WO2006137354A1 - アミロイド線維形成に対する阻害活性を有する抗体 - Google Patents

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Katsuhiko Yanagisawa
Masao Shibata
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Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.
The President Of National Center For Geriatrics And Gerontology
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody having an inhibitory activity against amyloid fibril formation, a method for producing the same, and the like. Specifically, the present invention relates to an antibody having a high inhibitory activity against amyloid fibril formation.
  • Amyloid fibril formation (aggregation 'polymerization of amyloid j8 protein) is considered to be essentially involved in the onset and progression of Alzheimer's disease. Therefore, the antibody of the present invention can be used for prevention, treatment, and diagnosis of Alzheimer's disease and elucidation of the mechanism of Alzheimer's disease.
  • AD Aruno-iuma disease
  • the characteristics commonly seen in patients with Arno-Ima disease include (1) brain atrophy (2) the formation of patchy deposits called senile plaques (3) the presence of fibrous substances in nerve cells
  • senile plaques There are three types of neurofibrillary tangles that have accumulated, and if these three are recognized, Alzheimer's disease is diagnosed. It is closely related to dementia, a clinical symptom of Alzheimer's disease, and the power that is the loss of nerve cells
  • the pathological changes described above are important for the reason why loss of nerve cells occurs. Gives hand strength.
  • Arno and Imah's disease are known to be familial Arno's imima caused by genetic factors and sporadic Alzheimer without genetic background, and the genes and risk factors for familial Alzheimer's Is being revealed.
  • One of the causative genes for familial Alzheimer's is a gene that codes for amyloid precursor protein (Amyloid Precursor Protein; APP), and if this gene is mutated, it always causes Alno-Ima disease. Are known. Therefore, if the action and function of these mutants are found, it is considered that the mechanism of the onset of ulzno and ima disease will be clarified. Since it is expected that there is a common mechanism between familial Alzheimer and sporadic Alzno-Ima, the research capabilities of the pathogenesis of familial Alzno and Imah's disease are also applicable to sporadic Alzheimer It is thought that a possible mechanism emerges.
  • APP amyloid Precursor Protein
  • a j8 is cleaved from APP by j8 and ⁇ -secretase
  • a j8 has ⁇
  • GM1 is contained in ⁇
  • this antibody recognizes GA ⁇ complex such as Albheimer's disease brain and suppresses ⁇ ⁇ polymerization using GA ⁇ complex as a seed.
  • 8 fibril formation the core of the amyloid hypothesis that explains the onset mechanism of Alzheimer's disease, may actually occur in vivo. (International Publication No. 03/014162, J Neurosci., 2004, 24: 4894-4902)
  • Patent Document 1 International Publication No. 03/014162
  • Non-Patent Document 1 K. Yanagisawa, A. Odaka, N. Suzuki, Y. Ihara, Nat. Med. 1, 1062 (19
  • Non-Patent Document 2 K. Yanagisawa, Y. Ihara, Neurobiol. Aging 19, S65 (1998)
  • Non-Patent Document 3 FEBS Letters 420, 43-46 (1997)
  • Non-patent literature 4 J. McLaurin, A. Chakrabartty, J. Biol. Chem. 271, 26482 (1996)
  • Non-patent literature 5 P. Choo—Smith, WK Surewicz, FEBS Lett. 402, 95 (1997)
  • Non-patent Reference 6 McLaurin J, Chakrabartty A, Eur J Biochem. 245 (2) 355 (1997)
  • Non-Patent Reference 7 P.Choo- Smith, W. Garzon- Rodriguez, CG Globe, WK Sutrewicz, J. Biol. Chem. 272, 22987 (1997)
  • Non-Patent Document 8 K. Matsuzaki, C. Horikiri, Biochemistry 38, 4137 (1999)
  • Non-patent document 9 V. Koppaka, P. H. Axelsen, Biochemistry 39, 10011 (2000)
  • Non-patent document 10 A. Kakio, S. Nishimoto, K. Yanagisawa, Y. Kozutumi, K. Matsuzaki,
  • Non-patent literature l l U.Igbavboa, N.A.Avdulov, F.Schroeder, W.G.Wood, J.Neurochem. 6 6, 1717 (1996)
  • Non-Patent Document 12 U. Igbavboa, N.A. Avdulov, S.V. Chochina, W. G. Wood, J. Neurochem. 69, 1661 (1997)
  • Non-Patent Document 13 R.G.Parton, J. Histochem.Cytochem. 42, 155 (1994)
  • Non-Patent Document 14 K. Simons, E. Ikonen, Nature 387, 569 (1997)
  • Non-Patent Document 15 S.J ⁇ ee et al., Nat. Med. 4, 730 (1998)
  • Non-patent document 16 M. Morishima-Kawashima, Y.lhara, Biochemistry 37, 15274 (1998)
  • Non-patent document 17 N. Sawamura et al, J. Biol. Chem. 275, 27901 (2000)
  • Non-Patent Document 18 J Neurosci., 2004, 24: 4894-4902
  • Alzheimer's treatment involves direct inoculation or ingestion of substances that cause an immune response, such as vaccine therapy.
  • ⁇ Active immunotherapy '' that stimulates and activates the immune system present in the body
  • ⁇ Passive immunotherapy '' that activates and restores lymphocytes responsible for the immune response such as activated lymphocyte therapy outside the body
  • antibodies that exhibit sufficient inhibitory activity against amyloid fibril formation have not been obtained.
  • the present inventors used the 4396 antibody, and the antigen to which this antibody reacts is present in a large amount in the brain of the Arno-i-maima disease patient and the aging cynomolgus monkey compared with the control, and the aging ability- It was shown that GM1 and A ⁇ coexisted histologically and physically in the quiz brain! (International Publication No. 03/014162, J Neurosci., 2004, 24: 4894-4902) .
  • the 4396 antibody (FEBS Letters 420, 43-46 (1997)) was obtained by reacting A j8 with GM1-containing ribosomes in vitro and using a crude fraction rich in A j8 in the brain of Alzheimer's disease patients.
  • the antigen to which) reacts was proved to be GA
  • 8 (for example, ⁇ J052, J Neurosci., 2004, 24: 4894-4902).
  • the 4396 antibody is the first antibody that does not recognize Aj8 and its precursor protein APP and reacts with GA ⁇ . Further investigation of the properties of this antibody using an Aj8 fibril formation assay using Thioflavin T in vitro revealed that the activity of inhibiting fibril formation not seen with conventional A
  • this antibody reacts with GA
  • GM1 ribosome composition ratio variation and binding ⁇ It was important to clarify the relationship between
  • variable region sequence especially CDR sequence information, has high ⁇ -polymerization inhibitory activity and is extremely important information for producing antibodies, and its utility value is high.
  • the CDR information of these antibodies is an essential feature of antibodies with high A
  • the first aspect of the present invention relates to an isolated antibody having an inhibitory activity against amyloid fibril formation.
  • the inhibitory effect is 50% or more in an in vitro amyloid
  • the inhibitory effect of the test antibody is based on the principle that the test antibody is added in an environment where ⁇ ⁇ polymerization occurs with the GA ⁇ complex as the nucleus! Or in an environment where ⁇ fibers already exist. It is calculated by comparing the amount of polymerization after reaction for a predetermined time with the amount of A polymerization under the condition that the test antibody is not added.
  • the antibody of the present invention preferably recognizes GM1 gandarioside-bound amyloid
  • One embodiment of the antibody of the present invention has a CDR comprising any one of SEQ ID NOs: 2 to 4, 10 to 12, 18 to 20, and 26 to 28, or an amino acid sequence substantially identical thereto.
  • Light chain variable region having a heavy chain variable region and a CDR comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 6-8, 14-16, 22-24, and 30-32 or an amino acid sequence substantially identical thereto With.
  • amino acid sequences are derived from antibody sequences that were actually obtained and identified as having high inhibitory activity against amyloid fibril formation.
  • the antibody of the present invention comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region of a combination selected from the group consisting of the following a to h.
  • heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or substantially the same amino acid sequence thereof
  • heavy chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or substantially the same amino acid sequence thereof
  • a heavy chain variable region having a CDR comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or substantially the same amino acid sequence thereof, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence substantially identical thereto Having CDR1, SEQ ID NO: 7 or CDR2 having substantially the same amino acid sequence, and SEQ ID NO: 8 amino acid sequence or CDR3 having substantially the same amino acid sequence.
  • a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or substantially the same amino acid sequence thereof, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
  • a heavy chain variable region having a CDR comprising a heavy chain CDR2 having SEQ ID NO: 12 or a heavy chain CDR3 having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or substantially the same CDR1 having a substantially identical amino acid sequence, SEQ ID NO: 15 or a CDR2 having substantially the same amino acid sequence, and SEQ ID NO: 16 having an amino acid sequence or substantially the same amino acid sequence as that Combination with light chain variable region with CDR3
  • heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or substantially the same amino acid sequence thereof
  • heavy chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or substantially the same amino acid sequence thereof
  • SEQ ID NO: 24 having the amino acid sequence of CDR3 or substantially the same amino acid sequence as CDR3.
  • heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 or substantially the same amino acid sequence thereof
  • heavy chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 or substantially the same amino acid sequence thereof
  • SEQ ID NO: : A heavy chain variable region having a CDR consisting of a heavy chain CDR3 having 28 amino acid sequences or an amino acid sequence substantially identical thereto, and having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 or an amino acid sequence substantially identical thereto CDR1, SEQ ID NO: 31, or CDR2 having substantially the same amino acid sequence, and SEQ ID NO: 32, having the amino acid sequence substantially identical to the CDR3 Combination with chain variable region
  • the combination of the heavy chain variable region and the light chain variable region described above is a combination of the heavy chain variable region and the light chain variable region in an antibody that was actually obtained and identified as having a high inhibitory activity against amyloid fibril formation. It corresponds to a combination.
  • the antibody of the present invention can be constructed as a humanized antibody. Being a human rabbit antibody, the antibody of the present invention is particularly suitable for therapeutic purposes.
  • the antibody of the present invention is a complete antibody (ie, an antibody consisting of a heavy chain and a light chain each having a constant region and a variable region), Fab, Fab ′, F (ab ′), scFv, or dsFv antibody, etc. of
  • Another aspect of the present invention provides a CDR region of an antibody having a high inhibitory activity against amyloid fibril formation.
  • a CDR comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2-4, 6-8, 10-12, 14-16, 18-20, 2 2-24, 26-28, and 30-32 Provided.
  • These CDRs can be used to construct antibodies with high inhibitory activity against amyloid fibril formation, and their utility value is high. In particular, it is an important material for constructing human or humanized antibodies.
  • the present invention further comprises an isolated nucleic acid molecule encoding the heavy chain or light chain variable region of the antibody of the present invention, the heavy chain or light chain of the antibody of the present invention, or the CDR region of the present invention. provide.
  • an antibody having a high inhibitory activity against amyloid fibril formation can be produced.
  • the present invention also provides a vector capable of expressing the nucleic acid molecule and a transformant into which the nucleic acid molecule is introduced.
  • the vector and the transformant can be used, for example, for preparing an antibody having a high inhibitory activity against amyloid fibril formation.
  • a synthetic lipid membrane for animal immunization that can be used to produce an antibody having a high inhibitory activity against amyloid fibril formation is provided.
  • the present invention further provides a method for producing an antibody using the synthetic lipid membrane.
  • the production method of the present invention comprises an immunization step of immunizing a non-human animal with the above synthetic lipid membrane, and the above-mentioned non-human animal force obtained after immunization is fused with an immortalized cell to obtain a hyperidoma.
  • a selection of a hyperidoma that produces an antibody having a binding property to the synthetic lipid membrane and not binding to a monomeric amyloid j8 protein is performed.
  • an antibody having a binding property to monomeric amyloid ⁇ protein that is, non-polymerized amyloid ⁇ protein
  • the present invention also provides an antibody production method using an antibody library. That is, a contact step in which the antibody library is brought into contact with the synthetic lipid membrane, a clone selection step in which clones having binding properties to the synthetic lipid membrane are selected from the antibody library, and expression of the selected clones And an antibody separation step for separating the antibody to be produced. Also in this production method, in order to obtain an antibody having high specificity for the GA j8 complex, a clone having binding property to the synthetic lipid membrane and not binding to monomer amyloid j8 protein was selected in the clone selection step. It is preferable to select.
  • the present invention further provides an isolated antibody obtained by the above production method.
  • the present invention also provides a method for measuring the inhibitory activity of an antibody on amyloid fibril formation.
  • the above is performed in the presence and absence of the test antibody, respectively.
  • To the synthetic lipid membrane between the step of contacting the synthetic lipid membrane with amyloid ⁇ protein the case where the above step is carried out in the presence of the test antibody, and the case where the above step is carried out in the absence of the test antibody Comparing the degree of binding of amyloid j8 protein and the degree of polymerization of sputum or amyloid ⁇ protein.
  • the measurement method of the present invention includes, for example, measuring the inhibitory activity of the antibody of the present invention, screening the target antibody in the antibody production method of the present invention, and inhibiting the antibody obtained by the antibody production method of the present invention. It is used for confirming the activity.
  • Figure 1 is a binding amount of the GM1-containing ribosomes 125 1-labeled amyloid j8 protein (1-40), varied GM1 and cholesterol molar ratio of lipid constituting the ribosome (molecular ratio) It is the graph which put together the result measured.
  • the amount of amyloid j8 protein (1-40) that binds to liposomes with a GM1 composition of 10-40% is high. In particular, the amount of binding is highest when the sphingomyelin: cholesterol: GM1 (molecular ratio) is 64:16:20.
  • FIG. 2 is 125 1-labeled amyloid j8 protein (1-42) GM1 results were measured boss binding amount by varying the GM1 and cholesterol molar ratio of lipid constituting the ribosome to contain ribosomes It is the graph which summarized. The amount of amyloid j8 protein (1-42) bound to the ribosome composed of 10-40% GM1 is large. In particular, when Sphingomyelin: cholesterol: GM1 (molecular ratio) is 64:16:20, the amount of binding is the highest.
  • FIG. 3 is a table summarizing the composition (molecular ratio) of the GM1 ribosome used in the A j8 binding experiment to GM1 ribosome.
  • SM Sphingomyelin
  • Choi Cholesterol
  • GM1 GM1 Gandarioside.
  • Ribosomes that do not contain GM1 have a GM1 molecular ratio of 0 during this process. Mixing was performed so that the total concentration (total concentration) of each component was 4600 ⁇ .
  • Fig. 4 shows the amyloid ⁇ protein polymerization inhibitory activity of the obtained antibodies by three types of polymerization systems ( ⁇ . ⁇ polymerization initiated by adding ⁇ fiber fragment, B.GA ⁇ 40 initiated ⁇ It is the result measured by polymerization of ⁇ 40, polymerization of C 42 starting from C.GA ⁇ 42. * Relative fluorescence intensity with 100% fluorescence intensity when polymerized with no antibody added! /. The experiment was performed three times and showed typical results. * * Fibrous ⁇ Polymerization reaction initiated by adding
  • FIG. 5 shows the results of measuring the amyloid ⁇ protein depolymerization activity of the obtained antibody 2E12.
  • Antibody 2E12 was added to A j840 solution at the same time as GA j8 was added, and fibril formation measurement of A
  • FIG. 6 shows the results of measuring the amyloid ⁇ protein depolymerization activity of the obtained antibody 3G11.
  • Antibody 3G11 was added to A j840 solution at the same time as GA j8 was added, and fibril formation measurement of A
  • FIG. 7 shows the effects of antibodies 2E12 and 3G11 on ⁇
  • Antibodies 4E12 and 3G11 were added 4 hours after the addition of GM1 ribosome.
  • the results of Thioflavin T fluorescence measurement over time after the addition are shown in a graph. A clear decrease in the measured value can be seen by adding antibodies 2E12 and 3G11.
  • 4396C is added as a positive control, suppression of ⁇
  • FIG. 8 shows the effects of antibodies 2E12 and 3G11 on ⁇
  • FIG. 9 shows the gene sequence (sequence size: 363) and amino acid sequence of antibody 1C9, which inhibits GM1 gandarioside-bound amyloid ⁇ protein polymerization, obtained by immunization with GM1-containing ribosomes.
  • FIG. CDR is a complementarity determinating region.
  • FIG. 10 shows the gene sequence (sequence size: 327) and amino acid sequence of the L chain variable region of antibody 1C9 obtained by immunization with GM1-containing ribosomes and inhibiting GM1 gandarioside-bound amyloid ⁇ protein polymerization.
  • FIG. CDR is the complementarity determining site (complementarity determing region).
  • FIG. 11 shows the gene sequence (sequence size: 345) and amino acid sequence of antibody 2E12 obtained by immunization with GM1-containing ribosome, which inhibits GM1-gandarioside-bound amyloid ⁇ protein polymerization.
  • FIG. CDR is the complementarity determining unit
  • FIG. 12 shows the gene sequence (sequence size: 327) and amino acid sequence of the L2 variable region of antibody 2E12 obtained by immunization with GM1-containing ribosomes and inhibiting GM1 gandarioside-bound amyloid ⁇ protein polymerization.
  • FIG. CDR represents a complementarity determining region (.complementarity determing region).
  • FIG. 13 shows the gene sequence (sequence size: 339) and amino acid sequence of antibody 3G11 obtained by immunization with a GM1-containing ribosome, which inhibits GM1-gandarioside-bound amyloid ⁇ protein polymerization.
  • FIG. CDR is the complementarity determining unit
  • FIG. 14 shows the gene sequence (sequence size: 339) and amino acid sequence of the L3 variable region of antibody 3G11 obtained by immunization with GM1-containing ribosomes, which inhibits GM1 gandarioside-bound amyloid ⁇ protein polymerization.
  • FIG. CDR is the complementarity determining unit
  • FIG. 15 shows the gene sequence (sequence size: 366) and amino acid sequence of antibody 4E11 obtained by immunization with GM1-containing ribosomes, which inhibits GM1-gandarioside-bound amyloid ⁇ protein polymerization.
  • FIG. CDR is the complementarity determining unit
  • FIG. 16 shows the gene sequence (sequence size: 342) and amino acid sequence of the L4 variable region of antibody 4E11 obtained by immunization with GM1-containing ribosomes, which inhibits GM1-gandarioside-bound amyloid ⁇ protein polymerization.
  • FIG. CDR represents a complementarity determining region (.complementarity determing region).
  • FIG. 17 is a diagram showing a structural example of an expression vector.
  • FIG. 17 (A) shows the structure of the heavy chain expression vector (BCMGSneo-H).
  • FIG. 17 (B) shows the structure of the L chain expression vector (BCMGSneoL).
  • FIG. 18 is a diagram schematically showing a method for producing human CDR-grafted antibody variable region DNA.
  • amyloid j8 protein is also abbreviated as “ ⁇
  • GM1 Gandarioside is abbreviated as “GM1”.
  • 8 protein is abbreviated as “GA ⁇ protein” or “GA ⁇ complex”! /
  • amyloid ⁇ protein polymerization inhibitory activity is a term including an activity of suppressing polymerization of amyloid / 3 protein and an activity of depolymerizing polymerized amyloid j8 protein, unless otherwise specified. Used.
  • isolated means that it is removed from its original environment (for example, the natural environment in the case of natural substances), that is, exists in a state different from the original state by human manipulation.
  • isolated antibody refers to an antibody that is naturally occurring and has not been subjected to any external manipulation (artificial manipulation), that is, an antibody that is produced and remains in an individual. Is not included. It should be noted that the isolated antibody typically exists in a state that is mixed with other types of antibodies, that is, alone (as a group of antibodies of the same type).
  • An “isolated” state in the case of a CDR region includes the state that exists with other regions of the antibody in addition to the state that exists alone.
  • isolated CDR includes CDRs present as part of an isolated antibody as well as CDRs present alone.
  • a nucleic acid is isolated as long as it exists as a result of human manipulation, whether it exists as part of a vector or composition, or as a foreign molecule in a cell. It corresponds to.
  • substantially identical used for the amino acid sequence means that the difference in sequence between the two amino acid sequences to be compared is relatively small and the difference in sequence is related to the ability to inhibit amyloid ⁇ protein polymerization. It means no substantial impact.
  • the amino acid sequence that can be considered to contain some modifications within the range that does not substantially affect the amyloid ⁇ protein polymerization inhibitory activity relative to the reference amino acid sequence is a substantially identical amino acid sequence. is there.
  • “partial modification of amino acid sequence” refers to deletion or substitution of one to several amino acids constituting the amino acid sequence, or addition, insertion, or combination of one to several amino acids. The change occurs in the amino acid sequence.
  • the position of the amino acid sequence mutation is not particularly limited, and the mutation may occur at a plurality of positions.
  • the term “plurality” as used herein refers to a number corresponding to, for example, within 10% of all amino acids constituting the amino acid sequence, and preferably a number corresponding to within 5% of all amino acids. More preferably, the number corresponds to within 1 percent of all amino acids.
  • the ability of two amino acids to be substantially identical depends on whether the antibody containing each amino acid sequence (the sequence of the other region is the same) has an amyloid ⁇ 8 protein polymerization inhibitory activity (hereinafter “inhibitory activity” unless otherwise stated).
  • inhibiting activity amyloid ⁇ protein polymerization inhibitory activity
  • the inhibitory activity of an antibody containing a reference amino acid sequence is assumed to be 100%, and the inhibitory activity of an antibody containing an amino acid sequence to be compared is 50% or less. If the difference is significant, substantial identity cannot be recognized. On the other hand, if there is no significant difference in the inhibitory activity, for example, 70% to 130%, substantial identity can be identified.
  • an antibody that inhibits the formation of amyloid fibrils that is, an antibody that has an inhibitory activity on amyloid fibril formation is also referred to as an "anti- ⁇ polymerization inhibitory antibody” in this specification.
  • antibodies specifically recognizing GM1 gandarioside-bound amyloid / 3 protein (GA complex) are also referred to as “anti-GA ⁇ antibodies”.
  • nucleic acid as used herein includes DNA (including cDNA and genomic DNA), RNA (including mRNA), DNA analogs, and RNA analogs.
  • the form of the nucleic acid of the present invention is not limited, that is, it may be either single-stranded or double-stranded. Preferred is double-stranded DNA.
  • the degeneracy of codon is also considered. That is, in the case of a nucleic acid encoding a protein, its expression and production As long as the protein is obtained as a product, it may have an arbitrary base sequence.
  • nucleic acid encoding a protein refers to a nucleic acid that can be obtained when the protein is expressed, and a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the protein.
  • nucleic acid having a sequence it also includes a nucleic acid (for example, a DNA containing one or more introns) in which such a nucleic acid does not encode an amino acid sequence and is added with a sequence.
  • isolated nucleic acid refers to other nucleic acids that typically coexist in the natural state in the case of nucleic acids that are naturally occurring (eg, nucleic acids in human organisms).
  • the nucleic acid is separated from the nucleic acid. However, it may contain some other nucleic acid components such as adjacent nucleic acid sequences in the natural state.
  • the preferred form of “isolated nucleic acid” in the case of genomic DNA is substantially free of other DNA components that coexist in the natural state (including DNA sequences that are contiguous in the natural state). Not included! / ⁇ .
  • isolated nucleic acid preferably refers to a nucleic acid that is substantially free of cell components and culture medium.
  • an ⁇ isolated nucleic acid '' in the case of a nucleic acid produced by chemical synthesis preferably does not substantially contain a precursor (raw material) such as dDNTP or a chemical substance used in the synthesis process! /, State nucleic acid!
  • nucleic acid is present as part of a vector or composition, or is present in a cell as a foreign molecule, as long as it exists as a result of human manipulation I can say. Unless otherwise stated, when simply described as “nucleic acid” in this specification, it means “an isolated nucleic acid”.
  • the first aspect of the present invention relates to an isolated antibody (A ⁇ polymerization inhibitory antibody) having inhibitory activity against amyloid fibril formation.
  • antibody herein includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, CDR grafted antibodies, humanized antibodies, fragments thereof,
  • the ⁇ polymerization inhibitory antibody of the present invention is characterized by having an inhibitory effect of 50% or more in an in vitro amyloid ⁇ protein polymerization inhibition test (see below). Due to such a high inhibitory effect, the antibody of the present invention can effectively inhibit the formation of amyloid fibrils.
  • 8 polymerization is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably substantially 100%. .
  • the antibody of the present invention preferably recognizes GM1 gandarioside-bound amyloid
  • the antibody can be expected to have an effect of inhibiting the initial stage of amyloid fibril formation. Therefore, the antibody is particularly useful for preventing the onset of Alzheimer's disease and initial diagnosis of Alzheimer's disease.
  • the “inhibitory activity against amyloid fibril formation ( ⁇ ⁇ polymerization inhibitory activity)” in the present specification is measured and evaluated by any of the following tests (1. to 3.) in principle.
  • amyloid ⁇ protein superposition inhibitory activity by other tests that are considered equivalent to the following tests, or other tests that can be equivalently evaluated by converting the test results into the results obtained by the following tests. You may measure 'evaluate.
  • test group In the presence (test group) or absence (control group) of the test antibody, mix the fibrous A ⁇ solution (5 1) with the A
  • Aj8 fibril formation measurement using Thioflavin T is performed according to Naiki H and Gejyo F (1999) Methods Enzymol 309, 305-318.
  • Thioflavin T Sigma
  • the fluorescence intensity (excitation wavelength: 446 nm, fluorescence wavelength: 490 nm) of the A ⁇ fiber is measured with a spectrofluorometer (for example, RF-5300PC, Shimadzu Corporation).
  • Inhibitory effect (%) (fluorescence intensity of control group fluorescence intensity of test group) Z control group fluorescence intensity X 100
  • This lipid suspension is centrifuged at 13,00 Orpm for 15 minutes (MX-160, TOMY, Tokyo, Japan), and the sediment is resuspended in TBS again so that GM1 has the same concentration. Finally, this suspension is placed on ice for 5 minutes using an ultrasonic crusher (UD-201, power level 2, TOMY, Tokyo, Japan) equipped with a microchip (TP-030, TOMY, Tokyo, Japan). Sonicate and repeat 3 times.
  • UD-201 power level 2, TOMY, Tokyo, Japan
  • test group or absence (control group) of the test antibody
  • 8 solution are mixed and incubated at 37 ° C.
  • Aj8 fibril formation measurement using Thioflavin T is performed according to Naiki H and Gejyo F (1999) Methods Enzymol 309, 305-318.
  • a part (5 ⁇ 1) of the solution after a predetermined time (for example, 20 hours) from the start of incubation is sampled, and Thioflavin T (Sigma) is added thereto to a final concentration of 5 ⁇ .
  • Thioflavin T Sigma
  • the fluorescence intensity (excitation wavelength: 446 nm, fluorescence wavelength: 490 nm) of the A ⁇ fiber is measured with a spectrofluorometer (for example, RF-5300PC, Shimadzu Corporation).
  • Inhibitory effect (%) (fluorescence intensity of control group fluorescence intensity of test group) Z control group fluorescence intensity X 100
  • the lipid membrane containing GM1 gandarioside is usually bound to an insoluble support such as polystyrene resin, polycarbonate resin, silicone resin, nylon resin, etc. Used in.
  • the present inventors succeeded in obtaining four types of antibodies (1C9 antibody, 2E12 antibody, 3G11 antibody, 4E11 antibody) having high inhibitory activity against amyloid fibril formation. .
  • sequence information was obtained. Following the antibody name, the amino acid sequence of the heavy chain variable region; the amino acid sequence of heavy chain CDR1; the amino acid sequence of heavy chain CDR2; the amino acid sequence of heavy chain CDR3; the amino acid sequence of the light chain variable region; Amino acid sequence: Described in the order of the light chain CDR2 amino acid sequence and the light chain CDR3 amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 1 VH
  • SEQ ID NO: 2 VH CDR1
  • SEQ ID NO: 3 VH CDR2
  • SEQ ID NO: 4 VH CDR3
  • SEQ ID NO: 5 VL
  • SEQ ID NO: 6 VL CDR1
  • SEQ ID NO: 7 VL CDR2
  • SEQ ID NO: 8 VL CDR3
  • SEQ ID NO: 9 VH
  • SEQ ID NO: 10 VH CDR1
  • SEQ ID NO: 11 VH CDR2
  • SEQ ID NO: 12 VH CDR3
  • SEQ ID NO: 13 VL
  • SEQ ID NO: 14 VL CDR1
  • SEQ ID NO: 15 VL C DR2
  • SEQ ID NO: 16 VL CDR3
  • SEQ ID NO: 17 (VH); SEQ ID NO: 18 (VH CDR1); SEQ ID NO: 19 (VH CDR2); SEQ ID NO: 20 (VH CDR3); SEQ ID NO: 21 (VL); SEQ ID NO: 22 (VL CDR1); SEQ ID NO: 23 (VL CDR2); SEQ ID NO: 24 (VL CDR3)
  • SEQ ID NO: 25 (VH); SEQ ID NO: 26 (VH CDR1); SEQ ID NO: 27 (VH CDR2); SEQ ID NO: 28 (VH CDR3); SEQ ID NO: 29 (VL); SEQ ID NO: 30 (VL CDR1); SEQ ID NO: 31 (VL CDR2); SEQ ID NO: 32 (VL CDR3)
  • variable region of the antibody of the present invention comprises at least a part of the CDR of the A ⁇ polymerization inhibitory antibody obtained by the present inventors or a substantially identical amino acid sequence.
