CN102459336B - 对β-淀粉样肽的初原纤维形式特异性的人源化抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及对β-淀粉样肽的初原纤维形式特异性的人源化抗体及所述抗体在阿耳茨海默氏病领域中的用途。

Description

对β-淀粉样肽的初原纤维形式特异性的人源化抗体
本发明涉及对β-淀粉样肽的初原纤维形式特异性的人源化抗体。本发明还涉及这些抗体的治疗性、诊断性和/或预防性用途，特别地与神经变性性病症和/或与淀粉样斑沉积有关的疾病，且值得注意地阿耳茨海默氏病(Alzheimer’sdisease)的诱导和进展有关。
阿耳茨海默氏病(AD)是一种影响高比例的老年群体的进行性神经变性性疾病。此疾病以记忆丧失和认知功能下降为临床特征，而以脑中存在胞内神经原纤维沉积物和形成淀粉样斑的β-淀粉样肽(A-β)的胞外沉积物为神经病理学特征。(Yanker等NatureMed.第2卷第8期(1996))。在这些体征外，存在着许多其它异常的变化，包括免疫和炎性系统的恶化及线粒体功能的恶化，这可以导致氧化应激的升高、凋亡机制的活化，且最终导致细胞死亡。
淀粉样斑主要由具有40或42个残基的A-β肽构成，所述A-β肽是在β-淀粉样肽前体(APP)蛋白的蛋白水解过程期间生成的。A-β肽的胞外沉积物代表AD的所有形式，包括家族性形式(FAD)的不变早期特征性特征。FAD出现得相对较早(在40和60岁之间)，并且是由于具有6种单一或双重错义突变的5％FAD病例(大于20种家族)中的APP基因；具有迄今鉴定的超过80种不同突变的50至70％FAD病例(大于200种家族)中的早老蛋白1(PS1)基因；和具有8种家族中所描述的2种错义突变的较少FAD病例中的早老蛋白2(PS2)基因的突变所致。已经显示了这三种基因的突变诱导对APP蛋白酶解的变化，这导致A-β的过度生成，而且导致与AD的偶发形式的病理学和症状相似的病理学和症状的早期出现。
淀粉样斑的神经元毒性可能在于通过可溶性A-β肽以原纤维形式聚集而形成的高分子量原纤维，所述原纤维形式最初是可溶性的(又称作初原纤维形式)，然后转化成掺入淀粉样斑中的不溶性形式。实际上，在体外显示了，可溶性A-β肽逐渐聚集成高分子量(大于200kDa)，但仍可溶的原纤维形式(即，其可以用识别肽/蛋白质的β-片层三级结构的药剂诸如刚果红或硫黄素S来标记)。因为此形式是可溶的，它经常称作初原纤维形式，而原纤维源自甚至更大的聚集，导致溶解性损失。一般认为初原纤维过渡形式是淀粉样纤维的前体，并且可能负责阿耳茨海默氏病和与蛋白质聚集有关的其它疾病中的细胞功能障碍和神经元损失。
已经显示了，与也广泛存在于不受影响的患者中的A-β肽的弥散性沉积物形成对比，衰老淀粉样斑(即聚集的，又称作成熟斑)与阿耳茨海默氏患者的认知状态关联。(Duyckaerts等，Neurobiol.Aging1997；18：33-42及Jellinger等，1998；54：77-95)。特别地，通过靶向这些衰老淀粉样斑，因此有可能更特异性且有效地治疗阿耳茨海默氏病。
已经尝试了许多治疗以阻止A-β肽的形成，例如APP的蛋白水解过程的抑制剂。
已经测试了免疫治疗性策略诸如施用抗A-β抗体(以减少淀粉样沉积物)或者用A-β肽抗原免疫接种(以促进体液应答)以降低斑的大小和密度。
例如，已经描述了针对阿耳茨海默氏病的治疗方法(US7179463)，其包括施用针对在编码A-β肽的区域中呈现北极型突变(Arcticmutation)的初原纤维的抗体。
实际上尚未描述抗体的例子。此外，尚未实施抗体对肽的亲和力作为这些肽的分子量的函数的比较。其它专利(US6761888和US6750324)已经提及识别沿着肽A-β42的氨基酸序列的各个表位的抗体。已经提交了关注对初原纤维特异性的抗体的国际申请(WO2007/108756)，但是所描述的抗体识别高分子量A-β肽和中等重量寡聚物两者。此外，没有提及相对于抗体对弥散斑的亲和力其对成熟斑的亲和力。
