UA123773C2 - ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ'ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА - Google Patents

ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ'ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА Download PDF

Info

Publication number
UA123773C2
UA123773C2 UAA201804022A UAA201804022A UA123773C2 UA 123773 C2 UA123773 C2 UA 123773C2 UA A201804022 A UAA201804022 A UA A201804022A UA A201804022 A UAA201804022 A UA A201804022A UA 123773 C2 UA123773 C2 UA 123773C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
amino acid
antibody
acid sequence
domain
zeo
Prior art date
Application number
UAA201804022A
Other languages
English (en)
Inventor
Роберт Ф. Келлі
Роберт Ф. КЕЛЛИ
Деніел К Кірчхофер
Дэниел К Кирчхофер
Джойс Лай
Чінгвей В. Лі
Чингвей В. Ли
Вей-Чінг Ліанг
Вей-Чинг Лианг
Майкл Т. Ліпарі
Майкл Т. Липари
Келлі М. Лоєт
Келли М. Лоет
Тао САЙ
Лукерен Кемпагне Менно ван
Ян Ву
Джермейн Фух
Original Assignee
Дженентек, Інк.
Дженентек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дженентек, Інк., Дженентек, Инк. filed Critical Дженентек, Інк.
Publication of UA123773C2 publication Critical patent/UA123773C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A61K9/0051—Ocular inserts, ocular implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіла проти HtrAl, способу одержання та застосування такого антитіла, наприклад, у способі лікування пов'язаних з HtrAl порушень, очних порушень та/або пов'язаних з комплементом порушень.

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується антитіла проти НІГАЇ, способу одержання та застосування такого антитіла, наприклад, у способі лікування пов'язаних з НІгГАЇ порушень, очних порушень та/або пов'язаних з комплементом порушень.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Подана заявка містить перелік послідовностей, який був наданий в електронному вигляді у форматі АЗСІЇ та тим самим повністю включений у цю заявку як посилання. Вказана копія
АЗСІЇ, створена 25 жовтня 2016 р., названа 50474-117М/04 бедцепсе І івіпуд 10 25 16 525, а її розмір складає 114779 байтів.
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Цей винахід загалом відноситься до антитіл проти НІГА1 та способів їх застосування.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Серинова протеаза, НігА-серинова пептидаза 1 (НігАтї) (РК5511; СІап РА, родина 51) відноситься до еволюційно консервативної родини білків НігА. У людини НІГАТ, НІГАЗ та НігА4 мають однакову доменну архітектуру: М-кінцевий ІСЕВР-подібний модуль та КалаіІ-подібний модуль, протеазний домен з трипсиноподібнім типом згортання, та С-кінцевий домен РОЇ.
Фізіологічну релевантність НІГАТ надійно встановили шляхом виявлення у людей мутацій, які обумовлюють втрату функції що викликають успадковане ішемічне захворювання дрібних церебральних судин. У цьому молекулярному механізмі задіяно недостатнє інгібування ТОЕВ (трансформуючий ростовий фактор бета) за участю НігАї, що призводить до збільшеної сигналізації ТОЕДВ. Порушення регулювання сигналізації ТОЕВ під впливом аномальної експресії
НІГАТ також може сприяти виникненню артриту, ймовірно у зв'язку з опосередкованою НігА1 деградацією різних компонентів позаклітинного матриксу або опосередковано через стимулювання металопротеаз матриксу. На додаток до цього, при генетичних дослідженнях людини виявлена сильна кореляція між прогресуванням вікової макулярної дегенерації (ВМД) та ЗМР (однонуклеотидним поліморфізмом) у промоторній ділянці НІГАї, що призводить до підвищених рівнів транскрипта НІГА!1 (див., наприклад, ЮОемап еї аї!., 5сівпсе 314:989-992, 2006 та Хапад еї аІ., 5сіепсе 314:992-993, 2006).
ВМД являє собою прогресуюче хронічне захворювання центральної сітківки із суттєвими наслідками для гостроти зору. Пізні форми захворювання є головною причиною втрати зору у розвинених країнах. Для європеоїдної популяції віком 2 40 років частота поширення ранньої
ВМД за оцінкою складає близько 6,8 95, а запущеної - близько 1,5 95. Частота поширення пізньої ВМД з віком суттєво збільшується, зростаючи до близько 11,8 95 після 80 років. Існує два
Зо типи ВМД, неексудативна (суха) та ексудативна (волога) ВМД. При більш поширеній сухій ВМД відбуваються атрофічні та гіпертрофічні зміни у ретинальному пігментному епітелії (КРЕ), який лежить під центральною сітківкою (макулою), а також утворюються відкладення (друзи) на самому КРЕ. Прогресування сухої ВМД може приводити до значного пошкодження сітківки, включаючи географічну атрофію (СА) з незворотною втратою зору. Більш того, у пацієнтів суха
ВМД може прогресувати у вологу форму, при якій під сітківкою утворюються анормальні кровоносні судини, названі хориоїдальними неоваскулярними мембранами (СММУМ), відбувається підтікання рідини й крові та, у кінцевому випадку, це призводить до утворення засліплюючого рубця у вигляді диска у сітківці або під нею.
Існує потреба в антитілах проти НІГАТ з покращеними властивостями, такими як афінність зв'язування, стабільність та інгібуюча активність (блокування), а також їх терапевтичному та діагностичному застосуванні.
СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ
Цей винахід відноситься до антитіл проти НІГА1 та способів застосування їх у терапевтичних і діагностичних цілях. Антитіла проти НігГАї за цим винаходом є високоактивними та мають високу афінність зв'язування по відношенню до НІігАт1. Покращені властивості антитіл за цим винаходом роблять їх придатними до застосування при лікуванні.
В одному аспекті, винахід охоплює виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом
НІГАТ, причому епітоп НІГАТ містить щонайменше одну амінокислоту білка НІГАТ, вибрану з групи, що складається з Аго9190, І ем192, Рго193, Рпе194 та Аг9197, де нумерація амінокислот відповідає нумерації білка-попередника НІГАТ людини.
В одному варіанті реалізації винаходу епітоп НІГАТ містить щонайменше одну амінокислоту білка НІГАТ1, вибрану з групи, що складається з І еи192, Рго193 та Аг9197.
В іншому варіанті реалізації винаходу епітоп НІігГАТ містить щонайменше дві амінокислоти білка НІГАТ, вибрані з групи, що складається з І еи192, Рго193 та Аг9197.
У конкретному варіанті реалізації винаходу епітоп НІГА1 містить амінокислоти НІГАТ ГІ еи192,
Рго193 та Аг9197.
В іншому варіанті реалізації винаходу епітоп НігА! містить амінокислоти НІігГАТ Аг9190,
Ї ем192, Рго193 та Аг9197.
У додатковому варіанті реалізації винаходу епітоп НІГА1 містить амінокислоти НІГАТ Аг9190, 60 Ї ем192, Рго193, Рпе194 та Аг9197.
В одному аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує людську НігА-серинову пептидазу 1 (НІГАТ) з КО близько 550 пМ або менше. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло специфічно зв'язує НіІгАї людини з КО від близько 40 пМ до близько 550 пМ. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло специфічно зв'язує НІгГА!1 людини з КО від близько 40 пМ до близько 250 пМ. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло специфічно зв'язує НІГАТ людини з КО від близько 50 пМ до близько 125 пМ. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло специфічно зв'язує НІГА1 людини з КО близько 110 пМ. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло специфічно зв'язує НІГАїЇ людини з КО близько 60 пМ. У деяких варіантах реалізації винаходу значення КО вимірюють методом поверхневого плазмонного резонансу (ППР) (наприклад, ППР ВІАСОКЕФ). У деяких варіантах реалізації винаходу ППР виконують, як описано у цьому документі (наприклад, у розділі "Приклади").
У деяких варіантах реалізації винаходу будь-яке з попередніх антитіл здатне інгібувати активність НІГА1. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло інгібує активність протеазного домена людської НІГАТ (пинНігА1-РО) з 50 95 інгібуючою концентрацією (ІС50) рівною 1,5 нМ або менше. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло інгібує активність пинНігА1-РО з ІС5О рівною від 0,25 нМ до близько 0,5 НМ. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло інгібує активність пинНігА1-РО з ІС5О рівною близько 0,3 нМ. У деяких варіантах реалізації винаходу інгібуючу активність вимірюють іп мійго в аналізі блокування на основі ЕКЕТ (резонансний перенос енергії флуоресценції). У деяких варіантах реалізації винаходу аналіз блокування іп міго на основі ЕКЕТ включає використання зонда Н2г-Орі (наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 152). У деяких варіантах реалізації винаходу виконують аналіз блокування іп міїго на основі ЕКЕТ, як описано у цьому документі (наприклад, у прикладах).
У деяких варіантах реалізації вищенаведеного аспекту антитіло містить зв'язуючий домен, що містить: (а) НМЕА-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕХ:Н (5ЕО ІЮ МО: 1), де Хі являє собою Меї або ей; (Б) НМК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність
СМОРЕТХ»ЗААУМОКЕКО (ЗЕО ІЮО МО: 2), де Х2 являє собою Сім або Авр; та (с) НМЕ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність СУОМОМАЇ ОМ (5ЕБО ІЮО МО: 3). У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить зв'язуючий домен, що містить: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕМН (5ЕО ІЮ МО: 7); (Б) НМЕ-Н2, яка містить амінокислотну
Зо послідовність ОМОРЕТЕСААУМОКЕКО (БО 10 МО: 8) та (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність СУЮМОМАГОМ (5БО ІО МО: 3). У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло додатково містить: (а) ЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність
ЕМО МОБИАЕУККРОАБУКУЗСКАБИМУХ ЕХ» (ЗЕО ІЮО МО: 12), де Хі являє собою І уз або Тпг, а
Хг2 являє собою ТТГ, ух або Агу; (Б) ЕК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність
З5 0 МмМАОАРООСІ ЕМО (БО ІО МО: 13); (с) ЕВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність
КАТІТКОТЗТ5ТАМІ БЇ 55І К5ЕОТАМУУСТК (БО ІО МО: 14); та (4) ЕК-Н4, яка містить амінокислотну послідовність МОСТІ МТУ (5ЕБО ІО МО: 15). У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло додатково містить: (а) ЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність
ЕМО! МОБСОАЕУККРОАБУКУЗСКАБИОМУКЕТ (5БЕО 10 МО: 16); (Б) БЕВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність МЛУКОАРОСОСІГЕММО (5ЕБО ІЮО МО: 13); (с) ЕК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КАТІТКОТЗТ5ТАМІ ЕІ 551 К5ЕОТАМУУСТЕ (ЗЕО ІО МО: 14); та (9)
ЕВ-НА, яка містить амінокислотну послідовність МОСТІ МТУ (ЗЕО ІЮ МО: 15).
У деяких варіантах реалізації вищенаведеного аспекту зв'язуючий домен додатково містить: (а) НУВ-І 1, яка містить амінокислотну послідовність КА5ЗЗМХзРІН (ЗЕО ІО МО: 4), де Хз являє собою сім або Авп; (б) НМК-12, яка містить амінокислотну послідовність АТ5ХАЇ А5 (5ЕО ІО МО: 5), де Ха. являє собою Азвп, Ні або си; та (с) НМА-І-3, яка містить амінокислотну послідовність
ОСООМУХ5ОХеРУМТ (5ЕО ІО МО: 6), де Хо являє собою 5ег або Туг, а Хє являє собою Аа або Авп. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язуючий домен додатково містить: (а) НМК-І1, яка містить амінокислотну послідовність КАЗОЗМЕРІН (ЗЕБО ІЮ МО: 9); (Б) НМК-І2, яка містить амінокислотну послідовність АТОМІ АБ (ЗБО ІО МО: 10); та (с) НМК-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність СООМУЗБАРУМТ (5БО ІЮ МО: 11). У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло додатково містить: (а) ЕК-Ї71, яка містить амінокислотну послідовність
РІОМТО5РБЗБІ БАЗМОИОВМТІТО (БО 10 МО: 17); (Б) ЕВ-І2, яка містить амінокислотну послідовність МУООКРОКАРКРІІЗ (5ЕБО ІЮ МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність СМРОКЕЗОБОЗОТОЕТІ ТІЗБОРЕОРБАТУУЄС (5ЕО ІО МО: 19); та (а) ЕК-14, яка містить амінокислотну послідовність ЕБОСТКМЕЇК (5ЕО ІЮО МО: 20).
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) варіабельний домен (МН) важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність 60 послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 21; (5) варіабельний домен (МІ)
легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 22; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (Б). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН додатково містить: (а) ЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЕМОЇ МОБСАЕМККРОАЗУКУЗСКАЗОМУКЕТ (ЗЕБО І МО: 16); (5) ЕБК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність М//КОАРОСОСІ ЕМО (ЗЕБО ІО МО: 13); (с) ЕК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КАТІТКОТЗТОТАМІ ЕІ 551 К5ЕОТАМУУСТК (ЗЕО ІЮО МО: 14); та (ад) ЕК-НА, яка містить амінокислотну послідовність МУЗОСТІ МТУ55 (ЗЕО ІЮ МО: 15). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 21. У деяких варіантах реалізації винаходу домен Мі додатково містить: (а) ЕК-І1, яка містить амінокислотну послідовність ОІОМТО5РББІ БАЗМООМКМТІТС (5ЕО ІО МО: 17); (5) ЕВ-1І2, яка містить амінокислотну послідовність М/'МООКРОКАРКРІІЗ (5ЕБО ІО МО: 18); (с) ЕК-І З, яка містить амінокислотну послідовність ЗМРОКЕЗОЗОЗОТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕОБАТУМС (5ЕО ІЮО МО: 19); та (й) ЕВ-14, яка містить амінокислотну послідовність ЕООСТКМЕЇК (ЗЕО ІО МО: 20). У деяких варіантах реалізації винаходу домен Мі. містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 22.
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА!1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕХ:Н (ЗЕО ІО МО: 1), де Хі являє собою Меї або І еи; (Б)
НМВ-На, яка містить амінокислотну послідовність ЗМОРЕТХ2ЗААУМОКЕКО (ЗЕО ІЮО МО: 2), де
Хг являє собою Сі або Авбп; (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність
СМУОМОМАГОМ (5БО 10 МО: 3); (4) НМВ-І71, яка містить амінокислотну послідовність
ВАБ5БОМХзРІН (ЗЕБО ІО МО: 4), де Хз являє собою Сі або Авп; (е) НМК-12, яка містить амінокислотну послідовність АТЗХАЇ АЗ (ЗЕО ІО МО: 5), де Ха являє собою Азвп, Ні або Си; та (І) НУВ-І3, яка містить амінокислотну послідовність ООМУХ5ОХеРУМТ (ЗЕО ІО МО: 6), де Хо являє собою Зег або Туг, а Хв являє собою Аа або Азп. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язуючий домен містить наступні шість НМА: (а) НМУВ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕМН (5ЕО ІЮО МО: 7); (Б) НМЕ-На2, яка містить амінокислотну послідовність
СМОРЕТЕСААУМОКЕКО (БО ІЮ МО: 8); та (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну
Зо послідовність СУМОМ АГОМ (5БО 10 МО: 3); (4) НМК-І71, яка містить амінокислотну послідовність КАЗЗЗМЕРІН (ЗЕО ІЮ МО: 9); (е) НМК-1 2, яка містить амінокислотну послідовність
АТЗМІАБ (5БО І МО: 10); та () НМК-І3, яка містить амінокислотну послідовність
ООМУЗБЗАРМУТ (5ЕО ІО МО: 11).
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 09595 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 21; (Б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9595 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 22; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен Мі, аналогічний описаному в (Б). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН додатково містить: (а) ЕВ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність
ЕМО! МОБСОАЕУККРОАБУКУЗСКАБИОМУКЕТ (5БЕО 10 МО: 16); (Б) БЕВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність МЛУКОАРОСОСІГЕММО (5ЕБО ІЮО МО: 13); (с) ЕК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КАТІТКОТЗТ5ТАМІ ЕІ 551 К5ЕОТАМУУСТЕ (ЗЕО ІО МО: 14); та (9)
ЕВ-Н4, яка містить амінокислотну послідовність МОСТІ МТМ (ЗЕБЕО ІЮО МО: 15). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮО МО: 21. У деяких варіантах реалізації винаходу домен Мі додатково містить: (а) ЕК-11, яка містить амінокислотну послідовність ОЮМТОЗРБОБІ БАЗМООКМТІТС (5БО ІЮ МО: 17); (5) ЕК-І2, яка містить амінокислотну послідовність МУМООКРОКАРКРІІЗ (ЗЕБО ІЮ МО: 18); (с) ЕВ-І3, яка містить амінокислотну послідовність ЗМРОКЕЗОЗОЗОТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕОБАТУМС (5ЕО ІЮО МО: 19); та (й) ЕБ-14, яка містить амінокислотну послідовність ЕОЗОСТКМЕЇК (ЗЕО ІО МО: 20). У деяких варіантах реалізації винаходу домен Мі. містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 22.
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА!1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 09995 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІО МО: 21; та (б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9995 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 22. 60 В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА1,
причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) варіабельний домен (МН) важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 23; (5) варіабельний домен (МІ) легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 24; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (Б). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН додатково містить: (а) ЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОМОЇ ОО0О5СОАЕЇ МКЕРОАБЗМТІ ЗСКАЗОМТЕТ (5БО ІЮ МО: 24); (Б) ЕБ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність МІМКОТРМУНОГЕМУМІС (5ЕБО ІО МО: 25); (с) ЕК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КАТІ ТАОК5ЗЗТАММЕЇ КІ ТЗЕОБАМУУСТЕК (ЗЕО І МО: 26); та (0) ЕБ-НА, яка містить амінокислотну послідовність МЗССТЗМТМУЗ5 (5ЕО ІО МО: 27). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 23. У деяких варіантах реалізації винаходу домен Мі додатково містить: (а) ЕК-І1, яка містить амінокислотну послідовність МІММТОЗРАБІАМ5І СОКАТІЗС (5ЕО ІО МО: 29); (в) ЕК-1І2, яка містить амінокислотну послідовність М/МООКРООРРКІІМ (ЗЕО ІЮО МО: 30); (с) ЕК-І-3, яка містить амінокислотну послідовність ЗМРАКЕЗОБОЗКТОЕТІ ТІОРМЕАОрААТУМС (5ЕО ІЮ МО: 31); та (а) ЕК-1 4, яка містить амінокислотну послідовність ЕССОСТКІ БІК (ЗЕБЕО ІЮО МО: 32). У деяких варіантах реалізації винаходу домен Мі. містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 24.
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА!1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 09995 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІО МО: 23; та (б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9995 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 24.
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА!1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗМІМ5 (ЗЕО 10 МО: 39); (Б) НМВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність УІЗМОСОТТУУБОТІКО (5ЕО ІО МО: 40); та (с) НМКАК-НЗ, яка містить
Зо амінокислотну послідовність ОМЕКЗООЗО5МОМ (5БО ІЮ МО: 41); (4) НМНК-І1, яка містить амінокислотну послідовність КАБЗЕЗМОЗУСКЗЕМН (5ЕО ІО МО: 42); (ве) НМВ-І2, яка містить амінокислотну послідовність ГАБКІЕБ (5БО ІО МО: 43); та () НМК-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність ФОММЕОРМТ (ЗЕО ІЮО МО: 44).
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 09595 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕС ІО МО: 45; (Б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9595 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 46; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен Мі, аналогічний описаному в (Б). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН додатково містить: (а) ЕВ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність
ЕМО! МЕЗССІЇ МОРОЗІ ВІ5СААБОЕТЕО (5ЕБО 10 МО: 47); (5) БЕВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність МЛ/КОАРОКОСГ ЕММА (5ЕБО ІО МО: 48); (с) ЕК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КЕТІЗКОМЗКМТІ МГ ОММІ-КАЕОТАМУМУСАК (ЗЕО ІЮ МО: 49); та (4) ЕВ-НА, яка містить амінокислотну послідовність МОСТІ МТМ (5ЕБЕО ІЮО МО: 50). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН містить амінокислотну послідовність зБЕО ІЮ МО: 45. У деяких варіантах реалізації винаходу домен Мі додатково містить: (а) ЕК-11, яка містить амінокислотну послідовність ОІММТОБРОБІГАМ5І СЕКАТІМС (5БО ІО МО: 51); (Б) ЕК-І2, яка містить амінокислотну послідовність МУМООКРООРРКІ ІМ (ЗЕБЕО ІЮ МО: 52); (с) ЕК-І3, яка містить амінокислотну послідовність ЗМРОКЕЗОБОБСОСТОЕТІ ТІЗБІ ОАХЛЕОМАМУМС (5ЕО ІЮ МО: 53); та (94) ЕК-14, яка містить амінокислотну послідовність ЕБОСТКМЕЇК (ЗЕО ІО МО: 54). У деяких варіантах реалізації винаходу домен Мі. містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 46.
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 09995 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕ ІЮО МО: 45; та (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9995 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 46. 60 В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА1,
причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) варіабельний домен (МН) важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕСО ІЮ МО: 55; (5) варіабельний домен (МІ) легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 56; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (Б). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН додатково містить: (а) ЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЕМКІ МЕЗОССІ МЕРОСОБІ КІГ АСМАБОРТЕЗ (ЗЕБЕО ІЮ МО: 57); (5) ЕК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність УУМКОТРЕКАКГЕМУМА (5ЕБО ІЮ МО: 58); (с) ЕВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КЕТІЗКОМАКМТІ МІ ОМ5ТІ КЗЕОТАІМЕСАК (5ЕБЕО ІЮ МО: 59); та (а) ЕБ-НА, яка містить амінокислотну послідовність МЗОСТАМТМУ55 (5ЕО ІЮ МО: 60). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ
МО: 55. У деяких варіантах реалізації винаходу домен Мі додатково містить: (а) ЕК-І1, яка містить амінокислотну послідовність МІММТОЗРАБІАМ5І СОКАТІЗС (5ЕО ІО МО: 61); (в) ЕК-1І2, яка містить амінокислотну послідовність ММООКРООРРКІШІМ (ЗЕО ІО МО: 62); (с) ЕВ-І-3, яка містить амінокислотну послідовність ЗМРАКЕЗОБОЗКТОЕТІ ТІОРМЕАОрААТУМС (5ЕО ІЮ МО: 63); та (94) ЕК-14, яка містить амінокислотну послідовність ЕОСОСТКІ БІК (ЗЕО ІЮ МО: 64). У деяких варіантах реалізації винаходу домен Мі. містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 56.
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА!1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 99595 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІО МО: 55; та (б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9995 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 56.
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) варіабельний домен (МН) важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕСО ІЮ МО: 65; (5) варіабельний домен (МІ)
Зо легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 66; або (с) домен УН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (б).
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА!1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) варіабельний домен (МН) важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 67; (5) варіабельний домен (МІ) легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 68; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (б).
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує НІГА!1, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить (а) варіабельний домен (МН) важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕСО ІЮ МО: 69; (5) варіабельний домен (МІ) легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 70; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (б).
У деяких варіантах реалізації будь-якого з попередніх аспектів антитіло є моноклональним, людським, гуманізованим або химерним. У конкретних варіантах реалізації винаходу антитіло є моноклональним, гуманізованим або химерним.
У деяких варіантах реалізації будь-якого з попередніх аспектів антитіло являє собою фрагмент антитіла, який зв'язується з НІгГА1. У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент антитіла вибраний з групи, що складається з фрагментів Раб, Бар'-5Н, Ем, 5СЕМ та (Бабр")». У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент антитіла являє собою Раб. У деяких варіантах реалізації винаходу Бар містить усічення у шарнірній ділянці константної ділянки важкого ланцюга. У деяких варіантах реалізації винаходу Бар містить усічення у верхньому шарнірі константної ділянки важкого ланцюга. У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка важкого ланцюга завершується положенням 221 (нумерація ЕШЮ). У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислотний залишок положення 221 являє собою аспарагінову кислоту.
У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка важкого ланцюга містить бо амінокислотну послідовність 5ЕО) ІО МО: 156. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга ЗЕО І МО: 160. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 159. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга ЕС ІЮ МО: 160 та амінокислотну послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 159.
У деяких варіантах реалізації винаходу Раб являє собою Раб Ідс1.
У деяких варіантах реалізації будь-якого з попередніх аспектів антитіло являє собою повнорозмірне антитіло. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло являє собою антитіло
Ід0. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло являє собою моноспецифічне антитіло.
У деяких варіантах реалізації будь-якого з попередніх аспектів антитіло являє собою біспецифічне антитіло. У деяких варіантах реалізації винаходу біспецифічне антитіло містить другий зв'язуючий домен, який зв'язується з фактором О. У деяких варіантах реалізації винаходу другий зв'язуючий домен містить наступні шість НМЕК: (а) НМЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність СЗУТЕТМУСОММ (ЗБО І МО: 109); (Б) НМУВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність УМІМТУТЗЕТТМАХІОРКО (ЗЕО ІО МО: 110), де Хі являє собою Азр або Сім; (с) НМЕ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕОСМХІМ (ЗЕО ІЮ МО: 111), де Хі являє собою Ар або 5ег; (й) НМК-11, яка містить амінокислотну послідовність ІТЗТХЇХ» х зОММ (ЗЕО ІЮ МО: 112), де Хі являє собою Ар або Зег, Хг являє собою Азр або Си, а Хз являє собою
Ар або Зег; (є) НМЕ-12, яка містить амінокислотну послідовність (ЗОМ КР (ЗЕО ІЮ МО: 113); та (5 НМК-1І3, яка містить амінокислотну послідовність І О5Х:5І РМТ (ЗЕО ІЮО МО: 114), де Хі являє собою Ар або Сій. У деяких варіантах реалізації винаходу другий зв'язуючий домен містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУТЕТМУОММ (ЗЕО ІО МО: 109); (б) НМВ-На, яка містить амінокислотну послідовність УЛМТУТОЕТТУАСОБКО (ЗЕО ІЮ МО: 115); та (с) НМА-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕССМММ (5ЕО ІЮО МО: 116); (4) НМВ-І11, яка містить амінокислотну послідовність ІТ5ТОІЮСОММ (5ЕО ІЮ МО: 117); (є)
НМВ-12, яка містить амінокислотну послідовність ЗСМТІ ЕР (5ЕО ІО МО: 113); та () НМЕ-І 3, яка містить амінокислотну послідовність ГО5ОБІ РУТ (5ЕБО ІО МО: 118). У деяких варіантах реалізації винаходу другий зв'язуючий домен містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9595 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 119; (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 120; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен Мі, аналогічний описаному (6). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 119. У деяких варіантах реалізації винаходу домен Мі. містить амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО: 120.
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує як
НЕІГАТ, так ії фактор 0, причому антитіло містить перший зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує НІігГАТї, що містить наступні шість НМЕК: (а» НМЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕМН (5ЕО ІЮО МО: 7); (Б) НМЕ-На2, яка містить амінокислотну послідовність аМмОРЕТЕСААММОКЕКа (5ЕО ІО МО: 8); (с) НУВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність
СМУОМОМАГОМ (5ЕБО 10 МО: 3), (а) НМУВ-І71, яка містить амінокислотну послідовність
ВАБЗБЗЗМЕРІН (5ЕО ІО МО: 9); (є) НМВ-12, яка містить амінокислотну послідовність АТЗМІА5 (ЗЕО ІЮ МО: 10); та () НМЕА-І3, яка містить амінокислотну послідовність ООМУЗ5АРУМЛ (ЗЕО І
МО: 11); та другий зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує фактор О, що містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУТЕТМУОММ (ЗЕБЕО ІЮ МО: 109); (б) НМВ-На, яка містить амінокислотну послідовність УМГ УТОЗЕТТУАВОЕКО (5ЕО ІО МО: 115); (с) НУВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕБОМУММ (ЗЕО ІЮО МО: 116); (4) НУЕ-
Ї1, яка містить амінокислотну послідовність ІТЄТОІЮСОММ (5ЕО ІЮ МО: 117); (е) НМА-1І2, яка містить амінокислотну послідовність ЗОМ КР (ЗЕО ІО МО: 113); та () НМА-І3, яка містить амінокислотну послідовність ГО5О5І РУТ (ЗЕО ІЮ МО: 118).
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує як
НЕІГАТ, так ії фактор 0, причому антитіло містить перший зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує НігГАТ, що містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 99 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 21; та (Б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність що має щонайменше 99 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 22, та другий зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує фактор 0, що містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9995 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 119; та (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність, що 60 має щонайменше 99 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:
У деяких варіантах реалізації вищенаведених аспектів винахід охоплює виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом НІГА1, причому епітоп НІГАТ містить щонайменше одну амінокислоту білка НІГА1, вибрану з групи, що складається з Аг9190, І еи192, Рго193, Рпе194 та
Аг9197, де нумерація амінокислот відповідає нумерації білка- попередника НІГА! людини.
В одному варіанті реалізації винаходу епітоп НІГАТ містить щонайменше одну амінокислоту білка НІГАТ1, вибрану з групи, що складається з І еи192, Рго193 та Аг9197.
У конкретному варіанті реалізації винаходу епітоп НІГАТ містить амінокислоти НІГА1 І ей192,
Рго193 та Аг9197.
В іншому варіанті реалізації винаходу епітоп НігАТї містить амінокислоти НігАтТ Агод190,
Ї ем192, Рго193 та Аг9197.
У додатковому варіанті реалізації винаходу епітоп НІГА1 містить амінокислоти НІгГАТ Аг9190,
Ї ем192, Рго193, Рпе194 та Аг9197.
В іншому аспекті винахід відноситься до виділеної нуклеїнової кислоти, яка кодує будь-яке з антитіл, описаних у цьому документі. В іншому аспекті винахід відноситься до вектора (наприклад, експресійного вектора), який містить виділену нуклеїнову кислоту для експресії антитіла. В іншому аспекті винахід відноситься до клітин-хазяїв, що містять попередні нуклеїнові кислоти та/або вектори. У деяких варіантах реалізації винаходу клітина-хазяїн являє собою клітину ссавця. У деяких варіантах реалізації винаходу клітина ссавця являє собою клітину яєчника китайського хом'ячка (СНО) або клітину 293. У деяких варіантах реалізації винаходу клітина-хазяїн являє собою прокаріотичну клітину. У деяких варіантах реалізації винаходу прокаріотична клітина являє собою Е. сої.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу отримання будь-якого з антитіл, описаних у цьому документі, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна, яка містить будь-який з попередніх векторів (наприклад, експресійних векторів), у культуральному середовищі. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб додатково включає виділення антитіла з клітини- хазяїна або культурального середовища.
В іншому аспекті винахід відноситься до композиції, що містить будь-яке з попередніх антитіл. У деяких варіантах реалізації винаходу композиція додатково містить фармацевтично
Зо прийнятний носій, наповнювач або розбавлювач. У деяких варіантах реалізації винаходу композиція являє собою фармацевтичну композицію. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція є ліофілізованою. У деяких варіантах реалізації винаходу композиція додатково містить антагоніст зв'язування фактора 0. У деяких варіантах реалізації винаходу антагоніст зв'язування фактора Ю являє собою антитіло проти фактора О або його антигензв'язуючий фрагмент. У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючий фрагмент являє собою Раб або (Раб")». У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора О або його антигензв'язуючий фрагмент містить наступні шість НМЕ: (а) НУВ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність СУТЕТММОММ (ЗЕО ІЮ МО: 109); (5) НМК-На, яка містить амінокислотну послідовність УМІМТУТЗЕТТМАХІОРКО (ЗЕО ІО МО: 110), де Хі являє собою Азр або Сім; (с) НМЕ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕБОСМУХІМ (ЗЕО ІЮ МО: 111), де Хі являє собою Ар або 5ег; (й) НМК-11, яка містить амінокислотну послідовність ІТЗТХЇХ» х зОММ (ЗЕО ІЮ МО: 112), де Хі являє собою Ар або Зег, Хг являє собою Азр або Си, а Хз являє собою
Ар або Зег; (є) НМЕ-12, яка містить амінокислотну послідовність (ЗОМ КР (ЗЕО ІЮО МО: 113); та (9 НМА-І3, яка містить амінокислотну послідовність О5ХІ5І РУТ (5ЕО ІЮО МО: 114), де Хі являє собою Ар або Сіи. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора О або його антигензв'язуючий фрагмент містить наступні шість НМЕК: (а) НМК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність СУТЕТМУСОММ (ЗБО І МО: 109); (5) НМК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність УЛМТУТОЕТТУАСОРКО (5БО ІЮ МО: 115); та (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕСОМММ (БО ІЮ МО: 116); (4) НМК-І1, яка містить амінокислотну послідовність ІТ5ТОІЮООММ (5ЕБО І МО: 117); (є) НМК-12, яка містить амінокислотну послідовність СЗОМТІКР (5ЕБЕО ІО МО: 113); та () НМК-І3, яка містить амінокислотну послідовність ГО5ОБІ РУТ (5ЕБО ІЮО МО: 118). У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора 0 або його антигензв'язуючий фрагмент містить (а) домен УН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 119; (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9595 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 120; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (Б). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 119. У деяких варіантах реалізації винаходу домен МІ. бо містить амінокислотну послідовність 5ЕС ІЮО МО: 120. У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючий фрагмент антитіла проти фактора О являє собою лампалізумаб.
В іншому аспекті винахід охоплює комбіновану терапію, що включає будь-яке з попередніх антитіл проти НігАї та антагоніст фактора О. У конкретному варіанті реалізації винаходу антагоніст фактора О являє собою антитіло проти фактора 0. У конкретному варіанті реалізації винаходу антагоніст фактора ЮО являє собою лампалізумаб. У конкретному варіанті реалізації винаходу антагоніст проти фактора О вводять послідовно.
У деяких аспектах винаходу будь-яке з попередніх антитіл можна застосовувати як лікарський засіб.
У деяких аспектах винаходу будь-яке з попередніх антитіл можна застосовувати для лікування пов'язаного з НігАї порушення або хвороби ока. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з НігАї порушення або хвороба ока являє собою вікову макулярну дегенерацію (ВМД), діабетичну ретинопатію, ретинопатію недоношених або поліпоподібну хориоїдальну васкулопатію. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з НігА!1 порушення або хвороба ока являє собою ВМД. У деяких варіантах реалізації винаходу ВМД являє собою ранню суху ВМД, проміжну суху ВМД або запущену суху ВМД. У деяких варіантах реалізації винаходу запущена суха ВМД являє собою географічну атрофію.
У деяких аспектах винаходу будь-яке з попередніх антитіл можна застосовувати для виготовлення лікарського засобу для лікування пов'язаного з НігА1 порушення або хвороби ока.
У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з НіІГАї порушення або хвороба ока являє собою ВМД, діабетичну ретинопатію, ретинопатію недоношених або поліпоподібну хориоїдальну васкулопатію. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з НігА!1 порушення або хвороба ока являє собою ВМД. У деяких варіантах реалізації винаходу ВМД являє собою ранню суху ВМД, проміжну суху ВМД або запущену суху ВМД. У деяких варіантах реалізації винаходу запущена суха ВМД являє собою географічну атрофію. У деяких варіантах реалізації винаходу лікарський засіб приготований з метою застосування у комбінації з антагоністом зв'язування фактора О. У деяких варіантах реалізації винаходу антагоніст зв'язування фактора ЮО являє собою антитіло проти фактора Ю або його антигензв'язуючий фрагмент. У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючий фрагмент являє собою
Еар або (Рар")». У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора О або його
Зо антигензв'язуючий фрагмент містить наступні шість НМК: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУТЕТММСОММ (5ЕБО ІО МО: 109); (Б) НМК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність МЛМ УТОЕТТУМАХІОЕКО (ЗЕО ІЮ МО: 110), де Хі являє собою А5р або си; (с)
НМУВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕССОМУХ:М (5ЕБО ІЮ МО: 111), де Хі являє собою Азр або Зег; (4) НМЕ-1І 1, яка містить амінокислотну послідовність ІТЗТХЇХ» х зОММ (5ЕО
ІО МО: 112), де Хі являє собою Азр або 5ег, Хг2 являє собою Азр або Сім, а Хз являє собою Азр або Зег; (є) НМЕ-1 2, яка містить амінокислотну послідовність (ЗОМ КР (ЗЕО ІЮ МО: 113); та (ї)
НУВ-І3, яка містить амінокислотну послідовність ГО5ХІ5І РУТ (5ЕО ІЮ МО: 114), де Хі являє собою Ар або Сім. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора О або його антигензв'язуючий фрагмент містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НТІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУТЕТММСОММ (5ЕБО ІО МО: 109); (Б) НМУВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність УМІМТУТОЕТТМАООРКО (БО ІО МО: 115); та (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕССМММ (ЗЕ ІЮО МО: 116); (4) НМК-11, яка містить амінокислотну послідовність І5ТОІЮСОММ (БО ІЮ МО: 117); (е) НМК-І12, яка містить амінокислотну послідовність СОСМТІ КР (ЗЕБО ІО МО: 113); та () НМК-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність ГОБОБІ РУТ (5ЕО ІО МО: 118). У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора Ю або його антигензв'язуючий фрагмент містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 09595 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 119; (Б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9595 ідентичність послідовності з амінокислотною
БО послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 120; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (Б). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 119. У деяких варіантах реалізації винаходу домен МІ. містить амінокислотну послідовність 5ЕС ІЮО МО: 120. У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючий фрагмент проти фактора О являє собою лампалізумаб.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу лікування пов'язаного з НІГАТ порушення або хвороби ока у суб'єкта, що має для цього показання, причому спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла будь-якого з попередніх антитіл. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з НІГАТ порушення або хвороба ока являє собою ВМД, діабетичну ретинопатію, ретинопатію недоношених або поліпоподібну хориоїдальну васкулопатію. У деяких 60 варіантах реалізації винаходу пов'язане з НІГАТ порушення або хвороба ока являє собою ВМД.
У деяких варіантах реалізації винаходу ВМД являє собою ранню суху ВМД, проміжну суху ВМД або запущену суху ВМД. У деяких варіантах реалізації винаходу запущена суха ВМД являє собою географічну атрофію. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб додатково включає введення антагоніста зв'язування фактора 0.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу інгібування ретинальної або фоторецепторної клітинної дегенерації у суб'єкта, причому спосіб включає введення суб'єкту ефективної кількості будь-якого з попередніх антитіл, тим самим інгібуючи ретинальну або фоторецепторну клітинну дегенерацію.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу інгібування активності серинової протеази
НЕГА! в оці суб'єкта, причому спосіб включає введення суб'єкту ефективної кількості будь-якого з попередніх антитіл, тим самим інгібуючи активність серинової протеази НІГА!Т в оці. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб додатково включає введення антагоніста зв'язування фактора 0.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу лікування пов'язаного з НІГАТ порушення або пов'язаного з комплементом порушення у суб'єкта, що має для цього показання, причому спосіб включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості антагоніста зв'язування
НЕІГА1 та антагоніста зв'язування фактора 0. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з
НІГАТ порушення або пов'язане з комплементом порушення являє собою хворобу ока. У деяких варіантах реалізації винаходу хвороба ока вибрана з групи, що складається з ВМД, діабетичної ретинопатії, хориоїдної неоваскуляризації (СММ), увеїту, діабетичного макулярного набряку, патологічної міопії, хвороби Гіпеля-Ліндау, гістоплазмозу ока, оклюзії центральної вени сітківки, корнеальної васкуляризації та ретинальної неоваскуляризації. У деяких варіантах реалізації винаходу хвороба ока являє собою ВМД. У деяких варіантах реалізації винаходу ВМД являє собою ранню суху ВМД, проміжну суху ВМД або запущену суху ВМД. У деяких варіантах реалізації винаходу запущена суха ВМД являє собою географічну атрофію. У деяких варіантах реалізації винаходу антагоніст зв'язування НігАї являє собою антитіло проти НігА1 або його антигензв'язуючий фрагмент. У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючий фрагмент вибраний з групи, що складається з фрагментів Раб, Бабр'-5Н, Ем, зсЕМ та (БРаб")». У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючий фрагмент являє собою Раб. У деяких
Зо варіантах реалізації винаходу Бар містить усічення у верхньому шарнірі константної ділянки важкого ланцюга. У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка важкого ланцюга завершується положенням 221 (нумерація ЕЕ). У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислотний залишок положення 221 являє собою аспарагінову кислоту (А5р). У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 156. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга ЗЕ ІО МО: 160. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність легсого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 159. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 160 та амінокислотну послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 159. У деяких варіантах реалізації винаходу Раб являє собою Раб Ідс1.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу лікування пов'язаного з НігГАї порушення або пов'язаного з комплементом порушення у суб'єкта, що має для цього показання, причому спосіб включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості будь-якого з попередніх антитіл та терапевтично ефективної кількості антагоніста зв'язування фактора 0.
У деяких варіантах реалізації будь-якого з попередніх аспектів антагоніст зв'язування фактора ОО являє собою антитіло проти фактора О або його антигензв'язуючий фрагмент. У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючий фрагмент являє собою Раб або (Баб")».
У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора О або його антигензв'язуючий фрагмент містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність амТЕТММаммМ (5ЕБО 10 МО: 109); (Б) НМВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність
МІМТУТОаЕТТМАХІОРКО (ЗЕО ІО МО: 110), де Хі являє собою А5р або Си; (с) НМЕ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕБОМУХ:М (5ЕО ІО МО: 111), де Хі являє собою Азр або зе"; (0) НУВ-1 1, яка містить амінокислотну послідовність ІТ ЗТХЇХ» х зОММ (ЗЕО ІЮ МО: 112), де
Хі являє собою Ар або 5ег, Х?2 являє собою Ар або Сім, а Хз являє собою Ар або зег; (є)
НМВ-12, яка містить амінокислотну послідовність СОМТІ КР (ЗЕО ІЮ МО: 113); та (3 НМЕ-І 3, яка містить амінокислотну послідовність І О5Х15І РУТ (ЗЕО ІЮ МО: 114), де Хі являє собою Азр або
Сіш. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора О або його антигензв'язуючий фрагмент містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НТІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУТЕТММСОММ (5ЕБО ІО МО: 109); (Б) НМК-Н2, яка містить амінокислотну 60 послідовність УМІМТУТОЕТТМАООРКО (БО ІО МО: 115); та (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕОСМММ (ЗЕО ІО МО: 116); (4) НУВ-І1, яка містить амінокислотну послідовність І5ТОІЮСОММ (БО ІЮ МО: 117); (е) НМК-І2, яка містить амінокислотну послідовність СОСМТІ КР (ЗЕБО ІО МО: 113); та () НМК-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність ГОБОБІ РУТ (5ЕО ІО МО: 118). У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора ОЮО або його антигензв'язуючий фрагмент містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 09595 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 119; (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9595 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 120; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (Б). У деяких варіантах реалізації винаходу домен МН містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 119. У деяких варіантах реалізації винаходу домен МІ. містить амінокислотну послідовність 5ЕС ІЮО МО: 120. У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючий фрагмент проти фактора О являє собою лампалізумаб.
У деяких варіантах реалізації будь-якого з попередніх аспектів пов'язане з НІГАТ порушення або пов'язане з комплементом порушення являє собою хворобу ока. У деяких варіантах реалізації винаходу хвороба ока вибрана з групи, що складається з ВМД, діабетичної ретинопатії, хориоїдної неоваскуляризації (СММ), увеїту, діабетичного макулярного набряку, патологічної міопії, хвороби Гіпеля-Ліндау, гістоплазмозу ока, оклюзії центральної вени сітківки, корнеальної васкуляризації та ретинальної неоваскуляризації. У деяких варіантах реалізації винаходу хвороба ока являє собою ВМД. У деяких варіантах реалізації винаходу ВМД являє собою ранню суху ВМД, проміжну суху ВМД або запущену суху ВМД. У деяких варіантах реалізації винаходу запущена суха ВМД являє собою географічну атрофію.
У деяких варіантах реалізації будь-якого з попередніх аспектів антитіло вводять у скловидне тіло, окулярно, всередину ока, біля склери, у субтеноновий простір, у супрахориоїдальний простір, місцево, внутрішньовенно, внутрішньом'язовно, внутрішньошкірно, через шкіру, внутрішньоартеріально, внутрішньочеревинно, всередину вогнища, інтракраніально, всередину суглоба, всередину простати, внутрішньоплеврально, інтратрахеально, інтратекально, назально, вагінально, ректально, місцево, внутрішньочеревинно, у черево, інтравентрикулярно, підшкірно, субкон'юЮюнктивально, всередину сечового пухиря, через слизову оболонку,
Зо інтраперикардіально, всередину пуповини, інтраорбітально, перорально, трансдермально, шляхом інгаляції, шляхом ін'єкції з очними краплями, шляхом імплантації, шляхом інфузії, шляхом неперервної інфузії шляхом безпосереднього омивання клітин-мішеней при локалізованій перфузії, за допомогою катетера, шляхом промивання, у кремах або у ліпідних композиціях. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло вводять у скловидне тіло, окулярно, всередину ока, біля склери, у субтеноновий простір, у супрахориоїдальний простір або місцево. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло вводять у скловидне тіло шляхом ін'єкції. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло вводять місцево за допомогою очних крапель або мазі. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло вводять за допомогою системи доставки тривалої дії. В конкретних варіантах реалізації винаходу система доставки тривалої дії являє собою твердий імплантат на основі РІ СА або систему доставки з портом, що імплантують.
У деяких варіантах реалізації будь-якого з попередніх аспектів суб'єкт є людиною.
Короткий опис графічних матеріалів
На ФІГ. 1А-18 зображені графіки, які показують, що більшість з позитивних за твердофазним імуноферментним аналізом (ІФА) клонів гібридом демонстрували подібні профілі реактивності як до людського (Пи), так і мишачого (ти) протеазного домену НІГА!1 (РО). На графіках показані значення оптичної густини при 650 нм (ОГезонм) для кожного із вказаних 75 клонів. Фоновий сигнал у цьому аналізі складав « 0,05 ОГввонм. Протеазні домени людської та мишачої НІігА1 мають 91 95 гомології.
На ФІГ. 2А наведена схематична діаграма аналізу блокування, використаного для визначення здатності вказаних супернатантів клонів гібридом проти НігАї1 інгібувати опосередковане НІГАТ-РО розщеплення ВООБІРУФ РІ -міченого флуоресцентного субстрату.
На ФІГ. 28-2С наведені графіки, які показують, що 10 супернатантів клонів гібридом проти
НіІгГАї суттєво інгібували опосередковане НігА1!ї--Ю людини розщеплення субстрату з використанням аналізу блокування, описаного на Фіг. 2А та у прикладі 1. Графіки показують середній флуоресцентний сигнал (тисячні відносні флуоресцентні одиниці (мВФО)/хв) супернатантів гібридом із вказаних клонів. Антитіло УМ/505.94 (також називається "94 Ід", див. міжнародну публікацію заявки на патент Мо УМО 2013/055998, яка у повному обсязі включена у цей документ як посилання) при вмісті 10 мкг/мл у кондиціонованому середовищі (КС або конд. бо середовище) служило позитивним контролем для демонстрації відсутності змін в аналізі внаслідок впливу середовища та стабільності протягом проведення аналізу. Буферний розчин або середовище служили як негативний контроль. На Фіг. 2 зображені вихідні та кінцеві результати аналізу для буферного розчина, середовища Е (багатого живильними речовинами середовища з СГОМАСЕЇ І М) та кондиціонованого середовища. 100 95 показує на повне інгібування.
На ФІГ. ЗА-3В наведені графіки, які зображають здатність супернатантів вказаних гібридом інгібувати розщеплення флуоресцентного субстрату тинігА1-РО (Фіг. ЗА) або пинНігА1-РО (Фіг.
ЗВ). На Фіг. ЗА використовували 40 нМ тиНігА1-РО у співвідношенні 40 мкл тиНнігА1-РО на 60 мкл супернатантів гібридом. На Фіг. ЗВ використовували 20 нМ пПиНігА1-РО у співвідношенні 40 мкл пиНігА1Т-РО на 60 мкл супернатанту гібридом. Антитіло УМУ505.94 (94 Ід) служило як позитивний контроль. Буферний розчин або КС служили як негативний контроль.
На ФІГ. 4А наведена схематична діаграма аналізу блокування на основі ЕКЕТ, використаного для визначення здатності очищених клонів антитіла проти НІГАТ інгібувати опосередковане НіІгГА1-РО розщеплення субстрату на основі ЕКЕТ, Н2-Орі.
На ФІГ. 48-4С наведені графіки, які показують, що очищені клони антитіл 15Н6, 19812, ЗА5, 12А5 та 20Е2 зберігають здатність інгібувати опосередковане мишачим (Фіг. 48) та людським (Фіг. 4С) НігГА1-РО розщеплення субстрату. Відсутність додавання антитіла (без аб) служило як негативний контроль, тоді як антитіло УМ/505.94 (94 Ід) служило як позитивний контроль.
Очищені антитіла додавали у концентраціях 5 нМ, 50 нМ або 500 нМ. В аналізі, представленому на Фіг. 4В, використовували 15 нМ тиНігА1-РО-Ес, тоді як в аналізі, представленому на Фіг. 4С, використовували З нМ пПиНнігА1-РО-Ес.
На ФІГ. 5А-5В8 наведені графіки, які показують, що вказані очищені клони антитіл тідс інгібують опосередковане повнорозмірним людським НігАї7 (пишНігА1-РІЇ) розщеплення пептидного субстрату ЕКЕТ. На графіку зображена активність (мВФО/хв) у вигляді залежності від концентрації до. Додавали пинігА1-РЇ. у концентрації 5 нм. УУу/505.94 у формі Ід (19594) та його химерний варіант (І4594-сі), як описано в Сійегі еї аї. (2015) Віоспет. У. 472(2):169-81, служили як позитивні контролі. Зображена напівмаксимальна інгібуюча концентрація (ІС50) для кожного клону антитіла.
На ФІГ. 50-50 наведені графіки, які показують, що вказані очищені клони антитіл тідс
Зо інгібують опосередковане тиНігА1-РЇ розщеплення пептидного субстрату ЕКЕТ. На графіку зображена активність (мВФО)/хв) у вигляді залежності від концентрації (дО. Додавали ІтинігА1 -
ЕІ. у концентрації 5 НМ. Іде94 та Ід594-спй служили позитивним контролем, як описано в описі фігур для Фіг. 5А та 5В. Зображена напівмаксимальна інгібуюча концентрація (ІС50).
На ФІГ. бА зображене вирівнювання послідовностей амінокислотних послідовностей варіабельної ділянки важкого ланцюга (МН) клонів антитіл 19812, 20Е2, ЗАБ, 12А5 та 15Н6.
На ФІГ. 6В зображене вирівнювання послідовностей амінокислотних послідовностей варіабельної ділянки легкого ланцюга (МІ) клонів антитіл 19812, 20Е2, ЗАБ, 12А5 та 15Нб6.
На ФІГ. 7А-7В наведені графіки, які зображають результати аналізу блокування на основі
ЕКЕТ з використанням клону 15Н6 антитіла тідс (Фіг. 7А) або клону 19812 (Фіг. 7В), очищеного з супернатанту гібридом (гиб) або рекомбінантного експресованого в клітинах 293 (293). Графіки зображають Мтах (мВФО/хв) у вигляді залежності від концентрації антитіл (НМ). У кожному аналізі використовували З нМ пиНІгА1-РЇ.. Зображені також значення ІС50 для вказаних клонів антитіл.
На ФІГ. 8А-88 зображені вирівнювання послідовностей амінокислотних послідовностей МІ. (Фіг. 8А) та МН (Фіг. 88) з клонів антитіл проти НігАї т15Нб, НІ5Нб.м1, НІ5Нб.м2 та пП15Н6.м2.АРЕС (також називають у цьому документі як п15Н6.у3) у порівнянні з консенсусною послідовністю к1 людини (Фіг. 8А) або послідовністю УНІ (Фіг. 88). НУЄ послідовності обмежені для кожного з клонів антитіл позначаючими прямокутниками. Підкреслені послідовності НУК. у відповідності з визначенням Кабата. Залишки, зображені текстом білого кольору у зафарбованих прямокутниках, указують на залишки, які розрізняються у консенсусній послідовності МНІ1 людини та у клонів антитіл проти НІГА1.
На ФІГ. 9А-90 наведені графіки, які зображають результати аналізу зв'язування т!і5Нб або пП15Нб.м1 із захопленим стрептавідином біотинильованим людським або мишачим НігА!1 методом поверхневого плазмонного резонансу (ППР) ВІАСОКЕ М, Застосовували кінетичний аналіз одного циклу. На графіках зображені одиниці відповіді (КО) у вигляді залежності від часу (с). На Фіг. 9А зображені результати зв'язування Бар т15Нб з ПиНІГА!Т. На Фіг. 9В зображені результати зв'язування Бар т15Нб з тинНігА1. На Фіг. 9С зображені результати зв'язування
П15Нб.М з пиНІГАТ. На Фіг. 90 зображені результати зв'язування п15Н6.м1 з пиНІгАт1. Визначені для кожного аналізу Ка, Ка та КО зображені у вигляді тексту всередині кожного графіка. бо На ФІГ. 10А-108 наведені графіки, які зображають результати експериментів ІФА з фагової конкуренції за зв'язування вказаних варіантів Раб п15Н6.м1 з мишачим (Фіг. 10А) або людським (Фіг. 108) НІгГА1. На графіку зображено зв'язування фага (ОГалзо нм) у вигляді залежності від концентрації НІГАТ (НМ).
На ФІГ. 11А-118 наведені графіки, які зображають результати аналізу ППР ВІАСОКЕ М порівняння зв'язування клону антитіла п15Нб.м2 та варіантів НМЕК-І З І С-МУ91І. та І С-УУ91М з мишачим (Фіг. 11А) або людським (Фіг. 118) НІгГА!1. Використані антитіла були у формі Раб.
Визначені для кожного аналізу Ка, Кд та КО зображені у вигляді тексту всередині кожного графіка.
На ФІГ. 12А наведений графік, який зображає результати аналізу ППР ВІАСОКЕ М порівняння зв'язування клону антитіла п15Нб.ма2 (вихідний) та вказаних варіантів у положенні МІ. 94 (тобто І! С-МО4А І С-РОБ5 (АР), І С-МО94Е І С-РОБ5 (ЕР), І 0-М940 І С-РО5 (ОР) та І С-М945 І 0-
РОБ (5Р)) з пиНІгА1. Використані антитіла були у формі Раб. На графіку зображені одиниці відповіді (КО) у вигляді залежності від часу (с).
На ФІГ. 128 наведена таблиця, на якій узагальнені результати аналізу ППР ВІАСОКЕ "М, зображеного на Фіг. 12А.
На ФІГ. 13А наведений графік, який зображає результати аналізу ППР ВІАСОКЕ М порівняння зв'язування клону антитіла п15Нб6.м2 (вихідний) та вказаних варіантів у положенні
МН 55 та/або 56 (тобто НС-О55А НО-С56 (АС), НО-О55Е НО-С56 (ЕС), НО-ЮО555 НО-О56 (55) та
НО-055 НО-О56А (БА)) з пПиНІГАТ. Використані антитіла були у формі Раб. На графіку зображені одиниці відповіді (КІ) у вигляді залежності від часу (с).
На ФІГ. 13В наведена таблиця, на якій узагальнені результати аналізу ППР ВІАСОКЕ "М, зображеного на фіг. 13А.
На ФІГ. 14А наведений графік, який зображає результати аналізу ППР ВІАСОКЕ М порівняння зв'язування клону антитіла п15Нб.м2 (вихідний) та вказаних комбінованих варіантів у положенні МІ. 94 та положенні МН 55 та/або 56 з пинНігАт. АР Ес: І С-МО4А І С-РО5 НО-О55Е
НО-О56 (також називається п15Н6.м2.АРЕС та п15Н6.м3). ЕР ЕС: І С-МО4Е І С-РО5 НО-О55Е
НО-256. ОР ЕС: 10-М940О І 0-РО5 НО-О55Е НО-256. ЗР ЕС: 1 0-М945 1 0-РОБ5 НО-О55Е НО- 56.
На ФІГ. 14В наведена таблиця, на якій узагальнені результати аналізу ППР ВІАСОКЕ "М,
Зо зображеного на Фіг. 14А.
На ФІГ. 14С наведений графік, який зображає результати аналізу блокування на основі
ЕКЕТ дослідження здатності Ід п15Нб.м2, Раб п15Нб.м2 та вказаних комбінованих варіантів у положенні МІ. 94 та положенні МН 55 та/або 56 інгібувати активність НігА1. Графіки зображають відсоток максимальної активності у вигляді залежності від Іюд-концентрації антитіл (М).
На ФІГ. 140 наведена таблиця, яка показує значення ІС50О для кожного з клонів антитіл, досліджених на Фіг. 146.
На ФІГ. 15А-158 зображені вирівнювання послідовностей амінокислотних послідовностей МІ. (Фіг. 15А) та МН (Фіг. 158) клонів антитіл проти НІГАї т19812 та п19812.м1 у порівнянні з консенсусною послідовністю к4 людини (Фіг. 15А) або послідовністю МНЗ (Фіг. 158). НУВ послідовності обмежені для кожного 3 клонів антитіл позначаючими прямокутниками.
Підкреслені послідовності НМК у відповідності з визначенням Кабата. Залишки, зображені текстом білого кольору у зафарбованих прямокутниках, указують на залишки, які розрізняються у консенсусній послідовності МНІ1 людини та у клонів антитіл проти НІГА1.
На ФІГ. 16А-160 наведені графіки, які зображають результати аналізу зв'язування клону антитіл т19812 або п19812.м1 з людським або мишачим НігАї методом ППР ВІАСОРКЕ "ММ,
Застосовували кінетичний аналіз одного циклу. На графіках зображені одиниці відповіді (КО) у вигляді залежності від часу (с). На Фіг. 16А зображені результати зв'язування баб т!19812 з
ПЧНІГАТ. На Фіг. 168 зображені результати зв'язування Бар т319812 з тиНігАт1. На Фіг. 16С зображені результати зв'язування баб п19812.м1 з пиНІГА1. На Фіг. 160 зображені результати зв'язування Бар п19812.м1 з пПиНІігАт. Ка, Кд та КО для кожного аналізу зображені у вигляді тексту всередині кожного графіка.
На ФІГ. 17 наведена схематична діаграма, яка відмічає стратегію фагового пенінгу, застосовану для глибокого скануючого ММК-мутагенезу НС я та С НМК з п15Нб.м2 щодо визрівання афінності.
На ФІГ. 18А-188 наведені карти інтенсивності у І0д2 коефіцієнтів збагачення для мутацій у вказаних положеннях НМА МН (Фіг. 18А) або МІ (Фіг. 188), розрахованих шляхом ділення частоти появи заданої мутації у за цьому положенні у відсортованому зразку з частотою появи точно такої ж мутації у невідсортованому зразку. Співвідношення збагачення типових мутацій вказані у вигляді карт інтенсивностей. бо На ФІГ. 19 наведена таблиця, яка показує мутації, ідентифіковані як збагачені у відсортованому зразку у порівнянні з невідсортованим зразком з бібліотек ММК та/або бібліотек "м'якої" рандомізації МН та МІ п15мб ма.
На ФІГ. 20 наведена таблиця, яка показує результати аналізу зв'язування ППР ВІАСОКЕ М вказаних клонів варіантів Бар антитіл з визрілою афінністю. Показані Ка, Ка та КО для кожного клону варіанта антитіла з визрілою афінністю отримані у цьому аналізі у порівнянні з пП15Нб.м2 та п15Н6.м2.АРЕС (також називають п15Н6.м3).
