BR112021008624A2 - Anticorpos que reconhecem tau - Google Patents

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BR112021008624A2
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Tarlochan S. Nijjar
Robin Barbour
Philip James Dolan Iii
Yue Liu
Svetlana Alexander
Mark E. Renz
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Prothena Biosciences Limited
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Abstract

anticorpos que reconhecem tau. a invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente à tau. os anticorpos inibem ou retardam patologias associadas à tau e deterioração sintomática associada.

Description

ANTICORPOS QUE RECONHECEM TAU REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido US 62/758.421, depositado em 9 de novembro de 2018 e ao pedido PCT PCT/US2018/059895, depositado em 8 de novembro de 2018, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins.
REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] Este aplicativo inclui uma lista de sequência eletrônica em um arquivo chamado 2019-11-08 5386322WO ST25.TXT, criado em 08 de novembro de 2019 e que contém 96.408 bytes, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0003] A tau é uma proteína humana bem conhecida que pode existir em formas fosforiladas (ver, por exemplo, Goedert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4051-4055 (1988); Goedert, EMBO J. 8: 393-399 (1989); Lee, Neuron 2: 1615- 1624 (1989); Goedert, Neuron 3: 519-526 (1989); Andreadis, Biochemistry 31: 10626-10633 (1992). Tau foi relatada como tendo um papel na estabilização dos microtúbulos, particularmente no sistema nervoso central. A tau total (t-tau, isto é, formas fosforiladas e não fosforiladas) e fosfo-tau (p-tau, isto é, tau fosforilada) são liberadas pelo cérebro em resposta a lesão neuronal e neurodegeneração e foram relatadas como ocorrendo a níveis aumentados em o CSF dos pacientes de Alzheimer em relação à população geral (Jack et al., Lancet Neurol 9: 119-28 (2010)).
[0004]A tau é o principal constituinte dos emaranhados neurofibrilares, que, juntamente com as placas, são uma característica marcante da doença de Alzheimer. Os emaranhados constituem fibrilhas anormais com 10 nm de diâmetro, que ocorrem aos pares, enroladas de forma helicoidal com uma periodicidade regular de 80 nm. A tau dentro de emaranhados neurofibrilares é anormalmente fosforilada (hiperfosforilada) com grupos fosfato ligados a sítios específicos na molécula. O envolvimento grave de emaranhados neurofibrilares é observado nos neurônios da camada Il do córtex entorrinal, no CA1 e nas regiões subiculares do hipocampo, na amígdala e nas camadas mais profundas (camadas
II, V e VI superficial) do neocórtex na doença de Alzheimer. A tau hiperfosforilada também foi relatada como interferindo na montagem dos microtúbulos, o que pode promover a quebra da rede neuronal.
[0005] Inclusões de tau são parte da neuropatologia definidora de várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer, degeneração lobar frontotemporal, paralisia supranuclear progressiva e doença de Pick.
BREVE RESUMO DA INVENÇÃO REIVINDICADA
[0006] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente a tau humana, compreendendo uma região variável de cadeia pesada madura compreendendo CDRs H1, H2 e H3 que compreendem SEQ ID NOS: 8, 9 e 10, respectivamente, exceto que a posição H28 pode ser ocupada por N ou T, H54 pode ser ocupado por N ou D, H56 pode ser ocupado por D ou E, e a posição H58 pode ser ocupada por V ou |, e uma região variável de cadeia leve madura compreendendo CDRs L1, L2 e L3 que compreendem SEQ ID NOS: 12, 13 e 14, respectivamente, exceto que a posição L24 pode ser ocupada por K ou R, em que pelo menos uma das seguintes posições é ocupada pelo aminoácido como especificado: H1 é ocupada por Q, H5 é ocupada por Q, H11 é ocupado por L, H20 é ocupado por L, H23 é ocupado por T, H38 é ocupado por K, H75 é ocupado por S, H56 é ocupado por E, H58 é ocupado por |, L10 é ocupado por T, L17 é ocupado por E, L24 é ocupada por R, L37 é ocupada por Q, Lê83 é ocupada por L, L86 é ocupada por H, L100 é ocupada por A ou Q, L106 é ocupada d por L.
[0007] Em alguns de tais anticorpos, CDR-H1 compreende SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 86, CDR-H2 compreende SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 92, CDR-H3 compreende SEQ ID NO: 10, CDR-L1 compreende SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 89, CDR-L2 compreende SEQ ID NO: 13 e CDR-L3 compreende SEQ ID NO: 14. Em alguns de tais anticorpos, CDR-H1 compreende SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 86, CDR-H2 compreende SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 88, CDR-H3 compreende SEQ ID NO: 10, CDR-L1 compreende SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 89, CDR-L2 compreende SEQ ID NO: 13 e CDR-L3 compreende SEQ ID NO: 14. Em alguns de tais anticorpos, CDR-H1 compreende SEQ ID NO: 86, CDR-H2 compreende
SEQ ID NO: 92, CDR-H3 compreende SEQ ID NO: 10, CDR-L1 compreende SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 89, CDR-L2 compreende SEQ ID NO: 13 e CDR-L3 compreende SEQ ID NO: 14.
[0008] Em alguns desses anticorpos, CDR-H1 possui uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 86. Em alguns desses anticorpos, CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 87. Em alguns destes anticorpos, CDR-H2 possui uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:88. Em alguns desses anticorpos, CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:92. Em alguns desses anticorpos, CDR-L1 possui uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:89.
[0009] Em alguns de tais anticorpos, CDR-H1 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 86 e CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 87. Em alguns desses anticorpos, CDR-H1 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 86 e CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 88. Em alguns de tais anticorpos, CDR-H1 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 86 e CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 92.
[0010]EmM alguns desses anticorpos, o anticorpo é um anticorpo humanizado, anticorpo "veneered" ou anticorpo quimérico.
[0011] Em alguns anticorpos, a região variável da cadeia pesada madura humanizada tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 76-80 e SEQ ID NOs: 90-91 e a região variável da cadeia leve madura humanizada tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 83-85. Em alguns anticorpos, a região variável da cadeia pesada madura humanizada tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 76-80 e a região variável da cadeia leve madura humanizada tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 83-85. Em alguns anticorpos, a região variável da cadeia pesada madura humanizada tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 90-91 e a região variável da cadeia leve madura humanizada tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 83-85.
[0012] Em alguns desses anticorpos, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H93 é ocupado por S e H94 é ocupado por T. Em alguns desses anticorpos, as posições H93 e H94 são ocupadas por S e T, respectivamente.
[0013] Em alguns desses anticorpos, a posição H91 na região VH é ocupada por F.
[0014] Em alguns desses anticorpos, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H1 é ocupado por E, H5 é ocupado por V, H11 é ocupado por V, H20 é ocupado por |, H23 é ocupado por K, H38 é ocupado por R, H42 é ocupado por G, H43 é ocupado por K, H66 é ocupado por R, H75 é ocupado por T, H76 é ocupado por D, H81 é ocupado por E, H108 é ocupado por L, H109 é ocupado por V. Em alguns anticorpos, as posições H1, H5, H11, H20, H23, H38, H42, H43, H66, H75, H76, H81, H108 e H109 na região VH são ocupadas por E, V, VI K RG, KR TD, E, Le V, respectivamente.
[0015] Em alguns desses anticorpos, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H17 é ocupado por T, H80 é ocupado por M, H83 é ocupado por R. Em alguns anticorpos, as posições H17, H80 e H83 na região VH são ocupados por T, Me R, respectivamente.
[0016] Em alguns desses anticorpos, a posição H58 na região VH é ocupada por |.
[0017] Em alguns desses anticorpos, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H28 é ocupado por T, H67 é ocupado por V. Em alguns anticorpos, as posições H28 e H67 na região VH são ocupadas por T e V, respectivamente.
[0018] Em alguns desses anticorpos, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H54 é ocupado por D, H56 é ocupado por E. Em alguns anticorpos, as posições H54 e
H56 na região VH são ocupadas por D e E, respectivamente.
[0019] Em alguns desses anticorpos, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H1 é ocupado por Q ou E, H5 é ocupado por Q ou V, H11 é ocupado por L ou V, H17 é ocupado por S ou T, H20 é ocupado por L ou |, H23 é ocupado por T ou K, H28 é ocupado por N ou T, H38 é ocupado por K ou R, H42 é ocupado por E ou G, H43 é ocupado por Q ou K, H54 é ocupado por N ou D, H56 é ocupado por D ou E, H58 é ocupado por V ou |, H66 é ocupado por K ou R, H67 é ocupado por A ou V, H75 é ocupado por S ou T, H76 é ocupado por N ou D, H80 é ocupado por L ou M, H81 é ocupado por Q ou E, H83 é ocupado por T ou R, H91 é ocupado por F ou Y, H93 é ocupado por S, H94 é ocupado por T, H108 é ocupado por T ou L, H109 é ocupado por L ou V.
[0020] Em alguns anticorpos, as posições H91, H93 e H94 na região VH são ocupadas por F, S e T, respectivamente. Em alguns anticorpos, as posições H1, H5, H11, H20, H23, H38, H42, H43, H66, H75, H76, H81, H91, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupadas por E, V, VI KR G KRTD,E,F, S, T,LeV, respectivamente. Em alguns anticorpos, as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H38, H42, H43, H58, H66, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupados por E, V, V, TT L K RG, KI, R TD, M, E, R, S, T, Le V, respectivamente. Em alguns anticorpos, as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH é ocupada por E, V, V, TT L K T,R,G, KI, R V,T,D,M E,R,S,T,LeV, respectivamente. Em alguns anticorpos, as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupados por E, V, V, TIL K TR G,K DEI, RV,T,D,M E,R,S,T,LeV, respectivamente. Em alguns anticorpos, as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H91, H93, H94, H108 e H109 na região VH é ocupada por E, V, V, TIL KT, RG KD,E,R, VT. DM, E R, F,S,T,L,eV, respectivamente. Em alguns anticorpos, as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupados por E, V, V, TI K TR G KDERVTDMERS T LevV, respectivamente.
[0021] Em alguns desses anticorpos, pelo menos uma das seguintes posições na região VL é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: L7 é ocupada por S, L10 é ocupada por S, L15 é ocupada por L, L83 é ocupada por V, L86 é ocupada por Y e L106 é ocupada por |. Em alguns anticorpos, as posições L7, L10, L15, L83, L86 e L1O06 são ocupadas por S, S, L, V Y e Y, respectivamente.
[0022] Em alguns desses anticorpos, pelo menos uma das seguintes posições na região VL é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: L7 é T ou S, L10 é Tou S, LI5 é louL, LIZ é Qou E, L24 é Kou R, L37 é Lou Q, LA5 é KouR,L83éLouV,L86éHouY, LI00é AouQ,LI06 éLoul.
[0023] Em alguns anticorpos, as posições L7, L10, L15, L83, L86 e L106 na região VL são ocupadas por S, S, L, V, Y e |, respectivamente. Em alguns anticorpos, as posições L7, L10, L15, L17, L24, L37, L45, L83, L86, L100 e L106 na região VL são ocupadas por S, S, L E, R, Q, R, V, Y, Q e |, respectivamente.
[0024] Em alguns anticorpos, a região variável da cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 76-80 e SEQ ID NOs: 90-91 e a região variável da cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer um de SEQ ID NO: 83-85. Em alguns anticorpos, a região variável da cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 76-80 e a região variável da cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 83-85. Em alguns anticorpos, a região variável da cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 90-91 e a região variável da cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 83-85.
[0025] Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
[0026] Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
[0027] Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
[0028] Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
[0029] Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
[0030] Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
[0031] Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
[0032] Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico. Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo "veneered".
[0033] O anticorpo pode ser um anticorpo de camundongo, quimérico, "veneered" ou humanizado intacto ou um fragmento de ligação, fragmento Fab de anticorpo de cadeia simples, fragmento Fab'2 ou Fv de cadeia simples. Alguns dos anticorpos têm um isotipo IgG1 humano, enquanto outros podem ter um isotipo IgG2 ou IgG4 humano. Alguns anticorpos têm a região variável da cadeia leve madura é fundida em uma região constante da cadeia leve e a região variável de cadeia pesada madura é fundida em uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada de alguns anticorpos é uma forma mutante de uma região constante de cadeia pesada humana natural que tem ligação reduzida a um receptor de Fcy em relação à região constante de cadeia pesada humana natural. Em alguns anticorpos, a região variável da cadeia pesada madura é fundida a uma região constante da cadeia pesada possuindo a sequência da SEQ ID NO: 103 com ou sem a lisina de terminal C e/ou a região variável da cadeia leve madura é fundida a uma cadeia leve região constante com a sequência de SEQ ID NO: 104.
[0034] Alguns anticorpos podem ter pelo menos uma mutação na região constante, tal como uma mutação que reduz a fixação ou ativação do complemento pela região constante, por exemplo, uma mutação em uma ou mais das posições 241, 264, 265, 270, 296, 297, 318, 320, 322, 329 e 331 por numeração da UE. Alguns anticorpos possuem uma alanina nas posições 318, 320 e 322. Alguns anticorpos podem ser pelo menos 95% p/p puros. O anticorpo pode ser conjugado a um agente terapêutico, citotóxico, citostático, neurotrófico ou neuroprotetor.
[0035JEM outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos divulgados neste documento e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0036] Em outro aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica a cadeia pesada e/ou cadeia leve de qualquer dos anticorpos divulgados neste documento, um vetor de expressão recombinante compreendendo o ácido nucleico e uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão recombinante. Por exemplo, o ácido nucleico pode ter uma sequência compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 30-31, 93-99, 100-102 e 105-
106. Em outro exemplo, o ácido nucleico pode ter uma sequência compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 30-31, 93-97, 100-102 e 105-106. Em outro exemplo, o ácido nucleico pode ter uma sequência compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 30-31, 98-99, 100-102 e 105-106.
[0037] Em outro aspecto, a invenção fornece um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia pesada madura e uma região variável da cadeia leve madura operacionalmente ligada a uma ou mais sequências regulatórias para efetuar a expressão em uma célula de mamífero de qualquer um dos anticorpos divulgados neste documento, uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico e um método de expressão de um anticorpo em uma célula de mamífero que compreende a incorporação do ácido nucleico no genoma de um animal transgênico, pelo qual o anticorpo é expresso.
[0038] Alguns vetores compreendem um ácido nucleico que codifica ainda uma região constante da cadeia pesada fundida à região variável da cadeia pesada madura e uma região constante da cadeia leve fundida à região variável da cadeia leve madura. Em alguns vetores, a região constante da cadeia pesada codificada tem a sequência da SEQ ID NO: 103 com ou sem a lisina de terminal C e a região constante da cadeia leve codificada tem a sequência da SEQ ID NO:
104. Em alguns vetores, a região constante da cadeia pesada é codificada pela sequência da SEQ ID NO: 105 e a região constante da cadeia leve é codificada pela sequência da SEQ ID NO: 106.
[0039] Em alguns vetores, o anticorpo expresso codificado pelo ácido nucleico é um scFv. Em alguns vetores, o anticorpo expresso codificado pelo ácido nucleico é um fragmento Fab.
[0040] Em alguns vetores, uma ou mais sequências reguladoras incluem um ou mais de um promotor, potenciador, sítio de ligação ao ribossoma e sinal de terminação da transcrição. Em alguns vetores, o ácido nucleico codifica adicionalmente os peptídeos de sinal fundidos às regiões variáveis da cadeia pesada e leve maduras. Em alguns vetores, o ácido nucleico é otimizado por códons para expressão em uma célula hospedeira. Em alguns vetores, uma ou mais sequências regulatórias incluem um promotor eucariótico. Em alguns vetores, o ácido nucleico codifica ainda um gene selecionável.
[0041] Em outro aspecto, a invenção fornece primeiro e segundo vetores, respectivamente, compreendendo ácidos nucleicos que codificam uma região variável de cadeia pesada madura e uma região variável de cadeia leve madura, cada um operacionalmente ligado a uma ou mais sequências reguladoras para efetuar a expressão em uma célula de mamífero de qualquer um dos anticorpos divulgados neste documento, uma célula hospedeira que compreende os ácidos nucleicos e um método de expressão de um anticorpo em uma célula de mamífero que compreende a incorporação dos ácidos nucleicos no genoma de um animal transgênico, pelo qual o anticorpo é expresso.
[0042] Em alguns vetores, os ácidos nucleicos, respectivamente, codificam ainda uma região constante da cadeia pesada fundida à região variável da cadeia pesada madura e uma região constante da cadeia leve fundida à região variável da cadeia leve madura. Em alguns vetores, a região constante da cadeia pesada codificada tem a sequência da SEQ ID NO: 103 com ou sem a lisina de terminal C e a região constante da cadeia leve codificada tem a sequência da SEQ ID NO:
104. Em alguns vetores, a região constante da cadeia pesada é codificada pela sequência da SEQ ID NO: 105 e a região constante da cadeia leve é codificada pela sequência da SEQ ID NO: 106.
[0043] Ainda noutro aspecto, a invenção fornece métodos de humanização de qualquer anticorpo não humano descrito neste documento, por exemplo, anticorpo 3D6 de camundongo, em que 3D6 caracterizado por uma região variável de cadeia pesada madura de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve madura de SEQ ID NO: 11. Tais métodos podem envolver selecionar um ou mais anticorpos aceitadores, sintetizar um ácido nucleico codificando uma cadeia pesada humanizada compreendendo CDRs da cadeia pesada de camundongo e um ácido nucleico codificando uma cadeia leve humanizada compreendendo CDRs da cadeia leve de anticorpo de camundongo e expressando os ácidos nucleicos em uma célula hospedeira para produzir um anticorpo humanizado.
[0044] São também fornecidos métodos de produção de anticorpos, tais como um anticorpo humanizado, quimérico ou estratificado, por exemplo, formas humanizadas, quiméricas ou estratificadas de 3D6. Em tais métodos, as células transformadas com ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo são cultivadas de modo a que as células segreguem o anticorpo. O anticorpo pode então ser purificado a partir do meio de cultura celular.
[0045] As linhagens celulares que produzem qualquer um dos anticorpos divulgados neste documento podem ser produzidas introduzindo um vetor codificando cadeias pesadas e leves do anticorpo e um marcador selecionável nas células, propagando as células sob condições para selecionar células com um número de cópias aumentado do vetor, isolando as células únicas das células selecionadas; e armazenar células clonadas a partir de uma única célula selecionada com base no rendimento do anticorpo.
[0046] Algumas células podem ser propagadas sob condições seletivas e triadas para linhagens celulares que expressam e secretam naturalmente o anticorpo em uma quantidade de pelo menos 100 mg/L/10º células/24 horas. Células únicas podem ser isoladas das células selecionadas. Células clonadas de uma única célula podem então ser armazenadas. Células únicas podem ser selecionadas com base nas propriedades desejáveis, como o rendimento do anticorpo. Linhagens celulares exemplificativas são linhagens celulares que expressam 3D6.
[0047] A invenção também fornece métodos de inibição ou redução da agregação de tau num indivíduo tendo ou em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por tau, compreendendo administrar ao sujeito um regime eficaz de um anticorpo divulgado neste documento, inibindo desse modo ou reduzindo a agregação de tau no sujeito. Os anticorpos exemplificativos incluem versões humanizadas de 3D6.
[0048] São também fornecidos métodos para tratar ou efetuar a profilaxia de uma doença relacionada com tau em um sujeito, compreendendo a administração de um regime eficaz de um anticorpo divulgado neste documento e, desse modo, o tratamento ou a realização da profilaxia da doença. Exemplos de tal doença são doença de Alzheimer, síndrome de Down, disfunção cognitiva leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós-encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia glial globular, complexo parkinsonismo-demência de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauoupatia glial globular (GGT)
ou paralisia supranuclear progressiva (PSP). Em alguns métodos, a doença relacionada à tau é a doença de Alzheimer. Em alguns métodos, o paciente é portador da ApoE4.
[0049] São também fornecidos métodos para reduzir a transmissão aberrante de tau compreendendo a administração de um regime eficaz de um anticorpo divulgado neste documento e reduzindo assim a transmissão de tau.
[0050] São também fornecidos métodos de indução de fagocitose de tau compreendendo a administração de um regime eficaz de um anticorpo divulgado neste documento e, desse modo, induzir fagocitose de tau.
[0051] São também fornecidos métodos de inibição da agregação ou depósito de tau compreendendo a administração de um regime eficaz de um anticorpo divulgado neste documento inibindo desse modo a agregação ou depósito de tau.
[0052] São também fornecidos métodos de inibição da formação de emaranhados tau compreendendo a administração de um regime eficaz de um anticorpo divulgado neste documento.
[0053] A invenção também fornece um método de detecção de depósitos de proteínas tau num sujeito com ou em risco de doença associada a agregação ou deposição de tau, compreendendo a administração a um sujeito de um anticorpo divulgado neste documento e a detecção do anticorpo ligado a tau no sujeito. Exemplos de tal doença são doença de Alzheimer, síndrome de Down, disfunção cognitiva leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós-encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia glial globular, complexo parkinsonismo-demência de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauoupatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP). Em algumas modalidade, o anticorpo é administrado por injeção intravenosa no corpo do sujeito. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado diretamente ao cérebro do indivíduo por injeção intracraniana ou perfurando um buraco através do crânio do sujeito. Em algumas modalidades, o anticorpo é rotulado. Em algumas modalidades, o anticorpo é rotulado com um rótulo fluorescente, um rótulo paramagnético ou um rótulo radioativo. Em algumas modalidades, o rótulo radioativo é detectado usando tomografia por emissão de pósitron (PET) ou tomografia computorizada por emissão de fóton único (SPECT).
[0054] A invenção também fornece um método para medir a eficácia do tratamento num indivíduo a ser tratado para uma doença associada a agregação ou deposição de tau, compreendendo a medição de um primeiro nível de depósitos de proteína tau no sujeito antes do tratamento, administrando a um indivíduo um anticorpo divulgado neste documento e detectar uma primeira quantidade do anticorpo ligado a tau no sujeito, administrando o tratamento ao sujeito, medindo um segundo nível de depósitos de proteína tau no sujeito após tratamento administrando a um sujeito o anticorpo e detectando a ligação do anticorpo a tau no sujeito, em que uma diminuição no nível de depósitos de proteína tau indica uma resposta positiva ao tratamento.
[0055] A invenção também fornece um método para medir a eficácia do tratamento em um sujeito a ser tratado para uma doença associada a agregação ou deposição de tau, compreendendo a medição de um primeiro nível de depósitos de proteína tau no sujeito antes do tratamento, administrando a um indivíduo um anticorpo divulgado neste documento e detectar uma primeira quantidade de anticorpo ligado a tau no sujeito, administrar o tratamento ao sujeito, medindo um segundo nível de depósitos de proteína tau no sujeito após tratamento administrando a um sujeito o anticorpo e detectando uma segunda quantidade de anticorpo ligado a tau no sujeito, em que nenhuma alteração no nível de depósitos de proteína tau ou um pequeno aumento nos depósitos de proteína tau indica uma resposta positiva ao tratamento.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0056] A Figura 1 descreve um alinhamento das regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo 3D6 de camundongo (SEQ ID NO: 7) e versões humanizadas do anticorpo 3D6 (hu3D6VHvb1, hu3D6VHvb2, hu3D6VHvb3, hu3D6VHvb4, hu3D6VHvb5, hu3sD6VHvb6, e hu3D6VHvb7) com sequência de região variável de cadeia pesada de linhagem germinativa humana GHV1-69-2*01
(SEQ ID NO: 25) e com sequência de região variável de cadeia pesada aceitadora humana 2RCS VH hFrwk (SEQ ID NO: 75). hu3D6VHvb1 é SEQ |D NO: 76, hu3D6VHvb2 é SEQ ID NO: 77, hu3D6VHvb3 é SEQ ID NO: 78, hu3D6VHvb4 é SEQ ID NO: 79, hu3D6VHvb5 é SEQ ID NO: 80, hu3D6VHvb6 é SEQ ID NO:90 e hu3D6VHvyb7 é SEQ ID NO: 91. As CDRs definidas pelo Composto Kabat/Chothia estão em negrito.
[0057] A Figura 2 representa um alinhamento de regiões variáveis de cadeia leve do anticorpo 3D6 de camundongo (SEQ ID NO: 11) e versões humanizadas do anticorpo 3D6 (hu3D6VLvb1, hu3D6VLvb2 e hu3D6VLvb3) com sequência de região variável de cadeia leve de linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ I|D NO: 27) e com a aceitadora huamana ARX71335 VL hFrwk (SEQ ID NO: 82). husD6VLvb1 é SEQ ID NO: 83, hu3D6VLvb2 é SEQ ID NO: 84 e hu3D6VLvb3 é SEQ ID NO: 85. As CDRs definidas por Kabat estão em negrito.
[0058] As Figuras 3A, 3B, e 3C representam resultados de ensaios de triagem ELISA para anticorpos monoclonais anti-tau de camundongo selecionados.
[0059] A Figura 4 representa cinética de ligação para anticorpos monoclonais antitau de camundongo selecionados para tau humana recombinante.
[0060] A Figura 5 representa os resultados de ensaios de bloqueio funcional para anticorpos monoclonais anti-tau de camundongo selecionados.
[0061] A Figura 6 representa os resultados dos ensaios de desagregação para anticorpos monoclonais anti-tau de camundongo selecionados.
[0062] A Figura 7 representa os resultados das experiências que mostram que a 3D6 e a 5G8 imunocapturam a tau do tecido da doença de Alzheimer humana.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[0063] A SEQ ID NO: 1 estabelece a sequência de aminoácidos de uma isoforma da tau humana (Swiss-Prot P10636-8).
[0064] A SEQ ID NO: 2 estabelece a sequência de aminoácidos de uma isoforma da tau humana (Swiss-Prot P10636-7).
[0065] A SEQ ID NO: 3 estabelece a sequência de aminoácidos de uma isoforma da tau humana (Swiss-Prot P10636-6), (4RON tau humana).
[0066] A SEQ ID NO: 4 estabelece a sequência de aminoácidos de uma isoforma da tau humana (Swiss-Prot P10636-5)
[0067] A SEQ ID NO: 5 estabelece a sequência de aminoácidos de uma isoforma da tau humana (Swiss-Prot P10636-4).
[0068] A SEQ ID NO: 6 estabelece a sequência de aminoácidos de uma isoforma da tau humana (Swiss-Prot P10636-2).
[0069] A SEQ ID NO: 7 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 do camundongo.
[0070] A SEQ ID NO: 8 estabelece a sequência de aminoácidos da CDR- H1 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 3D6 de camundongo.
[0071] A SEQ ID NO: 9 estabelece a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H2 do anticorpo 3D6 de camundongo.
[0072] A SEQ ID NO: 10 estabelece a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H3 do anticorpo 3D6 de camundongo.
[0073] A SEQ ID NO: 11 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo 3D6 de camundongo e do anticorpo 6A10 de camundongo.
[0074] A SEQ ID NO: 12 estabelece a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L1 do anticorpo 3D6 de camundongo e do anticorpo 6A10 de camundongo.
[0075] A SEQ ID NO: 13 estabelece a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L2 do anticorpo 3D6 de camundongo e do anticorpo 6A10 de camundongo.
[0076] A SEQ ID NO: 14 estabelece a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L3 do anticorpo 3D6 de camundongo e do anticorpo 6A10 de camundongo.
[0077] A SEQ ID NO: 15 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv1.
[0078] A SEQ ID NO: 16 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv2.
[0079] A SEQ ID NO: 17 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv1b.
[0080] A SEQ ID NO: 18 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv1bA11.
| &KASEQID NO: 19 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv5: | &KASEQID NO: 20 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLv1.
| &KASEQID NO: 21 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLv2.
| &KASEQID NO: 22 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLv3.
| &KASEQID NO: 23 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLv4.
| &KA SEQ ID NO: 24 estabelece a sequência de aminoácidos do aceitador variável de cadeia pesada Acc.f BAC01986,1.
| 8&/KA SEQ ID NO: 25 estabelece a sequência de aminoácidos do aceitador variável da cadeia pesada Acc. IMGTH IGHV1-69-2*01.
| 8&8KA SEQ ID NO: 26 estabelece a sequência de aminoácidos do aceitador variável de cadeia pesada Acc. IMGTHIGKJ1*01.
| &KA SEQ ID NO: 27 estabelece a sequência de aminoácidos do aceitador variável de cadeia leve Acc. tt IMGTHIGKV2-30*02 | KA AEQ ID NO: 28 estabelece a sequência de aminoácidos do aceitador variável de cadeia leve Acc. ft IMGTHIGKJ2*01.
| KA SEQ ID NO: 29 estabelece a sequência de aminoácidos do aceitador variável de cadeia leve Acc. tt! AAZO09048,1.
| KA SEQ ID NO: 30 estabelece uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia pesada do anticorpo 3D6 de camundongo.
| KA SEQ ID NO: 31 estabelece uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo 3D6 de camundongo.
| KA SEQ ID NO: 32 estabelece a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H1 do anticorpo 3D6 de camundongo.
| KA SEQ ID NO: 33 estabelece a sequência de aminoácidos da CDR- H1 de Chothia do anticorpo 3D6 de camundongo.
| KA SEQ ID NO: 34 estabelece a sequência de aminoácidos de
Chothia CDR-H2 do anticorpo 3D6 de camundongo.
[0097] A SEQ ID NO: 35 estabelece a sequência de aminoácidos de ADM CDR-H2 do anticorpo 3D6 de camundongo.
[0098] A SEQ ID NO: 36 estabelece a sequência de aminoácidos de Contact CDR-L1 do anticorpo 3D6 de camundongo.
[0099] A SEQ ID NO: 37 estabelece a sequência de aminoácidos de Contact CDR-L2 do anticorpo 3D6 de camundongo.
[0100] A SEQ ID NO: 38 estabelece a sequência de aminoácidos de Contact CDR-L3 do anticorpo 3D6 de camundongo.
[0101]A SEQ ID NO: 39 estabelece a sequência de aminoácidos de Contact CDR-H1 do anticorpo 3D6 de camundongo.
[0102]A SEQ ID NO: 40 estabelece a sequência de aminoácidos de Contact CDR-H2 do anticorpo 3D6 de camundongo.
[0103]A SEQ ID NO: 41 estabelece a sequência de aminoácidos de Contact CDR-H3 do anticorpo 3D6 de camundongo.
[0104] A SEQ ID NO: 42 estabelece a sequência de aminoácidos de uma CDR-H1 de Composto de Kabat-Chothia alternada de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHv5, hu3D6VHv1bA11B6G?2, hu3D6VHv1bA11B6H3, hu3D6VHv1e e hu3sD6VHv1f).
[0105] A SEQ ID NO: 43 estabelece a sequência de aminoácidos de um CDR-H2 alternativo de Kabat de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHv5 e hu3D6VHv1bA11B6H3).
[0106]A SEQ ID NO: 44 estabelece a sequência de aminoácidos de consenso entre as regiões variáveis de cadeia pesada do 3D6 de camundongo e anticorpos 3D6 humanizados selecionados (VHv1, VHv2, VHv1b, VHVIDA1N1 e VHv5) (rotulados como “Maioria” na Figura 2 de PCT/IB2017/052544).
[0107]A SEQ ID NO: 45 estabelece a sequência de aminoácidos de consenso entre as regiões variáveis de cadeia leve do 3D6 de camundongo e anticorpos 3D6 humanizados selecionados (rotulados como "Maioria" na Figura 3 de PCT/IB2017/052544).
[0108] A SEQ ID NO: 46 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv1bA11B6G?2.
[0109] A SEQ ID NO: 47 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv1bA11B6H3.
[0110] A SEQ ID NO: 48 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv1c.
[0111] A SEQ ID NO: 49 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv1d.
[0112] A SEQ ID NO: 50 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv1e.
[0113] A SEQ ID NO: 51 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv1f.
[0114] A SEQ ID NO: 52 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv3.
[0115] A SEQ ID NO: 53 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv3b.
[0116] A SEQ ID NO: 54 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv3c.
[0117] A SEQ ID NO: 55 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv4.
[0118] A SEQ ID NO: 56 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv4b.
[0119] A SEQ ID NO: 57 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHv4c.
[0120] A SEQ ID NO: 58 estabelece a sequência de aminoácidos de uma CDR-H1 de Composto de Kabat-Chothia alternativa de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VH1c).
[0121] A SEQ ID NO: 59 estabelece a sequência de aminoácidos de uma CDR-H1 de Composto de Kabat-Chothia alternada de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHv1d, hu3D6VHv3c e hu3D6VHv4c).
[0122] A SEQ ID NO: 60 estabelece a sequência de aminoácidos de uma CDR-H1 de Composto de Kabat-Chothia alternativa de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHv3b e hu3D6VHv4b).
[0123] A SEQ ID NO: 61 estabelece a sequência de aminoácidos de um
CDR-H2 alternativo de Kabat de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHv1bA11B6G2).
[0124] A SEQ ID NO: 62 estabelece a sequência de aminoácidos de um CDR-H2 alternativo de Kabat de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHv1c, hu3D6VHv3b, e huaD6VHv4b).
[0125] A SEQ ID NO: 63 estabelece a sequência de aminoácidos de uma CDR-H2 de Kabat alternada de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHv1d, hu3D6VHv1f, hu3D6VHv3c e hu3D6VHv4c).
[0126] A SEQ ID NO: 64 estabelece a sequência de aminoácidos de um CDR-H2 alternativo de Kabat de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHv1e).
[0127] A SEQ ID NO: 65 estabelece a sequência de aminoácidos de um CDR-H3 alternativo de Kabat de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHv1f).
[0128] A SEQ ID NO: 66 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 6A10 do camundongo.
