KR101981351B1 - 타우를 인식하는 포스포특이적 항체 - Google Patents

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에이씨 이뮨 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 신경섬유매듭에 의해 유발되거나 또는 이들과 연관된 질환과 장애의 치료에서 치료와 진단 용도를 위한 방법과 조성물에 관계하고, 특히, 본 발명은 인산화된 병리학적 단백질 타우-이형태체를 특이적으로 인식하고 이들에 결합하는 항체, 그리고 알츠하이머병 (AD)을 비롯한 타우병증의 치료에서 치료와 진단 용도를 위해 상기 항체를 필요로 하는 방법과 조성물에 관계한다.

Description

타우를 인식하는 포스포특이적 항체{PHOSPHOSPECIFIC ANTIBODIES RECOGNISING TAU}
본 출원은 2012년 4월 5일자 제출된 European Patent Application No. EP12163319.2 및 2011년 10월 7일자 제출된 International Patent Application No. PCT/EP2011/067604에 우선권을 주장하고, 이들 각각의 내용은 본원에 전체로서 참조로서 편입된다.
본 발명은 신경섬유매듭에 의해 유발되거나 또는 이들과 연관된 질환과 장애의 치료에서 치료와 진단 용도를 위한 방법과 조성물에 관계한다. 특히, 본 발명은 인산화된 병리학적 단백질 타우-이형태체를 특이적으로 인식하고 이들에 결합하는 항체, 그리고 알츠하이머병 (AD)을 비롯한 타우병증의 치료에서 치료와 진단 용도를 위해 상기 항체를 필요로 하는 방법과 조성물에 관계한다.
신경섬유매듭과 신경망실 (NTs)은 알츠하이머병 (AD)의 주요 신경병리학적 특질이다. 이들은 아스파라기닐 또는 아스파르틸 잔기에서 인산화, 탈아미드화와 이성화를 비롯한 번역후 변형을 겪는 미소관-연관된 단백질 타우로 구성된다. 이들은 고인산화된 단백질 타우 및 이의 이형태체의 응집에 의해 발생한다. AD는 많은 신경변성 타우병증, 특히 특수한 형태의 전측두엽 치매 (FTD)와 이러한 병리를 공유한다.
단백질 타우는 그들의 조립과 안정성을 촉진하기 위해 미소관 (MTs)에 강하게 결합하는 자유롭게 가용성, "자연적으로 비접힘된" 단백질이다. MT는 뉴런의 세포골격 보전 (cytoskeletal integrity) - 그리고 따라서, 뉴런 회로의 적절한 형성과 기능, 이런 이유로 학습과 기억에 매우 중요하다. MT의 타우의 결합은 주로 시험관내와 비-뉴런 세포에서 증명된 바와 같이, 동적 인산화와 탈인산화에 의해 제어된다. 다수의 가능한 인산화 부위 (>80)로 인하여, 각각의 정확한 기여 및 책임있는 키나아제의 정체는 생체내에서 거의 확정되지 않은 상태로 남아있다.
AD 뇌에서, 타우 병리는 아밀로이드 캐스케이드 가설의 본질을 구성하는 아밀로이드 병리보다 늦게, 그리고 이런 이유로, 아마도 아밀로이드 병리에 응하여 발생한다. 이것은 AD와 다운증후군 환자에서 연구에 기초되고 이들에 의해 지시되며, 그리고 합동된 아밀로이드와 타우 병리를 갖는 유전자도입 생쥐에서 연구에 의해 확증된다 (Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2004; Ribe et al., 2005; Muyllaert et al, 2006; 2008; Terwel et al, 2008).
인간 AD 환자에서 양쪽 병리의 정확한 시기뿐만 아니라 아밀로이드를 타우 병리에 연계하는 기전은 여전히 거의 알려져 있지 않지만, 주요 "타우-키나아제 (tau-kinase)"로서 GSK3과 cdk5 상에 또는 이들에 의해 동작하는 뉴런 신호전달 경로의 활성화를 수반하는 것으로 제안된다 (Muyllaert et al, 2006, 2008에 의해 검토됨).
타우병증이 AD에서 무고한 부작용이 아닌 주요 병리학적 집행자라는 가설은 서로를 완벽하게 확증하는 충실한 유전적, 병리학적 및 실험적 관찰 결과에 기초된다:
ㆍ 아밀로이드 단백질 전구체 (APP) 또는 프레세닐린에서 돌연변이에 기인하는 조기-발생 가족성 AD 사례에서, 절대적인 병원성 원인은 아밀로이드 축적이지만, 변함없이 상기 병리는 후기-발병 산발적 AD 사례에서와 동일한 부차적인 타우병증을 포함한다;
ㆍ 인지 기능장애와 치매의 심각도는 아밀로이드에 대한 PIB-PET 이미지화를 포함하고 많은 "가양성": 높은 뇌 아밀로이드 부하를 갖는 인지적으로 정상인 개체를 확인하는 몇몇 임상 단계-1&2 연구에 의해 가장 최근에 예증된 바와 같이, 아밀로이드 병리가 아닌 타우병증과 상관한다;
ㆍ 가족성 FTD에서, 타우병증은 돌연변이 타우에 의해 촉발되고, 그리고 아밀로이드 병리 없이, 신경변성을 직접적으로 유발한다;
ㆍ 실험적 생쥐 모델에서, 아밀로이드 병리에 의해 유발된 인지 결함은 단백질 타우의 부재에 의해 거의 완전하게 경감된다 (Roberson et al, 2007).
이들 통합된 주장은 단백질 타우가 AD 및 관련된 신경변성 타우병증에서 인지 종말 (cognitive demise)에서 주요한 플레이어라는 가설을 뒷받침한다.
AD의 최근 유망한 치료법은 신경-독성 또는 시냅스-독성인 것으로 추정되는 아밀로이드 펩티드 및 이들의 응집체를 제거하기 위해, 특이적인 mAb를 이용한 수동 면역요법이다.
여기에서 제안된 바와 같이, 타우 병리를 표적으로 하는 면역요법은 시냅스 기능장애 및 신경변성을 유발하는 것으로 알려져 있거나 또는 가정되는 병리학적 단백질 타우-이형태체를 중화시킬 것으로 예기된다.
단백질 타우를 표적으로 하는 다른 치료 접근법은 드물고 주로 하기를 포함한다:
ㆍ 타우의 인산화를 병리학적 수준까지 증가시키는 것으로 생각되는 키나아제의 저해제
ㆍ 고인산화된 단백질 타우의 세포질 응집을 차단하는 화합물.
이들 접근법은 그들이 APP와 아밀로이드의 대사를 변화시키는 시도와 공유하는 문제점인 특이성과 효능의 다양한 결점을 겪는데, 이들 모두 타우에 대한 면역요법을 비롯한 추가의 치료 옵션에 대한 연속적인 탐색의 중요성을 강조한다. 실제로, 합동된 AD-유사 병리를 갖는 전임상 생쥐 모델에서 아밀로이드를 표적으로 하는 면역요법 역시 타우 응집체가 존속하긴 하지만, 타우 병리에 대한 효과를 보였다 (Oddo et al., 2004).
면역요법에 의해 세포내 단백질 타우에 접근하는 실현가능성에 일부 의문이 제기되었다. 이들은 타우병증 생쥐 모델에서 가장 최근의 실험적 연구에 의해 철회되었다 (Asuni et al., 2007). 이들은 단백질 타우 유래된 포스포-펩티드로 예방접종에 의해 탱글 병리에서 감소 및 기능적 향상을 증명하였다. 이들 데이터는 파킨슨병 (PD)과 루이소체 질환 모델에서 α-시누클레인 (Masliah et al., 2005, 2011), 그리고 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 모델에서 과산화물 디스무타아제 (Urushitiani et al., 2007)를 표적으로 하는 면역요법의 기존 보고를 확증한다. 이들 질환은 세포내 단백질이 아직 완전하게 이해되지 않은 기전에 의해 시냅스 결함과 신경변성을 유발하는 실례이다.
예로서, 아밀로이드로서 AD에 전형적인 고인산화된 단백질 타우의 뉴런내 응집체에 의해 유발된 AD에서 신경변성 장애, 예를 들면, 아밀로이드 병리를 유발하는 것으로 알려져 있는 - 또는 추정되는 - 병리학적 단백질 이형태체를 중화시키는 수동 및/또는 능동 면역요법에 대한 요구가 해소되지 않고 있다.
이러한 해소되지 않은 요구는 타우 단백질의 주요 병리학적 포스포-에피토프를 인식하고 이들에 결합하는 결합 단백질을 제시하는 본 발명에 의해 해소된다. 특히, 본 발명은 AD를 비롯한 타우병증에서 시냅스-와 신경-독성을 주도하는 것으로 생각되는 단백질 타우, 특히 응집된 타우 단백질 상에서 선형과 입체형태, 단순하고 복잡한 포스포-에피토프에 대한 특이적인 항체를 제시한다.
따라서 본 발명은 한 구체예에서 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 단백질 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 응집된 타우 단백질 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 그리고 생체내에서, 특히 뇌에서, 특히 적어도 10 nM, 특히 적어도 8 nM, 특히 적어도 5 nM, 특히 적어도 2 nM, 특히 적어도 1 nM, 특히 적어도 500 pM, 특히 적어도 400 pM, 특히 적어도 300 pM, 특히 적어도 200 pM, 특히 적어도 100 pM, 특히 적어도 50 pM의 해리 상수로 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있다.
특히, 해리 상수는 2 nM 내지 80 nM, 특히 2 nM 내지 40 nM, 특히 2 nM 내지 10 nM의 범위 내에 있다.
일정한 양상에서, 항체 또는 이의 기능성 단편이 본원에서 제시되고, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 위치 396 (pS396)과 위치 404 (pS404)에서 인산화된 Ser을 포함하는 아미노산 서열 VYKSPVVSGDTSPRHL (서열 번호: 62) (서열 번호: 67의 타우 aa 393-408, 예로서 표 1에서 진술됨)을 갖거나, 또는 그 내에 포스포-에피토프에 결합한다.
두 번째 구체예에서, 본 발명은 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 104 M-1s-1 또는 그 이상, 특히 3 - 5 x 104 M-1s-1 또는 그 이상, 특히 105 M-1s-1 또는 그 이상; 특히 2 - 9 x 105 M-1s-1 또는 그 이상; 특히 106 M-1s-1 또는 그 이상, 특히 1 - 4 x 106 M-1s-1 또는 그 이상, 특히 107 M-1s-1 또는 그 이상의 결합 속도 상수를 갖는다.
특히, 결합 속도 상수는 1.6 x 103 내지 5 x 105, 특히 2.4 x 104 내지 5 x 105, 3 x 103 내지 5 x 105의 범위 내에 있다.
세 번째 구체예에서, 본 발명은 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 적어도 4 nM의 해리 상수 및 105 M-1s-1 또는 그 이상의 결합 속도 상수, 특히 적어도 3 nM의 해리 상수 및 106 M-1s-1 또는 그 이상의 결합 속도 상수, 특히 적어도 2 nM의 해리 상수 및 104 M-1s-1 또는 그 이상의 결합 속도 상수, 특히 적어도 1 nM의 해리 상수 및 105 M-1s-1 또는 그 이상의 결합 속도 상수, 특히 적어도 200 pM의 해리 상수 및 105 M-1s-1 또는 그 이상의 결합 속도 상수, 특히 적어도 100 pM의 해리 상수 및 106 M-1s-1 또는 그 이상의 결합 속도 상수로 높은 결합 친화성을 갖는다.
특히, 해리 상수는 2 nM 내지 80 nM의 범위 내에 있고, 그리고 결합 속도 상수는 1.6 x 103 내지 5 x 105의 범위 내에 있고, 특히 해리 상수는 2 nM 내지 40 nM의 범위 내에 있고, 그리고 결합 속도 상수는 2.4 x 104 내지 5 x 105의 범위 내에 있고, 특히 해리 상수는 2 nM 내지 10 nM의 범위 내에 있고, 그리고 결합 속도 상수는 3 x 103 내지 5 x 105의 범위 내에 있다.
본 발명의 한 구체예 (4)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류 상에서, 특히 서열 번호: 67에서 진술된 인간 타우 단백질 상에서, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-401, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 396-401, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 394-400, 위치 404에서 인산화된 Ser (pS404)을 포함하는 타우 aa 402-406 및 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-400으로 구성된 군에서 선택되는 에피토프에 결합한다.
한 구체예 (5)는 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 여기서 상기 펩티드는 포유류, 특히 인간 타우 단백질, 하지만 특히 서열 번호: 67에서 진술된 인간 타우 단백질 상에서, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-401을 포함하는 에피토프에 결합한다.
한 구체예 (6)는 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 여기서 상기 펩티드는 포유류, 특히 인간 타우 단백질, 하지만 특히 서열 번호: 67에서 진술된 인간 타우 단백질 상에서, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 396-401을 포함하는 에피토프에 결합한다.
한 구체예 (7)는 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 여기서 상기 펩티드는 포유류, 특히 인간 타우 단백질, 하지만 특히 서열 번호: 67에서 진술된 인간 타우 단백질 상에서, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 394-400을 포함하는 에피토프에 결합한다.
한 구체예 (8)는 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 여기서 상기 펩티드는 포유류, 특히 인간 타우 단백질, 하지만 특히 서열 번호: 67에서 진술된 인간 타우 단백질 상에서, 위치 404에서 인산화된 Ser (pS404)을 포함하는 타우 aa 402-406를 포함하는 에피토프에 결합한다.
한 구체예 (9)는 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 여기서 상기 펩티드는 포유류, 특히 인간 타우 단백질, 하지만 특히 서열 번호: 67에서 진술된 인간 타우 단백질 상에서, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-400을 포함하는 에피토프에 결합한다.
본 발명의 한 구체예 (10)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 73에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 74에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 그리고 서열 번호: 75에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 여기에 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 서열 내에 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 70에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 또는 여기에 적어도 95%, 특히 98%, 특히 99% 동일한 아미노산 서열, 서열 번호: 71에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 또는 여기에 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 72에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 여기에 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 서열 내에 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
한 양상에서, 항체 또는 이의 기능성 단편이 본원에서 제시되고, 상기 항체 또는 이의 단편은 포유류 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열 번호: 73에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 74에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 그리고 서열 번호: 75에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는
(b) 서열 번호: 70에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 71에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 그리고 서열 번호: 72에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인.
본 발명의 한 구체예 (11)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 81에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 82에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 그리고 서열 번호: 83에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 여기에 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 서열 내에 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 78에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 79에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 그리고 서열 번호: 80에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 여기에 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 서열 내에 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
한 양상에서, 항체 또는 이의 기능성 단편이 본원에서 제시되고, 상기 항체 또는 이의 단편은 포유류 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열 번호: 81에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 82에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 그리고 서열 번호: 83에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는
(b) 서열 번호: 78에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 79에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 그리고 서열 번호: 80에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인.
본 발명의 한 구체예 (12)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 93에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 94에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 그리고 서열 번호: 95에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중에서 임의의 한 가지에 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 서열 내에 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 12에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 90에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 그리고 서열 번호: 91에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중에서 임의의 한 가지에 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 서열 내에 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
일정한 양상에서, 항체 또는 이의 기능성 부분이 본원에서 제시되고, 상기 항체 또는 이의 단편은 포유류 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열 번호: 93에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 94에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 그리고 서열 번호: 95에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는
(b) 서열 번호: 12에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 90에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 그리고 서열 번호: 91에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인.
본 발명의 한 구체예 (13)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 101에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 102에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 그리고 서열 번호: 103에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중에서 임의의 한 가지에 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 서열 내에 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 98에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 99에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 그리고 서열 번호: 100에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중에서 임의의 한 가지에 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 서열 내에 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
한 양상에서, 항체 또는 이의 기능성 단편이 본원에서 제시되고, 상기 항체 또는 이의 단편은 포유류 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열 번호: 101에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 102에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 그리고 서열 번호: 103에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는
(b) 서열 번호: 98에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 99에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 그리고 서열 번호: 100에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인.
본 발명의 한 구체예 (14)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 106에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 107에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 그리고 서열 번호: 108에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중에서 임의의 한 가지에 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 서열 내에 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 89에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 115에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 그리고 서열 번호: 91에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중에서 임의의 한 가지에 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 서열 내에 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
특정 양상에서, 항체 또는 이의 기능성 단편이 본원에서 제시되고, 상기 항체 또는 이의 단편은 포유류 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열 번호: 106에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 107에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 그리고 서열 번호: 108에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는
(b) 서열 번호: 89에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 115에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 그리고 서열 번호: 91에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인.
일정한 구체예에서, 본원에서 설명된 항체 또는 이의 항체 단편의 첫 번째 결합 도메인은 경쇄 가변 영역이고, 그리고 본원에서 설명된 항체 또는 이의 항체 단편의 두 번째 결합 도메인은 중쇄 가변 영역이다.
다른 구체예 (15)에서, 본 발명은 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 69, 77, 116/92, 118, 97, 105에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 68, 76, 88, 96, 104에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 86%, 특히 적어도 87%, 특히 적어도 88%, 특히 적어도 89%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (16)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 69에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는 서열 번호: 68에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 91%, 92% 또는 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (17)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 77에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 93%, 94% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는 서열 번호: 76에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 88%, 89%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (18)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 116, 92, 또는 118에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 93%, 94% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는 서열 번호: 88에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 91%, 92% 또는 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (19)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 97에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는 서열 번호: 96에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 86%, 87%, 88% 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (20)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 105에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는 서열 번호: 104에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 88%, 89%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (21)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 69에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는 서열 번호: 68에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (22)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 77에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 76에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (23)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 116, 92, 또는 118에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 93 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는 서열 번호: 88에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (24)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 97에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는 서열 번호: 96에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (25)는 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 번호: 105에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인; 및/또는 서열 번호: 104에서 진술된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (26)는 구체예 (16)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계하고, 여기서 상기 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호: 73-75에서 진술된 CDR을 내포하고, 그리고 상기 두 번째 결합 도메인은 서열 번호: 70-72에서 진술된 CDR을 내포한다.
본 발명의 한 구체예 (27)는 구체예 (17)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계하고, 여기서 상기 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호: 81-83에서 진술된 CDR을 내포하고, 그리고 상기 두 번째 결합 도메인은 서열 번호: 78-80에서 진술된 CDR을 내포한다.
본 발명의 한 구체예 (28)는 구체예 (18)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계하고, 여기서 상기 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호: 93-95에서 진술된 CDR을 내포하고, 그리고 상기 두 번째 결합 도메인은 서열 번호: 12, 90, 그리고 91에서 진술된 CDR을 내포한다.
본 발명의 한 구체예 (29)는 구체예 (19)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계하고, 여기서 상기 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호: 101-103에서 진술된 CDR을 내포하고, 그리고 상기 두 번째 결합 도메인은 서열 번호: 98-100에서 진술된 CDR을 내포한다.
본 발명의 한 구체예 (30)는 구체예 (18)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계하고, 여기서 상기 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호: 89, 115, 그리고 91에서 진술된 CDR을 내포하고, 그리고 상기 두 번째 결합 도메인은 서열 번호: 106-108에서 진술된 CDR을 내포한다.
또 다른 구체예 (31)에서, 본 발명은 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 특히 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질에 높은 결합 친화성을 갖고, 생체내에서 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절할 수 있고, 그리고 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열 번호: 69에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 68에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인; 또는
b. 서열 번호: 77에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 76에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인; 또는
c. 서열 번호: 116에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 88에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인; 또는
d. 서열 번호: 92에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 88에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인; 또는
e. 서열 번호: 97에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 96에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인; 또는
f. 서열 번호: 105에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 104에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인, 또는
g. 서열 번호: 118에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 결합 도메인 및/또는 서열 번호: 88에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 결합 도메인.
본 발명의 한 구체예 (32)에서, 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드는 항체, 특히 IgG2a, IgG2b 또는 IgG3 아이소타입의 항체, 특히 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체이다.
본 발명의 한 구체예 (33)는 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관계한다.
한 구체예 (34)에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 핵산 분자를 포함한다:
a. 서열 번호: 84-87, 서열 번호: 109-114, 117과 119에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
b. 서열 번호: 84-87, 서열 번호: 109-114, 117과 119에서 진술된 서열에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
c. 서열 번호: 84-87, 서열 번호: 109-114, 117과 119에서 진술된 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
d. 서열 번호: 84-87, 서열 번호: 109-114, 117과 119에서 진술된 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
e. 서열 번호: 84-87, 서열 번호: 109-114, 117과 119에서 진술된 서열에 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
f. 서열 번호: 84-87, 서열 번호: 109-114, 117과 119에서 진술된 서열에 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
g. 상보성 가닥이 a) - f) 중에서 한 가지의 핵산 분자에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
h. 유전자 코드의 축중성에 의해 a) - g) 중에서 한 가지에서 정의된 뉴클레오티드 서열로부터 벗어나는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자,
여기서 a) - h) 중에서 한 가지에서 정의된 상기 핵산 분자는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서, 특히 서열 번호: 67에 진술된 인간 타우 단백질 상에서, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-401, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 396-401, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 394-400, 위치 404에서 인산화된 Ser (pS404)을 포함하는 타우 aa 402-406, 그리고 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-400으로 구성된 군에서 선택되는 포스포-에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합하고, 여기서 한 구체예에서, 상기 결합 펩티드는 적어도 10 nM, 특히 적어도 8 nM, 특히 적어도 5 nM, 특히 적어도 2 nM, 특히 적어도 1 nM, 특히 적어도 500 pM, 특히 적어도 400 pM, 특히 적어도 300 pM, 특히 적어도 200 pM, 특히 적어도 100 pM, 특히 적어도 50 pM의 해리 상수로 높은 결합 친화성을 갖고 및/또는 104 M-1s-1 또는 그 이상, 특히 3 - 5 x 104 M-1s-1 또는 그 이상, 특히 105 M-1s-1 또는 그 이상; 특히 6 - 9 x 105 M-1s-1 또는 그 이상; 특히 106 M-1s-1 또는 그 이상, 특히 1 - 4 x 106 M-1s-1 또는 그 이상, 특히 107 M-1s-1 또는 그 이상의 결합 속도 상수를 갖지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않는다.
본 발명의 다양한 구체예 (35)에서, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이 제시되고, 이것은 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 포스포-에피토프, 특히 미소관-연관된 단백질 타우, 특히 응집된 미소관-연관되고 고인산화된 단백질 타우, 예를 들면, 신경섬유매듭, 신경망실 및 영양실조 신경돌기 (dystrophic neurite)에서 유력한 구조인 쌍나선 필라멘트 (PHF) 내에 존재하는 것을 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않는다.
본 발명의 특정 구체예 (36)에서, 인간 타우 단백질은 서열 번호: 67에서 진술된 인간 타우 단백질이다.
전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드와 항체는 따라서, 증가된 수준의 가용성 타우 단백질 및/또는 가용성 인산화된 타우 단백질을 내포하는 포유동물 또는 인간의 뇌에서, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 전체 가용성 타우 단백질, 특히 가용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 감소시키는데 이용될 수 있다 (37).
전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드와 항체는 또한, 증가된 수준의 p타우 쌍나선 필라멘트를 내포하는 포유동물 또는 인간의 뇌에서, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 고인산화된 타우 단백질 (p타우 PHF)을 내포하는 쌍나선 필라멘트의 수준을 감소시키는데 이용될 수 있다 (38).
포유동물 또는 인간에서 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상의 원인이 되는 증가된 수준의 상기 타우 단백질 변이체를 내포하는 포유동물 또는 인간의 뇌에서, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 전체 가용성 타우 단백질 및/또는 가용성 인산화된 타우 단백질 및/또는 p타우 쌍나선 필라멘트의 수준 감소는 이런 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상과 연관된 증상의 향상 및/또는 경감을 유발할 수 있다 (39).
