CN109415434B - 识别tau的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了特异性结合tau的抗体。所述抗体抑制或延迟与tau相关联的病理和相关联的症状恶化。

Description

识别TAU的抗体
相关申请的交叉引用
本申请根据35 USC 119(e)要求2016年5月2日提交的美国临时申请No.62/330,800的权益，所述临时申请出于所有目的以引用的方式整体并入。
对序列表的引用
书写在文件497448SEQLIST.txt中的序列表为59千字节，创建于2017年5月2日，并且以引用的方式在此并入。
背景技术
Tau是可以磷酸化形式存在的众所周知的人蛋白(参见，例如，Goedert,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:4051-4055(1988)；Goedert,EMBO J.8:393-399(1989)；Lee,Neuron 2:1615-1624(1989)；Goedert,Neuron 3:519-526(1989)；Andreadis,Biochemistry 31:10626-10633(1992)。据报道，Tau在稳定微管方面发挥作用，尤其是在中枢神经系统中。总tau(t-tau，即磷酸化和非磷酸化形式)和磷酸化-tau(p-tau，即磷酸化tau)由脑部响应于神经元损伤和神经变性而释放，并且据报道，相对于普通群体，在阿尔茨海默病患者的CSF中以增大的水平存在(Jack等人,Lancet Neurol 9:119–28(2010))。
Tau是神经原纤维缠结的主要成分，其与斑一起是阿尔茨海默病的标志性特征。缠结构成直径测量为10nm的异常原纤维，其成对出现，以螺旋方式缠绕，具有80nm的规则周期性。神经原纤维缠结内的tau被异常磷酸化(过度磷酸化)，其中磷酸酯基团附接于分子上的特定位点。在阿尔茨海默病中的内嗅皮质的II层神经元、海马的CA1和钩回下区、扁桃体以及新皮质的深层(III层、V层和表层VI)中观察到神经原纤维缠结的严重受累。另外已有报道，过度磷酸化的tau干扰微管组装，这可能促进神经元网络的破坏。
Tau内含物是几种神经变性疾病的定义神经病理学的一部分，所述疾病包括阿尔茨海默病、额颞叶变性、进行性核上性麻痹以及皮克氏病(Pick’s disease)。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种特异性结合tau的分离的单克隆抗体。此类抗体的实例结合SEQ ID NO:3的氨基酸残基55-78、60-75或61-70(分别对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-136、118-133或119-128)内的表位。
一些此类抗体与抗体16G7竞争结合人tau。一些此类抗体与16G7结合人tau上的相同表位。
一些抗体包含单克隆抗体16G7的三个轻链CDR和三个重链CDR，其中16G7是通过具有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和具有包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链可变区表征的小鼠抗体。在一些抗体中，三个重链CDR如由Kabat/Chothia复合物所定义(SEQ ID NO:8、9和10)，并且三个轻链CDR如由Kabat/Chothia复合物所定义(SEQ ID NO:12、13和14)。
例如，抗体可以是16G7或其嵌合、饰面(veneered)或人源化形式。在一些此类抗体中，可变重链与人序列具有≥85％的同一性。在一些此类抗体中，可变轻链与人序列具有≥85％的同一性。在一些此类抗体中，可变重链和可变轻链中的每一个与人种系序列具有≥85％的同一性。在一些此类抗体中，成熟重链可变区包括如由Kabat/Chothia复合物所定义的三个重链CDR(SEQ ID NO:8、9和10)和如由Kabat/Chothia复合物所定义的三个轻链CDR(SEQ ID NO:12、13和14)；条件是位置H31被S或G占据，位置H60被N或A占据，并且位置64被K或Q占据。在一些此类抗体中，CDR-H1具有包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些此类抗体中，CDR-H2具有包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些此类抗体中，CDR-H2具有包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些此类抗体中，抗体是人源化抗体。
在一些此类抗体中，CDR-H1具有包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且CDR-H2具有包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些此类抗体中，CDR-H1具有包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且CDR-H2具有包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
一些抗体是特异性结合人tau的人源化或嵌合的16G7抗体，其中16G7是通过SEQID NO:7的成熟重链可变区和SEQ ID NO:11的成熟轻链可变区表征的小鼠抗体。一些此类抗体是人源化抗体，其包括包含16G7的三个重链CDR的人源化成熟重链可变区和包含16G7的三个轻链CDR的人源化成熟轻链可变区。在一些此类抗体中，CDR具有选自以下的组的定义：Kabat、Chothia、Kabat/Chothia复合物、AbM以及Contact。
在一些此类抗体中，人源化成熟重链可变区包含16G7的三个Kabat/Chothia复合物重链CDR(SEQ ID NO:8-10)，并且人源化成熟轻链可变区包含16G7的三个Kabat/Chothia复合物轻链CDR(SEQ ID NO:12-14)。
在一些此类抗体中，人源化成熟重链可变区包含16G7的三个Kabat重链CDR(SEQID NO:39、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)，并且人源化成熟轻链可变区包含16G7的三个Kabat轻链CDR(SEQ ID NO:12-14)。
在一些此类抗体中，人源化成熟重链可变区包含16G7的三个Chothia重链CDR(SEQID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:10)，并且人源化成熟轻链可变区包含16G7的三个Chothia轻链CDR(SEQ ID NO:12-14)。
在一些此类抗体中，人源化成熟重链可变区包含16G7的三个AbM重链CDR(SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:10))，并且人源化成熟轻链可变区包含16G7的三个AbM轻链CDR(SEQ ID NO:12-14)。
在一些此类抗体中，人源化成熟重链可变区包含16G7的三个Contact重链CDR(SEQID NO:46-48)，并且人源化成熟轻链可变区包含16G7的三个Contact轻链CDR(SEQ ID NO:43-45)。
在一些抗体中，人源化成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:15-27中的任一个至少90％相同的氨基酸序列，并且人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:28-30中的任一个至少90％相同的氨基酸序列。
在一些此类抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：H1被E占据，H5被Q占据，H7被P占据，H9被S占据，H10被V占据，H11被L占据，H12被V占据，H13被R占据，H20被L占据，H40被R占据，H48被I占据，H66被K占据，H67被A占据，H69被L占据，H71被V占据，H73被I占据，H75被S占据，H80被V占据，H82a被T占据，H82b被S占据，H83被T占据，并且H85被E占据。在一些此类抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73、H75、H80、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、P、S、V、L、V、R、L、R、I、K、A、L、V、I、S、V、T、S、T和E占据。
在一些抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：H1被E占据，H5被Q占据，H7被P占据，H9被S占据，H10被V占据，H11被L占据，H12被V占据，H13被R占据，H20被L占据，H48被I占据，H69被L占据，H71被V占据，H82a被T占据，H82b被S占据，H83被T占据，并且H85被E占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H48、H69、H71、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、P、S、V、L、V、R、L、I、L、V、T、S、T和E占据。
在一些抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：H1被E占据，H5被Q占据，H11被L占据，H12被V占据，H20被L占据，H48被I占据，H69被L占据，H71被V占据，H82a被T占据，H82b被S占据，H83被T占据，并且H85被E占据。在一些抗体中，VH区中的H1、H5、H11、H12、H20、H48、H69、H71、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、L、V、L、I、L、V、T、S、T和E占据。
在一些抗体中，VH区中的至少一个以下位置中被指定氨基酸占据：H1被E占据，H12被V占据，H31被G占据，H40被R占据，H48被I占据，H60被A占据，H69被L占据，H73被I占据，并且H83被T占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H12、H31、H40、H48、H60、H69、H73和H83分别被E、V、G、R、I、A、L、I和T占据。
在一些抗体中，VH区中的至少一个以下位置中被指定氨基酸占据：H1被E占据，H12被V占据，H40被R占据，H48被I占据，H69被L占据，H73被I占据，并且H83被T占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H12、H40、H48、H69、H73和H83分别被E、V、R、I、L、I和T占据。
在一些抗体中，VH区中的至少一个以下位置中被指定氨基酸占据：H1被E占据，H12被V占据，H40被R占据，H48被I占据，H66被K占据，H67被A占据，H69被L占据，H71被V占据，H73被I占据，并且H83被T占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H12、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73和H83分别被E、V、R、I、K、A、L、V、I和T占据。
在一些抗体中，VH区中的至少一个以下位置中被指定氨基酸占据：H1被E占据，H12被V占据，H40被R占据，H48被I占据，H69被L占据，H73被I占据，并且H83被T占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H12、H40、H48、H69、H73和H83分别被E、V、R、I、L、I和T占据。在一些抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定的氨基酸占据：H7被P占据、H71被V占据，并且H73被I占据。在一些抗体中，VH区中的位置H7、H71和H73分别被P、V和I占据。在一些抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定的氨基酸占据：H31被G占据并且H60被A占据。在一些抗体中，VH区中的位置H31和H60分别被G和A占据。在一些抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：H1被Q或E占据，H5被V或Q占据，H7被S或P占据，H9被A或S占据，H10被E或V占据，H11被V或L占据，H12被K或V占据，H13被K或R占据，H20被V或L占据，H31被G或S占据，H37被V或A占据，H38被R或K占据，H40被A或R占据，H48被M或I占据，H60被A或N占据，H64被Q或K占据，H66被R或K占据，H67被V或A占据，H69被M或L占据，H71被R或V占据，H73被T或I占据，H75被I、S或A占据，H80被M或V占据，H82a被S或T占据，H82b被R或S占据，H83被R或T占据，并且H85被D或E占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H37、H38、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73、H75、H80、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、P、S、V、L、V、R、L、A、K、R、I、K、A、L、V、I、S、V、T、S、T和E占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H5、H11、H12、H20、H48、H69、H71、H75、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、L、V、L、I、L、V、A、T、S、T和E占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H12、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73和H83分别被E、V、R、I、K、A、L、V、I和T占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H12、H31、H40、H48、H60、H66、H67、H69、H71、H73和H83分别被E、V、G、R、I、A、K、A、L、V、I和T占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H12、H40、H48、H69、H73和H83分别被E、V、R、I、L、I和T占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H12、H31、H40、H48、H60、H66、H67、H69、H71、H73和H83分别被Q、V、G、R、I、A、K、A、L、V、I和T占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H7和H73分别被Q、P、V和I占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H12、H31、H40、H48、H60、H64、H69、H73和H83分别被E、V、G、R、I、A、Q、L、I和T占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H48、H69、H71、H75、H82a、H82b、H83和H85被E、Q、P、S、V、L、V、R、L、I、L、V、A、T、S、T和E占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H5、H11、H12、H20、H48、H66、H67、H69、H71、H73、H75、H82a、H82b、H83和H85被E、Q、L、V、L、I、K、A、L、V、I、S、T、S、T和E占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H38、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73I、H75、H80、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、P、S、V、L、V、R、L、K、R、I、K、A、L、V、I、S、V、T、S、T和E占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73、H75、H80、H82a、H82b、H83和H85分别被Q、P、S、V、L、V、R、L、R、I、K、A、L、V、I、S、V、T、S、T和E占据。在一些抗体中，VH区中的位置H7、H71和H73分别被P、V和I占据。在一些抗体中，VH区中的位置H71被V占据。在一些抗体中，VH区中的位置H1、H7、H71和H73被E、P、V和I占据。
在一些抗体中，VL区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：L4被L占据，L9被S占据，L15被V占据，L22被S占据，并且L43被S占据。在一些抗体中，VL区中的位置L4、L9、L15、L22和L43分别被L、S、V、S和S占据。
在一些抗体中，VL区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：L4被L占据，L9被S占据，L15被V占据，L18被K占据，L19被V占据，L21被M占据，L22被S占据，并且L43被S占据。在一些抗体中，VL区中的L4、L9、L15、L18、L19、L21、L22和L43分别被L、S、V、K、V、M、S和S占据。
在一些抗体中，VL区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：L4被M或L占据，L9被D或S占据，L15被L或V占据，L18被R或K占据，L19被A或V占据，L21被I或M占据，L22被N或S占据，L43被P或S占据，并且L48被I或M占据。在一些抗体中，VL区中的L4、L9、L15、L18、L19、L21、L22和L43分别被L、S、V、K、V、M、S和S占据。
在一些抗体中，VL区中的位置L4、L9、L15、L22和L43分别被L、S、V、S和S占据。在一些抗体中，VL区中的位置L4、L9、L15、L18、L19、L21、L22和L43分别被L、S、V、K、V、M、S和S占据。
一些抗体包含具有与SEQ ID NO:15-27中的任一个至少95％相同的氨基酸序列的成熟重链可变区和具有与SEQ ID NO:28-30中的任一个至少95％相同的氨基酸序列的成熟轻链可变区。一些抗体包含具有与SEQ ID NO:15-27中的任一个至少98％相同的氨基酸序列的成熟重链可变区和具有与SEQ ID NO:28-30中的任一个至少98％相同的氨基酸序列的成熟轻链可变区。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:15-27中的任一个的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28-30中的任一个的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些抗体中，成熟重链可变区具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
例如，抗体可以是嵌合抗体。例如，抗体可以是饰面抗体。
抗体可以是完整的小鼠、嵌合、饰面或人源化抗体或结合片段、单链抗体Fab片段、Fab'2片段或单链Fv。一些抗体具有人IgG1同种型，而其他抗体可具有人IgG2或IgG4同种型。一些抗体具有与轻链恒定区融合的成熟轻链可变区和与重链恒定区融合的成熟重链可变区。一些抗体的重链恒定区是天然人重链恒定区的突变形式，相对于天然人重链恒定区，所述天然人重链恒定区的突变形式与Fcγ受体的结合减少。
一些抗体可在恒定区中具有至少一个突变，诸如通过恒定区减少补体固定或活化的突变，例如，在EU编号的位置241、264、265、270、296、297、318、320、322、329和331中的一个或多个处的突变。一些抗体在位置318、320和322处具有丙氨酸。一些抗体可以是至少95％w/w纯。抗体可缀合于治疗剂、细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、神经营养剂或神经保护剂。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文公开的任何抗体和药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了一种编码本文公开的任何抗体的重链和/或轻链的核酸，一种包含所述核酸的重组表达载体以及一种用所述重组表达载体转化的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了将本文所述的任何非人抗体人源化的方法，所述非人抗体例如，小鼠抗体16G7，其中16G7通过SEQ ID NO:7的成熟重链可变区和SEQ ID NO:11的成熟轻链可变区来表征。此类方法可包括选择一种或多种受体抗体，合成编码包含小鼠重链的CDR的人源化重链的核酸和编码包含小鼠抗体轻链的CDR的人源化轻链的核酸，以及在宿主细胞中表达该核酸以产生人源化抗体。
还提供了产生抗体的方法，所述抗体诸如人源化、嵌合或饰面抗体，例如16G7的人源化、嵌合或饰面形式。在此类方法中，对用编码抗体的重链和轻链的核酸转化的细胞进行培养，以使细胞分泌抗体。然后可以从细胞培养基中纯化抗体。
产生本文公开的任何抗体的细胞系可以通过以下方式产生：将编码抗体的重链和轻链以及选择标志物的载体引入细胞中，使细胞在用以选择具有增加拷贝数的载体的细胞的条件下增殖，从所选细胞中分离单细胞；并且将由基于抗体的产量选择的单细胞克隆的细胞建库。
一些细胞可以在选择性条件下增殖，并筛选天然表达和分泌至少100mg/L/106个细胞/24小时的细胞系。可以从所选细胞中分离单细胞。然后可以将由单细胞克隆的细胞建库。可以基于期望特性选择单细胞，诸如抗体的产量。示例性细胞系是表达16G7的细胞系。
本发明还提供了抑制或减少患有tau介导的淀粉样变性或有发展tau介导的淀粉样变性风险的受试者中的tau聚集的方法，包括向受试者施用本文公开的抗体的有效方案，从而抑制或减少受试者中的tau聚集。示例性抗体包括16G7的人源化型式。
还提供了在受试者中治疗tau相关疾病或实现tau相关疾病的预防的方法，包括施用本文公开的抗体的有效方案并且从而治疗疾病或实现疾病的预防。这种疾病的实例是阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病(tauopathy)、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病(type C Niemann-Pickdisease)、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征(amyotrophic lateral sclerosis/parkinsonism dementia complex of Guam)、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆(dementia with Lewy bodies)、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)。在一些方法中，tau相关疾病是阿尔茨海默病。在一些方法中，患者是ApoE4载体。
还提供了减少tau的异常传播的方法，包括施用本文公开的抗体的有效方案并且从而减少tau的传播。
还提供了诱导tau的吞噬的方法，包括施用本文公开的抗体的有效方案并且从而诱导tau的吞噬。
还提供了抑制tau聚集或沉积的方法，包括施用本文公开的抗体的有效方案，从而抑制tau聚集或沉积。
还提供了抑制tau缠结形成的方法，包括施用本文公开的抗体的有效方案。
本发明还提供了一种在患有与tau聚集或沉积相关联的疾病或有患与tau聚集或沉积相关联的疾病风险的受试者中检测tau蛋白沉积物的方法，包括向受试者施用本文公开的抗体，以及检测受试者中与tau结合的抗体。这种疾病的实例是阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)。在一些实施方案中，通过静脉内注射将抗体施用到受试者体内。在一些实施方案中，通过颅内注射或通过钻取穿透受试者的颅骨的孔来将抗体直接施用于受试者的脑部。在一些实施方案中，对抗体进行标记。在一些实施方案中，抗体用荧光标记、顺磁性标记或放射性标记进行标记。在一些实施方案中，使用正电子发射断层摄影术(PET)或单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)检测放射性标记。
本发明还提供了一种在被治疗与tau聚集或沉积相关联的疾病的受试者中测量治疗的功效的方法，包括在通过向受试者施用本文公开的抗体进行治疗之前测量受试者中tau蛋白沉积物的第一水平，并且检测受试者中与tau结合的抗体的第一量；向受试者施用治疗；在通过向受试者施用抗体进行治疗之后测量受试者中tau蛋白沉积物的第二水平，并且检测受试者中与tau结合的抗体；其中tau蛋白沉积物水平的降低表明对治疗的阳性应答。
本发明还提供了一种在被治疗与tau聚集或沉积相关联的疾病的受试者中测量治疗的功效的方法，包括在通过向受试者施用本文公开的抗体进行治疗之前测量受试者中tau蛋白沉积物的第一水平，并且检测受试者中与tau结合的抗体的第一量；向受试者施用治疗；在通过向受试者施用抗体进行治疗之后测量受试者中tau蛋白沉积物的第二水平，并且检测受试者中与tau结合的抗体的第二量；其中tau蛋白沉积物的水平没有变化或tau蛋白沉积物的少量增加表明对治疗的阳性应答。
附图说明
图1描绘了设计用于绘制由鼠16G7单克隆抗体结合的一个或多个表位的图谱的实验的结果。
图2描绘了小鼠16G7抗体和16G7抗体的人源化型式的重链可变区的比对。如由Kabat/Chothia复合物所定义的CDR以粗体显示。。将小鼠16G7抗体和16G7抗体的人源化型式的重链可变区中氨基酸残基与“Majority”序列不同的位置框入框中。
图3描绘了小鼠16G7抗体和16G7抗体的人源化型式的轻链可变区的比对。如由Kabat所定义的CDR以粗体显示。将小鼠16G7抗体和16G7抗体的人源化型式的轻链可变区中氨基酸残基与“Majority”序列不同的位置框入框中。
图4A和4B描绘了显示出16G7免疫捕获来自人阿尔茨海默病组织的tau的实验的结果。
图5描绘了所选小鼠单克隆抗-tau抗体的解聚测定的结果。
图6描绘了小鼠16G7抗体对tau的亲和力。
图7描绘了嵌合16G7抗体和人源化16G7抗体VHV2a、VHV2b和VHV6a H7L2对tau的结合动力学。
图8描绘了小鼠16G7Fab片段和小鼠16G7完整抗体对聚集的tau的亲合力。
序列的简要描述
SEQ ID NO:1列出人tau的同种型的氨基酸序列(Swiss-Prot P10636-8)。
SEQ ID NO:2列出人tau的同种型的氨基酸序列(Swiss-Prot P10636-7)。
SEQ ID NO:3列出人tau的同种型的氨基酸序列(Swiss-Prot P10636-6)(4R0N人tau)。
SEQ ID NO:4列出人tau的同种型的氨基酸序列(Swiss-Prot P10636-5)。
