KR20210082444A

KR20210082444A - 개선된 항-flt3 항원 결합 단백질

Info

Publication number: KR20210082444A
Application number: KR1020217010557A
Authority: KR
Inventors: 군드람 중; 헬무트 잘리; 파비안 폭트; 라티파 체크리-메트레프; 마르틴 플뤼글러; 이자벨레 에네스
Original assignee: 도이체스크레브스포르슝스젠트룸스티프퉁데스외펜트리헨레크츠; 에버하르트-칼스 유니버시태트 튀빙겐
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2021-07-05
Also published as: BR112021004686A2; JP7495409B2; SG11202102178PA; WO2020053300A1; EP3850010A1; JP2022500077A; US20220056141A1; CA3111462A1; AU2019337394A1; MX2021002749A; CN113056486A; IL281351A; PH12021550470A1

Abstract

본 발명은 개선된 FLT3 결합 친화성 및/또는 항종양 활성을 갖는 신규 인간 fms 관련 티로신 키나제 3 (FLT3) 항원 결합 단백질, 예컨대 항체를 제공한다. 본 발명의 FLT3 항체는 모 FLT3 항체의 돌연변이에 의해 생성되었고, 결합 검정에서 시험관내에서 뿐만 아니라 마우스 종양 모델 및 인간 환자 종양 샘플에서 생체내에서 시험되었다. 본 발명의 항체는 단일특이적 구축물로서 또는 이중특이적 FLT3xCD3 항체 포맷으로 제공되며, 우수한 표적 친화성 및/또는 종양 세포 사멸을 나타낸다. 본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 단백질을 생산하는 방법 뿐만 아니라 이들을 코딩하는 핵산, 이들의 발현을 위한 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 FLT3 항원 결합 단백질 (ABP)을 사용하여 질환, 예컨대 백혈병을 치료하거나 또는 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

개선된 항-FLT3 항원 결합 단백질

1980년대부터 시작된 과학적 연구는 종양 연관 항원 (TAA) 및 T 세포 수용체 (TCR)/CD3-복합체에 지정된 이중특이적 항체가 T 세포를 활성화시켜 활성화된 T 세포에 의한 TAA 발현 종양 세포의 용해를 초래할 수 있음을 확립하였다 (Staerz et al. Nature 1985, 314:628-631; Perez et al. Nature 1985, 316:354-356; Jung et al. Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83:4479-4483). Fc-부분을 통해 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 CD3-항체는 원치않는 부작용으로 T 세포 활성화 및 시토카인 방출을 유도하는데 극도로 효율적이기 때문에, FcR 결합을 방지하고 T 세포의 FcR-매개 활성화보다는 표적 세포 제한된-활성화를 허용하기 위해 Fc-고갈된 또는 -감쇠된 이중특이적 TAAxCD3-항체를 구축하는 것이 가장 중요하다 (Jung et al. Immunol Today 1988; 9:257-260; Jung et al. Eur J Immunol 1991; 21:2431-2435).

산업적 품질 및 수량에서 이 중요한 전제 조건을 충족하는 이중특이적 항체의 생산은 여전히 엄청난 도전과제이다. 최근에, 블리나투모맙이라고 지칭되는 CD19xCD3-특이성을 갖는 재조합 이중특이적 단일 쇄 (bssc) 항체가 ALL을 갖는 환자의 치료에서 상당한 효율을 입증하였으며 (Bargou et al. Science 2008, 321:974-977), FDA의 획기적인 지정으로 승인을 받았다. 특히, 상기 약물은 그의 낮은 혈청 반감기 및 오히려 높은 독성으로 인해 수 주에 걸쳐 연속적인 24시간 주입으로 적용된다: 안전하게 적용가능한 용량은 환자당 1일에 대략 30 μg이며, 이는 확립된 단일특이적 항종양 항체를 사용한 치료에 사용되는 것보다 10,000배 더 낮다 (Adams and Weiner. Nat Biotechnol 2005, 23:1147-57). 약물의 생성된 혈청 농도는 1 ng/ml 미만이다 (Topp et al. J Clin Oncol 2011; 29:2493-2498). 상이한 이중특이적 항체를 사용한 초기 임상 시험에서도 관찰된 이러한 심각한 용량 제한 (Kroesen et al. Br J Cancer 1994; 70:652-661; Tibben et al. Int J Cancer 1996; 66:477-483)은 전신 시토카인 방출을 초래하는 오프-타겟 T 세포 활성화로 인한 것이다. 분명히, 이 현상은 TCR/CD3 복합체를 자극하는 이중특이적 항체의 최적의 치료적 활성을 방지한다.

원칙적으로, 용량 제한 오프-타겟 T 세포 활성화 및 그로 인한 독성 문제는 2가지 상이한 메카니즘에 의해 야기될 수 있다. T 세포 활성화는 표적 세포 제한되지 않으며 (제한되어야 함), 즉, 이중특이적 항체 구축물 내의 1가 CD3 이펙터 결합 부위조차도 항체가 그의 표적화 모이어티와 결합하는 표적 세포의 부재 하에 일부 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 이는 표적 항원을 운반하는 세포가 현상을 유도하는데 필요하지 않기 때문에 엄격한 의미에서 오프-타겟 활성화를 나타낸다. 본 발명자들은 상이한 포맷의 상이한 CD3 항체를 사용하고 특정 자극 방관자 세포 (SBC), 예컨대 림프종 세포 (SKW6.4) 또는 내피 세포 (HUVEC)를 추가하여 T 세포 활성화에 대한 공동자극을 제공하는 경우에 이 현상이 상당히 달라진다는 사실을 발견하였다. 그러므로, 이중특이적 항체의 구축을 위해 최소 "오프-타겟" T 세포 활성화를 유도하는 CD3 모이어티를 선택해야 한다.

이중특이적 항체에 의해 표적화된 TAA는 완전히 종양 특이적이지 않아, 정상적인 TAA 발현 세포에 대한 결합으로 인해 항체 매개 T 세포 활성화를 초래한다. 엄격한 의미에서, 이는 오프 타겟 활성화가 아니며, 이는 "잘못된 세포", 즉 악성 세포가 아닌 정상 세포임에도 불구하고 항원 발현 표적 세포에 의해 유도되기 때문이다. 상기 언급된 이중특이적 CD19xCD3-항체인 블리나투모맙은 그의 표적 항원 CD19가 정상 B 림프구에서 발현되기 때문에 확실히 이 문제에 직면해 있다. 분명히, 악성 조직에 대한 표적화 항원의 특이성은 이러한 종류의 오프-타겟 T 세포 활성화를 방지하는데 중요하다. fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3)은 줄기 세포 인자 수용체 (c-KIT), 대식세포 콜로니-자극 인자 수용체 (FMS) 및 혈소판-유래 성장 인자 수용체 (PDGFR)를 포함하는 다른 클래스 III 패밀리 구성원과 상동성을 공유하는 조혈 클래스 III 수용체 티로신 키나제 단백질이다. FLT3 리간드와 결합 시, FLT3 수용체는 동종이량체화를 거치며, 그에 의해 막인접 도메인 내의 특이적 티로신 잔기의 자가인산화 및 PI3K Akt, MAPK 및 STAT5 경로를 통한 하류 활성화를 가능하게 한다. 그러므로 FLT3은 정상적인 조혈 세포의 증식, 생존 및 분화를 제어하는데 있어서 신호전달 구성성분으로서 중요한 역할을 한다.

인간 FLT3은 CD34+CD38- 조혈 줄기 세포 (HSC) 뿐만 아니라 수지상 전구체 세포의 서브세트에서 발현된다. FLT3 발현은 또한 다능성 선조 세포, 예컨대 CD34+CD38+CD45RA-CD123^low 공통 골수성 선조 (CMP), CD34+CD38+CD45RA+CD123^low 과립구 단핵구 선조 (GMP), 및 CD34+CD38+CD10+CD19- 공통 림프구양 선조 세포 (CLP)에서 검출될 수 있다. 흥미롭게도, FLT3 발현은 CD34+CD38-CD45RA-CD123- 거핵구 적혈구 선조 세포 (MEP)에서 거의 부재한다. 그러므로, FLT3 발현은 주로 초기 골수성 및 림프구양 선조 세포에 국한되며, 더 성숙한 단핵구 계통 세포에서 일부 발현된다. 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 급성 림프구성 백혈병 (ALL)에서, FLT3은 매우 높은 수준으로 발현된다. FLT3은 또한 모세포 위기에서 만성 골수성 백혈병 (CML)에서 발현되지만, 만성 단계에서는 발현되지 않는다. 전반적으로, FLT3은 프리-B ALL 환자의 대략 98% 및 AML 환자의 약 90%에서 발현된다.

AML 환자의 15% 내지 34%가 FLT3/ITD 돌연변이를 나타내며, 소아에서는 빈도가 더 낮고 노인에서는 빈도가 더 높다. FLT3/ITD 돌연변이를 갖는 성인 및 소아 AML 환자 둘 다는 매우 불량한 예후를 가지며 (Rombouts WJ, Blokland I, Loewenberg B, Ploemacher RELeukemia. 2000 Apr; 14(4):675-83.), 따라서 FLT3은 AML 뿐만 아니라 ALL 요법에 대한 유망한 표적이다. 돌연변이된 FLT3은 구성적으로 활성화되고, FLT3은 ras/MAP 키나제, STAT5 및 PI3 키나제/AKT를 포함하는 경로를 통해 신호를 전달하며, 이는 아폽토시스 및 분화 차단 및 증식 자극에 기여한다. FLT3은 AML 및 ALL 둘 다의 요법을 위한 항체 접근법을 통해 표적화될 수 있다. FLT3에 결합하고 수용체에 대한 FL 결합을 억제하는 항체가 개발되었다. 임클론(Imclone) 항체인 IMC-EB10은 I상 연구에서 재발성 AML 환자에서 평가되었지만, 효능 결여로 인해 연구가 종결되었다 (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00887926). 그러므로 AML 치료를 위한 이중특이적 항체를 포함하는 2세대 모노클로날 항체를 평가해야 할 긴급한 필요성이 남아있다.

진정한 단량체성 CD3 자극에 의해 유도되는 T 세포 활성화에 더하여, 최근 논문은 이중특이적 항체의 표적화 부분을 포함하는 오프-타겟 활성화를 위한 대안적인 메카니즘을 제안하며; 이 부분이 T 세포 표면에서 이중특이적 항체의 이펙터 부분의 클러스터링을 유도하는 단일 쇄 단편으로 이루어진 경우에, 긴장성 신호전달이 유도되어 T 세포 소진을 유발할 수 있으며 (Long et al. Nat Med 2015; 6:581), 이는 기존의 단기 시험관내 검정에 의해 거의 검출가능하지 않지만 생체내 효율에 심각한 영향을 미친다. 이들 관찰은 키메라 항원 수용체로 형질감염된 T 세포 (CAR T 세포)를 사용하여 이루어졌다. 키메라 T 세포 수용체는 표적화 모이어티로서 단일 쇄 항체를 포함한다. 이들 시약이 일단 T 세포에 결합되면 해당 CAR로 형질감염된 T 세포와 기능적으로 동등하기 때문에 문헌 [Long et al. (2015)]의 결과는 이러한 표적화 부분을 갖는 이중특이적 항체에도 마찬가지로 적용될 가능성이 높다. 대부분의 단일 쇄 항체가 다량체 및 응집체를 형성하는 경향이 있다는 것은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 (Worn et al. J Mol Biol 2001, 305:989-1010), 그러므로 문헌 [Long et al. (2015)]에 의해 시험된 CAR 중 하나를 제외한 모두가 비록 가변적임에도 불구하고 클러스터링 및 긴장성 CD3 신호전달의 현상을 나타내었다는 것은 놀라운 것이 아니다 (Long et al. 2015). 여기에 설명된 문제는 표적화 부분의 다량체화 및 이에 의한 클러스터링을 방지하는 이중특이적 포맷을 요구한다.

대부분의 이중특이적 포맷은 감소된 분자량 및 CH3 도메인의 결여로 인해 매우 낮은 혈청 반감기 (1-3시간)의 문제를 갖는다. 그러므로, 원형의 블리나투모맙 항체는 수 주에 걸쳐 연속적인 24시간 i.v. 주입에 의해 적용된다. 증가된 혈청 반감기를 갖는 전체 IgG-기반 포맷, 예컨대 도 1에 도시된 IgGsc의 사용은 2가 C-말단 CD3 결합 모이어티에 의해 유도된 오프-타겟 활성화가 증가할 가능성이 있기 때문에 부적합한 것으로 간주되었다.

상기에 기반하여, 상기 설명한 문제 중 적어도 하나를 해결하는 FLT3을 표적화하는 개선된 ABP가 관련 기술분야에 필요하다.

일반적으로 및 간단한 설명을 통해, 본 발명의 주요 측면은 하기와 같이 기재될 수 있다:

제1 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 인간 fms 관련 티로신 키나제 3 (FLT3)에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질 (ABP)로서:

(i) 서열식별번호(SEQ ID NO): 01 (SYWMH)에 기재된 CDRH1 영역, 서열식별번호: 02 (EIDPSDSYKDYNQKFKD)에 기재된 CDRH2 영역, 및 서열식별번호: 03 (AITTTPFDF)에 기재된 CDRH3 영역을 포함하거나, 또는 여기서 각각의 경우에 독립적으로 CDRH1, CDRH2 및/또는 CDRH3이 각각 서열식별번호: 01, 서열식별번호: 02 또는 서열식별번호: 03과 비교하여 3개 또는 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 서열을 포함하는 것인 1개, 바람직하게는 2개의 중쇄 가변 도메인(들); 및

(ii) 서열식별번호: 05 (RASQSISNNLH)에 기재된 CDRL1 영역, 서열식별번호: 06 (YASQSIS)에 기재된 CDRL2 영역, 및 서열식별번호: 07 (QQSNTWPYT)에 기재된 CDRL3 영역을 포함하거나, 또는 여기서 각각의 경우에 독립적으로 CDRL1, CDRL2 및/또는 CDRL3이 각각 서열식별번호: 05, 서열식별번호: 06 또는 서열식별번호: 07과 비교하여 3개 또는 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 서열을 포함하는 것인 1개, 바람직하게는 2개의 경쇄 가변 도메인(들);

상기 1개, 바람직하게는 2개의 중쇄 가변 도메인(들) 및 상기 1개, 바람직하게는 2개의 경쇄 가변 도메인(들)은 각각 인간 항체 컨센서스 프레임워크 서열의 적어도 일부분을 갖는 항체 프레임워크 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 ABP에 관한 것이다.

제2 측면에서, 본 발명은 fms 관련 티로신 키나제 3 (FLT3)에 결합할 수 있고 FLT3에 대한 제1 측면의 ABP의 결합과 경쟁할 수 있는 항원 결합 단백질 (ABP) 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

제3 측면에서, 본 발명은 인간 fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3) 항원에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인, 및 인간 분화 클러스터 3 (CD3) 항원에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 단백질 (ABP)로서, 여기서 이중특이적 ABP는:

a. 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 장치를 사용하는 유동 세포계측법에 의해 FLT3 양성 세포에 대한 이중특이적 ABP의 결합을 분석함으로써 결정된 바와 같은 10 nM 미만의 EC₅₀으로 FLT3에 결합하고;

b. 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 장치를 사용하는 유동 세포계측법에 의해 CD3 양성 세포에 대한 이중특이적 ABP의 결합을 분석함으로써 결정된 바와 같은 200 nM 미만의 EC₅₀으로 CD3에 결합한다.

제4 측면에서, 본 발명은 제1 또는 제2 측면의 ABP 또는 ABP의 항원 결합 단편 또는 단량체, 예컨대 중쇄 또는 경쇄를 코딩하거나, 또는 제3 측면에 따른 이중특이적 ABP를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.

제5 측면에서, 본 발명은 세포에서 제4 측면의 핵산 및 코딩된 항원 결합 단백질 (ABP) 또는 이중특이적 ABP의 발현을 허용하는 하나 이상의 추가 서열 특색, 또는 상기 ABP 또는 이중특이적 ABP의 구성성분 (예컨대 항체 중쇄 또는 경쇄)을 포함하는 핵산 구축물 (NAC)에 관한 것이다.

제6 측면에서, 본 발명은 제4 측면의 핵산 또는 제2 측면에 따른 핵산 구축물 (NAC)을 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.

제7 측면에서, 본 발명은 (i) 제1 내지 제3 측면의 항원 결합 단백질 (ABP) 또는 이중특이적 ABP, 또는 (ii) 제4 측면의 핵산 또는 제5 측면에 따른 NAC, 또는 (iii) 제6 측면에 따른 재조합 숙주 세포, 및 제약상 허용되는 담체, 안정화제 및/또는 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

제8 측면에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 구성성분으로서, (i) 제1 내지 제3 측면의 항원 결합 단백질 (ABP) 또는 이중특이적 ABP, 또는 (ii) 제4 측면의 핵산 또는 제5 측면에 따른 NAC, 또는 (iii) 제6 측면에 따른 재조합 숙주 세포 및 제7 측면에 따른 제약 조성물로 이루어진 목록으로부터 선택된 구성성분에 관한 것이다.

제9 측면에서, 본 발명은 인간 FLT3을 발현하는 인간 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 증진시키는 방법으로서, 면역 세포, 예컨대 T-세포 또는 자연 살해 (NK) 세포의 존재 하에 상기 세포를 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질 (ABP), 또는 제3 측면에 따른 이중특이적 ABP, 또는 제4 측면에 따른 상기 ABP 또는 이중특이적 ABP를 코딩하는 핵산과 접촉시키며, 그에 의해 상기 인간 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 증진시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

제10 측면에서, 본 발명은 대상체에서의 증식성 장애의 예방 및/또는 치료 방법으로서, 제8 측면에서 인용된 구성성분의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며; 여기서 증식성 장애는 증식성 장애와 연관된 세포에서의 인간 fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3)의 발현을 특징으로 하는 것인 방법에 관한 것이다.

이하에서는, 본 발명의 요소에 대해 기재될 것이다. 이들 요소는 특정 실시양태와 함께 나열되지만, 추가 실시양태를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 기재된 실시예 및 바람직한 실시양태는 본 발명을 명백하게 설명된 실시양태로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 설명은 명백하게 기재된 실시양태 중 둘 이상을 조합하거나 또는 명백하게 설명된 실시양태 중 하나 이상을 임의의 개수의 개시된 및/또는 바람직한 요소와 조합하는 실시양태를 지원하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 본 출원에 기재된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 맥락이 달리 지시하지 않는 한 본 출원의 기재에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.

제1 측면에서, 본 발명은 인간 fms 관련 티로신 키나제 3 (FLT3)에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질 (ABP)으로서: (i) 서열식별번호: 01 (SYWMH)에 기재된 CDRH1 영역, 서열식별번호: 02 (EIDPSDSYKDYNQKFKD)에 기재된 CDRH2 영역, 및 서열식별번호: 03 (AITTTPFDF)에 기재된 CDRH3 영역을 포함하거나, 또는 여기서 각각의 경우에 독립적으로 CDRH1, CDRH2 및/또는 CDRH3이 각각 서열식별번호: 01, 서열식별번호: 02 또는 서열식별번호: 03과 비교하여 3개 또는 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 서열을 포함하는 것인 중쇄 가변 도메인; 또는 서열식별번호: 01, 서열식별번호: 02 또는 서열식별번호: 03과 적어도 75% 서열 동일성 또는 적어도 80%, 바람직하게는 90% 서열 동일성을 갖는 CDRH1, CDRH2 또는 CDRH3 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 (ii) 서열식별번호: 05 (RASQSISNNLH)에 기재된 CDRL1 영역, 서열식별번호: 06 (YASQSIS)에 기재된 CDRL2 영역, 및 서열식별번호: 07 (QQSNTWPYT)에 기재된 CDRL3 영역을 포함하거나, 또는 여기서 각각의 경우에 독립적으로 CDRL1, CDRL2 및/또는 CDRL3이 각각 서열식별번호: 05, 서열식별번호: 06 또는 서열식별번호: 07과 비교하여 3개 또는 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 서열을 포함하는 것인 경쇄 가변 도메인; 또는 서열식별번호: 05, 서열식별번호: 06 또는 서열식별번호: 07과 적어도 75% 서열 동일성 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며; 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역은 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 ABP를 제공한다. 바람직하게는 상기 중쇄 가변 도메인(들) 및 상기 경쇄 가변 도메인(들)은 각각 인간 항체 컨센서스 프레임워크 서열의 적어도 일부분을 갖는 항체 프레임워크 영역을 포함한다.

본 발명은 또한 항-FLT3 항체 4G8 (WO 2011/076922에 완전히 개시된 마우스 항 FLT3 항체)의 인간화 버전으로부터 유래된 신규하고 고도로 친화성이 있고 효과적인 항체 구축물을 제공하며, 이는 본원에서 처음으로 CDR 그라프팅에 의해 인간화되었으며, 이는 뮤린 항체 4G8의 CDR 영역이 인간 항체의 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역으로 삽입됨을 의미한다. 그러나, 그 후 인간화 4G8 항체는 본 발명의 ABP를 얻기 위해 포맷, 불변 및 가변 영역에서 광범위하게 변경되었다. 원칙적으로 임의의 가변 인간 경쇄 및/또는 가변 중쇄는 CDR 그라프팅을 위한 스캐폴드로 작용할 수 있다. 본 발명의 인간화 항체의 한 예시적인 예에서, 항체 4G8의 경쇄의 CDR 영역 (서열식별번호: 5 내지 서열식별번호: 7의 CDR 루프를 의미함)은 수탁 번호 M23090 하에 IMGT/LIGM-데이터베이스에 기탁된 인간 κ 경쇄 서열 IGKV3-15*1의 (가변 도메인)에 삽입될 수 있으며, 또한 문헌 [Ichiyoshi Y., Zhou M., Casali P. A human anti-insulin IgG autoantibody apparently arises through clonal selection from an insulin-specific 'germ-line' natural antibody template. Analysis by V gene segment reassortment and site-directed mutagenesis' J. Immunol. 154(1):226-238 (1995)]을 참조한다. 본 발명의 인간화 항체의 또 다른 예시적인 예에서, 항체 4G8의 중쇄의 CDR 영역 (서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 3의 CDR 루프를 의미함)은 수탁 번호 L06612 하에 IMGT/LIGM-데이터베이스에 기탁된 중쇄 서열 IGHV1-46*03의 (가변 도메인)에 포함될 수 있다 (또한 문헌 [Watson C.T., et al. Complete haplotype sequence of the human immunoglobulin heavy-chain variable, diversity, and joining genes and characterization of allelic and copy-number variation. Am. J. Hum. Genet. 92(4):530-546 (2013)] 참조).

