KR20210094610A - c-Kit에 대한 인간화 항체 - Google Patents

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KR20210094610A
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지 리우
카비타 솜팔리
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포티 세븐, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 c-Kit에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 내인성 HSPC 제거를 필요로 하는 대상체에게 유효 요법의 상기 기술된 바와 같은 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 내인성 HSPC를 제거하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 암을 앓는 대상체에게 유효 요법의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, c-Kit를 발현하는 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 c-Kit 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다.

Description

c-Kit에 대한 인간화 항체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 11월 26일 출원된 62/771,526의 이익을 주장하고, 이는 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
서열 목록에 관한 언급
본 출원은 2019년 11월 25일 작성된, 31,466 바이트의 txt 파일 540687US SL_ST25 서열을 포함하고, 이는 참조로 포함된다.
c-Kit (CD117)는, "스틸 인자(steel factor)" 또는 "c-Kit 리간드"로도 알려져 있는, 특정 유형의 세포가 성장하도록 하는 물질인 줄기 세포 인자 (SCF)에 결합하는 수용체 티로신 키나제 타입 III이다. 상기 수용체가 줄기 세포 인자에 결합하였을 때, 이는 이량체를 형성하여 그의 고유한 티로신 키나제 활성을 활성화시킴으로써 결과적으로는 신호 전달 분자를 인산화시키고, 활성화시켜 세포에서 신호를 전파시킨다. C-Kit는 골수에서 특정 유형의 HSPC를 확인하는 데 사용되는 세포 표면 마커이다. 조혈 줄기 세포 (HSC), 다능성 전구체 (MPP), 및 일반 골수 전구체 (CMP)는 고수준의 c-Kit를 발현한다. 줄기 세포 대체 요법에서 내인성 세포를 제거하는 데 c-Kit에 대한 항체가 사용될 수 있다는 것이 제안되었다 (WO2016033201, WO2008067115).
본 발명은, 각각 서열식별번호(SEQ ID NO:) 2-4의 카바트(Kabat)에 의해 정의된 바와 같은 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 성숙한 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열식별번호 6-8의 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함하며, 예외적으로 중쇄 위치 60에서 N에서 A로의, 중쇄 위치 64에서 K에서 Q로의, 및 경쇄 위치 30에서 N에서 Q로의 치환으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 CDR 잔기 치환(들)이 존재하고, 여기서 위치는 카바트에 따라 넘버링된 것인, 인간 c-Kit에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
임의적으로, 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR H1, H2 및 H3은 각각 서열식별번호 2-4이고, 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR L1, L2 및 L3은 각각 서열식별번호 6-8이며, 예외적으로 중쇄 위치 64에서 K에서 Q로의, 및 경쇄 위치 30에서 N에서 Q로의 치환이 존재한다.
임의적으로, 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR H1, H2 및 H3은 각각 서열식별번호 2-4이고, 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR L1, L2 및 L3은 각각 서열식별번호 6-8이며, 예외적으로 중쇄 위치 60에서 N에서 A로의, 중쇄 위치 64에서 K에서 Q로의, 및 경쇄 위치 30에서 N에서 Q로의 치환이 존재한다.
임의적으로, 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호 13, 17 또는 21 (AH2, AH3 또는 AH4)과 적어도 85, 90, 95, 98, 또는 99%의 서열 동일성을 나타내고, 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호 53 (NL2)과 적어도 85, 90, 95, 98, 99%의 서열 동일성을 나타내며, 단 명시된 서열식별번호로부터의 임의의 변이는 CDR 밖에 있다.
임의적으로, 카바트 넘버링에 의하면, 중쇄 위치 1은 E이다. 임의적으로, 성숙한 경쇄 가변 영역의 하기 위치는 하기와 같이 아미노산에 의해 점유된다: 위치 9는 L에 의해 점유, 위치 12는 P에 의해 점유, 위치 14는 T에 의해 점유, 위치 15는 P에 의해 점유, 위치 18은 P에 의해 점유, 위치 20은 S에 의해 점유, 위치 22는 S에 의해 점유, 위치 37은 L에 의해 점유, 위치 43은 S에 의해 점유, 위치 45는 Q에 의해 점유, 위치 74는 K에 의해 점유, 위치 77은 R에 의해 점유, 위치 78은 V에 의해 점유, 위치 79는 E에 의해 점유, 위치 84는 G에 의해 점유. 임의적으로, 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호 13, 17 또는 21로부터 선택되는 서열을 가지며, 예외적으로 위치 1은 E일 수 있고, 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호 53의 서열을 갖는다. 임의적으로, 성숙한 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 연결되고, 성숙한 경쇄 가변 영역은 성숙한 경쇄 불변 영역에 연결된다. 임의적으로, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1이다. 임의적으로, 항체는 AMG191에 비해 증강된, 인간 c-Kit에의 결합을 갖는다. 임의적으로, 항체는 AMG191-IgG1에 비해 증강된 ADCP를 갖는다. 임의적으로, 항체는 AMG191-IgG1에 비해 증강된 ADCC를 갖는다.
본 발명은 상기 기술된 바와 같은 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 내인성 HSPC 제거를 필요로 하는 대상체에게 유효 요법의 상기 기술된 바와 같은 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 내인성 HSPC를 제거하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 암을 앓는 대상체에게 유효 요법의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, c-Kit를 발현하는 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
정의
모노클로날 항체 또는 다른 생물학적 엔티티는 전형적으로 단리된 형태로 제공된다. 이는, 항체 또는 다른 생물학적 엔티티가 그의 생산 또는 정제로부터 발생하는 간섭 단백질 및 다른 오염물질 없이 전형적으로 적어도 50% w/w로 순수하지만, 모노클로날 항체가 그의 사용을 촉진하기 위해 의도된 과량의 제약상 허용되는 담체(들) 또는 다른 비히클과 조합될 수 있는 가능성은 배제하지 않음을 의미한다. 때때로, 모노클로날 항체는 생산 또는 정제로부터의 간섭 단백질 및 오염물질 없이 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% w/w 순수하다. 대개 단리된 모노클로날 항체 또는 다른 생물학적 엔티티는 그의 정제 후 남아있는 우세한 거대분자 종이다.
특이적 결합은 규모면에서 검출가능하게 더 크고, 적어도 하나의 비관련 표적에 대해 발생하는 비-특이적 결합으로부터 구별될 수 있다. 특이적 결합은 특정한 작용기 또는 특정 공간 피트 (예컨대, 자물쇠와 열쇠(lock and key) 유형) 사이의 결합 형성의 결과일 수 있는 반면, 비특이적 결합은 보통 반데르발스 힘의 결과이다. 그러나, 특이적 결합은 반드시 항체가 하나 및 단 하나의 표적에 결합함을 내포하지는 않는다. 본 발명의 항체는 전형적으로 적어도 108, 109, 1010, 1011 또는 1012 M-1의 친화도로 c-Kit에 특이적으로 결합한다.
기본 항체 구조 단위는 서브유닛으로 이루어진 사량체이다. 각 사량체는, 각 쌍이 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는 것인, 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄 쌍을 포함한다. 각 쇄의 아미노-말단부는 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 포함한다. 상기 가변 영역이 먼저 발현되어 절단가능 신호 펩티드에 연결된다. 신호 펩티드가 없는 가변 영역은 때때로 성숙한 가변 영역으로 지칭된다. 따라서, 예를 들어, 경쇄 성숙한 가변 영역은 경쇄 신호 펩티드가 없는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 각 쇄의 카르복시-말단부는 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 항체의 이소타입을 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 여기서 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7] (상기 문헌은 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로 포함된다)을 참조한다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 (이는 또한 본원에서 각각 "경쇄 가변 도메인" ("VL 도메인") 또는 "중쇄 가변 도메인" ("VH 도메인")으로도 지칭)은 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이 개입된 "프레임워크" 영역으로 이루어진다. 프레임워크 영역은 항원의 에피토프에의 특이적인 결합을 위해 CDR을 정렬하는 역할을 한다. CDR은 주로 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 포함한다. 아미노-말단에서 카르복실-말단으로, VL 및 VH 도메인, 둘 모두 하기 프레임워크 (FR) 및 CDR 영역: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4를 포함한다. VL 도메인의 CDR 1, 2, 및 3은 또한 본원에서 각각 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3으로 지칭되고; VH 도메인의 CDR 1, 2, 및 3은 또한 본원에서 각각 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3으로 지칭된다.
각 VL 및 VH 도메인에의 아미노산 배정은 CDR에 관한 임의의 통상의 정의에 따른다. 통상의 정의는 카바트 정의 (문헌 [Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991]), 코티아(Chothia) 정의 (문헌 [Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987]; [Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989]); CDR-H1이 코티아 및 카바트 CDR의 복합물인 코티아 카바트 CDR의 복합물; 옥스퍼드 몰레큘러(Oxford Molecular)의 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되는 AbM 정의; 및 마틴(Martin) 등의 콘택트 정의 (월드 와이드 웹 bioinfo.org.uk/abs)를 포함한다. 카바트는, 상이한 중쇄 사이, 또는 상이한 경쇄 사이의 상응하는 잔기에 동일한 번호가 배정되는, 널리 사용되는 넘버링 협약 (카바트 넘버링)을 제공한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체의 가변 영역내 위치의 넘버링은 카바트 넘버링이다. 항체가 CDR의 특정 정의 (예컨대, 카바트)에 의해 CDR을 포함하는 것으로 언급될 때, 그 정의는 항체에 존재하는 CDR 잔기 (즉, 카바트 CDR)의 최소 개수를 지정한다. 또 다른 통상의 CDR 정의 내에 있지만, 명시된 정의 밖에 있는 다른 잔기가 또한 존재한다는 것을 배제하지 않는다. 예를 들어, 카바트에 의해 정의된 CDR을 포함하는 항체는 다른 가능성 중에서, CDR이 카바트 CDR 잔기를 포함하고, 다른 CDR 잔기를 포함하지 않는 항체, 및 CDR H1이 복합 코티아-카바트 CDR H1이고, 다른 CDR은 카바트 CDR 잔기는 함유하지만, 다른 정의에 기초한 추가의 CDR 잔기는 함유하지 않는 항체를 포함한다.
