JP2007320934A - アミロイドβオリゴマー並びにその製造方法及び使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＡＤのようなアミロイド関連疾患の研究並びに予防及び治療に有用な新規のＡβアセンブリー及びその製造方法を提供する。さらに、そのようなＡβアセンブリーを用いたアミロイド関連疾患の研究並びに予防及び治療のための方法及び化合物等を提供する。
【解決手段】ＧＭ１ガングリオシドの存在下でインビトロで形成される可溶性毒性アミロイドβアセンブリーであって、
（ａ）サイズ排除クロマトグラフィによる見かけの分子量が約２００〜約３００kDaであること；
（ｂ）原子力間顕微鏡観察による直径が約１０〜約２０nmである球状粒子を含むこと；
（ｃ）検出可能なＧＭ１ガングリオシドを含まないこと；及び
（ｄ）培養細胞に対してアポトーシス様細胞死を誘導すること、
を特徴とするアセンブリー。
【選択図】なし

Description

本発明は、アミロイドβの可溶性毒性アセンブリー（オリゴマー）、及びその製造方法及び使用方法に関する。

アミロイドβ（以下「Ａβ」ともいう）は、アルツハイマー病（以下「ＡＤ」ともいう）患者において観察されるプラークの主要タンパク質成分であり、ダウン症候群におけるプラーク成分でもあることがわかっている。

最近、可溶性Ａβアセンブリー（「Ａβオリゴマー」とも呼ばれる）(非特許文献１)、プロトフィブリル（非特許文献２、３）又はＡβ由来拡散性リガンド（Aβ-derived diffusible ligands；「ＡＤＤＬ」とも呼ばれる）（非特許文献４、特許文献１)は、ニューロン機能に対する傷害性の強さ又は神経変性の誘導性の強さによって注目されている（非特許文献４〜１０）。

ＡＤ患者の脳及び脳脊髄液中の可溶性Ａβレベルの増大（非特許文献１１〜１３）に加えて、天然のＡβオリゴマーによるインビボでの認知機能の破壊及び長期にわたる相乗作用の阻害（非特許文献６、１４）により、これらの可溶性Ａβアセンブリーの病理学的関連性が示唆されている。可溶性Ａβアセンブリーがどのようにしてニューロンを損傷するかは未解明であるが、ニューロン膜上での標的分子への特異的結合（非特許文献１５）及びイオン恒常性（ionic homeostasis）の撹乱と関連した原形質膜のユビキタスな破壊（非特許文献１６）などのいくつかの可能性が提案されている。

可溶性Ａβアセンブリーがインビトロで形成されることが報告されている。例えば、ＡＤＤＬは、培地で希釈したＡβ溶液を約４℃で約２時間〜約４８時間インキュベートし、約４℃で約１４，０００ｇで遠心分離した後、上清中に含まれる（特許文献１）。ＡＤＤＬは、非変性ゲル電気泳動において約２６〜約２８kD、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）において約２２〜約２４kD又は約１８〜約１９kDの分子量を有し、原子間力顕微鏡による観察において約４．７〜約６．２nmの大きさであることが記載されている（特許文献１）。

また、Ａβを、ホウ酸緩衝液中で過酸化水素及びペルオキシダーゼと共に３７℃で５日間インキュベートすることにより、チロシン架橋された神経毒性オリゴマーが得られることが記載されている（特許文献２）。

遺伝性変異型であるアークティック（Arctic）型Ａβは、神経毒性の可溶性Ａβアセンブリーを形成する傾向を有している（非特許文献１０、１７、１８）。本発明者らは、最近、アークティック型Ａβは野生型Ａβと同様にＧＭ１ガングリオシドの存在下で好適に沈澱性アセンブリーを形成することを観察した（非特許文献１９、２０）。

神経成長因子（ＮＧＦ）は広範な細胞タイプの分化及び機能において重要な役割を果たすこと、及び低親和性のＮＧＦレセプター（ｐ７５^ＮＴＲ）が細胞の生存及び死において二重の役割を果たすことについて、証拠が蓄積されている。そして、不溶性Ａβアセンブリーの毒性はｐ７５^ＮＴＲとの関連を通じて現れること（非特許文献２８、２９)、及びＡＤＤＬは培養細胞におけるＮＧＦ媒介性シグナル伝達を変え得ること（非特許文献８）が示唆されている。

特表２００１−５０１９７２（ＷＯ９８／３３８１５） 特表２００４−５０１２０４（ＷＯ２００２／０００２４５）

M. B. Podlisny, et al., J Biol. Chem. 270, 9564 (1995). J. D. Harper, S.S. Wong, C.M. Lieber, P.T. Lansbury, Chem. Biol. 4, 119 (1997). D. M. Walsh, et al., J. Biol. Chem. 272, 22364 (1997). M. P. Lambert, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448 (1998). D. M. Hartley, et al., J. Neurosci. 19, 8876 (1999). D. M. Walsh, et al., Nature. 416, 535 (2002). K. N. Dahlgren, et al., J. Biol. Chem. 277, 32046 (2002). B. A. Chromy, et al., Biochemistry. 42, 12749 (2003). M. Hoshi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 6370 (2003). B. M. Whalen, D. J. Selkoe, D. M. Hartley, Neurobiol. Dis. 20, 254 (2005). A. E. Roher, et al., J. Biol. Chem. 271, 20631 (1996). M. Pitschke, et al., Nat. Med. 4, 832 (1998). Y. Gong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 10417 (2003). J. P. Cleary, et al., Nat. Neurosci. 8, 79 (2005). P. N. Lacor, et al., J. Neurosci. 24, 10191 (2004). A. Demuro, et al., J. Biol. Chem. 280, 17294 (2005). C. Nilsberth, et al., Nat. Neurosci. 4, 887 (2001). H. A. Lashuel, et al., Nature. 418, 291 (2002). K. Yanagisawa, A. Odaka, N. Suzuki, Y. Ihara, Nat. Med. 1, 1062 (1995). N. Yamamoto, et al., J Neurochem. 90, 62 (2004). C. S. Atwood, et al., J. Neurochem. 75, 1219 (2000). G. Bitan, A. Lomakin, D. B. Teplow, J. Biol. Chem. 276, 35176 (2001). R. Kayed, et al., Science. 300, 486 (2003). D. M. Walsh, et al., J. Neurosci. 25, 2455 (2005). H. Hayashi, et al., J. Neurosci. 24, 4894 (2004). P. Brocca, P. Berthault, S. Sonnino, Biophys. J. 74, 309 (1998). N. Yamamoto, et al., FEBS Lett. 569, 135 (2004). S. Rabizadeh, et al., Proc. Natl. Acad. SCI. USA. 91, 10703 (1994) M. Yaar, et al., J. Clin. Invest. 100, 2333 (1997). S.P. Lad, K.E. Neet, E.J. Mufson, Current Drug Targets-CNS & Neurological Disrders. 2, 315 (2003). N. J. Woolf, R. W. Jacobs, L. L. Butcher, Neurosci. Lett. 96, 277 (1989). N. J. Woolf, E. Gould, L. L. Butcher, Neuroscience. 30, 143-152 (1989). S. Maeda et al., Neurosci Res (in press). H.G. Hansma et al., Biophys J 68, 1672-7 (1995). F. Schroeder, W.J. Morrison, C. Gorka, W.G. Woog, Biochim. Biophys. Acta 946, 85 (1988).

