KR20100115340A - Ａβ 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명자 등은 생리적 분자인 가용성 Aβ 모노머를 인식하지 않고, 가용성 Aβ 올리고머에만 특이적인 단일클론항체를 제작하는 것에 성공하고, 당해 항체가 알츠하이머병에 대한 진단·치료용 단일클론항체로서 유용한 것을 발견하였다.

Description

Ａβ 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 이용{Antibody capable of specifically binding to Aβ oligomer, and use thereof}

본 발명은 Aβ 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.

다양한 증거에 의해, 기억력 저하는 가용성 Aβ 올리고머에 의해 일어나는 시냅스 기능부전(synaptic dysfunction)에 기인하는 것이 나타내어져 있다(비특허문헌 1 및 2 참조). Aβ 올리고머의 과도한 축적 및 침착은, 알츠하이머병(AD)에 이르는 일련의 병적 캐스캐이드(cascade)의 원인이 되고 있을 가능성이 있다. 따라서, Aβ 올리고머를 표적으로 하는 치료적 개입은 이 병적 캐스캐이드를 차단하는데 유효하다고 생각된다. 그러나, 이 아밀로이드 캐스캐이드 가설의 중핵이 되는 책임분자, 특히 Aβ 올리고머에 의해 매개되는 신경 변성에 관한 지견(知見)은, 주로 인 비트로 실험에서 탄생한 것으로(비특허문헌 3 참조), 인 비보에서는 직접적으로는 증명되어 있지 않다. 지금까지 보고된 인 비보 실험(비특허문헌 4 참조)에 있어서의 최대 결점은, 입체구조 특이적인 분자 도구의 부족에 의해, 내인성 Aβ 중합체의 시냅스 독성 작용을 해명하기에 이르지 못한 것에 있다. 알츠하이머병 모델 마우스에서 조차 해결 곤란한 국면을, 인간 뇌에 있어서 해결하는 기술은 없어, 그 내인성 Aβ의 인 비보 신경독성은 때때로 무시되어 왔다. 왜 인간 내후영피질(內嗅領皮質, entorhinal cortex)에 있어서 NFT 형성 및 신경세포 상실이 노인반(senile plaque) 형성에 선행하는 것인지, 어떻게 Aβ 올리고머가 관여하는 것인지는 아직 불명확한 상태이다.

또한 본 발명에 관련된 선행기술문헌정보로서는 이하의 것이 있다.

비특허문헌 1 : Klein WL, Trends Neurosci 24: 219-224, 2001.

비특허문헌 2 : Selkoe DJ, Science 298: 789-791, 2002.

비특허문헌 3 : Hass C et al : Nature Reviw 8: 101-12, 2007.

비특허문헌 4 : Lee EB, et al: J Biol Chem. 281: 4292-4299, 2006.

본 발명은 상기 상황을 감안하여 이루어진 것으로, Aβ 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도를 제공하는 것을 과제로 한다. 보다 상세하게는, Aβ 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체, 그 항체를 사용한 Aβ 올리고머를 측정하는 방법, 그 항체를 사용한 알츠하이머병을 진단하는 방법, 및 그 항체를 포함하는 약제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자 등은 생리적 분자인 가용성 아밀로이드 β(Aβ) 모노머를 인식하지 않고, 가용성 Aβ 올리고머에만 특이적인 단일클론항체를 제작하여, 이하의 5가지 기능을 확인하였다.

(1) 항신경독성활성;

(2) Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성;

(3) Aβ 올리고머만을 인식하는 특이성;

(4) AD뇌에 있어서 Aβ 올리고머를 포착하는 능력;

(5) APPswe-형질전환 마우스(Tg2576)에 있어서의 알츠하이머병 유사 표현형 발증(기억장애, 뇌 Aβ 축적 레벨)을 예방하는 능력.

제작 항체 중에서, 단일클론의 1A9 또는 2C3는, 한외여과·분자체법에 의한 판정으로부터, 모노머(약 4.5 kDa)를 인식하지 않고, 30 kDa 이상, 주로 100 kDa 이상의 올리고머를 특이적으로 인식하는 것을 확인하였다. 이어서, 신경세포로 분화시킨 PC12 세포에 있어서, Aβ1-42가 유발하는 신경독성 중화효과를 검증한 결과, 양 항체 모두 신경독성 중화활성을 갖는 것을 확인하였다. 티오플라빈 T 어세이(thioflavin T assay) 및 전자현미경 검사에 있어서도, 양 항체에 Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성을 확인하였다. AD 뇌에 있어서의 양 항체의 Aβ 올리고머 포착능은, 1A9과 2C3를 사용한 면역침강으로 SDS 안정성 4-, 5-, 8-, 12-mer의 존재로 확인하였다. 또한 인간 뇌에 있어서의 인 비보 신경독성 검증을 목적으로 하여, 주로 Braak NFT 스테이지 I~III의 인간 내후영피질에서 양 항체에 인식되는 중합체의 많고 적음을 검증하였다. 특히 동물실험에서 신경독성을 갖는 것으로 보고되어 있던 12-mer에 착안한 결과, 그 축적은 인지기능장애의 출현에 선행하여, Braak NFT 스테이지가 진행함에 수반하여 증가하는 것을 확인하였다. 이 결과는 양 항체에서 특이적으로 인식되는 12-mer이 인간 뇌 내에서의 인 비보 신경독성의 원인이 되는 입체구조 중합체(conformational assembly)인 것을 처음 나타낸 것이다. 본 발명자 등은 또한, 양 항체가 인식하는 올리고머성 입체구조체가 CSF(뇌척수액) 중에 존재하고, AD 환자에서 증가하고 있는 것도 발견하였다. 본 발명자 등은 1A9 또는 2C3를 다른 신경질환과 마찬가지로 정맥주사로의 수동 면역요법으로서 사용하여, 아만성적인 수동 면역처치에 의해 Tg2576 마우스가 기억장애, 노인반 병변, 시냅스 기능부전 및 Aβ 축적으로부터 방어되어, 유해한 부작용도 보이지 않는 것을 확인하였다. 본 발명자 등의 결과는, 단일클론의 1A9 또는 2C3가, Tg2576 마우스에 있어서의 알츠하이머 유사 표현형을 예방하기 위한 치료용 항체로서, 특히 뇌내 이행을 고려하지 않고 통상의 말초정맥 투여로 그 효과가 발현되는 것을 기대할 수 있는 유망한 후보인 것을 처음 명확하게 한 것이다.

또한 본 발명자 등은, 1A9 및 2C3 항체의 수동 면역요법에 의해, 노인반 아밀로이드 및 종대변성 신경돌기 형성(swollen dystrophic neurite formation)이 억제되는 것을 확인하였다. 더 나아가서는, 혈액 중에 투여한 1A9 및 2C3 항체의 일부가 뇌내로 이행하는 것을 발견하였다.

전술한 바와 같이, 본 발명자 등은 본 명세서에 있어서, Aβ 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체인 단일클론의 1A9 또는 2C3가 진단·치료 항체 설정기준을 모두 만족하여, 알츠하이머병을 진단·예방하기 위한 치료용 항체의 유망한 후보인 것을 제시하는 것이다.

또한 본 발명자 등은, 1A9 및 2C3 항체와 마찬가지로, Aβ 모노머를 인식하지 않고 Aβ 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체 E12, 1C10 및 4D3 항체를 얻는 것에 성공하고, 이 중 E12 항체가 Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성을 갖는 것을 발견하였다.

이 때문에, 상기의 E12, 1C10 및 4D3 항체도, 알츠하이머병을 진단·예방하기 위한 치료용 항체의 유망한 후보인 것을 제시한다.

즉 본 발명은,

[1] Aβ 올리고머에 결합하는 항체로서, Aβ 모노머에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체,

[2] 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬, 및 서열번호:3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체가 결합하는 Aβ 올리고머와 결합하는 항체,

[3] 서열번호:21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬, 및 서열번호:23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체가 결합하는 Aβ 올리고머와 결합하는 항체,

[4] 서열번호:41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬, 및 서열번호:43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체가 결합하는 Aβ 올리고머와 결합하는 항체,

[5] 이하의 (1)~(20) 중 어느 하나에 기재된 항체,

(1) CDR1으로서 서열번호:9에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:11에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(2) CDR1으로서 서열번호:15에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:17에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체

(3) (1)에 기재된 H사슬, 및 (2)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(4) VH로서 서열번호:5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(5) VL로서 서열번호:7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체

(6) (4)에 기재된 H사슬, 및 (5)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(7) CDR1으로서 서열번호:29에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:31에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(8) CDR1으로서 서열번호:35에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:37에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체

(9) (7)에 기재된 H사슬, 및 (8)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(10) VH로서 서열번호:25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(11) VL로서 서열번호:27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체

(12) (10)에 기재된 H사슬, 및 (11)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(13) CDR1으로서 서열번호:49에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:51에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:53에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(14) CDR1으로서 서열번호:55에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:57에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:59에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체

(15) (13)에 기재된 H사슬, 및 (14)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(16) VH로서 서열번호:45에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(17) VL로서 서열번호:47에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체

(18) (16)에 기재된 H사슬, 및 (17)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(19) (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체

(20) (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체

[6] 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는, [5]에 기재된 항체,

[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물,

[8] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 항인지기능장애제,

[9] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 알츠하이머병 치료제,

[10] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 알츠하이머병 진행 억제제,

[11] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 노인반 형성 억제제,

[12] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 함유하는, Aβ 축적 억제제,

[13] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 항신경독성제,

[14] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 함유하는, Aβ 아밀로이드 섬유 형성 저해제,

[15] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 항시냅스 독성제,

[16] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 투여하는 공정을 포함하는, 인지기능장애의 예방 및 치료 중 어느 하나, 또는 양쪽을 위한 방법,

[17] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 투여하는 공정을 포함하는, 알츠하이머병의 예방 및 치료 중 어느 하나, 또는 양쪽을 위한 방법,

[18] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 투여하는 공정을 포함하는, 알츠하이머병의 진행을 억제하는 방법,

[19] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 투여하는 공정을 포함하는, 노인반 형성을 억제하는 방법,

[20] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 투여하는 공정을 포함하는, Aβ의 축적을 억제하는 방법,

[21] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 투여하는 공정을 포함하는, 신경독성을 중화하는 방법,

[22] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 투여하는 공정을 포함하는, Aβ 아밀로이드 섬유의 형성을 저해하는 방법,

[23] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물을 유효성분으로서 투여하는 공정을 포함하는, 시냅스 독성을 중화하는 방법,

[24] 피험자로부터 채취된 시료에 포함되는 Aβ 올리고머를, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체를 사용하여 검출하는 공정을 포함하는, Aβ 올리고머를 측정하는 방법,

[25] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체를 사용하여, 피험자로부터 채취된 시료에 있어서의 Aβ 올리고머를 검출하는 것을 특징으로 하는, 피험자가 알츠하이머병 후보인지 여부를 진단하는 방법,

[26] 이하의 공정을 포함하는, 피험자가 알츠하이머병 후보인지 여부를 진단하는 방법으로서, 공정(b)에 기재된 양이 건강한 정상인과 비교하여 높은 경우에, 피험자가 알츠하이머병 후보라고 판정되는 방법,

(a) 피험자로부터 채취한 시료, 및 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체를 접촉시키는 공정

(b) 상기 시료 중에 있어서의 Aβ 올리고머의 양을 측정하는 공정

[27] 이하의 공정을 포함하는, 피험자가 알츠하이머병 후보인지 여부를 진단하는 방법으로서, 공정(b)에 기재된 비가 건강한 정상인과 비교하여 높은 경우에, 피험자가 알츠하이머병 후보라고 판정되는 방법,

(a) 피험자로부터 채취한 시료, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 및 Aβ 모노머에 결합하는 항체를 접촉시키는 공정

(b) 상기 시료 중에 있어서의 Aβ 모노머에 대한 Aβ 올리고머의 비를 측정하는 공정

[28] 시료가 혈액 또는 뇌척수액인, [24] 내지 [27] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[29] [24] 내지 [27] 중 어느 하나에 기재된 방법에 사용하기 위한 약제,

[30] [24] 내지 [27] 중 어느 하나에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트,

를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은,

[31] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물의 항인지증 기능장애제의 제조에 있어서의 사용,

[32] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물의 알츠하이머병 치료제의 제조에 있어서의 사용,

[33] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물의 알츠하이머 진행 억제제의 제조에 있어서의 사용,

[34] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물의 노인반 형성 억제제의 제조에 있어서의 사용,

[35] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물의 Aβ 축적 억제제의 제조에 있어서의 사용,

[36] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물의 신경독성활성 중화(억제)제의 제조에 있어서의 사용,

[37] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물의 Aβ 아밀로이드 섬유 형성 저해제의 제조에 있어서의 사용,

[38] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물의 시냅스 독성활성 중화(억제)제의 제조에 있어서의 사용,

[39] 인지기능장애의 예방 및 치료 중 어느 하나, 또는 양쪽에 사용하기 위한, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물,

[40] 알츠하이머병의 예방 및 치료 중 어느 하나, 또는 양쪽에 사용하기 위한, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물,

[41] 알츠하이머병 진행 억제에 사용하기 위한, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물,

[42] 노인반 형성 억제에 사용하기 위한, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물,

[43] Aβ 축적 억제에 사용하기 위한, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물,

[44] 신경독성활성 중화(억제)에 사용하기 위한, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물,

[45] Aβ 아밀로이드 섬유 형성 저해에 사용하기 위한, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물,

[46] 시냅스 독성활성 중화(억제)에 사용하기 위한, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 [7]에 기재된 조성물,

을 제공한다.

본 발명에 의해 제공되는 항체에 의해, 알츠하이머병의 병태 야기성 책임분자 선택적인 예방·치료법 확립과 조기진단 마커 확립으로의 다대한 공헌이 기대된다. 뇌내 병태를 표적으로 해야 하는 항체요법에 있어서도, 그 뇌내 이행을 고려하지 않고 말초정맥 투여요법으로 충분하다는 방증(傍證)이 얻어진 결과, 알츠하이머병의 항체의료가 단번에 가속될 것으로 생각된다.