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원 결합 단백질" 또는 "ABP"는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단백질, 예컨대 표적 항원에 의해 표시되거나 또는 표적 항원 상에 존재하는 하나 이상의 에피토프(들)를 의미한다. 본 발명의 ABP의 항원은 FLT3, 또는 이중특이적 분자의 경우에 FLT3 및 CD3이다. 전형적으로, 항원 결합 단백질은 항체 (또는 그의 단편), 바람직하게는 이중특이적 항체이지만; 다른 형태의 항원 결합 단백질이 또한 본 발명에 의해 고려된다. 예를 들어, ABP는 예를 들어 조합 단백질 설계 방법을 사용함으로써 결합 기능을 구비한 것과 같은 작고 견고한 비-이뮤노글로불린 "스캐폴드"로부터 유래된 또 다른 (비-항체) 수용체 단백질일 수 있다 (Gebauer & Skerra, 2009; Curr Opin Chem Biol, 13:245). 이러한 비-항체 ABP의 특정한 예는 하기를 포함한다: 단백질 A의 Z 도메인에 기반한 아피바디 분자 (Nygren, 2008; FEBS J 275:2668); 감마-B 결정질 및/또는 유비퀴틴에 기반한 아필린 (Ebersbach et al., 2007; J Mo Biol, 372:172); 시스타틴에 기반한 아피머 (Johnson et al., 2012; Anal Chem 84:6553); 술폴로부스 아시드칼다리우스(Sulfolobus acidcaldarius)로부터의 Sac7d에 기반한 아피틴 (Krehenbrink et al., 2008; J Mol Biol 383:1058); 삼중 나선 코일드 코일에 기반한 알파바디 (Desmet et al., 2014; Nature Comms 5:5237); 리포칼린에 기반한 안티칼린 (Skerra, 2008; FEBS J 275:2677); 다양한 막 수용체의 A 도메인에 기반한 아비머 (Silverman et al., 2005; Nat Biotechnol 23:1556); 안키린 반복 모티프에 기반한 DARPin (Strumpp et al., 2008; Drug Discov Today, 13:695); Fyn의 SH3 도메인에 기반한 피노머 (Grabulovski et al., 2007; J Biol Chem 282:3196); 다양한 프로테아제 억제제의 Kunitz 도메인에 기반한 Kunitz 도메인 펩티드 (Nixon et al., Curr opin Drug Discov Devel, 9:261) 및 피브로넥틴의 10번째 유형 III 도메인에 기반한 센티린 및 모노바디 (Diem et al., 2014; Protein Eng Des Sel 27:419 doi: 10.1093/protein/gzu016; Koide & Koide, 2007; Methods Mol Biol 352:95). 본 발명의 ABP의 맥락에서, ABP는 바람직하게는 인간 FLT3 및 인간 CD3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 포맷으로 제공된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "상보성 결정 영역" (또는 "CDR" 또는 "초가변 영역")은 광범위하게 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 발견되는 하나 이상의 초가변 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 지칭한다. 예를 들어 하기를 참조한다: "IMGT", Lefranc et al., 20003, Dev Comp Immunol 27:55; Honegger & Plueckthun, 2001, J Mol Biol 309:657, Abhinandan & Martin, 2008, Mol Immunol 45:3832, Kabat, et al. (1987): Sequences of Proteins of Immunological Interest National Institutes of Health, Bethesda, Md. 이들 표현은 문헌 [Kabat et al (1983) Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept of Health and Human Services]에 의해 정의된 바와 같은 초가변 영역 또는 항체의 3차원 구조의 초가변 루프 (Chothia and Lesk, 1987; J Mol Biol 196:901)를 포함한다. 각 쇄 내의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 아주 근접하게 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR 내에는 항체-항원 상호작용에서 CDR에 의해 사용되는 중요한 접촉 잔기를 나타내는 선택성 결정 영역 (SDR)으로 기재되어 있는 선택된 아미노산이 있다. (Kashmiri, 2005; Methods 36:25).

용어 "항체"는 일반적으로 이뮤노글로불린에 기반한 단백질성 결합 분자를 지칭한다. 이러한 항체의 전형적인 예는 결합 특이성을 유지하는 이뮤노글로불린의 유도체 또는 기능적 단편이다. 항체 및 항체 단편의 생산 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 용어 "항체"는 또한 상이한 클래스 (즉, IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE) 및 서브클래스 (예컨대 IgG1, IgG2 등)의 이뮤노글로불린 (Ig)을 포함한다. 또한 상기 언급된 바와 같이, 항체 유도체 또는 분자의 예시적인 예는 Fab 단편, F(ab')2, Fv 단편, 단일-쇄 Fv 단편 (scFv), 디아바디 또는 도메인 항체를 포함한다 (Holt LJ et al., Trends Biotechnol. 21(11), 2003, 484-490). 그러므로 용어 "항체"의 정의는 또한 실시양태, 예컨대 키메라, 단일 쇄 및 인간화 항체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "ABP"는 이뮤노글로불린 M, 이뮤노글로불린 G, 이뮤노글로불린 A, 이뮤노글로불린 D 또는 이뮤노글로불린 E의 상응하는 자연 발생 도메인과 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92 %, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97 %, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 하나 이상의 도메인을 운반할 수 있다. 이와 관련하여, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20%의 편차 이내, 예컨대 10%의 편차 이내 또는 5% 이내를 의미한다는 점에 주목한다.

본 발명에서 사용된 바와 같은 "퍼센트 (%) 서열 동일성"은 이들 두 서열 중 더 긴 것의 잔기의 수에 대한 쌍별 동일한 잔기의 백분율 (해당 서열과 본 발명의 폴리펩티드의 서열의 상동성 정렬 후)을 의미한다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, ALIGN, 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 관련 기술분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열에 대해서도 동일하다.

"이뮤노글로불린"은 본원에서 사용될 때, 전형적으로 각각 대략 25 kDa의 2개의 경쇄 (L) 및 각각 대략 50 kDa의 2개의 중쇄 (H)로 구성된 사량체성 글리코실화된 단백질이다. 람다 및 카파라고 지칭되는 2가지 유형의 경쇄가 이뮤노글로불린에서 발견될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 5기지 주요 클래스: A, D, E, G 및 M에 할당될 수 있고, 이들 중 여러 개는 서브클래스 (이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. IgM 이뮤노글로불린은 J 쇄라고 불리는 추가 폴리펩티드와 함께 5개의 기본 이종사량체 단위로 이루어지고, 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 반면, IgA 이뮤노글로불린은 J 쇄와 조합하여 다가 집합체를 형성하기 위해 중합할 수 있는 2-5개의 기본 4-쇄 단위를 함유한다. IgG의 경우에, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다.

IgG 클래스의 이뮤노글로불린에서는 중쇄에 여러 이뮤노글로불린 도메인이 있다. 본원에서 "이뮤노글로불린 (Ig) 도메인"은 별개의 삼차 구조를 갖는 이뮤노글로불린의 영역을 의미한다. IgG 항체의 맥락에서, IgG 이소타입은 각각 3개의 CH 영역을 갖는다: "CH1"은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 EU 인덱스에 따라 위치 118-220을 지칭하고, "CH2"는 위치 237-340을 지칭하고, "CH3"은 위치 341-447을 지칭한다. 본원에서 "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역" 또는 "이뮤노글로불린 힌지 영역" 또는 "H"는 항체의 제1 및 제2 불변 도메인 사이에 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩티드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 위치 220에서 끝나고, IgG CH2 도메인은 잔기 EU 위치 237에서 시작한다. 그러므로, IgG의 경우에 힌지는 본원에서 위치 221 (IgG1에서 D221) 내지 236 (IgG1에서 G236)을 포함하도록 정의되며, 여기서 넘버링은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 EU 인덱스에 따른다. 본원에서 정의된 바와 같은 불변 중쇄는 CH1 도메인의 N-말단에서 CH3 도메인의 C-말단을 지칭하므로, 위치 118-447을 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.

용어 "가변"은 그의 서열에서 가변성을 나타내고 특정한 항체 (즉, "가변 도메인(들)")의 특이성 및 결합 친화성을 결정하는데 관여하는 이뮤노글로불린 도메인의 부분을 지칭한다. 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있지 않으며; 이는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 각각의 서브도메인에 집중되어 있다. 이들 서브도메인은 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV", 또는 "상보성 결정 영역" (CDR)이라고 불린다. 가변 도메인의 더 보존된 (즉, 비-초가변) 부분은 "프레임워크" 영역 (FR)이라고 불린다. 자연 발생 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 이는 주로 β-시트 구성을 채택하고, 3개의 초가변 영역에 의해 연결되며, 이는 루프 연결을 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄에서 초가변 영역은 FR에 의해 아주 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al.] 참조, 하기 참조). 일반적으로, 자연 발생 이뮤노글로불린은 6개의 CDR (하기 참조); VH에 3개 (CDRH1, CDRH2, CDRH3), 및 VL에 3개 (CDRL1, CDRL2, CDRL3)를 포함한다. 자연 발생 이뮤노글로불린에서, CDRH3 및 CDRL3은 6개의 CDR 중 가장 광범위한 다양성을 나타내며, 특히 CDRH3은 이뮤노글로불린에 미세한 특이성을 부여하는데 독특한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 불변 도메인은 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 예를 들어, 항체-의존적 세포-매개 세포독성 및 보체 활성화와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

용어 "VH" (VH라고도 함) 및 "VL" (VL이라고도 함)은 본원에서 이뮤노글로불린의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 각각을 지칭하는데 사용된다. 이뮤노글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 3개의 초가변 영역에 의해 중단된 "프레임워크" 영역으로 이루어진다. 그러므로, 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 이뮤노글로불린의 가변 부분에는 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR (또는 CDR 영역)이 있다. 그러므로, 본원에 사용된 바와 같은 "CDR"은 적절한 경우에 모든 3개의 중쇄 CDR (CDRH1, CDRH2 및 CDRH3), 또는 모든 3개의 경쇄 CDR (CDRL1, CDRL2 및 CDRL3), 또는 모든 중쇄 및 모든 경쇄 CDR 둘 다를 지칭한다. 3개의 CDR은 경쇄 가변 영역의 결합 특성을 구성하고 3개는 중쇄 가변 영역의 결합 특성을 구성한다. CDR은 이뮤노글로불린 분자의 항원 특이성을 결정하고, 스캐폴딩 또는 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산 서열에 의해 분리된다. 정확한 정의 CDR 경계 및 길이는 상이한 분류 및 넘버링 시스템에 따른다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 다른 잔기가 항원 결합 영역의 일부로 간주되고 통상의 기술자에 의해 이해될 수 있음을 의미할 수 있다. CDR은 항원 또는 에피토프에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 위한 대부분의 접촉 잔기를 제공한다.

CDR3은 전형적으로 항체-결합 부위 내에서 분자 다양성의 가장 큰 공급원이다. 예를 들어, H3은 2개의 아미노산 잔기만큼 짧거나 또는 26개의 아미노산보다 더 클 수 있다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 항체 구조의 검토에 대해, 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988]을 참조한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 각 서브유닛 구조, 예를 들어, CH, VH, CL, VL, CDR, FR 구조가 활성 단편, 예를 들어, VH, VL의 일부를 포함하거나, 또는 CDR 서브유닛이 항원, 즉, 항원-결합 단편, 또는 예를 들어, Fc 수용체 및/또는 보체에 결합하고/거나 활성화시키는 CH 서브유닛의 부분에 결합함을 인식할 것이다. CDR은 전형적으로 문헌 [Sequences of Proteins of immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.]에 기재된 바와 같이 카바트(Kabat) CDR을 지칭한다. 항원 결합 부위를 특징화하기 위한 또 다른 표준은 코티아(Chothia)에 의해 기재된 바와 같은 초가변 루프를 지칭하는 것이다. 예를 들어, 문헌 [Chothia, et al. (1992; J. Mol. Biol. 227:799-817]; 및 [Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638]을 참조한다. 또 다른 표준은 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되는 AbM 정의이다. 일반적으로, 예를 들어, 문헌 [Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)]을 참조한다. 카바트 CDR에 대하여 설명된 실시양태는 대안적으로 코티아 초가변 루프 또는 AbM-정의된 루프에 대하여 유사한 기재된 관계를 사용하여 구현될 수 있다.

상응하는 이뮤노글로불린 뮤 중쇄, 감마 중쇄, 알파 중쇄, 델타 중쇄, 엡실론 중쇄, 람다 경쇄 또는 카파 경쇄는 임의의 종, 예컨대 설치류 종을 포함하는 포유류 종, 양서류, 예를 들어 예를 들어 개구리, 두꺼비, 도롱뇽 또는 영원을 포함하는 서브클래스 진양서류의 양서류, 또는 무척추동물 종일 수 있다. 포유동물의 예는 래트, 마우스, 토끼, 기니피그, 다람쥐, 햄스터, 고슴도치, 오리너구리, 아메리칸 피카, 아르마딜로, 개, 여우원숭이, 염소, 돼지, 소, 주머니쥐, 말, 박쥐, 우드척, 오랑우탄, 붉은털 원숭이, 양털 원숭이, 마카크, 침팬지, 타마린 (사퀴누스 오이디푸스(saguinus oedipus)), 마모셋 또는 인간을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 언급된 바와 같이 이뮤노글로불린은 전형적으로 디술피드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L), 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재된 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. CDR은 항원과 항체의 특이적 상호작용을 담당하는 대부분의 잔기를 함유한다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 갖는다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원의 에피토프와 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.

"프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 초가변 영역 이외의 가변 도메인 잔기이다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서 상대적으로 보존된다. 그러므로, "인간 프레임워크 영역"은 자연 발생 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역과 실질적으로 동일한 (약 85% 또는 그 초과, 일반적으로 90-95% 또는 그 초과) 프레임워크 영역이다. 항체의 프레임워크 영역, 즉 구성적 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역은 CDR을 배치하고 정렬하는 역할을 한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다.

용어 "Fab", "Fab 영역", "Fab 부분" 또는 "Fab 단편"은 VH, CH1, VL, 및 CL 이뮤노글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 정의하는 것으로 이해된다. Fab는 단리에서 이 영역, 또는 ABP의 맥락에서 이 영역, 뿐만 아니라 전장 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린 단편을 지칭할 수 있다. 전형적으로 Fab 영역은 항체의 전체 경쇄를 함유한다. Fab 영역은 이뮤노글로불린 분자의 "아암"을 정의하기 위해 취해질 수 있다. 이는 해당 Ig의 에피토프-결합 부분을 함유한다. 자연 발생 이뮤노글로불린의 Fab 영역은 파파인-소화에 의해 단백질분해 단편으로 수득될 수 있다. "F(ab')2 부분"은 펩신-소화된 이뮤노글로불린의 단백질분해 단편이다. "Fab' 부분"은 F(ab')2 부분의 디술피드 결합을 환원시켜 생성된 산물이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "Fab", "Fab 영역", "Fab 부분" 또는 "Fab 단편"은 항체 아암의 C-말단 단부를 정의하는 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. 이 힌지 영역은 ABP의 아암이 Y를 정의하기 위해 취해질 수 있는 전장 이뮤노글로불린 내의 CH1 도메인의 C-말단에서 발견되는 힌지 영역에 해당한다. 용어 힌지 영역은 이뮤노글로불린이 이 영역에서 약간의 가요성을 갖기 때문에 관련 기술분야에서 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은 "Fab 중쇄"는 VH 및 CH1을 포함하는 Fab 단편의 부분 또는 폴리펩티드로 이해되는 반면, 본원에 사용된 바와 같은 "Fab 경쇄"는 VL 및 CL을 포함하는 Fab 단편의 부분 또는 폴리펩티드로 이해된다.

용어 "Fc 영역" 또는 "Fc 단편"은 본원에서 천연-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. Fc 부분은 항체의 이펙터 기능, 예를 들어 보체 시스템 및 Fc-수용체 보유 면역 이펙터 세포, 예컨대 NK 세포의 활성화를 매개한다. 인간 IgG 분자에서, Fc 영역은 Cys226에 대한 파파인 절단 N-말단에 의해 생성된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226의 아미노산 잔기에서, 또는 Pro230에서, 그의 카르복실-말단까지 연장되도록 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어, ABP의 생산 또는 정제 동안, 또는 ABP의 중쇄를 코딩하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 천연-서열 Fc 영역은 포유류, 예를 들어 인간 또는 뮤린, IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다. Fc 영역은 항체의 클래스에 따라 2개 또는 3개의 불변 도메인을 함유한다. 이뮤노글로불린이 IgG인 실시양태에서, Fc 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 갖는다.

용어 "단일-쇄 가변 단편" (scFv)은 본원에서 이뮤노글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역이 10 내지 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩티드에 의해 함께 융합되는 항체 단편을 정의하는데 사용된다. 링커는 일반적으로 가요성을 위한 글리신, 뿐만 아니라 용해성을 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결하거나 또는 VL의 N-말단을 VH의 C-말단과 연결할 수 있다. scFv 단편은 특이적 항원 결합 부위를 보유하지만 이뮤노글로불린의 불변 도메인을 결여한다.

"항원 결정기"로도 공지된 용어 "에피토프"는 항체 또는 T-세포 수용체가 특이적으로 결합하여, 그에 의해 복합체를 형성하는 항원의 부분을 지칭한다. 그러므로, 용어 "에피토프"는 이뮤노글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 단백질 결정기를 포함한다. 본원에 기재된 ABP의 결합 부위(들) (파라토프)는 표적 구조에 대해 고유한 입체형태적 또는 연속 에피토프에 특이적으로 결합/상호작용할 수 있다. 에피토프 결정기는 일반적으로 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 이루어지고, 일반적으로 특이적 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다. 일부 실시양태에서, 에피토프 결정기는 분자, 예컨대 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 술포닐의 화학적으로 활성인 표면 그룹화를 포함하고, 특정 실시양태에서, 특이적 3차원 구조적 특징, 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 폴리펩티드 항원과 관련하여, 입체형태적 또는 불연속 에피토프는 일차 서열에서 분리된 2개 이상의 별개의 아미노산 잔기의 존재를 특징으로 하지만, 폴리펩티드가 천연 단백질/항원로 폴딩할 때 분자 표면에서 일관된 구조로 어셈블리한다 (SeIa, M., Science (1969) 166, 1365-1374; Laver, W.G., et al. Cell (1990) 61, 553-556). 에피토프에 기여하는 2개 이상의 별개의 아미노산 잔기는 하나 이상의 폴리펩티드 쇄(들)의 별도의 섹션 상에 존재할 수 있다. 이들 잔기는 폴리펩티드 쇄(들)가 3차원 구조로 폴딩하여 에피토프를 구성할 때 분자 표면에서 함께 모인다. 대조적으로, 연속 또는 선형 에피토프는 폴리펩티드 쇄의 단일 선형 세그먼트에 존재하는 2개 이상의 별개의 아미노산 잔기로 이루어진다.

이 맥락에서 용어 "특이적" 또는 "특이적으로 결합하는" ("에 지정된"으로도 사용됨)은 본 발명에 따라 항체 또는 면역 수용체 단편이 특이적 항원 또는 리간드 또는 일련의 특이적 항원 또는 리간드와 특이적으로 상호작용하고/거나 결합할 수 있지만 본질적으로 다른 항원 또는 리간드에는 결합하지 않음을 의미한다. 이러한 결합은 "자물쇠-및-열쇠-원리"의 특이성에 의해 예시될 수 있다. 항체는 주어진 시점에서 오직 하나의 항체만이 에피토프에 결합할 수 있도록 항체가 교차-경쟁하는 경우에 "동일한 에피토프에 결합"한다고 하며, 즉 하나의 항체가 다른 항체의 결합 또는 조절 효과를 방지한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "단리된 ABP"는 그의 자연 환경의 구성성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 ABP를 지칭한다. 그의 자연 환경의 오염물질 구성성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 ABP는 로우리(Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같은 항체의 95 중량% 초과, 예컨대 99 중량% 초과로 정제된다. 일부 실시양태에서 항체는 쿠마시 블루 또는, 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 판단된 바와 같은 균질성으로 정제된다. 단리된 ABP는 일부 실시양태에서 항체의 자연 환경의 하나 이상의 구성성분(들)이 존재하지 않는 재조합 세포 내에 존재할 수 있다. 전형적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.

본원에 기재된 바와 같은 FLT3 및/또는 FLT3-발현 암 세포에 결합하는 본 발명의 (재조합) ABP는 임의의 적합한 재조합 항체 포맷으로, 예를 들어 Fv 단편, scFv, 힌지 영역을 결여한 1가 항체, 미니바디, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 재조합 ABP는 또한 불변 도메인 (영역), 예컨대 인간 IgG 불변 영역, CH1 도메인 (Fab 단편이 하는 것처럼) 및/또는 전체 Fc 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 ABP는 또한 바람직하게는 이중특이적 포맷의 전장 (전체) 항체일 수 있다.

항체가 필요한 성장 경로의 차단을 통한 항증식, 아폽토시스에 이르게 하는 세포내 신호전달, 수용체의 증진된 하향 조절 및/또는 턴오버, 보체-의존적 세포독성 (CDC), 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포-매개 식세포작용 (ADCP) 및 적응 면역 반응의 촉진을 포함하는 세포 효과를 매개하는 수많은 가능한 메카니즘이 있다 (Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11 541-547, Glennie et al., 2000, Immunol Today 21 403-410). 항체 효능은 이들 메카니즘의 조합으로 인한 것일 수 있으며, 종양학에 대한 임상 요법에서 그의 상대적 중요성은 암 의존적인 것으로 보인다.

일부 항체의 활성에 대한 FcγR-매개 이펙터 기능의 중요성은 마우스에서 (Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95 652-656, Clynes et al., 2000, Nat Med 6 443-446,) 및 인간에서 임상 효능 및 FcγRIIIa의 높은 (V158) 또는 낮은 (F158) 친화성 다형성 형태의 이들의 동종이형 사이의 관찰된 상관관계로부터 (Cartron et al., 2002, Blood 99 754-758, Weng & Levy, 2003, Journal of Clinical Oncology, 21 3940-3947) 입증되었다. 함께 이들 데이터는 특정 FcγR에 대한 결합에 최적화된 항체가 이펙터 기능을 더 잘 매개하며, 그에 의해 환자에서 표적 세포를 더 효과적으로 파괴할 수 있음을 시사한다. 그러므로 항체의 항종양 효력을 증진시키기 위한 유망한 수단은 세포독성 이펙터 기능, 예컨대 ADCC, ADCP 및 CDC를 매개하는 능력의 증진을 통한 것이다. 또한, 항체는 항체가 종양 세포에서 그의 표적에 결합할 때 발생할 수 있는 성장 억제성 또는 아폽토시스성 신호전달을 통해 항종양 메카니즘을 매개할 수 있다. 이러한 신호전달은 항체가 FcγR을 통해 면역 세포에 결합된 종양 세포에 제시될 때 강화될 수 있다. 따라서, FcγR에 대한 항체의 증가된 친화성은 증진된 항증식성 효과를 초래할 수 있다.

