UA117446C2 - Гуманізоване антитіло до cxcr5 - Google Patents

Гуманізоване антитіло до cxcr5 Download PDF

Info

Publication number
UA117446C2
UA117446C2 UAA201312423A UAA201312423A UA117446C2 UA 117446 C2 UA117446 C2 UA 117446C2 UA A201312423 A UAA201312423 A UA A201312423A UA A201312423 A UAA201312423 A UA A201312423A UA 117446 C2 UA117446 C2 UA 117446C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
amino acid
cells
acid sequence
antibodies
Prior art date
Application number
UAA201312423A
Other languages
English (en)
Inventor
Рената Лі
Венсан Міколь
Елізабет Аллен
Норман РЮЧ
Беатріс Камерон
Томас Оліджино
Ніколя Борен
Original Assignee
Санофі-Авентіс
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40429297&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA117446(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Санофі-Авентіс filed Critical Санофі-Авентіс
Publication of UA117446C2 publication Critical patent/UA117446C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)

Abstract

Винахід стосується гуманізованого антитіла, яке специфічно зв'язується з CXCR5 і інгібує функцію CXCR5, виділеної молекули нуклеїнової кислоти, вектора та мікробної клітини-хазяїна.

Description

Винахід стосується антитіл до СХСОК5 і їх застосування для полегшення стану, лікування або профілактики захворювань або розладів у ссавців, включаючи людину, викликаних аномальною активністю або метаболізмом СХСК5, або аномальним або випадковим їхнім зв'язуванням, наприклад з патогеном. Розглянуте антитіло може блокувати зв'язування ліганду, наприклад СХСІ 13, зі своїм рецептором, наприклад СХОК5. Також розкривається інформація про профілактичні, імунотерапевтичні і діагностичні препарати, що містять розглянуті антитіла і їх похідні, і їх застосування в рамках методів профілактики або лікування захворювань ссавців, включаючи людину, які викликані аномальним метаболізмом і/або активністю клітин СХСН5", наприклад В-лімфоцитів. До таких захворювань належать аутоімунні хвороби, а також хвороби, викликані або, що характеризуються запальними процесами, наприклад ревматоїдний артрит (РА), при якому спостерігається підвищена активність СХСК5.
СХ», також відомий як рецептор лімфоми Беркіта (ВІ К1), СО185, МОК15 і МОС117347, є рецептором, пов'язаним з б-білком, який входить у сімейство рецепторів хемокіну СХС. Як ліганд виступає ВІ С, інша назва - СХСІ 13, який є хемоатрактантом В-клітин.
Непроцесований попередник СХСК»5 складається з 372 амінокислот і має молекулярну вагу 42 кр.
СХС5 бере участь у міграції й локалізації В-клітин у певних анатомічних відділах. У нокаутних мишей з відсутніми периферичними лімфатичними вузлами менше пейерових бляшок і більш низький рівень В-клітин.
У даному винаході пропонуються нові гуманізовані й людські антитіла, а також їх фрагменти й похідні, які специфічним чином зв'язуються з СХСК»5. Деякі з антитіл і їх СХСКЗ-з'єднувальні фрагменти можуть бути змінені, для того, щоб перешкодити утворенню внутрішньоланцюгового дисульфідного зв'язку, що приводить до утворенню молекули, яка зберігає стабільність у процесі одержання й використання /л м/мо. Інші розглянуті антитіла можуть бути також змінені, для того, щоб звести до мінімуму зв'язування з ЕсК. Деякі розглянуті антитіла СХСК5 конкурують із СХСІ 13 за зв'язування з СХСК5. Інші антитіла знижують активність СХСК5.
Винахід включає амінокислотні послідовності варіабельного важкого й легкого ланцюга антитіл і відповідні ним послідовності нуклеїнових кислот.
Інший приклад здійснення винаходу включає послідовності гіперваріабельних ділянок (СОК) антитіл, для того, щоб одержати з'єднувальні молекули, які містять одну або кілька ділянок СОК або похідних від ділянок СОК, що зберігають здатність зв'язування СХСЕ5 вихідної молекули, з якої був одержаний СОМ.
Розглянутим антитілом може бути таке, яке не дозволяє СХСІ13 або іншому ліганду зв'язуватися із клітинами СХОК5", наприклад В-клітинами.
Інший приклад здійснення даного винаходу включає клітинні лінії й вектори, що містять послідовності антитіл згідно з даним винаходом.
Ще один приклад здійснення даного винаходу припускає використання антитіл для виготовлення медикаменту або лікарського препарату для лікування захворювань і порушень, пов'язаних з функцією й метаболізмом СХСК5.
В іншому прикладі здійснення даного винаходу пропонується використовувати зазначені антитіла при лікуванні порушень, пов'язаних з атипічною або аномальною біологічною природою й функціонуванням СХСК5.
Додаткові особливості й переваги описані в даному документі й будуть очевидні з наведеного нижче повного опису винаходу.
Даний винахід не обмежується конкретною методологією, протоколами, клітинними лініями, векторами або реагентами, описаними в даному документі, оскільки їх можна міняти, не зачіпаючи при цьому основної ідеї й об'єму винаходу. Далі, використовувана в даному документі термінологія призначена винятково для опису конкретних здійснень і не має на увазі обмеження об'єму даного винаходу. Якщо не зазначене інше, усі технічні й наукові терміни й скорочення, використовувані в даному документі, мають таке ж значення, яке загальновідомо рядовим фахівцям в галузі, до якої належить даний винахід. Будь-які способи й матеріали, аналогічні або ідентичні описаним у даному документі, можуть використовуватися в практичному застосуванні даного винаходу, і нижче приводяться тільки приклади способів, обладнань і матеріалів.
Усі публікації й патенти, зазначені в даному документі, включаються в даний документ як посилання на них для цілей опису й розкриття, що приводяться в ньому білків, ферментів, векторів, клітин-хазяїнів і методологій, які можуть використовуватися в даному винаході й у комбінації з ним. Разом з тим, ніякі положення даного документа не слід розглядати як визнання того, що даний винахід не має права на більш ранній пріоритет такого розкриття через попередній винахід.
Перед описом формулювання й застосування способів, пов'язаних з СХОК5, і розглянутих продуктів для відомості фахівців нижче приводяться визначення деяких термінів і словосполучень. "СХСК5" означає відому молекулу, що зустрічається в природі, яка присутня в лімфоцитах, зокрема В-клітинах, і особливо, в інтактних В-клітинах; таку молекулу, виділену з таких клітин; таку молекулу, одержану за допомогою рекомбінантних технологій з використанням відомих матеріалів і методів і з використанням нуклеїнової кислоти, що кодує СХСК5; а також частини
СХСР5, наприклад позаклітинний домен (ЕС), який зберігає характеристики й властивості, важливі для практичного застосування даного винаходу, такого як зв'язування СХСЇІ 13.
Розчинна молекула СХСК5 може, по суті, включати ЕС домен СХСК5, який звичайно складається з перших шістдесяти амінокислот молекули, тобто амінотермінальної частини схе.
СХСК5 вне є опроміскуїтетним рецептором. СХСІ13 виступає як ліганд СХСК5 і конститутивно експресується на стромальних клітинах, наприклад фолікулярних дендритних клітинах і в лімфоїдних тканинах. СХСІ13 специфічно залучає В-клітини й невелику субпопуляцію Т-клітин, які називаються В-хеллерними фолікулярними Т-клітинами, ТЕН. Таку поведінку не можна назвати несподіваною, беручи до уваги множину взаємодій між популяціями
Т-клітин і В-клітин в імунній системі. Більше того, активовані Т-клітини індукують або підсилюють експресію СХСК5. Було встановлено, що інфільтрація лімфоцитів у третинні ектопічні гермінативні центри (СС) добре корелює з гостротою, що підсилюється, захворювання й падінням переносимості у випадку певних розладів, які характерні ля подібних атипічних лімфовузлових структур. У моделях мишей /л умо, наприклад миші СХСК5-/- і СХСІ 13-/-, відсутність рецептора або ліганду приводить до зміненої тонкої структури С через зміну локалізації Т- і В-клітин, а, можливо, і взаємодії. Ці миші також захищені від розвитку гострого колаген-індукованого артриту (КІА). Оскільки СХСК5 селективно експресується на зрілих В- клітинах, які пов'язані з патогенезом РА, блокування цього рецептора буде модулювати артритогенну відповідь у страждаючих захворюванням пацієнтів. Була продемонстрована клінічна ефективність лікування ревматоїдного артриту біологічними молекулами (такими як анти-ТМРа і антитіла до СО20, ритуксимаб); зокрема, у пацієнтів, що одержували орієнтоване на
В-клітини лікування, відзначалися стійкі поліпшення клінічних ознак і симптомів. Селективна спрямована дія проти СХСК»5, який експресується тільки в зрілих В-клітинах і В-хелперних Т- клітинах, не буде впливати на розвиток В-клітин, і не буде викликати імунну недостатність у пацієнта. На відміну від ритуксимабу розглянуте антитіло належить до нейтралізуючих антитіл, які не опосередковують цитотоксичність клітин.
Під "хворобою СХСК5" розуміють розлад, порушення, захворювання, патологічний стан, відхилення та ін., яке характеризується або викликається надекспресією або підвищеними рівнями СХСІ13 або іншого ліганду СХСК5, підвищеними рівнями В-клітин, підвищеними рівнями активності В-клітин, підвищеними рівнями СХСК5 або аномальним метаболізмом і активністю СХОКО5.
Під "активністю В-клітин" маються на увазі більш високі в порівнянні з нормою рівні В-клітин, які можуть бути локальними, або ознаки біологічного прояву або функціонування В-клітин, наприклад експресія антитіла, присутність або активність тирозинкінази Брутона, експресія або присутність СЮО19, експресія або присутність фактора, що активує В-клітини й інш.
Термін "по суті ідентичні" стосовно послідовності поліпептидного ланцюга антитіла може бути витлумачений як ідентичність послідовності ланцюга антитіла, і поліпептидної послідовності, що зіставляється, щонайменше на 70 95, 80 95, 90 95, 95 96 або більше. Той же термін відносно послідовності нуклеїнової кислоти може бути витлумачений як ідентичність послідовності нуклеотидів і послідовності нуклеїнової кислоти, що зіставляється, щонайменше на 85, 90, 95, 97 95 або більше.
Терміни "ідентичність" або "гомологія" можуть означати відсоток основ нуклеотидів або амінокислотних залишків у послідовності кандидата, які ідентичні залишку відповідної послідовності, з якої вона порівнюється, після зіставлення послідовностей і введення пропусків, якщо необхідно, для забезпечення максимального відсотка ідентичності по всій послідовності й без урахування яких-небудь консервативних заміщень у рамках ідентичності послідовності. Ні
М-термінальні або С-термінальні подовжуючі сегменти, ні вставки не слід розглядати як такі, що зменшують ідентичність або гомологію. Методи й комп'ютерні програми для зіставлення доступні й відомі фахівцям в галузі. Ідентичність послідовності може оцінюватися за допомогою програмного забезпечення для зіставлення послідовностей.
Словосполучення й терміни "функціональний фрагмент, варіант, похідне або аналог" і їм бо подібні, а також їх форми, застосовувані у відношенні антитіла або антигену, описують сполуку або молекулу, що має якісну біологічну активність, властиву розглянутому антитілу або антигену повної довжини. Наприклад, функціональний фрагмент або аналог антитіла до СХСК5 може зв'язуватися з молекулою СХСК5О або може перешкоджати або суттєво знижувати здатність ліганду, наприклад СХСІ 13, або агоніста або антагоністичного антитіла зв'язуватися з
СХСК5. Прикладом є молекула 5сЕу. Що стосується СХСК5, її варіантом або похідним є молекула, яка неідентична СХСМК5, що зустрічається в природі, але, проте, може використовуватися для цілей даного винаходу, наприклад, незважаючи на відсутність ідентичності з немутантною СХСК»5, проте може використовуватися як імуноген для підвищення рівня антитіл, які селективно зв'язуються з немутантною СХСК5. "Субституційними" варіантами називають такі де щонайменше один амінокислотний залишок у нативній послідовності вилучений і замінений іншою амінокислотою, введеною на його місце в тому ж положенні. Заміщення можуть бути одиночними, при яких заміняється тільки одна амінокислота в молекулі, або множинними, якщо в одній і тій же молекулі заміщаються дві або більше амінокислоти. Множинні заміщення можуть проводитися в послідовних сайтах. Крім того, одна амінокислота може заміщуватися декількома залишками, такий варіант містить як заміщення, так і вставки. "Інсерційними" варіантами називають такі, де одна або кілька амінокислот були введені безпосередньо по сусідству з тією або іншою амінокислотою в конкретному положенні нативної послідовності. Під, безпосередньо сусідньою із тієї або іншою амінокислотою розуміється амінокислота, пов'язана з а-карбоксильною або а- амінною функціональною групою амінокислоти. "Делеційними" варіантами називають такі, де вилучена одна або кілька амінокислот з нативної амінокислотної послідовності. Звичайно в делеційних варіантах видаляють одну або дві амінокислоти в конкретній області молекули.
Термін "антитіло" використовується в найбільш широкому сенсі й, зокрема, включає моноклональні антитіла (включаючи моноклональні антитіла повної довжини), поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), фрагменти антитіл або синтетичні поліпептиди, що містять одну або більше послідовностей СОК або похідних СОК, за умови, що поліпептиди проявляють бажану біологічну активність. Антитіла (Аре5) і імуноглобуліни (Ід5) належать до глікопротеїнів, що мають однакові структурні особливості. Як правило, антитіла розглядають як Ід5 з визначеною або розпізнаваною специфічністю. Таким
Зо чином, антитіла проявляють специфічність зв'язування з конкретною мішенню, тоді як до імуноглобулінів належать й антитіла, і інші подібні антитіл молекули, які не мають специфічності до мішені. Антитіла згідно з даним винаходом можуть належати до будь-якого класу (наприклад,
Ід, ЧЕ, І9М, ІдО, ІдА та ін.) або підкласу (наприклад, Іден, ІдС2, ІДСга, ІдСз, ІДС, ІДАч, ІдАг та ін.) (терміни "тип" і "клас", а також "підтип" і "підклас" рівнозначно використовуються в даному документі). Нативні або немутантні, тобто одержані від представника популяції без штучних маніпуляцій, антитіла й імуноглобуліни звичайно являють собою гетеротетрамерні глікопротеїни з молекулярною вагою приблизно 150000 дальтон, що складаються із двох однакових легких ланцюгів () і двох однакових важких ланцюгів (Н). Кожний важкий ланцюг має на кінці варіабельний домен (Мн), за яким іде декілька константних доменів. Кожний легкий ланцюг має на кінці варіабельний домен (Мі), а на іншому кінці - константний домен. Під виразом «без штучних маніпуляцій» розуміють відсутність обробки, після якої елементи містять або експресують чужорідну антигензв'язу вальну молекулу. Визначення "нативний" може належати до найбільш переважної алелі або видів, що реєструються у популяції, або до антитіла, одержаного від тварини без маніпуляцій, у зіставленні з алеллю або поліморфізмом, або варіантів, або похідних, одержаних за рахунок тієї або іншої форми маніпуляцій, наприклад мутагенезу, застосування рекомбінантних методик та ін. для зміни амінокислоти антигензв'язу вальної молекули.
Використовуваний у даному документі термін "антитіло до СХСК5" означає антитіло або одержаний з нього поліпептид (похідне), які специфічно зв'язуються з людським СХСК5 відповідно до даного документа, у тому числі, серед інших, молекули, які інгібують або суттєво знижують рівень зв'язування СХСЕ5 з його лігандами або інгібують активність СХСК5.
Термін "варіабельний" у контексті варіабельного домену антитіл стосується певних частин відповідної молекули, які значною мірою відрізняються своєю послідовністю від одного до іншого антитіла й використовуються для специфічного розпізнавання й зв'язування конкретного антитіла з його певною мішенню. При цьому варіабельність нерівномірно розподіляється по варіабельним доменам антитіл. Варіабельність зосереджується в трьох сегментах, які називаються визначальними комплементарність областями (СО; тобто СОКІ, СОМК2 і СОКУ), також відомими як гіперваріабельні ділянки, які знаходяться у варіабельних доменах як легкого, так і важкого ланцюга. Області варіабельних доменів з більш високими рівнями бо консервативності називають каркасними ділянками (ЕК) або послідовностями. Варіабельні домени нативних важких і легенів ланцюгів містять по чотири області ЕК, значною мірою мають конформацію р-аркуша й зв'язані трьома СОК, які утворюють з'єднувальні петлі, а в деяких випадках і утворюють частину структури Р-аркуша. СОК у кожному ланцюзі часто сусідять із областями ЕК і разом з СОК іншого ланцюга сприяють формуванню шуканого (епітопа або детермінанта) сайту зв'язування антитіл (див., Кабаї єї аІ. Зедцепсез ої Ргоївіпз ої Іттипо|одісаї
Іпіеге5і, Майопа! Іпзійше ої Неац, ВеїШезаа, МО (1987)) Якщо не зазначене інакше, використовувана в даному документі нумерація амінокислотних залишків імуноглобуліну проводиться відповідно до системи нумерації амінокислотних залишків імуноглобуліну в роботі
Кабаї ег аІ. Один СОК може мати здатність специфічно зв'язувати когнатний епітоп.
Визначення "фрагмент антитіла" стосується частини інтактного або повного ланцюга або антитіла, як правило області зв'язування мішені або варіабельної області. До прикладів фрагментів антитіла, серед інших, належать фрагменти Еав, Ра», К(аюг і Ру. "Функціональним фрагментом" або "аналогом антитіла до СХСМК5" називають такий фрагмент, який може перешкоджати здатності рецептора, або суттєво знижувати таку здатність, зв'язуватися з лігандом або ініціювати сигнал. Використовуваний у даному документі термін "функціональний фрагмент" є синонімом терміна "фрагмент антитіла" і при вживанні відносно антитіл може стосуватися таких фрагментів, як Гу, Еаь, К(ав)г та ін., які в стані перешкоджати здатності рецептора, або суттєво знижувати таку здатність, зв'язуватися з лігандом або ініціювати сигнал.
Фрагмент "Бу" складається з димеру варіабельного домену з одним важким й одним легким ланцюгом, утвореного за допомогою нековалентної асоціації (димер Мн-Мі). У такій конфігурації три СОК кожного варіабельного домену взаємодіють, формуючи шуканий сайт зв'язування на поверхні димеру Мн-Мі, так само як в інтактному антитілі. У сукупності такі шість СОК забезпечують специфічність зв'язування мішені на інтактному антитілі При цьому навіть одиничний варіабельний домен (або половина Ку, що містить усього три СОК, специфічних до мішені) може мати здатність розпізнавати й зв'язувати мішень. "Одноланцюгові Бу", фрагменти антитіл "Бу" або "зсАБ" включають домени антитіла Мн і Мі, де ці домени присутні в єдиному поліпептидному ланцюзі. Як правило, поліпептид Еу додатково містить поліпептидний лінкер, часто гнучку молекулу, між доменами Мн і Мі, що дозволяє 5ЕУ утворювати потрібну структуру для зв'язування мішені.
Зо Термін "діатіла" стосується фрагментів антитіл із двома антигензв'язувальними сайтами, такі фрагменти можуть включати варіабельний домен важкого ланцюга (Мн), пов'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (Мі) у тому ж поліпептидному ланцюзі. За рахунок використання лінкера, який занадто короткий, щоб забезпечувати об'єднання двох варіабельні доменів одного й того самого ланцюга, домени діатіл змушені поєднуватися з доменами зв'язування іншого ланцюга для формування двох антигензв'язувальних сайтів.
Фрагмент Раь містить варіабельні й константні домени легкого ланцюга й варіабельний і перший константний домен (Сні) важкого ланцюга. Фрагменти Ра» відрізняються від фрагментів
Еаь додаванням декількох залишків у карбоксильному термінальному кінці домену Сні, так щоб він містив один або декілька цистеїнів із шарнірної області антитіла. Фрагменти Ра» можуть бути одержані розщепленням дисульфідного зв'язку в цистеїнах шарнірної області продукту руйнування пепсином (а»)». Додаткова ферментативна й хімічна обробка антитіл може приводити до утворення інших функціональних фрагментів, що представляють інтерес.
Використовуваний у даному документі термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла, одержаного з популяції значною мірою однорідних антитіл, тобто окремі антитіла, що утворюють популяцію, ідентичні, якщо не враховувати можливі природні мутації, які можуть бути присутніми у незначних кількостях.
У цьому випадку до моноклональних антитіл, зокрема, належать "химерні" антитіла, у яких частина важкого і/або легкого ланцюга ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, одержаних від конкретних видів або приналежних до певного класу або підкласу (типу або підтипу) антитіл, при цьому інший ланцюг (ланцюги) ідентичний або гомологічний відповідним послідовностям в антитілах, одержаних від інших видів або приналежних іншому класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, за умови що вони проявляють бажану біологічну активність при зв'язуванні з СХСН5 або впливі на активність або метаболізм
СХСН5 (патент США Мо 4816567; і Моїгтізоп еї аї!., Ргос Маї! Асай сі ОБА 81:6851 (1984)). Тому
СОК одного класу антитіл можуть бути щеплені в ЕК антитіла іншого класу або підкласу.
Моноклональні антитіла мають високу специфічність, вони орієнтовані на єдиний сайт- мішень, епітоп або детермінант. Крім того, на відміну від звичайних (поліклональних) препаратів антитіл, які, як правило, містять різні антитіла, спрямовані проти різних детермінантів (епітопів) антигену, кожне моноклональне антитіло спрямоване проти єдиного детермінанта в мішені. На 60 додаток до специфічності, перевага моноклональних антитіл полягає в тому, що вони продукуються клітиною-хазяїном без домішок інших імуноглобулінів, що забезпечує клонування відповідного гена й мРНК, що кодує антитіло його ланцюгів. Модифікатор "моноклональне" вказує на характеристику антитіла, яке було одержано зі значною мірою однорідної популяції антитіл, і не повинен бути витлумачений як потребуючий продукції антитіла будь-яким конкретним методом. Наприклад, моноклональні антитіла для використання в даному винаході можуть бути виділені з фагової бібліотеки антитіл за допомогою добре відомих методик або ж можуть бути виділені з поліклонального препарату. Вихідні моноклональні антитіла для використання відповідно до даного винаходу можуть бути виготовлені за допомогою гібридомного методу, описаного в Копіег єї аї., Маїшге 256:495 (1975), або можуть бути одержані рекомбінантними методами, які добре відомі фахівцям в галузі.
У порівнянні з людським антитілом "гуманізовані" форми нелюдських (наприклад, мишачих) антитіл являють собою химерні імуноглобуліни, ланцюги імуноглобулінів або їх фрагменти (наприклад Ру, Еаь, Ра», К(аюр»2 або інших зв'язуючих мішень підпослідовностей антитіл), які містять послідовності, похідні від нелюдського імуноглобуліну. Як правило, гуманізоване антитіло буде включати по суті всю послідовність одного, а звичайно двох варіабельних доменів, в яких усі або по суті всі ділянки СОК відповідають ділянкам СОК нелюдського імуноглобуліну, і всі або по суті всі області ЕЕ являють собою матричну послідовність людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло може також включати щонайменше частину константної області імуноглобуліну (Рс), як правило, вибраної матричної послідовності людського імуноглобуліну. Як правило, основною метою є одержання молекули антитіла, яка мінімально імуногенна для людини. Тому існує можливість також замінити одну або кілька амінокислот в одній або декількох СОК на такі, які будуть менш імуногенними для організму- хазяїна людини, суттєво не знижуючи специфічну функцію зв'язування однієї або декількох СОМ з СХОСК5 або з СХСІ 13. Як альтернатива можна використовувати нелюдську ЕК, але в ній найбільш імуногенні амінокислоти заміняються на менш імуногенні. Проте, що обговорювалося вище СОК-прищеплювання не є єдиним методом одержання гуманізованого антитіла.
Наприклад, модифікації одних тільки областей СОМ може бути недостатньо, оскільки досить часто каркасні залишки можуть відігравати важливу роль у визначенні тривимірної структури петель СОК і загальної афінності антитіла до свого ліганду. Тому можуть застосовуватися будь-
Зо які способи модифікації молекули нелюдського вихідного антитіла, так щоб бути менш імуногенними для людини, і повна ідентичність із людським антитілом не завжди є обов'язковою. Отже, гуманізація може також досягатися, наприклад, простим заміщенням усього лише декількох залишків, зокрема, тих, які знаходяться на поверхні молекули антитіла й не сховані усередині її структури, а тому недоступні для імунної системи хазяїна. Подібний спосіб запропонований у даному документі відносно заміщення "мобільних" або "гнучких" залишків молекули антитіла, при цьому мета полягає в тому, щоб зменшити або придушити імуногенність молекули, що виходить, не порушуючи специфічність антитіла у відношенні епітопу або детермінанту. Див., наприклад, 5ішапіскКа еї аї., Ргої Епо 7(6)805-814, 1994; Мої Ітт 44:1986-1988, 2007; бітв еї аї., ) Іттипої 151:2296 (1993); Споїпіа еї аї., У Мої! Віо!ї 196:901 (1987); Сапег єї аї., Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 89:4285 (1992); Ргезіа єї аї., У Іттипої 1512623 (1993), УМО 2006/042333 і патент США Мо5869619.
Адаптивна імунна відповідь має два основні аспекти: клітинна імунна відповідь Т-лімфоцитів і гуморальна імунна відповідь антитіла, що продукує В-лімфоцити. Епітопи В-клітин можуть бути лінійними, утвореними безперервною послідовністю амінокислот, або можуть бути конформаційними (Ргоївіп Зсіепсе (2005) 14, 246). Напроти, епітопи Т-клітин являють собою короткі лінійні пептиди, які відщеплюються від антигенних білків, що існують у формі білків основного комплексу гістосумісності (МНС) або, у випадку людини, молекул лейкоцитарного антигену людину (НГ А) класу І або класу Ії. Форма епітопу залежить як від зв'язування МНО- пептиду, так і від взаємодії з рецептором Т-клітин (ТСК). Білюии МНС мають високий поліморфізм, і кожний з них зв'язується з обмеженим набором пептидів. Тому конкретна комбінація алелей МНС, присутніх в організмі хазяїна, обмежує набір потенційних епітопів, розпізнаваних у випадку інфекції.
Два основні типи Т-клітин різняться по експресії білків СО8 і СО4, які визначають, чи буде Т- клітина розпізнавати епітопи, представлені молекулами класу І або класу Ії, відповідно.
Процесинг СО4- Т-епітопів відбувається після інкапсуляції антигенутримуючих клітин у пов'язаних з мембраною везикулах, де антиген розщеплюється протеазами на пептидні фрагменти, які зв'язуються з більами МНС класу ІЇ. Напроти, СО8: Т-клітини звичайно розпізнають вірусні або власні антигени, експресовані всередині клітини, білки, які розщеплюються на більш короткі пептиди імунопротеасомами в цитозолі. Після розщеплення бо пептиди переміщаються переносником, пов'язаним із процесингом антигену, (ТАР) в ендоплазматичний ретикулум для зв'язування з антигенами НГА І. Епітопи СО4-Т (хелперних) клітин мають велике значення для імунних відповідей, залежних від Т-клітин, на білкові антигени.
Пропонований спосіб гуманізації заснований на впливі гнучкості молекули антитіла в процесі й у момент імунного розпізнавання. Гнучкість білка пов'язана з молекулярним рухом його молекули. Під гнучкістю білка мають на увазі здатність усього білка, частини білка або окремо взятого амінокислотного залишку формувати ансамбль конформацій, які значною мірою відрізняються один від одного. Дані про гнучкість біль»а можна одержати за результатами експериментів рентгенівської кристалографії (див., наприклад, Кипаи еї аї. 2002, Віорпуз 83:723-732.), ядерного магнітного резонансу (див., наприклад, Егеедбего еї а!., У Ат Спет 50с 1998, 120(31):7916-7923) або за результатами моделювання молекулярної динаміки (МО).
Моделювання МО білка проводиться на комп'ютері й дозволяє виявити рухи всіх атомів білка за певний період часу за допомогою розрахунку фізичних взаємодій атомів один з одним.
Результатом моделювання МО є траєкторія для досліджуваного білка за період часу моделювання. Траєкторія являє собою ансамбль конформацій білка, який також називається статичними конфігураціями, які періодично реєструються за час моделювання, наприклад кожну пікосекунду (псек.-). Саме за допомогою аналізу ансамблю статичних конфігурацій можна визначити гнучкість амінокислотних залишків білка. Тому гнучким залишком вважається такий, який може мати ансамбль різних конформацій у структурі поліпептиду, де такий залишок знаходиться. Методи МО відомі фахівцям в галузі, див., наприклад, Вгоокз5 еї аї. "Ргоїеіп5: А
ТНеогеїїса! Регзресіїме ої бупатісв, біписішге апа ТНепподупатісв" (М/Пеу, Мем мок, 1988).
Земега! зоїмаге епабіє МО 5ітшіайоп5, зисп ах Атрег (див., Сазе еї а. (2005) У Сотр Спет 26:1668-1688), Спагтт (див., Вгоокз5 еї аї. (1983) У Сотр Спет 4:187-217; апа МаскКетеї! еї аї. (1998) іп "ТПне Епсусіоредіа ої Сотриїайопа! СНпетівшту" мої. 1:271-177, ЗспіІєуег єї аї., едв.
СВіспевіег: Уопп Уміеу 5 5оп5) ог Ітрасі (див. Кі70 еї а. У Ат Спет 5ос; 2000; 122(51):12898- 12900.)
Більшість комплексів білків об'єднані порівняно великою і планарною схованою поверхнею, і, було показано, що гнучкість зв'язуючих партнерів забезпечує основу для їхньої пластичності, що дозволяє їм конформаційно адаптуватися один до одного (5ігисішге (2000) 8, К137-Н142).
Відповідно, було показано, що приклади "індукованої відповідності" відіграють домінуючу роль в областях контакту білок-білок. Крім того, існує сукупність даних, що постійно поповнюється, які показують, що білки насправді зв'язують ліганди різних форм, розмірів і структур (Ргоївїіп
Зсіепсе (2002) 11:184-187) і що конформаційна різноманітність, мабуть, є істотною рисою здатності розпізнавати різних партнерів (Зсіепсе (2003) 299, 1362-1367). Гнучкі залишки беруть участь у зв'язуванні партнерів у парі білок-білок (Зігисіиге (2006) 14, 683-693).
Гнучкі залишки можуть приймати самі різні конформації, що формують ансамбль областей взаємодії, які, швидше за все, будуть розпізнаватися В-клітинами пам'яті й викликати імуногенну відповідь. Таким чином, антитіла можуть бути гуманізовані за допомогою модифікації ряду залишків каркасної ділянки, так щоб ансамбль конформацій і експонованих областей розпізнавання в модифікованому антитілі якомога більше походив на існуючі в антитілі людини.
Цього можна домогтися модифікацією обмеженого числа залишків за допомогою: (1) побудови моделі гомології вихідного моноклонального антитіла (тАбБ) і проведення молекулярно-динамічного моделювання (МО); (2) аналізу гнучких залишків і ідентифікації найбільш гнучких залишків у молекулі нелюдського антитіла, а також виявлення залишків або мотивів, які швидше за все, будуть джерелом гетерогенності або реакції розпаду; (3) ідентифікації людського антитіла, яке демонструє наявність найбільш схожого ансамблю зон розпізнавання, як вихідного антитіла; (4) виявлення гнучких залишків для мутації, залишків або мотивів, які швидше за все, будуть джерелом гетерогенності й розпаду й також будуть зазнавати мутації; і (5) перевірки на наявність відомих епітопів Т- або В-клітин. Гнучкі залишки можна виявляти на основі розрахунків МО, які пропонуються в даному документі, з використанням моделі передбачуваного розчинника, яка враховує взаємодію водного розчинника з атомами білка за період часу моделювання.
Після виявлення набору гнучких залишків у варіабельних легких і важких ланцюгах визначають набір каркасних ділянок важких і легких ланцюгів варіабельних областей людини, які мають близьку подібність із існуючим у розглянутому антитілі набором. Для цього, наприклад, можна скористатися пошуком ВІ А5Т для набору гнучких залишків по базі даних для послідовностей антитіл людської зародкової лінії. Цього також можна домогтися за допомогою зіставлення динаміки вихідного тАБ з динамікою бібліотеки канонічних структур зародкової лінії.
Залишки й сусідні залишки СОМ виключаються з пошуку, для того, щоб забезпечити бо збереження високої афінності для антигену.
Таким чином, проводили зіставлення траєкторії молекулярної динаміки для розглянутого антитіла із траєкторіями бібліотеки структур антитіл зародкової лінії. 1607 зіставляли з бібліотекою 49 структур зародкової лінії. Траєкторія молекулярної динаміки, зафіксована для кожного антитіла, являє собою ансамбль розрахунків молекулярної динаміки, одержаний у ході комп'ютерного моделювання молекулярної динаміки, де, наприклад, використовували 10 різних конформацій як різні точки відліку, і для кожної точки відліку проводили приблизно 10 розрахунків моделей молекулярної динаміки. 49 тривимірних гомологічних моделей антитіл зародкової лінії людину будували за допомогою систематичної комбінації 7 легких ланцюгів людини, що найбільш часто зустрічаються (мкі, ук2, мк, мк4, МА, мА2 і мАЗ) і 7 важких ланцюгів, що найбільш часто зустрічаються (мп1а, мп16б, мп2, мА3, мп4, мп5 і мпб) (Мисієвїс Асід5 Кезеагсй, 2005, Мої. 33, Оагаразе іззие 0593-0597). Гнучкі залишки 1607 потім заміняли на відповідні залишки структури зародкової лінії із траєкторією, найбільш близькою до траєкторії розглянутого антитіла.
Потім робили заміну гнучких залишків. Коли кілька людських залишків проявляли подібну гомологію, вибір визначався також природою залишків, які найбільш здатні вплинути на поведінку гуманізованого антитіла в розчині. Наприклад, перевага віддавалася полярним залишкам в експонованих гнучких петлях, а не гідрофобним залишкам. Залишки, які є потенційним джерелом нестабільності й гетерогенності, також піддавали мутації, навіть якщо їх виявляли в СОК. Сюди включаються експоновані метіоніни, оскільки утворення сульфоксиду може бути наслідком взаємодії з кисневими радикалами, протеолітичне розщеплення кислотно- нестійких зв'язків, наприклад, у дипептиді Азр-Рго (Огад ЮОем Невз (2004) 61:137-154), сайти деамідування, присутні в експонованому залишку аспарагіну, за яким іде невелика по розмірах амінокислота, наприклад Су, 5ег, Аа, Ні5, Азп або Суз () Спготаїйод (2006) 837:35-43), а також сайти М-глікозилування, наприклад сайт Авзп-Х-Зег/ГТПг. Як правило, експоновані метіоніни будуть заміщатися лейцинами, експоновані аспарагіни будуть заміщатися глутаміном або аспартатом, або ж буде заміщатися наступний за ними залишок. У випадку сайту глікозилування (Азп-Х-5ег/ТПг) буде замінятися або Авп, або залишок Зег/Т г.
Результуюча композитна послідовність перевіряється на предмет присутності відомих епітопів В-клітин або лінійних епітопів Т-клітин. Пошук проводиться, наприклад, по
Зо загальнодоступній базі даних імунних епітопів ЕОВ) (Ріоз Віої (2005) 3(3)е91). Якщо усередині композитної послідовності виявляється відомий епітоп, шукається інший набір людських послідовностей, усередині яких проводиться заміщення.
На відміну від запропонованого в патенті США Мо 5639641 способу зміни поверхні, у пропонованому способі враховуються також імуногенні відповіді, опосередковані В- і Т- клітинами. Даний спосіб також дозволяє обійти проблему втрати активності, яка іноді спостерігається при СОК-прищеплюванні (патент США Ме 5530101). Крім того, у процесі інженерії й селекції також враховуються аспекти стабільності й розчинності, що дозволяє створити антитіло, оптимізоване в плані низької імуногенності, високої афінності до антигену й більш прийнятних біофізичних характеристик.
Стратегії й способи зміни поверхні антитіл, а також інші способи зниження імуногенності антитіл у різних організмах хазяїна викладені, наприклад, у патенті США Мо 5639641. У цілому, у рамках переважного способу: (1) проводиться зіставлення положень набору варіабельних областей важких і легких ланцюгів антитіла, для того, щоб визначити експоновані поверхневі положення важкого й легкого ланцюга варіабельної області каркасної ділянки, при цьому зіставлені положення для всіх варіабельних областей повинні бути щонайменше приблизно на 98 95 ідентичні; (2) визначається набір нелюдських експонованих поверхневих амінокислотних залишків важких і легких ланцюгів варіабельної області каркасної ділянки, наприклад, для антитіла гризунів (або його фрагмента); (3) визначається набір експонованих поверхневих амінокислотних залишків важких і легких ланцюгів варіабельної області каркасної ділянки, який найбільш близький набору експонованих поверхневих амінокислотних залишків гризунів; і (4) набір експонованих поверхневих амінокислотних залишків важких і легких ланцюгів варіабельної області каркасної ділянки, ідентифікований на етапі (2), заміняється набором експонованих поверхневих амінокислотних залишків важких і легких ланцюгів варіабельної області каркасної ділянки, ідентифікованим на етапі (3), за винятком тих амінокислотних залишків, які розміщаються в межах 5А від будь-якого атома будь-якого залишку СОВ. антитіла гризунів, для того, щоб одержати гуманізоване антитіло, наприклад антитіло гризунів, що зберігає специфічність зв'язування.
Антитіла можуть гуманізуватися множиною інших методик, у тому числі СОК- прищеплюванням (ЕРО 0 239 400; УМО 91/09967; а також патенти США МоМо 5530101 і 5585089), 60 зміни поверхні антитіл (ЕРО 0592106; ЕРО 0519596; Радіап, 1991, Моїес Ітт 28(4/5):489-498;
зішцапіска еї аїЇ. 1994, Ргої Епу 7(6):805-814; і Кодиб5Ка еї аїЇ., 1994, РМАБ 91:969-973) і перестановки в ланцюзі (патент США Мо 5565332). Людські антитіла можуть виготовлятися із застосуванням різних методів, відомих фахівцям в галузі, у тому числі, серед інших, методів фаг-дисплея, див. патенти США МоМо 4444887, 4716111, 5545806 і 5814318; і УМО 98/46645, МО 98/50433, УМО 98/24893, УМО 98/16654, УМО 96/34096, УО 96/33735 і УМО 91/10741, з використанням трансгенних тварин, наприклад гризунів, з використанням химерних клітин та ін.
Терміни "гомолог антитіла" або "гомолог" стосуються будь-якої молекули, яка специфічним чином зв'язує СХСМК5О відповідно до змісту даного документа. Таким чином, до гомологів антитіла належать нативне або рекомбінантне антитіло, модифіковане або немодифіковане; частини антитіла, які зберігають біологічні властивості, що представляють інтерес; наприклад зв'язування СХСК5; наприклад молекули Раь або Ку; одноланцюжкове антитіло; поліпептид, що містить одну або кілька областей СОК та ін. Амінокислотна послідовність гомолога необов'язково повинна бути ідентична послідовності існуючого в природі антитіла, але може бути змінена або модифікована включенням амінокислот, що заміщають, введених амінокислот, вилучених амінокислот, амінокислот, що не входять у число двадцяти, які звичайно зустрічаються в білках, та ін., для того, щоб одержати поліпептид з поліпшеними або іншими корисними властивостями.
Антитілами з гомологічними послідовностями називають антитіла з амінокислотними послідовностями, які мають гомологію послідовності з амінокислотними послідовностями антитіла СХСК5 згідно з даним винаходом. Переважно, гомологія існує з амінокислотною послідовністю варіабельних областей антитіла згідно з даним винаходом. "Гомологія послідовності", стосовно послідовності амінокислот даного документа, визначається як послідовність із гомологією щонайменше приблизно 90 95, 91 9», 92 9в, 93 Фо, 94 У або вище й, більш переважно, з гомологією щонайменше близько 95 95, 96 9, 97 9», 98 9о або 99 95 стосовно іншої послідовності амінокислот, яка визначається, наприклад, по методу пошуку ЕАЗТА відповідно до Реагзоп 8. І іртап, Ргос Маї! Асай 5сі О5А 85, 2444-2448 (1988).
Химерним антитілом називають антитіло, що містить різні частини антитіла, одержані з різних джерел, таких як різні антитіла, різні класи антитіл, різні види тварин, наприклад антитіла, що мають варіабельну область, одержану з мишачого моноклонального антитіла, з'єднані з
Зо константною областю людського імуноглобуліну та ін. Таким чином, гуманізоване антитіло являє собою вид химерного антитіла. Методи виготовлення химерних антитіл відомі фахівцям в галузі, див, напр., Могтізоп, 1985, зсіепсе 229:1202; ОЇ еї аї., 1986, Віобтесппіднев 4:214; СіШез еї а!., 1989, У Іттипої! МеїШйоаз 125:191-202; і патенти США МоМо 5807715, 4816567 і 4816397.
До штучних антитіл належать одноланцюжкові антитіла, фрагменти 5сЕм, химерні антитіла, діатіла, триатіла, тетратіла й тги (див. рецензії УМіпіег 85 Міїстеіп, 1991, Маїшге 349:293-299; і
Нидзоп, 1999, Сцт Оріп Ітт 11:548-557), кожне з них має здатність зв'язувати антиген або епітоп. В одноланцюжковому фрагменті Ру (зсЕм), домени Мн і Мі антитіла зв'язані гнучким пептидом. Звичайно лінкер являє собою пептид довжиною близько 15 амінокислот. Якщо лінкер суттєво менше, наприклад довжиною в 5 амінокислот, утворюються діатіла, які являють собою бівалентні димери 5сЕм. Якщо лінкер скорочується до менше трьох амінокислотних залишків, формуються тримерні й тетрамерні структури, які називають триатілами й тетратілами, відповідно. Найменшою з'єднувальною одиницею антитіла може бути окремий СОК, як правило,
СОК2 або 3 важкого ланцюга, який має достатню здатність до розпізнавання й зв'язуванню, але може бути також будь-яка комбінація послідовностей СОЖК, яка може визначатися з використанням практичних методів, викладених у даному документі. Такий фрагмент називають молекулярною областю розпізнавання, або тги. Декілька таких тги можуть бути зв'язані разом з короткими лінкерними пептидами, тим самим, утворюючи штучний з'єднувальний білок з більш високою авідністю в порівнянні з окремою тги.
В об'єм даного винаходу також включаються функціональні еквіваленти розглянутого антитіла. Термін "функціональні еквіваленти" включає, наприклад, антитіла з гомологічними послідовностями, гомологи антитіл, химерні антитіла, штучні антитіла й модифіковані антитіла, наприклад ті, в яких кожний функціональний еквівалент визначається здатністю зв'язуватися з
СХ, інгібувати здатність або функцію СХСЕ5 передавати сигнал, або інгібувати зв'язування
СХСЇІ 13 і інших лігандів з СХСК5. Досвідченому фахівцеві в галузі буде очевидно часткове накладення термінів, що означають групи молекул, "фрагменти антитіл" ії "функціональні еквіваленти". Методи одержання функціональних еквівалентів, які зберігають здатність до зв'язування СХОСК5, відомі кваліфікованим фахівцям в галузі й викладені, наприклад, в М/О 93/21319, ЕРО Серійний номер 239,400, УМО 89/09622, ЕРО Серійний номер 338745 і ЕРО
Серійний номер 332424.
До функціональних еквівалентів даної заявки також належать модифіковані антитіла, наприклад антитіла, модифіковані за рахунок ковалентного зв'язку молекули будь-якого типу з антитілом. Наприклад, до модифікованих антитіл належать антитіла, які були модифіковані, наприклад глікозилуванням, ацетилуванням, зв'язуванням З поліетиленгліколем, деамідуванням, фосфорилуванням, амідуванням, введенням відомих захисних/блокувальних груп, протеолітичним розщепленням, зв'язком із клітинним лігандом, зв'язком з токсином або цитотоксичною групою або іншим білком та ін. Ковалентне зв'язування необов'язково приводить до антитіла, яке захищено від формування антиїідіотипічної відповіді. Модифікація може проводитися з використанням відомих методик, у тому числі, серед інших, специфічного хімічного розщеплення, ацетилізування, формілювання, метаболічного синтезу та ін. Крім того, модифіковані антитіла можуть містити одну або кілька некласичних амінокислот.
Рядовим фахівцям в галузі відома множина методик, які дозволяють проводити оптимізацію афінності зв'язування. Як правило, такі методики включають заміщення різних амінокислотних залишків у розглянутому сайті з наступним скринінговим аналізом афінності зв'язування мутантного поліпептиду з когнатним антигеном або епітопом.
Після ідентифікації й виділення антитіла часто буває корисно одержати варіант або мутант антитіла, або мутеїн, де змінено один або кілька амінокислотних залишків, наприклад, в одній або декількох гіперваріабельних областях антитіла. В альтернативному варіанті або додатково в структуру антитіла може бути внесено одна або кілька змін (наприклад, заміщень) у залишках каркасної ділянки, що приводить до підвищення афінності зв'язування мутанта антитіла з
СХОН5. Прикладами залишків каркасної ділянки, які можуть бути модифіковані, є такі залишки, які прямо нековалентно зв'язують антиген (Апії єї аїЇ., Зсіепсе 233:747-753 (1986)); взаємодіють із конформацією СОЄ. або впливають на неї (Споїпіа еї аї., У Мої Віо! 196:901-917 (1987)); і/або знаходяться в області контакту Мі-Мн (ЕР 239400). У деяких прикладах здійснення модифікація одного або декількох таких залишків каркасної ділянки приводить до підвищення афінності зв'язування антитіла з когнатним антигеном. Наприклад, у даному прикладі здійснення винаходу можна міняти від одного до приблизно п'яти залишків каркасної ділянки. Іноді цього може бути досить, щоб одержати мутант антитіла, придатний для використання в доклінічних випробуваннях, навіть якщо в жоден із залишків гіперваріабельної області не вносили зміни.
Зо Однак, як правило, мутант антитіла може включати одну або кілька змін гіперваріабельної області. Константні області також можна міняти, для того, щоб домогтися бажаних або більш бажаних ефекторних властивостей.
Залишки гіперваріабельної області, які зазнають заміщення, можна змінювати довільно, особливо, якщо вихідна афінність зв'язування вихідного антитіла така, що довільно одержані мутанти антитіл можуть легко аналізуватися в процесі скринінгу на зміну зв'язування за методикою аналізу, наведеною в даному документі.
Одним з методів одержання мутантів антитіл, наприклад мутантів СОК, є "мутагенез сканування аланіну" (Сиппіпдапат 8 УмеїІ5, Зсіепсе 244:1081-1085 (1989); і Сиппіпопат 8 Умеїїв5,
Ргос Маї Асай 5сі ОА 84:6434-6437 (1991)). Один або кілька залишків гіперваріабельної області заміняються аланіном або поліаланіновими залишками. Такий залишок (залишки) гіперваріабельної області, який проявляє функціональну чутливість до заміщень, потім модифікують, вводячи подальші або інші мутації в сайтах заміни. Таким чином, незважаючи на те, що сайт для введення варіації послідовності амінокислоти визначений, сам по собі характер мутації необов'язково заздалегідь заданий. Можна спробувати ввести аналогічні заміщення з іншими амінокислотами, залежно від бажаних властивостей сканованих залишків.
Більш систематичний метод ідентифікації амінокислотних залишків для модифікації включає ідентифікацію залишків гіперваріабельної області, задіяних у зв'язуванні СХСЕК»5, а також тих залишків гіперваріабельної області, які незначно або зовсім не задіяні у зв'язуванні СХСЕ5.
Проводиться аланінове сканування залишків незв'язувальної гіперваріабельної області, причому кожний Аа мутант проходить тестування на поліпшення зв'язування з СХСК5. В іншому прикладі здійснення для модифікації вибирається той залишок (залишки), які істотно задіяні у зв'язуванні СХСК5. Модифікація може передбачати делецію залишку або введення одного або декількох залишків у безпосередній близькості від розглянутого залишку. Однак, як правило, модифікація передбачає заміну залишку іншою амінокислотою. Перша заміна може бути консервативною. Якщо така заміна приводить до зміни біологічної активності (наприклад афінності зв'язування), тоді можна провести наступну консервативну заміну, щоб довідатися, чи вдалося домогтися більш істотних змін.
Ще більш значима зміна в лінії антитіл і прояві біологічних властивостей може бути досягнута при виборі амінокислоти, яка більш помітно відрізняється по властивостях від тієї, яка бо звичайно є присутньою на цьому сайті. Тому таке заміщення може проводитися при одночасному збереженні: (а) структури поліпептидного кістяка в зоні заміни, наприклад, у вигляді аркуша або спіральної конформації; (б) заряду або гідрофобності молекули в цільовому сайті, або (в) об'єму бічного ланцюга.
Наприклад амінокислоти, що зустрічаються в природі, можуть бути підрозділені на групи на основі загальних властивостей бічного ланцюга: (1) гідрофобні: метіонін (М або Ме)), аланін (А або Аа), валін (М або Маї), лейцин (І. або Г ец) і ізолейцин (І або Пе); (2) нейтральні, гідрофільні: цистеїн (С або Су), серин (5 або Зег), треонін (Т або ТпНг), аспарагін (М або Азп) і глутамін (0 або сіп); (3) кислі: аспарагінова кислота (0 або Азр) і глутамінова кислота (Е або Сім); (4) основні: гістидин (Н або Ні), лізин (К або І ув) і аргінін (Е або Аго); (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: гліцин (с або Су) і пролін (Р або Рго); (6) ароматичні: триптофан (М/ або Тір), тирозин (У або Туг) і фенілаланін (Е або Ре).
Під неконсервативними заміщеннями може матися на увазі заміна однієї з амінокислот на амінокислоту з іншої групи. Під консервативними заміщеннями може розумітися заміна однієї амінокислоти на іншу усередині однієї групи.
До переважних заміщень амінокислот належать такі, які: (1) знижують підданість протеолізу, (2) зменшують схильність до окиснення, (3) змінюють афінність зв'язування й (4) забезпечують або змінюють інші фізико-хімічні або функціональні властивості таких аналогів. Серед аналогів можуть бути присутнім різні мутеїни з послідовністю, що відрізняється від існуючої в природі пептидної послідовності. Наприклад, одиничні або множинні заміни амінокислот (переважно консервативні заміни амінокислот) можуть проводитися в існуючій у природі послідовності (переважно в частині поліпептиду за межами домену (доменів), відповідального за міжмолекулярні контакти). Консервативна заміна амінокислот не повинна суттєво змінювати структурні характеристики вихідної послідовності (наприклад, заміна амінокислоти звичайно не повинна приводити до порушення спіральної конформації, яка була присутня у вихідній послідовності, або ж порушувати інші елементи вторинної структури, які характеризують вихідну послідовність), виключенням є зміни загального об'єму або зміни конформації К-групи або бічного ланцюга, Ргоївіп5, 5ігисіиге5 апа Моїіесціаг Ргіпсіріеє5 (Стеідпіоп, ейд., МУ. Н. Егеетап апа Сотрапу, Мемж/ Моїк (1984)); Іпігодисіоп їо Ргоївіп бігисішге (Вгапдеп 5 Тоо7е, єдв., Сапапа
Рибіїзпіпу, Мем МогК, М. У. (1991)); ії Тпогпіоп еї аї. Мате 354:105 (1991).
Звичайно о мутант антитіла з поліпшеними біологічними властивостями буде мати амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 75 95 ідентична або подібна амінокислотній послідовності важкого або легкого ланцюга варіабельного домену вихідного антилюдського антитіла СХСЕ5, або має щонайменше 80 95-ну, щонайменше 85 95-ну, щонайменше 90 9о-ну і часто щонайменше 95 95-ну ідентичність. Ідентичність або подоба відносно послідовності вихідного антитіла визначається в даному документі як відсоток амінокислотних залишків у послідовності кандидата, які ідентичні (тобто той же залишок) або подібні (тобто амінокислотний залишок з тієї ж групи, основаних на близьких властивостях бічного ланцюга, див. вище) залишкам вихідного антитіла після зіставлення послідовностей і введення пропусків, якщо необхідно, для забезпечення максимального відсотка ідентичності послідовності.
В альтернативному варіанті мутанти антитіла можуть бути одержані систематичною мутацією ділянок ЕК і СОК важкого і легкого ланцюгів або ж ділянки Ес антитіла до СХСЕ5.
Інший метод одержання мутантів антитіла включає використання дозрівання афінності за допомогою фаг-дисплея (Нам/Кіп5 еї аїЇ., 9) Мо! Віої! 254:889-896 (1992) і ІОулптпап еї аї.,
Віоспетівігу 30(45): 10832-10838(1991)). Злиті білки оболонки бактеріофага (Зтійй, 5сіепсе 228:1315 (1985); Зсоїй б Зтійй, Зсіепсе 249:386 (1990); Сміпа еї а). Ргос Маї! Асад 5сі ОБА 8:309 (1990); Оеміїп еї аЇ. Зсіепсе 249:404 (1990); Умеїї5 8 І омлтап, Сигг Оріп 5ігисі Віо! 2:597 (1992); і патент США Мо 5223409) відомі як зручні об'єкти для зв'язування фенотипу білків і пептидів дисплея з генотипом частинок бактеріофага, які їх кодують. При використанні фаг-дисплея також відображаються домени Раьь антитіл (МсСанйегіу еї аї., Маїиге 348: 552 (1990); Вагбаєз еї а).
Ргос Маї! Асад 5сі ОБА 88:7978 (1991); і Саїтага еї аї. Віоїесппої 9:1373 (1991)).
Моновалентний фаг-дисплей відображає набір варіантів білка злитих з білюоом оболонки бактеріофага на частинках фага (Ваз5 еї аї., Ргоївіп5 8:309 (1990). Дозрівання афінності, або поліпшення рівноважної афінності зв'язування різних білків, раніше досягалося за допомогою послідовного застосування мутагенезу, моновалентного фаг-дисплея й функціонального аналізу (Гоулпап 8 МуеїЇ5, У Мої Віо! 234:564 578 (1993); і патент США Мо 5534617), наприклад, особлива увага приділялася ділянкам СОК антитіл (Вагбаз еї аї., Ргос Маї! Асай Зсі ОБА 91:3809 (1994); і Мапа еї аї., У Мої Віо! 254:392 (1995).
Бібліотеки множини (наприклад, 105 або більше) варіантів білків, які відрізняються в певних положеннях послідовності, можна побудувати на частинках бактеріофагів, кожна з яких містить
ДНК, що кодує певний варіант білка. Після циклів афінного очищення з використанням іммобілізованого антигену, ізолюють окремі клони бактеріофагів і на підставі ДНК визначають амінокислотну послідовність відображуваного білка.
Після одержання мутанта антитіла можна визначити біологічну активність даної молекули в порівнянні з вихідним антитілом, згідно з відомостями, викладеними в даному документі. Як відзначалося вище, для цього може знадобитися визначити афінність зв'язування й/або іншу біологічну активність або фізичні властивості антитіла. У переважному здійсненні даного винаходу готується набір мутантів антитіла з наступним скринінгом афінності зв'язування для антигену. Один або декілька мутантів антитіла, що вибираються за результатами скринінгу, можуть додатково перевірятися з використанням одного або декількох інших методів аналізу біологічної активності, для того, щоб підтвердити, що мутант (мутанти) антитіла має нові або поліпшені властивості. У переважних прикладах здійснення мутант антитіла зберігає здатність зв'язування СХСК5 з афінністю зв'язування, близькою або переважною/більш високою в порівнянні з характеристиками вихідного антитіла.
Відібраний у такий спосіб мутант (мутанти) антитіла може піддаватися подальшим модифікаціям, які часто залежать від передбачуваного використання антитіла. Такі модифікації можуть включати подальша зміну амінокислотної послідовності, злиття з гетерологічним поліпептидом (поліпептидами) і/або ковалентні модифікації. Наприклад, залишок цистеїну, який не задіяний у збереженні належної конформації мутанта антитіла, можна заміщати, як правило, на серин, для того, щоб поліпшити стабільність молекули до окиснення й попередити утворення аберантних зшивок. Напроти, цистеїн можна вводити в структуру антитіла, для того, щоб поліпшити його стабільність (особливо якщо як антитіло вибирається фрагмент антитіла, наприклад фрагмент Ру).
Інший тип мутанта антитіла має змінену структуру глікозилування. Із цією метою можна видаляти одну або кілька вуглеводних груп, що присутні в антитілі, і/або додавати один або кілька сайтів глікозилування, яких немає в молекулі антитіла. Глікозилування антитіл, як правило, або М-пов'язане з Абп, або О-пов'язане з Зег або Тпг. Трипептидні послідовності
Зо аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де Х - будь-яка амінокислота, крім проліну, є розповсюдженими послідовностями розпізнавання для ферментативного зв'язування вуглеводної групи з бічним ланцюгом аспарагіну. М-ацетилгалактозамін, галактоза, фукоза або ксилоза, наприклад, зв'язуються з гідроксіамінокислотою, як правило, із серином або треоніном, хоча може використовуватися й 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Додавання одного або декількох залишків серину або треоніну до послідовності вихідного антитіла або заміщення цими залишками може підвищити ймовірність О-зв'язаного глікозилування.
Можливо, буде бажаним модифікувати антитіло згідно з даним винаходом в плані ефекторної функції, для того, щоб підвищити ефективність антитіла. Наприклад, в область Ес може вводитися залишок (залишки) цистеїну, що забезпечує можливість утворення міжланцюжкового дисульфідного зв'язку в цій області. Одержане в такий спосіб гомодимерне антитіло може характеризуватися більш високою здатністю до інтерналізації й/або комплемент- залежного лізису й антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АОСС), див. Сагоп еї аї., У Ехр
Меа 176:1191-1195 (1992) ії 5порев, Іттипої! 148:2918-2922 (1993). В альтернативному варіанті може бути сконструйоване антитіло, яке має подвійні області Ес і тому може забезпечувати підвищені комплемент-залежний лізис і здатність до АЮОСС, див. біемепзоп еї аї., Апіі-Сапсег
Огид Оевідп 3: 219 230 (1989).
Ковалентні модифікації антитіла включаються в об'єм даного винаходу. Вони можуть проводитися за допомогою хімічного синтезу або, якщо можливо, ферментативного або хімічного розщеплення антитіла. Інші форми ковалентних модифікацій антитіла вводяться в молекулу за допомогою взаємодії вибраних амінокислотних залишків антитіла з органічним агентом, використовуваним для одержання похідних, які у стані реагувати з вибраними бічними ланцюгами або з М-термінальним або С-термінальним залишком.
Цистеїнові залишки можуть реагувати з о-галоацетатами (і відповідними амінами), наприклад хлороцтовою кислотою або хлорацетамідом, з утворенням карбоксиметильних або карбоксіамідометильних похідних. Похідні цистеїнових залишків також можна одержувати, наприклад, шляхом реакції із бромтрифторацетоном, «о-бром-р-(5-імідозоїл/упропіоновою кислотою, хлорацетилфосфатом, М-алкіламалеімідами, З-нітро-2-піридилдисульфідом, метил-2- піридилдисульфідом, п-хлормеркурбензоатом, 2-хлормеркур-4-нітрофенолом або -г2- оксадіазолом-1,3.
Похідні гістидинових залишків можуть бути одержані реакцією з діетилпірокарбонатом при рН 5,5-7,0. П-бромофенацилбромід може також використовуватися, реакцію переважно проводити в 0,1 М розчині какодилату натрію при рН 6,0.
Лізинові залишки й о-термінальні залишки можуть реагувати з бурштиновим ангідридом або з ангідридами інших карбонових кислот, для того, щоб змінити заряд залишків. До інших зручних реагентів для одержання похідних с-аміновмісних залишків належать імідоефіри, наприклад метилпіколінімідат, піридоксальфосфат, піридоксаль, хлорборогідрид, тринітробензолсульфонова кислота, О-метилізосечовина й 2,4-пентандіон, і амінокислота може каталізуватися трансаміназою у присутності гліоксилату.
Залишки аргініну можуть модифікуватися реакцією з одним або декількома стандартними реагентами, наприклад фенілгліоксалем, 2,3-бутандіоном, 1,2-циклогександіоном і нінгідрином.
Для одержання похідних у випадку залишків аргініну часто потрібно проводити реакцію в лужному середовищі. Крім того, реагенти можуть взаємодіяти з лізином, а також з є- аміногрупою аргініну.
Специфічна модифікація залишків тирозину може проводитися за допомогою ароматичних діазонієвих сполук або тетранітрометану. Наприклад, М-ацетилімідазол і тетранітрометан використовуються для утворення 0-ацетилтирозильних сполук і З-нітропохідних, відповідно.
Залишки тирозину можуть йодуватися з використанням "І або "|, щоб одержати мічені білки для застосування в радіоіїмунологічному аналізі.
Карбоксильні бічні групи (аспартил або глутаміл)у можуть бути модифіковані реакцією з карбодіммідами (К-М-С-0-К, де К і Е" можуть бути різними алкільними групами, наприклад 1- циклогексил-3-(2-морфолініл-4-етил)карбодіїмід або 1-етил-3-(4-азоній-4,4- диметилпентил)карбодіїмід. Крім того, залишки аспартил і глутамил можуть бути трансформовані в аспарагінові й глутамінові залишки реакцією з іонами амонію.
Глутамінові й аспарагінові залишки часто деамідують до відповідних глутамільних і аспартильних залишків, відповідно, у нейтральному або основному середовищі. Деамідована форма таких залишків входить в об'єм даного винаходу.
До інших модифікацій належить гідроксилювання проліну й лізину, фосфорилування гідроксильних груп залишків серину або треоніну, метилування с-аміногруп бічних ланцюгів
Зо лізину, аргініну й гістидину (Стеідпіоп, Ргоївіпе: 5Бігисіиге апа МоїІесшаг Ргорепієвз, М.Н. Егеетап а Со., Зап Нгапсівсо, рр. 79-86 (1983)), адетилування М-термінального аміну й амідування будь- якої С-термінальної карбоксильної групи.
Інша форма ковалентної модифікації являє собою хімічне або ферментативне зв'язування глікозидів з антитілом. Такі методи не вимагають продукції антитіл у клітині-хазяїні, яка проявляє глікозилуючі властивості в М-зв'язаному або О-зв'язаному глікозилуванні. Залежно від використаного методу комбінації цукор (цукри) можуть зв'язуватися з: (а) аргініном і гістидином; (б) вільними карбоксильними групами; (в) вільними сульфгідрильними групами, наприклад у цистеїні; (г) вільними гідроксильними групами, наприклад у серпні, треоніні або гідроксипроліні; (д) ароматичними залишками, наприклад у фенілаланіні, тирозині або триптофані; або (є) амідною групою глутаміну. Подібні методи описані в МО 87/05330 і в Аріїп 5 Мугівіоп, СКС Стії
Вем Віоспет, рр. 259-306 (1981).
Видалення будь-якої вуглеводної групи, що присутня у структурі антитіла, може здійснюватися хімічним або ферментативним способом. Наприклад, для хімічного деглікозилування може знадобитися подіяти на антитіло таким реагентом, як трифторметансульфонова кислота або рівноцінною сполукою, що приводить до розщеплення більшості або всіх цукрів, крім з'єднувального цукру (М-ацетилглюкозамін або М- ацетилгалактозамін), при цьому антитіло залишається інтактним. Хімічне деглікозилування описане, наприклад, в НакКітиааїйп еї аІ. Агсп Віоспет Віорпуз 259:52 (1987) і в Едде еї аї., Апаї
Віоспет 118:131 (1981). Ферментативне розщеплення вуглеводних груп на антитілах може здійснюватися за допомогою кожної з множини ендоглікозидаз і екзоглікозидаз, як це описано, наприклад, в Тпоїакига еї а!., Меп Еплутої 138:350 (1987).
Інша форма ковалентної модифікації антитіла включає зв'язування антитіла з одним з множини небілкових полімерів, наприклад поліетиленгліколем, поліпропіленгліколем або поліоксіалкіленами, на основі методу, наведеного в патентах США МоМо 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 або 4179337.
Інша переважна методика одержання мутантів або мутеїнів являє собою дозрівання афінності за допомогою фаг-дисплея (Наужіпз еї аї., У Мої Віої 254:889-896 (1992) і Ї омлтпап еї аІ., Віоспетівігу 30(45): 10832-10838(1991)). Коротко, проводиться мутація декількох сайтів гіперваріабельної області (наприклад, 6-7 сайтів), щоб одержати всі можливі амінокислотні бо заміщення на кожному сайті. Одержані в такий спосіб мутанти антитіла моновалентно проявляються на частинках фага як злиті з білююом, що знаходиться на частинках. Фаг, що експресує різні мутанти, може проходити цикл процедур селекції зв'язування з наступним виділенням і секвенуванням тих мутантів, які демонструють високу афінність.
Метод селекції нових зв'язуючих поліпептидів може спиратися на використання бібліотеки структурно зв'язаних поліпептидів. Бібліотека структурно зв'язаних поліпептидів, наприклад, злитих з білком оболонки фага, виходить за допомогою мутагенезу й проявляється на поверхні частинки. Потім частинки вступають у контакт із молекулою-мішенню, і частинки з найвищої афінністю до мішені відділяються від частинок, що мають більш низьку афінність. Частинки, що зв'язуються з високою афінністю, потім ампліфікують за допомогою інфікування придатного бактеріального хазяїна, і стадію конкурентного зв'язування повторюють. Процес повторюють, доти поки не будуть одержані поліпептиди з бажаною афінністю.
В альтернативному варіанті мультивалентний фаг (Мссапепу еї аї. (1990) Маїшге 348:552- 554; і Сіаскхоп еї аї. (1991) Маїшге 352:624-628) може також використовуватися для експресії випадкових точкових мутацій (наприклад, мутацій, одержаних у результаті використання ДНК- полімерази, що допускає помилки) для одержання фагової бібліотеки фрагментів антитіл, які потім можуть бути піддані скринінгу для перевірки афінності до СХСК5, Наужіпз еї аї., (1992) У
МОЇ Віо! 254:889-896.
Переважно, щоб у процесі дозрівання афінності реплікований вектор експресії залишався під строгим контролем регуляторного елемента транскрипції а умови культивування коректувалися таким чином, щоб кількість або число частинок, що несуть більше однієї копії злитого білка, було менше приблизно 1 95. Крім того, переважно, щоб кількість частинок, що несуть більше однієї копії злитого білка, було менше 10 95 від кількості частинок, що несуть єдину копію злитого білка. Переважно, щоб така кількість була меншою 20 95.
Функціональні еквіваленти можна одержувати заміною різних СОК у різних ланцюгах антитіл у каркасній або композитної ЕК, одержаній від багатьох антитіл. Так, наприклад, можна одержати різні класи антитіл для заданого набору СОМ за допомогою заміщення різних важких ланцюгів, наприклад Ідсі-«, ЯМ, ІдАї-2 або ІдО, для того, щоб одержати типи й ізотипи антитіл
СХСР5, що відрізняються. Аналогічним чином, штучні антитіла, що входять в об'єм даного винаходу, можуть бути одержані за допомогою вміщення заданого набору СОК у повністю
Зо синтетичну каркасну ділянку.
Наприклад, з молекули дб, що має знижену функцію, ефектора, одержують придатну каркасну область і частину Ес для включення варіабельної області або однієї або декількох, що представляють інтерес СОК.
В інших прикладах здійснення для посилення властивостей з'єднувальної СХСК5 молекули, яка становить інтерес, можуть вноситися певні модифікації в каркасну частину й/або Ес частину молекули, що несе антигензв'язувальну ділянку розглянутої молекули. Наприклад, можуть проводитися амінокислотні заміни для посилення або ослаблення розглянутих властивостей.
Таким чином, для проведення модифікації в молекулі да придатні заміщення на сайтах, відомих своїм впливом на функцію, наприклад у шарнірній області, в області, яка впливає на ефекторну функцію або яка впливає на зв'язування Ес. Для досягнення бажаних властивостей у молекулі Їд4 можуть проводитися заміщення наступних амінокислот по нумерації Кабата: 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255 і ін., або ж їхні комбінації. Наприклад, заміщення проліном серину 241 може стабілізувати третинну й четвертинну структури молекули (Мої Ітт 30(1)105-108, 1993), а заміщення глутаміновою кислотою лейцину 248 може пригнічувати ефекторну функцію (функції) (У Ітт 164(4)1925-1033, 2000; і Сіїп Ітт 98(2)164-174, 2001).
Іншою корисною властивістю є можливість одержання похідного антитіла, яке зв'язується з
СХСМК5, але, наприклад, не приводить до виснаження В-клітин. За рахунок цього можуть досягатися певні переваги, оскільки не відбувається порушення продукції антитіл в організмі пацієнта. Лікування таким реагентом також спрощує проведення комбінованих схем терапії із другим препаратом з конкретними показаннями дії на рівні, що не зачіпає В-клітин. Це може бути, наприклад, рівень Т-клітин.
Тому, наприклад, 1607-НС1-ЇС3 оброблявся таким чином, щоб містити два заміщення, 52А41Р і1248Е. Залишки проліну й глутамінової кислоти надають бажані властивості розглянутої
СХСК5-з'єднувальній молекулі, яка містить каркасну ділянку ІдСа, наприклад стабільність і знижену функцію ефектора.
До фрагментів антитіл ії функціональних еквівалентів даного винаходу належать такі молекули, які мають реєстрований рівень специфічного зв'язування з СХСК5. Реєстрований рівень зв'язування включає всі значення в діапазоні щонайменше 100-100 95, переважно 60 щонайменше 50 95, 60 95 або 70 95, більш переважно щонайменше 75 95, 80 95, 85 Фо, 90 95, 95 90 або 99 95 здатності зв'язування антитіла, що представляє інтерес. В об'єм даного винаходу також включаються еквіваленти з афінністю більше 100 95 у порівнянні з розглянутим антитілом.
СОК звичайно мають велике значення для розпізнавання епітопів і зв'язування антитіла.
При цьому, однак, можуть вноситися зміни в залишки, які входять до складу СОК, з одночасною відсутністю впливу на здатність антитіла розпізнавати когнатний епітоп і зв'язуватися з ним.
Наприклад, можуть вноситися зміни, які не виявляють впливу на розпізнавання епітопів, але, проте, підвищують афінність зв'язування антитіла з епітопом. У ряді досліджень приводиться огляд ефектів впливу проведення замін однієї або декількох амінокислот у різних положеннях послідовності антитіла, виходячи зі знань про первинну послідовність антитіла, на їхні властивості, наприклад зв'язування й рівень експресії (уапад еї аї., 1995, 9 Мої Віо! 254:392-403;
Вадег єї аїЇ., 1998, Ргтос Май Асай 5сі ОБА 95:8910-8915; і Мацдпап еї аї., 1998, Майшге
ВіотесппоЇоду 16, 535-539).
Таким чином, еквіваленти розглянутого антитіла можуть бути одержані зміною послідовностей генів важкого й легкого ланцюгів в СОКІ, СОМК2 або СОРЗ, або в каркасних областях за допомогою таких методів, як олігонуклеотид-опосередкований сайт-спрямований мутагенез, касетний мутагенез, ПЛР зниженої точності, перестановка в ДНК або штами мутатора Е. соїї (Мацшоднап еї а!., 1998, Маї Віоїєсп 16:535-539; і Адеу еї аї., 1996, Спар. 16, рр. 277-291, в Рпаде Оізріау ої Реріідез апа Ргоїеїіп5, ед5. Кау еї аї,, Асадетіс Рге55). Методи зміни послідовності нуклеїнової кислоти первинного антитіла можуть приводити до утворення антитіл з підвищеною афінністю (Сгат еї аї., 1992, Ргос Май! Асай сі ОБА 89:3576-3580; Водег вї аї., 2000, Ргос Маї! Асад бсі ОБА 97:10701-10705; Оамієз 5 Віесптапп, 1996, Іттипоїесй 2:169-179;
Тпотрзоп еї аї., 1996, У) Мої! Віо! 256:77-88; Зпоп еї аї., 2002, ) Віої Спет 277:16365-16370; і
ЕшгиКаума евї а!., 2001, У Віої Снет 276:27622-27628).
Повторювані цикли "поліпептидної селекції" можуть застосовуватися для відбору систем з усе більш високою афінністю зв'язування, наприклад, за допомогою селекції змін декількох амінокислот, які відбираються в ході множини циклів селекції. Після першого циклу селекції, що включає першу область селекції амінокислот у ліганді або поліпептиді антитіла, проводяться додаткові цикли селекції в інших областях або амінокислотах ліганду. Цикли селекції повторюються до досягнення бажаних характеристик афінності.
До вдосконалених антитіл також належать антитіла, що мають удосконалені характеристики, одержані з використанням стандартних методик імунізації тварин, утворенням гібридом і селекції антитіл з певними характеристиками.
Термін "антагоніст" стосується молекули, здатної інгібувати один або кілька проявів біологічної активності молекули-мішені, наприклад, передачу сигналу СХСК5. Антагоніст може перешкоджати зв'язуванню рецептора з лігандом і навпаки, виводячи з ладу або знищуючи клітини, активовані лігандом, і/або блокуючи активацію рецептора або ліганду (наприклад активацію тирозинкінази), або передачу сигналу після зв'язування ліганду з рецептором.
Антагоніст у стані повністю блокувати взаємодія рецептор-ліганд або може суттєво пригнічувати такі взаємодії. Для цілей даного винаходу всі подібні аспекти впливу антагоніста вважаються еквівалентними. Тому в об'єм даного винаходу включаються антагоністи (наприклад нейтралізуючі антитіла), які зв'язуються з СХСК5, СХСІ 13 або іншими лігандами СХСК»5, або комплексом СХСК5 і його лігандом, наприклад СХСІ113; варіанти амінокислотних послідовностей або похідні СХСВК5 або СХСЇІ 13, які є антагоністами взаємодії між СХСЕ5 і лігандом, наприклад СХСІ 13; розчинний СХСК»5, в одному з варіантів злитий з гетерологічною молекулою, наприклад областю імуноглобуліну (наприклад, імуноадгезин); комплекс, що включає СХСК5, пов'язаний з іншим рецептором або біологічною молекулою, пептиди із синтетичною або нативною послідовністю, які зв'язуються з СХСКО5; та ін.
Термін "агоніст" стосується сполуки, що включає білок, поліпептид, пептид, антитіло, фрагмент антитіла, кон'югат, більшу молекулу, малу молекулу, яка активує один або кілька проявів біологічної активності СХС5. Агоністи можуть втручатися у зв'язування рецептора з лігандом і навпаки, діяти як мітоген клітин, активованих лігандом, і/або перешкоджати інактивації клітин або інгібуванню сигналу після зв'язування ліганду з рецептором. Для цілей даного винаходу всі подібні аспекти впливу агоніста вважаються еквівалентними. Тому в об'єм даного винаходу включаються агоністи, які зв'язуються з СХСНК5, СХСЇІ 13 або іншими лігандами
СХСР5, або комплексом СХСК5 і його лігандом, наприклад СХСІ 13; варіанти амінокислотних послідовностей або похідні СХСК5О або СХСІ13, які стимулюють взаємодію між СХСЕ5 і лігандом, наприклад СХСІ 13; розчинний СХСК»5, в одному з варіантів злитий з гетерологічною молекулою, наприклад областю імуноглобуліну (наприклад, імуноадгезин); комплекс, що включає СХСК5, пов'язаний з іншим рецептором або біологічною молекулою, пептиди із синтетичною або нативною послідовністю, які зв'язуються з СХСК5; та ін. Агоністом звичайно є сполука, яка прямо активує СХСК»5, наприклад, для передачі сигналу.
Використовувані в даному документі терміни "клітина", "лінія клітин" і "клітинна культура" включають їхнє потомство. Також мається на увазі, що все потомство не може бути в точності ідентичним, наприклад, по вмісту ДНК, внаслідок навмисних або випадкових мутацій. Сюди входить варіант потомства, який має такі ж функції або біологічну характеристику, що представляє інтерес, для яких проводиться скринінг у вихідних клітинах. "Клітина-хазяїн", використовувана в даному винаході, як правило, є прокаріотичною або еукаріотичною клітиною, що відбирається залежно від поставленої мети. "Трансформація" клітинного організму, клітини або клітинної лінії за допомогою нуклеїнової кислоти означає введення нуклеїнової кислоти в клітину-мішень, для того, щоб забезпечити можливість реплікації нуклеїнової кислоти як у якості позахромосомного елемента, так ії за допомогою хромосомної інтеграції, а також, можливо, її експресію. "Трансфекцією" клітини або організму нуклеїновою кислотою називається поглинання нуклеїнової кислоти, наприклад вектора експресії, клітиною або організмом незалежно від того, чи буде фактично проходити експресія яких-небудь кодуючих послідовностей. Терміни "трансфікована клітина-хазяїн" і "грансформована" стосуються клітини, у яку була введена нуклеїнова кислота. Характерною прокаріотичною клітиною-хазяїном є різні штами БЕ. соїї. Характерними еукаріотичними клітинами-хазяїнами є клітини ссавців, наприклад клітини яєчників китайського хом'ячка або клітини людського походження. Послідовність нуклеїнової кислоти, що вводиться, може бути взята від того ж виду, що й вид клітини-хазяїна, або від виду, що відрізняється від виду клітини- хазяїна, або ж може являти собою вихідну послідовність нуклеїнової кислоти, що містить певні чужорідні й певні гомологічні нуклеїнові кислоти. Трансформація може також відбуватися за допомогою трансдукції або інфекції елементами вірусного походження.
Термін "вектор" означає конструкцію нуклеїнової кислоти, носій, що містить нуклеїнову кислоту, трансген, чужорідний ген або розглянутий ген, який може бути функціонально пов'язаний з придатними контрольними послідовностями для експресії трансгену в організмі придатного хазяїна. До таких контрольних послідовностей, наприклад, належать промотор для проведення транскрипції, додаткова операторна послідовність для контролю такої транскрипції, послідовність, що кодує придатні сайти зв'язування мРНК на рибосомі, а також послідовності, які контролюють зупинку транскрипції й трансляції. Вектором може бути плазміда, частка фага або просто потенційна геномна вставка. Після трансформації в придатного хазяїна вектор може реплікуватися й функціонувати незалежно від геному хазяїна, або може в деяких випадках інтегруватися в геном клітини-хазяїна. У наведеному описі терміни "плазміда" і "вектор" використовуються рівнозначно, оскільки плазміда є широко застосовуваною формою вектора.
Разом з тим передбачається, що винахід включає такі інші форми векторів, які виконують еквівалентні функції носіїв, які відомі або стають відомі фахівцям в галузі, наприклад віруси, синтетичні молекули, які містять нуклеїнові кислоти, ліпосоми та ін.
Під "ссавцем" для цілей лікування розуміється будь-яка тварина, що класифікується як ссавець, у тому числі люди, домашні й сільськогосподарські тварини, нелюдиноподібні примати, а також тварини із зоопарків, спортивні або свійські тварина, наприклад собаки, коні, кішки, корови та ін.
Розглянуті антитіла можуть піддаватися скринінгу або можуть використовуватися в методах аналізу, які описані в даному документі або відомі фахівцям в галузі. Часто для таких аналізів потрібен реагент, який можна виявити доступними методами, що наприклад містить мітку.
Використовуваний у даному документі термін "мітка" стосується детектованої сполуки або складу, який прямо або побічно може кон'югуватися з молекулою або білком, наприклад антитілом. Мітка може бути сама по собі детектованою (наприклад радіоізотопні мітки або флуоресцентні мітки) або, у випадку ферментативної мітки, може каталізувати хімічні зміни
БО субстрату або складу, які піддаються детектуванню.
Використовуваний у даному документі термін "тверда фаза" означає неводну матрицю, до якої може прикріплюватися частинка або молекула, наприклад антитіло згідно з даним винаходом. Прикладами твердих фаз, що входять в об'єм даного винаходу, є повністю або частково утворені зі скла (наприклад скла з контрольованою пористістю), полісахариди (наприклад агароза), поліакриламіди, полістирол, полівініловий спирт і силікони. У деяких прикладах здійснення, залежно від контексту, тверда фаза може являти собою ямку в аналітичному планшеті; в інших випадках вона може використовуватися в колонці для очищення (наприклад, у колонці для афінної хроматографії). Таким чином, твердою фазою може бути папір, гранули, полімерна поверхня, чип та ін., вона може бути виготовлена із всіляких матеріалів, наприклад нітроцелюлози, агарози, полістиролу, поліпропілену, силікону та ін., а також може мати всілякі конфігурації.
Розчинний СХСК5 або його фрагменти, наприклад позаклітинний домен (ЕС), можуть використовуватися як імуногени для одержання розглянутих антитіл. Імуноген може виходити або виділятися із природних джерел, або може бути одержаний за допомогою рекомбінантних технологій. Цільні клітини, наприклад клітини СХСКО", клітини, одержані із природних джерел (наприклад, В-клітини, лінії В-клітин або лінії ракових клітин), або трансформовані (або трансфіковані) клітини, одержані за допомогою рекомбінантних методик для експресії або, можливо, надекспресії СХСК5, можуть використовуватися як імуноген для виготовлення антитіл, що представляють інтерес. Крім того, можуть використовуватися мембранні препарати, що переносять СХСК5 або синтетичні пептиди, або процесовані поліпептиди, відповідні областям ЕС СХСК5, які відомі фахівцям в галузі.
Як імуноген може використовуватися ЕС СХСК5, довжиною приблизно 60 амінокислот, або його частина. Фахівцям в галузі будуть очевидні й інші форми імуногена, придатні для одержання антитіл, наприклад кон'югати. Таким чином, СХСК5 або його частини можуть зв'язуватися з молекулою носія, наприклад з альбуміном або КІН, для того, щоб використовуватися як імуноген. Звичайно, у випадку клітин, що експресують СХСК5, саме домен ЕС є переважним імуногеном або частиною імуногена.
Як відомо фахівцям в галузі, ген або кКДНК, що кодують СХСК5, можуть клонуватися в плазміду або інший вектор експресії й експресуватися в рамках кожної з декількох систем експресії відповідно до методів, добре відомих кваліфікованим фахівцям в галузі, див., наприклад, нижче. Через виродження генетичного коду для експресії рекомбінантного СХСК5 або його функціональних продуктів на практиці може використовуватися множина нуклеотидних послідовностей, що кодують білок СХСК5 або поліпептиди. Нуклеотидну послідовність можна змінювати за допомогою селекції комбінацій на підставі можливого вибору кодонів, наприклад тих, які переважні для клітини-хазяїна. Комбінації становлять у відповідності до стандартного триплетного генетичного коду у застосуванні до нуклеотидної послідовності, яка кодує існуючий у природі СХСК», і можуть розглядатися всі подібні варіації. Тому кодуюча СХОСК5 послідовність може бути змінена, так щоб містити кодони, які експресують розглянуті амінокислоти, при цьому
Зо триплетний кодон є переважним для механізму експресії генів у клітині-хазяїні, наприклад людській клітині. Кожний з таких поліпептидів може використовуватися для імунізації тварини, наприклад верблюдів, або в іншій системі для генерації антитіл, які зв'язуються з СХСК5.
