JP2024519078A - 抗ｃｅａ抗体及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、ヒトＣＥＡに結合する抗体及びその抗原結合フラグメント、前記抗体を含む医薬組成物、ならびにがんなどの疾患を治療するための抗ＣＥＡ抗体または組成物の使用を提供する。【選択図】なし

Description

本明細書には、ヒトＣＥＡに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、及びがんの治療に使用する方法が開示される。

がん胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５またはＣＤ６６ｅとしても知られる）は、存在するグリコシル化の量に応じて分子量が約７０～１００ｋＤａの糖タンパク質である。ヒト腺癌におけるがん特異抗原として関連するＣＥＡの存在は、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２１，４３９（１９６５）によって最初に報告された。ＣＥＡは、通常、様々な腺上皮組織（胃腸管、呼吸器管、及び泌尿生殖管など）で発現しており、細胞の頂端表面に局在していると考えられる（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｓ．Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．９，６７－８１（１９９９））。例えば、結腸の円柱上皮及び杯細胞において見出される（Ｆｒａｅｎｇｓｍｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．２０：２７７－２９２（１９９９））。これらの組織タイプから生成された腫瘍では、ＣＥＡ発現は頂端膜から細胞表面まで増加し、細胞表面から除去されると血流に入る（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｓ．Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．９，６７－８１；（１９９９）；Ｆｒａｅｎｇｓｍｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．２０：２７７－２９２（１９９９）も参照）。ＣＥＡの過剰発現は、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、肝細胞癌、乳癌、甲状腺癌など、多くの種類のがんで観察された。したがって、ＣＥＡは、がんの予後及び管理においてがん患者の血液中のＣＥＡレベルの上昇を判定するための診断腫瘍マーカーとして有用である（Ｃｈｅｖｉｎｓｋｙ，Ａ．Ｈ．（１９９１）Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．７，１６２－１６６；Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２，３５５－３９９）。

ＣＥＡは、標的療法に有用な腫瘍関連抗原と考えられている（Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２２：４２５５－６４）。１つのアプローチは、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖを表示し、ＣＥＡを発現するがん細胞に一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）遺伝子を送達するレトロウイルス構築物の生成であった。（Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０（６Ａ）：４０６７－７１）。別のアプローチは、放射性同位体を抗ＣＥＡ抗体に結合させ、放射線がＣＥＡ発現腫瘍に特異的に向けられたことを実証することであった（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８，１０２５６－６０（２００１）、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，８６：１３９２－１４０３（１９９１）、Ｏｌａｆｓｅｎ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１７，２１－２７，（２００４）、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：４４８４－４４９２（２００９）、Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４６：６２０－６３３（２００５））。放射性同位体によるアプローチは、抗ＣＥＡ抗体薬物複合体（ＡＤＣ）にも拡張されている。例えば、Ｓｈｉｎｍｉ ｅｔ ａｌ．は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に結合した抗ＣＥＡ抗体について報告した（Ｓｈｉｎｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ．６（４）：７９８－８０８（２０１７））。

しかし、抗ＣＥＡ抗体の問題の１つは交差反応性である。ＣＥＡは他のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーと高い相同性を示す。例えば、ヒトＣＥＡはＣＥＡＣＡＭ６と８４％の相同性、ＣＥＣＡＭ８と７７％の相同性、ＣＥＡＣＡＭ１と７３％の相同性を示す。本開示は、ＣＥＡに特異的な抗ＣＥＡ抗体を提供する。

本開示は、抗ＣＥＡ抗体及びその抗原結合フラグメントを対象とする。本開示は、以下の実施形態を包含する。

配列番号５２のアミノ酸５９６～～６７４でヒトＣＥＡに特異的に結合する抗体またはその結合フラグメントを含む、抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメント。

他のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーに結合しない、前記抗ＣＥＡ抗体または前記抗原結合フラグメント。

（ｉ）（ａ）配列番号７のＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）と、（ｂ）配列番号８のＨＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号９のＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、及び、（ｄ）配列番号１０のＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）と、（ｅ）配列番号１１のＬＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号６のＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）（ａ）配列番号２４のＨＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号２５のＨＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号２６のＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、及び、（ｄ）配列番号２７のＬＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号２８のＬＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２３のＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域；または
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号４１のＨＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号４２のＨＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号４３のＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、及び、（ｄ）配列番号４４のＬＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号４５のＬＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号４０のＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。

（ｉ）配列番号１４と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１５と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号３１と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号３２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
（ｉｉｉ）配列番号４８と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４９と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、前記抗ＣＥＡ抗体または前記抗原結合フラグメント。

配列番号１４、１５、３１、３２、４８、または４９内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸が挿入、削除、または置換されている、前記抗ＣＥＡ抗体または前記抗原結合フラグメント。

（ｉ）配列番号１４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１５を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号３１を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号３２を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
（ｉｉｉ）配列番号４８を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、前記抗ＣＥＡ抗体または前記抗原結合フラグメント。

モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト改変抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、またはＦ（ａｂ’）_２フラグメントである、前記抗ＣＥＡ抗体または前記抗原結合フラグメント。

抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有する、前記抗ＣＥＡ抗体または前記抗原結合フラグメント。

グリコシル化が低下しているか、グリコシル化がないか、または低フコシル化されている、前記抗ＣＥＡ抗体または前記抗原結合フラグメント。

増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を含む、前記抗ＣＥＡ抗体または前記抗原結合フラグメント。

ＦｃドメインがＩｇＧ１である、前記抗ＣＥＡ抗体または前記抗原結合フラグメント。

前記抗体が毒素に結合している、前記抗ＣＥＡ抗体または前記抗原結合フラグメント。

前記抗ＣＥＡ抗体またはその前記抗原結合フラグメントを含む医薬組成物であって、薬学的に許容される担体をさらに含む、前記医薬組成物。

有効量の前記抗体または前記抗原結合フラグメントを、必要とする患者に投与することを含む、がんの治療方法。

前記がんが、胃癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、頭頚部癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫及び肉腫である、前記方法。

前記抗体または前記抗原結合フラグメントが、別の治療剤と組み合わせて投与される、前記方法。

前記治療剤が、パクリタキセルもしくはパクリタキセル剤、ドセタキセル、カルボプラチン、トポテカン、シスプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、レナリドマイド、または５－アザシチジンである、前記方法。

前記治療剤が、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤＬ１抗体である、前記方法。

前記抗ＣＥＡ抗体または前記抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸。

前記核酸を含む、ベクター。

前記核酸または前記ベクターを含む、宿主細胞。

前記宿主細胞を培養し、培養物から抗体または抗原結合フラグメントを回収することを含む、前記抗ＣＥＡ抗体またはその前記抗原結合フラグメントを産生する方法。

一実施形態では、抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４１、配列番号４２、もしくは配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、及び／または（ｂ）配列番号１０、配列番号１１、配列番号６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２３、配列番号４４、配列番号４５、もしくは配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域を含む。

別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号７、配列番号２４、もしくは配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、配列番号８、配列番号２５、もしくは配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、配列番号９、配列番号２６、もしくは配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３との３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、及び／または（ｂ）配列番号１０、配列番号２７、もしくは配列番号４４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、配列番号１１、配列番号２８、もしくは配列番号４５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号６、配列番号２３、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３との３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域を含む。

別の実施形態では、抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３との３つの相補性決定領域、もしくは、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３との３つの相補性決定領域、もしくは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３との３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、及び／または（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３との３つの相補性決定領域、もしくは、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３との３つの相補性決定領域、もしくは、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３との３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域を含む。

別の実施形態では、抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号７のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号８のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに、（ｄ）配列番号１０のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

別の実施形態では、抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号２４のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２５のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに、（ｄ）配列番号２７のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２８のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号２３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

さらに別の実施形態では、抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４２のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに、（ｄ）配列番号４４のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４５のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号４０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

一実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号１４、配列番号３１、もしくは配列番号４８のアミノ酸配列、または、配列番号１４、配列番号３１、もしくは配列番号４８のいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／または（ｂ）配列番号１５、配列番号３２、もしくは配列番号４９のアミノ酸配列、または、配列番号１５、配列番号３２、もしくは配列番号４９のいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

別の実施形態では、本開示の抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号１４、配列番号３１、もしくは配列番号４８のアミノ酸配列、または、配列番号１４、配列番号３１、もしくは配列番号４８のアミノ酸配列において１、２もしくは３個のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／または（ｂ）配列番号１５、配列番号３２、もしくは配列番号４９のアミノ酸配列、または、配列番号１５、配列番号３２、もしくは配列番号４９のアミノ酸において１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。

一実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。より具体的な実施形態では、本開示の抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１（ヒトＩｇＧ１ｗｔまたはｈｕＩｇＧ１とも呼ばれる）またはＩｇＧ２のＦｃドメインを含む。別の実施形態では、本開示の抗体は、Ｓ２２８Ｐ及び／またはＲ４０９Ｋ置換（ＥＵ番号付けシステムによる）を有するヒトＩｇＧ４のＦｃドメインを含む。

一実施形態では、本開示の抗ＣＥＡ抗体は、１×１０^－６Ｍ～１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）でＣＥＡに結合する。別の実施形態では、本開示の抗体は、約１×１０^－６Ｍ、約１×１０^－７Ｍ、約１×１０^－８Ｍ、約１×１０^－９Ｍ、または約１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）でＣＥＡに結合する。

別の実施形態では、本開示の抗ヒトＣＥＡ抗体は、カニクイザルＣＥＡに対して種間結合活性を示す。

一実施形態では、本開示の抗体は、強力なＦｃ媒介エフェクター機能を有する。抗体は、ＣＥＡを発現する標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。

本開示は、抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメントのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。一実施形態では、単離された核酸は、配列番号１６、配列番号３３もしくは配列番号５０のＶＨヌクレオチド配列、または配列番号１６、配列番号３３もしくは配列番号５０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、本開示の抗体または抗原結合フラグメントのＶＨ領域をコードする。代替的にまたは追加的に、単離された核酸は、配列番号１７、配列番号３４もしくは配列番号５１のＶＬヌクレオチド配列、または配列番号１７、配列番号３４もしくは配列番号５１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、本開示の抗体または抗原結合フラグメントのＶＬ領域をコードする。

別の態様では、本開示は、抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメント、及び任意選択的に薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。

さらに別の態様では、本開示は、治療有効量の抗ＣＥＡ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＣＥＡ抗体医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における疾患を治療する方法に関する。別の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントによって治療される疾患はがんである。

本開示は、がんなどの疾患を治療するための抗ＣＥＡ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＣＥＡ抗体医薬組成物の使用に関する。

脱落したＣＥＡ（ｓＣＥＡ）、キメラＣＥＡ（ＣＨＩＭ）、ＣＥＡＣＡＭ６、及びＣＥＡ変異体（ＣＥＡ－ｖ）の概略図である。ＣＥＡでは、ドメインＮ、Ａ１、Ｂ１、Ａ２、Ｂ２、Ａ３、Ｂ３、及びＧＰＩリンカー（ＧＰＩ）が標識されており、ＣＥＡＣＡＭ６では、ドメインＮ’、Ａ’、及びＢ’が標識されている。 抗ＣＥＡドメインＢ３抗体のＶＨ領域の系統樹を示す図である。候補抗ＣＥＡ抗体のＶＨ配列は、ＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇａａｌｉｇｎ（商標）ソフトウェアを使用してアラインメントされた。配列相同性は系統樹に表示された。 抗ＣＥＡドメインＢ３抗体のＶＬ領域の系統樹を示す図である。候補抗ＣＥＡ抗体のＶＬ配列は、ＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇａａｌｉｇｎ（商標）ソフトウェアを使用してアラインメントされた。配列相同性は系統樹に表示された。 Ａは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるキメラ構築物（ＣＨＩＭ）上の精製マウス抗ＣＥＡ抗体ＢＧＡ１３の親和性測定を示す図である。Ｂは、抗原ＥＬＩＳＡによるＢＧＡ１３の結合プロファイルを示す図である。 ＭＫＮ４５細胞に結合するＣＥＡ抗体に対する可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）の効果を示す図である。可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）の存在下または非存在下におけるドメインＢ３抗体の結合プロファイルを示す。 ＭＫＮ４５細胞に結合するＣＥＡ抗体に対する可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）の効果を示す図である。Ａの抗体結合プロファイルをヒストグラムとして示したものである。 Ａ～Ｂは、ヒト化ＢＧＡ１３抗体の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）領域（Ａ）及び重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）領域（Ｂ）の親和性成熟のための抗体ライブラリーを生成するためのランダム化部位を示す図である。 ４ラウンドの選択後のＢＧＡ１３軽鎖ＣＤＲ領域のアミノ酸変化を示す図である。 フローサイトメトリーによる、親和性成熟ヒト化ＢＧＡ１３変異体のＬＯＶＯ細胞への結合を示す図である。 フローサイトメトリーによる、最適化されたヒト化ＢＧＡ１１３変異体のＭＫＮ４５細胞への結合を示す図である。 Ａ及びＢは、フローサイトメトリー（Ａ）及び抗原ＥＬＩＳＡ（Ｂ）により、抗体ＢＧＡ１１３Ｋの様々なＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーへのオフターゲット結合がないことを実証する図である。 様々な濃度の可溶性ＣＥＡの存在下でのＣＥＡ発現細胞ＭＫＮ４５細胞へのＢＧＡ１１３Ｋ結合に対する可溶性ＣＥＡの効果を示す図である。 抗体ＢＧＡ１１３がインビトロでＡＤＣＣによって細胞を死滅させることを実証する図である。 ＢＧＡ１１３抗体で処置した場合のマウスがんモデルの腫瘍体積の減少を示す図である。

定義
本書類の別の箇所で特に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。

添付の特許請求の範囲を含めて、本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの単数形の単語は、文脈が明らかにそうではないと指示しない限り、それらの対応する複数への参照を含む。

「または」という用語は、文脈が明らかにそうではないと指示しない限り、「及び／または」という用語を意味するために使用され、「及び／または」と同義に使用される。

本明細書で使用される「抗がん剤」という用語は、細胞傷害剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線療法剤、標的化抗がん剤、ならびに免疫療法剤を含むがこれらに限定されない、がんなどの細胞増殖性障害を治療するために使用することができる任意の薬剤を指す。