SEQ ID NO:5列出人tau的同种型的氨基酸序列(Swiss-Prot P10636-4)。
SEQ ID NO:6列出人tau的同种型的氨基酸序列(Swiss-Prot P10636-2)。
SEQ ID NO:7列出小鼠16G7抗体的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8列出小鼠16G7抗体的Kabat/Chothia复合物CDR-H1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9列出小鼠16G7抗体的Kabat CDR-H2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10列出小鼠16G7抗体的Kabat CDR-H3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11列出小鼠16G7抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12列出小鼠16G7抗体的Kabat CDR-L1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13列出小鼠16G7抗体的Kabat CDR-L2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14列出小鼠16G7抗体的Kabat CDR-L3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv2a的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv2aB7的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv2b的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv2bH7的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv5V的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv5VR的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv6a的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv6b的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27列出人源化16G7抗体的重链可变区hu16G7VHv7的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28列出人源化16G7抗体的轻链可变区hu16G7VLv1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29列出人源化16G7抗体的轻链可变区hu16G7VLv2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30列出人源化16G7抗体的轻链可变区hu16G7VLv3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31列出重链可变受体Acc.#AAA18265.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32列出重链可变受体Acc.#ADW08092.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33列出重链可变受体Acc.#IMGT#IGHV1-2*02的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34列出轻链可变受体Acc.#AAB24404.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35列出轻链可变受体Acc.#AEK69364.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36列出轻链可变受体Acc.#IMGT#IGKV4-1*01的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37列出编码小鼠16G7抗体的重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:38列出编码小鼠16G7抗体的轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:39列出小鼠16G7抗体的Kabat CDR-H1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40列出小鼠16G7抗体的Chothia CDR-H1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41列出小鼠16G7抗体的Chothia CDR-H2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42列出小鼠16G7抗体的AbM CDR-H2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43列出小鼠16G7抗体的Contact CDR-L1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44列出小鼠16G7抗体的Contact CDR-L2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45列出小鼠16G7抗体的Contact CDR-L3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46列出小鼠16G7抗体的Contact CDR-H1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47列出小鼠16G7抗体的Contact CDR-H2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48列出小鼠16G7抗体的Contact CDR-H3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49列出人源化16G7抗体的另选的Kabat-Chothia复合物CDR-H1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50列出人源化16G7抗体的另选的Kabat CDR-H2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51列出人源化16G7抗体的另选的Kabat CDR-H2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:52列出小鼠16G7和人源化16G7抗体的重链可变区中的共有氨基酸序列(在图2中标记为“Majority”)。
SEQ ID NO:53列出小鼠16G7和人源化16G7抗体的轻链可变区之间的共有氨基酸序列(在图3中标记为“Majority”)。
SEQ ID NO:54列出嵌合16G7抗体的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:55列出嵌合16G7抗体的轻链的氨基酸序列。
定义
单克隆抗体或其他生物学实体通常以分离形式提供。这意味着抗体或其他生物学实体通常至少50％w/w不含由其生产或纯化产生的干扰性蛋白质和其他污染物，但不排除单克隆抗体与过量的一种或多种药学上可接受的载体或旨在便于其使用的其他媒介物组合的可能性。有时单克隆抗体至少60％、70％、80％、90％、95％或99％w/w不含由其生产或纯化产生的干扰性蛋白质和污染物。通常，分离的单克隆抗体或其他生物学实体是其纯化后剩余的主要大分子物类。
抗体与其靶抗原的特异性结合意指至少106、107、108、109、1010、1011或1012M-1的亲和力和/或亲合力。特异性结合的量级可检测地更高，并且可区别于对至少一种不相关的靶标发生的非特异性结合。特异性结合可以是特定官能团之间形成键或特定空间配合(例如，锁钥型)的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而，特异性结合不一定意味着抗体仅仅结合一个靶标。
基本抗体结构单元是亚基的四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。此可变区最初被表达为与可切割的信号肽连接。没有信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区意指没有轻链信号肽的轻链可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。
轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10或更多个氨基酸的“D”区。大致参见Fundamental Immunology,Paul,W.编辑,第2版Raven Press,N.Y.,1989,第7章(出于所有目的以引用的方式整体并入)。
免疫球蛋白轻链或重链可变区(在本文中也分别称为“轻链可变结构域”(“VL结构域”)或“重链可变结构域”(“VH结构域”))由被三个“互补决定区”或“CDR”间隔开的“框架”区组成。框架区用于对齐CDR，以用于与抗原的表位特异性结合。CDR包括主要负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。从氨基末端到羧基末端，VL和VH结构域均包含以下框架(FR)和CDR区：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。VL结构域的CDR 1、2和3在本文也分别称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；VH结构域的CDR 1、2和3在本文也分别称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
每个VL和VH结构域的氨基酸的分配与CDR的任何常规定义一致。常规定义包括Kabat定义(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1987和1991)、Chothia定义(Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917,1987；Chothia等人,Nature 342:878-883,1989)；ChothiaKabat CDR的复合物，其中CDR-H1是Chothia和Kabat CDR的复合物；Oxford Molecular的抗体建模软件使用的AbM定义；以及Martin等人的contact定义(bioinfo.org.uk/abs)(参见表1)。Kabat提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中不同重链之间或不同轻链之间的对应残基被指定相同的编号。当通过CDR的某一定义(例如，Kabat)说抗体包含CDR时，该定义指明抗体中存在的CDR残基(即Kabat CDR)的最小数目。这不排除同时存在属于另一常规CDR定义但在指定定义之外的其他残基。例如，除其他可能性之外，包含由Kabat定义的CDR的抗体包括其中CDR含有Kabat CDR残基且不含有其他CDR残基的抗体，以及其中CDR H1是复合物Chothia-Kabat CDR H1并且其他CDR含有Kabat CDR残基且不含有基于其他定义的另外的CDR残基的抗体。
表1
使用Kabat编号的CDR的常规定义
Figure BDA0001929687460000231
*根据Chothia的CDR-H1可以在H32、H33或H34处结束(取决于环的长度)。这是因为Kabat编号方案在35A和35B处布置额外残基的插入，而Chothia编号将它们布置在31A和31B处。如果既不存在H35A也不存在H35B(Kabat编号)，那么Chothia CDR-H1环在H32处结束。如果仅存在H35A，那么它在H33处结束。如果H35A和H35B都存在，那么它在H34处结束。
术语“抗体”包括完整抗体及其结合片段。通常，片段与衍生它们的完整抗体竞争与靶标的特异性结合，包括单独的重链、轻链Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dab、纳米抗体和Fv。片段可以通过重组DNA技术产生，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离产生。术语“抗体”还包括双特异性抗体和/或人源化抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体(参见，例如，Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny等人,J.Immunol.,148:1547-53(1992))。在一些双特异性抗体中，两个不同的重链/轻链对包括人源化16G7重链/轻链对和对于tau上不同于16G7所结合的表位具有特异性的重链/轻链对。
在一些双特异性抗体中，一个重链/轻链对是如下文进一步公开的人源化16G7抗体，并且另一个重链/轻链对来自与在血脑屏障上表达的受体结合的抗体，所述受体诸如胰岛素受体、胰岛素样生长因子(IGF)受体、瘦素受体或脂蛋白受体或转铁蛋白受体(Friden等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4771-4775,1991；Friden等人,Science 259:373-377,1993)。这种双特异性抗体可以通过受体介导的胞转穿过血脑屏障转移。可通过工程化双特异性抗体以减小其与血脑屏障受体的亲和力来进一步增强双特异性抗体的脑部摄取。对受体的亲和力降低导致在脑部中更广泛的分布(参见，例如，Atwal等人,Sci.Trans.Med.3,84ra43,2011；Yu等人,Sci.Trans.Med.3,84ra44,2011)。
示例性双特异性抗体还可以是：(1)双可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每条轻链和重链通过短肽键含有两个串联的可变结构域(Wu等人,Generation and Characterizationof a Dual Variable Domain Immunoglobulin
Figure BDA0001929687460000241
Molecule,在:AntibodyEngineering,Springer Berlin Heidelberg(2010)中)；(2)Tandab，其为两个单链双抗体的融合体，从而得到四价双特异性抗体，其对于每种靶抗原具有两个结合位点；(3)柔性体(flexibody)，其为scFv与双抗体的组合，从而得到多价分子；(4)所谓的“对接并锁定(dockand lock)”分子，其基于蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”，当应用于Fab时，可以得到由连接于不同的Fab片段的两个相同的Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；或(5)所谓的Scorpion分子，其包含例如融合至人Fc区的两个末端的两个scFv。可用于制备双特异性抗体的平台的实例包括BiTE(Micromet)、DART(MacroGenics)、Fcab和Mab2(F-star)、Fc工程化IgGl(Xencor)或DuoBody(基于Fab臂交换，Genmab)。
术语“表位”是指抗原上与抗体结合的位点。表位可由连续氨基酸或通过一个或多个蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸(也称为线性表位)形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包括处于独特空间构象的至少3个、且更通常至少5或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括，例如，x射线晶体学和2维核磁共振。参见，例如，Epitope Mapping Protocols,在Methods in Molecular Biology中,第66卷,GlennE.Morris编辑,(1996)。
识别相同或重叠表位的抗体可以在显示出一种抗体与另一种抗体竞争结合靶抗原的能力的简单的免疫测定中鉴定。抗体的表位还可以通过与其抗原结合以鉴定接触残基的抗体的X射线晶体学来定义。另选地，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有重叠表位。
抗体之间的竞争通过测定来确定，在所述测定中，待测抗体抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合(参见，例如，Junghans等人,Cancer Res.50:1495,1990)。如果过量的测试抗体(例如，至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制至少50％的参考抗体的结合(如在竞争性结合测定中所测量的)，那么测试抗体与参考抗体竞争。一些测试抗体抑制至少75％、90％或99％的参考抗体的结合。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争性抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体和结合至与参考抗体结合的表位充分接近以产生位阻的相邻表位的抗体。
术语“药学上可接受的”是指载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂与制剂的其他成分相容并且对其接受者基本上无害。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
如果受试者具有至少一个已知的风险因素(例如，遗传、生化、家族史和情境暴露)，从而将具有所述风险因素的个体置于与没有该风险因素的个体相比在统计学上显著更大的发展该疾病的风险中，那么个体患病风险增加。
术语“生物样品”是指生物来源(例如人或哺乳动物受试者)内或可从其获得的生物材料的样品。此类样品可以是器官、细胞器、组织、组织切片、体液、外周血、血浆、血清、细胞、分子诸如蛋白质和肽以及由其衍生的任何部分或组合。术语生物样品还可包括通过处理样品衍生的任何材料。衍生材料可包括细胞或其后代。生物样品的处理可包括过滤、蒸馏、提取、浓缩、固定、干扰组分的失活等中的一个或多个。
术语“对照样品”是指未被已知或怀疑包括tau相关疾病影响区域的生物样品，或至少未被已知或怀疑包括给定类型的患病区域的生物样品。对照样品可以从未患有tau相关疾病的个体获得。另选地，对照样品可以从患有tau相关疾病的患者获得。此类样品可以与被认为包含tau相关疾病的生物样品同时获得或在不同场合获得。生物样品和对照样品都可以从相同的组织获得。优选地，对照样品基本上或完全由正常的健康区域组成，并且可用于与被认为包含tau相关疾病影响区域的生物样品的比较。优选地，对照样品中的组织与生物样品中的组织是相同类型。优选地，被认为在生物样品中的tau相关疾病影响细胞来自与对照样品中的细胞类型相同的细胞类型(例如，神经元或神经胶质)。
术语“疾病”是指损害生理功能的任何异常病状。该术语广泛用于涵盖生理功能受损的任何病症、病痛、异常、病理、不适、病状或综合征，而不论病因的性质如何。
术语“症状”是指受试者感知的疾病的主观证据，诸如步态改变。“体征”是指医生观察到的疾病的客观证据。
术语“对治疗的阳性应答”是指相对于未接受治疗的对照群体中的平均应答，个体患者中更有利的应答或患者群体中的平均应答。
为了将氨基酸取代分为保守或非保守取代，将氨基酸分组如下：第I组(疏水性侧链)：met、ala、val、leu、ile；第II组(中性亲水性侧链)：cys、ser、thr；第III组(酸性侧链)：asp、glu；第IV组(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；第V组(影响链取向的残基)：gly、pro；以及第VI组(芳香族侧链)：trp、tyr、phe。保守取代包括相同类别的氨基酸之间的取代。非保守取代包括将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别的成员。
用通过Kabat编号惯例最大限度地对齐的抗体序列确定序列同一性百分比。比对后，如果将受试者抗体区域(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区域进行比较，受试者抗体区域与参考抗体区域之间的序列同一性百分比是在受试者抗体区域和参考抗体区域中相同氨基酸占据的位置的数目除以两个区域的对齐位置的总数，其中空位不计数，乘以100以转换为百分比。
“包含”或“包括”一种或多种所列举的元素的组合物或方法可包括未具体列举的其他元素。例如，“包含”或“包括”抗体的组合物可含有单独或与其他成分组合的抗体。
值的范围的指定包括该范围内或限定该范围的所有整数，以及通过该范围内的整数限定的所有子范围。
除非从上下文中另外显而易见，否则术语“约”包括非实质性变型，诸如在指定值的测量误差(例如，SEM)的标准容限之内的值。
统计显著性意指p≤0.05。
除非上下文另外明确规定，否则冠词“一个”、“一种”和“该”的单数形式包括多个指代物。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
具体实施方式
I.概要
本发明提供了与tau结合的抗体。一些抗体特异性结合SEQ ID NO:3的残基55-78(对应于SEQ ID NO:1的残基113-136)内的表位，例如，残基60-75(对应于SEQ ID NO:1的残基118-133)或残基61-70(对应于SEQ ID NO:1的残基119-128)内的表位。一些此类抗体可特异性结合两种肽，例如，包含SEQ ID NO:3的残基55-69(对应于SEQ ID NO:1的残基113-127)的第一肽和包含残基64-78(对应于SEQ ID NO:1的残基122-136)的第二肽。一些抗体与tau结合，而不管是否为磷酸化状态。本发明的一些抗体用于抑制或延迟与tau相关联的病理和相关联的症状恶化。尽管本发明的实践不要求理解机制，但是由于抗体诱导tau的吞噬、抑制tau的分子间或分子内聚集或与其他分子的结合，通过稳定非毒性构象、通过抑制致病性tau形式的细胞间或细胞内传播、通过阻断tau磷酸化、通过阻止tau与细胞结合或通过诱导tau的蛋白质水解切割等机制可发生毒性的降低。。本发明的抗体或诱导此类抗体的剂可用于治疗阿尔茨海默病和与tau相关联的其他疾病或实现所述疾病的预防的方法中。
II.靶分子
除非从上下文中另外显而易见，否则对tau的提及意指tau的天然人形式，包括所有同种型，而不管是否存在翻译后修饰(例如，磷酸化、糖化或乙酰化)。在人脑中存在六种主要的tau同种型(剪接变体)。这些变体中最长的具有441个氨基酸，其中起始met残基被切割。根据441同种型对残基编号。因此，例如，对位置404处的磷酸化的提及意指441同种型的位置404，或当与441同种型最大限度地对齐时任何其他同种型的对应位置。同种型的氨基酸序列和Swiss-Prot编号如下文所指示。
P10636-8(SEQ ID NO：1)
Figure BDA0001929687460000291
P10636-7(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0001929687460000292
Figure BDA0001929687460000301
P10636-6(4RON人tau)(SEQ ID NO：3)
Figure BDA0001929687460000302
P10636-5(SEQ ID NO：4)
Figure BDA0001929687460000303
P10636-4(SEQ ID NO：5)
Figure BDA0001929687460000304
Figure BDA0001929687460000311
P10636-2(SEQ ID NO：6)
Figure BDA0001929687460000312
对tau的提及包括已知的自然变型，其中约30种列于Swiss-Prot数据库及其排列中，以及与tau病理相关联的突变，所述病理诸如痴呆、皮克氏病、核上性麻痹等(参见，例如，Swiss-Prot数据库和Poorkaj等人，Ann Neurol.43：815-825(1998))。通过441同种型编号的tau突变的一些实例为氨基酸残基257处的赖氨酸至苏氨酸突变(K257T)，氨基酸位置260处的异亮氨酸至缬氨酸突变(I260V)；氨基酸位置272处的甘氨酸至缬氨酸突变(G272V)；氨基酸位置279处的天冬酰胺至赖氨酸突变(N279K)；氨基酸位置296处的天冬酰胺至组氨酸突变(N296H)；氨基酸位置301处的脯氨酸至丝氨酸突变(P301S)；氨基酸301处的脯氨酸至亮氨酸突变(P301L)；氨基酸位置303处的甘氨酸至缬氨酸突变(G303V)；位置305处的丝氨酸至天冬酰胺突变(S305N)；氨基酸位置335处的甘氨酸至丝氨酸突变(G335S)；位置337处的缬氨酸至甲硫氨酸突变(V337M)；位置342处的谷氨酸至缬氨酸突变(E342V)；氨基酸位置369处的赖氨酸至异亮氨酸突变(K3691)；氨基酸位置389处的甘氨酸至精氨酸突变(G389R)；以及氨基酸位置406处的精氨酸至色氨酸突变(R406W)。
Tau可以在一个或多个氨基酸残基处被磷酸化，所述氨基酸残基包括氨基酸位置18、29、97、310和394处的酪氨酸、氨基酸位置184、185、198、199、202、208、214、235、237、238、262、293、324、356、396、400、404、409、412、413以及422处的丝氨酸；以及氨基酸位置175、181、205、212、217、231和403处的苏氨酸处被磷酸化。除非从上下文另外显而易见，否则对tau或其片段的提及包括天然人氨基酸序列，包括其同种型、突变体和等位基因变体。
IV.抗体
A.结合特异性和功能特性
本发明提供了与tau结合的抗体。一些抗体特异性结合SEQ ID NO:3的残基55-78(对应于SEQ ID NO:1的残基113-136)内的表位，例如，SEQ ID NO:3的残基60-75(对应于SEQ ID NO:1的残基118-133)或SEQ ID NO:3的残基61-70(对应于SEQ ID NO:1的残基119-128)内的表位。一些抗体与tau结合，而不管是否为磷酸化状态。这些抗体可以通过用从天然来源纯化或重组表达的tau多肽免疫来获得。可以筛选结合处于非磷酸化形式以及其中易于磷酸化的一个或多个残基被磷酸化的形式的tau的抗体。与非磷酸化的tau相比，此类抗体优选以不可区分的亲和力或至少在1.5倍、2倍或3倍的系数内结合磷酸化tau(即，是泛特异性的)。16G7是泛特异性单克隆抗体的实例。本发明还提供了与任何前述抗体结合相同表位例如16G7的表位的抗体。还包括了与任何前述抗体竞争结合tau的抗体，例如与16G7竞争。