На ФІГ. 21А-218 зображені вирівнювання послідовностей амінокислотних послідовностей МІ. (Фіг. 21А) та МН (Фіг. 218) клонів варіантів антитіл проти НІГА! з визрілою афінністю.
На ФІГ. 22А наведена таблиця, в якій узагальнені результати для вказаних клонів варіантів
Еар антитіл проти НІГАТ з визрілою афінністю щодо інгібування активності НІГА! за оцінкою аналізів активності з Н2-Орі на основі ЕКЕТ. У таблиці показані результати З незалежних експериментів, а також середнє та стандартне відхилення (Ст. відх.). У цих експериментах використовували аналіз швидкості (ВФО)/сС).
На ФІГ. 228 наведений графік, який зображає типовий графік результатів аналізу активності з Н2-Орі з використанням рекомбінантного НігАї, описаного на Фіг. 22А. Умови аналізу включають 400 пМ НІГАЇТ та 2,5 мкМ субстрату. Буферний розчин складався з 50 мМ Трис, 200 мМ масі, 0,25 95 СНАРБ, рН 8,3. Ці дані отримані із другого повторення трьох незалежних експериментів з Фіг. 22А.
На ФІГ. 23А-230 наведені графіки, які зображають результати аналізів активності з Н2-Орі для вказаних форм варіантів антитіла пП15Нб, проаналізовані з використанням підходу з визначенням швидкості ВФО/с. На графіках показано відсоткове значення контролю (ВФО)/5) у вигляді залежності концентрації (НМ) антитіла для моноклонального антитіла (тАбБ) до пП15Н6б.м4 (Фіг. 23А), позитивного контролю антитіла проти НігАї (дос МУУУ5О5.94А, див., наприклад, УМО 2013/055998) (Фіг. 238), баб п15Нб.ма4 (Фіг. 23С) та Бар 15Н6.м2 (Фіг. 2303. На таблиці біля кожного графіка для кожного аналізу показані ІС50, діапазон У, коефіцієнт нахилу та фонове значення.
На ФІГ. 23Е-23Н наведені графіки, які зображають результати аналізів активності з Н2-Орі для вказаних форм варіантів антитіла п15Нб, проаналізовані з використанням підходу з визначенням кінцевої точки (ВФО). На графіках показано відсоткове значення контролю
Зо (8ФО/5) у вигляді залежності концентрації (НМ) антитіла для Мар Ідс п15Н6б.м4 (Фіг. 23Е), позитивного контролю антитіла проти НІГА1 (дос УУУБоО5.94А) (Фіг. 23), Бар п1Т5Нб.ма (Фіг. 235) та Бар 15Н6.м2 (Фіг. 23Н). На таблиці біля кожного графіка для кожного аналізу показані ІС50, діапазон У, коефіцієнт нахилу та фонове значення.
На ФІГ. 24А-24В наведені таблиці, на яких показані результати ІС50 (фіг. 24А) та ІС9О (Фіг. 248) для вказаних форм варіантів антитіла п15Нб з першої вибірки трьох незалежних експериментів. Значення ІС5О визначали з використанням 4-х параметричних функцій апроксимації. Значення ІС9О визначали за значенням ІС5О та коефіцієнтами нахилу функцій апроксимації. Експеримент І відповідає даним, показаним на Фіг. 23А-23Е. КВ 95, коефіцієнт варіації. Дані аналізували з використанням підходу з визначенням швидкості (ВФО/с).
На ФІГ. 25А-25В8 наведені таблиці, на яких показані результати ІС50 (Фіг. 25А) та ІС9О (Фіг. 258) для вказаних форм варіантів антитіла й15Нб з другої вибірки трьох незалежних експериментів. Значення ІС5О визначали з використанням 4-х параметричних функцій апроксимації. Значення ІС9О визначали за значенням ІС5О та коефіцієнтами нахилу функцій апроксимації. Дані аналізували з використанням або підходу з визначенням швидкості (ВФО/с), або підходу з визначенням кінцевої точки (ВФО).
На ФІГ. 26А наведений графік, який зображає криву титрування інтактного а-казеїну.
Експериментальна концентрація зображена у вигляді залежності від теоретичної концентрації при використанні метода добавок. Коефіцієнт кореляції (К2) склав 0,999.
На ФІГ. 268 наведений графік, який зображає результати аналізу активності НІГА1 на основі мас-спектрометрії. Здатність АРЕС.ІС3.НСОСЗ (п15Н6.м4) інгібувати активність Ніга1-РО оцінювали як описано у прикладі 3, розділ з. Низькомолекулярний інгібітор исї-101 слугував як позитивний контроль.
На ФІГ. 27А-27В наведені графіки, які зображають результати двох незалежних аналізів активності ендогенного НІГА1, експеримент І (Фіг. 27А) та експеримент ІІ! (Фіг. 278). Для кожного
Еар антитіла Мо 1 та Мо 2 вказані окремі серії розведення одного й того ж антитіла з окремо приготованими початковими розведеннями. Серії двох розведень аналізували на одному і тому ж планшеті з іншими реактивами, приготованими для одного й того ж препарату.
На ФІГ. 27С наведена таблиця, на якій узагальнені результати аналізів активності ендогенного НІГАТ, зображені на Фіг. 27А та 278. бо На ФІГ. 28 наведена таблиця, на якій узагальнені кінетичні властивості зв'язування та інгібуюча активність вказаних варіантів Бар йп15Нб.м2 та похідних. УМУУ5О05.94а.28 (див., наприклад, М/О 2013/055998) служило як позитивний контроль. Усі варіанти та похідні Бар
П15Н6 показали покращення афінності та покращення активності у порівнянні з Бар
УМІ505.94а2.28, Бар п15Н6б.м4, демонструючи приблизно 30-разове покращення афінності у порівнянні з цим антитілом.
На ФІГ. 29А зображена амінокислотна послідовність людського НІігА1. Зріла послідовність зображена великими літерами, протеазний домен підкреслений, а залишки М224 та К248 затемнені.
На ФІГ. 298 зображена амінокислотна послідовність мишачого НІгА1. Зріла послідовність зображена великими літерами, а протеазний домен підкреслений.
На ФІГ. 30 зображено вирівнювання варіабельних доменів легкого та важкого ланцюга еталонного антитіла проти фактора О (ДТ, дикого типу) та його вибрані варіанти. НУК всередині варіабельних доменів підкреслені. Заміни залишків у варіантах зображені жирним шрифтом.
На ФІГ. 31А-31В зображено зв'язування Бар УМ/505.94 (як описано в УМО 2013/055998) з
НІГАТ. Коли амінокислоти, позначені на Фіг. З1А, замінюють аланіном, то афінність зв'язування
Еаб 505.94 для білка, який мутував, знижується. Структура, зображена на Фіг. 318, створена з використанням електронної мікроскопії, як описано в Сіїе!ті еї аї. (2015) Віоспет. У). 472(2):169- 81. Колом зображений епітоп бар Ууу505.94 на білку НІГАТ. Раб УУУ505.94 зв'язується з петлями
В та С білка НІГА1.
На ФІГ. 32А-32В зображено зв'язування Бар 15Н6.м4 з НІГА1 та показано, що епітоп НІГАТ, зв'язаний Бар 15Н6.м4, відрізняється від епітопа, зв'язаного Бар УУУ5О05.94. На Фіг. 32А зображена взаємодія між Бар 15Н6.м4 та його епітопом на білку НІГАТ, як визначено рентгенівською кристалографією. Бар 15Н6б.м4 зв'язується з ГА-петлею білка НІГАТ (див., наприклад, Сіала Р еї аї. (2015) Р о5 Опе 10(6):60131142). Структура, зображена на Фіг. 328, створена з використанням електронної мікроскопії. Колом зображений епітоп баб 15Н6У.4 на білку НІГА1.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Ї. ВИЗНАЧЕННЯ
У контексті цього документу термін "близько" відноситься до звичайного діапазону помилки
Зо для відповідного значення, легко зрозумілому фахівцю у цій технічній сфері. У цьому документі посилання на "близько" щодо значення або параметра включає (й описує) варіанти реалізації, які стосуються цього значення або параметра, як таких. "Акцепторна людська каркасна ділянка" для цілей цього винаходу являє собою каркасну ділянку, яка містить амінокислотну послідовність каркаса варіабельного домена легкого ланцюга (МІ) або каркаса варіабельного домена важкого ланцюга (МН), що походить від каркаса імуноглобуліну людини або консенсусної послідовності каркаса людини, як вказано нижче.
Акцепторна людська каркасна ділянка "що походить від" каркаса імуноглобуліну людини або консенсусної послідовності каркаса людини може мати таку ж амінокислотну послідовність, як у них, або може містити зміни в амінокислотній послідовності. У деяких варіантах реалізації винаходу кількість амінокислотних змін складає 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, 6 або менше, 5 або менше, 4 або менше, З або менше, або 2 або менше. У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність акцепторної каркасної ділянки МІ. людини ідентична послідовності каркасної ділянки МІ імуноглобуліну людини або консенсусної послідовності каркаса людини. "Активний" або "активність", або "біологічна активність" у контексті антитіла за цим винаходом являє собою здатність діяти антагоністично (частково або повністю інгібувати) по відношенню до біологічної активності своїх мішеней, наприклад, іп міїго та/або іп мімо. Одним прикладом біологічної активності антитіла є здатність досягати вимірюваного покращення стану, наприклад патології, порушення, зв'язаного з мішенню антитіла. Наприклад, для антитіла проти
НІГАТ порушення може представляти собою пов'язане з НІГАТ порушення, таке як, наприклад,
ВМД (наприклад, географічна атрофія). Активність антитіла проти НіІГАї можна визначати у дослідженнях іп міїго або іп мімо, включаючи аналізи зв'язування, аналізи активності (наприклад, аналізи активності на основі ЕКЕТ (наприклад, з використанням субстрату Н2-Орі) або аналізи активності на основі мас-спектрометрії), використовуючи релевантну модель на тваринах або клінічні дослідження на людях. В іншому прикладі для антитіла проти фактора О (наприклад, антитіла проти НігА1ї/фактора 0) порушення може бути пов'язаним з комплементом порушенням, таким як, наприклад, пов'язана з комплементом хвороба ока. Активність антитіла проти фактора Ю можна визначати у дослідженнях іп мйго або іп мімо, включаючи аналізи зв'язування, аналізи з альтернативним шляхом гемолізу (наприклад, аналізи вимірювання бо інгібування або активації альтернативного шляху активності комплементу), використовуючи релевантну модель на тваринах або клінічні дослідження на людях. "Афінність" відноситься до сили сумарних загальних нековалентних взаємодій між одиночним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитіла) та його партнером за зв'язування (наприклад, антигеном). У контексті цього документа, якщо не вказане інше, "афінність зв'язування" відноситься до притаманній молекулі афінності зв'язування, що відображає взаємодію між учасниками пари зв'язування (наприклад, антитілом та антигеном) при їх співвідношенні 1:11. Афінність молекули Х до її партнера У, загалом, можна виразити константою дисоціації (КО). Афінність можна вимірювати загальноприйнятими методами, відомими у цій галузі техніки, у тому числі описаними у цьому документі. Конкретні ілюстративні та типові варіанти реалізації винаходу, зв'язані з вимірюванням афінності зв'язування, описані у цьому документі далі. "Афінність визрілого" антитіла відноситься до антитіла з однією або більше модифікаціями в одній або більше гіперваріабельних ділянок (НМК) та/або каркасних ділянок (ЕК) у порівнянні з вихідним антитілом, яке не містить таких модифікацій, причому такі модифікації призводять до покращення афінності антитіла до антигена.
Терміни "антитіло проти НігАї" або "антитіло, яке специфічно зв'язується з НІГАТ" відноситься до антитіла, здатного зв'язуватися НІГА1 з достатньою афінністю, такою що вказане антитіло можна використовувати як діагностичний та/або терапевтичний засіб при цільовому впливі на НІГАТ1. В одному варіанті реалізації винаходу ступінь зв'язування антитіла проти НІігА1 з нерелевантним білком, що не є НІГАТ, складає менше близько 10 95 зв'язування антитіла з
НІГАТЇ при вимірюванні, наприклад, методом радіоіїмуноаналізу (РІА). У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло, яке зв'язується з НІГАТ, має константу дисоціації (КО) 2-1 мкМ, -100 НМ, 210 НМ, 51 НМ, 50,1 НМ, 50,01 нМ або - 0,001 нМ (наприклад, 108 М або менше, наприклад, від 108 М до 10-3 М, наприклад, від 109 М до 10-33 М). У деяких варіантах реалізації антитіло проти НІГА1 зв'язується з епітопом НІГАт, який є консервативним серед НІГА1 різних видів тварин. Антитіло проти НігАї може бути, наприклад, будь-яким антитілом проти НІГгГА1, описаним у цьому документі або у міжнародній публікації заявки на патент Мо УМО 2013/055998, яка включена у цей документ у повному обсязі як посилання.
Терміни "антитіло проти фактора ОО" або "антитіло, яке специфічно зв'язується з Ю" відноситься до антитіла, здатного зв'язувати фактор Ю з достатньою афінністю, такою що вказане антитіло можна використовувати як діагностичний та/або терапевтичний засіб при цільовому впливі на фактор О, наприклад, таким чином щоб інгібувати або в основному знижувати активацію комплементу. В одному варіанті реалізації винаходу ступінь зв'язування антитіла проти фактора Ю з нерелевантним білком, що не є фактором О, складає менше близько 10 95 зв'язування антитіла з фактором О при вимірюванні, наприклад, методом РІА. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло, яке зв'язується з фактором 0, має константу дисоціації (КО) 51 мкМ, 5100 НМ, 510 НМ, 51 НМ, 50,1 НМ, 5 0,01 нМ або 5 0,001 нм (наприклад, 109 М або менше, наприклад, від 102 М до 10-73 М, наприклад, від 1079 М до 10-73 М).
У деяких варіантах реалізації антитіло проти фактора О зв'язується з епітопом фактора 0, який є консервативним серед факторів О різних видів тварин. Антитіло проти фактора Ю може бути будь-яким антитілом проти фактора 0, описаним у цьому документі та/або у патентах США Мо 8067002; 8273352 та 8268310; та заявці на патент США Мо 14/700853, кожен з яких включено у цей документ у повному обсязі як посилання.
Термін "антитіло" у цьому документі використовується у самому широкому розумінні та охоплює різні структури антитіл, включаючи, але не обмежуючись ними, моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) та фрагменти антитіл, за умови, що вони проявляють потрібну антигензв'язуючу активність. "Фрагмент антитіла" відноситься до молекули, яка не є інтактним антитілом, але є такою, що містить частину інтактного антитіла та зв'язуючий антиген, з яким зв'язується інтактне антитіло.
Приклади фрагментів антитіл включають, але не обмежуються ними, Ем, Бар, Бар", Рар'-5Н,
Каб')г; діатіла; лінійні антитіла; молекули одноланцюгових антитіл (наприклад, 5сЕм) та мультиспецифічні антитіла, утворенні з фрагментів антитіл.
При розщеплені антитіл папаїном утворюються два ідентичні антигензв'язуючі фрагменти, які називають фрагментами Раб, і фрагмент Ес, що залишається, назва якого відображає його здатність легко кристалізуватися. Фрагмент Рар складається з цілого легкого (І) ланцюга разом з доменом варіабельної ділянки важкого (Н) ланцюга (МН) та першим константним доменом з одного важкого ланцюга (СНІ). Обробка антитіла пепсином дає єдиний великий фрагмент
Кар")г2, який умовно відповідає двом зв'язаним дисульфідами фрагментам Раб, які мають дивалентну антигензв'язуючу активність та ще здатні до перехресного зв'язування антигена. 60 Фрагменти Рар" відрізняються від фрагментів Рарб тим, що мають кілька додаткових залишків на карбоксильному кінці домена СНІ, включаючи один або більше цистеїнів з шарнірної ділянки антитіла. У цьому документі Баб'-ЄЗН являє собою позначення ГРар", в якому цистеїновий (-і) залишок (-ки) константних доменів несе (несуть) вільну тиольну групу. Фрагменти Е(аб")2 антитіл спочатку отримували у вигляді пар фрагментів Бар", між якими знаходились шарнірні залишки цистеїну. Відомі також інші варіанти хімічного зв'язування фрагментів антитіл.
Термін "Рс-ділянка" у цьому документі використовується для позначення С-кінцевої ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, який містить щонайменше частину константної ділянки. Цей термін включає нативну послідовність Ес-ділянок та варіанти Ес-ділянок. В одному варіанті реалізації винаходу Ес-ділянка важкого ланцюга дб людини проходить від Суб5226 або від
Рго230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Однак Ес-ділянка може містити С-кінцевий лізин (Гуз447) або не містити його. Якщо у цьому документі не вказане інше, нумерація амінокислотних залишків у Ес-ділянці або константній ділянці відповідає системі ЕО-нумерації, що також називають ЕШ-індексом, описаній в Кабаї еї аІ., Зедоепсез ої Ргоїеїп5 ої Іттипо|одісаї
Іптегеві, Бій Ед. Рибіїс Неацй Зегуісе, Майопаї! Іпвійшез ої Неайй, ВешШезаа, МО (1991). "Ру" складається з димера одного домена варіабельної ділянки важкого ланцюга та одного домена варіабельної ділянки легкого ланцюга, з'єднаних жорстким нековалентним зв'язком. У результаті фолдінгу цих двох доменів виділяється шість гіперваріабельних петель (по З петлі з кожного ланцюга Н та І), які надають амінокислотні залишки для зв'язування антигенів та надають антитілу антигензв'язуючу специфічність. Тим не менш навіть один варіабельний домен (або половина Ем, яка містить лише три НМК, специфічні по відношенню до антигена) має здатність розпізнавати та зв'язувати антиген, хоча часто й з більш низькою афінністю, ніж повна ділянка зв'язування. "Одноланцюгові Ем", що також мають абревіатуру 5Ем або 5сЕм, являють собою фрагменти антитіл, які містять домени антитіл МН та МІ, зв'язані в один поліпептидний ланцюг. Переважно, поліпептид 5СЕм додатково містить поліпептидний лінкер між доменами МН та Мі, які дають можливість 5сЕм утворювати потрібну структуру для зв'язування антигенів. Для огляду 5СЕм див.
РінсКійтип у Те РІіаптасоіоду ої Мопосіопа! Апііродієб5, моЇ. 113, Нозепригу апа Мооге еєав5.,
Зргіпде!-Мепйад, Мем МогК, рр. 269-315 (1994).
Термін "діатіла" відноситься до малих фрагментів антитіл, отриманих конструюванням
Зо фрагментів 5Ем (див. попередній параграф) з такими короткими лінкерами (близько 5-10 залишків) між доменами МН та Мі, щоб досягалось спарювання М-доменів між ланцюгами, але не всередині ланцюгів, яке призводить до отримання бівалентного фрагмента, тобто фрагмента, який має два антигензв'язуючих сайти. Біспецифічні антитіла являють собою гетеродимери двох "перехресних" фрагментів 5Ем, в яких домени МН та Мі двох антитіл наведені на різних поліпептидних ланцюгах. Діатіла детальніше описані, наприклад, в ЕР 404097; МО 93/11161 та Ноїїпдег єї аї., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА, 90: 6444-6448, 1993). "Блокуючим" антитілом або антитілом-«антагоністом" є таке антитіло, яке інгібує або зменшує біологічну активність зв'язуваного їм антигена. Деякі блокуючі антитіла або антитіла- антагоністи практично або повністю інгібують біологічну активність антигена. "Антитіло, яке зв'язується з тим же епітопом" як еталонне антитіло, відноситься до антитіла, яке контактує з набором, що перекривається, амінокислотних залишків антигена у порівнянні з еталонним антитілом або блокує зв'язування еталонного антитіла з його антигеном у конкурентному аналізі на 50 95 або більше. Можна визначати амінокислотні залишки антитіла, які контактують з антигеном, наприклад, шляхом визначення кристалічної структури антитіла у комплексі з антигеном або шляхом виконання аналізу обміну атомів водню/дейтерію. У деяких варіантах реалізації винаходу залишки антитіла, яке знаходиться у межах 5 А від антигена, вважаються такими, що контактують з антигеном. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло, яке зв'язується з тим же епітопом, що й еталоне антитіло, блокує зв'язування еталонного антитіла з його антигеном у конкурентному аналізі на 50 95 або більше, та навпаки, еталоне антитіло блокує зв'язування антитіла з його антигеном у конкурентному аналізі на 50 95 або більше. Ілюстративний конкурентний аналіз наведений у цьому документі.
Термін "химерне" антитіло відноситься до антитіла, в якому частина важкого та/або легкого ланцюга походить від конкретного джерела або виду тварини, у той час як інша частина важкого та/або легкого ланцюга походить від іншого джерела або виду тварини. "Клас" антитіла відноситься до типу константного домена або константної ділянки його важкого ланцюга. Існує п'ять основних класів антитіл: ІА, дО, ІДЕ, дс та ІМ, та деякі з них додатково діляться на підкласи (ізотипи), наприклад, Ідс:, ІдСі2, ІдСз, ІдСя, ІДАї та ІдА».
Константні домени важкого ланцюга, що відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються, відповідно, а, б, є, у, та р. бо Термін "ефекторні функції" відноситься до тих видів біологічної активності, притаманній Ес-
ділянці антитіла, які змінюються в залежності від ізотипу антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіл включають в себе: зв'язування С1д та комплемент-залежну цитотоксичність (КЗЦ); зв'язування рецептора Ес; антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (АЗКЦ); фагоцитоз; знижуючу регуляцію рецепторів поверхні клітини (наприклад, рецептора В- клітин) та активацію В-клітин.
Термін "каркас" або "каркасна ділянка" або "ЕК" відноситься до залишків варіабельного домена, за виключенням залишків гіперваріабельної ділянки (НУК). ЕК варіабельного домена звичайно складається з чотирьох доменів ЕК: ЕК, ЕК2, ЕКЗ та ЕКА4.
Терміни "повнорозмірне антитіло", "інтактне антитіло" та "ціле антитіло" у цьому документі є взаємозамінними та відносяться до антитіла, структура якого практично аналогічна структурі нативного антитіла, або яке містить важкі ланцюги, що містять Ес-ділянку, описану у цьому документі.
Термін "шарнірна ділянка" у цілому визначається як протяжність, що займає залишки 216- 238 (нумерація ЕО) або 226-251 (нумерація Кабата) (901 людини. Шарнір можна додатково розділяти на три різних ділянки, верхній, середній (наприклад, основний) та нижній шарнір. У деяких варіантах реалізації винаходу шарнірна ділянка антитіла ІДС! людини у цілому наведена наступним чином.
Верхній шарнір містить амінокислоти у послідовності ЕРК5СОКТНТ (ЗЕО ІО МО: 157). У деяких варіантах реалізації винаходу верхній шарнір містить амінокислоти у положеннях 216- 225 (нумерація ЕУ) або 226-238 (нумерація Кабата).
Середній (наприклад, основний) шарнір містить амінокислоти у послідовності СРРС (ЗЕО ІЮ
МО: 122). У деяких варіантах реалізації винаходу основний шарнір містить амінокислоти. у положеннях 226-229 (нумерація Е)) або 239-242 (нумерація Кабата).
Нижній шарнір містить амінокислоти у послідовності РАРЕ ССР (5ЕБО ІО МО: 158). У деяких варіантах реалізації винаходу нижній шарнір містить амінокислоти у положеннях 230-238 (нумерація ЕУ) або 243-251 (нумерація Кабата). "Антитіло людини" являє собою антитіло з амінокислотною послідовністю, що відповідає послідовності антитіла, продукованого в організмі людини або клітині людини, або такого, яке походить з джерела, що не є людиною, що використовує репертуари антитіл людини або інші послідовності, що кодують антитіла людини. Це визначення антитіла людини, зокрема, не включає гуманізоване антитіло, яке містить антигензв'язуючі залишки нелюдського походження. "Консенсусний каркас людини" є каркасом, який представляє найбільш поширені амінокислотні залишки у вибірці каркасних послідовностей МІ. або МН імуноглобуліну людини.
Звичайно вибір послідовностей МІ або МН людського імуноглобуліну здійснюють з підгрупи послідовностей варіабельного домена. Звичайно підгрупа послідовностей являє собою підгрупу за Кабаї єї аІ., Зедиепсев ої Ргоївїн5 ої Іттипоіодіса! Іпієегеві, БИ Еадйіоп, МІН Рибіїсайоп 91- 3242, ВеіШезаа МО (1991), моіб5. 1-3. В одному варіанті реалізації винаходу для МІ. підгрупа являє собою підгрупу капа І, згідно Кабаї еї аІ., вище. В одному варіанті реалізації винаходу для
МН підгрупа являє собою підгрупу ПІ, згідно Кабаї єї аї., вище. "Гуманізовані" форми нелюдських (наприклад, гризуна) антитіл являють собою химерні антитіла, які містять мінімальну послідовність, що походить з нелюдського антитіла. У більшості випадків гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (антитіло-реципієнт), в яких залишки гіперваріабельної ділянки реципієнта заміщені залишками гіперваріабельної ділянки видів, відмінних від людини (антитіло-донор), таких як миші, щура, кролика або нелюдського примата, які мають бажану специфічність, афінність та ефективність. У деяких випадках залишки ЕК імуноглобуліну людини заміняють відповідними залишками нелюдського походження. Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які відсутні в антитілі- реципієнті або в антитілі-донорі. Ці модифікації можна виконувати для подальшого покращення ефективності антитіла. Загалом, гуманізоване антитіло буде містити практично всі з щонайменше одного, а звичайно двох варіабельних доменів, в яких всі або практично всі гіперваріабельні петлі відповідають таким ділянкам імуноглобуліну нелюдського походження, а всі або практично всі ЕК відповідають таким ділянкам послідовності імуноглобуліну людини.
Гуманізоване антитіло також не обов'язково буде містити щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну (Ес), що звичайно походить з імуноглобуліну людини. Більш детально, див. допе5 еї аї., Майте 321:522-525 (1986); Ніесптапп еї аї., Майте 332:323-329 (1988) та
Ргезіа, Ситт. Ор. зігисі. Віо!. 2:593-596 (1992).
Термін "варіабельний" відноситься до того факту, що серед антитіл деякі сегменти варіабельних доменів сильно різняться за послідовностями. Варіабельний або М-домен опосередковує антигенне зв'язування та визначає специфічність конкретного антитіла до свого бо конкретного антигена. У той же час мінливість не рівномірно розподілена по довжині варіабельних доменів. Замість цього, М-ділянки складаються з відносно інваріантних проміжків, які називають каркасні ділянки (ЕК), з 15-30 амінокислот, розділених більш короткими ділянками з надзвичайною варіабельністю, що називають "гіперваріабельні ділянки", які складають у довжину 9-12 амінокислот кожна. Термін "гіперваріабельна ділянка" або НМР, коли використовується у цьому документі, відноситься до амінокислотних залишків антитіла, які відповідають за зв'язування антигена. Гіперваріабельна ділянка звичайно містить амінокислотні залишки з, наприклад, приблизно близько 24-34 (І 1), 50-56 (І 2) та 89-97 (І 3) залишків в МІ. та приблизно близько 26-35 (НІ), 49-65 (Н2) та 95-102 (НЗ) залишків в МН (в одному варіанті реалізації винаходу, Ні складається з приблизно близько 31-35 залишків); Кабаї еї аї.,
Зедиеєпсез ої Ргоївіпв ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, Бій Еа. Рибіїс Неайй Зегмісе, Маїйопаї! Іп5ійшев ої
Неак, ВеїШезаа, МО. (1991)) та/або цих залишків з "гіперваріабельной петлі" (наприклад, залишки 26-32 (І 1), 50-52 (І 2) та 91-96 (І 3) в МІ, та 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) та 96-101 (НЗ) - в МН;
СпоїШтіа апа І евзкК, у). Мої. Вісі. 196:901-917 (1987). Кожний з варіабельних доменів нативних важких та легких ланцюгів містить чотири ЕК, переважно таких, що приймають конфігурацію бета-листка, з'єднаних трьома гіперваріабельними ділянками, які утворюють петлі, що з'єднують структуру бета-листка, а у деяких випадках - утворюють її частину. Гіперваріабельні ділянки кожного ланцюга утримуються разом у безпосередній близькості за допомогою ЕЕ та, з гіперваріабельними ділянками з іншого ланцюга, приймають участь в утворенні антигензв'язуючого сайта антитіл (див. Кабаї еї аЇ., бедиепсев5 ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодісаї!
Іпіїегеві, 5БІШй Ед. Рибіїс Неанй Зегуісе, Маїййопа! Іпбійшев ої Неапйй, Веїйпезаа, МО. (1991)).
Відповідно, послідовності НУЕ та ЕЕ у складі МН (або МІ) звичайно розташовуються у наступній послідовності: ЕК1-НІ(11)-ЕН2-На(І 2)-ЕНЗ-НЗ(І 3)-ЕК4. Константні домени не приймають безпосередньої участі у зв'язуванні антитіла з антигеном, однак проявляють різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в антитілозалежній клітинній токсичності (АЗКЦ).
Термін "нумерація залишків варіабельних доменів за Кабатом", "амінокислотні залишки за
Кабатом" або "нумерація положень амінокислот за Кабатом" та їх варіації, відносяться до системи нумерації що використовують для варіабельних доменів важкого ланцюга або варіабельних доменів легкого ланцюга, компіляції антитіл в Кабаї єї аІ., вище. Використовуючи цю систему нумерації, фактична лінійна амінокислотна послідовність може містити менше
Ко) амінокислот або додаткові амінокислоти, відповідні усіченню ЕЕ або НУК варіабельного домена або вставці до них. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може містити одну амінокислотну вставку (залишок 52а за Кабатом) після залишку 52 Н2 та вставленні залишки (наприклад, залишки 82а, 825 та 82с тощо за Кабатом) після залишку 82 ЕК важкого ланцюга.
Для цього антитіла нумерацію залишків за Кабатом можна визначати шляхом вирівнювання ділянок гомології послідовності антитіла зі "стандартною" послідовністю, пронумерованою за
Кабатом.
Система нумерації Кабата звичайно використовується для позначення залишку у варіабельній ділянці (приблизно залишки 1-107 легкого ланцюга та залишки 1-113 важкого ланцюга) (наприклад, Кабаї еї аЇ., Зедоепсев ої Іттипоіодіса! Іпіегеві. БІй Ей. Рибіїс Неайн зегмісе, Майопаї Іпоійшев5 ої Неакп, Вемпезада, Ма. (1991)). Загалом, "система нумерації ЕЮО" або "індекс ЕО" використовується, коли мова йде про залишок у константній ділянці важкого ланцюга імуноглобуліну (наприклад, індекс ЄЮ, описаний в КаБбаї еї аї., вище). "Індекс БЮ за
Кабатом" відноситься до нумерації залишків антитіла ЄЮ Ід1 людини. Якщо у цьому документі не вказано інше, посилання на номери залишків у варіабельному домені антитіл позначають нумерацію залишків за системою нумерації Кабата. Якщо у цьому документі не вказано інше, посилання на номери залишків у константному домені антитіл позначають нумерацію залишків за системою нумерації ЄЮ (наприклад, див. попередню заявку США Мо 60/640,323, фігури з нумерацією ЕМ).
Якщо не вказане інше, залишки НУ. та інші залишки у варіабельному домені (наприклад, залишки ЕК) у цьому документі нумерують за КарБбаї еї аї., вище. "Імунокон'югат" являє собою антитіло, кон'юЮюговане з однією або більше гетерологічними молекулами, включаючи, але не обмежуючись цитотоксичним засобом.
Термін "виділене антитіло", коли використовується для опису різних антитіл, описаних у цьому документі, позначає антитіло, яке ідентифіковане та відділене та/або виділено з клітини або культури клітин, в якій воно експресоване. Контамінуючі компоненти природного оточення являють собою речовини, які, як правило, можуть заважати діагностичному або терапевтичному застосуванню поліпептиду, та можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини. У деяких варіантах реалізації антитіло є очищеним до більш ніж 95 95 або 99 95 чистоти, яка визначається, наприклад, за допомогою методів електрофорезу (наприклад, бо електрофорезу у ДСН-ПААГ, ізоелектричного фокусування (ІЕФ), капілярного електрофорезу)
або хроматографії (наприклад, іонообмінної або обернено-фазної ВЕРХ). Огляд методів оцінки чистоти антитіл див., наприклад, в ЕіІайтап еї аїЇ.,, ). СПготайодг. В 848:79-87 (2007). У переважних варіантах реалізації винаходу антитіло буде очищене (1) до ступеня, достатнього для отримання щонайменше 15 залишків на М-кінцевій або внутрішній амінокислотній послідовності шляхом використання секвенатора з чашкою, що обертається, або (2) до гомогенності, отриманої методом ДСН-ПААГ електрофорезу у невідновлювальних або відновлювальних умовах, використовуючи забарвлення Кумасі синім або, переважно, сріблом.
Виділене антитіло включає антитіла, отримані іп 5їш всередині рекомбінантних клітин, оскільки щонайменше один компонент з поліпептидного природного оточення буде відсутнім. У той же час, виділений поліпептид звичайно буде отриманий з використанням щонайменше однієї стадії очищення.
Термін "моноклональне антитіло" у цьому документі відноситься до антитіла, отриманого з популяції практично гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними та/або зв'язують один і той же епітоп, за виключенням можливих варіантних антитіл, наприклад, таких, що містять мутації природного походження або мутації, які виникають під час продукції при отриманні моноклонального антитіла, причому такі варіанти звичайно присутні у незначних кількостях. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які звичайно містять різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло препарату моноклонального антитіла спрямоване проти однієї детермінанти на антигені. Таким чином, модифікатор "моноклональне" вказує на те, що антитіло отримане з практично гомогенної популяції антитіл; та його не слід інтерпретувати як вимогу до продукції антитіла за допомогою певного конкретного способу. Наприклад, моноклональні антитіла для використання за цим винаходом можна отримувати за допомогою різних способів, включаючи, але не обмежуючись ними, гібридомну методику, методики рекомбінантних ДНК, методики фагового дисплея та методики з використанням трансгенних тварин, що повністю або частково містять локуси людських імуноглобулінів, причому такі способи та інші типові способи отримання моноклональних антитіл описані у цьому документі.
Термін "мультиспецифічне антитіло" використовується у самому широкому розумінні та конкретно охоплює антитіло, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) та
Зо варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), причому одиниця МН-МІ| має поліепітопну специфічність (тобто здатна зв'язуватися з двома різними епітопами на одній біологічній молекулі або кожним епітопом на різних біологічних молекулах). Такі мультиспецифічні антитіла включають, але не обмежуються ними, повнорозмірні нтитіла, антитіла, що мають два або більше доменів Мі. та МН, фрагменти антитіл, такі як Раб, Ем, а5Ем, 5сЕм, діатіла, біспецифічні антитіла та тріатіла, фрагменти антитіл, які зв'язані ковалентно або нековалентно. "Полієпітопна специфічність" передбачає здатність специфічно зв'язуватися з двома або більше різними епітопами на одній і тій же або відмінній (-их) мішені (-ях). "Подвійна специфічність" або "біспецифічність" відноситься до здатності специфічно зв'язуватися з двома різними епітопами на одній і тій же або відмінній (-их) мішені (ях). Однак на відміну від біспецифічних антитіл, антитіла з подвійною специфічністю містять два антигензв'язуючих плеча, ідентичних за амінокислотною послідовністю, та кожне Бар-плече здатне до розпізнавання двох антигенів.
Подвійна специфічність дає можливість антитілам взаємодіяти з високою афінністю з двома різними антигенами як одна молекула Раб або Ідо. У відповідності з одним варіантом реалізації винаходу мультиспецифічне антитіло у формі Ідс1 зв'язується з кожним епітопом з афінністю від 5 МКМ до 0,001 пМ, від З мкМ до 0,001 пМ, від 1 мкМ до 0,001 пМ, від 0,5 мкМ до 0,001 пмМ або від 0,1 мкМ до 0,001 пМ. Термін "моноспецифічний" відноситься до здатності зв'язувати лише один епітоп.
Термін "нативні антитіла" відноситься до молекул імуноглобулінів природного походження, що мають різні структури. Наприклад, нативні антитіла (Дб являють собою гетеротетрамерні глікопротетни з молекулярною масою близько 150000 Дальтон, які складаються з двох ідентичних легких ланцюгів та двох ідентичних важких ланцюгів, з'єднаних дисульфідними зв'язками. У напрямку від М- до С-кінця кожний важкий ланцюг містить варіабельну ділянку (МН), що також називають варіабельним важким доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, яка супроводжується трьома константними доменами (СНІ, СН2 та СНЗ). Аналогічним чином, у напрямку від М- до С-кінця кожен легкий ланцюг містить варіабельну ділянку (М), що також називають варіабельним легким доменом або варіабельним доменом легкого ланцюга, яка супроводжується константним легким (С!) доменом. У залежності від амінокислотною послідовності свого константного домена легкий ланцюг антитіла можна віднести до одного з двох типів, яких називають капа (к) та лямбда (А). бо Стосовно зв'язування антитіла з молекулою-мішенню, термін "специфічне зв'язування" або
"специфічно зв'язується з" або є "специфічним до" конкретного поліпептиду або епітопа на конкретній поліпептидній мішені означає зв'язування, яке вимірювано відрізняється від неспецифічної взаємодії. Специфічне зв'язування може бути виміряно, наприклад, визначенням зв'язування молекули у порівнянні зі зв'язуванням контрольної молекули. Наприклад, специфічне зв'язування може визначатися конкуренцією з контрольною молекулою, яка має подібність до мішені, наприклад, при надлишку неміченої мішені. У цьому випадку специфічне зв'язування показує чи може зв'язування міченої мішені із зондом повністю інгібуватися надлишком неміченої мішені. Термін "специфічне зв'язування" або "специфічно зв'язується з" або є "специфічним до" конкретного поліпептиду або епітопа на конкретній поліпептидній мішені, як використовується у цьому документі, може бути проілюстрованим, наприклад, молекулою, що має КО для мішені 107 М або нижче, альтернативно 105 М або нижче, альтернативно 105 М або нижче, альтернативно 107 М або нижче, альтернативно 108 М або нижче, альтернативно 107 М або нижче, альтернативно 10-79 М або нижче, альтернативно 10-!!
М або нижче, альтернативно 10-2 М або нижче, або КО у діапазоні від 102 М до 105 М, або від 105 М до 1079 М, або від 107 М до 107 М. Як буде ясно фахівцю у цій галузі техніки, значення афінності та КО зв'язані оберненою залежністю. Висока афінність для антигена вимірюється низьким значенням КО. В одному варіанті реалізації винаходу термін "специфічне зв'язування" відноситься до зв'язування, при якому молекула зв'язується з конкретним поліпептидом або епітопом на конкретному поліпептиді без суттєвого зв'язування з будь-яким іншим поліпептидом або поліпептидним епітопом. "Виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло" відноситься до однієї або більше молекул нуклеїнової кислоти, яка кодує важкі та легкі ланцюги антитіла (або їх фрагменти), включаючи таку (-ї) молекулу (-и) нуклеїнової кислоти у складі одного вектора або окремих векторів та таку (-ї) молекулу (-и) нуклеїнової кислоти, яка присутня (-ї) в одному або кількох місцях у клітині- хазяїні. У деяких варіантах реалізації нуклеїнова кислота кодує антитіло проти НІГА1. В інших варіантах реалізації винаходу нуклеїнова кислота може кодувати антитіло проти фактора 0 (наприклад, антитіло проти НігГАТ/фактора 0).
Як використовується у цьому документі термін "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної забезпечувати репродукцію іншої, зв'язаної з нею нуклеїнової кислоти. Термін
Зо включає вектор, що знаходиться у вигляді структури нуклеїнової кислоти, що самореплікується, а також вектор, введений до геному клітини-хазяїна, в яку його ввели. Деякі вектори здатні керувати експресією нуклеїнових кислот, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори у цьому документі називаються "експресійними векторами".
Терміни "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяїв" та "культура клітин-хазяїв" у цьому документі використовуються взаємозамінно та відносяться до клітин, в які введена екзогенна нуклеїнова кислота, включаючи потомство таких клітин. Клітини-хазяї включають "трансформанти" та "трансформовані клітини", які включають первинно трансформовані клітини та отримане з них потомство, незалежно від кількості пасажів. Потомство може бути не повністю ідентичним вихідній клітині за вмістом нуклеїнових кислот та може містити мутації. До обсягу цього опису входить мутантне потомство, отримане шляхом скринінгу або відбору, яке має таку ж функцію або біологічну активність, що й вихідна трансформована клітина. "Відсоток (95) ідентичності амінокислотної послідовності" щодо еталонної поліпептидної послідовності визначають як відсотковий вміст амінокислотних залишків послідовності- кандидата, ідентичних амінокислотним залишкам еталонної поліпептидної послідовності після вирівнювання послідовностей та введення гепів, якщо це необхідно для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей, причому при визначенні ідентичності послідовностей консервативні заміни не враховуються. Вирівнювання амінокислотних послідовностей з метою визначення відсотка їх ідентичності можна здійснювати різними способами, відомими фахівцям у цій галузі техніки, наприклад, з використанням загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як програми ВІА5Т,
ВІ АБТ-2, АГІСМ або Медодаїїдп (ОМАЗТАК). Фахівці у цій галузі техніки можуть визначати параметри, що підходять для вирівнювання послідовностей, у тому числі будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання порівнюваних послідовностей по усій довжині. Однак для цілей цього винаходу значення 95 ідентичності амінокислотних послідовностей генеруються з використанням комп'ютерної програми порівняння послідовностей АГІСМ-2. Комп'ютерна програма для порівняння послідовностей АГ І(М-2 розроблена Сепепіесі, Іпс., а її вихідний код подано з інформацією для користувача у Бюро із захисту авторських прав США, м. Вашингтон, округ Колумбія, 20559, де зареєстрований під Мо
ТХОИ510087 реєстрації авторського права у США. Програма АГІСМ-2 загальнодоступна у бо Сепепіесі, Іпс., м. Саут-Сан-Франциско, штат Каліфорнія, США, або може бути скомпільована з вихідного коду. Для застосування в операційній системі ОМІХ, що включає цифрову версію ОМІХ
М4.0О0, програму АГІСМ-2 потрібно компілювати. Усі параметри порівняння послідовностей задані програмою АГІСМ-2 та не змінюються.
У випадках, коли для порівняння амінокислотних послідовностей використовують АЇОМ- 2, Чо ідентичності цієї амінокислотною послідовності А по відношенню до, у порівнянні з або відносно цієї амінокислотної послідовності В (що альтернативно можна сформулювати як ця амінокислотна послідовність А має або характеризується визначеним 95 ідентичності послідовностей по відношенню до, у порівнянні з або відносно цієї амінокислотної послідовності
В) розраховують наступним чином: 100 помножено на дріб Х/У, де Х являє собою кількість підрахованих ідентичних збігів амінокислотних залишків, визначених при програмному вирівнюванні послідовностей А та В програмою для вирівнювання послідовностей АГІСМ-2, та де У являє собою загальну кількість амінокислотних залишків у послідовності В. Слід розуміти, що, якщо довжина амінокислотної послідовності А не рівна довжині амінокислотної послідовності В, то 95 ідентичності амінокислотної послідовності А амінокислотній послідовності
В не буде рівним 95 ідентичності амінокислотної послідовності В амінокислотній послідовності А.
Якщо конкретно не вказано інше, всі значення 95 ідентичностей амінокислотних послідовностей, використані у цьому документі, отримані як описано у безпосередньо попередньому параграфі із застосуванням комп'ютерної програми АСГІСМ-2.
Білок, включаючи антитіло, вказаний як "стабільний", якщо він по суті зберігає інтактну конформаційну структуру та біологічну активність. Різні аналітичні методики для вимірювання стабільності білка доступні у цій галузі техніки та розглядаються, наприклад, в Реріїде апа
Ргоївїп Огид Оевіїїмегу, 247-301, Міпсепі І єе Еа., Магсеї ОеккКег, Іпс., Мем МоїКк, М.У., Рибв. (1991) та допез (1993) Аду. Огид Овєїїмегу Веу. 10: 29-90. Варіант антитіла з "покращеною стабільністю" відноситься до варіанту антитіла, який є більш стабільним у порівнянні з вихідним еталонним антитілом. Переважно, варіанти антитіла з покращеною стабільністю являють собою варіанти еталонних (дикого типу) антитіл, в яких специфічні амінокислотні залишки змінені з метою покращення фізичної стабільності та/або хімічної стабільності, та/або біологічної активності та/або отримання зниженої імуногенності нативних антитіл.
Термін "ізомеризація" загалом відноситься до хімічного процесу, за допомогою якого хімічну
Зо сполуку перетворюють у будь-яку з її ізомерних форм, тобто форми з однаковим хімічним складом, але з різною структурою або конфігурацією і, відповідно, загалом, з різними фізичними та хімічними властивостями. У цьому документі конкретно використана ізомеризація аспартату, процес при якому один або більше залишків аспарагінової кислоти (ОО або Ар) поліпептиду трансформований у залишок (-ки) ізоаспарагінової кислоти. Див., наприклад, Сеїдегеї аї., 9. Віо!.
Спет. 262:785-94, 1987.
Термін "дезамідування" відноситься загалом до хімічної реакції, в ході якої з органічної сполуки видаляється амідна функціональна група. У цьому документі конкретно використано дезамідування аспарагіну, процес, при якому один або більше залишків аспарагіну (М або Авп) поліпептиду (наприклад, антитіла) були перетворені в аспарагінову кислоту (О або Авр), тобто нейтральний амід бокового ланцюга перетворений у залишок із загальним кислотним характером. Див., наприклад, Хіє еї аї., У. Рпагт. 5сі. 88:8-13, 1999. "Окиснений" варіант поліпептидної молекули (наприклад, антитіла) являє собою поліпептид, у якого один або більше залишків метіоніну (М або Ме) або триптофану (М/ або Тгр) вихідного поліпептиду були перетворені у сульфон або сульфоксид за участю сірки метіоніну. Окисненню можна запобігати перетворенням метіоніну (М або Ме) у лейцин (І або Геи) або ізолейцин (І або Пе). Див., наприклад, АтрПіецеї а!., Рнагт. Віоїесппо|!., 9:1-140, 1996.
Амінокислотні залишки, "схильні" до певних установлених фізичних або хімічних процесів (наприклад, ізомеризації, дезамідуванню або окисненню), відносяться до тих залишків у конкретній білковій молекулі, які ідентифіковані, як такі, що мають властивість піддаватися установленим процесам, таким як ізомеризація, дезамідування бо окиснення. Ці властивості часто визначають за відносним положенням залишків у первинній та/або конформаційній структурі білка. Наприклад, було показано, що перший Азхр у мотиві А5р-ХХХ (де ХХХ може бути
Азр, Су, Ні5, бег або Тпг) схильний до ізомеризації Ар через участь сусідньої до нього ділянки, тоді як деякі інші А5р у тому ж білку можуть не мати такої властивості. Аналізи для ідентифікації залишків, схильних до певних процесів у конкретній білковій молекулі добре відомі у цій галузі техніки. Див., наприклад, Сасіа єї аї., Віоспет. 35:1897-1903, 1996.
Термін "серинова пептидаза 1 НІГА (НІГА1)» або НІГА!1, як взаємозамінно використовується у цьому документі, відноситься до будь-якої нативної НігАї з будь-якого джерела хордової тварини, включаючи ссавців, таких як примати (наприклад, люди) та гризуни (наприклад, миші бо та щури), якщо не вказано інше. Термін охоплює "повнорозмірну" непроцесовану НІГАТ, а також будь-яку форму НІгГАТ, яка є результатом процесингу у клітині. Цей термін також охоплює варіанти НІгГАї природного походження, наприклад, сплайс-варіанти або алельні варіанти.
Амінокислотна послідовність типової НіІГАї людини зображена на 5ЕО ІЮ МО: 121 (див. Фіг. 29А). Номер доступу для НІГАТ людини у базі ОпіРгої -- 5492743. Амінокислотна послідовність типової НІГАТ миші зображена на ЗЕО ІО МО: 155 (див. Фіг. 298). Номер доступу для НІГА1 миші у базі ОпіРгої -- 99К118. Як описано у цьому документі, амінокислотні залишки пиНІігАї та тиНігАї розташовані згідно 5ЕО І МО: 121 та 5ЕО ІЮ МО: 155, відповідно. Амінокислотні положення відмічені за допомогою коду з однієї літери позначення амінокислот, з наступним їх положенням у ЗЕО ІЮ МО: 121 або 5ЕО ІЮ МО: 155 (див. Фіг. 298). Як зображено на фіг. 29А, зріла послідовність НІГАТ людини містить послідовність, починаючи з глутаміну у положенні 23
ЗЕО ІЮО МО: 121 та закінчуючи проліном у положенні 480 5ЕО ІЮ МО:121, наприклад, 023-РА80.
Типовий фрагмент НігАї людини включає фрагмент, що містить, складається по суті з або складається з амінокислот 0161-К379. НІгГАТ також відома у цій галузі техніки як протеаза, серинова, 11 (зв'язуюча ІСЕ) (РЕК5511), АКМО7, НІГА та ІСЕВР5-протеаза.
Термін "НІгГА1" також охоплює "варіант НІГА1", який означає активний поліпептид НІГАТ, який має щонайменше близько 8095 ідентичність амінокислотної послідовності з нативною послідовністю поліпептиду НІігГАт!, такою як 5ЕО ІЮ МО: 121 або 5ЕО ІО МО: 155. Як правило, варіант НІГАТ буде мати щонайменше близько 80 95 ідентичність амінокислотної послідовності або щонайменше близько 85 95 ідентичність амінокислотної послідовності, або щонайменше близько 90 95 ідентичність амінокислотної послідовності, або щонайменше близько 95 95 ідентичність амінокислотної послідовності, або щонайменше близько 98595 ідентичність амінокислотної послідовності, або щонайменше близько 99 95 ідентичність амінокислотної послідовності з нативною послідовністю НІігАт, наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 121 або 5ЕО ІЮО МО: 155.
Термін "антагоніст зв'язування НігА!1" використовується у самому широкому розумінні та включає будь-яку молекулу, яка здатна нейтралізувати, блокувати, частково або повністю інгібувати, пригнічувати, знижувати або негативно впливати на біологічну активність НІГА1.
Антагоністи зв'язування НІГАТ1 включають, без обмежень, антитіла проти НІГА1 та варіанти таких антитіл, їх антигензв'язуючі фрагменти, інші зв'язуючі поліпептиди, пептиди та непептидні малі молекули, які зв'язуються з НІігАтї, та вони здатні нейтралізувати, блокувати, частково або
Зо повністю інгібувати, пригнічувати, знижувати або негативно впливати на активності НІГАТ, такі як здатність НІГАТЇ до розщеплення субстрату іп міго (наприклад, субстрату Н2-Орі або казеїну) або іп мімо (наприклад, здатність НІГАТ приймати участь у патологічному процесі хвороби ока (наприклад, ВМД (наприклад, географічної атрофії).
Термін "фактор 0", як використовується у цьому документі, відноситься до поліпептидів з нативною послідовністю та варіантів фактора 0. Фактор О у цій галузі техніки також відомий як фактор Ю системи комплементу (СЕО), проактиватор конвертази ССЗ, фактор ЮО естерази пропердину та адипсин. "Нативна послідовність фактора Ю" являє собою поліпептид з такою ж амінокислотною послідовністю, що й у поліпептиду фактора 0, отриманого з природних джерел, не дивлячись на його спосіб отримання. Таким чином, нативну послідовність фактора Ю можна виділяти з природних джерел, або продукувати за допомогою рекомбінантних та/або синтетичних способів.
На додаток до зрілого білка фактора О, такого як зрілий білок фактора Ю людини (див., наприклад, еталонну послідовність МСВІ ММ 001928, 5ЕБЕО ІЮ МО: 126), термін "нативна послідовність фактора 0" конкретно охоплює форми попередника фактора ОО природного походження (наприклад, неактивний препробілок, який протеолітично розщеплюється з отриманням активної форми), форми варіантів природного походження (наприклад, в альтернативному варіанті сплайсовані форми) та алельні варіанти фактора ОО природного походження, а також структурні конформаційні варіанти молекул фактора 0, які мають таку ж амінокислотну послідовність, що й поліпептид фактора О, отриманий з природних джерел.
Номер доступу для фактора О людини у базі ОпіРгої -- РОО746. Поліпептиди фактора О тварин, що не є людиною, які включають вищі примати, та ссавців, що не є людиною, спеціально включені у межі цього визначення.
Термін "варіант фактора Юр" означає активний поліпептид фактора 0, який має щонайменше близько 80 95 ідентичність амінокислотної послідовності з нативною послідовністю поліпептиду фактора 0, такого як поліпептид фактора 0 з нативною послідовністю (наприклад, ММ 001928,
ЗБЕО ІЮ МО: 126). Як правило, варіант фактора Ю буде мати щонайменше близько 80 95 ідентичність амінокислотної послідовності або щонайменше близько 8595 ідентичність амінокислотної послідовності, або щонайменше близько 9095 ідентичність амінокислотної послідовності, або щонайменше близько 95 95 ідентичність амінокислотної послідовності, або 60 щонайменше близько 9895 ідентичність амінокислотної послідовності, або щонайменше близько 99 95 ідентичність амінокислотної послідовності зі зрілою амінокислотною послідовністю людини (наприклад, ММ 001928, 5ЕО ІЮО МО: 126).
Термін "антагоніст зв'язування фактора О" використовується у самому широкому розумінні та включає будь-яку молекулу, яка здатна нейтралізувати, блокувати, частково або повністю інгібувати, пригнічувати, знижувати або негативно впливати на біологічну активність фактора 0.
Антагоністи зв'язування фактора Ю включають, без обмежень, антитіла проти фактора О та варіанти таких антитіл, їх антигензв'язуючі фрагменти, інші зв'язуючі поліпептиди, пептиди та непептидні малі молекули, які зв'язуються з фактором О, та вони здатні нейтралізувати, блокувати, частково або повністю інгібувати, пригнічувати, знижувати або негативно впливати на активності фактора 0, такі як здатність фактора О приймати участь у патологічному процесі хвороби ока, пов'язаної з системою комплементу.
Термін "антагоніст МЕСЕ (фактор ендотелія судин)», як використовується у цьому документі, відноситься до молекули, здатної до зв'язування з МЕСЕ, зниження рівнів експресії МЕСЕ або нейтралізації, блокування, інгібування, пригнічення, зниження або негативного впливу на біологічні активності МЕСЕ, що включають, але не обмежуються ними, зв'язування МЕСЕ з одним або більше рецепторів УЕСЕ, сигналінгу МЕСЕ та опосередкованого МЕСЕ ангіогенезу та виживання або проліферації ендотеліальних клітин. Наприклад, здатна до нейтралізації, блокування, інгібування, пригнічення, зниження або негативного впливу на біологічні активності
МЕСЕ молекула може проявляти свої ефекти шляхом зв'язування з одним або більше рецепторами МЕСЕ (МЕСЕК) (наприклад, МЕСЕКІ, МЕСЕК2, МЕСЕКЗ, мембранозв'язаний рецептор, МЕСЕ (пБМЕСЕК), або розчинним рецептором МЕСЕ (5МЕСЕК)). Включені, як антагоністи МЕСЕ, та такі, що використовуються у способах за цим винаходом, поліпептиди, які специфічно зв'язуються з МЕСЕ, антитіла проти МЕСЕ та їх антигензв'язуючі фрагменти, рецепторні молекули та похідні, які специфічно зв'язуються з МЕСЕ, тим самим блокуючи його зв'язування з одним або більше рецепторів, гібридні білки (наприклад, МЕСЕ-Тгар (Кедепегоп)) та МЕС :21-гелонін (Регедгіпе). Антагоністи МЕСЕ також включають варіанти антагоністів поліпептидів МЕСЕ, антисмислові нуклеотидні олігомери, комплементарні щонайменше фрагменту молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид МЕСЕ; малі РНК, комплементарні щонайменше фрагменту молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид
МЕСЕ; рибозими, для яких мішенню є МЕСЕ; пептитіла до МЕСЕ та аптамери МЕСБЕ. Антагоністи
МЕСЕ також включають поліпептиди, які зв'язуються з МЕСЕК, антитіла проти МЕСЕК та їх антигензв'язуючі фрагменти та похідні, які зв'язуються з МЕСЕК, тим самим блокуючи, інгібуючи, пригнічуючи, знижуючи або негативно впливаючи на біологічні активності МЕСЕ (наприклад, сигналінг МЕСЕ), або гібридні білки. Антагоністи МЕСЕ також включають непептидні малі молекули, які зв'язуються з МЕСЕ або МЕСЕК, та здатні блокувати, |інгібувати, пригнічувати, знижувати або негативно впливати на біологічні активності МЕСЕ. Таким чином, термін "активності МЕСЕ" конкретно включає опосередковані МЕСЕ біологічні активності МЕОЕ.
У певних варіантах реалізації винаходу антагоніст МЕСЕ знижує або інгібує щонайменше на 1096, 2096, З0 96, 4096, 5095, 6096, 7095, 8095, 9095 або більше рівень експресії або біологічної активності МЕСЕ. У деяких варіантах реалізації винаходу МЕСЕ інгібується МЕСЕ- специфічним антагоністом, що є МЕСЕ (8-109), МЕСЕЕ (1-109) або МЕСЕ 65.
Як використовується у цьому документі, антагоністи МЕСЕ можуть включати, але не обмежуються ними, антитіла проти МЕСЕК2 та споріднені молекули (наприклад, рамуцирумаб, тинібірумаб, афліберцепт), антитіла проти МЕСЕКІ! та споріднені молекули (наприклад, ікрукумаб, афліберцепт (МЕСЕ Тгар-Еуе; ЕМІ ЕАФ)) та зів-афліберцепт (МЕСЕ Тгар; 7АІТКАРФ)), біспецифічні антитіла до МЕСЕ (наприклад, МР-0250, вануцизумаб (МЕСБЕ-АМО2) та біспецифічні антитіла, описані у 2001/0236388), біспецифічні антитіла, включаючи комбінації двох антитіл проти МЕСЕ, з плечами проти МЕСЕКІ та проти МЕСЕК2, антитіл проти МЕСЕ (наприклад, бевацизумаб, севацизумаб та ранібізумаб), та непептидні малі молекули-
БО антагоністи МЕСЕ (наприклад, пазопаніб, акситиніб, вандетаніб, стивагра, кабозантиніб, ленватиніб, нинтеданіб, орантиніб, телатиніб, довітиніг, цедираніб, мотесаніб, сульфатиніб, апатиніб, форетиніб, фамітиніб та тивозаніб).
Терміни "антитіло проти МЕСЕ", "антитіло, яке зв'язується з МЕСЕ" та "антитіло, яке специфічно зв'язує МЕСЕ" відноситься до антитіла, здатного зв'язувати МЕСЕ з достатньою афінністю, такою що вказане антитіло можна використовувати як діагностичний та/або терапевтичний засіб при цільовому впливі на МЕСЕ. В одному варіанті реалізації винаходу ступінь зв'язування антитіла проти МЕСЕ з нерелевантним білком, що не є МЕСЕ, складає менше близько 10 95 зв'язування антитіла до МЕСЕ при вимірюванні, наприклад, методом радіоїмуноаналізу (РІА). У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло, що зв'язується з 60 МЕСРЕ, має значення константи дисоціації (Ка) х їмкМ, х 100 НМ, То НМ, 1 НМ, 01 НМ, х
0,01 нМ або х 0,001 нМ (наприклад, 108 М або менше, наприклад, від 108 М до 10-73 М, наприклад, від 109 М до 10-33 М). У деяких варіантах реалізації антитіло проти МЕСЕ зв'язується з епітопом МЕСЕ, який є консервативним серед УЕСБЕ різних видів тварин.