"항체"라는 용어는 무손상 항체 및 그의 결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dab, 나노바디, 및 Fv를 비롯한 단편은 그의 유래 기점이 된 무손상 항체와 표적에의 특이적 결합에 대하여 경쟁한다. 단편은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 생성될 수 있다. "항체"라는 용어는 또한 이중특이적 항체 및/또는 인간화 항체를 포함한다. 이중특이적 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다 (예컨대, 문헌 [Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990)]; [Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)] 참조).
예시적인 이중특이적 항체는 또한 (1) 각 경쇄 및 중쇄가 짧은 펩티드 연결부를 통해 일렬로 2개의 가변 도메인을 함유하는 것인, 이중-가변-도메인 항체 (DVD-Ig) (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) 각각의 표적 항원에 대해 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성하는 2개의 단일 쇄 디아바디의 융합체인 Tandab; (3) 다가 분자를 생성하는 디아바디와 scFv의 조합인, 플렉시바디(flexibody); (4) Fab에 적용하는 경우, 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어진 3가 이중특이적 결합 단백질을 수득할 수 있는, 단백질 키나제 A에서의 "이량체화 및 도킹 도메인"에 기초한, 소위 "독(dock) 및 록(lock)" 분자라고 하는 것; 또는 (5) 예컨대, 인간 Fc-영역의 둘 모두에 융합된 두 scFv를 포함하는, 소위 스콜피온(Scorpion) 분자라고 하는 것일 수 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 데 유용한 플랫폼의 예로는 BiTE (마이크로메트(Micromet)), DART (마크로제닉스(MacroGenics)), Fcab 및 Mab2 (F-스타(F-star)), Fc-조작된 IgG1 (젠크로(Xencor)) 또는 듀오바디(DuoBody) (Fab 아암 교환을 기반으로 함, 젠맙(Genmab))를 포함한다.
"에피토프"라는 용어는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 인접 아미노산 또는 하나 이상의 단백질의 3차 폴딩에 의해 나란히 놓인 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프 (선형 에피토프로도 공지)는 전형적으로 변성 용매에 노출된 때에도 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프 (입체형태적 에피토프로도 공지)는 전형적으로 변성 용매로 처리시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 공유한 공간 입체형태 중 적어도 3, 및 더욱 일반적으로, 적어도 5 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 입체형태를 결정하는 방법으로는 예를 들어, x-선 결정학법 및 2차원 핵자기 공명을 포함한다. 예컨대, 문헌 [Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다.
항체 사이의 경쟁은 시험하에서 항체가 참조 항체의 공통 항원에의 특이적인 결합을 억제시키는 검정법에 의해 결정된다 (예컨대, 문헌 [Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990] 참조). 과량의 시험 항체 (예컨대, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)가 경쟁 결합 검정법에서 측정 시, 참조 항체의 결합을 적어도 50%만큼 억제시킨다면, 시험 항체는 참조 항체와 경쟁하는 것이다. 일부 시험 항체는 참조 항체의 결합을 적어도 75%, 90% 또는 99%만큼 억제시킨다. 경쟁 검정법에 의해 확인된 항체 (경쟁 항체)는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체 장애가 발생하도록, 참조 항체가 결합하는 에피토프에 충분히 가까운 위치에 있는 인접한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
"제약상 허용되는"이라는 용어는 담체, 희석제, 부형제, 또는 보조제가 제제의 다른 성분들과 화합성이고, 그의 수용자에게 실질적으로 유해하지 않고/거나, 상기 담체, 희석제, 부형제, 또는 보조제는 인간에게로의 비경구적 투여용 제약 조성물 중에 포함시키는 것에 관하여 FDA의 승인을 받았거나, 또는 승인을 받을 가능성이 있음을 의미한다.
"대상체"라는 용어는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 피험체를 포함한다.
아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적인 것으로 분류하기 위한 목적으로, 아미노산은 하기와 같이 분류된다: 그룹 I (소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II (중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III (산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV (염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V (쇄 배향에 영향을 주는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI (방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 부류 중의 아미노산 사이의 치환을 포함한다. 비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 구성원 대신으로 교환하는 것으로 구성된다.
서열 동일성(%)은 카바트 넘버링 협약에 의해 최대로 정렬된 항체 서열들을 이용하여 결정된다. 정렬 후, 대상 항체 영역 (예컨대, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙한 가변 영역)을 참조 항체의 동일한 영역과 비교한다면, 대상 항체 영역과 참조 항체 영역 사이의 서열 동일성(%)은 대상 항체 영역과 참조 항체 영역, 둘 모두에서 동일한 아미노산에 의해 점유되는 위치의 개수를 두 영역의 정렬된 위치의 총 개수로 나누고 (여기서, 갭은 계수되지 않고), 여기에 100을 곱하여 백분율로 변환시킨 것이다.
하나 이상의 언급된 요소를 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하는(including)" 조성물 또는 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소도 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 "포함하는(comprises)" 또는 "포함하는(includes)" 조성물은 항체만 단독으로, 또는 다른 성분과 함께 조합하여 함유할 수 있다.
값의 범위의 지정은 범위내 또는 범위를 정의하는 모든 정수, 및 범위내 정수에 의해 정의되는 모든 부분범위를 포함한다.
맥락상 분명하게 다르게 간주되지 않는 한, "약"이라는 용어는 언급된 값의 측정의 표준 오차 한계 (예컨대, SEM) 내의 값과 같은 비실질적인 변동을 포함한다.
통계적 유의도는 p<0.05를 의미한다.
인간화 항체는, 비-인간 "공여자" 항체로부터의 CDR이 인간 "수용자" 항체 서열 내로 이식된 유전적으로 조작된 항체이다 (예컨대, US 5,530,101 및 5,585,089 (퀸(Queen)); US 5,225,539 (윈터(Winter); US 6,407,213 (카터(Carter)); US 5,859,205 (어데어(Adair)); 및 US 6,881,557 (푸테(Foote)) 참조). 수용자 항체 서열은 예를 들어, 성숙한 인간 항체 서열, 상기 서열의 복합체, 인간 항체 서열의 컨센서스 서열, 또는 생식계열 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 전적으로 또는 실질적으로 공여자 항체로부터의 CDR, 및 존재할 경우, 전적으로 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역을 갖는 항체이다. (카바트에 의해 정의된 바) 각 CDR 사이에 상응하는 잔기 중 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 동일할 때, 인간화 항체 중 CDR은 실질적으로 비-인간 항체 중의 상응하는 CDR로부터의 것이다. 카바트에 의해 정의된 상응하는 잔기 중 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 인간 수용자 서열과 동일할 때, 항체 쇄의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 쇄의 불변 영역은 실질적으로 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터의 것이다.
도 1a 및 1b는 HB-10716으로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 마우스 항-c-Kit 항체의 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 보여주는 것이다.
도 2a 및 2b는 마우스 및 인간 수용자 서열과 비교된, 본 발명의 5개의 인간화 중쇄 성숙한 가변 영역 및 2개의 인간화 경쇄 성숙한 가변 영역의 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 보여주는 것이다. 인간화 서열의 가변 영역 프레임워크는 AMG191의 것과 동일하지만, CDR은 상이하다.
도 2c는 AMG191을, CDR 치환을 갖는 그의 변이체와 결합에 관하여 비교하는 것이다. CDR 치환된 변이체들 모두 증강된 결합을 보였다.
도 2d는 AMG191을, 다른 CDR 치환을 갖는 변이체와 결합에 관하여 비교하는 것이다. 이들 변이체들은 감소된 결합을 보였다.
도 3a 및 3b는 AMG191, 마우스 서열 및 인간 수용자 서열과 비교된, 6개의 인간화 중쇄 성숙한 가변 영역 및 3개의 인간화 경쇄 성숙한 가변 영역의 서열을 제공하는 것이다. 이들 인간화 쇄에서, 가변 영역 프레임워크는 AMG191 항체 중의 것과 상이하다. 인간화 쇄 중 일부는 또한 CDR도 상이하다.
도 3c는 AMG191을, (상이한 인간 수용자 서열 사용으로부터 생성된) CDR은 동일하지만, 가변 영역 프레임워크는 상이한 인간화 항체와 결합에 관하여 비교하는 것이다. 신규 프레임워크 (NF)를 갖는 항체는 더 높은 친화도를 갖는다.
도 3d는 AMG191을, AMG191과 비교하여 신규 프레임워크에 기반하고, 또는 CDR 치환을 갖는 추가의 인간화 변이체와 결합에 관하여 비교하는 것이다. 변이체 항체 3개 모두 더 높은 친화도를 갖는다.