上述抗体可以通过用包括SEQ ID NO:3的残基55-78、55-69或64-78(分别对应于SEQ ID NO:1的残基113-136、113-127或122-136)的肽进行免疫或通过用全长tau多肽或包含此类残基的其片段进行免疫，并针对与包括此类残基的肽的特异性结合进行筛选来重新生成。此类肽优选附接于有助于引发对肽的抗体应答的异源缀合物分子。附接可以是直接的或通过间隔肽或氨基酸进行。使用半胱氨酸作为间隔氨基酸，因为其游离SH基团有利于载体分子的附接。还可以使用在甘氨酸与肽之间具有或不具有半胱氨酸残基的聚甘氨酸接头(例如，2-6个甘氨酸)。载体分子用于提供T细胞表位，其有助于引发针对肽的抗体应答。通常使用几种载体，具体为匙孔血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。肽间隔物可以作为固相肽合成的一部分添加到肽免疫原中。载体通常通过化学交联添加。可以使用的化学交联剂的一些实例包括交联-N-马来酰亚胺基-6-氨基己酰基酯或间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)(参见例如，Harlow,E.等人,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.1988；Sinigaglia等人,Nature,336:778-780(1988)；Chicz等人,J.Exp.Med.,178:27-47(1993)；Hammer等人,Cell 74:197-203(1993)；Falk K.等人,Immunogenetics,39:230-242(1994)；WO 98/23635；以及Southwood等人J.Immunology,160:3363-3373(1998))。如果存在，载体和间隔物可附接于免疫原的任一端。
具有任选间隔物和载体的肽可用于免疫实验室动物或B细胞，如下文更详细描述的。可以测试杂交瘤上清液结合一种或多种肽的能力，所述肽包括SEQ ID NO:3的残基55-78、55-69或64-78(分别对应于SEQ ID NO:1的残基113-136、113-127或122-136)和/或tau的磷酸化和非磷酸化形式，例如具有处于磷酸化形式的位置404的tau的全长同种型。可以将肽附接于载体或其他标签以有利于筛选测定。在这种情况下，载体或标签优先不同于用于免疫的间隔物和载体分子的组合，以消除对间隔物或载体而不是tau肽具有特异性的抗体。可以使用任何tau同种型。
本发明提供了与tau内的表位结合的单克隆抗体。被命名为16G7的抗体是一种这样的示例性小鼠抗体。除非从上下文中另外显而易见，否则对16G7的提及应理解为是指该抗体的小鼠、嵌合、饰面和人源化形式中的任一种。抗体已经以[保藏号]被保藏。此抗体特异性结合在SEQ ID NO:3的氨基酸残基55-78、55-69或64-78(分别对应于SEQ ID NO:1的残基113-136、113-127或122-136)内。该抗体通过其结合磷酸化和非磷酸化tau、tau的非病理和病理形式和构象以及tau的错误折叠/聚集形式的能力进一步表征。
本发明的一些抗体与被命名为16G7的抗体结合相同或重叠的表位。该抗体的重链和轻链成熟可变区的序列分别命名为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11。具有这种结合特异性的其他抗体可以通过以下方式产生：用tau或其包括期望表位的部分对小鼠进行免疫并且针对任选地与具有小鼠16G7(IgG1κ)的可变区的抗体竞争结合tau而对所得抗体进行筛选。包括期望表位的tau片段可以与有助于引发对片段的抗体应答的载体连接和/或与有助于引发这种应答的佐剂组合。与特定残基的突变体相比，可以针对与tau或其片段的差异结合对此类抗体进行筛选。针对此类突变体的筛选更精确地定义了结合特异性，以允许鉴定其结合受到特定残基的诱变的抑制并且可能共享其他所例示抗体的功能特性的抗体。突变可以是在整个靶标或已知表位驻留在其中的整个区段中用丙氨酸(或丝氨酸，如果丙氨酸已经存在的话)进行系统性替换取代，一次一个残基，或间隔更宽的间隔。如果同一组突变显著降低两种抗体的结合，那么这两种抗体结合相同的表位。
具有所选鼠抗体(例如，16G7)的结合特异性的抗体也可以使用噬菌体展示方法的变体产生。参见Winter，WO 92/20791。该方法尤其适用于产生人抗体。在该方法中，使用所选鼠抗体的重链或轻链可变区作为起始材料。如果例如选择轻链可变区作为起始材料，构建噬菌体文库，其中成员展示出相同的轻链可变区(即，鼠起始材料)和不同的重链可变区。重链可变区可以例如由重排的人重链可变区的文库获得。选择对于tau或其片段显示出强特异性结合(例如，至少108且优选地至少109M-1)的噬菌体。然后来自该噬菌体的重链可变区用作构建另一噬菌体文库的起始材料。在该文库中，每个噬菌体展示出相同的重链可变区(即，从第一展示文库中鉴定的区域)和不同的轻链可变区。轻链可变区可以例如由重排的人可变轻链区的文库获得。再一次，选择对于tau显示出强特异性结合的噬菌体。所得抗体通常具有与鼠起始材料相同或相似的表位特异性。
16G7的重链的Kabat/Chothia复合物CDR分别被命名为SEQ ID NO:8、9和10，并且16G7的轻链的Kabat CDR分别被命名为SEQ ID NO:12、13和14。
表2：如由Kabat、Chothia、Chothia和Kabat的复合物、AbM和Contact所定义的16G7CDR
Figure BDA0001929687460000351
其他抗体可以通过编码示例性抗体(诸如16G7)的重链和轻链的cDNA的诱变获得。在成熟重链和/或轻链可变区的氨基酸序列中与16G7至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同且维持其功能特性，和/或与相应抗体的差别在于少量功能上不重要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入的单克隆抗体也包括在本发明中。还包括具有至少一个或所有六个CDR的单克隆抗体，所述CDR如由任何常规定义所定义，但优选Kabat，其与16G7的对应CDR具有90％、95％、99％或100％的同一性。
本发明还提供了具有完全或基本上来自16G7的一些或全部(例如，3、4、5和6个)CDR的抗体。此类抗体可包括具有完全或基本上来自16G7的至少两个、且通常全部三个重链可变区的CDR的重链可变区，和/或具有完全或基本上来自16G7的至少两个且通常全部三个轻链可变区的CDR的轻链可变区。抗体可包括重链和轻链。当CDR包含不超过4、3、2或1个取代、插入或缺失时，所述CDR基本上来自对应的16G7CDR，不同的是CDR-H2(当由Kabat定义时)可具有不超过6、5、4、3、2或1个取代、插入或缺失。此类抗体可在成熟重链和/或轻链可变区的氨基酸序列中与16G7具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且维持其功能特性，和/或与16G7的差别在于少量功能上不重要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入。
通过此类测定鉴定的一些抗体可以结合tau的单体、错误折叠、聚集、磷酸化或非磷酸化形式或其他形式。同样，一些抗体对tau的非病理和病理形式和构象具有免疫反应性。
B.非人抗体
针对tau或其片段(例如，SEQ ID NO:3的氨基酸残基55-78、60-75、61-70、55-69或64-78，分别对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-136、118-133、119-128、113-127或122-136)的其他非人抗体(例如鼠、豚鼠、灵长类动物、兔或大鼠)的产生可以通过例如用tau或其片段对动物进行免疫来实现。参见Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(CSHP NY,1988)(出于所有目的以引用方式并入)。这种免疫原可以从天然来源、通过肽合成或通过重组表达获得。任选地，免疫原可以与载体蛋白融合或以其他方式复合进行施用。任选地，免疫原可以与佐剂一起施用。可以如下所述使用几种类型的佐剂。对于实验室动物的免疫，优选完全弗氏佐剂，然后是不完全佐剂。兔或豚鼠通常用于制备多克隆抗体。小鼠通常用于制备单克隆抗体。针对与tau或tau内表位(例如，包括SEQ ID NO:3的氨基酸残基55-78、60-75或61-70(分别对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-136、118-133或119-128)中的一个或多个的表位)的特异性结合对抗体进行筛选。这种筛选可以通过以下方式实现：确定抗体与tau变体的集合的结合，所述tau变体诸如含有SEQ ID NO:3的氨基酸残基55-78、60-75、61-70、55-69或64-78(分别对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-136、118-133、119-128、113-127或122-136)或这些残基内的突变的tau变体；并且确定哪些tau变体与抗体结合。可以例如通过蛋白质印迹(Western blot)、FACS或ELISA评估结合。
C.人源化抗体
人源化抗体是遗传工程化的抗体，其中将来自非人“供体”抗体的CDR接枝到人“受体”抗体序列中(参见，例如，Queen,US 5,530,101和5,585,089；Winter,US 5,225,539；Carter,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205；以及Foote,US 6,881,557)。受体抗体序列可以是，例如，成熟人抗体序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区序列。因此，人源化抗体是具有完全或基本上来自供体抗体的至少三个、四个、五个或全部CDR，以及完全或基本上来自人抗体序列的可变区框架序列和恒定区(如果存在的话)的抗体。类似地，人源化重链具有完全或基本上来自供体抗体重链的至少一个、两个且通常全部三个CDR，以及基本上来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在的话)。类似地，人源化轻链具有完全或基本上来自供体抗体轻链的至少一个、两个且通常全部三个CDR，以及基本上来自人轻链可变区框架和恒定区序列的轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在的话)。除纳米抗体和dAb之外，人源化抗体包括人源化重链和人源化轻链。当相应CDR之间至少85％、90％、95％或100％的对应残基(如由任何常规定义所定义，但优选地由Kabat定义)相同时，人源化抗体中的CDR基本上来自非人抗体中的对应CDR。当至少85％、90％、95％或100％的由Kabat定义的对应残基相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别基本上来自人可变区框架序列或人恒定区。为了根据2014年世界卫生组织(WHO)国际非专有名称(INN)对人源化抗体的定义被归为人源化的，抗体必须与人种系抗体序列(即，在体细胞高频突变(somatic hypermutation)之前)具有至少85％的同一性。混合抗体是一条抗体链(例如，重链)满足阈值但另一条链(例如，轻链)不满足阈值的抗体。如果任一条链都不满足阈值，那么抗体被归为嵌合体，即使两条链的可变框架区是基本上人的，具有一些鼠回复突变的。参见Jones等人(2016)The INNs and outsof antibody nonproprietary names,mAbs 8:1,1-9,DOI:10.1080/19420862.2015.1114320。还参见“WHO-INN:International nonproprietary names(INN)for biological and biotechnological substances(a review)”(Internet)2014。可从：http://www.who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf)获得，其以引用方式并入本文。为避免疑义，如本文所用的术语3人源化2不旨在限制人源化抗体的2014 WHO INN定义。本文提供的一些人源化抗体与人种系序列具有至少85％的序列同一性，并且本文提供的一些人源化抗体与人种系序列具有小于85％的序列同一性。本文提供的人源化抗体的一些重链与人种系序列具有约60％至100％的序列同一性，例如，在约60％至69％、70％至79％、80％至84％或85％至89％的范围内。一些重链不满足2014WHO INN定义，并且与人种系序列具有，例如，约64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％或84％的序列同一性，而其他重链满足2014WHO INN定义并且与人种系序列具有约85％、86％、87％、88％、89％或更高的序列同一性。本文提供的人源化抗体的一些轻链与人种系序列具有约60％至100％的序列同一性，例如，在约80％至84％或85％至89％的范围内。一些轻链不满足2014 WHO INN定义，并且与人种系序列具有，例如，约81％、82％、83％或84％的序列同一性，而其他轻链满足2014 WHOINN定义并且与人种系序列具有约85％、86％、87％、88％、89％或更高的序列同一性。根据2014 WHO INN定义为“嵌合”的本文提供的一些人源化抗体具有与人种系序列具有小于85％同一性的重链，所述重链和与人种系序列具有小于85％同一性的轻链配对。根据2014WHO INN定义为“混合”的本文提供的一些人源化抗体，例如，具有与人种系序列具有至少85％序列同一性的重链，所述重链和与人种系序列具有小于85％序列同一性的轻链配对，或反之亦然。本文提供的一些人源化抗体满足“人源化”的2014 WHO INN定义并且具有与人种系序列具有至少85％序列同一性的重链，所述重链和与人种系序列具有至少85％序列同一性的轻链配对。满足“人源化”的2014 WHO INN定义的示例性抗体包括与具有SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的氨基酸序列的成熟重链序列配对的具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的成熟轻链的抗体。本发明的另外的人源化抗体包括具有与具有SEQ ID NO:28-30中的任一个的氨基酸序列的成熟轻链配对的具有SEQ ID NO:15-27中的任一个的氨基酸序列的成熟重链的抗体。
尽管人源化抗体通常掺入来自小鼠抗体的全部六个CDR(由任何常规定义所定义，但优选由Kabat定义)，但它们也可以用少于来自小鼠抗体的全部CDR(例如，至少3个、4个或5个CDR)制备(例如，Pascalis等人,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos等人,J.ofMol.Biol.,320:415-428,2002；Iwahashi等人,Mol.Immunol.36:10 79-1091,1999；Tamura等人,J.Immunol.,164:1432-1441,2000)。
在一些抗体中，仅需要部分CDR，即结合所需的CDR残基的子集，称为SDR，保持结合在人源化抗体中。可以基于先前的研究(例如，通常不需要CDR H2中的残基H60-H65)从位于Chothia高变环外的Kabat CDR区域(Chothia,J.Mol.Biol.196:901,1987)中，通过分子建模和/或经验性地，或如Gonzales等人,Mol.Immunol.41:863,2004中所述鉴定不接触抗原且不在SDR中的CDR残基。在此类人源化抗体中，在一个或多个供体CDR残基不存在或省略了整个供体CDR的位置处，占据该位置的氨基酸可以是占据受体抗体序列中的对应位置(通过Kabat编号)的氨基酸。CDR中将包括的受体对供体氨基酸的此类取代的数量反映了竞争考虑的平衡。此类取代可能有利于减少人源化抗体中小鼠氨基酸的数量，并且因此降低潜在的免疫原性和/或满足“人源化”的WHO INN定义。然而，取代还可引起亲和力的改变，并且优选避免亲和力的显著降低。CDR内用于取代的位置和用于取代的氨基酸也可经验性地选择。
人受体抗体序列可任选地选自许多已知的人抗体序列，以在人受体序列可变区框架与供体抗体链的对应的可变区框架之间提供高度的序列同一性(例如，65-85％的同一性)。
用于重链的受体序列的实例是具有NCBI登录号AAA18265.1(SEQ ID NO:31)的人成熟重链可变区。用于重链的受体序列的实例是具有NCBI登录号ADW08092.1(SEQ ID NO:32)的人成熟重链可变区。用于重链的受体序列的实例是具有NCBI登录号IMGT#IGHV1-2*02(SEQ ID NO:33)的人成熟重链可变区。IMGT#IGHV1-2*02包括具有与小鼠16G7重链相同的规范形式的CDR CDR-H1和CDR-H2，并且是Kabat人重链第1亚组的成员。用于轻链的受体序列的实例是具有NCBI登录号AAB24404.1(SEQ ID NO:34)的人成熟轻链可变区。用于轻链的受体序列的实例是具有NCBI登录号AEK69364.1(SEQ ID NO:35)的人成熟轻链可变区。用于轻链的受体序列的实例是具有NCBI登录号IMGT#IGKV4-1*01(SEQ ID NO:36)的人成熟轻链可变区。IMGT#IGKV4-1*01具有与小鼠16G7相同的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的规范类别，并且属于人κ第1亚组。
如果选择多于一种人受体抗体序列，那么可以使用那些受体的复合物或杂交体，并且在人源化轻链和重链可变区中的不同位置使用的氨基酸可以取自所用的任何人受体抗体序列。
可以基于它们对CDR构象和/或与抗原的结合的可能影响来选择来自人可变区框架残基的某些氨基酸用于取代。对此类可能影响的研究通过建模、检查特定位置处的氨基酸的特征，或经验观察特定氨基酸的取代或诱变的作用来实现。
例如，当鼠可变区框架残基与选定的人可变区框架残基之间的氨基酸不同时，当合理地预期氨基酸有以下特征时人框架氨基酸可以被来自小鼠抗体的等效框架氨基酸取代：
(1)直接非共价结合抗原；
(2)与CDR区相邻或在由Chothia但不是Kabat所定义的CDR内；
(3)或者与CDR区相互作用(例如，在CDR区的约
Figure BDA0001929687460000411
内)，(例如，通过对同源已知免疫球蛋白链的解析结构上的轻链或重链进行建模来鉴定)；或
(4)是参与VL-VH界面的残基。
本发明提供了鼠16G7抗体的人源化形式，其包括13个所例示的人源化成熟重链可变区：hu16G7VHv1(SEQ ID NO:15)、hu16G7VHv2)(SEQ ID NO:16)、hu16G7VHv2a(SEQ IDNO:17)、16G7VHv2aB7(SEQ ID NO:18)、hu16G7VHv2b(SEQ ID NO:19)、hu16G7VHv2bH7(SEQID NO:20)、hu16G7VHv3(SEQ ID NO:21)、hu16G7VHv4(SEQ ID NO:22)、hu16G7VHv5V(SEQID NO:23)、hu16G7VHv5VR(SEQ ID NO:24)、hu16G7VHv6a(SEQ ID NO:25)、hu16G7VHv6b(SEQ ID NO:26、hu16G7VHv7(SEQ ID NO:27)，以及3个所例示的人成熟轻链可变区：hu16G7VLv1(SEQ ID NO:28)、hu16G7VLv2(SEQ ID NO:29)和hu16G7VLv3(SEQ ID NO:30)。
在一个实施方案中，使用两阶段PCR方案生成人源化序列，其允许使用QuikChange定点诱变引入多个突变、缺失和插入[Wang,W.和Malcolm,B.A.(1999)BioTechniques 26:680-682)]。
来自由Queen,US 5,530,101定义的类别(1)至(3)的框架残基有时另选地被称为规范残基和微调残基(vernier residue)。有助于限定CDR环的构象的框架残基有时被称为规范残基(Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Thornton&Martin,J.Mol.Biol.263:800-815(1996))。支持抗原结合环构象并在精细调节抗体与抗原的配合中发挥作用的框架残基有时被称为微调残基(Foote&Winter,J.Mol.Biol 224:487-499(1992))。
作为取代候选的其他框架残基是产生潜在糖基化位点的残基。其他取代候选是受体人框架氨基酸，其在该位置对于人免疫球蛋白不常见。这些氨基酸可以被来自小鼠供体抗体的等同位置或来自更典型的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸取代。
作为取代候选的其他框架残基是N末端谷氨酰胺残基(Q)，其可以替换为谷氨酸(E)以最小化焦谷氨酸转化的可能性[Y.Diana Liu等人,2011,J.Biol.Chem.,286:11211–11217]。谷氨酸(E)至焦谷氨酸(pE)的转化比从谷氨酰胺(Q)更慢地发生。由于在谷氨酰胺至pE转化中失去伯胺，因此抗体变得具有更大酸性。不完全转化产生抗体的异质性，这使用基于电荷的分析方法可以观察为多个峰。异质性差异可能表明缺乏过程控制。具有N末端谷氨酰胺至谷氨酸取代的示例性人源化抗体为SEQ ID NO:15(hu16G7VHv1)、SEQ ID NO:16(hu16G7VHv2)、SEQ ID NO:17(hu16G7VHv2a)、SEQ ID NO:18(16G7VHv2aB7)、SEQ ID NO:19(hu16G7VHv2b)、SEQ ID NO:20(hu16G7VHv2bH7)、SEQ ID NO:21(hu16G7VHv3)、SEQ ID NO:22(hu16G7VHv4)、SEQ ID NO:23(hu16G7VHv5V)、SEQ ID NO:24(hu16G7VHv5VR)以及SEQ IDNO:27(hu16G7VHv7)。
示例性的人源化抗体是小鼠16G7的人源化形式，命名为Hu16G7。
小鼠抗体16G7包括成熟的重链和轻链可变区，其分别具有包含SEQ ID NO:7和SEQID NO:11的氨基酸序列。本发明提供了13个所例示的人源化成熟重链可变区：hu16G7VHv1、hu16G7VHv2)、hu16G7VHv2a、16G7VHv2aB7、hu16G7VHv2b、hu16G7VHv2bH7、hu16G7VHv3、hu16G7VHv4、hu16G7VHv5V、hu16G7VHv5VR、hu16G7VHv6a、hu16G7VHv6b以及hu16G7VHv7。本发明还提供了3个所例示的人成熟轻链可变区：hu16G7VLv1、hu16G7VLv2和hu16G7VLv3。图2和图3分别示出鼠16G7和各种人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的比对。
出于诸如可能影响CDR构象和/或与抗原的结合、介导重链与轻链之间的相互作用、与恒定区的相互作用、是期望或不期望的翻译后修饰的位点、是其在人可变区序列中的位置的不常见残基且因此潜在地具有免疫原性、获得聚集潜力以及其他原因之类的原因，以下33个可变区框架位置被认为是用于3个所例示的人成熟轻链可变区和13个所例示的人成熟重链可变区中的取代候选，如实例中进一步指定的：L4(M4L)、L9(D9S)、L15(L15V)、L18(R18K)、L19(A19V)、L21(I21M)、L22(N22S)、L43(P43S)、L48(I48M)、H1(Q1E)、H5(V5Q)、H7(S7P)、H9(A9S)、H10(E10V)、H11(V11L)、H12(K12V)、H13(K13R)、H20(V20L)、H37(V37A)、H38(R38K)、H40(A40R)、H48(M48I)、H66(R66K)、H67(V67K)、H69(M69L)、H71(R71V)、H73(T73I)、H75(I75S或I75A)、H80(M80V)、H82a(S82a-T)、H82b(R82b-S)、H83(R83T)、H85(D85E)。以下3个可变区CDR位置被认为是13个所例示的人成熟重链可变区中的取代候选，如实例中进一步指定的：H31(S31G)、H60(N60A)和H64(K64Q)。
此处，与其他地方一样，首先提到的残基是通过将Kabat CDR或复合物Chothia-Kabat CDR(在CDR-H1的情况下)接枝到人受体框架中而形成的人源化抗体的残基，并且第二提到的残基是考虑替换这一残基的残基。因此，在可变区框架内，首先提到的残基是人，并且在CDR内，首先提到的残基是小鼠。
所例示的抗体包括所例示的成熟重链和轻链可变区的任何排列或组合，例如，VHv1/VLv1、VHv1/VLv2、VHv1/VLv3、VHv2/VLv1、VHv2/VLv2、VHv2/VLv3、VHv2a/VLv1、VHv2a/VLv2、VHv2a/VLv3、VHv2aB7/VLv1、VHv2aB7/VLv2、VHv2aB7/VLv3、VHv2b/VLv1、VHv2b/VLv2、VHv2b/VLv3、VHv2bH7/VLv1、VHv2bH7/VLv2、VHv2bH7/VLv3、VHv3/VLv1、VHv3/VLv2、VHv3/VLv3、VHv4/VLv1、VHv4/VLv2、VHv4/VLv3、VHv5/VLv1、VHv5/VLv2、VHv5/VLv3、VHv5VR/VLv1、VHv5VR/VLv2、VHv5VR/VLv3、VHv6a/VLv1、VHv6a/VLv2、VHv6a/VLv3、VHv6b/VLv1、VHv6b/VLv2、VHv6b/VLv3、VHv7/VLv1、VHv7/VLv2或VHv7/VLv3。