  • a specific amino acid sequence when a specific amino acid sequence is described, it is clear that it represents only itself. Means that the particular amino acid sequence or an amino acid substantially identical thereto.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is described, it usually means “the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid substantially identical thereto”.
  • the heavy chain variable region of the antibody of the present invention comprises the following groups: (1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, (2) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, (3) SEQ ID NO: 4 (4) SEQ ID NO: 10 amino acid sequence, (5) SEQ ID NO: 11 amino acid sequence, (6) SEQ ID NO: 12 amino acid sequence, (7) SEQ ID NO: 18 amino acid sequence, (8 ) SEQ ID NO: 19 amino acid sequence, (9) SEQ ID NO: 20 amino acid sequence, (10) SEQ ID NO: 26 amino acid sequence, (11) SEQ ID NO: 27 amino acid sequence, and (12) SEQ ID NO: 28 An amino acid sequence selected from the group consisting of at least one amino acid sequence as a part or all of CDR (for example, included as CDR3), preferably two (for example, included as CDR2 and CDR3), and more preferably three (Ie, included as CDR1-3).
  • the above (1), (4), (7) and (10) are preferably included as CDR1 when included as the CDR of the variable region.
  • (2), (5), (8) and (11) are preferably included as CDR2, and (3), (6), (9) and (12) are included as CDR3. It is preferable.
  • the light chain variable region of the antibody of the present invention comprises the following groups: (13) amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, (14) amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, (15) amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, (16) SEQ ID NO: 14 amino acid sequence, (17) SEQ ID NO: 15 amino acid sequence, (18) SEQ ID NO: 16 amino acid sequence, (19) SEQ ID NO: 22 amino acid sequence, (20) sequence SEQ ID NO: 23 amino acid sequence, (21) SEQ ID NO: 24 amino acid sequence, (22) SEQ ID NO: 30 amino acid sequence, (23) SEQ ID NO: 31 amino acid sequence, and (24) SEQ ID NO: It contains at least one amino acid sequence selected from the group consisting of 32 amino acid sequences as part or all of CDR (eg, as CDR3), preferably two (eg, as CDR2 and CDR3), more preferably Include three (that is, include as CDR1-3).
  • CDR1 of the heavy chain variable region is the above (1), (4), (7) and And the heavy chain variable region CDR2 has the amino acid sequence of any one of (2), (5), (8) and (11) above, and the heavy chain CDR3 of the variable region has the amino acid sequence of any of the above (3), (6), (9) and (12), and CDR1 of the light chain variable region has the above (13), (16), (1
  • the light chain variable region CDR2 has the amino acid sequence of any one of (14), (17), (20) and (23), CDR3 of the chain variable region has any one of the amino acid sequences of (15), (18), (21) and (24).
  • CDR3 of the heavy chain variable region and the light chain variable region is any combination of the following (A) to (D).
  • Heavy chain CDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • light chain CDR3 combination of amino acid sequences of SEQ ID NO: 8
  • Heavy chain CDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • light chain CDR3 amino acid sequence combination of SEQ ID NO: 16
  • Heavy chain CDR3 SEQ ID NO: 20 amino acid sequence
  • light chain CDR3 SEQ ID NO: 24 amino acid sequence combination
  • Heavy chain CDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 28
  • light chain CDR3 amino acid sequence combination of SEQ ID NO: 32
  • CDR R2 and CDR3 of the heavy chain variable region and the light chain variable region are any combination of the following (E) to (; H).
  • Heavy chain CDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • heavy chain CDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • light chain CDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • light chain CDR3 amino acid of SEQ ID NO: 8
  • Heavy chain CDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 11
  • heavy chain CDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • light chain CDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 15
  • light chain CDR3 amino acid of SEQ ID NO: 16 Array combination
  • Heavy chain CDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 19
  • heavy chain CDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
  • light chain CDR2 amino acid sequence of 23
  • light chain CDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 24
  • Heavy chain CDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 27
  • heavy chain CDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 28
  • light chain CDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 31
  • light chain CDR3 amino acid of SEQ ID NO: 32
  • CDR 2 and CDR3 are combinations of CDR 2 and CDR3 in the order of 1C9 antibody, 2E12 antibody, 3G11 antibody, and 4E11 antibody from the top, and a higher A
  • CDR 1 to CDR3 of the heavy chain variable region and the light chain variable region are any combination of the following (I) to (L).
  • Heavy chain CDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • heavy chain CDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • heavy chain CDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • light chain CDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • Light chain CDR2 SEQ ID NO: 7 amino acid sequence
  • Light chain CDR3 SEQ ID NO: 8 amino acid sequence combination
  • Heavy chain CDR1 SEQ ID NO: 10 amino acid sequence
  • heavy chain CDR2 SEQ ID NO: 11 amino acid sequence
  • heavy chain CDR3 SEQ ID NO: 12 amino acid sequence
  • light chain CDR1 SEQ ID NO: 14 amino acid sequence
  • Light chain CDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 15
  • light chain CDR3 combination of amino acid sequences of SEQ ID NO: 16
  • Heavy chain CDR1 SEQ ID NO: 18 amino acid sequence
  • heavy chain CDR2 SEQ ID NO: 19 amino acid sequence
  • heavy chain CDR3 SEQ ID NO: 20 amino acid sequence
  • light chain CDR1 SEQ ID NO: 22 amino acid Sequence
  • light chain CDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 23
  • light chain CDR3 amino acid sequence combination of SEQ ID NO: 24
  • Heavy chain CDR1 SEQ ID NO: 26 amino acid sequence
  • heavy chain CDR2 SEQ ID NO: 27 amino acid sequence
  • heavy chain CDR3 SEQ ID NO: 28 amino acid sequence
  • light chain CDR1 SEQ ID NO: 30 amino acid Sequence
  • light chain CDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 31
  • light chain CDR3 combination of amino acid sequences of SEQ ID NO: 32
  • the portion of the variable region other than the complementarity determining region (CDR) is called a "framework" for retaining the CDR structure.
  • Framework region in the variable region of the antibody of the present invention The sequence of (FR region) is not particularly limited as long as it does not substantially affect the Aj8 polymerization inhibitory activity.
  • an amino acid sequence obtained by modifying the FR region of the 1C9 antibody, 2E12 antibody, 3G11 antibody, or 4E11 antibody or a part thereof can be employed as the FR region of the antibody of the present invention.
  • the FR region of a known human antibody can be used.
  • the expected effect can be achieved without using the human antibody FR region. It may not be appropriate to use the human antibody FR region. In such a case, the FR region of a non-human animal species (for example, mouse or rat) can be used.
  • a non-human animal species for example, mouse or rat
  • the antibody of the present invention includes a constant region in addition to a variable region (for example, in the case of an IgG type antibody).
  • the sequence of the constant region in this embodiment is not particularly limited.
  • a constant region of a known human antibody can be used.
  • a constant region of an animal species other than human for example, mouse or rat
  • humanized antibody refers to an antibody whose structure is similar to that of a human antibody.
  • a human chimeric antibody in which only the constant region of an antibody is replaced with that of a human antibody, and a constant region and a variable region.
  • the human CDR-grafted antibody (PT Johons et al., Nature 321,522 (1986)) in which a part other than the CDR (complementarity determining region) present in FIG.
  • the human chimeric antibody is, for example, a constant region of an antibody having the structure of the H chain variable region and the structure of the Z or L chain variable region (for example, 1C9 antibody, 2E12 antibody, 3G11 antibody or 4E11 antibody). It can be produced by replacing the region with the constant region of a human antibody.
  • Known constant regions of human antibodies can be employed. An example of a method for producing a human chimeric antibody is shown below.
  • mRNA is extracted from a hyperidoma producing a mouse A
  • the synthesized cDNA is incorporated into a vector to construct a cDNA library.
  • a vector containing the H chain gene and the L chain gene is selected by using the H chain gene fragment and the L chain gene fragment as probes.
  • the sequences of the genes of the heavy chain variable region and the light chain variable region are determined. Based on the sequence data thus obtained, DNA encoding the H chain variable region is prepared by chemical synthesis, biochemical cleavage, Z recombination, or the like.
  • the obtained DNA encoding the H chain variable region is ligated with DNA encoding the human H chain constant region and incorporated into an expression vector to prepare an H chain expression vector.
  • expression vectors include, but are not limited to, SV40 virus based vectors, EB virus based vectors, and BPV (papilloma vinores) based vectors.
  • a light chain expression vector is prepared by the same method.
  • Host cells are cotransformed with these H chain expression vector and L chain expression vector.
  • CHO cells Choinese nomstar ovary
  • SP2 / 0 cells mouse myeloma
  • a human CDR-grafted antibody can be prepared, for example, by the following method. First, the amino acid sequences of the H chain variable region and the L chain variable region of the mouse A polymerized antibody and the base sequence encoding the same are determined by the method described in the column of the method for producing a chimeric antibody. In addition, the amino acid sequence and base sequence of each CDR region are determined.
  • CDR base sequences for example, the following base sequences can be used.
  • H chain CDR1 SEQ ID NO: 34, 42, 50, or 58 nucleotide sequence
  • H chain CDR2 VH CDR2
  • VH CDR3 SEQ ID NO: 36, 44, 52, or 60 nucleotide sequence
  • L chain CDR1 SEQ ID NO: 38, 46, 54, or 62 nucleotide sequence
  • L chain CDR2 VL CDR2
  • SEQ ID NO: 39, 47, 55, or 63 nucleotide sequence L chain CDR3 SEQ ID NO: 40, 48, 56, or 64 nucleotide sequence
  • VH CDR1 SEQ ID NO: 34 nucleotide sequence
  • VH CDR2 SEQ ID NO: 35 nucleotide sequence
  • VH CDR3 SEQ ID NO: 36 nucleotide sequence
  • VL CDR1 SEQ ID NO: 38 nucleotide sequence
  • VL CDR 2 SEQ ID NO: 39 nucleotide sequence
  • VL CDR3 SEQ ID NO: 40 nucleotide sequence combination
  • VH CDR1 SEQ ID NO: 42 nucleotide sequence
  • VH CDR2 SEQ ID NO: 43 nucleotide sequence
  • VH CDR3 SEQ ID NO: 44 nucleotide sequence
  • VL CDR1 SEQ ID NO: 46 nucleotide sequence
  • VL CDR 2 SEQ ID NO: 47 nucleotide sequence
  • VL CDR3 SEQ ID NO: 48 nucleotide sequence combination
  • VH CDR1 SEQ ID NO: 50 nucleotide sequence
  • VH CDR2 SEQ ID NO: 51 nucleotide sequence
  • VH CDR3 SEQ ID NO: 52 nucleotide sequence
  • VL CDR1 SEQ ID NO: 54 nucleotide sequence
  • VL CDR 2 Base sequence of SEQ ID NO: 55
  • VL CDR3 Combination of base sequences of SEQ ID NO: 56
  • VH CDR1 SEQ ID NO: 58 nucleotide sequence
  • VH CDR2 SEQ ID NO: 59 nucleotide sequence
  • VH CDR3 SEQ ID NO: 60 nucleotide sequence
  • VL CDR1 SEQ ID NO: 62 nucleotide sequence
  • VL CDR 2 Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63
  • combination of VL CDR3 nucleotide sequence of SEQ ID NO: 64.
  • an FR framework region existing across the CDR region is selected.
  • the first method is already tertiary, such as NEWM, REI This is a method using a human antibody frame with a clear structure (Riechmann L. et al., Nature 332, 323— 3Z7 (1988); Tempst, PR. Et al., Protein Engineering 7, 1501— 1507 (1994); Ellis JH. Etal, J. Immunol 155, 925-937 (1995)).
  • the second method is to select a human antibody variable region having the highest homology with the mouse antibody variable region of interest from the database and use its FR (Queen C.
  • the third method is to select the most commonly used amino acid in FR of human antibodies (Sato K. et al., Mol Immunol 31, 371-381 (1994); Kobinger F. et al., Protein Engineering 6, 971—980 (1993); Kettle borough CA. et al., Protein Engineering 4, 773-783 (1991)). Any of these methods can be used in the present invention.
  • the amino acid sequence of the selected human FR is altered, the amino acid sequence of the FR will be sufficient as long as the finally obtained human CDR-grafted antibody effectively inhibits the formation of A
  • the number of amino acids to be modified is preferably 30% or less of the entire FR, more preferably 20% or less of the entire FR, and still more preferably 10% or less of the entire FR.
  • a DNA encoding the H chain variable region and the L chain variable region is designed by combining the FR selected by any of these methods and the CDR.
  • DNA encoding the H chain variable region and DNA encoding the L chain variable region are prepared by chemical synthesis, biochemical cleavage, Z recombination, and the like. Then, DNA encoding the heavy chain variable region is incorporated into an expression vector together with DNA encoding the human immunoglobulin heavy chain constant region to construct a heavy chain expression vector. Similarly, a DNA encoding the light chain variable region is incorporated into an expression vector together with DNA encoding the human immunoglobulin light chain constant region to construct a light chain expression vector.
  • expression vectors include, but are not limited to, SV40 virus based vectors, EB virus based vectors, BPV (papillomawinoles) based vectors, and the like.
  • Host cells include CHO cells (Chinese nomstar ovary XA. Wrig ht & S ⁇ . Morrison, J. Immunol. 160, 3393-3402 (1998)), SP2 / 0 cells (mouse myeloma) (K. Motmans et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 512-519 (1996), RP Junghans et al., Cancer Res. 50, 1495-1502 (1990), etc. are preferably used, and the lipophectin method (RWMalone et al. , Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the human CDR-grafted antibody After culturing the transformant, the human CDR-grafted antibody is isolated from the transformant cells or from the culture solution.
  • methods such as centrifugation, ammonium sulfate fractionation, salting out, ultrafiltration, affinity chromatography, ion exchange chromatography, and gel filtration chromatography can be used in appropriate combinations. it can.
  • Antibody fragments can be prepared based on the antibody of the present invention or based on the sequence information of the gene encoding the antibody of the present invention.
  • Antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab'), scFv, ds
  • Fab is composed of L-chain and H-chain variable region obtained by digesting IgG with pasine in the presence of cysteine, and H-chain fragment that is also part of the C1 domain and hinge region.
  • the antibody can be obtained by digesting with papain.
  • DNA encoding the part of the H chain and L chain of the above antibody is incorporated into an appropriate vector, and Fab is prepared from a transformant transformed with the vector.
  • the antibody can be obtained by digesting with pepsin and cleaving the disulfide bond using a reducing agent.
  • Fab it can be prepared by genetic engineering using DNA encoding Fab ′.
  • F (ab ′) is obtained by digesting IgG with pepsin, and the L chain and H chain variable regions, and
  • It can also be prepared by genetic engineering.
  • scFv is an antibody fragment in which an Fv comprising an H chain variable region and an L chain variable region is made into a single chain by linking the C terminus of one chain and the other N terminus with an appropriate peptide linker.
  • an appropriate peptide linker for example, highly flexible (GGGGS) can be used.
  • GGGGS highly flexible
  • the DNA encoding the scFv antibody is constructed using DNA encoding the H chain variable region and L chain variable region of the above antibody and DNA encoding a peptide linker, and this is incorporated into an appropriate vector, and the vector is used.
  • ScFv can be prepared from the transformant transformed as described above.
  • dsFv is an Fv fragment in which a Cys residue is introduced at an appropriate position in the H chain variable region and the L chain variable region, and the H chain variable region and the L chain variable region are stabilized by disulfide bonds.
  • the position of Cys residue introduction in each chain can be determined based on the three-dimensional structure predicted by molecular modeling.
  • DNAs encoding the H chain variable region and the L chain variable region into which mutations are introduced based on the prediction of the amino acid sequence ability and the three-dimensional structure of the H chain variable region and L chain variable region of the above antibody
  • the dsFv can be prepared from a transformant that has been constructed, incorporated into an appropriate vector, and transformed with the vector.
  • a fusion antibody or labeled antibody can be constructed by fusing or binding a low molecular weight compound, protein, labeling substance or the like to the antibody (including antibody fragment) of the present invention.
  • Radioactive material 125 1 such as a standard ⁇ quality, Peruokishidaze, / 3 D-galactosidase, micro pel O Kishida over zero, horseradish peroxide O Kishida over peptidase (HRP), Furuorese in isothiocyanate Xia sulfonate (FITC), rhodamine isothiocyanate Xia sulfonates (RITC ), Alkaline phosphatase, piotin and the like can be used.
  • Radioactive material 125 1 such as a standard ⁇ quality, Peruokishidaze, / 3 D-galactosidase, micro pel O Kishida over zero, horseradish peroxide O Kishida over peptidase (H
  • the antibody (including antibody fragment) of the present invention can effectively suppress the formation of amyloid fibrils, it is useful for diagnosis, prevention, treatment, etc. of Alzheimer's disease. That is, it is considered that Alzheimer's disease can be diagnosed, prevented, or treated using the antibody of the present invention. It is done. In other words, Alzheimer's disease diagnosis method, prevention method, and treatment method are provided by using the antibody of the present invention.
  • a drug (diagnostic agent, prophylactic agent, or therapeutic agent) for Alzheimer's disease can be constituted using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention that has been humanized it is recognized as a human protein even when administered to humans, so it is difficult to be excluded from the circulatory system and hardly causes allergic reactions. It can be used as a medicine.
  • lipid membrane lipid membrane containing GM1
  • force ⁇ polymerization inhibitory antibody used in the above Aj8 polymerization inhibition test is effective as an antigen. Based on this finding, a further aspect of the present invention is:
  • GM1 gandarioside Contains GM1 gandarioside, other lipids, and AMI8 protein ( ⁇
  • 8) bound to the GM1 gandarioside, and the component ratio (molecular ratio) of other lipids: GM1 gandarioside 90:10 Synthetic lipid membranes for animal immunization in the range of ⁇ 60: 40 are provided.
  • the synthetic lipid membrane of the present invention is typically composed of three components, namely GM1 gandalioside, other lipids, and amyloid
  • 8 protein. (However, the amount of amyloid j8 protein is not included): GM1 ganglioside 90:10 to 60:40.
  • lipid is used as a comprehensive term for simple lipids, complex lipids (eg, sphingomyelin, ganarioside), and derived lipids (eg, cholesterol) unless otherwise specified.
  • the synthetic lipid membrane of the present invention is used as an antigen for preparing an Aj8 polymerization-inhibiting antibody, and in particular, can be used as an antigen for efficiently preparing an anti-GA
  • the animal used for immunization with the synthetic lipid membrane of the present invention is not particularly limited, and for example, a mouse, a rat, a rabbit, a hedge, a goat and the like can be used.
  • the immunization method is not particularly limited, and intravenous injection, intraperitoneal injection, injection into a foot pad, and the like can be employed.
  • Sphingomyelin is preferably used as the lipid component that is one of the constituent components of the synthetic lipid membrane of the present invention.
  • One preferred embodiment of the synthetic lipid membrane of the present invention contains cholesterol as one of the lipid components. Cholesterol promotes the formation of GM1 “clusters” on the membrane, which can be expected to promote the binding of A to GM1. In addition, since the structure of such a synthetic lipid membrane is close to that of the nerve cell membrane in the brain where amyloid fibrils are formed, it becomes an antigen that promotes the production of antibodies that more effectively inhibit the formation of amyloid fibrils.
  • an A polymerization inhibitory antibody can be efficiently produced by using a synthetic lipid membrane having the component ratio.
  • GM1 for example, commercially available products (such as those provided by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan, etc.) can be used.
  • commercially available ⁇ ⁇ (Amyloid ⁇ -Pro) can be used.
  • commercially available ⁇ ⁇ (Amyloid ⁇ -Pro) can be used.
  • commercially available ⁇ ⁇ (Amyloid ⁇ -Pro) can be used.
  • the synthetic lipid membrane of the present invention can be prepared by bringing A into contact with a lipid membrane containing a constituent other than A (see the examples below for details of the preparation method).
  • the contact between the lipid membrane and A j8 is preferably performed for a short time, and more preferably, the two are brought into contact with each other instantaneously. According to long-term reaction, A
  • the synthetic lipid membrane of the present invention is usually prepared in a ribosome form in a solution.
  • Preparation of an A ⁇ polymerization inhibitory antibody using the synthetic lipid membrane of the present invention is performed using an immunological technique, a phage display method using an antibody library, a ribosome display method, or the like.
  • Preparation of a polyclonal antibody by an immunological technique can be performed by the following procedure.
  • An antigen (the above synthetic lipid membrane) is prepared, and this is immunized to non-human animals such as mice, rats, rabbits and goats. If effective immunostimulation cannot be expected due to the low molecular weight, it is preferable to use an antigen bound to a carrier protein.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ LM Keyhole Lignt Hemocyanin, BSA (Bovine Serum Albumin), OVA (Ovalbumin), etc. are used as the carrier protein.
  • the benzoyl succinimide method can be used.
  • the synthetic lipid membrane used as the antigen can be used. Specifically, first, an antiserum and a synthetic lipid membrane are brought into contact. As a result, the component that binds to the synthetic lipid membrane is separated to obtain the target antibody. In addition to the above separation steps, it is preferable to perform a step of contacting the separated antibody with the monomer amyloid j8 protein and selecting an antibody that does not bind to the monomer amyloid / 3 protein.
  • an antibody that does not recognize monomeric amyloid ⁇ protein but recognizes only GA ⁇ complex can be obtained. That is, it becomes possible to obtain an antibody with high specificity for the GA
  • Such antibodies are suitable for applications targeting the GA
  • a monoclonal antibody can be prepared by the following procedure. First, immunization is performed in the same procedure as above. Repeat the immunization as necessary, and the antibody titer is sufficient At the point of time, the antibody-producing cells are removed from the immunized animal. Next, the obtained antibody-producing cells and myeloma cells are fused to obtain hybridomas. Subsequently, after monoclonalizing this hyperidoma, a clone producing an antibody having high specificity to the synthetic lipid membrane of the present invention is selected.
  • the target antibody is separated from the culture solution of the selected clone.
  • the selected clone hyperidoma
  • the selected clone can be transplanted into the abdominal cavity of a non-human animal (eg, mouse) and grown in ascites, and the target antibody can be isolated from the ascites.
  • affinity chromatography using protein G, protein A, or the like is preferably used for the isolation of antibodies from the culture medium or ascites fluid.
  • affinity chromatography in which an antigen is immobilized may be used.
  • methods such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, ammonium sulfate fractionation, and centrifugation can also be used. These methods can be used alone or in any combination.
  • antibody production methods Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497; Brown et al. (1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980—83;
  • the phage display method is a system for expressing a foreign gene as a fusion protein with a coding protein (cp3, cp8) of filamentous phage such as M13.
  • a phage library of about 10 6 to 10 12 is constructed by assembling genes of a mixture of different proteins or peptides into phage DNA.
  • fuzzy antibody libraries are available commercially or non-commercially (eg Hucal GO LD (MorphoSys), Griffin.1 library: Griffiths, AD et al. EMBO J.13: 3245-3260 ( 19 94) "Nissim Library” (Nissim, A et al. EMBO J.13 :: 692-698), suitable ones can be selected and used.
  • Pan-Jung is typically a reaction between a target protein and a phage library (contact), removal of unbound phage (washing), elution of bound phage, and infection of recovered phage into E. coli (phage growth). A series of step force is also constructed. Pan Jung enriches phages that display proteins that have binding properties to the target protein. Normally, panning is repeated until sufficient concentration is confirmed. By infecting appropriate host cells with the phage thus selected and concentrated, the protein (peptide) displayed by the phage can be expressed as a soluble molecule.
  • the screened and enriched phage can also be presented by cutting out the foreign gene, incorporating the recovered foreign gene into an appropriate expression vector, and expressing the foreign gene using an appropriate expression system. Proteins (peptides) may be obtained soluble.
  • the expression product can be collected by appropriately combining methods such as centrifugation, ammonium sulfate fractionation, salting out, ultrafiltration, affinity chromatography, ion exchange chromatography, and gel filtration chromatography.
  • kits for preparing and screening phage display libraries are commercially available, and can be suitably used.
  • the ribosome display method involves mutating the stop codon so that the transcription product and translation product of the truncated DNA are bound to the ribosome, and the thus obtained protein ZmRNAZ ribosome complex (ARM ), For example, how to screen the target.
  • ARM protein ZmRNAZ ribosome complex
  • a genetic engineering technique such as a phage display method or a ribosome display method
  • mRNA and DNA are taken out from immune system cells and PCR
  • RT - Obtain antibody genes containing antigen-binding domains by gene amplification methods such as PCR, and use them to construct antibody libraries such as phage display libraries.
  • a clone having a specific binding property to an antigen synthetic lipid membrane
  • the antibody library and the synthetic lipid membrane of the present invention are brought into contact with each other, and a clone exhibiting binding properties to the synthetic lipid membrane is selected.
  • a clone having (or expressing) a specific binding molecule may be in any state of a polyclonal, oligoclone, and monoclone. Once the desired clone is selected, the antibodies it presents are separated as described above.
  • a further aspect of the present invention relates to DNA encoding the antibody of the present invention, ie, an antibody that inhibits A fiber formation (A ⁇ polymerization inhibitory antibody) or an antibody fragment.
  • 8 filament formation a DNA encoding a human CDR-grafted antibody, and a DNA encoding a human antibody fragment are also provided.
  • DNA encoding the H chain or L chain of these antibodies or antibody fragments is also one aspect of the present invention.
  • these anti- DNA encoding the H chain variable region or L chain variable region of the antibody or antibody fragment is also one aspect of the present invention. In this case, it may be DNA constituted by excluding the signal portion.
  • DNA sequence of the heavy chain variable region examples include those shown in SEQ ID NOs: 33, 41, 49, and 57.
  • examples of the DNA sequence of the L chain variable region include those shown in SEQ ID NO: 37, 45, 53, or 61.
  • nucleic acid sequence encoding the variable region CDR of the A ⁇ polymerization inhibitory antibody is also one aspect of the present invention.
  • a nucleotide sequence encoding any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 4, 6 to 8, 10 to 12, 14 to 16, 18 to 20, 22 to 24, 26 to 28, and 30 to 32 (For example, SEQ ID NOs: 34 to 36, 38 to 40, 42 to 44, 46 to 48, 50 to 52, 54 to 56, 58 to 60, and 62 to 64) .
  • the above nucleic acids can be prepared by appropriately using biochemical techniques, genetic engineering techniques, etc., and can be used for the production of A ⁇ polymerization inhibitory antibodies (or antibody fragments).
  • the nucleic acid of the present invention is isolated by using standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, biochemical techniques, etc. with reference to the sequence information disclosed in this specification or the attached sequence listing. Can be prepared. For example, a specific nucleic acid can be isolated using a hybridization method using the whole or part of the complementary sequence as a probe. Further, it can be amplified and isolated using a nucleic acid amplification reaction (for example, PCR) using a synthetic oligonucleotide primer designed to specifically hybridize to a part of the base sequence. In general, oligonucleotide primers can be easily synthesized using a commercially available automated DNA synthesizer.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid inserted thereinto into a target such as a cell.
  • Plasmid vector, cosmid vector, phage vector, virus vector adenovirus vector, Adeno-associated virus vectors, retro wingless betaters, henorepesuinores vectors, etc.
  • An appropriate vector is selected according to the purpose of use (cloning, protein expression) and taking into account the type of host cell.
  • E. coli host vectors M13 phage or a variant thereof, ⁇ phage or a variant thereof, pBR322 or a variant thereof ( ⁇ 325, ⁇ T153, pUC8, etc.), yeast host vectors (pYepSecl, pMFa, pYES2, etc.), insect cell hosts (pAc, pVL, etc.), mammalian cell hosts (pC DM8, pMT2PC, etc.) ) Can be used.
  • the vector of the present invention is preferably an expression vector.
  • “Expression vector” refers to a vector capable of introducing a nucleic acid inserted therein into a target cell (host cell) and allowing expression in the cell.
  • Expression vectors usually contain a promoter sequence necessary for the expression of the inserted nucleic acid, an enzyme sequence that promotes the expression, and the like.
  • An expression vector containing a selectable marker can also be used. When such an expression vector is used, the presence or absence of the expression vector (and the degree thereof) can be confirmed using a selection marker.
  • Insertion of the nucleic acid of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. are performed using standard recombinant DNA techniques (for example, Molecula r Cloning, Third Edition, 1.84, However, it can be carried out using a known method using restriction enzymes and DNA ligase, which can be referred to Old Spring Harbor Laboratory Press, New York.
  • the nucleic acid of the present invention can be incorporated into an expression vector and used to transform host cells.