도 1은 올리고머 특이 항체의 제작 및 특성 결정의 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. A, 면역원의 전기영동. SDS-PAGE로 Aβ1-42 모노머(백색 화살표)의 혼입을 수반하지 않는 Aβ1-42 테트라머(적색 화살표)를 단리하였다. 레인 1, 10 mM 인산완충액에 용해한 Aβ1-42; 레인 2, 증류 탈이온수에 용해한 Aβ1-42. B, 알츠하이머병 환자 뇌로부터 완충액 불용성으로 포름산으로 추출 가능한 Aβ 아밀로이드를 양성 하이브리도마 세포 배양물의 상청을 사용하여 면역침강시키고, 면역복합체를 프로테인-G 아가로오스(Amersham)로 선택적으로 분리하였다. 시험한 9종의 클론 중, 레인 2(적색 별표)는 1A9이고, 레인 6은 2C3이다(적색 이중 별표). C, 순화(馴化)배지 SEC에서의 용출 프로파일. SEC 수집한 24 획분 중, 획분 8, 13 및 16을 1A9 면역침강에 제공하였다. Aβ 면역반응성은 4G8에 의해 검출하였다. 적색 화살표는 트리머를 나타내고, 백색의 것은 다이머를 나타낸다. *는 항마우스 IgG의 경쇄(輕鎖)를 나타낸다.
도 2는 1A9 또는 2C3의 항독성활성을 나타내는 사진 및 그래프이다. A-F, 항체의 비존재하 또는 존재하에서, 시드프리(seed-free) Aβ1-42에 37℃에서 48시간 폭로처리한 NGF 처리 PC12(PC12N) 세포의 대표적 화상(각 패널의 좌측 절반). 생세포가 녹색의 염색을 나타내고, 사세포가 적색의 염색을 나타내고 있는, 대표적인 칼세인 AM/PI 염색(각 패널의 우측 절반). G, 시드프리 Aβ1-42(25 μM)에서 폭로처리한 세포 생존도:비특이적 IgG2b(■ 검정 네모);4G8(△ 흰 세포);1A9(□ 흰 네모);2C3(●검정 동그라미).
도 3은 1A9 또는 2C3가 표적으로 하는 독성 Aβ 중합체의 사이즈와 형태적 특징을 나타내는 사진 및 그래프이다. A, Aβ1-42의 540,000×g 상청(25 μM)을, 분자량 커트오프값이 3, 10, 30 및 100 kDa(Microcon)의 한외여과막을 사용하여, 연속 분자체질 공정에 제공하였다. 이 결과 분획한 4종의 여액을 이하와 같이 명명하였다:획분 1(＜3 kDa), 획분 2(3~10 kDa), 획분 3(10~30 kDa) 및 획분 4(30~100 kDa) 및 최종적인 보유액 획분 5(＞100 kDa). 이상의 획분 모두에 있어서의 Aβ1-42의 존재를 4G8 이뮤노블로팅에 의해 축차적으로 조사하였다. B, 5종의 획분에 의해 37℃에서 48시간 처리한 NGF 처리 PC12(PC12N) 세포의 대표적 화상. 각각의 획분의 독성은 도 2에 기재된 바와 같이 평가하였다. C, Aβ1-42의 540,000×g 상청 및 5종의 획분(획분 1~5)으로 처리한 세포 생존도. 2개의 독립된 실험에 의해 동일한 결과가 얻어졌다. 값은 대조에 대한 퍼센티지(평균±SD)로서 표시되어 있다. D, 5종의 획분(획분 1~5)의 도트 블롯 해석. 블롯은 A11, 1A9, 2C3 및 4G8과 반응시켰다. E, 5종의 획분의 AFM 화상. 가장 독성이 강한 획분 5(Fr.5)에서는 입상(粒狀) 분자에 더하여, 윤상(輪狀)이나 비드상의 형태도 관찰되었다.
도 4는 1A9 또는 2C3의 Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성을 나타내는 사진 및 그래프이다. A, 각종 농도(10, 25, 50 μM)에서의 Aβ1-42의 아밀로이드 섬유 형성을, 37℃에서 최종 72시간까지, ThT 어세이로 모니터하였다:10 μM(□ 흰 네모);25 μM(◆ 검정 마름모);50 μM(○ 흰 동그라미). B, Aβ1-42의 아밀로이드 섬유 형성의 공존 항체용량 의존적 저해가 2C3(○)에서 관찰되었으나, 1A9(□ 흰 네모), 4G8(▲ 검정 세모) 및 비특이적 IgG(■ 검정 네모) 중 어느 항체도 시드프리 Aβ1-42(540,000×g에 의한 ThT 음성 상청)의 섬유 형성성 중합을 저해하지 않았다. C, Aβ1-42의 섬유 형성성 중합의 공존 항체용량 의존적 저해가 2C3(○)에서 관찰되고, 3 μM에 있어서는, 1A9(□ 흰 네모)에서도 거의 완전 저해가 관찰되었다. D, 사전에 24시간 인큐베이트하여 Aβ1-42의 아밀로이드 섬유 형성을 형성시킨 후에 첨가한 어느 피험항체도, Aβ1-42의 아밀로이드 섬유를 용해하거나, 탈중합시키는 것은 불가능하였다. E~G, 2C3 및 1A9의 비존재하(패널 E) 및 존재하(각각 패널 F, 패널 G)에 있어서의, Aβ1-42의 EM 화상.
도 5는 독성 관련 Aβ1-42 올리고머에 관한 사진 및 그래프이다. A, 도트 블롯 어세이(패널 A의 상측 절반):37℃에서 추정 시간(0~72시간)에 걸쳐 인큐베이트한 Aβ1-42 모노머(25 μM)를 니트로셀룰로오스막 상에 고상화하고, A11, 1A9, 2C3 또는 4G8을 사용하는 도트 블롯 어세이에 제공하여, 각 항체의 면역활성 양성 구조체의 출현을 검증하였다. 면역활성 강도분석(패널 A의 하측 절반):도트 블롯 어세이의 결과를 Multi Gauge v3.0 소프트웨어(Fuji Film, Tokyo)에 의해 반정량 분석하였다. 올리고머 형성과 아밀로이드 섬유 형성의 관련을 비교하기 위해, ThT 형광값(우측의 Y축)을 동일한 시간축으로 겹쳐서 표시하였다. B, 37℃에서 0, 2, 4, 24시간 인큐베이션시의 Aβ1-42 중합상태와 추가적으로 48시간 인큐베이션 시행시의 Aβ1-42 중합변화. Aβ1-42 중합상태는 4G8 이뮤노블로팅으로 검출. C, 상기 각종 Aβ1-42 중합체의 독성활성. 신경세포의 생존도는 도 2에 기재된 바와 같이 LIVE/EDAD 어세이에 의해 판정하였다. D, 1A9 또는 2C3의 항신경독성활성을 각종의 Aβ 중합체(37℃, 0, 2시간에 형성된 Aβ1-42 중합체[0h, 2h];2h의 540,000×g 초원심 후 회수한 ThT 양성 상청[2h sup])를 사용하여 검증하였다. 항체의 비존재하 또는 존재하에서 각종 Aβ1-42 중합체에 폭로처리한 PC12N 세포의 대표적 화상을 패널 D의 좌측 절반에 나타낸다(a:0h; b:2h; c:2h sup; d:2h sup + IgG2b; e: 2h sup + 1A9; f: 2h sup + 2C3). 항체의 비존재하 또는 존재하에서 각종 Aβ1-42 중합체에 폭로처리한 세포 생존도를 대조에 대한 퍼센티지(평균±SD)로서 표시하고, 패널 D의 우측 절반에 나타내었다. Aβ1-42 중합체(2h)는 Aβ1-42 중합체(0h)에 비해 신경독성이 감소되었으나, 2h sup는 Aβ1-42 중합체(0h)와 동일 정도로 신경독성을 회복하였다. 비특이적 IgG2b는 Aβ1-42 중합체[2h sup]의 신경독성의 유도를 차단할 수 없었다. 단일클론의 1A9은 2h sup 유발성 신경독성을 완전히 저해하였으나, 2C3의 독성 저해능은 조금 떨어졌다. 한편, 단일클론의 어느 실험에 있어서도, 양쪽의 mAb의 항독성활성은 mAb와 Aβ의 몰비가 1:25~50 미만에서 관찰되고, 이것은 구조적으로 상이한 올리고머성 1A9 또는 2C3 중합체가 비교적 낮은 농도로 존재하는 것을 시사하고 있다.
도 6은 가용성 1A9 또는 2C3 올리고머가 인간 뇌내에 존재하는 것을 나타내는 사진 및 그래프이다. Aβ 올리고머에 대한 항체는, 프로테아제-K 전처리 후에만, AD 뇌내의 노인반 및 혈관 아밀로이드 검출이 가능하다. A, 1A9 염색;B, 2C3 염색;C, A11 염색. D, 완충액 가용성 AD 뇌(레인 1~2, 4~5) 및 건강한 정상 대조 뇌(레인 3, 6)에 있어서의 1A9 또는 2C3 면역침강 Aβ의 4G8 이뮤노블로팅. 패널의 좌측 절반에 1A9, 패널의 우측 절반에 2C3의 대표적 결과를 나타낸다. E 및 F, 건강한 정상 고령집단의 부검 증례 50예(Braak NFT 스테이지 I~II, n=35;Braak NFT 스테이지 III~IV, n=13, Braak NFT 스테이지＞IV, AD 증례, n=2)로부터 입수한 인간 내후영피질에 있어서의, 가용성 1A9 면역반응성 12-mer(패널 E) 및 가용성 2C3 면역반응성 12-mer(패널 F)의 판정량 분석(액틴으로 보정).
도 7a는 가용성 1A9 또는 2C3 올리고머가 인간 CSF 중에 존재하는 것을 나타내는 그래프이다. 패널 A 및 B에서는 푸울한 전뇌척수액(pooled whole CSF)(AD=10, NC=10)을, 패널 C 및 D에서는 푸울한 리포단백질 제거 뇌척수액(pooled lipoprotein-depleted CSF)(AD=10, NC=10)을 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)에 제공하였다. 패널 A 및 B에 있어서는, 수집 획분을 BNT77-BA27, BNT77-BC05 ELISAs로 Aβ4O 모노머 및 Aβ42 모노머 분포를 해석하였다. 패널 C 및 D에서는 1A9·2C3 혼합 항체에서 포착된 Aβ4O 올리고머 및 Aβ42 올리고머의 존재를 나타낸다.
도 7b는 도 7a의 계속되는 도면이다. 올리고머성 1A9 중합체량(1A9-BC05, 1A9-BA27 ELISAs) 또는 2C3 중합체량(2C3-BC05, 2C3-BA27 ELISAs)을 AD 12예(○ 흰 동그라미) 및 NC 13예(● 검정 동그라미)에서 측정하였다(패널 E 및 G). 올리고머와 모노머의 비는 각각 도 F(1A9) 및 H(2C3)에 나타내었다.
도 8은 수동 면역처치에 의해 Tg2576 마우스의 기억장애발증을 예방할 수 있는 것을 나타내는 그래프이다. 13개월령의 Tg2576 마우스를 이하의 3군으로 나눠 학습·행동시험을 시행하였다:PBS 투여군, n=10;1A9 투여군, n=13;2C3 투여군, n=11. 각 측정값은 모두 평균±SE로 나타내었다. (A) Y 미로시험. Y 미로 태스크에 있어서의 8분간의 세션 중에서의 자발적 변화행동을 각 군에서 측정하였다. 일원배치 ANOVA에 의한 결과는 이하와 같다:F(1,52)=3.09, p＜0.05, *PBS를 투여한 Tg2576 마우스와의 비교에서 p＜0.05. (B)신규물체 인식시험. 유지 세션은 훈련 24시간 후에 행하였다. 신규물체 인식시험에 있어서의 10분간의 세션 중에서의 탐색 우선도(exploratory preference)를 각 군에서 측정하였다. 이원배치 ANOVA에 의한 결과는 이하와 같았다:훈련/유지, F(1,64)=31.53, p＜0.01;동물군, F(2,64)~7.49, p＜0.01;동물군에 의한 훈련/유지의 반복, F(2,64)=10.12, p＜0.01, ** 대응하는 비훈련 마우스와의 비교에서 p＜0.01. ##PBS를 투여한 Tg2576 마우스와의 비교에서 p＜0.01. (C) 수미로시험(water maze test)에 있어서의 60초간의 세션 중에서의 유영노정(swimming path)의 길이를 각 군에서 측정하였다. 이원배치 ANOVA에 의한 결과는 이하와 같았다:시행, F(9,320)=20.46, p＜0.01;동물군, F(2,320)=12.59, p＜0.01;동물군에 의한 시행의 반복, F(18,320)=1.78, p＜0.05;p＜0.05, **PBS를 투여한 Tg2576 마우스와의 비교에서 p＜0.01. 조건부 공포 학습시험:문맥 의존적(D) 및 단서 의존적인 움츠러지는 시간(freezing time)(E)을 측정하였다. 이원배치 ANOVA에 의한 결과는 이하와 같았다;문맥 의존시험, F(2,32)=5.94, p＜0.01, 단서 의존시험, F(2,32)=7.33, p＜0.01;*PBS를 투여한 Tg2576 마우스와의 비교에서 p＜0.05, **는 마찬가지로 p＜0.01.
도 9는 수동 면역요법에서 Tg2576 뇌내 Aβ 축적 예방이 가능한 것을 나타내는 사진 및 그래프이다. 13개월령의 Tg2576 마우스 3군(PBS 투여군, n=10;1A9 투여군, n=13;2C3 투여군, n=11)의 해마·대뇌피질을 3단계 연속 추출하고, 완충액 가용성(saline-soluble) 획분, SDS 가용성(SDS-soluble) 획분, 포름산 추출(FA-extractable) 획분을 준비하였다. 각 획분을 Aβ 특이적 ELISAs(WAKO kit:BNT77-BA27 for Aβx-40;BNT77-BC05 for Aβx-42)로 측정한 바, 1A9 치료군에 있어서만 SD40/42, FA40 축적이 유의하게 억제되어 있는 것이 명확해졌다. SDS 가용성 대뇌피질 획분에서는 A11 양성 올리고머(4-mer)의 축적 억제효과가 양항체 치료군에서 확인되었다.
도 10은 Tg2576의 혈장 및 뇌에 있어서의 Aβ 올리고머에 대해서 나타내는 사진 및 그래프이다. A, B, ELISA 분석의 결과, 혈장 중에 있어서의 Aβx-40 및 Aβx-42의 양은 PBS 투여군과 면역치료군을 비교해도 유의한 변화는 확인되지 않았다. C, Aβ40/Aβ42의 비도 마찬가지로, 시험을 행한 3군에서 변화는 보이지 않았다. D, 푸울한 뇌 호모지네이트를 사용한 도트 블롯으로 분석한 결과, 생리식염수 용해성 A11 양성 올리고머의 양은, 시험한 3군에서 변화는 보이지 않았다:해마(좌측 패널) 및 대뇌피질(우측 패널). PBS 투여군(n=10), 1A9 투여군(n=13), 2C3 투여군(n=11). E, 항올리고머 항체 A11을 사용한 면역 블롯 분석에 의하면, SDS 추출 대뇌피질 분획(우측 패널)에 있어서의 Aβ 테트라머의 면역반응이, PBS 투여군에 비해 1A9 또는 2C3 투여군에 있어서 감소되어 있었다. 한편, 해마(좌측 패널)에서는 이러한 현상은 확인되지 않았다. F, 각 군 내에서 혈액(알부민 제거 혈장, 패널 F 상단;알부민·리포단백 제거 혈장, 패널 F 하단)을 푸울하고, A11 도트 블롯 해석을 시행한 결과, PBS 투여군에 비해, 1A9 및 2C3 투여군에서 A11 면역활성 증가를 확인하였다(패널 F). 또한, 2C3 올리고머는 리포단백 결합형으로서 존재하는 비율이 1A9 올리고머 보다 많았다(패널 F 하단). 또한, A11 이뮤노블로팅에서도 약 200 kDa에 양성을 확인하고, 그 면역활성은 PBS 투여군에 비해, 1A9 및 2C3 투여군에서 명확히 증가하였다(패널 G). 이 결과는, 항체 투여군에 있어서, 생리적 분자에 영향을 미치지 않고 표적이 되는 Aβ 올리고머 분자에만 선택적인 치료효과가 발현된 결과로 파악하는 것이 가능하다.
도 11은 수동 면역처치에 의해 Tg2576 마우스 뇌내의 노인반 아밀로이드(A:Aβ 특이적 항체 염색, B:티오플라빈-S 양성 분석)와 종대변성 신경돌기 형성이 억제된 것(C:시냅토피신(synaptophysin) 양성 분석)을 나타내는 도면 및 사진이다.
도 12는 1A9 또는 2C3의 수동 면역처치에 의한 시냅스 변성 억제에 대해서 나타내는 사진이다. 전 또는 후 시냅스성 점상 주변세포에 있어서의 시냅토피신(좌측 패널) 또는 드레브린(drebrin)(우측 패널)에 의한 면역염색. 상측 도면:PBS 투여, 중앙 도면:1A9 투여, 하측 도면:2C3 투여.
도 13은 수동 면역처치에 의한 항체의 뇌내 이행에 대해서 나타내는 사진이다. Tg2576 마우스 뇌내에 투여 항체의 분포사진. 항Aβ 항체에 의한 염색상(좌측 패널), IgG 염색상(중앙 패널). 1A9 투여(A), 2C3 투여(B), PBS 투여(C).
도 14는 단일클론의 2C3, E12, 1C10(아이소타입:IgM) 및 4D3는, 올리고머(3-96 h) 특이적으로 모노머(0 h)를 인식하지 않는 것을 도트 블롯 해석으로 확인한 사진이다.
도 15는 유전자 재조합에 의해 IgM에서 IgG2b로 클래스 변경한 E12 항체가 Aβ 모노머(0 hr)를 인식하지 않고, Aβ 올리고머(3-96 hr) 특이적인 것을 도트 블롯 해석으로 확인한 사진이다.
도 16은 유전자 재조합에 의해 IgM에서 IgG2b로 클래스 변경한 E12 항체의 Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성을 나타내는 그래프이다. Aβ1-42(12.5 μM) 용액에 3단계의 농도로 항체를 첨가하여 37℃에서 24시간 보온 후, ThT 형광강도 측정법으로 Aβ 아밀로이드 섬유 형성량을 측정하였다. 가로축은 첨가한 항체량, 세로축은 항체 무첨가 Aβ 아밀로이드 섬유 형성량을 기준으로 항체 첨가시의 아밀로이드 섬유 형성량을 상대화한 수치를 나타내고 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명자 등은, 전술한 바와 같이, Aβ 올리고머에 특이적으로 결합하고 Aβ 모노머에 결합하지 않는 항체를 얻는 것에 성공하였다. 즉 본 발명은, Aβ 올리고머에 결합하고, Aβ 모노머에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체를 제공한다. 이러한 항체는, 단리된 항체 또는 정제된 항체인 것이 바람직하다.

본 발명의 물질(항체 등)에 있어서 사용되는 「단리된」 및 「정제된」이라는 용어는, 그 물질이, 천연 공급원에 포함되어 있을지도 모르는 하나 이상의 물질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 나타낸다. 따라서, 「단리된 항체」 또는 「정제된 항체」는, 그 항체(단백질)가 유래하는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 탄화수소, 지질, 또는 기타 혼입 단백질과 같은 세포재료를 실질적으로 포함하지 않거나, 또는, 화학 합성된 경우에는, 화학 전구물질 또는 기타 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는 항체를 가리킨다. 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 항체는 단리 또는 정제되어 있다.

「항체」란, 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대해 결합 특이성을 나타낸다. 여기서 「항원」이란, 대응하는 항체와의 결합능력을 가지고 있으며, 또한 항원-항체반응을 인 비보에서 유도하는 단백질을 가리킨다.

아밀로이드의 주요 구성성분인 Aβ 단백질이란, 40-42 아미노산으로 되는 펩티드로, 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein; APP)이라는 전구체 단백질로부터, 프로테아제의 작용에 의해 생산되는 것이 알려져 있다. APP로부터 생성되는 아밀로이드 분자에는, 초원심침사 획분에 회수되는 아밀로이드 섬유와는 별개로, 가용성 모노머에 더하여 올리고머의 비섬유성 중합체가 있다. 본 발명에 있어서의 「Aβ 올리고머」란, 비섬유성 중합체를 가리키는 것이다. 본 발명에 있어서의 「Aβ 올리고머」에는, 예를 들면, Aβ40(Aβ1-40) 올리고머, Aβ42(Aβ1-42) 올리고머가 포함된다. 예를 들면, 본 발명에 있어서의 「Aβ42 올리고머」란, SDS-PAGE에서는 분자량 45~160 kDa, Blue Native-PAGE에서는 분자량 22.5~1,035 kDa의 분자이다. 분자체에서는 주로 ＞100 kDa 보유액에 회수되고, 원자간력 현미경에서 높이 1.5-3.1 nm의 입상 분자, 비드상 분자, 윤상 분자가 혼재된 형태를 나타낸다. 겔 여과법에서는 분자량＞680 kDa 이상의 void volume 획분 8과 분자량 17-44 kDa 경계의 획분 15에 용출되었다.

본 발명에서 사용되는 항체는, Aβ 올리고머에 결합하고, Aβ 모노머에 결합하지 않는 항체이면 되고, 그 유래 및 형상에 대해서는 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서의 「항체」에는, 단일클론항체 및 다중클론항체의 양쪽이 포함된다. 또한, 본 발명의 항체에는, 비인간 동물 항체, 인간화 항체, 키메라화 항체, 인간 항체, 후술하는 저분자화 항체, 아미노산 서열이 개변된 항체, 다른 분자(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜 등의 고분자 등)가 결합한 수식 항체, 당사슬이 개변된 항체 등 어떠한 항체도 포함된다.

본 명세서에 있어서의 「단일클론항체」라는 용어는, 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 입수되는 항체를 가리킨다. 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는, 미량 존재할지 모르는 일어날 수 있는 천연 변이를 제외하고, 동일하다. 단일클론항체는, 고도로 특이적으로, 단일 항원성 부위에 대응하는 것이다. 또한, 상이한 항원결정기(에피토프)에 대한 상이한 항체를 전형적으로는 포함하고 있는 종래의 (다중클론)항체 조제물과는 대조적으로, 각 단일클론항체는 항원 상의 단일 결정기에 대응한다.

전술한 특이성에 더하여, 단일클론항체는 다른 면역글로불린이 혼입되어 있지 않은 하이브리도마 배양물에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 따라서, 「단일클론」이란, 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 입수되는 항체의 특징을 나타내며, 또한, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제작을 필요로 한다고 해석되어서는 안 된다.

단일클론항체의 제작은, 기본적으로는 공지기술을 사용해서 제작이 가능하다. 예를 들면 Kohler 및 Milstein(Nature 256:495-7, 1975)에 의해 최초로 기재된 하이브리도마법에 의해 제작되어도 되고, 또는 재조합 DNA법(Cabilly et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:3273-7, 1984)에 의해 제작되어도 되는데, 이들 방법에 의해 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 하이브리도마법을 사용하는 경우, Aβ 올리고머(예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이 Aβ 테트라머)를 감작항원으로서 사용하고, 이를 통상의 면역방법에 따라 면역하여, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론항체 생산세포를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.

본원 발명에 있어서의 단일클론항체는, 이하와 같이 하여 제작할 수 있다. 먼저, 합성 Aβ1-42(펩티드연구소, 오사카)를 증류 탈이온수 또는 10 mM 인산완충액 중에 용해시키고, 그것을 37℃에서 18시간 인큐베이트 후, 4-12% SDS-PAGE로 펩티드를 분리하고, CBB 염색으로 가시화 후, Aβ1-42 모노머의 혼입이 없는 Aβ1-42 테트라머만을 잘라낸다. 이어서 BALB/c 마우스의 발바닥에 대해, 완전 프로인트 애쥬번트에 의해 유화(乳化)시킨 2.5 ㎍의 Aβ1-42 테트라머에 의한 면역처치를 행하고, 계속해서 추가적으로 6회의 추가면역을 행한다. 서경 림프절(inguinal lymph node)을 사용하여, 폴리에틸렌글리콜 1500을 사용한 Sp2/O-Ag14 세포와의 융합에 의해 하이브리도마를 제작한다.

본 발명에 있어서, 감작항원으로 면역되는 동물은 특별히 한정되지 않으나, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하면 되고, 일반적으로, 설치류, 토끼목, 또는 영장류가 사용된다. 설치류에는, 예를 들면, 마우스, 랫트, 및 햄스터가 포함된다. 토끼목에는, 예를 들면 토끼가 포함된다. 영장류에는, 예를 들면 게잡이원숭이(Macaca fascicularis), 붉은털 원숭이(Macaca mulatta), 망토비비, 및 침팬지 등의 협비원류(구세계) 원숭이가 포함된다.

감작항원을 동물에 면역하는데는, 공지의 방법에 따라 행해진다. 예를 들면, 일반적 방법으로서, 감작항원을 포유동물의 복강내나 피하에 주사함으로써 행해진다.

상기 면역세포와 융합을 행하는 다른 쪽의 친세포로서, 후술하는 실시예에 기재되는 Sp2/O-Ag14 세포가 예시되는데, 그 밖에도 공지의 각종 세포주를 사용할 수 있다.

상기 면역세포와 골수종세포의 세포융합은, 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면, 쾰러와 밀스테인 등의 방법(Kohler G. and Milstein C., Methods Enzymol.(1981)73, 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 통상의 선택배양법, 예를 들면 HAT 배양액(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)에서 배양함으로써 선택된다. 상기 HA 배양액에서의 배양은, 통상, 수일에서 수주간, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되는데 충분한 시간 계속한다. 이어서, 통상의 한계희석법을 실시하여, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 행한다.