本发明提供了16G7人源化抗体的变体，其中人源化成熟重链可变区显示出与hu16G7VHv1、hu16G7VHv2、hu16G7VHv2a、16G7VHv2aB7、hu16G7VHv2b、hu16G7VHv2bH7、hu16G7VHv3、hu16G7VHv4、hu16G7VHv5V、hu16G7VHv5VR、hu16G7VHv6a、hu16G7VHv6b和hu16G7VHv7(SEQ ID NO:15-27)至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，并且人源化成熟轻链可变区显示出与hu16G7VLv1.hu16G7VLv2和hu16G7VLv3(SEQ ID NO:28-30)至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些此类抗体中，保留了在SEQ IDNO:15-27和SEQ ID NO:28-30中发现的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或全部36个回复突变或其他突变。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：H1被E占据，H5被Q占据，H7被P占据，H9被S占据，H10被V占据，H11被L占据，H12被V占据，H13被R占据，H20被L占据，H40被R占据，H48被I占据，H66被K占据，H67被A占据，H69被L占据，H71被V占据，H73被I占据，H75被S占据，H80被V占据，H82a被T占据，H82b被S占据，H83被T占据，并且H85被E占据。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73、H75、H80、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、P、S、V、L、V、R、L、R、I、K、A、L、V、I、S、V、T、S、T和E占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：H1被E占据，H5被Q占据，H7被P占据，H9被S占据，H10被V占据，H11被L占据，H12被V占据，H13被R占据，H20被L占据，H48被I占据，H69被L占据，H71被V占据，H82a被T占据，H82b被S占据，H83被T占据，并且H85被E占据。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H48、H69、H71、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、P、S、V、L、V、R、L、I、L、V、T、S、T和E占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：H1被E占据，H5被Q占据，H11被L占据，H12被V占据，H20被L占据，H48被I占据，H69被L占据，H71被V占据，H82a被T占据，H82b被S占据，H83被T占据，并且H85被E占据。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H5、H11、H12、H20、H48、H69、H71、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、L、V、LI、L、V、T、S、T和E占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置中被指定氨基酸占据：H1被E占据，H12被V占据，H31被G占据，H40被R占据，H48被I占据，H60被A占据，H69被L占据，H73被I占据，并且H83被T占据。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H12、H31、H40、H48、H60、H69、H73和H83分别被E、V、G、R、I、A、L、I和T占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置中被指定氨基酸占据：H1被E占据，H12被V占据，H40被R占据，H48被I占据，H69被L占据，H73被I占据，并且H83被T占据。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H12、H40、H48、H69、H73和H83分别被E、V、R、I、L、I和T占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置中被指定氨基酸占据：H1被E占据，H12被V占据，H40被R占据，H48被I占据，H66被K占据，H67被A占据，H69被L占据，H71被V占据，H73被I占据，并且H83被T占据。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H12、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73和H83分别被E、V、R、I、K、A、L、V、I和T占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置中被指定氨基酸占据：H1被E占据，H12被V占据，H40被R占据，H48被I占据，H69被L占据，H73被I占据，并且H83被T占据。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H12、H40、H48、H69、H73和H83分别被E、V、R、I、L、I和T占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定的氨基酸占据：H7被P占据、H71被V占据，并且H73被I占据。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H7、H71和H73分别被P、V和I占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定的氨基酸占据：H31被G占据并且H60被A占据。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H31和H60分别被G和A占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H12、H31、H40、H48、H60、H66、H67、H69、H71、H73和H83分别被Q、V、G、R、I、A、K、A、L、V、I和T占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H7、H71和H73分别被Q、P、V和I占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：H1被Q或E占据，H5被V或Q占据，H7被S或P占据，H9被A或S占据，H10被E或V占据，H11被V或L占据，H12被K或V占据，H13被K或R占据，H20被V或L占据，H31被G或S占据，H37被V或A占据，H38被R或K占据，H40被A或R占据，H48被M或I占据，H60被A或N占据，H64被Q或K占据，H66被R或K占据，H67被V或A占据，H69被M或L占据，H71被R或V占据，H73被T或I占据，H75被I、S或A占据，H80被M或V占据，H82a被S或T占据，H82b被R或S占据，H83被R或T占据，并且H85被D或E占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H37、H38、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73、H75、H80、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、P、S、V、L、V、R、L、A、K、R、I、K、A、L、V、I、S、V、T、S、T和E占据，如在hu16G7VHv1中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H5、H11、H12、H20、H48、H69、H71、H75、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、L、V、L、I、L、V、A、T、S、T和E占据，如在hu16G7VHv2中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H12、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73和H83分别被E、V、R、I、K、A、L、V、I和T占据，如在hu16G7VHv2a中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H12、H31、H40、H48、H60、H66、H67、H69、H71、H73和H83分别被E、V、G、R、I、A、K、A、L、V、I和T占据，如在hu16G7VHv2aB7中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H12、H40、H48、H69、H73和H83分别被E、V、R、I、L、I和T占据，如在hu16G7VHv2b中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H12、H31、H40、H48、H60、H64、H69、H73和H83分别被E、V、G、R、I、A、Q、L、I和T占据，如在hu16G7VHv2bH7中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H48、H69、H71、H75、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、P、S、V、L、V、R、L、I、L、V、A、T、S、T和E占据，如在hu16G7VHv3中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H5、H11、H12、H20、H48、H66、H67、H69、H71、H73、H75、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、L、V、L、I、K、A、L、V、I、S、T、S、T和E占据，如在hu16G7VHv4中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H38、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73I、H75、H80、H82a、H82b、H83和H85分别被E、Q、P、S、V、L、V、R、L、K、R、I、K、A、L、V、I、S、V、T、S、T和E占据，如在hu16G7VHv5V中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H73、H75、H80、H82a、H82b、H83和H85分别被Q、P、S、V、L、V、R、L、R、I、K、A、L、V、I、S、V、T、S、T和E占据，如在hu16G7VHv5VR中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H7、H71和H73分别被P、V和I占据，如在hu16G7VHv6a中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H71被V占据，如在hu16G7VHv6b中。在一些人源化16G7抗体中，VH区中的位置H1、H7、H71和H73分别被E、P、V和I占据，如在hu16G7VHv7中。
在一些人源化16G7抗体中，可变重链与人序列具有≥85％的同一性。在一些人源化16G7抗体中，可变轻链与人序列具有≥85％的同一性。在一些人源化16G7抗体中，可变重链和可变轻链中的每一个与人种系序列具有≥85％的同一性。
在一些人源化16G7抗体中，三个重链CDR如由Kabat/Chothia复合物所定义(SEQID NO:8、9和10)，并且三个轻链CDR如由Kabat/Chothia复合物所定义(SEQ ID NO:12、13和14)；条件是位置H31被S或G占据，位置H60被N或A占据，并且位置64被K或Q占据。在一些人源化16G7抗体中，CDR-H1具有包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些人源化16G7抗体中，CDR-H2具有包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些人源化16G7抗体中，CDR-H2具有包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：L4被L占据，L9被S占据，L15被V占据，L22被S占据，并且L43被S占据。在一些人源化16G7抗体中，VL区中的位置L4、L9、L15、L22和L43分别被L、S、V、S和S占据。
在一些人源化16G7抗体中，VH区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：L4被L占据，L9被S占据，L15被V占据，L18被K占据，L19被V占据，L21被M占据，L22被S占据，并且L43被S占据。在一些人源化16G7抗体中，VL区中的位置L4、L9、L15、L18、L19、L21、L22和L43分别被L、S、V、K、V、M、S和S占据。
在一些人源化16G7抗体中，VL区中的至少一个以下位置被指定氨基酸占据：L4被M或L占据，L9被D或S占据，L15被L或V占据，L18被R或K占据，L19被A或V占据，L21被I或M占据，L22被N或S占据，L43被P或S占据，并且L48被I或M占据。
在一些人源化16G7抗体中，VL区中的位置L4、L9、L15、L18、L19、L21、L22和L43分别被L、S、V、K、V、M、S和S占据，如在hu16G7VLv1中。在一些人源化16G7抗体中，VL区中的位置L4、L9、L15、L22和L43分别被L、S、V、S和S占据，如在hu16G7VLv2中。在一些人源化16G7抗体中，VL区中的位置L4、L9、L15、L18、L19、L21、L22和L43分别被L、S、V、K、V、M、S和S占据，如在hu16G7VLv3中。
在一些人源化16G7抗体中，可变重链与人序列具有≥85％的同一性。在一些人源化16G7抗体中，可变轻链与人序列具有≥85％的同一性。在一些人源化16G7抗体中，可变重链和可变轻链中的每一个与人种系序列具有≥85％的同一性。在一些人源化16G7抗体中，三个重链CDR如由Kabat/Chothia复合物所定义(SEQ ID NO:8、9和10)，并且三个轻链CDR如由Kabat/Chothia复合物所定义(SEQ ID NO:12、13和14)；条件是位置H31被S或G占据，位置H60被N或A占据，并且位置64被K或Q占据。在一些人源化16G7抗体中，CDR-H1具有包含SEQID NO:49的氨基酸序列。在一些人源化16G7抗体中，CDR-H2具有包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些人源化16G7抗体中，CDR-H2具有包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
此类人源化抗体的CDR区可与16G7的CDR区相同或基本相同。CDR区可由任何常规定义(例如，Chothia或Chothia和Kabat的复合物)来定义，但优选如由Kabat所定义的。
除非另行指出，否则可变区框架位置符合Kabat编号。其他此类变体通常与所例示的Hu16G7重链和轻链的序列相差少量的(例如，通常不超过1、2、3、5、10或15个)替换、缺失或插入。此类差异通常在框架中，但也可存在于CDR中。
人源化16G7变体的另外变异的可能性是可变区框架中的另外的回复突变。人源化mAb中不与CDR接触的许多框架残基可以适应来自供体小鼠mAb或其他小鼠或人抗体的对应位置的氨基酸的取代，并且甚至许多潜在的CDR接触残基也允许取代。甚至CDR内的氨基酸也可以被改变，例如，使用在用于提供可变区框架的人受体序列的对应位置处发现的残基。另外，可以使用另选的人受体序列，例如，用于重链和/或轻链。如果使用不同的受体序列，那么可以不进行上文推荐的一种或多种回复突变，因为在没有回复突变的情况下对应的供体和受体残基已经相同。
优选地，人源化16G7变体中的替换或回复突变(无论是否保守)对人源化mAb的结合亲和力或效力，即其结合tau的能力没有实质影响。
人源化16G7抗体通过它们结合磷酸化和未磷酸化tau两者以及tau的错误折叠/聚集形式的能力进一步表征。
D.嵌合和饰面抗体
本发明还提供了非人抗体，具体为实例的16G7抗体的嵌合和饰面形式。
嵌合抗体是其中非人抗体(例如，小鼠)的轻链和重链的成熟可变区与人轻链和重链恒定区组合的抗体。此类抗体基本上或完全保留小鼠抗体的结合特异性，并且是约三分之二的人序列。在一个实施方案中，嵌合16G7抗体具有SEQ ID NO:54的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:55的轻链氨基酸序列。
饰面抗体是一种类型的人源化抗体，其保留非人抗体的一些且通常所有CDR和一些非人可变区框架残基，但将可有助于B或T细胞表位的其他可变区框架残基，例如暴露残基(Padlan,Mol.Immunol.28:489,1991)替换为来自人抗体序列的对应位置的残基。结果是其中CDR完全或基本上来自非人抗体，并且非人抗体的可变区框架通过取代而变得更像人的抗体。16G7抗体的饰面形式包括在本发明中。
E.人抗体
针对tau或其片段(例如，SEQ ID NO:3的氨基酸残基55-78、60-75、61-70、55-69或64-78，分别对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-136、118-133、119-128、113-127或122-136)的人抗体通过下文所述的多种技术提供。通过竞争性结合实验，通过Winter的噬菌体展示方法(上文)或以其他方式选择一些人抗体，以具有与特定小鼠抗体(诸如实例中所述的小鼠单克隆抗体中的一个)相同的表位特异性。还可以通过仅使用tau的片段，诸如仅含有SEQ ID NO:3的氨基酸残基55-78、60-75、61-70、55-69或64-78(分别对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-136、118-133、119-128、113-127或122-136)的tau片段作为靶抗原，和/或通过针对tau变体的集合，诸如在SEQ ID NO:3的氨基酸残基55-78、60-75、61-70、55-69或64-78(分别对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-136、118-133、119-128、113-127或122-136)内含有各种突变的tau变体筛选抗体来针对特定表位特异性对人抗体进行筛选。
用于产生人抗体的方法包括Oestberg等人,Hybridoma 2:361-367(1983)；Oestberg,美国专利No.4,634,664；以及Engleman等人,美国专利4,634,666的三体杂交瘤法；使用包括人免疫球蛋白基因的转基因小鼠(参见，例如，Lonberg等人,WO93/12227(1993)；US 5,877,397；US 5,874,299；US 5,814,318；US 5,789,650；US 5,770,429；US 5,661,016；US 5,633,425；US 5,625,126；US 5,569,825；US 5,545,806；Neuberger,Nat.Biotechnol.14:826(1996)；以及Kucherlapati,WO 91/10741(1991))；噬菌体展示方法(参见，例如Dower等人,WO 91/17271；McCafferty等人,WO 92/01047；US 5,877,218；US5,871,907；US 5,858,657；US 5,837,242；US 5,733,743；以及US 5,565,332)；以及WO2008/081008中描述的方法(例如，将从人分离的记忆B细胞永生化，例如用EBV，针对期望特性进行筛选，并且克隆和表达重组形式)。
F.恒定区的选择
嵌合、饰面或人源化抗体的重链和轻链可变区可以与人恒定区的至少一部分连接。恒定区的选择部分取决于是否需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬和/或补体依赖性细胞毒性。例如，人同种型IgG1和IgG3具有补体依赖性细胞毒性，而人同种型IgG2和IgG4则没有。人IgG1和IgG3还诱导比人IgG2和IgG4更强的细胞介导的效应子功能。轻链恒定区可以是λ或κ。恒定区的编号惯例包括EU编号(Edelman,G.M.等人,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969))、Kabat编号(Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)、IMGT唯一编号(Lefranc M.-P.等人,IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cellreceptor constant domains and Ig superfamily C-like domains,Dev.Comp.Immunol.,29,185-203(2005))以及IMGT外显子编号(Lefranc,同上)。
轻链和/或重链的氨基或羧基末端的一个或几个氨基酸，诸如重链的C末端赖氨酸，可在一部分或全部分子中缺失或衍生。可在恒定区中进行取代以减少或增加效应子功能，诸如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见，例如，Winter等人,美国专利No.5,624,821；Tso等人,美国专利No.5,834,597；以及Lazar等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005,2006)，或延长在人体中的半衰期(参见，例如，Hinton等人,J.Biol.Chem.279:6213,2004)。示例性取代包括位置250处的Gln和/或位置428处的Leu(EU编号在该段中用于恒定区)以用于增加抗体的半衰期。位置234、235、236和/或237中的任一个或所有位置处的取代降低了对Fcγ受体，尤其是FcγRI受体的亲和力(参见，例如，US 6,624,821)。人IgG1的位置234、235和237处的丙氨酸取代可用于减小效应子功能。一些抗体具有在人IgG1的位置234、235和237处的丙氨酸取代，以用于减小效应子功能。任选地，人IgG2中的位置234、236和/或237被丙氨酸取代，并且位置235被谷氨酰胺取代(参见，例如，US 5,624,821)。在一些抗体中，使用人IgG1的位置241、264、265、270、296、297、322、329和331(EU编号)中的一个或多个位置处的突变。在一些抗体中，使用人IgG1的位置318、320和322(EU编号)中的一个或多个位置处的突变。在一些抗体中，位置234和/或235被丙氨酸取代和/或位置329被甘氨酸取代。在一些抗体中，位置234和235被丙氨酸取代。在一些抗体中，同种型是人IgG2或IgG4。
抗体可以被表达为含有两条轻链和两条重链的四聚体、单独的重链、轻链、Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv，或其中重链和轻链成熟可变结构域通过间隔物连接的单链抗体。
人恒定区显示出不同个体之间的同种异型变异和同族同种异型变异，即在一个或多个多态性位置，恒定区在不同个体中可以不同。同族同种异型与同种异型的区别在于，识别同族同种异型的血清结合至一个或多个其他同种型的非多态性区域。因此，例如，另一个重链恒定区属于具有或不具有C末端赖氨酸的IgG1G1m3。对人恒定区的提及包括具有任何天然同种异型或占据天然同种异型中的位置的残基的任何排列的恒定区。
G.重组抗体的表达
已知许多方法用于使用抗体表达细胞系(例如，杂交瘤)产生嵌合和人源化的抗体。例如，可以使用众所周知的方法对抗体的免疫球蛋白可变区进行克隆和测序。在一种方法中，使用由杂交瘤细胞制备的mRNA通过RT-PCR克隆重链可变VH区。将通用引物作为5'引物和g2b恒定区特异性3'引物用于包括翻译起始密码子的VH区前导肽。示例性引物描述于Schenk等人的美国专利公布US 2005/0009150中(下文称为“Schenk”)。可以比较来自多个独立衍生克隆的序列，以确保在扩增过程中不引入任何变化。还可以通过对通过5'RACERT-PCR方法和3'g2b特异性引物获得的VH片段进行测序来确定或确认VH区的序列。
可以以类似的方式克隆轻链可变VL区。在一种方法中，使用被设计成与包括翻译起始密码子的VL区杂交的5'引物和对于与V-J接合区下游的Ck区具有特异性的3'引物来设计用于VL区的扩增的共有引物组。在第二种方法中，采用5'RACE RT-PCR方法克隆VL编码cDNA。示例性引物描述于Schenk,同上中。然后将克隆的序列与编码人(或其他非人物种)恒定区的序列组合。
在一种方法中，将重链和轻链可变区重新工程化为编码相应VDJ或VJ接合处下游的剪接供体序列，并克隆到哺乳动物表达载体中，诸如用于重链的pCMV-hγ1和用于轻链的pCMV-Mcl。这些载体将人γ1和Ck恒定区编码为插入的可变区盒下游的外显子片段。在序列验证后，可以将重链和轻链表达载体共转染到CHO细胞中以产生嵌合抗体。转染后48小时收集条件培养基，并通过蛋白质印迹分析评估抗体产量或通过ELISA评估抗原结合。如上所述将嵌合抗体人源化。
嵌合、饰面、人源化和人抗体通常通过重组表达产生。重组多核苷酸构建体通常包括可操作地连接于抗体链的编码序列的表达控制序列，包括天然相关联的或异源的表达控制元件，诸如启动子。表达控制序列可以是能够转化或转染真核或原核宿主细胞的载体中的启动子系统。一旦已经将载体掺入适当的宿主中，即将宿主维持在适于核苷酸序列的高水平表达和交叉反应性抗体的收集和纯化的条件下。
这些表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分在宿主生物中复制。通常，表达载体含有选择标志物，例如，氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性，以允许检测用期望的DNA序列转化的那些细胞。
大肠杆菌是可用于表达抗体，尤其是抗体片段的一种原核宿主。诸如酵母的微生物也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)是根据需要带有具有表达控制序列、复制起点、终止序列等等的合适载体的酵母宿主。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子尤其包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
哺乳动物细胞可用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段。参见Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。已经开发出许多能够分泌完整的异源蛋白质的合适的宿主细胞系，并且包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞，以及非抗体产生性骨髓瘤，包括Sp2/0和NS0。细胞可以是非人的。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子、增强子(Queen等人,Immunol.Rev.89:49(1986))和必要的加工信息位点诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点以及转录终止子序列。表达控制序列可包括衍生自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。参见Co等人,J.Immunol.148:1149(1992)。
另选地，可以将抗体编码序列掺入转基因中以用于引入转基因动物的基因组中并随后在转基因动物的乳汁中表达(参见，例如，美国专利No.5,741,957；美国专利No.5,304,489；以及美国专利No.5,849,992)。合适的转基因包括与来自乳腺特异性基因(诸如酪蛋白或β乳球蛋白)的启动子和增强子可操作地连接的轻链和/或重链的编码序列。
含有感兴趣的DNA区段的载体可以通过取决于细胞宿主类型的方法转移到宿主细胞中。例如，对于原核细胞，通常利用氯化钙转染，而对于其他细胞宿主，可使用磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、基因枪法或基于病毒的转染。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔以及显微注射。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到受精卵母细胞中或可以将其掺入胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞的细胞核转移到去核卵母细胞中。