尽管关注阿耳茨海默氏病的知识目前有进展，仍需要以最大程度限制副作用的治疗和/或预防此病理学的组合物和方法。诸如本申请中所描述的、人源化的且对A-β肽的初原纤维形式特异性的抗体旨在解决此问题。容许识别衰老淀粉样斑而非弥散斑，依照本发明的抗体比识别A-β的所有形式的抗体(其会主要附着弥散性沉积物或附着单体或低分子量A-β肽的可溶性形式)有效得多地识别病理性斑。
此外，仅识别A-β肽的初原纤维形式，而非与阿耳茨海默氏病无关的其它蛋白质的初原纤维形式的实情避免可降低对疾病有效的抗体浓度的无用结合。
已经人源化的鼠抗体遍及本申请会称作抗体13C3。
表2中显示了可以编码或构成依照本发明的人源化抗体的序列。
本发明涉及特异性结合A-β肽的初原纤维形式，即高分子量肽的人源化抗体。
在一个更有利的实施方案中，抗体结合具有大于200、300、400或500kDa的分子量的A-β肽。
依照一个实施方案，依照本发明的抗体结合聚集成老年斑的A-β肽，而不结合A-β肽的弥散性沉积物。
在一个有利的实施方案中，依照本发明的抗体特异性结合A-β肽的初原纤维形式，但不结合淀粉样结构的其它蛋白质(例如，IAPP、胰岛淀粉样多肽)。
本发明还涉及具有降低的效应器功能的人源化抗体，使得有可能限制不利效应，诸如微出血(microhaemorrhage)和血管性水肿(vasogenicoedema)的形成。
在一个有利的实施方案中，依照本发明的抗体不再拥有效应器功能。
在一个甚至更有利的实施方案中，抗体是免疫球蛋白G4，其Fc域已经经历降低半分子(half-molecule)生成的突变。
在一个甚至更有利的实施方案中，抗体是免疫球蛋白G4，其Fc域已经经历降低效应器活性的突变。
本发明涉及一种人源化抗体，其包含至少一种由与序列SEQIDNO：9、11、13、15、17和19之一具有相同序列的核苷酸序列，或由与这些序列分别相差1、2、3、4或5个核苷酸的序列编码的CDR。
本发明还涉及一种人源化抗体，其包含至少一种与序列SEQIDNO：10、12、14、16、18和20之一具有相同序列的CDR。
在另一个实施方案中，依照本发明的抗体包含至少一种其序列相对于序列SEQIDNO：10、12、14、16、18、20和32之一相差1至2个氨基酸的CDR，只要所述抗体维持其结合特异性。
在一个有利的实施方案中，抗体包含由核苷酸序列SEQIDNO：9、11、13、15、17和19，或由与这些序列分别相差1、2、3、4或5个核苷酸的序列编码的CDR。
在另一个有利的实施方案中，抗体包含序列SEQIDNO：10、12、14、16、18和20的CDR。
依照本发明的抗体还可以包含由核苷酸序列SEQIDNO：9、11、13、31、17和19，或由与这些序列分别相差1、2、3、4或5个核苷酸的序列编码的CDR。
在一个有利的实施方案中，依照本发明的抗体包含序列SEQIDNO：10、12、14、32、18和20的CDR。
本发明的一个目的是人源化抗体，其包含由核苷酸序列SEQIDNO：9、11、29、31、17和19，或由与这些序列分别相差1、2、3、4或5个核苷酸的序列编码的CDR。
本发明还涉及包含序列SEQIDNO：10、12、30、32、18和20的CDR的人源化抗体。
在一个有利的实施方案中，依照本发明的抗体包含由与序列SEQIDNO：5或序列SEQIDNO27具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列编码的其重链可变部分(VH)。
在一个有利的实施方案中，依照本发明的抗体含有包含与序列SEQIDNO：6或序列SEQIDNO28具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列的其重链可变部分(VH)。
在一个有利的实施方案中，依照本发明的抗体包含由与序列SEQIDNO：7或序列SEQIDNO23具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列编码的其轻链可变部分(VL)。
在一个有利的实施方案中，依照本发明的抗体含有包含与序列SEQIDNO：8或序列SEQIDNO24具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列的其轻链可变部分(VL)。