「がん胎児性抗原」または「ＣＥＡ」という用語は、約７０～１００ｋＤａの糖タンパク質を指す。ＣＥＡはＣＥＡＣＡＭ５またはＣＤ６６ｅとしても知られている。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号５２）は、受託番号Ｐ０６７３１またはＮＭ＿００４３６３．２としても見出すことができる。

本明細書で使用される「投与」、「投与すること」、「治療すること」、及び「治療」という用語は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、または生体液に適用される場合、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官、または生体液への外因性医薬品、治療剤、診断剤、または組成物の接触を意味する。細胞の治療は、試薬の細胞への接触、ならびに試薬の流体への接触を包含し、流体が細胞と接触する。「投与」及び「治療」という用語はまた、例えば細胞の、試薬、診断、結合化合物による、または別の細胞による、インビトロ及びエクスビボ治療を意味する。本明細書における「対象」という用語には、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、及び最も好ましくはヒトが含まれる。一態様において、任意の疾患または障害を処置することは、疾患または障害を緩和すること（すなわち、疾患またはその臨床症状のうちの少なくとも１つの発症を遅らせる、または阻止する、または減少させること）を指す。別の態様において、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、患者によって識別できない可能性のあるものを含む少なくとも１つの物理的パラメータを緩和または改善することを指す。さらに別の態様において、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患または障害を、物理的（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的（例えば、物理的パラメータの安定化）のいずれか、またはその両方で調節することを指す。さらに別の態様において、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患または障害の発症または発達もしくは進行を予防または遅延させることを指す。

本開示の文脈における「対象」という用語は、哺乳動物、例えば、霊長類、好ましくは高等霊長類、例えば、ヒト（例えば、本明細書に記載の障害を有するか、または有するリスクがある患者）である。

本明細書で使用される「親和性」という用語は、抗体と抗原との間の相互作用の強さを指す。抗原内では、抗体の可変領域が非共有結合力を介して多くの部位で抗原と相互作用する。一般に、相互作用が多ければ多いほど、親和性は強くなる。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、対応する抗原に非共有結合的に、可逆的に、かつ特異的に結合することができる免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含む四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略記される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬまたはＶκと略記される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域と共に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に、さらに細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順序で配列される。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を含むが、これらに限定されない。抗体は、いずれかのアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のものであることが可能である。

いくつかの実施形態では、抗ＣＥＡ抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位、少なくとも可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＥＡ抗体は、本明細書に記載のＣＥＡ抗体からの抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＥＡ抗体は、単離されるか、または組み換え体である。

本明細書における「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」もしくは「Ｍａｂ」という用語は、実質的に同種の抗体の集団を意味し、すなわち、その集団に含まれる抗体分子は、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いて、アミノ酸配列が同一である。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は通常、可変ドメイン、特に異なるエピトープに特異的であることが多い相補性決定領域（ＣＤＲ）内に異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含む。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるものとして抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるものではない。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当業者に知られている方法によって得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９７５ ２５６：４９５－４９７；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，３７６，１１０；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ １９９２；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８８；及びＣｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ １９９３を参照されたい。本明細書に開示される抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラス、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのその任意のサブクラスのものであり得る。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養することができる。高力価のモノクローナル抗体は、個々のハイブリドーマからの細胞をマウス（初期刺激済みのＢａｌｂ／ｃマウスなど）に腹腔内注射して、所望の抗体を高濃度に含有する腹水を産生するインビボ産生で得ることができる。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのモノクローナル抗体は、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を使用して、そのような腹水または培養上清から精製することができる。

一般に、基本的な抗体構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「重鎖」（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０以上のアミノ酸長の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義することができる。通常、ヒト軽鎖はカッパ軽鎖とラムダ軽鎖に分類される。さらに、ヒト重鎖は通常、α、δ、ε、γ、またはμとして分類され、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭとして定義される。軽鎖及び重鎖内では、可変領域及び定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖には、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれている。

各軽鎖／重鎖（ＶＬ／ＶＨ）対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、完全な抗体は２つの結合部位を有する。二機能性抗体または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は、一般的に、一次配列において同じである。

通常、重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の間に位置する「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とも呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは通常、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方は、ＦＲ－１（またはＦＲ１）、ＣＤＲ－１（またはＣＤＲ１）、ＦＲ－２（ＦＲ２）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ２）、ＦＲ－３（またはＦＲ３）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ３）、及びＦＲ－４（またはＦＲ４）を含む。ＣＤＲ及びフレームワーク領域の位置は、当技術分野で周知の様々な定義、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ及びＩＭＧＴを使用して決定することができる（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２０５－２０６（２００１）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８８３（１９８９）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７９９－８１７（１９９２）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－７４８（１９９７）ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２－１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５－７７（２００３）（「ＩＭＧＴ」番号付け手順）を参照されたい）。抗原結合部位の定義は以下にも記載されている：Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１９－２２１（２０００）；及びＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２０７－２０９（２００１）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２－７４５（１９９６）；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９２６８－９２７２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０３：１２１－１５３（１９９１）；及びＲｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１４１－１７２（１９９６）。例えば、Ｋａｂａｔでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基には３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付けられており、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基には２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）の番号が付けられている。Ｃｈｏｔｈｉａでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸には２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付けられており、ＶＬのアミノ酸残基には２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）の番号が付けられている。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義の組み合わせにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬのアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基にはおよそ２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５１～５７（ＨＣＤＲ２）、及び９３～１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付けられており、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基にはおよそ２７～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）の番号が付けられている（Ｋａｂａｔによる番号付け）。ＩＭＧＴでは、抗体のＣＤＲ領域を、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎを使用して決定することができる。

「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「ＣＤＲ」（例えば、軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）からのアミノ酸残基を含む。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（配列によって抗体のＣＤＲ領域を定義している）を参照されたい。また、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（構造によって抗体のＣＤＲ領域を定義している）をも参照されたい。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書においてＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を意味する。

他に示さない限り、「抗原結合フラグメント」は、抗体の抗原結合フラグメント、すなわち、完全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域を保持する断片を意味する。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子、例えば、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）；ナノボディ及び抗体断片から形成された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、抗体が標的タンパク質に「特異的に結合」することは、抗体が他のタンパク質と比較してその標的に対して優先的な結合を示すことを意味するが、この特異性は、絶対的な結合特異性を必要としない。抗体が「特異的に結合する」または「選択的に結合する」ことは、抗原（例えば、タンパク質）と抗体または抗原結合抗体フラグメントとの間の相互作用を説明する文脈で使用され、タンパク質及び他の生物製剤の不均一集団、例えば生物学的サンプル、血液、血清、血漿または組織サンプルにおける抗原の存在を決定する結合反応を指す。したがって、特定の指定されたイムノアッセイ条件下では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、バックグラウンドレベルと比較して少なくとも２倍特定の抗原に特異的に結合し、サンプル中に存在する他の抗原には有意な量で特異的に結合しない。一態様では、指定されたイムノアッセイ条件下では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、結合のバックグラウンドレベルと比較して少なくとも１０倍特定の抗原に特異的に結合し、サンプル中に存在する他の抗原には有意な量で特異的に結合しない。

本明細書において「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。ヒト抗体は、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞由来のハイブリドーマで生成される場合、マウスの糖鎖を含むことができる。同様に、「マウス抗体」または「ラット抗体」は、それぞれマウスまたはラットの免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。

「ヒト化」または「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト（例えばマウス）抗体及びヒト抗体由来の配列を含む抗体の形態を意味する。このような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。ヒト化抗体をげっ歯類の親抗体と区別するために必要な場合、接頭辞「ｈｕｍ」、「ｈｕ」、「Ｈｕ」、または「ｈ」が抗体クローンの名称に追加される。げっ歯類抗体のヒト化形態は、一般に、げっ歯類の親抗体と同じＣＤＲ配列を含むが、親和性を高め、ヒト化抗体の安定性を高め、翻訳後修飾を除去するため、または他の理由のために、特定のアミノ酸置換を含むことができる。

「対応するヒト生殖系列配列」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域配列によってコードされる他のすべての既知の可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列またはサブ配列と決定された最も高いアミノ酸配列同一性を共有するヒト可変領域アミノ酸配列またはサブ配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖系列配列は、他のすべての評価された可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列またはサブ配列と最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列またはサブ配列を指すこともできる。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワーク及び相補性決定領域、可変セグメント（上記で定義したとおり）、または可変領域を含む配列もしくはサブ配列の他の組み合わせであり得る。配列同一性は、本明細書に記載の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、または当技術分野で公知の別のアラインメントアルゴリズムを使用して２つの配列をアラインメントすることを使用して決定することができる。対応するヒト生殖系列核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領域の核酸またはアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もそのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、もしくはヒト生殖系列配列の変異バージョン、または、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７－８６，２０００に記載されているように、ヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列を含む抗体に由来する。

「平衡解離定数（Ｋ_Ｄ、Ｍ）」という用語は、解離速度定数（ｋｄ、時間^－１）を結合速度定数（ｋａ、時間^－１、Ｍ^－１）で割ったものを指す。平衡解離定数は、当技術分野で知られている任意の方法を使用して測定することができる。本開示の抗体は、一般に、約１０^－７Ｍ未満または１０^－８Ｍ未満、例えば、約１０^－９Ｍ未満または１０^－１０Ｍ未満、いくつかの態様では、約１０^－１１Ｍ未満、１０^－１２Ｍ未満、または１０^－１３Ｍ未満の平衡解離定数を有することになる。

本明細書における「がん」または「腫瘍」という用語は、当該技術分野で理解される最も広い意味を有し、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指す。本開示の文脈において、がんは、特定の種類または位置に限定されない。

本開示の文脈において、アミノ酸配列に言及する場合、「保存的置換」という用語は、元のアミノ酸の、抗体またはフラグメントの化学的、物理的及び／または機能的特性、例えば、そのＣＥＡへの結合親和性を実質的に改変しない新しいアミノ酸による置換を意味する。具体的には、アミノ酸の一般的な保存的変換は当該技術分野で周知である。

本明細書で使用される「ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ」技術という用語は、１つのポリペプチド内に空間的隆起（ｋｎｏｂ）を導入し、他のポリペプチド内にソケットまたは空洞（ｈｏｌｅ）を導入する（それらが相互作用する界面において）ことによって、インビトロまたはインビボのいずれかで２つのポリペプチドの対合を一緒に指示するアミノ酸を指す。例えば、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、Ｃ_Ｌ：Ｃ_ＨＩ界面、またはＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ界面に導入されている（例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、及びＺｈｕ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：７８１－７８８を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅは、抗体の製造中に、２つの異なる重鎖が一緒になる正しい対合を保証する。例えば、それらのＦｃ領域内にｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅアミノ酸を有する抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインをさらに含み得るか、または類似のもしくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインをさらに含み得る。Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ技術をＶＨまたはＶＬ領域で使用して正しい対合を保証することもできる。

本明細書で使用される「ｋｎｏｂ」という用語は、「ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ」技術の文脈では、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面において、ポリペプチド内に隆起（ｋｎｏｂ）を導入するアミノ酸の変化を指す。いくつかの実施形態において、他のポリペプチドは、ｈｏｌｅ突然変異を有する。

本明細書で使用される「ｈｏｌｅ」という用語は、「ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ」の文脈では、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面において、ポリペプチド内にソケットまたは空洞（ｈｏｌｅ）を導入するアミノ酸の変化を指す。いくつかの実施形態において、他のポリペプチドは、ｋｎｏｂ突然変異を有する。

パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９７７；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて一般に入手可能である。このアルゴリズムは、第１に、データベース配列において同じ長さのワードと整列するときに、一致するかまたは何らかの正値の閾値スコアＴを満たすクエリ配列における長さＷの短いワードを特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と称される。これらの初期の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための値として機能する。ワードヒットは、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に延びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（マッチする残基の対についての報酬スコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチする残基についてのペナルティスコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコア化マトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向の単語ヒットの拡張は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少するか、１つ以上の負のスコア残基アライメントの累積に起因して累積スコアがゼロもしくはゼロ以下になるか、または配列のいずれかの終わりに達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１の単語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴプログラムは、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、ならびに５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５７８７，１９９３を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸とを比較した際の最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、参照配列に類似しているとみなされる。

２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１－１７，（１９８８）のアルゴリズムを使用して決定することもできる。このアルゴリズムは、ＰＡＭ１２０重み剰余テーブル、１２のギャップ長さペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用してＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み及び１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３，（１９７０）のアルゴリズムを使用して決定することができる。

「核酸」という用語は、本明細書で「ポリヌクレオチド」という用語と同義に使用され、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態でのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。この用語は、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または結合を含有する核酸を包含し、これらは、合成物、天然存在物、及び非天然存在物であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。かかる類似体の例としては、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。

「作用可能に連結された」という用語は、核酸の文脈では、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、転写調節配列の転写配列に対する機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、適切な宿主細胞または他の発現系におけるコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、転写配列に作動可能に連結されているプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に連続しており、すなわち、それらはシス作動性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写調節配列は、それらが転写を増強するコード配列に物理的に連続しているか、または近接して位置する必要はない。

いくつかの態様において、本開示は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化される、本明細書に記載の抗ＣＥＡ抗体を含む組成物、例えば、薬学的に許容される組成物を提供する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、生理学的に適合性である任意の及びすべての溶媒、分散媒体、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。賦形剤は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、直腸、脊髄、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に好適であり得る。

本明細書に開示される組成物は、様々な形態であることができる。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射及び注入溶液）、分散液または懸濁液、リポソーム、及び坐剤などの液体、半固体及び固体剤形が含まれる。好適な形態は、意図される投与様式及び治療的適用に依存する。典型的な好適な組成物は、注射液または注入液の形態である。１つの好適な投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。いくつかの実施形態では、抗体は、静脈内注入または注射によって投与される。ある特定の実施形態において、抗体は、筋肉内または皮下注射によって投与される。

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、疾患、または疾患もしくは障害の臨床症状のうちの少なくとも１つを治療するために対象に投与するときに、疾患、障害、または症状に対してそのような治療を達成するのに十分である抗体の量を指す。「治療有効量」は、抗体、疾患、障害、及び／または疾患もしくは障害の症状、疾患、障害、及び／または疾患もしくは障害の症状の重症度、治療される対象の年齢、及び／または治療される対象の体重と共に変化し得る。任意の所与の事例における適切な量は、当業者には明白であり得るか、または慣例的な実験によって決定することができる。併用療法の場合、「治療有効量」は、疾患、障害、または状態の効果的な治療のための併用対象の総量を指す。

