KR20220151164A - 항-NKp30 항체 및 이용 방법 - Google Patents

항-NKp30 항체 및 이용 방법 Download PDF

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Abstract

인간 NKp30에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편, 하나의 항원으로서의 NKp30 및 적어도 하나의 다른 항원을 인식하는 다중특이성 항체, NKp30 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 질병, 예컨대 암을 치료하기 위한 항체, 다중특이성 항체 또는 조성물의 용도.

Description

항-NKp30 항체 및 이용 방법
인간 NKp30에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 상기 항체를 포함하는 조성물, 및 암의 치료를 위한 이용 방법이 본원에 개시된다.
자연 살해(NK) 세포는 선천 면역계에 속하며, 바이러스 감염 및 종양에 대한 일차 방어선의 역할을 한다(문헌[Biron et al., 1999 Annu Rev Immunol. 117:189-220]). NK 세포는 세포 표면 상의 T-세포 수용체(TCR)를 결여하며, 사전 감작 없이 표적 세포를 인식하고 제거할 수 있다. NK 세포의 기능적 활성(사이토카인 생성 및 세포독성 포함)은 활성화 및 저해 신호 둘 모두를 포함하는 복잡한 메커니즘에 의해 조절된다(문헌[Pegram et al., 2011 Immunol Cell Biol. 89(2):216-224]).
NKp30은 30 KD I형 막횡단 당단백질이며, 이는 세포외 V-유사 면역글로불린 도메인을 갖는다(문헌[Pende et al., 1999 J Exp Med. 190(10):1505-16]). NKp30을 코딩하는 유전자 및 cDNA는 클로닝되었고 인간 및 래트에서 특성화되었다(상기 문헌[Pende et al., 1999], 문헌[Hsieh et al., 2006 Eur J Immunol. 36(8):2170-80]). 마우스에서, NKp30은 위유전자이다(문헌[Hollyoake et al., 2005 Mol Biol Evol.22(8):1661-1672]). 전장 인간 NKp30은 201개 아미노산(SEQ ID NO: 1) 길이의 서열을 가지며, 여기서, 처음 18개 아미노산은 신호 펩티드이다. 성숙 인간 NKp30의 아미노산 서열은 183개 아미노산(aa) 잔기를 함유한다(NCBI 수탁 번호: NM_147130.1). 성숙 인간 NKp30의 세포외 도메인(ECD)은 117개 아미노산 잔기(SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1의 아미노산 19 내지 135에 상응)에 이어서 21개 aa 막횡단 서열 및 45개 aa 세포질 도메인으로 이루어진다. ECD 내에서, 인간 NKp30은 각각 래트 및 사이노몰거스 원숭이와 67% 및 95% aa 서열 동일성을 공유한다. 세포질 도메인에서 발견되는 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(ITAM)와 같은 알려져 있는 활성화 신호전달 모티프는 존재하지 않는다. 신호전달을 위하여, NKp30은 ITAM-보유 어댑터 분자, 예컨대 CD3ζ/Fc
Figure pct00001
RIγ와 회합한다(문헌[Koch et al., 2013 Trends Immunol. 2013 34(4):182-91]). NKp30과 CD3ζ의 상호작용은 NKp30 막횡단 도메인 내의 하전된 잔기를 통해 발생한다(문헌[Augugliaro et al., 2003 Eur J Immunol. 33(5):1235-41]).
NKp30은 NK 세포 및 "선천-유사" CD8+ T 세포 상에서 주로 발현된다(상기 문헌[Pende et al., 1999], 문헌[Correia et al., 2018 Proc Natl Acad Sci U S A. 115(26)). 이의 발현은 IL-2, IL-15 및 IFN-α에 의해 상향조절되고, TGF-β에 의해 하향조절될 수 있다(문헌[Castriconi et al., 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100(7):4120-4125]; 문헌[Bozzano et al., 2011 Eur J Immunol, 41, 2905-14]). NKp30은 종양 세포 상에서 우선적으로 발현되는 리간드를 인식한다. 키메라 NKp30 수용체(예를 들어, CD3ζ 및 CD28 신호전달 도메인에 융합된 NKp30)를 T 세포 내로 도입함으로써 NKp30을 표적화하는 것은 NKp30 리간드-양성 종양 세포에 대하여 강력한 항-종양 활성을 유도하는 것으로 나타났다(문헌[Zhang et al., 2012 J Immunol. 189(5):2290-9]).
NK 세포-매개된 면역감시 및 항-종양 효과에서의 NKp30의 매우 중요한 역할을 고려하여, 단일요법으로서 또는 NKp30 및 또 다른 항원을 표적화하는 다중-특이성 항체의 항원 결합 도메인으로서 NK 세포를 종양 항원-발현 종양 세포에 대하여 재지향시킨다.
본 개시내용은 NKp30에 특이적으로 결합하는 효능성 항-NKp30 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 인간 NKp30에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 개시내용은 하기의 구현예를 포함한다.
인간 NKp30에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
상기 항체에 있어서, 항체가 적어도 SEQ ID NO: 1의 아미노산 이소류신 50 및 류신 86에서 인간 NKp30에 결합하는, 항체.
상기 항체에 있어서, 항체가 NKp30과 B6H7 리간드의 상호작용을 감소시키는, 항체.
상기 항체에 있어서, 항체가 NKp30 효능제 활성을 갖는, 항체.
하기를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(i) (a) SEQ ID NO: 19의 HCDR1(중쇄 상보성 결정 영역 1), (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 29의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1(경쇄 상보성 결정 영역 1), (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ii) (a) SEQ ID NO: 19의 HCDR1, (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 20의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1, (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(iii) (a) SEQ ID NO: 3의 HCDR1, (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1, (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
하기를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편:
(i) SEQ ID NO: 30과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 32와 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(ii) SEQ ID NO: 21과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 23과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(iii) SEQ ID NO: 11과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 13과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
상기 항체 또는 항원-결합 단편으로서, SEQ ID NO: 30, 32, 21, 23, 11 또는 13 내의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산이 삽입되거나, 결실되거나, 치환된, 항체 또는 항원-결합 단편.
하기를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편:
(i) SEQ ID NO: 30을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 32를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(ii) SEQ ID NO: 21을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(iii) SEQ ID NO: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 13을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
상기 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 조작된 항체, 단일 쇄 항체(scFv), Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편인, 항체 또는 항원-결합 단편.
상기 항체로서, 항체가 다중특이성 항체인, 항체.
적어도 인간 NKp30에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 적어도 인간 종양-연관 항원(TAA)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 다중특이성 항체.
상기 다중특이성 항체로서, 제1 항원 결합 도메인이 하기를 포함하는, 다중특이성 항체:
(i) (a) SEQ ID NO: 19의 HCDR1(중쇄 상보성 결정 영역 1), (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 29의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1(경쇄 상보성 결정 영역 1), (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ii) (a) SEQ ID NO: 19의 HCDR1, (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 20의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1, (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(iii) (a) SEQ ID NO: 3의 HCDR1, (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1, (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
및 적어도 인간 종양 연관 항원(TAA)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인.
상기 다중특이성 항체로서, 다중특이성 항체가 이중특이성 항체인, 다중특이성 항체.
상기 이중특이성 항체로서, 이중특이성 항체가 이중특이성 4가 항체인, 이중특이성 항체.
VD1-CL-(X1)n-VD2-CH1-Fc 또는 VD1-CH-(X1)n-VD2-CL-Fc를 포함하는 이중특이성 4가 항체로서, VD1이 항원 결합 도메인의 제1 가변 도메인이며, VD2가 항원 결합 도메인의 제2 가변 도메인이며, Fc가 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 쇄이며, CH 또는 CL이 불변 중쇄 또는 불변 경쇄 도메인이며, (X1)n이 적어도 2개 아미노산의 링커인, 이중특이성 4가 항체.
상기 이중특이성 4가 항체로서, 링커가 SEQ ID NO: 43 내지 SEQ ID NO 85의 서열인, 이중특이성 4가 항체.
상기 이중특이성 4가 항체로서, 링커가 SEQ ID NO: 44인, 이중특이성 4가 항체.
상기 이중특이성 4가 항체로서, 링커가 SEQ ID NO: 50인, 이중특이성 4가 항체.
상기 이중특이성 4가 항체로서, 링커가 SEQ ID NO: 55인, 이중특이성 4가 항체.
상기 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
상기 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 감소된 글리코실화를 갖거나, 글리코실화를 갖지 않거나, 하이포푸코실화(hypofucosylated)된, 항체 또는 항원-결합 단편.
상기 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 증가된 이분(bisecting) GlcNac 구조를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
상기 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, Fc 도메인이 IgG1을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
상기 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, Fc 도메인이 IgG4를 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
상기 항체 또는 항원-결합 단편으로서, IgG4가 (EU 넘버링 체계에 따른) S228P 치환을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 상기 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 약제학적 조성물.
유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을, 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법.
상기 방법에 있어서, 암이 위암, 결장암, 췌장암, 유방암, 두경부암, 신장암, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 및 육종인, 방법.
상기 방법에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 또 다른 치료제와 조합되어 투여되는, 방법.
상기 방법에 있어서, 치료제가 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 파클리탁셀 작용제, 도세탁셀(docetaxel), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 시스플라틴(cisplatin), 이리노테칸(irinotecan), 독소루비신(doxorubicin), 레날리도미드(lenalidomide) 또는 5-아자시티딘인, 방법.
상기 방법에 있어서, 치료제가 파클리탁셀 작용제, 레날리도미드 또는 5-아자시티딘인, 방법.
상기 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는, 단리된 핵산.
핵산을 포함하는, 벡터.
핵산 또는 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
숙주 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 항체 또는 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성 공정.
항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 진단 시약.
상기 진단 시약으로서, 표지가 방사성표지, 형광단, 발색단, 영상화제 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 진단 시약.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: (a) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: (a) SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3인 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 (b) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3인 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: (a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 또는 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 또는 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3인 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3인 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: (a) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 30 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23 또는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23 또는 SEQ ID NO: 32 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: (a) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23 또는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23 또는 SEQ ID NO: 32의 아미노산에 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역. 또 다른 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(c) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(d) SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형(isotype)을 갖는다. 더 구체적인 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 야생형 인간 IgG1(인간 IgG1wt 또는 huIgG1로도 지칭됨) 또는 IgG2의 Fc 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 (EU 넘버링 체계에 따른) S228P 및/또는 R409K 치환을 갖는 인간 IgG4의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 1 Х 10-6 M 내지 1 Х 10-10 M의 결합 친화도(KD)로 NKp30에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 약 1 Х 10-6 M, 약 1 Х 10-7 M, 약 1 Х 10-8 M, 약 1 Х 10-9 M 또는 약 1 Х 10-10 M의 결합 친화도(KD)로 NKp30에 결합한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항-인간 NKp30 항체는 사이노몰거스 NKp30에 대하여 교차-종 결합 활성을 보인다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 강력한 Fc-매개된 이펙터 기능을 갖는다. 항체는 NKp30 발현 표적 세포에 대하여 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 매개한다.
본 개시내용은 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 일 구현예에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 31의 VH 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 31과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편의 VH 영역을 인코딩한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단리된 핵산은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 33의 VL 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 33과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편의 VL 영역을 인코딩한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 NKp30 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서의 질병의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 치료적 유효량의 NKp30 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 NKp30 항체 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 치료하려는 질병은 암이다.
본 개시내용은 질병, 예컨대 암을 치료하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 NKp30 항체 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
도 1은 NKp30-mIgG2a(상측) 및 NKp30-huIgG1(하측)의 개략도이다. NKp30 ECD: NKp30 세포외 도메인. N: N-말단. C: C-말단.