本発明は、ＡＤのようなアミロイド関連疾患の研究並びに予防及び治療に有用な新規のＡβアセンブリー及びその製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、そのようなＡβアセンブリーを用いたアミロイド関連疾患の研究並びに予防及び治療のための方法及び化合物等を提供することを目的とする。

本発明者らは、特定の濃度のＧＭ１ガングリオシドの存在下で、野生型又は遺伝性変異型Ａβ、特にアークティック型Ａβから、より迅速に、より毒性の強い新規の可溶性毒性Ａβアセンブリー（soluble toxic amyloid β；以下において「ＴＡβ」ともいう）が形成されることを見出し、本発明を完成した。

本発明は、
〔１〕ＧＭ１ガングリオシドの存在下でインビトロで形成される可溶性毒性アミロイドβアセンブリーであって、
（ａ）サイズ排除クロマトグラフィによる見かけの分子量が約２００〜約３００kDaであること；
（ｂ）原子力間顕微鏡観察による直径が約１０〜約２０nmである球状粒子を含むこと；
（ｃ）検出可能なＧＭ１ガングリオシドを含まないこと；及び
（ｄ）培養細胞に対してアポトーシス様細胞死を誘導すること、
を特徴とするアセンブリー；
〔２〕アミロイドβが、野生型ペプチド又はアークティック型変異を有するペプチドである、前記〔１〕記載のアセンブリー；
〔３〕可溶性毒性アミロイドβアセンブリーの製造方法であって、単量体アミロイドβを、脂質成分のモル比で約１０〜約１５％のＧＭ１ガングリオシドを含むリポソームと共に約３５〜約４０℃で約１〜約３０時間インキュベートする工程を含むことを特徴とする方法；
〔４〕単量体アミロイドβが野生型ペプチドであり、インキュベーション時間が２０〜３０時間である、前記〔３〕記載の方法；
〔５〕単量体アミロイドβがアークティック型変異を有するペプチドであり、インキュベーション時間が１〜３時間である、前記〔３〕記載の方法；
〔６〕前記〔３〕〜〔５〕のいずれか１項記載の製造方法によって製造された可溶性毒性アミロイドβアセンブリー；
〔７〕前記〔１〕、〔２〕又は〔６〕記載の可溶性毒性アミロイドβアセンブリーを含む液体を、５４０，０００×ｇで１５分間又は同等の条件で遠心分離して、上清を回収することを特徴とする、可溶性毒性アミロイドβアセンブリーの精製方法；
〔８〕前記回収された上清を、さらにサイズ排除クロマトグラフィに供することを特徴とする、前記〔７〕記載の方法；
〔９〕前記〔７〕又は〔８〕記載の精製方法によって精製された可溶性毒性アミロイドβアセンブリー；
〔１０〕可溶性毒性アミロイドβの神経毒性を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（ａ）培養細胞を、前記〔１〕、〔２〕、〔６〕又は〔９〕のいずれか１項記載の可溶性毒性アミロイドβアセンブリー及び被検物質の存在下でインキュベートする工程、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記培養細胞の生死を測定する工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた結果を、被検物質を含まない状態で工程（ａ）を行なった場合の結果と比較する工程
を含むことを特徴とする方法、
を提供する。

本発明の可溶性毒性Ａβアセンブリーは、ＡＤＤＬや不溶性アセンブリー（フィブリル）等と比較して顕著に強力な毒性を有する。したがって、毒性に影響する化合物等の検出において非常に高感度である。

また、本発明のＴＡβはＮＧＦレセプターへの結合を介して各種のニューロン又は非ニューロン細胞にアポトーシス様の細胞死を誘導することがわかっており、よく特徴づけられているので、ＡＤ等の疾患及びアポトーシスの研究において非常に有用である。

本発明のＴＡβは、Ａβを、その遺伝型に適した濃度のＧＭ１ガングリオシドを含むリポソームの存在下でインキュベートすることにより生成される。ＴＡβの製造に使用する単量体Ａβとしては、野生型であっても変異型であってもよいが、毒性の強さ等の点から、変異型のもの、特にＡβドメインの内部に変異が存在する型（例えば、イタリアン（Italian）型、アークティック（Arctic）型、フレミッシュ（Flemish）型など）のものが好ましく、アークティック型のものが最も好ましい。

アークティック型変異は、ヒトのアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）のコドン６９３に位置するアミノ酸の置換（グルタミン酸がグリシンで置換されている；Ｅ６９３Ｇ）であり、この変異はＡβにおいて２２番目のアミノ酸の置換に相当する。本発明に関して、アークティック型という場合、ヒト以外の動物に由来する配列において上記の変異に相当する変異を有するものも含む。他の変異型についても同様であり、ヒトにおける各変異に相当する他の動物における変異をも包含する。

本発明において使用するＡβは、溶解後に超遠心に供することによってＡβ重合の種（seed）となりうる不溶性ペプチドを予め除去しておくことができる。

本発明において使用される、ＧＭ１ガングリオシドを含むリポソームは、アミロイドフィブリル形成に必要とされるよりも低い、全脂質成分中のモル比が約１０／１００〜約１５／１００（約１０〜約１５モル％）の割合のＧＭ１ガングリオシドを含有していればよく、公知の一般的な方法で調製することができる。この特定の濃度のＧＭ１ガングリオシドの存在下でＴＡβが好適に形成される理由は解明されていないが、ＧＭ１ガングリオシドの横方向の分布が分子のオリゴ糖鎖の空間的配置に影響することが示唆されており（非特許文献２６）、特定の濃度のＧＭ１ガングリオシドは、ＧＭ１ガングリオシドのコンフォメーションを調節し、ＴＡβ形成に好ましい微細環境を提供する可能性があると考えられる。

脂質混合物中のＧＭ１ガングリオシド以外の成分は、コレステロール又はリン脂質であればよく、リン脂質としては脳内に存在するリン脂質が好ましい。このようなものとしては、例えば、コレステロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン等が挙げられ、コレステロール、スフィンゴミエリンが好ましい。リン脂質は１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。脂質混合物中のＧＭ１ガングリオシド以外の成分は、最も好適には、コレステロール及びスフィンゴミエリンを含む。特にコレステロール：スフィンゴミエリンのモル比が０．５：１．５〜１．５：０．５の割合であることが望ましい。その中でもコレステロール：スフィンゴミエリンのモル比が０．５：１〜１：０．５程度、さらには０．８：１．２〜１．２〜０．８程度の割合の混合物が、ＧＭ１ガングリオシドがＴＡβ形成に好ましいコンフォメーションとなるための微細環境を与える可能性が高く、好ましいと考えられ、１：１のモル比の混合物が最も好ましい。

具体的には、ＧＭ１ガングリオシドを含む好適なリポソームは、例えば、後述するように、コレステロール：スフィンゴミエリン：ＧＭ１ガングリオシドのモル比が４５：４５：１０〜４２．５：４２．５：１５（即ち、脂質混合物中のＧＭ１ガングリオシドの割合がモル比で１０〜１５％）となるように脂質混合物を調製し、これを使用直前に適当な緩衝液（例えばトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ））に懸濁させることにより調製することができる。

ＧＭ１ガングリオシドを含むリポソームとＡβとのインキュベーションは、溶液中で各々を適当な濃度で一緒にすることによって開始することができる。例えば、このようなインキュベーション混合物（ＧＭ１ガングリオシドを含むリポソームとＡβとを含む溶液）中の終濃度として、Ａβが１０〜２００μM、好ましくは２５〜１００μM程度である場合に、ＧＭ１ガングリオシドが３０〜５００μM、好ましくは６２〜３７５μM程度、特に好ましくは１００〜２００μM程度、リポソーム構成脂質全体としては０．３〜５mM、好ましくは０．６２〜３．７５mM、特に好ましくは１〜２mM程度で、両者を溶液中で共存させる。
ＴＡβ形成のためのインキュベーションは、一般的には約２０〜約４０℃（好ましくは約３７℃、即ち約３５〜約４０℃程度）で、約１〜約３０時間行なうことができるが、用いるＡβに応じて適宜最適な条件を選択することができる。例えば野生型ペプチドを用いる場合、約３５〜約４０℃（特に約３７℃）で約２０〜３０時間；アークティック型Ａβを用いる場合、約３５〜約４０℃（特に約３７℃）で約１〜約５時間（特に約１〜約３時間）のインキュベーションがそれぞれ最適である。

インキュベーション時間の選択は重要である。ＴＡβは、インキュベーション時間中の初期に出現し、その後のインキュベーションを通じて消失する傾向がある。このことは、ＴＡβがより大きいＡβアセンブリーを形成する過程での中間体でもある可能性を示唆する。また、従来からの証拠、特にインビトロにおいてインキュベーション期間の初期に可溶性Ａβアセンブリーが形成され、その後しばしば成熟したフィブリルが出現すること（非特許文献２、１０）やある種のＡβフィブリル生成の阻害剤がＡβオリゴマー生成を強力にブロックすること（非特許文献２４）は、可溶性Ａβアセンブリー及びプロトフィブリルが、アミロイドフィブリル形成の中間体として形成されることを示唆している。

しかし、上記のように、本発明のＴＡβは一般にアミロイドフィブリル形成に必要とされるＧＭ１ガングリオシド濃度よりも低い濃度のＧＭ１ガングリオシドの存在下で好適に形成されること、及び後述するようにＴＡβ形成はアミロイドフィブリル形成の種（ＧＭ１ガングリオシドとＡβとが１分子ずつ結合したもの）に対して特異的な抗体によって阻害されないこと等から、ＴＡβが、アミロイドフィブリル形成を直線的にもたらす経路とは異なる経路を介して形成されることが示されている。

