖株中從Ile突變為Gln和從Gly突變為Gln。位置29不僅具有高頻率的Gln突變,而且具有突變為酪胺酸的殖株子集。位置31不僅具有高頻率的Gln突變,而且有約12.5%的機會突變為Leu。由於文庫設計限制,沒有發現位置29和31的突變彼此結合。然而,這兩個位點中的每一個中的突變通常與其他CDR中的突變組合。關於LCDR2,只有A51在至少64.71%的殖株中發生突變,但沒有任何明顯的模式,其包括大的疏水和極性殘基,諸如Tyr、Phe、Thr和Asn。關於LCDR3,兩個位點在至少50%的殖株中發生了突變。輕鏈殘基90和92分別在11.76%和47.06%的殖株中從His突變為Leu和從Tyr突變為Leu。
圖 6示出了四輪選擇後輕鏈CDR區的序列差異。
所選擇的人源化 BGA13 變體的表現
進行了突變的組合。將來自所選噬菌體殖株的輕鏈可變區亞選殖到人κ輕鏈表現哺乳動物表現載體中。將輕鏈表現載體與表現BGA13-1F重鏈的哺乳動物表現載體以1 : 1的比例共轉染到293G細胞中。藉由蛋白A親和層析法(目錄號17543802,通用生命科學公司)從培養上清液中純化CEA抗體形式。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-5 mg/mL並以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。
親和力成熟的人源化 BGA13 變體的表徵
藉由使用BIAcore™ T-200(通用生命科學公司)的SPR測定(
表 9)和流式細胞術(
圖 7)進行BGA13-1F和其他親和力成熟殖株的親和力比較。對於該實驗,將抗人IgG(Fc)抗體固定在活化的CM5生物感測器晶片(目錄號BR100839,通用生命科學公司)上。抗CEA抗體流過晶片表面並被抗人Fab抗體捕獲。然後使CHIM的連續稀釋液(1.37 nM至333 nM)流過晶片表面,並藉由使用一對一Langmuir結合模型(BIA評估軟體,通用生命科學公司)分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率(
k on)和解離速率(
k off)。對於流式細胞術,將表現CEA的細胞(10
5個細胞/孔)與各種濃度的純化的親和力成熟抗體一起孵育,隨後與Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體(目錄號409320,美國的百進生化技術公司(BioLegend, USA))結合。使用流式細胞儀(Guava easyCyte™ 8HT,美國的默克密理博公司)定量細胞螢光。將平衡解離常數(
K D)計算為比率
k off/
k on。BGA131F-ph-L(SEQ ID NO: 95)和BGA131F-ph-M(SEQ ID NO: 96)顯示出對huCEA表面蛋白的親和力提高(
表 10)。
[ 表 9] :藉由 SPR 比較結合親和力
[ 表 10] :胺基酸序列
實例 8. 親和力成熟的人源化 BGA13 變體的進一步工程化
樣本 ID | Ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD(M) | Rmax(RU) |
1F-ph-E | 3.4E+3 | 3.5E-3 | 1.0E-6 | 284 |
1F-ph-F | 1.0E+2 | 1.2E-2 | 1.2E-4 | 4162 |
1F-ph-G | 6.4E+1 | 2.6E-3 | 4.1E-5 | 3487 |
1F-ph-H | 1.1E+2 | 2.8E-3 | 2.5E-5 | 1983 |
1F-ph-I | 2.0E+2 | 2.2E-3 | 1.1E-5 | 2248 |
1F-ph-L | 6.7E+3 | 3.0E-4 | 4.6E-8 | 184 |
1F-ph-M | 2.5E+3 | 2.5E-4 | 9.9E-8 | 224 |
1F-ph-N | 1.1E+3 | 1.0E-2 | 9.2E-6 | 1267 |
BGA13-1F | 1.9E+3 | 1.5E-3 | 7.9E-7 | 367 |
SEQ ID NO: 95 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLL IYNFKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPY TFGQGTKVEIK | BGA13-1F-ph-L VL |
SEQ ID NO: 96 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLL IYNTKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPY TFGQGTKVEIK | BGA13-1F-ph-M VL |
藉由在基於BGA131F-ph-M模板的CDR中引入突變進行了進一步的工程化,該模板包括VH中的W33Y、Q54N和S59N以及VL中的T51Y。這產生BGA1132A(W33Y(VH))、BGA1132B(Q54N(VH))、BGA 1132C(S59N(VH))、BGA 1131A(T51Y(VL)),它們都具有改進的與BGA-1131F的結合活性,其中改進最大的抗體最終產生具有(W33Y(VH)、T51Y(VL))改變的BGA113抗體(
表 11),序列在
表 12中示出。