도 2a 및 도 2b는 항-NKp30 항체 VH(도 2a) 및 VL(Vk)(도 2b) 영역의 계통수의 그래프이다. 후보 항-NKp30 항체의 VH 및 VL 서열을 DNASTAR의 Megalign™ 소프트웨어를 사용하여 정렬하였다. 서열 상동성은 계통수에 나타나 있다.
도 3a 내지 도 3d는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 정제된 쥣과 항-NKp30 항체의 친화도 결정을 보여준다.
도 4는 유세포측정에 의한 쥣과 항-NKp30 항체 결합의 결정을 도시한다.
도 5a 내지 도 5c는 항-NKp30 항체에 의한 IFN-γ의 유도를 입증한다. 도 5a는 항-NKp30 항체 mu183 또는 mu17의 존재 하에 마우스 FcγR+ P815 세포와 하룻밤 동시-배양한 NKp30+ NK92MI 세포(NK92MI/NKp30)를 보여준다. IFN-γ 생성은 ELISA에 의해 결정하였다. 도 5b 및 도 5c는 건강한 공여자로부터의 PBMC를 IL-2(1000 U/ml)로 3일 동안 자극한 후에, P815 세포 + 항-NKp30 Ab와 하룻밤 동시-배양하였음을 보여준다. IFN-γ 생성은 ELISA에 의해 결정하였다. 결과는 3벌 반복시험의 평균 ± SD로 나타나 있다.
도 6은 유세포측정에 의한 인간화 항-NKp30 Ab BGA1831의 결합 검정이며, 이는 NKp30으로의 결합이 인간화 후에 유지되는 것을 입증한다.
도 7a는 인간화 항-NKp30 Ab의 에피토프 맵핑을 보여주며, 도 7b는 B7H6과의 복합체에서의 NKp30의 분자 모델링을 보여준다.
도 8은 항-NKp30 Ab BGA1833에 의한 NKp30/B7-H6 상호작용의 차단을 보여준다. 항-NKp30 Ab에 의한 NKp30/B7-H6 상호작용의 저해를 보여주는 개략도. B7-H6-발현 HCT116 세포(HCT116/B7-H6)로의 용해성 NKp30의 결합(NKp30-mIgG2a 융합 단백질)을 유세포측정에 의해 결정하였다. 단계 희석된 BGA1833/IgG1을 첨가함으로써 NKp30/B7-H6 상호작용의 차단을 정량적으로 측정하였다. 결과는 2벌 반복시험의 평균 ± SD로 나타나 있다.
도 9a 및 도 9b는 BGA1833/IgG1에 의한 NK92MI/NKp30 세포의 활성화를 보여준다. 도 9a는 NK92MI/NKp30 세포를 BGA1833/IgG1의 존재 하에 THP-1 세포와 동시-배양하였음을 보여준다. 배양 상청액 중 IFN-γ를 ELISA에 의해 결정하였다. 도 9b는 항-NKp30 Ab에 의한 NK 세포-매개된 사멸의 유도를 역(reverse) ADCC 검정에서 수행하였음을 보여준다. 요약하여, NK92MI/NKp30 세포를 BGA1833/IgG1의 존재 하에 THP-1 세포와 동시-배양하였다. 세포독성의 백분율을 LDH(락트산 탈수소효소) 방출 검정에 의해 결정하였다. 모든 조건을 3벌 반복시험으로 수행하였으며, 결과는 평균 ± SD로 나타나 있다.
도 10a는 제1 항원-결합 도메인으로서의 NKp30의 이중특이성 항체 및 제2 항원 결합 도메인으로서의 항-클라우딘(claudin) 18.2(CLDN18.2)의 단리를 보여준다. 도 10b는 IFN-감마 방출 검정에서의 이중특이성 항체 NKp30 x 항-클라우딘 18.2(CLDN18.2)를 보여준다.
도 11은 IFN-감마 방출 검정에서 제1 항원-결합 도메인으로서의 NKp30의 이중특이성 항체 및 제2 항원 결합 도메인으로서의 항-5T4 종양태아 항원(5T4)을 보여준다.
정의
본 명세서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 다른 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
첨부된 청구범위를 포함하여 본원에 사용되는 바와 같이, 단어의 단수형, 예컨대 "부정관사(a 및 an)", 및 "정관사(the)"는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 그들의 상응하는 복수의 지시 대상을 포함한다.
용어 "또는"은, 문맥이 달리 명확히 나타내지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되고, "및/또는"과 상호교환 가능하게 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항암제"는 세포독성제, 화학치료제, 방사선요법 및 방사선치료제, 표적화된 항암제 및 면역치료제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포 증식 장애, 예컨대 암을 치료하는 데 사용될 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다.
용어 "천연 세포독성 촉발 수용체" 또는 "NKp30" 또는 "CD337"은 대략 21 킬로달톤의 단백질을 지칭한다. 인간 NKp30의 아미노산 서열, (SEQ ID NO: 1)은 또한, 수탁 번호 O14931(NCTR3_HUMAN) 또는 NP_667341.1로 찾을 수 있다. NKp30의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "투여", "투여하는", "치료하는" 및 "치료"는 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 대한 외인성 약제학적, 치료적, 진단적 작용제, 또는 조성물의 접촉을 의미한다. 세포의 처리는 세포에 대한 시약의 접촉뿐만 아니라, 세포와 접촉 상태에 있는 유체에 대한 시약의 접촉을 포함한다. 용어 "투여" 및 "치료"는 또한 시약, 진단용, 결합 화합물에 의한 또는 또 다른 세포에 의한, 예를 들어 세포의, 시험관내 및 생체외(ex vivo) 치료를 의미한다. 본원에서, 용어 "대상체"는 임의의 유기체, 바람직하게는 동물, 더 바람직하게는 포유동물(예를 들어, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼), 가장 바람직하게는 인간을 포함한다. 일 양태에서, 임의의 질병 또는 장애를 치료한다는 것은 질병 또는 장애를 개선하는(즉, 질병의 발생 또는 이의 임상 증상들 중 적어도 하나를 둔화, 정지, 또는 감소시키는) 것을 지칭한다. 또 다른 양태에서, "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 환자에 의해 식별 가능하지 않을 수 있는 것들을 포함한 적어도 하나의 신체적 파라미터를 경감 또는 개선하는 것을 지칭한다. 또 다른 양태에서, "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 질병 또는 장애를 신체적으로 조절하거나(예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화), 생리학적으로 조절하거나(예를 들어, 신체적 파라미터의 안정화), 또는 둘 모두를 지칭한다. 또 다른 양태에서, "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 질병 또는 장애의 발병 또는 발생 또는 진행을 예방 또는 지연시키는 것을 지칭한다.
본 개시내용과 관련하여 용어 "대상체"는 포유동물, 예를 들어 영장류, 바람직하게는 고등 영장류, 예를 들어 인간(예를 들어, 본원에 기재된 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 환자)이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "친화도"는 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 항원에서, 항체의 가변 영역은 다수의 부위에서 항원과 비공유적인 힘을 통해 상호작용한다. 일반적으로, 상호작용이 더 많을수록 친화도는 더 강해진다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 상응하는 항원에 비공유적으로, 가역적으로, 그리고 특이적 방식으로 결합할 수 있는 면역글로불린 패밀리의 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 천연 발생 IgG 항체는 이황화물 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 사량체이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약기됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약기됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, 즉 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역들로 추가로 세분될 수 있으며, 이들 사이에는 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 더 보존된 영역들이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 구성되며, 아미노-말단부터 카르복실-말단까지 하기의 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은, 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "항체"는 단일클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 항체는 임의의 동종형/부류(class)(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 또는 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 항-NKp30 항체는 적어도 하나의 항원-결합 부위, 적어도 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-NKp30 항체는 본원에 기재된 NKp30 항체로부터의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-NKp30 항체는 단리되거나 재조합된 것이다.
본원에서, 용어 "단일클론 항체" 또는 "mAb" 또는 "Mab"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단을 의미하며, 즉, 그러한 집단 내에 포함된 항체 분자들은 소량으로 존재할 수 있는 천연 발생 돌연변이의 가능성을 제외하고는 아미노산 서열이 동일하다. 대조적으로, 통상적인(다중클론) 항체 제제는 통상적으로, 종종 상이한 에피토프에 특이적인 가변 도메인, 특히 상보성 결정 영역(CDR) 내에 상이한 아미노산 서열을 포함하는 다수의 상이한 항체를 포함한다. 수식어 "단일클론"은 항체들의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 것으로서 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 단일클론 항체(mAb)는 당업자에게 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kohler et al., Nature 1975 256:495-497]; 미국 특허 4,376,110; 문헌[Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992]; 문헌[Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988]; 및 문헌[Colligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993]을 참조한다. 본원에 개시된 항체는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA를 포함한 임의의 면역글로불린 부류 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4와 같은 이들의 임의의 하위부류를 가질 수 있다. 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양될 수 있다. 고역가의 단일클론 항체는 생체내 생성에서 수득될 수 있는데, 여기서는 개별 하이브리도마들로부터의 세포를 마우스, 예컨대 고유하게 프라이밍된(pristine-primed) Balb/c 마우스 내로 복막내 주사하여 고농도의 원하는 항체를 함유하는 복수(ascites fluid)를 생성한다. 동종형 IgM 또는 IgG의 단일클론 항체가 당업자에게 잘 알려진 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 그러한 복수로부터 또는 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다.
일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70 kDa)를 포함한다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은, 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 규정할 수 있다. 통상적으로, 인간 경쇄는 카파 경쇄 및 람다 경쇄로 분류된다. 더욱이, 인간 중쇄는 통상적으로 α, δ, ε, γ, 또는 μ로 분류되며, 각각 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM으로서 항체의 동종형을 규정한다. 경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역과 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다.
각각의 경쇄/중쇄(VL/VH) 쌍의 가변 영역은 항체-결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이작용성 또는 이중특이성 항체의 경우를 제외하고는, 2개의 결합 부위는 일반적으로 일차 서열이 동일하다.
통상적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 도메인은 "상보성 결정 영역(CDR)"으로도 불리는 3개의 초가변 영역을 포함하며, 이들은 상대적으로 보존된 프레임워크 영역들(FR) 사이에 위치된다. CDR들은 통상 프레임워크 영역들에 의해 정렬되어, 특정 에피토프에 대한 결합을 가능하게 한다. 일반적으로, N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두는 FR-1(또는 FR1), CDR-1(또는 CDR1), FR-2(FR2), CDR-2(CDR2), FR-3(또는 FR3), CDR-3(CDR3), 및 FR-4(또는 FR4)를 포함한다. CDR 및 프레임워크 영역의 위치는 당업계에 잘 알려진 다양한 정의, 예를 들어 카바트(Kabat), 초티아(Chothia), AbM 및 IMGT를 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001)]; 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)]; 문헌[Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989)]; 문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992)]; 문헌[Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997)]; 문헌[ImMunoGenTics (IMGT) numbering (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)]; 문헌[Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)("IMGT" numbering scheme)] 참조). 항원-결합 부위의 정의는 또한 하기에 기재되어 있다: 문헌[Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000)]; 및 문헌[Lefranc, M. P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001)]; 문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)]; 및 문헌[Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989)]; 문헌[Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991)]; 및 문헌[Rees et al., In Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)]. 예를 들어, 카바트 하에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 내의 CDR 아미노산 잔기는 31-35(HCDR1), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인(VL) 내의 CDR 아미노산 잔기는 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3)로 넘버링된다. 초티아 하에서, VH 내의 CDR 아미노산은 26-32(HCDR1), 52-56(HCDR2) 및 95-102(HCDR3)로 넘버링되며; VL 내의 아미노산 잔기는 26-32(LCDR1), 50-52(LCDR2) 및 91-96(LCDR3)으로 넘버링된다. 카바트 및 초티아 둘 모두의 CDR 정의를 조합함으로써, CDR은 인간 VH에서 26-35(HCDR1), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3), 및 인간 VL에서 아미노산 잔기 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3)로 넘버링된다. IMGT 하에서, VH 내의 CDR 아미노산 잔기는 대략 26-35(HCDR1), 51-57(HCDR2) 및 93-102(HCDR3)로 넘버링되고, VL 내의 CDR 아미노산 잔기는 대략 27-32(LCDR1), 50-52(LCDR2) 및 89-97(LCDR3)로 넘버링된다(카바트에 따른 넘버링). IMGT 하에서, 항체의 CDR 영역은 프로그램 IMGT/DomainGap Align을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인에서의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 및 중쇄 가변 도메인에서의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)를 포함한다. 문헌[Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.](서열에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)을 참조하며; 또한, 문헌[Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917](구조에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)을 참조한다. 용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 CDR 잔기로 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다.