증진된 이펙터 기능을 제공하기 위해 FcγR에 대한 선택적으로 증진된 결합을 갖는 항체를 변형시키는데 일부 성공이 달성되었다. 최적화된 이펙터 기능을 위한 항체 조작은 아미노산 변형을 사용하여 달성되었다 (예를 들어 미국 특허 출원 US 2004-0132101 또는 미국 특허 출원 2006-0024298 참조).

본 발명의 ABP는 인간 FLT3에 결합할 수 있다. 용어 "fms 관련 티로신 키나제 3" 또는 "FLT3"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 인간 FLT3의 변이체, 이소형 및 종 상동체를 포함한다. 인간 FLT3 단백질은 유니프롯(UniProt) 수탁 번호 P36888 (2018년 9월 9일 버전)을 갖는다. 인간 FLT3에 대한 유전자는 염색체 13에 위치하고, HGNC:3765의 HGNC 접속 (www.genenames.org - 2018년 9월 9일의 HGNC 버전)을 갖는다. 인간 FLT 3은 명칭 CD135, FLK2, STK1로도 공지되어 있다. 그러나, 본 발명의 항체는 특정의 바람직한 경우에 인간 이외의 종으로부터의 FLT3과 교차-반응하지 않을 수 있다.

에피토프를 결정하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 표준 에피토프 맵핑 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체에 결합하는 FLT3의 단편 (펩티드) (예를 들어 합성 펩티드)은 후보 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 선형 에피토프의 경우에, 정의된 길이 (예를 들어, 8개 이상의 아미노산)의 중복된 펩티드가 합성된다. 펩티드는 FLT3 단백질 서열의 모든 8개 아미노산 단편을 커버하는 일련의 펩티드가 제조되도록 1개 아미노산으로 오프셋될 수 있다. 더 큰 오프셋, 예를 들어, 2 또는 3개의 아미노산을 사용함으로써 더 적은 펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 더 긴 펩티드 (예를 들어, 9-, 10- 또는 11-mer)를 합성할 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편에 대한 펩티드의 결합은 표면 플라스몬 공명 (비아코어(BIACORE)) 및 ELISA 검정을 포함하는 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 입체형태적 에피토프의 검사를 위해, 더 큰 FLT3 단편을 사용할 수 있다. 입체형태적 에피토프를 정의하기 위해 질량 분광분석법을 사용하는 다른 방법이 기재되었고 기재될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Baerga-Ortiz et al., Protein Science 11:1300-1308, 2002] 및 여기에 인용된 참고문헌 참조). 에피토프 결정을 위한 또 다른 방법은 표준 실험실 참고문헌 작업, 예컨대 문헌 [Current Protocols in Immunology, Coligan et al., eds., John Wiley & Sons]의 유닛 6.8 ("파지 디스플레이 선택 및 B-세포 에피토프의 분석") 및 유닛 9.8 ("합성 펩티드 조합 라이브러리를 사용한 항원 결정기의 확인")에서 제공된다. 에피토프는 공지된 에피토프에 점 돌연변이 또는 결실을 도입한 다음, 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편과의 결합을 시험하여 어느 돌연변이가 항체 또는 항원-결합 단편의 결합을 감소시키는지 결정함으로써 확인될 수 있다.

본 발명의 ABP는 일부 바람직한 실시양태에서 제1 항원 결합 도메인에 대립유전자 IGHV1-46, 바람직하게는 IGHV1-46*3의 인간 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 ABP는 경쇄 내에 IGKV3D-15*01의 프레임워크를 갖는 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서 본 발명의 항체는 V0-V6으로 표시되고 각각 서열식별번호: 76 및 77의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 완전히 그라프팅된 인간화 항체이다. 그러나, T-세포의 동원 및 활성화를 위한 개선된 결합 친화성, 결합성 및/또는 활성 및 T 세포 매개 항종양 세포독성을 갖는 인간화 항-FLT3 항체의 돌연변이된 변이체를 제공하는 것이 본 발명의 하나의 달성이다. 따라서, 본 발명에 따라 FLT3 특이적 제1 항원 결합 도메인에서 본 발명의 ABP가 바람직하며, ABP는 카바트 넘버링에 따라 16, 18, 19, 20, 22, 48, 57, 60, 69, 70, 75, 76, 78, 80, 81, 87 및 108로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 돌연변이(들)를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 가장 바람직하게는 돌연변이는 카바트 넘버링에 따라 K16G, V18L, K19R, V20L, K22A, M48I, K57T, N60A, M69I, T70S, T75K, S76N, V78L, M80L, E81Q, S87A, 및 T108L 중 임의의 하나 또는 임의의 조합, 또는 모두이다. 또한 본 발명의 ABP는 그의 FLT3 특이적 제1 항원 결합 도메인에 49, 87 및 55로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이, 바람직하게는 Y49K, I55A 및 Y87F를 갖는 가변 경쇄 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 넘버링은 카바트 시스템에 따른다. 일부 실시양태에서 그의 제1 항원 결합 도메인에서 본 발명의 ABP는 중쇄 가변 서열 돌연변이, 및 바람직하게는 돌연변이로서만, K16G, V18L, K19R, V20L, K22A, K57T, N60A, M69I, T70S, T75K, S76N, V78L, M80L, E81Q, S87A 및 T108L, 및 경쇄 가변 서열 돌연변이 I55A, 또는 가변 경쇄 영역에서 돌연변이 없음을 포함할 수 있다. 또는 본 발명의 ABP는 K16G, V18L, K19R, V20L, K22A, M69I, T70S, T75K, S76N, V78L, M80L, E81Q, S87A, T108L, 바람직하게는 돌연변이로서만, 및 경쇄 가변 서열에서 돌연변이 없음을 포함할 수 있다. 또 다른 예는 항-FLT3 결합 도메인 중쇄 가변 서열에 돌연변이를 포함하지 않고, 상응하는 경쇄 가변 서열에 I55A 돌연변이를 포함하는 ABP에 관한 것이다. 항-FLT3 제1 항원 결합 도메인 중쇄 가변 서열에 위치 48의 돌연변이, 바람직하게는 48I를 포함하고, 상응하는 경쇄 가변 서열에 돌연변이 49K 및 87F를 포함하는 본 발명의 ABP가 추가로 바람직하다. 넘버링은 카바트 시스템에 따른다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 FLT3에 지정된 이들의 제1 항원 결합 도메인에 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 ABP에 관한 것이며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 15, 17, 19, 21, 23 또는 76으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 각각의 경우에 독립적으로, 임의로 이들 서열과 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개 이하, 바람직하게는 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 삽입(들) 또는 결실(들)을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/거나; 여기서 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 16, 18, 20, 22, 24 또는 77로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 각각의 경우에 독립적으로, 임의로 이들 서열과 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개 이하, 바람직하게는 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 삽입(들) 또는 결실(들)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 여기서 이러한 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 가장 바람직하게는 경쇄 및 중쇄는 하기 표 1의 본원에 개시된 항체에 따라 쌍형성된 이들 ABP에 있다. 또한, 본 발명에 따른 바람직한 ABP는 중쇄 가변 영역에 서열식별번호: 15, 17, 19, 21 또는 23 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 아미노산 위치 16, 18, 19, 20, 22, 48, 57, 60, 69, 70, 75, 76, 78, 80, 81, 87 및 108을 포함하고/거나; 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 16, 18, 20, 22 또는 24 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 아미노산 위치 49, 55 및 87을 포함하며; 여기서 넘버링은 카바트 시스템에 따른다.

본 발명의 일부 실시양태에서 ABP의 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 21에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 22에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 76에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 77에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일부 특정한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역이 48I를 포함하고, 경쇄 가변 영역이 87F를 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 시스템에 따른 것인 ABP가 바람직하다. 보다 더 바람직한 것은 경쇄 가변 영역이 49K를 추가로 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 시스템에 따른 것인 본 발명의 ABP이다.

본 발명의 ABP는 본원에 설명된 바와 같이, 바람직하게는 이중특이적 분자이며, 여기서 상기 제2 항원 결합 도메인은 CD3에 결합하고, 바람직하게는 여기서 상기 제2 항원 결합 도메인은 제1 항체 결합 도메인의 중쇄에 융합된다. 제2 항원 결합 도메인이 서열식별번호: 14, 25, 26 및 27로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖거나, 또는 각각의 경우에 독립적으로, 임의로 이들 서열과 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개 이하, 바람직하게는 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 삽입(들) 또는 결실(들)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv 단편을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 ABP는 일부 실시양태에서 서열식별번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 및 78로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나, 또는 이들 서열과 비교하여 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 4개 이하, 바람직하게는 3 또는 2개, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 항체 중쇄를 포함하고/거나; 서열식별번호: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 및 79로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나, 또는 이들 서열과 비교하여 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 4개 이하, 바람직하게는 3 또는 2개, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 항체 경쇄를 포함하는 ABP일 수 있다. 바람직한 실시양태에서 본 발명의 ABP는 이 단락에 기재된 바와 같은 ABP이며, 단, 경쇄 및 중쇄는 하기 표 1의 본원에 개시된 항체에 대해 표시된 바와 같이 쌍형성된다.

본 발명의 ABP는 바람직하게는 1개, 바람직하게는 2개의 항체 중쇄 및 1개, 바람직하게는 2개의 항체 경쇄를 포함하며, 각각이 하기 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 하기 서열과 비교하여 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 4개 이하, 바람직하게는 3 또는 2개, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABP이다:

a. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 28 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 29로부터 선택된 서열 (항체 V1-V6);

b. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 30 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 31로부터 선택된 서열 (항체 V2-V6);

c. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 32 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 33으로부터 선택된 서열 (항체 V3-V6);

d. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 34 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 35로부터 선택된 서열 (항체 V4-V6);

e. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 36 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 37로부터 선택된 서열 (항체 V5-V6);

f. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 38 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 39로부터 선택된 서열 (항체 V1-V7);

g. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 40 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 41로부터 선택된 서열 (항체 V2-V7);

h. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 42 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 43으로부터 선택된 서열 (항체 V3-V7);

i. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 44 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 45로부터 선택된 서열 (항체 V4-V7);

j. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 46 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 47로부터 선택된 서열 (항체 V5-V7);

k. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 48 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 49로부터 선택된 서열 (항체 V1-V8);

l. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 50 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 51로부터 선택된 서열 (항체 V2-V8);

m. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 52 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 53으로부터 선택된 서열 (항체 V3-V8);

n. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 54 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 55로부터 선택된 서열 (항체 V4-V8);

o. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 56 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 57로부터 선택된 서열 (항체 V5-V8);

p. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 58 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 59로부터 선택된 서열 (항체 V1-V9);

q. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 60 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 61로부터 선택된 서열 (항체 V2-V9);

r. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 62 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 63으로부터 선택된 서열 (항체 V3-V9);

s. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 64 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 65로부터 선택된 서열 (항체 V4-V9);

t. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 66 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 67로부터 선택된 서열 (항체 V5-V9);

u. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 68 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 69로부터 선택된 서열 (항체 V6-V6);

v. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 70 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 71로부터 선택된 서열 (항체 V6-V7);

w. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 72 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 73으로부터 선택된 서열 (항체 V6-V8);

x. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 74 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 75로부터 선택된 서열 (항체 V6-V9).

y. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 78 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 79로부터 선택된 서열 (항체 V0-V6).

본 개시내용 전반에 걸쳐 바람직한 항체 가변 쇄 변이체는 명칭 "Vx" 또는 "Vx-Vy"로 지칭된다. 어구 "Vx" (여기서 x는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9일 수 있음)는 표 1 또는 실시예 섹션에 따라 본 발명에 개시된, 특히 실시예 3에 기재된 바와 같은 가변 영역 변이체를 나타낸다. 특히, 인간화 4G8 FLT3 항원 결합 도메인은 변이체 0 또는 V0으로 제시되어 있다. 용어 V0, V1, V2, V3, V4, V5 및 V6은 본 발명의 항체의 FLT3 결합 부위의 가변 영역 변이체를 지칭할 수 있다. 다른 한편으로, 용어 V6, V7, V8 및 V9는 본 발명의 항체 (이중특이적)의 CD3 결합 부위의 특정 변이체를 지칭한다. 용어 "Vx-Vy"는 본 발명의 바람직한 이중특이적 FLT3xCD3 ABP를 기술하기 위해 본원에서 사용되며, 여기서 Vx는 항 FLT3 결합 부위 변이체를 나타내고, Vy는 항-CD3 결합 부위 변이체를 나타낸다. 이 맥락에서 Vx는 V0, V1, V2, V3, V4, V5 및 V6 중 하나일 수 있는 반면, Vy는 V6, V7 V8 또는 V9 중 하나일 수 있다. V6은 본 발명의 항-FLT3 결합 부위 변이체 또는 항-CD3 결합 부위 변이체의 맥락 둘 다에서 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 사용은 맥락으로부터 명백해질 것이다. 변이체의 서열 및 전체 구축물 명명법은 또한 하기 표 1로부터 명백하게 된다.

상기 ABP (a.) 내지 (y.)의 중쇄 및 경쇄는 바람직하게는 서로 쌍형성된다. 본 발명의 바람직한 ABP는 백혈병 암 세포의 T-세포 매개 사멸 및/또는 성장 억제를 유도하는 이들의 능력에 따라, 예를 들어 본 개시내용의 실시예 섹션에 제공된 데이터에 따라 선택된다. 예를 들어 특정 구축물, 예컨대 V5-V9는 가장 높은 조합된 FLT3 및 CD3 친화성을 나타낸다. V5-V9의 CD3 또는 FLT3 항원 결합 도메인을 포함하는 각 구축물은 이와 관련하여 바람직한 ABP이지만, 일부 적용은 이러한 강한 FLT3/CD3 결합제를 필요로 할 수 있다. 그러나, 또한 약간 감소된 친화성을 갖지만 따라서 더 우수한 내약성 (인간화) 또는 생물학적 활성 (항암 활성)을 갖는 항체도 본 발명의 바람직한 구축물로서 포함된다. 따라서, 상기 도시된 ABP a. 내지 x., 특히 V6-V6의 FLT3 (제1) 항원 결합 도메인을 포함하지 않는 모든 인간화 변이체가 모두 바람직하다.

본 발명의 또 다른 측면은 또한 인간 fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3) 항원에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인, 및 인간 분화 클러스터 3 (CD3) 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 단백질 (ABP)에 관한 것이다. 이 측면에 대해 기재된 바와 같은 이중특이적 ABP는 바람직한 실시양태에서 이전에 본원에 기재된 ABP의 실시양태 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이전에 본원에 기재된 바와 같은 ABP는 그의 모든 실시양태에서 하기에 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 ABP일 수 있다.

특정 실시양태에서 이중특이적 ABP는 10 nM 미만, 바람직하게는 9 nM 미만, 보다 바람직하게는 8 nM 미만, 보다 바람직하게는 7 nM 미만, 보다 바람직하게는 6 nM 미만, 또는 5.5 nM 미만의 EC50으로 FLT3에 결합하는 것이 바람직하다. 대안적으로 또는 추가적으로 본 발명의 이중특이적 ABP는 0.5 nM 초과, 보다 바람직하게는 1 nM 초과, 보다 바람직하게는 1.3 nM 초과, 보다 바람직하게는 2 nM 초과, 보다 바람직하게는 3 nM 초과, 또는 4 nM, 또는 4.5 nM 초과의 EC50으로 FLT3에 결합한다. 게다가 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명에 따른 이중특이적 ABP는 10 nM 미만 및 0.5 nM 초과, 보다 바람직하게는 9 nM 미만 및 1 nM 초과, 바람직하게는 8 nM 미만 및 1.3 nM 초과, 바람직하게는 7 nM 미만 및 3 nM 초과, 바람직하게는 6 nM 미만 및 4 nM 초과, 바람직하게는 5.5 nM 미만 및 4.5 nM 초과의 EC50으로 FLT3에 결합한다. FLT3에 대한 이중특이적 ABP의 결합의 EC50은 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 장치를 사용하는 유동 세포계측법에 의해 FLT3 양성 세포에 대한 이중특이적 ABP의 결합을 분석함으로써 결정된 바와 같고; 바람직하게는 FLt3 양성 세포는 B 세포 전구체 백혈병 세포, 바람직하게는 NALM-16 세포 (DSMZ에서 ACC 680 하에 기탁된 바와 같음)이고/거나; 바람직하게는 여기서 결합은 형광 표지된 이차 항체를 사용하여 검출되고/거나; 이중특이적 ABP는 유동 세포계측법 전에 약 30분 동안 FLT3 양성 세포와 함께 인큐베이션된다. 이 실시양태에서 본 발명은 표적 항원 결합 분자에 대한 특정의 바람직한 결합 친화성이 개선된 치료적 효과로 변역될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견된 항체에 관한 것이다. 이와 관련하여 실시예에 제시된 바와 같이, 특정 항체는 다른 항체와 비교하여 FLT3에 대한 더 낮은 친화성을 갖지만 세포독성 매개에 있어서 유의하게 개선된 효과를 갖는다. 일부 바람직한 측면 및 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 이러한 친화성 "창"에 속하는 항체가 바람직하다.

추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 이중특이적 ABP는 50 μM 미만, 보다 바람직하게는 of 20 μM 미만, 보다 바람직하게는 10 μM 미만, 보다 바람직하게는 5 μM 미만, 보다 바람직하게는 1 μM 미만의 kD로 FLT3에 결합하고/거나; 50 nM 초과, 보다 바람직하게는 100 nM 초과, 보다 바람직하게는 160 nM 초과, 보다 바람직하게는 200 nM 초과, 보다 바람직하게는 300 nM 초과의 kD로 FLT3에 결합한다. 가장 바람직하게는 본 발명의 이중특이적 ABP는 특정의 바람직한 범위, 예컨대 50 μM 미만 및 50 nM 초과, 보다 바람직하게는 20 μM 미만 및 100 nM 초과, 보다 바람직하게는 10 μM 미만 및 160 nM 초과, 보다 바람직하게는 5 μM 미만 및 200 nM 초과, 보다 바람직하게는 1 μM 미만 및 300 nM 초과의 kD로 FLT3에 결합하며; 여기서 kD는 예를 들어 실시예 섹션에 제공된 바와 같은 비아코어 친화성 검정에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같다.

또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이적 ABP는 200 nM 미만, 바람직하게는 90 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만, 보다 바람직하게는 20 nM 미만, 보다 바람직하게는 15 nM 미만의 EC50으로 CD3에 결합하고/거나, 1 nM 초과, 바람직하게는 2 nM 초과, 보다 바람직하게는 4.1 nM 초과, 보다 바람직하게는 6 nM 초과, 보다 바람직하게는 8 nM 초과의 EC50으로 CD3에 결합하고/거나; 일부 실시양태에서 CD3 결합에 대한 친화성의 특정 범위, 예컨대 200 nM 미만 및 1 nM 초과, 바람직하게는 200 nM 미만 및 2 nM 초과, 보다 바람직하게는 90 nM 미만 및 4.1 nM 초과, 보다 바람직하게는 20 nM 미만 및 6 nM 초과, 보다 바람직하게는 15 nM 미만 및 8 nM 초과의 EC50으로 CD3에 결합하는 ABP가 바람직하다. CD3에 대한 이중특이적 ABP의 결합의 EC50은 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 장치를 사용하는 유동 세포계측법에 의해 CD3 양성 세포에 대한 이중특이적 ABP의 결합을 분석함으로써 결정된 바와 같고; 바람직하게는 CD3 양성 세포는 T 세포 백혈병 세포, 바람직하게는 Jurkat 세포 (DSMZ에서 ACC 282 하에 기탁된 바와 같음)이고/거나; 바람직하게는 결합은 형광 표지된 이차 항체를 사용하여 검출되고/거나; 이중특이적 ABP는 유동 세포계측법 전에 약 30분 동안 CD3 양성 세포와 함께 인큐베이션된다.

대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 본 발명의 ABP는 인간 FLT3을 발현하는 암 세포, 예컨대 ALL 또는 AML 세포를 사멸시키거나 또는 그의 증식을 억제하는 이들의 능력을 특징으로 한다. 따라서, 비관련 대조군과 비교하여 시험관내 검정에서 급성 백혈병을 앓고 있는 환자의 백혈병 혈액 단핵 세포의 증식 및/또는 생존력을 50% 이하, 보다 바람직하게는 40% 이하, 보다 바람직하게는 30% 이하, 가장 바람직하게는 25% 이하로 억제하는 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 ABP가 본 발명의 맥락에서 바람직하다. 본 발명의 이러한 바람직한 이중특이적 ABP는 V3-V6, V3-V8, V3-V9, V4-V6, V4-V8, V4-V9, V5-V6, V5-V8, 및 V5-V9, 및 이들의 본원에 개시된 변이체에 예시된다.

또한, 본 발명의 일부 실시양태는 예를 들어 FLT3에 대한 본 발명의 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하기 위해 FLT3에 대한 결합에 대해 본 발명의 ABP와 경쟁하는 ABP에 관한 것이다. 경쟁적 억제를 결정하기 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 검정이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 또 다른 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 FLT3에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는지 여부를 결정하기 위해 교차-경쟁 검정이 사용될 수 있다. 이들은 유동 세포계측법 또는 고체상 결합 분석을 사용하는 세포-기반 방법을 포함한다. 고체상 또는 용액상에서 세포의 표면에서 발현되지 않는 FLT3 분자에 대해 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 능력을 평가하는 다른 검정이 또한 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 ABP는 2개의 쇄, 일부 실시양태에서 경쇄일 수 있는 더 짧은 쇄, 및 일부 실시양태에서 또한 중쇄로서 언급될 수 있는 주쇄를 가질 수 있다. ABP는 일반적으로 이들 2개의 쇄의 이량체이다.

본 발명의 ABP는 바람직하게는 이중특이적 ABP일 수 있다. 이중특이적 ABP는 (i) 선행 청구항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 가변 영역으로서, 인간 FLT3에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인을 포함하는 가변 영역 및 (ii) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 ABP의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. FLT3에 대한 결합 부위는 바람직하게는 본원에 기재된 본 발명의 FLT3-결합 항체의 결합 부위인 것으로 이해된다.

"이중특이적" 또는 "이중기능적" ABP는 2개의 상이한 에피토프/항원 결합 도메인 (또는 "부위")을 갖고 따라서 2개의 상이한 표적 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 ABP이다. 이들 2개의 에피토프는 동일한 항원의 에피토프, 또는 본 발명에서 바람직하게는 상이한 항원, 예컨대 상이한 항원 FLT3 및 CD3의 에피토프일 수 있다.