  • the nucleic acid encoding the antibody H chain (or H chain variable region) is incorporated into one vector
  • the nucleic acid encoding the antibody L chain (or L variable region) is incorporated into the other nucleic acid.
  • Host cells can also be cotransformed with the two expression vectors obtained by integration into the vector.
  • the nucleic acid encoding the antibody H chain (or H chain variable region) and the DNA encoding the antibody L chain (or L chain variable region) in the nucleic acid of the present invention are incorporated into one vector and used. Can also transform host cells
  • host cells include mammalian cells such as humans, monkeys, mice, and rats (COS cells, CHO cells, etc.), bacterial cells such as Escherichia coli, yeast cells, insect cells, and the like.
  • Another aspect of the present invention relates to a host cell (ie, a transformant) into which the nucleic acid of the present invention has been introduced.
  • the transformant of the present invention is preferably obtained by transformation or transformation using the vector of the present invention. Transfusion etc. Calcium Phosphate Coprecipitation, Elect Mouth Poration (Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161-7165 (1984), Lipofexion (Feigner, PL et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,7413-7417 (1984)), microinjection (Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73,366-370 (1976)), etc. .
  • the transformant of the present invention can be used for producing the antibody or antibody fragment of the present invention. That is, another aspect of the present invention provides a method for producing the antibody of the present invention using the transformant.
  • the production method of the present invention includes at least a step of culturing the transformant under conditions that produce the antibody or the like of the present invention. Usually, in addition to this step, a step of recovering (separating and purifying) the produced antibody and the like is performed. Recovery of the antibody of interest from the transformant cells or in the culture medium includes centrifugation, ammonium sulfate fractionation, salting out, ultrafiltration, affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, etc. These methods can be combined appropriately.
  • the purpose of investigating the behavior when the antibody of the present invention is expressed in a specific cell, or by expressing the antibody of the present invention in a specific cell can also be obtained for the purpose of changing the state of cells (for example, for therapeutic purposes).
  • a transformant can also be obtained for the purpose of producing a transgenic animal (not including humans). That is, the transformant of the present invention can be used for production of a non-human transgenic animal. For example, a fertilized oocyte or embryonic stem cell into which a nucleic acid encoding the protein of the present invention has been introduced as a transformant can be produced, and a transgenic animal can be generated therefrom.
  • Transgenic animals can be produced using a microinjection method in which DNA is directly injected into the pronucleus of a fertilized egg, a method using a retrovirus vector, a method using ES cells, or the like.
  • a method using the microinjection method will be described as an example of a method for producing a transgenic animal.
  • a fertilized egg is first collected from the oviduct of a female mouse in which mating has been confirmed, and after culturing, a DNA construct (DNA encoding the protein of the present invention) is injected into its pronucleus.
  • the DNA construct used has transgene efficiency It is preferred to include a promoter sequence that allows for specific expression. Examples of such promoters include chicken j8-actin promoter, prion protein promoter, human AR promoter, neurofilament L chain promoter, L7 promoter, and cytomegalovirus promoter.
  • the fertilized egg that has been injected is transplanted into the oviduct of a pseudopregnant mouse, and the transplanted mouse is bred for a predetermined period to obtain a pup mouse (F0).
  • the DNA such as the tail of the pup is extracted, and the PCR method or transgene using primers specific to the transgene is used. Dot hybridization using a specific probe.
  • transgenic animal in the present specification is not particularly limited, but is preferably a mammal, and more preferably a rodent such as a mouse or a rat.
  • a screening method for a compound having an activity of binding to the GA ⁇ complex can be constructed using the antibody (including antibody fragment) of the present invention. That is, the present invention also provides a screening method for a compound having an activity of binding to the GA
  • this screening method includes a step of confirming that the formation of amyloid fibrils is suppressed, the compound selected by the screening method has a binding property to the GA ⁇ complex, and It is possible to confirm that it has an activity to suppress the formation of amyloid fibrils
  • step 0 the binding property between the antibody or antibody fragment and the sample is examined, and the first compound having the binding property is selected.
  • Samples here include natural proteins, natural peptides, natural polymer compounds, etc. extracted from plants, animals, bacteria, etc., as well as synthetic proteins, synthetic peptides, synthetic polymer compounds, synthetic low molecular compounds, antibodies ( Examples include cell extracts, culture supernatants, and the like.
  • the antibody to be used is immobilized on a solid phase, and a sample can be brought into contact therewith. Conversely, the sample side can be fixed to a solid phase.
  • the selection (detection) can be facilitated and the selection (detection) efficiency can be improved.
  • the label ⁇ a radioactive substance such as 125 ⁇ , an enzyme such as peroxidase, ⁇ -D-galactosidase, and the like can be used.
  • selection (detection) efficiency can be improved by using a secondary antibody that recognizes the antibody to be used.
  • the antibody (including antibody fragment) of the present invention can also be used in a method for screening a compound that binds to a polymerization-inhibiting antibody. That is, a screening method for a compound that binds to an A
  • Samples here include natural proteins, natural peptides, natural polymer compounds, etc. extracted from plants, animals, bacteria, etc., as well as synthetic proteins, synthetic peptides, synthetic polymer compounds, synthetic low molecular compounds, and antibodies. (Including the antibody of the present invention), cell extract, culture supernatant and the like.
  • a screening method for a compound that binds to an A ⁇ polymerization-inhibiting antibody can also be configured, including the following steps.
  • a step of selecting a compound having a three-dimensional structure complementary to the three-dimensional structure is shown by NMR (nuclear magnetic resonance) method (Wuthrich, K .: NMR of Protein and Nucleic Acids, John Wiley & Sons, New York, 1986), X-ray crystal structure analysis (Blun dell, TL).
  • Candidate compounds in Step D) include natural proteins, natural peptides, natural polymer compounds, etc. extracted from plants, animals, bacteria, etc., as well as synthetic proteins, synthetic peptides, synthetic polymer compounds, synthetic polymers, etc. Examples thereof include molecular compounds and antibodies.
  • the compound obtained by the above screening method has an activity of binding to an A ⁇ polymerization inhibitory antibody, it can induce the production of a polymerization inhibitory antibody when administered to a living body. It is considered possible. That is, Aj8 polymerization inhibitory antibody can be produced by acting on the immune defense mechanism of the living body, and as a result,
  • a drug against Alzheimer's disease containing the compound as an active ingredient that is, a vaccine or a therapeutic drug can be constituted.
  • the synthetic lipid membrane of the present invention can also be recognized as an Aj8 polymerization-inhibiting antibody, it can be considered that it can exert the effect of inducing the production of Aj8 polymerization-inhibiting antibody by administering it to a living body. It is done. Therefore, it can be said that the synthetic lipid membrane can be used to produce an antibody having an inhibitory activity against amyloid fibril formation in vivo. Therefore, the present invention further provides an Alzheimer prophylactic vaccine or therapeutic composition comprising the above synthetic lipid membrane (lipid membrane containing GM1).
  • the antibody of the present invention when used as a drug, other pharmaceutically acceptable components (eg, physiological saline, excipient, preservative) can be contained. It can be formulated into various forms. For example, it can be prepared as a capsule, syrup, tablet, granule and the like, and can be applied by oral administration or parenteral administration (intravenous, intraarterial, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal injection, etc.).
  • parenteral administration intravenous, intraarterial, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal injection, etc.
  • the dosage varies depending on symptoms, patient age, body weight, etc., but those skilled in the art can appropriately select and set an appropriate dosage.
  • a ⁇ solution is prepared by the following procedure. First, synthetic ⁇ ⁇ (e.g. Lot.
  • the seeds of amyloid fibril formation can be removed by centrifugation from the commercially available A ⁇ solution.
  • 8 using Thioflavin T was performed, the formation of ⁇ fibers at 37 ° C incubation was observed.
  • the present inventors revealed that no increase in fluorescence intensity was observed for 96 hours and 6 hours (J Neurosci., 2004, 24: 4894-4902).
  • the nature of this preparation method is important for measuring species activity in Aj8 fibril formation.
  • a synthetic lipid containing GM1 gandalioside is prepared by the following procedure. First, place cholesterol and sphingomyelin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) and G Ml (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) into Kuroguchi Form Z methanol mixture (1: 1). Dissolve at a specified ratio (eg 2: 2: 1). The mixture is dried with nitrogen gas for 1 hour and stored at -40 ° C until use. Resuspend the lipid mixture dried immediately before use in TBS so that the GM1 concentration is 2.5 mM, and freeze and thaw 10 times with liquid nitrogen.
  • This lipid suspension is centrifuged at 13,00 Orpm for 15 minutes (MX-160, TOMY, Tokyo, Japan), and the sediment is resuspended in TBS again so that GM1 has the same concentration. Finally, this suspension is placed on ice for 5 minutes using an ultrasonic crusher (UD-201, power level 2, TOMY, Tokyo, Japan) equipped with a microchip (TP-030, TOMY, Tokyo, Japan). Sonicate and repeat 3 times. The obtained solution was used as a GM1 liposome solution.
  • UD-201 power level 2, TOMY, Tokyo, Japan
  • Radioactive iodine ( 125 1) label ⁇ ⁇ (Amersham, Falmacia, ⁇ -2394, 370 KBq)
  • GM1 ribosome solutions having the component ratios shown in Table 2 were prepared according to the method described in 12. Each GM1 ribosome solution was prepared so that the total concentration of each component (that is, the ribosome concentration) was 4600 kg. On the other hand, the radioactive A ⁇ treated in the same way as above with the ultracentrifugation (100,000 rpm, 2 hours, 4 ° C) was mixed with lOOnCi into the ⁇
  • the mixture was mixed with radioactive sodo ( 12 3 ⁇ 4 labeled A ⁇ (Amersham, Falmasia, ⁇ ⁇ -336, 370 KBq) treated with ultracentrifugation (100,000 rpm, 2 hours, 4 ° C) in the same way.
  • radioactive sodo 12 3 ⁇ 4 labeled A ⁇ (Amersham, Falmasia, ⁇ ⁇ -336, 370 KBq) treated with ultracentrifugation (100,000 rpm, 2 hours, 4 ° C) in the same way.
  • Spleen cells from isolated mice and myeloma cells from syngeneic mice, Sp2 / 0-Agl4, are mixed at a ratio of about 10: 1 and cell fusion using 50% polyethylene glycol 4000 as a fusion promoter to produce a hyperidoma. did.
  • the fused cells were suspended in a 10% ushi serum-containing HAT medium (medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the obtained cell suspension was dispensed on a 96-well microtiter plate (Nunk Maxi Soap, the same applies hereinafter) at a rate of 50 1 per tool.
  • the fused cells are cultured in a CO incubator (5% CO, 37 ° C), and the medium is replaced with HAT medium.
  • the cells were proliferated and screened for fusion cells consisting of spleen cells and myeloma cells
  • HRP horseradish saponin peroxidase
  • TMB Tetramethyl benzidine
  • Cloning by the limiting dilution method was repeated twice for the selected wells to establish a fused cell clone.
  • the resulting clone was subjected to selection (secondary screening) using the following A
  • test antibody test group, antibody addition concentration 1 IX M
  • control group control group
  • Aj8 fibril formation measurement using Thioflavin T is performed according to Naiki H and Gejyo F (1999) Methods Enzymol 309, 305-318. First, sample a portion (5 ⁇ 1) of the solution 4 hours after the start of incubation, and add Thioflavin T (Sigma) to a final concentration of 5 ⁇ . After diluting with 1 ml of 50 mM glycine sodium hydroxide buffer, measure the fluorescence intensity of A
  • a spectrofluorometer eg RF-530 PC, Shimadzu Corporation
  • Inhibitory effect (%) (fluorescence intensity of control group fluorescence intensity of test group) Z control group fluorescence intensity X 100
  • test group antibody addition concentration 1 IX ⁇
  • control group a synthetic lipid containing GM1 gandarioside and ⁇
  • Aj8 fibril formation measurement using Thioflavin T is performed according to Naiki H and Gejyo F (1999) Methods Enzymol 309, 305-318. First, sample a portion (5 ⁇ 1) of the solution 20 hours after the start of incubation, and add Thioflavin T (Sigma) to a final concentration of 5 ⁇ .
  • Inhibitory effect (%) (fluorescence intensity of control group fluorescence intensity of test group) Z control group fluorescence intensity X 100
  • the lipid membrane containing GM1 gandarioside is usually bound to an insoluble support such as polystyrene resin, polycarbonate resin, silicone resin, nylon resin, etc. Used in.
  • clones 1C9, 2E12, 3G11, and 4E11 were selected as the antibodies (secondary selection).
  • the table in Fig. 4 shows the A fiber formation inhibitory effect of each clone.
  • Clone 1C9 strongly inhibits polymerization initiated by the addition of filamentous 8
  • clones 2E12 and 3G11 showed strong inhibitory activity in each of the three polymerization systems.
  • the negative control 4G8 antibody recognizes free sputum, but no inhibitory activity was observed in this inhibition test.
  • the positive control 4396C antibody has a mispolymerization system. However, it also showed an inhibitory effect on ⁇ polymerization, but (B) polymerization of ⁇ ⁇ 40 initiated from GA ⁇ 40 or (C) polymerization of ⁇ ⁇ 42 initiated from GA ⁇ 42 In addition, ( ⁇ ) ⁇ ⁇ was characterized by having a strong inhibitory activity on polymerization initiated by the addition of ⁇ fiber fragments.
  • Both clones 2E12 and 3G11 have three polymerization systems (( ⁇ ) ⁇ polymerization initiated by adding 8 fiber fragments, (8).
  • the 4396C antibody was used as a negative control.
  • the antibody concentration was 2 / ⁇ .
  • the reaction temperature for fiber formation in this analysis was all 37 ° C.
  • FIG. 5 shows the measurement results when 2E12 was added (results of measurement of A ⁇ 40 fibril formation using Thioflavin T).
  • the ⁇ solution does not add GM1 ribosome, and no increase in fluorescence intensity is observed for 20 hours.
  • Antibody addition was performed simultaneously with the addition of GM1 ribosome, a small sample was taken over time, and Thioflavin T solution was mixed to measure fluorescence intensity. Since GM1 ribosome has auto-fluorescence, the fluorescence intensity of the reaction system is increased by the addition of the auto-fluorescence. In the system without added antibody, the fluorescence intensity increased at the time of addition, and the fluorescence intensity increased until 4 hours. Thereafter, the fluorescence intensity remained constant until 20 hours.
  • FIG. 6 shows the measurement results when 3G11 was added (results of measurement of A ⁇ 40 fibril formation using Thioflavin T).
  • the results shown in FIG. 6 are different from the results shown in FIG. 5, and the values obtained by subtracting the fluorescence intensity immediately after the addition of GM1 ribosome from all the measured values are plotted.
  • the fluorescence intensity increased rapidly even when GM1 ribosome was applied, and the fluorescence rate continued to increase while decreasing the increase rate until 20 hours.
  • the 4396C antibody was added, the fluorescence intensity was lower than when the 4396C antibody was not added, and the increase in fluorescence intensity was observed up to 6 hours.
  • 3F1 used as a negative control is an antibody that recognizes the C-terminus of the free ⁇
  • 3G 11 antibody was added, the fluorescence intensity increased up to 1 hour at the beginning of the reaction at any addition concentration (1, 2 and 3 / z M), but thereafter the fluorescence intensity decreased, and finally GM1 liposomal It became almost the same as the time of the time.
  • 3G11 like 2E12, has no effect at the start of A j8 fiber formation starting from GA j8 40, but determines the length of the formed A ⁇ fiber after fiber elongation has progressed. It is considered that the equilibrium relationship between fiber elongation due to ⁇ -polymerization and fiber shortening due to ⁇ -depolymerization has an effect of leaning toward fiber shortening.
  • VH primers 5 V-end primer of mouse VH, added the sfil site, designed the primers, and mixed them in equal amounts to create the mix primer.
  • Vhprimers (as an example)
  • mVHlB2 act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccc agg tgc age tga age agt cag g (52 mer, SEQ ID NO: 67)
  • mVH2Al act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg agg tec age tgc a (a / g) ca (a / g) t ctg g (52 mer, SEQ ID NO: 68)
  • mVH2A2 act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg agg ttc age tgc age agt ctg g (5 2 mer, SEQ ID NO: 69)
  • [l l] mVH3C2 act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg agg tga age tgg atg aga ctg g (52 mer, SEQ ID NO: 75)
  • mVH3C3 act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg aag tga age tgg tgg agt ctg a (52 mer, SEQ ID NO: 76)
  • mVH5A2 act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccc agg tec age tgc age agt ctg g (52 mer, SEQ ID NO: 81) (A / g) and (g / t) represent a two-base mix.
  • L chain ⁇ mix primers were prepared from the VL mouse sequence at the 5 ′ end and the Ck ( ⁇ constant region) sequence, respectively, and the VL gene was similarly isolated by PCR.
  • the L chain ⁇ mix primer is prepared from the VL mouse sequence at the 5 end and the C ⁇ ( ⁇ constant region) sequence, respectively, and the VL gene is similarly isolated by PCR.
  • the gene sequence was determined by CEQ 2000 DNA Analysis System (BECMAN COULTER) based on the installation.
  • the amino acid sequences and base sequences of clones 1C9, 2E12, 3G11, and 4E11 selected by the secondary screening were identified as follows.
  • SEQ ID NO: 1 VH
  • SEQ ID NO: 2 VH CDR1
  • SEQ ID NO: 3 VH CDR2
  • SEQ ID NO: 4 VH CDR3
  • SEQ ID NO: 5 VL
  • SEQ ID NO: 6 VL CDR1
  • SEQ ID NO: 7 VL CDR2
  • SEQ ID NO: 8 VL CDR3
  • SEQ ID NO: 9 VH
  • SEQ ID NO: 10 VH CDR1
  • SEQ ID NO: 11 VH CDR2
  • SEQ ID NO: 12 VH CDR3
  • SEQ ID NO: 13 VL
  • SEQ ID NO: 14 VL CDR1
  • SEQ ID NO: 15 VL C DR2
  • SEQ ID NO: 16 VL CDR3
  • SEQ ID NO: 17 (VH); SEQ ID NO: 18 (VH CDR1); SEQ ID NO: 19 (VH CDR2); SEQ ID NO: 20 (VH CDR3); SEQ ID NO: 21 (VL); SEQ ID NO: 22 (VL CDR1); SEQ ID NO: 23 (VL CDR2); SEQ ID NO: 24 (VL CDR3)
  • SEQ ID NO: 25 (VH); SEQ ID NO: 26 (VH CDR1); SEQ ID NO: 27 (VH CDR2); SEQ ID NO: 28 (VH CDR3); SEQ ID NO: 29 (VL); SEQ ID NO: 30 (VL CDR1); SEQ ID NO: 31 (VL CDR2); SEQ ID NO: 32 (VL CDR3)
  • SEQ ID NO: 33 VH
  • SEQ ID NO: 34 VH CDR1
  • SEQ ID NO: 35 VH CDR2
  • SEQ ID NO: 36 VH CDR3
  • SEQ ID NO: 37 VL
  • SEQ ID NO: 38 VL CDR1
  • SEQ ID NO: 39 VL CDR2
  • SEQ ID NO: 40 VL CDR3
  • SEQ ID NO: 41 VH
  • SEQ ID NO: 42 VH CDR1
  • SEQ ID NO: 43 VH CDR2
  • SEQ ID NO: 44 VH CDR3
  • SEQ ID NO: 45 VL
  • SEQ ID NO: 46 VL CDR1
  • SEQ ID NO: 47 VL CDR2
  • SEQ ID NO: 48 VL CDR3
  • SEQ ID NO: 49 VH
  • SEQ ID NO: 50 VH CDR1
  • SEQ ID NO: 51 VH CDR2
  • SEQ ID NO: 52 VH CDR3
  • SEQ ID NO: 53 VL
  • SEQ ID NO: 54 VL CDR1
  • SEQ ID NO: 55 VL CDR2
  • SEQ ID NO: 56 VL CDR3
  • SEQ ID NO: 57 (VH); SEQ ID NO: 58 (VH CDR1); SEQ ID NO: 59 (VH CDR2); SEQ ID NO: 60 (VH CDR3); SEQ ID NO: 61 (VL); SEQ ID NO: 62 (VL CDR1); SEQ ID NO: 63 (VL CDR2); SEQ ID NO: 64 (VL CDR3)
  • Human short-chain constant region DNA and human ⁇ -chain constant region DNA are obtained from a human lymphocyte cDNA library using DNA complementary to a part of each DNA as a template.
  • the human ⁇ -chain constant region DNA was ligated with the mouse ⁇ -chain variable region DNA obtained in Section 5 above, and this was ligated to the expression vector “BCMGS Neo vector” (Kazuyama Hatakeyama “Usipapiroma virus vector”, Masami Muramatsu and Hiroshi Okayama. Human chimera, experimental medicine separate volume, Genetic engineering handbook, Yodosha, ⁇ .297-299 (1991), to construct chimera chain vector, similarly, human ⁇ constant region DNA and mouse L obtained in 5. above Ligation with the strand variable region DNA is incorporated into the BCMGS Neo vector to create a chimeric L chain vector ( Figure 17).
  • chimeric H chain vector chimera L chain vector
  • CHO Choinese Chinese Star Ovary
  • the amount of IgG in the culture is measured as follows. Anti-human gamma chain (Medical and Biological Laboratories Co., Ltd .: code 103AG) diluted to 10 g / ml with PBS, dispensed into polystyrene microplates at a rate of 100 1 / well, and sensation at 4 ° C Make it. Next, block with 4% C using 5% BSA / 5% sucrose / PBS. 100 ⁇ 1 sample was reacted at 37 ° C for 1 hour Then, it is washed with PBS / 0.05% Tween20.
  • Anti-human gamma chain Medical and Biological Laboratories Co., Ltd .: code 103AG
  • Serum (IgG amount: 200 ng / ml, 20 ng / ml, 2 ng / ml, 0.2 ng / ml) is used. In this way, the clone with the highest expression level is selected, and the culture supernatant is recovered. From the collected culture supernatant
  • H chain and L chain For the H chain and L chain, select the homologous height and sequence of the antibody H chain and L chain obtained in 5. above from a known database (for example, Fasta database search).
  • the H chain variable region DNA and L chain variable region DNA designed in 7- 1. can be prepared as follows.
  • synthetic DNAs were prepared as shown in FIG. These synthetic DNAs are constructed so as to cover about 400 bp of the variable region and to overlap each by about 20 bp. These synthetic DNA lOpmol / 10 ⁇ 1 were treated at 100 ° C for 5 minutes, then rapidly cooled, mixed with synthetic DNAs 1 and 2, 3 and 4, 5 and 6, and 7 and 8, respectively, with a heat block at 65 ° C. After heating for 30 minutes, leave it for 12 hours and slowly anneal.
  • the expression vector “BCMGS Neo vector”, a synthetic H chain variable region DNA to which a restriction enzyme site was attached by PCR, and human ⁇ chain DNA were ligated, and the CDRH Create a chain vector.
  • a CDRL chain vector incorporating a synthetic L chain variable region DNA and human ⁇ chain DNA is prepared.
  • the CDRH chain vector and the CDRL chain vector were simultaneously transfected into CHO cells using the lipofectin method, incubated at 37 ° C for 12 hours, then re-plated into a 96-well plate and DMEM / 500 ml containing neomycin 500 g / ml. Select with 10% FCS. Then select the clone with the highest expression level by ELISA. Collect the culture supernatant and purify the antibody using a Protein A agarose column.
  • an antibody having high inhibitory activity against amyloid fibril formation is provided.
  • an antibody (including an antibody fragment) having the activity is provided.
  • humanized antibodies can be prepared based on CDR information. These antibodies can be used as effective means in the diagnosis, prevention, treatment, etc. of Alzheimer's disease.