달리 나타내지 않는 한, "항원-결합 단편"은 항체의 항원-결합 단편, 즉, 전장 항체에 의해 결합되는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 의미한다. 항원-결합 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 다이아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자, 예를 들어 단일쇄 Fv(ScFv); 나노바디; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 항체는 표적 단백질에 "특이적으로 결합"하는데, 이는, 항체가 기타 다른 단백질과 대비하여 그러한 표적에 우선적으로 결합함을 나타내지만, 이러한 특이성은 절대적인 결합 특이성을 필요로 하지 않음을 나타낸다. 항원(예를 들어, 단백질)과 항체 또는 항원 결합 항체 단편 사이의 상호작용을 기술하는 맥락에서 사용되는, 항체가 "특이적으로 결합한다" 또는 "선택적으로 결합한다"는 단백질 및 기타 생물제제의 비균질 집단, 예를 들어, 생물학적 샘플, 혈액, 혈청, 혈장 또는 조직 샘플 내의 항원의 존재를 결정짓는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 특정한 지정된 면역검정 조건 하에, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 백그라운드 수준과 비교하는 경우 적어도 2배 더 크게 특정 항원에 특이적으로 결합하고, 샘플 내에 존재하는 다른 항원에는 상당한 양으로 특이적으로 결합하지 않는다. 일 양태에서, 지정된 면역검정 조건 하에, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 백그라운드 결합 수준과 비교하여 적어도 열(10)배 더 크게 특정 항원에 특이적으로 결합하고, 샘플 내에 존재하는 다른 항원에는 상당한 양으로 특이적으로 결합하지 않는다.
본원에서, 용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다. 인간 항체는 마우스에서, 마우스 세포에서, 또는 마우스 세포로부터 유래되는 하이브리도마에서 생성된다면, 뮤린 탄수화물 사슬을 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "래트 항체"는 각각 마우스 또는 래트 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다.
용어 "인간화" 또는 "인간화 항체"는 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체뿐만 아니라 인간 항체로부터의 서열을 함유하는 항체의 형태를 의미한다. 그러한 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소한의 서열을 함유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 통상적으로는 2개의, 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 통상적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 접두사 "hum", "hu", "Hu", 또는 "h"는 인간화 항체를 모 설치류 항체와 구별하는 데 필요할 때 항체 클론 표기에 추가된다. 설치류 항체의 인간화 형태는 일반적으로 모 설치류 항체와 동일한 CDR 서열을 포함하겠지만, 친화도를 증가시키기 위하여, 인간화 항체의 안정성을 증가시키기 위하여, 번역후 변형을 제거하기 위하여, 또는 기타 다른 이유로 특정 아미노산 치환이 포함될 수 있다.
용어 "상응하는 인간 생식세포계열 서열"은 인간 생식세포계열 면역글로불린 가변 영역 서열에 의해 인코딩된 모든 다른 알려진 가변 영역 아미노산 서열과 대비하여, 참조 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 최고로 결정된 아미노산 서열 동일성을 공유하는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 인코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 상응하는 인간 생식세포계열 서열은 또한 모든 다른 평가된 가변 영역 아미노산 서열과 대비하여, 참조 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 최고의 아미노산 서열 동일성을 갖는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 지칭할 수 있다. 상응하는 인간 생식세포계열 서열은 오직 프레임워크 영역이거나, 오직 상보성 결정 영역이거나, 프레임워크 및 상보성 결정 영역이거나, 가변 세그먼트(상기에 정의된 바와 같음)이거나, 가변 영역을 포함하는 서열 또는 하위서열의 기타 다른 조합일 수 있다. 서열 동일성은 본원에 기재된 방법을 사용하여, 예를 들어 BLAST, ALIGN, 또는 당업계에 알려진 또 다른 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다. 상응하는 인간 생식세포계열 핵산 또는 아미노산 서열은 참조 가변 영역 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 91, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유한다면, 불변 영역은 또한, 예를 들어, 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000]에 기재된 바와 같이, 이러한 인간 서열, 예를 들어, 인간 생식세포계열 서열 또는 인간 생식세포계열 서열의 돌연변이 버전 또는 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 공통 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다.
용어 "평형 해리 상수(KD, M)"는 해리 속도 상수(kd, 시간-1)를 회합 속도 상수(ka, 시간-1, M-1)로 나눈 값을 지칭한다. 평형 해리 상수는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 본 개시내용의 항체는 일반적으로 평형 해리 상수가 약 10-7 또는 10-8 M 미만, 예를 들어 약 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 일부 양태에서는, 약 10-11 M, 10-12 M 또는 10-13 M 미만일 것이다.
본원에서, 용어 "암" 또는 "종양"은 당업계에 이해되는 바와 같은 가장 넓은 의미를 가지며, 통상적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭한다. 본 개시내용과 관련하여, 암은 특정 유형 또는 위치로 한정되지 않는다.
본 개시내용과 관련하여, 아미노산 서열을 언급할 때, 용어 "보존적 치환"은 원래의 아미노산을 항체 또는 단편의 화학적, 물리적 및/또는 기능적 특성, 예를 들어 NKp30에 대한 그의 결합 친화도를 실질적으로 변경시키지 않는 새로운 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 아미노산의 일반적인 보존적 치환은 당업계에 잘 알려져 있다.
서열 동일성% 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 알고리즘이며, 이들은 문헌[Altschul et al, Nuc. Acid Res. 25:3389-3402, 1977]; 및 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 NCBI(National Center for Biotechnology Information, 미국 국립생물공학정보센터)를 통해 공개적으로 입수 가능하다. 이 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열 중의 동일한 길이의 단어와 정렬될 때, 양의 역치 점수(positive-valued threshold score) T에 어느 정도 매칭되거나 충족되는, 질의(query) 서열 중의 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 고득점 서열 쌍(high scoring sequence pair, HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 단어 점수 역치(neighborhood word score threshold)라고 한다. 이들 초기 이웃 단어 히트(hit)는 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하기 위한 값으로서 역할을 한다. 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 멀리 각각의 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 누적 점수는, 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M(매칭 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 득점 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각 방향에서의 단어 히트의 연장은 다음의 경우에 정지된다: 누적 정렬 점수가 그의 최대 도달 값으로부터 X의 양만큼 하락한 경우; 하나 이상의 실점(negative-scoring) 잔기 정렬의 축적으로 인해, 누적 점수가 0 이하가 된 경우; 또는 어느 서열이든 말단에 도달한 경우. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 단어 길이(W) = 11, 기대치(E) = 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLAST 프로그램은 디폴트로서 단어 길이 = 3, 및 기대치(E) = 10, 및 BLOSUM62 득점 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915] 참조), 정렬(B) = 50, 기대치(E) = 10, M = 5, N = -4, 및 양쪽 가닥 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성 통계 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 척도는 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 참조 핵산 대비 검사 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성%는 또한, PAM120 가중치 잔기(weight residue) 표, 12의 갭 길이 페널티 = 12 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 통합된 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다(문헌[E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17, (1988)]). 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성%는, BLOSUM62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 어느 하나, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 내로 통합된 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다(문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, (1970)]).
본원에서, 용어 "핵산"은 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환 가능하게 사용되며, 단일가닥 형태 또는 이중가닥 형태 중 어느 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 알려진 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본(backbone) 잔기 또는 결합(linkage)을 함유하는 핵산을 포함하며, 이러한 핵산은 합성, 천연 발생, 및 비천연 발생 핵산이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사된다. 그러한 유사체의 예에는, 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 및 펩티드-핵산(PNA)이 포함된다.
핵산과 관련하여 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA) 세그먼트 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 통상적으로, 그것은 전사 조절 서열과 전사된 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 적절한 숙주 세포 또는 기타 다른 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우, 그것은 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사된 서열에 물리적으로 인접해 있으며, 즉, 이들은 시스-작용성(cis-acting)이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는 전사를 향상시키려는 코딩 서열에 물리적으로 인접해 있거나 근접하게 위치될 것을 필요로 하지 않는다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화되는, 본원에 기재된 바와 같은 항-NKp30 항체를 포함하는 조성물, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 생리학적으로 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 부형제는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 직장, 척수 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합할 수 있다.
본원에 개시된 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들어 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대 액체 용액(예를 들어, 주사가능 및 주입 용액), 분산물 또는 현탁액, 리소좀, 및 좌제를 포함한다. 적합한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 응용에 좌우된다. 통상적인 적합한 조성물은 주사가능 용액 또는 주입 용액의 형태이다. 하나의 적합한 투여 방식은 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 복막내, 근육내)이다. 일부 구현예에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 질병을 치료하거나 질병 또는 장애의 임상 증상들 중 적어도 하나를 치료하기 위하여 대상체에게 투여될 때, 질병, 장애, 또는 증상을 위한 그러한 치료를 달성하기에 충분한 항체의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"은 항체, 질병, 장애, 및/또는 질병 또는 장애의 증상; 질병, 장애, 및/또는 질병 또는 장애의 증상의 중증도; 치료하려는 대상체의 연령; 및/또는 치료하려는 대상체의 체중에 따라 변동될 수 있다. 임의의 주어진 경우의 적절한 양이 당업자에게 명백할 수 있거나 일상 실험에 의해 결정될 수 있다. 조합 요법의 경우에, "치료적 유효량"은 질병, 장애 또는 질환의 유효적 치료를 위한 조합 물질들의 총량을 지칭한다.
용어 "조합 요법"은 본 개시내용에 기재된 치료적 질환 또는 장애를 치료하기 위하여 2개 이상의 치료제를 투여하는 것을 지칭한다. 그러한 투여는 실질적으로 동시적인 방식으로 이들 치료제를 공동투여하는 것을 포함한다. 그러한 투여는 또한 각각의 활성 성분을 위한 다수의 또는 개별 용기(예를 들어, 캡슐, 분말, 및 액체)로 공동투여하는 것을 포함한다. 분말 및/또는 액체는 투여 전에 원하는 용량으로 재구성되거나 희석될 수 있다. 추가적으로, 그러한 투여는 또한 대략적으로 동일한 시간에 또는 상이한 시간에 순차적 방식으로 각각의 유형의 치료제를 사용하는 것을 포함한다. 어느 경우이든, 치료 계획(treatment regimen)은 본원에 기재된 질환 또는 장애를 치료하는 데 있어서 약물 조합의 유익한 효과를 제공할 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 어구 "~와 조합되어"는 항-NKp30 항체, 항원 결합 단편 또는 다중특이성 항체가 추가의 치료제의 투여와 동시에, 그 직전에, 또는 그 직후에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 항-NKp30 항체, 항원 결합 단편 또는 다중특이성 항체는 추가의 치료제와의 공동제형(co-formulation)으로서 투여된다.