도 4는 AMG191을, CDR 치환 및 상이한 경쇄 가변 영역 프레임워크 (중쇄 가변 영역 프레임워크는 동일)의 존재에 의해 AMG191과 상이한 3개의 인간화 항체와 결합에 관하여 비교하는 것이다. 변이체 항체 3개 모두 더 높은 친화도를 갖는다.
도 5는 AMG191, 야생형 IgG1 불변 영역을 갖는 AMG191의 변이체를, 본 발명의 신규 인간화 항체 5개와 식세포 활성에 관하여 비교하는 것이다. 신규 변이체, 특히, HF12 및 NF112는 특히 시험된 더 낮은 저농도에서 증가된 식세포용해를 보였다.
도 6은 AMG191을, 2개의 신규 인간화 변이체 HF112 및 HF12 및 이소타입 매칭된 비관련 대조군과 ADCC 활성에 관하여 비교하는 것이다. HF112 및 HF12는 더욱 큰 ADCC 활성을 가졌다.
도 7은 AMG191, AMG191-인간 IgG1 및 음성 대조군과 비교된 HF12 및 HF112에 의한, SCF-유도성 HSPC 증식 억제를 보여주는 것이다.
도 8은 항-c-Kit 항체를, 대조군 A23187 및 IgE + 항-IgE와 비교하여, 비만 세포 탈과립화에 관하여 비교하는 것이다.
서열의 간단한 설명
서열식별번호 1-4는 HB-10716의 항체의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 CDR-H1, H2 및 H3이다.
서열식별번호 5-8은 HB-10716의 항체의 성숙한 경쇄 가변 영역 및 CDR-L1, L2 및 L3이다.
서열식별번호 9-12는 인간화 중쇄 AH1의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 CDR-H1, H2 및 H3이다.
서열식별번호 13-16은 인간화 중쇄 AH2의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 CDR-H1, H2 및 H3이다.
서열식별번호 17-20은 인간화 중쇄 AH3의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 CDR-H1, H2 및 H3이다.
서열식별번호 21-24는 인간화 중쇄 AH4의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 CDR-H1, H2 및 H3이다.
서열식별번호 25-28은 인간화 중쇄 AH5의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 CDR-H1, H2 및 H3이다.
서열식별번호 29는 AMG191의 성숙한 중쇄 가변 영역이다.
서열식별번호 30은 IGHV1-46*01의 가변 영역 서열이다.
서열식별번호 31-34는 인간화 경쇄 가변 영역 AL1의 성숙한 경쇄 가변 영역 및 CDR-L1, L2 및 L3이다.
서열식별번호 35-38은 인간화 경쇄 AL2의 성숙한 경쇄 가변 영역 및 CDR-L1, L2 및 L3이다.
서열식별번호 39는 AMG191의 성숙한 경쇄 가변 영역이다.
서열식별번호 40-43은 IGKV4-1*01의 가변 영역 서열, 및 3개의 CDR-L1, L2 및 L3이다.
서열식별번호 44-50은 인간화 중쇄 NH, NH1, NH2, NH3, NH4 및 NH5, 및 IGHV3-23*01의 성숙한 중쇄 가변 영역이다.
서열식별번호 51-54는 인간화 경쇄 NL, NL1, NL2, 및 IGKV2-28*01의 성숙한 경쇄 가변 영역이다.
상세한 설명
I. 일반
본 발명은 인간 c-Kit (스위스 프로트(Swiss Prot) P10721)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 각각 서열식별번호 1 및 5의 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는, HB-10716으로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된, 앞서 개시된 마우스 항-c-Kit 항체의 인간화 형태를 나타낸다. 상기 마우스 항체는 AMG191과 같이 인간화된 것이다(US 7915391 참조). AMG191의 카바트 CDR은 그의 유래 기점이 된 마우스 항체와 동일하다. AMG191은 크리에이티브 바이오랩스(Creative Biolabs)로부터 상업적으로 이용가능하다.
본 항체는 인간 수용자 서열 내로 이식된, 실질적으로 HB-10716으로서 기탁된 마우스 항체로부터의 CDR로서, 임의적으로는 하기에 추가로 기술되는 바와 같은 특정 위치에 치환을 포함하는 CDR을 갖는다.
일부 항체는 서열식별번호 1의, CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 성숙한 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호 5의, CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함하며, 단 적어도 하나의 CDR 잔기 치환이 존재한다. CDR H1, H2 및 H3은 바람직하게, 각각 서열식별번호 2-4를 포함하고, CDR L1, L2 및 L3은 바람직하게, 서열식별번호 6-8 (즉, 카바트에 의해 정의되는 바와 같음)을 포함하며, 단 적어도 하나의 CDR 치환이 존재한다. CDR 치환은 바람직하게, 중쇄 위치 60에서 N에서 A로의, 중쇄 위치 64에서 K에서 Q로의, 경쇄 위치 30에서 N에서 Q로의 치환으로부터 선택되고, 여기서 상기 위치는 카바트에 따라 넘버링된 것이다. 이들 치환 중 1, 2 또는 3개 모두 존재할 수 있다. 일부 항체는 중쇄 위치 64 및 경쇄 위치 30에 치환을 포함한다. 일부 항체는 중쇄 위치 60, 중쇄 위치 64 및 경쇄 위치 30에 치환을 포함한다. 일부 항체는 중쇄 위치 60 및 경쇄 위치 30에 치환을 포함한다. 일부 항체는 중쇄 위치 60 및 중쇄 위치 64에 치환을 포함하였다. 일부 항체는 개별적으로 또는 열거된 조합으로 중쇄 위치 60 및 64 및 경쇄 위치 30에서의 치환을 제외한, 카바트 CDR 치환은 갖지 않는다. 임의의 다른 카바트 CDR 치환이 존재한다면, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 그러한 다른 치환이 존재하는 것이 바람직하다.
본 항체 중 일부는 AMG191에 존재하는 잔기와 비교하여 CDR 잔기의 적어도 하나의 치환 존재에 의해 AMG191과 상이하다. 바람직한 치환은 중쇄 위치 60에서 N에서 A로의, 중쇄 위치 64에서 K에서 Q로의, 및 경쇄 위치 30에서 N에서 Q로의 치환이고, 여기서 상기 위치는 카바트에 따라 넘버링된 것이다. 이들 치환 중 1, 2 또는 3개 모두 존재할 수 있다. 일부 항체는 중쇄 위치 64 및 경쇄 위치 30에 치환을 포함한다. 일부 항체는 중쇄 위치 60, 중쇄 위치 64 및 경쇄 위치 30에 치환을 포함한다. 일부 항체는 중쇄 위치 60 및 경쇄 위치 30에 치환을 포함한다. 일부 항체는 중쇄 위치 60 및 중쇄 위치 64에 치환을 포함하였다. 일부 항체는 개별적으로 또는 열거된 조합으로 중쇄 위치 60 및 64 및 경쇄 위치 30에서의 치환을 제외하고 AMG191의 카바트 CDR에 비한 치환은 갖지 않는다. 임의의 다른 카바트 CDR 치환이 존재한다면, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 그러한 다른 치환이 존재하는 것이 바람직하다.
개별적으로 및 열거된 조합으로 중쇄 위치 60 및 64 및 경쇄 위치 30에서의 CDR 치환은 인간 c-Kit에 대하여 증가된 결합 친화성을 부여할 수 있다. 치환은 또한 한 위치에 대해 마우스 잔기를 인간 생식계열 잔기로 대체하는 것을 나타내며, 따라서, 다른 것들은 인간화 항체의 인간 특징을 증가시키는 것과 같다. 하기 표 1은 HB-10716으로서 기탁된 마우스 항체, AMG191, 및 본 인간화 항체 3개 중의 중쇄 위치 60 및 64 및 경쇄 위치 30을 점유하는 잔기를 비교한다:
<표 1>
Figure pct00001
추가로 또는 대안적으로, 본 인간화 항체 중 일부는 상이한 가변 영역 프레임워크 서열의 존재에 의해 AMG191의 것과 상이하다. AMG191은 마우스 CDR 서열을 중쇄 및 경쇄에 대해 각각 IGHV1-46*01 IGKV4-1*01의 생식계열 프레임워크 내로 이식함으로써 유도되었다. 본 개시내용은 IGH3-23*01의 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 IGKV2-28*01의 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 CDR을 이식시키는 것을 제공한다. 이들 프레임워크가 AMG191의 것보다 더 높은 결합 친화성을 부여하는 것으로 나타났다. 본 발명의 일부 바람직한 항체는 AMG191의 중쇄 가변 영역에서의 것과 동일한 복귀 돌연변이를 도입한, IGHV1-46*01에 기초한 중쇄 가변 영역 프레임워크, 및 IGKV2-28*01에 기초한 경쇄 가변 영역 프레임워크를 포함한다. 상기와 같은 프레임워크 조합은 AMG191과 비교하여 개선된 친화성의 이점을, IGH3-23*01의 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 IGKV2-28*01의 경쇄 가변 영역 프레임워크의 조합을 가진 항체보다 개선된 발현과 조합한다.
