BR112021008454A2 - Anticorpos humanizados contra c-kit - Google Patents
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Abstract
anticorpos humanizados contra c-kit. a presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a c-kit e métodos de uso desses anticorpos na substituição com células-tronco e tratamento de câncer.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS HUMANIZADOS CONTRA C-KIT".
[001] O presente pedido reivindica o benefício de 62/771.526, depositado em 26 de novembro de 2018, que é incorporado na íntegra como referência para todos os propósitos.
[002] O presente pedido inclui sequências no arquivo txt 540687US SL_ST25, de 31.466 bytes, criado em 25 de novembro de 2019, que é incorporado como referência.
[003] c-Kit (CD117) é um receptor tirosina cinase tipo III, que se liga a fator de células-tronco (SCF), uma substância que faz com que certos tipos de células cresçam, também conhecido como "fator de Steel" ou "ligante de c-Kit”. Quando esse receptor se liga a fator de células-tronco, ele forma um dímero que ativa sua atividade de tirosina cinase intrínseca, que, por sua vez, fosforila e ativa moléculas de transdução de sinal que propagam o sinal na célula. c-Kit é um marca- dor de superfície celular usado para identificar certos tipos de HSPCs na medula óssea. Células-tronco hematopoiéticas (HSC), progenitores multipotentes (MPP) e progenitores mieloides comuns (CMP) expres- sam altos níveis de c-Kit. Foi proposto que anticorpos contra c-Kit po- dem ser usados para remover células endógenas em terapia de substi- tuição com células-tronco (WO2016033201, WO2008067115).
[004] A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a c-Kit humano que compreende uma região variável pesada madura que contém CDRs H1, H2 e H3, como definido por Kabat, de SEQ ID NOS: 2-4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve madura que compreende CDRs L1, L2 e L3, como defi-
nido por Kabat, de SEQ ID NOS: 6-8, respectivamente, exceto que 1, 2 ou 3 substituições de resíduos de CDRs são/estão presentes selecio- nadas de N por A na posição da cadeia pesada 60, K por Q na posição da cadeia pesada 64 e N por Q na posição da cadeia leve 30, sendo as posições numeradas de acordo com Kabat.
[005] Opcionalmente, CDRs H1, H2 e H3 conforme definidas por Kabat são SEQ ID NOS: 2-4, respectivamente, e CDRs L1, L2 e L3 conforme definidas por Kabat são SEQ ID NOS: 6-8, respectivamente, exceto que as substituições de K por Q na posição da cadeia pesada 64 e N por Q na posição da cadeia leve 30 estão presentes.
[006] Opcionalmente, As CDRs H1, H2 e H3 conforme definidas por Kabat São SEQ ID NOS: 2-4, respectivamente, e as CDRs LI, L2 e L3 conforme definidas por Kabat são SEQ ID NOS: 6-8, respectiva- mente, exceto que estão presentes as substituições de N por A na po- sição da cadeia pesada 60, K por Q na posição da cadeia pesada 64 e N por Q na posição da cadeia leve 30.
[007] Opcionalmente, a região variável da cadeia pesada madura mostra pelo menos 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 13, 17 ou 21 (AH2, AH3 ou AH4) e a região variável da cadeia leve madura mostra pelo menos 85, 90, 95, 98, 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 53 (NL2), contanto que qualquer variação das SEQ ID NOS indicadas esteja fora das CDRs.
[008] Opcionalmente, a posição 1 da cadeia pesada por numera- ção de Kabat é E. Opcionalmente, as posições seguintes da região variável da cadeia leve madura são ocupadas por aminoácidos como segue: Posição 9 ocupada por L, Posição 12 ocupada por P, Posição 14 ocupada por P, Posição 15 ocupada por P, Posição 18 ocupada por P, Posição 20 ocupada por S, Posição 22 ocupada por S, Posição 37 ocupada por L, Posição 43 ocupada por S, Posição 45 ocupada por Q, Posição 74 ocupada por K, Posição 77 ocupada por R, Posição 78 ocupada por V, Posição 79 ocupada por E, Posição 84 ocupada por G. Opcionalmente, a região variável da cadeia pesada madura tem uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 13, 17 ou 21, exceto que a po- sição 1 pode ser E, e a região variável da cadeia leve madura tem uma sequência de SEQ ID NO: 53. Opcionalmente, a região variável da ca- deia pesada madura é ligada a uma região constante da cadeia pesa- da e a região variável da cadeia leve madura é ligada a uma região constante da cadeia leve madura. Opcionalmente, a região constante da cadeia pesada é IgG1 Humana. Opcionalmente, o anticorpo tem uma ligação melhorada com c-Kit humano em relação a AMG191. Op- cionalmente, o anticorpo tem ADCP melhorada em relação a AMG191- lgG1. Opcionalmente, o anticorpo tem ADCC melhorada em relação a AMG191-lgG1.
[009] A invenção fornece ainda uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo como descrito acima e um veículo far- maceuticamente aceitável.
[0010] A invenção fornece ainda um método de ablação de HSPCs endógenas que compreende a administração de um regime eficaz de um anticorpo conforme descrito acima a um indivíduo com necessida- de de ablação.
[0011] A invenção fornece ainda um método de tratamento de um câncer que expressa c-Kit, método este que compreende a adminis- tração de um regime eficaz de um anticorpo a um indivíduo que tem o câncer.
[0012] Anticorpos monoclonais ou outras entidades biológicas são tipicamente providos na forma isolada. Isso significa que um anticorpo ou outra entidade biológica é tipicamente pelo menos 50% p/p pura de proteínas interferentes e outros contaminantes que surgem de sua produção ou purificação, mas não exclui a possibilidade de que o anti-
corpo monoclonal seja combinado com um excesso de veículo(s) far- maceuticamente aceitável(eis) ou outro veículo destinado a facilitar seu uso. Algumas vezes os anticorpos monoclonais são pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% p/p puros de proteínas interferen- tes e contaminantes de produção ou purificação. Frequentemente, um anticorpo monoclonal isolado ou outra entidade biológica é a espécie macromolecular predominante remanescente após sua purificação.
[0013] Ligação específica é em termos de detecção maior em magnitude e distinguível de ligação não específica que ocorre em rela- ção pelo menos a um alvo não relacionado. Ligação específica pode ser o resultado da formação de ligações entre grupos funcionais parti- culares ou ajuste espacial particular (por exemplo, tipo trava e chave), enquanto ligação não específica é usualmente o resultado de forças de van der Waals. Ligação específica não implica necessariamente, entretanto, que um anticorpo se liga a um e apenas um alvo. Os anti- corpos da invenção tipicamente se ligam especificamente a c-Kit com uma afinidade de pelo menos 108,109,1010, 1011 ou 1012 M-1.
[0014] A unidade estrutural básica de anticorpo é um tetrâmero de subunidades. Cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção terminal amino de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Essa região variável é inicialmente expressa ligada a um peptídeo de sinal clivável. A região variável sem o peptídeo de sinal é algumas vezes referida como uma região variável madura. Assim, por exemplo, uma região variável madura da cadeia leve significa uma re- gião variável da cadeia leve sem o peptídeo de sinal da cadeia leve. A porção terminal carbóxi de cada cadeia define uma região constante responsável principalmente pela função efetora.
[0015] As cadeias leves são classificadas como capa ou como lâmbda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, e definem o isótipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Nas cadeias leve e pesada, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos. Ver, geralmente, Fun- damental Immunology, Paul, W., ed., 2ª ed., Raven Press, NI, 1989, Cap. 7 (incorporado na íntegra como referência para todos os propósi- tos).
[0016] Uma região variável da cadeia leve ou da cadeia pesada de imunoglobulina (também referida aqui como "domínio variável da ca- deia leve" ("domínio VL") ou "domínio variável da cadeia pesada" ("domínio VH"), respectivamente) consiste de uma região de "moldura" interrompida por três "regiões de determinação de complementarida- de" ou "CDRs”. As regiões de moldura servem para alinhar as CDRs para ligação específica com um epítopo de um antígeno. As CDRs in- cluem os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são principal- mente responsáveis pela ligação com antígeno. Do término amino ao término carboxila, ambos os domínios VL e VH compreendem as se- guintes regiões de moldura (FR) e CDRs: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As CDRs 1, 2 e 3 de um domínio VL são também referidas aqui, respectivamente, como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3; as CDRs 1, 2 e 3 de um domínio VH são também referidas aqui, respecti- vamente, como CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3.
[0017] A atribuição de aminoácidos a cada domínio VL e VH ocor- re de acordo com qualquer definição convencional de CDRs. Defini- ções convencionais incluem a definição de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes Of Health, Bethesda, MD, 1987 e 1991), a definição de Chothia (Chothia & Lesk,
J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); um compósito de CDR De Chothia-Kabat em que CDR-H1 é um compósito de CDRs de Chothia e Kabat; a definição de AbM usada Pelo software de modelagem de anticorpos da Oxford Molecular; e a definição de contato de Martin et al. (rede mundial de computadores bioinfo.org.uk/abs). Kabat fornece uma convenção de numeração am- plamente usada (numeração de Kabat) na qual resíduos correspon- dentes entre cadeias pesadas diferentes ou entre cadeias leves dife- rentes recebem o mesmo número. A menos que especificado de outra forma, a numeração das posições dentro das regiões variáveis dos anticorpos é a numeração Kabat. Quando se diz que um anticorpo compreende CDRs por uma certa definição de CDRs (por exemplo, Kabat), essa definição especifica o número mínimo de resíduos de CDR presentes no anticorpo (isto é, as CDRs de Kabat). Isso não ex- clui que outros resíduos que caem em outra definição convencional de CDRs, mas fora da definição especificada, também estejam presentes. Por exemplo, um anticorpo que compreende CDRs definidas por Kabat inclui entre outras possibilidades um anticorpo em que as CDRs con- têm resíduos de CDR de Kabat e nenhum outro resíduo de CDR, e um anticorpo em que CDR H1 é um compósito CDR H1 de Chothia-Kabat e outras CDRs contêm resíduos de CDR de Kabat e nenhum resíduo adicional de CDR com base em outras definições.