[ 表 11] :藉由 SPR 比較與 CHIM 的結合親和力
[ 表 12] : BGA113 的胺基酸和核酸序列
實例 9. BGA113 的優化
樣本 ID | Ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD(M) | Rmax(RU) |
BGA1311F-ph-M | 1.97E+04 | 2.48E-04 | 1.26E-08 | 97.2 |
1132A | 1.99E+04 | 2.82E-04 | 1.42E-08 | 129.1 |
1132B | 1.98E+04 | 3.80E-04 | 1.92E-08 | 71.1 |
1132C | 1.84E+04 | 3.94E-04 | 2.15E-08 | 59.4 |
1131A | 3.21E+04 | 4.63E-04 | 1.44E-08 | 92.9 |
113 | 3.15E+04 | 4.75E-04 | 1.51E-08 | 112.4 |
BGA113 | SEQ ID NO: 97 | VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGY TSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSS |
SEQ ID NO: 15 | VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIK | |
SEQ ID NO: 98 | VH DNA | ||
SEQ ID NO: 17 | VL DNA |
為了進一步改善生物化學/生物物理學性質,藉由在CDR和框架區中引入取代來優化BGA113(
表 13)。選擇大的疏水殘基並將其改變為極性殘基,K13和Q53除外,它們係基於觀察到的人VH種系之間的差異而選擇的。考慮因素包括胺基酸組成、熱穩定性(Tm)、表面疏水性和等電點(pI),同時保持功能活性。如實例6所述,藉由選殖到載體pCANTAB-5E中以Fab形式表現變體。然後藉由ELISA和SPR分析篩選含有Fab的上清液的CEA結合。選擇沒有顯著親和力降低的變體並鑒定出可耐受取代的殘基。證明輕鏈中的L92E,重鏈中的K13E、Q54E、Y57D/E和Y57K對親和力的影響極小。因此,表現和純化具有單個鑒定出的突變或組合的IgG形式的BGA113變體,如實例8中所述。進行SPR研究和FACS分析並總結在
表 14中。證實了特異性和表位沒有由於引入的胺基酸取代而發生改變(數據未示出)。總之,結果表明該等單一或組合突變(重鏈中的K13E、Q54E、Y57D和Y57K,輕鏈中的L92E)對親和力的影響極小,L92E除外,它略微降低了與CEA的結合親和力。總之,Y57K改變優化了BGA113抗體的表現、CEA結合和親和力,從而產生BGA113K(
表 1)。
[ 表 13] :用於取代的殘基的總結
[ 表 14] :藉由 SPR 對 BGA113 變體的親和力測量之總結
實例 10. 抗 CEA 抗體 BGA113K 之結合概況
殘基 | AA 取代 |
H:K13 | E |
H:Y32 | H、N、Q、D、E、K |
H:Y33 | H、N、Q、D、E、K |
H:Q53 | A、D、G、N、S、T、Y、R、H |
H:Y57 | H、N、Q、D、E、K |
H:Y100 | H、N、Q、D、E、K |
H:Y105 | H、N、Q、D、E、K |
L:V15 | T、P、L |
L:Y30 | H、N、Q、D、E、K |
L:Y32 | H、N、Q、D、E、K |
L:Y49 | H、N、Q、D、E、K |
L:P80 | S、T、A |
L:L92 | H、N、Q、D、E、K |
BGA113 變體 | 動力學(huCEA) | 親和力(MKN45細胞) | |||
ka ( 1/Ms ) | kd ( 1/s ) | KD (M) | 最高 | EC50 ( μg/ml ) | |
L92E、Y57K | 3.34E+04 | 1.77E-04 | 5.29E-09 | 969.9 | 1.09 |
L92E | 4.17E+04 | 1.88E-04 | 4.50E-09 | 945.4 | 1.19 |
Q54E、Y57K | 1.10E+05 | 2.60E-04 | 2.36E-09 | 901.9 | 0.58 |
Y57K | 1.02E+05 | 1.81E-04 | 1.77E-09 | 934.6 | 0.52 |
K13E、Y57K | 1.28E+05 | 1.72E-04 | 1.34E-09 | 959.9 | 0.48 |
Q54E、Y57E | 1.17E+05 | 2.50E-04 | 2.14E-09 | 926.9 | 0.65 |
Y57D | 1.07E+05 | 1.95E-04 | 1.82E-09 | 949.3 | 0.56 |
BGA113 | 1.13E+05 | 1.69E-04 | 1.49E-09 | 919.3 | 0.49 |
BGA113K和先前揭露的CEA抗體(在U.S. 2012/0251529中命名為抗體2F1)以人IgG1形式產生並使用BIAcore
TMT-200(通用生命科學公司)藉由SPR測定表徵它們的結合動力學。