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Abstract

　アミロイド線維形成に対する阻害活性の高い抗体を提供する。所定の割合でGM1ガングリオシドを含むリポソームを免疫原として抗体を得る。アミロイド線維形成に対する阻害活性の高い４種の抗体の配列が開示される。

Description

明 細 書
アミロイド線維形成に対する阻害活性を有する抗体
技術分野
[0001] 本発明はアミロイド線維形成に対する阻害活性を有する抗体、及びその作製方法 などに関する。詳しくは、本発明はアミロイド線維形成に対する阻害活性の高い抗体
、その作製方法、その結合特性を決定する CDR湘補性決定領域)、並びに当該抗 体又は CDRをコードする核酸に関する。アミロイド線維形成 (アミロイド j8タンパク質の 凝集'重合）はアルツハイマー病の発症、進行において本質的に関与していると考え られている。従って、本発明の抗体等は、アルツハイマー病の予防、治療、及び診断 、並びにアルツハイマー病の機構の解明等に利用され得る。
背景技術
[0002] 現在、日本はかって無いスピードで人口の高齢ィ匕が進展しており、それと共に痴呆 症患者の数も増えつつある。国立社会保障 '人口問題研究所の調査によれば、痴呆 症患者数は西暦 2000年には 165万人、 2015年には 264万人に及ぶと見積もられてい る。これら痴呆性疾患の患者の介護は経済的にも大きな負担となることから、一日も 早 、有効な治療法の開発が望まれて 、る。
[0003] 老人性痴呆症のうち、主要なものはアルッノヽイマ一病 (AD)であり、本疾患の病態 生理の全体像は依然不明である力 研究は急速に進展している。アルッノヽイマ一病 患者に共通してみられる特徴としては（1)脳の萎縮（2)老人斑と呼ばれる斑状の蓄 積物の形成を認めること (3)神経細胞内に線維状の物質が蓄積した神経原線維変 ィ匕、の 3つがあり、この 3つを認める場合にアルツハイマー病と診断される。アルッハ イマ一病の臨床症状である痴呆と密接に結びつ 、て 、るのが神経細胞の脱落であ る力 神経細胞の脱落がどの様な理由で起こるかについて、上記の病理変化が重要 な手力 Sかりを与える。 1990年代後半力もの研究の進展により、老人斑がアミロイド j8タ ンパク (A β )と呼ばれるペプチドが凝集して沈着したものであることが明らかになった 。一方、神経原線維変化は神経細胞の骨格タンパク質の一つである tauタンパク質が リン酸ィ匕されて細胞内で凝集しているものであることが明らかにされた。 [0004] アルッノ、イマ一病には遺伝的要因によって引き起こされる家族性アルッノヽイマ一と 、遺伝的背景を持たない孤発性アルツハイマーが知られており、家族性ァルツハイ マーの原因遺伝子や危険因子が明らかにされつつある。家族性アルツハイマーの原 因遺伝子の一つにアミロイド前駆体タンパク質 (Amyloid Precursor Protein ； APP)をコ ードする遺伝子があり、この遺伝子に突然変異があると必ずアルッノヽイマ一病を引き 起こすことが知られている。従って、これら変異体の作用、機能を見出せればァルツ ノ、イマ一病の発症機構が明らかになると考えられる。家族性アルツハイマーと孤発性 アルッノヽイマ一との間には共通の機構が存在すると予測されるため、家族性ァルツ ノ、イマ一病の発症機構の研究力も孤発性アルツハイマーの場合にも適用できる機構 が浮かび上がってくると考えられる。
[0005] A j8は APPから j8及び γセクレターゼによって切り出される力 A j8には切断点の違 いにより Α |8 と A 13 が存在し、 Α |8 の方が Α |8 よりも凝集しやすいこと、また病理
40 42 42 40
学的観察により Α |8 が最初に凝集し、この A |8 を核として A |8 が凝集して線維形
42 42 40
成が進むという説が提唱されている。最近の本発明者らの研究によれば、 ADの脳に おいて GM1ガンダリオシド（以下、略して「GM1」ともいう）、に結合することによって A j8の沈着が開始するとの知見が得られている (K. Yanagisawa, A. Odaka, N. Suzuki, Y. Ihara, Nat. Med. 1 , 1062 (1995)、 K. Yanagisawa, Y. Ihara, Neurobiol. Aging 19, S 65 (1998))。また、本発明者らは、 GM1結合型 A |8を特異的に認識するモノクローナ ル抗体（4396抗体）の作製に成功したことを報告した（FEBS Letters 420, 43-46 (199 7)) 0本発明者らは、 GM1結合型 Α |8のユニークな分子特性に基づき、 Α |8が GM1へ の結合によって構造を変化させ、そしてアミロイド線維形成の種 (シード）として働くと いう仮説を立てた (K. Yanagisawa, A. Odaka, N. Suzuki, Y. Ihara, Nat. Med. 1 , 1062
(1995))。その後、複数の研究者が in vitroでの研究を行い、この仮説を支持する結 果、即ち、 A j8は膜上において GM1に特異的に結合すること、 in vitroにおいては GM 1を含有するリボソームの添カ卩によって可溶性の A βが凝集を開始しアミロイド線維を 形成することが示されている（J. McLaurin, A. Chakrabartty, J. Biol. Chem. 271 , 264 82 (1996)、 P. Choo- Smith, W. K. Surewicz, FEBS Lett. 402, 95 (1997)、 McLaurin J,
Chakrabartty A, Eur J Biochem. 245(2)355(1997), P.Choo— Smith, W. Garzon— Rodri guez, C. G. Globe, W. K. Sutrewicz, J. Biol. Chem. 272, 22987 (1997)、 K. Matsuza ki, C. Honkiri, Biochemistry 38, 4137 (1999)、 V. Koppaka, P. H. Axelsen, Biochemi stry 39, 10011 (2000))。
その後、 GMlと A j8とが複合体を形成する分子メカニズムについて、 A j8の GMlへ の結合が、結合する膜のコレステロールの濃度に依存していること、即ち、高濃度の コレステロールにより膜上の GM1「クラスター」の形成が促され、これにより A j8と GM1 との結合が促進されることが報告された (A. Kakio, S. Nishimoto, K. Yanagisawa, Y. Kozutumi, K. Matsuzaki, J.Biol.Chem, 276,24985(2001》。また、シナプス膜の exofaci al leafletsにおけるコレステロール濃度は加齢及び Z又はアポリポタンパク質 E (Apo E)の欠乏とともに有意に増加することから (U.Igbavboa, N.A.Avdulov, F.Schroeder, W.G.Wood, J.Neurochem. 66, 1717 (1996)、 U.Igbavboa, N.A.Avdulov, S.V.Chochin a, W.G.Wood, J.Neurochem. 69, 1661 (1997))、 A j8は老化脳のシナプス膜において GM1に結合することが推測された。一方、 GM1及びコレステロールを豊富に含む膜ド メイン (raftsと呼ばれる）は生理的に多量の A |8を含有し、かつある種の家族性ァルツ ハイマー病モデルマウスにおいて不溶性 A を蓄積することから、 A はこの膜ドメイ ン（rafts)において GMlに結合する可能性も推測された (R.G.Parton, J. Histochem. C ytochem. 42, 155(1994)、 K.Simons, E.lkonen, Nature 387, 569 (1997)、 S.J.Lee et al. , Nat. Med. 4, 730 (1998)、 M. Morishima- Kawashima, Y.Ihara, Biochemistry 37, 152 74 (1998)、 N.Sawamura et al" J. Biol. Chem. 275, 27901 (2000》。
[0006] その後、本発明者らは、抗体 (4396C)を用いた免疫学的手法で生体中の Α |8線維 形成の種 (GA |8複合体）中には GM1が含まれることを示すとともに、この抗体がアル ッハイマー病脳カゝら GA β複合体を認識し、 GA β複合体を種とする Α β重合を抑制 することを明らかにした。これらの結果力もアルツハイマー病発症機構を説明するアミ ロイド仮説の中でもその核心である Α |8線維形成の種形成機構力 実際に生体内で 起きている可能性を示唆した。（国際公開第 03/014162号公報、 J Neurosci., 2004, 24 ： 4894-4902)
[0007] 特許文献 1 :国際公開第 03/014162号公報
非特許文献 1 : K. Yanagisawa, A. Odaka, N. Suzuki, Y. Ihara, Nat. Med. 1, 1062 (19 非特許文献 2 : K. Yanagisawa, Y. Ihara, Neurobiol. Aging 19, S65 (1998)
非特許文献 3 : FEBS Letters 420, 43-46 (1997)
非特許文献 4 : J. McLaurin, A. Chakrabartty, J. Biol. Chem. 271, 26482 (1996) 非特許文献 5 : P. Choo— Smith, W. K. Surewicz, FEBS Lett. 402, 95 (1997) 非特許文献 6 : McLaurin J, Chakrabartty A, Eur J Biochem. 245(2)355(1997) 非特許文献 7 : P.Choo- Smith, W. Garzon- Rodriguez, C. G. Globe, W. K. Sutrewicz, J. Biol. Chem. 272, 22987 (1997)
非特許文献 8 : K. Matsuzaki, C. Horikiri, Biochemistry 38, 4137 (1999)
非特許文献 9 : V. Koppaka, P. H. Axelsen, Biochemistry 39, 10011 (2000) 非特許文献 10 : A. Kakio, S. Nishimoto, K. Yanagisawa, Y. Kozutumi, K. Matsuzaki,
J.Biol.Chem, 276, 24985(2001)
非特許文献 l l : U.Igbavboa, N.A.Avdulov, F.Schroeder, W.G.Wood, J.Neurochem. 6 6, 1717 (1996)
非特許文献 12 : U.Igbavboa, N.A.Avdulov, S.V.Chochina, W.G.Wood, J.Neurochem. 69, 1661 (1997)
非特許文献 13 : R.G.Parton, J. Histochem. Cytochem. 42, 155(1994)
非特許文献 14 : K.Simons, E.Ikonen, Nature 387, 569 (1997)
非特許文献 15 : S.J丄 ee et al.， Nat. Med. 4, 730 (1998)
非特許文献 16 : M. Morishima-Kawashima, Y.lhara, Biochemistry 37, 15274 (1998) 非特許文献 17 : N.Sawamura et al, J. Biol. Chem. 275, 27901 (2000)
非特許文献 18 : J Neurosci., 2004, 24: 4894-4902
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
アルッノ、イマ一病を標的とする治療法や診断法の開発のためには、アミロイド線維 形成 (A β重合)を効果的に阻害する抗体、特に GA β複合体に対する特異性の高!、 抗体を効率的に得る手段が必要である。従来、アルツハイマー治療にはワクチン療 法などの免疫反応を起こす物質を直接接種または摂取することによって、身体の中 に存在する免疫系を刺激し活性化する「能動免疫療法」や活性化リンパ球療法など の免疫反応を担うリンパ球などを身体の外で活性ィ匕して再び身体に戻す「受動免疫 療法」も考慮されてきたが、アミロイド線維形成に対する十分な阻害活性を発揮する 抗体は得られていなカゝつた。本発明者らは、高い阻害活性を有する抗体が得られな い原因が免疫原として使用される A |8にあり、 Α |8に代えて GA |8複合体を免疫原とす れば阻害活性の一層高い抗体を産生させることができると考えた。し力しながら、 GA j8複合体をアルツハイマー病脳から大量に高純度で得ることは技術的にも材料の入 手の点でも難 、ことから、このアプローチは現実的でな!、。
ところで本発明者らは、 4396抗体を用いて、アルッノヽイマ一病患者脳および高齢力 二クイザル脳内にこの抗体が反応する抗原が対照と比較して多量に存在し、かつ高 齢力-クイザル脳内では GM1および A βと組織学的および物理的にも共存して!/、る ことを示した（国際公開第 03/014162号公報、 J Neurosci., 2004, 24: 4894-4902)。 in vitroで GM1を含むリボソームと A j8を反応させた実験によって、アルツハイマー病患 者脳の A j8に富む粗分画を免疫原として得られた 4396抗体（FEBS Letters 420, 43- 46 (1997))が反応する抗原は GA |8であることが証明された。従来知られている A を認識する抗体の中には、 A |8だけでなく GA |8とも反応するものがある（たとえば ΒΑ Ν052, J Neurosci., 2004, 24: 4894-4902)が、重合していない A j8およびその前駆タ ンパク質である APPを認識しない抗体でかつ GA βと反応する抗体は 4396抗体が初 めてである。この抗体の特性を in vitroでの Thioflavin Tを用いた A j8の線維形成測定 法で更に調べたところ、従来の A |8を認識する抗体には見られない線維形成阻害活 性を用量依存的に示した。このことから、 4396抗体が認識する GA |8を in vitroで作製 することで、生体中の GA |8と同等の性質を持っている大量かつ既知の組成力 なる 免疫原が得られる。この抗原力 得られた抗体の中から、 GA |8と反応するがその構 成成分 (A βと GM1)単独とは反応しな!、性質を持つ抗体を選択することで、 Α |8の線 維形成を阻害するという、 4396抗体の持つ性質と同様の性質を持つ抗体が取得でき ると期待された。し力しながら、至適な GA |8の調製法が確立されていな力つた。 課題を解決するための手段
以上の背景の下、本発明者らは、アミロイド線維形成に対する阻害活性 (以下、 ΓΑ β重合阻害活性」とも 、う）の高 、抗体を得ることを目的として鋭意検討した。まず、 A β重合阻害活性の高い抗体を得るための免疫原として、 GM1とそれに結合した Α |8 を含有する合成脂質膜 (リボソーム)を採用することとした。 Α β重合阻害活性の高!ヽ 抗体を得るための免疫原であるためには、それを核として Α |8が効率的に重合するこ と、即ち A 重合開始活性が高いことが要求されると考えられた。そこで、形成される GA β量と Α β線維伸長を制御し、より効率的に Α βの線維形成の阻害活性を持つ抗 体を得るためには、 GM1のリボソーム内の構成比変動と結合 Α |8量の関係を明らか にすることが重要であり、また、 GM1含有リボソームと A |8の反応時間の設定も重要で あると考え、各種実験を施行した。その結果、合成脂質膜中の GM1の含有量に注目 して行った実験によって、合成脂質膜の A |8重合開始活性力 SGM1の含有量に依存 することが明ら力となった。また、 GM1含有リボソームと A |8の反応時間は短いことが 好ましいとの知見を得た。これらの知見に基づいて、適量の GM1を含む合成脂質膜 を免疫原とし、抗体の作製を試みた。得られた複数の抗体についてその A 重合阻 害活性を検証したところ、通常の A 単独の免疫より A 重合阻害活性が遙かに高 い抗体が得られていた。また、このようにして取得された抗体の中には、一度形成さ れた A |8線維を脱重合させる活性を有するものも認められた。これらの結果から、 A |8 重合阻害活性の高い抗体を作製するための材料として上記合成脂質膜が有効であ ることが確認された。
一方、 A β重合阻害活性の高!、抗体にっ 、てはそのアミノ酸配列 (及び塩基配列） を同定し、可変領域の配列の決定、及び相補性決定領域 (CDR)の特定に成功した 。可変領域の配列、特に CDRの配列情報は、 Α β重合阻害活性の高!、抗体を作製 する上での極めて重要な情報であり、その利用価値は高い。
以上の検討によって得られた抗体は高い Α 重合阻害活性を有することから、それ 自体でアルツハイマー病の治療法等の開発に有用である。また、これらの抗体の CD Rの情報は、 A |8重合阻害活性の高い抗体の本質的特徴であって、これを基に A |8 重合阻害活性の高い抗体の創出や改変等が可能である。特に、 A j8重合阻害活性 の高 、ヒトキメラ抗体、ヒトイ匕抗体等の作製が可能となる。
本発明は少なくとも部分的には以上の成果に基づくものであり、次の構成を提供す る。即ち、本発明の第 1の局面はアミロイド線維形成に対する阻害活性を有する単離 された抗体に関し、その一態様では in vitroでのアミロイド |8タンパク質重合阻害試験 において阻害効果が 50%以上である。尚、後述のように被験抗体の阻害効果は原 則として、 GA β複合体を核とした Α β重合が生ずる環境にお!、て又は既に Α β線維 が存在する環境において、被験抗体を添加し所定時間反応させた後の Α |8重合量と 、被験抗体を添加しない条件としたときの A 重合量とを比較することによって算出さ れる。
本発明の抗体は好ましくは、 GM1ガンダリオシド結合型アミロイド |8タンパク質 (GA ι8複合体)を認識する。カゝかる特徴を備えることによって、 GA |8複合体を核としたアミ ロイド線維形成を有効に阻害できる抗体となる。
本発明の抗体の一態様は、配列番号： 2〜4、 10〜12、 18〜20、及び 26〜28の いずれかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含む CDRを有す る重鎖可変領域と、配列番号： 6〜8、 14〜16、 22〜24、及び 30〜32のいずれか のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含む CDRを有する軽鎖可 変領域とを備える。これらのアミノ酸配列は、アミロイド線維形成に対して高い阻害活 性を有するものとして実際に取得及び同定に成功した抗体の配列に由来する。 本発明の抗体は、より具体的には以下の a〜hからなる群より選択される組合せの重 鎖可変領域及び軽鎖可変領域を備える。
(a)配列番号： 2のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する重 鎖 CDR1、配列番号： 3のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有す る重鎖 CDR2、及び配列番号: 4のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配 列を有する重鎖 CDR3からなる CDRを有する重鎖可変領域と、配列番号: 6のアミノ酸 配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR1、配列番号： 7のアミノ酸 配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR2、及び配列番号: 8のァ ミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR3力 なる CDRを有 する軽鎖可変領域との組合せ
(b)配列番号： 10のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する 重鎖 CDR1、配列番号： 11のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を 有する重鎖 CDR2、及び配列番号： 12のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する重鎖 CDR3からなる CDRを有する重鎖可変領域と、配列番号： 14の アミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR1、配列番号： 15 のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR2、及び配列番 号： 16のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR3力 な る CDRを有する軽鎖可変領域との組合せ
(c)配列番号： 18のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する重 鎖 CDR1、配列番号： 19のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有 する重鎖 CDR2、及び配列番号： 20のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のァミノ 酸配列を有する重鎖 CDR3からなる CDRを有する重鎖可変領域と、配列番号： 22の アミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR1、配列番号： 23 のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR2、及び配列番 号： 24のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR3力 な る CDRを有する軽鎖可変領域との組合せ
(d)配列番号： 26のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する 重鎖 CDR1、配列番号： 27のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を 有する重鎖 CDR2、及び配列番号： 28のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する重鎖 CDR3からなる CDRを有する重鎖可変領域と、配列番号： 30の アミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR1、配列番号： 31 のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR2、及び配列番 号： 32のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR3力 な る CDRを有する軽鎖可変領域との組合せ
(e)配列番号： 1のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する重 鎖可変領域と、配列番号： 5のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列 を有する軽鎖変領域との組合せ
(£)配列番号： 9のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する重 鎖可変領域と、配列番号： 13のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列 を有する軽鎖変領域との組合せ (g)配列番号： 17のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する重 鎖可変領域と、配列番号： 21のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列 を有する軽鎖変領域との組合せ
(h)配列番号： 25のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する 重鎖可変領域と、配列番号： 29のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配 列を有する軽鎖変領域との組合せ
以上の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せは、アミロイド線維形成に対して高 い阻害活性を有するものとして実際に取得及び同定に成功した抗体における重鎖可 変領域と軽鎖可変領域の組合せに相当する。
[0012] 本発明の抗体をヒト化抗体として構築することができる。ヒトイ匕抗体であることによつ て、本発明の抗体は特に治療目的に好適なものとなる。
本発明の抗体は、完全な抗体 (即ち定常領域及び可変領域をそれぞれ備える重鎖 及び軽鎖からなる抗体）であっても、 Fab、 Fab'、 F(ab')、 scFv、又は dsFv抗体などの
2
抗体断片であってもよい。
[0013] 本発明の他の局面は、アミロイド線維形成に対する阻害活性の高い抗体の CDR領 域を提供する。具体的には配列番号： 2〜4、 6〜8、 10〜12、 14〜16、 18〜20、 2 2〜24、 26〜28、及び 30〜32のいずれかのアミノ酸配列を含む CDRが提供される 。これらの CDRは、アミロイド線維形成に対する阻害活性の高い抗体を構築すること に使用され得、その利用価値は高い。特に、ヒト型乃至ヒト化抗体を構築する上で重 要な材料となる。
[0014] 本発明は更に、本発明の抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域、本発明の 抗体の重鎖若しくは軽鎖、又は本発明の CDR領域をコードする単離された核酸分子 を提供する。当該核酸分子を利用して、アミロイド線維形成に対する阻害活性の高い 抗体を作製することが可能である。
[0015] 本発明はまた、上記核酸分子を発現可能に保持するベクター、及び上記核酸分子 が導入されて ヽる形質転換体を提供する。当該ベクター及び形質転換体はそれぞ れ例えばアミロイド線維形成に対する阻害活性の高い抗体を作製することに利用さ れ得る。 [0016] 本発明の更なる局面では、アミロイド線維形成に対する阻害活性の高い抗体を作 製することに利用可能な動物免疫用の合成脂質膜が提供される。本発明の合成脂 質膜は、 GM1ガンダリオシドと、その他の脂質と、及び該 GM1ガンダリオシドに結合し たアミロイド j8タンパク質とを含有し、その他の脂質： GM1ガンダリオシド = 90 : 10〜6 0： 40の範囲にあることを特徴とする。
本発明はさらに、上記合成脂質膜を利用した抗体作製方法を提供する。本発明の 作製方法は、上記合成脂質膜を非ヒト動物に免疫する免疫ステップと、免疫後の前 記非ヒト動物力 取り出した抗体産生細胞を不死化細胞と融合し、ハイプリドーマを 得るハイプリドーマ作製ステップと、上記合成脂質膜に結合性を有する抗体を産生す るハイプリドーマを選抜するハイプリドーマ選抜ステップと、及び選抜されたハイブリド 一マの発現する抗体を分離する抗体分離ステップと、を含んで構成される。好ましい 一形態では、前記ハイプリドーマ選抜ステップにおいて、上記合成脂質膜に結合性 を有し且つモノマーアミロイド j8タンパク質に結合性を有しない抗体を産生するハイ プリドーマを選抜することが行われる。これによつて、作製過程において、モノマーァ ミロイド βタンパク質 (即ち非重合状態のアミロイド βタンパク質）に結合性を有する抗 体が排除される。従って、合成脂質膜、即ち GA jS複合体に対して特異性の高い抗 体を得ることが可能となる。
本発明はまた、抗体ライブラリーを利用した抗体作製方法も提供する。即ち、抗体 ライブラリーを上記合成脂質膜に接触させる接触ステップと、抗体ライブラリーの中か ら上記合成脂質膜に結合性を有するクローンを選抜するクローン選抜ステップと、及 び選抜されたクローンの発現する抗体を分離する抗体分離ステップと、を含んで構成 される抗体作製方法が提供される。この作製方法においても、 GA j8複合体に対して 特異性の高い抗体を得るため、前記クローン選抜ステップにおいて前記合成脂質膜 に結合性を有し且つモノマーアミロイド j8タンパク質に結合性を有しないクローンを 選抜することが好ましい。
本発明はさらに、上記作製方法で得られる単離された抗体も提供する。
[0017] 本発明はまた、抗体のアミロイド線維形成に対する阻害活性を測定する方法を提 供する。本発明の測定方法では、被験抗体の存在下及び非存在下でそれぞれ、上 記合成脂質膜にアミロイド βタンパク質を接触させるステップと、被験抗体の存在下 で上記ステップを実施した場合と、被験抗体の非存在下で上記ステップを実施した 場合との間で、合成脂質膜へのアミロイド j8タンパク質の結合及び Ζ又はアミロイド βタンパク質の重合の程度を比較するステップとが実施される。本発明の測定方法 は例えば、本発明の抗体の阻害活性を測定すること、本発明の抗体作製方法にお いて目的の抗体をスクリーニングすること、本発明の抗体作製方法で得られた抗体の 阻害活性を確認すること等に利用される。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、 1251標識アミロイド j8タンパク質（1-40)の GM1含有リボソームへの結合量 を、リボソームを構成する脂質中の GM1とコレステロールのモル比（分子比）を変動さ せて測定した結果をまとめたグラフである。 GM1組成が 10-40%で構成されるリポソ一 ムに結合するアミロイド j8タンパク質（1-40)量は多い。特に、スフインゴミエリン:コレ ステロール： GM1 (分子比）が 64 : 16 : 20の場合が最も結合量が多 、。
[図 2]図 2は、 1251標識アミロイド j8タンパク質（1-42)の GM1含有リボソームへの結合量 をそのリボソームを構成する脂質中の GM1とコレステロールの分子比を変動させて測 定した結果をまとめたグラフである。 GM1組成が 10-40%で構成されるリボソームに結 合するアミロイド j8タンパク質（1-42)量は多い。特に、スフインゴミエリン：コレステロ一 ル： GM1 (分子比）が 64 : 16 : 20の場合が最も結合量が多 、。
[図 3]図 3は、 GM1リボソームへの A j8結合実験に使用した GM1リボソームの組成（分 子比）をまとめた表である。 SM :スフインゴミエリン、 Choi:コレステロール、 GM1 : GM1 ガンダリオシド。 GM1を含まないリボソームはこの糸且成中の GM1分子比を 0とした。各 成分の濃度の合計 (総濃度）が 4600 μ Μとなるように混合した。
[図 4]図 4は、取得した抗体のアミロイド βタンパク質重合阻害活性を三種の重合系（ Α.Α β線維断片を添加することで開始される重合、 B.GA β 40から開始される Α β 40 の重合、 C.GA β 42から開始される Α β 42の重合)で測定した結果である。 *抗体を 加えな!/、で重合させた場合の蛍光強度を 100%としたときの相対蛍光強度。実験は 三回行い、典型的な結果を示した。 * *線維状 Α |8を添加することで開始される重合 反応、 GA β 40から開始される Α β 40の重合反応、 GA β 42から開始される Α β 42の重 合反応をあらわす。 * * *遊離の A |8ペプチドと反応するモノクローナル抗体（陰性 対照)。
[図 5]図 5は取得した抗体 2E12のアミロイド βタンパク質脱重合活性を測定した結果 である。抗体 2E12を GA j8添加と同時に A j8 40溶液に添カ卩し、経時的に Thioflavin T を用いた A |8 40の線維形成測定を行った。 2E12添カ卩により明らかな測定値の低下が 見られる。
[図 6]図 6は取得した抗体 3G11のアミロイド βタンパク質脱重合活性を測定した結果 である。抗体 3G11を GA j8添加と同時に A j8 40溶液に添カ卩し、経時的に Thioflavin T を用いた A |8 40の線維形成測定を行った。 3G11添カ卩により明らかな測定値の低下が 見られる。
[図 7]図 7は、 Α |8線維重合に対する抗体 2E12と 3G11の作用を示す。 GM1リボソーム 添加から 4時間経過後に抗体 2E12と 3G11を添カ卩した。添加後、経時的に Thioflavin T 蛍光測定を行った結果をグラフに表した。抗体 2E12および 3G11の添カ卩により明らか な測定値の低下が見られる。陽性対照としての 4396Cを添加した場合は Α |8線維伸 長反応の抑制が見られ、 2E12および 3G11を添カ卩した場合には、形成された Α |8線維 の破壊効果が見られる。
[図 8]図 8は、 Α |8線維重合に対する抗体 2E12と 3G11の作用を示す。 GM1リボソーム 添加から 24時間経過後に取得抗体 2E12と 3G11を添カ卩した。添加後、経時的に Thiofl avin T蛍光測定を行った。 2E12および 3G11の添カ卩により明らかな測定値の低下が見 られる。 2E12および 3G11を添カ卩した場合には、形成された Α |8線維の破壊効果が見 られる。対照として用いた 4396Cにはこの作用は認められな 、。
[図 9]図 9は、 GM1含有リボソームの免疫によって得られた、 GM1ガンダリオシド結合 型アミロイド βタンパク質重合を阻害する抗体 1C9の Η鎖可変領域の遺伝子配列 (シ ークエンスサイズ： 363)及びアミノ酸配列を示す図である。 CDRは相補性決定部位 (c omplementarity determing regionノを ¾：す。
[図 10]図 10は、 GM1含有リボソームの免疫によって得られた、 GM1ガンダリオシド結 合型アミロイド βタンパク質重合を阻害する抗体 1C9の L鎖可変領域の遺伝子配列（ シークェンスサイズ： 327)及びアミノ酸配列を示す図である。 CDRは相補性決定部位 (complementarity determing region)を表す。
[図 11]図 11は、 GM1含有リボソームの免疫によって得られた、 GM1ガンダリオシド結 合型アミロイド βタンパク質重合を阻害する抗体 2E12の Η鎖可変領域の遺伝子配列 (シークェンスサイズ： 345)及びアミノ酸配列を示す図である。 CDRは相補性決定部
(.complementarity aeterming region; 表す。
[図 12]図 12は、 GM1含有リボソームの免疫によって得られた、 GM1ガンダリオシド結 合型アミロイド βタンパク質重合を阻害する抗体 2E12の L鎖可変領域の遺伝子配列（ シークェンスサイズ： 327)及びアミノ酸配列を示す図である。 CDRは相補性決定部位 (.complementarity determing region)を ¾す。
[図 13]図 13は、 GM1含有リボソームの免疫によって得られた、 GM1ガンダリオシド結 合型アミロイド βタンパク質重合を阻害する抗体 3G11の Η鎖可変領域の遺伝子配列 (シークェンスサイズ： 339)及びアミノ酸配列を示す図である。 CDRは相補性決定部
(.complementarity aeterming region; 表す。
[図 14]図 14は、 GM1含有リボソームの免疫によって得られた、 GM1ガンダリオシド結 合型アミロイド βタンパク質重合を阻害する抗体 3G11の L鎖可変領域の遺伝子配列 (シークェンスサイズ： 339)及びアミノ酸配列を示す図である。 CDRは相補性決定部
(.complementarity aeterming region; 表す。
[図 15]図 15は、 GM1含有リボソームの免疫によって得られた、 GM1ガンダリオシド結 合型アミロイド βタンパク質重合を阻害する抗体 4E11の Η鎖可変領域の遺伝子配列 (シークェンスサイズ： 366)及びアミノ酸配列を示す図である。 CDRは相補性決定部
(.complementarity aeterming region; 表す。
[図 16]図 16は、 GM1含有リボソームの免疫によって得られた、 GM1ガンダリオシド結 合型アミロイド βタンパク質重合を阻害する抗体 4E11の L鎖可変領域の遺伝子配列（ シークェンスサイズ： 342)及びアミノ酸配列を示す図である。 CDRは相補性決定部位 (.complementarity determing region)を ¾す。
[図 17]図 17は発現ベクターの構成例を示した図である。図 17(A)には、 H鎖発現べク ター（BCMGSneo-H)の構成が示される。図 17(B)には、 L鎖発現ベクター（BCMGSne o-L)の構成が示される。 [図 18]図 18は、ヒト型 CDR移植抗体可変領域 DNAの作製方法を模式的に示した図 である。
発明を実施するための最良の形態
[0019] (用語の説明）
説明の便宜上、本明細書に使用される用語の一部についてその定義をまとめて以 下に示す。
本明細書において、アミロイド j8タンパク質を略して「Α |8」ともいう。また、 GM1ガン ダリオシドを略して「GM1」ともいう。同様に、 GM1ガンダリオシド結合型アミロイド |8タ ンパク質を略して「GA βタンパク質」又は「GA β複合体」とも！/、う。
本明細書にぉ 、て「アミロイド βタンパク質重合阻害活性」は、特に記載のな 、限り 、アミロイド /3タンパク質の重合を抑制する活性、及び重合したアミロイド j8タンパク質 を脱重合させる活性を含む用語として用いられる。
[0020] 本明細書において用語「〜を含む」又は「〜を含んでなる」は、「〜からなる」の意味 をも含む表現として使用される。したがって例えば、「複数の要素 (部材)を含んで構 成される物（又は方法)」と記載した場合には、それが意味するものとして「当該複数 の要素 (部材)から構成される物 (又は方法)」も当然に考慮される。