Як відзначалося вище, при сприятливих обставинах імуноген СХСК5 може експресуватися у формі злитого білка, що містить СХСК»5, пов'язаний із сегментом злиття, який звичайно являє собою поліпептид з однією або декількома корисними функціями. Сегмент злиття часто допомагає проводити очищення білка, наприклад, дає можливість виділити й очистити злитої білок за допомогою афінної хроматографії, але може також використовуватися для підвищення імуногенності. Злиті біло можна продукувати за допомогою культивування рекомбінантних клітин, трансформованих за допомогою злитої послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, пов'язаний з карбоксильним і/або амінотермінальним закінченням поліпептиду СХСК5.
Сегменти злиття можуть, серед інших, включати області Ес імуноглобуліну, глутатіон-5- трансферазу, р-галактозидазу, полігістидиновий сегмент, який може зв'язуватися (із двовалентним іоном металу, і білок, що зв'язує мальтозу.
Молекули нуклеїнових кислот, що кодують амінокислотну послідовність мутантів, можуть бути одержані за допомогою різних методів, відомих фахівцям в галузі. До таких методів, серед інших, належать олігонуклеотидний (або сайт-спрямований) мутагенез, ПЛР-мутагенез і касетний мутагенез раніше виготовленого мутованого або немутованого варіанта розглянутої молекули (див., наприклад, КипкКеї, Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 82:488 (1985)).
Рекомбінантна експресія антитіла згідно з даним винаходом або його фрагмента, похідного або аналога (наприклад, важкого або легкого ланцюга антитіла згідно з даним винаходом, одноланцюжкового антитіла згідно з даним винаходом або антитіла мутеїну згідно з даним винаходом) має на увазі конструювання вектора експресії, що містить полінуклеотид, який кодує антитіло або фрагмент антитіла, як описано в даному документі. Після одержання полінуклеотиду, що кодує молекулу антитіла, можна приготувати вектор для продукції антитіла, використовуючи технологію рекомбінантної ДНК, відому фахівцям в галузі. Конструюється вектор експресії, що містить послідовності, що кодують антитіло, а також відповідні маркери контролю транскрипції й трансляції. До таких методів належать, наприклад, методики рекомбінантної ДНК /л уйто, синтетичні методики й генетична рекомбінація /п у//о.
Вектор експресії переноситься в клітину-хазяїна за допомогою стандартних методик, і бо трансфіковані клітини потім культивують за допомогою стандартних методик з метою одержати антитіло згідно з даним винаходом або його фрагмент. В одному з аспектів винаходу в клітині- хазяїні може проводитися спільна експресія векторів, що кодують важкий і легкий ланцюги, для того, щоб забезпечити експресію всієї молекули імуноглобуліну, як це докладно описано в даному документі.
При експресії молекул антитіла, представлених у даному винаході, можуть використовуватися найрізноманітніші системи хазяїна/вектора експресії. Такі системи експресії являють собою носії для одержання й наступного очищення розглянутих кодуючих послідовностей, але також являють собою клітини, які при трансформації або трансфекції відповідними, кодуючими нуклеотидними послідовностями в стані експресувати молекулу антитіла згідно з даним винаходом іп 5йи. Бактеріальні клітини, наприклад, Е. соїї, а також еукаріотичні клітини широко використовуються для експресії молекули рекомбінантного антитіла, особливо для експресії всієї молекули рекомбінантного антитіла. Наприклад, клітини ссавців, такі як клітини СНО, у комбінації з вектором, що наприклад несуть основний елемент проміжного раннього гена-промотору цитомегаловірусу людини, є ефективною системою експресії антитіл (Роескіпо еї а!., Сепе 45:101 (1986); і Соскей еї а!., Віо/Гесппоіоду 8:2 (1990)).
Як відомо фахівцям в галузі, для виготовлення білків, що представляють інтерес, можуть також використовуватися рослини й культури рослинних клітин, клітини комах та ін.
Крім того, може вибиратися клітина-хазяїн, яка модулює експресію введених послідовностей або модифікує й забезпечує процесинг генного продукту конкретним заданим чином. Подібні модифікації (наприклад, глікозилування) і процесинг (наприклад, розщеплення) білкових продуктів можуть мати важливе значення для функціонування білка. Різні клітини-реципієнти мають характерні й специфічні механізми пост-трансляційного процесингу й модифікації білків і генних продуктів. Відповідні лінії клітин або системи реципієнтів можуть вибиратися для забезпечення необхідної модифікації й процесингу розглянутого експресованого антитіла.
Отже, може використовуватися еукаріотична клітина-хазяїн, яка має клітинний апарат для належного процесингу первинного транскрипту, глікозилування й фосфорилування генного продукту. До таких клітин-реципієнтів ссавців, серед інших, належать СНО, СО5, 293, З3Т3 або клітини мієломи.
Стабільна експресія є переважною для довгострокової високопродуктивної продукції
Зо рекомбінантних білків. Наприклад, можуть бути сконструйовані лінії клітин, які стабільно експресують молекулу антитіла. Замість використання векторів експресії, які містять вірусні джерела реплікації, клітина-хазяїн може бути трансформована за допомогою ДНК в умовах регулювання, яке забезпечується відповідними елементами контролю експресії (наприклад, промотором, енхансером, послідовностями, термінаторами транскрипції, сайтами поліаденілування та ін.) і селектованим маркером. Після інтродукції чужорідної ДНК сконструйованим клітинам протягом одного або двох днів дають рости в збагаченім середовищі, потім їх переносять в селективне середовище. Селектований маркер у рекомбінантній плазміді надає стабільність стосовно селекції й дозволяє клітинами стабільно інтегрувати плазміду в хромосому з наступним розвитком у лінію клітин. Такі сконструйовані лінії клітин зручні не тільки для продукції антитіл, але також придатні для скринінгу й оцінки сполук, які прямо або побічно взаємодіють із молекулою антитіла.
Може використовуватися ряд систем селекції, у тому числі, серед інших, тимідинкіназа вірусу Негрев5 вітрієх (Мідіег еї а!., сеї 11:223 (1977)), гіпоксантин- гуанінфосфорибозилтрансфераза (57убаїєКа еї аіЇ., Ргос Май Асай Зсі ОБА 48:202 (1992)), селекція глутаматсинтази в присутності метіонінсульфоксиміду (Адм Огид Оеї Кем 58, 671, 2006, див. також веб-сайт або добірку літератури 0пла Стгоцр (43), а також гени аденінфосфорибозилтрансферази (І оугу сеї аї., СеїІ 22:817 (1980)) у клітинах ІК, поргі або аргі, відповідно. Також стійкість до антиметаболітів може використовуватися як основа для селекції наступних генів: апії, який забезпечує стійкість до метатрексату (М/діег еї а!., Ргос Маї! Асаай 5сі
БА 77:357 (1980); О'"паге еї аїІ., Ргос Май Асай 5сі ОБА 78:1527 (1981)); орі, який визначає стійкість до мікофенолової кислоти (Миїїдап еї а!., Ргос Маї! Асай сі ОБ5А 78:2072 (1981)); пео, який забезпечує стійкість до аміноглікозиду, 5-418 (Ми єї а!ї., Віоїпегару 3:87 (1991)); пудго, який визначає стійкість до гігроміцину (Запіе!тте еї аї., зЗепе 30:147 (1984)). Методи, відомі фахівцям в галузі технології рекомбінантної ДНК, можуть стандартним чином застосовуватися для селекції бажаного рекомбінантного клону, і такі методи описані, наприклад, в А!,зирбеї еї аї., ед5., Сиггепі
Ргоїосоїв іп Моїесшіаг Віоіоду, доп У/єу в оп (1993); Кіїєдієї, Сепе Тгапеїтег апа Ехргезвіоп, А
І арогаїогу Мапиа!ї, єіосКіоп Ргез5 (1990); Огасороїї єї аї., ед5., Сцтепі РгоїосоЇїв іп Нитап
Сепеїйісз5, Уопп Уміеу 5 Зоп5 (1994); і СоІрегге-Сагаріп еї аї., У Мої Віої! 150:1 (1981).
Рівні експресії молекули антитіла можуть бути підвищені за допомогою векторної бо ампліфікації (наприклад, див. Вербріпдіоп еї аї., в ОМА Сіопіпо, Мої. 3. Асадетіс Ргез5 (1987)). У випадку можливості ампліфікації маркера у векторній системі, експресуючій антитіло, збільшення рівня інгібітору, присутнього в культурі, буде приводити до росту числа копій маркерного гена. Оскільки ампліфікована область асоційована з геном антитіла, продукція антитіла буде також зростати (Сгоизе еї а!., Мої Сеї! Віо! 3:257 (1983)).
Клітина-хазяїн може спільно трансфікуватися двома або більше векторами експресії згідно з даним винаходом, наприклад першим вектором, що кодує похідний від важкого ланцюга поліпептид, і другим вектором, що кодує похідний від легкого ланцюга поліпептид. Ці два вектори можуть містити ідентичні селектовані маркери, які забезпечують рівну експресію поліпептидів важкого й легкого ланцюгів. Як альтернатива може використовуватися одиничний вектор, який кодує й у стані експресувати поліпептиди як важкого, так і легкого ланцюгів. У подібних випадках легкий ланцюг повинний розташовуватися до важкого, щоб уникнути появи надлишку токсичного вільного важкого ланцюга (Ргоцагоої, Маїиге 322:52 (1986); і Копіег, Ргос май Асайд 5сі ОБА 77:2197 (1980)). Послідовності, що кодують, для важкого й легкого ланцюгів можуть включати КкДНК або геномну ДНК.
Після того як молекула антитіла згідно з даним винаходом була одержана в організмі тварини, синтезована хімічним шляхом або за допомогою рекомбінантної експресії, її можна очистити за допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям в галузі, застосовуваного для очищення молекули імуноглобуліну, наприклад хроматографії (наприклад іонообмінної, афінної, зокрема, що спирається на афінність СХСК5 для білка А, а також гель-фільтрацією та ін.), центрифугування, диференціальної розчинності або за допомогою будь-якої іншої стандартної методики для очищення білків. Крім того, для спрощення процесу очищення антитіла згідно з даним винаходом або їх фрагменти можуть бути злиті в гетерологічні поліпептидні послідовності, описані в даному документі або ж відомі фахівцям в галузі.
Рекомбінантний білок СХСК5, який розглядається в наведених нижче прикладах, використовувався для імунізації мишей, для того, щоб одержати гібридоми, які продукують моноклональні антитіла згідно з даним винаходом. З одержаних моноклональних антитіл відбиралися ті, які мали корисні терапевтичні властивості, наприклад, перешкоджали зв'язуванню ліганду СХОСК5 із цим білком. Відібрані антитіла потім модифікувалися з метою додання їм корисних властивостей, наприклад, підвищеної стабільності /л у//о.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути одержані будь-яким зручним методом, відомим фахівцям в галузі. До антитіл згідно з даним винаходом можуть належати поліклональні антитіла, хоча через модифікацію антитіл для оптимізації застосування на людині, а також для оптимізації застосування антитіл самих по собі, моноклональні антитіла є переважними через простоту одержання й обробки конкретних білків. Методи виготовлення поліклональних антитіл відомі кваліфікованим фахівцям в галузі (Нагіом/ еї аї., Апіродіев: а
І абогаїогу Мапиаї, Соїа 5рііпуд Нагбог І абогайогу Ргев5, 2па еєад. (1988)).
Наприклад, розглянутий у даному документі імуноген може вводитися різним тваринам- реципієнтам, у тому числі, серед інших, кроликам, мишам, верблюдам, щурам та ін., для того, щоб індукувати продукцію сироватки, що містить поліклональні антитіла, специфічні стосовно
СХСР5. Введення імуногену може припускати одну або кілька ін'єкцій імунізуючого агента й, якщо бажано, ад'юванту. Для посилення імунної відповіді можуть використовуватися різні ад'юванти, що залежать від виду хазяїна, і до них, серед іншого, належать ад'юванти Фройнда (повні й неповні), мінеральні масла, гелі, гідроксид алюмінію, поверхнево-активні речовини, наприклад лізолецитин, плюронілові поліоли, поліаніони, пептиди, масляні емульсії, гемоціанін лімфи равлика (КІН), динітрофенол, а також потенційно застосовні людські ад'юванти, наприклад БКГ (Васійе Саітейе-Сиегіп) або Согуперасієгішт раг/шт. Додаткові приклади ад'ювантів, які можуть застосовуватися, включають ад'ювант МРІ-ТОМ (монофосфорилліпід А, синтетичний дикориноміколат трегалози). Протоколи імунізації добре відомі фахівцям в галузі, і вона може проводитися відповідно до будь-якого методу, який забезпечує імунну відповідь у вибраному організмі тварини-реципієнта. Таким чином, залежно від поставленої мети в різні періоди часу можуть використовуватися найрізноманітніші методи введення.
Як правило, імуноген (з ад'ювантом або без нього) вводиться ссавцеві за допомогою декількох підшкірних або внутрішньоочеревинних ін'єкцій, або внутрішньом'язово, або внутрішньовенно. Імуноген може включати поліпептид СХСК5, злитий білок або їх варіанти, які можуть виходити в клітині, що продукує або надпродукує СХСК5, такою клітиною може бути існуюча в природі клітина, існуюча в природі клітина-мутант або клітина, сконструйована за допомогою генної інженерії. У певних обставинах можуть використовуватися цільні клітини, експресуючі СХСМК5. Залежно від природи поліпептидів (тобто відсотка гідрофобності, гідрофільності, стабільності, сумарного заряду, ізоелектричної точки та ін.) СХСК5 або його 60 частина можуть модифікуватися або кон'югуватися, щоб забезпечити імуногенність або більш високу імуногенність в організмі тварини, наприклад ссавця, який піддається імунізації.
Наприклад, СХОК5 або його частина може кон'югуватися з носієм. Під кон'югацією розуміється хімічна кон'югація за допомогою одержання похідних активних хімічних функціональних груп імуногену й кон'югованого імуногенного білка, для того, щоб утворювати ковалентний зв'язок, або ж кон'югація з використанням методології злитих білків, або ж інших методів, відомих кваліфікованим фахівцям в галузі. Прикладами таких носіїв або імуногенних білків, серед інших, є КІН, овальбумін, сироватковий альбумін, бичачий тироглобулін, соєвий інгібітор трипсину й проміскуїтетні Т-хелперні пептиди. Як описувалося вище, для посилення імунної відповіді можуть використовуватися різні ад'юванти.
Після одержання придатного препарату з'являється можливість виділити конкретні антитіла з множини антитіл з використанням відомих методик розділення, наприклад афінної хроматографії, пенінгу, абсорбції та ін. Таким способом можуть бути одержані індивідуальні види антитіл для подальшого дослідження, наприклад секвенування із встановленням амінокислотних послідовностей однієї або декількох СОВ.
Антитіла згідно з даним винаходом переважно включають моноклональні антитіла.
Моноклональні антитіла можуть бути виготовлені за допомогою гібридомних методик, наприклад описаних в КопПіег еї аї., Маїиге 256:495 (1975); патент США Мо 4376110; Напому вї аї.,
Апііродіев: А І арогаїогу Мапиаї, Соїа 5ргіпд Нагброг Гарогайогу Ргез5, 2па еа. (1988) і Наттегійпд еї а!І., Мопосіопаї! Апіїродієз апа Т-Сеї! Нубгідотав, ЕІбвеміег (1981), методик рекомбінантної ДНК, наприклад виготовлення й використання трансфектом, або інших методів, відомих фахівцям в галузі. Інші приклади методів, які можуть використовуватися для продукції моноклональних антитіл, серед інших, включають, гібридомні методики В-клітин людини (Ко5рог еї аї.,
Іптітипоїоду Тодау 4:72 (1983); ії Соїе еї аїЇ., Ргос Майї! Асай сі ОБА 80:2026 (1983)), і ЕВМ- гіоридомну методику (Соїе еї аїЇ., Мопосіопа! Апіїбодіе5х апа Сапсег Тпегару, рр. 77-96, Аіап В.
ЇГів5 (1985)). Такі антитіла можуть належати до будь-якого класу імуноглобулінів, у тому числі
ІЯсї, ЯМ, ЧЕ, ІА ії дО, а також до будь-якого їхнього підкласу. Гібридоми, продукуючі тАб згідно з даним винаходом, можуть культивуватися /л уйго або /п мімо.
У рамках гібридомної моделі організм хазяїна, наприклад миші, гуманізованої миші, трансгенної миші з генами імунної системи людини, хом'ячка, кролика, щура, верблюда або
Зо будь-якої іншої придатної тварини-хазяїна, імунізується з метою активувати лімфоцити, які продукують або в стані продукувати антитіла, що специфічно зв'язуються з СХСК5. В альтернативному варіанті лімфоцити можуть бути імунізовані /л уйго. Потім лімфоцити зливають із клітинами мієломи за допомогою придатного реагенту для злиття, наприклад поліетиленгліколю, для того, щоб утворювати клітини гібридоми (Содіпуд, Мопосіопа! Апііродієв:
Рііпсірієз апа Ргасіїсе, Асадетіс Ргев5, рр. 59-103 (1986)).
Як правило, при виготовленні продукуючих антитіла гібридом використовуються лімфоцити периферичної крові (РВІ), якщо бажано одержати клітини людського походження, або ж клітини селезінки або лімфатичних вузлів, якщо потрібні клітини, що походять від ссавців, крім людини.
Імморталізовані лінії клітин звичайно являють собою трансформовані клітини ссавців, зокрема, клітини мієломи, одержані від гризунів, великої рогатої худоби або людини. Звичайно використовують лінію клітин мієломи щурів або мишей. Клітини гібридоми можуть культивуватися в придатному культуральному середовищі, яке переважно містить одну або кілька сполук, інгібуючих ріст або виживання незлитих, імморталізованих клітин. Наприклад, якщо в батьківських клітинах був відсутній фермент гіпоксантин- гуанінфосфорибозилтрансферази (НОРКТ або НРЕТ), культуральне середовище для гібридом, як правило, буде містити гіпоксантин, аміноптерин і тимідин ("середовище НАТ")-речовини, які перешкоджають росту НОРКТ-дефіцитних клітин.
До переважних ліній імморталізованих клітин належать такі, які ефективно беруть участь у злитті, підтримують стабільно високий рівень продукції антитіла відібраними антитіло- продукуючими клітинами й чутливі до середовища, наприклад до середовища НАТ. До таких ліній клітин мієломи належать лінії мієломи миші, наприклад одержані з мишачих пухлин МОРС- 21 ї МРО-11, що поставляються заїК Іпбзійше Сеї! Обізігібшіоп Сепіег, Зап Оіедо, Саїї, а також клітини ЗР2/0О, БО або Хб63-А98-653, що поставляються Атегісап Туре Сийите СоПІесійп,
Мапаззав, МА.
Описувалася також продукція людських моноклональних антитіл з ліній клітин мієломи людини й мишачо-людських клітин гетеромієломи (Ко2брог, У Іттипої 133:3001 (1984); і Вгодеиг еї аІ., Мопосіопа! Апіїроду Ргодисіюп Тесппідне5 апа Арріїсайоп5, Магсе! ОеккКетг, Іпс, рр. 51-63 (1987)). Може також використовуватися лінія клітин мієломи миші МБО (Еигореап СоПесіоп ої
Сеїї Сипигев, Заїївригу, УМіївпіге, ОК).
В альтернативному варіанті для одержання гібридом пропонується використовувати електричне злиття замість хімічного. В місці злиття В-клітини можуть бути імморталізовані з використанням, наприклад, вірусу Епштейна-Барр або іншого гена, що трансформує, див., наприклад, 7игаугакі єї аІ., в Мопосіопа! Апіїродіє5, ейд., Кеппеїї єї аї., Ріеєпит Ргез5, рр. 19-33. (1980). Можуть також використовуватися трансгенні миші й миші з важким комбінованим імунодефіцитом (ЗСІЮД), яким трансплантовані В-лімфоцити людини.
Культуральне середовище, в якому вирощують клітини гібридоми, аналізується на предмет продукції моноклональних антитіл, спрямованих проти СХСК5. Специфічність зв'язування моноклональних антитіл, продукованих клітинами гібридоми, може визначатися за імунопреципітацією або аналізом зв'язування /л УЛго, наприклад радіоіїмунологічним аналізом (КІА), флуороцитометричним аналізом (ЕАС5) або твердофазним імуноферментним аналізом (ЕГІЗА). Перераховані методики відомі в галузі, і ними володіє будь-який фахівець в галузі.
Афінність зв'язування моноклонального антитіла з СХСК5О може, наприклад, визначатися аналізом по Скетчарду (Мипзоп еї аї., Апаї! Віоспет 107:220(1980)).
Після ідентифікації клітин гібридоми, продукуючих антитіла з бажаною специфічністю, афінністю й/або активністю, клони можуть бути субклоновані з використанням процедур серійних розведень і культивуватися за допомогою стандартних методів (одіпуд, Мопосіопаї
Апіїродієб: Рііпсіріеєє ап Ругасіїсе, Асадетіс Ргебз5, рр. 59-103 (1986)) До придатних культуральних середовищ, наприклад, належать модифіковане середовище Дульбеко-Ігла (0-
МЕМ) або середовище КРМІ-1640. Крім того, клітини гібридоми можуть вирощуватися /л мїхо у формі асцитних пухлин в організмі тварини.
Моноклональні антитіла, продуковані субклонами, належним чином відділяються або ізолюються з культурального середовища, асцитної рідини або сироватки із застосуванням стандартних процедур очищення імуноглобуліну, наприклад білка А-сефароза, білка с- сефароза, хроматографії на гідроксіапатиті, гель-фільтраційної хроматографії, гель- електрофорезу, діалізу або афінної хроматографії.
В галузі існує широка різноманітність методик продукції моноклональних антитіл, а тому винахід не обмежується тільки їх продукцією в гібридомах. Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути одержані на основі методик рекомбінантної ДНК, наприклад методик, подібних
Зо описаним у патенті США Мо 4816567. У даному контексті термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла, одержаного від єдиного еукаріотичного, фагового або прокаріотичного клону.
ДНК, що кодує моноклональні антитіла згідно з даним винаходом, легко виділяється й секвенується з використанням стандартних процедур (наприклад, із застосуванням олігонуклеотидних зондів, які в стані специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкий і легкий ланцюги мишачих антитіл або ці ж ланцюги людини, гуманізовані або з інших джерел) (Іппі5 ес аїЇ. в РОК Ргоїосої5. А Сиціде о Меїшпоаз апа Арріїсайопв5, Асадетіс (1990), і Запдег еї аї.,
Ргос Маї! Асай Зсі 74:5463 (1977)). Клітини гібридом служать як джерело таких ДНК. Після виділення ДНК може вводитися у вектори експресії, які потім трансфікуються в клітини- реципієнти, наприклад клітини БЕ. соїї, клітини М5О, клітини СО5, клітини яєчників китайського хом'ячка (СНО) або клітини мієломи, які в інших ситуаціях не продукують імуноглобуліновий білок, для того, щоб добитися синтезу моноклональних антитіл у рекомбінантних клітинах- реципієнтах. ДНК може також модифікуватися, наприклад, за допомогою підстановки константних доменів, що кодує послідовності важких і легких ланцюгів людини замість гомологічних послідовностей миші (патент США Мо 4816567; і Моггізоп еї аї., Ргос Маї! Асай зЗсі
БА 81:6851 (1984)) або ж ковалентного зв'язування кодуючої послідовності імуноглобуліну з усією або частиною кодуючої послідовності неімуноглобулінового поліпептиду. Такий неімуноглобуліновий поліпептид може бути використаний замість константних доменів антитіла згідно з даним винаходом або замість варіабельних доменів одного із сайтів комбінування
СХ антитіла згідно з даним винаходом, так щоб утворювати химерне бівалентне антитіло.
Антитіла можуть бути моновалентними. Методи одержання моновалентних антитіл добре відомі фахівцям в галузі. Наприклад, один з методів передбачає рекомбінантну експресію легкого ланцюга імуноглобуліну й модифікованого важкого ланцюга. Важкий ланцюг звичайно обрізається в будь-якій точці області Ес, для того, щоб попередити утворення перехресних зшивок у важкому ланцюзі В альтернативному варіанті відповідні цистеїнові залишки заміняються іншим амінокислотним залишком або видаляються, для того, щоб перешкодити перехресним зшивкам.
Фрагменти антитіла, які розпізнають специфічні епітопи, можуть бути одержані з використанням відомих методик. Такі фрагменти традиційно одержують методом бо протеолітичного руйнування інтактних антитіл (див., наприклад, Могітоїо еї аІ., У Віоспет
Віорпу5 Меїпоаз 24:107 (1992); і Вгеппап еї аї., 5сіепсе 229:81 (1985)). Наприклад, фрагменти
Евь ії Ратг згідно з даним винаходом можуть бути одержані протеолітичним розщепленням молекул імуноглобуліну під дією таких ферментів, як папаїн (для одержання фрагментів Ра) або пепсин (для одержання фрагментів Е(аюг) Фрагменти Е(аюг містять варіабельну область, константний домен легкого ланцюга й константну область Сні важкого ланцюга. Разом з тим ці фрагменти можуть бути одержані прямо з рекомбінантних клітин-реципієнтів. Наприклад, фрагменти антитіла можуть бути виділені з фагової бібліотеки антитіла. В альтернативному варіанті фрагменти Е(атю2-ЗН можуть бути прямо виділені з Е. соїї і хімічно пов'язані з утворенням фрагментів Е|(аь2 (Сапег єї аї., Віо/Гесппоіоду 10:163 (1992). Відповідно до іншого підходу фрагменти Е(заь» можуть бути прямо виділені з культури рекомбінантних клітин- реципієнтів. Досвідченому експериментаторові будуть очевидні й інші методики одержання фрагментів антитіл. В інших прикладах здійснення переважним антитілом є одноланцюжковий фрагмент Ру (Ру) (УМО 93/16185).
Для деяких додатків, у тому числі застосування антитіл в організмі людини /л умо і аналітичних методах детектування /л мігто, може виявитися кращим використовувати химерні, гуманізовані або людські антитіла. Методи одержання химерних антитіл відомі фахівцям в галузі, див., наприклад, Могтізоп, Зсіепсе 229:1202 (1985); ОЇ еї а!., Війесппідне5 4:214 (1986); сіПез еї аї., У Іттипої Меїпоаз 125:191 (1989); і патенти США МоМое 5807715; 4816567 і 4816397.
Гуманізовані антитіла одержують із молекул антитіл, які продукуються організмами, крім людини, і зв'язуються з СХСК5, причому одна або декілька їх СОК введена в області ЕК молекули людського імуноглобуліну. Антитіла можуть гуманізуватися на основі безлічі методик, відомих фахівцям в галузі, у тому числі, наприклад, вставки в СОК (ЕРО 239,400; МО 91/09967; і патенти США МоМо 5225539; 5530101 і 5585089), зміни поверхні антитіл (ЕРО 592,106; ЕРО 519,596; Радіап, Моїесшаг Іттипоіоду 28:489 (1991); ЗщапісКа еї аї., Ргоївіп Епдіпеєегіпд 7:805 (1994); ї Кодизка еї а!., Ргос Маї! Асай сі ОБА 91:969 (1994)), і перестановки в ланцюзі (патент
США Мо 5565332).
Гуманізоване антитіло містить один або кілька амінокислотних залишків, джерелом яких є будь-який організм, крім людського. Не присутні в людини амінокислотні залишки часто називають "імпортованими" залишками, які звичайно беруть із "імпортованого" варіабельного
Зо домену. Гуманізація може в основному проводитися з використанням методів Вінтера зі співробітниками (допез еї аї., Маїшге 321:522 (1986); Кіесптапп еї аї., Маїшге 332:323 (1988); і
Мептпоеуеп еї аї., Зсіепсе 239:1534 (1988)), за допомогою заміщення нелюдськими СОК або ділянками послідовностей СОК відповідні послідовності людського антитіла. Відповідно, такі "гуманізовані" антитіла є химерними (патент США Мо 4816567), у яких значно менша ділянка в порівнянні з інтактним людським варіабельним доменом заміщена на відповідну послідовність організму, що не є людським. На практиці гуманізовані антитіла звичайно являють собою людські антитіла, у яких певні залишки СОЖК і, можливо, деякі залишки ЕК заміщені аналогічними сайтами антитіл гризунів. Константна область важкого ланцюга, який може включати один або декілька доменів важкого ланцюга, а також шарнірна область можуть бути взяті від будь-якого класу або підкласу, для того, щоб добитися бажаного ефекту, наприклад конкретної ефекторної функції.
Часто остовні залишки каркасних ділянок людини можуть бути замінені відповідним залишком СОК донорного антитіла, для того, щоб змінити й, по можливості, поліпшити зв'язування антигену. Остовні заміщення визначають по методах, відомих фахівцям в галузі, наприклад за допомогою моделювання взаємодій СОР і остовних залишків, для того, щоб визначити остовні залишки, що мають важливе значення для зв'язування антигену, а також шляхом зіставлення послідовності для ідентифікації незвичайних остовних залишків у конкретних положеннях, див., наприклад, патент США Мо 5585089; і Кіесптапп еї аї., Маїиге 332:323 (1988).
Крім того, переважно, щоб гуманізовані антитіла зберігали високу афінність до СХСК»5, а також зберігали або здобували інші сприятливі біологічні властивості. Таким чином, гуманізовані антитіла готуються в рамках процесу аналізу вихідних послідовностей і різних концептуальних гуманізованих продуктів за допомогою тривимірних моделей вихідних і гуманізованих послідовностей. Тривимірні моделі імуноглобулінів широко доступні й відомі фахівцям в галузі.
Існують комп'ютерні програми, які візуально представляють і відображають можливі тривимірні конформаційні структури вибраних кандидатів імуноглобулінових послідовностей. Вивчення зображень дозволяє проводити аналіз імовірної ролі різних залишків у функціонуванні імуноглобулінової послідовності-кандидата, тобто аналіз залишків, які впливають на здатність імуноглобуліну-кандидата зв'язувати СХСК5. Таким чином, можуть відбиратися й комбінуватися бо залишки ЕЕ з реципієнтної і імпортованої послідовностей, для того, щоб максимізувати бажану характеристику антитіла, наприклад, зростаючої афінності до антигену-мішені, хоча саме залишки СОК прямо й найбільш істотним чином впливають на зв'язування СХСК5. Області СО також можуть модифікуватися, так щоб містити одну або кілька амінокислот, що відрізняються від одержаних від вихідного антитіла, від якого була взята СОК, для того, щоб забезпечити посилення або появу інших властивостей, що представляють інтерес, наприклад зв'язування з більшою афінністю або більшою авідністю.
Можна проводити маніпуляції й вносити зміни в певні частини константних областей антитіла, для того, щоб додати гомологам, похідним, фрагментам і іншим елементам антитіла властивості, що відрізняються від тих, що спостерігалися у вихідному антитілі або кращі в порівнянні з ним. Так, наприклад, багато антитіл дб. утворюють внутрішньоланцюгові дисульфідні зв'язки на околицях шарнірної області. Внутрішньоланцюговий зв'язок у стані дестабілізувати вихідну бівалентну молекулу з утворенням моновалентних молекул, що містять важкий ланцюг з асоційованим легким ланцюгом. Такі молекули можуть знову асоціюватися, але вже випадковим чином.
Відзначалося, що модифікація амінокислот у шарнірній області молекул Їдсб4 може знизити ймовірність утворення внутрішньоланцюгового зв'язку, тим самим стабілізуючи молекулу Ідса, що зведе до мінімуму ймовірність утворення біспецифічних молекул. Подібна модифікація може виявитися корисною, якщо використовуваним для лікування антитілом є молекула Ідся, оскільки зросла стабільність буде зводити до мінімуму ймовірності дисоціації молекули в процесі одержання й виробництва, а також і /л у/у/о. Моновалентне антитіло може не мати такої ж ефективності, що й бівалентна вихідна молекула. Наприклад, якщо пацієнтові вводиться бівалентний Ідса, відсоток бівалентного ІдСя« спадає до приблизно 30 95 за двотижневий період.
Заміщення амінокислоти в положенні 228 збільшує стабільність ІдС«. Серии, який знаходиться в положенні 228, може бути заміщений на іншу амінокислоту, наприклад, на одну з інших 19 амінокислот. Така зміна може бути зроблена, зокрема, у випадку рекомбінантних антитіл де кодуючи послідовність нуклеїнової кислоти може бути мутована, для того, щоб одержати, заміняючу амінокислоту в положенні 228. Наприклад, компонент 5 може бути замінений на пролін.
Інший набір амінокислот, придатний для модифікації, включає амінокислоти в шарнірній
Зо області, які впливають на зв'язування молекули, що містить важкий ланцюг з рецептором, що зв'язуються з Ес, і інтерналізацію зв'язаного антитіла. У молекулах Ідсї до таких амінокислот належать залишки із приблизно 233 по приблизно 237 (С1н-І єи-І еи-Спу-Спу); (ЗЕО ІО МО: 49) із приблизно 252 по приблизно 256 (Меї-Пе-5ег-Агуд-ТНиг) (ЗЕО ІО МО: 50) і із приблизно 318 (СМ) по приблизно 331 (Рго), включаючи, наприклад, ГІ уззго, І убзг» і Ргозго.
Використання повністю людських антитіл особливо бажане при терапевтичному впливі на людей-пацієнтів. Людські антитіла можуть виготовлятися із застосуванням різних методів, відомих фахівцям в галузі, у тому числі фаг-дисплея, описаних вище, з використанням бібліотеки антитіл людини, одержаних з імуноглобулінових послідовностей людини, див. патенти США МоМо 4444887 і 4716111; ії УМО 98/46645, УМО 98/50433, УМО 98/24893, УМО 98/16654,
УМО 96/34096, УМО 96/33735 і УМО 91/10741. Методики з робіт Соїе еї аї. і Воегаеєг єї аЇ. також можуть застосовуватися для виготовлення людських моноклональних антитіл (Соїе еї аї.,
Мопосіопаї! Апііродіе5 апа Сапсег Тпегару, Аїйап К. І із5 (1985); і Воетег еї аї., У Іттипої 147:86 (1991)).
Людські антитіла можуть бути також одержані з використанням трансгенних мишей, які нездатні до експресії функціональних ендогенних імуноглобулінів, але які також експресують певні гени людського імуноглобуліну. Наприклад, генні комплекси людського важкого й легкого ланцюгів імуноглобуліну можуть вводитися в мишачі ембріональні стовбурні клітини випадковим чином або за допомогою гомологічної рекомбінації. В альтернативному варіанті людська варіабельна область, константна область і О-область можуть вводитися в мишачі ембріональні стовбурні клітини на додаток до генів важкого й легкого ланцюга людини. Мишачі гени важкого й легкого ланцюга імуноглобуліну можуть перевести в нефункціональний стан окремо або одночасно із введенням л оку сів людського імуноглобуліну за допомогою гомологічної рекомбінації. Зокрема, гомозиготна делеція в області УНН перешкоджає ендогенній продукції антитіла. Модифіковані ембріональні стовбурні клітини розмножують і проводять їхню мікроін'єкцію в бластоцисти для одержання химерних мишей. Химерних мишей потім вирощують для одержання гомозиготного потомства, яке експресує людські антитіла, див., наприклад, Чакобоміїі5 еї аїЇ.,, Ргос Майї! Асай сі ОБА 90:2551 (1993); ЧаКороміїі5 еї а!., Маїиге 362:255 (1993); Вгиддегтапп еї аї., Уеаг іп Іттипої 7:33 (1993); і биспозаї еї аї., Майшге 355:258 (1992)).
Трансгенні миші звичайним чином зазнають імунізації СХСК5, наприклад повною послідовністю СХСР5 або її частиною, такою як її домен ЕС. Моноклональні антитіла, орієнтовані проти СХСК5, можуть бути одержані від імунізованих трансгенних мишей за допомогою стандартної гібридомної технології. Трансгени людського імуноглобуліну, накопичені трансгенними мишами, реорганізуються під час диференціації В-клітин і потім піддаються класовому перемиканню й соматичній мутації. Таким чином, за допомогою даної методики є можливість продукувати терапевтично застосовні антитіла Ідс, ІА, ДМ їі ЧЕ. Огляд див. у роботі І опбего еї аї., Іпї Кем Іттипої 13:65-93 (1995). Обговорення продукції людських антитіл і людських моноклональних антитіл і протоколів одержання таких антитіл: див., наприклад, МО 98/24893; УМО 92/01047; УМО 96/34096 і УМО 96/33735; ЕРО Мо. 0 598 877; і патенти США МоМо 5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771 і 5939598.
Крім того, такі компанії, як Атдеп (Егетопі, СА), Сепрпагт (Зап чщозе, СА) і Медагех, Іпс. (Ргіпсеїп, МУ) можуть залучатися для поставки людських антитіл, націлених проти СХСК5, з використанням технології, яка аналогічна наведеній вище.
Крім того, людські тАбБ5 можуть бути одержані імунізацією мишей, яким трансплантовані людські лейкоцити периферичної крові, спленоцити або кістковий мозок (наприклад методика тріом ХТІ Віорпагтасецшціїсаї!5, Ієгаєї). Повністю людські антитіла, які розпізнають вибраний епітоп, можуть бути одержані з використанням методики, яка називається "спрямованою селекцією". У рамках цього підходу відібране нелюдське моноклональне антитіло, наприклад мишаче антитіло, використовується для спрямованої селекції повністю людського антитіла, що розпізнає той же епітоп (дезрегз еї аі., ВіоЛесппоЇоду 12:899 (1988)).
При використанні рекомбінантних методик варіант антитіла може продукуватися внутрішньоклітинно, у периплазматичному просторі, або прямо секретуватися в середовище.
Якщо варіант антитіла продукується внутрішньоклітинно, на першому етапі можна відокремити залишки частинок, клітини-реципієнти або фрагменти після лізису, наприклад, за допомогою центрифугування або ультрафільтрації. У роботі Сапег еї аї., Віо/ЛГесппоїоду 10:163 (1992) описана процедура ізолювання антитіл, які секретуються в периплазматичний простір Е. соїї.
Отже, клітинну пасту обробляють ацетатом натрію (рН 3,5) і ЕОТА. Залишки клітин можна вилучити центрифугуванням. Якщо варіант антитіла секретується в середовище, супернатант
Зо від такої системи експресії звичайно спочатку концентрують за допомогою комерційно доступних фільтрів для концентрації білків, наприклад, системи ультрафільтрації Атісоп або
МійПіроге Реїйсоп. Для інгібування протеолізу може додаватися інгібітор протеази, наприклад,
РМ5ЕБ, а також можна включити антибіотики, щоб перешкодити росту випадкових забруднювачів.
Препарат антитіл, виготовлений із клітин, може очищатися з використанням, наприклад, хроматографії на гідроксіапатиті, гель-електрофорезу, діалізу й афінної хроматографії.
Придатність білка А або білка С як афінного ліганду залежить від виду й ізотипу будь-якого домену Ес імуноглобуліну, який утримується у варіанті антитіла. Білок А може застосовуватися для очищення антитіл, в основі яких лежать людські важкі ланцюги Ідсі, С»: або Ідса (І іпатак еї аІ,, У Іттипої Мей 62:1 (1983)). Білок б може використовуватися для ізотипів мишей і людського ЇдОз (би55 еї аІ., ЕМВО у 5:1567 (1986)). Як матриця, з якою зв'язується афінний ліганд, найчастіше використовується агароза, але існують і інші матриці. Механічно міцні матриці, наприклад стекло з регульованою пористістю або полі(стирол-дивініл)бензол, допускають використання більш високих швидкостей потоку й дозволяють домагатися більш коротких часів обробки в порівнянні з агарозою. Якщо у варіант антитіла включений домен СНЗз, для очищення зручно використовувати смолу ВаКегропа АВХТМ (УТ ВакКег; РийшШірзбригу, МУ).
Залежно від виділюваного антитіла і його варіанта можуть також застосовуватися інші методики очищення білка, наприклад фракціонування на іонообмінній колонці, осадження етанолом, зворотнофазова ВЕРХ, хроматографія на силікагелі, хроматографія на гепарин-агарозі, хроматографія на аніонообмінній або катіонообмінній смолі (наприклад, на колонці з поліаспарагіновою кислотою), хроматофокусування, 5205-РАСЕ і осадження сульфатом амонію.
Після будь-якої стадії (стадій) попереднього очищення можна провести хроматографію з гідрофобною взаємодією при низьких рН для суміші, що містить розглянуте антитіло або його варіант і домішки, в умовах елюювання буфером при рН в інтервалі приблизно 2,5-4,5, переважно проведеного при низьких концентраціях солей (наприклад, в інтервалі приблизно 0- 0,25 М солі).
Крім того, антитіла згідно з даним винаходом можуть, у свою чергу, використовуватися для одержання антиідіотипічних антитіл, які "імітують" СХСК»5, застосовуючи методики, добре відомі фахівцям в галузі (див., наприклад, Сгтеепзрап еї а!І., РАЗЕВ У 7:437 (1989); і Мізвіпоїй, У Іттипої бо 1472429 (1991)). Наприклад, антитіла, які зв'язуються з СХСР5 і конкурентно інгібують мультимеризацію й/"або зв'язування ліганду з СХСМК5, можуть використовуватися для одержання антиідіотипів, які "імітують" СХОК5 і домен зв'язування, і в результаті зв'язуються з
СХС5 і нейтралізують СХСК5 і/або його ліганд. Подібні нейтралізуючі антиідіотипи або фрагменти Раь таких антиіїдіотипів можуть використовуватися в терапевтичних схемах лікування, наприклад, для нейтралізації СХСІ 13.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути біспецифічними. Біспецифічні антитіла можуть бути моноклональними, переважно людськими або гуманізованими антитілами, які мають специфічність зв'язування щонайменше до двох різних антигенів. У даному винаході один з напрямків специфічності зв'язування стосується СХСК5, а другий може стосуватися будь-якого іншого антигену, наприклад білка клітинної поверхні, рецептора, субодиниці рецептора, ліганду, тканиноспецифічного антигену, білка вірусного походження, кодованого вірусом оболонкового білка, білка бактеріального походження, білка бактеріальної поверхні та ін. При цьому друга специфічність може бути до СХСІ 13.
Методи виготовлення біспецифічних антитіл добре відомі фахівцям в галузі. Звичайно рекомбінантна продукція біспецифічних антитіл основана на спільній експресії пар, важкий ланцюг/легксий ланцюг двох імуноглобулінів, причому два важкі ланцюги мають різні специфічності (Міїсїеїп еї а!І., Маїшге 305:537 (1983)). Внаслідок випадкового розподілу важких і легких ланцюгів імуноглобуліну гібридоми (квадроми) продукують імовірну суміш десяти різних молекул антитіл, з яких лише одна має правильну біспецифічну структуру. Виділення потрібної молекули звичайно проводиться за допомогою декількох стадій афінної хроматографії.
Аналогічні процедури описані в заявці М/О 93/08829 і в роботі ТгаипескКег еї аі., ЕМВО у 10:3655 (1991). Інші методи виготовлення біспецифічних антитіл приводяться, наприклад, в Киїег еї аї.,
Тгепаз Віоївєсп 22:238-244, 2004.
Варіабельні домени антитіла з бажаними специфічностями зв'язування можна зливати з послідовностями константних доменів імуноглобулінів. Злиття краще проводиться з константним доменом важкого ланцюга імуноглобуліну, що включає щонайменше частину шарнірних областей СН» і СНз. Щонайменше в одному із продуктів злиття може втримуватися константна область першого важкого ланцюга (Сні), що включає сайт, необхідний для зв'язування легкого ланцюга. ДНК що кодують продукти злиття важкого ланцюга імуноглобуліну,
Зо і, якщо бажано, легкий ланцюг імуноглобуліну вводяться в різні вектори експресії й спільно трансформуються в придатному організмі хазяїна. Більш докладно про одержання біспецифічних антитіл можна довідатися, наприклад, у роботі 5игезі еї аіІ., Мей Епгут 121:210 (1986).
Гетерокон'югати антитіл також становлять частину даного винаходу. Гетерокон'югати антитіл складаються із двох ковалентно зв'язаних антитіл. Такі антитіла, наприклад, були запропоновані для орієнтування клітин імунної системи на небажані клітини (патент США Мо 4676980). Передбачається, що антитіла можуть бути виготовлені /л мігто за допомогою відомих методів синтетичної хімії білків, у тому числі із застосуванням агентів для перехресних зшивок.
Наприклад, імунотоксини можуть конструюватися за допомогою реакції дисульфідного обміну або за рахунок утворення тіоефірного зв'язку. Прикладами придатних для цього реагентів є імінотіолат і метил-4-меркаптобутирімідат, а також запропоновані, наприклад, у патенті США Мо 4676980.
Крім того, можна одержати о дно доменні антитіла до СХСК5. Приклади подібної технології були описані в заявці ММО9425591 для випадку антитіл, одержаних з важкого ланцюга Ід верблюда, а також в 05 20030130496, де обговорюється виділення однодоменних повністю людських антитіл з фагових бібліотек.
В альтернативному варіанті методики, описані при одержанні одноланцюжкових антитіл (патент США Мо 4946778; Віга, зсіепсе 242:423 (1988); Низіоп еї аї., Ргос Май! Асай 5сі О5А 85:5879 (1988); і Мага, еї аїЇ., Маїшге 334:544 (1989)), можуть бути адаптовані для одержання одноланцюжкових антитіл. Одноланцюжкові антитіла утворюються за допомогою зв'язування фрагментів важкого й легкого ланцюгів області Гу через амінокислотний місток з утворенням одноланцюжкового поліпептиду. Можна також використовувати методики складання функціональних фрагментів Р, в Е. соїї (ФКеїта єї аі., Зсієпсе 242:1038 (1988)).
Даний винахід включає антитіла, рекомбінантно злиті або хімічно кон'юговані (у тому числі ковалентно й нековалентно кон'юговані) з поліпептидом. Злиті або кон'юговані антитіла згідно з даним винаходом можуть використовуватися для простоти очищення, див., наприклад, УМО 93/21232; ЕР 439,095; Магатига еї аї., Іттипої Гей 39:91 (1994); патент США Мо 5474981; Сіев еї аі,, Ргос Май Асай Зсі ОСОБА 89:1428 (1992); і Бей еї аїЇ.,, У Іттипої 146:2446 (1991).
Амінокислотна послідовність маркера може являти собою гексагістидиновий пептид (ЗЕО ІЮ 60 МО: 51), наприклад пептид, подібний маркеру у векторі РОЕ (ОІАСЕМ, Іпс., Спазми, СА),
серед інших, багато з яких комерційно доступні, Сепі еї аїЇ.,, Ргос Майї! Асай 5сі ОБА 86:821 (1989). До інших пептидних маркерів, зручних для очищення, серед інших, належать маркер «НА», який відповідає епітопу, одержаному з гемаглютинуючого білка грипу (М/їзоп еї аї.,СеїЇ 37:767 (1984)) і маркер «Пад».
Можна також створити одноланцюжкові пептидні з'єднувальні молекули, в яких області важкого й легкого ланцюга Ру з'єднані одна з одною. Одноланцюжкові антитіла («5сЕу») і метод їх конструювання описані, наприклад, у патенті США Мо 4946778. В альтернативному варіанті аналогічними способами можна сконструювати й експресувати Раь. Усі повністю або частково людські антитіла можуть бути менш імуногенними, ніж повністю мишачі тАре, фрагменти й одноланцюжкові антитіла також можуть бути менш імуногенними.
Антитіла або фрагменти антитіл можуть виділятися з фагових бібліотек антитіл, одержаних за допомогою методик, описаних в Мссапйегіу еї аї., Майшге 348:552 (1990). Сіагкзоп еї аї., Маїиге 352:624 (1991) ії Маїк5 еї аї., 9) Мої! Віо! 222:581 (1991) розглядають виділення мишачих і людських антитіл, відповідно, з використанням фагових бібліотек. У наступних публікаціях описана продукція високоафінних (в інтервалі нМ) людських антитіл за допомогою перестановки в ланцюзі (Магк5 еї аї., Віо/ГесппоЇоду 10:779 (1992)), а також метод комбінаторної інфекції й рекомбінація /л у/уо як стратегії побудови дуже великих фагових бібліотек (Ууаїетпоизе еї аї.,
Мисі Асід5 Ке5 21:2265 (1993)). Таким чином, подібні методики є практичною альтернативою традиційним гібридомним методикам в одержанні моноклональних антитіл.
Антитіла до СХСК5 аналізувалися методами твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА), РАС5, вестерн-блотингом або іншими імунохімічними методами, відомими фахівцям в галузі. Так, В-клітини або клітини, експресуючі СХСК5, можуть використовуватися для детектування зв'язування з ним антитіла за допомогою тієї або іншої відомої методики, або ж рекомбінантно експресований СХСМК5О або його частина, наприклад домен ЕС, можуть закріплювати на твердій фазі й використовувати як елемент захоплення при аналізі, побудованому залежно від поставленої мети.
Щоб визначити, чи зв'язується той або інший конкретний гомолог антитіла з людським
СХСР5, можна використовувати будь-який стандартний метод аналізу зв'язування. До зручних методів аналізу зв'язування СХСОК5 належать аналіз РГАС5, аналіз ЕГІЗА, радіоіїмунологічні методи аналізу і їм подібні, які детектують зв'язування антитіла з СХСК5 людини й виникаючі в результаті функції. Для таких аналізів зручні розглянуті в даному описі, що мають повну довжину й розчинні форми людського СХСК»5. Зв'язування антитіла або гомолога з СХСК»5, або з його розчинними фрагментами, можна легко реєструвати за рахунок використання другого антитіла, специфічного до імуноглобулінів виду, від якого одержані антитіло або гомолог.
Щоб встановити, блокує чи в помітній мірі те або інше антитіло або гомолог зв'язування
СХСІ13 або іншого ліганду з людським СХСК5, можна скористатися будь-яким зручним методом конкурентного аналізу. До придатних методів аналізу, наприклад, належать методи
ЕГІ5А, методи ЕАС5, радіоімунологічні методи аналізу і їм подібні, які дозволяють кількісно визначити здатність антитіла або гомолога конкурувати з СХСІ13 або іншим лігандом за зв'язування з людським СХСК5. Переважно, оцінюється здатність ліганду блокувати зв'язування міченого людського СХСК5 з іммобілізованим антитілом або гомологом.
Здатність антитіла або гомолога зв'язуватися з людським СХСК5 можна оцінити перевіркою його здатності зв'язуватися з людськими клітинами СХСКО5". Придатними клітинами СХСКО5: для використання при визначенні того, чи може те або інше конкретне антитіло або гомолог зв'язуватися з людським СХСК5, є клітини культур тканин ссавців, трансформовані за допомогою ДНК, яка кодує людський СХСОК5 повної довжини, і експресує СХСК5 на поверхні клітин або в лініях В-клітин.
Зв'язування антитіла або гомолога із клітиною СХСК5: може реєструватися за допомогою фарбування клітин флуоресцентно-міченим другим антитілом, специфічним до імуноглобулінів того ж виду, від якого одержаний аналізований гомолог антитіла. Клітинний сортер з активацією флуоресценції («РАС5») може використовуватися для реєстрації й кількісного опису будь-якого зв'язування, див., у загальному випадку, Зпаріго, Ргасіїса! ГІом/ Суютеїгу, Аіап В. І 55, Іпс., Мем
УОК, М.М. (1985).
Крім того, здатність гомолога антитіла блокувати зв'язування ліганду, наприклад, СХСІ 13, з людським СХСК5О може визначатися за допомогою преінкубування надлишку ліганду із клітинами СХ: і кількісної реєстрації міри блокування зв'язування антитіла або гомолога із клітинами за рахунок присутності зв'язаного ліганду. Зв'язування гомолога антитіла із клітинами
СХОСВ5: може реєструватися за допомогою РАС5, з використанням флуоресцентно-міченого другого антитіла, специфічного до імуноглобулінів того ж виду, від якого одержаний аналізований гомолог антитіла. В альтернативному варіанті можлива постановка конкурентного аналізу, відомого фахівцям в галузі, за допомогою міченого ліганду або антитіла.
Ліганд, наприклад, СХСІ 13, який використовувався в описаних вище процедурах аналізу, може продукуватися клітинами, трансформованими геном для синтезу ліганду, або ж може застосовуватися виділений СХСІ 13, одержуваний із застосуванням викладених у даному документі практичних методів, або ж може здобуватися ліганд, що серійно випускається.
Щоб визначити, чи не приводить те або інше конкретне антитіло або гомолог до помітного зниження кількості циркулюючих клітин СХСК5: /п умо, визначалася кількість циркулюючих клітин СХСК5:", взятих у ссавця протягом 24 годин після введення антитіла або гомолога ссавцеві з нормальною імунною функцією, і ця величина зіставлялася з кількістю до введення або кількістю в контрольного ссавця, якому вводили антитіло або гомолог відповідного ізотипу без певної специфічності замість антитіла або гомолога згідно з даним винаходом. Кількісне визначення клітин СХСК5: у тварин, що одержали дозу антитіла СХСК5 або його функціональної частини, або його похідного, може проводитися, наприклад, за допомогою фарбування одержаних клітин флуоресцентно-міченими антитілами, які зв'язують антитіла до
СХСМК5, а також міченими антитілами, специфічними до Т-клітин і В-клітин, з наступним аналізом ЕАС5.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть описуватися або характеризуватися з погляду епітопа (епітопів) або частини (частин) СХСК»5, які антитіло розпізнає або з якими воно специфічно зв'язується. Епітоп (епітопи) або частина (частини) поліпептидів, як описано в даному документі, можуть характеризуватися, наприклад, по М-термінальним і С-термінальним положенням, по довжині безперервного ланцюга амінокислотних залишків, конформаційним епітопам та ін.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть також описуватися або характеризуватися по перехресній реакційній здатності. В об'єм даного винаходу також включаються антитіла, які зв'язують поліпептиди СХСК5, що характеризуються щонайменше 95 956, щонайменше 90 95, щонайменше 85 95, щонайменше 80 95, щонайменше 75 956, щонайменше 70 956, щонайменше 65 до, щонайменше 60 95, щонайменше 55 95 і щонайменше 50 95 ідентичністю (яка розраховується за допомогою методів, відомих фахівцям в галузі й описаних у даному документі) до СХСКО5.
Зо Антитіла згідно з даним винаходом можуть також описуватися або характеризуватися по афінності зв'язування з розглянутим СХСК5. Антитіла до СХСК5 можуть зв'язуватися з кО менше приблизно 10-7 М, менше приблизно 105 М або менше приблизно 105 М. Більш висока афінність зв'язування розглянутого антитіла може бути більш бажана, наприклад, з рівноважною константою дисоціації або кО від приблизно 108 до приблизно 10-75 М, від приблизно 103 до приблизно 10-12 М, від приблизно 107 до приблизно 10-" М або від приблизно 108 до приблизно 1079 М. У даному винаході також пропонуються антитіла, які конкурентно інгібують зв'язування антитіла з епітопом згідно з даним винаходом, що визначається будь-яким методом, відомим фахівцям в галузі, для реєстрації конкурентного зв'язування, наприклад, описаними в даному документі методами імунологічного аналізу. У переважних прикладах здійснення антитіло конкурентно інгібує зв'язування з епітопом щонайменше на 95 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 75 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 60 95 або щонайменше на 50 95.
В об'єм даного винаходу також включаються кон'югати, що містять розглянуте антитіло.
Кон'югати складаються із двох основних компонентів: розглянутого антитіла й другого компонента, яким може бути з'єднуючий клітини агент, цитотоксичний агент та ін.
Використовуваний у даному документі термін «з'єднуючий клітини агент» стосується речовини, яка специфічно розпізнає й зв'язує молекулу на поверхні клітини. Так, як зв'язуючий клітини агент може виступати антиген СО, патогенний антиген, наприклад вірусний антиген, диференціюючий антиген, раковий антиген, клітинно-специфічний антиген, тканиноспецифічний антиген, Ід або подібна Ід молекула та ін.
В одному із прикладів здійснення з'єднуючий клітини агент специфічно розпізнає СХСІ 13 або комплекс СХСК5 з його лігандом, наприклад з СХСІ 13. Кон'югат може знаходитися в контакті із клітиною-мішенню протягом тривалого періоду часу, для того, щоб дати можливість ефекторній функції кон'югата вплинути на клітину й/або забезпечити достатній час, протягом якого відбудеться інтерналізація кон'югата клітиною.
З'єднуючі клітини агенти можуть бути будь-якого типу, який відомий у цей час або стане відомим у майбутньому, до них належать пептиди, непептидні сполуки, сахариди, нуклеїнові кислоти, ліганди, рецептори та ін. або їх комбінації. З'єднуючим клітини агентом може бути будь-яка сполука, яка зв'язує клітину як специфічним, так і неспецифічним чином. Як правило, бо як агент може виступати антитіло (зокрема моноклональне антитіло), лімфокіни, гормони,
фактори росту, вітаміни, молекули-переносники живильних речовин (наприклад, трансферин) або будь-яка інша зв'язуюча клітину молекула або речовина.
До інших прикладів зв'язуючих клітину агентів, які можуть використовуватися в даному винаході, належать: поліклональні антитіла, моноклональні антитіла й фрагменти антитіл, наприклад, Раь, Ра», Е(ав2 і Е. (Ратат, у. Іттипої. 131:2895-2902 (1983); ргіпо вї аї., У. Іттипої. 113:470-478 (1974); і Мізопоїї еї аї., Агоп. Віоспет. Віорпув. 89: 230-244 (1960)).
Другим компонентом також може бути цитотоксичний агент. Використовуваний у даному документі термін «цитотоксичний агент» стосується речовини, яка пригнічує або блокує функціонування або ріст клітин і/або викликає деструкцію клітин. Так, як цитотоксичний агент може виступати таксол, майтансиноїд, наприклад ОМІ або ЮОМ4, СС-1065 або СС-1065 аналог, рицин, мітоміцин С та ін. У деяких прикладах здійснення цитотоксичний агент, подібно будь- якому зв'язуючому агенту кон'югата за даним винаходом, ковалентно пов'язаний з антитілом, що розглядається, прямо або через розщеплюваний або нерозщеплюваний лінкер.
Прикладами придатних майтансиноїдів є майтансинол і аналоги майтансинолу.
Майтансиноїди пригнічують утворення мікроканальців і найвищою мірою токсичні для клітин ссавців.
До прикладів придатних аналогів майтансинолу належать аналоги, що мають модифіковане ароматичне кільце, а також аналоги з модифікаціями в інших положеннях. Такі придатні для використання майтансиноїди пропонуються в патентах США МоМо 4424219; 4256746; 4294757; 4307016; 4313946; 4315929; 4331598; 4361650; 4362663; 4364866; 4450254; 4322348; 4371533; 6333410; 5475092; 5585499 і 5846545.
Приклади придатних аналогів майтансинолу з модифікованим ароматичним кільцем включають: (1) С-19-дехлор (патент США Мо 4256746) (одержуваний, наприклад, ГАН- відновленням ансамітоцину Рг); (2) С-20-гідрокси (або С-20-деметил) ж/- С-19-дехлор (патенти
США Мо 4361650 і 4,307,016) (одержуваний, наприклад, деметилуванням з використанням стрептоміцетів або актиноміцетів або дехлоруванням із застосуванням літійалюмінійгідриду (АН)); ії (3) С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-ОСОВ), ч/-дехлор (патент США Мо 4294757) (одержуваний ацилуванням під дією ацилхлоридів).
Приклади придатних аналогів майтансинолу з модифікаціями в інших положеннях
Зо включають: (1) С-9-5Н (патент США Мо 4424219) (одержуваний реакцією майтансинолу з Н25 або Роб5); (2) С-14-алкоксиметил (деметокси/СНг2ОК) (патент США Мо 4,331,598); (3). С-14- гідроксиметил або ацилоксиметил (СН2ОН або СНогОАс) (патент США Мо 4450254) (одержуваний з нокардій); (4) С-15-гідрокси/ацилокси (патент США Ме 4364866) (одержуваний конверсією майтансинолу стрептоміцетами); (5) С-15-метокси (патенти США Мо 4313946 і 4315929) (виділюваний з Тгемла пидйога); (6) 18-М-деметил (патенти США Мо 4362663 і 4322348) (одержуваний деметилуванням майтансинолу стрептоміцетами); і (7) 4,5-деокси (патент США Мо 4371533) (одержуваний відновленням майтансинолу під дією трихлористого титану/ АН).
Цитотоксичні кон'югати можуть бути одержані методами / мо. Для зв'язування цитотоксичного агента, ліків або проліків з антитілом, як правило, використовується лінкерна група. Придатні лінкерні групи відомі фахівцям в галузі, до них належать дисульфідні групи, тіоефірні групи, кислотонестійки групи, фотолабільні групи, групи, нестійкі до впливу пептидази, а також групи, нестійкі до впливу естерази. Наприклад, кон'югати можуть конструюватися за допомогою реакції дисульфідного обміну або за рахунок утворення тіоефірного зв'язку між розглянутим антитілом і ліками або проліками.
Як обговорювалося вище, у даному винаході пропонуються послідовності виділених нуклеїнових кислот, що кодують описані в даному документі антитіло або його функціональний варіант, конструкції векторів, що включають нуклеотидну послідовність, що кодує з'єднуючі
СХСР»5 поліпептиди згідно з даним винаходом, клітини-реципієнти, що несуть такий вектор, а також рекомбінантні методики продукції такого поліпептиду.
Вектор, як правило, складається з компонентів, відомих фахівцям в галузі, і звичайно, серед інших, включає один або декілька перерахованих нижче елементів: сигнальна послідовність, точка початку реплікації один або кілька маркерів або генів селекції, послідовності, що сприяють і/або стимулюють трансляцію, енхансер та ін. Таким чином, вектори експресії містять нуклеотидну послідовність, яка функціонально пов'язана з такими придатними транскрипційними або трансляційними регуляторними нуклеотидними послідовностями як, наприклад, похідними від генів ссавців, мікробів, вірусів або комах. До прикладів додаткових регуляторних послідовностей належать оператори, рибосомальні сайти зв'язування мРНК і/або інші відповідні послідовності, які контролюють транскрипцію й трансляцію, наприклад їх бо ініціювання й припинення. Нуклеотидні послідовності є «Функціонально зв'язаними», якщо регуляторна послідовність має функціональне відношення до нуклеотидної послідовності відповідного поліпептиду. Так, нуклеотидна послідовність промотору функціонально зв'язана, наприклад, з послідовністю важкого ланцюга антитіла, якщо нуклеотидна послідовність промотору контролює транскрипцію такої нуклеотидної послідовності.
Крім того, у вектори експресії можна вбудовувати послідовності, що кодують відповідні сигнальні пептиди, які звичайно не є природним чином пов'язаними з послідовностями важкого і або легкого ланцюгів антитіла. Наприклад, нуклеотидна послідовність сигнального пептиду (секреторний лідер) може бути злита усередині рамки з поліпептидною послідовністю, так щоб антитіло секретувалося у периплазматичний простір або в середовище. Сигнальний пептид, який діє в передбачуваних клітинах-реципієнтах, підсилює позаклітинну секрецію відповідного антитіла або його частини. Сигнальний пептид може відщеплюватися від поліпептиду при виділенні антитіла із клітини. Приклади таких секреторних сигналів добре відомі й включають, наприклад, описані в патентах США Мо 5698435; 5698417 і 6204023.
Як вектор може виступати плазміда, одноланцюжковий або дволанцюжковий вірусний вектор, фаговий вектор одноланцюжкової або дволанцюжкової РНК або ДНК, фагмід, косміда або будь-який інший носій трансгена, що представляє інтерес. Такі вектори можуть вводитися в клітини як полінуклеотиди, з використанням добре відомих методик введення ДНК і РНК у клітини. Вектори, у випадку фагових або вірусних векторів, також можуть вводитися в клітини у формі вірусу в оболонці або в капсулі з використанням добре відомих методик інфекції й трансдукції. Вірусні вектори можуть бути компетентними або дефективними стосовно реплікації.
В останньому випадку розмноження вірусу буде, як правило, проходити тільки в комплементарних клітинах-реципієнтах і з використанням множинних векторів, що несуть різні вірусні компоненти, необхідні для продукції частинок. Безклітинні системи трансляції можуть також застосовуватися для продукції білка з використанням РНК, одержаних з існуючих конструкцій ДНК (див., наприклад, УМО 86/05807 і УМО 89/01036; і патент США Мо 51224654).
Експресія антитіл згідно з даним винаходом може здійснюватися в будь-якій придатній клітині-хазяїні. До прикладів клітин-реципієнтів, придатних для використання в даному винаході, належать прокаріотичні, дріжджові або вищі еукаріотичні клітини, і сюди, серед інших, входять мікроорганізми, наприклад бактерії (зокрема Е. соїї, В. зиБій5, ентеробактер, ервінії, клебсіели, протеус, сальмонели, сератії й шигели, а також паличкоподібні бактерії, псевдомонади й стрептоміцети), трансформовані за допомогою векторів експресії рекомбінантної ДНК бактеріофага, плазмідної ДНК або космідної ДНК, що містять кодуючи послідовності розглянутого антитіла; дріжджі (наприклад, сахароміцети, пічіа, актиноміцети, клювероміцети, шизосахароміцети, кандиди, триходерма, нейроспора й гіфоміцети, такі як нейроспора, пеніцил, толіпокладіум і аспергіли), трансформовані за допомогою рекомбінантних векторів експресії дріжджів, що містять послідовності, що кодують антитіла; клітинні системи комах, інфіковані рекомбінантними векторами експресії вірусу (наприклад, бакуловірусу), що містять послідовності, що кодують антитіла; рослинні клітинні системи, інфіковані рекомбінантними векторами експресії вірусу (наприклад, вірус мозаїки кольорової капусти, Самум; або вірус тютюнової мозаїки, ТММ) або трансформовані векторами експресії рекомбінантної плазміди (наприклад, плазміди Ті), що містять послідовності, що кодують, антитіла; або ж клітинні системи ссавців (наприклад, клітини СО5, СНО, ВНК, 293 або 313), що несуть рекомбінантні конструкції експресії, що містять промотори, одержані з генома клітин ссавців (наприклад, промотор металотіонеїну) або з вірусів ссавців (наприклад, пізній промотор аденовірусу або 7.5К промотор вірусу осповакцини).
Вектори експресії для використання в прокаріотичних клітинах-реципієнтах звичайно включають один або декілька фенотипічних селектованих маркерних генів. Фенотипічний селектований маркерний ген, наприклад, являє собою ген, що кодує білок, який забезпечує стійкість стосовно антибіотиків або задовольняє аутотрофним вимогам. До прикладів придатних для використання векторів експресії для прокаріотичних клітин-реципієнтів належать вектори, одержані на основі комерційно доступних плазмід, наприклад, серії векторів ркКк223-3 (Рпаптасіа Ріпе Спетісаіє, Оррзаїа, Змєдеп), раєм (Рготеда Віоїєс, Мадібзоп, МУМІ), реї (Момадеп, Мадізоп, УМІ) і РЕТ (Момадеп, Мадізоп, У) ї РЕЗЕТ (Іпмігодеп, Сагі5райд, СА) (зіцайїег, У
МОЇ Віо! 219:37 (1991); і Зспоеріег, Сепе 124:83 (1993)). До промоторних послідовностей, які звичайно використовуються для рекомбінантних векторів експресії прокаріотичних клітин- реципієнтів, належать 17, (Козепбего еї аї., бепе 56:125 (1987)), В-лактамаза (пеніциліназа), промоторна система лактози (Спапа еї а!., Маїшиге 275:615 (1978); і соєві еї а!., Маїиге 281:544 (1979)), промоторна система триптофану (Тгр) (Соедаеї! еї аї., Мис! Асіаз Кез5 8:4057 (1980)), і
Тас-промотор (Затьгоок еї аїЇ., Моїесшаг СіІопіпо, А І арогафогу Мапааї, 2па ей., Соїа Зргіпд Нагбог (510) І арогаїогу (1990)).
У дріжджових векторах часто присутні послідовність точки початку реплікації, наприклад, від плазміди дріжджів 2н, автономно реплікована послідовність (АК5), область промотору, послідовності поліаденілування, послідовності припинення транскрипції й ген селектованого маркера. До придатних промоторних послідовностей для векторів дріжджів, серед інших, належать промотори металотіонеїну, З-фосфогліцераткінази (Ніїлетап еї аї., У Віої Спет 255:2073 (1980)) або інші гліколітичні ферменти (Нойапа еї аї., Віоспет 17:4900 (1978), наприклад енолаза, гліцеральдегід-З-фосфатдегідрогеназа, гексокіназа, піруватдекарбоксилаза, фосфофруктокіназа, глюкозо-6-фосфатізомераза, 3- фосфогліцератмутаза, піруваткіназа, триозофосфатізомераза, фосфоглюкозоіїзомераза й глюкокіназа. Інші придатні вектори й промотори для використання в експресії дріжджів докладно описані в роботі ЕРіІеег еї аїЇ,, Сепе 107:285 (1991). Інші придатні промотори й вектори для дріжджів і протоколів трансформації дріжджів добре відомі фахівцям в галузі. Протоколи трансформації дріжджів також добре відомі. Один з таких протоколів описаний в Ніппеп еї аї.,
Ргос Маї! Асай 5сі 75:1929 (1978), де проводиться відбір трансформантів Тгтр" у селективному середовищі.
Застосовна будь-яка клітинна культура еукаріотів, як з культури хребетних, так і безхребетних. До прикладів клітин безхребетних належать клітини рослин і комах (І исКомуу еї аї.,
Віо/Тесппоїоду 6:47 (1988); Міїег єї аї!., Сепеїїс Епдіпеегіпду, Зейому єї аї., едв., мої. 8, рр. 277-9,
Ріеєпит Рибіїхпіпд (1986); і Маєда еї аї., Мате 315:592 (1985)). Наприклад, для продукції гетерологічних білків можуть використовуватися бакуловірусні системи. У системі комах вірус ядерного поліедрозу Ашодгарна саїйогпіса (АСМРМУ) може використовуватися як вектор для експресії чужорідних генів. Вірус росте в клітинах б5родорієга пидірегда. Кодуюча послідовність антитіла може клонуватися під контролем промотору АСМРМ (наприклад, промотору поліеєдрину). До інших встановлених реципієнтів належать Аеде5, Огозорпйа теїаподабвіє!" і
Вотрбрух тотгі. Широко доступні різноманітні вірусні штами для трансфекції, наприклад варіант І - 1 АсМРМ і штам Вт-5 Вотрух тої МРМ. Крім того, як відомо фахівцям в галузі, клітинні культури рослин, наприклад бавовни, кукурудзи, картоплі, соєвих бобів, петунії, помідорів і тютюну, також можуть використовуватися як реципієнти.
Використання клітин хребетних і розмноження клітин хребетних у клітинній культурі (культурі
Зо тканин) може являти собою стандартну процедуру, хоча в реальності й існують примхливі лінії клітин, які вимагають, наприклад, спеціалізованого середовища з унікальними факторами, живильними клітинами та ін., див. Тієзце Сийиге, Кгизе еї аї., ед5., Асадетіс Рге55 (1973).
Приклади придатних для використання ліній клітин-реципієнтів ссавців включають клітини нирок мавпи; клітини мезонефроса людини; клітини нирок новонародженого хом'ячка; клітини яєчників китайського хом'ячка/-ОНЕК (СНО, Шпацрб еї а!., Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 77:4216 (1980)); мишачі клітини Сертолі; клітини карциноми шийки матки людини (наприклад, НеїГа); клітини нирок собаки; клітини легені людини; клітини печінки людини; клітини пухлини молочної залози мишей і клітини М5О.
Клітки-реципієнти трансформують за допомогою векторів для продукції антитіл і культивують у стандартному живильному середовищі, що містить фактори росту, вітаміни, мінеральні речовини та ін., а також індуктори, що придатні для використовуваних клітин і векторів. Широко застосовувані послідовності промотору й послідовності енхансера одержують із вірусу поліоми, аденовірусу 2, вірусу мавп 40 (5М40) і цитомегаловірусу людини (СММ).
Послідовності ДНК, одержані з вірусного генома 5М40, можуть використовуватися для підготовки інших генетичних елементів для експресії структурної генетичної послідовності в клітинах-реципієнтах ссавців, наприклад послідовності, одержаних з 5М40, ранніх і пізніх промоторів, енхансера, сайтів сплайсингу й поліаденілування. Вірусні ранні й пізні промотори особливо зручні, оскільки й той, і інший досить просто одержати з вірусного генома у вигляді фрагмента, який також може містити вірусну точку початку реплікації. У продажі є комерційно доступні стандартні вектори експресії для використання в клітинах-реципієнтах ссавців.
Для культивування клітин-реципієнтів придатні комерційно доступні середовища, наприклад середовище Хема Е10, мінімальне підтримуюче середовище (МЕМ), КРМІ-1640 і модифіковане середовище Дульбеко-Ігла (ОМЕМ). Крім того, будь-яке середовище з описаних в Нат еї аї.,
Ме Еплгутої 58:44 (1979) і Вагпез еї аї., Апа! Віоспет 102:255 (1980), і в патентах США МоМо 4767704; 4657866; 4560655; 5122469; 5712163 або 6048728, може використовуватися як культуральне середовище для клітин-реципієнтів. Кожне із цих середовищ може при необхідності бути доповнене гормонами й/або іншими факторами росту (такими як інсулін, трансферин або епідермальний фактор росту), солями (наприклад, хлоридами, зокрема, хлоридами натрію, кальцію або магнію; і фосфатами), буферами (наприклад, НЕРЕФЗ5), 60 нуклеотидами (наприклад, аденозин і тимідин), антибіотиками, мікроелементами (які визначаються як неорганічні сполуки, звичайно присутні в кінцевих концентраціях, що лежать у мікромолярному діапазоні), а також глюкозою або еквівалентним їй джерелом енергії. Залежно від поставленої мети можуть включатися й будь-які інші необхідні добавки у відповідних концентраціях. Умови культивування, наприклад температура, рН та ін., як відомо фахівцям в галузі, придатні для клітин і забезпечують бажану експресію трансгену.
За допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям в галузі, можна одержати полінуклеотиди, що представляють інтерес, й визначити нуклеотидну послідовність таких полінуклеотидів. Наприклад, якщо відома нуклеотидна послідовність антитіла, полінуклеотид, що кодує антитіло, може бути складений з хімічно синтезованих олігонуклеотидів (наприклад, як це описано в Кийтеїег еї аї., Віо/Гесппідиез 17:242 (1994)), а потім пов'язані з лігандами полінуклеотиди ампліфікують, наприклад, за допомогою ПЛР.
Як альтернатива можна створити полінуклеотид, що кодує антитіло, з нуклеїнової кислоти, яку експресує та або інша клітина. Якщо клон, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує конкретне антитіло, недоступний, але послідовність молекули антитіла відома, нуклеїнову кислоту, що кодує імуноглобулін, можна одержати з придатного джерела, наприклад бібліотеки, яка може бути специфічною для продукуючих антитіло клітин, наприклад клітин гібридоми, відібраних для експресії антитіла згідно з даним винаходом. Для ПЛР-ампліфікації можуть бути підготовлені придатні праймери. Ампліфіковані нуклеїнові кислоти, одержані за допомогою ПЛР, можуть потім клонуватися в репліковані вектори клонування за допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям в галузі.
Після того як нуклеотидна послідовність і відповідна послідовність антитіла встановлені, можливі маніпуляції з нуклеотидною послідовністю антитіла, для того, щоб одержати еквіваленти, що представляють інтерес, описані в даному винаході, з використанням методів маніпуляції нуклеотидними послідовностями, які відомі фахівцям в галузі, наприклад, методики рекомбінантної ДНК, сайт-спрямований мутагенез, ПЛР та ін. (див., наприклад, Затогоок еї аї.,
МоїІесшціаг СіІопіпо, А І арогаїюгу Мапаиаї, 2па єа., Соїа 5ргіпд Нагброг І арогаїогу (1990); і Аизибеї еї а!., ед5., Сигтепі Ргоїосої5 іп МоЇесціаг Віоіоду, хУопп Уміеу 5 5оп5 (1998), для того, щоб одержати антитіла, що містять різні амінокислотні послідовності, наприклад, для проведення заміщень, делецій і/або вставок амінокислот.
Зо Амінокислотна послідовність важкого й/або легкого ланцюгів варіабельного домену може аналізуватися на предмет ідентифікації послідовностей СОМ за допомогою добре відомих методів, наприклад, зіставленням з відомими амінокислотними послідовностями інших важких і легких ланцюгів варіабельних областей, для того, щоб визначити області гіперваріабельності послідовності. Застосовуючи стандартні методики рекомбінантної ДНК, можна ввести одну або декілька СОРК у каркасні ділянки, наприклад у каркасні ділянки білка людини, для того, щоб гуманізувати нелюдське антитіло, як описано вище. Полінуклеотид, що представляє інтерес, одержаний за рахунок комбінації каркасних ділянок і однієї або декількох СОЕ, кодує антитіло, яке специфічно зв'язує СХСНК5 або щонайменше його ЕЮ домен. Такі методи, наприклад, можуть використовуватися для проведення замін або делецій амінокислот для одного або декількох цистеїнових залишків варіабельної області, які беруть участь в утворенні внутрішньоланцюжкового дисульфідного зв'язку, для того, щоб одержати молекулу антитіла без одного або декількох внутрішньоланцюжкових дисульфідних зв'язків.
Антитіла або фрагменти антитіла згідно з даним винаходом можуть бути використані для виявлення СХСК»5, а виходить, і клітин, експресуючих СХСК»5, у біологічному зразку як /л Уго, так і /л умо. В одному із прикладів здійснення антитіло до СХСК5 згідно з даним винаходом використовується, для того щоб встановити присутність і рівень СХСК5 у тканинах або в клітинах, виділених із тканини. Рівні СХС5 у тканині або зразку біопсії можна визначати, наприклад, за допомогою імуноаналізу для антитіл або фрагментів антитіл згідно 3 даним винаходом. Тканина або проба її біопсії можуть заморожуватися або фіксуватися. Такі ж або інші методи можуть використовуватися, щоб встановити інші властивості СХСК5, наприклад його рівень, клітинну локалізацію, рівні мРНК, їхні мутації та ін.
Описаний вище спосіб, наприклад, може використовуватися для діагностики раку в пацієнта, у якого підтверджений або підозрюється рак, при цьому рівень СХСНК5, реєстрований у зазначеного пацієнта, зіставляється з нормальним рівнем здоровішого пацієнта або зі стандартом. Розглянутий аналіз також може використовуватися для діагностики артриту або інших аутоїмунних захворювань, для яких характерна інфільтрація й концентрація В-клітин поряд з розвитком диференційованої лімфоїдної тканини.
У даному винаході також пропонуються моноклональні антитіла, гуманізовані антитіла і їх фрагменти, що зв'язують епітопи, в які вводиться мітка для наступного використання в 60 дослідницьких або діагностичних додатках. У деяких прикладах здійснення мітка є ко)
радіоактивною, також як мітка використовується флуорофор, хромофор, контрастний агент або іон металу.
Пропонується також спосіб діагностики, в якому зазначені мічені антитіла або їх зв'язуючі епітоп фрагменти вводяться пацієнтові, у якого підозрюється рак, артрит, аутоїмунне захворювання або інші пов'язані з СХСК5 хвороби, і вимірюється або відслідковується розподіл мітки в організмі пацієнта.
Антитіла або їх фрагменти, пропоновані в даному винаході, можуть використовуватися як агенти для афінного очищення. У цьому процесі антитіла іммобілізують на твердій фазі, наприклад смолі з декстраном або агарозою, або на фільтрувальному папері, за допомогою методів, відомих фахівцям в галузі. Іммобілізоване антитіло обробляється зразком, що містять
СХСР5 або несучі його клітини, які піддаються очищенню, після чого основу промивають придатним розчинником, який вилучить практично весь матеріал зі зразка, крім СХСК5 або клітин, які піддаються очищенню, оскільки вони пов'язані з іммобілізованим антитілом, яке становить інтерес згідно з даним винаходом. Нарешті, основу промивають іншим придатним розчинником, таким як гліциновий буфер, рН 5,0, який забезпечує вивільнення СХСК5 або клітин від зв'язку з розглянутим антитілом.
Для діагностичних додатків розглянуте антитіло, як правило, буде позначатися контрастною речовиною. Існує безліч різних міток, які, у цілому, можна згрупувати в наступні категорії: (а) радіоїзотопи, наприклад 365, 1405, 125), ЗН їі 71| (антитіло може позначатися радіоїзотопом на основі методик, наприклад методик, описаних у роботі Ситепі Ргоїосоїв5 іп Іттипоїіоду, мої. 12,
Соїїдеп еї аї., єд., УМіПеу-Іпіегосіепсе, Мем МогКк (1991), і радіоактивність може вимірюватися на основі сцинтиляційного рахунку); (б) флуоресцентні мітки, наприклад хелати рідкісноземельних металів (хелати європію), флуоресцеїн і його похідні, родамін і його похідні, дансил, лісамін, фікоеритрин і техаський червоний, флуоресцентні мітки можуть кон'югуватися з антитілом за допомогою методики, викладеної, наприклад, в Сигтепі Ргоїосої5 іп Іттипоїіоду, як згадувалося вище, причому флуоресценція може кількісно визначатися за допомогою флуориметра; і (в) доступні також мітки у вигляді субстратів різних ферментів (патент США Мо 4275149 містить огляд), причому фермент, як правило, каталізує хімічну трансформацію хромогенного субстрату, що може визначатися за допомогою різних методик, наприклад, фермент може
Зо каталізувати зміну кольору субстрату, що може реєструватися спектрофотометрично, або ж фермент може впливати на флуоресценцію або хемілюмінесценцію субстрату. Добре відомі методи кількісного визначення зміни флуоресценції, наприклад, за допомогою люмінометра, або ж реєстрації передачі енергії від мітки флуоресцентному акцептору. До прикладів ферментативних міток належать люциферази (наприклад люцифераза світлячка й бактеріальна люцифераза; о патент США Мо 4737456) люциферин, 2,3-дигідрофталазиндіони, малатдегідрогеназа, уреаза, пероксидаза, наприклад, пероксидаза, така як пероксидаза хрону (НКРО), лужна фосфатаза, Д-галактозидаза, глюкоамілаза, лізоцим, сахаридоксидази (наприклад глюкозоксидаза, галактозоксидаза Й глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа), гетероциклічні оксидази (наприклад уриказа й ксантиноксидаза), лактопероксидаза, мікропероксидаза та ін. Методики кон'югування ферментів з антитілами описані в О'5зиПмап еї а|., Мей Епаг, єд. І апдопе 5 Мап МипакКі5, Асадетіс Ргез5, Мем Мої, 7З (1981).
На випадок використання таких міток існують придатні субстрати, наприклад: (ї) для пероксидази хрону з перекисом водню як субстрату, причому перекис водню окиснить попередник барвника (наприклад, ортофенілендіамін (ОРБ) або 3,3,5,5- тетраметилбензидингідрохлорид (ТМВ)); (її) для лужної фосфатази (АР) як хромогенний субстрат виступає п-нітрофенілфосфат; і (ії) для В-Ю-галактозидази (8-О0-Саї) використовується хромогенний субстрат (наприклад, п-нітрофенил-В-О-галактоза) або флуорогенний субстрат, наприклад 4-метилумбеліферил-В-ЮО-галактозидаза.
Кваліфікованим фахівцям в галузі доступні й інші комбінації фермент-субстратів. Загальний огляд див. у патентах США Мо 4275149 і 4318980.
У деяких випадках мітка непрямим чином кон'югується з антитілом. Наприклад, антитіло може кон'югуватися з біотином, і кожний із зазначених вище репортерів може кон'югуватися з авідином або навпаки. Біотин селективно зв'язується з авідином, і в цих умовах мітка може опосередковано кон'югуватися з антитілом. В альтернативному варіанті для одержання непрямої кон'югації мітки антитіло зв'язується з невеликим гаптеном (наприклад, дигоксином), і один з різних видів міток або репортерів, зазначених вище, кон'югується з антитілом антидигоксину. Таким чином, використовуючи друге антитіло, можна провести непряму кон'югацію мітки з антитілом або мутеїном.
В іншому прикладі здійснення винаходу в антитіло необов'язково вводиться мітка, і її наявність може реєструватися за допомогою іншої форми другого антитіла-міченого антитіла, яке зв'язується з розглянутим антитілом.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть використовуватися в будь-якому відомому методі аналізу, наприклад аналізі конкурентного зв'язування, прямих і непрямих сандвіч-аналізах і аналізах імунопреципітації. 20оЇа, Мопосіопа! Апіїбодіе5: А Мапиаї ої Тесппіднез (СКС Ргез5, Іпс. 1987).
Аналіз конкурентного зв'язування спирається на здатність міченого стандарту конкурувати з випробовуваним зразком у процесі зв'язування з обмеженою кількістю антитіла. Кількість антигену у випробовуваному зразку зворотно пропорційна кількості стандарту, який зв'язується з антитілами. Щоб спростити визначення кількості стандарту, який виявляється зв'язаним, антитіла, як правило, до або після конкурентної взаємодії переводять у нерозчинну форму. У результаті стандартний і випробовуваний зразки, які пов'язані з антитілами, можуть без праці відділятися від стандарту й випробовуваного зразка, які залишаються незв'язаними.