為了獲得該數據,將抗人IgG(Fc)抗體固定在活化的CM5生物感測器晶片(目錄號BR100839,通用生命科學公司)上。BGA113K抗體流過晶片表面並被抗人Fab抗體捕獲。然後使可溶性huCEA或cynoCEA(目錄號:CE5-C52H5,北京百普賽斯生物科技股份有限公司(Acrobiosystem))的連續稀釋液(1.37 nM至2150 nM)流過晶片表面,並藉由使用一對一Langmuir結合模型(BIA評估軟體,通用生命科學公司)分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率(
k on)和解離速率(
k off)。將平衡解離常數(
K D)計算為比率
k off/
k on。BGA113K和2F1對照抗體表現出不同的結合親和力。BGA113K對人CEA具有非常高的親和力,對cynoCEA也具有相當的親和力,如下
表 15所示。
對於流式細胞術,將表現CEA的MKN45細胞(10
5個細胞/孔)與各種濃度的純化的親和力成熟抗體一起孵育,隨後與Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體(目錄號409320,美國的百進生化技術公司)結合。使用流式細胞儀(Guava easyCyte™ 8HT,美國的默克密理博公司)定量細胞螢光。如
圖 8所示,BGA-113K以劑量反應方式與活細胞上的天然CEA特異性結合,EC50為2.92 µg/ml。
[ 表 15] :藉由 SPR 比較抗 CEA 抗體的結合親和力
實例 11. 脫靶特異性的評估
BGA113K | 2F1 抗體 | |||||
Ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD (M) | Ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD (M) | |
huCEA | 1.02E+05 | 1.81E-04 | 1.77E-09 | 4.50E+4 | 3.00E-3 | 6.50E-8 |
cynoCEA | 2.67E+04 | 5.34E-04 | 1.99E-08 | ND | ND | ND |
通過ELISA和流式細胞術評估BGA113K的脫靶特異性。對於流式細胞術,將CEACAM3(SEQ ID NO: 65)、CEACAM7(SEQ ID NO: 66)或CEACAM8(SEQ ID NO: 67)瞬時轉染到HEK293細胞(10
5個細胞/孔)中,然後與2 µg/ml純化的BGA113K一起孵育,隨後與Alexa Fluor-647標記的抗huIgG Fc抗體(目錄號409320,美國的百進生化技術公司)結合。使用流式細胞儀(Guava easyCyte™ 8HT,美國的默克密理博公司)定量細胞螢光。對於抗原ELISA、CEACAM1(SEQ ID NO: 64)(目錄號10822-H08H,中國的義翹神州公司(Sino Biological, China))、CHIM(SEQ ID NO: 63)、CEA(SEQ ID NO: 55)或CEACAM6(SEQ ID NO: 57)以10 µg/ml的濃度在4°C下包被在96孔板中過夜。使用HRP-連接的抗人Fc(Fc特異性)IgG抗體(目錄號A0170,美國的西格瑪公司(Sigma, USA))和底物(目錄號00-4201-56,美國的伊生物技術公司)進行顯色,並使用酶標儀(SpectraMax Paradigm,美國的分子設備公司)測量450 nm波長處的吸光度信號。如
圖 9A 至圖 9B所示,沒有觀察到與其他CEACAM家族成員的交叉反應性,因此BGA113K僅表現出對CEA的特異性(
圖 9A-B中的CEACAM5)。
實例 12. 可溶性 huCEA 對 BGA113K 與 CEA 表現細胞的結合之影響
為了確定可溶性CEA(sCEA)是否對BGA113K的特異性結合有任何影響,將不同濃度(0、0.5、1、2 µg/ml)的重組可溶性CEA與(0.01-100 µg/ml)BGA113K預混合並孵育5分鐘。然後將混合物與2 × 10
5個CEA表現細胞諸如MKN45細胞在4°C下孵育30分鐘。將細胞用第二抗體抗huFc-APC(目錄號409320,美國的百進生化技術公司)染色並藉由流式細胞術分析。在2 µg/ml重組sCEA存在下,BGA113K與CEA表現細胞的結合不受影響。該結果針對MKN45細胞顯示(
圖 10),並表明BGA113K對CEA的膜結合形式的特異性。
實例 13. BGA113 誘導對 CEA
+ 腫瘤細胞的有效 ADCC 作用
為了確定野生型IgG1形式的BGA113是否可以誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC),將表現CD16(V158)的NK92MI細胞(NK92MI/CD16V)用作效應細胞,並與表現CEA的小鼠結腸癌細胞(CT26 - ATCC CRL-2638)共培養。在指定濃度(0.00005-5 μg/ml)的BGA113存在下,以1 : 1的E:T比率進行共培養5小時,並藉由乳酸脫氫酶(LDH)釋放確定細胞毒性。使用CytoTox™ 96非放射性細胞毒性測定套組(威斯康辛州麥迪森的普洛麥格公司(Promega, Madison, WI))測量上清液中LDH的量,並根據製造商的說明計算特異性裂解的量。如
圖 11所示,BGA113可在體外誘導ADCC,EC
50為約6.7 ng/ml。
實例 14. BGA113 的體內抗腫瘤功效
為了確定BGA113針對CEA
+腫瘤細胞的體內功效,將NK92MI/CD16V細胞(5 × 10
6)與CT26/CEA細胞(10