У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти МЕСЕ можна застосовувати як терапевтичний засіб для цілеспрямованого впливу та втручання у хід захворювань або патологічних станів, в яких задіяна активність МЕСЕ. Крім того, антитіло можна піддавати іншим аналізам біологічної активності, наприклад, з метою оцінки його ефективності як терапевтичного засобу. Такі аналізи відомі у цій галузі техніки та залежать від антигена-мішені та запланованого застосування антитіла. Приклади включають аналіз інгібування НОМЕС; аналізи інгібування росту пухлинних клітин (наприклад, описані в УМО 89/06692); аналізи антитіло-залежної клітинної цитотоксичності (АЗКЦ) та комплемент-опосередкованої цитотоксичності (КЗЦ) (патент США Мо 5500362); та аналізи агоністичної активності або кровотворення (див. УМО 95/27062). Антитіло проти МЕСЕ звичайно не зв'язується з іншими гомологами МЕСБЕ, наприклад, МЕСЕ-В або МЕСЕ-С, та іншими факторами росту, наприклад, РІСЕ, РОСЕ або
БЕСРЕ. В одному варіанті реалізації винаходу антитіло проти МЕСЕ являє собою моноклональне антитіло, яке зв'язується з тим же епітопом, що й моноклональне антитіло проти МЕСЕ А4.6.1, яке продукується гібридомою АТСС НВ 10709. В іншому варіанті реалізації винаходу антитіло проти МЕСЕ являє собою рекомбінантне гуманізоване моноклональне антитіло проти МЕСОБЕ, створене у відповідності з Ргеєїа еї аЇ. (1997) Сапсег Вев5. 57:4593-4599, включаючи, але обмежуючись антитілом, відомим як бевацизумаб (ВУ; АМАЗТІМФ).
Антитіло проти МЕСЕ "ранібізумаб", також відоме як "І исепіїєФ» або "пиБар М2", являє собою гуманізований афінно зрілий фрагмент Раб проти МЕСЕ людини. Ранібізумаб отримують стандартними способами рекомбінантних технологій в експресійному векторі ЕзсПегіспіа сої та ферментацією бактерій. Ранбізумаб не є глікозильованим та має молекулярну масу - 48000
Дальтон. Див. МО 98/45331 та 05 2003/0190317. Додаткові переважні антитіла включають антитіла серії 56 або В20 (наприклад, 56-31, В20-4.1), як описано у публікаціях заявки РСТ Мо
УМО 2005/012359 та МО 2005/044853, кожна з яких повністю включена у цей документ як посилання. Щодо додаткових переважних антитіл див. патенти США Мо 7060269, 6582959, 6703020; 6054297; УМО98/45332; УМО 96/30046; УО94/10202; ЕР 066686881; публікації
Зо патентних заявок США Мо 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 та 20050112126; та Рорком еї аї., Чошттаї ої Іттипоіодіса! Меїйпоа5 288:149-164 (2004). Інші переважні антитіла включають антитіла, що зв'язуються з функціональним епітопом на МЕСЕ людини, який містить залишки Е17, М18, 019, 21, М25, 089, І91, К101, Е103 та С104 або, в альтернативному варіанті, який містить залишки Е17, 21, 022, 25, 063, І8З та 089. Додаткові антитіла проти МЕСЕ включають антитіла проти МЕСЕ, описані у публікації заявки за протоколом РСТ Ме УМО 2009/155724.
Термін "антагоністи зв'язування 1-6" відноситься до молекули, яка знижує, блокує, інгібує, пригнічує або порушує сигнальну трансдукцію, яка виникає через взаємодію 1-6 з одним або більше його партнерами за зв'язування, такими як рецептор інтерлейкіну-б (ІІ/-6К) (також називають СО126) та/або др130 (також називають СО130). Типові антагоністи зв'язування 1-6 включають, наприклад, антагоністи проти 1-6 (включаючи антитіла проти 1-6, наприклад, ЕВІ- 031 (ЕІемеп Віої(пегарешісв)) та антагоністи проти І/-6К (включаючи антитіла проти 1Г-6Н, наприклад, тоцилізумаб (АСТЕМКАФ)). "Мала молекула" визначена у цьому документі як така, що має молекулярну масу менше близько 600, переважно менше близько 1000 Дальтон. "Порушення" являє собою будь-який патологічний стан, який буде покращено при лікуванні за допомогою цього антитіла. Цей термін охоплює хронічні та гострі порушення або захворювання, включаючи ті патологічні стани, які збільшують схильність ссавця до порушення, що розглядається. Необмежуючі приклади порушень, які вимагають лікування, у цьому документі включають пов'язані з НІГАТ порушення, очні порушення та/або порушення, пов'язані з системою комплементу.
Термін "пов'язане з НІГАТ порушення", як використовується у цьому документі, відноситься у самому широкому розумінні до будь-якого порушення або патологічного стану, пов'язаного з анормальною експресією або активностями НігАї. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язані з НіІгГАї порушення з надлишковими рівнями НігАї, при яких можуть проявляться атипові симптоми через локальні рівні або активності НІГА1 (наприклад, в оці) та/або системні в організмі. Типові пов'язані з НігАї порушення, включають пов'язані з НігАї порушення, які включають, наприклад, вікову макулярну дегенерацію (ВМД), що включає вологу (ексудативну)
ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху (неексудативну) ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху ВМД (наприклад, географічну атрофію (ГА)), але 60 не обмежуються ними.
Як використовується у цьому документі, термін "хвороба ока" включає, але не обмежується ними, порушення ока, які включають макулярні дегенеративні захворювання, такі як вікова макулярна дегенерація (ВМД), що включає вологу (ексудативну) ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху (неексудативну) ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху ВМД (наприклад, географічну атрофію (ГА)); діабетичну ретинопатію (ОК) та інші пов'язані з ішемією ретинопатії; ендофтальміт; увеїт; хориоїдальну неоваскуляризацію (СММ); ретинопатію недоношених (КОР); поліпоподібну хориоїдальну васкулопатію (РСМ); діабетичний макулярний набряк; патологічну міопію, хворобу Гіпеля-Ліндау; гістоплазмоз ока; оклюзію центральної вени сітківки (СКМО); корнеальну васкуляризацію та ретинальну неоваскуляризацію. У деяких варіантах реалізації винаходу хвороба ока являє собою ВМД (наприклад, ГА).
Термін "пов'язане з комплементом порушення" використовується у самому широкому розумінні та включає порушення, пов'язані з надлишковою або неконтрольованою активацією комплементу. Вони включають активацію комплементу під час операцій серцево-легеневого шунтування; активацію комплементу внаслідок ішемії-реперфузії з наступним гострим інфарктом міокарду, аневризми, інсульту, геморагічного шоку, пошкодження при аварії, поліорганної недостатності, гіпоболемічного шоку, кишкової ішемії або інших подій, які викликають ішемію. Показано, що активація комплементу може бути пов'язана із запальними патологічними станами, такими як важкі опіки, ендотоксемія, септичний шок, синдром гострої дихальної недостатності у дорослих, гемодіаліз; анафілактичний шок, важка астма, ангіоєдема, хвороба Крона, серповидноклітинна анемія, постстрептококовий гломерулонефрит та панкреатит. Порушення може бути результатом несприятливої побічної реакції на лікарський засіб, алергією на лікарський засіб, індукованим ІЇ/-2 синдромом пропотівання рідини через судини або алергією на контрастне середовище для рентгенографії. Воно також включає аутоїмунне захворювання, таке як системний червоний вовчак, важка міастенія, ревматоїдний артрит, хвороба Альцгеймера та множинний склероз. Активація комплементу також пов'язана з реакцією відторгнення трансплантата. Активація комплементу також пов'язана з очними порушеннями, такими як пов'язані з комплементом очні порушення.
Термін "пов'язана з комплементом хвороба ока" використовується у самому широкому
Зо розумінні та включає усі стани очей, при патології яких задіяний комплемент, включаючи класичний та альтернативний шляхи, та зокрема альтернативний шлях активації комплементу.
Пов'язані з комплементом очні порушення включають, без обмежень, макулярні дегенеративні захворювання, такі як усі стадії вікової макулярної дегенерації (ВМД), хориоїдальну неоваскуляризацію (СММ), увеїт, діабетичну та інші пов'язані з ішемією ретинопатії, ендофтальміт, увеїт та інші внутрішньоочні та інші неоваскулярні захворювання, такі як діабетичний макулярний набряк; патологічну міопію, хворобу Гіпеля-Ліндау; гістоплазмоз ока; оклюзію центральної вени сітківки (СКМО); корнеальну васкуляризацію та ретинальну неоваскуляризацію. В одному прикладі ВМД включає вологу ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху ВМД (наприклад, географічну атрофію (ГА)). У додатковому прикладі суха (неексудативна) ВМД може включати присутність твердих друз, м'яких друз, географічної атрофії та/або перерозподіл пігменту. Легка ВМД може включати, наприклад, багато від малих до однієї або більше невеликих друз середнього розміру. Проміжна ВМД може включати, наприклад, від значної друзи середнього розміру до однієї або більше великих друз. Див., наприклад, Регїтів еї аї.,
АВЕО5 Вероп Мо. 18; Заїо єї аІ., Еує Рез, 34(3):238-40,2009; дУадег єї аІ., Мем Епді. У. Мед., 359(1):1735, 2008. У додатковому прикладі проміжна суха ВМД може включати великі друзи, що зливаються. У додатковому прикладі географічна атрофія може включати втрату фоторецепторного та/або пігментованого епітелію сітківки (КРЕ). У додатковому прикладі область географічної атрофії може бути малою або більшою та/або може знаходитися в області жовтої плями або на периферійній сітківці В одному прикладі пов'язана з комплементом хвороба ока являє собою проміжну суху ВМД. В одному прикладі пов'язана з комплементом хвороба ока являє собою географічну атрофію. В одному прикладі пов'язана з комплементом хвороба ока являє собою вологу ВМД (наприклад, хориоїдну неоваскуляризацію (СММ)).
Вищенаведені переліки не є всеосяжними та повинно бути зрозуміло, що захворювання або порушення може потрапляти до різних категорій. Наприклад, у деяких випадках ВМД може виявитися у категорії пов'язаного з НігАї порушення, хвороби ока та пов'язаного з комплементом порушення.
Як використовується у цьому документі, термін "введення" означає спосіб надання суб'єкту дозування сполуки (наприклад, антитіла проти НігАї за цим винаходом, нуклеїнової кислоти, бо яка кодує антитіло проти НІГАТ за цим винаходом) або композиції (наприклад, фармацевтичної композиції, наприклад, фармацевтичної композиції, що містить антитіло проти НігАї за цим винаходом). Композиції, що використовують у способах, описаних у цьому документі, можна вводити, наприклад, у скловидне тіло (наприклад, інтравітреальною ін'єкцією), окулярно (наприклад, очною ін'єкцією), всередину ока (наприклад, внутрішньоочною ін'єкцією), біля склери (наприклад, ін'єкцією біля склери), у субтеноновий простір (наприклад, субтеноновою ін'єкцією), у супрахориоїдальний простір (наприклад, супрахориоїдальною ін'єкцією), місцево (наприклад, з очними каплями), внутрішньом'язово, внутрішньовенно, внутрішньошкірно, через шкіру, внутрішньоартеріально, внутрішньочеревинно, всередину вогнища, інтракраніально, всередину суглоба, всередину простати, внутрішньоплеврально, інтратрахеально, інтратекально, назально, вагінально, ректально, всередину пухлини, у черево, підшкірно, субкон'юнктивально, всередину сечового пухиря, через слизову оболонку, інтраперикардіально, всередину пуповини, інтраорбітально, перорально, трансдермально, шляхом інгаляції, шляхом ін'єкції, шляхом імплантації шляхом інфузії шляхом безперервної інфузії, шляхом безпосереднього омивання клітин-мішеней при локалізованій перфузії, за допомогою катетера, шляхом промивання, у кремах або у ліпідних композиціях. Композиції, що використовують у способах, описаних у цьому документі, можна також вводити системно або локально. Спосіб введення може змінюватися в залежності від різних факторів (наприклад, сполуки або композиції для введення, ступеня важкості патологічного стану, захворювання або порушення, що підлягає лікуванню). У конкретних варіантах реалізації винаходу антитіла, описані у цьому документі (наприклад, антитіла проти НІігГА!, антитіла проти фактора О та антитіла проти
НІГАТ/фактора 0) вводять інтравітреальною ін'єкцією.
Введення "у комбінації з" одним або більше додатковими терапевтичними засобами включає одночасне (спільне) та послідовне введення у будь-якому порядку.
Термін "доставка з тривалою дією", "сповільнене вивільнення" та "контрольоване вивільнення" звичайно використовують для опису механізму доставки з використанням рецептури, лікарської форми, пристрою або інших типів технологій для досягнення пролонгованого або подовженого вивільнення або біодоступності терапевтичного засобу (наприклад, антитіла за цим винаходом).
Він може відноситься до технологій, які надають пролонговане або подовжене вивільнення
Зо або біодоступність лікарського засобу для загального системного кровотоку або суб'єкта, або локальних місць впливу в організмі суб'єкта, що включають, але не обмежуються ними, клітини, тканини, органи, суглоби, області тощо. Крім того, ці терміни можуть відноситися до технології, яка використовується для пролонгування або подовження вивільнення лікарського засобу з рецептури або лікарської форми, або вони можуть відноситися до технології, яка використовується для подовження або пролонгування біодоступності або фармакокінетичних параметрів, або тривалості впливу лікарського засобу на організм суб'єкта, або вони можуть відноситися до технології яка відноситься до подовження або пролонгування фармакодинамічної дії, викликаної рецептурою. "Рецептура тривалої дії", "рецептура із сповільненим вивільненням" або "рецептура з контрольованим вивільненням" являє собою фармацевтичну рецептуру, лікарську форму або іншу технологію, яку використовують для забезпечення доставки тривалої дії. В одному аспекті винаходу контрольоване вивільнення використовують для покращення місцевої біодоступності терапевтичного засобу, особливо часу утримання всередині ока у контексті окулярної доставки. "Збільшений час утримання всередині ока" відноситься до періоду після доставки, протягом якого доставлений в око лікарський засіб залишається ефективним як у розумінні якості (наприклад, активність), так й у розумінні кількості (наприклад, ефективна кількість). На додаток або замість введення високої дози або контрольованого вивільнення для досягнення збільшення періоду напіввиведення іп хмімо лікарський засіб можна модифікувати після трансляції, наприклад, за допомогою ПЕГілювання. "Ефективна кількість" засобу, наприклад фармацевтичної рецептури, відноситься до кількості, ефективної у дозах та протягом періодів часу, необхідних для досягнення потрібного терапевтичного або профілактичного результату. "Індивід" або "суб'єкт" являє собою ссавця. Ссавці включають, але не обмежуються ними, одомашнених тварин (наприклад, корів, овець, кішок, собак та коней), приматів (наприклад, людей та приматів, що не є людьми, таких як мавпи), кроликів та гризунів (наприклад, мишей та щурів). У деяких варіантах реалізації винаходу індивід або суб'єкт є людиною. "Суб'єкт" може бути "пацієнтом".
Термін "вкладиш до упаковки" використовується по відношенню до інструкцій, які звичайно вкладають до комерційних упаковок терапевтичних продуктів, які містять інформацію про 60 показники, застосування, дозування, введення, комбіновану терапію, протипоказання та/або попередження, що стосуються застосування таких терапевтичних продуктів.
Термін "фармацевтично прийнятний носій" відноситься до інгредієнту фармацевтичної рецептури, який відрізняється від активного інгредієнту та є нетоксичним для суб'єкта.
Фармацевтично прийнятний носій включає буфер, наповнювач, стабілізатор або консервант, але не обмежується ними.
Термін "фармацевтична рецептура" відноситься до препарату, який знаходиться у такій формі, щоб забезпечувати ефективну біологічну активність активного інгредієнту, який у ній міститься, та не містить додаткових компонентів, що є неприйнятно токсичними для суб'єкта, якому композиція повинна бути введена.
Як використовується у цьому документі, термін "лікування" (та його граматичні варіанти, наприклад, "лікувати") відноситься до клінічного втручання зі спробою змінити природній хід захворювання, яке піддається лікуванню, та може здійснюватися або для профілактики, або у ході клінічної патології. Бажані ефекти лікування включають попередження частоти або повторного прояву хвороби або порушення, полегшення симптомів, зменшення їх прямих або опосередкованих патологічних наслідків захворювання або порушення, зменшення швидкості прогресування хвороби, покращення або тимчасового полегшення стану захворювання або порушення та ремісію або покращення прогнозу, але не обмежуються ними. У деяких варіантах реалізації антитіла за цим винаходом використовують для затримки розвитку захворювання або порушення, або для сповільнення прогресування захворювання або порушення. У деяких прикладах порушення являє собою пов'язане з НІГАТ порушення, хворобу ока та/або пов'язане з комплементом порушення, наприклад ВМД (наприклад, ГА). "Виділена" молекула нуклеїнової кислоти являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка ідентифікована та відділена від щонайменше однієї молекули забруднюючої нуклеїнової кислоти, з якої вона звичайно зв'язана у природному джерелі цієї нуклеїнової кислоти. Виділена молекула нуклеїнової кислоти відрізняється за формою або структурою, в якій вона виявлена у природі. Тому виділені молекули нуклеїнових кислот відрізняються від молекули нуклеїнової кислоти, яка існує у природних клітинах. Тим не менше виділена молекула нуклеїнової кислоти включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься у клітинах, які звичайно експресують антитіло, в яких, наприклад, молекула нуклеїнової кислоти знаходиться на ділянці хромосоми,
Зо що відрізняється від такого положення у природних клітинах.
Термін "регуляторні послідовності" відноситься до послідовностей ДНК, необхідних для експресії функціонально зв'язаної кодуючої послідовності у конкретному організмі-хазяїні.
Послідовності контролю, придатні для прокаріот, наприклад, містять промотор, необов'язково операторну послідовність та ділянку зв'язування рибосом. Відомо, що в еукаріотичних клітинах використовуються промотори, сигнали поліаденилювання та енхансери.
Нуклеїнова кислота є "функціонально зв'язаною", якщо вона вступає у функціональні взаємодії з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК передпослідовності або секреторного лідера є функціонально зв'язаними з ДНК поліпептиду, якщо вона експресується як пребілок, що приймає участь у секреції цього поліпептиду; промотор або енхансер функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію цієї послідовності, або ділянка зв'язування рибосом функціонально зв'язана з кодуючою послідовністю, якщо вона розташована так, щоб сприяти процесу трансляції. Загалом, "функціонально зв'язаний" означає, що послідовності ДНК, будучи зв'язаними, є неперервними та, у випадку наявності секреторного лідера, неперервними та знаходяться у фазі зчитування.
Тим не менше, енхансери не обов'язково повинні бути неперервними. Зв'язування супроводжується лігуванням за підходящою ділянкою рестрикції. Якщо таких ділянок немає, то у відповідності з традиційною практикою використовуються синтетичні олігонуклеотидні адаптори або лінкери.
Як використовуються у цьому документі, вирази "клітина", "лінія клітин" та "культура клітин" використовуються взаємозаміно, та усі такі позначення включають потомство. Таким чином, слова "трансформанти" та "трансформовані клітини" включають первинну клітину суб'єкта та отримані з неї культури, незалежно від кількості пасажів. Також зрозуміло, що все потомство не може бути точно ідентичним за вмістом ДНК через навмисні або ненавмисні мутації. До обсягу опису включено мутантне потомство, яке має таку ж функцію або біологічну активністю за результатами скринінгу, що й початково трансформована клітина. Якщо припускаються відмінні позначення, то це буде ясно з контексту.
Як використовується у цьому документі, термін "бібліотека" відноситься до множини послідовностей антитіл або фрагментів антитіл (наприклад, антитіл проти НІгАї за цим винаходом) або нуклеїнових кислот, які кодують ці послідовності, причому послідовності 60 відрізняються за комбінацією варіантів амінокислот, які введені у ці послідовності, наприклад, як описано у цьому документі. "Мутація" являє собою делецію, вставку або заміну нуклеотиду (-ів) відносно еталонної нуклеотидної послідовності, такої як послідовність дикого типу.
Як використовується у цьому документі, "кодонний набір" відноситься до набору різних послідовностей нуклеотидних триплетів, які використовують для кодування потрібних варіантів амінокислот. Набор олігонуклеотидів можна синтезувати, наприклад, методом твердофазного синтезу, включаючи послідовності, які представляють усі можливі комбінації нуклеотидних триплетів, забезпечених кодонним набором, та які будуть кодувати потрібну групу амінокислот.
Стандартна форма позначення кодонів відповідає коду, встановленому МБС (Міжнародним біохімічним союзом), який відомий у цій галузі техніки. Як правило, кодонний набір наведений З великими літерами курсивом, наприклад, ММК, ММ5, ХУ2, ОМК тощо. Синтез олігонуклеотидів з вибраною нуклеотидною "виродженістю" у певних положеннях добре відомий у цій галузі техніки, наприклад, при використанні підходу ТКІМ (Кпаррек еї аї., 9). Мої. Віої. 296:57-86, 1999;
Сатага єї аії., Сепе 128:103, 1993). Такі набори олігонуклеотидів, які мають певні кодонні набори, можна синтезувати з використанням комерційних синтезаторів нуклеїнових кислот (доступних, наприклад, у компанії Арріїей Віозузіет5, м. Фостер Сити, штат Каліфорнія, США) або їх можна отримувати комерційним замовленням (наприклад, з компанії І їе Тесппоїодіев5, м.
Роквіл, штат Меріленд, США). Тому, набір олігонуклеотидів, синтезований з конкретним кодонним набором, як правило, буде містити багато оолігонуклеотидов з різними послідовностями, причому відмінності визначаються кодонним набором у межах усієї послідовності. Олігонуклеотиди, що використовують у відповідності 3 цим винаходом, мають послідовності, які допускають гібридизацію з нуклеотидною матрицею варіабельного домена і також можуть, але не обов'язково, містити сайти для ферментів рестрикції, наприклад у цілях проведення клонування. "Фаговий дисплей" являє собою методику, за допомогою якої поліпептиди відображаються у вигляді гібридних білків з щонайменше частиною білка оболонки на поверхні фагових, наприклад нитчастого фага, частинок. Корисність фагового дисплея полягає у тому факті, що великі бібліотеки рандомізованих білкових варіантів можна швидко та ефективно сортувати на наявність послідовностей, які зв'язуються з антигеном-мішенню з високою афінністю.
Зо Відображення пептидних та білкових бібліотек на фагові використовують для скринінгу мільйонів поліпептидів на наявність тих, які мають властивості специфічного зв'язування.
Методи з полівалентними фаговими дисплеями використовують для відображення малих випадкових пептидів та малих білків за допомогою злиттів або з геном І, або з геном МІ! нитчастого фага. Див., наприклад, Умеї5 еї аїЇ., Сит. Оріп. бігисі. ВіоіІ., 3:355-362, 1992, та цитовані у цьому документі посилання. У моновалентому фаговому дисплеї білкову або пептидну бібліотеку гібридизують з геном ІІЇ або його частиною та експресують його на низьких рівнях у присутності білка гена І дикого типу, так що фагові частинки відображають одну копію або жодного з гібридних білків. Впливи авідности знижуються щодо полівалентного фага, так що сортування відбувається на основі внутрішньої афінности лігандів, та використовуються фагмідні вектори, які спрощують маніпуляції з ДНК. Див., наприклад, І оултпап еї аї., Меїйодв5: А сотрапіоп (о Меїпод5 іп Епгутоіоду, 3:205-216, 1991. "Варіант" або "мутант" вихідного або еталонного поліпептиду (наприклад, еталонного антитіла або його варіабельного (-их) домена (-ів)/НУК), являє собою поліпептид, який (1) має амінокислотну послідовність, що відрізняється від послідовності вихідного або еталонного поліпептиду та (2) отриманий з вихідного або еталонного поліпептиду за допомогою або природного або штучного (виконаного людиною) мутагенезу. Такі варіанти включають, наприклад, делеції та/або вставки та/або заміни залишків в амінокислотній послідовності поліпептиду, що цікавить, названі у цьому документі "змінами амінокислотних залишків". Таким чином, варіант НМК відноситься до НУК, яка містить варіант послідовності відносно вихідної або еталонної поліпептидної послідовності (такої як послідовність вихідного антитіла або антигензв'язуючого фрагмента). У цьому контексті, зміна амінокислотного залишку відноситься до амінокислоти, яка відрізняється від амінокислоти у відповідному положенні у вихідній або еталонній поліпептидній послідовності (такій як послідовність еталонного антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента). Для отримання варіанта або мутанта конструкції можна вносити будь-яку комбінацію делецій, вставок та замін за умови, що кінцева конструкція має потрібні функціональні характеристики. Амінокислотні зміни також можуть змінювати посттрансляційні процеси щодо поліпептиду, такі як змінені кількості або положення сайтів глікозилювання.
Послідовність "дикого типу (ДТ)» або "еталонна" послідовність, або послідовність 60 білка/поліпептиду "дикого типу" або "еталонна" послідовність білка/поліпептиду, така як НУК або варіабельний домен еталонного антитіла, може бути еталонною послідовністю, 3 якої отримують варіанти поліпептидів за допомогою введення мутацій. Загалом, послідовність "дикого типу" для цього білка являє собою послідовність, яка найбільше поширена у природі.
Подібним чином, послідовність гена "дикого типу" являє собою послідовність для такого гена, який частіше усього виявляється у природі. Мутації можна вводити до гена "дикого типу" (їі таким чином до кодованого ним білка) або за допомогою природних процесів, або за допомогою створених людиною засобів. Продуктами таких процесів є "варіантні" або "мутантні" форми вихідного білка або гена "дикого типу".
Як використовується у цьому документі, "еталонне антитіло" відноситься до антитіла або його фрагмента, антигензв'язуюча послідовність якого служить як матрична послідовність, на якій виконується диверсифікація у відповідності з критеріями, описаними у цьому документі.
Антигензв'язуюча послідовність, загалом, включає варіабельну ділянку антитіла, переважно щонайменше одного НУК, переважно включаючи каркасну область.
Термін "збагачений", як використовується у цьому документі, означає, що об'єкт (наприклад, зміна амінокислотного залишку) присутній у відсортованій бібліотеці з більшою частотою, у порівнянні з відповідною еталонною бібліотекою (наприклад, невідсортованою бібліотекою або бібліотекою, яка відсортована за іншим або нерелевантним антигеном). | навпаки, термін "виснажений" означає, що об'єкт (наприклад, зміна амінокислотного залишку) присутній у відсортованій бібліотеці з меншою частотою, у порівнянні з відповідною еталонною бібліотекою (наприклад, невідсортованою бібліотекою або бібліотекою, яка відсортована за іншим або нерелевантним антигеном). Термін "нейтральний", при застосуванні по відношенню до методів ідентифікації варіантів амінокислотних залишків, означає, що об'єкт є ні збагаченим, ні виснаженим, іншими словами, він присутній у відсортованій бібліотеці приблизно з тією же частотою, у порівнянні з відповідною еталонною бібліотекою (наприклад, невідсортованою бібліотекою або бібліотекою, яка відсортована за іншим або нерелевантнім антигеном).
Терміном "ізоелектрична точка (рІ)» позначають значення рН, при якому молекула (наприклад, такий білок, як антитіло) не несе чистого електрично заряду, воно також називається у цій галузі техніки як рН(І) або ІЕР.
І. КОМПОЗИЦІЇ ТА СПОСОБИ
У винаході запропоновані нові антитіла, які зв'язуються з НігАт!, та способи створення і використання таких антитіл, наприклад, для терапевтичного та діагностичного застосування.
Антитіла за цим винаходом застосовні, наприклад, для діагностики або лікування різних порушень, включаючи пов'язані з НігАї порушення, очні порушення та/або пов'язані з комплементом порушення, включаючи вікову макулярну дегенерацію (наприклад, географічну атрофію).
А. Типові антитіла проти НІгА1
В одному аспекті винахід частково засновано на антитілах, які специфічно зв'язуються з
НІГАТ. Антитіла за цим винаходом застосовні, наприклад, для лікування або діагностики порушень, включаючи пов'язані з НігАї порушення, очні порушення та/або пов'язані з комплементом порушення, включаючи вікову макулярну дегенерацію (наприклад, географічну атрофію).
У винаході запропоновані виділені антитіла, здатні специфічно зв'язуватися з НІГА1. У деяких випадках НігАїТ є людським НІГА1 (пПиНІгГАТ1). В інших випадках НІГАТ є мишачим НігА!1 (тиНігА7). У певних випадках антитіло проти НігАї за цим винаходом специфічно зв'язує
ПЧНЕІГАТ з КО рівною 100 нМ або нижче (наприклад, 100 нМ або нижче, 10 нМ або нижче, 5 нм або нижче, 2,5 нМ або нижче, 1 нМ або нижче, 100 пМ або нижче, 10 пМ або нижче, 1 пМ або нижче або 0,1 пМ або нижче). Наприклад, у певних випадках антитіло проти НігАї за цим винаходом специфічно зв'язує пинНігА!Т з КО рівною 1 нМ або нижче (наприклад, 1 нМ або нижче, 900 пМ або нижче, 800 пМ або нижче, 700 пМ або нижче, 600 пМ або нижче, 550 пМ або
БО нижче, 500 пМ або нижче, 400 пМ або нижче, 300 пМ або нижче, 200 пМ або нижче, 150 пМ або нижче, 125 пМ або нижче, 100 пМ або нижче, 75 пМ або нижче, 50 пМ або нижче, 25 пМ або нижче або 1 пМ або нижче). У деяких випадках антитіло проти НІГАТ зв'язує ПпиНІгГАт з КО між близько 40 пМ та близько 700 пМ (наприклад, між близько 40 пМ та близько 700 пМ, між близько 40 пМ та близько 600 пМ, між близько 40 пМ та близько 550 пМ, між близько 40 пМ та близько 500 пМ, між близько 40 пМ та близько 400 пМ, між близько 40 пМ та близько 300 пМ, між близько 40 пМ та близько 250 пМ, між близько 50 пМ та близько 200 пМ, між близько 50 пмМ та близько 175 пМ, між близько 50 пМ та близько 150 пМ, між близько 50 пМ та близько 125 пМ, між близько 70 пМ та близько 125 пМ або між близько 50 пМ та близько 125 пМ). У деяких випадках антитіло проти НІГА1 зв'язує ПИНІГА!Т з КО близько 110 пМ. У деяких випадках антитіло бо проти НігАТ зв'язує пИиНігА! з КО близько 60 пМ. Будь-яке з попередніх значень КО може представляти афінність зв'язування антитіла проти НІігГА!1 за цим винаходом (наприклад, Еар антитіла проти НІГАТї за цим винаходом) з протеазним доменом (РО) пПиНІігАт1 (пинНігА1-РО), наприклад, як виміряно з використанням поверхневого плазмонного резонансу ВІАСОКЕФ, наприклад, як описано у цьому документі.
У деяких випадках антитіло проти НігАї за цим винаходом здатне інгібувати активність
НІГАТ. У деяких випадках антитіло інгібує активність протеазного домена пинНігАТ-РО з 50 95 інгібуючою концентрацією (ІС50) рівною 10 нМ або нижче (наприклад, 10 нМ або нижче, 5 нм або нижче, 2 нМ або нижче, 1,5 нМ або нижче, 1 нМ або нижче, 900 пМ або нижче, 800 пМ або нижче, 700 пМ або нижче, 600 пМ або нижче, 500 пМ або нижче, 400 пМ або нижче, 300 пМ або нижче, 200 пМ або нижче, 100 пМ або нижче, 50 пМ або нижче або 1 пМ або нижче). У деяких випадках антитіло проти НІГгА1 інгібує активність пинНігА1-РО з ІС5О між близько 0,25 нМ та близько 1 нМ (наприклад, між близько 0,25 нМ та близько 1 нМ, між близько 0,25 нМ та близько 0,9 нМ, між близько 0,25 нМ та близько 0,8 нМ, між близько 0,25 нМ та близько 0,7 нМ, між близько 0,25 нМ та близько 0,6 нМ, між близько 0,25 нМ та близько 0,5 нМ або між близько 0,25
НМ та близько 0,4 нМ). У деяких випадках антитіло проти НІГА!1 інгібує активність пинНігА1-РО з
ІС50О рівною близько 0,3 нМ. У будь-якому з попередніх випадків інгібуючу активність можна вимірювати в аналізі блокування іп мйго на основі ЕКЕТ. У деяких випадках аналіз блокування іп міго на основі ЕКЕТ включає розщеплення зонда Н2г-Орі (наприклад, (МсалтккУзУзЕ(Юпркк (ЗЕО ІЮ МО: 152). У будь-якому з попередніх випадків значення ІС50 може базуватися на здатності антитіла проти НІГА1 у бівалентній формі (наприклад, формі Ідс) інгібувати активність пинНігА1-РО.
Винахід також охоплює виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом НІГА1, причому епітоп НІгГА! містить щонайменше одну амінокислоту білка НІГАТ, вибрану з групи, що складається з Аг9190, Геи192, Рго193, Рпе194 та Аг9197, де нумерація амінокислот відповідає нумерації білка-попередника НігАї людини. В одному варіанті реалізації винаходу білок- попередник НіІгГАї людини має послідовність 5ЕС ОО МО: 121. В одному варіанті реалізації винаходу епітоп НІГАТ1 містить щонайменше одну амінокислоту білка НІГАТ, вибрану з групи, що складається з І еи192, Рго193 та Аг9197. В одному варіанті реалізації винаходу епітоп НІігА!1 містить щонайменше дві амінокислоти білка НІГАТ, вибрані з групи, що складається з І е0192,
Зо Рго193 та Аг9197. У конкретному варіанті реалізації винаходу епітоп НІГАТ містить амінокислоти
НІГАТ Геши192, Рго193 та Аг9197. В іншому варіанті реалізації винаходу епітоп НІгГАТ містить амінокислоти НігАї1 Аг9190, Їейи192, Рго193 та Аг9197. У додатковому варіанті реалізації винаходу епітоп НІГА1 містить амінокислоти НІГА1 Аго190, І еи192, Рго193, Рпе194 та Аг9197.
У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти НігА!ї при зв'язуванні з НігА1 розташоване на відстані 4 ангстрема або менше від однієї або більше амінокислот Аг9190,
Геи192, Рго193, Рпе194 та Аг9197. У деяких варіантах реалізації винаходу відстань між антитілом та однією або більше амінокислот визначають методом кристалографії, наприклад, з використанням методів кристалографії, описаних у прикладах.
У деяких випадках антитіло проти НіІгГАї може містити щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість гіперваріабельних ділянок (НМК), вибраних з: (а) НМК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕХ:ІН (ЗЕО ІО МО: 1), де Хі являє собою Меї або І еи; (5) НМЕ-
Н2, яка містить амінокислотну послідовність ЗМОРЕТХ»ОААМУМОКЕКО (5ЕБЕО ІО МО: 2), де Х2 являє собою Сім або Авп; (с) НМЕА-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУОМОМАГОМУ (ЗЕО ІО МО: 3); (а) НМВ-І1, яка містить амінокислотну послідовність КАЗЗЗМХзЗРІН (5ЕО ІЮ МО: 4), де Хз являє собою Сі або Авп; (є) НМВ-І2, яка містить амінокислотну послідовність
АТОХА АБЗ (ЗЕБО ІЮ МО: 5), де Ха являє собою Авп, Ніх5 або сій; та () НМЕ-І3, яка містить амінокислотну послідовність ООМУХ5ОХєРУМТ (5ЕО ІЮ МО: 6), де Х5 являє собою 5ег або Туг, а
Хв являє собою Аїа або Авзп, або комбінацію з однієї або більше вищенаведених НМК та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 то, 82 то, 83 то, 84 то, 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 Фо, 95 о, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичність) з будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 1-6.
Наприклад, антитіло проти НІігА! може містити щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НМК, вибраних з: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕМН (5ЕО І
МО: 7); (5) НУВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність ЗМОРЕТЕСААУМОКЕКО (ЗЕО І
МО: 8); (с) НУВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЗМОМОМАГ ОМ (5ЕО ІЮО МО: 3); (4)
НМВА-11, яка містить амінокислотну послідовність КАЗ5ОЗМЕРІН (5ЕО ІО МО: 9); (є) НМЕА-12, яка містить амінокислотну послідовність АТОМІ АБ (БО ІЮ МО: 10); та (М НМК-І3, яка містить амінокислотну послідовність ООУМУЗЗАРУМТ (ЗЕО ІЮ МО: 11), або комбінацію з однієї або більше вищенаведених НМЕК та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше 80 95 60 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 95, 86 90, 87 Фо,
Зо
88 оо, 89 95, 90 о, 91 95, 92 о, 93 Фо, 94 95, 95 Ус, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичність) з будь- якою з БЕО ІО МО: З або 7-11.
У деяких випадках будь-яке з попередніх антитіл проти НІГАТ може містити одну, дві, три або чотири наступні каркасні ділянки (ЕК) варіабельних доменів важкого ланцюга (МН): (а) ЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЕМОЇ МОБОСАЕУККРОАЗУКУЗСКАЗОУХ ЕХ» (5ЕО І
МО: 12), де Хі являє собою І ух або Тпг, а Х»2 являє собою ТПг, Гуз або Аго; (Б) ЕБК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність М//КОАРОСОСІ ЕМО (ЗЕБО ІО МО: 13); (с) ЕК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КАТІТКОТЗТОТАМІ ЕІ 551 К5ЕОТАМУУСТК (ЗЕО ІЮО МО: 14); та (ад) ЕК-НА, яка містить амінокислотну послідовність УМЗОСТІ МТУ (ЗЕО ІЮО МО: 15).
У деяких випадках будь-яке з попередніх антитіл проти НІГАТ може містити одну, дві, три або чотири наступні ЕК варіабельних доменів легкого ланцюга (МІ): (а) ЕК-І1, яка містить амінокислотну послідовність ОЮМТО5РБЗБІ БАЗМООКМТІТС (5БО ІЮ МО: 17); (5) ЕК-І2, яка містить амінокислотну послідовність МУМООКРОКАРКРІІЗ (ЗЕБО ІЮ МО: 18); (с) ЕК-І3, яка містить амінокислотну послідовність ЗМРОКЕЗОЗОЗОТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕОБАТУМС (5ЕО ІЮО МО: 19); та (а) ЕК-І 4, яка містить амінокислотну послідовність ЕЗОСТКМЕЇК (5ЕО ІЮ МО: 20).
Наприклад, у деяких випадках антитіло проти НІГА1 містить наступні шість НМЕ: (а) НМА-НІ1, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕМН (ЗЕБО ІЮ МО: 7); (Б) НМА-Н2, яка містить амінокислотну послідовність ЗМОРЕТЕСААУМОКЕКО (5ЕБО ІО МО: 8); та (с) НМЕК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність СУЮОМОМАГОМ (5БО ІО МО: 3); (4) НМК-11, яка містить амінокислотну послідовність КАББЗЗМЕРІН (5БО ІЮ МО: 9); (є) НМК-І2, яка містить амінокислотну послідовність АТЗМІАБ (ЗБО ІЮО МО: 10); та () НМК-І3, яка містить амінокислотну послідовність ОБУУЗЗАРУМТ (ЗЕО ІЮО МО: 11). У деяких випадках антитіло проти
НІГА1 містить наступні чотири ЕК варіабельних доменів важкого ланцюга: (а) ЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЕМОЇ МО5БСАЕМККРОАБМКУМЗСКАЗОУКЕТ (БО ІЮ МО: 16); (Б)
ЕВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність М/Л/КОАРСОСІ ЕУМІС (5ЕБЕО ІЮО МО: 13); (с) ЕК-
НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КАТІТКОТ5ТЗТАМІ ЕІ 55І КЗЕОТАМУУСТЕК (5ЕО
ІО МО: 14); та (а) ЕБ-НА, яка містить амінокислотну послідовність МЗОСТІ МТУ55 (ЗЕО ІЮО МО: 15). У додаткових випадках антитіло проти НІгГАї містить наступні чотири ЕК варіабельних доменів легкого ланцюга: (а; ЕК-Ї1, яка містить амінокислотну послідовність зо ІОМТО5БРБОБІ БАБМООАМТІТС (5ЕБО 10 МО: 17); (Б) ЕВ-І2, яка містить амінокислотну послідовність МУООКРОКАРКРІІЗ (5ЕБО ІЮ МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність СМРІЗКЕЗОЗОЗОТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕОБАТУУС (ЗЕО ІЮ МО: 19); та (а) ЕК-14, яка містить амінокислотну послідовність ЕОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти НІГА1 містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮО МО: 21, та (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 22. У деяких випадках антитіло проти НІігГА1 являє собою АРЕС.І С3.НСОЗ.
В іншому прикладі, у деяких випадках, антитіло проти НІГА1 містить наступні шість НМЕ: (а)
НМВ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕМН (5ЕО ІЮ МО: 7); (5) НМЕК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність ЗМОРЕТОСААММОКЕКО (5ЕО ІО МО: 123); та (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУЮОМОМАГОМ (5ЕО ІЮ МО: 3); (4) НМА-І1, яка містить амінокислотну послідовність КАБЗЗММЕІН (5ЕБО ІО МО: 124); (є) НМК-12, яка містить амінокислотну послідовність АТЗМІАБ (ЗБО ІО МО: 10); та () НМК-І3, яка містить амінокислотну послідовність ООУУЗЗАРУМТ (ЗЕО ІО МО: 125). У деяких випадках антитіло проти
НІГА1 містить наступні чотири ЕК варіабельних доменів важкого ланцюга: (а) ЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність МОЇ О0О5ОАЕЇ МАРОАБМТІ ЗСКАБОМТЕТ (5ЕБО ІЮО МО: 25); (Б)
ЕВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність М/КОТРУНОСЇ ЕУМІС (5ЕО ІЮО МО: 26); (с) ЕК-
НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КАТ. ТАОКЗЗЗТАММЕЇ КІ ТЗЕОБАМУУСТЕК (5ЕО
ІО МО: 27); та (а) ЕК-НА, яка містить амінокислотну послідовність ММЗОСТЗМУТМУ55 (5ЕО ІЮ МО: 28). У додаткових випадках антитіло проти НІгГАї містить наступні чотири ЕЕ варіабельних доменів легкого ланцюга: (а) ЕК-Ї7, яка містить амінокислотну послідовність
МІММТО5РАБІ АМБІ ЯОВАТІЗС (5ЕБЕО 10 МО: 29); (Б) ЕВ-І2, яка містить амінокислотну послідовність МУСООКРООРРКІ ІМ (5БО ІЮО МО: 30); (с) ЕК-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЗМРАКЕЗОЗОЗЕКТОЕТІ ТІОРУЕАЮБААТУМС (ЗЕО ІЮ МО: 31); та (9) ЕК-1 4, яка містить амінокислотну послідовність ЕСССТКІ ЕК (ЗЕО ІО МО: 32). У деяких випадках антитіло проти НІГА1 містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮО МО: 23, та (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 24. У деяких випадках антитіло проти НІГА1 являє собою 15Н6 (також називається т!5Нб).
В іншому прикладі антитіло проти НІГАТ може містити щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних з: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУІМ5 510) (ЗЕО ІО МО: 39); (в) НУВ-НаІ, яка містить амінокислотну послідовність МІЗМОСОТТУУЗОТІКО
(ЗЕО І МО: 40); (с) НУВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ОМЕКЗОСЗ5МОМ (ЗЕО
ІО МО: 41); (а) НУВ-11, яка містить амінокислотну послідовність КАБЗЕЗМОБУСКЗЕМН (ЗЕО ІЮ
МО: 42); (е) НУВ-12, яка містить амінокислотну послідовність АЗКІ Е5 (5ЕО ІЮ МО: 43); та ()
НУВ-1І3, яка містить амінокислотну послідовність ООММЕОРУТ (5ЕО ІЮО МО: 44), або комбінацію з однієї або більше вищенаведених НМЕ та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 Уо, 84 Об, 85 95, 86 95, 87 Уо, 88 95, 89 95, 90 95, 91 У, 92 95, 93 У, 94 95, 95 ую, 96 95, 97 У, 98 9о або 99 95 ідентичність) з будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 39-44.
У деяких випадках будь-яке з попередніх антитіл проти НІГАТ може містити одну, дві, три або чотири наступних ЕК варіабельних доменів важкого ланцюга: (а) ЕБК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЕМОЇ МЕБОСОСІ МОРООБІ КІ ЗСААБСОЕТЕЗ (5БО ІЮО МО: 47) або
ЕМКІМЕЗБОССІ МЕРОСОЗІ КІ АСМАБОЕТЕЗ (5ЕБО 10 МО: 57); (Б) БЕВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність М/МКОАРОКОГ ЕММА (ЗЕО ІЮ МО: 48) або ММКОТРЕКАІ ЕМУМА (ЗЕБЕО 10 МО: 58); (с) БВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність
ЕЕТІЗКОМЗКМТІ МІ ОММ5І КАЕОТАМУУСАК (ЗЕО ІО МО: 49) або
КЕТІЗКОМАКМТІ МГ ОМ КЗЕОТАІМЕСАК (5БО ІО МО: 59); та (4) ЕК-Н4, яка містить амінокислотну послідовність МОСТІ МТУ (ЗЕО ІЮ МО: 50) або М/СОСТАМТМУЗ5 (ЗЕО ІЮ
МО: 60).
У деяких випадках будь-яке з попередніх антитіл проти НІГАТ може містити одну, дві, три або чотири наступних ЕК варіабельних доменів легкого ланцюга: (а) ЕВ-І1, яка містить амінокислотну послідовність ОІММТОЗРОБЗІАМ5ЗІСЕКАТІМС (ЗЕБЕО ОО МО: 51) або
МІММТОБРАБІ АМБІ ЯОВАТІЗС (5ЕБЕО 10 МО: 61); (Б) ЕВ-І2, яка містить амінокислотну послідовність МУМООКРООРРКИЇ М (ЗЕО ІЮО МО: 52) або ММООКРООРРКІ ПМ (ЗЕО ІЮ МО: 62); (с) ЕВ-І-3, яка містить амінокислотну послідовність ЗМРОКЕЗОБОЗОТОЕТІ ТІЗБІ ОХЕОМАМУУС (ЗЕО ІО МО: 53) або СОМРАКЕЗО5ОБКТОЕТІ ТІОРМЕАОВААТУМС (5ЕО ІО МО: 63); та (9) ЕК-1 4, яка містить амінокислотну послідовність ЕЗОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮ МО: 54) або ЕСОСТКІ ЕК (5ЗЕО
ІО МО: 64).
Наприклад, у деяких випадках антитіло проти НігАТ містить наступні шість НМЕ: ЗМУІМ5 (ЗЕО ІО МО: 39); (в) НУВ-НаІ, яка містить амінокислотну послідовність МІЗМООСТТУУЗОТІКО
Зо (ЗЕБЕО ІЮО МО: 40); та (с) НМЕА-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ОМЕКЗОИа5ЗО5МОУ (ЗЕО ІО МО: 41); (а) НУВ-11, яка містить амінокислотну послідовність КАБЕЗМОБУСКЗЕМН (ЗЕО ІО МО: 42); (є) НУВ-12, яка містить амінокислотну послідовність ГАЗКІГЕЗ (ЗЕО ІЮ МО: 43); та (3 НМА-1І3, яка містить амінокислотну послідовність ООММЕОРМТ (5ЕО ІЮ МО: 44). У деяких випадках антитіло проти НІГА1 містить наступні чотири ЕК варіабельних доменів важкого ланцюга: (а) ЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність
ЕМО! МЕЗССІЇ МОРОЗІ ВІ5СААБОЕТЕО (5ЕБО 10 МО: 47); (5) БЕВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність М/МКОАРСОКОЇГ ЕММА (5ЕБЕО ІЮО МО: 48); (с) ЕК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КЕТІЗКОМЗКМТ М ОММ5І КАЕОТАМУУСАК (5ЕО ІО МО: 49); та (4) ЕВ-Н4, яка містить амінокислотну послідовність УУБОСТІ МУЗ (ЗБЕО ІЮО МО: 50). У додаткових випадках антитіло проти НІгГАї містить наступні чотири ЕК варіабельних доменів легкого ланцюга: (а) ЕК-1, яка містить амінокислотну послідовність
РІММТО5РОБІ АМБІЯЕВАТІМС (БО 10 МО: 51); (Б) ЕВ-І2, яка містить амінокислотну послідовність МУСООКРООРРКІ ІМ (5БО ІЮО МО: 52); (с) ЕВ-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЗМРОКЕБОЗОЗСОСТОЕТІ ТІЗБІ ОАЕОМАМУУС (5ЕО ІЮО МО: 53); та (й) ЕК-1 4, яка містить амінокислотну послідовність ЕСОСТКМЕЇїК (ЗЕО ІО МО: 54). У деяких випадках антитіло проти НІГА1 містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 45, та (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІО МО: 46. У деяких випадках антитіло проти НІігГА1 являє собою п19812.м1.
Наприклад, у деяких випадках антитіло проти НІгГАТ містить наступні шість НМК: 5МУІМ5 (ЗЕО ІО МО: 39); (в) НУВ-НаІ, яка містить амінокислотну послідовність МІЗМООСТТУУЗОТІКО (ЗЕБЕО ІЮО МО: 40); та (с) НМЕК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ОМЕКЗОСЗЗМОУ (ЗЕО ІО МО: 41); (а) НУВ-11, яка містить амінокислотну послідовність КАБЕЗМОЗУСКЗЕМН (ЗЕО ІО МО: 42); (є) НУВ-12, яка містить амінокислотну послідовність ГАЗКІГЕЗ (ЗЕО ІЮ МО: 43); та (3 НМА-1І3, яка містить амінокислотну послідовність ООММЕОРМТ (5ЕО ІЮО МО: 44). У деяких випадках антитіло проти НІГА1 містить наступні чотири ЕК варіабельних доменів важкого ланцюга: (а) ЕВ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність
ЕМКІМЕЗБОССІ МЕРОСОЗІ КІ АСМАБОЕТЕЗ (5ЕБО 10 МО: 57); (Б) БЕВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність МУУКОТРЕККІ ЕММА (5ЕБО ІЮО МО: 58); (с) ЕБ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КЕТІЗКОМАКМТІ МГ ОМ5ТІ КЗЕОТАЇІМЕСАК (5ЕО ІО МО: 59); та (а) 60 ЕВ-НА, яка містить амінокислотну послідовність МЗОСТАМТУЗ5 (ЗЕО ІЮО МО: 60). У додаткових випадках антитіло проти НігАї містить наступні чотири ЕК варіабельних доменів легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, яка містить амінокислотну послідовність МІММТО5РАЗБІ АМ5І СОКАТІЗС (5ЕО ІО МО: 61); (б) ЕВ-12, яка містить амінокислотну послідовність М'МООКРООРРКІ ІМ (ЗЕО
ІО МО: 62); (с) ЕВ-І3, яка містить амінокислотну послідовність
СУРАНЕЗОаЗаЗАТОЕТІ ТІОРМЕАООСААТУМС (5БО І МО: 63); та (4) ЕБ-14, яка містить амінокислотну послідовність ЕСОСТКІ БІК (5ЕО ІО МО: 64). У деяких випадках антитіло проти
НІГА1 містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 55, та (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 56. У деяких випадках антитіло проти НІГА1 являє собою 19812 (також називається т!319812).
В іншому прикладі антитіло проти НІгГАТ! за цим винаходом містить одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК варіабельних доменів легкого та важкого ланцюга антитіла 20Е2 (5ЕО ІЮ
МО: 66 та 65, відповідно), та причому (ї) послідовність НМК-І1 містить амінокислотні залишки 24-34 за Кабатом, послідовність НУВ-12 містить амінокислотні залишки 50-56 за Кабатом, а послідовність НМЕ-І З містить амінокислотні залишки 89-97 за Кабатом 5ЕО ІЮО МО: 66, та (ії) послідовність НМЕ-НІ1 містить амінокислотні залишки 31-35 за Кабатом, послідовність НУВ-Н2 містить амінокислотні залишки 50-65 за Кабатом, а послідовність НУВ-НЗ містить амінокислотні залишки 95-102 за Кабатом 5ЕО ІО МО: 65, або комбінацію однієї або більше з вищенаведених
НМА та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 Уо, 83 Ус, 84 95, 85 Уо, 86 90, 87 Уо, 88 Ус, 89 9о, 90 96, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 Уо, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичність) з будь-якою з вищенаведених НУК антитіла 20Е2. У деяких випадках антитіло проти НІГАТ містить (а) домен
МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 90 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 9, 93 У», 94 9, 95 90, 96 9», 97 Фо, 98 95, або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 65; (Б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 90 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 9, 93 Фо, 94 9, 95 95, 96 95, 97 90, 98 9о, або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 66; або (с) домен УН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (Б). У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 65, та домен МІ, який містить амінокислотну
Ко) послідовність ЗЕО ІЮ МО: 66.
В іншому прикладі антитіло проти НІгГАТ! за цим винаходом містить одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НМК варіабельних доменів легкого та важкого ланцюга антитіла ЗА5 (5ЕО ІЮ
МО: 68 та 67, відповідно), та причому (ї) послідовність НМК-І1 містить амінокислотні залишки 24-34 за Кабатом, послідовність НУВ-12 містить амінокислотні залишки 50-56 за Кабатом, а послідовність НМЕ-І З містить амінокислотні залишки 89-97 за Кабатом 5ЕО ІЮО МО: 68, та (ії) послідовність НУВ-НІ1 містить амінокислотні залишки 31-35 за Кабатом, послідовність НУВ-Н2 містить амінокислотні залишки 50-65 за Кабатом, а послідовність НУВ-НЗ містить амінокислотні залишки 95-102 за Кабатом 5ЕО ІО МО: 67, або комбінацію однієї або більше з вищенаведених
НМА та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 Уо, 83 Ус, 84 95, 85 Уо, 86 90, 87 Уо, 88 Ус, 89 9о, 90 96, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 Уо, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичність) з будь-якою з вищенаведених НМК антитіла ЗА5. У деяких випадках антитіло проти НІГА1 містить (а) домен
МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 90 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 9, 93 У», 94 9, 95 90, 96 9», 97 Фо, 98 95, або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 67; (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 90 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 9, 93 Фо, 94 9, 95 95, 96 95, 97 90, 98 9о, або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 68; або (с) домен УН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (Б). У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 67, та домен МІ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 68.
В іншому прикладі антитіло проти НІгГАТ! за цим винаходом містить одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК варіабельних доменів легкого та важкого ланцюга антитіла 12А5 (ЗЕО ІО
МО: 70 та 69, відповідно), та причому (ї) послідовність НМК-І1 містить амінокислотні залишки 24-34 за Кабатом, послідовність НМЕ-І/2 містить амінокислотні залишки 50-56 за Кабатом, а послідовність НМЕ-І З містить амінокислотні залишки 89-97 за Кабатом 5ЕО ІЮО МО: 70, та (ії) послідовність НУВ-НІ1 містить амінокислотні залишки 31-35 за Кабатом, послідовність НУВ-Н2 містить амінокислотні залишки 50-65 за Кабатом, а послідовність НУВ-НЗ містить амінокислотні залишки 95-102 за Кабатом 5ЕО ІО МО: 69, або комбінацію однієї або більше з вищенаведених 60 НМА та один або більше їх варіантів, що мають щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 Уо, 83 Ус, 84 95, 85 Уо, 86 90, 87 Уо, 88 Ус, 89 9о, 90 96, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 Уо, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичність) з будь-якою з вищенаведених НУК антитіла 12А5. У деяких випадках антитіло проти НІГАТ містить (а) домен
МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 90 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 9, 93 У», 94 9, 95 90, 96 9», 97 Фо, 98 95, або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 69; (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 90 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 9, 93 Фо, 94 9, 95 95, 96 95, 97 90, 98 9о, або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 70; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (Б). У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 69, та домен МІ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 70.
У деяких випадках антитіло проти НІГА1 містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 90 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9790, 9895, або 9995 ідентичність послідовності) з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 21, 23, 76, 77, 78, 93-101, 106 або 107; (5) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 90 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 9, 93 У», 94 9, 95 90, 96 9», 97 Фо, 98 95, або 99 95 ідентичність послідовності) з будь-якою з послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 22, 24, 72-74, 81-92, 105 або 108; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен Мі, аналогічний описаному в (Б). Наприклад, у деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 21, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 23, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 24. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 76, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 72. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 77, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 73. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить
Ко) амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 78, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 74. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 77, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 87. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 95, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 73. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 94, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 73. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 93, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 73. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 77, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 83. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 97, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 73. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 77, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 85. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 77, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 84. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮО МО: 100, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 73. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить
БО амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 99, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 73. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 101, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 73. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 77, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 86. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 96, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 73. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 77, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 82. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить 60 амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 77, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 88. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 77, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 81. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 77, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 89. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 98, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 73. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 77, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 90. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 95, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 83. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 93, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 83. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 94, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 87. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 97, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 83. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 94, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 83. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 95, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 87. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 94, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 85. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 97, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 87. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 93, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 87. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 93, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 84. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить
Ко) амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 97, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 85. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 95, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 85. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 93, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 85. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 97, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 84. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 95, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 84. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 94, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 84. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 104, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 22. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 106, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 105. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕБЕО ІЮО МО: 107, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 105. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 106, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 108. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить
БО амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 107, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 108.
У деяких випадках будь-яке з попередніх антитіл проти НІГАТ може містити одну, дві, три або чотири наступних каркасних ділянки (ЕК) варіабельних доменів важкого ланцюга: (а) ЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЕМОЇ МОЗСАЕМККРОАБУКУЗСКАЗОУХ ЕХ» (5ЕО ІЮ МО: 12), де Х: являє собою І у5 або Тпг, а Хо» являє собою ТПг, І у5 або Аго; (Б) ЕК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність МЛУКОАРОСОСІГЕММО (5ЕБО ІЮО МО: 13); (с) ЕК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КАТІТКОТЗТ5ТАМІ ЕІ 551 К5ЕОТАМУУСТЕ (ЗЕО ІО МО: 14); та (9)
ЕВ-Н4, яка містить амінокислотну послідовність М/ЗОСТІ МТУ (ЗЕБЕО ІЮ МО: 15). У деяких випадках будь-яке з попередніх антитіл НігА1 може містити одну, дві, три або чотири наступних бо ЕК варіабельних доменів важкого ланцюга: (а) ЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність
ОМОГОО5САБЇ МАРОАБЗМТІ ЗСКАБОМТЕТ (5ЕБО 10 МО: 25) (Б) БЕВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність М"ІМКОТРМНОГЕУМІС (ЗБО І МО: 26); (с) ЕК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність КАТ ТАОКЗЗЗТАММЕЇ КІ ТЗЕОБАМУУСТК (5ЕО ІО МО: 27); та (ад) ЕВ-НА, яка містить амінокислотну послідовність УММЗОСТОМТМУ55 (5ЕО ІЮ МО: 28).