그 후, 얻어진 하이브리도마를 마우스의 복강에 이식하고, 목적의 단일클론항체를 포함하는 복수를 추출한다. 예를 들면, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 여과, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 칼럼 크로마토그래피가 선택된 조합을 포함하는, 종래의 단백질 분리법 및/또는 정제법에 의해, 항체를 복수로부터 정제할 수 있다(Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and David, Lane (edit.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

프로테인 A 칼럼 및 프로테인 G 칼럼을 친화성 칼럼으로서 사용할 수 있다. 사용되는 예시적인 프로테인 A 칼럼에는, Hyper D, POROS, 및 Sepharose F.F.(Pharmacia)가 포함된다.

크로마토그래피(친화성 크로마토그래피를 제외함)에는, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 및 흡착 크로마토그래피가 포함된다("Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual" Daniel R Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). HPLC나 FPLC 등의 액상 크로마토그래피의 수순에 따라, 크로마토그래피를 실시할 수 있다.

이와 같이 하여 제작되는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마는, 통상의 배양액 중에서 계대배양이 가능하고, 또한, 액체질소 중에서 장기 보존하는 것이 가능하다.

또한 항체생산용 면역원을 사용하여 임의의 포유동물을 면역화할 수 있다. 그러나, 하이브리도마를 생산함으로써 단일클론항체를 조제하는 경우에는, 하이브리도마 생산용 세포융합에 있어서 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하는 것이 바람직하다.

일반적으로, 그러한 면역화에는, 설치류, 토끼목, 또는 영장류가 사용된다. 설치류에는, 예를 들면, 마우스, 랫트, 및 햄스터가 포함된다. 토끼목에는, 예를 들면 토끼가 포함된다. 영장류에는, 예를 들면 게잡이원숭이(Macaca fascicularis), 붉은털 원숭이(Macaca mulatta), 망토비비 및 침팬지 등의 협지원류(구세계) 원숭이가 포함된다.

이 밖에도, 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 포함하는 형질전환 동물의 사용은, 당기술분야에 있어서 공지이다(Ishida I, et al., Cloning and Stem Cells 4: 91-102, 2002). 기타 동물과 마찬가지로, 인간 단일클론항체를 입수하기 위해서는, 형질전환 동물을 면역화하고, 이어서, 항체생산세포를 동물로부터 수집하여, 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 얻고, 이들 하이브리도마로부터 항단백질 인간 항체를 조제할 수 있다(국제공보 제92-03918호, 제94-02602호, 제94-25585호, 제96-33735호, 및 제96-34096호 참조).

또는, 암 유전자에 의해 불활성화된 림프구가, 단일클론항체 생산을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, EB 바이러스 등에 의해 감염된 인간 림프구가, 면역원에 의해 인 비트로에서 면역화될 수 있다. 이어서, 면역화된 림프구를, 무한 분열 가능한 인간 유래 골수종세포(U266 등)와 융합시키고, 이와 같이 하여, 목적하는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 입수한다(일본국 특허출원 공개공보(JP-A) 소63-17688).

일단, 상기 방법 중 어느 하나를 매개로 하여 단일클론항체를 얻을 수 있다면, 그것은, 유전자 조작법을 사용해서도 조제될 수 있다(예를 들면, Borrebaeck CAK and Larrick JW, Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers, UK, 1990 참조). 예를 들면, 재조합 항체는, 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 림프구와 같은 항원생산세포로부터 목적의 항체를 코드하는 DNA를 클로닝하고, 이어서, 클로닝된 DNA를 적절한 벡터에 삽입하여, 벡터를 적당한 숙주세포에 형질전환함으로써 조제될 수 있다. 그러한 재조합 항체도 본 발명에 포함된다.

본 발명에 있어서의 단일클론항체로서는, 예를 들면 1A9 단일클론항체, 2C3 단일클론항체, E12 단일클론항체, 1C10 단일클론항체, 4D3 단일클론항체를 들 수 있다. 바람직하게는, 이하의 (i)~(iii) 중 어느 하나에 기재된 항체이다.

(i) 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬(중쇄), 및 서열번호:3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬(경쇄)을 포함하는 항체

(ii) 서열번호:21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬(중쇄), 및 서열번호:23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬(경쇄)을 포함하는 항체

(iii) 서열번호:41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬(중쇄), 및 서열번호:43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬(경쇄)을 포함하는 항체

또한 본 발명 항체의 하나의 태양으로서, 저분자화 항체를 들 수도 있다. 저분자화 항체는, 전장 항체의 일부분이 결손되어 있는 항체 단편을 포함하고, 항원으로의 결합능을 가지고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 항체 단편으로서는, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 등을 들 수 있다. 또한, 저분자화 항체로서는, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv(single chain Fv), Diabody, sc(Fv)2(single chain (Fv)2) 등을 들 수 있다.

여기서, 본 발명의 단백질에 대한 다중클론항체를 얻기 위해서는, 혈청 중의 목적하는 항체 레벨이 상승된 것을 확인한 후, 항원을 감작한 포유동물의 혈액을 꺼낸다. 이 혈액으로부터 공지의 방법에 의해 혈청을 분리한다. 다중클론항체로서는, 다중클론항체를 포함하는 혈청을 사용해도 되고, 필요에 따라 이 혈청으로부터 다중클론항체를 포함하는 획분을 추가적으로 단리하여, 이를 사용해도 된다. 예를 들면, 본 발명의 단백질을 커플링시킨 친화성 칼럼을 사용하여, 본 발명의 단백질만을 인식하는 획분을 얻고, 추가적으로 이 획분을 프로테인 A 또는 프로테인 G 칼럼을 이용하여 정제함으로써, 면역글로불린 G 또는 M을 조제할 수 있다.

본 발명에 있어서, Aβ 올리고머와 결합하는 항체는, 1A9, 2C3, E12, 1C10 또는 4D3가 결합하는 Aβ 올리고머와 결합하는 항체로, 바람직하게는 이하의 (A)~(C) 중 어느 하나에 기재된 항체이다.

(A) 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬(중쇄), 및 서열번호:3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬(경쇄)을 포함하는 항체가 결합하는 Aβ 올리고머와 결합하는 항체

(B) 서열번호:21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬, 및 서열번호:23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체가 결합하는 Aβ 올리고머와 결합하는 항체

(C) 서열번호:41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬, 및 서열번호:43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체가 결합하는 Aβ 올리고머와 결합하는 항체

또한 본 발명은, 본 발명의 항체가 결합하는 Aβ 올리고머를 제공한다. 항체로서는, 바람직하게는 1A9 단일클론항체, 2C3 단일클론항체, E12 단일클론항체, 1C10 단일클론항체 또는 4D3 단일클론항체를 들 수 있다. 이러한 Aβ 올리고머는, 항체를 조제하기 위한 항원이나, 백신으로서 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 항체의 바람직한 태양으로서, 예를 들면 이하의 (1)~(20) 중 어느 하나에 기재된 항체를 들 수 있다.

(1) CDR1으로서 서열번호:9에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:11에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(2) CDR1으로서 서열번호:15에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:17에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체

(3) (1)에 기재된 H사슬, 및 (2)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(4) VH로서 서열번호:5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(5) VL로서 서열번호:7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체

(6) (4)에 기재된 H사슬, 및 (5)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(7) CDR1으로서 서열번호:29에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:31에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(8) CDR1으로서 서열번호:35에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:37에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체

(9) (7)에 기재된 H사슬, 및 (8)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(10) VH로서 서열번호:25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(11) VL로서 서열번호:27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체

(12) (10)에 기재된 H사슬, 및 (11)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(13) CDR1으로서 서열번호:49에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:51에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:53에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(14) CDR1으로서 서열번호:55에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:57에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:59에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체

(15) (13)에 기재된 H사슬, 및 (14)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(16) VH로서 서열번호:45에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체

(17) VL로서 서열번호:47에 기재된 아미노산 서열을 가는 L사슬을 포함하는 항체

(18) (16)에 기재된 H사슬, 및 (17)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체

(19) (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1) 내지 (18) 중 어느 한 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체

(20) (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체

상기 (1)에 기재된 「CDR1으로서 서열번호:9에 기재된 아미노산 서열(E12 항체의 H사슬 CDR1의 서열), CDR2로서 서열번호:11에 기재된 아미노산 서열(E12 항체의 H사슬 CDR2의 서열), 및 CDR3로서 서열번호:13에 기재된 아미노산 서열(E12 항체의 H사슬 CDR3의 서열)을 갖는 H사슬」에 있어서의 VH로서는, 서열번호:5에 기재된 아미노산 서열(E12 항체의 VH의 서열)을 갖는 VH를 예시할 수 있다.

또한, 상기 (2)에 기재된 「CDR1으로서 서열번호:15에 기재된 아미노산 서열(E12 항체의 L사슬 CDR1의 서열), CDR2로서 서열번호:17에 기재된 아미노산 서열(E12 항체의 L사슬 CDR2의 서열), 및 CDR3로서 서열번호:19에 기재된 아미노산 서열(E12 항체의 L사슬 CDR3의 서열)을 갖는 L사슬」에 있어서의 VL로서는, 서열번호:7에 기재된 아미노산 서열(E12 항체의 VL의 서열)을 갖는 VL을 예시할 수 있다.

또한, 상기 (7)에 기재된 「CDR1으로서 서열번호:29에 기재된 아미노산 서열(1C10 항체의 H사슬 CDR1의 서열), CDR2로서 서열번호:31에 기재된 아미노산 서열(1C10 항체의 H사슬 CDR2의 서열), 및 CDR3로서 서열번호:33에 기재된 아미노산 서열(1C10 항체의 H사슬 CDR3의 서열)을 갖는 H사슬」에 있어서의 VH로서는, 서열번호:25에 기재된 아미노산 서열(1C10 항체의 VH의 서열)을 갖는 VH를 예시할 수 있다.

또한, 상기 (8)에 기재된 「CDR1으로서 서열번호:35에 기재된 아미노산 서열(1C10 항체의 L사슬 CDR1의 서열), CDR2로서 서열번호:37에 기재된 아미노산 서열(1C10 항체의 L사슬 CDR2의 서열), 및 CDR3로서 서열번호:39에 기재된 아미노산 서열(1C10 항체의 L사슬 CDR3의 서열)을 갖는 L사슬」에 있어서의 VL로서는, 서열번호:27에 기재된 아미노산 서열(1C10 항체의 VL의 서열)을 갖는 VL을 예시할 수 있다.

또한, 상기 (13)에 기재된 「CDR1으로서 서열번호:49에 기재된 아미노산 서열(4D3 항체의 H사슬 CDR1의 서열), CDR2로서 서열번호:51에 기재된 아미노산 서열(4D3 항체의 H사슬 CDR2의 서열), 및 CDR3로서 서열번호:53에 기재된 아미노산 서열(4D3 항체의 H사슬 CDR3의 서열)을 갖는 H사슬」에 있어서의 VH로서는, 서열번호:45에 기재된 아미노산 서열(4D3 항체의 VH의 서열)을 갖는 VH를 예시할 수 있다.

또한, 상기 (14)에 기재된 「CDR1으로서 서열번호:55에 기재된 아미노산 서열(4D3 항체의 L사슬 CDR1의 서열), CDR2로서 서열번호:57에 기재된 아미노산 서열(4D3 항체의 L사슬 CDR2의 서열), 및 CDR3로서 서열번호:59에 기재된 아미노산 서열(4D3 항체의 L사슬 CDR3의 서열)을 갖는 L사슬」에 있어서의 VL로서는, 서열번호:47에 기재된 아미노산 서열(4D3 항체의 VL의 서열)을 갖는 VL을 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서의 E12 항체의 H사슬 전장의 아미노산 서열을 서열번호:1, 염기서열을 서열번호:2, L사슬 전장의 아미노산 서열을 서열번호:3, 염기서열을 서열번호:4, H사슬 가변영역(VH)의 아미노산 서열을 서열번호:5, 염기서열을 서열번호:6, L사슬 가변영역(VL)의 아미노산 서열을 서열번호:7, 염기서열을 서열번호:8, H사슬 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호:9, 염기서열을 서열번호:10, H사슬 CDR2의 아미노산 서열을 서열번호:11, 염기서열을 서열번호:12, H사슬 CDR3의 아미노산 서열을 서열번호:13, 염기서열을 서열번호:14, L사슬 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호:15, 염기서열을 서열번호:16, L사슬 CDR2의 아미노산 서열을 서열번호:17, 염기서열을 서열번호:18, L사슬 CDR3의 아미노산 서열을 서열번호:19, 염기서열을 서열번호:20에 나타낸다.

본 발명에 있어서의 1C10 항체의 H사슬 전장의 아미노산 서열을 서열번호:21, 염기서열을 서열번호:22, L사슬 전장의 아미노산 서열을 서열번호:23, 염기서열을 서열번호:24, H사슬 가변영역(VH)의 아미노산 서열을 서열번호:25, 염기서열을 서열번호:26, L사슬 가변영역(VL)의 아미노산 서열을 서열번호:27, 염기서열을 서열번호:28, H사슬 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호:29, 염기서열을 서열번호:30, H사슬 CDR2의 아미노산 서열을 서열번호:31, 염기서열을 서열번호:32, H사슬 CDR3의 아미노산 서열을 서열번호:33, 염기서열을 서열번호:34, L사슬 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호:35, 염기서열을 서열번호:36, L사슬 CDR2의 아미노산 서열을 서열번호:37, 염기서열을 서열번호:38, L사슬 CDR3의 아미노산 서열을 서열번호:39, 염기서열을 서열번호:40에 나타낸다.

본 발명에 있어서의 4D3 항체의 H사슬 전장의 아미노산 서열을 서열번호:41, 염기서열을 서열번호:42, L사슬 전장의 아미노산 서열을 서열번호:43, 염기서열을 서열번호:44, H사슬 가변영역(VH)의 아미노산 서열을 서열번호:45, 염기서열을 서열번호:46, L사슬 가변영역(VL)의 아미노산 서열을 서열번호:47, 염기서열을 서열번호:48, H사슬 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호:49, 염기서열을 서열번호:50, H사슬 CDR2의 아미노산 서열을 서열번호:51, 염기서열을 서열번호:52, H사슬 CDR3의 아미노산 서열을 서열번호:53, 염기서열을 서열번호:54, L사슬 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호:55, 염기서열을 서열번호:56, L사슬 CDR2의 아미노산 서열을 서열번호:57, 염기서열을 서열번호:58, L사슬 CDR3의 아미노산 서열을 서열번호:59, 염기서열을 서열번호:60에 나타낸다.

상기 (1) 내지 (20)에 기재된 항체에는, 1가 항체 뿐 아니라, 2가 이상의 다가 항체도 포함된다. 본 발명의 다가 항체에는, 모두 동일한 항원결합부위를 갖는 다가 항체, 또는 일부 또는 모두 상이한 항원결합부위를 갖는 다가 항체가 포함된다.

상기 (19)에 기재된 항체의 바람직한 태양은, CDR에 개변이 생기지 않은 항체이다. 일례로서, 상기 (19)에 기재된 항체 중, 「(1)에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체」의 바람직한 태양은, 「(1)에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖고, (1)에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, CDR1으로서 서열번호:9에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:11에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체」이다. 상기 (19)에 기재된 항체 중, 기타 항체의 바람직한 태양도 동일하게 표현할 수 있다.

여기에서 「동등한 활성」이란, 대상이 되는 항체가 본 발명의 항체와 동일한 생물학적 또는 생화학적 활성을 갖는 것을 가리킨다. 본 발명에 있어서의 「활성」으로서는, 예를 들면, Aβ 올리고머에 특이적으로 결합하고 Aβ 모노머에 결합하지 않는 활성, 항신경독성활성, Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성, 항시냅스 독성활성, 항기억장애활성을 예시할 수 있다.

어느 한 폴리펩티드와 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드를 조제하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면, 부위특이적 변이유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 사용하여, 본 발명의 항체에 적절히 변이를 도입함으로써, 그 항체와 동등한 활성을 갖는 항체를 조제할 수 있다. 또한, 아미노산의 변이는 자연계에 있어서도 발생할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 항체의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 변이된 아미노산 서열을 갖고, 그 항체와 동등한 활성을 갖는 항체도 또한 본 발명의 항체에 포함된다. 이러한 변이체에 있어서의, 변이되는 아미노산 수는, 통상 50 아미노산 이내이고, 바람직하게는 30 아미노산 이내이며, 더욱 바람직하게는 10 아미노산 이내(예를 들면, 5 아미노산 이내)라고 생각된다.

변이되는 아미노산 잔기에 있어서는, 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 다른 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들면 아미노산 측쇄의 성질로서는, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 황원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)을 들 수 있다(괄호 안은 모두 아미노산의 1문자 표기를 나타낸다).

일반적으로, 어느 한 아미노산 서열에 있어서의 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기에 의해 수식(결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환)된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 그 생물학적 활성(기능)을 유지하는 것은 공지이다.

전술한 수식에 더하여, 본 발명의 항체는, 활성을 유지하고 있는 한, 다른 물질에 추가적으로 연결되어 있어도 된다. 다른 물질로서는, 예를 들면, 펩티드, 지질, 당 및 당사슬, 아세틸기, 천연 및 합성의 폴리머 등을 들 수 있다. 이들 수식은, 부가적인 기능을 부여하거나, 또는 항체를 안정화하기 위해 실시될 수 있다.

본 발명의 항체의 아미노산 서열에 복수 개의 아미노산 잔기가 부가된 항체에는, 이들 항체를 포함하는 융합 단백질이 포함된다. 융합 단백질이란, 이들 항체와 다른 펩티드 또는 단백질이 융합된 것이다. 융합 단백질을 제작하는 방법은, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 다른 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 프레임이 일치하도록 연결하고 이것을 발현벡터에 도입하여, 숙주에서 발현시키면 되고, 당업자에게 공지의 수법을 사용할 수 있다. 본 발명의 항체와의 융합에 사용되는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드로서는, 예를 들면, FLAG(Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6개의 His(히스티딘)잔기로 되는 6×His, 10×His, 인플루엔자 응집소(HA), 인간 c-myc의 단편, VSV-GP의 단편, p18HIV의 단편, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T 항원의 단편, lck tag, α-tubulin의 단편, B-tag, Protein C의 단편 등의 공지의 펩티드, GST(글루타티온-S-트랜스페라아제), 면역글로불린 정상영역, β-갈락토시다아제, MBP(말토오스 결합 단백질) 등을 들 수 있다. 시판되고 있는 이들 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 융합시키고, 이것에 의해 조제된 융합 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써, 융합 폴리펩티드를 조제할 수 있다.

본 발명의 항체는, 생산하는 세포나 숙주 또는 정제방법에 따라, 아미노산 서열, 분자량, 당사슬의 유무나 형태 등이 상이할 수 있다. 그러나, 얻어진 항체가, 본 발명의 항체와 동등한 활성을 가지고 있는 한, 본 발명에 포함된다.

(1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 얻는 것이 가능하다. 예를 들면, (1) 내지 (18) 중 어느 하나의 항체가 결합하는 에피토프를 통상의 방법에 의해 결정하고, 그 에피토프가 포함되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 면역원으로서 항체를 제작하는 방법이나, 통상의 방법으로 제작된 항체의 에피토프를 결정하고, (1) 내지 (18) 중 어느 하나의 항체와 에피토프가 동일한 항체를 선택하는 방법 등에 의해 얻을 수 있다.

상기 (1) 내지 (20)에 기재된 항체에는, 전술한 저분자화 항체, 인간화 항체나 키메라화 항체 등의 아미노산 서열이 개변된 항체, 비인간 동물 항체, 인간 항체, 다른 분자(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜 등의 고분자 등)가 결합한 수식 항체, 당사슬이 개변된 항체 등 어떠한 항체도 포함된다.