已经将编码抗体重链和轻链的一种或多种载体引入细胞培养物中，可以在无血清培养基中针对生长率和产品质量对细胞库进行筛选。最佳产量的细胞库随后可进行基于FACS的单细胞克隆以产生单克隆系。可以使用每个细胞每天50pg或100pg以上的比生产率，其对应于大于7.5g/L培养物的产物滴度。由单细胞克隆产生的抗体还可以进行浊度、过滤特性、PAGE、IEF、UV扫描、HP-SEC、碳水化合物-寡糖映射、质谱以及结合测定(诸如ELISA或Biacore)的测试。选定的克隆可随后存储在多个小瓶中并且冷冻储存，以备后用。
一旦被表达，抗体可根据本领域的标准程序进行纯化，包括蛋白A捕获、HPLC纯化、柱色谱法、凝胶电泳等(通常参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982))。
可以使用商业生产抗体的方法，包括密码子优化、启动子的选择、转录元件的选择、终止子的选择、无血清单细胞克隆、细胞建库、使用用于拷贝数扩增的选择标志物、CHO终止子，或改善蛋白质滴度(参见，例如，US 5,786,464；US 6,114,148；US 6,063,598；US7,569,339；W02004/050884；W02008/012142；W02008/012142；W02005/019442；W02008/107388；W02009/027471；以及US 5,888,809)。
IV.活性免疫原
用于主动免疫的剂用于在患者中诱导和与结合以上被动免疫所描述的相同类型的抗体。用于主动免疫的剂可以是用于在实验室动物中生成单克隆抗体的相同类型的免疫原，例如，来自tau的对应于SEQ ID NO:3的残基55-78、60-75、61-70、55-69或64-78(分别对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-136、118-133、119-128、113-127或122-136)的区域的3-15或3-12或5-12或5-8个连续氨基酸的肽，例如包括SEQ ID NO:3的残基55-78、60-75、61-70、55-69或64-78(分别对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-136、118-133、119-128、113-127或122-136)的肽。为了诱导与16G7结合相同或重叠表位的抗体，可以对这些抗体的表位特异性作图(例如，通过测试与跨越tau的一系列重叠肽的结合)。然后可以使用由该表位组成或包括该表位或与该表位重叠的tau的片段作为免疫原。此类片段通常以非磷酸化的形式使用。
如果使用的话，异源载体和佐剂可以与用于生成单克隆抗体的相同，但也可以针对在人中使用的更好的药物适用性进行选择。合适的载体包括血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素或来自其他致病细菌诸如白喉(例如，CRM197)、大肠杆菌、霍乱或幽门螺杆菌的类毒素或减毒的毒素衍生物。T细胞表位也是合适的载体分子。一些缀合物可以通过将本发明的剂连接于免疫刺激性聚合物分子(例如，三棕榈酰基-S-甘油半胱氨酸(Pam3Cys)、甘露聚糖(甘露糖聚合物)或葡聚糖(β1→2聚合物))、细胞因子(例如，IL-1、IL-1α和β肽、IL-2、γ-INF、IL-10、GM-CSF)和趋化因子(例如，MIP1-α和β以及RANTES)来形成。免疫原可以连接于载体，并且具有或不具有间隔氨基酸(例如，gly-gly)。另外的载体包括病毒样颗粒。病毒样颗粒(VLP)，也称为假型病毒或病毒衍生颗粒，代表由能够在体内自组装成具有限定的球形对称性的VLP的病毒衣壳和/或包膜蛋白质的多个拷贝组成的亚单位结构。(Powilleit等人,(2007)PLoS ONE 2(5):e415。)另选地，肽免疫原可以连接于至少一个人工T细胞表位，所述表位能够结合大部分的MHC II类分子，诸如pan DR表位(“PADRE”)。PADRE描述于US 5,736,142、WO 95/07707和Alexander J等人,Immunity,1:751-761(1994)中。活性免疫原可以多聚体形式存在，其中免疫原和/或其载体的多个拷贝作为单个共价分子存在。
片段通常与药学上可接受的佐剂一起施用。相对于单独使用肽的情况，佐剂增加诱导抗体的滴度和/或诱导抗体的结合亲和力。多种佐剂可与tau的免疫原性片段组合使用以引发免疫应答。优选的佐剂增强对免疫原的固有应答，而不导致影响应答的定性形式的免疫原构象变化。优选的佐剂包括铝盐诸如氢氧化铝和磷酸铝、3De-O-酰化的单磷酰基脂质A(MPLTM)(参见GB 2220211(RIBIImmunoChem Research Inc.,Hamilton,Montana,现为Corixa的一部分))。StimulonTM QS-21是从在南美洲发现的皂皮树(Quillaja SaponariaMolina)的树皮中分离的三萜糖苷或皂草苷(参见Kensil等人,在Vaccine Design:TheSubunit and Adjuvant Approach(Powell&Newman编辑，Plenum Press，NY，1995中)；US 5,057,540)，(Aquila BioPharmaceuticals,Framingham,MA；现为Antigenics Inc.,NewYork,NY)。其他佐剂是水包油乳剂(诸如角鲨烯或花生油)，任选地组合免疫刺激剂，诸如单磷酰基脂质A(参见Stoute等人,N.Engl.J.Med.336,86-91(1997))、普罗尼克(pluronic)聚合物以及杀死的分枝杆菌。Ribi佐剂是水包油乳液。Ribi含有用含有吐温80的盐水乳化的可代谢油(角鲨烯)。Ribi还含有充当免疫刺激剂的精制的分枝杆菌产品和细菌单磷酰基脂质A。另一种佐剂是CpG(WO 98/40100)。佐剂可以作为治疗组合物的组分与活性剂一起施用，或可以在施用治疗剂之前、同时或之后单独施用。
还可以使用诱导针对tau的抗体的tau的天然片段的类似物。例如，一种或多种或所有的L-氨基酸可以被此类肽中的D氨基酸取代。氨基酸的顺序也可以逆转(逆向肽(retropeptide))。任选地，肽包括相反顺序的所有D-氨基酸(逆反肽(retro-inverso peptide))。肽和其他化合物不一定与tau肽具有显著的氨基酸序列相似性，但仍然充当tau肽的模拟物并诱导相似的免疫应答。还可以使用针对如上所述的tau的单克隆抗体的抗独特型抗体。此类抗Id抗体模拟抗原并且产生针对所述抗原的免疫应答(参见Essential Immunology,Roit编辑,Blackwell Scientific Publications,Palo Alto,CA第6版,第181页)。
肽(和任选地与肽融合的载体)也可以以编码肽的核酸的形式施用并且在患者中原位表达。编码免疫原的核酸区段通常连接于调控元件，诸如启动子和增强子，其允许DNA区段在患者的预期靶细胞中表达。为了在血细胞中表达，如免疫应答的诱导所希望的，来自轻链或重链免疫球蛋白基因或CMV主要立即早期启动子和增强子的启动子和增强子元件适于指导表达。通常将连接的调控元件和编码序列克隆到载体中。抗体也可以以编码抗体重链和/或轻链的核酸的形式施用。如果重链和轻链均存在，那么链优选作为单链抗体连接。用于被动施用的抗体也可以例如通过亲和色谱从用肽免疫原处理的患者的血清中制备。
DNA可以以裸露的形式(即，没有胶体或包封材料)递送。另选地，可以使用许多病毒载体系统，包括逆转录病毒系统(参见，例如，Lawrie and Tumin,Cur.Opin.Genet.Develop.3,102-109(1993))；腺病毒载体{参见，例如，Bett等人,J.Virol.67,591 1(1993))；腺相关病毒载体{参见，例如，Zhou等人,J.Exp.Med.179,1867(1994))、来自痘科的病毒载体(包括牛痘病毒和禽痘病毒)、来自α病毒属的病毒载体诸如衍生自新培斯病毒(Sindbis Viruse)和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Viruse)的那些(参见，例如，Dubensky等人,J.Virol.70,508-519(1996))、委内瑞拉马脑炎病毒(参见US5,643,576)和弹状病毒诸如水疱性口炎病毒(参见WO 96/34625)以及乳头瘤病毒(Ohe等人,Human Gene Therapy 6,325-333(1995)；Woo等人，WO 94/12629以及Xiao&Brandsma,Nucleic Acids.Res.24,2630-2622(1996))。
编码免疫原的DNA或含有其的载体可以包装到脂质体中。合适的脂质和相关类似物由US 5,208,036、US 5,264,618、US 5,279,833和US 5,283,185描述。载体和编码免疫原的DNA还可以被吸附至微粒载体或与其相关联，其实例包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚乳酸以及聚(丙交酯-共-乙交酯)，(参见，例如，McGee等人，J.Micro Encap.1996)。
H.抗体筛选测定
可以如上所述针对预期结合特异性对抗体进行初始筛选。同样可以针对诱导具有这种结合特异性的抗体的能力对活性免疫原进行筛选。在这种情况下，使用活性免疫原对实验室动物进行免疫，并针对适当的结合特异性对所得血清进行测试。
然后可以在细胞和动物模型中测试具有期望的结合特异性的抗体。用于这种筛选的细胞优先为神经元细胞。已经报道了tau病理的细胞模型，其中用任选地具有与tau病理相关联的突变的tau的四重复结构域转染神经母细胞瘤细胞(例如，δK280，参见Khlistunova,Current Alzheimer Research 4,544-546(2007))。在另一模型中，通过添加强力霉素在神经母细胞瘤N2a细胞系中诱导tau。细胞模型使得能够研究在可溶或聚集状态中tau对细胞的毒性、开启tau基因表达后tau聚集体的出现、再次关闭基因表达后tau聚集体的溶解以及抗体在抑制tau聚集体的形成或使其解聚方面的功效。
还可以在与tau相关联的疾病的转基因动物模型中筛选抗体或活性免疫原。此类转基因动物可包括tau转基因(例如，人同种型中的任一种)和任选的尤其人APP转基因，诸如磷酸化tau、ApoE、早老素或α突触核蛋白的激酶。此类转基因动物被设置用于发展与tau相关联的疾病的至少一种体征或症状。
示例性的转基因动物是K3系小鼠(Itner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(41):15997-6002(2008))。这些小鼠具有人tau转基因，所述人tau转基因具有K 369 I突变(该突变与皮克氏病相关联)和Thy1.2启动子。该模型显示出快速的神经变性、运动缺陷以及传入纤维和小脑粒细胞的变性的过程。另一种示例性动物是JNPL3系小鼠。这些小鼠具有人tau转基因，所述人tau转基因具有P301L突变(该突变与额颞叶痴呆相关联)和Thy1.2启动子(Taconic,Germantown,N.Y.,Lewis等人,Nat Genet.25:402-405(2000))。这些小鼠具有更渐进的神经变性过程。小鼠在几个脑区域和脊髓中发展神经原纤维缠结，其据此全文以引用方式并入)。这是研究缠结发展的后果以及可抑制这些聚集体产生的筛选疗法的优秀模型。这些动物的另一个优点是病理的相对早发。在纯合系中，至少早在3个月就可以观察到与tau病理相关联的行为异常，但动物至少在8月龄之前都保持相对健康。换句话说，在8个月时，动物走动、给自己喂食，并且可以充分良好地执行行为任务以允许监测治疗效果。使用-AI wI KLH-PHF-1对这些小鼠进行6-13个月的主动免疫产生约1,000的滴度，并且相对于未处理的对照小鼠显示出较少的神经原纤维缠结、较少的pSer422以及减少的体重减轻。
抗体或活性剂的活性可通过各种标准评估，包括总tau或磷酸化tau的量的减少、其他病理特征诸如Aβ的淀粉样蛋白沉积物的减少，以及抑制或延迟或行为缺陷。还可以针对血清中抗体的诱导对活性免疫原进行测试。可以针对抗体穿过血脑屏障进入转基因动物的脑中对被动和主动免疫原进行测试。还可以在天然地或通过诱导发展以tau为特征的疾病的症状的非人灵长类动物中测试抗体或诱导抗体的片段。对抗体或活性剂的测试通常与对照结合执行，其中进行平行实验，不同的是不存在抗体或活性剂(例如，通过媒介物替换)。然后可以相对于对照评估可归因于待测的抗体或活性剂的疾病体征或症状的减少、延迟或抑制。
VI.适合治疗的患者
已经在几种疾病中发现了神经原纤维缠结的存在，包括阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)以及进行性核上性麻痹(PSP)。本发明的方案也可用于治疗或预防这些疾病中的任一种。由于神经疾病和病状与tau之间的广泛关联，本发明的方案可用于治疗或预防与没有神经疾病的个体中的平均值相比显示出升高水平的tau或磷酸化tau(例如，在CSF中)的任何受试者。本发明的方案还可用于治疗或预防在与神经疾病相关联的tau中具有突变的个体的神经疾病。本发明的方法特别适用于治疗或预防阿尔茨海默病，尤其是在患者中。
适合治疗的患者包括有患病风险但未显示出症状的个体，以及目前显示出症状的患者。有患病风险的患者包括具有已知的疾病遗传风险的那些。此类个体包括具有经历过该疾病的亲属的那些个体，以及通过遗传或生化标志物分析确定其风险的那些个体。风险的遗传标志物包括tau中的突变，诸如上面讨论的那些，以及与神经疾病相关联的其他基因中的突变。例如，杂合和甚至尤其纯合形式中的ApoE4等位基因与阿尔茨海默病的风险相关联。阿尔茨海默病风险的其他标志物包括APP基因中的突变，具体是位置717以及位置670和671处的突变(分别称为Hardy和Swedish突变)、早老素基因PS1和PS2中的突变、AD的家族史、高胆固醇血症或动脉粥样硬化。目前患有阿尔茨海默病的个体可以通过PET成像、由特征性的痴呆以及如上所述的风险因素的存在来识别。此外，许多诊断测试可用于鉴定患有AD的个体。这些包括CSF tau或磷酸化-tau以及Aβ42水平的测量。升高的tau或磷酸化-tau和降低的Aβ42水平意味着AD的存在。一些突变与帕金森病相关联。Ala30Pro或Ala53或与帕金森病相关联的其他基因诸如富含亮氨酸重复片段的激酶PARK8中的突变。根据DSM IV TR的标准，个体也可以被诊断患有上文提及的任何神经疾病。
在无症状患者中，治疗可以在任何年龄开始(例如，10、20、30)。然而，通常，在患者达到40、50、60或70岁之前不必开始治疗。通常需要在一段时间内进行多剂量的治疗。可以通过测定随时间推移的抗体水平对治疗进行监测。如果应答下降，表明需要加强剂量。在潜在的唐氏综合症患者的情况下，可以通过向母亲施用治疗剂在出生前开始治疗或在出生后不久开始治疗。
I.核酸
本发明还提供了编码上述重链和轻链中的任一个的核酸(例如，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11)。任选地，此类核酸进一步编码信号肽，并且可以被表达为具有连接于恒定区的信号肽。核酸的编码序列可以与调控序列可操作地连接以确保编码序列的表达，诸如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等。编码重链和轻链的核酸可以以分离形式存在或可以克隆到一种或多种载体中。核酸可以通过例如固态合成或重叠寡核苷酸的PCR来合成。编码重链和轻链的核酸可以作为一个连续核酸接合在例如表达载体内，或可以是分开的，例如，各自克隆到其自身的表达载体中。
J.缀合抗体
与抗原诸如tau特异性结合的缀合抗体，可用于检测tau的存在；监测和评价治疗剂用于治疗被诊断患有以下疾病的患者的功效：阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)；抑制或减少tau的聚集；抑制或减少tau原纤维形成；减少或清除tau沉积物；稳定tau的无毒构象；或在患者中治疗以下疾病或实现所述疾病的预防：阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)。
例如，此类抗体可以与其他治疗性部分、其他蛋白质、其他抗体和/或可检测标记缀合。参见WO 03/057838；US 8,455,622。此类治疗性部分可以是可用于在患者中治疗、抗击、缓解、预防或改善不想要的病状或疾病任何剂，所述病状或疾病诸如阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)。
缀合的治疗性部分可包括细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、神经营养剂、神经保护剂、放射治疗剂、免疫调节剂或促进或增强抗体活性的任何生物活性剂。细胞毒性剂可以是对细胞有毒性的任何剂。细胞生长抑制剂可以是抑制细胞增殖的任何剂。神经营养剂可以是促进神经元维持、生长或分化的任何剂，包括化学剂或蛋白质剂。神经保护剂可以是保护神经元免于急性侵害或退化过程的剂，包括化学剂或蛋白质剂。免疫调节剂可以是刺激或抑制免疫应答的发展或维持的任何剂。放射治疗剂可以是发射辐射的任何分子或化合物。如果此类治疗性部分偶联于tau特异性抗体，诸如本文所述的抗体，那么偶联的治疗性部分将相对于正常细胞对tau相关疾病影响细胞具有特异性亲和力。因此，缀合抗体的施用直接靶向癌细胞，而对周围的正常健康组织具有最小的伤害。这对于毒性太大而不能单独施用的治疗性部分可以是特别有用的。此外，可以使用较少量的治疗性部分。
一些此类抗体可以被修饰以充当免疫毒素。参见，例如，美国专利No.5,194,594。例如，通过使用用于抗体的双功能试剂S-乙酰基巯基琥珀酸酐和用于蓖麻毒素的3-(2-吡啶基二硫代)丙酸琥珀酰亚胺酯，可以将来源于植物的细胞毒素蓖麻毒素偶联于抗体。参见Pietersz等人,Cancer Res.48(16):4469-4476(1998)。偶联导致蓖麻毒素的B链结合活性丧失，同时既不损害蓖麻毒素的A链的毒性潜力，也不损害抗体的活性。类似地，核糖体组装的抑制剂皂草素可通过化学插入的硫氢基(sulfhydryl)基团之间的二硫键偶联于抗体。参见Polito等人,Leukemia 18:1215-1222(2004)。
一些此类抗体可连接于放射性同位素。放射性同位素的实例包括，例如，钇90(90Y)、铟111(111In)、131I、99mTc、放射性银-111、放射性银-199以及铋213。放射性同位素与抗体的连接可以用常规的双功能螯合物进行。对于放射性银-111和放射性银-199连接，可以使用硫基接头。参见Hazra等人,Cell Biophys.24-25:1-7(1994)。银放射性同位素的连接可涉及用抗坏血酸还原免疫球蛋白。对于诸如111In和90Y的放射性同位素，可以使用替伊莫单抗并且将使其与此类同位素反应以分别形成111In-替伊莫单抗和90Y-替伊莫单抗。参见Witzig,Cancer Chemother.Pharmacol.,48增刊1:S91-S95(2001)。
一些此类抗体可以连接于其他治疗性部分。此类治疗性部分可以具有例如细胞毒性、细胞生长抑制性、神经营养性或神经保护性。例如，抗体可以与毒性化学治疗药物诸如美登素(maytansine)、格尔德霉素(geldanamycin)、微管蛋白抑制剂诸如微管蛋白结合剂(例如，奥瑞斯他汀(auristatin))或小沟结合剂诸如卡里奇霉素(calicheamicin)缀合。其他代表性的治疗性部分包括已知可用于以下疾病的治疗、处理或改善的剂：阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)。
抗体还可与其他蛋白质偶联。例如，抗体可与Fynomer偶联。Fynomer是衍生自人Fyn SH3结构域的小结合蛋白(例如，7kDa)。它们可以是稳定且可溶的，并且它们可缺乏半胱氨酸残基和二硫键。可将Fynomer工程化为以与抗体相同的亲和力和特异性结合至靶分子。它们适用于基于抗体产生多特异性融合蛋白。例如，Fynomer可以融合至抗体的N末端和/或C末端，以产生具有不同架构的双特异性和三特异性FynomAb。可以使用Fynomer文库，通过筛选技术，使用FACS、Biacore以及允许有效选择具有最佳特性的Fynomer的基于细胞的测定选择Fynomer。Fynomer的实例公开于Grabulovski等人,J.Biol.Chem.282:3196-3204(2007)；Bertschinger等人,Protein Eng.Des.Sel.20:57-68(2007)；Schlatter等人,MAbs.4:497-508(2011)；Banner等人,Acta.Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.69(Pt6):1124-1137(2013)；以及Brack等人,Mol.Cancer Ther.13:2030-2039(2014)。
本文公开的抗体还可以与一种或多种其他抗体偶联或缀合(例如，以形成抗体异源缀合物(antibody heteroconjugate))。此类其他抗体可以结合tau内的不同表位或可以结合不同的靶抗原。
抗体还可与可检测的标记偶联。此类抗体可用于例如诊断阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)，和/或用于评估治疗的功效。此类抗体尤其适用于在患有或易患以下疾病的受试者中：阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)，或在从此类患者获得的适当生物样品中执行此类测定。可以与抗体偶联或连接的代表性可检测标记包括各种酶，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，诸如链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，诸如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，诸如鲁米诺；生物发光材料，诸如萤光素酶、萤光素以及水母发光蛋白；放射性材料，诸如放射性银-111、放射性银-199、铋213、碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(5S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn以及117Tin；正电子发射金属，使用各种正电子发射断层摄影术；非放射性顺磁性金属离子；以及放射性标记的或缀合于特定放射性同位素的分子。
放射性同位素与抗体的连接可以用常规的双功能螯合物进行。对于放射性银-111和放射性银-199连接，可以使用硫基接头。参见Hazra等人,Cell Biophys.24-25:1-7(1994)。银放射性同位素的连接可涉及用抗坏血酸还原免疫球蛋白。对于诸如111In和90Y的放射性同位素，可以使用替伊莫单抗并且将使其与此类同位素反应以分别形成111In-替伊莫单抗和90Y-替伊莫单抗。参见Witzig,Cancer Chemother.Pharmacol.,48增刊1:S91-S95(2001)。
治疗性部分、其他蛋白质、其他抗体和/或可检测标记可以直接或通过中间体(例如，接头)间接与本发明的抗体偶联或缀合。参见，例如，Arnon等人,"MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,"在MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(编辑),第243-56页(Alan R.LissInc.1985)中；Hellstrom等人,"Antibodies For Drug Delivery,"在Controlled DrugDelivery(第2版),Robinson等人(编辑),第623-53页(Marcel Dekker Inc.1987)中；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,"在Monoclonal Antibodies 84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(编辑),第475-506页(1985)中；"Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,"在MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(编辑),第303-16页(Academic Press 1985)中；以及Thorpe等人,Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。合适的接头包括，例如，可切割和不可切割的接头。可采用在酸性或还原条件下，在暴露于特定蛋白酶时或在其他限定条件下释放所偶联的治疗性部分、蛋白质、抗体和/或可检测标记的不同接头。
VI.药物组合物和使用方法
在预防性应用中，抗体或用于诱导抗体的剂或其药物组合物以有效降低风险、减轻严重性，或延迟该疾病的至少一个体征或症状的发作的方案(剂量、频率和施用途径)施用至易患疾病(例如，阿尔茨海默病)或有患病风险的患者。具体地讲，该方案优选地有效抑制或延迟脑中的tau或磷酸化-tau和由其形成的成对丝，和/或抑制或延迟其毒性作用和/或抑制/或延迟行为缺陷的发展。在治疗性应用中，抗体或诱导抗体的剂以有效改善或至少抑制疾病(例如，阿尔茨海默病)的至少一个体征或症状的进一步恶化的方案(剂量、频率和施用途径)施用至疑似患有或已经患有该疾病的患者。具体地，该方案优选地有效减少或至少抑制与毒性和/或行为缺陷相关联的tau、磷酸化tau或由其形成的成对丝的水平的进一步增加。
如果个体治疗的患者达到的结果比不通过本发明的方法治疗的对比患者的对照群体中的平均结果更有利，或如果经治疗患者的结果相对于对照临床试验(例如，II期、II/III期或III期试验)中的对照患者被证明更有利，在p<0.05或0.01或甚至0.001的水平，那么方案被认为是治疗或预防有效的。
有效剂量随许多不同的因素而变化，所述因素诸如施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是否为ApoE载体、患者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。
抗体的示例性剂量范围为约0.01至60mg/kg，或约0.1至3mg/kg或0.15-2mg/kg或0.15-1.5mg/kg，以患者体重为基数。抗体可以每天、隔日、每周、每两周、每月、每季度或根据通过实证分析决定的任何其他时间表施用此类剂量。示例性的治疗需要长期施用多种剂量，例如至少六个月。另外的示例性治疗方案需要每两周施用一次或一月施用一次或每3至6个月施用一次。
对于人施用，用于主动施用的剂的量在每个患者0.1-500μg的，且更通常在每次注射1-100或1-10μg变化。注射的时间可以从一天一次至一年一次至十年一次显著变化。典型的方案由免疫，然后以诸如6周间隔或两个月的时间间隔进行加强注射组成。另一种方案由免疫，然后在1、2和12个月后进行加强注射组成。另一种方案需要两月一次终身注射。另选地，加强注射可以如通过免疫应答的监测所指示的不规律地进行。
抗体或用于诱导抗体的剂优选通过外部途径(即施用的或诱导的抗体穿过血脑屏障到达脑部中的预期部位的途径)施用。施用途径包括局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内、眼内或肌内。抗体施用的优选途径是静脉内和皮下。主动免疫的优选途径是皮下和肌内。这种类型的注射最通常在手臂或腿部肌肉中进行。在一些方法中，将剂直接注射到积聚沉积物的特定组织中，例如颅内注射。