"이중특이적 ABP"는 중쇄 및 경쇄 또는 주쇄 및 더 짧은/더 작은 쇄의 제1 쌍에 의해 정의된 2개 이상의 결합 아암 중 하나와 하나의 항원 또는 에피토프에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 또는 주쇄 및 더 작은 쇄의 제2 쌍에 의해 정의된 제2 아암 상의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는 ABP일 수 있다. 이중특이적 ABP의 이러한 실시양태는 특이성 및 CDR 서열 둘 다에서 2개의 별개의 항원 결합 아암을 갖는다. 전형적으로, 이중특이적 ABP는 이것이 결합하는 각 항원에 대해 1가이며, 즉, 이는 각 항원 또는 에피토프에 오직 하나의 아암과 결합한다. 그러나, 이중특이적 항체는 또한 이량체화 또는 다량체화될 수 있으며, 이는 본 발명의 맥락에서 바람직하다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 이량체성 IgGsc 포맷으로, 항체는 각 항원에 대한 2개의 결합 부위를 가질 수 있다 (도 1). 이중특이적 항체는 제1 경쇄 가변 영역 및 제1 중쇄 가변 영역에 의해 정의된 제1 결합 영역, 및 제2 경쇄 가변 영역 및 제2 중쇄 가변 영역에 의해 정의된 제2 결합 영역을 가질 수 있는 하이브리드 ABP일 수 있다. 본 발명은 이들 결합 영역 중 하나가 중쇄/경쇄 쌍에 의해 정의될 수 있음을 고려한다. 본 발명의 맥락에서 이중특이적 ABP는 주쇄 및 더 작은 쇄의 가변 영역에 의해 정의된 제1 결합 부위, 및 ABP의 주쇄에 포함된 scFv 단편의 가변 영역에 의해 정의된 제2 상이한 결합 부위를 가질 수 있다.

이중특이적 ABP의 제조 방법, 예를 들어 2개의 상이한 모노클로날 항체의 화학적 접합 또는 예를 들어, 또한 2개의 항체 단편, 예를 들어, 2개의 Fab 단편의 화학적 접합은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 대안적으로, 이중특이적 ABP는 쿼드로마 기술, 즉, 모 항체를 생산하는 하이브리도마의 융합에 의해 제조된다. H 및 L 쇄의 무작위 분류 때문에, 10개의 상이한 항체 구조의 잠재적인 혼합물이 생성되며, 그 중 오직 하나만이 원하는 결합 특이성을 갖는다.

본 발명의 이중특이적 ABP는 각 표적에 대하여 모노클로날 항체 (mAb)로서 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서 항체는 키메라, 인간화 또는 완전 인간이다. 이중특이적 ABP는 예를 들어 이중특이적 탠덤 단일 쇄 Fv, 이중특이적 Fab2, 또는 이중특이적 디아바디일 수 있다.

본 발명의 ABP에 포함된 도메인에 기반하여, 본 발명의 이중특이적 ABP는 일반적으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 단일 쇄 Fv 단편을 포함할 수 있는 Fab 단편을 포함할 수 있다. 이러한 이중특이적 ABP는 "Fabsc"-ABP로 지칭되고, 국제 특허 출원 WO 2013/092001에 최초로 기재되었다. 보다 구체적으로, 본원에서 사용된 바와 같은 "Fabsc" 포맷 ABP는 전형적으로 Fab 단편을 갖는 본 발명의 이중특이적 ABP를 지칭하며, 이는 일반적으로 힌지 영역을 포함하며, 이는 CH2 도메인의 N-말단에 연결된 Fab 단편의 C-말단에 있으며, 그의 C-말단은 차례로 scFv 단편의 N-말단에 연결된다. 이러한 "Fabsc"는 CH3 도메인을 포함하지 않거나 또는 본질적으로 포함하지 않는다. 이 맥락에서, "포함하지 않는" 또는 "본질적으로 포함하지 않는"은 ABP가 전장 CH3 도메인을 포함하지 않음을 의미한다. 이는 바람직하게는 ABP가 CH3 도메인의 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하, 바람직하게는 3개 또는 심지어 더 적은 아미노산을 포함함을 의미한다. Fabsc 포맷 ABP에 대한 예시적인 예가 도 1A에 제시되어 있고, Fabsc 포맷 ABP에 대한 또 다른 예시적인 예가 도 12에 제시되어 있다. 예시적인 실시양태 (또한 이와 관련하여 도 1A 참조)에서, 본 발명의 Fabsc ABP는 카바트 넘버링 [EU-인덱스]에 따라 힌지 영역의 서열 위치 226의 시스테인 잔기 및/또는 힌지 도메인 중 하나의 서열 위치 229의 시스테인 잔기에 의해 형성된 디술피드 결합에 의해 이량체화하는 능력이 결여된 CH2 도메인을 포함할 수 있다. 그러므로, 이들 실시양태에서, 서열 위치 226 및/또는 서열 위치 229의 시스테인 잔기는 제거되거나 또는, 예를 들어, 세린 잔기에 의해 대체된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 "Fabsc" ABP는 또한 "Fc-감쇠된" CH2 도메인 (힌지 영역을 포함함)을 가질 수 있다. 이 "Fc-감쇠"는 Fc-수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 CH2 도메인에 있는 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 결실 및/또는 치환 (돌연변이)함으로써 달성된다. 예시적인 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합을 매개할 수 있고 결여되거나 또는 돌연변이된 힌지 영역 또는 CH2 도메인의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 서열 위치 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327 및 330 (EU-인덱스에 따른 서열 위치의 넘버링)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 예에서, 이러한 Fc-감쇠된 ABP는 아미노산 228의 결실, 아미노산 229의 결실, 아미노산 230의 결실, 아미노산 231의 결실, 아미노산 232의 결실, 아미노산 233의 결실, 치환 Glu233→Pro, 치환 Leu234→Val, 아미노산 234의 결실, 치환 Leu235→Ala, 아미노산 235의 결실, 아미노산 236의 결실, 아미노산 237의 결실, 아미노산 238의 결실, 치환 Asp265→Gly, 치환 Asn297→Gln, 치환 Ala327→Gln, 및 치환 Ala330→Ser으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 함유할 수 있다 (EU-인덱스에 따른 서열 위치의 넘버링, 이와 관련하여, 예를 들어, 또한 국제 특허 출원 WO 2013/092001의 도 1O 및 도 1P 참조). 예를 들어 종양 세포에 대해 T 세포를 활성화시키는 이중특이적 항체의 경우에, Fc-감쇠는 T 세포의 바람직하지 않은 오프-타겟 활성화를 초래할 수 있는 Fc-수용체 운반 세포에 대한 항체의 결합을 방지하는데 바람직할 수 있다.

간행물 [Coloma and Morrison (Nat Biotechnol 15:159-63, 1997)]에 따르면, 본 발명의 이중특이적 ABP는 또한 일반적으로 CH2 도메인의 C-말단에 배열된 CH3 도메인을 가질 수 있다. 이러한 분자는 또한 본원에서 "IgGsc" 포맷 ABP로 지칭되며, Fab 단편을 갖는 본 발명의 이중특이적 ABP를 의미하며, 이는 일반적으로 힌지 영역을 포함하며, 이는 전형적으로 CH2 도메인의 N-말단에 연결된 Fab 단편의 C-말단에 있으며, 그의 C-말단은 차례로 전형적으로 CH3 도메인의 N-말단에 연결되며, 그의 C-말단은 차례로 전형적으로 scFv 단편의 N-말단에 연결된다. IgGsc 포맷 ABP의 예시적인 예는 도 1에 제시되어 있다. 이러한 이중특이적 ABP 포맷이 본 발명의 맥락에서 바람직하다.

항체 포맷 Fabsc 및 IgGsc는 둘 다 N-말단 표적화 부분이 각각 "생리학적" Fab- 또는 Fab2 영역으로 이루어지며, 그에 의해 분자의 이 부분에서 단일 쇄 모이어티의 사용을 회피한다는 공통점을 갖는다. 이들 포맷이 표적 세포 제한된 T 세포 활성화에 사용되는 경우에, FcR 매개 활성화를 방지하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합의 감쇠가 사용될 수 있다 (원하거나 또는 필요한 경우). 이는 예를 들어 상기 및 또한 국제 특허 출원 WO 2013/092001 및 문헌 [Armour et al. Eur J Immunol 1999; 29:2613]에 기재된 바와 같이 분자의 CH2 도메인에 정의되고 널리 공지된 돌연변이의 도입에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 또한 본 발명의 IgGsc ABP는 Fc 수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 힌지 영역 또는 CH2 도메인의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결여되거나 또는 돌연변이된 CH2 도메인 (힌지 영역을 포함함)을 가질 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, CH2 및 힌지 영역의 이 잔기는 각각 서열 위치 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327 및 330 (EU-인덱스에 따른 서열 위치의 넘버링)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나, IgGsc 분자에 CH3 도메인의 존재로 인해, 2개의 개별 분자가 CH3 도메인을 통해 (자발적으로) 동종이량체화하여 4가 분자를 형성할 것이다 (이와 관련하여 다시 도 1B 참조). 그러므로, 힌지 영역의 서열 위치 226 및/또는 서열 위치 229의 시스테인 잔기를 결실 또는 돌연변이시킬 필요가 없다. 그러므로, 본 발명의 이러한 사량체성 IgGsc ABP는 카바트 넘버링 [EU-인덱스]에 따라 각 힌지 도메인 중 하나의 서열 위치 226 및/또는 서열 위치 229의 시스테인 잔기를 가질 수 있다.

FLT3 결합 및/또는 백혈병 암 세포에 대한 결합을 매개하는 CDR 영역 세트를 함유하는 이중특이적 ABP의 상기 개시내용에 따라, 본 발명의 ABP는 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포 상의 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부위를 포함할 수 있다. 면역 세포 상에 존재하는 이 수용체는 면역 세포를 활성화시키거나 또는 면역 세포의 면역 반응을 자극할 수 있는 수용체일 수 있다. 유발된 면역 반응은 바람직하게는 세포독성 면역 반응일 수 있다. 이러한 적합한 수용체는, 예를 들어, CD3, 항원 특이적 T 세포 수용체 (TCR), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1 BB, CD2, CD5, 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 및 CD95일 수 있다. 제2 결합 부위가 CD3, TCR 또는 CD16에 결합하는 ABP가 특히 바람직하다. 제2 결합 부위가 CD3에 특이적으로 결합하는 ABP가 가장 바람직하다. 하나의 바람직한 ABP는 항-CD3 항체 OKT3의 항원 결합 부위에 상응하는 제2 결합 부위를 포함한다. 항체 OKT3의 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인의 아미노산 서열은, 예를 들어, 또한 문헌 [Arakawa et al. J. Biochem. 120, 657-662 (1996)] 및 국제 특허 출원 WO 2015/158868 (WO 2015/158868의 서열 목록에서 서열식별번호: 17 및 18 참조)에 기재되어 있다. 또 다른 바람직한 ABP는 항-CD3 항체 UCHT1의 항원 결합 부위에 상응하는 제2 결합 부위를 포함한다. 인간화 UCHT1 항체의 VH 및 VL 서열은 국제 특허 출원 WO 2013/092001에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 CD3 결합 ABP의 다른 예는 인간 및 칼리트릭스 자쿠스(Callithrix jacchus), 사퀴누스 오이디푸스 또는 사이미리 시우레우스(Saimiri sciureus) CD3ε 쇄의 에피토프에 결합할 수 있는 유럽 특허 2 155 783 B1 또는 유럽 특허 EP 2 155 788 B1에 기재된 ABP를 포함한다.

따라서, 본 발명의 이중특이적 ABP는 본원에 기재된 바와 같은 Fab 단편 및 scFv 단편을 포함하는 이중특이적 ABP, 예컨대 IgGsc-분자일 수 있다. 이 분자에서 제1 결합 부위는 FLT3에 결합할 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 Fab (또는 IgGsc 포맷의 맥락에서 2가 FLT3 F(ab)2) 단편에 포함될 수 있고, 제2 결합 부위 (면역 수용체에 결합할 수 있음)는 scFv 단편, 예컨대 CD3에 특이적으로 결합하는 scFv에 포함될 수 있다. 대안적으로, FLT3에 결합하는 제1 결합 부위는 단일 쇄 Fv 단편에 포함되고, 제2 결합 부위 (CD3에 결합할 수 있음)는 Fab 단편에 포함된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 ABP는 그 자체로 결합, 예컨대 CD3에 대한 결합 시 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 활성화시키지 않는다. 대신에, 결합 부위 둘 다, 예를 들어 FLT3-특이적 결합 부위 및 CD3 특이적 결합 부위가 T 세포 상의 수용체 및 표적 암 세포 상의 FLT3에 결합된 경우에만, 전자는 활성화 수용체를 교차-연결하여, 이펙터 세포를 촉발시켜 특이적 표적 세포를 사멸시킬 수 있다. 본 발명의 이중특이적 ABP의 존재 및 부재 하에 림프구에 의한 표적 세포 -사멸 능력을 평가하기 위한 표준 기능적 검정은 ABP가 결합하는 수용체를 활성화시키는 ABP의 능력을 평가 및/또는 스크리닝하도록 설정될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서 이중특이적 ABP는 제2 항원 결합 도메인으로서 scFv 및 항-CD3 항체, 예컨대 UCHT1 또는 그의 변이체를 포함하며, 이는 예를 들어 서열식별번호: 14, 및 25 내지 27에 본 출원에 개시되어 있다.

이 맥락에서 ABP가 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다는 것이 본 발명의 범주 내에 포함됨을 주목한다. 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 용어 "돌연변이된", "돌연변이체" 및 "돌연변이"는 "자연" 또는 "모" (참조가 제공되는 경우) 발생 핵산 또는 폴리펩티드, 즉 야생형을 정의하기 위해 취해질 수 있는 참조 서열과 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 교환, 결실 또는 삽입을 지칭한다. 예를 들어, 모 4G8 분자의 광범위한 돌연변이 변경에 의해 수득되고 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 ABP의 가변 도메인이 모 서열로서 취해질 수 있다.

이와 관련하여 용어 "위치"는 본 발명에 따라 사용될 때 본원에 도시된 아미노산 서열 내의 아미노산의 위치를 의미하는 것으로 이해된다. 이 위치는 유사 천연 서열, 예를 들어 자연 발생 IgG 도메인 또는 쇄의 서열에 비해 표시될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "상응하는"은 또한 위치가 반드시 선행 뉴클레오티드/아미노산의 수에 의해 결정되는 것은 아니거나 뿐만 아니라 결정되지 않는 것도 포함한다. 그러므로, 치환될 수 있는 본 발명에 따른 주어진 아미노산의 위치는 항체 쇄의 다른 곳에서 아미노산의 결실 또는 첨가로 인해 변할 수 있다.

그러므로, 본 발명에 따른 "상응하는 위치" 하에서 아미노산은 표시된 수가 상이할 수 있지만 여전히 유사한 인접 아미노산을 가질 수 있음을 이해해야 한다. 교환, 결실 또는 첨가될 수 있는 상기 아미노산은 또한 용어 "상응하는 위치"에 포괄된다. 주어진 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기가 자연 발생 이뮤노글로불린 도메인 또는 쇄의 아미노산 서열 내의 특정 위치에 상응하는지 여부를 결정하기 위해, 통상의 기술자는 수동으로 또는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 BLAST2.0 (이는 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool)을 의미함) 또는 ClustalW 또는 서열 정렬을 생성하는데 적합한 임의의 다른 적합한 프로그램을 사용함으로써 관련 기술분야에 널리 공지된 수단 및 방법 (예를 들어, 정렬)을 사용할 수 있다.

일부 실시양태에서 치환 (또는 대체)은 보존적 치환이다. 보존적 치환은 일반적으로 돌연변이될 아미노산에 따라 나열된 하기 치환이며, 각각은 보존적이라고 할 수 있는 하나 이상의 대체(들)가 뒤따른다: Ala → Gly, Ser, Val; Arg → Lys; Asn → Gln, His; Asp → Glu; Cys → Ser; Gln → Asn; Glu → Asp; Gly → Ala; His → Arg, Asn, Gln; Ile → Leu, Val; Leu → Ile, Val; Lys → Arg, Gln, Glu; Met → Leu, Tyr, Ile; Phe → Met, Leu, Tyr; Ser → Thr; Thr → Ser; Trp → Tyr; Tyr → Trp, Phe; Val → Ile, Leu. 다른 치환이 또한 허용되며, 경험적으로 또는 다른 공지된 보존적 또는 비-보존적 치환에 따라 결정될 수 있다. 추가 배향으로, 하기 8개의 그룹은 각각 전형적으로 서로에 대한 보존적 치환을 정의하는데 사용될 수 있는 아미노산을 함유한다:

- 알라닌 (Ala), 글리신 (Gly);

- 아스파르트산 (Asp), 글루탐산 (Glu);

- 아스파라긴 (Asn), 글루타민 (Gln);

- 아르기닌 (Arg), 리신 (Lys);

- 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 발린 (Val);

- 페닐알라닌 (Phe), 티로신 (Tyr), 트립토판 (Trp);

- 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr); 및

- 시스테인 (Cys), 메티오닌 (Met)

이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하는 경우에, 하기와 같은 보다 실질적인 변화, 또는 아미노산 클래스와 관련하여 하기 추가로 기재된 바와 같은 변화가 도입될 수 있고, 원하는 특징에 대해 산물이 스크리닝될 수 있다. 이러한 보다 실질적인 변화의 예는 다음과 같다: Ala → Leu, Ile; Arg → Gln; Asn → Asp, Lys, Arg, His; Asp → Asn; Cys → Ala; Gln → Glu; Glu → Gln; His → Lys; Ile → Met, Ala, Phe; Leu → Ala, Met, 노르류신; Lys → Asn; Met → Phe; Phe → Val, Ile, Ala; Trp → Phe; Tyr → Thr, Ser; Val → Met, Phe, Ala.

일부 실시양태에서 본 발명에 따른 ABP는 시스테인 잔기를 통한 이량체화를 방지하거나 또는 Fc-기능을 조정하기 위해 돌연변이된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다 (상기 참조). 이들 실시양태 중 일부에서 Fc 수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 CH2 도메인 및/또는 힌지 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)가 돌연변이된다. 존재하는 경우에, Fc 수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 보체-매개 세포독성 (CDC)을 활성화시킬 수 있는 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 실시양태에서 일반적으로 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG에서 상응하는 자연 발생 도메인의 서열과 서열을 비교할 때 Fc 수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 각 아미노산 잔기는 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 일부 실시양태에서 Fc 수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 이러한 아미노산 잔기는 일반적으로 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG에서 상응하는 자연 발생 도메인의 서열에 비해 결실된다.

일부 실시양태에서 하나 이상의 돌연변이된, 예를 들어 치환된 또는 결실된 아미노산 잔기는 위치 226, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327 및 330 중 하나에 위치된 아미노산이다. 다시, 사용된 아미노산의 넘버링은 카바트 넘버링 [EU-인덱스]에 따른 서열 위치에 상응한다. 아미노산의 상응하는 결실은 예를 들어 아미노산 228, 일반적으로 IgG 내의 프롤린의 결실, 아미노산 229, 일반적으로 IgG 내의 시스테인의 결실, 아미노산 230, 일반적으로 IgG 내의 프롤린의 결실, 아미노산 231, 일반적으로 IgG 내의 알라닌의 결실, 아미노산 232, 일반적으로 IgG 내의 프롤린의 결실, 아미노산 233, 일반적으로 IgG 내의 글루탐산의 결실, 아미노산 234, 일반적으로 IgG 내의 류신의 결실, 아미노산 235, 일반적으로 IgG 내의 류신의 결실, 아미노산 236, 일반적으로 IgG 내의 글리신의 결실, 아미노산 237, 일반적으로 IgG 내의 글리신의 결실, 아미노산 238, 일반적으로 IgG 내의 프롤린의 결실 및 아미노산 265, 일반적으로 IgG 내의 아스파르트산의 결실일 수 있다. 아미노산의 상응하는 치환은 예를 들어 아미노산 226, 일반적으로 IgG 내의 시스테인의 치환, 아미노산 228, 일반적으로 IgG 내의 프롤린의 치환, 아미노산 229, 일반적으로 IgG 내의 시스테인의 치환, 아미노산 230, 일반적으로 IgG 내의 프롤린의 치환, 아미노산 231, 일반적으로 IgG 내의 알라닌의 치환, 아미노산 232, 일반적으로 IgG 내의 프롤린의 치환, 아미노산 233, 일반적으로 IgG 내의 글루탐산의 치환, 아미노산 234, 일반적으로 IgG 내의 류신의 치환, 아미노산 235, 일반적으로 IgG 내의 류신의 치환, 아미노산 265, 일반적으로 IgG 내의 아스파르트산의 치환, 아미노산 297, 일반적으로 IgG 내의 아스파라긴의 치환, 아미노산 327, 일반적으로 IgG 내의 알라닌, 및 아미노산 330, 일반적으로 IgG 내의 알라닌의 치환일 수 있다. 각 치환은 치환 Cys226→Ser, 치환 Cys229→Ser, 치환 Glu233→Pro, 치환 Leu234→Val, 치환 Leu235→Ala, 치환 Asp265→Gly, 치환 Asn297→Gln, 치환 Ala327→Gln, 치환 Ala327→Gly, 및 치환 Ala330→Ser 중 하나일 수 있다. 상기로부터 취해질 수 있는 바와 같이, 일부 실시양태에서 힌지 영역 내의 위치 226 및 229의 시스테인 잔기 중 1개 또는 2개는 또 다른 아미노산, 예를 들어 세린 잔기로 치환된다. 그에 의해, 또 다른 주쇄와의 디술피드 결합의 형성이 방지될 수 있다. 추가로 및 또한 하기 설명된 바와 같이, Fc-수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 CH2 도메인 내의 선택된 아미노산 잔기의 결실 및/또는 치환 (돌연변이)은 본 발명의 ABP가 항체-의존적 세포-매개 세포독성 및 보체의 고정의 면에서 더 적은 활성을 갖거나 또는 활성을 갖지 않게 할 수 있다.