[0018] O termo "anticorpo" inclui anticorpos intactos e seus frag- mentos de ligação. Tipicamente, os fragmentos competem com o anti- corpo intacto do qual foram derivados para ligação específica com o alvo, incluindo cadeias pesadas separadas, cadeias leves Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dabs, nanocorpos e Fv. Fragmentos podem ser pro- duzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por separação enzimá- tica ou química de imunoglobulinas intactas. O termo "anticorpo" tam- bém inclui um anticorpo biespecífico e/ou um anticorpo humanizado.
Um anticorpo biespecifico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artifici- al que tem dois pares diferentes da cadeia pesada/leve e dois sítios de ligação diferentes (ver, por exemplo, Songsivilai e Lachmann, Clin. Exp Immunol. 79:315-321 (1990); Koelny et al., J. Immunol. 148:1547-53 (1992)).
[0019] Anticorpos biespecíficos exemplares podem também ser: (1) um anticorpo de domínio variável duplo (DVD-lg), no qual cada ca- deia leve e cadeia pesada contém dois domínios variáveis em tandem por meio de uma ligação peptídica curta (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variablel Domain Immunoglobulin (DVD- lg™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010); (2) um TandAb, que é uma fusão de dois diacorpos de cadeia simples que resulta em um anticorpo biespecífico tetravalente que tem dois sítios de ligação para cada um dos antígenos-alvo; (3) um felxi- corpo, que é uma combinação de scFvs com um diacorpo que resulta em uma molécula multivalente; (4) uma chamada molécula "chave- fechadura", com base no "domínio de dimerização e ancoragem" na Proteína Cinase A, que, quando aplicada a Fabs, pode produzir uma proteína de ligação biespecífica trivalente que consiste de dois frag- mentos Fab idênticos ligados a um fragmento Fab diferente; ou (5) uma chamada molécula Escorpião, que compreende, por exemplo, dois scFvs fundidos em ambos os terminais de uma região Fc huma- na.
[0020] Exemplos de plataformas úteis para a preparação de anti- corpos biespecíficos incluem BiTE (Microgenet), DART (MacroGenics), Fcab e Mab2 (F-star), IgGI engenheirada com Fc (Xencor) ou Duobody (com base em troca do braço Fab, Genmab).
[0021] O termo "epítopo" refere-se a um sítio em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Um epítopo pode ser formado a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por enovelamento terciário de uma ou mais proteínas. Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos (também conhecidos como epítopos lineares) são tipicamente retidos sob exposição a solventes de desna- turação, enquanto epítopos formados por enovelamento terciário (tam- bém conhecidos como epítopos conformacionais) são tipicamente per- didos no tratamento com solventes de desnaturação. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, e mais usualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos de deter- minação da conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensio- nal. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, In Methods in Mole- cular Biology, Vol. 66, Glenn e Morris, Ed. (1996).
[0022] Competição entre anticorpos é determinada por um ensaio no qual um anticorpo sob teste inibe ligação específica de um anticor- po de referência com um antígeno comum (ver, por exemplo, Jun- ghans e outros, Cancer Res. 50:1495, 1990). Um anticorpo de teste compete com um anticorpo de referência se um excesso de um anti- corpo de teste (por exemplo, pelo menos 2x, 5x, 10x, 20x ou 100x) ini- be ligação do anticorpo de referência em pelo menos 50% conforme medido em um ensaio de ligação competitiva. Alguns anticorpos de teste inibem ligação do anticorpo de referência em pelo menos 75%, 90% ou 99%. Os anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos competitivos) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anti- corpo de referência para que ocorra bloqueio estérico.
[0023] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa que o veí- culo, diluente, excipiente ou auxiliar é compatível com os outros ingre- dientes da formulação e não substancialmente prejudicial ao seu re- ceptor e/ou que tal veículo, diluente, excipiente ou auxiliar é aprovado ou aprovável pelo FDA para inclusão em uma composição farmacêuti- ca para administração parenteral a seres humanos.
[0024] O termo "indivíduo" inclui seres humanos e outros indiví- duos mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico.
[0025] Para propósitos de classificação de substituições de ami- noácidos como conservativas ou não conservativos, os aminoácidos são agrupados como segue: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (ca- deias laterais básicas): asn, gin, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação da cadeia): gly, pro; e grupo VI (cadeias late- rais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservativas envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não conservativas constituem troca de um membro de uma dessas classes por um membro de outra.
[0026] As identidades de sequência percentuais são determinadas com sequências de anticorpos maximamente alinhadas pela conven- ção de numeração de Kabat. Após o alinhamento, se uma região do anticorpo em questão (por exemplo, a região variável inteira madura de uma cadeia pesada ou leve) está sendo comparada com a mesma região de um anticorpo de referência, a identidade de sequência per- centual entre as regiões do anticorpo do indivíduo e de referência é o número de posições ocupadas pelo mesmo aminoácido tanto na regi- ão do anticorpo do indivíduo quanto na região do anticorpo de referên- cia dividido pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com intervalos não contados, multiplicado por 100 para converter em porcentagem.
[0027] Composições ou métodos "que compreendem" ou "que in- cluem" um ou mais elementos citados podem incluir outros elementos não especificamente citados. Por exemplo, uma composição que
"compreende" ou "inclui" um anticorpo pode conter o anticorpo sozinho ou em combinação com outros ingredientes.
[0028] A designação de uma faixa de valores inclui todos os núme- ros inteiros dentro da ou que definem a faixa, e todas as subfaixas de- finidas por números inteiros dentro da faixa.
[0029] A menos que evidente de outro modo a partir do contexto, o termo "cerca de" abrange variações não substanciais, tais como valo- res dentro de uma margem padrão de erro de medição (por exemplo, SEM) de um valor declarado
[0030] Significância estatística significa p < 0,05.
[0031] Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente engenheirado no qual as CDRs de um anticorpo "doador" não humano são enxertadas em sequências do anticorpo "receptor" humano (ver, por exemplo, Queen, US 5.530.101 e 5.585.089; Winter, US
5.225.539; Carter, US 6.407.213; Adair, US 5.859.205; e Foote, US
6.881.557). As sequências do anticorpo receptor podem ser, por exemplo, uma sequência de anticorpo humano maduro, um composto de tais sequências, uma sequência de consenso de sequências de an- ticorpos humanos, ou uma sequência de região de linhagem germina- tiva. Assim, um anticorpo humanizado é um anticorpo que tem CDRs inteiramente ou substancialmente de um anticorpo doador e sequên- cias de moldura de regiões variáveis e regiões constantes, se presen- tes, inteiramente ou substancialmente de sequências de anticorpos humanos. Uma CDR em um anticorpo humanizado é substancialmente de uma CDR correspondente em um anticorpo não humano quando pelo menos 85%, 90%, 95% ou 100% de resíduos correspondentes (conforme definido por Kabat) são idênticos entre as respectivas CDRs. As sequências de moldura da região variável de uma cadeia de anticorpo ou região constante de uma cadeia de anticorpo são subs- tancialmente de uma sequência de moldura de região variável humana ou região constante humana, respectivamente, quando pelo menos 85%, 90%, 95% ou 100% de resíduos correspondentes definidos por Kabat são Idênticos a uma sequência receptora humana.
[0032] As Figuras 1A e 1B mostram as regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve maduras do anticorpo anti-c-Kit de camundongo produzido por um hibridoma depositado como HB-10716.
[0033] As Figuras 2A e 2B mostram regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve maduras de cinco regiões variáveis maduras da cadeia pesada humanizada da presente invenção e duas regiões vari- áveis maduras da cadeia leve humanizada comparadas com as se- quências receptoras humanas e de camundongo. As molduras da re- gião variável das sequências humanizadas são as mesmas de AMG191, mas as CDRs são diferentes.
[0034] A Figura 2C compara ligação de AMG191 com variantes da mesma que têm substituições de CDRs. Todas as variantes com subs- tituições de CDRs mostraram ligação melhorada.
[0035] A Figura 2D compara ligação de AMG191 com variantes que têm outras substituições de CDRs. Essas variantes mostraram ligação reduzida.
[0036] As Figuras 3A e 3B fornecem a sequência de seis regiões variáveis maduras da cadeia pesada humanizada e três regiões variá- veis maduras da cadeia leve humanizada comparadas com AMG191, sequências de camundongo e sequências receptoras humanas. Nes- sas cadeias humanizadas, as molduras da região variável diferem da- quelas no anticorpo AMG191. Algumas das cadeias humanizadas também diferem nas CDRs.