본 발명에 있어서의 항체의 바람직한 태양의 하나로서, 키메라 항체 또는 인간화 항체 등의 개변 항체를 들 수 있다. 보다 바람직한 태양으로서는, 가변영역이 E12 항체, 1C10 항체 또는 4D3 항체 유래의 가변영역이고, 또한 정상영역이 인간 면역글로불린 유래의 정상영역인 것을 특징으로 하는 키메라 항체, CDR이 E12 항체, 1C10 항체 또는 4D3 항체 유래의 CDR이고, FR이 인간 면역글로불린 유래의 FR이며, 또한 정상영역이 인간 면역글로불린 유래의 정상영역인 것을 특징으로 하는 인간화 항체를 들 수 있다. 또한 이들 개변 항체는, 기지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체나 인간화 항체는 인간 체내에 있어서의 항원성이 저하되어 있기 때문에, 치료 목적 등으로 인간에게 투여하는 경우에 유용하다.

키메라 항체는, 상이한 동물 유래의 서열을 조합하여 제작되는 항체로, 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상영역으로 되는 항체 등이다. 키메라 항체의 제작은 공지의 방법을 사용하여 행할 수 있다(예를 들면, Jones et al., Nature 321:522-5, 1986;Riechmann et al., Nature 332:323-7, 1988; 및 Presta, Curr Opin Struct Biol 2:593-6, 1992 참조). 예를 들면, 먼저, 관심 대상 항체의 가변영역 또는 CDR을 코드하는 유전자가, 항체생산세포의 RNA로부터 폴리머라아제 연쇄반응(PCR) 등에 의해 조제된다(예를 들면, Larrick et al., "Methods: a Companion to Methods in Enzymology", Vol. 2: 106, 1991;Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application;Ritter et al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, 1995, and Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications;Birch et al. (eds.), page 137, Wiley-Liss, Inc., 1995 참조). 조제된 가변영역을 코드하는 유전자를, 정상영역 또는 프레임워크영역을 코드하는 유전자와 연결한다. 정상영역 또는 프레임워크영역을 코드하는 유전자는, CDR을 코드하는 유전자와 동일하게 결정될 수 있고, 또는 기존 항체의 서열정보를 토대로, 그들을 조제하는 것도 가능하다. 키메라 산물 및 CDR 그래프트 산물을 코드하는 DNA 서열은, 올리고뉴클레오티드 합성기술을 사용하여, 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, Jones 등(Nature 321:522-5, 1986)에 의해 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드용 합성이 사용될 수 있다. 또한, 일부의 경우에는, 부위특이적 돌연변이 유발 및 폴리머라아제 연쇄반응의 기술이 적절히 사용될 수 있다. Verhoeyen 등(Science 239: 1534-6, 1988) 또는 Riechmann 등(Nature 332: 323-7, 1988)에 의해 기재된 기존의 가변영역의 올리고뉴클레오티드 특이적 돌연변이 유발을 위한 기술이, 가변영역의 서열을 수식하고, 예를 들면, 키메라 항체의 결합능력을 증강하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 필요하다면, 예를 들면, Queen 등(Proc Natl Acad Sci USA 86: 10029-33, 1989;WO 90/07861)에 의해 기재된 바와 같은, T4 DNA 폴리머라아제를 사용한, 갭을 갖는 올리고뉴클레오티드의 효소적 필인(filling in)이 사용될 수 있다.

예를 들면 CDR 그래프트 기술은, 당기술분야에 있어서 공지이다("Immunoglobulin genes", Academic Press (London), pp260-74, 1989;Michael A et al., Proc Natl Acad Sci USA 91: 969-73, 1994). 이 기술에 의하면, 어느 한 항체의 CDR이, 다른 항체의 CDR과 교환된다. 그러한 교환을 통해, 전자의 항체의 결합 특이성이, 후자의 항체의 것으로 변화된다. 그러한 키메라 항체 중, 프레임워크 아미노산이 인간 항체에 유래하는 것은, 「인간화 항체(CDR 그래프트 항체)」라 불린다. 인간의 처치에 항체를 사용하는 경우에는, 인간 항체 또는 인간화 항체를 사용하는 것이 바람직하다.

일반적으로, 키메라 항체는, 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간 항체 유래의 정상영역으로 된다. 한편, 인간화 항체는, 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 CDR(상보성 결정영역)과, 인간 항체 유래의 프레임워크영역 및 정상영역으로 된다.

또한, 키메라 항체나 인간화 항체를 제작한 후에, 가변영역(예를 들면, FR)이나 정상영역 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나 해도 된다.

키메라 항체에 있어서의 가변영역, 또는 인간화 항체에 있어서의 CDR의 유래는 특별히 한정되지 않는다.

또한, 키메라 항체 및 인간화 항체의 C영역에는, 인간 항체의 것이 사용되고, 예를 들면, H사슬로서는, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2, Cε를, L사슬로서는 Cκ, Cλ를 사용할 수 있다. 이들 서열은 공지이다. 또한, 항체 또는 그 생산의 안정성을 개선하기 위해, 인간 항체 C영역을 수식할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체의 항원(Aβ 올리고머)으로의 결합활성은, 예를 들면 흡광도측정법, 효소결합 면역흡착 어세이법(ELISA), 효소면역 어세이법(EIA), 방사면역 어세이법(RIA), 및/또는 면역형광법 등을 사용하여 행할 수 있다. ELISA에서는, 항체를 플레이트 상에 고정하고, 그것에 대한 항원을 플레이트에 첨가하여, 이어서, 항체를 생산하는 세포의 배양상청 또는 정제항체 등의 목적하는 항체를 포함하는 시료를 첨가한다. 다음으로, 1차항체를 인식하고 또한 알칼리포스파타아제 등의 효소로 태그 부가된 2차항체를 첨가하고, 플레이트를 인큐베이션한다. 세정 후에, p-니트로페닐인산 등의 효소기질을 플레이트에 첨가하고, 흡광도를 측정하여, 목적 시료의 항원결합능력을 평가한다. 평가는 BIAcore(Pharmacia)를 사용해서 행해질 수 있다.

또한 본 발명은, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명자 등에 의해, 후술하는 바와 같이, 단일클론의 1A9 또는 2C3 항체가, 알츠하이머 유사 표현형을 예방하기 위한 치료용 항체의 유망한 후보인 것이 강하게 시사되었다. 예를 들면, 기억력 저하는 가용성 Aβ 올리고머에 의해 야기되는 시냅스 기능부전에 상당하는 것이 나타내어져 있다[Klein WL, 2001, Trends Neurosci;Selkoe DJ, 2002, Science]. Aβ 올리고머의 과도한 축적 및 침착은, 알츠하이머병을 결과적으로 야기하는 복잡한 하류 캐스캐이드의 원인이 될 가능성이 있다. 만일 그렇다면, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 사용한 치료적 개입은, 이 병적 캐스캐이드를 차단하는데 유효할 가능성이 있어, 그것은 알츠하이머병을 치료하는 것을 가능하게 할 것으로 생각된다.

본 발명에 있어서 「치료」란, 질환 또는 질병에 따른 증상을 나타내는 장기, 조직에 대해, 반드시 완전한 치료효과 또는 예방효과를 가질 필요는 없고, 부분적인 효과를 갖는 경우여도 된다.

본 발명에 있어서의 「알츠하이머병의 치료」란, 알츠하이머병에 의해 생길 수 있는 하나 이상의 증상을 개선하는 것으로, 예를 들면, 인지기능장애의 개선이나 억제, 노인반 형성의 개선이나 억제, 시냅스 기능부전의 개선이나 억제, 뇌조직 중 또는 혈액 중 등에 있어서의 Aβ 축적의 감소나 억제 등을 들 수 있다. 여기서 「인지기능장애」에는, 예를 들면, 기억장애로 여겨지는, 장기/단기 기억장애, 물체 인식 기억장애, 공간기억장애, 및 연합정서기억장애가 포함된다.

즉, 본 발명은 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 의약 조성물 또는 약제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 「상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 유효성분으로서 함유하는」이란, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 주요 성분으로서 포함한다는 의미이고, 함유율을 제한하는 것은 아니다.

상기 의약 조성물로서는, 예를 들면 항인지기능장애제, 알츠하이머병 치료제, 알츠하이머병 진행 억제제, 노인반 형성 억제제, Aβ 축적 억제제, 항신경독성제(신경독성 중화제), Aβ 아밀로이드 섬유 형성 저해제, 항시냅스 독성제(시냅스 독성 중화제) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 상기 의약 조성물은, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상(개체)에 투여하는 공정을 포함하는, 예를 들면, 「알츠하이머병을 억제하는 방법」으로 표현하는 것도 가능하다. 다른 태양으로서는, 인지기능장애를 억제하는 방법, 알츠하이머병의 진행을 억제하는 방법, 노인반 형성을 억제하는 방법, Aβ의 축적을 억제하는 방법, 신경독성활성을 중화하는(억제하는) 방법, Aβ 아밀로이드 섬유 형성을 저해하는 방법, 또는 시냅스 독성활성을 중화하는(억제하는) 방법도 들 수 있다. 또한 다른 태양으로서, 인지기능장애의 예방 및 치료 중 어느 하나, 또는 양쪽을 위한 방법, 알츠하이머병의 예방 및 치료 중 어느 하나, 또는 양쪽을 위한 방법도 들 수 있다.

또는, 상기 의약 조성물의 제조에 있어서의, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 사용으로 표현하는 것도 가능하다.

또한 본 발명은, 이하의 각 조성물에 관한 것이다.

·인지기능장애의 예방 및 치료 중 어느 하나, 또는 양쪽에 사용하기 위한, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물

·알츠하이머병의 예방 및 치료 중 어느 하나, 또는 양쪽에 사용하기 위한, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물

·알츠하이머병 진행 억제에 사용하기 위한, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물

·노인반 형성 억제에 사용하기 위한, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물

·Aβ 축적 억제에 사용하기 위한, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물

·신경독성활성 중화(억제)에 사용하기 위한, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물

·Aβ 아밀로이드 섬유 형성 저해에 사용하기 위한, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물

·시냅스 독성활성 중화(억제)에 사용하기 위한, 상기 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물

상기 본 발명의 약제는, 인간 또는 기타 동물에 투여 가능하다. 본 발명에 있어서, 약제를 투여하는 인간 이외의 동물에는, 마우스, 랫트, 기니피그, 토끼, 닭, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 비비, 및 침팬지가 포함될 수 있다. 이들 동물은, 예를 들면, 인지기능장애, 노인반 형성, 시냅스 기능부전, 뇌조직 중 또는 혈액 중에 있어서의 Aβ 축적 등의 증상 중 하나 이상의 증상을 나타내는 동물인 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물에 함유되는 항체는, 상기 본 발명의 항체인 한 특별히 제한은 없고, 예를 들면 본 명세서 중에 기재된 항체를 예시할 수 있다.

상기 본 발명의 항체를 의약 조성물로서 사용하는 경우에는, 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라, 물 또는 다른 임의의 약학적으로 허용되는 액체로 무균성 용액 또는 현탁액으로 함으로써, 비경구적으로 투여될 수 있는 주사 가능한 형태로 조제할 수 있다. 예를 들면, 의약 조성물에 포함되어야 하는 항체를, 허용되는 담체 또는 용매, 구체적으로는 멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 용제, 보존제, 결합제 등과 혼합하여, 약제로서의 사용에 필요한 일반적으로 허용되는 단위용량으로 할 수 있다. 「약학적으로 허용되는」이라는 용어는, 그 물질이 불활성이고, 또한 약물용 희석제 또는 비히클로서 사용되는 종래 물질을 포함하는 것을 나타낸다. 적절한 부형제 및 그 제형은, 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th ed. (1980) Mack Publishing Co., ed. Oslo et al.에 기재되어 있다.

생리식염수, 글루코오스, 및 애쥬번트(D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 및 염화나트륨 등)를 포함하는 다른 등장성 용액을, 주사용 수용액으로서 사용할 수 있다. 이들은 알코올, 구체적으로는 에탄올 및 폴리알코올(예를 들면 프로필렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜), 및 비이온성 계면활성제(예를 들면 폴리소르베이트 80(상표) 또는 HCO-50) 등의 적절한 가용화제와 함께 사용할 수 있다.

참기름 또는 대두유를 유성 액체로서 사용할 수 있고, 이들과 함께 가용화제로서 안식향산 벤질 또는 벤질알코올을 사용해도 된다. 완충액(인상완충액, 초산나트륨완충액 등), 진통제(염산프로카인 등), 안정제(벤질알코올, 페놀 등), 및 항산화제를 제제로 사용할 수 있다. 조제한 주사액은 적절한 앰플에 충전할 수 있다.

투여는 바람직하게는 비경구투여이고, 구체적으로는, 주사제형, 경비투여제형, 경폐투여제형, 경피투여형 등을 들 수 있다. 주사제형의 예로서는, 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.

의약 조성물은, 약학적으로 유효한 양의 활성성분(상기 본 발명의 항체)을 포함한다. 화합물의 「약학적으로 유효한 양」이란, 상기 본 발명의 항체가 중요한 역할을 하고 있는 장애를 처치 및/또는 예방하기에 충분한 양이다. 약학적으로 유효한 양의 예는, 개체(환자)에 투여된 경우에, 예를 들면 Aβ의 축적을 감소, Aβ 유발성의 독성을 중화, 또는 Aβ 원섬유 형성을 감소시키고, 그것에 의해 알츠하이머병에 의해 생기는 장애를 처치 또는 예방하기 위해 필요한 양일 수 있다. 감소 또는 중화는, 예를 들면, 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 감소 또는 중화일 수 있다.

상기 본 발명의 항체의 그러한 약학적으로 유효한 양을 결정하기 위한 사정은, 조직병리학적인 진단을 포함하는 표준적인 임상 프로토콜을 사용해서 이루어질 수 있다.

또한, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 항체를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는, 예를 들면, 1회에 대해 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1000 ㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는, 예를 들면, 환자당 0.001~100000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있으나, 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여방법은, 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라 변동되나, 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하다. 후술하는 동물실험에서는, 인간에서 보험이 적용되는 면역글로불린 대량 정맥주사요법(400 ㎎/㎏)에 준하여 투여량을 선택하였다.

또한 본 발명은, 샘플 중의 Aβ 올리고머(예를 들면 Aβ40(Aβ1-40) 올리고머 및 Aβ42(Aβ1-42) 올리고머를 들 수 있다)를 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서의 「샘플」로서는, 예를 들면 피험자로부터 채취된 시료를 들 수 있다. 본 방법에는, 구체적으로는, 피험자로부터 채취된 시료에 포함되는 Aβ 올리고머를, 본 발명의 항체를 사용하여 검출하는 공정이 포함된다. 시료 중의 Aβ 올리고머의 측정은, 예를 들면 화학발광을 이용하는 샌드위치 고상 효소면역 어세이(화학발광-ELISA)에 의한 방법, 및 취득 항체로의 면역침강법, 이뮤노블로팅, 플로우 사이토메트리, 질량분석법, 면역조직화학법 등의 방법을 사용할 수 있다.

상기 측정방법에 의해, 피험자로부터 채취된 시료 중에 Aβ 올리고머가 검출되는 경우에, 피험자는 알츠하이머병 후보라고 생각할 수 있다. 예를 들면, 피험자와 건강한 정상인 각각으로부터 채취된 시료 중에 있어서의 Aβ 올리고머량을 비교하여, 피험자의 Aβ 올리고머량이 건강한 정상인의 Aβ 올리고머량과 비교하여 많다고 판정되는 경우에, 피험자가 알츠하이머병 후보라고 판단된다. 피험자가 알츠하이머병 후보인지 여부의 진단은, 통상, 의사(의사의 지시를 받은 자도 포함한다. 이하 동일.)에 의해 행해지나, 본 진단방법에 의해 얻어지는, 피험자와 건강한 정상인 각각으로부터 채취된 시료 중에 있어서의 Aβ 올리고머량에 관한 데이터는, 의사에 의한 진단에 도움이 되는 것이다. 따라서, 본 진단방법은, 의사에 의한 진단에 도움이 되는 데이터를 수집하고, 제시하는 방법으로도 표현할 수 있다.

즉, 본 발명은 본 발명에 기재된 항체를 사용하여, 피험자로부터 채취된 시료에 있어서의 Aβ 올리고머를 검출하는 것을 특징으로 하는, 피험자가 알츠하이머병 후보인지 여부를 진단하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 이하의 공정을 포함하는, 피험자가 알츠하이머병 후보인지 여부를 진단하는 방법으로서, 공정(b)에 기재된 비가 건강한 정상인과 비교하여 높은 경우에, 피험자가 알츠하이머병 후보라고 판정되는 방법을 제공한다.

(a) 피험자로부터 채취한 시료, 본 발명에 기재된 항체, 및 Aβ 모노머에 결합하는 항체를 접촉시키는 공정

(b) 상기 시료 중에 있어서의 Aβ 모노머에 대한 Aβ 올리고머의 비를 측정하는 공정

먼저 본 방법에 있어서는, 피험자로부터 채취한 시료, 본 발명에 기재된 항체, 및 Aβ 모노머에 결합하는 항체를 접촉시킨다. 여기서 「접촉」이란, 예를 들면, 시험관 내에 있어서의 피험자로부터 채취한 시료에, 상기 각 항체를 첨가함으로써 행해진다. 이 경우에 있어서, 첨가되는 항체의 형상으로서는, 용액 또는 동결건조 등에 의해 얻어지는 고체 등의 형상을 적절히 사용할 수 있다. 수용액으로서 첨가되는 경우에 있어서는 순수하게 항체만을 함유하는 수용액이어도 되고, 예를 들면 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함하는 용액이어도 된다. 항체의 첨가하는 농도는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 인간 면역글로불린 제제와 동일하게 동결건조상태에서 500 ㎎, 1,000 ㎎, 2,500 ㎎ 제제 등이 바람직하게 사용될 수 있다.

다음으로, 상기 시료 중에 있어서의 Aβ 모노머에 대한 Aβ 올리고머의 비(본원 명세서에서는, 「O/M 지수」로 기재하는 경우도 있다)를 측정한다. 당해 비의 측정에 대해서는, 이하의 방법이 바람직하게 사용된다. 예를 들면, 후술하는 실시예에 기재되는 바와 같이, 동일 검체로부터 얻어진 올리고머와 모노머 ELISA값의 비 등의 방법을 사용하여 실시할 수 있다.

다음으로, 이 비를, 건강한 정상인의 경우에 있어서의 비와 비교한다. 그리고 건강한 정상인과 비교하여 피험자의 비가 높은 경우에, 피험자가 알츠하이머병 후보라고 판정한다.

본 발명의 진단방법은 인 비트로 또는 인 비보 중 어느 쪽으로도 행하는 것이 가능하나, 인 비트로에서 행해지는 것이 바람직하다.

또한 본 발명에 있어서의 「시료」란, 바람직하게는 피험자 유래의 조직이라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 피험자의 뇌(뇌실질 등), 장기, 체액(혈액, 뇌척수액 등)을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 바람직하게는 혈액(보다 바람직하게는 혈장)과 뇌척수액이다.

또한 본 발명은, 전술한 샘플 중의 Aβ 올리고머를 측정하는 방법, 또는 피험자가 알츠하이머병 후보인지 여부를 진단하는 방법에 사용하기 위한 약제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 항체를 포함하는 의약 조성물은, 대상의 병리학적 상태를 처치하기 위해 유용한 재료를 함유하고 있는 제품 및 키트에 포함될 수 있다. 제품은, 라벨을 포함하는 화합물 중 어느 하나의 용기를 포함할 수 있다. 적당한 용기에는, 보틀, 바이알, 및 시험관이 포함된다. 용기는, 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성되어 있어도 된다. 용기 표면의 라벨은, 질환 중 하나 또는 복수의 상태를 처치 또는 예방하기 위해 조성물이 사용되는 것을 나타내고 있어야 한다. 라벨은 투여를 위한 설명 등도 나타낼 수 있다.