전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드와 항체는 이런 이유로, 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상의 진행을 지연하거나 또는 정지시키기 위한 요법에서, 특히 인간 요법에서 이용될 수 있다 (40).
전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드와 항체는 게다가, 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상과 연관된 증상, 예를 들면, 추론, 상황 판단, 기억 용량, 학습, 특수 내비게이션 등을 비롯한 인지 기능의 손상 또는 상실을 향상시키거나 또는 경감하기 위한 요법에서, 특히 인간 요법에서 이용될 수 있다 (41).
한 구체예 (42)에서, 본 발명은 타우병증, 일군의 타우-단백질-연관된 질환과 장애의 요법에서 이용, 특히 치료에서 이용을 위한, 또는 타우병증과 연관된 증상을 경감하기 위한 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드와 항체에 관계한다.
한 구체예 (43)에서, 본 발명은 타우병증을 앓는 포유동물에서 인지 기억 용량을 유지하거나 또는 증가시키기 위한 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드와 항체에 관계한다.
본 발명의 다른 특정한 구체예 (44)에서, 서열 번호: 73-75, 81-83, 93-95, 101-103, 106-108에서 진술된 바와 같은 항체 ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1D2-Ab1; ACI-35-2G5-Ab1; ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3의 경쇄 CDR 중에서 적어도 하나 또는 전부 및/또는 서열 번호: 70-72, 78-80, (12, 90, 91), 98-100, (89, 115, 91)에서 진술된 바와 같은 항체 ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1D2-Ab1; ACI-35-2G5-Ab1; ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3의 중쇄 CDR 중에서 적어도 하나 또는 전부를 포함하는 결합 펩티드와 항체는 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상과 연관된 증상, 예를 들면, 추론, 상황 판단, 기억, 학습, 특수 내비게이션 등을 비롯한 인지 기능의 손상 또는 상실을 향상시키거나 또는 경감하기 위한 요법에서, 특히 인간 요법에서 이용된다.
본 발명의 다른 특정한 구체예 (45)에서, 서열 번호: 106-108에서 진술된 바와 같은 항체 ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3의 경쇄 CDR의 적어도 하나 또는 전부 및/또는 서열 번호: 89, 115와 91에서 진술된 바와 같은 항체 ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3의 중쇄 CDR 중에서 적어도 하나 또는 전부를 포함하는 결합 펩티드와 항체는 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상과 연관된 증상, 예를 들면, 추론, 상황 판단, 기억, 학습, 특수 내비게이션 등을 비롯한 인지 기능의 손상 또는 상실을 향상시키거나 또는 경감하기 위한 요법에서, 특히 인간 요법에서 이용된다.
뇌에서 타우 탱글과 p타우에 전술한 구체예에 따른 펩티드 또는 항체의 결합은 실시예에서 설명된 바와 같이 각각, 선별된 뇌 절단면의 단백질 면역-반응성 검사를 적용함으로써, 그리고 뇌 균질액의 웨스턴 블롯팅에 의해 결정될 수 있다.
다른 구체예 (46)에서, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체와 함께, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 치료 효과량으로 포함하는 제약학적 조성물을 제시한다.
한 구체예 (47)에서, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제약학적 조성물, 또는 이들의 조합은 신경변성 장애, 예를 들면, 타우병증을 비롯한 타우-단백질-연관된 질환 또는 장애의 증상의 치료 또는 경감을 위한 요법에서, 특히 인간 요법에서 이용된다.
전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드, 항체 및/또는 제약학적 조성물은 따라서, 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상을 앓는 동물, 특히 포유동물, 특히 인간에 상기 결합 펩티드, 항체 및/또는 제약학적 조성물의 투여 시에, 이런 질환 또는 장애의 진행을 지연하거나 또는 정지시키는데 이용될 수 있다 (48).
전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드, 항체 및/또는 제약학적 조성물은 게다가, 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상과 연관된 증상, 예를 들면, 추론, 상황 판단, 기억 용량, 학습, 특수 내비게이션 등을 비롯한 인지 기능의 손상 또는 상실을 앓는 동물, 특히 포유동물, 특히 인간에 상기 결합 펩티드, 항체 및/또는 제약학적 조성물의 투여 시에, 이런 질환 또는 이상을 향상시키거나 또는 경감하는데 이용될 수 있다 (49).
한 구체예 (50)에서, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약학적 조성물, 또는 이들의 조합은 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 권투 선수 치매, 다운증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병, 봉입체 근염, 그리고 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 타우와 아밀로이드 병리 둘 모두의 존재를 보이는 질환 또는 장애, 외상성 뇌 손상, 그리고 근위축성 측삭 경화증/괌의 파킨슨병 치매 복합증, 신경섬유매듭을 동반하는 비-괌 운동 뉴런 질환, 은친화성 그레인 치매, 피질기저 퇴행, 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유매듭, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 동반하는 전측두엽 치매, 전측두엽 치매, 할러포르덴-슈파츠병, 다계통 위축증, 니만-피크병, 타입 C, 팔리도 폰토 흑질성 변성, 픽 병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 탱글 단독 치매, 뇌염후 파킨슨병, 그리고 근긴장성 이영양증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 별개의 아밀로이드 병리를 보이지 않는 추가의 질환 또는 장애를 비롯한 신경변성 질환 또는 장애의 이종성 그룹을 포함하는 타우병증에서 유력한 뇌 병리인 신경원섬유성 병소의 형성에 의해 유발되거나 또는 이와 연관된 질환과 장애의 치료에 이용된다.
한 구체예 (51)에서, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약학적 조성물, 또는 이들의 조합은 알츠하이머병의 치료에 이용된다.
본 발명의 한 구체예 (52)에서, 특히 생체내에서, 특히 동물, 특히 포유동물 또는 인간의 뇌에서, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 가용성 및/또는 저중합체성 및/또는 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 검출하고 및/또는 조절하기 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 상기 동물, 특히 포유동물 또는 인간에, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약학적 조성물, 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 조절은 증가된 수준의 가용성 타우 단백질 및/또는 가용성 인산화된 타우 단백질을 내포하는 동물, 특히 포유동물 또는 인간의 뇌에서, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 가용성 타우 단백질, 특히 가용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 감소시키는 것에 관계한다.
본 발명의 한 구체예 (53)에서, 증가된 수준의 불용성 타우 단백질, 특히 p타우 쌍나선 필라멘트 (p타우 PHF)를 내포하는 동물, 특히 포유동물 또는 인간의 뇌에서, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 불용성 타우 단백질, 특히 고인산화된 타우 단백질 (p타우 PHF)을 내포하는 쌍나선 필라멘트의 수준을 감소시키기 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 상기 동물, 특히 포유동물 또는 인간에, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약학적 조성물, 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
한 구체예 (54)에서, 본 발명은 동물, 특히 포유동물 또는 인간에서 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상의 진행을 지연하거나 또는 정지시키기 위한 방법에 관계하고, 상기 방법은 이런 질환 또는 이상을 앓는 상기 동물, 특히 포유동물 또는 인간에, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약학적 조성물, 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
한 구체예 (55)에서, 본 발명은 동물, 특히 포유동물 또는 인간에서 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상과 연관된 증상, 예를 들면, 추론, 상황 판단, 기억 용량, 학습, 특수 내비게이션 등을 비롯한 인지 기능의 손상 또는 상실을 향상시키는 또는 경감하기 위한 방법에 관계하고, 상기 방법은 이런 질환 또는 이상을 앓는 상기 동물, 특히 포유동물 또는 인간에 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약학적 조성물, 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
한 구체예 (56)에서, 본 발명은 타우병증을 앓는 포유동물에서 인지 기억 용량을 유지하거나 또는 증가시키기 위한 방법에 관계한다.
본 발명의 또 다른 구체예 (57)에서, 신경변성 질환 또는 장애, 예를 들면, 타우병증을 비롯한 타우-단백질-연관된 질환 또는 장애의 치료를 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 이런 질환 또는 장애를 앓는 동물, 특히 포유동물, 하지만 특히 인간에, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약학적 조성물, 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 한 구체예 (58)에서, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 권투 선수 치매, 다운증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병, 봉입체 근염, 그리고 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 타우와 아밀로이드 병리 둘 모두의 존재를 보이는 질환 또는 장애, 외상성 뇌 손상, 그리고 근위축성 측삭 경화증/괌의 파킨슨병 치매 복합증, 신경섬유매듭을 동반하는 비-괌 운동 뉴런 질환, 은친화성 그레인 치매, 피질기저 퇴행, 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유매듭, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 동반하는 전측두엽 치매, 전측두엽 치매, 할러포르덴-슈파츠병, 다계통 위축증, 니만-피크병, 타입 C, 팔리도 폰토 흑질성 변성, 픽 병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 탱글 단독 치매, 뇌염후 파킨슨병, 그리고 근긴장성 이영양증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 별개의 아밀로이드 병리를 보이지 않는 추가의 질환 또는 장애를 비롯한 신경변성 질환 또는 장애의 이종성 그룹을 포함하는 타우병증에서 유력한 뇌 병리인 신경원섬유성 병소의 형성에 의해 유발되거나 또는 이와 연관된 질환과 장애의 치료를 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 이런 질환 또는 장애를 앓는 동물, 특히 포유동물, 하지만 특히 인간에, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약학적 조성물, 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예 (59)에서, 신경변성 장애, 예를 들면, 타우병증을 앓는 동물, 특히 포유동물 또는 인간에서 수동 면역 반응을 유도하기 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 상기 동물 또는 인간에, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제약학적 조성물, 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예 (60)에서, 환자에서 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상을 진단하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 시료에서 또는 현장에서 타우 단백질의 에피토프에 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 활성 단편, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분의 면역특이적 결합을 검출하는 것을 포함하고, 이것은 하기 단계를 포함한다:
a. 타우 단백질을 내포하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정한 신체 부분 또는 신체 구역을 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 단편, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분과 접촉시키는 단계, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체 또는 이의 단편은 타우 단백질의 에피토프에 결합하고;
b. 상기 결합 펩티드, 특히 상기 항체, 특히 상기 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분이 타우 단백질에 결합할 수 있도록 하여 면역학적 복합체를 형성하는 단계;
c. 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계; 그리고
d. 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 시료 또는 특정한 신체 부분이나 구역 내에 타우 단백질의 존재 또는 부재와 상관시키는 단계.
본 발명의 또 다른 구체예 (61)에서, 환자에서 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상에 대한 소인을 진단하기 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 시료에서 또는 현장에서 타우 단백질의 에피토프에 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 활성 단편, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분의 면역특이적 결합을 검출하는 것을 포함하고, 이것은 하기 단계를 포함한다:
a. 타우 항원을 내포하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정한 신체 부분 또는 신체 구역을 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 활성 단편, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분과 접촉시키는 단계, 상기 펩티드 또는 이의 단편은 타우 단백질의 에피토프에 결합하고;
b. 상기 결합 펩티드, 특히 상기 항체, 특히 상기 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분이 타우 항원에 결합할 수 있도록 하여 면역학적 복합체를 형성하는 단계;
c. 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계;
d. 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 시료 또는 특정한 신체 부분이나 구역 내에 타우 항원의 존재 또는 부재와 상관시키는 단계; 그리고
e. 상기 면역학적 복합체의 양을 정상적인 대조 값과 비교하는 단계;
여기서 정상적인 대조 값과 비교하여 상기 응집체의 양에서 증가는 상기 환자가 타우 단백질-연관된 질환 또는 이상을 앓고 있거나 또는 이것이 발생할 위험에 처해 있다는 것을 지시한다.
본 발명의 한 구체예 (62)에서, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제약학적 조성물로 치료 이후에 환자에서 최소 잔여 질환을 모니터링하기 위한 방법이 제시되고, 여기서 상기 방법은 하기를 포함한다:
a. 타우 항원을 내포하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정한 신체 부분 또는 신체 구역을 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분과 접촉시키고, 상기 펩티드 또는 이의 단편은 타우 단백질의 에피토프에 결합하고;
b. 상기 결합 펩티드, 특히 상기 항체, 특히 상기 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분이 타우 항원에 결합할 수 있도록 하여 면역학적 복합체를 형성하고;
c. 면역학적 복합체의 형성을 검출하고;
d. 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 시료 또는 특정한 신체 부분이나 구역 내에 타우 항원의 존재 또는 부재와 상관시키고; 그리고
e. 상기 면역학적 복합체의 양을 정상적인 대조 값과 비교하고;
여기서 정상적인 대조 값과 비교하여 상기 응집체의 양에서 증가는 상기 환자가 최소 잔여 질환을 여전히 앓고 있다는 것을 지시한다.
한 구체예 (63)에서, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제약학적 조성물로 치료되는 환자의 반응성을 예측하기 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a. 타우 항원을 내포하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정한 신체 부분 또는 신체 구역을 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 활성 단편, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분과 접촉시키고, 상기 펩티드 또는 이의 단편은 타우 단백질의 에피토프에 결합하고;
b. 상기 결합 펩티드, 특히 상기 항체, 특히 상기 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분이 타우 항원에 결합할 수 있도록 하여 면역학적 복합체를 형성하고;
c. 면역학적 복합체의 형성을 검출하고;
d. 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 시료 또는 특정한 신체 부분이나 구역 내에 타우 항원의 존재 또는 부재와 상관시키고; 그리고
e. 치료의 시작 전후에 상기 면역학적 복합체의 양을 비교하고,
여기서 상기 응집체의 양에서 감소는 상기 환자가 치료에 반응하는 높은 잠재력을 갖는다는 것을 지시한다.
항-타우 항체 및 이들의 단편이 본 발명의 상기 방법에 이용될 수 있다. 상기 방법에서, 항체 또는 이의 단편을 내포하는 시료는 시료를 고형 서포트에 부착된 항-타우 항체 또는 이의 단편과 접촉시킴으로써 시료에서 타우 단백질의 농도를 증가시키기 위해 면역-농축될 수 있다.
단계 (a)에 앞서, 시료는 시료를 고형 서포트에 부착된 항-타우 항체 또는 이의 단편과 접촉시킴으로써 시료에서 타우 단백질의 농도를 증가시키기 위해 면역-농축된다.
다른 구체예 (64)에서, 본 발명은 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 활성 단편, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분을 포함하는, 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상의 검출과 진단을 위한 검사 키트에 관계한다.
한 구체예 (65)에서, 상기 검사 키트는 전술한 구체예중 한 가지에 따른 하나 또는 그 이상의 결합 펩티드 또는 이들의 활성 단편, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분을 수용하는 용기, 그리고 면역학적 복합체의 존재 또는 부재가 타우 항원의 존재 또는 부재와 상관하도록 타우 항원에 결합하여 면역학적 복합체를 형성하고 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 목적으로 이들 결합 펩티드 또는 항체를 이용하기 위한 사용설명서를 포함한다.
또 다른 구체예 (66)에서, 본 발명은 포유류 상에서, 특히 서열 번호: 67에 진술된 인간 타우 단백질 상에서, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-401, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 396-401, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 394-400, 위치 404에서 인산화된 Ser (pS404)을 포함하는 타우 aa 402-406, 그리고 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-400으로 구성된 군에서 선택되는 에피토프에 관계한다.
한 구체예 (67)에서, 상기 에피토프는 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-401로 구성된다.
한 구체예 (68)에서, 상기 에피토프는 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 396-401로 구성된다.
한 구체예 (69)에서, 상기 에피토프는 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 394-400으로 구성된다.
한 구체예 (70)에서, 상기 에피토프는 위치 404에서 인산화된 Ser (pS404)을 포함하는 타우 aa 402-406으로 구성된다.
한 구체예 (71)에서, 상기 에피토프는 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-400으로 구성된다.
다른 구체예 (72)에서, 본 발명은 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 활성 단편, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분을 생산하는 세포주에 관계한다.
한 구체예 (73)에서, 본 발명은 DSM ACC3136으로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-4A6-48인 세포주에 관계한다.
한 구체예 (74)에서, 본 발명은 DSM ACC3137로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30인 세포주에 관계한다.
한 구체예 (75)에서, 본 발명은 DSM ACC3138로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-2G5-41인 세포주에 관계한다.
한 구체예 (76)에서, 본 발명은 DSM ACC3139로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18인 세포주에 관계한다.
한 구체예 (77)에서, 본 발명은 DSM ACC3140으로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-2A1-40인 세포주에 관계한다.
한 구체예 (78)에서, 본 발명은 DSM ACC3141로서 2011년 9월 6일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12인 세포주에 관계한다.
한 구체예 (79)에서, 본 발명은
a. 첫 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 149의 5'-프라이머 및 서열 번호: 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 및/또는
b. 두 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 120, 123, 124, 136, 137, 138, 139, 그리고 140으로 구성된 군에서 선택되는 5'-프라이머 및 서열 번호: 131, 134, 그리고 141-148로 구성된 군에서 선택되는 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 혼합물을 이용하여, DSM ACC3139로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18의 DNA의 PCR 증폭에 의해 획득될 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계한다.
한 구체예 (80)에서, 본 발명은
a. 첫 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 51과 169-174로 구성된 군에서 선택되는 5'-프라이머 및 서열 번호: 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 혼합물; 및/또는
b. 두 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 124, 127, 그리고 150-158로 구성된 군에서 선택되는 5'-프라이머 및 서열 번호: 130, 그리고 159-168로 구성된 군에서 선택되는 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 혼합물을 이용하여, DSM ACC3137로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30의 DNA의 PCR 증폭에 의해 획득될 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계한다.
한 구체예 (81)에서, 본 발명은
a. 첫 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 178, 179와 180으로 구성된 군에서 선택되는 5'-프라이머 및 서열 번호: 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 혼합물; 및/또는
b. 두 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 121, 127, 139, 154, 155, 그리고 175로 구성된 군에서 선택되는 5'-프라이머 및 서열 번호: 128, 129, 147, 176, 그리고 177로 구성된 군에서 선택되는 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 혼합물을 이용하여, DSM ACC3140으로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-2A1-40의 DNA의 PCR 증폭에 의해 획득될 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계한다.
한 구체예 (82)에서, 본 발명은
a. 첫 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 51과 188-192로 구성된 군에서 선택되는 5'-프라이머 및 서열 번호: 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 혼합물; 및/또는
b. 두 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 120, 124, 126, 181, 182와 183으로 구성된 군에서 선택되는 5'-프라이머 및 서열 번호: 144, 145와 184-187로 구성된 군에서 선택되는 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 혼합물을 이용하여, DSM ACC3138로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-2G5-41의 DNA의 PCR 증폭에 의해 획득될 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계한다.
한 구체예 (83)에서, 본 발명은
a. 첫 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 50과 201-204로 구성된 군에서 선택되는 5'-프라이머 및 서열 번호: 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 혼합물; 및/또는
b. 두 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 121, 137, 151과 193-197로 구성된 군에서 선택되는 5'-프라이머 및 서열 번호: 131, 141, 144, 166, 198, 199와 200으로 구성된 군에서 선택되는 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 혼합물을 이용하여, DSM ACC3136으로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-4A6-48의 DNA의 PCR 증폭에 의해 획득될 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계한다.
한 구체예 (84)에서, 본 발명은
a. 첫 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 209-214, 그리고 219-221로 구성된 군에서 선택되는 5'-프라이머 및 서열 번호: 215의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 혼합물; 및/또는
b. 두 번째 결합 도메인의 증폭을 위한, 서열 번호: 216, 217과 218로 구성된 군에서 선택되는 5'-프라이머 및 서열 번호: 208의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 혼합물을 이용하여, DSM ACC3141로서 2011년 9월 6일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12의 DNA의 PCR 증폭에 의해 획득될 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계한다.
한 구체예 (85)에서, 전술한 구체예중 한 가지에 따른 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 낙타 항체, 디아바디, 또는 변형되거나 조작된 항체일 수 있다.
한 구체예 (86)에서, 본 발명은 전술한 구체예중 한 가지의 결합 펩티드 또는 항체를 생산하기 위한 방법을 제시하고, 상기 방법은 전술한 구체예중 한 가지의 세포주를 적절한 배양 배지에서 배양하고, 그리고 선택적으로, 세포주 또는 배양 배지로부터 결합 펩티드 또는 항체를 정제하는 단계를 포함한다.
다른 구체예 (87)에서, 본 발명은 뇌 시료에서 포스포타우 (p타우) 다합체를 검출하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a. 시료를 전술한 청구항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편과 접촉시키고, 상기 펩티드 또는 이의 단편은 포스포타우 단백질의 에피토프에 결합하고;
b. 항체가 타우 단백질에 결합할 수 있도록 하여 면역학적 복합체를 형성하고;
c. 특히, ELISA 검정을 적용함으로써, 면역학적 복합체의 형성을 검출한다.
특히, 본 발명은 특정 구체예 (88)에서, 타우-연관된 질환 또는 장애를 앓는 것으로 의심되는 개체 및 건강한 대조 개체로부터 뇌 균질액에서 포스포타우 (p타우) 다합체의 사후 검출의 방법에 관계하고, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a. 양쪽 개체로부터 뇌 균질액의 시료를 전술한 청구항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편과 접촉시키고, 상기 펩티드 또는 이의 단편은 포스포타우 단백질의 에피토프에 결합하고;
b. 항체가 타우 단백질에 결합할 수 있도록 하여 면역학적 복합체를 형성하고;
c. 특히, ELISA 검정을 적용함으로써, 면역학적 복합체의 형성을 검출하고, 그리고
d. 타우-연관된 질환을 앓는 것으로 의심되는 개체로부터 획득된 시료에서 면역학적 복합체의 양 또는 강도를 대조 시료의 것과 비교하고,
여기서 대조 값과 비교하여 상기 면역학적 복합체의 양 또는 강도에서 증가는 상기 환자가 최소 잔여 질환을 앓았다는 것을 지시한다.
한 구체예 (89)에서, 대조 시료와 비교하여 검사 시료에서 관찰된 증가는 30% 내지 50%, 특히 35% 내지 45%이다.
한 구체예 (90)에서, 본 발명은 전술한 구체예중 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분을 제시하고, 상기 항체 또는 단편은 호의적인 pK 프로필을 보인다. 특히, 상기 항체 또는 단편은 투여 후 10일까지 높은 혈청 농도를 갖는데, 이것은 치료 항체로서 상기 항체의 용도를 우호적으로 뒷받침하는 약동학적 (PK) 프로필을 지시한다 (Deng et al., Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2012, 8(2) 141-60; Putman et al., Trends Biotech, 2010 (28) 509-516 ; Bai, S. Clin Pharmacokinet 2012; 51 (2): 119-135).
도면과 서열의 간단한 설명
도면
도 1은 대조와 AD 개체로부터 인간 뇌 균질액에서 ACI-35-2A1-Ab1 (왼쪽 패널), ACI-35-2G5-Ab3 (중간 패널), 그리고 대조 항체 (HT7; 오른쪽 패널)에 의한 인산화된 타우 다합체의 검출 결과를 도시한다.
도 2 (2A와 2 B)는 인간 뇌 균질액에서 상업적 항체에 의한 전체 타우와 p-타우의 검출 결과를 도시한다.
도 3 (3A, 3B, 3C)은 인간 뇌 균질액에서 ACI-35-2A1-Ab1 (A), ACI-35-1D2-Ab1 (B), 그리고 ACI-35-2G5-Ab3 (C)에 의한 포스포-타우의 검출을 도시한다.