[0021] 「単離された」とは、その本来の環境 (例えば天然の物質の場合は天然の環境)から 取り出された状態、即ち人為的操作によって本来の存在状態と異なる状態で存在し ていることを意味する。従って用語「単離された抗体」には、天然であって且つ何ら外 的操作 (人為的操作)が施されていない抗体、即ちある個体の体内で産生され、そこ に留まっている状態の抗体は含まれない。尚、単離された抗体は、典型的には、他 の種類の抗体が混在して ヽな 、状態、即ち単独で（同種の抗体の集合として)存在し ている。 CDR領域の場合の「単離された」状態には、単独で存在している状態に加え 、抗体の他の領域とともに存在している状態も含まれる。即ち、用語「単離された CDR 」には、単独で存在している CDRは勿論のこと、単離された抗体の一部として存在し ている CDRも含まれる。核酸については、それがベクターや組成物の一部として存在 していても又は外来性分子として細胞内に存在していても、人為的操作の結果として 存在している限り「単離された核酸」に該当する。 [0022] アミノ酸配列に関して使用する用語「実質的に同一」とは、比較される二つのァミノ 酸配列間で配列上の相違が比較的小さく且つ配列上の相違がアミロイド βタンパク 質重合阻害能に関して実質的な影響を与えないことを意味する。基準となるアミノ酸 配列に対して、アミロイド βタンパク質重合阻害活性に実質的な影響を与えない範囲 で一部の改変を含んでいるとみることができるアミノ酸配列は実質的に同一なァミノ 酸配列である。ここでの「アミノ酸配列の一部の改変」とは、アミノ酸配列を構成する 1 〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは 1〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれ らの組合せによりアミノ酸配列に変化が生ずることをいう。アミノ酸配列の変異の位置 は特に限定されず、複数の位置で変異を生じていてもよい。ここでの複数とはァミノ 酸配列を構成する全アミノ酸の例えば 10%以内に相当する数であり、好ましくは全ァ ミノ酸の 5%以内に相当する数である。さらに好ましくは全アミノ酸の 1パーセント以内 に相当する数である。
二つのアミノ酸が実質的に同一である力否かは、各アミノ酸配列を含む抗体 (他の 領域の配列は同一）のアミロイド ι8タンパク質重合阻害活性 (以下、特に記載のない 限り「阻害活性」は「アミロイド βタンパク質重合阻害活性」を意味する)を比較するこ とによって判定できる。具体的には、基準となるアミノ酸配列を含む抗体の阻害活性 を 100%とし、これに対する比率として比較対象のアミノ酸配列を含む抗体の阻害活 性が例えば 50%以下である場合など、阻害活性の差が顕著であれば実質的な同一 性を認定できない。一方で、例えば 70%〜130%である場合など阻害活性に大きな 差が認められなければ実質的な同一性を認定できる。
[0023] アミロイド線維の形成を阻害する抗体、即ちアミロイド線維形成に対する阻害活性を 有する抗体のことを本明細書では「Α β重合阻害抗体」とも 、う。また、 Α β重合阻害 抗体の中で、 GM1ガンダリオシド結合型アミロイド /3タンパク質 (GA 複合体)を特異 的に認識する抗体のことを特に「抗 GA β抗体」とも 、う。
[0024] 本明細書における用語「核酸」は DNA(cDNA及びゲノム DNAを含む）、 RNA(mRNA を含む）、 DNA類似体、及び RNA類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定されず 、即ち 1本鎖及び 2本鎖のいずれであってもよい。好ましくは 2本鎖 DNAである。またコ ドンの縮重も考慮される。即ちタンパク質をコードする核酸の場合には、その発現産 物として当該タンパク質が得られる限り任意の塩基配列を有していてよい。本明細書 にお 、て「あるタンパク質 (例えば抗体)をコードする核酸」は、それを発現させた場合 に当該タンパク質が得られる核酸のことをいい、当該タンパク質のアミノ酸配列に対 応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードし な 、配列が付加されてなる核酸 (例えば 1又は複数個のイントロンを含む DNA)をも含 む。
[0025] 本明細書において用語「単離された核酸」とは、もともと天然に存在している核酸（ 例えばヒト生体内の核酸)の場合、典型的には、天然状態において共存するその他 の核酸から分離された状態の核酸をいう。但し、天然状態において隣接する核酸配 列など一部の他の核酸成分を含んで 、てもよ 、。例えばゲノム DNAの場合の「単離 された核酸」の好ま ヽ形態では、天然状態にお!ヽて共存する他の DNA成分 (天然 状態にお 1ヽて隣接する DNA配列を含む)を実質的に含まな！/ヽ。
例えば cDNA分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単 離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核 酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は 好ましくは、 dDNTPなどの前駆体 (原材料)や合成過程で使用される化学物質等を実 質的に含まな!/、状態の核酸を!、う。
ベクターや組成物の一部として核酸が存在して 、ても、又は外来性分子として細胞 内に核酸が存在していても、人為的操作の結果として存在している限り「単離された 核酸」と言える。尚、特に言及しない限り、本明細書において単に「核酸」と記載した 場合には「単離された状態の核酸」を意味する。
[0026] 本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号 (括弧内）を使用する。
重鎖 (H鎖)、軽鎖 (L鎖)、重鎖可変領域 (VH)、軽鎖可変領域 (VL)、相補性決定 領域 (CDR)、第 1相補性決定領域 (CDR1)、第 2相補性決定領域 (CDR2)、第 3相補 性決定領域 (CDR3)重鎖の第 1相補性決定領域 (VH CDR1)、重鎖の第 2相補性決 定領域 (VH CDR2)、重鎖の第 3相補性決定領域 (VH CDR3)軽鎖の第 1相補性決 定領域 (VL CDR1)、軽鎖の第 2相補性決定領域 (VL CDR2)、軽鎖の第 3相補性決 定領域 (VL CDR3) [0027] 本発明の第 1の局面は、アミロイド線維形成に対する阻害活性を有する単離された 抗体 (A β重合阻害抗体）に関する。ここでの用語「抗体」はポリクローナル抗体、モノ クローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、 CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、又はこれら の断片等を含む。
本発明の Α β重合阻害抗体は、 in vitroでのアミロイド βタンパク質重合阻害試験（ 以下参照）において阻害効果が 50%以上であることを特徴とする。このような高い阻 害効果によって、本発明の抗体はアミロイド線維の形成を効果的に阻害することがで きる。
本発明の抗体の Α |8重合に対する阻害効果は好ましくは 70%以上であり、さらに 好ましくは 80%以上であり、より一層好ましくは 90%以上であり、最も好ましくは実質 的に 100%である。
本発明の抗体は、好ましくは、 GM1ガンダリオシド結合型アミロイド |8タンパク質 (G A β複合体)を認識する。当該抗体ではアミロイド線維形成の初期段階を阻害する効 果を期待できる。従って、アルツハイマー病の発症の防止、アルツハイマー病の初期 診断などにぉ 、て特に有用性の高 、抗体となる。
[0028] 本明細書における「アミロイド線維形成に対する阻害活性 (Α β重合阻害活性)」は 原則として以下のいずれかの試験（1.〜3. )によって測定'評価される。但し、以下 の試験と同等であると見なされる他の試験、又はその試験結果を以下の試験で得ら れる結果へ換算して同等の評価が可能な他の試験によってアミロイド βタンパク質重 合阻害活性を測定'評価してもよい。
[0029] 1. Α β重合阻害試験 1 (Α β線維を添加することで開始される重合に対する阻害効 果）
1- 1. Α |8溶液の調製
Α β溶液を以下の手順で調製する。まず、合成 Α β (例えば Lot.501001 (ぺプチ
1-40
ド研究所、大阪、日本）又は Lot.519599 (Bachem AG,スイス））を最初に 0.002%のァ ンモニァ溶液に約 500 μ Μとなるように溶解し、 100,000rpmで 3時間遠心する（TLA12 0.0ローター、 Optima TL、ベックマン、カルフォルニア州、米国）。上清の上 3分の 2を 集め、 Α βの濃度を決定する。 Α β溶液は小分けして使用時まで- 80°Cに保存する。 使用直前に溶解し、生理的トリス緩衝液（TBS : 150mM NaCl及び 10mM Tris- HC1, p H7.4)で適切な濃度に希釈する。
[0030] 1-2.線維状 A β溶液の調製
線維状 Α β溶液を以下の手順で調製する。まず、合成 Α β (例えば Lot.501001 (
1-40
ペプチド研究所、大阪、日本）又は Lot.519599 (Bachem AG,スイス））を 4°Cで約 500 μ Μのアンモニア溶液に短時間ボルテックスすることにより溶解し、インキュベーショ ンバッファー（50mMリン酸緩衝液、 pH7.5； lOOmM NaCl)で 50 μ Μに希釈する。 37°C で 24時間インキュベートした後、混合液を 1.6 X 104g、 4°Cで 3時間遠心する。エツペン ドルフチューブ内で沈渣を 0.005%NaNを含む氷冷したインキュベーションバッファー
3
に再懸濁し、マイクロチップ (TP-030、 ΤΟΜΥ、東京、日本)を備えた超音波破砕機（ UD-201 , ΤΟΜΥ、東京、日本）を用いて氷上で超音波処理し、使用時まで 4°Cで保 存する。
[0031] 1-3.阻害効果の評価
(1)被験抗体の存在下 (試験群)又は非存在下 (対照群）にお!ヽて、線維状 A β溶液 ( 5 1)と、 A |8溶液（100 μ 1)とを混合し、 37°Cでインキュベーションする。
(2) Thioflavin Tを用いた A j8の線維形成測定を、 Naiki H and Gejyo F(1999) Methods Enzymol 309, 305-318に従って行う。まず、インキュベーション開始から所定時間経 過後（例えば 4時間）の溶液の一部（5 μ 1)をサンプリングし、これに終濃度 5 μ Μとな るように Thioflavin T (Sigma)を添加する。 1mlの 50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液 で希釈した後、 A β線維の蛍光強度 (励起波長 446nm、蛍光波長 490nm)を分光蛍光 光度計 (例えば RF-5300PC、島津製作所)で測定する。
(3)以下の計算式で被験抗体の阻害効果 (阻害活性)を求める。
阻害効果 (％) = (対照群の蛍光強度 試験群の蛍光強度) Z対照群の蛍光強度 X 100
[0032] 2. Α β重合阻害試験 2 (GA β 40から開始される Α β 40の重合に対する阻害効果） 2-1. Α |8溶液の調製方法
上記 1-1.と同様の手順で A β溶液を調製する。
[0033] 2-2. GM1ガンダリオシドを含む合成脂質の調製 GM1ガンダリオシドを含む合成脂質を以下の手順で調製する。まず、コレステロ一 ルとスフインゴミエリン（シグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ一州、米国）及び G Ml (和光純薬工業株式会社、大阪、日本)をクロ口ホルム Zメタノール混液 (1 : 1)〖こ 2:2 : 1の割合で 1モル濃度に溶解する。この混液を窒素ガスで 1時間乾燥し、 -40°Cで使 用時まで保存する。使用直前に乾燥した脂質混合物を GM1濃度が 2.5mMになるよう に TBSに再懸濁し、液体窒素を用いて 10回凍結溶解を行う。この脂質懸濁液を 13,00 Orpmで 15分間遠心し (MX- 160、 TOMY、東京、日本）、沈渣を再度 GM1が同濃度に なるよう TBSに再懸濁する。最後にこの懸濁液を氷上で 5分間マイクロチップ (TP-030 、 TOMY、東京、日本）を備えた超音波破砕機（UD- 201、出力レベル 2、 TOMY、東 京、 日本)を用いて超音波処理し、これを 3回繰り返す。
[0034] 2-3.阻害効果の評価
(1)被験抗体の存在下 (試験群)又は非存在下 (対照群）において、 GM1ガンダリオシ ドを含む合成脂質と A |8溶液とを混合し、 37°Cでインキュベーションする。
(2) Thioflavin Tを用いた A j8の線維形成測定を、 Naiki H and Gejyo F(1999) Methods Enzymol 309, 305-318に従って行う。まず、インキュベーション開始から所定時間経 過後（例えば 20時間）の溶液の一部（5 μ 1)をサンプリングし、これに終濃度 5 μ Μと なるように Thioflavin T (Sigma)を添加する。 1mlの 50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝 液で希釈した後、 A β線維の蛍光強度 (励起波長 446nm、蛍光波長 490nm)を分光蛍 光光度計 (例えば RF-5300PC、島津製作所)で測定する。
(3)以下の計算式で被験抗体の阻害効果 (阻害活性)を求める。
阻害効果 (％) = (対照群の蛍光強度 試験群の蛍光強度) Z対照群の蛍光強度 X 100
尚、 GM1ガンダリオシドを含む脂質膜は通常、ポリスチレン榭脂、ポリカーボネート 榭脂、シリコン榭脂、ナイロン榭脂等の榭脂ゃガラス等力もなるビーズ、マイクロプレ ート等の不溶性支持体に結合した状態で使用される。
[0035] 3. Α β重合阻害試験 2 (GA β 42から開始される Α β 42の重合に対する阻害効果） 合成 Α β に代えて合成 Α β (例えば、 Amyloid β - Protein (Human, 1-42)、コ
1-40 1-42
ード 4349-v、ペプチド研究所、大阪)を使用して上記 1-1.の手順に従い A |8溶液を調 製する。一方、上記 2-2.と同様の手順で GM1ガンダリオシドを含む合成脂質を調製 する。これら二つの溶液を用いて、上記 2-3.と同様の手順で阻害効果を評価する。
[0036] 以下の実施例に示すように、本発明者らはアミロイド線維形成に対する阻害活性の 高い 4種類の抗体（1C9抗体、 2E12抗体、 3G11抗体、 4E11抗体）を取得することに成 功した。各抗体の可変領域の配列を解析した結果、以下の配列情報が得られた。尚 、抗体名に続けて、重鎖可変領域のアミノ酸配列；重鎖 CDR1のアミノ酸配列；重鎖 C DR2のアミノ酸配列、重鎖 CDR3のアミノ酸配列；軽鎖可変領域のアミノ酸配列；軽鎖 CDR1のアミノ酸配列；軽鎖 CDR2のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3のアミノ酸配列の順で 記載する。
[0037] (1)1C9抗体
配列番号： 1(VH)；配列番号： 2(VH CDR1)；配列番号： 3(VH CDR2)；配列番号： 4( VH CDR3)；配列番号： 5(VL) ;配列番号： 6(VL CDR1) ;配列番号： 7(VL CDR2)；配 列番号： 8(VL CDR3)
[0038] (2)2E12抗体
配列番号： 9(VH)；配列番号： 10(VH CDR1)；配列番号： 11(VH CDR2)；配列番号 ： 12(VH CDR3)；配列番号： 13(VL) ;配列番号： 14(VL CDR1) ;配列番号： 15(VL C DR2)；配列番号： 16(VL CDR3)
[0039] (3)3G11抗体
配列番号： 17(VH) ;配列番号： 18(VH CDR1) ;配列番号： 19(VH CDR2)；配列番 号： 20(VH CDR3)；配列番号： 21(VL)；配列番号： 22(VL CDR1)；配列番号： 23(VL CDR2)；配列番号： 24(VL CDR3)
[0040] (4)4E11抗体
配列番号： 25(VH) ;配列番号： 26(VH CDR1) ;配列番号： 27(VH CDR2)；配列番 号： 28(VH CDR3)；配列番号： 29(VL) ;配列番号： 30(VL CDR1) ;配列番号： 31(VL CDR2)；配列番号： 32(VL CDR3)
[0041] 本発明の抗体の可変領域は、本発明者らが取得に成功した A β重合阻害抗体の C DRの少なくとも一部又はそれと実質的に同一なアミノ酸配列を含む。尚、以下の説 明にお 、て特定のアミノ酸配列を記載したときには、それ自体のみを表すことが明か である場合を除いて、それは「当該特定のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一なァ ミノ酸」を意味する。例えば配列番号： 1のアミノ酸配列と記載した場合には通常、「配 列番号： 1のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一なアミノ酸」を意味する。
具体的には例えば、本発明の抗体の重鎖可変領域は以下の群、即ち (1)配列番号 : 2のアミノ酸配列、（2)配列番号： 3のアミノ酸配列、（3)配列番号: 4のアミノ酸配列、（4 )配列番号： 10のアミノ酸配列、（5)配列番号： 11のアミノ酸配列、（6)配列番号： 12の アミノ酸配列、（7)配列番号： 18のアミノ酸配列、（8)配列番号： 19のアミノ酸配列、（9) 配列番号： 20のアミノ酸配列、（10)配列番号： 26のアミノ酸配列、（11)配列番号： 27 のアミノ酸配列、及び (12)配列番号： 28のアミノ酸配列力 なる群より選択されるァミノ 酸配列を CDRの一部又は全部として少なくとも一つ含み（例えば CDR3として含む）、 好ましくは二つ含み (例えば CDR2及び CDR3として含む）、更に好ましくは三つ含む（ 即ち CDR1〜3として含む)。ここで上記 (1)、（4)、（7)及び (10)は、それが可変領域の C DRとして含まれる場合、 CDR1として含まれることが好ましい。同様に上記 (2)、（5)、 (8) 及び (11)は CDR2として含まれることが好ましぐ上記 (3)、（6)、（9)及び (12)は CDR3とし て含まれることが好ましい。
一方、本発明の抗体の軽鎖可変領域は以下の群、即ち (13)配列番号 : 6のアミノ酸 配列、（14)配列番号： 7のアミノ酸配列、（15)配列番号： 8のアミノ酸配列、（16)配列番 号： 14のアミノ酸配列、（17)配列番号： 15のアミノ酸配列、（18)配列番号： 16のァミノ 酸配列、（19)配列番号： 22のアミノ酸配列、（20)配列番号： 23のアミノ酸配列、（21)配 列番号： 24のアミノ酸配列、（22)配列番号： 30のアミノ酸配列、（23)配列番号： 31のァ ミノ酸配列、及び (24)配列番号： 32のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸 配列を CDRの一部又は全部として少なくとも一つ含み (例えば CDR3として含む）、好 ましくは二つ含み (例えば CDR2及び CDR3として含む）、更に好ましくは三つ含む (即 ち CDR1〜3として含む）。ここで上記 (13)、（16)、（19)及び (22)は、それが可変領域の C DRとして含まれる場合、 CDR1として含まれることが好ましい。同様に上記 (14)、（17)、 ( 20)及び (23)は CDR2として含まれることが好ましぐ上記 (15)、（18)、（21)及び (24)は CD R3として含まれることが好まし 、。
本発明の好ましい一形態の抗体では、重鎖可変領域の CDR1が上記 (1)、（4)、（7)及 び (10)のいずれかのアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域の CDR2が上記 (2)、（5)、（8)及 び (11)のいずれかのアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域の CDR3が上記 (3)、（6)、（9)及 び (12)のいずれかのアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の CDR1が上記 (13)、（16)、 (1 9)及び (22)のいずれかのアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の CDR2が上記 (14)、 (17) 、（20)及び (23)のいずれかのアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の CDR3が上記 (15)、 (18)、（21)及び (24)の 、ずれかのアミノ酸配列を有する。
[0043] 本発明の更に好ま 、一形態の抗体では重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の CDR 3が以下の (A)〜(D)の 、ずれかの組合せである。
(A)重鎖 CDR3：配列番号： 4のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3：配列番号： 8のアミノ酸配 列の組合せ
(B)重鎖 CDR3 :配列番号： 12のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3 :配列番号： 16のアミノ酸 配列の組合せ
(C)重鎖 CDR3：配列番号： 20のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3：配列番号： 24のアミノ酸 配列の組合せ
(D)重鎖 CDR3：配列番号： 28のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3：配列番号： 32のアミノ酸 配列の組合せ
これらは上から順に 1C9抗体、 2E12抗体、 3G11抗体、及び 4E11抗体における CDR 3の組合せであり、高い A 重合阻害活性を期待できる。
[0044] 本発明の一層好ましい一形態の抗体では重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の CD R2と CDR3が以下の (E)〜(； H)のいずれかの組合せである。
(E)重鎖 CDR2：配列番号： 3のアミノ酸配列、重鎖 CDR3：配列番号： 4のアミノ酸配 列、軽鎖 CDR2 :配列番号： 7のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3 :配列番号： 8のアミノ酸配列 の組合せ
(F)重鎖 CDR2 :配列番号： 11のアミノ酸配列、重鎖 CDR3 :配列番号： 12のアミノ酸 配列、軽鎖 CDR2 :配列番号： 15のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3 :配列番号： 16のァミノ 酸配列の組合せ
(G)重鎖 CDR2 :配列番号： 19のアミノ酸配列、重鎖 CDR3 :配列番号： 20のアミノ酸 配列、軽鎖 CDR2 : 23のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3 :配列番号： 24のアミノ酸配列の組 合せ
(H)重鎖 CDR2：配列番号： 27のアミノ酸配列、重鎖 CDR3：配列番号： 28のアミノ酸 配列、軽鎖 CDR2 :配列番号： 31のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3 :配列番号： 32のァミノ 酸配列の組合せ
これらは上から順に 1C9抗体、 2E12抗体、 3G11抗体、及び 4E11抗体における CDR 2と CDR3の組合せであり、一層高い A |8重合阻害活性を期待できる。
[0045] 本発明の最も好ましい一形態の抗体では重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の CDR 1〜CDR3が以下の (I)〜(L)のいずれかの組合せである。
(I)重鎖 CDR1：配列番号： 2のアミノ酸配列、重鎖 CDR2：配列番号： 3のアミノ酸配列 、重鎖 CDR3：配列番号： 4のアミノ酸配列、軽鎖 CDR1：配列番号： 6のアミノ酸配列、 軽鎖 CDR2：配列番号： 7のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3：配列番号： 8のアミノ酸配列の 組合せ
0)重鎖 CDR1：配列番号： 10のアミノ酸配列、重鎖 CDR2 :配列番号： 11のアミノ酸 配列、重鎖 CDR3 :配列番号： 12のアミノ酸配列、軽鎖 CDR1：配列番号： 14のァミノ 酸配列、軽鎖 CDR2 :配列番号： 15のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3 :配列番号： 16のアミ ノ酸配列の組合せ
(K)重鎖 CDR1：配列番号： 18のアミノ酸配列、重鎖 CDR2 :配列番号： 19のアミノ酸 配列、重鎖 CDR3 :配列番号： 20のアミノ酸配列、軽鎖 CDR1 :配列番号： 22のァミノ 酸配列、軽鎖 CDR2：配列番号： 23のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3：配列番号： 24のアミ ノ酸配列の組合せ
(L)重鎖 CDR1：配列番号： 26のアミノ酸配列、重鎖 CDR2：配列番号： 27のアミノ酸 配列、重鎖 CDR3 :配列番号： 28のアミノ酸配列、軽鎖 CDR1 :配列番号： 30のァミノ 酸配列、軽鎖 CDR2 :配列番号： 31のアミノ酸配列、軽鎖 CDR3 :配列番号： 32のアミ ノ酸配列の組合せ
これらは上から順に 1C9抗体、 2E12抗体、 3G11抗体、及び 4E11抗体における CDR 1〜CDR3の組合せであり、より一層高い A |8重合阻害活性を期待できる。
[0046] 可変領域の相補性決定領域 (CDR)以外の部分は CDRの構造を保持するための「 フレームワーク」と呼ばれる。本発明の抗体の可変領域においてフレームワーク領域 (FR領域)の配列は、 A j8重合阻害活性に実質的な影響のない限り、特に限定され ない。例えば、 1C9抗体、 2E12抗体、 3G11抗体、又は 4E11抗体の FR領域又はその 一部を改変したアミノ酸配列を本発明の抗体の FR領域として採用することができる。 後述のように本発明の抗体をヒト化抗体として構築する場合には、公知のヒト抗体の F R領域を用いることができる。また、検出用の試薬として使用される抗体又はヒト以外 の動物種への適用に使用される抗体を構築する場合など、ヒト抗体 FR領域を使用し なくとも期待される効果が奏される場合ゃヒト抗体 FR領域を使用することがむしろ適 当でない場合がある。このような場合には、ヒト以外の動物種 (例えばマウスゃラット） の FR領域を用いることができる。
[0047] 本発明の抗体は一態様において、可変領域に加えて定常領域を含む (例えば IgG 型抗体の場合など)。当該態様における定常領域の配列は特に限定されない。例え ば、後述のように本発明の抗体をヒト化抗体として構築する場合には、公知のヒト抗 体の定常領域を用いることができる。また、上記定常領域と同様に、ヒト以外の動物 種 (例えばマウスゃラット）の定常領域を用いることもできる。以上のアミノ酸配列又は その一部を改変したアミノ酸配列である。
[0048] 本発明の抗体の一形態はヒト化抗体である。ここでの「ヒト化抗体」とは、ヒトの抗体 に構造を類似させた抗体のことをいい、抗体の定常領域のみをヒト抗体のものに置換 したヒト型キメラ抗体、及び定常領域及び可変領域に存在する CDR (相補性決定領 域)以外の部分をヒト抗体のものに置換したヒト型 CDR移植 (CDR-grafted)抗体 (P.T. Johons et al., Nature 321,522(1986))を含む。ヒト型 CDR移植抗体の抗原結合活性を 高めるため、マウス抗体と相同性の高いヒト抗体 FRを選択する方法、相同性の高いヒ ト型化抗体を作製する方法、ヒト抗体にマウス CDRを移植した後さらに FR領域のアミ ノ酸を置換する方法の改良技術もすでに開発され (米国特許第 5585089号、米国特 許第 5693761号、米国特許第 5693762号、米国特許第 6180370号、欧州特許第 4512 16号、欧州特許第 682040号、特許第 2828340号などを参照）、本発明のヒト型抗体の 作製に利用することもできる。
ヒト型キメラ抗体は例えば、上記の H鎖可変領域の構造及び Z又は L鎖可変領域の 構造を有する抗体 (例えば 1C9抗体、 2E12抗体、 3G11抗体又は 4E11抗体)の定常領 域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト抗体の定常 領域としては公知のものを採用することができる。以下に、ヒト型キメラ抗体の作製方 法の一例を示す。
まず、マウス A |8重合阻害抗体を産生するハイプリドーマより mRNAを抽出し、常法 に従って cDNAを合成する。合成した cDNAをベクターに組み込み cDNAライブラリー を構築する。この cDNAライブラリーから、 H鎖遺伝子フラグメント及び L鎖遺伝子フラ グメントをプローブとして用いることにより、 H鎖遺伝子及び L鎖遺伝子を含有するべク ターを選択する。選択されたベクターの挿入配列のシークェンシングを行うことにより 、 H鎖可変領域及び L鎖可変領域の遺伝子の配列が決定される。このようにして得ら れた配列データを基に H鎖可変領域をコードする DNAを化学合成、生化学的切断 Z 再結合等により作製する。得られた H鎖可変領域をコードする DNAを、ヒト H鎖定常領 域をコードする DNAとライゲーシヨンして発現用ベクターに組込むことにより H鎖発現 ベクターを作製する。発現ベクターとしては例えば SV40 virus basedベクター、 EB vir us basedベクター、 BPV (パピローマウイノレス） basedベクターなどを用いることができる が、これらに限定されるものではない。一方、同様の方法により L鎖発現ベクターを作 製する。これら H鎖発現ベクター及び L鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換 する。宿主細胞としては CHO細胞 (チャイニーズノヽムスター卵巣 )(A.Wright& S丄. Mor rison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998》、 SP2/0細胞 (マウスミエローマ) (K.Motmans et al" Eur.J.Cancer Prev.5,512 - 519 (1996),R.P.Junghans et al, Cancer Res.50,1495 -1502 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフエクチン法 (R.W.M alone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P丄. Feigner et al.,Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法 (F丄. Graha m & A.J.van der Eb.Virology 52,456-467(1973》、 DEAE- Dextran法等が好適に用い られる。
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型キメラ抗体を 分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、了フィニ ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーな どの方法を適宜組み合わせて利用することができる。 [0049] 一方、ヒト型 CDR移植抗体は例えば以下の方法により作製することができる。まず、 上記キメラ抗体の製造方法の欄で述べた方法により、マウス A 重合抗体の H鎖可 変領域及び L鎖可変領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を決定する 。併せて各 CDR領域のアミノ酸配列及び塩基配列を決定する。
具体的な CDRの塩基配列として例えば以下の塩基配列を用いることができる。
H鎖 CDR1 (VH CDR1)：配列番号： 34、 42、 50、及び 58のいずれかの塩基配列 H鎖 CDR2 (VH CDR2)：配列番号： 35、 43、 51、及び 59のいずれかの塩基配列 H鎖 CDR3 (VH CDR3)：配列番号： 36、 44、 52、及び 60のいずれかの塩基配列 L鎖 CDR1 (VL CDR1)：配列番号： 38、 46、 54、及び 62のいずれかの塩基配列 L鎖 CDR2 (VL CDR2)：配列番号： 39、 47、 55、及び 63のいずれかの塩基配列 L鎖 CDR3 (VL CDR3)：配列番号： 40、 48、 56、及び 64のいずれかの塩基配列
[0050] CDRの塩基配列として、以下の 、ずれかの組合せを用いることが好まし 、。
(1) VH CDR1 :配列番号： 34の塩基配列、 VH CDR2 :配列番号： 35の塩基配列、 V H CDR3 :配列番号： 36の塩基配列、 VL CDR1：配列番号： 38の塩基配列、 VL CDR 2 :配列番号： 39の塩基配列、及び VL CDR3 :配列番号: 40の塩基配列の組合せ
(2) VH CDR1 :配列番号： 42の塩基配列、 VH CDR2 :配列番号： 43の塩基配列、 V H CDR3 :配列番号： 44の塩基配列、 VL CDR1：配列番号： 46の塩基配列、 VL CDR 2 :配列番号: 47の塩基配列、及び VL CDR3 :配列番号: 48の塩基配列の組合せ
(3) VH CDR1 :配列番号： 50の塩基配列、 VH CDR2 :配列番号： 51の塩基配列、 V H CDR3 :配列番号： 52の塩基配列、 VL CDR1：配列番号： 54の塩基配列、 VL CDR 2：配列番号： 55の塩基配列、及び VL CDR3：配列番号： 56の塩基配列の組合せ
(4) VH CDR1：配列番号： 58の塩基配列、 VH CDR2：配列番号： 59の塩基配列、 V H CDR3 :配列番号： 60の塩基配列、 VL CDR1：配列番号： 62の塩基配列、 VL CDR 2：配列番号： 63の塩基配列、及び VL CDR3：配列番号： 64の塩基配列の組合せ 尚、これらは上から順に 1C9抗体、 2E12抗体、 3G11抗体、及び 4E11抗体における 各 CDRの組合せに相当する。
[0051] 次に、 CDR領域を挟んで存在する FR (フレームワーク領域)を選択する。 FRの選択 には、およそ三つの方法が採用できる。 1つめの方法は、 NEWM、 REIなど既に三次 元構造の明ら力となったヒト抗体フレームを用いる方法である（Riechmann L. et al., N ature 332, 323— 3Z7 (1988); Tempst, PR. et al., Protein Engineering 7, 1501—1507 ( 1994); Ellis JH. etal, J. Immunol 155, 925-937 (1995))。 2つめの方法は、目的のマ ウス抗体可変領域と最も高いホモロジ一を持つヒト抗体可変領域をデータベースより 選択し、その FRを用いる方法である（Queen C. et al., Proc Natl Acad SciUSA 86, 10 029-10033 (1989); Rozak MJ. et al., J Biol Chem 271, 22611-22618 (1996); Shearm an CW. et al., J.Immunol 147, 4366-4373 (1991))。 3つめの方法は、ヒト抗体の FRで 最も共通に用いられるアミノ酸を選択する方法である（Sato K. et al., Mol Immunol 31 , 371-381 (1994); Kobinger F. et al., Protein Engineering 6, 971—980 (1993); Kettle borough CA. et al., Protein Engineering 4, 773-783 (1991))。本発明ではこれらいず れの方法を用いることもできる。
尚、選択されたヒト FRのアミノ酸配列を改変したアミノ酸配列であっても、最終的に 得られるヒト型 CDR移植抗体が A |8線維の形成を効果的に阻害する限り、 FRのァミノ 酸配列として利用することができる。特に、選択されたヒト FRのアミノ酸の一部を CDR の由来となった抗体の FRのアミノ酸に変更した場合、抗体の特性が維持される可能 性が高い。改変されるアミノ酸の数は好ましくは FR全体の 30%以下であり、更に好ま しくは FR全体の 20%以下であり、更に更に好ましくは FR全体の 10%以下である。 次に、これらいずれかの方法により選択した FRと上記 CDRとを組み合わせることに より H鎖可変領域及び L鎖可変領域をコードする DNAを設計する。この設計を基に H 鎖可変領域をコードする DNAと L鎖可変領域をコードする DNAをィ匕学合成、生化学 的切断 Z再結合等によりそれぞれ作製する。そして H鎖可変領域をコードする DNA を、ヒト免疫グロブリン H鎖定常領域をコードする DNAとともに発現ベクターに組み込 み H鎖発現ベクターを構築する。同様に、 L鎖可変領域をコードする DNAを、ヒト免疫 グロブリン L鎖定常領域をコードする DNAとともに発現ベクターに組み込み L鎖発現 ベクターを構築する。発現ベクターとしては例えば SV40 virus basedベクター、 EB vir us basedベクター、 BPV (パピローマウイノレス） basedベクターなどを用いることができる 力 これらに限定されるものではない。