「併用療法」という用語は、本開示に記載される治療的状態または障害を治療するための２つ以上の治療剤の投与を指す。かかる投与は、実質的に同時の様式でのこれらの治療剤の同時投与を包含する。かかる投与はまた、各活性成分について、複数の容器内または別々の容器内（例えば、カプセル、粉末、及び液体）での同時投与を包含する。粉末及び／または液体は、投与前に所望の用量に再構成または希釈され得る。さらに、このような投与は、ほぼ同じ時間または異なる時間のいずれかで、各種の治療剤を順次使用することも包含する。いずれの場合においても、治療レジメンは、本明細書に記載の状態または障害の治療において薬物併用の有益な効果を提供する。

本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」という語句は、抗ＣＥＡ抗体が、追加の治療剤の投与と同時に、その直前に、またはその直後に、対象に投与されることを意味する。ある特定の実施形態において、抗ＣＥＡ抗体は、追加の治療剤との共製剤として投与される。

「毒素」または「ペイロード」または「細胞傷害性剤」という用語は、本明細書では、細胞内の分子の発現、細胞の機能を阻害または低減し、細胞のアポトーシスを誘導し、及び／または細胞の破壊を引き起こす分子として使用される。この用語は、放射性同位体、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素（それらの断片及び／または変異形を含む）を含む。細胞傷害性剤の例としては、オーリスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）、オーロマイシン、メイタンシノイド、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、リシン、リシンＡ鎖、コムブラスタチン、デュオカルミシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、キュリシン、クロチン、カリケアマイシン、ならびにＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２または２１３、Ｐ３２、及びＬｕ１７７などの放射性同位体を挙げることができるが、これらに限定されない。

発明を実施するための形態
本開示は、抗ＣＥＡ抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。さらに、本開示は、所望の薬物動態特性及び他の所望の属性を有し、したがって、がんの可能性を低減するために、またはがんを治療するために使用することができる抗体を提供する。本開示は、がん及び関連する障害の予防及び治療のために、抗体を含む薬学的組成物、ならびにそのような薬学的組成物を作製及び使用する方法をさらに提供する。

抗ＣＥＡ抗体
本開示は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、以下に記載されるように生成される抗体またはその抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。

本開示は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントを提供し、ここで、前記抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号１４、３１または４８のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む（表１）。本開示はまた、ＣＥＡに特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントを提供し、ここで、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に列挙されるＨＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＣＤＲを含む。一態様では、本開示は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントを提供し、ここで、前記抗体は、表１に列挙されるＨＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３、またはそれ以上のＨＣＤＲを含む（あるいは、１、２、３、またはそれ以上のＨＣＤＲからなる）。

本開示は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントを提供し、ここで、前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１５、３２または４９のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む（表１）。本開示はまた、ＣＥＡに特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントを提供し、ここで、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に列挙されるＬＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＬＣＤＲを含む。特に、本開示は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に列挙されるＬＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３、またはそれ以上のＬＣＤＲを含む（あるいは、１、２、３、またはそれ以上のＬＣＤＲからなる）。

本開示の他の抗体またはその抗原結合フラグメントは、変更されているが、表１に開示されたＣＤＲ領域においてＣＤＲ領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの態様では、これは、表１に記載の配列に示されるＣＤＲ領域と比較した場合、ＣＤＲ領域において１、２、３、４または５個以下のアミノ酸が変更されているアミノ酸変化を含む。

本開示の他の抗体は、アミノ酸、またはアミノ酸をコードする核酸が変更されているが、表１に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するものを含む。いくつかの態様では、これは、表１に記載の配列に示される可変領域と比較した場合、実質的に同じ治療活性を保持しながら、可変領域において１、２、３、４または５個以下のアミノ酸が変更されているアミノ酸配列の変化を含む。

本開示はまた、ＣＥＡに特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、及び全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。このような核酸配列は、哺乳類細胞における発現のために最適化することができる。

本開示は、ヒトＣＥＡのエピトープに結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。特定の態様では、抗体及び抗原結合フラグメントは、ＣＥＡの同じエピトープに結合することができる。

本開示は、表１に記載の抗ＣＥＡ抗体と同じエピトープに結合する抗体及びその抗原結合フラグメントも提供する。したがって、追加の抗体及びその抗原結合フラグメントは、結合アッセイにおいて他の抗体と交差競合する（例えば、統計的に有意な方法で結合を競合的に阻害する）能力に基づいて同定することができる。本開示の抗体及びその抗原結合フラグメントのＣＥＡへの結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がＣＥＡへの結合に関してその抗体またはその抗原結合フラグメントと競合できることを実証する。このような抗体は、いずれか１つの理論に束縛されることなく、競合する抗体またはその抗原結合フラグメントと同じまたは関連する（例えば、構造的に類似したまたは空間的に近位の）ＣＥＡ上のエピトープに結合することができる。特定の態様では、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントと同じＣＥＡ上のエピトープに結合する抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。このようなヒトまたはヒト化モノクローナル抗体は、本明細書に記載のように調製及び単離することができる。

リンカー
抗体のポリペプチド鎖のドメイン及び／または領域は、様々な長さのリンカー領域によって分離することができることもまた理解される。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、リンカー領域によって互いに、ＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＦｃ領域全体から分離されている。例えば、ＶＬ１－ＣＬ－（リンカー）ＶＨ２－ＣＨ１のようなリンカー領域は、ランダムなアミノ酸の類別、または限定されたアミノ酸のセットを含み得る。このようなリンカー領域は、柔軟であっても剛直であってもよい（ＵＳ２００９／０１５５２７５を参照）。

異なる実施形態では、リンカーを使用して、毒素と抗体との間の化合物を結合させることができ、いくつかの実施形態では、リンカーは細胞内条件下で切断可能であり、リンカーの切断により細胞内環境において抗体から毒素が放出される。さらに他の実施形態では、リンカーユニットは切断可能ではなく、例えば抗体分解によって毒素が放出される。リンカーは、制限なく、切断可能なリンカー、非切断可能なリンカー、親水性リンカー、プロチャージされたリンカー、及びジカルボン酸ベースのリンカーであり得る。

二量体化特異的アミノ酸
一実施形態では、抗体は少なくとも１つの二量体化特異的アミノ酸変化を含む。二量体化特異的アミノ酸変化により、「ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ」の相互作用が生じ、正しい抗体の集合が増加する。二量体化特異的アミノ酸は、ＣＨ１ドメインもしくはＣＬドメインまたはそれらの組み合わせ内にあり得る。二量体化特異的アミノ酸は、ＣＨ１ドメインと他のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１－ＣＨ１）、及びＣＬドメインと他のＣＬドメイン（ＣＬ－ＣＬ）を対にするために使用され、少なくともＷＯ２０１４０８２１７９、ＷＯ２０１５１８１８０５ファミリー及びＷＯ２０１７０５９５５１の開示で見出すことができる。二量体化特異的アミノ酸は、Ｆｃドメイン内にあってもよく、ＣＨ１またはＣＬドメイン内の二量体化特異的アミノ酸と組み合わされてもよい。一実施形態において、本開示は、少なくとも１つの二量体化特異的アミノ酸対を含む抗体を提供する。

Ｆｃ領域のフレームワークのさらなる改変
さらに他の態様において、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えて抗体のエフェクター機能を改変することにより、Ｆｃ領域が改変される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，６２４，８２１号及び同第５，６４８，２６０号に記載されている。

別の態様において、抗体が改変されたＣ１ｑ結合及び／または低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、１つ以上のアミノ酸残基が、１つ以上の異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このアプローチについては、例えば、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．による米国特許第６，１９４，５５１号に記載されている。

さらに別の態様において、１つ以上のアミノ酸残基が変更され、それにより、補体を固定する抗体の能力が改変される。このアプローチは、例えば、Ｂｏｄｍｅｒ ｅｔ ａｌ．による公開第ＷＯ９４／２９３５１号に記載される。特定の態様において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントの１つ以上のアミノ酸は、ＩｇＧ１サブクラス及びカッパアイソタイプについての１つ以上のアロタイプのアミノ酸残基によって置き換えられる。アロタイプのアミノ酸残基には、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３サブクラスの重鎖の定常領域、ならびにＪｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂ．１：３３２－３３８（２００９）によって記述されるカッパアイソタイプの軽鎖の定常領域も含まれる。

別の態様では、Ｆｃ領域は、１つ以上のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるため、及び／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるために修飾される。このアプローチは、例えば、Ｐｒｅｓｔａによる公開ＷＯ００／４２０７２に記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎについてのヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされ、結合が改善された変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４，２００１を参照）。

さらに別の態様では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化が欠如しているか、グリコシル化が低下している）。グリコシル化を変更して、例えば「抗原」に対する抗体の親和性を高めることができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を変更することによって達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１つ以上のアミノ酸置換を行うことができ、それによってその部位でのグリコシル化が除去される。このような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。このようなアプローチは、例えば、Ｃｏ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号に記載されている。

さらに、または代わりに、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体または増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体など、改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することができる。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化経路が改変された宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化経路が改変された細胞は当該技術分野で記載されており、組換え抗体を発現させてグリコシル化が改変された抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．によるＥＰ１，１７６，１９５には、そのような細胞株で発現される抗体が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株が記載されている。Ｐｒｅｓｔａによる公開ＷＯ０３／０３５８３５には、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合する能力が低下した変異型ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されており、これはその宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化ももたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０をも参照）。Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．によるＷＯ９９／５４３４２は、操作された細胞株で発現される抗体が二分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）－ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株を記載しており、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性が増加する（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０，１９９９をも参照）。

別の態様において、ＡＤＣＣの低減が所望される場合、ヒト抗体サブクラスＩｇＧ４は、多くの以前の報告において、適度なＡＤＣＣのみを有し、ＣＤＣエフェクター機能をほとんど有しないことが示された（Ｍｏｏｒｅ ＧＬ，ｅｔ ａｌ．，２０１０ ＭＡｂｓ，２：１８１－１８９）。しかしながら、天然のＩｇＧ４は、酸性緩衝液中または昇温中などのストレス条件において安定性が低いことが見出された（Ａｎｇａｌ，Ｓ．１９９３ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０：１０５－１０８；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：９２６６－９２７３；Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０５：９－１９）。低減されたＡＤＣＣは、抗体を、ＦｃγＲ結合またはＣ１ｑ結合活性を低減する改変の組み合わせによって操作されたＩｇＧ４ Ｆｃに動作可能に結合し、それによってＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター機能を低減または排除することによって達成することができる。生物学的薬としての抗体の物理化学的特性を考慮すると、ＩｇＧ４のより望ましくない内在的特性の１つは、溶液中におけるその２つの重鎖を動的に分離して半分の抗体を形成することであり、これにより、「Ｆａｂアーム交換」と呼ばれるプロセスを介してインビボで二重特異性抗体が生成される（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１７：１５５４－１５７）。２２８位（ＥＵ番号付けシステム）におけるセリンのプロリンへの突然変異は、ＩｇＧ４重鎖分離に対して阻害されるように見えた（Ａｎｇａｌ，Ｓ．１９９３ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０：１０５－１０８；Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０５：９－１９）。ヒンジ及びγＦｃ領域のアミノ酸残基のいくつかは、Ｆｃγ受容体との抗体相互作用に影響を与えることが報告されている（Ｃｈａｐｐｅｌ Ｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９０３６－９０４０；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ，９：１１５－１１９；Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２９：２６１３－２６２４；Ｃｌｙｎｅｓ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ，２０００ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６：４４３－４４６；Ａｒｎｏｌｄ Ｊ．Ｎ．，２００７ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ ｉｍｍｕｎｏｌ，２５：２１－５０）。さらに、ヒト集団において稀に生じるいくつかのＩｇＧ４アイソフォームはまた、異なる物理化学的特性を誘発することができる（Ｂｒｕｓｃｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ，２５：３４９－５５；Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０５：９－１９）。低いＡＤＣＣ及びＣＤＣを有するが良好な安定性を有する抗体を生成するために、ヒトＩｇＧ４のヒンジ及びＦｃ領域を修飾し、いくつかの改変を導入することが可能である。これらの修飾ＩｇＧ４ Ｆｃ分子は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．による米国特許第８，７３５，５５３号の配列番号８３～８８に見出すことができる。

抗体産生
抗体及びその抗原結合フラグメントは、抗体四量体の組換え発現、化学合成、及び酵素消化を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている任意の手段によって産生することができ、一方、完全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え生産によって得ることができる。組換え発現は、当該技術分野で既知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などに由来し得る。

本開示はさらに、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載の相補性決定領域を含む重鎖または軽鎖可変領域またはセグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６、配列番号３３、または配列番号５０からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの態様では、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７、配列番号３４、または配列番号５１からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。

本開示のポリヌクレオチドは、抗ＣＥＡ抗体の可変領域配列をコードすることができる。本開示のポリヌクレオチドは、抗体の可変領域と定常領域の両方をコードすることもできる。ポリヌクレオチド配列のいくつかは、例示された抗ＣＥＡ抗体の重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。

本開示において、抗ＣＥＡ抗体を生成するための発現ベクター及び宿主細胞も提供される。発現ベクターの選択は、ベクターが発現される意図された宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、抗ＣＥＡ抗体鎖または抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーター及び他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有する。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、誘導条件の制御下にある場合以外に挿入された配列の発現を防止するために使用される。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物の培養物は、発現産物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列のために集団を偏らせることなく、非誘導条件下で増やすことができる。プロモーターに加えて、他の調節エレメントも、抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメントの効率的な発現のために必要とされ、または所望され得る。これらのエレメントは、典型的には、ＡＴＧ開始コドン及び隣接リボソーム結合部位または他の配列を含む。加えて、発現の効率は、使用中の細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって高めることができる（例えば、Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；及びＢｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７を参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳類宿主細胞における発現を増加させることができる。