本発明のＴＡβは、上記のような条件下でのインキュベーション後に好適に形成され、インキュベーション混合物中に含まれる。本発明のＴＡβが形成されるのに好ましい条件下ではフィブリル（不溶性アセンブリー）はほとんど又は全く形成されないと考えられるが、必要であれば、このインキュベーション混合物を例えば５４０，０００×ｇ、１５分間又は同等の条件で遠心分離して上清を回収することにより、本発明のＴＡβを濃縮又は部分精製することができる。ここで「同等の条件」とは、指定された条件での遠心分離と実質的に同じ分離をもたらす条件を指す。また、回収された上清をさらにサイズ排除クロマトグラフィに供し、ＴＡβを含む画分を回収することにより、ＴＡβをさらに精製することができる。

後述するように、本発明のＴＡβは、少なくとも、ラット一次培養ニューロン；ネイティブな又はＮＧＦ処理により分化させたＰＣ１２細胞、ヒト脳微小血管（microvascular）内皮（ｈＢＭＥ）細胞、ヒト脳星状膠細胞（ｈＡＳＴ）、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＳＹ５Ｙ）細胞、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、マウス単球ＲＡＷ２６４．７（ＲＡＷ２６４）細胞を含む培養細胞（非ニューロン細胞を含む）に対して、アポトーシス様の特徴を呈する細胞死を誘導することができる。したがって、本発明のＴＡβの存在は、例えばこのようなインキュベーション混合物又はその遠心上清もしくは画分をこれらのＴＡβ感受性の培養細胞に添加して、細胞死が誘導されるか否かを調べることにより、確認することができる。細胞の生死の判定は、公知の方法、例えば後述するような公知の色素による染色や乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイ等により、容易に行なうことができる。

本発明のＴＡβは、その毒性の強さに最大の特徴を有する。一例として、後述するＰＣ１２Ｎ細胞を本発明のＴＡβ（Ａβ濃度２５μM）とともに３７℃で４８時間インキュベートした場合、ＬＤＨ放出率（即ち、細胞をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で溶解させ、全細胞中のＬＤＨを放出させた場合のＬＤＨ放出量に対する、検体で処理した場合のＬＤＨ放出量の百分率）で判定して、少なくとも３０％、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上のＬＤＨ放出率を示し、ほぼ完全に細胞を死に至らせることができる。なお、ＬＤＨ放出率による細胞毒性の試験においては、細胞膜が壊れて細胞内から放出されたＬＤＨ量を指標としているが、アポトーシスによる細胞死の場合は細胞が死んでいてもしばらくは細胞膜が壊れない（例えば細胞の萎縮）ためにＬＤＨが放出されないものがある。したがって、ＬＤＨ放出率で約７０％程度以上であれば細胞がほぼ全て死んでいる状態であり、上記のような本発明のＴＡβによるＬＤＨ放出率は非常に高いものである。

また、後述する方法でラット一次培養ニューロンを本発明のＴＡβ（Ａβ濃度２５μM）とともに３７℃で４８時間インキュベートし、色素染色により細胞の生死を判定した場合、生存ニューロンの数は、本発明のＴＡβを含まない対象培養物と比較して７５％以下、好ましくは６０％以下、より好ましくは４０％以下、最も好ましくは２０％以下となる。

本発明のＴＡβのこの毒性は、Ａ１１抗オリゴマー抗体（anti-Oligo）によって抑制される。Ａ１１抗体は、アミロイド形成性タンパクのオリゴマーに対して特異的な抗体であり、例えば可溶性のＡβ４０オリゴマーとは反応するが、可溶性の単量体Ａβ４０又はＡβ４０フィブリルとは反応しない。

本発明のＴＡβは、不溶性であるアミロイドフィブリル又は公知の他の可溶性アセンブリーとは全く異なる形態を有する。例えば、本発明のＴＡβは通常の電子顕微鏡によって観察されない一方、原子力間顕微鏡により、直径約１０〜約２０nmの球状粒子として見える構造を含む。ここでいう直径は、原子力間顕微鏡（ＡＦＭ）の原理に従い、試料から得られる高低差をもって長さとするものであり、断面解析法によって測定されたものである。

また、本発明のＴＡβは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ではバンドを形成せず、サイズ排除クロマトグラフィによる分子量測定では約２００〜約３００kDaにピークを有する。さらに、ＴＡβ中にＧＭ１ガングリオシドは検出されない。アミロイドフィブリル形成の種に対する抗体（４３９６Ｃ、非特許文献２５）は、アミロイドフィブリル形成を阻害するが、本発明のＴＡβの生成はこの抗体によって阻害されない。

したがって、本発明のＴＡβは、ＡＤＤＬ等の公知のオリゴマーや公知のフィブリルとは明らかに異なるものである。

ＴＡβは、インビボにおいても形成され、病理学的な役割を有していると考えられる。本発明のＴＡβは、シナプトソーム、特に老化したマウス脳の海馬由来のシナプトソームの存在下で有意に形成される。このことは、シナプトソーム中のＧＭ１ガングリオシドの密度は年齢及びアポリポタンパク質Ｅ４の発現に伴って増大するという本発明者らの最近の観察（非特許文献２７）とともに、インビボで、特にＡＤ発症のリスク因子と関連した海馬のような脳の特定の領域において、ＴＡβが形成され得ることを示唆している。また、ＴＡβのような可溶性Ａβアセンブリーは、インビボにおいてＡＤにおけるコリン作用性基底前脳におけるＮＧＦ依存性ニューロンの喪失の原因となると考えられる。
したがって、ＴＡβの毒性を低減又は阻止する物質は、ＡＤのようなアミロイド関連疾患の予防又は治療において重要である。

本発明のＴＡβは、その特性（例えば毒性）に影響を与える物質をスクリーニングするために使用することができる。例えば、本発明のＴＡβに対して感受性の培養細胞を、本発明のＴＡβ及び被検物質の存在下でインキュベートした後、培養細胞の生死を測定することにより、被検物質がＴＡβの特性に影響を与えたか否かを調べることができ、所望の影響を与える物質を同定することができる。

ここで使用される培養細胞としては、ＴＡβに対して感受性のものであればよく、一次培養であっても樹立された株細胞であってもよい。例としては、上述したようなＴＡβによって細胞死を誘導される細胞が挙げられるが、これらに限らない。

被検物質としては、特に制限はなく、一般的には低分子化合物、ペプチド、タンパク質（抗体及びそれらの改変物を含む）、核酸（一本鎖又は二本鎖の高分子又は低分子ＤＮＡ又はＲＮＡ等）、植物・動物等の抽出物等の混合物、ウイルス・細菌等の微生物等が挙げられる。

細胞の生死は上述のように公知の方法で測定することができる。被検物質を含まない状態でインキュベーションを行なった場合の結果と比較して、被検物質を含む場合に細胞死が増大しているのであれば、その被検物質はＴＡβの毒性を増強する可能性があり、細胞死が低減しているのであれば、その被検物質はＴＡβの毒性を抑制する作用を有すると判定することができる。なお、前者の場合にその被検物質が固有の毒性を有するかどうかは、別途その被検物質の存在下でＴＡβの不存在下で同様の試験を行なうことにより調べることができる。

上記のようなスクリーニングによって、ＴＡβの毒性を抑制する作用を有すると判定された物質は、医薬候補物質として選択することができる。

本発明のＴＡβは、ＮＧＦレセプターに対してＮＧＦと競合的に結合する。即ち、本発明のＴＡβにより誘導される細胞死は、ＮＧＦの存在下では有意に抑制される。また、ＮＧＦレセプターｐ７５^ＮＴＲ及びＴｒｋＡのいずれかのノックダウンによっても、ＴＡβにより誘導される細胞死が顕著に抑制される。これを利用して、ＴＡβの毒性を抑制する化合物をスクリーニングすることができる。

この方法においては、上記と同様に、本発明のＴＡβに対して感受性の培養細胞を、本発明のＴＡβ及び被検物質の存在下でインキュベートした後、培養細胞の生死を測定することにより、ＴＡβの毒性を抑制する化合物を同定することができる。この場合、被検物質を含まない状態でインキュベーションを行なった場合の結果と比較して、被検物質を含む場合に細胞死が低減しているのであれば、その被検物質はＮＧＦレセプターへのＴＡβの結合を抑制する可能性があると判定することができる。

Ｉ．可溶性毒性Ａβアセンブリー（ＴＡβ）の製造
１．Ａβ溶液
合成Ａβ(Ａβ１−４０)（野生型、アークティック型ともペプチド研究所にて合成、大阪、日本）を、５００μMの濃度となるように０．０２％アンモニア溶液に溶解した。この溶液を、「Optima TL」（商品名、Beckman, USA）超遠心機を用いて５４０，０００×ｇで３時間遠心分離して、種として作用し得る不溶性のペプチドを除去した。得られた上清（以下「種無含有Ａβ溶液」ともいう）を集め、アリコートに小分けして使用時まで−８０℃で保存した。
使用の直前に、アリコートを融解し、トリス緩衝生理食塩水(ＴＢＳ:１５０mM ＮａＣｌ及び１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４)で希釈した。