상기의 용기에 더하여, 항체를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 키트는, 임의이며, 약학적으로 허용되는 희석제를 수납하고 있는 제2 용기를 포함할 수 있다. 이는, 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용을 위한 설명을 포함하는 포장 삽입물을 포함하는, 상업상 및 사용자의 견지에서 바람직한 기타 재료를 추가적으로 포함하고 있어도 된다.

필요에 따라, 의약 조성물을, 활성성분을 포함하는 하나 또는 복수의 단위용량 제형을 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서장치 내에 제공해도 된다. 팩은 예를 들면, 금속 또는 블리스터 팩과 같은 플라스틱 호일을 포함해도 된다. 팩 또는 디스펜서장치에는, 투여를 위한 설명서를 첨부해도 된다.

상기의 약제나 키트에 있어서는, 유효성분인 상기 본 발명의 항체 이외에, 예를 들면, 멸균수, 생리식염수, 식물유, 계면활성제, 지질, 용해보조제, 완충제, 단백질 안정제(BSA나 젤라틴 등), 보존제, 블로킹용액, 반응용액, 반응정지액, 시료를 처리하기 위한 시약 등이 필요에 따라 혼합되어 있어도 된다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

[방법]

단일클론의 1A9, 2C3, E12, 1C10 및 4D3의 제작

합성 Aβ1-42(펩티드연구소, 오사카)를 증류 탈이온수 또는 10 mM 인산완충액 중에 용해시키고, 그것을 37℃에서 18시간 인큐베이트 후, NuPAGE Tris-Glycine gel 4-12% SDS-PAGE로 펩티드를 분리하고, CBB 염색으로 가시화 후, Aβ1-42 모노머의 혼입이 없는 Aβ1-42 테트라머만을 잘라내었다. 이어서 BALB/c 마우스의 발바닥에 대해, 완전 프로인트 애쥬번트에 의해 유화시킨 2.5 ㎍의 Aβ1-42 테트라머에 의한 면역처치를 행하고, 계속해서 추가적으로 6회의 추가면역을 행하였다. 서경 림프절을 사용하여, 폴리에틸렌글리콜 1500을 사용한 Sp2/O-Ag14 세포와의 융합에 의해 하이브리도마를 제작하였다.

항체 아이소타입 판정

정제 면역글로불린의 아이소타입 판정은, Serotec(Oxford, UK) 마우스 단일클론항체 아이소타입 판정 키트를 사용해서 행하였다. 1A9 및 2C3의 아이소타입은 IgG2b였다.

도트 블롯 해석(1차 스크리닝)

초기 스크리닝은, 18시간 프리인큐베이트한 2.5 ㎕의 Aβ1-42(2.5 ㎍/dot)를 니트로셀룰로오스막 상에 고상화하는 도트 블롯 해석으로 행하였다. 막 상의 비특이 결합부위를 5% 저지방유, 1% BSA 및 0.05% Tween-20을 함유하는 인산완충액으로 블로킹 후, 배양액 상청과 함께 인큐베이트하였다. 배양상청 중의 Aβ 올리고머 결합항체는 서양고추냉이 퍼옥시다아제 표지 염소 항마우스F(ab')₂(1:3000;Amersham)로 검출하고, LAS3000 mini(Fujitsu, Tokyo, Japan)를 사용하는 고감도 화학발광(ECL) 키트에 의해 추출하였다. 400종의 클론 중, 1A9 및 2C3를 포함하는 도트 블롯 양성 16종을 하기와 같이 2차 스크리닝에 제공하였다.

면역침강 및 이뮤노블롯 해석(2차 스크리닝)

1차 스크리닝으로 선택한 16종의 클론이 AD 뇌내의 Aβ 올리고머를 포착할 수 있는지 여부를 조사하는 2차 스크리닝을 위해, Aβ 올리고머를 대량으로 함유하는 아밀로이드 분획(Matsubara E, et al, Neurobiol Aging, 2004)으로 면역침강실험(Ghiso J, et al, Biochem J, 1993)을 행하였다. AD 뇌로부터 조제한 완충액 불용성·포름산 가용성 획분에, 배양액 상청 및 프로테인-G-Sepharose와 인큐베이트하였다. 면역침강시킨 Aβ 올리고머는 NuPAGE 4-12% Bis-트리스-글리신 겔에 의해 분리하고, 10% 메탄올을 포함하는 10 mM 3-시클로헥실아미노-1-프로판설폰산(pH 11)을 사용하여, 니트로셀룰로오스막 또는 Immobilon P(Millipore) 상에 400 mA로 1시간 전사하였다. 막 상의 비특이 결합부위를 5% 저지방유, 1% BSA 및 0.05% Tween-20을 함유하는 인산완충액으로 실온에서 3시간 블로킹하였다. 면역침강시킨 Aβ 올리고머의 검출은, 단일클론의 4GB(1:1000) 또는 6E10(1:1000)을 사용한 이뮤노블로팅을 전술한 바와 같이 행하여, 16종의 클론 중 2종의 클론, 즉 1A9 및 2C3를 알츠하이머병에 대한 치료용 항체의 후보로서 선출하였다.

항체

단일클론항체 6E10 및 4G8(Covance Immuno-Technologies, Dedham, MA)은 인간 Aβ 서열의 1-16 및 17-24를 각각 에피토프로서 인식한다. Aβ 올리고머를 특이적으로 인식하는 다중클론의 A11은, Biosource사(Camarillo, CA)로부터 구입하였다. Alex Fluor(AF)488 또는 594 결합 염소 항마우스 IgG 및 Alex Fluor(AF)488 결합 염소 항랫트 IgG는 Molecular Probes사(Eugene, OR)로부터 구입하였다. 항마우스 IgG2b는 Sigma사(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 항시냅토피신 항체는 Santa Cruz사(Santa Cruz, CA)로부터, 항드레브린 항체는 MBL사(Nagoya, Japan)로부터 구입하였다.

사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)

1A9 또는 2C3의 사이즈 특이성을 추가적으로 평가하기 위해 SEC를 행하였다. 이전의 보고[Matsubara E, et al; Neurobiol Aging, 25: 833-841, 2004]에 기재된 방법으로는 Aβ 모노머와 Aβ 올리고머, 리포단백 결합성 Aβ와 리포단백 비결합성 Aβ의 선택적 분리가 가능하였다. 본 발명자 등은 APP/PS1을 강발현시킨 HEK293 세포로부터의 배양상청을 Microcon 3 kDa 분자량 커트오프 필터(Millipore Corp.)를 사용하여 약 10배로 농축 후, 인산완충용액으로 평형화한 Superose 12 사이즈 배제 칼럼(1 ㎝×30 ㎝, Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden, 유속 0.5 ㎖/분)으로 각 1 ㎖의 28 획분을 분획하였다. 각각의 획분의 절반을 1A9 또는 2C3를 사용하여 면역침강시켰다. 그 결과 얻어진 면역침강물 중에 존재하는 Aβ는, 4G8을 사용한 이뮤노블로팅으로 검출하였다.

알츠하이머병 환자와 age-matched 건강한 정상 증례 각 10예의 푸울한 뇌척수액(CSF)과 리포단백질 제거 CSF도 동일한 조건하에서 분획하였다. Aβ의 회수 획분의 동정은 각 획분의 ELISA 해석으로 하였다. 지질의 평가를 위해서는, 표준적인 키트(Wako, Osaka, Japan)를 사용하여 총 콜레스테롤을 효소적으로 측정하였다. 본 발명자 등의 실험조건하에서는, CSF 리포단백질은 분획 7~14 중에 용출되고, 획분 15~28은 콜레스테롤 비함유 단백질을 포함하고 있었다.

시드를 포함하지 않는 Aβ 용액의 조제

합성 Aβ1-42를 0.02% 암모니아용액 중에 250 μM으로 용해 후, 시드를 포함하지 않는 Aβ용액 조제를 목적으로, 시드로서 작용할 염려가 있는 용해되지 않은 펩티드를 Optima TL 초원심기(Beckman, USA)를 사용하여 540,000×g으로 3시간 초원심하였다. 그 상청을 회수 후 분주하여 사용시까지 -80℃에서 보존하였다. 샘플 조제는 사용 직전에 해동한 Aβ 스톡용액을 Tris-완충식염수(TBS:150 mM NaCl 및 10 mM Tris-HCl, pH 7.4)로 10배 희석하고, 25 μM용액을 이하의 실험에서 사용하였다. 합성 Aβ1-40(HCL form, 펩티드연구소, 오사카)에서는 2배 농도에서 조제를 행하였다.

Aβ 인큐베이션 및 ThT 어세이(Yamamoto N, et al: J Biol Chem, 282: 2646-2655, 2007)

Aβ용액(25 μM)을 지정 농도의 항체 존재하에서, 37℃에서 2시간 또는 24시간 인큐베이트하였다. 인큐베이션 혼합물에 있어서의 ThT 형광강도를 형광분광 광도계(RF-5300PC)(Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 사용해서 측정하였다. 5 μM ThT 및 50 mM 글리신-NaOH를 포함하는 pH 8.5의 반응혼합물(1.0 ㎖)을 사용하여, 여기파장 및 발광파장을 각각 446 nm 및 490 nm로 하여 Aβ 아밀로이드 섬유의 가장 적합한 형광강도를 측정하였다. 형광강도는 혼합물을 조제한 직후에 측정하였다.

또한, E12 항체의 Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성은, 세포배양용 배지로 12.5 μM의 농도로 희석한 Aβ1-42용액을 E12 항체의 존재하 또는 비존재하에서 37℃에서 24시간 보온 후, 상기 ThT 형광강도 측정법으로 아밀로이드 섬유 형성량을 측정함으로써 평가하였다.

Aβ 유발성 신경독성 어세이(Yamamoto N, et al: J Biol Chem, 282: 2646-2655, 2007)

랫트 갈색 세포종 PC12(PC12)세포를 10% 열 비활성화 말 혈청(Invitrogen) 및 5% 소태아 혈청(FBS)(Invitrogen)을 첨가한 Dulbecco 변법 Eagle 배지(DMEM)(Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에서 배양하였다. 신경세포로 분화유도하기 위해, 폴리-L-리신(10 ㎎/㎖)을 코팅한 배양접시에 PC12 세포를 20,000개/㎠의 밀도로 플레이팅하여, 100 ng/㎖의 신경성장인자를 첨가한 DMEM 중에서 6일간 배양하였(PC12N)(NGF;Alornone Labs, Jerusalem, Israel). PC12N에 대해, 1A9 또는 2C3 항체의 존재하 또는 비존재하에서, 시드 프리 Aβ1-42 또는 프리인큐베이트한 Aβ1-42 각 25 μM를 4℃에서 48시간에 걸쳐 폭로시켰다. Aβ1-42가 야기하는 신경독성은, Live/Dead 2색형광 어세이를 제조원의 지시(Molecular Probes, Eugene, Oregon)에 따라 평가하였다.

또한, E12 항체의 Aβ 유발성 신경독성 중화활성은 이하의 방법을 사용하여 평가하였다. 먼저, 인간 신경아종세포(SH-SY5Y)를 24 웰 플레이트에 150,000개/웰의 밀도로 10% FBS를 포함하는 DMEM 중에서 24시간 배양하였다. 다음으로, 배지를 E12 항체 첨가 또는 무첨가의 Aβ1-42(12.5 μM)를 포함하는 혈청 불함유 배지로 치환하여 추가적으로 24시간 배양하였다. Aβ1-42가 야기하는 세포독성은, 배지 중에 방출된 사세포 유래의 LDH의 양을 CytoTox96 키트(Promega사제)에 의해 측정하였다.

한외여과 및 분자체

신경독성 Aβ 올리고머의 25 μM으로의 사이즈의 특성을 명확하게 하기 위해, Microcon 3 kDa, 10 kDa, 30 kDa, 및 100 kDa 커트오프 막을 사용하는 연속적인 한외여과를 행하여, 4종의 여액(＜3 kDa, 3~10 kDa, 10~30 kDa, 30~100 kDa) 및 1종의 보유액(＞100 kDa)을 조제하였다. 각각의 획분을 전술한 바와 같이 Aβ 유발성 신경독성 어세이에 제공하였다. PC12N을 각 획분에 폭로시키고, 독성 획분을 상기한 바와 같이 평가하였다. A11, 1A9, 2C3 또는 4G8 인식 입체구조체의 분포 동정도, 전술한 도트 블록 해석에 의해 행하였다. 신경독성 올리고머 형태의 특정은, 각각의 획분을 원자간력 현미경 검사에 제공해서 행하였다.

전자현미경 검사(EM) 및 원자간력 현미경 검사(AFM)

전자현미경 검사를 위해서는, 시료를 증류수로 희석하고, 탄소 코팅한 그리드(grid) 상에 살포하였다. 그리드를 1% 인텅스텐산에 의해 음성 염색하고, Hitachi H-7000 전자현미경(Tokyo, Japan)을 가속전압 77 kV로 사용하여 검사하였다. AFM 평가는 최근 보고된 바와 같이 행하였다. 시료를 새롭게 벽개(劈開, cleave)시킨 운모 상에 적하하였다. 30분간 그대로 두고, 물로 세정한 후에, 용액상태의 시료를, 탭핑모드로 설정한 Nanoscope IIIa(Digital Instruments, Santa Barbara, CA, USA)를 사용해서 평가하였다[Tero, R, et al., Langmuir 20, 7526-7531, 2004]. OMCL-TR400PSA(Olympus, Japan)를 캔틸레버로서 사용하였다.

조직 피험자 및 추출

본 연구는, 도쿄도 노인종합연구소(Itabashi, Tokyo, Japan)의 뇌은행에 의한 부검 증례(n=50;남성 26예, 여성 24예)를 토대로 하고 있다. 이 연구 프로젝트는, 도쿄대학 의학부, 도쿄도 노인종합연구소·도쿄도 노인의료센터, 및 고꾸리쯔 장수의료 연구소의 시설 내 윤리위원회에 의한 승인을 받았다. 피험자 및 시료 채취 상세는 이미 보고하였는데, 불용성 뇌 획분 해석을 특징으로 하고 있다[Katsuno T, Neurology, 64: 687-692, 2005]. 본 프로젝트에 있어서, 본 발명자 등은 과거의 연구에서 특성이 명확해져 있지 않은 가용성 뇌 획분을 해석대상으로 하였다[Katsuno T, Neurology, 64: 687-692, 2005]. 동결조직시료(내후영피질의 전방부분)를, 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 9배량의 Tris-식염수(TS) 완충액 중에서 호모지네이트화하였다. 이 호모지네이트를 265,000×g으로 20분간 초원심 후 회수한 상청의 3분의 1(0.5 ㎖)을 이뮤노블롯 분석에 제공하였다.

면역조직화학

Tg2576 마우스의 뇌의 좌반구를, 동결 마이크로톰(RM 2145;Leica, Wetzlar, Germany)을 사용해서, 두께 30 ㎛ 절편으로서 화살표형상 방향으로 절단하였다. 티오플라빈-S 염색을 이전에 기재된 바와 같이 행하였다(Wyss-Coray et al, 2001). 종대변성 신경돌기 형성관찰은 시냅토피신 항체(Chemicon, Temecula, CA)를 사용해서 행하고, 각 마우스에 관하여, 뇌의 좌반구 하나에 대해 4~5장의 절편에 있어서의 티오플라빈-S 양성반과 시냅토피신 양성 종대변성 신경돌기 수를 배율 40배로 산정하였다. Aβ 침착 관찰은 연속 절편을, 포름산 또는 프로테아제-K에 의한 단시간의 전처리 후에 Aβ 면역염색 키트(Sigma, St. Louis, MO)로 행하고, 면역 양성 시그널을 ABC elite 키트(Vector Laboratories)를 사용해서 추출하였다. 대뇌피질 및 해마의 화상을 현미경에 접속한 디지털 카메라로 촬영하여, 간단한 PCI 소프트웨어(Compix Imaging System, Lake Oswego, OR)를 사용해서 해석하였다. 항체의 뇌내 이행은 공초점 레이저 현미경(Carl Zeiss LSM510)을 사용해서 관찰하였다. 티오플라빈-S 양성반과 시냅토피신 양성 종대변성 신경돌기 수 정량은, 이중맹검 양식으로 보고하였다.

수동 면역치료 및 행동분석

3개월령의 자성(female) 비형질전환(비 Tg) 마우스, 및 가족성 AD의 Swedish 이중변이(K670N;M671L)를 갖는 인간 APP 유전자를 보유하고 또한 과잉 발현하는 Tg2576 마우스를 Taconics사(Germantown, NY, USA)로부터 구입하여, 본 발명자 등의 동물사육시설에서 13개월령이 될 때까지 사육하였다. 수동 면역치료에 의해 알츠하이머 유사 표현형이 예방되는지 여부를 판정하기 위해, 4개월령 Tg2576에 대해, 13개월령이 될 때까지 1A9 또는 2C3(0.4 ㎎/㎏/주) 또는 PBS를 꼬리정맥 내 투여하였다. 기억기능은 13개월령의 시점에서, 이전에 기재한 바와 같이 4가지 행동 패러다임에 관하여 계측하였다(Mouri A, FASEB J, 21: 2135-2148, 2007):(1) Y미로시험(Y-maze test)에 있어서의 단기기억; (2) 신규물체 인식시험; (3) Morris 수미로시험(water maze test); (4) 문맥적 공포조건부 시험. 행동시험의 종료부터 3일 후에 마우스를 생화학적 및 조직학적인 평가를 위해 도살하였다. 실험결과는 일원배치 ANOVA 및 이원배치 ANOVA에 의해 분석하고, post-hoc 분석에는 Fisher 검정을 사용하였다.

리포단백질의 분리 및 제거

CSF의 분리 후에, AD 환자 12예 및 NC 13예에 있어서, 600 ㎕의 CSF 및 이전에 기재된 프로토콜[Matsubara E, et al; Ann Neurol, 45: 537-541, 1999]을 사용한 조제용 연속 밀도 부유 초원심분리에 의해, 리포단백질의 제거를 행하였다. CSF의 밀도를 KBr로 1.25 g/㎖로 조정하고, Hitachi RP100AT 원심기를 사용하여 100,000 rpm, 16℃에서 8시간에 걸쳐 초원심을 행하였다. 밀도 1.25 g/㎖에 있어서의 부유 리포단백질과 그의 제거를 행한 CSF(LPD-CSF) 양자를 3 kDa 커트오프막(Microcon 3;Arnicon, Inc)을 사용하는 한외여과에 제공하고, 사용시까지 동결하 또는 4℃에서 보존하였다.

또한 PHML-LIPOSORB(Calbiochem, La Jolla, CA)를 사용한 친화성 크로마토그래피에 있어서도 리포단백질의 제거를 행하였다. 시료(혈장 또는 뇌) 1.5에 대해 PHML-LIPOSORB(Calbiochem, La Jolla, CA) 1의 비율로 60초간 혼합 후, 3,000 rpm으로 10분간 원심으로 얻어진 상청(리포단백질 제거 시료)을, 6E10 올리고머 ELISA에 제공하였다. PHML-LIPOSORB와 결합한 리포단백질 결합 샘플의 용출은, 20 mM 데옥시콜산나트륨으로 행하였다. 특이적 리포단백질 제거의 확인은, 1% 아가로오스 겔 전기영동(Beckmann) 후의 FAST-RED 7B(Wako, Osaka, Japan) 염색으로 행하였다.