抗ＣＥＡ抗体鎖を保有及び発現するための宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。Ｅ．ｃｏｌｉは、本開示のポリヌクレオチドのクローニング及び発現に有用な１つの原核宿主である。使用に適した他の微生物宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの桿菌、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、及び種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種などの他の腸内細菌科が挙げられる。これらの原核宿主において、発現ベクターを作製することもでき、これは典型的には、宿主細胞（例えば、複製起点）に適合する発現制御配列を含有する。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダ由来のプロモーター系など、任意の数の様々な既知のプロモーターが存在するであろう。プロモーターは、典型的には、任意選択的にオペレーター配列によって発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完了するための、リボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物も、抗ＣＥＡ抗体を発現するために使用することができる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。

他の態様において、哺乳動物宿主細胞を使用して、本開示の抗ＣＥＡ抗体を発現及び産生する。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、または外因性発現ベクターを有する哺乳動物細胞株であり得る。これらには、任意の正常な致死または正常もしくは異常な不死の動物またはヒト細胞が含まれる。例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨＥＫ２９３細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞、及びハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロブリンを分泌することができるいくつかの好適な宿主細胞株が開発されている。ポリペプチドを発現するための哺乳類組織細胞培養物の使用は、概して、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，１９８７において議論される。哺乳類宿主細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、及びエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９－６８，１９８６を参照されたい）、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、ステージ特異的、及び／または調節可能（ｍｏｄｕｌａｔａｂｌｅ）もしくは調節可能（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）であり得る。有用なプロモーターとしては、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト最初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、及び当該技術分野において知られているプロモーター－エンハンサーの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

検出及び診断方法
本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＥＡの検出方法を含むがこれらに限定されない様々な用途において有用である。一態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、生体試料中のＣＥＡの存在の検出に有用である。本明細書で使用される「検出すること」という用語は、定量または定性検出を含む。ある特定の態様では、生物学的試料は、細胞または組織を含む。他の態様では、かかる組織は、他の組織と比較して高レベルでＣＥＡを発現する正常な組織及び／またはがん性組織を含む。

一態様において、本開示は、生体試料中のＣＥＡの存在を検出する方法を提供する。ある特定の態様において、この方法は、生体試料と、抗ＣＥＡ抗体とを、抗原に抗体が結合することを許容する条件下で接触させることと、複合体が抗体と抗原との間で形成されるかどうかを検出することと、を含む。生体試料は、尿、組織、痰、または血液サンプルを含み得るが、これらに限定されない。

また、ＣＥＡの発現に関連する障害を診断する方法も含まれる。特定の態様では、この方法は、試験細胞を抗ＣＥＡ抗体と接触させることと、抗ＣＥＡ抗体のＣＥＡポリペプチドへの結合を検出することによって、試験細胞によって発現されるＣＥＡの発現レベル（定量的または定性的のいずれか）を決定することと、試験細胞による発現レベルを、対照細胞（例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞または非ＣＥＡ発現細胞）におけるＣＥＡ発現レベルと比較することとを含み、ここで、対照細胞と比較して試験細胞におけるＣＥＡ発現の高いレベルは、ＣＥＡの発現に関連する障害の存在を示す。

治療方法
本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＥＡ関連障害または疾患の治療方法を含むがこれらに限定されない様々な用途において有用である。一態様では、ＣＥＡ関連障害または疾患はがんである。

一態様において、本開示は、がんの治療方法を提供する。ある特定の態様において、方法は、有効量の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメントを必要とする患者に投与することを含む。がんとしては、胃癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、頭頚部癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫及び肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、非経口、肺内、及び鼻腔内を含む任意の好適な手段によって投与することができ、所望の場合、局所治療、病変内投与を含む。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短期であるか、または長期であるかに部分的に依存して、任意の適した経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注入によることができる。限定されないが、様々な時点での単回または複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書において企図される。

本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、グッドメディカルプラクティス（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）と一致した様式で製剤化、投薬、及び投与することができる。この文脈における考慮の要因には、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的病態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール管理、及び医療従事者に既知の他の要因が含まれる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意に、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療の種類、及び上で考察される他の要因に左右される。これらは、一般に、本明細書に記載されるのと同じ投薬量、投与経路により、または本明細書に記載される投薬量の約１～９９％、または適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投薬量で、任意の経路によって、使用される。

疾患の予防または治療のため、本開示の抗体または抗原結合フラグメントの適切な投与量は、治療される疾患の種類、抗体の種類、その疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、これまでの治療法、患者の臨床歴及び抗体への反応、ならびに主治医の判断に応じて異なる。抗体は好適に、１回で、または一連の治療にわたって患者に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によるものであれ、連続注入によるものであれ、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの抗体が、患者への投与のための初期候補投薬量であり得る。１つの典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。病態に依存する、数日間またはより長い日数にわたる反復投与について、治療は、一般に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。かかる用量は、間欠的に、例えば、毎週または３週間に１回（例えば、患者が約２～約２０回、または例えば約６回用量の抗体を受けるように）投与され得る。最初により高い負荷用量、続いて１つ以上のより低い用量を投与することができる。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。

併用療法
一態様において、本開示の抗ＣＥＡ抗体は、他の治療剤と併用することができる。本開示の抗ＣＥＡ抗体と共に使用することができる他の治療剤としては、化学療法剤（例えば、パクリタキセルまたはパクリタキセル剤（例えば、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ドセタキセル、カルボプラチン、トポテカン、シスプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、レナリドミド、５－アザシチジン、イホスファミド、オキサリプラチン、ペメトレキセド二ナトリウム、シクロホスファミド、エトポシド、デシタビン、フルダラビン、ビンクリスチン、ベンダムスチン、クロラムブシル、ブスルファン、ゲムシタビン、メルファラン、ペントスタチン、ミトキサントロン、ペメトレキセド二ナトリウム）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ）、マルチキナーゼ阻害剤（例えば、ＭＧＣＤ２６５、ＲＧＢ－２８６６３８）、ＣＤ－２０標的化剤（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、ＲＯ５０７２７５９、ＬＦＢ－Ｒ６０３）、ＣＤ５２標的化剤（例えば、アレムツズマブ）、プレドニソロン、ダルベポエチンアルファ、レナリドミン、Ｂｃｌ－２阻害剤（例えば、オブリメルセンナトリウム）、オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、ＭＬＮ８２３７、ＴＡＫ－９０１）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、ＣＤ－１９標的化剤（例えば、ＭＥＤＩ－５５１、ＭＯＲ２０８）、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＡＢＴ－３４８）、ＪＡＫ－２阻害剤（例えば、ＩＮＣＢ０１８４２４）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、テムシロリムス、エベロリムス）、ＢＣＲ／ＡＢＬ阻害剤（例えば、イマチニブ）、ＥＴ－Ａ受容体アンタゴニスト（例えば、ＺＤ４０５４）、ＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲ－２）アゴニスト（例えば、ＣＳ－１００８）、ＥＧＥＮ－００１、Ｐｏｌｏ様キナーゼ１阻害剤（例えば、ＢＩ ６７２）が含まれるが、これらに限定されない。

別の態様では、抗ＣＥＡ抗体は、抗ＰＤ１抗体と組み合わせて使用することができる。抗ＰＤ１抗体としては、限定されないが、チスレリズマブ、ペンブロリズマブまたはニボルマブを挙げることができる。チスレリズマブは、ＵＳ８，７３５，５５３に開示されている。ＭｅｒｃｋによるＵＳ８，３５４，５０９及びＵＳ８，９００，５８７において開示されているペムブロリズマブ（旧名ＭＫ－３４７５）は、ＰＤ１受容体を標的とし、ＰＤ１受容体リガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の結合を阻害するヒト化ＩｇＧ４－Ｋ免疫グロブリンである。ペムブロリズマブは、転移性黒色腫及び転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の適応症について承認されており、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）及び難治性ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）の治療について臨床研究されている。ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによって開示）は、完全ヒトＩｇＧ４－Ｋモノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）は、米国特許第８，００８，４４９号及びＷＯ２００６／１２１１６８に開示されている。ニボルマブは、黒色腫、肺癌、腎臓癌、及びホジキンリンパ腫の治療に承認されている。

薬学的組成物及び製剤
また、抗ＣＥＡ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＣＥＡ抗体もしくは抗原結合フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む、薬学的製剤を含む組成物も提供される。特定の実施形態では、組成物は、１つ以上の抗ＣＥＡ抗体もしくは抗原結合フラグメント、または１つ以上の抗ＣＥＡ抗体もしくは抗原結合フラグメントをコードする配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当該技術分野で周知である、緩衝液を含む薬学的に許容される賦形剤などの好適な担体をさらに含むことができる。

本明細書に記載される抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメントの薬学的製剤は、所望される程度の純度を有するそのような抗体または抗原結合フラグメントと、１つ以上の任意選択の薬学的に許容される担体とを混合すること（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））によって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及び、グルコース、マンコース、またはデキストリンを含む他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体として、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などの間質性薬物分散剤がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許第７，８７１，６０７号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。

例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものを含み、後者の製剤は、ヒスチジン－アセテート緩衝液を含む。

持続放出製剤を調製することができる。徐放性調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。

インビボ投与のために使用される製剤は、一般に滅菌されている。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を介した濾過によって容易に達成され得る。

実施例１：抗ＣＥＡモノクローナル抗体の生成
免疫化及び結合アッセイ用のＣＥＡ組換えタンパク質
ドメインＢ３（配列番号５２のアミノ酸５９６～６７４、Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，１９８７，７（９）：３３２１－３３３０を参照）を含む膜周辺領域においてヒト及びＭａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ ＣＥＡの両方と交差反応するが他のヒトＣＥＡＣＡＭメンバーとのオフターゲット結合を起こさない、ＣＥＡに対する新規抗体を発見するために、抗体スクリーニング用にいくつかの組換えタンパク質が設計され、発現された（表２を参照）。

全長ヒトＣＥＡ（配列番号５２）、Ｍａｃａｃａ ＣＥＡ（配列番号５３）、及び全長ヒトＣＥＡＣＡＭ６（配列番号５４）のｃＤＮＡコード領域は、ＧｅｎＢａｎｋ配列に基づいて配列された。ヒトＣＥＡ（受託番号：ＮＭ＿００４３６３．２）の場合、遺伝子はＳｉｎｏｂｉｏ（カタログ番号ＨＧ１１０７７－ＵＴ）から入手できる。Ｍａｃａｃａ ＣＥＡ（受託番号：ＮＭ＿００１０４７１２５）の場合、遺伝子はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（カタログ番号ＯＭｂ２３８６５Ｄ）から入手できる。ヒトＣＥＡＣＡＭ６（受託番号：ＮＭ＿００２４８３．４）の場合、遺伝子はＳｉｎｏｂｉｏ（カタログ番号ＨＧ１０８２３－ＵＴ）から入手できる。ＣＥＡ融合タンパク質の概略図を図１に示す。ヒトＣＥＡのスプライス変異体が腫瘍上で完全長ＣＥＡと同時に発現することが報告されており（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ，７，ｅ３６４１２－ｅ３６４１２（２０１２））、変異体（ＣＥＡ－ｖ）はそれに応じて調製された。この構築物を生成するために、ｈｕＣＥＡのアミノ酸（ＡＡ）１～６８７（配列番号５５）からなる細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のコード領域、サルＣＥＡのアミノ酸（ＡＡ）１～６９０（配列番号５６）の領域、及びＣＥＡＣＡＭ６のアミノ酸（ＡＡ）１～３２０（配列番号５７）の領域をＰＣＲ増幅した。ＣＥＡのアミノ酸（ＡＡ）１～７８（配列番号５８）及びＣＥＡのアミノ酸３９８～６８７（配列番号５９）の領域をＰＣＲ増幅し、次いでオーバーラップＰＣＲによって結合させてＣＥＡ変異体（ＣＥＡ－ｖ）（配列番号６０）を作製した。あるいは、ＣＥＡＣＡＭ６アミノ酸（ＡＡ）１～２７３（配列番号６１）の領域、及びＣＥＡアミノ酸（ＡＡ）５９６～６８７（配列番号６２）のドメインＢ３を含む膜周辺領域は、ＰＣＲ増幅し、次いでオーバーラップＰＣＲによって結合させてキメラ構築物（ＣＨＩＭ）（配列番号６３）を作製した。次に、すべての構築物を、６ｘＨｉｓタグと融合したＣ末端を持つｐｃＤＮＡ３．１ベースの発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）に個別にクローニングし、ＣＥＡ、サルＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡ－ｖ、及びＣＨＩＭの５つの組換え融合タンパク質発現プラスミドが得られた。組換え融合タンパク質の生産では、ＣＥＡ、サルＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡ－ｖ、及びＣＨＩＭプラスミドをＨＥＫ２９３ベースの哺乳類細胞発現システム（インハウスで生成）に一時的にトランスフェクションし、回転シェーカーを備えたＣＯ_２インキュベーターで５～７日間培養した。組換えタンパク質を含む上清を収集し、遠心分離によって除去した。組換えタンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（カタログ番号Ｒ９０１１５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製した。すべての組換えタンパク質はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、少量ずつアリコートに分けて－８０℃の冷凍庫に保存した。

細胞株での安定した発現
全長ヒトＣＥＡ（受託番号：ＮＭ＿００４３６３．２）を発現する安定した細胞株を確立するために、ＣＥＡを発現するｃＤＮＡをレトロウイルスベクターｐＦＢ－Ｎｅｏ（カタログ番号２１７５６１、Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）にクローニングした。デュアルトロピックレトロウイルスベクターは、以前のプロトコールに従って生成した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００５ １０６（５）：１５４４－５１）。ヒトＣＥＡ発現細胞株を生成するために、ヒトＣＥＡを含むウイルスベクターをＬ９２９（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）及びＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）に形質導入した。高発現細胞株は、Ｇ４１８を含む１０％ＦＢＳを含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地で培養することによって選択され、次いでＦＡＣＳ結合アッセイによって検証した。

免疫化、ハイブリドーマ融合及びクローニング
８～１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（ＨＦＫ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＣＯ．，ＬＴＤ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）を、水溶性アジュバント（カタログ番号ＫＸ０２１００４１、ＫａｎｇＢｉＱｕａｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）の有無にかかわらず、５００μｌの１×１０^７個のＬ９２９／ｈｕＣＥＡ細胞で腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫した。抗体産生を促進するために、この手順を２週間後に繰り返した。３回目の免疫化の２週間後、マウス血清をＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）結合について評価した。脾細胞を単離し、標準技術（Ｃｏｌｌｉｇａｎ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，１９９３）を用いてマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）に融合した。

ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによる抗体のＣＥＡ結合活性の評価
ヒトＣＥＡには結合するがＣＥＡＣＡＭ６またはｓＣＥＡには結合しない抗体をスクリーニングするために、ＣＨＩＭには結合するがｓＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６及びＣＥＡ－ｖには結合しない抗体、ならびにＣＨＩＭ、ｓＣＥＡ及びＣＥＡ－ｖには結合するがＣＥＡＣＡＭ６には結合しない抗体をスクリーニング及びカウンタースクリーニングした。ハイブリドーマクローンの上清を、（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）３７８：３３－５２）に記載されているようにＥＬＩＳＡによって最初にスクリーニングし、いくつかの変更を加えた。簡単に説明すると、ｓＣＥＡ、ＣＨＩＭ、ＣＥＡＣＡＭ６、またはＣＥＡ－ｖを３μｇ／ｍｌの低濃度で９６ウェルプレートに個別にコーティングした。ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号７０７６Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）及び基質（カタログ番号００－４２０１－５６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を開発に使用し、波長４５０ｎｍの吸光度シグナルを、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍ（商標），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を使用して測定した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンは、Ｌ９２９／ｈｕＣＥＡ及び／またはＭＫＮ４５細胞（ＡＴＣＣ）を使用してＦＡＣＳによってさらに検証された。ＭＫＮ４５細胞はヒト胃癌由来である。ＣＥＡ発現細胞（１０^５細胞／ウェル）をＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマ上清と共にインキュベートし、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ－６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号Ａ０４７３、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ）と結合させた。フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴ、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を使用して細胞の蛍光を定量した。

ＦＡＣＳスクリーニングにおいて陽性シグナルを示し、ＣＥＡＣＡＭ６及びｓＣＥＡには結合しないがＣＨＩＭには結合するハイブリドーマからの馴化培地を機能アッセイに供して、ＣＥＡ発現細胞へのＣＥＡ抗体の結合におけるｓＣＥＡの存在を評価した（以下の実施例を参照）。所望の結合特異性及び機能活性を備えた抗体をさらにサブクローニングし、特性付けた。

ハイブリドーマのサブクローニング及び無血清培地または低血清培地への適応
主にＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、及び機能アッセイによるスクリーニングの後、陽性ハイブリドーマクローンを限界希釈法によってサブクローニングした。機能アッセイを通じて検証された上位の抗体サブクローンは、３％ＦＢＳを含むＣＤＭ４ＭＡｂ培地（カタログ番号ＳＨ３０８０１．０２、Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）での増殖に適応された。

モノクローナル抗体の発現及び精製
ハイブリドーマ細胞をＣＤＭ４ＭＡｂ培地（カタログ番号ＳＨ３０８０１．０２、Ｈｙｃｌｏｎｅ）で培養し、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で５～７日間インキュベートした。精製前に、遠心分離及び０．２２μｍの膜を通過させる濾過によって馴化培地を収集した。マウス抗体を含む上清を適用し、製造元ガイドのプロトコールに従ってプロテインＡカラム（カタログ番号１７１２７９０１、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合させた。この手順により、通常、９０％を超える純度の抗体が得られた。プロテインＡアフィニティー精製抗体をＰＢＳに対して透析するか、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００カラム（カタログ番号１７５３１８０１、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してさらに精製して凝集体を除去した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。最終的な抗体調製物は、アリコートに分けて－８０℃の冷凍庫に保存した。

実施例２：ＣＥＡ抗体のクローニング及び配列分析
製造元のプロトコールに基づいて、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＲＮＡキット（カタログ番号７４１０４、ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、マウスのハイブリドーマ細胞を回収して全ＲＮＡを調製した。第１鎖ｃＤＮＡは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号１８０８０－０５１）を使用して合成し、マウスモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ遺伝子のＰＣＲ増幅を、ＰＣＲキット（カタログ番号ＣＷ０６８６、ＣＷＢｉｏ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）を使用して行った。重鎖可変領域（ＶＨ）及びカッパ軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗体ｃＤＮＡクローニングに使用されるオリゴプライマーは、以前に報告された配列に基づいて合成した（Ｂｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００１ ７（７）：４６１－９．）。次に、ＰＣＲ産物をｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（カタログ番号ＣＢ１０１－０２、ＴｒａｎｓＧｅｎ，Ｃｈｉｎａ）にサブクローニングし、配列を決定した。ＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列決定の結果から決定された。

モノクローナル抗体は、配列相同性を比較することによって分析され、配列類似性に基づいてグループ化された（図２）。相補的決定領域（ＣＤＲ）は、配列アノテーションによるＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：２０９－２１２）システムに基づいて定義された。代表的なクローンＢＧＡ１３のアミノ酸配列を表３に示す。

実施例３：精製マウス抗ＣＥＡ抗体の結合プロファイルの決定
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって示されるＣＥＡに対する特異的結合を有するＣＥＡ抗体、ならびにｓＣＥＡ干渉のないＣＥＡ抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ－２００（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＳＰＲアッセイによってそれらの結合動態について特徴付けられた（図３Ａ）。簡単に説明すると、抗マウスＩｇＧ抗体を活性化されたＣＭ５バイオセンサーチップ（カタログ番号ＢＲ１００５３０、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に固定化した。精製マウス抗体をチップ表面に流し、抗マウスＩｇＧ抗体によって捕捉した。次に、精製ＣＨＩＭ、ＣＥＡ－ｖ、ＣＥＡ、またはサルＣＥＡ組換えタンパク質の段階希釈（６．０ｎＭ～２１５０ｎＭ）をチップ表面に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化を分析して、１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、比率ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして計算した。ＢＧＡ１３の結合親和性プロファイルを以下の表４に示す。

ＢＧＡ１３の結合プロファイルを抗原ＥＬＩＳＡでチェックし、精製ＢＧＡ１３のｈｕＣＥＡ及びサルＣＥＡへの結合を観察した。これらは、ＢＧＡ１３が可溶性ｈｕＣＥＡ及びサルＣＥＡに対して弱い結合剤であるか、または可溶性ＣＥＡが固定化されたときに異なる立体構造を有することを示した（図３Ｂ）。この実験では、ｓＣＥＡ、ＣＨＩＭ、サルＣＥＡ、ＣＥＡ－ｖ、及びＢＳＡを９６ウェルプレートに１０μｇ／ｍｌの高濃度で４℃で一晩コーティングした。ＢＧＡ１３または対照の抗体ａｂ４４５１（カタログ番号ａｂ４４５１、ａｂｃａｍ，ＵＳＡ）を２μｇ／ｍｌの濃度で１時間インキュベートした。ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号７０７６Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）及び基質（カタログ番号００－４２０１－５６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を開発に使用し、波長４５０ｎｍの吸光度シグナルを、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を使用して測定した。

実施例４：ＣＥＡ発現細胞へのＢＧＡ１３の結合に対する組換え可溶性ＣＥＡの影響
ＣＥＡ発現細胞に対する様々なＣＥＡ抗体の特異的結合における可溶性ＣＥＡの存在を、フローサイトメトリーによって評価した。簡単に説明すると、ヒトＣＥＡ発現細胞（１０^５細胞／ウェル）を、２０μｇ／ｍｌの超組換え可溶性ＣＥＡタンパク質の存在下で２μｇ／ｍｌの精製ＣＥＡマウスモノクローナル抗体とインキュベートし、その後Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ－６４７－標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号Ａ０４７３、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ）と結合させた。フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴ、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を使用して細胞の蛍光を定量した。図４Ａ及び図４Ｂに示すように、ＣＥＡ発現細胞へのＢＧＡ１３の結合は、可溶性ＣＥＡの存在によって影響されなかった。

実施例５：マウス抗ヒトＣＥＡ抗体のヒト化
ｍＡｂのヒト化及び操作
ＢＧＡ１３のヒト化については、ＩＭＧＴ及びＮＣＢＩのヒト免疫グロブリン遺伝子データベースにおける配列比較により、ＢＧＡ１３可変領域のｃＤＮＡ配列と高い相同性を共有する配列をヒト生殖系列ＩｇＧ遺伝子で検索した。ヒト抗体レパートリーに高頻度で存在し（Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００９ ＰＮＡＳ １０６：２０２１６－２０２２１）、ＢＧＡ１３との相同性が高いヒトＩＧＶＨ及びＩＧＶＬ遺伝子を、ヒト化のテンプレートとして選択した。ヒト化前に、ＢＧＡ１３重鎖及び軽鎖可変ドメインを、それぞれ、ヒトＩｇＧ１ｗｔ（配列番号８７）として指定される野生型ヒトＩｇＧ１定常領域及びヒトカッパ定常（ＣＬ）領域（配列番号８８）に融合した。

ヒト化は、ＣＤＲグラフティング（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ２４８：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）によって実施され、ＢＧＡ１３抗体はヒトＩｇＧ１フォーマットで操作された。ヒト化の最初のラウンドでは、フレームワーク領域におけるマウスからヒトアミノ酸残基への変異は、シミュレートされた３Ｄ構造によって誘導され、ＣＤＲの標準構造を維持するために構造的に重要なマウスのフレームワーク残基は、ヒト化抗体ＢＧＡ１３、ＢＧＡ１３１（重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を配列番号８９及び９０に示す）の最初のバージョンで保持された。

具体的には、ＢＧＡ１３ ＶＬのＣＤＲを、２つのマウスフレームワーク残基（Ｎ６６及びＶ６８）を保持した状態でヒト生殖系列可変遺伝子ＩＧＶＫ１－２７のフレームワークに移植した（軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号９２に示す）。ＢＧＡ１３ ＶＨのＣＤＲは、５つのマウスフレームワーク（Ｌ３９、Ｉ５３、Ｙ５５、Ｎ６６、Ｓ６８）残基を保持した状態で、ヒト生殖系列可変遺伝子ＩＧＶＨ１－４６のフレームワークに移植した（重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号９１に示す）。

ＢＧＡ１３－１は、容易に適応できるサブクローニング部位を備えた野生型ヒトＩｇＧ１の定常領域を含むインハウス開発の発現ベクターを使用して、ヒト完全長抗体フォーマットとして構築した。ＢＧＡ１３－１抗体の発現及び調製は、上記２つの構築物の２９３Ｇ細胞への同時トランスフェクションと、プロテインＡカラム（カタログ番号１７５４３８０２、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した精製とによって達成された。精製した抗体をＰＢＳ中で０．５～５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、アリコートに分けて－８０℃の冷凍庫に保存した。

ＢＧＡ１３１を使用して、追加の単一または複数のアミノ酸変更を行い、ＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域のヒト残基を、それぞれＶＨではＶ６８Ａ、Ｒ７２Ａ、及びＶ７９Ａ、ＶＬではＶ４３Ｓを含む、対応するマウス生殖系列残基に変換した。その結果、ＢＧＡ１３２（ＶＨ中のＶ６８Ａ、Ｒ７２Ａ）、ＢＧＡ１３３（ＶＨ中のＶ７９Ａ）、ＢＧＡ１３４（ＶＨ中のＶ６８Ａ、Ｒ７２Ａ、Ｖ７９Ａ）、ＢＧＡ１３５（ＶＬ中のＶ４３Ｓ）、ＢＧＡ１３６（ＶＨ中のＶ６８Ａ、Ｒ７２Ａ、及びＶＬ中のＶ４３Ｓ）、ＢＧＡ１３７（ＶＨ中のＶ７９Ａ、ＶＬ中のＶ４３Ｓ）、及びＢＧＡ１３８（ＶＨ中のＶ６８Ａ、Ｒ７２Ａ、Ｖ７９Ａ、ＶＬ中のＶ４３Ｓ）が得られた。修飾を含むすべての抗体はＢＧＡ１３１に対して同様の結合活性を有し、いずれの変化も結合を破壊しなかった。

翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を除去するために、ＢＧＡ１３１配列に基づいてＣＤＲ及びフレームワーク領域に変異を導入することでさらなる操作が行われた。これには、ＶＨ領域におけるＮ５２Ｔ、Ｎ５４Ｑ、Ｎ５９Ｓ、Ｎ１０２Ｇ、Ｎ１０４Ｑ、及びＳ６１Ａアミノ酸の変化が含まれた。その結果、ＢＧＡ１３１Ａ（Ｎ５２Ｔ（ＶＨ））、ＢＧＡ１３１Ｂ（Ｎ５４Ｑ（ＶＨ））、ＢＧＡ１３１Ｃ（Ｎ５９Ｓ（ＶＨ））、ＢＧＡ１３１Ｄ（Ｎ１０２Ｇ（ＶＨ））、ＢＧＡ１３１Ｅ（Ｎ１０４Ｑ（ＶＨ））、及びＢＧＡ１３１Ｆ（Ｎ５４Ｑ、Ｎ５９Ｓ、Ｓ６１Ａ（ＶＨ））が得られ、すべての抗体はＢＧＡ１３１に対して同様の結合特異性を有し、いずれの変化も結合を破壊しなかった。特異性を維持しながら、アミノ酸組成及び発現レベルも考慮された。すべてのヒト化変異は、特定の位置に変異を含むプライマー及び部位特異的変異誘発キット（カタログ番号ＦＭ１１１－０２、ＴｒａｎｓＧｅｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）を使用して作成された。望ましい変異は配列分析によって確認された。ＢＧＡ１３－１と比較して、ＢＧＡ１３－１Ｆはグリコシル化部位がなく結合親和性が有意に低下していたが、発現レベルが高かった（表８）。

実施例６：親和性成熟ライブラリーの生成
ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を標準的な分子生物学技術によって使用して、ＢＧＡ１３－１Ｆ Ｆａｂフラグメントを遺伝子３の微量のコートタンパク質のフラグメントのＮ末端との融合体としてＭ１３バクテリオファージの表面に表示するように設計されたファージミドを構築した。ファージミドクローンから直接Ｆａｂフラグメントを発現できるように、遺伝子３配列の前にアンバー終止コドンがあった。ファージミドをテンプレートとして使用して、１０^８個のユニークなメンバーを含むファージディスプレイライブラリーを構築した。