상세한 설명
본 개시내용은 인간 NKp30에 특이적으로 결합하는 항체, 항원-결합 단편 또는 다가 항체를 제공한다. 더욱이, 본 개시내용은 바람직한 약동학적 특성 및 기타 다른 바람직한 속성을 갖는 항체를 제공하며, 이에 따라 암의 가능성을 감소시키거나 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물 및 암 및 연관 장애의 예방 및 치료를 위하여 그러한 약제학적 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
항-NKp30 항체
본 개시내용은 NKp30에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 하기에 기재된 바와 같이 생성된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 개시내용은 NKp30에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다(표 1). 본 개시내용은 또한, NKp30에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 HCDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR(중쇄 상보성 결정 영역)을 포함한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 NKp30에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체는 표 1에 열거된 HCDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 HCDR을 포함한다(또는 대안적으로는 이로 이루어진다).
본 개시내용은 NKp30에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23 또는 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다(표 1). 본 개시내용은 또한 NKp30에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 LCDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR(경쇄 상보성 결정 영역)을 포함한다. 특히, 본 개시내용은 NKp30에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 LCDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 LCDR을 포함한다(또는 대안적으로는 이로 이루어진다).
본 개시내용의 기타 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 변경되었지만, 여전히 CDR 영역 내에서 표 1에 개시된 CDR 영역과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성%를 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 그것은 아미노산 변경을 포함하는데, 여기서는 표 1에 기재된 서열에 나타낸 CDR 영역과 비교할 때 CDR 영역 내에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 변경되었다.
기타 다른 본 개시내용의 항체는, 아미노산 또는 아미노산을 인코딩하는 핵산이 변경되었지만; 여전히, 표 1에 기재된 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성%를 갖는 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 그것은 아미노산 서열의 변경을 포함하는데, 여기서는 표 1에 기재된 서열에 나타낸 가변 영역과 비교할 때, 실질적으로 동일한 치료적 활성을 보유하면서, 가변 영역 내에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 변경되었다.
본 개시내용은 또한 NKp30에 특이적으로 결합하는 항체의 VH, VL, 전장 중쇄, 및 전장 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 그러한 핵산 서열은 포유류 세포에서의 발현을 위하여 최적화될 수 있다.
[표 1]
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에피토프 및 동일한 에피토프에 결합하는 항체의 확인
본 개시내용은 인간 NKp30의 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에서, 항체 및 항원-결합 단편은 NKp30의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본 개시내용은 또한 표 1에 기재된 항-NKp30 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 따라서, 추가적인 항체 및 이의 항원-결합 단편이 결합 검정에서 기타 다른 항체와 교차-경쟁하는(예를 들어, 통계학적으로 유의한 방식으로 그의 결합을 경쟁적으로 억제하는) 그들의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. NKp30에 대한 본 개시내용의 항체 및 이의 항원-결합 단편의 결합을 억제하는 검사 항체의 능력은 검사 항체가 NKp30에 대한 결합을 위하여 그러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁할 수 있음을 입증한다. 그러한 항체는, 어느 하나의 이론에 구애되지 않고서, 그것이 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 NKp30 상의 동일하거나 관련된(예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 NKp30 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 또는 인간화 단일클론 항체이다. 그러한 인간 또는 인간화 단일클론 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 단리될 수 있다.
Fc 영역의 변경
또 다른 양태에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체의 이펙터 기능을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은, 항체가 이펙터 리간드에 대한 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경되는 이펙터 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 C1 보체 성분일 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 5,624,821 및 5,648,260(둘 모두 Winter et al.)에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는, 항체가 변경된 C1q 결합을 갖고/갖거나 감소되거나 소실된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖도록 하나 이상의 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 6,194,551(Idusogie et al.)에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써, 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은, 예를 들어 공개 WO 94/29351(Bodmer et al.)에 기재되어 있다. 구체적인 양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 아미노산은 IgG1 하위부류 및 카파 동종형에 대하여 하나 이상의 알로타입(allotypic) 아미노산 잔기로 대체된다. 알로타입 아미노산 잔기는 또한 문헌[Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)]에 기재된 바와 같이, IgG1, IgG2, 및 IgG3 하위부류의 중쇄의 불변 영역뿐만 아니라, 카파 동종형의 경쇄의 불변 영역을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, Fc 영역은 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/시키거나, 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이러한 접근법은, 예를 들어 공개 WO00/42072(Presta)에 기재되어 있다. 더욱이, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위는 맵핑되어 있으며, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다(문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001]).
또 다른 양태에서, NKp30 항체 또는 항원 결합 단편의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화(aglycosylated) 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 글리코실화가 결여되어 있거나 감소됨). 글리코실화는, 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 그러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 가져옴으로써 그 부위에서의 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 그러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 그러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 5,714,350 및 6,350,861(Co et al.)에 기재되어 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 포함하는 하이포푸코실화 항체 또는 증가된 이분 GlcNac 구조를 포함하는 항체가 제조될 수 있다. 그러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 그러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 경로를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 경로를 갖는 세포는 당업계에 설명되어 있으며, 재조합 항체를 발현시킴으로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195(Hang et al.)는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하는데, 이는 푸코실 트랜스퍼라제를 인코딩하여, 그러한 세포주에서 발현되는 항체가 하이포푸코실화를 나타내도록 한다. 공개 WO 03/035835(Presta)는 변이 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하는데, 이것은 Asn(297)-결합된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소되며, 이는 또한 그러한 숙주 세포에서 발현된 항체의 하이포푸코실화를 가져온다(또한, 문헌[Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). WO99/54342(Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예를 들어, 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하는데, 이에 따라, 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이분 GlcNac 구조를 나타내며, 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 가져온다(또한, 문헌[Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999] 참조).
또 다른 양태에서, ADCC의 감소가 요구된다면, 인간 항체 하위부류 IgG4가 많은 이전 보고서에서 단지 약한 ADCC만을 가지며 CDC 이펙터 기능을 거의 갖지 않는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Moore et al., 2010 MAbs, 2:181-189]). 그러나, 천연 IgG4는 스트레스 조건에서, 예컨대 산성 완충액 중에서 또는 증가하는 온도 하에서 덜 안정한 것으로 확인되었다(문헌[Angal, 1993 Mol Immunol, 30:105-108]; 문헌[Dall'Acqua et al, 1998 Biochemistry, 37:9266-9273]; 문헌[Aalberse et al., 2002 Immunol, 105:9-19]). 감소된 ADCC는, 항체를 FcγR 결합 또는 C1q 결합 활성을 감소시키는 변경들의 조합으로 조작된 IgG4 Fc에 작동 가능하게 연결시킴으로써ADCC 및 CDC 이펙터 기능을 감소시키거나 제거함으로써 달성될 수 있다. 생물학적 약물로서 항체의 물리화학적 특성을 고려해 볼 때, IgG4의 덜 바람직한 고유 특성 중 하나는 용액 중에서 그의 2개의 중쇄를 동적 분리하여 하프 항체(half antibody)를 형성하는 것인데, 이는 "Fab 아암 교환"으로 불리는 공정을 통해 생체내에서 생성되는 이중특이성 항체로 이어진다(문헌[Van der Neut Kolfschoten M, et al., 2007 Science, 317:1554-157]). 위치 228(EU 넘버링 체계)에서 세린에서 프롤린으로의 돌연변이는 IgG4 중쇄 분리에 대해 억제적인 것으로 나타났다(문헌[Angal, 1993 Mol Immunol, 30:105-108]; 문헌[Aalberse et al., 2002 Immunol, 105:9-19]). 힌지 및 γFc 영역 내의 아미노산 잔기들 중 일부는 Fcγ 수용체와의 항체 상호작용에 대해 영향을 미치는 것으로 보고되었다(문헌[Chappel et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9036-9040]; 문헌[Mukherjee et al., 1995 FASEB J, 9:115-119]; 문헌[Armour et al., 1999 Eur J Immunol, 29:2613-2624]; 문헌[Clynes et al, 2000 Nature Medicine, 6:443-446]; 문헌[Arnold, 2007 Annu Rev immunol, 25:21-50]). 더욱이, 인간 집단에서 드물게 발생하는 일부 IgG4 아이소형(isoform)은 또한 상이한 물리화학적 특성을 유도할 수 있다(문헌[Brusco et al., 1998 Eur J Immunogenet, 25:349-55]; 문헌[Aalberse et al., 2002 Immunol, 105:9-19]). 낮은 ADCC 및 CDC를 갖지만 우수한 안정성을 갖는 NKp30 항체를 생성하기 위하여, 인간 IgG4의 힌지 및 Fc 영역을 변형시키고 다수의 변경을 도입하는 것이 가능하다. 이들 변형된 IgG4 Fc 분자는 SEQ ID NO: 83 내지 88에서 찾을 수 있다(미국 특허 8,735,553(Li et al.)).
NKp30 항체 생성
항-NKp30 항체, 항원-결합 단편 및 다중특이성 항체는 항체 사량체의 재조합 발현, 화학적 합성, 및 효소적 분해를 포함하지만 이로 한정되지 않는 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 생성될 수 있는 반면, 전장 단일클론 항체는, 예를 들어 하이브리도마 또는 재조합 생성에 의해 수득될 수 있다. 재조합 발현은 당업계에 알려진 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들어 포유류 숙주 세포, 세균 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등으로부터 이루어질 수 있다.