Сндвіч-аналіз припускає використання двох антитіл, кожне з яких у стані зв'язуватися з різними імуногенними частинами, детермінантами або епітопами, мішені, яка детектується. У сандвіч-методі випробовуваний зразок, зв'язується з першим антитілом, прямо або побічно іммобілізованим на твердій основі, після чого друге антитіло, позначене прямим або непрямим чином, зв'язується із зафіксованим випробовуваним зразком, тим самим утворюючи нерозчинний тричастковий комплекс, див., наприклад, патент США Мо 4376110. Друге антитіло може бути саме по собі позначене реєстрованою міткою (прямій сандвіч-метод) або може детектуватися з використанням антиімуноглобулінового антитіла або іншого придатного компонента зв'язаної пари (наприклад, антитіло/антиген, рецептор/ліганд, фермент/субстрат), який позначений детектованою міткою (непрямий сандвіч-метод). Наприклад, одним з видів сандвіч-аналізу є метод ЕГІЗА, у цьому випадку як детектована мітка виступає фермент.
Для цілей імуногістохімії зразок клітин або тканин може бути свіжовиробленим або замороженим, або ж може бути внесений у парафін і фіксований консервантом, наприклад, формаліном.
Антитіла можуть також використовуватися в методах діагностики /л у/уо. Як правило, у
Ко) мутант антитіла вводиться радіонуклідна мітка (наприклад, "п, 99Тс, 110, 1911, ЗН, З2Р або 955), для того, щоб сайти, які експресують СХСК5, можна було б локалізувати з використанням імуносцинтиграфії.
В обсяг даного винаходу також входять набори, наприклад, що включають антитіла, їх фрагменти, гомологи, їх похідні та ін., такі як мічені або цитотоксичні кон'югати, а також інструкції із застосування антитіла, кон'югата для знищення певних видів клітин та ін. В інструкціях можуть знаходитися вказівки по використанню антитіла, кон'югату та ін. /л Уго, /п мімо або ех мімо. Антитіло може знаходитися в рідкій або твердій формі, як правило, ліофілізованій. Набір може містити інші придатні реагенти, наприклад буфер, відновлювальний розчин і інші необхідні інгредієнти для передбачуваного використання. Передбачається, що набір буде являти собою упаковану комбінацію реагентів у заздалегідь встановлених кількостях з інструкціями з їхнього застосування, наприклад, у лікувальних цілях для проведення діагностичних аналізів. Якщо в антитіло вводиться мітка, наприклад ферменту, набір може включати субстрати й кофактори, необхідні для ферменту (наприклад, попередник субстрату, який забезпечує утворення реєстрованого хромофору або флуорофору). Крім того, у набір можуть включатися інші добавки, наприклад стабілізатори, буфери (наприклад, блок-буфер або лізисний буфер) та ін. Відносні кількості різних реагентів можна міняти, для того, щоб у наборі були присутні концентрати розчинів реагентів, що забезпечує користувачеві гнучкість, економію місця, реагентів та ін. Реагенти можуть поставлятися у вигляді сухих порошків, звичайно ліофілізованих, разом з наповнювачами, які після розчинення утворюють розчин реагенту в належній концентрації.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути використані для лікування ссавців. В одному із прикладів здійснення антитіло або його еквівалент, що представляють інтерес, вводяться ссавцеві, крім людини, наприклад, з метою одержати доклінічні дані. До прикладів ссавців, крім людини, які можуть одержувати препарат, належать нелюдиноподібні примати, собаки, кішки, гризуни й інші ссавці, на яких проводяться доклінічні дослідження. Такими ссавцями можуть бути апробовані моделі тварин для тієї або іншої хвороби, яку передбачається лікувати за допомогою антитіла, або ж вони можуть використовуватися для вивчення токсичності розглянутого антитіла. У кожному з таких прикладів здійснення для ссавця можуть проводитися дослідження наростаючої дози.
Як лікарський препарат може використовуватися антитіло в присутності або за відсутності другого компонента, наприклад терапевтичної функції, кон'юЮгованої з ним, вводиться без добавок або в комбінації із цитотоксичним фактором (факторами). Даний винахід присвячений терапії антитілами, яка припускає введення антитіл згідно з даним винаходом тварині, ссавцеві або людині для лікування опосередкованих СХСК5 хвороб, порушень або патологічних станів.
Твариною або пацієнтом може бути ссавець, що потребує конкретного лікування, такий як ссавець із поставленим діагнозом конкретного порушення, наприклад, викликаного СХОК5.
Антитіла, спрямовані проти СХСК»5, придатні для використання, наприклад, для профілактики або лікування артриту, запальних захворювань у цілому, відторгнення трансплантату, раку й аутоїмунних розладів. Наприклад, за допомогою введення терапевтично прийнятної дози антитіла до СХСК5 згідно з даним винаходом або суміші різних антитіл згідно з даним винаходом, або їх еквівалентів, або в комбінації з іншими антитілами з різних джерел, у ссавця, що одержує лікування, особливо, людини, можна зм'якшити симптоми захворювання або запобігти їх прояву.
Лікувальні препарати згідно з даним винаходом включають, серед інших, антитіла згідно з даним винаходом (у тому числі їх фрагменти, аналоги, еквіваленти й похідні, як описано в даному документі), і нуклеїнові кислоти, що кодують антитіла згідно 3 даним винаходом, які описані в даному документі (у тому числі їх фрагменти, аналоги й похідні), а також антиідіотипічні антитіла, які описані в даному документі. Антитіла згідно з даним винаходом можуть використовуватися для лікування, придушення або профілактики захворювань, порушень або патологічних станів, пов'язаних з аберантною експресією й/або активністю
СХ, у тому числі, серед інших, якого-небудь одного або декількох захворювань, порушень або патологічних станів, які описані в даному документі. Лікування й/або профілактика захворювань, порушень або патологічних станів, пов'язаних з аберантною експресією й/або активністю СХСК»5, включає, серед інших, пом'якшення щонайменше одного симптому таких захворювань, порушень або патологічних станів. Антитіла згідно з даним винаходом можуть поставлятися у формі фармацевтично прийнятних складів, які відомі фахівцям в галузі або описані в даному документі. Термін «фізіологічно прийнятний», «фармацевтично прийнятний» та ін. означає затверджений розпорядчим органом федерального уряду або уряду штату або
Зо внесений у Фармакопею США або іншу загальноприйняту фармакопею для використання на тваринах і, особливо, на людині.
Антитіло до СХСН5 може вводитися ссавцеві будь-яким прийнятним способом. До методів введення, серед інших, належать парентеральний, підшкірний, внутрішньоочеревинний, внутрішньолегеневий, інтраназальний, епідуральний, інгаляція й оральні шляхи, а також, якщо це бажано у випадку імунодепресивного лікування, передбачається введення усередину враженої ділянки. Парентеральні вливання включають внутрішньом'язове, внутрішньошкірне, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне або внутрішньоочеревинне введення. Антитіла або склади можуть вводитися будь-яким придатним способом, наприклад вливанням або болюсною ін'єкцією, абсорбцією через епітеліальні або шкірно-слизові оболонки (наприклад, слизова ротової порожнини, слизова прямої кишки й кишечнику та ін.) і можуть вводитися разом з іншими біологічно-активними агентами. Введення може бути системним або локальним. Крім того, може бути бажано вводити терапевтичні антитіла або склади згідно з даним винаходом в центральну нервову системи будь-яким зручним методом, у тому числі за допомогою інтравентрикулярної ін'єкції й ін'єкції ов порожнину хребетного каналу; причому інтравентрикулярній ін'єкції може сприяти інтравентрикулярний катетер, наприклад, з'єднаний з резервуаром, наприклад з резервуаром Оммайа. Крім того, антитіло зручно вводити імпульсними вливаннями, особливо у випадку доз антитіла, що знижуються. Переважно, дозування проводиться ін'єкцією, переважно за допомогою внутрішньовенних або підшкірних ін'єкцій, частково залежно від того, чи носить введення короткочасний або тривалий характер.
Відомі інші різні системи доставки, і вони можуть використовуватися для введення антитіла згідно з даним винаходом, наприклад інкапсуляція в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули (див. І апдег, Зсіепсе 249:1527 (1990); Тгеаї еї а!., в Прозотез іп їпе Тегару ої ІпТесійои5 Оізеазе апа Сапсег; І оре;-Вегезівїп еї аї!., єд5., р. 353-365 (1989); і І оре7-Вегевівїп, там же, р. 317-327), а також рекомбінантні клітини, здатні експресувати сполуку, опосередкований рецепторами ендоцитоз (див., наприклад, УМи еї аї., У Віої Спет 262:4429 (1987)); конструювання нуклеїнової кислоти в рамках ретровірусного або іншого вектора та ін.
Активні інгредієнти можуть також захоплюватися у виготовлені мікрокапсули, наприклад, за допомогою методик коацервації або міжфазної полімеризації, наприклад мікрокапсули гідрокисметилцелюлози або желатину й мікрокапсули поліметилметакрилату, відповідно, у бо колоїдні системи доставки ліків (наприклад, ліпосоми, мікросфери альбуміну, мікроемульсії,
наночастинки й нанокапсули) або в макроемульсії. Такі методики описані в Кептіпдіоп'є
Ріпаптасеціїіса! бсіепсез, 161й єдйоп, А. Озаї, Ес. (1980).
Може також застосовуватися пульмональна доставка, наприклад, з використанням інгалятора або аерозольного апарата, а також складу, що містить агент для переведення в аерозоль. Антитіло також може вводитися в легені пацієнта у формі сухого порошкового складу, див., наприклад, патент США Мо 6514496.
В одному з конкретних прикладів здійснення може бути бажано вводити лікувальні антитіла або склади згідно з даним винаходом місцево, у зону, яка потребує лікування; цього можна домогтися різними методами, наприклад, серед інших, місцевим вливанням, топікальним застосуванням, за допомогою ін'єкції, катетера, за допомогою супозиторія або імпланта, причому зазначений імплант може мати пористий, непористий або желатиноподібний матеріал, у тому числі являти собою мембрану, наприклад силастикову мембрану або волокна.
Переважно при введенні антитіла згідно з даним винаходом намагатися використовувати матеріали, які не адсорбують і не абсорбують білок.
У ще одному прикладі здійснення антитіло може доставлятися в системі контрольованого вивільнення. В одному із прикладів здійснення може використовуватися насос (див. Іаподег,
Зсієпсе 249:1527 (1990); Зепоп, СВО Сіїї Неї Віотей Епа 14:201 (1987); Виспмаїа еї аї., Зигдегу 88:507 (1980); ї Зацаек еї аІ,, М ЕподіІ У Меа 321:574 (1989)). В іншому прикладі здійснення можуть застосовуватися полімерні матеріали (див. Меаіса! Арріїсайоп5 ої СопігоПей Кеїеазе,
І апдег єї аї., єд5., САС Ргевзв (1974); СопігоПей Огид Віоамайаріїйу, Огид Ргодисі Оезідп апа
Репоптапсе, Зтоїеп еї аї., едв., УМіІеу (1984); Наподег вї аї., У Масготої 5сі Вем Мастотої Спет 23:61 (1983); див. також І ему еї аї., Зсіепсе 228:190 (1985); Юигіпуд еї аЇ., Апп Меигої 25:351 (1989); і Ноулага еї аї., ) Меигозигуд 71:105 (1989)). У ще одному прикладі здійснення система контрольованого вивільнення може розміщатися в безпосередній близькості від терапевтичної мішені.
Лікувальні препарати поліпептиду або антитіла можуть готуватися для зберігання у формі ліофілізованих складів або водних розчинів за допомогою змішування поліпептиду бажаного ступеня чистоти з можливими «фармацевтично прийнятними» носіями, розчинниками, наповнювачами або стабілізаторами, які звичайно використовуються в галузі, наприклад
Зо буферними реагентами, стабілізуючими реагентами, консервантами, ізотоніфікаторами, неїоногенними детергентами, антиоксидантами й іншими різноманітними добавками, див.
Кетіпдіоп'є РІагтасеціїса! Зсіепсеб5, 161й ей., О50ї, ей. (1980). Такі добавки, як правило, нетоксичні для організму реципієнтів у застосовуваних дозах і концентраціях, а отже, наповнювачі, розріджувачі, носії та ін. є фармацевтично прийнятними. «Виділене» або «очищене» антитіло не містить істотної кількості клітинного матеріалу або інших забруднюючих білків із клітинного або тканинного джерела, або середовища, з якого одержаний білок, або не містять істотної кількості хімічних попередників або інших хімічних речовин при одержанні шляхом хімічного синтезу. Вираз «не містять істотної кількості клітинного матеріалу» включає препарати антитіла, в яких даний поліпептид/білок відділений від клітинних компонентів клітин, з яких він виділений або одержаний при рекомбінації. Таким чином, антитіло, що не містить істотної кількості клітинного матеріалу, включає препарати антитіла, що містять менше ніж приблизно 30 95, 20 95, 10 95, 5 95, 2,5 Ую або 1 95 (сухої ваги) забруднюючого білка. У тому випадку, коли антитіло одержане за допомогою рекомбінантних методик, також переважно, щоб воно не містило істотної кількості культурального середовища, тобто якщо культуральне середовище становить менше ніж приблизно 20 95, 10 95, 5 95, 2,5 95 або 1 95 від об'єму препарату білка. У тому випадку, коли антитіло одержують хімічним синтезом, переважно, щоб воно не містило істотної кількості хімічних попередників або інших хімічних речовин і реагентів, тобто щоб розглянуте антитіло було відділено від хімічних попередників або інших хімічних речовин, використаних у синтезі білка. Відповідно, такі препарати антитіла містять менше ніж приблизно 30 95, 20 95, 10 95, 5 95 або 1 95 (сухої ваги) хімічних попередників або хімічних речовин, відмінних від розглянутого антитіла. У переважному прикладі здійснення даного винаходу проводиться виділення або очищення антитіл.
Наведений в даному документі вираз «від низьких до невизначуваних рівнів агрегування» стосується зразків, що містять не більше 5 95, не більше 4 95, не більше З 95, не більше 2 95, не більше 1 95 і часто не більше 0,5 95 агрегатів по вазі білка, що визначається, наприклад, високоефективною гель-проникаючою хроматографією (ВЕГПХ).
Використовуваний у даному документі термін «від низьких до невизначуваних рівнів фрагментації» стосується зразків, що містять не менше 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 98 95 або 99 95, сумарного білка, наприклад, в одному піку, що визначається ВЕГПХ, або в 2 (двох) піках (важкий 60 ланцюг і легкий ланцюг), що визначаються, наприклад, за допомогою відновного капілярного гель-електрофорезу (ГОСЕ) і не місять інших одиничних сигналів з більше 5 95, більше 4 95, більше 3 95, більше 2 95, більше 1 95 або більше 0,5 95 сумарного білка кожний.
Використовуваний у даному документі термін ГСОЕ стосується капілярного гель-електрофорезу в умовах відновлення, достатніх для відновлення дисульфідних зв'язків в антитілі або молекулі типу антитіла, або похідній молекулі.
Використовувані в даному документі терміни «стабільність» і «стабільний» у контексті рідкого препарату, що містить антитіло СХСК5 або його з'єднувальний фрагмент, належать до стійкості антитіла або його антигензв'язувального фрагмента в препараті до термічного або хімічного розгортання, агрегації, деградації або фрагментації в конкретних умовах виробництва, одержання, транспортування й зберігання. «Стабільні» препарати згідно з даним винаходом зберігають біологічну активність не менше ніж на 80 905, 85 95, 90 95, 95 95, 98 95, 99 95 або 99,5 905 в конкретних умовах виробництва, одержання, транспортування й зберігання. Стабільність зазначеного препарату антитіла може оцінюватися по ступеню агрегації, деградації або фрагментації із застосуванням методів, відомих кваліфікованим фахівцям в галузі, у тому числі, серед інших, ГСОЕ, гель-електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (505-РАСЕ) і ВЕГПХ, у порівнянні зі стандартом.
Термін «носій» стосується розріджувача, ад'юванту, наповнювача або носія, з яким вводиться лікарський препарат. Такими фізіологічними носіями можуть бути стерильні рідини, наприклад вода й масла, у тому числі нафтового, тваринного, рослинного або синтетичного походження, наприклад, арахісова олія, соєва олія, мінеральне масло, кунжутна олія й подібні до них масла. При внутрішньовенному введенні лікарського препарату придатним носієм є вода. Фізіологічні розчини й водні розчини одекстрози й гліцерину також можуть використовуватися як рідкі носії особливо для ін'єкційних розчинів. До придатних фармацевтичних наповнювачів належать крохмаль, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, борошно, крейда, силікагель, стеарат натрію, гліцеринмоностеарат, тальк, хлорид натрію, сухе зняте молоко, гліцерин, пропіленгліколь, вода, етанол і подібні до них речовини.
Якщо бажано, склад може також містити невеликі кількості змочувальних речовин або емульгаторів, або буферних речовин для підтримки рН. Такі препарати можуть мати форму розчинів, суспензій, емульсій, таблеток, пігулок, капсул, порошків, препаратів з уповільненим вивільненням, депо і до них подібних. Склад може мати форму супозиторія зі стандартними сполучними й носіями, наприклад тригліцеридами. Препарати для перорального застосування можуть включати стандартні носії, такі як належні до фармацевтичної категорії манітол, лактоза, крохмаль, стеарат магнію, сахарин натрію, целюлоза, карбонат магнію та ін. Приклади придатних носіїв описані в "Кетіпдіоп'є Рпагтасецііса! Зсіепсе5," Мапйіп. Такі склади будуть містити ефективну кількість антитіла, переважно в очищеній формі, поряд з відповідною кількістю носія, для того, щоб забезпечити форму для належного введення пацієнтові. Як відомо фахівцям в галузі, склад буде створюватися таким чином, щоб відповідати способу введення.
Буферні реагенти допомагають підтримувати рН в інтервалі, який наближається до фізіологічних умов. Буфери переважно присутні в концентраціях в інтервалі від приблизно 2 мМ до приблизно 50 мМ. У якості придатних буферних реагентів згідно з даним винаходом можуть використовуватися як органічні, так і неорганічні кислоти і їх солі, наприклад цитратні буфери (наприклад, суміш мононатрію цитрат-динатрію цитрат, суміш лимонна кислота-тринатрію цитрат, суміш лимонна кислота-мононатрію цитрат та ін.), сукцинатні буфери (наприклад, суміш бурштинова кислота-мононатрію сукцинат, суміш бурштинова кислота-гідроксид натрію, суміш бурштинова кислота-динатрію сукцинат та ін.), тартратні буфери (наприклад, суміш винна кислота-натрію тартрат, винна кислота-калію тартрат, суміш винна кислота-гідроксид натрію та ін.), фумаратні буфери (наприклад, суміш фумарова кислота-мононатрію фумарат, суміш фумарова кислота-динатрію фумарат, суміш мононатрію фумарат-динатрію фумарат та ін.), глюконатні буфери (наприклад, суміш глюконова кислота-глюконат натрію, суміш глюконова кислота-гідроксид натрію, суміш глюконова кислота-глюконат калію та ін.), оксалатні буфери (наприклад, суміш щавлева кислота-оксалат натрію, суміш щавлева кислота-гідроксид натрію, суміш щавлева кислота-оксалат калію та ін.), лактатні буфери (наприклад, суміш молочна кислота-лактат натрію, суміш молочна кислота-гідроксид натрію, суміш молочна кислота-лактат калію та ін.) і ацетатні буфери (наприклад, суміш оцтова кислота-ацетат натрію, суміш оцтова кислота-гідроксид натрію та ін.). Можуть застосовуватися фосфатні буфери, карбонатні буфери, гістидинові буфери, солі триметиламіну, наприклад, Тгі5, НЕРЕ5, а також інші подібні до них відомі буфери.
Для вповільнення росту мікроорганізмів можуть додаватися консерванти, які можна бо використовувати в кількостях в інтервалі 0,2 95 - 1 95 (вага/об.). До консервантів, придатних для використання в даному винаході, належать фенол, бензиловий спирт, м-крезол, метилпарабен, пропілларабен, октадецилдиметилбензиламонійхлорид, галоїди бензалконію (наприклад хлорид, бромід і йодид), гексаметонійхлорид, алкілларабени, наприклад метил- або пропілпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол і З-пентанол.
Ізотоніфікатори вводяться, для того, щоб забезпечити фізіологічну ізотонічність рідких препаратів згідно з даним винаходом, до таких належать багатоатомні цукрові спирти, переважно, триатомні й більш високі цукрові спирти, наприклад гліцерин, еритритол, арабітол, ксилітол, сорбітол і манітол. Багатоатомні спирти можуть бути присутніми у кількостях від приблизно 0,1 95 до приблизно 25 9б, по вазі, переважно від 1 95 до 5 95 з урахуванням відносних кількостей інших інгредієнтів.
Стабілізаторами називають широку категорію наповнювачів, функції яких міняються від об'ємоутворюючих речовин до добавок, солюбілізуючих лікарський препарат або сприяючих попередженню денатурації або адгезії до стінок ємності. Як характерні стабілізатори можуть виступати багатоатомні цукрові спирти; амінокислоти, наприклад аргінін, лізин, гліцин, глутамін, аспарагін, гістидін, аланін, орнітин, І -лейцин, 2-фенілаланін, глутамінова кислота, треонін та ін., органічні цукри або цукрові спирти, наприклад лактоза, трегалоза, стахіоза, арабітол, еритритол, манітол, сорбітол, ксилітол, рибітол, міоінозитол, галактитол, гліцерин і до них подібні, у тому числі циклітоли, наприклад інозитол; полієтиленгліколь; полімери амінокислот; сірковмісні відновники, наприклад сечовина, глутатіон, ліпоєва кислота, тіогліколят натрію, тіогліцерин, а-монотіогліцерин і тіосульфат натрію; поліпептиди з низькою молекулярною вагою (тобто «10 залишків); білки, наприклад альбумін сироватки людини, альбумін бичачої сироватки, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, наприклад полівінілпіролідон, сахариди, моносахариди, наприклад ксилоза, маноза, фруктоза, глюкоза; дисахариди, наприклад лактоза, мальтоза й сахароза; трисахариди, наприклад рафіноза; полісахариди, наприклад декстран та ін. Стабілізатори присутні в інтервалі від 0,1 до 10000 вага/вага на одну частину активного білка.
До додаткових різних наповнювачів належать об'ємоутворювальні агенти (наприклад, крохмаль), хелатуючі агенти (наприклад, ЕЮТА), антиоксиданти (наприклад, аскорбінова кислота, метіонін або вітамін Е) і допоміжні розчинники.
Наведені в даному документі склади також можуть містити більше одного активного компонента, якщо необхідно для індивідуальних показань при лікуванні, переважно компоненти, що мають взаємодоповнюючу активність, які не виявляють несприятливого впливу один на одного. Наприклад, може бути бажано додатково ввести імунодепресант. Подібні молекули належним чином присутні в складі в кількостях, які ефективні для передбачуваної мети.
Використовуваний у даному документі термін «поверхнево-активні речовини» стосується органічних сполук, що мають амфіпатичну структуру, а саме, що складаються із груп із протилежними характеристиками розчинності, як правило, з жиророзчинного вуглеводневого ланцюжка й водорозчинної іонної групи. Залежно від заряду поверхнево-активної групи поверхнево-активні речовини можуть підрозділятися на аніонні, катіонні й неїіоногенні.
Поверхнево-активні речовини часто застосовуються як змочувальні, емульгуючі, солюбілізуючі й диспергуючі агенти для різних лікарських складів і препаратів біологічних матеріалів.
Неіоногенні поверхнево-активні речовини або детергенти (також відомі як «змочувальні речовини») можуть додаватися для того, щоб сприяти солюбілізації лікарського засобу, а також щоб захистити лікарський білок від викликаного струшуванням агрегування, що також дозволяє піддавати склад впливу поверхневого зрушення, не викликаючи денатурації білка. До придатних неіоногенних поверхнево-активних речовин належать полісорбати (20, 80 та ін.), поліоксамери (184, 188 та ін.), поліоли Ріпгопіст і моноефіри поліоксіетиленсорбітану (ТМЛЕЕМ-209), ТММЕЕМ- 8ОФ та ін.). Неіоногенні поверхнево-активні речовини можуть бути присутніми у кількостях в інтервалі від приблизно 0,05 мг/мл до приблизно 1,0 мг/мл, переважно від приблизно 0,07 мг/мл
БО до приблизно 0,2 мг/мл.
Використовуваний у даному документі термін «неорганічна сіль» стосується будь-якої сполуки, що не містить вуглецю, яка утворюється в результаті заміни частини або всіх кислих воднів або кислоти металом або групою, що виступає в якості металу, і часто використовуваному в якості речовини для коректування тонічності в лікарських складах і препаратах з біологічних матеріалів. Найпоширенішими неорганічними солями є Масі, Косі,
МангРох та ін.
У даному винаході пропонуються рідкі склади анти-СХСК5-зв'язувальної речовини або її фрагмента, що має рН у діапазоні від приблизно 5,0 до приблизно 7,0, або від приблизно 5,5 до 6,5, або від приблизно 5,8 до приблизно 6,2, або приблизно 6,0.
Даний винахід включає рідкі склади, що мають стабільність при температурах, характерних для комерційних холодильників і морозильників, які використовуються в кабінетах лікаря або лабораторіях, наприклад, від приблизно -20 "С до приблизно 5 "С, причому зазначена стабільність оцінюється, наприклад, високоефективною гель-проникаючою хроматографією (ВЕГПХ), для цілей зберігання, наприклад, протягом приблизно 60 днів, приблизно 120 днів, приблизно 180 днів, приблизно року, приблизно 2 років або більше. Рідкі склади згідно з даним винаходом також проявляють стабільність, яка оцінюється, наприклад, за допомогою ВЕГПХ, при кімнатних температурах щонайменше за декілька годин, наприклад однієї години, двох годин або приблизно трьох годин, до застосування.
В обсяг терміна «мала молекула» і аналогічних термінів, серед інших, входять пептиди, пептидоміметики, амінокислоти, аналоги амінокислот, полінуклеотиди, аналоги полінуклеотидів, нуклеотиди, аналоги нуклеотидів, органічні або неорганічні сполуки (наприклад, у тому числі гетероорганічні й/або металоорганічні сполуки), що мають молекулярну вагу менше ніж приблизно 10000 грам на моль, органічні або неорганічні сполуки, що мають молекулярну вагу менше ніж приблизно 5000 грам на моль, органічні або неорганічні сполуки, що мають молекулярну вагу менше ніж приблизно 1000 грам на моль, органічні або неорганічні сполуки, що мають молекулярну вагу менше ніж приблизно 500 грам на моль, а також солі, ефіри й інші фармацевтичні прийнятні форми таких сполук.
Тому, наприклад, у випадку раку антитіла згідно з даним винаходом можуть вводитися окремо або в комбінації з іншими препаратами для лікування раку, включаючи стандартні хіміотерапевтичні ліки (паклітаксель, карбоплатин, цисплатин і доксорубіцин), анти-ЕСЕК агенти (гефитиніб, ерлотиніб і цетуксимаб), антиангіогенні агенти (бевакузимаб і сунітиніб), а також імуномодулятори, наприклад інтерферон а і талідомід.
В іншому прикладі здійснення, у випадку ревматичних захворювань, наприклад ревматоїдного артриту (РА), може використовуватися комбінаційна терапія, що включає СХСЕ- зв'язувальну молекулу, що представляє інтерес. Наприклад, гуманізовані антитіла СХОК5 можна змішувати з малою молекулою наприклад, антиревматичним препаратом, що модифікує, у тому числі, серед інших, наприклад метотрексатом і інгібіторами синтезу піридину, наприклад лефлуномідом (Мадег 5 Кеузіопе, У Кпешт 34 Зирр (16-24) 2007, Само єї аІ., Ат у) Неайй бузі
Зо Рпагт 63:2451-2465, 2006).
Оскільки різні форми СХОСК5-зв'язувальної молекули, що представляє інтерес, можуть і не приводити до виснаження В-клітин, розглянуту молекулу можна поєднувати з іншими ліками, що демонструють механізми дії, що перекриваються, щоб домогтися адитивного або синергічного результату. Тому, наприклад, другими ліками можуть бути ліки, що діють на рівні цитокіну в напрямку Т-клітин і пр.
Використовувані в даному винаході визначення «терапевтичний агент» і «терапевтичні агенти» належать до будь-якого агента (агентів), які можуть використовуватися при лікуванні, контролі й пом'якшенні захворювань, порушень, розладів та ін., пов'язаних з аберантними метаболізмом і активністю СХСЕ5 і/або СХСІ 13. Проявами цього можуть бути аномальні рівні
В-клітин або активність В-клітин. Сюди також входять відомі сполуки з фармакологічним ефектом при лікуванні порушень та ін., які пов'язані з аберантними метаболізмом і активністю
СХеН5 і/або СХСІ 13.
Крім того, антитіла згідно з даним винаходом можуть кон'югуватися з різними ефекторними молекулами, наприклад гетерологічними поліпептидами, ліками, радіонуклеотидами або токсинами, див., наприклад, УМО 92/08495; УМО 91/14438; МО 89/12624; патент США Мо 5314995; і ЕРО 396387. Антитіло або його фрагмент можуть кон'югуватися з терапевтичним агентом, наприклад цитотоксином (наприклад цитостатичним або цитопатичним агентом), терапевтичним агентом або іоном радіоактивного металу (наприклад а-активним ізотопом, таким як 2ЗВі). До цитотоксинів або цитотоксичних агентів належать будь-які речовини, які впливають на клітини. До прикладів належать паклітаксол, цитохалазин В, граміцидин 0, етидий бромід, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин ОО, 1- дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин, а також їх аналоги або гомологи. До терапевтичних агентів, серед інших, належать антиметаболіти (наприклад, метотрексат, б-меркаптопурин, б-тіогуанін, цитарабін, 5- фторурацил і декарбазин), алкілуючі агенти (наприклад, мехлоретамін, хлорамбуцил, мельфалан, кармустин (В5М) і ломустин (ССМО), циклофосфамід, бусульфан, дибромманітол, стрептозотоцин, мітоміцин С і цис-дихлородіамінплатина (ІІ) (ОР) цисплатин), антрацикліни (наприклад, даунорубіцин, дауноміцин і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин,
актиноміцин, блеоміцин, мітраміцин і антраміцин (АМС)) а також антимітотичні агенти (наприклад, вінкристин і вінбластин).
Методики кон'югації такої терапевтичної функції з антитілами добре відомі, див., наприклад,
Атоп еї а!., в Мопосіопа! Апібодієз апа Сапсег Пнегару, Неївтеєїа еї аї. (еав5.), р. 243-56 АїІап НВ.
ЇГ із (1985); Неїївігот еї аї., в СопігоПейа Огид Оеїїмегу, 2па ей., Кобіпзоп еї аї., еа5., р. 623-53,
Магсе! ОекКег (1987); Тпогре, в Мопосіопа! Апііродіеє5 "84: Віоіодіса! Апа Сіїпіса! Арріїсайіоп5,
РіпснНега еї аї., єдв., р. 475-506 (1985); Мопосіопа! Апіїбодієз Рог Сапсег Оеєїесіюп апа ТПегару,
Ваїдмі/іп еї аї!., еадв., р. 303-16, Асадетіс Ргез5 (1985); і Тпогре, сеї аї., Іттипої Кем 62:119 (1982).
Як альтернатива антитіло можна кон'югувати із другим антитілом з утворенням гетерокон'югату антитіла, наприклад біфункціонального антитіла, див., наприклад, патент США Мо 4676980.
Кон'югати згідно з даним винаходом можуть використовуватися для модифікації заданої біологічної відповіді, терапевтичний агент або лікарський препарат не повинні розглядатися, як такі, що обмежуються класичними хімічними терапевтичними агентами. Наприклад, у якості лікарської функції може виступати білок або поліпептид, що має бажану біологічну активність.
До таких білків можуть, наприклад, належати токсин, такий як абрин, рицин А, екзотоксин псевдомонад або дифтеричний токсин; білок, наприклад фактор некрозу пухлини, а- інтерферон, В-інтерферон, фактор росту нервів, тромбоцитарний фактор росту, активатор тканинного плазміногена, агент апоптозу, наприклад ТМЕ-а, ТМЕ-В, АЇМ І (МО 97/33899), АЇМ 1 (МО 97/34911), ліганд Раз (ТаКапабзпі еї аї., Іпї Іттипої, 6:1567 (1994)), МЕСЕ (МО 99/23105); тромботичний агент; антиангіогенний агент, наприклад ангіостатин або ендостатин; або модифікатори біологічної відповіді, наприклад лімфокіни, інтерлейкін-1 (ІІ -1), інтерлейкін-2 (ПІІ - 2), інтерлейкін-б (1-6), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (СМ-
С5Е), гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (СС5БЕ) або інші фактори росту.
Препарати для введення /л у//о повинні бути стерильними. Цього можна досягти, наприклад, фільтрацією через стерильні фільтрувальні мембрани. Наприклад, рідкі препарати згідно з даним винаходом можуть стерилізуватися фільтрацією через фільтр 0,2 мкм або 0,22
МКМ.
Можуть готуватися препарати з уповільненим вивільненням. До характерних прикладів препаратів з уповільненим вивільненням належать напівпроникні матриці твердих гідрофобних
Зо полімерів, що містять антитіло, ці матриці являють собою формовані вироби, наприклад плівки або матриці. Приклад матриць з уповільненим вивільненням включає поліефіри, гідрогелі (наприклад полі(2-гідроксіетилметакрилат), полівініловий спирт)), полілактиди (патент США Мо 3773919), співполімер І-глутамінової кислот й етил-1-глутамату, нерозкладаний етиленвінілацетат, розкладані співполімери молочної кислоти-гліколевої кислоти (наприклад, ін'єкційні мікросфери, що складаються зі співполімеру молочної кислоти-гліколевої кислоти) і полі-О-(-)-3-гідроксимасляна кислота. Такі полімери, як етиленвінілацетат і молочна кислота- гликолева кислота, забезпечують вивільнення молекул протягом більше 100 днів, тоді як деякі гідрогелі вивільняють білки протягом більш короткого часу. Можна виробити раціональні стратегії для стабілізації залежно від механізмів реакцій. Наприклад, якщо встановлено, що механізм агрегування пов'язаний з утворенням міжмолекулярного зв'язку 5-5 за рахунок тіодисульфідного обміну, стабілізація може досягатися за рахунок модифікації сульфгідрильних залишків, ліофілізації з кислих розчинів, контролю вмісту вологи, використання необхідних добавок, заміни амінокислот і розробки спеціальних складів полімерних матриць.
Склад, що містить антитіло або його варіант, буде формулюватися, дозуватися і вводитися таким способом, який буде відповідати принципам належної медичної практики. У цьому плані до розглянутих факторів належать конкретне порушення, що підлягає лікуванню, конкретний ссавець, що одержує лікування, клінічний стан конкретного пацієнта, причина захворювання, зона доставки агента, метод введення, схема введення й інші фактори, відомі медичним працівникам. «Терапевтична ефективна кількість» антитіла або варіанта, яка буде при цьому вводитися, визначається наведеними вище міркуваннями, і може являти собою мінімальну кількість, необхідну для профілактики, придушення або лікування захворювання, патологічного стану або порушення, викликаного СХСК5.
Антитіло або його варіант, можливо, включається до складу разом з одним або декількома агентами, використовуваними в цей час для профілактики або лікування розглянутого захворювання. Ефективна кількість таких інших агентів залежить від кількості антитіла, що присутнє в складі, виду розладу або лікування й інших факторів, що обговорювалися вище.
Вони, як правило, використовуються в тих же дозуваннях і з тими ж методами введення, які застосовувалися в описаному вище тексті або ж становлять приблизно від 1 до 99 95 від дозувань, що застосовувалися дотепер.
Використаний у даному документі термін «ефективна кількість» стосується кількості ліків (наприклад, профілактичного або терапевтичного агента), достатнього для зменшення гостроти й/"або тривалості захворювання, викликаного СХСК5, полегшення одного або декількох його симптомів, попередження розвитку захворювання, викликаного СХСК5, або початку регресії захворювання, викликаного СХСМ5, або достатній для попередження розвитку, рецидивів, початку або прогресу захворювання, викликаного СХСК5, або одного або декількох його симптомів, або посилення або поліпшення профілактичного й/або терапевтичного ефекту (ефектів) інших ліків (наприклад, іншого терапевтичного агента), застосовуваного для лікування захворювання, викликаного СХСК5. Наприклад, розглянуте лікування може знизити підвищений рівень В-клітин у порівнянні з вихідним або нормальним рівнем щонайменше на 5 95, переважно щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 9565, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або щонайменше на 100 95. В іншому прикладі здійснення ефективна кількість лікарського або профілактичного препарату полегшує симптоми захворювання, викликаного СХСК5, наприклад, артриту або відторгнення трансплантату, щонайменше на 5 95, переважно щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 956, щонайменше на 35 95, щонайменше на 40 20 до, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 95, щонайменше на 70 9565, щонайменше на 75 956, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або щонайменше на 100 95.
Крім того, як еквівалент в даному документі використовується термін «терапевтично ефективна кількість».
Кількість лікарського поліпептиду, антитіла або його фрагмента, яка буде ефективною при використанні або лікуванні конкретного захворювання або стану, буде залежати від природи розладу або стану й може визначатися стандартними клінічними методиками. По можливості, спочатку /л мійгто можна одержати криву доза-ефект і лікарські препарати згідно з даним винаходом. При наявності зручної моделі тварин можна знову досліджувати криву доза-ефект, і
Зо використовувати її для екстраполяції придатної дози для людини, спираючись на практичні методи, відомі фахівцям в галузі. Разом з тим, виходячи із загальних знань в галузі, лікарський препарат, що ефективно стимулює зниження запального ефекту, наприклад, може забезпечувати локальні концентрації лікарського засобу між 5 і 20 нг/мл, і, переважно, між приблизно 10 і 20 нг/мл. У додатковому специфічному прикладі здійснення винаходу лікарський препарат, що ефективно поліпшує ріст і виживаність клітин, відповідальних за аутоїмунні прояви або відторгнення трансплантату, залежні від В-клітин, може забезпечувати локальні концентрації лікарського препарату в межах від приблизно 10 нг/мл до приблизно 100 нг/мл.
У переважному прикладі здійснення водний розчин лікарського поліпептиду, антитіла або його фрагмента може вводитися за допомогою підшкірної ін'єкції. Кожна доза може мінятися від приблизно 0,5 мг до приблизно 50 мг на кілограм ваги тіла, або, більш переважно, від приблизно З мг до приблизно 30 мг на кілограм ваги тіла. Дозування можна встановити емпірично для конкретного захворювання, групи пацієнтів, способу введення та ін. з використанням фармацевтичних методів, відомих фахівцям в галузі.
Схема дозування для підшкірного введення може мінятися від разу на тиждень до щоденної, залежно від набору клінічних факторів, включаючи характер захворювання, міру гостроти хвороби й чутливості пацієнта до терапевтичного агента.
У даному винаході пропонуються способи виготовлення рідких препаратів антитіла або його
СХСР5-зв'язувального фрагмента, причому зазначені способи включають концентрування фракції очищеного антитіла до кінцевої концентрації приблизно 15 мг/мл, приблизно 20 мг/мл, приблизно 30 мг/мл, приблизно 40 мг/мл, приблизно 50 мг/мл, приблизно 60 мг/мл, приблизно 70 мг/мл, приблизно 80 мг/мл, приблизно 90 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 200 мг/мл, приблизно 250 мг/мл, приблизно 300 мг/мл або більше, з використанням, наприклад, напівпроникної мембрани з відповідним відсіканням молекулярної ваги (мВ) (наприклад, відсіканням 30 кО для його Е(агж» фрагментів; і відсіканням 10 кО для Раь Фрагментів) і додатковим діафільтруванням концентрованої фракції антитіл у препаративний буфер з використанням тієї ж мембрани.
Крім того, даний винахід включає стабільні, наприклад, стабільні по кО, рідкі препарати розглянутої продукції, які поліпшували напіввиведення /л у/мо. Так, період напіввиведення розглянутого антитіла з організму, переважно людини, більше З днів, більше 7 днів, більше 10 днів, більше 15 днів, більше 25 днів, більше 30 днів, більше 35 днів, більше 40 днів, більше 45 днів, більше 2 місяців, більше З місяців, більше 4 місяців, більше 5 місяців або більше.
Для збільшення тривалості циркуляції антитіла в сироватці /7 умо можуть використовуватися різні методики. Наприклад, інертні полімерні молекули, такі як поліеєтиленгліколь (РЕС) з високою молекулярною вагою, можуть зв'язуватися з антитілом через багатофункціональний лінкер або без нього, або за допомогою сайт-специфічної кон'югації РЕО з М-термінальним або з С-термінальним закінченням антитіла, або через є-аміногрупи, що присутні в лізинових залишках. Можуть використовуватися лінійні або розгалужені похідні полімеру, які приводять до мінімальної втрати біологічної активності. Ступінь кон'югації можна чітко відслідковувати по 505-РАСЕ і за допомогою мас-спектрометрії, щоб забезпечити належну кон'югацію молекул РЕСб з антитілами. РЕСб, що не прореагував, можна відокремлювати від кон'югатів антитіло-«ТЕсС за допомогою гель-фільтрації або іонобмінної хроматографії. Модифіковані РЕС антитіла можуть також випробовуватися на предмет активності зв'язування, а також ефективності /л м/мо, для чого можуть використовуватися методи, відомі фахівцям в галузі, наприклад, описані в даному документі методи імуноаналізу.
Антитіло, що має підвищений рівень напіввиведення /л7 у/моО, може також виходити за допомогою проведення однієї або декількох модифікацій амінокислот (наприклад, замін, вставок або делецій) у константний домен Ідс, або його ЕРеі-зв'язувальний фрагмент (наприклад
Ее або фрагмент шарнірної області домену Ре), див., наприклад, УМО 98/23289; УМО 97/34631; і патент США Мо 6277375.
Крім того, антитіло можна кон'югувати із альбуміном з утворенням антитіла, більш стабільного /п умо або, що має більш тривалий періодом напіввиведення /л у//о. Методики добре відомі фахівцям в галузі, див., наприклад, МО 93/15199, МО 93/15200 ї УМО 01/77137; а також ЕРО 413622. Антитіло можна також модифікувати, наприклад за допомогою глікозилування, ацетилування, фосфорилування, амідування, введення відомих захисних/блокувальних груп, протеолітичного розщеплення, зв'язування із клітинним лігандом або іншим білком та ін.
В одному із прикладів здійснення склад препарату визначається згідно з стандартними процедурами для лікарських препаратів, виготовлених для внутрішньовенного введення в
Зо організм людини. Як правило, склади для внутрішньовенного введення являють собою розчини в стерильному ізотонічному водному буфері. У необхідних випадках склад може також включати солюбілізуючий агент і місцевий анестетик, наприклад лідокаїн або інший «каіновий» анестетик, для зменшення болі в місці введення. Звичайно інгредієнти поставляються або окремо, або змішуються в дозованій лікарській формі, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку, або безводного концентрату в герметичному контейнері, наприклад в ампулі або в пакеті із вказівкою кількості активного агента. У випадках, коли склад повинен вводитися за допомогою вливання, він може поставлятися із флаконом для вливання, що містить стерильну воду або фізіологічний розчин фармацевтичної категорії чистоти. Якщо склад вводиться за допомогою ін'єкції може поставлятися ампула зі стерильною водою або фізіологічним розчином для ін'єкції, наприклад у наборі, так що інгредієнти можуть змішуватися перед введенням.
У винаході також передбачається, що рідкий препарат згідно з даним винаходом вміщується в герметичний контейнер, наприклад ампулу або пакет із вказівкою кількості продукту, що розглядається. Рідкі препарати згідно з даним винаходом можуть перебувати в герметичному контейнері із вказівкою кількості й концентрації антитіла або фрагмента антитіла. Рідкі препарати згідно з даним винаходом можуть поставлятися в герметичному контейнері, що містить щонайменше 15 мг/мл, 20 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл або 300 мг/мл антитіла СХСЕ5, наприклад, в об'ємі, рівному 1 мл, 2 мл, З мл, 4 мл, 5 мл, 6 мл, 7 мл, 8 мл, 9 мл, 10 мл, 15 мл або 20 мл.
Випускається виріб, до складу якого входять засоби для лікування описаних вище розладів.
Виріб являє собою контейнер і етикетку. До придатних контейнерів належать, наприклад, пляшки, флакони, шприци й пробірки. Контейнери можуть виготовлятися із самих різних матеріалів, наприклад, скла або пластика. Контейнер містить склад, який придатний для діагностики, профілактики або лікування патологічного стану або захворювання, викликаного
СХСК5, і може мати стерильний отвір для відбору (наприклад, у якості контейнера може використовуватися мішок з розчином для внутрішньовенного введення або флакон із пробкою, яку можна проколювати голкою для підшкірної ін'єкції). На етикетці, яка знаходиться на контейнері або додається до нього, вказується, що склад використовується для лікування певного захворювання. Виріб також може включати другий контейнер, що містить бо фармацевтично прийнятний буфер, наприклад фосфатно-буферний фізіологічний розчин,
розчин Рінгера й розчин декстрози. Виріб також може включати інші матеріали, бажані з погляду комерційних додатків і користувача, включаючи буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприци й вкладиші з інструкцією із застосування.
В іншому аспекті даного винаходу нуклеїнові кислоти, що включають послідовності, які кодують антитіла або їх функціональні похідні, застосовуються для лікування, придушення або профілактики захворювання або розладу, пов'язаного з аберантною експресією й/або активністю СХСК5, за допомогою генної терапії. Генною терапією називають терапію, яка проводиться за допомогою введення пацієнтові експресованої нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес. У цьому прикладі здійснення даного винаходу нуклеїнові кислоти продукують кодований білок у виступаючих в якості мішеней клітинах-реципієнтах, які опосередковують терапевтичний вплив і такими клітинами. Відповідно до даного винаходу можуть використовуватися будь-які доступні методи генної терапії.
Загальний огляд методів генної терапії можна знайти в соїазрієї! еї аї., Сііпіса! Рвапгтасу 12:488 (1993); Ми еї аї!., Віоїйегару 3:87 (1991); Тоівю5Ппем, Апп Нем РНагтасої! Тохісо!ї 32:573 (1993); Миїїдап, Зсіепсе 260:926 (1993); Могдап еї аї., Апп Кем Віоспет 62:191 (1993); і Мау,
ТІВТЕСН 11:155 (1993).
В одному з аспектів сполука включає послідовності нуклеїнових кислот, що кодують антитіло або його функціональні з'єднувальні фрагменти, причому зазначені послідовності нуклеїнових кислот є частиною векторів експресії, які експресують антитіло, або його фрагменти, химерні білки, або його важкі або легкі ланцюги в придатному хазяїні. Зокрема, такі послідовності нуклеїнових кислот містять промотори, функціонально пов'язані з областю, що кодує антитіло, причому зазначені промотори є індукованими або конститутивними, а також, можливо, тканиноспецифічними, також присутні й інші регуляторні послідовності.
В іншому конкретному прикладі здійснення використовуються молекули нуклеїнових кислот, в яких кодуючі антитіло послідовності й будь-які інші бажані послідовності фланкуються областями, які промотують гомологічну рекомбінацію в потрібному сайті генома, тим самим, створюючи умови для внутрішньохромосомної експресії нуклеїнових кислот, що кодують антитіло (КопПег, еї аї., Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 86:8932 (1989); 2|Івїга єї аї., Маїшге 342:435 (1989)).
У конкретних прикладах здійснення молекула експресованого антитіла являє собою
Зо одноланцюжкове антитіло; в альтернативних варіантах послідовності нуклеїнової кислоти включають послідовності, що кодують важкі й легкі ланцюги антитіла або його фрагменти. До альтернативних методів включення належить використання конкретних факторів транскрипції, які розпізнають специфічні послідовності нуклеїнових кислот, «цинкові пальці» та ін.
Доставка нуклеїнових кислот в організм пацієнта може здійснюватися прямо, у цьому випадку пацієнт прямо зазнає впливу нуклеїнової кислоти або векторів, що несуть нуклеїнову кислоту, або непрямим чином, у цьому випадку клітини спочатку трансформуються під впливом нуклеїнових кислот /л у/го, а потім трансплантуються пацієнтові.
В одному із прикладів здійснення послідовності нуклеїнових кислот прямо вводяться /п у/мо і експресуються для одержання кодованого продукту. Така процедура може проводитися з використанням кожного з множини методів, відомих фахівцям в галузі, наприклад, за допомогою конструювання послідовностей, що кодують антитіло, як частини відповідного вектора експресії нуклеїнової кислоти, і введення його таким чином, щоб вектори ставали внутрішньоклітинними, наприклад, за допомогою інфекції з використанням дефектних або ослаблених ретровірусних або інших вірусних векторів (див. патент США Мо 4980286), прямою ін'єкцією депротеїнізованої
ДНК, за допомогою бомбардування мікрочастинками (наприклад, генна гармата; Віоїївііс, биропі), з використанням невірусних векторів, наприклад синтетичних складів, що включають амфіпатичні сполуки, які зв'язують гідрофільну нуклеїнову кислоту й мають здатність злиття із клітинами, як правило, при цьому утримуючі гідрофобну частину для зв'язування з мембранами, покриттям ліпідами, або рецепторами клітинної поверхні або агентами трансфекції, інкапсулюванням у ліпосомах, мікрочастинках або мікрокапсулах, за допомогою введення вектора, пов'язаного з пептидом, для якого відома можливість проникнення в ядро, за допомогою введення вектора, пов'язаного з лігандом, який зазнає опосередкованого рецептором ендоцитозу (див., наприклад, УМи еї аї.,.) Віої Спет 262:4429 (1987)) (що може використовуватися для клітин-мішеней, селективно експресуючих рецептори) та ін. В іншому прикладі здійснення можуть бути виготовлені комплекси нуклеїнова кислота-ліганд, в яких ліганд включає схильний до злиття вірусний пептид для руйнування ендосом, що дозволяє нуклеїновій кислоті уникнути лізосомального розпаду. У ще одному прикладі здійснення нуклеїнову кислоту можна піддавати клітинно-специфічному поглинанню й експресії /л. У/мо, націлюючись на конкретний рецептор (див., наприклад, УМО 92/06180; УМО 92/22635; УМО 60 92/20316; УМО 93/14188 ії УМО 93/20221).
Що стосується векторів, то відповідно до підходів, відомих фахівцям в галузі, може використовуватися, наприклад, лентивірусний вектор. Лентивірусні вектори містять компоненти для впакування вірусного генома й інтеграції в ДНК клітину-хазяїна. Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують антитіло, які будуть використовуватися в генній терапії, клонуються в один або кілька векторів, що сприяє доставці гена в організм пацієнта. Наприклад, лентивірусний вектор може використовуватися для доставки трансгену в гематопоетичні стовбурні клітини.
Застосування ретровірусних векторів у генній терапії розглядається в наступних літературних джерелах: СіІомез еї аї., У Сіїп Іпме5і 93:644 (1994); Кіет еї аї!., Віоса 83:1467 (1994); ЗаІтопв5 еї аІ., Нитап Сепе Паегару 4:129 (1993); і сгоз5тап еї аї., Си Оріп Сеп апа Оєм 3:110 (1993).
У даному винаході також можуть використовуватися аденовіруси. Мішенями для систем доставки на основі аденовірусів є, наприклад, печінка, центральна нервова система, ендотеліальні клітини й м'язи. Аденовіруси інфікують клітини, що не діляться, що є перевагою у порівнянні з ранніми ретровірусними векторами. У роботі КолагеКу еї аІ., Си Оріп Сеп Оем 3:499 (1993) представлений огляд генної терапії на основі аденовірусів. У роботі Воші еї аї.,
Нитап Сепе Тпегару 5:3 (1994) продемонстроване використання аденовірусних векторів для передачі генів клітинам дихального епітелію макак-резусів. Інші приклади використання аденовірусів у генній терапії можна знайти в роботі Козепіеїй еї аїЇ., Зсіепсе 252:431 (1991);
Козептейй еї аї., СеїЇ 68:143 (1992); Махігаподеїї еї аї., У Сііп Іпмев5і 91:225 (1993); МО 94/12649; і
Мапа єї аІ., Сепе ТПнегару 2:775 (1995).
У генній терапії також може використовуватися аденосателітний вірус (ААМ) (УмаїзП еї аї.,
Ргос бос Ехр Віої Мей 204:289 (1993); і патенти США МоМо 5436146; 6632670 і 6642051).
Інший підхід до генної терапії передбачає перенос гена в клітини клітинної культури за допомогою таких методів, як електропорація, ліпофекція, трансфекція, опосередкована фосфатом кальцію або вірусна інфекція. Як правило, метод переносу передбачає перенос селектованого маркера в клітини. Потім проводиться селекція клітин, для того, щоб виділити ті клітини, які захопили й експресують перенесений ген. Потім такі клітини доставляють в організм пацієнта.
Таким чином, нуклеїнова кислота може вводитися в клітину до введення одержаної рекомбінантної клітини /л у//юо. Таке введення можна проводити будь-яким методом, відомим
Зо фахівцям в галузі, включаючи, серед інших, трансфекцію, електропорацію, мікроінжекцію, інфекцію вектором вірусу або бактеріофага, що містять послідовності нуклеїнових кислот, злиття клітин, опосередкований хромосомами перенос генів, опосередкований мікроклітинами перенос генів, злиття сферопластів та ін. Фахівцям в галузі відома множина методик введення чужорідних генів у клітини (див., наприклад, І оепег еї аІ., Меп Еплутої 217:599 (1993); Сопеп еї а. Мей Еплутої 217:618 (1993); і СіІіпе РПпагт Тпег 29:69 (1985)) і вони можуть використовуватися в рамках даного винаходу, за умови збереження необхідних функцій розвитку й фізіологічних функцій клітин-реципієнтів. Методика повинна забезпечувати стабільний перенос нуклеїнової кислоти в клітину, так щоб нуклеїнова кислота експресувалася клітиною, була наслідуваною й експресувалася потомством клітини.
Одержані рекомбінантні клітини можуть доставлятися в організм пацієнта з використанням різних методів, відомих фахівцям ов галузі. Рекомбінантні клітини крові (наприклад, гематопоетичні стовбурні клітини або клітини-попередники) переважно вводити внутрішньовенно. Кількість клітин для застосування залежить від бажаного ефекту, стану пацієнта та ін. і може визначатися кваліфікованим фахівцем в галузі.
До клітин, в які для цілей генної терапії може вводитися та або інша нуклеїнова кислота, належать будь-які бажані й доступні види клітин, які включають, серед інших, епітеліальні клітини, ендотеліальні клітини, кератиноцити, фібробласти, м'язові клітини, гепатоцити, клітини крові, наприклад, Т-лімфоцити, В-лімфоцити, моноцити, макрофаги, нейтрофіли, еозинофіли, мегакаріоцити й гранулоцити; різні стовбурні клітини або клітини-попередники, зокрема, гематопоетичні стовбурні клітини або клітини-попередники, наприклад клітини, одержані з кісткового мозку, крові пуповини, периферичної крові, печінки ембріону та ін.
В одному прикладі здійснення використовувана для генної терапії клітина є аутологічною пацієнтові. Нуклеїнові послідовності, що кодують антитіло згідно з даним винаходом, вводяться в клітини, так що трансген експресується клітинами або їх потомством, і рекомбінантні клітини потім вводяться /л7 умо для одержання терапевтичного ефекту. У конкретному прикладі здійснення використовуються стовбурні клітини або клітини-попередники. Для можливого прикладу здійснення даного винаходу використовуються будь-які стовбурні клітини й/або клітини-попередники, які можуть бути виділені й збережені /л уйго (див., наприклад, М/О 94/08598; 5іептріє сеї а!., Сеї! 71:973 (1992); КПеіпмав Мей Сеї Віо 21А:229 (1980); і РіцеЇКОм єї бо аІ!., Мауо Сіїпіс Ргос 61:771 (1986)). Придатними клітинами-реципієнтами є клітини крові й клітини кісткового мозку, оскільки СХСК5 експресується, наприклад, на В-клітинах. Разом з тим об'єм даного винаходу в плані використання стовбурних клітин-реципієнтів не передбачає виготовлення й застосування трансгена для одержання трансгенного організму за допомогою введення такого трансгена, що представляє інтерес, в ембріони й ембріональні стовбурні клітини.
У даному винаході пропонуються способи лікування, профілактики й ослаблення захворювань, викликаних СХС5, або одного або декількох їх симптомів за допомогою введення пацієнтові ефективної кількості, наприклад, рідкого препарату згідно з даним винаходом. Пацієнтом переважно є ссавець, наприклад неприматні види (корови, свині, коні, кішки, собаки, щури та ін.) і примати (наприклад, мавпи, зокрема яванський макак супотоїдиз і люди). У переважному прикладі здійснення таким пацієнтом є людина.
СХСК5 також експресується на деяких ракових клітинах, наприклад ракових клітинах підшлункової залози, товстої кишки й сечового міхура й при Т-клітинних лейкозах (Оіпріпо еї аї.,
Опсодепе 24:573-584, 2005), а також В-клітинних лейкозах (ВигКеї! еї аї., Віоод, Ум! 2007; доі:10.1182/біо0а-2007-05-089409), крім того, стимулювання СХСК5 корелювало (із проліферацією клітин карциноми, Меї/|ег еї аІ., Сапе Кезв 66:9576-9582, 2006.
Таким чином, розглянуте антитіло або його похідне можуть використовуватися для контролю проліферації ракових клітин, експресуючих СХСК5, при цьому наявність раку діагностується по експресії СХСК5 за допомогою наведених у даному документі методів аналізу. Антитіло, що представляє інтерес, може зменшити інфільтрацію злоякісних клітин, знизити стійкість до апоптозу й звести до мінімуму проліферацію. Як пропонується в даному винаході, зазначеним пацієнтам вводиться така кількість розглянутого антитіла або його похідного, яке забезпечує інгібування проліферації ракових клітин.
Аутоїмунні розлади пов'язані з аберантним і/або високим рівнем експресії СХСЇІ 13, наприклад, при вовчаку (Ізпікамжма еї аіІ., У Ехр Мей 193:1393-1402, 2001) і 5)огеп'є 5упаготе (Заіотопвгзоп еї аї., Зсап У Ітт 55:336-342, 2002; і Вагопе еї аї., Агй Епешт 52(6)1773-1784, 2005), або високим рівнем експресії СХСК5, наприклад, при злоякісній міастенії (Зіт5 еї аї.,
Ітт 167:1935-1944, 2001; Зайюо еї аї., ) Мейгоїтт 55:336-342, 2005; і Таскепбрего еї а!., Єиг У Ітт 37:849-863, 2007). Тому розглянуте антитіло використовується для мінімізації впливу високих
Зо рівнів або високої активності ліганду СХСІ13 або СХСК5. При аутоїмунних розладах, що характеризуються високими рівнями В-клітин, високими рівнями СХОСК»5, або високими рівнями
СХСЇ 13, або іншого ліганду СХСК»5, як зазначено в даному документі, вводиться така кількість розглянутого антитіла, яка пригнічує активність В-клітин.
Аберантна експресія СХСОК5 спостерігалася при розсіяному склерозі, Вгаіїп 129 (РІ 1)200- 211, 2006.
При коліті СХСК5 відіграє певну роль в утворенні й функціонуванні лимфоїдної тканини, пов'язаної з кишечником (Сагізеп еї аї., зи, 2002, 51(3)364-367). Розглянуте антитіло пригнічує опосередковану СХСНК5 міграцію й інфільтрацію В-клітин у власну пластинку слизової оболонки кишечнику, а також інфільтрацію слизової оболонки в цілому (Ма2исспеїїї еї аї., У Сіїп Іпмеві, 1999, 104(10) Н!49-К54) і їх експресію в осередках виразкового коліту, які містять ектопічні гермінативні центри.
Виснаження В-клітин може мати терапевтичний ефект при придушенні симптомів у певних обставинах і при певних показаннях, наприклад при ревматоїдному артриті (Оїїдіпо 8. Оаігутріеє,
Апи Аез Тег 5 (Зуррі 4)57-511, 2003). Високі рівні експресії СХСК5 реєструються в синовіальній тканині страждаючих артритом пацієнтів у порівнянні із тканиною окремих осіб, які не страждають ревматоїдним артритом (Зсптиї? еї аї., Айп Кез Тег 7:К217-К229, 2005). Таким чином, певні форми розглянутого антитіла і його похідних можуть знижувати популяцію В-клітин і попереджати інфільтрацію й взаємодію В-клітин у суглобі. Відповідно, лікування може включати введення пацієнтові, що страждає артритом, визначеної кількості розглянутого антитіла, яке знижує рівень В-клітин. Антитіло може вводитися локально у хворобливий суглоб.
Ектопічний лімфоїдний неогенез спостерігається при різних умовах, у тому числі псоріатичному артриті (Сапеїе еї аІ., Апп Кпешт бів, Уап 12, 2007, доі:10:1136/ага.2006.062042), хронічних запальних захворюваннях загального характеру (Аїоїізі 85 Ри|оІ-ВоїтеїЇ, Маї Вем Ітт 6:205-217, 2006) і в трансплантатах, з відторгненням як при хронічному плині (Ваааоига еї аї.,
Ат ./ Тгтап5 5:510-516, 2005), так і в ситуаціях загострення (Оісагіо еї аІ., Ат У Тгап5 7:201-210, 2007). СХСІ 13 ї СХСНК5 були присутні у випадку кардіотрансплантатів (Оісагіо еї аї!., вище); а
СХСІ13 реєструвався у випадку псоріатичного артриту (Сапеїе еї аїЇ., вище). Присутність
СХСЇІ 13 і/або СХСОК5 пов'язана з розвитком ектопічних лімфоїдних фолікулів із зонами В-клітин і Т-клітин, які присутні в нормальних вузлах. Формування алоантигену для антигену В-клітин також зв'язувалося з моделлю гострого відторгнення серцевого алогенного трансплантату (Моотспавзнт еї аї., У Ітт 177:7715-7722, 2006).
Таким чином, розглянуте антитіло може використовуватися для придушення запалення й відторгнення трансплантату. Пацієнтові вводиться інгібуюча В-клітини кількість антитіла, для того, щоб придушити запалення, звести до мінімуму розвиток ектопічних гермінативних центрів, якнайбільше знизити захоплення В-клітин трансплантатом і мінімізувати формування алоантигену В-клітин до або після процедури трансплантації.
Нижче для відомості фахівців в галузі наводяться ілюстрації даного винаходу в наступних, таких, що не вичерпуються даним перерахуванням, прикладах варіантів, що описують деякі здійснення, за допомогою яких даний винахід може бути реалізований на практиці.
Приклади
Приклад 1: Одержання імуногена
Моноклональні антитіла до СХСК5 можна виробляти у трансформованих клітинах СНО із
ДНК, що кодує людський СХОК»5 повної довжини і експресується на поверхні клітин («клітини г-
СХОВ5-СНО»). Використовувана для трансформування клітин послідовність СХСК5 може бути одержана з баз даних, таких як ММ 001716.2, МСО00011.8 або ММО01716, і синтезована або виділена з придатного клітинного джерела.
Відкриту рамку зчитування СХСК5 поміщали в експресуючий вектор, такий як роСОМАЗ.Тпео ОЕЗТ, і потім трансфікували у клітини 300-19 (імуноген).
Крім того, позаклітинний домен СХСК5 (Еб-домен) з амінокислотною послідовністю
ММУРТІ ЕМО ЕМ ЕВ ЕМЕГОВІГОМММТ5І МЕМНІ С (ЗЕО 10 МО: 1) кон'югували з гемоціаніном лімфи равлика («КІ Н) через С-термінальний цистеїн і використовували як імуноген. Клітини, що експресують СХСОК5 або позаклітинний домен СХСК5, вводили внутрішньоочеревинно (5х105 клітин в 0,2 мл, або 50 мкг пептиду в 100 мкл буферного розчину, додатково змішані з 100 мкл ад'юванту, такого як повний ад'ювант Фрейнда). Ін'єкції антигену повторювали кожні два тижні до виявлення у сироватці високого титру антитіл СХСН5 з використанням будь-якого з відомих методів, наприклад, імуноферментного аналізу (ЕГІЗА) або клітинного сортера з активацією флуоресценції (ГАС5), використовуючи, наприклад, клітини СХСК5", які можуть бути виділені, наприклад, за допомогою ЕАСЗ, і, наприклад, комерційно доступні моноклональні антитіла МАВ
Зо 190 (К 5 О Бувіетв) як позитивний контроль.
Клітини, що експресують СХСК5, тримали при температурі 37 "С в атмосфері 5 96 СО» в
ВРМІ-розчині (Іпмігодеп, Сагієрайд, СА) з додаванням 10 95 діалізованої ембріональної бичачої сироватки (ЕВ5) (Іпмігодеп). Клітини готували до ін'єкції шляхом заміни зазначеного вище культурального середовища на фосфатний буферний розчин, що не містить Са/ма (СМЕ-РВ5), з додаванням 5 мМ ЕОТА, збираючи клітини в цьому буфері. Зібрані клітини відділяли центрифугуванням на 500хд протягом приблизно 5 хвилин, однократно промивали шляхом ресуспендування одержаного концентрату у СМЕ-РВЗ і повторного центрифугування, підраховували і доводили до відповідного об'єму (наприклад, до 5х105 клітин на 0,2 мл) для ін'єкції шляхом ресуспендування клітинного концентрату в СМЕ-РВ5.
Як зазначено вище, експресію СХСК5 контролювали, наприклад, за допомогою аналізу
ЕАС5, використовуючи комерційно доступні антитіла СХСК5, такі як МАВ 190 (К 48 0), клони
Ег882 і 2058 (208 являє собою щуряче антимишаче антитіло СХСК5, інші придбані антитіла є антилюдськими антитілами СХОК5) (ВО), і 2С1 (Арпома), а також різні активні відносно НЯСХСК5 поліклональні антитіла, виготовлені стандартними у даній галузі методами.
Для полегшення створення плазміди і підвищення рівня експресії СХСК5, готували олігонуклеотиди, що відповідають сигнальній послідовності перших 135 пар основ послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує СХСК5. Виготовлені олігонуклеотиди були дещо модифіковані у положеннях неоднозначності кодону для зниження кількості гермінативних центрів (С). Усі зміни нуклеотидної послідовності були німими, тобто не приводили до зміни амінокислотної послідовності. Після спільного відпалу олігонуклеотидів, створену таким чином сигнальну послідовність зв'язували з іншою частиною кодуючої послідовності методом ПЛР зі сплайсингом термінальних фрагментів РСК-5ОЕ, що перекриваються (Но еї аїІ., Зепе 77:51 (1989); і Ногіоп еї а!., Віотесппіднев 8:528 (1990)).
Перед використанням клітин як імуногена перевіряли ступінь експресії СХСК5. Клітини культивували в КРМІ-розчині (Іпмйгодеп, Сагізрай, СА) з додаванням 10 956 ЕВ5, 02 мМ глутаміну і їх розчину замінних амінокислот, потім висівали приблизно 3-5х105 клітин на ямку у стандартній посудині 175 і вирощували протягом приблизно 24-48 годин.
Трансформовані або трансфіковані клітини культивували протягом приблизно двох тижнів, доки клітини, що не несуть плазміни, які експресують СХСК5, не були селективно знищені антибіотиком. Клітини стійких клітинних ліній можна лізувати, виділити з них білки і провести з ними вестерн-блотинг.
Стабільно або тимчасово трансфіковані клітини аналізували на експресію СХСК5, використовуючи методи для виявлення експресії СХСК5 на поверхні клітин, такі як ЕАС5 аналіз. Крім того, клітини можна лізувати і одержані білки аналізувати, наприклад методом вестерн-блотингу. Трансфіковані клітини, зібрані з чашок з культуральним середовищем, однократно промивали фосфатно-сольовим буферним розчином (РВ5), ресуспендували. у деіонізованій воді, змішаній з рівним об'ємом 2х завантажувального буфера для білкових зразків (Віогад, Негсціе5, СА), і потім витримували при температурі близько 100 "С протягом 10 хвилин. Мембранний білок аналізували з використанням кондиціонованого середовища, змішаного з рівним об'ємом 2х завантажувального буфера для білкових зразків, витримуючи при 100 "С протягом 10 хвилин. Зразки розділяли методом електрофорезу у поліаакриламідному гелі ХО5-РАСЕ, використовуючи 4-12 95 градієнтний гель. Потім білки переносили з гелю на нітроцелюлозну мембрану (Віогайд, Негсціе5, СА), перед перенесенням блоковану 5 96 нежирним сухим молоком у фосфатному буфері з твіном РВ5Т (РВ5 з додаванням 0,05 95 ТУМЕЕМ-209) протягом не менше години.
СХС5 детектували шляхом інкубування мембрани з СХСОК5-специфічними первинними антитілами у блокувальному буфері протягом не менше години при кімнатній температурі зі струшуванням на шейкері. Потім мембрану промивали не менше трьох раз, додавали кон'юговані з репортером вторинні антитіла у блокувальному буфері, та інкубували не менше години при кімнатній температурі зі струшуванням на шейкері. Потім мембрану тричі промивали
РВ5Т і проявляли, наприклад, використовуючи хемілюмінесцентний субстрат.
Приклад 2: Одержання моноклональних антитіл до СХСК5
Мишей ліній А/) або ВАГ В/су у віці приблизно 4-6 тижнів (даскхоп І арх, Ваг Нагрог, МЕ) імунізували СХСК5-трансфікованими клітинами або пептидом, що містить позаклітинний домен
СХСМК5. У день 0 групу мишей первинно внутрішньоочеревинно інфікували 1:11 емульсією кон'югованого з КІ-Н пептиду у суміші з ад'ювантом (повний ад'ювант Фрейнда, СЕА), у день 20 повторно внутрішньоочеревинно інфікували сумішшю пептиду з неповним ад'ювантом Фрейнда (ІРС) і/або клітинами у фосфатному буфері без ад'юванту, і втретє інфікували внутрішньовенно
Зо у день 44 сумішшю кон'югованого з КІ Н пептиду в ІЕС і (або клітинами) у фосфатному буфері без ад'юванту. Іншу групу мишей первинно внутрішньоочеревинно інфікували в день 0, повторно внутрішньоочеревинно інфікували в день 15, 39, 53 і 67, і нарешті, інфікували внутрішньовенно в день 81 (усі ін'єкції виконували з суспензією клітин у фосфатному буфері без ад'юванту). Для обох груп мишей кожна ін'єкція містила приблизно від 3х105 до 2х107 клітин в об'ємі приблизно 200 мкл. В іншому варіанті, імунізацію пептидом і/або клітинами проводили кожні два тижні, 3-6 разів до досягнення бажаного титру анти-СХСК»5, який визначався, наприклад, методами ЕАСЗ5 або ЕГГ ІЗА.
Через три дні після останньої ін'єкції у деяких випадках мишей перевіряли на титр анти-
СХСН5 у плазмі крові, умертвляли, діставали селезінку і поміщали її у чашку Петрі, що містить приблизно 10 мл безсироваткового середовища, модифікованого способом Дульбеко-Ігла (ОМЕМ) (бірсо). Спленоцити пінцетом відділяли від капсули і двічі промивали у 10 мл безсироваткового модифікованого способом Ігла середовища Дульбеко (МОМ) (СеїЇдтго,
Негпдоп, МА) при температурі 37 "С. Суспензію клітин селезінки переносили у пробірку з конічним дном об'ємом 15 мл і чекали осадження суспензії протягом приблизно 2-5 хвилин.
Супернатант, що містить спленоцити, переносили у чисту пробірку з конічним дном об'ємом 15 мл і перед проведенням злиття ще тричі промивали ІМОМ. Відібрані з різних тварин спленоцити миші можна об'єднувати.
У деяких випадках з неімунізованої миші готували 5 мл одноклітинної суспензії контрольних фідерних спленоцитів, практично як описано вище для імунізованих спленоцитів, і поміщали її в інкубатор (37 "С, 5 95 СО»2) для майбутнього використання.
В альтернативному варіанті методики, описані при одержанні одноланцюжкових антитіл (патент США Мо 4946778; Віга, зсіепсе 242:423 (1988); Низіоп еї аї., Ргос Май! Асай 5сі О5А 85:5879 (1988); і Мага, еї аїЇ., Маїиге 334:544 (1989)), можуть бути адаптовані для одержання одноланцюжкових антитіл. Одноланцюжкові антитіла утворюються за допомогою зв'язування фрагментів важкого й легкого ланцюгів області Гу через амінокислотний місток з утворенням одноланцюжкового поліпептиду. Можна також використовувати методики складання функціональних фрагментів РЕ, в Е. соїї (ФКеїта єї аі., Зсієпсе 242:1038 (1988)).
Даний винахід включає антитіла, рекомбінантно злиті або хімічно кон'юговані (у тому числі ковалентно й нековалентно кон'юговані) з поліпептидом. Злиті або кон'юговані антитіла згідно з 60 даним винаходом можуть використовуватися для простоти очищення, див., наприклад, УМО
93/21232; ЕР 439,095; Магатига еї аї., Іттипої Гей 39:91 (1994); патент США Мо 5474981; Се еї аі,, Ргос Май Асай Зсі ОСОБА 89:1428 (1992); і Бей еї аїЇ.,, У Іттипої 146:2446 (1991).
Амінокислотна послідовність маркера може являти собою гексагістидиновий пептид (ЗЕО ІЮ
МО: 51), наприклад пептид, подібний маркеру у векторі РОЕ (ОІАСЕМ, Іпс., Спаїбмогій, СА), серед інших, багато з яких комерційно доступні, Сепі еї аїЇ.,, Ргос Май! Асай 5сі ОБА 86:821 (1989). До інших пептидних маркерів, зручних для очищення, серед інших, належать маркер «НА», який відповідає епітопу, одержаному з гемагглютинуючого білка грипу (ММ/їзОПп еї аї.,СеїЇ 37:767 (1984)) і маркер «Пад».
Можна також створити одноланцюжкові пептидні з'єднувальні молекули, в яких області важкого й легкого ланцюга Ру з'єднані одна з одною. Одноланцюжкові антитіла («5сЕу») і метод їх конструювання описані, наприклад, у патенті США Мо 4946778. В альтернативному варіанті аналогічними способами можна сконструювати й експресувати Рьь. Усі повністю або частково людські антитіла можуть бути менш імуногенними, ніж повністю мишачі тАре, фрагменти й одноланцюжкові антитіла також можуть бути менш імуногенними.
Антитіла або фрагменти антитіл можуть виділятися з фагових бібліотек антитіл, одержаних за допомогою методик, описаних в Мссапйегіу еї аї., Майшге 348:552 (1990). Сіагкзоп еї аї., Маїиге 352:624 (1991) ії МагК5 еї аї., У Мої! ВіоїЇ 222:581 (1991) розглядають виділення мишачих і людських антитіл, відповідно, з використанням фагових бібліотек. У наступних публікаціях описана продукція високоафінних (в інтервалі НМ) людських антитіл за допомогою перестановки в ланцюзі (Магк5 еї аї., Віо/ГесппоЇоду 10:779 (1992)), а також метод комбінаторної інфекції й рекомбінація /л у/уо як стратегії побудови дуже великих фагових бібліотек (Ууаїетпоизе еї аї.,
Мисі Асід5 Ке5 21:2265 (1993)). Таким чином, подібні методики є практичною альтернативою традиційним гібридомним методикам в одержанні моноклональних антитіл.
Антитіла до СХСК5 аналізувалися методами твердофазного імуноферментного аналізу (ЕПІЗА), ЕАС5, вестерн-блотингом або іншими імунохімічними методами, відомими фахівцям в галузі. Так, В-клітини або клітини, експресуючі СХСК5, можуть використовуватися для детектування зв'язування з ним антитіла за допомогою тієї або іншої відомої методики, або ж рекомбінантно експресований СХСМК5О або його частина, наприклад домен ЕС, можуть закріплювати на твердій фазі й використовувати як елемент захоплення при аналізі, побудованому залежно від поставленої мети.
Щоб визначити, чи зв'язується той або інший конкретний гомолог антитіла з людським
СХСР5, можна використовувати будь-який стандартний метод аналізу зв'язування. До зручних методів аналізу зв'язування СХСОК5 належать аналіз ЕАС5, аналіз ЕГІ5А, радіоімунологічні методи аналізу і їм подібні, які детектують зв'язування антитіла з СХСК5 людини й виникаючі в результаті функції. Для таких аналізів зручні розглянуті в даному описі, що мають повну довжину й розчинні форми людського СХСК5. Зв'язування антитіла або гомолога з СХСК5, або з його розчинними фрагментами, можна легко реєструвати за рахунок використання другого антитіла, специфічного до імуноглобулінів виду, від якого одержані антитіло або гомолог.
Щоб встановити, блокує чи в помітній мірі те або інше антитіло або гомолог зв'язування
СХСІ13 або іншого ліганду з людським СХСК5, можна скористатися будь-яким зручним методом конкурентного аналізу. До придатних методів аналізу, наприклад, належать методи
ЕГІ5А, методи ЕАС5, радіоімунологічні методи аналізу і їм подібні, які дозволяють кількісно визначити здатність антитіла або гомолога конкурувати з СХСІ13 або іншим лігандом за зв'язування з людським СХСК5. Переважно, оцінюється здатність ліганду блокувати зв'язування міченого людського СХСК5 з іммобілізованим антитілом або гомологом.
Здатність антитіла або гомолога зв'язуватися з людським СХСК5 можна оцінити перевіркою його здатності зв'язуватися з людськими клітинами СХСК5". Придатними клітинами СХСКО5: для використання при визначенні того, чи може те або інше конкретне антитіло або гомолог зв'язуватися з людським СХСК5, є клітини культур тканин ссавців, трансформовані за допомогою ДНК, яка кодує людський СХОК5 повної довжини, і експресує СХСК5 на поверхні клітин або в лініях В-клітин.
Зв'язування антитіла або гомолога із клітиною СХСК5" може реєструватися за допомогою фарбування клітин флуоресцентно-міченим другим антитілом, специфічним до імуноглобулінів того ж виду, від якого одержаний аналізований гомолог антитіла. Клітинний сортер з активацією флуоресценції («РАС5») може використовуватися для реєстрації й кількісного опису будь-якого зв'язування, див., у загальному випадку, Зпаріго, Ргасіїса! Іо Суотеїгу, Аап К. І і55, Іпс., Межм/
УОК, М.М. (1985).
Крім того, здатність гомолога антитіла блокувати зв'язування ліганду, наприклад, СХСІ 13, з людським СХСК5 може визначатися за допомогою преінкубування надлишку ліганду із бо клітинами СХСК5: і кількісної реєстрації міри блокування зв'язування антитіла або гомолога із клітинами за рахунок присутності зв'язаного ліганду. Зв'язування гомолога антитіла із клітинами
СХОСВ5: може реєструватися за допомогою РАС5, з використанням флуоресцентно-міченого другого антитіла, специфічного до імуноглобулінів того ж виду, від якого одержаний аналізований гомолог антитіла. В альтернативному варіанті можлива постановка конкурентного аналізу, відомого фахівцям в галузі, за допомогою міченого ліганду або антитіла.
Ліганд, наприклад, СХСІ 13, який використовувався в описаних вище процедурах аналізу, може продукуватися клітинами, трансформованими геном для синтезу ліганду, або ж може застосовуватися виділений СХСІ13, одержуваний із застосуванням викладених у даному документі практичних методів, або ж може здобуватися ліганд, що серійно випускається.
Щоб визначити, чи не приводить те або інше конкретне антитіло або гомолог до помітного зниження кількості циркулюючих клітин СХСК5: /п умо, визначалася кількість циркулюючих клітин СХСК5:", взятих у ссавця протягом 24 годин після введення антитіла або гомолога ссавцеві з нормальною імунною функцією, і ця величина зіставлялася з кількістю до введення або кількістю в контрольного ссавця, якому вводили антитіло або гомолог відповідного ізотипу без певної специфічності замість антитіла або гомолога згідно з даним винаходом. Кількісне визначення клітин СХСК5 у тварин, що одержали дозу антитіла СХСК5 або його функціональної частини, або його похідного, може проводитися, наприклад, за допомогою фарбування одержаних клітин флуоресцентно-міченими антитілами, які зв'язують антитіла до
СХСМК5, а також міченими антитілами, специфічними до Т-клітин і В-клітин, з наступним аналізом ЕАС5.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть описуватися або характеризуватися з погляду епітопа (епітопів) або частини (частин) СХСК»5, які антитіло розпізнає або з якими воно специфічно зв'язується. Епітоп (епітопи) або частина (частини) поліпептидів, як описано в даному документі, можуть характеризуватися, наприклад, по М-термінальним і С-термінальним положенням, по довжині безперервного ланцюга амінокислотних залишків, конформаційним епітопам та ін.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть також описуватися або характеризуватися по перехресній реакційній здатності. В об'єм даного винаходу також включаються антитіла, які зв'язують поліпептиди СХСК5, що характеризуються щонайменше 95 95, щонайменше 90 95,
Зо щонайменше 85 95, щонайменше 80 95, щонайменше 75 956, щонайменше 70 96, щонайменше 65 до, щонайменше 60 95, щонайменше 55 95 і щонайменше 50 95 ідентичністю (яка розраховується за допомогою методів, відомих фахівцям в галузі й описаних у даному документі) до СХСКО5.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть також описуватися або характеризуватися по афінності зв'язування з розглянутим СХСК5. Антитіла до СХСК5О можуть зв'язуватися з кО менше приблизно 10-7 М, менше приблизно 105 М або менше приблизно 105 М. Більш висока афінність зв'язування розглянутого антитіла може бути більш бажана, наприклад, з рівноважною константою дисоціації або кО від приблизно 108 до приблизно 10-75 М, від приблизно 103 до приблизно 1072 М, від приблизно 107 до приблизно 107! М або від приблизно 108 до приблизно 1079 М. У даному винаході також пропонуються антитіла, які конкурентно інгібують зв'язування антитіла з епітопом згідно з даним винаходом, що визначається будь-яким методом, відомим фахівцям в галузі, для реєстрації конкурентного зв'язування, наприклад, описаними в даному документі методами імунологічного аналізу. У переважних прикладах здійснення антитіло конкурентно інгібує зв'язування з епітопом щонайменше на 95 9б, щонайменше на 90 95, щонайменше на 85 9565, щонайменше на 80 95, щонайменше на 75 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 60 95 або щонайменше на 50 95.
В об'єм даного винаходу також включаються кон'югати, що містять розглянуте антитіло.
Кон'югати складаються із двох основних компонентів: розглянутого антитіла й другого компонента, яким може бути з'єднуючий клітини агент, цитотоксичний агент та ін.
Використовуваний у даному документі термін «з'єднуючий клітини агент» стосується речовини, яка специфічно розпізнає й зв'язує молекулу на поверхні клітини. Так, як зв'язуючий клітини агент може виступати антиген СО, патогенний антиген, наприклад вірусний антиген, диференціюючий антиген, раковий антиген, клітинно-специфічний антиген, тканиноспецифічний антиген, Ід або подібна Ід молекула та ін.
В одному із прикладів здійснення з'єднуючий клітини агент специфічно розпізнає СХСІ 13 або комплекс СХСК5 з його лігандом, наприклад з СХСІ 13. Кон'югат може знаходитися в контакті із клітиною-мішенню протягом тривалого періоду часу, для того, щоб дати можливість ефекторній функції кон'югата вплинути на клітину й/або забезпечити достатній час, протягом якого відбудеться інтерналізація кон'югата клітиною.
З'єднуючі клітини агенти можуть бути будь-якого типу, який відомий у цей час або стане 60 відомим у майбутньому, до них належать пептиди, непептидні сполуки, сахариди, нуклеїнові кислоти, ліганди, рецептори та ін. або їх комбінації. З'єднуючим клітини агентом може бути будь-яка сполука, яка зв'язує клітину як специфічним, так і неспецифічним чином. Як правило, як агент може виступати антитіло (зокрема моноклональне антитіло), лімфокіни, гормони, фактори росту, вітаміни, молекули-переносники живильних речовин (наприклад, трансферин) або будь-яка інша зв'язуюча клітину молекула або речовина.