У деяких випадках будь-яке з попередніх антитіл проти НІГАТ може містити одну, дві, три або чотири наступних ЕК варіабельних доменів легкого ланцюга: (а) ЕК-І71, яка містить амінокислотну послідовність ОІЮМТО5РБЗБЗІ ЗАЗМООКМТІТС (ЗЕО ІЮ МО: 17); (Б) ЕВ-12, яка містить амінокислотну послідовність МУМООКРОКАРКРІІЗ (ЗЕБО ІЮ МО: 18); (с) ЕК-І3, яка містить амінокислотну послідовність ЗМРОКЕЗОЗОЗОТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕОБАТУМС (5ЕО ІЮО МО: 19); та (й) ЕВ-14, яка містить амінокислотну послідовність ЕБОСТКМЕЇК (ЗЕО ІО МО: 20). В інших випадках будь-яке з попередніх антитіл проти НігГАї може містити одну, дві, три або чотири наступних ЕК варіабельних доменів легкого ланцюга: (а) ЕК-І71, яка містить амінокислотну послідовність МІММТО5РАЗІ АМ5І СОКАТІЗС (ЗЕО ІЮ МО: 29); (Б) ЕВ-І2, яка містить амінокислотну послідовність МУМООКРООРРКІЇЛІМ (ЗЕБЕО ІЮ МО: 30); (с) ЕК-І3, яка містить амінокислотну послідовність ЗМРАКЕЗОБОЗКТОЕТІ ТІОРМЕАОрААТУМС (5ЕО ІЮ МО: 31); та (9) ЕК-1 4, яка містить амінокислотну послідовність ЕЗСОСТКІ ЕК (5ЕО ІЮ МО: 32).
У деяких випадках антитіло проти НІГАТ містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 90 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9790, 9895, або 9995 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 45, 55, 65, 67 або 69; (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 90 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 9, 93 Фо, 94 9, 95 95, 96 95, 97 90, 98 9о, або 99 95 ідентичність послідовності) з будь-якою з послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 46, 56, 66, 68 або 70; або (с) домен УН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (Б). Наприклад, у деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність зБЕО ІЮО МО: 45, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 46. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІО МО: 55, та домен
МІ, який містить амінокислотну послідовність ЕС І МО: 56. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 65, та домен МІ., який містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 66. У деяких випадках антитіло містить домен
МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 67, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 68. У деяких випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 69, та домен МІ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 70.
У деяких випадках у винаході запропоновано виділене антитіло, яке специфічно зв'язує
НЕГАТ, яке містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 21, та (Б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22, таке як антитіло, що називається у цьому документі АРЕО.І СЗ3.НОЗ.
У деяких випадках у винаході запропоновано виділене антитіло, яке специфічно зв'язує
НЕГАТ, яке містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 45, та (Б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 46, таке як антитіло, що називається у цьому документі п1986.м1.
У деяких випадках у винаході запропоновано антитіло проти НІГАТ, яке зв'язується з тим же самим епітопом, що й будь-яке з попередніх антитіл. У деяких випадках у винаході запропоновано антитіло проти НігАї, яке конкурує за зв'язування НігАї з будь-яким з попередніх антитіл.
У деяких варіантах реалізації винаходу будь-яке з попередніх антитіл проти НІГАТї може мати одну або більше наступних властивостей: (і) зв'язуватися з НІігГАТ у співвідношенні 1 варіабельний домен до однієї суб'єдиниці тримера НігАї (наприклад, Бар зв'язується з тримером НІГА1 у співвідношенні З Рабр до 1 тримера НІГА1, а дО зв'язується з тримером НІГА1 у співвідношенні З ДС до 2 тримерів НІГАТ), (її) для антитіл, які містять два варіабельних домена, зв'язуватися з НігАї способом, що призводить до утворення "клітки", подібної зображеній на ФІГ. 9 публікації заявки на патент США 05 2013/0129743, (ії) не попереджати утворення тримера НігАт1, (ім) перехресно реагувати з мишачим НігАт1; (м) не реагувати перехресно з НігА2г, НІГАЗ та/або НІіГА4; (мі) повністю зв'язуватися з НІГАТ щодо антитіла проти
НІГАТ УМ/505.94.2в8а (див., наприклад, УМО 2013/055998), (мії) інгібувати утворення комплексу між НігГАї та альфа-антитрипсином (АІАТ). У деяких варіантах реалізації винаходу запропоновано антитіло, яке зв'язується з тим же самим епітопом, що й будь-яке з попередніх антитіл. 60 У додатковому аспекті винаходу антитіло проти НігАї у відповідності з будь-яким з вищенаведених варіантів реалізації винаходу може включати ознаки, окремо або у комбінації, описані нижче у розділах 1-8 розділу С "Властивості та особливості антитіла".
В. Типові антитіла проти фактора О
У винаході запропоновані антитіла проти фактора 0, які можна застосовувати з антитілами проти НігГАї за цим винаходом, наприклад, у способах лікування порушення, включаючи пов'язане з НігАї порушення, хворобу ока та/або пов'язане з комплементом порушення (наприклад, ВМД (наприклад, географічна атрофія)) У винаході також запропоновані мультиспецифічні (наприклад, біспецифічні) антитіла, здатні специфічно зв'язуватися з НІГА1 та фактором О (наприклад, антитіла проти НігА1т/фактора 0). У композиціях та способах за цим винаходом можна використовувати будь-яке підходяще антитіло проти фактора 0. Як необмежуючий приклад, у композиціях та способах за цим винаходом можна використовувати будь-яке антитіло проти фактора ОО, описане у цьому документі та/(або у патенті США Мо 8067002; 8268310; 8273352 та/або у заявці на патент США Мо 14/700853.
Наприклад, у деяких випадках антитіло проти фактора О може містити амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 то, 82 то, 83 то, 84 то, 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 9495, 9595, 9690, 9795, 9895 або 9995 ідентичність послідовності) з послідовністю моноклонального антитіла 166-32, отриманого з гібридоми, депонованій в Американській колекції типових культур (АТСС) та позначеній НВ12476. Наприклад, у деяких випадках антитіло проти фактора О містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 У, 84 95, 85 95, 86 Ус, 87 У, 88 95, 89 95, 90 Ус, 91 У, 92 95, 93 Ус, 94 Ус, 95 У, 96 95, 97 Ус, 98 Уо або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 136; (Б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність що має щонайменше близько 8095 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 Уо, 83 Ус, 84 95, 85 Уо, 86 90, 87 Уо, 88 Ус, 89 9о, 90 оо, 91 95, 92 95, 93 95, 94 90, 9595, 96 95, 97 Ус, 98 95 або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 137; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен Мі, аналогічний описаному в (Б). Наприклад, у деяких випадках антитіло проти фактора О містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 136, та домен МІ., який містить
Зо амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 137, таке як моноклональне антитіло проти фактора Ю 166-32. У деяких випадках антитіло проти фактора Ю являє собою гуманізоване похідне моноклонального антитіла 166-32. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора О зв'язується з тим же епітопом, що й моноклональне антитіло 166-32. У деяких випадках антитіло проти фактора О являє собою фрагмент антитіла, отриманий з моноклонального антитіла 166-32. У деяких випадках фрагмент антитіла, отриманий з моноклонального антитіла 166-32, являє собою фрагмент Раб, БРаб'-5Н, Ем, зоЕм або (Рабр")». У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент антитіла, отриманий з моноклонального антитіла 166-32, являє собою Еаб.
У деяких випадках гуманізоване похідне моноклонального антитіла 166-32 можна застосовувати у композиціях та способах за цим винаходом. Наприклад, у композиціях та способах за цим винаходом можна застосовувати будь-яке гуманізоване похідне моноклонального антитіла 166-32, описане, наприклад, у патенті США Мо 8067002. Типові гуманізовані похідні моноклонального антитіла 166-32, описані у патенті США Мо 8067002, включають, наприклад, клони Мо 111, Мо 56, Мо 250 та Мо 416 гуманізованих антитіл проти фактора 0. Амінокислотні послідовності доменів МН та Мі. клонів Мо 111, Мо 56, Мо 250 та Мо 416 гуманізованих антитіл проти фактора О показані, наприклад, на Фіг. 5 патенту США Мо 8067002.
У деяких випадках антитіло проти фактора О містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 У, 84 95, 85 95, 86 Ус, 87 У, 88 95, 89 95, 90 Ус, 91 У, 92 95, 93 Ус, 94 Ус, 95 У, 96 95, 97 Ус, 98 Уо
БО або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю клону Мо 111, Мо 56, Мо 250 або Мо 416 антитіла проти фактора 0.
У деяких випадках у композиціях та способах за цим винаходом можна застосовувати модифіковані антитіла або варіанти гуманізованих антитіл проти фактора О та їх фрагменти.
Наприклад, у композиціях та способах за цим винаходом можна застосовувати будь-яке модифіковане або версію варіанта клону Мо 111 гуманізованого антитіла проти фактора 0, описану, наприклад, у патенті США Мо 8273352, наприклад, клон 238 або 238-1 антитіла. У деяких випадках антитіло проти фактора О містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 У, 84 95, 85 95, 86 Ус, 87 У, 88 95, 89 95, 90 Ус, 91 У, 92 95, 93 Ус, 94 Ус, 95 У, 96 95, 97 Ус, 98 Уо 60 або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю клону 238 або 238-1 антитіла проти фактора 0.
У деяких випадках антитіло проти фактора О або його антигензв'язуючий фрагмент може містити щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних з: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність СУТЕТММОММ (ЗЕО ІЮ МО: 109); (5) НМК-На, яка містить амінокислотну послідовність УМІМТУТЗЕТТМАХІОРКО (ЗЕО ІО МО: 110), де Хі являє собою Азр або Сім; (с) НМЕ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕОСМХІМ (ЗЕО ІЮ МО: 111), де Хі являє собою Авзп або 5ег; (й) НМК-11, яка містить амінокислотну послідовність ІТЗТХЇХ» х зОММ (ЗЕО ІЮ МО: 112), де Хі являє собою Ар або 5ег, Хг являє собою Ар або Сім, а Хз являє собою
Ар або Зег; (є) НМЕ-12, яка містить амінокислотну послідовність (ЗОМ КР (ЗЕО ІЮ МО: 113); та (3 НМК-1І3, яка містить амінокислотну послідовність ГО5Х:5І РМТ (ЗЕО ІЮО МО: 114), де Хі являє собою Авр або Сім, або комбінацію з однієї або білоше вищенаведених НУК та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 то, 82 то, 83 то, 84 то, 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичність) з будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 109-114.
Наприклад, у деяких випадках антитіло проти фактора О або його антигензв'язуючий фрагмент містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУТЕТМУОММ (ЗЕО ІО МО: 109); (б) НУВ-НАа, яка містить амінокислотну послідовність УМІМГУТЗЕТТМАХІОЕКа (ЗЕО ІЮО МО: 110), де Хі являє собою Ар або Си; (с) НМЕ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕССМХ:М (ЗЕО ІЮО МО: 111), де Хі являє собою Авр або 5Зег; (4) НМЕ-І1, яка містить амінокислотну послідовність ІТЗТХ ЇХ» х ЗОММ (ЗЕО ІЮО МО: 112), де Хі являє собою Азр або Зег, Хг являє собою Ар або сій, а Хз являє собою Азвр або 5ег; (є) НМК-12, яка містить амінокислотну послідовність СЗОМТІКР (5ЕБЕО ІО МО: 113); та () НМК-І3, яка містить амінокислотну послідовність ГО5Х:5ЗІ РУТ (ЗЕО ІО МО: 114), де Хі являє собою Азр або Сім.
Наприклад, у деяких випадках антитіло проти фактора ЮО або його антигензв'язуючий фрагмент може містити щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних з: (а)
НМВ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУТЕТММСОММ (5ЕО ІЮ МО: 109); (5) НМА-На2, яка містить амінокислотну послідовність УМІМТ УТОЕТТМАВОРКО (5ЕО ІЮ МО: 115); (с) НМА-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕССМММ (ЗЕБЕО ІЮ МО: 116); (4) НМК-1І1, яка містить амінокислотну послідовність ІТ5ТОІЮООММ (5ЕБО І МО: 117); (є) НМК-12, яка містить
Зо амінокислотну послідовність СЗОМТІКР (5ЕБЕО ІО МО: 113); та () НМК-І3, яка містить амінокислотну послідовність І О5О5І РУТ (ЗЕО ІЮ МО: 118), або комбінацію з однієї або більше вищенаведених НМЕК та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 95, 86 90, 87 Фо, 88 оо, 89 95, 90 о, 91 95, 92 о, 93 Фо, 94 95, 95 Ус, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичність) з будь- якою з ЗЕО ІЮ МО: 109, 113 або 115-118. Наприклад, у деяких випадках антитіло проти фактора р або його антигензв'язуючий фрагмент містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУТЕТМУОММ (ЗБО ІО МО: 109); (5) НМК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність УЛМТУТОЕТТУАСОРКО (5БО ІЮ МО: 115); та (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕСОМММ (БО ІЮ МО: 116); (4) НМК-І1, яка містить амінокислотну послідовність ІТ5ТОІЮОЮОММ (ЗЕБО ІЮО МО: 117); (є) НМК-12, яка містить амінокислотну послідовність СЗОМТІКР (5ЕБЕО ІО МО: 113); та () НМК-І3, яка містить амінокислотну послідовність ГОО5ОБІ РУТ (ЗЕО ІЮ МО: 118).
У деяких випадках антитіло проти фактора О містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 90 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 9, 93 Фо, 94 9, 95 95, 96 95, 97 90, 98 9о, або 99 95 ідентичність послідовності) з будь-якою з послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 119, 131 або 132; (р) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність що має щонайменше близько 9095 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 9, 93 У», 94 9, 95 90, 96 9», 97 Фо, 98 95, або 99 95 ідентичність послідовності) з будь-якою з послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 120, 133, 134 або 135; або (с) МН, аналогічний описаному в (а), та МІ, аналогічний описаному в (Б). Наприклад, у деяких випадках антитіло містить домен УН, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ
МО: 119, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 120. В інших випадках антитіло містить домен УН, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 131, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 133. В інших випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 131, та домен
МІ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 134. В інших випадках антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІО МО: 131, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮО МО: 135. В інших випадках антитіло містить домен
МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 132, та домен Мі, який містить 60 амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 135. У композиціях та способах за цим винаходом можна використовувати будь-яке з антитіл проти фактора О, зображених на Фіг. 30, або їх варіанти, або їх фрагменти. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора Ю або його антигензв'язуючий фрагмент містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність 560 ІЮО МО: 119, та домен МІ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ
МО: 120. У деяких випадках антигензв'язуючий фрагмент антитіла проти фактора О являє собою лампалізумаб, що має реєстраційний номер СА5 1278466-20-8.
В іншому прикладі, у деяких випадках антитіло проти фактора О являє собою або отримане з антитіла 20012, наприклад, як описано у патенті США Мо 8268310. В одному прикладі антитіло проти фактора О містить одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НМК варіабельних доменів легкого та важкого ланцюга антитіла 20012 (5ЕО ІО МО: 128 та 127, відповідно), та причому (Її) послідовність НУВ-І1 містить амінокислотні залишки 24-34 за Кабатом, послідовність НМУРВ-І 2 містить амінокислотні залишки 50-56 за Кабатом, а послідовність НУВ-І З містить амінокислотні залишки 89-97 за Кабатом 5ЕО ІЮ МО: 128, та (ії) послідовність НМЕК-НІ містить амінокислотні залишки 31-35 за Кабатом, послідовність НУМК-Н2 містить амінокислотні залишки 50-65 за
Кабатом, а послідовність НУВ-НЗ містить амінокислотні залишки 95-102 за Кабатом 5ЕО ІЮО МО: 127, або комбінацію однієї або більше з вищенаведених НМК та один або більше їх варіантів, що мають щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 Фо, 82 95, 83 У, 84 95, 85 У, 86 95, 87 У, 88 95, 89 У, 90 Ус, 91 У, 92 Ус, 93 У, 94 Ус, 95 У, 96 9, 97 9», 98 95 або 99 95 ідентичність) з будь-якою з вищенаведених НУК антитіла 20012.
У деяких випадках антитіло проти фактора О містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 95, 84 Уо, 85 95, 86 Уо, 87 Ус, 88 95, 89 о, 90 95, 91 9о, 92 9, 93 90, 94 Фо, 95 95, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю
ЗЕО ІЮ МО: 127; (В) домен МГ, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 9, 84 95, 85 95, 86 95, 87 95, 88 95, 89 95, 90 У, 91 9, 92 9, 93 95, 94 95, 95 95, 96 У, 97 Ус, 98 95 або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 128; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен Мі, аналогічний описаному в (Б). Наприклад, у деяких випадках антитіло проти фактора О містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 127, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 128, таке як антитіло проти фактора О 20012. У деяких випадках антитіло проти фактора О містить важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮО МО: 129 та легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 130. У деяких випадках антитіло проти фактора ЮО являє собою гуманізоване похідне моноклонального антитіла 20012. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора О зв'язується з тим же епітопом, що й моноклональне антитіло 20012 або його гуманізоване похідне. У деяких випадках антитіло проти фактора Ю являє собою фрагмент антитіла, отриманий з моноклонального антитіла 20012 або його гуманізоване похідне. У деяких випадках фрагмент антитіла, отриманий з моноклонального антитіла 20012 або його гуманізованого похідного, являє собою фрагмент
Еаб, Рар-5Н, Ем, зсбм або (Бар")». У деяких випадках фрагмент антитіла, отриманий з моноклонального антитіла 20012 або його гуманізованого похідного, являє собою Раб.
У деяких випадках у композиціях та способах за цим винаходом можна використовувати фрагменти будь-якого з попередніх антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язуючі фрагменти). Фрагменти антитіл за цим винаходом можуть представляти собою, наприклад, Раб,
Еабр", Каб")», зегм, (зсЕм)», АБ, фрагменти гіперваріабельних ділянок (НУК), лінійні антитіла, молекули одноланцюгових антитіл, мінітіла, діатіла або мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. У додатковому варіанті реалізації винаходу у композиціях та способах за цим винаходом можна використовувати фрагмент антитіла проти фактора О (наприклад, антигензв'язуючий фрагмент), здатний проникати практично до всієї сітківки. У ще одному додатковому варіанті реалізації винаходу у композиціях та способах за цим винаходом можна використовувати фрагмент антитіла проти фактора О (наприклад, антигензв'язуючий фрагмент), здатний проникати крізь всю товщину сітківки.
У деяких випадках винахід може охоплювати застосування гуманізованих антитіл проти фактора 0, причому фрагмент Раб таких антитіл має період напіввиведення щонайменше 3, 5, 7, 10 або 12 днів після введення до ока ссавця (наприклад, людини) за допомогою одноразової ін'єкції всередину скловидного тіла. В іншому варіанті реалізації винахід може охоплювати застосування гуманізованих антитіл проти фактора О, причому фрагмент Рар таких антитіл інгібує альтернативний шлях (АР) активації комплементу протягом щонайменше 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 або 115 днів після введення до ока ссавця бо (наприклад, людини) за допомогою одноразової ін'єкції всередину скловидного тіла. В іншому варіанті реалізації винахід може охоплювати застосування гуманізованих антитіл проти фактора р, причому концентрація фрагмента Раб таких антитіл, яка інгібує альтернативний шлях (АР) активації комплементу, підтримується у тканині сітківки протягом щонайменше 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 або 85 днів після введення до ока ссавця (наприклад, людини) за допомогою одноразової ін'єкції всередину скловидного тіла. В іншому варіанті реалізації винахід може охоплювати застосування гуманізованих антитіл проти фактора О, причому концентрація фрагмента Раб таких антитіл, яка інгібує альтернативний шлях (АР) активації комплементу, підтримується у скловидному тілі протягом щонайменше 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 або 115 днів після введення до ока ссавця (наприклад, людини) за допомогою одноразової ін'єкції всередину скловидного тіла. В одному прикладі винахід охоплює застосування фрагмента вказаних антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язуючих фрагментів).
У деяких випадках будь-яке з попередніх антитіл проти фактора О у своїй моновалентній формі зв'язує фактор О з КО рівною близько 20 нМ або нижче (наприклад, КО антитіла у вигляді фрагмента Рар до фактора 0). У деяких випадках запропоноване у цьому документі антитіло у своїй моновалентній формі зв'язує фактор О з КО рівною близько 10 нМ або нижче. У деяких випадках запропоноване у цьому документі антитіло у своїй моновалентній формі зв'язує фактор О з КО рівною близько 5 нМ або нижче. У деяких випадках запропоноване у цьому документі антитіло у своїй моновалентній формі зв'язує фактор 0 з КО рівною близько 2 нМ або нижче. Наприклад, у деяких випадках антитіло у своїй моновалентній формі зв'язує фактор О з
КО між близько 0,5 пМ та близько 2 нМ (наприклад, близько 0,5 пМ, близько 1 пМ, близько 2 пМ, близько З пМ, близько 4 пМ, близько 5 пМ, близько 6 пМ, близько 7 пМ, близько 8 пМ, близько 9
ПМ, близько 10 пМ, близько 15 пМ, близько 20 пМ, близько 25 пМ, близько 50 пМ, близько 75
ПМ, близько 100 пМ, близько 125 пМ, близько 150 пМ, близько 175 пМ, близько 200 пМ, близько 225 пМ, близько 250 пМ, близько 275 пМ, близько 300 пМ, близько 325 пМ, близько 350 пМ, близько 375 пМ, близько 400 пМ, близько 425 пМ, близько 450 пМ, близько 475 пМ, близько 500
ПМ, близько 525 пМ, близько 550 пМ, близько 575 пМ, близько 600 пМ, близько 625 пМ, близько 650 пМ, близько 675 пМ, близько 700 пМ, близько 725 пМ, близько 750 пМ, близько 775 пМ, близько 800 пМ, близько 825 пМ, близько 850 пМ, близько 875 пМ, близько 900 пМ, близько 925
ПМ, близько 950 пМ, близько 975 пМ, близько 1 нМ, близько 1,1 нМ, близько 1,2 нМ, близько 1,3
Ко) НМ, близько 1,4 нМ, близько 1,5 нМ, близько 1,6 нМ, близько 1,7 НМ, близько 1,8 нМ, близько 1,9
НМ або близько 2 нМ). У деяких випадках антитіло у своїй моновалентній формі зв'язує фактор р з КО від близько 0,5 пМ до близько 100 пМ. У деяких випадках антитіло у своїй моновалентній формі зв'язує фактор ЮО з КО рівною близько 0,5 пМ. У деяких випадках антитіло у своїй моновалентній формі зв'язує фактор О з КО нижче близько 10 пМ.
У деяких випадках будь-яке з попередніх антитіл проти фактора 0 у своїй бівалентній формі зв'язує фактор О з КО рівною близько 10 нМ або нижче (наприклад, КО антитіла у вигляді дО до фактора 0). У деяких випадках запропоноване у цьому документі антитіло у своїй бівалентній формі зв'язує фактор ОЮ з КО рівною близько 5 нМ або нижче. У деяких випадках запропоноване у цьому документі антитіло у своїй бівалентній формі зв'язує фактор Ю з КО рівною близько 2 нМ або нижче. Наприклад, у деяких випадках антитіло у своїй бівалентній формі зв'язує фактор О з КО між близько 0,5 пМ та близько 2 нМ (наприклад, близько 0,5 пМ, близько 1 пМ, близько 2 пМ, близько З пМ, близько 4 пМ, близько 5 пМ, близько 6 пМ, близько 7
ПМ, близько 8 пМ, близько 9 пМ, близько 10 пМ, близько 15 пМ, близько 20 пМ, близько 25 пМ, близько 50 пМ, близько 75 пМ, близько 100 пМ, близько 125 пМ, близько 150 пМ, близько 175
ПМ, близько 200 пМ, близько 225 пМ, близько 250 пМ, близько 275 пМ, близько 300 пМ, близько 325 ПМ, близько 350 пМ, близько 375 пМ, близько 400 пМ, близько 425 пМ, близько 450 пМ, близько 475 пМ, близько 500 пМ, близько 525 пМ, близько 550 пМ, близько 575 пМ, близько 600
ПМ, близько 625 пМ, близько 650 пМ, близько 675 пМ, близько 700 пМ, близько 725 пМ, близько 750 пМ, близько 775 пМ, близько 800 пМ, близько 825 пМ, близько 850 пМ, близько 875 пМ,
БО близько 900 пМ, близько 925 пМ, близько 950 пМ, близько 975 пМ, близько 1 нМ, близько 1,1
НМ, близько 1,2 нМ, близько 1,3 нМ, близько 1,4 нМ, близько 1,5 нМ, близько 1,6 нМ, близько 1,7
НМ, близько 1,8 нМ, близько 1,9 нМ або близько 2 нМ). У деяких випадках антитіло у своїй бівалентній формі зв'язує фактор ЮО з КО від близько 0,5 пМ до близько 100 пМ. У деяких випадках антитіло у своїй бівалентній формі зв'язує фактор О з КО рівною близько 0,5 пМ. У деяких випадках антитіло у своїй бівалентній формі зв'язує фактор О з КО нижче близько 10 пМ.
У додатковому аспекті винаходу антитіло проти фактора О у відповідності з будь-яким з вищенаведених варіантів реалізації винаходу може включать ознаки, окремо або у комбінації, описані нижче в розділах 1-8 розділу С "Властивості та ознаки антитіл".
С. Властивості та ознаки антитіл бо Описані у цьому документі антитіла (наприклад, антитіла проти НІігАї1 та антитіла проти фактора 0, описані вище, а також антитіла проти НігАт/фактора О, описані нижче), а також будь-яке з антитіл для застосування в описаних у цьому документі способах, може мати будь- яку з ознак, окремо або у комбінації, описані нижче у розділах 1-8. 1. Афінність антитіл
У деяких варіантах реалізації винаходу запропоноване у цьому документі антитіло (наприклад, антитіло проти НІГАТ, антитіло проти фактора О або біспецифічне антитіло проти
НІГА1 та проти фактора 0) має значення константи дисоціації (КО) х 1 мкМ, х 100 НМ, х 10 НМ, х 1 НМ, х0,1 нМ, х 0,01 нМ або х 0,001 нМ (наприклад, 103 М або менше, наприклад, від 109 М до 1073 М, наприклад, від 109 М до 10-73 М). Наприклад, у деяких випадках запропоноване у цьому документі антитіло зв'язує НІГАТ (пиНігАт) з КО рівною близько 10 нМ або нижче. У деяких випадках запропоноване у цьому документі антитіло зв'язує пПиНІігА1 з КО рівною близько 5 нм або нижче. У деяких випадках запропоноване у цьому документі антитіло зв'язує пПиНІгА1 з КО рівною близько 2 нМ або нижче. Наприклад, у деяких випадках антитіло зв'язує пПиНігАт з КО між близько 25 пМ та близько 2 нМ (наприклад, близько 25 пМ, близько 50 пМ, близько 75 пМ, близько 100 пМ, близько 125 пМ, близько 150 пМ, близько 175 пМ, близько 200 пМ, близько 225
ПМ, близько 250 пМ, близько 275 пМ, близько 300 пМ, близько 325 пМ, близько 350 пМ, близько 375 пМ, близько 400 пМ, близько 425 пМ, близько 450 пМ, близько 475 пМ, близько 500 пМ, близько 525 пМ, близько 550 пМ, близько 575 пМ, близько 600 пМ, близько 625 пМ, близько 650
ПМ, близько 675 пМ, близько 700 пМ, близько 725 пМ, близько 750 пМ, близько 775 пМ, близько 800 пМ, близько 825 пМ, близько 850 пМ, близько 875 пМ, близько 900 пМ, близько 925 пМ, близько 950 пМ, близько 975 пМ, близько 1 нМ, близько 1,1 нМ, близько 1,2 НМ, близько 1,3 нМ, близько 1,4 НМ, близько 1,5 нМ, близько 1,6 нМ, близько 1,7 НМ, близько 1,8 нМ, близько 1,9 нм або близько 2 НМ). У деяких випадках антитіло зв'язує ПИНігАТ з КО між близько 75 пМ та близько 600 нМ (наприклад, близько 75 пМ, близько 100 пМ, близько 125 пМ, близько 150 пМ, близько 175 пМ, близько 200 пМ, близько 225 пМ, близько 250 пМ, близько 275 пМ, близько 300
ПМ, близько 325 пМ, близько 350 пМ, близько 375 пМ, близько 400 пМ, близько 425 пМ, близько 450 пМ, близько 475 пМ, близько 500 пМ, близько 525 пМ, близько 550 пМ, близько 575 пМ, близько 600 пМ). У деяких випадках антитіло зв'язує ПИНІГА!Т з КО між близько 75 пМ та близько 500 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує ПиНІгА1 з КО між близько 75 пМ та близько 400 пМ.
У деяких випадках антитіло зв'язує ПпиНІіГгА1 з КО між близько 75 пМ та близько 300 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує пиИнНігАТ з КО між близько 75 пМ та близько 200 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує пиИнНігАТ з КО між близько 75 пМ та близько 150 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує пиИнНігАТ з КО між близько 75 пМ та близько 125 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує пиИнНігАТ з КО між близько 75 пМ та близько 100 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує пПИНігАї з КО близько 80 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує
ПЧНЕІГАТ з КО близько 60 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує ПиНІГгА! з КО близько 40 пМ.
В одному варіанті реалізації винаходу КО вимірюють аналізом зв'язування антигена, міченого радіоактивним ізотопом (РІА). В одному варіанті реалізації РІА виконують з використанням версії Бар антитіла, що цікавить, та його антигена. Наприклад, афінність зв'язування Раб з антигеном в розчині вимірюють шляхом урівноваження Рар з мінімальною концентрацією (125І)-міченого антигена у присутності серії титрування неміченого антигена з наступним захопленням зв'язаного антигена за допомогою планшета, покритого антитілом проти Рабр (див., наприклад, Спеп еї аї., У. Мої. ВіоІ. 293:865-881(1999)). Для визначення умов аналізу багатолункові планшети МІСЕОТІТЕКФ (Тпегто 5сіепійс) покривають протягом ночі 5 мкг/мл антитіла для захоплення Раб (Сарреї І арх) у 50 мМ розчині карбонату натрію (рН 9,6), а потім блокують 2 95 (мас./06б.) розчином бичачого сироваткового альбуміну в ФБС протягом від двох до п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23 "С). У планшеті, що не містить адсорбенту (Мипс Мо 269620), змішують 100 пМ або 26 пмМ ГЦ-антигена з серійними розведеннями Раб, що цікавить (наприклад, у відповідності з оцінкою антитілом проти МЕСБЕ,
Еар-12 згідно Ргевзіа еї аІ., Сапсег Вев. 57:4593-4599 (1997)). Потім Раб, що цікавить, інкубують протягом ночі; однак інкубацію можна продовжувати протягом більш тривалого періоду (наприклад, близько 65 годин) для забезпечення досягнення рівноваги. Після цього суміші переносять до планшета для захоплення та інкубують при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Потім розчин видаляють та планшет промивають вісім разів 0,1 Фо полісорбатом 20 (ТМ/ЕЕМ-208) в ФСБ. Після висушування планшетів додають 150 мкл сцинтілятору (МІСКОБСІМТ-20 "М; РасКага) на лунку та виконують підрахунок планшетів на гама-лічильнику ТОРСОИШМТ "М (РасКага) протягом десяти хвилин. Для застосування в аналізах конкурентного зв'язування вибирають концентрації кожного Раб, які забезпечують зв'язування менше або рівне 20 95 від максимального. бо У відповідності з іншим варіантом реалізації винаходу КО вимірюють з використанням аналізу поверхневого плазмонного резонансу (ППР) ВІАСОКЕФ. Наприклад, аналіз з використанням приладу ВІАСОКЕФ-2000 або ВІАСОКЕФ-3000 (ВіІАсоге, Іпс., м. Піскатауей, штат Нью-Джерсі, США) виконують при 25 "С на чипах СМ5 з іммобілізованим антигеном при -0 одиницях відповіді (КО). В одному варіанті реалізації винаходу чипи біосенсора з карбоксиметильованим декстраном (СМ5, ВІАСОМКЕ, Іпс.) активували /М-етил-М'-(3- диметиламінопропіл)-карбодіїмідгідрохлоридом (ЕЮС) та М-гідроксисукцинімідом (МН5Б) згідно інструкцій постачальника. Антиген розбавляють 10 мМ розчином ацетату натрію, рН 4,8, до 5 мкг/мл (х0,2 мкМ) та потім вводять його при швидкості потоку 5 мкл/хвилину до досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (КО) зв'язаного білка. Після введення антигена вводять 1 М етаноламіну для блокування груп, що не прореагували. Для вимірювань кінетичних параметрів дворазові серійні розведення Раб (від 0,78 нМ до 500 нМ) вводять у ФСБ з 0,05 95 полісорбатом- 20 (ТжеепФ-20) (РВЗТ) при 25"С при швидкості потоку приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (Ка) та дисоціації (Кд) розраховують за допомогою простої моделі зв'язування Ленгмюра при співвідношенні один до одного (програмне забезпечення ВІАСОКЕ Ф Емаїчайоп Зоймаге версії 3.2) шляхом одночасної апроксимації сенсограм асоціації та дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (КО) розраховують як співвідношення Кд/Ка. Див., наприклад, Спеп еї аї.,..
Мої. Віої. 293:865-881 (1999). Якщо швидкість асоціації згідно вищеописаного аналізу поверхневого плазмонного резонансу перевищує 1056 М' с", то її можна визначати за допомогою методики гасіння флуоресценції, яка вимірює збільшення або зниження інтенсивності випромінення флуоресценції (збудження 295 нм; випромінення 340 нм, смуга пропускання 16 нм) при 25 "С для 20 нМ розчину антитіл проти антигена (у формі Раб) в ФСБ, рН 7,2, у присутності зростаючих концентрацій антигена при вимірюванні на спектрометрі, такому як обладнаний для дослідження методом зупиненого потоку (Амім Іпбігитепів) або спектрофотометрі ЗІ М-АМІМСО М серія 8000 (Тпептозресігопіс) з перемішуючою кюветою.
Значення КО також можна вимірювати з використанням аналізу ППР ВІАСОКЕФ), як описано нижче у прикладах. 2. Стабільність антитіл
У винаході запропоновані антитіла з підвищеною стабільністю, наприклад, у порівнянні з еталонним антитілом проти НІгГАТ. Стабільність антитіла можна визначати, використовуючи будь-який спосіб, відомий у цій галузі техніки, наприклад, спектроскопію (наприклад, мас- спектроскопію), диференціальну скануючу флуориметрію (ДСФ), круговий дихроїзм (КД), власну флуоресценцію білків, диференціальну скануючу калориметрію (ДСК), розсіяння світла (наприклад, динамічне розсіяння світла (ДРС) та статичне розсіяння світла (СРС), хроматографію на основі самовзаємодії (5ІС). Антитіло проти НігАї може мати, наприклад, підвищену температуру плавлення (Тт), температуру агрегації (Та) або інші параметри стабільності у порівнянні з еталонним антитілом проти НІігГА1.
У винаході запропоновані антитіла з пониженим дезамідуванням у порівнянні з еталонним антитілом проти НІГА1. Дезамідування можна знижувати або попереджати його, як описано у цьому документі та/або використовуючи відомі у цій галузі техніки способи. У винаході також запропоновані антитіла з пониженою здатністю до окиснення (наприклад, окиснення триптофану, наприклад у положенні І С-УУ91), наприклад у порівнянні з еталонним антитілом проти НІігГА1. Окиснення (наприклад, окиснення триптофану) можна знижувати або попереджати його, як описано у цьому документі та/або використовуючи відомі у цій галузі техніки способи. У винаході також запропоновані антитіла з пониженою здатністю до ізомеризації, наприклад, у порівнянні з еталонним антитілом проти НІГА1. Ізомеризацію можна знижувати або попереджати її, як описано у цьому документі та/або використовуючи відомі у цій галузі техніки способи. 3. Фрагменти антитіл
У деяких варіантах реалізації винаходу запропоноване у цьому документі антитіло являє собою фрагмент антитіла. Фрагменти антитіл включають, але не обмежуються ними, фрагменти
БО Еар, Раб", Бар'-ЗН, К(ар")», Ем та 5сЕм, а також інші фрагменти, описані нижче. Огляд деяких фрагментів антитіл див. в Ниазоп еї аї., Маї. Мед. 9:129-134 (2003). Огляд фрагментів 5сЕм див., наприклад, у Рінск(ййп, в Те Рпаптасоїоду ої Мопосіопа! Апііродієв5, мої. 113, Нозеприга апа
Мооге єав., (Зргіпдег-Мепад, Мем мок), рр. 269-315 (1994); див. також УМО 93/16185 та патенти
США Мо 5571894 і 5587458. Обговорення фрагментів Рар та К(аб», які містять залишки епітопа зв'язування рецептора реутилізації та такі, що мають збільшений період напіввиведення іп мімо, див. у патенті США Мо 5869046.
Діатіла являють собою фрагменти антитіл, які містять два антигензв'язуючі сайти, та можуть бути двовалентними або біспецифічними. Див., наприклад, ЕР 404097; МО 1993/01161; Нидзхоп еї аї., Маї. Мед. 9:129-134 (2003) та Ноїїпдег еї аї., Ргос. Май). Асад. сі. ОБА 90: 6444-6448 бо (1993). Тріатіла та тетратіла також описані у публікації Ниазоп еї аї., Маї. Мед. 9:129-134 (2003).
Однодоменні антитіла являють собою фрагменти антитіл, які містять цілий варіабельний домен важкого ланцюга антитіла або його частину, або цілий варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або його частину. У деяких варіантах реалізації однодоменне антитіло являє собою однодоменне антитіло людини (Оотапіїй5, Іпс, м. Уолтем, штат Масачусетс, США; див., наприклад, патент США Мо 6248516 В1).
Фрагменти антитіл можна отримувати різними методиками, включаючи протеолітичний гідроліз інтактного антитіла, а також продукцію рекомбінантними клітинами-хазяями (наприклад,
Е. соїї або фагом), але не обмежуючись ними, як описано у цьому документі.
У деяких варіантах реалізації винаходу запропоноване у цьому документі антитіло (наприклад, антитіло проти НігА!ї) являє собою фрагмент антитіла. У деяких варіантах реалізації винаходу Раб містить усічення в шарнірній ділянці (наприклад, верхньому шарнірі) константної ділянки важкого ланцюга. У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка Рар важкого ланцюга завершується положенням 221 (нумерація ЕО). У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислотний залишок положення 221 являє собою аспарагінову кислоту (0221). У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка важкого ланцюга Раб містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 95, 84 Уо, 85 95, 86 Уо, 87 Ус, 88 95, 89 о, 90 95, 91 9о, 92 9, 93 90, 94 Фо, 95 95, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю
ЗБО ІО МО: 156. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга 5ЕО І МО: 160. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 159. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга
ЗЕО ІЮ МО: 160 та амінокислотну послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 159. У деяких варіантах реалізації винаходу Бар являє собою Раб Ідс1.
У деяких випадках Рар зв'язує НІГАТ та може містити щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних з: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕМН (ЗЕО ІО МО: 7); (Б) НМВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність ЗМОРЕТЕСААУМОКЕКО (ЗЕО ІО МО: 8); (с) НУВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ОСХОМОМАГОМ (5ЕО ІЮ
МО: 3); (84) НУВ-11, яка містить амінокислотну послідовність КАЗЗЗМЕРІН (ЗЕО ІЮО МО: 9); (є)
Зо НМВ-12, яка містить амінокислотну послідовність АТОМІ АБ (5ЕО ІЮ МО: 10); та (3 НМА-І 3, яка містить амінокислотну послідовність ООМ/З5АРУМТ (5ЕО І МО: 11), або комбінацію з однієї або більше вищенаведених НМК та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 95, 86 90, 87 Фо, 88 оо, 89 95, 90 о, 91 95, 92 о, 93 Фо, 94 95, 95 Ус, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичність) з будь- якою з ЗЕО ІЮО МО: З або 7-11. У деяких випадках такий Рар може містити усічення в шарнірній ділянці (наприклад, верхньому шарнірі) константної ділянки важкого ланцюга. У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка Бар важкого ланцюга завершується положенням 221 (нумерація ЕМ). У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислотний залишок положення 221 являє собою Авр (0221). У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка важкого ланцюга Бар містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 У, 84 95, 85 95, 86 Ус, 87 У, 88 95, 89 95, 90 Ус, 91 У, 92 95, 93 Ус, 94 Ус, 95 У, 96 95, 97 Ус, 98 Уо або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 156. У деяких випадках Бар містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕМН (ЗЕО
ІО МО: 7); (б) НУВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність ЗМОРЕТЕСААУМОКЕКО (ЗЕ
ІО МО: 8); та (с) НМА-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУОМОМАГОМ (5ЕБЕО ІЮ МО: 3); (4) НУВ-1 1, яка містить амінокислотну послідовність ВАБЗ5ОМЕРІН (ЗЕО ІЮ МО: 9); (є) НУВ-
Ї2, яка містить амінокислотну послідовність АТЗМІ АБЗ (5ЕО ІЮ МО: 10); та (3 НМА-І3, яка містить амінокислотну послідовність ОСОУМУЗБЗАРУМТ (ЗЕБЕО ІО МО: 11), та додатково містить константну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО: 156.
У деяких випадках Раб зв'язує НІГА!1 та містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 то, 82 то, 83 то, 84 то, 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 9495, 9595, 9695, 97 95, 9895 або 9995 ідентичність послідовності) з послідовністю або амінокислотною послідовністю 5ЕС ІО МО: 21; (Б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 8095 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 то, 82 то, 83 то, 84 то, 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 9495, 9595, 9695, 97 95, 9895 або 9995 ідентичність послідовності) з послідовністю або амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 22; та (с) усічення в шарнірній ділянці (наприклад, бо верхньому шарнірі) константної ділянки важкого ланцюга. У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка Габ важкого ланцюга завершується положенням 221 (нумерація
ЕО). У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислотний залишок положення 221 являє собою Ар (0221). У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка важкого ланцюга
Раб містить амінокислотну послідовність що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 Уо, 83 Ус, 84 95, 85 Уо, 86 90, 87 Уо, 88 Ус, 89 9о, 90 оо, 91 95, 92 95, 93 95, 94 90, 9595, 96 95, 97 Ус, 98 95 або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю 5ЕС ІО МО: 156. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга ЗЕ ІО МО: 160. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність легсого ланцюга 5ЕО ІО МО: 159. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 160 та амінокислотну послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 159.
У деяких випадках Раб зв'язує НІГА!1 та містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 21, (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ
МО: 22, та (с) константну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 156. 4. Химерні та гуманізовані антитіла
У деяких варіантах реалізації винаходу запропоноване у цьому документе антитіло являє собою химерне антитіло. Деякі химерні антитіла описані, наприклад, у патенті США Мо 4816567 та Моїтізоп еї аї., Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА, 81:6851-6855 (1984). В одному прикладі химерне антитіло містить варіабельну ділянку нелюдського походження (наприклад, варіабельну ділянку, яка походить від антитіла миші, щура, хом'яка, кролика або тваринного примата, наприклад, мавпи) та людський константний домен. У додатковому прикладі химерне антитіло являє собою антитіло "з переключеним класом", в якому клас або підклас змінений у порівнянні з вихідним антитілом. Термін "химерні антитіла" включає антигензв'язуючі фрагменти таких антитіл.
У деяких варіантах реалізації винаходу химерне антитіло являє собою гуманізоване антитіло. Як правило, нелюдське антитіло гуманізують для зниження імуногенності для людей та збереження при цьому специфічності та афінності вихідного нелюдського антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло містить один або більше варіабельних доменів, в яких НУК, наприклад, СОЕ. (або їх фрагменти) походять від антитіла нелюдського походження, а ЕЕ. (або їх фрагменти) походять від послідовностей антитіла людини. Гуманізоване антитіло необов'язково також містить щонайменше частину людської константної ділянки. У деяких варіантах реалізації винаходу деякі залишки ЕК в гуманізованому антитілі замінюють відповідними залишками антитіла нелюдського походження (наприклад, антитіла, з якого отримані залишки НУК), наприклад, з метою відновлення або покращення специфічності або афінності антитіла.
Гуманізовані антитіла та способи їх створення розглядалися, наприклад, в АЇтадго апа
Егапебзоп, Егопі. Віозсі. Віовсі. 13:1619-1633 (2008), та додатково описані, наприклад, в
Віеєсптапп еї аї., Майте 332:323-329 (1988); Оцеєп еї аї., Ргос. Маг! Асай. сі. ОБА 86:10029- 10033 (1989); патентах США Мо 5821337, 7527791, 6982321 та 7087409; КазПптіїгіеї аїЇ., Меїнодз 36:25-34 (2005) (де описана пересадка ділянки, яка визначає специфічність (5ОК)); Радіап, Мої.
Іттипої. Іттипої. 28:489-498 (1991) (де описана "зміна поверхні"); БаІгАсдца еї аї., Меїпоадз 3643-60 (2005) (де описана "перетасовка ЕК") та О5рошигп еї аї., Меїйосз 36:61-68 (2005) та
КіїткКа еї аї., Вг. 9У. Сапсег, 83:252-260 (2000) (де описаний підхід "спрямованого відбору" до перетасовки ЕК).
Каркасні ділянки людини, які можна застосовувати для гуманізації, містять, але не обмежуються ними: каркасні ділянки, вибрані з використанням способу "найкращої відповідності" (див., наприклад, біт5 еї аї., У. Іттипої. 151:2296 (1993)); каркасні ділянки, отримані з консенсусної послідовності людських антитіл, що містить конкретну підгрупу варіабельних ділянок легкого або важкого ланцюга (див., наприклад, Сагієг еї аї., Ргос. Маї).
Асад. сі. ОБА, 89:4285 (1992) та Ргевзіа еї аї., У. Іттипої., 151:2623 (1993)); зрілі (соматичні з мутаціями) каркасні ділянки людини або ембріональні каркасні ділянки людини (див., наприклад, АІтадго ап Егапбезоп, Егопі. Віозсі. 13:1619-1633 (2008)); та каркасні ділянки, отримані при скринінгу бібліотек ЕК (див., наприклад, Васа еї аї., У. Віої. Спет. 272:10678-10684 (1997) та Козок еї аї., У. Віої. Снет. 271:22611-22618 (1996)). 5. Антитіла людини
У деяких варіантах реалізації винаходу запропоноване у цьому документі антитіло являє собою антитіло людини. Антитіла людини можуть бути отримані за допомогою різних методик, відомих у цій галузі техніки. Антитіла людини загалом описані в мап Рік еї аїЇ, Си. Оріп. бо Рпагтасої. 5: 368-74 (2001) та Гопрего, Сит. Оріп. Іттипої. 20:450-459 (2008).
Антитіла людини можна отримувати шляхом введення імуногену трансгенній тварині, модифікованій з метою надання їй здатності продукувати інтактні антитіла людини або інтактні антитіла, які містять варіабельні ділянки людини, у відповідь на введення антигена. Такі тварині звичайно містять всі або частину локусів імуноглобулінів людини, які замінюють ендогенні локуси імуноглобулінів, або які присутні поза хромосомами, або інтегруються випадковим чином до хромосом тварини. У таких трансгенних мишей ендогенні локуси імуноглобулінів звичайно інактивовані. Огляд способів отримання антитіл людини з використанням трансгенних тварин див. Гопрего, Маї. Віоїесп. 23:1117-1125 (2005). Крім того, див., наприклад, патенти США Мо 6075181 та 6150584, в яких описана технологія ХЕМОМОШБЕ М: патент США Мо 5770429, в якому описана технологія НОМАВФО; патент США Мо 7041870, в якому описана технологія К-М
МОИЗЕФ), та публікацію патентної заявки США Мо 05 2007/0061900, в якій описана технологія
МЕГОСІМОИШ5БЕФ). Варіабельні ділянки людини з інтактних антитіл, які генеруються такими тваринами, можна додатково модифікувати, наприклад, шляхом об'єднання з іншою константною ділянкою людини.
Антитіла людини також можна отримувати за допомогою гібридомних способів. Описані людські мієломні та мишачо-людські гетеромієломні лінії клітин, які використовують для отримання моноклональних антитіл людини. (Див., наприклад, Корог .). Іттипої., 133: З001 (1984); Вгодеийг єї аІ., Мопосіопа! Апіїбоду Ргодисіюп Тесппіднез апа Арріїсайоп5, рр. 51-63 (Магсе! ОеккКег, Іпс., Мем Могк, 1987)) та Воегпег еї аї., у. Іттипої!., 147: 86 (1991).) Антитіла людини, отримані за допомогою технології на основі В-клітинних гібридом людини, також описані в І і еї аї., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 103:3557-3562 (2006). Додаткові способи включають способи, описані, наприклад, у патенті США Мо 7189826 (де описана продукція моноклональних
ІдМ-антитіл людини гібридомними лініями клітин) та в Мі, Хіапдаї Міапуїхиє, 26(4):265-268 (2006) (де описані гібридоми людини-людини). Технологія на основі гібридом людини (технологія триом) також описана в МоїІтег5 апа Вгапаїеїп, Нізіоіоду апа Нівіораїпо!оду, 20(3):927-937 (2005) та Моїїтег5 апа Вгапаїєїп, МеїШосд5 апа Ріпаіпд5 іп Ехрегпітепіа! апа Сіїпіса! Ріаптасоіоду, 27(3):185-91 (2005).
Антитіла людини також можна отримувати шляхом виділення Ем-клону послідовностей варіабельного домена, відібраних з бібліотек фагового дисплея людського походження. Такі послідовності варіабельного домена можна потім об'єднувати з потрібним константним доменом людини. Методики відбору антитіл людини з бібліотек антитіл описані нижче. 6. Антитіла, отримані з бібліотек
Антитіла за цим винаходом можна виділяти шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек на антитіла, що мають потрібну активність або активності. Наприклад, у цій галузі техніки відомі різні способи створення бібліотек фагового дисплея та скринінгу таких бібліотек на антитіла, що мають потрібні характеристики зв'язування. Про такі способи складено огляд, наприклад в
Ноодепроот еї аІ. в Меїноадв5 іп МоїІесшціаг Віоіоду 178:1-37 (О'Вгієп еї аї., єд., Нитап Ргев5,
Тоїомжа, МУ, 2001), та додатковий опис, наприклад, в МсСайепу еї аї., Маїште 348:552-554;
Сіаскзоп еї аї!., Маїште 352: 624-628 (1991); Магїкз5 евї аї., У. Мої. Вісі. 222: 581-597 (1992); Маїк5 апа Вгадригу, в Меїнод5 іп Моїесшіаг Віоїоду 248:161-175 (10, ед., Нитап Ргев55, ТоїЮуа, Му, 2003); Біани еї аї., у). Мої. Вісі. 3938(2): 299-310 (2004); І еє еї аї., У. Мої. Віої. 340(5): 1073-1093 (2004); Ееїоизе, Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 101(34): 12467-12472 (2004) та | ее еї аї., 9). Іттипої.
Меїтоаз 284(1-2): 119-132(2004).
У деяких способах використання фагових дисплеїв репертуари генів МН та МІ. клонують окремо за допомогою полімеразної ланцюгої реакції (ПЛР) та випадковим чином рекомбінирують у фагових бібліотеках, які потім можна піддавати скринінгу на антигензв'язуючі фаги, як описано в М/іпіег еї аЇ., Апп. Рем. Іттипої., 12: 433-455 (1994). Як правило, фаг відображає фрагменти антитіл або у вигляді одноланцюгових фрагментів Ем (зсЕм), або у вигляді фрагментів Раб. Бібліотеки, отримані з імунізованих джерел, містять антитіла, що мають високу афінність до імуногену, відповідно, необхідність конструювання гібридом відпадає. В альтернативному варіанті можна клонувати наївний репертуар (наприклад, людини) для забезпечення єдиного джерела антитіл до широкого спектра чужорідних антигенів, а також аутоантигенів, без будь-якої імунізації, як описано Сгіййне еї а!І.,, ЕМВО у, 12: 725-734 (1993).
Нарешті, наївні бібліотеки можна також отримувати шляхом синтезу, клонуючи сегменти М-генів стволових клітин, яких не піддавали реаранжуванню, використовуючи ПЛР-праймери, що містять випадкову послідовність для кодування гіперваріабельних ділянок СОКЗ та здійснення реаранжування іп міо, як описано Ноодепроот апа Уміпіег, У. Мої. Віої., 227: 381-388 (1992).
Патентні публікації, в яких описані фагові бібліотеки антитіл людини включають, наприклад: патент США Мо 5750373 та патентні публікації США Мо 2005/0079574, 2005/0119455, 60 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 та 2009/0002360.
Антитіла або фрагменти антитіл, виділені з бібліотек антитіл людини, у цьому документі вважаються антитілами людини або фрагментами антитіл людини. 7. Мультиспецифічні антитіла
У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло, запропоноване у цьому документі, являє собою мультиспецифічне антитіло, наприклад, біспецифічне антитіло. Мультиспецифічні антитіла являють собою моноклональні антитіла, які містять щонайменше дві різні ділянки специфічного зв'язування. У деяких варіантах реалізації винаходу біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами НІігА1. У деяких варіантах реалізації цього винаходу одна з ділянок специфічного зв'язування призначена для НГІГАТ, а інша -- для будь-якого іншого антигена (наприклад, другої біологічної молекули, наприклад, фактора 0). Відповідно, біспецифічне антитіло може мати специфічність зв'язування до НігАї та фактора 0.
Біспецифічні антитіла можна отримувати у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл. Будь-яке з антитіл проти НІГА1, описаних у цьому документі, можна застосовувати для конструювання мультиспецифічного антитіла (наприклад, біспецифічного антитіла), наприклад біспецифічного антитіла проти НігГАТ/фактора 0. Будь-яке з антитіл проти фактора 0, описаних у цьому документі та/або відомих у цій галузі техніки, можна застосовувати для конструювання такого біспецифічного антитіла проти НІГА1/фактора 0.
Наприклад, у деяких випадках біспецифічне антитіло проти НІГА1, яке містить щонайменше перший зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує НІГА1, містить щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість гіперваріабельних ділянок (НУК), вибраних з: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕХ:ІН (ЗЕО ІО МО: 1), де Хі являє собою Меї або І еи; (5) НМЕ-
Н2, яка містить амінокислотну послідовність ЗМОРЕТХІЗААУМОКЕКО (5ЕБЕО ІО МО: 2), де Хі являє собою Сім або Авзп; (с) НУВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУОМОМАЇ У (ЗЕО ІО МО: 3); (а) НМВ-І1, яка містить амінокислотну послідовність КАЗЗЗМХзЗРІН (5ЕО ІЮ МО: 4), де Хз являє собою Сі або Авбп; (є) НМК-І2, яка містить амінокислотну послідовність
АТОХАа АБ (ЗЕО ІЮО МО: 5), де Хі являє собою Авп, Ні5 або Сіи; та () НМК-13, яка містить амінокислотну послідовність ООМУХ5ОХєРУМТ (5ЕО ІЮ МО: 6), де Х5 являє собою 5ег або Туг, а
Хв являє собою Аїа або Азп, або комбінацію з однієї або більше вищенаведених НМЕК та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше 80 95 ідентичність послідовності (наприклад,
Коо) 81 Фо, 82 95, 83 У, 84 95, 85 У, 86 95, 87 У, 88 95, 89 У, 90 Ус, 91 У, 92 Ус, 93 У, 94 Ус, 95 У, 96 9, 97 95, 9895 або 9995 ідентичність) з будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 1-6, може містити другий зв'язуючий домен, який зв'язує фактор Ю. Другий зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує фактор О може, наприклад, містити щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НМК, вибраних з: (а) НМЕ-НТІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУТЕТММОамММ (5ЕО ІЮО МО: 109); (б) НУВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність УМІМГУТЗЕТТМАХІРЕКа (ЗЕО ІЮ МО: 110), де Хі являє собою Ар або Си; (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність
ЕВСУХІМ (ЗЕБЕО ІЮ МО: 111), де Хі являє собою Аб5п або Зег; (а) НМУВ-І1, яка містить амінокислотну послідовність ІТ5ТХ ЇХ» х ЗОММ (ЗЕО ІЮО МО: 112), де Х: являє собою Азр або 5ег,
Хг2 являє собою Ар або Сі, а Хз являє собою Ав5р або Зег; (е) НМК-І2, яка містить амінокислотну послідовність СЗОМТІКР (5ЕБЕО ІО МО: 113); та () НМК-І3, яка містить амінокислотну послідовність І О5Х:ІЗІ РУТ (ЗЕО ІО МО: 114), де Хі являє собою Ар або сім, або комбінацію з однієї або більше вищенаведених НУК та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, 81 95, 82 Фо, 83 Фо, 84 Фо, 85 о, 8695, 87 Ую, 88 95, 89 95, 90 95, 91 95, 92 90, 93 95, 94 90, 95 95, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичність) з будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 109-114.
Наприклад, у деяких випадках біспецифічне антитіло проти НігАї, яке містить перший зв'язуючий домен, що специфічно зв'язує НІгГА!, містить щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість гіперваріабельних ділянок (НМК), вибраних з: (а) НМК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕМН (5ЕО ІЮ МО: 7); (Б) НМЕ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність ЗМОРЕТЕСААУМОКЕКО (5ЕО ІО МО: 8); (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність СУМОМ АГОМ (5БО 10 МО: 3); (4) НМК-І71, яка містить амінокислотну послідовність КАЗЗЗМЕРІН (ЗЕО ІЮ МО: 9); (е) НМК-1 2, яка містить амінокислотну послідовність
АТЗМІАБ (5БО І МО: 10); та () НМК-І3, яка містить амінокислотну послідовність
ООСУУЗБАРУМТ (ЗЕО ІО МО: 11), або комбінацію з однієї або більше вищенаведених НУК та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, 81 зо, 82 то, 83 то, 84 то, 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 95, 95 У, 96 9, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичність) з будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: З або 7-11, може містити другий зв'язуючий домен, який зв'язує фактор О. Другий зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує фактор 0, наприклад, містить щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або бо шість НМК, вибраних з: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність СУТЕТММОММ
(ЗЕО ІО МО: 109); (р) НУВ-НАа, яка містить амінокислотну послідовність УЛМТ УТ ЗЕТТУАСОБКО (ЗЕО ІО МО: 115); (с) НУВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕОСМММ (ЗЕО ІО МО: 116); (4) НМВ-І11, яка містить амінокислотну послідовність ІТ5ТОІЮСОММ (5ЕО ІЮ МО: 117); (є)
НМВ-12, яка містить амінокислотну послідовність ОМ КР (5ЕО ІЮ МО: 113); та () НМЕ-І3, яка містить амінокислотну послідовність І О5О5І РУТ (ЗЕО ІЮ МО: 118), або комбінацію з однієї або більше вищенаведених НМК та одного або більше їх варіантів, що мають щонайменше 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 95, 86 90, 87 Фо, 88 оо, 89 95, 90 о, 91 95, 92 о, 93 Фо, 94 95, 95 Ус, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичність) з будь- якою з БЕО ІЮ МО: 109, 113 або 115-118.