[0129] A SEQ ID NO: 67 estabelece a sequência de aminoácidos da CDR- H1 de Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 6A10 de camundongo.
[0130] A SEQ ID NO: 68 estabelece a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H2 do anticorpo 6A10 de camundongo.
[0131] A SEQ ID NO: 69 estabelece a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H3 do anticorpo 6A10 de camundongo.
[0132] A SEQ ID NO: 70 estabelece a sequência de aminoácidos da região VH do anticorpo de camundongo (código pdb 1CR9) utilizada como modelo de estrutura para a humanização da cadeia pesada.
[0133]A SEQ ID NO: 71 estabelece a sequência de aminoácidos de consenso entre as regiões variáveis da cadeia pesada dos anticorpos 3D6 humanizados “seleccionados (VHvl, VHvilb, VHvVILDA11I, VHvVIDA11IB6G?2, VHv1bA11B6H3, VHvic, VHvi1d, VHv1le, VHv1f, VHv2, VHv3, VHv3b, VHv3c, VHv4, VHv4b, VHv4c, e VHv5) (rotulados como “Maioria” nas Figuras 4A e 4B de PCT/IB2017/052544).
[0134] A SEQ ID NO: 72 estabelece a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de um anticorpo 3D6 quimérico.
[0135] A SEQ ID NO: 73 estabelece a sequência de aminoácidos da cadeia leve de um anticorpo 3D6 quimérico.
[0136]A SEQ ID NO: 74 estabelece a sequência de aminoácidos do modelo estrutural variável de cadeia pesada Acc.t SMYX-VH mSt.
[0137]A SEQ ID NO: 75 estabelece a sequência de aminoácidos do aceitador variável de cadeia pesada Acc.t! 2RCS-VH huFrwk.
[0138] A SEQ ID NO: 76 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb1.
[0139] A SEQ ID NO: 77 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb2.
[0140] A SEQ ID NO: 78 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb3.
[0141] A SEQ ID NO: 79 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb4.
[0142] A SEQ ID NO: 80 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb5.
[0143] A SEQ ID NO: 81 estabelece a sequência de aminoácidos do modelo estrutural variável de cadeia leve Acc.t!t 5SMYX-VL mSt.
[0144] A SEQ ID NO: 82 estabelece a sequência de aminoácidos do aceitador variável de cadeia leve Acc. ARX71335-VL huFrwk.
[0145] A SEQ ID NO: 83 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb1.
[0146] A SEQ ID NO: 84 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb2.
[0147] A SEQ ID NO: 85 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb3.
[0148] A SEQ ID NO: 86 estabelece a sequência de aminoácidos de um CDR-H1 de composto de Kabat-Chothia alternativo de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHvb4 e hu3D6VHvb5).
[0149] A SEQ ID NO: 87 estabelece a sequência de aminoácidos de um CDR-H2 de Kabat alternativo de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHvb3 e hu3D6VHvb4).
[0150] A SEQ ID NO: 88 estabelece a sequência de aminoácidos de um CDR-H2 alternativo de Kabat de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHvb5).
[0151] A SEQ ID NO: 89 estabelece a sequência de aminoácidos de um CDR-L1 de Kabat alternativo de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VLvb3).
[0152] A SEQ ID NO: 90 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb6.
[0153] A SEQ ID NO: 91 estabelece a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb7.
[0154] A SEQ ID NO: 92 estabelece a sequência de aminoácidos de um CDR-H2 de Kabat alternativo de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHvb6 e hu3D6VHvb7).
[0155] A SEQ ID NO: 93 estabelece a uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb1.
[0156] A SEQ ID NO: 94 estabelece a uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb?2.
[0157] A SEQ ID NO: 95 estabelece a uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb3.
[0158] A SEQ ID NO: 96 estabelece a uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb4.
[0159] A SEQ ID NO: 97 estabelece a uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb5.
[0160] A SEQ ID NO: 98 estabelece a uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb6.
[0161] A SEQ ID NO: 99 estabelece a uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb7.
[0162] A SEQ ID NO: 100 estabelece a uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb1.
[0163] A SEQ ID NO: 101 estabelece a uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb?2.
[0164] A SEQ ID NO: 102 estabelece a uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb3.
[0165] A SEQ ID NO: 103 estabelece a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada humana de IgG1 exemplificativa.
[0166] A SEQ ID NO: 104 estabelece a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia leve kappa exemplificativa.
[0167] A SEQ ID NO: 105 estabelece uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia pesada de IgG1 exemplificativa.
[0168] A SEQ ID NO: 106 estabelece a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia leve kappa exemplificativa.
DEFINIÇÕES
[0169] Anticorpos monoclonais ou outras entidades biológicas são tipicamente fornecidos em forma isolada. Isto significa que um anticorpo ou outra entidade biológica é tipicamente pelo menos 50% peso/peso puro de proteínas interferentes e outros contaminantes decorrentes da sua produção ou purificação, mas isto não exclui a possibilidade de que o anticorpo monocional seja combinado com um excesso de carreador farmaceuticamente aceitável ou outro veículo destinado a facilitar o seu uso. Por vezes, os anticorpos monoclonais são, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% em peso/peso puros de proteínas e outras macromoléculas de produção ou purificação. Muitas vezes, um anticorpo monoclonal isolado ou outra entidade biológica é a espécie macromolecular predominante que permanece após a sua purificação.
[0170] A ligação específica de um anticorpo ao seu antígeno alvo significa uma afinidade e/ou avidez de pelo menos 106, 107, 108, 10º, 107º, 1071, ou 10º M- 1, A ligação específica é detectavelmente maior em magnitude e distinta da ligação não específica que ocorre a pelo menos um alvo não relacionado. A ligação específica pode ser o resultado da formação de ligações entre grupos funcionais específicos ou ajuste espacial particular (por exemplo, tipo de fechadura e chave), enquanto a ligação não específica é geralmente o resultado de forças de van der Waals. No entanto, a ligação específica não implica necessariamente que um anticorpo se ligue a um e apenas um alvo.
[0171]A unidade estrutural básica do anticorpo é um tetrâmero de subunidades. Cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção amino terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Esta região variável é inicialmente expressa ligada a um peptídeo sinal clivável. A região variável sem peptídeo sinal é por vezes referida como uma região variável madura. Assim, por exemplo, uma região variável madura da cadeia leve significa uma região variável da cadeia leve sem o peptídeo sinal da cadeia leve. A porção carboxi-terminal de cada cadeia estabelece uma região constante essencialmente responsável pela função efetora.
[0172] As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de 10 aminoácidos ou mais. Ver, em geral, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2º ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7 (incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins).
[0173] Uma região variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina (também referida neste documento como um "domínio variável de cadeia leve" ("domínio VL") ou um "domínio variável de cadeia pesada" ("domínio VH"), respectivamente) consiste em uma região de "estrutura" interrompida por três
“regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”. As regiões estruturais servem para alinhar as CDRs para ligação específica a um epítopo de um antígeno. As CDRs incluem os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são principalmente responsáveis pela ligação ao antígeno. Do terminal amino ao terminal carboxil, os domínios VL e VH compreendem as seguintes regiões estruturais (FR) e CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As CDRs 1, 2 e 3 de um domínio VL são também referidas neste documento, respectivamente, como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3; As CDR 1, 2 e 3 de um domínio VH são também referidas neste documento, respectivamente, como CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3. Quando o pedido divulga uma sequência VL com R como o resíduo do terminal C, o R pode, alternativamente, ser considerado como sendo o resíduo do terminal N da região constante de cadeia leve. Assim, o pedido também deve ser entendido como a divulgação da sequência VL sem o terminal C de R.
[0174] A atribuição de aminoácidos a cada domínio VL e VH está de acordo com qualquer definição convencional de CDRs. As definições convencionais incluem, a definição de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), a definição de Chothia (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; et al., Nature 342:878-883, 1989); um composto de CDR de Chothia Kabat em que CDR-H1 é um composto de CDRs de Chothia e Kabat; a definição de APM usada pelo software de modelagem de anticorpos da Oxford Molecular; e a definição de contato de Martin et al (bioinfo.org.uk/abs) (vide Tabela 1). O Kabat fornece uma convenção de numeração amplamente usada (numeração de Kabat) na qual os resíduos correspondentes entre cadeias pesadas diferentes ou entre cadeias leves diferentes recebem o mesmo número. Quando se diz que um anticorpo compreende CDRs por uma certa definição de CDRs (por exemplo, Kabat), essa definição especifica o número mínimo de resíduos de CDR presentes no anticorpo (isto é, as CDRs de Kabat). Isto não exclui que outros resíduos que caem dentro de outra definição convencional de CDR, mas fora da definição especificada, também estejam presentes. Por exemplo, um anticorpo compreendendo CDRs definidas por Kabat inclui, entre outras possibilidades, um anticorpo no qual as CDRs contenham resíduos de CDR de Kabat e nenhum outro resíduo de CDR, e um anticorpo no qual CDR-H1 é uma CDR-H1 de Compósito de Chothia-Kabat e outras CDRs contenham resíduos de CDR de Kabat e nenhum resíduo adicional de CDR com base em outras definições. Tabela 1 Definições convencionais de CDRs usando numeração de Kabat Composto de Chothia Chothia & Contact Kabat L24--L34 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96 H26-- H1 H31--H35B H26--H35B* [H26--H35B [H30--H35B H32..H34* H50--H65 — | H52--H56 H50--H65 H50--H58 H47--H58 H95--H102 | H95--H102 H95--H102 [H95--H102 [H93--H101 *CDR-H1 por Chothia pode terminar em H32, H33 ou H34 (dependendo do comprimento da alça). Isto ocorre porque o esquema de numeração Kabat coloca inserções de resíduos extras em 35A e 35B, enquanto a numeração Chothia os coloca em 31A e 31B. Se nem H35A nem H35B (numeração de Kabat) estiverem presentes, a alça CDR-H1 de Chothia termina em H32. Se apenas H35A estiver presente, termina em H33. Se ambas H35A e H35B estiverem presentes, terminará em H34.
[0175] O termo "anticorpo" inclui anticorpos intactos e fragmentos de ligação deste. Tipicamente, os fragmentos competem com o anticorpo intacto a partir do qual foram derivados para ligação específica ao alvo incluindo cadeias pesadas separadas, cadeias leves Fab, Fab', F(ab')2, F (ab) c, Dabs, nanobodies e Fv. Os fragmentos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por separação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. O termo "anticorpo" também inclui um anticorpo biespecífico e/ou um anticorpo humanizado. Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial que tem dois diferentes pares de cadeia pesada/leve e dois locais de ligação diferentes (ver, por exemplo., Songsivilai e Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelnhy et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). Em alguns anticorpos biespecíficos, os dois pares de cadeia pesada/leves diferentes incluem um par de cadeia pesada/cadeia leve humanizada 3D6 e um par de cadeia de cadeia pesada/leve específico para um epítopo diferente em tau do que aquele ligado por 3D6.
[0176]EM alguns anticorpos biespecíficosó, um par de cadeia pesada/cadeia leve é um anticorpo 3D6 humanizado como descrito adicionalmente abaixo e o outro par de cadeia pesada/cadeia leve é de um anticorpo que se liga a um receptor expresso na barreira hematoencefálica, tal como um receptor de insulina, uma insulina como receptora de fator de crescimento (IGF), um receptor de leptina, ou um receptor de lipoproteína, ou um receptor de transferrina (Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). Tal anticorpo biespecífico pode ser transferido através da barreira sanguínea do cérebro por transcitose mediada por receptor. A captação no cérebro do anticorpo biespecífico pode ser ainda reforçada por manipulação do anticorpo biespecífico para reduzir a sua afinidade com o receptor da barreira hematoencefálica. Afinidade reduzida para o receptor resultou numa distribuição mais ampla no cérebro (ver, por exemplo, Atwal et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011).
[0177] Anticorpos bispecíficos exemplificativos também podem ser: (1) um anticorpo dual-variável-domínio (DVD-lg), onde cada cadeia leve e pesada corrente contém dois domínios variáveis em conjunto através de uma ligação de peptídeo curta (Wu et al/., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-lgTY) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer
Berlin Heidelberg (2010)); (2) um Tandab, que é uma fusão de dois diacorpos de cadeia única, resultando em um anticorpo bispecífico tetravalente que possui dois sítios de ligação para cada um dos antígenos alvo; (3) um flexicorpo, que é uma combinação de scFvs com um diacorpo, resultando em uma molécula multivalente; (4) uma molécula chamada de "encaixar e travar", baseado na "dimerização e encaixe de domínio" na Proteína Quinase A, que, quando aplicado a Fabs, pode produzir uma proteína bispecífica trivalente consistindo de dois fragmentos Fab idênticos, ligados a um fragmento Fab diferente; ou (5) uma molécula chamada de Scorpion, compreendendo, por exemplo, dois scFvs fundidos para ambos terminais de uma região Fc humana. Exemplos de plataformas úteis para a preparação de anticorpos biespecíficos incluem BITE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab e Mab2 (F-star), IgGI manipulada por Fc (Xencor) ou DuoBody (baseado em troca de braços Fab, Genmab).
[0178] O termo "epítopo" se refere ao sítio em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Um epítopo pode ser formado a partir de aminoácidos contínuos ou aminoácidos não contínuos justapostos por dobragem terciária de uma ou mais proteínas. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos (também conhecidos como epítopos lineares) são tipicamente retidos por exposição a solventes desnaturantes enquanto que os epítopos formados por dobragem terciária (também conhecidos como epítopos conformacionais) são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais geralmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma única conformação espacial. Os métodos de determinação da conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, em Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).
[0179] Os anticorpos que reconhecem os epítopos iguais ou sobrepostos podem ser identificados num imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo competir com a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo. O epítopo de um anticorpo pode também ser definido cristalografia de raios X do anticorpo ligado ao seu antígeno para identificar resíduos de contato. Alternativamente, considera-se que dois anticorpos têm o mesmo epítopo se todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem a ligação do outro. Dois anticorpos têm epítopos sobrepostos se algumas mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.
[0180] A competição entre anticorpos é determinada por um ensaio em que um anticorpo em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Um anticorpo de teste compete com um anticorpo de referência se um excesso de um anticorpo de teste (por exemplo, pelo menos 2x, 5X, 10x, 20x, ou 100x) inibe ou bloqueia a ligação do anticorpo de referência por, por exemplo, pelo menos 50% conforme medido em um ensaio de ligação competitiva. Alguns anticorpos de teste inibem a ligação do anticorpo de referência em pelo menos 75%, 90% ou 99%. Os anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que o bloqueio estérico ocorra.
[0181] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa que o carreador, diluente, excipiente ou auxiliar é compatível com os outros ingredientes da formulação e não substancialmente prejudicial para o receptor deste.
[0182] O termo “paciente” inclui humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico.
[0183] Um indivíduo está em risco aumentado de uma doença se o sujeito tiver pelo menos um fator de risco conhecido (por exemplo, genético, bioquímico, história familiar e exposição situacional) colocando os indivíduos com esse fator de risco em um risco estatisticamente significativo maior de desenvolver a doença do que indivíduos sem o fator de risco.
[0184] O termo “amostra biológica” refere-se a uma amostra de material biológico dentro ou obtenível de uma fonte biológica, por exemplo, um sujeito humano ou mamífero. Tais amostras podem ser órgãos, organelas, tecidos, seções de tecidos, fluidos corporais, sangue periférico, plasma sanguíneo, soro sanguíneo, células, moléculas tais como proteínas e peptídeos, e quaisquer partes ou combinações derivadas dos mesmos. O termo amostra biológica também pode abranger qualquer material derivado do processamento da amostra. O material derivado pode incluir células ou sua progênie. O processamento da amostra biológica pode envolver uma ou mais filtrações, destilações, extrações, concentrações, fixação, inativação de componentes interferentes e semelhantes.
[0185] O termo “amostra de controle" refere-se a uma amostra biológica não conhecida ou suspeita de incluir regiões afetadas pela doença relacionadas à tau, ou pelo menos não conhecida ou suspeita de incluir regiões doentes de um determinado tipo. As amostras de controle podem ser obtidas de indivíduos que não sofrem com a doença relacionada com tau. Alternativamente, as amostras de controle podem ser obtidas de pacientes que sofrem da doença relacionada com a tau. Tais amostras podem ser obtidas ao mesmo tempo que uma amostra biológica considerada como compreendendo a doença relacionada com a tau ou em uma ocasião diferente. Una amostra biológica e uma amostra de controle podem ser obtidas do mesmo tecido. De um modo preferido, as amostras de controle consistem essencialmente ou inteiramente de regiões saudáveis normais e podem ser utilizadas em comparação com uma amostra biológica que se pensa que compreende regiões afetadas por doenças relacionadas com tau. De um modo preferido, o tecido na amostra de controle é do mesmo tipo que o tecido na amostra biológica. De preferência, as células afetadas por tau relacionadas com a tau, que se pensa estarem na amostra biológica, surgem do mesmo tipo de célula (por exemplo, neurônios ou glia) que o tipo de células na amostra de controle.
[0186] O termo “doença” refere-se a qualquer condição anormal que prejudique a função fisiológica. O termo é usado amplamente para abranger qualquer distúrbio, doença, anormalidade, patologia, doença, condição ou síndrome em que a função fisiológica é prejudicada, independentemente da natureza da etiologia.
[0187] O termo “sintoma” refere-se a uma evidência subjetiva de uma doença, como a marcha alterada, conforme percebida pelo sujeito. Um "sinal" refere-se à evidência objetiva de uma doença, conforme observado por um médico.
[0188] O termo “resposta positiva ao tratamento” refere-se a uma resposta mais favorável em um paciente individual ou resposta média em uma população de pacientes em relação a uma resposta média em uma população de controle que não está recebendo tratamento.
[0189] Para efeitos de classificação de substituições de aminoácidos como conservadoras ou não conservadoras, os aminoácidos são agrupados da seguinte forma: Grupo | (cadeias laterais hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo |l (cadeias hidrofílicas laterais neutras): cys, ser, thr; Grupo Ill (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gln, his, Iys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação da cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservadoras envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não conservadoras constituem a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra.
[0190] Identidades de sequência percentual são determinadas com sequências de anticorpo alinhadas ao máximo pela convenção de numeração de Kabat. Após o alinhamento, se uma região de anticorpo do sujeito (por exemplo, toda a região variável madura de uma cadeia pesada ou leve) está sendo comparada com a mesma região de um anticorpo de referência, a identidade de sequência percentual entre as regiões de anticorpos do sujeito e de referência é o número de posições ocupadas pelo mesmo aminoácido na região, tanto do sujeito quanto do anticorpo de referência, dividida pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com lacunas não contadas, multiplicado por 100 para converter em percentagem.
[0191] Composições ou métodos que "compreendem" ou "incluem" um ou mais elementos recitados podem incluir outros elementos não especificamente recitados. Por exemplo, uma composição que "compreende" ou "inclui" o anticorpo pode conter o anticorpo por si só ou em combinação com outros ingredientes.
[0192] A designação de um intervalo de valores inclui todos os inteiros dentro ou definindo o intervalo e todos os sub-intervalos definidos por números inteiros dentro do intervalo.
[0193] Salvo quando o contrário fica aparente pelo contexto, o termo "cerca de" engloba variações não substanciais, tais como valores dentro de uma margem padrão de erro de medida (por exemplo, SEM) de um valor declarado.
[0194] A significância estatística significa p<0,05.
[0195] As formas singulares dos artigos "uma", "um" e "a/0" incluem suas referências no plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas dos mesmos.
DESCRIÇÃO DETALHADA |. Geral
[0196] A invenção fornece anticorpos que se ligam à tau. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a epítopos na região de ligação de microtúbulos (MTBR) da tau humana. Alguns anticorpos se ligam à tau independentemente do estado de fosforilação. Alguns anticorpos da invenção servem para inibir ou retardar patologias associadas a tau e deterioração sintomática associada. Embora não seja necessária uma compreensão do mecanismo para a prática da invenção, pode ocorrer uma redução na toxicidade como resultado do anticorpo que induz a fagocitose da tau, inibindo a tau da agregação inter ou intramolecular, ou da ligação a outras moléculas, estabilizando uma conformação não tóxica, inibindo a transmissão intercelular ou intracelular de formas patogênicas de tau, pelo bloqueio da fosforilação da tau, impedindo a ligação da tau às células, ou induzindo a clivagem proteolítica da tau, entre outros mecanismos. Os anticorpos da invenção ou agentes que induzem tais anticorpos podem ser usados em métodos de tratamento ou de realização da profilaxia da doença de Alzheimer e outras doenças associadas com a tau.
1. Moléculas Alvo
[0197] A menos que seja de outro modo aparente do contexto, referência a tau significa uma forma humana natural de tau incluindo todas as isoformas, independentemente de haver modificação pós-translacional (por exemplo, fosforilação, glicação ou acetilação). Existem seis isoformas principais (variantes de união) da tau que ocorrem no cérebro humano. A mais longa dessas variantes tem 441 aminoácidos, dos quais o resíduo encontrado é clivado. Os resíduos são numerados de acordo com a isoforma 441. Portanto, por exemplo, referência a uma fosforilação na posição 404 significa a posição 404 da isoforma 441, ou posição correspondente de qualquer outra isoforma quando alinhado ao máximo com a isoforma 441. As sequências de aminoácidos das isoformas e dos números Swiss-Prot estão indicadas abaixo. P10636-8 (SEQ ID NO: 1) 40 50 60
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQODQEGDTD AGLKESPLQT
PTEDGSEEPG 70 80 90 100 110 120
SETSDAKSTP TAEDVTAPLV DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG TTAEEAGIGD
TPSLEDEAAG 130 140 150 160 170 180
HVTQARMVSK SKDGTGSDDK KAKGADGKTK IATPRGAAPP GQKGQANATR
IPAKTPPAPK 190 200 210 220 230 240
TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP GSPGTPGSRS RTPSLPTPPT REPKKVAVVR
TPPKSPSSAK 250 260 270 280 290 300
SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKHQP GGGKVQIINK KLDLSNVOASK
CGSKDNIKHV 310 320 330 340 350 360
PGGGSVQIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNIHH KPGGGQVEVK SEKLDFKDRV
QSKIGSLDNI 370 380 390 400 410 420
THVPGGGNKK IETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS GDTSPRHLSN
VSSTGSIDMV 430 440
DSPQLATLAD EVSASLAKQG L P10636-7 (SEQ ID NO:2)
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT
PTEDGSEEPG 70 8 9 100 110 120
SETSDAKSTP TAEAEEAGIG DTPSLEDEAA GHVTQARMVS KSKDGTGSDD
KKAKGADGKT 130 140 150 160 170 180
KIATPRGAAP PGQKGQANAT RIPAKTPPAP KTPPSSGEPP KSGDRSGYSS
PGSPGTPGSR 190 200 210 220 230 240
SRTPSLPTPP TREPKKVAVV RTPPKSPSSA KSRLQTAPVP MPDLKNVKSK
IGSTENLKHQ 250 260 270 28 290 300
PGGGKVQIIN KKLDLSNVOS KCGSKDNIKH VPGGGSVQIV YKPVDLSKVT
SKCGSLGNIH 310 320 330 340 350 360
HKPGGGQVEV KSEKLDFKDR VOSKIGSLDN ITHVPGGGNK KIETHKLTFR
ENAKAKTDHG 370 380 390 400 410
AEIVYKSPVV SGDTSPRHLS NVSSTGSIDM VDSPQLATLA DEVSASLAKQ GL P10636-6 (4RON human tau) (SEQ ID NO:3) 10 20 30 40 50 60
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKAEEAGI
GDTPSLEDEA 70 8 9 100 110 120
AGHVTQARMV SKSKDGTGSD DKKAKGADGK TKIATPRGAA PPGQAKGQANA
TRIPAKTPPA 130 140 150 160 170 180
PKTPPSSGEP PKSGDRSGYS SPGSPGTPGS RSRTPSLPTP PTREPKKVAV VRTPPKSPSS AKSRLQTAPV PMPDLKNVKS KIGSTENLKH QPGGGKVQI! NKKLDLSNVQ
SKCGSKDNIK 250 260 270 28 290 300 HVPGGGSVOQ! VYKPVDLSKV TSKCGSLGNI HHKPGGGQVE VKSEKLDFKD
RVOSKIGSLD 310 320 330 340 350 360
NITHVPGGGN KKIETHKLTF RENAKAKTDH GAEIVYKSPV VSGDTSPRHL
SNVSSTGSID 370 — 380
MVDSPQLATL ADEVSASLAK QGL P10636-5 (SEQ ID NO:4) 40 50 60
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLOT
PTEDGSEEPG 70 8 9 100 110 120
SETSDAKSTP TAEDVTAPLV DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG TTAEEAGIGD
TPSLEDEAAG 130 140 150 160 170 180
HVTQARMVSK SKDGTGSDDK KAKGADGKTK IATPRGAAPP GQKGQANATR
IPAKTPPAPK 190 200 210 220 230 240
TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP GSPGTPGSRS RTPSLPTPPT REPKKVAVVR
TPPKSPSSAK 250 260 270 28 290 300
SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKHQP GGGKVQIVYK PVDLSKVTSK
CGSLGNIHHK 310 320 330 340 350 360
PGGGQVEVKS EKLDFKDRVQ SKIGSLDNIT HVPGGGNKKI ETHKLTFREN
AKAKTDHGAE 370 380 390 400 410
IVYKSPVVSG DTSPRHLSNV SSTGSIDMVD SPQLATLADE VSASLAKQGL P10636-4 (SEQ ID NO:5) 40 50 60
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT
PTEDGSEEPG 70 8 9 100 110 120
SETSDAKSTP TAEAEEAGIG DTPSLEDEAA GHVTQARMVS KSKDGTGSDD
KKAKGADGKT 130 140 150 160 170 180
KIATPRGAAP PGQKGQANAT RIPAKTPPAP KTPPSSGEPP KSGDRSGYSS
PGSPGTPGSR 190 200 210 220 230 240
SRTPSLPTPP TREPKKVAVV RTPPKSPSSA KSRLQTAPVP MPDLKNVKSK
IGSTENLKHQ 250 260 270 28 290 300
PGGGKVAIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNIHH KPGGGQVEVK SEKLDFKDRV
QSKIGSLDNI 310 320 330 340 350 360
THVPGGGNKK IETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS GDTSPRHLSN
VSSTGSIDMV 370 — 380
DSPQLATLAD EVSASLAKQG L P10636-2 (SEQ ID NO:6) 10 20 30 40 50 60
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKAEEAGI
GDTPSLEDEA 70 8 9 100 110 120
AGHVTQARMV SKSKDGTGSD DKKAKGADGK TKIATPRGAA PPGQAKGQANA TRIPAKTPPA PKTPPSSGEP PKSGDRSGYS SPGSPGTPGS RSRTPSLPTP PTREPKKVAV
VRTPPKSPSS 190 200 210 220 230 240
AKSRLQTAPV PMPDLKNVKS KIGSTENLKH QPGGGKVQIV YKPVDLSKVT
SKCGSLGNIH 250 260 270 280 290 300
HKPGGGQVEV KSEKLDFKDR VOSKIGSLDN ITHVPGGGNK KIETHKLTFR
ENAKAKTDHG 310 320 330 340 350
AEIVYKSPVYV SGDTSPRHLS NVSSTGSIDM VDSPQLATLA DEVSASLAKQ GL
[0198] A referência a tau inclui variações naturais conhecidas, cerca de 30 das quais estão listadas na base de dados Swiss-Prot e suas permutações, bem como mutações associadas a patologias tau, tais como demência, doença de Pick, paralisia supranuclear, etc. (vide, (por exemplo, banco de dados Swiss-Prot e Poorkaj, et al. Ann Neurol. 43: 815-825 (1998)). Alguns exemplos de mutações tau numeradas pela isoforma 441 são uma lisina para mutação de treonina em resíduo de aminoácido 257 (K257T), uma isoleucina para mutação de valina na posição aminoácido 260 (1260V); uma glicina para mutação de valina na posição do aminoácido 272 (G272V); uma asparagina de mutação de lisina na posição do aminoácido 279 (N279K); uma asparagina de mutação de histidina na posição do aminoácido 296 (N296H); uma prolina para mutação de serina na posição do aminoácido 301 (P301S); uma prolina para mutação de leucina no aminoácido 301 (P301L); uma glicina para mutação de valina na posição do aminoácido 303 (G303V); uma serina para mutação de asparagina na posição 305 (S305N); uma glicina para mutação de serina na posição do aminoácido 335 (G335S); uma valina para mutação de metionina na posição 337 (V337M); um ácido glutâmico para mutação de valina na posição 342 (E342V); uma lisina para mutação de isoleucina a posição do aminoácido 369 (K3691); uma glicina para mutação de arginina na posição do aminoácido 389 (G389R); e uma arginina para mutação de triptofano na posição do aminoácido 406 (R406W).
[0199] A tau pode ser fosforilada em um ou mais resíduos de aminoácidos incluindo tirosina nas posições de aminoácidos 18, 29, 97, 310 e 394 de serina nas posições de aminoácidos 184, 185, 198, 199, 202, 208, 214, 235, 237, 238, 262, 293, 324, 356, 396, 400, 404, 409, 412, 413 e 422; e treonina nas posições de aminoácidos 175, 181, 205, 212, 217, 231 e 403.
Salvo indicação contrária do contexto, a referência à tau, ou seus fragmentos inclui as sequências naturais de aminoácidos humanos incluindo isoformas, mutantes e variantes alélicas dos mesmos.
1. Anticorpos A. Especificidade de Ligação e Propriedades Funcionais
[0200] A invenção fornece anticorpos que se ligam à tau. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a epítopos na região de ligação de microtúbulos (MTBR) da tau humana. Alguns anticorpos se ligam à tau independentemente do estado de fosforilação. Alguns anticorpos ligam-se a um epítopo que não inclui um resíduo sujeito a fosforilação. Estes anticorpos podem ser obtidos por imunização com um polipeptídeo tau purificado a partir de uma fonte natural ou expresso por via recombinante. Os anticorpos podem ser triados quanto à ligação da tau na forma não fosforilada, bem como uma forma em que um ou mais resíduos susceptíveis à fosforilação são fosforilados. Tais anticorpos ligam-se preferivelmente com afinidades indistinguíveis ou pelo menos dentro de um fator de 1,5, 2 ou 3 vezes a tau fosforilada em comparação com tau não fosforilada (isto é, são "pan-específicos"”). 3D6 é um exemplo de um anticorpo monoclional pan-específico. A invenção também fornece anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos anteriores, tal como, por exemplo, o epítopo de 3D6. Estão também inclusos anticorpos que competem pela ligação à tau com qualquer um dos anticorpos anteriores, tais como, por exemplo, competir com o 3D6.
[0201] A menos que seja de outro modo aparente do contexto, a referência a 3D6 deve ser entendida como referindo-se a qualquer uma das formas de camundongo, quimérica, estratificada e humanizada deste anticorpo. O anticorpo foi depositado como [NÚMERO DE DEPÓSITO]. Este anticorpo se liga especificamente na região MTBR da SEQ ID NO: 1). Este anticorpo é ainda caracterizado pela sua capacidade de se ligar a tau fosforilada e não fosforilada, tanto formas não patológicas e patológicas e conformações de tau, como formas de tau desdobradas/agregadas. Um anticorpo designado como 6A10 é um outro tal anticorpo de camundongo exemplificativo. A menos que seja de outro modo aparente do contexto, a referência a 6A10 deve ser entendida como referindo-se a qualquer uma das formas de camundongo, quimérica, estratificada e humanizada deste anticorpo. As CDR de Composto de Kabat/Chothia da cadeia pesada de 6AÍIO são designados como SEQ ID NOs: 67, 68 e 69, respectivamente, e as CDRs de Kabat da cadeia leve de 6A10 são designadas SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectivamente. O camundongo 6A10 partilha 82,1% da identidade da sequência VH e 100% da identidade da sequência VL com a cadeia VH e a cadeia VL, respectivamente, do camundongo 3D6.
[0202] Alguns anticorpos da invenção se ligam ao mesmo epítopo que se sobrepõe como um anticorpo designado como 3D6. As sequências das regiões variáveis maduras da cadeia pesada e leve desse anticorpo são designadas SEQ ID NOS: 7 e 11, respectivamente.
[0203] As CDRs de Composto de Kabat/Chothia da cadeia pesada de 3D6 são designados como SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, respectivamente, e as CDRs de Kabat da cadeia leve de 3D6 são designadas SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectivamente.
[0204] A Tabela 2 indica as CDRs 3D6 como definidas por Kabat, Chothia, Composto de Chothia e Kabat (também referido neste documento como "Composto de Kabat/Chothia"), ADM e Contact.