２．リポソームの調製
リポソームの調製のためには、コレステロール（シグマ社、カタログ番号：Ｃ８６６７）、スフィンゴミエリン（シグマ社、カタログ番号：Ｓ７００４）、及びＧＭ１ガングリオシド（マトレア社、カタログ番号：１０６１）を、５０：５０：０、４５：４５：１０、４２．５：４２．５：１５、又は４０：４０：２０のモル比で、合計脂質濃度が１５mMになるように（即ち、ＧＭ１ガングリオシド濃度はそれぞれ０mM、１．５mM、２．２５mM、又は３．０mM）クロロホルム／メタノール（１：１、容量比）溶液中に溶解した。したがって、リポソームを構成する全脂質分子の中でのＧＭ１ガングリオシドの割合は、それぞれ０％、１０％、１５％、２０％であった。この脂質混合物溶液を８６μLずつガラスチューブに分注し、窒素ガス（４０℃）を1時間吹き付けて溶媒を蒸発させた。この脂質混合物を使用時まで−８０℃で保存した。

使用直前に、各ガラスチューブに１００μLのＴＢＳ（ｐＨ７．４）を加えて脂質混合物をＴＢＳ中に再懸濁させ、この懸濁液を、凍結融解を１０回繰り返した後、ソニケーター(TOMY UD-201、output=2、continuous mode)で５分間、３回超音波処理に供した。この操作により、脂質混合物が直径約５００μm以下程度の均一な球状のリポソームとなった。

３．Ａβとリポソームとのインキュベーション（ＴＡβの調製）
上記１．で調製した種無含有Ａβ溶液を希釈し、上記２．の各リポソーム含有ＴＢＳ溶液を１０倍希釈になるように添加して、３７℃で２時間（比較のために２４時間でも行なった）インキュベートした。このインキュベーション混合物における終濃度は、Ａβが５０μM、リポソーム濃度（合計脂質濃度）が１２５０μM（そのうち、ＧＭ１ガングリオシド濃度は０μM、１２５μM、１８７．５μM、又は２５０μM）であった。

II．ＴＡβの特徴づけ
上記で調製した種無含有Ａβ（Ａβ１−４０）溶液（野生型又はアークティック型）とＧＭ１ガングリオシド含有リポソームとの種々のインキュベーション混合物を用いて、ＴＡβの神経毒性、形態等の特徴づけを行なった。

１．一次培養ニューロンに対する神経毒性試験
一次培養ニューロンとして、大脳皮質ニューロンを、Sprague-Dawleyラット１７日胚から調製し、Dulbecco’ｓ modified Eagle medium nutrient 混合物（商品名；Invitrogen社、カタログ番号：１２８００−０１７）及びＮ２サプレメント（「N2-supplement」（商品名；Invitrogen社、カタログ番号：１７５０２−０４８）からなる無血清培地中で培養した（５％ＣＯ_２、３７℃、加湿下）。

この一次培養ニューロン（細胞数１．５×１０^４個／well）を、上記の各インキュベーション混合物で処理した（インキュベーション混合物：培地＝１：１、Ａβ濃度２５μM、処理時間は４８時間）。ニューロンを、カルセインＡＭ（calcein AM, Invitrogen, Carlsbad, CA）・エチジウムホモダイマーで染色した。これにより生細胞は緑色、死細胞は赤色にそれぞれ染色される。

結果を、図１、パネル（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
パネル（Ａ）は、ＧＭ１ガングリオシド含量０％（上段）、１０％（中段）、２０％（下段）のリポソームを含む、Ａβを含まない（左列）又は野生型（「wild」）Ａβ（中央列）もしくはアークティック型（「Arctic」）Ａβ（右列）を含むインキュベーション混合物（３７℃、２時間）で処理した細胞の光学顕微鏡写真を表す。右下のバーは５０μmである。

パネル（Ｂ）は、示した条件下でＧＭ１ガングリオシドの存在下又は不存在下で５０μM（インキュベーション混合物中の終濃度）で３７℃、２時間プレインキュベートされた野生型又はアークティック型のＡβで処理された、生存している一次培養ニューロンの数を示す。各カラムは、ＡβもＧＭ１ガングリオシドも含まない対照培養物（ＧＭ１ ０％、Ａβ（−））に対するパーセンテージの３つの値の平均値（±ＳＤ）であり、*はＰ＜０．０００１を表す。

これらの結果から、１０％のＧＭ１ガングリオシドを含むリポソームの存在下で３７℃で２時間プレインキュベートされたアークティック型Ａβで処理された培養において、非常に顕著なニューロン死が観察された。したがって、以降の実験においては、この条件下で形成されたＴＡβを基本的に用いた（即ち、特にそれと異なる条件を示していない限り、この条件下で形成されたＴＡβである）。

２．神経成長因子（ＮＧＦ）で分化させたＰＣ１２細胞に対する毒性試験
ラットのクロム親和性細胞腫（pheochromocytoma）ＰＣ１２細胞を、１０％熱非働化ウマ血清(Invitrogen)及び５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）(Invitrogen)を添加したDulbecco’s modified Eagle’s medium(ＤＭＥＭ）（商品名、Invitrogen, Carlsbad, CA）中で培養した。

ＰＣ１２細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングした（１０mg／mL）２cm²ディッシュに２０，０００細胞／cm²の密度で播き、１００ng／mL神経成長因子（ＮＧＦ; Alomone Labs, Jerusalem, Israel)を添加したＤＭＥＭ中で６日間培養し、分化させた(以下「ＰＣ１２Ｎ」細胞ともいう)。

この細胞を一次培養ニューロンの代わりに用いて、上記と同様に、インキュベーション混合物で処理し、細胞を観察した。

結果を図１、パネル（Ｃ）に示す。この図において、右端（Ａβ（＋）／ＧＭ１（＋））は、ＧＭ１ガングリオシド（１０％）を含むリポソームの存在下で３７℃で２時間プレインキュベートされたアークティック型Ａβを含むインキュベーション混合物で処理した細胞である。同様に、中央左（Ａβ（＋）／ＧＭ１（−））はＡβのみ、中央右（Ａβ（−）／ＧＭ１（＋））はＧＭ１ガングリオシドのみ、左端（Ａβ（−）／ＧＭ１（−））はＴＢＳのみをそれぞれ含むインキュベーション混合物で処理した細胞である。

ＮＧＦ処理したＰＣ１２細胞もまた、ＧＭ１ガングリオシドの存在下でアークティック型Ａβから形成された毒性のＡβアセンブリーに対して感受性であることが確認された。以下の実験においては、主にＰＣ１２Ｎ細胞を用いた。

３．ＴｈＴアッセイ
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は、アミロイドフィブリル構造を特異的に認識する。インキュベーション混合物中のアミロイドフィブリル構造の有無又は量を調べるために、上記の各インキュベーション混合物のＴｈＴ蛍光強度を、分光蛍光光度計（RF-5300PC）（島津、京都、日本）を用いて測定した。アミロイドフィブリルの至適蛍光強度は、励起及び発光波長をそれぞれ４４６nm及び４９０nmとして、５μM ＴｈＴ及び５０mM グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）を含む１．０mLの反応混合物（インキュベーション混合物１０μlを含む）を用いて測定した。蛍光強度は、反応混合物を調製した直後に測定した。

結果を図２、パネル（Ａ）に示す。この図は、ＧＭ１ガングリオシド含量０％、１０％、２０％のリポソームを含むＡβなし（「Ａβ（−）」；白抜き）、野生型Ａβ（「wild」；斜線）、アークティック型（「Arctic」；黒塗り）のインキュベーション混合物についての結果である。

ＴｈＴの蛍光強度は、神経毒性の強さと一致せず、強い神経毒性を示したアークティック型Ａβ及びＧＭ１ガングリオシド（１０％）を含むインキュベーション混合物において低いレベルのままであった。したがって、この結果から、高い神経毒性を示すＡβアセンブリーがアミロイドフィブリルではないことが示された。

４．乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイ
上記２．の実験におけるのと同様にしてＰＣ１２Ｎ細胞を用意した。
ＰＣ１２Ｎ細胞を、上記Ｉ．と同様にして調製した各インキュベーション混合物で処理した（細胞数１．５×１０^４個／well、３７℃、処理時間４８時間、インキュベーション混合物：培地＝１：１）。