在一个甚至更有利的实施方案中，抗体含有包含由核苷酸序列SEQIDNO5和SEQIDNO27之一编码的可变部分(VH)的重链。
在一个甚至更有利的实施方案中，抗体含有包含多肽序列SEQIDNO6或SEQIDNO28的可变部分(VH)的重链。
在另一个实施方案中，抗体含有包含由核苷酸序列SEQIDNO7和SEQIDNO23之一编码的可变部分(VL)的轻链。
在另一个实施方案中，抗体含有包含多肽序列SEQIDNO8或SEQIDNO24的可变部分(VL)的轻链。
在一个有利的实施方案中，抗体包含由核苷酸序列SEQIDNO：5和7编码的序列。
在一个有利的实施方案中，抗体包含多肽序列SEQIDNO：6和8。
在另一个实施方案中，抗体包含由核苷酸序列SEQIDNO：5和23编码的序列。
在另一个实施方案中，抗体包含多肽序列SEQIDNO：6和24。
在另一个实施方案中，抗体包含由核苷酸序列SEQIDNO：27和23编码的序列。
在另一个实施方案中，抗体包含多肽序列SEQIDNO：28和24。
本发明还涉及包含由与核苷酸序列SEQIDNO1和SEQIDNO25之一具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列编码的重链的抗体。
本发明还涉及包含与多肽序列SEQIDNO2或与多肽序列SEQIDNO26具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的重链的抗体。
在一个有利的实施方案中，抗体包含由与核苷酸序列SEQIDNO3和SEQIDNO21之一具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列编码的轻链。
在另一个实施方案中，抗体含有包含与多肽序列SEQIDNO4和SEQIDNO22之一具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列的轻链。
本发明的一个目的是包含由核苷酸序列SEQIDNO：1和3编码的序列的抗体。
本发明的另一个目的是其序列包含多肽序列SEQIDNO：2和4的抗体。
本发明的一个目的是包含由核苷酸序列SEQIDNO：1和21编码的序列的抗体。
本发明的另一个目的是其序列包含多肽序列SEQIDNO：2和22的抗体。
本发明的一个目的是包含由核苷酸序列SEQIDNO：25和21编码的序列的抗体。
本发明的另一个目的是其序列包含多肽序列SEQIDNO：26和22的抗体。
本发明的另一个目的是一种人源化抗肽Aβ抗体，所述人源化抗肽Aβ抗体具有比其对肽Aβ的其它形式的亲和力大至少100倍的对此肽的初原纤维形式的亲和力。
本发明的另一个目的是一种抗体，其特征在于它诱导淀粉样斑的缩小。
本发明的另一个目的是人源化抗肽Aβ抗体在治疗与神经变性性病症有关的疾病，且特别是在治疗阿耳茨海默氏病中的用途。
本发明的另一个目的是药物组合物，其包含人源化抗肽Aβ抗体和赋形剂。
本发明的另一个目的是治疗阿耳茨海默氏病的方法，包括对患者施用人源化抗肽Aβ抗体。
本发明的另一个目的是生成人源化抗肽Aβ抗体的细胞，及生成此抗体的方法，包括培养这些细胞。所述细胞是自一种细胞系有利地衍生的。
本发明的一个目的是包含人源化抗肽Aβ抗体的医学产品。
本发明的一个目的是编码与序列SEQIDNO：2、4、6、8、22、24、26或28之一具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽的多核苷酸。
本发明的另一个目的是具有与序列SEQIDNO：1、3、5、7、21、23、25、或27之一具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列的多核苷酸。
本发明的另一个目的是包含具有序列SEQIDNO1、3、5、7、21、23、25、或27之一的核酸的重组载体，及包含此载体的宿主细胞。
定义
特异性结合理解为对一种受体相对于对另一种的结合强度间，在这里对A-β肽的初原纤维形式的结合与对肽的其它形式的结合间相差至少约10、20、30、40、50、或100倍。
“表位”意指抗原中抗体结合的位点。若抗原是聚合物，诸如蛋白质或多糖，则表位可以由连续的或不连续的残基形成。在这里，表位是构象性的，即与初原纤维A-β肽的三维结构有关。