도 4 (4A, 4B, 4C)는 AlphaLISA를 이용하여, ACI-35-2A1-Ab1 (A), ACI-35-1D2-Ab1 (B), 그리고 ACI-35-2G5-Ab3 (C) 항체에 의한 인간 AD와 대조 (Ctrl) 뇌에서 타우-pS396의 검출 결과를 도시한다. 만-휘트니 검증에 의해 ****p<0.0001, **p<0.01.
도 5 (5A와 5B)는 ACI-35-2G5-Ab3으로 타우 유전자도입 생쥐의 치료 이후에, 편도체 (A)와 해마 (B)에서 타우-pT231 (AT180) IHC 염색의 결과를 도시한다.
도 6 (6A와 6B)은 ACI-35-2G5-Ab3으로 타우 유전자도입 생쥐의 치료 이후에, 편도체 (A)와 해마 (B)에서 전체 타우 (HT7) IHC 염색의 결과를 도시한다.
도 7은 상이한 GSK3β 조건을 이용하여 산출되고, 그리고 ACI-35-2G5-Ab3 항체를 이용하여 막 블롯팅된 타우-pS396에 대한 SDS-PAGE를 도시한다.
도 8은 ACI-35-2G5-Ab3-BT와 타우-13 항체를 이용한 특정한 AlphaLISA 검정 셋업을 도시한다.
도 9는 한 AD 공여자로부터 인간 S1 뇌 분획물에서 타우-pS396의 검출을 도시한다; IP에 의해 농축된 시료 및 비-IP 시료로부터 획득된 신호의 비교.
도 10은 IP, 그 이후에 AlphaLISA를 이용하여, ACI-35-2G5-Ab3 항체에 의한 인간 AD와 대조 (Ctrl) CSF에서 타우-pS396의 검출 결과를 도시한다. 만-휘트니 검증에 의해 *** p=0.0003.
서열
서열 번호: 46 - 57은 VH/VK 전방과 역방 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 62는 타우 항원, 펩티드 T3의 아미노산 서열을 진술한다 (표 1 참조).
서열 번호: 67은 타우40으로 불리는 인간 타우의 가장 긴 동종형 (441 aa)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 68은 하이브리도마 세포주 A4-4A6-18에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 69는 하이브리도마 세포주 A4-4A6-18에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 70은 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 71은 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 72는 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR3의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 73은 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 74는 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 75는 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 76은 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 77은 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 78은 단일클론 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 79는 단일클론 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 80은 단일클론 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR3의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 81은 단일클론 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 82는 단일클론 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 83은 단일클론 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 84는 하이브리도마 세포주 A4-4A6-18에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 85는 하이브리도마 세포주 A4-4A6-18에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 86은 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 87은 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 88은 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18, A4-2A1-40과 A4-4A6-48에 의해 각각 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, 그리고 ACI-35-4A6-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 89는 단일클론 항체 ACI-35-2G5-AB2, 그리고 ACI-35-2G5-AB3 각각의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 90은 단일클론 항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, 그리고 ACI-35-4A6-Ab2 각각의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 91은 단일클론 항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2, 그리고 ACI-35-2G5-AB3 각각의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR3의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 92는 하이브리도마 세포주 A4-2A1-40에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2A1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 93은 단일클론 항체 ACI-35-2A1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 94는 단일클론 항체 ACI-35-2A1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 95는 단일클론 항체 ACI-35-2A1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 96은 하이브리도마 세포주 A6-2G5-08에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 97은 하이브리도마 세포주 A6-2G5-08에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 98은 단일클론 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 99는 단일클론 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 100은 단일클론 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR3의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 101은 단일클론 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 102는 단일클론 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 103은 단일클론 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 104는 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30과 A6-2G5-41에 의해 각각 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2G5-AB2와 ACI-35-2G5-AB3의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 105는 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30과 A6-2G5-41에 의해 각각 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2G5-AB2와 ACI-35-2G5-AB3의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 106은 단일클론 항체 ACI-35-2G5-AB2와 ACI-35-2G5-AB3 각각의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 107은 단일클론 항체 ACI-35-2G5-AB2와 ACI-35-2G5-AB3 각각의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 108은 단일클론 항체 ACI-35-2G5-AB2와 ACI-35-2G5-AB3 각각의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 109는 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18, A4-2A1-40과 A4-4A6-48에 의해 각각 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, 그리고 ACI-35-4A6-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 110은 하이브리도마 세포주 A4-2A1-40에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2A1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 111은 하이브리도마 세포주 A6-2G5-08에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2G5-AB1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 112는 하이브리도마 세포주 A6-2G5-08에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2G5-AB1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 113은 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30과 A6-2G5-41에 의해 각각 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2G5-AB2와 ACI-35-2G5-AB3의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 114는 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30과 A6-2G5-41에 의해 각각 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2G5-AB2와 ACI-35-2G5-AB3의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 115는 단일클론 항체 ACI-35-2G5-AB2와 ACI-35-2G5-AB3의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 116은 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2A1-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 117은 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-2A1-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 118은 하이브리도마 세포주 A4-4A6-48에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 진술한다.
서열 번호: 119는 하이브리도마 세포주 A4-4A6-48에 의해 생산된 단일클론 항체 ACI-35-4A6-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
서열 번호: 120 - 221은 VH/VK 전방과 역방 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 진술한다.
용어의 정의
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 그리고 "단백질"은 교체가능하고 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 구성되는 생물분자를 의미하는 것으로 정의된다.
용어 "펩티드," 또는 "결합 펩티드"는 본원에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 알파 탄소가 한 아미노산의 알파 탄소의 카르복실 기 및 다른 아미노산의 알파 탄소의 아미노 기 사이에 축합 반응에 의해 형성된 펩티드 결합을 통해 연결되는 아미노산 (전형적으로, L-아미노산)의 사슬을 지칭한다. 사슬의 한쪽 단부 (즉, 아미노 말단)에서 말단 아미노산은 유리 아미노 기를 갖고, 반면 사슬의 다른 단부 (즉, 카르복시 말단)에서 말단 아미노산은 유리 카르복실 기를 갖는다. 따라서, 용어 "아미노 말단" (약칭 N-말단)은 펩티드의 아미노 말단에서 아미노산 상에서 유리 알파-아미노 기, 또는 펩티드 내에 임의의 다른 위치에서 아미노산의 알파-아미노 기 (펩티드 결합에 참여할 때 이미노 기)를 지칭한다. 유사하게, 용어 "카르복시 말단" (약칭 C-말단)은 펩티드의 카르복시 말단에서 아미노산 상에서 유리 카르복실 기, 또는 펩티드 내에 임의의 다른 위치에서 아미노산의 카르복실 기를 지칭한다. 결합 펩티드는 본원에서 정의된 바와 같은 항체, 예를 들면, 다중클론 또는 단일클론 항체, 인간 또는 인간화 항체, 디아바디, 낙타 항체 등, 또는 이들의 기능성 부분을 구성할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 펩티드의 맥락에서 용어 "이의 단편" 또는 "단편"은 본원에서 정의된 본래 펩티드와 본질적으로 동일한 (생물학적) 활성을 갖는 기능성 펩티드 단편을 지칭한다. 본원에서 항체의 맥락에서 이용될 때 이들 용어는 본래 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 내포하는 본래 항체의 일부분을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 항체 단편의 실례에는 Fab, Fab', F(ab')2, 그리고 Fv 단편; 디아바디; 단일-사슬 Fv (scFv) 분자를 비롯한 단일-사슬 항체 분자; 그리고 이중특이적 및 다중특이적 항체 및/또는 항체 단편이 포함된다.
전형적으로, 펩티드를 구성하는 아미노산은 아미노 말단에서 시작하고, 그리고 펩티드의 카르복시 말단을 향하는 방향으로 증가하는 순서로 넘버링된다. 따라서 한 아미노산이 다른 아미노산을 "후행"하는 것으로 일컬어질 때, 상기 아미노산은 선행 아미노산보다 펩티드의 카르복시 말단에 더욱 가깝게 위치한다.
용어 "잔기"는 본원에서, 아미드 결합에 의해 펩티드 내로 함입되는 아미노산을 지칭하는데 이용된다. 따라서 아미노산은 자연 발생 아미노산이거나 또는, 달리 한정되지 않으면, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 자연 아미노산의 공지된 유사체 (즉, 아미노산 모방체)를 포괄할 수 있다. 게다가, 아미드 결합 모방체는 당업자에게 널리 알려진 펩티드 중추 변형을 포함한다.
관용구 "(으)로 본질적으로 구성되는"는 본원에서, 상기 관용구가 지칭하는 펩티드의 본질적인 성질을 실질적으로 변화시키는 임의의 요소를 배제하는데 이용된다. 따라서 "(으)로 본질적으로 구성되는" 펩티드의 설명은 상기 펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키는 임의의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 배제한다.
게다가, 당업자는 전술한 바와 같이, 인코딩된 서열 내에서 단일 아미노산 또는 낮은 비율의 아미노산 (전형적으로, 5% 이하, 더욱 전형적으로 1% 이하)을 변경하거나, 부가하거나 또는 결실시키는 개별 치환, 결실 또는 부가가 보존성으로 변형된 변형물이고, 여기서 이들 변경이 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 유발한다는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 표는 당분야에 널리 알려져 있다. 하기 6개 군은 각각, 서로에 대해 보존성 치환인 아미노산을 내포한다:
1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T);
2) 아스파르트산 (D), 글루타민산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 리신 (K);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 그리고
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).
관용구 "단리된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 자연 상태에서 발견될 때 자연적으로 동반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 따라서 본원에서 설명된 펩티드는 그들의 현장 환경에서 정상적으로 연관되는 물질을 내포하지 않는다. 전형적으로, 본원에서 설명된 단리된, 면역원성 펩티드는 은 착색된 겔에서 띠 강도에 의해 측정될 때, 적어도 약 80%, 통상적으로 적어도 약 90%, 그리고 바람직하게는, 적어도 약 95% 순수하다.
단백질 순도 또는 균질성은 당분야에 널리 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 단백질 시료의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 그 이후에 염색 시에 명시화에 의해 표시될 수 있다. 일정한 목적을 위하여, 높은 분해능이 필요하고, 그리고 HPLC 또는 유사한 정제 수단이 이용될 것이다.
면역원성 펩티드가 길이에서 상대적으로 짧을 때 (즉, 약 50개 이하 아미노산), 이들은 종종, 표준 화학 펩티드 합성 기술을 이용하여 합성된다.
서열의 C-말단 아미노산이 불용성 서포트에 부착되고, 그 이후에 서열 내에 나머지 아미노산이 순차적으로 부가되는 고형 상 합성은 본원에서 설명된 면역원성 펩티드의 화학 합성에 선호되는 방법이다. 고형 상 합성을 위한 기술은 당업자에게 알려져 있다.
대안으로, 본원에서 설명된 면역원성 펩티드는 재조합 핵산 방법을 이용하여 합성된다. 일반적으로, 이것은 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 창조하고, 상기 핵산을 발현 카세트 내에 특정 프로모터의 제어 하에 배치하고, 펩티드를 숙주에서 발현하고, 발현된 펩티드 또는 폴리펩티드를 단리하고, 그리고 필요하면, 펩티드를 복원하는 것을 수반한다. 당업자를 이런 절차에 대해 보도할 만큼 충분한 기술은 기존 문헌에서 발견된다.
일단 발현되면, 재조합 펩티드는 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 비롯한 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 치료제로서 이용을 위해, 약 50 % 내지 95 % 균질성의 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하고, 그리고 80 % 내지 95 % 또는 그 이상의 균질성이 가장 바람직하다.
당업자는 화학 합성, 생물학적 발현 또는 정제 후, 면역원성 펩티드가 구성 펩티드의 고유 입체형태와 실질적으로 상이한 입체형태를 가질 수도 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 경우에, 항증식성 펩티드를 변성하고 환원하고, 이후 상기 펩티드가 바람직한 입체형태로 재-접힘되도록 유도하는 것이 종종 필요하다. 단백질을 환원하고 변성하고, 그리고 재-접힘을 유도하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다.
정제된 단백질의 항원성은 예로서, 면역 혈청, 또는 단백질 그 자체에 대해 생산된 항혈청과의 반응을 증명함으로써 확인될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 단수 관사 ("a", "an" 및 "the")는 "하나 또는 그 이상"을 의미하는 것으로 정의되고, 그리고 문맥이 부적절한 경우가 아니라면 복수를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "검출하고" 또는 "검출된"은 생물학적 분자의 검출을 위한 공지된 기술, 예를 들면, 면역화학 또는 조직학적 방법을 이용하는 것을 의미하고, 그리고 조사 중인 생물분자의 존재 또는 농도를 정성적으로 또는 정량적으로 결정하는 것을 지칭한다.
"단리된"은 생물학적 분자가 자신이 자연적으로 함께 발생하는 성분 중에서 적어도 일부를 결여한다는 것을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체" 또는 "항체들" 또는 "이의 기능성 부분"은 당분야에서 인정된 용어이고, 그리고 공지된 항원에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편, 특히 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성 부분, 다시 말하면, 항원에 면역특이적으로 결합하는 결합 부위를 내포하는 분자를 지칭하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 면역글로불린은 임의의 유형 (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA와 IgY) 또는 부류 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1과 IgA2) 또는 면역글로불린 분자의 하위부류일 수 있다.
"항체"는 본 발명의 범위 내에서, 단일클론, 다중클론, 키메라, 단일 사슬, 이중특이적, 유인원화, 인간과 인간화 항체, 낙타 항체, 디아바디, 그리고 이들의 기능성 부분 또는 활성 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 공지된 항원에 결합하는 분자의 활성 단편의 실례에는 Fab 면역글로불린 발현 라이브러리의 산물 및 전술한 임의의 항체와 단편의 에피토프-결합 단편을 비롯한 Fab와 F(ab')2 단편이 포함된다.
이들 활성 단편은 다양한 기술에 의해, 본 발명의 항체로부터 유래될 수 있다. 가령, 정제된 단일클론 항체는 효소, 예를 들면, 펩신으로 개열되고, 그리고 HPLC 겔 여과에 종속될 수 있다. Fab 단편을 내포하는 적절한 분획물은 이후, 수집되고 막 여과 등에 의해 농축될 수 있다. 항체의 활성 단편의 단리를 위한 일반적인 기술에 관한 추가의 설명을 위해, 예로서 Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, (1986)을 참조한다.
"인간화 항체"는 CDR이 비-인간 공여자 면역글로불린으로부터 유래되고, 분자의 나머지 면역글로불린-유래된 부분이 하나 (또는 그 이상)의 인간 면역글로불린(들)으로부터 유래되는 한 유형의 조작된 항체를 지칭한다.
인간화 항체는 뼈대 영역 중에서 하나 또는 그 이상이 인간 또는 영장류 아미노산을 갖는 가변 영역을 갖는 항체를 더욱 지칭할 수도 있다. 이에 더하여, 뼈대 서포트 잔기가 결합 친화성을 보존하도록 변경될 수 있다. "인간화 항체"를 획득하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. (예로서, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9:421 (1991) 참조).
"인간화 항체"는 또한, 큰 동물, 예를 들면, 토끼에서 친화성-성숙된 인간형 다중클론 항체의 생산을 가능하게 하는 신규한 유전자 조작 접근법에 의해 획득될 수도 있다 (http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php).
용어 "완전 인간 항체" 또는 "인간" 항체는 인간 항체 유전자를 보유하는 유전자도입 생쥐로부터 또는 인간 세포로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 하지만, 인간 면역계에서, "완전 인간", "인간", 그리고 "인간화" 항체 사이에 차이는 미미하거나 또는 존재하지 않고, 따라서 3가지 모두 동등한 효능과 안정성을 가질 수 있다.
용어 "단일클론 항체" 역시 당분야에서 인정되고, 그리고 실험실에서 단일 클론으로부터 대량 생산되고 단지 한 가지 항원만을 인식하는 항체를 지칭한다. 단일클론 항체는 전형적으로, 정상적으로 단수명, 항체-생산 B 세포를 신속-성장 세포, 예를 들면, 암 세포 (때때로, "영속" 세포로 지칭됨)에 융합함으로써 만들어진다. 결과의 하이브리드 세포, 또는 하이브리도마는 급속하게 배증하고, 대량의 항체를 생산하는 클론을 창출한다.
용어 "항원"은 생물체, 특히 동물, 더욱 구체적으로 인간을 비롯한 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 실체 또는 이의 단편을 지칭한다. 상기 용어는 면역원 및 항원성 또는 항원 결정기를 담당하는 영역을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "가용성"은 수성 용액에서 부분적으로 또는 완전하게 용해된다는 것을 의미한다.
또한, 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "면역원성"은 면역원성 작용제에 대해 지향된 항체, T-세포 및 기타 반응성 면역 세포의 생산을 유도하거나 증진하고 인간 또는 동물에서 면역 반응에 기여하는 물질을 지칭한다.
면역 반응은 개체가 치료되는 장애를 완화하거나 경감하기 위해 투여된 본 발명의 면역원성 조성물에 대한 충분한 항체, T-세포 및 기타 반응성 면역 세포를 생산할 때 일어난다.
용어 "하이브리도마"는 당분야에서 인정되고, 그리고 항체-생산 세포 및 영속 세포, 예를 들면, 다발성 골수종 세포의 융합에 의해 생산된 세포를 지칭하는 것으로 당업자에 의해 이해된다. 이러한 하이브리드 세포는 항체의 연속 공급을 산출할 수 있다. 융합 방법의 더욱 상세한 설명을 위해 상기 "단일클론 항체"의 정의 및 하기 실시예를 참조한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "담체"는 항원성 펩티드 또는 초분자 구조체가 항원성 펩티드 또는 펩티드의 일부 내로 함입되거나 또는 이들과 결합되고, 따라서 이들을 인간 또는 동물의 면역계에 제시하거나 노출하는 구조를 의미한다. 동물 또는 인간 요법에서 적절하게 이용될 수 있는 임의의 입자, 예를 들면, 소포, 입자 또는 미립자체가 본 발명의 단락 내에서 담체로서 이용될 수 있다.
용어 "담체"는 항원성 펩티드를 포함하는 초분자 항원성 구조체 조성물이 전달 기전에 의해 원하는 부위로 운반되는 전달 방법을 더욱 포함한다. 이런 전달 시스템의 한 실례는 콜로이드성 금속, 예를 들면, 콜로이드성 금을 이용한다.
본 발명의 초분자 항원성 구조체 조성물에 이용될 수 있는 담체 단백질에는 말토오스 결합 펩티드 "MBP"; 소 혈청 알부민 "BSA"; 키홀 림펫 헤모시아닌 "KLH"; 난백알부민; 플라젤린; 사이로글로불린; 임의의 종의 혈청 알부민; 임의의 종의 감마 글로불린; 동계 세포; Ia 항원을 보유하는 동계 세포; 그리고 D- 및/또는 L- 아미노산의 중합체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
더 나아가, 용어 "치료 효과량" 또는 "제약학적 효과량"은 인간 또는 동물에 투여될 때, 상기 인간 또는 동물에서 치료 효과를 유발하는데 충분한 결합 펩티드의 양을 지칭한다. 효과량은 일과적인 절차에 따라 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
"p타우 PHF", "PHF", 그리고 "쌍나선 필라멘트"는 본원에서 동의어로서 이용되고, 그리고 전자 현미경에서 가시적인 160 nm의 주기성 (periodicity)을 갖는 나선으로 감기는 대략 10 nm 섬유의 쌍을 지칭한다. 너비는 10 내지 22 nm 범위에서 변한다. PHF는 알츠하이머병 (AD)의 신경섬유매듭 및 신경망실에서 유력한 구조이다. PHF는 또한, 신경반과 연관된, 전체는 아니지만 일부 영양실조 신경돌기에서 관찰될 수 있다. PHF의 주요 성분은 미소관-연관된 단백질 타우의 고인산화된 형태이다. PHF는 이황화-연결된 역평행 고인산화된 타우 단백질로 구성된다. PHF 타우는 C-말단 20개 아미노산 잔기가 절두될 수 있다. PHF 형성의 기초가 되는 기전은 불확실하지만, 타우의 고인산화는 이것을 미소관으로부터 해방하고 타우의 가용성 풀을 증가시킨다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명에 따른 항원성 조성물에 대한 항체 유도된 반응은 거의 T-세포 독립성인 것으로 증명되었다. 누드 생쥐 모델이 이와 관련하여 이용되었고, 그리고 누드 생쥐는 예방접종되고, 그리고 면역화된 누드 생쥐에서 본 발명에 따른 항원성 조성물에 의해 유도된 Aβ-특이적 항체 반응을 평가하기 위해 항체 반응이 측정되었다. 누드 생쥐는 Foxn1nu 돌연변이를 보유하고, 그리고 결과로서, 적절한 흉선의 결여로 인한 감소된 T-세포 기능을 갖는다.
본원에서 이용된 바와 같이, "제약학적 효과량"은 치료되는 질환, 장애 또는 이상의 증상 또는 이들과 연관된 임의의 합병증을 치료하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키는데 적절한 제약학적 조성물 내에 활성 성분의 분량을 지칭한다.
본 발명은 타우 단백질의 주요 병리학적 포스포-에피토프를 인식하고 이들에 결합하는 결합 펩티드를 제시한다. 특히, 본 발명은 AD를 비롯한 타우병증에서 시냅스-와 신경-독성을 주도하는 것으로 생각되는 단백질 타우 상에서 선형과 입체형태, 단순하고 복잡한 포스포-에피토프에 특이적인 항체를 제시한다.
따라서 본 발명은 한 구체예에서, 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분에 관계하고, 상기 결합 펩티드 또는 항체는 포유류, 특히 인간 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하지만, 한 구체예에서, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않고, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 적어도 10 nM, 특히 적어도 8 nM, 특히 적어도 5 nM, 특히 적어도 2 nM, 특히 적어도 1 nM, 특히 적어도 500 pM, 특히 적어도 400 pM, 특히 적어도 300 pM, 특히 적어도 200 pM, 특히 적어도 100 pM, 특히 적어도 50 pM의 해리 상수로 높은 결합 친화성을 갖는다.
본원에서 이용된 바와 같이, "가용성 타우" 단백질은 완전하게 가용화된 타우 단백질/펩티드 단위체 둘 모두, 또는 타우-유사 펩티드/단백질, 또는 변형된 또는 절두된 타우 펩티드/단백질, 또는 타우 펩티드/단백질 단위체의 다른 유도체, 그리고 타우 단백질 저중합체로 구성되는 단백질을 지칭한다. "가용성 타우"는 특히 신경섬유매듭 (NFT)을 배제한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "불용성 타우"는 시험관내에서 수성 매체, 그리고 생체내에서 포유류 또는 인간 신체, 더욱 구체적으로 뇌 둘 모두에서 불용성인 저중합체성 또는 중합체성 구조를 형성하는 타우 펩티드 또는 단백질, 또는 타우-유사 펩티드/단백질, 또는 변형된 또는 절두된 타우 펩티드/단백질, 또는 타우 펩티드/단백질의 다른 유도체의 복수의 응집된 단위체, 하지만 특히, 포유류 또는 인간 신체, 더욱 구체적으로 뇌에서 불용성인 타우, 또는 변형된 또는 절두된 타우 펩티드/단백질, 또는 이들의 유도체의 복수의 응집된 단위체 각각을 지칭한다. "불용성 타우"는 특히 신경섬유매듭 (NFT)을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "단위체성 타우" 또는 "타우 단위체"는 수성 매체에서 응집된 복합체 없이, 완전하게 가용화된 타우 단백질을 지칭한다.