본 개시내용은 본원에 기재된 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 세그먼트를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 항-NKp30 항체의 가변 영역 서열을 인코딩할 수 있다. 이들은 또한 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 모두를 인코딩할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열들 중 일부는 예시된 항-NKp30 항체들 중 하나의 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
항-NKp30 항체를 생성하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 본 개시내용에 또한 제공된다. 발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되도록 의도된 숙주 세포에 따라 다르다. 통상적으로, 발현 벡터는 프로모터, 및 항-NKp30 항체 사슬 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 기타 다른 조절 서열(예를 들어, 인핸서)을 함유한다. 일부 양태에서, 유도성 조건의 제어 하에서를 제외하고, 삽입된 서열의 발현을 방지하도록 유도성 프로모터가 사용된다. 유도성 프로모터는, 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열충격 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은, 발현 생성물에 대해 숙주 세포가 더 우수한 내성을 나타내는 코딩 서열을 위하여, 집단을 편향시키지 않고서 비유도성 조건 하에서 증폭될 수 있다. 프로모터에 더하여, 항-NKp30 항체 또는 항원-결합 단편의 효율적인 발현을 위하여 기타 다른 조절성 요소가 또한 필요하거나 요구될 수 있다. 이들 요소는 통상적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 기타 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용 중인 세포 시스템에 대해 적절한 인핸서의 포함에 의해 향상될 수 있다(예를 들어, 문헌[Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994]; 및 문헌[Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서는 포유류 숙주 세포에서의 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
항-NKp30 항체 사슬을 보유하고 발현시키기 위한 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포 중 어느 하나일 수 있다. E. 콜라이(E. coli)는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키기에 유용한 하나의 원핵생물성 숙주이다. 사용하기에 적합한 기타 다른 미생물성 숙주는 간균강, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 기타 다른 장내세균과(enterobacteriae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵생물성 숙주에서, 발현 벡터를 또한 제조할 있으며, 이는 통상적으로 숙주 세포와 양립 가능한 발현 제어 서열(예를 들어, 복제 기점)을 함유한다. 또한, 임의의 수의 다양한 잘 알려진 프로모터가 존재할 것이며, 이에는 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템과 같은 것이 있다. 이들 프로모터는 통상적으로, 선택적으로 작동자 서열과 함께 발현을 제어하며, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜-결합 부위 서열 등을 갖는다. 기타 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 항-NKp30 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 배큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
기타 다른 양태에서, 본 개시내용의 항-NKp30 폴리펩티드를 발현시키고 생성하는 데 포유류 숙주 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 포함하는 포유류 세포주 중 어느 하나일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 필멸(mortal) 또는 정상적 또는 비정상적인 불멸(immortal) 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, 온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 몇몇의 적합한 숙주 세포주가 개발되어 왔으며, 이에는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HEK 293 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마가 포함된다. 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 포유류 조직 세포 배양을 사용하는 것은, 예를 들어 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, N.Y., 1987]에 전반적으로 논의되어 있다. 포유류 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터, 및 인핸서(예를 들어, 문헌[Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 처리 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 포유류 유전자 또는 포유류 바이러스로부터 유래되는 프로모터를 통상 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 발생단계-특이적, 및/또는 조정 가능한 또는 조절 가능할 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예컨대, 인간 전초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 당업계에 알려진 프로모터-인핸서 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
NKp30 다중특이성 항체
일 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 항-NKp30 항체는 항-NKp30xTAA 다중특이성 항체 내로 혼입될 수 있으며, 여기서 TAA는 임의의 인간 종양 연관 항원(TAA)이다. 항체 분자는 다중특이성 항체 분자이며, 예를 들어, 이는 다수의 항원 결합 도메인을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 도메인 서열은 제1 에피토프로서 NKp30에 특이적으로 결합하며, 제2 항원 결합 도메인 서열은 제2 에피토프로서 TAA에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 다중특이성 항체는 제3, 제4 또는 제5 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 다중특이성 항체는 이중특이성 항체, 삼중특이성 항체 또는 사중특이성 항체이다. 각각의 예에서, 다중특이성 항체는 적어도 하나의 항-NKp30 항원 결합 도메인 및 적어도 하나의 항-TAA 항원 결합 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 다중특이성 항체는 이중특이성 항체이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 이중특이성 항체는 오직 2개의 항원에만 특이적으로 결합한다. 이중특이성 항체는 NKp30에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 TAA에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 이는 제1 에피토프로서 NKp30에 특이적으로 결합하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인, 및 제2 에피토프로서 TAA에 특이적으로 결합하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이중특이성 항체는 NKp30에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편 및 TAA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다. 이중특이성 항체는 항원 결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fv(ScFv) 또는 scFv일 수 있다.
이전의 실험(문헌[Coloma and Morrison Nature Biotech. 15: 159-163 (1997)])에는 lgG3 항-단실(dansyl) 항체의 C-말단 뒤에(CH3-scFv) 또는 힌지 뒤에(힌지-scFv) 단일 쇄 항-단실 항체 Fv(scFv)를 인코딩하는 DNA를 융합시킴으로써 조작된 4가 이중특이성 항체가 기재된다. 본 개시내용은 항체의 폴리펩티드 쇄를 인코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생성될 수 있는 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 갖는 다가 항체(예를 들어, 4가 항체)를 제공한다. 본원에서 다가 항체는 적어도 2개의 항원에 특이적으로 결합하는 3개 내지 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 도메인을 포함한다.
본 개시내용은 VD1-CL-(X1)n-VD2-CH1-Fc 또는 VD1-CH-(X1)n-VD2-CL-Fc를 포함하는 이중특이성 4가 항체를 제공하며, VD1은 제1 가변 도메인이며, VD2는 제2 가변 도메인이며, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 쇄이며, CH 또는 CL은 불변 중쇄 또는 불변 경쇄 도메인이며, (X1)n은 적어도 2개의 아미노산의 링커이다.
일 구현예에서, 이중특이성 4가 항체는 4개의 폴리펩티드 쇄의 다량체일 수 있으며, 2개의 중쇄는 각각 제1 VH 도메인(VH1), 제1 CH1 도메인, 제2 VH 도메인(VH2) 및 제2 CH1, 힌지, CH2, CH3을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 2개의 경쇄에서, 각각의 경쇄는 제1 VL 도메인(VL1), 제1 CL 영역, 제2 VL 도메인(VL2) 및 제2 CL 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이중특이성 4가는 단일의 Fc 도메인에 함께 연결된 다수의 항체 Fab 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fab1은 폴리펩티드 링커를 통해 Fab 중 하나의 CH1 도메인, Fc 도메인의 힌지 영역에 이어서 CH2 및 CH3을 포함하는 Fab2에 연결될 수 있다. 예를 들어, 항-TAA Fab는 링커를 통해 항-TAA Fab의 CL 도메인으로부터 항-NKp30 Fab의 VH 도메인으로, 그리고 항-Nkp30 Fab의 CH1 도메인으로부터 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인으로 연결될 수 있다. 또 다른 예에서, 항-NKp30 Fab는 링커를 통해 항-NKp30 Fab의 CL 도메인으로부터 항-TAA Fab의 VH 도메인으로, 그리고 항-TAA Fab의 CH1 도메인으로부터 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인으로 연결될 수 있다.
링커
이중특이성 4가 항체의 폴리펩티드 쇄의 도메인 및/또는 영역은 다양한 길이의 링커 영역에 의해 분리될 수 있다는 것이 또한 이해된다. 일부 구현예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 영역에 의해 서로, CL, CH1, 힌지, CH2, CH3 또는 전체 Fc 영역으로부터 분리된다. 예를 들어, VL1-CL-(링커) VH2-CH1. 이러한 링커 영역은 아미노산의 무작위 배열, 또는 아미노산의 제한된 세트를 포함할 수 있다. 이러한 링커 영역은 유연성이거나 또는 강성일 수 있다(US2009/0155275 참조).
2개의 단일 쇄 Fv(scFv) 또는 Fab 단편을 이량체화 디바이스, 예컨대 류신 지퍼(문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 1992148:1547-53]; 문헌[de Kruifetal J. Biol. Chem. 1996 271:7630-4]) 및 Ig C/CH1 도메인(문헌[Muller et al., FEBS Lett. 422:259-64])을 통해; 디아바디(문헌[Holliger et al., (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998 90:6444-8]; 문헌[Zhu et al., Bio/Technology (NY) 1996 14:192-6]); Fab-scFv 융합(문헌[Schoonjans et al., J. Immunol. 2000 165:7050-7]); 및 미니 항체 형식(문헌[Packet al., Biochemistry 1992.31:1579-84]; 문헌[Packet al., Bio/Technology 1993 11:1271-7])에 의해, 유연성 링커(문헌[Mallender et al., J. Biol. Chem. 1994 269:199-206]; 문헌[Macket et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 92:7021-5]; 문헌[Zapata Protein Eng. 1995 8.1057-62])의 이용과 함께 또는 이것 없이 유전학적으로 융합시킴으로써 다중특이성 항체를 구축하였다.
본원에 개시된 바와 같은 이중특이성 4가 항체는 이의 에피토프 결합 도메인, CL 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인, CH3 도메인 또는 Fc 영역 중 하나 이상 사이에 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 링커 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 글리신 및 세린은 링커 영역 내의 아미노산을 구성한다. 또 다른 구현예에서, 링커는 GS(SEQ ID NO: 43), GGS(SEQ ID NO: 44), GSG(SEQ ID NO: 45), SGG(SEQ ID NO: 46), GGG(SEQ ID NO: 47), GGGS(SEQ ID NO: 48), SGGG(SEQ ID NO: 49), GGGGS(SEQ ID NO: 50), GGGGSGS(SEQ ID NO: 51), GGGGSGS(SEQ ID NO: 52), GGGGSGGS(SEQ ID NO: 53), GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 54), GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 55), AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: 56), AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 57), AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 58), SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 59), AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 60), SAKTTP(SEQ ID NO: 61), SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 62), RADAAP(SEQ ID NO: 63), RADAAPTVS(SEQ ID NO: 64), RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO: 65), RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO: 66), SAKTTP(SEQ ID NO: 67), SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 68), SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 69), ADAAP(SEQ ID NO: 70), ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 71), TVAAP(SEQ ID NO: 72), TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 73), QPKAAP(SEQ ID NO: 74), QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 75), AKTTPP(SEQ ID NO: 76), AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO: 77), AKTTAP(SEQ ID NO: 78), AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO: 79, ASTKGP(SEQ ID NO: 80), ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 81), GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 82), GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO: 83) 및 GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 84) 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다(WO2007/024715 참조). 예를 들어, GGGGS(SEQ ID NO: 50)를 SAKTTP(SEQ ID NO: 67)와 조합하여, GGGGSSAKTTP(SEQ ID NO: 85)를 형성할 수 있다.
이량체화 특이적 아미노산
일 구현예에서, 다중특이성 항체는 적어도 하나의 이량체화 특이적 아미노산 변경을 포함한다. 이량체화 특이적 항체 변경은 "노브 인투 홀(knobs into holes)" 상호작용을 초래하며, 정확한 다중특이성 항체의 어셈블리를 증가시킨다. 이량체화 특이적 아미노산은 CH1 도메인 또는 CL 도메인 또는 이의 조합 내에 존재할 수 있다. 이량체화 특이적 아미노산을 사용하여, CH1 도메인과 다른 CH1 도메인을 짝짓거나(CH1-CH1), CL 도메인과 다른 CL 도메인을 짝지었으며(CL-CL), 적어도 WO2014082179, WO2015181805 및 WO2017059551의 개시내용에서 찾을 수 있다. 이량체화 특이적 아미노산은 또한 Fc 도메인 내에 존재할 수 있으며, CH1 또는 CL 도메인 내의 이량체화 특이적 아미노산과 조합되어 존재할 수 있다.
검출 및 진단의 방법
본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 NKp30의 검출을 위한 방법을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 응용에 유용하다. 일 양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 생물학적 샘플 내의 NKp30의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다. 기타 다른 양태에서, 그러한 조직은 기타 다른 조직에 비하여 더 높은 수준으로 NKp30을 발현하는 정상 및/또는 암성 조직을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플 내의 NKp30의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 항원에 대한 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 항-NKp30 항체와 접촉시키는 단계 및 항체와 항원 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플은 제한 없이, 소변, 조직, 가래 또는 혈액 샘플을 포함할 수 있다.
NKp30의 발현과 연관된 장애를 진단하는 방법이 또한 포함된다. 특정 양태에서, 상기 방법은 시험 세포를 항-NKp30 항체와 접촉시키는 단계; NKp30 폴리펩티드에 대한 항-NKp30 항체의 결합을 검출함으로써 시험 세포에 의해 발현되는 NKp30의 발현의 수준을 (정량적으로 또는 정성적으로) 결정하는 단계; 및 시험 세포에 의한 발현 수준을 대조군 세포(예를 들어, 시험 세포와 동일한 조직 기원의 정상 세포 또는 비-NKp30 발현 세포)에서의 NKp30 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 대조군 세포와 대비하여 시험 세포에서의 더 높은 수준의 NKp30 발현은 NKp30의 발현과 연관된 장애의 존재를 나타낸다.