У конкретних варіантах реалізації винаходу у винаході запропоновано біспецифічне антитіло проти НІГАТ, яке специфічно зв'язує як НІГАТ, так і фактор 0, причому антитіло містить перший зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує НІГАТ, що включає наступні шість НМЕ: (а) НМА-НІ1, яка містить амінокислотну послідовність ОБЕМН (5ЕО ІО МО: 7); (Б) НМВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність ЗМОРЕТЕСААМУМОКЕКО (5ЕО ІЮ МО: 8); (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність СЗУОМОМАГОМ (5ЕБО І МО: 3), (4) НМК-І1, яка містить амінокислотну послідовність КАЗЗ5МЕРІН (ЗЕБО І МО: 9); (є) НМУВ-І2, яка містить амінокислотну послідовність АТЗМІАБ (ЗБО ІО МО: 10); та () НМК-І3, яка містить амінокислотну послідовність ООМУЗБЗАРУМТ (ЗЕО ІЮО МО: 11); та другий зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує фактор О, що містить наступні шість НМА: (а) НМВА-НІ, яка містить амінокислотну послідовність СУТЕТМУСОММ (ЗБО І МО: 109); (5) НМК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність МТ УТОЕТТУАРОРКО (5ЕО ІЮО МО: 115); (с) НМА-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕССМММ (ЗЕ ІЮО МО: 116); (4) НМВ-11, яка містить амінокислотну послідовність І5ТОІЮСОММ (БО ІЮ МО: 117); (е) НМК-І2, яка містить амінокислотну послідовність СОСМТІ КР (ЗЕБО ІО МО: 113); та () НМК-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність ГО5051РМТ (5БО ІЮ МО: 118). У деяких випадках другий зв'язуючий домен містить одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НМК з антигензв'язуючого фрагмента антитіла проти фактора 0, лампалізумабу.
У деяких випадках біспецифічне антитіло проти НігА!ї містить перший зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує НігАї, що містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 то, 82 то, 83 то, 84 то, 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 95, 95 95, 96 90, 97 ФУ, 98 95 або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 21; (5) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 95, 86 90, 87 Фо, 88 то, 89 то, 90 зо, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 9895 або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 22; або (с) домен УН, аналогічний описаному в (а), та домен Мі, аналогічний описаному в (б), такий як АРЕС.І.С3.НОСЗ, може містити другий зв'язуючий домен, який специфічно зв'язується з фактором 0. Другий зв'язуючий домен, який специфічно зв'язується з фактором 0, може, наприклад, містити (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 95, 84 Уо, 85 95, 86 Уо, 87 Ус, 88 95, 89 о, 90 95, 91 9о, 92 9, 93 90, 94 Фо, 95 95, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю
ЗЕО ІЮО МО: 119; (Б) домен МІ, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 9, 84 95, 85 95, 86 95, 87 Уо, 88 95, 89 95, 90 95, 91 У, 92 95, 93 У, 94 95, 95 ую, 96 95, 97 У, 98 9о або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 120; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен Мі, аналогічний описаному в (Б). У деяких випадках другий зв'язуючий домен, що специфічно зв'язується з фактором 0, може містити (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше близько 8095 ідентичність
БО послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 Уо, 83 Ус, 84 95, 85 Уо, 86 90, 87 Уо, 88 Ус, 89 9о, 90 оо, 91 95, 92 95, 93 95, 94 90, 9595, 96 95, 97 Ус, 98 95 або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю антигензв'язуючого фрагмента антитіла проти фактора 0, лампалізумабу; (Б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність що має щонайменше близько 80 95 ідентичність послідовності (наприклад, щонайменше 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 95, 86 90, 87 Фо, 88 то, 89 то, 90 зо, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 9895 або 99 95 ідентичність послідовності) з послідовністю антигензв'язуючого фрагмента антитіла проти фактора 0, лампалізумабу; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен Мі, аналогічний описаному в (б).
Методики отримання мультиспецифічних антитіл включають, але не обмежуються ними, бо рекомбінантну коекспресію двох пар важкого ланцюга-легкого ланцюга імуноглобулінів, що мають різну специфічність (див. Міїсїєїп апа СцейПйо, Маїшге 305: 537 (1983)), МО 93/08829 та
ТгашпескКег єї аіІ., ЕМВО 3. 10: 3655 (1991)) та рекомбінантну технологію "виступ-до-западини" (див., наприклад, патент США Мо 5731168). Мультиспецифічні антитіла також можна отримувати за рахунок конструювання електростатичних спрямовуючих ефектів для створення Ес- гетеродимерних молекул антитіл (УМО 2009/0890044А1); перехресного зшивання двох або більше антитіл або фрагментів (див., наприклад, патент США 4676980 та Вгеппап еї аї., бсівєпсе, 229: 81 (1985)); застосування лейцинових блискавок для отримання біспецифічних антитіл (див., наприклад, Козіе!Іпу сеї аї., У. Іттипої!., 148(5):1547-1553 (1992)); застосування технології "діатіл" для створення біспецифічних фрагментів антитіл (див., наприклад, НоїІйпдег еї аї., Ргос. Маї).
Асад. бсі. ОБА, 90:6444-6448 (1993)); та застосування одноланцюгових димерів Ем (5Ем) (див., наприклад, огибег еї аї., у. Іттипої., 152:5368 (1994)); та отримання триспецифічних антитіл, як описано, наприклад, в Тий еї аї. У. Іттипої. 147:60 (1991).
У цей документ входить також конструювання антитіл з трьома або більше функціональними антигензв'язуючими сайтами, у тому числі "антитіл-восьминогів" (див., наприклад, 5 2006/0025576А1).
У цьому документі антитіло або фрагмент також включає "ЕАБ подвійної дії" або "САЕ", яке містить антигензв'язуючий сайт, що зв'язується з НІігГАТ, а також з ще одним, відмінним від нього, антигеном (див., наприклад, 05 2008/0069820). 8. Варіанти антитіл
У деяких варіантах реалізації винаходу передбачаються варіанти амінокислотних послідовностей антитіл (наприклад, варіанти антитіл, що містять одну або більше замін амінокислотних залишків), запропонованих у цьому документі. Наприклад, може бути потрібне покращення афінності зв'язування та/або інших біологічних властивостей антитіла. Варіанти амінокислотних послідовностей антитіла можна отримувати шляхом внесення відповідних модифікацій до нуклеотидної послідовності, що кодує антитіло, або шляхом пептидного синтезу.
Такі модифікації включають, наприклад, делеції та/або вставки та/або заміни залишків в амінокислотних послідовностях антитіла. Для отримання кінцевої конструкції можна внести будь-яку комбінацію делецій, вставок та замін за умови, що кінцева конструкція має потрібні характеристики, наприклад, зв'язування з антигеном.
Зо а) Варіанти, отримані в результаті замін, вставок та делецій
У деяких варіантах реалізації винаходу запропоновані варіанти антитіл, що містять одну або більше амінокислотних замін. Сайти, що представляють цікавість для замісного мутагенезу, включають НМК та ЕК. Консервативні заміни показані нижче у таблиці 1 під заголовком "переважні заміни". Більш суттєві зміни наведені у таблиці 1 під заголовком "типові заміни" та детальніше описані нижче по відношенню до класів бокового ланцюга амінокислот. До антитіла, що цікавить, можна вносити амінокислотні заміни та досліджувати продукти за допомогою скринінгу на наявність потрібної активності, наприклад, збереження/покращення зв'язування антигена, зниження імуногенності або покращення АЗКЦ або КЗЦ.
Таблиця 1
Типові заміни Переважні заміни залишок
Ше() 11111111 бешМа;МесАа;Рпеснорлейцин.о в/с цец(3)у 77111111 /Норлейцин;оМе; Ма; МебАга;РйедЗ ес
Типові заміни Переважні заміни залишок
Амінокислоти можна групувати за загальними властивостями бокового ланцюга: (1) гідрофобні: норлейцин, Меї, Аа, Маї, Гей, Пе; (2) нейтральні гідрофільні: Суб, Зег, ТАг, Азп, Сп; (3) кислотні: Ар, СМ; (4) основні: Ні, Г ув, Ага; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: су, Рго; (6) ароматичні: Тгр, Туг, Ріє.
Неконсервативні заміни призводять до заміни представника одного з цих класів на представника іншого класу.
Один тип варіантів, отриманих шляхом заміни, включає заміну одного або більше залишків гіперваріабельної ділянки та/"або залишків ЕК вихідного антитіла (наприклад, гуманізованого антитіла або антитіла людини). Як правило, отриманий (-ї) варіант (-и), відібраний (-ї) для подальшого дослідження, характеризується (-ються) модифікаціями (наприклад, покращеннями) певних біологічних властивостей (наприклад, підвищеної афінності, збільшеної стабільності, збільшеної експресії, зміненої рі та/або зниженої імуногенністі) у порівнянні з вихідним антитілом та/або у значній мірі зберігають певні біологічні властивості вихідного антитіла. Типовий варіант, що отримують шляхом заміни, являє собою антитіло зі визрілою афінністю, яке можна легко отримувати, наприклад, з використанням методик визрівання афінності на основі фагового дисплея, наприклад, описаних у цьому документі. Коротко, піддають мутації один або більше залишків НУК та відображають варіантні антитіла на фагові та піддають скринінгу на наявність конкретної біологічної активності (наприклад, афінності зв'язування).
Можна вносити зміни (наприклад, заміни) на НУК, наприклад, для покращення афінності антитіла. Такі зміни можна вносити до "гарячих точок" НМ, тобто залишки, які кодуються кодонами, з високою частотою піддаються мутаціям під час процесу соматичного визрівання (див., наприклад, Спом/айпигу, Меїйпод5 Мої. Віої. 207:179-196 (2008)), та/або залишки, які контактують з антигеном, з тестуванням отриманого варіанта МН або Мі на афінність
Зо зв'язування. Визрівання афінності шляхом конструювання та повторного відбору з вторинних бібліотек описано, наприклад, в Ноодепроот еї аі. в Мейоз іп МоїІесшціаг Віоіоду 178:1-37 (О'Віїєп вї а!., єд., Нитап Ргезв, Тоїомжа, МУ, (2001)). У деяких варіантах реалізації визрівання афінності вносять різноманіття у варіабельні гени, вибрані для визрівання, будь-яким з різних способів (наприклад, ПЛР пониженої точності, перетасовкою ланцюгів або олігонуклеотид- спрямованим мутагенезом). Потім створюють вторинну бібліотеку. Після цього бібліотеку піддають скринінгу для виявлення варіантів антитіла з потрібною афінністю. Ще один спосіб внесення різноманіття включає НМЕК-спрямованні підходи, в яких рандомізують кілька залишків
НМК (наприклад, 4-6 залишків за раз). Залишки НМК, що приймають участь у зв'язуванні антигена, можна специфічно визначати, наприклад, за допомогою мутагенезу з аланіновим скануванням або моделювання. Зокрема, мішенями часто є НМЕ-НЗ та НМК-Ї 3.
У деяких варіантах реалізації винаходу заміни, вставки або делеції можуть виникати в одному або більше НМЕК за умови, що такі зміни по суті не знижують здатність антитіла до зв'язування антигена. Наприклад, до НМК можна вводити консервативні зміни (наприклад, консервативні заміни, як запропоновано в цьому документі), які по суті не знижують афінність зв'язування. Такі зміни можуть, наприклад, знаходитися у НУК поза залишками, що контактують з антигеном. У деяких варіантах реалізації винаходу з послідовностей варіантів МН та МІ, запропонованих вище, кожний НУ або не змінений, або містить не більше однієї, двох або трьох амінокислотних замін.
У деяких варіантах реалізації винаходу заміни, вставки або делеції можуть виникати в одній або більше ЕК за умови, що такі зміни по суті не знижують здатність антитіла до зв'язування антигена. Такі зміни можуть, наприклад, покращувати афінність антитіла та/або стабільність (наприклад, за оцінкою за допомогою підвищеної температури плавлення).
Приклади залишків каркасної ділянки або залишки ділянки НМК щодо модифікації включають можливі сайти дезамідування (тобто аспарагін (М або Азп)), сайти окиснення (тобто метіонін (М або
Меб або триптофан (М/ або Тгр)) або сайти перетворення у піроглутамат (тобто глутамін (0 або
СіІп)), причому модифікація у таких сайтах, відповідно, попереджає або знижує дезамідування та/або окиснення та/або перетворення у піроглутамат.
Для попередження або зниження утворення дезамідованих варіантів, аспарагін (М або Авп) можна піддавати мутації в аланін (А або Аїа), глутамін (0 або Сіп) або серин (5 або 5ег). Для попередження або зниження утворення окиснених варіантів, метіонін (Ме) або триптофан (М/ або Тгр) можна піддавати мутації у лейцин (І) або ізолейцин (І). Для попередження або зниження утворення варіантів з піроглутаматом, глутамін (0 або Сіп) можна піддавати мутації у глутамат (Е або сім).
Див., наприклад, АтрпПей аї., Рнагт. Віоїтеснпо)!., 9:1-140, 1996. В альтернативному варіанті або додатково, одна або більше змін (наприклад, замін) залишків каркасного ділянки може відбуватися на ділянці Ес у вихідному антитілі.
Підходящий спосіб визначення залишків або ділянок антитіла, які можуть бути мішенями для мутагенезу, називається "мутагенезом з аланіновим скануванням", як описано в Сиппіпдапат апа Му/єїї5 (1989) Зсіепсе, 244:1081-1085. У цьому способі виявляють залишок або групу залишків-мішеней (наприклад, заряджених залишків, таких як Аго, А5р, Ніб5, Гуз та Сім) та заміщують їх нейтральними або негативно зарядженими амінокислотами (наприклад, аланіном або поліаланіном) для визначення чи впливає це на взаємодію антитіла з антигеном. До амінокислотних положень, що характеризуються функціональною чутливістю до вихідних замін, можна вводити додаткові заміни. В альтернативному варіанті або додатково, точки контакту антитіла з антигеном ідентифікують з використанням кристалічної структури комплексу антиген- антитіло. Такі контактні залишки або сусідні з ними залишки можна застосовувати як мішені для заміни, або вони можуть не розглядатися як кандидати для заміни. Варіанти можна піддавати скринінгу для визначення наявності у них потрібних властивостей.
Вставки до амінокислотної послідовності включають аміно- та/або карбоксил-кінцеві гібриди з варіацією довжини від одного залишку до поліпептидів, що містять сотню або більше залишків, а також вставки одного або багатьох амінокислотних залишків всередину послідовності. Приклади кінцевих вставок включають антитіло з М-кінцевим метіонільним залишком. Інші інсерційні варіанти молекули антитіла включають з'єднання М- або С-кінця
Зо антитіла з ферментом (наприклад, для АЮЕРТ) або поліпептидом, який збільшує період напіввиведення антитіла із сироватки.
Юр) Варіанти глікозилювання
У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло, запропоноване у цьому документі, змінюють для збільшення або зменшення ступеня глікозилювання антитіла. Додавання ділянок глікозилювання в антитіло або видалення з нього можна з легкістю здійснювати шляхом зміни амінокислотною послідовності, в результаті чого створюється або видаляється один або більше сайтів глікозилювання.
Якщо антитіло містить ділянку Ес, то можна змінювати приєднаний до нього вуглевод.
Нативні антитіла, що продукуються клітинами ссавців, як правило, містять розгалужений двоантенарний олігосахарид, звичайно приєднаний за допомогою М-зв'язку до А5п297 у домені
СНІ ділянки Ес. Див., наприклад, М/гідні еї аі. ТІВТЕСН 15:26-32 (1997). Цей олігосахарид може містити різні вуглеводи, наприклад, манозу, М-ацетилглюкозамін (СІСМАс), галактозу та сіалову кислоту, а також фукозу, приєднані до сСІСМАс у "стеблі" двоантенарної олігосахаридної структури. У деяких варіантах реалізації винаходу можна виконувати модифікації олігосахариду в антитілі за цим винаходом з метою створення варіантів антитіла з певними покращеними властивостями.
В одному варіанті реалізації винаходу запропоновані варіанти антитіл, що містять вуглеводну структуру без фукози, приєднаної (безпосередньо або опосередковано) до Ес- ділянки. Наприклад, кількість фукози у такому антитілі може складати від 1 95 до 80 95, від 1 9о до 65 9б, від 5 95 до 65 95 або від 20 95 до 40 95. Кількість фукози визначають шляхом розрахунку середньої кількості фукози у вуглеводному ланцюзі при А5п297 по відношенню до суми усіх вуглеводних структур, приєднаних до Ап 297 (наприклад, складних гібридних структур з високим вмістом манози), виміряної за допомогою ЧП-МАЛДІ мас-спектрометрії, як описано, наприклад, в УМО 2008/077546. А5п297 відноситься до залишку аспарагіну, розташованому приблизно в положенні 297 на Ес-ділянці (ЕС-нумерація залишків Ес-ділянки); однак А5зп297 також може розташовуватися на відстані близько х З амінокислоти вище або нижче положення 297, тобто між положеннями 294 та 300, через незначні варіації послідовностей у антитіл. Такі варіанти фукозилювання можуть мати покращену функцію АЗКЦ. Див., наприклад, публікації патентів США Ме 5 2003/0157108; 05 2004/0093621. Приклади публікацій, що стосуються бо "дефукозильованих" або "фукозодефицитних" варіантів антитіла, включають: О5 2003/0157108; 5О0
МО 2000/61739; МО 2001/29246; 05 2003/0115614; 05 2002/0164328; 005 2004/0093621; ОО5 2004/0132140; 005 2004/0110704; 05 2004/0110282; 005 2004/0109865; МО 2003/085119; МО 2003/084570; МО 2005/035586; МО 2005/035778; УМО2005/053742; МО2002/031140; ОкКа?лакі еї а!., У. Мої. Віої. 336:1239-1249 (2004); Матапе-ОНпикі еї аї., Віоїесп. Віоєпуд. 87: 614 (2004).
Приклади ліній клітин, здатних продукувати дефукозильовані антитіла, включають клітини І ес13
СНО, дефектні за фукозилюванням білка (Кірка еї аІ. Агсн. Віоспет. Віорпув. 249:533-545 (1986); заявка на патент США Мо 05 2003/0157108 АТ, Ргезіа, І; та УМО 2004/056312 АТ, Адать еї аІ.,, особливо приклад 11), та лінії клітин з нокаутом, наприклад, клітини СНО з нокаутом гена альфа-1,6-фукозилтрансферази, РОТВ (див., наприклад, Матапе-ОНпикі єї аї. Віоїєсн. Віоєпод. 1087: 614 (2004); Капаа 6вї а!., Віотеснпої. Віоепа., 94(4):680-688 (2006); та УМО2003/085107).
Додатково, запропоновані варіанти антитіл з олігосахаридами, розділеними навпіл, наприклад, в яких двоантенарний олігосахарид, приєднаний до Ес-ділянки антитіла, розділений за СіІсМАс. Такі варіанти антитіл можуть характеризуватися зниженим фукозилюванням та/або покращеної функцією АЗКЦ. Приклади таких варіантів антитіл описані, наприклад, в УМО 2003/011878, патентах США Мо 6602684 та 05 2005/0123546 (Отапа еї аї!.). Крім того, запропоновані варіанти антитіл, що містять щонайменше один залишок галактози у складі олігосахариду, приєднаного до Ес-ділянку. Такі варіанти антитіл можуть мати покращену функцію КЗЦ. Такі варіанти антитіл описані, наприклад, в М/О 1997/30087, УМО 1998/58964 та
МО 1999/22764. с) Варіанти Есо-ділянки
У деяких варіантах реалізації до Ес-ділянки антитіла, запропонованого у цьому документі, можна вводити одну або більше амінокислотних модифікацій, тим самим отримуючи варіант Ес- ділянки. Варіант Ес-ділянки може містити послідовність Ес-ділянки людини (наприклад, Ес- ділянка Ідс1, Ідс2, ІдсСЗ або Ідб4 людини), яка містить зміну амінокислотного залишку (наприклад, заміну) в одному або більше амінокислотних положеннях.
У деяких варіантах реалізації у винаході розглядається варіант антитіла, що має деякі, але не всі ефекторні функції, що робить його бажаним кандидатом для варіантів застосування, в яких важливий період напіввиведення антитіла іп мімо, а деякі ефекторні функції (наприклад, для комплементу та АЗКЦ) не потрібні або шкідливі. Для підтвердження зниження/ослаблення
Зо активності КЗЦ та/або АЗКЦ можна виконувати аналізи цитотоксичності іп мійго та/або іп мімо.
Наприклад, для підтвердження відсутності зв'язування антитіла з ЕсуК (відповідно, ймовірно, відсутності активності АЗКЦ), але збереження здатності зв'язування ЕсКп, можна проводити аналізи зв'язування рецептора Ес (БСК). Основні клітини, що опосередковують АЗКЦ, МК- клітини, експресують лише ЕсукКІЇїШ, у той час як моноцити експресують ЕсукКІ, ЕсуКІ! та ЕсугПІ.
Об'єднана інформація про експресію ЕСЕ. на кровотворних клітинах наведена у таблиці З на с. 464 Рамеїсі апа Кіпеї, Аппи. Неу. Іттипої. 9:457-492 (1991).
Не обмежуючі приклади аналізів іп мійго для оцінки активності АЗКЦ молекули, що представляє цікавість, описані у патенті США 5500362 (див., наприклад, НеїЇІвігот еї аї., Ргос.
Маг! Асад. 5сі. ОБА 83:7059-7063 (1986) та Неїїбігот еї аї., Ргос. Маї! Асад. 5сі. ОБА 82:1499- 1502 (1985); патент США Мо 5821337 та Вгиддетапп еї аї., ). Ехр. Мед. 166:1351-1361 (1987)). В альтернативному варіанті можна використовувати методи аналізів без радіоактивних міток (див., наприклад, аналіз цитотоксичності АСТІ"М для проточної цитометрії без радіоактивних міток (СеїПесппоїоду, Іпс., м. Маунтин-Вью, штат Каліфорнія, США; та аналіз цитотоксичності
СУТОТОХ 968 без радіоактивних міток (Рготеда, м. Медісон, штат Вісконсин, США). Як ефекторні клітини у таких аналізах можна застосовувати мононуклеарні клітини периферійної крови (МКПК) та клітини-природні кілери (МК). В альтернативному варіанті, або додатково, активність АЗКЦ молекули, що представляє цікавість, можна оцінювати іп мімо, наприклад, на тваринній моделі, такій як описано в Сіупе5 еї аї. Маї! Асад. 5сі. ОБА 95:652-656 (1998). Для підтвердження нездатності антитіла зв'язувати С14 та, відповідно, відсутності активності КЗЦ, також можна проводити аналізи зв'язування С14. Див., наприклад, аналіз ІФА щодо зв'язування
Стд та СЗс в УМО 2006/029879 та УМО 2005/100402. Для оцінки активації комплементу можна виконувати аналіз КЗЦ (див., наприклад, Залапо-Запіого еї аї., У. Іттипої. Меїноде 202:163 (1996); Стада єї аї., Віа 101:1045-1052 (2003) та Стгаду еї аї., Віососа 103:2738-2743 (2004)).
Визначення зв'язування ЕсКп та виведення/періодів напіввиведення також можна виконувати з використанням методів, відомих у цій галузі техніки (див., наприклад, Реїкома еї аї., ТИг'1.
Іттипої. 18(12):1759-1769 (2006)).
Антитіла з пониженою ефекторною функцією включають антитіла із заміною одного або більше із залишків 238, 265, 269, 270, 297, 327 та 329 Ес-ділянки (патент США Мо 6737056). Такі
Ес-мутанти включають Ес-мутантів із замінами в двох або більше амінокислотних положеннях 60 265, 269, 270, 297 та 327, включаючи так звані Ес-мутанти "САМА" із заміною залишків 265 та
297 на аланін (патент США Мо 7332581).
Описані деякі варіанти антитіл з покращеним або зменшеним зв'язуванням з ЕсСК. (Див., наприклад, патент США Мо 6737056; УМО 2004/056312 та ЗПіеїдз» еї аї., 9. Вісі. Снет. 9(2): 6591- 6604 (2001)).
У деяких варіантах реалізації винаходу варіант антитіла містить Ес-ділянку з однією або більше амінокислотними замінами, які покращують АЗКЦ, наприклад, заміни у положеннях 298, 333 та/або 334 ЕРсо-ділянки (ЕО-нумерація залишків).
У деяких варіантах реалізації винаходу вносять зміни до Ес-ділянки, що призводить до зміни (тобто покращення або зниження) зв'язування С14 та/або комплемент-залежної цитотоксичності (КЗЦ), наприклад, як описано у патенті США Мо 6194551, МО 99/51642 та Ідизодіє еї аї., ..
Іттипої. 164: 4178-4184 (2000).
Антитіла з підвищеними періодами напіввиведення та покращеним зв'язуванням з неонатальним рецептором Ес (БсКп), який відповідає за перенос материнських ДО плоду (Сцуег еї аї., У. Іттипої. 117:587 (1976) та Кіт еї аї., у). Іттипої. 24:249 (1994)), описані в 052005/0014934А1 (Ніпоп еї а/1.). Ці антитіла містять Ес-ділянку з однією або більше замінами в них, які покращують зв'язування Ес-ділянки з ЕсКп. Такі варіанти Ес включають ті, які містять заміни в одному або більше залишків Ес-ділянки: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434, наприклад, заміна залишку 434 Ес- ділянки (патент США Мо 7371826). Див. також Оипсап 8 М/іпіег, Маїшге 322:738-40 (1988); патент
США Мо 5648260; патент США Мо 5624821 та УМО 94/29351, відносно інших прикладів варіантів
Ес-ділянки. а) Варіанти антитіл, сконструйовані з використанням залишків цистеїну
У деяких варіантах реалізації може бути потрібним створювати антитіла, сконструйовані з використанням залишків цистеїну, наприклад, "тіоМАБбБ", в яких один або більше залишків антитіла замінені залишками цистеїну. У конкретних варіантах реалізації винаходу замінені залишки знаходяться у доступних сайтах антитіла. Шляхом заміни цих залишків цистеїном у доступних сайтах антитіла таким чином розташовуються реакційноздатні тіольні групи, які можна використовувати для кон'югування антитіла з іншими фрагментами, такими як фрагменти лікарських засіб або фрагменти лінкер-лікарський засіб, для створення імунокон'югату, як
Зо додатково описано у цьому документі. У деяких варіантах реалізації винаходу цистеїном можна замінювати один або більше з наступних залишків: М205 (нумерація Кабата) легкого ланцюга;
А118 (БО-нумерація) важкого ланцюга та 5400 (ЕО-нумерація) Ес-ділянки важкого ланцюга.
Антитіла, сконструйовані з використанням залишків цистеїну, можна отримувати, як описано, наприклад, у патенті США Мо 7521541. е) Похідні антитіл
У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло, запропоноване у цьому документі, можна додатково модифікувати, щоб воно містило додаткові небілкові фрагменти, відомі та легко доступні у цій галузі. Фрагменти, які підходять для отримання похідних антитіла, включають водорозчинні полімери, але не обмежуються ними. Необмежуючі приклади водорозчинних полімерів включають полієтиленгліколь (ПЕГ), співполімери етиленгліколю та пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімер етилену/малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (гомополімери або випадкові співполімери) та декстран або полі(н- вінілпіролідон)поліетиленгліколь, гомополімери пропіленгліколю, співполімери пропіленоксиду/етиленоксиду, поліоксіетильовані поліоли (наприклад, гліцерин), полівініловий спирт та їх суміші але не обмежуються ними. У виробництві пропіоновий альдегід поліетиленгліколю може мати переваги через його стабільність у воді. Полімер може мати будь- яку молекулярну масу та може бути розгалуженими або нерозгалуженими. Число полімерів, приєднаних до антитіла, може змінюватися та, у випадку приєднання більше одного полімеру, вони можуть представляти собою однакові або різні молекули. Загалом, число та/або тип полімерів, які використовують для отримання похідних, можна визначати, виходячи з міркувань, що включають конкретні властивості або функції антитіл, які підлягають покращенню, можливість застосування похідних антитіла у терапії при певних умовах тощо, але не обмежуються ними.
Кон'югати антитіла-полімеру можна отримувати, використовуючи підходящу методику для дериватизації антитіла з полімерами. Таким чином, слід розуміти, що винахід не обмежується кон'югатами, в яких застосовується будь-який конкретний тип зв'язку або зв'язок між антитілом або фрагментом антитіла та полімером.
В одному аспекті кон'югат за цим винаходом включає види, в яких полімер ковалентно бо приєднаний до специфічного сайта або специфічних сайтів на вихідному антитілі, тобто приєднання полімеру націлено на конкретну ділянку або конкретний амінокислотний залишок або залишки у вихідному антитілі або фрагменті антитіла. Сайт-специфічної кон'югації полімерів частіше всього досягають приєднанням до залишків цистеїну у вихідному антитілі або фрагменті антитіла. У таких варіантах реалізації винаходу при хімічному зв'язуванні може, наприклад, використовуватися вільна сульфгідрильна група цистеїнового залишку, що не знаходиться у вихідному антитілі у дисульфідному містку. Полімер можна активувати за будь- якою функціональною групою, здатною специфічно реагувати з вільною (-ими) сульфгідрильною (-ими) або тіольною (-ими) групою (-ами), такими як функціональні групи малеїміду, сульфгідрилу, тіолу, трифлату, тезилату, азиридину, екзирану та 5-піридилу. Полімер можна з'єднувати з вихідним антитілом, використовуючи будь-який протокол, придатний для хімічної реакції вибраної системи зв'язування, такої як протоколи та системи, описані у патентах США Мо 4179337 та 7122636 та деуземаг еї аї., Віоїтесп. 9. 5:113-128, 2010.
В одному варіанті реалізації винаходу один або більше цистеїнових залишків, природнім чином присутніх у вихідному антитілі, використовують як сайт (-и) приєднання для кон'югації полімеру. В іншому варіанті реалізації винаходу з метою забезпечення специфічного сайту або сайтів для приєднання полімеру у вихідному антитілі у вибраному сайті або сайтах конструюють один або більше залишків цистеїну.
В одному аспекті винахід охоплює кон'югати фрагмента антитіла-полімеру, причому фрагмент антитіла являє собою Раб, а полімер приєднаний до одного або більше цистеїнових залишків у легсому або важкому ланцюзі фрагмента Раб, що, як правило, може формувати дисульфідний зв'язок між ланцюгами, який зв'язує легкий та важкий ланцюги.
В одному аспекті винахід охоплює кон'югати фрагмента антитіла-полімеру, причому фрагмент антитіла являє собою Рар", а приєднання полімеру націлено на шарнірну ділянку фрагмента Рар". В одному варіанті реалізації винаходу один або більше цистеїнових залишків, природним чином присутні на шарнірній ділянці фрагмента антитіла, використовують для приєднання полімеру. В іншому варіанті реалізації винаходу з метою забезпечення специфічного сайту або сайтів для приєднання полімеру до шарнірної ділянки фрагмента Рар" конструюють один або більше залишків цистеїну. В одному варіанті реалізації винаходу з метою забезпечення одного сайту приєднання для кон'югації полімеру фрагмент Раб за цим
Зо винаходом (наприклад, фрагмент Раб проти НігАї, фрагмент Раб проти фактора О або фрагмент Раб проти НіІгГАТ/фактора О) модифікують додаванням одного цистеїну до С'-кінцевої ділянки. В іншому варіанті реалізації винаходу з метою забезпечення двох сайтів приєднання для кон'югації полімеру фрагмент Бар за цим винаходом модифікують додаванням чотирьох додаткових залишків, Суз-Рго-Рго-Сувз (ЗЕО ІЮО МО: 122) на С"-кінцеву ділянку.
Одним способом, що звичайно використовується, кон'югації антитіл є ПЕГилювання, при якому один або більше полімерів поліетиленгліколю (ПЕГ) ковалентно приєднують до константної ділянки антитіла. Див. патенти США Мо 4179337 та 7122636. У цій галузі відомі та широко застосовують полімери ПЕГ різних розмірів (наприклад, від близько 500 Да до близько 300000 Да). Полімери, придатні для цього винаходу, можна придбати на ринку (наприклад, у компаніях Мірроп ОЇїЇ апіа Раїб; МеКаг Тпегареціїс5; Стеайме РЕСУМОгК5) або отримувати з доступних та навіть вихідних речовин, використовуючи традиційні хімічні процедури.
ПЕГилювання змінює фізичні та хімічні властивості лікарського засобу на основі антитіла та може призводити до покращених фармакокінетичних параметрів, таких як покращена стабільність, зменшена імуногенність, збільшений період циркуляції, а також збільшений час утримання. В іншому варіанті реалізації винаходу будь-яке антитіло, описане у цьому документі (наприклад, антитіло проти НіІгАї за цим винаходом) можна кон'югувати з гіалуроновою кислотою (НА).
В іншому варіанті реалізації цього винаходу запропоновані кон'югати антитіла з небілковим фрагментом, який можна вибірково нагрівати за допомогою впливу опромінення. В одному варіанті реалізації винаходу небілюовий фрагмент являє собою вуглецеву нанотрубку (Кат еї а!І., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 102: 11600-11605 (2005)). Довжина хвилі випромінення може бути будь-якою та включає довжини хвиль, але не обмежується, довжиною хвиль, що не пошкоджують звичайні клітини, але нагрівають небілюовий фрагмент до температури, що викликає загибель клітин, розташованих поблизу від антитіла з небілюковим фрагментом.
І) Варіанти за ізоелектричною точкою
У винаході запропоновані варіанти антитіл зі зміненими ізоелектричними точками.
Наприклад, у винаході запропоновані варіанти антитіл зі зниженим значенням ізоелектричної точки (рі), наприклад, у порівнянні з еталонним антитілом проти НІГА1. У деяких випадках заряд поверхні знижений до фізіологічного рН. У деяких випадках антитіло проти НІГАТ має значення 60 рі нижче або рівне близько 8 (наприклад, близько 8, близько 7, близько 6, близько 5 або близько
4). У деяких випадках антитіло має рі від близько 4 до близько 8 (наприклад, близько 4, близько 5, близько 6, близько 7 або близько 8). У деяких випадках антитіло проти НІігАї має рі від близько 5 до близько 7 (наприклад, близько 5, близько б або близько 7). У деяких випадках антитіло проти НІГА1 має рі від близько 5 до близько 6 (наприклад, близько 5,1, близько 5,2, близько 5,3, близько 5,4, близько 5,5, близько 5,6, близько 5,7, близько 5,8, близько 5,9 або близько 6).
Антитіла за цим винаходом можна конструювати для отримання зниженого рі, наприклад, заміною амінокислотних залишків дикого типу у зацьому положенні на амінокислоту, що має більш низьке значення рі. Значення рі амінокислоти можна визначати на основі значень рКа аміну (-МНг), карбонової кислоти (-СООН) та амінокислоти бокового ланцюга, які відомі у цій галузі техніки. У деяких варіантах реалізації винаходу для зниження рі антитіла можна замінювати розташовані на поверхні амінокислотні залишки. В одному варіанті реалізації винаходу можна замінювати розташовані на поверхні амінокислотні залишки на глутамат (Е). В одному варіанті реалізації винаходу можна замінювати розташовані на поверхні амінокислотні залишки на аспартат (0). р. Рекомбінантні способи та композиції
Будь-яке з антитіл (наприклад, антитіл проти НІГАТ), описаних у цьому документі, можна отримувати з використанням рекомбінантних способів та композицій, наприклад, як описано у патенті США Мо 4816567. В одному варіанті реалізації винаходу запропонована виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло проти НІГА1, описане у цьому документі. Така нуклеїнова кислота може кодувати амінокислотну послідовність, що містить МІ, та/або амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла (наприклад, легкий та/або важкий ланцюги антитіла). У додатковому варіанті реалізації винаходу запропоновані один або більше векторів (наприклад, експресійних векторів), що містять таку нуклеїнову кислоту. У додатковому варіанті реалізації винаходу запропонована клітина-хазяїн, що містить таку нуклеїнову кислоту. В одному такому варіанті реалізації винаходу клітина-хазяїн містить (наприклад, була трансформована з використанням): (1) вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МІ. антитіла, та амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла, або (2) перший вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність,
Зо що містить МІ. антитіла, та другий вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла. В одному варіанті реалізації винаходу клітина-хазяїн є еукаріотичною, наприклад, клітиною яєчника китайського хом'яка (СНО) або лімфоїдною клітиною (наприклад, клітиною МО, МБО, 5р20). В одному варіанті реалізації винаходу запропонований спосіб отримання антитіла проти НІГАТ, який включає культивування клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, кодуючу антитіло, як запропоновано вище, в умовах, які підходять для експресії антитіла та, за необхідності, виділення антитіла з клітини- хазяїна (або культурального середовища клітини-хазяїна).
Для рекомбінантної продукції антитіла проти НігАї1 нуклеїнова кислота, що кодує антитіло, наприклад, як описано вище, виділена та вставлена в один або більше векторів для подальшого клонування та/або експресії у клітині-хазяїні. Таку нуклеїнову кислоту можна легко виділяти та секвенувати з використанням загальноприйнятих процедур (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, здатних специфічно зв'язуватися з генами, кодуючими важкі та легкі ланцюги антитіла).
Клітини-хазяї, що підходять для клонування або експресії векторів, кодуючих антитіло, включають прокаріотичні або еукаріотичні клітини, описані у цьому документі. Наприклад, антитіла можна отримувати у бактеріях, особливо, якщо глікозилювання та ефекторна функція
Ес не є необхідними. Експресію фрагментів антитіла та поліпептидів у бактеріях див., наприклад, у патентах США Мо 5648237, 5789199 та 5840523. Див. також Спапоп, Меїнодв іп
Моїесшіаг Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. 10, єд., Нитапа Ргев55, Тома, МУ, 2003), рр. 245-254, де описана експресія фрагментів антитіла в Е. соїї. Після експресії антитіло можна виділяти з бактеріальної біомаси у розчинну фракцію та піддавати подальшому очищенню.
Окрім прокаріотів як хазяїв, підходящих для клонування або експресії векторів, що кодують антитіло, можна використовувати еукаріотичні мікроорганізми, такі як міцеліальні гриби або дріжджі, що включають штами грибів та дріжджів з "гуманізованими" шляхами глікозилювання, які дозволяють отримувати антитіло з частково або повністю людським профілем глікозилювання. Див. Сегпдго55, Маї. Віоїесп. 22:1409-1414 (2004) та Її еї аї., Маї. Віоїесн. 24:210-215 (2006).
Клітини-хазяї, що підходять для експресії глікозильованого антитіла, також можна отримувати з багатоклітинних організмів (безхордових та хордових). Приклади клітин бо безхордових включають клітини рослин та комах. Ідентифіковані чисельні бакуловирусні штами,
які можна використовувати у поєднанні з клітинами комах, зокрема, для трансфекції клітин зЗродоріега Ігидірегаа.
Як хазяїв також можна використовувати культури рослинних клітин. Див., наприклад, патенти США Мо 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 та 6417429 (де описана технологія
РІ АМТІВООІЕ5"М для продукції антитіл у трансгенних рослинах).
Як хазяїв також можна використовувати клітини хордових. Наприклад, можна використовувати лінії клітин ссавців, адаптовані для росту у суспензії. До інших прикладів, які використовують лінії клітин ссавців як клітин-хазяїв, відносяться лінія клітин СМ1 нирки мавпи, трансформована 5М40 (СО5-7); лінія людських ембріональних клітин нирки (293 або клітини 293, які описані, наприклад, в Стапат еї аї., У. Сбеп Мігої. 36:59 (1977)); клітини нирки новонародженого хом'яка (ВНК); клітини Сертолі миші (клітини ТМА4, як описано, наприклад, в
Маїнетг, Вісо!. Вергод. 23:243-251 (1980)); клітини нирки мавпи (СМ); клітини нирки африканської зеленої мавпи (МЕКО-76); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА); клітини нирки собаки (МОСК; клітини печінки щура лінії бийаю (ВК ЗА); клітини легень людини (М/138); клітини печінки людини (Нер 02); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТКІ, як описано, наприклад, у статті Маїнег еї а!., Аппаї!5 М.У. Асай. 5сі. 383:44-68 (1982); клітини МКС 5 та клітини Е54. Інші підходящі лінії клітин-хазяїв ссавців включають клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), у тому числі ОНЕЕ-клітини СНО (Шпацрб еї аї., Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 77:4216 (1980)); та мієломні лінії клітин, такі як МО, МБО та 5рг/0. Огляд деяких ліній клітин-хазяїв ссавців, придатних до продукції антитіл, див., наприклад, в Хазакі апа Ми, Меїтод3 іп МоїІесшціаг
Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. І о, єд., Нитапа Ргевз5, Тоїоула, МУ), рр. 255-268 (2003).
Е. Аналізи
Антитіла проти НІГА1 (наприклад, антитіла проти НІГА1 та антитіла проти НігАТ/фактора 0), запропоновані у цьому документі, можна ідентифікувати, піддавати скринінгу або характеризувати за їх фізичними/хімічними властивостями та/або видами біологічної активності за допомогою різних аналізів, відомих у цій галузі техніки. 1. Аналізи зв'язування та інші аналізи
В одному аспекті антитіло за цим винаходом досліджують на його антигензв'язуючу активність, наприклад, за допомогою відомих методів, таких як аналізи ІФА, вестерн-блотингу,
Зо поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕФ) тощо.
В одному аспекті активність зв'язування антигена (наприклад, як вказано значенням КО) вимірюють з використанням аналізу поверхневого плазмонного резонансу (ППР) ВІАСОКЕФ.
Наприклад, аналіз з використанням приладу ВІАСОКЕФ-2000 або ВІАСОКЕФ-3000 (ВІАсоге,
Іпс., м. Піскатауей, штат Нью-Джерсі, США) виконують при 25"С на чипах СМ5 з іммобілізованим антигеном при «10 одиницях відповіді (КШ). В одному варіанті реалізації винаходу чипи біосенсора з карбоксиметильованим декстраном (СМ5, ВІАСОКЕ, Іпс.) активували М-етил-М'-(З-диметиламінопропіл)-карбодіїмідгідрохлоридом (ЕЕОС) та /М- гідроксисукцинімідом (МН5) згідно інструкцій постачальника. Антиген розбавляють 10 мМ розчином ацетату натрію, рН 4,8, до 5 мкг/мл («0,2 мкМ) та потім вводять його при швидкості потоку 5 мкл/хвилину до досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (К) зв'язаного білка. Після введення антигена вводять 1 М етаноламіну для блокування груп, що не прореагували. Для вимірювань кінетичних параметрів дворазові серійні розведення Рар (від 0,78 нМ до 500 нм) вводять у ФСБ з 0,05 95 полісорбатом-20 (ТуеепФ-20) (РВ5Т) при 25 "С при швидкості потоку приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (Ка) та дисоціації (Кл) розраховують за допомогою простої моделі зв'язування Ленгмюра при співвідношенні один до одного (програмне забезпечення ВІАСОКЕ Ф Емаїнайоп Боймаге версії 3.2) шляхом одночасної апроксимації сенсограм асоціації та дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (КО) розраховують як співвідношення Кд/Ка. Див., наприклад, Спеп еї аї., У. Мої. Віої. 293:865-881 (1999). Якщо швидкість асоціації згідно вищеописаного аналізу поверхневого плазмонного резонансу перевищує 105 М" с", то її можна визначати за допомогою методики гасіння флуоресценції, яка вимірює збільшення або зниження інтенсивності випромінення флуоресценції (збудження 295 нм; випромінення 340 нм, смуга пропускання 16 нм) при 25 "С для 20 нМ розчину антитіл проти антигена (у формі Бар) в ФСБ, рН 7,2, у присутності зростаючих концентрацій антигена при вимірюванні на спектрометрі, такому як обладнаний для дослідження методом зупиненого потоку (Амім Іпбзігитепів) або спектрофотометрі ЗІ М-АМІМСО "М серія 8000 (Теппозресігопіс) з перемішуючою кюветою. Значення КО також можна вимірювати з використанням аналізу ППР
ВІАСОКЕЄФ, як описано нижче у прикладах.
В іншому аспекті для виявлення антитіла, конкуруючого з антитілом, як описане у цьому документі, за зв'язування з НігАї, можна використовувати конкурентні аналізи. У деяких бо варіантах реалізації таке конкуруюче антитіло зв'язується з тим же епітопом (наприклад,
лінійним або конформаційним епітопом), що й антитіло, описане у цьому документі. Детальні приклади способів картування епітопа, з яким зв'язується антитіло, наведені в Могтіх5 (1996) "Ерйоре Марріпд Ргоїосої5, " в Меїпосд3з іп Моїесшіаг Віоіоду мої. 66 (Нитапа Ргезв, Тоїома, МУ).
У типовому конкурентному аналізі іммобілізований НігА! інкубують у розчині, що містить перше мічене антитіло, яке зв'язується з НІгГАТ, та друге немічене антитіло, що підлягає дослідженню, на здатність конкурувати з першим антитілом за зв'язування з НІГгГА1. Друге антитіло може бути присутнім у супернатанті гібридом. Як контроль іммобілізований НігА!1 інкубують у розчині, що містить перше мічене антитіло, але не містить друге немічене антитіло.
Після інкубування в умовах, сприятливих для зв'язування першого антитіла з НІГАТ, видаляють надлишок незв'язаного антитіла та вимірюють кількість мітки, зв'язаної з іммобілізованим НІгА!1.
Якщо кількість мітки, зв'язаної з іммобілізованим НІГАТ, суттєво знижується у досліджуваному зразку у порівнянні з контрольним зразком, то це вказує на те, що друге антитіло конкурує з першим антитілом за зв'язування з НІгГА1. Див. Нагіом/ апа Гапе (1988) Апііродіє:в: А І арогаїгу
Мапциаї сп.14 (Соїа 5рііпуд Нагбог І абогаїогу, Соїд Зргіпду Нагбог, МУ). 2. Аналізи активності
В одному аспекті винаходу запропоновані аналізи для виявлення антитіл проти НІігАт, що мають біологічну активністю. Біологічна активність може полягати, наприклад, в інгібуванні, блокуванні, антагоністичному впливі, пригніченні, інтерференції, модуляції та/або зниженні однієї або більше біологічних активностей НІГАТ. Запропоновані також антитіла, що мають таку біологічну активність іп мімо та/або іп міго.
У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло за цим винаходом досліджують на таку біологічну активність. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти НІГАЇТ зв'язується з
НІГАТ та знижує або інгібує її активність серинової протеази по відношенню до одного або більше субстратів НігАї, включаючи, наприклад, субстрат Н2-Орі, а-казеїн, ДВ-казеїн або
ВОБІРМФ РІ -казеїнові субстрати, як описано нижче в прикладах, або будь-якого іншого субстрату НігА!, що підходить. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти НігА! інгібує активність серинової протеази НІГА1 з ІСсоо менше 50 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10
НМ, 5 нМ, З нМ, 2,5 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 800 пМ, 600 пМ, 500 пМ, 400 пМ, 300 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 50
ПМ або менше по відношенню до одного або більше субстратів НіІгГАї. У деяких варіантах
Зо реалізації винаходу антитіло проти НігАї захищає фоторецепторні клітини від руйнування, захищаючи товщину зовнішнього ядерного шару, або захищає функціональну активність електроретинограми у моделі очного захворювання, такого як мишача модель з постійним впливом світла, описаною у прикладі 10 Ш.5. 2013/0129743.
Для визначення здатності антитіла або його варіанта або фрагмента проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язуючого фрагмента) зв'язуватися з фактором О та проявляти біологічну дію, наприклад, інгібування альтернативного шляху гемолізу, можна використовувати аналізи гемолітичного інгібування, використовуючи еритроцити кролика (КВС), включаючи аналізи описані у прикладі 2 патенту США Мо 8273352, який включений у цей документ у повному обсязі як посилання. Таке гемолітичне інгібування можна визначати з використанням стандартних аналізів (Козіамавії еї аї., у). Іттипоіоду 158:1763-72, 1997; Міезтапп еї аї., Маїште 444:159-60, 2006). У таких аналізах активацію комплементу можна ініціювати за допомогою сироватки або плазми. Відповідні концентрації фактора О у сироватці та плазмі (Разсцча! еї аї., Кідпеу
Іптегпайіопа! 34:529-536, 1998; Сотрієтепі Расіб ВоокК, Вегпага У. Могієу апа Мак 9. УМаїроті, едіт5, Асадетіс Ргев5 (2000); Ватит еї аї., У. Іттипої. Меїпоав5, 67: 303-309, 1984) можна звичайним чином визначати у відповідності з методами, відомими у цій галузі техніки, включаючи описані у таких посиланнях як Разсцаї еї аІ., вище та Вагпит еї аї., вище, та у прикладі 4 патенту США Мо 8273352. Антитіла проти фактора 0, описані у цьому документі, загалом здатні інгібувати біологічні активності, зв'язані з фактором 0. Наприклад, при концентрації 18 мкг/мл (еквівалентній близько 1,5-разовій молярній концентрації фактора Ю людини в крові; молярне співвідношення антитіла проти фактора О до фактора О складає близько 1,511), може спостерігатися значне інгібування альтернативної комплементарної активності антитілом (див., наприклад, патент США Мо 6956107). 3. Аналізи стабільності
В одному аспекті винаходу запропоновані аналізи для визначення стабільності (наприклад, термостабільності) антитіла проти НІГА1. Наприклад, стабільність антитіла можна визначати, використовуючи будь-який спосіб, відомий у цій галузі техніки, наприклад, диференціальну скануючу флуориметрію (ДСФ), круговий дихроїзм (КД), власну флуоресценцію білків, диференціальну скануючу калориметрію (ДСК), спектроскопію, розсіяння світла (наприклад, динамічне розсіяння світла (ДРС) та статичне розсіяння світла (СРС), хроматографію на основі бо самовзаємодії (5ІС). Стабільність кількісним аналізом можна визначати, як описано у цьому документі, наприклад, використовуючи мас-спектрометрію, описану, наприклад, у прикладі 4, наприклад, у контексті стрес-дослідження ААРН та/або стрес-дослідження при підвищених температурах.
Е. Способи та композиції для діагностики та виявлення
У деяких варіантах реалізації будь-яке з антитіл проти НІігА!, запропонованих у цьому документі, можна застосовувати для виявлення наявності НігАї у біологічному зразку. У контексті цього документу термін "виявлені" охоплює кількісне або якісне виявлення. У деяких варіантах реалізації винаходу біологічний зразок містить клітину або тканину, такий як зразок, що містить фоторецепторні клітини, клітини пігментного епітелію сітківки, клітини зовнішнього ядерного шару, внутрішнього ядерного шару, клітини Мюлера, війковий епітелій або тканину сітківки. У деяких варіантах реалізації винаходу біологічний зразок містить біологічну рідину організму, наприклад, скловидне тіло або кров.
В одному варіанті реалізації винаходу запропоновано антитіло проти НігАї для застосування у способі діагностики або виявлення. У додатковому аспекті запропонований спосіб виявлення наявності НІГАТ у біологічному зразку. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб включає приведення у контакт біологічного зразка з антитілом проти НІГАТ, описаним у цьому документі, в умовах, що допускають зв'язування антитіла проти НігАї з НГІГАТ, та визначення утворення комплексу між антитілом проти НігАї та НІгАї1. Такий спосіб можна здійснювати іп міто або іп мімо. В одному варіанті реалізації винаходу антитіло проти НігА1 застосовують для відбору суб'єктів, які підходять для лікування за допомогою антитіла проти
НІГАТ, наприклад, якщо НІГА! є біомаркером для відбору пацієнтів.
У деяких варіантах реалізації винаходу пацієнта, якому підходить лікування за допомогою антитіла проти НІГА1, можна ідентифікувати виявленням одного або більше поліморфізмів у гені
НІгГАТї або регуляторній послідовності НігАї, такого як поліморфізм промотора НігА1 г511200638(5/А) (див., наприклад, Оеумап еї аї., бсівпсе 314: 989-992, 2006, яка включена у цей документ у повному обсязі як посилання).
Типові порушення, які можна діагностувати з використанням антитіла за цим винаходом включають рак, але не обмежуються ними, пов'язані з НІГА порушення, очні порушення, зв'язані з комплементом порушення та прееклампсію. У деяких прикладах хвороба ока включає, але не
Зо обмежується ними, ВМД, включаючи вологу ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху ВМД (наприклад, географічну атрофію (ГА)), діабетичну ретинопатію (ДР), ретинопатію недоношених (КОР) або поліпоподібну хориоїдальну васкулопатію (РСМ).
У деяких варіантах реалізації винаходу використанням антитіла за цим винаходом можна діагностувати прееклампсію. У деяких варіантах реалізації винаходу збільшений рівень НІГА1 у зразку, отриманому у суб'єкта, відносно еталонного рівня НІгГАТ може бути показником наявності у суб'єкта прееклампсії або його сприйнятливості до неї. Див., наприклад, Теой еї аї. Ріасепіа 36(9):990-995, 2015. У деяких варіантах реалізації винаходу використанням антитіла за цим винаходом можна виявляти у сироватці рівні НіІгГАТ1. В інших варіантах реалізації винаходу використанням антитіла за цим винаходом можна виявляти плацентарні рівні НІГАТ1.
У деяких варіантах реалізації винаходу запропоновані мічені антитіла проти НІігАт. Мітки включають мітки або фрагменти, які виявляються безпосередньо (наприклад, флуоресцентні, хромофорні, електронно-щільні, хемілюмінесцентні та радіоактивні мітки), а також такі фрагменти, як ферменти або ліганди, які виявляються опосередковано, наприклад, за допомогою ферментативної реакції або молекулярних взаємодій, але не обмежуються ними.
Типові мітки включають радіоізотопи 9З2Р, 140, 125), ЗН та "І, флуорофори, наприклад, хелати рідкоземельних елементів або флуоресцеїн та його похідні, родамін та його похідні, дансил, умбеліферон, люциферази, наприклад, люциферазу світляка та бактеріальну люциферазу (патент США Мо 4737456), люциферин, 2,3-дигідрофталазиндіони, пероксидазу хріну (НКР), лужну фосфатазу, р-галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, оксидази вуглеводів, наприклад, глюкозооксидазу, галактозооксидазу та глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу, оксидази гетероциклічних сполук, наприклад, уриказу та ксантиноксидазу, у поєднанні з ферментом, який використовує пероксид водню для окиснення попередника барвника, наприклад, НРЕР, лактопероксидазою або мікропероксидазою, біотин/авідин, спінові мітки, мітки-бактеріофаги, стабільні вільні радикали тощо, але не обмежуються ними.
В іншому варіанті реалізації винаходу антитіло не потребує введення мітки, а його присутність можна виявляти, використовуючи мічене антитіло, яке зв'язується з цим антитілом.
Антитіла цього винаходу можна застосовувати у будь-якому відомому методі аналізу, такому як аналізи конкурентного зв'язування, прямі та непрямі сендвіч-аналізи та аналізи 60 імунопреципітації. 70Іа, Мопосіопа! Апіїродієв: А Мапиаї ої Тесппіднев, рр.147-158 (СВО Ргезв,
Іпс. 1987).
Аналізи конкурентного зв'язування залежать від здатності міченого стандарту конкурувати з аналітом випробуваного зразка за зв'язування з обмеженою кількістю антитіла. Кількість антигена у випробуваному зразку обернено пропорційна кількості стандарту, який здійснює зв'язування з цими антитілами. Для полегшення визначення кількості стандарту, який здійснює зв'язування, антитіла звичайно переводять у нерозчинну форму до або після конкурентного зв'язування так, щоб стандарт та аналіт, які зв'язані з антитілами, можна було зручно відділяти від молекул стандарту та аналіту, які залишилися незв'язаними.
У сендвіч-аналізах задіюють два антитіла, кожне з яких здатне зв'язуватися з різною імуногенною частиною або епітопом білка, що виявляється. У сендвіч-аналізі аналіт досліджуваного зразка зв'язаний першим антитілом, яке іммобілізоване на твердій основі та, після цього, друге антитіло зв'язується з аналітом, завдяки чому утворюється нерозчинний комплекс з трьох частин. Див., наприклад, патент США Мо 4376110. Друге антитіло можна саме мітити фрагментом, що детектується (прямий сендвіч-аналіз) або можна проводити вимірювання з використанням антитіла проти імуноглобуліну, яке мічене фрагментом, що виявляється (непрямий сендвіч-аналіз). Наприклад, один тип сендвіч-аналізу являє собою твердофазний імуноферментний аналіз (ІФА), у випадку якого фрагментом, що виявляється, є фермент.
Для імуногістохімічного дослідження зразок може бути свіжим або замороженим, або він може бути залитим парафіном та фіксованим таким консервантом, як, наприклад, формалін. б. Діагностичні набори
З метою зручності антитіло за цим винаходом (наприклад, антитіло проти НІГА!1 або антитіло проти НІігГАТ/фактора 0) можна надавати у наборі, тобто розфасованої комбінації реактивів, у попередньо визначених кількостях з інструкціями для виконання діагностичного аналізу. Якщо антитіло мітять ферментом, набір буде містити субстрати та кофактори, необхідні для ферменту (наприклад, попередник субстрату, який забезпечує хромофор або флуорофор, що виявляється). На додаток, до складу набора можна включати інші добавки, такі як стабілізатори, буфери (наприклад, блокуючий буфер або лізуючий буфер) тощо. Для забезпечення концентрацій реактивів у розчинах, які практично оптимізують чутливість аналізу, можна у
Зо широких межах варіювати відносні кількості різних реактивів. Зокрема, реактиви можуть надаватися у вигляді сухих порошків, звичайно ліофілізованих, що включають наповнювачі, щоб при розчиненні отримувати розчин реактиву у відповідній концентрації.
Н. Фармацевтичні рецептури
Терапевтичні рецептури антитіла або варіанта такого антитіла (наприклад, антитіла проти
НІГАТ або антитіла проти НігАТ/фактора О за цим винаходом) можна готувати для зберігання у вигляді ліофілізованих рецептур або водних розчинів шляхом змішування поліпептиду, який має потрібний ступінь чистоти з оптимальними "фармацевтично прийнятними" носіями, наповнювачами або стабілізаторами, що звичайно застосовують у цій галузі техніки (всі з яких називають "наповнювачами"). Наприклад, буферизуючі агенти, стабілізуючі агенти, консерванти, ізотонізуючі добавки, неіонні поверхнево-активні речовини, антиоксиданти та інші різноманітні добавки. Див., наприклад, Ветіпдіоп'є Рпаптасешійса! бсівепсев, 16!" еайіоп, А. О5о0Ї,
Еа. (1980). Такі добавки повинні бути нетоксичними для реципієнтів у дозуваннях та концентраціях, що застосовуються.
Буферизуючі агенти допомагають підтримувати рН у діапазоні, наближеному до фізіологічних умов. Переважно вони присутні у концентраціях від близько 2 мМ до близько 50
ММ. Прийнятні буферизуючі агенти для застосування у цьому винаході включають як органічні, так і неорганічні кислоти та їх соли, такі як цитратні буфери (наприклад, суміш цитрату мононатрію-цитрату динатрію, суміш лимонної кислоти-цитрату тринатрію, суміш лимонної кислоти-цитрату мононатрію тощо), сукцинатні буфери (наприклад, суміш бурштинової кислоти- сукцинату мононатрію, суміш бурштинової кислоти-гідроксиду натрію, суміш бурштинової кислоти-сукцинату динатрію тощо), тартратні буфери (наприклад, суміш винної кислоти- тартрату натрію, суміш винної кислоти-тартрату калію, суміш винної кислоти-гідроксиду натрію тощо), фумаратні буфери (наприклад, суміш фумарової кислоти-фумарату мононатрію, суміш фумарової кислоти-фумарату динатрію, суміш фумарату мононатрію-фумарату динатрію тощо), глюконатні буфери (наприклад, суміш глюконової кислоти-глюконату натрію, суміш глюконової кислоти-гідроксиду натрію, суміш глюконової кислоти-глюконату калію тощо), оксалатний буфер (наприклад, суміш щавлевої кислоти-оксалату натрію, суміш щавлевої кислоти-гідроксиду натрію, суміш щавлевої кислоти-оксалату калію тощо), лактатні буфери (наприклад, суміш молочної кислоти-лактату натрію, суміш молочної кислоти-гідроксиду натрію, суміш молочної бо кислоти-лактату калію тощо) та ацетатні буфери (наприклад, суміш оцтової кислоти-ацетату натрію, суміш оцтової кислоти-гідроксиду натрію тощо). Додатково можна згадати фосфатні буфери, гістидинові буфери та такі соли триметиламіну, як Трис.