以上の方法で作製された H鎖発現ベクター及び L鎖発現ベクターにより宿主細胞を 共形質転換する。宿主細胞としては CHO細胞 (チャイニーズノヽムスター卵巣 XA.Wrig ht& S丄. Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、 SP2/0細胞 (マウスミエローマ） (K.Motmans et al., Eur.J. Cancer Prev.5,512- 519 (1996),R.P.Junghans et al., Cancer Res.50,1495-1502 (1990》などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフエクチ ン法 (R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P丄. Feigner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム 法 (F丄. Graham & A.J.van der Eb.Virology 52,456-467(1973》、 DEAE- Dextran法等 が好適に用いられる。
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型 CDR移植抗 体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、ァフ ィ-ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィ 一などの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基に して抗体断片を作製することができる。抗体断片としては Fab、 Fab'、 F(ab')、 scFv、 ds
2
Fv抗体が挙げられる。
Fabは、 IgGをシスティン存在下パパイン消化することにより得られる、 L鎖と H鎖可変 領域、並びに C 1ドメイン及びヒンジ部の一部力もなる H鎖フラグメントとから構成され
H
る分子量約 5万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより 得ることができる。また、上記抗体の H鎖の一部及び L鎖をコードする DNAを適当なベ クタ一に組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体より Fabを調製す ることちでさる。
Fab'は、後述の F(ab')の H鎖間のジスルフイド結合を切断することにより得られる分
2
子量が約 5万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用 いてジスルフイド結合を切断することにより得られる。また、 Fab同様に、 Fab'をコード する DNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
F(ab')は、 IgGをペプシン消化することにより得られる、 L鎖と H鎖可変領域、並びに
2
C 1ドメイン及びヒンジ部の一部力もなる H鎖フラグメントとから構成される断片 (Fab')
H
がジスルフイド結合で結合した分子量約 10万の断片である。本発明では、上記抗体 をペプシン消化することにより得られる。また、 Fab同様に、 F(ab')をコードする DNAを
2
用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
scFvは、 H鎖可変領域と L鎖可変領域とからなる Fvを、片方の鎖の C末端と他方の N 末端とを適当なペプチドリンカ一で連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリ ンカーとしては例えば柔軟性の高い（GGGGS)などを用いることができる。例えば、
3
上記抗体の H鎖可変領域及び L鎖可変領域をコードする DNAとペプチドリンカーをコ ードする DNAを用いて scFv抗体をコードする DNAを構築し、これを適当なベクターに 組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体より scFvを調製すること ができる。
dsFvは、 H鎖可変領域及び L鎖可変領域の適切な位置に Cys残基を導入し、 H鎖 可変領域と L鎖可変領域とをジスルフイド結合により安定化させた Fv断片である。各 鎖における Cys残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づ き決定することができる。本発明では例えば上記抗体の H鎖可変領域及び L鎖可変 領域のアミノ酸配列力 立体構造を予測し、力かる予測に基づき変異を導入した H鎖 可変領域及び L鎖可変領域をそれぞれコードする DNAを構築し、これを適当なベクタ 一に組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体より dsFvを調 製することができる。
尚、適当なリンカ一を用いて scFv抗体、 dcFv抗体などを連結させたり、ストレプトァ ビジンを融合させたりして抗体断片を多量体ィ匕することもできる。
本発明の抗体 (抗体断片を含む）に低分子化合物、タンパク質、標識物質などを融 合又は結合させることにより、融合抗体又は標識ィ匕抗体を構成することができる。標 識物質としては1251等の放射性物質、ペルォキシダーゼ、 /3 D ガラクトシダーゼ、 マイクロペルォキシダーゼ、ホースラディッシュペルォキシダーゼ（HRP)、フルォレセ インイソチオシァネート（FITC)、ローダミンイソチオシァネート（RITC)、アルカリホスフ ァターゼ、ピオチンなどを用いることができる。
本発明の抗体 (抗体断片を含む）はアミロイド線維の形成を効果的に抑制すること ができるため、アルツハイマー病の診断、予防、治療等に有用である。即ち、本発明 の抗体を用いてアルツハイマー病の診断、予防、又は治療を行うことができると考え られる。換言すれば、本発明の抗体を用いることによりアルツハイマー病の診断方法 、予防方法、及び治療方法が提供される。また、本発明の抗体を用いてアルッハイマ 一病に対する薬剤 (診断薬、予防薬、又は治療薬)を構成し得る。ここで、ヒト化した 本発明の抗体を用いれば、ヒトに投与した場合であってもヒトタンパク質と認識される ため循環器系から排除されにくぐまたアレルギー反応もおこり難いので、好適な診 断薬等として用いることができると考えられる。
本発明者らの検討の結果、上記の A j8重合阻害試験に使用される脂質膜 (GM1を 含む脂質膜)力 β重合阻害抗体を得るための抗原として有効であることが判明した 。この知見に基づいて本発明のさらなる局面は、
GM1ガンダリオシドと、その他の脂質と、及び該 GM1ガンダリオシドに結合したアミ口 イド ι8タンパク質 (Α |8 )とを含有し、成分比率 (分子比）が、その他の脂質: GM1ガン ダリオシド = 90 : 10〜60： 40の範囲である、動物免疫用の合成脂質膜を提供する。 本発明の合成脂質膜は典型的には 3成分、即ち、 GM1ガンダリオシド、その他の脂 質、及びアミロイド |8タンパク質からなり、本発明の合成脂質膜の典型的な態様の成 分比率は、その他の成分 (但し、アミロイド j8タンパク質の量は含まない）： GM1ガング リオシド = 90： 10〜60： 40の範囲となる。
本明細書において「脂質」は、特に記載のない限り、単純脂質、複合脂質 (例えば スフインゴミエリン、ガンダリオシド）、及び誘導脂質 (例えばコレステロール)を包括的 に表す用語として使用される。
本発明の合成脂質膜は、 A j8重合阻害抗体を作製するための抗原として用いられ 、特に、抗 GA |8抗体を効率的に作製するための抗原として用いることができる。本発 明の合成脂質膜による免疫に使用される動物は特に限定されず例えばマウス、ラット 、ゥサギ、ヒッジ、ャギなどを用いることができる。免疫方法も特に限定されず、静脈注 射、腹腔内注射、フットパッドへの注射などを採用できる。
本発明の好ましい一形態では、合成脂質膜の成分比率 (分子比）が、その他の脂 質： GM1ガンダリオシド = 85 : 15〜70 : 30の範囲である。更に好ましい一形態では、 合成脂質膜の成分比率 (分子比）が、その他の脂質： GM1ガンダリオシド =約 80： 20 である。 GM1ガンダリオシドの含有量がこの範囲内の合成脂質膜は一層良好な A β 重合開始活性を有し、それを用いれば A j8重合阻害活性の高い抗体を一層効率的 に作製することが可能となる。
本発明の合成脂質膜の構成成分の一つである脂質成分としてはスフインゴミエリン が好適に使用される。
本発明の合成脂質膜の好ましい一態様は脂質成分の一つとしてコレステロールを 含有する。コレステロールにより膜上の GM1「クラスター」の形成が促され、これにより A と GM1との結合を促進することを期待できる。また、かかる合成脂質膜の構成は アミロイド線維が形成される脳内の神経細胞膜のそれに近 、ことから、アミロイド線維 の形成をより有効に阻害する抗体の産生を促す抗原となる。
この態様での合成脂質膜の成分比率 (分子比）は例えば、残りの脂質:コレステロ一 ル： GM1ガンダリオシド =80〜20： 10〜40： 10〜40である。後述の実施例に示され るように、当該成分比率の合成脂質膜を用いることによって効率的に A 重合阻害抗 体を作製できる。合成脂質膜の成分比率 (分子比)が残りの脂質:コレステロール: G \11ガングリォシド= 70〜50 : 10〜20 : 20〜30でぁることが好ましぃ。この成分比率 の合成脂質膜は一層良好な A β重合開始活性を有し、それを用いれば Α β重合阻 害活性の高い抗体を一層効率的に作製することが可能となる。
好ましい合成脂質膜の具体例として、成分比率 (分子比）力 Sスフインゴミエリン (残り の脂質に相当する）：コレステロール： GM1ガンダリオシド =64 : 16 : 20のものを挙げ ることがでさる。
GM1としては例えば市販のもの（和光純薬工業株式会社、大阪、日本が提供するも の等）を使用することができる。 Α としては、例えば、市販の Α β (Amyloid β - Pro
1-40
tein (Human, 1-40)コード 4307- v Lot.501001、ペプチド研究所、大阪、 日本、 Lot.51 9599、 Bachem AG、スイスなど）、 A β (Amyloid β - Protein (Human, 1— 42)、コー
1-42
ド 4349-v、ペプチド研究所、大阪)などを使用することができる。
本発明の合成脂質膜は、 A 以外の構成成分を含む脂質膜に A を接触させるこ とによって調製することができる (調製方法の詳細については後述の実施例を参照さ れたい)。脂質膜と A j8との接触は短時間行われることが好ましぐ更に好ましくは両 者を瞬間的に接触させる。長時間の反応によれば、 A |8線維形成が過度に進行して しまうためである。尚、本発明の合成脂質膜は通常、溶液内でリボソーム状に調製さ れる。
[0057] 本発明の合成脂質膜を用いた A β重合阻害抗体の作製は免疫学的手法、抗体ラ イブラリーを用いたファージディスプレイ法やリボソームディスプレイ法等を利用して 行われる。
免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗 原 (上記合成脂質膜)を調製し、これをマウス、ラット、ゥサギ、ャギ等の非ヒト動物に 免疫する。低分子量のために有効な免疫惹起作用を期待できない場合には、キヤリ ァタンパク質を結合させた抗原を用いることが好まし ヽ。キャリアタンパク質としては Κ LM (Keyhole Lignt Hemocyanin 、 BSA (Bovine Serum Albumin)、 OVA (Ovalbumin) などが使用される。また、キャリアタンパク質の結合にはカルポジイミド法、ダルタルァ ルデヒド法、ジァゾ縮合法、 MBS (マレイミドベンゾィルォキシコハク酸イミド)法などを 使用できる。
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理 などによって血清を得る。得られた抗血清から抗体を分離する。目的の抗体の分離 には、抗原として用いた合成脂質膜を利用することができる。具体的にはまず、抗血 清と合成脂質膜とを接触させる。その結果、合成脂質膜に結合する成分を分離し、 目的の抗体を得る。以上の分離ステップに加えて、分離された抗体とモノマーアミ口 イド j8タンパク質とを接触させ、モノマーアミロイド /3タンパク質に結合性を有しない 抗体を選抜するステップを実施することが好まし。このステップを実施することにより、 モノマーアミロイド βタンパク質を認識せず、 GA β複合体のみを認識する抗体が得ら れる。即ち、 GA |8複合体に対して特異性の高い抗体を得ることが可能となる。かかる 抗体はその特異性の高さ故に、 GA |8複合体をターゲットとした用途に好適なものと なる。また、それを基に、 GA |8複合体に対する特異性が高ぐ従ってアルツハイマー 病の予防、治療、及び診断等において優れた効果を奏するヒト化抗体乃至ヒト型抗 体を構築することができる。
[0058] 一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず上記 と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価 が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生 細胞と骨髄腫細胞とを融合してノ、イブリドーマを得る。続いて、このハイプリドーマを モノクローナル化した後、本発明の合成脂質膜に対して高 1ヽ特異性を有する抗体を 産生するクローンを選抜する。具体的には、ハイプリドーマの培養上清を合成脂質膜 に接触させることによって、培養上清中に合成脂質膜に結合性を有する抗体が存在 するか否かを調べ、存在が確認されたノヽイブリドーマクローンを選抜する。この選抜 ステップにおいて、モノマーアミロイド |8タンパク質に結合性を有する抗体を産生する クローンを排除することが好ましい。即ち、合成脂質膜に結合性を有し且つモノマー アミロイド βタンパク質に結合性を有しない抗体を産生するハイプリドーマを選抜する ことが好ましい。モノマーアミロイド j8タンパク質を認識せず、 GA |8複合体のみを認 識する抗体を産生するクローンが得られるからである。尚、合成脂質膜と結合性を有 する抗体を産生するノ、イブリドーマクローンをまず選抜し、その後モノクローナルィ匕を 実施してちょい。
次に、選抜されたクローンの培養液から目的の抗体を分離する。一方、選抜された クローン (ハイプリドーマ）を非ヒト動物（例えばマウス）の腹腔内に移植して腹水内で 増殖させ、そして腹水から目的の抗体を分離することもできる。
ノ、イブリドーマの培養液又は腹水力 の抗体の分離には、プロテイン G、プロテイン A等を用いたァフィユティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相 化したァフィユティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロ マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用 いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。尚、 抗体の作製方法に関して Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495- 497;Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980—83;
Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75; Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72; Kenneth, R.H. in Mo noclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Co rp., New York, New York (1980); Lerner, E.A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402 ； Gefter, M.L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231- 36等を参照することができる ファージディスプレイ法とは、 M13などの線維状ファージのコードタンパク質（cp3、 cp 8)との融合タンパク質として外来遺伝子を発現させるシステムである。ファージデイス プレイ法では、異なるタンパク質又はペプチドの混合物の遺伝子をファージ DNAに 組みことによって、 106〜1012程度のファージライブラリーが構築される。いくつかのフ ァージ抗体ライブラリーが商業的又は非商業的に提供されており（例えば Hucal GO LD (MorphoSys社）、 Griffin.1 library: Griffiths, AD et al. EMBO J.13: 3245-3260 (19 94) "Nissim Library" (Nissim, A et al. EMBO J.13::692-698)、これらの中から適当 なものを選択して用いることができる。
ファージライブラリ一力もの特定ファージの選択はパン-ングと呼ばれる操作によつ て行われる。パンユングは、典型的には、標的タンパク質とファージライブラリーとの 反応 (接触）、非結合ファージの除去 (洗浄)、結合ファージの溶出、及び回収された ファージの大腸菌への感染 (ファージの増殖)の一連のステップ力も構成される。パン ユングによって、標的タンパク質に結合性を有するタンパク質を提示するファージが 濃縮される。通常、十分な濃縮が確認されるまでパンユングが繰り返される。このよう にして選別'濃縮されたファージを適当な宿主細胞に感染させることによって、当該 ファージが提示して 、たタンパク質 (ペプチド)を可溶性分子として発現させることが できる。または、選別'濃縮されたファージカも外来遺伝子を切り出し、回収された外 来遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、そして適当な発現系を利用して当該外 来遺伝子を発現させることによって、提示されていたタンパク質 (ペプチド)を可溶性 に得てもよい。発現産物の回収は、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、了フィニ ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーな どの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
ファージディスプレイ法に関しては種々の文献、例えば Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Fuchs et al. (1991) B io/Technology 9: 1370—1372; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:797 8-7982; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133—4137; Gram et al. (1 992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hy bridomas 3:81-85; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; PCT国際公開第 WO 90/02809号； PCT国際公開第 WO 92/20791号； PCT国際公開第 WO 92/15679号； PCT国際公開第 WO 92/09690号等を参照することができる。また、ファージデイス プレイライブラリの作製及びスクリーニング用のキットが市販されており、それらを好適 に利用することができる。
[0060] リボソームディスプレイ法とは、終止コドンを変異させることによって铸型 DNAの転写 産物と翻訳産物とをリボソームに結合させた状態とし、このようにして得られたタンパク 質 ZmRNAZリボソーム複合体 (ARM)を用いて、例えばターゲットに対するスクリー ニングなどを行う方法を ヽぅ。リボソームディスプレイを抗体ライブラリーの製造に適用 した例が米国特許第 5,643,768号、及び同第 5,658,754号に開示されている。
[0061] ファージディスプレイ法やリボソームディスプレイ法などの遺伝子工学的手法を用い て抗体を調製する場合には例えば、抗原を動物に免疫した後、免疫系細胞より mRN Aや DNAを取り出して PCR、 RT-PCR等の遺伝子増幅法によって抗原結合ドメインを 含む抗体遺伝子を取得し、これを用いてファージディスプレイライブリー等の抗体ライ ブラリーを構築する。次に、このようにして構築された抗体ライブラリーの中から抗原（ 合成脂質膜)に特異的結合性を有するクローンを選択する。即ち、抗体ライブラリーと 本発明の合成脂質膜を接触させ、合成脂質膜に結合性を示すクローンを選抜する。 この方法においても、モノマーアミロイド j8タンパク質に結合性を有するクローンを排 除することが好ましい。 GA |8複合体のみに結合性を有する、特異性の高い抗体を得 ることがでさるカゝらである。
尚、特異的結合性分子を有する（又は発現する）クローンを含む限りにおいて、ポリ クローン、オリゴクローン、及びモノクローンのいずれの状態であってもよい。 目的のク ローンが選択されたら、それが提示する抗体を上記の手順で分離する。
[0062] 本発明のさらなる局面は、本発明の抗体、即ち A 線維の形成を阻害する抗体 (A β重合阻害抗体)又は抗体断片をコードする DNAに関する。当該局面では、 Α |8線 維形成に対する阻害活性を有するヒト型キメラ抗体、ヒト型 CDR移植抗体をコードす る DNA、及びヒト型抗体断片をコードする DNAも提供される。また、これらの抗体又は 抗体断片の H鎖又は L鎖をコードする DNAも本発明の一つである。更に、これらの抗 体又は抗体断片の H鎖可変領域又は L鎖可変領域をコードする DNAも本発明の一 つである。この場合において、シグナル部分を除いて構成される DNAであってもよい 。具体的な H鎖可変領域の DNA配列として配列番号： 33、 41、 49、又は 57に示すも のを例示できる。同様に L鎖可変領域の DNA配列として配列番号： 37、 45、 53、又 は 61に示すものを例示できる。
[0063] 更には、 A β重合阻害抗体の可変領域 CDRをコードする核酸の配列も本発明の一 つである。具体例として、配列番号： 2〜4、 6〜8、 10〜12、 14〜16、 18〜20、 22 〜24、 26〜28、及び 30〜32のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列（例 えば配列番号： 34〜36、 38〜40、 42~44, 46~48, 50〜52、 54~56, 58~60 、及び 62〜64のいずれかの塩基配列）を挙げることができる。以上の核酸は生化学 的手法、遺伝子工学的手法などを適宜用いて調製することができ、 A β重合阻害抗 体 (又は抗体断片)の作製等に利用することができる。
本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、 標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いること によって、単離された状態に調製することができる。例えば、その相補配列の全体又 は一部をプローブとしたハイブリダィゼーシヨン法を利用して特定の核酸を単離する ことができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダィズするようにデザィ ンされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応 (例えば PCR)を利 用して増幅及び単離することができる。尚、オリゴヌクレオチドプライマーは一般に、 市販の自動化 DNA合成装置などを用いて容易に合成することができる。
[0064] 本発明のさらに他の局面は、本発明の核酸を含有するベクターに関する。本明細 書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと 輸送することができる核酸性分子をいい、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファー ジベクター、ウィルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、 レトロウイノレスベタター、へノレぺスゥイノレスベクター等）を含む。
使用目的 (クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮 して適当なベクターが選択される。例えば大腸菌を宿主とするベクター (M13ファージ 又はその改変体、 λファージ又はその改変体、 pBR322又はその改変体（ρΒ325、 ρΑ T153、 pUC8など）など）、酵母を宿主とするベクター（pYepSecl、 pMFa、 pYES2等、昆 虫細胞を宿主とするベクター (pAc、 pVLなど）、哺乳類細胞を宿主とするベクター (pC DM8、 pMT2PCなど)を用いることができる。
[0065] 本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿 入された核酸を目的の細胞 (宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内に おいて発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核 酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるェンノヽンサ一配列等を含 む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクター を用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無 (及びその程 度）を確認することができる。
本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入 (必要な場合）、 プロモーターの挿入 (必要な場合)等は標準的な組換え DNA技術 (例えば、 Molecula r Cloning, Third Edition, 1.84, し old Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参 照することができる、制限酵素及び DNAリガーゼを用いた周知の方法)を用いて行う ことができる。
具体的には例えば、本発明の核酸を発現ベクターに組み込み、これを用いて宿主 細胞を形質転換することができる。また、本発明の核酸の中で抗体 H鎖 (又は H鎖可 変領域)をコードする核酸を一のベクターに組み込み、他方、抗体 L鎖 (又は L可変領 域)をコードする核酸を他のベクターに組み込み、得られた二つの発現ベクターで宿 主細胞を共形質転換させることもできる。さらには、本発明の核酸の中で抗体 H鎖（ 又は H鎖可変領域)をコードする核酸及び抗体 L鎖 (又は L鎖可変領域)をコードする DNAを一のベクターに組み込み、これを用いて宿主細胞を形質転換することもできる
[0066] 宿主細胞としてはヒト、サル、マウス、ラット等の哺乳類細胞 (COS細胞、 CHO細胞 など）、大腸菌などの細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞等を挙げることができる。
[0067] 本発明の他の局面は、本発明の核酸が導入された宿主細胞 (即ち形質転換体）に 関する。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトラン スフエクシヨン乃至はトランスフォーメーションによって得られる。トランスフエクシヨン等 はリン酸カルシウム共沈降法、エレクト口ポーレーシヨン (Potter,H. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161—7165(1984》、リポフエクシヨン (Feigner, P.L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション (Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366— 370(1976))等によって実 施することができる。
本発明の形質転換体は、本発明の抗体又は抗体断片を生産することに利用するこ とができる。即ち、本発明の他の局面は、上記形質転換体を用いた、本発明の抗体 等の生産方法を提供する。本発明の生産方法は、本発明の抗体等が産生される条 件下で上記形質転換体を培養するステップを少なくとも含む。通常はこのステップに 加えて、産生された抗体等を回収 (分離及び精製)するステップが実施される。形質 転換体の細胞内又は培養液中からの目的の抗体の回収は、遠心分離、硫安分画、 塩析、限外濾過、ァフィユティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ ルろ過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて実施することができる。 本発明の抗体等を生産する目的ではなぐ例えば特定の細胞内において本発明 の抗体等を発現させた場合の挙動を調べる目的や、特定の細胞内で本発明の抗体 等を発現させることによって当該細胞の状態を変化させる目的 (例えば治療目的)で 形質転換体を得ることもできる。また、トランスジヱニック動物 (ヒトを含まない)を作製 する目的で形質転換体を得ることもできる。即ち、本発明の形質転換体を非ヒトトラン スジエニック動物の作製に利用することも可能である。例えば、形質転換体として、本 発明のタンパク質等をコードする核酸を導入した受精卵母細胞又は胚性幹細胞を作 製し、これからトランスジエニック動物を発生させることができる。トランスジエニック動 物は、受精卵の前核に直接 DNAの注入を行うマイクロインジェクション法、レトロウイ ルスベクターを利用する方法、 ES細胞を利用する方法などを用いて作製することが できる。以下、トランスジエニック動物の作製方法の一例としてマイクロインジェクション 法を利用した方法を説明する。
マイクロインジェクション法ではまず、交尾が確認された雌マウスの卵管より受精卵 を採取し、そして培養した後にその前核に DNAコンストラクト (本発明のタンパク質等 をコードした DNA)の注入を行う。使用する DNAコンストラクトには導入遺伝子の効率 的な発現を可能とするプロモーター配列が含まれて 、ることが好まし 、。このようなプ 口モーターとしては例えばチキン j8—ァクチンプロモータ、プリオン蛋白プロモーター 、ヒト ARプロモーター、ニューロフィラメント L鎖プロモーター、 L7プロモーター、サイト メガロウィルスプロモーターなどを用いることができる。注入操作を終了した受精卵を 偽妊娠マウスの卵管に移植し、移植後のマウスを所定期間飼育して仔マウス (F0)を 得る。仔マウスの染色体に導入遺伝子が適切に組込まれて ヽることを確認するため、 仔マウスの尾などカゝら DNAを抽出し、導入遺伝子に特異的なプライマーを用いた PC R法や導入遺伝子に特異的なプローブを用いたドットハイブリダィゼーシヨン法等を 行う。
本明細書における「トランスジ ニック動物」の種は特に限定されないが、好ましくは 哺乳類であって、より好ましくはマウス、ラットなどの齧歯類である。
本発明の抗体 (抗体断片を含む)を利用して GA β複合体に結合する活性を有する 化合物のスクリーニング方法を構成することができる。即ち本発明は、以下の工程を 含む、 GA |8複合体に結合する活性を有する化合物のスクリーニング方法も提供する
0本発明の抗体又は抗体断片に結合する第 1の化合物を選択する工程、及び ii)前 記第 1の化合物に結合する第 2の化合物を選択する工程である。このスクリーニング 方法にお!、ても、アミロイド線維の形成が抑制されることを確認する工程を含ませるこ とにより、スクリーニング方法により選択される化合物が GA β複合体に結合性を有し 、かつアミロイド線維の形成を抑制する活性を有することを確認することが可能となる
工程 0では、抗体又は抗体断片と試料との結合性が調べられ、結合性を有する第 1 の化合物が選択される。ここでの試料には、植物、動物、細菌など力 抽出した天然 タンパク質、天然ペプチド、天然高分子化合物等の他、合成タンパク質、合成べプチ ド、合成高分子化合物、合成低分子化合物、抗体 (本発明の抗体を含む)、細胞抽 出液、培養上清等を例示できる。
工程 0において、使用される抗体を固相に固定ィ匕しておき、これに試料を接触させ ることができる。これとは逆に試料側を固相に固定ィ匕しておくこともできる。 使用する抗体を予め標識化しておくことにより選択 (検出）の容易化、選択 (検出） 効率の向上を図ることもできる。標識ィ匕には125ι等の放射性物質、ペルォキシダーゼ、 β—D—ガラクトシダーゼ等の酵素等を用いることができる。また、使用する抗体を認 識する二次抗体を用いて選択 (検出）効率の向上を図ることもできる。
[0070] 本発明の抗体 (抗体断片を含む)を、 Α 重合阻害抗体に結合する化合物のスクリ 一-ング方法に利用することもできる。即ち、以下の工程 A)及び B)を含む、 A |8重合 阻害抗体に結合する化合物のスクリーニング方法を構成することができる。
A)本発明の抗体に試料を接触させる工程、及び
B)前記抗体に結合した化合物を回収する工程。
ここでの試料としては、植物、動物、細菌など力 抽出した天然タンパク質、天然べ プチド、天然高分子化合物等の他、合成タンパク質、合成ペプチド、合成高分子化 合物、合成低分子化合物、抗体 (本発明の抗体を含む)、細胞抽出液、培養上清等 を例示できる。
[0071] また、以下の工程を含む、 A β重合阻害抗体に結合する化合物のスクリーニング方 法を構成することもできる。
C)本発明の抗体の可変領域の立体構造を予測する工程、
D)前記立体構造に相補的な立体構造を有する化合物を選択する工程。 抗体可変領域の立体構造は、 NMR (核磁気共鳴）法（Wuthrich, K.： NMR of Prote in and Nucleic Acids, John Wiley & Sons, New York, 1986)、 X線結晶構造解析（Blun dell, T.L. and John, L.N.： Protein Crystallography, Academic Press, Oxford, pp.1— 5 65, 1976、 McPherson, A.： Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley & Sons, New York, pp.1-371,1982,松島正明ら：蛋白工学研究法,第 7章,立体構造 解析,廣川書店,東京, 160-200,1990)等の方法により予測することができる。
工程 D)における候補ィ匕合物としては、植物、動物、細菌など力 抽出した天然タン パク質、天然ペプチド、天然高分子化合物等の他、合成タンパク質、合成ペプチド、 合成高分子化合物、合成低分子化合物、抗体等を例示できる。
以上のスクリーニング方法で取得される化合物は A β重合阻害抗体に結合する活 性を有することから、生体に投与されれば Α 重合阻害抗体の産生を惹起することが できると考えられる。即ち、生体の備える免疫防御機構に作用して A j8重合阻害抗体 を産生させることができ、その結果、生体において形成された GA |8複合体に Α |8が 重合してアミロイド線維が形成されることをこの抗体の作用により抑制することができ ると考えられる。従って、当該化合物を用いてアルツハイマー病を予防、又は治療す ることが可能と考えられる。換言すれば、当該化合物を用いることによりアルッハイマ 一病の予防方法、及び治療方法が提供される。また、当該化合物を有効成分として 含有するアルツハイマー病に対する薬剤、即ちワクチン又は治療薬を構成できる。一 方、上記本発明の合成脂質膜についても A j8重合阻害抗体に認識され得るため、こ れを生体に投与することにより A j8重合阻害抗体の産生を惹起する作用を奏すること ができると考えられる。従って、アミロイド線維形成に対する阻害活性を有する抗体を ヒト生体内で産生させるために当該合成脂質膜を使用することができるといえる。そこ で本発明は更に、上記の合成脂質膜 (GM1を含む脂質膜)を含むアルツハイマー予 防ワクチン又は治療用組成物を提供する。
[0072] 本発明の抗体等を薬剤として利用する場合には、製剤上許容される他の成分 (例 えば、生理食塩水、賦形剤、防腐剤、）を含有させることができる。また、種々の形態 に製剤化できる。例えば、カプセル剤、シロップ剤、錠剤、顆粒剤などとして調製でき 、経口投与、非経口投与 (静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）により適 用することができる。
投与量については、症状、患者の年齢、体重などによって異なるが、当業者であれ ば適宜適当な投与量を選択、設定することが可能である。
実施例
[0073] 1. GM1ガンダリオシドを含むリボソーム（GM1リボソーム）への A j8 および A j8 の
1-40 1-42 定量的結合
1 - 1. A |8溶液の調製方法
A β溶液を以下の手順で調製する。まず、合成 Α β (例えば Lot.501001 (ぺプチ
1-40