Tabela 2: CDRs 3D6 conforme definido por Kabat, Chothia, Composto de Chothia e Kabat, ADM e Contact Composto Alça Chothia de Chothia Contact & Kabat
Tabela 2: CDRs 3D6 conforme definido por Kabat, Chothia, Composto de Chothia e Kabat, ADM e Contact Composto Alça Chothia de Chothia Contact & Kabat L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36 L24--L34 L1 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO:12 NO:12 NO:12 NO:12 NO:36 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55 L50--L56 L2 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO:13 NO:13 NO:13 NO:13 NO:37 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96 L89--L97 L3 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO:14 NO: 14 NO: 14 NO:14 NO:38 H30-- H31--H35B H26--H32 H26--H35B H26-H35B |H35B H1 SEQ ID SEQ ID NO:33 | SEQ ID NO:8 | SEQ ID NO:8 | SEQ ID NO:32 NO:39 H50--H65 H50--H58 H47--H58 H52--H56 H50--H65 H2 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO:34 | SEQ ID NO:9 NO:9 NO:35 NO:40 H93-- Ho5--H102 [H95--H102 — In495--H102 |H95--H102 H3 H101 SEQ ID SEQ ID NO:10 |SEQID SEQ ID
SEQ ID
Tabela 2: CDRs 3D6 conforme definido por Kabat, Chothia, Composto de Chothia e Kabat, ADM e Contact Composto Alça Chothia de Chothia Contact & Kabat
EE
[0205] Outros anticorpos podem ser obtidos por mutagênese de cDNA que codifica as cadeias pesada e leve de um anticorpo exemplificativo, como 3D6. Anticorpos monoclonais que são pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos a 3D6 ou qualquer outro anticorpo ou cadeia de anticorpo exemplificado na sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve maduras e mantêm suas propriedades funcionais, e/ou que diferem do respectivo anticorpo por um pequeno número de substituições de aminoácidos funcionalmente inconsequentes (por exemplo, substituições conservativas), deleções ou inserções também estão incluídas na invenção. Os anticorpos monoclonais que possuem pelo menos uma ou todas as seis CDR (s) como definido por qualquer definição convencional, mas preferencialmente Kabat, que são 90%, 95%, 99% ou 100% idênticos às CDRs correspondentes de 3D6 também estão incluídos.
[0206] A invenção também fornece anticorpos que possuem alguns ou todos (por exemplo, 3, 4, 5 e 6) CDRs total ou substancialmente a partir de 3D6. Tais anticorpos podem incluir uma região variável de cadeia pesada que tenha pelo menos duas, e usualmente todas as três, CDRs inteiramente ou substancialmente da região variável de cadeia pesada de 3D6 e/ou uma região variável de cadeia leve com pelo menos dois e geralmente todos três, CDRs inteiramente ou substancialmente da região variável da cadeia leve de 3D6. Os anticorpos podem incluir tanto cadeias pesadas quanto cadeias leves. Uma CDR é substancialmente a partir de uma 3D6 CDR correspondente quando não contém mais de 4, 3, 2 ou 1 substituições, inserções ou deleções, exceto que o CDR-H2 (quando definido por Kabat) não pode ter mais de 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições,
inserções ou exclusões. Tais anticorpos podem ter pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para 3D6 na sequência de aminoácidos da variável de regiões de cadeia pesada e/ou leve madura e manter suas propriedades funcionais, e/ou diferir de 3D6 por um pequeno número de substituições de aminoácidos funcionalmente inconsequentes (por exemplo, substituições conservadoras), deleções ou inserções.
[0207] Alguns anticorpos identificados por tais ensaios podem se ligar a formas monoméricas, não dobradas, agregadas, fosforiladas ou não fosforiladas de tau ou de outro modo. Da mesma forma, alguns anticorpos são imunorreativos em formas não patológicas e patológicas e conformações de tau.
B. Anticorpos Humanizados
[0208] Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente modificado em que as CDRs de um anticorpo "doador" não humano são enxertadas em sequências de anticorpo "aceitadoras" humanas (ver, por exemplo, Queen, US
5.530.101 e 5.585.089; Winter, US 5.225.539, Carter, US 6.407.213, Adair, US
5.859.205; e Foote, US 6.881.557). As sequências de anticorpo aceitadora podem ser, por exemplo, uma sequência de anticorpo humana madura, um composto de tais sequências, uma sequência consenso de sequências de anticorpos humanos ou uma sequência da região da linhagem germinativa. Assim, um anticorpo humanizado é um anticorpo que possui pelo menos três, quatro, cinco ou todas as CDR total ou substancialmente de um anticorpo doador e sequências de framework da região variável e das regiões constantes, se presentes, no todo ou substancialmente a partir de sequências de anticorpos humanos. Da mesma forma uma cadeia pesada humanizada tem, pelo menos, uma, duas e, normalmente, todas as três CDR inteiramente, ou substancialmente, de uma cadeia pesada de um anticorpo doador, e uma sequência de framework da região variável da cadeia pesada e região constante da cadeia pesada, se presente, substancialmente a partir da framework da região variável da cadeia pesada humana e sequências da região constante. Da mesma forma uma cadeia leve humanizada tem, pelo menos, uma, duas e, normalmente, todas as três CDRs total, ou substancialmente, de uma cadeia leve de um anticorpo doador, e uma sequência de framework da região da cadeia leve e região constante da cadeia leve, se presente, substancialmente a partir da framework da região variável da cadeia leve humana e das sequências da região constante. Além de nanbodies e dAbs, um anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve humanizada. Uma CDR em um anticorpo humanizado é substancialmente de uma CDR correspondente num anticorpo não humano quando, pelo menos, 85%, 90%, 95% ou 100% dos resíduos correspondentes (conforme definido por qualquer definição convencional, mas preferencialmente definida por Kabat) são idênticos entre as respectivas CDRs. As sequências estruturais de região variável de uma cadeia de anticorpo ou a região constante de uma cadeia de anticorpo são substancialmente de uma sequência estrutural de região variável humana ou região constante humana, respectivamente, quando, pelo menos, 85%, 90%, 95% ou 100% de resíduos definido por Kabat correspondente são idênticos. Para ser classificado como humanizado de acordo com a definição de anticorpos humanizados da Denominação Comum Internacional (DCI) da Organização Internacional de Saúde (OMS) de 2014, um anticorpo deve ter pelo menos 85% de identidade com sequências de anticorpos da linhagem germinativa humana (isto é, antes da hipermutação somática). Os anticorpos mistos são anticorpos para os quais uma cadeia de anticorpo (por exemplo, cadeia pesada) atende ao limite, mas a outra cadeia (por exemplo, cadeia leve) não atende ao limite. Um anticorpo é classificado como quimérico se nenhuma das cadeias atender ao limite, mesmo que as regiões framework variáveis para ambas as cadeias tenham sido substancialmente humanas com algumas mutações reversas murinas. Ver, Jones et al. (2016) The INNs and outs of antibody nonproprietary names, mAbs 8:1, 1-9, DOI:
10.1080/19420862.2015.1114320. Ver também "WHO-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (a review)" (Internet) 2014. Disponível em: http://www. who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf), incorporado neste documento por referência. Para evitar dúvidas, o termo “humanizado” como usado neste documento não se destina a ser limitado à definição da WHO INN de 2014 de anticorpos humanizados. Alguns dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm pelo menos 85% de identidade de sequência com sequências de linhagem germinativa humana e alguns dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm menos de 85% de identidade de sequência com sequências de linhagem germinativa humana.
Algumas das cadeias pesadas dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm desde cerca de 60% a 100% de sequência de sequência até sequências de linhagem germinativa humana, tais como, por exemplo, na faixa de cerca de 60% a 69%, 70% a 79%, 80% a 84%, ou 85% a 89%. Algumas cadeias pesadas ficam abaixo da definição da WHO INN de 2014 e têm, por exemplo, cerca de 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, T6%, 17%, 18%, 79%, 80%, 81%, ou 82%, 83% ou 84% de identidade sequencial com sequências de linhagem germinativa humana, enquanto outras cadeias pesadas atendem à definição da WHO INN de 2014 e têm cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou mais de identidade de sequência com sequências de linhagem germinativa humana.
Algumas das cadeias leves dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm cerca de 60% a 100% de identidade de sequência com sequências de linhagem germinativa humana, tais como, por exemplo, na gama de cerca de 80% a 84% ou 85% a 89%. Algumas cadeias leves caem abaixo da definição WHO INN de 2014 e têm, por exemplo, cerca de 81%, 82%, 83% ou 84% de identidade sequencial com sequências da linhagem germinativa humana, enquanto outras cadeias leves atendem à definição WHO INN 2014 e têm cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou mais de identidade de sequência com sequências de linhagem germinativa humana.
Alguns anticorpos humanizados fornecidos neste documento que são "quiméricos" sob a definição WHO INN de 2014 têm cadeias pesadas com menos de 85% de identidade com sequências de linhagem germinativa humana pareadas com cadeias leves com menos de 85% de identidade com sequências de linhagem germinativa humana.
Alguns anticorpos humanizados fornecidos neste documento são "misturados" sob a definição WHO INN de 2014, por exemplo, tendo uma cadeia pesada com pelo menos 85% de identidade de sequência com sequências de linhagem germinativa humana pareadas com uma cadeia leve com menos de 85% de identidade de sequência com sequências de linhagem germinativa humana, ou vice-versa.
Alguns anticorpos humanizados fornecidos neste documento estão de acordo com a definição de WHO INN de
2014 de "humanizado" e tem uma cadeia pesada com pelo menos 85% de identidade de sequência com as sequências de linhagem germinativa humana pareadas com uma cadeia leve tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com as sequências de linhagem germinativa humanas. Os anticorpos humanizados adicionais da invenção atendem à definição de "misturado" da WHO INN de 2014.
[0209] Embora os anticorpos humanizados muitas vezes incorporem todas as seis CDRs (definido por qualquer definição convencional, mas de preferência conforme definido por Kabat) a partir de um anticorpo de camundongo, eles também podem ser feitos com menos do que todas as CDRs (por exemplo, pelo menos 3, 4, ou 5 CDRs) de um anticorpo de camundongo (por exemplo, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., J. of Mol. Biol., 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, J. Immunol., 164:1432-1441, 2000).
[0210] Em alguns anticorpos apenas uma parte das CDRs, a saber, o subconjunto de resíduos de CDR necessários para a ligação, denominadas SDRs, é necessária para manter a ligação de um anticorpo humanizado. Resíduos de CDR não entram em contato com o antígeno e que não estão nas SDRs podem ser identificados com base em estudos anteriores (por exemplo, os resíduos H60- H65 em CDR H2 frequentemente não são necessários), a partir de regiões de CDRs de Kabats que se encontram fora das alças hipervariáveis de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196: 901, 1987), por modelação molecular e/ou empiricamente, ou como descrito em Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004. Em tais anticorpos humanizados em posições nas quais um ou mais resíduos de CDR doadores estão ausentes ou em que todo um doador de CDR é omitido, o aminoácido que ocupa a posição pode ser um aminoácido que ocupa a posição correspondente (por numeração Kabat) na sequência de anticorpo aceitador. O número de tais substituições de aceitador para aminoácidos doadores nas CDRs para incluir reflete um equilíbrio de considerações concorrentes. Tais substituições são potencialmente vantajosas em diminuir o número de aminoácidos de camundongo num anticorpo humanizado e consequentemente diminuindo a imunogenicidade potencial e/ou para satisfazer a definição de
“humanizado” da WHO INN. No entanto, as substituições também podem causar mudanças de afinidade e reduções significativas na afinidade são preferencialmente evitadas. Posições de substituição dentro de CDRs e aminoácidos a substituir também podem ser selecionadas empiricamente.
[0211]As sequências de anticorpo humano aceitador podem ser, opcionalmente, selecionadas de entre as muitas sequências de anticorpos humanos conhecidas por proporcionar um elevado grau de identidade de sequência (por exemplo, 65-85% de identidade) entre estruturas de região variável de sequência aceitadora humana e as correspondentes estruturas da região variável de uma cadeia de anticorpo de doador.
[0212] Um exemplo de uma sequência de aceitador para a cadeia pesada é a região variável da cadeia pesada humana madura de Fab 48G7 humanizado com código de acesso PDB 2RCS-VH huFrwk (SEQ ID NO: 75). Os domínios variáveis de Fab 3D6 e 48G7 também compartilham comprimentos idênticos para as alças CDR-H1, H2. Outro exemplo de uma sequência de aceitador para a cadeia pesada é a região variável da cadeia pesada humana madura IMGT t IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25). O IMGTA IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) partilha a forma canônica da CDR-H1 e H2 da cadeia pesada 3D6 de camundongo. O IMGTH IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) pertence ao subgrupo 1 da cadeia pesada humana. Um exemplo de uma sequência de aceitador para a cadeia leve é a região variável da cadeia leve humana madura com o código de acesso PDB, anticorpo humano ARX71335 VL (SEQ ID NO: 82). O domínio leve variável do anticorpo 3D6 e ARX71335 também compartilha comprimentos idênticos para as alças CDR-L1, L2 e L3. Outro exemplo de uma sequência de aceitador para a cadeia leve é a região variável da cadeia leve humana madura com IMGTA IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27). O IMGT&IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27) possui as mesmas classes canônicas para CDR-L1, CDR-L2 e L3 que o 3D6 de camundongo. O IMGTH IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27) pertence ao subgrupo kappa humano 2.
[0213] Se for selecionada mais do que uma sequência de anticorpos aceitadores humanos, pode ser usado um compósito ou híbrido desses aceitadores e os aminoácidos usados em diferentes posições nas regiões variáveis da cadeia leve humanizada e da cadeia pesada podem ser retirados de qualquer uma das sequências de anticorpos aceitadores humanos usadas. Por exemplo, as regiões variáveis da cadeia pesada humana madura de IMGTH IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) e código de acesso PDB % 2RCS-VH huFrwk (SEQ ID NO: 75) foram usadas como sequências de aceitador para humanização da região variável de cadeia pesada madura 3D6. Um exemplo de uma posição em que esses dois aceitadores diferem é a posição H17 (T ou S). As versões humanizadas da região variável da cadeia pesada 3D6 podem incluir qualquer um dos aminoácidos nesta posição. Por exemplo, as regiões variáveis da cadeia leve humana madura IMGTH IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27) e o código PDB * ARX71335-VL huFrwk (SEQ ID NO: 82) foram usadas como sequências de aceitador para humanização da região variável de cadeia leve madura 3D6. Um exemplo de uma posição em que estes dois aceitadores diferem é a posição L100 (Q ou A). As versões humanizadas da região variável da cadeia leve 3D6 podem incluir qualquer um dos aminoácidos nesta posição.
[0214] Certos aminoácidos dos resíduos da framework de região variável humana são selecionados para substituição com base em sua possível influência na conformação e/ou ligação de CDR a antígeno. Investigação de tais possíveis influências é por modelação, análise das características dos aminoácidos em determinadas localizações ou observação empírica dos efeitos de substituição ou mutagênese de determinados aminoácidos.
[0215] Por exemplo, quando um aminoácido difere entre um resíduo estrutural de região variável de murino e um resíduo estrutural de região humana variável selecionado, o aminoácido de estrutura humana pode ser substituído pelo aminoácido estrutural equivalente do anticorpo de camundongo quando for razoavelmente esperado que o aminoácido: (1) não covalentemente liga o antígeno diretamente; (2) é adjacente a uma região CDR ou dentro de um CDR como definido por Chothia, mas não Kabat; (3) interage de outra forma com uma região CDR (por exemplo, está dentro de cerca de 6 À de uma região CDR), (por exemplo, identificado por modelagem da cadeia leve ou pesada na estrutura resolvida de uma cadeia de imunoglobulina conhecida homóloga); ou (4) é um resíduo que participa na interface VL-VH.
[0216] A invenção fornece formas humanizadas do anticorpo 3D6 murino incluindo 7 regiões variáveis maduras de cadeia pesada humanizadas exemplificadas (hu3D6VHvb1 (SEQ ID NO: 76), hu3dD6VHvb2 (SEQ ID NO: 77), hu3D6VHvb3 (SEQ ID NO: 78), hu3aD6VHvb4 (SEQ ID NO: 79), hu3D6VHvb5 (SEQ ID NO: 80), hu3D6VHvb6 (SEQ ID NO: 90) e hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO: 91)) e 3 regiões variáveis maduras de cadeia leve humanizadas exemplificadas (hu3D6VLvb1 (SEQ ID NO: 83), huaD6VLvb2 (SEQ ID NO: 84) e hu3D6VLvb3 (SEQ ID NO: 85)).
[0217] EM uma modalidade, as sequências humanizadas são geradas usando um protocolo de PCR de dois estágios que permite a introdução de múltiplas mutações, deleções e inserções usando mutagênese dirigida ao sítio de QuikChange [Wang, W. e Malcolm, BA (1999) BioTechniques 26: 680-682.)].
[0218] Resíduos de framework das classes (1) até (3) como definido por Queen, US. 5.530.101, são algumas vezes alternadamente referidos como resíduos canônicos e de vernier. Os resíduos de framework que ajudam a definir a conformação de uma alça de CDR são por vezes referidos como resíduos canônicos (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Thornton & Martin, J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996). Os resíduos de estrutura que suportam conformações de alça de ligação ao antígeno e desempenham um papel no ajuste do ajuste de um anticorpo contra o antígeno são por vezes referidos como resíduos de vernier (Foote & Winter, J. Mol. Biol 224:487-499 (1992)).
[0219] Outros resíduos de framework que são candidatos à substituição são os resíduos que criam um sítio potencial de glicosilação. Ainda outros candidatos para substituição são aminoácidos de framework humanos aceitadores que são incomuns para uma imunoglobulina humana nessa posição. Estes aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos da posição equivalente do anticorpo de camundongo doador ou a partir das posições equivalentes de imunoglobulinas humanas mais típicas.
[0220] Outros resíduos estruturais que são candidatos para substituição são os resíduos de glutamina N-terminais (Q) que podem ser substituídos com ácido glutâmico (E) para minimizar potencial para conversão de piroglutamato [Y. Diana Liu, et al., 2011, J. Biol. Chem., 286: 11211—11217]. A conversão do ácido glutâmico (E) em piroglutamato (pE) ocorre mais lentamente que na glutamina (Q). Devido à perda de uma amina primária na conversão de glutamina para pE, os anticorpos tornam-se mais ácidos. A conversão incompleta produz heterogeneidade no anticorpo que pode ser observada como múltiplos picos usando métodos analíticos baseados em carga. Diferenças de heterogeneidade podem indicar falta de controle de processo.
[0221] Exemplos de anticorpos humanizados são formas humanizadas da 3D6 de camundongo, designado Hu3D6.
[0222] O anticorpo 3D6 de camundongo compreende regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada maduras tendo sequências de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 11, respectivamente. A invenção fornece 7 regiões variáveis de cadeia pesada maduras humanizadas exemplificadas: hu3D6VHvb1, hu3D6VHvb2, hu3D6VHvb3, hus3D6VHvb4, hu3D6VHvb5, hu3D6VHvb6 e hu3D6VHvb7. A invenção fornece ainda 3 regiões variáveis de cadeia leve maduras exemplificadas hu3D6VLvb1, hu3D6VLvb2 e hu3D6VLvb3. As Figuras 1 e 2 mostram os alinhamentos da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve, respectivamente, da 3D6 murina e vários anticorpos humanizados.
[0223] Por razões como possível influência na conformação da CDR e/ou ligação ao antígeno, interação mediadora entre cadeias pesadas e leves, interação com a região constante, ser um sítio para modificação pós-tradução desejada ou indesejada, ser um resíduo incomum para sua posição em uma sequência de região variável humana e, portanto, potencialmente imunogênico, obter potencial de agregação, e outras razões, as seguintes 31 posições de framework da região variável foram consideradas como candidatas para substituições nas 3 regiões variáveis de cadeia leve madura humana exemplificadas e nas 7 regiões variáveis de cadeia pesada humana madura exemplificadas, como especificado adicionalmente nos exemplos: L7 (T7S, da linhagem germinativa), L10 (T10S, da linhagem germinativa), L15 (I115L, da linhagem germinativa), L17 (Q17E, para aumentar a estabilidade), L37 (L37Q, de linhagem germinativa), L45 (K45R, da linhagem germinativa), L83 (L83V, da linhagem germinativa), L86 (H86Y, do 3D6 de camundongo), L100 (A100Q, da linhagem germinativa), L106 (L106I, da linhagem germinativa), H1 (Q1E, do 3D6 de camundongo), H5 (Q5V, da linhagem germinativa), H11 (L11V, da linhagem germinativa), H17 (S17T, da linhagem germinativa), H20 (L20l, da linhagem germinativa), H23 (T23K, da linhagem germinativa), H38 (K38R, do 3D6 de camundongo), H42 (E42G, da linhagem germinativa), H43 (Q43K, da linhagem germinativa), H66 (K66R, da linhagem germinativa), H67 (A67V, da linhagem germinativa), H75 (S75T, da linhagem germinativa), H76 (N76D, da linhagem germinativa), H80 (L80M, da linhagem germinativa), H81 (Q81E, da linhagem germinativa), H83 (T83R, da linhagem germinativa), H91 (Y91F, do 3D6 de camundongo), H93 (A93S, do 3D6 de camundongo), H94 (S94T, do 3D6 de camundongo), H108 (T108L, da linhagem germinativa) e H109 (L109V, da linhagem germinativa). Aqui e acolá, ao se descreverem as substituições, os comentários entre parênteses indicam uma justificativa para uma substituição.
Algumas substituições têm vários fundamentos.
As seguintes 5 posições de CDR de região variável foram consideradas como candidatas para substituições nas 3 regiões variáveis de cadeia leve madura humana exemplificadas e 7 regiões variáveis de cadeia pesada madura humana exemplificadas, conforme especificado adicionalmente nos exemplos: L24 (K24R, da linhagem germinativa), H28 (N28T, da linhagem germinativa), H54 (N54D, da linhagem germinativa), H5S6 (D56E, da linhagem germinativa) e H58 (V581, da linhagem germinativa). Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, Kabat CDR-H2 possui uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 87. Em alguns desses anticorpos 3D6 humanizados, a CDR-H1 de Composto de Kabat-Chothia possui uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 86 e a CDR-H2 de Kabat possui uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 87. Em alguns desses anticorpos 3D6 humanizados, a CDR-H1 de Composto de Kabat-Chothia possui uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 868 e a CDR-H2 de Kabat possui uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 88. Em alguns desses anticorpos 3D6 humanizados, a CDR-H1 de Composto de Kabat-Chothia possui uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 86 e a CDR-H2 de Kabat possui uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 92. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, Kabat CDR-L1 possui uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 89.
[0224] Neste documento, como em qualquer outro, o resíduo mencionado em primeiro lugar é o resíduo de um anticorpo humanizado formado por enxertia de CDRs de Kabat ou uma CDR de Composto de Chothia-Kabat no caso de CDR-H1 em um framework aceitador humano, e o resíduo segundo mencionado é um resíduo considerado para substituir este resíduo. Portanto, dentro das frameworks de regiões variáveis, o primeiro resíduo mencionado é humano, e dentro das CDRs, o primeiro resíduo mencionado é de camundongo.
[0225] Os anticorpos exemplificados incluem quaisquer permutações ou combinações das regiões variáveis de cadeia pesada e leve maduras exemplificadas VHvb1/VLvb1, VHvb1/VLvb2, VHvb1/VLvb3, VHvb2/VLvb1, VHvb2/VLvb2, VHvb2/VLvb3, VHvb3/VLvb1, VHvb3/VLvb2, VHvb3/VLvb3, VHvb4/VLvb1, VHvb4/VLvb2, VHvb4/VLvb3, VHvb5/VLvb1, VHvb5/VLvb2, VHvb5/VLvb3, VHvb6/VLvb1, VHvb6/VLvb2, VHvb6/VLvb3, VHvb7/VLvb1, VHvb7/VLvb2, VHvb7/VLvb3.
[0226] Anticorpos exemplificados incluem quaisquer permutações ou combinações das regiões variáveis de cadeia pesada maduras exemplificadas hu3D6VHvb1 (SEQ ID NO: 76), hu3aD6VHvb2 (SEQ ID NO: 77), hu3D6VHvb3 (SEQ ID NO: 78), hu3D6VHvb4 (SEQ ID NO: 79), hu3aD6Hvb5 (SEQ ID NO: 80), hu3D6VHvb6 (SEQ ID NO: 90) e hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO: 91) com qualquer uma das regiões variáveis da cadeia leve 3D6VL humanizada, hu3D6VLv1 (SEQ ID NO:20), hu3D6VLv2 (SEQ ID NO:21), hu3D6VLv3 (SEQ ID NO:22), e hu3D6VLv4 (SEQ ID NO:22). Anticorpos exemplificados incluem quaisquer permutações ou combinações das regiões variáveis de cadeia leve maduras exemplificadas hu3D6VLvb1 (SEQ ID NO: 83), hu3dD6VLvb2 (SEQ ID NO: 84) ou hu3D6VLvb3 (SEQ ID NO: 85) com qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada 3D6V6 humanizadas, hu3D6VHv1 (SEQ ID NO:15); hu3D6VHv2 (SEQ ID NO:16); hu3D6VHv1b (SEQ ID NO:17); hu3D6VHv1ILbA11 (SEQ ID NO:18); hu3D6VHv5 (SEQ ID NO:19); hu3D6VvVHvVIDA1IBEG2 (SEQ ID NO:46);,
hu3D6VHvIDA11IB6H3 (SEQ ID NO:47); husD6VHvic (SEQ ID NO:48); hu3D6VHv1d (SEQ ID NO:49); hu3D6VHv1e (SEQ ID NO:50); hu3D6VHv1f (SEQ ID NO:51); hu3dD6VHv3 (SEQ ID NO:52); hu3D6VHv3b (SEQ ID NO:53); hu3D6VHv3c (SEQ ID NO:54); hu3D6VHv4 (SEQ ID NO:55); hu3D6VHv4b (SEQ ID NO:56); e hu3D6VHv4c (SEQ ID NO:57).
[0227] A invenção fornece variantes do anticorpo humanizado 3D6 em que a região variável da cadeia pesada madura humanizada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com hu3D6VHvb1 (SEQ ID NO: 76), hu3D6VHvb2 (SEQ ID NO: 77), hu3aD6VHvb3 (SEQ ID NO: 78), hu3D6VHvb4 (SEQ ID NO: 79), hu3D6Hvb5 (SEQ ID NO: 80), hu3D6VHvb6 (SEQ ID NO:90) ou hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO:91), e a região variável da cadeia leve madura humanizada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com hu3D6VLvb1 (SEQ ID NO: 83), huaD6VLvb2 (SEQ ID NO: 84), ou hu3D6VLvb3 (SEQ ID NO: 85). Em alguns desses anticorpos, pelo menos 1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, ou todas as 36 das mutações reversas ou outras mutações nas SEQ ID NOs:76-80, SEQ ID NOs:90-91, e SEQ ID NOs:83-85) são retidas. Alguns desses anticorpos humanizados contêm o mesmo conjunto de retromutações ou outras mutações que nas sequências exemplificadas que definem a identidade de sequência.
[0228] Assim, por exemplo, a invenção inclui anticorpos humanizados com uma região variável de cadeia pesada madura com pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a região variável de cadeia pesada madura de SEQ ID NO: 77, e o mesmo conjunto de mutações conforme listado na Tabela 6 de SEQ ID NO: 77, e três CDRs de SEQ ID NO: 77 e uma região de cadeia leve madura com pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID 84 ou 85, e o mesmo conjunto de mutações conforme listado na Tabela 7 para SEQ ID NO: 84 ou 85 respectivamente, e três CDRs de SEQ ID NO: 84 ou 85 respectivamente. Alguns anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada madura de SEQ ID NO: 77 e uma região variável de cadeia leve madura de SEQ ID NO: 84 ou 85.
[0229] A invenção também inclui anticorpos humanizados com uma região variável de cadeia pesada madura com pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a região variável de cadeia pesada madura de SEQ ID NO: 90 e o mesmo conjunto de mutações conforme listado na Tabela 6 para SEQ ID NO: 90 e três CDRs de SEQ ID NO: 90 e uma região de cadeia leve madura com pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 84 ou 85, e o mesmo conjunto de mutações conforme listado na Tabela 7 para SEQ ID NO: 84 ou 85 respectivamente, e três CDRs de SEQ ID NO: 84 ou 85 respectivamente. Alguns anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada madura de SEQ ID NO: 90 e uma região variável de cadeia leve madura de SEQ ID NO: 84 ou 85.
[0230] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H93 é ocupado por S e H94 é ocupado por T. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, posições H93 e H94 (resíduos Vernier) são ocupados por S e T, respectivamente, como é o caso em, por exemplo, huVHvb1, huVHvb?2, huVHvb3, huVHvb4, huVHvb5, huVHvb6 e huVHvb7.
[0231] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, a posição H91 (resíduo de interface) na região VH é ocupada por F, como é o caso em, por exemplo, huVHvb1, huVHvb2 e huVHvb6.
[0232] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H1 é ocupado por E, H5 é ocupado por V, H11 é ocupado por V, H20 é ocupado por |, H23 é ocupado por K, H38 é ocupado por R, H42 é ocupado por G, H43 é ocupado por K, H66 é ocupado por R, H75 é ocupado por T, H76 é ocupado por D, H81 é ocupado por E, H108 é ocupado por L, H109 é ocupado por V. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições H1, H5, H11, H20, H23, H38, H42, H43, H66, H75, H76, H81, H108 e H109 na região VH estão ocupadas por E, V, V , K, R G, KR, T, D, E, Le V, respectivamente, como é o caso em, por exemplo, huVHvb2, huVHvb3, huVHvb4, huVHvb5, huVHvb6, e huvHvb7.
[0233] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H17 é ocupado por T, H80 é ocupado por M, H83 é ocupado por R. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições H17, H80 e H83 na região VH são ocupadas por T, M e R, respectivamente, como é o caso em, por exemplo, huVHvb3, huVHvb4, huVHvb5, huVHvb6 e huVHvb7.
[0234] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, a posição H58 (resíduo CDR-H2) na região VH é ocupada por |, como é o caso em, por exemplo, huVHvb3, huVHvb4 e huVHvb5.
[0235] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H28 é ocupado por T, H67 é ocupado por V. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições H28 e H67 no A região VH é ocupada por Te V, respectivamente, como é o caso, por exemplo, em huVHvb4, huVHvb5, huVHvb6 e huvHvb7.
[0236] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H54 é ocupado por D, H56 é ocupado por E. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, posições H54 e H56 (resíduos de CDR -H2) na região VH são ocupados por D e E, respectivamente, como é o caso em, por exemplo, huVHvb6 e huvHvh7.
[0237] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H1 é ocupado por Q ou E, H5 é ocupado por Q ou V, H11 é ocupado por L ou V, H17 é ocupado por S ou T, H20 é ocupado por L ou |, H23 é ocupado por T ou K, H28 é ocupado por N ou T, H38 é ocupado por K ou R, H42 é ocupado por E ou G, H43 é ocupado por Q ou K, H54 é ocupado por N ou D, H56 é ocupado por D ou E, H58 é ocupado por V ou |, H66 é ocupado por KouR, H67 é ocupado por A ou V, H75 é ocupado por S ou T, H76 é ocupado por N ou D, H80 é ocupado por L ou M, H81 é ocupado por Q ou E, H83 é ocupado por T ou R, H91 é ocupado por F ou Y, H93 é ocupado por S, H94 é ocupado por T, H108 é ocupado por T ou L, H109 é ocupado por L ou V.
[0238] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições H91, H93 e H94 na região VH são ocupadas por F, S e T, respectivamente, como em huVHvb1. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições H1, H5, H11, H20, H23, H38, H42, H43, H66, H75, H76, H81, H91, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupadas por E, V, V IL K R G, KR TD E FS T, LeV, respectivamente, como em huVHvb2. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H38, H42, H43, H58, H66, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupados por E, V, V, TI, K, RG, KI,IRT DM E,R,S,T,LeV, respectivamente, como em huVHvb3. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH é ocupada por E, V, V, TI, K TR GG KI RV, TD,M E, R,S,T,L e V, respectivamente, como em huVHvb4. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupados por E, V, V, T ,L K, T. RG, K DEL, RV,T.D,M ER, S, T,Le V, respectivamente, como em huVHvb5. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H91, H93, H94, H108 e H109 na região VH é ocupada por E, V, V, TI KT. RG KD E RV TD MERFS, T, L, e V, respectivamente como em huVHvb6. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupados por E, V, V, T L K,K T RG KD E RV TDMER, S,T,LeV, respectivamente, como em huVHvb7.
[0239] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, pelo menos uma das seguintes posições na região VL é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: L7 é ocupada por S, L10 é ocupada por S, L15 é ocupada por L, L83 é ocupada por V, L86 é ocupado por Y, e L106 é ocupado por |. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições L7, L10, L15, L83, L86 e L106 são ocupadas por S, S, L, V, Y e Y, respectivamente, como é o caso em, por exemplo, huVHvb2 e huVLvb3.
[0240] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, pelo menos uma das seguintes posições na região VL é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: L7 é Tou S, L10 é Tou S, LI5é l ouL, LIZé Qou E, LM24 é KouR, L37 é Lou Q, LAS é Kou R, Lê3 é Lou V, L686 é Hou Y, LI0OO0 é A ou Q, LIOB é L oul.
[0241] Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições L7, L10, L15, L83, L86 e L106 na região VL são ocupadas por S, S, L, V, Y e |, respectivamente, como em huVLvb2. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as posições L7, L10, L15, L17, L24, L37, L45, L83, L86, L100 e L106 na região VL são ocupadas por S, S,L, E, R, Q, RV, Y, Q el, respectivamente, como em huVLvb3.
[0242] Em alguns desses anticorpos 3D6 humanizados, a cadeia pesada variável tem 2 85% de identidade com a sequência humana. Em alguns desses anticorpos 3D6 humanizados, a cadeia leve variável tem > 85% de identidade com a sequência humana. Em alguns desses anticorpos 3D6 humanizados, cada uma das cadeia pesada variável e cadeia leve variável tem = 85% de identidade relativamente à sequência da linha germinativa humana. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, as três CDRs da cadeia pesada são conforme definidos pelo Composto Kabat/Chothia (SEQ ID NOs: 8, 9€ 10) e as três CDRs da cadeia leve são conforme definidos pelo Composto Kabat/Chothia (SEQ ID NOs: 12, 13 e 14); desde que a posição H28 seja ocupada por N ou T, a posição H54 é ocupada por N ou D, a posição H56 é ocupada por D ou E, a posição H58 é ocupada por V ou | e a posição L24 é ocupada por K ou R. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, Composto Kabat/Chothia CDR-H1 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 86. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, Kabat CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 92. Em alguns anticorpos 3D6 humanizados, Kabat CDR-L1 possui uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 89.