До інших прикладів зв'язуючих клітину агентів, які можуть використовуватися в даному винаході, належать: поліклональні антитіла, моноклональні антитіла й фрагменти антитіл, наприклад, Раь, Ра», Ка» і Е. (Ратат, у). Іттипої. 131:2895-2902 (1983); ргіпо вї аї., У. Іттипо)Ї. 113:470-478 (1974); і Мізопоїї еї аї., Агоп. Віоспет. Віорпув. 89: 230-244 (1960)).
Другим компонентом також може бути цитотоксичний агент. Використовуваний у даному документі термін «цитотоксичний агент» стосується речовини, яка пригнічує або блокує функціонування або ріст клітин і/або викликає деструкцію клітин. Так, як цитотоксичний агент може виступати таксол, майтансиноїд, наприклад ОМІ або ЮОМ4, СС-1065 або СС-1065 аналог, рицин, мітоміцин С та ін. У деяких прикладах здійснення цитотоксичний агент, подібно будь- якому зв'язуючому агенту кон'югата за даним винаходом, ковалентно пов'язаний з антитілом, що розглядається, прямо або через розщеплюваний або нерозщеплюваний лінкер.
Прикладами придатних майтансиноїдів є майтансинол і аналоги майтансинолу.
Майтансиноїди пригнічують утворення мікроканальців і найвищою мірою токсичні для клітин ссавців.
До прикладів придатних аналогів майтансинолу належать аналоги, що мають модифіковане ароматичне кільце, а також аналоги з модифікаціями в інших положеннях. Такі придатні для використання майтансиноїди пропонуються в патентах США МоМо 4424219; 4256746; 4294757; 4307016; 4313946; 4315929; 4331598; 4361650; 4362663; 4364866; 4450254; 4322348; 4371533; 6333410; 5475092; 5585499 і 5846545.
Приклади придатних аналогів майтансинолу з модифікованим ароматичним кільцем включають: (1) С-19-дехлор (патент США Мо 4256746) (одержуваний, наприклад, ГАН- відновленням ансамітоцину Рг); (2) С-20-гідрокси (або С-20-деметил) ж/- С-19-дехлор (патенти
США Мо 4361650 і 4,307,016) (одержуваний, наприклад, деметилуванням з використанням стрептоміцетів або актиноміцетів або дехлоруванням із застосуванням літійалюмінійгідриду
Зо (АН)); ії (3) С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-ОСОВ), ч/-дехлор (патент США Мо 4294757) (одержуваний ацилуванням під дією ацилхлоридів).
Приклади придатних аналогів майтансинолу з модифікаціями в інших положеннях включають: (1) С-9-5Н (патент США Мо 4424219) (одержуваний реакцією майтансинолу з Н25 або Роб5); (2) С-14-алкоксиметил (деметокси/СНг2ОК) (патент США Мо 4,331,598); (3). С-14- гідроксиметил або ацилоксиметил (СН2ОН або СНогОАс) (патент США Мо 4450254) (одержуваний з нокардій); (4) С-15-гідрокси/'ацилокси (патент США Ме 4364866) (одержуваний конверсією майтансинолу стрептоміцетами); (5) С-15-метокси (патенти США Мо 4313946 і 4315929) (виділюваний з Тгемла пидйога); (6) 18-М-деметил (патенти США Мо 4362663 і 4322348) (одержуваний деметилуванням майтансинолу стрептоміцетами); і (7) 4,5-деокси (патент США Мо 4371533) (одержуваний відновленням майтансинолу під дією трихлористого титану/ АН).
Цитотоксичні кон'югати можуть бути одержані методами / мо. Для зв'язування цитотоксичного агента, ліків або проліків з антитілом, як правило, використовується лінкерна група. Придатні лінкерні групи відомі фахівцям в галузі, до них належать дисульфідні групи, тіоефірні групи, кислотонестійки групи, фотолабільні групи, групи, нестійкі до впливу пептидази, а також групи, нестійкі до впливу естерази. Наприклад, кон'югати можуть конструюватися за допомогою реакції дисульфідного обміну або за рахунок утворення тіоефірного зв'язку між розглянутим антитілом і ліками або проліками.
Як обговорювалося вище, у даному винаході пропонуються послідовності виділених нуклеїнових кислот, що кодують описані в даному документі антитіло або його функціональний варіант, конструкції векторів, що включають нуклеотидну послідовність, що кодує з'єднуючі
СХСР»5 поліпептиди згідно з даним винаходом, клітини-реципієнти, що несуть такий вектор, а також рекомбінантні методики продукції такого поліпептиду.
Вектор, як правило, складається з компонентів, відомих фахівцям в галузі, і звичайно, серед інших, включає один або декілька перерахованих нижче елементів: сигнальна послідовність, точка початку реплікації один або кілька маркерів або генів селекції, послідовності, що сприяють і/або стимулюють трансляцію, енхансер та ін. Таким чином, вектори експресії містять нуклеотидну послідовність, яка функціонально пов'язана з такими придатними транскрипційними або трансляційними регуляторними нуклеотидними послідовностями як, 60 наприклад, похідними від генів ссавців, мікробів, вірусів або комах. До прикладів додаткових регуляторних послідовностей належать оператори, рибосомальні сайти зв'язування мРНК і/або інші відповідні послідовності, які контролюють транскрипцію й трансляцію, наприклад їх ініціювання й припинення. Нуклеотидні послідовності є «Функціонально зв'язаними», якщо регуляторна послідовність має функціональне відношення до нуклеотидної послідовності відповідного поліпептиду. Так, нуклеотидна послідовність промотору функціонально зв'язана, наприклад, з послідовністю важкого ланцюга антитіла, якщо нуклеотидна послідовність промотору контролює транскрипцію такої нуклеотидної послідовності.
Крім того, у вектори експресії можна вбудовувати послідовності, що кодують відповідні сигнальні пептиди, які звичайно не є природним чином пов'язаними з послідовностями важкого і або легкого ланцюгів антитіла. Наприклад, нуклеотидна послідовність сигнального пептиду (секреторний лідер) може бути злита усередині рамки з поліпептидною послідовністю, так щоб антитіло секретувалося у периплазматичний простір або в середовище. Сигнальний пептид, який діє в передбачуваних клітинах-реципієнтах, підсилює позаклітинну секрецію відповідного антитіла або його частини. Сигнальний пептид може відщеплюватися від поліпептиду при виділенні антитіла із клітини. Приклади таких секреторних сигналів добре відомі й включають, наприклад, описані в патентах США Мо 5698435; 5698417 і 6204023.
Як вектор може виступати плазміда, одноланцюжковий або дволанцюжковий вірусний вектор, фаговий вектор одноланцюжкової або дволанцюжкової РНК або ДНК, фагмід, косміда або будь-який інший носій трансгена, що представляє інтерес. Такі вектори можуть вводитися в клітини як полінуклеотиди, з використанням добре відомих методик введення ДНК і РНК у клітини. Вектори, у випадку фагових або вірусних векторів, також можуть вводитися в клітини у формі вірусу в оболонці або в капсулі з використанням добре відомих методик інфекції й трансдукції. Вірусні вектори можуть бути компетентними або дефективними стосовно реплікації.
В останньому випадку розмноження вірусу буде, як правило, проходити тільки в комплементарних клітинах-реципієнтах і з використанням множинних векторів, що несуть різні вірусні компоненти, необхідні для продукції частинок. Безклітинні системи трансляції можуть також застосовуватися для продукції білка з використанням РНК, одержаних з існуючих конструкцій ДНК (див., наприклад, МО 86/05807 і УМО 89/01036; і патент США Мо 5122464).
Експресія антитіл згідно з даним винаходом може здійснюватися в будь-якій придатній клітині-хазяїні. До прикладів клітин-реципієнтів, придатних для використання в даному винаході, належать прокаріотичні, дріжджові або вищі еукаріотичні клітини, і сюди, серед інших, входять мікроорганізми, наприклад бактерії (зокрема Е. соїї, В. зиБій5, ентеробактер, ервінії, клебсіели, протеус, сальмонели, сератії й шигели, а також паличкоподібні бактерії, псевдомонади й стрептоміцети), трансформовані за допомогою векторів експресії рекомбінантної ДНК бактеріофага, плазмідної ДНК або космідної ДНК, що містять кодуючи послідовності розглянутого антитіла; дріжджі (наприклад, сахароміцети, пічіа, актиноміцети, клювероміцети, шизосахароміцети, кандиди, триходерма, нейроспора й гіфоміцети, такі як нейроспора, пеніцил, толіпокладіум і аспергіли), трансформовані за допомогою рекомбінантних векторів експресії дріжджів, що містять послідовності, що кодують антитіла; клітинні системи комах, інфіковані рекомбінантними векторами експресії вірусу (наприклад, бакуловірусу), що містять послідовності, що кодують антитіла; рослинні клітинні системи, інфіковані рекомбінантними векторами експресії вірусу (наприклад, вірус мозаїки кольорової капусти, Самум; або вірус тютюнової мозаїки, ТММ) або трансформовані векторами експресії рекомбінантної плазміди (наприклад, плазміди Ті), що містять послідовності, що кодують, антитіла; або ж клітинні системи ссавців (наприклад, клітини СО5, СНО, ВНК, 293 або 313), що несуть рекомбінантні конструкції експресії, що містять промотори, одержані з генома клітин ссавців (наприклад, промотор металотіонеїну) або з вірусів ссавців (наприклад, пізній промотор аденовірусу або 7.БК промотор вірусу осповакцини).
Вектори експресії для використання в прокаріотичних клітинах-реципієнтах звичайно включають один або декілька фенотипічних селектованих маркерних генів. Фенотипічний селектований маркерний ген, наприклад, являє собою ген, що кодує білок, який забезпечує стійкість стосовно антибіотиків або задовольняє аутотрофним вимогам. До прикладів придатних для використання векторів експресії для прокаріотичних клітин-реципієнтів належать вектори, одержані на основі комерційно доступних плазмід, наприклад, серії векторів ркКк223-3 (Рпаптасіа Ріпе Спетісаі5, Оррзаїа, Змедеп), раємМІ (Рготеда Віоїєс, Мадібзоп, ММ), реї (Момадеп, Мадізоп, УМІ) ії РЕТ (Момадеп, Мадізоп, У) і РЕЗЕТ (Іпмігодеп, Сагізраайд, СА) (5 їщшайїег, У
МОЇ Віо! 219:37 (1991); і Зспоеріег, Сепе 124:83 (1993)). До промоторних послідовностей, які звичайно використовуються для рекомбінантних векторів експресії прокаріотичних клітин- реципієнтів, належать 17, (Козепбего еї аї., бепе 56:125 (1987)), В-лактамаза (пеніциліназа), бо промоторна система лактози (Спапо еї а!., Маїшиге 275:615 (1978); і соеаавеї! еї аї., Майте 281:544
(1979)), промоторна система триптофану (Тгр) (Соедаеї еї аї., Мис! Асій5 Ке5 8:4057 (1980)), і
Тас-промотор (Затьгоок еї аїЇ., Моїесшаг СіІопіпо, А І арогафогу Мапааї, 2па ей., Соїа Зргіпд Нагбог
І арогаїогу (1990)).
У дріжджових векторах часто присутні послідовність точки початку реплікації, наприклад, від плазміди дріжджів 2н, автономно реплікована послідовність (АК5), область промотору, послідовності поліаденілування, послідовності припинення транскрипції й ген селектованого маркера. До придатних промоторних послідовностей для векторів дріжджів, серед інших, належать промотори металотіонеїну, 3-фосфогліцераткінази (Нілетап еї аї.,, У Віої Спет 255:2073 (1980)) або інші гліколітичні ферменти (Нойапа еї аї., Віоспет 17:4900 (1978), наприклад енолаза, гліцеральдегід-З-фосфатдегідрогеназа, гексокіназа, піруватдекарбоксилаза, фосфофруктокіназа, глюкозо-6-фосфатізомераза, 3- фосфогліцератмутаза, піруваткіназа, триозофосфатізомераза, фосфоглюкозоіїзомераза й глюкокіназа. Інші придатні вектори й промотори для використання в експресії дріжджів докладно описані в роботі ЕРіІеег еї аїЇ,, Сепе 107:285 (1991). Інші придатні промотори й вектори для дріжджів і протоколів трансформації дріжджів добре відомі фахівцям в галузі. Протоколи трансформації дріжджів також добре відомі. Один з таких протоколів описаний в Ніппеп еї аї.,
Ргос Маї! Асай 5сі 75:1929 (1978), де проводиться відбір трансформантів Тгр" у селективному середовищі.
Застосовна будь-яка клітинна культура еукаріотів, як з культури хребетних, так і безхребетних. До прикладів клітин безхребетних належать клітини рослин і комах (І исКоу»у єї аї.,
Віо/Тесппоїоду 6:47 (1988); Міїег єї аї!., Сепеїїс Епдіпеегіпду, Зейому єї аї., едв., мої. 8, рр. 277-9,
Ріеєпит Рибіїхпіпд (1986); і Маєда еї аї., Мате 315:592 (1985)). Наприклад, для продукції гетерологічних білків можуть використовуватися бакуловірусні системи. У системі комах вірус ядерного поліедрозу Ашодгарна саїйогпіса (АСМРМУ) може використовуватися як вектор для експресії чужорідних генів. Вірус росте в клітинах б5родорієга пидірегда. Кодуюча послідовність антитіла може клонуватися під контролем промотору АсМРМ (наприклад, промотору поліеєдрину). До інших встановлених реципієнтів належать Аеде5, Огозорпйа теїаподабвіє!" і
Вотрбрух тотгі. Широко доступні різноманітні вірусні штами для трансфекції, наприклад варіант І - 1 АсМРМ і штам Вт-5 Вотрух тогі МРМ. Крім того, як відомо фахівцям в галузі, клітинні
Зо культури рослин, наприклад бавовни, кукурудзи, картоплі, соєвих бобів, петунії, помідорів і тютюну, також можуть використовуватися як реципієнти.
Використання клітин хребетних і розмноження клітин хребетних у клітинній культурі (культурі тканин) може являти собою стандартну процедуру, хоча в реальності й існують примхливі лінії клітин, які вимагають, наприклад, спеціалізованого середовища з унікальними факторами, живильними клітинами та ін., див. Тізвце СиПйиге, Кгиве єї аї., ед5., Асадетіс Ргев5 (1973).
Приклади придатних для використання ліній клітин-реципієнтів ссавців включають клітини нирок мавпи; клітини мезонефроса людини; клітини нирок новонародженого хом'ячка; клітини яєчників китайського хом'ячка/-ОНЕК (СНО, Шпашрб еї аї., Ргос Май! Асад 5сі ОБА 77:4216 (1980)); мишачі клітини Сертолі; клітини карциноми шийки матки людини (наприклад, НеїГа); клітини нирок собаки; клітини легені людини; клітини печінки людини; клітини пухлини молочної залози мишей і клітини М5О.
Клітки-реципієнти трансформують за допомогою векторів для продукції антитіл і культивують у стандартному живильному середовищі, що містить фактори росту, вітаміни, мінеральні речовини та ін., а також індуктори, що придатні для використовуваних клітин і векторів. Широко застосовувані послідовності промотору й послідовності енхансера одержують із вірусу поліоми, аденовірусу 2, вірусу мавп 40 (5М40) і цитомегаловірусу людини (СММ).
Послідовності ДНК, одержані з вірусного генома 5М40, можуть використовуватися для підготовки інших генетичних елементів для експресії структурної генетичної послідовності в клітинах-реципієнтах ссавців, наприклад послідовності, одержаних з 5М40, ранніх і пізніх промоторів, енхансера, сайтів сплайсингу й поліаденілування. Вірусні ранні й пізні промотори особливо зручні, оскільки й той, і інший досить просто одержати з вірусного генома у вигляді фрагмента, який також може містити вірусну точку початку реплікації. У продажі є комерційно доступні стандартні вектори експресії для використання в клітинах-реципієнтах ссавців.
Для культивування клітин-реципієнтів придатні комерційно доступні середовища, наприклад середовище Хема Е10, мінімальне підтримуюче середовище (МЕМ), КРМІ-1640 і модифіковане середовище Дульбеко-Ігла (ОМЕМ). Крім того, будь-яке середовище з описаних в Нат еї аї.,
Ме Еплгутої 58:44 (1979) і Вагпез еї аї., Апа! Віоспет 102:255 (1980), і в патентах США МоМо 4767704; 4657866; 4560655; 5122469; 5712163 або 6048728, може використовуватися як культуральне середовище для клітин-реципієнтів. Кожне із цих середовищ може при бо необхідності бути доповнене гормонами й/або іншими факторами росту (такими як інсулін, 5О0 трансферин або епідермальний фактор росту), солями (наприклад, хлоридами, зокрема, хлоридами натрію, кальцію або магнію; і фосфатами), буферами (наприклад, НЕРЕФЗ5), нуклеотидами (наприклад, аденозин і тимідин), антибіотиками, мікроелементами (які визначаються як неорганічні сполуки, звичайно присутні в кінцевих концентраціях, що лежать у мікромолярному діапазоні), а також глюкозою або еквівалентним їй джерелом енергії. Залежно від поставленої мети можуть включатися й будь-які інші необхідні добавки у відповідних концентраціях. Умови культивування, наприклад температура, рН та ін., як відомо фахівцям в галузі, придатні для клітин і забезпечують бажану експресію трансгену.
За допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям в галузі, можна одержати полінуклеотиди, що представляють інтерес, й визначити нуклеотидну послідовність таких полінуклеотидів. Наприклад, якщо відома нуклеотидна послідовність антитіла, полінуклеотид, що кодує антитіло, може бути складений з хімічно синтезованих олігонуклеотидів (наприклад, як це описано в Киїтеїег еї аї., Віо/Тесппідоез 17:242 (1994)), а потім пов'язані з лігандами полінуклеотиди ампліфікують, наприклад, за допомогою ПЛР.
Альтернативно можна створити полінуклеотид, що кодує антитіло, з нуклеїнової кислоти, яку експресує та або інша клітина. Якщо клон, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує конкретне антитіло, недоступний, але послідовність молекули антитіла відома, нуклеїнову кислоту, що кодує імуноглобулін, можна одержати з придатного джерела, наприклад бібліотеки, яка може бути специфічною для продукуючих антитіло клітин, наприклад клітин гібридоми, відібраних для експресії антитіла згідно з даним винаходом. Для ПЛР-ампліфікації можуть бути підготовлені придатні праймери. Ампліфіковані нуклеїнові кислоти, одержані за допомогою ПЛР, можуть потім клонуватися в репліковані вектори клонування за допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям в галузі.
Після того як нуклеотидна послідовність і відповідна послідовність антитіла встановлені, можливі маніпуляції з нуклеотидною послідовністю антитіла, для того, щоб одержати еквіваленти, що представляють інтерес, описані в даному винаході, з використанням методів маніпуляції нуклеотидними послідовностями, які відомі фахівцям в галузі, наприклад, методики рекомбінантної ДНК, сайт-спрямований мутагенез, ПЛР та ін. (див., наприклад, Ззатьгоок еї аї.,
Моїіесшіаг Сіопіпа, А І арогаїогу Мапиаї, 2па ед., Соїа Зргіпд Нагбог І арогайогу (1990); і Аизибеї еї а!., ед5., Сигтепі Ргоїосої5 іп МоЇесціаг Віоіоду, хУопп Уміеу 5 5оп5 (1998), для того, щоб одержати антитіла, що містять різні амінокислотні послідовності, наприклад, для проведення заміщень, делецій і/або вставок амінокислот.
Амінокислотна послідовність важкого й/або легкого ланцюгів варіабельного домену може аналізуватися на предмет ідентифікації послідовностей СОК за допомогою добре відомих методів, наприклад, зіставленням з відомими амінокислотними послідовностями інших важких і легких ланцюгів варіабельних областей, для того, щоб визначити області гіперваріабельності послідовності. Застосовуючи стандартні методики рекомбінантної ДНК, можна ввести одну або декілька СОРК у каркасні ділянки, наприклад у каркасні ділянки білка людини, для того, щоб гуманізувати нелюдське антитіло, як описано вище. Полінуклеотид, що представляє інтерес, одержаний за рахунок комбінації каркасних ділянок і однієї або декількох СОК, кодує антитіло, яке специфічно зв'язує СХСНК5 або щонайменше його ЕЮ домен. Такі методи, наприклад, можуть використовуватися для проведення замін або делецій амінокислот для одного або декількох цистеїнових залишків варіабельної області, які беруть участь в утворенні внутрішньоланцюжкового дисульфідного зв'язку, для того, щоб одержати молекулу антитіла без одного або декількох внутрішньоланцюжкових дисульфідних зв'язків.
Антитіла або фрагменти антитіла згідно з даним винаходом можуть бути використані для виявлення СХСК»5, а виходить, і клітин, експресуючих СХСОСК5, у біологічному зразку як /л Уго, так і /л умо. В одному із прикладів здійснення антитіло до СХСК5 згідно з даним винаходом використовується, для того щоб встановити присутність і рівень СХСК5О у тканинах або в клітинах, виділених із тканини. Рівні СХСК5 у тканині або зразку біопсії можна визначати, наприклад, за допомогою імуноаналізу для антитіл або фрагментів антитіл згідно 3 даним винаходом. Тканина або проба її біопсії можуть заморожуватися або фіксуватися. Такі ж або інші методи можуть використовуватися, щоб встановити інші властивості СХСК5, наприклад його рівень, клітинну локалізацію, рівні мРНК, їхні мутації та ін.
Описаний вище спосіб, наприклад, може використовуватися для діагностики раку в пацієнта, у якого підтверджений або підозрюється рак, при цьому рівень СХСК5, реєстрований у зазначеного пацієнта, зіставляється з нормальним рівнем здоровішого пацієнта або зі стандартом. Розглянутий аналіз також може використовуватися для діагностики артриту або інших аутоїмунних захворювань, для яких характерна інфільтрація й концентрація В-клітин бо поряд з розвитком диференційованої лімфоїдної тканини.
У даному винаході також пропонуються моноклональні антитіла, гуманізовані антитіла і їх фрагменти, що зв'язують епітопи, в які вводиться мітка для наступного використання в дослідницьких або діагностичних додатках. У деяких прикладах здійснення мітка є радіоактивною, також як мітка використовується флуорофор, хромофор, контрастний агент або іон металу.
Пропонується також спосіб діагностики, в якому зазначені мічені антитіла або їх зв'язуючі епітоп фрагменти вводяться пацієнтові, у якого підозрюється рак, артрит, аутоїмунне захворювання або інші пов'язані з СХСЕ5 хвороби, і вимірюється або відслідковується розподіл мітки в організмі пацієнта.
Антитіла або їх фрагменти, пропоновані в даному винаході, можуть використовуватися як агенти для афінного очищення. У цьому процесі антитіла іммобілізують на твердій фазі, наприклад смолі з декстраном або агарозою, або на фільтрувальному папері, за допомогою методів, відомих фахівцям в галузі. Іммобілізоване антитіло обробляється зразком, що містять
СХСР5 або несучі його клітини, які піддаються очищенню, після чого основу промивають придатним розчинником, який вилучить практично весь матеріал зі зразка, крім СХСК5 або клітин, які піддаються очищенню, оскільки вони пов'язані з іммобілізованим антитілом, яке становить інтерес згідно з даним винаходом. Нарешті, основу промивають іншим придатним розчинником, таким як гліциновий буфер, рН 5,0, який забезпечує вивільнення СХСК5 або клітин від зв'язку з розглянутим антитілом.
Для діагностичних додатків розглянуте антитіло, як правило, буде позначатися контрастною речовиною. Існує безліч різних міток, які, у цілому, можна згрупувати в наступні категорії: (а) радіоїзотопи, наприклад 965, 140, 125І, ЗН ї 191І (антитіло може позначатися радіоіїзотопом на основі методик, наприклад методик, описаних у роботі Ситепі Ргоїосої5 іп Іттипоїіоду, мої. 12,
Соїїдеп еї аї., єд., УМіПеу-Іпіегосіепсе, Мем МогКк (1991), і радіоактивність може вимірюватися на основі сцинтиляційного рахунку); (б) флуоресцентні мітки, наприклад хелати рідкісноземельних металів (хелати європія), флуоресцеїн і його похідні, родамін і його похідні, дансил, лісамін, фікоеритрин і техаський червоний, флуоресцентні мітки можуть кон'югуваться з антитілом за допомогою методики, викладеної, наприклад, в Сигтепі Ргоїосої5 іп Іттипоїіоду, як згадувалося вище, причому флуоресценція може кількісно визначатися за допомогою флуориметра; і (в)
Зо доступні також мітки у вигляді субстратів різних ферментів (патент США Мо 4275149 містить огляд), причому фермент, як правило, каталізує хімічну трансформацію хромогенного субстрату, що може визначатися за допомогою різних методик, наприклад, фермент може каталізувати зміну кольору субстрату, що може реєструватися спектрофотометрично, або ж фермент може впливати на флуоресценцію або хемілюмінесценцію субстрату. Добре відомі методи кількісного визначення зміни флуоресценції, наприклад, за допомогою люмінометра, або ж реєстрації передачі енергії від мітки флуоресцентному акцептору. До прикладів ферментативних міток належать люциферази (наприклад люцифераза світлячка й бактеріальна люцифераза; о патент США Мо 4737456) люциферин, 2,3-дигідрофталазиндіони, малатдегідрогеназа, уреаза, пероксидаза, наприклад, пероксидаза, така як пероксидаза хрону (НКРО), лужна фосфатаза, Д-галактозидаза, глюкоамілаза, лізоцим, сахаридоксидази (наприклад глюкозоксидаза, галактозоксидаза Й глюкозо-6б-фосфатдегідрогеназа), гетероциклічні оксидази (наприклад уриказа й ксантиноксидаза), лактопероксидаза, мікропероксидаза та ін. Методики кон'югування ферментів з антитілами описані в О'зШиПмап еї а|., Мей Епг, єд. І апдопе 5 Мап МипакКі5, Асадетіс Ргез55, Мем МоК, 7З (1981).
На випадок використання таких міток існують придатні субстрати, наприклад: (ї) для пероксидази хрону з перекисом водню як субстрату, причому перекис водню окиснить попередник барвника (наприклад, ортофенілендіамін (ОРБ) або 3,3,5,5- тетраметилбензидингідрохлорид (ТМВ)); (її) для лужної фосфатази (АР) як хромогенний субстрат виступає п-нітрофенілфосфат; і (ії) для В-Ю-галактозидази (8-О0-Саї) використовується хромогенний субстрат (наприклад, п-нітрофенил-В-ЮО-галактоза) або флуорогенний субстрат, наприклад 4-метилумбеліферил-В-ЮО-галактозидаза.
Кваліфікованим фахівцям в галузі доступні й інші комбінації фермент-субстратів. Загальний огляд див. у патентах США Мо 4275149 і 4318980.
У деяких випадках мітка непрямим чином кон'югується з антитілом. Наприклад, антитіло може кон'югуватися з біотином, і кожний із зазначених вище репортерів може кон'югуватися з авідином або навпаки. Біотин селективно зв'язується з авідином, і в цих умовах мітка може опосередковано кон'югуватися з антитілом. В альтернативному варіанті для одержання непрямої кон'югації мітки антитіло зв'язується з невеликим гаптеном (наприклад, дигоксином), і один з різних видів міток або репортерів, зазначених вище, кон'югується з антитілом анти-
дигоксину. Таким чином, використовуючи друге антитіло, можна провести непряму кон'югацію мітки з антитілом або мутеїном.
В іншому прикладі здійснення винаходу в антитіло необов'язково вводиться мітка, і її наявність може реєструватися за допомогою іншої форми другого антитіла-міченого антитіла, яке зв'язується з розглянутим антитілом.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть використовуватися в будь-якому відомому методі аналізу, наприклад аналізі конкурентного зв'язування, прямих і непрямих сандвіч-аналізах і аналізах імунопреципітації. 20Їа, Мопосіопа! Апіїродієх: А Мапиаї ої Тесппідцез (СКС Ргез5, Іпс. 1987).
Аналіз конкурентного зв'язування спирається на здатність міченого стандарту конкурувати з випробовуваним зразком у процесі зв'язування з обмеженою кількістю антитіла. Кількість антигену у випробовуваному зразку зворотно пропорційна кількості стандарту, який зв'язується з антитілами. Щоб спростити визначення кількості стандарту, який виявляється зв'язаним, антитіла, як правило, до або після конкурентної взаємодії переводять у нерозчинну форму. У результаті стандартний і випробовуваний зразки, які пов'язані з антитілами, можуть без праці відділятися від стандарту й випробовуваного зразка, які залишаються незв'язаними.
Сандвіч-аналіз припускає використання двох антитіл, кожне з яких у стані зв'язуватися з різними імуногенними частинами, детермінантами або епітопами, мішені, яка детектується. У сандвіч-методі випробовуваний зразок, зв'язується з першим антитілом, прямо або побічно іммобілізованим на твердій основі, після чого друге антитіло, позначене прямим або непрямим чином, зв'язується із зафіксованим випробовуваним зразком, тим самим утворюючи нерозчинний тричастковий комплекс, див., наприклад, патент США Мо 4376110. Друге антитіло може бути саме по собі позначене реєстрованою міткою (прямій сандвіч-метод) або може детектуватися з використанням антиімуноглобулінового антитіла або іншого придатного компонента зв'язаної пари (наприклад, антитіло/антиген, рецептор/ліганд, фермент/субстрат), який позначений детектованою міткою (непрямий сандвіч-метод). Наприклад, одним з видів сандвіч-аналізу є метод ЕГІЗА, у цьому випадку як детектована мітка виступає фермент.
Для цілей імуногістохімії зразок клітин або тканин може бути свіжовиробленим або замороженим, або ж може бути внесений у парафін і фіксований консервантом, наприклад,
Зо формаліном.
Антитіла можуть також використовуватися в методах діагностики /л у/уо. Як правило, у мутант антитіла вводиться радіонуклідна мітка (наприклад, "п, 99Тс, 120, 191І, ЗН, 32Р або 555), для того, щоб сайти, які експресують СХСК5, можна було б локалізувати з використанням імуносцинтиграфії.
В об'єм даного винаходу також входять набори, наприклад, що включають антитіла, їх фрагменти, гомологи, їх похідні та ін., такі як мічені або цитотоксичні кон'югати, а також інструкції із застосування антитіла, кон'югата для знищення певних видів клітин та ін. В інструкціях можуть знаходитися вказівки по використанню антитіла, кон'югату та ін. /л Уго, /п мімо або ех мімо. Антитіло може знаходитися в рідкій або твердій формі, як правило, ліофілізованій. Набір може містити інші придатні реагенти, наприклад буфер, відновлювальний розчин і інші необхідні інгредієнти для передбачуваного використання. Передбачається, що набір буде являти собою упаковану комбінацію реагентів у заздалегідь встановлених кількостях з інструкціями з їхнього застосування, наприклад, у лікувальних цілях для проведення діагностичних аналізів. Якщо в антитіло вводиться мітка, наприклад ферменту, набір може включати субстрати й кофактори, необхідні для ферменту (наприклад, попередник субстрату, який забезпечує утворення реєстрованого хромофору або флуорофору). Крім того, у набір можуть включатися інші добавки, наприклад стабілізатори, буфери (наприклад, блок-буфер або лізисний буфер) та ін. Відносні кількості різних реагентів можна міняти, для того, щоб у наборі були присутні концентрати розчинів реагентів, що забезпечує користувачеві гнучкість, економію місця, реагентів та ін. Реагенти можуть поставлятися у вигляді сухих порошків, звичайно ліофілізованих, разом з наповнювачами, які після розчинення утворюють розчин реагенту в належній концентрації.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути використані для лікування ссавців. В одному із прикладів здійснення антитіло або його еквівалент, що представляють інтерес, вводяться ссавцеві, крім людини, наприклад, з метою одержати доклінічні дані. До прикладів ссавців, крім людини, які можуть одержувати препарат, належать нелюдиноподібні примати, собаки, кішки, гризуни й інші ссавці, на яких проводяться доклінічні дослідження. Такими ссавцями можуть бути апробовані моделі тварин для тієї або іншої хвороби, яку передбачається лікувати за допомогою антитіла, або ж вони можуть використовуватися для вивчення токсичності розглянутого антитіла. У кожному з таких прикладів здійснення для ссавця можуть проводитися дослідження наростаючої дози.
Як лікарський препарат може використовуватися антитіло в присутності або за відсутності другого компонента, наприклад терапевтичної функції, кон'юЮгованої з ним, вводиться без добавок або в комбінації із цитотоксичним фактором (факторами). Даний винахід присвячений терапії антитілами, яка припускає введення антитіл згідно з даним винаходом тварині, ссавцеві або людині для лікування опосередкованих СХСК5 хвороб, порушень або патологічних станів.
Твариною або пацієнтом може бути ссавець, що потребує конкретного лікування, такий як ссавець із поставленим діагнозом конкретного порушення, наприклад, викликаного СХОК5.
Антитіла, спрямовані проти СХСК»5, придатні для використання, наприклад, для профілактики або лікування артриту, запальних захворювань у цілому, відторгнення трансплантату, раку й аутоїмунних розладів. Наприклад, за допомогою введення терапевтично прийнятної дози антитіла до СХСМК5 згідно з даним винаходом або суміші різних антитіл згідно з даним винаходом, або їх еквівалентів, або в комбінації з іншими антитілами з різних джерел, у ссавця, що одержує лікування, особливо, людини, можна зм'якшити симптоми захворювання або запобігти їх прояву.
Лікувальні препарати згідно з даним винаходом включають, серед інших, антитіла згідно з даним винаходом (у тому числі їх фрагменти, аналоги, еквіваленти й похідні, як описано в даному документі), і нуклеїнові кислоти, що кодують антитіла згідно 3 даним винаходом, які описані в даному документі (у тому числі їх фрагменти, аналоги й похідні), а також антиідіотипічні антитіла, які описані в даному документі. Антитіла згідно з даним винаходом можуть використовуватися для лікування, придушення або профілактики захворювань, порушень або патологічних станів, пов'язаних з аберантною експресією й/або активністю
СХ, у тому числі, серед інших, якого-небудь одного або декількох захворювань, порушень або патологічних станів, які описані в даному документі. Лікування й/або профілактика захворювань, порушень або патологічних станів, пов'язаних з аберантною експресією й/або активністю СХСК»5, включає, серед інших, пом'якшення щонайменше одного симптому таких захворювань, порушень або патологічних станів. Антитіла згідно з даним винаходом можуть поставлятися у формі фармацевтично прийнятних складів, які відомі фахівцям в галузі або
Зо описані в даному документі. Термін «фізіологічно прийнятний», «фармацевтично прийнятний» та ін. означає затверджений розпорядчим органом федерального уряду або уряду штату або внесений у Фармакопею США або іншу загальноприйняту фармакопею для використання на тваринах і, особливо, на людині.
Антитіло до СХСН5 може вводитися ссавцеві будь-яким прийнятним способом. До методів введення, серед інших, належать парентеральний, підшкірний, внутрішньоочеревинний, внутрішньолегеневий, інтраназальний, епідуральний, інгаляція й оральні шляхи, а також, якщо це бажано у випадку імунодепресивного лікування, передбачається введення усередину враженої ділянки. Парентеральні вливання включають внутрішньом'язове, внутрішньошкірне, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне або внутрішньоочеревинне введення. Антитіла або склади можуть вводитися будь-яким придатним способом, наприклад вливанням або болюсною ін'єкцією, абсорбцією через епітеліальні або шкірно-слизові оболонки (наприклад, слизова ротової порожнини, слизова прямої кишки й кишечнику та ін.) і можуть вводитися разом з іншими біологічно-активними агентами. Введення може бути системним або локальним. Крім того, може бути бажано вводити терапевтичні антитіла або склади згідно з даним винаходом в центральну нервову системи будь-яким зручним методом, у тому числі за допомогою інтравентрикулярної ін'єкції й ін'єкції ов порожнину хребетного каналу; причому інтравентрикулярній ін'єкції може сприяти інтравентрикулярний катетер, наприклад, з'єднаний з резервуаром, наприклад з резервуаром Оммайа. Крім того, антитіло зручно вводити імпульсними вливаннями, особливо у випадку доз антитіла, що знижуються. Переважно, дозування проводиться ін'єкцією, переважно за допомогою внутрішньовенних або підшкірних ін'єкцій, частково залежно від того, чи носить введення короткочасний або тривалий характер.
Відомі інші різні системи доставки, і вони можуть використовуватися для введення антитіла згідно з даним винаходом, наприклад інкапсуляція в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули (див. І апдег, Зсіепсе 249:1527 (1990); Тгеаї еї аї., в Гірозотез іп те Тпегару ої Іптесіби5 Оізеавзе апа Сапсег; І оре;-Вегезівїп еї аї!., єд5., р. 353-365 (1989); і І оре7-Вегевівїп, там же, р. 317-327), а також рекомбінантні клітини, здатні експресувати сполуку, опосередкований рецепторами ендоцитоз (див., наприклад, УМи еї аї., У Віої Спет 262:4429 (1987)); конструювання нуклеїнової кислоти в рамках ретровірусного або іншого вектора та ін.
Активні інгредієнти можуть також захоплюватися у виготовлені мікрокапсули, наприклад, за бо допомогою методик коацервації або міжфазної полімеризації, наприклад мікрокапсули гідрокисметилцелюлози або желатину й мікрокапсули поліметилметакрилату, відповідно, у колоїдні системи доставки ліків (наприклад, ліпосоми, мікросфери альбуміну, мікроемульсії, наночастинки й нанокапсули) або в макроемульсії. Такі методики описані в Кептіпдіоп'є
Ріпаптасеціїіса! бсіепсез, 161й єдйоп, А. Озаї, Ес. (1980).
Може також застосовуватися пульмональна доставка, наприклад, з використанням інгалятора або аерозольного апарата, а також складу, що містить агент для переведення в аерозоль. Антитіло також може вводитися в легені пацієнта у формі сухого порошкового складу, див., наприклад, патент США Мо 6514496.
В одному з конкретних прикладів здійснення може бути бажано вводити лікувальні антитіла або склади згідно з даним винаходом місцево, у зону, яка потребує лікування; цього можна домогтися різними методами, наприклад, серед інших, місцевим вливанням, топікальним застосуванням, за допомогою ін'єкції, катетера, за допомогою супозиторія або імпланта, причому зазначений імплант може мати пористий, непористий або желатиноподібний матеріал, у тому числі являти собою мембрану, наприклад силастикову мембрану або волокна.
Переважно при введенні антитіла згідно з даним винаходом намагатися використовувати матеріали, які не адсорбують і не абсорбують білок.
У ще одному прикладі здійснення антитіло може доставлятися в системі контрольованого вивільнення. В одному із прикладів здійснення може використовуватися насос (див. Іапдег,
Зсієпсе 249:1527 (1990); Зепоп, САС Сіїї Веї Віотей Епд 14:201 (1987); Виспмайа еї аї., Зигдегу 88:507 (1980); ії Зацаек еї аІ., М Епо! У Мей 321:574 (1989)). В іншому прикладі здійснення можуть застосовуватися полімерні матеріали (див. Медіса! Арріїсайоп5 ої СопігоПей Кеїеавзе,
І апдег єї аї., єд5., САС Ргевзв (1974); СопігоПей Огид Віоамайаріїйу, Огид Ргодисі Оезідп апа
Репоптапсе, Зтоїеп еї аї., едв., УМіІеу (1984); Наподег вї аї., У Масготої сі Вем Мастотої Спет 23:61 (1983); див. також І ему еї аїЇ., 5сіеєпсе 228:190 (1985); Оигіпу еї аІ., Апп Мешго! 25:351 (1989); ї Ноугага еї аї., У Меигозигуд 71:105 (1989)). У ще одному прикладі здійснення система контрольованого вивільнення може розміщатися в безпосередній близькості від терапевтичної мішені.
Лікувальні препарати поліпептиду або антитіла можуть готуватися для зберігання у формі ліофілізованих складів або водних розчинів за допомогою змішування поліпептиду бажаного
Зо ступеня чистоти з можливими «фармацевтично прийнятними» носіями, розчинниками, наповнювачами або стабілізаторами, які звичайно використовуються в галузі, наприклад буферними реагентами, стабілізуючими реагентами, консервантами, ізотоніфікаторами, неїоногенними детергентами, антиоксидантами й іншими різноманітними добавками, див.
Ветіпдіюоп'є РНаптасеціїса! Зсієпсе5, 161й єйд., О50їЇ, ей. (1980). Такі добавки, як правило, нетоксичні для організму реципієнтів у застосовуваних дозах і концентраціях, а отже, наповнювачі, розріджувачі, носії та ін. є фармацевтично прийнятними. «Виділене», або «очищене» антитіло не містить істотної кількості клітинного матеріалу або інших забруднюючих білків із клітинного або тканинного джерела, або середовища, з якого одержаний білок, або не містять істотної кількості хімічних попередників або інших хімічних речовин при одержанні шляхом хімічного синтезу. Вираз «не містять істотної кількості клітинного матеріалу» включає препарати антитіла, в яких даний поліпептид/білок відділений від клітинних компонентів клітин, з яких він виділений або одержаний при рекомбінації. Таким чином, антитіло, що не містить істотної кількості клітинного матеріалу, включає препарати антитіла, що містять менше ніж приблизно 30 95, 20 95, 10 95, 5 95, 2,5 Ую або 1 95 (сухої ваги) забруднюючого білка. У тому випадку, коли антитіло одержане за допомогою рекомбінантних методик, також переважно, щоб воно не містило істотної кількості культурального середовища, тобто якщо культуральне середовище становить менше ніж приблизно 20 95, 10 95, 5 9в, 2,5 90 або 1 95 від об'єму препарату білка. У тому випадку, коли антитіло одержують хімічним синтезом, переважно, щоб воно не містило істотної кількості хімічних попередників або інших хімічних речовин і реагентів, тобто щоб розглянуте антитіло було відділено від хімічних попередників або інших хімічних речовин, використаних у синтезі білка. Відповідно, такі препарати антитіла містять менше ніж приблизно 30 95, 20 95, 10 9о, 5 95 або 1 95 (сухої ваги) хімічних попередників або хімічних речовин, відмінних від розглянутого антитіла. У переважному прикладі здійснення даного винаходу проводиться виділення або очищення антитіл.
Наведений в даному документі вираз «від низьких до невизначуваних рівнів агрегування» стосується зразків, що містять не більше 5 95, не більше 4 95, не більше З 95, не більше 2 95, не більше 1 95 і часто не більше 0,5 95 агрегатів по вазі білка, що визначається, наприклад, високоефективною гель-проникаючою хроматографією (ВЕГПХ).
Використовуваний у даному документі термін «від низьких до невизначуваних рівнів 60 фрагментації» стосується зразків, що містять не менше 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 98 95 або 99 95,
сумарного білка, наприклад, в одному піку, що визначається ВЕГПХ, або в 2 (двох) піках (важкий ланцюг і легкий ланцюг), що визначаються, наприклад, за допомогою відновного капілярного гель-електрофорезу (ГОСЕ) і не місять інших одиничних сигналів з більше 5 95, більше 4 905, більше 3 95, більше 2 95, більше 1 95 або більше 0,5 95 сумарного білка кожний.
Використовуваний у даному документі термін ГССЕ стосується капілярного гель-електрофорезу в умовах відновлення, достатніх для відновлення дисульфідних зв'язків в антитілі або молекулі типу антитіла, або похідній молекулі.
Використовувані в даному документі терміни «стабільність» і «стабільний» у контексті рідкого препарату, що містить антитіло СХСК5 або його з'єднувальний фрагмент, належать до стійкості антитіла або його антигензв'язувального фрагмента в препараті до термічного або хімічного розгортання, агрегації, деградації або фрагментації в конкретних умовах виробництва, одержання, транспортування й зберігання. «Стабільні» препарати згідно з даним винаходом зберігають біологічну активність не менше ніж на 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 98 95, 99 95 або 99,5 905 в конкретних умовах виробництва, одержання, транспортування й зберігання. Стабільність зазначеного препарату антитіла може оцінюватися по ступеню агрегації, деградації або фрагментації із застосуванням методів, відомих кваліфікованим фахівцям в галузі, у тому числі, серед інших, ГСОЕ, гель-електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (505-РАСЕ) і ВЕГПХ, у порівнянні зі стандартом.
Термін «носій» стосується розріджувача, ад'юванту, наповнювача або носія, з яким вводиться лікарський препарат. Такими фізіологічними носіями можуть бути стерильні рідини, наприклад вода й масла, у тому числі нафтового, тваринного, рослинного або синтетичного походження, наприклад, арахісова олія, соєва олія, мінеральне масло, кунжутна олія й подібні до них масла. При внутрішньовенному введенні лікарського препарату придатним носієм є вода. Фізіологічні розчини й водні розчини одекстрози й гліцерину також можуть використовуватися як рідкі носії особливо для ін'єкційних розчинів. До придатних фармацевтичних наповнювачів належать крохмаль, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, борошно, крейда, силікагель, стеарат натрію, глицеринмоностеарат, тальк, хлорид натрію, сухе зняте молоко, гліцерин, пропіленгліколь, вода, етанол і подібні до них речовини.
Якщо бажано, склад може також містити невеликі кількості змочувальних речовин або
Зо емульгаторів, або буферних речовин для підтримки рН. Такі препарати можуть мати форму розчинів, суспензій, емульсій, таблеток, пігулок, капсул, порошків, препаратів з уповільненим вивільненням, депо і до них подібних. Склад може мати форму супозиторія зі стандартними сполучними й носіями, наприклад тригліцеридами. Препарати для перорального застосування можуть включати стандартні носії, такі як належні до фармацевтичної категорії манітол, лактоза, крохмаль, стеарат магнію, сахарин натрію, целюлоза, карбонат магнію та ін. Приклади придатних носіїв описані в "Кетіпдіоп'є Рпагтасецііса! Зсіепсе5," Мапйіп. Такі склади будуть містити ефективну кількість антитіла, переважно в очищеній формі, поряд з відповідною кількістю носія, для того, щоб забезпечити форму для належного введення пацієнтові. Як відомо фахівцям в галузі, склад буде створюватися таким чином, щоб відповідати способу введення.
Буферні реагенти допомагають підтримувати рН в інтервалі, який наближається до фізіологічних умов. Буфери переважно присутні в концентраціях в інтервалі від приблизно 2 мМ до приблизно 50 мМ. У якості придатних буферних реагентів згідно з даним винаходом можуть використовуватися як органічні, так і неорганічні кислоти і їх солі, наприклад цитратні буфери (наприклад, суміш мононатрію цитрат-динатрію цитрат, суміш лимонна кислота-тринатрію цитрат, суміш лимонна кислота-мононатрію цитрат та ін.), сукцинатні буфери (наприклад, суміш бурштинова кислота-мононатрію сукцинат, суміш бурштинова кислота-гідроксид натрію, суміш бурштинова кислота-динатрію сукцинат та ін.), тартратні буфери (наприклад, суміш винна кислота-натрію тартрат, винна кислота-калію тартрат, суміш винна кислота-гідроксид натрію та ін), фумаратні буфери (наприклад, суміш фумарова кислота-мононатрію фумарат, суміш фумарова кислота-динатрію фумарат, суміш мононатрію фумарат-динатрію фумарат та ін.), глюконатні буфери (наприклад, суміш глюконова кислота-глюконат натрію, суміш глюконова кислота-гідроксид натрію, суміш глюконова кислота-глюконат калію та ін.), оксалатні буфери (наприклад, суміш щавлева кислота-оксалат натрію, суміш щавлева кислота-гідроксид натрію, суміш щавлева кислота-оксалат калію та ін.), лактатні буфери (наприклад, суміш молочна кислота-лактат натрію, суміш молочна кислота-гідроксид натрію, суміш молочна кислота-лактат калію та ін.) і ацетатні буфери (наприклад, суміш оцтова кислота-ацетат натрію, суміш оцтова кислота-гідроксид натрію та ін.). Можуть застосовуватися фосфатні буфери, карбонатні буфери, гістидинові буфери, солі триметиламіну, наприклад, Тгі5, НЕРЕ5, а також інші подібні до них 60 відомі буфери.
Для вповільнення росту мікроорганізмів можуть додаватися консерванти, які можна використовувати в кількостях в інтервалі 0,2 95 - 1 95 (вага/об.). До консервантів, придатних для використання в даному винаході, належать фенол, бензиловий спирт, м-крезол, метилпарабен, пропілларабен, октадецилдиметилбензиламонійхлорид, галоїди бензалконію (наприклад хлорид, бромід і йодид), гексаметонійхлорид, алкілларабени, наприклад метил- або пропілпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол і З-пентанол.
Ізотоніфікатори вводяться, для того, щоб забезпечити фізіологічну ізотонічність рідких препаратів згідно з даним винаходом, до таких належать багатоатомні цукрові спирти, переважно, триатомні й більш високі цукрові спирти, наприклад гліцерин, еритритол, арабітол, ксилітол, сорбітол і манітол. Багатоатомні спирти можуть бути присутніми у кількостях від приблизно 0,1 95 до приблизно 25 9б, по вазі, переважно від 1 95 до 5 95 з урахуванням відносних кількостей інших інгредієнтів.
Стабілізаторами називають широку категорію наповнювачів, функції яких міняються від об'ємоутворюючих речовин до добавок, солюбілізуючих лікарський препарат або сприяючих попередженню денатурації або адгезії до стінок ємності. Як характерні стабілізатори можуть виступати багатоатомні цукрові спирти; амінокислоти, наприклад аргінін, лізин, гліцин, глутамін, аспарагін, гістидін, аланін, орнітин, І -лейцин, 2-фенілаланін, глутамінова кислота, треонін та ін., органічні цукри або цукрові спирти, наприклад лактоза, трегалоза, стахіоза, арабітол, еритритол, манітол, сорбітол, ксилітол, рибітол, міоінозитол, галактитол, гліцерин і до них подібні, у тому числі циклітоли, наприклад інозитол; полієтиленгліколь; полімери амінокислот; сірковмісні відновники, наприклад сечовина, глутатіон, липоєва кислота, тіогліколят натрію, тіогліцерин, а-монотіогліцерин і тіосульфат натрію; поліпептиди з низькою молекулярною вагою (тобто «10 залишків); білки, наприклад альбумін сироватки людини, альбумін бичачої сироватки, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, наприклад полівінілпіролідон, сахариди, моносахариди, наприклад ксилоза, маноза, фруктоза, глюкоза; дисахариди, наприклад лактоза, мальтоза й сахароза; трисахариди, наприклад рафіноза; полісахариди, наприклад декстран та ін. Стабілізатори присутні в інтервалі від 0,1 до 10000 вага/вага на одну частину активного білка.
До додаткових різних наповнювачів належать об'ємоутворювальні агенти (наприклад,
Зо крохмаль), хелатуючі агенти (наприклад, ЕОТА), антиоксиданти (наприклад, аскорбінова кислота, метіонін або вітамін Е) і допоміжні розчинники.
Наведені в даному документі склади також можуть містити більше одного активного компонента, якщо необхідно для індивідуальних показань при лікуванні, переважно компоненти, що мають взаємодоповнюючу активність, які не виявляють несприятливого впливу один на одного. Наприклад, може бути бажано додатково ввести імунодепресант. Подібні молекули належним чином присутні в складі в кількостях, які ефективні для передбачуваної мети.
Використовуваний у даному документі термін «поверхнево-активні речовини» стосується органічних сполук, що мають амфіпатичну структуру, а саме, що складаються із груп із протилежними характеристиками розчинності, як правило, з жиророзчинного вуглеводневого ланцюжка й водорозчинної іонної групи. Залежно від заряду поверхнево-активної групи поверхнево-активні речовини можуть підрозділятися на аніонні, катіонні й неїіоногенні.
Поверхнево-активні речовини часто застосовуються як змочувальні, емульгуючі, солюбілізуючі й диспергуючі агенти для різних лікарських складів і препаратів біологічних матеріалів.
Неіоногенні поверхнево-активні речовини або детергенти (також відомі як «змочувальні речовини») можуть додаватися для того, щоб сприяти солюбілізації лікарського засобу, а також щоб захистити лікарський білок від викликаного струшуванням агрегування, що також дозволяє піддавати склад впливу поверхневого зрушення, не викликаючи денатурації білка. До придатних неіоногенних поверхнево-активних речовин належать полісорбати (20, 80 та ін.), поліоксамери (184, 188 та ін.), поліоли Ріпгопіст і моноефіри поліоксіетиленсорбітану (ТМ/Е ЕМ-209), ТММЕЕМ- 809 та ін.). Неіоногенні поверхнево-активні речовини можуть бути присутніми у кількостях в інтервалі від приблизно 0,05 мг/мл до приблизно 1,0 мг/мл, переважно від приблизно 0,07 мг/мл до приблизно 0,2 мг/мл.
Використовуваний у даному документі термін «неорганічна сіль» стосується будь-якої сполуки, що не містить вуглецю, яка утворюється в результаті заміни частини або всіх кислих воднів або кислоти металом або групою, що виступає в якості металу, і часто використовуваному в якості речовини для коректування тонічності в лікарських складах і препаратах з біологічних матеріалів. Найпоширенішими неорганічними солями є Масі, Косі,
МангРох та ін.
У даному винаході пропонуються рідкі склади анти-СХСК5-зв'язувальної речовини або її фрагмента, що має рН у діапазоні від приблизно 5,0 до приблизно 7,0, або від приблизно 5,5 до 6,5, або від приблизно 5,8 до приблизно 6,2, або приблизно 6,0.
Даний винахід включає рідкі склади, що мають стабільність при температурах, характерних для комерційних холодильників і морозильників, які використовуються в кабінетах лікаря або лабораторіях, наприклад, від приблизно -20 "С до приблизно 5 "С, причому зазначена стабільність оцінюється, наприклад, високоефективною гель-проникаючою хроматографією (ВЕГПХ), для цілей зберігання, наприклад, протягом приблизно 60 днів, приблизно 120 днів, приблизно 180 днів, приблизно року, приблизно 2 років або більше. Рідкі склади згідно з даним винаходом також проявляють стабільність, яка оцінюється, наприклад, за допомогою ВЕГПХ, при кімнатних температурах щонайменше за декілька годин, наприклад однієї години, двох годин або приблизно трьох годин, до застосування.
В обсяг терміна «мала молекула» і аналогічних термінів, серед інших, входять пептиди, пептидоміметики, амінокислоти, аналоги амінокислот, полінуклеотиди, аналоги полінуклеотидів, нуклеотиди, аналоги нуклеотидів, органічні або неорганічні сполуки (наприклад, у тому числі гетероорганічні й/або металоорганічні сполуки), що мають молекулярну вагу менше ніж приблизно 10000 грам на моль, органічні або неорганічні сполуки, що мають молекулярну вагу менше ніж приблизно 5000 грам на моль, органічні або неорганічні сполуки, що мають молекулярну вагу менше ніж приблизно 1000 грам на моль, органічні або неорганічні сполуки, що мають молекулярну вагу менше ніж приблизно 500 грам на моль, а також солі, ефіри й інші фармацевтичні прийнятні форми таких сполук.
Тому, наприклад, у випадку раку антитіла згідно з даним винаходом можуть вводитися окремо або в комбінації з іншими препаратами для лікування раку, включаючи стандартні хіміотерапевтичні ліки (паклітаксель, карбоплатин, цисплатин і доксорубіцин), анти-ЕСЕК агенти (гефитиніб, ерлотиніб і цетуксимаб), антиангіогенні агенти (бевакузимаб і сунітиніб), а також імуномодулятори, наприклад інтерферон а і талідомид.
В іншому прикладі здійснення, у випадку ревматичних захворювань, наприклад ревматоїдного артриту (РА), може використовуватися комбінаційна терапія, що включає СХСК- зв'язувальну молекулу, що представляє інтерес. Наприклад, гуманізовані антитіла СХСВ5
Зо можна змішувати з малою молекулою наприклад, антиревматичним препаратом, що модифікує, у тому числі, серед інших, наприклад метотрексатом і інгібіторами синтезу піридину, наприклад лефлуномідом (Мадег 4 Кеузіопе, У Кпешт 34 Зирр (16-24) 2007, Само єї аІ., Ат У Неайй бувзі
Рпагт 63:2451-2465, 2006).
Оскільки різні форми СХОСК5-зв'язувальної молекули, що представляє інтерес, можуть і не приводити до виснаження В-клітин, розглянуту молекулу можна поєднувати з іншими ліками, що демонструють механізми дії, що перекриваються, щоб домогтися адитивного або синергічного результату. Тому, наприклад, другими ліками можуть бути ліки, що діють на рівні цитокіну в напрямку Т-клітин і пр.
Використовувані в даному винаході визначення «терапевтичний агент» і «терапевтичні агенти» належать до будь-якого агента (агентів), які можуть використовуватися при лікуванні, контролі й пом'якшенні захворювань, порушень, розладів та ін., пов'язаних з аберантними метаболізмом і активністю СХСЕ5 і/або СХСІ 13. Проявами цього можуть бути аномальні рівні
В-клітин або активність В-клітин. Сюди також входять відомі сполуки з фармакологічним ефектом при лікуванні порушень та ін., які пов'язані з аберантними метаболізмом і активністю
СХеН5 і/або СХСІ 13.
Крім того, антитіла згідно з даним винаходом можуть кон'югуватися з різними ефекторними молекулами, наприклад гетерологічними поліпептидами, ліками, радіонуклеотидами або токсинами, див., наприклад, УМО 92/08495; УМО 91/14438; УМО 89/12624; патент США Мо 5314995; і ЕРО 396387. Антитіло або його фрагмент можуть кон'югуватися з терапевтичним агентом, наприклад цитотоксином (наприклад цитостатичним або цитопатичним агентом), терапевтичним агентом або іоном радіоактивного металу (наприклад а-активним ізотопом, таким як 2ЗВі). До цитотоксинів або цитотоксичних агентів належать будь-які речовини, які впливають на клітини. До прикладів належать паклітаксол, цитохалазин В, граміцидин 0, етидий бромід, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин Ю, 1- дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин, а також їх аналоги або гомологи. До терапевтичних агентів, серед інших, належать антиметаболіти (наприклад, метотрексат, б-меркаптопурин, б-тіогуанін, цитарабін, 5- фторурацил і декарбазин), алкілуючі агенти (наприклад, мехлоретамін, хлорамбуцил, бо мельфалан, кармустин (В5МИ) і ломустин (ССМО), циклофосфамід, бусульфан, дибромманітол,
стрептозотоцин, мітоміцин С ії цис-дихлородіамінплатина (ІІ) (ОР) цисплатин), антрацикліни (наприклад, даунорубіцин, дауноміцин і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин, актиноміцин, блеоміцин, мітраміцин і антраміцин (АМС)), а також антимітотичні агенти (наприклад, вінкристин і вінбластин).
Методики кон'югації такої терапевтичної функції з антитілами добре відомі, див., наприклад,
Агпоп еї аї., в Мопосіопа! Апіїродієх апа Сапсег Тпегару, Кеїзтеїй еї аї. (едз5.), р. 243-56 Аап В.
ЇГїі55 (1985); Неїїбігот еї аї., в СопігоПей Огид Оєїїмегу, 2па єд., Нобіпзоп еї аї., едв., р. 623-53,
Магсе! ОекКег (1987); Тпогре, в Мопосіопа! Апііродіеє5 "84: Віоіодіса! Апа Сіїпіса! Арріїсайіоп5,
Ріпснега еї аї., єдв., р. 475-506 (1985); Мопосіопа! Апіїбодієз Рог Сапсег Оєїесіюп апа ТПегару,
Ваїдмі/іп еї аї!., еадв., р. 303-16, Асадетіс Ргез5 (1985); і Тпогре, сеї аї., Іттипої Кем 62:119 (1982).
Як альтернатива антитіло можна кон'югувати із другим антитілом з утворенням гетерокон'югату антитіла, наприклад біфункціонального антитіла, див., наприклад, патент США Мо 4676980.
Кон'югати згідно з даним винаходом можуть використовуватися для модифікації заданої біологічної відповіді, терапевтичний агент або лікарський препарат не повинні розглядатися, як такі, що обмежуються класичними хімічними терапевтичними агентами. Наприклад, як лікарська функція може виступати білок або поліпептид, що має бажану біологічну активність. До таких білків можуть, наприклад, належати токсин, такий як абрин, рицин А, екзотоксин псевдомонад або дифтеричний токсин; білок, наприклад фактор некрозу пухлини, а-інтерферон, |ВД- інтерферон, фактор росту нервів, тромбоцитарний фактор росту, активатор тканинного плазміногена, агент апоптозу, наприклад ТМЕ-а, ТМЕ-В, АІМ І (МО 97/33899), АІМ І (МО 97/34911), ліганд Раз (Такапахні еї аї., Іпї Іттипої, 6:1567 (1994)) МЕСЕ (МО 99/23105); тромботичний агент; антиангіогенний агент, наприклад ангіостатин або ендостатин; або модифікатори біологічної відповіді, наприклад лімфокіни, інтерлейкін-1 (ІІ -1), інтерлейкін-2 (ПІІ - 2), інтерлейкін-б (1-6), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (СМ-
С5Е), гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (СС5БЕ) або інші фактори росту.
Препарати для введення /л у//о повинні бути стерильними. Цього можна досягти, наприклад, фільтрацією через стерильні фільтрувальні мембрани. Наприклад, рідкі препарати згідно з даним винаходом можуть стерилізуватися фільтрацією через фільтр 0,2 мкм або 0,22
МКМ.
Зо Можуть готуватися препарати з уповільненим вивільненням. До характерних прикладів препаратів з уповільненим вивільненням належать напівпроникні матриці твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, ці матриці являють собою формовані вироби, наприклад плівки або матриці. Приклад матриць з уповільненим вивільненням включає поліефіри, гідрогелі (наприклад полі(2-гідроксіетилметакрилат), полівініловий спирт)), полілактиди (патент США Мо 3773919), співполімер І-глутамінової кислот й етил-1-глутамата, нерозкладаний етиленвінілацетат, розкладані співполімери молочної кислоти-гліколевої кислоти (наприклад, ін'єкційні мікросфери, що складаються з співполімера молочної кислоти-гліколевої кислоти) і полі-О-(-)-3-гідроксимасляна кислота Такі полімери, як етиленвінілацетат і молочна кислота- гликолева кислота, забезпечують вивільнення молекул протягом більше 100 днів, тоді як деякі гідрогелі вивільняють білки протягом більш короткого часу. Можна виробити раціональні стратегії для стабілізації залежно від механізмів реакцій. Наприклад, якщо встановлено, що механізм агрегування пов'язаний з утворенням міжмолекулярного зв'язку 5-5 за рахунок тіодисульфідного обміну, стабілізація може досягатися за рахунок модифікації сульфгідрильних залишків, ліофілізації з кислих розчинів, контролю вмісту вологи, використання необхідних добавок, заміни амінокислот і розробки спеціальних складів полімерних матриць.
Склад, що містить антитіло або його варіант, буде формулюватися, дозуватися і вводитися таким способом, який буде відповідати принципам належної медичної практики. У цьому плані до розглянутих факторів належать конкретне порушення, що підлягає лікуванню, конкретний ссавець, що одержує лікування, клінічний стан конкретного пацієнта, причина захворювання, зона доставки агента, метод введення, схема введення й інші фактори, відомі медичним працівникам. «Терапевтична ефективна кількість» антитіла або варіанта, яка буде при цьому вводитися, визначається наведеними вище міркуваннями, і може являти собою мінімальну кількість, необхідну для профілактики, придушення або лікування захворювання, патологічного стану або порушення, викликаного СХСЕ5.
Антитіло або його варіант, можливо, включається до складу разом з одним або декількома агентами, використовуваними в цей час для профілактики або лікування розглянутого захворювання. Ефективна кількість таких інших агентів залежить від кількості антитіла, що присутнє в складі, виду розладу або лікування й інших факторів, що обговорювалися вище.
Вони, як правило, використовуються в тих же дозуваннях і з тими ж методами введення, які застосовувалися в описаному вище тексті або ж становлять приблизно від 1 до 99 95 від дозувань, що застосовувалися дотепер.
Використаний у даному документі термін «ефективна кількість» стосується кількості ліків (наприклад, профілактичного або терапевтичного агента), достатнього для зменшення гостроти й/"або тривалості захворювання, викликаного СХСК5, полегшення одного або декількох його симптомів, попередження розвитку захворювання, викликаного СХСК5, або початку регресії захворювання, викликаного СХСМ5, або достатній для попередження розвитку, рецидивів, початку або прогресу захворювання, викликаного СХСК5, або одного або декількох його симптомів, або посилення або поліпшення профілактичного й/або терапевтичного ефекту (ефектів) інших ліків (наприклад, іншого терапевтичного агента), застосовуваного для лікування захворювання, викликаного СХСК5. Наприклад, розглянуте лікування може знизити підвищений рівень В-клітин у порівнянні з вихідним або нормальним рівнем щонайменше на 5 95, переважно щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 9565, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 9565, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або щонайменше на 100 95. В іншому прикладі здійснення ефективна кількість лікарського або профілактичного препарату полегшує симптоми захворювання, викликаного СХСК5, наприклад, артриту або відторгнення трансплантату, щонайменше на 5 9о, переважно щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 9о, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 956, щонайменше на 35 95, щонайменше на 40 до, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 95, щонайменше на 70 956, щонайменше на 75 956, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або щонайменше на 100 95.
Крім того, як еквівалент в даному документі використовується термін «терапевтично ефективна кількість».
Кількість лікарського поліпептиду, антитіла або його фрагмента, яка буде ефективною при використанні або лікуванні конкретного захворювання або стану, буде залежати від природи розладу або стану й може визначатися стандартними клінічними методиками. По можливості,
Зо спочатку /л мйгто можна одержати криву доза-ефект і лікарські препарати згідно з даним винаходом. При наявності зручної моделі тварин можна знову досліджувати криву доза-ефект, і використовувати її для екстраполяції придатної дози для людини, спираючись на практичні методи, відомі фахівцям в галузі. Разом з тим, виходячи із загальних знань в галузі, лікарський препарат, що ефективно стимулює зниження запального ефекту, наприклад, може забезпечувати локальні концентрації лікарського засобу між 5 і 20 нг/мл, і, переважно, між приблизно 10 і 20 нг/мл. У додатковому специфічному прикладі здійснення винаходу лікарський препарат, що ефективно поліпшує ріст і виживаність клітин, відповідальних за аутоїмунні прояви або відторгнення трансплантату, залежні від В-клітин, може забезпечувати локальні концентрації лікарського препарату в межах від приблизно 10 нг/мл до приблизно 100 нг/мл.
У переважному прикладі здійснення водний розчин лікарського поліпептиду, антитіла або його фрагмента може вводитися за допомогою підшкірної ін'єкції. Кожна доза може мінятися від приблизно 0,5 мг до приблизно 50 мг на кілограм ваги тіла, або, більш переважно, від приблизно З мг до приблизно 30 мг на кілограм ваги тіла. Дозування можна встановити емпірично для конкретного захворювання, групи пацієнтів, способу введення та ін. з використанням фармацевтичних методів, відомих фахівцям в галузі.
Схема дозування для підшкірного введення може мінятися від разу на тиждень до щоденної, залежно від набору клінічних факторів, включаючи характер захворювання, міру гостроти хвороби й чутливості пацієнта до терапевтичного агента.
У даному винаході пропонуються способи виготовлення рідких препаратів антитіла або його
СХС5-зв'язувального фрагмента, причому зазначені способи включають концентрування фракції очищеного антитіла до кінцевої концентрації приблизно 15 мг/мл, приблизно 20 мг/мл, приблизно 30 мг/мл, приблизно 40 мг/мл, приблизно 50 мг/мл, приблизно 60 мг/мл, приблизно 70 мг/мл, приблизно 80 мг/мл, приблизно 90 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 200 мг/мл, приблизно 250 мг/мл, приблизно 300 мг/мл або більше, з використанням, наприклад, напівпроникної мембрани з відповідним відсіканням молекулярної ваги (мВ) (наприклад, відсіканням 30 кО для його Е(агж» фрагментів; і відсіканням 10 кО для Раь Фрагментів) і додатковим діафільтруванням концентрованої фракції антитіл у препаративний буфер з використанням тієї ж мембрани.
Крім того, даний винахід включає стабільні, наприклад, стабільні по кО, рідкі препарати бо розглянутої продукції, які поліпшували напіввиведення /л у/мо. Так, період напіввиведення бо розглянутого антитіла з організму, переважно людини, більше З днів, більше 7 днів, більше 10 днів, більше 15 днів, більше 25 днів, більше 30 днів, більше 35 днів, більше 40 днів, більше 45 днів, більше 2 місяців, більше З місяців, більше 4 місяців, більше 5 місяців або більше.
Для збільшення тривалості циркуляції антитіла в сироватці /7 умо можуть використовуватися різні методики. Наприклад, інертні полімерні молекули, такі як поліетиленгліколь (РЕС) з високою молекулярною вагою, можуть зв'язуватися з антитілом через багатофункціональний лінкер або без нього, або за допомогою сайт-специфічної кон'югації РЕО з М-термінальним або з С-термінальним закінченням антитіла, або через є-аміногрупи, що присутні в лізинових залишках. Можуть використовуватися лінійні або розгалужені похідні полімеру, які приводять до мінімальної втрати біологічної активності. Ступінь кон'югації можна чітко відслідковувати по 505-РАСЕ і за допомогою мас-спектрометрії, щоб забезпечити належну кон'югацію молекул РЕС з антитілами. РЕСб, що не прореагував, можна відокремлювати від кон'югатів антитіло-«ТЕсС за допомогою гель-фільтрації або іонобмінної хроматографії. Модифіковані РЕС антитіла можуть також випробовуватися на предмет активності зв'язування, а також ефективності /л м/мо, для чого можуть використовуватися методи, відомі фахівцям в галузі, наприклад, описані в даному документі методи імуноаналізу.
Антитіло, що має підвищений рівень напіввиведення /л7 у/мОо, може також виходити за допомогою проведення однієї або декількох модифікацій амінокислот (наприклад, замін, вставок або делецій) у константний домен Ідс, або його ЕРеі-зв'язувальний фрагмент (наприклад
Ее або фрагмент шарнірної області домену Ре), див., наприклад, УМО 98/23289; УМО 97/34631; і патент США Мо 6277375.
Крім того, антитіло можна кон'югувати із альбуміном з утворенням антитіла, більш стабільного /п у/уо або, що має більш тривалий період напіввиведення /л м/о. Методики добре відомі фахівцям в галузі, див., наприклад, УМО 93/15199, МО 93/15200 ії УМО 01/77137; а також
ЕРО 413622. Антитіло можна також модифікувати, наприклад за допомогою глікозилування, ацетилування, фосфорилування, амідування, введення відомих захисних/блокувальних груп, протеолітичного розщеплення, зв'язування із клітинним лігандом або іншим білком та ін.
В одному із прикладів здійснення склад препарату визначається згідно з стандартними процедурами для лікарських препаратів, виготовлених для внутрішньовенного введення в
Зо організм людини. Як правило, склади для внутрішньовенного введення являють собою розчини в стерильному ізотонічному водному буфері. У необхідних випадках склад може також включати солюбілізуючий агент і місцевий анестетик, наприклад лідокаїн або інший «каїновий» анестетик, для зменшення болі в місці введення. Звичайно інгредієнти поставляються або окремо, або змішуються в дозованій лікарській формі, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку, або безводного концентрату в герметичному контейнері, наприклад в ампулі або в пакеті із вказівкою кількості активного агента. У випадках, коли склад повинен вводитися за допомогою вливання, він може поставлятися із флаконом для вливання, що містить стерильну воду або фізіологічний розчин фармацевтичної категорії чистоти. Якщо склад вводиться за допомогою ін'єкції може поставлятися ампула зі стерильною водою або фізіологічним розчином для ін'єкції, наприклад у наборі, так що інгредієнти можуть змішуватися перед введенням.
У винаході також передбачається, що рідкий препарат згідно з даним винаходом вміщується в герметичний контейнер, наприклад ампулу або пакет із вказівкою кількості продукту, що розглядається. Рідкі препарати згідно з даним винаходом можуть перебувати в герметичному контейнері із вказівкою кількості й концентрації антитіла або фрагмента антитіла. Рідкі препарати згідно з даним винаходом можуть поставлятися в герметичному контейнері, що містить щонайменше 15 мг/мл, 20 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл або 300 мг/мл антитіла СХОН5, наприклад, в об'ємі, рівному 1 мл, 2 мл, З мл, 4 мл, 5 мл, 6 мл, 7 мл, 8 мл, 9 мл, 10 мл, 15 мл або 20 мл.
Випускається виріб, до складу якого входять засоби для лікування описаних вище розладів.
Виріб являє собою контейнер і етикетку. До придатних контейнерів належать, наприклад, пляшки, флакони, шприци й пробірки. Контейнери можуть виготовлятися із самих різних матеріалів, наприклад, скла або пластика. Контейнер містить склад, який придатний для діагностики, профілактики або лікування патологічного стану або захворювання, викликаного
СХСК5, і може мати стерильний отвір для відбору (наприклад, у якості контейнера може використовуватися мішок з розчином для внутрішньовенного введення або флакон із пробкою, яку можна проколювати голкою для підшкірної ін'єкції). На етикетці, яка знаходиться на контейнері або додається до нього, вказується, що склад використовується для лікування певного захворювання. Виріб також може включати другий контейнер, що містить бо фармацевтично прийнятний буфер, наприклад фосфатно-буферний фізіологічний розчин,
розчин Рінгера й розчин декстрози. Виріб також може включати інші матеріали, бажані з погляду комерційних додатків і користувача, включаючи буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприци й вкладиші з інструкцією із застосування.
В іншому аспекті даного винаходу нуклеїнові кислоти, що включають послідовності, які кодують антитіла або їх функціональні похідні, застосовуються для лікування, придушення або профілактики захворювання або розладу, пов'язаного з аберантною експресією й/або активністю СХСК5, за допомогою генної терапії. Генною терапією називають терапію, яка проводиться за допомогою введення пацієнтові експресованої нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес. У цьому прикладі здійснення даного винаходу нуклеїнові кислоти продукують кодований білок у виступаючих в якості мішеней клітинах-реципієнтах, які опосередковують терапевтичний вплив і такими клітинами. Відповідно до даного винаходу можуть використовуватися будь-які доступні методи генної терапії.
Загальний огляд методів генної терапії можна знайти в соїд5рієї еї аї., Сіїіпіса! Рпагтасу 12:488 (1993); Ми еї аї!., Віоїйегару 3:87 (1991); Тоівю5Ппем, Апп Нем РНагтасої Тохісо!ї 32:573 (1993); Миїїдап, Зсіепсе 260:926 (1993); Могдап еї аї., Апп Кем Віоспет 62:191 (1993); і Мау,
ТІВТЕСН 11:155 (1993).
В одному з аспектів сполука включає послідовності нуклеїнових кислот, що кодують антитіло або його функціональні з'єднувальні фрагменти, причому зазначені послідовності нуклеїнових кислот є частиною векторів експресії, які експресують антитіло, або його фрагменти, химерні білки, або його важкі або легкі ланцюги в придатному хазяїні. Зокрема, такі послідовності нуклеїнових кислот містять промотори, функціонально пов'язані з областю, що кодує антитіло, причому зазначені промотори є індукованими або конститутивними, а також, можливо, тканиноспецифічними, також присутні й інші регуляторні послідовності.
В іншому конкретному прикладі здійснення використовуються молекули нуклеїнових кислот, в яких кодуючі антитіло послідовності й будь-які інші бажані послідовності фланкуються областями, які промотують гомологічну рекомбінацію в потрібному сайті генома, тим самим, створюючи умови для внутрішньохромосомної експресії нуклегтових кислот, що кодують антитіло (Коїег, еї аї., Ргос Май! Асай Зсі ОА 86:8932 (1989); 2|Івіга єї а!., Майшге 342:435 (1989)).
У конкретних прикладах здійснення молекула експресованого антитіла являє собою
Зо одноланцюжкове антитіло; в альтернативних варіантах послідовності нуклеїнової кислоти включають послідовності, що кодують важкі й легкі ланцюги антитіла або його фрагменти. До альтернативних методів включення належить використання конкретних факторів транскрипції, які розпізнають специфічні послідовності нуклеїнових кислот, «цинкові пальці» та ін.
Доставка нуклеїнових кислот в організм пацієнта може здійснюватися прямо, у цьому випадку пацієнт прямо зазнає впливу нуклеїнової кислоти або векторів, що несуть нуклеїнову кислоту, або непрямим чином, у цьому випадку клітини спочатку трансформуються під впливом нуклеїнових кислот /л у/го, а потім трансплантуються пацієнтові.
В одному із прикладів здійснення послідовності нуклеїнових кислот прямо вводяться /п у/мо і експресуються для одержання кодованого продукту. Така процедура може проводитися з використанням кожного з множини методів, відомих фахівцям в галузі, наприклад, за допомогою конструювання послідовностей, що кодують антитіло, як частини відповідного вектора експресії нуклеїнової кислоти, і введення його таким чином, щоб вектори ставали внутрішньоклітинними, наприклад, за допомогою інфекції з використанням дефектних або ослаблених ретровірусних або інших вірусних векторів (див. патент США Мо 4980286), прямою ін'єкцією депротеїнізованої
ДНК, за допомогою бомбардування мікрочастинками (наприклад, генна гармата; Віоїїетіс, биропі), з використанням невірусних векторів, наприклад синтетичних складів, що включають амфіпатичні сполуки, які зв'язують гідрофільну нуклеїнову кислоту й мають здатність злиття із клітинами, як правило, при цьому утримуючі гідрофобну частину для зв'язування з мембранами, покриттям ліпідами, або рецепторами клітинної поверхні або агентами трансфекції, інкапсулюванням у ліпосомах, мікрочастинках або мікрокапсулах, за допомогою введення вектора, пов'язаного з пептидом, для якого відома можливість проникнення в ядро, за допомогою введення вектора, пов'язаного з лігандом, який зазнає опосередкованого рецептором ендоцитозу (див., наприклад, УМи еї аї.,.) Віої Спет 262:4429 (1987)) (що може використовуватися для клітин-мішеней, селективно експресуючих рецептори) та ін. В іншому прикладі здійснення можуть бути виготовлені комплекси нуклеїнова кислота-ліганд, в яких ліганд включає схильний до злиття вірусний пептид для руйнування ендосом, що дозволяє нуклеїновій кислоті уникнути лізосомального розпаду. У ще одному прикладі здійснення нуклеїнову кислоту можна піддавати клітинно-специфічному поглинанню й експресії /л. У/мо, націлюючись на конкретний рецептор (див., наприклад, УМО 92/06180; УМО 92/22635; УМО 60 92/20316; УМО 93/14188 ії УМО 93/20221).
Що стосується векторів, то відповідно до підходів, відомих фахівцям в галузі, може використовуватися, наприклад, лентивірусний вектор. Лентивірусні вектори містять компоненти для впакування вірусного генома й інтеграції в ДНК клітину-хазяїна. Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують антитіло, які будуть використовуватися в генній терапії, клонуються в один або кілька векторів, що сприяє доставці гена в організм пацієнта. Наприклад, лентивірусний вектор може використовуватися для доставки трансгену в гематопоетичні стовбурні клітини.
Застосування ретровірусних векторів у генній терапії розглядається в наступних літературних джерелах: СіІомез еї аї., У Сіїп Іпме5і 93:644 (1994); Кіет еї аї!., Віоса 83:1467 (1994); ЗаІтопв5 еї аІ,, Нитап Сепе Тпегару 4:129 (1993); і сго55тап еї аї., Сит Оріп Сеп апа Оєм 3110 (1993).
У даному винаході також можуть використовуватися аденовіруси. Мішенями для систем доставки на основі аденовірусів є, наприклад, печінка, центральна нервова система, ендотеліальні клітини й м'язи. Аденовіруси інфікують клітини, що не діляться, що є перевагою у порівнянні з ранніми ретровірусними векторами. У роботі КолагеКу еї аІ., Си Оріп Сеп Оем 3:499 (1993) представлений огляд генної терапії на основі аденовірусів. У роботі Воші еї аї.,
Нитап Сепе Тпегару 5:3 (1994) продемонстроване використання аденовірусних векторів для передачі генів клітинам дихального епітелію макак-резусів. Інші приклади використання аденовірусів у генній терапії можна знайти в роботі Козепіеїй еї аїЇ., Зсіепсе 252:431 (1991);
Возеп'іеїйа еї аї., Сеї! 68:143 (1992); Мавхігапдеїї еї аї., у Сіїп Іпме5і 91:225 (1993); УХО 94/12649 і
Мапа єї аІ., Сепе ТПнегару 2:775 (1995).
У генній терапії також може використовуватися аденосателітний вірус (ААМ) (УмаїзП еї аї.,
Ргос 5ос Ехр Віої Меа 204:289 (1993); і патенти США МоМо 5436146; 6632670 і 6642051).
Інший підхід до генної терапії передбачає перенос гена в клітини клітинної культури за допомогою таких методів, як електропорація, ліпофекція, трансфекція, опосередкована фосфатом кальцію або вірусна інфекція. Як правило, метод переносу передбачає перенос селектованого маркера в клітини. Потім проводиться селекція клітин, для того, щоб виділити ті клітини, які захопили й експресують перенесений ген. Потім такі клітини доставляють в організм пацієнта.
Таким чином, нуклеїнова кислота може вводитися в клітину до введення одержаної рекомбінантної клітини /л у//юо. Таке введення можна проводити будь-яким методом, відомим
Зо фахівцям в галузі, включаючи, серед інших, трансфекцію, електропорацію, мікроінжекцію, інфекцію вектором вірусу або бактеріофага, що містять послідовності нуклеїнових кислот, злиття клітин, опосередкований хромосомами перенос генів, опосередкований мікроклітинами перенос генів, злиття сферопластів та ін. Фахівцям в галузі відома множина методик введення чужорідних генів у клітини (див., наприклад, І оепег еї аІ., Меп Епгутої 217:599 (1993); Сопеп еї а. Мей Еплутої 217:618 (1993); і СіІіпе РПпагт Тпег 29:69 (1985)) і вони можуть використовуватися в рамках даного винаходу, за умови збереження необхідних функцій розвитку й фізіологічних функцій клітин-реципієнтів. Методика повинна забезпечувати стабільний перенос нуклеїнової кислоти в клітину, так щоб нуклеїнова кислота експресувалася клітиною, була наслідуваною й експресувалася потомством клітини.
Одержані рекомбінантні клітини можуть доставлятися в організм пацієнта з використанням різних методів, відомих фахівцям ов галузі. Рекомбінантні клітини крові (наприклад, гематопоетичні стовбурні клітини або клітини-попередники) переважно вводити внутрішньовенно. Кількість клітин для застосування залежить від бажаного ефекту, стану пацієнта та ін. і може визначатися кваліфікованим фахівцем в галузі.
До клітин, в які для цілей генної терапії може вводитися та або інша нуклеїнова кислота, належать будь-які бажані й доступні види клітин, які включають, серед інших, епітеліальні клітини, ендотеліальні клітини, кератиноцити, фібробласти, м'язові клітини, гепатоцити, клітини крові, наприклад, Т-лімфоцити, В-лімфоцити, моноцити, макрофаги, нейтрофіли, еозинофіли, мегакаріоцити й гранулоцити; різні стовбурні клітини або клітини-попередники, зокрема, гематопоетичні стовбурні клітини або клітини-попередники, наприклад клітини, одержані з кісткового мозку, крові пуповини, периферичної крові, печінки ембріону та ін.