"응집된 타우", "저중합체성 타우" 및 "타우 저중합체"는 각각, 시험관내에서 수성 매체, 그리고 생체내에서 포유류 또는 인간 신체, 더욱 구체적으로 뇌 둘 모두에서 불용성 또는 가용성인 저중합체성 또는 중합체성 구조를 형성하는 타우 펩티드 또는 단백질, 또는 타우-유사 펩티드/단백질, 또는 변형된 또는 절두된 타우 펩티드/단백질, 또는 타우 펩티드/단백질의 다른 유도체의 복수의 응집된 단위체, 하지만 특히, 포유류 또는 인간 신체, 더욱 구체적으로 뇌에서 불용성 또는 가용성인 타우, 또는 변형된 또는 절두된 타우 펩티드/단백질, 또는 이들의 유도체의 복수의 응집된 단위체를 지칭한다.
"조절 항체"는 다양한 구체예에서 본원에서 설명된 바와 같은 항체 또는 이의 기능성 단편을 지칭하는데, 이것은 생체내에서, 특히 증가된 수준의 가용성 타우 단백질 및/또는 가용성 인산화된 타우 단백질을 내포하는 동물, 특히 포유동물 또는 인간의 뇌에서, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 가용성 및/또는 불용성 및/또는 저중합체성 타우 단백질, 특히 가용성 인산화된 타우 단백질의 기능적 성질, 생물학적 활성 또는 수준을 상향-조절하고 (가령, 활성화시키거나 또는 자극하고), 하향-조절하고 (가령, 저해하거나 또는 억제하고) 또는 달리 변화시킬 수 있다. 조절 항체 또는 이의 기능성 단편은 타우 단백질 또는 타우 단백질을 인코딩하는 폴리펩티드를 직접적으로 또는 간접적으로 조절하는 역할을 할 수도 있다. 일정한 구체예에서, 조절 항체 또는 이의 기능성 단편은 가용성 및/또는 불용성 및/또는 저중합체성, 특히 가용성과 불용성 타우 단백질, 특히 가용성과 불용성과 저중합체성 타우 단백질의 수준을 감소시킨다. 한 양상에서, 가용성 및/또는 불용성 및/또는 저중합체성 타우 단백질은 증가된 수준의 타우 단백질 및/또는 인산화된 타우 단백질, 특히 가용성 타우 단백질 및/또는 가용성 인산화된 타우 단백질을 내포하는 동물, 특히 포유동물 또는 인간의 뇌에서, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 인산화된 타우 단백질, 특히 가용성 인산화된 타우 단백질이다.
한 구체예에서, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체와 함께, 본원에서 설명되고 청구된 구체예 중에서 임의의 한 가지에 따른 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 기능성 부분, 또는 상기 결합 펩티드 또는 항체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 치료 효과량으로 포함하는 제약학적 조성물을 제시한다.
적절한 제약학적 담체, 희석제 및/또는 부형제는 당분야에 널리 알려져 있고, 여기에는 예로서, 인산염 완충된 식염수 용액, 물, 유화액, 예를 들면, 오일/물 유화액, 다양한 유형의 습윤제, 무균 용액 등이 포함된다.
항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드는 생리학적으로 허용되는 제제로 제조될 수 있고, 그리고 공지된 기술을 이용하여 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 가령, 임의의 기능적으로 등가의 결합 펩티드 또는 이의 기능성 부분을 비롯한 본원에서 설명되고 본 발명에 따른 결합 펩티드, 특히 임의의 기능적으로 등가의 항체 또는 이의 기능성 부분을 비롯한 본 발명의 단일클론 항체는 치료 조성물을 형성하기 위해 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 합동된다. 적절한 제약학적 담체, 희석제 및/또는 부형제는 당분야에 널리 알려져 있고, 여기에는 예로서, 인산염 완충된 식염수 용액, 물, 유화액, 예를 들면, 오일/물 유화액, 다양한 유형의 습윤제, 무균 용액 등이 포함된다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물의 조제는 당업자에게 알려진 표준 방법에 따라 달성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 적절한, 제약학적 효과량에서 고체, 액체 또는 에어로졸의 형태에서 개체에 투여될 수 있다. 고형 조성물의 실례에는 알약, 크림, 그리고 이식가능 투약 단위가 포함된다. 알약은 경구 투여될 수 있다. 치료 크림은 국소 투여될 수 있다. 이식가능 투약 단위는 국부, 예를 들면, 종양 부위에 투여되거나, 또는 치료 조성물의 전신 방출을 위해, 예로서 피하 이식될 수 있다. 액체 조성물의 실례에는 근육내, 피하, 정맥내, 동맥내 주사에 맞게 개조된 제제, 그리고 국소와 안구내 투여를 위한 제제가 포함된다. 에어로졸 제제의 실례에는 폐에 투여를 위한 흡입기 제제가 포함된다.
조성물은 표준 투여 루트에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 국소, 비경구, 직장, 코, 피내, 복강내, 또는 비경구 (가령, 정맥내, 피하, 또는 근육내) 루트에 의해 투여될 수 있다.
이에 더하여, 조성물은 지속 방출 기반, 예를 들면, 생물분해성 중합체 내로 함입될 수 있고, 이들 중합체는 전달이 요망되는 부위, 예를 들면, 종양 부위의 주변에 이식된다. 이러한 방법은 단일 분량의 투여, 미리 결정된 시간 간격에서 반복 분량의 투여, 그리고 미리 결정된 기간 동안 지속 투여를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 지속 방출 기반은 효소 또는 산/염기 가수분해에 의해 또는 용해에 의해 분해가능한 물질, 통상적으로 중합체로 만들어진 기반이다. 일단 체내로 삽입되면, 상기 기반은 효소와 체액에 의해 작동된다. 지속 방출 기반은 바람직하게는, 생물적합성 물질, 예를 들면, 리포좀, 폴리락티드 (폴리락티드산), 폴리글리콜리드 (글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드 (유산과 글리콜산의 공중합체), 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 황산염, 카르복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘에 의해 선택된다. 바람직한 생물분해성 기반은 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 또는 폴리락티드 코-글리콜리드 (유산과 글리콜산의 공-중합체) 중에서 한 가지의 기반이다.
조성물의 용량이 다양한 인자, 예를 들면, 치료되는 질환, 이용된 특정 조성물, 그리고 기타 임상적 인자, 예를 들면, 환자의 체중, 크기, 성별과 전반적인 건강 상태, 신체 표면적, 투여되는 특정 화합물 또는 조성물, 동시에 투여되는 다른 약물, 그리고 투여 루트에 좌우된다는 것은 당업자에게 널리 알려져 있다.
본 발명에 따른 조성물은 생물학적으로 활성 성분 또는 화합물, 예를 들면, 예로서 타우병증 및/또는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질, 예를 들면, 알츠하이머병에 관련된 아밀로이드 β 단백질과 연관된 일군의 질환과 장애인 아밀로이드증의 약물 치료에 이용되는 공지된 화합물을 포함하는 다른 조성물과 공동으로 투여될 수 있다.
다른 생물학적으로 활성 성분 또는 화합물은 본 발명에 따른 치료 백신과 동일하거나 유사한 기전에 의해, 또는 무관한 작용 기전에 의해, 또는 복수의 관련된 및/또는 무관한 작용 기전에 의해 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.
일반적으로, 다른 생물학적으로 활성 화합물에는 중성자-전송 개선제, 정신요법 약물, 아세틸콜린 에스테라아제 저해제, 칼슘-채널 차단제, 생체 아민, 벤조디아제핀 진정제, 아세틸콜린 합성, 저장 또는 방출 개선제, 아세틸콜린 시냅스후 수용체 효현제, 모노아민 산화효소-A 또는 -B 저해제, N-메틸-D-아스파르트산염 글루타민산염 수용체 길항제, 비-스테로이드성 소염제, 항산화제, 그리고 세로토닌성 수용체 길항제가 포함될 수 있다.
특히, 생물학적으로 활성 작용제 또는 화합물은 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드, 그리고 선택적으로, 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제 및 질환의 치료를 위한 사용설명서와 함께, 산화 스트레스를 억제하는 화합물, 항-아폽토시스성 화합물, 금속 킬레이터, DNA 수복의 저해제, 예를 들면, 피렌제핀과 대사산물, 3-아미노-1-프로판술폰산 (3APS), 1,3-프로판디술폰산염 (1,3PDS), 세크레타아제 활성화제, [베타]-와 7-세크레타아제 저해제, 타우 단백질, 신경전달물질, /3-시트 파괴제, 소염성 분자, "비정형 항정신병약", 예를 들면, 클로자핀, 지프라시돈, 리스페리돈, 아리피프라졸 또는 올란자핀, 또는 콜린에스테라아제 저해제 (ChEIs), 예를 들면, 타크린, 리바스티그민, 도네페질 및/또는 갈란타민, 그리고 기타 약물과 영양 보조제, 예를 들면, 비타민 B12, 시스테인, 아세틸콜린의 전구체, 레시틴, 콜린, 은행나무, 아세틸-L-카르니틴, 이데베논, 프로펜토필린, 또는 크산틴 유도체로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함할 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드, 그리고 선택적으로, 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께, 니아신 또는 메만틴을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 환각, 망상, 사고 장애 (눈에 띄는 사고 멸렬, 탈선, 사고이탈에 의해 나타남), 그리고 기괴하거나 무질서한 행동뿐만 아니라 무쾌감, 정서 둔마, 무관심, 그리고 사회적 위축을 비롯한 양성과 음성 정신병 증상의 치료를 위해, 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드, 그리고 선택적으로, 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께, "비정형 항정신병약", 예를 들면, 클로자핀, 지프라시돈, 리스페리돈, 아리피프라졸 또는 올란자핀을 포함하는 조성물이 제시된다.
본 발명에 따른 결합 펩티드에 더하여 조성물에서 적절하게 이용될 수 있는 다른 화합물은 예로서, 치료 약물 표적 (페이지 36-39), 알칸술폰산과 알칸올황산 (페이지 39-51), 콜린에스테라아제 저해제 (페이지 51-56), NMDA 수용체 길항제 (페이지 56-58), 에스트로겐 (페이지 58-59), 비-스테로이드성 소염성 약물 (페이지 60-61), 항산화제 (페이지 61-62), 페록시솜 증식인자-활성화된 수용체 (PPAR) 효현제 (페이지 63-67), 콜레스테롤-강하제 (페이지 68-75); 아밀로이드 저해제 (페이지 75-77), 아밀로이드 형성 저해제 (페이지 77-78), 금속 킬레이터 (페이지 78-79), 항-정신병약과 항-우울제 (페이지 80-82), 영양 보조제 (페이지 83-89), 뇌에서 생물학적으로 활성 성분의 가용성을 증가시키는 화합물 (페이지 89-93 참조), 그리고 프로드러그 (페이지 93과 94)를 비롯하여, 본원에 참조로서 편입되는 WO 2004/058258 (특히, 페이지 16과 17 참조)에서 개시된 화합물, 하지만 특히, 상기 표시된 페이지에서 언급된 화합물이다.
제약학적으로 활성 단백질성 물질은 분량당 1 ng 내지 10 mg의 양으로 존재할 수 있다. 일반적으로, 투여 섭생은 0.1 μg 내지 10 mg의 본 발명에 따른 항체, 특히 1.0 μg 내지 1.0 mg, 그리고 더욱 바람직하게는, 1.0 μg 내지 100 μg의 범위 내에 있고, 이들 범위 내에 속하는 모든 개별 숫자 역시 본 발명의 일부이다. 투여가 연속 주입을 통해 일어나면, 더욱 적절한 용량은 시간당 체중 킬로그램당 0.01 μg 내지 10 mg 단위의 범위 내에 있고, 이들 범위 내에 속하는 모든 개별 숫자 역시 본 발명의 일부이다.
투여는 일반적으로, 비경구, 예를 들면, 정맥내 또는 피하일 것이다. 비경구 투여를 위한 제조물에는 무균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 유화액이 포함된다. 비-수성 용매에는 제한 없이, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들면, 올리브 오일, 그리고 주사가능 유기 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레산염이 포함된다. 수성 용매는 물, 알코올/수성 용액, 유화액, 또는 염수와 완충된 매체를 포함하는 현탁액으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 비경구 운반체에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스와 염화나트륨, 유산화 링거, 또는 고정유가 포함된다. 정맥내 운반체에는 유체와 영양 보충물, 전해질 보충물 (가령, 링거 덱스트로스에 기초된 것들) 등이 포함된다. 보존제, 예를 들면, 항균제, 항산화제, 킬레이트화제, 비활성 가스 등 역시 존재할 수 있다.
제약학적 조성물은 단백질성 담체, 예를 들면, 특히 인간 기원의 혈청 알부민 또는 면역글로불린을 더욱 포함할 수 있다. 추가의 생물학적으로 활성 작용제가 의도된 용도에 따라, 본 발명의 제약학적 조성물 내에 존재할 수 있다.
결합 표적이 뇌에 위치할 때, 본 발명의 일정한 구체예는 뇌-혈관 장벽을 관통하기 위한, 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드를 제시한다. 일정한 신경변성 질환은 뇌-혈관 장벽의 투과성에서 증가와 연관되고, 따라서 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드는 뇌에 쉽게 도입될 수 있다. 뇌-혈관 장벽이 본래 상태로 존속할 때, 이를 가로질러 분자를 수송하기 위한 몇몇 공지된 접근법, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 물리적인 방법, 지질-기초된 방법, 그리고 수용체와 채널-기초된 방법이 존재한다.
뇌-혈관 장벽을 가로질러 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드를 수송하는 물리적인 방법에는 뇌-혈관 장벽을 완전하게 우회하거나, 또는 뇌-혈관 장벽 내에 구멍을 만드는 것이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 우회 방법에는 뇌내로 직접 주사 (예로서, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002) 참조) 및 뇌내에 전달 장치 이식 (예로서, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); 그리고 Gliadel Wafers(TM), Guildford Pharmaceutical)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 장벽 내에 구멍을 만드는 방법에는 초음파 (예로서, U.S. Patent Publication No. 2002/0038086 참조), 삼투압 (가령, 긴장 과도의 만니톨의 투여에 의해 (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N. Y. (1989)), 예로서 브래디키닌 또는 투과제 A-7에 의한 투과화 (예로서, U.S. Patent Nos. 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 그리고 5,686,416 참조), 그리고 결합 펩티드 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 유전자를 내포하는 벡터로 뇌-혈관 장벽에 퍼져 있는 뉴런의 형질감염 (예로서, U.S. Patent Publication No. 2003/0083299 참조)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
뇌-혈관 장벽을 가로질러 항체, 특히 단일클론 항체, 또는 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드를 수송하는 지질-기초된 방법에는 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드를 뇌-혈관 장벽의 관 내피 상에 수용체에 결합하는 이들의 활성 단편에 커플링된 리포좀 내에 캡슐화하기 (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 20020025313 참조), 그리고 저밀도 지단백 입자 (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 20040204354 참조) 또는 아포리포단백질 E (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 20040131692 참조)에서 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드의 코팅이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
뇌-혈관 장벽을 가로질러 항체, 특히 단일클론 항체, 또는 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드를 수송하는 수용체와 채널-기초된 방법에는 뇌-혈관 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 글루코코르티코이드 차단제 이용 (예로서, U.S. Patent Application Publication Nos. 2002/0065259, 2003/0162695, 그리고 2005/0124533 참조); 칼륨 채널 활성화 (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 2005/0089473 참조), ABC 약물 운반체 저해 (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 2003/0073713 참조); 트랜스페린으로 항체의 코팅 및 하나 또는 그 이상의 트랜스페린 수용체의 활성 조절 (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 2003/0129186 참조), 그리고 항체 양이온화 (예로서, U.S. Patent No. 5,004,697 참조)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
항체, 특히 단일클론 항체, 또는 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드, 또는 본 발명에 따른 제약학적 조성물의 단일 또는 반복 투여는 연장된 기간에 걸쳐 개체에 제공될 수 있다. 투여의 지속 기간은 1주 내지 12개월까지 또는 그 이상일 수 있다. 이러한 기간 동안, 결합 펩티드, 항체 또는 제약학적 조성물은 치료되는 개체의 필요에 따라, 주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회 등, 또는 더욱 높은 또는 더욱 낮은 빈도에서 투여될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 신경변성 질환 또는 장애, 예를 들면, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 권투 선수 치매, 다운증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병, 봉입체 근염, 그리고 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 타우와 아밀로이드 병리 둘 모두의 존재를 보이는 질환 또는 장애, 외상성 뇌 손상, 그리고 근위축성 측삭 경화증/괌의 파킨슨병 치매 복합증, 신경섬유매듭을 동반하는 비-괌 운동 뉴런 질환, 은친화성 그레인 치매, 피질기저 퇴행, 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유매듭, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 동반하는 전측두엽 치매, 전측두엽 치매, 할러포르덴-슈파츠병, 다계통 위축증, 니만-피크병, 타입 C, 팔리도 폰토 흑질성 변성, 픽 병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 탱글 단독 치매, 뇌염후 파킨슨병, 그리고 근긴장성 이영양증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 별개의 아밀로이드 병리를 보이지 않는 추가의 질환 또는 장애를 비롯한 신경변성 질환 또는 장애의 이종성 그룹을 포함하는 타우병증을 비롯한 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상의 검출과 진단을 위한 방법과 키트를 제시한다. 이들 병리학적 이상은 타우병증에서 유력한 뇌 병리인 신경원섬유성 병소의 형성에 의해 유발되거나 또는 이와 연관될 수 있다.
게다가, 본 발명은 신경변성 질환 또는 장애, 예를 들면, 타우와 아밀로이드 병리 둘 모두의 존재를 보이는 질환 또는 장애를 비롯한 신경변성 질환 또는 장애의 이종성 그룹을 포함하는 타우병증을 비롯한 타우-단백질-연관된 질환, 장애 또는 이상에 대한 소인을 진단하거나, 또는 환자에서 최소 잔여 질환을 모니터링하거나, 또는 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드, 또는 본원에서 설명된 바와 같은 본 발명에 따른 조성물로 치료에 대한 환자의 반응성을 예측하기 위한 방법과 키트를 제시한다. 이들 방법은 생물학적 시료에서 또는 현장 상황에서 물질을 검출하거나 정량하는데 통상적으로 이용되는 공지된 면역학적 방법을 포함한다.
병든 개체, 특히 포유동물, 더욱 구체적으로 인간에서, 신경변성 질환 또는 장애, 예를 들면, 타우와 아밀로이드 병리 둘 모두의 존재를 보이는 질환 또는 장애를 비롯한 신경변성 질환 또는 장애의 이종성 그룹을 포함하는 타우병증을 비롯한 타우-단백질-연관된 질환 또는 이상, 또는 타우-단백질-연관된 질환 또는 이상에 대한 소인의 진단은 시료에서 또는 현장에서 타우 단백질의 에피토프에 본 발명의 결합 펩티드, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이들의 활성 단편의 면역특이적 결합을 검출함으로써 달성되고, 이것은 타우 단백질을 내포하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정한 신체 부분 또는 신체 구역을 타우 단백질의 에피토프에 결합하는 항체와 접촉시키고, 항체가 타우 단백질에 결합할 수 있도록 하여 면역학적 복합체를 형성하고, 면역학적 복합체의 형성을 검출하고, 그리고 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 시료 또는 특정한 신체 부분이나 구역 내에 타우 단백질의 존재 또는 부재와 상관시키는 것을 포함하고, 선택적으로 면역학적 복합체의 양을 정상적인 대조 값과 비교하는 것을 포함하고, 여기서 정상적인 대조 값과 비교하여 면역학적 복합체의 양에서 증가는 개체가 타우 단백질-연관된 질환 또는 이상을 앓고 있거나 또는 이것이 발생할 위험에 처해 있다는 것을 지시한다.
항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드, 또는 본 발명에 따른 조성물로 치료 이후에, 개체, 특히 포유동물, 더욱 구체적으로 인간에서 최소 잔여 질환의 모니터링은 시료에서 또는 현장에서 타우 단백질의 에피토프에 본 발명의 결합 펩티드, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이들의 활성 단편의 면역특이적 결합을 검출함으로써 달성되고, 이것은 타우 단백질을 내포하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정한 신체 부분 또는 신체 구역을 타우 단백질의 에피토프에 결합하는, 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드와 접촉시키고, 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드가 타우 단백질에 결합할 수 있도록 하여 면역학적 복합체를 형성하고, 면역학적 복합체의 형성을 검출하고, 그리고 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 시료 또는 특정한 신체 부분이나 구역 내에 타우 단백질의 존재 또는 부재와 상관시키는 것을 포함하고, 선택적으로 상기 면역학적 복합체의 양을 정상적인 대조 값과 비교하는 것을 포함하고, 여기서 정상적인 대조 값과 비교하여 상기 면역학적 복합체의 양에서 증가는 개체가 최소 잔여 질환을 여전히 앓고 있다는 것을 지시한다.
항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드, 또는 본 발명에 따른 조성물로 치료에 대한, 개체, 특히 포유동물, 더욱 구체적으로 인간에서 반응성 예측은 시료에서 또는 현장에서 타우 단백질의 에피토프에 본 발명의 결합 펩티드, 특히 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이들의 활성 단편의 면역특이적 결합을 검출함으로써 달성되고, 이것은 타우 단백질을 내포하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정한 신체 부분 또는 신체 구역을 타우 단백질의 에피토프에 결합하는, 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드와 접촉시키고, 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드가 타우 단백질에 결합할 수 있도록 하여 면역학적 복합체를 형성하고, 면역학적 복합체의 형성을 검출하고, 그리고 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 시료 또는 특정한 신체 부분이나 구역 내에 타우 단백질의 존재 또는 부재와 상관시키는 것을 포함하고, 선택적으로 치료의 시작 전후에 상기 면역학적 복합체의 양을 비교하고, 여기서 상기 면역학적 복합체의 양에서 감소는 상기 환자가 치료에 반응하는 높은 잠재력을 갖는다는 것을 지시한다.
타우 단백질-연관된 질환 또는 이상의 진단, 신경변성 질환 또는 장애, 예를 들면, 타우와 아밀로이드 병리 둘 모두의 존재를 보이는 질환 또는 장애를 비롯한 신경변성 질환 또는 장애의 이종성 그룹을 포함하는 타우병증을 비롯한 타우-단백질-연관된 질환 또는 이상에 대한 소인의 진단, 또는 환자에서 최소 잔여 질환 모니터링, 또는 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드, 또는 본원에서 설명된 바와 같은 본 발명에 따른 조성물로 치료에 대한 환자의 반응성 예측에서 이용될 수 있는 생물학적 시료는 예로서, 유체, 예를 들면, 혈청, 혈장, 타액, 위 분비물, 점액, 뇌척수액, 림프액 등, 또는 생물체로부터 획득된 조직 또는 세포 시료, 예를 들면, 신경, 뇌, 심장 또는 혈관 조직이다. 시료 내에 타우 단백질의 존재 또는 부재를 결정하기 위해, 당업자에게 알려진 임의의 면역검정, 예를 들면, 검출을 위해 이차 시약을 이용하는 간접 검출 방법을 활용하는 검정, ELISA, 그리고 면역침전과 유착 검정이 이용될 수 있다. 이들 검정에 관한 상세한 설명은 예로서, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612, WO96/13590 (Maertens and Stuyver), Zrein et al. (1998) 및 WO96/29605에서 제공된다.
현장 진단을 위해, 본 발명의 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편, 또는 이들의 임의의 활성 기능성 부분을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드는 본 발명에 따른 항체 및 아밀로이드 단백질 상에서 에피토프성 영역 사이에 특이적인 결합이 발생할 수 있도록, 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 정맥내, 피하, 비내, 복강내, 뇌내, 동맥내 주사에 의해 진단 생물체에 투여될 수 있다. 결합 펩티드/항원 복합체는 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이들의 기능성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드에 부착된 표지를 통해, 또는 임의의 다른 공지된 검출 방법에 의해 편의하게 검출될 수 있다.