“初原纤维形式”意指在体外可溶的，并且可以以大于200kDa、300kDa、400kDa或500kDa的分子量的实体分离，而且可以固定诸如硫黄素-S或刚果红等药剂的A-β肽的寡聚形式。
“老年斑”意指由被营养不良性神经突和神经胶质细胞反应围绕的淀粉样核心(固定硫黄素S或刚果红)构成的斑。与数目多得多但与阿耳茨海默氏病无关的弥散性淀粉样沉积物(其不固定硫黄素S或刚果红)形成对比，特别地在阿耳茨海默氏病患者中找到老年斑。
抗体(又称作免疫球蛋白)由通过二硫桥连接的两个相同的重链(“CH”)和两个相同的轻链(“CL”)构成。每条链含有恒定区和可变区。每个可变区包含三个称作“互补决定区”(“CDR”)或“高变区”的区段，其主要负责结合抗原的表位。
术语“VH”指抗体的免疫球蛋白的重链可变区，包括片段Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab)’的重链。
术语“VL”指抗体的免疫球蛋白的轻链可变区，包括片段Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab)’的轻链。
“抗体”还意指抗体的任何功能性片段：Fab(抗原结合片段)、Fv、scFv(单链Fv)、Fc(可结晶片段)。优选地，这些功能性片段会是类型Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc、双抗体、多特异性抗体(值得注意地双特异性)、含有一种或多种CDR序列的合成多肽的片段，其一般与衍生它们的人源化抗体拥有相同的固定特异性。依照本发明，本发明的抗体片段可以通过诸如酶诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的消化和/或通过化学反应还原切割二硫桥等方法自人源化抗体获得。
纳米抗体(nanobody)也归入此定义。
“CDR”意指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如由Kabat等(Kabat等，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，NIH，1991，及后来的版本)所定义的。存在着3个重链CDR和3个轻链CDR。如可适用的，术语CDR在本文用于指一个或多个，或者甚至所有这些含有大多数负责抗体对其识别的抗原或表位的亲和结合的氨基酸的区域。可变域的最保守区域称作FR区或序列，代表“框架区”。
本发明涉及人源化抗体。
“人源化抗体”意指主要含有人免疫球蛋白序列的抗体。此术语一般指已经通过掺入人序列或人序列中找到的残基修饰的非人免疫球蛋白。
一般地，人源化抗体包含一个或通常两个如下的可变域，其中整个或部分CDR区对应于自非人亲本序列衍生的部分，且其中整个或部分FR区自人免疫球蛋白序列衍生。然后，人源化的抗体可以包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)，特别是选定的参照人免疫球蛋白的。
如此，我们尝试获得在人中最小免疫原性的抗体。如此，有可能的是，在不实质性降低抗体对高分子量的A-β肽的结合特异性的情况中，通过对人宿主免疫原性较小的氨基酸修饰一个或多个CDR的一个或两个氨基酸。此外，框架区的残基不需要是人的，并且有可能的是，不修饰它们，因为它们不促成抗体的免疫原性潜力。
数种人源化方法是本领域技术人员已知的，其用于将非人亲本抗体修饰成在人中免疫原性较小的抗体。与人抗体的完全序列同一性是不必要的。实际上，完全序列同一性并非必然是降低的免疫原性的预测性指标，并且对有限数目的残基的修饰可以导致在人中呈现非常减弱的免疫原性潜力的人源化抗体(MolecularImmunology(2007)44，1986-1998)。
例如，一些方法是纳入CDR(嫁接)(EPO0239400；WO91/09967；及美国专利No.5,530,101和5,585,089)、表面重建(EPO0592106；EPO0519596；Padlan，1991，MolecImm28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，ProtEng7(6)：805-814；及Roguska等，1994，PNAS91：969-973)或链混合(美国专利No.5,565,332)。