ド研究所、大阪、日本）又は Lot.519599 (Bachem AG,スイス））を最初に 0.002%のァ ンモニァ溶液に約 500 μ Μとなるように溶解し、 100,000rpmで 3時間遠心する（TLA12 0.0ローター、 Optima TL、ベックマン、カルフォルニア州、米国）。上清の上 3分の 2を 集め、 A 13の濃度を決定する。 A β溶液は小分けして使用時まで- 80°Cに保存する。 使用直前に溶解し、生理的トリス緩衝液（TBS : 150mM NaCl及び 10mM Tris-HCl, p H7.4)で適切な濃度に希釈する。
この方法によれば、市販の A βカゝら調製した Α β溶解液からアミロイド線維形成の種 を遠心除去することができる。 Thioflavin Tを用いた Α |8の線維形成測定で 37°Cイン キュベーシヨン時の A β と Α β の Α βの線維形成を観察したところ、それぞれ、少
1-40 1-42
なくとも 96時間と 6時間は蛍光強度の上昇が見られないことを本発明者らは明らかに した (J Neurosci., 2004, 24: 4894-4902)。この調製法の性質は、 A j8の線維形成にお ける種活性を測定するために重要である。
[0074] 1 - 2. GM1ガンダリオシドを含む合成脂質 (GM1リボソーム溶液)の調製方法
GM1ガンダリオシドを含む合成脂質を以下の手順で調製する。まず、コレステロ一 ルとスフインゴミエリン（シグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ一州、米国）及び G Ml (和光純薬工業株式会社、大阪、日本)をクロ口ホルム Zメタノール混液 (1:1)に所 定比率 (例えば 2:2:1)で溶解する。この混液を窒素ガスで 1時間乾燥し、 -40°Cで使 用時まで保存する。使用直前に乾燥した脂質混合物を GM1濃度が 2.5mMになるよう に TBSに再懸濁し、液体窒素を用いて 10回凍結溶解を行う。この脂質懸濁液を 13,00 Orpmで 15分間遠心し (MX- 160、 TOMY、東京、日本）、沈渣を再度 GM1が同濃度に なるよう TBSに再懸濁する。最後にこの懸濁液を氷上で 5分間マイクロチップ (TP-030 、 TOMY、東京、日本）を備えた超音波破砕機（UD- 201、出力レベル 2、 TOMY、東 京、 日本)を用いて超音波処理し、これを 3回繰り返す。得られた溶液を GM1リポソ一 ム溶液とした。
[0075] 1 3. GM1リボソーム溶液と A j8との反応
GM1リボソーム溶液と A |8溶液を混合し、ボルテックスで 1分間撹拌して水中に分散 させる。 100000 X gで 10分間、遠心した後、上清を吸い取り、沈殿にトリス緩衝液（10m M Tris-HCl buffer pH7.4/150mM NaCl) 1mlをカ卩え、十分に撹拌して水中に分散させ る。
[0076] 1 -4. GM1リボソームへの A β結合実験
放射性ョード (1251)標識 Α β (アマシャム、フアルマシア， ΙΜ-2394, 370 KBq)を用 V、て GM1を含むリボソーム（GM1リボソーム）への A β結合量を定量した（図 1)。
まず、 1 2.の方法に準じて、表 2に示す成分比率の GM1リボソーム溶液をそれぞ れ用意した。尚、各成分の総濃度（つまりリボソーム濃度）が 4600 Μとなるように各 GM1リボソーム溶液を調製した。一方、 1 1.の方法で調製した Α |8溶液へ、同様に 超遠心分離（100000rpm、 2時間、 4°C)処理した放射性 A βを lOOnCi混合し Α β濃度 46 μ Μの溶液 100 μ 1を調製した。この Α β溶液に対してそれぞれ上記の GM1リポソ ーム溶液を 100 1添カ卩し、 37°Cで 1分間インキュベートした。続いて、 1mlのトリス緩衝 液（10mM Tris-HCl buffer pH7.4/150mM NaCl)をカ卩え遠心分離で沈殿させることを 4度繰り返した後、 GM1リボソームに結合しな力つた A |8を洗浄除去した。沈殿した放 射活性量を求めることによって、 GM1リボソームに結合した A |8量を測定した（図 1)。 同様に、放射性ョード（12¾標識 A β (Amvloid β - Protein (Human, 1—42)、コー
1-42
ド 4349-v、ペプチド研究所、大阪）を用いて GM1を含むリボソーム（GM1リボソーム） への A |8結合量を定量した（図 2)。即ち、 1 1.と同様の方法で調製した A |8 溶
1-42 液に同様に超遠心分離（100000rpm、 2時間、 4°C)処理した放射性ョード (12¾標識 A β (アマシャム、フアルマシア， ΙΜ- 336, 370 KBq)を混合し A j8 の GM1リポソ
1-42 1-42 一 ムへの結合量を測定した（図 2)。
以上の実験結果力 GM1を 10〜40% (分子比)含むリボソームは、 A β 及び Α β
1-40 1-4
Vヽずれの Α β重合開始活性も持つことがわかる。 Α β を使用した場合と Α β を
2 1-40 1-42 使用した場合を比較すれば、両者ともリボソーム組成に依存してリボソームへの結合 量は変化するが、その結合量変動に実質的な差はない（図 1、 2)。調べた範囲で特 に重合開始に有効な GM1分子比は 20%であった（図 1、 2)。この濃度で作製した GM 1リボソームに A j8を短時間（1分間）反応させることで形成される GM1リボソーム- A j8 複合体 (合成 GA |8 )を、免疫原またはスクリーニング用抗原として、以下の各実験に 使用した。
2. Α βプロテオリボソームの免疫による抗 Α βモノクローナル抗体の作製
2- 1. in vitroで調製した GA βのマウスへの免疫
重合阻害活性を有するモノクローナル抗体を得るため、 1.の結果カゝら最も GA |8形 成量が多くなる至適条件（スフインゴミエリン：コレステロール： GM 1 = 64 : 16 : 20の成 分比 (分子比）のリボソームに対して A βを 1分間接触)で免疫原 (合成 GA β )を作製 した。 100 1を 1回分として、この合成 GA |8をマウス（Balb/c)の腹腔に 1週間おきに 数回免疫し、 5回免疫後の翌週にマウスより眼てい採血し抗体価を確認した。抗体価 の高 、マウスの脾臓を取り出し、以下の手順で細胞融合を行った。
[0078] 2- 2.細胞融合、及びノ、イブリドーマの選択
摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞 Sp2/0- Agl4とを約 10:1の 割合で混合し、 50%ポリエチレングリコール 4000を融合促進剤として細胞融合すること によってハイプリドーマを作製した。融合後の細胞を 1 X 106 cells/mlの濃度となるよう に 10%ゥシ血清含有 HAT培地 (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地)に 懸濁した。得られた細胞懸濁液を、 96ゥエルのマイクロタイタープレート (ヌンク社製マ キシソープ、以下同じ)に 1ゥヱルあたり 50 1ずつ分注した。
[0079] 融合細胞を COインキュベータ (5%CO、 37°C)内で培養し、 HAT培地で培地交換を
2 2
行 、増殖させて、脾臓細胞と骨髄腫細胞力 なる融合細胞のスクリーニングを行った
。っ 、で HT培地中で馴化し、さらに 10%FCS (ゥシ胎児血清) -DMEM培地で馴化した
[0080] HATセレクションの後、生存しているハイプリドーマの培養上清中に含まれる抗体 の結合性を、合成 GA |8を感作したマイクロタイタープレートを用いて以下の ELISA法 により検出した。このように結合活性を指標にスクリーニングを行った。
[0081] 2- 3. GA j8 結合マイクロプレートを用いた ELISAによる融合細胞クローンの一次ス クリーニング
まず、 GM1をスフインゴミエリン及びコレステロールと混合し、クロ口ホルム一エタノー ル（クロ口ホルム：エタノール =1 : 1)に溶解後、 96穴 ELISAプレート（ポリカーボネイト製 )に 50 1ずつ分注した。続いて室温で乾燥させ、脂質膜 (lipid film)を形成させた。こ れを 1%スキムミルク/ PBSでブロッキングした後、 20 μ g/mlの A j8を入れ、短時間（1分 間）反応させて GA |8を形成させた。洗浄後、上記のようにして調製したハイプリドー マの培養上清を各ゥエルに 100 Lずつ加え、室温で 2時間インキュベートした。ゥェ ル内の液を除去し、続いて PBSで洗浄した後、 0.1% Tween 20-TBSで 3000倍希釈し た西洋ヮサビペルォキシダーゼ (HRP)標識ャギ抗マウス IgG+IgM (H+L)抗体（Kirkeg aard & Perry Laboratories, Inc.)を各ゥエルに 100 μ 1ずつ分注し、室温に 1時間静置 した (二次反応)。二次反応後、同様に PBSで洗浄した後、 TMB (Tetramethyl benzidine)溶液をゥヱルあたり 100 μ 1添加し、 30°Cで 5〜20分間発色させた (発色反 応）。 1.5 NH POを各ゥエルに 100 1ずつ加えて発色反応を停止させ、マイクロタイタ
3 4
一プレートリーダーを用いて、 450 nmにおける吸光度を東ソー (株) MPR A4iにて測定 した。対照として、 A |8を添加しない系を用意し、これに対して陰性であるとともに、遊 離状態の A β 20 μ g/mlを感作させたプレート及び脂質膜 (lipid film)に対する反応が 陰性なものを選択した。
選択されたゥエルに対して限界希釈法によるクローユングを 2回繰り返し、融合細胞 クローンを榭立した。得られたクローンを以下の A |8重合評価系を用いた選択（2次ス クリーニング)に供した。
[0082] 3. 3種の in vitro Α β重合評価系によるモノクローナル抗体の評価
本発明者らの報告（J Neurosci., 2004, 24: 4894-4902)に記載した in vitroでの 3種 の A β重合評価系（(Α)Α β線維断片を添加することで開始される重合、（B)GA β 40 力 開始される Α β 40の重合、 (C)GA β 42から開始される Α β 42の重合）を用いて、 上記 2.で得られた各融合細胞クローンが産生する抗体の Α |8重合反応に対する効 果をみた。使用した A β重合評価系（Α β重合阻害試験 A〜C)を以下に示す。尚、 陽性対照及び陰性対照としてそれぞれ、重合抑制活性のある 4396C抗体 (国際公開 第 03/014162号公報、 J Neurosci., 2004, 24: 4894- 4902)及び 4G8抗体（フリーの A j8 を認識する抗体)を用いた。
[0083] A. Α 重合阻害試験 1 (Α β線維を添加することで開始される重合に対する阻害効 果）
Α-1. Α |8溶液の調製
上記 1-1.と同様の手順で Α β溶液を調製する。
[0084] Α-2.線維状 Α β溶液の調製
線維状 Α β溶液を以下の手順で調製する。まず、合成 Α β (例えば Lot.501001 (
1-40
ペプチド研究所、大阪、日本）又は Lot.519599 (Bachem AG,スイス））を 4°Cで約 500 μ Μのアンモニア溶液に短時間ボルテックスすることにより溶解し、インキュベーショ ンバッファー（50mMリン酸緩衝液、 pH7.5； lOOmM NaCl)で 50 μ Μに希釈する。 37°C で 24時間インキュベートした後、混合液を 1.6 X 104g、 4°Cで 3時間遠心する。エツペン ドルフチューブ内で沈渣を 0.005%NaNを含む氷冷したインキュベーションバッファー
3
に再懸濁し、マイクロチップ (TP-030、 ΤΟΜΥ、東京、 日本)を備えた超音波破砕機（ UD-201 , ΤΟΜΥ、東京、 日本）を用いて氷上で超音波処理し、使用時まで 4°Cで保 存する。
[0085] A-3.阻害効果の評価
(1)被験抗体の存在下 (試験群、抗体添加濃度 1 IX M)又は非存在下 (対照群）にお
V、て、線維状 A β溶液 (5 1)と、 A |8溶液（100 μ 1)とを混合し、 37°Cでインキュベー シヨンする。
(2) Thioflavin Tを用いた A j8の線維形成測定を、 Naiki H and Gejyo F(1999) Methods Enzymol 309, 305-318に従って行う。まず、インキュベーション開始から 4時間後の 溶液の一部（5 μ 1)をサンプリングし、これに終濃度 5 μ Μとなるように Thioflavin T (Sig ma)を添加する。 1mlの 50mMグリシン水酸ィ匕ナトリウム緩衝液で希釈した後、 A |8線維 の蛍光強度 (励起波長 446nm、蛍光波長 490nm)を分光蛍光光度計 (例えば RF-530 0PC、島津製作所)で測定する。
(3)以下の計算式で被験抗体の阻害効果 (阻害活性)を求める。
阻害効果 (％) = (対照群の蛍光強度 試験群の蛍光強度) Z対照群の蛍光強度 X 100
[0086] B. Α β重合阻害試験 2 (GA β 40から開始される Α β 40の重合に対する阻害効果） Β-1.Α |8溶液の調製方法
上記 1-1.と同様の手順で Α β溶液を調製する。
[0087] B-2. GM1ガンダリオシドを含む合成脂質の調製
上記 1-2.と同様の手順で GM1ガンダリオシドを含む合成脂質を調製する。
[0088] Β-3.阻害効果の評価
(1)被験抗体の存在下 (試験群、抗体添加濃度 1 IX Μ)又は非存在下 (対照群）にお いて、 GM1ガンダリオシドを含む合成脂質と Α |8溶液とを混合し、 37°Cでインキュべ ーシヨンする。 (2) Thioflavin Tを用いた A j8の線維形成測定を、 Naiki H and Gejyo F(1999) Methods Enzymol 309, 305-318に従って行う。まず、インキュベーション開始から 20時間後の 溶液の一部（5 μ 1)をサンプリングし、これに終濃度 5 μ Μとなるように Thioflavin T (Sig ma)を添加する。 1mlの 50mMグリシン水酸ィ匕ナトリウム緩衝液で希釈した後、 A |8線維 の蛍光強度 (励起波長 446nm、蛍光波長 490nm)を分光蛍光光度計 (例えば RF-530 0PC、島津製作所)で測定する。
(3)以下の計算式で被験抗体の阻害効果 (阻害活性)を求める。
阻害効果 (％) = (対照群の蛍光強度 試験群の蛍光強度) Z対照群の蛍光強度 X 100
尚、 GM1ガンダリオシドを含む脂質膜は通常、ポリスチレン榭脂、ポリカーボネート 榭脂、シリコン榭脂、ナイロン榭脂等の榭脂ゃガラス等力もなるビーズ、マイクロプレ ート等の不溶性支持体に結合した状態で使用される。
[0089] C. Α β重合阻害試験 2 (GA β 42から開始される Α β 42の重合に対する阻害効果） 合成 Α β に代えて合成 Α β (例えば、 Amyloid β - Protein (Human, 1-42)、コ
1-40 1-42
ード 4349-v、ペプチド研究所、大阪)を使用して上記 1-1.の手順に従い A |8溶液を調 製する。一方、上記 1-2.と同様の手順で GM1ガンダリオシドを含む合成脂質を調製 する。これら二つの溶液を用いて、上記 B-3.と同様の手順で阻害効果を評価する。
[0090] A β重合阻害試験の結果、 Α β重合阻害効果の高!、抗体としてクローン 1C9、 2E1 2、 3G11、及び 4E11を選択した（二次選択)。各クローンの A 線維形成阻害効果を 図 4の表に示す。クローン 1C9は線維状 Α |8を添加することで開始される重合を強く 阻害し、 GA β力 開始される Α β 40の重合および GA β力 開始される Α β 42の重合 に対する阻害活性は弱い。また、クローン 2E12と 3G11では三種の重合系それぞれに おいて強い阻害活性が認められた。これらのクローンは、 4396C抗体に比較して、 GA β力 開始される Α β 40の重合と GA β力 開始される Α β 42の重合に対して強 、活 性を持つ。一方、クローン 4E11にも三種の重合系において同等の阻害活性が認めら れた。
尚、陰性対照の 4G8抗体はフリーの Α を認識する抗体であるが、この阻害試験で は阻害活性は見られな 、。これに対して陽性対照の 4396C抗体は 、ずれの重合系 にお 、ても Α β重合阻害効果を示したが、 (B)GA β 40から開始される Α β 40の重合、 又は (C)GA β 42から開始される Α β 42の重合に対してよりも、 (Α)Α β線維断片を添加 することで開始される重合に対して強い阻害活性を有するという特徴が認められた。
[0091] 4.クローン 2E12、 3G11抗体の in vitro A j8重合に対する阻害作用の解析
クローン 2E12と 3G11は共に三種の重合系（(Α)Α |8線維断片を添加することで開始 される重合、（8)。 |8 40から開始される |8 40の重合、（C) GA |8 42から開始される A β 42の重合）において阻害活性を有し、特に 4396C抗体と比較して、 GA |8 40から開 始される A β 40の重合と GA β 42から開始される Α β 42の重合に対して強 、活性を有 するという性質がある（上記 3. ) 0この阻害活性の分子機構を調べるために、 GA |8 40 力 開始される A β 40の重合系をこれら抗体で阻害し、経時的に Α β線維形成をモ- ターした。陰性対照として 4396C抗体を用いた。抗体濃度は 2 /ζ Μとした。尚、この解 析における線維形成の反応温度は全て 37°Cとした。
[0092] 図 5は、 2E12を添カ卩した場合の測定結果 (Thioflavin Tを用いた A β 40の線維形成 を測定した結果)である。 Α β溶液は GM1リボソームを添加しな 、と蛍光強度の上昇 は 20時間見られない。抗体添カ卩は GM1リボソームの添加と同時に行い、経時的に少 量サンプルを取り出して Thioflavin T液を混合し蛍光強度を測定した。 GM1リボソーム には自家蛍光があるので、その添カ卩により反応系の蛍光強度は上昇する。抗体を添 カロしない系は添加時点力も蛍光強度の上昇を開始し、 4時間まで蛍光強度が上昇し た。その後、蛍光強度は 20時間まで一定値を保った。この結果は、 GM1リボソームの 添カ卩により GA β 40が形成され、これから Α β 40の線維形成が時間とともに進行して線 維が伸長し、溶液中の Α が線維形成に消費されて濃度が減少し、線維形成の臨界 濃度以下になったと解釈される。陽性対照である 2 Mの 4396C抗体の添加系では、 無添加系に比較してより早い 2時間で蛍光強度の上昇がとまり、その蛍光強度は 20 時間まで維持された。この結果は、 A |8の線維形成がこの抗体により停止し、それ以 後の線維伸長は抑制されると解釈される。一方、 2E12の場合、蛍光強度の上昇は、 添加濃度が 0.5 μ Μの場合は 4時間で、添加濃度が 1又は 2 μ Μの場合は 2時間で停 止し、それ以後は抗体濃度に依存する速度で蛍光強度が低下した。この結果から 2Ε 12は、 GA |8 40から開始される Α |8の線維形成開始時には影響を与えないが、線維 伸長が進行した後には、形成された A β線維長を決めることになる、 Α βの重合反応 による線維伸長と Α |8の脱重合による線維の短縮の平衡関係を、線維の短縮のほう に傾力せる作用があると考えられる。
[0093] 図 6は 3G11を添カ卩した場合の測定結果 (Thioflavin Tを用いた A β 40の線維形成を 測定した結果)である。この図 6の結果は図 5の結果とは異なり、すべての測定値から GM1リボソーム添加直後の蛍光強度の値を減じた数値をプロットしてある。抗体を添 カロしない系では GM1リボソーム添力卩時カも急激に蛍光強度が上昇し、 20時間まで上 昇速度を減少させながら蛍光速度が上昇し続けた。 4396C抗体を添加した場合、無 添加の場合と比較して蛍光強度が低値であり、また蛍光強度の上昇は 6時間まで見 られた。陰性対照として用いた 3F1はフリーの Α |8 40ペプチドの C末端を認識する抗 体である力 これを添加した場合の蛍光強度変化は無添加の場合とほぼ同一であつ た。この結果から、この抗体は A |8 40の線維形成に影響を与えないことが分かる。 3G 11抗体を添加した場合、いずれの添加濃度（1、 2および 3 /z M)でも反応初期 1時間ま で蛍光強度は上昇したものの、それ以後は蛍光強度が減少し、最終的に GM1リポソ ーム添カ卩時とほぼ同等になった。以上の結果から 3G11は 2E12と同様に、 GA j8 40か ら開始される A j8の線維形成開始時には影響を与えないが、線維伸長が進行した後 には、形成された A β線維長を決める Α βの重合反応による線維伸長と Α βの脱重合 による線維の短縮の平衡関係を、線維の短縮のほうに傾カゝせる作用があると考えら れる。
[0094] 次に、 Α β線維伸長をしていると考えられる GM1リボソームを添カ卩して 4時間経過後 に抗体を添加する実験を行った（図 7)。先の実験では A β濃度は 23 μ Μであったが 、この実験では 100 Μに増加させた。抗体を添加しない系の蛍光強度は測定開始 時から 24時間まで連続的に上昇した。陰性対照として用いた 2 Μの 3F1を添加した 場合の蛍光強度変化は無添加の場合とほぼ同一であって、測定開始時から 24時間 まで連続的に上昇した。 4396Cを 添加した場合、蛍光強度が測定開始から 24 時間後までほぼ一定値を維持した。 2E12を添加した場合と 3G11を添加した場合はい ずれも、測定開始時から蛍光強度は減少を続け、 24時間後には測定開始時の約 60 %となった。これらの現象から、 4396Cは Α |8線維の新たな伸長を抑制していると考え ら得るが、 2E12と 3G11はこれとは異なり、形成された A |8線維の分断ィ匕または A |8線 維の脱重合を促進していると考えられる。そこで、実験的にすでに Thioflavin T蛍光 測定値が最大値付近に達したサンプルに抗体を添加して蛍光強度を測定した（図 8 )。 Α |8濃度を 23 Mし、 GM1リボソーム添加後、 24時間経過したサンプルを用いた。 これに 2 Μの抗体をカ卩え、経時的に Thioflavin T蛍光測定を行った。無添加の場合 、蛍光強度は測定開始時から 8時間まで非常に緩やかに上昇した (約 10%)。 2 Μ の 3F1を添加した場合の蛍光強度変化は、無添加の場合とほぼ同一で測定開始時 力も 8時間まで約 10%上昇した。また、 4396Cを 添カ卩した場合、測定開始力も 8 時間後まで、無添加の場合及び 3F1を添加した場合とほぼ同一の蛍光強度変化を示 した。 2E12を添加した場合と 3G11を添加した場合は同様の蛍光強度変化を示し、測 定開始時から 8時間までの間に蛍光強度が約 20%減少した。以上の結果から、 2E12 と 3G11は明らかに、 Α βの線維分断ィ匕または Α β線維の脱重合を促進して Thioflavin T蛍光測定値を減少させて 、る。
以上の実験結果から、 4396Cは Α |8線維の新たな伸長を抑制するのに対して、 2E1 2と 3G11は Α 線維の分断ィ匕または Α 線維の脱重合を促進する活性を持って!/、る ことがわ力ゝる。
5. VH、 VL遺伝子の単離
5 - 1. VH遺伝子の増幅 (PCR)
遺伝子データベースからマウス VHの 5，末端の Primer (VH primers)を調べ、 sfilサイ トを付加しプライマーをデザイン、等量ずつ混ぜその mixプライマーを作成した。
Vhprimers (一例として）
Name : 5'末端側→3 '末端側
L丄」 mVHlA: act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg a、g/t)g tgc age ttc agg agt cag g (52 mer、配列番号： 65)
|_2」mVHlBl： act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccc agg tgc age tga agg agt cag g(5 2 mer、配列番号： 66)
L«3」mVHlB2 : act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccc agg tgc age tga age agt cag g ( 52 mer、配列番号： 67) [4]mVH2Al： act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg agg tec age tgc a(a/ g)c a(a/ g)t ctg g (52 mer、配列番号： 68)
[5]mVH2A2： act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg agg ttc age tgc age agt ctg g (5 2 mer、配列番号： 69)
[6]mVH2Bl： act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccc agg tec aac tgc age age ctg g ( 52 mer、配列番号： 70)
[7]mVH2B2： act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccc agg tec acc tgc age agt ctg g (5 2 mer、配列番号： 71)
[8]mVH3A: act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg agg tga age tgg tgg a(a/ g)t ctg g (52 mer、配列番号： 72)
[9]mVH3B： act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg agg tga age ttc tgg agt ctg g (52 mer、配列番号： 73)
[10]mVH3Cl： act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg aag tga age ttg agg agt ctg g ( 52 mer、配列番号： 74)
[l l]mVH3C2 : act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg agg tga age tgg atg aga ctg g (52 mer、配列番号： 75)
[12]mVH3C3 : act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg aag tga age tgg tgg agt ctg a( 52 mer、配列番号： 76)
[13]mVH3Dl： act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg aag tgc age tgg tgg agt ctg g ( 52 mer、配列番号： 77)
[14]mVH3D2： act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg aag tga tgc tgg tgg agt ctg g ( 52 mer配列番号： 78)
[15]mVH3D3： act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg aag tga age tgg tgg agt ctg g ( 52 mer、配列番号： 79)
[16]mVH5Al： act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccg agg ttc age ttc age agt ctg g ( 52 mer、配列番号： 80)
[17]mVH5A2 : act tac tcg egg ccc age egg cca tgg ccc agg tec age tgc age agt ctg g ( 52 mer、配列番号： 81) 尚、（a/g)、（g/t)は 2塩基ミックスを表す。
[0096] 同様に 3 '末端の Primers (JH Primers)を調べ、相補鎖の配列に Xholサイトを付カロし プライマーデザイン、等量混ぜその mixプライマーを作成した。
JH Primers (—例として）
Name : 5'末端側→3 '末端側
山 mJHlXho : cgt ttt ggc get cga gac ggt gac cgt ggt ccc tgc g (37 merゝ酉 C列 ¾·号： 8 2)
[2]mJH2Xho： cgt ttt ggc get cga gac tgt gag agt ggt gcc ttg g (37 mer、酉己歹幡号： 8 3)
l_3」mJH3Xho : cgt ttt ggc get cga gac agt gac cag agt ccc ttg g (37 merゝ酉己列 号：8 4)
[4]mJH4Xho : cgt ttt ggc get cga gac ggt gac tga ggt tec ttg a 7 mer、目己歹' J番 ：8 5)
[0097] 2次スクリーニング (上記 3. )の結果選択された陽性ハイプリドーマを細胞培養し、 常法により cDNAを取得した。次に、得られた cDNAをテンプレートとし、上記プライマ 一 VH Primers(200pmol/ μ 1)と JH Primers (200pmol/ μ 1)をそれぞれ 20 μ 1用いて LA Taq(TAKARA)で MgCL、 dNTPmix存在下で PCR (サイクル 94°C、 1分、 65°C
2 、 2分、 72
。C、 1分を 30サイクル)を実施した。これによつて VH遺伝子を単離した。
[0098] 5 - 2. VL遺伝子の増幅 (PCR)
上記 VH遺伝子の増幅と同様に、 L鎖 κ mixプライマーを 5 '末端の VLマウス配列及 び Ck ( κ constant領域)配列からそれぞれ作成し、 PCRで同様に VL遺伝子を単離し た。或いは、 L鎖 λ mixプライマーを 5，末端の VLマウス配列及び C λ ( λ constant領 域)配列からそれぞれ作成し、 PCRで同様に VL遺伝子を単離する。
VHと VLの組合せが実際に機能しているか否かは、各組合せを Sfil、 Xholで発現べ クタ一に組み込み発現させて得られた精製タンパク質を上記 2.の ELISA試験に供す ること〖こよって検証した。
遺伝子配列は CEQ 2000 DNA Analysis System(BECMAN COULTER)にて、インス トラクシヨンに基づき決定した。 2次スクリーニングで選択されたクローン 1C9、 2E12、 3G11、及び 4E11のアミノ酸配 列及び塩基配列は次の通り同定された。
a.アミノ酸配列
(1) 1C9抗体（図 9、 10)
配列番号： 1(VH)；配列番号： 2(VH CDR1)；配列番号： 3(VH CDR2)；配列番号： 4( VH CDR3)；配列番号： 5(VL) ;配列番号： 6(VL CDR1) ;配列番号： 7(VL CDR2)；配 列番号： 8(VL CDR3)
(2) 2E12抗体（図 11、 12)
配列番号： 9(VH)；配列番号： 10(VH CDR1)；配列番号： 11(VH CDR2)；配列番号 ： 12(VH CDR3)；配列番号： 13(VL) ;配列番号： 14(VL CDR1) ;配列番号： 15(VL C DR2)；配列番号： 16(VL CDR3)
(3) 3G11抗体（図 13、 14)
配列番号： 17(VH) ;配列番号： 18(VH CDR1) ;配列番号： 19(VH CDR2)；配列番 号： 20(VH CDR3)；配列番号： 21(VL)；配列番号： 22(VL CDR1)；配列番号： 23(VL CDR2)；配列番号： 24(VL CDR3)
(4) 4E11抗体（図 15、 16)
配列番号： 25(VH) ;配列番号： 26(VH CDR1) ;配列番号： 27(VH CDR2)；配列番 号： 28(VH CDR3)；配列番号： 29(VL) ;配列番号： 30(VL CDR1) ;配列番号： 31(VL CDR2)；配列番号： 32(VL CDR3)
b.塩基配列
(1) 1C9抗体（図 9、 10)
配列番号： 33(VH) ;配列番号： 34(VH CDR1) ;配列番号： 35(VH CDR2)；配列番 号： 36(VH CDR3)；配列番号： 37(VL)；配列番号： 38(VL CDR1)；配列番号： 39(VL CDR2)；配列番号： 40(VL CDR3)
(2) 2E12抗体（図 11、 12)
配列番号： 41(VH) ;配列番号： 42(VH CDR1) ;配列番号： 43(VH CDR2)；配列番 号： 44(VH CDR3)；配列番号： 45(VL) ;配列番号： 46(VL CDR1) ;配列番号： 47(VL CDR2)；配列番号： 48(VL CDR3) (3) 3G11抗体（図 13、 14)
配列番号： 49(VH) ;配列番号： 50(VH CDR1) ;配列番号： 51(VH CDR2)；配列番 号： 52(VH CDR3)；配列番号： 53(VL)；配列番号： 54(VL CDR1)；配列番号： 55(VL CDR2)；配列番号： 56(VL CDR3)
(4) 4E11抗体（図 15、 16)
配列番号： 57(VH) ;配列番号： 58(VH CDR1) ;配列番号： 59(VH CDR2)；配列番 号： 60(VH CDR3)；配列番号： 61(VL) ;配列番号： 62(VL CDR1) ;配列番号： 63(VL CDR2)；配列番号： 64(VL CDR3)
[0100] 6.マウスーヒトキメラ抗体の作製
6— 1.ヒト γ鎖定常領域遺伝子、及びヒト λ鎖定常領域遺伝子の単離
ヒト Ί鎖定常領域 DNA、及びヒト λ鎖定常領域 DNAは、ヒトリンパ球 cDNAライブラリ 一より各 DNAの一部に相補的な DNAをテンプレートにして取得される。
[0101] 6- 2.キメラ H鎖ベクター、及びキメラ L鎖ベクターの作製
まず、ヒト γ鎖定常領域 DNAと上記 5.で得られるマウス Η鎖可変領域 DNAとをライ ゲーシヨンし、これを発現ベクター「BCMGS Neoベクター」（烏山一「ゥシパピローマウ ィルスベクター」，村松正実および岡山博人編,実験医学別冊遺伝子工学ハンドブッ ク,羊土社 ,ρρ.297-299 (1991)に組み込みキメラ Η鎖ベクターを作製する。同様に、ヒト λ定常領域 DNAと上記 5.で得られるマウス L鎖可変領域 DNAとをライゲーシヨンし、 これを BCMGS Neoベクターに組み込み、キメラ L鎖ベクターを作製する（図 17)。
[0102] 6- 3.トランスフエクシヨン
2種類のベクター（キメラ H鎖ベクター、キメラ L鎖ベクター）を CHO (チャイニーズノヽ ムスター卵巣）細胞にリポフエクチン法を用いて同時にトランスフエクシヨンし、 37°Cで 所定時間培養した後、 96穴プレートに移植し、ネオマイシン 500 μ g/mlを含む DMEM /10%FCSで選択する。
培養液中の IgG量は以下のようにして測定する。抗ヒト γ鎖 (株式会社医学生物学 研究所： code 103AG)を 10 g/mlに PBSで希釈調製し、ポリスチレン製マイクロプレー トに 100 1/ゥヱルずつ分注し、 4°Cでー晚感作させる。次に、 5%BSA/5%ショ糖/ PB Sを用いて 4°Cでー晚ブロッキングする。 100 μ 1のサンプルを 37°Cで 1時間反応させた 後、 PBS/0.05%Tween20で洗浄する。洗浄後、 4000倍希釈したペルォキシダーゼ標 識抗ヒ HgG (株式会社医学生物学研究所: code 208)を 37°Cで 1時間反応させ、 PBS/ 0.05%Tween20で洗浄後、酵素基質液を 100 1分注して室温で 15分反応させる。そ して、各ゥエルに 2N硫酸を 100 μ 1ずつ分注し、 Α を測定する。コントロールには、ヒト
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血清（IgG量： 200ng/ml、 20ng/ml、 2ng/ml、 0.2ng/ml)を用いる。このようにして、最も 発現量の多いクローンを選択し、その培養上清を回収する。回収された培養上清より
、 protein Aァガロースカラムを用いて抗体を精製する。
[0103] 7.ヒト型 CDR移植抗体の作製
7- 1.ヒト型 CDR移植抗体の設計
H鎖及び L鎖について、公知のデータベース（例えば、 Fasta database search)より、 上記 5.で取得した抗体の H鎖及び L鎖とホモロジ一の高 、配列をそれぞれ選択する
。そして、これらの配列の FRと阻害抗体の CDRを備える配列を設計する。
[0104] 7- 2.ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターの作製
7- 1.で設計された H鎖可変領域 DNA及び L鎖可変領域 DNAは次のように作製す ることがでさる。
最初に、合成 DNAを図 18に示すように 8本作製した。これら合成 DNAは可変領域 の約 400bpをカバーし、且つそれぞれ約 20bpずつオーバーラップするように作製され ている。これら合成 DNA lOpmol/10 μ 1を 100°Cで 5分処理した後、急冷し、合成 DNA の 1と 2、 3と 4、 5と 6、 7と 8をそれぞれ混ぜ、ヒートブロックで 65°C、 30分加熱したのち 、 12時間放置し、ゆっくりとァニールさせる。次に、 20mM dNTPを 1 μ 1、シーケナーゼ (アマシャム社） 1 1、 5 Xシーケナーゼバッファー 10 μ 1を加え、滅菌水で最終的に 50 1とし、 37°C、 1時間インキュベートする。この DNAフラグメント（1-2、 3-4、 5-6、 7-8) を 2%ァガロースで泳動し、切り出し、 30 1の滅菌水に溶解する。次に、切り出した D NAフラグメント 1—2と 3— 4、 5— 6と 7— 8、それぞれ 2 μ 1に、 Pfoポリメラーゼ 1 μ 1、 DMSO 5 μ 1、 lO X Pfoバッファー 9 μ 1を加え、滅菌水をカ卩ぇ 90 μ 1としたのち、 PCRを 94°C1分、 5 5°C1分、 72°C2分の条件で 6サイクル行う。次に、 10 Xノ ッファー 1 μ 20 μ Μプライマ 一（aと b、または cと d)をそれぞれ 5 μ 1加え、 PCRをさらに 94°C1分、 55°C1分、 72°C2分 で 25サイクル行う。増幅された DNAフラグメント（1-2-3-4と 5-6-7-8)を切り出し、 30 1 の滅菌水に溶解し、それぞれの DNA2 /Z 1を用いて PCRを前述の条件で 6サイクル行 い、プライマー e、 1¾カ卩えてさらに PCRを前述の条件で 25サイクル行う。得られた DNA フラグメントを切り出し、 pT7blueTベクターにクローユングし、配列を確認する。