用于肠胃外施用的药物组合物优选是无菌且基本上等渗并在GMP条件下制造的。药物组合物可以单位剂型(即，用于单次施用的剂量)提供。可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂配制药物组合物。配方取决于所选择的施用途径。对于注射，抗体可在水溶液中配制，优选在生理相容的缓冲液诸如汉克氏溶液(Hank’ssolution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐水或乙酸盐缓冲液中(以减少注射部位的不适)中配制。溶液可含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另选地，抗体可以是冻干形式，以在使用前用合适的媒介物(例如，无菌的无热原水)复原。
本发明的方案可以与有效治疗或预防正在治疗的疾病的另一种剂组合施用。例如，在阿尔茨海默病的情况下，本发明的方案可以与针对Aβ的免疫疗法(WO/2000/072880)、胆碱酯酶抑制剂或美金刚(memantine)组合，或在帕金森病的情况下，本发明的方案可以与针对α突触核蛋白的免疫疗法WO/2008/103472、左旋多巴、多巴胺激动剂、COMT抑制剂、MAO-B抑制剂、金刚烷胺或抗胆碱能剂组合。
抗体以有效方案施用，所述有效方案意指延迟发作、降低严重性、抑制进一步恶化和/或改善正在治疗的病症的至少一种体征或症状的剂量、施用途径和施用频率。如果患者已经患有病症，那么可以将该方案称为治疗有效方案。如果患者相对于普通群体患有该病症的风险高但尚未出现症状，那么将该方案称为预防有效方案。在一些情况下，相对于历史对照或同一患者的过去经历，可以在个体患者中观察到治疗或预防功效。在其他情况下，相对于未治疗患者的对照群体，可以在经治疗患者的群体的临床前或临床试验中证明治疗或预防功效。
抗体的示例性剂量为0.1-60mg/kg(例如，0.5、3、10、30或60mg/kg)或0.5-5mg/kg体重(例如，0.5、1、2、3、4或5mg/kg)或作为固定剂量的10-4000mg或10-1500mg。剂量取决于患者的状况和对先前治疗的应答(如果有的话)、治疗是预防性的还是治疗性的以及该病症是急性的还是慢性的以及其他因素。
施用可以是肠胃外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌内。可以通过静脉内或皮下施用将一些抗体施用到体循环中。静脉内施用可以，例如，通过在诸如30-90min的时间内输注。
施用频率取决于循环中抗体的半衰期、患者的状况和施用途径以及其他因素。频率可以是响应于患者状况的改变或正在治疗的病症的进展每天、每周、每月、每季度或不定期地。静脉内施用的示例性频率是在连续治疗过程内的每周与每季度之间，但也可以更频繁或更不频繁地给药。对于皮下施用，示例性给药频率是每天至每月，但也可以更频繁或更不频繁地给药。
施用的剂量数取决于该病症是急性的还是慢性的以及该病症对治疗的应答。对于急性病症或慢性病症的急性加重，1与10剂量之间通常是足够的。有时单次推注剂量，任选地以分开的形式，足以用于急性病症或慢性病症的急性加重。治疗可以重复用于急性病症或急性加重的复发。对于慢性病症，可以定期，例如，每周、每两周、每月、每季度、每六个月施用抗体至少1年、5年或10年，或患者终生。
A.诊断和监测方法
体内成像、诊断方法和优化免疫疗法
本发明提供了在患者体内对tau蛋白沉积物(例如，神经原纤维缠结和tau内含物)成像的方法。该方法通过向患者施用试剂诸如结合tau的抗体(例如，小鼠、人源化、嵌合或饰面的16G7抗体)，然后在其结合后检测该剂来工作。在一些方法中，抗体结合至SEQ IDNO:3的氨基酸残基55-78(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-136)内的tau的表位。在一些方法中，抗体结合至SEQ ID NO:3的氨基酸残基60-75(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基118-133)或SEQ ID NO:3的氨基酸残基61-70(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基119-128)内的表位。通过使用缺乏全长恒定区的抗体片段，诸如Fab，可以避免或减少对所施用抗体的清除应答。在一些方法中，相同的抗体可以用作治疗和诊断试剂两者。
诊断试剂可以通过静脉内注射施用到患者体内，或通过颅内注射或通过在颅骨上钻孔直接施用到脑部中。试剂的剂量应在与用于治疗方法相同的范围内。通常，对试剂进行标记，但在一些方法中，对tau具有亲和力的主要试剂未标记并且第二标记剂用于结合主要试剂。标记的选择取决于检测手段。例如，荧光标记适用于光学检测。顺磁性标记的使用适用于无需外科手术干预的断层摄影检测。还可以使用正电子发射断层摄影术(PET)或单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)检测放射性标记。
tau蛋白沉积物的体内成像方法可用于诊断tau蛋白病(诸如阿尔茨海默病、额颞叶变性、进行性核上性麻痹和皮克氏病)或确认其诊断或对这种疾病的易感性。例如，该方法可用于表现出痴呆症状的患者。如果患者具有异常的神经原纤维缠结，那么患者可能患有阿尔茨海默病。另选地，如果患者具有异常的tau内含物，那么取决于内含物的位置，患者可能患有额颞叶变性。该方法还可用于无症状患者。异常tau蛋白沉积物的存在表明对未来症状性疾病的易感性。该方法还可用于在先前已被诊断患有tau相关疾病的患者中监测疾病进展和/或对治疗的应答。
可以通过将标记基因座的数量、大小和/或强度与对应的基线值相比较来进行诊断。基线值可代表未患病个体的群体的平均水平。基线值还可代表在同一患者中确定的先前水平。例如，可以在开始tau免疫疗法治疗之前在患者中确定基线值，然后将测量值与基线值进行比较。相对于基线的值的减小传达了对治疗的阳性应答的信号。
在一些患者中，可以通过进行PET扫描来辅助tau蛋白病的诊断。可以使用例如常规的PET成像器和辅助设备进行PET扫描。扫描通常包括通常已知与tau蛋白沉积物相关联的一个或多个脑部区域以及其中通常存在很少(如果有的话)沉积物以用作对照的一个或多个区域。
在PET扫描中检测到的信号可以表示为多维图像。多维图像可以是表示穿过脑部的横截面的二维、表示三维脑部的三维或表示三维脑部随时间的变化的四维。可以使用具有不同颜色的色标，从而指示不同的标记量并且推测性地指示所检测到tau蛋白沉积物。扫描结果还可以利用与检测到的标记量以及因此tau蛋白沉积物的量相关的数字以数字方式呈现。存在于已知与特定tau蛋白病(例如，阿尔茨海默病)的沉积物相关联的脑部区域中的标记可与存在于已知与沉积物无关的区域中的标记进行比较，以提供指示前一个区域内的沉积物程度的比率。对于相同的放射性标记的配体，此类比例提供了不同患者之间的tau蛋白沉积物及其变化的可比较的度量。
在一些方法中，PET扫描与MRI或CAT扫描同时或在同一次患者就诊时进行。MRI或CAT扫描提供比PET扫描更多的脑部解剖细节。然而，来自PET扫描的图像可以叠加在MRI或CAT扫描图像上，从而更精确地指示相对于脑部的解剖结构PET配体的位置并由此推出tau沉积物的位置。一些机器可以执行PET扫描和MRI或CAT扫描，而无需患者在扫描之间改变位置，从而有利于图像的叠加。
合适的PET配体包括本发明的放射性标记的抗体(例如，小鼠、人源化、嵌合或饰面的16G7抗体)。所使用的放射性同位素可以是，例如，C11、N13、O15、F18或I123。施用PET配体与进行扫描之间的间隔可取决于PET配体，且具体地是其在脑部的摄取和清除速率，以及其放射性标记的半衰期。
PET扫描还可以作为预防措施在无症状患者中或在有轻度认知障碍症状但尚未被诊断患有tau蛋白病但发展tau蛋白病的风险高的患者中进行。对于无症状患者，扫描尤其适用于由于家族史、遗传或生化风险因素或中老年而被认为患tau蛋白病的风险高的个体。例如在45与75岁之间的患者年龄就可以开始预防性扫描。在一些患者中，在50岁时进行第一次扫描。
预防性扫描可以以例如介于六个月与十年，优选地介于1至5年的间隔进行。在一些患者中，一年一次进行预防性扫描。如果作为预防措施进行的PET扫描指示异常高的tau蛋白沉积物水平，那么可以开始免疫疗法并且随后进行PET扫描，就像在被诊断患有tau蛋白病的患者中那样。如果作为预防措施进行的PET扫描指示tau蛋白沉积物的水平在正常水平内，那么可以像之前一样以介于六个月与10年之间、且优选地1至5年的间隔，或响应于tau蛋白病或轻度认知障碍的体征或症状的出现而进行另外的PET扫描。如果且当检测到高于正常水平的tau蛋白沉积物时，通过将预防性扫描与tau定向免疫疗法的施用组合，可以将tau蛋白沉积物的水平降低至或接近正常水平，或至少抑制进一步增加，并且与没有接受预防性扫描和tau定向免疫疗法相比，患者可以保持更长时间不患tau蛋白病(例如，至少5年、10年、15年或20年，或患者的余生)。
tau蛋白沉积物的正常水平可以通过未被诊断患有特定tau蛋白病(例如，阿尔茨海默氏病)且不被认为处于发展这种疾病的高风险的普通群体中的个体的代表性样本(例如，50岁以下无疾病个体的代表性样本)的脑部神经原纤维缠结或tau内含物的量来确定。另选地，如果已知其中发展了tau蛋白沉积物的脑部区域中的根据本方法的PET信号不同于(在测量的准确度内)来自其中已知此类沉积物通常不发展的脑部区域中的信号，那么可以在个体患者中识别正常水平。通过与正常水平(例如，外部平均值和标准偏差的方差)进行比较，或者仅仅由与不被已知与沉积物相关联的区域相比与tau蛋白沉积物相关联的脑部区域中超出实验误差的升高的信号，可以识别个体中的升高水平。为了比较个体和群体中tau蛋白沉积物的水平，tau蛋白沉积物应优选在脑部的一个或多个相同区域中确定，这些区域包括已知形成与特定的tau蛋白病(例如，阿尔兹海默病)相关联的tau蛋白沉积物的至少一个区域。具有升高水平的tau蛋白沉积物的患者是开始免疫疗法的候选者。
在开始免疫疗法后，可首先将tau蛋白沉积物水平的降低视为治疗具有期望效果的指示。观察到的降低可以是，例如，在基线值的1-100％、1-50％或1-25％的范围内。此类效果可以在已知沉积物在其中形成的脑部的一个或多个区域中测量，或可以由此类区域的平均值测量。治疗的总效果可以通过将相对于基线的减少百分比与平均未治疗患者中将可能存在的tau蛋白沉积物的增加相加来近似计算。
tau蛋白沉积物在大约恒定水平的维持或甚至tau蛋白沉积物的少量增加也可以指示对治疗的应答，尽管是非最佳应答。可以将此类应答与未接受治疗的具有特定tau蛋白病(例如，阿尔茨海默病)的患者中的tau蛋白沉积物水平的时间过程进行比较，以确定免疫疗法是否具有抑制tau蛋白沉积物进一步增加的作用。
tau蛋白沉积物的变化的监测允许响应于治疗调整免疫疗法或其他治疗方案。PET监测提供了对治疗的应答的性质和程度的指示。然后，可以确定是否调整治疗，并且如果需要，可以响应于PET监测来调整治疗。因此，PET监测允许在其他生物标志物、MRI或认知测量已经可检测地响应之前调整tau定向免疫疗法或其他治疗方案。显著变化意指治疗后的参数值相对于基线的比较提供了治疗已经或尚未产生有益效果的一些证据。在一些情况下，患者自身中参数值的变化提供了治疗已经或尚未产生有益效果的证据。在其他情况下，将患者中的值的变化(如果有的话)与未进行免疫疗法的患者的代表性对照群体中的值的变化(如果有的话)进行比较。特定患者的应答与对照患者的正常应答的差异(例如，平均值加标准偏差的方差)也可以提供免疫疗法方案在患者中实现或未实现有益效果的证据。
在一些患者中，监测指示了tau蛋白沉积物的可检测下降，但是tau蛋白沉积物的水平仍保持高于正常水平。在此类患者中，如果没有不可接受的副作用，那么治疗方案可以按原样继续，或甚至增加施用频率和/或剂量(如果尚未达到最大推荐剂量的话)。
如果监测指示患者中tau蛋白沉积物的水平已经降低至tau蛋白沉积物的正常或接近正常水平，那么免疫治疗方案可以从诱导的方案(即，降低tau蛋白沉积物的水平)调整为维持的方案(即，将tau蛋白沉积物维持在大致恒定的水平)。这种方案可通过减少施用免疫疗法的剂量和/或频率实现。
在其他患者中，监测可指示免疫疗法具有一些有益效果但是非最佳效果。最佳效果可以定义为在开始疗法后在给定时间点进行免疫疗法的tau蛋白病患者的代表性样本所经历的tau蛋白沉积物的变化的上半部分或四分点之内的tau蛋白沉积物水平的百分比减少(在整个脑部或已知tau蛋白沉积物在其中形成的其代表性区域中测量或计算)。经历较小降低的患者或其tau蛋白沉积物保持恒定或甚至增加但程度小于在不存在免疫疗法的情况下所预期的程度(例如，如从不施用免疫疗法的患者的对照组所推断的那样)的患者可被归类为经历阳性但非最佳的应答。此类患者可以任选地进行方案调整，其中增加了剂的剂量和或施用频率。
在一些患者中，tau蛋白沉积物可以与不接受免疫疗法的患者中的tau沉积物类似或更大的方式增加。如果此类增加持续一段时间，诸如18个月或2年，甚至在剂的频率或剂量的任何增加之后，那么可以根据需要停止免疫疗法，以有利于其他治疗。
诊断、监测和调整tau蛋白病的治疗的以上描述主要集中在使用PET扫描。然而，可以使用用于可视化和/或测量适于本发明的tau抗体(例如，小鼠、人源化、嵌合或饰面的16G7抗体)的使用的tau蛋白沉积物的任何其他技术代替PET扫描来执行此类方法。
还提供了在患有或易患与tau相关联的疾病的患者中检测针对tau的免疫应答的方法。所述方法可用于监测使用本文提供的剂的治疗性和预防性治疗的过程。被动免疫后的抗体谱通常显示出抗体浓度的立即峰值，然后是指数衰减。在没有再次给药的情况下，衰变取决于所施用的抗体的半衰期在数天至数月的时间段内接近治疗前水平。例如，一些人抗体的半衰期为约20天。
在一些方法中，在施用之前进行受试者中针对tau的抗体的基线测量，之后不久进行第二次测量以确定峰值抗体水平，并且间隔地进行一次或多次进一步测量以监测抗体水平的衰减。当抗体水平已经下降至基线或低于基线的峰值(peak less baseline)的预定百分比(例如，50％、25％或10％)时，施用另一剂量抗体的施用。在一些方法中，将低于背景的峰值或随后测定的水平与先前测定的参考水平进行比较以在其他受试者中构建有益的预防性或治疗性治疗方案。如果测量的抗体水平显著小于参考水平(例如，小于由治疗受益的受试者群体中的参考值的平均值减一个或优选地，两个标准偏差)，指示施用附加剂量的抗体。
还提供了检测受试者中的tau的方法，例如，通过测量来自受试者的样品中的tau或通过受试者中的tau的体内成像。此类方法可用于诊断或确认与tau相关联的疾病的诊断或其易感性。所述方法还可用于无症状受试者。tau的存在指示对未来症状性疾病的易感性。所述方法还可用于监测先前已经被诊断患有以下疾病的受试者中的疾病进展和/或对治疗的应答：阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)。
可以使从患有阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)、疑似患有所述疾病或有患所述疾病风险的受试者获得的生物样品与本文公开的抗体接触以评估tau的存在。例如，可以将此类受试者中的tau水平与健康受试者中存在的那些水平进行比较。另选地，可以将接受对该疾病的治疗的此类受试者中的tau水平与没有针对以下疾病进行治疗的受试者的那些tau水平相比较：阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)。一些此类测试涉及从此类受试者中获得的组织活检。ELISA测定也可以是有用的方法，例如，用于评估流体样品中的tau。
IX.药盒
本发明还提供了包括本文公开的抗体和相关材料诸如使用说明书(例如，包装插页)的药盒(例如，容器)。使用说明书可包含例如施用抗体和任选的一种或多种另外剂的说明书。抗体的容器可以是单位剂量、散装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。
包装插页是指通常治疗性产品的商业包装中通常包括的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或关于此类治疗产品的使用的警告的信息。
药盒还可包括第二容器，其包括药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
X.其他应用
抗体可用于在临床诊断或治疗或研究的情况下检测tau或其片段。例如，抗体可用于检测生物样品中tau的存在，作为生物样品包括tau沉积物的指示。可以将抗体与生物样品的结合和抗体与对照样品的结合进行比较。对照样品和生物样品可包括相同组织来源的细胞。对照样品和生物样品可以从相同的个体或不同的个体并且可以在相同的场合或在不同的场合获得。如果需要，在多个场合评价多个生物样品和多个对照样品，以对抗与样品之间的差异无关的随机变化。然后可以在一个或多个生物样品和一个或多个对照样品之间进行直接比较，以确定相对于抗体与一个或多个对照样品的结合而言，抗体与一个或多个生物样品的结合(即，tau的存在)增加、减少还是相同。相对于一个或多个对照样品，抗体与一个或多个生物样品的结合的增加表明一个或多个生物样品中存在tau。在一些情况下，增加的抗体结合在统计学上是显著的。任选地，抗体与生物样品的结合是抗体与对照样品的结合的至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或100倍。
此外，抗体可用于检测生物样品中tau的存在，以监测和评价用于治疗被诊断患有以下疾病的患者的治疗剂的功效：阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)。对来自被诊断患有阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)的患者的生物样品进行评价，以建立在用治疗剂开始疗法之前抗体与样品的结合的基线(即，样品中存在tau的基线)。在一些情况下，在多个场合评价来自患者的多个生物样品，以建立基线和与治疗无关的随机变化的量度。然后以一个方案施用治疗剂。该方案可包括在一段时间内多次施用剂。任选地，在多个场合在来自患者的多个生物样品中评价抗体的结合(即，tau的存在)，以建立随机变化的量度并显示出响应于免疫疗法的趋势。然后比较抗体与生物样品的结合的各种评估。如果仅进行两次评估，那么可以在这两次评估之间进行直接比较，以确定抗体结合(即，tau的存在)在两次评估之间是否增加、减少或保持相同。如果进行了多于两次的测量，那么可以将测量分析为在用治疗剂治疗之前开始且在整个疗程中前进的时间过程。在抗体与生物样品的结合(即，tau的存在)减少的患者中，可以推断出治疗剂有效治疗患者中的以下疾病：阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)。抗体结合的减少可以是在统计学上显著的。任选地，结合减少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抗体结合的评估可以与评估以下疾病的其他体征和症状结合进行：阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)。
抗体还可以用作检测tau或其片段的实验室研究的研究试剂。在此类用途中，抗体可以用荧光分子、自旋标记分子、酶或放射性同位素标记，并且可以以具有用以执行检测测定的所有必需试剂的试剂盒的形式提供。抗体还可用于例如通过亲和色谱纯化tau或tau的结合配偶体。
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实施例
实施例1.tau单克隆抗体的鉴定
单克隆抗体16G7根据Kohler和Milstein(G.Kohler和C.Milstein(1975)Nature256:495-497)的方法的修改进行制备。在所有注射和筛选测定中使用含有所有4个微管结合重复序列且缺少N末端剪接变体的人tau(4R0N tau，383个氨基酸)。从用含有tau的杆状病毒构建体感染的SF9细胞中纯化tau(J.Knops等人(1991)J Cell Biol 115(5):725-33)。以两周的间隔向六周龄A/J小鼠注射100μg的纯化tau。将Tau在完全弗氏佐剂中乳化以用于第一次免疫，并且在不完全弗氏佐剂中乳化以用于所有后续免疫。在第三次注射后三天取血清样品以评估这些动物的滴度。将最高滴度的小鼠在接受其第三次注射后两周静脉内注射在500μL PBS中的100μg tau。三天后使用SP2/0作为融合配偶体发生骨髓瘤融合。针对它们沉淀125I标记的tau的能力对来自含有杂交瘤细胞的孔的上清液进行筛选。根据制造商的说明书(Bio-Rad)，使用固定化的葡萄糖氧化酶和乳过氧化物酶对tau进行放射性碘化。简而言之，将10μg纯化的重组tau用1mCi的Na125I放射性标记至20μCi/μg蛋白质的比活。16G7被鉴定为对于tau具有特异性的高亲和力单克隆抗体，并通过有限稀释进行克隆。16G7的同种型被确定为γ1κ。
实施例2.抗体16G7的表位作图
跨越整个383aa 4R0N人tau蛋白的一系列重叠生物素化肽用于对鼠16G7抗体进行作图。另外的肽用于对蛋白质的C末端和N末端的潜在的翻译后修饰进行建模。
生物素化肽结合至链霉抗生物素蛋白包被的ELISA平板的单独的孔。将平板封闭并用鼠16G7处理，然后与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠抗体一起孵育。彻底洗涤后，将OPD施加到平板上并使其显影。读取平板在450nm处的吸光度。利用不含一抗的孔的吸光度值进行背景减除，并且将阳性结合的阈值设定为0.2吸光度单位。
对于跨越SEQ ID NO:3的氨基酸残基55-69的肽检测到阳性结合，并且对于跨越SEQ ID NO:3的氨基酸残基64-78的肽检测到较小的结合(图1)。使用全长4R2N人tau蛋白(441个氨基酸)(SEQ ID NO:1)的编号，这些肽分别对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基113-127和122-136。
实施例3.人源化16G7抗体的设计
人源化的起点或供体抗体是小鼠抗体16G7。成熟m16G7的重链可变氨基酸序列作为SEQ ID NO:7提供。成熟m16G7的轻链可变氨基酸序列作为SEQ ID NO:11提供。重链Kabat/Chothia复合物CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别作为SEQ ID NO:8-10提供。轻链Kabat CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别作为SEQ ID NO 12-14提供。始终使用Kabat编号。
16G7的可变κ(Vk)属于小鼠Kabat第1亚组，其对应于人Kabat第4亚组，并且可变重链(Vh)属于小鼠Kabat第2b亚组，其对应于人Kabat第1亚组[Kabat E.A.等人,(1991),Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版NIH出版号91-3242]。在Vk中，17残基Chothia CDR-L1属于规范类别3，7残基Chothia CDR-L2属于类别1，9残基Chothia CDR-L3属于类别1[Martin A.C和Thornton J.M.(1996)J.Mol.Biol.263:800-15.]。10残基Chothia CDR-H1属于类别1，17残基Chothia CDR-H2属于类别2[Martin&Thornton,1996]。CDR-H3没有规范类别，但根据Shirai等人的规则，9残基环可能具有扭结的碱基[Shirai H等人,(1999)FEBS Lett.455:188-97.]。对PDB数据库中的蛋白质序列进行了搜索[Deshpande N等人,(2005)Nucleic Acids Res.33:D233-7.]，以寻找将提供16G7的粗略结构模型的结构。使用具有2.1A的分辨率的土拉弗朗西斯菌(Francisellatularenis)FAB(pdb代码3UJT)[Rynkiewicz,M.J.等人,(2012)Biochemistry 51:5684-5694]的抗O-抗原的结构构建16G7的Fv模型。它保留了与16G7相同的环规范结构。对于VLv1、VLv2和VLv3，还应用了从来自NCBI的非冗余蛋白质序列数据库的搜索获得的人VL受体AAB24404.1和AEK69364.1(遵照先前的INN人源化规则)。对于VHv1、VHv2、VHv3、VHv4、VHv5V和VHv5VR，还应用了从来自NCBI的非冗余蛋白质序列数据库的搜索获得的受体AAA18265.1和ADW08092.1(遵照先前的INN人源化规则)。
遵照2015 INN抗体人源化规则[Jones,T.D.等人,(2016),The INNs and outs ofantibody nonproprietary names.mAbs(http://dx.doi.org/10.1080/19420862.2015.1114320)]，IMGT数据库的搜索允许选择将鼠CDR接枝到其中的合适的人种系框架。对于Vk，选择具有IMGT#IGKV4-1*01的人κ轻链。这具有对于CDR-L1、CDR-L2和L3相同的规范类别，并且属于人κ第1亚组。对于Vh，选择具有IMGT#IGHV1-2*02的人重链，其属于人重链第1亚组。它共享16G7CDR-H1和H2的规范形式。使用IMGT#IGHV1-2*02作为受体设计VHv2a、VHv2b、VHv2aB7、VHv2bH7、VHv6a、VHv6b和VHv7。
使用IMGT Domain GapAlign工具将由抗体人源化过程产生的重链和轻链变体序列与人种系序列进一步比对，以评估重链和轻链的人源性(humanness)，如WHO INN委员会准则所概述的。(WHO-INN:International nonproprietary names(INN)for biologicaland biotechnological substances(综述)(Internet)2014.获自：http://www.who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf)。在可能的情况下，改变残基以与对应的人种系序列对齐，以增强人源性。
构建出含有不同的取代排列的13个人源化重链可变区变体和3个人源化轻链可变区变体(hu16G7VHv1、hu16G7VHv2、hu16G7VHv2a、16G7VHv2aB7、hu16G7VHv2b、hu16G7VHv2bH7、hu16G7VHv3、hu16G7VHv4、hu16G7VHv5V、hu16G7VHv5VR、hu16G7VHv6a、hu16G7VHv6b和hu16G7VHv7(分别为SEQ ID NO:15-27)以及hu16G7VLv1、hu16G7VLv2和hu16G7VLv3(分别为SEQ ID NO:28-30)(表4和3)。具有基于所选人框架的回复突变和其他突变的示例性人源化Vk和Vh设计分别在表3和表4中示出。表3和表4中的灰色阴影区域表示由Kabat/Chothia复合物定义的CDR。SEQ ID NO:15-27和SEQ ID NO:28-30含有如表5所示的回复突变和其他突变。hu16G7VHv1、hu16G7VHv2、hu16G7VHv2a、16G7VHv2aB7、hu16G7VHv2b、hu16G7VHv2bH7、hu16G7VHv3、hu16G7VHv4、hu16G7VHv5V、hu16G7VHv5VR、hu16G7VHv6a、hu16G7VHv6b和hu16G7VHv7中的位置H1、H5、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H20、H31、H37、H38、H40、H48、H60、H64、H66、H67、H69、H71、H73、H75、H80、H82s、H82b、H83和H85处的氨基酸在表6中列出。hu16G7VLv1、hu16G7VLv2和hu16G7VLv3中的位置L4、L9、L15、L18、L19、L21、L22、L43和L48处的氨基酸在表7中列出。人源化VH链hu16G7VHv1、hu16G7VHv2、hu16G7VHv2a、16G7VHv2aB7、hu16G7VHv2b、hu16G7VHv2bH7、hu16G7VHv3、hu16G7VHv4、hu16G7VHv5V、hu16G7VHv5VR、hu16G7VHv6a、hu16G7VHv6b和hu16G7VHv7(分别为SEQ ID NO:15-27)和人源化VL链hu16G7VLv1、hu16G7VLv2和hu16G7VLv3(分别为SEQ ID NO:28-30)的人源性百分比在表8中示出。