特别地，本发明涉及人源化抗体，其可变部分依照国际专利申请WO2009/032661中解释的技术来修饰。
值得注意地，此技术使用基于抗体的三维模型的动力学分子模拟，所述模型是通过同源性构建的。
本发明还涉及具有降低的效应器功能的任何形式的抗体，诸如携带降低其对免疫系统的受体的亲和力的Fc域突变的免疫球蛋白或诸如纳米抗体。
“效应器功能”意指抗体Fc域对诱导免疫应答的受体或蛋白质的任何固定。降低这些效应器功能使得有可能降低不利的效应诸如诱导微出血(Racke等JNeurosci2005，25：629)。
可以通过本领域技术人员已知的任何技术来测量亲和力。有利地，它通过基于RatkovskDA和ReedyTJ(Biometrics，1986，42，575-82)所描述的算法开发的BiostatSpeed技术来测量。
为了容许表达依照本发明的抗体的重链和/或轻链，将编码所述链的多核苷酸在表达载体中插入。这些表达载体可以是质粒、YAC、粘粒、逆转录病毒、自EBV衍生的附加体、和本领域技术人员可以判定为适合于所述链表达的所有载体。
可以使用这些载体来转化自一种细胞系有利地衍生的细胞。甚至更有利地，所述细胞系是自哺乳动物衍生的。
有利地，它是CHO系或自此系衍生的系，或HEK293系或自此系衍生的系。
可以通过本领域技术人员已知的用于将多核苷酸导入宿主细胞中的任何方法来实施细胞的转化。所述方法可以是依靠右旋糖苷的转化、通过磷酸钙的沉淀、依靠Polybrene的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中的多核苷酸包囊、生物射弹注射和DNA进入细胞核的直接显微注射。
为了通过表面、口服、胃肠外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、眼内或其它路径施用，依照本发明的抗体可以包含在药物组合物中。优选地，药物组合物含有用于可注射配制剂的药学可接受媒介物。这些可以特别是无菌的、等张的盐水溶液(磷酸一钠或二钠、氯化钠、钾、钙或镁，等等，或所述盐的混合物)、或干燥的组合物，值得注意地冻干的，其通过在适当时添加无菌水或生理学血清而容许构成可注射溶质。
举例而言，药物组合物包含(1)Dulbecco磷酸盐缓冲液(pH约7.4)，其任选地含有1mg/ml至25mg/ml的人血清清蛋白、(2)0.9％w/v氯化钠(NaCl)、和(3)5％(w/v)右旋糖。它还可以包含抗氧化剂诸如色胺和稳定剂诸如Tween20。
所讨论的病理学可以是与淀粉样斑沉积有关的任何疾病。特别地，所讨论的病理学是阿耳茨海默氏病。
剂量取决于期望的效果、治疗的持续时间和所使用的施用路径；它们一般是对于成人的每天5mg-1000mg抗体。一般地，医生会决定与疾病的阶段、患者的年龄和重量、或必须考虑的任何其它患者相关因素有关的合适剂量。
本发明通过下文给出的实施例例示，而非限制。
附图简述
图1A：容许抗Aβ抗体13C3-VH1VL1的轻链LC1表达的质粒pXL4973的图。
图1B：容许抗Aβ抗体13C3-VH1VL1的重链HC1表达的质粒pXL4979的图。
图2A和2B：通过在Superdex75上的凝胶过滤分离初原纤维和低分子量寡聚物(分别在t＝0和t＝16小时时)。
图3：初原纤维的分子量的测定。
图4A、4B和4C：人源化抗体(分别为抗体LP09027(4A)、LP09026(4B)和LP09028(4C))对初原纤维的亲和力的测定(来自3次实验的均值数值±sem)。
图5：人源化抗体LP09027对于Aβ原纤维的特异性。
图6A和6B：人源化抗体(LP09027)分别对小鼠额皮质(6A)和海马(6B)的成熟老年斑的特异性。箭标示老年斑。
实施例
实施例1：获得人源化抗体
将鼠抗体13C3人源化。
此实施例描述了人源化抗肽Aβ抗体VH1VL1(LP09027)的序列和生成，其通过在称作FreeStyle293-F的哺乳动物系HEK293中瞬时表达的生成来进行。