２つのライブラリー（Ｈ－ＡＭ、Ｌ－ＡＭ）は、それぞれ重鎖及び軽鎖のＣＤＲ位置をランダム化して構築した。３つのＣＤＲはすべて各ライブラリーでランダム化されたが、各ＣＤＲには、２つの同時変異を有し得るＨＣＤＲ３を除き、各クローンに最大１つの変異があった。各位置は、任意のアミノ酸またはアンバー終止コドンをコードするＮＮＫコドン（ＩＵＰＡＣコード）でランダム化された。組み合わされた重鎖及び軽鎖のライブラリー設計には、終止コドンやシステインコドンを持たない５．０×１０^６個のユニークな完全長クローンの潜在的な多様性があり、それぞれ０、１、２、及び３個の変異を有するクローンの予想分布は約０．０２％、１．１％、１７％、及び８２％であった。重鎖クローンの少数の部分には、ＨＣＤＲ３領域のプライマー設計のため４つの変異があることが予想された。最初のステップとして、テンプレートとしてｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ、及びランダム化されたＣＤＲ３位置を含むプライマーを使用してＤＮＡフラグメントを増幅した（図５のＡ及びＢを参照）。次に、ＰＣＲ産物をゲル精製し、ランダム化されたＣＤＲ２位置を含むプライマーを使用して組み立てた。この手順を、ランダムなＣＤＲ１位置に向けられたプライマーを使用して繰り返した。次に、得られた重鎖または軽鎖のＰＣＲ産物を、オーバーラップＰＣＲによって対応するＣＨフラグメントまたはＣＬフラグメントと組み立てた。フラグメントは、オーバーラップＰＣＲによって、変異のない軽鎖または重鎖とさらに組み立てた。次いで、得られたフラグメントをゲル精製し、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化後にｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅとライゲーションした。精製されたライゲーションは、エレクトロポレーションによってＴＧ１細菌に形質転換された。各ライブラリーからの４８クローンの配列決定により、各位置のランダム化が確認された（データは示されていない）。ただし、サンプリング深度が限られているため、すべての位置ですべてのアミノ酸変異が観察されたわけではない。軽鎖及び重鎖ライブラリーの約５２％及び５５％は完全長のランダム化クローンを有しており、オリゴヌクレオチド合成及びライブラリー構築において中程度の取り込みバイアスがあっても生成された１０^８個の独立したクローンで設計の潜在的な多様性をすべてカバーするのに十分であった。

実施例７：親和性成熟ヒト化ＢＧＡ１３変異体の生成
ライブラリーの選択及びスクリーニング
親和性成熟ヒト化ＢＧＡ１３ Ｆａｂの生成は、標準プロトコールを用いたファージディスプレイによって実施した（Ｓｉｌａｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，５，２３４０－５０；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９，ｅ１１１３３９）。第１と第２のラウンドの選択では、免疫チューブ（カタログ番号４７０３１９、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中の固定化ＣＨＩＭに対して競合選択を行った。簡単に説明すると、免疫チューブを１ｍｌのＣＨＩＭ（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）で一晩４℃でコーティングした。すべての親和性成熟ライブラリーを、さまざまな濃度のＢＧＡ１３－１Ｆ ＩｇＧ（ラウンド１、１μｇ／ｍｌ；ラウンド２、５μｇ／ｍｌ）の存在下で、コーティングされた免疫チューブと共に１時間インキュベートした。第３と第４のラウンドの選択では、Ｌ９２９／ｈｕＣＥＡ細胞（ラウンド３）またはＬＯＶＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２２９）（ラウンド４）を使用し、枯渇細胞としてＨＥＫ２９３細胞を使用して細胞パニングを行った。４つのラウンドの選択後、個々のクローンを選択し、標準プロトコールを使用してファージを含む上清を調製した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンの配列を決定し、変異部位を分析した。

ＣＤＲの変異頻度の解析
４つのラウンドの選択後の各ＣＤＲにおける変異の頻度は比較的高く、ＨＣＤＲ３の１７％からＬＣＤＲ２の９５％の範囲であった。重鎖に関しては、Ｈ－ＡＭライブラリーで同定されたクローンの約半数が親クローンと同一であった。他のクローンには、ＨＣＤＲ２中のＱ５４Ｎに１つの逆突然変異が含まれていた。

軽鎖を分析すると、変異はさらに多様であった。２つの部位では、それぞれＬＣＤＲ１のほぼすべてのクローンに変異が発生していた。軽鎖残基２９及び３１は、それぞれクローンの４７．０９％及び３５．２９％でＩｌｅからＧｌｎに、及びＧｌｙからＧｌｎに変異した。２９位はＧｌｎ変異の頻度が高いだけではなく、チロシンへの変異を持つクローンのサブセットも有していた。位置３１はＧｌｎ変異の頻度が高いだけではなく、Ｌｅｕに変異する可能性が約１２．５％であった。ライブラリー設計の制約により、２９位と３１位の変異は、互いに組み合わせて見られなかった。しかしながら、これら２つの部位のそれぞれの変異は、他のＣＤＲの変異と組み合わせられることがよくあった。ＬＣＤＲ２に関しては、Ａ５１のみに少なくとも６４．７１％のクローンにおいて変異が発生していたが、明らかなパターンはなく、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｎなどの大きな疎水性極性残基が含まれていた。ＬＣＤＲ３に関しては、２つの部位で少なくとも５０％のクローンに変異が発生していた。軽鎖残基９０及び９２は、それぞれクローンの１１．７６％及び４７．０６％でＨｉｓからＬｅｕに、及びＴｙｒからＬｅｕに変異していた。図６は、４つのラウンドの選択後の軽鎖のＣＤＲ領域の配列分散を示す。

選択されたヒト化ＢＧＡ１３変異体の発現
突然変異の組み合わせが行われた。選択したファージクローンからの軽鎖可変領域を、ヒトカッパ軽鎖発現哺乳類発現ベクターにサブクローニングした。軽鎖発現ベクターを、ＢＧＡ１３－１Ｆ重鎖を発現する哺乳類発現ベクターと共に１：１の比率で２９３Ｇ細胞に同時トランスフェクトした。ＣＥＡ抗体のバージョンは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（カタログ番号１７５４３８０２、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって培養上清から精製された。精製した抗体をＰＢＳ中で０．５～５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、アリコートに分けて－８０℃の冷凍庫に保存した。

親和性成熟ヒト化ＢＧＡ１３変異体の特徴付け
ＢＧＡ１３－１Ｆ及び他の親和性成熟クローンの親和性比較は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ－２００（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びフローサイトメトリー（図７）を使用するＳＰＲアッセイ（表９）によって行われた。この実験では、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を活性化されたＣＭ５バイオセンサーチップ（カタログ番号ＢＲ１００８３９、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に固定化した。抗ＣＥＡ抗体をチップ表面に流し、抗ヒトＦａｂ抗体によって捕捉した。次に、ＣＨＩＭの段階希釈（１．３７ｎＭ～３３３ｎＭ）をチップ表面に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化を分析して、１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を算出した。フローサイトメトリーでは、ＣＥＡ発現細胞（１０^５細胞／ウェル）をさまざまな濃度の精製された親和性成熟抗体とインキュベートし、次いでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ－６４７標識抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃ抗体（カタログ番号４０９３２０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＵＳＡ）と結合させた。フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴ、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を使用して細胞の蛍光を定量した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、比率ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして計算した。ＢＧＡ１３１Ｆ－ｐｈ－Ｌ（配列番号９５）及びＢＧＡ１３１Ｆ－ｐｈ－Ｍ（配列番号９６）は、ｈｕＣＥＡ表面タンパク質に対して改善された親和性を有することが示された（表１０）。

実施例８：親和性成熟ヒト化ＢＧＡ１３変異体のさらなる操作
ＢＧＡ１３１Ｆ－ｐｈ－Ｍテンプレートに基づいてＣＤＲに変異を導入することにより、さらなる操作が行われた。これには、ＶＨのＷ３３Ｙ、Ｑ５４Ｎ、及びＳ５９Ｎ、ならびにＶＬのＴ５１Ｙが含まれていた。その結果、ＢＧＡ１１３２Ａ（Ｗ３３Ｙ（ＶＨ））、ＢＧＡ１１３２Ｂ（Ｑ５４Ｎ（ＶＨ））、ＢＧＡ１１３２Ｃ（Ｓ５９Ｎ（ＶＨ））、ＢＧＡ１１３１Ａ（Ｔ５１Ｙ（ＶＬ））が得られ、これらはすべてＢＧＡ－１１３１Ｆに対する結合活性が改善された。最も改善された抗体は、最終的に、（Ｗ３３Ｙ（ＶＨ）、Ｔ５１Ｙ（ＶＬ））変化を有するＢＧＡ１１３抗体（表１１）をもたらし、配列は表１２に示されている。

実施例９：ＢＧＡ１１３の最適化
生化学的／生物物理学的特性をさらに改善するために、ＣＤＲ及びフレームワーク領域に置換を導入することによってＢＧＡ１１３の最適化を行った（表１３）。ヒトＶＨ生殖系列間で観察された差に基づいて選択されるＫ１３及びＱ５３を除き、大きな疎水性残基を選択し、極性残基に変更した。機能的活性を維持しながら、アミノ酸組成、熱安定性（Ｔｍ）、表面疎水性、及び等電子点（ｐＩ）を考慮する。実施例６に記載したように、ベクターｐＣＡＮＴＡＢ－５Ｅにクローニングすることによって変異体をＦａｂ形式で発現させた。次いで、Ｆａｂ含有上清をＥＬＩＳＡ及びＳＰＲ分析によってＣＥＡ結合に関してスクリーニングした。有意な親和性低下のない変異体を選択し、置換を許容できる残基を同定した。軽鎖のＬ９２Ｅ、重鎖のＫ１３Ｅ、Ｑ５４Ｅ、Ｙ５７Ｄ／Ｅ、及びＹ５７Ｋは、親和性に最小限の影響を与えることが示された。したがって、単一の同定された変異または組み合わせを有するＩｇＧフォーマットのＢＧＡ１１３変異体を実施例８に記載のように発現及び精製した。ＳＰＲ研究及びＦＡＣＳ分析を実施し、表１４にまとめた。導入されたアミノ酸置換によって特異性及びエピトープに変化が生じないことが確認された（データは示されていない）。まとめると、これらの結果は、これらの単一または複合変異（重鎖のＫ１３Ｅ、Ｑ５４Ｅ、Ｙ５７Ｄ及びＹ５７Ｋ、軽鎖のＬ９２Ｅ）が、ＣＥＡへの結合親和性をわずかに低下させるＬ９２Ｅを除いて、親和性に対する影響が最小限であることを示した。要約すると、Ｙ５７Ｋの変化により、ＢＧＡ１１３抗体の発現、ＣＥＡ結合及び親和性が最適化され、その結果ＢＧＡ１１３Ｋが得られた（表１）。

実施例１０：抗ＣＥＡ抗体ＢＧＡ１１３Ｋの結合プロファイル
ＢＧＡ１１３Ｋ及びＵＳ２０１２／０２５１５２９で抗体２Ｆ１と称される以前に開示されたＣＥＡ抗体は、ヒトＩｇＧ１フォーマットで生成し、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ－２００（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＳＰＲアッセイによって結合動態について特徴付けられた。

このデータを得るために、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を活性化されたＣＭ５バイオセンサーチップ（カタログ番号ＢＲ１００８３９、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に固定化した。ＢＧＡ１１３Ｋ抗体をチップ表面に流し、抗ヒトＦａｂ抗体によって捕捉した。次に、可溶性ｈｕＣＥＡまたはｃｙｎｏＣＥＡ（カタログ番号：ＣＥ５－Ｃ５２Ｈ５、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）の段階希釈（１．３７ｎＭ～２１５０ｎＭ）をチップ表面に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化を分析して、１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、比率ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして計算した。ＢＧＡ１１３Ｋ及び２Ｆ１対照抗体は異なる結合親和性を示した。以下の表１５に示すように、ＢＧＡ１１３Ｋは、ヒトＣＥＡに対して非常に高い親和性を有し、カニクイザルＣＥＡに対しても同等の親和性を有する。

フローサイトメトリーでは、ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞（１０^５細胞／ウェル）をさまざまな濃度の精製された親和性成熟抗体とインキュベートし、次いでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ－６４７標識抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃ抗体（カタログ番号４０９３２０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＵＳＡ）と結合させた。フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴ、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を使用して細胞の蛍光を定量した。図８に示すように、ＢＧＡ－１１３Ｋは、２．９２ｕｇ／ｍｌのＥＣ５０で用量反応的に生細胞上の天然ＣＥＡに特異的に結合することを示した。

実施例１１：オフターゲット特異性の評価
ＢＧＡ１１３Ｋのオフターゲット特異性は、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーによって評価した。フローサイトメトリーでは、ＣＥＡＣＡＭ３（配列番号６５）、ＣＥＡＣＡＭ７（配列番号６６）、またはＣＥＡＣＡＭ８（配列番号６７）をＨＥＫ２９３細胞（１０^５細胞／ウェル）に一時的にトランスフェクトし、次いで２μｇ／ｍｌの精製ＢＧＡ１１３Ｋでインキュベートし、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７－標識抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃ抗体（カタログ番号４０９３２０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＵＳＡ）と結合させた。フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴ、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を使用して細胞の蛍光を定量した。抗原ＥＬＩＳＡの場合、ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：６４）（カタログ番号１０８２２－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃｈｉｎａ）、ＣＨＩＭ（配列番号：６３）、ＣＥＡ（配列番号：５５）、またはＣＥＡＣＡＭ６（配列番号：５７）を９６ウェルプレートに１０μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一晩コーティングした。ＨＲＰ結合抗ヒトＦｃ（Ｆｃ特異的）ＩｇＧ抗体（カタログ番号Ａ０１７０、Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）及び基質（カタログ番号００－４２０１－５６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を開発に使用し、波長４５０ｎｍの吸光度シグナルを、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を使用して測定した。図９のＡ～Ｂに示すように、他のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーに対する交差反応性は観察されず、したがって、ＢＧＡ１１３ＫはＣＥＡ（図９のＡ～ＢのＣＥＡＣＡＭ５）に対してのみ特異性を示した。