В одному прикладі здійснення використовувана для генної терапії клітина є аутологічною пацієнтові. Нуклеїнові послідовності, що кодують антитіло згідно з даним винаходом, вводяться в клітини, так що трансген експресується клітинами або їх потомством, і рекомбінантні клітини потім вводяться /л7 умо для одержання терапевтичного ефекту. У конкретному прикладі здійснення використовуються стовбурні клітини або клітини-попередники. Для можливого прикладу здійснення даного винаходу використовуються будь-які стовбурні клітини й/або клітини-попередники, які можуть бути виділені й збережені /л уйго (див., наприклад, М/О 94/08598; 5іептріє сеї а!., Сеї! 71:973 (1992); КПеіпмав Мей Сеї Віо 21А:229 (1980); і РіцеЇКОм єї бо аІ!., Мауо Сіїпіс Ргос 61:771 (1986)). Придатними клітинами-реципієнтами є клітини крові й клітини кісткового мозку, оскільки СХСК5 експресується, наприклад, на В-клітинах. Разом з тим об'єм даного винаходу в плані використання стовбурних клітин-реципієнтів не передбачає виготовлення й застосування трансгена для одержання трансгенного організму за допомогою введення такого трансгена, що представляє інтерес, в ембріони й ембріональні стовбурні клітини.
У даному винаході пропонуються способи лікування, профілактики й ослаблення захворювань, викликаних СХСК5, або одного або декількох їх симптомів за допомогою введення пацієнтові ефективної кількості, наприклад, рідкого препарату згідно з даним винаходом. Пацієнтом переважно є ссавець, наприклад неприматні види (корови, свині, коні, кішки, собаки, щури та ін.) і примати (наприклад, мавпи, зокрема яванський макак супотої!диз і люди). У переважному прикладі здійснення таким пацієнтом є людина.
СХСК5 також експресується на деяких ракових клітинах, наприклад ракових клітинах підшлункової залози, товстої кишки й сечового міхура й при Т-клітинних лейкозах (Оіпріпо еї аї.,
Опсодепе 24:573-584, 2005), а також В-клітинних лейкозах (ВигКеї! еї аї., Віоод, Ум! 2007; доі:10.1182/біо0а-2007-05-089409), крім того, стимулювання СХСК5 корелювало (із проліферацією клітин карциноми, Меїег еї аІ., Сапе Не5 66:9576-9582, 2006.
Таким чином, розглянуте антитіло або його похідне можуть використовуватися для контролю проліферації ракових клітин, експресуючих СХСК5, при цьому наявність раку діагностується по експресії СХСК5 за допомогою наведених у даному документі методів аналізу. Антитіло, що представляє інтерес, може зменшити інфільтрацію злоякісних клітин, знизити стійкість до апоптозу й звести до мінімуму проліферацію. Як пропонується в даному винаході, зазначеним пацієнтам вводиться така кількість розглянутого антитіла або його похідного, яке забезпечує інгібування проліферації ракових клітин.
Аутоїмунні розлади пов'язані з аберантним і/або високим рівнем експресії СХСЇІ 13, наприклад, при вовчаку (Ізпікаула еї аі., ) Ехр Мей 193:1393-1402, 2001) і 5іогеп'є Зупаготе (Заіотопвгзоп еї аї., Зсап У Ітт 55:336-342, 2002; і Вагопе еї аї., Агй Епешт 52(6)1773-1784, 2005), або високим рівнем експресії СХСК5, наприклад, при злоякісній міастенії (Зіт5 еї аї.,
Ітт 167:1935-1944, 2001; Зайюо еї аї!., У Меигоїтт 55:336-342, 2005; і Таскепбрего еї аї., Єиг У Ітт 37:849-863, 2007). Тому розглянуте антитіло використовується для мінімізації впливу високих
Зо рівнів або високої активності ліганду СХСІ13 або СХСК5. При аутоїмунних розладах, що характеризуються високими рівнями В-клітин, високими рівнями СХОСК»5, або високими рівнями
СХСЇ 13, або іншого ліганду СХСК»5, як зазначено в даному документі, вводиться така кількість розглянутого антитіла, яка пригнічує активність В-клітин.
Аберантна експресія СХСОК5 спостерігалася при розсіяному склерозі, Вгаїп 129 (РІ 1)200- 211, 2006.
При коліті СХСК5 відіграє певну роль в утворенні й функціонуванні лимфоїдної тканини, пов'язаної з кишечником (Сагізеп еї аї., зи, 2002, 51(3)364-367). Розглянуте антитіло пригнічує опосередковану СХСЕК5 міграцію й інфільтрацію В-клітин у власну пластинку слизової оболонки кишечнику, а також інфільтрацію слизової оболонки в цілому (Ма2исспеїїї еї аї., У Сіїп Іпмеві, 1999, 104(10) Н!49-К54) і їх експресію в осередках виразкового коліту, які містять ектопічні гермінативні центри.
Виснаження В-клітин може мати терапевтичний ефект при придушенні симптомів у певних обставинах і при певних показаннях, наприклад при ревматоїдному артриті (Оїїдіпо 8. Оаігутріеє,
Апи Аез Тег 5 (Зуррі 4)57-511, 2003). Високі рівні експресії СХСК5 реєструються в синовіальній тканині страждаючих артритом пацієнтів у порівнянні із тканиною окремих осіб, які не страждають ревматоїдним артритом (Зсптиї? еї аї., Айп Кез Тег 7:К217-К229, 2005). Таким чином, певні форми розглянутого антитіла і його похідних можуть знижувати популяцію В-клітин і попереджати інфільтрацію й взаємодію В-клітин у суглобі. Відповідно, лікування може включати введення пацієнтові, що страждає артритом, визначеної кількості розглянутого антитіла, яке знижує рівень В-клітин. Антитіло може вводитися локально у хворобливий суглоб.
Ектопічний лімфоїдний неогенез спостерігається при різних умовах, у тому числі псоріатичному артриті (Сапеїе еї аІ., Апп Кпешт бів, Уап 12, 2007, доі:10:1136/ага.2006.062042), хронічних запальних захворюваннях загального характеру (Аїоїізі 5 Ри)оІ-Во!теїЇ, Маї Вем Ітт 6:205-217, 2006) і в трансплантатах, з відторгненням як при хронічному плині (Ваааоига еї аї.,
Ат ./ Тгтап5 5:510-516, 2005), так і в ситуаціях загострення (Оісагіо еї аІ., Ат У) Тгап5 7:201-210, 2007). СХСІ 13 ї СХСНК5 були присутні у випадку кардіотрансплантатів (Оісагіо еї аї!., вище); а
СХСІ13 реєструвався у випадку псоріатичного артриту (Сапеїе еї аїЇ., вище). Присутність
СХСЇІ 13 і/або СХОК5 пов'язана з розвитком ектопічних лімфоїдних фолікулів із зонами В-клітин і Т-клітин, які присутні в нормальних вузлах. Формування алоантигену для антигену В-клітин також зв'язувалося з моделлю гострого відторгнення серцевого алогенного трансплантату (Моотспавзнт еї аї., У Ітт 177:7715-7722, 2006).
Таким чином, розглянуте антитіло може використовуватися для придушення запалення й відторгнення трансплантату. Пацієнтові вводиться інгібуюча В-клітини кількість антитіла, для того, щоб придушити запалення, звести до мінімуму розвиток ектопічних гермінативних центрів, якнайбільше знизити захоплення В-клітин трансплантатом і мінімізувати формування алоантигену В-клітин до або після процедури трансплантації.
Нижче для відомості фахівців в галузі наводяться ілюстрації даного винаходу в наступних, таких, що не вичерпуються даним перерахуванням, прикладах варіантів, що описують деякі здійснення, за допомогою яких даний винахід може бути реалізований на практиці.
Приклади
Приклад 1: Одержання імуногена
Моноклональні антитіла до СХСК5 можна виробляти у трансформованих клітинах СНО із
ДНК, що кодує людський СХОК»5 повної довжини і експресується на поверхні клітин («клітини г-
СХОВ5-СНО»). Використовувана для трансформування клітин послідовність СХСК5 може бути одержана з баз даних, таких як ММ 001716.2, МСО00011.8 або ММОО01716, і синтезована або виділена з придатного клітинного джерела.
Відкриту рамку зчитування СХСК5 поміщали в експресуючий вектор, такий як роСОМАЗ.Тпео ОЕЗТ, і потім трансфікували у клітини 300-19 (імуноген).
Крім того, позаклітинний домен СХСК5 (ЕС-домен) з амінокислотною послідовністю
ММУРТІ ЕМО ЕМ ЕВ ЕМЕГОВІГОМММТ5І МЕМНІ С (ЗЕО 10 МО: 1) кон'югували з гемоціаніном лімфи равлика («КІ Н) через С-термінальний цистеїн і використовували як імуноген. Клітини, що експресують СХСОК5 або позаклітинний домен СХСК5, вводили внутрішньоочеревинно (5х105 клітин в 0,2 мл, або 50 мкг пептиду в 100 мкл буферного розчину, додатково змішані з 100 мкл ад'юванту, такого як повний ад'ювант Фрейнда). Ін'єкції антигену повторювали кожні два тижні до виявлення у сироватці високого титру антитіл СХСК5 з використанням будь-якого з відомих методів, наприклад, імуноферментного аналізу (ЕГІЗА) або клітинного сортера з активацією флуоресценції (ГАС5), використовуючи, наприклад, клітини СХСК5", які можуть бути виділені, наприклад, за допомогою ЕАСЗ5, і, наприклад, комерційно доступні моноклональні антитіла МАВ
Зо 190 (К 5 О Бувіетв) як позитивний контроль.
Клітини, що експресують СХСК5, тримали при температурі 37 "С в атмосфері 5 96 СО» в
ВРМІ-розчині (Іпмігодеп, Сагієрайд, СА) з додаванням 10 95 діалізованої ембріональної бичачої сироватки (ЕВ5) (Іпмігодеп). Клітини готували до ін'єкції шляхом заміни зазначеного вище культурального середовища на фосфатний буферний розчин, що не містить Са/ма (СМЕ-РВ5), з додаванням 5 мМ ЕОТА, збираючи клітини в цьому буфері. Зібрані клітини відділяли центрифугуванням на 500хд протягом приблизно 5 хвилин, однократно промивали шляхом ресуспендування одержаного концентрату у СМЕ-РВЗ і повторного центрифугування, підраховували і доводили до відповідного об'єму (наприклад, до 5х105 клітин на 0,2 мл) для ін'єкції шляхом ресуспендування клітинного концентрату в СМЕ-РВ5.
Як зазначено вище, експресію СХСК5 контролювали, наприклад, за допомогою аналізу
ЕАС5, використовуючи комерційно доступні антитіла СХСК5, такі як МАВ 190 (К 8 0), клони
Ег882 і 2058 (208 являє собою щуряче антимишаче антитіло СХСК5, інші придбані антитіла є антилюдськими антитілами СХОК5) (ВО), і 2С1 (Арпома), а також різні активні відносно НЯСХСК5 поліклональні антитіла, виготовлені стандартними у даній галузі методами.
Для полегшення створення плазміди і підвищення рівня експресії СХСК5, готували олігонуклеотиди, що відповідають сигнальній послідовності перших 135 пар основ послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує СХСК5. Виготовлені олігонуклеотиди були дещо модифіковані у положеннях неоднозначності кодону для зниження кількості гермінативних центрів (С). Усі зміни нуклеотидної послідовності були німими, тобто не приводили до зміни амінокислотної послідовності. Після спільного відпалу олігонуклеотидів, створену таким чином сигнальну послідовність зв'язували з іншою частиною кодуючої послідовності методом ПЛР зі сплайсингом термінальних фрагментів РСК-5ОЕ, що перекриваються (Но еї аїІ., Зепе 77:51 (1989); і Ногіоп еї а!., Віотесппіднев 8:528 (1990)).
Перед використанням клітин як імуногена перевіряли ступінь експресії СХСК5. Клітини культивували в КРМІ-розчині (Іпмйгодеп, Сагізрай, СА) з додаванням 10 956 ЕВ5, 02 мМ глутаміну і їх розчину замінних амінокислот, потім висівали приблизно 3-5х105 клітин на ямку у стандартній посудині 175 і вирощували протягом приблизно 24-48 годин.
Трансформовані або трансфіковані клітини культивували протягом приблизно двох тижнів, доки клітини, що не несуть плазміни, які експресують СХСК5, не були селективно знищені антибіотиком. Клітини стійких клітинних ліній можна лізувати, виділити з них білки і провести з ними вестерн-блотинг.
Стабільно або тимчасово трансфіковані клітини аналізували на експресію СХСК5, використовуючи методи для виявлення експресії СХСК5 на поверхні клітин, такі як ЕАС5 аналіз. Крім того, клітини можна лізувати і одержані білки аналізувати, наприклад методом вестерн-блотингу. Трансфіковані клітини, зібрані з чашок з культуральним середовищем, однократно промивали фосфатно-сольовим буферним розчином (РВ5), ресуспендували у деіонізованій воді, змішаній з рівним об'ємом 2х завантажувального буфера для білкових зразків (Віогад, Негсціе5, СА), і потім витримували при температурі близько 100 "С протягом 10 хвилин. Мембранний білок аналізували з використанням кондиціонованого середовища, змішаного з рівним об'ємом 2х завантажувального буфера для білкових зразків, витримуючи при 100 "С протягом 10 хвилин. Зразки розділяли методом електрофорезу у поліаакриламідному гелі ХО5-РАСЕ, використовуючи 4-12 95 градієнтний гель. Потім білки переносили з гелю на нітроцелюлозну мембрану (Віогайд, Негсціе5, СА), перед перенесенням блоковану 5 96 нежирним сухим молоком у фосфатному буфері з твіном РВ5Т (РВ5 з додаванням 0,05 95 ТУМЕЕМ-209) протягом не менше години.
СХС5 детектували шляхом інкубування мембрани з СХСК5-специфічними первинними антитілами у блокувальному буфері протягом не менше години при кімнатній температурі зі струшуванням на шейкері. Потім мембрану промивали не менше трьох раз, додавали кон'юговані з репортером вторинні антитіла у блокувальному буфері, та інкубували не менше години при кімнатній температурі зі струшуванням на шейкері. Потім мембрану тричі промивали
РВ5Т і проявляли, наприклад, використовуючи хемілюмінесцентний субстрат.
Приклад 2: Одержання моноклональних антитіл до СХСНЬ
Мишей ліній А/) або ВАГ В/су у віці приблизно 4-6 тижнів (даскхоп І арх, Ваг Нагрог, МЕ) імунізували СХСК5-трансфікованими клітинами або пептидом, що містить позаклітинний домен
СХСМК5. У день 0 групу мишей первинно внутрішньоочеревинно інфікували 1:11 емульсією кон'югованого з КІ-Н пептиду у суміші з ад'ювантом (повний ад'ювант Фрейнда, СЕА), у день 20 повторно внутрішньоочеревинно інфікували сумішшю пептиду з неповним ад'ювантом Фрейнда (ІРС) і/або клітинами у фосфатному буфері без ад'юванту, і втретє інфікували внутрішньовенно
Зо у день 44 сумішшю кон'югованого з КІ Н пептиду в ІЕС і (або клітинами) у фосфатному буфері без ад'юванту. Іншу групу мишей первинно внутрішньоочеревинно інфікували в день 0, повторно внутрішньоочеревинно інфікували в день 15, 39, 53 і 67, і нарешті, інфікували внутрішньовенно в день 81 (усі ін'єкції виконували з суспензією клітин у фосфатному буфері без ад'юванту). Для обох груп мишей кожна ін'єкція містила приблизно від 3х105 до 2х107 клітин в об'ємі приблизно 200 мкл. В іншому варіанті, імунізацію пептидом і/або клітинами проводили кожні два тижні, 3-6 разів до досягнення бажаного титру анти-СХСК»5, який визначався, наприклад, методами ЕАСЗ5 або ЕГГ ІЗА.
Через три дні після останньої ін'єкції у деяких випадках мишей перевіряли на титр анти-
СХСН5 у плазмі крові, умертвляли, діставали селезінку і поміщали її у чашку Петрі, що містить приблизно 10 мл безсироваткового середовища, модифікованого способом Дульбеко-Ігла (ОМЕМ) (бірсо). Спленоцити пінцетом відділяли від капсули і двічі промивали у 10 мл безсироваткового модифікованого способом Ісков середовища Дульбеко (МОМ) (Сеїдно,
Негпдоп, МА) при температурі 37 "С. Суспензію клітин селезінки переносили у пробірку з конічним дном об'ємом 15 мл і чекали осадження суспензії протягом приблизно 2-5 хвилин.
Супернатант, що містить спленоцити, переносили у чисту пробірку з конічним дном об'ємом 15 мл і перед проведенням злиття ще тричі промивали ІМОМ. Відібрані з різних тварин спленоцити миші можна об'єднувати.
У деяких випадках з неімунізованої миші готували 5 мл одноклітинної суспензії контрольних фідерних спленоцитів, практично як описано вище для імунізованих спленоцитів, і поміщали її в інкубатор (37 "С, 5 95 СО»2) для майбутнього використання.
Роль партнера для злиття / для імунізованих спленоцитів може грати гіпоксантин/аміноптерин/тимідин (НАТ)-чутлива, несекретуюча клітинна лінія мієломи, така як
РЗХб3-АС8.653 або 5Р2/0 (АТСС, Мапаззав5, МА), або РО В лімфобласти (АТС, СКІ -1646)).
Перед злиттям лімфоїдні клітини витримували в ІМОМ/ЛО 95 ЕВ5 (37 "С, 7 96 СО»), стежачи за тим, щоб у день злиття клітини знаходилися у логарифмічній фазі росту. юІнший можливий механізм відбору базується на використанні азасерину, який звичайно додають через день після проведення злиття.
Злиття проводили, дотримуючись гібриду протоколів, запропонованих у роботах І егпег (Хаїе
У Віо! Меда, 1981, 54(5)387-402) і СепПег єї аІ. (Ботаїййс СеїЇ Сепеї, 1977, 3(2)231-236). Перед бо злиттям об'єднані фракції спленоцитів тричі промивали безсироватковим ІМОМ і підраховували клітини. Також безпосередньо перед злиттям, мієломні клітини, що знаходяться у логарифмічній фазі, тричі промивали безсироватковим ІМОМ і підраховували. Лімфоїдні клітини ресуспендували до концентрації 1х107 клітин на мл у безсироватковому ІМОМ. Для кожного злиття 1-1,5х108 спленоцитів змішували з 1-3х107 мієломних клітин у поліпропіленовій пробірці об'ємом 50 мл з конічним дном, і однократно промивали клітини безсироватковим ІМОМ.
Співвідношення спленоцитів до мієломних клітин складало 5:1. Пробірки центрифугували при
Б50Охуд протягом 10 хвилин для осадження клітин. Після видалення супернатанту, осад обережно ресуспендували шляхом постукування по дну пробірки. Потім пробірки поміщали у посудину з водою при 37 "С. Усі подальші стадії злиття проводили у цій посудині.
Потім повільно, протягом приблизно однієї хвилини, додавали 1 мл попередньо нагрітого до 37 "С поліеєтиленгліколю 1500 (Коспе Арріїєй З5сієепсе, Іпаіапароїї5, ІМ) до клітинного осаду у кожній пробірці при легкому погойдуванні пробірки. Клітини інкубували у поліетиленгліколі протягом приблизно однієї хвилини, потім у кожну пробірку протягом 30 секунд по краплях додавали по одному мл безсироваткового ІМОМ, потім протягом наступної хвилини у кожну пробірку додавали ще по 9 мл безсироваткового ІМОМ. Пробірки центрифугували при 500ха протягом 10 хвилин при кімнатній температурі і потім супернатант аспурували. Клітинний осад ресуспендували у 100 мл фільтрованого повного середовища для виробництва гібридом (500 мл ІМОМ (СеїЇЇдго) з додаванням 1095 ЕВ5 (Зегасагє, Міїйога, МА), 0,2 мМ І-глутаміну, їх розчину замінних амінокислот, 1 мМ пірувату натрію, 0,01 95 суміші пеніциліну і стрептоміцину (реп-5ігер, Іпмігодеп), і 1х суміші гіпоксантину і тимідину (НТ 5,ирріетепі, Іпмігодеп)).
Кожну клітинну суспензію об'ємом 100 мл висадили у 10 9б-ямкових титраційних мікропланшетів з плоским дном з об'ємом приблизно 100 мкл/ямку. Планшети витримали в інкубаторі при температурі 37 "С, в атмосфері 7 95 СО». На 2-й день після злиття, клітини відібрали шляхом додавання 5,7 мкМ розчину азасерину в ІМОМ до одержаних у результаті злиття гібридних клітин у кількості 100 мкл на ямку. З ямок, що містять клони, зібрали супернатанти для первинного скринінгу, як правило, на 10-14 день після злиття. Ефективність злиття склала 75-99 95 (в 720-950 з 960 можливих ямок утворювалися клони, на яких проводили скринінг).
Для первинного скринінгу можна використовувати радіоіїмуноаналіз (КІА), призначений для
Зо детектування антитіл, що зв'язуються з людським СХСК5. Для проведення радіоімуноаналізу, розчин аффінно-очищеного козячого антимишачого дес (специфічного до Ес фрагмента) (Сарреїї, Соспгапмійє, РА) у фосфатному буфері наносили на 9б-ямкові ПВХ титраційні мікропланшети (50 мкл/ямку) та інкубували протягом ночі при температурі 4 "С. Потім козячий антимишачий Ідс видаляли з планшета, і ямки протягом години блокували 5 95 розчином ЕС5 у фосфатному буфері (РВБЗ/5 95 ЕС5, 100 мкл/ямку) при кімнатній температурі. Після видалення блокувального розчину в ямки додавали чистий супернатант культури гібридоми (50 мкл/ямку), і планшет інкубували 1 годину при кімнатній температурі. Потім планшети тричі промивали фосфатним буфером з 0,05 95 Гиееп-20 (РВ5Б/0,05 95 Тмееп-20). Далі в кожну ямку додавали 50 мкл 25|-СХСОСВ5 (активність -20000 срт) в РВ5/5 95 ЕС5, і планшети інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Нарешті, ямки тричі промивали РВБЗ/0,05 95 Гмееп-20. Після повного і швидкого видалення промивального буферного розчину, планшет розрізали на окремі ямки, які аналізували на гамма-радіометрі. Як фоновий контроль використовували ямки, в які замість супернатанту клітинної культури додавали РВЗ/5 95 ЕС5.
Очищений СХСК5 мітили ізотопом 25 за методом Болтона-Хантера, головним чином дотримуючись опису, що наводиться постачальником реагенту Болтона-Хантера (Мем Епдіапа
Мисієаг, Возіоп, МА). Якість одержаного /25І-СХСВ5 контролювали шляхом перевірки того, що процедура введення мітки не привела до руйнування епітопів, які розпізнаються комерційно доступними антитілами СХСОЕ5 (К 4. 0 або Весіоп ріскіпзоп, Мошипіаїп Міем/, СА).
При первинному скринінгу клони вважаються позитивними, якщо за результатами радіоїмуноаналізу кількість міток у супернатанті зразків виявляється приблизно у 10 разів більшою, ніж для фонового контролю. Позитивні клони дістають, збагачують і зберігають у замороженому вигляді.
Процедуру первинного скринінгу гібридоми розробляли для визначення того, чи розпізнає антитіло нативні епітопи СХСК5. Ця мета була досягнута за допомогою аналізу БАС5 поверхневих СХСК5 на поверхні клітин СХСК5", забарвлених моноклональними антитілами, для візуалізації зв'язування використовували козяче антимишаче вторинне антитіло з флуоресцентною міткою. При первинному скринінгу клони вважалися позитивними, якщо за результатами аналізу ЕГАС5 кількість міток у супернатанті зразків була приблизно у 10 разів більшою, ніж для фонового контролю. Також для локалізації епітопів СХСР5, з якими бо зв'язувалися антитіла, проводили конкурентний аналіз з антитілами СХСК5. Позитивні клони діставали, збагачували і зберігали у замороженому вигляді Приклад 3: Клітинний аналіз зв'язування для моноклональних антитіл до СХСК5
Для характеризації моноклональних антитіл до СХСК5 використовували клітинний аналіз зв'язування. Наприклад, можна використовувати описані вище трансфіковані клітини, що експресують СХСК5, такі як ПСХСК5Б/НЕК293. Повнорозмірну відкриту рамку зчитування людського СХСК5 клонували у вектор, наприклад РСОМАЗ.Тпео ОЕ5Т (Іпмігодеп, Сагізрай, СА).
Область, що кодує СХСК5, синтезували методом ЗТ-ПЛР, використовуючи як матрицю РНК людського мозку і печінки (Атрбіоп, Іпс., А!йвііп, ТХ). Створений таким чином плазмідний гібрид
СХСРБ/СОМАЗ.Тпео експресував повнорозмірний білок СХС5. Стабільну лінію клітин, що експресують СХСК5, одержали трансфекцією плазмідного гібриду СХСК5/рСОМАЗ.Тпео у клітини СНО або НЕК293 (АТСС Мо. СІ -1573), використовуючи стандартний і комерційно доступний набір реагентів І іроїесіатіпе 2000. Після трансфікування клітини культивували у середовищі ОМЕМ протягом ночі, потім пересівали їх у середовище з додаванням 200 мкг/мл неоміцину і культивували 12-14 днів. Виділені одиночні колонії відбирали і вирощували в окремих ямках до вироблення достатньої кількості клонованих клітин. Стабільні клони, що стійкі до неоміцину і експресують високі рівні білюа СХСК5, ідентифікували методом ЕАС5 аналізу з використанням поліклональних антитіл до СХСК5 (К8УО Зувзіет5, Міппеароїїх, ММ) або спеціально виготовлених поліклональних антитіл.
Методом ЕАСЗ5 аналізу також підтвердили експресію СХСК»5 для клітин людини, що нативно експресують СХСК5, лінії Н5 З,йиМап (АТСС Мо. СВІ -1484). Клітини Н5 иМап вирощували у розчині КРМІ 1640, що містить 10 95 ембріональної телячої сироватки, 0,2 мМ глутаміну, і 0,1 95 розчин пеніциліну/стрептоміцину (100 мкг/мл пеніциліну і 10 мкг/мл стрептоміцину).
Ступінь зв'язування антитіл з клітинами можна аналізувати, використовуючи флуоресцентну макро-конфокальну систему високопродуктивного скринінгу ЕМАТ"М 8100 НТ5 або систему клітинного детектування 8200 Сеїшміаг Оєїесіоп БЗузіет (Арріїей Віозузіет5, Розвієг СПУ, СА), дотримуючись доданих виробником протоколів. Клітинні лінії, що нативно експресують СХСК5 або стабільно трансфіковані плазмідними гібридами, що експресують СХСК»5, висівали в 96- ямкові планшети. Крім того, в 9б6-ямковий планшет висівали тимчасово трансфіковані клітини ліній 2937 або СНО. Клітини висівали з щільністю 5000-30000 клітин на ямку. Через 20-24 години в ямки спільно додавали моноклональні антитіла до СХОСК5 і кон'юговані з ЕМАТ козячі антимишачі дос антитіла, і планшети інкубували протягом 1 години, 2 годин, 4 годин або ночі при кімнатній температурі.
Ступінь зв'язування антитіл з клітинами також аналізували методом ЕАС5, використовуючи стійку клітинну лінію НЕК293/СХСМК5, що експресує СХСМК5. Клітини інкубували з моноклональними антитілами до СХСК5 у фосфатному буфері. Після трикратного промивання, клітини інкубували з вторинними антитілами, кон'югованими з флуоресціюючою молекулою (ВО
Зсієпсез, Раїо Апо, СА).
Результати показали, що декілька моноклональних антитіл зв'язуються з СХСК5, що експресуються з рекомбінантних плазмідних гібридів. Наприклад, клони 1106, 14С9, 19Н5, Н28, 5406, 57, 56Нб, 7987 і 1607, а також гуманізовані варіанти останнього антитіла, 1607, 1607-
НС1Т-ІС23, 1607-НС1-і02, 1607-НС1-їС1 ї 1607-НОС2-ЇС1, використовуване як негативний контроль антитіло І13, СА13, позитивні контролі, МАВ190, 2С1 і КЕ8В2, три мишачих ізотипних контролі до дві, ІдСіга і ІдОгь, і щурячий ІдОгь ізотипний контроль (що відповідає КЕ8В2), перевірили на зв'язування з клітинами НЕК293, трансфікованими для експресії СХОСК5.
Використовувані як позитивні контролі антитіла 2С1 ії МАВ190 зв'язуються з СХСК»5 клітинами.
КЕ88В2 демонстрував проміжні рівні зв'язування. Антитіла, використовувані як негативні контролі, показали тільки фоновий рівень зв'язування. Профілі зв'язування всіх антитіл, за винятком СА13, з клітинами НЯСХСК5Б/НЕК293 і кінетики титрування були подібні до відповідних профілів і кінетик для вихідного антитіла 1607 і для 7987.
Тимчасово трансфіковані клітини НЕК293, що містять СХСК5/неоплазміду, також забарвлювали імунофлуоресцентними методами, як описано вище, і спостерігали за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Клітинні ЕМАТ їі ЕАС5 аналізи підтверджували, що моноклональні антитіла дійсно зв'язуються з СХСМК5, що експресуються або з рекомбінантних плазмідних гіоридів, або як нативний білок у клітинах, що культивуються. Сигнал зв'язування вважається позитивним при одержанні вихідного сигналу ЕМАТ аналізатора, що суттєво перевищує сигнал фонового зв'язування і зв'язування з клонами негативних гібридом (р»0,01).
Моноклональні антитіла СХСЕ5, що виробляються, такі як 1607, 1409, 19Н5, Н28, 5406, 7, 56Нб і 7987, зв'язувалися з позаклітинним доменом і перешкоджали зв'язуванню СХСІ 13 з
СХ» на клітині. 60 Приклад 4: Аналіз афінності методом Віасоге
Синтезували М-термінальну позаклітинну ділянку СХСК5 (амінокислоти 1-59) людини і миші з термінальним біотиновим маркером, який потім використовували в аналізі методом поверхневого плазмонного резонансу (Віасоге) прямого типу, коли досліджувані пептиди іммобілізують на поверхні сенсорного чіпу, і потім визначають кінетику взаємодії антитіл з фіксованими на чіпі пептидами. Синтетичні пептиди іммобілізували на чіпі Віасоге до досягнення щільності приблизно 20 одиниць відгуку (КО). Потім для проведення кінетичних вимірювань чіп обробляли моноклональними антитілами, дотримуючись рекомендацій виробника (СЕ Неайпсаге, Різсаїамау, МУ).
Клон мишачого анти-пСсХОСК»5 моноклонального антитіла, 1607, мав розраховану константу кО-2,1672 М; мишачий/людський ІдС« химерний 1607 (варіабельні домени Мн і Мі 1607, привиті на константний домен людського імуноглобуліну Ідса4 Ес, послідовність якого відома фахівцям у галузі, 3 можливою оптимізацією кодону, з використанням стандартних методів, таких як клонування, ампліфікація кінців, визначення маси ділянок і клонування окремих частин) мав кО-1,41-12 М; ї різні гуманізовані варіанти 16007, для яких структура варіантів і модифікація важких і легких ланцюгів позначається з використанням символів "НС " для конкретного важкого ланцюга і "С " для конкретного легкого ланцюга, привитих на імуноглобуліновий кістяк
І4с4, де склад ланцюгів наводиться нижче, мали наступні константи: 1607-НС1-ІїС1 мав кО-3,1172 М; 1607-НС1-(С2 мав кО-1,4172 М; 1607-НО2г-ІС1 мав кО-2,4072 М; 1607-НС1-і03 мав кО-1,2172 М; 1607-НОЗ-І С4 мав кО-4,9272 М; 1607-НОЗ-І С5 мав кО-1,8479 М; і 1607-НС1-
І С6 мав кО-9,177! М.
ЗА 113244, різновид гуманізованого варіанта 1607, 1607-НС1-І С3, що несе заміни 5241Р і
Ї248Е (заміни виконували з використанням відомих методів і реагентів, використовували систему нумерації за Кабатом), захоплювали на сенсорний чіп Віасоге попередньо іммобілізованими мишачими антилюдськими дО Ес антитілами, і потім використовували для проведення Віасоге аналізу зворотного типу, коли визначається кінетика взаємодії немаркованого М-термінального пептиду (амінокислоти 1-59) людського СХСК5 з моноклональними антитілами на чіпі. Для величин констант кО для 5АЕК 113244, були одержані значення 1,13240,0871 М. Величини констант кО, визначених в аналізі прямого типу з використанням іммобілізованого на поверхні чіпу біотинільованого людського пептиду, і ЗАК
Зо 113244 як аналіту, узгоджувалися з величинами констант, одержаних в аналізі зворотного типу.
Приклад 5: Вестерн-блот аналіз активності зв'язування моноклональних антитіл до СХСК5
Для оцінки активності зв'язування моноклональних антитіл до СХСК5 в умовах денатурації, а також рівнів експресії СХСК5 та інших пов'язаних з СХСОК5 білків у клітинах ліній людини проводили вестерн-блотинг. Крім того, готували зразки білків зі стабільно трансфікованих клітин, використовуючи набір реагентів для діставання білків ссавців М-РЕК (Рієгсе, ВосКіапа,
І.,, Саї Ж 78501) і дотримуючись інструкцій виробника, і нагрівали при температурі 70 С протягом 10 хвилин після додавання рівного об'єму 2х завантажувального буфера для білкових зразків. Усі зразки розділяли методом електрофорезу в поліакриламідному гелі ЗО5-РАСЕ, використовуючи 4-12 95 градієнтний гель. Потім білки переносили з гелю на ПВДФ мембрану, і мембрану для блотингу обробляли моноклональними антитілами до СХСК5 як первинним детектуючим антитілом. Для детектування використовували кон'юговані з АІеха 680 вторинні антитіла, мембрани сканували за допомогою системи інфрачервоного сканування Одуззеу (Сісог, Сіпсоїп, МебгазКа) або використовуючи хемілюмінесценцію (ЕСІ). Позитивні контрольні антитіла людського СХСК5 одержували, як описано у даному документі.
Приклад 6: ЕАС5 аналіз для контролю інтерналізації СХСК5
У здорових добровольців відбирали клітини лейкоцитарної плівки (сиг Соаві Віосй Сепіевг,
Ноизіоп, ТХ). Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) людини виділяли стандартним градієнтним методом Фікол-Гіпак РВМС культивували (0,5х105 клітин/ямку) в 96-ямковому планшеті при 4 "С. Кожна ямка містила 0,2 мл розчину КРМІ 1640 з додаванням 10 95 ЕВ5 у присутності/за відсутності моноклональних антитіл (10 мкг/мл). Після 30 хвилин інкубації середовище змінювали на свіжий холодний розчин КЕРМІ 1640 з додаванням 10 95 ЕВ5, що не містить антитіл. Клітини переносили у прогріту до 37 "С зволожену камеру для вирощування культур, що містить 5 95 СО». Оброблені моноклональними антитілами клітини збирали негайно, через 2 і через 24 години після перенесення клітин на 37 "С. Клітини однократно промивали фосфатним буфером та інкубували у холодному фосфатному буфері з додаванням 1 95 БСА (РВОВ) протягом 30 хвилин. Потім клітини забарвлювали кон'югованим з фікоеритрином антилюдським СХСК5 (ВО Віозсіепсе5). Через 30 хвилин клітини тричі промивали РВЗВ і фіксували в 1 95 розчині параформальдегіду протягом ночі. Наступного дня за допомогою проточного цитометра ВО Расзсаїйриг м зуєїет (ВО Віозсіепсе5, зап 9до5зе, СА) аналізували бо присутність СХСК5.
Приклад 7: ЕГІРК аналіз
Зміни внутрішньоклітинного вмісту кальцію визначали шляхом нанесення на планшет по 9000 клітин/'ямку та інкубування протягом ночі. Використовували клітини лінії ЕКВІ-2НЗ, стабільно трансфіковані людським СХСЕК5. Потім клітини промивали і обробили 2 мМ розчину
ЛПо-4/АМ (МоїІесшаг Ргобех5) у буфері, що містить 2,5 мМ пробеніциду. Клітини обробляли моноклональними антитілами СХСК5 і промивали буфером. Потім клітини обробляли 10 нм
СХСІ13 (К50). Зміни внутрішньоклітинного рівня Са"? реєстрували за допомогою ЕГІРЕ аналізатора 384-В8 (МоІесшаг Оемісе5). Як контроль використовували комерційно доступні антилюдські моноклональні антитіла СХСК5, мишачі да і ІдОгь.
Як буде обговорюватися далі, було створено декілька гуманізованих варіантів моноклональних антитіл 16007, таких як химерне 1607 (химера пІдба), 1607-НС1-ІС1, 1607-
НеС1-1 02, 1607-НОг-І С1, 1607-НС1-1023, 1607-НОЗ-І С4, 1607-НОЗ-І 5 і 1607-НС1-І 06, які були перевірені на біологічну активність, що відбивається в потоці іонів кальцію.
Гуманізовані антитіла, за винятком негативного контролю, САТ13, показали на трансфікованих клітинах зі стабільною експресією СХСК5 активність відносно нейтралізації сигналу, рівну активності вихідного антитіла 1607.
Приклад 8: Хемотаксичний аналіз
Клітини СХСК5У: Н5 З!Тйап (АТСС СКІ 1484) поміщали у верхню камеру плати для хемотаксису (ТгапзугеїЇ ріаїе, МіПіроге) у кількості 0,5х109 клітин/ямку у присутності 100 нм
СХСОІ 13 (НУО) або буфера СТХ (ЕРМІ-розчин без фенолового червоного, що містить 1 95 ЕВ5, 0,5 95 БСА і 1 нМ пірувату натрію) і підраховували клітини, що мігрують у нижню камеру. Камери збирали та інкубували протягом двох годин. Клітини у нижній камері підраховували після додавання колориметричного реагенту (Рготеда), вимірюючи ОЮгзоо.
СХОСВАБ-специфічну міграцію визначали як різницю між повною кількістю клітин, що мігрували, і кількістю клітин, що мимовільно мігрували. При аналізі на антитіла до СХСОК5, клітини інкубували з антитілом протягом 30 хвилин перед вміщенням у верхню камеру плати.
Ступінь інгібування антитілом визначали як співвідношення специфічної міграції у присутності антитіла до величини міграції за відсутності антитіла. Співвідношення можна помножити на 100 95 для одержання процентного вираження ступеня інгібування.
Зо Антитіла прикладу 7 порівняли з вихідним антитілом 16007 за здатністю нейтралізувати хемотаксис. Всі гуманізовані антитіла, за винятком негативного контролю, СА13, показали профіль нейтралізації хемотаксису, порівнянний з профілем для 1607 і 7987, 14С9, 19Н5, Н28, 5406, 57, 56Нб. Антитіло МАВІ190 (КУ) показало проміжну активність, а Наг8 і антитіло 2С1 (Арпома) були не в змозі повністю нейтралізувати індуковану лігандом міграцію клітин.
Приклад 9: Аналіз реактивності первинних в клітин людини
Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) людини виділяли з цільної крові на колонках Асси5ріп (Зідта). Потім РВМС ресуспендували у забарвлювальному буфері ВО 5іаїп
Брибйег (Весіоп ОісКіпбоп) до концентрації 20 мільйонів клітин/мл. Один мкг мишачих антилюдських СХСК5 моноклональних антитіл додавали до 50 мкл РВМС і очікували 20 хвилин при температурі 4 "С для зв'язування. Клітини двічі промивали забарвлювальним буфером ВО.
До суміші РВМС і антитіла додавали 50 мкл вторинного антитіла, розведеного 1/100 козячого антимишачого ІдДО-РЕ РЕ(а»» (ВесКтап СоиГег), і очікували 20 хвилин при температурі 4 "С для зв'язування. Клітини тричі промивали забарвлювальним буфером ВО. До клітин додавали суміш, що містить мишачі антилюдські СО20О-РІТС (ВО) ії СО4-АРС (ВО) у розведенні 1/50 кожне, одержану суміш інкубували 20 хвилин при температурі 4 "С для оцінки специфічності до В/Т- клітин. Клітини тричі промивали забарвлювальним буфером ВО, ресуспендували у 250 мкл забарвлювального буфера ВО і проводили з ними ГАСЗ аналіз на аналізаторі Расвїаг Ріи5. Як позитивний контроль використовували мишаче антилюдське СХСОК5 антитіло (КО; тАбБІ190).
Для гуманізованих антитіл одержували криві титрування і побудували залежність середньої інтенсивності рлюоресценції (Меап РіІпогезсепсе Іпіепзйу, МЕЇ) від концентрації.
Гуманізовані антитіла прикладу 7 перевіряли на зв'язування з клітинами РМВС5 людини.
Усі антитіла, за винятком негативного контролю СА13, зв'язувалися і мали однаковий профіль титрування на В-клітинах людини. Негативний контроль СА1З показав тільки фонове зв'язування. Клон КЕ8В2 (ВО) погано зв'язувався з клітинами РМВСОС»5 людини.
Приклад 10: Аналіз реактивності В-клітин макаки (СИМОМОГ И5)
Цільну кров макаки СупотоЇди5 (супо) одержували від компанії Віогесіатацйіоп, пс. (Ніскомійе, МУ). Кров була одержана у спеціалізованих пробірках для виготовлення клітин ВО
СеїІ Ргерагайноп Тибе (СРТ) після центрифугування. Мононуклеарні клітини периферичної крові макаки (супо РВМС), що містяться у плазматичному шарі, переносили з пробірки СРТ у пробірку 60 об'ємом 50 мл, не зачіпаючи шар градієнтного гелю у пробірці СРТ. Пробірку промивали 5 мл фосфатного буфера для повного діставання всіх клітин, використаний при промиванні розчин збирали в окрему пробірку об'ємом 50 мл. Клітини супо РВМС центрифугували на 1200 об./хв. протягом 10 хвилин при температурі 4 "С. Одержаний осад ресуспендували в 1 мл забарвлювального буфера ВО для ГАС5 аналізу (ВО). Для кожного аналізу використовували один мільйон клітин. Один мкг мишачого антилюдського СХСОК5 моноклонального антитіла (очищеного) додавали до 50 мкл клітин РВМС і очікували 20 хвилин при температурі 4 "С для зв'язування. Клітини двічі промивали забарвлювальним буфером ВО. До суміші РВМС і антитіла додавали 50 мкл вторинного антитіла, розведеного 1/100 козячого антимишачого ІДО-РЕ К(аь) (ВесКтап СошпНег), і очікували 20 хвилин при температурі 4 "С для зв'язування. Клітини тричі промивали забарвлювальним буфером ВО. До клітин додавали суміш, що містить мишачі антилюдські СО20-РІТС (ВО) і СО4-АРС (ВО) у розведенні 1/20 кожне, одержану суміш інкубували 20 хвилин при температурі 4 "С для оцінки специфічності до В/І-клітин. Клітини тричі промивали забарвлювальним буфером ВО, ресуспендували у 250 мкл забарвлювального буфера ВО і проводили з ними ЕГАСЗ аналіз на аналізаторі Расвїаг Рій5. Як позитивний контроль використовували комерційно доступне мишаче антилюдське СХСК5 антитіло (КУО; тАбБ190).
Мишаче моноклональне антитіло 1106 за даним винаходом, активне відносно людського
СХОК5, порівнювали з ізотипним дсС контролем. Гуманізовані варіанти 1607 і комерційно доступні антитіла МАВІ190 перевіряли на активність відносно СХСК5 макаки. Також перевіряли 7987.
Позитивні відносно СО20О ії СХСК»5 клітини виявили за допомогою МАВ190 і 1106. З іншого боку, 1607 і його гуманізовані варіанти, а також 57, КЕ882 (ВО) і 2С1 (Абпома) не зв'язувалися з
В-клітинами макаки. 1429, 19Н5, Н28, 5406, 56Нб і 7987 також зв'язувалися з В-клітинами макаки.
Для вивчення клітин периферичної крові використовували антитіла за даним винаходом до
СХ. В-клітини експресували СХСК5 і щонайменше в одному експерименті приблизно 10 95 периферичних Т-клітин також експресували СХСК5.
Приклад 11: Секвенування моноклональних антитіл до СХСК5
Мишачі моноклональні антитіла ізотипували, використовуючи комерційно доступний набір для ізотипування. Секвенували варіабельні послідовності 1607 та інших моноклональних
Зо антитіл до СХСК5. Використовуючи набір Оіадеп Оіапеазу тіпіргер і дотримуючись доданого до набору протоколу, виділили повну РНК з приблизно п'яти мільйонів клітин гібридоми. Для синтезу КДНК використовували набір реагентів Іпмйгодеп Бирегзогірі КИ (Саї 11904-018), дотримуючись доданих до набору протоколів.
Варіабельні області важкого ланцюга і легкого ланцюга спочатку ампліфікували, використовуючи наведені нижче вироджені ПЛР праймери і полімеразу Тад (Коспе) на основі методів, описаних у роботі У/апо еї аї. У Іттипої Меїпоав5. 233:167-77, 2000.
Важкий ланцюг: лівий праймер: 1. СТтоСаспААТТОЗАНОТММАаСТа,авАдавАдато (5ЕО ІЮ МО: 2) 2: СТ ТоСаспААТТОЗАНОТММАаСТаздавБАдатосмаса (5ЕО І МО: 3)
Важкий ланцюг: правий праймер: садспАтТоСАТАЧАСАаАтТасаваатТатиИ!ттттао (5ЕО ІЮ МО: 4)
Легкий ланцюг: лівий праймер: садастопАМАТТатТамтТ5зАСМСАВМ/СТМСА (ЗЕО ІО МО: 5)
Легкий ланцюг: правий праймер: тТАТАСАССТСААаСсттасСатаатавцААаАТасвсАТАСАаТТастає (5ЕО ІЮ МО: б), де К може бути А або б; М може бути А, б, Т або С; М може бути А або С; М/ може бути А або Т; 5 може бути С або С; і У може бути С або Т.
Продукти ПЛР клонували у плазміду рСК4-ТОРО?Є, використовуючи набір реагентів для клонування Іпмігодеп ТОРО ТА сіопіпд? КИ (Сай Ж: 45-0641), і потім секвенували, використовуючи праймери ТЗ ї Т7. Одержані послідовності порівнювали програмою ВІА5Т з базою даних генів для пошуку сигнальних послідовностей для клонування повних варіабельних ділянок. За результатами комп'ютерного аналізу ВГА5Т для другого етапу ПЛР ампліфікації з використанням Ріх полімерази (Іпмийгодеп) були вибрані наведені нижче праймери (Спагаез еї а!І., ЕЕВ5 І ецегв 452:386-394, 1999).
Важкий ланцюг:
Лівий праймер:
ССААдастТаТататсстАТСОС (5ЕО ІЮ МО: 7)
Правий праймер:
СОАСАдатосаАСтТАаСССТТаАССАсаТсАТСС (5ЕО ІЮ МО: 8) бо Легкий ланцюг:
Лівий праймер: мттотнадатСсдатаєци (5ЕО І МО: 9)
Правий праймер:
СаАстТаатсадстаатасаААаАтТасАТАСАС (ЗЕО ІО МО: 10).
Продукти ПЛР клонували у плазміду рСК-Вішпі ПО-ТОРО-, використовуючи набір реагентів для клонування Іпмігодеп его Вішпі? ТОРО? РОСА сіопіпд КИ (Саї 45-0245), і секвенували, використовуючи праймери 17.
Після секвенування легкого і важкого ланцюгів нуклеїнові кислоти можна перекодувати для оптимізації експресії, наприклад у людських клітинах-хазяїнах.
Приклад 12: Трансфектоми
Клітини М5З0О-еи вирощували до щільності 1х106 клітин/мл. Клітини підтримували в експонентній фазі росту і замінювали середовище за день до трансфекції. У день трансфекції промивали 40х105 клітин. Потім до клітинної суспензії додавали 10 мкг лінеаризованої нуклеїнової кислоти, такої як ДНК легкого ланцюга, і 10 мкг, наприклад, лінеаризованої ДНК важкого ланцюга (повний об'єм ДНК повинен бути менше 50 мкл), та інкубували культуру на льоді протягом 15 хвилин. Суміш клітин і ДНК переносили в охолоджену кювету (0,4 см) і подавали електричний імпульс (750 В і 25 мкФ). Відразу ж після електричного імпульсу кювету поміщали на лід і витримували на льоді 10-15 хвилин. Потім клітини збирали і висівали на планшет. Клітини інкубували в інкубаторі з 5 95 СО» протягом 12-16 днів або до появи колоній.
Супернатант клітинних колоній або вирощені у суспензії клітини перевіряли імуноферментним аналізом (ЕГІ5А) і виявлені позитивні трансфектоми клонували на свіжому середовищі. Для подальшого скринінгу на позитивні трансфектоми проводили титраційний ІФА (ЕГІ5А) або аналіз Віасоге. Збагачені трансфектоми утримували у посудинах для шейкера і збирали з супернатанту антитіла або їх похідні.
Приклад 13: Аналізи /л у//о
Для демонстрації ефективності антитіл відносно ТМЕс; (М/Патв еї а!., РМАБ5 1992, 89:9784- 9788), а також злитих білків СТІ А-4 і ТМЕо (М/ербр еї аї., Єик У Іттипої. 1996, 26:2320-2328; і
Муооієу еї аї., У Іттипої. 1993, 151:6602-6607) використовували колаген-індукований артрит (СІА) - добре відому модель ревматоїдного артриту (КА) людини. Для щурячого антимишачого
Зо моноклонального антитіла СХСК5, клону 1038, одержували профіль у мишачій моделі СІА, в якій мишей лінії ОВАЛ.) імунізували і потім повторно інфікували курячим колагеном типу ІІ.
Ступінь тяжкості хвороби (що оцінювали візуально шляхом вимірювання ступеня набрякання лапок і запалення) перевіряли два рази на тиждень, а зібрані після закінчення дослідження суглоби аналізували на зміну ступеня запалення, панус, розкладання хрящової тканини і ерозію кісткової тканини. Клон 1038 при введенні в режим профілактичного дозування приводив до значного зниження як ступеня тяжкості хвороби, так і ступеня патології суглобів у порівнянні з
СІА мишами, які одержували ізотипне лікування (АМОМА на повторних вимірюваннях, р«е0,05).
Для оцінки ефективності 1607-НС1-І СЗ в /лп мо хемотаксисі використовували модель миші з гострою формою захворювання. Коротко, мишей лінії С57/816 (вік 8-16 тижнів) з селективною експресією пиИСХСК»5 на імуноцитах, таких як В-клітини, Т-клітини і нейтрофіли, одержували традиційними трансгенними методами з використанням промотору СО11а. У використовуваній моделі /п у/уо хемотаксис стимулювався нейтрофілами. При внутрішньоочеревинному введенні 20 мкг ліганду пиСХСІ13 (КО), нейтрофіли миші, що експресують рецептор пПИСХСК»5, мігрували у черевну порожнину у відповідь на виникнення градієнта концентрації пиСхХеІ 13.
Через 80 хвилин після внутрішньоочеревинного введення пиСхХсСІ 13, черевну порожнину промивали для діставання клітин і проводили флуороцитометричний аналіз для визначення числа нейтрофілів, що експресують ПИСХСК»5, які специфічно мігрували у черевну порожнину у відповідь на введення пиСХСі13, у зразках перитонеальних змивів об'ємом 2 мл. Для ідентифікації нейтрофілів використовували фенотипічні маркери, такі як Губо, СО19 і СО11Б.
БО Підшкірне введення гуманізованого анти-пСсхХСвВ5, 1607-НС1-І С3 у двох різних дозуваннях (7,5 мкг або 15 мкг) за 24 години до введення пиСХСІ13 показало ефективність для зниження міграції нейтрофілів, що експресують пПиИСХСК5, у черевну порожнину у відповідь на введення писСХеСІ13 у порівнянні з ізотипним контролем, причому для двох зразків, що одержували антитіло СХСК5, не було зафіксовано статистично значимих відмінностей рівня нейтрофілів у порівнянні з рівнем нейтрофілів у ізотипного негативного контрольного зразка. При дозі 1,5 мкг гуманізоване антитілло СХСК5О мало низький рівень придушення міграції нейтрофілів у порівнянні з більш високими дозами антитіл СХСЕК5, перевіреними в експерименті.
Приклад 14: Зміна поверхні антитіл (КЕЗОКЕАСІМО)
Зміну поверхні мишачого клону 1607 проводили, дотримуючись процедури, описаної у 60 роботі Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА (1994) 91:969 і в патенті США Мо 5639641.
Послідовності областей Мі і Мн 1607 порівнювали програмою ВІ А5БТ з банком даних зі структури білків Ргоївїіп ЮБаїа Вапк РОВ (Мисієїс Асій5 Кезеагсі, 28:235-242 (2000), також доступний у мережі Іпіегпеб), який містить просторові координати для біологічних макромолекул, і вибирали з нього десять амінокислотних послідовностей для легкого і важкого ланцюгів, найбільш близьких до відповідних послідовностей 1607. Для ідентифікації послідовностей використовували ідентифікаційні коди РОВ.
Десятьма найближчими гомологами до варіабельного легкого ланцюга виявилися 1МОШ (у
МОЇ Віої 332:423-435, 2003), ТАЕ6 (Ргоївіп5 29:161-171, 1997), 10, (РогНаїгї»кКі єї а!., "Саг/па а
Віпаїіпа 5йе: Бігисіига! 2їшау ої ап Апіі-Сосаїпе Апіїбоду" в "Сотріех ум/йп ТНгее Сосаїпе АпаїЇод5"), 10722 (У Мігої 79:1223, 2005), 1085 (Веизсенег вї аї., "Зіписіцге апа бупатісв ої Віне Ріпогезсепі
Апіїроду 1922 аї Віне апа Міоіеї Ріногезсепі Тетрегаїштев5"), 1ВОВ (Ргос Майї! Асад 5сі ОБА 110:2247-2252, 2004, 1ЕРТ (Маї 5ігисі Віо! 2:232-243, 1995), ТОРИ (Маї бігисі Віо! 6:530-534, 1999), 1МАК (Мігоіоду 315:159-173, 2003) і 10055 () Мої Віо! 236:247-274, 1994) (надлишкові послідовності видалили), а десятьма найближчими гомологами до варіабельного важкого ланцюга виявилися 1ЕМ5 (Маї 5ігисі Віо! 7:881-884, 2000), 1ОАК (Маї 5ігисі Віо! 5:189-194, 1998), 1ТМЕВ (Ргос Маї! Асай 5сі 91:1089-1093, 1994), 1СІС (Маїште 348:254-257, 1990), 121 (Асіа
Стузіайодг О Віо! Стувіаоаг 50:768-777, 1994), 1Т4К (У Мої Віої 343:1269-1280, 2004), ТА7Р (Магкз еї аїІ.), 1РЕ8 (У Віої Снет 276:9985-9991, 2001), 1017 () Ехр Мей 191:2101-2112, 2000) і 1МУ8 (Сапсег Се! 7:301-311, 2005). Найближчими гомологами легкого і важкого ланцюга виявилися послідовності 1МУШ ї ТЕМ5, відповідно. Ці дві послідовності використовували для побудови гомологічної моделі варіабельних доменів, яку потім мінімізували за енергією шляхом мінімізації координат атомів методом сполучених градієнтів з силовим полем СНАКММ22 (У
Сотриї Спет (1983) 4, 187; У Сотриї Спет (1986) 7, 591), реалізованим у програмному пакеті
Моїесшаг Орегайіпуд Епмігоптепі (МОЕ) (Спетіса! Сотршіпд Сгоир, Оцебрес, СА). Побудовану модель використовували для пошуку гіперваріабельних областей і кістякових залишків. Для кожного залишку варіабельної області кожного з десяти найближчих гомологів до варіабельної області кожного антитіла розрахували доступність розчинника і усереднили одержані значення в електронній таблиці ЕхсеІ, дотримуючись протоколу Зсйедіс (Ні 4 І ем/сКкі (2006) Зіаівісв5:
Меїпод» апа Арріїсайоп5, Зіаїзой, Тиїза, ОК). Положення з усередненою доступністю більше
Зо 30 96 вважали залишками, що знаходяться на поверхні. Положення з усередненою доступністю у діапазоні від 25 95 до 30 95 далі розглядали в залежності від ступеня їх близькості до петель гіперваріабельних ділянок.
Положення варіабельної області мишачого 1607, що знаходяться на поверхні, порівнювали з відповідними положеннями для послідовностей антитіл людини. При пошуку враховували тільки залишки, що мали частку доступної розчиннику поверхні більше 30 95, включивши також ряд залишків з часток доступної розчиннику поверхні більше 25 95, що фланкують доступні розчиннику залишки. Для поліпшення конвертації пошуку в аналіз також включили ряд консервативних залишків послідовностей усіх імуноглобулінів. Для аналізу збігів залишили тільки послідовності зародкових ліній. Для заміни залишків варіабельної області мишачого 1607, що знаходяться на поверхні, вибирали поверхню варіабельної області антитіла людини з найбільшим ступенем збігу залишків, що знаходяться на поверхні, приділяючи особливу увагу положенням, що знаходяться у межах 5,0Е від гіперваріабельної області.
Жодна з одержаних послідовностей не містить відомих епітопів В-клітин або Т-клітин, перерахованих у базі даних імунних епітопів людини Іттипе Ерйоре Оаїаразе (ІОВ, Іттипе
Еріюре Оаїабазе апа Апаїузіз Везошгсе ме віге; РІ о5 Віої. 2005; 3(3):е91).
Вихідні послідовності варіабельних доменів мишачого 1607 мають наведений нижче вигляд: легкий ланцюг (СОК підкреслені):
ІМУМТОЛАВУУАУТРИЕВІУЧ СВІ КО І ПУСК ТУ УК ОРОС
КМУ АЗСУ РОВОМ ТАЕТЬКІ КУБА УЄУ УЖСМОМЕ КУ
ТЕО КТ КЕ КИ Ку важкий ланцюг (СОК підкреслені)
СУССКЕВИРОБУАРЕОВУ СТУС ОВ ХО УК МКОРРОКОСЕУО УТ
СИВАК КОВО вв 0 МОП АМУУСАК КСО СУ ТУВА КОТ МЕТИ.
У набір залишків, що зберігаються, які знаходяться на поверхні, при пошуку для легкого ланцюга включили 01, М3, А7, РО, Р15, К16, Е17, 518, Р45, 546, 047, 065, К79, К82, Е86б, К108,
Е110 ї К112.
Запит на пошук для легкого ланцюга містив визначений вище набір залишків, що знаходяться на поверхні, і консервативні амінокислоти, С23, М/40, 043, 91, С93, 2103, 104,
С106 і 7107, які включили для конвертації протоколу ВГА5Т. Як всі інші амінокислоти могли бути присутніми будь-які з 20 природних амінокислот. Пошук у програмі ВІ А5Т вели по базі даних послідовностей антитіл зародкових ліній людини, підготованій Міжнародною інформаційною системою з імуногенетики ІМОСТ (Іпіегпайопа! Іттиподепеїйс5 Іптогтайоп
Зузієте мервіє, МоЇес Іттипої, 2004, 40:647-659). Найкращий збіг одержали для Х72482 (ргооївіп ій-САА5Б1150.1), з якої був одержаний легкий ланцюг І С4. Запропонували також два варіанти ділянки МІ 4 (МІ. означає варіабельну ділянку легкого ланцюга), І. С5 і І Сб, для заміни потенційно проблематичних залишків легкого ланцюга: мутацією одного доступного розчинника метіоніну (М51) на лейцин (І С5 і І Сб), і заміною аспарагіну М5З3 на залишок серину в одному потенційному сайті деамідування (Сб). В цілому запропоновано три варіанти варіабельного легкого ланцюга, що містять від 4 до 6 мутацій у порівнянні з вихідним клоном мишачого 1607.
Відповідні мутації подані у таблиці 1, що наводиться нижче. У таблиці наведена як послідовна нумерація, так і нумерація за Кабатом.
У набір залишків, що збереглися на поверхні, при пошуку для варіабельного важкого ланцюга включили 1, 033, К5, 57, РУ, 111, 515, 916, 520, Р41, 42, Ка43, 561, Аб62, Кб4, 565,
К7О0, 574, 075, 086, Т87, 088, 0103, 1106, А111, А112 ї К113 (послідовна нумерація). У набір інваріантних амінокислот, включених у запит ВІ А5Т для збіжності пошуку, увійшли С22, МУЗ6, 137, 939, 089, 93, С95, ММ101, 102, 104 і Т105. Пошук у програмі ВІ А5Т вели по базі даних послідовностей антитіл зародкових ліній людини, підготованій ІМСТ. За результатами пошуку залишили один варіант важкого ланцюга (НСЗ) Дві Мн о області АРОб62266 (рооївіп ій-ААС18304.1) і АУ393082 (ргоївіп ій-ААБ5В86018.1), що показали найкращий збіг для набору залишків, які знаходяться на поверхні, мали еквівалентні ступені гомології і однакові залишки, що знаходяться на поверхні. Тому для важкого ланцюга була залишена тільки одна послідовність з десятьма мутаціями. Послідовності з меншим ступенем збігу, що мали інші залишки, які знаходяться на поверхні, були відкинуті як такі, що мають менш полярні залишки, що вказує на потенційно меншу розчинність.
Таблиця 1
Легкий ланцюг Легкий ланцюг (послідовна (нумерація за Версія 5 (І. С4) Версія 6 (І С5) Версія 7 (І. Сб) нумерація) Кабатом) о РазомдляМі | | 4 мутації | мутацій | бумутацій.9/
Важкий ланцюг Важкий ланцюг (послідовна (нумерація за (НСЗ) (НСЗ) (НСЗ) нумерація) Кабатом)
РазомдлямМі | | бОмутацй | ЧОмутацій | ЧїОмутацій.
Для легкого ланцюга запропоновано три варіанти (І С4, І С5 і І Сб). Індивідуальні мутації, що вводяться за допомогою зміни поверховості варіабельних ланцюгів, зазначені маленькими літерами і виділені підкресленням, гіперваріабельні ділянки підкреслені. Нижче наведені послідовності варіабельних ділянок зі зміненою поверхнею, константний домен (Ідса) опущений.
І ба:
УМА УАУТРЕЕВУХ СЗЗ ПЕВОКТ Я СОКРОЮЗРО
ПОЛУ ВМЕМА ЗСУРЕНЕБОВ СРМІГАРІІК БУВАЄ ЖУСМОНЕЕуВ
ТВО КБ ТОК ХК ТР,
СБ:
УМОВА УАУЇРЬСВУХ СВК Нет кОВРОСВРО
ПлДУЩеМоА ЗСУРОВБЕОХ О5ОТАЄТ І ЗБУВАБОУЄСУ жУСМОНЕКУР
ТРОС КСКІК ЗЕСНО Же.
Сб:
ПУМТОБАІХ УЛУТРЕЕВУХ СВЯТЕ. НОВОКТКЬКУ РООБРООВЗРО
МІЖ ЗСУРОКЕБОВ І АВБІКІ ЗУБА УЄСУ ТУСМОНЕБУкЄ
УТРОССТКККІК БО ПО МВ,
Для важкого ланцюга запропоновано один варіант (МНЗ) (МН означає варіабельну ділянку важкого ланцюга). Мутації, що вводяться через зміну поверховості варіабельного ланцюга, зазначені маленькими літерами і виділені підкресленням, гіперваріабельні ділянки підкреслені.
Послідовність константного домену опущена.
НеЗ:
СУС СУА СТУ ЖУКОВ РОКОКО У
ГУСТИМ о ЖяВІЯІх КОМ УРІ КМУ Найт АМУУСАВІУУ
СОС ТСУ ГУ КСО ТО МО
Нуклеотидні послідовності одержували методом ПЛР з перекриванням термінальних фрагментів ОБ-РСК і клонували у сайти МПеїІ/Ніпа!й вектора епісомної експресії рхІі 4214 (ЮОигоспег еї аї!., МАК, 2002, 30(2), Е9). Послідовності оптимізували по кодону для експресії у клітинах людини. Ділянку Мі зливали з ІЗКС (ААНеОЗО97). Ділянку Мн зливали з ІбНО4 (ААН25985) з відсутнім С-термінальним лізином (ІЗНО4ДК). Послідовності перевіряли двохланцюжковим секвенуванням.
І ба:
МОСС АТАТОУНЕНУ МОН ЗУАУТРОВОУ ВІСК А НВО
КРУЖОК РОСХРОВ ЛУ ММ АЗОСУКОВРУСЗОЗОТАКТ КЕ БЕУВАВВУЄ
УХУСМОаН УВС КЛІК УААРУУВІЕВРУОКО КОТА УУЄТІ МЕ
УРЕ АКУСУКУВМАЦ ЗСУ КОВО У ТКА ЕЕНКУ Є
АСЕУТНОССУВРУТКВЕМКОКСТВКО ПІ М
СТАС АССАТВАОСТО ОА ОСТОСАТСАТОСТОТП ЕЕСТОНО ЕНОССАСЮСЮ
САС ССАСАОСОЬКСАТСО ТИ АТИАСССАВАВССССТС АСК
СТ ОАССССОВОСО АОС АОС ВАСКСА САССТОИССКО СЛАВА ОССЕ с ОСАСК САС ААСАССТАССТОИТАСТОО ТТ ТОСТОСАССОСССССВОЄ
САВАОСЦНКЦКСС САС ОСА СТ АССОСАТОАЛОСЛАСЄСТО ОО ССАЦЄСОВССИТОЄС шчь мн ТСАСНХНОСКЬЯКОСЯ ОС МОСС АССОССТ ТС АС ТТОТАМАТСАЄ рн ек АСШИКССО ВСЮ АСО ТОНООСО ТО АСТАСТОСЬЬОССЬ ОСС СОСОК
ТАССССТАСАССТІ СТИ КСО ССО САССЛАССТТТОС А АТСААОСОТАССОЮТОЮ
ССОСПССТ ССС ТИРСА СТ ОССТТОСИССТОСССВАСОАЛОСАСОСТО ЛАСТІ ме цюоСсе во ТО СЕТ ААСААСТІСТАСССТОССНКЮВАСОССААОЮ
ТОСАСТЕ АМІНИ ИСАСА АС О САТ ОСС ААСТОСС АОС АСТОСОТ
ПАСА КТ САЛА ЧВКСАСЄСТАСЄТТОССТЧ ОСТ ССС АС
ЛЕ ССАККНССВАСТАЦЄАСАЛОСАСТАЦООТ ПОТ АСК ТО а АСО АС
МКАС СТО САТИН ААОТССТ ТОААСССКОС АНТ ОСТО
ААСЛ ТЯ ОО КОВІ
1с5:
МОСС АТАТО УНН УКМТОВАСЗУАУТРОКУ ЧСС НЯ
ЕТ ОВБРОСВРОС ТУ Ц МЕ АСУ РОКЕВОЗООТАКТС ККУ КАСУ,
УЄУСМОНСЕУВУЕОСО ТЕ у КАТУААРУУ РСР КЗСТАБУУСЬСМКМЕ
УВЕКА КУЦ КУ ВМЧАТОСММОВВУТКОМВЬКОВТ ЕВ ЗО ОКАВЖВЕЕНЕУ
АСКУТНОССОВРУТЕЕМКОВС СО Ме
ОСТАССАССАТОВОСТОЬ АТС АТСАТСОСТОТ ЕССТОСТ ОС САССЮ
ОСАССООСТТ ССАСАОСОАСА СО ПЛАТО АЄССАСЬНКН ССС САС
СТО АССОСССЮСАВАОСОТО НС АТО КСО СО САОСАОСААСМЮЄСТ
СЛОСАСАСА ОСС АЛОЕ АССТСТАСТО ОП НОСИКА СО СОСОК в. САВАССССССАССТОСТВА ТСТАСОССТОАОСААССТОНОСАОССОССЄТОЄ
СОПАССОСТТ САС АОС ОС АСИСТ НОСАССОССТ ТСАСОСТОААСАТСАЮ
ОС КО АЦОСССОСАОСАСО НИК СТ АСТАСТОСАТОСАОГПАССТОСО
ТАССССТАСАССТ СОТ НО ОССОНОСАССААОСТОТАСА СЛ АСССТАССНТ СЮ
Ом ССП ОСС САС СЕТ СССТОССТАСВА ОСА СТО АСТО НО
АМТС ПЕТ СТО СТОСТО В АСААСТТСТАСОССТОЕСТО ПАСА СЮ
ТОСЛОТОВАЛОИТОВАСЛАСОСССТОСАТССООСААСТОССАООАЮТОСОТ
ГАССОАОСАЙОАСТОСАЛОПВАСАОСАССТАСТОССТОТОСТОСАСОСТОЛОС
СТОТОСАЛОИССОАСТАСОАИААОСАСААСОТОТАСОССТОТОАЛОЮСТО ССС
АССАОПОССТОТССАОСССТОТОАССААСТОСТТСААСОВОВОСОАОТОСТО
ААШСТТ ЗВО І МОЮ) об:
МЕПУЗСНСВІСУАТАТОУНІ УМОВ АЇЯУАУТРОВКУВІЕСВІВКВ НВО
КУБ ВРООКРОГМІ УВІ БІ АВОУРОВІНЗЗОВИТАКТКІЗВУВАКОВУЄ
УУХСМОНІБУРУТРЧОСТКЦВІКВТУААРХУЮЕРРЕХОВОЇКВИТАХУУЄМІММЕ
УРВКЕАКУСЦУКУВМАЦОЧОМЯОКЕУТЕОЮВЧКОВТУВІ ВТ ЛІ ЗКАВТЕКНЮУХ
АСЕУТНОСТ Я5РУТКЯЕМЕОВС ЖЕО ТО Ме
ОСТАОЙСАССАТОСОСТОЮАИСТОСАТСАТОСТОТТОСТООСТОВОСАССО
ССАССПВОСОТОСАСАОСОАСАТСОТИАТОАСССЛОЛИСОСССТСАОСОТОЮС
СОТОАССОССПВОСОАОСАССОТОАОСАТСАОСТОССОСЛИСАОСААВАЮЮСТ
ССТОСАСАОСАОСОПВСААВАССТАЄСТОТАСТООТТОСТОСЛОСОСОССВОС
СсАвАОСССОСТЗОСТОСТОАТСТАССОССТОАОСАЬСОСТООСОСЛОСОССОТОС
ССПАОССОСТТСАОСООСАИСООСМИСИОСАСООССТТСАСОСТИААВАТСАС
ССОСОТОЧПАСОСССПАОЧАСОТОСИСОТОТАСТАСТОСАТОСЛОСАССТОАС
ТАССССТАСАССТТСООСООСПОСАССАМОСТОЧАЦАТСАЛОСОТАЄОЮТОЮ
ССОСТОСТТОСОТИаттсАТСТТСССТОССТОСИАСОВАОСАОСТОАМТОСКЮЄ в. АССОССТОСОТОСТИатТОтСтОСтТОчАСЛАСТТСТАСЄССТОВИВАОВОСААОЮ
ТОСАСТИСААВОТОИАСААСОСССТОСАОТОСВОСЛАСТОССЛОЮ МИСТ
САССБЛОСАОВАСТОСАЛОПВАСАОСАССТАСТОССТОТОСТОСАСССТОАСС
СТОТССААБИССОАСТАСОАСАЛОСАСААСЮТОТАСОЗОСТО ТО АбИТОАССО
АсСсАОВЧССТОТОСАОСОСТОТОЗССААОТОСТТОЗАЛОСОСПОЧОСОАОТОСТО
ААССТТІВНО ЦО Мод) нез:
МЕЛУВСП В УАТАТСУНІОУЄСТ ОККО УАРЗЕВИТСТУВСЕВЮХОУ
КУЛЕОРРО КСО ЕК СУВИОСЮСТТУУМРЕІ КК КОМУ КТОУРІ ЕММА А
ПТАМУУСАВТУ ХВОСТІ УТУХЗАЗТКОВУКРІ АРСЯВЖТЧЕВТААОСЬУКО
УЕРЕРУТУЮУМОСАТЯСУНТЕРАУТ ОВС УВІ З5УУТУРЗАЧ ОТКТУТСМУЮ
НЕРХМТКУЮКЕУВХКХОРРСРУСВАРЕВСОРЗУВІ ГЕРЕРКІТІ МІЗВТРЕУТСУ
УУБВУВОВОРЕУОЕМУУУЮОУЮУНМАКТКРЕКВОМУТ УВУ УЛ УМНОГ МІ.
МОКИУКСКУЗМКСІ РУМІЕКТІЗКАКООРВЕРОУ УТ РЕОБЕМТКМОУМЛСУ
КОИБУРЗВІАУЮУКУМООЮРЕММУКТТРРУТОЗОСОБЕРІ УВІ ТУВКЗВУОВОМУЄ
ЗСХУМНЕАІНМНУТОКТ ЗО (5БОЮ МОЗ
ОСТАОСАССАТОСЮЄСТОВАОСТОСАТСАТОСТОТТОСТОСТООССАССО
ССАССООСОТОСАСЛОССАОЮТОСЯЛНЬСТОСЛОВЛОЛОСОЦССССВОССТОСТ
ЕСССССАОСИЛОАОССТОАОСАТСАССТОСАССОТОАОЄВОСТТСТОССТО
АТСОАСТАСООСОТОЛАСТОВАТССОССЛОСОССССООСЛАСООССТОСАЄТ
СОСТОСОСОТОАТСТООСООСОАСООССАССАССТАСТАСААССССАОССТО ХА
ПАПЙССОССТОАОСАТСТОСАЛОВАСААСАОСАЛООЛОССЬССТОТТОСТОЛАЙ
АТОЛАСАЙССТОАССОССОССОАСАССОССАТОТАСТАСТОСОСССОСАТСО
ТОТАСТОВООССАООВОСАСССТО СТО АСООТОАОСАОСОССЛОСАССААОЮ
ЗСССТТОСОТТТОССТСТОовССОсттастоСевотосАССТОСОзЗОТОСАСЄ
ОЄСОСТОТОСОСТОССТОвтТОоААСВАЄТАСЄТТСССТВАОЮССТОТОЛОСОТОТС стайлАСТСТООСОСОСТОАОСТОСОИСОТОСАСАССТТОССТОССЮТОСТОС
АСТОСТОСООССТОТАСТОССТОТОСТОСОТО СТО АСОССТОССТЮСТОСТОСО
ТЕВОСАССААСЦАССТАСАЄСТОТААСОТОСАССАСААЦЮСТТССААСАССАА
ПСТОДАСААЛОСОДОТОСАОТОСАЛОТАСОДСОСТОСТТОСССТТЮСТОСОСТ
ПОСОСТОАОТТОСТОПОСОВАССТАОСО ТИ ТТОСТОТТОССТОСТААЛОССТАА
ССАСАСССТОАТОЛТСТОССОВАССССТО АОС ТО АОСТОТОТОСТОЮТОСАЄС
ПТОТОССАВОЛОСАСОСТОАОСТОСАЦТТСААСТОСТАСЮТОВАСОСССТОЄ
АОПТОСАСААСОССААОАССАМОССТО ЦЮ АС ЛО САЮТТСАЛАТТОСАЄСТА
ССОЦЮСТОСТОТС ТОТОСТОАОСОТОСТОСАССАОИВАСТИЮСТОЛАСОЮСАЛА
ПААТАСАЛАЦТЕТААОСТСТОСАЛСАЛОВОССТОСОСТОСТОСАТСОВАСАААА
ССАТСТССААСОССААЙВИССАОССТАОСОАОССТСАВОТОТАСАСОСТОЮС в. ТОСТАВССАВОЛАВАСАТОАОСААОААССАЧСТОТОССТЗАССТОТСТОСТО
КАНТ ТСТАСЄСЄТТССВАСА ТС СОС С ОНИ АСТСОСА АС
СОПЛА АСТАСА АТАКА ОСС ТТ ОСТ АТ СТАС
СТССТОИ ТТ АСТССАСНСТОАСОСОС ПО АСЛАТ СС СН ТОНН МНН СА АС
Се СОС аАТОССО АННА КАСАХ
Оце ОСТ СИТО АВОСТТ КО НІ МЗЯ,
Приклад 15: Гуманізація
Послідовності областей Мі і Мн 1607 проаналізували програмою ВІ А5бТ, найближчими гомологами для варіабельного легкого ланцюга виявилися 1МН5, 1М) ії 1МОУШ (У Мої Віо! 332:423-435, 2003) з еквівалентними ступенями гомології. Як шаблон вибирали послідовність 1Му, виходячи з високої точності кристалічної структури, яка для неї визначена з розрізненням до 1,22Е. Найближчим гомологом для важкого ланцюга виявилася послідовність 1ЕМ5 (Маї зігисі Віо! 7:881-884, 2000). Вибрані послідовності, 1МОШ ії 1ЕМ5, використовували для побудови гомологічної моделі варіабельних доменів, яку потім мінімізували за енергією стандартними методами. Потім проводили моделювання тривимірної гомологічної моделі 1607 методами молекулярної динаміки (МО) протягом 1,7 наносекунд, використовуючи узагальнену модель розчинника Борна (див. саїйПсспіоді ему, У Сотриї Спет 2004, 25:479-499).
Молекулярно-динамічне моделювання почали з вибору початкових значень швидкостей відповідно до гауссового розподілу при температурі 298,15 К з подальшим періодом приходу до рівноваги тривалістю 300 пс. При моделюванні наявність всіх зв'язків враховували за допомогою алгоритму ЗНАКЕ (див. Вапйй. еї а)., У Сотр СПет, 1995, 16:1192-1209), використовували крок за часом 1 фемтосекунда (фс), моделювання вели на основі алгоритму інтегрування Верле у канонічному ансамблі ММТ (число частинок, об'єм і температура) при температурі 298,15 К. У процесі моделювання зберегли 1700 кадрів, по кадру кожну 1 пс.
Одержані таким чином 1700 конформацій мишачого антитіла склали ансамбль, на якому проводився подальший аналіз з виявлення найбільш гнучких залишків. Для програмування аналізу використовували мову зсіепійіс Месіог І апдчаде (ЗМ), що підтримується середовищем молекулярного моделювання МОЕ (МоїІесшаг Орегаїпуд Епмігоптепі (МОЕ), Спетіса! Сотрипд
Сгоир, Оцерес, Сапада). Насамперед, кожний кадр М оптимальним чином накладали на попередній кадр М-1 для врахування обертання і трансляції молекули як цілого у процесі молекулярно-динамічного моделювання і розрахунку. Таке накладення одержували шляхом мінімізації середньоквадратичної відстані (Коої Меап Здиаге ОРісїапсе, КМ5О) між усіма парами відповідних атомів двох кадрів. При побудові накладення враховували тільки важкі атоми кістяка антитіла. Потім, використовуючи той самий метод накладення, кожний кадр наклали на медоїдний кадр. Медоїдним кадром називається конформація антитіла з декартовими координатами атомів, найбільш близькими до середніх координат по всіх конформаціях.
Для кожного залишку антитіла і розрахували середньоквадратичну відстань між важкими атомами конформації | і медоїдної конформації порівняння К. Середньоквадратична відстань розраховується за наведеною нижче формулою: т 2
У(ак) вм50)-15 А - т з де дк. евклідова відстань в ангстремах (А) між важким атомом 1 залишку | і цим же атомом у медоїдній конформації порівняння К. Для попарного ототожнення важких атомів 1 також враховували симетрію по важких атомах бічних ланцюгів амінокислот Авр, Гей, Маї, Сім, Ага,
Ре ї Туг. Конформація порівняння К змінюється при переході від одного залишку до іншого і відповідає медоїдній конформації К з мінімальною евклідовою відстанню до середніх по всіх конформаціях координат для залишку Її, що аналізується. Потім для кожного залишку і одержали розподіл 1700 середньоквадратичних відстаней, який відбиває зміну координат залишку і у ході молекулярно-динамічного моделювання. Об'єднанням всіх величин ЕМ5О для всіх амінокислотних залишків досліджуваного антитіла одержали глобальний розподіл всіх середньоквадратичних відстаней для даного антитіла. Глобальний розподіл по всіх середньоквадратичних відстанях потім використовували як еталонний розподіл. Для кожного високогнучкого залишку і проводили статистичну перевірку для з'ясування того, чи є спостережувана середня середньоквадратична відстань для залишку і, ті, значно більшою, ніж глобальна середня середньоквадратична відстань по всіх залишках, то. Оскільки розмір вибірки був досить великий, 1700 для аналізу клону 1607, використовували однобічний 2-критерій (див.
Богоїеєм а Стапі, "єіаїїівіїсв Тог геа!-ІГТе затріє зиг/еув. Моп-5ітріе-гтапдот затрієз апа меїднієй дата" 2006. Сатбгідде Опімегейу Рге55) з нульовою гіпотезою Но для розрахунку статистики, впостеД жує вна величина ті менша глобального середнього ту" і розрахували величини 2 за формул і Пдіораї
Те п ; де Лі - середня середньоквадратична відстань, розрахована з розподілу по середньоквадратичних відстанях для залишку і, то. середня середньоквадратична відстань, розрахована з глобального розподілу по середньоквадратичних відстанях, ва. стандартне відхилення, розраховане з розподілу по середньоквадратичних відстанях для залишку Ї, іп - розмір вибірки, п-1700 для аналізу клону 1607. Розраховані величини 7і потім порівняли з інтегральними ймовірностями стандартного нормального розподілу для оцінки 99,9 95 рівня значимості альтернативної гіпотези, а саме, "спостережувана величина т; більша глобального середнього пу", що відповідає величині 7і23,08. Параметр 7і, який можна розглядати як деякий критерій ступеня гнучкості, не корелював ні з молекулярною вагою, ні з числом важких атомів у залишку антитіла (г--0,014 і 0,0009, відповідно, при аналізі молекулярно-динамічної моделі клону 1607 антитіла до СХСК5).
У набір гнучких залишків для легкого ланцюга ввійшли наведені нижче залишки (послідовна нумерація): О1, 714, Р15, К16, Е17, 047, 065, 572 К79, К82, Е86, К108, Е110 їі К112; у набір для важкого ланцюга ввійшли наведені нижче залишки: 01, М2, 93, 111, 515, 916, 561, Аб62, Кб4,
З65, 870, 072, 075, К81, М82, М83, 086, 0103, 5110, А111, А112 ї К113. Гнучкі ділянки послідовності 1607 порівняли з відповідними положеннями послідовностей антитіла людини, взятих з сайту бази даних ІтМипосепетіс5 Юагаразе вересневої версії 2005 року.
Залишки, для яких при аналізі був одержаний значимо високий ступінь гнучкості, і ряд
Зо фланкуючих залишків, що зберігають тривимірну структуру гнучких залишків, включили у запити для подальшого пошуку.
Для заміни гнучких залишків варіабельної ділянки мишачого антитіла 1607 вибирали варіабельну область людського антитіла з найбільшим ступенем ідентичності гнучких залишків, особливо з положеннями, що знаходяться у межах 5,0А від гіперваріабельних ділянок.
Одержані таким чином гуманізовані послідовності проаналізували програмою ВІАБ5Т на подібність послідовностей по базі даних ОпіРгоїКкВ/Зм/і55Ргої, щоб підтвердити раціональність зроблених припущень. Для всіх послідовностей одержали високий ступінь гомології з рядом антитіл людини. Крім того, жодна з послідовностей не містила жодного з відомих епітопів для В- клітин або Т-клітин, перерахованих у базі даних ІОВ.
Найкращий збіг з послідовністю з бази даних ІЕЮВ для легкого ланцюга (І/С1,1С21і 1 С3) був одержаний для послідовності КРООРРЕП ІМОАЗМАКАТОСІРА (5ЕБО ІЮО МО: 25), яка покриває гіперваріабельну ділянку СОК2, але суттєво відрізняється за складом залишків, про що говорить ступінь ідентичності послідовностей 56 96, одержаний при пошуку програмою ВІ АТ по базі даних ІЕЮВ.
Найкращий збіг з послідовністю з бази даних ІЕОВ для важкого ланцюга (НСІ1 і НС2) був одержаний для послідовності ТОЮОТАМУМСАКІ (5БО ІЮ МО: 26), яка знаходиться перед початком ділянки СОКЗ. Для даної послідовності одержали ступінь ідентичності 6195 з послідовністю пептиду 5ЕОЗА! УУСАКО (ЗЕБЕО ОО МО: 27), що робить малоймовірним можливість її функціонування як потенційного епітопу для Т-клітин людини (У Ехр Мей (1995) 181, 1540).
Вихідні послідовності варіабельних доменів мишачого 1607 мають наведений нижче вигляд: легкий ланцюг (СОК підкреслені):
ПЛУВМЕМІ А БСУРОВЕЩОХ сЗОТАКТІВІ ЗВУБАЕВЗУЄСУ УУСМОНІ КВ
ХТО КВК з ее важкий ланцюг (СОК підкреслені):
ОУОБКЕВИРО ГУАРБОВСЯ ТСТУВОВМА ПВС УМЖІВОР РОКССЕУТАТУ
ПИ ГУМАТІВ КОМхОоВОУК ММ АМУУСАЮУЄ в ЦО УТУВ А СБЕО ЦМВ.
Запропоновано два варіанти важкого ланцюга (НСІ1 і НС) і три варіанти легкого ланцюга (С1, 102 і 1 С23). Обидва варіанти важкого ланцюга одержані модифікацією послідовностей
АРЕ262096/ААЕ79987 і АВОб3657/ВАСО1285.1, відповідно. Ці дві послідовності мають еквівалентні ступені гомології, але були обидві залишені для аналізу, оскільки вони мають відносно різні набори мутованих залишків і відрізняються за своїми фізико-хімічними властивостями. Послідовність ЇС1 одержана з послідовності ВАСО1682/АВО64054.1, в якій потрібна мутація тільки двох залишків. Послідовності І С2 і | С3З - варіанти послідовності І С1, в якій рекомендується замінити потенційно проблематичні залишки легкого ланцюга: мутацією одного доступного розчиннику метіоніну (М51) на лейцин (версії З і 4), і заміною аспарагіну М5З на залишок серину в одному потенційному сайті деамідування (версія 4). Не всі можливі комбінації були залишені, однак чотири комбінації покривають більшість потребуючих уваги моментів. Використовується нумерація за Кабатом.
Таблиця 2
Легкий ланцюг | Легкий ланцюг (послідовна (нумерація за | Версія 1 (І С1) | Версія 2 (І С1) | Версія З (І С2) | Версія 4 (І С3) нумерація) Кабатом) сіш17 сіш17
Меїбб Меїбі 77111111. | РазомдляМі сіпт6 сСіптб діаб2 діаб2 сбіп75 сіп75
Меїв2 Меїв2
Авп8гА сіпеб сіп8З діаї 11 Аіат1З 71111111 | РазомдляМу 11 мутацій
Мутації, що вводяться через гуманізацію варіабельних ланцюгів, зазначені маленькими літерами і виділені підкресленням, гіперваріабельні ділянки підкреслені. Послідовності константних доменів опущені.
ІС1:
ЩУМТОВАРХ УЧАТЬ СКК. НЕБЕС КОМ БЕОКАСОБРО
ПЛУВМОМОА БУВ СТАВИ 5ВУБАБОУЄХЄ ТУСМОНЕЕЖЕ
ТЕС ЕКС ІК ВЕСТ МЕН
І Сг:
ПУМТОЛАРЕ УАУТтТреаУВ СВК НЕО КТУ УМХ БОБИ РО
ЛЖВ БОУРОВЕОВ ОБ АКТВІ ЗВУВАКОУЄУ ЖУСМОНЕЖКР в ЗТЕОпОТКСВІК ЗВО ТО Ме)
І СЗ:
ІЇУМТОЗАРЕ УАУТРеВЗУВ ІЗСВО5КВІІ. НОСИК ТУСУХ БІОВБРОСЯВО
ПУВІбН А БОУРОВЕБОЯ 5ОТАКИ ВІ ЯВУБАВОУЄСУ УУСМОН ЕХ
ІНТЕ ВІК БО ТО М
Не:
ОУОГЕЖВОВО ГАРТ ВІ ТСТУЧ ЧІ ОВУСУМУВО РОК ЕМ У
ПУСЮСТТКЕМ озіКеВ КТИМУККОУ В, Ки ТОЮт
АаМУУСАВІУ ОСТ УТУХ ДІЗБО ПЗ МК
Нег:
ЕС КЕ ОРО СУАРаВБ А ТСТУчСВМИ ВУСУМУВОР РОКОСЕУ КА
ТОТЕГ у Ух зі ке Кі: КОМОРІ, КА 5ЕТТЮТ
АМТУСАВУ УМ ООСТУТУ5 ЗІБ КЗ
Послідовності одержаних химерних гібридів мають наведений нижче вигляд:
Химерні послідовності І С
МСС Р УАТАТОСУННМИ УМОВА АУТВВЕВУМ СК КМ НВО
КТ УК ОБВООБРО ТВ МОМ АЗС УРОВЕЗОВСОТАКТ ВІКУ БАКУ Є
УУУСМОаНБУВУТЕОССТК КІКЕТУААРХУМЕРРУВЕО КІОТАВУУСЬСММЕ
УРЕВАКУСУКЮУВМАОЧОМЗОКВУТЕОВУКОВТУВ БУТТІ ОКАТЖЕКНЕУ У
АСЕУТНІКН ЧУ ТКЗЕМКСКС ІЕС НО МОЮ
СТАН АССАЛТОСТО ПАСТ ОА ТСАТССТО ТЕСТ НН ССАССЮ
ОА НС ОСАСАССТОАСАТССО ТАЛА САН ООН С АНТ СОЮ
СИТА НАВАН ТАТА САН ОС АСТАТАААНЮТО стос АСАСТАНОСА М АССТАССТО ТАТО СИТО СОН НСС
АплнЧтОАсч НАТАНА АКА АССТ НС САССНО СКС
СИН ТСН АВСОН САН НС АС НЄСТ ТСАСССТОСОСА ТС сира АН НН АС ОТ АСТАСТОСА САС АССТТОС АС
АССССТАСАССТ ТИН НАС АМНТОЗАНА САН АССО ТСН пет АС ТТ САС АОС ААОТ ОС НА
Ха Си АСААСТСТАСССТЕНЧН НАС АМНИЕ
ОСА А АОС ЕС АСААДОСОССЧСТ ОС НСС ОА АСССОС АСТМІ СССТС
АСЕСПВАССАСВАСТОСАССАСМЧ НК АССТАЄТОСССТО ОСТ АСССТОАССЮ
ТОТССААООССОАСТАСВАПВАЛОСАСААСОСТИТАСОССТОТО ВО СТО ВСОСА
ССС ТТ ССАОСССТО ТТ САССААСССТ СТАНЕ НН НС АНТ
АЗС МеВ,
Химерні послідовності НС
МОЖ ПУ АТАТОУ НСТУ КЕЗОРО У АРЗОВ ЗИ СТУЗОКО ЦУУСУ
МУТКОРРОКСО БУС УПУЄЄ ТТ УМА КУВОМАКОМОВОУ ВКМ ОТО
ОТАМУУСАВУУЖСОСТЬУТУВААВТКОРЗУВИ АРСЗВЕТХЕОТААОСТЬУКО
УКРЕВУТУЄУМУСАТТЯОУНТЕРАУ ОВО УЧ ЕВУУТУРКВЖ ОТКТУТОМУВ в НЕРЕМТКУРКЕУКЄЗКУСРРСРЯСРТАРЕВСОЮРУУКОЕВРЕРКЮТІ МІХЕТРЕУТСУ
УУВУВОКОРЕУЮВМ У УПОСУВУНМАКТЕРЕССОВКУТУ ВУ ВУ ТУЄНОГНУЄ
МОКЕУКСКУ МЕС РОМЕО КАКОСВЕЕРОУ УТ РРО ЕМ ТЕМУ ТС У
КОТРА УВУКУМОЗРЕММ КТ ТОВОЗЕВ УВУ ВЕУ УЄ
СУМНА НМНУ ТОК ОКО КУТ
ТАС АССАТОЦОНТТ ОА ССТОСАТСАТССТТОТ ТЕСТ НО НОСА
АК НС ОС АСАКЦЦСАССТОС АНТ САМО АОС НСС ОСС
ВК С САС АСАСН СТО АОССАТСАССТЕОСАССО ТО АСССТКОСТ ТС АС
ПСАТСОАСТАСООССИ ТИЛ АСТЧОСА ТС АСКЦСОССССС ОС АЕН СТОСАС тост АТС КН СОСНА АССТАСТАСААСАСКН СТО
ММС А АТСС АКА АСАНН САВА САСО ЕТО
АПАТІЮ САСАСССАССАСАССОССА ТЕТ АСТАС ТИС СССОСАТ
МІ ТАС СС НН САСССТТОЮ ТО АСССТ ИАОСОСССК САС сс не пестить иИа с АССТОСОВАИССАС
ПОС ЕНТТТ СААСВАСТАСТТ СОСОК СТО ТИ АССОТОТ
СТО ААСТОТ ОС ЕТ СТАС НС ОС АСАССТТ ССС ОСНО
СА ЕСТОНОССТОТАСТОСС ТОП СОТ ССО НОТ О АЕСО ОСС СС ССС
СН САССААЧАССТАСАССТО ТАС ОМ АССТАСААОССТ ТС САС
АПЕТИТ АСААОСОТТ ОО АСТССААСТАССТНИСССТОСТТОСОСТТОСТОССС
ПЕС ТССТЕКНОСОН СС АНА ОН ТОСТИ СОССТОСТА АКТА
МАС АСССТОАТАТС ТС АССОСТО АС СТАССТО ТС ОСТ ОЮТ ОСА
СТО ССС АВ АСССТТТО ОН ОСА СА АСТОСТАСОТОПАСНССТО
АОС ТСАСААСНСАЛОАААМ НС СОВА АОСАСТСААТТСАССТ
АСОСОООО ТО ТСТеЕ СТ ОАССТ С АССАСНТАСТО ОСТ ОА АС
АСААТАСААО ТО ТААОТ СТО ААСЛАСННИОССТТТОС НТ ССО АОС
АССАТСЕССАЛОЦСС АМС АС АСНОО АС СТАВ ТОТАСАСССТОЄ пОСОССТА С САССААСАСА НК САМО АССТАСЦО ОТО ТЛ АСИСТ СНУ
АХА СТАС ССО ККАТСОССОТ НА Н НІА СТАМНЮСА
ССПОАСААСЛАСТАСА АВАНС СТ ОСТ ОО ПОСТ СТАС ОС АНТ ептестатАСТОСАССНТ ОСА ОВАСА АТС С КН АСО ЧА А
СУС СТИ С ТС САТОС СО АН СТО САСВАССАСТАСАСОСАИА
АОС ССС СС СА АСИТИЕБО ТО КОЗА,
Гуманізовані послідовності МІ.
І С1:
МЕТ ЗСТЕОУАТАТОУНУНУМТОДАРЕУАУТРОАВУВІСКВКМ ІНЬ
ОТ КВОКРОСМЗВО ЛЕВКА УВО ОСТ АКТ ВІВ УЄАЕОУ
ОУТУСУ Се У ТО КК УА АРЗУРТТВРИТВКОГ КОТА ВУУЄТИОИ
ТУРКА КУСУКУТМАСОВОМВОвЗУ ТОК ПЛ ЯКАВУСКНКУ в. тАСЕУТНОСТ УХРУТКЗЕМВОВС ТК ТО Мецю)
ЕЛ АССАССА ТОНИ ВАТА САМ ОССТО ГП ОС ТОВ НСС
МАН НАСОСА СООІОА АССОСАКНКНКСАСНЕО
ОТО АС СН АЕН ТО МАМА НААН АС АСССТТО
ПОСАСАССА ОСИ ААСАКЄСТАСЄСТОТАСТОН ОСТО СТАС ССС
ММА ТО АТС АОТАТО МТА АКНЕ НОСА НН НОТ
Оса САН КОСА С АССОССТТСАСССТОСО САТ
ПОС АСК АН АС ОКО ОТ АСТАСТОСА ОСА АСЄСТОМ АС
МИСТ АСАССТТ С НН НАС ААСКТОІАНАТСААНІ ТАНК
СИЛОС ТОСТИ САС ТО СТЕ ССО АС АСС АОС ОА А НА
ССС ТОСТИ ОСС ОА АСААСТТСТАСССТТОСИИ АСК СААСНУК
САС ОАЕ ОИАСАМНКЛ СОТ А ТО НАСОСА ТЕСТ
АЯКС АССАСТ САС АСАОСАССТАЄСТ ОСС ОС СОС АСООЮТТАССЄ
ТАН МТ АСПАЛААССАСАМНТ ОТ АСНСТО ЗАСТОСО
САС СС А ОССЄСТО ПАСА АСТСС ТТ АС НН САСТОСТИА
АОСТТ БО ПО Ме
І Сг:
МОСТИ УАТАТОСУНЯЕНУМТОАЛАРЕУАУТРОАВУ СВК. НЯ
СКТУМИУРОВРООВБРОМ УВІ ЯМ АЗОУРОВЕБОБОВОТАЕТ НВ УВАВОУ
ПУХУСМОНЕУРУТРОСОТКІ ІКТ УААРЗУМЕРЕЗОВОГ КОТА УУЄТЬММ
ГЕРЕВАКУТУКЮУЮВМАСОБОМЕОВУУТЕОЮУКОВТУ ВУ ТІ ЯКАЗУБЕНКУ
УАСЕУТНОСИ 55РУТЕЗЕМВОВС (БО НО Ме)
ОСТАОСЄЛССАТИпОСТОСАОСТОСАТСАТОСТОТТОСТОСТООССЛССО
ССАССОВСОТИислокасаАСАТССТОАТОАСССАЧОССОСССССЛЬОСОТОЮС
ГЕТОАСССССПВОИСасслосюта ласАТСАЄСТОССОСАОСЛИСАЛИЛОЮСТО
СТОСАСАЙСАОСООСЛАСАССТАЄСТОТАСТОСТТОСТОСЬКОСОССССООЮЄ
АОАЛОСССССАОСТОСТОАТСТАССОССТОАОСААССТО ОС СЛОСОССОТОЮСС
СВАСОСОСТТСАОСООСЛОСОПСАОСООСАССОССТТСАСССТОСОСАТСВОС
СОСОТОВАВОССПАВСАСОТОСОСОТОТАСТАСТОСАТОСАОСАССТОВАЄТ
АССССТАСАССТТТ СОЮ СООСООСАССАЛИСТОСАСАТСААОЄЮСТАЄТЬСТОЮС
СОСТОСТТССОТИТСАТСТТОССТОССТОСОАСОАОСАОСТОААСТССОЦОСА
ССОССТОСОТООТОТОТСТОСТОЛАСААСТТСТАСОСТО ЙО САСОССААОЮТ
ОСАСТОСВАЛИСТОВАСАЛАСОСССТОСАОТОССОСААСТОССАООАОТОСОТС
АССОАЧСАСВАСТОСААОВАСАССАССТАСТОССТОИТОСТОСАСССТОзССЄ
ТОТССААООССВАСТАСОВАСАЛОСАСАЛОСТОТАСОССТОТОАОСТОАСОСА сблабаєстатеслассстатвассАасТеСТТСААССИЦИВОСОАСТОСТОХ
АОСТТІВКО ТО Ме) /с3;
МСЕЖУСПЬВІ ТАТАТОУНИМУМТОЛАРНУАУТРОАВУВІЧСВЯВКН НЯ
ОКРУГУ ОВРООЗРОСМІ ТУ ВІЗ САБОУРОВЕНОВОХОТАКИ ВІВ УКАКОУО
УУЖСМОНІЕУРУТЕОСОТКОЗЧКЕТУААРЕУВЕРЕЗОВОЇ КОТАВУУЄМММЕ
УРЕБАКУСТЖКУЮМАЦОВОМОКУТЕОЮУКОВТУ ВІ ЗВТ ЗКАВУВКНКУХ в АСЕУТНОСІЯЯРУТКЕЕМЕОВС (БОЮ Ме
ПСТАИЙСАССАТОСОСТОИСАОСТОСАТСАТОСТОТТОСТОВТОЮОСАСС
СОСАССОССОТОСАСМССАСАТСОТЧАТОАСССАСЮОССОСССССАОСЮТ поса АСССССОСОССАИСО ТО АОСАТСАОСТОССОСАОСАОСААСА
ОощлЛОоСстисАСАОС АТ НОСА АВАССТАСЄСТТТ АСВ ОСТ САНОСОЮС
ОН САН С ССАССТНТСАТСТАСТСОССТТО АКОТ ОСТАННЄ с Оса АСЦИТ АОСОНС НЕНАЧЕ С АС АССТ
КАСА ПОАСОСС НАСОС ТНК ОТ АСТАСТТВ АТО
МСС ЛАСК ССТАСАСЄСТТ СН ОН НН САС ОСАСАТС
АНТ АСЮ ТОСССЄСТССТ ТО СС ТО САЛО ТОСТИ А
САС ААТ СН САССОССТССО ОТО ССС АСААСТІСТАЄ
ССО алО СА АСН ТОСАСТОСААЛОС НАС А АСОСОИСТО САС
СААСТОЕСЦСА ОСЬ ТОСТІВ САССС АОС ЬССЬЬСТТ ОСА АОС АСАССАССТАЄТ
СИСсТИВетеАсєстАЄЄєюттССтАСОССТЬКТАССАСААССАСА АС пт АСОССТО ТОНН ОО ТАСС АОС ОТ СОС АОС АОС АС
СП САС АС ОВ АЛОСТТІВЕО ПО Ме,
Гуманізовані послідовності МН не:
МОУ ПМ АТАТОУ НО УВ КЕБИРОСУ АЕН ОО ТСТУ БОР ЗЄС У
МІК ОВРОКСО БК ТТ УМА КВК ОКОМ УВК УТ тТАМУЖСАВІУТ НК УТУБААТЕСРЕУВР АСК ТТ ААУ КЕ
БРЕРУТУВУКЧОСАІ ТО УНТЕРА У ОБО ТОБ У УГТ УВІ КТ УТСМУ Є
КРОМКУ ЛКК УБВК УСРР ОСРАРЕР ОСРУУК БЕРЕ РКЕГВ ТС МІК ТРЕУ ТУ У
УБПУБОВОРКУСЕЧУТУ СУК УНМАКТКРКЕКОСМУ ТКУ УВУЛТ УСНО УЄУ
ОКЕУКСЕУЧККЕСИ РУЧЕКПяКАКООРВЕРОУХ ПТ ВРЯОБЕМТКМОУВО ТУ К
СКУ АУККУМООРЕММУКТТВВУ ОКР ВТ УКВ КСО МУ Є в ЗУ МНЕАСНУНУ ТОК ВЕС АВ
СТАВСАССТА ТОНН СОНАТА ТСАТССТО ПСО НОНОССАССО
ССАССОН НОСАСАЄССАЛЬ СЕ ОСА ОСТОИ АЛАНА ОСНО ССС НЄ
ЕС АОСОАСАСССТО МСАТСАССТОСАССОТТИ ОСОСТТ САС
ЗАС АСТАМЧН АХ САТАНА СОН АСНОНОЕ СТІ АЮ тиСстекарєа т вАа тен ас АССАСЄСТАСЄТАСАКЛС СС ОСТ А
АМТС АТС АМНАСААСАСААСВАЦССАОСО ТСОСТЕСА
Ми АСЄСАН СТО М САС АСО АС СС СА ОТ АСТАСТОСОСССОСАТ
СОТ АСТОЕНОН ОСА СОННА ОСТ СЕНТ ПТО АСОСОЛТ С АОС СНО АССАЄСЛАЄ сю нт СсоСАССТОСОАТССАЄ
СПОСОСТеТИапВастасстото вАОЛАСТАСТТОССТО АОССТОТОАССОТОТ
ССтТОПААСТСТООСОСССТИАССТОСООСОТОСАСАССТТОССТОССОТОСТО
САЦТОСТОСПОССТОИТАСТОССТОТОСТОСОТО СТО АОСОТОССТССТОСТОЄ
СТИВИСАССЛАПАССТАСАССТИатААСОТОВАССАСАВОССТТССААСАССА
МИТОЧВАСАЛОСОДОТОСАОТОСААСТАСООСССТОСТТОСОСТТОСТОССС
ТОССССТОАИТТОСТО ОСС АССТАОСОТОТ ТОСТИ ТЕСССТОСТААОЮСТА
АОПВАСАСССТОАТОАТСТОССОВАСОССТОАОВТОАОСТОТОТОЧТОСТОСА
СПОТОТОССАООАОПАСОСТОАОСТОСАСТТСЛАСТООСТАСЄСТОСАСОЮСОТО
ПАОСТОСАСААСОССААОАССААОССТОО ОС ВООАОСАСТТОААТТОСАЮСТ
АСОоООТаСТОатСтОТСтОАССОТОСТОСАССАОСАСТООСТОААСООСАА
АПЙААТАСААОТИТААОСТСТОСААСААОПОССТОСОСТОСТОСАТСО АС А А
МОСАТСТОСААОСКОСАХМИЮОССАИЮСТАСИО АОССТСАСЮТТОТАСАСОСТОЄ
СТОСТАОССЛООЛАВАСАТОАССАЛОААССАСЮТОТОССТОАОСТОТСТОЮТ
ПААОПОСТТСТАСОСТТССОАСАТООССОТОПАОТОСИАОТОСААССОССАЦ
ОССТО ВО ЛАСААСТАСААПАССАССОСТОСТОТОСТОЗАСТОССАСЧОСТОСТ
ТСТТОСТОТАСТОС МИСТ АССОТО ПАСА АСТОССООТИВСАИСАВОИСЛА
СОПСТЕТТССТОСТОСОТОАТОСАСО АОС ССТОСАСААМССАСТАСАСССАВА
АатесстатесстотстетовастолайєсттиВвО І Мено
Ннег:
МОЖЕСНСРІУАТАТОУНЧЕУ ОТ КЕ УАРОСВІ ЯК ТСТУВОВИ ЛІ КО
УММІВОРВО КСО УПЛУЄТОТТУУМАРІ КОВІ КОМ КЗОУВ ОМВК
ПОТАМУЖСАВІУ УКОСУ ТУМЕАЕТКОРУЕРІ АРСВЕТУКЕТААЦОСТУК
ПУБЕРУТУЗЖУМІОАІ ТЗСУНТЕРАУ ОБ БІ З5УУТУВІІВІОТКТУТОМУ в МиКРЕМТКУЮКЕУККУСРРСЕЗСРАРЕВ ООРУУКЕЕРРЕРКІУТІ МІ5АТРЕУТС
УУУВУЧТВОРЕУОВМУУУЮСУКУНМАКТКРЕККОВМЕТУВУУВУ Є ТУСНОГАУЄ
ІМОКБУКСКУЗМКСИ РУМЕКТІУКАКОСОРВЕРОУ УТ РРООБЕМТК МОУ ВТО.
УКОВУРЗОІАУКУВУМООРЕММУКТТРВУЦЮВОСЯКИ УЛ УЮКУЮТОВОМУ
ЕЗСЗУМНЕАІНМНУТОКВІ ВІВ О8БО ЩО ХК)
СТАОСАССАТОВОСТОЮВАОСТОСАТСАТОСТОТТССТОСТОЦЮСАЮСО ссьседасотасАєвасогаотосласто АЛ ЛОСОВССССОВОССТОЮ тІИСССССПОСООСАСЮСТИАОСАТСАССТОСАССОТО ЛОСОЮСТТС АОС
ПАТСОАСТАСОССОТОААСТОВАТССОИССАССОССССОСПИСАЛОСИССТОВАЄ
СТО НС ЧАСТО СО СН АССАССТАСТАСААСОССССОСТОА
МКК СН СТаАССАТСАОССААСОАСААСАНСА АЙ САТ ТТ
АВАТОЛАСАОССТОЛАПТАССВАСОАСАССОССАТОТАСТАСТОСОСССОСАТ сататТАСТОНН НС МН НСАСССТОНТТ СО АССТСТС Е САЧНЧСААСГАО
ОСС ССО ССС оС САС СС А АЄС сосен ОА АС АСТАСТТСССТОЬН ОТ ОАССОТО
СТОЮ ААСТСТО ЮК СС ЧНАССТОС ОО СС ТОП АСАССТСССТОСССТОСТО
САС Нота АСССТ НОСИ ОСС
СИС АССАЛОАССТАСАСЄСТОТААССТООЬНО С СААССТОС АС АССА
Хатка ОСАС СА АСТАССОНН ССС ОСС ССТНЄ
ТЕСТИ Оое Стос АС НС ОСТ
АМОЛПАСАСССТОАТОА ТС СОС ОО АСОССТО АС САСЄСТОТО ТОСТИ СНІ А
ОТ СОСССАСАСОЮАСЮЮЄТО АОС ССАСТТСААСТОН ГТ АСОТООАСТН НН О
ПАС ТЕС АСААСИССААСАССАНЮС ТЕН АНА ОТ ТСААТТОСАССТ жа а СИ АССПТОСТЕСАССАСВАС ТОСТИ АСОССАА
АСААТАСААСВН ТАН СТО АСК СС ОСССТССТССАТСИАВАлА
АСАНИНСАМмМиН АННИ СТАСН ОН СТ САНТА САС
ОПП АС АСЮААВАВА НАС АВАКМКСКМН ОО САС СТО
САН НКСТ ТСТАСССТТ ССО СА ПОЦССКССОССТ ОВ АСПЕН АС ТА АСК АЮ
СОС АС АСТАСАЛАВАССАСОССТОСТО ПОСТТЕКАСТОССАСОЕООЄСТОСТ
СПЕ АСТОССАСИЄСТОАССО МОТАНКИ ОС АС АСЮОСАА
СОС ПСЕСТОСТОС АТС АСПА НЕ ССТОСАСААССАСТАЄАССССАСА
АМС ССС ТСН ТАС ТЕБЕ Ме,
Приклад 16: Гуманізація на основі молекулярно-динамічних траєкторій
Послідовності областей Мі і Мн 1607 проаналізували програмою ВІ АЗТ у базі даних білків (РОВ) (Вептап евї а!., Мисівїс Асіа5 Везеагсн, 2000, 28:235-242), і найближчими гомологами для варіабельного легкого ланцюга виявилися 1МН5, 1М9У і 1МОШ (У Мої Віої 332:423-435, 2003) з еквівалентними ступенями гомології. Як шаблон вибирали послідовність 1МУО, виходячи з високої точності кристалічної структури, яка для неї визначена з розрізненням до 1,22А.
Найближчим гомологом для важкого ланцюга виявилася послідовність ТЕМ (Маї 5ігисі Віо|! 7:881-884, 2000). Вибрані послідовності 1МОУ і 1ЕМ5 використовували для побудови гомологічної моделі варіабельних доменів, яку потім мінімізували за енергією стандартними методами.
Потім провели моделювання тривимірної гомологічної моделі 1607 методами молекулярної динаміки (МО) протягом 1,1 наносекунди, використовуючи неявний узагальнений розчинник
Борна (див. Сайсспіо 4 Іему, ) Сотршї Сет 2004, 25:479-499). Молекулярно-динамічне моделювання почали з вибору початкових значень швидкостей відповідно до гауссового розподілу при температурі 500 К з подальшим періодом приходу до рівноваги тривалістю 200 пікосекунд (пс). При моделюванні наявність усіх зв'язків враховували за допомогою алгоритму
ЗНАКЕ (див. Вагій. еї аї., У Сотр Спет, 1995, 16:1192-1209), використовували крок за часом 1 фемтосекунда (фс), моделювання вели на основі алгоритму інтегрування Верле в канонічному ансамблі ММТ (число частинок, об'єм і температура) при температурі 500 "К. Моделювання вели з накладенням гармонійних обмежень на атоми кістяка. У ході останньої 1 нс цього першого моделювання зберегли 10 різних конформацій, по одній кожні 100 пс.