인간 Aβ의 정량

이전에 상세하게 기재된 바와 같이 [Matsubara E, et al, Ann Neurol, 537-541, 1999; Matsubara E, et al, Neurobiol Aging, 25: 833-841, 2004], 전혈장 또는 LPDP Aβ종을 특이적으로 정량하기 위해 샌드위치 ELISA를 사용하였다. 뇌 Aβ종의 분석을 위해서는, 100 ㎕의 완충액 가용성 Aβ종을 ELISA에 그대로 제공하고, 70% 포름산 추출물의 형태에 있는 불용성 Aβ 시료는, ELISA 전에 1 M Tris-HCl(pH 8.0)로 중화하여 1:1000으로 희석하였다. 그 결과 얻어진 값을 뇌의 습중량으로 보정하여, 최종적으로는 pmol/g으로서 표시하였다. 모든 플레이트 상의 3개의 표준적인 혈장시료를 포함시킴으로써, 플레이트를 서로 표준화하였다.

Aβ 올리고머에 대해 특이적인 ELISA

모노머성 Aβ가 아니라 Aβ 올리고머를 특이적으로 검출하기 위해, 화학발광을 이용하는 샌드위치 고상 효소면역 어세이(화학발광-ELISA)를 사용하였다. 마이크로플레이트를 단일클론의 1A9(IgG2b 아이소타입), 2C3(IgG2b 아이소타입) 또는 1A9/2C3의 혼합물로 코팅하여, 100 ㎕의 다른 시료(뇌·뇌척수액)와 함께 4℃에서 24시간 연속 인큐베이트한 다음에, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 결합 BA27 Fab' 단편(항Aβ1-40, Aβ40에 대해 특이적, Wako pure chemical, Osaka, Japan) 또는 서양고추냉이 퍼옥시다아제 결합 BCO5 Fab' 단편(항Aβ35-43, Aβ42에 대해 특이적, Wako pure chemical, Osaka, Japan) 모두 4℃에서 24시간 인큐베이트하였다. SuperSignal ELISA Pico 화학발광기질(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 발생시킨 화학발광은, Veritas 마이크로플레이트 조도계(Promega)로 정량하였다.

인 비보에서의 단일클론의 1A9 또는 2C3의 말초 투여의 유효성을 평가하기 위해서는, 투여 마우스로부터 입수한 혈장 및 장기에 있어서의 Aβ 올리고머 분석을, 6E10-HRP 표지 6E10(Senetek PLC, Napa, CA, USA) 인간 특이적 올리고머 ELISA를 사용해서 행하였다. 감도를 높이기 위해, 전술한 화학발광 시스템에 의해 검출하였다. 리포단백 결합성 Aβ 모노머가 검출되는 것을 피하기 위해, 본 발명자 등은 전술한 바와 같이 PHML-LIPOSORB를 사용하여, 혈장 또는 장기로부터 사전에 리포단백을 제거한 샘플을 측정에 사용하였다.

[실시예 1] Aβ 올리고머 특이적 단일클론항체(1A9 및 2C3)의 제작

용액 중에 있어서는 Aβ 올리고머와 모노머는 혼재하여 존재하고 있다. 이 때문에, Aβ 올리고머 특이적 항체를 얻기 위한 항원의 조제에 있어서는, Aβ 모노머의 제거가 불가결하다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, 본 발명자 등은 SDS-PAGE 분석에 의해, Aβ 모노머의 혼입을 수반하지 않고 SDS 안정성 Aβ 테트라머만을 단리할 수 있었다. 단리한 Aβ 테트라머에 의한 인 비보 면역처치 후의 양성 하이브리도마 클론 선택에는, 도트 블롯 분석을 행한 후에 면역침강처치를 행하는 2단계의 스크리닝을 채용하였다. 도트 블롯 분석에 제공한 400종의 클론 중, 16종이 양성으로 판정되었다(양성율=4%). 선택한 양성 클론의 올리고머 특이성을 평가하기 위해, AD 뇌 유래의 인산완충액 불용성이고 포름산(FA)에는 가용성인 아밀로이드 획분[Matsubara E et al, Neurobiol Aging, 25: 833-841, 2004]을, 양성 하이브리도마 세포배양물의 상청을 사용한 면역침강법으로 해석하였다(도 1B). 항Aβ 단일클론의 4G8을 사용한 이뮤노블롯 분석에 의해, 다이머, 그보다도 소량의 트리머, 더 나아가서는 응집된 Aβ 분자종의 특징인 보다 고분자량 스미어(smear)가 검출되었다. 미량의 SDS 존재하에서 해리된 Aβ 모노머도 확인되었다. Native 1A9 또는 2C3 입체구조체(올리고머)의 존재를 추가적으로 검증하기 위해, 본 발명자 등은, 변이형 PS1 cDNA를 트랜스펙트한 인간 태아 신장(HEK)293 세포의 순화배지(CM) 중에서의 검출을 목표로 하였다(Nakaya Y et al, J Biol Chem, 280: 19070-19077, 2005). 본 발명자 등은 SEC를 사용하여 HEC293 CM을 분획 후, 올리고머 동정을 시도하였다. 이전에 보고한 바와 같이(Matsubara E et al, Neurobiol Aging, 25: 833-841, 2004; Yamamoto N, et al: J Biol Chem, 282: 2646-2655, 2007), 이 수법은 올리고머(획분 8~13)를 모노머(획분 14~20)로부터 효과적으로 분리한다. 단일클론의 1A9은, CM 중에 분비되는 SDS 안정성 Aβ 다이머를 획분 8(＞680 kDa)에, SDS 안정성 다이머 및 트리머를 획분 13(17~44 kDa)에, 더 나아가서는 극히 미량의 다이머를 획분 16(도 1C) 중에 면역침강시켰다. 동일한 결과가 2C3에서의 면역침강에서도 얻어졌다(비제시 데이터). 이들 데이터로부터, 단일클론의 1A9 또는 2C3가, Aβ 모노머를 인식하지 않고, Aβ 올리고머에 대해 실로 특이적인 것이 명확하게 나타내어졌다.

[실시예 2] 단일클론의 1A9 및 2C3의 항신경독성활성

단일클론의 1A9 또는 2C3가 Aβ 유발성 신경독성을 방어할 수 있는지 여부에 대해서 평가하기 위해서, NGF로 분화시킨 PC12 세포(PC12N)를, 단일클론항체(mAh)의 존재하 또는 비존재하에서, 시드프리 25 μM의 Aβ1-42(540,000×g에 의한 ThT 음성 상청)와 함께 37℃에서 48시간 인큐베이트하였다. 신경세포의 생존도는 LIVE/DEAD 어세이를 사용해서 판정하였다(도 2). 대조 어세이(도 2A)와 비교하여, Aβ1-42의 존재하에서는 유의한 신경세포사(50%)가 관찰되었다(도 2B 및 2G). 비특이적인 IgG2b(도 2C 및 2G)는, Aβ1-42 유발성 신경독성을 동일 조건하에서 저해할 수 없었다. 시판의 Aβ 특이적 단일클론항체 4G8(IgG2b 아이소타입, 도 2D 및 2G)에서는 독성을 증강하는 경향이 보였다. 단일클론의 2C3(IgG2b 아이소타입, 도 2F 및 2G)는, Aβ1-42의 신경독성을 농도 의존적으로 거의 완전히 중화한 것으로부터, de novo 형성성의 신경독성 2C3 입체구조체는 올리고머 형태를 취하고 있다고 생각되었다. 한편, 1A9(IgG2b 아이소타입, 도 2E 및 2G)의 항신경독성활성은 2C3와 비특이적 IgG2b의 중간으로, 이것은 1A9 입체구조체가 2C3 올리고머와는 구조적으로 상이한 입체구조를 갖는 것을 시사한다.

[실시예 3]

신경독성 Aβ1-42 올리고머의 정확한 사이즈 및 형태의 동정은 현재, 가장 중요한 과제 중 하나로 치열한 경쟁하에 있다. 본 발명자 등은 가용성 신경독성 Aβ1-42 분자종을 한외여과 및 분자체(UC/MS)에 의해 단리하여 이하의 5개의 획분으로 분할할 수 있었다(도 3):획분 1, ＜3 kDa의 여액(레인 1);획분 2, 3~10 kDa의 여액(레인 2);획분 3, 10~30 kDa의 여액(레인 3);획분 4, 30~100 kDa의 여액(레인 4);획분 5, ＞100 kDa의 보유액(레인 5). 단일클론의 4G8을 사용한 이뮤노블롯 분석(도 3A)에 의해, 획분 1(레인 1)에는 Aβ가 존재하지 않고, 획분 2(레인 2)에는 Aβ 모노머가, (레인 3)에는 Aβ 모노머에 더하여 소량의 다이머가, 획분 4(레인 4)에는 모노머에서 펜타머까지의 Aβ가, 획분 5(레인 5)에는 모노머에서 펜타머까지에 더하여 45~160 kDa의 밴드가 확인되었다. 이들 데이터는, 2% SDS가 고분자량(HMW) Aβ 올리고머를 모노머 및 저분자량(LMW) 올리고머로 탈중합시키는 것을 나타내고 있다. 독성 Aβ1-42의 사이즈 분포를 검증하기 위해, 본 발명자 등은 PC12N과 함께 37℃에서 48시간 인큐베이트한 각 획분의 생물활성을 조사하였다. 도 3B 및 3C에 나타내어져 있는 바와 같이, 획분 1은 비독성이고, 획분 2의 독성도 극히 미약하여, Aβ 모노머 및 다이머가 유독할 가능성은 낮은 것이 나타내어졌다. 획분 3~5는 유의한 독성을 나타내[One-way ANOVA 해석, p＜0.0001], 신경독성 올리고머의 사이즈가 이론상 트리머 이상에 상당하는 것을 시사하고 있다. 올리고머 특이적 A11 항체를 사용한 도트 블롯 해석에서도, 신경독성을 갖는 상기 3획분(3~5)에 A11 양성 소견을 보여, 신경독성체는 확실히 올리고머일 것이라는 방증이 얻어졌다(도 3D). 2C3 올리고머는 획분 4 및 5에서 관찰되어(도 3D), 2C3가 실제로 신경독성 Aβ 올리고머(＞30 kDa)와 반응하는 것이 확인되었다. 또한 2C3 올리고머의 대부분은 독성이 가장 높은 획분 5에 확인되어(＞100 kDa), 분자량이 100 kDa을 상회하는 2C3 올리고머가 강력한 신경독성을 나타내는 것으로 생각되었다(도 3D). 한편, 1A9 올리고머는 독성이 가장 높은 획분 5에 약간 분포하지만 극히 소량으로, 1A9에 의한 신경독성 중화활성이 불충분하였던 결과(도 2E 및 2G)에 잘 부합하고 있다. 이에 대해, 항신경독성활성이 없는 단일클론의 4G8은 모든 획분에 분포하는 Aβ종을 검출하여(도 3D), 동일한 사이즈의 경우에도 올리고머가 비독성 중합체로서 존재하고 있을 가능성이 생각되었다.

독성-구조 관련에 대해서 추가적으로 검증하기 위해, 각 획분을 원자간력 현미경검사(AFM)에 제공하였다. 신경독성을 나타내는 3획분에서만, 그 분획 사이즈에 대응한 구형 입자 형태가 명확해졌다. 도 3E에는 독성이 없는 획분 2(Fr.2), 독성을 나태는 획분 3(Fr.3) 및 4(Fr.4), 최강 독성을 나타내는 획분 5(Fr.5)의 원자간력 현미경상을 나타낸다. 독성 획분에서의 무수한 입상 중합분자 형성이 명확하고, 특히 획분 5는 크고 작은 다양한 입상 분자에 더하여, 비드상 분자나 윤상 형태 분자가 혼재된 불균일한 독성 분자로 구성되는 것이 명확해졌다.

[실시예 4] 1A9 또는 2C3의 Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성

본 발명자 등은 다음으로, 1A9 또는 2C3가 Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성을 갖는지 여부의 검토를 행하였다. Aβ1-42 아밀로이드 섬유 형성(0, 10, 25, 50 μM)을, ThT 형광에 의해 37℃에서 72시간에 걸쳐 어세이하였다. 본 발명자 등이 시행한 조건하에서는, 시드프리 Aβ1-42(540,000×g 초원심 후의 ThT 음성 상청 획분)는, 중합 핵 의존적인 메커니즘에 의해, 아밀로이드 섬유로 중합하였다(도 4A). 1A9 또는 2C3의 Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성을 평가하기 위해, 본 발명자 등은, 항체의 존재하 또는 비존재하에서, 25 μM의 시드프리 Aβ1-42를 37℃에서 48시간 인큐베이트하였다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, ThT 형광강도 변화는 2C3의 농도 의존적이었으나, 단일클론의 1A9, 4G8 또는 비특이적 IgG2b의 존재하에서는 변화가 확인되지 않았다. 한편, 2시간의 인큐베이트에서의 Aβ의 중합에서는, 2C3와 마찬가지로 1A9에 있어서도 거의 완전한 섬유 형성 억제활성이 보였다(도 4C). Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성은 Aβ에 대해 2C3의 몰비가 낮아도 보여, 2C3가 Aβ1-42 아밀로이드 섬유 형성 조기에 de novo 형성되는 중합 핵 또는 시드 기능 저해효과를 가지고 있는 것으로 추측되었다. 동일한 결과는 형태적으로도 관찰되었다. 도 4E(Aβ42 단독) 및 도 4F(Aβ42+2C3, 25:3)에 나타낸 바와 같이, Aβ 아밀로이드 섬유 형성이 단일클론의 2C3의 존재하에서는 부분적으로 저해되고, 1A9(도 4G) 존재하에서는 저해효과가 약간만 확인된 것이, 전자현미경검사(EM)에 의해 실증되었다. 한편, 피험항체는 모두 24시간 인큐베이트로 사전에 형성된 Aβ1-42 아밀로이드 섬유에 대해서는, 그 용해효과나 탈중합효과는 관찰되지 않았다(도 4D).

[실시예 5] 1A9 또는 2C3가 표적으로 하는 독성 관련 올리고머

Aβ1-42 올리고머화와 아밀로이드 섬유 형성 사이의 구조적 및 동태학적인 관계를 해명하기 위해, 중합체 형성의 타임코스를 A11, 1A9, 2C3 또는 4G8을 사용한 도트 블롯 해석으로 행하였다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, A11 항체 반응성 올리고머의 대부분은 중합의 래그타임기(lag time phase)(0~8시간)에 구축되고, ThT-형광값은 상대적으로 약하다. 다음의 섬유 신장기(8~24시간)에는, A11 면역반응성 올리고머의 레벨은 안정기(plateau)에 도달하고, 그 후에는 72시간(안정기)의 사이에 걸쳐 일정하게 유지되었다(피크값의 20% 전후). 항올리고머 A11 항체는, 아밀로이드 섬유를 인식하지 않고, Aβ 올리고머 형성을 특이적으로 관찰할 수 있는 것이 나타내어져 있기 때문에[Kayed R, et al, Science 300, 486-489, 2003], 본 발명자 등의 결과는, Aβ 올리고머 형성이 아밀로이드 섬유 형성에 선행하며, 또한 아밀로이드 섬유 형성 경로로 직접 이행되지 않는 올리고머 중합상태가 존재하는 것을 시사하고 있다. 2C3 올리고머와 A11 올리고머의 동태는 유사하였으나, 1A9 올리고머의 동태는 상이한 것이었다. 1A9 올리고머는 4시간 후에 처음으로 검출되고, 그 후 경시적으로 2배 정도의 1A9 면역반응성 상승을 확인하였다. 이는 바꿔말하면 1A9 올리고머가 지연형 형성을 취하는 것을 시사한다. 이에 대해, 2C3 올리고머는 래그타임기(0~8시간)에 일과성 출현을 나타낸 후, 8~72시간 사이는 올리고머 중합상태로서 극미량(5% 미만) 존재하고 있는 것이 명확해졌다. 이들 본 발명자 등의 데이터는 A11, 1A9 및 2C3 올리고머가 구조적 및 면역학적으로 서로 상이한 입체구조 또는 안정성을 갖고, 2C3 올리고머는 1A9 올리고머에 비해, 비교적 불안정할 가능성이 시사되었다.

De novo의 독성 중합상태에 대해서 조사하기 위해, 시드프리 Aβ1-42(0시간)와 2시간, 4시간 및 24시간 프리인큐베이트한 Aβ1-42(도 5B)를, PC12N에 37℃에서 48시간 폭로시켜서 그 신경독성활성을 검증하였다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, 4G8을 사용한 이뮤노블롯 해석에 의해, 모노머에서 트리머까지는 0시간의 시점에서 이미 존재하는 것이 명확해졌다. 2시간 및 4시간의 프리인큐베이션에서는, 모노머에서 펜타머에 더하여, 분자량이 45~160 kDa인 고분자량(HMW) 스미어 패턴이 얻어졌다. HMW 스미어의 양은 24시간 시점에서는 극적으로 감소하고 있어, 웰 내에 잔존하여 겔 내에 진입할 수 없는 고분자군과 다이머와 소량의 모노머라는 2군이 주된 구성성분으로 되어 있었다. 37℃에서 48시간 인큐베이트하자 HMW 스미어는 소실되었다. 도 3A, 5C에 나타낸 바와 같이, 시드프리 Aβ1-42는 분자체질 실험으로부터 ＞100 kDa 이상의 분자량으로 되어 최대 독성을 발휘하는 것이 명확해졌다. 이 독성분자는 SDS-PAGE 상, 모노머에서 펜타머에 더하여, 분자량이 45~160 kDa인 고분자량(HMW) 스미어 패턴을 나타내는 분자로부터 구성되는 것이 명확해져, SDS 존재하에서 독성 중합체는 용이하게 저분자에 탈중합을 받는 것이 판명되었다. 그러나 2시간, 4시간 및 24시간으로 시드프리 Aβ1-42에 프리인큐베이션 처치를 행하자, de novo에서 형성되는 Aβ 올리고머의 신경독성활성이 약 12.5%, 약 26% 저하되었다(도 5C). 이 결과는 Aβ 중합 조기에 de novo에서 형성되는 Aβ 올리고머량의 많고 적음이 신경독성활성의 규정 인자가 되는 것, 0-2시간 사이에 그 형성 피크가 있고, 시간 경과와 함께 그 형성량은 감소하는 것으로 생각되었다. 한편으로, Aβ 아밀로이드 섬유 de novo 중합 핵이나 아밀로이드 섬유 자체가 신경독성 중화효과를 가질 가능성도 생각할 수 있다. 본 발명자 등은 2시간 인큐베이트한 Aβ1-42로부터, 540,000×g로 3시간의 초원심분리 처리에 의해 불용화한 Aβ 중합 핵 또는 아밀로이드 섬유를 제거하였다. 초원심처리의 결과 얻어진 540,000×g 상청 및 펠릿은 동일 정도의 티오플라빈-T 시그널을 나타낸 것으로부터, ThT 양성 가용성 Aβ 중합체가 540,000×g 상청(ThT 결합은 섬유 형성이 아니라 β시트 구조에 풍부한 구조변화를 초래하고 있는 것을 시사) 중에도 존재하는 것을 알 수 있다. 이 가용성 중합체만을 PC12N에 대해 폭로시키면 신경독성이 회복 증강된 것으로부터(도 5D), 불용화 Aβ1-42 자체가 항독성활성을 발휘하고 있는 것으로 생각되었다. 이들 조건하에서, 단일클론의 1A9은 β시트 구조가 풍부한 가용성 Aβ 올리고머가 유발하는 신경독성을 완전 중화하여, 2C3의 중화활성을 상회하는 것이었다. 한편, 비특이적 IgG2b는 그 자체로는 배양하에 있는 PC12N의 생존에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 신경독성 1A9 중합체는 본질적으로는 보다 구조변화를 초래하여 약간 안정화된 가용성 독성 올리고머이고, 신경독성 2C3 중합체는 본질적으로는, 중합 프로세스의 초기 단계에 있어서의 실로 구조변화를 초래하고 있는 불안정함이 풍부한 짧은 수명의 올리고머성 중간체로 생각된다.