実施例１２：ＣＥＡ発現細胞へのＢＧＡ１１３Ｋの結合に対する可溶性ｈｕＣＥＡの影響
可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）がＢＧＡ１１３Ｋの特異的結合に何らかの影響を与えるかどうかを確認するために、さまざまな濃度（０、０．５、１、２μｇ／ｍｌ）の組換え可溶性ＣＥＡを（０．０１～１００μｇ／ｍｌ）ＢＧＡ１１３Ｋと事前混合し、５分間インキュベートした。次いで、これらの混合物を、ＭＫＮ４５細胞などの２×１０^５ＣＥＡ発現細胞と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞を二次抗体抗ｈｕＦｃ－ＡＰＣ（カタログ番号４０９３２０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＵＳＡ）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。２μｇ／ｍｌの組換えｓＣＥＡの存在下では、ＣＥＡ発現細胞へのＢＧＡ１１３Ｋの結合は影響を受けなかった。この結果はＭＫＮ４５細胞について示されており（図１０）、膜結合型ＣＥＡに対するＢＧＡ１１３Ｋの特異性を示している。

実施例１３：ＢＧＡ１１３は、ＣＥＡ^＋腫瘍細胞に対して強力なＡＤＣＣ効果を誘導する
野生型ＩｇＧ１フォーマットのＢＧＡ１１３が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導できるかどうかを確認するために、ＣＤ１６（Ｖ１５８）発現ＮＫ９２ＭＩ細胞（ＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ）をエフェクター細胞として使用し、ＣＥＡを発現するマウス結腸癌細胞（ＣＴ２６－ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６３８）と共培養した。共培養は、示された濃度（０．００００５～５μｇ／ｍｌ）のＢＧＡ１１３の存在下、Ｅ：Ｔ比１：１で５時間実施し、細胞毒性を乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出によって決定した。上清中のＬＤＨの量は、ＣｙｔｏＴｏｘ（商標）９６ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して測定し、特異的溶解量を製造業者の指示に従って計算した。図１１に示すように、ＢＧＡ１１３は、約６．７ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０でインビトロでＡＤＣＣを誘導することができた。

実施例１４：ＢＧＡ１１３のインビボ抗腫瘍効果
ＣＥＡ^＋腫瘍細胞に対するＢＧＡ１１３のインビボ効果を測定するために、ＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞（５ｘ１０^６）をＣＴ２６／ＣＥＡ細胞（１０^６）と混合し、ＮＣＧマウスに皮下注射した。ＢＧＡ１１３（０．１２、０．６２または３．１ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照を、腫瘍注射の日から始めて週に２回与えた（１群あたり７匹のマウス）。ビヒクルと比較して、用量３．１ｍｇ／ｋｇのＢＧＡ１１３は、ビヒクル対照との差は統計的に有意ではなかった（Ｐ＞０．０５）が、低量の腫瘍阻害を示した（図１２）。

参考文献
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Ｂｒｏｃｋｓ，Ｂ．，Ｐ．Ｇａｒｉｎ－Ｃｈｅｓａ，Ｅ．Ｂｅｈｒｌｅ，Ｊ．Ｅ．Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｊ．Ｒｅｔｔｉｇ，Ｋ．Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ ＆ Ｄ．Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ（２００１）Ｓｐｅｃｉｅｓ－ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｃＦｖ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｔｒｏｍａ ｍａｒｋｅｒ“ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ”ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ＦＡＰ－／－ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ ｍｏｕｓｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．），７，４６１－４６９．
Ｃｈａｕ，Ｉ．，Ｍ．Ｊ．Ａｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ａ．Ｒ．Ｎｏｒｍａｎ，Ｇ．Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｅ．Ｆｏｒｄ，Ｎ．Ｔｅｂｂｕｔｔ，Ｄ．Ｔａｉｔ，Ｍ．Ｈｉｌｌ，Ｐ．Ｊ．Ｒｏｓｓ ＆ Ｊ．Ｏａｔｅｓ（２００４）Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｒｏｕｔｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｃａｒｃｉｎｏ－ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２２，１４２０－９．
ｄｅ Ｓｔ Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．＆ Ｄ．Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ（１９８０）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｎｄ ｔａｃｔｉｃｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５，１－２１．
Ｄｏｔａｎ，Ｅ．，Ａ．Ｓｔａｒｏｄｕｂ，Ｊ．Ｂｅｒｌｉｎ，Ｃ．Ｈ．Ｌｉｅｕ，Ｍ．Ｊ．Ｇｕａｒｉｎｏ，Ｊ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｊ．Ｒ．Ｈｅｃｈｔ，Ｓ．Ｊ．Ｃｏｈｅｎ，Ｗ．Ａ．Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｐ．Ｍａｌｉａｋａｌ，Ｗ．Ａ．Ｗｅｇｅｎｅｒ，Ｒ．Ｍ．Ｓｈａｒｋｅｙ ＆ Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（２０１５）Ａ ｎｅｗ ａｎｔｉ－ＣＥＡ－ＳＮ－３８ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡＤＣ），ＩＭＭＵ－１３０，ｉｓ ａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ （ｍＣＲＣ） ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ （ｐｔｓ） ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｏｒ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ｉｎｉｔｉａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３３，２５０５－２５０５．
Ｄｕｒｂｉｎ，Ｈ．，Ｓ．Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｆ．Ｗｒｂａ，Ａ．Ｊ．Ｒｏｗａｎ，Ｄ．Ｓｎａｒｙ ＆ Ｗ．Ｆ．Ｂｏｄｍｅｒ（１９９４）Ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＰＲ１Ａ３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９１，４３１３－７．
Ｅｎｇｌｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｊ．Ｒ．Ｐｏｌｌｉ，Ｔ．Ｌｉ，Ｂ．Ａｎ，Ｍ．Ｏｔｔｅｎｅｄｅｒ，Ｊ．Ｑｕ ＆ Ｊ．Ｐ．Ｂａｌｔｈａｓａｒ（２０１８）“Ｃａｔｃｈ－ａｎｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ” Ａｎｔｉ－Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｅａｄｓ ｔｏ Ｇｒｅａｔｅｒ Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ，３６６，２０５－２１９．
Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｅ．，Ｋ．Ｃｈａｉｔａｎｙａ，Ｔ．Ｗｕｅｓｔ，Ａ．Ｗａｄｌｅ，Ａ．Ｍ．Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｋ，Ｒ．Ｓｃｈｉｂｌｉ，Ｓ．Ｂａｕｅｒ ＆ Ｃ．Ｒｅｎｎｅｒ（２０１２）Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１８，６２０８－１８．
Ｆｌａｍｉｎｉ，Ｅ．，Ｌ．Ｍｅｒｃａｔａｌｉ，Ｏ．Ｎａｎｎｉ，Ｄ．Ｃａｌｉｓｔｒｉ，Ｒ．Ｎｕｎｚｉａｔｉｎｉ，Ｗ．Ｚｏｌｉ，Ｐ．Ｒｏｓｅｔｔｉ，Ｎ．Ｇａｒｄｉｎｉ，Ａ．Ｌａｔｔｕｎｅｄｄｕ，Ｇ．Ｍ．Ｖｅｒｄｅｃｃｈｉａ ＆ Ｄ．Ａｍａｄｏｒｉ（２００６）Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌｓ：ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１２，６９８５－８．
Ｇａｎｇｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．，Ｄ．Ａ．Ｌａｚｕｒｅ ＆ Ｐ．Ｔｈｏｍａｓ（１９９７）Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１８，１－６．
Ｇａｕｔｈｉｅｒ，Ｌ．，Ａ．Ｍｏｒｅｌ，Ｎ．Ａｎｃｅｒｉｚ，Ｂ．Ｒｏｓｓｉ，Ａ．Ｂｌａｎｃｈａｒｄ－Ａｌｖａｒｅｚ，Ｇ．Ｇｒｏｎｄｉｎ，Ｓ．Ｔｒｉｃｈａｒｄ，Ｃ．Ｃｅｓａｒｉ，Ｍ．Ｓａｐｅｔ，Ｆ．Ｂｏｓｃｏ，Ｈ．Ｒｉｓｐａｕｄ－Ｂｌａｎｃ，Ｆ．Ｇｕｉｌｌｏｔ，Ｓ．Ｃｏｒｎｅｎ，Ａ．Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｂ．Ａｍｉｇｕｅｓ，Ｇ．Ｈａｂｉｆ，Ｆ．Ｃａｒａｇｕｅｌ，Ｓ．Ａｒｒｕｆａｔ，Ｒ．Ｒｅｍａｒｋ，Ｆ．Ｒｏｍａｇｎｅ，Ｙ．Ｍｏｒｅｌ，Ｅ．Ｎａｒｎｉ－Ｍａｎｃｉｎｅｌｌｉ ＆ Ｅ．Ｖｉｖｉｅｒ（２０１９）Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＮＫｐ４６ Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｅｌｌ，１７７，１７０１－１７１３ ｅ１６．
Ｇｏｌｄ，Ｐ．＆ Ｓ．Ｏ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ（１９６５）Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａｔａ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１２１，４３９－６２．
Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｍ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＥＡ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｒｋｅｒｓ，７，１８３－８．
Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｓ．（１９９９）Ｔｈｅ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ （ＣＥＡ） ｆａｍｉｌｙ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，６７－８１．
Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．，Ａ．Ｊ．Ｈｅｓｓｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｇ．ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ ＆ Ｐ．Ｗ．Ｐａｒｒｅｎ（２００１）Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ａ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７５，１２１６１－８．
Ｈｏｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．，Ｐ．Ｍ．Ｓｃｈｌａｇ，Ｔ．Ｇｅｒｎｅｔｈ ＆ Ｃ．Ｈｅｒｆａｒｔｈ（１９９４）Ｐｒｅ－ ａｎｄ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ，２１９，１３５－４３．
Ｈｕｄｓｐｅｔｈ，Ｋ．，Ｂ．Ｓｉｌｖａ－Ｓａｎｔｏｓ ＆ Ｄ．Ｍａｖｉｌｉｏ（２０１３）Ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｂｒｏａｄｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４，６９．
Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｅ．，Ｉ．Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ，Ｍ．Ｓｅｌａ ＆ Ｙ．Ｙａｒｄｅｎ（１９９５）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ＥｒｂＢ－２ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９２，３３５３－７．
Ｉｇａｗａ，Ｔ．，Ｈ．Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｙ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．Ｔａｎａｋａ，Ａ．Ｋｏｇａ，Ｙ．Ｓｅｋｉｍｏｒｉ，Ｔ．Ｏｒｉｔａ，Ｙ．Ａｓｏ，Ｋ．Ｈａｔｔｏｒｉ ＆ Ｍ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ（２０１０）ＶＨ／ＶＬ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｄｉａｂｏｄｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，２３，６６７－７７．
Ｋｏｃｈ，Ｊ．，Ａ．Ｓｔｅｉｎｌｅ，Ｃ．Ｗａｔｚｌ ＆ Ｏ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ（２０１３）Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３４，１８２－９１．
Ｋｕｅｓｐｅｒｔ，Ｋ．，Ｓ．Ｐｉｌｓ ＆ Ｃ．Ｒ．Ｈａｕｃｋ（２００６）ＣＥＡＣＡＭｓ：ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１８，５６５－５７１．
Ｋｒｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．，Ｊ．Ｍａｔｔａ，Ｓ．Ｕｇｏｌｉｎｉ ＆ Ｅ．Ｖｉｖｉｅｒ（２０１４）Ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９２，２２１－９．
Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．（２０１５）ＮＫＧ２Ｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ Ｈｏｓｔ Ｄｅｆｅｎｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ，３，５７５－８２．
Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．＆ Ｓ．－Ｗ．Ｌｅｅ（２０１７）Ｔｈｅ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２０１７，１１．
Ｌｅｅ，Ｋ．－Ａ．，Ｅ．－Ａ．Ｂａｅ，Ｙ．Ｃ．Ｓｏｎｇ，Ｅ．－Ｋ．Ｋｉｍ，Ｙ．－Ｓ．Ｌｅｅ，Ｔ．－Ｇ．Ｋｉｍ ＆ Ｃ．－Ｙ．Ｋａｎｇ（２０１５）Ａ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｉｇｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ＳＨＰ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ：Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１３６，２５７９－２５８７．
Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．，Ｖ．Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｃ．Ｇｉｎｅｓｔｏｕｘ，Ｊ．Ｂｏｄｍｅｒ，Ｗ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｂｏｎｔｒｏｐ，Ｍ．Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ａ．Ｍａｌｉｋ，Ｖ．Ｂａｒｂｉｅ ＆ Ｄ．Ｃｈａｕｍｅ（１９９９）ＩＭＧＴ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２７，２０９－１２．
Ｌｉｅｒｓｃｈ，Ｔ．，Ｊ．Ｍｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｂｉｔｔｒｉｃｈ，Ｂ．Ｋｕｌｌｅ，Ｈ．Ｂｅｃｋｅｒ ＆ Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（２００７）Ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ（１３１）Ｉ－ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ ａｆｔｅｒ ｓａｌｖａｇｅ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｏｕｔｃｏｍｅ ｔｏ ａ ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ，１４，２５７７－９０．
Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｗ．Ｚｅｎｇ，Ｍ．Ａ．Ｗｏｒｔｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｂ．Ｙａｎ，Ｐ．Ｃｏｒｎｗｅｌｌ，Ｖ．Ｌ．Ｐｅｅｋ，Ｊ．Ｒ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｊ．Ｗ．Ｔｅｔｒｅａｕｌｔ，Ｊ．Ｘｉａ，Ｊ．Ｒ．Ｍａｎｒｏ，Ｋ．Ｍ．Ｃｒｅｄｉｌｌｅ，Ｄ．Ｗ．Ｂａｌｌａｒｄ，Ｐ．Ｂｒｏｗｎ－Ａｕｇｓｂｕｒｇｅｒ，Ｖ．Ｗａｃｈｅｃｋ，Ｃ．Ｋ．Ｃｈｏｗ，Ｌ．Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｉ．Ｄｅｎｎｉｎｇ，Ｊ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｙ．Ｔａｎｇ，Ｐ．Ｖａｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ ＆ Ｊ．Ｌｕ（２０１４）ＬＹ２８７５３５８，ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－ＭＥＴ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＨＧＦ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ＨＧＦ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＭＥＴ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０，６０５９－７０．
Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｙ．，Ｙ．Ｍａｔｓｕｏ，Ｋ．Ｓｕｇａｎｏ，Ｈ．Ｏｈｋｕｒａ，Ｍ．Ｋｕｒｏｋｉ ＆ Ｍ．Ｋｕｒｏｋｉ（１９９０）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ａｄｕｌｔ Ｆｅｃｅｓ．Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８１，５１４－５１９．
Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒ，Ｅ．（２００７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，３７８，１－１３．
Ｍｏｅｒｔｅｌ，Ｃ．Ｇ．，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｊ．Ｓ．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｇ．Ｈａｌｌｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｌａｕｒｉｅ ＆ Ｃ．Ｔａｎｇｅｎ（１９９３）Ａｎ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ （ＣＥＡ） ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｅｃｔｅｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｊａｍａ，２７０，９４３－７．
Ｎａｐ，Ｍ．，Ｍ．Ｌ．Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｏ．Ｂｏｒｍｅｒ，Ｓ．Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｃ．Ｗａｇｅｎｅｒ，Ｓ．Ｈａｎｄｔ，Ｍ．Ｓｃｈｒｅｙｅｒ，Ｊ．Ｐ．Ｍａｃｈ，Ｆ．Ｂｕｃｈｅｇｇｅｒ，Ｓ．ｖｏｎ Ｋｌｅｉｓｔ ＆ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２，２３２９－３９．
Ｎａｐ，Ｍ．，Ｋ．Ｍｏｌｌｇａｒｄ，Ｐ．Ｂｕｒｔｉｎ ＆ Ｇ．Ｊ．Ｆｌｅｕｒｅｎ（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏ－ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏ，ｆｅｔｕｓ ａｎｄ ａｄｕｌｔ．Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ，９，１４５－５３．
Ｏｂｅｒｓｔ，Ｍ．Ｄ．，Ｓ．Ｆｕｈｒｍａｎｎ，Ｋ．Ｍｕｌｇｒｅｗ，Ｍ．Ａｍａｎｎ，Ｌ．Ｃｈｅｎｇ，Ｐ．Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ，Ｌ．Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｓ．Ｃｏａｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＆ Ｓ．Ａ．Ｈａｍｍｏｎｄ（２０１４）ＣＥＡ／ＣＤ３ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＭＥＤＩ－５６５／ＡＭＧ ２１１ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ ｉｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．ＭＡｂｓ，６，１５７１－８４．
Ｐｅｇｒａｍ，Ｈ．Ｊ．，Ｄ．Ｍ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｍ．Ｊ．Ｓｍｙｔｈ，Ｐ．Ｋ．Ｄａｒｃｙ ＆ Ｍ．Ｈ．Ｋｅｒｓｈａｗ（２０１１）Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，８９，２１６－２４．
Ｐｅｎｇ，Ｌ．，Ｍ．Ｄ．Ｏｂｅｒｓｔ，Ｊ．Ｈｕａｎｇ，Ｐ．Ｂｒｏｈａｗｎ，Ｃ．Ｍｏｒｅｈｏｕｓｅ，Ｋ．Ｌｅｋｓｔｒｏｍ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｈ．Ｗｕ，Ｙ．Ｙａｏ，Ｓ．Ｒ．Ｃｏａｔｓ，Ｗ．Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｍ．Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒ ＆ Ｓ．Ａ．Ｈａｍｍｏｎｄ（２０１２）Ｔｈｅ ＣＥＡ／ＣＤ３－ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＭＥＤＩ－５６５ （ＭＴ１１１） ｂｉｎｄｓ ａ ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｂｕｔ ｎｏｔ ａ ｓｈｏｒｔ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ＣＥＡ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，７，ｅ３６４１２－ｅ３６４１２．
Ｐｏｕｌ，Ｍ．Ａ．，Ｂ．Ｂｅｃｅｒｒｉｌ，Ｕ．Ｂ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｍｏｒｉｓｓｏｎ ＆ Ｊ．Ｄ．Ｍａｒｋｓ（２０００）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，３０１，１１４９－６１．
Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，Ｊ．Ｎ．，Ｒ．Ｐｅｒｅｒａ，Ａ．Ｇｒａｙ，Ｐ．Ｒｏｓｅ，Ａ．Ｆｕｌｌｅｒ，Ａ．Ｃｏｒｋｈｉｌｌ，Ｓ．Ｇｅｏｒｇｅ ＆ Ｄ．Ｍａｎｔ（２０１４）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ３ ｔｏ ５ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ ＣＥＡ ａｎｄ ＣＴ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ ＦＡＣＳ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ．Ｊａｍａ，３１１，２６３－７０．
Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｐ．Ｉ．＆ Ｗ．Ｆ．Ｂｏｄｍｅｒ（１９８７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，３９，３１７－２８．
Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｌ．Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ ＆ Ｐ．Ｃａｒｔｅｒ（１９９６）’Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，９，６１７－２１．
Ｓａｉｔｏ，Ｇ．，Ｓ．Ｓａｄａｈｉｒｏ，Ｋ．Ｏｋａｄａ，Ａ．Ｔａｎａｋａ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ ＆ Ａ．Ｋａｍｉｊｏ（２０１６）Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｓｅｒｕｍ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｌｅｖｅｌｓ ａｔ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，９１，８５－９．
Ｓａｋｕｒａｉ，Ｙ．，Ｓ．Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ，Ｔ．Ｏｈｉｓｈｉ，Ｙ．Ｓｈｉｍｏｓａｔｏ，Ｓ．Ｋｏｄａｉｒａ ＆ Ｏ．Ａｂｅ（１９８９）Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒａｉｓｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｊ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ，４２，３９－４６．
Ｓｈｅａｈａｎ，Ｋ．，Ｍ．Ｊ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｂ．Ｂｕｒｋｅ，Ｐ．Ａ．Ｄｅｒｖａｎ，Ｊ．Ｃ．Ｏ’Ｋｅａｎｅ，Ｌ．Ｓ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ ＆ Ｎ．Ｚａｍｃｈｅｃｋ（１９９０）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ （ＣＥＡ） ａｎｄ ＣＥＡ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｍｏｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，９４，１５７－６４．
Ｓｈｉｎｍｉ，Ｄ．， Ｒ．Ｎａｋａｎｏ，Ｋ．Ｍｉｔａｍｕｒａ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ－Ｉｍａｉｚｕｍｉ，Ｊ．Ｉｗａｎｏ，Ｙ．Ｉｓｏｄａ，Ｊ．Ｅｎｏｋｉｚｏｎｏ，Ｙ．Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，Ｅ．Ａｒａｋａｗａ，Ｋ．Ｔｏｍｉｚｕｋａ ＆ Ｋ．Ｍａｓｕｄａ（２０１７）Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｈａｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ，６，７９８－８０８．
Ｓｉｌａｃｃｉ，Ｍ．，Ｓ．Ｂｒａｃｋ，Ｇ．Ｓｃｈｉｒｒｕ，Ｊ．Ｍａｒｌｉｎｄ，Ａ．Ｅｔｔｏｒｒｅ，Ａ．Ｍｅｒｌｏ，Ｆ． Ｖｉｔｉ ＆ Ｄ．Ｎｅｒｉ（２００５）Ｄｅｓｉｇｎ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，５，２３４０－５０．
Ｓｔｅｒｎ，Ｎ．，Ｇ．Ｍａｒｋｅｌ，Ｔ．Ｉ．Ａｒｎｏｎ，Ｒ．Ｇｒｕｄａ，Ｈ．Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｄ．Ｇｒａｙ－Ｏｗｅｎ ＆ Ｏ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ（２００５）Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ （ＣＥＡ） Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＮＫ Ｋｉｌｌｉｎｇ ｖｉａ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＥＡ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ １．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７４，６６９２－６７０１．
Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｌ．Ｍ．，Ｓ．Ｙｏｕｎｇ，Ｇ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｍａｔｈｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｂａｔｅｓ，Ｈ．Ａ．Ｂａｎｄ，Ｒ．Ｗ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．Ｒｏｓｓ ＆ Ｄ．Ｓｎａｒｙ（１９９９）Ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＲ１Ａ３，ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｃｅｌｌ－ｂｏｕｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，４７，２９９－３０６．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ｓ．Ｍｉｎａｍｉ，Ｙ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｋ．Ｔａｊｉｍａ，Ｎ．Ｓａｋａｉ，Ｋ．Ｓｕｇａ，Ｓ．Ｉ．Ｈｉｓａｎａｇａ，Ｎ．Ｏｈｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｆｕｋｕｄａ ＆ Ｈ．Ｋａｗａｈａｒａ（２０１９）Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｒａｂ ｆａｍｉｌｙ ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＢＡＧ６．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ，２０．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｆ．Ｇｒｕｎｅｒｔ ＆ Ｗ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ（１９９１）Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ，５，３４４－３６６．
Ｗｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｄ．Ｚ．Ｃｈｕ，Ｌ．Ｅ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｍ．Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｄ．Ｎ．Ｉｋｌｅ，Ｃ．Ｓ．Ｋｗｏｋ，Ａ．Ｌｉｕ，Ｓ．Ｗｉｌｃｚｙｎｓｋｉ，Ｄ．Ｃｏｌｃｈｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｙａｚａｋｉ，Ｊ．Ｅ．Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ａ．Ｍ．Ｗｕ ＆ Ａ．Ａ．Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅｋ（２００４）Ｐｉｌｏｔ ｔｒｉａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａｎ １２３Ｉ－ｌａｂｅｌｅｄ ８０－ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ （ｃＴ８４．６６ ｍｉｎｉｂｏｄｙ） ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１０，５０１４－２１．
Ｗｕ，Ｊ．，Ｙ．Ｓｏｎｇ，Ａ．Ｂ．Ｂａｋｋｅｒ，Ｓ．Ｂａｕｅｒ，Ｔ．Ｓｐｉｅｓ，Ｌ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ ＆ Ｊ．Ｈ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（１９９９）Ａｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ＤＡＰ１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，７３０－２．
Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．＆ Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ（１９７０）Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｍｙｅｌｏｍａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１３２，２１１－５０．
Ｚｈａｎｇ，Ｔ．，Ｂ．Ａ．Ｌｅｍｏｉ ＆ Ｃ．Ｌ．Ｓｅｎｔｍａｎ（２００５）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＮＫ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｅａｒｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ，１０６，１５４４－１５５１．
Ｚｈａｎｇ，Ｔ．，Ｘ．Ｓｏｎｇ，Ｌ．Ｘｕ，Ｊ．Ｍａ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｇｏｎｇ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｚｈｏｕ，Ｚ．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｓｈｉ，Ｈ．Ｂａｉ，Ｎ．Ｌｉｕ，Ｘ．Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｃｕｉ，Ｙ．Ｃａｏ，Ｑ．Ｌｉｕ，Ｊ．Ｓｏｎｇ，Ｙ．Ｌｉ，Ｚ．Ｔａｎｇ，Ｍ．Ｇｕｏ，Ｌ．Ｗａｎｇ ＆ Ｋ．Ｌｉ（２０１８）Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＦｃｇａｍｍａＲＩｏｔａ ｈａｓ ａ ｐｒｏｆｏｕｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，６７，１０７９－１０９０．
Ｚｈａｏ，Ｌ．，Ｌ．Ｑｕ，Ｊ．Ｚｈｏｕ，Ｚ．Ｓｕｎ，Ｈ．Ｚｏｕ，Ｙ．Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｄ．Ｍａｒｋｓ ＆ Ｙ．Ｚｈｏｕ（２０１４）Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｏｕｎｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９，ｅ１１１３３９．