これらの細胞の培地をサンプルとして、「LDH assay toxicity kit」(商品名、Promega, Madison, WI)を用いてＬＤＨアッセイを行なった。各サンプル中のＬＤＨ放出の程度は、「Emax precision」（商品名、Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA）マイクロプレートリーダーを用いて４９０nmでの吸収を測定することによって評価した。バックグラウンドの吸光度は、細胞を含まないウェルを用いて測定し、各テストサンプルの吸光度から引き算した。キットに添付の指示書にしたがって、３つのウェルで測定した吸光度を平均し、細胞内のＬＤＨ放出を誘発するために１％Triton Ｘ−１００で処理した各テストサンプルについての測定値で割って、ＬＤＨ放出率（％）を算出した。

その結果を、図２、パネル（Ｂ）に示す。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示し、*は、ｐ＜０．０００１（one-way ANOVA combined with Scheffe’s test）を表す。カラムは、ＧＭ１ガングリオシド含量０％、１０％、２０％のリポソームを含むＡβなし（「Ａβ（−）」、即ちＴＢＳのみの対照；白抜き）、野生型Ａβ（「wild」；斜線）、アークティック型（「Arctic」；黒塗り）である。アークティック型Ａβについては、２時間のインキュベーションの場合、１０％又は１５％のＧＭ１を含むリポソームの存在下で細胞死を起こす毒性が見られた。一方、野生型Ａβについては、２時間のインキュベーションではほとんど毒性が示されず、２４時間のインキュベーションの場合により高濃度（１５％又は２０％）のＧＭ１ガングリオシドの存在下で毒性が見られた。

最も強い毒性を示した、ＧＭ１ガングリオシド（１０％）を含むリポソームの存在下で３７℃で２時間インキュベートされたアークティック型Ａβを含むインキュベーション混合物を、５４０，０００×ｇ、１５分、４℃で超遠心して上清及び沈殿物をそれぞれ回収した。これらの上清、沈殿物及び遠心前のインキュベーション混合物の各々を用いて、上記と同様にＬＤＨ放出アッセイを行なった。比較のため、Ａβのみ（Ａβ＋／ＧＭ１−）、ＧＭ１ガングリオシドのみ（Ａβ−／ＧＭ１＋）、ＴＢＳのみ（Ａβ−／ＧＭ１−）についても同様にインキュベーション混合物を調製してＬＤＨアッセイを行なった。

結果を図２、パネル（Ｃ）に示す。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示し、*は、ｐ＜０．０００１を表す。ＧＭ１ガングリオシド存在下でインキュベートされた遠心前のＡβインキュベーション混合物（「whole」）が示した毒性は、超遠心によって得られた上清（「sup」）中のみに回収され、沈澱物（「ppt」）は毒性をほとんど示さなかった。

これらの結果から、アークティック型及び野生型Ａβから、それぞれ好適な濃度のＧＭ１ガングリオシドの存在下で形成されたアセンブリーが、毒性の可溶性Ａβアセンブリーであることが示された。

５．ＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＴＡβの生物物理学的及び構造的特徴を決定するために、ＴＡβを含むインキュベーション混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。Schagger et al., Analytical Biochemistry Vol. 166, 368-379, 1987に記載の方法に基づいて、陽極バッファーを０．２M トリス（ｐＨ８．９）、陰極バッファーを０．１M トリス−０．１M トリシン−０．１％ ＳＤＳ緩衝液として、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル(第一化学ミニゲル)を使用し、４０mA（定流）で３０分間泳動した。このゲルをニトロセルロース紙に６０mAで１時間ブロットし、Ａβを認識するモノクローナル抗体（６Ｅ１０、Signet Laboratories (Dedham, MA)）を検出用に用いてウェスタン・ブロットを行なった。

しかし、バンドは全く検出されなかった。これは、可溶性Ａβアセンブリーは、細胞培養中のある種のオリゴマー（非特許文献１）を除き、架橋されていない（非特許文献２１、２２）場合、変性ゲル電気泳動で解離（disaggregated）する（非特許文献３）という従来の知見と一致した。

６．ドット・ブロット解析
次に、アークティック型Ａβのみ、ＧＭ１ガングリオシド（１０％）を含むリポソームのみ、又はアークティック型Ａβ及びＧＭ１ガングリオシド（１０％）を含むリポソームをそれぞれ含むインキュベーション混合物の上記と同様の条件での超遠心によって得られた上清（「sup」）を用いて、非特許文献２３の方法によりドット・ブロット解析を行なった。比較のため、遠心前のインキュベーション混合物（「whole」）も同様に用いた。

各サンプルをドットしたニトロセルロース紙（ブロット）を、抗オリゴマー抗体「anti-Oligo」（Biosource Inc., Camarillo, CA）又はＨＲＰ結合コレラトキシンサブユニットＢ「ＣＴＸ」（Sigma, St. Louis, MO）と反応させた。反応条件は４℃で一晩、検出方法としてＥＣＬ（化学発光）を用いた。なお、ＣＴＸはＧＭ１ガングリオシドと特異的に反応する天然のリガンドである。

結果を図３、パネル（Ａ）に示す。アークティック型Ａβ及びＧＭ１ガングリオシド（１０％）含有リポソームを含むインキュベーション混合物中のＴＡβは、anti-Oligoによって容易に認識されたが、ＣＴＸとの反応性は上清中に回収されなかった。したがって、ＴＡβはＧＭ１ガングリオシドを含まないと考えられる。

７．抗オリゴマー抗体によるＴＡβ毒性の抑制
ＴＡβ毒性に対する抗体の影響を調べるために、上記４．の実験と同様に、上記Ｉ．と同様に調製したインキュベーション混合物（１０％ ＧＭ１ガングリオシド（１２５μM）＋５０μM アークティック型Ａβ）を用いて、０．３μM濃度のanti-Oligo抗体とともに３７℃で１２０分間プレインキュベーションした後、ＰＣ１２Ｎ細胞でＬＤＨ放出アッセイを行なった。対照として、anti-Oligoの代わりにＩｇＧを用いた。

結果を図３、パネル（Ｂ）に示す。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示し、*は、ｐ＜０．０００１を表す。ＴＡβの毒性、即ち、ＰＣ１２Ｎ細胞からのＴＡβ誘導ＬＤＨ放出は、インキュベーション混合物をanti-Oligoとプレインキュベーションすることによって有意に抑制された。

８．電子顕微鏡による形態観察
電子顕微鏡での観察は以下のようにして行なった。サンプルを水で希釈し、カーボンコーティングしたグリッド上に拡げた。このグリッドを、２％ウラニルアセテートでネガティブ染色し、加速電圧１００ｋVで透過型電子顕微鏡（JEM-2000EX、JEOL、東京、日本）で観察した（倍率：５０，０００倍）。比較のため、非特許文献１７に記載された方法にしたがってプロトフィブリルを調製して同様に観察した。

結果を、図４、パネル（Ａ）に示す。パネル（Ａ）において、左側（「Ａ」）は、プロトフィブリル形成可能なように非特許文献１７の方法でインキュベートされたアークティック型Ａβを含むインキュベーション混合物、右側（「Ｂ」）は、ＴＡβを含有するインキュベーション混合物（ＧＭ１（１０％）、アークティック、３７℃、２時間）の電子顕微鏡写真（右下のバーは１００μm）である。

「Ａ」においてプロトフィブリルの典型的な構造が観察された。これに対し、「Ｂ」においては確実な構造は観察されなかった（丸く見えるのはリポソームである）。したがって、本発明のＴＡβは、以前に報告されたとおりに調製されたプロトフィブリル(非特許文献１７)が容易に検出可能な条件下で、電子顕微鏡によって観察されなかった。

９．原子力間顕微鏡（ＡＦＭ）による形態観察
ＡＦＭでの評価は、非特許文献１に記載されたとおりに行なった。ＧＭ１ガングリオシドのみ又はＡβのみを含むインキュベーション混合物、又は両者を含むインキュベーション混合物を５４０,０００×ｇ、１５分、４℃で超遠心した後の上清（「Ａβ＋ＧＭ１」；ＧＭ１（１０％）、アークティック、３７℃、２時間）の各サンプルを新たに切断した雲母の上に滴下した。３分間放置した後、水で洗浄し、サンプルを、tapping modeに設定した「Nanoscope IIIa」(商品名、Digital Instruments, Santa Barbara, CA, USA)を用いて（非特許文献２）溶液中で評価した。カンチレバーとして「OMCL-TR400PSA」(商品名、Olympus, Japan)を使用した。共鳴周波数（resonant frequency）は約９kHzであった。振幅（amplitude）範囲は０．１Ｖであった。