따라서, 본 발명의 일부 바람직한 항체는 AH2, AH3, 및 AH4에 상응하는 서열식별번호 13, 17 또는 21로 지정된 쇄들 중 임의의 것의 서열을 갖는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 NL2에 상응하는 서열식별번호 53의 서열을 갖는 성숙한 경쇄 가변 영역을 갖는다. 중쇄 가변 영역 서열은 오직 중쇄 위치 60에만, 오직 중쇄 위치 64에만, 또는 중쇄 위치 60 및 64에 CDR 치환을 가짐으로써 서로 상이하며, 상기 위치는 모두 카바트 넘버링에 의한 것이다. CDR 치환 이외의 다른 중쇄 가변 영역 서열은 AMG191의 성숙한 중쇄 가변 영역과 동일하다. 서열식별번호 13, 17 및 21의 중쇄 서열은 카바트 위치 71 (R에서 A로), 73 (T에서 K로) 및 78 (V에서 A로)에 가변 영역 프레임워크 치환 (즉, 마우스 공여자에의 인간 수용자 잔기)을 포함한다. 위치 69의 M에서 I로의 추가 치환이 존재한다.
서열식별번호 53의 성숙한 경쇄 가변 영역은 위치 30에 CDR 치환을 갖는다. 서열식별번호 53의 성숙한 경쇄 가변 영역은 또한 상이한 수용자 선택에 기인하여 하기와 같이 가변 영역 프레임워크 중 여러 위치에서 AMG191의 성숙한 경쇄 가변 영역과 상이하다:
L에 의해 점유된 위치 9
P에 의해 점유된 위치 12
T에 의해 점유된 위치 14
P에 의해 점유된 위치 15
P에 의해 점유된 위치 18
S에 의해 점유된 위치 20
S에 의해 점유된 위치 22
L에 의해 점유된 위치 37
S에 의해 점유된 위치 43
Q에 의해 점유된 위치 45
K에 의해 점유된 위치 74
R에 의해 점유된 위치 77
V에 의해 점유된 위치 78
E에 의해 점유된 위치 79
G에 의해 점유된 위치 84.
서열식별번호 53의 성숙한 경쇄 가변 영역은 가변 영역 프레임워크의 인간 생식계열로부터의 마우스 잔기로의 복귀 돌연변이를 함유하지 않는다.
본 발명은 또한 예시된 서열의 변이체를 나타내는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체도 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열식별번호 13, 17 또는 21 중 임의의 것과 적어도 85%, 90%, 95%, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호 53과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 성숙한 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 지정된 서열로부터의 임의의 변이는 바람직하게, 카바트에 의해 정의되는 바와 같이 CDR 밖에 있다. 변이는 또한 바람직하게, 명시된 서열에서 복귀 돌연변이의 대상이 되는 가변 영역 프레임워크 위치 (카바트 넘버링에 의한 위치 71, 73 및 78)에는 존재하지 않는다. 일부 항체에서, 어느 치환도 카바트 넘버링에 의한 중쇄 위치 69에는 존재하지 않는다. 일부 항체에서, 변이는 서열식별번호 53이 AMG191의 성숙한 경쇄 가변 영역과 상이한 위치 이외의 다른 가변 영역 프레임워크 위치(들)에 존재한다. 다른 항체에서, 변이는 서열식별번호 53이 AMG191의 성숙한 경쇄 가변 영역과 상이한 가변 영역 프레임워크 위치(들)와 이와 조합하여 가변 영역 프레임워크 중의 다른 위치(들)에 존재한다. 일부 항체에서, 서열식별번호 53이 AMG191의 성숙한 경쇄 가변 영역 프레임워크와 상이한 가변 영역 프레임워크 잔기 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개는 유지된다. 일부 항체에서, 변이는 보존적 치환(들)에 의한 것이다. 일부 항체에서, 중쇄 위치 1의 Q는 피로글루타메이트 전환 잠재성을 감소시키는 E로 대체될 수 있다 (Liu, et al., 2011, J. Biol. Chem., 286: 11211-11217). 피로글루타메이트 (pE)로의 글루탐산 (E) 전환은 글루타민 (Q)으로부터의 전환보다 더 느리게 이루어진다. 글루타민에서 pE로의 전환에서 1급 아민의 손실 때문에, 항체는 더 산성을 띠게 된다. 불완전 전환은 전하 기반 분석 방법 이용시 다중 피크로 관찰될 수 있는 항체의 이질성을 생성한다. 이질성 차이는 프로세스 제어 결여를 나타낼 수 있다.
항체는 실시예에 제공된 검정법을 이용하여 인간 c-Kit에 대한 결합 친화성, ADCP, ADCC 및 SCF-유도성 HSPC 증식 억제에 대해 시험될 수 있다. 항체는 또한 예컨대, WO2016033201에 기술된 동물 모델에서 스크리닝될 수 있다. 본 발명의 바람직한 항체는 예컨대, 검정법을 이용하여 측정된 바, AMG191 또는 그의 인간 IgG1 형태에 비하여, 인간 c-Kit에 대해 증진된 결합 친화성, 증진된 ADCP 및/또는 증진된 ADCC 및/또는 SCF-유도성 HSPC 증식의 증진된 억제를 갖는다. 바람직한 항체는 또한 인간-c-Kit의 그의 리간드 인간 줄기 세포 인자에의 결합을 억제시킨다.
본 발명은 또한 AMG191 또는 그의 인간 IgG1 형태와 비교하여 인간 c-Kit에의 결합 및/또는 인간 c-Kit를 발현하는 세포에 대한 ADCP 및/또는 ADCC를 증진시키기 위한 수단이며, 여기서 증진은 본 실시예에서와 같이 측정되는 것인 수단을 제공한다. 예시적인 수단은 서열식별번호 13, 17 또는 21 중 임의의 것의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호 53의 성숙한 경쇄 가변 영역과, 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 항체이다. 중쇄 위치 60에서 N에서 A로의, 중쇄 위치 64에서 K에서 Q로의, 및/또는 경쇄 위치 30에서 N에서 Q로의 CDR 내의 AMG191에 비한 치환은 예시적인 수단의 증진된 특성에 기여한다. 상기 수단은 제약상 활성인 담체와 함께 제약 조성물에 도입될 수 있다.
항체는 다른 인자들 중에서도 특히 발현 조건 또는 불변 영역 선택에 따라 예컨대, 글리코실화와 같은 번역 후 변형의 대상이 될 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있다.
II. 불변 영역 선택
상기 기술된 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 일부분에 연결될 수 있다. 불변 영역 선택은 부분적으로 항체-의존성 세포-매개 세포독성, 항체 의존성 세포 식세포용해 및/또는 보체 의존성 세포독성이 요구되는지 여부에 의존한다. 예를 들어, 인간 이소타입 IgG1 및 IgG3은 보체-의존성 세포독성을 갖고 있지만, 인간 이소타입 IgG2 및 IgG4에는 없다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강력한 세포 매개 이펙터 기능을 유도한다. 본 항체의 경우 인간 IgG1이 바람직하다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카르복시 말단, 예컨대, 중쇄의 C-말단의 하나 또는 수개의 아미노산은 분자가 일정 비율로 또는 분자 모두가 소실되거나, 또는 유도체화될 수 있다. 이펙터 기능, 예컨대, 보체-매개 세포독성 또는 ADCC를 감소 또는 증가시키기 위해, 또는 글리코실화 부위를 제거하기 위해 (예컨대, 미국 특허 번호 5,624,821 (윈터 등); 미국 특허 번호 5,834,597 (초(Tso) 등); 및 문헌 [Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006] 참조), 또는 인간에서 반감기를 연장시키기 위해 (예컨대, 문헌 [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004] 참조) 불변 영역에서 치환이 이루어질 수 있다. 예시적인 치환으로는 항체의 반감기를 증가시키기 위한 Gln 위치 250 및/또는 Leu 위치 428이 있다 (불변 영역에 대한 EU 넘버링이 본 단락에서 사용된다). M252Y/S254T/T256E 또한 N434A 또는 S, T250Q, 및 V3089P와 같이 반감기를 증가시킨다. 위치 234, 235, 236 및/또는 237 중 임의의 위치 또는 그들 모든 위치에서의 치환이 Fcγ 수용체, 특히, FcγRI 수용체에의 친화성을 감소시킨다 (예컨대, US 6,624,821 참조). 하기 치환 중 임의의 것이 이펙터 기능을 증가시킨다: F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S298A/E333A/K334A, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, 및 S298A/E333A/K334A.
인간 불변 영역은 상이한 개체 사이에 알로타입 변이 및 이소알로타입 변이를 나타내며, 즉, 불변 영역은 상이한 개체에서의 하나 이상의 다형성 위치에서 상이할 수 있다. 이소알로타입을 인식하는 혈청은 하나 이상의 다른 이소타입 중 비-다형성 영역에 결합한다는 점에서 이소알로타입은 알로타입과 다르다.
III. 재조합 항체의 발현
인간화 항체는 전형적으로 재조합 발현에 의해 생성된다. 재조합 폴리뉴클레오티드 구축물은 전형적으로 자연적으로 회합된 또는 이종성 발현 제어 요소, 예컨대, 프로모터를 비롯한, 항체 쇄의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 발현 제어 서열은 진핵 또는 원색 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 중의 프로모터 시스템일 수 있다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 도입되고 나면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현, 및 교차 반응 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건하에 유지된다.
이들 발현 벡터는 전형적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수적인 부분으로서 숙주 유기체에서 복제가능하다. 일반적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 상기 세포가 검출될 수 있도록 허용하기 위해 선별 마커, 예컨대, 앰피실린 내성 또는 히그로마이신 내성을 함유한다.