진단 적용에서, 또는 신경변성 질환 또는 장애, 예를 들면, 타우와 아밀로이드 병리 둘 모두의 존재를 보이는 질환 또는 장애를 비롯한 신경변성 질환 또는 장애의 이종성 그룹을 포함하는 타우병증을 비롯한 타우-단백질-연관된 질환 또는 이상에 대한 소인의 진단, 또는 환자에서 최소 잔여 질환 모니터링, 또는 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드, 또는 본원에서 설명된 바와 같은 본 발명에 따른 조성물로 치료에 대한 환자의 반응성 예측에 대한 적용에서 이용된 면역검정은 전형적으로, 검출을 위해 표지된 항원, 결합 펩티드, 또는 이차 시약에 의존한다. 이들 단백질 또는 시약은 효소, 방사성동위원소, 그리고 유색 입자, 예를 들면, 콜로이드성 금과 라텍스 비드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 형광, 발광과 발색 물질을 비롯한 당업자에게 널리 알려진 화합물로 표지화될 수 있다. 이들 중에서, 방사성 표지화는 거의 모든 유형의 검정을 위해, 그리고 가장 다양하게 이용될 수 있다. 효소-접합된 표지는 방사성이 회피되어야 할 때 또는 신속한 결과가 필요할 때 특히 유용하다. 형광색소는 비록 그들의 이용을 위해 값비싼 장치를 필요로 하지만, 매우 민감한 검출 방법을 제공한다. 이들 검정에서 유용한 결합 펩티드는 항체, 특히 단일클론 항체, 다중클론 항체, 그리고 친화성 정제된 다중클론 항체를 비롯한 본원에서 개시되고 청구된 것들이다.
대안으로, 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드는 면역글로불린에 대한 친화성을 갖는 표지화된 물질, 예를 들면, 단백질 A 또는 G 또는 이차 항체와의 반응에 의해 간접적으로 표지화될 수 있다. 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드는 두 번째 물질과 접합되고, 그리고 항체에 접합된 두 번째 물질에 대한 친화성을 갖는 표지화된 세 번째 물질로 검출될 수 있다. 가령, 항체, 특히 단일클론 항체 및 이들의 활성 단편을 비롯한 본 발명에 따른 결합 펩티드는 비오틴에 접합되고, 그리고 결합 펩티드/비오틴 접합체는 표지화된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 이용하여 검출될 수 있다. 유사하게, 결합 펩티드는 합텐에 접합되고, 그리고 결합 펩티드/합텐 접합체는 표지화된 항-합텐 결합 펩티드를 이용하여 검출될 수 있다.
당업자는 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 이런 저런 적절한 표지를 알고 있을 것이다. 결합 펩티드 또는 이들의 단편에 이들 표지의 결합은 당업자에게 널리 알려진 표준 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 전형적인 기술은 Kennedy, J. H., et al., 1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31), 그리고 Schurs, A. H. W. M., et al. 1977 (Clin. Chim Acta 57:1-40)에 의해 설명된다. 후자에서 언급된 커플링 기술은 글루타르알데히드 방법, 과옥소산염 방법, 디말레이미드 방법 등인데, 이들 모두 본원에서 참조로서 편입된다.
현재의 면역검정은 분석물의 존재를 검출하기 위해 이중 항체 방법을 활용하고, 여기서 상기 항체는 검출가능 표지로 표지화된 두 번째 항체와의 반응성에 의해 간접적으로 표지화된다. 두 번째 항체는 바람직하게는, 단일클론 항체가 유래되는 동물의 항체에 결합하는 것이다. 다시 말하면, 단일클론 항체가 생쥐 항체이면, 표지화된 두 번째 항체는 항-생쥐 항체이다. 본원에서 설명된 검정에서 이용되는 항체의 경우에, 이러한 표지는 바람직하게는, 항체-코팅된 비드, 특히 자성 비드이다. 본원에서 설명된 면역검정에 이용되는 항체의 경우에, 표지는 바람직하게는, 검출가능 분자, 예를 들면, 방사성, 형광 또는 전기화학발광 물질이다.
분석물의 존재의 신속 결정에 적합되기 때문에 신속 형식 시스템 (fast format system)으로서 종종 지칭되는 대안적인 이중 항체 시스템 역시 본 발명의 범위 내에서 이용될 수 있다. 상기 시스템은 항체와 분석물 사이에 높은 친화성을 필요로 한다. 본 발명의 한 구체예에 따라, 아밀로이드 단백질의 존재는 아밀로이드 단백질에 각각 특이적인 한 쌍의 항체를 이용하여 결정된다. 상기 쌍의 항체 중에서 하나는 본원에서 "검지 항체 (detector antibody)"로서 지칭되고, 그리고 상기 쌍의 항체 중에서 다른 하나는 본원에서 "포획 항체 (capture antibody)"로서 지칭된다. 본 발명의 단일클론 항체는 포획 항체 또는 검지 항체로서 이용될 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체는 또한, 단일 검정에서 함께, 포획 항체와 검지 항체 둘 모두로서 이용될 수도 있다. 따라서 본 발명의 한 구체예는 생물학적 유체의 시료에서 아밀로이드 단백질을 검출하기 위해, 이중 항체 샌드위치 방법을 이용한다. 이러한 방법에서, 분석물 (아밀로이드 단백질)은 검지 항체와 포획 항체 사이에 샌드위치 모양으로 끼워지고, 포획 항체는 고형 서포트 위에 비가역적으로 고정된다. 검지 항체는 항체-분석물 샌드위치의 존재 및 따라서, 분석물의 존재를 확인하기 위해, 검출가능 표지를 내포할 것이다.
예시적인 고형 상 물질에는 방사성면역검정 및 효소 면역검정의 분야에서 널리 공지된 마이크로역가 평판, 폴리스티렌의 검사 튜브, 자성, 플라스틱 또는 유리 비드와 슬라이드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 항체를 고형 상에 커플링하기 위한 방법 역시 당업자에게 널리 알려져 있다. 더욱 최근에, 다수의 다공성 물질, 예를 들면, 나일론, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 유리 섬유 및 기타 다공성 중합체가 고형 서포트로서 이용되고 있다.
본 발명은 또한, 앞서 정의된 바와 같은 조성물을 포함하는, 생물학적 시료에서 타우 단백질을 검출하기 위한 진단 키트에 관계한다. 게다가, 본 발명은 앞서 정의된 바와 같은 조성물 이외에, 앞서 정의된 바와 같은 검출 시약을 또한 포함하는 후자 진단 키트에 관계한다. 용어 "진단 키트"는 일반적으로, 당분야에 공지된 임의의 진단 키트를 지칭한다. 더욱 구체적으로, 후자 용어는 Zrein et al. (1998)에서 설명된 진단 키트를 지칭한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 결합 펩티드를 포함하는, 타우 단백질-연관된 질환과 장애의 검출과 진단을 위한 신규한 면역프로브와 검사 키트를 제공하는 것이다. 면역프로브의 경우에, 결합 펩티드는 적절한 리포터 분자, 예를 들면, 효소 또는 방사성핵종에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 검사 키트는 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 결합 펩티드를 수용하는 용기, 그리고 면역학적 복합체의 존재 또는 부재가 타우 단백질의 존재 또는 부재와 상관하도록 타우 항원에 결합하여 면역학적 복합체를 형성하고 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 목적으로 결합 펩티드를 이용하기 위한 사용설명서를 포함한다.
실시예
실시예 1: 하이브리도마와 항체의 산출과 스크리닝
본 연구의 목적은 항-타우 mAb (단일클론 항체)를 산출하고 스크리닝하는 것이었다. 하이브리도마는 타우 백신 면역화된 생쥐 비장 세포와 골수종 세포주의 융합에 의해 산출되었다. 이들 하이브리도마는 인산화된 및 비-인산화된 전장 타우 단백질 둘 모두뿐만 아니라 백신 제조에서 이용된 인산화된 및 비-인산화된 타우 항원성 펩티드에 대한 반응성에 대해 산정되었다. 하이브리도마 스크리닝은 또한, 타우 유전자도입 생쥐 뇌 조각에서 면역화학을 이용하여 타우 탱글에 대한 하이브리도마 상층액의 반응성에 대해 수행되었다.
1.1 방법
1.1.1 융합
ACI-35 (Tau393-408 [pS396, pS404])로 예방접종된 야생형 C57BL/6 생쥐가 하이브리도마 생산에 이용되었다. 생쥐는 0일자, 이후 4일자에 다시 한 번 ACI-35 백신으로 추가 접종되고, 그리고 7일자에 융합이 수행되었다.
면역화된 생쥐로부터 6 x107 (ACI-35) 비장세포는 3 비장세포 / 1 골수종 세포의 비율에서 2 x 107 SP2-O-Ag14 골수종 세포와 융합되었다.
이들 융합은 8x96 웰 평판을 유발하고, 그리고 클론은 평판 (1-8), 이후 행 (A-G) 및 최종적으로, 열 (1-12)에 따라 명명되었다.
1.1.2 클론을 선별하기 위한 스크리닝 방법
8x96 웰 평판은 먼저, IgG 발현에 대해 2회 스크리닝되었다. 양성 발현 클론은 이후, 24 웰 평판에서 이전되고, 그리고 성장 세포의 세포 상층액 (=클론)은 타우 ELISA 스크린 및 면역조직화학 TAUPIR 스크린에서 조사되었다. ELISA 및/또는 TAUPIR에서 양성 상층액은 T25 플라스크로 이전되고, 그리고 클론은 타우 ELISA 스크린 및 TAUPIR 스크린에서 IgG 발현에 대해 다시 한 번 스크리닝되었다.
1.1.3 IgG 스크린
ELISA 평판 (Costar; Sigma)은 코팅 완충액에서 4℃에서 16시간 동안, 50 μl/웰의 항-생쥐 IgG 항체 (AbD Serotec, D
Figure 112014042234116-pct00001
sseldorf, Germany)로 코팅되었다. PBS/Tween으로 평판을 세척한 후, 웰은 실온에서 1시간 동안 100 μl/웰의 차단 용액으로 차단되었다. 희석되지 않은 하이브리도마 상층액 (웰당 50 μl)은 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 세척 후, 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-접합된 항-생쥐 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgM (AbD Serotec)의 혼합물은 실온에서 1시간 동안 적용되었다. 최종 세척 후, 검출은 HRP 기질 (TMB; 3-3',5,5'-테트라메틸벤지딘)로 수행되고, 그리고 평판은 마이크로평판 판독기를 이용하여 405 nm에서 판독되었다. 결과는 흡광도 (O.D.)로서 표시된다.
1.1.4 하이브리도마 타우 ELISA 스크린
하이브리도마 ELISA 스크린은 p타우 펩티드 (ACI-35, T3.5: 타우393-408[pS396/pS404; PolyPeptide Laboratories, Hillerød, Denmark), 상응하는 비-인산화된 타우 펩티드 (T3.6: 타우393-408, PolyPeptide Laboratories), 인산화된 전장 (441aa) 타우 단백질 (p타우 단백질, Vandebroek et al., 2005) 및 전장 (441aa) 타우 단백질 (타우 단백질, SignalChem, Richmond, Canada)에서 수행되었다. 최종적으로, 소 혈청 알부민 (BSA)이 음성 대조로서 이용되었다.
평판은 4℃에서 하룻밤동안, 10 μg/ml의 상응하는 타우 펩티드 및 1 μg/ml의 상응하는 타우 단백질로 코팅되었다. PBS-0.05% Tween 20으로 각 웰을 세척하고 PBS-0.05% Tween 20에서 1% BSA로 차단한 후, 희석되지 않은 하이브리도마 상층액 또는 배지 음성 대조가 평판에 첨가되고 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 세척 후, 평판은 37℃에서 2시간 동안 알칼리 포스파타아제 (AP)-접합된 항-생쥐 IgG 전체 항체 (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA)와 함께 배양되었다. 세척 후, 평판은 AP에 대한 포스파타아제 기질인 pNPP (파라-니트로-페닐-인산염)과 함께 배양되고, 그리고 ELISA 평판 판독기를 이용하여 405 nm에서 판독되었다. 결과는 O.D. (흡광도)로서 표시된다.
1.1.5 하이브리도마 IHC 스크린: 유전자도입 생쥐로부터 뇌 조각에서 탱글에 항-타우 항체의 결합 (TAUPIR)
TAUPIR 실험은 실시예 3.1.2로부터 프로토콜에 따라 수행되었다.
1.1.6 T25 플라스크 IgG 스크린
ELISA 평판은 탄산염-중탄산염 코팅 완충액 pH 9.6 (Sigma, Buchs, Switzerland)에서 4℃에서 하룻밤동안 5ug/ml의 항-생쥐 IgG F(ab')2 단편 특이적 항체 (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA)로 코팅되었다. 평판을 세척한 후, 희석되지 않은 하이브리도마 상층액, 양성 대조 IgG1 항체 (1ug/ml에서 6E10: Covance, Emeryville, CA, USA) 또는 음성 대조 (배양 배지 단독)는 RT에서 1시간 동안 배양되었다. 세척 단계 후, 이차 AP-접합된 염소 항-생쥐 IgG (하위부류 1+2a+2b+3) Fcγ 단편 특이적 항체 (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA)가 37℃에서 2시간 동안 평판에서 배양되었다. 최종 세척 후, 검출은 AP에 대한 포스파타아제 기질인 pNPP (파라-니트로-페닐-인산염)로 수행되고, 그리고 평판은 ELISA 평판 판독기를 이용하여 405 nm에서 판독되었다. 결과는 O.D. (흡광도)로서 표시된다.
1.2 결과
융합으로부터 발생하는 8x96 웰 평판으로부터 세포 상층액은 IgG의 생산에 대해 스크리닝되었다. 조사된 768 웰 (8x96 웰) 중에서, IgG 생산에 대해 양성인 48 웰이 백신 포스포-펩티드, 그리고 전장 포스포-타우에 대한 최대 결합에 기초하여 선별되었다. 선별은 ELISA에 의해 펩티드와 전장 포스포-타우 단백질에 대한 결합, 그리고 또한, 비-포스포-펩티드 및 비-포스포 전장 타우 단백질과 비교할 때 선별성에 기초하였다. 24개의 선별된 하이브리도마는 2개 평판을 하이브리도마마다 1 세포/웰에서, 그리고 1개 평판을 0.5 세포/웰에서 파종함으로써 서브클로닝되었다. 상층액은 결합 프로필을 확인하기 위해 포스포-펩티드 및 포스포-단백질에 결합에 대해 다시 한 번 조사되고, 그 후 안정성이 6-주 배양 동안 평가되었다. 이후, 8개의 안정한 클론이 선별되고 아이소타이핑, 그리고 방법에서 설명된 바와 같은 ELISA와 TAUPIR을 이용한 결합에 대해 조사되었다.
1.3. 결론
산출된 항체는 비-인산화된 펩티드에 단지 최저의 결합으로, p타우 펩티드에 대한 높은 특이성을 보인다.
총 8개의 클론이 추가 서브클로닝을 위해 선별되고 서열화되고 (표 6과 표 7 참조), 그리고 6개의 클론이 DSMZ에 기탁되었다 (표 10 참조).
전술한 이들 양성 모체 클론은 96 웰 평판, 이후 24 웰 평판, 최종적으로 T25 플라스크에서 더욱 배양되었다. 각 단계에서, 이들 하이브리도마 클론의 상층액은 ELISA, TAUPIR 및 웨스턴 블롯에 의해 스크리닝되었다.
실시예 2: 항체 경쇄와 중쇄 가변 영역의 클로닝
하이브리도마 세포로부터 항체 중쇄와 경쇄 가변 영역 유전자는 클로닝되고, 그리고 상보성 결정 영역 (CDRs)의 DNA 서열과 위치뿐만 아니라 항체 결합 특질이 결정되었다.
전체 RNA는 Qiagen RNeasy 미니 키트 (Cat No: 74104)를 이용하여 3 x 106 하이브리도마 세포 (1 바이알)로부터 준비되었다. RNA는 50uL 물에서 용리되고 1.2% 아가로오스 겔에서 검사되었다.
VH와 VK cDNA는 IgG와 카파 불변 영역 프라이머를 이용한 역전사효소에 의해 제조되었다. 첫 번째 가닥 cDNA는 많은 세트의 신호 서열 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. 증폭된 DNA는 겔-정제되고 벡터 pGem® T Easy (Promega) 내로 클로닝되었다. 획득된 VH와 VK 클론은 예측된 크기의 삽입물에 대해 스크리닝되었다. 선별된 클론의 DNA 서열은 자동화 DNA 서열화에 의해 양 방향에서 결정되었다. 서열 내에서 상보성 결정 영역 (CDRs)의 위치는 다른 항체 서열 (Kabat EA et al., 1991)을 참고하여 결정되었다.
실시예 3: 결합 연구 I
목적은 타우 리포좀 백신으로 면역화된 생쥐로부터 유래된 서브클로닝된 하이브리도마로부터 산출된 항체의 포스포-타우 (p타우) 결합을 측정하는 것이었다. 이를 조사하기 위해, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)이 인산화된 및 비-인산화된 전장 타우 단백질 둘 모두뿐만 아니라 리포좀 백신 제조에 이용된 인산화된 및 비-인산화된 타우 항원성 펩티드에 대한 정제된 항체의 결합을 측정하는데 이용되었다.
스크리닝은 2가지 다른 방법에 의해 완결되었다. 항-타우 항체를 일차 항체로서 이용한, 타우 유전자도입 동물로부터 뇌 조각에서 면역조직화학 (IHC) (TAUPIR)이 수행되었다. 부가적으로, 타우 유전자도입 생쥐로부터 뇌 단백질 균질액에서 웨스턴 블롯 (WB)이 항-타우 항체를 블롯팅 항체로서 이용하여 수행되었다.
3.1 방법
3.1.1. ELISA: 포스포-타우 결합 검정
타우와 p타우에 대한 정제된 항체의 결합을 조사하기 위해, ELISA 검정이 이용되었다. 간단히 말하면, Nunc MaxiSorp 96-웰 평판 (Nunc, Roskilde, Denmark)은 1 μg/mL의 전장 (441 aa) 타우 단백질 (SignalChem, Richmond, Canada) 또는 인산화된 전장 (441 aa) 타우 단백질 (Vandebroek et al., 2005)로 코팅되었다. 부가적으로, 평판은 10 μg/mL의 타우-유래된 백신 펩티드, 타우393-408 (S396과 S404에서 인산화되거나 또는 인산화되지 않음)로 코팅되었다. 백신 제조에 이용되지 않은 상이한 p타우 에피토프의 타우와 p타우 서열에 대한 교차-반응성을 조사하기 위해, 평판은 10 μg/mL의 하기 펩티드: 타우393-408 (S396과 S404에서 인산화되거나 또는 인산화되지 않음)로 코팅되고, 코팅은 인산염-완충된 식염수 (PBS)에서 4℃에서 하룻밤동안 수행되었다. 평판은 0.05% Tween20/PBS로 충분히 세척되고, 이후 37℃에서 1시간 동안 0.05% Tween20/PBS에서 1% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단되었다. 이후, 조사되는 항체가 20과 0 μg/mL 사이에 8 또는 16회 2-배 연속 희석에서 첨가되고, 그리고 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 평판은 이후, 전술한 바와 같이 세척되고, 그리고 AP-접합된 항-생쥐 IgG 이차 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, England)가 0.05% Tween20/PBS에서 1/6000 희석에서 37℃에서 2시간 동안 첨가되었다. 세척 후, 평판은 p-니트로페닐 인산염 이나트륨 6수화물 (pNPP; Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) 포스파타아제 기질 용액과 함께 배양되고, 그리고 30분, 1, 2 또는 16시간 배양 시간 이후에, ELISA 평판 판독기를 이용하여 405 nm에서 판독되었다.
3.1.2. TAUPIR과 웨스턴 블롯: 타우 유전자도입 동물로부터 뇌 조각에서 타우 탱글에 대한 항-타우 항체의 결합 (TAUPIR)
TAUPIR 염색을 위해, 뇌 조각이 TPLH 생쥐 (hTauP301L의 가장 긴 동종형 (441aa)을 발현하는 유전자도입 생쥐), 늙은 (>18월령) 이중 유전자도입 biGT 생쥐 (TPLH와 교미된 GSK-3β 유전자도입 생쥐), 그리고 이중 유전자도입 biAT 생쥐 (TPLH와 교미된 hAPPV717I 유전자도입 생쥐)로부터 획득되었다. 음성 대조로서, 타우 적중 생쥐 (TKO; 6월령)로부터 조각이 이용되었다. 뇌 조각은 PBS에서 5분 동안 세척되고, 이후 내인성 페록시다아제 활성을 차단하기 위해 PBS:MeOH (1:1)에서 1.5% H2O2에서 RT에서 15분 동안 배양되었다. PBST (PBS/0.1% TritonX100)에서 3회 세척한 후, 이들 조각은 PBST+10% FCS (우태아혈청) 차단 용액에서 RT에서 30분 동안 배양되었다. 조사되는 항-타우 항체와 함께 배양은 PBST/10% FCS에서 하기 항체 농도를 이용하여 4℃에서 하룻밤동안 수행되었다: 0.0053 μg/mL에서 ACI-35-2A1-Ab1, 0.0048 μg/mL에서 ACI-35-2A1-Ab2, 0.015 μg/mL에서 ACI-35-4A6-Ab1, 0.0047 μg/mL에서 ACI-35-1D2-Ab1, 0.0055 μg/mL에서 ACI-35-2G5-Ab1, 그리고 0.01 μg/mL에서 ACI-35-2G5-Ab2와 ACI-35-2G5-Ab3. 조각은 그 다음, PBST/10% FCS에서 RT에서 1시간 동안 HRP-접합된 염소 항-생쥐 (Dako, Glostrup, Denmark로부터 구입됨) 이차 항체와 함께 배양하기에 앞서, PBST에서 3회 세척되었다. 검출에 앞서, 조각은 PBST로 3회 세척되고 50 mM Tris/HCl pH7.6에서 5분 동안 배양되었다. 검출은 디아미노벤지딘 (DAB: 10 ml의 50 mM Tris.HCl + 3 μl H2O2 30%에서 1개 정제; MP Biomedicals, Solon, OH, USA)에서 3분 동안 이들 조각을 배양함으로써 수행되었다. 반응은 이들 조각을 PBST에서 3회 세척함으로써 중단되었다. 조각은 이후, 실란화 유리-평판 위에 이전되고 가온-평판 위에서 50℃에서 2시간 동안 자연-건조되었다. 대조염색은 Mayers 헤마톡실린 (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland)과 함께 1분 동안 배양, 그 이후에 흐르는 수돗물에서 4분 동안 세척 단계를 이용하여 수행되었다. 조각은 50%, 70%, 90%, 그리고 100% 에탄올조에서 2회, 이후 크실롤에서 2회 1분 동안 통과시킴으로써 탈수되었다. 최종적으로, 조각은 이미지화를 위해 DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, England)에서 유리 커버-슬립 아래에 적재되었다.