항체의 또 다른 유형의 아미노산 변이체는 ABP의 원래 글리코실화 패턴 (있는 경우)을 변경한다. 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결실, 및/또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 의미한다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 의미한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 그러므로, 폴리펩티드 내의 이들 트리펩티드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 또한 사용될 수 있다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가는 상기 기재된 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 원래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 이에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

본 발명의 맥락에서, 일부 실시양태에서 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 나타내는 본 발명의 ABP의 주쇄의 부분은 Fc 수용체에 대한 결합과 관련하여 전형적으로 불활성이거나, 또는 적어도 본질적으로 낮은 영향을 미친다. 상기한 바와 같이, 이는 Fc-수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 CH2 도메인 내의 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나의 결실 및/또는 치환 (돌연변이)에 의해 달성된다. 이러한 분자는 또한 본원에서 "Fc-감쇠된" ABP 또는 "Fcko" ABP로 지칭된다. Fc 단편의 일부, 즉 CH2 도메인, 및 존재하는 경우에, CH3 도메인을 나타내기 위해 취해질 수 있는 본 발명에 따른 항체 쇄의 부분은 그러므로, 예를 들어, 특정한 생물학적 기능, 예컨대 이펙터 기능을 제공하지 않는 "스캐폴드"를 정의할 수 있다. 그러나, 본 발명에서, 이 스캐폴드는 공지된 ABP와 비교하여 본 발명의 ABP의 정제, 생산 효율 및/또는 안정성의 면에서 상당한 이점을 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

일부 실시양태에서 주어진 Fc 수용체에 대한 이 Fc-상응 부분의 인식 및 그에 따른 결합은 자연 발생 이뮤노글로불린의 Fc 영역보다 약 2배, 약 5배, 약 8배, 약 10배, 약 12배, 약 15배, 약 20배 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서 이 Fc-상응 부분은 Fc 수용체에 대한 결합의 그의 능력이 전혀 없다. 해리 상수를 결정하는 것을 포함하여 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 표준 기술, 예컨대 표면 플라스몬 공명을 사용하여, 예를 들어 비아코어™ 측정을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 생체분자 결합을 측정하는 임의의 다른 방법이 마찬가지로 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 분광, 광화학, 광도 또는 방사선 수단에 의존할 수 있다. 해당 검출 방법에 대한 예는 각각 형광 상관관계 분광법, 광화학 가교 및 광활성 또는 방사성 표지의 사용이다. 이들 방법 중 일부는 추가 분리 기술, 예컨대 전기영동 또는 HPLC를 포함할 수 있다.

필요한 경우에, 상기 설명된 바와 같이 아미노산 잔기의 치환 또는 결실이 이 효과를 위해 수행될 수 있다. 적합한 돌연변이는 예를 들어 문헌 [Armour et al. (Eur. J. Immunol. [1999] 29, 2613-2624)]으로부터 취해질 수 있다. 항체 쇄의 서열에 대한 돌연변이를 위한 추가 적합한 위치는 FcγRIII 및 인간 IgG1 Fc 단편 사이의 복합체에 공개된 결정 구조 데이터로부터 취해질 수 있다 (Sondermann et al., Nature [2000] 406, 267-273). "Fc 감쇠"의 수준 또는 결합 친화성의 손실을 평가하기 위해 상기 기재된 바와 같은 결합 친화성을 측정하는 것 외에도, Fc-수용체에 대한 결합을 매개하는 능력 (그의 결여)을 기능적으로 평가하는 것도 가능하다. 하나의 표적으로서 CD3에 결합하는 ABP의 경우에, 예를 들어 세포에 대한 이러한 CD3 결합 ABP의 유사분열촉진성을 통해 결합을 평가할 수 있다. 유사분열촉진성은 보조 세포, 예컨대 단핵구 상의 Fc-수용체에 대한 CD3 항체의 결합에 의해 매개된다. CD3에 대한 하나의 결합 부위를 갖는 본 발명의 ABP는 어떠한 유사분열촉진 효과도 나타내지 않는 반면, 기능적 Fc 부분을 갖는 모 모노클로날 항-CD3 항체는 T 세포에서 강한 유사분열을 유도하는 경우에, 유사분열의 결여로 인해, 본 발명의 ABP는 Fc 결합에 대한 능력이 결여되므로 "Fc 녹아웃" 분자로서 간주될 수 있음이 분명하다. 항-CD3 매개 유사분열촉진성을 평가하는 방법의 예시적인 예는 문헌 [Davis, Vida & Lipsky (J.Immunol (1986) 137, 3758)] 및 [Ceuppens, JL, & van Vaeck, F, (문헌 [J.Immunol. (1987) 139, 4067] 또는 [Cell. Immunol. (1989) 118, 136] 참조)]에 기재되어 있다. 항체의 유사분열촉진성을 평가하기 위한 검정의 추가 예시적인 적합한 예는 문헌 [Rosenthal-Allieri et al. (Rosenthal-Allieri MA, Ticcioni M, Deckert M, Breittmeyer JP, Rochet N, Rouleaux M, and Senik A, Bernerd A, Cell Immunol. 1995 163(1):88-95)] 및 [Grosse-Hovest et al. (Grosse-Hovest L, Hartlapp I, Marwan W, Brem G, Rammensee H-G, and Jung G, Eur J Immunol. [2003] May;33(5):1334-1340)]에 기재되어 있다. 또한, Fc 결합의 결여는 Fc 부분의 널리 공지된 이펙터 기능 중 하나 이상을 매개하는 본 발명의 ABP의 능력에 의해 평가될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 잠재적인 또는 이전에 존재하는 디술피드 결합을 도입 또는 제거하는 것을 포함하여 하나 이상의 디술피드 결합을 도입 또는 제거하기 위해 시스테인 잔기의 치환 또는 결실이 수행될 수 있다. 그에 의해, 본 발명에 따른 ABP의 주쇄 및 더 낮은 중량/더 짧은 길이의 쇄 사이의 연결은 확립, 강화 또는 폐지를 포함하여 제어될 수 있다. 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입 또는 제거함으로써 디술피드 브릿지를 도입 또는 제거할 수 있다. 예시적인 예로서, 본 발명에 따른 사량체성 ABP는 일반적으로 2개의 이량체성 ABP를 연결하는 하나 이상의 디술피드 결합을 갖는다. 하나의 이러한 디술피드 결합은 전형적으로 제1 이량체성 ABP의 주쇄 내의 시스테인 및 제2 이량체성 ABP의 힌지 영역 내의 시스테인에 의해 정의된다. 이와 관련하여, 일부 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 카바트 넘버링 [EU-인덱스]에 따른 인간 IgG 이뮤노글로불린의 서열에 비해 위치 226 및/또는 229의 천연 시스테인 잔기의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

아미노산 잔기, 예컨대 아르기닌, 아스파라긴, 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기의 치환 또는 결실은 또한 항체의 글리코실화 패턴을 변형시키기 위해 수행될 수 있다. 예시적인 예로서, IgG 분자는 CH2 도메인의 Asn297에 단일 N-연결된 비안테나리 탄수화물을 갖는다. 혈청으로부터의 IgG 또는 하이브리도마 또는 조작된 세포에서 생체외 생성된 IgG의 경우에, IgG는 Asn297 연결된 탄수화물에 대하여 이질적이다. 인간 IgG의 경우에, 코어 올리고당은 전형적으로 외부 잔기의 수가 상이한 GlcNAc2Man3GlcNAc로 이루어진다.

명시된 바와 같이, 항원/에피토프의 결합 외에도 이뮤노글로불린은 이뮤노글로불린의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성인 "이펙터 기능"을 추가로 갖는 것으로 공지되어 있으며, 이뮤노글로불린 이소타입에 따라 다르다. 항체 이펙터 기능의 예는 하기를 포함한다: Clq 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화. 항체의 이펙터 기능을 발휘하는 것은 일반적으로 이펙터 세포를 동원하는 것을 포함한다. 여러 이뮤노글로불린 이펙터 기능은 항체의 Fc 영역에 결합하는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 매개된다. FcR은 이뮤노글로불린 이소타입에 대한 이들의 특이성에 의해 정의되며; IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR, IgE의 경우에 FcεR, IgA의 경우에 FcαR 등으로 지칭된다. CDC 또는 ADCC와 같은 임의의 이들 이펙터 기능 (또는 이러한 이펙터 기능의 상실)은 본 발명의 ABP가 Fc 결합의 능력을 결여하는지 여부를 평가하기 위해 사용될 수 있다.

이 맥락에서, 용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 수용체, 일반적으로 항체의 Fc 영역에 결합할 수 있는 단백질을 정의한다는 점에 주목한다. Fc 수용체는 유기체의 면역계의 특정 세포, 예를 들어 자연 살해 세포, 대식세포, 호중구 및 비만 세포의 표면 상에서 발견된다. 생체내 Fc 수용체는 감염된 세포에 고정되거나 또는 침입하는 병원체 상에 존재하는 이뮤노글로불린에 결합한다. 이들의 활성은 식세포적 또는 세포독성 세포를 자극하여, 항체-매개 식세포작용 또는 항체-의존적 세포-매개 세포독성에 의해 미생물 또는 감염된 세포를 파괴한다. 일부 바이러스, 예컨대 플라비바이러스는 Fc 수용체를 사용하여, 감염의 항체-의존적 증진으로 공지된 메카니즘에 의해 세포를 감염시키는 것을 돕는다. FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에서 검토되었다.

"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 이들의 동족 항원에 결합된 (적절한 서브클래스의) 항체에 대한 보체 시스템 (Clq)의 제1 구성성분의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1997)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다.

용어 "보체 시스템"은 일반적으로 불활성 전구체 (프로-단백질)로서 순환하는 혈액에서 발견되는 수많은 작은 단백질 (보체 인자라고 함)을 지칭하기 위해 관련 기술분야에서 사용된다. 상기 용어는 병원체, 예컨대 박테리아, 뿐만 아니라 항원-항체 복합체를 유기체로부터 제거하는 항체 및 식세포적 세포의 능력을 "보완"하는 이러한 변경불가능하고 적응가능하지 않은 시스템의 능력을 지칭한다. 보체 인자의 예는 C1q 및 2개의 세린 프로테아제, C1r 및 C1s를 포함하는 복합체 C1이다. 복합체 C1은 CDC 경로의 구성성분이다. C1q는 대략 460,000의 분자량을 갖는 6가 분자이며, 6개의 콜라겐성 "줄기"가 6개의 구형 헤드 영역에 연결된 튤립 꽃다발과 유사한 구조이다. 보체 캐스케이드를 활성화시키기 위해, C1q는 IgG1, IgG2 또는 IgG3의 적어도 2개의 분자에 결합해야 한다.

"항체-의존적 세포성 세포독성" 또는 ADCC는 특정 세포독성 세포 (예컨대, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 이뮤노글로불린 분자가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 후속적으로 세포독소로 표적 세포를 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장"하고, 이 메카니즘에 의해 표적 세포의 사멸에 필요하다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRlI 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)]의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 것이 수행될 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS USA 95: 652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.

본 발명의 ABP는 임의의 공지되고 잘 확립된 발현 시스템 및 재조합 세포 배양 기술을 사용하여, 예를 들어, 박테리아 숙주 (원핵생물 시스템) 또는 진핵생물 시스템, 예컨대 효모, 진균, 곤충 세포 또는 포유류 세포에서의 발현에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ABP는 "IgGsc" 포맷으로 사용될 때, ABP는 (물론) 문헌 [Coloma and Morrison (Nat Biotechnol 15:159-63, 1997)]에 기재된 바와 같이 또는 본 출원의 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 생산될 수 있다. 마찬가지로, "Fabsc" 포맷으로 사용되는 본 발명의 ABP는 국제 특허 출원 WO 2013/092001에 기재된 바와 같이 또는 본원의 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 생산될 수 있다. 본 발명의 ABP는 또한 트랜스제닉 유기체, 예컨대 염소, 식물 또는 제노마우스 트랜스제닉 마우스, 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 큰 단편을 갖고 마우스 항체 생산이 결핍된 조작된 마우스 균주에서 생산될 수 있다. 항체는 또한 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.

본 발명의 재조합 ABP의 생산을 위해, 전형적으로 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단리되고, 추가 클로닝 (증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터, 예컨대 플라스미드에 삽입된다. 적합한 발현 시스템의 예시적인 예는 글루타메이트 신세타제 시스템 (예컨대 론자 바이올로직스(Lonza Biologics)에 의해 판매됨)이며, 숙주 세포는 예를 들어 CHO 또는 NS0이다. 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석된다. 사용될 수 있는 벡터는 플라스미드, 바이러스, 파지, 트랜스포손, 미니염색체를 포함하며, 그 중 플라스미드가 전형적인 실시양태이다. 일반적으로 이러한 벡터는 발현을 용이하게 하기 위해 경쇄 및/또는 중쇄 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 추가로 포함한다. 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 별도의 벡터에 삽입되고 동일한 숙주 세포로 형질감염될 수 있거나, 또는 원하는 경우에 중쇄 및 경쇄 둘 다가 숙주 세포로의 형질감염을 위해 동일한 벡터에 삽입될 수 있다. 쇄 둘 다는, 예를 들어, 문헌 [Skerra, A. (1994) Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli, Gene 151, 131-135] 또는 [Skerra, A. (1994) A general vector, pASK84, for cloning, bacterial production, and single-step purification of antibody Fab fragments, Gene 141, 79-8]에 기재된 바와 같이 디시스트론성 오페론의 제어 하에 배열되고, 기능적이고 올바르게 폴딩된 ABP를 생성하도록 발현될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 한 측면에 따라, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 벡터를 구축하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 벡터에 본 발명의 ABP의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것을 포함한다.

재조합 기술을 사용할 때, ABP는 세포내에서, 원형질막주위 공간에서 생산되거나, 또는 직접 배지로 분비될 수 있다 (또한 상기 문헌 [Skerra 1994] 참조). 항체가 세포내에서 생산되는 경우에, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 파편은, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]은 이. 콜라이(E. coli)의 원형질막주위 공간으로 분비되는 항체를 단리하는 절차를 기술한다. 항체는 또한 임의의 산화 환경에서 생산될 수 있다. 이러한 산화 환경은 그람-음성 박테리아, 예컨대 이. 콜라이의 원형질막공간에 의해, 그람-양성 박테리아의 세포외 환경에서 또는 진핵생물 세포 (동물 세포, 예컨대 곤충 또는 포유류 세포 포함)의 소포체의 내강에서 제공될 수 있고, 일반적으로 구조적 디술피드 결합의 형성을 선호한다. 그러나, 또한 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이의 시토졸에서 본 발명의 ABP를 생산하는 것이 가능하다. 이 경우에, 폴리펩티드는 가용성 및 폴딩된 상태에서 직접 수득되거나 또는 봉입체 형태로 회수된 후, 시험관내에서 복원될 수 있다. 추가 옵션은 산화성 세포내 환경을 갖는 특정 숙주 균주를 사용하는 것이며, 이는 그러므로 시토졸에서 디술피드 결합의 형성을 허용할 수 있다 (Venturi M, Seifert C, Hunte C. (2002) "High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm." J. Mol. Biol. 315, 1-8).

세포에 의해 생성된 ABP는 임의의 통상적인 정제 기술, 예를 들어, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 하나의 바람직한 정제 기술이다. ABP는 불변 도메인, 예컨대 CH1 또는 CL 도메인에 특이적으로 및 가역적으로 결합하는 단백질/리간드를 사용한 친화성 정제를 통해 정제될 수 있다. 이러한 단백질의 예는 이뮤노글로불린-결합 박테리아 단백질, 예컨대 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 또는 단백질 L이며, 여기서 단백질 L 결합은 카파 경쇄를 함유하는 ABP로 제한된다. κ-경쇄를 사용한 항체의 정제를 위한 대안적인 방법은 비드 커플링된 항 카파 항체 (카파셀렉트(KappaSelect))의 사용이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 의존한다. 단백질 A는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 감마3에 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 본 발명의 특정한 ABP에 사용되는 정제 방법의 선택은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 지식 범위 내에 있다.

본 발명의 ABP의 쇄 중 하나에 하나 이상의 친화성 태그를 장착하는 것도 가능하다. 친화성 태그, 예컨대 스트렙-태그(Strep-tag)® 또는 스트렙-태그® II (Schmidt, T.G.M. et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766), myc-태그, FLAGTM-태그, His6-태그 또는 HA-태그는 재조합 ABP의 쉬운 검출 및 또한 간단한 정제를 허용한다.

이제 본 발명의 핵산으로 돌아가면, 본 발명에 따른 항체의 하나 이상의 쇄를 코딩하는 핵산 분자는 임의의 가능한 구성의 임의의 핵산, 예컨대 단일 가닥, 이중 가닥 또는 이들의 조합일 수 있다. 핵산은 예를 들어 DNA 분자, RNA 분자, 뉴클레오티드 유사체를 사용하거나 또는 핵산 화학을 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체, 잠금 핵산 분자 (LNA), 및 단백질 핵산 분자 (PNA)를 포함한다. DNA 또는 RNA는 게놈 또는 합성 기원일 수 있고, 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 이러한 핵산은 예를 들어 mRNA, cRNA, 합성 RNA, 게놈 DNA, cDNA 합성 DNA, DNA 및 RNA의 공중합체, 올리고뉴클레오티드 등일 수 있다. 더욱이 각 핵산은 비-천연 뉴클레오티드 유사체를 함유할 수 있고/거나 친화성 태그 또는 표지에 연결될 수 있다.

일부 실시양태에서 본 발명에 따른 항체의 쇄, 예컨대 주쇄 및/또는 더 작은 쇄를 코딩하는 핵산 서열은 벡터, 예컨대 플라스미드에 포함된다. 치환 또는 결실이 항체 쇄에 포함되는 경우에, 항체의 자연 발생 도메인 또는 영역과 비교할 때, 예를 들어 이뮤노글로불린의 서열에 포함된 각 천연 도메인/영역의 코딩 서열은 돌연변이유발에 대한 시작점으로 사용될 수 있다. 선택된 아미노산 위치의 돌연변이유발을 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 부위-지정 돌연변이유발을 위한 다양한 확립된 표준 방법을 원하는 대로 사용한다. 일반적으로 사용되는 기술은 원하는 서열 위치에서 축중성 염기 조성을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 사용하는 PCR (중합효소 연쇄 반응)에 의한 돌연변이의 도입이다. 예를 들어, 코돈 NNK 또는 NNS (여기서 N = 아데닌, 구아닌 또는 시토신 또는 티민; K = 구아닌 또는 티민; S = 아데닌 또는 시토신)의 사용은 돌연변이유발 동안 모든 20개 아미노산 플러스 앰버 정지 코돈의 혼입을 허용하는 반면, 코돈 VVS는 가능한 혼입된 아미노산의 수를 12로 제한하며, 이는 아미노산 Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val이 폴리펩티드 서열의 선택된 위치에 혼입되는 것을 배제하기 때문이고; 예를 들어, 코돈 NMS (여기서 M = 아데닌 또는 시토신)의 사용은 선택된 서열 위치에서 가능한 아미노산의 수를 11로 제한하며, 이는 아미노산 Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val이 선택된 서열 위치에 혼입되는 것을 배제하기 때문이다. 이와 관련하여, 다른 아미노산 (일반적인 20개의 자연 발생 아미노산이 아닌), 예컨대 셀레노시스테인 또는 피로리신에 대한 코돈이 또한 ABP의 핵산에 혼입될 수 있다는 점에 주목한다. 문헌 [Wang, L., et al. (2001) Science 292, 498-500] 또는 [Wang, L., and Schultz, P.G. (2002) Chem. Comm. 1, 1-11]에 기재된 바와 같이, 다른 독특한 아미노산, 예를 들어 o-메틸-L-티로신 또는 p-아미노페닐알라닌을 삽입하기 위해 일반적으로 정지 코돈으로 인식되는 "인공" 코돈, 예컨대 UAG를 사용하는 것이 또한 가능하다.

예를 들어 이노신, 8-옥소-2'데옥시구아노신 또는 6(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3,4-디히드로-8H-피리미도-1,2-옥사진-7-온 (Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603)으로서 감소된 염기 쌍 특이성을 갖는 뉴클레오티드 빌딩 블록의 사용은 선택된 서열 세그먼트에 돌연변이를 도입하기 위한 또 다른 옵션이다. 추가 가능성은 소위 트리플렛-돌연변이유발이다. 이 방법은 각각 코딩 서열로의 혼입을 위해 1개의 아미노산을 코딩하는 상이한 뉴클레오티드 트리플렛의 혼합물을 사용한다 (Virnekas B, et al., 1994 Nucleic Acids Res 22, 5600-5607).

본 발명에 따른 항체의 쇄, 예컨대 주쇄 및/또는 더 작은 쇄를 코딩하는 핵산 분자는 임의의 적합한 발현 시스템을 사용하여, 예를 들어 적합한 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 발현될 수 있다. 수득된 ABP는 선택 및/또는 단리에 의해 풍부하게 될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 핵산은 유전적 구축물, 예컨대 벡터/플라스미드의 맥락에서 제공된다.

핵산의 시스템, 또는 이러한 본 발명의 핵산을 포함하는 구축물이 추가로 제공되며, 여기서 본 발명의 시스템은 본 발명의 ABP의 하나의 단량체를 각각 코딩하는 본 발명의 적어도 2개의 핵산, 예를 들어 중쇄 서열을 코딩하는 하나의 핵산 및 경쇄 서열을 코딩하는 제2 핵산을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 ABP의 폴리펩티드는 생체내 또는 시험관내 발현을 위해 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 본 발명의 ABP를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본 발명의 ABP의 하나의 부분 또는 단량체 (예를 들어 항체의 2개 (중쇄 및 경쇄)의 쇄 중 하나)를 코딩하고/거나, 또 다른 핵산은 본 발명의 ABP의 또 다른 부분 또는 단량체 (예를 들어 항체의 2개의 쇄 중 다른 하나)를 코딩한다. 이러한 핵산은 조합으로 또는 함께 시스템으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개 이상의 ABP 폴리펩티드 쇄, 예를 들어, 적어도 2개의 항체 쇄를 코딩한다. 다중 ABP 쇄를 코딩하는 핵산은 적어도 2개의 쇄 서열 사이의 핵산 절단 부위를 포함할 수 있고/거나, 2개 이상의 쇄 서열 사이의 전사 또는 번역 시작 부위를 코딩할 수 있고/거나, 2개 이상의 ABP 쇄 사이의 단백질분해 표적 부위를 코딩할 수 있다.