[0243] As regioes CDR de tais anticorpos humanizados podem ser idênticas ou substancialmente idênticas às regiões CDR de 3D6. As regiões CDR podem ser definidas por qualquer definição convencional (por exemplo, Chothia ou Composto de Chothia e Kabat), mas são preferencialmente como definido por Kabat.
[0244] As posições da framework das regiões variáveis estão de acordo com a numeração Kabat, salvo indicação em contrário. Outras variantes tais tipicamente diferem das sequências das cadeias pesadas e leves Hu3D6 exemplificadas por um pequeno número (por exemplo, tipicamente não superior a 1, 2, 3, 5, 10 ou 15) de substituições, deleções ou inserções. Tais diferenças são geralmente na estrutura, mas também podem ocorrer nas CDRs.
[0245] Uma possibilidade de variação adicional em variantes humanizadas de 3D6 é de mutações reversas adicionais nas estruturas da região variável. Muitos dos resíduos de framework que não estão em contato com as CDRs no mAb humanizado podem acomodar substituições de aminoácidos das posições correspondentes do mAb de camundongo doador ou outros anticorpos de camundongo ou humanos, e mesmo muitos resíduos de contato de CDR potenciais também são suscetíveis de substituição. Mesmo os aminoácidos dentro das CDRs podem ser alterados, por exemplo, com resíduos encontrados na posição correspondente da sequência aceitadora humana usada para fornecer framework de regiões variáveis. Além disso, podem ser utilizadas sequências aceitadoras humanas alternativas, por exemplo, para a cadeia pesada e/ou leve. Se diferentes sequências aceitadoras forem usadas, uma ou mais das mutações reversas recomendadas acima podem não ser realizadas porque os resíduos correspondentes do doador e do aceitador já são os mesmos sem mutações reversas.
[0246] Preferivelmente, substituições ou mutações inversas em variantes 3D6 humanizadas (sejam ou não conservadoras) não tem efeito substancial sobre a afinidade de ligação ou potência do MAb humanizado, isto a sua capacidade para se ligar a tau.
[0247] Os anticorpos 3D6 humanizados são ainda caracterizados pela sua capacidade para se ligar a tau fosforilada e não fosforilada e formas de tau mal dobradas/agregadas. Alguns anticorpos humanizados são caracterizados pela ligação à tau humana ou posse de outra propriedade funcional, como a inibição da ligação da tau às células neuronais ou desagregação da tau, igual ou mais fortemente do que 3D6 de camundongo (por exemplo, até 2x, 5x, 10x ou 20x), aquele do 3D6 do camundongo. Essas propriedades podem ser comparadas por qualquer um dos ensaios descritos nos exemplos.
C. Seleçãoda Região Constante
[0248] As regiões variáveis das cadeias pesada e leve de anticorpos quiméricos, "veneered" ou humanizados podem ser ligadas a pelo menos uma porção de uma região constante humana. A escolha de uma região constante depende, em parte, da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, fagocitose celular dependente de anticorpo e/ou citotoxicidade dependente de complemento são desejadas. Por exemplo, os isotipos humanos IG1 e IgG3 têm citotoxicidade dependente de complemento e os isotipos humanos IgG2 e IgG4 não. IgG1 e IgG3 humanos também induzem funções efetoras mediadas por células mais fortes do que IgG2 e IgG4 humanos. As regiões constantes da cadeia leve podem ser lambda ou kappa. As convenções de numeração para regiões constantes incluem a numeração da UE (Edelman, GM et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)), numeração de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, numeração exclusiva de IMGT (Lefranc M.-P. et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains, Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005), e numeração IMGT de exons (Lefranc, supra).
[0249] Um ou vários aminoácidos no terminal amino ou carboxi da cadeia leve e/ou cadeia pesada, tal como a lisina do terminal C da cadeia pesada, podem estar faltando ou derivatizados em uma proporção ou na totalidade das moléculas. As substituições podem ser feitas nas regiões constantes para reduzir ou aumentar a função efetora, tais como citotoxicidade mediada pelo complemento ou ADCC (ver, por exemplo, Winter et al., Patente US nº. 5.624.821; Tso et al, Patente US nº. 5.834.597; e Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 4005, 2006), ou para prolongar a meia-vida em seres humanos (ver, por exemplo, Hinton et al, J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). As substituições exemplificativas incluem uma Gln na posição 250 e/ou uma Leu na posição 428 (numeração EU é usada neste parágrafo para a região constante) para aumentar a meia-vida de um anticorpo. Substituição em qualquer ou todas as posições 234, 235, 236 e/ou 237 reduz a afinidade para os receptores Fcy, particularmente o receptor FcyRI (Ver, por exemplo, US 6.624.821). Uma substituição de alanina nas posições 234, 235,
e 237 da IgG1 humana pode ser usada para reduzir as funções efetoras. Alguns anticorpos têm substituição de alanina nas posições 234, 235 e 237 da IgG1 humana para reduzir as funções efetoras. Opcionalmente, as posições 234, 236 e/ou 237 em IgG2 humana são substituídas com alanina e a posição 235 com glutamina (ver, por exemplo, US 5.624.821). Em alguns anticorpos, uma mutação numa ou mais das posições 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 e 331 por numeração EU de IgG1 humana é usada. Em alguns anticorpos, uma mutação numa ou mais das posições 318, 320, e 322 por numeração EU de IgG1 humana é usada. Em alguns anticorpos, as posições 234 e/ou 235 são substituídas com alanina e/ou a posição 329 é substituída por glicina. Em alguns anticorpos, as posições 234 e 235 são substituídas por alanina. Em alguns anticorpos, o isotipo é IgG2 ou IgG4 humano.
[0250] Um exemplo de região constante kappa de cadeia leve humana tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 (com ou sem a arginina N- terminal). Uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana exemplar possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 (com ou sem a lisina C- terminal). Anticorpos podem ser expressos como tetrâmeros que contém duas cadeias leves e duas pesadas, como distintas cadeias pesadas, leves, como Fab, Fab', F(ab') 2 e Fv, ou como anticorpos de cadeia única, em que domínios variáveis da cadeia leve e pesada maduros são ligados através de um espaçador.
[0251] Regiões constantes humanas mostram uma variação alotípica e uma variação isoalotípica entre indivíduos diferentes, isto é, as regiões constantes podem diferir de indivíduo para indivíduo em uma ou mais posições polimórficas. Isoaolotipos diferem dos alotipos em que os soros que reconhecem um isoalotipo se ligam a uma região não polimórfica de um ou mais outros isotipos. Portanto, por exemplo, outra região constante da cadeia pesada é de I9G1 G1m3 com ou sem a lisina C-terminal. A referência a uma região constante humana inclui uma região constante com qualquer alotipo natural ou qualquer permutação de resíduos que ocupam posições em alotipos naturais.
D. Expressão de anticorpos recombinantes
[0252] São conhecidos vários métodos para produzir anticorpos quiméricos e humanizados utilizando uma linhagem celular que expressa anticorpo (por exemplo, hibridoma). Por exemplo, as regiões variáveis de imunoglobulina de anticorpos podem ser clonadas e sequenciadas utilizando métodos bem conhecidos. Em um método, a região VH variável da cadeia pesada é clonada por RT-PCR usando mRNA preparado a partir de células de hibridoma. Os primers de consenso são usados para o peptídeo líder da região VH abrangendo o códon de iniciação da tradução como o primer 5' e um primer 3' específico das regiões constantes de g2b. Exemplos de primers são descritos na publicação de patente US 2005/0009150 de Schenk et al. (a seguir "Schenk"). As sequências de múltiplos clones independentemente derivados podem ser comparadas para garantir que não sejam introduzidas alterações durante a amplificação. A sequência da região VH também pode ser determinada ou confirmada pelo sequenciamento de um fragmento VH obtido por metodologia 5' RACE RT-PCR e o primer específico 3' de g2b.
[0253] A região VL variável da cadeia leve pode ser clonada de maneira análoga. Em uma abordagem, um conjunto de primers de consenso é projetado para amplificação de regiões VL usando um primer 5' projetado para hibridar com a região VL abrangendo o códon de iniciação da tradução e um primer 3' específico para a região Ck a jusante da região de junção V-J. Em uma segunda abordagem, a metodologia SRACE RT-PCR é usada para clonar um cDNA codificador de VL. Os exemplos de iniciadores são descritos em Schenk, supra. As sequências clonadas são então combinadas com sequências que codificam regiões constantes humanas (ou outras espécies não humanas). Sequências exemplares que codificam regiões constantes humanas incluem SEQ ID NO: 105, que codifica uma região constante de IgG1 humana (SEQ ID NO: 103) e SEQ ID NO: 106, que codifica uma região constante de cadeia leve kappa humana (SEQ ID NO: 104).
[0254] Em uma abordagem, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve são remanipuladas para codificar as sequências de doadores de emenda a jusante das respectivas junções VDJ ou VJ e são clonadas em um vetor de expressão de mamífero, como pCMV-hy1 para a cadeia pesada e pCMV-Mcl para a cadeia leve. Estes vetores codificam humanos y1 e Ck como fragmentos exônicos a jusante de cassete da região variável inserida. Seguindo a verificação da sequência, os vetores de expressão da cadeia pesada e da cadeia leve podem ser cotransfectados em células CHO para produzir anticorpos quiméricos. O meio condicionado é coletado 48 horas após a transfecção e ensaiado por análise Western Blot para produção de anticorpos ou ELISA para ligação ao antígeno. Os anticorpos quiméricos são humanizados como descrito acima.
[0255] Os anticorpos quiméricos, "veneered", humanizados e humanos são tipicamente produzidos por expressão recombinante. Os construtos de polinucleotídeos recombinantes tipicamente incluem uma sequência de controle de expressão ligada operacionalmente às sequências de codificação de cadeias de anticorpo, incluindo elementos de controle de expressão associados de forma natural ou heteróloga, tais como um promotor. As sequências de controle de expressão podem ser sistemas promotores em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas. Uma vez que o vetor for incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido em condições adequadas para expressão de um elevado nível de sequências de nucleotídeos e da coleta e purificação dos anticorpos de reação cruzada.
[0256] Esses vetores de expressão geralmente são replicáveis em organismos hospedeiros como epissomas ou como parte integral do DNA cromossômico hospedeiro. Comumente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção, por exemplo, resistência à ampicilina ou resistência à higromicina, para permitir a detecção das células transformadas com as sequências de DNA desejadas.
[0257] E. coli é um hospedeiro procariótico útil para a expressão de anticorpos, particularmente os fragmentos de anticorpo. Os micróbios, tais como levedura, também são úteis para expressão. Saccharomyces é um hospedeiro com vetores adequados tendo sequências de controle de expressão, uma origem de replicação, sequências de terminação e semelhantes, como desejado. Os promotores típicos incluem 3-fosfoglicerato quinase e outras enzimas glicolíticas. Os promotores de levedura induzíveis incluem, dentre outros, promotores de álcool desidrogenase, isocitocromo C e as enzimas responsáveis pela utilização da maltose e da galactose.
[0258] As células de mamíferos podem ser utilizadas para expressar os segmentos de nucleotídeos que codificam as imunoglobulinas ou fragmentos destes. Ver Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Uma variedade de linhagens celulares hospedeiras adequadas capazes de secretar proteínas heterólogas intactas foram desenvolvidas e incluem as linhagens de células CHO, várias linhagens celulares COS, células HeLa, células HEK293, células L e mielomas não-produtores de anticorpos, incluindo SP2/0 e NS0. As células podem ser não humanas. Vetores de expressão para essas células podem incluir sequências de controle de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor, um potencializador (Queen et al., Immunol. Rev. Rev. 89:49 (1986)) e sítios de informação de processamento necessários, como sítios de ligação de ribossomos, sítios de divisão de RNA, sítios de poliadenilação e sequências de terminação transcricional. As sequências de controle de expressão adequadas são os promotores derivados de genes endógenos, citomegalovírus, SVA40, adenovírus, vírus do papiloma bovino e semelhantes. Ver Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).
[0259] Alternativamente, as sequências de codificação do anticorpo podem ser incorporadas em transgenes para introdução no genoma de um animal transgênico e subsequente expressão no leite do animal transgênico (ver, por exemplo, Pat. US nº, 5.741.957; Pat. US nº. 5.304.489; e Pat. US nº. 5.849.992). Os transgenes adequados incluem sequências de codificação para cadeias leves e ou pesadas ligadas operativamente com um promotor e potenciador de um gene específico de glândula mamária, tal como caseína ou beta lactoglobulina.
[0260] Os vetores contendo os segmentos de DNA de interesse podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto que o tratamento com fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, biolítica ou transfecção baseada em vírus pode ser usado para outros hospedeiros celulares. Outros métodos utilizados para transformar células de mamíferos incluem o uso de polibreno, fusão de protoplastos, lipossomas, eletroporação e microinjeção. Para a produção de animais transgênicos, os transgenes podem ser microinjetados em oócitos fertiizados ou podem ser incorporados no genoma de células-tronco embrionárias e os núcleos dessas células são transferidos para oócitos enucleados.
[0261] Uma vez que vetor(es) que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpo sejam introduzidos em cultura de células, agrupamentos de células podem ser triados para uma produtividade de crescimento e qualidade do produto em meio livre de soro. Agrupamentos de células produtoras superiores podem então ser submetidos a uma clonagem de célula simples baseada em FACS para gerar linhagens monoclonais. Podem ser usadas produtividades específicas superiores a 50 pg ou 100 pg por célula por dia, que correspondem a títulos de produtos de maior do que 7,5 g/L de cultura. Os anticorpos produzidos por clones de células individuais também podem ser testados quanto às propriedades de turvação, de filtragem, PAGE, IEF, varredura UV, HP-SEC, o mapeamento de carboidrato-oligossacarídeo, espectrometria de massa e ensaio de Bining, como ELISA ou Biacore. Um clone selecionado pode então ser depositado em vários frascos e armazenado em congelamento para uso posterior.
[0262] Uma vez expressos, os anticorpos podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrão da técnica, incluindo a captura da proteína A, purificação por HPLC, cromatografia em coluna, eletroforese em gel e semelhantes (ver geralmente, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).
[0263] Podem ser utilizadas metodologias para a produção comercial de anticorpos, incluindo otimização de códons, seleção de promotores, seleção de elementos de transcrição, seleção de terminadores, clonagem de células isoladas isentas de soro, banco celular, uso de marcadores de seleção para amplificação do número de cópias, terminador CHO, ou melhoria dos títulos de proteínas (ver, por exemplo, US 5.786.464; US 6.114.148; US 6.063.598; US 7.569.339; WO02004/050884; WO02008/012142; WO02008/012142; WO02005/019442; WO02008/107388; WO2009/027471; e US 5.888.809).
Os anticorpos também podem ser administrados na forma de ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesada e/ou leve do anticorpo. Se ambas as cadeias, pesada e leve, estiverem presentes, as cadeias estão preferencialmente ligadas na forma de um anticorpo de cadeia simples. Os anticorpos para administração passiva também podem ser preparados, por exemplo, por cromatografia de afinidade sérica de pacientes tratados com imunógenos peptídicos.
[0264] O DNA pode ser administrado na forma pura (isto é, sem materiais coloidais ou encapsulantes). Em alternativa, podem ser utilizados vários sistemas de vetores virais, incluindo sistemas retrovirais (vide, por exemplo, Lawrie e Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)) incluindo vetores derivados de retrovírus, tais como MMLV, HIV-1 e ALV; vetores adenovirais (ver, por exemplo, Bett et al, J. Virol. 67, 591 1 (1993)); vetores de vírus adenoassociados (ver, por exemplo, Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), vetores lentivirais, tais como aqueles baseados em sequências gag de HIV ou FIV, vetores virais da família da varíola incluindo vírus vaccinia e os vírus da varíola aviária, vetores virais do gênero de vírus alfa, tais como aqueles derivados de vírus da floresta de Sindbis e Semliki (ver, por exemplo, Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)), vírus da encefalite equina venezuelana (ver US 5.643.576) e rabdovírus, como vírus da estomatite vesicular (ver WO 96/34625) e papilomavírus (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995), Woo et al., WO 94/12629 e Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).
[0265] O DNA que codifica um imunógeno, ou que codifica as cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo, ou um vetor contendo-as, pode ser empacotado em lipossomas. Os lipídios adequados e análogos relacionados são descritos nos documentos US 5.208.036, US 5.264.618, US 5.279.833 e US 5.283.185. Os vetores e o DNA que codificam um imunógeno, ou que codificam as cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo, também podem ser adsorvidos ou associados a carreadores — particulados, — cujos exemplos incluem polímeros de polimetilmetacrilato, polilactidas e poli(lactida-co-glicólidos) (ver, por exemplo, McGee et al., J. Micro Encap. 1996).
[0266] Vetores ou segmentos deles que codificam as cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo podem ser incorporados em células ex vivo, por exemplo, em células explantadas de um paciente individual (por exemplo, linfócitos, aspirados de medula óssea, biópsia de tecido) ou células-tronco hematopoiéticas de doadores universais, seguido por reimplante das células em um paciente, geralmente após a seleção de células que incorporaram os transgenes. (ver, por exemplo, WO 2017/091512). Células derivadas de paciente exemplares incluem células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de paciente (iPSCs) ou outros tipos de células-tronco (embrionárias, hematopoiéticas, neurais ou mesenquimais).
[0267] Um vetor ou segmento do mesmo que codifica as cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo pode ser introduzido em qualquer região de interesse em células ex vivo, tal como um gene de albumina ou outro gene de porto seguro. As células que incorporam o vetor podem ser implantadas com ou sem diferenciação prévia. As células podem ser implantadas em um tecido específico, como um tecido secretor ou um local de patologia, ou sistemicamente, como por infusão no sangue. Por exemplo, as células podem ser implantadas em um tecido secretor de um paciente, como o fígado, opcionalmente com diferenciação prévia em células presentes nesse tecido, como os hepatócitos no caso de um fígado. À expressão do anticorpo no fígado resulta na secreção do anticorpo para o sangue.
E. Ensaios de Triagem de Anticorpos
[0268] Os anticorpos podem ser selecionados inicialmente quanto à especificidade de ligação desejada, conforme descrito acima. Os imunógenos ativos também podem ser selecionados quanto à capacidade de induzir anticorpos com essa especificidade de ligação. Neste caso, um imunógeno ativo é utilizado para imunizar um animal de laboratório e o soro resultante é testado quanto à especificidade de ligação apropriada.
[0269] Os anticorpos com a especificidade de ligação desejada podem então ser testados em modelos celulares e animais. As células utilizadas nessa triagem são preferencialmente células neuronais. Relatou-se um modelo celular de patologia tau em que as células de neuroblastoma são transfectadas com um domínio de quatro repetições de tau, opcionalmente com uma mutação associada com a patologia tau (por exemplo, delta K280, ver Khlistunova, Current Alzheimer Research 4, 544-546 (2007)). Em outro modelo, a patologia tau é induzida na linhagem celular do neuroblastoma N2a pela adição de doxiciclina. Com os modelos celulares, pode-se estudar a toxicidade da tau quanto às células no estado solúvel ou agregado, à aparência dos agregados tau após a ativação da expressão do gene tau, à dissolução dos agregados tau após desativar-se novamente a expressão gênica e à eficiência dos anticorpos que inibem a formação de agregados de tau ou sua desagregação.
[0270] Os anticorpos também podem ser triados em modelos animais transgênicos de doenças associadas à tau. Esses animais transgênicos podem incluir um transgene de tau (por exemplo, qualquer uma das isoformas humanas) e, opcionalmente, um transgene de APP humano, entre outros, tal como uma quinase que fosforila tau, ApoE, presenilina ou alfa-sinucleína. Esses animais transgênicos estão dispostos a desenvolver pelo menos um sinal ou sintoma de uma doença associada ao tau.
[0271]UM exemplo de animal transgênico é a linhagem K3 de camundongos (ltner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 (41): 15997-6002 (2008)). Esses camundongos tem um transgene tau humano têm um transgene tau humano com uma mutação K369I (a mutação está associada à doença de Pick) e um promotor de Thy1.2. Esse modelo apresenta um rápido curso de neurodegeneração, um déficit motor e uma degeneração de fibras aferentes e células granulares do cerebelo. Outro animal exemplificativo inclui a linhagem JNPL3 de camundongos. Esses camundongos têm um transgene tau humano com uma mutação P301L (a mutação está associada à demência frontotemporal) e um promotor de Thy1.2 (Taconic, Germantown, NY, Lewis, et al., Nat Genet. 25: 402-405 (2000)). Esses camundongos têm um curso mais gradual de neurodegeneração. Os camundongos desenvolvem emaranhados neurofibrilares em várias regiões do cérebro e da medula espinal, que são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade). Esse é um excelente modelo para estudar as consequências do desenvolvimento de emaranhados e para a seleção de terapias que possam inibir a geração desses agregados. Outra vantagem desses animais é o início relativamente precoce da patologia. Na linhagem homozigótica, anomalias comportamentais associadas à patologia da tau podem ser observadas no mínimo aos 3 meses, mas os animais permanecem relativamente saudáveis pelo menos até os 8 meses de idade. Em outras palavras, aos 8 meses os animais se movimentam, se alimentam e podem realizar as tarefas comportamentais suficientemente bem para que o efeito do tratamento seja monitorado. A imunização ativa desses camundongos por 6-13 meses com - Al wl KLH-PHF-1 gerou títulos de cerca de 1000 e apresentou menos emaranhados neurofibrilares, menos pSer422 e perda de peso reduzida em relação aos camundongos de controle sem tratamento.
[0272] A atividade de anticorpos pode ser avaliada por vários critérios, incluindo a redução na quantidade total de tau ou de tau fosforilado, a redução de outras características patológicas, tais como depósitos amiloides de AB ea inibição, atraso ou déficits comportamentais. Os anticorpos podem ser testados quanto à passagem de anticorpos pela barreira hematoencefálica para o cérebro de um animal transgênico. Anticorpos ou fragmentos que induzem um anticorpo também podem ser testados em primatas não-humanos que desenvolvem naturalmente ou por indução os sintomas de doenças caracterizadas pelo tau. Os testes em um anticorpo são geralmente realizados juntamente com um controle no qual um experimento paralelo é conduzido, exceto pelo fato de o anticorpo ou agente ativo estarem ausentes (por exemplo, substituídos por um veículo). À redução, o atraso ou a inibição de sinais ou sintomas da doença atribuíveis ao anticorpo ou agente ativo em teste podem ser avaliados em relação ao controle.
IV. — Pacientes Passíveis de Tratamento
[0273] A presença de emaranhados neurofibrilares foi encontrada em várias doenças, incluindo: mal de Alzheimer, síndrome de Down, disfunção cognitiva leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós- encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia glial globular, complexo parkinsonismo-demência de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauopatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP). Os regimes atuais também podem ser usados no tratamento ou na profilaxia de qualquer uma dessas doenças. Devido à ampla associação entre as doenças neurológicas, as condições clínicas e o tau, os presentes regimes podem ser usados no tratamento ou na profilaxia de qualquer indivíduo que apresentar níveis elevados de tau ou de tau fosforilado (por exemplo, no líquido cefalorraquidiano) em comparação com um valor médio em indivíduos sem doenças neurológicas. Os presentes regimes também podem ser utilizados no tratamento ou na profilaxia de doenças neurológicas em indivíduos com uma mutação no tau associado à doença neurológica. Os presentes métodos são particularmente adequados para o tratamento ou para a profilaxia do mal de Alzheimer, e especialmente nos pacientes.
[0274] Os pacientes passíveis de tratamento incluem indivíduos com risco de doença, mas que não apresentam sintomas, bem como pacientes que apresentam sintomas. Os pacientes com risco da doença incluem aqueles com risco genético conhecido da doença. Tais indivíduos incluem os que têm familiares que sofreram desta doença, e aqueles cujo risco é determinada por análise de marcadores genéticos ou bioquímicos. Os marcadores genéticos de risco incluem mutações no tau, como aquelas discutidas acima, bem como mutações em outros genes associados à doença neurológica. Por exemplo, o alelo ApoE4 em heterozigose e ainda mais na forma homozigótica está associado ao risco do mal de Alzheimer. Outros marcadores de risco do mal de Alzheimer incluem mutações no gene APP, particularmente mutações na posição 717 e nas posições 670 e 671, referidas como mutações Hardy e suecas, respectivamente, mutações nos genes de presenilina, PS1 e PS2, um histórico familiar de AD, hipercolesterolemia ou aterosclerose. Indivíduos que atualmente sofrem do mal de Alzheimer podem ser reconhecidos por exames de imagenologia por PET, a partir da demência característica, bem como pela presença dos fatores de risco descritos acima. Além disso, vários testes de diagnóstico estão disponíveis para identificar indivíduos com AD. Eles incluem a medição dos níveis de tau ou fosfo- tau e AB42 no CSF. Um nível elevado de tau ou fosfo-tau e a diminuição dos níveis de AB42 significam a presença de AD. Algumas mutações associadas ao mal de Parkinson. Ala30Pro ou Ala53, ou mutações em outros genes associados ao mal de Parkinson, como a quinase de repetição rica em leucina, PARK8. Os indivíduos também podem ser diagnosticados com qualquer uma das doenças neurológicas supramencionadas pelos critérios do DSM IV TR.
[0275] EM pacientes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, 10, 20, 30). Normalmente, no entanto, não é necessário começar o tratamento até que um paciente atinja 40, 50, 60 ou 70 anos. O tratamento geralmente envolve doses múltiplas ao longo de um período de tempo. O tratamento pode ser monitorado testando-se os níveis de anticorpos ao longo do tempo. Se a resposta cai, uma dose de reforço é indicada. No caso de pacientes com síndrome de Down em potencial, o tratamento pode ser iniciado no período pré-natal pela administração do agente terapêutico à mãe ou logo depois do nascimento.
V. Ácidos Nucleicos
[0276] A invenção fornece ainda ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das cadeias pesadas e leves descritas acima (por exemplo, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NOs: 76-80, SEQ ID NOs: 90-91 e SEQ ID NOs: 83-85). Ácidos nucleicos exemplares incluem SEQ ID NOs: 30-31, 93-99, 100-102 e 105-
106. Opcionalmente, tais ácidos nucleicos codificam ainda um peptídeo sinal e podem ser expressos com o peptídeo sinal ligado à região variável da cadeia pesada ou à região variável da cadeia leve. As sequências de codificação dos ácidos nucleicos podem estar ligadas operacionalmente com sequências reguladoras para assegurar a expressão das sequências de codificação, tais como um promotor, intensificador, sítio de ligação ao ribossoma, sinal de terminação da transcrição e semelhantes. As sequências regulatórias podem incluir um promotor, por exemplo, um promotor procariótico ou um promotor eucariótico. Os ácidos nucleicos que codificam cadeias pesadas ou leves podem ser otimizados por códons para expressão em uma célula hospedeira. Os ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves podem codificar um gene selecionável. Os ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesada e leve podem ocorrer na forma isolada ou podem ser clonados em um ou mais vetores. Os ácidos nucleicos podem ser sintetizados, por exemplo, pela síntese de estado sólido ou por PCR de oligonucleotídeos sobrepostos. Os ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesada e leve podem ser unidos como um ácido nucleico contíguo, por exemplo, dentro de um vector de expressão, ou podem ser separados, por exemplo, cada um clonado no seu próprio vetor de expressão.
VI. Anticorpos Conjugados
[0277]Os anticorpos conjugados que se ligam especificamente a antígenos, tais como tau, são úteis para detectar a presença do tau; acompanhar e avaliar a eficácia de agentes terapêuticos que são usados para tratar pacientes diagnosticados com o mal de Alzheimer, síndrome de Down, transtorno cognitivo leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós-encetfalite, pós- traumático demência ou demência pugilistica, doença de Pick, tipo C Niemann- Pick doença, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença de grão argirofílico, taupatia glial globular, esclerose lateral amiotrófica/complexo de demência de parkinsonismo de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, corpo de Lewy, variantes do mal de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauopatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP); inibir ou reduzir a agregação de tau; inibir ou reduzir a formação de fibrila de tau; reduzir ou eliminar depósitos de tau; estabilizar conformações não-tóxicas de tau; ou tratar ou efetuar a profilaxia do mal de Alzheimer, síndrome de Down, transtorno cognitivo leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós-encefalite, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença de grão argirofílico, taupatia glial globular, complexo de demência por esclerose lateral amiotrófica/parkinsonismo de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, corpos de Lewy, variantes do mal de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauopatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP) em um paciente.
Por exemplo, estes anticorpos podem ser conjugados com outras frações terapêuticas, outras proteínas, outros anticorpos e/ou marcadores detectáveis.
Vide WO 03/057838; US 8.455.622. Estas porções terapêuticas podem incluir qualquer agente que possa ser usado para tratar, combater, melhorar, prevenir ou melhorar uma condição indesejada ou uma doença em um paciente, como mal de Alzheimer, síndrome de Down, disfunção cognitiva leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós- encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia glial globular, complexo parkinsonismo-demência de Guam, degeneração corticobasal
(CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauopatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP).
[0278] As porções terapêuticas conjugadas podem incluir agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes neurotróficos, agentes neuroprotetores, agentes — radioterapêuticos, — imunomoduladores ou quaisquer agentes biologicamente ativos que facilitam ou aumentam a atividade do anticorpo. Um agente citotóxico pode ser qualquer agente que seja tóxico a uma célula. Um agente citostático pode ser qualquer agente que iniba a proliferação celular. Um agente neurotrófico pode ser qualquer agente, incluindo agentes químicos ou proteináceos, que promova a manutenção, o crescimento ou a diferenciação dos neurônios. Um agente neuroprotetor pode ser um agente, incluindo agentes químicos ou proteináceos, que protejam os neurônios de insultos agudos ou processos degenerativos. Um imunomodulador pode ser qualquer agente que estimula ou inibe o desenvolvimento ou a manutenção de uma resposta imunológica. Um agente radioterapêutico pode ser qualquer molécula ou composto que emite radiação. Se tais porções terapêuticas forem acopladas a um anticorpo específico de tau, tal como os anticorpos descritos neste documento, as porções terapêuticas acopladas terão uma afinidade específica com as células afetadas pelo tau relacionado com as células normais. Consequentemente, a administração dos atinge se direciona diretamente às células cancerosas com um dano mínimo ao tecido saudável normal circundante. Isso pode ser particularmente útil para frações terapêuticas que são demasiado tóxicas para serem administradas isoladamente. Além disso, podem-se utilizar quantidades menores das frações terapêuticas.
[0279] Alguns desses anticorpos podem ser modificados para atuar como imunotoxinas. Vide, por exemplo, a Patente US nº. 5.194.594. Por exemplo, a ricina, uma toxina celular derivada de plantas, pode ser acoplada a anticorpos utilizando-se anidrido S-acetilmercaptosuccínico de reagentes bifuncionais e succinimidil-3- (2-piridiltio) propionato para ricina. Vide Pietersz et al., Cancer Res. 48(16):4469-4476 (1998). O acoplamento resulta na perda da atividade de ligação da cadeia B de ricina, ao mesmo tempo em que não prejudica nem o potencial tóxico da cadeia A de ricina nem a atividade do anticorpo. Da mesma forma, a saporina, um inibidor ribossomal estrutural, pode ser acoplado a anticorpos através de uma ligação dissulfureto entre os grupos sulfidril inseridos quimicamente. Vide Polito et al., Leukemia 18:1215-1222 (2004).
[0280] Alguns desses anticorpos podem ser ligados a radioisótopos. Os exemplos de radioisótopos incluem, por exemplo, ítrioºº (90Y), índio! (1111n), 9, *ºmTec, radioisótopos de prata radiosilver-111, radioisótopos de prata radiosilver- 199 e bismuto?'?. A ligação dos radioisótopos aos anticorpos pode ser realizada com quelatos bifuncionais convencionais. Para a ligação de radiosilver-111 (radioisótopo de prata) e de radiosilver-199 (radioisótopo de prata), podem ser usados ligantes à base de enxofre. Vide Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994). A ligação de radioisótopos de prata pode envolver a redução da imunoglobulina com ácido ascórbico. Para radioisótopos, tais como 111In e 90Y, ibibritumomab tiuxetano pode ser usado e reagirá com esses isótopos para formar 111In-ibritumomab tiuxetano e 90Y-ibritumomab tiuxetano, respectivamente. Ver Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:891-S95 (2001).
[0281] Alguns desses anticorpos podem ser ligados a outras porções terapêuticas. Essas porções terapêuticas podem ser, por exemplo, citotóxicas, citostáticas, neurotróficas ou neuroprotetoras. Por exemplo, os anticorpos podem ser conjugados com drogas de quimioterapia tóxicas, tais como maitansina, geldanamicina, inibidores de tubulina, tais como agentes de ligação à tubulina (por exemplo, auristatinas) ou agentes de ligação de sulco menor, tais como caliqueamicina. Outras porções terapêuticas representativas incluem agentes conhecidos pela sua utilidade no tratamento, na administração ou na melhora do mal de Alzheimer, síndrome de Down, disfunção cognitiva leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós-encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia glial globular, complexo parkinsonismo- demência de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauoupatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP).