치료 방법
본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 NKp30-연관 장애 또는 질병의 치료를 위한 방법을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 응용에 유용하다. 일 양태에서, NKp30-연관 장애 또는 질병은 암이다. NKp30xTAA 다중특이성 항체의 경우에, 암은 TAA에 특이적일 수 있으며, NKp30은 NK 세포를 TAA 발현 종양에 동원하는 역할을 한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 유효량의 항-NKp30 항체, 항원-결합 단편 또는 NKp30 함유 다중특이성 항체를, 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 암은, 제한 없이, 위암, 결장암, 췌장암, 유방암, 두경부암, 신장암, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 및 육종을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 비경구, 폐내, 및 비강내를 포함하여 임의의 적합한 수단에 의해, 그리고 필요하다면 국부 치료, 병변내 또는 종양내 투여를 위하여 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는, 부분적으로 투여가 짧은지 만성인지의 여부에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 행해질 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단회 또는 다회 투여, 볼루스 투여, 및 펄스 주입을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 투여 일정이 본원에서 고려된다.
본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 모범 의료행위 지침(good medical practice)에 따른 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려 대상이 되는 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 질환, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 알려진 기타 다른 인자를 포함한다. 항체는 대상이 되는 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형화될 필요는 없지만, 선택적으로 제형화된다. 그러한 기타 다른 작용제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기에 논의된 기타 다른 인자에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 것과 동일한 투여량으로 그리고 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용되거나, 임의의 투여량으로 그리고 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 경로에 의해 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위하여, 본 개시내용의 항체, 항원-결합 단편 또는 다중특이성 항체의 적절한 투여량은 치료하려는 질병의 유형, 항체의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 항체가 예방적 또는 치료적 목적을 위하여 투여되는지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 좌우될 것이다. 항체는 일시에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg의 항체가, 예를 들어 1회 이상의 별개의 투여, 또는 연속 주입 중 어느 것이든, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 통상적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 질환에 따라, 치료는 질병 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 일반적으로 지속될 것이다. 그러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3주마다(예를 들어, 환자가 약 2회 내지 약 20회의 투여를 제공받도록) 투여될 수 있다. 초기의 높은 로딩 용량 후에 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 기타 다른 투여량 계획이 유용할 수 있으며, 요법의 진행은 통상적인 기법 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
조합 요법
일 양태에서, 본 개시내용의 NKp30 항체, 항원 결합 단편 또는 다중특이성 항체는 기타 다른 치료제와 조합되어 사용될 수 있다. 본 개시내용의 NKp30 항체와 함께 사용될 수 있는 기타 다른 치료제는 화학요법제(예를 들어, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀제(예를 들어, Abraxane®), 도세탁셀; 카보플라틴; 토포테칸; 시스플라틴; 이리노테칸, 독소루비신, 레날리도미드, 5-아자시티딘, 이포스파미드, 옥살리플라틴, 페메트렉시드 이나트륨, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 데시타빈, 플루다라빈, 빈크리스틴, 벤다무스틴, 클로람부실, 부설판, 젬시타빈, 멜팔란, 펜토스타틴, 미톡산트론, 페메트렉시드 이나트륨), 티로신 키나제 억제제(예를 들어, EGFR 억제제(예를 들어, 에를로티닙), 멀티키나제 억제제(예를 들어, MGCD265, RGB-286638), CD-20 표적화제(예를 들어, 리툭시맙, 오파투무맙, RO5072759, LFB-R603), CD52 표적화제(예를 들어, 알렘투주맙), 프레드니솔론, 다르베포에틴 알파, 레날리도미드, Bcl-2 억제제(예를 들어, 오블리메르센 나트륨), 오로라 키나제 억제제(예를 들어, MLN8237, TAK-901), 프로테아좀 억제제(예를 들어, 보르테조밉), CD-19 표적화제(예를 들어, MEDI-551, MOR208), MEK 억제제(예를 들어, ABT-348), JAK-2 억제제(예를 들어, INCB018424), mTOR 억제제(예를 들어, 템시롤리무스, 에베롤리무스), BCR/ABL 억제제(예를 들어, 이마티닙), ET-A 수용체 길항제(예를 들어, ZD4054), TRAIL 수용체 2(TR-2) 효능제(예를 들어, CS-1008), EGEN-001, Polo-유사 키나제 1 억제제(예를 들어, BI 672)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
약제학적 조성물 및 제형
항-NKp30 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-NKp30 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 약제학적 제형을 포함한 조성물이 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 조성물은 NKp30에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 NKp30에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 적합한 담체, 예컨대 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용되는 부형제(완충액을 포함함)를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항-NKp30 항체 또는 항원-결합 단편의 약제학적 제형은 원하는 순도를 갖는 그러한 항체 또는 항원-결합 단편을 하나 이상의 선택적인 약제학적으로 허용되는 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980])와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 제조된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 대해 일반적으로 비독성이며, 완충액, 예컨대 인산염, 시트르산염, 및 기타 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당, 이당, 및 기타 다른 탄수화물(글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함함); 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 본원에서 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 틈새 약물 분산제(interstitial drug dispersion agent), 예컨대 가용성 중성-활성 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 7,871,607 및 US 2006/0104968에 기재되어 있다. 일 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형이 미국 특허 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다. 지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이어야 한다. 멸균성은, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
실시예
실시예 1 항-NKp30 단일클론 항체의 생성
통상적인 하이브리도마 융합 기술(문헌[de St Groth and Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35:1]; 문헌[Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378:1])에 기초하여 항-NKp30 단일클론 항체(mAb)를 생성하였다. 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 검정에서 높은 결합 활성을 갖는 mAb를 추가의 특성화를 위하여 선택하였다.
면역화 및 결합 검정을 위한 NKp30 재조합 단백질
전장 인간 NKp30(SEQ ID NO: 1)을 코딩하는 cDNA를 이의 GenBank 서열(수탁 번호 NM_147130.1)에 기초하여 Sino Biological(중국 베이징 소재)로부터 구입하였다. SEQ ID NO: 1의 아미노산(AA) 19 내지 135에 대응하는 전장 인간 NKp30의 세포외 도메인(ECD)의 코딩 영역을 PCR-증폭시키고, C-말단을 마우스 IgG2a의 Fc 도메인 또는 인간 IgG1 중쇄의 Fc 도메인에 융합하여, pcDNA3.1-기반의 발현 벡터(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 내로 클로닝하였으며, 그 결과 2개의 재조합 융합 단백질 발현 플라스미드, 즉 각각 NKp30-mIgG2a 및 NKp30-huIgG1이 생성되었다. NKp30 융합 단백질의 개략도가 도 1에 나타나 있다. 재조합 융합 단백질 생성을 위하여, NKp30-mIgG2a 및 NKp30-huIgG1 플라스미드를 293G 세포(사내에서 개발) 내로 일시적으로 형질감염시키고, 회전 진탕기가 구비된 CO2 인큐베이터 내에서 7일 동안 배양하였다. 재조합 단백질을 함유하는 상청액을 수집하고, 원심분리에 의해 청징화하였다. NKp30-mIgG2a 및 NKp30-huIgG1을 단백질 A 컬럼(카탈로그 번호 17127901, GE Life Sciences)을 사용하여 정제하였다. NKp30-mIgG2a 및 NKp30-huIgG1 단백질 둘 모두를 인산염 완충 식염수(DPBS)에 대해 투석하고, 소량의 분취물로 -80℃ 냉동기 내에 저장하였다.
안정한 발현 세포주
전장 인간 NKp30(huNKp30) 또는 마카카 파시쿨라리스 NKp30(mkNKp30, 수탁 번호: AJ278389.1(SEQ ID NO: 42), Sino Biological로부터 구입, 중국 소재)을 발현하는 안정한 세포주를 확립하기 위하여, 이를 레트로바이러스 벡터 pFB-Neo(카탈로그 번호 217561, Agilent, 미국 소재) 내로 클로닝하였다. 이중-향성(dual-tropic) 레트로바이러스 벡터를 이전의 프로토콜에 따라 생성하였다(문헌[Zhang, et al., 2005 Blood 106, 1544-1551]). huNKp30 및 mkNKp30을 함유하는 벡터를 각각 NK92MI 세포(ATCC, 미국 버니지아주 머내서스 소재) 내로 형질도입하여, 세포주, NK92MI/huNKp30 및 NK92MI/mkNKp30을 생성하였다. 고발현 세포주를 G418이 있는 배지에서의 배양 및 FACS 결합 검정에 의해 선택하였다.
면역화, 하이브리도마 융합 및 클로닝
8 내지 12주령 Balb/c 마우스(HFK BIOSCIENCE CO., LTD, 중국 베이장 소재)를 10 μg의 NKp30-mIgG2a 및 수용성 애쥬번트(카탈로그 번호 KX0210041, KangBiQuan, 중국 베이징 소재)를 함유하는 100 μL의 항원 혼합물로 복강내(i.p.) 면역화시켰다. 절차를 3주 후에 반복하였다. 제2 면역화 2주 후에, 마우스 혈청을 ELISA 및 FACS에 의해 NKp30 결합에 대하여 평가하였다. 혈청 스크리닝 10일 후에, 가장 높은 항-NKp30 항체 혈청 역가를 갖는 마우스를 50 μg의 NKp30-mIgG2a의 복강내 주사를 통해 부스팅하였다. 부스팅 3일 후에, 비장세포를 단리하고, 표준 기법을 사용하여 쥣과 골수종 세포주, SP2/0 세포(ATCC)에 융합시켰다(문헌[Gefter et al., Somat Cell Genet, 1977 3(2):231-6]).
ELISA 및 FACS에 의한 항체의 NKp30 결합 활성의 평가
하이브리도마 클론의 상청액을 초기에 문헌[(Methods in Molecular Biology (2007) 378:33-52)]에 기재된 기본 기법을 사용하여 변형된 ELISA에 의해 스크리닝하였다. NKp30-huIgG1 단백질을 96-웰 플레이트에 코팅하였다. HRP-연결된 항-마우스 IgG 항체(카탈로그 번호 7076S, Cell Signaling Technology, 미국 소재) 및 기질(카탈로그 번호 00-4201-56, eBioscience, 미국 소재)을 사용하여 450 nm의 파장에서 색 흡광도 신호를 발생시켰으며, 이를 플레이트 판독기를 사용함으로써 측정하였다(SpectraMax Paradigm™, Molecular Devices, 미국 소재). ELISA-양성 클론을 상기 기재된 NK92MI/huNKp30 또는 NK92mi/mkNKp30 세포를 사용하여 FACS에 의해 추가로 입증하였다. NKp30-발현 세포(105개 세포/웰)를 ELISA-양성 하이브리도마 상청액과 함께 인큐베이션 시킨 후에, Alexa Fluro-647 표지된 염소 항-마우스 IgG 항체(카탈로그 번호 A0473, Beyotime Biotechnology, 중국 소재)와 결합시켰다. 세포 형광을 유세포측정기(Guava easyCyte™ 8HT, Merck-Millipore, 미국 소재)를 사용하여 정량화하였다.
ELISA 및 FACS 스크리닝 둘 모두에서 양성 신호를 보이는 하이브리도마로부터의 조정 배지를 기능 검정으로 처리하여, 인간 면역 세포-기반의 검정(하기 섹션 참조)에서 우수한 기능적 활성을 갖는 항체를 확인하였다. 원하는 기능적 활성을 갖는 항체를 추가로 서브-클로닝하고 특성화하였다.
서브클로닝 및 혈청-부재 또는 저 혈청 배지에 대한 하이브리도마의 적응
상기 기재된 바와 같은 ELISA, FACS 및 기능적 검정에 의한 일차 스크리닝 후에, 양성 하이브리도마 클론을 제한 희석에 의해 서브-클로닝하였다. 각각의 플레이트로부터의 ELISA 및 FACS 스크리닝에 기초한 3개의 양성 서브클론을 기능적 검정에 의해 선택하고 특성화하였다. 기능적 검정을 통해 확인된 상위 항체 서브클론을 3% FBS가 있는 CDM4MAb 배지(카탈로그 번호 SH30801.02, Hyclone, 미국 소재)에서의 성장을 위해 적응시켰다.