[0037] A Figura 3C compara ligação de AMG191 com um anticor- po humanizado com as mesmas CDRs, mas molduras de região variá- vel diferentes (que surgem do uso de diferentes sequências receptoras humanas). O anticorpo com as novas molduras (NF) tem maior afini- dade.
[0038] A Figura 3D compara ligação de AMG191 com variantes humanizadas adicionais, com base nas novas molduras e também apresentando substituições de CDRs em relação a AMG191. Todos os três anticorpos variantes tinham afinidade maior.
[0039] A figura 4 compara ligação de AMG191 com três anticorpos humanizados que diferem de AMG191 pela presença de substituições de CDRs e uma moldura de região variável da cadeia leve diferente (a moldura da região variável da cadeia pesada sendo a mesma). Todos os três anticorpos variantes tinham afinidade mais alta.
[0040] A figura 5 compara a atividade fagocítica de AMG191, uma variante de AMG191 que tem uma região constante de lgG1 do tipo selvagem com cinco novos anticorpos humanizados da presente in- venção. As novas variantes, particularmente HF12 e NF112, mostra- ram aumento de fagocitose particularmente nas concentrações mais baixas testadas.
[0041] A Figura 6 compara a atividade ADCC de AMG191 com duas novas variantes humanizadas HF112 E HF12 e um controle irre- levante de isótipo combinado. HF112 e HF12 apresentaram mais ativi- dade ADCC.
[0042] A Figura 7 mostra inibição de proliferação de HSPC induzi- da por SCF por HF12 E HF112 em comparação com AMG191, AMG191-IgG1 humano e um controle negativo.
[0043] A Figura 8 compara a desgranulação de mastócitos de anti- corpos anti-c-Kit em comparado com controles positivos A23187 e IgE + anti-lgE.
[0044] SEQ ID NOS: 1-4 são a região variável pesada madura e CDRs-H1, H2 e H3 do anticorpo de HB-10716.
[0045] SEQ ID NOS: 5-8 são a região variável da cadeia leve ma- dura e CDRs-L1, L2 e L3 do anticorpo de HB -10716.
[0046] SEQ ID NOS: 9-12 são a região variável da cadeia pesada madura e CDRs-H1, H2 e H3 da cadeia pesada humanizada AH1.
[0047] SEQ ID NOS: 13-16 são a região variável da cadeia pesada madura e CDRs-H1, H2 e H3 da cadeia pesada humanizada AH2.
[0048] SEQ ID NOS: 17-20 são a região variável da cadeia pesada madura e CDRs-H1, H2 e H3 da cadeia pesada humanizada AH3.
[0049] SEQ ID NOS: 21-24 são a região variável da cadeia pesada madura e CDRs-H1, H2 e H3 da cadeia pesada humanizada AH4.
[0050] SEQ ID NOS: 25-28 são a região variável da cadeia pesada madura e CDRs-H1, H2 e H3 da cadeia pesada humanizada AH5.
[0051] SEQ ID NO: 29 é a região variável da cadeia pesada madu- ra de AMG191.
[0052] SEQ ID NO: 30 é uma sequência da região variável de IGHV1-46*01.
[0053] SEQ ID NOS: 31-34 são a região variável da cadeia leve madura e CDRs-L1, L2 e L3 da região variável da cadeia leve humani- zado AL1.
[0054] SEQ ID NOS: 35-38 são a região variável da cadeia leve madura e CDRs-L1, L2 e L3 da cadeia leve humanizada AL2.
[0055] SEQ ID NO: 39 é a região variável da cadeia leve madura de AMG191.
[0056] SEQ ID NOS: 40-43 são a sequência da região variável e três CDRs-L1, L2 e L3, de IGKV4-1*01.
[0057] SEQ ID NOS: 44-50 é a região variável da cadeia pesada madura das cadeias pesadas humanizadas NH, NH1, NH2, NH3, NH4 e NH5 e IGHV3-23*01.
[0058] SEQ ID NOS: 51-54 são as regiões variáveis da cadeia leve madura das cadeias leves humanizadas NL, NL1, NL2 e IGKV2-28*01.
DESCRIÇÃO DETALHADA I. General
[0059] A invenção fornece anticorpos que se ligam especificamen- te a c-Kit humano (Swiss Prot. P10721). Os anticorpos representam formas humanizadas do anticorpo anti-c-Kit de camundongo anterior- mente descrito produzido pelo hibridoma depositado como HB-10716, que tem regiões variáveis das cadeias pesada e leve maduras de SEQ ID NOS: 1 e 5, respectivamente. Esse anticorpo de camundongo foi anteriormente humanizado como AMG191 (ver US 7915391). As CDRs Kabat de AMG191 são as mesmas do anticorpo de camundon- go do qual foram derivadas. AMG191 está disponível comercialmente junto à Criative Biolabs.
[0060] Os presentes anticorpos têm CDRs substancialmente do anticorpo de camundongo depositado como HB-10716 enxertadas em sequências receptoras humanas, opcionalmente com substituições em certas posições conforme descrito adicionalmente abaixo.
[0061] Alguns anticorpos compreendem uma região variável pesa- da madura que contém CDRs H1, H2 e H3 da SEQ ID NO: 1, e uma região variável da cadeia leve madura que contém CDRs L1, L2 e L3 da SEQ ID NO: 5, contanto que pelo menos uma substituição de resí- duo de CDR esteja presente. As CDRs H1, H2 e H3 compreendem, de preferência, SEQ ID NOS: 2-4, respectivamente, e as CDRs L1, L2 e L3 compreendem, de preferência, SEQ ID NOS: 6-8 (isto é, conforme definido por Kabat), contanto que pelo menos uma substituição de CDRs esteja presente. A substituição de CDRs é preferivelmente sele- cionada de N por A na posição da cadeia pesada 60, K por Q na posi- ção da cadeia pesada 64 e N por Q na posição da cadeia leve 30, sendo as posições numeradas de acordo com Kabat. Uma, duas ou todas as três dessas substituições podem estar presentes. Alguns an- ticorpos incluem as substituições na posição da cadeia pesada 64 e na posição da cadeia leve 30. Alguns anticorpos incluem as substituições na posição da cadeia pesada 60, na posição da cadeia pesada 64 e posição da cadeia leve 30. Alguns anticorpos incluem as substituições na posição da cadeia pesada 60 e na posição da cadeia leve 30. Al- guns anticorpos incluíram as substituições na posição da cadeia pesa- da 60 e na posição da cadeia pesada 64. Alguns anticorpos não têm substituições das CDRs de Kabat, exceto as substituições nas posi- ções das cadeias pesadas 60 e 64 e na posição da cadeia leve 30 in- dividualmente ou nas combinações listadas. Se quaisquer outras subs- tituições das CDRs de Kabat estiverem presentes, é preferível que não mais de 1, 2, 3, 4 ou 5 dessas substituições estejam presentes.
[0062] Alguns dos presentes anticorpos diferem de AMG191 pela presença de pelo menos uma substituição de um resíduo de CDR em relação ao resíduo presente em AMG191. Substituições preferidas são N por A na posição da cadeia pesada 60, K por Q na posição da ca- deia pesada 64 e N por Q em uma posição da cadeia leve 30, sendo as posições numeradas de acordo com Kabat. Uma, duas ou todas as três dessas substituições podem estar presentes. Alguns anticorpos incluem as substituições na posição da cadeia pesada 64 e na posição da cadeia leve 30. Alguns anticorpos incluem as substituições na posi- ção da cadeia pesada 60, na posição da cadeia pesada 64 e posição da cadeia leve 30. Alguns anticorpos incluem as substituições na posi- ção da cadeia pesada 60 e na posição da cadeia leve 30. Alguns anti- corpos incluíram as substituições na posição da cadeia pesada 60 e na posição da cadeia pesada 64. Alguns anticorpos não têm substitui- ções em relação às CDRs de Kabat de AMG191, exceto as substitui- ções nas posições das cadeias pesadas 60 e 64 e na posição da ca- deia leve 30 individualmente ou nas combinações listadas. Se quais- quer outras substituições das CDRs de Kabat estiverem presentes, é preferível que não mais de 1, 2, 3, 4 ou 5 dessas outras substituições estejam presentes.
[0063] As substituições de CDRs nas posições das cadeias pesa- das 60 e 64 e na posição da cadeia leve 30 individualmente e em combinação podem conferir aumento de afinidade de ligação para c- Kit humano. As substituições também representam substituição de um resíduo de camundongo por um resíduo de linhagem germinativa hu- mana em uma posição, sendo assim outras coisas iguais levando a aumento do caráter humano do anticorpo humanizado. A Tabela 1 abaixo compara os resíduos que ocupam posições das cadeias pesa- das 60 e 64 e a posição da cadeia leve 30 no anticorpo de camundon- go depositado como HB-10716, AMG191 e três dos presentes anticor- pos humanizados. Tabela 1 Resíduo HB-10716 AMG191 HF12 HF11 HF112 H60 N N A N A H64 K K K Q Q L30 N N Q Q Q
[0064] Adicionalmente ou alternativamente, alguns dos presentes anticorpos humanizados diferem daqueles de AMG191 pela presença de diferentes sequências de moldura de região variável. AMG191 foi derivado enxertando sequências de CDR de camundongo nas moldu- ras de linhagem germinativa de IGHV1-46*01 IGKV4-1*01 para as ca- deias pesada e leve, respectivamente. A presente descrição fornece CDRs de enxerto em uma moldura de região variável da cadeia pesa- da de IGH3-23*01 e uma moldura de região variável da cadeia leve de IGKV2-28*01. Verificou-se que essas molduras conferem uma maior afinidade de ligação do que aquelas de AMG191. Alguns anticorpos preferidos da invenção incluem uma moldura de região variável da ca- deia pesada, com base em IGHV1-46*01, incorporando as mesmas mutações de retorno como na região variável da cadeia pesada de AMG191 e uma moldura de região variável da cadeia leve, com base em IGKV2-28*01. Essa combinação de molduras combina vantagens de afinidade melhorada em relação a AMG191 com expressão melho- rada sobre anticorpos com uma combinação de uma moldura de regi- ão variável da cadeia pesada de IGH3-23*01 e uma moldura de região variável da cadeia leve de IGKV2-28*01.