[실시예 6] 단일클론의 1A9 또는 2C3는 뇌실질 중의 Aβ 올리고머를 인식한다

1A9 또는 2C3의 특이성 및 생물활성이 실증된 것으로부터, 본 발명자 등은 계속해서, 뇌내의 1A9 또는 2C3 중합체를 면역조직화학법에 의해 검출하는 것을 목표로 하였다. 본 발명자 등은 먼저 관례적인 면역조직화학법:즉, 뇌 절편의 포름알데히드 고정 및 포름산, SDS 또는 마이크로파 처리에 의한 면역반응성의 증강법 등을 실시하였다. 어느 증강법을 사용해도, 양 항체에 의한 AD 뇌에서의 면역반응성은 관찰되지 않았다. 본 발명자 등은 면역염색을 개선하는 것이 알려져 있는 프로테아제-K로 절편을 전처리한 바[Wrzolek MA, et al: Am J Pathol, 141: 343-355, 1992], 다수의 노인반이 1A9(도 6A), 2C3(도 6B) 및 A11(도 6C)에 의해 면역염색되었다. Aβ 아밀로이드 섬유가 Aβ 올리고머 유발성 신경독성을 중화한다는 본 발명자 등의 인 비트로 실험에서의 지견과 종합해보면, 노인반은 Aβ 올리고머를 격리 수납하기 위한 일종의 방어적 리저버(reservoir)로, 그 내부에는 항체는 용이하게 도달할 수 없는 것으로 생각되었다. 실제로, 1A9 또는 2C3를 사용한 면역침강에서는 양 항체가 인식하는 Aβ 올리고머의 존재가 노인반으로 구성되는 아밀로이드 획분에서 확인되고 있어, 본 발명자 등의 가설은 인 비보에서의 정합성이 검증되었다(도 1B 참조).

뇌내에서의 「가용성」1A9 또는 2C3 중합체의 존재에 대해서 추가적으로 검증하기 위해, 본 발명자 등은 양 항체를 사용하여 면역침강시험을 행하였다. 가용성 올리고머의 추출시에 있어서의 화학적 수식을 피하기 위해, 트리스완충식염수(TBS)를 사용하여 뇌 호모지네이트를 조제하였다. TBS 시료에 있어서, AD 뇌의 대뇌피질로부터는, 4-mer, 5-mer, 8-mer 및 12-mer에 대응하는 분자량을 갖는 올리고머가 1A9에 의해 면역침강되었으나(도 6D, 레인 2), 건강한 정상 대조뇌에서는 검출감도 이하였다(레인 3). 1A9(레인 2)는 1A9과 4G8/6E10 사이에서 4-mer, 5-mer 및 8-mer의 강도가 동일 정도임에도 불구하고, 단일클론의 4G8/6E10의 혼합물(레인 1)보다도 12-mer을 강하게 회수하는 것처럼 생각되었다. 2C3 면역침강에 의해서도 거의 동일한 결과가 얻어졌다(도 6, 레인 4~6). 이 때문에, 본 발명자 등은 다음으로, 인간 내후영피질에 있어서 확인되는 인 비보 신경독성의 책임분자의 동정을 시도하였다. 일반적인 고령 집단에서는 이 병변에 있어서 신경원섬유변화(NFT) 및 신경세포상실이 노인반 형성에 선행하는 것이 잘 알려져 있다. 본 발명자 등은, 1A9 또는 2C3 중합체에 대한 노인반 등의 기능적 리저버의 결핍이 내후영피질의 뉴론에 있어서 유해하여, 틀림없이 기억장애의 원인일 것으로 가정하였다. 이전에 보고한 50예의 부검 증례(Katsuno et al:Neurology, 64: 687-692, 2005):AD 2예, Braak NFT 스테이지 I~II의 개체 35예 및 NFT 스테이지 III~IV의 13예에 있어서, 단일클론의 1A9 또는 2C3를 사용하는 이뮤노블로팅에 의해 완충액 가용성 획분에 있어서의 12-mer의 레벨을 평가하였다. 도 6E(1A9) 및 6F(2C3)에 나타내어져 있는 바와 같이, 1A9- 또는 2C3- 면역반응성 12-mer의 액틴에 대한 상대적 면역활성강도는, 건강한 정상 대조군(Braak NFT 스테이지 I~II) 및 경도 인지기능장애군(Braak 스테이지 III~IV)에 비해 AD 환자 쪽이 유의하게 높았다. 흥미롭게도, 건강한 정상 대조(Braak NFT 스테이지 I~II) 및 경도 인지기능장애(Braak 스테이지 III~IV)의 내후영피질에서는, 12-mer가 각각 약 45% 및 60%의 레벨(AD 증례를 100%로 하여)로 축적되어 있었다(도 6E 및 F). 이 결과는 12-mer의 축적이 인지기능장애의 출현에 선행하여, Braak NFT 스테이지가 진행할수록 증가하는 것을 시사하고, 이는 1A9 또는 2C3 면역반응성 12-mer가 인 비보 신경독성의 원인이 되는 중합체인 것을 시사한다.

[실시예 7] 단일클론의 1A9 또는 2C3는 뇌척수액 중의 Aβ 올리고머를 인식한다

인 비보 신경독성의 원인이 되는 Aβ 중합체(가용성 1A9- 또는 2C3- 면역반응성 12-mer)가 뇌실질 중에 존재하는 것으로부터, 본 발명자 등은 동 중합체가 CSF 중에도 존재할 것으로 추측하였다. 이 예측을 검증하기 위해, 본 발명자 등은 AD 환자 및 age-matched 건강한 정상 대조자 각 10예를 푸울한 CSF를 SEC에 의해 분획하고, 각각의 획분을 포착 및 검출계에 동일한 단일클론의 BC05 또는 BA27을 사용한 Aβ 올리고머에 대해 특이적인 샌드위치 ELISA에 제공하였다. BC05-BC05 올리고머 ELISA에서는 획분 13에 가용성 Aβ1-42의 존재가 동정되는 한편, BA27-BA27 ELISA에서는 획분 7~14에 가용성 Aβ1-42의 존재가 검출되었다(비제시 데이터). 그러나, 어느 ELISA에서 얻어진 흡광도값(O.D.450 nm)도 낮은 값에 머물러, CSF 중에 존재하는 미량의 Aβ 올리고머를 검출하기에는 감도가 부족함을 부정할 수 없었다. 또한, 동일 획분의 BNT77-ELISA에 의한 Aβ 모노머의 검토로부터, 리포단백 결합성 Aβ 모노머(획분 7~14) 및 리포단백 비결합성 Aβ 모노머(획분 15~17)는 동일한 획분 중에서 Aβ 올리고머와 공존하고 있는 것이 확인되었다(도 7a A 및 7a B)[Matsubara E, et al; Neurobiol Aging, 25: 833-841, 2004]. AD에 있어서의 리포단백 결합성 Aβ 모노머의 값은 건강한 정상 대조와 동일 정도인 한편, 리포단백 비결합형 Aβ40 모노머(도 7a A) 및 Aβ42 모노머(도 7a B)는, age-matched 정상 대조와 비교하여 AD 쪽이 낮은 값이었다. 이들 어세이에 있어서, 본 발명자 등은 또한, BC05 항체 또는 BA27 항체를 포착항체로서 사용하여, HRP로 표지한 동일 항체를 포착항체로서 구축한 ELISA에서는, 올리고머에 더하여, 리포단백질 상에 따로 따로 존재하는 Aβ 모노머를 검출할 수 있는 것을 발견하였다. 본 명세서에 기재된 동일한 어세이(예를 들면, 6E10/6E10 ELISA)를 사용한 선행하는 보고에서는[Lee EB, et al, J Biol Chem, 281: 4292-4299, 2006], 이 문제는 간과되어 있었다. 이러한 리포단백 결합성 Aβ 모노머와 올리고머는 SEC에서는 동일 정도의 보유시간으로 용출되기 때문에, 동일 항체의 포착·검출에 사용하는 올리고머 ELISA로는 서로를 식별하는 것이 불가능하여, Aβ 올리고머 비선택적인 항체로 Aβ 올리고머를 분석하기 위해서는, 리포단백을 함유한 CSF 그 자체는, 검체로서 부적절한 것이 판명되었다.

본 발명자 등은 이러한 선행법의 약점을 극복하기 위해, 사용 샘플과 ELISA 검출 항체를 고안하였다. 측정 샘플은 사전에 리포단백질을 제거한 CSF(LPD-CSF)를 사용하고, ELISA 검출 항체에는 Aβ 올리고머 특이적인 1A9과 2C3를 사용하였다. 또한, 감도 향상을 꾀하기 위해, 화학발광 ELISA를 개발하였다. 푸울한 LPD-CSF(도 7a C~D)를 SEC로 분획하고, 각 획분을 1A9·2C3를 검출 항체로서 발광계 ELISA로 Aβ 올리고머 분포를 해석하였다. 도 7a C~D에 나타낸 바와 같이, SEC 획분 12~15(분자량 18~108 kDa의 범위에 있는 비교적 큰 Aβ로 4-mer~24-mer에 대응)에 Aβ 올리고머의 존재가 동정되었다. 동정된 모든 분획에 있어서 1A9·2C3 올리고머의 레벨은, AD 환자에서 상승하고 있었다. 이 진단 마커로서의 유용성을 확인하기 위해, 소수예에 그치기는 하였으나 AD 환자와 연령을 일치시킨 건강한 정상 대조와의 사이에서 LPD-CSF Aβ 올리고머량을 비교 검토하였다. 도 7b G에 나타낸 바와 같이, Aβx-42로 되는 2C3 올리고머는 정상 대조군과 비교하여 AD 환자에서 유의하게 증가하고 있었다(논파라메트릭 분석:p=0.0103). 이에 대해 Aβx-40으로 되는 2C3 올리고머에서는 양 군간에 유의차가 확인되지 않았다. 한편, Aβx-42로 되는 1A9 올리고머는 통계상 유의차는 확인되지 않았으나, AD 환자에서 증가하고 있는 경향이 있었다. Aβx-40으로 되는 1A9 올리고머 양 군간에 유의차는 확인되지 않았다(도 7b E). Aβ 모노머로부터 올리고머로의 구조 변화는 Aβ 중합과정에 있어서의 최초기의 사상(事象)으로, Aβ 올리고머와 Aβ 모노머의 비[O/M 지수]는, AD의 병적 상태를 반영한 임상적 지표에 상당한다. 도 7b F 및 7b H에 나타낸 바와 같이, Aβ42 또는 Aβ40에 있어서의 O/M 지수는 모두 건강한 정상 대조군에 비해, AD 환자군에서 유의한 상승이 확인되었다(1A9:Aβ42, P=0.0137;Aβ40, p=0.0429 vs 2C3:Aβ42, P=0.0012;Aβ40, p=0.0051). 이상의 결과로부터, 1A9 또는 2C3 양성 입체구조체는 LPD-CSF 중에 Aβ 올리고머로서 존재할 뿐 아니라, AD 환자에서 증가하고 있었다. 또한 본 발명자 등의 결과는, 리포단백 비결합형 가용성 Aβ의 올리고머성 중간체로의 구조 변환이 AD의 CSF에서 일어나고 있는 것, 및 그의 검출이 산발성 AD(sporadic AD)의 진단에 유용한 생물학적 마커로 될 수 있는 것을 명확하게 하였다.

[실시예 8] 단일클론의 1A9 또는 2C3의 수동 면역요법은 Tg2576에 있어서의 기억장애의 발증을 예방한다

1A9(n=13)와 2C3(n=11) 투여에 의한 수동 면역요법의 인 비보 예방치료효과를 검중하기 위해, 본 발명자 등은 Tg2576 마우스의 4개월령에서 13개월령까지 1A9, 2C3(0.4 ㎎/㎏/week) 또는 PBS를 꼬리정맥 투여하였다. 13개월령에서의 기억기능을 4종의 학습·행동 패러다임에 대해서 판정하였다:(1) Y미로시험에 있어서의 단기기억(도 8A);(2) 신규물체 인식시험에 있어서의 물체 인식시험(도 8B); (3) 수미로시험에 있어서의 공간기억(도 8C); (4) 문맥적 공포 학습시험에 있어서의 연합정서기억(도 8D). PBS를 투여한 Tg2576 마우스는, 1A9 또는 2C3를 투여한 Tg2576 마우스와 비교하여 유의한 학습·행동장애를 발증하고 있었다(도 8A~D). PBS를 투여한 Tg2576 마우스(n=10)와는 달리, 1A9 또는 2C3를 투여한 Tg2576 마우스의 기억기능은, 이전 동일 월령의 비투여 야생형 마우스의 집단으로부터 얻어진 결과와 식별 불가능한 것으로부터, 1A9 또는 2C3를 투여한 Tg2576 마우스에서는 PBS를 투여군에서 확인된 본래 저하 대상인 단기기억 및 장기기억 양쪽이 유지되어 있는 것으로 확인되었다. 즉, 기억장애 발증 이전부터 Aβ 올리고머를 표적으로 한 수동 면역요법을 시행하면, 기억장애 발증 예방, 즉 AD 발증 예방이 가능한 방증을 얻을 수 있었다. 또한, 본 결과는 Aβ 올리고머가 기억장애 발증분자인 것을 직접 나타내는 첫 인 비보 증거의 제시이다.

[실시예 9] 단일클론의 1A9은 Tg2576 뇌에 있어서의 Aβ의 축적을 예방한다

4개월령에서 13개월령까지 수동 면역치료를 받은 Tg2576 마우스(1A9 투여군 n=13, 2C3 투여군 n=11)와 PBS 투여를 받은 Tg2576 마우스(n=10)를, 학습·행동실험의 종료 후 해부하고, 뇌내(대뇌피질 vs 해마) Aβ 축적량을 프로테아제 인히비터 함유 트리스완충액, 가용성(2% SDS)과 불용성 아밀로이드(2% SDS 불용 70% 포름산 가용)의 3 획분(150 ㎎/각 추출액)에 연속 추출하여 검증하였다. 트리스완충액 중에는 비축적성의 생리적 Aβ 분자가, 2% SDS로 가용화되는 Aβ에는, 아밀로이드 섬유 형성 전의 미만성 노인반(diffuse senile plaque)이나 면역세포화학적으로 검출 불가능한 Aβ나 입체구조 변화를 초래한 축적성의 가용성 올리고머 Aβ가 함유되어 있는 것으로 생각되고 있다. Aβ는, Aβ40 단단(斷端), Aβ42 단단 각각에 특이적인 ELISA(BNT77/BA27 specific for Aβ40, BNT77/BC05 specific for Aβ42, WAKO 키트)로 분별 정량하였다. 비축적성 생리적 Aβ분자가 주체인 트리스완충액 중 Aβ 농도는 3군간에서 현저히 다르지 않았다(도 9A, C, Aβx-40;도 9B, D, Aβx-42). 가용성 뇌내 Aβ 축적량(SDS 획분)에 있어서는, 1A9 투여군에 있어서만 대뇌피질 Aβx-40과 Aβx-42의 유의한 축적 억제효과가 확인되었다(도 9E, Aβx-40;도 9F, Aβx-42). 해마에서는 축적 억제효과 확인되지 않았다(도 9G, Aβx-40;도 9H, Aβx-42). 한편, 불용성 뇌내 Aβ 축적량(FA 획분)에서는, 1A9 투여군에 있어서만 대뇌피질 Aβx-40의 유의한 축적 억제효과가 확인되었다(도 9I, Aβx-40;도 9J, Aβx-42). 해마에서는 축적 억제효과가 확인되지 않았다(도 9K, Aβx-40;도 9L, Aβx-42). 가용성 SDS 획분의 A11 이뮤노블롯 해석에서는, 대뇌피질에 있어서 A11 양성 올리고머(4-mer)의 축적 억제효과가 양 항체 치료군에서 확인되었다(도 9M).

[실시예 10] 1A9과 2C3 수동 면역요법에서는 혈장 중 Aβ 올리고머가 증가한다

4개월령에서 13개월령까지 수동 면역치료를 받은 Tg2576 마우스(1A9 투여군 n=13, 2C3 투여군 n=11)와 PBS 투여를 받은 Tg2576 마우스(n=10)의 3군간에서 혈장 중 Aβ 농도에 유의차가 확인되지 않았다(도 10A, Aβx-40;도 10B, Aβx-42). Aβ40/42 비에도 유의차는 확인되지 않았다(도 10C).

이어서, Tg2576 마우스에 있어서의 AD 유사 표현형에 대한 1A9 또는 2C3 수동 면역처치(IVIg)의 예방효과 발현 메커니즘 해명을 위해, 본 발명자 등은 푸울한 뇌 호모지네이트를 사용한 생리식염수 가용성 및 불용성 Aβ 올리고머의 존재, 및 Aβ 올리고머의 말초, 혈장 중에 있어서의 존재를 검증하였다. 각 치료군 내에서 푸울한 뇌 호모지네이트의 생리식염수 가용성 Aβ 올리고머의 양에 변화는 보이지 않았다(도 10D). 한편, 불용성 Aβ 올리고머의 양은, 1A9 또는 2C3 치료군에서의 감소가 확인되었다(도 10E). 또한, 각 치료군 내에서 푸울한 혈장(알부민 제거 혈장, 패널 F 상단;알부민·리포단백 제거 혈장, 패널 F 하단) 중 Aβ 올리고머를 A11 도트 블롯으로 검증한 바, PBS 투여 Tg2576 마우스 혈장 중에 올리고머의 존재를 확인하였다(도 10F). 수동 면역치료군에서는 PBS 투여군에 비해, A11 양성 올리고머의 혈장 중 증가가 명확하였다(도 10F). 또한, 2C3 올리고머는 리포단백 결합형으로서 존재하는 비율이 1A9 올리고머 보다 많았다(패널 F 하단). 또한, A11 면역침강법으로 혈장 중 Aβ 올리고머를 검토한 결과, PBS 투여군과 비교하여, 수동 면역요법을 받은 Tg2576 마우스에서 약 200 kDa의 올리고머가 증가하고 있었다(도 10G). 이 수동 면역요법군에 있어서의 혈장 중 Aβ 올리고머의 증가는 뇌로부터의 클리어런스 증가를 직접 반영한 결과로 파악할 수 있다. 정맥 내 수동 면역처치의 직접 표적분자가 뇌 이외에 혈액 중에도 존재하고, 말초를 작용점으로 하여 뇌로부터 올리고머 선택적 클리어런스 증가를 도모할 수 있다는 방증이 얻어져, 재차 정맥 내 수동 면역처치의 임상적 정합성을 확인할 수 있었다.

[실시예 11] 1A9과 2C3 수동 면역요법으로 노인반 아밀로이드와 종대변성 신경돌기 형성이 억제된다

수동 면역요법군에서는 면역조직화학적인 Aβ 침착이 억제되었다(도 11A). 티오플라빈-S 염색 양성 노인반 아밀로이드 수도 대뇌피질·해마의 양자에서 우위로 그 형성이 억제되어(도 11B, 상단), 그 감소는 조직학적으로도 명확하였다(도 11B, 하단). 시냅토피신 양성 종대변성 신경돌기 형성도 수동 면역요법군에서 우위로 억제되었다(도 11C).

[실시예 12] 항시냅토피신 항체 또는 드레브린 항체에 의한 면역염색 분석

1A9 및 2C3는 대뇌신피질에 있어서의 전 및 후 시냅스 변성을 억제하였다(도 12).

[실시예 13] 항체는 뇌내 이행한다

공초점 레이저 현미경으로 Aβ 침착과 뇌내 마우스 IgG의 존재와 국재를 검토한 결과, 미만성 노인반 존재부위에, Aβ 침착과는 거의 독립된 형태로 마우스 IgG의 존재를 확인하였다. 이 마우스 IgG는 수동 면역치료군(1A9(도 13A) 및 2C3(도 13B)]에서만 관찰되고, PBS 투여군(도 13C)에서는 확인되지 않은 것으로부터, 혈액 중에 투여한 항체의 일부가 뇌내 이행한 것으로 생각되어다. 이 결과는, 뇌내 이행한 항체가 직접적으로 가용성 Aβ 중합체의 독성을 중화하는 것, 또한 항체와 가용성 Aβ 중합체의 복합체의 형태로 혈액 중에 클리어런스됨으로써 기억장애 예방효과가 발휘되고 있어, 치료효과는 복합적 작용 메커니즘을 토대로 하고 있는 것으로 생각되었다.