6)混合並皮下注射到NCG小鼠中。在腫瘤注射當天開始,每週兩次給予BGA113(0.12、0.62或3.1 mg/kg)或媒介物對照(每組7隻小鼠)。與媒介物相比,3.1 mg/kg劑量的BGA113表現出少量的腫瘤抑制,儘管與媒介物對照的差異在統計學上不顯著(P > 0.05)(
圖 12)。
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無
[ 圖 1]示出了脫落CEA(sCEA)、嵌合CEA(CHIM)、CEACAM6和CEA變體(CEA-v)之示意圖。在CEA中,標記了N結構域、A1、B1、A2、B2、A3、B3和GPI連接子(GPI);在CEACAM6中,標記了結構域N'、A'和B'。
[ 圖 2A- 圖 2B]描繪了抗CEA結構域B3抗體VH(圖2A)和VL(
圖 2B)區之系統發生樹。使用DNASTAR的Megalign™軟體對候選抗CEA抗體的VH和VL序列進行比對。序列同源性在系統發生樹中顯示。
[ 圖 3A]示出了藉由表面電漿共振(SPR)對嵌合構建體(CHIM)上的純化的鼠抗CEA抗體BGA13之親和力測定。
圖 3B描繪了藉由抗原ELISA分析的BGA13之結合概況。
[ 圖 4A- 圖 4B]示出了可溶性CEA(sCEA)對CEA抗體與MKN45細胞的結合之影響。
圖 4A示出了在可溶性CEA(sCEA)存在或不存在下結構域B3抗體之結合概況;
圖 4B係
圖 4A的抗體結合概況,示出為直方圖。
[ 圖 5A- 圖 5B]示出了產生用於人源化BGA13抗體輕鏈CDR(LCDR)區(
圖 5A)和重鏈CDR(HCDR)區(
圖 5B)的親和力成熟的抗體文庫之隨機化位點。
[ 圖 6]示出了四輪選擇後BGA13輕鏈CDR區的胺基酸改變。
[ 圖 7]示出了藉由流式細胞術測定的親和力成熟的人源化BGA13變體與LOVO細胞的結合。
[ 圖 8]係藉由流式細胞術測定的優化的人源化BGA113變體與MKN45細胞的結合。
[ 圖 9A 和圖 9B]表明藉由流式細胞術(
圖 9A)和抗原ELISA(
圖 9B)所發現,抗體BGA113K與各種CEACAM家族成員沒有脫靶結合。
[ 圖 10]示出了在各種濃度的可溶性CEA存在下,可溶性CEA對BGA113K與CEA表現細胞MKN45細胞結合之影響。
[ 圖 11]表明抗體BGA113在體外藉由ADCC殺傷細胞。
[ 圖 12]描繪了當用BGA113抗體治療時鼠癌症模型的腫瘤體積減小。
無。
Claims (22)
- 一種抗CEA抗體或其抗原結合片段,其包含在SEQ ID NO:52的胺基酸596至674處特異性結合人CEA的抗體或其結合片段。
- 如請求項1所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段不與其他CEACAM家族成員結合。
- 如請求項1所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其包含: (i) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1(重鏈互補決定區1)、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3,以及輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1(輕鏈互補決定區1)、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3; (ii) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 24的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 25的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 26的HCDR3;以及輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(d) SEQ ID NO: 27的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 28的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 23的LCDR3;或 (iii) 重鏈可變區,該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 41的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 42的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 43的HCDR3;以及輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(d) SEQ ID NO: 44的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 45的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 40的LCDR3。