그러나, 본 발명의 한 추가 측면은 본원에 개시된 바와 같은 ABP, 또는 ABP의 부분 또는 단량체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대 발현 벡터)를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, ABP가 다량체성 단백질인 경우에, 핵산은 항원 구축물의 단일 폴리펩티드 쇄만을 코딩한다. 따라서, 이러한 항원 결합 구축물을 발현하기 위해, 본 발명의 발현 벡터는 각각이 ABP의 별도의 부분 또는 단량체를 코딩하는 2개 이상의 핵산을 함유할 수 있으며, 이는 조합으로 전체 ABP를 발현할 것이다. 유사하게, 항원 결합 구축물의 부분 또는 단량체만을 코딩하는 핵산을 포함하는 본 발명의 발현 벡터는 각각 ABP의 별도의 부분 또는 단량체를 코딩하는 본 발명의 다른 별도의 발현 벡터와 조합하여 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서 핵산은 본 발명의 ABP의 다중 폴리펩티드 쇄를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 포유류 발현을 위한 pcDNA3.1™/myc-His (-) 버전 A 벡터 (인비트로젠, 인크.(Invitrogen, Inc.)) 또는 그의 변이체를 포함한다. pcDNA3.1 발현 벡터는 포유류 발현을 위한 CMV 프로모터 및 포유류 (네오마이신) 및 박테리아 (암피실린) 선택 마커 둘 다를 특색으로 한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 플라스미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 실시양태에서, 벡터는 코스미드, YAC 또는 BAC를 포함한다.

또 다른 관련 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포 (예컨대 숙주 세포 및/또는 재조합 숙주 세포)에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 상기 핵산에 의해 코딩되는 ABP (또는 그의 구성성분)를 발현할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ABP가 2개의 별도의 폴리펩티드 쇄 (예를 들어 IgG의 중쇄 및 경쇄)를 포함하는 경우에, 본 발명의 세포는 이러한 ABP의 중쇄를 코딩하는 (그리고 발현할 수 있는) 제1 핵산 뿐만 아니라 이러한 ABP의 경쇄를 코딩하는 (그리고 발현할 수 있는) 제2 핵산을 포함할 수 있으며; 대안적으로, 세포는 이러한 ABP의 쇄 둘 다를 코딩하는 단일 핵산을 포함할 수 있다. 이들 방식으로, 본 발명의 이러한 세포는 본 발명의 기능적 ABP를 발현할 수 있을 것이다. 본 발명의 (숙주) 세포는 특히 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 경우에, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 포유류, 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 중 하나일 수 있다.

이러한 측면의 특정 실시양태에서, (숙주) 세포는 인간 세포이고; 특히 특정 개체로부터 샘플링된 인간 세포일 수 있다 (예를 들어, 자가 인간 세포). 이러한 실시양태에서, 이러한 인간 세포는 본 발명의 핵산을 도입하기 위해 시험관내에서 증식 및/또는 조작될 수 있다. 특정 개체로부터의 조작된 인간 세포의 유용성은 예컨대 요법에서 사용하기 위해 이러한 조작된 인간 세포의 집단을 인간 대상체에 재도입하는 것을 포함하여 본 발명의 ABP를 생산하는 것일 수 있다. 이러한 특정 용도에서, 조작된 인간 세포는 그것이 처음 샘플링된 동일한 인간 개체에; 예를 들어, 자가 인간 세포로서 도입될 수 있다.

이러한 조작을 받는 인간 세포는 신체의 임의의 배세포 또는 체세포 유형일 수 있다. 예를 들어, 공여자 세포는 섬유모세포, B 세포, T 세포, 수지상 세포, 각질세포, 지방 세포, 상피 세포, 표피 세포, 연골세포, 난구 세포, 신경 세포, 아교 세포, 성상세포, 심장 세포, 식도 세포, 근육 세포, 멜라닌세포, 조혈 세포, 대식세포, 단핵구, 및 단핵 세포로부터 선택된 배세포 또는 체세포일 수 있다. 공여자 세포는 신체의 임의의 기관 또는 조직으로부터 수득될 수 있으며; 예를 들어, 간, 위, 장, 폐, 췌장, 각막, 피부, 담낭, 난소, 고환, 신장, 심장, 방광 및 요도로 이루어진 군으로부터 선택된 기관으로부터의 세포일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 ABP 및 임의로 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 ABP는 단백질성 약물에 대해 치료적으로 효과적인 임의의 비경구 또는 비-비경구 (내장) 경로를 통해 투여될 수 있다. 비경구 적용 방법은, 예를 들어, 피내, 피하, 근육내, 기관내, 비강내, 유리체내 또는 정맥내 주사 및 주입 기술 (예를 들어 주사 용액, 주입 용액 또는 팅크제의 형태로, 뿐만 아니라 에어로졸 설치 및 흡입, 예를 들어 에어로졸 혼합물, 스프레이 또는 분말의 형태로)을 포함한다. 폐 약물 전달 (즉, 에어로졸의 흡입 (또한 비강내 투여에 사용될 수 있음) 또는 기관내 점적주입을 통해)에 대한 개요는 예를 들어 문헌 [J.S. Patton et al. The lungs as a portal of entry for systemic drug delivery. Proc. Amer. Thoracic Soc. 2004 Vol. 1 pages 338-344]에 제공된다. 비-비경구 전달 방식은, 예를 들어, 경구로, 예를 들어 환제, 정제, 캡슐, 용액 또는 현탁액의 형태로, 또는 직장으로, 예를 들어 좌제의 형태로 수행된다. 본 발명의 ABP는 필요에 따라 통상적인 비-독성 제약상 허용되는 부형제 또는 담체, 첨가제 및 비히클을 함유하는 제형으로 전신으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서 약제는 포유동물, 및 특히 인간에게 비경구로 투여된다. 해당 투여 방법은, 예를 들어, 피내, 피하, 근육내, 기관내 또는 정맥내 주사 및 주입 기술 (예를 들어 주사 용액, 주입 용액 또는 팅크제의 형태로 뿐만 아니라 에어로졸 설치 및 흡입, 예를 들어 에어로졸 혼합물, 스프레이 또는 분말의 형태로)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 정맥내 및 피하 주입 및/또는 주사의 조합은 상대적으로 짧은 혈청 반감기를 갖는 화합물의 경우에 가장 편리할 수 있다. 제약 조성물은 수용액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼일 수 있다.

이와 관련하여, 문헌 [Meidan VM and Michniak BB 2004 Am. J. Ther. 11(4): 312-316]에 기재된 바와 같은 경피 전달 기술, 예를 들어 이온영동, 초음파영동 또는 미세바늘-증진된 전달이 또한 본원에 기재된 ABP의 경피 전달에 사용될 수 있다는 점에 주목한다. 비-비경구 전달 방식은, 예를 들어, 경구 (예를 들어 환제, 정제, 캡슐, 용액 또는 현탁액의 형태로) 또는 직장 투여 (예를 들어 좌제의 형태로)이다. 본 발명의 ABP는 다양한 통상적인 비-독성 제약상 허용되는 부형제 또는 담체, 첨가제 및 비히클을 함유하는 제형으로 전신으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.

적용되는 ABP의 투여량은 원하는 예방적 효과 또는 치료적 반응을 달성하기 위해 넓은 한계 내에서 달라질 수 있다. 예를 들어, 이는 선택된 표적에 대한 ABP의 친화성 뿐만 아니라 생체내에서 ABP 및 리간드 사이의 복합체의 반감기에 의존할 것이다. 또한, 최적 투여량은 ABP 또는 그의 접합체의 생체분포, 투여 방식, 치료될 질환/장애의 중증도 뿐만 아니라 환자의 의학적 상태에 의존할 것이다. 예를 들어, 국소 도포용 연고에 사용되는 경우에, 고농도의 ABP가 사용될 수 있다. 그러나, 원하는 경우에, ABP는 또한 지속 방출 제형, 예를 들어 리포솜 분산액 또는 히드로겔-기반 중합체 마이크로스피어, 예컨대 폴리액티브(PolyActive)TM 또는 옥토덱스(OctoDEX)TM로 제공될 수 있다 (cf. Bos et al., Business Briefing: Pharmatech 2003: 1-6). 이용가능한 다른 지속 방출 제형은 예를 들어 PLGA 기반 중합체 (PR 파마슈티칼스(PR pharmaceuticals)), PLA-PEG 기반 히드로겔 (메딘셀(Medincell)) 및 PEA 기반 중합체 (메디바스(Medivas))이다.

따라서, 본 발명의 ABP는 제약상 허용되는 성분 뿐만 아니라 확립된 제조 방법을 사용하여 조성물로 제형화될 수 있다 (Gennaro, A.L. and Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). 제약 조성물을 제조하기 위해, 제약상 불활성 무기 또는 유기 부형제가 사용될 수 있다. 예를 들어 환제, 분말, 젤라틴 캡슐 또는 좌제를 제조하기 위해, 예를 들어, 락토스, 활석, 스테아르산 및 그의 염, 지방, 왁스, 고체 또는 액체 폴리올, 천연 및 경화 오일이 사용될 수 있다. 용액, 현탁액, 에멀젼, 에어로졸 혼합물 또는 분말 (사용 전에 용액 또는 에어로졸 혼합물로의 재구성을 위한)의 생산에 적합한 부형제는 물, 알콜, 글리세롤, 폴리올, 및 이들의 적합한 혼합물 뿐만 아니라 식물성 오일을 포함한다.

제약 조성물은 또한 첨가제, 예컨대, 예를 들어, 충전제, 결합제, 습윤제, 활택제, 안정화제, 방부제, 유화제, 및 더욱이 용매 또는 가용화제 또는 데포 효과를 달성하기 위한 작용제를 함유할 수 있다. 후자는 융합 단백질이 느린 또는 지속 방출 또는 표적화된 전달 시스템, 예컨대 리포솜 및 마이크로캡슐로 혼입될 수 있다는 것이다.

제형은 박테리아-유지 필터를 통한 여과를 포함하는 수많은 수단에 의해, 또는 사용 직전에 멸균수 또는 다른 멸균 매질에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균화제를 혼입함으로써 멸균될 수 있다.

ABP는 질환의 치료 또는 예방에 적합할 수 있고 이에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 ABP는 의학적 상태, 예컨대 장애 또는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 ABP는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 치료 또는 예방될 질환은 증식성 질환일 수 있다. 이러한 증식성 질환은 바람직하게는 종양 또는 암일 수 있다. FLT3에 결합하는 본 발명의 ABP의 능력으로 인해, 이 ABP는 FLT3 (야생형 또는 돌연변이된 FLT3 둘 다)을 발현하는 세포로 이루어진 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 치료에 대하여, 암은 임의의 급성 림프구성 암, 급성 골수성 백혈병 (AML), 포상 횡문근육종, 방광암 (예를 들어, 방광 암종), 골암, 뇌암 (예를 들어, 수모세포종), 유방암, 항문, 항문관 또는 항문직장의 암, 눈암, 간내 담관암, 관절암, 경부, 담낭 또는 흉막의 암, 코, 비강 또는 중이의 암, 구강암, 외음부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 암, 결장암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 위장관 카르시노이드 종양, 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종), 호지킨 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 백혈병, 액체 종양, 간암, 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐 암종 및 폐 선암종), 림프종, 중피종, 비만세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비-호지킨 림프종, B-만성 림프구성 백혈병, 모발상 세포 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 버킷 림프종, 난소암, 췌장암, 복막, 대망 및 장간막 암, 인두암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 연조직암, 고형 종양, 윤활막 육종, 위암, 고환암, 갑상선암, 및 요관암을 포함하는 임의의 암일 수 있다. 바람직하게는, 암은 FLT3의 발현을 특징으로 한다. 가장 바람직하게는 암은 FLT3 양성 백혈병, 예컨대 AML 또는 ALL이다.

융합 단백질로 치료될 대상체는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다. 이러한 동물은 바람직하게는 포유동물, 예를 들어 인간, 돼지, 소, 토끼, 마우스, 래트, 영장류, 염소, 양, 닭 또는 말, 가장 바람직하게는 인간이다.

본 발명의 ABP는 또한 질환, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 질환의 진단에 사용될 수 있다. ABP는 이 목적을 위해 적합한 검출가능한 신호전달 표지로 표지될 수 있다. 이러한 표지된 ABP는 FLT3 수준 또는 암, 예컨대 백혈병, 또는 임의의 상기 언급된 암, 또는 대상체의 검출 또는 정량을 허용할 수 있다. 생체내 사용을 위해 지정된 경우에, 상기 검출가능한 신호전달 표지는 바람직하게는 생체내에서 검출가능하다.

표지된 ABP는 면역-영상화 기술에 사용될 수 있다. 그 후, 검출가능한 신호전달 표지는 각각, 예를 들어, 진단에 사용되는 면역-영상화 기술, 예를 들어, 감마 카메라-영상화 기술/SPECT의 경우에 감마-방출 방사성핵종 (또는 감마-방출기), MRI 또는 PET 영상화 기술의 경우에 금속 또는 양전자 방출기에 기반하여 선택될 수 있다. 이와 관련하여, 본 개시내용의 하나 이상의 검출가능한 신호전달 표지는 감마 카메라-영상화가능한 작용제, PET-영상화가능한 작용제 및 MRI-영상화가능한 작용제, 예컨대, 방사성핵종, 형광체, 형광원, 발색단, 발색체, 인광체, 화학발광체 및 생물발광체를 포함한다.

적합한 검출가능한 신호전달 표지는 방사성핵종일 수 있다. 상기 방사성핵종은 3H, 14C, 35S, 99Tc, 1231, 1251, 131I, mIn, 97Ru, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr 및 201T1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

적합한 검출가능한 신호전달 표지는 또한 형광단 또는 형광원일 수 있다. 상기 형광단 또는 형광원은 플루오레세인, 로다민, 단실, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민, 플루오레세인 유도체, 오레곤 그린, 로다민 그린, 로돌 그린 또는 텍사스 레드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

표지된 ABP는 검출가능한 신호전달 표지에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 예를 들어, ABP는 검출가능한 신호전달 표지에 직접적으로 (예를 들어 ABP의 티로신 잔기를 통해) 또는 간접적으로 (예를 들어 링커를 통해--금속 킬레이트제로서) 커플링될 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, ABP는 사용 시간 및 장소에서 검출가능한 신호전달 표지에 (시험관내 또는 생체내) 커플링될 수 있는 분자에 커플링될 수 있다.

검출가능한 신호전달 표지는 ABP에 커플링된 하나 이상의 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 잔기를 통해 ABP에 결합될 수 있다.

본 발명은 또한 본원에서 정의된 질환을 검출 또는 진단하는 시험관내 방법을 고려한다. 이러한 방법은 대상체로부터 수득된 샘플을 본 발명의 바람직하게 표지된 ABP와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 샘플은 혈액, 소변 또는 뇌척수액 샘플일 수 있지만, 바람직하게는 액체 샘플 또는 생검 샘플일 수 있다. 검출 또는 진단될 질환은 바람직하게는 백혈병, 예컨대 ALL 또는 AML이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "[본] 발명의", "본 발명에 따라", "본 발명에 따른" 등은 본원에 기재되고/거나 청구된 본 발명의 모든 측면 및 실시양태를 지칭하기 위한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는"은 "포함한" 및 "로 이루어진" 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 하며, 둘 다의 의미는 구체적으로 의도되고, 따라서 본 발명에 따라 개별적으로 개시된 실시양태이다. 본원에서 사용되는 경우에, "및/또는"은 다른 하나와 함께 또는 없이 2개의 특정된 특색 또는 구성성분 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 본원에서 개별적으로 제시된 것처럼 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "약" 및 "대략"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 해당 특색의 기술적 효과를 여전히 보장하기 위해 이해하는 정확도의 간격을 나타낸다. 상기 용어는 전형적으로 표시된 수치로부터 ±20%, ±15%, ±10%, 및 예를 들어 ±5%의 편차를 나타낸다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 주어진 기술적 효과에 대한 수치에 대한 이러한 특정 편차는 기술적 효과의 성질에 의존할 것이다. 예를 들어, 자연적 또는 생물학적 기술적 효과는 일반적으로 인위적 또는 공학적 기술적 효과보다 더 큰 이러한 편차를 가질 수 있다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 주어진 기술적 효과에 대한 수치에 대한 이러한 특정 편차는 기술적 효과의 성질에 의존할 것이다. 예를 들어, 자연적 또는 생물학적 기술적 효과는 일반적으로 인위적 또는 공학적 기술적 효과보다 더 큰 이러한 편차를 가질 수 있다. 단수 명사를 언급할 때 부정 관사 또는 정관사가 사용되는 경우 (예를 들어 "하나"), 이는 구체적으로 언급하지 않는 한 해당 명사의 복수형을 포함한다.

특정 문제 또는 환경에 본 발명의 교시내용의 적용, 및 본 발명의 변형 또는 그에 대한 추가 특색 (예컨대 추가 측면 및 실시양태)의 포함은 본원에 포함된 교시내용에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있을 것임이 이해되어야 한다.

맥락이 달리 지시하지 않는 한, 상기 제시된 특색의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정한 측면 또는 실시양태에 제한되지 않으며, 기재된 모든 측면 및 실시양태에 동일하게 적용된다.

본원에서 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 간행물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

상기의 관점에서, 본 발명은 또한 하기 항목화된 실시양태에 관한 것임이 이해될 것이다:

항목 1: 인간 fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3) 항원에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인, 및 인간 분화 클러스터 3 (CD3) 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 단백질 (ABP).

항목 2: 항목 1에 있어서, 이중특이적 ABP가 10 nM 미만, 바람직하게는 9 nM 미만, 보다 바람직하게는 8 nM 미만, 보다 바람직하게는 7 nM 미만, 보다 바람직하게는 6 nM 미만, 또는 5.5 nM 미만의 EC50으로 FLT3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 3: 항목 1 또는 2에 있어서, 이중특이적 ABP가 0.5 nM 초과, 보다 바람직하게는 1 nM 초과, 보다 바람직하게는 1.3 nM 초과, 보다 바람직하게는 2 nM 초과, 보다 바람직하게는 3 nM 초과, 또는 4 nM, 또는 4.5 nM 초과의 EC50으로 FLT3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 4: 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 ABP가 10 nM 미만 및 0.5 nM 초과, 보다 바람직하게는 9 nM 미만 및 1 nM 초과, 바람직하게는 8 nM 미만 및 1.3 nM 초과, 바람직하게는 7 nM 미만 및 3 nM 초과, 바람직하게는 6 nM 미만 및 4 nM 초과, 바람직하게는 5.5 nM 미만 및 4.5 nM 초과의 EC50으로 FLT3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 5: 항목 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, FLT3에 대한 이중특이적 ABP의 결합의 EC50이 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 장치를 사용하는 유동 세포계측법에 의해 FLT3 양성 세포에 대한 이중특이적 ABP의 결합을 분석함으로써 결정된 바와 같고; 바람직하게는 FLt3 양성 세포가 B 세포 전구체 백혈병 세포, 바람직하게는 NALM-16 세포 (DSMZ에서 ACC 680 하에 기탁된 바와 같음)이고/거나; 바람직하게는 결합이 형광 표지된 이차 항체를 사용하여 검출되고/거나; 이중특이적 ABP가 유동 세포계측법 전에 약 30분 동안 FLT3 양성 세포와 함께 인큐베이션되는 것인 이중특이적 ABP.

항목 6: 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 ABP가 50 μM 미만, 보다 바람직하게는 20 μM 미만, 보다 바람직하게는 10 μM 미만, 보다 바람직하게는 5 μM 미만, 보다 바람직하게는 1 μM 미만의 kD로 FLT3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 7: 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 ABP가 50 nM 초과, 보다 바람직하게는 100 nM 초과, 보다 바람직하게는 160 nM 초과, 보다 바람직하게는 200 nM 초과, 보다 바람직하게는 300 nM 초과의 kD로 FLT3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 8: 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 ABP가 50 μM 미만 및 50 nM 초과, 보다 바람직하게는 20 μM 미만 및 100 nM 초과, 보다 바람직하게는 10 μM 미만 및 160 nM 초과, 보다 바람직하게는 5 μM 미만 및 200 nM 초과, 보다 바람직하게는 1 μM 미만 및 300 nM 초과의 kD로 FLT3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 9: 항목 6 내지 8 중 어느 하나에 있어서, kD가, 예를 들어 비아코어 친화성 검정에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 것인 이중특이적 ABP.

항목 10: 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 ABP가 200 nM 미만, 바람직하게는 90 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만, 보다 바람직하게는 20 nM 미만, 보다 바람직하게는 15 nM 미만의 EC50으로 CD3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 11: 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 ABP가 1 nM 초과, 바람직하게는 2 nM 초과, 보다 바람직하게는 4.1 nM 초과, 보다 바람직하게는 6 nM 초과, 보다 바람직하게는 8 nM 초과의 EC50으로 CD3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 12: 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 ABP가 200 nM 미만 및 1 nM 초과, 바람직하게는 200 nM 미만 및 2 nM 초과, 보다 바람직하게는 90 nM 미만 및 4.1 nM 초과, 보다 바람직하게는 20 nM 미만 및 6 nM 초과, 보다 바람직하게는 15 nM 미만 및 8 nM 초과의 EC50으로 CD3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 13: 항목 10 내지 12 중 어느 하나에 있어서, CD3에 대한 이중특이적 ABP의 결합의 EC50이 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 장치를 사용하는 유동 세포계측법에 의해 CD3 양성 세포에 대한 이중특이적 ABP의 결합을 분석함으로써 결정된 바와 같고; 바람직하게는 CD3 양성 세포가 T 세포 백혈병 세포, 바람직하게는 Jurkat 세포 (DSMZ에서 ACC 282 하에 기탁된 바와 같음)이고/거나; 바람직하게는 결합이 형광 표지된 이차 항체를 사용하여 검출되고/거나; 이중특이적 ABP가 유동 세포계측법 전에 약 30분 동안 CD3 양성 세포와 함께 인큐베이션되는 것인 이중특이적 ABP.

항목 14: 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 비-처리된 대조군과 비교하여 시험관내 검정에서 급성 백혈병을 앓고 있는 환자의 백혈병 혈액 단핵 세포의 증식 및/또는 생존력을 50% 이하, 보다 바람직하게는 40% 이하, 보다 바람직하게는 30% 이하, 가장 바람직하게는 25% 이하로 억제하는 이중특이적 ABP.

항목 15: 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 ABP가 2개의 제1 항원 결합 부위를 포함하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 16: 항목 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 ABP가 2개의 제2 항원 결합 부위를 포함하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 17: 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항체 변이체인 이중특이적 ABP.

항목 18: 항목 17에 있어서, 항원 결합 도메인이 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인으로 구성된 것인 이중특이적 ABP.

항목 19: 항목 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 각 단량체에 (i) 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 가변 영역을 포함하며, 여기서 상기 가변 영역은 제1 항원 결합 부위를 포함하는 것인 N-말단 Fab 단편; (ii) 제2 항원 결합 부위를 포함하는 C-말단 scFv 단편을 포함하며, 여기서 (i) 및 (ii)는 CH2 및 CH3 도메인에 의해 연결되는 것인, 4가 및 동종이량체성 이중특이적 항체인 이중특이적 ABP.

항목 20: 항목 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체에서 Fc 수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 CH2 도메인의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결여되거나 또는 돌연변이된 것인 이중특이적 ABP.