추가의 염색 (웨스턴-블롯팅)은 야생형 생쥐 (FVB) 타우 유전자도입 생쥐 (TPLH와 biGT), 또는 타우 적중 생쥐 (TKO)로부터 SDS-PAGE (10%) 분리된 뇌 균질액 단백질에서 수행되었다. 웨스턴-블롯팅을 위해, 항체가 다음 농도에서 이용되었다: 0.53 μg/mL에서 ACI-35-2A1-Ab1, 0.48 μg/mL에서 ACI-35-2A1-Ab2, 0.5 μg/mL에서 ACI-35-4A6-Ab1, 0.47 μg/mL에서 ACI-35-1D2-Ab1, 0.55 μg/mL에서 ACI-35-2G5-Ab1, 0.33 μg/mL에서 ACI-35-2G5-Ab2, 그리고 0.5 μg/mL에서 ACI-35-2G5-Ab3.
3.2 결과
항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-1D2-Ab1, ACI-35-2G5-Ab2와 ACI-35-2G5-Ab3는 인산화된 인간 타우 단백질 (표 2), 더욱 구체적으로 상응하는 백신에서 이용된 항원성 포스포-타우 펩티드에 높은 결합 활성과 특이성을 보였다. 비-인산화된 타우, 또는 조사된 다른 인산화된 및 비-인산화된 타우-유래된 펩티드에 대한 교차-반응성은 관찰되지 않았다. 항체 ACI-35-4A6-Ab1은 선별 때마다, 백신 제조에서 이용된 항원성 포스포-타우 펩티드에만 높은 결합 활성을 보였다. 낮은 교차-반응성은 클론 선별에 기초하여 예측된 백신 제조에서 이용된 항원성 펩티드의 비-포스포 대응물에 대해 발견되었다. 항체 ACI-35-2G5-Ab1은 백신 제조에서 이용된 항원성 포스포-타우 펩티드에만 높은 결합 활성을 보였다. 작은 교차-반응성은 백신에서 이용된 항원성 펩티드 서열의 일부를 포함하는 T4.5 포스포-펩티드에 대해 관찰되었다.
TAUPIR과 WB가 진전된 타우병증을 앓는 생쥐 (biGT > 18월)의 뇌에서 타우 탱글, 그리고 이들 생쥐로부터 유래된 변성된 균질액에서 전장 타우에 대한 결합을 조사하는데 이용되었다. 상이한 뇌 영역이 분석되었다: 피질 및 해마의 CA1, CA3과 치상회 (DG) 부분. 항체 ACI-35-2A1-Ab1과 ACI-35-2A1-Ab2는 특히, 해마의 CA1과 CA3 영역에서 밀집한 세포질 염색 및 투명한 신경망실로, 최고 TAUPIR 결과를 보였다. 항체 ACI-35-4A6-Ab1은 약하게 염색된 단지 희미한 산발적 탱글 유사 구조로 TAUPIR에서 음성이었다. 항체 ACI-35-1D2-Ab1은 CA1 영역에서 신경망실로 우수한 세포질 TAUPIR 염색을 보였다. 항체 ACI-35-2G5-Ab1은 핵 염색 및 단지 일부 탱글 염색으로 TAUPIR에서 음성이었다. 최종적으로, ACI-35-2G5-Ab2와 ACI-35-2G5-Ab3 항체는 해마의 CA1과 CA3에서 관찰된 신경망실로 유사한 우수한 세포질 TAUPIR 염색을 보였다. + 또는 - 기호를 이용한 염색 품질의 등급은 표 2에 제시된다. 타우 유전자도입 생쥐로부터 뇌 균질액은 블롯팅되고, 모든 항체가 예측된 타우 밴드에 잘 결합한다는 것을 보였고 (표 2, + 등급), ACI-35-1D2-Ab1과 ACI-35-2G5-Ab1은 또한, 추가적인 비-특이적 결합 (-/+)을 보였다.
실시예 4: 결합 연구 II
4.1 방법
4.1.1 SPR 결합 검정
모든 SPR 실험은 Biacore X 기구 (GE Healthcare)에서 수행되었다. 센서 칩 SA (스트렙타비딘 유도체화된 카르복시메틸 덱스트란)는 GE Healthcare로부터 구입되었다. 작동 완충액은 PBS (Dulbecco's PBS, Sigma D8537)이었다. 비-공유 결합된 스트렙타비딘은 먼저, 8 펄스 (각 ~1 μL)의 16 mM NaOH (aq)를 주입함으로써 센서 표면으로부터 제거되었다. 포스포-타우 펩티드는 이후, PBS에서 용해되어 1 μM의 최종 펩티드 농도가 제공되고, 이후 5 μl/분에서 센서 칩의 유식 세포 (fc) 2 위에 주입되었다 (35 μL). 커플링 후, 130 RU의 최종 고정화 수준이 획득되었다. 칩 표면에 항체의 결합을 조사하기 위해, 여러 농도의 항체가 작동 완충액으로 연속 2-배 희석에 의해 제조되었다. 주입은 50 μL/분의 유속에서 120초 동안 fc 1과 2 둘 모두에서 수행되었다. 유식 세포 1은 유도체화되지 않고, 그리고 fc 1의 반응은 기구 잡음 및 벌크 굴절 변화 (bulk refractive change)를 보정하기 위해 fc 2로부터 감산되었다. 각 주입 후, 표면은 100초 동안 작동 완충액으로 즉시 세척되었다. 임의의 남아있는 결합된 항체를 칩으로부터 제거하기 위해, 표면 재생이 1 μL의 10 mM 글리신-HCl pH 1.7을 주입함으로써 수행되었다. 동역학 분석은 BIAevaluation 3.0을 이용하여 수치 적분 및 전체적인 분석을 위한 알고리즘에 의해 수행되었다. 상이한 농도에서 항체의 주입에 대해 획득된 센서그램은 겹쳐지고, 그리고 기준선은 0으로 조정되었다. 곡선 맞춤 (curve fitting)을 위해, 모든 데이터는 1:1 동차 (Langmuir) 모델에 동시에 맞춤되었다.
이용된 펩티드
Figure 112014042234116-pct00002
4.2 결과
인산화된 타우 펩티드에 항-타우 항체의 결합은 SPR을 이용하여 실시간 모니터링되었다. 항체 결합의 결합과 해리 단계의 분석은 결합 속도 상수 (k a), 해리 속도 상수 (k d), 그리고 해리 상수 KD를 결정하는데 이용될 수 있었다.
모든 항체는 분석된 항체의 46 → 734 nM (또는 ACI-35-4A6-Ab1의 경우에 11.5 → 184 nM) 범위에서 비-유도체화된 카르복시메틸 덱스트란 표면 위에서 펩티드 T3.30에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이들 센서그램의 동역학 분석은 상이한 항체와 T3.30 사이에 결합 상호작용에 대한 해리 상수 KD가 2와 82 nM 사이에 있다는 것을 드러냈다. 이것은 이런 이유로, 이들 항체가 매우 높은 친화성으로 포스포펩티드 T3.30을 인식한다는 것을 증명한다 (표 3).
실시예 5: 인간 뇌 시료에서 결합 연구 III ELISA (인산화된 타우의 다합체의 검출을 위한 ELISA)
5.1 방법
5.1.1. 인간 시료: 여기에서 설명된 검정에 이용된 인간 뇌 시료의 제조
10명의 알츠하이머병 (AD) 환자 및 10명의 연령-정합된 대조에 대한 측두부 사후 피질은 Brain Endowment Bank of the University of Miami로부터 획득되었다. 평균 연령은 AD 개체 (7명의 여성, 3명의 남성)의 경우에 사망 시점에서 81.1 ± 7.3세이고, 대조 (신경학적 증상 없음; 9명의 여성, 1명의 남성)의 경우에 87.0 ± 5.8이었다 (스튜던트 t-검증에 의해 AD 개체로부터 유의미하게 상이하지 않음). 모든 시료는 백인 기원이었다. 이들 AD 시료는 표 4에서 제시된 바와 같이, 브라크 질환 단계에 대해 특징화되었다 (Braak and Braak (1991) Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82:239-259).
10명의 AD 개체 및 10명의 연령-정합된 대조에 대한 측두부 사후 피질은 하기 프로토콜에 따라 균질화되었다. 뇌 단편은 칭량되고, 그리고 포스파타아제 저해제 (30 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 1 nM 오카다산, 1 mM PMSF, 5 mM Na4P2O7) 및 프로테아제 저해제 (Complete Mini; Roche, Switzerland)를 내포하는 9 볼륨의 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1 mM EGTA에서 균질화되었다. 균질화는 유리 포터를 이용하여 얼음 위에서 수행되었다. 이것은 전체 균질액 분획물 (TH)을 구성한다. 단백질 농도는 Bradford 시약 (Sigma)을 이용하여 측정되었다.
5.1.2. 셋업 1 ELISA: AD-병든 개체와 연령-정합된 대조로부터 인간 사후 외피 뇌 균질액에서 인산화된 타우의 다합체의 존재를 검출하기 위한 셋업 1 ELISA 검정
다중역가 96-웰 평판은 4℃에서 하룻밤동안, 탄산염/중탄산염 완충액에서 5 μg/ml에서 항체로 코팅되었다. PBS-Tween에서 4회 세척 후, 평판은 37℃에서 1시간 동안 PBS-Tween 10% BSA로 포화되었다. 이후, 뇌 균질액이 50 μL PBS에서 100 ng/μL의 농도에서 웰에 첨가되고, 그리고 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 평판을 세척한 후, 비오틴화를 제외하고 동일한 항체가 코팅에 이용되고, 37℃에서 1시간 동안 5 μg/mL의 최종 농도에서 배양되었다. 평판은 세척되고, 그리고 아비딘-페록시다아제 (Vectastain ABC 키트, Vector Laboratories) 및 이의 기질 (ABTS, Roche 10881420)의 첨가 후, 이들 평판은 상이한 시점에서 판독되었다. 값은 10명의 AD 개체와 10명의 대조 개체에 대한 평균 OD±SD로서 표시된다.
5.2 결과
항체 ACI-35-2A1-Ab1과 ACI-35-2G5-Ab3은 포스포-와 다합체-특이적 셋업 1 ELISA를 이용하여, AD 개체와 대조 개체로부터 뇌 균질액에서 포스포타우 (p타우) 다합체를 검출하는 능력에 대해 조사되었다. 양쪽 항체에 대한 이러한 검정에서 AD 개체와 연령-정합된 대조 (n=10) 사이에 매우 유의한 (p<0.001) 차이가 관찰되었다 (도 1). AD와 연령-정합된 대조 뇌로부터 인간 사후 외피 균질액을 이용하여, 사후 인간 뇌 시료에서 타우-pS396의 다합체를 검출하는 ACI-35-2A1-Ab1과 ACI-35-2G5-Ab3 항-p타우 항체의 능력이 증명되었다.
실시예 6: 결합 연구 IV - 인간 뇌 시료에서 웨스턴 블롯.
6.1 방법
6.1.1. 인간 시료: 5.1.1에서 설명된 바와 동일한, 인간 시료의 제조를 위한 방법.
6.1.2. 웨스턴 블롯: AD-병든 개체와 연령-정합된 대조로부터 인간 사후 외피 뇌 균질액에서 인산화된 타우의 존재를 검출하기 위한 웨스턴 블롯 검정
본 연구에서 이용된 항-인간 타우 항체는 타우-pS396에 대해 모두 지향되는 생쥐 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, 그리고 ACI-35-2G5-Ab3이었다. 전체 인간 타우에 대해 지향된 생쥐 단일클론 타우-13 항체 (Abcam ab24636), 그리고 타우-pS396 (Abcam ab32057)에 대해 지향된 토끼 단일클론 항체 E178이 대조로서 이용되었다. 20 μg의 각 전체 균질액은 10% 폴리아크릴아미드 Bis-TRIS 미리 성형된 겔 (Nupage Novex 10% Bis-TRIS Midi Gel, Invitrogen)의 레인마다 부하되었다. 단백질은 NuPAGE MOPS SDS 작동 완충액 (Invitrogen NP0001)에서 제조업체에 의해 권장된 바와 같이 용해되었다. 단백질 블롯팅은 PVDF 막 (Immobilon-FL, Millipore IPFL00010)에서 얼음 위에서 25 mM TRIS pH 8.6, 190 mM 글리신 완충액, 20% 메탄올에서 3시간 동안 수행되었다. 막은 PBS에서 1/3 희석된 Licor 차단 완충액 (Odyssey)에서 1시간 동안 차단되었다. 막은 다음 농도에서 일차 항체와 함께 하룻밤동안 배양되었다: Licor 완충액에서 1/3 및 0.1% Tween-20을 포함하는 PBS (PBS-T)에서 2/3 희석된 0.6 μg/mL에서 타우-13, 1/5000 희석된 E178, 0.53 μg/mL에서 ACI-35-2A1-Ab1, 0.47 μg/mL에서 ACI-35-1D2-Ab1, 그리고 0.5 μg/mL에서 ACI-35-2G5-Ab3. PBS-T에서 4회 세척 후, 막은 실온에서 1시간 동안, LICOR 800 염료와 커플링된 염소 항-생쥐 항체 (염소 항-생쥐 IRDye 800 CW, Odyssay)와 함께 배양되고, PBS-T로 다시 한 번 4회 세척되고, 그리고 LICOR 시스템을 이용한 이미지 재생을 위해 스캐닝되었다.
6.2 결과
항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, 그리고 ACI-35-2G5-Ab3은 포스포-특이적 웨스턴 블롯을 이용하여, AD 개체와 대조 개체로부터 뇌 균질액에서 포스포타우 (p타우)를 검출하는 능력에 대해 조사되었다. 모든 사후 인간 피질 시료는 먼저, 인간 타우에 대한 상업적 항체: 항-전체 타우 (TAU-13) 및 항-pS396 타우 (E178) 항체를 이용하여 특징화되었다. 도 2A에서 도시된 바와 같이, 타우-13 항체를 이용하면, 모든 시료에서 50-70 kDa의 범위에서 상이한 타우 동종형에 상응하는 특징적인 타우 사다리가 검출되었다. 흥미롭게도, AD 뇌 균질액에서, AD 뇌에서 고인산화된 타우의 존재에 대해 예측된 바와 같은 타우의 이동 패턴에서 상대적인 변동 역시 관찰되었다. 이러한 가설을 뒷받침하듯, 상업적 항-pS396 타우 항체는 대조와 AD를 매우 잘 식별한다 (도 2B). 실제로, 항-pS396 타우 항체는 모든 AD 뇌 균질액에서 타우의 (고)-인산화된 동종형에 상응하는 3개의 주요 면역반응성 띠를 드러내고, 그리고 건강한 대조에서는 강도가 매우 약하거나 부재하였다. 이에 더하여, AD 시료는 아마도 응집된 타우의 존재를 반영하는 높은 분자량 타우-13 면역반응성 얼룩을 전시하였다 (도 2A).
ACI-35-2A1-Ab1로 웨스턴-블롯팅은 AD 뇌 균질액에서 포스포 타우에 대한 예상된 크기의 2개 면역반응성 단백질 띠가 존재하지만 대조에서는 그렇지 않다는 것을 드러냈다 (도 3A). ACI-35-2A1-Ab1을 이용한 웨스턴 블롯에 의한 약한 면역반응은 ~35와 ~40 kDa에서 2개의 주요 비특이적인 띠의 존재에 의해 설명될 수 있다. ACI-35-1D2-Ab1로 웨스턴-블롯팅은 AD 뇌 균질액에서 포스포 타우에 대한 예상된 크기의 2개 면역반응성 단백질 띠가 존재하지만 대조에서는 그렇지 않다는 것을 드러냈다 (도 3B). ACI-35-1D2-Ab1을 이용한 웨스턴 블롯에 의한 약한 면역반응은 ~40과 ~50 kDa에서 비특이적인 띠뿐만 아니라 80 kDa와 150 kDa 사이에 4개의 비특이적인 띠의 존재에 의해 설명될 수 있다. ACI-2G5-Ab3으로 웨스턴-블롯팅은 모든 AD 뇌 균질액에서 타우의 (고)-인산화된 동종형에 상응하는 3가지 주요 면역반응성 띠가 존재하고 AD의 가족력이 있는 1명의 대조 개체 (C22)를 제외한 건강한 대조에서 부재한다는 것을 드러냈다 (도 3C). 이러한 보고는 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, 그리고 ACI-35-2G5-Ab3이 인간 사후 피질에서 pS396 타우의 존재에 대해 AD 개체와 연령-정합된 대조를 식별할 수 있고, 그리고 따라서, 이들 단일클론 항체가 AD-연관된 병리학적 타우 동종형을 인식한다는 것을 증명하였다.
실시예 7: 결합 연구 V - 셋업 1 (인간 뇌 시료에서 ELISA)
7.1 방법
7.1.1. 인간 시료. 마지막 부분, S1 분획물 제조를 제외하고, 5.1.1에서 설명된 바와 동일한, 인간 시료의 제조를 위한 방법.
7.1.2. S1 타우 단백질 분획물: 가용성 타우와 포스포-타우 단백질을 획득하기 위한 전체 균질액 분획물의 하위분획.
AlphaLISA 검정에 이용된 가용성 타우 (S1) 분획물을 제조하기 위해, 절반 볼륨의 TH 분획물은 분액되고 -80℃에서 보관되었다. TH 분획물의 나머지는 Triton X-100을 0.4%의 최종 농도까지 첨가함으로써 더욱 처리되었다. 시료는 충분히 혼합되고, 그리고 4℃에서 5분 동안 5'000 rpm에서 원심분리에 앞서 수회 와동되었다. 상층액은 S1 분획물을 구성한다. 이들 시료는 분액되고 -80℃에서 보관되었다. 단백질 농도는 Bradford 시약을 이용하여 측정되었다.
7.1.3. AlphaLISA: AD-병든 개체와 연령-정합된 대조로부터 인간 사후 외피 뇌 균질액에서 인산화된 타우의 존재를 검출하기 위한 AlphaLISA 검정.
타우-pS396에 대해 모두 지향되는 항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, 그리고 ACI-35-2G5-Ab3은 제조업체의 사용설명서에 따라, EZ-링크 마이크로 술포-NHS-LC-비오틴화 키트 (Thermo Scientific)를 이용하여 비오틴화되었다. 항체에 비하여 25-배 몰 과잉의 비오틴이 표지화 반응에 이용되었다. 비오틴화 후, 과잉의 유리 비오틴은 Slide-A-Lyzer MINI 투석 장치, 10K MWCO (Thermo Scientific)를 이용한 PBS에 대한 투석에 의해 제거되었다. 비오틴화된 항체는 ACI-35-2A1-Ab1-BT, ACI-35-1D2-Ab1-BT, 그리고 ACI-35-2G5-Ab3-BT로서 지칭된다. 항체 타우-13은 다음 프로토콜을 이용하여, 활성화된 알파 수용자 비드 (Perkin Elmer)에 접합되었다: 0.1 mg의 타우-13 항체 용액 (단백질 A 칼럼에서 정제됨)은 1 mg의 AlphaLISA 수용자 비드 펠릿과 혼합되고 0.13 M 인산염 완충액 (pH 8.0)으로 200 μL의 최종 반응 부피까지 보충되었다. 그 다음, 1.25 μL의 10% Tween-20 및 10 μL의 NaBH3CN의 25 mg/mL 용액이 첨가되고, 그리고 튜브는 가볍게 회전 (7 rpm)하면서 37℃에서 48시간 동안 배양되었다. 접합 반응 후, 비드 상에서 활성 부위는 10 μL의 카르복시-메톡실아민 용액을 첨가함으로써 차단되고 37℃에서 1시간 동안 더욱 배양되었다. 최종적으로, 이들 비드는 200 μL의 0.1 M Tris-HCl pH 8.0으로 2회 세척되고 4℃에서 200 μL 보관 완충액 (0.05% Proclin-300을 포함하는 PBS)에서 보관되어 5 mg/ml의 최종 AlphaLISA 수용자 비드 농도가 산출되었다.
AlphaLISA는 비드 근접 화학발광에 기초된 균질성 검정이다. 알파 공여자와 수용자 비드가 가깝게 근접하면, 레이저 여기 시에, 일련의 화학 반응이 증폭된 신호를 발생시킨다. 680 nm에서 여기 시에, 공여자 비드에 내포된 광민감물질은 주변 산소를 더욱 반응성 단일항 산소 화학종으로 변화시킨다. 이들 단일항은 확산하고 (반감기의 4 μ초 이내에, 200 nm까지), 그리고 수용자 비드에서 화학발광 반응을 발생시켜 광 방사를 유발한다. 검정 세팅은 아래와 같았다:
S1 시료는 20 μg/mL 스톡 농도를 획득하기 위해 알파 검정 완충액 (PerkinElmer AL000C)에서 미리 희석되었다. 하기 시약이 50 μL의 최종 부피까지 384-웰 백색 OptiPlate (PerkinElmer)에 첨가되었다: 각각 0.2 nM, 0.5 nM, 또는 0.5 nM의 최종 항체 농도에서 S1 뇌 균질액 (5 μL), 10 μL의 ACI-35-2A1-Ab1-BT, ACI-35-1D2-Ab1-BT, 또는 ACI-35-2G5-Ab3-BT, 그리고 2.5 μg/mL의 최종 비드 농도에서 10 μL의 타우13-수용자 비드 접합체. 반응 혼합물은 실온에서 1시간 동안 배양되고, 그리고 25 μL의 스트렙타비딘 공여자 비드가 첨가되고 어둠에서 실온에서 2시간 동안 더욱 배양되었다. 판독은 EnSpire Workstation 버전 3.00을 이용한 EnSpire 알파 기구와 분석에 의해 수행되었다. 데이터의 통계학적 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 수행되었다. 결과는 알파 단위±SD로서 제공된다.
7.2 결과
AlphaLISA 검정은 사후 인간 뇌 균질액에서 타우-pS396을 검출하고, 그리고 AD 개체를 연령-정합된 대조로부터 식별하는 능력에 대해 항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, 그리고 ACI-35-2G5-Ab3을 조사하는데 이용되었다. 모든 항체는 타우-pS396을 검출하였다 (도 4A, 4B, 4C). AD 개체와 대조 (n=10) 사이에 신호 검출에서 차이 역시 모든 항체에서 매우 유의하였고, AD 개체의 뇌에서 증가된 신호를 증명하였다; ACI-35-2A1-Ab1 (p<0.0001), ACI-35-1D2-Ab1 (p<0.0001), 그리고 ACI-35-2G5-Ab3 (p=0.002). 결론적으로, AlphaLISA 기술은 AD 개체의 뇌에서 pS396-타우를 검출하고, 그리고 AD와 대조 공여자를 식별하는 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, 그리고 ACI-35-2G5-Ab3의 능력을 증명하는데 이용되었다.
실시예 8: ACI-35-2G5-Ab3 항체의 생체내 효능
8.1 방법
8.1.1. 연구 셋업: 타우 유전자도입 생쥐에서 항-p타우 항체 ACI-35-2G5-Ab3의 2회 투여의 생체내 치료 효과
C57BL/6xDBA 배경을 갖는 6-7월령의 암컷과 수컷 타우 유전자도입 생쥐 (TMHT)는 3 또는 10 mg/kg의 ACI-35-2G5-Ab3, 또는 운반체 대조 (PBS)가 i.p 주사에 의해 1주 간격에서 2회 투여되었다. 14일자에, 동물은 안락사되고, 뇌가 수확되고, 그리고 면역조직화학 (IHC)을 위해 처리되었다. 해마와 편도체에서 타우 병리의 결정을 위해, 뇌마다 5개 절편 (각 수준으로부터 1개)은 AT180 (타우-pT231의 경우)과 HT7 (전체 인간 타우의 경우) 항체를 이용하여 표지화되고, 그리고 차후에, 면역반응성 구역이 Image Pro Plus (v6.2) 소프트웨어를 이용하여 평가되었다. 면역반응성 물체는 크기 제한 (편도체에서 30 μm2, 해마에서 7 μm2)을 초과하고, 그리고 동적 강도 역치 (dynamic intensity threshold)를 초과하면 측정되었다. 물체의 전체 구역과 강도 및 개별 역치는 자동적으로 정리되었다. 이용되면, 동적 역치는 강도 구역 (AOI) 내에서 평균 강도 + AOI 내에서 픽셀 강도의 표준 편차 배수 인자로서 정의되었다. 영역 크기는 해마와 편도체의 손 경계식별 (manual delineation)에 의해 측정되었다. AT180과 HT7 IR 구역 데이터는 영역 (해마에서) 또는 AOI 크기 (편도체에서)에 정규화되었다.