[0282] Os anticorpos também podem ser acoplados com outras proteínas. Por exemplo, os anticorpos podem ser acoplados com Fynomers. Fynomers são pequenas proteínas de ligação (por exemplo, 7 kDa) derivadas do domínio SH3 Fyn humano. Elas podem ser estáveis e solúveis e podem não ter resíduos de cisteína e ligações dissulfureto. Os Fynomers podem ser manipulados para se ligarem a moléculas alvo com a mesma afinidade e especificidade de anticorpos. Eles são apropriados para a criação de proteínas de fusão multiespecíficas com base em anticorpos. Por exemplo, os Fynomers pode ser fundidos com as extremidades N-terminal e/ou C-terminal dos anticorpos para criar FynomAbs bi e triespecíficos com arquiteturas diferentes. Os Fynomers podem ser selecionados utilizando-se bibliotecas de Fynomers através de tecnologias de triagem que usam FACS, Biacore e ensaios baseados em células que permitem a seleção eficiente dos Fynomers com propriedades ideais. Exemplos de Fynomers são revelados em Grabulovski et al, J. Biol. Chem. 282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein Eng. Des. Sel. 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs. 4:497-508 (2011); Banner et al. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69(Pt6): 1124-1137 (2013); e Brack et al., Mol. Cancer Ther. 13: 2030-2039 (2014).
[0283] Os anticorpos aqui divulgados podem também ser acoplados ou conjugado com um ou mais outros anticorpos (por exemplo, Para formar anticorpos heteroconjugados). Esses outros anticorpos podem se ligar a epítopos diferentes no tau ou podem ligar-se a um antígeno alvo diferente.
[0284] Os anticorpos também podem ser acoplados com um marcador detectável. Tais anticorpos podem ser usados, por exemplo, para diagnosticas o mal de Alzheimer, síndrome de Down, disfunção cognitiva leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós-encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia glial globular, complexo parkinsonismo- demência de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauoupatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP) e/ou para avaliar a eficácia do tratamento. Esses anticorpos são particularmente úteis para realizar essas determinações em indivíduos com ou sendo suscetíveis ao mal de Alzheimer, síndrome de Down, deficiência cognitiva suave, tauopatia primária relacionada com a idade, parkinsonismo pós-encefálico, demência p-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença granulosa argirofílica, tauopatia glial globular, esclerose lateral amiotrófica/complexo demencial parkinsonismo de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy do mal de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauoupatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP) ou em amostras biológicas apropriadas obtidas desses indivíduos. Os marcadores detectáveis representativas que podem ser acopladas ou ligadas a um anticorpo incluem várias enzimas, tais como a peroxidase = de rábano, fosfatase alcalihaa beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos prostético, tal como nbiotina/estreptavidina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, como umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloreto de dansyl ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tais como o luminol; materiais bioluminescentes, como luciferase, luciferina e aequorina; materiais radioativos, tais como radioisótopo de prata-111, radioisótopo de prata-199, bismuto?'3, iodo (181, 1251, 1231, 1211,), carbono (ºC), enxofre (5S), trítio (9H), índio (SIn, ln, 12lh, 1lh,), tecnécio (To), tálio (2 Ti), gálio (Ga, Ga), paládio (Pd), molibdênio (Mo), xenônio (**Xe), flúor (*SF), *SSm, Lu, **ºGd, **ºPm, 1ºLa, 175Yb, *6Ho, 2OY, Sc, 186Re, 188ReE, 142Pr, 105Rh, Ru, Ge, 57COo, S7n, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, S'Cr, Mn, 75Se, **Sn, e "estanho; metais que emitem pósitron, utilizando-se várias tomografias de emissão de pósitron; íons de metal para-magnético não- radiotivos; e moléculas que são radiomarcadas ou conjugadas a radioisótopos específicos.
[0285] A ligação dos radioisótopos aos anticorpos pode ser realizada com quelatos bifuncionais convencionais. Para a ligação de radiosilver-111 (radioisótopo de prata) e de radiosilver-199 (radioisótopo de prata), podem ser usados ligantes à base de enxofre. Ver Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994). A ligação de radioisótopos de prata pode envolver a redução da imunoglobulina com ácido ascórbico. Para radioisótopos, tais como 111In e 90Y, ibibritumomab tiuxetano pode ser usado e reagirá com esses isótopos para formar 111In-ibritumomab tiuxetano e 90Y-ibritumomab tiuxetano, respectivamente. Ver Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:891-S95 (2001).
[0286] Substâncias terapêuticas, outras proteínas, outros anticorpos e/ou etiquetas detectáveis podem ser acopladas ou conjugadas, direta ou indiretamente através de um intermediário (por exemplo, um ligante), a um anticorpo da invenção. Ver por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," In: Controlled Drug Delivery (2º Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et a/. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985); and Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982). Os ligantes adequados incluem, por exemplo, ligantes cliváveis e não-cliváveis. Diferentes ligantes que liberam porções terapêuticas acopladas, proteínas, anticorpos e/ou marcadores detectáveis em condições ácidas ou de redução, quando exposto às proteases específicas ou sob outras condições definidas, podem ser empregados.
VI... Composições Farmacêuticas e Métodos de Uso
[0287] Em aplicações profiláticas, um anticorpo ou uma composição farmacêutica que o inclui é administrado a um paciente suscetível ou em risco de uma doença (por exemplo, mal de Alzheimer) em um regime (dose, frequência e via de administração) eficaz para reduzir o risco, diminuir a gravidade ou atrasar o aparecimento de pelo menos um sinal ou sintoma da doença. Em particular, o regime é eficaz, preferencialmente, para inibir ou retardar filamentos de tau ou fosfo-tau e pares formados a partir deles no cérebro e/ou inibir ou retardar os seus efeitos tóxicos e/ou inibir/retardar o desenvolvimento de déficits comportamentais. Em aplicações terapêuticas, um anticorpo é administrado a um paciente com suspeita ou que já sofre de uma doença (por exemplo, mal de Alzheimer) em um regime (dose, frequência e via de administração) eficaz para melhorar ou pelo menos inibir a deterioração adicional de pelo menos um sinal ou sintoma da doença. Em particular, o regime é eficaz, de preferência, para reduzir ou pelo menos inibir o aumento adicional dos níveis de tau, fósforo-tau ou filamentos emparelhados formados a partir dele, das toxicidades associadas e/ou dos déficits comportamentais.
[0288] Um regime é considerado terapeuticamente ou profilaticamente eficaz se um paciente tratado individual alcançar um resultado mais favorável do que o resultado médio de uma população de pacientes comparáveis de controle não tratada pelos métodos da invenção, ou se um resultado mais favorável é demonstrado em doentes tratados versus pacientes de controlo em um ensaio clínico controlado (por exemplo, uma fase Il, fase II/Ill ou ensaio de fase Ill) no p <0,05 ou 0,01 ou até no mesmo nível de 0,001.
[0289] As doses eficazes variam de acordo com muitos fatores diferentes, como os meios de administração, o local alvo, o estado fisiológico do paciente, se o paciente é um portador de ApoE, se o paciente é um ser humano ou um animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico.
[0290] Os intervalos de dosagem exemplificativos para os anticorpos são de cerca de 0,01 a 60 mg/kg, de cerca de 0,1 a 3 mg/kg, 0,15-2 mg/kg ou 0,15-1,5 mg/kg do peso corporal do paciente. O anticorpo pode ser administrado nessas doses diariamente, em dias alternados, semanalmente, quinzenalmente, mensalmente, trimestralmente ou de acordo com qualquer outro agendamento determinado por análise empírica. Um tratamento exemplar envolve a administração em doses múltiplas ao longo de um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Exemplos adicionais de regimes de tratamento implicam a administração uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês ou uma vez a cada 3 até 6 meses.
[0291] Os anticorpos ou agentes para induzir anticorpos são administrados preferencialmente através de uma via periférica (isto é, uma em que um anticorpo administrado ou induzido atravesse a barreira hematoencefálica para alcançar um local desejado do cérebro. As vias de administração incluem via tópica, intravenosa, orali subcutânea, intra-arterial, intracraniana, — intratecal, intraperitoneal, intranasal, intraocular ou intramuscular. Algumas vias preferidas para administração dos anticorpos são a via intravenosa e a subcutânea. As vias preferidas para imunização ativa são as vias subcutânea e intramuscular. Esse tipo de injeção é feito com mais frequência nos músculos do braço ou da perna. Em alguns métodos, os agentes são injetados diretamente em um tecido em particular onde se acumularam os depósitos, por exemplo, por injeção intracraniana.
[0292] As composições farmacêuticas para administração parentérica são, de preferência, estéreis e substancialmente isotônicas e fabricadas sob condições de GMP. As composições farmacêuticas podem ser fornecidas na forma de dosagem unitária (isto é, a dosem para uma administração única). As composições farmacêuticas podem ser formuladas utilizando-se um ou mais carreadores fisiologicamente aceitáveis, diluentes, excipientes ou auxiliares. À formulação depende da via de administração escolhida. Para injeção, os anticorpos podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer ou solução salina fisiológica ou tampão de acetato (para reduzir o desconforto no local da injeção). A solução pode conter agentes de formulação, como suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Em alternativa, os anticorpos podem ser em forma liofilizada para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água sem pirogênio estéril, antes do uso.
[0293] Os regimes atuais podem ser administrados em combinação com outro agente eficaz para o tratamento ou a profilaxia da doença a ser tratada. Por exemplo, no caso do mal de Alzheimer, os regimes atuais podem ser combinados com imunoterapia contra AB (WO/2000/072880), inibidores da colinesterase ou memantina ou, no caso da imunoterapia contra o mal de Parkinson, contra alfa- sinucleina WO/2008/103472, Levodopa, agonistas de dopamina, inibidores da COMT, inibidores da MAO-B, amantadina ou agentes anticolinérgicos.
[0294] Os anticorpos são administrados num regime eficaz, o que significa que uma dosagem, via de administração e frequência de administração que atrasa o início, reduz a gravidade, inibe a continuação da degradação e/ou melhora, pelo menos, um sinal ou sintoma de um distúrbio a ser tratado. Se um paciente já sofre de uma doença, o regime pode ser referido como um regime terapeuticamente eficaz. Se o paciente está em risco elevado da doença em relação à população em geral, mas ainda não sente os sintomas, o regime pode ser referido como um regime profilaticamente eficaz. Em alguns casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser observada em um paciente individual em relação aos controles históricos ou a experiências anteriores no mesmo paciente. Em outros casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser demonstrada em um ensaio pré-clínico ou clínico em uma população de pacientes tratados em relação a uma população de pacientes não-tratados de controle.
[0295] As dosagens exemplificativas de um anticorpo são 0,1-60 mg/kg (por exemplo, 0,5, 3, 10, 30 ou 60 mg/kg) ou 0,5-5 mg/kg de peso corporal (por exemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4 ou 5 mg/kg) ou 10-4000 mg ou 10-1500 mg na forma de dose fixa. A dosagem depende da condição do paciente e da resposta ao tratamento prévio, se houver, se o tratamento é profilático ou terapêutico e se a doença é aguda ou crônica, entre outros fatores.
[0296] A administração pode ser parentérica, intravenosa, oral, subcutânea, intra-arterial, intracraniana, intratecal, intraperitoneal, tópica, intranasal ou intramuscular. Alguns anticorpos podem ser administrados na circulação sistêmica por administração intravenosa ou subcutânea. A administração intravenosa pode ser, por exemplo, por infusão ao longo de um período tal como 30-90 min.
[0297] A frequência de administração depende da meia-vida do anticorpo na circulação, a condição do paciente e da via de administração, entre outros fatores. A frequência pode ser diária, semanal, mensal, trimestral ou em intervalos irregulares em resposta a mudanças na condição ou a progressão do distúrbio do paciente sendo tratado. Uma frequência exemplificativa para a administração intravenosa é entre semanal e trimestral por uma causa contínua de tratamento, embora uma dosagem mais ou menos frequente também seja possível. Para administração subcutânea, uma frequência de dosagem exemplificativa é diária a mensal, embora uma dosagem mais ou menos frequente também seja possível.
[0298] O número de doses administradas depende do fato de o distúrbio ser agudo ou crônico e da resposta do distúrbio ao tratamento. Para distúrbios agudos ou exacerbações agudas de um distúrbio crônico, entre 1 e 10 doses muitas vezes basta. Por vezes, uma única dose bolus, opcionalmente dividida, é suficiente para uma doença aguda ou exacerbação aguda de uma doença crônica. O tratamento pode ser repetido para a recorrência de um distúrbio agudo ou uma exacerbação aguda. Para doenças crônicas, um anticorpo pode ser administrado em intervalos regulares, por exemplo, semanal, quinzenal, mensal, trimestral, de seis em seis meses durante pelo menos 1, 5 ou 10 anos, ou a vida do paciente.
A. Diagnóstico e Métodos de Monitoramento Imagenologia in vivo, métodos de diagnóstico e imunoterapia de otimização
[0299] A invenção fornece métodos de imagenologia in vivo de depósitos da proteína tau (por exemplo, emaranhados neurofibrilares e inclusões da tau) em um paciente. Os métodos funcionam administrando um anticorpo humanizado da invenção ao paciente e, em seguida, detectando o anticorpo após sua ligação. Uma resposta de limpeza aos anticorpos administrados pode ser evitada ou reduzida usando os fragmentos de anticorpos sem uma região constante de comprimento total, como Fabs. Em alguns métodos, o mesmo anticorpo pode servir como um tratamento e um reagente de diagnóstico.
[0300] Os reagentes de diagnóstico podem ser administrados por injeção intravenosa no corpo do paciente ou diretamente no cérebro por injeção intracraniana ou perfurando-se um buraco no crânio. A dosagem do reagente deve estar dentro dos mesmos intervalos que para os métodos de tratamento. Em geral, o reagente é rotulado, embora em alguns métodos, o reagente primário com afinidade com tau não é marcado e é utilizado um agente de marcação secundário para se ligar ao reagente primário. A escolha do marcador depende dos meios de detecção. Por exemplo, um marcador fluorescente é adequado para a detecção ótica. O uso de marcadores paramagnéticos é adequado para detecção tomográfica sem intervenção cirúrgica. Os marcadores radioativos também podem ser detectados usando tomografia por emissão de pósitrons (PET)
ou tomografia computadorizada de emissão de fótons simples (SPECT).
[0301] Os métodos de imagenologia in vivo de depósitos de proteína tau são úteis para diagnosticar ou confirmar o diagnóstico de tauopatia, como mal de Alzheimer, degeneração lobar frontotemporal, paralisia supranuclear progressiva e doença de Pick, ou a suscetibilidade a essas doenças. Por exemplo, os métodos podem ser usados em um paciente que apresenta sintomas de demência. Se o paciente tiver emaranhados neurofibrilares anormais, então o paciente provavelmente está sofrendo do mal de Alzheimer. Em alternativa, se o paciente tiver inclusões de tau anormais, dependendo da localização das inclusões, o paciente pode estar sofrendo de degeneração lobar frontotemporal. Os métodos também podem ser usados em pacientes assintomáticos. A presença de depósitos anormais de proteína tau indica a suscetibilidade a futuras doenças sintomáticas. Os métodos também são úteis para monitorar a progressão da doença e/ou resposta ao tratamento em doentes que tenham sido diagnosticados anteriormente com uma doença relacionada à tau.
[0302] O diagnóstico pode ser realizado comparando o número, o tamanho e/ou a intensidade dos loci marcados com os valores correspondentes da linha de base. Os valores da linha de base podem representar os níveis médios em uma população de indivíduos sem doença. Os valores da linha base também podem representar os níveis anteriores determinados no mesmo paciente. Por exemplo, os valores de referência podem ser determinados em um paciente antes de se iniciar o tratamento de imunoterapia com tau, e os valores medidos depois disso em comparação com os valores da linha de base. Uma diminuição nos valores em relação à linha de base sinaliza uma resposta positiva ao tratamento.
[0303] Em alguns pacientes, o diagnóstico de tauopatia pode ser auxiliado pela realização de uma tomografia computadorizada (PET). Uma tomografia PET pode ser realizada usando, por exemplo, um varredor PET convencional e um equipamento auxiliar. O exame inclui, geralmente, uma ou mais regiões do cérebro em geral conhecidas como associadas a depósitos de proteína tau e uma ou mais regiões nas quais poucos depósitos, se houver, geralmente estão presentes para servir como controles.
[0304] O sinal detectado em uma tomografia PET pode ser representado como uma imagem multidimensional. A imagem multidimensional pode estar em duas dimensões representando uma seção transversal através do cérebro, em três dimensões, representando o cérebro tridimensional, ou em quatro dimensões, representando mudanças no cérebro tridimensional ao longo do tempo. Uma escala de cores pode ser usada com cores diferentes indicando quantidades diferentes de marcadores e, inferencialmente, o depósito de proteína tau detectado. Os resultados da varredura também podem ser apresentados numericamente, com números relativos à quantidade de marcadores detectados e consequentemente à quantidade de depósitos de proteína tau. O marcador presente em uma região do cérebro que se sabe estar associada aos depósitos de uma taupatia específica (por exemplo, mal de Alzheimer) pode ser comparada com o marcador presente em uma região conhecida que se sabe não estar associada aos depósitos para fornecer uma proporção indicativa da extensão dos depósitos na região anterior. Para o mesmo ligante radiomarcado, essas proporções fornecem uma medida comparável de depósitos de proteína tau e suas alterações entre diferentes pacientes.
[0305]Em alguns métodos, uma tomografia por emissão de pósitrons (PET) é realizada simultaneamente ou na mesma consulta do paciente que uma ressonância magnética (MRI) ou uma tomografia computadorizada (CAT). Uma ressonância magnética (MRI) ou uma tomografia computadorizada (CAT) fornece mais detalhes anatômicos do cérebro do que uma tomografia PET. No entanto, a imagem de uma tomografia PET pode ser sobreposta em uma imagem de ressonância magnética (MRI) ou tomografia computadorizada (CAT), mais precisamente indicando a localização do ligante da PET e inferencialmente depósitos de tau em relação às estruturas anatômicas no cérebro. Algumas máquinas podem realizar a tomografia PET e a ressonância magnética (MRI) ou a tomografia computadorizada (CAT) sem que o paciente mude de posição entre as varreduras, facilitando a sobreposição de imagens.
[0306] Os ligantes de PET adequados incluem os anticorpos radiomarcados da invenção (por exemplo, um anticorpo 3D6 de camundongo, humanizado, quimérico ou "veneered"). O radioisótopo usado pode ser, por exemplo, C*1, Nº3, 075, F18 ou 1123. O intervalo entre a administração do ligante de
PET e a realização da varredura pode depender do ligante de PET e, particularmente, de sua taxa de captação e compensação no cérebro e da meia- vida do seu marcador radioativo.
[0307] A tomografia computadorizada (PET) também pode ser realizada como medida profilática em pacientes assintomáticos ou em pacientes com sintomas de comprometimento cognitivo leve, mas que ainda não foram diagnosticados com tauopatia, mas apresentam risco elevado de desenvolver uma tauopatia. Para pacientes assintomáticos, os exames são particularmente úteis para indivíduos considerados com alto risco de tauopatia devido ao histórico familiar, fatores de risco genéticos ou bioquímicos ou idade madura. Os exames profiláticos podem começar, por exemplo, em pacientes com idade entre 45 e 75 anos. Em alguns pacientes, uma primeira varredura é realizada aos 50 anos de idade.
[0308] Os exames profiláticos podem ser realizados em intervalos de, por exemplo, entre seis meses e dez anos, preferencialmente entre 1-5 anos. Em alguns pacientes, os exames profiláticos são realizados anualmente. Se uma tomografia por emissão de pósitrons (PET) realizada como uma medida profilática indicar níveis atipicamente altos de depósitos de proteína tau, a imunoterapia pode ser iniciada e as varreduras de PET subsequentes realizadas como em pacientes diagnosticados com tauopatia. Se um exame de PET realizado como medida profilática indicar níveis de depósitos de proteína tau dentro dos níveis normais, os exames de PET adicionais podem ser realizados em intervalos de seis meses a 10 anos e, preferencialmente, de 1 a 5 anos, como antes, ou em resposta ao aparecimento de sinais e sintomas de uma tauopatia ou comprometimento cognitivo leve. Ao combinar varreduras profiláticas com a administração de imunoterapia direcionada à tau se e quando um nível acima da normalidade de depósitos de proteína tau for detectado, os níveis de depósitos de proteína tau podem ser reduzidos para, ou mais próximos a níveis normais, ou pelo menos impedidos de aumentar ainda mais, e o paciente pode permanecer livre da tauopatia por um período maior do que se não estivesse recebendo exames profiláticos e imunoterapia direcionada à tau (por exemplo, pelo menos 5, 10, 15 ou 20 anos ou pelo resto da vida do paciente).
[0309] Os níveis normais de depósitos de proteína tau podem ser determinados pela quantidade de emaranhados neurofibrilares ou inclusões de tau nos cérebros de uma amostra representativa de indivíduos na população geral que não foram diagnosticados com uma tauopatia específica (por exemplo, mal de Alzheimer) e não são considerados com risco elevado de desenvolver essa doença (por exemplo, uma amostra representativa de indivíduos sem a doença com menos de 50 anos de idade). Em alternativa, um nível normal pode ser reconhecido em um paciente individual se o sinal de PET de acordo com os métodos presentes em uma região do cérebro em que se sabe que os depósitos de proteína tau não são diferentes (dentro da precisão da medição) do sinal de uma região do cérebro em que se sabe que esses depósitos normalmente não se desenvolvem. Um nível elevado em um indivíduo pode ser reconhecido por comparação com os níveis normais (por exemplo, média externa e variância de um desvio padrão) ou simplesmente de um sinal elevado além do erro experimental em uma região do cérebro associada a depósitos de proteína tau região em comparação com uma região que não se sabe estar associada aos depósitos. Para fins de comparação dos níveis de depósitos de proteína tau em um indivíduo e em uma população, os depósitos de proteina tau devem preferencialmente ser determinados na(s) mesma(s) região(ões) do cérebro, incluindo essas regiões pelo menos uma região na qual se sabem formar os depósitos de proteína tau associados à tauopatia específica (por exemplo, mal de Alzheimer). Um paciente com um nível elevado de depósitos de proteína tau é um candidato para iniciar a imunoterapia.
[0310] Após o início da imunoterapia, uma diminuição no nível de depósitos de proteína tau pode ser vista primeiramente como uma indicação de que o tratamento está tendo o efeito desejado. A diminuição observada pode ser, por exemplo, no intervalo de 1-100%, 1-50% ou 1-25% do valor da linha de base. Tais efeitos podem ser medidos em uma ou mais regiões do cérebro em que se sabe que os depósitos se formam ou podem ser medidos a partir de uma média dessas regiões. Pode-se aproximar do efeito total do tratamento pela adição da redução percentual em relação à linha de base ao aumento dos depósitos de proteína tau que, caso contrário, ocorreria em um paciente médio não tratado.
[0311]A manutenção de depósitos de proteina tau em um nível aproximadamente constante ou mesmo um pequeno aumento nos depósitos de proteína tau também pode ser uma indicação de resposta ao tratamento, embora seja uma resposta sub-ótima. Tais respostas podem ser comparadas com um curso de tempo de níveis de depósitos de proteína tau em pacientes com uma tauopatia específica (por exemplo, mal de Alzheimer) que não receberam tratamento, a fim de determinar se a imunoterapia está tendo um efeito na inibição de novos aumentos dos depósitos de proteína tau.
[0312]O monitoramento das mudanças nos depósitos de proteína tau permite o ajuste da imunoterapia ou de outro regime de tratamento em resposta ao tratamento. O monitoramento por PET fornece uma indicação da natureza e extensão da resposta ao tratamento. Em seguida, pode-se determinar se se deve ajustar o tratamento e se o tratamento desejado pode ser ajustado em resposta ao monitoramento por PET. O monitoramento por PET permite, assim, que a imunoterapia direcionada à tau ou outro regime de tratamento sejam ajustados antes de outros biomarcadores, a ressonância magnética ou as medidas cognitivas terem respondido de forma detectável. Uma mudança significativa significa que a comparação do valor de um parâmetro após o tratamento em relação à base fornece alguma evidência de que o tratamento resultou ou não em um efeito benéfico. Em alguns casos, uma mudança de valores de um parâmetro em um paciente em si fornece evidências de que o tratamento resultou ou não em um efeito benéfico. Em outros casos, a mudança de valores, se houver, em um paciente, é comparada com a mudança de valores, se houver, em uma população de controle representativa de pacientes que não foram submetidos à imunoterapia. Uma diferença na resposta de um paciente em particular da resposta normal no paciente de controle (por exemplo, média mais variância de um desvio padrão) também pode fornecer evidências de que um regime de imunoterapia está ou não alcançando um efeito benéfico em um paciente.
[0313] Em alguns pacientes, o monitoramento indica um declínio detectável nos depósitos de proteína tau, mas que o nível de depósitos de proteína tau permanece acima do normal. Nestes pacientes, se não houver efeitos colaterais inaceitáveis, o regime de tratamento pode ser continuado como está ou mesmo aumentado na frequência de administração e/ou dose, se ainda não estiver na dose máxima recomendada.
[0314] Se o monitoramento indicar que os níveis de depósitos de proteínas tau em um paciente já foram reduzidos a níveis normais ou quase normais de depósitos de proteína tau, o regime de imunoterapia pode ser ajustado a partir de um de indução (isto é, que reduz o nível de proteína tau depósitos) a um de manutenção (isto é, que mantém depósitos de proteína tau em um nível aproximadamente constante). Este regime pode ser afetado pela redução da dose e/ou frequência da administração da imunoterapia.
[0315]EmM outros pacientes, o monitoramento pode indicar que a imunoterapia está tendo algum efeito benéfico, mas um efeito sub-ótimo. Um efeito ótimo pode ser definido como uma redução percentual no nível de depósitos de proteína tau na metade superior ou quartil da alteração nos depósitos de proteína tau (medida ou calculada em todo o cérebro ou região representativa dele em que se sabe que se formam os depósitos de proteína tau) experimentada por uma amostra representativa de pacientes com tauopatia submetida a imunoterapia em um determinado momento após o início da terapia. Um paciente com um declínio menor ou um paciente cujos depósitos de proteína tau permaneçam constantes ou até aumentem, mas em menor grau do que o esperado na ausência de imunoterapia (por exemplo, inferido de um grupo controle de pacientes que não receberam imunoterapia) pode ser classificado como experimentando uma resposta positiva, porém sub-ótima. Esses pacientes podem opcionalmente submeter-se a um ajuste do regime no qual a dose e/ou a frequência da administração de um agente aumentam.
[0316] Em alguns pacientes, os depósitos de proteina tau podem aumentar de maneira semelhante ou superior aos depósitos de tau em pacientes que não estão recebendo imunoterapia. Se tais aumentos persistirem ao longo de um período de tempo, tal como 18 meses ou 2 anos, mesmo após qualquer aumento na frequência ou dose de agentes, a imunoterapia pode, se desejado, ser descontinuada em favor de outros tratamentos.
[0317] A descrição anterior de diagnosticar, monitorar e ajustar o tratamento para tauopatias tem sido amplamente focada no uso de PET. No entanto, qualquer outra técnica para visualizar e/ou medir depósitos de proteína tau que seja suscetível ao uso de anticorpos tau da invenção (por exemplo, um anticorpo 3D6 de camundongo, humanizado, quimérico ou "veneered") pode ser usada no lugar de PET para executar esses métodos.
[0318] Também são fornecidos métodos de detecção de uma resposta imunológica contra a tau em um paciente que sofre ou é suscetível a doenças associadas à tau. Os métodos podem ser utilizados para monitorar um curso de tratamento terapêutico e profilático com os agentes fornecidos neste documento. O perfil de anticorpos após imunização passiva mostra tipicamente um pico imediato na concentração de anticorpos seguido por uma decomposição exponencial. Sem uma dose adicional, a decadência se aproxima dos níveis de pré-tratamento dentro de um período de dias a meses, dependendo da meia-vida do anticorpo administrado. Por exemplo, a meia-vida de alguns anticorpos humanos é da ordem de 20 dias.
[0319] Em alguns métodos, uma medida de linha de base do anticorpo para a tau no indivíduo é feita antes da administração, uma segunda medida é feita logo depois para determinar o nível máximo de anticorpos e uma ou mais medições adicionais são feitas em intervalos para monitorar a deterioração dos níveis de anticorpos. Quando o nível de anticorpo diminuiu para a linha de base ou uma porcentagem predeterminada do pico menos linha de base (por exemplo, 50%, 25% ou 10%), administra-se a administração de uma outra dose de anticorpo. Em alguns métodos, os níveis de pico ou subsequentes medidos, menos fundo são comparados com níveis de referência previamente determinados para constituir um regime de tratamento profilático ou terapêutico benéfico em outros sujeitos. Se o nível de anticorpos medido for significativamente menor do que um nível de referência (por exemplo, inferior à média menos uma ou, de preferência, dois desvios-padrão do valor de referência em uma população de sujeitos que se beneficiam do tratamento) é indicada a administração de uma dose adicional de anticorpo.
[0320] Também são proporcionados métodos de detecção de tau em um indivíduo, por exemplo, medindo-se a tau em uma amostra de um indivíduo ou por imagenologia in vivo de tau em um indivíduo. Tais métodos são úteis para diagnosticar ou confirmar o diagnóstico de doenças associadas à tau ou a suscetibilidade a elas. Os métodos também podem ser usados em sujeitos assintomáticos. A presença de tau indica a suscetibilidade a futuras doenças sintomáticas. Os métodos também são úteis para monitorar a progressão da doença e/ou a resposta ao tratamento em indivíduos que foram diagnosticado previamente com mal de Alzheimer, síndrome de Down, disfunção cognitiva leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós-encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia glial globular, complexo parkinsonismo-demência de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy do mal de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauoupatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP).
[0321] As amostras biológicas obtidas de um indivíduo com suspeita de ter ou em risco de ter mal de Alzheimer, síndrome de Down, comprometimento cognitivo leve, tauopatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós- encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença granulosa argirofílica, tauopatia glial globular, esclerose lateral amiotrófica/complexo demencial de parkinsonismo de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variantes do corpo de Lewy do mal de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauoupatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP) podem ser postas em contato com os anticorpos divulgados neste documento para avaliar a presença da tau. Por exemplo, os níveis de tau nesses indivíduos podem ser comparados com os presentes em indivíduos saudáveis. Em alternativa, os níveis da tau nesses indivíduos que recebem tratamento para a doença podem ser comparado aos dos indivíduos que não foram tratados para o mal de Alzheimer, síndrome de Down, disfunção cognitiva leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós- encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick,
doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia glial globular, complexo parkinsonismo-demência de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy do mal de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauoupatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP). Alguns desses testes envolvem uma biópsia de tecido obtida a partir desses sujeitos. Os ensaios de ELISA também podem ser métodos úteis, por exemplo, para avaliar a tau em amostras de fluido.
VI... Kits
[0322] A invenção proporciona ainda kits (por exemplo, recipientes) compreendendo um anticorpo aqui descrito e materiais relacionados, tais como instruções de utilização (por exemplo, inserção da embalagem). As instruções para uso podem conter, por exemplo, instruções para administração dos anticorpos e, opcionalmente, um ou mais agentes adicionais. Os recipientes do anticorpo podem ser doses unitárias, embalagens em lote (por exemplo, embalagens multidose) ou doses de subunidade.
[0323] Bula se refere às instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou avisos quanto ao uso de tais produtos terapêuticos
[0324] Os kits também podem incluir um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), soro fisiológico tamponado com fosfato, solução de dextrose e solução de Ringer. Eles podem incluir também outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
VII. Outras aplicações
[0325] Os anticorpos podem ser utilizados para detectar a tau, ou seus fragmentos, no contexto do diagnóstico clínico, do tratamento ou da pesquisa. Por exemplo, os anticorpos podem ser utilizados para detectar a presença da tau em uma amostra biológica como uma indicação de que a amostra biológica compreende depósitos da tau. A ligação dos anticorpos à amostra biológica pode ser comparada à ligação dos anticorpos a uma amostra de controle. A amostra de controle e a amostra biológica podem compreender células da mesma origem do tecido. Amostras de controle e amostras biológicas podem ser obtidas a partir do mesmo indivíduo ou indivíduos diferentes e na mesma ocasião ou em ocasiões diferentes. Caso desejado, múltiplas amostras biológicas e múltiplas amostras de controle são avaliadas em várias ocasiões para proteger contra variações aleatórias, independentemente das diferenças entre as amostras. Uma comparação direta pode então ser feita entre a(s) amostra(s) biológica(s) e a(s) amostra(s) de controle para determinar se a ligação do anticorpo (isto é, a presença da tau) para a(s) amostra(s) biológica é aumentada, diminuída ou a mesma relativa à ligação do anticorpo à(s) amostra(s) de controle. A maior ligação do anticorpo à(s) amostra(s) biológica(s) relativamente à(s) amostra(s) de controle indica a presença de tau na(s) amostra(s) biológica(s). Em alguns casos, o aumento da ligação do anticorpo é estatisticamente significativo. Opcionalmente, a ligação do anticorpo à amostra biológica é pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes ou 100 vezes superior à ligação do anticorpo à amostra de controle.
[0326] Além disso, os anticorpos podem ser usados para detectar a presença da tau em uma amostra biológica para monitorar e avaliar a eficácia de um agente terapêutico a ser usado para tratar um paciente diagnosticado com mal de Alzheimer, síndrome de Down, comprometimento cognitivo leve, taupatia relacionada à idade primária, parkinsonismo pós-encefalítico, demência pós- traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença granulosa argirofílica, tauopatia glial globular, esclerose lateral amiotrófica/complexo de demência parkinsonista de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy do mal de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauopatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP). Uma amostra biológica de um paciente diagnosticado com mal de Alzheimer, síndrome de Down, comprometimento cognitivo leve, tauopatia primária relacionada à idade,
parkinsonismo pós-encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença granulosa argirofílica, tauopatia glial globular, esclerose lateral amiotrófica/complexo demencial parkinsoniano de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy do mal de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauopatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP) é avaliada para estabelecer uma linha de base para a ligação dos anticorpos à amostra (isto é, uma linha de base para a presença da tau na amostra) antes de iniciar a terapia com o agente terapêutico.