分别将编码人源化可变链VL1和VH1的cDNA与编码人恒定区Cκ和IgG4的cDNA融合。恒定区IgG4的序列是具有Kabat命名中的替代S241P和L248E的变体的，以显著降低半分子的生成(Angla等，1993，Mol.Immunol.，30：105-108)和效应器功能(WO97/09351)。
分别将编码CH1(SEQIDNO1)和CL1(SEQIDNO3)的核酸序列在表达载体中独立克隆以生成质粒pXL4973(图1A)和pXL4979(图1B)。
依照由Invitrogen(产品目录参照K9000-01)所描述的方案在共转染质粒pXL4973和pXL4979后通过在系FreeStyle293-F(Invitrogen)中瞬时表达的生成来生成一批抗体。然后，将此批(LP09027)通过在MabSelect凝胶(Amersham)柱上依照供应商的推荐的亲和层析来纯化，然后在PBS缓冲液(参照Dulbecco14190-094)中配制，并进行无菌过滤(0.2μm)。自1L培养物开始，通过变性条件中的SDS-PAGE及通过空间排阻层析以97％的纯度获得33mg抗体。通过变性条件中的SDS-PAGE及通过LC/MS获得的质量与一级氨基酸序列和Fc域上N-聚糖的存在一致，即对于LC1为23969Da的质量，而考虑G0F形式的N-聚糖，对于HC1为49650Da。通过非变性条件中的SDS-PAGE及通过大小排阻层析获得的质量与150kDa的抗体的异四聚体结构一致(图4A)。
依照相同的方法，自对于LP09026的核苷酸序列SEQIDNO25和SEQIDNO21(图4B)，及对于LP09028的SEQIDNO1和SEQIDNO21(图4C)开始，生成人源化抗体LP09026和LP09028的批次。
实施例2：自肽Aβ(1-42)制备初原纤维
依照由Johansson等(FEBS，2006，2618-2630)所描述的方法自合成肽Aβ(1-42)制备初原纤维。将冻干的肽(Anaspec参照24224)在10mMNaOH中以100μM的浓度溶解，然后搅拌1分钟，并在冰上温育10分钟。然后，将肽的溶液在100mM磷酸钠，200mMNaClpH＝7.4的缓冲液中稀释至50μM浓度，然后搅拌1分钟。将制备物于37℃温育过夜以形成初原纤维，然后以17900g于16℃离心15分钟以除去不溶性聚集物。为了分离初原纤维与低分子量的寡聚形式的Aβ，将上清液在50mM乙酸铵缓冲液pH＝8.5中平衡的Superdex75凝胶过滤柱上加载。将与初原纤维和低分子量寡聚物对应的级分收集，并于4℃贮存。图2显示了分离初原纤维的典型谱。使用Biorad校正试剂盒(参照150-1901)作为分子量标志物通过Superdex200凝胶过滤测定初原纤维的分子量。图3显示了初原纤维的分子量大于200kDa。
实施例3：人源化抗体对于初原纤维的特异性和亲和力
将50μl在PBS(Gibco，参照70011)中的浓度1μg/ml的初原纤维和低分子量寡聚物在ELISA板(Nunc，参照442404)的孔中沉积，并于4℃温育过夜。除去过量的抗原后，将200μl缓冲液PBS+5％奶粉(重量/体积)在每孔中沉积以除去非特异性吸附，并于室温温育2小时。然后，用300μl缓冲液PBSTween0.02％将孔清洗4次。将50μl一抗溶液(对于寡聚物自100μg/ml的浓度开始，而对于初原纤维自25μg/ml浓度开始，在PBSTween中3倍3倍稀释)添加至每孔，并于室温温育1小时。用300μl缓冲液PBSTween将孔清洗4次。将在缓冲液PBSTween中以1/10000稀释的与过氧化物酶偶联的抗人Fc二抗(山羊抗人IgG(Fc)，过氧化物酶缀合的，Pierce，参照31413)添加至每孔，并于室温温育1小时。用300μlPBSTween清洗4次后，将100μlTMB(Interchim，参照UP664782)添加至每孔，并温育约10分钟，然后用1MHCl溶液(Interchim，参照UPS29590)停止反应，并于以450nm波长测量的OD读板。通过BioStatSpeed测定EC50值。表1和图4中呈现了获得的结果，并且显示了相对于低分子量寡聚物，抗体对初原纤维的非常高的特异性(184倍)。