8.2 결과
AT180 p타우 항체는 내인성과 인간 p타우 (Thr231과 Ser235에서 이중 인산화됨)를 검출한다. 본 연구에서 이용된 타우 유전자도입 생쥐의 경우에, AT180 조직학적 측정은 해마와 편도체 뉴런에 집중되었다. ACI-35-2G5-Ab3으로 치료된 생쥐는 편도체와 해마 둘 모두에서, 몸체 표지화의 AT180 평균과 정규화된 총합 강도에 대한 유의미한 감소를 갖고 (도 5A와 5B), 치료된 생쥐에서 전체적인 몸체 AT180-양성 p타우의 감소가 관찰되었다.
전체 인간 (유전자도입) 타우의 경우에, HT7 항체가 이용되었다. HT7은 잔기 159와 163 사이에 정상적인 인간 타우를 인식한다. 조직학적 측정은 해마와 편도체 뉴런의 면역반응성 몸체에 집중되었다. ACI-35-2G5-Ab3으로 치료된 생쥐는 HT7 면역반응성 구역뿐만 아니라 편도체 내에서 면역반응성의 총합과 평균 HT7 강도가 감소하였다 (도 6A). 해마에서, 평균 강도에 대해 동일한 것이 관찰되었다 (도 6B). 하지만, 10 mg/kg에서 치료된 생쥐에서 해마 내에 면역반응성 구역에 대한 HT7 표지화, 그리고 총합 강도에서 증가가 관찰되었다. 해마에서 관찰된 이러한 증가는 조사된 총 8마리 생쥐 중에서 3마리 생쥐에 주로 기인하였다.
ACI-35-2G5-Ab3 치료는 양쪽 조사된 영역에서, 따라서 해마와 편도체 뉴런의 몸체에서 AT180 면역반응성 p타우 수준을 유의미하게 감소시켰다. 편도체에서, 표지화의 총합 강도는 AT180 면역반응성 p타우 및 HT7 면역반응성 전체 인간 타우 둘 모두에 대해 감소하였다. 3 mg/kg의 분량으로 치료 역시 양쪽 영역에서 평균 HT7 강도를 유의미하게 감소시켰다. 하지만, 10 mg/kg에서 해마에서 평균 HT7 면역반응성 구역과 총합 강도가 대조 치료된 생쥐에 비하여 증가하였는데, 이것은 ACI-35-2G5-Ab3 치료가 병리학적 p타우로부터 변동을 유발한다는 것을 암시하였다.
실시예 9: 항 p타우 항체의 에피토프 맵핑
9.1 방법
항-포스포 타우 생쥐 단일클론 항체의 에피토프 맵핑은 상이한 포스포와 비-포스포 펩티드 라이브러리를 이용한 ELISA에 의해 수행되었다. 이용된 펩티드 라이브러리 T3의 아미노산 서열은 표 11A에 제시된다. 각 라이브러리는 펩티드 백신 내에 존재하는 포스포와 비-포스포 서열에 걸쳐 있는 짧은 비오틴화된 펩티드로 구성되었다. 부가적으로, 표 11B와 11C에서 제시된 바와 같이, 알라닌 (Ala)을 갖는 항체에 결합하는 펩티드 서열의 각 잔기를 치환하는 펩티드 라이브러리가 산출되었다. 각 라이브러리는 펩티드 백신 내에 존재하는 포스포와 비-포스포 서열에 걸쳐 있는 짧은 비오틴화된 펩티드로 구성되었다. 펩티드 라이브러리는 ANAWA Trading SA로부터 구입되었다. 펩티드 라이브러리는 ANAWA Trading SA로부터 구입되었다. 에피토프 맵핑은 제조업체 (Mimotopes)의 사용설명서에 따라 수행되었다. 간단히 말하면, 스트렙타비딘 코팅된 평판 (NUNC)은 4℃에서 하룻밤동안 인산염-완충된 식염수 (PBS)에서 0.1% BSA로 차단되었다. PBS-0.05% Tween 20으로 세척 후, 평판은 RT에서 1시간 동안 각 라이브러리로부터 상이한 펩티드로 코팅되고, 0.1% BSA, PBS에서 0.1% 아지드화나트륨에서 10 μM의 최종 농도로 희석되었다. 세척 후, 평판은 2% BSA, 그리고 PBS에서 0.1% 아지드화나트륨에서 40 ng/ml로 희석된 조사 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 배양되었다. 평판은 다시 한 번 세척되고, 그리고 1/6000 희석에서 AP-접합된 항-생쥐 IgG 이차 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, England)와 함께 RT에서 1시간 동안 배양되었다. 최종 세척 후, 평판은 p-니트로페닐 인산염 이나트륨 6수화물 (pNPP; Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) 포스파타아제 기질 용액과 함께 배양되고, 그리고 2시간 배양 이후에, ELISA 평판 판독기를 이용하여 405 nm에서 판독되었다. 결합은 흡광도 (O.D.)가 배경 O.D보다 적어도 2-배이면, 양성으로 간주되었다.
9.2 결과
에피토프 맵핑 실험의 결과로서, 본원에서 개시된 항체가 특이적으로 결합하는데 필요한 인산화된 아미노산 잔기 (표 5 참조)를 포함하는 에피토프가 확인될 수 있었다.
ㆍ 타우 aa 393-401, pS396에 대한 요구 있음 (ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2)
ㆍ 타우 aa 396-401, pS396에 대한 요구 있음 (ACI-35-4A6-Ab1)
ㆍ 타우 aa 394-400, pS396에 대한 요구 있음 (ACI-35-1D2-Ab1)
ㆍ 타우 aa 402-406, pS404에 대한 요구 있음 (ACI-35-2G5-Ab1)
ㆍ 타우 aa 393-400, p396에 대한 요구 있음 (ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3)
실시예 10: GSK3β 키나아제를 이용하여 세린 396에서 타우의 인산화 (pS396), 그리고 SDS-PAGE / 웨스턴 블롯 분석
10.1 방법
16 μM의 최종 농도 (20 μg 타우/25 μL 반응)에서 인간 전장 타우의 가장 긴 동종형 (TAU441; SignalChem)은 HEPES pH 7.64 (40 mM), EGTA (5 mM), MgCl2 (3 mM), 그리고 ATP (2 mM)를 내포하는 인산화 완충액에서 0.018 U GSK3β/pmol의 타우와 함께 4, 30, 또는 37℃에서 1, 6, 또는 20시간 동안 배양되었다. 1 단위의 GSK3β는 제조업체 (New England BioLabs)에 의해, 30℃에서 1분 동안 ATP로부터 1 pmol 인산염을 CREB 포스포펩티드 (KRREILSRRPpSYR)로 이전하는 효소의 양으로서 정의된다. GSK3β로 인산화된 타우 (p타우-GSK3β)는 키나아제 활성과 특이성 (제시되지 않음)을 최적화하고 확인하기 위해, 직접 ELISA와 웨스턴 블롯 (WBs)에서 가동된, 세린 202, 396, 404, 409, 트레오닌 181, 205, 그리고 231에서 인산화된 타우, 그리고 전체 타우에 대해 지향된 항체로 탐침되었다. 부가적으로, 블롯은 항-GSK3α/β 항체 (BioSource Invitrogen)를 이용하여 GSK3β의 존재에 대해 탐침되었다. 모든 WB의 경우에, p타우-GSK3β는 동등한 부피의 시료 완충액 A (125 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% [w/v] 나트륨 도데실 황산염 [SDS], 20% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루, 5% β-메르캅토에탄올)를 첨가함으로써 희석되고, 그리고 이들 시료는 10분 동안 95℃로 가열되었다. 30 μg의 시료가 4-12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen) 위에 부하되고 MOPS SDS 완충액 (Invitrogen)에서 작동되었다. 단백질은 이전 완충액 (25 mM Tris pH 8.6, 190 mM 글리신, 20% 메탄올)에서 0.45 μm PVDF 막으로 이전되었다. 단백질 이전을 확인하기 위해, 막은 5분 동안 폰소 S로 염색되었다. 막은 이후, 세척되고, 그 다음 차단 완충액 (TBS [50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl]에서 5% BSA)에서 1시간 동안 차단되었다. 막은 4℃에서 하룻밤동안, 차단 완충액 및 0.1% Tween에서 일차 항체로 블롯팅되었다. ACI-35-2G5-Ab3으로 블롯팅은 0.5 μg/mL 항체 희석에서 수행되었다.
10.2 결과
GSK3β로 처리된 타우는 상이한 타우 포스포-세린과 트레오닌 잔기에 특이적인 항체를 이용하여 확인될 때, 타우 세린 396에서 인산화 (타우-pS396)의 높은 존재를 유발하였다 (제시되지 않음). 도 7은 상이한 GSK3β 조건을 이용하여 산출되고, 그리고 ACI-35-2G5-Ab3 항체를 이용하여 막 블롯팅된 타우-pS396에 대한 SDS-PAGE를 도시한다. 타우-pS396에 특이적인 ACI-35-2G5-Ab3 항체는 타우-pS396에 대한 우수한 신호를 나타내고, 띠가 또한 관찰되는데, 이것은 상기 항체가 타우-pS396 이합체에 결합한다는 것을 암시한다 (도 7, 레인 11과 13). GSK3β 처리의 부재에서 어떤 띠도 관찰되지 않았다 (레인 6-8 및 14-15).
실시예 11: 인간 뇌척수액 ( CSF ) 시료에서 타우 ( pSer396 )의 인산화의 검출
11. 1. 방법
11.1.1 인간 시료 - 사후 뇌 시료
한 알츠하이머병 (AD) 공여자 AD19의 측두부 사후 피질이 Brain Endowment Bank of the University of Miami로부터 획득되었다. 본 연구를 위한 시료를 제공해준 University of Miami Brain Endowment Bank에 감사를 표한다. 공여자에 관한 인구학적 정보는 하기 표 12에 제공되는데, 여기서 브라크 질환 단계 (Braak and Braak (1991) Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82:239-259) 역시 표시된다.
본 연구에서 이용된 뇌 시료 AD19의 설명
시료 ID 성별 사망 시에
연령		 진단 시에
연령		 질환 지속
기간		 질환 상태
AD 19 여성 81 77 4 브라크 V
11.1.2. 사후 뇌로부터 균질액 분획물 S1의 제조
AD19 공여자의 측두부 사후 피질은 하기 프로토콜에 따라 균질화되었다. 뇌 단편은 칭량되고, 그리고 포스파타아제 저해제 (30 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 1 nM 오카다산, 1 mM PMSF, 5 mM Na4P2O7) 및 프로테아제 저해제 (Complete Mini, Roche 04 693 124 001)를 내포하는 9 볼륨의 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1 mM EGTA에서 균질화되었다. 균질화는 유리 포터를 이용하여 얼음 위에서 수행되었다. 이것은 전체 균질액 분획물 (TH)을 구성한다. 절반 볼륨의 TH 분획물은 분액되고 -80℃에서 보관되었다. TH 분획물의 나머지는 Triton X-100을 0.4%의 최종 농도까지 첨가함으로써 더욱 처리되었다. 시료는 충분히 혼합되고, 그리고 4℃에서 5분 동안 5'000 rpm에서 원심분리에 앞서 수회 와동되었다. 상층액은 S1 분획물을 구성한다. 이들 시료는 분액되고 -80℃에서 보관되었다. 단백질 농도는 Bradford 시약 (Sigma B6916-500)을 이용하여 측정되었다.
11.1.3. 인간 CSF 시료
임상적으로 확증된 경등도-내지-중등도 알츠하이머병 (AD) 환자 및 건강한 지원자 대조 공여자 (대조)로부터 뇌척수액 (CSF) 시료는 Charit
Figure 112014042234116-pct00003
School of Medicine Berlin에 의해 제공되었다. 본 연구를 위한 시료를 제공해준 Charit
Figure 112014042234116-pct00004
School of Medicine Berlin에 감사를 표한다. 이들 시료는 분액되고, -80℃에서 보관되고, 그리고 추가 처리 없이 이용되었다. CSF 시료 공여자에 관한 인구학적 및 임상적 정보는 하기 표 13에 제시된다.
CSF 시료 공여자에 관한 인구학적 정보와 임상적 정보
진단 n 평균 연령
(StDev)		 연령 범위 여성% MMSE 스코어
(StDev)		 MMSE 범위
AD 17 72.5(8) 57-85 35 21.2(4) 13-27
대조(Ctrl) 16 65(7) 53-77 69 29(1) 27-30
11.1.4. CSF 타우의 면역-농축
11.1.4.1 항체 커플링
CSF 타우의 면역-농축을 위해, 상업적 인간 타우 항체 (클론 HT7, Thermo Scientific MN 1000)가 이용되었다. HT7을 단백질 G Dynabeads (Life Technologies 10004D)에 커플링하기 위해, 각 시료에 대해 1.5 mg (50 μL) 단백질 G Dynabeads가 와동에 의해 재현탁되고 1.7 mL 최대 회수 튜브 (Axygen MCT-175-L-C)로 이전되었다. 이들 튜브는 비드를 튜브의 측면에 농축하고 완충액을 제거하기 위해, 자성 서포트 (DynaMag, Life Technologies 123.21D)에 배치되었다. 단백질 G Dynabeads에 대한 200 μL의 PBS에서 1 μg HT7의 결합은 10/20 rpm, 25°/10 기울기, 5°/2 진동에서 10분 동안 Hula 혼합기 (Life Technologies)를 이용하여 수행되고, 그 후 튜브가 자석 위에 배치되고, 완충액이 제거되고, 그리고 이들 튜브는 200 μL PBS/0.02% Tween 20으로 1회 및 200 μL 접합 완충액 (20 mM Na 인산염, 150 mM NaCl, 새로 제조됨)으로 2회 조심스러운 피펫팅에 의해 세척되었다. 세척 완충액은 항상, 자석을 이용하여 제거되었다. HT7을 단백질 G Dynabeads에 교차결합하기 위해, HT7-비드는 접합 완충액에서 용해된 250 μL의 5 mM BS3 용액 (Sigma-Aldrich S5799)에서 재현탁되고 실온 (RT)에서 30분 동안 회전 (상기와 동일한 설정)하면서 배양되고, 반응은 12.5 μL의 진정 완충액 (1M Tris-HCl pH 7.5)을 15분 동안 첨가하고, 그 이후에 200 μL PBS/0.02% Tween 20로 3회 세척함으로써 종결되었다.
11.1.4.2 CSF 타우 면역-농축
CSF는 희석되지 않은 상태로 이용되고, 그리고 각 공여자에 대해 1 mL의 CSF가 HT7 교차-연결된 비드를 내포하는 튜브에 이전되고 4℃에서 1시간 동안 연속 회전 (10 rpm) 하에 배양되었다. 결합되지 않은 물질을 자석에서 제거한 후, 비드는 200 μL PBS/0.02% Tween 20으로 세척되고, 그리고 타우는 70℃에서 10분 동안 PBS에서 20 μL 1% 나트륨 도데실 황산염 (SDS)에서 용리되었다. 비드의 침강을 피하기 위해, 튜브는 짤게 혼합되었다 (1분마다 5초 동안, 가열된 수평 혼합기에서 300 rpm). 이러한 배양 후, 용리된 시료는 튜브를 자석 위에 배치함으로써 수집되었다.
양성 대조로서, 타우 역시 인간 뇌 균질액으로부터 농축되었다. AD19 공여자로부터 인간 뇌 S1 분획물의 이러한 연속 희석액은 PBS (0.5 μg/mL, 0.17 μg/mL, 0.056 μg/mL, 0.019 μg/mL, 0.006 μg/mL, 0.002 μg/mL, 0.0007 μg/mL)에서 제조되었다. 각 시료 (1 mL)는 이후, 전술한 바와 같이 처리되고 25 μL 1% SDS에서 용리되었다.
11.1.5 AlphaLISA.
11.1.5.1 AlphaLISA 검정 설명
AlphaLISA는 비드-기초된 알파 기술을 이용하는 균질성 검정이다. AlphaLISA는 민감성 및 최소 숫자의 단계에 기초하여 기술 플랫폼으로서 선택되었다. 간단히 말하면, 상기 검정은 비드 근접에 기초된다. 680 nm에서 여기 시에, 공여자 비드를 내포하는 광민감물질은 주변 산소를 단일항 산소 화학종으로 변화시키고, 이들 단일항은 확산하고 (반감기의 4 μ초 이내에, 200 nm까지), 그리고 수용자 비드에서 화학발광 반응을 발생시켜 광 방사를 유발한다.
본 실험에서 이용된 검정 세팅은 하기와 같았다 (도 8 참조):
ㆍ 알파 수용자 비드에 커플링된 범-타우 항체 타우-13 (Abcam ab24636)는 시료 내에 존재하는 인간 타우에 결합하고, 그리고 "타우 단백질-타우-13 항체-수용자 비드" 복합체를 형성한다.
ㆍ 검출 항체 ACI-35-2G5-Ab3-BT는 인간 타우의 pS396에 결합하고, 그리고 상기 복합체에 스트렙타비딘-코팅된 (SAv) 알파 공여자 비드의 결합을 가능하게 한다.
모든 시약을 반응시킨 후, 화학발광 신호는 EnSpire 알파 2390 판독기를 이용하여 판독된다.
11.1.5.2 ACI-35-2G5-Ab3 항체의 비오틴화
AlphaLISA 검정에서 이용되기 위해, 항체 ACI-35-2G5-Ab3은 제조업체의 사용설명서에 따라 EZ-링크 마이크로 술포-NHS-LC-비오틴화 키트 (Thermo Scientific 21935)를 이용하여 비오틴화되었다. 항체보다 25-배 몰 과잉의 비오틴이 표지화 반응에 이용되었다. 비오틴화 후, 과잉의 유리 비오틴은 50'000 MWCO Spin-X UF 500 농축기 (Corning 431480)를 이용하여 PBS에서 항체를 4회 세척함으로써 제거되었다. 비오틴화된 ACI-35-2G5-Ab3 항체는 ACI-35-2G5-Ab3-BT로서 표시된다.
11.1.5.3 AlphaLISA 수용자 비드에 타우-13 항체의 커플링.
AlphaLISA 검정에서 이용되기 위해, 항체 타우-13은 활성화된 알파 수용자 비드 (Perkin Elmer 6772001)에 접합되었다. 하기 접합 프로토콜이 이용되었다: 0.1 mg의 타우-13 항체 용액 (단백질 A 칼럼에서 정제됨)은 1 mg의 AlphaLISA 수용자 비드 펠릿과 혼합되고 200 μL의 최종 반응 부피까지 0.13 M 인산염 완충액 (pH 8.0)으로 보충되었다. 그 다음, 1.25 μL의 10% Tween-20 및 10 μL의 NaBH3CN의 25 mg/mL 용액이 첨가되고, 그리고 튜브는 가볍게 회전 (7 rpm)하면서 37℃에서 48시간 동안 배양되었다. 접합 반응 후, 비드 상에서 활성 부위는 10 μL의 카르복시-메톡실아민 용액을 첨가함으로써 차단되고 37℃에서 1시간 동안 더욱 배양되었다. 최종적으로, 이들 비드는 200 μL의 0.1 M Tris-HCl pH 8.0으로 2회 세척되고 4℃에서 200 μL 보관 완충액 (0.05% Proclin-300을 포함하는 PBS)에서 보관되어 5 mg/ml의 최종 AlphaLISA 수용자 비드 농도가 산출되었다.
11.1.5.4 뇌 pS396-타우를 이용한 검출 결정의 한계
면역-농축된 타우 뇌 시료, S1 뇌 분획물 시료 및 완충액 블랭크가 본 실험에 이용되었다. 각 시료는 384-웰 백색 OptiPlate (PerkinElmer 6007291)를 이용하여 50 μL 최종 부피에서 분석되었다. 모든 시약의 희석은 알파 검정 완충액 (PerkinElmer AL000C)으로 수행되었다.
ㆍ 5 μL 시료 (최종 부피의 1/10, 이런 이유로 검정에서 최종 단백질 농도는 시료 농도의 1/10에 해당한다).
ㆍ S1 뇌 분획물 시료의 경우에 10 μL 0.5% SDS 또는 면역-농축된 타우 뇌 시료의 경우에 10 μL 순전한 완충액이 첨가되었다
ㆍ 타우13-수용자 비드 접합체 (최종 비드 농도: 2.5 μg/mL)와 혼합된 15 μL의 ACI-35-2G5-Ab3-BT 항체 (최종 농도: 5 nM)
ㆍ 실온에서 1시간 동안 배양
ㆍ 20 μL의 스트렙타비딘 공여자 비드 (최종 비드 농도: 25 μg/mL)
ㆍ 실온에서 30분 동안 배양 (광으로부터 보호됨)
ㆍ EnSpire Workstation 버전 3.00을 이용한 EnSpire 알파 기구와 분석에 의한 판독
11.1.5.5 CSF에서 면역-농축된 pS396-타우의 결정
각 시료는 384-웰 백색 OptiPlate (PerkinElmer 6007291)를 이용하여 50 μL 최종 부피에서 분석되었다. 모든 시약의 희석은 알파 검정 완충액 (PerkinElmer AL000C)으로 수행되었다.
ㆍ 각 공여자로부터 5 μL의 면역침전된 용출액
ㆍ 타우13-수용자 비드 접합체 (최종 비드 농도: 2.5 μg/mL)와 혼합된 20 μL의 ACI-35-2G5-Ab3-BT 항체 (최종 농도: 5 nM)
ㆍ RT에서 1시간 동안 배양
ㆍ 25 μL의 스트렙타비딘 공여자 비드 (최종 비드 농도: 25 μg/mL)
ㆍ RT에서 30분 동안 배양 (광으로부터 보호됨)
ㆍ EnSpire Workstation 버전 3.00을 이용한 EnSpire 알파 기구와 분석에 의한 판독
11.1.6 통계학적 분석
데이터의 통계학적 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 수행되었다.
11.2 결과
예비 실험은 인간 CSF 내에 존재하는 pS396의 양이 검출하기에는 너무 적다는 것을 지시하였다. 이런 이유로, 고-민감성 면역-검출에 커플링된 면역-농축 프로토콜이 개발되었다. 면역-농축 프로토콜은 먼저, 인간 AD 사후 뇌 물질을 이용하여 입증되었다. 처리되지 않은 뇌 균질액 시료와 타우 면역-농축된 시료의 나란한 비교는 상응하는 농도에서, 타우13/ACI-35-2G5-Ab3 AlphaLISA 검정의 검출 한계가 처리되지 않은 시료의 경우에 0.5 μg/mL에서 도달되고, 그리고 면역-농축된 시료의 경우에 0.002-0.006 μg/mL 사이에서 도달된다는 것을 드러내고, 100-배 농축을 지시하였다 (도 9).