[0065] Assim, alguns anticorpos preferidos da invenção têm uma região variável da cadeia pesada madura com uma sequência de qualquer das cadeias designadas SEQ ID NOS: 13, 17 ou 21 corres- pondendo a AH2, AH3 e AH4 e uma região variável da cadeia leve madura com uma sequência de SEQ ID NO: 53 correspondente a NL2. As sequências da região variável da cadeia pesada diferem umas das outras por ter substituições de CDRs na posição da cadeia pesada 60 somente, posição da cadeia pesada 64 somente ou posições das ca- deias pesadas 60 e 64, todas por numeração de Kabat. Além das substituições de CDRs, as sequências da região variável da cadeia pesada são as mesmas da região variável da cadeia pesada madura de AMG191. As sequências da cadeia pesada de SEQ ID NOS: 13, 17 e 21 incluem substituições de moldura de região variável (isto é, o re- síduo receptor humano para doador camundongo) nas posições de Kabat 71 (R por A), 73 (T por K) e 78 (V por A). Há uma substituição adicional na posição 69 de M por I.
[0066] A região variável da cadeia leve madura da SEQ ID NO: 53 tem uma substituição de CDR na posição 30. A região variável da ca- deia leve madura da SEQ ID NO: 53 também difere da região variável da cadeia leve madura de AMG191 em várias posições na moldura de região variável como segue devido às diferentes seleções de recepto- res: Posição 9 ocupada por L Posição 12 ocupada por P Posição 14 ocupada por T
Posição 15 ocupada por P Posição 18 ocupada por P Posição 20 ocupada por S Posição 22 ocupada por S Posição 37 ocupada por L Posição 43 ocupada por S Posição 45 ocupada por Q Posição 74 ocupada por K Posição 77 ocupada por R Posição 78 ocupada por V Posição 79 ocupada por E Posição 84 ocupada por G
[0067] A região variável da cadeia leve madura da SEQ ID NO: 53 não contém quaisquer mutações de retorno da moldura de região vari- ável para resíduos de camundongo da linhagem germinativa humana.
[0068] A invenção também fornece anticorpos que apresentam regiões variáveis das cadeias pesada e leve representando variantes de sequências exemplificadas. Por exemplo, a invenção inclui anticor- pos que apresentam uma região variável da cadeia pesada madura com pelo menos 85%, 90%, 95%, 98 ou 99% de identidade com qual- quer uma das SEQ ID NOS: 13, 17 ou 21 e uma região variável da ca- deia leve madura com pelo menos 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 53. Qualquer variação das sequências designadas é preferivelmente externa às CDRs como defi- nido por Kabat. Variação também está preferivelmente não em posi- ções da moldura da região variável sujeitas a mutações de retorno nas sequências indicadas (posições 71, 73 e 78 por numeração de Kabat). Em alguns anticorpos, qualquer substituição não está na posição da cadeia pesada 69 por numeração de Kabat. Em alguns anticorpos, a variação está em posição(ões) da moldura da região variável diferen-
tes daquelas em que a SEQ ID NO: 53 difere da região variável da ca- deia leve madura de AMG191. Em outros anticorpos, a variação está em posição(ões) da moldura da região variável em que a SEQ ID NO: 53 difere da região variável da cadeia leve madura de AMG191, opcio- nalmente em combinação com outra(s) posição(ões) nas molduras de região variável. Em alguns anticorpos, são retidos pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 dos resíduos da moldura da região variável em que SEQ ID NO: 53 diferem da moldura da região variável da cadeia leve madura de AMG191. Em alguns anticorpos, a variação ocorre por meio de substituição(ões) conservativa(s). Em al- guns anticorpos, Q na posição 1 da cadeia pesada pode ser substituí- do por um potencial de redução E para conversão de piroglutamato (Liu et al., 2011, J. Biol. Chem., 286:11211-11217). A conversão de ácido glutâmico (E) em piroglutamato (pE) ocorre mais lentamente do que a partir de glutamina (Q). Por causa da perda de uma amina pri- mária na conversão de glutamina a pE, os anticorpos tornam-se mais ácidos. A conversão incompleta produz heterogeneidade no anticorpo que pode ser observada como múltiplos picos usando métodos analíti- cos baseados em carga. Diferenças de heterogeneidade podem indi- car uma falta de controle de processo.
[0069] Anticorpos podem ser testados em relação a afinidade de ligação com c-Kit humano, ADCP, ADCC e inibição de proliferação de HSPC induzida por SCF usando os ensaios proporcionados nos exemplos. Os anticorpos também podem ser selecionados em mode- los animais, tal como descrito em WO02016033201. Anticorpos prefe- ridos da invenção têm maior afinidade de ligação com c-Kit humano, ADCP melhorada e/ou ADCC melhorada e/ou aumento de inibição de proliferação de HSPC induzida por SCF medida usando tais ensaios sobre AMG191 ou uma forma de IgG1 humana do mesmo. Anticorpos preferidos também inibem ligação de c-Kit humano com seu ligante fator de células-tronco humano.
[0070] A invenção também fornece um meio para ligação melho- rada com c-Kit humano e/ou ADCP e/ou ADCC contra células que ex- pressam c-Kit humano em comparação com AMG191 ou uma forma de IgG1 humana do mesmo, em que o aumento é medido como nos presentes exemplos. Meios exemplares são anticorpos que têm uma região variável da cadeia pesada madura de qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 17 ou 21 e uma região variável da cadeia leve madura de SEQ ID NO: 53 com uma região constante da cadeia pesada de IgG1 humana e região constante da cadeia leve capa humana. Substitui- ções relativas a AMG191 nas CDRs de N por A na posição da cadeia pesada 60, K por Q na posição da cadeia pesada 64 e/ou N por Q em uma posição da cadeia leve 30 contribuem para as propriedades me- lhoradas do meio exemplar. Tais meios podem ser incorporados em uma composição farmacêutica com um veículo farmaceuticamente ati- vo.
[0071] Os anticorpos podem ou não estar sujeitos a modificação pós-tradução, tal como glicosilação, dependendo das condições de expressão ou seleção da região constante entre outros fatores. II. Seleção de Região Constante
[0072] As regiões variáveis das cadeias pesada e leve descritas acima podem ser ligadas a pelo menos uma porção de uma região constante humana. A escolha da região constante depende, em parte, de se são desejadas citotoxicidade mediada por células dependentes do anticorpo, fagocitose celular dependente do anticorpo e/ou citotoxi- cidade dependente do complemento. Por exemplo, isótipos humanos IgG1 e lgG3 têm citotoxicidade dependente de complemento e isótipos humanos lgG2 e lgG4 não. IgG1 e lgG3 humanas também induzem funções efetoras mediadas por células mais fortes do que lgG2 e lgG4 humanas. IgG1 humana é preferida para os presentes anticorpos. As regiões constantes da cadeia leve podem ser lâmbda ou capa.
[0073] Um ou vários aminoácidos no término amino ou carbóxi da cadeia leve e/ou pesada, tal como lisina com término C da cadeia pe- sada, podem estar faltando ou estar derivatizados em uma proporção ou em todas as moléculas. Substituições podem ser feitas nas regiões constantes para reduzir ou aumentar a função efetora tal como citoto- xicidade mediada por complemento ou ADCC, ou remover um sítio de glicosilação (ver, por exemplo, Winter et al., patente US Nº 5.624.821; Tso et al., patente US Nº 4.834.597; e Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4905, 2006), ou para prolongar a meia-vida em humanos (ver, por exemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Subs- tituições exemplares incluem um Gln na posição 250 e/ou um Leu na posição 428 (numeração EU é usada neste parágrafo para a região constante) para aumentar a meia-vida de um anticorpo. M252Y/S254T/T256E também aumenta a meia-vida como o faz N434A ou S, T250Q e V3089P. Substituição em qualquer uma ou to- das as posições 234, 235, 236 e/ou 237 reduz a afinidade por recepto- res de Fcy, particularmente o receptor FcyRI (ver, por exemplo, US
6.624.821). Qualquer uma das seguintes substituições aumenta a fun- ção efetora: e
[0074] As regiões constantes humanas mostram variação alotípica e variação isoalotípica entre diferentes indivíduos, isto é, as regiões constantes podem diferir em indivíduos diferentes em uma ou mais posições polimórficas. Isoalotipos diferem de alotipos pelo fato de que os soros que reconhecem um isoalotipo ligam-se a uma região não polimórfica de um ou mais outros isótipos. III. Expressão de Anticorpos Recombinantes
[0075] Anticorpos humanizados são tipicamente produzidos por expressão recombinante. Construtos de polinucleotídeos recombinan- tes tipicamente incluem uma sequência de controle de expressão ope- rativamente ligada às sequências de codificação da cadeias de anti- corpos, incluindo elementos de controle de expressão naturalmente associados ou heterólogos, tal como um promotor. As sequências de controle de expressão podem ser sistemas promotores em vetores ca- pazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado no hos- pedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para expressão em alto nível das sequências de nucleotídeos e a cole- ta e purificação dos anticorpos de reação cruzada.