항목 21: 항목 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 부위가 배향 C-말단에서 N-말단으로 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 이중특이적 ABP.

항목 22: 인간 fms 관련 티로신 키나제 3 (FLT3)에 결합할 수 있는 ABP로서: (i) 서열식별번호: 01 (SYWMH)에 기재된 CDRH1 영역, 서열식별번호: 02 (EIDPSDSYKDYNQKFKD)에 기재된 CDRH2 영역, 및 서열식별번호: 03 (AITTTPFDF)에 기재된 CDRH3 영역을 포함하거나, 또는 여기서 각각의 경우에 독립적으로 CDRH1, CDRH2 및/또는 CDRH3이 각각 서열식별번호: 01, 서열식별번호: 02 또는 서열식별번호: 03과 비교하여 3개 또는 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 서열을 포함하는 것인 중쇄 가변 도메인; 또는 서열식별번호: 01, 서열식별번호: 02 또는 서열식별번호: 03과 적어도 75% 서열 동일성 또는 적어도 80%, 바람직하게는 90% 서열 동일성을 갖는 CDRH1, CDRH2 또는 CDRH3 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 (ii) 서열식별번호: 05 (RASQSISNNLH)에 기재된 CDRL1 영역, 서열식별번호: 06 (YASQSIS)에 기재된 CDRL2 영역, 및 서열식별번호: 07 (QQSNTWPYT)에 기재된 CDRL3 영역을 포함하거나, 또는 여기서 각각의 경우에 독립적으로 CDRL1, CDRL2 및/또는 CDRL3이 각각 서열식별번호: 05, 서열식별번호: 06 또는 서열식별번호: 07과 비교하여 3개 또는 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 서열을 포함하는 것인 경쇄 가변 도메인; 또는 서열식별번호: 05, 서열식별번호: 06 또는 서열식별번호: 07과 적어도 75% 서열 동일성 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며; 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역은 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 ABP.

항목 23: 항목 22에 있어서, 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 이중특이적 ABP이며, 여기서 항목 22에서 (i) 및 (ii)의 상기 CDR 영역이 상기 제1 항원 결합 도메인에 포함되는 것인 ABP.

항목 24: 항목 22 또는 23에 있어서, 중쇄 가변 도메인 인간 프레임워크 서열이 IGHV1-46, 바람직하게는 IGHV1-46*3으로부터 유래되고/거나 중쇄 가변 도메인 인간 프레임워크 서열이 IGKV3D-15로부터 유래되는 것인 ABP.

항목 25: 항목 24에 있어서, 중쇄 가변 영역이 하기 돌연변이: K16G, V18L, K19R, V20L, K22A, M48I, K57T, N60A, M69I, T70S, T75K, S76N, V78L, M80L, E81Q, S87A 및 T108L 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 시스템에 따른 것인 ABP.

항목 26: 항목 24 또는 25에 있어서, 경쇄 가변 영역이 하기 돌연변이: Y49K, Y87F 및 I55A 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 시스템에 따른 것인 ABP.

항목 27: 항목 1에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 15, 17, 19, 21 또는 23으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 각각의 경우에 독립적으로, 임의로 이들 서열과 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개 이하, 바람직하게는 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 삽입(들) 또는 결실(들)을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/거나; 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 16, 18, 20, 22 또는 24로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 각각의 경우에 독립적으로, 임의로 이들 서열과 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개 이하, 바람직하게는 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 삽입(들) 또는 결실(들)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABP.

항목 28: 항목 27에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 아미노산 위치 16, 18, 19, 20, 22, 48, 57, 60, 69, 70, 75, 76, 78, 80, 81, 87 및 108이 서열식별번호: 15, 17, 19, 21 또는 23 중 어느 하나에서와 같고/거나; 경쇄 가변 영역에서 아미노산 위치 49, 55 및 87이 서열식별번호: 16, 18, 20, 22 또는 24 중 어느 하나에서와 같으며; 여기서 넘버링은 카바트 시스템에 따른 것인 ABP.

항목 29: 항목 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 적어도 1개, 바람직하게는 2개의 제2 항원 결합 도메인(들)을 포함하며, 여기서 상기 제2 항원 결합 도메인은 CD3에 결합하고, 바람직하게는 상기 제2 항원 결합 도메인은 제1 항체 결합 도메인의 중쇄에 융합된 것인 ABP.

항목 30: 항목 29에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 서열식별번호: 14, 25, 26 및 27로부터 선택된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖거나, 또는 각각의 경우에 독립적으로, 임의로 이들 서열과 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개 이하, 바람직하게는 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 삽입(들) 또는 결실(들)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv 단편을 포함하는 것인 ABP.

항목 31: 항목 27 또는 28에 있어서, 서열식별번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 및 74로부터 선택된 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나, 또는 이들 서열과 비교하여 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 4개 이하, 바람직하게는 3 또는 2개, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 항체 중쇄를 포함하고/거나; 서열식별번호: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73 및 75로부터 선택된 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나, 또는 이들 서열과 비교하여 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 4개 이하, 바람직하게는 3 또는 2개, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 항체 경쇄를 포함하는 ABP.

항목 32: 항목 31에 있어서, 1개, 바람직하게는 2개의 항체 중쇄 및 1개, 바람직하게는 2개의 항체 경쇄를 포함하며, 각각이 하기 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 하기 서열과 비교하여 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 4개 이하, 바람직하게는 3 또는 2개, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABP:

a. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 28 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 29로부터 선택된 서열;

b. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 30 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 31로부터 선택된 서열;

c. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 32 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 33으로부터 선택된 서열;

d. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 34 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 35로부터 선택된 서열;

e. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 36 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 37로부터 선택된 서열;

f. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 38 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 39로부터 선택된 서열;

g. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 40 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 41로부터 선택된 서열;

h. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 42 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 43으로부터 선택된 서열;

i. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 44 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 45로부터 선택된 서열;

j. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 46 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 47로부터 선택된 서열;

k. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 48 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 49로부터 선택된 서열;

l. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 50 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 51로부터 선택된 서열;

m. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 52 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 53으로부터 선택된 서열;

n. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 54 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 55로부터 선택된 서열;

o. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 56 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 57로부터 선택된 서열;

p. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 58 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 59로부터 선택된 서열;

q. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 60 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 61로부터 선택된 서열;

r. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 62 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 63으로부터 선택된 서열;

s. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 64 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 65로부터 선택된 서열;

t. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 66 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 67로부터 선택된 서열;

u. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 68 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 69로부터 선택된 서열;

v. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 70 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 71로부터 선택된 서열;

w. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 72 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 73으로부터 선택된 서열;

x. 중쇄의 경우에 서열식별번호: 74 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 75로부터 선택된 서열;

여기서 중쇄 및 경쇄는 서로 쌍형성된다.

항목 33: 항목 1 내지 32 중 어느 하나에 따른 ABP의 결합과 경쟁할 수 있는 인간 FLT3에 결합할 수 있는 ABP 또는 그의 항원-결합 단편.

항목 34: 항목 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, T-세포 및 FLT3 발현 종양 세포에 결합하는 활성을 가지며, 바람직하게는 항체가 FLT3 및 CD3에 대한 결합에 의해 FLT3 발현 종양 세포에 대한 T-세포의 동원을 증가시키는 것인 ABP.

항목 35: 항목 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 제2 결합 도메인을 포함하는 항체 분자의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 UCHT1의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인 ABP.

항목 36: 항목 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 불변 중쇄 영역 CH1 내지 CH3을 포함하며, 여기서 Fc 수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 인간 CH2 도메인의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결여되거나 또는 돌연변이된 것인 ABP.

항목 37: 항목 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, ABP가 사량체성 항체 분자 또는 동종이량체성 및 4가 항체 분자인 ABP.

항목 38: 항목 1 내지 37 중 어느 하나의 ABP 또는 ABP의 항원 결합 단편 또는 단량체를 코딩하는 단리된 핵산.

항목 39: 항목 38의 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포.

항목 40: (i) 항목 1 내지 37 중 어느 하나의 ABP, 또는 (ii) 항목 38의 핵산, 또는 (iii) 항목 39에 따른 재조합 숙주 세포, 및 제약상 허용되는 담체, 안정화제 및/또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.

항목 41: 의약에 사용하기 위한 구성성분으로서, 항목 1 내지 37 중 어느 하나의 ABP, 항목 38의 단리된 핵산, 항목 39에 따른 재조합 숙주 세포 및 항목 40에 따른 제약 조성물로 이루어진 목록으로부터 선택된 구성성분.

항목 42: 항목 41에 있어서, 의약에서의 사용이 발현 FLt3과 연관된 증식성 장애의 치료에서의 사용인 사용하기 위한 구성성분.

항목 43: 항목 41 또는 42에 있어서, 구성성분이 T 세포 매개 사멸의 증진 및/또는 FLT3 양성 종양 세포의 증식의 억제에 사용하기 위한 것인 구성성분.

항목 44: 항목 41 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 구성성분이 증식성 질환의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이며, 여기서 증식성 질환은 바람직하게는 암이며, 여기서 암은 백혈병, 예컨대 급성 골수성 백혈병 (AML) 또는 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), 또는 전립선암, 결장직장암, 위암, 폐 암종, 골육종, 유선암, 췌장암, 또는 편평 세포 암종으로부터 선택된 고형 암으로부터 선택되고; 바람직하게는 암이 백혈병, 예컨대 AML 또는 ALL인 사용하기 위한 구성성분.

항목 45: 항목 44에 있어서, 암이 FLT3을 발현하는 종양 세포와 연관된 것인 사용하기 위한 구성성분.

도면 및 서열의 간단한 설명

도면은 하기를 제시한다:

도 1은 본 발명에서 기재된 이중특이적 FLT3xCD3 항체-변이체의 구축에 사용된 Fc-감쇠된 IgGsc-포맷을 도시한다. FLT3 항원 결합 도메인 (V1 내지 V5)의 변이체는 상이한 엄격성을 갖는 대체 전략을 사용하여 CDR-그라프팅에 의해 FLT3 항체 4G8의 V-영역의 인간화로부터 시작하여 수득되었다. 상이한 CD3-항원 결합 도메인 (V6 내지 V9)의 생성을 위해, UCHT1 scFv 서열을 사용하였다.

도 2는 CC-2의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 제시한다. A: FLT3 (4G8) X CD3 (인간화 hUCHT1) 이중특이적 IgGsc 포맷 항체 분자의 중쇄 서열 (서열식별번호: 68). 중쇄는 4G8의 마우스 중쇄 (HC) 가변 영역, IgG1 CH1 도메인, IgG1 힌지 영역, 변형된 IgG1 CH2 도메인, IgG1 CH3 도메인, 및 인간화 CD3 (UCHT1) 단일 쇄 Fv 단편을 포함한다. B: FLT3 (4G8) x CD3 (인간화 hUCHT1)의 카파 경쇄의 아미노산 서열 (서열식별번호: 69)을 제시한다. 이 경쇄는 각각 키메라 4G8xUCHT1 IgGsc- 및 Fabsc-분자를 형성하기 위해 서열식별번호: 68의 중쇄 구축물을 완성한다 (도 1 참조).

도 3은 가용성 재조합 FLT3 단백질에 대한 상이한 CC-2 변이체의 결합을 도시한다. 각각의 항체 변이체를 단백질 A로 코팅된 비아코어 칩에 고정시키고, His 태그부착된, 재조합 FLT3 단백질 (시노 바이올로지칼스(Sino Biologicals))의 결합을 비아코어 X 기기 (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여 결정하였다. FLT3 항원 결합 도메인 (V1 내지 V5)의 다양한 돌연변이된 변이체의 결과가 제시되어 있다.

도 4는 FLT3을 발현하는 Nalm16 세포에 대한 CC-2 변이체의 결합을 제시한다. 계산된 EC50 값은 도 3의 해당 막대에 제시되어 있다. FLT3 항원 결합 도메인 (V1 내지 V5)의 돌연변이된 변이체를 시험하였다.

도 5는 본 발명의 다양한 상이한 CC-2 구축물을 사용하여 AML 환자의 혈액 샘플로부터의 백혈병 세포의 고갈을 도시한다. FLT3 항원 결합 도메인 (V1 내지 V5)의 돌연변이된 변이체의 비교가 제시되어 있다. 또한 도 3의 비아코어 결과 및 도 4의 유동 세포계측법 EC50의 값이 제시되어 있다.

도 6은 CD3을 발현하는 Jurkat 세포에 대한 CC-2 변이체의 결합을 제시한다. 계산된 EC50 값은 도 5의 해당 막대에 제시되어 있다. CD3 항원 결합 도메인 (V7 내지 V9)의 돌연변이된 변이체를 시험하였다.

도 7은 본 발명의 다양한 상이한 CC-2 구축물을 사용하여 AML 환자의 혈액 샘플로부터의 백혈병 세포의 고갈을 도시한다. CD3 항원 결합 도메인 (V7 내지 V9)의 돌연변이된 변이체의 비교가 제시되어 있다. 또한 도 6의 유동 세포계측법 EC50의 값이 제시되어 있다.

도 8은 유동 세포계측법 검정에서 상이한 CC-2 변이체에 의한 T 세포 활성화 및 모세포 감소의 결과를 도시한다. 사용된 CC2 변이체는 이들의 FLT3 항원 결합 도메인 및 CD3 항원 결합 도메인 둘 다에서 상이하다 (사용된 항체는 V6-V6 (V6); V6-V9 (V9); V4-V6 (V4)임). A: CD4 양성 세포의 감소; B: CD8 양성 세포의 감소; C: 모세포 카운트.

도 9는 유동 세포계측법 검정에서 CC-2의 상이한 변이체에 의한 NALM16 백혈병 세포의 고갈을 도시한다. 사용된 CC2 변이체는 이들의 FLT3 항원 결합 도메인 및 CD3 항원 결합 도메인 둘 다에서 상이하다 (사용된 항체는 V6-V6 (V6); V6-V8 (V8); V4-V6 (V4); V6-V7 (V7)임).

도 10은 일차 AML (A) 또는 ALL (B)로 그라프팅된 면역-결핍된 NSG 마우스에서 생체내 CC-2 변이체 4의 항-백혈병 활성을 도시한다. 예로서 FLT3 항원 결합 도메인 V4 (V4-V6)를 갖는 CC-2 변이체가 제시되어 있다.

도 11은 단일특이적 항-FLT3 항체 변이체의 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 도시한다. 표시된 FLT3 구축물 또는 Fc-대조군 (각 5μg/ml)의 존재 하에 동종이계 폴리클로날 자연 살해 세포 (pNKC)에 의한 FLT3+ 백혈병 세포 (SEM; DSMZ no. ACC 546)의 특이적 용해를 2h BATDA-유로퓸 세포독성 검정에 의해 측정하였으며, 이는 제시되어 있다.

본 발명의 ABP는 모두 서열 목록 및 하기 표 1에 기재되어 있다:

실시예

본 발명의 특정 측면 및 실시양태는 이제 본원에 제시된 설명, 도면 및 표를 참조하여 및 실시예에 의해 예시될 것이다. 본 발명의 방법, 용도 및 다른 측면의 이러한 실시예는 단지 대표적인 것이며, 본 발명의 범주를 이러한 대표적인 실시예로만 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

실시예는 하기를 제시한다:

실시예 1: 재조합 이중특이적 FLT3xCD3 ABP (CC-2)의 생산

4G8 항-FLT3 항체를 IgGsc 포맷의 재조합 이중특이적 ABP의 구축에 사용하였으며 (도 1), 즉, 마우스 FLT3 항체 4G8의 가변 도메인은 하기 순서로 CD3 항체UCHT1의 인간 불변 영역 및 가변 영역에 융합되었다. 경쇄의 경우에 VL-CL 및 중쇄의 경우에 VH-CH1-CH2mod-CH3-scFv(UCHT1) (도 1 참조). 이들 ABP에서, FLT3 결합 부위는 Fab2 단편으로 존재하는 반면, CD3 결합 부위는 scFv 단편으로 존재한다 (다시 도 1 참조). FcR-결합을 폐지하기 위해, 하기 변형을 힌지 영역 및 CH2 도메인 (EU-인덱스)에 도입하였다: E233P; L234V; L235A; ΔG236; D265G;; A327Q; A330S (이와 관련하여 또한 국제 특허 출원 WO 2013/092001 참조). 또한 국제 특허 출원 WO 2013/092001에 기재된 바와 같이 pcDNA3.1 (인비트로젠(InVitrogen), 써모 피셔(Thermo Fisher))로부터 유래된 발현 벡터에서 구축물을 클로닝하고, CHO-세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 단백질 A 수지를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 형질감염된 세포의 상청액으로부터 ABP를 정제하였다 (지이 헬스케어 (독일 프라이부르크)로부터 구입함). 생성된 마우스 FLT3xCD3 이중특이적 항체는 V6-V6으로 제시되어 있다.

실시예 2: 인간화 4G8 항체의 생성

항체 4G8의 경쇄의 CDR 영역 (서열식별번호: 5 내지 서열식별번호: 7의 CDR 루프를 의미함)을 수탁 번호 M23090 하에 IMGT/LIGM-데이터베이스에 기탁된 인간 κ 경쇄 서열 IGKV3-15*01의 (가변 도메인)에 그라프팅함으로써 4G8 항-FLT3 항체를 인간화하였다 (문헌 [Ichiyoshi Y., Zhou M., Casali P. A human anti-insulin IgG autoantibody apparently arises through clonal selection from an insulin-specific 'germ-line' natural antibody template. Analysis by V gene segment reassortment and site-directed mutagenesis' J. Immunol. 154(1):226-238 (1995)] 참조). 또한, 항체 4G8의 중쇄의 CDR 영역 (서열식별번호: 01 내지 서열식별번호: 03의 CDR 루프를 의미함)을 수탁 번호 L06612 하에 IMGT/LIGM-데이터베이스에 기탁된 중쇄 서열 IGHV1-46*03의 (가변 도메인)에 포함시켰다 (또한 문헌 [Watson C.T., et al. Complete haplotype sequence of the human immunoglobulin heavy-chain variable, diversity, and joining genes and characterization of allelic and copy-number variation. Am. J. Hum. Genet. 92(4):530-546 (2013)] 참조). 생성된 인간화 4G8을 본 발명의 돌연변이 분석/변이에 대한 기반으로서 사용하였다.

실시예 3: 이중특이적 FLT3xCD3 ABP (CC-2)의 본 발명의 변이체의 생성

인간화 4G8의 FLT3 결합 도메인의 다중 변이체 (V1 내지 V5)를 생성하였다. 더욱이, 인간화 CD3 항체 UCHT1로부터 유래된 CD3 결합 도메인 scFv의 다중 공개된 변이체 (V7 내지 V9)를 본 발명의 FLT3 결합 도메인 변이체와 다양한 조합으로 사용하였다. 이러한 인간화 4G8 변이체의 사용을 원하는 특정 기술적 효과를 갖는 하기 바람직한 돌연변이된 변이체를 확인하였다 (CDR은 밑줄 그어져 있고, 돌연변이는 변이체 0 또는 V0으로 표시된 인간화 4G8 FLT3 항원 결합 도메인에 존재하는 상응하는 중쇄 및 경쇄에 대하여 표시됨):

인간화 4G8 FLT3 가변 영역 변이체 1 ( V1)

중쇄 가변 영역:

돌연변이: K16G, V18L, K19R, V20L, K22A, K57T, N60A, M69I, T70S, T75K, S76N, V78L, M80L, E81Q, S87A, T108L

경쇄 가변 영역:

돌연변이: K49Y, I55A

인간화 4G8 FLT3 가변 영역 변이체 2 ( V2 )

중쇄 가변 영역:

경쇄 가변 영역:

인간화 4G8 FLT3 가변 영역 변이체 3 ( V3 )

중쇄 가변 영역:

돌연변이: 48I

경쇄 가변 영역:

돌연변이: K49Y, I55A

인간화 4G8 FLT3 가변 영역 변이체 4 ( V4 )

중쇄 가변 영역:

돌연변이: 48I

경쇄 가변 영역:

돌연변이: 49K, 87F

인간화 4G8 FLT3 가변 영역 변이체 5 ( V5 )

중쇄 가변 영역:

돌연변이: K16G, V18L, K19R, V20L, K22A, M69I, T70S, T75K, S76N, V78L, M80L, E81Q, S87A, T108L

경쇄 가변 영역:

인간화 UCHT1 CD3 scFv 변이체 1 ( V7 )

돌연변이: N60A, Q61D, K62S, D65G, K73D

인간화 UCHT1 CD3 scFv 변이체 2 ( V8 )

돌연변이: K73D

인간화 UCHT1 CD3 scFv 변이체 3 ( V9 )

돌연변이: 경쇄 - 중쇄 대체 (VL-VH → VH-VL):

상기 표 1에 표시된 바와 같이 이중특이적 ABP 버전을 생성하는데 상기 변이체를 사용하였다.

실시예 4: 인간화 4G8의 FLT3 항원 결합 도메인 변이체의 결합 친화성.

도 3에서, 상기 표시된 바와 같은 상이한 FLT3 결합 도메인 변이체 V1 내지 V5의 결합을 이들의 해리 상수에 대해 가용성 재조합 FLT3 단백질을 사용하여 시험하였다. 각각의 항체 변이체를 단백질 A로 코팅된 비아코어 칩에 고정시키고, 비아코어 X 기기 (지이 헬스케어)를 사용하여 His 태그부착된 재조합 FLT3 단백질 (시노 바이올로지칼스)의 결합을 결정하였다. 결과는 표 2에 나타낸다:

또한, 항체 결합 친화성을, 또한 세포에서 발현된 바와 같은 그의 표적(들)에 대한 항체의 결합을 사용하여 시험하였다. FLT3을 발현하는 Nalm16 세포 (도 4) 또는 CD3을 발현하는 Jurkat 세포 (도 6)에 대한 CC-2 변이체의 결합을 분석하였다. 상기 나열된 삽입 서열을 사용하여 CHO 세포의 일시적 형질감염 후 변이체 V1 내지 V9 (V6은 V6-V6임)를 생성하였다. 항체를 단백질 A 친화성- 및 크기 배제-크로마토그래피에 의해 정제하였다. V1 내지 V5는 상기 표시된 바와 같은 FLT3 항체 및 동일한 CD3 결합 항체의 상이한 변이체 (~10nM의 EC50으로 CD3에 결합하는 UCHT1 변이체)를 함유한다. V6 내지 V9는 ~1nM의 EC50으로 FLT3에 결합하는 모 4G8 항체 및 상이한 UCHT1 변이체를 함유한다. FLT3 및 CD3에 대한 항체 결합을 측정하기 위해, NALM16 (FLT3+) 및 Jurkat (CD3+) 세포를 각각의 변이체와 함께 30분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 염소 항 인간 Fcγ-특이적 및 PE-접합된 이차 항체 (잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research))로 염색하고, 다시 세척하고, 유동 세포계측법 (FACSCalibur, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))에 의해 분석하였다.