Можна додавати консерванти для стримування мікробного росту та їх можна додавати у кількостях у діапазоні від 0,2 95 до 1 95 (мас./06.). Прийнятні консерванти для застосування за цим винаходом включають фенол, бензиловий спирт, мета-крезол, метилпарабен, пропілпарабен, хлорид октадецилдиметилбензиламонію, галогеніди бензалконію (наприклад, хлорид, бромід, йодид), хлорид гексаметонію, алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехін; резорцин; циклогексанол та З-пентанол.
Для забезпечення ізотонічності рідких композицій цього винаходу ізотонуючі агенти, інколи відомі як "стабілізатори", можна додавати багатоатомні сахарні спирти, переважно тригідратні вищі сахарні спирти, такі як гліцерин, ерітрит, арабіт, ксиліт, сорбіт та маніт.
Стабілізатори відносяться до широкої категорії наповнювачів, які можуть охоплювати діапазон функцій від об'ємоутворюючого агента до добавки, яка солюбілізує терапевтичний засіб або допомагає підтримати денатурацію або прилипання до стінки контейнера. Типові стабілізатори можуть представляти собою багатоатомні цукрові спирти (перелічені вище); амінокислоти, такі як аргінін, лізин, гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аланін, орнітин, 1 - лейцин, 2-фенілаланін, глутамінова кислота, треонін тощо; органічні цукри або цукрові спирти, такі як лактоза, трегалоза, стахіоза, маніт, сорбіт, ксиліт, рибіт, міоінізит, галактит, гліцерин тощо, включаючи такі цикліти, як інозит, поліетиленгліколь; полімери амінокислот; сіркомісні відновлювачі, такі як сечовина, глутатіон, тіоктова кислота, тіогліколят натрію, тіогліцерин, а- монотіогліцерин та тіосульфат натрію; поліпептиди з низькою молекулярною масою (тобто «10 залишків), такі білюию, як людський сироватковий альбумін, бичачий сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; моносахариди, такі як ксилоза, маноза, фруктоза та глюкоза, дисахариди, такі як лактоза, мальтоза та цукроза); трисахариди, такі як рафіноза, та полісахариди, такі як декстан. Стабілізатори можуть бути присутні у діапазоні від 0,1 до 10000 масових частин на частину маси активного білка.
Можна додавати неіїонні поверхнево-активні речовини або детергенти (також відомі "змочуючі агенти") для полегшення солюбілізації терапевтичного білка (наприклад, антитіла), а також для захисту терапевтично білка від агрегації, викликаної перемішуванням, що також
Зо дозволяє рецептурі переносити напруження на поверхні зсуву без ініціювання денатурації білка.
Прийнятні неіїонні поверхнево-активні речовини включають полісорбати (20, 80 тощо.), поліоксамери (184, 188 тощо), поліоли Р ЮЕОМІСФ), прості моноефіри поліоксіетиленсорбітану (ТУМЕЕМФ-20, ТМ/ЕЕМФ-80 тощо). Неїонні поверхнево-активні речовини можуть міститися у діапазоні від близько 0,05 мг/мл до близько 1,0 мг/мл, переважно від близько 0,07 мг/мл до близько 0,2 мг/мл.
Додаткові різні наповнювачі включають об'ємоутворюючі агенти (наприклад, крохмаль), хелатуючі агенти (наприклад, ЕДТК (етилендіамінтетраоцтова кислота), антиоксиданти (наприклад, аскорбінова кислота, метіонін та вітамін Е) та співрозчинники. Рецептура, описана у цьому документі, також може містити більше однієї активної сполуки, якщо це необхідно для лікування за конкретними показаннями, переважно, сполуки зі взаємодоповнючими активностями, що не спричиняють небажаної дії одна на одну. Наприклад, може бути потрібним включення до рецептури антагоніста зв'язування НІГА1 (наприклад, антитіла проти НІГАТ1) та антагоніста зв'язування фактора О (наприклад, антитіла проти фактора 0). В іншому прикладі для лікування хвороби ока, пов'язаної з небажаною неоваскуляризацією, такою як ВМД, може бути потрібно додатково надавати антиангіогенну терапію, таку як терапію антагоністом МЕСБЕ, наприклад ГОСЕМТІЗФ (ранібізумаб). Відповідно, такі активні інгредієнти присутні у комбінації в кількостях, ефективних для мети, що передбачається.
Активні інгредієнти також можна заключати у мікрокапсули, отримані, наприклад, методиками коацервації або міжфазної полімеризації, наприклад, мікрокапсули з гідроксиметилцелюлози або желатину та поліметилметакрилатні мікрокапсули, відповідно, у колоїдні системи доставки лікарських засобів (наприклад, ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, наночастинки та нанокапсули) або у макроемульсії. Такі методики описані в
Ветіпдюп'в РНаптасеціїса! Зсієпсев, 161й єдійоп, А. Овзаї, Ед. (1980).
Можна готувати препарати сповільненого вивільнення. Підходящі приклади препаратів із сповільненим вивільненням включають напівпроникні матриці твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, варіант антитіла або його фрагмент (наприклад, антигензв'язуючий фрагмент), матриці, які приготовлені у формі профільованих виробів, наприклад, плівок або мікрокапсул. Приклади матриць із сповільненим вивільненням включають складні поліефіри, гідрогелі (наприклад, полі(2-гідроксіетилметакрилат) або полівініловий бо спирт),
полілактиди (патент США Мо 3773919), співполімери І-глутамінової кислоти та етилч-і- глутамат, етилвінілацетат, що не руйнується, співполімери молочної кислоти-гліколевої кислоти, що руйнуються, такі як
ГОРКОМ ОЕРОТ "М (ін'єкційні мікросфери, що складаються зі співполімеру молочної кислоти-гліколевої кислоти та лейпролиду ацетату) та полі-О-(-)-3-гідроксимасляну кислоту. У той час як такі полімери, як етиленвінілацетат та молочна кислота-гліколева кислота здатні вивільняти молекули протягом більше 100 діб, деякі гідрогели вивільняють білки за більш короткі періоди часу. Якщо інкапсульовані антитіла залишаються в організмі протягом тривалого часу, то вони можуть денатурувати або агрегувати в результаті впливу вологи при 37 "С, що призводить до втрати біологічної активності та можливим змінам імуногенності Для стабілізації можна розробляти раціональні стратегії, які залежать від механізму, що приймає участь.
Наприклад, якщо виявлено, що механізм агрегації викликає утворення міжмолекулярного зв'язку 5-5 за допомогою тіодисульфідного обміну, то можна досягати стабілізації модифікацією сульфгідрильних залишків, ліофілізацією з кислих розчинів, регулюванням вмісту вологи, використанням підходящих добавок та розробкою спеціальних композицій з полімерними матрицями.
І. Терапевтичні способи та композиції
У терапевтичних способах можна застосовувати будь-яке з антитіл проти НІГАТ, запропонованих у цьому документі (наприклад, антитіла проти НігАї та антитіла проти
НІГАТ/фактора 0).
В одному аспекті винаходу для застосування як лікарського засобу запропоновано антитіло проти НігГАї. У додатковому аспекті у винаході запропоновано антитіло проти НігАї для застосування при лікуванні пов'язаного з НігАї порушення. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з НІГАТ порушення являє собою ВМД, що включає вологу ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху ВМД (наприклад, географічну атрофію (ГА)). У деяких випадках ВМД являє собою запущену суху ВМД (наприклад, ГА).
Зо В іншому варіанті реалізації у винаході запропоновано антитіло проти НігАї для застосування при лікуванні хвороби ока. У деяких випадках хвороба ока являє собою ВМД, що включає вологу (ексудативну) ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху (неексудативну) ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху ВМД (наприклад, ГА); діабетичну ретинопатію (ОК) та інші пов'язані з ішемією ретинопатії; ендофтальміт; увеїт; хориоїдальну неоваскуляризацію (СММ); ретинопатію недоношених (КОР); поліпоподібну хориоїдальну васкулопатію (РСМ); діабетичний макулярний набряк; патологічну міопію, хворобу
Гіпеля-Ліндау; гістоплазмоз ока; оклюзію центральної вени сітківки (СКМО); корнеальну васкуляризацію та ретинальну неоваскуляризацію. У деяких варіантах реалізації винаходу хвороба ока являє собою ВМД (наприклад, запущену суху ВМД (наприклад, ГА)).
В іншому аспекті запропоновано антитіло проти НІГА1 для застосування у способі лікування.
У деяких випадках у винаході запропоновано антитіло проти НІГА1 для застосування у способі лікування суб'єкта, який має пов'язане з НігАї порушення, що включає введення індивіду ефективної кількості антитіла проти НІГА1. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з
НІГАТ порушення являє собою ВМД, що включає вологу ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху ВМД (наприклад, ГА)). У деяких випадках ВМД являє собою запущену суху ВМД (наприклад, ГА).
В іншому випадку у винаході запропоновано антитіло проти НіІгГАї для застосування у способі лікування суб'єкта, який має хворобу ока, що включає введення індивіду ефективної кількості антитіла проти НігА1. У деяких випадках хвороба ока являє собою ВМД, що включає вологу (ексудативну) ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху (неексудативну) ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху ВМД (наприклад, ГА); ОК та інші пов'язані з ішемією ретинопатії; ендофтальміт; увеїт; СММ; КОР; РСУ; діабетичний макулярний набряк; патологічну міопію, хворобу Гіпеля-Ліндау; гістоплазмоз ока; СЕМО; корнеальну васкуляризацію та ретинальну неоваскуляризацію. У деяких варіантах реалізації винаходу хвороба ока являє собою ВМД (наприклад, запущену суху ВМД (наприклад, ГА)).
У деяких випадках у винаході запропоновано антитіло проти НігАї для застосування в інгібуванні у суб'єкта дегенерації сітківки або рецепторних клітин. В інших випадках у винаході запропоновано антитіло проти НігА!ї для застосування в інгібуванні у суб'єкта активності серинової протеази НігА1. "Суб'єкт" згідно будь-якого з вищеописаних застосувань може бути
Гс10) людиною. бо
У винаході запропоновано застосування антитіла проти НігАї для виробництва або приготування лікарського засобу. Наприклад, в одному випадку лікарський засіб призначений для лікування пов'язаного з НігАї порушення. У додатковому випадку лікарський засіб призначений для застосування у способі лікування пов'язаного з НІГАТ порушення, що включає введення суб'єкту, який має пов'язане з НігАї порушення, ефективної кількості цього лікарського засобу. У будь-якому з попередніх застосувань лікарських засобів спосіб може включати введення індивіду ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного засобу, наприклад, як описано нижче. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з НІГАТ порушення являє собою ВМД, що включає вологу ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху
ВМД (наприклад, ГА)). У деяких випадках ВМД являє собою запущену суху ВМД (наприклад,
ГА).
В іншому випадку лікарський засіб призначено для застосування у способі лікування хвороби ока, що включає введення суб'єкту, який має хворобу ока, ефективної кількості цього лікарського засобу. У деяких випадках хвороба ока являє собою ВМД, що включає вологу (ексудативну) ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху (неексудативну) ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху ВМД (наприклад, ГА); ОК та інші пов'язані з ішемією ретинопатії; ендофтальміт; увеїт; СММ; КОР; РСУ; діабетичний макулярний набряк; патологічну міопію, хворобу Гіпеля-Ліндау; гістоплазмоз ока; СЕМО; корнеальну васкуляризацію та ретинальну неоваскуляризацію. У деяких варіантах реалізації винаходу хвороба ока являє собою ВМД (наприклад, запущену суху ВМД (наприклад, ГА)).
У винаході запропонований спосіб лікування пов'язаного з НігАї порушення. В одному варіанті реалізації винаходу спосіб включає введення суб'єкту, який має пов'язане з НІігА! порушення, ефективної кількості антитіла проти НІгА1. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з НІГАї порушення являє собою ВМД, що включає вологу ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху
ВМД (наприклад, ГА)). У деяких випадках ВМД являє собою запущену суху ВМД (наприклад,
ГА). У додаткових випадках спосіб додатково включає введення індивіду ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного засобу, як описано нижче. "Суб'єкт" згідно
Зо будь-якого з вищеописаних методів може бути людиною.
У винаході запропонований спосіб лікування хвороби ока. В одному варіанті реалізації винаходу спосіб включає введення суб'єкту, який має хворобу ока, ефективної кількості антитіла проти НігАї. У деяких випадках хвороба ока являє собою ВМД, що включає вологу (ексудативну) ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху (неексудативну) ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху ВМД (наприклад, ГА); ОК та інші пов'язані з ішемією ретинопатії; ендофтальміт; увеїт; СММ; КОР; РСУ; діабетичний макулярний набряк; патологічну міопію, хворобу Гіпеля-Ліндау; гістоплазмоз ока; СЕМО; корнеальну васкуляризацію та ретинальну неоваскуляризацію. У деяких варіантах реалізації винаходу хвороба ока являє собою ВМД (наприклад, запущену суху ВМД (наприклад, ГА)).
У винаході запропонований спосіб лікування пов'язаного з НіІгГАї порушення, хвороби ока та/або пов'язаного з комплементом порушення у суб'єкта, що має для цього показання, причому спосіб включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості антагоніста зв'язування
НІГАТ та/або антагоніста зв'язування фактора ОО. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з НІГАТЇ порушення або пов'язане з комплементом порушення являє собою хворобу ока. У деяких варіантах реалізації винаходу хвороба ока вибрана з групи, що складається з
ВМД, діабетичної ретинопатії, хориоїдної неоваскуляризації (СММ), увеїту, діабетичного макулярного набряку, патологічної міопії, хвороби Гіпеля-Ліндау, гістоплазмозу ока, оклюзії центральної вени сітківки, корнеальної васкуляризації та ретинальної неоваскуляризації. У деяких випадках хвороба ока являє собою ВМД, що включає вологу ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху
ВМД (наприклад, ГА)). У деяких випадках ВМД являє собою запущену суху ВМД (наприклад,
ГА). У будь-якому з попередніх варіантів реалізації винаходу антагоніст зв'язування НІГАТ може представляти собою антитіло проти НІгГАТ або його антигензв'язуючий фрагмент, наприклад будь-яке антитіло проти НІГАТ або його антигензв'язуючий фрагмент, описані у цьому документі.
У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючий фрагмент антитіла вибраний з групи, що складається з фрагментів баб, Бар'-5Н, Ем, зсЕМ та (Рабр")». У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючий фрагмент антитіла являє собою Рар. У деяких варіантах реалізації винаходу Рар містить усічення в шарнірній ділянці (наприклад, верхньому шарнірі) константної ділянки важкого ланцюга. У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка Еар бо важкого ланцюга завершується положенням 221 (нумерація ЕМО). У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислотний залишок положення 221 являє собою аспарагінову кислоту. У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка важкого ланцюга Равб містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 156. У деяких варіантах реалізації винаходу Бар являє собою Раб
ІДС1. У деяких випадках антагоніст зв'язування фактора О являє собою антитіло проти фактора
О або його антигензв'язуючий фрагмент, наприклад будь-яке з антитіл проти фактора 0, описаних у цьому документі.
В іншому аспекті у винаході запропоновано застосування біспецифічного антитіла, яке специфічно зв'язує як НІГА!1, так і фактор 0, або антигензв'язуючого фрагмента такого антитіла для виготовлення лікарського засобу для лікування пов'язаного з НІГАТ порушення, хвороби ока та/або пов'язаного з комплементом порушення. У деяких варіантах реалізації винаходу пов'язане з НІГАТ1 порушення та/або пов'язане з комплементом порушення являє собою хворобу ока. У деяких випадках хвороба ока являє собою ВМД, що включає вологу ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену вологу ВМД) та суху ВМД (включаючи ранню, проміжну та запущену суху ВМД (наприклад, ГА)). У деяких варіантах реалізації винаходу ВМД являє собою запущену суху ВМД (наприклад, ГА). Біспецифічне антитіло може містити зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує НігГАТї, що походить з будь-якого з антитіл проти НІГАТ, описаних у цьому документі. Біспецифічне антитіло може містити зв'язуючий домен, який специфічно зв'язує фактор Ю, що походить з будь-якого з антитіл проти фактора 0, описаних у цьому документі. У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючий фрагмент антитіла являє собою фрагмент Раб або фрагмент (Бар")».
Будь-яке з антитіл проти фактора 0 або їх антигензв'язуючих фрагментів, описаних у цьому документі та/або відомих у цій галузі техніки, можна застосовувати у будь-якому з попередніх способів або застосувань. Наприклад, у деяких випадках антитіло проти фактора О або його антигензв'язуючий фрагмент може містити наступні шість НМЕК: (а) НМЕК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність СУТЕТМУСОММ (ЗБО І МО: 109); (5) НМК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність УМІМТУТЗЕТТМАХІОРКО (ЗЕО ІО МО: 110), де Хі являє собою Азр або Сім; (с) НМЕ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕССМХ:М (ЗЕО ІО МО: 111), де Хі являє собою Ар або 5ег; (й) НМК-11, яка містить амінокислотну послідовність ІТЗТХЇХ» х зОММ (ЗЕО ІО МО: 112), де Хі являє собою Ар або 5ег, Хг2 являє собою Ар або Сім, а Хз являє
Зо собою Ар або Зег; (є) НМК-12, яка містить амінокислотну послідовність СОМ КР (5ЕО ІЮ МО: 113); та () НМЕА-1І 3, яка містить амінокислотну послідовність ГО5Х:5І РУТ (5ЕО ІЮО МО: 114), де
Хі являє собою Ар або Сіш. У деяких випадках антитіло проти фактора ОО або його антигензв'язуючий фрагмент містить наступні шість НМЕ: (а) НУВ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗУТЕТММСОММ (5ЕБО ІО МО: 109); (Б) НМК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність УМІМТУТОЕТТМАООРКО (БО ІО МО: 115); та (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЕССМММ (ЗЕ ІЮО МО: 116); (а) НМВ-11, яка містить амінокислотну послідовність І5ТОІЮСОММ (БО ІЮ МО: 117); (е) НМК-І2, яка містить амінокислотну послідовність СОСМТІ КР (ЗЕБО ІО МО: 113); та () НМК-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність ГОБОБІ РУТ (5ЕО ІЮО МО: 118). У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора ОЮО або його антигензв'язуючий фрагмент містить (а) домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9095 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 119; (Б) домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9095 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 120; або (с) домен МН, аналогічний описаному в (а), та домен МІ, аналогічний описаному в (Б). У деяких випадках домен МН містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮО МО: 119. У деяких випадках домен МГ. містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 120. У деяких випадках антигензв'язуючий фрагмент антитіла проти фактора Ю являє собою лампалізумаб, що має реєстраційний номер СА5 1278466-20-8.
Передбачається, що антитіло за цим винаходом можна застосовувати для лікування ссавця.
В одному варіанті реалізації винаходу антитіло вводять ссавцю, що не відноситься до людині, з метою отримання, наприклад, доклінічних даних. Приклади ссавців, які не відносяться до людини та підлягають лікуванню, включають приматів, що не відносяться до людини, собак, котів, гризунів (наприклад, мишей та щурів) та інших ссавців, на яких виконують доклінічні дослідження. За допомогою таких ссавців можна створювати тваринні моделі захворювання, що підлягає лікуванню цим антитілом, або їх можна застосовувати для вивчення токсичності антитіла, що цікавить. В кожному з таких варіантів реалізації винаходу на ссавцеві можна проводити дослідження з підвищенням дози.
У додатковому аспекті у винаході запропоновані фармацевтичні рецептури, що містять будь-яке з антитіл проти НігАї, запропонованих у цьому документі, наприклад, для бо застосування у будь-якому з вищеперелічених терапевтичних способів. В одному варіанті реалізації фармацевтична рецептура містить будь-яке з антитіл проти НІГАТ, запропонованих у цьому документі, та фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті реалізації фармацевтична рецептура містить будь-яке з антитіл проти НІГАТ, запропонованих у цьому документі, та щонайменше один додатковий терапевтичній засіб, наприклад, як описано нижче.
У будь-якому з терапевтичних застосувань та способів, описаних у цьому документі, антитіло проти НігАї може представляти собою Рар. У деяких варіантах реалізації винаходу
ЕРар містить усічення у шарнірній ділянці (наприклад, верхній шарнірній ділянці) константної ділянки важкого ланцюга. У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка Еар важкого ланцюга завершується положенням 221 (нумерація ЕО). У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислотний залишок положення 221 являє собою аспарагінову кислоту. У деяких варіантах реалізації винаходу константна ділянка важкого ланцюга Равб містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 156. У деяких варіантах реалізації винаходу Бар являє собою ЕБар
ІДИ.
Антитіло за цим винаходом (та будь-який додатковий терапевтичний засіб) для попередження або лікування очного захворювання або патологічного стану можна вводити будь-якими прийнятними способами, які включають, але не обмежуються ними, наприклад, окулярною, внутрішньоочною та/або інтравітреальною ін'єкцією, та/або близькосклеральною ін'єкцією, та/або ін'єкцією у субтеноновий простір, та/або супрахориоїдальною ін'єкцією, та/або місцевим нанесенням у формі очних капель та/або мазі. Такі антитіла за цим винаходом можна доставляти різноманітними способами, наприклад, інтравітреально у вигляді пристрою та/або депо, яке забезпечує повільне вивільнення сполуки у скловидне тіло, включаючи описані у таких посиланнях, як Іпігаосшаг Огид Оеєїїмегу, УЧапне, УЧане, Азпіоп, апа Реагзоп, еаіюогв5, Тауїог
Егапсі5 (Магсп 2006). В одному прикладі пристрій може мати форму мінінасоса та/або матриці та/або системи пасивної дифузії та/або інкапсульованих клітин, які вивільняють сполуку протягом тривалого періоду часу (Іпігаосшаг ЮОгид Оеєїїмегу, Чапйе, даїе, Азпоп, апа Реагзоп, еййоге, Тауїог 5 Егапсі5 (Магспй 2006). Можна також застосовувати інші способи введення, які включають місцеве, парентеральне, підшкірне, внутрішньочеревне, внутрішньолегеневе, інтраназальне введення та введення всередину вогнища, але не обмежуються ними.
Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне,
Зо внутрішньочеревне або підшкірне введення.
Рецептури для окулярного, внутрішньоочного або інтравітреального введення можна готувати способами та з використанням наповнювачів, відомих у цій галузі техніки. Важливою ознакою ефективного лікування є належне проникнення всередину ока. На відміну від захворювань на передній поверхні ока, коли лікарський засіб наносять місцево, як правило, для захворювань сітківки позитивний результат отримують при більш локалізованому підході. Очні краплі та мазі ледве проникають до очного дна, а гематоофтальмічний бар'єр перешкоджає проникненню введених до системного кровотоку лікарських засобів в очні тканини. Відповідно, переважним способом доставки лікарських засобів для лікування захворювання сітківки, такого як ВМД та СМУ, як правило, є пряма інтравітреальна ін'єкція. Інтравітреальні ін'єкції звичайно повторюють з інтервалами, які залежать від стану пацієнта, властивостей та періоду напіввиведення лікарського засобу, що доставляється. Для проникнення всередину ока (наприклад, у скловидне тіло) звичайно переважними є молекули меншого розміру.
У очей є багато біофізичних та анатомічних елементів, які створюють складності для окулярної доставки лікарських засобів. Наприклад, гематоофтальмічні бар'єри та захисні механізми захищають очі від інфекції, але у то же час ускладнюють проникнення лікарського засобу, особливо для захворювань у задніх сегментах ока. Відповідно, для досягнення та підтримання біодоступності лікарського засобу на місці (наприклад, час утримання в оці) часто потрібно введення високої дози для покращення ефективності. Між тим, обмежений простір задньої частини ока скорочує об'єм лікарського засобу, що підлягає доставці, що у свою чергу може давати перевагу лікарським засобам, які можна доставляти у вигляді рецептури з високою концентрацією.
Пацієнти з очними порушеннями (наприклад, ВМД (наприклад, географічна атрофія)) також можуть отримувати позитивний результат від доставки терапевтичних засобів тривалої дії/сповільненого вивільнення. Менш часте введення доз може створювати підвищену зручність для пацієнта, даючи потенціальні переваги зі зниженням частоти виникнення інфекцій та збільшенням клінічної ефективності. Контрольоване вивільнення лікарського засобу у високих дозах також може зводити до мінімуму побічні ефекти лікарських засобів. Дві багатообіцяючі системи для доставки з тривалою дією наведені твердими імплантами на основі РІ СА та порт- системи доставки, що імплантується (РОБ). Обидві системи потенційно здатні забезпечувати бо кінетику вивільнення практично нульового порядку протягом тривалого періоду часу. Для РІ СА-
імплантів інкапсулюють білковий лікарський засіб у гідрофобну полімерну матрицю та здійснюється вивільнення лікарського засобу за допомогою повільного гідролізу полімеру.
Швидкість вивільнення можна контролювати зміною навантаження лікарським засобом, гідрофобності полімеру або молекулярної маси полімеру. РОЗ являє собою надійний пристрій, у якому вивільнення у скловидне тіло контролюється пористою металічною мембраною, що містить титанову кераміку. Оскільки резервуар має малий об'єм, для ефективної доставки за допомогою РОЗ потрібна висока концентрація білка.
На додаток або замість високої концентрації та доставки з тривалою дією, можна досягати збільшеної біодоступності (наприклад, час утримання в оці) лікарського засобу або полегшувати її за допомогою посттрансляційних модифікацій, при яких білковий лікарський засіб ковалентно кон'юговано з природними або синтетичними полімерами, такими способами як полісіалювання,
НЕЗіалювання (кон'югація з гідроксіетилкрахмалом) та ПЕГилювання. Див., наприклад, Спеп еї аІ., Ехреп. Оріп. Огид Оеїїм. 8:и1221-36, 2011; Копівєптаппи, Віобгид5 23:93-109, 2011.
ПЕГилювання, ковалентне приєднання полімеру поліетиленгліколю (ПЕГ) до білка, являє собою добре відпрацьовану технологію, особливо придатну для подовження періоду напіввиведення терапевтичних засобів на основі фрагментів антитіл. Уеуземаг еї а!., Віоїесн. У. 5:113-128, 2010.
Умови, дії яких піддається лікарський засіб, змінюються в залежності від системи доставки, що використовується. Для включення до рецептури твердих РІ СА-імплантів використовують ліофілізований або висушений розпиленням лікарський засіб. Імпланти виготовляють з використанням процесу екструзії гарячого розплаву таким чином, що лікарський засіб короткочасно піддається впливу температур, що наближаються до 90 "С. Хоча лікарський засіб залишається у твердому стані під час вивільнення, руйнування РІСА може піддавати лікарський засіб дії оточення з низьким значенням рн. На противагу цьому, лікарський засіб, що постачається за допомогою РОБ, підтримується у рідкому стані з високою концентрацією та знаходиться у середовищі скловидного тіла, для якого характерно відновлювальне оточення з фізіологічними значеннями іонної сили та рн.
Кількість антитіла або варіанта такого антитіла, яка буде ефективною при лікуванні конкретної хвороби ока або патологічного стану, буде залежати від природи порушення або патологічно стану, та може бути визначеною стандартними клінічними методиками. Якщо можливо, перед дослідженнями на людях бажано спочатку визначати криву "доза-відповідь" для фармацевтичних композицій за цим винаходом іп міїго, а потім на застосовних системах тваринних моделей.
Додаткові прийнятні засоби введення включають парентеральне, внутрішньолегеневе та інтраназальне введення та, якщо це необхідно для місцевого лікування, введення всередину вогнищ. Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревне або підшкірне введення. Введення дози можна здійснювати будь-яким прийнятним способом, наприклад, за допомогою ін'єкцій, таких як внутрішньовенні або підшкірні ін'єкції що зокрема залежить від того, чи є введення короткочасним або тривалим. У цьому документі розглядаються різні схеми введення доз, включаючи одне або багато введень у різні моменти часу, болюсне введення та імпульсне вливання, але не обмежуються ними. У деяких випадках антитіло проти НІГАЇ можна вводити внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, через шкіру, внутрішньоартеріально, внутрішньочеревинно, всередину вогнища, інтракраніально, всередину суглоба, всередину простати, внутрішньоплеврально, інтратрахеально, інтратекально, назально, вагінально, ректально, місцево, всередину пухлини, внутрішньочеревинно, у черево, інтравентрикулярно, підшкірно, субкон'юнктивально, всередину сечового пухиря, через слизову оболонку, інтраперикардіально, всередину пуповини, інтраорбітально, перорально, місцево, трансдермально, шляхом інгаляції, шляхом ін'єкції, шляхом імплантації, шляхом інфузії, шляхом неперервної інфузії шляхом безпосереднього омивання клітин-мішеней при локалізованій перфузії, за допомогою катетера, шляхом промивання, у кремах або у ліпідних композиціях.
Ефективність лікування очних порушень (наприклад, пов'язаних з комплементом очних порушень), таких як ВМД або СММ, можна вимірювати різними кінцевими критеріями, що звичайно використовують при оцінці внутрішньоочних захворювань. Наприклад, можна оцінювати втрату зору. Втрату зору можна оцінювати будь-яким способом, відомим у цій галузі техніки та/"або описаним у цьому документі, включаючи, але обмежуючись ними, наприклад, вимірювання за середньою величиною зміни кращої корекції гостроти зору (ВСМА) від вихідного рівня у потрібний момент часу (наприклад, коли ВСМА заснована на таблиці гостроти зору оцінки при відстані тестування 4 метри у дослідженні діабетичної ретинопатії при своєчасному лікуванні (ЕТОК5)), вимірювання пропорції суб'єктів, які втрачають гостроту зору менше 15 бо літер у потрібний момент часу, у порівнянні з вихідним рівнем, вимірювання пропорції суб'єктів,
які набувають гостроту зору, що рівна або перевищує 15 літер у потрібний момент часу, у порівнянні з вихідним рівнем, вимірювання пропорції суб'єктів з еквівалентом гостроти зору за таблицею Снелена 20/2000 або гірше у потрібний момент часу, вимірювання функціонування зору за опитувальником МЕЇ, вимірювання розміру СММ та величини підтікання при СММ у потрібний момент часу, наприклад, флуоресцентною ангіографією тощо. Оцінювання характеристик очей можна виконувати способами, наприклад, які включають виконання огляду очей, вимірювання внутрішньоочного тиску, оцінку гостроти зору, вимірюванні тиску у світлі щілинної лампи, оцінку внутрішньоочного запалення тощо, але не обмежуються ними.
Для попередження або лікування захворювання відповідне дозування антитіла за цим винаходом (що використовується самостійно або у комбінації з одним або більше іншими додатковими терапевтичними засобами) буде залежати від типу захворювання, яке підлягає лікуванню, типу антитіла, важкості та протікання захворювання, того чи вводиться антитіло з попереджуючою або терапевтичною метою, попередньої терапії, історії хвороби пацієнта та реакції на антитіло, та припису лікуючого лікаря. Антитіло підходить для введення пацієнту одноразово або у кілька прийомів. У залежності від типу та важкості захворювання, антитіло можна застосовувати для введення пацієнту у початковому передбачуваному дозуванні від близько 1 мкг/кг до 15 мг/кг (наприклад, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,8 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, З мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, б мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг або 10 мг/кг) або, наприклад, за допомогою одного або більше роздільних введень або шляхом безперервної інфузії. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло застосовують у дозі від близько 0,01 мг/кг до близько 45 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 40 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 35 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 30 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 25 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 20 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 15 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 10 мг/кг, близько 0,01 мг/кг до близько 5 мг/кг або близько 0,01 мг/кг до близько 1 мг/кг.
Одна типова добова доза може знаходитися у діапазоні від близько 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше в залежності від вищезгаданих факторів. При повторних введеннях протягом кількох днів або довше, в залежності від стану, лікування звичайно слід продовжувати до бажаного пригнічення симптомів захворювання.
У деяких випадках вводять фіксовану дозу антитіла проти НігАї за цим винаходом, наприклад, до ока. У деяких випадках в око вводять від близько 0,1 мг до близько 10 мг або близько 5-15 мг антитіла проти НІГА1 за цим винаходом, наприклад, від близько 0,1 мг/око до близько 0,5 мг/око, від близько 0,5 мг/око до близько 1 мг/око, від близько 1 мг/око до близько 1,5 мг/око, від близько 1,5 мг/око до близько 2 мг/око, від близько 2 мг/око до близько 2,5 мг/око, від близько 2,5 мг/око до близько З мг/око, від близько З мг/око до близько 3,5 мг/око, від близько 3,5 мг/око до близько 4 мг/око, від близько 4 мг/око до близько 4,5 мг/око, від близько 4,5 мг/око до близько 5 мг/око, від близько 5 мг/око до близько 5,5 мг/око, від близько 5,5 мг/око до близько б мг/око, від близько б мг/око до близько 6,5 мг/око, від близько 6,5 мг/око до близько 7 мг/око, від близько 7 мг/око до близько 7,5 мг/око, від близько 7,5 мг/око до близько 8 мг/око, від близько 8 мг/око до близько 8,5 мг/око, від близько 8,5 мг/око до близько 9 мг/око, від близько 9 мг/око до близько 9,5 мг/око або від близько 9,5 мг/око до близько 10 мг/око. У деяких випадках антитіло застосовують у дозі від близько 0,1 мг/око до близько 2 мг/око, від близько 01 мг/око до близько З мг/око, від близько 0,1 мг/око до близько 5 мг/око, від близько 0,1 мг/око до близько б мг/око, від близько 0,1 мг/око до близько 7 мг/око, від близько 0,1 мг/око до близько 8 мг/око, від близько 0,1 мг/око до близько 9 мг/око, від близько 0,1 мг/око до близько 10 мг/око, від близько 0,5 мг/око до близько 2 мг/око, від близько 0,5 мг/око до близько З мг/око, від близько 1 мг/око до близько З мг/око або від близько 2 мг/око до близько 5 мг/око. У деяких випадках застосовують фіксовану дозу антитіла проти НІігГАТ1, що складає близько 0,5 мг/око, близько 1 мг/око, близько 1,5 мг/око, близько 2 мг/око, близько 2,5 мг/око, близько З мг/око, близько 3,5 мг/око, близько 4 мг/око, близько 4,5 мг/око, близько 5 мг/око, близько 5,5 мг/око,
БО близько 6 мг/око, близько 6,5 мг/око, близько 7 мг/око, близько 7,5 мг/око, близько 8 мг/око, близько 8,5 мг/око, близько 9 мг/око, близько 9,5 мг/око, близько 10 мг/око або більше. У конкретному випадку, наприклад, вводять фіксовану дозу антитіла проти НІГА1 близько 2 мг/око.
У деяких варіантах реалізації винаходу дозу можна вводити один раз на тиждень, один раз кожні два тижні, один раз кожні три тижні, один раз кожні чотири тижні, один раз кожні п'ять тижнів, один раз кожні шість тижнів, один раз кожні сім тижнів, один раз кожні вісім тижнів, один раз кожні дев'ять тижнів, один раз кожні десять тижнів, один раз кожні одинадцять тижнів або один раз кожні дванадцять тижнів.
Антагоніст зв'язування НІгГА1 (наприклад, антитіло проти НігГА! за цим винаходом) можна вводити самостійно або у комбінації з щонайменше другою терапевтичною сполукою. Введення бо антагоніста зв'язування НІГА1 (наприклад, антитіла проти НІГА1 за цим винаходом) та будь-якої другої терапевтичної сполуки можна виконувати одночасно, наприклад, у вигляді єдиної композиції або у вигляді двох або більше композицій, що відрізняються, використовуючи однаковий або різні шляхи введення. В альтернативному варіанті або додатково введення можна виконувати послідовно у будь-якому порядку. У деяких варіантах реалізації винаходу між введеннями двох або більше композицій можуть бути інтервали від хвилин до діб, від тижнів до місяців. Наприклад, антагоніст зв'язування НігАї (наприклад, антитіло проти НігАї за цим винаходом) можна вводити першим, з наступним введенням другої терапевтичної сполуки. Тим не менше, також передбачають одночасне введення або введення другої терапевтичної сполуки перед антагоністом зв'язування НігАї (наприклад, антитілом проти НігАї за цим винаходом). В одному прикладі антагоніст зв'язування НІгГАТ! являє собою антитіло проти НІГАТ, наприклад, будь-яке антитіло проти НІГАТ, описане у цьому документі або відоме у цій галузі техніки. В одному прикладі друга терапевтична сполука являє собою антагоніст зв'язування фактора 0. У додатковому прикладі антагоніст зв'язування фактора Ю являє собою антитіло проти фактора 0, наприклад, будь-яке антитіло проти фактора 0, описане у цьому документі або відоме у цій галузі техніки. У конкретних варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора О являє собою лампалізумаб. У додаткових варіантах реалізації винаходу антитіло проти фактора О вводять у дозі 1-15 мг, наприклад, у дозі 10 мг. У конкретних варіантах реалізації винаходу лампалізумаб вводять один раз кожні дві тижні, один раз кожні три тижні або один раз кожні чотири тижні. У деяких варіантах реалізації винаходу додатковий терапевтичний засіб придатний для лікування хвороби ока, пов'язаної з небажаною неоваскуляризацією ока, такою, наприклад, як волога ВМД. Прийнятні терапевтичні засоби включають, наприклад, антиангіогенні терапевтичні засоби, такі як антагоністи МЕСЕ (наприклад, антитіла проти МЕСЕ та фрагменти антитіл, включаючи ГОСЕМТІЗФ (ранібізумаб), та антитіл проти МЕСЕКІ1 та споріднені молекули (наприклад, афліберцепт (МЕСЕ Тгар-Еує;
ЕМ ЕАФ))); інгібітори системи комплементу, такі як антагоністи фактора С2 комплементу (включаючи, наприклад, антитіла проти СЕС2); та протизапальні засоби, такі як антагоністи зв'язування 1-6 (наприклад, тоцилізумаб (АСТЕМКАФ) та ЕВІ-031 (ЕІемеп Віоїпегарешісв)). В інших варіантах реалізації винаходу для лікування захворювання або порушення, пов'язаного з небажаною неоваскуляризацією ока, можна задіяти комбінацію антитіла проти НігАї та
Зо фотодинамічну терапію (наприклад, за допомогою МАСОСЕМ М або МІЗОЮОМУМЕ М),
Такі варіанти комбінованої терапії, відмічені вище, включають спільне введення (де два або більше терапевтичних засобів міститися в одній і тій же або окремих рецептурах), а також роздільне введення, й у цьому випадку введення антитіла за цим винаходом може походити до, одночасно та/або після введення додаткового терапевтичного засобу або засобів. В одному варіанті реалізації винаходу введення антагоніста зв'язування НІГА1 (наприклад, антитіла проти
НІГАТ) та введення додаткового терапевтичного засобу здійснюється з інтервалом близько одного місяця або близько одного, двох або трьох тижнів, або близько однієї, двох, трьох, чотирьох, п'яти або шести діб між введеннями.
Слід розуміти, що будь-які з вказаних вище рецептур або терапевтичних способів можна здійснювати з використанням імунокон'югату за цим винаходом замість антитіла проти НігА1 або як доповнення до нього.
У. Вироби
В іншому аспекті винаходу запропонований виріб, що містить матеріали, що використовуються для лікування, попередження та/або діагностики описаних вище порушень.
Виріб містить контейнер та зв'язану з контейнером етикетку або етикетку, що знаходиться на ньому, або вкладиш до упаковки. Підходящі контейнери включають, наприклад, бутилі, флакони, шприци, пакети з розчинами для в/в введення тощо. Контейнери можна виробляти з різних матеріалів, таких як скло або пластик. У контейнері міститься композиція, яка сама по собі або у поєднанні з іншою композицією є ефективною для лікування, попередження та/або діагностики патологічного стану, та може мати стерильний отвір доступу (наприклад, контейнер може представляти собою пакет або флакон з розчином для внутрішньовенного введення, який має пробку, виконану з можливістю проколювання голкою для підшкірних ін'єкцій). Щонайменше один активний агент у композиції являє собою антитіло за цим винаходом. На етикетці або на листку-вкладиші до упаковки вказано, що композицію застосовують для лікування переважного патологічного стану. Крім того, виріб може містити (а) перший контейнер з композицією, що міститься у ньому, причому композиція містить антитіло за цим винаходом; та (Б) другий контейнер з композицією, що міститься у ньому, причому композиція включає додатковий цитотоксичний або інший терапевтичний засіб. Виріб у цьому варіанті реалізації винаходу може додатково містити вкладиш до упаковки, у якому вказано, що композиції можна застосовувати бо для лікування конкретного патологічного стану. В альтернативному варіанті або додатково виріб може додатково містити другий (або третій) контейнер, що містить фармацевтично прийнятний буфер, такий як бактеріостатична вода для ін'єкцій (ВМ/РІ), фосфатно-сольовий буферний розчин, розчин Рінгера та розчин декстрози. Виріб може включати у себе інші матеріали, потрібні з комерційної та споживацької точки зору, у тому числі інші буфери, разбавлювачі, фільтри, голки та шприци.
І. ПРИКЛАДИ
Нижче наведені приклади способів та композицій за цим винаходом. Слід розуміти, що враховуючи наведений вище загальний опис, можна здійснювати різні інші варіанти реалізації цього винаходу.
Розробка стабільних антитіл з високою активністю та високою афінністю, які зв'язують НігА1
Метою наступних експериментів було виявлення нових антитіл проти НІГАТ, що мають більш високу активність та більш високу афінність щодо НІГА1.
Спочатку отримували мишей з нокаутом за тнНігАї. Була необхідність використання нокаутних мишей, оскільки не були успішними початкові зусилля зі створення гібридом з мишей, що експресують НігАї, ймовірно через те, що мишачі та людські білки НігГАї мають 98 95 ідентичність послідовностей.
Далі нокаутних за НігАї мишей імунізували протеазним доменом тнНігАї1. Отримані гібридоми піддавали скринінгу методом ІФА та ідентифікували 75 позитивних за ІФА клонів. На здатність інгібувати розщеплення субстрату протеази НігА! досліджували 75 клонів. Показано, що 10 з 75 клонів інгібують протеазну активність НІГА1.
Для подальшого аналізу відбирали сім з цих клонів за їх здатністю інгібувати протеазну активність, за зв'язуванням людського та мишачого НігАї та за селективним зв'язуванням тиНІігА1 у порівнянні з тинігАЗ та тинНнігА4. Ці сім клонів піддавали додатковому скринінгу та виявлено чотири з них, що мали покращену активність по відношенню до НІгА!1 у порівнянні з контрольним антитілом УУУ505.94. На основі їх переважного молекулярного профілю, який включає активність та селективність, для подальшої розробки відбирали двоє з цих антитіл, 15Нб та 9812.
Гіперваріабельні залишки відібраних антитіл прививали на каркасну ділянку людини, як відмічено нижче. Важливість залишків зони Мегпіег легсого ланцюга миші досліджували для
Зо 15Н6 окремими перестановками цих залишків та дослідженням зв'язування з НігАї людини та миші. Одна заміна порушувала зв'язування, дві -- знижували зв'язування, дві -- впливали лише на зв'язування з мишачим НігАт, а три -- не створювали значимого впливу на зв'язування. Ці три заміни вводили в антитіло 15Н6.м1 для отримання антитіла 15Н6 .м2.
Потім 15Н6.м2 конструювали таким чином, щоб покращити його стабільність. Визначали потенційно нестабільні залишки, які могли призводити до окиснення (М/91 на НМК-І 3), усічення (М94 РОБ на НМК-1І С) та дезамідування (055 556 на НМК-Н2). Заміни УМ91 суттєво впливали на зв'язування. Досліджували чотири заміни у положенні МУ4. Дві з цих замін впливали на зв'язування, а дві відбирали для додаткового аналізу. Досліджували чотири заміни у положенні 055. Лише одна з цих замін показала порівняне зв'язування з вихідною молекулою.
Наступним етапом було покращення афінності зв'язування п15Нб.м2 з НІГАТ. На першому етапі для вивчення взаємозв'язку структура/функції щодо п15Н6.м2 застосовували глибоке секвенування. З багатьох окремих досліджених у цьому експерименті мутацій, знайдено приблизно 19 окремих мутацій, що покращують афінність щодо НігАї. Розробляли та досліджували антитіла, що містять комбінації мутацій І С та НС із самою повільною швидкістю дисоціації, що призвело до визначення варіантів антитіл, що мають покращену активність та афінність щодо НІігА1. Для введення стабілізуючих замін, описаних вище, конструювали також варіанти, що мають найкращу афінність та активність. З отриманих варіантів виявлено, що
П15Нб.м4 має найвищу активність проти НІГА1.
Рентгенівською кристалографією та електронною мікроскопією визначали структуру п15Нб.м4 у формі Раб, зв'язаного з НігА1. Цей структурний аналіз виявив, що Бар п15Нб.м4 зв'язується поблизу "ІА-петлі" білка НігАТ. Зв'язаний П15Нб.м4 епітоп відрізняється від зв'язаного контрольним антитілом УУУ505.94. Хоча не передбачається, що цей винахід прив'язаний до якого-небудь конкретного механізму, можливо, що близька взаємодія між пП15Н6.м4 та ГА-петлею НігАї пояснює значне покращення афінності та активності цього антитіла у порівнянні з УУУ505.94.
Описані вище експерименти більше детально обговорюються нижче.
Приклад 1. Створення антитіл проти НІГА1 з використанням підходів з отриманням гібридом
А. Середовища та антитіла
Середовище В СІ ОМАСЕГ І тм-Ну(Мо 03802 за кат.) середовище С (Мо 03803 за кат.),, бо середовище ЮО (Ме 03804 за кат.) та середовище Е (Ме 03805 за кат.) отримані від компанії езіетсСеїІ! Тесппоіодіеє. Середовище С, що застосовується для електрофокусування
СУТОРИОБВІОМФО (Мо | СМ-С за кат.), отримане від Су Риїзе 5сіепсе5. Мічений алофікоціаніном (АРС) Р(аб")» козла проти Ід миші отримували від бЗошійпегпВіоїеспй (Мо 1012-11 за кат., кон'юговане з пероксидазою хріну (НКР) антитіло козла проти Ес дб миші -- від 5ідта.
Однокомпронентний субстрат НКР ТМВ (3,3",5,5'-тетраметилбензидин) (Мо ТМВУМ-1000-01 за кат.) та стоп-реактив ТМВ (Ме ВБТР-1000-01 за кат.) отримували від Віогх І арогацогієв.
В. Імунізація мишей іп мімо
П'ять НІГА1-нокаутних мишей (НІГА1.попео.ВАГВ.Ко.С1-3) імунізували очищеним протеазним доменом Нів-міченої рекомбінантної мишачої НігАт (називається у цьому документі тинігА1-
РО-Ніх, 5ЕО ІО МО: 153; див. приклад 2 УМО 2013/055998), суспендованим у ад'юванті монофосфорилліпіду А/дикоріноміколату трегалози шляхом ін'єкції у подушечку стопи (2 мкг/ін'єкцію для однієї миші) з інтервалами від З до 4 діб з усього 12 стимулюючими ін'єкціями, після 2 попередніх спільних стимуляцій антигеном у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ). Через три дні після останньої стимуляції збирали та виділяли лімфоцити з селезінок та лімфовузлів імунізованих мишей. Для ін'єкції готували очисткою тинНігА1-РО-Ніз, як описано у прикладі 2
МО 2013/055998. б. Злиття клітин, скринінг гібридом та субклонування
Виділені клітини селезінки миші з двох мишей (під номерами 748 та 749) зливали з мієломними клітинами 5Р2/0 (Американська колекція типових культур), використовуючи прилад
Су Риїзєе СЕБЕР-50 (Сую Риїзе Зсіепсе5). Коротко, після дворазового промивання середовищем С СУТОРИБІОМЕ змішували виділені клітини селезінки та клітини ЗР2/О у співвідношенні 1:1, а потім ресуспендували у середовищі С СУТОРИОБІОМО у концентрації 10 мільйонів клітин/мл. Виконували електрозлиття у відповідності з керівництвом виробника. Злиті клітини культивували у середовищі С СГОМАСЕЇ тмМ-НУ протягом ночі при 37 "С в інкубаторі з 7 У СО». На наступний день центрифугували злиті клітини, а потім ресуспендували їх у 10 мл середовища С СІГОМАСЕГЇ пМ-НУ та потом обережно змішували з 90 мл середовища Ю
СГОМАСЕЇ ЇЇ М-НУ на основі метилцелюлози, що містить селективні реактиви гіпоксантин, аміноптерин та тимідин (ГАТ). Висаджували клітини на чашки Петрі 40 х 100 мм (Ме 351029 за кат., Весіоп ОісКіпзоп) та давали можливість рости при 37 "С в інкубаторі з 7 96 СО». Через 10 діб інкубації збирали 1429 окремих клонів гібридом, використовуючи систему СІ ОМЕРІХ М (Сепеїїх, Великобританія) та переносили до 15 х 96-лункових культуральних планшетів (Мо 353075, Весіоп ОісКіп5оп) з 200 мкл/лунку середовища Е СІГОМАСЕГ І пМ-НУ. Замінювали культуральне середовище гібридом та через З доби супернатанти гібридом піддавали скринінгу твердофазним імуноферментним аналізом (ІФА) для визначення зв'язування з тинігА1-РО-НІів.
Виконували ІФА у відповідності зі стандартним протоколом. Коротко, покривали 96-лункові планшети для мікротитрування ІФА (Огеїпег, Німеччина) 100 мкл/лунку тиНігА1-РО-Нібх або пинНігА1-РО-НІіх (ЗЕО ІО МО: 154) у 2 мкг/мл в 0,05 М карбонатному буфері (рН 9,6) при 4"С протягом ночі. Після триразового промивання промивальним буфером (0,05 95 ТМ/ЕЕМФ 20 в
ФСБ, Зідта) планшети блокували 100 мкл розбавлювача для аналізу ІФА з БСА (бичачим сироватковим альбуміном). Додавали 100 мкл культивованих супернатантів або розбавлених очищених моноклональних антитіл (тАбБ) та інкубували протягом 1 год. при кімнатній температурі. Промивали планшети три рази та інкубували з кон'югованим з НЕР Ес козла проти
Ідб миші протягом 1 год. Після триразового промивання виявляли зв'язаний фермент додаванням 100 мкл/лунку субстрату ТМВ (ВіоЕхХ І арогайогіє5) з витримуванням 5 хв. Реакції зупиняли додаванням 100 мкл/лунку стоп-реактиву (ВіобХ І арогафогіе5) з наступним виявленням забарвлення при поглинанні 650 нм (Авзо нм). Виявляли 105 вихідних ІФА- позитивних супернатантів. Після розмноження та культивування протягом З діб, ці клони повторно піддавали скринінгу у наступному ІФА, який підтвердив, що 75 з 105 клонів все ще були ІФА-позитивними за зв'язуванням з тинігА1-РО-Нів (Фіг. ТА та 18). Більшість з цих 75 клонів також зв'язувалася з протеазним доменом НігА1 людини (Фіг. ТА та 18).
Далі ці 75 ІФА-позитивних клонів досліджували з використанням аналізу іп міо для оцінки здатності супернатанту гібридоми інгібувати розщеплення субстрату протеазним доменом НІГА1 людини (пПинНігАТ-РО-Ніз; 5ЕБЕО ІЮ МО: 154). Застосовували протеазний аналіз ЕМАСНЕКОФ із зеленою флуоресценцією (ТпептоРієпег Зсіепійс). У цьому аналізі як субстрат використовується похідне казеїну, яке інтенсивно мічене нечутливим до рН зеленим флуоресцентним барвником ВОБІРМФ БІ. Флуоресценція барвника ВОБІРМФ РІ. внутрішньомолекулярно гаситься повнорозмірним міченим субстратом. Розщеплення субстрату під дією пиНігА1-РО вивільняє флуоресцентні мічені ВОБІРЖФ РІ пептиди, призводячи до збільшення флуоресцентного сигналу (Фіг. 2А). Коротко, інкубували супернатант гібридоми та бо НігАт1-РО (20 нМ пНІігА1-РБО; 40 мкл пНІгГА1-РО з 60 мкл супернатанту) у буфері (50 мМ Трис, 200
ММ масі, 0,25 95 СНАР5, рн 8,0) у кінцевому об'ємі 200 мкл протягом 20 хв при 37 "С. Додавали мкг/мл міченого ВОБІРЖУФ РІ. субстрату та протягом 20 хв зчитували флуоресценцію (відносні тисячні одиниці флуоресценції мВФоО/хв. Використовуючи цей аналіз блокування виявлено, що з 75 клонів інгібують опосередковане НіІгГА1-РО розщеплення субстрату (Фіг. 28 та 230). На 5 Фіг. ЗА та ЗВ показано порівняння здатності субпопуляції клонів інгібувати активність тинігА1-
РО у порівнянні з пинНігА1-РО.
Через щонайменше 2 раунди субклонування окремих клітин методом граничного розведення масштабували 7 клонів з різними характеристиками (20Е2, 19812, 12А5, ЗА5, 15Н6, 15ЕЗ та 190510) та збирали супернатанти для очистки антитіла та додаткової очистки. 10 Відбирали ці клони, зокрема, на основі здатності інгібувати активність НігАї іп мійго та зв'язування з тинігАЗ (19812). Ці 7 клонів також досліджували на здатність виявляти ІтиНІгА1 у імуногістохімічному аналізі, а також здатність зв'язувати мишачий НігАЗ-РО та мишачий НігА4-
РО (за оцінкою ІФА). У таблиці 2 показана коротка інформація про кількісні властивості цих 7 клонів.
Таблиця 2
Властивості 7 кінцевих клонів, відібраних при очистці антитіл
Блокує
Зв'язує Зв'язує | розщеплення ІГХ- Зв'язує Зв'язує
Клон ІзоТИП тингАТ- | пинігА1- субстрату позитивний | тинНікАЗ-| тинтгА4-
РО РО Пи/тиНігА1- тинігА РО РО
РО
Наступним етапом було визначення здатності семи відібраних вище антитіл інгібувати опосередковане НІГА1 розщеплення при вимірюванні в аналізі ЕКЕТ.
Очищали супернатанти гібридом методом афінної хроматографії на білку А, з наступною стерильною фільтрацією (розмір пор 0,2 мкм, Маїде Мипс Іпгегпайопаї, штат Нью-Йорк, США) та зберігали їх при 4 "С у ФСБ. Очищені моноклональні антитіла підтверджували методами ІФА та
ЕАС5 перед додатковим дослідженням у функціональних аналізах. Визначали ізотипи очищених тАр набором для ізотипування моноклональних антитіл миші ІЗО5ТКІР мМ (Коспе
Біадпозіїсв Согрогаїййоп).
Досліджували очищенні антитіла на здатність інгібувати активність НігАї в аналізі блокування на основі ЕКЕТ (наприклад, аналіз Н2-Орі). У цьому аналізі визначали здатність антитіла інгібувати розщеплення субстрату методом резонансного перенесення енергії флуоресценції (ЕКЕТ, також називається ферстеровським резонансним переносом енергії).
ЕВЕТ-пептидний субстрат Н2-Орі, який має молекулярну масу 1600 Да, містить донор Мса (7-
Зо метоксикумарин-4-іл-ацетил) та акцептор (гаситель) Опр (М-2,4-динітрофеніл). Повнорозмірна послідовність ЕКЕТ-пептидного субстрату являє собою (МсаївКУзУЗЕ(Юпркк (ЗО ІО МО: 152). У інтактного пептидного субстрату фрагмент гасіння Опр гасить флуоресценцію донора
Мса. Протеолітичне розщеплення ЕРКЕТ-пептидного субстрату розділяє флуорофор та гаситель, тим самим вивільняючи флуоресценцію Мса від гасіння та призводячи до збільшення флуоресцентного сигналу (Фіг. 4А). Цей аналіз виконували, використовуючи умови аналізу Н2-
Орі, описані нижче у прикладі З, розділу БЕ. Залежне від часу збільшення інтенсивності флуоресценції пов'язане зі ступенем гідролізу субстрату. Досліджували антитіла у концентраціях 5 НМ, 50 нМ або 500 нМ. П'ятеро з очищених антитіл проти НІГАТ (15Н6, 19812,
ЗА5, 12А5 та 20Е2) зберігають здатність блокувати опосередковане мишачим та людським
НігА1-РО розщеплення субстрату (Фіг. 4В та 4С).
Далі досліджували здатність очищених антитіл інгібувати опосередковане повнорозмірною
НІГАТ розщеплення субстрату. Застосовували аналіз блокування на основі ЕКЕТ, описаний у попередньому параграфі, використовуючи повнорозмірну (Б) тиНігА1 або пиНІігАтТ. Очищували тинНіАТ-РС та пинНігАТ-РЇ як описано у прикладі 2 УМО 2013/055998. Очищені антитіла, включаючи 15Нб та 19812, інгібували активність пинігА1-РГ. (Фіг. 5БА-58) та тиНігА1-РІ. (Фіг. 5С- 50). У цьому аналізі клон 15Н6 інгібував пиНнігА1-РЇ. зі значенням ІС5О рівним 0,7 нМ, яке приблизно у два рази краще у порівнянні зі значенням ІС50 антитіла позитивного контролю
УМ505.94. 15Н6, що інгібував тинНігА1-РЇ. з ІС50 рівним 1,1 нМ, яке майже у 5 разів краще у порівнянні з антитілом УУУ505.94 позитивного контролю. Клон 19812 інгібував пинігА1-РЇ. з ІС5О рівним 1,4 нМ та інгібував тиНігА1-РЇ з ІС5О рівним 1,0 нМ. Відібрані антитіла піддавали секвенуванню, як описано нижче у розділі Ю. Послідовності цих п'яти антитіл зображені на Фіг. бА та Фіг. 6В. На основі їх переважного молекулярного профілю, який включає активність та селективність, для подальшої розробки відбирали двоє антитіл, 15Нб та 19812.
Переформатування цих антитіл описано нижче у розділі Е. р. Секвенування антитіл з клонів гібридом і. Клонування послідовностей генів варіабельних ділянок з клітин гібридом з використанням 5'-швидкої ампліфікації кінців КДНК (5-КАСЕ) у 96-лунковому форматі
Для кожного клону гібридоми з планшетів для культивування тканин переносили близько 25 мкл клітин, що росли у лог-фазі (0,5-1,0 х 105 клітин/мл), до лунок 96-лункового планшета з О- подібним дном. Потім перед центрифугуванням при 1000 об/хв протягом 5 хвилин додавали 150 мкл холодного їх ФСБ для промивання клітин. Видаляли супернатант та осад клітин ресуспендували у 25 мкл холодного їх ФСБ. і. Полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією (ОТ-ПЛР)
У пробірці Еррепадогі готували суміш мастер-мікс з наступних інгредієнтів (на 50 лунок): 2,5 мкл ЕМАБЗЕОШТТМ (Іпмйгодеп Мо 10777019), 12,5 мкл 10х буферу для синтезу (5х буфер
ЗИРЕКЗСРІРТФ)), 12,5 мкл дитіотреїтолу (ДТТ) (0,1 М Іпийгодеп Мо Р/ММ00147), 6,25 мкл дНТФ (10 мМ Іпмйгодеп Ме 18427-013), 12,5 мкл 2,5 96 нонілфеноксиполіетоксіетанолу (МР-40), 6,25 мкл бичачого сироваткового альбуміну (БСА) з концентрацією 2 мг/мл (Віої арх Мо 90015), 25 мкл праймера КАСЕЯтинс (1:100 у воді для ПЛР) (для секвенування легкого ланцюга (І С) замінювали на праймер Касе З капа), 37,5 мкл води для ПЛР та 10 мкл ферменту
ЗПРЕКЗСКІРТО З (Іпмігодеп Мо 18080-093). Нуклеотидна послідовність виродженого праймера
Касе4тинс являє собою ТТ МТ ТС САС СКТ ОСТ ОСТ ОС (5ЕО ІЮО МО: 139), де У кодує С
Ко) або Т, а К кодирує С або Т. Нуклеотидна послідовність Касе З капа являє собою СТА САА СТ
СТТ САА САА С (5ЕО ІО МО: 140).