結果を図４、パネル（Ｂ）に示す。右下のバーは２００nmである。電子顕微鏡を用いた場合と異なり、ＡＦＭを用いた場合には、直径約１０〜約２０nmの球状粒子が、棒状構造物と共に、ＴＡβを含むインキュベーション混合物の超遠心によって得られた上清（「Ａβ＋ＧＭ１」）中に観察された。アークティック型Ａβのみ（左上）又はＧＭ１ガングリオシド（１０％）のみ（左下）を含むインキュベーション混合物の上清には、確実な構造は何も観察されなかった。
なお、球状粒子の直径の測定は、上記「Nanoscope IIIa」及びそれに内臓されているソフトウェアを用いて行なった。

１０．サイズ排除クロマトグラフィによるＴＡβの分子量の測定
サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）及びanti-Oligoを用いたドット・ブロット解析によってＴＡβの分子の大きさを決定した。Ａβのみ又は「Ａβ＋ＧＭ１」サンプル（１０％ ＧＭ１ガングリオシド及び５０μM アークティック型Ａβを３７℃で２時間インキュベートした後、５４０,０００×ｇ、１５分、４℃の超遠心を行なって得た上清を、流速０．５mL／minでＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化した「Superose 12」（商品名）サイズ排除カラム(１cm×３０cm、Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)に適用した。１mLずつの３５個のフラクションを集めて、前記６．と同様にしてanti-Oligoを用いたドット・ブロットにより解析した。３５のフラクションの溶出サンプルをニトロセルロース膜上にドットした。このブロットを、anti-Oligo抗体と反応させた。

結果を図４、パネル（Ｃ）に示す。左側がサンプルとしてＡβのみ、右側が「Ａβ＋ＧＭ１」の遠心後上清を用いた結果である。フラクション２及び４は、それぞれＴＡβ及びモノマーＡβを含むフラクションに相当する。
anti-Oligoとの免疫反応性は、「Ａβ＋ＧＭ１」サンプルにおいて、相対分子量約２００〜約３００kDaの単一ピークとして回収された。これは、アークティック型Ａβから形成される、アミロイドポア(非特許文献１８)と呼ばれるある種の可溶性Ａβアセンブリーと同様であった。しかし、アミロイドポアは中央部にできた穴のような構造を有し、写真上はドーナツのように見えるのに対し、ＴＡβにはポアは観察されなかった。

１１．アミロイドフィブリル形成の種に対する抗体によるＴＡβ形成の阻害
アミロイドフィブリル形成のための種に対して特異的なモノクローナル抗体（４３９６Ｃ）（非特許文献２５）によってＴＡβ形成が阻害されるかどうかを調べた。

０、０．３、１又は３μMの４３９６Ｃ又は抗Ａβモノクローナル抗体（４Ｇ８）と共にＧＭ１ガングリオシド（１０％）を含むリポソームの存在下で５０μM（インキュベーション混合物中の終濃度）で３７℃で２時間インキュベートされたアークティック型Ａβを含むインキュベーション混合物のＴｈＴ蛍光強度を、上記と同様にして調べた。

結果を図５、パネル（Ａ）に示す。抗Ａβモノクローナル抗体（４Ｇ８）は、ＴｈＴ蛍光強度に影響しなかったが、４３９６Ｃ抗体が共存すると濃度依存的にＴｈＴ蛍光強度が低減し、４３９６Ｃ抗体はアミロイドフィブリル形成を阻害することが確認された。

また、０．３μMの４３９６Ｃ抗体の存在下又は不存在下で、ＧＭ１ガングリオシド（１０％）を含むリポソームの存在下でプレインキュベートされた（３７℃、２時間）アークティック型Ａβで処理されたＰＣ１２Ｎ細胞を用いて、上記と同様にＬＤＨ放出アッセイを行なった。対照としてＩｇＧ ２ａ（シグマ社、カタログ番号：Ｍ９１４４）を用いた。

結果を図５、パネル（Ｂ）に示す。４３９６Ｃ抗体は、ＴＡβ生成を阻害しなかった。

１２．シナプトソーム存在下でのＴＡβの形成
天然のニューロン膜の存在下でＴＡβが形成され得るかどうかをテストした。
シナプトソームは、以前報告されたとおりに調製した（非特許文献３）。３つの異なる年齢群（１ヵ月、１年、２年）のマウス脳の海馬又は海馬を除いた脳全体を、０．２５mM ＥＤＴＡを含有する０．３２Ｍショ糖緩衝液中でホモジナイズした。このホモジネートを、５８０×ｇで８分間遠心分離した。その上清を、１４５，０００×ｇで２０分間遠心分離した。得られたペレットを、ＥＤＴＡ無含有の０．３２Ｍショ糖緩衝液中に懸濁させ、ショ糖緩衝液中のFicoll（商品名、シグマ社）上に重層した。８７，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、シナプトソームが濃縮された界面を採取し、これを再度遠心分離して残存するFicollを除いた。

アークティック型Ａβを、マウス脳から調製したシナプトソームの存在下でインキュベートした。アークティック型Ａβを、５０μM（インキュベーション混合物中の終濃度）で３７℃で２時間、調製された各シナプトソーム（１００μg／mL protein）の存在下又は不存在下で、ＧＭ１ガングリオシドに対して特異的な抗体（「anti-GM1」）又はanti-Oligo抗体（０．３μM）と共に又はそれらなしに、プレインキュベートした（３７℃、２時間）。対照としてＩｇＧを用いた。

ＴＡβ形成を、これらのインキュベーション混合物で処理されたＰＣ１２Ｎ細胞培養物における上記と同様のＬＤＨ放出アッセイによって評価した。

結果を図６に示す。「Ｗｈ」は海馬を除いた全脳、「Ｈｐ」は海馬由来のシナプトソームである。各カラムは、４つの値の平均値（±ＳＤ）を示す。*は、ｐ＜０．０００１、**はｐ＜０．００５を表す。ＴＡβ形成のレベルは、老化した（２歳）マウスの海馬から調製されたシナプトソームを含むインキュベーション混合物において、他のすべてのインキュベーション混合物（より若い（１ヶ月及び１歳）マウス脳の海馬又は海馬を除いた全脳からのシナプトソームを含むものなど）よりも有意に高かった。

１３．核染色による観察
ＴＡβの驚くべき特徴は、その強い毒性である。ＴＡβによって誘導された細胞死を特徴づけするために、核透過性色素であるHoechst 33258（商品名）を用いてＴＡβを含むインキュベーション混合物（５０μM アークティック型Ａβ及び１０％ ＧＭ１ガングリオシド、３７℃、２時間）で１２時間処理された（細胞数１．５×１０^４個／well、インキュベーション混合物：培地＝１：１）ＰＣ１２Ｎ細胞の核染色を行なった。

処理後のＰＣ１２Ｎ細胞の写真を図７、パネル（Ａ）に示す（バーは５０μm）。ａ及びｂは位相差顕微鏡像、ｃ及びｄは核染色像である。上記ＴＡβを含むインキュベーション混合物で１２時間処理されたＰＣ１２Ｎ細胞（ｂ及びｄ）は、退縮した（retracted）神経突起、萎縮した細胞体、核の凝縮（condensation）及び断片化（fragmentation）などを含むアポトーシス様の変化の特徴（図中に矢印で示す）を示した。

１４．種々のタイプの培養細胞に対するＴＡβ毒性
種々のタイプの培養細胞をＴＡβで処理し、ＴＡβに対する細胞の感受性を調べた。
上記のＰＣ１２細胞及びＰＣ１２Ｎ細胞のほか、以下の細胞を使用した。ヒト脳微小血管内皮（ｈＢＭＥ）細胞及びヒト脳星状膠細胞（ｈＡＳＴ）（いずれもDainippon Pharmaceutical Inc.、大阪、日本）は、コラーゲンでコーティングしたフラスコ中でＣＳ−Ｃ培地（Dainippon Pharmaceutical Inc.）で培養した。ラット星状膠細胞（ｒＡＳＴ）は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＳＹ５Ｙ）細胞は、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地中で培養した。ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞は、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で培養した。マウス単球ＲＡＷ２６４．７（ＲＡＷ２６４）細胞は、Dainippon Pharmaceutical Inc.から購入した。ＲＡＷ２６４細胞は、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で培養した。ラージＴ抗原で不死化されたマウス線維芽細胞（「fibroblast」）は、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で培養した。すべての細胞は、５％ＣＯ_２、３７°Ｃで加湿して培養した。