결론: 도 3 및 4에 제시된 바와 같이, 변이체 5는 각각 표면 플라스몬 공명 (비아코어) 및 유동 세포계측법에 의해 측정된 바와 같이 FLT3에 대한 가장 높은 결합 친화성, 이어서 V4에 대한 친화성을 갖는다.

실시예 5: 상이한 FLT3-결합 또는 CD3-결합 도메인 변이체의 AML 환자의 혈액 샘플로부터 백혈병 세포의 고갈.

말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 급성 백혈병 환자로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 수득하고, 표시된 CC-2 변이체와 함께 5일 동안 1μg/ml로 인큐베이션하고, FACSCanto-II (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. CD33, CD34 또는 CD117에 대한 항체를 사용하여 백혈병 세포를 확인하였다. 세포 수의 보정을 위해, 정의된 양의 보상 비드 (비디 바이오사이언시스)를 모든 샘플에 첨가하였다. 2명의 상이한 공여자로부터의 세포를 사용하여 3개 (V4, V5, V6, V9) 및 2개 (V3)의 독립적 실험으로부터 데이터를 수득하였다. 모든 값은 비관련 특이성을 갖는 대조군 IgGsc 항체로 수득된 데이터와 관련이 있었다. FLT3 결합 변이체에 대한 결과는 도 5에 표시되고, CD3 결합 변이체에 대한 결과는 도 7에 제시되어 있다.

결론: 항백혈병 활성은 초기에 이중특이적 분자의 양측에서 친화성 값을 따른다. 변이체 V5는 FLT3에 대해 고도로 활성이고 친화성이다. 그러나, 놀랍게도, 덜 친화성인 변이체 V4는 다른 변이체와 같이 백혈병 세포에 대해 상당히 더 우수한 세포독성 잠재력을 가지며, 이는 특정 적용에 대해 항-FLT3 항체에 대한 더 낮은 친화성 범위가 선택될 수 있음을 나타낸다. CD3 결합 부분에서 유사한 결과가 관찰되었다.

T 세포 활성 및 모세포 세포 감소를 도 8 및 9의 상이한 항체 농도에 대해 분석하였다. 환자 MM2의 PBMC 제제를 수득하고, 표시된 농도의 CC-2 변이체와 함께 인큐베이션하였다. 5일 후, T 세포 활성화 및 백혈병 세포의 고갈을 유동 세포계측법에 의해 평가하였다 (도 8). Nalm16 세포를 표시된 농도의 CC-2 변이체와 함께 2:1의 E:T 비율로 3일 동안 인큐베이션한 후, 유동 세포계측법에 의해 분석하였다 (도 9).

실시예 6: 본 발명의 ABP의 생체내 항백혈병 활성

본 발명의 CC-2 변이체의 생체내 적용을 시험하기 위해, FLT3 및 CD3 결합에 대한 바람직한 변이체를 면역 결핍된 마우스 모델에서 이들의 치료적 잠재력에 대해 시험하였다 (도 10). 면역결핍된 NSG 마우스를 일차 AML (왼쪽) 또는 ALL (오른쪽) 세포로 그라프팅하였다. 제7일에 CC-2 (V4-V6) 또는 대조군 항체와 함께 PBMC를 주사하고, 제10일에 bsAb 처리를 반복하였다. 제17일에, 골수 내의 백혈병 부담 (비율 hCD45+/mCD45+ 세포)을 유동 세포계측법에 의해 결정하였다.

결론: 상기 실험은 훨씬 덜 친화성인 CC2 변이체, 예컨대 V4에 대한 치료적 잠재력을 입증한다.

본원에 예시적으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적합하게 실시될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 용어 "포함하는", "포함한", "함유하는" 등은 광범위하게 및 제한없이 이해될 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되었으며, 이러한 용어 및 표현을 사용하여 제시되고 기재된 특색의 임의의 균등물 또는 그의 일부를 배제하려는 의도는 없으나, 다양한 변형은 청구된 본 발명의 범주 내에서 가능한 것으로 인식된다. 그러므로, 본 발명이 예시적인 실시양태 및 임의의 특색에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 본 명세서에 구현된 발명의 변형 및 변경은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 재분류될 수 있으며, 이러한 변형 및 변경은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주됨을 이해해야 한다.

실시예 7: 단일특이적 IgG 포맷의 인간화 4G8 변이체

본 발명의 생성된 항체 변이체의 우월성을 시험하기 위해, 새로운 가변 도메인 서열을 단일특이적 항-FLT3 인간 IgG 포맷으로 클로닝하였다. 이를 위해, 각각의 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 단일특이적 인간 IgG 포맷으로 클로닝하였다. 이를 위해, 항체 유전자를 인간 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화하였고, 5' 및 3' 단부에 NheI 및 Not 제한 부위로 설계하였다. 유전자를 합성한 후, 하기 표준 절차에 따라 포유류 발현 벡터로 클로닝하였다. 서열 검증 후, 플라스미드를 플라스미드 플러스 정제 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 형질감염에 충분한 양으로 제조하였다.

HEK 293 (인간 배아 신장 293) 포유류 세포를 일시적 형질감염을 위한 최적 단계로 계대배양하였다. 세포를 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시키고, 추가 6일 동안 배양하였다.

배양물을 4000 rpm에서 원심분리에 의해 수확하고, 0.22 mm 필터를 통해 여과하였다. 정제의 제1 단계를 400 mM 이미다졸을 함유하는 PBS를 사용한 용출로 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 정제의 제2 단계를 PBS (포스페이트 완충된 염수) pH7.2에서의 용출로 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 항체 농도를 UV 분광법에 의해 결정하고, 항체를 필요에 따라 농축시켰다. 항체 순도를 SDS-PAGE (나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 및 HPLC (고성능 액체 크로마토그래피)에 의해 결정하였다. 0.2 ml/분으로 PBS에서 실행되는 MabPac 크기 배제 컬럼을 사용하여 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 기기에서 HPLC를 수행하였다.

생성된 4G8 변이체의 우월성을 설명하기 위해, V4 변이체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열 (각각 서열식별번호: 21 및 22에 제시된 바와 같은 가변 도메인 중쇄 및 경쇄 서열)을 갖는 단일특이적 IgG를 ADCC 검정에서 모 (마우스) IgG V6 (각각 서열식별번호: 4 및 8에 제시된 바와 같은 가변 도메인 중쇄 및 경쇄 서열) 및 Fc 대조군과 비교하였다. 이를 위해, 이전에 기재된 바와 같이 미국 세인트 주드 소아병원(St Jude's Children's Research Hospital)으로부터 수득된 K562-41BBL-IL15 피더 세포와 비-플라스틱 접착성 PBMC의 인큐베이션에 의해 pNKC를 생성하였다 (Schmiedel BJ et al. Int J Cancer 2011; 128: 2911-2922; Fujisaki H et al. Cancer Res 2009; 69: 4010-4017). BATDA-유로퓸 사멸을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Baessler T et al. Cancer Res 2009: 69: 1037-1045). 결과는 도 11에 제시되어 있다.

도 11의 데이터는 표시된 이펙터:표적 비율에서 하나의 pNKC 공여자에 대한 예시적인 결과를 제시한다. V6 FLT3 단일특이적 IgG 항체 변이체와 비교하여 V4에 대한 우수한 용해 속도는 이 실험 환경에서 관찰될 수 있으므로, 이는 모 4G8 항체와 비교하여 본 발명의 변이체의 개선된 치료적 잠재력을 입증한다.

SEQUENCE LISTING <110> Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des oeffentlichen Rechts Eberhard Karls Universitaet Tuebingen <120> IMPROVED ANTI-FLT3 ANTIGEN BINDING PROTEINS <130> D31605WO <150> EP18193889.5 <151> 2018-09-11 <150> EP19189566.3 <151> 2019-08-01 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 1 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 2 Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 3 Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe 1 5 <210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 5 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 6 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 7 Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 9 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 10 <211> 98 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 10 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 11 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 12 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 10 15 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 20 25 30 Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 65 70 75 80 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln 85 90 95 Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 <210> 13 <211> 109 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 13 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly 100 105 <210> 14 <211> 244 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr 165 170 175 Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr 210 215 220 Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 16 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 18 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 20 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 22 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 24 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 244 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr 165 170 175 Lys Gly Val Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr 210 215 220 Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 26 <211> 244 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr 165 170 175 Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr 210 215 220 Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 27 <211> 244 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu 180 185 190 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys <210> 28 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 28 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 29 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 29 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 30 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 31 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 31 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 32 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 33 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 33 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 34 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 35 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 35 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 36 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 37 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 37 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 38 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 39 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 39 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 40 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 41 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 41 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 42 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 43 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 43 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 44 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 44 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 45 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 45 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 46 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 47 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 47 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 48 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 49 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 49 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 50 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 51 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 51 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 52 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 52 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 53 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 53 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 54 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 54 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 55 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 55 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 56 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 56 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 57 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 57 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 58 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 450 455 460 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 465 470 475 480 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 485 490 495 Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys 500 505 510 Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala 515 520 525 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 530 535 540 Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 545 550 555 560 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 580 585 590 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 595 600 605 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 610 615 620 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu 625 630 635 640 Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 645 650 655 Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 660 665 670 Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 675 680 685 Lys Val Glu Ile Lys 690 <210> 59 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 59 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 60 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 60 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 450 455 460 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 465 470 475 480 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 485 490 495 Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys 500 505 510 Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala 515 520 525 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 530 535 540 Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 545 550 555 560 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 580 585 590 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 595 600 605 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 610 615 620 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu 625 630 635 640 Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 645 650 655 Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 660 665 670 Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 675 680 685 Lys Val Glu Ile Lys 690 <210> 61 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 61 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 62 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 62 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 450 455 460 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 465 470 475 480 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 485 490 495 Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys 500 505 510 Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala 515 520 525 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 530 535 540 Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 545 550 555 560 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 580 585 590 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 595 600 605 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 610 615 620 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu 625 630 635 640 Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 645 650 655 Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 660 665 670 Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 675 680 685 Lys Val Glu Ile Lys 690 <210> 63 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 63 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 64 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 450 455 460 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 465 470 475 480 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 485 490 495 Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys 500 505 510 Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala 515 520 525 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 530 535 540 Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 545 550 555 560 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 580 585 590 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 595 600 605 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 610 615 620 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu 625 630 635 640 Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 645 650 655 Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 660 665 670 Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 675 680 685 Lys Val Glu Ile Lys 690 <210> 65 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 65 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 66 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 66 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 450 455 460 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 465 470 475 480 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 485 490 495 Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys 500 505 510 Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala 515 520 525 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 530 535 540 Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 545 550 555 560 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 580 585 590 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 595 600 605 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 610 615 620 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu 625 630 635 640 Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 645 650 655 Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 660 665 670 Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 675 680 685 Lys Val Glu Ile Lys 690 <210> 67 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 67 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 68 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 68 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 69 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 69 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 70 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 70 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 71 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 71 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 72 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 72 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 73 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 73 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 74 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 74 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 450 455 460 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 465 470 475 480 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 485 490 495 Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys 500 505 510 Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala 515 520 525 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 530 535 540 Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 545 550 555 560 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 580 585 590 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 595 600 605 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 610 615 620 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu 625 630 635 640 Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 645 650 655 Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 660 665 670 Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 675 680 685 Lys Val Glu Ile Lys 690 <210> 75 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 75 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 76 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 76 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 77 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 77 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 78 <211> 693 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 78 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 435 440 445 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 450 455 460 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 485 490 495 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 515 520 525 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 530 535 540 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 565 570 575 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 580 585 590 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val 595 600 605 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro 610 615 620 Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 625 630 635 640 Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 645 650 655 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 660 665 670 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 675 680 685 Val Thr Val Ser Ser 690 <210> 79 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variant antibody sequence <400> 79 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims

하기를 포함하는, 인간 fms 관련 티로신 키나제 3 (FLT3)에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질 (ABP)로서:
(i) 서열식별번호: 01 (SYWMH)에 기재된 CDRH1 영역, 서열식별번호: 02 (EIDPSDSYKDYNQKFKD)에 기재된 CDRH2 영역, 및 서열식별번호: 03 (AITTTPFDF)에 기재된 CDRH3 영역을 포함하거나, 또는 여기서 각각의 경우에 독립적으로 CDRH1, CDRH2 및/또는 CDRH3이 각각 서열식별번호: 01, 서열식별번호: 02 또는 서열식별번호: 03과 비교하여 3개 또는 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 서열을 포함하는 것인 1개, 바람직하게는 2개의 중쇄 가변 도메인(들); 및
(ii) 서열식별번호: 05 (RASQSISNNLH)에 기재된 CDRL1 영역, 서열식별번호: 06 (YASQSIS)에 기재된 CDRL2 영역, 및 서열식별번호: 07 (QQSNTWPYT)에 기재된 CDRL3 영역을 포함하거나, 또는 여기서 각각의 경우에 독립적으로 CDRL1, CDRL2 및/또는 CDRL3이 각각 서열식별번호: 05, 서열식별번호: 06 또는 서열식별번호: 07과 비교하여 3개 또는 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)을 갖는 서열을 포함하는 것인 1개, 바람직하게는 2개의 경쇄 가변 도메인(들);
상기 1개, 바람직하게는 2개의 중쇄 가변 도메인(들) 및 상기 1개, 바람직하게는 2개의 경쇄 가변 도메인(들)은 각각 인간 항체 컨센서스 프레임워크 서열의 적어도 일부분을 갖는 항체 프레임워크 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 ABP.
제1항에 있어서, 중쇄 가변 도메인 인간 항체 컨센서스 프레임워크 서열이 IGHV1-46, 바람직하게는 IGHV1-46*3으로부터 유래되고/거나 중쇄 가변 도메인 인간 항체 컨센서스 프레임워크 서열이 IGKV3D-15로부터 유래되는 것인 ABP.
제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 15, 17, 19, 21, 23 또는 76으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 각각의 경우에 독립적으로, 임의로 이들 서열과 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개 이하, 바람직하게는 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 삽입(들) 또는 결실(들)을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/거나; 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 16, 18, 20, 22, 24 또는 77로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 각각의 경우에 독립적으로, 임의로 이들 서열과 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개 이하, 바람직하게는 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환(들), 삽입(들) 또는 결실(들)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABP.
제3항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 아미노산 위치 16, 18, 19, 20, 22, 48, 57, 60, 69, 70, 75, 76, 78, 80, 81, 87 및 108이 서열식별번호: 15, 17, 19, 21 또는 23 중 어느 하나에서와 같고/거나; 경쇄 가변 영역에서 아미노산 위치 49, 55 및 87이 서열식별번호: 16, 18, 20, 22 또는 24 중 어느 하나에서와 같으며; 여기서 넘버링은 카바트(Kabat) 시스템에 따른 것인 ABP.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 21에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 22에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABP.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 76에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 77에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABP.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 48I를 포함하고, 경쇄 가변 영역이 87F를 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 시스템에 따른 것인 ABP.
제7항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 49K를 추가로 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 시스템에 따른 것인 ABP.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ABP가 적어도 1개, 바람직하게는 2개의 항체 중쇄 서열(들) 및 적어도 1개, 바람직하게는 2개의 항체 경쇄 서열(들)로 구성된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 상기 항체 중쇄 서열(들) 및 항체 경쇄 서열(들)은 각각 하기 조합 V0 내지 V5 중 하나에서의 가변 영역 서열을 포함하는 것인 ABP:
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 50 μM 미만 및 50 nM 초과인 k_D로 상기 FLT3에 결합하고; 바람직하게는 1 μM 미만 및 300 nM 초과인 k_D로 상기 FLT3에 결합하는 ABP.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 10 nM 미만 및 0.5 nM 초과인 EC₅₀으로 FLT3을 발현하는 인간 세포에 결합하는 ABP.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 5.5 nM 미만 및 4.5 nM 초과인 EC₅₀으로 FLT3을 발현하는 인간 세포에 결합하는 ABP.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 그룹을 포함하고/거나 표지된 ABP.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단리되고/거나 실질적으로 순수한 ABP.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 예컨대 모노클로날 항체이거나; 또는 항체의 단편, 예컨대 모노클로날 항체의 단편인 ABP.
제15항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체, 예컨대 인간-키메라 항체인 ABP.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 항체가 IgG, IgE, IgD, IgA 또는 IgM 이뮤노글로불린; 바람직하게는 IgG 이뮤노글로불린인 ABP.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 F(ab')2로 이루어진 목록으로부터 선택된 항체 단편인 ABP.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABP가 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 증가시키도록 변형되거나 또는 조작되고, 바람직하게는 상기 ABP가 비-푸코실화된 것인 ABP.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FLT3 이외의 항원(들); 예컨대 포유류 T-세포 상에 존재하는 항원(들), 가장 바람직하게는 인간 CD3에 결합하는 하나 이상의 추가 항원 결합 도메인(들)을 포함하는 ABP.
제20항에 있어서, 이중특이적이고, 바람직하게는 FLT3에 결합하는 2개의 결합 부위 및 상기 FLT3 이외의 항원, 예컨대 포유류 T-세포 상에 존재하는 항원(들), 가장 바람직하게는 인간 CD3에 결합하는 2개의 결합 부위를 포함하는 ABP.
제21항에 있어서, 상기 FLT3 이외의 항원에 결합하는 2개의 결합 부위가 인간 CD3에 결합하고, 바람직하게는 UCHT1 항-CD3 scFv 구축물, 예컨대 서열식별번호: 14에 제시된 scFv를 포함하는 것인 ABP.
제22항에 있어서, 2개의 항체 중쇄 서열 및 2개의 항체 경쇄 서열을 포함하며, 여기서 상기 항체 중쇄 서열 및 항체 경쇄 서열은 각각 하기 조합 V0 내지 V5 중 어느 하나에서의 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABP:
인간 FLT3에 결합할 수 있고 FLT3에 대한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 ABP의 결합과 경쟁할 수 있는 항원 결합 단백질 (ABP) 또는 그의 항원-결합 단편.
인간 fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3) 항원에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인, 및 인간 분화 클러스터 3 (CD3) 항원에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 단백질 (ABP)로서, 여기서 이중특이적 ABP는
a. 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 장치를 사용하는 유동 세포계측법에 의해 FLT3 양성 세포에 대한 이중특이적 ABP의 결합을 분석함으로써 결정된 바와 같은 10 nM 미만의 EC₅₀으로 FLT3에 결합하고;
b. 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 장치를 사용하는 유동 세포계측법에 의해 CD3 양성 세포에 대한 이중특이적 ABP의 결합을 분석함으로써 결정된 바와 같은 200 nM 미만의 EC₅₀으로 CD3에 결합하는 것인
이중특이적 ABP.
제25항에 있어서, 이중특이적 ABP가 0.5 nM 초과의 EC₅₀으로 FLT3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.
제25항 또는 제26항에 있어서, 이중특이적 ABP가 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 50 μM 미만의 k_D로 FLT3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 ABP가 1 nM 초과의 EC₅₀으로 CD3에 결합하는 것인 이중특이적 ABP.
제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 비관련 대조군과 비교하여 시험관내 검정에서 급성 백혈병을 앓고 있는 환자의 백혈병 혈액 단핵 세포의 증식 및/또는 생존력을 50% 이하로 억제하는 이중특이적 ABP.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 그 초과도 미만도 아닌 2개의 제1 항원 결합 도메인 및 2개의 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 ABP.
제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체에서 Fc 수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 CH2 도메인의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결여되거나 또는 돌연변이된 것인 이중특이적 ABP.
제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 ABP 또는 그의 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 이중특이적 ABP.
제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 및 FLT3 발현 종양 세포에 결합하는 활성을 가지며, 바람직하게는 항체가 FLT3 및 CD3에 대한 결합에 의해 FLT3 발현 종양 세포에 대한 T-세포의 동원을 증가시키는 것인 이중특이적 ABP.
제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 UCHT1의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 이중특이적 ABP.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 ABP 또는 ABP의 항원 결합 단편 또는 단량체, 예컨대 중쇄 또는 경쇄를 코딩하거나, 또는 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 ABP를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산.
세포에서 제35항의 핵산 및 코딩된 ABP 또는 이중특이적 ABP의 발현을 허용하는 하나 이상의 추가 서열 특색, 또는 상기 ABP 또는 이중특이적 ABP의 구성성분 (예컨대 항체 중쇄 또는 경쇄)을 포함하는 핵산 구축물 (NAC).
제35항의 핵산 또는 제36항에 따른 NAC를 포함하는 재조합 숙주 세포.
(i) 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 ABP 또는 이중특이적 ABP, 또는 (ii) 제35항의 핵산 또는 제36항에 따른 NAC, 또는 (iii) 제37항에 따른 재조합 숙주 세포, 및 제약상 허용되는 담체, 안정화제 및/또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
의약에 사용하기 위한 구성성분으로서, 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 ABP 또는 이중특이적 ABP, 제35항의 단리된 핵산 또는 제36항에 따른 NAC, 제37항에 따른 재조합 숙주 세포 및 제38항에 따른 제약 조성물로 이루어진 목록으로부터 선택된 구성성분.
제39항에 있어서, 구성성분이 FLT3 양성 종양 세포의 T 세포-매개 사멸의 증진 및/또는 증식의 억제에 사용하기 위한 것인 구성성분.
제33항 또는 제34항에 있어서, 구성성분이 증식성 질환의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이며, 여기서 증식성 장애는 발현 FLt3과 연관되고, 바람직하게는 암, 예컨대 백혈병, 예컨대 급성 골수성 백혈병 (AML) 또는 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), 또는 전립선암, 결장직장암, 위암, 폐 암종, 골육종, 유선암, 췌장암, 또는 편평 세포 암종으로부터 선택된 고형 암으로부터 선택된 암이고; 바람직하게는 암이 백혈병, 예컨대 AML 또는 ALL인 구성성분.
인간 FLT3을 발현하는 인간 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 증진시키는 방법으로서, 면역 세포, 예컨대 T-세포 또는 자연 살해 (NK) 세포의 존재 하에 상기 세포를 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 ABP, 또는 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 ABP, 또는 제35항에 따른 상기 ABP 또는 이중특이적 ABP를 코딩하는 핵산과 접촉시키며, 그에 의해 상기 인간 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 증진시키는 것을 포함하는 방법.
대상체에서의 증식성 장애의 예방 및/또는 치료 방법으로서, 제39항에서 인용된 구성성분의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며; 여기서 증식성 장애는 증식성 장애와 연관된 세포에서의 FLT3의 발현을 특징으로 하는 것인 방법.