Em alguns casos, várias amostras biológicas do paciente são avaliadas em múltiplas ocasiões para estabelecer uma linha de base e uma medida de variação aleatória independente do tratamento.
Um agente terapêutico é então administrado em regime.
O regime pode incluir várias administrações do agente durante um período de tempo.
Opcionalmente, a ligação dos anticorpos (isto é, a presença da tau) é avaliada em múltiplas ocasiões em múltiplas amostras biológicas do paciente, tanto para estabelecer uma medida de variação aleatória quanto para mostrar uma tendência em resposta à imunoterapia.
As várias avaliações da ligação do anticorpo às amostras biológicas são então comparadas.
Se apenas forem feitas duas avaliações, pode-se fazer uma comparação disto éa entre as duas avaliações para determinar se a ligação do anticorpo (isto é, a presença da tau) aumentou, diminuiu ou permaneceu igual entre as duas avaliações.
Se mais de duas medidas forem feitas, as medidas podem ser analisadas como um curso de tempo que começa antes do tratamento com o agente terapêutico e após o curso da terapia.
Em pacientes nos quais a ligação de anticorpos às amostras biológicas diminuiu (isto é, a presença da tau), pode-se concluir que o agente terapêutico foi eficaz no tratamento da doença de Alzheimer, síndrome de Down, comprometimento cognitivo leve, tauopatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós-encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick do tipo C, paralisia — supranuclear, — demência — frontotemporal, — degeneração — lobar frontotemporal, doença granulosa argirofílica, tauopatia glial globular, esclerose lateral amiotrófica/complexo de demência parkinsonista de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauopatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP) no paciente. À diminuição na ligação do anticorpo pode ser estatisticamente significativa. Opcionalmente, a ligação diminui em pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%. A avaliação da ligação do anticorpo pode ser feita juntamente com a avaliação de outros sinais e sintomas do mal de Alzheimer, síndrome de Down, disfunção cognitiva leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós-encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia glial globular, complexo parkinsonismo-demência de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy do mal de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauopatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP).
[0327] Os anticorpos também podem ser usados como reagentes de pesquisa para pesquisas laboratoriais na detecção da tau ou de fragmentos seus. Em tais usos, os anticorpos podem ser marcados com moléculas fluorescentes, moléculas, enzimas ou radioisótopos marcados por rotação e podem ser fornecidos na forma de kit com todos os reagentes necessários para realizar o ensaio de detecção. Os anticorpos também podem ser utilizados para purificar a tau ou parceiros de ligação da tau, por exemplo, por cromatografia de afinidade.
[0328] Todos os pedidos de patentes, sites, outras publicações, números de adesão e semelhantes citados acima ou abaixo são incorporados a este documento por referência na sua totalidade para todos os fins na mesma medida como se cada item individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser assim incorporado por referência. Se diferentes versões de uma sequência estão associadas com um número de acesso em momentos diferentes, a versão associada com o número de acesso na data de depósito efetiva do presente pedido é a que vale. A data de depósito eficaz significa a mais cedo dentre a data de depósito real ou data de depósito de um pedido de prioridade referindo-se ao número de acesso, se for o caso. Da mesma forma se versões diferentes de uma publicação, website ou semelhantes são publicadas em momentos diferentes, a versão mais recentemente publicada na data do depósito efetivo da aplicação é a referida, salvo indicação em contrário. Qualquer característica, etapa, elemento, modalidade ou aspecto da invenção pode ser utilizado em combinação com qualquer outro, a menos que indicado especificamente de outra forma. Embora a invenção presente tenha sido descrita com certos detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de esclarecimento e clareza, ficará visível que certas alterações e modificações podem ser feitas dentro do escopo das reivindicações em anexo.
EXEMPLOS Exemplo 1. Identificação de Anticorpos Monoclonais da Tau
[0329] Os anticorpos monoclonais contra tau foram gerados conforme se segue. As imunizações foram realizadas com a tau humana recombinante de terminal N marcada com His 383 (4RON), contendo uma mutação P301S [imunógeno A] ou a tau recombinante humana 383 aa (4RON), contendo uma mutação P301S, sem uma marcação His de terminal N [imunógeno B]. Os imunógenos foram emulsionados em adjuvante RIBI.
[0330] Camundongos Balb/c fêmeas com cinco semanas foram imunizados por via intraperitoneal com 25ug de imunógeno A no dia O e 10 ug do imunógeno A nos dias 7, 14, 21, 27, 34, 48, 55 e 62. Os camundongos foram imunizados com ug de imunógeno B nos dias 76 e 90. Nos dias 43 e 98, os camundongos passaram por sangria e foram titulados contra o imunógeno A; no dia 101, os animais com títulos mais elevados foram reforçados com uma imunização terminal de 50 ug do imunógeno B, que foi administrado % por via intraperitoneal e % por via intravenosa. Os hibridomas fundidos foram triados através de ELISA contra os ambos os imunógenos, e os positivos com o sinal mais elevado foram mapeados por epítopo (ver Exemplo 2).
Exemplo 2. Mapeamento de epítopos do anticorpo 3D6
[0331] Utilizou-se uma gama de peptídeos biotinilados sobrepostos abrangendo toda a proteína tau humana 383aa 4RON para mapear o anticorpo
3D6 de murinos. Foram usados peptídeos adicionais para modelas as modificações pós-traduções em potencial das terminações de terminal C e N da proteína.
[0332] Os peptídeos biotinilados foram ligados a poços separados de uma placa de ELISA revestida com estreptavidina. A placa foi bloqueada e tratada com 3D6 de murino, seguida da incubação com um anticorpo anticamundongo conjugado com peroxidase de rábano. Após a lavagem completa, o OPD foi aplicado na placa e deixado para desenvolver. A placa foi lida a uma absorvância de 450 nm. A subtração de fundo foi feita com valores de absorvância de poços sem nenhum anticorpo primário, e um limite para ligação positiva foi estabelecido como sendo de 0,2 unidade de absorvância. A ligação foi mapeada a sítios dentro da região MTBR.
Exemplo 3.Concepção dos anticorpos 3D6 humanizados
[0333] O ponto de partida ou o anticorpo doador para humanização foi o anticorpo de camundongo 3D6. A sequência de aminoácidos variável de cadeia pesada de m3D6 maduro é fornecida como a SEQ ID NO:7. A sequência de aminoácidos variável de cadeia leve de m3D6 maduro é fornecida como a SEQ ID NO: 11. As sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 do composto de Kabat/Chothia de cadeia pesada são fornecidas como as SEQ ID NOs: 8-10, respectivamente. As sequências de aminoácidos de Kabat de cadeia leve CDR1, CDR?2 e CDR3 são fornecidas como as SEQ ID NOs: 12-14, respectivamente. À numeração de Kabat é usada ao longo de todo o documento.
[0334] A variável kappa (Vk) do 3D6 pertence ao subgrupo 2 de Kabat de camundongo, que corresponde ao subgrupo 2 de Kabat humano, e à variável pesada (Vh) ao subgrupo 2c de Kabat de camundongo, que corresponde ao subgrupo 1 de Kabat humano [Kabat E.A,., et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição. Publicação NIH Nº 91-3242]. O resíduo 16 da CDR-L1 de Chothia pertence à classe canônica 4, o resíduo 7 da CDR-L2 de Chothia pertence à classe 1, o resíduo 9 da CDR-L3 de Chothia pertence à classe 1 em Vk [Martin AC, e Thornton JM (1996) J. Mol. Biol. 263:800-15. [Martin & Thornton, 1996]. O resíduo 10 da CDR-H1 de Chotia pertence à classe 1, o resíduo 17 da CDR-H2 de Chotia pertence à classe 2 [Martin & Thornton, 1996].
A CDR-H3 não tem classes canônicas. Uma pesquisa foi feita sobre as sequências de proteínas no banco de dados PDB (Deshpande et al., (2005) Nucleic Acids Res. 33: D233-7) para encontrar estruturas que forneçam um modelo estrutural aproximado de 3D6. Para construir um modelo Fv de 3D6, uma estrutura de anticorpo murino anti-piroglutamato-Abeta Fab cf 24 (código pdb S5MYX) [Piechotta, A. et al., 2017, J Biol Chem. 292: 12713—12724] com uma resolução de 1,4 A foi usado. Ela reteve a mesma estrutura canônica para as alças que o 3D6.
[0335] As estruturas de 3D6 VH compartilham um alto grau de similaridade de sequência com as regiões correspondentes do Fab 48G7 humanizado PDB: 2RCS, projetado por Wedemayer, GJ, et al. (1997; Science 276: 1665-1669). Os domínios variáveis de fab 3D6 e 48G7 também compartilham comprimentos idênticos para as alças CDR-H1, H2. Da mesma forma, as estruturas de 3D6 VL compartilham um alto grau de similaridade de sequência com as regiões correspondentes do anticorpo humano ARX71335 VL, clonado por Dafferner, AJ, et al. (2017;. Submissão Direta). O domínio leve variável do anticorpo 3D6 e ARX71335 também compartilha comprimentos idênticos para as alças CDR-L1, L2 e L3. Por conseguinte, as regiões de framework de 48G7 VH (2RCS-VH) e ARX71335 VL foram escolhidas como as sequências aceitadoras para as CDRs de 3D6. Um modelo das CDRs de 3D6 enxertadas nas respectivas estruturas humanas para VH e VL foi construído e usado como orientação para futuras mutações.
[0336] As sequências de variantes de cadeia pesada e leve resultantes do processo de humanização de anticorpos foram posteriormente alinhadas com as sequências de linha germinativa humana usando a ferramenta IMGT Domain GapAlign para avaliar a humanização das cadeias pesada e leve, conforme descrito pelas diretrizes do comitê WHO INN. (WHO-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (a review) (Internet) 2014. Disponível em: http:/Mww. who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf) Os resíduos foram alterados para se alinharem com a sequência da linha germinativa humana correspondente, quando possível, para melhorar a humanização e reduzir imunogenicidade. Para variantes humanizadas de VLvb2 e VLvb3, as mutações foram introduzidas para tornar as sequências mais semelhantes ao gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27) para variantes humanizadas de VHvb2, VHvb3, VHvb4, VHvb5, VHvb6 e VHvb6, mutações foram introduzidas para tornar as sequências mais semelhantes ao gene da linhagem germinativa humana IGHV1- 69-2*01 (SEQ ID NO: 25)
[0337] As versões de hu3D6-VH e hu3D6-VL foram manipuladas para permitir a avaliação de vários resíduos de estrutura para suas contribuições para a ligação ao antígeno, termoestabilidade e imunogenicidade, e para otimização de glicosilação, agregação, heterogeneidade de N-termo, termoestabilidade, manchas carregadas expostas à superfície, manchas de carga expostas na superfície, desaminação e suscetibilidade à proteinase. As posições consideradas para mutação incluem aquelas que...
- definir as conformações de CDR canônicas (resumidas em Martin, A.C.R. (2010) Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains. Em: Kontermann R and Dúbel S (eds). Antibody Engineering. Heidelberg, Germany: Springer International Publishing AG.), - estão dentro da zona Vernier (Foote J and Winter G. (1992), Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J Mol Biol. 224(2):487-99.), - estão localizadas na interface do domínio VH/VL (resumida em Léger OJP e Saldanha J. (2000). Preparation of recombinant antibodies from immune rodent spleens and the design of their humanisation by CDR grafting. Em: Shepherd P and Dean C (eds). Monoclonal Antibodies: a Practical Approach. Oxford, UK: Oxford University Press.), - são suscetíveis a modificações pós-traducionais, como glicosilação ou piroglutaminação, - são ocupados por resíduos que estão previstos para se chocar com CDRs, de acordo com o modelo de CDRs de 3D6 enxertadas em estruturas VH e VL, ou - são ocupadas por resíduos que são raros entre os anticorpos humanos sequenciados, nos quais o resíduo 3D6 do camundongo de origem ou algum outro resíduo é muito mais prevalente dentro do repertório de anticorpos humanos.
[0338] Os alinhamentos de 3D6 murino e vários anticorpos humanizados são mostrados para as regiões variáveis da cadeia leve (Tabela 4 e Figura 2) e regiões variáveis da cadeia pesada (Tabela 3 e Figura 1).
[0339] 7 variantes de região variável de cadeia pesada humanizada e 3 variantes de região variável de cadeia leve humanizada foram construídas contendo diferentes permutações de substituições: hu3D6VHvb1, hu3D6VHvb2, hu3D6VHvb3, hu3D6VHvb4, hu3D6Hvb5, hu3D6VHvb6, ou huaD6VHvb7 (SEQ ID NOs:76-80 e 90-91, respectivamente); e hu3D6VLvb1, hu3D6VLvb2, ou hu3D6VLvb3 (SEQ ID NOs: 83-85, respectivamente) (Tabelas 3 e 4). Os modelos exemplificados de Vh e Vk humanizados, com mutações reversas e outras mutações baseadas em estruturas humanas selecionadas, são mostrados nas Tabelas 3 e 4, respectivamente. As áreas em negrito nas Tabelas 3 e 4 indicam as CDRs conforme definido pelo Composto de Kabat/Chothia. As SEQ ID NOs: 76-80 e SEQ ID NOs: 90-91 contêm mutações reversas e outras mutações como mostrado na Tabela 5. Os aminoácidos nas posições em hu3D6VHvb1, hu3D6VHvb2, hu3D6VHvb3, hu3sD6VHvb4, hu3sD6VHvb5, hu3sD6VHvb6 e hu3D6VHvb7 estão listados na Tabela 6. Os aminoácidos nas posições em hu3D6VLvb1, hu3D6VLvb2 e hu3D6VLvb3 estão listados na Tabela 7. À humanidade percentual para as cadeias VH humanizadas hu3D6VHvb1, hu3D6VHvb2, hu3sD6VHvb3, hu3sD6VHvb4, hu3D6Hvb5, hu3D6VHvb6, e hu3D6VHvb7 (SEQ ID NOs: 76-80 e 90-91, respectivamente) e cadeias humanizadas VL hu3D6VLvb1, hu3D6VLvb2, e hu3D6VLvb3 (SEQ ID NOs: 83-85, respectivamente) é mostrada na Tabela 8.
Tabela 3
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[0340] Tabela 5: Mutações Reversas de Vn, V. e Outras Mutações Para o 3D6 Humanizado Sequência Variante . dora d Alterações dos resíduos do framework do aceitadora de de Vx ou , dev aceitador (ou CDR) (com base nos CDRs éxons de Vx ou Vv. v do compósito de Kabat/Chothia)
L Hu3D6VHv | PDB ID 2RCS- H91, H93, H94 b1 VH huFrwk
(SEQID | (SEQIDNO:75) NO:76) IMGTH IGHV1- 69-2*01 (SEQ ID NO:25) PDB ID 2RCS- Hu3D6VHv | VH huFrwk b2 (SEQ ID NO:75) | H1, H5, H11, H20, H23, H38, H42, H43, H66, (SEQID | IMGT&IGHV1- | H67, H75, H76, H81, H91, H93, H94 NO:77) | 69-2*01 (SEQID NO:25) PDB ID 2RCS- Hu3D6VHv | VH huFrwk H1, H5, H11, H17, H20, H23, H38, H42, H43, b3 (SEQ ID NO:75) H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, (SEQID | IMGTXIGHV1- H93, H94, H108, H109 NO:78) | 69-2*01 (SEQ ID NO:25) PDB ID 2RCS- Hu3D6VHv | VH huFrwk H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, b4 (SEQ ID NO:75) H43, H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, (SEQID | IMGTXIGHV1- H83, H93, H94, H108, H109 NO:79) | 69-2*01 (SEQ ID NO:25) PDB ID 2RCS- Hu3D6VHv | VH huFrwk H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, b5 (SEQ ID NO:75) H43, H54, H56, H58, H66, H67, H75, H76, (SEQID | IMGTXIGHV1- H80, H81, H83, H93, H94, H108, H109 NO:80) | 69-2*01 (SEQID NO:25) Hu3D6 PDB ID 2RCS- H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, VHvb6 VH huFrwk H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, (SEQID | (SEQIDNO:75) H81, H83, H91, H93, H94, H108, H109 NO:90) IMGTH IGHV1-
69-2*01 (SEQ ID NO:25) PDB ID 2RCS- Hu3D6 VH huFrwk H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, VHvb7 (SEQ ID NO:75) H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, (SEQ ID IMGTH IGHV1- H81, H83, H93, H94, H108, H109 NO:91) 69-2*01 (SEQ ID NO:25)
PDB ID ARX71335- Hu3D6VLv p1 VL huFrwk (SEQ ID NO:82); (SEQ ID IMGTHIGKV2- NO:83) 30*02 (SEQ ID NO:27)
PDB ID ARX71335- Hu3D6VLv po VL huFrwk (SEQ ID NO:82); L7, L10, L15, L83, L86, L106 (SEQ ID IMGTHIGKV2- NO:84) 30*02 (SEQ ID NO:27)
PDB ID ARX71335- Hu3D6VLv VL huFrwk (SEQ b3 L7, L10, L15, L17, L24, L37, L45, L83, L86, ID NO:82); (SEQ ID L100, L106 IMGTHIGKV2- NO:85) 30*02 (SEQ ID NO:27)
[0341] Tabela 6: Numeração de Kabat dos resíduos de framework (ou CDR) (com base nos CDRs do composto de Kabat/Chothia) para mutações reversas e outras mutações em cadeias pesadas de anticorpos 3D6 humanizados a a 2º ola ja la 2 /2 | a |o nm eg lo aq j g FZ ig ja io vs = om wu uu uu 8 uu u u o E RL 25 e 2 e = 2 e 2 3 | 8% Tro 323 <o NT) mo to no / oSo| | nTE 3 E" | ZEN ER SM / 2m|/ ST) >NmM/ 22/20/29 365 | SN q — Ss $ 2 j&22/50 52/52|52/22/32/52/52 IT se 84 o o o o o o o > SS ç2o f=) f=) â =) =) =) "A SET 6 o o o o o o o Õ So | 3 3 3 > 3 3 3 CE 2º Ir Ir Ir x Ir I I o mi je e je e e | E | E | EE) spa pr a a
O A a a e Aja | | KR AR |A| Ai ir) me je | e ja e | e | € | <|*|* “|
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[0342] Tabela 7: Numeração de Kabat dos resíduos de framework (com base nas CDRs do composto de Kabat/Chothia) para mutações reversas e outras mutações em cadeias leves de anticorpos 3D6 humanizados a ' a &| 3 8 & S o e “= É À õ .- .- E SS | & Z 2 2 % ld | a. E &l sm os) As fe! o E 3) ww | =) = o) —-— hn uu uu 7 << .. = o| PP " o) o) o 4 o e) wu E o) =| qe o XY >) = a | E = o| o Oo "o im S 2 ã ã o so o > > > o o Ss) o O o) O S gal > ao O O o Dr o o Fl o O 3| =| E) < o TI) TI) IT s ' a o 3 O & Is lo - - . u .—- .—- e SS) o 2 2 2 = *| O a a fe z El =|| = = = o 2 jEss sa sas] a) a 3 [So 79 ão S S é 22/28 32/32 | 3 |: 1 2 | >| >) >) 1 o e ") =| — = FE | o >| >) > Oo o o| o) o ba ol Ss o O. =| =| Z so o GC) GC) Fl o â 3| =| E) < o TI) TI) TI)
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O E A A A A A IRA OR
[0343] Tabela 8: Percentual de integridade humana e cadeias leves de anticorpos 3D6 humanizados Variante de Vy4 ou V. % de Humanização Hu3D6VHvb1 (SEQ ID NO:76) 65,3% Hu3D6VHvb2 (SEQ ID NO:77) 76,5% Hu3D6VHvb3 (SEQ ID NO:78) 81,6% Hu3D6VHvb4 (SEQ ID NO:79) 83,7% Hu3D6VHvb5 (SEQ ID NO:80) 85,7%
[0344] As posições em que os resíduos canônicos, vernier ou de interface diferem entre as sequências de aceitador de camundongo e humanas são candidatas à substituição. Exemplos de resíduos canônicos/CDR que interagem incluem os resíduos Kabat H54 e H94 na Tabela 3. Exemplos de resíduos de vernier incluem resíduos de Kabat H28, H67, H93 e H94 na Tabela 3. Exemplos de resíduos de interface/empacotamento (VH + VL) incluem resíduos de Kabat H91 e H93 na Tabela 3.
[0345] As razões para a seleção das posições indicadas na Tabela 3 na região variáveis de cadeia pesada como candidatos à substituição são as seguintes.
[0346] regiões variáveis da cadeia pesada
[0347] hu3D6VHvb1 - consiste nas alças CDR-H1, H2 e H3 de 3D6-VH enxertadas no framework de 48G7-VH (RCS-VH), com mutações reversas nas posições H91 (Y91F), H93 (A93S) e H94 (S94T).
[0348] hu3D6VHvb2 - reverte todas as substituições de framework em posições que são fundamentais para definir as classes canônicas de Chothia, fazem parte da zona de Vernier ou se localizam na interface do domínio VH/VL ou contribuem para a estabilidade — estrutural... 3D6-VH vb2 incorpora mutações reversas OU substituições Q1E, Q5V, L11V, L20I], T23K, K38R, E42G, Q43K, K66R, S75T, N76D, Q81E, Y91F, A93S, S94T, T108L e L1O09V, para permitir a avaliação dessas posições afinidade de ligação ao antígeno e imunogenicidade.
[0349] hu3D6VHvb3, —hus3D6VHvb4, hu3D6VHvb5, hu3D6VHvb6 e hu3D6VHvb7 consiste em substituições adicionais e adicionar à estabilidade do anticorpo e/ou para otimização da glicosilação, agregação, heterogeneidade do termo N,
termoestabilidade, manchas carregadas expostas à superfície, manchas de carga expostas à superfície, desaminação e suscetibilidade à proteinase.
[0350] Q1E: é uma mutação que aumenta a estabilidade para mitigar o potencial de formação de piroglutamato (Liu, supra.) Q1E é uma mutação reversa.
[0351] Q5V: é uma mutação de alinhamento de linhagem germinativa e baseada em frequência. Val é mais frequente em sequências humanas nesta posição. Val está no gene da linhagem germinativa humana IMGTX IGHV1-69- 2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição.
[0352] L1 1V: é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Val está no gene da linhagem germinativa humana IMGTX IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25) nesta posição.
[0353] S17T: é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Thr está no gene da linhagem germinativa humana IMGTX IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição.
[0354] L20!: é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. lle está no gene da linhagem germinativa humana IMGTX IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição.
[0355] T23K: é uma mutação de alinhamento de linhagem germinativa e baseada em frequência. Lys é mais frequente nesta posição. Lys está no gene da linhagem germinativa humana IMGTH IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição.
[0356] N28T: Esta é uma substituição de resíduo CDR-H1 por Thr. N28T é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Thr está no gene da linhagem germinativa humana IMGTX% IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição.
[0357] K38R: é uma mutação reversa baseada em frequência. Arg é mais frequente nesta posição. Prevê-se que Arg nesta posição faça duas ligações H com Glu 46 além de uma ligação H, cada uma com Asp86 e Tyr 90 na cadeia pesada; portanto, a substituição de Arg pode aumentar a estabilidade em relação a Lys nesta posição.
[0358] E42G: é uma mutação de alinhamento de linhagem germinativa e baseada em frequência. Gly está no gene da linhagem germinativa humana
IMGTH IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição. Gly é mais frequente nesta posição. Prevê-se que a substituição de Gly não afete a estabilidade.
[0359] Q43K: Prevê-se que a cadeia lateral de Lys nesta posição faça ligação H com G42, além de ligações H da cadeia principal com GIn 39 e Arg 40, desse modo a substituição de Lys pode aumentar a estabilidade sobre Q nesta posição. Q43K é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Lys está no gene da linhagem germinativa humana IMGTX IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição.
[0360] N54D e D56E são substituições de resíduos de CDR e prevê-se que sejam posições de contato não antígeno de acordo com o modelo de homologia. As substituições N54D e D56E são previstas para estabilizar a estrutura do anticorpo. N54D e D56E são mutações de alinhamento de linhagem germinativa. Asp está na posição H54 e Glu está na posição H56 no gene da linhagem germinativa humana IMGT* IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25).
[0361] V58l]: é uma substituição de um resíduo de CDR-H2. O gene da linhagem germinativa IMGTX% IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) tem lle nesta posição. Prevê-se que este resíduo não entre em contato com o antígeno.
[0362] KS66R: Arg nesta posição está previsto para fazer ligações H com Ser 82a e Thr 83, além de fazer ligações H e ponte de sal com Asp 86. K66R é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Arg está no gene da linhagem germinativa humana IMGTX% IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição.
[0363] A67 V: é uma substituição de um resíduo da zona Vernier. O gene da linhagem germinativa IMGTX% IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) tem Val nesta posição.
[0364] S75T: Prevê-se que Ser nesta posição faça ligação H com Asp 72 e Tyr 76. Prevê-se que Thr nesta posição também faça esses contatos, mas sendo o resíduo Thr exposto à superfície pode aumentar a estabilidade do anticorpo. S75T é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Thr está no gene da linhagem germinativa humana IMGT* IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição.
[0365] N76D: Asp é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa.
Asp está no gene da linhagem germinativa humana IMGTH IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25) nesta posição.
[0366] L80M: Met é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Met está no gene da linhagem germinativa humana IMGTH IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição.
[0367] 081E: Prevê-se que Glu faça ligação H mais ponte de sal com K19; portanto, Glu nesta posição aumenta a estabilidade do anticorpo. O81E é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Glu está no gene da linhagem germinativa humana IMGT* IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição.
[0368] T83R melhora a termoestabilidade e aumenta a humanidade. Arg é também uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Arg está no gene da linhagem germinativa humana IMGT* IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição. Arg é mais frequente nesta posição.
[0369] Y91F : é uma mutação de um resíduo de interface e é uma mutação reversa. Tyr nesta posição pode aumentar a estabilidade do anticorpo.
[0370] A93S: é uma mutação reversa de uma zona Vernier e resíduo da zona de interface.
[0371] S94T: é uma mutação reversa de um resíduo estrutural canônico definido por Chothia e um resíduo vernier.
[0372] T108L: Leu é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Leu está no gene da linhagem germinativa humana IMGTH IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição. Prevê-se que Leu nesta posição torne o anticorpo menos imunogênico e não tenha impacto na estabilidade do anticorpo.
[0373] L109V: é uma mutação baseada em frequência. Val é mais frequente nesta posição. L109V é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Val está no gene da linhagem germinativa humana IMGTH IGHV1- 69-2*01 (SEQ ID NO: 25) nesta posição.
[0374] As razões para a seleção das posições indicadas na Tabela 4 na região variáveis de cadeia leve como candidatos à substituição são as seguintes.
[0375] regiões variáveis da cadeia leve Kappa
[0376] hu3D6VLvb1 - consiste nas alças CDR-L1, L2 e L3 de 3D6-VL enxertadas no framework de ARX71335 VL.
[0377] hu3D6VLvb2 e hu3D6VLvb3 - reverte todas as substituições de framework em posições essenciais para definir as classes canônicas de Chothia, fazem parte da zona Vernier ou localizam na interface de domínio VH/VL. Hu3D6-VLvb2 e Hu3D6-VLvb3 também incluem substituições que contribuem para a estabilidade estrutural; hu3D6- VL vb2 incorpora mutações reversas T7S, 115L, L83V, H86Y e L106I, para permitir a avaliação das contribuições dessas posições para a afinidade de ligação ao antígeno e imunogenicidade.
Hu3D6-VL vb3 todas as substituições mencionadas para vb2 juntamente com alterações adicionais em Q17E, K24R, L37Q, K45R e L1061
[0378] T7S: é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Ser está no gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27) nesta posição.
[0379] T10S: é uma mutação de alinhamento de linhagem germinativa e baseada em frequência. Ser é frequente nesta posição. Ser está no gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27) nesta posição.
[0380] 115L: é uma mutação de linhagem germinativa. Leu está no gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27) nesta posição.
[0381] Q17E: Glu nesta posição está previsto para fazer ligação H com T14 e ponte salina com Lys 107, ambos os resíduos da cadeia leve, e para aumentar a estabilidade do anticorpo.
[0382] K24R: é uma mutação de um resíduo de CDR. Prevê-se que ambos Lys e Arg façam ligação H e ponte salina com Asp 70 na cadeia leve. Prevê-se que Arg se encaixe melhor na conformação. Arg é também uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Arg está no gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27) nesta posição.
[0383] L37Q: Prevê-se que este seja um resíduo enterrado profundamente, Leu não deverá interagir com os resíduos circundantes, enquanto GIn deverá fazer ligações H com Q38 e Asp 82 na cadeia leve. Glh também é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. GlIh está no gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:27) nesta posição.
[0384] K45R: Embora seja previsto que Lys faça ligações H com S56 e Gly 57; a interação prevista de Arg com resíduos vizinhos é muito mais extensa, pois é previsto formar pontes de sal com DB55, ligação H com Arg46 e ligações H duplas com S56. Arg é também uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Arg está no gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27) nesta posição.
[0385] L83V: Esta é uma mutação baseada na frequência de um resíduo previsto para exposição na superfície. Val é também uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Val está no gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27) nesta posição.
[0386] H86Y: Murino 3D6 VL tem Tyr nesta posição. Tyr também é o resíduo mais frequente nesta posição.
[0387] A100Q: Ala é raro nesta posição. Prevê-se que Ala seja um resíduo exposto na superfície e não se prevê que interaja com os resíduos circundantes. Gln é mais frequente nesta posição e também é uma mutação de alinhamento da linhagem germinativa. Gln está no gene da linhagem germinativa humana IGKV2- 30*02 (SEQ ID NO: 27) nesta posição. Prevê-se que Gln faça ligação H com intracadeia de estabilização de Ser 7.
[0388] L1061: é uma mutação baseada em frequência e de linhagem germinativa. Ile é mais frequente nesta posição. lle está no gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 27) nesta posição.
[0389] Os designs baseados nessas estruturas humanas foram: regiões variáveis da cadeia pesada >hu3D6VHvb1 (SEQ ID NO:76)
QVALQASGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYLHWVKQRPEQGLEWIGWIDPE
NGDTVYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCSTLDFWGOQGTTLT vsSS >hu3D6VHvb2 (SEQ ID NO:77)
EVQLVAOSGAEVVKPGASVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPE
NGDTVYDPKFQGRATITADTSTDTAYLELSSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVT vsSS >hu3D6VHvb3 (SEQ ID NO:78)
EVQLVOSGAEVVKPGATVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPE
NGDTIYDPKFQGRATITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLVT vsSS hu3D6VHvb4 (SEQ ID NO:79)
EVQLVOSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQORPGKGLEWIGWIDPE
NGDTIYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLVT vsSS >hu3D6VHvb5 (SEQ ID NO:80)
EVQLVOSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQORPGKGLEWIGWIDPE
DGETIYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLVT vsSS >hu3D6VHvb6 (SEQ ID NO:90)
EVQLVOSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQORPGKGLEWIGWIDPE DGETVYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLV
TVSS >hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO:91)
EVQLVOSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQORPGKGLEWIGWIDPE DGETVYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLV
TVSS regiões variáveis da cadeia leve Kappa hu3D6VLvb1 (SEQ ID NO:83)
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQORPGQSPKRLIYL VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVHYCWQGTHFPYTFGAGTKL
ELKR >hu3D6VLvb2 (SEQ ID NO:84)
DVVMTOQSPLSLSVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQORPGOQSPKRLIYL VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGAGTKL
EIKR >hu3D6VLvb3 (SEQ ID NO:85)
DVVMTQSPLSLSVTLGEPASISCRSSQOSLLDSDGKTYLNWLOQRPGQOSPRRLIYL VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQAGTK LEIKR
[0390] As sequências humanizadas são geradas utilizando um protocolo de PCR de dois estágios que permite a introdução de múltiplas mutações, deleções e inserções utilizando mutagênese direcionada ao sítio de QuikChange [Wang, W. e Malcolm, BA (1999) BioTechniques 26: 680-682].
[0391] Exemplo 4. Os anticorpos monoclonais de camundongo ligam à tau em ensaios de ELISA
[0392] Métodos: ELISA indireto: placas de poliestireno de 96 poços foram revestidas com anticorpos de captura anti-6xHis (Figura 3A) ou um anti-tau policlonal (Dako tt AO0024, Figura 3B) suspensas em 1xPBS durante 2 h em temperatura ambiente ou 16 h em 4ºC. O revestimento foi removido e as placas foram bloqueadas durante 1 h com BSA a 1% em 1xPBS, seguido da incubação com tau recombinante humana, com (Figura 3A) ou sem (Figura 3B) um marcador de poli-histidina no terminal N da proteína. Após a lavagem, as placas foram incubadas com os anticorpos indicados, lavadas e incubadas com um anticorpo secundário anti-camundongo caprino conjugado com o HRP. As placas foram reagidas com TMB e o Aaso foi medido com um leitor de placas.