ＴＡβを含むインキュベーション混合物（５０μM アークティック型Ａβ及び１０％ ＧＭ１ガングリオシド、３７℃、２時間）で各細胞を上記と同様に処理（細胞数１．５×１０^４個／well、３７℃、４８時間、インキュベーション混合物：培地＝１：１）し、ＬＤＨ放出アッセイを行なった。

結果を図７、パネル（Ｂ）に示す。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示し、*は、Ａβのみを含むインキュベーション混合物で処理した場合の値に対してＰ＜０．０００１を表す。ネイティブなＰＣ１２細胞を含む非ニューロン細胞もまた、ＴＡβに対して感受性であった。

１５．ＮＧＦレセプターに対するＴＡβの結合
ＴＡβがＮＧＦレセプターを介してアポトーシスを誘導するか否かを調べるために、外来性ＮＧＦの存在下でＰＣ１２Ｎ細胞及びネイティブなＰＣ１２細胞をＴＡβで処理した。ＰＣ１２Ｎ細胞及びＰＣ１２細胞（細胞数１．５×１０^４個／well）に１００ng／mLのＮＧＦを添加し、上記と同様にＴＡβを含むインキュベーション混合物（５０μM アークティック型Ａβ及び１０％ ＧＭ１ガングリオシド、３７℃、２時間）で各細胞を処理し、ＬＤＨ放出アッセイを行なった。

結果を図８、パネル（Ａ）に示す。両方の培養物において、ＮＧＦが存在する場合に、細胞死の程度は有意に抑制された。したがって、ＴＡβはＮＧＦレセプターに対して競合的に結合することが示された。

１６．ＴｒｋＡ又はｐ７５ ^ＮＴＲ のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンによるＴＡβ毒性の抑制
特異的スモールインターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いてＴｒｋＡ及びｐ７５^ＮＴＲをノックダウンした。

ＰＣ１２細胞ＴｒｋＡ（GenBank no. NM_021589）及びｐ７５（GenBank no. NM_012610）に対する「Stealth」（登録商標）スモールインターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖オリゴヌクレオチドを、Invitrogen社（Carlsbad, CA）で合成した。ｓｉＲＮＡ配列は、以下のとおりであった：
ｒＴｒｋＡ−ｓｉＲＮＡ（ポジション１３７０）
センス＝５’−ＧＣＣＣＵＣＣＵＣＣＵＡＧＵＧＣＵＣＡＡＣＡＡＡＵ−３’;
アンチセンス＝５’−ＡＵＵＵＧＵＵＧＡＧＣＡＣＵＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣ−３’;
ｒＴｒｋＡ−ｓｉＲＮＡ−コントロール
センス＝５’−ＧＣＣＣＵＣＣＧＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＡＡＵ−３’;
アンチセンス＝５’−ＡＵＵＧＡＵＧＵＵＧＡＣＧＡＧＡＵＣＧＧＡＧＧＧＣ−３’;
ｒｐ７５−ｓｉＲＮＡ（ポジション１２１２）
センス＝５’−ＣＡＧＣＣＵＧＡＡＣＡＵＡＵＡＧＡＣＵＣＣＵＵＵＡ−３’;
アンチセンス＝５’−ＵＡＡＡＧＧＡＧＵＣＵＵＡＵＡＵＧＵＵＣＡＧＧＣＵＧ−３’;
ｒｐ７５−ｓｉＲＮＡ−コントロール
センス＝５’−ＣＡＧＧＵＡＡＡＣＡＵＡＵＡＧＵＣＣＣＵＣＣＵＵＡ−３’;
アンチセンス＝５’−ＵＡＡＧＧＡＧＧＧＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＵＡＣＣＵＧ−３’。

これらのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ量２０pmol）を、製品添付のプロトコールにしたがって「LipofectAMINE 2000」(商品名、Invitrogen)を用いてＰＣ１２細胞（細胞数１．５×１０^４個／well）にトランスフェクトした。

ＴｒｋＡ又はｐ７５^ＮＴＲに対するｓｉＲＮＡで処理した後、これらのＰＣ１２細胞を、上記と同様にＴＡβを含むインキュベーション混合物（５０μM アークティック型Ａβ及び１０％ ＧＭ１ガングリオシド、３７℃、２時間）で処理し、ＬＤＨ放出アッセイを行なった。

各細胞におけるＴｒｋＡ及びｐ７５^ＮＴＲ発現レベルの低減は、それぞれ抗ＴｒｋＡ(Santa Cruz社)及び抗ｐ７５^ＮＴＲ(NeoMarker社)抗体を用いた細胞ライセートのウェスタン・ブロット解析（７．５％及び４〜２０％ポリアクリルアミドゲル(第一化学ミニゲル)を使用、４０mAで１時間泳動し、その後、１２０mA、２時間ブロットした）によって確認した。

結果を図８、パネル（Ｂ）に示す。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示し、*は、ｐ＜０．０００１を表す。ｐ７５^ＮＴＲだけでなく、ＴｒｋＡのノックダウンも、ＴＡβにより誘導される細胞死を顕著に抑制した。
これらの結果から、ＴＡβは、ｐ７５^ＮＴＲ又はＴｒｋＡに結合することによりヘテロメリックＴｒｋＡ／ｐ７５^ＮＴＲ複合体の機能を混乱させ、その結果、ｐ７５^ＮＴＲ分子の細胞質部分の死に関与するドメインの活性化を通じてアポトーシスがもたらされることが示唆された。