次に、上記 6.と同様に、発現ベクターである「BCMGS Neoベクター」と、 PCRにて制 限酵素サイトを付けた合成 H鎖可変領域 DNAと、ヒト γ鎖 DNAとをライゲーシヨンし、 C DRH鎖ベクターを作製する。同様に、合成 L鎖可変領域 DNAとヒト λ鎖 DNAとが組込 まれた CDRL鎖ベクターを作製する。
[0105] 7- 3. トランスフエクシヨン
CDRH鎖ベクター及び CDRL鎖ベクターを CHO細胞にリポフエクチン法を用いて同 時にトランスフエクシヨンし、 37°C、 12時間培養した後、 96穴プレートにまき直し、ネオ マイシン 500 g/mlを含む DMEM/10%FCSで選択する。その後、 ELISAにて最も発 現量の多いクローンを選択する。培養上清を回収し、 Protein Aァガロースカラムを用 いて抗体を精製する。
産業上の利用可能性
[0106] 本発明により、アミロイド線維形成に対する阻害活性の高!ヽ抗体の情報 (アミノ酸配 列、 DNA配列)が提供される。また、当該活性を有する抗体 (抗体断片を含む)が提 供される。特に、 CDRの情報を基にヒト化抗体の作製が可能となる。これらの抗体は、 アルツハイマー病の診断、予防、治療等における有効な手段として利用され得る。
[0107] この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものでは ない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その 全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

請求の範囲
[1] in vitroでのアミロイド /3タンパク質重合阻害試験にお!、て阻害効果が 50%以上で ある、アミロイド線維形成に対する阻害活性を有する単離された抗体。
[2] GM1ガンダリオシド結合型アミロイド βタンパク質を認識することを特徴とする、請求 項 1に記載の単離された抗体。
[3] 配列番号： 2〜4、 10〜12、 18〜20、及び 26〜28のいずれかのアミノ酸配列又は それと実質的に同一のアミノ酸配列を含む CDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号： 6〜8、 14〜16、 22〜24、及び 30〜32のいずれかのアミノ酸配列又は それと実質的に同一のアミノ酸配列を含む CDRを有する軽鎖可変領域とを備え、 アミロイド線維形成に対する阻害活性を有する単離された抗体。
[4] 以下の a〜hからなる群より選択される組合せの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を 備える、請求項 3に記載の単離された抗体：
(a)配列番号： 2のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する重 鎖 CDR1、配列番号： 3のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有す る重鎖 CDR2、及び配列番号: 4のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配 列を有する重鎖 CDR3からなる CDRを有する重鎖可変領域と、配列番号: 6のアミノ酸 配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR1、配列番号： 7のアミノ酸 配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR2、及び配列番号: 8のァ ミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR3力 なる CDRを有 する軽鎖可変領域との組合せ、
(b)配列番号： 10のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する 重鎖 CDR1、配列番号： 11のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を 有する重鎖 CDR2、及び配列番号： 12のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する重鎖 CDR3からなる CDRを有する重鎖可変領域と、配列番号： 14の アミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR1、配列番号： 15 のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR2、及び配列番 号： 16のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR3力 な る CDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、 (c)配列番号： 18のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する重 鎖 CDR1、配列番号： 19のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有 する重鎖 CDR2、及び配列番号： 20のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のァミノ 酸配列を有する重鎖 CDR3からなる CDRを有する重鎖可変領域と、配列番号： 22の アミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR1、配列番号： 23 のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR2、及び配列番 号： 24のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR3力 な る CDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(d)配列番号： 26のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する 重鎖 CDR1、配列番号： 27のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を 有する重鎖 CDR2、及び配列番号： 28のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する重鎖 CDR3からなる CDRを有する重鎖可変領域と、配列番号： 30の アミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR1、配列番号： 31 のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR2、及び配列番 号： 32のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する CDR3力 な る CDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(e)配列番号： 1のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する重 鎖可変領域と、配列番号： 5のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列 を有する軽鎖変領域との組合せ、
(£)配列番号： 9のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する重 鎖可変領域と、配列番号： 13のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列 を有する軽鎖変領域との組合せ、
(g)配列番号： 17のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する重 鎖可変領域と、配列番号： 21のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列 を有する軽鎖変領域との組合せ、
(h)配列番号： 25のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する 重鎖可変領域と、配列番号： 29のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配 列を有する軽鎖変領域との組合せ。
[5] ヒト化抗体である、請求項 1〜4のいずれかに記載の単離された抗体。
[6] Fab、 Fab'、 F(ab')、 scFv、又 ίま dsFv抗体である、請求項 1〜5の! /、ずれ力に記載の
2
単離された抗体。
[7] 配列番号： 2〜4、 6〜8、 10〜12、 14〜16、 18〜20、 22〜24、 26〜28、及び 30
〜32の!、ずれかのアミノ酸配列を含む CDR。
[8] 請求項 3若しくは 4に記載の抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域、又は請 求項 8に記載の CDRをコードする単離された核酸分子。
[9] 請求項 8に記載の核酸分子を発現可能に保持するベクター。
[10] 請求項 8に記載の核酸分子が導入されている形質転換体。
[11] GM1ガンダリオシドと、その他の脂質と、及び該 GM1ガンダリオシドに結合したアミ口 イド βタンパク質とを含有し、成分比率 (分子比）が、
その他の脂質： GM1ガンダリオシド = 90 : 10〜60 :40の範囲にある、動物免疫用 の合成脂質膜。
[12] アミロイド線維形成に対する阻害活性を有する抗体をヒト生体内で産生させるため に請求項 11に記載の合成脂質膜を含むことを特徴とする、アルツハイマー予防ワク チン又は治療用組成物。
[13] 請求項 11に記載の合成脂質膜を非ヒト動物に免疫する免疫ステップと、
免疫後の前記非ヒト動物から取り出した抗体産生細胞を不死化細胞と融合し、ハイ ブリドーマを得るハイプリドーマ作製ステップと、
前記合成脂質膜に結合性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選抜するハイ ブリドーマ選抜ステップと、及び
選抜されたハイブリドーマの発現する抗体を分離する抗体分離ステップと、 を含んでなる、アミロイド線維形成に対する阻害活性を有する抗体の作製方法。
[14] 前記ノ、イブリドーマ選抜ステップにお!、て、前記合成脂質膜に結合性を有し、且つ モノマーアミロイド j8タンパク質に結合性を有しない抗体を産生するハイプリドーマを 選抜する、請求項 13に記載の作製方法。
[15] 抗体ライブラリーを、請求項 11に記載の合成脂質膜に接触させる接触ステップと、 前記抗体ライブラリーの中から、前記合成脂質膜に結合性を有するクローンを選抜 するクローン選抜ステップと、及び
選抜されたクローンの発現する抗体を分離する抗体分離ステップと、
を含んでなる、アミロイド線維形成に対する阻害活性を有する抗体の作製方法。
[16] 前記クローン選抜ステップにお ヽて、前記合成脂質膜に結合性を有し、且つモノマ 一アミロイド タンパク質に結合性を有しないクローンを選抜する、請求項 15に記載 の作製方法。
[17] 請求項 13〜16のいずれかの作製方法で得られる単離された抗体。
[18] 被験抗体の存在下及び非存在下でそれぞれ、請求項 11に記載の合成脂質膜に アミロイド /3タンパク質を接触させるステップと、
被験抗体の存在下で前記ステップを実施した場合と、被験抗体の非存在下で前記 ステップを実施した場合との間で、合成脂質膜へのアミロイド j8タンパク質の結合及 び Z又はアミロイド j8タンパク質の重合の程度を比較するステップと、
を含んでなる、被験抗体のアミロイド線維形成に対する阻害活性を測定する方法。
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Cited By (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007320934A (ja) * 2006-06-05 2007-12-13 Japan Health Science Foundation アミロイドβオリゴマー並びにその製造方法及び使用方法
WO2008104580A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Probiodrug Ag New use of glutaminyl cyclase inhibitors
WO2009051220A1 (ja) * 2007-10-19 2009-04-23 Immunas Pharma, Inc. Aβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用
US7700719B2 (en) 2000-07-07 2010-04-20 Bioarctic Neuroscience Ab Arctic β amyloid protofibril
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
WO2011029920A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Probiodrug Ag Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2011107530A2 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2011110613A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
US8025878B2 (en) 2006-03-23 2011-09-27 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril selective antibodies and the use thereof
WO2011131748A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Probiodrug Ag Novel inhibitors
US8106164B2 (en) 2004-06-21 2012-01-31 Bioarctic Neuroscience Ab Antibodies specific for soluble amyloid beta peptide protofibrils and uses thereof
WO2012123563A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Probiodrug Ag Benz imidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
US8378081B2 (en) 2008-02-08 2013-02-19 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to Aβ oligomers and uses thereof
US8497072B2 (en) 2005-11-30 2013-07-30 Abbott Laboratories Amyloid-beta globulomer antibodies
US8613924B2 (en) 2009-08-06 2013-12-24 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to A beta oligomers and use thereof
US8691224B2 (en) 2005-11-30 2014-04-08 Abbvie Inc. Anti-Aβ globulomer 5F7 antibodies
US8858949B2 (en) 2009-08-06 2014-10-14 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof
US8877190B2 (en) 2006-11-30 2014-11-04 Abbvie Inc. Aβ conformer selective anti-Aβ globulomer monoclonal antibodies
US8895004B2 (en) 2007-02-27 2014-11-25 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
EP2865670A1 (en) 2007-04-18 2015-04-29 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
US9062101B2 (en) 2010-08-14 2015-06-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
US9085614B2 (en) 2008-08-01 2015-07-21 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to Aβ oligomers and uses thereof
US9090679B2 (en) 2009-04-17 2015-07-28 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to A beta oligomers and use thereof
US9176150B2 (en) 2003-01-31 2015-11-03 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid beta(1-42) oligomers, derivatives thereof and antibodies thereto, methods of preparation thereof and use thereof
US9550824B2 (en) 2008-07-08 2017-01-24 Geneuro Sa Therapeutic use of specific ligand in MSRV associated diseases
US9573994B2 (en) 2014-07-10 2017-02-21 Bioarctic Neuroscience Ab Aβ protofibril binding antibodies
EP3461819A1 (en) 2017-09-29 2019-04-03 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100291071A1 (en) * 2008-08-01 2010-11-18 Immunas Pharma, Inc. Antibody Specific Binding to A-Beta Oligomer and the Use
LT3023438T (lt) 2009-09-03 2020-05-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-gitr antikūnai
JP2014510080A (ja) * 2011-03-09 2014-04-24 セントローズ， エルエルシー 細胞外標的化薬物複合体
US20160158381A1 (en) * 2013-07-17 2016-06-09 Department of Veterans Affairs, Technology Transfer Program Novel nanoliposomes and their use for the treatment of amyloid protein diseases
US10035847B2 (en) 2013-10-02 2018-07-31 The Rockefeller University Amyloid protofibril antibodies and methods of use thereof
TW202016145A (zh) * 2018-06-29 2020-05-01 財團法人生物技術開發中心 抗人類tim-3之人類化抗體及其用途
TW202300517A (zh) 2021-03-12 2023-01-01 美商美國禮來大藥廠 抗類澱粉β抗體及其用途
WO2022251048A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Eli Lilly And Company Anti-amyloid beta antibodies and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003014162A1 (en) * 2001-08-03 2003-02-20 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. ANTIBODY RECOGNIZING GM1 GANGLIOSIDE-BOUND AMYLOID β-PROTEIN AND DNA ENCODING THE ANTIBODY

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9325182D0 (en) * 1993-12-08 1994-02-09 T Cell Sciences Inc Humanized antibodies or binding proteins thereof specific for t cell subpopulations exhibiting select beta chain variable regions
ES2388280T3 (es) * 2002-12-20 2012-10-11 Abbott Biotherapeutics Corp. Anticuerpos que reaccionan frente a GPR64 y utilización de los mismos
WO2005097832A2 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7435804B2 (en) * 2004-10-19 2008-10-14 Phage Biotechnology, Inc. Method for obtaining single chain antibodies to human interferon α2b

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003014162A1 (en) * 2001-08-03 2003-02-20 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. ANTIBODY RECOGNIZING GM1 GANGLIOSIDE-BOUND AMYLOID β-PROTEIN AND DNA ENCODING THE ANTIBODY

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAYASHI H. ET AL.: "A seed for Alzheimer amyloid in the brain", J. NEUROSCI., vol. 24, no. 20, 2004, pages 4894 - 4902, XP009039691 *
See also references of EP1921137A4 *
YAGUCHI Y. ET AL.: "Ko-Amyloid beta Tanpaku Kotai", THE CELL, vol. 33, no. 2, 2001, pages 56 - 57, XP003007232 *
YANAGISAWA K. ET AL.: "Amyloid beta-protein (A beta) associated with lipid molecules: immunoreactivity distinct from that of soluble A beta", FEBS LETT., vol. 420, no. 1, 1997, pages 43 - 46, XP004261667 *
YANAGISAWA K. ET AL.: "GM1 ganglioside-bound amyloid beta-protein (A beta): a possible form of preamyloid in Alzheimer's disease", NAT. MED., vol. 1, no. 10, 1995, pages 1062 - 1066, XP003007233 *
YANAGISAWA K.: "Amyloid beta Tanpaku Chikuseki Kaishi Kijo no Kenkyu, Alzheimer's Disease no Hassho Bunshi Kiko ni Kansuru Kenkyu", HEISEI 14 NENDO SOKATSU . BUNTAN KENKYU HOKOKUSHO, 2004, pages 11 - 14, XP003007231 *

Cited By (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7700719B2 (en) 2000-07-07 2010-04-20 Bioarctic Neuroscience Ab Arctic β amyloid protofibril
US8409575B2 (en) 2000-07-07 2013-04-02 Bioarctic Neuroscience Ab Antibodies specific for amyloid beta protofibril
US9176150B2 (en) 2003-01-31 2015-11-03 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid beta(1-42) oligomers, derivatives thereof and antibodies thereto, methods of preparation thereof and use thereof
US10464976B2 (en) 2003-01-31 2019-11-05 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid β(1-42) oligomers, derivatives thereof and antibodies thereto, methods of preparation thereof and use thereof
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
US8809010B2 (en) 2003-05-05 2014-08-19 Probiodrug Ag Method for prophylactic treatment of alzheimer's disease using inhibitors of glutaminyl cyclase and glutamate cyclases
US8106164B2 (en) 2004-06-21 2012-01-31 Bioarctic Neuroscience Ab Antibodies specific for soluble amyloid beta peptide protofibrils and uses thereof
US8999936B2 (en) 2004-06-21 2015-04-07 Bioarctic Neuroscience Ab Antibodies specific for soluble amyloid beta peptide protofibrils and uses thereof
US8404459B2 (en) 2004-06-21 2013-03-26 Bioarctic Neuroscience Ab Antibodies specific for soluble amyloid beta peptide protofibrils and uses thereof
US9540432B2 (en) 2005-11-30 2017-01-10 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Anti-Aβ globulomer 7C6 antibodies
US10208109B2 (en) 2005-11-30 2019-02-19 Abbvie Inc. Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
US8691224B2 (en) 2005-11-30 2014-04-08 Abbvie Inc. Anti-Aβ globulomer 5F7 antibodies
US10323084B2 (en) 2005-11-30 2019-06-18 Abbvie Inc. Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
US10538581B2 (en) 2005-11-30 2020-01-21 Abbvie Inc. Anti-Aβ globulomer 4D10 antibodies
US8497072B2 (en) 2005-11-30 2013-07-30 Abbott Laboratories Amyloid-beta globulomer antibodies
US8025878B2 (en) 2006-03-23 2011-09-27 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril selective antibodies and the use thereof
US9034334B2 (en) 2006-03-23 2015-05-19 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril selective antibodies and the use thereof
JP2007320934A (ja) * 2006-06-05 2007-12-13 Japan Health Science Foundation アミロイドβオリゴマー並びにその製造方法及び使用方法
US8877190B2 (en) 2006-11-30 2014-11-04 Abbvie Inc. Aβ conformer selective anti-Aβ globulomer monoclonal antibodies
US9951125B2 (en) 2006-11-30 2018-04-24 Abbvie Inc. Aβ conformer selective anti-Aβ globulomer monoclonal antibodies
US9359430B2 (en) 2006-11-30 2016-06-07 Abbvie Inc. Abeta conformer selective anti-Abeta globulomer monoclonal antibodies
US9394360B2 (en) 2006-11-30 2016-07-19 Abbvie Inc. Aβ conformer selective anti-Aβ globulomer monoclonal antibodies
US8895004B2 (en) 2007-02-27 2014-11-25 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
WO2008104580A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Probiodrug Ag New use of glutaminyl cyclase inhibitors
EP2481408A2 (en) 2007-03-01 2012-08-01 Probiodrug AG New use of glutaminyl cyclase inhibitors
EP2865670A1 (en) 2007-04-18 2015-04-29 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
JPWO2009051220A1 (ja) * 2007-10-19 2011-03-03 イムナス・ファーマ株式会社 Ａβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用
WO2009051220A1 (ja) * 2007-10-19 2009-04-23 Immunas Pharma, Inc. Aβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用
US9090680B2 (en) 2008-02-08 2015-07-28 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to abeta oligomers and uses thereof
US8378081B2 (en) 2008-02-08 2013-02-19 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to Aβ oligomers and uses thereof
US9550824B2 (en) 2008-07-08 2017-01-24 Geneuro Sa Therapeutic use of specific ligand in MSRV associated diseases
US10059758B2 (en) 2008-07-08 2018-08-28 Geneuro Sa Therapeutic use of specific ligand in MSRV associated diseases
US9815888B2 (en) 2008-07-08 2017-11-14 Geneuro Sa Therapeutic use of specific ligand in MSRV associated diseases
US9085614B2 (en) 2008-08-01 2015-07-21 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to Aβ oligomers and uses thereof
US9090679B2 (en) 2009-04-17 2015-07-28 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to A beta oligomers and use thereof
US8858949B2 (en) 2009-08-06 2014-10-14 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof
US8613924B2 (en) 2009-08-06 2013-12-24 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to A beta oligomers and use thereof
WO2011029920A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Probiodrug Ag Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2011107530A2 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2011110613A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
US9822171B2 (en) 2010-04-15 2017-11-21 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
WO2011131748A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Probiodrug Ag Novel inhibitors
US10047121B2 (en) 2010-08-14 2018-08-14 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
US9062101B2 (en) 2010-08-14 2015-06-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
WO2012123563A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Probiodrug Ag Benz imidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
US9573994B2 (en) 2014-07-10 2017-02-21 Bioarctic Neuroscience Ab Aβ protofibril binding antibodies
EP3461819A1 (en) 2017-09-29 2019-04-03 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase

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