- 如請求項3所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其包含: (i) 重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 14至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列,以及輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 15至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列; (ii) 重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 31至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列,以及輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 32至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列;或 (iii) 重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 48至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列,以及輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 49至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
- 如請求項4所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其中SEQ ID NO: 14、15、31、32、48或49中已插入、缺失或取代一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。
- 如請求項1所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其包含: (i) 包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區(VL); (ii) 包含SEQ ID NO: 31的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO: 32的輕鏈可變區(VL);或 (iii) 包含SEQ ID NO: 48的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO: 49的輕鏈可變區(VL)。
- 如請求項1至6中任一項所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其為單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人工程化抗體、單鏈抗體(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab') 2片段。
- 如請求項1至7中任一項所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。
- 如請求項1至7中任一項所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段具有降低的糖基化或無糖基化或係低岩藻糖基化的。
- 如請求項1至7中任一項所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段包含增加的二等分GlcNac結構。
- 如請求項1至7中任一項所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該Fc結構域係IgG1。
- 如請求項1至7中任一項所述之抗CEA抗體或抗原結合片段,其中該抗體軛合到毒素。
- 一種藥物組成物,其包含如請求項1至7中任一項所述之抗CEA抗體或其抗原結合片段,進一步包含藥學上可接受的載劑。
- 一種治療癌症之方法,其包括向有需要的患者投與有效量的如請求項1所述之抗體或抗原結合片段。
- 如請求項14所述之方法,其中該癌症係胃癌、結腸癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、間皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
- 如請求項14所述之方法,其中該抗體或抗原結合片段與另一種治療劑組合投與。
- 如請求項16所述之方法,其中該治療劑係紫杉醇或紫杉醇藥劑、多西他賽、卡鉑、托泊替康、順鉑、伊立替康、多柔比星、來那度胺或5-氮雜胞苷。
- 如請求項16所述之方法,其中該治療劑係抗PD1或抗PDL1抗體。
- 一種分離的核酸,其編碼如請求項1至7中任一項所述之抗CEA抗體或抗原結合片段。
- 一種載體,其包含如請求項19所述之核酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項19所述之核酸或如請求項20所述之載體。
- 一種用於生產抗CEA抗體或其抗原結合片段之方法,其包括培養如請求項21所述之宿主細胞以及從培養物中回收該抗體或抗原結合片段。
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