E. 콜라이(E. coli)는 항체, 특히, 항체 단편을 발현시키는 데 유용한 원핵성 숙주이다. 미생물, 예컨대, 효모 또한 발현에 유용하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)는 원하는 바에 따라, 발현 제어 서열, 복제 기점, 종결 서열 등을 포함하는 적합한 벡터를 갖는 효모 숙주이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 해당 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 다른 것들 중에서도 특히 알콜 데히드로게나제, 이소시토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
포유동물 세포는 면역글로불린 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 세그먼트를 발현하는 데 사용될 수 있다. 문헌 [Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)]을 참조한다. 무손상 이종성 단백질을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었고, 이는 CHO 세포주, 각종 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포, 및 Sp2/0 및 NS0을 비롯한, 비-항체-생산 골수종을 포함한다. 세포는 비인간 세포일 수 있다. 이들 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대, 복제 기점, 프로모터, 인핸서 (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대, 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 내인성 유전자, 시토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종바이러스 등으로부터 유래된 프로모터를 포함할 수 있다. 문헌 [Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)]을 참조한다.
대안적으로, 항체 코딩 서열은 트랜스제닉 동물의 게놈 내로의 도입, 및 이어서, 트랜스제닉 동물의 유즙에서의 발현을 위해 트랜스진에 도입될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 5,741,957; 미국 특허 번호 5,304,489; 및 미국 특허 번호 5,849,992 참조). 적합한 트랜스진은 유선 특이적 유전자, 예컨대, 카세인 또는 베타 락토글로불린으로부터의 프로모터 및 인핸서와 작동가능하게 연결된, 경쇄 및/또는 중쇄에 대한 코딩 서열을 포함한다.
관심 DNA 세그먼트를 함유하는 벡터는 세포 숙주 유형에 따른 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 원핵 세포에 대해서는 염화칼슘 형질감염이 보편적으로 사용되는 반면, 다른 세포 숙주에 대해서는 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 바이오리스틱스 또는 바이러스 기반 형질감염이 사용될 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 다른 방법으로는 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포솜, 전기천공, 및 미세주입의 사용을 포함한다. 트랜스제닉 동물 생산을 위해, 트랜스진을 수정된 난모 세포 내로 미세주입시킬 수 있거나, 또는 배아 줄기 세포의 게놈 내도 도입할 수 있고, 상기 세포의 핵을 핵이 제거된 난모 세포 내로 전달할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터(들)를 세포 배양물 내로 도입하고 나면, 세포 풀을 무혈청 배지 중 성장 생산성 및 생성물 품질에 대해 스크리닝할 수 있다. 이어서, 상위의 생산 세포 풀에 대해 FACS-기반 단일-세포 클로닝을 수행하여 모노클로날 세포주를 생성할 수 있다. 7.5 g/L 배양물 초과인 생성물 역가에 상응하는, 50 pg 또는 100 pg/세포/일 초과인 특이적 생산성이 사용될 수 있다. 단일 세포 클론에 의해 생산된 항체는 또한 탁도, 여과 특성, PAGE, IEF, UV 스캔, HP-SEC, 탄수화물-올리고당 맵핑, 질량 분광분석법, 및 결합 검정법, 예컨대, ELISA 또는 비아코어(Biacore)에 대해 시험할 수 있다. 이어서, 선별된 클론을 다중 바이알 속에 저장하고, 차후 사용을 위해 냉동하여 보관할 수 있다.
일단 발현되면, 항체는 단백질 A 포획, HPLC 정제, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 비롯한, 관련 기술분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)] 참조).
코돈 최적화, 프로모터 선택, 전사 요소 선택, 종결인자 선택, 무혈청 단일 세포 클로닝, 세포 뱅킹, 카피수 증폭을 위한 선별 마커의 사용, CHO 종결인자, 또는 단백질 역가 개선을 비롯한, 항체의 상업적 생산을 위한 방법론도 이용될 수 있다 (예컨대, US 5,786,464; US 6,114,148; US 6,063,598; US 7,569,339; W02004/050884; W02008/012142; W02008/012142; W02005/019442; W02008/107388; W02009/027471; 및 US 5,888,809 참조).
IV. 핵산
본 발명은 추가로 상기 기술된 중쇄 및 경쇄 중 임의의 것을 코딩하는 핵산을 제공한다. 임의적으로, 상기 핵산은 추가로 신호 펩티드를 코딩하고, 불변 영역에 연결된 신호 펩티드와 함께 발현될 수 있다. 핵산의 코딩 서열은 코딩 서열의 발현이 확실히 이루어지도록 하는 조절 서열, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 등과 작동가능하게 연결될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 단리된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 하나 이상의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 핵산은 예를 들어, 중첩 올리고뉴클레오티드의 PCR 또는 고체 상태 합성에 의해 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 예컨대, 발현 벡터 내에서 하나의 인접 핵산으로서 연결될 수 있거나, 또는 분리될 수 있고, 예컨대, 그 자체의 발현 벡터로 각각 클로닝될 수 있다.
V. 접합된 항체
본 발명의 항체는 세포독성의 추가 기전을 제공하기 위해 세포독성 또는 세포증식 억제성 모이어티에 접합될 수 있다.
일부 상기 항체는 면역독소로서 작용하도록 개질될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 5,194,594를 참조한다. 예를 들어, 식물로부터 유래된 세포 독소인, 리신은 항체용 이작용성 시약 S-아세틸메르캅토숙신산 무수물 및 리신용 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 사용함으로써 항체에 커플링될 수 있다. 문헌 [Pietersz et al., Cancer Res. 48(16):4469-4476 (1998)]을 참조한다. 커플링은 리신의 A-쇄의 잠재적인 독성 또는 항체의 활성은 손상시키지 않으면서, 리신의 B-쇄 결합 활성의 손실을 초래한다. 유사하게, 리보솜 어셈블리의 억제제인 사포린은 화학적으로 삽입된 술프히드릴 기 사이의 이황화 결합을 통해 항체에 커플링될 수 있다. 문헌 [Polito et al., Leukemia 18:1215-1222 (2004)]을 참조한다.
일부 상기 항체는 방사성 동위원소에 연결될 수 있다. 방사성 동위원소의 예로는 예를 들어, 이트륨90 (90Y), 인듐111 (111In), 131I, 99mTc, 라디오실버-111, 라디오실버-199, 및 비스무트213을 포함한다. 방사성 동위원소의 항체에의 연결은 종래의 이작용성 킬레이트를 이용하여 수행될 수 있다. 라디오실버-111 및 라디오실버-199 연결의 경우, 황-기반 링커가 사용될 수 있다. 문헌 [Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994)]을 참조한다. 은 방사성 동위원소의 연결은 아스코르브산으로 면역글로불린을 환원시키는 것을 포함할 수 있다. 방사성 동위원소, 예컨대, 111In 및 90Y의 경우, 이브리투모맙 티욱세탄이 사용될 수 있고, 이는 상기 동위원소와 반응하여 각각 111In-이브리투모맙 티욱세탄 및 90Y-이브리투모맙 티욱세탄을 형성할 것이다. 문헌 [Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001)]을 참조한다.
일부 상기 항체는 독성 화학요법 약물, 예컨대, 메이탄신, 젤다나마이신, 튜불린 억제제, 예컨대, 튜불린 결합제 (예컨대, 아우리스타틴), 또는 마이너 그루브 결합제, 예컨대, 칼리키아마이신과 접합될 수 있다.
VI. 치료적 적용
본 발명의 항체, 또는 상기 항체를 도입한 제약 조성물은 다양한 병태 치료를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 내인성 조혈 줄기 및 전구체 세포 (HSPC)의 제거를 필요로 하는 대상체에서 내인성 HSPC를 제거하는 데 사용될 수 있다. 내인성 HSPC 제거는 줄기 세포 대체 요법에서 초기 단계이다. 줄기 세포 대체 요법은 일반적으로 내인성 HSPC를 감소 또는 제거하고 (이는 어떤 면에서는 결합이 있다), 그를 대체 HSPC로 대체시키는 것을 포함한다. 대체 HSPC는 자가조직, 동종, 또는 이종발생인 것일 수 있다. 내인성 HSPC는 기능 또는 발현을 손상시키는 유전성 돌연변이의 결과로서 (예컨대, 겸상 적혈구 빈혈 또는 지중해 빈혈), 혈액암의 결과로서, 또는 암 치료에 사용되는 화학요법으로부터의 손상의 결과로서 결함이 있을 수 있다. 내인성 HSPC는 또한 기관 이식과 함께 대체될 수 있는데, 이는 내인성 HSPC가 이식의 면역 공격을 초래할 수 있기 때문이다.
c-Kit에 대한 항체는 또한 c-Kit를 발현하는 암 치료에서 사용될 수 있다. 상기 암으로는 혈액암, 예컨대, AML 및 고형 종양, 예컨대, 비만 세포암, 고환 기질암, 위장관 기질암, 흑색종, 유방암 및 폐암을 포함한다. 면역조직화학 검정법으로 결정된 바, c-Kit의 발현은 바람직하게, 조직 매칭된 정상 대조군 세포보다 수준이 더 높다.