表1：
EC50(μg/ml) LMW PF LMW/PF
LP09026 41.4±40.1 0.0587±0.004 705.3
LP09027 14.7±2.7 0.0798±0.007 184.2
LP09028 21.8±5.3 0.0892±0.007 244.4
将冻干的肽Aβ1-42(Anaspec参照24224)依照供应商的推荐来溶解：将40μl1％NH4OH添加至500μgAβ1-42。完全溶解后，添加460μlPBS以获得1mg/ml的浓度。制备10μl的等分试样，并于-80℃贮存。
将在碳酸盐缓冲液(NaHCO30.025M(AcrosOrganics，参照217120010)、Na2CO30.025M(AcrosOrganics，参照207810010)，pH9.7中的50μl1μg/ml浓度的肽Aβ1-42溶液在ELISA板的孔中沉积，并于室温温育过夜。如先前的，将孔用缓冲液PBSTween清洗，在存在缓冲液PBS+5％奶粉(重量/体积)的情况中温育，并用缓冲液PBSTween清洗。将0.02μg/ml浓度的人源化抗体与一定浓度范围的(自1μg/ml开始)肽Aβ1-28(Bachem，参照H7865)、Aβ1-16(Anaspec，参照24225)、Aβ25-35(Anaspec，参照24227)、低分子量寡聚物或如先前所描述的那样制备的初原纤维一起于室温温育1小时。然后，将抗体/抗原混合物在每孔中沉积，并将微量滴定板于室温温育1小时。依照与先前所描述相同的ELISA方案来测定游离的、未复合的抗体。这些竞争性实验显示了只有比低分子量聚合物具有高得多的亲和力的初原纤维能够通过阻止抗体与肽Aβ1-42相互作用来中和人源化抗体；肽无一能够中和抗体。
实施例4：人源化抗体LP09027对于Aβ1-42的原纤维的特异性
将肽Aβ1-42(Anaspec，20276)在200μl10mMNaOH中溶解至5mg/ml的浓度。将肽IAPP(Anaspec，60804)在200μl50％DMSO中稀释至5mg/ml的浓度。将100μl每种制备物在400μlPBS1.25X中稀释。肽的终浓度是在500μl中的1mg/ml。将样品于37℃温育72小时。温育后，将样品以17900g于4℃离心30分钟。除去上清液，并将团粒用PBS1X清洗三次。最后一次清洗后，将原纤维的团粒在150μlPBS中吸收。为了检查淀粉样型原纤维的存在，实施硫黄素T荧光测试(Anaspec，88306)。将20μl硫黄素T(最终20μM)、10μl样品和70μlPBS1X(终体积100μl)在黑色板(Corning，3792)的孔中混合。以450nm激发硫黄素T，并且在存在淀粉样型结构的情况中发射482nm的荧光。将50μl1μg/mlAβ1-42原纤维和0.5μg/mlIAPP在微量滴定板的每孔中沉积。使用自10μg/ml开始的人源化抗体的连续稀释来应用ELISA方案。图5显示了人源化抗体LP09027特异性识别Aβ1-42的原纤维，而非IAPP的原纤维。
实施例5：人源化抗体LP09027对成熟的老年斑，而非弥散斑的特异性
在免疫组织化学(VentanaRobot)中对来自小鼠APPPS1(SchmitzC.等，Am.J.Pathol，2004，164，1495-1502所描述的阿耳茨海默模型)的脑切片及自阿耳茨海默氏病患者衍生的人脑切片(脑皮层)使用与洋地黄毒苷(洋地黄毒苷-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯：Roche11333054001；11418165001)缀合的人源化抗体(LP09027)。已经预先将样品在甲醛中固定，并在石蜡中包埋。
小鼠中获得的结果(图6A和图6B)清楚地显示了人源化抗体仅识别密集的、成熟的老年斑，而非肽Aβ的弥散性沉积物。
这些数据与此抗体的特性联系起来，所述抗体对初原纤维Aβ形式是特异的，并且因此不识别此肽的可溶性、单体或寡聚形式。
表2：

Claims (27)

1.对A-β肽的初原纤维形式特异性的人源化抗体，其特征在于：
-所述抗体包含