그 다음, 면역-농축 프로토콜은 생존-공여자 CSF 시료 (경등도-내지-중등도 AD 환자의 경우에 n=17 및 연령-정합된 건강한 지원자의 경우에 n=16)에 적용되었다. 획득된 데이터 (도 10)는 하기를 증명한다: a) 면역-농축 프로토콜에 따라서, 타우13/ACI-35-2G5-Ab3 AlphaLISA는 모든 인간 CSF 시료에서 pS396-타우를 검출하였다; 그리고 b) 더욱 중요하게는, 대조와 비교할 때 AD CSF에서 pS396-타우의 양에서 유의미한 증가가 관찰되었다 (p=0.0003, 만-휘트니 검증).
결론적으로, 인간 CSF에서 pS396-타우의 검출을 가능하게 하는 면역-농축 / 면역-검출 프로토콜이 개발되었다. 경등도-내지-중등도 AD의 CSF에서 pS396-타우의 증가는 이러한 방법이 질환 진행, 환자 계층화 및 치료 효능을 산정하기 위한 임상적 생물마커 연구에서 성공적으로 이용될 수 있다는 것을 암시한다. ACI-35-2G5-Ab3 항체는 모든 인간 CSF 시료에서 pS396-타우를 검출하고, 그리고 더욱 중요하게는, 상기 항체는 대조와 비교할 때 AD CSF를 식별할 수 있었다.
타우 서열, 백신과 항체 설명
설명 백신 서열 * , 길이 (n), 서열 번호 하이브리도마 항체
T3: 타우 393-408 [pS396, pS404] ACI-35



 VYKS(p)PVVSGDTS(p)PRHL (n = 16) (서열 번호: 62)



 A4-4A6-48 ACI-35-4A6-Ab2
A6-2G5-30 ACI-35-2G5-Ab2
A6-2G5-41 ACI-35-2G5-Ab3
A4-2A1-18 ACI-35-2A1-Ab1
A4-2A1-40 ACI-35-2A1-Ab2
A6-1D2-12 ACI-35-1D2-Ab1
A4-4A6-18 ACI-35-4A6-Ab1
A6-2G5-08 ACI-35-2G5-Ab1
*인간 타우의 가장 긴 동종형 (Tau441)에 기초됨. p는 인산화된 잔기를 지시한다.
<표 2>
Figure 112014042234116-pct00005
결합의 강도는 단지 동일한 칼럼 내에서, 동일한 검정 (ELISA, 또는 TAUPIR, 또는 WB) 내에서만 비교될 수 있다.
- 우수한 결합 없음 또는 부재; + 우수한 결합; ++ 매우 우수한 결합; +++ 고도 결합 (매우 우수한 결합보다 이상)
항-타우 항체의 결합 친화성
하이브리도마 항체 결합 속도 상수 ( k d ) (1/Ms) 해리 속도 상수 ( k a ) (1/s) 해리 상수 (K D ) (nM)
A4-4A6-18 ACI-35-4A6-Ab1 2.00 x 105
1.10 x 105 		3.10 x 10-3
1.70 x 10-3 		16 a
15 b
A6-1D2-12 ACI-35-1D2-Ab1 1.60 x 103
2.20 x 104 		9.30 x 10-6
1.80 x 10-3 		≤ 6 a
82 b
A6-2G5-08 ACI-35-2G5-Ab1 4.80 x 105
3.20 x 104 		5.30 x 10-3
2.20 x 10-3 		10 a
70 b
A6-2G5-30 ACI-35-2G5-Ab2 2.40 x 104 2.30 x 10-4 10 b
A6-2G5-41 ACI-35-2G5-Ab3 1.70 x 104 3.80 x 10-5 2 b
A4-2A1-18 ACI-35-2A1-Ab1 2.70 x 104 1.00 x 10-3 38 b
A4-2A1-40 ACI-35-2A1-Ab2 3.00 x 104 9.00 x 10-4 30 b
a 64 %의 포스포-펩티드 순도에서 HPLC에 의해 수행된 분석.
b 87 %의 포스포-펩티드 순도에서 HPLC에 의해 수행된 분석.
본 연구에 이용된 AD 개체의 설명
AD 개체 ID 성별 사망 시에 연령 진단 시에 연령 질환 지속 기간 AD 브라크 단계
AD 18 여성 82 66 16 브라크 V
AD 19 여성 81 77 4 브라크 V
AD 20 남성 88 82 6 브라크 V
AD 21 여성 82 77 5 브라크 VI
AD 22 남성 62 49 13 브라크 V
AD 23 여성 76 65 11 브라크 VI
AD 24 여성 86 84 2 브라크 V
AD 25 남성 81 78 3 브라크 V
AD 26 여성 88 83 5 브라크 V
AD 27 여성 85 82 3 브라크 V
항체 결합에 요구되는 타우 아미노산과 포스포-잔기.
하이브리도마 항체 에피토프 *
A4-2A1-18 ACI-35-2A1-Ab1 타우 aa 393-401, pS396에 대한 요구 있음
A4-2A1-40 ACI-35-2A1-Ab2 타우 aa 393-401, pS396에 대한 요구 있음
A4-4A6-18 ACI-35-4A6-Ab1 타우 aa 396-401, pS396에 대한 요구 있음
A6-1D2-12 ACI-35-1D2-Ab1 타우 aa 394-400, pS396에 대한 요구 있음
A6-2G5-08 ACI-35-2G5-Ab1 타우 aa 402-406, pS404에 대한 요구 있음
A6-2G5-30 ACI-35-2G5-Ab2 타우 aa 393-400, pS396에 대한 요구 있음
A6-2G5-41 ACI-35-2G5-Ab3 타우 aa 393-400, pS396에 대한 요구 있음
*인간 타우의 가장 긴 동종형 (Tau441)에 기초됨
<표 6>
Figure 112017095689919-pct00040
Figure 112017095689919-pct00042
Figure 112014042234116-pct00008

<표 7>
Figure 112014042234116-pct00009
Figure 112014042234116-pct00010
Figure 112014042234116-pct00011

<표 8>
Figure 112014042234116-pct00012
Figure 112014042234116-pct00013
Figure 112014042234116-pct00014
Figure 112014042234116-pct00015
Figure 112014042234116-pct00016

타우40으로 불리는 인간 타우의 가장 긴 동종형 (441aa)
타우40으로 불리는 인간 타우의 가장 긴 동종형 (441aa)
(서열 번호: 67)

미소관-연관된 단백질 타우 동종형 2 [호모 사피엔스]

NCBI 참고 서열: NP_005901.2
 MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTEDGSEEPG
SETSDAKSTP TAEDVTAPLV DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG
HVTQARMVSK SKDGTGSDDK KAKGADGKTK IATPRGAAPP GQKGQANATR IPAKTPPAPK
TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP GSPGTPGSRS RTPSLPTPPT REPKKVAVVR TPPKSPSSAK
SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKHQP GGGKVQIINK KLDLSNVQSK CGSKDNIKHV
PGGGSVQIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNIHH KPGGGQVEVK SEKLDFKDRV QSKIGSLDNI
THVPGGGNKK IETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS GDTSPRHLSN VSSTGSIDMV
DSPQLATLAD EVSASLAKQG L (서열 번호: 67)
기탁:
하기 하이브리도마 세포주는 부다페스트 조약의 규정 하에, Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig에 소재하는 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 AC Immune SA, PSE-EPFL Building B, 1015 Lausanne/Switzerland 및 Katholieke Universiteit Leuven, Waaistraat 6 - Box 5105, 3000 Leuven/Belgium의 명칭으로 기탁되었다:
하이브리도마 명칭 기탁 번호 기탁 일자
A4-4A6-48 DSM ACC3136 2011년 8월 30일
A6-2G5-30 DSM ACC3137 2011년 8월 30일
A6-2G5-41 DSM ACC3138 2011년 8월 30일
A4-2A1-18 DSM ACC3139 2011년 8월 30일
A4-2A1-40 DSM ACC3140 2011년 8월 30일
A6-1D2-12 DSM ACC3141 2011년 9월 6일
<표 11A>
에피토프 맵핑에 이용되는 펩티드 라이브러리
Figure 112014042234116-pct00017

<표 11B>
pS396-특이적 항체의 에피토프 맵핑에 이용되는 알라닌 (Ala) 치환 펩티드 라이브러리
Figure 112014042234116-pct00018

<표 11C>
pS404-특이적 항체의 에피토프 맵핑에 이용되는 알라닌 (Ala) 치환 펩티드 라이브러리
Figure 112014042234116-pct00019

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U.S. Patent No. 5,112,596,
U.S. Patent No. 5,268,164,
U.S. Patent No. 5,506,206,
U.S. Patent No. 5,686,416
U.S. Patent No. 5,004,697
DSMZ DSMACC3136 20110830 DSMZ DSMACC3137 20110830 DSMZ DSMACC3138 20110830 DSMZ DSMACC3139 20110830 DSMZ DSMACC3140 20110830 DSMZ DSMACC3141 20110906
SEQUENCE LISTING <110> AC Immune S.A. Katholieke Universiteit Leuven <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION <130> 103112PC <140> <141> 2012-10-05 <150> EP 12 16 3319.2 <151> 2012-04-05 <150> PCT/EP2011/067604 <151> 2011-10-07 <160> 221 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SOURCE <222> 1..115 <223> /mol_type="protein" /organism="Mus musculus" <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Tyr Tyr Ala Val Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SOURCE <222> 1..115 <223> /mol_type="protein" /organism="Mus 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aagaagggga 300 cagctcaggc tacgcctgtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 39 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> source <222> 1..357 <223> /mol_type="DNA" /organism="Mus musculus" <400> 39 gaggtgaagc tgatggaatc tggaggaggc ttggtacacc ctggggcttc tctgagactc 60 tactgtgcag cttctggatt cacctttact gattactaca tgagctgggt ccgccagcct 120 ccagggaagg cacctgagtg gttggctttg attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtatactg catctgttaa gggtcggttc accatctcca gagataattc ccaaaacatc 240 ctctatcttc aaatgaacac cctgagggct gaggacagtg ccacttatta ctgtgtaaaa 300 gctctgggac gttacttcga tgtctggggc acagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 40 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> source <222> 1..339 <223> /mol_type="DNA" /organism="Mus musculus" <400> 40 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtgttttt aatagtggca atcaaaagaa ctctttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgg tatactttgc atccactagg 180 gaatctgggg 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artificial sequence: primer" /organism="Artificial Sequence" <400> 216 atgaaatgca gctggrtyat sttctt 26 <210> 217 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..26 <223> /mol_type="DNA" /note="Description of artificial sequence: primer" /organism="Artificial Sequence" <400> 217 atggrcagrc ttacwtyytc attcct 26 <210> 218 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..26 <223> /mol_type="DNA" /note="Description of artificial sequence: primer" /organism="Artificial Sequence" <400> 218 atgatggtgt taagtcttct gtacct 26 <210> 219 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..24 <223> /mol_type="DNA" /note="Description of artificial sequence: primer" /organism="Artificial Sequence" <400> 219 atgragwcac akwcycaggt cttt 24 <210> 220 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..32 <223> /mol_type="DNA" /note="Description of artificial sequence: primer" /organism="Artificial Sequence" <220> 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Claims (91)

  1. 포유류 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능성 단편이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은
    (a) 서열 번호: 106에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 107에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호: 108에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 89에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 115에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호: 91에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
    (b) 서열 번호: 93에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 94에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호: 95에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 12에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 90에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호: 91에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 기능성 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 위치 396 (pS396)에서 및 위치 404 (pS404)에서 인산화된 Ser을 포함하는 아미노산 서열 VYKSPVVSGDTSPRHL (서열 번호: 62) (서열 번호: 67의 타우 aa 393-408)을 갖는 포스포-에피토프, 또는 상기 아미노산 서열 내에 있는 포스포-에피토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  3. 청구항 1에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 가용성, 저중합체성 및 불용성 인산화된 타우 단백질과 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  4. 청구항 1에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 인산화된 타우 단백질과 2 nM 내지 80 nM 범위의 해리 상수로 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  5. 청구항 1에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 인산화된 타우 단백질과 1.6 x 102 M-1s-1 내지 5 x 105 M-1s-1 범위의 결합 속도 상수로 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 포유류의 뇌에서 가용성 및/또는 불용성 타우 수준을 조절하는 조절 항체인 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 뇌 피질 및/또는 해마에서 가용성 및/또는 불용성 타우 수준을 조절하는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 전체 가용성 및/또는 불용성 타우 단백질의 수준을 감소시키는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 가용성 및/또는 불용성 인산화된 타우 단백질의 수준을 감소시키는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 고인산화된 타우 단백질을 내포하는 쌍나선 필라멘트의 수준을 감소시키는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 전체 가용성 타우 단백질, 가용성 인산화된 타우 단백질 및 p타우 쌍나선 필라멘트의 수준을 감소시키는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 포유류는 인간인 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 하기로 구성된 군에서 선택되는 에피토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편:
    a. 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 VYKSPVVSG (서열 번호: 67의 타우 aa 393-401); 및
    b. 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 VYKSPVVS (서열 번호: 67의 타우 aa 393-400).
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 67에서 진술된 인간 타우 단백질 상에서, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-401 (VYKSPVVSG)을 포함하는 에피토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 67에서 진술된 인간 타우 단백질 상에서, 위치 396에서 인산화된 Ser (pS396)을 포함하는 타우 aa 393-400 (VYKSPVVS)을 포함하는 에피토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 포유류 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편:
    a. 서열 번호: 93에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 94에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호: 95에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는
    b. 서열 번호: 12에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 90에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호: 91에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역.
  17. 청구항 1에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 포유류 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 포스포-에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편:
    a. 서열 번호: 106에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 107에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호: 108에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는
    b. 서열 번호: 89에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 115에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호: 91에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역.
  18. 청구항 1에 있어서,
    a. 서열 번호: 116에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호: 88에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
    b. 서열 번호: 92에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호: 88에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
    c. 서열 번호: 105에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호: 104에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
    d. 서열 번호: 118에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호: 88에서 진술된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편.
  19. 청구항 1에 있어서, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이의 기능성 단편인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  20. 청구항 1에 있어서, IgG2b, IgG2a 또는 IgG3 아이소타입인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  21. 청구항 1에 있어서, 상기 포유류 타우 단백질은 인간 타우 단백질인 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  22. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 병리학적 단백질 타우 이형태체에 결합하지만, 상응하는 인산화되지 않은 에피토프 및/또는 무관한 에피토프에 결합하지 않는 것인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  23. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능성 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 청구항 23에 있어서, 하기로 구성된 군에서 선택되는 핵산 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드:
    a. 서열 번호: 109, 110, 113, 114, 117, 또는 119에서 진술된 서열에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
    b. 서열 번호: 109, 110, 113, 114, 117, 또는 119에서 진술된 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
    c. 서열 번호: 109, 110, 113, 114, 117, 또는 119에서 진술된 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
    d. 서열 번호: 109, 110, 113, 114, 117, 또는 119에서 진술된 서열에 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
    e. 서열 번호: 109, 110, 113, 114, 117, 또는 119에서 진술된 서열에 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
    f. 상보성 가닥이 a) - d) 중에서 한 가지의 핵산 분자에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; 또는
    g. 유전자 코드의 축중성에 의해, a) - e) 중에서 한 가지에서 정의된 뉴클레오티드 서열로부터 벗어나는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  25. 제약학적으로 허용되는 담체와 함께, 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 이들의 조합을 치료 효과량으로 포함하는, 포유류에서 타우병증의 치료에 사용하기 위한 제약학적 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서, 포유류 타우 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 상이한 포스포-에피토프를 인식하는 두 번째 항체 또는 이의 기능성 단편을 추가로 포함하는 제약학적 조성물.
  27. 청구항 25에 있어서, 아밀로이드형성 단백질 또는 펩티드를 인식하고 이에 결합하는 추가의 항체 또는 이의 기능성 단편을 더욱 포함하는 제약학적 조성물.
  28. 삭제
  29. 청구항 25에 있어서, 포유류가 인간인 것인 제약학적 조성물.
  30. 청구항 25에 있어서, 치료는 포유류에서 인지 결손의 진행에서 정지를 유발하는 것인 제약학적 조성물.
  31. 청구항 25에 있어서, 치료는 치료된 개체에서 인지 기억 용량의 보존에서 증가 또는 완전한 복원을 유발하는 것인 제약학적 조성물.
  32. 청구항 25에 있어서, 타우병증은 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 권투 선수 치매, 다운증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병, 근위축성 측삭 경화증/괌의 파킨슨병 치매 복합증, 신경섬유매듭을 동반하는 비-괌 운동 뉴런 질환, 은친화성 그레인 치매, 피질기저 퇴행, 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유매듭, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 동반하는 전측두엽 치매, 전측두엽 치매, 할러포르덴-슈파츠병, 다계통 위축증, 니만-피크병 타입 C, 팔리도 폰토 흑질성 변성, 픽 병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 탱글-단독 치매, 뇌염후 파킨슨병, 그리고 근긴장성 이영양증으로 구성된 군에서 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  33. 청구항 32에 있어서, 타우병증은 전측두엽 치매인 것인 제약학적 조성물.
  34. 청구항 32에 있어서, 알츠하이머병의 치료에서 이용되는 것인 제약학적 조성물.
  35. 청구항 25에 있어서, 타우병증은 타우와 아밀로이드 병리 둘 모두의 존재를 보이는 것인 제약학적 조성물.
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  38. 청구항 35에 있어서, 타우병증은 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 권투 선수 치매, 다운증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병, 봉입체 근염, 및 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증 및 외상성 뇌 손상으로부터 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  39. 청구항 25에 있어서, 타우병증은 별개의 아밀로이드 병리를 보이지 않는 것인 제약학적 조성물.
  40. 청구항 39에 있어서, 타우병증은 근위축성 측삭 경화증/괌의 파킨슨병 치매 복합증, 신경섬유매듭을 동반하는 비-괌 운동 뉴런 질환, 은친화성 그레인 치매, 피질기저 퇴행, 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유매듭, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 동반하는 전측두엽 치매, 전측두엽 치매, 할러포르덴-슈파츠병, 다계통 위축증, 니만-피크병 타입 C, 팔리도 폰토 흑질성 변성, 픽 병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 탱글 단독 치매, 뇌염후 파킨슨병, 및 근긴장성 이영양증으로부터 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  41. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능성 단편 또는 이들의 조합을 포함하는, 포유류에서 타우병증을 치료하거나, 경감하거나, 또는 이로부터 보호하기 위한 제약학적 조성물.
  42. 청구항 41에 있어서, 타우병증은 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 권투 선수 치매, 다운증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병, 봉입체 근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 외상성 뇌 손상, 근위축성 측삭 경화증/괌의 파킨슨병 치매 복합증, 신경섬유매듭을 동반하는 비-괌 운동 뉴런 질환, 은친화성 그레인 치매, 피질기저 퇴행, 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유매듭, 염색체 17에 연관된 파킨슨병을 동반하는 전측두엽 치매, 전측두엽 치매, 할러포르덴-슈파츠병, 다계통 위축증, 니만-피크병 타입 C, 팔리도 폰토 흑질성 변성, 픽 병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 탱글-단독 치매, 뇌염후 파킨슨병 및 근긴장성 이영양증으로 구성된 군에서 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  43. 청구항 41에 있어서, 포유류는 인간인 것인 제약학적 조성물.
  44. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능성 단편 또는 이들의 조합을 포함하는, 타우병증을 앓는 동물에서 수동 면역 반응을 유도하기 위한 제약학적 조성물.
  45. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는, 환자에서 타우병증을 진단하기 위한 조성물.
  46. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는, 치료 항체로 치료 이후에 환자에서 타우병증의 최소 잔여 질환을 모니터링하기 위한 조성물.
  47. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는, 타우병증을 앓고 치료 항체로 치료되는 환자의 반응성을 예측하기 위한 조성물.
  48. 청구항 45에 있어서, 타우병증을 앓는 환자로부터의 뇌척수액 시료에 대해 사용하기 위한 조성물.
  49. 타우병증을 앓은 것으로 의심되는 개체로부터의 뇌 시료에서 포스포타우 (p타우) 다합체의 사후 검출을 위한 정보를 제공하는 시험관내 방법이며, 하기를 포함하는 것인 방법:
    a. 개체의 뇌 시료를 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 기능성 단편과 접촉시키고, 상기 항체 또는 이의 단편은 포스포타우 단백질의 에피토프에 결합하고;
    b. 항체가 포스포타우 단백질에 결합할 수 있도록 하여 면역학적 복합체를 형성하고;
    c. 면역학적 복합체의 형성을 검출하고, 그리고
    d. 상기 개체로부터 획득된 시료에서 면역학적 복합체의 양 또는 강도를, 동일한 조건을 이용하여 건강한 대조 개체로부터 획득된 면역학적 복합체의 양 또는 강도와 비교하고,
    여기서 대조 값과 비교하여 상기 면역학적 복합체의 양 또는 강도에서 증가는 상기 개체가 타우병증을 앓았다는 것을 지시한다.
  50. 청구항 49에 있어서, 대조 시료와 비교하여 검사 시료에서 관찰된 증가는 30% 내지 100%인 것인 방법.
  51. 청구항 49에 있어서, 단계 (a)에 앞서, 시료는 고형 서포트에 부착된 항-타우 항체 또는 이의 기능성 단편과 시료를 접촉시킴으로써 시료에서 타우 단백질의 농도를 증가시키기 위해 면역-농축된 것인 방법.
  52. 청구항 45에 있어서, 고형 서포트에 부착된 항-타우 항체 또는 이의 단편과 시료를 접촉시킴으로써 시료에서 타우 단백질의 농도를 증가시키기 위해 면역-농축된 시료에 대해 사용하기 위한 조성물.
  53. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는, 타우병증의 검출과 진단을 위한 검사 키트.
  54. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 하나 또는 그 이상의 항체 또는 이의 기능성 단편을 수용하는 용기, 그리고 면역학적 복합체의 존재 또는 부재가 타우 항원의 존재 또는 부재와 상관하도록 타우 항원에 결합하여 면역학적 복합체를 형성하고 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 목적으로 이들 항체를 이용하기 위한 사용설명서를 포함하는, 타우병증의 검출과 진단을 위한 검사 키트.
  55. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 기능성 단편을 생산하는 세포주.
  56. 청구항 55에 있어서, DSM ACC3136으로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-4A6-48인 것인 세포주.
  57. 청구항 55에 있어서, DSM ACC3137로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30인 것인 세포주.
  58. 청구항 55에 있어서, DSM ACC3138로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-2G5-41인 것인 세포주.
  59. 청구항 55에 있어서, DSM ACC3139로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18인 것인 세포주.
  60. 청구항 55에 있어서, DSM ACC3140로서 2011년 8월 30일자 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-2A1-40인 것인 세포주.
  61. 청구항 23의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이며, 상기 폴리뉴클레오티드는 작동가능하게 연결된 것인, 벡터.
  62. 청구항 61의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  63. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 기능성 단편을 생산하는 숙주 세포.
  64. 청구항 63에 있어서, 포유류 세포인 숙주 세포.
  65. 청구항 64에 있어서, 중국 햄스터 난소 세포인 숙주 세포.
  66. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능성 단편을 생산하는 숙주 세포를 배양하고, 항체 또는 이의 기능성 단편을 회수하는 것을 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능성 단편을 생산하기 위한 방법.
  67. 뇌 시료에서 포스포타우 (p타우) 다합체를 검출하기 위한 정보를 제공하는 시험관내 방법이며,
    a. 시료를 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 기능성 단편과 접촉시키고, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은 포스포타우 단백질의 에피토프에 결합하고;
    b. 항체 또는 이의 단편이 포스포타우 단백질에 결합할 수 있도록 하여 면역학적 복합체를 형성하고; 그리고
    c. 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함하는 방법.
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