항체는 예컨대, 내인성 HSPC의 감소 또는 c-Kit를 발현하는 암 세포의 감소와 같은 의도하는 목적을 달성하는 것인 투여량, 투여 경로, 및 투여 빈도를 의미하는 유효 요법으로 투여된다. 일부 경우에, 효능은 개별 환자에서 과거 대조군과 또는 동일 환자의 과거 경험과 비교하여 관찰될 수 있다. 다른 경우에, 효능은 임상전 또는 임상 시험에서 비처리 환자로 이루어진 대조군 집단과의 비교로 처리된 환자 집단에서 입증될 수 있다.
예시적인 투여량은 고정 투여량으로서 적어도 0.05 mg/k 내지 최대 10 mg/kg, 예컨대, 약 0.05-10 mg/kg, 또는 0.1 내지 5 mg/kg 또는 5-750 mg이다. 투여량은 다른 인자들 중에서도 특히 환자의 상태 및 존재할 경우, 이전 치료에 대한 반응, 처치가 예방적 처치인지 또는 치료적 처치인지 여부, 및 장애가 급성인지 또는 만성인지 여부에 의존한다.
투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 복강내, 국소, 비내 또는 근육내일 수 있다. 일부 항체는 정맥내 또는 피하 투여에 의해 전신 순환으로 투여될 수 있다. 정맥내 투여는 예를 들어, 예컨대, 30-90분인 일정 기간에 걸쳐 주입에 의해 이루어질 수 있다.
항체는 1회 또는 다회 투여될 수 있다. 다회 투여되는 경우, 간격은 예컨대, 매일, 매주, 매 2주마다, 매월, 또는 매 분기별일 수 있다.
VI. 제약 조성물 및 사용 방법
비경구 투여를 위한, 본 발명의 항체를 제약 조성물은 멸균성이고, 실질적으로 등장성이며 (250-350 mOsm/kg 물), GMP 조건하에서 제조될 수 있다. 제약 조성물은 단위 용량 형태 (즉, 단일 투여를 위한 용량)로 제공될 수 있다. 제약 조성물은 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 제제화될 수 있다. 제제화는 선택된 투여 경로에 의존한다. 주사인 경우, 항체는 수용액, 예컨대, 생리학상 화합성인 완충제, 예컨대, 행크스 용액(Hank's solution), 링거액, 또는 생리 염수 또는 아세테이트 완충제 (주사 부위의 불편감을 감소시키기 위해)에서 제제화될 수 있다. 용액은 제제화제, 예컨대, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예컨대, 멸균 발열물질-무함유 물을 사용한 구성을 위한 동결건조된 형태일 수 있다.
요법은 치료되는 병태 치료에서 효과적인 또 다른 작용제 (예컨대, 암 치료를 위한 화학요법제 또는 생물제제)와 함께 조합하여 투여될 수 있다.
치료 후, 치료받은 대상체의 병태는 치료에 대해 반응한 변화 (예컨대, 내인성 HSPC 개수 감소), 또는 c-Kit를 발현하는 암 세포의 개수 감소에 대해 모니터링될 수 있다.
VII. 다른 용도
본 발명의 항체는 또한 면역 검정법, 예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 면역조직화학법에 의해 c-Kit를 검출하는 데에도 사용될 수 있다. 상기 시험은 암이 c-Kit를 발현하는지 여부를 결정하는 데 유용할 수 있으며, 이를 통해 본 발명의 방법을 이용하여 더 쉽게 치료할 수 있게 된다. 항체는 또한 친화성 크로마토그래피에 의해 c-Kit를 발현하는 HSPC를 농축시키는 데에도 사용될 수 있다.
실시예
1. 물질 및 방법
항체 V 클로닝 및 서열분석. 항-인간 c-kit 하이브리도마 세포주를 ATCC로부터 구입하였다 (HB-10716). 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역을 진스크립트(Genscript)에 의해 클로닝하고, 서열분석하였다.
항체 인간화 및 CDR 치환. 마우스 항체로부터의 CDR 잔기를 인간 생식계열 프레임워크 (FR) 상에 장착시킴으로써 HB-10716의 인간화를 수행하였다. 간략하면, 상응하는 CDR 잔기 및 몇몇 프레임워크 (FR) 잔기를 인간 IGHV1-46*01 또는 IGHV3-23*01로 신중히 동원하여 마우스 VH를 인간화시켰다. 상응하는 CDR 잔기 및 몇몇 프레임워크 (FR) 잔기를 인간 IGKV4-1*01 또는 IGKV2-28*01로 신중히 동원하여 마우스 VL을 인간화시켰다. 마우스와 인간 FR 잔기 사이의 차이를 개별적으로 모델링하여 그가 CDR 입체형태에 미칠 수 있는 가능한 영향에 대해 조사하였다. 항체를 추가로 인간화시키고, 인간화 항체의 결합 친화성을 증가시키기 위해, CDR 중의 잔기를 선택하고, 인간 생식계열 서열의 상응하는 CDR 잔기로 돌연변이화시켰다.
세포 형질감염. 293F 세포를 프리스타일™ 293 발현 배지(FreeStyle™ 293 Expression Medium) (인비트로겐(Invitrogen)) 하에서 배양하였다. 제조사의 설명서에 따라 293펙틴(293fectin) 형질감염 시약 (인비트로겐)을 이용하여 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터의 공동-형질감염에 의해 일시적 형질감염을 수행하였다. 4 내지 5일 후, 형질감염된 세포로부터 상청액을 수거하고, ELISA에 의해 항체 분비에 대하여 시험하였다. 간략하면, 96-웰 플레이트 (눈크(Nunc: 덴마크 로스킬레))를 4℃에서 16시간 동안 포스페이트-완충처리된 염수 (PBS) 중 1 ug/ml 염소 항-인간 Fc 감마 항체로 코팅하였다. 실온에서 1시간 동안 PBS 중 0.4% BSA로 차단한 후, 단리된 상청액을 1/3 순차 희석액 중에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 3회에 걸쳐 세척하고, 실온에서 1시간 동안 HRP-접합된 염소 항-인간 카파-특이적 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 플레이트를 TMB로 발색시켰다. 2 M H2SO4로 반응을 정지시키고, 450 nM에서 OD를 측정하였다.
항체 정제 및 특징화. 배양물 상청액을 단백질 A 세파로스 칼럼 (protein A Sepharose column) (GE 헬쓰케어(GE Healthcare))에 적용시켰다. 칼럼을 PBS로 세척한 후, 이어서, 용리 완충제 (0.1 M 시트르산나트륨 완충제, pH 3.0)로 단백질을 용출시켰다. 수집된 분획을 1 M 트리스(Tris) pH 9.0으로 중화시켰다. 마지막으로, 정제된 샘플을 PBS에 대해 투석시켰다. 용출된 항체 분획의 순도를 환원 또는 비환원 조건하에 10% 겔 상에서 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분석하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) 염색에 의해 밴드를 시각화하였다.
ELISA에 의한 항원 결합 활성 측정. 96-웰 플레이트 (눈크: 덴마크 로스킬레)를 4℃에서 16시간 동안 포스페이트-완충처리된 염수 (PBS) 중 1 ug/ml 인간 c-Kit-Fc 융합 단백질로 코팅하였다. 실온에서 1시간 동안 PBS 중 0.4% BSA로 차단한 후, 항-c-Kit 항체를 1/3 순차 희석액 중에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 3회에 걸쳐 세척하고, 실온에서 1시간 동안 HRP-접합된 염소 항-인간 카파-특이적 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 플레이트를 TMB로 발색시켰다. 2 M H2SO4로 반응을 정지시키고, 450 nM에서 OD를 측정하였다.
시험관내 식세포용해 검정법. MHC-1 암 세포를 세척하고, 계수한 후, 이어서, 무혈청 IMDM 중 1 x 105개 세포를 함유하는 25 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 최종 농도 10 ㎍/mL로 (25 ㎕ 중) 항체 처리물을 웰에 가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 30분째, TrypLE로 앞서 수거된 대식세포를 계수하고, 50 ㎕ 무혈청 IMDM 중 5 x 104개 세포를 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다 (이펙터:표적 = 1:2). GFP+ 대식세포를 찾는 유세포 분석법 분석에 의해 식세포용해 비율(%)을 산출하였다.
ADCC 검정법. 스템셀 테크놀러지즈(Stemcell Technologies: 캐나다 브리티시 컬럼비아 밴쿠버, 카탈로그 번호 17855)로부터의 이지셉(EasySep) 인간 CD56 양성 선별 키트를 이용하여 인간 PBMC로부터 자연 살해 세포를 단리시켰다. 단리된 세포를 10% FBS 및 100 U/mL 재조합 인간 IL-2 (페프로테크(PeproTech: 미국 뉴저지주 로키 힐, 카탈로그 번호 200-02)로 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 밤새도록 배양하였다. GIST-T1 세포를 37℃에서 10분 동안 5 uM 칼세인-AM (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific: 미국 매사추세츠주 월섬, 카탈로그 번호 C3100MP)으로 표지한 후, 2회 세척하였다. 항-c-Kit 또는 이소타입 대조군 항체를 0.0003 ug/mL에서 30 ug/mL로 10배 연속 희석하고, V-바닥 검정 플레이트로 옮겨 놓았다. 표지된 GIST-T1 세포를 검정 플레이트에 첨가한 후, 이어서, 활성화된 자연 살해 세포를 최종 1:5인 표적 대 이펙터 비로 첨가하였다. 2시간 인큐베이션 후, 상청액을 수집하고, 투명한 평평한 바닥 플레이트로 옮겨 놓았다. 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 7.0 소프트웨어와 함께, 490 nm 여기, 520 nm 방출, 및 컷오프 515 nm를 이용하여 스펙트라맥스(SpectraMax) M3 형광 플레이트 판독기 상에서 플레이트를 판독하였다. 하기 공식을 이용하여 상대 형광 단위 (RFU)에 기초하여 특이적 용해율(%)을 산출하였다: [(시험 RFU - 평균 배경 RFU)/(평균 최대 RFU - 평균 배경 RFU)] X 100, 여기서 배경은 항체 부재하의 이펙터 세포 + 표적 세포이고, 최대 용해는 용해 완충제 존재하의 이펙터 세포 + 표적 세포이다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 7.05를 이용하여 데이터를 분석하였다. 특이적 항체 의존 용해율(%)을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다.