序列SEQIDNO:10、12、14、16、18和20的CDR，
序列SEQIDNO:10、12、14、32、18和20的CDR，或
序列SEQIDNO:10、12、30、32、18和20的CDR；
-且其中当所述抗体包含序列SEQIDNO:10、12、14、16、18和20的CDR时，其重链的可变部分由序列SEQIDNO:6组成，和/或其轻链的可变部分由序列SEQIDNO:8组成。
2.依照权利要求1的抗体，其特征在于其重链的可变部分由与序列SEQIDNO:6和SEQIDNO28之一具有至少90％同一性的序列组成。
3.依照权利要求1的抗体，其特征在于其轻链的可变部分由与序列SEQIDNO:8和SEQIDNO24之一具有至少99％同一性的序列组成。
4.依照权利要求2的抗体，其特征在于它含有包含多肽序列SEQIDNO6或SEQIDNO28的可变部分的重链。
5.依照权利要求3的抗体，其特征在于它含有包含多肽序列SEQIDNO8或SEQIDNO24的可变部分的轻链。
6.依照权利要求1的抗体，其特征在于它包含由多肽序列SEQIDNO:6组成的重链可变部分和由多肽序列SEQIDNO:24组成的轻链可变部分。
7.依照权利要求1的抗体，其特征在于它包含由多肽序列SEQIDNO:24组成的轻链可变部分和由多肽序列SEQIDNO:28组成的重链可变部分。
8.依照权利要求1的抗体，其特征在于它包含与多肽序列SEQIDNO2和SEQIDNO26之一具有至少80％同一性的重链。
9.依照权利要求1的抗体，其特征在于它包含与多肽序列SEQIDNO4和SEQIDNO22之一具有至少80％同一性的轻链。
10.依照权利要求1的抗体，其特征在于它包含具有多肽序列SEQIDNO:2和4的链。
11.依照权利要求1的抗体，其特征在于它包含具有多肽序列SEQIDNO:2和22的链。
12.依照权利要求1的抗体，其特征在于它包含具有多肽序列SEQIDNO:26和22的链。
13.依照权利要求1的抗体，其特征在于它诱导淀粉样斑的缩小。
14.依照权利要求1的抗体，其特征在于其对所述肽A-β的初原纤维形式的亲和力比其对此肽的其它形式的亲和力大至少100倍。
15.依照权利要求1的抗体，其特征在于它包含如下的重链和轻链，该重链由多肽序列SEQIDNO：2组成，该轻链由多肽序列SEQIDNO：4组成。
16.依照权利要求15的抗体，其特征在于它由如下的重链和轻链组成，该重链由多肽序列SEQIDNO：2组成，该轻链由多肽序列SEQIDNO：4组成。
17.依照权利要求1-16中任一项的抗体在制备用于治疗与神经变性性病症有关的疾病的药物中的用途。
18.依照权利要求1-16中任一项的抗体在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途。
19.药物组合物，其包含依照权利要求1至16中任一项的抗体和赋形剂。
20.生成依照权利要求1至16中任一项的抗体的细胞。
21.生成依照权利要求1至16中任一项的抗体的方法，其特征在于它包括培养依照权利要求20的细胞。
22.包含依照权利要求1至16中任一项的抗体的医学产品。
23.编码权利要求1的抗体的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQIDNO:9、11、13、15、17和19，或与这些序列分别相差1、2、3、4或5个核苷酸的序列。
24.编码权利要求1的抗体的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQIDNO:9、11、13、31、17和19，或与这些序列分别相差1、2、3、4或5个核苷酸的序列。
25.编码权利要求1的抗体的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQIDNO:9、11、29、31、17和19，或与这些序列分别相差1、2、3、4或5个核苷酸的序列。
26.包含依照权利要求23-25中任一项的核酸的重组载体。
27.包含依照权利要求26的载体的宿主细胞。
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