[실시예 14] 다른 Aβ 모노머를 인식하지 않고, 올리고머 특이적인 항체(E12, 1C10 및 4D3)

1C10 및 4D3는 재차 마우스로 면역하여 얻어진 하이브리도마 386 웰 중의 양성세포 24 웰 중의 강양성이었던 2개이다. 용이하게 랜덤 코일 구조에서 β시트 구조를 취하는 합성 Aβ-40(HCl form)으로부터 50 μM의 시드프리 Aβ1-40(모노머)을 조제하고, 37℃에서 0-96시간 인큐베이트로 올리고머를 제작하고, 도트 블롯으로 항체의 올리고머 특이성을 검증하였다. E12, 1C10 및 4D3(모두 IgM 아이소타입)는, 2C3와 마찬가지로 모노머에 반응하지 않아, 올리고머 특이적인 것을 확인하였다(도 14).

[실시예 15] IgG2b로 클래스 변경한 E12 항체의 이뮤노 도트 블롯 해석

기존의 방법으로 IgG2b 아이소타입으로 변경한 E12 항체에 대해 이뮤노 도트 블롯 해석을 행한 결과, E12 항체(IgG2b 아이소타입)는 Aβ 모노머(0시간)를 인식하지 않고 Aβ 올리고머 특이적으로 결합하는 항체였다(도 15). 또한, 아이소타입의 변경에 의해 항체의 특성에 변화가 없는 것이 확인되었다.

[실시예 16] IgG2b로 클래스 변경한 E12 항체의 Aβ 아밀로이드 섬유 형성 억제활성

E12 항체(IgG2b 아이소타입)가 Aβ 아밀로이드 섬유 형성의 억제활성을 갖는지 여부를 조사하기 위해, Aβ 유발성 신경독성 실험과 동일한 용액조성 중(배지 중)의 Aβ 아밀로이드 섬유 형성을 전술한 ThT 형광강도 측정법으로 측정하였다. 그 결과, 1.5 μM의 E12 항체 존재하에 Aβ 아밀로이드 섬유 형성의 억제가 관찰되었다(도 16).

[고찰]

본 발명자 등의 데이터는, 단일클론의 1A9 또는 2C3가, 독성활성 또는 항원 섬유 형성활성의 원인이 되는 가용성 Aβ 중합체의 「신경독성 에피토프」와 「중합성 에피토프」를 특이적으로 인식하는 항체인 것을 보고하는 것이다. 단일클론의 1A9 또는 2C3는 생리적 분자인 가용성 Aβ 모노머와는 반응하지 않기 때문에, 1A9나 2C3에 인식되는 에피토프를 갖는 입체구조체는 가용성 올리고머성 중합체에 특징적이라 단정할 수 있다. 한외여과 및 분자체 실험에 의해, 1A9 또는 2C3 면역반응성 올리고머의 사이즈는 100 kDa을 상회하는(＞20-mer) 것이 명확해졌다. AFM에 따른 형태 관찰결과로부터, 독성 중합체는 이질적(heterogeneous) 형태(입상, 비드상, 윤상)를 취하는 것도 확인되었다.

이러한 독성 중합체가 실제로 인 비보에서 시냅스 독성이 있는 생물활성분자인 것을 실증하기 위해, 1A9 또는 2C3 독성중합체를 표적으로 한 항Aβ 올리고머 수동 면역요법을 기억장애 발증 전의 약령(若齡) Tg2576 마우스에서 개시하였다. 본 발명자 등은, 항Aβ 올리고머 특이 항체(1A9 및 2C3)를 사용한 수동 면역처치가, Tg2576 마우스에서 통상 발증하는 가령(加齡) 의존적인 기억력 저하로부터 방어하는 방증을 처음 제시하였다. 본 명세서에서 Y-미로시험에 의해 평가한 단기기억의 장애는, 경도 인지기능장애(MCI) 및 조기 AD에 있어서 Aβ 축적에 수반하여 보여지는 것과 유사하다. Y-미로시험에서는, 1A9 및 2C3를 투여한 Tg2576 마우스의 각각에 있어서, 훨씬 양호한 성적, 및 거의 정상의 성적이 관찰되었다. 신규물체 인식 태스크, Morris 수미로시험 또는 조건부 공포 태스크에 의해 평가한 장기기억에 관해서는, 어느 쪽 항Aβ 올리고머 항체도 성적을 거의 정상인 그대로 유지시켰다.

이러한 양 항체의 기억장애 발증 예방효과(기억 유지효과)에 일치하여, 항체 치료 마우스군에서는 PBS 치료군에 비해 혈액 중에 A11 양성 올리고머의 선택적인 증가가 확인되었다. 1A9 항체 치료에서는, 뇌내 Aβ 축적 억제효과도 확인되었다. 2C3 항체 치료에서는 1A9 항체 치료 이상으로 혈액 중 A11 양성 올리고머의 존재가 증명되었으나, 뇌내 Aβ 축적 억제효과는 명확하지 않았다. 따라서, 뇌내 Aβ 축적으로의 공헌도는 1A9 올리고머 쪽이 2C3 항체보다 큰 것으로 생각되었다. 신경독성 1A9 중합체는 약간 입체구조적으로 안정화된 가용성 독성 올리고머이고, 신경독성 2C3 중합체는 중합 프로세스의 초기 단계에 출현하는 매우 불안정하고 입체구조 변화를 초래하기 쉬운, 수명이 짧은 올리고머성 중간체로 생각되는 뇌내 Aβ 축적으로의 관여에 대한 설명이 가능하다.

어느 경우에도, 본 명세서에 제시한 항올리고머 항체에 의한 알츠하이머병의 인 비보 예방효과는, 인 비보에서 생성되는 독성 Aβ 올리고머가 신경세포 기능을 방해하여 알츠하이머병의 증상을 초래할 수 있다는 증거를 처음 직접적으로 증명한 것이다.

본 발명자 등의 데이터는 또한, 인간 뇌에 있어서의 Aβ의 인 비보 신경독성에 대해서도 첫 방증을 제시하는 것이다. 인간 내후영피질은 AD로 침범당하기 쉬운 부위인 것은 유명하나, 동일 부위에서는 NFT 형성 및 신경세포 상실이 노인반 형성에 선행하여, 넓게 받아들여지고 있는 아밀로이드 캐스캐이드 가설이 들어맞지 않는 예위 부위인 것이 오랫동안 무시 방치되어 왔다.

본 발명자 등은 지금까지 동정 불가능했던 비가시적인 Aβ 올리고머가 내후영피질의 신경세포에 대해 유해하여, 기억장애를 일으킨다는 가설을 세우고 검증하였다. 이 가설을 검증하기 위해, 본 발명자 등은, 주로 Braak NFT 스테이지 I~III의 고령 인간의 내후영피질에 있어서 1A9 또는 2C3 면역반응성 12-mer의 반정량적 해석을 행하였다. 1A9 또는 2C3 면역반응성 12-mer은 Braak NFT 스테이지 I~II의 건강한 정상 개체의 내후영피질에 이미 존재하고, Braak NFT 스테이지가 진행됨에 따라 증가하여, AD에서 유의한 증가가 확인되었다. 따라서, 1A9 또는 2C3 면역반응성 12-mer의 출현은 인지기능장애의 발증에 선행하는 것이 인간 뇌에서 명확해졌다. 한편, 노인반 자체에 1A9 또는 2C3 면역반응성 Aβ 올리고머가 존재하는 것이, 생화학적·면역조직화학적 수법에 의해 확인된 것, 불용화된 아밀로이드 섬유 자체에 신경독성 중화활성이 존재하는 것도 확인된 것으로부터, 이러한 Aβ 올리고머가 존재함에도 불구하고, 노인반이 형성되지 않는 상황에서는, Aβ 올리고머 자체가 인 비보 독성을 발휘하여 기억장애 발증의 한 원인이 되는 것으로 생각되었다.

본 발명자 등의 데이터는, 앞에서도 기술한 바와 같이, 인 비보에서의 내인성 Aβ 올리고머를 매개로 한 시냅스 기능 이상에 기인한 기억장애를 직접적으로 증명한 첫 보고이다. 또한, 지금까지 능동 면역처치[Janus D, 2000, Nature;Morgan D, 2000, Nature] 또는 수동 면역처치[Bard F, 2222、Nat med;DeMattos RB, PNAS, 2001]가 이루어져 왔지만, 학습장애 및 기억장애가 어떻게 저지되는지에 대한 메커니즘에 관해서는 추측의 영역을 벗어나지 못한 것이 현재 상황이다. 널리 제창되고 있는 하나의 가능성은, 항체가 혈액뇌관문을 통과하여 뇌에 도달하고, 인 비보에서 기억력 저하의 원인이 되는 가용성 Aβ 올리고머를 직접 중화한다는 것이다. 제2 가능성은, 항체 자체는 말초에서 작용하고, 혈액 중의 Aβ 말초 푸울을 고갈시켜 뇌로부터의 Aβ 클리어런스를 활성화시킨다는 "sink theory"이다. DeMattos 등은, 말초 투여된 항Aβ 항체가 혈장 중에 뇌내 Aβ 모노머 뿐 아니라, Aβ 다이머의 급속한 추출과 CSF로의 뇌내 Aβ의 급속한 추출을 행하는 것을 보고하고 있다[DeMattos RB et al, PNAS, 98; 8850-8855, 2001]. 본 발명자 등도, 인간 CSF 중에 Aβ 올리고머가 존재하고, AD 환자에서 증가하고 있는 것을 명확하게 하고, AD 진단 마커로서의 유용성을 확인하였다. 또한 Tg2576 마우스 혈장 중에 Aβ 올리고머가 존재하고, 경정맥 주사에 따른 그 특이적 포착·중화에 의한 수동 면역치료에 있어서는, 항체를 뇌내에 운반할 필요가 없어, 혈액 중이라는 말초의 작용점에서, 뇌로부터 혈액 중으로 Aβ 올리고머의 클리어런스 촉진이 가능하다는 방증도 처음 제시하였다. 또한 노인반 아밀로이드 형성 자체, 또한 노인반 아밀로이드를 매개로 한 간접적인 신경세포 상해(종대변성 신경돌기 형성) 억제도 수동 면역요법으로 가능하다는 방증을 처음 제시할 수 있었다. 이들 결과는 Aβ 올리고머가 알츠하이머병 발증의 분자기반으로, 그 특이적 항체에 따른 선택적 제어로 알츠하이머병 자체의 질병 제어가, 치료보다 일보 진전한 예방적 견지에서 가능한 것을 확인할 수 있었다. 또한 뇌내로 투여 항체의 일부가 이행하는 것이 증명되어, 뇌내에서 가용성 Aβ 올리고머를 직접 중화하는 작용이나, Aβ 올리고머와 항체가 면역복합체로서 neonatal Fc-receptor[Deane R, 2005, J Neurosci]를 매개로 혈중으로 수송되는 작용, 앞선 sink 작용 등이 복합적으로 작용하여, 기억장애 억제효과가 발휘되고 있는 것으로 생각되었다.

또한, 이러한 예방치료 구축에 불가결한 명제가, AD를 발증할 리스크가 높은 증례의 확실한 발증 전 진단의 실현이다. 본 명세서에서 보고한 AD에 있어서의 CSF O/M비의 유의한 증대는, 이 목적 달성을 위한 유력 후보라 생각하였다.

본 발명에 의해 제공되는 항체는, 예를 들면 알츠하이머병의 경정맥적 예방적 수동 면역요법, 바이올로지컬 마커(발증 전 진단, 병세 관찰, 약효 모니터·판정) 등에 사용하는 것이 가능하다.

또한 본 발명에 의해 제공되는 항체에 의해, 알츠하이머병의 병태 야기성 책임분자 선택적인 예방·치료법 확립과 조기 진단 마커 확립으로의 다대한 공헌이 기대된다. 뇌내 병태를 표적으로 해야 하는 항체 요법에 있어서도, 그 뇌내 이행을 고려하지 않고 말초 정맥 투여요법으로 충분하다는 방증, 더 나아가서는 뇌내 이행을 고려하지 않고 행할 수 있는 말초 정맥 투여요법으로도 항체의 일부는 뇌내로 이행하여 그 직접효과에 의한 부가효과가 얻어진다고 하는 증거가 얻어진 결과, 알츠하이머병의 항체 의료가 단번에 가속될 것으로 생각된다.

SEQUENCE LISTING <110> IMMUNAS PHARMA, INC. Matsubara, Etsuro <120> ANTIBODY SPECIFIC BINDING TO A BETA OLIGOMER AND THE USE <130> M7-X0601P <150> JP 2007-272015 <151> 2007-10-19 <150> US 61/085,540 <151> 2008-08-01 <160> 60 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Arg Glu Val Arg Pro Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn 145 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21 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 40 caacagggta atacgcttcc gtacacg 27 <210> 41 <211> 455 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Glu Leu Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr 210 215 220 Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys 245 250 255 Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn 275 280 285 Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu 325 330 335 Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg 340 345 350 Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg 355 360 365 Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp 370 375 380 Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser 420 425 430 Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr 435 440 445 Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 42 <211> 1368 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 42 gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcgac ctggaggatc catgaaactc 60 tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120 ccagagaagg ggctcgagtg ggttgctgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180 cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gggatgattc caaaagtagt 240 gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtaccagg 300 gaactacggt atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagcc 360 aaaacaacac ccccatcagt ctatccactg gcccctgggt gtggagatac aactggttcc 420 tccgtgactc tgggatgcct ggtcaagggc tacttccctg agtcagtgac tgtgacttgg 480 aactctggat ccctgtccag cagtgtgcac accttcccag ctctcctgca gtctggactc 540 tacactatga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggccaagtca gaccgtcacc 600 tgcagcgttg ctcacccagc cagcagcacc acggtggaca aaaaacttga gcccagcggg 660 cccatttcaa caatcaaccc ctgtcctcca tgcaaggagt gtcacaaatg cccagctcct 720 aacctcgagg gtggaccatc cgtcttcatc ttccctccaa atatcaagga tgtactcatg 780 atctccctga cacccaaggt cacgtgtgtg gtggtggatg tgagcgagga tgacccagac 840 gtccagatca gctggtttgt gaacaacgtg gaagtacaca cagctcagac acaaacccat 900 agagaggatt acaacagtac tatccgggtg gtcagcaccc tccccatcca gcaccaggac 960 tggatgagtg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca aagacctccc atcacccatc 1020 gagagaacca tctcaaaaat taaagggcta gtcagagctc cacaagtata catcttgccg 1080 ccaccagcag agcagttgtc caggaaagat gtcagtctca cttgcctggt cgtgggcttc 1140 aaccctggag acatcagtgt ggagtggacc agcaatgggc atacagagga gaactacaag 1200 gacaccgcac cagtcctgga ctctgacggt tcttacttca tatatagcaa gctcaatatg 1260 aaaacaagca agtgggagaa aacagattcc ttctcatgca acgtgagaca cgagggtctg 1320 aaaaattact acctgaagaa gaccatctcc cggtctccgg gtaaatga 1368 <210> 43 <211> 214 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 44 <211> 645 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 44 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctcctcggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag taccctcacg 540 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 645 <210> 45 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Glu Leu Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 46 gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcgac ctggaggatc catgaaactc 60 tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120 ccagagaagg ggctcgagtg ggttgctgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180 cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gggatgattc caaaagtagt 240 gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtaccagg 300 gaactacggt atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 48 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 48 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctcctcggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 50 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 50 aactactgga tgaac 15 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His 1 5 10 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 52 gaaattagat tgaaatctaa taattatgca acacat 36 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Glu Leu Arg Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 54 gaactacggt atgctatgga ctac 24 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 56 cgagcaagtg ggaatattca caattattta gca 33 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 58 aatgcaaaaa ccttagcaga t 21 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 60 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 60 caacattttt ggagtactcc tcggacg 27

Claims (22)

1. Aβ 올리고머에 결합하는 항체로서, Aβ 모노머에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
2. 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬, 및 서열번호:3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체가 결합하는 Aβ 올리고머와 결합하는 항체.
3. 서열번호:21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬, 및 서열번호:23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체가 결합하는 Aβ 올리고머와 결합하는 항체.
4. 서열번호:41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬, 및 서열번호:43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체가 결합하는 Aβ 올리고머와 결합하는 항체.
5. 이하의 (1)~(20) 중 어느 하나에 기재된 항체.
   (1) CDR1으로서 서열번호:9에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:11에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체
   (2) CDR1으로서 서열번호:15에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:17에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체
   (3) (1)에 기재된 H사슬, 및 (2)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체
   (4) VH로서 서열번호:5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체
   (5) VL로서 서열번호:7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체
   (6) (4)에 기재된 H사슬, 및 (5)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체
   (7) CDR1으로서 서열번호:29에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:31에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체
   (8) CDR1으로서 서열번호:35에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:37에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체
   (9) (7)에 기재된 H사슬, 및 (8)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체
   (10) VH로서 서열번호:25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체
   (11) VL로서 서열번호:27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체
   (12) (10)에 기재된 H사슬, 및 (11)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체
   (13) CDR1으로서 서열번호:49에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:51에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:53에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체
   (14) CDR1으로서 서열번호:55에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호:57에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3로서 서열번호:59에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체
   (15) (13)에 기재된 H사슬, 및 (14)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체
   (16) VH로서 서열번호:45에 기재된 아미노산 서열을 갖는 H사슬을 포함하는 항체
   (17) VL로서 서열번호:47에 기재된 아미노산 서열을 갖는 L사슬을 포함하는 항체
   (18) (16)에 기재된 H사슬, 및 (17)에 기재된 L사슬을 포함하는 항체
   (19) (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체
   (20) (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체
6. 제5항에 있어서,
   항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제7항의 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 항인지기능장애제.
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제7항의 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 알츠하이머병 치료제.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제7항의 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 알츠하이머병 진행 억제제.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제7항의 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 노인반 형성 억제제.
12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제7항의 조성물을 유효성분으로서 함유하는, Aβ 축적 억제제.
13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제7항의 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 항신경독성제.
14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제7항의 조성물을 유효성분으로서 함유하는, Aβ 아밀로이드 섬유 형성 저해제.
15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제7항의 조성물을 유효성분으로서 함유하는, 항시냅스 독성제.
16. 피험자로부터 채취된 시료에 포함되는 Aβ 올리고머를, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체를 사용하여 검출하는 공정을 포함하는, Aβ 올리고머를 측정하는 방법.
17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체를 사용하여, 피험자로부터 채취된 시료에 있어서의 Aβ 올리고머를 검출하는 것을 특징으로 하는, 피험자가 알츠하이머병 후보인지 여부를 진단하는 방법.
18. 이하의 공정을 포함하는, 피험자가 알츠하이머병 후보인지 여부를 진단하는 방법으로서, 공정(b)에 기재된 양이 건강한 정상인과 비교하여 높은 경우에, 피험자가 알츠하이머병 후보라고 판정되는 방법.
    (a) 피험자로부터 채취한 시료, 및 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체를 접촉시키는 공정
    (b) 상기 시료 중에 있어서의 Aβ 올리고머의 양을 측정하는 공정
19. 이하의 공정을 포함하는, 피험자가 알츠하이머병 후보인지 여부를 진단하는 방법으로서, 공정(b)에 기재된 비가 건강한 정상인과 비교하여 높은 경우에, 피험자가 알츠하이머병 후보라고 판정되는 방법.
    (a) 피험자로부터 채취한 시료, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체, 및 Aβ 모노머에 결합하는 항체를 접촉시키는 공정
    (b) 상기 시료 중에 있어서의 Aβ 모노머에 대한 Aβ 올리고머의 비를 측정하는 공정
20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    시료가 혈액 또는 뇌척수액인 방법.
21. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 약제.
22. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 키트.

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