Потім до 9б-лункового реакційного планшета для ПЛР переносили 2,5 мкл/лунку мастер- міксу. До планшета додавали 1 мкл клітин/лунку та його короткочасно центрифугували протягом секунд, а потім планшет струшували. Планшет поміщали до ампліфікатора для ПЛР та задавали програму на 30 хв при 45 "С з наступною витримкою протягом 30 хвилин при 50 "С.
Цей планшет позначали як планшет А. ії. Реакція добудовування
Готували 10х маточний буфер для добудовування з наступними інгредієнтами (на 50 лунок): 5 мкл 1 М Мосіг, 5 мклО,1 М ДТТ, 5 мкл 1 М Трис рн 7,5, 10 мкл з 100 мм д/ТФ та 25 мкл води для ПЛР.
Готували робочий розчин з наступними інгредієнтами (на 50 лунок): 50 мкл 10х маточного буферу для добудовування, 312,5 мкл води для ПЛР та 12,5 мкл кінцевої дезоксинуклеотидилтрансферази (тат) з активністю 300 одиниць (Рготеда Мо М828А/С).
Потім до реакційного ПЛР планшета А додавали робочий розчин у кількості 7,5 мкл/лунку.
Потом планшет А поміщали до ампліфікатора для ПЛР на 1 год. при 37 "С з наступною витримкою протягом 5 хвилин при 65"С. Цей планшет позначали як планшет А/В для розрізнення проведення добудовування на цьому планшеті. їм. Перша реакція ПЛР
Отримували мастер-мікс, що складається з наступних інгредієнтів (для 50 лунок) у пробірці
Еаїсоп на 15 мл: 1050 мкл води для ПЛР, 500 мкл 5х реакційного буферу для ПЛР ОС кДНК, 500 мкл реактиву для плавлення С (Сіопіесп Мо 51091), 50 мкл прямого праймера ОС5ап, 50 мкл
Касе7тинс (для С -- праймер Касе 2 капа), 50 мкл дНТФ (10 мм) та 50 мкл полімерази С
АОМАМТАСЕФ (Сіопіеспй Мо 51088). Нуклеотидна послідовність виродженого праймера
Касе7тиНс являє собою САН ТС АМО ТС АСТ СКС ТСА б (ЗЕО ІЮ МО: 141), де К кодує або А або б, М кодує або А або С, а О кодує або с або А або Т. Нуклеотидна послідовність праймера Касе 2 капа являє собою САС ОСА ССТ ССА САТ ОТТ ААС (5ЕО І МО: 142).
Потім до лунки нового реакційного планшета для ПЛР переносили 45 мкл цього мастер- міксу та потім додавали 1 мкл матриці з планшета А/В. Потім цей планшет поміщали до ампліфікатора для ПЛР та виконували аналіз за методом ПЛР Тоиспдожм/п зі зменшенням бо температур відпалювання, як вказано нижче. Цей планшет позначали як планшет с.
Метод ПЛР Тоиспаом/п: 96 "С протягом 4 хв
З цикли з (96 "С протягом 45 с, 64 "С протягом 30 с, 68 "С протягом 90 сі, З цикли з (96 "С протягом 45 с, 61 "С протягом 30 с, 68" С протягом 90 сі, З цикли з (96 "С протягом 45 с, 5870 протягом 30 с, 68 "С протягом 90 сі, З цикли з 196 "С протягом 45 с, 57 "С протягом 30 с, 6870 протягом 90 сі, З цикли з 196 "С протягом 45 с, 55 "С протягом 30 с, 68 "С протягом 90 сі 25 циклів з (96 "С протягом 45 с, 52 "С протягом 30 с, 68 "С протягом 90 с 68 "С протягом 5 хв, з наступною кінцевою витримкою при 4 "С.
Після цього З мкл продукту ПЛР аналізували на гелі Е-СЕЇ Ф з 2 95 бромідом етидію (ЕїЇВг) та відмічали смуги. По 10 мкл/лунку додавали лужну фосфатазу Ехої/креветки (5АР) та поміщали до ампліфікатора для ПЛР на 45 хв при 37 "С з наступною витримкою 15 хв при 85 "С. Готували мастер-мікс Ехої/5ЗАР для 50 лунок: 2,5 мкл екзонуклеази | з активністю 20 одиниць/мкл (Геппепіах Мо ЕМО582), 25 мкл БАР (БВ Мо 70092), 472,5 мкл води для ПЛР. Готували розведення продукту ПЛР у воді 1:4. Для секвенування важкого ланцюга (НС) застосовували праймер Касе/тинНсС, а для секвенування ЇС застосовували праймер Касе7.Тти! с.
Нуклеотидна послідовність праймера Касе7.1ти! С являє собою АСТ ОСТ САС То АТО СТО асаА Ас (ЗЕО ІО МО: 143). м. Визначення характеристик гель-фильтрацією та мас-спектрометрією
Для проведення аналізу гель-фильтрацією до колонки Т2К-СЕЦФ Зирег 5МУЗОО00О (внутрішній діаметр 4,6 мм х 30 см, ТО5ОН Віозсієпсе) інжектували 10 мл очищеного зразка при 0,35 мл/хв, використовуючи як рухому фазу 200 мМ КгРО», 250 мМ КСІ, рН 7,0. При 37 "С протягом 20 хв за допомогою 50 мМ дитіотреїтолу відновлювали приблизно 2 мг очищеного Ідс та після розділення на оберненій фазі у режимі реального часу з використанням колонки РІ КР-5 (Адіїеп) та градієнту ацетонітрилу аналізували часопролітною (ЧП) мас-спектрометрією (Адіїепі
ЖХ/МС 6224). Визначали значення інтактних мас за максимальною ентропійною деконволюцією зібраних спектрів Іп/7, використовуючи програмне забезпечення Ма55Нипіег Оцчаїнайме Апаїувзіб (Адіїепі). мі. Результати
На Фіг. бА для 19812, 20Е2, ЗА5, 12А5 та 15Н6 зображені послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга (МН). На Фіг. 6В для 19812, 20Е2, ЗА5, 12А5 та 15Н6 зображені послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга (МІ). Ці клони мають унікальні важкий та легкий ланцюги. Дані мас-спектрометрії погоджувалися з даними для послідовностей (див. таблиці З та 4) (див., наприклад, Воз еї аї. Віотеснпо!. Віоепд. 112(9): 1832-1842, 2015).
Таблиця З
Маси НС, визначені мас-спектрометрією 1БНЄ
Таблиця 4
Маси І С, визначені мас-спектрометрією
Е. Переформатування антитіл 15Н6 та 19812 і. Клонування ТОРОФ антитіл 15Н6 та 19812
Клонування ТОРОФ виконували для підтвердження послідовностей варіабельних ділянок клонів антитіл 15Н6 та 19812, отриманих в результаті прямого секвенування продуктів ПЛР 5'-
КАСЕ (описаних вище). Виконували реакцію клонування ТОРОФ ТА як описано в інструкції набора для клонування рек "М4-ТОРОФ ТА для проведення секвенування (Іпийгодеп К457 5-02).
Коротко, у пробірці об'єднували 2 мкл продукту ПЛР, 2 мкл води, 1 мкл вектора рек "М4-ТОРОФ та 1 мкл прикладеного сольового розчину, змішували та інкубували протягом 5 хв при кімнатній температурі. Потім реакцію поміщали на лід та додавали 2 мкл цієї реакційної суміші для клонування ТОРОФ у флакон, що відтанув, хімічно компетентних ОМЕ-ЗНОТФ клітин
ЕзсПегісніа соїї ТОРІТО (Іпийтодеп К4575-02) та змішували без піпетування. Реакційну суміш інкубували на льоді протягом 5-30 хв. Потім клітини піддали тепловому шоку протягом 30 з при 42 7С без струшування. Пробірки негайно переносили на лід. Додавали 250 мкл середовища
БОС з кімнатною температурою. Пробірку закривали та струшували горизонтально при 200 об/хв при 37 "С протягом 1 год. Далі з кожної трансформації розподіляли 50 мкл по поверхні чашки з підігрітим агаром ЛБ, що містить 50 мкг/мл карбеніциліну. Чашки інкубували протягом ночі при 37 "С, на наступний день збирали колонії та проводили очищення плазмід. Провіряли послідовності та відбирали конкретні лунки, що містять послідовності МН та МІ. 15Н6, та МН та
МІ 19812, кожна у векторі ТОРОФ, для застосування як векторів для клонування без використання рестрикції. і. Клонування у тідс2а без використання рестрикції
Ампліфікували варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюга у векторах ТОРОФ за допомогою приготування суміші для ПЛР для С наступним чином: 0,5 мкл матриці ДНК (вихідний вектор з мінінабора), 4 мкл прямого праймера для МІ 15Н6, 4 мкл зворотного праймера для МІ 15Н6, 2 мкл з 10 мМ днНтТФ, 20 мкл 5х буфера НЕ, 1 мкл полімерази
РНОБІОМФ (Б-5491, Тпепто Зсіепійіс, 2 Ед/мкл) та 68,5 мкл води. Реакційну суміш для клонування НС готовили таким же чином, за виключенням застосування прямого та зворотного праймера для УН 15Н6. Суміші для ПЛР 19812 готували таким же чином, як суміші для 15Н6, за виключенням застосування праймерів 19812. Послідовності праймерів були наступними:
Нуклеотидна послідовність прямого праймера МІ 15Н6: ОСА АСТ ОСА АСТ О0БА СТА САТ
ТСА САА АТТ СТ СТО ТоС Са Тест СС (5ЕО ІО МО: 144).
Нуклеотидна послідовність зворотного праймера МІ 15Н6: ЗОБА ТАС АСТ То ТОоС дос
АТО ДИС Са ТТ АТ ТТ САС СТ сс (ЗЕО ІЮ МО: 145).
Нуклеотидна послідовність прямого праймера МН 15Н6: СА АСТ ОСА АСТ ОСА СО ТАС асо САс ато САС Ста САС САС ТСтТ са (5ЕО ІЮО МО: 146).
Нуклеотидна послідовність зворотного праймера МН 15Н6: оо ССС То ото вдо ост авда са Са аа АСТ пас ТТ ССТ ТаА ССС (5ЕО ІЮ МО: 147).
Нуклеотидна послідовність прямого праймера МІ. 19812: ОСА АСТ ОСА АСТ ООБА СТА САТ
ТСА ААС АТТ ста ато АСОС САА ТСТ СО (5ЕО ІЮ МО: 148).
Нуклеотидна послідовність зворотного праймера МІ 19812: БА ТАС АСТ тоб Таб да
АТО ДИС Са СТ ТАТ ТТ САа СТ са (5ЕО ІЮ МО: 149).
Нуклеотидна послідовність прямого праймера МН 19812: СА АСТ ОСА АСТ ОСА ССО ТАС асо сАс ата Ада Ста ста пАА ТСТ сода сА ца (5ЕО ІЮ МО: 150).
Нуклеотидна послідовність зворотного праймера МН 19812: 22:02 СОС та ста вла аст вда са Аа ата АСТ або СТ ССТ ТаА ССС (ЗЕО ІО МО: 151).
Умови проведення циклів ПЛР були наступними: 98 "С протягом 30 секунд
35 циклів з 98 "С протягом 15 секунд, 68 "С протягом 30 секунд, 72 "С протягом 35 секунді 7270 протягом 10 хвилин
Як праймери для ампліфікації матриці ДНК використовували ампліфіковані МН та МІ за допомогою приготування суміші для ПЛР наступним чином для І С 15Н6: 1,25 мкл матриці РЕК- векторної ДНК тідсга (розведення з мінінабора 1:10), 0,5 мкл продукту ПЛР МІ 15Н6 (100-200 нг/мкл), 1 мкл 10 мМ днНтФ, 10 мкл буферу НЕ (5х), 1 мкл полімерази РНОБІОМО та 35,75 мкл води. Суміш для ПЛР НС 15Н6б готували таким же чином, за виключенням застосування продукту ПЛР МН 15Н6. Суміші для ПЛР 19812 готували таким же чином, за виключенням застосування продукту ПЛР 19812.
Умови проведення циклів ПЛР були наступними: 98 "С протягом 30 секунд 25 циклів з (98 "С протягом 15 секунд, 68 "С протягом 30 секунд, 72 "С протягом 4 хвилині 7270 протягом 10 хвилин
Потім до нової пробірки переносили 18 мкл реакційної суміші для ПЛР та проводили розщеплення 2 мкл Орпі (Мо КО176Ї, МЕВ 20000 Ед/мл) протягом 2 год. при 37 "С, періодично здійснюючи центрифугування пробірки. Трансформували 30 мкл компетентних клітин
МОМАВІ ШЕ 5ІМОЇ ЕЗ'М (Момадеп, 70181) 1 мкл розщепленого Орпі препарату у відповідності з інструкцією виробника. Коротко, відтаювали клітини та додавали ДНК, клітини інкубували на льоді протягом 5 хв перед тепловим шоком протягом 30 с, поміщали назад на лід протягом 2 хв з наступним додаванням середовища 50С. Висаджували 25 мкл або 50 мкл на планшети, що містять 50 мкг/ мл карбеніциліну та залишали при 37 "С протягом ночі. На наступний день збирали колонії, проводили очистку плазмід за допомогою мінінабору та секвенували плазміди. ії. Очистка антитіл
Проводили автоматизовану очистку супернатантів клітин 293 на системі для роботи з рідинами Тесап Егеедот ЕМОФ 200 з насадкою МСА9У6 на 500 мл. Коротко, захоплювали Ідс, використовуючи колонки-наконечники, спеціально наповнені 20 мл смоли МАВЗЕГЕСТ 5БОКЕ М (СіІудеп Согр., Соїштбіа, Магуїапа 8. СЕ Неайвсаге, м. Пітсобург, штат Пенсильванія, США). Після промивання їх ФСБ з рН 7,4 елюювали дс в 160 мл 50 мМ фосфорної кислоти, рН 3, та нейтралізували за допомогою 12 мл 20х ФСБ з рН 11. Колонки-наконечники МАВЗЕГЕСТ
Зо ЗМИКЕ "М очищали у 0,1 М Маон та регенерували за допомогою їх ФСБ з рН 7,4 для наступного застосування до 15 разів. Аналогічним чином захоплювали ЕРар, використовуючи колонки- наконечники з 20 мл смоли САММАВІМО М РіІцуз (Іудеп Согр 5 ЗЕ Неайсаге), та згодом їх промивали їх ФСБ рн 7,4. Бар елюювали у 190 мл 10 мМ цитрату, рН 2,9, та нейтралізували за допомогою 19 мл 0,4 М Трис з рН 8,7. Колонки-наконечники ЗАММАВІМО м РіІи5 очищали у 6 М гуанідині та регенерували за допомогою їх ФСБ з рН 7,4 для наступного застосування до 15 разів. їм. Рекомбінантні антитіла 15Н6 та 19812 зберігають початкову блокуючу активність
Оцінювали здатність рекомбінантних антитіл 15Н6 та 19812 інгібувати активність пиНнігА1-
ЕМ, використовуючи аналіз блокування ЕРКЕТ, описаний вище у розділі С. Обидва рекомбінантних антитіла зберігали свою початкову блокуючу активність, як визначено за антитілами, отриманими з гібридом (Фіг. 7А та 7В). Для рекомбінантного антитіла 15Н6 значення ІС5О приблизно склало 0,7 нМ, тоді як для рекомбінантного антитіла 19812 значення
ІС50 приблизно склало 1,2 нМ, що відбиває активність отриманих з гібридом антитіл (Фіг. 7А та 7В).
Приклад 2. Гуманізація гібридомних антитіл проти НІГА1 15Н6 та 19812
А. Гуманізація антитіла проти НІігГА1 15Н6
Вирівнювали послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга (МІ) та варіабельної ділянки важкого ланцюга (МН) мишачого антитіла 15Н6б (також називається т15Нб) з консенсусними послідовностями антитіла людини, та встановили, що консенсусний легкий ланцюг капа | людини (пик!) та консенсусний важкий ланцюг підгрупи | людини (пиМНІ1) є найбільш близькими до каркасних ділянок людини Фіг. 8А та 88).
Прививали гіперваріабельні ділянки (НМК) легкого ланцюга та важкого ланцюга т'!5Нб на консенсусні акцепторні каркасні ділянки пикіІ та пиМНІ, відповідно, методом мутагенезу за
Кюнкелем (див., наприклад, Кипкеї еї аіІ., Меїйпод5 Епгутої. 154: 367-382, 1987), використовуючи для отримання клону антитіла п15Нб.м1 окремі олігонуклеотиди для кожної гіперваріабельної ділянки (Фіг. ВА та 88). У цьому процесі прививали положення 24-34 на НМНК-11, 50-56 на НМК-
ІЇ2 та 89-97 на НМК-ІЇ З для МІ т15Нб на консенсусний акцептор Пикі, а положення 26-35 на
НМУВ-НІ, 49-65 на НМК-Н2 та 95-102 на НМК-НЗ для МН т!'!5Нб прививали на консенсусний акцептор пис. У процес гуманізації також включали положення 46, 47 та 49 у каркасній ділянці бо 2 легкого ланцюга (ЕК-12), та положення 67, 69, 71 та 93 у каркасній ділянці З важкого ланцюга
(ЕВ-І3), оскільки Рооїе та М/іпіег проаналізували кристалічні структури комплексу антитіла та антигена і виявили, що ці положення, які є частиною залишків каркаса, діють як зона Мегпіег, що може коректувати структуру НМК та точно підлаштовувати підгонку до антигену (Рооїе 6ї аї., ».
МОЇ. Віої. 224:487-499, 1992) (Фіг. ВА-88). Вимірювали афінність зв'язування т!5Нб та п15Н6.м1 у формі Раб для людського та мишачого НІА!1 аналізом зв'язування поверхневим плазмонним резонансом (ППР) ВІАСОКЕ М, як описано нижче у підрозділі ії розділу С (Фіг. 9А-90).
Результати цього аналізу узагальнені у таблиці 5.
Таблиця 5
Кінетичний аналіз зв'язування т15Нб та п15Н6.м!1 з НІГА1
Для додаткової оцінки важливості мишачих залишків зони Мегпіег в П15Нб.мМ1, це антитіло відображали на фагові, а окремі мишачі залишки Мегпіег (Г.С: РАб, УМ47, 549; НС: Аб7, 1 69, А71 та Т93) для створення варіантів з точковими мутаціями заміняли людськими залишками (Іс:
І 46, 1 47, 49; НС: Мб67, Іб69, К7/1 та А9З). Усі 7 варіантів піддавали ІФА з фаговою конкуренцією проти людської або мишачої НІГА! для визначення афінностей зв'язування (виражених у ІС5О0 фага, див. нижче підрозділ і розділу С). Результати показують, що варіант ГС-РАбІ. повністю порушує зв'язування п15Н6.м1 як з людською, так і мишачою НІГгАт1. Варіант ГС-549У знижував зв'язування з людською та мишачою НігАї майже у 10 разів (Фіг. 10А та 108). Обидва НС- варіанти НС-Аб7М та НОС-Т93ЗА порушували лише зв'язування з мишачою НігАтТ, але не з людською НІГА1 (Фіг. 10А та 108). Інші варіанти, І С-М/471, НО-169І та НС-А71ЕК, не показували певного значимого падіння зв'язування з людською та мишачою НігА!1 (Фіг. 10А та 108). Тому, додатково конструювали клон антитіла п15Н6.м1 додаванням наступних мутацій: І С-М/471, НО-
І 691 та НС-А71К для отримання клону антитіла п15Нб.м2 (див. Фіг. вА та 88).
При аналізі хімічної стабільності клону антитіла пП15Нб.м2 на НМЕК виявили кілька потенційно нестабільних залишків або пар залишків: М/91Ї на НМЕ-І3 (окиснені), МО94 РОБ на НМРЕ-І З (усічення) та 055-556 на НММК-Н2 (ізомеризація). Див., наприклад, приклад 4 нижче. Для подолання окиснення УМ91ї на НМК-ІЇЗ, створювали 2 варіанти (І С-М/91М та І С-М/911) та отримували їх у вигляді баб для проведення аналізу зв'язування ППР ВІАСОКЕ "М. Результати, узагальнені нижче у таблиці 6, показали, що положення І С-У/91 є важливим для афінності зв'язування, а також заміни, що вливали на зв'язування з людською та мишачою НІігАї у
Зо кратності близько 20-50 разів (Фіг. 11А та 118).
Таблиця 6
Кінетичний аналіз зв'язування І С-УМ91 варіантів П15Н6.м2 з НІгГА1
Стосовно усічення у положеннях І С-М94 І С-РО5 на НМК-І 3, створювали чотири варіанти пТ5Нб.м2 (І 0-М94А І С-РО5 (також названі АР), І С-МО4Е І С-РО5 (також названі ЕР), І С-М940
І С-РОУ5 (також названі ОР) та І С-М945 І С-РО5 (також названі 5Р)) та отримували їх у вигляді
Еар для проведення аналізу зв'язування ВІАСОКЕ "мМ, Результати показали, що варіанти АР та
ЕР проявили подібну афінность зв'язування з НігАї людини, а варіанти ОР та 5Р дали приблизно 2-разове зниження за афінністю зв'язування з НІгГА1 людини (Фіг. 12А-12В8). Таблиця із узагальненими результатами цього аналізу показана на Фіг. 128.
Стосовно ізомеризації за залишками НОС-055 НО-С25б на НМК-Н2, створювали чотири варіанти (НС-О55А НО-О56 (також названі АС), НС-О55Е НО-О56 (також названі ЕС), НС-О555
НО-О56 (також названі 50) та НС-О55 НО-О56А (також названі БА)) та отримували їх у вигляді гар для проведення аналізу зв'язування ВІАСОКЕ М. Результати показали, що лише варіант
ЕС проявив порівняну афінність зв'язування по відношенню НІігАї людини, а решта варіантів у положеннях 55 та/або 56 важкого ланцюга дали від 2- до 3-х разове зниження афінности зв'язування з НІГАТ людини (Фіг. 13А та 13В). Таблиця із узагальненими результатами цього аналізу показана на Фіг. 138.
На основі цих результатів ввели обидва варіанти АР (НМК-І3) та ЕС (НМЕ-Н2) до послідовності клону антитіла п15Н6.м2 для створення клону антитіла п15Н6.м2.АРЕС (також названий п15Н6б.у3 або АР ЕС) (див. Фіг. 8А та 88). Цей клон також порівнювали з кількома іншими варіантами п15Нб.м2, включаючи І С-МО94Е І Сб-РО5 НО-О55Е НО-О56 (також названий
ЕР ЕС); І 0-М940 І С-РОБ5 НО-О55Е НО-О56 (також названий ОР Ес) та І С-М945 І С-РО5 НО-
О55Е НО-С256 (також названий 5Р Ес). Аналіз ППР ВІАСОКЕ "М показав, що п15Н6.м2.АРЕС зберігає порівняну афінність зв'язування з п15Н6.м2 (Фіг. 14А та 14В). Таблиця із узагальненими результатами цього аналізу показана на Фіг. 14В. Здатність цих варіантів блокувати активність
НІГА1 визначали з використанням аналізу блокування на основі ЕКЕТ, описаного у прикладі 1 (Фіг. 14С та 140). Значення рі цих варіантів у формі Баб також визначали з використанням програмного забезпечення ЗМАСК (див., наприклад, Зпагта еї аІ. Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА 111: 18601, 2014) та вони показані у таблиці 7 у порівнянні з Гар проти МЕСЕ ранібізумабом (ГОСЕМТІВФ).
Таблиця 7
Значення рі варіантів НІЗНб.м2 1 Клонантитла /-:/ | рі
В. Гуманізація гібридомного антитіла 19812 проти НгіА1
Вирівнювали амінокислотні послідовності Мі та МН мишачого антитіла 19812 (також названого т?9В12) з консенсусними послідовностями людини та встановили, що консенсусний легкий ланцюг капа ЇМ людини (Ппик4) та консенсусний важкий ланцюг підгрупи Ш людини (пиМНЗ) є найбільш близькими до каркасних ділянок людини Фіг. 15А-158).
Прививали гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга та важкого ланцюга т?19812, відповідно, на консенсусні акцепторні каркасні ділянки пик4 та пиМНЗ методом мутагенезу за
Кюнкелем з використанням окремих олігонуклеотидів для кожної гіперваріабельної ділянки для отримання прямого НМЕ-привитого варіанта, що називається у цьому документі клоном антитіла пП19812.м1. У цьому процесі прививали положення 24-34 на НМК-11, 50-56 на НМК-12
Зо та 89-97 на НМК-ІЇЗ для МІ. 19812 на консенсусний акцептор пик4, а положення 26-35 на НМК-
НІ, 50-65 на НМК-НаО та 95-102 на НМК-НЗ для МН 19812 прививали на консенсусний акцептор пис (Фіг. 15А-158).
Афінність зв'язування т?9В812 та п19812.м1 (у формі Раб) визначали з використанням ППР
ВІАСОКЕ "М (фіг. 16А-160)), використовуючи описаний нижче у підрозділі ії розділу С підхід.
Результати цього аналізу узагальнені нижче у таблиці 8. Рівноважна константа зв'язування (КО) п19812.м1 з НІГАТ людини покращилася приблизно у 2 рази після гуманізації (таблиця 8), у порівнянні з т'!9812.
Таблиця 8
Кінетичний аналіз зв'язування іт19812 або п19812.м1 з НігА!
С. Матеріали та методи і. ІФА з фаговою конкуренцією для визначення ІС5О фага
Покривали планшети для мікротитрування МАХІЗОКР"М НІігАТ-РО-Нії людини при концентрації 2 мкг/мл в ФСБ протягом 2 год., а потім блокували буфером РВ5Т (0,5 95 БСА та 00595 ТУМУЕЕМОФ2О в ФСБ) протягом 1 год. при кімнатній температурі Очищений з культуральних супернатантів фаг інкубували протягом 1 год. з послідовно розведеною у буфері
РВЗТ людською або мишачою НІгА! у планшеті для мікротитрування тканин-культур, після чого переносили 80 мкл суміші до лунок, покритих НіІгГАї людини протягом 15 хв для захоплення незв'язаного фага. Промивали планшет буфером РВТ (0,05 965 ТМУМЕЕМФ20О в ФСБ) та додавали кон'юговане з НЕР антитіло проти М1З3 (Атегепат Рпаптасіа Віоїесі) (1:5000 у буфері РВ5Т) протягом 40 хвилин. Промивали планшет буфером РВТ та проявляли додаванням субстрату тетраметилбензидину (Кігкедаага апа Реггу І арогайогіе5, м. Гейтерсберг, штат Меріленд, США).
Для визначення ІС5О фага на графіку відмічали поглинання при 450 нм у вигляді залежності від концентрації мішені у розчині. Це значення використовували як оцінку афінності для клону Раб, що відображається на поверхні фага. і. Визначення афінності антитіл методом ВІАСОКЕ М
Для визначення афінності зв'язування ЕРар проти НІГА!1 за кінетичними параметрами одного циклу виконували вимірювання (ППР) за допомогою приладу Т100 ВІАСОКЕ "М. Коротко, активували сенсорний чип СМ5 серії 5 реактивами гідрохлоридом /1-етил-3-(3- диметиламінопропіл)карбодіїміду (ЕЮОС) та М-гідроксисукцинімідом (МН) у відповідності з інструкцією постачальника, та зв'язували стрептавідин (Ріегсе) до отримання приблизно 2500 одиниць відповіді (КО) з наступним блокуванням груп, що непрореагували, 1 М етаноламіном.
Для вимірювання кінетичних параметрів спочатку вводили біотинильовану НІігА1-РО-НІів людини або миші при швидкості потоку 10 мкл/хв для захоплення приблизно 150 КИ у З різних проточних комірках (ЕС), за виключенням ЕС1 (яка служила як еталон), а потім вводили (швидкість потоку: 30 мкл/хв) 5-разові послідовні розведення від низького (0,48 нМ) до високого (300 НМ) Рар проти НіІгГАї у буфері НВ5-Р (0,01 М ГЕПЕС рН 7,4, 0,15 М Масі, 0,005 95 сурфактант Р20) одне за іншим у тому ж циклі без регенерації між введеннями. Записували сенсорграму та виконували віднімання показників еталона та буферу перед оцінюванням програмним забезпеченням ВІАСОКЕ "м Т100 Емаїшчайоп (версія 2.0). Швидкості асоціації (Ка) та швидкості дисоціації (Кд) обчислювали з використанням простої однозв'язної моделі зв'язування
Ленгмюра. Рівноважну константу дисоціації (КО) розраховували як співвідношення Кад/Ка.
Зо Приклад 3. Визрівання афінності антитіла проти НІГАТ клону пП15Н6б.м2
А. Конструювання бібліотеки ММК визрівання афінності п15Нб.м2 та пенінг
Для додаткового покращення афінності клону антитіла пП15Н6.м2 проти НІгА1 з варіанта п15Нб.мМ2 у формі Рар-амбер конструювали фагові бібліотеки для фагового дисплея моновалентного Раб або із залишками НУК легкого ланцюга (тобто НМК-І 1, НУВ-І2 та НМЕ-
ІЗ), або із залишками НМК важкого ланцюга (тобто НМЕК-НІ, НУВ-Н2 та НМЕ-НЗ), залишки рандомізували використовуючи вироджений кодон ММК, що кодує усі 20 амінокислот з 32 кодонами (див., наприклад, Вгеппег єї аї., Ргос. МаїЇ. Асад. 5сі. ОБА 89(12): 5381-5383, 1992).
Конструювали бібліотеки для забезпечення однієї мутації ММК у кожному з трьох НМК легкого ланцюга або важкого ланцюга. Отриману бібліотеку ДНК вводили електропорацією до клітин
ХІ1 Е. соїї, забезпечуючи приблизно 107 трансформантів. У деяких випадках використовували бібліотеки для м'якої рандомізації та ММК-епістазу, як описано в РСТ/О52015/055672. Фагові бібліотеки інкубували з 750 мМ Масі у буфері ФСБ БОРЕКВІ ОСКМ (Ріегсе) та 0,05 95 ТМУЕЕМФ 20 протягом 30 хв, а потім застосовували на захопленому нейтравідином біотинильованому
НІГАТ з маркером Ніх у першому раунді пенінгу для зниження неспецифічної електростатичної взаємодії між НігАї та фагом. У наступних двох раундах з використанням понижуючої концентрації біотинильованого антигена пПинНігА1-РО-Ніє у присутності у розчині 1000х небіотинильованої НігАї як конкурента для збільшення жорсткості відбору. Див. Фіг. 17 зі схематичною діаграмою стратегії пенінгу.
В. Глибоке секвенування бібліотек визрівання афінності п15Н6.м2
Для глибокого секвенування з вихідної фагової бібліотеки та з третього раунду відбору виділяли фагміду з двоспіральною ДНК з клітин ХІ-1 Е. соїї, що несуть фагмідні вектори. Як матриці застосовували очищену ДНК для ампліфікації ділянок Мі та МН на базі ПЛР з обмеженням циклів, використовуючи ДНК-полімеразу РНИОБІОМФОФ (Мем/ Епдіапа Віоїабрв).
Продукти ПЛР очищали екстракцією в агарозному гелі та сорбували (набір для екстракції з гелю
Оіадеп). Елюйовані ДНК-амплікони використовували як основу препарату для глибокого секвенування бібліотек за допомогою стандартних способів отримання бібліотек Шитіпа, використовуючи набір для препаратів зразків ДНК ТКОБЕО М (Шитіпа). Ліговані з адаптером бібліотеки піддавали одному циклу ПЛР та секвенували на Питіпа МІЗЕОФ, використовуючи секвеновані зі спареними кінцями з розміром вставки 200 п. н. або 300 п. н., необхідними для бо покривання усієї довжини амплікону.
С. Аналіз глибокого секвенування бібліотек визрівання афінності П15Н6б.м2
Аналізували дані секвенування, використовуючи мову програмування К для статистичних даних (див., наприклад, К Соге Теат, В: А Іапдиаде апа епмігоптепі ог віаїїбіїса! сотршиїйпа, 2013) та пакет ЗпогіКеай (див. Могдап еї аї., Віоіпіоптаїййс5 25(19): 2607-2608, 2009). На встановлених послідовностях НМА виконували контроль якості (0С), при якому кожну послідовність НМК перевіряли на наявність правильної довжини, та забезпечували введення лише до однієї мутації ММК та відсутність мутації, що не є ММК. Створювали матриці ваги положення розрахунком частоти появи усіх мутацій за кожним рандомізованим положенням.
Розраховували коефіцієнти збагачення для кожної мутації шляхом ділення частоти появи заданої мутації у зацьому положенні у відсортованому зразку із частотою появи точно такої ж мутації у невідсортованому зразку, як описано раніше (Роу/лег еї аІ., Маїште Меїпоа5 7(9): 741- 746, 2010). На Фіг. 18А та 1888 показані карти інтенсивності, які зображують коефіцієнти збагачення, відповідно, для кожної мутації у положеннях НМК легкого ланцюга та положеннях
НМК важкого ланцюга.
Для синтезу відбирали одиночні мутації з бібліотек легкого ланцюга або важкого ланцюга з високим коефіцієнтом збагачення для клонування в експресійній конструкції баб ссавця, що містить маркер Ріад для створення гібридних білків Раб-маркер Ріад. Трансфікували плазміди, що кодують важкий або легкий ланцюг, до клітин 2937 для експресії в об'ємі 30 мл, а Бар очищали за допомогою колонки з антитілом проти Ріад.
Використовували очищені Бар, що містять одиночні мутації, для визначення афінності зв'язування з використанням аналізу ППР ВІАСОКЕ "М (див. розділ О нижче). Дані за афінністю для одиночних мутацій узагальнені у таблиці 9. Значення швидкості дисоціації знаходилися у межах від близько 0,0013 до близько 0,004, у порівнянні зі значенням близько 0,0016 для пП15Н6.м2. У варіанта ГС3 (ГСО-МЗ1Е) від 2- до 3-х разів покращилася швидкість дисоціації у порівнянні з 15Н6.м2.
Таблиця 9
Афінність зв'язування для мутацій п15Н6.м2 виявлених мутагенезом з глибоким скануванням твнвма | 77777771 1722Б505|158Е-04 220ЕЛ30О| 73 | 77 нс 711111 Ф|НСАБВЕ 0 2.71Е5:05|165Е-04 бЛЕЛОЇ 73 | Ющ 99 щ-о6 7771 0фьсе-ов9н 0 013.90Е:05|251Е-04 б42ЕЛОЇ 86 |ДЮфЬ77 нся 0 ф|нетаевА 0 331Е:05|2л2Е-04 6АЗЕЛОЇ 73 |Ющф Ф96 -е 71 016о-5ОЗІ 1 1.88Е205|404Е-04 21509) 89 | 77 необ 00 |НСЕБЗА 0 1.01Е:05|260Е-04 25809) 73 | 98 -ото 1 0сб-єЗ2М,.10б-592К | 253Е05|213Е-03|842Е-09| 90 | 77 р. Комбінація відібраних варіантів для подальшого покращення афінності
Більшість одиночних мутацій з бібліотеки ММК важкого ланцюга або легкого ланцюга не
Зо покращували афінність зв'язування з НІгГА! у порівнянні з вихідним клоном п15Н6.м2 (таблиця 9). Для створення комбінаційних мутантів відбирали варіанти з найменшою швидкістю дисоціації як для легкого ланцюга (І С3З, І СА та І С7), так і важкого ланцюга (НС1, НС2, НОЗ та
НСБ). Ці комбінаційні мутанти включали як варіант легкого ланцюга, так і варіант важкого ланцюга. З використанням комбінаційних мутантів виконували кінетичний аналіз ВІАСОКЕ "М (як описано нижче у розділі С). Комбінаційні мутанти !С3.НСЗ, І С3.НС1 та І С7.НС2 мали 2-3 кратне покращення афінности у порівнянні з вихідним Раб (п15Нб.м2) (таблиця 10).
Таблиця 10
Кінетичний аналіз зв'язування комбінаційного мутанта з НігА!
Далі додатково комбінували мутанти С (1С237-ІС31С7,1 0347-13 | С4 | С7) та мутанти
НО (НС13-НС1 НОСЗ, НОС2г3-НС2 НСЗ). Ці мутанти додатково модифікували введенням варіантів МО4А НМК-ЇЗ та 0О55Е НМК-Н2 (тобто АР Еб, див. приклад 2), щоб уникнути саморозщеплення та дезамідування, для аналізу кінетики афінної взаємодії.
Кращими клонами були АРЕС./С3.НС1, АРЕС.ІСЗ3.НОСЗ (п15Нб.м4), АРЕС.І С37.НС13,
АРЕС.І/С37.НС23, АРЕСІС347.НС13 та АРЕС.1С347.НС23 з від 3- до 5-х кратними покращеннями, у середньому, у порівнянні з п15Нб.м2 (Фіг. 20). Амінокислотні послідовності МІ. та МН цих варіантів показані на Фіг. 21А та 218, відповідно. Аналізували послідовності цих клонів за потенціальним ризиком окиснення на УМ91 НМК-1І3, використовуючи віртуальний аналіз (Зпагта еї аї. Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 111:18601, 2014). Для АРЕС.І СЗ3.НСОЗ (п15Нб.м4),
АРЕС.І С37.НС13 та АРЕС.І С347.НС13 отримали рівень ризику, еквівалентний п15Н6.му3. Для інших ризик був вищим, ніж для п15Н6.м2.
Е. Визначення афінності Рар методом ППР ВІАСОКЕФ
Для визначення афінності зв'язування відібраних варіантів бар по відношенню до НігА!л, виконували вимірювання ППР за допомогою приладу 1200 ВІАСОКЕ М. Коротко, активували сенсорний чип СМ5 серії 5 реактивами 1-ЕОС та МН у відповідності з інструкцією постачальника, та зв'язували антитіло проти Ніх до отримання приблизно 200-300 одиниць відповіді (КО) з наступним блокуванням груп, що непрореагували, 1 М етаноламіном. Для вимірювання кінетичних параметрів спочатку вводили приблизно 5 нМ ПпиНнігА1-РО-Ні5 при швидкості потоку 10 мкл/хв для захоплення приблизно 100 КО у 2 різних проточних комірках (ЕС), за виключенням ЕСІ1 (яка служила як еталон). Далі вводили (швидкість потоку: 30 мкл/хв)
Б-разові послідовні розведення від низького (0,8 НМ) до високого (50 нМ) Раб у буфері НВ5-Р (0,01 М ГЕПЕС рн 7,4, 0,15 М Масі, 0,005 95 сурфактант Р20). Коректували відповіді зв'язування на НІгГАТ відніманням значення КИ, отриманого для пустої проточної комірки. Записували
Зо сенсорграму та виконували віднімання показників еталона та буферу перед оцінюванням програмним забезпеченням ВІАСОКЕФТ200 ЕмаїЇнчайоп (версія 2.0). Швидкості асоціації (Ка) та швидкості дисоціації (Ка) обчислювали з використанням простої однозв'язної моделі зв'язування
Ленгмюра. Рівноважну константу дисоціації (КО) розраховували як співвідношення Кад/Ка.
Е. Інгібуюча активність варіантів п15Нб.м2 в аналізі блокування НІГАТ на основі ЕРКЕТ (Н2-
Орі аналіз блокування)
Досліджували відібрані варіанти п15Н6б.м2 з визрілою афінністю на здатність інгібувати активність НіІгГАТ. Виконували аналізи блокування іп міго на основі ЕЕЕТ з використанням субстрату Н2-Орі (Мсаї! АУЗУЗЕ(Опр)КК). Н2г-Орі аналізи блокування виконували як описано у прикладі З публікації заявки на патент Мо 2013/0129743А1, яка у повному обсязі включена у цей документ як посилання. Коротко, пептид Н2-Орі (Мса-ІАВУЗУЗЕ(Опрукк) (5ЕО ІО МО: 152), початково описаний як субстрат для НігА2 (див., наприклад, Магійп5 еї аї., У. Віої. СНет. 278:49417-27, 2003), синтезували на смолі Етос-І уз(Вос)-жапд, використовуючи стандартні процедури зв'язування з НВТО. У положенні Р5" включений Етос-І уб(ОМР)--ОН (Апазрес).
Синтезували пептид до Р5 (Мса, 7-метоксикумарин, Аійагіс!і), а потім відщдеплювали від твердої основи, використовуючи трифтороцтову кислоту, триїзопропілсилан та воду протягом 2 годин при кімнатній температурі. Пептид осаджували з етилового ефіру, екстрагували оцтовою кислотою, ацетонітрилом, водою та ліофілізували. Розчиняли неочищений мічений пептид та очищали на препаративній обернено-фазній колонці С18, використовуючи ацетонітрил/воду.
Очищені фракції об'єднували, ліофілізували та аналізували рідинною хроматографією/мас- спектрометрією (РЕ/Зсіех), виявлено, що маси погоджувалися з розрахованими.
Інкубували НІГАТ у 96-лункових планшетах з чорним оптичним прозорим дном (МаїЇде Мипс
Іпг.,, м. Рочестер, штат Нью-Йорк, США) з антитілами проти НІГАТ, послідовно розведеними в аналітичному буфері (50 мМ Трис-НСІ, рН 8,0, 200 мМ Масі, 0,25 95 СНАР5), протягом 20 хв при 37 "С. Розбавляли водою 10 мМ маточний розчин пептидного субстрату Мса-ІВВУЗУЗЕ(ЮОпр Кк (ЗЕО І МО: 152) (Н2-Ор) в ДМСО до 12,5 мкМ, підігрівали до 37 "С, а потім додавали до реакційної суміші. Вимірювали збільшені сигнали флуоресценції (збудження 328 нм, випромінювання 393 нм) на пристрої для зчитування мікропланшетів ЗРЕСТКАМАХФ М5 (МоІесшаг ЮОемісе5, м. Санівейл, штат Каліфорнія, США) та визначали лінійні швидкості розщеплення Н2-Орі (мВФО)/хв).
На Фіг. 22А показане резюме результатів експериментів трьох незалежних аналізів з Н2-Орі, по суті виконаних як описано вище. Більшість клонів мало значення ІС50 у діапазоні від близько 0,4 нм до близько 0,5 нМ, у порівнянні з близько 0,39 нМ для п15Нб6.м2. Антитіло проти НігА!
АРЕС.І С3.НСОЗ (також назване п15Нб.м4) показало найкраще значення ІС50 у цьому аналізі при 0,386 нМ (Фіг. 22А). На Фіг. 228 зображений репрезентативний графік для цього аналізу.
Зо Загалом, варіанти п15Нб.м2 з визрілою афінністю показали краще максимальне інгібування
НІГА1 у порівнянні з п15Н6.м2 (фіг. 22А), зі значеннями максимального інгібування у діапазоні від близько 78 95 до близько 96 95.
Для оцінки здатності різних форм антитіл варіантів п15Н6.м2, включаючи п15Нб.ма4, інгібувати активність НігА!ї застосовували Н2-Орі аналіз блокування на основі ЕКЕТ.
Виконували аналіз Н2-Орі по суті як описано вище, за виключенням того, що умови аналізу були такими: 1 нМ ферменту пПишНнігА1-РО, 1,25 мкМ субстрату Н2г-Орі, 50 мМ Трис з рН 8, 200 мМ масі, 0,25956 СНАРБ5Б. Аналізували результати на основі швидкості зміни у відносних флуоресцентних одиницях ВФО/с (50-1000 с) або за значенням ВФО у кінцевій точці на 2000 с.
На Фіг. 23А-23Н показані результати приблизного незалежного експерименту порівняння здатності пП15Н6.м2 у формі Раб та п15Н6.м4 у формі Ідс або Ра інгібувати активність пиНІГгА1-
РО. Антитіло УМ/505.94а проти НІГАТ (див. ММО2013/055988) служило як позитивний контроль.
На Фіг. 24А та 24В показані узагальнені результати визначення ІС5О та ІС9О, відповідно, з першої серії трьох незалежних експериментів, проаналізованих з використанням підходу ВФО/с.
На Фіг. 25А та 25В показані узагальнені результати визначення ІС5О та ІС9О, відповідно, з другої серії трьох незалежних експериментів, проаналізованих для Бар п15Н6б.м4 з використанням ВФО/;с або підходу з вимірюванням ВФО кінцевої точки. б. Здатність АРЕС.І С3.НСОЗ (п15Н6.м4) до блокування в аналізі активності на основі мас- спектрометрії
Оцінювали здатність АРЕС.!С3.НОСЗ (п15Н6.м4) інгібувати опосередковане пПинігА1-РО розщеплення інтактного повнорозмірного субстрату (а-казеїну) з використанням аналізу активності на основі мас-спектрометрії (МС). У цьому прикладі порівнювали антитіло п15Н6.м4 проти НІГА1 з низькомолекулярним інгібітором протеаз НІГА, исі-101, описаним як антагоніст до
НІГА2 (також відомий як Оті) (Сіїепії еї аї., 9. Віої. Спет. 278(13):11489-11494, 2003). Для кількісного визначення на основі МС розщеплення а-казеїну за допомогою НІгГА1 у присутності пПТ5Нб.ма4 або исі-101 застосовували мітки тандемних маркерів мас (ТМТ), що маркують ізобарні маси. У а-казеїну є три залишки Р1", які можуть розщеплюватися НІГА!1: 5ег72, Тпг95 та Зег157.
Для розрізнення мічених стандартів с-казеїну та зразків, що аналізуються, для кількісного визначення інтактного а-казеїну застосовували реактиви для маркування ізобарних мас
ТМТрИОРГЕХ М. Реактиви ТМТОШОРІ ЕХ "М являють собою набори ізобарних сполук (тобто з бо однаковою масою та структурою, так звані ізотопомери), які МН5З-активовані для ковалентного необоротного маркування груп первинних амінів (-МН2). Кожний ізобарний реактив містить різну кількість важких ізотопів у фрагменті мас-репортерного маркера, що призводить до отримання унікальної репортерної маси під час тандемної МС/МС для ідентифікації та відносного кількісного визначення зразка.
Інкубували 100 мМ бікарбонату триетиламонію, 100 нМ пиНІГгАт, 100 мкг/мл а-казеїну та інгібітор (тобто исі-101 або п15Нб.м4) (кінцевий об'єм 20 мкл) при 37 "С протягом 18 годин (розчин, що піддали розщепленню). Окремо отримували аналогічний розчин без додавання інгібітору та інкубували його в ідентичних умовах (контрольний розчин). Досліджували Бар пП1Т5Нб.ма4 у діапазоні концентрацій від 3,12 нМ до 100 нМ, тоді як низькомолекулярний інгібітор исі-101 позитивного контролю досліджували у діапазоні концентрацій від 2 нМ до 250 нМ.
Готували маточні розчини маркерів тандемних мас (ТМТОШРІ ЕХ М) згідно рекомендаціям виробника (Тпепто Різпег Зсіепійіс). До розчину, що піддали розщепленню, додавали 5 мкл
ТМТ-126, а до контрольному розчину додавали 5 мкл ТМТ-127. Через 1 год. інкубації при кімнатній температурі вищевказані розчини об'єднували у рівних за об'ємом кількостях.
Аналізували зразки на РХ-МС та кількісно визначали за фрагментацією найбільш інтенсивних піків іонів з використанням високоенергетичної дисоціації у С-ловушці (НС); співвідношення інтенсивності репортерних іонів 126/127 після фрагментації використовували для визначення концентрації у розчині, що піддали розщепленню.
Крива титрування показала, що у цьому аналізі точно кількісно визначали інтактний а-казеїн (Фіг. 268). У цьому аналізі бар п15Нб.м4 інгібував опосередковане пинНігАТ1-РО розщеплення інтактного а-казеїну з ІС5О близько 45 нМ (ІС90 - близько 71 нМ). Це значення було значно покращене у порівнянні з низькомолекулярним інгібітором исі-101, у якого ІС50О складало 77
МКМ.
Н. Блокуюча здатність варіантів п15Нб.м2 з визрілою афінністю в аналізі активності ендогенної НІГА1
Оцінювали здатність варіантів п15Нб.м2 з визрілою афінністю інгібувати ендогенну активність НІГАТ у моделі з використанням очей у кроликів. Для аналізу активності ендогенної
НІГАТ як джерела НІігГАТї використовували середовище клітин, які секретують НІГАТ (клітини меланоми С32 людини). Див., наприклад, Сігегі еї аі. Віоспет У. Зеріетрег 18, 2015, БОЇ: 10.1042/89)20150601. Слід відмітити, що при аналізі ендогенного білка, існує приблизно у 10 разів вища концентрація НігА! у порівнянні з аналізом Н2-Орі рекомбінантного НІГАїТ (див., наприклад, Фіг. 28), що, як вважається, пояснює різні значення ІС5О, що спостерігали в аналізах
Н2г-Орі з використанням ендогенного НІГА!Т та рекомбінантного НІГА1. На Фіг. 27А-27С показані результати аналізу ендогенного НІгГАТ. Зокрема, клон АРЕС.Г С3.НОЗ (п15Н6.м4) мав значення
ЇС50 близько 1,125 нМ (Фіг. 27С) з максимальним інгібуванням близько 80,1 95.
Ї. Резюме властивостей вибраних варіантів П15Н6б.м2
Порівнювали кінетику зв'язування та інгібуючу активність вибраних похідних клону п15Н6.м2 антитіла проти НІГАТ, використовуючи аналіз ППР ВІАСОНВЕ та аналіз Н2-Орі активності на основі ЕКЕТ. Для визначення максимального інгібування використовували позитивні та негативні контролі для визначення 0 95 інгібування (лише фермент, без інгібітору) та 100 95 інгібування (без ферменту). Результати цього порівняння показані на Фіг. 28.
Приклад 4. Аналіз молекулярного оцінювання антитіл проти НігА1
Досліджували клони йп15Н6.м2, п15Н6.м2.АРЕС (також називається п15Н6.м3) та
АРЕС.І С3.НОЗ (також називається пП15Н6.м4) антитіл проти НІГАТ в аналізах молекулярного оцінювання (МА) на властивості стабільності. Досліджували також клон п19812.м1 антитіла проти НІГАТ1. Коротко, досліджували антитіла проти НІГА1 (1 мг/мл) у стресових умовах хімічного оточення з ААРН (дигідрохлорид 2,2-азобіс(2-амідопропан), мала молекула, яка як відомо генерує вільні радикали (див., наприклад, і єї аї., У. Рпатт. 5сі. 98(12):4485-4500, 2009), а також в умовах нагріву при різних рН (стрес-дослідження з двотижневою витримкою при 40 "С, рН 5,5) (див., наприклад, 2Ппапо еї аї., У. Спготайодгарпу А 1272:56-64, 2013).
У таблиці 11 показано порівняння між п15Н6.м2 та п15Н6.у3 за результатами аналізів МА.
Примітно, що ГС-ММ91 на НМК-ІЇЗ3 мало збільшену здатність до окиснення після стресового впливу ААРН як для пП15Нб.ма2, так і п15Н6.Уу3 (відповідно, близько 84,5 95 та близько 86,4 965). У таблиці 12 показані результати аналізу МА для п15Нб.м4. Неочікувано виявлено, що окиснення
ІО-М/91 на НМК-І/ 3 п15Н6.м4 знижене у порівнянні з п15Нб.м2 та п15Н6.у3, було збільшення окиснення лише на 26,5 95 після стресового впливу ААРН у порівнянні з приблизно 84,5-86,4 95 збільшеним окисненням п15ІН6б.м2 та п15Н6.м3. Це покращення було неочікуваним, оскільки
АРЕОБ.І С3.НОЗ має лише дві заміни у порівнянні з п15Нб.му3, тобто НО-Т28К на ділянці ЕК-НІ та
ІЇ0О-М31Е на НМК-Ї71, обидві з яких введені для покращення афінності та жодна з них бо припустимо не впливала на окиснення І С-М/91. Готували антитіло п15Нб.м4, що використане в цьому аналізі МА, використовуючи процедуру одноколонкової очистки. Коли повторювали аналіз МА для п15Н6.м4, використовуючи антитіло, отримане з використанням процедури двоколонкової очистки, показано, що І С-УМ91 нестабільне в умовах стресу під впливом ААРН.
Передбачається, що результати за стресовою оцінкою з ААРН, виконані з речовиною, очищеною з використанням двоколонкової очистки, відрізнялися від результатів, отриманих з використанням речовини, очищеної процедурою одноколонкової очистки, тому що очищене одноколонковою процедурою речовина містила домішку, яка перешкоджала оцінці стресу з
ААРН.
Таблиця 11
Властивості за МА п15Нб.м2 та п15Н6.м3 пІТ5Нв.м2 пТ5НвУЗ 031552 на НМЕ-НІ стабільні
Тепловий ре»(456 на НМЕ-НАІ2 нестабільні -- Н . - т е встановлено стрес збільшення ізомеризації на 5,8 95 регр»га на НУВ-НАІ2 стабільні
М на НМЕ-НІ стабільний . . М на НМА-НЗ стабільний 34 -
Му ча НМА-НІ стабільний Муе! на НУВ-І.З нестабільний --
М/! на НМА-Ї-3 нестабільний -- . о
ААРН-стрес | збільшення ізомеризації на 84,5 95 (ву контролі та Ве али Кк (3,7 95 у контролі та 88,2 95 в ААРН) ААРН). Р т 2» у випадку 96 - і ії
МУЗ на НМЕ-І3 стабільний ууе6 на НУВ-І З стабільний
Втрата мономера (0,9 95) прийнятна прийнятна
РХ/МС Маси відповідають очікуваним
Таблиця 12
Властивості за МА п15Н6.м4 (АРЕС.І СЗ3.НСЗ)
ПТ5Нб.м4 (АРЕС..СЗ.НОЗ 031532 на НМЕ-НІ стабільні регрога на НМЕ-НЕІ2 стабільні
Тепловий стрес ре7у8 на НМЕ-НЗ стабільні ру на НМЕ-НЗ стабільні ртогутг на НМЕ-НЗ стабільні
М на НМЕ-НІ стабільний
ААРН- МУ! на НМК-ІЗ стабільний -- збільшення окиснення на 26,5 95 (0,5 90 стрес контролі та 27,0 9о при стресі з ААРН)
Муз на НМК-Ї3 стабільний
Втрата мономера (0,1 96) прийнятна
Втрата основного піку (3,7 95) прийнятна
РХ/МС Маси відповідають очікуваним
У таблиці 13 показані результати аналізу МА для клону п19812.м1 антитіла проти НІгГА1. При визначенні НОС-М52а НОС-553 на НМК-Н2 виявилися нестабільними зі збільшеним дезамідуванням на 49 95. Відповідно, заміни у цих положеннях НМК-Н2 п19812.м1 (наприклад,
НО-М5гає, НО-М52габ5, НО-М52а5 та НОС-Мб52га НО-С53А) за припущенням покращують стабільність.
Таблиця 13
Властивості за МА п19812.м1 ретег на НМЕА-НАІО стабільні ртоо(гуова на НМК-НЗ стабільні
Тепловий стрес ретевета на НМЕВ-1І 1 стабільні
МУ1М92 на НМВ-І З стабільні рр на НМЕ-І-3 стабільні
М5га(353 на НМЕ-НІ2 нестабільні (зміна по дезамідуванню на 49 95) (ю: 15 95 до їлмк: 64 в) стрес. М'єоз на НМВ-НЗ стабільний
М на СОК-І 1 стабільний
М на СОБ-НІ стабільний
Приклад 5. Структура Раб п15Нб ма4, зв'язаного з НІГА1
Рентгенівською кристалографією та електронною мікроскопією визначали структуру Бар п15Нб.м4, зв'язаного з НІГАТ. Результати продемонстрували, що НігА1-епітоп Бар п15Н6.м4 головним чином формується амінокислотами, які містять початок І А-петлі НІгАТт.
Синтез пептидів:
Створювали пептиди, які відповідають ділянкам білка НІГАТ, використовуючи способи, добре відомі у цій галузі техніки. Див., наприклад, Аїйегіоп, Е., еї а). (1978). ). Спет 5ос. Спет.
Соттип. 13:537-539.
Кристалізація:
Інкубували Раб п15Н6 ма4 (1 мл) при концентрації 10 мг/мл в 0,15 М Масі, 20 мМ Трис рН 7,5 протягом ночі при 4"7С з 1 мг пептиду (3З3-разовий молярний надлишок пептиду/білка), який містить амінокислоти у І А-петлі НІГАТ. Комплекс Рар-пептид кристалізували з використанням 2
М сульфату амонію, 0,2 М ацетату калію.
Уточнення за допомогою рентгеноструктурного аналізу:
Вирощували пептидні кристали Раб п15Нб.м4/пептиду НІГА!1 та зберігали для дифракційного аналізу зануренням у кріопротекторний розчин, приготований додаванням 30 95 гліцерину до маточного розчину, з наступним швидким зануренням у рідкий азот. Збирали дані у пучку випромінення З5КІ 12-2 та обробляли їх, використовуючи ХО5 (Кабабсп УМ (2010) Асіа
СтузіайНоаг О Віо! СтувіаПодг. 266:125-32). Достягали молекулярного заміщення комплексу Рар- пептиду, використовуючи як шуканий зонд у ССРА4 структурі Бар (УУпп МО еї аї. (2011) Асіа
Стузіаоди О Віо! СтувіаПодг. 67:235-42). Після уточнення за моделлю абсолютно твердого тіла могли спостерігати густину Бо-Ес пептиду. Потім підбирали по суті густину у частині залишків протеазного домена НІГАТ з петлі А (ККГРЕБККЕМРМ) (РОВ 3Т90), як описано в Етвіеу еї а). (2010) Асіа СтузіайІоаг О Віо! Стувтаоаг. 66:125-32.
Застосовували кілька раундів уточнення в Рпепіх (Адатв5 РО еї аї. (2010) Аста СтузіаПодиг О
Віо! Стувіаоаг. 66:213-21). У кінцевому раунді уточнення у Вивіег (Вгісодпе с еї аї. (2011) отримані значення РЕ для розрізнення 2,1 А Б-16,8 95, Евільн. - 19,8 95.
Зо Структура Рар1'5нНб.ма4, зв'язаного з НІГАТ, за даними електронної мікроскопії (ЕМ)
Для візуалізації ЕМ інкубували 4 мкл комплексу НІігА1-пРаб15Нб.м4 протягом 30 с на свіжепрокаленій з повним видаленням вуглецю мідній сітці з числом комірок 400 меш (ЕІесігоп
Містозсору Зсіепсе5). Після інкубації зразок негативно забарвлювали, використовуючи розчин 2 90 (мас./о0б.) форміату уранілу (5РІ Зирріїезх). Надлишок розчину барвника видаляли ватманським папером та висушували сітку на повітрі. Аналізували зразок НІГАТ1-Рар15Нб.м4 на приладі Теспаі-12 ВіоТжееп (ЕЕЇ), обладнаному катодом Гавб, який працював при 120 кеВ в умовах низької дози. Отримували зображення, використовуючи ПЗ33-камеру 4к х 4 к (Сайап Іпс.) при номінальному збільшенні х 62000 (2,22 А на піксель). У напівавтоматичному режимі зібрали 27346 часточок, що мають розмір сторони квадрата 128 пікселей, використовуючи алгоритм змагпт, доступний у звичайному режимі егаодрісКег.ру, включаючи розподіл ЕМАМАІ (Тапа Г. єї аІ. (2007) У. Спет. Іпї. Модеї. 47:1438-45). Потім ці часточки піддавали 20-класификації без еталона, використовуючи програмний пакет Кеїїоп (5спеге5 ЗН (2012) 9. Зітгисі. Віо!. 180:519-30).