表3
Figure BDA0001929687460000851
表3
Figure BDA0001929687460000861
表3
Figure BDA0001929687460000871
表3
Figure BDA0001929687460000881
表3
Figure BDA0001929687460000891
表4
Figure BDA0001929687460000901
表4
Figure BDA0001929687460000911
表4
Figure BDA0001929687460000921
表4
Figure BDA0001929687460000931
表4
Figure BDA0001929687460000941
表5人源化16G7的VH、VL回复突变和其他突变表5
Figure BDA0001929687460000942
表5
Figure BDA0001929687460000951
表5
Figure BDA0001929687460000961
表6：人源化16G7抗体的重链中的回复突变和其他突变的框架(或CDR)残基(基于Kabat/Chothia复合物CDR)的Kabat编号
表6
Figure BDA0001929687460000971
表6
Figure BDA0001929687460000972
表7：人源化16G7抗体的轻链中的回复突变和其他突变的框架残基(基于Kabat/Chothia复合物CDR)的Kabat编号
表7
Figure BDA0001929687460000981
表8：人源化16G7抗体的重链和轻链的人源性百分比
V<sub>H</sub>或V<sub>L</sub>变体 人源性％
hu16G7VHv1(SEQ ID NO：15) 64.30％
hu16G7VHv2(SEQ ID NO：16) 76.50％
hu16G7VHv2a(SEQ ID NO：17) 79.60％
16G7VHv2aB7(SEQ ID NO：18) 81.60％
hu16G7VHv2b(SEQ ID NO：19) 82.70％
hu16G7VHv2hH7(SEQ ID NO：20) 85.70％
hu16G7VHv3(SEQ ID NO：21) 72.40％
hu16G7VHv4(SEQ ID NO：22) 73.50％
hu16G7VHv5V(SEQ ID NO：23) 66.30％
hu16G7VHv5VR(SEQ ID NO：24) 67.30％
hu16G7VHv6a(SEQ ID NO：25) 86.70％
hu16G7VHv6b(SEQ ID NO：26) 88.80％
hu16G7VHv7(SEQ ID NO：27) 85.70％
hu16G7VLv1(SEQ ID NO：28) 82.20％
hu16G7VLv2(SEQ ID NO：29) 86.10％
hu16G7VLv3(SEQ ID NO：30) 83.20％
在小鼠与人受体序列之间规范、微调或界面残基不同的位置是取代候选。规范/CDR相互作用残基的实例包括表4中的Kabat残基H24、H26、H27、H29、H34、H52a、H55、H70、H71、H74、H94、L2、L4、L25、L27b、L33、L48、L64、L71、L90和L95。界面/堆积(VH+VL)残基的实例包括表3中的Kabat残基H35、H37、H39、H45、H47、H91、H93、H95、H100a、H103、L34、L36、L38、L44、L46、L87、L89、L91、L96、L98。
选择轻链可变区中表3所示位置作为取代候选的理由如下。
M4L是与LCDR1和LCDR3接触的残基的突变。P43S是与VH中的两个界面残基(Y91和W103)接触的残基的突变。I48M是界面残基的突变。D9S、L15V、R18K、A19V、I21M和N22S是基于频率的回复突变或频率/种系对齐突变(frequency/germ-line aligning mutation)。
选择重链可变区中表4所示位置作为取代候选的理由如下。
Q1E是稳定性增强突变，以减少形成焦谷氨酸的可能性。(Liu,2011,同上)。
S7P是脯氨酸的突变，以改善折叠。R71V是可通过氢键与HCDR2接触的残基的突变。T73I是可与HCDR1和HCDR2接触的残基的突变。
V5Q、E10V、V11L、K12V、K13R、V20L、S31G、V37A、R38K、A40R、M48I、N60A、K64Q、R66K、V67A、M69L、I75S、I75A、M80V、S82a-T、R83b-S、R83T和D85E是基于频率的回复突变或种系对齐突变。
使用两阶段PCR方案生成人源化序列，其允许使用QuikChange定点诱变引入多个突变、缺失和插入[Wang,W.和Malcolm,B.A.(1999)BioTechniques 26:680-682)。
基于这些人框架的设计是：
可变K
hu16G7VLv1(SEQ ID NO：28)：
Figure BDA0001929687460001001
hu16G7VLv2(SEQ ID NO：29)：
Figure BDA0001929687460001002
hu16G7VLv3(SEQ ID NO：30)：
Figure BDA0001929687460001003
可变重链
hu16G7VHv1(SEQ ID NO：15)：
Figure BDA0001929687460001011
hu16G7VHv2(SEQ ID NO：16)：
Figure BDA0001929687460001012
hu16G7VHv2a(SEQ ID NO：17)：
Figure BDA0001929687460001013
hu16G7VH2aB7(SEQ ID NO：18)
Figure BDA0001929687460001014
hu16G7VHv2b(SEQ ID NO：19)：
Figure BDA0001929687460001015
hu16G7VH2bH7(SEQ ID NO：20)
Figure BDA0001929687460001021
hu16G7VHv3(SEQ ID NO：21)：
Figure BDA0001929687460001022
hu16G7VHv4(SEQ ID NO：22)：
Figure BDA0001929687460001023
hu16G7VHv5V(SEQ ID NO：23)：
Figure BDA0001929687460001024
hu16G7VHv5VR(SEQ ID NO：24)：
Figure BDA0001929687460001025
hu16G7VHv6a(SEQ ID NO：25)：
Figure BDA0001929687460001026
hu16G7VHv6b(SEQ ID NO：26)：
Figure BDA0001929687460001027
hu16G7VHv7(SEQ ID NO：27)：
Figure BDA0001929687460001028
实施例4.16G7免疫捕获来自人阿尔茨海默病组织的tau
方法：
图4A：使用来自阿尔茨海默病脑部的颞叶皮层组织提取各种溶解度的蛋白质级分。将冷冻组织在5体积的重组(RAB)缓冲液(100mM MES、1mM EGTA、0.5mM MgSO4、750mMNaCl，pH 6.8)中匀浆，并离心以产生RAB可溶性级分。然后将沉淀物在5体积的放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(25mM Tris、150mM NaCl、1％NP-40、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS，pH7.5)中匀浆并离心以产生RIPA可溶性级分。将该沉淀物在5体积的sarkosyl缓冲液(25mMTris、1mM EGTA、1％sarkosyl、10％蔗糖、1mM DTT、500mM NaCl，pH 7.5)中匀浆，并离心以产生sarkosyl可溶性级分。将该最终的sarkosyl不溶性沉淀物在2％SDS中匀浆。在还原/变性样品缓冲液中制备样品，并通过SDS-PAGE解析。使用鼠16G7进行蛋白质印迹。
图4B：将RAB可溶性蛋白质级分制备成1mg/ml。对于每次免疫沉淀，使用300μg的样品。将10μg的指示抗体(同种型对照、16G7或抗-tau抗体16B5)添加到RAB样品制备物中，并孵育2h。然后将蛋白G磁珠添加到混合物中，并且再孵育一小时以捕获抗体/抗原复合物。用1xPBS彻底洗涤样品，并将珠子在还原/变性样品缓冲液中煮沸以释放捕获的蛋白质。通过SDS-PAGE解析所得的样品，并使用多克隆抗-tau抗体(Dako，#A0024)进行蛋白质印迹。
结果：
图4A：16G7识别来自人阿尔茨海默病组织的可溶性和sarkosyl不溶性tau。通过SDS-PAGE解析不同溶解度的蛋白质级分，并用16G7进行印迹。在可溶性和不溶性级分中观察到多种tau同种型，并且在不溶性级分中检测到电泳迁移率变化，这与tau的病理形式一致。在sarkosyl不溶性级分中存在明显的tau积聚。左侧：分子量标志物。泳道名称：1-RAB可溶物，2-RIPA可溶物，3-Sarkosyl可溶物，4-Sarkosyl不溶物。
图4B：16G7免疫沉淀来自阿尔茨海默病组织的tau。用指示抗体使RAB可溶性级分免疫沉淀，并使用针对tau分子的单独区域的多克隆抗-tau抗体从16G7和抗-tau抗体16B5的结合位点检测。16G7从该级分强健地捕获tau。输入(RAB可溶性样品)在右侧示出。
实施例5.对人阿尔茨海默病组织的反应性(免疫组织化学)
从在死后评估时确认没有神经变性疾病或患有阿尔茨海默病的患者中获得额颞叶皮质。在轻度丙酮固定的10μm载玻片包埋的冷冻切片上进行免疫组织化学。使用Leica消耗品，使用Leica BOND Rx自动染色机进行所有染色步骤。将16G7的鼠或人形式与组织切片一起孵育，然后添加缀合于HRP聚合物的物种适当的二抗。当在人组织上使用人源化抗体时，为了防止内源免疫球蛋白的非特异性结合，在体外用生物素缀合的抗人单价Fab片段非共价标记抗体，然后在组织上孵育。使用抗生物素蛋白-生物素扩增系统(VectorLaboratories,Burlingame,CA)进一步扩增用一抗-生物素Fab片段复合物标记的组织。用DAB色原使染色可视化，产生褐色沉积物。阴性对照由用IgG同种型对照抗体在相邻切片上执行整个免疫组织化学程序组成。
所测试的抗体是鼠16G7、嵌合16G7(其含有来自具有人恒定区、重链SEQ ID NO:54和轻链SEQ ID NO:55的鼠抗体的VH和VL)以及人源化16G7变体hu16G7VHv7/hu16G7VLv2和hu16G7VHv2bH7/hu16G7VLv2。
对用鼠16G7、嵌合16G7和16G7的人源化形式(hu16G7VHv7/hu16G7VLv2和hu16G7VHv2bH7/hu16G7VLv2)进行的染色进行定性比较并评估染色的强力和强度，以及免疫反应性的定位。对于16G7的嵌合和人源化形式，染色强度是相似的，并且与抗体的鼠形式相比表现出相似的定位模式。在神经原纤维缠结、原纤维、神经纤维网线以及变性轴突中检测到tau。还检测到明显的神经元体细胞(somal)染色。
实施例6.解聚活性
方法：
重组tau的聚集-将具有N末端6xHis标签的经纯化的重组tau与等摩尔量的低分子量肝素在1xPBS(pH 7.4)中配混，并在章动器(nutator)上于37℃孵育96h。通过与硫磺素T的结合确认样品的聚集。
与抗体一起孵育-将抗体与聚集的重组tau以指示的摩尔比一起孵育，在没有旋转或章动的情况下在37℃下孵育96h。在实验结束时，通过将样品与25mM硫磺素T一起孵育并测量发射的荧光(450nm/482nm激发/发射)来测量聚集。将信号背景减除至缓冲样品。
结果：
如图5所示，16G7优先分解完整的tau原纤维。将不同摩尔比的16G7(三角形)、同种型对照(圆圈)和抗-tau抗体16B5(正方形)与含淀粉样蛋白的tau原纤维一起孵育96小时。在这一时间段结束时，通过与硫磺素T的结合评估聚集程度。与同种型对照抗体以及抗-tau抗体16B5(结合至tau的不同区域)相比，16G7优先降低样品中存在的硫磺素T信号。
实施例7.鼠16G7抗体与tau的亲和力
使用Biacore T200进行SPR分析以确定16G7与重组人tau的结合动力学。为了制备传感器表面，通过胺偶联将抗小鼠抗体(GE Life Sciences)固定在传感器芯片CM5上，并且以一定的水平捕获16G7以确保50RU的最大结合。在运行缓冲液(HBS+0.05％P-20，1mg/mLBSA)中，使在10-0.14nM范围内的各种浓度的重组tau以50μL/min的流速经过捕获配体，进行180sec缔合和900sec解离。数据双重参考不含抗体配体的不相关传感器和0nM分析物浓度，以考虑到配体与捕获部分的解离。然后使用全局1:1拟合对数据进行分析。结合动力学在图6中示出。
实施例8.嵌合16G7抗体和人源化变体对tau的亲和力
使用Biacore T200进行SPR分析以确定16G7与重组人tau的结合动力学。为了制备传感器表面，通过胺偶联将抗人抗体(GE Life Sciences)固定在传感器芯片CM5上，并且以一定的水平捕获嵌合或人源化抗体以确保50RU的最大结合。在运行缓冲液(HBS+0.05％P-20，1mg/mL BSA)中，使在10-0.14nM范围内的各种浓度的重组tau以50μL/min的流速经过平行的捕获配体，进行180sec缔合和900sec解离。数据双重参考不含抗体配体的不相关传感器和0nM分析物浓度，以考虑到配体与捕获部分的解离。然后使用全局1:1拟合对数据进行分析。
所测试的抗体是嵌合16G7((其含有来自具有人恒定区、重链SEQ ID NO:54和轻链SEQ ID NO:55的鼠抗体的VH和VL)以及人源化变体(hu16G7VHv2a/hu16G7VLv2、hu16G7VHv2b/hu16G7VLv2和hu16G7VHv7/hu16G7VLv2)。
图7：通过SPR分析确定所测试抗体的亲和力。使不同浓度的重组tau流过固定化抗体，并使用全局1:1拟合分析所得的传感图。动力学亲和力、缔合和解离速率在图7中示出。
实施例9.对聚集的tau的亲合力
方法：
Fab片段的生成-使用Fab Micro Preparation试剂盒遵照制造商的指导(Pierce)生成16G7的Fab片段。通过SDS-PAGE监测所释放的Fc的移除和完整的最终产物的验证，并使用二辛可宁酸测定(Pierce)来确定浓度。
重组tau的聚集-将具有N末端6xHis标签的经纯化的重组tau与等摩尔量的低分子量肝素在1xPBS(pH 7.4)中配混，并在章动器(nutator)上于37℃孵育96h。通过与硫磺素T的结合确认样品的聚集。
Fab片段和完整抗体的SPR分析-使用Biacore T200进行Fab片段和完整抗体的比较性结合研究。为了制备传感器表面，通过胺偶联将抗-his抗体(GE Life Sciences)固定在传感器芯片CM3上，并且使聚集的重组tau(上文制备)经过测试通道并充当测定配体。在单循环模式中使16G7(完整抗体或Fab片段)在运行缓冲液(HBS+0.05％P-20、1mg/mL BSA)中以50μL/min的流速经过捕获的聚集tau，浓度范围为10-0.016nM，进行180sec的缔合阶段和900sec的最终解离阶段。将缔合/解离迹线双参考减除不含抗体配体的不相关传感器和0nM分析物浓度，以考虑到配体从捕获部分上的解离。
结果：
亲合力是抗体-抗原相互作用的多重亲和力的量度，并且更接近地表示抗体对固定化抗原诸如由tau构成的聚集体或神经原纤维缠结的功能亲和力。在SPR测量中，亲和力(单一相互作用)与亲合力(多重相互作用)之间的差异通过比较含有单个结合结构域的Fab片段和具有两个结合结构域的完整抗体的结合动力学而产生。
在图8中，将16G7 Fab片段的结合测量结果与完整抗体进行比较。图示了缔合(水平实线)和解离(水平虚线)阶段。单结合位点亲和力与双结合位点亲合力之间的差异在终末解离阶段最明显，从1300秒开始。对于完整抗体，抗体/抗原复合物没有明显的解离，而Fab片段明显从聚集tau上解离。
序列表
P10636-8(SEQ ID NO：1)
Figure BDA0001929687460001081
P10636-7(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0001929687460001082
P10636-6(4RON人tau)(SEQ ID NO：3)
Figure BDA0001929687460001083
P10636-5(SEQ ID NO：4)
Figure BDA0001929687460001084
Figure BDA0001929687460001091
P10636-4(SEQ ID NO：5)
Figure BDA0001929687460001092
P10636-2(SEQ ID NO：6)
Figure BDA0001929687460001093
SEQ ID NO：7；VH蛋白序列：
Figure BDA0001929687460001094
SEQ ID NO：8；鼠HHCDR1：
Figure BDA0001929687460001095
SEQ ID NO：9；鼠HCDR2：
Figure BDA0001929687460001096
SEQ ID NO：10；鼠HCDR3：
Figure BDA0001929687460001101
SEQ ID NO：11；鼠VL蛋白序列：
Figure BDA0001929687460001102
SEQ ID NO：12；鼠LCDR1：
Figure BDA0001929687460001103
SEQ ID NO：13；鼠LCDR2：
Figure BDA0001929687460001104
SEQ ID NO：14；鼠LCDR3：
Figure BDA0001929687460001105
SEQ ID NO：15；＞hu16G7VHv1
Figure BDA0001929687460001106
SEQ ID NO：16：＞hu16G7VHv2
Figure BDA0001929687460001107
SEQ ID NO：17：＞hu16G7VHv2a
Figure BDA0001929687460001108
SEQ ID NO：18；＞hu16G7VHv2aB7
Figure BDA0001929687460001109
SEQ ID NO：19；＞hu16G7VHv2b
Figure BDA00019296874600011010
SEQ ID NO：20；＞hu16G7VHv2bH7
Figure BDA00019296874600011011
SEQ ID NO：21；＞hu16G7VHv3
Figure BDA0001929687460001111
SEQ ID NO：22；＞hu16G7VHv4
Figure BDA0001929687460001112
SEQ ID NO：23；＞hu16G7VHv5V
Figure BDA0001929687460001113
SEQ ID NO：24；＞hu16G7VHv5VR
Figure BDA0001929687460001114
SEQ ID NO：25；＞hu16G7VHv6a
Figure BDA0001929687460001115
SEQ ID NO：26；＞hu16G7VHv6b
Figure BDA0001929687460001116
SEQ ID NO：27；＞hu16G7VHv7
Figure BDA0001929687460001117
SEQ ID NO：28；＞hu16G7VLv1
Figure BDA0001929687460001118
SEQ ID NO：29；＞hu16G7VLv2
Figure BDA0001929687460001119
SEQ ID NO：30；＞hu16G7VLv3
Figure BDA00019296874600011110
SEQ ID NO：31；VH人受体AAA18265.1
Figure BDA0001929687460001121
SEQ ID NO：32；VH人受体ADW08092.1
Figure BDA0001929687460001122
SEQ ID NO：33；VH人受体IMGT#IGHV1-2*02
Figure BDA0001929687460001123
SEQ ID NO：34；VL人受体AAB24404.1
Figure BDA0001929687460001124
SEQ ID NO：35；VL人受体AEK69364.1
Figure BDA0001929687460001125
SEQ ID NO：36；VL人受体IMGT#IGKV4-1*01
Figure BDA0001929687460001126
SEQ ID NO：37；鼠VH核苷酸序列：
Figure BDA0001929687460001127
SEQ ID NO：38；鼠VL核苷酸序列：
Figure BDA0001929687460001131
SEQ ID NO：39：Kabat CDR-H1
Figure BDA0001929687460001132
SEQ ID NO：40；Chothia CDR-H1
Figure BDA0001929687460001133
SEQ ID NO：41；Chothia CDR-H2
Figure BDA0001929687460001134
SEQ ID NO：42；AbM CDR-H2
Figure BDA0001929687460001135
SEQ ID NO：43；Contact CDR-L1
Figure BDA0001929687460001136
SEQ ID NO：44：Contact CDR-L2
Figure BDA0001929687460001137
SEQ ID NO：45；Contact CDR-L3
Figure BDA0001929687460001138
SEQ ID NO：46；Contact CDR-H1
Figure BDA0001929687460001139
SEQ ID NO：47；Contact CDR-H2
Figure BDA00019296874600011310
SEQ ID NO：48；Contact CDR-H3
Figure BDA0001929687460001141
SEQ ID NO：49；另选的CDR-H1
Figure BDA0001929687460001142
SEQ ID NO：50；另选的CDR-H2
Figure BDA0001929687460001143
SEQ ID：51；另选的CDR-H2
Figure BDA0001929687460001144
SEQ ID NO：52；小鼠16G7和人源化16G7抗体的重链可变区中的共有氨基酸序列(在图2中标记为“Majority”)。
Figure BDA0001929687460001145
SEQ ID NO：53；小鼠16G7和人源化16G7抗体的轻链可变区中的共有氨基酸序列(在图3中标记为“Majority”)。
Figure BDA0001929687460001146
SEQ ID NO：54；嵌合16G7抗体的重链
Figure BDA0001929687460001147
SEQ ID NO：55；嵌合16G7抗体的轻链
Figure BDA0001929687460001148
序列表
<110> Prothena Biosciences Ltd.
Barbour, Robin
Dolan, Philip J.
Liu, Yue
<120> 识别tau的抗体
<130> 057450-497448
<150> US 62/330,800
<151> 2016-05-02
<160> 55
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 2
<211> 412
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
65 70 75 80
Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
85 90 95
Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
115 120 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
130 135 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
165 170 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
180 185 190
Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
195 200 205
Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
210 215 220
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser
245 250 255
Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys
275 280 285
Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly
290 295 300
Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
305 310 315 320
Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly
325 330 335
Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn
340 345 350
Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
355 360 365
Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser
370 375 380
Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala
385 390 395 400
Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
405 410
<210> 3
<211> 383
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala
35 40 45
Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
50 55 60
Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro
85 90 95
Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg
100 105 110
Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly
115 120 125
Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
165 170 175
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
180 185 190
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu
195 200 205
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu
210 215 220
Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys
225 230 235 240
His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp
245 250 255
Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His
260 265 270
Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe
275 280 285
Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His
290 295 300
Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe
305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr
325 330 335
Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn
340 345 350
Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala
355 360 365
Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
370 375 380
<210> 4
<211> 410
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln
305 310 315 320
Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly
325 330 335
Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys
340 345 350
Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val
355 360 365
Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly
370 375 380
Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu
385 390 395 400
Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
405 410
<210> 5
<211> 381
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
65 70 75 80
Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
85 90 95
Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
115 120 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
130 135 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
165 170 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
180 185 190
Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
195 200 205
Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
210 215 220
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser
245 250 255
Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro
260 265 270
Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp
275 280 285
Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro
290 295 300
Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu
305 310 315 320
Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser
325 330 335
Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser
340 345 350
Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu
355 360 365
Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
370 375 380
<210> 6
<211> 352
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala
35 40 45
Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
50 55 60
Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro
85 90 95
Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg
100 105 110
Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly
115 120 125
Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
165 170 175
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
180 185 190
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu
195 200 205
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val
210 215 220
Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His
225 230 235 240
His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
245 250 255
Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr
260 265 270
His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr
275 280 285
Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val
290 295 300
Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser
305 310 315 320
Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu
325 330 335
Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
340 345 350
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Asp Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Ile Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr
1 5
<210> 11
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Gly
20 25 30
Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Met Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Asp Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Gly Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
Gln Gln Phe Tyr Asp Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 15
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Gly
20 25 30
Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Met Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Asp Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 29
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Gly
20 25 30
Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Asp Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 30
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Gly
20 25 30
Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Asp Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Ala Asp Asp Asp Pro Glu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 96
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
<210> 34
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 35
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Lys Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Gly
20 25 30
Ser Asp Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Ala Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu
85 90 95
Tyr Tyr Ser Ser Leu Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 36
<211> 101
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro
100
<210> 37
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
caggtccaac tgcagcagcc tgggtctgtg ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctcctgga tacactgggc gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag atttatccta atagtggtaa tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgtagaca tatcctccag cacagcctac 240
gtggatctca ccagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtgc aagattggga 300
tggttaatac cccttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcatagtctc ctca 354
<210> 38
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
gacattgtgc tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta gatggtaatg atcaaaagaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tgtactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtt tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcagtt ttatgactat 300
ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac gt 342
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
Ser Ser Trp Ile His
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
Tyr Pro Asn Ser Gly Asn
1 5
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn
1 5 10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr
1 5
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
Leu Leu Met Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu
1 5 10
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
Gln Gln Phe Tyr Asp Tyr Pro Trp
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
Thr Ser Ser Trp Ile His
1 5
<210> 47
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn
1 5 10
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp
1 5 10
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 52
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Gln或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Pro或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(67)
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (68)..(68)
<223> Xaa = Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa = Thr或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa = Ser或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(89)
<223> Xaa = Glu或Asp
<400> 52
Glu Val Gln Leu Xaa Gln Xaa Gly Ala Glu Xaa Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Xaa Xaa Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Xaa Xaa Leu Thr Ser Xaa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> Xaa = Met或Ile
<400> 53
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Gly
20 25 30
Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Xaa Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Asp Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 54
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Asp Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Trp Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 55
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Gly
20 25 30
Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Met Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Asp Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Lys Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
130 135 140
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
145 150 155 160
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
165 170 175
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
180 185 190
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
195 200 205
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220

Claims (30)

1.一种分离的单克隆抗体或其结合片段，其与人tau结合，所述分离的单克隆抗体或其结合片段包括SEQ ID NO:17的重链可变结构域和SEQ ID NO:29的轻链可变结构域；或SEQID NO:19的重链可变结构域和SEQ ID NO:29的轻链可变结构域；或SEQ ID NO:27的重链可变结构域和SEQ ID NO:29的轻链可变结构域；或SEQ ID NO:7的重链可变结构域和SEQ IDNO:11的轻链可变结构域。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其结合片段，其中所述重链可变结构域具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其结合片段，其中所述重链可变结构域具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其结合片段，其中所述重链可变结构域具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其结合片段，其中所述结合片段是单链抗体、Fab或F(ab')2片段。
6.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其结合片段，其中所述结合片段为Fab片段或单链Fv。
7.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其结合片段，其中所述分离的单克隆抗体是人IgG1同种型。
8.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其结合片段，其中所述轻链可变结构域与轻链恒定区融合，并且所述重链可变结构域与重链恒定区融合。
9.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其结合片段，其中所述分离的单克隆抗体属于人IgG2或IgG4同种型。
10.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其结合片段是至少95％w/w纯。
11.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其结合片段缀合于治疗剂、细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、神经营养剂或神经保护剂。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项所定义的分离的单克隆抗体或其结合片段和药学上可接受的载体。
13.一种核酸，其编码权利要求1-11中任一项所述的分离的单克隆抗体的重链和轻链。
14.一种重组表达载体，其包含权利要求13的核酸。
15.一种宿主细胞，其使用权利要求14的重组表达载体转化。
16.一种将小鼠抗体人源化的方法，所述方法包括：
(a)选择一种或多种受体抗体序列；
(b)鉴定待保留的所述小鼠抗体的氨基酸残基；
(c)合成编码包含所述小鼠抗体重链的CDR的人源化重链的核酸和编码包含所述小鼠抗体轻链的CDR的人源化轻链的核酸；以及
(d)在宿主细胞中表达所述核酸以产生人源化抗体；
其中所述小鼠抗体通过SEQ ID NO:7的重链可变结构域和SEQ ID NO:11的轻链可变结构域来表征。
17.一种产生权利要求1所述的分离的单克隆抗体的方法，所述方法包括：
(a)对用编码所述单克隆抗体的所述重链和轻链的核酸转化的细胞进行培养，以使所述细胞分泌所述单克隆抗体；以及
(b)从细胞培养基中纯化所述单克隆抗体。
18.一种制备产生权利要求1所述的分离的单克隆抗体的细胞系的方法，所述方法包括：
(a)将编码所述分离的单克隆抗体的重链和轻链以及选择标志物的载体引入细胞中；
(b)使所述细胞在用以选择具有增加拷贝数的所述载体的细胞的条件下增殖；
(c)从所选细胞中分离单细胞；以及
(d)将由基于分离的单克隆抗体的产量选择的单细胞克隆的细胞建库。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括使所述细胞在选择性条件下增殖并筛选天然表达和分泌至少100mg/L/106个细胞/24h的细胞系。
20.权利要求1-11中任一项所述的分离的单克隆抗体或其结合片段在制造用于抑制或减少患有tau介导的淀粉样变性或有发展tau介导的淀粉样变性风险的受试者中的tau聚集的药物中的用途，其中向所述受试者施用所述的分离的单克隆抗体或其结合片段的有效方案，从而抑制或减少所述受试者中的tau聚集。
21.权利要求1-11中任一项所述的分离的单克隆抗体或其结合片段在制造用于在受试者中治疗阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)或实现阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)的预防的药物中的用途，其中向所述受试者施用所述分离的单克隆抗体或其结合片段的有效方案，从而治疗所述疾病或实现所述疾病的预防。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述受试者是ApoE4携带者。
23.权利要求1-11中任一项所述的分离的单克隆抗体或其结合片段在制造用于减少受试者中tau的异常传播的药物中的用途，其中向所述受试者施用所述分离的单克隆抗体或其结合片段的有效方案，从而减少tau的传播。
24.权利要求1-11中任一项所述的分离的单克隆抗体或其结合片段在制造用于诱导受试者中的tau的吞噬的药物中的用途，其中向所述受试者施用所述分离的单克隆抗体或其结合片段的有效方案，从而诱导tau的吞噬。
25.权利要求1-11中任一项所述的分离的单克隆抗体或其结合片段在制造用于抑制受试者中的tau聚集或沉积的药物中的用途，其中向所述受试者施用所述分离的单克隆抗体或其结合片段的有效方案，从而抑制tau聚集或沉积。
26.权利要求1-11中任一项所述的分离的单克隆抗体或其结合片段在制造用于抑制受试者中的tau缠结的形成的药物中的用途，其中向所述受试者施用所述分离的单克隆抗体或其结合片段的有效方案，从而抑制tau缠结的形成。
27.权利要求1-11中任一项所述的分离的单克隆抗体或其结合片段在制造用于在患有阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)或有患阿尔茨海默病、唐氏综合症、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)或进行性核上性麻痹(PSP)风险的受试者中检测tau蛋白沉积物的药物中的用途，其中将来自所述受试者的生物样品与所述分离的单克隆抗体或其结合片段接触，以及检测所述生物样品中与tau结合的分离的单克隆抗体或其结合片段。
28.根据权利要求27所述的用途，其中对所述分离的单克隆抗体或其结合片段进行标记。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述分离的单克隆抗体或其结合片段用荧光标记、顺磁性标记或放射性标记进行标记。
30.根据权利要求29所述的用途，其中使用正电子发射断层摄影术(PET)或单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)检测所述放射性标记。
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