[0076] Esses vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros ou como epissomas ou como uma parte integral do DNA cromossômico do hospedeiro. Comumente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção, por exemplo, resistên- cia à ampicilina ou resistência à higromicina, para permitir a detecção daquelas células transformadas com as sequências de DNA deseja- das.
[0077] E. coli é um hospedeiro procariótico útil para expressar an- ticorpos, particularmente fragmentos de anticorpos. Micróbios, tal co- mo levedura, são também úteis para expressão. Saccharomyces é um hospedeiro de levedura com vetores adequados que apresentam se- quências de controle de expressão, uma origem de replicação, se- quências de terminação e similares conforme desejado. Promotores típicos incluem 3-fosfoglicerato cinase e outras enzimas glicolíticas. Promotores de leveduras induzíveis incluem, entre outros, promotores de álcool desidrogenase, isocitocromo C e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose.
[0078] Células de mamíferos podem ser usadas para expressar segmentos de nucleotídeos que codificam imunoglobulinas ou seus fragmentos. Ver Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, NI, 1987). Várias linhagens de células hospedeiras adequadas capa- zes de secretar proteínas heterólogas intactas foram desenvolvidas e incluem linhagens de células CHO, várias linhagens de células COS, células HeLa, células HEK293, células L e mielomas que não produ- zem anticorpos, incluindo Sp2/0 e NSO. As células podem ser não humanas. Vetores de expressão para essas células podem incluir se- quências de controle de expressão, tais como uma origem de replica- ção, um promotor, um intensificador (Quen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), e sítios de informação de processamento necessários, tais como sítios de ligação com ribossomos, sítios de junção de RNA, sí- tios de poliadenilação e sequências terminadoras de transcrição. As sequências de controle de expressão podem incluir promotores deri- vados de genes endógenos, citomegalovírus, SV40, adenovírus, papi- lomavírus bovino e similares. Ver Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).
[0079] Alternativamente, sequências que codificam anticorpos po- dem ser incorporadas em transgenes para introdução no genoma de um animal transgênico e subsequente expressão no leite do animal transgênico (ver, por exemplo, Patente US Nº 5.741.957; Patente US Nº 5.304.489; e Patente US Nº 5.889.992). Transgenes adequados incluem sequências de codificação para cadeias leves e/ou pesadas operativamente ligadas a um promotor e intensificador a partir de um gene específico da glândula mamária, tal como caseína ou beta lacto- globulina.
[0080] Os vetores que contêm os segmentos de DNA de interesse podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos que de- pendem do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, transfecção com cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, en-
quanto tratamento com fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, biolística ou transfecção com base virai podem ser usados para outros hospedeiros celulares. Outros métodos usados para transformar célu- las de mamíferos incluem o uso de polibreno, fusão de protoplastos, lipossomas, eletroporação e microinjeção. Para a produção de animais transgênicos, transgenes podem ser microinjetados em oócitos fertili- zados ou podem ser incorporados no genoma de células-tronco em- brionárias, e os núcleos dessas células transferidos para oócitos enu- cleados.
[0081] Uma vez introduzido(s) vetor(es) que codifica(m) cadeias pesada e leve de anticorpos em cultura de células, pools de células podem ser selecionados para produtividade em crescimento e quali- dade do produto em meios isentos de soro. Pools de células de alta produção podem então ser submetidas a clonagem de células indivi- duais baseada em FACS para gerar linhagens monoclonais. Produtivi- dades específicas acima de 50 pg ou 100 pg por célula por dia, que correspondem a títulos de produto maiores do que 7,5 g/L de cultura, podem ser usadas. Anticorpos produzidos por clones de células indivi- duais também podem ser testados quanto a turvação, propriedades de filtração, PAGE, IEF, Varredura UV, HP-SEC, mapeamento de carboi- drato-oligossacarídeo, espectrometria de massa e ensaio de ligação, tal como ELISA ou Biacore. Um clone selecionado pode então ser de- positado em múltiplos frascos e armazenado congelado para uso sub- sequente.
[0082] Uma vez expressos, os anticorpos podem ser purificados de acordo com procedimentos padrões do estado da técnica, incluindo captura de proteína A, purificação por HPLC, cromatografia de coluna, eletroforese em gel e similares (ver, de modo geral, Scopos, Protein Purification (Springer-Verlag, NI, 1982)).
[0083] Metodologia para a produção comercial de anticorpos pode ser empregada, incluindo otimização por códons, seleção de promoto- res, seleção de elementos de transcrição, seleção de terminadores, clonagem de células individuais sem de soro, deposição de células, uso de marcadores de seleção para amplificação de número de có- pias, terminador de CHO ou aperfeiçoamento de títulos de proteínas (ver, por exemplo, US 5.786.464; US 6.114.148; US 6.063.598; US
7.569.339; WO2004/050884; WO2008/012142; WO2008/012142; WO2005/019442; WO2008/107388; WO2009/027471; e US 5.888.809. IV. Ácidos Nucleicos
[0084] A invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das cadeias pesada e leve descritas acima. Opcional- mente, tais ácidos nucleicos também codificam um peptídeo de sinal e podem ser expressos com o peptídeo de sinal ligado às sequências de codificação da região constante de ácidos nucleicos que podem ser operativamente ligadas a sequências reguladoras para assegurar a expressão das sequências de codificação, tais como um promotor, in- tensificador, sítio de ligação de ribossomos, sinal de terminação de transcrição e similares. Os ácidos nucleicos que codificam cadeias pe- sada e leve podem ocorrer de forma isolada ou podem ser clonados em um ou mais vetores. Os ácidos nucleicos podem ser sintetizados, por exemplo, por síntese em estado sólido ou PCR de oligonucleotí- deos sobrepostos. Os ácidos nucleicos que codificam cadeias pesada e leve podem ser unidos como um ácido nucleico contíguo, por exem- plo, em um vetor de expressão, ou podem ser separados, por exem- plo, cada um clonado em seu próprio vetor de expressão. V. Anticorpos Conjugados
[0085] Os anticorpos da presente invenção podem ser conjugados com porções citotóxicas ou citostáticas para fornecer um mecanismo de adição de citotoxicidade.
[0086] Alguns desses anticorpos podem ser modificados para agir como imunotoxinas. Ver, por exemplo, a Patente U.S. Nº 5.194.54. Por exemplo, ricina, uma toxina celular derivada de plantas, pode ser aco- plada a anticorpos usando os reagentes bifuncionais anidrido S- acetilmercaptosuccínico para o anticorpo e 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidila para ricina. Ver Pieltersz et al., Cancer Res. 48(16):4469-4476 (1998). O acoplamento resulta em perda de ativida- de de ligação da cadeia B da ricina, ao mesmo tempo que não prejudi- ca nem o potencial tóxico da cadeia A da ricina nem a atividade do an- ticorpo. Similarmente, saporina, um inibidor de agregação ribossômica, pode ser acoplada a anticorpos por meio de uma ligação dissulfeto en- tre grupos sulfidrila quimicamente inseridos. Ver Polito et al., Leukemia 18:1215-1222 (2004).
[0087] Alguns desses anticorpos podem ser ligados a radioisóto- pos. Exemplos de radioisótopos incluem, por exemplo, ítrio90 (90Y), índio111 (111In), 131I, 99mTc, rádio-prata-111, rádio-prata-199 e bis- muto213. A ligação de radioisótopos com anticorpos pode ser realiza- da com quelatos bifuncionais convencionais. Para a ligação de rádio- prata-111 e rádio-prata-199, podem ser usados ligantes à base de en- xofre. Ver Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994). A ligação de radioisótopos de prata pode envolver a redução da imunoglobulina com ácido ascórbico. Para radioisótopos tais como 111In e 90Y, ibri- tumomab tiuxetano pode ser usado e reagirá com tais isótopos para formar 111In-ibritumomab tiuxetano e 90Y-ibritumomab tiuxetano, res- pectivamente. Ver Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol. 48, Supl. 1:S91-S95 (2001).
[0088] Alguns desses anticorpos podem ser conjugados com fár- macos quimioterápicos tóxicos tais como maitansina, geldanamicina, inibidores da tubulina tais como agentes de ligação da tubulina (por exemplo, auristatinas) ou agentes de ligação de sulcos menores tais como caliqueamicina.
VI. Aplicações Terapêuticas
[0089] Os anticorpos da invenção ou composições farmacêuticas que incorporam esses anticorpos podem ser usados para o tratamento de várias condições. Por exemplo, tais anticorpos podem ser usados na ablação de células hematopoiéticas e células progenitoras hemato- poiéticas endógenas (HSPCs) em um indivíduo com necessidade des- se tratamento. A ablação de HSPCs endógenas é uma etapa inicial na terapia de substituição com células-tronco. A terapia de substituição com células-tronco geralmente envolve a redução ou eliminação de HSPCs endógenas, que são defeituosas em algum aspecto, e substi- tuí-las por HSPCs de substituição. As HSPCs de substituição podem ser autólogas, alogênicas ou xenogênicas. As HSPCs endógenas po- dem ser defeituosas como resultado de mutação hereditária que pre- judica função ou expressão (por exemplo, anemia falciforme ou talas- semia), como resultado de um câncer hematológico ou como resultado de dano originado de quimioterapia usada no tratamento de um cân- cer. As HSPCs endógenas também podem ser substituídas em con- junto com um transplante de órgão, porque as HSPCs endógenas re- sultariam em ataque imune do transplante.