단일클론 항체의 발현 및 정제
항체 발현 플라스미드(카탈로그 번호 R79007, Invitrogen)로 일시적으로 트랜스펙션시킨 하이브리도마 세포 또는 293G 세포를 CDM4MAb 배지(카탈로그 번호 SH30801.02, Hyclone) 또는 FreestyleTM 293 발현 배지(카탈로그 번호 12338018, Invitrogen)에서 배양하고, 37℃에서 5일 내지 7일 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 조정 배지를 원심분리를 통해 수집하고, 정제 전에 0.22 μm 멤브레인을 통과시킴으로써 여과하였다. 쥣과 또는 재조합 항체 함유 상청액을 제조처의 지침에 따라 단백질 A 컬럼(카탈로그 번호 17127901, GE Life Sciences)에 적용하고 결합시켰다. 이 절차는 90% 초과의 순도 수준을 갖는 항체를 제공하였다. 단백질 A-친화성 정제된 항체를 PBS에 대하여 투석시키거나, HiLoad 16/60 Superdex200™ 컬럼(카탈로그 번호 17531801, GE Life Sciences)을 사용하여 추가로 정제하여, 응집물을 제거하였다. 단백질 농도를 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 최종 항체 제제를 -80℃ 냉동기에서 분취물로 저장하였다.
실시예 2 NKp30 항체의 클로닝 및 서열 분석
쥣과 하이브리도마 클론을 수집하여, 제조처의 프로토콜에 기초하여 Ultrapure RNA 키트(카탈로그 번호 74104, QIAGEN, 독일 소재)를 사용하여 총 세포 RNA를 제조하였다. 제1 가닥 cDNA를 Invitrogen의 cDNA 합성 키트(카탈로그 번호 18080-051)를 사용하여 합성하였으며, 쥣과 mAb의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 PCR 증폭을 PCR 키트(카탈로그 번호 CW0686, CWBio, 중국 베이징 소재)를 사용하여 수행하였다. VH 및 VL의 항체 cDNA 클로닝을 위해 사용되는 올리고 프라이머를 이전에 보고된 서열(문헌[Brocks et al., 2001 Mol Med 7:461])에 기초하여 Invitrogen(중국 베이징 소재)에 의해 합성하였다. 이어서, PCR 생성물을 pEASY-Blunt 클로닝 벡터(카탈로그 번호 C B101-02, TransGen, 중국 소재) 내로 서브클로닝하고, Genewiz(중국 베이징 소재)에 의해 서열분석하였다. VH 및 VL 영역의 아미노산 서열을 DNA 서열결정 결과로부터 추정하였다.
쥣과 mAb를 서열 상동성을 비교함으로써 분석하고, 도 2에 나타낸 바와 같은 서열 유사성에 기초하여 그룹화시켰다. 상보성 결정 영역(CDR)을 서열 주석에 의해, 그리고 서열 분석에 의해 카바트(문헌[Wu and Kabat 1970 J. Exp. Med. 132:211-250]) 및 IMGT(문헌[Lefranc 1999 Nucleic Acids Research 27:209-212]) 체계에 기초하여 정의하였다. 대표적인 상위 클론(mu183)의 아미노산 서열은 상기 표 1에 열거되어 있다.
실시예 3 SPR에 의한 정제된 쥣과 항-NKp30 항체의 친화도 결정
ELISA 및 FACS에서 높은 결합 활성을 갖고, 세포-기반의 검정(상기 실시예 1에 기재됨)에서 강력한 기능적 활성을 갖는 NKp30 항체를 BIAcoreTM T-200(GE Life Sciences)을 사용하여 SPR 검정에 의해 이들의 결합 반응속도에 대하여 특성화하였다. 요약하여, 항-마우스 IgG 항체를 활성화된 CM5 바이오센서 칩(카탈로그 번호 BR100530, GE Life Sciences) 상에 고정화시켰다. 정제된 NKp30 쥣과 항체를 칩 표면 상에 유동시키고, 항-마우스 IgG 항체에 의해 포획하였다. 그 다음, his-태깅된 인간 NKp30의 단계 희석액(serial dilution)(0.098 nM 내지 25 nM)을 칩 표면 상에 유동시키고, 표면 플라스몬 공명 신호의 변경을 분석하여, 1-대-1 랑뮤어 결합 모델(BIA Evaluation Software, GE Life Sciences)을 사용함으로써, 회합 속도(k on) 및 해리 속도(k off)를 계산하였다. 평형 해리 상수(K D)를 비 k off/k on로서 계산하였다. mu183, mu17 및 mu191을 포함하는 선택된 항체의 결합 친화도 프로파일은 도 3 및 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
Figure pct00011
실시예 4 쥣과 항-인간 NKp30 mAb mu183의 인간화
mAb 인간화 및 조작
mu183의 인간화를 위하여, IMGT 및 NCBI에서의 인간 면역글로불린 유전자 데이터베이스에 대하여 BLAST 알고리즘을 수행함으로써, 인간 생식세포계열 IgG 유전자를 mu183 가변 영역의 cDNA 서열에 대하여 고도의 상동성을 공유하는 서열에 대하여 검색하였다. 인간 항체 레퍼토리에 높은 빈도로 존재하고(문헌[Glanville et al., 2009 PNAS 106:20216-20221]), mu183과 고도로 상동성인 인간 IGVH 및 IGVL 유전자를 인간화를 위한 주형으로서 선택하였다.
인간화를 CDR-그라프팅(문헌[Methods in Molecular Biology, Vol 248: Antibody Engineering, Methods and Protocols, Humana Press])에 의해 수행하였으며, 인간화 항체(BGA1831-BGA1833)를 사내 개발된 발현 벡터를 사용하여 인간 IgG1mf(SEQ ID NO: 41) 형식으로서 조작하였다. 초기 회차의 인간화에서, 프레임워크 영역 내의 쥣과로부터 인간 아미노산 잔기로의 돌연변이는 모의된 3D 구조에 의해 안내되었으며, CDR의 정규 구조를 유지하기 위하여 구조적으로 중요한 쥣과 프레임워크 잔기를 초기 인간화 항체 BGA1831(SEQ ID NO: 3 내지 8)에서 유지하였다. 구체적으로, mu183 VH의 CDR(SEQ ID NO: 3 내지 5)을 9개의 쥣과 프레임워크(V10, V12, T30, A37, I48, A68, L70, V72 및 A79) 잔기(SEQ ID NO: 11)가 유지된 인간 생식세포계열 가변 유전자 IGVH1-46의 프레임워크 내로 그라프팅하였다. mu183 VL의 CDR(SEQ ID NO: 6 내지 8)을 5개의 쥣과 프레임워크 잔기(Q1, V3, L4, S43 및 F73)(SEQ ID NO: 13)가 유지된 인간 생식세포계열 가변 유전자 IGVL 1-39의 프레임워크 내로 그라프팅하였다.
BGA1831을 용이하게 조정되는 서브-클로닝 부위와 함께, 각각 IgG1mf(SEQ ID NO: 41)로 지칭되는 인간 IgG1 변이체의 불변 영역 및 경쇄를 함유하는 사내 개발된 발현 벡터를 사용하여 인간 전장 항체 형식으로서 구축하였다. BGA1831 항체의 발현 및 제조를 293G 세포 내로의 상기 2개의 구축물의 동시-형질감염에 의해, 그리고 단백질 A 컬럼(카탈로그 번호 17543802, GE Life Sciences)을 사용한 정제에 의해 달성하였다. 정제된 항체를 PBS 중에 0.5 내지 5 mg/mL로 농축시키고, -80℃ 냉동기에 분취물로 저장하였다.
몇몇의 단일의 아미노산 변경을 BGA1831에서 이루었고, 이는 VL의 프레임워크 영역 내에 유지된 쥣과 잔기를 싱응하는 인간 생식세포계열 잔기로 전환시켰다. 생성된 인간화 버전은 모두 유사한 결합 및 기능적 활성을 가졌다. 모든 인간화 돌연변이를 특정 위치에 돌연변이를 함유하는 프라이머 및 위치 지정 돌연변이유발 키트(카탈로그 번호 FM111-02, TransGen, 중국 베이징 소재)를 사용하여 이루었다. 원하는 돌연변이를 서열분석에 의해 입증하였으며, 변이체 항체를 이전에 기재된 바와 같이 결합 및 기능적 검정에서 시험하였다.
CDR 및 프레임워크 영역에 돌연변이를 도입함으로써 다른 항체를 추가로 조작하여, 인간에서의 치료적 이용을 위하여 분자 및 생물물리학적 특성을 개선시켰다. 고려사항은 아미노산 조성, 열 안정성(Tm), 표면 소수성 및 기능적 활성을 유지하는 동안의 등전점(pI)을 포함한다.
추가의 조작된 버전의 인간화 단일클론 항체는 상기와 같이 기재된 돌연변이 과정으로부터 유래되었으며, 상세히 특성화되었다. 조작된 항체의 분석은, BGA1832(SEQ ID NO: 19, 4, 20, 6 내지 8) 및 BGA1831(SEQ ID NO: 3 내지 8) 둘 모두가 결합 친화도 및 기능적 활성, 예컨대 NKp30-매개된 하류 신호전달의 유도에서 매우 유사하였음을 보여주었다. 이것이 초기 항체의 친화도보다 약 10배 더 낮은 친화도를 갖는 BGA1833(SEQ ID NO: 19, 4, 29, 6 내지 8)을 초래함에 따라, 조작된 항체의 친화도를 이 과정 동안 원하는 친화도로 조정하였다. 친화도 결정을 위하여, 항체를 항-인간 Fc 표면에 의해 포획하고, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술에 기초한 친화도 검정에서 사용하였다. 항-NKp30 항체의 SPR-결정된 결합 프로파일의 결과는 표 4에 요약되어 있다. 또한, 상기 나타낸 모든 인간화 항체를 건강한 공여자로부터 단리된 일차 인간 면역 세포 상에서의 기능적 활성에 대하여 확인하였다(하기 실시예 7에 기재됨).
[표 4]
Figure pct00012
실시예 5 고유 NKp30에 대한 상이한 버전의 항-NKp30 항체의 결합 활성
살아 있는 세포 상의 고유 NKp30에 대한 항-NKp30 항체의 결합 활성을 평가하기 위하여, NK92MI 세포를 형질감염시켜, 인간 NKp30을 과발현시켰다. 살아 있는 NK92mi/NKp30 발현 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 항-NKp30 항체의 단계 희석액과 인큐베이션시켰다. 염소 항-인간 IgG를 세포 표면에 결합하는 항체를 검출하기 위한 이차 항체로서 사용하였다. 용량-반응 데이터를 GraphPad Prism™을 사용하여 4-파라미터 로지스틱 모델에 핏팅시킴으로써 인간 고유 NKp30으로의 용량-의존적 결합을 위한 EC50 값을 결정하였다. 도 6 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 인간화 항-NKp30 항체 BGA1831 및 BGA1833 둘 모두는 살아 있는 세포 상의 고유 NKp30에 대하여 높은 결합 친화도를 입증하였다.