HSPC 증식 검정법. 냉동 제대혈 CD34+ 줄기/전구체 세포 (올셀즈(ALLCELLS), 카탈로그 번호 CB005F)를, 20 ng/ml의 인간 재조합 SCF (스템셀 테크놀러지즈, 카탈로그 번호 78062), 20 ng/ml의 재조합 인간 Flt3-리간드 (페프로테크, 카탈로그 번호 300-19) 및 20 ng/ml의 재조합 인간 TPO (페프로테크, 카탈로그 번호 300-18)로 보충된 HSC 유지 배지, 스템스팬(StemSpan) SFEMII (스템셀 테크놀러지즈, 카탈로그 번호 09605) 중에 재현탁시켰다. 3개의 코스타 울트라(COSTAR Ultra) 저 클러스터 96-웰 플레이트 (코닝(Corning), 카탈로그 번호 7007)의 웰당 약 3,000개의 줄기 세포를 플레이팅하였다. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 1,250 rpm으로 원심분리하고, 세포를 삼중으로 항-c-Kit 항체 존재 또는 부재하의 200 ul HSC 유지 배지 중에 재현탁시켰다. 4개의 항-c-Kit 항체, AMG191, AMG191-G1, HF12 및 HF112를 0.1, 1, 10 및 50 ug/ml 농도에서 시험하였다. 1, 3, 5, 및 11일째에 카운트브라이트 절대 카운팅 비드(Countbright absolute Counting bead) (인비트로겐TM 카탈로그 번호 C36950)를 이용하여 세포 증식을 시험하였다. AMG191은 위치 297에 N에서 E로의 돌연변이를 갖고, 그 결과로 비글리코실화는 이펙터 기능을 감소시킨다. AMG191-G1 또는 -IgG1은 야생형 인간 IgG1 불변 영역을 갖는다.
2. 결과
(a) 항-c-Kit 하이브리도마 가변 영역 클로닝 및 서열분석
항-인간 c-Kit 하이브리도마 세포주를 ATCC로부터 구입하였다 (HB-10716). 인간 c-Kit에의 ELISA 결합에 의해 하이브리도마 클론 HB-10716의 특이성을 조사하였다. 범용 항체 프라이머를 이용하여 HB-10716의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 하이브리도마로부터 클로닝하였다. 각 V 유전자 생성물의 다중 클론을 서열분석하여 PCR 유도 오류를 모니터링하였다. HB-10716의 VH 및 VL의 뉴클레오티드 서열을 결정하였고, 추론된 아미노산 서열이 각각 도 1a 및 b에 제시되어 있다.
(b) 항체 인간화 및 CDR 치환
CDR-이식을 위한 주형으로서 사용하고자 하는 인간 항체 프레임워크 (FR) 선별을 위해, 마우스 HB-10716 VL 및 VH 영역을 인간 생식계열 서열의 것과 비교하였다. 마우스 HB-10716 VL 영역의 FR이 IGKV4-1 서브군과 더 높은 상동성을 갖는 것으로 나타났고, VH 영역의 FR이 인간 IGHV1-46 서브군과 더 높은 상동성을 보였다. 이에, 인간 IGKV4-1 및 IGHV1-46으로부터의 FR을 인간화 HB-10716을 디자인하기 위한 베이스로서 사용하였다. HB-10716과 IGKV4-1/IGHV1-46 서열 사이에 차이가 나고, 항원 결합에 영향을 줄 수 있는, FR 영역 중의 아미노산 위치는 분자 모델링을 통해 확인하였다. FR 중 동일한 잔기는 유지시키고, 비-동일 잔기는 분자 모델링 프로그램에 기초하여 유지시키거나, 또는 치환하였다. 추가로, VH 및 VL의 CDR 영역 중의 잔기는 분자 모델링을 통해 확인하였다. 부위-지정 돌연변이유발법에 의해 CDR 치환을 수행하였다.
하기 표 2에는 제조된 신규 인간화 항체 및 그의 중쇄 및 경쇄 성숙한 가변 영역 성분이 요약되어 있다. 간략하면, AF로 명시된 항체는 AMG191과 동일한 가변 영역 프레임워크를 갖는다. NF로 명시된 항체는 AMG191과 상이한 가변 영역 프레임워크를 갖는다. HF로 명시된 항체는 AMG191과 동일한 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 상이한 경쇄 가변 영역 프레임워크를 갖는다. 번호 2-1, 11, 12, 112 및 3은 각각 위치 H54/L30, H60/L30, H64/L30, H60/H64/L30, H95/L30에 CDR 치환이 존재함을 나타낸다.
<표 2>
Figure pct00002
H60, H64, 및 L30에서의 CDR 치환은 단독으로 또는 조합을 통해 결합을 증가시켰다 (AF11, AF12, 및 AF112, 표 2, 도 2a-c). 가장 중요하게, H60 및 H64에서의 잔기를 인간 생식계열 서열로 복귀 돌연변이화시켰고, AF11, AF12, 및 AF112의 인간화 항-c-Kit 항체의 인간성을 증가시켰다. 더욱이, H54, H95, 또는 L27에서의 단일 아미노산 CDR 치환 (표 2, 도 2a-b)은 AF-2-1, AF-3, 및 AF-1-1의 인간화 항-c-Kit 항체의 결합을 손상시켰다 (도 2d).
프레임워크로서 IGHV3-23*01 및 IGKV2-28*01의 상이한 인간 생식계열 서열을 이용하여 CDR-이식을 수행함으로써 항-c-Kit 인간화 항체인 NF를 제조하였다 (표 2, 도 3a-b). 항체 NF는 AMG191과 비교하여 증가된 결합 활성을 보였다 (도 3c). 이어서, H54, H60, H64, H95, L27, 및 L30에서의 동일한 CDR 치환을 NF에 적용시켰다 (표 2, 도 3a-b). H60, H64, 및 L30에서의 CDR 치환은 IGKV4-1/IGHV1-46 프레임워크를 갖는 항체와 같이 작용하였을 뿐만 아니라, IGHV3-23*01/IGKV2-28*01 프레임워크를 갖는 항체와 같이 작용하였다. H60, H64, 및 L30에서의 CDR 치환은 단독으로 또는 조합하여 NF11, NF12, 및 NF112의 결합 활성을 증가시키거나, 또는 유지시켰다 (도 3d).
표 2에 제시된 바와 같이 상이한 VH 및 VL을 조합하여 인간화 HF11, HF12, 및 HF112를 구축하였고, 이들은 모두 AMG191과 비교하였을 때, 증가된 결합 활성을 보였다 (도 4).
(c) 인간화 항-c-Kit 항체는 대식세포-매개 식세포용해를 촉진시킨다 .
이어서, 본 발명자들은 인간 말초 혈액-유래 대식세포에 의한 인간 암 세포 식세포용해를 가능하게 할 수 있는 인간화 항-c-Kit 항체의 능력을 조사하였다. AMG191은 침묵화된 Fc를 갖는 바, 본 발명자들은 AMG191과 동일한 서열을 가지며, 예외적으로 AMG191-G1은 활성 인간 IgG1 Fc 불변 영역을 갖는 것인, AMG191-G1을 제조하였다. PBS 대조군과 비교하여 AMG191은 식세포용해를 유도하지 않았지만; AMG191-G1은 활성 인간 IgG1 스캐폴드를 갖는 바, 예상대로 더 높은 식세포 활성을 유도하였다 (도 5). AMG191-G1은 0.1, 1, 및 10 ug/ml에서 유사한 수준의 식세포 활성을 유도하였다. AMG191-G1과 달리, 인간화 AF12, AF112, HF12, HF112, 및 NF112는 더 낮은 저농도에서 더욱 강력한 효력을 발휘하였고, 0.1 ug/ml, 1 ug/ml, 또는 심지어는 10 ug/ml에서도 AMG191-G1의 것보다 더 높은 식세포 활성을 유도하였으며, 이는 인간화 AF12, AF112, HF12, HF112, 및 NF112의 경우에 요구되는 치료 용량은 더 낮다는 것을 제안하는 것이다 (도 5). 본 데이터는 AMG191-G1, AF12, AF112, HF12, HF112, 및 NF112 모두 인간 IgG1 포맷된 항체이지만, AF12, AF112, HF12, HF112, 및 NF112가 더욱 강력한 효력을 발휘한다는 것을 나타낸다. 이는 가능하게는 프레임워크 및/또는 CDR 치환으로 인한 AF12, AF112, HF12, HF112, 및 NF112의 더 높은 결합 친화성에 기인하는 것일 수 있다.