[0090] Anticorpos contra c-Kit também podem ser usados no tra- tamento de cânceres que expressam c-Kit. Esses cânceres incluem cânceres hematológicos, tais como AML e tumores sólidos, tais como câncer de mastócitos, câncer estromal testicular, câncer estromal gas- trointestinal, melanoma, câncer de mama e de pulmão. A expressão de c-Kit está preferivelmente em um nível mais alto do que as células de controle normais combinadas com tecido conforme determinado por ensaio de imuno-histoquímica.
[0091] Os anticorpos são administrados em um regime eficaz, sig- nificando dosagem, via de administração e frequência de administra- ção que alcança o propósito pretendido, tal como redução de HSPCs endógenas ou células cancerosas que expressam c-Kit. Em alguns casos, a eficácia pode ser observada em um paciente individual com relação a controles históricos ou experiência passada no mesmo paci- ente. Em outros casos, a eficácia pode ser demonstrada em um teste pré-clínico ou clínico em uma população de pacientes tratados com relação a uma população de controle de pacientes não tratados.
[0092] Dosagens exemplares são pelo menos 0,05 mg/kg e até 10 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,05-10 mg/kg, ou 0,1 a 5 mg/kg ou 5- 750 mg como uma dosagem fixa. A dosagem depende da condição do paciente e da resposta ao tratamento anterior, se houver, se o trata- mento é profilático ou terapêutico e se o distúrbio é agudo ou crónico, entre outros fatores.
[0093] A administração pode ser parenteral, intravenosa, oral, subcutânea, intra-arterial, intracraniana, intratecal, intraperitoneal, tópi- ca, intranasal ou intramuscular. Alguns anticorpos podem ser adminis- trados na circulação sistêmica por administração intravenosa ou sub- cutânea. A administração intravenosa pode ser, por exemplo, por infu- são por um período tal como 30-90 minutos.
[0094] O anticorpo pode ser administrado uma vez ou múltiplas vezes. Se múltiplas vezes, os intervalos podem ser, por exemplo, dia- riamente, semanalmente, a cada duas semanas, a cada mês ou a ca- da trimestre. VI. Composições Farmacêuticas e Métodos de Uso
[0095] As composições farmacêuticas que incorporam um anticor- po da invenção para administração parenteral podem ser estéreis e substancialmente isotônicas (250-350 mOsm/kg de água) e fabricadas sob condições de GMP. As composições farmacêuticas podem ser fornecidas em forma de dose unitária (isto é, a dose para uma única administração). As composições farmacêuticas podem ser formuladas usando um ou mais veículos, diluentes, excipientes ou auxiliares far-
maceuticamente aceitáveis. A formulação depende da via de adminis- tração escolhida. Para injeção, os anticorpos podem ser formulados em soluções aquosas, por exemplo, em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, solução de Ringer ou soro fisiológico ou tampão de acetato (para reduzir o desconforto no local de injeção). A solução pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativa- mente, os anticorpos podem estar na forma liofilizada para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirogênio esté- ril, antes do uso.
[0096] Os regimes podem ser administrados em combinação com um outro agente eficaz no tratamento da condição que está sendo tra- tada (por exemplo, agentes de quimioterapia ou produtos biológicos para o tratamento de câncer).
[0097] Após o tratamento, a condição do indivíduo tratado pode ser monitorada em relação a mudanças responsivas ao tratamento (por exemplo, números reduzidos de HSPCs endógenas) ou números reduzidos de células cancerosas que expressam c-Kit. VII. Outros Usos
[0098] Os anticorpos da invenção também podem ser usados para detectar c-Kit por imunoensaio, tais como ELISA, Western blot ou imu- no-histoquímica. Esse ensaio pode ser útil na determinação de se um câncer expressa c-Kit tornando-o receptivo ao tratamento com os pre- sentes métodos. Os anticorpos também podem ser usados para au- mento de HSPCs que expressam c-Kit por cromatografia de afinidade. Exemplos
1. Materiais e Métodos
[0099] Clonagem e sequenciamento de anticorpo V. Uma linha- gem de células de hibridoma c-kit anti-humano foi adquirida da ATCC (HB-10716). As regiões variáveis da cadeia pesada (VH) e da cadeia leve (VL) foram clonadas e sequenciadas por Genscript.
[00100] Humanização de anticorpo e substituições de CDRs. A humanização de HB-10716 foi realizada instalando resíduos de CDRs de anticorpos de camundongo em molduras de linhagem germinativa humana (FRs). Resumidamente, camundongo VH foi humanizado por recrutamento criterioso de resíduos de CDRs correspondentes e al- guns resíduos da moldura (FR) em IGHV1-46*01 ou IGHV3-23*01 hu- mano. Camundongo VL foi humanizado por recrutamento criterioso de resíduos de CDRs correspondentes e alguns resíduos da moldura (FR) em IGKV4-1*01 ou IGKV2-28*01 humano. Diferenças entre ca- mundongo e os resíduos de FR humanos foram modeladas individu- almente para investigar sua influência possível na conformação de CDRs. A fim de humanizar ainda mais o anticorpo e aumentar a afini- dade de ligação dos anticorpos humanizados, resíduos em CDRs fo- ram selecionados e mutados nos resíduos de CDRs correspondentes de sequências de linhagem germinativa humana.
[00101] Transfecção celular. Células 293F foram cultivadas sob meio de expressão FreesyleTM 293 (Invitrogen). Transfecção transiente foi realizada por cotransfecção de vetores de expressão que codificam cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo usando reagente de trans- fecção fectina 293 (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabri- cante. Quatro a cinco dias depois, os sobrenadantes das células trans- fectadas foram colhidos e testados por ELISA quanto a secreção de anticorpos. Resumidamente, placas de 96 poços (Nunc, Roskilde, Di- namarca) foram revestidas com 1 μg/ml de anticorpo gama Fc anti- humano de cabra em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) durante 16 horas a 4°C. Após o bloqueio durante 1 hora com BSA a 0,4% em PBS a temperatura ambiente, os sobrenadantes isolados fo- ram adicionados em diluições sequenciais de 1/3 e incubados durante 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram subsequentemente lavadas três vezes e incubadas com anticorpo específico capa anti- humano de cabra conjugado com HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram reveladas com TMB. A rea- ção foi interrompida com H2S04 2M e a DO foi medida a 450 nM.
[00102] Purificação e caracterização de anticorpo. O sobrena- dante de cultura foi aplicado em colunas de Sefarose de proteína A (GE Healthcare). A coluna foi lavada com PBS e a proteína foi então eluída com tampão eluente (tampão de citrato de sódio 0,1 M, pH 3,0). As frações coletadas foram neutralizadas com Tris 1 M, pH 9,0. Final- mente, as amostras purificadas foram dialisadas contra PBS. A pureza da fração de anticorpo eluída foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) em géis a 10% sob condições redutoras ou não redutoras. As bandas foram visualizadas por coloração com azul brilhante Coomassie.
[00103] Medição de atividade de ligação de antígeno por ELISA. Placas de 96 Poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 1 μg/ml de proteína de fusão c-Kit-Fc humana em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) durante 16 horas a 4°C. Após bloqueio durante 1 hora com BSA a 0,4% em PBS a temperatura ambiente, an- ticorpos anti-c-Kit foram adicionados em diluições sequenciais de 1/3 e incubados durante 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram subsequentemente lavadas três vezes e incubadas com anticorpo es- pecífico capa anti-humano de cabra conjugado com HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram revela- das com TMB. A reação foi interrompida com H2S04 2M e a DO foi medida a 450 nM.
[00104] Ensaio de fagocitose in vitro. Células de câncer MHC-1 foram lavadas e contadas, em seguida 25 μL contendo 1 x 105 células em IMDM livre de Soro foram adicionados em cada poço. Tratamento com anticorpo (em 25 μL) com uma concentração final de 10 μg/mL foi adicionado aos poços e incubado a 37°C por 30 minutos. Em 30 minu- tos, macrófagos que foram previamente colhidos com TrypLE foram contados e plaqueados com 5 x 104 células em 50 μL de IMDM sem soro. As placas foram incubadas a 37°C durante duas horas (Efe- tor:Alvo = 1:2). A porcentagem de fagocitose foi calculada por análise de Citometria de Fluxo procurando GFP+ macrófagos.