[표 6]
Figure pct00013
실시예 6 BGA1833의 에피토프 맵핑
BGA1833의 결합 에피토프를 특성화하기 위하여, 이전에 보고된 NKp30의 결정 구조로부터의 정보(문헌[Li et al., J Exp Med. 2011 208: 703-714])에 기초하여, NKp30의 10개 아미노산 잔기를 개별적으로 알라닌으로 돌연변이시켜, 10개의 단일-돌연변이 NKp30 변이체를 생성하였다. 야생형 NKp30 단백질과 함께 돌연변이 NKp30 단백질을 BGA1833에 의한 이들의 인식 및 결합에 대하여 분석하였다. 또 다른 인간화 항-NKp30 항체, BGA1913을 또한 비교를 위하여 동일한 ELISA 검정에서 분석하였다. 이 검정에서, 50 ng의 야생형 또는 돌연변이 Nkp30-Fc 각각을 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 블로킹 후에, 20 nM의 농도의 BGA1833 또는 BGA1913 항체 100 ㎕를 플레이트에 첨가하고, 각각의 항체의 결합 신호를 HRP-연결 이차 항체에 의해 검출하였다. 모든 ELISA 결과를 표준물로서 야생형 NKp30-Fc 결합 신호의 ELISA 판독의 평균 값을 사용하여 정규화시켰다. 데이터 분석을 단순화시키기 위하여, 특정 돌연변이 NKp30에 대한 항체의 ELISA 결합 신호가 25% 이하로 떨어진다면, 그 부위의 아미노산을 에피토프에 매우 중요한 것으로 간주하였다. 야생형 또는 돌연변이 NKp30을 사용한 ELISA 결합 검정에서, 아미노산 I50A 및 L86A(야생형 NKp30의 aa 1로부터 넘버링됨)는 NKp30 및 BGA1833의 결합을 유의미하게 손상시켰다(도 7a). 대조적으로, I50A 또는 L86A 변경 중 어느 것도 NKp30으로의 항체 BGA1913의 결합을 파괴하지 않았으며, 이는 BGA1913 및 BGA1833이 상이한 에피토프를 갖는 것을 나타낸다. 이 데이터는 I50 및 L86이 항체 BGA1833에 대한 에피토프에서 매우 중요한 아미노산인 것을 나타내었다. 도 7b에 나타낸 B7H6과의 복합체의 NKp30의 분자 모델링은, 폴딩된 입체형태로 존재하는 경우, L86 및 I50이 NKp30과 B7H6의 결합 계면 상에서 서로 근접해 있다는 것을 보여준다.
실시예 7 항-NKp30 항체는 NKp30과 이의 리간드 B7-H6의 상호작용을 감소시킨다
NKp30은 2.5 내지 3.5 μM의 대략적인 Kd의 약한 친화도로 이의 주요 리간드 B7-H6에 결합한다(문헌[Joyce et al., 2011 PNAS 108:6223-6228]). 상기 실시예 6의 에피토프 맵핑 결과는 NKp30의 아미노산 잔기 I50 및 L86이 BGA1833 항체에 대한 에피토프의 부분을 구성하는 매우 중요한 아미노산 잔기임을 보여준다. 또한, 이들 2개의 잔기는 구조 연구에서 NKp30/B7-H6 상호작용에 중요한 것으로 이전에 결정되었다(문헌[Li et al., J Exp Med. 2011 208: 703-714]). 이 데이터에 기초하여, BGA1833 항체가 NKp30/B7-H6 상호작용을 차단할 수 있는 것을 가정하였다. 이 검정을 위하여, B7-H6 안정적으로 형질도입된 세포주 HCT116/B7-H6을 단계 희석된 BGA1833의 존재 하에 NKp30-mIgG2a와 인큐베이션시킨 후에, 염소-항-인간 IgG-APC로 검출하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, BGA1833 항체는 용량-의존적 방식으로 NKp30/B7-H6 상호작용을 경쟁적으로 차단할 수 있었다.
실시예 8 항-NKp30 항체에 의한 NKp30 + NK 세포주 NK92MI/NKp30의 활성화
BGA1833 항체의 기능적 활성을 먼저 NK92MI/NKp30과 FcγR+ THP-1 세포의 하룻밤 동시-배양에 의해 평가하였다. IFN-γ 생성을 판독물로서 사용하였다. 인간 IgG 및 배지 단독을 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 9a에 나타낸 바와 같이, BGA1833은 NK92MI/NKp30 세포가 THP-1 세포의 존재 하에 IFN-γ를 용량-의존적 방식으로 분비하도록 유도하였다(EC50: 0.0049 μg/ml). 다음으로, BGA1833 매개된 사멸을 "역" ADCC 검정에서 시험하였다. 이 검정에서, NK92MI/NKp30 세포를 5시간 동안 BGA1833의 존재 하에 5:1의 E:T 비로 THP-1 세포와 동시-배양하였다. 상청액 중 LDH의 양을 CytoTox™ 96 비-방사성 세포독성 검정 키트(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 사용하여 측정하였으며, 특이적인 용해의 백분율을 제조처의 지침에 따라 계산하였다. 도 9b에 나타낸 바와 같이, 항-NKp30 항체 BGA1833은 NK92MI/NKp30 세포가 표적 THP-1 세포를 용량-의존적으로 용해시키도록 유도할 수 있었다(EC50: 0.0026 μg/ml).
실시예 9 항-NKp30 함유 다중특이성 항체에 의한 NKp30 + NK 세포주 NK92MI/NKp30의 활성화
상기 기재된 것과 유사한 기능 실험에서, 항원 결합 도메인 중 하나로서 NKp30을 포함한 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)를 IFN-감마 방출을 유도하는 이들의 능력에 대하여 시험하였다. 제1 항원-결합 도메인으로서 NKp30 및 제2 항원 결합 도메인으로서 항-클라우딘 18.2(CLDN18.2)를 갖는 이중특이성 항체를 생성하였다. 제1 항원-결합 도메인으로서 NKp30 및 제2 항원 결합 도메인으로서 항-5T4 종양태아 항원(5T4)을 갖는 또 다른 이중특이성 항체도 생성하였다.
NKp30 x CLDN18.2 및 NKp30 x 5T4에 대한 이중특이성 항체를 NK92MI/NKp30과 CLDN18.2+ 종양 세포(KATO III) 또는 5T4+ 종양 세포(MDA-MB-468, U-87-MG 또는 T-47D)의 하룻밤 동시-배양에 의해 평가하였다. IFN-γ 생성을 판독물로서 사용하였다. 인간 IgG 및 배지 단독을 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 10b 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 항원-결합 도메인으로서 NKp30을 포함한 이중특이성 항체는 NK92MI/NKp30 세포가 TAA+ 종양 세포의 존재 하에 IFN-γ를 용량-의존적 방식으로 분비하도록 유도하였다. 이는 또한, 항원-결합 도메인 중 하나로서 NKp30을 사용하여 생성된 다중특이성 항체가 제2 항원 결합 도메인의 결합을 방해하지 않았음을 입증하였다. 이는 또한, NKp30 다중특이성 항체가 완전히 기능성이었음을 보여주었으며, 이는 다중특이성 항체의 NKp30 부분을 통해 NK 세포의 동원을 가능하게 하고, TAA 부분의 결합/기능이 발생하게 한다. 이는 제1 항원 결합 도메인으로서 NKp30이 임의의 다중특이성 항체를 생성하는 데 유용할 것임을 나타낸다.

Claims (37)

  1. 인간 NKp30에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 적어도 SEQ ID NO: 1의 아미노산 이소류신 50 및 류신 86에서 인간 NKp30에 결합하는, 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체가 NKp30과 B6H7 리간드의 상호작용을 감소시키는, 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체가 NKp30 효능제 활성을 갖는, 항체.
  5. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) (a) SEQ ID NO: 19의 HCDR1(중쇄 상보성 결정 영역 1), (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 29의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1(경쇄 상보성 결정 영역 1), (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (ii) (a) SEQ ID NO: 19의 HCDR1, (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 20의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1, (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (iii) (a) SEQ ID NO: 3의 HCDR1, (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1, (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  6. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편:
    (i) SEQ ID NO: 30과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 32와 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (ii) SEQ ID NO: 21과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 23과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (iii) SEQ ID NO: 11과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 13과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
  7. 제2항에 있어서, SEQ ID NO: 30, 32, 21, 23, 11 또는 13 내의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산이 삽입되거나, 결실되거나, 치환된, 항체 또는 항원-결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편:
    (i) SEQ ID NO: 30을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 32를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (ii) SEQ ID NO: 21을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (iii) SEQ ID NO: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 13을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 조작된 항체, 단일 쇄 항체(scFv), Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편인, 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항체가 다중특이성 항체인, 항체.
  11. 적어도 인간 NKp30에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 적어도 인간 종양-연관 항원(TAA)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 다중특이성 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인이 하기를 포함하는, 다중특이성 항체:
    (i) (a) SEQ ID NO: 19의 HCDR1(중쇄 상보성 결정 영역 1), (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 29의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1(경쇄 상보성 결정 영역 1), (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (ii) (a) SEQ ID NO: 19의 HCDR1, (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 20의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1, (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (iii) (a) SEQ ID NO: 3의 HCDR1, (b) SEQ ID NO: 4의 HCDR2, (c) SEQ ID NO: 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) SEQ ID NO: 6의 LCDR1, (e) SEQ ID NO: 7의 LCDR2 및 (f) SEQ ID NO: 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    및 적어도 인간 종양 연관 항원(TAA)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인.
  13. 제12항에 있어서, 상기 다중특이성 항체가 이중특이성 항체인, 다중특이성 항체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 이중특이성 4가 항체인, 이중특이성 항체.
  15. 제14항에 있어서, VD1-CL-(X1)n-VD2-CH1-Fc 또는 VD1-CH-(X1)n-VD2-CL-Fc를 포함하는 이중특이성 4가 항체로서, VD1이 항원 결합 도메인의 제1 가변 도메인이며, VD2가 항원 결합 도메인의 제2 가변 도메인이며, Fc가 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 쇄이며, CH 또는 CL이 불변 중쇄 또는 불변 경쇄 도메인이며, (X1)n이 적어도 2개 아미노산의 링커인, 이중특이성 4가 항체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 링커가 SEQ ID NO: 43 내지 SEQ ID NO 85의 임의의 서열인, 이중특이성 4가 항체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 링커가 SEQ ID NO: 44인, 이중특이성 4가 항체.
  18. 제16항에 있어서, 상기 링커가 SEQ ID NO: 50인, 이중특이성 4가 항체.
  19. 제16항에 있어서, 상기 링커가 SEQ ID NO: 55인, 이중특이성 4가 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 감소된 글리코실화를 갖거나, 글리코실화를 갖지 않거나, 하이포푸코실화된(hypofucosylated), 항체 또는 항원-결합 단편.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 증가된 이분(bisecting) GlcNac 구조를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인이 IgG1을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  24. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인이 IgG4를 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  25. 제24항에 있어서, 상기 IgG4가 (EU 넘버링 체계에 따른) S228P 치환을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  26. 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 약제학적 조성물.
  27. 유효량의 제1항 또는 제11항의 항체 또는 항원-결합 단편을, 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 암이 위암, 결장암, 췌장암, 유방암, 두경부암, 신장암, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 및 육종인, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 또 다른 치료제와 조합되어 투여되는 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 치료제가 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 파클리탁셀 작용제, 도세탁셀(docetaxel), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 시스플라틴(cisplatin), 이리노테칸(irinotecan), 독소루비신(doxorubicin), 레날리도미드(lenalidomide) 또는 5-아자시티딘인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 치료제가 파클리탁셀 작용제, 레날리도미드 또는 5-아자시티딘인, 방법.
  32. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는, 단리된 핵산.
  33. 제32항의 핵산을 포함하는, 벡터.
  34. 제32항의 핵산 또는 제33항의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  35. 제35항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양물로부터 항체 또는 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성 공정.
  36. 제1항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 진단 시약.
  37. 제36항에 있어서, 상기 표지가 방사성표지, 형광단, 발색단, 영상화제 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 진단 시약.
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