Одержані 10 різних конформацій потім використовували як 10 вихідних точок для 10 циклів молекулярно-динамічного моделювання без обмежень на атоми кістяка при температурі 300 "К тривалістю 2,3 нс кожне в неявному узагальненому розчиннику Борна. Кожне молекулярно- динамічне моделювання починається з вибору початкових значень швидкостей відповідно до гауссового розподілу при температурі 298,15 "К з подальшим періодом приходу до рівноваги тривалістю 300 пс. Наявність усіх зв'язків враховували за допомогою алгоритму ЗНАКЕ (див.
Вапй. єї аім., У Сотр Сет, 1995, 16:1192-1209), використовували крок за часом 1 фс, моделювання вели на основі алгоритму інтегрування Верле в канонічному ансамблі ММТ (число частинок, об'єм і температура) при температурі 298,15 "К. У процесі моделювання зберегли 2000 кадрів, по кадру кожну 1 пс. Для програмування наступного протоколу на етапі після введення використовували мову 5сіепійс Месіог І апдиаде (ЗМ), підтримувану середовищем молекулярного моделювання МОЕ (МоїІесшаг Орегаїпуд Епмгоптепі (МОЕ), Спетіса! Сотриїпд
Стоимр, Оцебес, Сапада).
Насамперед, кожний кадр М оптимальним чином накладали на попередній кадр М-1 для усунення обертання і трансляції молекули як цілого у процесі молекулярно-динамічного моделювання і розрахунку. Таке накладення одержували шляхом мінімізації середньоквадратичної відстані (Коої Меап зЗдиаге Оізіапсе, КМ5О) між усіма парами відповідних атомів двох кадрів. При побудові накладення враховували тільки важкі атоми кістяка антитіла. Потім, використовуючи той самий метод накладення, кожний кадр наклали на медоїдний кадр. Медоїдним кадром називається конформація антитіла з декартовими координатами атомів, найбільш близькими до середніх координат по всіх конформаціях. Для кожного з 10 проведених циклів молекулярно-динамічного моделювання використовували останні 2000 конформацій для кількісної оцінки відхилення положень атомів кожної амінокислоти мишачого антитіла від їх положень у медоїдній конформації для даної амінокислоти. Для кожного залишку антитіла і розрахували середньоквадратичну відстань між важкими атомами конформації | і медоїдної конформації порівняння К. Середньоквадратична
Зо відстань розраховується за наведеною нижче формулою: т 2
У(ак) вм50)-15 А - т з де дк. евклідова відстань в ангстремах (А) між важким атомом 1 залишку | і цим же атомом у медоїдній конформації порівняння К. Для попарної асоціації важких атомів 1 також враховували симетрію по важких атомах бічних ланцюгів амінокислот Авр, Гей, Маї, Сім, Ага,
Ре ї Туг. Конформація порівняння К змінюється при переході від одного залишку до іншого і відповідає медоїдній конформації К з мінімальною евклідовою відстанню до середніх по всіх конформаціях координат для аналізованого залишку і.
Гуманізуючі мутації шукали шляхом визначення зародкових ліній антитіл людини, найбільш близьких до мишачого антитіла у термінах їх найбільш гнучких амінокислот. Для цього руху 60 найбільш гнучких амінокислот мишачого антитіла у процесі 20 нс (10х2 нс) молекулярно- динамічного моделювання порівняли з рухами відповідних амінокислот 49 гомологічних моделей зародкових ліній антитіл людини, для кожної з яких провели по 10 циклів молекулярно- динамічного моделювання, дотримуючись того ж протоколу. 49 тривимірних гомологічних моделей зародкових ліній антитіл людини побудували шляхом систематичного комбінування 7 легких ланцюгів антитіл людини, що найбільш часто зустрічаються (мК1, мКк2, МмКк3, мк4, мА, маг,
УХЗ), і 7 важких ланцюгів, що найбільш часто зустрічаються (мп1а, мп160, мп2, мАЗ, мп4, мп5, мб), (Мисівїс Асід5 Незеагсиі, 2005, Мої. 33, Оагаразе ізвце 0593-0597).
До складу 60 найбільш гнучких амінокислот не входили амінокислоти з гіперваріабельної області і її безпосередньої околиці, тобто амінокислоти з б атомом вуглецю, що знаходяться на відстані менше 5Е від будь-якого б атома вуглецю амінокислот гіперваріабельної області у тривимірній гомологічній моделі.
Ступінь гнучкості амінокислоти кількісно характеризували шляхом порівняння середньоквадратичної відстані (Рі) для даної амінокислоти (ї) до її медоїдної конформації відповідно до даного раніше визначення останньої, усередненої за результатами 10 циклів молекулярно-динамічного моделювання, з середньоквадратичною відстанню (Ет) по всіх амінокислотах мишачого антитіла, усередненою по тих самих 10 циклах молекулярно- динамічного моделювання. Амінокислоту вважали досить гнучкою для можливої взаємодії з рецепторами Т-клітини та ініціації імунної відповіді, якщо її параметр гнучкості 71, що визначається за формулою 21-(Бі-єт)/Ет, перевищував 0,15.
Використовуючи описаний протокол оцінки гнучкості амінокислот на основі усереднення результатів молекулярно-динамічного моделювання, 23 амінокислоти були визнані гнучкими у варіабельній області мишачого антитіла 1607, за виключенням гіперваріабельної ділянки і її безпосередньої околиці.
У набір гнучких залишків легкого ланцюга увійшли наведені нижче залишки (використовується послідовна нумерація): К16, Е17, 44, 546, 047, 548, К79, 282, Е84, Е86 і
Е110; для важкого ланцюга у набір увійшли наведені нижче залишки: К5, РА1, (342, К43, Кб4,
В70, 072, М73, 574, 975, 0861 0103.
Ступінь чотиривимірної відповідності мишачого антитіла 49 гомологічним моделям зародкових ліній людини кількісно характеризується шляхом аналізу по положеннях окремих атомів 60 гнучких амінокислот на єдиній просторовій кубічній решітці, використовуючи всі пікосекундні кадри для 10 циклів молекулярно-динамічного моделювання. Решітка має розрізнення ТЕ і складається з 445740 вузлів. Решітку ініціалізували, використовуючи тривимірну структуру кристалографічної моделі антитіла людини на основі антитіла ЗЕАВ (Віоспет 30:3739-3748, 1991). Модель 8ЕАВ також використовується для позиціонування всіх конформацій антитіла з пікосекундних кадрів на просторовій решітці. Для цього одержана у процесі молекулярно-динамічного моделювання медоїдна конформація антитіла накладається на модель 8ЕАВ. Процедура накладення полягає у вирівнюванні моментів інерції двох моделей з подальшою мінімізацією скалярних відстаней між б атомами вуглецю обох моделей. Всі інші одержані у ході молекулярно-динамічного моделювання конформації таким самим чином накладаються на медоїдну конфігурацію.
Для пари порівнюваних антитіл проводиться два типи аналізу і одержують два ступені гомології (електростатична гомологія і ліпофільна гомологія), які потім підсумовуються для одержання повного ступеня гомології. При аналізі електростатичної гомології на решітці враховуються всі атоми бічних ланцюгів амінокислот. Шукану величину у деякому вузлі решітки
Зо х одержують шляхом обчислення для атома значення просторової гауссової функції (х), взятої з вагою, співвіднесеною з частковим зарядом атома відповідно до опису силового поля Атрег99 (Сіеріак еї а1І.; У. Сотр. Спет. 2001, 22:1048-1057). Функцію Кх) беруть у системі просторових декартових осей координат у наведеному нижче вигляді: г)- (Буг) З хек ЗБЕ,
ЗБ 25 де Х ї М - відповідно декартові координати вузла решітки і атома в амінокислотному залишку, з -/1,6 (де Г - ковалентний радіус атома). Аналіз проводять для всіх конформацій амінокислоти, одержані результати усереднюють по всіх вузлах просторової решітки. При аналізі ліпофільної гомології враховуються тільки ліпофільні атоми бічних ланцюгів амінокислот.
Шукану величину у деякому вузлі решітки х одержують з тією самою гауссовою функцією К(х) без зарядового зважування. У результаті для двох наборів конформацій молекулярного динамічного моделювання, взятих з пікосекундних кадрів для двох порівнюваних антитіл, одержують дискретизацію по одній і тій же просторовій решітці. Ступінь електростатичної гомології (віт-е|есу); між антитілом а і антитілом р можна розрахувати, використовуючи наведений ниж увив зхб|-|хе хв) бт-еівс---2. деду 7 ------
У, (ее) і-ї І
Ступінь ліпофільної гомології розраховується за тією самою формулою з використанням даних, одержаних при описаній вище дискретизації за ліпофільністю.
Найбільший ступінь чотиривимірної гомології (повний ступінь гомології - 5095) по 60 найбільш гнучких амінокислотах у порівнянні з 60 найбільш гнучкими амінокислотами мишачого антитіла 1607 спостерігається для моделі зародкової лінії людини мл2-мп4. Тому для заміни гнучких залишків мишачого антитіла 1607 використовували модель зародкової лінії людини мл2- мп4. Перед заміною амінокислоти двох послідовностей вирівнювали для одержання найкращого накладення б атомів вуглецю у відповідних тривимірних гомологічних моделях. Небажані мотиви в одержаних гуманізованих послідовностях шукали аналізом у програмі ВГ А5Т, як описано раніше у параграфі 41, див. вище. Крім того, використовуючи базу даних ІЄОВ, одержані гуманізовані послідовності перевірили на наявність відомих епітопів для В-клітин або
Т-клітин, як описано раніше у параграфі 44.
Найкращий збіг з послідовністю з бази даних ІОВ для легкого ланцюга ((С7) був одержаний для послідовності РОКАРОГІМАМОМІ (5ЕО ОО МО: 52), яка покриває гіперваріабельну ділянку СОК2. Послідовність має ступінь збігу 73 95 з послідовністю пептиду
РОКАРКІ ІМААБОЇ (5ЕО ІЮ МО: 53), який демонструє зв'язування з НГ А-ОКВІ 0404", але імуногенність якого для людини не показана (У Іттипої! (1995) 155,5655).
Найкращий збіг з послідовністю з бази даних ІЕЄЮОВ для важкого ланцюга (НС4 і НСБ) був одержаний для послідовності З'ІЮМСММУМКОРРО (5БО ІО МО: 54), яка покриває гіперваріабельну ділянку СОКІ, але має суттєво відмінну послідовність залишків, про що свідчить ступінь збігу 40 95, одержаний аналізом у програмі ВІ А5Т по базі даних ІЄОВ.
Одержано два варіанти важкого ланцюга (НС і НСБ) і один варіант легкого ланцюга (С7).
Обидва варіанти важкого ланцюга одержані модифікацією послідовностей моделі зародкової лінії людини мла2-мп4. Послідовність НС5-варіанта послідовності НС4 з додатковою заміною потенційно проблематичного залишку: заміною аспарагіну МбО на залишок проліну в одному потенційному сайті деамідування.
Мутації, що вводяться через гуманізацію варіабельних ланцюгів, зазначені маленькими літерами і виділені підкресленням, гіперваріабельні ділянки підкреслені. Послідовності константних доменів опущені.
І С7:
ПШУМІСААРУ УАУТРЕДУВ ПОВЗЕ НБК ЕКЬОМ РСОБРОКРО
СОТ МОМОА БОУРЮВКУОВ ОБСТАКТЯ бвУЗаАББВУЄУ УУСМОНІгУуВ
ЗРК КОКО НМУ
Не:
СУСЦЕЗИРО СУАРБОВЧ ТОТУЗСЬВА ПЖСУМТОЮ БОКС
ТУ ЕТУУМ БАКІВ: КІНО КММеТНУЇ АМУУСАЩУХ
ОСТ УТУ» ДАК КО ЦІ МОВІ не:
СОУС ЧЕР ГЕ УАВХОВ ВІ ТСТУЗСКВ І ВУСУМАЖВОР РОБОТУ
БУНТУ ув ЗАСН Кін УК БМК ТО АМУУСАКУУ зо ООСТЬУТУВ ААКІЗКО Ме? 0 Легкийланцюг(послідовнанумерація)ї | (С7
АВаІв 11111111 Фам1111ї1г шт 11111 бїам1111г1
АВ 11111111 НВ 17111111 ім? 11111111
НЕТУ С: ВН ТО ОН НО
АВТ 11111111 НА11117ї11
АВаВа 11111111 Фам1111ї1г ев. 11111111 бїам111717ї11
РазомдляМ. 77777777 |вмутацій////// 17777771
АЗМБО 77771111 ФАВМ 7 РОГ
0 Легкийланцюг(послідовнанумерація)ї | (С7
Приклад 17: Фармакокінетика
Дослідження фармакокінетики проводилося на відповідній кількості тварин (наприклад, 4 в одному дослідженні; 2 для одинарної дози і 2 для повторної дози, 5 доз на тиждень), здорових, спеціально вирощених самцях макаки Супотоїди5 вагою від 2,0 до 5,4 кг у віці від 2 до 7 років.
Тварин розділили на дві групи лікування, тварини однієї групи одержували антитіла Ідса як контроль, тварини другої групи одержували гуманізований 1607. Мавпам кожної групи одноразово внутрішньовенно вводили болюсну дозу, наприклад, 2,5-10 мг/кг в об'ємі дози 2-3 мл/кг, або 5 доз на тиждень, внутрішньовенно. Зразки крові відбирали у різні моменти часу після введення кожної дози і обробляли для відділення плазми. Зразки плазми аналізували на концентрацію повного Ідса і моноклональних антитіл СХСК5, використовуючи імуноферментний аналіз (ЕГІЗА).
Приклад 18: Порівняльні дослідження
Ряд антитіл даного винаходу порівнювали з комерційно доступними антитілами у паралельних експериментах. МАВІ190, що постачається компанією К 8. О Зузіет5, являє собою мишаче моноклональне антитіло. КЕ82В являє собою щуряче антилюдське СХСОСК»5 антитіло і постачається компанією ВО. Клон 2С1 являє собою мишаче моноклональне антитіло з введеним маркером (глутатіон-5-трансфераза, ЗТ), що постачається компанією Абрпома.
Описані тут різні гуманізовані антитіла ізотипували з використанням реагентів і методів, відомих у галузі. Наприклад, багато з описаних антитіл мали легкий ланцюг к, багато були дос, а 4609, 6803 і Н28 належали до ІдоОзга. Більшість антитіл зв'язувалися з аміно-термінальним закінченням
СХ, і декілька антитіл конкурували один з одним за зв'язування з тим самим епітопом або областю.
Антитіло компанії ВО погано зв'язується з мононуклеарними клітинами периферичної крові (РВМС) людини.
Хоча антитіла, як правило, не зв'язуються з клітинами СупотоїЇди5, описані у даному винаході антитіла 14С9, 19Н5, Н2г8, 5406, 56Нб і 7987 зв'язуються з клітинами макаки.
Виявлено, що антитіло 1607 мало більш високу афінність, яка щонайменше десятикратно перевищує афінність комерційно доступних антитіл, і мало у 100 разів кращу швидкість
Зо дисоціації комплексу антиген-антитіло у порівнянні з іншими антитілами.
Приклад 19: Масштабування
Кожний варіант моноклонального антитіла виробляли у клітинах НЕК293, що культивуються у суспензії, Е5'"М шляхом тимчасової трансфекції двох експресуючих плазмід, що кодують важкий або легкий ланцюг, у комплексі з 293Тесіїп"Мм (Іпмйгодеп). Білки, що секретуються, збирали через вісім днів після трансфекції і центрифугували. Білки очищали афінною хроматографією з середовищем Ргоїеїп А (Ргозерма, МіПроге) після промивання колонки 0,15 М масі буфером з 25 мМ цитрату, рН 3. Моноклональні антитіла переносили у фосфатний буфер і пропускали через 0,22 мкм фільтр. Концентрацію білка визначали за поглинанням на довжині хвилі 280 нм. Кожну партію аналізували гель-електрофорезом 505-РАСЕ (Мираде Вівігіз/МЕ5-
ЗО5 10 95) у відновних і невідновних умовах для визначення чистоти і молекулярної ваги кожної субодиниці і мономера. Кожну партію білка також аналізували гель-фільтрацією (Тгісогп 10/300
СІ Зирегаех 200) для визначення ступеня однорідності мономера і присутності домішок з високою молекулярною вагою.
З культур об'ємом 240 мл одержували від 30 до 40 мг восьми варіантів моноклонального антитіла 1607 достатньої якості для подальших аналізів /л Уйго та /п м/о.
Фахівці у галузі легко запропонують або зможуть знайти, використовуючи лише стандартні експерименти, множину еквівалентів до конкретних прикладів здійснення описуваного винаходу, викладених у даному документі. Такі еквіваленти покликані бути охопленими наведеною далі формулою винаходу.
Список послідовностей «1105 БАМОРІ-АМЕМТІ5 «12 0» ГУМАНІЗОВАНІ АНТИТІЛА ДО СХСЕ5, ЇХ ПОХІДНІ І ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ -130» 190809-14330601
-1505» 60/968,792 -1515 2007-08-29 -1605» 57 «170» Раїепііп Версия 3.3 «21051 «2115» 36 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005» 1
ЗЕ дат бУЮ ВМ НІЖ нм) (0 МК йщЕ їхни Б ДЕмх ТК їх МЖЕ Дид те тку сію бе дев оЗЕч Бей аеое Аза о ТУух а Те ЧеЄ цей Узі Ох «21052 «2115 32 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» -213» Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «220» «221» модифікована основа
Зо «222» (18) «223» а, с, 9 абої «4005» 2 «2105 3 «2115» 35 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «220» «221» модифікована основа «гео» (18) «223» а, с, 9 абої «4005 З
СЕКСОМ совакстивина оре коном 3 «2105» 4
«2115» 36 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400» 4 дово сасоса багача зозагпоатое Екс 35 «21055 «2115 З1 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «4005 5 пд ау ВУС смозахмешнно я Ж «21056 «2115» 46 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер
Зо «4005 6 «2105 7 «211518 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400» 7 2105» 8 «2115 32 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400» 8 спощосваск екс засос хх «2105» 9 «211518 212» ДНК 213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400» 9 ха СеуВОроое 18 «210510 «2115 32 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «4005 10 сих и лоз ноє зов АЗ ТЕ -2105 11 «2115112 «212» Білок «213» Мивз 5р. «4005 11 дах їіш УЩІ Ме Тв бій ів Дів Бут бе Маї дів Уві тн БЕо Аве спіл обиж Чві бек їі беу Суд дже ех бек Мушойек Сей Бей Бій ЕЕ зи й дв ха
Як бу СУ Же БУХ фа Чую СБКЮ Бак зво сть же Бко ую ат Мах
Бус ік імла з 11: ТУкК дк: Ме пек Ав бе о йіж Беж сі Уа Бу
Зщж Бе Біо Бек ше дк п М ВЕК ОФбіш БОЖЕ діа БЕ Таж Беац вже ІВ пес вк УЧ Ста Аїв о пій жк ме собу уві Теж о Тую Суд Меб бів Бін
Б й З зма (Ід ТУЮ БЕ Тує Тдю Же бук йім сбіу ЧЕ бує їм «(ЩО бів бує -210512 «2115111
Зо «212» Білок «213» Мивз 5р. «4005 12 сб Майо хі мені ГУуж Фо Фо с Бк іу іш за дій Ско бек сій 4 5 їз ї5 пеню Їли) Ша 136 ви Су ЛМЖ УЖЕ Бек осо КБ беж їн бів АВюЮ бек ; ОК ж УА мак осо Кі беж їла бів АН Кук я ах Кк ші дю й тв оті Зк п Вк Бе пі» Був шіУу із Ом жк аку 30 КУ пі УВІ Зі тТхв піУу АЮ ПіУ ТОЖ ОХБЕ бух Трю бЕТЬ бек ДіВ їм: Буш ване 5 БО бек ВК що пев Зі дк ПУ Бар вне шек сів шах фік чах СБ отим
В КЗ ть по пу БВ фам менш їм СО ТЕ дев обжю ТИЖ дія Ме бук тую СУ БЕЗ ав зо 5
Мет бів зві ТРЕ ТЕЮв ОбБіФ ПІБ су ТВ їхав о Уді ТБ а ах Віда о ВО ККЗ «210513 «2115112 5 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 13 - кої ях пд ТИ, вен и од Фола філе У ї ув нн НН НН длю бле Маї БЕ не сав пек пів зей вес УЗА ду Мах Оп Бо бум
У Кк, погу зх . М КУ о ба бек УєЮ дек їі век у бер ошек ах феуй Беюь Тим) Збма На меж йо дл о пек осі Був ук бух Сщиз бю БЕ Іма бив ік дже бхо у У веж че КЕ 4 шжтоідя ій: ім: Ті бую дк Мен беж чих їемі Віа омеюЄ сіу УВІ ЕКО и Ух в
Заг ох те Мем бім екс бі ще бує ТБ о АТВ рве Тв ої Був 16
Піх та 15 щи теж Аж Ме яю і мо 31 3ї да рі Ле ЗгвИІ Яо Чщи фиххву Меум о їі кро М сх
УПА. ТА МОЖ КУКА ЗАМ ОЕМ мА ою МАМ Км Х сКУЖ СВО п МІВ 5 по 25 меч Аж ЖЕК Бк тих ТК бін ФУ сію СІ Ти бе бен блю 1316 Тутв
Зогту пох т варення ОО у «210» 14 «2115112 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 14
Ав бі Уві Ме їм ЗК беж бів сви Шеюк Уві ів У тТвх бкз піу ї ря КН к ї ї ЩО 1 ту ля Билечич июля: Раш «хх щ- поч ох пт ижх ан чих «яки я, ін чи У. суч чн М що
Іди ше мМ ши А ОДЕВО ЛИЙК У УК ХУ ЖИ самі ТМ лУшКид дл КЕ СУМ 2 яв з ек Бугу душ ТМНЕ беж й бух ТЕ БО ев сів хе Бе су СІЙ де туш дл лох
Лі БАКУ ВАН
МЕ отіх Тева інша біє Ук й саму й жит їм: Лів са ау У жо ; З ро х ви В 5 акий аги о рое пах піу бек Бі Беж о шАУу Тех Зі Бе тв о цебо БУВ іє
Б «оку т тр
М мА ТТ Ге бак дк о Уі ій дів с: зр ше б3Уу Уві Тк Жук буж МеЄ іа ів вд п пк їмві був бУю Без тю Сп о бре бю о бЕж Ст тво Був бем єю бі св
З туге їпЕ т15 же НО КОН «210515 «2115113 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005» 15 хат лі бе Мер ТБх йів паж Аза Оео пах а від Уді бвж жЖко у й ме 1 15
К- яке Ти ав пін: пек УВУ пе Кі дек сСув дуб ше Бах УВв бек бив їни НЕО
НО я їй пек пу Му ЖЖ ую їм Ук ри Бе ів) бій ба те щі св бек
З БВ Б пге спів беж ойбец їіє ТУЮ ва Бей бек бек дав їн Ал Бак іє Уві пи 5 ВО ге даю КО Біне Бек сіє Шах біу Бек Фу Тих діа Веб бах Гц Буш 5 та Як а їїє Бек дк УВО сів Ві біб Бе о Увь о сіУ Чаї тую Тею Су оМеб ІВ ах за з
Ма іа сім УЖ Бк о срУЮ ВК Б ЗУ щі сі Тв Се їм бій де іп 05 що то «210516 «2115111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид пн нь тт фо Моща ОБЛ жу, ЖМЛоюю блю Хто кум (я У ще Хі от не НК З АН ма УХА АД. ЛІВИЙ М АЮ СЕК му КЕ шаУ ШИ УМ АХ ЖЖ М Сід ї ш 4 пох
К ХУ Не М ов не о я НК М оно в НН Нв я НН спкзає жк сплю Мн га. ж бек и
ЖК 0 Мешидо хау А АЖ. ІБК ЗУ БО ММ НК їх БЮ Од АК А АФ ХМ АСУ якіх хУш, ла
ЯН «й що ли і екон и НИ НН А А. Шен, НО ас и На КА НИ о НН о кН и НН ев ен и З ро ун АХ Ж ХО КУ Я ПУ кА Ж ОО МСТА ЗДАЄ МАКС ект пк ці п 0 ж пХ лк. її пе ожщо Жені ЕМ хо ок ух МУ тю проку СЛ кає п дя Туя ее ни са жа ТАБУ КЕ А АЮ зу КАХ ОСП ОСГУЮ СКК Ж ЕМО лах Мито ле
ТІ пт ср тиж учи Ким шу ту сш Ту Можу Де лиху Тл Ж Р ЕКО оди них Кт Уа хМ АХ ДОД Тех УЖ УЖ ЯМА се МВ ОМ УКХ КА ЯМИ М Ц о в 7 рек с. щи - укр - ко топи Мол мс Кк (с шк х їоююшю Бу Тс Му лій тошУ:: МК їх т люд ТІУКНн М оїощо сміх бю юю ху п
МУШ БНЕМ Ашхь пе їм дп дій ма щ ле мк Ол мЖНу ЗК УЖ У АХ че аж ох дод Мах Ж км с п мм. ТТшмих. што МАЮ ви Кі оиї: сл См ух ТЕ Фе до щдую юшки ЩО М ВУ МЕМ КМУ ХАТА ЛИКУ ку АЖ. ри АТАК рУвЯ ХЛ Х. рвана
НН Ср НЕ
Мети фе піру сю ж Ха о Гц Мт бод Хто пуд АЛ пу фі
ВКМ ОКА Су КО ух ше АДАМ ММ ЖАМЬ зм а ДА СКЗ ла уп АУ ї с я. Кк щі мох домо бонур З дз щі Мкю орки жізя4х Фу Бра Какнії стреми 3К М хх
ММА сяЖхА ЧК ИТА ІВ ОМОЮчИ лк МАМІ ха о ше Кая бити ха и в МН А У НАВ лЕга пу ПЕ кА «МІЙ М ме: пед их, и ЧАН ож пен ння Сич зх С. У нчн ти х ч - що ше. У ек, ж
УМ: бух ЦЕНА хор хи С м ді сл рук шу дує КУ тишн Том
ЖБК ОК МКМ УМА Уа М о МІЖ хМиХ В СЗШ СУБ АК СК У Му ТВВХ о дм і дя чн
Ох У с м як на ен я но на НН на и НН ве я о о НН и Но Но
ВЕЗІННЯ У ши КУКУ яке пом у ЖАХ Тк ВІ ша КАХ ЯК МОХ
М дО щі
КА Я ду Шемих А жу том Таж ж. «Ах Си Хан Й х 2 хх сх
Ту тіло шю тис Тіт тим ам т стеж ую МЕМ ссУєю Мі гам ЕЕ т гцтих їх МУ їн лю о КК схАШЮ п ЦЕ лов дек ДО МО чаю АІма ме бод СХ
Ки гусу ре сх г щу З ТЕ пз
Ії го Ух щу жах жк тему Дату Мом их Ж сви Я и слухи т хх млн МУ ур я Кін. МК де
АЖ дО жу лю А ІМ сах ЗКУ сжНмА юю ж ХУ СКД ма СХ СКХЮ
Му ту НЯ
Бе жошжшю Ул и Мету судест що ОмУї Хо ту Ту ТР Ст ХК: поч лютує у У тиша. ох тощо миру я хг ТЗ Хв ль сш тк СТІ хю І а ета а о нн а нн нки и Й ко п па ко В В М В: 1 7 ЖК АУХ сут порчу З их й
Не ДОТИ Ач цен рен М ку теку ЄМ сте ау Муеуя Люда МУКуаю фу сля ТЗ ях Юр тодкду Ж туту
УМ МО хи ду Нх ХО АД. де ЮМ ЗАМОК КО ХЕ Мамо у УЖ хи ОКА А ОО ДО
НЕ в тах
МА чи їж
Ти УЗ гад Давю Яких ка А я Ж о сть пд ее тех Зх ку дах хКАХК АК Му пт АЛ МАМО ХА А ХА а міш ЖЖ ши УФ БР Таж ЕшУНЕ шщІМа. БК же тлу НЕ
АЛ їз А
КО Ач хлору тя Хек подую трак тру уз у «ща с ївщо С хк умо оф щу пох долу Тл Тл стою Те сеЕМ тт сть 03 АК сг що лечо таль Ті тиж ЯМИ хЕАХ ЗАТА АБИ М мух НК УА АТАК а МУ Уж (М се МК М ния шу хх ЗЕ
ЕК ХК Али М ХКМ вади Али віце отТУк Вуро дже сім діє був о УІ ів ТЕю був УВІ даяюЮ ЗЕ 1 їх Ма лів їні Щі лет слу да) мех би баб лек зві тк опе Фі по ше тк хх, тк
АлУЮ МІУ че
Буш дей бек отНу Тож дек там Бек о фнеш их о ЖБК їз ес Буш ДІВ 15 жМИ КИ хе нт. - С чН У с КУ ил то г пе тт - я 1УУкя юю Еко КА ую тк дшЕо УЖ Та Гея йлш о бе Уді Ск о віщ лю Ма Ма пи МОЄ слу рол М те реа ну шу ою жк хж А їдмі Яким їж жо б ТЕ Бей ее ббе дн де бу ЗМ СУвВ
С ва В «2105 18 «2115 731 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний полінуклеотид «4005 18 гео стетіет Бтиту ттутуднх змо тва УК икК о ухетімижиж беж ют юю ияи птии чт ти ті А лава м и, м о на а и ни м в а вв в а з вид п рн о о о В СО В
Ай Іди шими Ура У НН ке нн и п а и п а м м в мини и песо Моск овос сс мови сосен со стос Як чійвлпевоса се щсви содою «ов соастозчсва сис БО зашшамс сосачичиоо сопцссааоо ссосестоє певессвосс сзвісвичсваєс ва похила ери ФОКС МУ НАКИДУ ос шосе МИ видат добро сзесоасчмо чести веб дзесвосиано й пастсосивов соб свия соззсассвая спосчовиса доска зм сцсвоссь ЗиО песо ріВ сет еЕКе сірсссмВо башта сосен список во вела ай вида сиссоз сестер оса зправа зовсвасчшю Зк попе ве м Фокса сажею поебоноєвеку по боспавоа песо ОО
Хо Мо ачуиюде Кене ки НН о НН в в НН НИ лан рю т тати ит ОКУ шетсосяиити Созсососслає соосчос песо пасну даси шоссе ва сшесови шо порі нрвЯ поч соосчес спо оетима азс оКесав осо зм нео хк Канон БУК «2105 19 «2115 238 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 19 ких бут кю ЛИ лек бля Ж Код Тодухт о ваш тож ху лу ння йо и жуу тих иБИХО ХК СМЯСЩХ Уехл ЗХ ОМ М АОЖХМ МАМИ МАтУМ МІХ Ж ожевкУ ЖЖ КМ МЛК ОС У : т ІННУ г а чина в НА о НН Ша В НН З ОН А ОЧКИ се ЖЖ що 2 ба Билх дик аа ща ж ВАК ЖМХ ба о пшЕжш а Пе ше ЗЕ ал УЗ я хх М тих ут ЖЖ ЖИЛА 1 кожи ХО юю т щ дЗудае фйкощи Форею бю Ак Ти сід км
УТЕЖО МЯ бю ББЖ мА м НІК МОЮ ЛУКА СК ше МУ шиНЕ БМ рен г 5
У яд А сх ож жу М ім жує - гихх ди Пн Му че Ух Мото Пуеух тий ВМО що тую Меаюю йти Її СН чу тю пи бета боїМмі бл й жа
МЕ БО ВМ су ЛИ СУБ ЗМО АК їн Ух КЕ ЄІБ ЯМ алу КК Ж ке СЯ КА
З "її Ки ро г Кт Хо й кл Уухо у. Кк У їх с м. я т ще м ст ра Км та ЕЕ я. М аща Том Уж ср юю мих т т ші Щаумх бю МО суду чяж шКю зп У ПОБУ КАЄ мМ А ЮК ФАХ ММ ДНК. ЗАЖЕ ДЗ ЕВАМ ЯКЮ ДИ «Е пре со пт їх зи вах М па нн о Ук пошук джек Б а НК в НА На В ОН НН ЕНН ННЯ
МИ АТАК СЛ Ух хЗ ОП КЕ ОМ К хм ТУШ Фе МО ЛИ У ВІТА КМ ДТ АТАК влу У Зв
С ЗО их тошжкує довж ху їз щі що І зу зошит ХМ ке и у Ім є о ММ ех пен ак а и ет ЗИ СО ПЕ В ВН А М В В яз п я ВН М Се СП а М А подисУ хоЕу, я щ
НеКЯЧНЯ КК, хлї
ШИМИ НУК кс чеу
Мишко ами мо їм ші Му Ху муз мидняя ЖЖ ла ПЕТ Зх а шу Ля Кі Ж Том
УМЖОМ КАТІ ІЛ АН КК ХУ ВОК ОЗ мо АМА ХАТІ УА УК АЛЮ УК АОУ УТ ОККО АОЕКА хх КИ ли
ОА МУ БАС КНАН пі не г х які їм їх скік пром дж Ух ст днк Мучиух ех Тл из Ту М учи Мі шо їти хх Хо мих пеку ДЕ тку Тих лу, куму Ще зи Кок шІ дух АБУ АЛАХ мих ТУЖ ЖЕ ЖУК КИМ Х, Кая М НК у У не В Сх НК а ВВ их У лих я нак А АК що а ек КчЬШ х У. ях ла у, т. Уже. г. о що и. З винен зи ж ок осмих штею ТІ СЕТ 1 А т Теща тиж леж І ЕК хі АК Б ЕТО бум Її щі
ПЖИДТ ЛДІКІ б ВАЛА ММА ж ВЖК ху ТАКО СТАДА ДИ СМАКАМ 1 АЖ мим хожАМІ тд Зо арен ще
ПОТ КЕ ДУ М
С нн в нн и ня ШК нн и НУ НАВ и НН НН НН Жомих
Зм ай Кт беж шко ах а тки В М зару яд Уж сміх МК
ТЕ тла золу оте бухт ГА ях ух з шу ик ях калі у що Мун й їх ка м Луг ОН
Тая М А СИМ бл Ж. ТЕХ КЕ УМ ХХ сем В УМ МАТ АВ АКА ОМ Її ТИХ реа 5-5 ее їм СМ Не
ЄМ ДОМІ ЕХ тождх лижних Ктдуєє ТИ сажа дю Мо Жциче сід ОМУмет їм Ху Код Жди Мох М
Мимідх пМш еВ СУТ Се ше аа дж дшЖ суп їм гл їн ща бум ід
ЛОВ гг тегу ц
М Ми кеХМУ
Миші бів (т отам 14 ие ка М жує Кр що бю СЕ п жує АХ ух булу УЛ
ТММ ЖК зпАсСА МЕМ ЛЛлЛь да ЕС миА ЕХ вл шоп ЖХКА. МІК їхе Це ЗА У
ШО ях: ШИ кОм А М
Те сОШує дю бами З бір Тухжк: пл юм о ОЇ іЖМ Ма жим і хи ЕТ СТА
М дм УМО Мк МА ТМ м ЖО шУНЖ іще АБУ ек КУ ККАЛ ле пли, жах зад «ик хм ше а нн НІ о нн и На не а ННЯ ресур аж и КС о ту КК ЖК Мо кит етие жи Моз умі жи Фет жеи жи ут же СУК Ку ехех схеми ТАТУ
СІ РОІМСЕМ МемІлсма шва мусом Мао смак ННІ хх
ПІДЕМ М І КЕ ТЕМІ КД ОНИ І М МИ фо МВВ ЕХ Ка ЕОМ : се дкт мод ек нн В нн НН НО тип и шШеФбасоввочі суп сесювюкО кома «СОКУ . -мЕ пікету пет фтизку у ик жу гар с ктуя дтитЕЗ іт фево о сере тк і КК схе их С шим жири еВ ЗЕМАН А НКИ КК МБ МУ почи з лфитуву три тую тти тофу им туту ж т М КИ г ж г су к и их ЕК шишки С
Іл сссе шо соц Па жо ій чок ММК НИ п овУ ферит щік шижне я КЕ ЕІ Ки ки перисті КЕ ПЕТ У жі режи 0 фетр ТИВ вимо ен о а а І ВЕ В А НН А ОК В ВК и НИХ МИ шим М и т шик и пери м ит нн НН в НН и НН п о о НК м Ми НА КЕ КАМ МОЮ МІ ТО У г ща ВИ Мо ТАТА МИ ШИ КУКИ е ХВОЯ
Фо ути Кк пиши ик тод у кіт г лиття перси ру щдучиит ВД
МІ ЕІ Я Пе МОП ЕХ КО Я В НИ и ВСЯ Кр СВІ МК есте чу жор х уми стем ее м муху етІвочуУ МИ щуки те теме пюю МИХ спосо ам у м СІЯ КК ТИ пет Вер Семи шо фоечи чити хи ти фут тки фу икфичичсвдуєт ста щук. дити рись «тече КІ
ПМ МАХ БМ М МІЯ ОКУ ти ЩО КВК ФМ ЕК ТО М КМ ШИ нн нн В ВН и НК НН иа спа ши ше вКІ МОКІЯ КИ ЬИ ее юм ВИ НА СКК но тк треті ни ШЕ ери ТАК злих 2тл У буулУ обу фено Жду А ду боеміу БМічао Тато А ре З ду Мун Ве
ДИТЬ УМ. АК Ім ко З нн о и и з п і о в м і м я о і КЕ М і а ЗЕ З Ж ОО т ЕМ лот КД
ЯН З А М три І: а ї М. хх моз, ин я ВХ п а УЛ сю ож Ох ою рек СУ ЧИ оч шкЯ Я
ВЕН Ії шк Сп тих и Кс пк м би А до їм ЕЕ САН А
Я Між шнек дви т ям й б сті ть НК не ДМА ШК СВІ МА УВУ п ШІХ В т во я. ком ях ях я З ик щ ЧІ о: є ит У жи п м Му У пи их ЗПУ ку Ж шик тич ан ташену МУ кю аю о сллдую ищ шт СИЛ вк ДМК пити Тжеує око ушаю боки а ші
КК дл со. зад УК УА ЕК юш шаАКО боУп лКАК СВО УВК лама ХНЛК ЗМипід п й їх дп
Оу с ОКУ їЯ в - п шт Б ни мех х - уже шую беодиууі Мини Ко Ух Ходжу би уч ун а в НН ке он НН НН тору. ЩКМЕХ те Ло доутих бемих
МБ МЛ ОАУМаК сит мА МК СКМ Ж ше Ух МЖК ЖИ пам хх АХУ УКХ ОМ ЕМУ шк шк кл ване а У
АХ ЖАЛО ро кн и о хо я Ки ІК а ОВК НЕ Я Нео р АН НИ Кл: ох
М їди У Же СУК мкм пав да ГУМКИ НК ЗК мВ г шмеХ вся з ве ще т г у Б тло ля тд хсух Мохтиж о ЗУ коор и ни не НН НН ав ня НЯ Нв нен хг щі Тек Де ж т МІХ ялжте цих ха шт їх ЛЕК НН з Ед КН їх
ШУ НН ЖК хм а Та ЖИМ У ВЕ ААУ ЖК АНУ ШЛЕ ЖЕН ОСІ па ча ре . т Я Кя х и не: Ан А АНЯ Кк емне А АНА АНА
Ходжію ЖТоджею. ЖСвіко фіин Дбум їщі ЖМчА ЮЛ Миті іх слрх ХЕ Рими Ме тидКЖ ОТАК ати ЯЧТИ. ЖК СУА лих ЖАХИ ла и м ін хоча УМХ УМ их лен та ж
МАО МТА ЯК поки НП хе жо жо гля Тріо их, ная Маю МЕ С І Ши ях х ит СУ т. м У сижа, Ли. тот птн М пох ення тиву пу піз г ьо їх: пттУ УЖ ом и не а м а м п а п З В Ух ЖОСАУХ МІВ А М У Кк ОО КАММО ААУ УМ ау
СКК та я
ОО о. Ко
ЗАЧ жолоби Ту ХУ СК я узи яти хг кино жа Кн Мем Тер шій ді гУш ВЕ гвЕ ТЗІ Мі Ві ВЕО ба За ве ті РІ бос рЕш до «Кк сам
Ма ОЗ 153 поднк Жіуююу МАК м. фе юю лупи Тихі юю ММ ЖК Кт риє в. що Ки. божу мух
КО ЄМ уеАЛАС ЛА ХМК АУЇ ЖК МАО ЛАК Мала ХК Зк Мах сю БИКА бий з Зо У т
МЛ ж ХХ З вщиа Аа Бі осбмк бко ах лім ія Бу УЗІ піт Щфхв Буш УЮ бю ДЕД ї55 І ке ів їі під щит Зіж Ада ех дів сід беж УА Бах пав пав аяю аю а КЕ їз
Гжжосбюма ех бмЕ Тую бе обер ех Мах сх їм тп Без о шек цу ДІщ ак зи тв кжЕ ТУж Пій ев НОВ Буш ва Тек лів пу Іі Уві Ттвж Ні Су пк чл дув ху-М й Уж КЯ мех ін-ті беу бас то ві ВЕ Буш БеЕ Ба дет ДК щі ЛЮ СТуУх
ТУ ие для «2105» 22 «2115 731 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний полінуклеотид «400» 22 сви овлса стос ча спос еовкс ско стешор соєю сао Бо слвшчанеяю псовозно сиди «спимким м сиза нои сома Ти стану сего сслевия сЕсстасовЗоЄ сошекосала зсбасюсмасвиа засос о рн ин ни Нв НН в ни НН І А Не
ПОСЛИ УвіІМО ЗЛО Ел СНИ У СХ СКК беасмЕ пох ПИВО ТИ кх о піде сопе шспесесившу сешрогсосов спосо пшессвооогст ЗИ штани с десдгпозцаосо сслазчзаиечис спосопосаво звоаєсаочсв сови о шоссе секс сесосвсовас сірка шень весно сови Я пос сошста секс окою сосен стзссонавяи осо сосен ав комод ква ее оппопша пис спосо виходи счасаасвсо ЧИ спкероль сю сом вотснтщ сере ори еосувесащя весосанооа сепцевосеи БО
Мом птериМК сови попере сени Еаи ке ювова сш аниеви. БО пидтласща спосо шоп емац семою зас Мнен дос хх ка КП НННЕИ х реа кро СХ «210» 23 «2115» 456 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 23
Міка Ла Між слух фл ПО ем ем Там ІЛічВО Гадяч КТ пу ЕМЛЖ
УМ кА СУ КІ ІК у СА КАЖЕ МЕ КІН МА м. лак ВУ що о р х х и ЗХ тм 125 их шк Ура Кк Ол у гамі. Ж жу ія ех ує ці поему (їх ох ша и АЛ
ЗІ МУКАХ МИ АТ ШІ БТ Ми КАК ХА НК Ж ж АЮ У сл ЗА А -- з на
У ший я туру о пе ПБС сли: Жолмї Ж Ех ен фе Муки ХК ше Ех ТУмдо сш уюОо ою
ШОК лиж лад САМО Ба СЕ ДОД БІК ХА ЖК СЮ ХК АЖ ММК маю ЖБК ОКУАКЖАХ ДИКУ я Ота ФО
ЛЕ пА по лк ск івкчо Мк З пед пзжчя Хо щожумо и дм их ту бю токумх ж тих
На ік вхо їв М А гутх. ПУК Ул де Ж ж щем тух ОХ пи тиж ШК Тим
ДОЖЖЕООЖМІ ЖАХ ММ МАО яма АК до ТОМ мим АК КАМ ДІЮ Ах му ЖЕО У жо АХ ск як ох
ЛА Мк Та ня тилу я як ши сво РМ БУК я ст сис сах Мк ме Я :
ФУ пе ую Та іди тА т ду бі-ху. ТА ших Кал ур си БМах тра юю ах уч
ЗИМ МАМ ОАЖИЖХЮ ХкАЛУ 0 А АН МАМО МОЖУ стад Уу. ММ МК У ЩІ Ам ю ДЖ МІХ КК їм ТО 7 и
Фі тити чия Кия тус ваш ТП п мо Се т хх. Срок уд недо тод ро УЛ
ФП Идт тдти Ж оухкх Ін дея т.і ПУ в її Ж паж у рам а ТУ тож пу о
ТЦ де Шут тако Фо аж дек зе М У ну теж АЮ Ж. шк мух шк мА т гу щ-У
Ух ви ШО тЖА ЛО. ЖЕД полях Жошш МИ Ех іі тиву Ї дуєх Пам МЛ че фа КУ Долота У о суч
ФО БТ Сешаї думі Бк о вщАшТОсМНМ ДЬ СКІИ хле Мр Ол СКАТ дк, факс ЖЕ пом тиц я Ех
ЛИХ От ЗАТ ен нн и ня з нн Но вн в НН НК а НН пк ож м НИХ ІДЕ НЕ тіше ді Ти Сп иту Фі Іл ту глхе лик гм ЕТ МКУ а и ех В и я я ех КМ ОАхХ КЗ ХА ау НА А Мак ЕНЯ «КА "пе поту У
М М я жк ТА ни чеННИи п сних ММ зда Жди ої тиме доти. о ТІвжУ тку тлі Кл тки ТА ЗИе они ся Фо. Іо Міри ту їли МІ ше ОСИ МЕ Ту їні Лю ж Ед пе с Ма сни КТ МЕ їх м ЖЕ лину УМ МІЖ Ж БямА ВО Ор Кледу п ск чо доддову
ІСД тц НЯ ще -к й сх. у чі І ром че мії Жолом хх ЛЬ Ш Кп її ек Я Ку С прдтю бою хйущює Та при Лю соду сю ою ох хм гі уми Ти: хи Кк ши МК ск Зак бе сам зе УЛ іл Аль МА ЗАМ УВІ Удо Оу бхт хд я ж а и
ЛЮ КАСУ МЖК ин
Дому стю ТІЖеемо ус. (ах фену ЩА тку ля опір сем фр бю йтл ки У У ЖИ
ТИЖ Ля МІМБ МИТ бід юЮдь шХК МХМК ФАО ТИХ, види Ух ша УжЖАЖ ХМ АЛЬ зд
КН яр, З
АХ М долу тифстук о тилу шо ку ші сланцю ДК пл ХО пл Ток КЛ ЖК дра ЕЛ яв Її пк
ТИЖ еВ зу МА МІЖ СХ КІМ КО мі осеща МА УувАЖМ МАК О ШНМ Ку Доска
ННЯ 155 НЕО ек на пи ї очи Бе Фситит ЩІ КК У є чн Фет Стих Лу спа хижі аю у
Нау Пр її НУ Ід ХУку: ОСТ К ОН МУ їх ПІК УКХ ек НИКА М Вя
ВОК Хай хУЩТІМ УМО ЛУ о я св ни я Км У ЗК В і В зо в І В А ОТ ЗЕ КЕ АХ і55 228 вен : пит ет п ех. гео я сх: т чек г то пр - сх. тоди ЗИМА сх ху ДК фчаиє фожеує чи сдишжа І2у То Ме фати дн: сум Ту чу
Мф ШО КУБКУ ЖЕО СТУК ЗОЛюА УК шЖМВОСлЬдУЮІ ДАК ЖЕ ЖК тдЖКК ЛУКАХ МАККО фут ХМ «КІ Мн Як и нн НН А ьо тя рень в нео НО о НН я зи ди їн у Ем С Мк Гак гищ Ди Уют ма бл ДЛ ДУМ УМО Ам КшТ г К ЕЕ и о тую ок си пвх
КиКЯ КБУ Ах ШІ що т п нг, пт шу шт змити пс У УЩуИ тро хо Жопишух ОХ Уч Жид рн моде фени. ШТ: ШИХ тата бали ЖИ хя бе аю ЗАМ и бащао їз Бцй би ик тУ Дощ
Ек мн и ми и и а м о з м, о в В я В М те КЕ на СІВ КО Уже Бк»
ти, ту У
КОЖ Конан СУА ке Хе: Пс Жак ди. Ту лижних Може ТУЮ. Щюм С КМ кю. лан ПМХвух баки ХУ шк УЖ ММ АТУЮ биМміа МЕ бе шим КО Же Ох уд СК СУК ща
Ва ше В м ня ЕН пидує Тл КАТЯ ву Ши з: І Еш пУВОМ жаху слу Мою
МА аж ТАКО УЖ АТАК ІДНА ЕК АПК КМ О МБ А ХА БІВ АЛ СВО УЄ п М КН щу тої Мою Ка дк у т їтщ фло ших МО Тож УМіЕаниє Ж ху СИ пк Кк са
УА МК їх У У ШІ УА БЕК БИ площ Му сКщЕ Му БК КК ШАХ ху, тити: та я еВ СВ 1 ж. ик По реж р о Щоки одн хх ож о ня ие ТІЛ. вч Ки се У
Ь и Ох ЧЕ У тк КТ Шосе СК що тих НИ НАИЯ ТЕ до тиші МО мед ЖАВ ЯМУ КО ую АЖЯ ЖК МВА ТЯ У зош МЖК Уж ЗЕМ ОБОХ
КО ту мог чи трек
Дно ЗО МА БУ п песюм ХУ, Ті ккжю то о ких Ас Я ниж ТЕ ян ке Бичко 7. о Жокжих, ж ж ц уся у Жодк у
Та бу без її Дж І кто ля зн ОН Ж «хх ЖУК ше бю тр суку меуїй Фа АКБ аа ям у МУ БАЛЮК М УМ УЖ ут ща мЖХ МТ де схе т пкт, рн ях я их й жо Єви «Ач я чої хо оно а у я х х7 сг Как я прі. Ля їли ле пух СТЕ до ЩІ хх ТИ ла піар Те Хот шо ТВ ак я хх су КА Кс шк ше ю дк КМ шум КТ м ХМ Ю мушок мВ су мА х дах -8к чи
ТК КТК ОЮТИЙ ххх фони м хну УПА У. х ТЕ КЕ ох лю Шум ти КТ м. не х я. хх с пе їм 11 кт Мі ЖЖ. Яйхаяє Ким ої уру юю КУ «іди ЗУ Ж; З мех на кн ко ко З В В М Ех и З ЗВ З з а п п о а п о т М Я Ме озуа Мех.
ІХТУ БЕ Зах зебру Мали буку ЕТ хи 42 бух бум примх но У щі ХХ фджи хи ДМ УМ: ТВ
Ж МУ Цит АЮ Мая сеЗК Бех ЖКП шу о» ах МУВ о шу КІВ СКУ ЖЕ тт ерку прут
НК Ки о дівкко Деу ехо ою й її лпнжу КУТ: Ше шу СТА офі ту ГАЇ Мох Мох ско Мі де маю МЕ СМ У ШАХ Юр ОЮ м ЖАХ пок АЛЛА ТІМ МОВ п Бе Зх ВНІ
Теги в сх тИЛиех. МУ Цих пит туї Жошжют Мо рОмься Ти ря Три вих ви КА той сити тихо В гли Кк у по стащур Ма Мою Лу в ен лет МУЗ хіх
УУш цуш УЖ КМПЖ шо вус УА сне Я ех МЖК гу шо о КІце Біне Бо хх ях ав и БУ МН пхати лиш фати тод ПЕ у хі Хом Блум стдж Аоушу пуу КА ко иа юю діжу 1 дж МИХ АКОТ МАМ МАО МЕ ЦЮ МИЛА МУ ЖК їз АСУ балон НУК ОМА
СОМИ ОО мк т
І Ех азу шлю о Ше ем ЖІ р Но нн В Хо МА Хе ДК ик ху Му КТ мо
Кім ЗЕ жу смак ума мм п ли «АФ ши БЕК Ов пЗпаВвОзУЮ ЗИ КИ зи С Ах
СОЛІ ЛК ІЛюІВ кн нн ВШ НН Но НН ІНК АНУ не а ОН ЗИ З НА ЯКУ я щих
ЛА ПЕ нн и нн В В нн НО ШК
ЗХ КІКІМІ ІК лоді МИТА з п АНА А УМ М я ем КУМ МИ М ми и НН ро а о ак и ооо а и вн НЕННЯ смс ОМА КЕ ХК МИ Хр Тема АХ мете ще тки теми ми кри мими фев пе Криму пихи и тк Ж ер уки МІ «КУА М ПА АВК Оля мМ МТ лю м м ни м м о а ку кн в и м о По а М Я пев ие ртуті сити че у стерти фії режи кеВ год ру ге
ЕД у Жук у НМ М ФЕТА МАН В ЛОСЯ оди демитузЕ у туз ек дви фл жди що Кім соки гілуиречи ові т СУТЬ
В НН о В Я МТА СОКУ МИТА КУКИ У ИН 3. Я КАНА ФДМ КМ дети нки ж оси кових мок мире. стиму ша шити ит БЖ су пут іт фо и Ки тихо ВІТ
ОМ ТАМ МЮИТІМИХ Ме МІК ЛЬКіКУХИ ТО АДМ ОХИУИ УВУ ЕТ УМ Ух пед МИ АКТА шу л
ВІК дру УК ТКу Ку ЖІ ЖИТ ЗУ КуКцІМИМ Мих Ух мм ф гм Сережки ТВ
МК МКК ККУ БІО ЕЕЕ АЕН КВК ЗИ АЕН И КА УЯННМКК М но
ЖК ЖЕ Кур форуми Мер смерч вия духи ит ситі Коизіиуитиугх іч ДМ
ІА и МІК М ера миш м мм м аа Кох ат ми ТИ ЕД А М КК КІ тара Мих ТТ М нам нн и НН в НН НН КН НН НС
ПУ Мона МІ Би шо са чу и НИ СН ще се тий ШИ Хек и и не НН В КН НН их шт Меш чими ММмММ шою ЯМИ шссі о СИМ Би о нн НН В ОХ
ПАМ ИН ШИТИ юКУККНОЄ ІД и Но іна евя І Кн спекти вити ще жеті уж щи СМТ се уж ис ижим і р ерезиев ИИТ
ПАМ МАЮ МИ І ВІ МОНА АТАК ХАІ СІК ЖМмМІМОН М ХМИОНИКИ С ук ке нн І УК пе Муки и Вик их Фета рити суч их сив ит ин ТЗ
Км шен Са а КІ МКК КТК піс пивних Вимк дж ші й стоки утекти пюмвМю рі рем с сткуузмті те ких ПТ есе в и М и о у п ДВ В В и и а Ж В С ВЗ ВЕ ВЕ ВЕ Я с МО КІШКИ Ки сег ихи тлу т ке ух шив жи Копуєтеті ут ур рити Кук вжи ПГУ
ХУ иУи и ДОА ТА Ку кУМ МИ р СеКИ ІТА ТА ЕКО УВК КІ І. ЕК МІК А
Б НН ва в вн нн о о НН о ЕН заслано доска смимх пелена Собою спа с сда с ВО й щк о . й сш щ- щ - : я я . я отих сети ети діти вику те і тут нт ту щи тд пизди юс оу і ет гу вивихи ОПТ ши КА сома НА НОІУЕНЯ Фран ВМ БІК Я и М пак Ак М ши шоимм мМ пемоНняниа КНТ СКК ЕІ СПОМИН ях рони м ДНЮ па и НК ВЧ и НИК НН
ЗЕМ У ИКІ УАД МАТИ МАЮ ОМА СЕК КК ФК МТИХо апа сосна Ки 0 КУАЖ КІТ М
УК ит ик УМ пед Киів и сту си по иуих жан НИ ОО сіна кВ ОД ОХ МК КК АТ КАК М ШИ І БІВ щ Еш МИ ММ СОМ М еошУ І у шуи пут ль В узи ке ви Момот и ау уту ти ие хе ер гуд г: пече ВОІВ Се Іо С ЗЄС пу дм
Я й х : шик я К гід тут ен НН и вв и НН в и гл палЕМатуаи а о ІК ЕН м ЕМ КА КИ ІНК М
ПпеорорасІЗЕЧчізоЯиї шу куту а ВЮДу о ипетіві и сотих пиши мури мок ккУ т що і УК У ОМ МИ ЖАКА ДВА КН У УАНМ АККАШ Я ДАМ ди т
Си МУК ПОЗХЛЮЬ тони Фк йИі дю ще Хржеу лю, зу хлахюх т аж У хх сб мує Ду км Фр МШему МІВ ха гум точки ДМ СЮ КМ УМсУ п Є ЯМУ дав бКуУЖ м люки УмВКО МАТ во: Б п І 12 їх
Хр ск В сво Ук. В ж
КМ ТК лю Од ФК ЯКА ятлнемь бреуату йощме Уют М тю МшУЄ бу паж ж бул рута
УЖ ЕН АН рю любі ХЕ ХУ Ух ук якАлЮ ЖУКИ лот пи ЖИ Мікро сито ЩИТ що Жду СЖчжж Й ре хх СВТ до ух и
ТИЛ ді ММ МмчК мл ОМ САУ ВЖК МД жЕАЖК УВІ ЛЕ х ї-Я ВН учи а ху дике дар КИ поки ер ошожиття сто ж - ; ч пе чит Й
Ацю ВіФф Мві Мекоїтвк сів дта дів Бже йеж чаї дів ува бвНЕ рез дос й У З ЗЕ
Тут м Ку им ОПОВ пух СЯ ух ее ни кн нн НН НА НН пт Шехмх вАЛДЮ СЖМАЖ МІ СМЖКУ СМ хм У АК щем деУ сСуєш ше ім БМ Ми ах ва В Б ши Й ую ша Тк м пу ОК дм є ая Пну меч «осі шк щи мин ин в нн
МУЖА МАСУ. ШКО АХ пу Ук оман БГух Ко птМме тяМмі ту ДЕ ГУ БЕ У сю ще
З Би ях
КН и 5
Па Ж Ки Моди кла Му о МЖожею ДЛ Жири ою ее нс а НА НН УЧ туди
КІ а мем Бе жав УЖ АЖ Мат сю Ашт іншим о Ян ек У Ма. оеКе
БЕК пе НЯ фам тулетж СТАЖ Е сш т сни їх ку Му М Умічащо Мч шик кути даю ес піц ем збу ше За ошш су Клк ВАВ Юля СКМ сем ому ДА
Б ти 7 ва
ЖУмюю Дж т ла Ко Мак А п ВАСУ п чіт и иа НОВ НА Не СИНЯ
СВК ОКА Ус. бум жк Ак М АВ б ААУ ЗА ОУ Ж УК еВ МК. шк БЕ шк По: ТОК ре КБУ ма т дя т теж юто Мити Мем. НК КЗлдю Кюрі Тож кит У пу мл у токкух
АТ МЕККА ОК ЛЯ ЖЖ КО КІВ ОМА М и їв КК дежжкк А хі дл МОХ побут пог р УвИшНн
ММ ДА Ме «2105» 29 «2115111 «213» Ми5 тивсши5 «400» 29 сно ж КМ он, пою «уже ки шй хи АТ м х сич мл жов БАЧ зом пк юн Тл юх КК ок піц Ущі іт обяни Му ФА щеК пу Вже ФА М МЕ МІ БжшО же жав ї Ко їх а
Кк - о ху ща їлмі Шех даже ЖЕЖ Су ЩЖИЖ У. ЩЕю ФУ БО щех бен дае бе оКУє
ШІ 5 ща ві з» ай сдаукю баку т ую 0 жу ау ую Кл Тиха їх тазу 11 тб ки ТЕма
Ху ОК Я ЗИ ВАНН с а А Я А СО АК У ан Ва В В З о В В М о ВВ КВ В В п я яц су й Же яю сті У ЗВЕОЗЛЮУ ЖЕ Тв оОдЕх тую Ашво мет ві гам оБух
Ку У й смак дже іш пе Ті Дюй був ЗшЮ Аши пет пів дек б У Бе Бей
БЕ п 5 щи . г ц я - я ес щи - ее й хо ху ки уж Жук СА
Ідет МВ ба МшХ їм ОС ЖИ двродЕШе ТБ Але Має тую ТУую Св АХ
Я ЕВ Бен ся кл хм од Не АН Ухил прурю ую гії Сем І
Еш бле ер Ух ЕЕ Кит Сбилю жу Жах речо ам пт Уа. Мах ли жо хи Ц рр, ха дО МА -2105 30 «2115112 «220» «400» 30 пЕф Мія. У Мей же сліз йіа Аа бо пес та1 Аза Мві ТВ ВК ді ї З їй 15 ме шак чаї дек бів о цеж був Ак Бех Мак треш Ше їде їМму Мі Зах
З Ку ХО
Ше Це бе ГВЕ Обех ім фею ТюЕОббЄє їде пів Зуб Бхюо сію «рю шк ї ЩО Б
Кто шій ізн іч Ті Тк Зк Меж бех ди Фо ві беакобіУ Заї Бко
КН в що вв Дж Бе сх бу ват сім пек су Бу дів в ле бою ог ік
БЕ то у Б ак бив Зако вів піз дво Уві іш Че) Лук бек сув Ме сів Не й ща ту я ло ро для С ме ІПМ ТА не Дане нин ННЯ су Хм ІТ у. ою їдко са бек Бус ТУЮ ТИ спе сі Бу БУ Тис БУ їеб був дув См
Мов вже ВО «2105» 31 «2115112 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» З1
Мале тс ЩА Мет Бк ств і вія Бе дме ва Аля як ЖЖ МкОо є 1 5 МЕ 15 лів С ек о Мві пах сів дев був ве паж лек був о шех ії їм Мів ше ще 5 її пост пуш цую ву беж їде Бех хо БНшобею зб дк ко Му іп йве а 4 45 ке ти ї т о ЯТІ чих Моб во С ран ж» раровя таж НОЯ рано Нм Ж Мен
Жито і імм) Мей її бує Адже Ба Сех мат іа Бій пек о шаеУу ам БКе
ЩІ ІК кр ат дис Біве фе ті у НВЕЖ су дшж Фуе ТС дій ЖК Мох ев» Акт гі 5 то 75 ап дея дк Уві бі віз біл диво Чя3 і Уві бую тТух Суд Мек б пха мк п з там ПО ух ЕЕже, МУ Так Ба іУ Чу З3У ТВ Пув без біло хів Зув
ВО 105 не «2105 32 «2115112 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 32
ЕМ обі МеА Ме: отв бій діа Лід бто Хек уві дій Уа Трж БВкео СІ 1 5 ШУ їх
Зіщ шнаю Уві бек оїів бек був дк беж сс ЗУв Сех ін їн Мі пет пт тю ту
КИ хх В зак іш му ЖК о тТею їм Тек ТЕО бБеої бік йАжеа Бк буУ а дех п 4 Б
Бе Біб бе дей» лі Тех Аже бем о беє дек ої вія бер біб Уві ко хо хх ВУ звіх бич Ве пес біє ех сут жк обі Тис Аіш Біб Ту Без дже тів 53 ще та за звж Вгцп оса бій дія піа во За бо щі бою Тех Суб Мат бів міш п За ак
Пе ЩЕУМ Пе Бко гук ТВ Ве пі ПУ лу ЩЕ бух їм Са Бі цулй
НЕ БВ 1їд -2105 33 «2115111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005» 33 пів У ль ем МеВ обі: пер ослУ го бує Ме Уді вів БО бек шо 1 п 1 15 щЕак ер ойаеу Чі ЩЕ Сую ТВЕ Уві ек сіу Брводех Бей Лв Ал ТУХ що Ке БЕ щі маі дик бе лі вже ІМЯ Бжех Буд фу Бут 15 фах С ЖЕК Мем
Кк ли Б ру че Ще ко лі вав обу Че бик бик тую Ашуе Бко шк бемі Гуд пої я Ки п пес Ах іме Беж тів шек був они вай Бех му Бек се УВІ. Бе б я з т їв пт Ма жит деко їсмх ТВ бе йо АеросбБх діа Меє бУю ЖУК Сув дів йпщ З тк вищ би Ук тую Теж сі Ів ціУ ТВК їв За Ме сі Беж ДІВ ї50 іп 3 «2105» 34 «2115111 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 34 яку жит ть кох якої а уч у п че пух цк пл до ЛЬ Така Где шує дю б хк баку тако фор жд що бемку сл хк о їтіху хм КА дяді Ба муж жа вЗшЕ СУ СК їж цем оУді мав вже Од шує « х фо ех
У В Ал МТ их го Я Фея пух ТІ, Су же ттУх Н хх 3 ча ши т, УЧ С т щ хх кож ее, по Тл шує о Ток яти сю ру Ух «туш Ех» УУрЕХ ссплджю том т дов бок
МУК ше ЕОМ Ж СІ МІ СЛ ОКО яННЖ ККУ Сг ОН ба ЩО А ТЕТУ т пр а я хх, ПО
Кук Ху сДлкіх блю Ж що Же. КМ уч Жарких КЕ А Ж сто ти Ан тую т так Ха Маша кт бі фор (шу кт ДЕК Біле Тдедо шКьхх тод Ку пу. тег ше АСЮ ЖЖ ЕМІТЕРА ЕКС їА У. У ШОЮ СОЖУЛ АКА ДК ОМА
ЛЮТХ Б хр сі їдь Біо ліку Уїяху Док стіл» ЛЬ ми чую о Ччм Хщує В фечя Тахо Ту
Лоу ах ВМ в З а о ЗНУ ММ ОКХ у МОЖ ЖЗІВМІХ бюд ЖУК КЮ а Оу КМ
Беж ск ЕК
БІтйи учт бар дає її Меху ТдуУв о Лі. Ко фішим тус що ЖЕО і- Зі Же ТМ рн я С ка я ие ж м но з з М о м м во В В с М В ПО я НН У ку та тро ца 27 Щх їх З хі Де сов п кож - х ех що и а а нн и ох
Фет: Міні» их хм о божу бла Мах фуккї дик у 5 Вк Мет хе ук я
МА КВ ХХ зе мо муж ОХ лю я САМ дО М УЮ УЖ УВА В. а зп за
Хоскижке мо лина ТІїж ж. 1 УТ льне ав ль У У Беже Туя, Кн Мости. У м.
Кл ее и о нн АК чт її МТМ о Ж. ХХ, тр Ен рю ку х лися дл Ме лк стику ау лит Му СЕ Бей МВ тн Уа беж о ошх моих хо докт т її НН 13
АЛ кн АК пн нн и и НН НЕ а НН ни в и НН НН НН аа
Пов ван а М ьо ом о Км ЗІ М І а А В п З ОЦ З п У ЗМ КО о В ; М ху Я
М й Ам Как щі Мла іх Мвт їла А МЕХи ЗИМ й я А ву Шк ку мах В. МАО А люд. ВУ ПИЙ О МЛАЮЮЮ долю ек соду САЛУК ХАТА ОалЛА АВ ЖК АХ МА КАМ У щох сек ех зл
ОЇ хі «Для рен в о А На и в Не НУ ШЕдужх ОСМО ж Мдих ти ди мя ун им ШТикюМо ПЕ ТТ ко юю ж ТІМ не и З СПК ЯН м ОЖУЖАКО С МОАЖВ сЕхй А САУ Ж ОО ХУЖТЯХ міт. у ОХ Не
ХО г чн
ОТ НИ жа - -ї не щ- шт кА че п У й НУК жи Жду. МхМ да Код ол Коен їн ток фа же лож служу З дво Мл СМі ІМжи У мі УМ вже хана ДК їм АТ ею Кк и
МД ЩІ Млю сив дви зву Уу меш КМ Уж цем А УДК СГЖю Єви С ххАЖУ АК ОХ
М ен ТУ мук их ши нн тм «о ж що т пранні Ж ся х н ко - ті ях о ж щує буучя Я тощо Тоят Ж х бує руч Ваше Фени Мито богу А ххх
Сем ХА шк ХО ащ Це ОМ Ку кн а а ня и Ко З В В В МЕ Я М А ЯК НК
Бек ЗИ жу ВО ни ее не хода шунт СТУ пд. ха их ко шчнчи лю ши Ж А жахи тю Ук
ТтхелА жеет де йбеку ЛЕМ хлдиує ТЕ х мама Ха дя сли боки Мун Що ТМ гу пах важ мМ ФО ХО ЯКШО КГТМБО БВ СКУ ше су ВК ОКУ Ка Ба КІ СЕ шк гії ур тт. /а п ТУ
Тдміу ЖЖ ОЇ ко шиємо Фу лДІщ БІ 33 Ж м ях ух ЛІ Мк Зх ря умру жит
МЕЛЕ К ДО ж Х ЯМ УА УВА МАЯ пла лих Ущк сш чех ЕК ДУХ у з КУ їх іще 281 м За йо ба БМ МчЧтгух Тюеку км Птююує УМХ ж іл ло ст Нау У хх т ех
МУШОМ МИХ: ОМКЖХЮ аХтаю ххх ух кА ЮК х КАМ СКІМЕ ку З У КОЖ СУБ м нем МК ЯН УК
А КИ М ех й вн ори Нх хх хо мо Учік п хх сх зом туї - т ак нн но НА о Не НН и Не о кН в Нв о
МАЛА длимо муч МІ СЖУЮХУ ЯКО яка Я м НІ мех ІМ бл ЖИВ ЮК Ж дом чн -х
НЕБІ 1 т пери ння АН а НН ун ни НН НН НН стик леж с си жопу; томі
ХНИ ж хх АХ тн Ми МмУШшОЖМВж УЖ ЗК Зі о шжЮ ще У СК ІН У Мех
ЗЕ аош то їх щі
Мох у МЛ ам ке НН ШК во Ху пе титан есе ни НН ож окт мету бою Щи сок кА
ТшШЕЮ ЛУЙІЮ ФА ОСА УК куль МЕ Фа ля му ВК пл ЕК АУД Її еВ МУ з ди ча ТЕ
Віа сбямі шій обею СУ сим Шек т жа пеж М вк са ів вщрво ще
ЕВ 155 їдо
МеВ авролек ТЕ Тук жЖеж їм) зеросех блх Хе Тис ее Щек бу ій їл5 ТМ НЯ йпшюо ту СО беБ На цу Чек уж Лів дув яєщлх лот На піт Су.
О 15 шо пма Жежх Беж рос Уві їв Був окех Би дво Ага осо сі: був
ЖИ пил зх «2105» 36 «2115 731 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний полінуклеотид «400» 36 риси періо ска свіо спекнтост бо латстю саосзчосио о спвшеес поп оакоч Феаешеюцею сосен спекою ссоссвовоає и пичіасмака рожа споваваом сш Фон оссасва песо ТО састижішосе сСосасессос сопосвоває дешева с пово сатршнаю а штщшачомнУ сива отЕНІ Можно «нм ниов соми КЕсвесомов ХО ссосасесвасс осо совозаснем спа впслевоив емо У пзопспсплем пет шешеск: соззсассващ стирати асосеасоссо ссссоосси ЯМ сосодшасссла сс сеоє Єсросонвмх сазчссзчавас сопочсасою плодову о емо тева овен ка стече сосааоосщ вооаана оре оцю СНМ пктчсвспосо шевзаслеся сосок востпашеаоя вссосевчча сейсассваст во
ПЕВНИМ шишки КОСОВА ЗДУ ВХ вожнаедсвова сс ни Ба сао сосасовоє собакою сечо вавссва есе скрсав поссеююмат ТИ
ХЕ ЄМ МКМ Ком «2105» 37 «2115» 456 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 37 хлеб, Жіущує рек КОТ яю З ту тт Шум Томи жі ко т кл пещямо
Микол ТУ п (мих: ТЕМ Ті) шх тиха ОйКУух булі Удрі що пме йіщ в гл с а ЗІ КО ок В ВЕ В Я СЕ ЧК Я З В С о М ВЕ СЕ КЕ ИН о а ЧЕ ЯК о ВЕ НЄ ї х У в в їх ку Та ут я ях слшу бю ху Во щу Ж хе ТУТ я шу я м ек тд ФІ тя нн І А КВН М С МЕ І М М В п с В СМ В ВЕ НВ СМТ СО З ИН СКК у У Х Мі ий їх ва пПруч иює 25 о дух Тодеу лжад ОБ Юм МК ню ЧИЯ ле ж Же Мч Ж дп мВ мех ЗТ: жк ді с Ка СТЮ и Ка Ух БК У пе СИХ Мипу
Же зх з моя гло «КЛ ті йижу пмкуи КМУ ЗК дмує се Ж щу бул КЗЗ о Шуєх Єурчя ст хх Ж ху БАТає Тлюмі
МОМшІ МЕ УЖ з АУ і МИШІ МЖК Колки кА БЮ ЮК ОА У М хх АМО БА
ВАН О.О нн пута уч Тищт; бі хх щі тож пий ут фл шу 3 м рух пастух не м пк к
АТАК ЕК ма мес мА ДОАЖИ АЮ ЛА у ЖУК МУ САЛККО СІТІ 1 ЖК Оу АН ХУ
А ШУ ху міх льш ня жо шк жи Уолт плоду У нн ин я Мак м «Ух о ую тбіще тоді т МІД Думи Го Щщдие їжу Дж ги хіт Дю ди. Ім МЕ у
ТЕЖ МАВ ДЖ щиИМХ АХ ЗНМ У ОЕМ як Міді. ЧЕ УКВ Ж ХУАХЮ ВК РК
ТЕТУ З Я тео ст т е НЯ х КУ " су пед туя ох «ум желе Хдиміх п х тям біо божих ТохУ« ММ їх мк. Си Тоиз: Їй Ти ТУ Бен ТД лих. Ії МУК мус
М. ОДОМІЧЕ лоді їм; ФАО АК ЧИХ ДОУЧЕМО УХЮХ АЗАЖК МЖК А КА МА КУ УК до, тк ян
У Мих МУ ужлосяю пи Ж з о Уж дожи Пех и г Ул НАЛЕ Ми ому м нн НН р на М А НО НА так бббучж Бк Ву гУр пух ТК ух нет ше НН а на а на а М и М о т пп о В М То сь Ве КМ ж АЛЖО СКМ МІН ща МАО ж Кх «ах 4 ох Ех чо
ЕНВНННАУ ВОЮ Мох от пня ЩО а ДЛ лу служ ло тіж. ЖІ ух. ЖЕ хх ж ЕМ Ви йому х обошух М СОЮ я їз У хх
КО ЖК МАЮ МІХ ПКЖО зУшЕЬ АЮ п ТАК суще АРОК си Яке БК АК тла за5 1
Ми У; У ие
Фу уж лому бр мо баюу ЕЯ бчя йде сиза Ж А. і Я ко ід Кжма А ле
МАС гаму ТИ МЕХ МАЕ и ОТАК АХ кн м о п мно и п с з м С а па З а о я С В и ЗЕ СНО лах зал іх да
МАЛ гм Ой ОЙ АЮ
Млттге ббмежи о Ши Ум йУту Тюзчу ух не 453 лм му уч пам хе щі мо ті
І ЛУ Ж ЛТмачЕ ДК КА МКУ УМХ я их. Но хх МЮ ЖМЮ КО ТАКО ДЯК УХ т 7 тк иа: Я ЯМ тузі «ин і хх т ІІ їх вну и нях хе хх ен не но ОА я у а
Мн ни В п С Я С ВЕ Я КО ЖК ДК ЯМАХ МІ. МА хе ЛШ ШО АХА па
ЗМ ТО Не
ЕНН ТАТИ КОЖ ув сну мо бе бик лишь УМО хе Мчч фа. жеких бік ех щує Кап: Тр Ук
Пс а м З С СН КУ и МИНЕ ВМ С М ЗО п я с М ЗБ В ДЕ їх тугу соку
МТУ «ХХХ щит ще . ст я це га --ї г кт йожулу Пік; а Срмжах ЗМІ ах о йЗкомо щей б хіх од Зх литек ЩЕ Дод Мир то хе
М ХХ ММ. ММ ХХ БТ хижих ЖІ Х Ва мих МОЖ МОБ ОКА ХДМА. ЖМІМЮ ОЇ лАЄ лу ошо Ж М яв пьЕ сіті си. зи о х кож г ФК или т я пт їч па Дині вер ен ях нє о є жом Тер ев Я меня У у «Ен хз пл х ЕВ г Уж жу СА каша но В ач хан тУшМИ Му Ж ям мА шо ли ДУШ у ше КК КА Му дКОДИЯММХК мшУ АНУ КОХ
ЕТ, тих ЕІ й
Кн «д «БЮ Же ож Сл Ж СБУ тост фах су т Шини бука Ж ВнУ Туя устя Ти див ж ка тім еВ У У ЕЖЖ сИВХ МИМО ДИ днйжу КІМ ва оКит мух суду ши сю
ТУ УНН ШІ
-ї т х ща ЕН я Ж о годує йому Ппфеум бзузуу ст рф хЖщ руш сус Зб
Фея. Точку ПТК с дух Тіто вує ЖЖ По буку сії А у хо іга: м мушок м ла Ма Ж дом же МК ФСК ЖЕ п МКМ СУ Ух т пи ям
З АКА СМЧНИ оленя хх ях ми АХ - сти ву « и - ; : ст штмну пе чи си злу ху Мекку чию и З жі КІ ду ат тах їх ФИту ТаУ смух екя Тут
А СЖЕА МЕМ УЛ КК ОКХ А М ММ мХТ ад ою КАТ Бл ВО ОК ОГУЮ тут зай ОКУ шо КІЗ МК ит ще гад що - ре но х пхх що зу Даю Ура Хм ут ТА Мі о шу А що бледо фу тло сдкух вик фею тт
Зі ле ж У ів са Нія Аюл ові у оо КК НН В в І С З ІН ЗОН сних сел ув п оон ха
Б Ук йошую лрую брри спдую оду ЛЕ ЗЕ шШеми рі том Я Ж оду БТ пі Шк джу ями би бек ДК Уві У Бе УВА см Та МА інн НІВ піц Тіт пк, за
СЮ АК ОЮА лем ху -х те т ян т - пу ин на НН НО Е тлшк у воші ех : коощаже му Лора дома СТЬ бок у Пух. блиту ха Та Мі сх дощ ПЗ ат биш С кхІ ме дав сш бе МАВ ОТУуМ Мудо служ МДУ Уві. ех вва Му по дл Се хх БК ІКТ - я - ня - хе ех ще - : : З мк яю Ко Шен Пи лим МК ха сМкук ТІд жмькУ дещо іх ох ск ДЛ
Б Тавли Шеєщу СЕУ Тем ої Філ Баш Мк; Где сь пмщо Аікр о зтуд щі її
НУ м'я ЖК ЖЕК УМХ ОАЕ РАСА Кут МЕЖ ОА УМЕХ МОЮ Мала мушку КАХ тт вро зр
БЖ Мт «ХК. ; с - й пи зей : коукця гуте ни нн ни НН
Іду ди кіз їх ші здо Зм ж тони їХкчтч дю Фгу сумо жк Є Ж М
Ж ЖІ с ФК а Уа УЖЕ АХ ших КЕ КК мМ ЛЮ АД АК СН зак, -кдх зак
ДОЛУМ дм ЛАВ мих т. Ач хо шк и не а а НН гам ватху ЖМях ба ке пОкрю У: ФО мМ Як же Таки ПЕ птах яхт: ЗУ тис їшіхУ КАХ вхо їй кл
МИЖО ем ММ АхАТУ Ж хе АН ХМК ШУ мо МУ АЖ КТ СК КК пити яке чт
СН Бас УМ ш я о фши Ж ш щш СХЕ СЕР бе ЕІ Ффеимо феї КУбах ЖУЄ о рює ЕТ зі сом о
Сп ДАЦЮК Мами ож СУКА ХХ СК ККК ДЛЯ МК МЕМ хи МО А КЕ ам ЯН КБ щи лам т: Ялїї
Мт СБ ЛЯ Б: - я хх. н ка, - х г ку чн г КУ и лиж Мол Мам Мо
Пе їди Ж Сі бігу баку Хкщрі Тихі Ач о ех служу ул кю Мих ШУ бул
УЖ Ом ем МТ АХ Ж ИМЯ мжад МмйА Тл тА. ЖІ ЖУК ОВЧАВ КН ОК дв т Ах вена МО МВ. : і што : мин Ж ми ик у рю М ши сх, 0 сонник У м рих тої М шу Фу Ж дже Яну. піл ач жи Хм дл лихих ктх ІТК х хи цих Ед: їж Лют тю уж 1 важ Не : з
М Х МЖшЖдт. Ж МЖЮ же хИхА А АХ ти ЛЕМ ММ еЄМжЖА ж АСМО МЕМАК ККАУК САЛО ЯМАТА ОХ га пд Е Е: ці З я яву ач
ЗХ кий лю ту г. г хх хи Ган НЯ ДУШ Ко Гах бажни ДОК о Ук алею СИНИ 3 дя піч пуд м й юю ошууя ха дих дж ФЛ НЄ тот. о: Лу ОО ХК еле ТМ ще
Гм оси У шому СА ЖАН УЖЕ ЗАЛА бен АНА ТКАЯМ «ЕТО ВЕЖ док ОКА УХА яю ста ск,
ТОЛД ЗІ У
. Щ : сх : де - хи
РА ЕД ОК МА п вн У СЗЗ дологу пцц реЯНКМН чом а о НН Нв КН оно о На м На в НІВ я в на В ик и ни и ки ин и ВЗ а в п В НО ЕЕ ВЕН Я В саден глосит спасе пизомаєнт вену пс ешеще СІВ о
М КІТ ЕХ тики малу мети ся ЕТ ВИТ И КО. пихи и ХУ ПЕК ІК ОК Си ВТ МО пок ду коик стропи тему ФМ Море: фев Керовані
КИДКІВ КОТИ МО ТАТА ТИХ на о В а В КВ о ЗІ В ва ВХ роди нтуті стро туту тактів пи Кі Туди дв ПИ
МЕМ ВИ І р У СЕМ М Ин ноу рН АК ЯМИ ЗУ првссіноврехр Сем лну списи є Зоо єолму портале сся павчссвВиеші о спину соми шемаємиу лан оиеє Зоо теалима лиса ЗИ У : ; : мод ори кс а и нн и НН НО усу лу диЕт споді сля аа Кави пило КИ нена аа с пн В о ки т З в п А и п НН ув В Ви ВН НН о ВИХ х - ам и ях томі ох фоток гетсесіотететю ех СЕ КТК кт оуих УВК Ір ее сфевеже мими
Му ли ИН ІІ КІ НИХ БЕТА ОН СВІ рН МА ЗЕ МИ КИ М шиущшестосос позов сосслодосс аосососсовоас совсссосде бетони сечо яспмзальшлює буси сс сема сочшшсповию чи поссспоюмо зозвссстлоя Соуси сеєтю стор снсв Фен собоКосоос я пу томатих Хек спсссідин воссжатасок взузоскосав сппосасове БИ авось пасечНН позов денне осо взсвоочесс поси ТО ее ешс сосен сс дессяє ссбацоввис бостесі Бешеввен 0 каерченикокмо орви сера сирі СЕ Чех сзаозоциою Я сасочеачосо сови са зесоачско бзсооооаов сезон «ФовБоецюг Я пеФдчесоваси спе чя совки сешавоскасю суч согостекни я чи тимІВиЗ: вовленссщаки спос екв Фр база шо піджеснтссст севсоуаоза заосехосос аеччссояоє сосвоссвВа позшесктмаш ЗИ зочКиашискмІ пес МмІінмх свому зКдзоссвов пса чинс сокзассви 115 сопчсєлзеєє бебвсосасоє сесеуасатє сс зчччавсссова сс ТО пецезвоват виталицНаєсеє Фосоостоювму стнатссся зу соКоскловс 15 писар да пече чае ечсосоецем савани чері скл хо пада латчиа сстосбоповосае севссвсовою басма чееюе БебетотЕи сомоденя уза
ДЕК ай «2105» 39 «2115 238 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 39
Ме обу ТЕрофеахм Су Тіжв Ті їз Ем ої. Маї Мів ЖВЕ АБ ЧУЄ СУ т ту пт Ук - Ух ем ох. тУві Мів Мексоваю їіж заз Меж тТВх Сів Бі Бі рЕо мех бву Аїд Ок пЙ де БЕ трж вже бі вій ек Уві Беж Ті сек був дже Хек ек те БеК оцец ї5 4 4х вн ОЗ іже їні Бій: бище Беж пі цУув жах тую фе бух ро іме Су а ОКО ВКО
ЗО па Бе шу лав шину пух Сі бе бами Та бух Ак Бе Бек ах ме дк ОБех пл й Вк РЕЯ
Ме м ще по
Фах Ме шко де лам БНаЖ пе Сл ХХ У яна «АУ МК Вл Бо Ту
БЖ з З їси Ажев бі шек о дмлЕч Зк Зі від са АЮ Уа білу МаВ бе Жук ух м МОЗ 110 май ій їні Під тую БЕ ФУЮ ШВЖ бе ші ру Фе ЩЕ Був Се
ВЕ їх ках сі її бух йде тТьк Уа Хів дід БУ Бек уві Бр. їі Фр оБто ба лих І Ї ТАК ТАТ тич Мих ел
ХекоАвк лім СЛ бем був ек осау ЖЕ Аза дек Уві Уді бу їм) Їде у ТБ 15 їпо дію долом Фі їх мує Шачетрофуюцтю КУТЯ А хе лю и ФУ рату тд ХУ Можу Ком
Авт дит Кий бу БЖ щук і маг шУщоОМЕМ АкА ТЕ ому хтл. В ККОЕМ дяк ач пт ря Я ее
КОХ ие шия шу яд МГ тод фе ше для М ОКА шує ЖИМ ба ям мя ках мя зи ії щі пек о спіУу два овБеюЖ піз баб еко СПУ сл о со ве мех іно їх їз
ФТопех Хай бує СИМ сумо Шеюк о Та я нн АНЯ а НА НОЯ мамо ВЕ КННЖ СКК МУ СЛ ляяНХ НК КН Скла ТУЮ сциВцрОХВНХ ХУшЖе ЯКА ос ТО Мах ем шмМ ями о не ННЯ бою М ож Тл чна ШИ ее їх ті ні 12 с бувюю ух Їх тя»
АЖ СУК сим мувОо Мал мух ВА ЖЖ КИ у а МЕ УВО БА хіт Ту я ОМ «о їм джшЕ Беж С УщО ТВ Буш Беж ГП Ави-жо вк у ща СВ ш В пл 2105» 40 «2115 731 «220» «400» 40 дж гуд тк тю и о в в о я не о НН НАННН чикаслииа сла бло суто бедеозисе висо и паста сич еєшею сову шила шим стран мере
Ан НА НААН НН дя вжи вима м мем му ву мом сим вжи кА смт ви ЕХ
Фів ее зум рови су перо нееНе СІСБО КІМН щи сс с МО
Еш КНи Бу и Я І С В М СОН КУ КВ АВК Ко ппеусемаєх скоса Себоглммму своя Зоо евс Кк Іто ЗО пис лото срок см сем сосна си ж о модеми му ин ям учету пев ве ит пюф жилу мс ус меха ки дотри вокжню ТТ
ВЛИТИ ХИХЕ С аОИІ ЖУК синами ран ЧИНОМ и пе «а о о З в и о м У о и о о о о п п Де о и ЗМ п и оч пр Ки естн шдж Ессе сема соц соми яви п шсипоомх свт мм спосо сенси пе оре КЕН ОО шлидосМмІссУл спасе смуток асо ви ес ам само Бо ши поиск КЕКВ сор пох вих Няю З гра ци А
Соч спосо песо состав ши е соц км пд васня о Е Ії «2105 41 «2115 238 «220» «4005 41
БО ПЛ тину ти Ум о Ву у ТЛ ве Томіч (ЖИМ То люі ї5ц 1 Ту ДАЮТЬ му Ту ШИ юх
МЕМ. у СПА Ол Клеї КАХ ДИ ОМ АЮ ДМА МА ФАХ КК пал ГИ жЖО А у т ц шк го
КЯ НКУ ди ОЦЕ гі мли МеУ ЖЕ щодо Же ВавКотнУ яр омій ів МК Жим лю жів Ул
І де БІ
У. Є жо шт х Кз Фаотизих Зої маочЯ АТ КО ЕВ, пику ИН с їх они ж ро О Жоосдех
КЗ о шу АКА ШЕ У ЗМВЖ де Не тує ЖІ ик пек Був шех мк хх Ії «ТІ
У нн НН НИ ох чн с ут пк гечНи хо т Фон М
Как: Зі ше ун ку гУТак Бдадо Зече СМне Хома ЛУ тку зічег Уа КМ вия Мтих мя маш ше с ку МЕЖ А Ух золу У ЄМ це ух УК КК
ВО ко що
КМ ДИ Беж сухих си шле зу пртию и. лк. пе я п х. Ушку ет. чих Ак од их су х сн Кот УжичА Пашечи
Те жд т. яю. фе Я таюМмі би тА Стеж щи ба Мих ож уЄ Змищі ЩО ще и. ЗБ ШЕ ЛШ НЯ АКУЖЬ аЕМІ Бища дО ТУ Жж яму БМ сша КО АМІ КваМОББАяК ЮК Е ко тк тк ве
ТЕЙ Ти Си хе їз яю що жк бі йо чі ВИ БІ ях сухе суки її М Кук Жов шк ен ж АХ МЕ ХО АТКОИ ЧЕК РА ЯКО ЗАМ аж МКМ СУХУКО ЯКА ЛТІМИ МОМ
Оу У сх
Тіт Сюеея СК дж соку Хлатет лір ЕТ: ще За скла Мих Не ї ТЛ» Ящик уя тра гу,
ЖИТА АСК УМ У рах м и о с і м в п о С ан М и о м я МЕЖА ОУН ТУ
НЕННЯ НИ НН лати тий ях
Хо ил ен НН Ток ам ух. перех Жити ТИМИ сени нн в ен Кн НН него хлем Зоя а хо год І у мух сід уєах сли Орг Чіа гак гі Ул ТО Тохану Год
МВ їх маш ни ЛАК КК СУХОЮ Бл хх А їм ЯН Ж СК лу ДУ жо яких я туї
Не х: хи
Я.Б ки ДОМІВ щих пе . . кі: амило я кл с сх шу удо у Мк дж ям: тих ту ок му: їв хо Ж о мя у ує хну мене ту Ех ку дич мипле ОМ ОКЖЕ дл ККУ сх тіх МІ. Як ММ ях жи У АЖ КОМІ мІМЕ -ЖІ Ка цих я ч мч
ТУ ОМ ТАТ
А БК Ууще «аж св а я тм Таж рю фі ТИМ йо у хи 3 б Том Том
ТЕ жи В АК Ко юЮХ мед шу шо ААУ УЖ УдАЮ Кк Ул мл ух ОКА а «ок пу чуми З Ех
НЕ кави ек шо дат й Ме ла кю кт Доу 3 й г М У ж пкт бле Хр шу шт ее В КО о и МИ ИН А УЗН МНЕ п КК ВО М І В о кю З я З М СК о м по КАН ККУ от х Ох ке що с пт ж Я зх ол дуди Е я соя п хо мурах жу ЖК щонує Ме
Що тодва бл жу лу я дк годую ФА 234 Ед ді ню Ф214 ЕХО уч Ду щяе
ЖОВ ДАВ хеАЇЮ СВК МАСУ МІХ МК Аза АТ ХХ ОМ СКХІЖК кт ді ЗАЯВОЮ ДИ чт «т доку
Не Я ЯК
Кк. опе нка пн зе а Ех тож шкі п мм ст пе ГУ п Ух х
Віхи ож Додаю Пл аМм ЗУдежи Ху бадмзя БЦ жу ЛУК у том "Чері Бодумі КД. жи сх пУше лешжр ий ЛО м НУ зма ож ХМ СК Миша СуДЕ ЦІ шив ХМ А пт пт зла ше кю ее
Х го Я ж п оо оп стож нт пи яті тт ге НУ нн КУ о нео не а не НН КН о о о на На и Не и о НН АВ
МУ У АХ ШТАМ УЮ ЕК КУ АХ МУ лАМО ММ А УГЬЮС КО СА ХУ АХ
Ел тп поли ки КАХ ко МХ дУхУ М, вини ше На о НН и На ЕНН о Нв о НН я НН НН Но НА ВН Кая мама сим о пМйпАх же Мем СУТУЮ у яНАК АТФ ХМК с па ЛА ОКОМ
ТІ бюл сл сте омлетом ФК дик гУМ тив им их тхір уує Купати жих гу етрю т щ шоссе ати Яея по мам Оу м ХА сим пт ши и ку. ти М еру се у туту гли ке Кж куму у ЖК ие ОТЕ
ЖИ ен ММ ЖЕО АК КЕ А ТІ АХА ІК ЕК еВ НН МКУ кю уже мити шаг алі іх вика де ЕІ КЕ щи тиви и и дь сел о ви І
ММА М АЖ А ММ НАХ М МАМ ІІІ ФМ І На НВК КИ КА ик нн нн на и т в Но в о но и на и й а ее ли
Ко не Ми В А и з юн он ко В В п п м о п ни и а п в но п п В зн о ма век во х В М ВВ в пкт угли мук туижихим пжути ЕК фут ютиу тихих в дит кет те ЕТЕтТЕ оцю ик их ж тує щим тр ших. иМ, шари СИЛИ МЕ МО о Хо Е КУ им Опері у І МА оо ав т Ва по и НН и Нв НН НН НЯНЯ
ТД ІА о. ХУ Се МІВ В ЩА М ІМТ. ЕМО ІК ДХРЖ М УТ ут КЕ ЛК «еле ми ви дити ик у ииуиутитих о сечі щі жк у спричи путч Крут м и ТІ
ШИТИ хви ЖИТІ ТЯ МЕМ А І ККАЛ В ІН ОСС з дере уєю ним мое фен В ух их ге Кит ии хи сову ж ме кі федри ик учити ті хухи тм ЛІ
ЮХИМ МИТИ МІК КІТТІ ЛІФА КОТА АХ ОО НІК ФТІ УТ УЮ ОК нн в В и В НН ННІ ліміти вис ши км сома Мя и рі шу мене пали НИ М фе же люту тм «тео У КТК рф тиви спот сід ФЕВ ко тт «за иа ТА а ки они т а на и о и о СЯ В а В УТ М ЗО и МУ БУ З хи ТИ ЕК ОМ певне саке: КУТ спав Від увихвв сен п ту Шок МІ МеВ сосна зошита пад пи почти учи их щити ку их ур увщии ВІКІ квитки М; с ав кн нини ла нн о м о о м и о В п пн в в у з о охо о М В В сети Мк сроии В лет
М КАХ
«210» 43 «2115» 238 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 43
Мат сі беж Маю ослуш Щї1Ф фі: Бех Ше ік Мі зт Мис Аі ТВю сля
З що толю ях
А ме Я я щи не на ШО НИ пт меш пу хх Ж т. Же сло вхах Ху не нач щу БЕЖ Є ЯМУ да яю Ме УП ос А мая КЕ Беж УВК ОМ
І м зи а: ах Бі
ІНЖЕ виб пі дів бЖет Уві ех біє беж Сстев дЕйп щех Беж бр дат бе
Ох ла Ол и лю Ач
Тож тд лях іх сія іх Сток ЛИКУ бух бот Мат Сну Ти тож ее пом дих вт ту А мех У МВ СУЛИ СМХ енд Ку сржую Бім цех Злість ВХ БЖ
ЧІ за й ж СН прюу г Кодихя сих СКЛ ММ их п у НН НН Ь х я
Сьу Біб лек бхсоблІв ем ої Сів обУую Акущ їні БеЄ шеб Бе дів мех 2 МН Ех це пку Уа Вже Аво Ак вне дес ЗіУ Бек Піт ек бу ТМ одіЗ бе Ну п при Зк х фолиєм Ж но и шк ХЕ по ДТ кВ ух Можу. тот ри щі Тон ВИю и ж печах Б бек стеюк Долу Ук са жів с дні Мао ру б Тек фе Се
Ех х У х і: З їй 1 112 ох МА У
Мет ІЙ Ку іа Фмю ТУК СЕЗ ОТУуХ ТИЖ Біб Сі фу СУ ВУ спе Тим
Тл ВИ иа
Бій їЕш Бе Бкботие Уа Аіз Во вк дек Уві Вбйеа Ї18а8 Бе БЕ Буш хо Ї т5 їй
Й АЙ КОН
Пежо дя СІМ ців Бей оісевж ет Піт ТБкодія бею Ук Маї СЮ їжа Бані
Ва МЕ МУ а мил ям Ллоищо ТЩОЮю ХА Хом ди М тк тА УТ: псує тюлю ди ож ог але дат ше КУЄ БЕКО АХ ма Ба фут УА ЩА ТЕВо Му МЕ АЮ дО
Мій МИ 15 кн їде сті. ШК я АшИ Бак пав опо бе Уке бл бу бліх аю Оойпаеш їв НЕ Мо їзуУуФ Ми ех дю Жую С їжі ех ех Тих фа тю іїма ех СУШКА 135 ОВ яму да сге са бу ойла зує удо рек віз Шут спа М СБК Мі сам пу рАЧачИКЯ МА титри ху «ЕК о
Ум: ритм ФЖиучи Тк чен пк Та ох ам буки Мт бук 1 и ке млн ОхМиХІ хуй СК му КТК муте хм БІМТ «МмМмх МЕ лу КОМ ОС зе пут пу
ХУ «ОД дО «210» 44 «2115 731 «212» ДНК 213» Штучна послідовність сте Море мне форту ие киу с М етузау ух міт Ме Мем Метр уучуаих схе шипи кн шас старим ЗЕ Мт ПІСНЯ КНУ срок п чн р ча о и и а Кк и п А п п и
ТеХЕУСЕКін иа Мо МИ М ААУ МАУ КІ ААУ АТМ Мжте і шЕКМе Я А же ик тих. «ЧІМ ІЕЕ тлу суєти ле МІзу у густе и ср Ки их М иа нн и нн м а ки о и и и ни ко м ши и пк в о а я Ск а и о нак ск а т а сн ОЗ
НН З А и КН КН КК м А не КК В о у СХ кед і ежіуитих уж Ли хамам ДЛ ІА СЕМИ КИ МА ННЯ СОС хо мн в и о в НО В З ИН мери І КІ ТІ ІД ОО АХ ЕН ке и В в и НН НОЮ
МІДІ ТтИ КИ асвк сф ремя ИН НИ ВАМ ох щеЕМ КК
Кіфектвии ие дит фік Ні Стенд (Кінг щит ек греч уКиче в ДИ нини м з и в м о во о ВО З ик А ММ Я «І нина она и о В ЕН фотитедтю мук ря ни нн НО НН в на и ЗНИК
МЕ ТИ І ЗАС ПИ БИ КК ЗИ Ер МИ МО КНЕУ и НН в в НН в НН о НН НОЧОЖН печу гая «лавок сосок паса Зеров педа Ул ен Но ни и В НН НН НО НК им Ма моишіма см ЗИ Ха Ки В У пи нн и В В в НИ о о ЧИНИ айс ММ КО Б ЕК КІ КО дна ОО РОВІ МО фо тм, М Ми и Кн ин Не і В и А п п ж и п о п Кв и оо м ою
УМО МУПИИ МЕ КО КІВІ ИИ ОО тлу М КО МКМ КЕКС пи Не от о м и о У ЗЕ ЕН ТОК
ПК НН Чт
АКТ ОХ
ВЖИ км тя стуку ба Ж и р иу тому лем Ти ївщі щі що пам до я
ВЛ СА МІЖ а ук ОК Б КТ НА УЩК МАО поді суп ниУ Су
В її п їх
А сл А Мо дж Р в но Но а нн о АН Не НН и и в у НН А Мо
ММОЛЬ УК ХАТУ м КК їм дУМЕЮ АЛЬ ЯКО шКМУ юЕЧжсЮ І БМ АХ малу ст сктх у ши А: КУ
Фа ищо ТД УТ юю Ім С ЕОтущ ями Ле и у мушу. Мих Ст а оно а о А о Не нм дме ле ЛАК їх ех ДА Сл юУВ ЛУ Уа сив ху киш о ОК Бе
А С о
Том сію бут те умо їтщ 0 оту ух Ж щем 1 бшюжу Уют А хи їй кю М ню хг Кашу См мя ЛУ КТ лот АР Ухму МТ МК жу МУ Мем Си то й БО
Фи.хи Ву Ен зхі ди ЖЖ Жде сани Зх фавтя ли фу рум фб'ююм Мам для фени нн мн и а о о м в о ЗМ КЕ М Ж п НЕ и ВО Я З ВВ У АКА Ж АЖ ОО ГА КА ЖЕ
ТУ ш Но У
Федя ТоштІа Теюхжу смсюх сни нн я НИ а ОНИ зе Доти спи Ж м Ск
ЛІД АХ УЮ ДУМІ УЛ «АК МіО ЗІ. КУКТХ МКК ХМ слі ИЙ ТУР сти БЕ ТЯ сил
МІХ рН ща ти для Той охо Хор ди оп СИМ пУМяє Ж ому че АЙ що Му мує
Фі СЕМ срощаї су ша ЕКО хЖ зАНМО СУМИ АТАК АД М ТК ОКХ ях Живи ос ХУ тлу ІК, ен
АМУ М А
Я СН х п ХА пу упала г? гії ЕТ ТРАН ти хи труни дІв пчииує фхигю КТ щению ря, ЛО сте пах Тек оії жу КАЛ Ух епі ожхтрі ее Ів
МЕ м ть лк ск ЗІВА М ВАД МОМ ою ЗАКО МЕЖАХ ТУ МА ЖАКА МАТ МАУ чек похо 4ї
БЕ КН ВОК ї С я те се хх п п тех Суниця ток сн Ба
Сапа мі дО ли жу ум їі шкту диву бі бНш Мет; їм) ЩІ МУ тщх
ХМ лиже яхАЄЮ сн му сю Же Сак А КНИ БР БО КАХ МКК Оу Ж їз 135 їйп
МОХ ККНУ Кен
З 4 х - «- з ке я Жито
Хто учет дан ТИМ бе ЕХТії рю стае Ді що Мо темі її фія Тоцаї 3 туш вих ек ше ЕЖ СИ Ж СК ЗАТ НЕК СКЛ ЗА ла МУ МАУ СУ шо МеУ мМУВ рт «лу «ік ох 1Х НА Ну МЕ 4 . му - х 4 дн пу тещі Мік др ТАК Мол
Под. педях ЛліиИу уа Її з3 У гУу 3 Мн хи шати си юу дівтх Мах ТАЛА М Год
Ммеца ЖК жТНн Фгуза ККМО кп НА У пХ УЩО хМиж У щІ МНУ ех У Май Мши
ЗЕ пл ул
Мох. сю Ах
Е я не я се с п - «о ях шж « Я «У о Я хи Фу те ФРІ биту Не Ук том її ен ик шШемує кл ли ЖІ чар терни Зх Хв Щі тв СЕ ща ік ло ли «км іх ще Ех ТіК ла тлх МУК МОЮ ЖК А ТАДОЕ С АХ ХАТЖО БОМ ХА СМАЛЬ МІЖ О ЖАР ЛУЮМУ ОХКВЕЮ УЖ АСЛЖ. КОХ топ т На
ШИ іею У - «ех ско дО щи па А, А ЧІ чия У сх У ду хну Лу Кок сива кує Зк жа Зане г баку Же бере Куца її щаї (ЗА хе Муув
Ту: ро ане ши не ея КН БО КИ ВИК ЗЕ моту З Я їм тещі кН Е
Ен а ке в п о п КК М в п ОК М а В І С В а В М а У М ЕВ
ПОД тюгугу лук
ШОЕ ик Ка я «ух ще « хуй ІМ мо Утпжкшя Оп Ж у т звик, и ук ПУ дУ Мои УХВІА бхухиє Сік Зуй ке То мм уче тя рю Дт ю сор. Хід
ШУ Ул ЗК СХ КУ с кам СА Ма дує УЖ СК АЦП ОСЮЛХК му ВЕ тилу тх уж ц пли зу чи З т Го ск Ч Ка ма т т чо що Ж я: сь их хау її Ам ща алі пет їде сли са» Бе чі жощо Шу Жеу бут о феті
УМ сук М жа МАМ о юшЕ МЕ Ух АХ КО ЕЕ МВ КИ лю МВ ОКУх пер тут сту ке ах я АНЯ МАЛИ і ШК : - я Кк подих ст жін КЖоджаю УМ афїчиє 1 щі ЇйМ ля отдечеу СУА КХ Я лову хх ее ТУ Темі бю ПИКА ле ТЕ Шев З пи ід: Її тат лАаУжю то йон лю хи міма Ми БУу ЖК жо нак Мі Кн ди рБІшжО КЕжОо Ка сКУХх от тУщоц ма ц ля з щ
СО СЕ ИЙ кт У к.К т и. їм с чи Фо почек ж пе ук оку кни не в НН НН ОН
Шут дит дюшуру ОСП їідма МНЕ Жах пн уєш бум шт їі ері пвх Ж лек
КА ам ю ЖАДУЮ СКУ МЕ ТОМ ОМ Ме ТУЮ СКМ жд св ж ВО У ОКУ при худ тек ту Га УТ «ЛІ еВ ХА - х шов 1 м ст од и Я чн іт ху Хопюмя Тпюї о ВТ ен М йлхм сао ПН у А а и ке Нора НН хх
МО Ех МЕ ЕД ОХ ОУКО ХА їчІх ТУ Бош З ке М КК Я В У с Сен ВН меш Я
Ех пл Я
ОО УТА ДЕТІТХ ож « - нн т сто Ь зх ях
Км жа и судото вал фе дя дов МО у Хоб Мф 7 хім мих Моамию ФА. Ух хижі м ту щи ру 3 ц що ІжЙЩО ух вати ОК Е гух КИ РН що м аж са ЯВИ КМ Сум БК ВО МУ УМХ ут КМ ЖК ЛКК ТАЛА
ТЕТ МЕНЯ А яю уки фу ею сум ММ Ммиує Хати уки гл ГУ суху т Туші. ме 1с7хщ7 Коші М шт ле ДТП СЕТ їх Ге АшІК Ух ке КУ М ов А МІХ МЛК Жди МАЮ САЛО рн тому поту. жи тк, 17 ху шу
МОУ М ИЙ веж я зву Маму Том балу Зах То У: Тк то бук жі тлу бич бу бл реа ОН ІН о в м СК КЕ В ЗЛ ОМ а В С кн о м і в З о М А КЕ док вх мот я
БЕБЧН ОК ЛІ пе - лящ, се - тт мн нн ин нн и нн А Я шт тож жи Кит пр Сл Ії тт СТО ЕК ше Тло М пит у сЕАЛУ М ОК хИйХ МЕЖ Аа хх АТО МИ ГОМ ОБО сте У ка МВ М БУ рат да хугі пЕАИ МЕМ нах - - ура нн о НН я жд дж кам іт срчткт Я мих КЛ я КО стиках раю ти ШУ Шечетяо сту ЗТ лах щі шк дея ЗД ТІ ІЛ КК ММ шу ШК ХУ хх І І ХУ гру Я шодо
ЗПІВ ВЕ Ви НУ уж лові сфодху Чл ад би Ті СИ ю фбтх том ХУ Том Фо Шен страт Вул
ЗК МОЛЬ ЖЕ сад ЕОМ ОД СМ ОС ШКО ЗА жи. АЮ УМ ТАКИ ОКОМ ОО ОКИ
МО З Ел жи дж ня Ж що схо сії сту в я ше я гУжшж схіах Ми Я дає до пий жк ОБ ом КМ м їхХ УКХ мм пежш М ї5ц ж АТ КУ ЗАД НК АВ нео "Ч7ц; Ся пит
ВВ БЕН а о ; - ке я ке що І я артюх тод. бЧгни МІ еує дит їли То НН ТІ Щи ІЛ х слуху Тих б МІ хЖЖ їм ІК УК МКК КА ме Машу пу с ЄмМММ Севу ОК КІ КИ НМ
СД пло пох вени АЛІ Я
Ач Ппкеекю. Пост ок пек Му Ху мо ЯН М Плюти Хот ку ка яю ит сан лк зок «г Пи бо зе ке НН я о НЯ ПЕ До ут Тіжмр гу: їтіхх Де шкі
Ух кН яр чи МК Уа Сл аж ЖУшУ УМ ССО ЗІ КАК КУМ АМЖК МАХ зап вк 430 ер нн но но и ВН НН ан нка НА ВН М Но я НО КН ім Ух уд щи ру ВМО ТК ШК хи МІ ЯМ БЕ БУХ ОСККХ КАХ лк додом до
КОТА ЖК ВУ
Ж ллшжх 7 шк і. ст еч ати ХХ шк Ух
М КК цем Аа ВМ мам ІК КА сх Ку
Са ях
У Ка
Фоми І ШИТИ гул ух жує ж гофхух мує щуття Емо и жи фут міх желе ШИ
ПИ А МИТ НЬ АЕС ПОНІ ОО МАМО ТАН ОК МІЛАН Я КВ теории биту ож жим ХТО три пуху узи жи ЩІ иа федри и и ТАМИ и чи пс о лим КЕ м КАК ЛИ жи БУК ат ий Мр М МІ КАМ цптТеМІВІЧЄУ ЩУКИ КО ЖЖ ут у щИиМ поки Мезим ут Ім В УєУТИ МО ще Кмчииужуг с Марк жмвкажих ЩІ
УМ ЕКХИМИ ти саАЧИИ ТВ НІ КН МОХ МАСКА КИ М ХУ ие ка ЕЕ ХИКІКАКІ МИЛИ вира ма на а В НН В ня
ПЛИТ тен ПреЛИОВОИ МАУ КА КН Проснлриуцт у МІ МІМІКУ І СУКИ МИ КАМИ АЛ А ХИКМ фол меж сню ми ж и ит, рема нн А НН ИН Чи ее и КН НН
ИВЕМАТІ ЛЯТЬ ІМ ВВ С МА ВИ ІА КІВІ ВИ ЕЧАКХВ ами ЕН МЗНЕН
Муки Кт щити вели у уд КОВИХ и Кит г ом о А ВН НН и о УКХ ія ЕЕ хи Му тю дм ММ Ж А КО ІА КАВА КИ у вх КО ЕКУ ККІО не ни І Я а А ие и ОНА и ве и их А и пк єси и и тю пок. до о дм и ТИЛУ тЕмажкоди пи тєтьх жжучЗи мч ут у жуки кричи жі ством укт Фе гтелетаті дя мм УТ ше Па МЕНЯ МО МТА АЕН ННІ НИ КЕКВ СІК МОХ Зх а а м пн и С о сон п п п п а в и пд п в п ор о ро в БК плитки х сито лее шо ами аосшЕссчачо пово око а печити ще М дих їз уичичи фут вера два ук ит житт т вк жу жи Етики МІХ
Му сю С ни НУ ОН Я МІНИ МО ЕН КИ КУ в в а а ВСЯ теме гріти мимтх Момот су стихію свое вк рих ДІ шик риУо сном Сем шемІрчКиЕ ОНИ шо НН шодо СХ се полоаю алей засешесчова спла ассвм по си МИИ п х и шОМЕМЕ ш т м ЯКУ
Мк НН о В ВН и НВ чаш Кит рими Ма о Срок ДЕ НИ НОМ НИ ИН п в НН НО и НН КК
МхА АСЦИТ И СМ У ЕМ САМ У ІК ит МА ТАТІА МИТО А АМЛАТА ТИН КОТИ СТОК пенали Микити фев ие Кметюк ет ЖІ и ее В ее Кс в и Оверко и В КО М п В В В ково нн а В а М МЕ ЕВ КВ ЯН палив каихих о пеже іще ЩЕ Кт Біт фра іде діти ОК ак о а в о о о М В а Си З ЕВ А Мк аз ох на и о Кв ММ и ви ви ВК чн нн в В НН НН НЯ
ХУ а о нн ВА В и І НЕ ОНИ п МА М ДНЯ сни Б в Нв НН Не в В в поши чих амм вида сташиМ АС ОчКиВа паза сиах УВІМК щас НвиНоО У поши М ин стр ее умі м пет Міли мету ми муюю сом лю Ме Се ек ПИ лес паси ЗОНІ М ВІЗА ПВА КНО пецЗ ФжрнсКІсчм МО кан и Но о НН в отр На ва в НН
ШИ МИ ЗК хи хи МИТИ МИ ХИ хи МАК МАХ с ОКХ хи М КИ МИ ДТ А ПКТ и А ВИ АК той дже меді по М дини С опоумтмеЖжме КОТОМ Фет т фу тку Іх М ух рухи и ВИНИ ил АНЯ ОТ ХО ЯМІ МЕН КК В І МАМА ХВ ВХ А кулю Ми тре мухи шими МИ уч межах си а дну пити ІКТ КМ УК Козик ук ща ТЕ ЕІ палю ос оду плесо слон во Ме с КК ЕК КМ
Км КК сизий ут у іти м кт бгінзиз ую иуйу ех щифежіи же мюмтмам М Ве Мои ик пу чі мою ОХ
Мк ла ши Ук МИ ММ ММ НК ЕЕ ЗИМ УА ПЕ КУКА АХА ГКМ М Се жААНИХУ щоки Ки ситет т п І узух сви руч ма ит уж им ую и Кум умів своих ихифижуєімити ІТ
САНИ МИТИ І У КА МКК МЕ І ЛУКА ЛАМИ КА КВК АХА МІ АОС МЕМ МОМЖА кож АХ
МІХ ТАТУХ
Ме її юс Маеку Мр бета Я Кі ХЕ ша і рю Я т мно ххх мл. ЩА УЖЕ жк ЖІ 0 іч ди Кп с За ва ОЛМ ві Олю сх ї в то ож -- -х и и х г т: хх « «ж 4
С жі се я подих пе Фі ЇХ хх фмаих КЛЛди Ж ех ЖУЛуТ хлох тр я що беж фл. сх г ж шо лу. Ла сжнНех 431 БЕ Ре їм; Сі Ада
Уві м НЕК слі а шалі з ЖІ їх Оле Х У ОКА ХА Ух Її. НН й ск тк «В ай п З рт 5 пт кА Уж тік уми Ши Тодха т. же ситу оре хоале очна но НО НН її ех Єр ан ЖУюиУ ЛУ ак
ОМ 111 хх ЧУ ут ХЕ. УЛ ГК Гак Ех чу с М пкт М ж ОНИ м ЖЖ М, нори В се Во М З Ярова В у М ЕЕ НЕ СОЯ ОО Кк у с
МЕ З А я ве Ж - Я дл г. сажу Я то рю тя гу. ЗК хв х Мк тлі Лю Дія тТхезку бух уко фозит Ех. КМ
У ду ік Крах їв дор сту тла юучч ДЯ точку у зіхк фрхв Ек. Гапд іш дві ТУЮ БЖу УшА ях ЩО ша Мює ди шЖжЖО БЕК У щу у З ох па п
Кя ; с ку нку дев стю пе во В й Чі х У ли Чтв сім ПМ, ії їх пил п зок Уж шу туя йо но Чен У дю Ки м. тра де ук Б х з
Не етвка нн ЗНН е О НН Я НА НН БЛОК ЕМАЛЬ
МАМО СКЛІ МА їН АЮ ЖАН СЕ ЗА ЯМ пилу у ; я А ши а ня ВО пе й щ ц я і пухка кл гу т нт у поси й сна т ке дбиуюе Тон сбжуюю лем «би Тобьхі дк ФО
Шу такі вкл Її хо щуку гм оку Те щих уж ДІМ Дол Зевл 1Ии ОО БЕ І1їу
Ж МЮ вий ОАКИЖ СМ лю ММА БК ОБЖ ХКмЖжО МАт УМ Ями МНЕ Х Ок У пи 4 п х ; а в НН ххх тоемті КЕР, Зо Щову сббкую о Том. Жар Ма йому бот Тк о дій Ма Е пух
МяЮ БіМма мящцрошату шко АЮ ОеЖ Бе осУує КАК ей мож Ай га Оу
Й чо їли НМУ М ку б я о У УК пули ту
Е я ти плин п да Ач ше яко п ие НН о сУщюї чеаи шля дій ді Ті а беж спже щі іт ср ее Тай сві твЕ Ук
НУМО Су шо А АЖ дм УЖ УК ХА їхату му МИЛЕ щих ч т . дош доти я,
ШАТИ до ший
ЯН т що тя фуд о оТачеря То АЛ о дах хх о г : сб ЛИ е У хщ Б хх Па пики. ух ут там. ТМ дО ла, Гтутх па сце Ал Мах СМ ОО УХ ж Ом щих МЛ А Кк АЮ ху АК ОККО У
КА ДАЮ юю І КАК АЮ КАЛ МАЛА дим : ку КЕ
Б: я ит
ІЛ ах Ма х - я ен Ин а ННЯ х Ба пт бек сіру «Рів о фатк ЛК Ал Хлю Тами Щі м ниж їдмі Ха Її а пжшЕЖОслр мм СОМ ЕК Лала ЖНиж СКК ЯКА ЛА ПМ ум Км ша Уа УЮ п тк ня
В НН ОТуТу БО
НЕ Най мли М
ОКХ Мо їх т У х Є сек А о Ух ще га їх го скат. у ідо бю бору ким сорею 3 ЩО тпм ве тех ІЕ ТЛ їх МІ МЕКІ МІ Ех х СХ ЕЯКЯ та хіх п ПІ ВОК. Му КК ран а з с Ка М іа кн оо и У НВ КУрАНи ММ. зання : Ве 7 7 жи зику ї ск ня НН ТЕ
АТКЙ М
. кот дю е жу пед дж м ЖК М тт пк УЧНЯ мух сх Шум ЛЮ о. ЗЕ о лом Кк умо Жук й тних
Чт беж У юю зу ОІВ шо сИЖем о чих фумму ЛЮЗ оо ЩЕщ та у. НУ Ж пуху БАХ тлу а р Кок НМ У М НИ НМ у С а В и з и ри ИН У ЗМ ОК Я МН ЕК МУ й пов 4 фр
МО 155 їв шу МЖК : х ие ще т - п и т с ст по зад ЗМ хи ему у да Шоу щіхют т да бут лж Мох бужо лЕ бм БМВ у же У ді М ллаві шж меж маю хім їдМмР см ТУ и ше цЕМма ли НЕ Ж я Уа АТМ Ок МИ Ж ОЗ і; ул МО ЗЕМ шк Мих я ; тот х ти тр
КчерИКЯ ян Ах : Я т ге -х ее Не п У я. що че Дату лі во блуд ку бух Же Ук їх ді
МЕ СЕК беж СрИпкопев ода Уе ЖЕ КВ о бу хх аю ОК МЕ ох ау
Мі М СКМКЖУ ЗЯО КК ж не ко и МК я а я В М НЕ а МЕ а и а ох 34 су Х й пет тет. Бе я «КО лм з ще з її чл пе Жхжсмя лиш змо Ганну с м пен неДачИ а нн а пу Тік чут сф жмя лугу охо Деу до зажди 133 ЯК був бує дру бер ос тю Бухта в сСбУущо фжі) мата лущ о я ся л АКАЛЮ СЯ Му КуХ км БЕ ОКО і х пити, Ух тальку шо пе Й «НА, ям УЗ ЛЕМ пе г що нн нн ННЯ Й тр дути Бухесч уож хх 1 - т т кл га бухти псує І узи сум ШЕ бучу дж їли куУ
А Мхту У Шум о Сб Фі ЩІ юю Ум ле КТ ру осика с ж м а З зн В СЕ А СЛ ВВ ша МР кА ЮТО мКА І Х ж Ку ЖК УЙХИу ЖЕК АК АЖ БУ М
Й т мо тю М, у ВУ : се сиди м мк : сю й 2 хори Мур іл її а: діщд/Лю сна кмуйо Ху 17 У пу ти сих а нн рок ЗМ УхУ іл із: Ед На ка У пас: Їгуш о ААШЕ БТ їз а їі шт Ето му шу а дл ги С Ж в а в о о м у КМ В її щі т туту пк зи ка гас сх щої хі пода МИ нещИ
Е ке х о г п НН пф доме М уечА. м
Зошит Уч певу аю их шк Щбрез туї щі А Фін Доу мех ек р ЗВ попл ХА Ен адм Лі ЛАКУ ШОВ ЕН СХ я їцще АК ГК ПХ аа МОВ оди ше Х сла М ВИШІЕХ БшЖО БАЗ за Ам КЕ Ех КАХ у сах тік БУВ дО ЖЖ Ка : ді з х пом КОВШ
З а ши ду ге ШЕННЯ жопу: й що бло Брик Ти фе; ока 1: пл
АН ху пт Алл ЖІ мл шу; о гл я ТІМ кино и МНЕ ЯНВ
ЧИ ЕЛ МОМ М КМ МЕКА ГУМИ: МКМ О ДУ Ж ОСКЛАМ м тООХ - хО і т 7 кота о
КОН ХО мА ки сс яд ее нн НН А я т вд джу пре чек ті Згщ а шмае ЗАу тами Р, тю Гл МА й же ОД ЗІх у І АЖ ЕІ. МЕЛЕ ПЛ ж МУ КУ майки. ОлашЕА Су ло ми од АК ХУЙ Мі МИ К сУ ОКАО ЯКІ потоки чом прик дл пото х Ел СОН іх гу хг пуху том Моди ча тк КА: чиї шо ж, кинь хх «У оку х ех
ТІ даю чн ри Тк І хх ху чо То ЇМ ху Ям хе ие НЯ
АЖ МОМ А КТ Міжна АТ БЕ СУБ А АУХ му щш УЮ УЖЕ ЗХ Ще АП ОСМУЄ гютуту пого т
ЗУ о Ту тю стор дих ЕК лю Я ну шт жоюм о пт Клео бурю рин А ху хм КІ хх У ох
Кі в ВА НЕ з оо ЗНИК З КК жОЛІ К и ЗНУ Я ЕКО ж В мух ОА АТУ за зак Зк
ЯК У ль ях хни МР ним и м во пе Пе ос: хну арки лиж М межа ШІ і Ви Уя пут жи ЕМ пет хх Е тую Лю Бод Ко пу чек М Аля ЕНН
МВ не ЯН и ЕЕ З ВЕ оо ВК В п Я с В Я ЗІ В Я В с З З с З З В м ВН С М ВС
Ву зай за о НЯ Мод ох «тин Шімн Х ому УК ую п Фуму Бі чиї У хєу жк БУМ УХюю М учеи
ЕІ Буш жна гро сш МО ТУ СУК са УЖ ХВ ша кре ОобшК гу
ТЕТ ЕК З ог ОКО Ж стали пул хи Ти М. жи Ля Ту, щи г Пл я По пн ВТ ж Тих, ичиЕ То ба пан Жошжь ої 153 Ал щі ГІЯ вк ТІ СК Аа і М Шк і: АН вл
ПА О иЖКО ам яка МЕ в АЛА ЖК Х ЕМ КАМ док ЯМІ їв А ЖЖ МКМ яБХ МІХ
КТ хау З апа
ПА КІ мен БУ
У оижю й Як аж ц их. хі их г ї х пт 5 - о я ха це і-ї. Ук й праж їде лефюди бета. дити їаатяу ХК т ащії душу біду Маму пали сло МИ ДЗВНИ. ТАгна вк нн а нн и у З и С о СК Ком МІ я Бош м ЖІ ху ж ЖрУМО ЮК КК
З СН КН маг ХМ кОм ие ня Ка -- пози о, Уч Тор. Б чу С Мох рос гослАН т. Мо Ян му пхак о щЕкм т МЖошеижо Ж вт Й чи Мол буку сю Дое Теж ж зжі ЕМ М хх Мік хуУщЇ
МЕ у КО ФП дама СКЛОМ А МБО сяк ЛЯ ККУ ММ ХА КУ ВІ ха м ту ще
УУТрик о Фодше блїукхо юю ЖЖ жи 22 що КІ Ак то зн и р
ФІ о їм Іще НА КО щи. Ме ДЮ КА А зима МП ЛЕМ паю ТК ІТ
Ех 4 алі й х
Ух лк юю
Ти дю Тапзд пшКо їду ДЕ Тниму СТіле
ТпКДЖХ ОТ А МІЩТМО СІЮ. УТ АВМ Ми Си ю хопоку І ав; ЗАЛІ нене о НН но І НИ ши ІВ І БОМ І КЕЛИХ в БА но С и ЕВ ЕС ит фрукти. ух шли Стики о меми МІ Міри изу и уми кими м и ОТЬту
Мед ІиманнО НЕ КЕ ККЗ ІННО ше СОКОМ КИ М дрефиттві ит пьутюмі 0 дир у г тот вуж ут дуєжу» сте чит у и им из У гуру уки ОДУ он нн во а м о мн в м в по м в пз в о и м в о в и З ВВ а а З В ВИ в З НИ а пемуифич ит и пуху ие і жом Мр ие ру МІВ У бхгхртужУєміхмт и семи в ТУ
ПИВНІ КІВ ВІКИ ЗАЕС НК Кри СКЛ МВ М шию а нн нн НН В ОН
У КМТ НКУ кити ЕН Ме КК Же КК МАМИ СОНАТА КАТЯ сша різких у єжутіюютів РЕЖИМИ Ми пи метизи жов жмут Кит ІМ цем оду их худих им. С
ПІ ОопХвтимь сизим Ям ІЕМ маминих анти Ме мес СС лю т и дути фе им а тих ж ифи ж ит ФМІф тих укуси ок тт уж ки ВУ
Му Ми ШЕ И СМІТ. дн и МА ЕД КИ КУ ть МЕМ ГЕТя я г кн на на нн ви а в и ко З з Ци ОД В оди еК ди жи МЕзизитечиче ВМ їж фу юр МЕ прим М столу дз ачих жиє и КМ оервеі ммею Щ анна на я о а а и кр мВ и и и С а опи и ов І в м и п и ДОКИ В у НЕ ЛЕ В СО Я НК У позетче в ім Ум муж і щих ит фр у кру шефи ий уже у ме ко ушк меум рі Ми МОЙ
МОМ Ж НІ у І МЕН ВКМ ІМ ЕММА МІХ ори о НН и не в о В Ко и рев не Ка в а АННУ
НЕК Оу Мов о. САН М в М З З Я ОК АН ВИК У в С КВН З ЯННЯ ПНІ Не КЕ ШЕ ших пет динтт Бачив умху ст тууртих иа Вес НІГ А рн а о п и вка о а и с п п и вв в кв о а м ви в з з п в а о а мож жих м о Бе тими сту йти ті дру тих Ух вити Смт и пи диву утиих о ЯМІ ре ЖУК сли пі ОМ ФОН срср и ик ММ ем М І КОН пози ти дичини их дужі с Море гемо жи пути жі тут уч і ж де ит узи дитимиме о ЛЕТ мо Мед че Ку еко то ВИ МІЙ Мом бе р ЗІ ие ши МІЖ Мр НА МИНАЛИ КУКИ Б
Момуєжи же мудтитах бом имеет пйУК УР ул ЄМ ФУ Ех ми Ку ки еф мій их М
ВТІМ ттт МОДНЕ ІІІ МЯКІ СМАКУ ФК КУЄ сток и нн и А м нм дн ен Не в НН В НН
ПИМАТД МИ ШЬТЕИСХТиМи ЗИ ШІ АККАУНТ Се ММК Ж А КИ ЮК КАК АД СЕК МА КИ КА ВИ ОТ прави али Мити Мем сщІМЗ М ДИМ лети іти Ж фо Мате уашиЕ МДЬ
ПАНА НН Мун: МАТ МО МОЛ БІ МІН НАХ КТК смію пи дути Спи п их стем РК ри ЖІ МК с Ку дк ю т. Бі у ЕМ ше узд пити ЛО
Мак туди пу им ни м в ку У и Рі М у учи и Ір
ХЕТУВ У Как ФІЛ І ИН КО ЕК У Рак А ва р ІМ А ЕК МИНЕ МІ М ти жу чити у ти ше ух пе гитут шкі Іхх вивих ФК Кт теку у рт ступи пи МИ и МИТИ т КЛИМ 0 АВК КІшкии КИ ОМ МТА ТАТА ТЯ А ЖЧА МОХ МЕ АИХИ ММІЖВУА СОМИ ен нн Не и НН нн НН КО НАННЯ
ПРЕ НМ Сари о мм Уест посла сосен І ТИ о
Уют жир луиих сстут музи Музеї Форт Мт туту хви КИ рве и їх АВ
ТИ ЛАМИ І КО ЛСОУ МИ рр. СМУуЄМАЛЬМИТЕНА КИДОК и ме в и В кН НН и НН в На о и КО НАННЯ:
ІЛЛІ аж ЕХ М М ІП ВК ОС МИ хи ее НН НН На о пт ково меж ря чумі ТА ЛЬХ постать ссхімиимеляя пло семенення яна Ки спека нЕКо мо дузі чущирих усну ти мч щирих пове утии Вифкуихихитеиюі у Мезіфчечечу тити ТОБ ен ни су коза ми нн а вк ки п нн п в вн п п п п п по м о в м пн м нн и вв п а ота ЗВ спр сире ее Шен и КАК
«210» 49
«212» Білок «213» Ното заріеп5 «400» 49 «2105 50 «-21155 «212» Білок «213» Ното заріеп5 «400» 50 «2105» 51 -21155 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний маркер бх Ніб
«400» 51 «2105 52 «-211515 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 52 пко бі Буд Ді ВЕ Фі Сей ей Те тую Вк Має деж Ар Се 2105 53 «-211515 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 53 го сіє МбУв о Аїза Кт іду їли їх Тіє бТую Бі ів ех пемх бекх
«210» 54 «-211515 «212» Білок 213» Штучна послідовність
«020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 54
ШЕк їжма Її АЮ Тек пі Мах дв ото Ї1в Ака бів Бо Вес су 1. ще ке МО «2105 55 «2115112 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 55 май їі Уві Ме тв бій аТїа мів реж Мем т аа Уа Тих Беж Ду патпю ек ад о бнвЖ бле нею жу Ак ню леж бле сек фемх фенх НЯою деке паж оух ми тТвЕ тую фе) бек Ту вБе іш шій нів рт бі БУВ дід
Вр пах ем ої їі Тую Бо Меб бек пай іїяви Абе пед біж Мах Бко п Ту ТО дак дже рпє беж пі вк жу Беж бі Би Вів Кп тиж ій МЕЖ Лі ех пуіУу Уві піл Бі За яз Уві бі Уа ЖУК ТК Шу Ме Ша Нав їт ПЗ бек бух ух Ябре Бім ше спру слу Ж БУ б ЗІ в був «2105 56 «2115113 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005» 56 сію Уа іт іже 303 1) дек збу БЕскоЗуУ Зм Уаі бі Бхсу ех ЕК ї х о ва
Меж о їм: ем фа ЖБК ЄМ блю а шах піМ шк їае ім дів АВрОожУЮ спі ув ба о тІю їі Ак пів БЖ Бо сіб був Біб ін ЗВ ТЕО Бе спі Уві їТіє тив обі бвю осіУ ТВх тв Тек Те бюм беж дія бань 1уу пек вже їм) бек бі ешж БУуж АБ ХВ ях бух ее САМ УЮ Бе бе пує Меї би пек о ви Та Те в5БО вже бог вів Меї ТУую Тує СУБ ВІЗ хв ща Ен
Зло ші ем о тУуЖ кю ФУ ат що ТтвжЖ о Бей Уві тро зді бах Ал АВ
Й :дЕ | о яв5 115 «2105 57 «2115113 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 57 піщ Уві ізо Зі Пій дек бу БЕЗ ріж Бо Узі дів БЕЗ бе са щ-ак без ек Їй тах Сук ТВЖ Зві БУ су ВН ойдеж бе Ті Ав Тух сл зей бл бю її АЖже бів бик па бу бущ ОУ їн 1 КІ їж шіу Зам біб бо СуУ бвЕоламУу Дж бл УЮ ех Бк ВЩах Маю їм МеВ дек оду емо Бек іт ек цу ЕК ОЛИЖ БекогбтУв ск си Зі їн: їла 5 7 та їй
ПУ МЕ дит дек і Тв тек дво» дяю Спо від Ме ТК ТУух був сід їх зи з вч вів Уа тую ти» діУ ЗіБ ЩЕ тВк мецв о ук ТЕ чай бек дів ові