[00105] Análise de ADCC. Células assassinas naturais foram iso- ladas de PBMC humana usando kit de seleção positiva de CD56 hu- mano EasySep da Stemcell Technologies (Vancouver, British Colum- bia, Canadá, Nº de Catálogo 17855). As células isoladas foram culti- vadas durante a noite em meio RPMI 1640 suplementar com FBS a 10% e 100 U/mL de IL-2 humana recombinante (PeproTech, Rocky Hill, NJ, Nº de Catálogo 200-02). Células GIST-T1 foram marcadas com 5 μM de calceína-AM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Nº de Catálogo C3100MP) por 10 minutos a 37°C, em seguida lavadas duas vezes. Anti-c-Kit ou anticorpo de controle de isótipo foram diluí- dos em série 10 vezes de 0,0003 a 30 μg/mL e transferidos para uma placa de ensaio de fundo em V. Células GIST-T1 marcadas foram adi- cionadas à placa de ensaio seguidas de células assassinas naturais ativadas para uma razão final alvo para efetor de 1:5. Após duas horas de incubação, sobrenadante foi coletado e transferido para uma placa de fundo plano limpa. A placa foi lida em leitora de placa de fluores- cência SpectraMax M3 com excitação de 490 nm, emissão de 520 nm e corte de 515 nm, com software SoftMax Pro 7.0. Lise específica per- centual foi calculada com base em unidade de fluorescência relativa (RFU) com a seguinte fórmula: [(RFU de teste – média de RFU de fundo)/(RFU média máxima – RFU de fundo média)] X 100, em que fundo são células efetoras + células-alvo sem anticorpo, e lise máxima são células efetoras + células-alvo com tampão de lise. Os dados fo- ram analisados com GraphPad Prism 7.05. Lise percentual específica dependente de anticorpo foi plotada contra a concentração de anticor- pos.
[00106] Ensaio de proliferação de HSPC. Células-tronco CD34+ de sangue de cordão umbilical congelado/células progenitoras (ALL- CELLS, Nº de Catálogo CB005F) foram ressuspensas em meio de re- tenção de HSC, StemSpan SFEMII (STEEMCELL Technologies, Nº de Catálogo 09605), suplementado com 20 ng/ml de SCF recombinante humano (STECELL Technologies Cat. Nº 78062), 20 ng/ml de ligante Flt3 humano recombinante (Peprotech, Nº de Catálogo 300-19) e 20 ng/ml de TPO humana recombinante (Peprotech, Nº de Catálogo 300- 18). Cerca de 3.000 células-tronco foram plaqueadas por poço em três placas de 96 poços de ultrabaixo aglomerado COSTAR (Corning, Nº de Catálogo 7007). As placas foram centrifugadas sob 1.250 rpm a 4°C por 5 minutos e as células ressuspensas em 200 μl de meio de retenção de HSC com ou sem os anticorpos anti-c-Kit em triplicatas. Quatro anticorpos anti-c-Kit, AMG191, AMG191-G1, HF12 e HF112, foram testados em concentrações de 0,1; 1; 10 e 50 μg/ml. A prolifera- ção de células foi testada usando contas de contagem absoluta Countbright (InvitrogenTM, Nº de Catálogo C36950) nos dias 1º, 3º, 5º e 11º. AMG191 tem uma mutação N por E da posição 297 tornando não glicosilada a função efetora de redução. AMG191-G1 ou -lgG1 tem uma região constante de IgG1 humana do tipo selvagem.
2. Resultados (a) Clonagem e sequenciamento da região variável de hibridoma anti-c-Kit
[00107] Uma linhagem de células de hibridoma de c-Kit anti- humano foi adquirida da ATCC (HB-10716). A especificidade do clone de hibridoma HB-10716 foi examinada por ligação ELISA com c-Kit humano. Regiões variáveis das cadeias pesada e leve de HB-10716 foram clonadas do hibridoma usando primers de anticorpo universal.
Múltiplos clones de cada produto de gene V foram sequenciados para monitorar erros induzidos por PCR. As sequências de nucleotídeos de VH e VL de HB-10716 foram determinadas e as sequências de amino- ácidos deduzidas são mostradas nas Figuras 1A e B, respectivamente. (b) Humanização de anticorpo e substituições de CDRs
[00108] Para selecionar molduras de anticorpos humanos (FRs) a serem usadas como gabaritos para enxerto de CDRs, as regiões VL e VH de HB-10716 foram comparadas com aquelas de sequências de linhagem germinativa humana. Verificou-se que as FRs da região VL de HB-10716 de camundongo têm homologia maior com o subgrupo IGKV4-1 humano, e que as FRs da região VH apresentam maior ho- mologia com o subgrupo IGHV1-46 humano. As FRs de IGKV4-1 e IGHV1-46 humanas foram, portanto, usadas como as bases para pro- jetar o HB-10716 humanizado. As posições de aminoácidos nas regi- ões FR que diferem entre as sequências HB-10716 e IGKV4-1/IGHV1- 46 e que podem ter influência na ligação do antígeno foram identifica- das por modelagem molecular. Resíduos idênticos nas FRs foram reti- dos e resíduos não idênticos foram retidos ou substituídos com base no programa de modelagem molecular. Além disso, resíduos nas regi- ões CDR de VH e VL foram identificados por meio de modelagem mo- lecular. Substituições de CDRs foram realizadas por mutagênese dire- cionada a sítios.
[00109] A Tabela 2 resume os novos anticorpos humanizados que foram produzidos e seus componentes da região variável madura das cadeias pesada e leve. Em resumo, os anticorpos designados AF têm as mesmas molduras da região variável de AMG191. Os anticorpos designados NF têm molduras diferentes da região variável de AMG191. Os anticorpos designados HF têm a mesma moldura da re- gião variável da cadeia pesada de AMG191 e uma moldura da região variável da cadeia leve diferente.As substituições de CDR presentes em cada uma das cadeias na Tabela 2 abaixo em relação ao anticorpo produzido por HB-10716 são mostradas nas Figs. 2A-B e 3A-B. Tabela 2 Anticorpos Humanizados VH VL AF-2-1 AH1 AL2 AF11 AH2 AL2 AF12 AH3 AL2 AF112 AH4 AL2 AF-3 AH5 AL2 AF-1-1 AH4 AL1
NF NH NL NF-2-1 NH1 NL2 NF11 NH2 NL2 NF12 NH3 NL2 NF112 NH4 NL2 NF-3 NH5 NL2 HF11 AH3 NL2 HF12 AH2 NL2 HF112 AH4 NL2
[00110] Substituições de CDRs em H60, H64 e L30 aumentaram a ligação sozinhas ou em combinação (AF11, AF12 e AF112, Tabela 2, Figuras 2A-C). Mais importante, os resíduos em H60 e H64 foram mu- tados de volta às sequências de linhagem germinativa humana, au- mentando a humanidade dos anticorpos anti-c-Kit humanizados de AF11, AF12 e AF112. Além disso, uma única substituição de CDR de aminoácido em H54, H95 ou L27 (Tabela 2, Figuras 2A-B) prejudicou a ligação dos anticorpos anti-c-Kit humanizados de AF-2-1, AF-3 e AF-1- 1 (Fig. 2D).
[00111] Um anticorpo humanizado anti-c-Kit, NF, foi produzido por enxerto de CDR usando diferentes sequências de linhagem germinati- va humana de IGHV3-23*01 e IGKV2-28*01 como molduras (Tabela 2,
Figuras 3A-B). Anticorpo NF mostrou aumento de atividade de ligação quando comparado com AMG191 (Fig. 3C). Por conseguinte, as mes- mas substituições de CDRs em H54, H60, H64, H95, L27 e L30 foram aplicadas a NF (Tabela 2, Figuras 3A-B). Substituições de CDRs em H60, H64 e L30 não somente funcionaram com anticorpos com moldu- ras IGKV4-1/IGHV1-46, como também funcionaram com anticorpos com molduras IGHV3-23*01/IGKV2-28*01. Substituições de CDRs em H60, H64 e L30 sozinhas ou em combinação aumentaram ou retive- ram a atividade de ligação de NF11, NF12 e NF112 (Fig. 3D).