[0393] ELISA sanduíche: placas de poliestireno de 96 poços foram revestidas com anticorpos anti-camundongo em 1xPBS por 2hem RT ou 16 ha 4ºC. O revestimento foi removido e as placas foram bloqueadas durante 1 hora com BSA a 1% em 1xPBS. Em seguida, a placa foi incubada com os anticorpos indicados em concentrações idênticas, diluídos em BSA a 0,1% em 1xPBS. As placas foram sucessivamente tratadas com tau humano, anti-tau policlonal de coelho (Dako t%A0024) e anticorpo anti-coelho caprino conjugado com HRP, todos diluídos em BSA a 0,1% em PBS com lavagens ocorrendo entre cada etapa. À estreptavidina-HRP foi adicionada, as placas foram reagidas com TMB e o Auaso foi medido com um leitor de placas. Ver Figura 3C.
[0394] Resultados: um painel de anticorpos produzidos por hibridoma foi ensaiado quanto à ligação à tau através de uma quantidade de diferentes formatos de ELISA. A detecção da tau foi confirmada usando um formato indireto, usando a proteína tau imobilizada por seu marcador de poli-histidina fundido ao terminal N (Figura 3A). A ligação à proteína nativa não marcada também foi confirmada (Figura 3B). Para avaliar a afinidade da solução dos vários anticorpos,
foi utilizado um formato ELISA sanduíche em que foram utilizados anticorpos de hibridoma testados como reagentes de captura (Figura 3C).
[0395] Exemplo 5. Afinidade de anticorpos monoclonais de camundongo com a tau
[0396] Métodos: a análise de SPR foi realizada utilizando um Biacore T200 para determinar a cinética de ligação dos anticorpos de murino à tau humana recombinante. Para preparar uma superfície de sensor, o anticorpo anti- camundongo (GE Life Sciences) foi imobilizado no chip sensor CM5 por uma ligação de amina e o anticorpo foi capturado em um nível para garantir a máxima ligação de 50 RU. Várias concentrações de tau recombinante variando de 10-0,14 nM foram passadas sobre o ligante capturado a uma taxa de fluxo de 50 pulL/min em um tampão em execução (HBS + 0,05% de P-20, 1 mg/mL de BSA), por associação de 180 segundos de e dissociação de 900s. Os dados foram duplamente referenciados tanto a um sensor irrelevante que não contém um ligante de anticorpo quanto à concentração de analito de O nM para justificar a dissociação do ligante da porção de captura. Os dados foram então analisados usando um ajuste global de 1:1.
[0397] Resultados: vários anticorpos murinos foram selecionados com base no seu desempenho em uma bateria de ensaios de ELISA e suas afinidades de ligação foram avaliadas por SPR. Os anticorpos foram testados em conjuntos paralelos e as suas taxas de associação e dissociação de ligação foram comparadas para selecionar o ligante mais elevado para a tau humana recombinante. A maior afinidade de ligação foi observada com o clone 3D6 do anticorpo. As afinidades de ligação são mostradas na Figura 4.
[0398] Exemplo 6. Os anticorpos monoclonais de camundongo evitam a ligação da tau humana à superfície das células neuronais imortalizadas
[0399] Métodos: inibição da ligação da tau a células de neuroblastoma B103 com anticorpos monoclonais anti-tau
1. Ressuspender células B103 em PBS em 5 x 10º células/mL. Placa de 50uUL de suspensão de células por poço em uma placa de elevada ligação de MSD. Isso resulta em 25K células/poço. Cobrir a placa e permitir a fixação das células a 37 ºC, 5% de CO;, por 2 horas.
2. Depois da ligação da fixação das células, remover o PBS dos poços invertendo a placa e batendo levemente para remover o excesso de tampão. Adicionar 50 ul de 3% de bloqueador A MSD em PBS ou outro tampão de bloqueio adequado a cada poço e incubar a placa em RT por 1 hora sem agitação.
3. Durante a etapa de bloqueio de placas, co-incubar os anticorpos de Tau e anti-Tau da seguinte maneira: a. Iniciar com um anticorpo anti-tau a 2 mg/mL e diluir em série com PBS, 1:2, por mais 7 diluições.
b. Diluir Tau a 20 nM em PBS. A concentração de tau será constante em cada poço.
Cc. Misturar a tau e o anticorpo anti-tau, 1:1, para uma concentração final de tau de 10 nM e uma concentração inicial do anti-Tau de 1 mg/mL.
d. Incubar a mistura por aproximadamente 1h em RT com agitação (600rpm).
4. Depois do bloqueio da placa, etapa 2, remover o tampão de bloqueio dos poços invertendo a placa e batendo levemente e lavar a placa 2x com PBS usando uma pipeta multicanais. Garantir de que o excesso de tampão seja completamente removido. Resfriar as células plaqueadas a 4 ºC antes de adicionar os complexos Tau:anti-Tau.
5. Adicionar 50uL de complexo resfriado, etapa 3, às células plaqueadas e incubar em gelo por 30 minutos.
6. Lavar a placa 2x com PBS resfriado, conforme descrito anteriormente.
7. Adicionar 50uL por poço do 16B5.SULFO-TAG para detecção de Tau ligado à superfície celular. Incubar por 30 minutos no gelo.
8. Lavar a placa 2x com PBS resfriado, novamente, conforme descrito anteriormente.
9. Adicionar 150 ul por poço do tampão T de leitura 1X sem surfactante (diluído em H2O) e fazer a leitura imediatamente no instrumento MSD SECTOR TY
600. Evitar introduzir bolhas ao adicionar o tampão de leitura.
10. Relatar os sinais de MSD versus concentração de anti-Tau.
[0400] Os anticorpos testados foram os anticorpos anti-tau 3D6, 16G7,
3H9, 4C5 e 5G8 e o isotipo de controle.
[0401] Resultados:
[0402] A diminuição do sinal SulfoTag anti-tau que ocorre com o aumento do anticorpo de teste indica o bloqueio funcional da ligação da tau às superfícies das células neuronais. Nenhum bloqueio foi observado com o controle do isotipo, 16G7 ou 3H9. Quantidades crescentes de atividade de bloqueio funcional foram observadas com 4C5, 5G8 e 3D6. 3D6 apresentou a atividade de bloqueio mais profunda dentre os anticorpos testados. Ver a Figura 5.
[0403] Exemplo 7. Atividade de desagregação
[0404] Métodos: agregação de tau recombinante - A tau recombinante purificada com um marcador 6xHis de terminal N foi combinada com quantidades equimolares de heparina de baixo peso molecular em 1xPBS (pH 7,4) e incubada a 37 ºC durante 96 horas em um nutador. A agregação da amostra foi confirmada pela ligação à tioflavina T.
Incubação com anticorpos — Os anticorpos foram incubados com tau agregada e recombinante nas razões molares indicadas incubadas a 37 ºC por 96 horas sem rotação ou nutação. No final do experimento, a agregação foi medida incubando-se as amostras com tioflavina T a 25 mM e medindo a fluorescência emitida (450/482 ex/em). Os sinais foram subtraídos em segundo plano das amostras do tampão.
[0405] Resultados: como mostrado na Figura 6, o 3D6 desmonta preferencialmente as fibrilas intactas de tau. Razões molares variáveis do 3D6 (triângulos), controle de isotipo (círculos) e 16G7 (quadrados) foram incubadas com fibrilas de tau contendo amiloide durante 96 horas. No final desse período, a extensão da agregação foi avaliada pela ligação à tioflavina T. O 3D6 diminui preferencialmente o sinal da tioflavina T presente na amostra, em comparação tanto com um anticorpo isotipo de controle quanto com o 16G7, um anticorpo anti- tau liga-se a uma região diferente da tau.
[0406] Exemplo 8. 3D6 e 5G8 fazem uma imunocaptura da tau do tecido da doença humana.
[0407] Métodos: Frações proteicas solúveis com alto teor foram preparadas para 1 mg/ml. Para cada imunoprecipitação, foram utilizados 200 ug de amostra.
10ug do anticorpo indicado (um controle de isotipo, 3D6 ou anticorpo anti-tau 5G8) foram adicionados a preparações da amostra com alto teor de sal e incubados durante 2 h. Os grânulos magnéticos de proteína G foram então adicionados às misturas e incubados por mais uma hora para capturar complexos anticorpo/antígeno. As amostras foram cuidadosamente lavadas com 1xPBS e os grânulos foram fervidos em um tampão de amostra de redução/desnaturação para liberar as proteínas capturadas. As amostras resultantes foram resolvidas por SDS-PAGE e o Western blotting foi realizado usando um anticorpo policlonal anti- tau (Dako, ttA0024).
[0408] Resultados: como mostrado na Figura 7, 3D6 e 5G8 imunoprecipitaram a tau do tecido da doença de Alzheimer. As frações solúveis com teor de sal elevado foram imunoprecipitadas com o anticorpo indicado e detectadas com um anticorpo anti-tau policlonal direcionado a uma região separada da molécula de tau a partir dos sítios de ligação para o 3D6 e o anticorpo A da tau. O 3D6 capturou fortemente a tau dessa fração. A entrada (amostra solúvel com alto teor de sal) é mostrada à direita.
[0409] Exemplo 9. Imunorreatividade imunohistoquímica de 3D6,
[0410] Os córtices frontotemporais foram obtidos de pacientes sem doença neurodegenerativa ou com doença de Alzheimer, o que foi confirmado com uma avaliação post-mortem. A imunohistoquímica foi realizada em criossecções levemente fixadas em acetona e montadas em uma lâmina de 10um. Todas as etapas foram realizadas usando um autocorador Leica BOND Rx, usando consumíveis Leica. A forma murina ou humana de 3D6 foi incubada com seções de tecido, seguida da adição de anticorpos secundários apropriados para a espécie, conjugados com um polímero HRP. Para evitar a ligação não específica da imunoglobulina endógena ao se usar anticorpos humanizados no tecido humano, os anticorpos foram marcados de forma não covalente com um fragmento Fab anti-humano monovalente conjugado com biotina in vitro antes da incubação no tecido. O tecido marcado com o complexo de fragmento Fab anticorpo primário-biotina foi amplificado adicionalmente usando um sistema de amplificação de avidina-biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA). A coloração foi visualizada com um cromogênio DAB, que produziu um depósito marrom. O controle negativo consistiu na realização de todo o procedimento imunohistoquímico nas seções adjacentes com um anticorpo de controle do isotipo de IgG.
[0411] Os anticorpos testados foram o CD6 murino, o 3D6 químico (que continha a VH e a VL do anticorpo murino com regiões constantes humanas, a cadeia pesada da SEQ ID NO: 72 e a cadeia leve da SEQ ID NO: 73) e uma variante humanizada hu3D6VHv5/hu3D6VLv2.
[0412] A coloração realizada com formas murinas, quiméricas e humanizadas de 3D6 foi comparada qualitativamente e avaliada quanto à força e a intensidade da coloração, bem como a localização da imunorreatividade. A intensidade da coloração foi semelhante para as formas quiméricas e humanizadas de 3D6 e apresentou padrões de localização semelhantes em comparação com a forma murina do anticorpo. A tau foi detectada em emaranhados neurofibrilares, fibrilas, fios de neurópilos e em axônios em degeneração. Também detectou-se uma notável coloração somática.
[0413] Exemplo 10. Afinidade de variantes humanizadas com a tau
[0414] Métodos: as placas de poliestireno de 96 poços de ELISA indireto foram revestidas com a tau recombinante humana suspensa em 1xPBS por 2 h em temperatura ambiente ou 16 h a 4ºC. O revestimento é removido e as placas são bloqueadas durante 1 h com BSA a 1% em 1xPBS. Os anticorpos da variante humanizada a 1 ug/ml em BSA a 0,1% em 1x PBS foram adicionados a placas durante 1 hora, seguido de lavagem, e foi adicionado um anticorpo anti-humano caprino conjugado com HRP. As placas foram reagidas com TMB e o Auaso foi medido com um leitor de placas.
[0415] ELISA sanduíche: placas de poliestireno de 96 poços foram revestidas com anticorpos anti-humano em 1xPBS por 2 h em RT ou 16 h a 4ºC. O revestimento é removido e as placas são bloqueadas durante 1 h com BSA a 1% em 1xPBS. Adicionaram-se anticorpos da variante humanizada em concentrações variáveis diluídos em BSA a 0,1% em 1xPBS a placas por 1 hora seguido de lavagem e a tau recombinante biotinilada diluída em BSA a 0,1% em 1xPBS foi adicionada. Depois da lavagem, a estreptavidina-HRP foi adicionada, as placas foram reagidas com TMB e o Aa45o foi medido com um leitor de placas.
[0416] Exemplo 11. Análise de variantes 3D6 humanizadas
[0417] Variantes 3D6 humanizadas foram analisadas quanto a várias características, incluindo afinidade de ligação ao alvo, atividade em ensaios baseados em células, termoestabilidade, título de expressão e presença de agregação.
[0418] Os plasmídeos foram gerados contendo DNA que codifica as cadeias pesadas hu3D6 VHvb1, h3D6VHvb2, hu3D6VHvb3, hu3D6VHvb4, hu3D6VHvb5, h3D6VHvb6 e h3D6VHvb7 e as cadeias leves hu3D6 VLvb1, hu3D6VLvb2 e hu3D6VLvb3. Diferentes combinações de cadeias pesadas e leves foram expressas transitoriamente como anticorpos intactos em células HEK-293, e os anticorpos foram purificados a partir de meio condicionado usando cromatografia de proteína A. Os anticorpos purificados foram analisados por cromatografia de exclusão por tamanho-cromatografia líquida de alta eficiência (SEC-HPLC) para detectar a presença de agregação. Os resultados são apresentados na Tabela 9, na coluna denominada "% de Monômero".
[0419] Os anticorpos purificados foram analisados por calorimetria diferencial de varredura (DSC) para determinar a termoestabilidade de cada variante. Os valores de termoestabilidade foram determinados usando calorimetria diferencial de varredura (DSC). Todas as varreduras de DSC foram realizadas usando um sistema VP-Capillary DSC (Malvern). Todas as amostras foram preparadas para 0,5 mg/ml em 1xPBS e referenciadas para 1xPBS. Aproximadamente 0,5 mL de solução de proteína e tampão foram introduzidos na amostra e na célula de referência. As taxas de varredura calorimétricas foram realizadas a taxas de varredura de 60 ºC/hora, de 25 ºC a 110 ºC sob pressão constante. A análise foi realizada usando o software de origem. Os valores relatados são a temperatura na qual a capacidade máxima de calor do pico Fab é registrada. Os resultados são apresentados na Tabela 9, na coluna denominada “Termoestabilidade (ºC)”.
[0420] O título foi determinado como segue. Após a expressão em células de suspensão 293, os anticorpos foram purificados usando cromatografia de Proteína A utilizando métodos padrão. Após a purificação, os anticorpos foram trocados em 1xPBS e as concentrações de proteína foram determinadas por absorbância a 280 nm. Os títulos foram calculados dividindo o rendimento final da proteína purificada pelo volume inicial da cultura de expressão e relatados em miligramas por litro. Os resultados são apresentados na Tabela 9, na coluna denominada “Título de expressão (mg/L)”.
[0421] A afinidade de variantes humanizadas purificadas para tau foi determinada por ressonância plasmônica de superfície (SPR). A análise de SPR foi realizada utilizando um Biacore T200 para determinar a cinética de ligação de anticorpos humanizados à tau humana recombinante. Para preparar uma superfície de sensor, o anticorpo anti-humano (GE Life Sciences) foi imobilizado no chip sensor CM3 por uma ligação de amina e o anticorpo foi capturado em um nível para garantir a máxima ligação de 50 RU. Várias concentrações de tau recombinante variando de 50-0,62 nM foram passadas sobre o ligante capturado a uma taxa de fluxo de 50 uL/min em tampão em execução (HBS + 0,05% de P- 20, 1 mg/ml de BSA), em um único ciclo. Os dados foram duplamente referenciados tanto a um sensor irrelevante que não contém um ligante de anticorpo quanto à concentração de analito de O nM para justificar a dissociação do ligante da porção de captura. Os dados foram então analisados usando um ajuste de 1:1. Os resultados são apresentados na Tabela 9, nas colunas denominadas “kKon (Ms), kor (Ss!) e Ka (nM)Y”.
[0422]A capacidade das variantes humanizadas purificadas de bloquear a internalização de tau foi determinada por ensaios de internalização de células. Um ensaio de internalização empregando separação de células ativadas por fluorescência (FACS) foi realizado para avaliar a capacidade de vários anticorpos para bloquear a internalização neuronal de tau. Os anticorpos que bloqueiam a internalização provavelmente bloqueiam a transmissão de tau. O oligômero solúvel P301L de tau humana 4RON marcado com pHrodo (concentração final de 1,55 ug/mL) foi pré-incubado com variantes humanizadas (titulação da dose: concentração inicial de 80 ug/mL seguida por diluições em série de 4 vezes) por 30 min em temperatura ambiente em meio de cultura de células. A mistura de tau/anticorpo foi então adicionada às linhagens celulares de neuroblastoma B103 na concentração final de
500.000 células/ml e incubada por 3-4 horas a 37 ºC em uma incubadora de cultura de tecidos (CO> a 5%). As células foram então lavadas 3x com meio de cultura, seguido por 10 minutos de incubação do meio de cultura e lavadas 2x com tampão FACS (FBS a 1% em PBS). As células foram ressuspensas em 100 ul de tampão FACS e intensidade média de fluorescência Texas Red medida por FACS LSR Il.
A fluorescência Texas Red de pHrodo é ativada por baixo pH associado a compartimentos endolisossomais após a internalização.
Como FACS detecta células e o pHrodo só apresenta fluorescência após a internalização, apenas a tau internalizada pelas células é detectada.
Quanto menor a intensidade média de fluorescência, menor a quantidade de tau internalizada e maior a atividade de bloqueio do anticorpo testado.
Os resultados são apresentados na Tabela 9. Tabela 9. Características biofísicas/de expressão, afinidade e resultados do ensaio de internalização para variantes humanizadas 3D6 Características a o Nome do Anticorpo Biofísicas/de Afinidade v 8 vv Expressão do e o vW.
SE — o Was = — o E EX |? EEE o 7 =| SR 8 2 kk) o vv o o =cE92xc o > o o E Woº o o o vv o como o — = o o = q A [E o as 2/5 gcso Ss o S 2|s ET8o o 7 v ú o Gr v o o o BETE Ss o o e |O 3oº— o ve geo E E o |º & OOo S = e ES Fr = = É Fr = IHu3D6VHvb1/Hu3D6VLvb1 Oo 00E (SEQ ID (SEQ ID 69,4 176 1,40E+06) na 0,64 80,0 NO:76) NO:83) 15,7 0E-| Hu3D6VHvb2/Hu3D6VLvb2| 804 |a7g 1,50E+06 0,04 84,9 (SEQ ID (SEQ ID o5 o
Hu3D6VHvb2lHu3D6VLvb3| 3 00E (SEQID | (SEQID | 835 |435/100/1,60E+06 "” 0,19! 85,0 NO:77) NO:85)
Hu3D6VHvb3lHu3D6VLvb2 1 50E (SEQID | (SEQID | 808 |528/100/1,40E+06 3 1,07) 71,2 NO:78) NO:84)
Hu3D6VHvb3lHu3D6VLvb3| 1 80E (SEQID | (SEQID | 83,15 | 529 |100/1,60E+06 "” 1,13] 721 NO:78) NO:85)
Hu3D6VHvb4lHu3D6VLvb2 > 90E (SEQID | (SEQID | 81,3 |557 | 98 /6,900E+05 "” 4,20] 61,0 NO:79) NO:84)
Hu3D6VHvb4lHu3D6VLvb3| 3 40 (SEQID | (SEQID | 835 |575/100/9,10E+05 3 3,74] 490 NO:79) NO:85)
Hu3D6VHvb5|Hu3D6VLvb2 | 606 (SEQID | (SEQID | 806 |597 /100/1,80E+06 3 144) 67,2 NO:80) NO:84)
Hu3D6VHvb5|Hu3D6VLvb3| | 806 (SEQID | (SEQID | 829 |612/100/2,00E+06 "” 140) 67,7 NO:80) NO:85)
Hu3D6VHvb6|Hu3DEVLvb2 3 69E (SEQID | (SEQID | 79,9 |395 /100/3,45E+06 na 0,107] 76,3 NO:90) NO:84)
Hu3D6VHvb6|Hu3D6VLvb3| 5 386 (SEQID | (SEQID | 82,5 |350 /100/3,54E+06 na 0,152! 70,0 NO:90) NO:85)
Hu3D6VHvb7/|Hu3D6VLvb2| NO:91) NO:84) Hu3D6VHvb7|Hu3D6VLvb3| (SEQ ID (SEQ ID 83,0 |447 13,69E+06) OE 209 NO:91) NO:85) o Listagem de Sequências
[0423] P10636-8 (SEQ ID NO:1)
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPT EDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEA GIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPP GQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTP SLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKH QPGGGKVQIINKKLDLSNVASKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG SLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTF RENAKAKTDHGAEIVYKSPVYVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVS ASLAKQGL
[0424] P10636-7 (SEQ ID NO:2)
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPT EDGSEEPGSETSDAKSTPTAEAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGT GSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPP KSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRL QTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIK HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVOQS KIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVYVSGDTSPRHL SNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL
[0425] P10636-6 (4RON tau humana) (SEQ ID NO:3)
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGD TPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQK GQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPT PPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPG GGKVQIINKKLDLSNVOSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLG NIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFREN AKAKTDHGAEIVYKSPVYVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASL AKQGL
[0426] P10636-5 (SEQ ID NO:4)
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPT EDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEA GIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPP GQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTP SLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKH QPGGGKVQIVYKPVYDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVOSK IGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLS NVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL
[0427] P10636-4 (SEQ ID NO:5)
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPT EDGSEEPGSETSDAKSTPTAEAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGT GSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPP KSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRL QTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIH HKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKA KTDHGAEIVYKSPVYVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQ GL
[0428] P10636-2 (SEQ ID NO:6)
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGD TPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQK GQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPT PPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPG GGKVQIVYKPVYDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVOQSKIGS LDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNV SSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL
[0429] SEQ ID NO:7; sequência de aminoácidos de Murino 3D6 VH:
EVQLQOQSGADLVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYLHWVRQRPEQGLEWIGWIDPE
NGDTVYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTTLT vsSS
[0430] SEQ ID NO:8; HCDR1 de Kabat/Chothia:
GFNIKDYYLH
[0431] SEQ ID NO:9; Kabat HCDR2:
WIDPENGDTVYDPKFQG
[0432] SEQ ID NO:10; Kabat HCDR3:
LDF
[0433] SEQ ID NO:11; sequência de aminoácidos de Murino 3D6 VL:
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSOSLLDSDGKTYLNWLLORPGQSPKRLIYL VSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKL EIKR
[0434] SEQ ID NO:12; LCDR1 de Murino de Kabat:
KSSQSLLDSDGKTYLN
[0435] SEQ ID NO:13; LCDR2 de Murino de Kabat:
LVSKLDS
[0436] SEQ ID NO:14; LCDR3 de Murino de Kabat:
WQGTHFPYT
[0437] SEQ ID NO:15; hu3D6VHv1:
EVQLVAOSGAEVVRPGALVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPEQGLEWIGWIDPE
NGDTVYDPKFQGKATITADTSTNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCSTLDFWGOQGTLVT vsSS
[0438] SEQ ID NO:16; hu3D6VHv2:
EVQLVAOSGAEVKKPGASVKVSCKVSGFNIKDYYLHWVRQAPEQGLEWMGWIDP ENGDTVYDPKFQGRVTITADTSTNTAYMELSSLTSEDTAVYYCSTLDFWGQGTL VTVSS
[0439] SEQ ID NO:17; hu3D6VHv1b:
EVQLVOSGAEVVRPGALVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPEQGLEWIGWIDPE
NGDTVYDPKFQGKATITADTSTNTAYLQLGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVT vsSS
[0440] SEQ ID NO:18; hu3dD6VHv1bA11:
EVQLVAOSGAEVVKPGATVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQORPGQGLEWIGWIDPE
NGDTVYDPKFQGRATITADTSTDTAYLQLGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVT vsSS
[0441] SEQ ID NO:19; hu3D6VHv5:
EVQLVAOSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRORPGQGLEWIGWIDPE
DGDTVYAPKFQGRATITADTSTDTAYLQLGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVT vsSS
[0442] SEQ ID NO:20; hu3D6VLv1:
DVVMTQSPLSLSVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQORPGQOSPKRLIYL VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTK LEIKR
[0443] SEQ ID NO:21; hu3D6VLv2:
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQORPGOQSPRRLIYL VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTK LEIKR
[0444] SEQ ID NO:22; hu3D6VLv3:
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQORPGOQSPRRLIYL VSKLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKL EIKR
[0445] SEQ ID NO:23; hu3D6VLv4:
DIVMTQTPLSLSVTIGQPASISCKSSQOSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPKRLIYLV SKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKL EIKR
[0446] SEQ ID NO:24; aceitador variável de cadeia pesada Acc. t BACO01986.1
QVALQASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFGSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPI LGIATYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMDLSSLRSEDTAVYYCARGKGEFEGMDV WGQGTTVTVSS
[0447] SEQ ID NO:25; aceitador variável de cadeia pesada Acc.ft IMGTH IGHV1-69-2*01
EVQLVAOSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVD PEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT
[0448] SEQ ID NO:26; aceitador variável de cadeia pesada Acc.t IMGTHIGKJ1*01
QHWGQGTLVTVSS
[0449] SEQ ID NO:27; aceitador variável de cadeia leve Acc. É IMGTHIGKV2-30*02 Acc. t IMGTHIGKV2-30*02
DVVMTOQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQOSLVHSDGNTYLNWFQOQRPGQSPRRLIY KVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWP
[0450] SEQ ID NO:28; aceitador variável de cadeia leve Acc. À IMGTHIGKJ2*01
YTFGQGTKLEIK
[0451] SEQ ID NO:29; aceitador variável de cadeia leve Acc. tt AAZ09048.1
DVVMTOQSPLSLTVTLGQPASISCRSSQOSLVYSDGNTYLNWFQOQRPGQOSPRRLIY RVSHWDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTYWPLTFGQOGT KLEIK
[0452] SEQ ID NO:30; sequência de ácidos nucleicos de murino 3D6 VH:
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGACCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTA GTCAAGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATTTGCA CTGGGTGAGGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGA TCCTGAGAATGGTGATACTGTATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACT ATAACAGCAGACACATCCTCCAATACAGCCTACCTGCAGCTCGGCAGCCTGA CATCTGAGGACACTGCCGTCTATTTCTGTTCTACCCTTGACTTCTGGGGCCAA GGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
[0453] SEQ ID NO:31; sequência de ácidos nucleicos de murino 3D6 VL:
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACC AGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGA CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATC TATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTG GATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTT GGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCGTACACGTTCGGAGGG GGGACCAAGCTGGAAATAAAACGT
[0454] SEQ ID NO:32; CDR-H1 de murino de Kabat
DYYLH
[0455] SEQ ID NO:33; CDR-H1 de murino de Chothia
GFNIKDY
[0456] SEQ ID NO:34; CDR-H2 de murino de Chothia
DPENGD
[0457] SEQ ID NO:35; CDR-H2 de murino ADM
WIDPENGDTV
[0458] SEQ ID NO:36; contato de CDR-L1 de murino
KTYLNWL
[0459] SEQ ID NO:37; contato de CDR-L2 de murino
RLIYLVSKLD
[0460] SEQ ID NO:38; contato de CDR-L3 de murino
WQGTHFPY
[0461] SEQ ID NO:39; contato de CDR-H1 de murino
KDYYLH
[0462] SEQ ID NO:40; contato de CDR-H2 de murino
WIGWIDPENGDTV
[0463] SEQ ID NO:41; contato de CDR-H3 de murino
STLD
[0464] SEQ ID NO:42; CDR-H1 de Kabat-Chothia alternativo
GFTIKDYYLH
[0465] SEQ ID NO:43; CDR-H2 de Kabat alternativo
WIDPEDGDTVYAPKFQG
[0466] SEQ ID NO:44; sequência de aminoácidos VH de consenso da Figura 2 de PCT/IB2017/052544
EVQLVOSGAEVVXPGALVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPEQGLEWIGWIDPE
NGDTVYDPKFQGXATITADTSTNTAYLQLGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVT vsSS
[0467] SEQ ID NO:45; sequência de aminoácidos VL de consenso da Figura 3 de PCT/IB2017/052544
DVVMTQSPLSLSVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQORPGOQSPKRLIYL VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTK LEIKR
[0468] SEQ ID NO:46; hu3D6VHv1bA11B6G2:
EVQLVOSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWVDPE
DGDTVYAPKFQGRATITADTSTDTAYLELGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVT VvSS
[0469] SEQ ID NO:47; hu3D6VHv1bA11B6H3:
EVQLVAOSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPE
DGDTVYAPKFQGRATITADTSTDTAYLELGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVT VvSS
[0470] SEQ ID NO:48; hu3D6VHv1c:
EVQLVAOSGAEVKRPGALVKISCKASGFNFKDYYLHWVRQRPEQGLEWMGWIDP ENGDTVYDEKFQGRVTITADTSTNTAYLQLGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTL VTVSS
[0471] SEQ ID NO:49; hu3D6VHv1d:
EVQLVAOSGAEVKRPGALVKISCKASGYTFTDYYLHWVRQRPEQGLEWMGWVD PEDGDTVYAEKFQGRVTITADTSTNTAYLQLGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTL VTVSS
[0472] SEQ ID NO:50; hu3D6VHv1e:
EVQLVAOSGADVVKPGALVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPEQGLEWIGWIDPE
NGDTVYAEKFQGRVTITADTSTNTAYLELGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTTLT VvSS
[0473] SEQ ID NO:51; hu3D6VHv1f:
EVQLVASGADVVKPGALVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPGQGLEWIGWVDP EDGDTVYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELGSLTSEDTAVYFCSTLDYWGQGTT LTVSS
[0474] SEQ ID NO:52; hu3D6VHv3:
EVQLVAOSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYLHWVRQAPGKGLEWMGWIDP ENGDTVYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTL VTVSS
[0475] SEQ ID NO:53; hu3D6VHv3b:
EVQLVAOSGAEVKKPGALVKISCKVSGYNFKDYYLHWVRQAPGKGLEWMGWIDP ENGDTVYDEKFQGRVTITADTSTNTAYMELGSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTL VTVSS
[0476] SEQ ID NO:54; hu3D6VHv3c:
EVQLVAOSGAEVKKPGALVKISCKVSGYTFTDYYLHWVRQAPGKGLEWMGWVD PEDGDTVYAEKFQGRVTITADTSTNTAYMELGSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGT LVTVSS
[0477] SEQ ID NO:55; hu3D6VHv4:
EVQLVOSGAEVVKPGATVKISCKVSGFNIKDYYLHWVRQORPGKGLEWIGWIDPE
NGDTVYDPKFQGKATITADTSTNTAYLELGSLTSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLVT vsSS
[0478] SEQ ID NO:56; hu3D6VHv4b:
EVQLVOSGAEVVKPGALVKISCKVSGYNFKDYYLHWVRQRPGKGLEWMGWIDP ENGDTVYDEKFQGRVTITADTSTDTAYLELGSLTSEDTAVYYCSTLDFWGQGTL VTVSS
[0479] SEQ ID NO:57; hu3D6VHv4c:
EVQLVOSGAEVVKPGALVKISCKVSGYTFTDYYLHWVRQORPGKGLEWMGWVD PEDGDTVYAEKFQGRVTITADTSTDTAYLELGSLTSEDTAVYYCSTLDFWGQGTL VTVSS
[0480] SEQ ID NO:58; CDR-H1 de Kabat-Chothia alternativo (como em hu3D6VH1c).
GFNFKDYYLH
[0481] SEQ ID NO: 59; CDR-H1 de Kabat-Chothia alternativo (como em hu3D6VHv1d, hu3D6VHv3c e hu3D6VHv4c).
GYTFTDYYLH
[0482] SEQ ID NO: 60; CDR-H1 de Kabat-Chothia alternativo (como em hu3D6VHv3b e hu3D6VHv4b)
GYNFKDYYLH
[0483] SEQ ID NO: 61; CDR-H2 de Kabat alternativo (como em hu3D6VHv1bA11B6G2).
WVDPEDGDTVYAPKFOG
[0484] SEQ ID NO: 62, CDR-H2 de Kabat alternativo (como em hu3D6VHv1c, hu3D6VHv3b e hu3D6VHv4b).
WIDPENGDTVYDEKFQOG
[0485] SEQ ID NO: 63; CDR-H2 de Kabat alternativo (como em hu3D6VHv1d, hu3D6VHv1f, hu3D6VHv3c e hu3D6VHv4c).
WVDPEDGDTVYAEKFOG
[0486] SEQ ID NO: 64; CDR-H2 de Kabat alternativo (como em hu3D6VHv1e).
WIDPENGDTVYAEKFOG
[0487] SEQ ID NO: 65; CDR-H3 de Kabat alternativo (como em hu3D6VHv1f)
LDY
[0488] SEQ ID NO: 66; região variável de cadeia pesada do anticorpo 68A10 de camundongo.
EVOAQLQQASGAELVRSGASVKLSCTASGLNIKDYYIHWVKQRPEQGLEWIGWIDPE NDDTEYAPKFQGRATLTTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTPLDYWGQGTSV TVSS
[0489] SEQ ID NO: 67; CDR-H1 do composto de Kabat/Chothia do anticorpo 6A10 de camundongo.
GLNIKDYYIH
[0490] SEQ ID NO: 68; CDR-H2 de Kabat do anticorpo 6A10 de camundongo.