Claims (16)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з позаклітинним доменом СХСР5 людини, де антитіло або його фрагмент включає: (а) варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮО МО: 11, і варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 905 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 12, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислотні послідовності КОКО І НЗБЗОКТМУІ М, ЕМ5МІАВ та МОНІЕХУРУТ, а варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислотні послідовності СЕ ОМОМУМ, МІМСОСТТУ та ІМ;
(5) варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 13, 5ЕО ІЮ МО: 14 або ЗЕО ІЮ МО: 15, і варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності зЗЕО ІЮ МО: 16, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислотні послідовності:
() Е55КБІ І НОЗОКТУ У, ЕМ5ЗМІА5 та МОНІ ЕМРУТ;
(ї) КЕЗ5К5І І НЗЗОКТУІ МУ, КІ ЗМІ А5 та МОНІ ЕУРУТ; або
(і) КЕЗ5К5І І НЗБОКТМІ М, КІ ЗМІ АЗ та МОН ЕУРУТ; і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислотні послідовності СЕЗ ОМОММ, МІМ/СОСТТУ і ММ;
(с) варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 17, 5ЕО ІЮ МО: 19 або ЗЕО ІЮ МО: 21, і варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності зЗЕО ІЮО МО: 23, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислотні послідовності:
() БОКИ НОБОКТМІ У, ВМ5ОМІГА та МОНІГЕМРУТ;
(ії) АВ55КОИ НОБОКТМ У, БІ ЗМІ А та МОНІЕУРУТ; або
(ї) ВОК НОБОКТМ У, КІ 551 А та МОНІ ЕУРУТ, і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислотні послідовності СЕ5БПОМММ, МУУСОСТТУ і МУ;
(4)варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО: 30, 5ЕО ІЮ МО: 31 або ЗЕО ІЮ МО: 32, і варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО: 33 Ко) або 5ЕО ІЮ МО: 34, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислотні послідовності:
(й К55КЗИ НЗБОКТМИ У, КЕМ5ОМІ А та МОНІ ЕМРУТ;
(й Е55КЗИ НЗБОКТИ У, ВІ ЗМІГ А та МОНІ ЕМРУТ; або
(ї) К55КЗИ НЗБОКТИ У, ВІ 551 А та МОНІ ЕУРУТ; і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислотні послідовності СЕ5БПОМММ, МУУСОСТТУ і МУ;
(е) варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає акмінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 35, і варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 905 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 37, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислотні послідовності ВОК НОБОКТМ М, ЕММА та МОНГЕМРУТ; а варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислотні послідовності СЕ ОМОМУМ,
МІМ/СОСТТУ і ММ;
() варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 39, 5ЕО ІЮ МО: 41, або 5ЕО ІЮ МО: 43, і варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 45 або 5ЕО ІО МО: 47, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислотні послідовності:
() А55КОИ НОБОКТМ М, ЕММА та МОН ЕМРУТ;
(ії) АВ55КОЗИ НОБОКТМІ У, КІ ЗМІ А та МОНІ ЕУРУТ; або (ії) ВБ5КОИ НОБОКТМІ МУ, КІ 551 А та МОНІ ЕУРУТ; і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислотні послідовності СЕБОМОММ,
МІМУСОСТТУ і ММ; або
(9) варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 55, і варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 90 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 56 або 5ЕО ІЮ МО: 57; де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислотні послідовності ВОК НОБОКТМУІ УМ, КМЗМІА та
МОНГЕМРУТ, а варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислотні послідовності
СЕБГІОМОМУМ, МІМУО ОСТ і МУ.
2. Антитіло або його фрагмент за п. 1, де антитіло або його фрагмент містить одну або більше константних ділянок.
3. Антитіло або його фрагмент за п. 1, де антитіло або його фрагмент містить Сні, Снг, Снз або їхні комбінації.
4. Антитіло або його фрагмент за п. 2, де одна або більше константних ділянок походять з антитіла до.
5. Антитіло або його фрагмент за п. 4, де антитіло Ї|Д являє собою антитіло Ід.
б. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або його фрагмент за п. 1.
7. Вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 6.
8. Мікробна клітина-хазяїн, яка містить вектор за п. 7.
9. Виділене антитіло або його фрагмент, які специфічно зв'язуються з позаклітинним доменом СХСР5 людини, де антитіло або його фрагмент включає варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІО МО: 32, та варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 33, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислотні послідовності ВОК НОБОКТМ М, КІ 5З5ІА та МОНІЕМРУТ, а варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислотні послідовності ЗЕЗІ ОМС МУМ, МІУМООСТТУ і МУ.
10. Антитіло або його фрагмент за п. 9, де антитіло або його фрагмент містить одну або більше константних ділянок.
11. Антитіло або його фрагмент за будь-яким з п. 9, де антитіло або його фрагмент містить Сні, Снг, Снз або їхні комбінації.
12. Антитіло або його фрагмент за п. 10, де одна або більше константних ділянок походять з антитіла дах.
13. Антитіло або його фрагмент за п. 12, де антитіло |Д являє собою антитіло досі.
14. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або його фрагмент за п. 9.
15. Вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 14.
16. Мікробна клітина-хазяїн, яка містить вектор за п. 15.
UAA201312423A 2007-08-29 2008-08-27 Гуманізоване антитіло до cxcr5 UA117446C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US96879207P 2007-08-29 2007-08-29
UAA201003491A UA104715C2 (en) 2007-08-29 2008-08-27 Isolated anti-cxcr5 antibody