[00112] HF11, HF12 e HF112 humanizados foram construídos combinando diferentes VHs E VLs como mostrado na Tabela 2, e to- dos mostraram aumento de atividades de ligação, conforme compara- ção com AMG191 (Fig. 4). (c) Anticorpos anti-C-Kit humanizados promovem fagocitose me- diada por macrófagos
[00113] Foi então investigada a capacidade de anticorpos anti-c-Kit humanizados permitirem a fagocitose de células de câncer humano por macrófagos derivados de sangue periférico humano. Como AMG191 tem uma Fc silenciada, foi produzido AMG191-G1 que tem as mesmas sequências de AMG191, exceto que AMG191-G1 tem uma região constante Fc de IgGl humana ativa. AMG191 não induziu fago- citose quando comparado com o controle PBS, entretanto, AMG191- G1 induziu atividade fagocítica mais elevada como esperado, porque ela tem uma estrutura de sustentação de lgG1 humana ativa (Fig. 5). AMG191-G1 induziu níveis similares de atividade fagocítica em 0,1; 1 e 10 μg/ml. Em contraste com AMG191-G1, AF12, AF112, HF12, HF112 e NF112 humanizados foram mais potentes em concentração mais baixa e induziram atividade fagocítica mais elevada do que aque- la de AMG191-G1 sob 0,1; 1 ou mesmo sob 10 μg/ml, sugerindo doses terapêuticas mais baixas exigidas para AF12, AF112, HF12, HF112 e
NF112 humanizados (Figura 5). Os dados mostram que embora AMG191-G1, AF12, AF112, HF12, HF112 e NF112 sejam todos anti- corpos formatados de lgG1 humana, AF12, AF112, HF12, HF112 e NF112 são mais potentes. Isso se dá possivelmente devido às maiores afinidades de ligação de AF12, AF112, HF12, HF112 e NF112 atribuí- das a molduras e/ou substituições de CDRs. (d) Anticorpos anti-C-Kit humanizados Induzem ADCC potente
[00114] A capacidade de anticorpo anti-c-Kit humanizado induzir atividade de ADCC foi testada contra células GIST. AMG191 não indu- ziu ADCC em qualquer uma das concentrações testadas. HF12 e HF112 mediaram ADCC de uma maneira dependente da dose (Figura 6). (e) Anticorpos anti-C-Kit humanizados Inibem a proliferação de Células-Tronco/Células Progenitoras Hematopoiéticas (HSPC)
[00115] Células hematopoiéticas maduras desenvolvem-se de célu- las-tronco hematopoiéticas (HSCs) por meio de um processo organi- zado hierarquicamente que produz células cada vez mais restritas a linhagens com capacidade de autorrenovação decrescente. A proteína de superfície celular tirosina cinase c-Kit, que interage com seu ligante cognato, fator de células-tronco (SCF), regula a autorrenovação de HSC. Bloqueando a interação c-Kit com SCF, os requerentes testaram se anticorpos anti-c-Kit humanizados podem inibir a proliferação de HSPC. Conforme mostrado na Figura 7, SCF induziu proliferação de HSPC na ausência de qualquer tratamento com anticorpo. Entretanto, AMG191, AMG191-G1, HF12 e HF112 inibiram a proliferação de HSPC (Figura 7). Além disso, HF12 e HF112 são mais potentes em inibir proliferação de HSPC do que AMP191 e AMG191-G1 (Fig. 7). Isso ocorre possivelmente devido às maiores afinidades de ligação de HF12 e HF112 atribuídas a molduras e/ou substituições de CDRs. (f) Anti-c-Kit humanizado não induz uma desgranulação de mas-
tócitos significativa
[00116] C-KIT é expresso em células-tronco hematopoiéticas e mastócitos maduros. Mastócitos são derivados de progenitores hema- topoiéticos CD34+ na medula óssea. Quando da migração para vários tecidos periféricos, essas células progenitoras diferenciam-se em mas- tócitos maduros que expressam c-KIT juntamente com receptor de IgE de alta afinidade, FcεRI. Ligação de antígeno com um FcεRI iniciado com IgE em mastócitos aciona desgranulação e liberação de mediado- res químicos tais como histamina e triptase juntamente com citocinas, leucotrienos e proteases. A liberação de mediadores químicos causa os sintomas clássicos da alergia. Em uso clínico, é desejável que um anticorpo anti-c-KIT reduza células-tronco hematopoiéticas sem induzir a desgranulação de mastócitos.
[00117] Mastócitos maduros fenotipados (CD34-, FcεRlα+, c-KIT+) diferenciados de sangue total periférico de um doador humano saudá- vel foram incubados com diferentes concentrações de anticorpos anti- c-Kit humanizados HF12 e HF12 (10; 1; 0,1 & 0,01 μ/ml) por 7 horas. A23187 (10 μM) e IgE, mais anti-lgE (10 μg/ml cada), foram usados como controles positivos. Desgranulação foi quantificada medindo a liberação de β-hexosaminidase usando método de absorbância como descrito nos métodos.
[00118] Mastócitos primários humanos foram diferenciados in vitro e apresentaram o fenótipo CD34-, FcεRlα+ e c-KIT+ no fim da 9º sema- na, que foi consistente com as características fenotípicas de mastóci- tos maduros. As células foram então estimuladas com ionóforo de cál- cio A23187 ou IgE em combinação com anti-lgE. A23187 e IgE+ anti- IgE induziram eficazmente desgranulação de mastócitos conforme medido pela liberação de β-hexosaminidase.
[00119] Tratamento direto das células com anticorpos anti-c-Kit ou reticulação de anticorpos anti-c-Kit por um anticorpo anti-lgG não indu-
ziram desgranulação significativa de mastócitos em comparação com aquelas de tratamento com A23187 e anti-lgE (Fig. 8). A imobilização de anticorpos anti-c-Kit em uma placa também teve pouco efeito sobre a desgranulação de mastócitos. Coincubação de mastócitos e células NK na presença de várias concentrações de anticorpos anti-c-Kit tam- bém não induziu desgranulação de mastócitos em todas as concentra- ções testadas.
[00120] Em conclusão, os anticorpos anti-c-Kit HF12 e HF112 tive- ram pouco efeito sobre a desgranulação de mastócitos humanos pri- mários in vitro, em comparação com aquelas de ionóforo de cálcio A23187 ou IgE em combinação com tratamento com anti-lgE.
[00121] Todos os depósitos de patente, sítios da web, outras publi- cações, números de acesso e similares citados acima ou abaixo são incorporados na íntegra como referência para todos os propósitos na mesma extensão como se cada item individual fosse específica e indi- vidualmente indicado como sendo assim incorporado como referência. Se versões diferentes de uma sequência são associadas a um número de acesso em momentos diferentes, a versão associada ao número de acesso na data de depósito efetiva desse pedido é pretendida. A data de depósito efetiva significa anterior à data de depósito real ou data de depósito de um pedido de prioridade com referência ao número de acesso se aplicável. Da mesma forma, se versões diferentes de uma publicação, sítio da rede ou similar são publicadas em tempos diferen- tes, é pretendida a versão mais recentemente publicada na data de depósito efetiva do pedido, a menos que indicado de outro modo. Qualquer característica, etapa, elemento, modalidade de realização ou aspecto da invenção pode ser usada em combinação com qualquer outra, a menos que indicado especificamente de outra maneira. Embora a presente invenção tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo com propósitos de clareza e compreen-
são, será evidente que certas mudanças e modificações podem ser praticadas no escopo das reivindicações anexas.
Claims (15)
1. Anticorpo que se liga especificamente a c-Kit humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável pesa- da madura que contém CDRs H1, H2 e H3, como definido por Kabat, de SEQ ID NOS: 2-4, respectivamente, e uma região variável da ca- deia leve madura que compreende CDRs L1, L2 e L3, como definido por Kabat, de SEQ ID NOS: 6-8, respectivamente, exceto que 1, 2 ou 3 substituições de resíduos de CDR é/estão presentes selecionadas de N por A na posição da cadeia pesada 60, K por Q na posição da cadeia pesada 64 e N por Q na posição da cadeia leve 30, sendo as posições numeradas de acordo com Kabat.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que as CDRs H1, H2 e H3 conforme definidas por Ka- bat são SEQ ID NOS: 2-4, respectivamente, e CDRs L1, L2 e L3 con- forme definidas por Kabat são SEQ ID NOS: 6-8, respectivamente, ex- ceto que estão presentes as substituições de K por Q na posição da cadeia pesada 64 e N por Q na posição da cadeia leve 30.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que as CDRs H1, H2 e H3 conforme definidas por Ka- bat são SEQ ID NOS: 2-4, respectivamente, e as CDRs LI, L2 e L3 conforme definidas por Kabat são SEQ ID NOS: 6-8, respectivamente, exceto que estão presentes as substituições de N por A na posição da cadeia pesada 60, K por Q na posição da cadeia pesada 64 e N por Q na posição da cadeia leve 30.
4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada madura mostra pelo menos 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 13, 17 ou 21 (AH2, AH3 ou AH4) e a região variável da cadeia leve madura mostra pelo menos 85, 90, 95, 98, 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 53
(NL2), contanto que qualquer variação das SEQ ID NOS indicadas es- teja fora das CDRs como definidas por Kabat.
5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracteriza- do pelo fato de que a posição da cadeia pesada 1 por numeração Ka- bat é E.
6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que as seguintes posi- ções da região variável da cadeia leve madura são ocupadas por ami- noácidos como segue: Posição 9 ocupada por L, Posição 12 ocupada por P, Posição 14 ocupada por T, Posição 15 ocupada por P, Posição 18 ocupada por P, Posição 20 ocupada por S, Posição 22 ocupada por S, Posição 37 ocupada por L, Posição 43 ocupada por S, Posição 45 ocupada por Q, Posição 74 ocupada por K, Posição 77 ocupada por R, Posição 78 ocupada por V, Posição 79 ocupada por E, Posição 84 ocupada por G.
7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que a região variável da cadeia pesada madura tem uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 13, 17 ou 21, exceto que a posição 1 pode ser E, e a região variável da cadeia leve madura tem uma sequência de SEQ ID NO: 53.
8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada madura liga-se a uma região constante da cadeia pe- sada e a região variável da cadeia leve madura liga-se a uma região constante da cadeia leve madura.
9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- do pelo fato de que a região constante da cadeia pesada é IgG1 hu- mana.
10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que tem uma ligação me- lhorada com c-Kit humano em relação a AMG191.
11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que apresenta aumento de ADCP em relação a AMG191-lgG1.
12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que apresenta aumento de ADCC em relação a AMG191-lgG1.
13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes e um veículo farmaceuticamente aceitável.
14. Método de ablação de HSPCs endógenas, caracteriza- do pelo fato de que compreende a administração de um regime eficaz de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações pre- cedentes a um indivíduo com necessidade de ablação.
15. Método de tratamento de um câncer que expressa c-Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um re- gime eficaz de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindi- cações precedentes a um indivíduo que tem o câncer.
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Legal Events
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---|---|---|---|
B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] |