Claims (22)

1. 配列番号５２のアミノ酸５９６～６７４でヒトＣＥＡに特異的に結合する抗体またはその結合フラグメントを含む、抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. 他のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーに結合しない、請求項１に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。
3. （ｉ）（ａ）配列番号７のＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）と、（ｂ）配列番号８のＨＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号９のＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、及び、（ｄ）配列番号１０のＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）と、（ｅ）配列番号１１のＬＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号６のＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域；
   （ｉｉ）（ａ）配列番号２４のＨＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号２５のＨＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号２６のＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、及び、（ｄ）配列番号２７のＬＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号２８のＬＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２３のＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域；または
   （ｉｉｉ）（ａ）配列番号４１のＨＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号４２のＨＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号４３のＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、及び、（ｄ）配列番号４４のＬＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号４５のＬＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号４０のＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域
   を含む、請求項１に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。
4. （ｉ）配列番号１４と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１５と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
   （ｉｉ）配列番号３１と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号３２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
   （ｉｉｉ）配列番号４８と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４９と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
   を含む、請求項３に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。
5. 配列番号１４、１５、３１、３２、４８、または４９内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸が挿入、削除、または置換されている、請求項４に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。
6. （ｉ）配列番号１４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１５を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
   （ｉｉ）配列番号３１を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号３２を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
   （ｉｉｉ）配列番号４８を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
   を含む、請求項１に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。
7. モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト改変抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、またはＦ（ａｂ’）_２フラグメントである、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。
8. 前記抗ＣＥＡ抗体またはその前記抗原結合フラグメントが抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。
9. 前記抗ＣＥＡ抗体またはその前記抗原結合フラグメントは、グリコシル化が低下しているか、グリコシル化がないか、または低フコシル化されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。
10. 前記抗体またはその前記抗原結合フラグメントが、増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。
11. ＦｃドメインがＩｇＧ１である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。
12. 前記抗体が毒素に結合している、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメント。
13. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物であって、薬学的に許容される担体をさらに含む、前記医薬組成物。
14. 有効量の請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメントを、必要とする患者に投与することを含む、がんの治療方法。
15. 前記がんが、胃癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、頭頚部癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫及び肉腫である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記抗体または前記抗原結合フラグメントが、別の治療剤と組み合わせて投与される、請求項１４に記載の方法。
17. 前記治療剤が、パクリタキセルもしくはパクリタキセル剤、ドセタキセル、カルボプラチン、トポテカン、シスプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、レナリドマイド、または５－アザシチジンである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記治療剤が、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤＬ１抗体である、請求項１６に記載の方法。
19. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡ抗体または抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸。
20. 請求項１９に記載の核酸を含む、ベクター。
21. 請求項１９に記載の核酸または請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
22. 請求項２１に記載の宿主細胞を培養し、培養物から抗体または抗原結合フラグメントを回収することを含む、抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する方法。