WIDPENDDTEYAPKFQG
[0491] SEQ ID NO: 69; CDR-H3 de Kabat do anticorpo 6A10 de camundongo
LDY
[0492] SEQ ID NO: 70; modelo da estrutura da VH de Mus (PDBHX1CR9 H)
KVKLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYIQWVKQRPEQGLEWIGWIDPE NGNSEYAPRFQGKATMTADTLSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNADLHDYWGQG TTLTVSS
[0493] SEQ ID NO: 71; sequência de aminoácidos VH de consenso das Figuras 4A e 4B do PCT/IB2017/052544
EVQLVAOSGAEVVKPGALVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPGQGLEWIGWIDPE
NGDTVYDPKFQGRVTITADTSTNTAYLELGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGOQGTLVT vsSS
[0494] SEQ ID NO: 72; cadeia pesada do anticorpo 3D6 quimérico
EVOAQLQQASGADLVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYLHWVRQRPEQGLEWIGWIDPE NGDTVYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTTLT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK
[0495] SEQ ID NO: 73; cadeia leve do anticorpo 3D6 quimérico
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSOSLLDSDGKTYLNWLLORPGQSPKRLIYL VSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE Cc
[0496] SEQ ID NO: 74; sequência de aminoácidos do modelo estrutural variável de cadeia pesada Acc. 5SMYX-VH msSt
EVQAQLQQASGAELVRPGSSVKISCKASGYIFNNYWINWVKQRPGQGLEWIGQIYPG DGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYIVYWGQ GTLVTVSA
[0497] SEQ ID NO: 75; sequência de aminoácidos do aceitador variável da cadeia pesada Acc.t 2RCS-VH huFrwk
QVALQQASGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPA NGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASYYGIYWGQGTT LTVSS
[0498] SEQ ID NO: 76; sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb1
QVALQASGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYLHWVKQRPEQGLEWIGWIDPE
NGDTVYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCSTLDFWGOQGTTLT vsSS
[0499] SEQ ID NO: 77; sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb2
EVQLVAOSGAEVVKPGASVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPE
NGDTVYDPKFQGRATITADTSTDTAYLELSSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVT vsSS
[0500] SEQ ID NO: 78; sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb3
EVQLVAOSGAEVVKPGATVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQORPGKGLEWIGWIDPE
NGDTIYDPKFQGRATITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGOQGTLVT vsSS
[0501] SEQ ID NO: 79; sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb4
EVQLVAOSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPE
NGDTIYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLVT vsSS
[0502] SEQ ID NO: 80; sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb5
EVQLVAOSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPE
DGETIYDPKFOQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLVT vsSS
[0503] SEQ ID NO: 81; sequência de aminoácidos do modelo estrutural variável de cadeia leve Acc.t 5MYX-VL mSt
DVVLTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWLLORPGOSPKRLIYVV SKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVOGTHFPFTFGSGTKLEI K
[0504] SEQ ID NO: 82; sequência de aminoácidos do aceitador variável da cadeia leve Acc.tt ARX71335-VL huFrwk
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSOSLLYSNGKTYLNWLLORPGOQSPKRLIYLV SKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVHYCEQGTHFPLTFGAGTKLE LK
[0505] SEQ ID NO: 83; sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb1
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSOSLLDSDGKTYLNWLLORPGQSPKRLIYL VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVHYCWQGTHFPYTFGAGTKL ELKR
[0506] SEQ ID NO: 84; sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb2
DVVMTQSPLSLSVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQORPGQOSPKRLIYL VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGAGTKL EIKR
[0507] SEQ ID NO: 85; sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb3
DVVMTQSPLSLSVTLGEPASISCRSSOSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYL VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTK LEIKR
[0508] SEQ ID NO: 86; sequência de aminoácidos de um CDR-H1 de composto de Kabat-Chothia alternativo de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHvb4 e hu3D6VHvb5)
GFTIKDYYLH
[0509] SEQ ID NO: 87; sequência de aminoácidos de um CDR-H2 de Kabat alternativo de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHvb3 e hu3D6VHvb4)
WIDPENGDTIYDPKFOG
[0510] SEQ ID NO: 88; sequência de aminoácidos de um CDR-H2 de Kabat alternativo de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHvb5)
WIDPEDGETIYDPKFOG
[0511] SEQ ID NO: 89; sequência de aminoácidos de um CDR-L1 de Kabat alternativo de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VLvb3)
RSSQSLLDSDGKTYLN
[0512] SEQ ID NO: 90; sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb6
EVQLVAOSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPE DGETVYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLV TVSS
[0513] SEQ ID NO: 91; sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb7
EVQLVAOSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPE DGETVYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLV TVSS
[0514] SEQ ID NO: 92; sequência de aminoácidos de um CDR-H2 de Kabat alternativo de um anticorpo 3D6 humanizado (como em hu3D6VHvb6 e hu3D6VHvb7)
WIDPEDGETVYDPKFOG
[0515] SEQ ID NO: 93; uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb1
CAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGGGCAGAATTGGTCAAGCCCGGAGCGTCA GTGAAGCTGAGCTGCACCGCCTCCGGCTTCAACATCAAAGACTACTATCTTC ACTGGGTCAAGCAACGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGTTGGATCG ACCCAGAAAACGGCGACACCGTGTACGATCCGAAGTTTCAGGGGAAGGCCA CCATCACTGCTGATACGTCCTCGAACACCGCCTACCTCCAACTGAGCTCCCT GACTTCCGAGGACACTGCCGTGTACTTCTGTTCCACCCTGGACTTCTGGGGA CAGGGAACTACCCTCACCGTGTCCTCGGCCAGCACTAAGGGGCCTAGCGTC TTTCCGCTGGCCCCGTCCTCCAAGTCCACTTCEGGGTGGAACCGCGGCACTG GGGTGCCTCG
[0516] SEQ ID NO: 94; uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb2
GAAGTGCAGCTCGTGCAGTCCGGTGCCGAAGTCGTGAAACCGGGAGCCAGC GTGAAGATTAGCTGCAAGGCCTCAGGGTTCAACATCAAGGACTATTACCTTCA CTGGGTCAGACAGCGGCCTGGAAAGGGCTTGGAGTGGATCGGATGGATTGA CCCCGAGAACGGCGACACCGTGTACGATCCGAAGTTTCAGGGCCGCGCAAC CATCACTGCTGACACCTCCACCGATACCGCGTACCTGGAACTCTCGAGCCTG ACTTCCGAGGATACGGCCGTGTACTTCTGTTCCACCCTGGACTTCTGGGGAC AAGGGACTCTGGTCACCGTGTCCTCGGCCAGCACTAAGGGGCCTAGCGTCT TTCCGCTGGCCCCGTCCTCCAAGTCCACTTCEGGGTGGAACCGCGGCACTGG GGTGCCTCG
[0517] SEQ ID NO: 95; uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb3
GAGGTGCAACTGGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTCGTGAAGCCGGGAGCCAC CGTGAAGATTTCGTGCAAAGCGTCAGGGTTTAACATCAAGGACTACTATCTGC ACTGGGTCCGCCAGAGGCCCGGGAAGGGCCTCGAGTGGATCGGTTGGATC GACCCTGAAAACGGCGACACCATCTACGATCCAAAGTTCCAGGGCAGAGCCA CTATTACCGCTGACACGAGCACCGATACTGCATACATGGAATTGTCCTCCCT GCGGTCCGAGGATACTGCCGTGTACTACTGTAGCACCCTGGACTTCTGGGG ACAGGGAACCCTTGTGACCGTGTCGTCCGCCAGCACTAAGGGGCCTAGCGT CTTTCCGCTGGCCCCGTCCTCCAAGTCCACTTCEGGGTGGAACCGCGGCACT GGGGTGCCTCG
[0518] SEQ ID NO: 96; uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb4
GAGGTGCAGCTCGTGCAGTCCGGTGCTGAAGTCGTGAAGCCCGGCGCAACT GTGAAGATTAGCTGCAAGGCCTCAGGGTTCACGATCAAGGACTACTATCTGC ACTGGGTCCGCCAACGGCCAGGAAAGGGACTGGAGTGGATCGGATGGATCG ATCCTGAAAACGGCGACACCATCTACGACCCGAAATTTCAGGGGAGAGTGAC CATTACCGCCGATACCTCCACCGACACTGCGTACATGGAACTGTCCAGCCTT CGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTTCGACCCTGGATTTCTGGGGA CAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCGTCCGCCAGCACTAAGGGGCCTAGCGTC TTTCCGCTGGCCCCGTCCTCCAAGTCCACTTCEGGGTGGAACCGCGGCACTG GGGTGCCTCG
[0519] SEQ ID NO: 97; uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb5
GAAGTGCAACTGGTGCAGTCCGGCGCAGAAGTCGTGAAGCCTGGAGCCACC GTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTTCACCATCAAAGACTACTACTTGC ACTGGGTCAGACAGCGCCCAGGAAAGGGTCTGGAATGGATTGGATGGATTG ACCCCGAGGACGGGGAGACTATCTACGATCCGAAGTTTCAGGGCCGGGTCA CCATCACGGCTGATACCTCGACCGACACTGCGTACATGGAACTTTCCTCGCT GCGGTCCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTTCCACCCTGGATTTCTGGGGA CAGGGGACTCTCGTGACTGTGTCAAGCGCCAGCACTAAGGGGCCTAGCGTC TTTCCGCTGGCCCCGTCCTCCAAGTCCACTTCEGGGTGGAACCGCGGCACTG GGGTGCCTCG
[0520] SEQ ID NO: 98; uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb6
GAAGTGCAACTGGTGCAGTCCGGCGCAGAAGTCGTGAAGCCTGGAGCCACC GTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTTCACCATCAAAGACTACTACTTGC ACTGGGTCAGACAGCGCCCAGGAAAGGGTCTGGAATGGATTGGATGGATTG ACCCCGAGGACGGGGAGACTGTGTACGATCCGAAGTTTCAGGGCCGGGTCA CCATCACGGCTGATACCTCGACCGACACTGCGTACATGGAACTTTCCTCGCT GCGGTCCGAGGACACCGCCGTGTATTTCTGTTCCACCCOTGGATTTCTGGGGA CAGGGGACTCTCGTGACTGTGTCAAGCGCCAGCACTAAGGGGCCTAGCGTC TTTCCGCTGGCCCCGTCCTCCAAGTCCACTTCEGGGTGGAACCGCGGCACTG GGGTGCCTCG
[0521] SEQ ID NO: 99; uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VHvb7
GAAGTGCAACTGGTGCAGTCCGGCGCAGAAGTCGTGAAGCCTGGAGCCACC GTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTTCACCATCAAAGACTACTACTTGC ACTGGGTCAGACAGCGCCCAGGAAAGGGTCTGGAATGGATTGGATGGATTG ACCCCGAGGACGGGGAGACTGTGTACGATCCGAAGTTTCAGGGCCGGGTCA CCATCACGGCTGATACCTCGACCGACACTGCGTACATGGAACTTTCCTCGCT GCGGTCCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTTCCACCCTGGATTTCTGGGGA CAGGGGACTCTCGTGACTGTGTCAAGCGCCAGCACTAAGGGGCCTAGCGTC TTTCCGCTGGCCCCGTCCTCCAAGTCCACTTCEGGGTGGAACCGCGGCACTG GGGTGCCTCG
[0522] SEQ ID NO: 100; uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb1
GATGTCGTGATGACCCAGACGCCGCTGACCCTGTCCGTGACTATCGGCCAG CCCGCGTCCATTTOEGTGCAAGAGCAGCCAGTCCCTGCTGGACTCCGACGGA AAGACCTACCTGAACTGGCTGTTGCAACGGCCGGGACAGTCACCCAAGCGC CTCATCTATCTGGTGTCCAAGCTCGACTCGGGAGTGCCTGATAGGTTTTCGG GATCCGGCAGCGGGACCGACTTCACCCTGAAAATCTCAAGAGTGGAAGCCG AGGACCTTGGTGTCCATTACTGTTGGCAGGGTACCCACTTCCCATACACTTTC GGGGCCGGCACTAAGCTCGAACTGAAG
[0523] SEQ ID NO: 101; uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb2
GATGTCGTGATGACCCAGTCGCCGCTGTCCCTGTCCGTGACCCTGGGACAG CCAGCCTCCATTAGCTGCAAGAGCAGCCAGTCCTTGCTGGACTCAGACGGAA AGACCTATCTGAACTGGCTGCTGCAAAGGCCCGGCCAGTCCCCGAAGAGAC TCATCTACCTCGTGTCGAAGCTGGACTCCGGCGTGCCTGATCGCTTCTCGGG TTCCGGGTCTGGAACTGACTTCACCCTCAAAATCTCACGGGTCGAAGCCGAG GACGTGGGCGTGTACTACTGTTGGCAGGGTACCCACTTTCCCTACACTTTCG GGGCGGGAACTAAGCTTGAGATCAAG
[0524] SEQ ID NO: 102; uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo 3D6 humanizado hu3D6VLvb3
GATGTCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGAGCGTGACTCTGGGGGAA CCGGCCAGCATTTCATGCCGGTCCTCACAATCEGCTGCTCGACTCCGACGGAA AGACCTATTTGAACTGGCTGCAGCAAAGACCAGGACAGTCCCCTCGCCGGCT CATCTACCTGGTGTCCAAGCTTGACTCGGGCGTGCCGGATAGGTTCTCCGG GTCCGGAAGCGGCACCGACTTCACTCTGAAAATCTCGCGCGTGGAAGCCGA GGACGTGGGAGTCTACTACTGTTGGCAGGGTACCCACTTCCCCTACACGTTT GGCCAGGGTACCAAGCTCGAGATCAAG
[0525] A SEQ ID NO: 103; sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada de I9gG1 exemplificativa
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK
[0526] SEQ ID NO: 104; sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia leve kappa exemplificativa
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQOSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0527] SEQ ID NO: 105; uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia pesada de I9gG1 exemplificativa
GCCAGCACTAAGGGGCCTAGCGTCTTTCCEGCTGGCCCCGTCCTCCAAGTCC ACTTCGGGTGGAACCGCGGCACTGGGGTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCC GAGCCGGTCACCGTGTCCTGGAACTCEGGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCAT ACTTTCCCTGCGGTGCTGCAGTCCTCCGGGCTCTACTCEGCTGTCAAGCGTGG TCACCGTCCCGAGCTCATCCCTGGGTACTCAGACCTACATTTGCAACGTGAA
CCACAAACCTTCCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTGGAGCCTAAGAGCTGC GACAAGACCCACACCTGTCCCCCGTGTCCCGCCceTtGAGCTGCTGGGCGGC
CCCAGCGTGTTCCTCTTCCCGCCTAAGCCGAAGGACACTCTGATGATCTCGA GAACCCCTGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCGG AAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTGGAAGTCCATAACGCCAAGAC CAAGCCCCGCGAGGAACAGTACAACTCAACTTACCGGGTGGTGTCAGTGCT GACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGT CTCCAACAAGGCGCTGCCGGCCCCCATTGAAAAGACCATCAGCAAGGCTAA GGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTCTACACCTTGCCCCCTTCCCGGGAGGA AATGACCAAGAACCAAGTGTCGCTGACGTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCA TCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTAC AAGACTACCCCGCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCGTTCTTCCTGTATTCCA AGCTCACCGTGGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCA GCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACTCAGAAATCACTGTCCCT TTCCCCCGGAAAGTAA
[0528] SEQ ID NO: 106; uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia leve kappa exemplificativa
CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTT GAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAG CACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGC GAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG GGAGAGTGTTAA

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo que se liga especificamente a tau humana, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada madura compreendendo CDRs H1, H2 e H3 que compreendem SEQ ID NOS: 8, 9 e 10, respectivamente, exceto que a posição H28 pode ser ocupada por N ou T, H54 pode ser ocupada por N ou D, H56 pode ser ocupada por D ou E, e a posição H58 pode ser ocupada por V ou |, e uma região variável de cadeia leve madura compreendendo CDRs L1, L2 e L3 que compreendem SEQ ID NOS: 12, 13 e 14, respectivamente, exceto que a posição L24 pode ser ocupada por K ou R, em que pelo menos uma das seguintes posições é ocupada pelo aminoácido como especificado: H1 é ocupada por Q, H5 é ocupada por Q, H11 é ocupada por L, H20 é ocupada por L, H23 é ocupada por T, H38 é ocupada por K, H75 é ocupada por S, H56 é ocupada por E, H58 é ocupada por |, L10 é ocupado por T, L17 é ocupada por E, L24 é ocupada por R, L37 é ocupada por Q, L83 é ocupada por L, L86 é ocupada por H, L100 é ocupada por A ou Q, L106 é ocupada d por L.
    2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR-H1 compreende SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 86, CDR-H2 compreende SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 92, CDR-H3 compreende SEQ ID NO: 10, CDR-L1 compreende SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 89, CDR-L2 compreende SEQ ID NO: 13 e CDR-L3 compreende SEQ ID NO: 14.
    3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR-H1 compreende SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 86, CDR-H2 compreende SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 88, CDR- H3 compreende SEQ ID NO: 10, CDR-L1 compreende SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 89, CDR-L2 compreende SEQ ID NO: 13 e CDR-L3 compreende SEQ ID NO:
    14.
    4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR-H1 compreende SEQ ID NO: 86, CDR-H2 compreende SEQ ID NO: 92, CDR-H3 compreende SEQ ID NO: 10, CDR-L1 compreende SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 89, CDR-L2 compreende SEQ ID NO: 13 e CDR-L3 compreende SEQ ID NO: 14.
    5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR-H1 tem uma sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO:
    86.
    6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO:
    87.
    7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO:
    88.
    8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO:
    92.
    9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR-L1 tem uma sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO:
    89.
    10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR-H1 tem uma sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO: 86 e CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO:
    87.
    11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR-H1 tem uma sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO: 86 e CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO:
    88.
    12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR-H1 tem uma sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO: 86 e CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO:
    92.
    13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado, anticorpo veneered, ou anticorpo quimérico.
    14. Anticorpo — humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada madura humanizada que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 76-80 e SEQ ID NOs: 90-91 e uma região variável de cadeia leve madura humanizada que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 83-85.
    15. Anticorpo — humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada madura humanizada que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 76-80 e uma região variável de cadeia leve madura humanizada que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 83-85.
    16. Anticorpo — humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada madura humanizada que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 90-91 e uma região variável de cadeia leve madura humanizada que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 83-
    85.
    17. Anticorpo — humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-16, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H93 é ocupada por S e H94 é ocupada por T.
    18. Anticorpo — humanizado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que as posições H93 e H94 são ocupadas por S e T, respectivamente.
    19. Anticorpo — humanizado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a posição H91 na região VH é ocupada por F.
    20. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H1 é ocupada por E, H5 é ocupada por V, H11 é ocupada por V, H20 é ocupada |, H23 é ocupada por K, H38 é ocupada por R, H42 é ocupada por G, H43 é ocupada por K, H66 é ocupada por R, H75 é ocupada por T, H76 é ocupada por D, H81 é ocupada por E, H108 é ocupada por L, H109 é ocupada por V.
    21. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que as posições H1, H5, H11, H20, H23, H38, H42, H43, H66, H75, H76, H81, H108 e H109 na região VH são ocupadas por E, V, V, LK RG KRTD,E,LeV, respectivamente.
    22. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H17 é ocupada por T, H80 é ocupada por M, H83 é ocupada por R.
    23. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as posições H17, H80 e H83 na região VH são ocupadas por T, M e R, respectivamente.
    24. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a posição H58 na região VH é ocupada por |.
    25. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H28 é ocupada por T e H67 é ocupada por V.
    26. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as posições H28 e H67 na região VH são ocupadas por T e V, respectivamente.
    27. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H54 é ocupada por D e H56 é ocupada por E.
    28. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as posições H54 e H56 na região VH são ocupadas por D e E, respectivamente.
    29. Anticorpo — humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-16, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes posições na região VH é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: H1 é ocupada por Q ou E, H5 é ocupada por Q ou V, H11 é ocupada por L ou V, H17 é ocupada por S ou T, H20 é ocupada por L ou |, H23 é ocupada por T ou K, H28 é ocupada por N ou T, H38 é ocupada por K ou R, H42 é ocupada por E ou G, H43 é ocupada por Q ou K, H54 é ocupada por N ou D, H56 é ocupada por D ou E, H58 é ocupada por V ou |, H66 é ocupada por Kou R, H67 é ocupada por A ou V, H75 é ocupada por S ou T, H76 é ocupada por N ou D, H80 é ocupada por L ou M, H81 é ocupada por Q ou E, H83 é ocupada por T ou R, H91 é ocupada por F ou Y, H93 é ocupada por S, H94 é ocupada por T, H108 é ocupada por T ou L, H109 é ocupada por L ou V.
    30. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as posições fornecidas H91, H93 e H94 na região VH são ocupadas por F, S e T, respectivamente.
    31. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as posições H1, H5, H11, H20, H23, H38, H42, H43, H66, H75, H76, H81, H91, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupadas por E, V, V, L K, R G, KR, T, DE, F, S, T, Le V, respectivamente.
    32. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H38, H42, H43, H58, H66, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupadas por E, V, V, T LI K RG KI RT D MERS T,Le V, respectivamente.
    33. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupadas por E, V, V, T L K TR G KIRVT DM, E,R,S,T,LeV, respectivamente.
    34. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H58, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupadas por E, V, V, TIL K T.RG K D,E,l, RV, TI, D, ME,R,S,T,LeV, respectivamente.
    35. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H91, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupadas por E, V, V TI KT RG KD.ER, VT, D, ME,R,F,S,T,LeV, respectivamente.
    36. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as posições H1, H5, H11, H17, H20, H23, H28, H38, H42, H43, H54, H56, H66, H67, H75, H76, H80, H81, H83, H93, H94, H108 e H109 na região VH são ocupadas por E, V, V, , | K T, RG, K D, E,R,V,T, D, M E,R,S,T,LeV, respectivamente.
    37. Anticorpo — humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-16, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes posições na região VL é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: L7 é ocupada por S, L10 é ocupada por S, L15 é ocupada por L, L83 é ocupada por V, L86 é ocupada por Y e L106 é ocupada por |.
    38. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que as posições L7, L10, L15, L83, L86 e L106 são ocupadas por S, S, L, V, Y e Y, respectivamente.
    39. Anticorpo — humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-16, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes posições na região VL é ocupada pelo aminoácido conforme especificado: L7 é Tou S, L10 é Tou S, LI5é louL, LIT é Qouu E, LMI4 é KouR, L37 é Lou Q, L45 é Kou R, L83 é L ou V, L86 é H ou Y, LI00 é A ou Q, LAOB é L oul.
    40. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que as posições L7, L10, L15, L83, L86 e L106 na região VL são ocupadas por S, S, L, V, Y e |, respectivamente.
    41. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que as posições L7, L10, L15, L17, L24, L37, L45, L83, L86, L100 e L106 na região VL são ocupadas por S, S, L E R Q,R,V,Y, Q e |, respectivamente.
    42. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 14,
    caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 76-80 e SEQ ID NOs: 90-91 e a região variável da cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 83-85.
    43. Anticorpo — humanizado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 76-80 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 83-85.
    44, Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 90-91 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 83-85.
    45. Anticorpo — humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
    46. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84.
    47. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
    48. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
    49. Anticorpo — humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84.
    50. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
    51. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
    52. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84.
    53. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
    54. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
    55. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84.
    56. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
    57. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
    58. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84.
    59. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
    60. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
    61. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84.
    62. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
    63. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91 e a região variável da cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
    64. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84.
    65. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91 e a região variável da cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
    66. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico.
    67. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo veneered.
    68. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-67, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo intacto.
    69. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-67, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de ligação.
    70. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação é um anticorpo de cadeia simples, fragmento Fab ou Fab'2.
    71. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-67, caracterizado pelo fato de que é um fragmento Fab ou Fv de cadeia única.
    72. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o isotipo é I9G1 humana.
    73. Anticorpo — humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-65 e 67-72, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve madura é fundida a uma região constante de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada madura é fundida a uma região constante de cadeia pesada.
    74. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é uma forma mutante de uma região constante de cadeia pesada humana natural que tem ligação reduzida a um receptor Fcy com relação à região constante de cadeia pesada humana natural.
    75. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 73 ou a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é de isotipo IgG1.
    76. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura é fundida a uma região constante de cadeia pesada possuindo a sequência da SEQ ID NO: 103 com ou sem a lisina de terminal C e/ou a região variável de cadeia leve madura é fundida a uma região constante de cadeia leve com a sequência de SEQ ID NO: 104.
    TT. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que tem pelo menos uma mutação na região constante.
    78. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que a mutação reduz a fixação ou ativação do complemento pela região constante.
    79. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que tem uma mutação em uma ou mais das posições 241, 264, 265, 270, 296, 297, 318, 320, 322, 329 e 331 de acordo com a numeração EU.
    80. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que tem alanina nas posições 318, 320 e 322.
    81. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-74, caracterizado pelo fato de que o isotipo é um isotipo de IgG2 ou IgG4 humana.
    82. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-81, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é pelo menos 95% p/p puro.
    83. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é conjugado a um agente terapêutico, citotóxico, citostático, neurotrófico ou neuroprotetor.
    84. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-83 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
    85. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica a cadeia pesada e/ou a cadeia leve de um anticorpo conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1-84.
    86. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 30-31, 93-99, 100-102 e 105-106.
    87. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs:
    30-31, 93-97, 100-102 e 105-106.
    88. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 30-31, 98-99, 100-102 e 105-106.
    89. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada madura e uma região variável de cadeia leve madura operacionalmente ligada a uma ou mais sequências regulatórias para efetuar a expressão em uma célula de mamífero de um anticorpo, conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1-83.
    90. Vetor, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico codifica ainda uma região constante de cadeia pesada fundida à região variável de cadeia pesada madura e uma região constante de cadeia leve fundida à região variável de cadeia leve madura.
    91. Vetor, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada tem a sequência da SEQ ID NO: 103 com ou sem a lisina de terminal C e a região constante de cadeia leve tem a sequência da SEQ ID NO: 104.
    92. Vetores, de acordo com a reivindicação 90, caracterizados pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é codificada pela sequência da SEQ ID NO: 105 e a região constante de cadeia leve é codificada pela sequência da SEQ ID NO: 106.
    93. Vetor, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um scFv.
    94. Vetor, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento Fab.
    95. Vetor, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências regulatórias incluem um ou mais de um promotor, intensificador, sítio de ligação ao ribossomo e sinal de terminação da transcrição.
    96. Vetor, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico codifica adicionalmente os peptídeos de sinal fundidos às regiões variáveis de cadeia pesada e leve maduras.
    97. Vetor, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é otimizado por códons para expressão em uma célula hospedeira.
    98. Vetor, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências regulatórias incluem um promotor eucariótico.
    99. Vetor, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico codifica ainda um gene selecionável.
    100. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 85.
    101. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é transformada com o vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 100.
    102. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 89.
    103. Método de expressão de um anticorpo em uma célula de mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a incorporação do ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 89, no genoma de um animal transgênico, pelo qual o anticorpo é expresso.
    104. Primeiro e segundo vetores, respectivamente, caracterizados pelo fato de que compreendem ácidos nucleicos que codificam uma região variável de cadeia pesada madura e uma região variável de cadeia leve madura, cada um operacionalmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias para efetuar a expressão em uma célula de mamífero de um anticorpo, conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1-83.
    105. Vetores, de acordo com a reivindicação 104, caracterizado pelo fato de que os ácidos nucleicos, respectivamente, codificam ainda uma região constante de cadeia pesada fundida à região variável de cadeia pesada madura e uma região constante de cadeia leve fundida à região variável de cadeia leve madura.
    106. Vetores, de acordo com a reivindicação 105, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada tem a sequência da SEQ ID NO: 103 com ou sem a lisina de terminal C e a região constante de cadeia leve tem a sequência da SEQ ID NO: 104.
    107. Vetores, de acordo com a reivindicação 105, caracterizados pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é codificada pela sequência da SEQ ID NO: 105 e a região constante de cadeia leve é codificada pela sequência da SEQ ID NO: 106.
    108. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende os ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 104.
    109. Método de expressão de um anticorpo em uma célula de mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a incorporação do ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 104, no genoma de um animal transgênico, pelo qual o anticorpo é expresso.
    110. Método de humanização de um anticorpo de camundongo, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: (a) selecionar um ou mais anticorpos aceitadores; (b) identificar os resíduos de aminoácidos do anticorpo de camundongo a serem retidos; (c) sintetizar um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada humanizada compreendendo as CDRs da cadeia pesada de anticorpo de camundongo e um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve humanizada compreendendo as CDRs da cadeia leve de anticorpo de camundongo; e (d) expressar os ácidos nucleicos em uma célula hospedeira para produzir um anticorpo humanizado; em que o anticorpo de camundongo é 3D6, em que 3D6 é caracterizado por uma região variável de cadeia pesada madura da SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve madura da SEQ ID NO: 11.
    111. Método para produzir um anticorpo humanizado, quimérico ou veneered, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar células transformadas com ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo, de modo que as células secretam o anticorpo; e (b) purificar o anticorpo a partir de meios de cultura de células; em que o anticorpo é uma forma humanizada, quimérica ou veneered de 3D6.
    112. Método para produzir uma linhagem celular que produz um anticorpo humanizado, quimérico ou veneered, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir um vetor que codifica cadeias pesadas e leves de um anticorpo e um marcador selecionável nas células; (b) propagar as células em condições para selecionar células que tenham maior número de cópias do vetor; (c) isolar células únicas a partir das células selecionadas; e (d) armazenar as células clonadas a partir de uma única célula selecionada com base no rendimento do anticorpo; em que o anticorpo é uma forma humanizada, quimérica ou veneered de 3D6.
    113. Método, de acordo com a reivindicação 112, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, a propagação das células em condições seletivas e a varredura de linhagens celulares que expressam e secretam naturalmente o anticorpo em uma quantidade de pelo menos 100 mg/L/10º células/24h.
    114. Método para inibir ou reduzir a agregação de tau em um sujeito que tem ou está em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por tau, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito um regime efetivo do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-84, inibindo ou reduzindo assim a agregação de tau no sujeito.
    115. Método, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é uma versão humanizada de 3D6.
    116. Método para tratar ou efetuar a profilaxia de uma doença relacionada à tau em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um regime eficaz de um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1-84 e assim tratar ou efetuar a profilaxia da doença.
    117. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a doença relacionada à tau é doença de Alzheimer, síndrome de Down, disfunção cognitiva leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós-encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia glial globular, complexo parkinsonismo-demência de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauoupatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP).
    118. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que a doença relacionada à tau é a doença de Alzheimer.
    119. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que o paciente é um portador de ApoE4.
    120. Método para reduzir a transmissão aberrante de tau, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um regime eficaz de um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-84 e, assim, reduzir a transmissão de tau.
    121. Método para induzir fagocitose de tau, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um regime eficaz de um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1-84 e, assim, induzir a fagocitose de tau.
    122. Método para inibir agregação ou deposição de tau, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um regime eficaz de um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-84, inibindo assim a agregação ou deposição de tau.
    123. Método para inibir a formação de emaranhados de tau, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um regime eficaz de um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-84.
    124. Método para detectar depósitos de proteína tau em um sujeito com ou em risco de ter uma doença associada à agregação ou deposição de tau, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um sujeito um anticorpo, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1-84 e detectar o anticorpo ligado à tau no sujeito.
    125. Método, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que a doença relacionada à agregação ou deposição de tau é doença de Alzheimer, síndrome de Down, disfunção cognitiva leve, taupatia primária relacionada à idade, parkinsonismo pós-encefalítico, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Pick, doença de Niemann-Pick tipo C, paralisia supranuclear, demência frontotemporal, degeneração lobar frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia glial globular, complexo parkinsonismo- demência de Guam, degeneração corticobasal (CBD), demência com corpos de Lewy, variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), encefalopatia traumática crônica (CTE), tauoupatia glial globular (GGT) ou paralisia supranuclear progressiva (PSP).
    126. Método, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado por injeção intravenosa no corpo do sujeito.
    127. Método, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado diretamente ao cérebro do sujeito por injeção intracraniana ou pela perfuração de um furo através do crânio do sujeito.
    128. Método, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é marcado.
    129. Método, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é marcado com um marcador fluorescente, um marcador paramagnético ou um marcador radioativo.
    130. Método, de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que o marcador radioativo é detectado usando tomografia por emissão de pósitrons (PET) ou tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT).
    131. Método para medir a eficácia do tratamento em um sujeito sendo tratado para uma doença associada à agregação ou deposição de tau, caracterizado pelo fato de que compreende (a) medir um primeiro nível de depósitos de proteína tau no sujeito antes do tratamento por administração a um sujeito de um anticorpo, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1-84 e detecção de uma primeira quantidade do anticorpo ligado à tau no sujeito, (b) administrar o tratamento ao sujeito, (c) medir um segundo nível de depósitos de proteína tau no sujeito após o tratamento ao administrar o anticorpo a um sujeito e detectar o anticorpo ligado à tau no sujeito,
    em que uma diminuição no nível de depósitos de proteína tau indica uma resposta positiva ao tratamento.
    132. Método para medir a eficácia do tratamento em um sujeito sendo tratado para uma doença associada à agregação ou deposição de tau, caracterizado pelo fato de que compreende (a) medir um primeiro nível de depósitos de proteína tau no sujeito antes do tratamento por administração a um sujeito de um anticorpo, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1-84 e detecção de uma primeira quantidade de anticorpo ligado à tau no sujeito, (b) administrar o tratamento ao sujeito, (c) medir um segundo nível de depósitos de proteína tau no sujeito após o tratamento por administração, a um sujeito, do anticorpo, e detecção de uma segunda quantidade do anticorpo ligado à tau no sujeito, em que nenhuma alteração no nível de depósitos de proteína tau ou um pequeno aumento nos depósitos de proteína tau indica uma resposta positiva ao tratamento.
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