図１は、ＧＭ１ガングリオシドの存在下で形成された可溶性Ａβアセンブリーの毒性を示す図である。 パネル（Ａ）： 無血清Ｎ２サプレメント培地（N2-supplemented meddium）中で培養された一次大脳皮質ニューロンを、リポソーム中のＧＭ１ガングリオシド（０、１０又は２０モル％）の存在下又は不存在下で３７℃で２時間プレインキュベートされた、最終濃度２５μMの種無含有の野生型又はアークティック型Ａβ（Ａβ１−４０）を含むインキュベーション混合物で処理した。ニューロンを、カルセインＡＭ（Invitrogen, Carlsbad, CA）・エチジウムホモダイマーで染色した写真である。緑色が生細胞、赤色が死細胞をそれぞれ表す。バーは５０μm。 パネル（Ｂ）： 示した条件下でＧＭ１ガングリオシドの存在下又は不存在下で３７℃、２時間プレインキュベートされた野生型又はアークティック型のＡβで処理された、生存している一次培養ニューロンの数を示す図である。ニューロンは、カルセインＡＭ／エチジウムホモダイマー及びヨウ化プロピジウム（propidium iodine）で染色した。各カラムは、ＡβもＧＭ１ガングリオシドも含まない対照培養物に対するパーセンテージの３つの値の平均値（±ＳＤ）を示す。*Ｐ＜０．０００１ パネル（Ｃ）： ＧＭ１ガングリオシド（１０％）の存在下又は不存在下で３７℃で２時間プレインキュベートされたアークティック型Ａβを含むインキュベーション混合物で処理されたＰＣ１２Ｎ細胞の代表的な像である。バーは５０μm。 図２は、ＧＭ１ガングリオシドとＡβを含むインキュベーション混合物中で毒性を示すものが可溶性アセンブリーであることを示す図である。 パネル（Ａ）： 示した条件下でＧＭ１ガングリオシドの存在下又は不存在下で３７℃でプレインキュベートされた野生型又はアークティック型Ａβを含むインキュベーション混合物で処理された一次培養ニューロンの培地中のＴｈＴ蛍光強度を示す図である。カラムは、白＝ＴＢＳ（対照）、斜線＝野生型、黒＝アークティック型である。 パネル（Ｂ）： 示した条件下でＧＭ１ガングリオシドの存在下又は不存在下でプレインキュベートされた野生型又はアークティック型Ａβを含むインキュベーション混合物で処理されたＰＣ１２Ｎ細胞からのＬＤＨ放出率を示す図である。各カラムは、インキュベーション混合物での処理後のＬＤＨ放出量／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００での処理後のＬＤＨ放出量の（％）を表す。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示す。*は、ｐ＜０．０００１（one-way ANOVA combined with Scheffe's test）を表す。カラムは、白＝ＴＢＳ（対照）、斜線＝野生型、黒＝アークティック型である。 パネル（Ｃ）： ＧＭ１ガングリオシド（１０％）の存在下でプレインキュベートされたアークティック型Ａβを含むインキュベーション混合物（whole）の超遠心によって得られた上清（sup）及び沈澱物（ppt）で処理されたＰＣ１２Ｎ細胞からのＬＤＨ放出率を示す図である。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示す。*は、ｐ＜０．０００１を表す。 図３は、ＴＡβの特性（抗体との反応性）を示す図である。 パネル（Ａ）： アークティック型Ａβのみ、ＧＭ１ガングリオシド（１０％）のみ、又はアークティック型Ａβ＋ＧＭ１ガングリオシド（１０％）を含むインキュベーション混合物（whole）の超遠心によって得られた上清（sup）のドットブロット解析の結果を示す。ブロットは、anti-Oligo抗体（Biosource Inc., Camarillo, CA）又はＨＲＰ結合コレラトキシンサブユニットＢ（ＣＴＸ（Sigma, St. Louis, MO）と反応させた。 パネル（Ｂ）： anti-Oligoとの共インキュべーションによる、ＰＣ１２Ｎ細胞からのＴＡβ誘導ＬＤＨ放出の抑制を示す図である。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示す。*は、ｐ＜０．０００１を表す。 図４は、ＴＡβの生物物理学的及び構造的解析を示す図である。 パネル（Ａ）： プロトフィブリル形成可能なようにプレインキュベートされたアークティック型Ａβを含むインキュベーション混合物（Ａ）又はＴＡβを含有するインキュベーション混合物（Ｂ）の電子顕微鏡写真である。バーは１００μm。 パネル（Ｂ）： ＴＡβを含むフラクションのＡＦＭ像である。ＴＡβを含むインキュベーション混合物を超遠心して得られた上清をＡＦＭ解析した。インキュベーション混合物はアークティック型Ａβのみ（Ａβ）、ＧＭ１ガングリオシド（１０％）のみ（ＧＭ１）、又は両者（Ａβ＋ＧＭ１）を含んでいた。バーは２００nm。 パネル（Ｃ）： Superose 12 を用いたＴＡβ含有フラクションのサイズ排除クロマトグラフィの結果を示す図である。３５のフラクションの溶出サンプルをニトロセルロース膜上にドットした。このブロットを、anti-Oligo抗体と反応させた。代表的な５つのフラクションを示す。フラクション２及び４は、それぞれＴＡβ及びモノマーＡβを含むフラクションに相当する。免疫反応性は、約２００〜約３００kDaの見かけの分子量を有する単一のピーク（２）として回収された。 図５は、４３９６Ｃ抗体によるＴＡβ形成の抑制不能を示す図である。 パネル（Ａ）： ４３９６Ｃ又は抗Ａβモノクローナル抗体（４Ｇ８）と共にＧＭ１ガングリオシドの存在下で３７℃でインキュベートされたアークティック型Ａβを含むインキュベーション混合物のＴｈＴ蛍光強度。 パネル（Ｂ）： ４３９６Ｃ抗体の存在下又は不存在下で、ＧＭ１ガングリオシド（１０％）の存在下でプレインキュベートされたアークティック型Ａβで処理されたＰＣ１２Ｎ細胞からのＬＤＨ放出率。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示す。*Ｐ＜０．０００１、ｎｓ：非有意。 図６は、シナプトソームの存在下でのアークティック型ＡβのインキュベーションによるＴＡβの形成を示す図である。 ＴＡβ形成は、アークティック型Ａβで処理されたＰＣ１２Ｎ細胞培養物におけるＬＤＨ放出アッセイによって評価した。Ｗｈ＝海馬を除いた全脳、Ｈｐ＝海馬。下にマウスの年齢を示す（１mo＝１ヵ月、１yr＝１年、２yrs＝２年）。各カラムは、４つの値の平均値（±ＳＤ）を示す。*は、ｐ＜０．０００１、**はｐ＜０．００５を表す。 図７は、ＰＣ１２又はＰＣ１２Ｎ細胞に対するＴＡβの毒性の特徴を示す図である。 パネル（Ａ）： ＴＡβを含むインキュベーション混合物で１２時間処理されたＰＣ１２Ｎ細胞。ａ及びｂは位相差顕微鏡像、ｃ及びｄはHoechst 33258核染色像。矢印は、核の凝縮（condensation）及び断片化（fragmentation）、細胞体の収縮及び神経突起の退縮を示す。バーは５０μm。 パネル（Ｂ）： 種々のタイプの培養細胞に対するＴＡβ毒性を示す図である。細胞生存率は、これらの培養物中でＬＤＨ放出アッセイによって評価した。ＰＣ１２Ｎ＝ＮＧＦ処理されたＰ１２細胞、ＰＣ１２＝ネイティブＰＣ１２細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ＝ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫、ｈＢＭＥ＝ヒト脳微小血管内皮細胞、ＨＥＫ２９３＝ＨＥＫ２９３細胞、ｈＡＳＴ＝ヒト星状膠細胞、ｒＡＳＴ＝ラット星状膠細胞、ＲＡＷ２６４．７＝マウス単球、及びfibroblast＝ラージＴ抗原で不死化されたマウス線維芽細胞。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示す。*Ｐ＜０．０００１、対Ａβのみを含むインキュベーション混合物で処理した場合の値。 図８は、ＴＡβがＮＧＦレセプターを介して細胞死を誘導することを示す図である。 パネル（Ａ）：外来性ＮＧＦ（１００ng／mL）の添加によるネイティブＰＣ１２細胞及びＰＣ１２Ｎ細胞に対するＴＡβ毒性の抑制を示す図である。ＴＡβ毒性は、これらの細胞培養物においてＬＤＨ放出アッセイによって評価した。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示す。*Ｐ＜０．０００１ パネル（Ｂ）： ＮＧＦレセプター、ＴｒｋＡ又はｐ７５^ＮＴＲのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンによるネイティブなＰＣ１２細胞に対するＴＡβ毒性の抑制を示す図である。 ＰＣ１２細胞は、ＴｒｋＡ又はｐ７５^ＮＴＲに対するｓｉＲＮＡで処理した後、ＴＡβを含むインキュベーション混合物に暴露した。グラフはＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。各カラムは、３つの値の平均値（±ＳＤ）を示す。*は、ｐ＜０．０００１を表す。グラフの下の図は、ＴｒｋＡ及びｐ７５^ＮＴＲ発現レベルの低減を確認した抗ＴｒｋＡ及び抗ｐ７５^ＮＴＲ 抗体を用いた細胞ライセートのウェスタン・ブロット解析の結果を示す。

Claims (10)

1. ＧＭ１ガングリオシドの存在下でインビトロで形成される可溶性毒性アミロイドβアセンブリーであって、
   （ａ）サイズ排除クロマトグラフィによる見かけの分子量が約２００〜約３００kDaであること；
   （ｂ）原子力間顕微鏡観察による直径が約１０〜約２０nmである球状粒子を含むこと；
   （ｃ）検出可能なＧＭ１ガングリオシドを含まないこと；及び
   （ｄ）培養細胞に対してアポトーシス様細胞死を誘導すること、
   を特徴とするアセンブリー。
2. アミロイドβが、野生型ペプチド又はアークティック型変異を有するペプチドである、請求項１記載のアセンブリー。
3. 可溶性毒性アミロイドβアセンブリーの製造方法であって、単量体アミロイドβを、脂質成分のモル比で約１０〜約１５％のＧＭ１ガングリオシドを含むリポソームと共に約３５〜約４０℃で約１〜約３０時間インキュベートする工程を含むことを特徴とする方法。
4. 単量体アミロイドβが野生型ペプチドであり、インキュベーション時間が２０〜３０時間である、請求項３記載の方法。
5. 単量体アミロイドβがアークティック型変異を有するペプチドであり、インキュベーション時間が１〜３時間である、請求項３記載の方法。
6. 請求項３〜５のいずれか１項記載の製造方法によって製造された可溶性毒性アミロイドβアセンブリー。
7. 請求項１、２又は６記載の可溶性毒性アミロイドβアセンブリーを含む液体を、５４０，０００×ｇで１５分間又は同等の条件で遠心分離して、上清を回収することを特徴とする、可溶性毒性アミロイドβアセンブリーの精製方法。
8. 前記回収された上清を、さらにサイズ排除クロマトグラフィに供することを特徴とする、請求項７記載の方法。
9. 請求項７又は８記載の精製方法によって精製された可溶性毒性アミロイドβアセンブリー。
10. 可溶性毒性アミロイドβの毒性を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
    （ａ）培養細胞を、請求項１、２、６又は９のいずれか１項記載の可溶性毒性アミロイドβアセンブリー及び被検物質の存在下でインキュベートする工程、
    （ｂ）前記工程（ａ）の後、前記培養細胞の生死を測定する工程、
    （ｃ）前記工程（ｂ）で得られた結果を、被検物質を含まない状態で工程（ａ）を行なった場合の結果と比較する工程
    を含むことを特徴とする方法。

Images