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA117446C2 true UA117446C2 (uk) 2018-08-10

Family

ID=40429297

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201312423A UA117446C2 (uk) 2007-08-29 2008-08-27 Гуманізоване антитіло до cxcr5
UAA201003491A UA104715C2 (en) 2007-08-29 2008-08-27 Isolated anti-cxcr5 antibody

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201003491A UA104715C2 (en) 2007-08-29 2008-08-27 Isolated anti-cxcr5 antibody

Country Status (44)

Country Link
US (9) US8647622B2 (uk)
EP (3) EP2195023B1 (uk)
JP (3) JP5743543B2 (uk)
KR (4) KR101667944B1 (uk)
CN (4) CN104017078B (uk)
AR (2) AR068354A1 (uk)
AU (1) AU2008296538B2 (uk)
BR (1) BRPI0815983A2 (uk)
CA (1) CA2698203C (uk)
CL (1) CL2008002565A1 (uk)
CO (1) CO6270238A2 (uk)
CR (2) CR11293A (uk)
CY (1) CY1120665T1 (uk)
DK (1) DK2195023T3 (uk)
DO (1) DOP2010000069A (uk)
EC (1) ECSP109985A (uk)
ES (1) ES2672769T3 (uk)
HR (1) HRP20180873T1 (uk)
HU (1) HUE037489T2 (uk)
IL (2) IL204173A (uk)
LT (1) LT2195023T (uk)
MA (1) MA31821B1 (uk)
MX (5) MX338395B (uk)
MY (1) MY159201A (uk)
NI (2) NI201000281A (uk)
NO (1) NO2195023T3 (uk)
NZ (1) NZ583605A (uk)
PA (1) PA8794201A1 (uk)
PE (1) PE20090993A1 (uk)
PH (1) PH12015500248A1 (uk)
PL (1) PL2195023T3 (uk)
PT (1) PT2195023T (uk)
RS (1) RS57273B1 (uk)
RU (2) RU2571515C2 (uk)
SG (1) SG10201407388XA (uk)
SI (1) SI2195023T1 (uk)
SV (1) SV2010003494A (uk)
TN (1) TN2010000092A1 (uk)
TR (1) TR201807983T4 (uk)
TW (4) TWI608017B (uk)
UA (2) UA117446C2 (uk)
UY (1) UY31309A1 (uk)
WO (1) WO2009032661A1 (uk)
ZA (1) ZA201001514B (uk)

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120263733A1 (en) * 2002-11-15 2012-10-18 Morehouse School Of Medicine Anti-cxcl9, anti-cxcl10, anti-cxcl11, anti-cxcl13, anti-cxcr3 and anti-cxcr5 agents for inhibition of inflammation
EP2044122B1 (en) 2006-07-18 2018-03-28 Sanofi Antagonist antibody against epha2 for the treatment of cancer
SG10201407388XA (en) 2007-08-29 2015-01-29 Sanofi Aventis Humanized anti-cxcr5 antibodies, derivatives thereof and their uses
JP5529869B2 (ja) * 2008-08-14 2014-06-25 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション プロテインａアフィニティークロマトグラフィーを用いる抗体の精製方法
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
AR078470A1 (es) 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2
US8956607B2 (en) 2009-11-30 2015-02-17 Biotest Ag Humanized anti-IL 10 antibodies for the treatment of systemic lupus erythematosus (SLE)
EP2397495A1 (en) 2010-06-21 2011-12-21 Sanofi Novel antagonist antibodies and their Fab fragments against GPVI and uses thereof
EP2402371A1 (en) 2010-07-01 2012-01-04 Sanofi Novel antagonist antibodies and their Fab fragments against GPVI and uses thereof
EP2336188A1 (en) 2009-12-18 2011-06-22 Sanofi-Aventis Novel antagonist antibodies and their Fab fragments against GPVI and uses thereof
EP2933269A1 (en) 2009-12-18 2015-10-21 Sanofi Novel antagonist antibodies and their fab fragments against gpvi and uses thereof
FR2958936A1 (fr) 2010-04-14 2011-10-21 Sanofi Aventis Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
TWI560199B (en) 2010-08-31 2016-12-01 Sanofi Sa Peptide or peptide complex binding to α2 integrin and methods and uses involving the same
UA112170C2 (uk) 2010-12-10 2016-08-10 Санофі Протипухлинна комбінація, що містить антитіло, яке специфічно розпізнає cd38, і бортезоміб
EP2652508B1 (en) * 2010-12-14 2018-02-07 Jyant Technologies, Inc. The use of anti-cxcl13 and anti-cxcr5 antibodies for the treatment or detection of cancer
AR085302A1 (es) 2011-02-24 2013-09-18 Sanofi Sa Metodo de produccion de anticuerpos sialilados
KR102073034B1 (ko) 2012-01-20 2020-02-05 젠자임 코포레이션 항cxcr3 항체
PT2830658T (pt) * 2012-03-26 2018-12-28 Sanofi Sa Formulações de agente de ligação igg4 estável
BR122019026701B1 (pt) * 2012-03-26 2023-01-24 Sanofi Formulações de agentes de ligação à base de igg4 estáveis, kit, e dispositivo ou recipiente pré-cheios
US9592289B2 (en) 2012-03-26 2017-03-14 Sanofi Stable IgG4 based binding agent formulations
SG10201702396QA (en) 2012-03-28 2017-04-27 Sanofi Sa Antibodies to bradykinin b1 receptor ligands
CN104870013A (zh) * 2012-06-27 2015-08-26 吉安特科技公司 用于抑制炎症的抗-cxcl9、抗-cxcl10、抗-cxcl11、抗-cxcl13、抗-cxcr3和抗-cxcr5试剂
WO2014003744A1 (en) * 2012-06-27 2014-01-03 Morehouse School Of Medicine Anti-cxcl9, anti-cxcl 10, anti-cxcl 11, anti-cxcl 13, anti-cxcr3 and anti-cxcr5 agents for inflammatory disorder
DK3199552T3 (da) 2012-11-20 2020-03-30 Sanofi Sa Anti-ceacam5-antistoffer og anvendelser heraf
US20150322152A1 (en) 2012-11-30 2015-11-12 Institut Pasteur Use of anti-fcyri and/or anti-fcyriia antibodies for treating arthritis, inflammation, thrombocytopenia and allergic shock
US10342869B2 (en) 2012-12-07 2019-07-09 The Regents Of The University Of California Compositions comprising anti-CD38 antibodies and lenalidomide
PE20151603A1 (es) 2012-12-27 2015-11-20 Sanofi Sa Anticuerpos anti-lamp1 y conjugados anticuerpo farmaco, y usos de estos
JO3580B1 (ar) * 2013-03-15 2020-07-05 Lilly Co Eli أجسام مضادة لكيموكين elr+ cxc شامل
EP2992014A1 (en) * 2013-05-02 2016-03-09 Ares Trading S.A. Monoclonal antibody directed against cxcr5
SG11201510377SA (en) * 2013-06-24 2016-01-28 Neximmune Compositions and methods for immunotherapy
EA033403B1 (ru) 2013-08-13 2019-10-31 Sanofi Sa Антитела к ингибитору активатора плазминогена 1 (pai-1) и пути их применения
TW201722994A (zh) 2013-08-13 2017-07-01 賽諾菲公司 胞漿素原活化素抑制劑-１（ｐａｉ-１）之抗體及其用途
KR102601491B1 (ko) * 2014-03-21 2023-11-13 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
JP2017525710A (ja) * 2014-08-22 2017-09-07 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｃｘｃｒ５に結合する抗原結合タンパク質
KR20230144092A (ko) * 2014-12-24 2023-10-13 넥스이뮨, 인크. 면역요법을 위한 나노입자 조성물 및 방법
PT3247725T (pt) 2015-01-23 2020-10-07 Sanofi Sa Anticorpos anti-cd3, anticorpos anti-cd123 e anticorpos biespecíficos que se ligam de forma biespecífica a cd3 e/ou a cd123
MX2017017138A (es) 2015-06-23 2018-04-30 Bayer Pharma AG Conjugados homogeneos especificos de sitio con inhibidores de ksp.
EP3371223B1 (en) 2015-11-03 2021-03-10 Merck Patent GmbH Bi-specific antibodies for enhanced tumor selectivity and inhibition and uses thereof
CN106674352B (zh) * 2015-11-10 2020-05-15 孙嘉琳 抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物及应用
MX2018011627A (es) 2016-03-24 2019-01-10 Bayer Pharma AG Profarmacos de farmacos citotoxicos que tienen grupos enzimaticamente escindibles.
CN109310781B (zh) 2016-06-15 2024-06-18 拜耳制药股份公司 具有ksp抑制剂和抗-cd123-抗体的特异性抗体-药物-缀合物(adc)
TWI760345B (zh) * 2016-07-05 2022-04-11 法商賽諾菲公司 抗體調配物
CA3029642A1 (en) * 2016-07-05 2018-01-11 Sanofi Antibody formulations
TWI790206B (zh) 2016-07-18 2023-01-21 法商賽諾菲公司 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白
KR20190071722A (ko) 2016-09-26 2019-06-24 엠피오, 아이엔씨. 난자, 수정란 또는 배아의 질 개선제
JP7066714B2 (ja) 2016-12-21 2022-05-13 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト 酵素的に切断可能な基を有する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
EP3558387B1 (de) 2016-12-21 2021-10-20 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Spezifische antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren
CA3047491A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
WO2018119288A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Sanofi Anti-human cxcr3 antibodies for treatment of vitiligo
TW201837053A (zh) 2016-12-22 2018-10-16 法商賽諾菲公司 具有消耗活性的人源化cxcr3抗體及其使用方法
EP3354278A1 (en) 2017-01-31 2018-08-01 Sanofi Neuronal cell protective effect of antibodies specific for the protofibrillar form of the beta-amyloid peptide
AU2018238540A1 (en) * 2017-03-22 2019-11-07 Sanofi Treatment of lupus using humanized anti-CXCR5 antibodies
TWI808963B (zh) * 2017-03-22 2023-07-21 法商賽諾菲公司 使用人類化抗ｃｘｃｒ５抗體治療狼瘡
US10781265B2 (en) * 2017-05-24 2020-09-22 Development Center For Biotechnology Humanized antibodies against Globo H and uses thereof in cancer treatments
RU2019142330A (ru) 2017-06-30 2021-07-30 Займворкс, Инк. Стабилизированные химерные fab
EP3717516A1 (en) * 2017-12-01 2020-10-07 Pfizer Inc Anti-cxcr5 antibodies and compositions and uses thereof
JP2021512103A (ja) 2018-01-31 2021-05-13 バイエル アクチェンゲゼルシャフトＢａｙｅｒ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｎａｍｐｔ阻害剤を含む抗体薬物複合体（ａｄｃｓ）
US20210002366A1 (en) * 2018-02-13 2021-01-07 Indian Institute Of Technology Bombay Novel humanized anti-cd19 chimeric antigen receptor, its nucelic acid sequence and its preparation
JP7328243B2 (ja) * 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
WO2019243159A1 (de) * 2018-06-18 2019-12-26 Bayer Aktiengesellschaft Gegen cxcr5 gerichtete binder-wirkstoff-konjugate mit enzymatisch spaltbaren linkern und verbessertem wirkungsprofil
EP3753954A1 (en) 2019-06-21 2020-12-23 Université de Franche-Comté Anti-cd123 antibodies, anti-cd123 chimeric antigen receptors and anti-cd123 chimeric antigen receptors t cells
US20210032370A1 (en) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Recruiting agent further binding an mhc molecule
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
JP2023525423A (ja) 2020-01-15 2023-06-16 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー Ｐｒａｍｅに特異的に結合する抗原結合タンパク質
CN115515643A (zh) 2020-02-28 2022-12-23 建新公司 用于优化的药物缀合的经修饰的结合多肽
WO2023010483A1 (en) * 2021-08-05 2023-02-09 Hifibio (Hk) Limited Anti-human cxcr5 antibody and uses thereof
MX2022013406A (es) 2020-04-24 2022-11-14 Sanofi Sa Combinaciones antitumorales que contienen productos conjugados de anticuerpos anti-ceacam5 y cetuximab.
WO2021214222A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates, trifluridine and tipiracil
MX2022013405A (es) 2020-04-24 2022-11-14 Sanofi Sa Combinaciones antitumorales que contienen productos conjugados de anticuerpos anti-ceacam5 y folfox.
JP2023522392A (ja) 2020-04-24 2023-05-30 サノフイ 抗ｃｅａｃａｍ５抗体コンジュゲートおよびフォルフィリを含有する抗腫瘍組み合わせ
BR112023001733A2 (pt) 2020-09-04 2023-03-28 Merck Patent Gmbh Anticorpos anti-ceacam5 e conjugados e usos dos mesmos
CN112521499B (zh) * 2020-12-24 2022-10-25 四川大学 抗cxcl13抗体及其用途
AU2022218137A1 (en) 2021-02-03 2023-08-24 Mozart Therapeutics, Inc. Binding agents and methods of using the same
AU2022234328A1 (en) * 2021-03-09 2023-09-28 Hifibio, Inc. Anti-human cxcr5 antibody and uses thereof
CN117597364A (zh) * 2021-05-12 2024-02-23 百进生物科技公司 抗ccr8抗体、其抗原结合片段、以及试剂和组合物及其制备和使用方法
CN113278072B (zh) * 2021-05-25 2023-06-20 河南凯普瑞生物技术有限公司 一种抗体的制备方法
WO2023051656A1 (zh) * 2021-09-30 2023-04-06 贝达药业股份有限公司 双特异性抗体及其应用
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
IL312519A (en) 2021-11-05 2024-07-01 Lilly Co Eli Anticancer combinations containing antibody-drug conjugates anti-CEACAM5 and anti-VEGFR-2 antibodies
WO2023170239A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Merck Patent Gmbh Methods and tools for conjugation to antibodies
AU2023230951A1 (en) 2022-03-09 2024-09-05 Merck Patent Gmbh Anti-gd2 antibodies, immunoconjugates and therapeutic uses thereof
WO2023212587A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant polypeptides comprising single-domain antibodies targeting herv-k subtype hml-2
WO2024011077A2 (en) 2022-07-04 2024-01-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Monoclonal antibodies directed to phosphorylated psd95 and uses thereof
WO2024180192A1 (en) 2023-03-01 2024-09-06 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating neuroendocrine cancers expressing ceacam5
EP4427763A1 (en) 2023-03-06 2024-09-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates, anti-vegfr-2 antibodies and anti-pd1/pd-l1 antibodies
WO2024194455A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Sanofi CEACAM5 mRNA ASSAY FOR PATIENT SELECTION IN CANCER THERAPY
CN117004700A (zh) * 2023-10-07 2023-11-07 北京爱博生生物技术有限公司 单克隆抗体可变区基因高通量测序的方法及其所用组合物与试剂盒

Family Cites Families (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) * 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4307016A (en) * 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4275149A (en) * 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) * 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4256746A (en) * 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) * 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) * 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) * 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) * 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) * 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4444887A (en) * 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
WO1982001188A1 (en) * 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) * 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) * 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) * 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) * 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4716111A (en) * 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4560655A (en) * 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) * 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4767704A (en) * 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5807715A (en) * 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB2183662B (en) 1985-04-01 1989-01-25 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4737456A (en) * 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
EP0206448B1 (en) * 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4980286A (en) * 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) * 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8601597D0 (en) * 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
IL89489A0 (en) 1988-03-09 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen
AU631545B2 (en) 1988-04-15 1992-12-03 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
ES2070172T3 (es) 1988-04-16 1995-06-01 Celltech Ltd Procedimiento para producir proteinas mediante adn recombinante.
WO1989012624A2 (en) 1988-06-14 1989-12-28 Cetus Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US6048728A (en) * 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US5534617A (en) * 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
DE68913658T3 (de) * 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
CA2018228C (en) * 1989-06-05 1996-02-27 Nancy L. Parenteau Cell culture systems and media
US5413923A (en) * 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5436146A (en) * 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
JP3068180B2 (ja) * 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
WO1991014438A1 (en) 1990-03-20 1991-10-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE158021T1 (de) * 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5625126A (en) * 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) * 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) * 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) * 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) * 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU660629B2 (en) 1990-10-01 1995-07-06 University Of Connecticut, The Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
EP1149913A1 (en) 1990-11-09 2001-10-31 GILLIES, Stephen D. Cytokine immunoconjugates
DE69231736T2 (de) 1991-05-14 2001-10-25 The Immune Response Corp., Carlsbad Gerichtete abgabe von genen, die immunogene proteine kodieren
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
CA2103371C (en) 1991-06-05 2003-09-16 George Y. Wu Targeted delivery of genes encoding secretory proteins
WO1992022653A1 (en) * 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) * 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
PT1024191E (pt) * 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5869619A (en) * 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
WO1993014188A1 (en) 1992-01-17 1993-07-22 The Regents Of The University Of Michigan Targeted virus
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
EP0563475B1 (en) * 1992-03-25 2000-05-31 Immunogen Inc Cell binding agent conjugates of derivatives of CC-1065
EP0633943A4 (en) 1992-04-03 1997-05-02 Alexander T Young GENTHERAPY USING TARGETED VIRAL VECTORS.
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
WO1994004670A1 (en) * 1992-08-26 1994-03-03 President And Fellows Of Harvard College Use of the cytokine ip-10 as an anti-tumor agent
US5639641A (en) * 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
DK0671923T3 (da) 1992-10-09 2001-08-13 Advanced Tissue Sciences Inc Leverreserveceller
WO1994012649A2 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
US6165463A (en) * 1997-10-16 2000-12-26 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2230758A1 (en) * 1995-09-08 1997-03-13 Genzyme Corporation Improved aav vectors for gene therapy
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
EP0904278A4 (en) 1996-03-22 1999-09-15 Human Genome Sciences Inc MOLECULE II INDUCER OF APOPTOSIS
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1998046645A2 (en) 1997-04-14 1998-10-22 Micromet Gesellschaft Für Biomedizinische Forschung Mbh Method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6642051B1 (en) * 1997-10-21 2003-11-04 Targeted Genetics Corporation Amplifiable adeno-associated virus(AAV) packaging cassettes for the production of recombinant AAV vectors
CN1174993C (zh) 1997-11-03 2004-11-10 人体基因组科学有限公司 Vegi,一种血管发生和肿瘤生长的抑制剂
CA2361877A1 (en) 1999-03-01 2000-09-08 Genentech, Inc. Antibodies for cancer therapy and diagnosis
US6926898B2 (en) 2000-04-12 2005-08-09 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6333410B1 (en) * 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
CA2421842A1 (en) * 2000-09-08 2002-03-14 Micromet Ag Antibody and/or chemokine constructs which bind to a chemokine receptor and their use in immunological disorders
US7321026B2 (en) * 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
CA2467718C (en) * 2001-12-21 2011-04-26 Anormed Inc. Chemokine receptor binding heterocyclic compounds with enhanced efficacy
WO2003104432A2 (en) * 2002-06-07 2003-12-18 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Anti-cd30 stalk and anti-cd30 antibodies suitable for use in immunotoxins
AU2003251471A1 (en) * 2002-08-06 2004-02-25 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human cxc chemokine receptor 5(cxcr5)
TW200530269A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
US20060148009A1 (en) 2004-10-12 2006-07-06 Xencor, Inc. Prediction and assessment of immunogenicity
GB0607774D0 (en) * 2006-04-20 2006-05-31 Renovo Group Plc Medicaments
TW200813086A (en) 2006-05-11 2008-03-16 Hoffmann La Roche Immunereconstituted mouse
SG10201407388XA (en) 2007-08-29 2015-01-29 Sanofi Aventis Humanized anti-cxcr5 antibodies, derivatives thereof and their uses

Also Published As

Publication number Publication date
US20110027266A1 (en) 2011-02-03
US20220073629A1 (en) 2022-03-10
HUE037489T2 (hu) 2018-08-28
MY159201A (en) 2016-12-30
US20130236476A1 (en) 2013-09-12
ZA201001514B (en) 2011-04-28
US20180100019A1 (en) 2018-04-12
CN104017078A (zh) 2014-09-03
EP3792284A1 (en) 2021-03-17
CN111909273B (zh) 2024-03-26
RU2571515C2 (ru) 2015-12-20
EP3354662A1 (en) 2018-08-01
PT2195023T (pt) 2018-06-08
JP5743543B2 (ja) 2015-07-01
AU2008296538A1 (en) 2009-03-12
RU2015147300A (ru) 2019-01-11
JP2010537636A (ja) 2010-12-09
TWI608017B (zh) 2017-12-11
NI201000281A (es) 2012-02-21
PL2195023T3 (pl) 2018-08-31
TW201425337A (zh) 2014-07-01
UA104715C2 (en) 2014-03-11
CN101842115A (zh) 2010-09-22
JP6129152B2 (ja) 2017-05-17
PE20090993A1 (es) 2009-07-08
KR20150082692A (ko) 2015-07-15
SI2195023T1 (en) 2018-07-31
KR101599704B1 (ko) 2016-03-07
AR112564A2 (es) 2019-11-13
TW200918558A (en) 2009-05-01
CN104017079B (zh) 2017-01-04
EP2195023A1 (en) 2010-06-16
EP2195023A4 (en) 2012-09-05
KR20140121486A (ko) 2014-10-15
US9175087B2 (en) 2015-11-03
MA31821B1 (fr) 2010-11-01
CA2698203C (en) 2018-09-11
CA2698203A1 (en) 2009-03-12
AR068354A1 (es) 2009-11-11
MX338474B (es) 2016-04-18
ECSP109985A (es) 2010-03-31
MX338397B (es) 2016-04-15
US20130243793A1 (en) 2013-09-19
KR20140117638A (ko) 2014-10-07
IL204173A (en) 2015-06-30
UY31309A1 (es) 2009-03-31
CY1120665T1 (el) 2019-12-11
TWI574976B (zh) 2017-03-21
EP2195023B1 (en) 2018-03-07
MX2010001975A (es) 2010-03-10
WO2009032661A1 (en) 2009-03-12
MX346172B (es) 2017-03-10
AU2008296538B2 (en) 2014-08-14
SV2010003494A (es) 2011-01-25
CN101842115B (zh) 2014-07-30
US20130246035A1 (en) 2013-09-19
DOP2010000069A (es) 2010-03-31
NZ583605A (en) 2012-10-26
KR101701140B1 (ko) 2017-02-01
DK2195023T3 (en) 2018-06-18
KR101667944B1 (ko) 2016-10-20
ES2672769T3 (es) 2018-06-18
CR20150054A (es) 2015-04-06
MX338395B (es) 2016-04-15
CO6270238A2 (es) 2011-04-20
US8980262B2 (en) 2015-03-17
CN104017079A (zh) 2014-09-03
NO2195023T3 (uk) 2018-08-04
HRP20180873T1 (hr) 2018-07-13
US9815902B2 (en) 2017-11-14
EP3354662B1 (en) 2020-08-19
CL2008002565A1 (es) 2009-01-16
CR11293A (es) 2010-03-23
US9243067B2 (en) 2016-01-26
US20130243783A1 (en) 2013-09-19
RU2010111751A (ru) 2011-10-10
US20130251714A1 (en) 2013-09-26
PA8794201A1 (es) 2009-07-23
LT2195023T (lt) 2018-06-25
TWI439468B (zh) 2014-06-01
TW201630939A (zh) 2016-09-01
TR201807983T4 (tr) 2018-06-21
TW201741341A (zh) 2017-12-01
SG10201407388XA (en) 2015-01-29
US20170044263A1 (en) 2017-02-16
IL238505A (en) 2017-05-29
KR20100061815A (ko) 2010-06-09
CN111909273A (zh) 2020-11-10
US9228019B2 (en) 2016-01-05
NI201000028A (es) 2012-02-21
AU2008296538A2 (en) 2010-06-03
JP2015096075A (ja) 2015-05-21
TN2010000092A1 (en) 2011-09-26
JP2017123866A (ja) 2017-07-20
US8647622B2 (en) 2014-02-11
IL238505A0 (en) 2015-06-30
BRPI0815983A2 (pt) 2018-05-22
CN104017078B (zh) 2020-09-08
RS57273B1 (sr) 2018-08-31
PH12015500248A1 (en) 2018-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA117446C2 (uk) Гуманізоване антитіло до cxcr5
CN104427999B (zh) 用于治疗癌症的涉及针对密蛋白18.2之抗体的联合治疗
JP6518199B6 (ja) Ｍｉｃａおよびｍｉｃｂタンパク質に対する抗体
CN103140501B (zh) 体内利用cldn6靶标定向之抗体的癌症治疗
UA124615C2 (uk) АНТИТІЛО ПРОТИ ПОДІБНОГО ДО Fc-РЕЦЕПТОРА БІЛКА 5 (FcRH5)
SA520411230B1 (ar) ميوتينات إنترليوكين-21 وطرق العلاج
UA120753C2 (uk) Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
UA103297C2 (uk) Спосіб лікування захворювання, пов'язаного з імунітетом, шляхом одночасного націлювання на il-17a і il-17f антитіл-антагоністів
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
CN107250159A (zh) 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)抗体及其使用方法
UA126280C2 (uk) Біспецифічні конструкції антитіл, які залучають т-клітини
UA104130C2 (uk) Антитіло, що специфічно зв'язується з il-4 і іl-13 та спосіб лікування астми у ссавця за допомогою такого антитіла
UA74330C2 (uk) СПОСОБИ ВИКОРИСТАННЯ РОЗЧИННОГО РЕЦЕПТОРА BR43x2
UA108201C2 (xx) Антитіла, специфічні для кадгерину-17
UA120102C2 (uk) АНТИТІЛО ДО CD79b І ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
UA126275C2 (uk) Конструкція антитіла для cd70 та cd3
US20220396627A1 (en) Anti-siglec-9 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
UA127450C2 (uk) Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123
UA98762C2 (uk) Моноклональне антитіло, яке зв'язується з tat226, та імунокон'югат
HU230586B1 (hu) Anti-ErbB antitest/maytansinoid konjugátumok alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására
US20060210571A1 (en) Engineering antibodies that bind irreversibly
UA123773C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ'ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА
CN107098970A (zh) 结合细胞内prl‑1多肽或prl‑3多肽的抗体
CN101563366A (zh) 抗notch3激动性抗体及其在治疗notch3相关疾病中的用途
UA128330C2 (uk) Конструкція на основі біспецифічного антитіла, спрямована на muc17 і cd3