(d) 인간화 항-c-Kit 항체는 강력한 ADCC를 유도한다.
ADCC 활성을 유도할 수 있는 인간화 항-c-Kit 항체의 능력을 GIST 세포에 대하여 시험하였다. AMG191은 시험된 어느 농도에서도 ADCC를 유도하지 못했다. HF12 및 HF112는 용량에 의존하는 방식으로 ADCC를 매개하였다 (도 6).
(e) 인간화 항-c-Kit 항체는 조혈 줄기/전구체 세포 ( HSPC ) 증식을 억제시킨다 .
성숙한 조혈 세포는 자기-재생 능력이 감소됨에 따라 점점 더 많이 계통-제한적 세포를 생산하는 계층적 조직화된 프로세스를 통해 조혈 줄기 세포 (HSC)로부터 발생한다. 세포 표면 단백질 티로신 키나제 c-Kit는 그의 동족 리간드, 줄기 세포 인자 (SCF)와 상호작용하는 것으로서, HSC 자기-재생을 조절한다. SCF와의 c-Kit 상호작용을 차단함으로써, 본 발명자들은 인간화 항-c-Kit 항체가 HSPC 증식을 억제시킬 수 있는지 여부에 대해 시험하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, SCF는 어떤 항체 처리 부재하에서도 HSPC 증식을 유도하였다. 그러나, AMG191, AMG191-G1, HF12, 및 HF112는 HSPC 증식을 억제시켰다 (도 7). 더욱이, AMG191 및 AMG191-G1의 것보다 HF12 및 HF112는 HSPC 증식을 억제시키는 데 있어 더욱 강력한 효력을 발휘한다 (도 7). 이는 가능하게는 프레임워크 및/또는 CDR 치환으로 인한 HF12 및 HF112의 더 높은 결합 친화성에 기인하는 것일 수 있다.
(f) 인간화 항-c-kit는 유의적인 비만 세포 탈과립화를 유도하지 않는다.
cKIT는 조혈 줄기 세포 및 성숙한 비만 세포 상에서 발현된다. 비만 세포는 골수 중 CD34+ 조혈 전구체로부터 유래된다. 다양한 말초 조직으로의 이동시, 상기 전구체 세포는 고친화성 IgE 수용체, FcεRI와 함께 cKIT를 발현하는 성숙한 비만 세포로 분화된다. 비만 세포 상의 IgE 프라이밍된 FcεRI에의 항원 결합은 탈과립화, 및 시토카인, 류코트리엔 및 프로테아제와 함께 화학 매개체, 예컨대, 히스타민 및 트립타제 방출을 일으킨다. 화학 매개체의 방출은 알레르기의 전형적인 증상을 유발한다. 임상적 사용에서, 항-cKIT 항체는 비만 세포 탈과립화를 유도하지 않으면서 조혈 줄기 세포를 감소시키는 것이 바람직하다.
건강한 인간 공여자의 말초 전혈로부터 분화된, 표현형이 분석된 성숙한 비만 세포 (CD34-, FcεRIα+, cKIT+)를 7시간 동안 상이한 농도의 HF12 및 HF12 인간화 항-c-Kit 항체 (10, 1, 0.1 & 0.01 ㎍/ml)와 함께 인큐베이션시켰다. A23187 (10 μM) 및 IgE + 항-IgE (각각 10 ug/ml씩)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 방법에 기술된 바와 같은 흡광도 방법을 사용하여 β-헥소사미니다제 방출을 측정함으로써 탈과립화를 정량화하였다.
인간 1차 비만 세포를 시험관내에서 분화시켰고, 이는 9주째인 말기 시점에 CD34-, FcεRIα+, 및 cKIT+ 표현형을 나타내었고, 이는 성숙한 비만 세포의 표현형 특징과 일치하였다. 이어서, 세포를 칼슘 이온운반체 A23187, 또는 항-IgE와 함께 조합하여 IgE로 자극시켰다. β-헥소사미니다제 방출에 의해 측정된 바와 같이, A23187 및 IgE + 항-IgE는 비만 세포 탈과립화를 효과적으로 유도하였다.
A23187 및 항-IgE 처리의 것과 비교하였을 때, 항-c-Kit 항체를 이용한 세포의 직접적인 처리 또는 항-IgG 항체에 의한 항-c-Kit 항체의 가교 결합은 유의적인 비만 세포 탈과립화를 유도하지 않았다 (도 8). 플레이트 상에의 항-c-Kit 항체 고정화 또한 비만 세포 탈과립화에는 거의 영향을 미치지 않았다. 다양한 농도의 항-c-Kit 항체 존재하에서의 비만 세포와 NK 세포의 공동 인큐베이션 또한 시험된 모든 농도에서 비만 세포 탈과립화를 유도하지 않았다.
결론적으로, 칼슘 이온운반체 A23187, 또는 항-IgE 처리와 함께 조합된 IgE의 것과 비교하였을 때, 항-c-Kit 항체 HF12 및 HF112는 시험관내에서 1차 인간 비만 세포의 탈과립화에는 거의 영향을 미치지 않았다.
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SEQUENCE LISTING <110> FORTY SEVEN, INC. LIU, JIE SOMPALLI, KAVITHA <120> HUMANIZED ANTIBODIES AGAINST C-KIT <130> 063673-540687 <150> 62/771,526 <151> 2018-11-26 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Tyr Ser Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Ile Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Asp Thr Arg Phe Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 2 Ser Tyr Asn Met His 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 3 Val Ile Tyr Ser Gly 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100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 49 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 49 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ile Tyr Ser Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Asp Thr Arg Phe Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 50 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys <210> 51 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 52 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 52 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Asp Ser Val Asp Ile Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 53 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 53 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr 20 25 30 Gly Gln Ser Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 54 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro 100

Claims (15)

  1. 각각 서열식별번호(SEQ ID NO:) 2-4의 카바트(Kabat)에 의해 정의된 바와 같은 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 성숙한 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열식별번호 6-8의 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함하며, 예외적으로 중쇄 위치 60에서 N에서 A로의, 중쇄 위치 64에서 K에서 Q로의, 및 경쇄 위치 30에서 N에서 Q로의 치환으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 CDR 잔기 치환(들)이 존재하고, 여기서 위치는 카바트에 따라 넘버링된 것인, 인간 c-Kit에 특이적으로 결합하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR H1, H2 및 H3이 각각 서열식별번호 2-4이고, 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR L1, L2 및 L3이 각각 서열식별번호 6-8이며, 예외적으로 중쇄 위치 64에서 K에서 Q로의, 및 경쇄 위치 30에서 N에서 Q로의 치환이 존재하는 것인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR H1, H2 및 H3이 각각 서열식별번호 2-4이고, 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR L1, L2 및 L3이 각각 서열식별번호 6-8이며, 예외적으로 중쇄 위치 60에서 N에서 A로의, 중쇄 위치 64에서 K에서 Q로의, 및 경쇄 위치 30에서 N에서 Q로의 치환이 존재하는 것인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙한 중쇄 가변 영역이 서열식별번호 13, 17 또는 21 (AH2, AH3 또는 AH4)과 적어도 85, 90, 95, 98, 99%의 서열 동일성을 나타내고, 성숙한 경쇄 가변 영역이 서열식별번호 53 (NL2)과 적어도 85, 90, 95, 98, 99%의 서열 동일성을 나타내고, 여기서 명시된 서열식별번호로부터의 임의의 변이는 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR 밖에 있는 것인 항체.
  5. 제4항에 있어서, 카바트 넘버링에 의한 중쇄 위치 1이 E인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙한 경쇄 가변 영역의 하기 위치가 하기와 같이 아미노산에 의해 점유된 것인 항체:
    위치 9는 L에 의해 점유
    위치 12는 P에 의해 점유
    위치 14는 T에 의해 점유
    위치 15는 P에 의해 점유
    위치 18은 P에 의해 점유
    위치 20은 S에 의해 점유
    위치 22는 S에 의해 점유
    위치 37은 L에 의해 점유
    위치 43은 S에 의해 점유
    위치 45는 Q에 의해 점유
    위치 74는 K에 의해 점유
    위치 77은 R에 의해 점유
    위치 78은 V에 의해 점유
    위치 79는 E에 의해 점유
    위치 84는 G에 의해 점유.
  7. 제1항에 있어서, 성숙한 중쇄 가변 영역이 서열식별번호 13, 17 또는 21로부터 선택되는 서열을 가지며, 예외적으로 위치 1은 E일 수 있고, 성숙한 경쇄 가변 영역이 서열식별번호 53의 서열을 갖는 것인 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙한 중쇄 가변 영역이 중쇄 불변 영역에 연결되고, 성숙한 경쇄 가변 영역이 성숙한 경쇄 불변 영역에 연결된 것인 항체.
  9. 제7항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 인간 IgG1인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, AMG191에 비해 증강된, 인간 c-Kit에의 결합을 갖는 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, AMG191-IgG1에 비해 증강된 ADCP를 갖는 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, AMG191-IgG1에 비해 증강된 ADCC를 갖는 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  14. 내인성 HSPC 제거를 필요로 하는 대상체에게 유효 요법의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 내인성 HSPC를 제거하는 방법.
  15. 암을 앓는 대상체에게 유효 요법의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, c-Kit를 발현하는 암을 치료하는 방법.
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