Використовували алгоритм З3О-класифікації Кеїоп, що забезпечує гнучкість розрізнення між тримером НТКАТ та зв'язаними Бар, для створення п'яти 3ЗО-об'ємів, використовуючи як початкову модель кристалічної структури тримера НіІгГАТ (РОВ ІО 3Т90), відфільтровану на низькій частоті до розрізнення бОА. Кожний з цих об'ємів остаточно уточнювали, використовуючи алгоритм КеїйпезЗзО в Кеїїоп. Значення атомної густини тримера НТКА1 та кристалічну структуру Рар15Нб.м4 підбирали за густиною ЕМ, використовуючи підбір в алгоритмі картування в Спітега (Рецегзеп ЕЕ еїа!., 2004). У. Сотриї. Спет. 25:1605-12 (2004).
Перевірка структури Раб Рар15Нб.ма4, зв'язаного з НІГА1, з використанням замін аланіном
Описані вище структурні дослідження продемонстрували, що Бар Рар15Нб.м4 щільно взаємодіє з петлею "А" білка НіІгГАї. Для підтвердження цього, синтезували пептид, який відповідає залишкам 190-201 послідовності НІГА1 людини (в якій нумерація відповідає нумерації білка-попередника), та досліджували його на зв'язування з Бар п15Нб.м4, використовуючи поверхневий плазмонний резонанс (ППР), як описано вище. Пептид (ГА-рер1ї) показав сильну взаємодію зв'язування з Раб 15Нб.ма4 зі значенням КО рівним 0,4 нМ. Див. таблицю 14.
Заміни аланіном у цій пептидній послідовності знижують (І А-рерг, І А-рер5) або повністю порушують (ГА-рер3, І А-рер4, І А-рер5) зв'язування з Раб 15Н6.м4. Ці біофізичні результати узгоджуються зі структурними дослідженнями, описаними вище на Фіг. 32А та 32В, та демонструють, що зв'язуючий епітоп 15Н6.м4 головним чином формується амінокислотами, які містять початок Г А-петлі НІГА1.
На противагу цьому, Раб УУу505.94 не зв'язується ні з Г А-рер'ї, ні з будь-якою з мутантних форм (таблиця 14).
Це є показником того, що не дивлячись на факт конкуренції бар Жуу5О5.94 та п15Н6.м4 одного з іншим за зв'язування з НІГА1, епітопи цих двох Раб відрізняються. Епітоп бар УУу/505.94 знаходиться в центрі біля петель В та С, тоді як епітоп Раб 15Нб.м4 в основному містить верхню частину ГІ А-петлі.
Хоча не передбачається, що цей винахід прив'язаний до будь-якого конкретного механізму, можливо, що близька взаємодія між п15Н6б.м4 та ГА-петлею НігА!7 відповідає за значне покращення афінності та активності цього антитіла у порівнянні з УМ/505.94.
Таблиця 14
Зв'язування пептидів НІГА! петлі А (І А) з Раб 15Н6.м4 та Бар УУУ505.94
Раб п15Нб.мг Еар й афінностіх» Ко (нм)
А-рері |ВКІРЕЗКВЕМРМ | Дикийтип | 0,396. | - |ВЗ' "ВЗ - при 1 мкМ виявлено відсутність зв'язування, "«втрата афінності - Ко мутанта/Ко дикого типу.
Коо)
Хоча для ясності розуміння деякі подробиці попереднього винаходу описані за допомогою ілюстрацій та прикладів, не слід вважати, що ці описи та приклади обмежують обсяг цього винаходу. Описи усіх патентів та наукової літератури, процитовані у цьому документі, явним чином повністю включені у цей документ як посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» Сепепівси, Іпс.
Е. Нойтапн-їІ а ВКоспе АС
КЕ ЕМ, Робеті Б.
КІАВСННОЕЕН, Вагпівї! К.
І АІ, Уоусе
Г ЕЕ, Спіпдууеї У.
ПАМа, М/єеі-Спіпд
ПРАВІ, Міспавї! Т.
ГОУЕТ, Кеїу М.
ЗАЇ, Тао
МАМ ГООКЕНВЕМ САМРАСМЕ, Меппо
МИ, мап
ЕН, Сегтаїпе -120» АНТИТІЛА ПРОТИ НІгА! ТА СПОСОБИ ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ «130» 50474-117М04 «1505 05 62/411113 «151» 2016-10-21 «1505 5 62/345669 «151» 2016-06-03 «1505. 5 62/248871 -151» 2015-10-30 «160» 160 -170» Раїепіи, версія 3.5 «-2105» 1 «2115» 5 212» ПРТ -213» Штгтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «220» «221» МІЗС ГЕАТОВЕ «222» (4).(4) «223» Хаа представляє собою Меї або І еи «400» 1
Азр Бег Сім Хаа Ніб 1 5 «2105» 2 «-2115 17 212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «220» «221» МІЗС ГЕАТОВЕ «222» (7)..(7) «223» Хаа представляє собою Сім або Азр «4005» 2
Сіу Ма! Азвр Рго Сім Тниг Хаа Сіу Аа Аа Туг Авп ап Гу РНе Гуз 1 5 10 15 спіу «2105» З «-2115 10 212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» бо «223» Синтетична конструкція
«400» З
Сіу Туг Ар Туг Авр Туг Аа І єи Ар Туг 1 5 10 «-210» 4 «-2115 10 212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична конструкція «020» «221» МІБС ЕГЕАТОВЕ «222» (7)..(7) «223» Хаа представляє собою Сім або Ап «400» 4
Ага Аа 5ег бег 5ег Ма! Хаа Рне Іе Ніб 1 5 10 «2105» 5 «-2115 7 212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична конструкція «020» «221» МІБС ЕГЕАТОВЕ «222» (4).(4) «223» Хаа представляє собою Авп, Ні або Сіи «4005 5
Ада Тиг 5ег Хаа І єи Аа 5ег 1 5
Зо «210» 6 «-2115» 9 «212» ПРТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична конструкція «020» «221» МІБС ЕГЕАТОВЕ «222» (4).(4) «223» Хаа представляє собою 5ег або Туг «020» «221» МІБС ЕГЕАТОВЕ «222» (6)..(6) «223» Хаа представляє собою Аа або Авп «400» 6 іп ап Тгр Хаа 5ег Хаа Рго Тгр ТНг 1 5 «-2105 7 «-2115 5 «212» ПРТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична конструкція «4005» 7
Азр Зег Спи Меї Ніб 1 5 «210» 8 «-2115 17 «212» ПРТ 213» Штучна послідовність 60 «020»
«223» Синтетична конструкція «4005» 8
Сіу Ма! Авр Рго Сім Тиг Спи Су Аа Аа Туг Авп ап Гуз РНе Гуз 1 5 10 15 ау «2105» 9 «2115 10 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 9
Аг Аа 5ег Зег 5ег Ма! Спи РНе Пе Нів 1 5 10 «2105 10 «2115 7 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 10
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег 1 5 «2105 11 «2115» 9 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220»
Зо «223» Синтетична конструкція «4005 11
Сіп Сп Тер Зег 5ег Аа Рго Тгр ТНг 1 5 «2105 12 «2115 З30 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «220» «221» МІЗС ГЕАТОВЕ «222» (28).(28) «223» Хаа представляє собою І уз або ТНг «220» «221» МІЗС ЕГЕАТОВЕ «222» (30)..(30) «223» Хаа представляє собою ТнНг, Гуз, або Аг «-4005 12
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аіа 1 5 10 15 зег Ма! Гуз Маї Бег Суз ГГ уз Аа 5ег Сіу Туг Хаа Рпе Хаа 20 25 зо «2105 13 «2115 14 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція -4005 13 60 Тр Маї Аго Сп Айа Рго Сіу Сип Спіу І еи Спи Тур Пе Спу
1 5 10 «2105» 14 «2115 32 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 14
Аг Аа Тпг Пе Тиг Агу Авр Тнг Зег Тнг 5ег ТНг Айва Туг І еи Си 1 5 10 15
Ї еи Зег Зег І еи Агу Бег Спи Азр Тиг Аїа Маї Туг Туг Суз ТНг Агд зо «-2105 15 «2115 11 15. «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 15 20 ТПтраїу сп Спу ТНг І єи Маї Тнг Маї бег Зег 1 5 10 «2105 16 «2115 З30 «2125» ПРТ 25 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 16
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аіа
Ко) 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Спу Туг Гуз Рпе ТНг 20 25 зо -2105 17 «2115 23 0«212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 17
Ав5р Пе Сіп Меї Тнг Сп Зег Рго Зег Зег І еи Бег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аго Маї Тиг Пе Тнг Сув 20 «2105» 18 «2115 15 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 18
Тер Туг Сп Сп Гуз Рго Сту Гуз Аа Рго Гуз Рго І еи Пе Зег 1 5 10 15 «2105» 19 «2115 32 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 19 60 Спу Маї Рго бег Агу Рпе Зег СПу Зег СПу Зег СПу Тиг Азр Ріє Тнг
1 5 10 15
Ї єи Тит Пе 5ег 5ег І ви Сп Рго Сіи Авзр РНеє Аа Тнг Туг Туг Суб 20 25 0) «2105» 20 «2115 10 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 20
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 1 5 10 «2105 21 «2115» 119 15. «2125» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 21 си Маї Сіп І еи Маї Сп Зег Спу Аа Сім Ма! Гуз Гуз Рго Сіу Аа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Спіу Туг Гуз Рпе Тнг Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сп Аїа Рго Спу СИПп Спу Геи Спи Тгр Пе 35 40 45
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Спи Стпу Айа Аа Туг Авп ап Г ув Рпе 50 55 60
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «2105 22 «2115» 106 «2125 ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 22
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа Зег Ма! Спу 1 5 10 15
Авр Ага Маї ТАг Пе Тнг Суз Ага Аа 5ег Зег Зег Ма! Спи РНе Іе 20 25 0)
Ні Тгтр Туг ап Сіп Гуз Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз Рго Гей Пе Зег 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег 50 55 60 сСіу Зег Спу Тиг Азр Ріе Тнг Геи ТАиг Пе Зег 5ег І еи Сп Рго Си 65 70 75 80
Азр Ре Аа ТАг Туг Туг Суз Сип Сп Тер Зег 5ег Аа Рго Тгр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНиг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 23 «2115» 119 «212» ПРТ 60 -213» Штвтучна послідовність
«223» Синтетична конструкція «4005 23
Сп Маї Стій Ї ви Сп Сіпй бег Спу Аа Сі І єи Ма! Агу Рго Стпу Аа 1 5 10 15 зЗег Ма! Тит Геи Зег Суз Гуз Аіа Зег Сіу Туг ТАг Ре ТАиг Авр 5ег 20 25 Зо
Сім Меї Ніз Ттр Ма! Гуз Сип Тнг Рго Маї Ні5 Спу І еи Сім Тер Пе 35 40 45 спу Спу Маї Авр Рго Спи Тнг Авр Су Айа Аа Туг Авп ап Г ув Рпе 50 55 бо
Гуз Спу Гуз Аа ТАг І єи ТАг Аа Авр Гуз 5ег Зег 5ег ТНиг Аа Туг 65 70 75 80
Меї Сі І єи Агу 5ег І ви Те бег Сім Авр 5ег Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 100 105 110
Тниг Зег Маї Тиг Ма! Бег Зег 115 «2105» 24 «2115» 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 24
Сп Пе Маї І єи бег Сп бег Рго Аїйа ІІе І єи 5ег Аа 5ег Рго Спіу 1 5 10 15
Сім Гуз Маї Тиг Меї Тнг Суз Агу Аа 5ег 5ег 5ег Маї Авп РНе Пе
Ко) 20 25 Зо
Ні Тгтр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу 5ег Зег Рго Гуз Рго Тгр Пе 5ег
Аа Тнг бег Авп І єи Аа Зег Сіу Маї Рго Рго Агу РНе 5ег СПУ бег бо 35 ау Зег Спу ТНг бег Туг Зег І ви ТНг Пе бег Ага Маї Спи Аа Спи 65 70 75 80
Азр Аїа Аа Тиг Туг Туг Суз Сп Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Тр ТНг 85 90 95
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз І еи См Пе Гув 40 100 105 «2105» 25 «2115 З30 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність 45 «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 25
Сп Маї Стій Ї ви Сп Сіпй бег Спу Аа Сі І єи Ма! Агу Рго Стпу Аа 1 5 10 15 50 ЗБег Ма! ТНИг І єи Зег Суз Гуз Аа бег Спу Туг ТНг Рпе Тнг 20 25 Зо «2105» 26 «2115 14 «212» ПРТ 55 -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 26
Тр Маї Гуз Сіп Тнг Рго Маї Нів СпПу Геи Спи Тгр Пе Спу бо 1 5 10
«2105» 27 «2115 32 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 27
Гуз АІа ТАг І еи Тнг Аа Авр Гуз Зег 5ег Зег ТНг Аа Туг Меї Сі 1 5 10 15
Ї ви Агу 5ег І еи Тнг Зег Спи Авр 5ег Аа Маї Туг Туг Суз ТНг Агд 20 25 зо «2105» 28 «2115 11 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 28
Тр Спу Сп Стпу ТНг Зег Ма! Тнг Ма! бЗег 5ег 1 5 10 «2105» 29 «2115 23 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 29
Азп Іе Маї Маї Тнг Сіп 5ег Рго Аа 5ег І єи Аа Маї 5ег І ви Спу 1 5 10 15
Сп Аг Аа ТНг Пе бег Суз 20 «2105» 30 «2115 15 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 30
Тер Туг Сп Сп Гув Рго Спу Сіп Рго Рго Гуз І єи Геи Пе Туг 1 5 10 15 «2105 31 «2115 32 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 31
Сіу Маї Рго Аа Агу Рне 5ег СпПу 5ег СПу Зег Агу Тиг Азр Рпе ТНиг 1 5 10 15
Ї еи Тит Пе Авр Рго Маї Спи Аїіа Авр Ар Аа Аа Тнг Туг Туг Сувз 20 25 зо «2105 32 «2115 10 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «-4005 32
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Геи Спи Пе Гув (510) 1 5 10
«2105 33 «4005 33 000 «2105» 34
Б «400» 34 000 «2105 35 «4005 35 000 «2105» 36 «4005 36 000 «-2105 37 «4005 37 000 «2105 38 «4005» 38 000 «2105» 39 «2115 5 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 39 зЗег Тут Пе Меї 5ег 1 5 «2105» 40 «2115 17
Зо «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 40
ТупПе бЗег Азп Сіу Спу СПу ТАг ТАг Туг Туг Зег Авр ТАг Пе Гуз 1 5 10 15 спіу «2105» 41 «2115 12 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 41
Сіп Авп РНе Агу 5ег Азр Сіу Зег Зег Меї Авр Туг 1 5 10 «210» 42 «2115» 15 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 42
Ага АІа бег Си 5ег Ма! Азр бег Туг Спу Гуз Зег Рпє Меї Нів 1 5 10 15 «2105 43 «2115 7 «2125» ПРТ 60 213» Штучна послідовність
«223» Синтетична конструкція «4005» 43
Ї еи Авіа 5ег Гуз І еи Сім бег 1 5 «2105» 4А «2115» 9 «2125 ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 4А
Сіп Сп Авп Авп Спи Авр Рго Туг ТНг 1 5 «2105» 45 «2115 121 «2125 ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 45
Сім Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Сіу Сіу Спу Геи Маї Сіп Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аїа Аа 5ег Сіу Рпе Тнг Ріє 5ег Зег Туг 20 25 Зо
Пе Меї 5ег Тгр Маї Аг Сіп Аа Рго Сту Гуз СПУ І єи Сім Тр Маї
Аа Туг Пе Зег Авп Спіу Спу Спу Тит Тнг Туг Туг Зег Азр ТНг Пе 60
Коо) Гуз Спіу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп з5ег І уз Азп ТНг ГГ еи Туг 65 70 75 80
Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Спи Ар ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Аа Агд Сп Авп Рне Ага 5ег Авр Сіу 5ег Зег Меї Азр Туг Ттр Су 35 100 105 110
Сіп СІу ТАг І єи Маї ТАиг Ма! бЗег Зег 115 120 «2105» 46 «2115 111 40 «2125» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 46 45 А5р Пе Маї Меї Тнг Сп 5ег Рго Авр 56"! І єи Аа Маї 5ег І єи Спу 1 5 10 15
Сім Ага Аа Тниг Пе Авп Суз Агу Аа 5ег Сіи Зег Ма! А5р 5ег Туг 20 25 Зо
Сіу Гуз Зег Ре Меї Ні Ттр Туг Сп Сп Гуз Рго Спу Сп Рго Рго 50 35 40 45
Гуз І еи Ї єи Пе Туг Гей Аа 5ег Гуз І еи Сім бег Спіу Маї Рго Азр 50 55 60
Агу Рпе 5ег Спу Зег Сіу Зег Спу ТНиг А5р Рне Тнг І єи Тнг Пе Бег 65 70 75 80 55 зегпіеи Сп Аіа Спи Азр Маї Аїа Маї Туг Туг Суз Сп Сп Авп Авп 85 90 95 сій Авр Рго Туг Тиг Рпе Стпу Спп Спу ТАг Гуз Ма! Спи Пе Гув 100 105 110 «2105» 47 бо «2115 З30
«212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 47
Сім Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Сіу Сіу Спу Геи Маї Сіп Рго Спу Спу 1 5 10 15 зЗег І ей Ага І єи бег Суз Аа Аа бег Спіу Рне Тнг Рне 5ег 20 25 зо «2105» 468 «2115 14 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 48
Тр Маї Ага Сп Аа Рго Сіу Гуз СпПу Геи Сім Тгр Маї Аа 1 5 10 «2105» 49 «2115 32 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 49
Агу Ре Ти Пе 5ег Агу Авр Авп 5ег Гуз Авп ТНг І єи Туг І еи Сп 1 5 10 15
Меї Авп 5ег" І єи Ага Аа Спи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз Аа Агд 20 25 зо
Зо «2105 50 «2115 11 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 50
Тр Стпу Сп Слпу ТНг ГГ еи Маї ТАг Ма! Зег Зег 1 5 10 «2105 51 «2115 23 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 51
Азр Іе Ма! Меї Тнг Сп 5ег Рго Авр 56! І єи Аа Ма! 5ег І ви Спу 1 5 10 15
Сім Агу Айа Тиг Пе Авп Суз 20 «2105» 52 «2115 15 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «-4005 52
Тер Туг Сп Сп Гув Рго Спу Сіп Рго Рго Гуз І єи Геи Пе Туг 1 5 10 15 «2105 53 60 «2115 32
«212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 53
Сіу Маї Рго Ар Аг Ре 5ег СПу Зег СПу Зег СПу Тиг Азр Ріє Тнг 1 5 10 15
Ї єи Тит Пе 5ег Бе" І єи Сп АІа Сім Авр Маї Аа Ма! Туг Туг Суб 20 25 0) «2105» 54 «2115 10 «212» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 54
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 1 5 10 «2105» 55 20. «2115 121 «212» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція 25 «4005 55
Сім ма! Гуз Г еи Ма! Спи Зег Спу Сіу Спу Геи Маї Спи Рго Спу Спу 1 5 10 15 зЗег І єи Гуз І єи Аа Су Маї Аіа Зег Сіу Рпе Тнг Рпе Зег Зег Туг зо
Коо) Пе Меї зег Ттр Маї Агу Сіп Тнг Рго Сім Гуз Аго І ви Сім Тр Ма!
Аа Туг Пе Зег Авп Спіу Спу Спу Тит Тиг Туг Туг Зег Авр ТНг Пе бо
Гуз Спу Ага Ре Тнг Іе 5ег Ага Азвр Авп Аа Гуз Авп ТНг І єи Туг 35 65 70 75 80
Ї еи СіІп Меї 5ег ТНг І єи І ув бег СІи Авр ТНг Аа Пе Туг Рне Суб 85 90 95
Аа Агд Сп Авп Рне Ага 5ег Авр Сіу 5ег Зег Меї Азр Туг Ттр Су 100 105 110 40 ап Спу Тнг Ада Маї Тнг Маї Зег Зег 115 120 «2105» 56 «2115 111 «212» ПРТ 45 -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 56
Азп Іе Маї Маї Тнг Сіп 5ег Рго Аа 5ег І єи Аа Маї 5ег І ви Спу 50 1 5 10 15
Сіп Ага Аа Тниг Пе 5ег Суз Агу Аа 5ег Сіи Зег Маї А5р 5ег Туг 20 25 0)
Сіу Гуз Зег Ре Меї Ні Ттр Туг Сп Сп Гуз Рго Спу Сп Рго Рго 35 40 45 55 Гуз Геиц ГІ єи Ме Туг І єи Аа 5ег Гуз І еи Спи Зег Спу Маї Рго Аіа 50 55 бо
Агу Ре Зег Спу Зег Сіу Зег Агу Тиг А5р Ре Тнг ГГ еи Тнг Пе А5р 65 70 75 80
Рго Маї Сім Аа Азр Авр Аа Ага Тнг Туг Туг Сув Сип Сп Авп Авп бо 85 90 95 сій Авр Рго Туг Тиг Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз І ви Сім Пе Гув 100 105 110 «2105 57 «2115 З30 «2125» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 57
Си Маї Гуз І ви Маї Спи Зег СПу Спу Спу Гей Маї Сім Рго Спу Спу 1 5 10 15 зЗегі ей Гуз І єи Аа Суз Маї Аіа 5ег Сіу Рпе Тнг РНе 5ег 20 25 зо «2105 58 «2115 14 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 58
Тр Маї Ага сСіп Тнг Рго Сім Гуз Агу Гей Спи Тгр Ма! Аїа 1 5 10 «2105» 59 «2115 32 25. «212» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 59
Зо Агу Ре Ти Пе 5ег Агу Ар Авп Аа Гуз Азп ТНг ГГ еи Туг Геи Сп 1 5 10 15
Меї Зег ТНг І єи Гуз Бег Спи Азр Тпг Айа Пе Туг Ре Суз Аа Аг9 20 25 зо «210» 60 «2115 11 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 60
Тр Стпу Сп Слпу Тнг Айва Ма! ТАг Ма! Зег Зег 1 5 10 «2105 61 «2115 23 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 61
Авп Пе Маї Ма! Тнг Сіп 5ег Рго Аа 56ег І єи Аа Ма! 5ег І ви Спу 1 5 10 15
Сіп Агу Аа Тниг Пе Зег Суб 20 «2105» 62 «2115 15 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція 60 «4005» 62
Тер Туг Сп Сп Гув Рго Спу Сп Рго Рго Гуз І еи ГГ еи Пе Туг 1 5 10 15 «2105» 63 «2115 32 00о«2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 63 сту Маї Рго Аа Агу Ріє 5ег Сіу Зег Сіу Зег Ага Тиг Авр Ре ТНг 1 5 10 15
Ї єи Тит Пе Авр Рго Маї Спи АІа Авр Азр Аїйа Аа Тнг Туг Туг Суз 20 25 Зо «2105» 64 «2115 10 «212» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 64
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Геи Спи Пе Гув 1 5 10 «210» 65 «2115 121 25. «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 65
Си Маї Гуз І еи Маї Спи Зег СПІу Спу СпПу І еи Маї Сп Рго пу Спу 1 5 10 15 зег і єи Гуз І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег Спу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 Зо
Пе Меї 5ег Тр Маї Агу Сіп Тне Рго Спи І уз Аго І єи Спи Тгр Ма! 35 40 45
Аа Туг Пе Зег Авп Спіу Спу Спу Тит Тйг Туг Туг Рго Авр ТНг Пе 50 55 бо
Гуз Спу Ага Ре ТНг Пе Зег Ага Авр Авп Аа Гуз Авп ТНг І єи Туг 65 70 75 80
Ї еи Сп Меї Азп ТНг Гей Гуз Зег Спи Авр ТНг Аа Пе Туг Рне Суз 85 90 95
Аа Агд Сп Авп РНе Ага 5ег Авр Сіу Зег Зег Меї Азр Туг Ттр Су 100 105 110
Сіп Спу ТАг Зег Маї Тниг Маї Зег Зег 115 120 «210» 66 «2115 111 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 66
Азп Іе Маї Гей Тниг Сп бег Рго Аа 5ег І єи Аа Маї 5ег І ви Су 1 5 10 15 ап Агу Аа Тпг Пе Зег Суз Агу Аа 5ег Спи Бег Маї А5р ТАг Зег 20 25 Зо
Сіу Агу бег Рпе Меї Ні Тгтр Туг Сп Сп Гуз Рго Спу Сп Рго Рго 35 40 45
Аго І еи Геи Пе Туг Геи Аа 5ег Гуз І еи Спи Зег СПу Маї Рго Аа бо 50 55 бо
Агу Ре Зег Спу Зег Сіу Зег Агу Тиг А5р Ре Тнг ГГ еи Тнг Пе А5р 65 70 75 80
Рго Маї Сім Аа Азвр Азр Аа Ага Тнг Туг Туг Сув Сп Сп Авп Авп 85 90 95 ам А5р Рго Туг Тит Рпе Спу Спу Спу ТНиг Авп І ви Сім Пе Гув 100 105 110 «2105» 67 «2115 117 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 67
Азр Маї Нів І єм Маї Сіи Зег Сіу Спіу Спу І еи Маї Агу Рго Сіу Спу 15. 1 5 10 15 зЗег Ага Гуз І еи бег Су См Аа 5ег Сіу Рпе ТАг Рне 5ег Зег Рпе зо
Сіу Меї Ніз Тгр Маї Аго Сп Айа Рго Сі Гув СПу Г еи Спи Тгр Маї 20 Аа РНе Іе Тпг Зег Авр 5ег Зег ТНг Пе Туг Туг АІа Авр Тнг Маї 60
Гуз Спіу Ага Ре Тнг Іе 5ег Агу Авр Авп Рго Гуз Авзп ТНг Гей Рпе 65 70 75 80
Ї еи Сп Меї Тнг 5ег І єи Ага 5ег Сім Авр ТНг Аа Меї Туг Туг Сув 25 85 90 95
Тпиг Агу 5ег Спу Авр Авр Туг І еи Авр Туг Тгр Спу Сп Спу ТАг ТАг 100 105 110
Ї еи Тиг Маї Зег Зег 115
Зо «2105» 68 «2115 111 «212» ПРТ -213» Штгтучна послідовність «220» 35 «223» Синтетична конструкція «4005» 68
Азр Іе Маї І єи Тниг Сп Зег Рго Аа 5ег І ви Аа Маї 5ег І ви Спу 1 5 10 15
Сіп Ага Аа Тниг Пе 5ег Суз Агу Аа 5ег СіІп 5ег Ма! Зег Тит Зег 40 20 25 0) зЗег Зег Зег Туг Меї Ніз Тгр Туг Сп СІп Гу Рго Стпу Сп Рго Рго 35 40 45
Гуз Ма! Ре Пе Гуз Туг Аа 5ег Авп І ви Спи Зег СПу Маї Рго Аа 50 55 60 45 Ага РНе 5ег Сіу бег Сіу бЗег Спіу Тиг Азр РНе Тнг Гей 5ег Пе Нів 65 70 75 80
Рго Маї Сім СіПи Спи Авр ТАг Аа Тнг Туг Туг Суз Сп Ні Зег Тр 85 90 95
Сі Пе Рго Ре ТАг Рне Сіу Сіу Спу Ти Гуз Геи Спи Пе Гув 50 100 105 110 «210» 69 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність 55 «220» «223» Синтетична конструкція «400» 69
Сім Ма! Меї І еи Маї Спи Зег СПу Спу СПУ Геи Маї Гув Рго СПу Спу 1 5 10 15 60 Бегі єи Гуз Г єи бег Суз Аа Аа 5ег Спу Рпе ТАг Рне Зег Зег Туг
20 25 зо ма! Меї 5ег Тгтр Маї Ага Сіп Тнг Рго Сім Гуз Агу Гей Си Тгр Маї 35 40 45
Аа Аа Пе Зег Спу Спіу Спу Авр Туг ТНг Туг Туг Рго Авр З5ег І єи 50 55 60
Гуз Спу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп Аїа Агд Авп ТнНг І єи Туг 65 70 75 80
Ї еи СіІп Меї 5ег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Меї Туг Туг Суз 85 90 95
Аа Аг Маї Авр Туг Авр Си Туг Зег РНе Сім Туг Ттр Спіу Сип СІу 100 105 110
Тиг Айва І еи Тиг Ма! бег Зег 115 «2105» 70 15. «2115 111 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 70
Азр Іе Маї І єи Тниг Сп Зег Рго Аа 5ег І ви Аа Маї 5ег І ви Спу 1 5 10 15
Сіп Ага Аа Тниг Пе 5ег Суз Агу Аа 5ег Си Зег Маї А5р Авп Туг 20 25 0) ау Пе бег Рпе Меї Авп Тгр РНе Сп Сп Гуз Рго Стпу Сп Рго Рго 35 40 45
Гуз Ге І єи Ме Туг Аїа Аа 5ег Авзп Сп Сіу Зег Спіу Маї Рго Аа 50 55 60
Агу Рпе 5Зег Спу Зег Сіу Зег СПу ТНиг А5р Рпе зег І еи Авп Іе Ніб 65 70 75 80
Рго Мег Спи Спи Авр Ар ТНг Аа Меї Туг Рне Суз Сіп Сп 5ег І ув 85 90 95
Сіи Маї Рго Тгтр ТНг Рпе Спу СПу Спу ТАг Гуз І ви Спи Пе Гув 100 105 110 «2105 71 «2115 107 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 71
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тпг Пе Тнг Суз Агу Аа Зег Сп СпПу Пе Зег Зег Туг 20 25 0)
Ї еи Ага Тр Туг СіІп Сп Гуз Рго Стпу Гуз Айа Рго Гуз І єи Геи Пе 35 40 45
Туг АІа Аа 5ег 5ег І єи Сп 5ег Спу Ма! Рго 5ег Агу Рне 5ег Спу 60 50 Бег Сіу бег Сіу Тиг Азр РНе ТНг Гей Тнг Пе 5ег Зег І еи Сп Рго 65 70 75 80 сій Авр РНе Аа Тнг Туг Туг Сув Сип Сп Туг Туг Зег Туг Рго Рпе 85 90 95
Тиг Рне Су Сіп Спу Тиг Гуз Маї Спи Пе Гув 55 100 105 «2105 72 «2115 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність бо «220»
«223» Синтетична конструкція «4005 72
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15 Авр Ага Маї Тит Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег Зег Зег Маї Азп РНе Пе 20 25 зо
Ні Тгтр Туг ап Сп Гуз Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз Рго Тгр Пе 5ег 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег 50 55 бо сСіу Зег Спу Тиг Азр Ре Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І и Сіп Рго Спи 65 70 75 80
Азр Ре Аа Тпг Туг Туг Суз Сип Сп Тер Зег 5ег Авп Рго Тгр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 7З «2115 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 7З
Азр Пе Сип Меї Тиг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа Зег Ма! Спу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег 5ег 5ег Ма! Азп РНе Іе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Сп Гуз Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз Рго Гей Пе Зег 35 40 45
Аа ТАг Зег Авп І єи Аа бег Су Маї Рго Зег Агу Рпе Зег Спіу Зег 50 55 60 сСіу Зег Спу Тиг А5р Ріе Тнг ГГ еи ТАг Пе Зег 5ег І еи Сп Рго Сіи 65 70 75 80
Азр Ре Аа Тпг Туг Туг Суз Сип Сп Тер Зег 5ег Авп Рго Тгр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 74 «2115 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 74
Авр Пе Сіп Меї Тнг Сп Зег Рго Зег Зег І еи Бег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег 5ег 5ег Ма! Азп РНе Іе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег 50 55 60 сСіу Зег Спу Тиг Азр Ре Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І и Сіп Рго Спи 65 70 75 80
Ав5р РІПє Аа Тиг Туг Туг Суз Сп Сп Тгр Зег Зег Аа Рго Тр Тиг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 75 60 0о«2115 112
«212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 75
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аіа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Ма! Бег Суз Гуз Аіа Зег Спу Туг Тиг Рпе Тнг Зег Туг 20 25 0)
ТупПе Ні5 Ттр Маї Ага Сп Аїа Рго Спу Сіп Спту Гей Спи Тгр Пе 35 40 45
Сіу Тгтр Пе Авп Рго Спу 5ег Спу Авп ТАг Азп Туг Аа Сіп Гуз Рпе 50 55 60
Сіп Спу Аг Маї Тк Пе Тниг Агу Авр ТНг Зег Тнг Зег Тнг Аа Туг /(65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Аа Ага Ре Азр Туг Тгтр Спу Сп Спу ТНг Гей Маї Тниг Маї Зег Зег 100 105 110 «2105 76 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 76
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аіа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї бег Суз І уз Аа Зег Спу Туг Тиг Ре Тнг Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сп Аїа Рго Спу СИПп Спу Геи Спи Тгр Пе
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Авр Сту Аа Аа Туг Авп Сп Гув Рпе 60 35 І уз Спу Агу Аа ТНг І єи Тнг Аа Ар Тнг бег ТНг бег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 40 100 105 110
Тиг Ге Маї Тнг Ма! 5ег Зег 115 «-2105 77 «2115» 119 45 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 77 50 сім Маї Сіп І еи Маї Сп Зег Спу Аа Сім Ма! Гуз Гуз Рго Сіу Аа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз ГГ уз Аа 5ег Спу Туг Тиг Ре Тнг Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сп Аїа Рго Спу СИПп Спу Геи Спи Тгр Пе 55 35 40 45
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Авр Сту Аа Аа Туг Авп Сп Гуз Ріе 50 55 60
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80 60 Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз
85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «2105» 78 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 78
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Сіу Аа 1 5 10 15
Зег Маї Гуз Ма! Зег Сувз Гуз Аа 5ег СПу Туг Тит Рпе Тниг Авр 5ег 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Аг Сіп Аїа Рго Спу Спіп Спу Геи Спи Тр Пе
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Спи Стпу Айа Аа Туг Авп ап Г ув Рпе 20 50 55 бо
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тниг Агу Ар ТНпг Зег ТНг Зег Тнг Аа Туг 65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95 25 Ти г Ага Сіу Туг Азр Туг Авр Туг Аа І єи Ар Туг Ттр Спу Сп Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «2105» 79 3000 «2115 113 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція 35 «4005» 79
Азр Іе Маї Меї Тнг Сп 5ег Рго Авр 56"! І єи Аа Маї 5ег І єи Спу 1 5 10 15
Сім Ага Аа Тниг Пе Авп Суз І уз Зег Зег Сп 5ег Ма! І єи Туг Зег 20 25 0) 40 Бег Авп Авп Гуз Авп Туг ГГ еи Аа Тгр Туг Сп Сіп Гув Рго Спу Сип 35 40 45
Рго Рго Гуз І єи Г еи Пе Туг Ттр Аа 5ег ТАг Агу Сіи Зег Спіу Маї 60
Рго Авр Аг Ріє 5ег Спіу Зег СПу Зег Сіу ТНг Авр РНе ТНг Геи ТНг 45 65 70 75 80
Пе Бег Зег І єи Сп Аа Си Авр Маї Аа Маї Туг Туг Сув Сіп Сип 85 90 95
Туг Туг Зег ТНг Рго Рпе Тниг Ріє Спу Сип Спу Тиг Гуз Маї Спи Пе 100 105 110 50 Гуз «210» 80 «2115 112 «212» ПРТ 55 -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 80
Сім Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Сіу Сіу Спу Геи Маї Сіп Рго Спу Спу 601 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аїа Аа 5ег Спіу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)
Аа Меї 5ег Тгтр Маї Ага Сіп Аа Рго СІу І уз С1пу І єи СИП Тер Маї 35 40 45 ау Аа Пе бег Зег Зег Сіу Бег Зег ТНг Туг Туг АІа А5р 5ег Маї 50 55 60
Гуз Спіу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп з5ег І уз Азп ТНг ГГ еи Туг 65 70 75 80
Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Аа Ага Ре Азр Туг Тгтр Спу Сп Спу ТНг Гей Маї Тниг Маї Зег Зег 100 105 110 «2105 81 «2115 106 15. к212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 81
Авр Пе Сіп Меї Тнг Сп Зег Рго Зег Зег І еи Бег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег 5ег Ага Маї Азп РНе Іе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег 50 55 60 сСіу Зег Спу Тиг Азр Ре Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І и Сіп Рго Спи 65 70 75 80
Абр РПє Аа Тиг Туг Туг Суз Сп Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Тр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 82 0«2115 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 82
Азр Пе Сип Меї Тиг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа бег Ма! СПУ 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тпг Пе Тнг Суз Агу Аа бег 5ег Зег Ма! Ні РНе Іе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Сіп Гуз Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз Рго ГІ еи Пе 5ег 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег 60 сСіу Зег Спу Тиг Азр Ріе Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег Гей Сіп Рго Сі 50 (65 70 75 80
Азр Ре Аа Тпг Туг Туг Суз Сип Сп Тер Зег 5ег Авп Рго Тгр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 55 «2105» 83 «2115 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» бо «223» Синтетична конструкція
«4005» 83
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа бег 5ег Зег Ма! Спи РНе Пе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег 50 55 60
Спіу бБег Спу ТНиг Азр РНе ТНг Гей Тнг Пе 5ег 5ег І еи Сп Рго Сім 65 70 75 80
Азр Ре Аа Тпг Туг Туг Суз Сип Сп Тер Зег 5ег Авп Рго Тгр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «210» 84 «2115 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 84
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15 А5р Аго Маї Тиг Пе Тниг Суз Аг Аа 5ег Зег Зег Маї А5п РНе Пе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег 35 40 45
Аа Тнг 5ег Ніз І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Ага Рне 5ег Сіу Бег 50 55 60 сСіу Зег Спу Тиг Азр Ре Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І и Сіп Рго Спи 65 70 75 80
Азр Ре Аа Тпг Туг Туг Суз Сип Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Тгр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 85 «2115 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 85
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег 5ег 5ег Ма! Азп РНе Іе 20 25 зо
Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег 35 40 45
Аа ТАг Зег Сі І єи Аа бег Сіпу Маї Рго Зег Агу Ре БЗег Спу Зег 50 55 60 сСіу Зег Спу Тиг Азр Ре Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І и Сіп Рго Спи 65 70 75 80
Азр Ре Аа Тпг Туг Туг Суз Сип Сп Тер Зег 5ег Авп Рго Тгр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «210» 86 «2115 106 60 0 «212» ПРТ
-213» Штвтучна послідовність «223» Синтетична конструкція «400» 86 Авр е Сіп Меї Тниг Сп Зег Рго Бег 5ег І еи Зег Аіа Зег Ма! Спу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег 5ег 5ег Ма! Азп РНе Іе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Сп Гуз Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз Рго Гей Пе Зег 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег 50 55 60 сСіу Зег Спу Тиг А5р Ріе Тнг ГГ еи ТАг Пе Зег 5ег І еи Сп Рго Сіи 65 70 75 80
Авр Ріє Аа ТНиг Туг Туг Суз Ні Сп Тр бег 5ег Авп Рго Ттр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «210» 87 20. «2115» 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція 25 «4005» 87
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег 5ег 5ег Ма! Азп РНе Іе 0)
Коо) Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег 60 сСіу Зег Спу Тиг Азр Ре Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І и Сіп Рго Спи 35 65 70 75 80
Азр Ре Аа ТАг Туг Туг Суз Сип Сп Тер Туг 5ег Авп Рго Тр Тиг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 40 «2105» 88 «2115 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» 45 «223» Синтетична конструкція «4005» 88
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег 5ег 5ег Ма! Азп РНе Іе 50 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег 50 55 60 55 Спіу бБег Спу ТНиг Азр РНе ТНг Гей Тнг Пе 5ег 5ег І еи Сп Рго Сім 65 70 75 80
Азр Ре Аа Тпг Туг Туг Суз Сип Сп Тер Гуз 5ег Авп Рго Тгр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув бо 100 105
«210» 89 «2115 106 «212» ПРТ 213» Штгтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 89
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Ар Аго Маї ТАг Пе Тниг Суз Аг Аа 5ег 5ег 5ег Ма! Азп РНе Пе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне бег Спу 5ег 50 55 бо сСіу Зег Спу Тиг Азр Ре Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І и Сіп Рго Спи 65 70 75 80
Азр Ре Аа ТАг Туг Туг Сувз Сип Сп Тер 5ег Пе Авп Рго Тр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 90 «2115 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 90
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа 5бег 5ег Зег Ма! Азп Ма! Пе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег 35 Аа ТАг Зег Авп І єи Аа бег Су Маї Рго Зег Агу Рпе Бег Спіу Зег 60 сСіу Зег Спу Тиг Азр Ре Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І и Сіп Рго Спи 65 70 75 80
Азр Ре Аа Тпг Туг Туг Суз Сип Сп Тер Гуз 5ег Авп Рго Тгр ТНг 40 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 91 «2115 106 45 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 91 50 Авр Пе Сіп Меї Тнг Сп Зег Рго Зег Зег І еи Зег Аа Зег Ма! Су 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа бег 5ег Зег Ма! Спи РНе Пе 20 25 0)
Ні Тгтр Туг ап Сіп Гуз Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз Рго І еи Пе Зег 55 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег 50 55 60 сСіу Зег Спу Тиг Азр Ріе Тнг Геи ТАг Пе Зег 5ег Геи Сп Рго Сі 65 70 75 80 60 Авр РНе Аїа Тиг Туг Туг Сувз Сп Сп Тер Туг Зег Авп Рго Тр Тиг
85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 92 «2115» 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 92
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа бег 5ег Зег Ма! Спи РНе Пе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег 35 40 45
Аа Тнг 5ег Ніз І єи Аа бег Сіу Ма! Рго 5ег Агу Рпе 5ег Сіу 5ег 50 55 60 сСіу Зег Спу Тиг Азр Ре Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І и Сіп Рго Спи 65 70 75 80
Азр Ре Аа ТАг Туг Туг Суз Сип Сп Тер Туг 5ег Авп Рго Тр Тиг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 93 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220»
Зо «223» Синтетична конструкція «4005» 93
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аіа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аіа бег Спіу Туг Тиг РНе Гуз Авр Зег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сп Аїа Рго Спу СИПп Спу Геи Спи Тгр Пе 35 40 45
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Азр Су Аа Аа Туг Авп Сп Гуз Рпе 50 55 60
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї еи Сіш І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Маї Зег Зег 115 «210» 94 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 94 ам Маї Сіп І еи Маї Сп Зег Спу Аа Сім Ма! Гуз Гуз Рго Сіу Аа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз ГГ уз Аа бег Спіу Туг Тиг РНе Агу Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сп Аїа Рго Спу СИПп Спу Геи Спи Тгр Пе бо 35 40 45
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Авр Сту Аа Аа Туг Авп Сп Гуз Ріе 50 55 60
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Гена єи бег Зег І єи Агу бег Спи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суб 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «2105» 95 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 95
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аа 1 5 10 15
Бе Маї Гуз Маї Зег Суз І уз Аіа бег Спу Туг Гуз Рне ТНг Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Аг Сіп Аїа Рго Спу Сп Спу Геи Спи Тр Пе 35 40 45
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Авр Сту Аа Аа Туг Авп Сп Гуз Ріе 50 55 бо
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95 /ТАг Ага сту Туг Азр Туг Авр Туг Аа І еи Авр Туг Тгр Спу Сип Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «2105» 96 0«2115 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 96
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Стпу АІа Спи Маї Гуз Гуз Рго Стпу Аіа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз ГГ уз Аа бег Спіу Туг Ага Рпе Тнг Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сіп Аа Рго Сіу Сіп Сіу Геи Спи Тер Пе 35 40 45
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Авр Сту Аа Аа Туг Авп Сп Гуз Ріе 60
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 50 (65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 100 105 110 55 ТНгІ еи Маї Тниг Маї Зег Зег 115 «210» 97 «2115» 119 «212» ПРТ 60 -213» Штвтучна послідовність
«223» Синтетична конструкція «4005» 97
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аіа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз ГГ уз Аа 5ег Спу Туг Тиг Ре Тнг Авр 5ег 20 25 зо
СІш Г еи Ні Тер Маї Агу Сп Айа Рго Спу СіПп СпПу Геи Спи Тр Пе 35 40 45 спу Спу Маї Авр Рго Спи Тнг Авр Су Айа Аа Туг Авп ап Г ув Рпе 50 55 60
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «210» 98 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 98
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аіа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз ГГ уз Аа бег Сіу Туг Тиг Рне ТНиг Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сп Аїа Рго Спу СИПп Спу Геи Спи Тгр Пе
Сіу Спу Маї Авр Рго Аа Тнг Авр Су Айа Аа Туг Авп ап Гу Рпе 60 35 Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї еи Сі Ї єи Зег 5ег І єи Ага бег Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Сув 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 40 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! 5ег Зег 115 «210» 99 «2115» 119 45 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 99 50 сім Маї Сіп І еи Маї Сп Зег Спу Аа Сім Ма! Гуз Гуз Рго Сіу Аа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз ГГ уз Аа 5ег Спу Туг Тиг Ре Тнг Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сп Аїа Рго Спу СИПп Спу Геи Спи Тгр Пе 55 35 40 45
Сіу Спу Маї Авр Рго Сіли ТАг Азр Су Аа РНе Туг Авп ап ГГ ув Рпе 50 55 60
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80 60 Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз
85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «2105» 100 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 100
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аіа 1 5 10 15
Зег Маї Гуз Ма! Зег Сувз Гуз Аа 5ег СПу Туг Тит Рпе Тниг Авр 5ег 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Аг Сіп Аїа Рго Спу Сп Спу Геи Спи Тгр Пе 35 40 45
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Авр Сту Аа Аа Туг Авп Сп Гуз Ріе 20 50 55 бо
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95 25 ТНг Ага Сіу Туг Азр Туг Авр Іе Аа Г еи Авр Туг Ттр Спу Сіп Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «2105» 101 00«2115 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 101
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Спу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Сіпу Аїа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз ГГ уз Аа 5ег Спу Туг Тиг Ре Тнг Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сіп Аа Рго Сіу Сіп Сіу Геи Спи Тер Пе 35 40 45
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Авр Сту Аа Аа Туг Авп Сп Гуз Ріе 50 55 бо
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг Зег ТНг Зег Тиг Аа Туг 65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Ар Туг Рго І єи Авр Туг Ттр Спу Сп Спу 100 105 110 ТАгІ еи Маї Тниг Маї Зег Зег 115 «2105» 102 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 102
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аіа 601 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа 5ег Спіу Туг Гув Ре Гуз Авр 5ег 20 25 зо
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сп Аїа Рго Спу СИПп Спу Геи Спи Тгр Пе 35 40 45 ау ау Маї А5р Рго Спи Тнг Авр Су Айа Аа Туг Авп ап Г ув Рпе 50 55 60
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «2105 103 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 103
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аіа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бЗег Спіу Туг Гув Рпе Агу Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сп Аїа Рго Спу СИПп Спу Геи Спи Тгр Пе
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Азр Су Аа Аа Туг Авп Сп Гуз Рпе 60
Коо) Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї еи Сі Ї єи Зег 5ег І єи Ага 5ег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Сув 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 35 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! 5ег Зег 115 «210» 104 «2115» 119 40 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 104 45 Си Маї Сіп І еи Маї Сп Зег Спу Аа Сім Ма! Гуз Гуз Рго Сіу Аа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз ГГ уз Аа б5ег Спіу Туг Тиг РНе Гуз Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сп Аїа Рго Спу СИПп Спу Геи Спи Тгр Пе 50 35 40 45
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Спи Стпу Айа Аа Туг Авп ап Г ув Рпе 50 55 60
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80 55 Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег бо 115
«2105 105 «2115 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 105
Азр Пе Сип Меї Тиг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! Спу 1 5 10 15
Авр Ага Маї ТАг Пе Тнг Суз Ага Аа 5ег Зег Зег Ма! Спи РНе Пе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Сіп Гуз Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз Рго Геи Пе 5ег 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег 50 55 бо сСіу Зег Спу Тиг Азр Ріе Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І єи Сп Рго Сі 65 70 75 80
Азр Ре Аа ТАг Туг Туг Сувз Сип Сп Тер Туг Зег Аа Рго Тр Тиг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 106 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 106
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Аіа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа 5ег Спіу Туг Гув Ре Гуз Авр 5ег 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Агу Сп Аїа Рго Спу СИПп Спу Геи Спи Тгр Пе 35 Спіу Спу Маї Авр Рго Спи Тнг Си Спу Аа Аа Туг Авп Сп Гуз Рпе 60
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 40 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Тр Спу Сип Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 45 -2105» 107 «2115» 119 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» 50 «223» Синтетична конструкція «4005» 107
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Стпу Аа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа 5ег Спіу Туг Гув Рпе Агу Авр 5ег 55 20 25 0)
Сім Меї Ніз Тгр Маї Аг Сіп Аїа Рго Спу Сп Спу Геи Спи Тр Пе 35 40 45
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Спи Стпу Айа Аа Туг Авп ап Г ув Рпе 50 55 60 (510) Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тнг Агу Ар ТНг 5ег Тиг Зег ТНг Аа Туг
65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Тпиг Агу сапу Туг Авр Туг Авр Туг Ага Геи Авр Туг Ттр Спу Сп Спу 100 105 110
Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 -2105» 108 «2115» 106 «2125» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 108
Авр Іе Сп Меї Тнг Сп Зег Рго Зег Зег І єи 5ег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Агу Аа бег 5ег Зег Ма! Спи РНе Пе
Зо
Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег 20 35 40 45
Аа Тнг 5ег Ніз І єи Аа бег Сіу Ма! Рго 5ег Агу Рпе 5ег Сіу 5ег 50 55 бо сСіу Зег Спу Тиг Авр Ріе Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І еи Сп Рго Спи 65 70 75 80 25 Ар РІПє Аа Тиг Туг Туг Суз Сп Сп Тгр Туг Зег Аа Рго Тр ТНг 85 90 95
Рпе Стпу Сп Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 -2105» 109
Зо «2115 10 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 109
Сіу Тут Тиг Рпе Тнг Авп Туг Спу Меї Авп 1 5 10 «210» 110 «2115 17 «2125» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «220» «2215 МІБС ГЕАТОВЕ «реа» (13)..413) «223» Хаа представляє собою Азвр або сіи «400» 110
Тер Пе Авп ТАг Туг Тиг Спу Спи Тиг ТАг Туг Аа Хаа Азвр Ре Гуз 1 5 10 15 спіу «2105 111 «-2115 6 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «220» 60 0о«221»5 МІБС ГЕАТОВЕ
«222» (5)..(5) «223» Хаа представляє собою Азп або Зег «4005 111
Сім СЧіу Спу Маї Хаа Авп 1 5 «2105 112 «2115 11 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «220» «221» МІЗС ГЕАТОВЕ «222» (5)..(5) «223» Хаа представляє собою Ар або 5ег «220» «221» МІЗС ГЕАТОВЕ «222» (7)..(7) «223» Хаа представляє собою Азвр або сіи «220» «221» МІЗС ГЕАТОВЕ «222» (8)..(8) «223» Хаа представляє собою Азр або Зег «-4005 112
Пе Тнк Зег Тнг Хаа Іе Хаа Хаа Ар Меї Авп 1 5 10 «2105 113 «2115 7 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 113
Сіу Спу Азп Тпг Гей Агу Рго 1 5 «2105» 114 «2115» 9 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «220» «221» МІЗС ГЕАТОВЕ «222» (4).(4) «223» Хаа представляє собою Ар або Сі «4005» 114
Ї еи Сп Зег Хаа 5ег І еи Рго Туг ТНг 1 5 -2105 115 «2115 17 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 115
Тер Пе Авп ТАг Туг Тнг Спу Спи Тиг ТАг Туг Авіа Авр Авр Ре Гуз 1 5 10 15 спіу 60 «2105 116
«-2115 6 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 116
Сі Сіу Сіу Ма! Абп Авп 1 5 «2105 117 «2115 11 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 117
Пе Тиг Зег ТНг Авр Іе Авр Азр Азр Меї Авп 1 5 10 «2105» 118 «2115» 9 200 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 118 25 Гей Сп бЗег Авр 5ег І єи Рго Туг ТНг 1 5 «210» 119 «2115 115 «2125» ПРТ 30 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 119
Сі Маї Сип І єи Маї Сип Зег Сіу Рго Спи Гей Гуз Гуз Рго Сіу Аа 35 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Спу Туг Тиг Рпе Тнг Авп Туг
Зо
Сіу Меї Авп Тр Маї Аго ап Аа Рго Спу Спп СПу Геи Спи Тгтр Меї 40 ау Тер Пе Авп Тит Туг ТАг Спу Спи ТАг Тнг Туг Авіа Авзр Ар Ріе бо
Гуз Спу Агу РНе Маї Рне 5ег ей Авр ТНг Зег Ма! бег Тнг Аа Туг 65 70 75 80
Ї еи СіІп Пе 5ег Зег І еи І уз Аа Спи Ар ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 45 85 90 95
Сім Ага Спи Сту Спу Ма! Авп Авп Ттр Сіу Сп Су Тк Геи Маї ТнНг 100 105 110 маї Зег Зег 115 50 «210» 120 «2115» 106 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» 55 «223» Синтетична конструкція «400» 120
Азр Іе Сп Ма! ТАиг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Ар Аг Маї Тниг Пе Тниг Суз Пе Тиг Зег ТНиг Авр Пе Авр Ар Авр бо 20 25 Зо
Меї Авп Тгр Туг Сп Сп Гуз Рго Спу Гуз Маї Рго Гуз І єи Г еи Пе 35 40 45 зЗег Сіу Сіу Авп ТНг Гей Агу Рго Стпу Маї Рго 5ег Агу Рпе 5ег Спу 50 55 60
Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе Зег 5ег І єи Сп Рго 65 70 75 80
Сім Авр Маї Аа Тиг Туг Туг Сувз І ви Сп Зег Авр Зег І єи Рго Туг 85 90 95
Тиг Рне Саіу Сип ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 121 «2115 480 «2125 ПРТ «213» Ното зарієп5 «400» 121
Меї Сіп Пе Рго Агу Аїа Аа І єп Г еи Ріо! еп! еиГец її еи ГГ еи Ї єи 1 5 10 15
Аа Аа Рго Аїа 5ег Аа Сп І єи Бег Агу Аа Стпу Агу зЗег Аа Рго 0) 20 Ї еи Аа Аа Стпу Сув Рго Авр Ага Суз Сім Рго Аа Ага Суз Рго Рго 35 40 45
Сіп Рго Спи Ніз Сув Спи Спіу СпПу Агу Аа Агу Авр Аа Суз СПу Су 50 55 60
Суз Сіи МаїЇ Сувз Сіу Аа Рго Спи Сіу Аа АІа Суз Спу Ї ей Спи Спи 25 Х65 70 75 80
Спу Рго Сувз Спіу Спи Спу Гей Сп Сувз Маї Ма! Рго РНне Сіу Маї Рго 85 90 95
Аа 5ег Аа Тиг Маї Ага Аг Ага Аїа Сп Аїйа Сіу І еи Суз Ма! Суб 100 105 110
Аа бег 5ег Сім Рго Ма! Сув СПу Зег Азр Аа Авп ТНг Туг Аа Авп 115 120 125
Ї еи Суз ап І єи Ага Аа Аїа 5ег Агу Аго 5ег Сім Агу І єи Нів Ага 130 135 140
Рго Рго Маї Пе Маї І єи Сип Агу Спу Аіа Суб Спу СіІп Спу Сп Спи 145 150 155 160
Авр Рго Авп 5ег Гей Аг Ні Гуз Туг Азп РНе Іе Аїа Ар Маї Маї 165 170 175
Сі Гуз Пе Аа Рго Аа Маї Маї Ніз Пе Спи І еи Ре Ага Гуз І єи 180 185 190
Рго РНе 5ег Гуз Аг Сіи Маї Рго Маї Аіа Зег Спіу бег Спу Ре Пе 195 200 205 ма! Зег Си Азр Су І ей Пе Маї Тнг Авп Аїа Ніз Маї Ма! Тнг Авп 210 215 220
Гуз Ні Агу Маї Гуз Маї Сім Геи Гуз Авзп Сту Аа ТАг Туг Спи Аа 225 230 235 240
Гуз Пе Гуз Авр Маї Азвр Сім Гуз Аа Авр Іе Аїа ГГ еи Іе Гуз Пе 245 250 255
Авр Ніз Сіп Су Гуз І еи Рго Маї Геи І єи Гей Спу Агу Зег Зег Си 260 265 270
Ї еи Агу Рго Сіу Си РНе Маї Маї Аа Пе Спу Зег Рго РНе 5ег і єи 275 280 285
Сіп Авп ТНг Маї Тиг ТАг Спу Пе Маї 5ег ТАг ТНг Сип Агу Спу Спу 290 295 00
Гуз Спи Геи слу І ви Ага Авп 5ег Ар Меї Азр Туг Пе Сіп ТАг Азр 305 з10 315 з20
Аа Іе Пе Авзп Туг Спу Авп 5ег Сіу Спу Рго І єи Маї Авп І еи А5р 325 330 335
Сіу Спи Ма! Пе Спу Пе Авп ТНг ГГ еи Гуз Маї Тнг Аа Слу Пе Зег 340 345 350 (510) Рпє Аїа Іе Рго 5ег Авр Гуз Пе Гуз І уз РНе ГГ еи Тнг Спи 5ег Нів
355 збо 365
Азр Аго ап Аа Гуз Спу Гуз Аа Пе Тиг Гуз Гуз Гуз Туг Пе Спу 370 375 80
Пе Агу Меї Меї 5ег І єи Тнг 5ег з5ег І уз Айва І уз Спи І ей Гуз Азр 385 390 395 400
Ага Ніз Агд Ар Ре Рго Азр Маї Іе бег Стіу Аа Туг Пе Пе Спи 405 до 415 ма! Ме Рго Азр ТНг Рго Аа Спи Аа Спу Спу І єи Гуз Спи Авп Ар 420 425 430
Ма Пе Пе Зег Пе Авзп Спу Сп Зег Ма! Ма! Зег Аа Ап Азр Маї 435 440 445 зЗег А5р Ма! Пе Гуз Агу Спи бег ТНг І єи Азп Меї Маї Маї Агу Аг 450 455 460
Сіу Азп Си Авр Пе Меї Іе Тнг Ма! Пе Рго Сім Спи Пе Авр Рго 465 470 475 480 «2105 122 «2115» 4 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 122
Сузв Рго Рго Суз 4 «2105» 123 «2115 17 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220»
Зо «223» Синтетична конструкція «400» 123
Сіу Ма! Авр Рго Сім Тниг Авр Су Аа Аа Туг Авп Сіп Гуз Рпе Гуз 1 5 10 15 спіу «2105» 124 «2115 10 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 124
Аг Аа 5ег Зег 5ег Ма! Авп Ре Пе Нів 1 5 10 «2105» 125 «2115» 9 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 125
Сіп Сп Тер Зег 5ег Авп Рго Тгр ТНг 1 5 «210» 126 «2115» 253 «2125» ПРТ «213» Ното зарієп5 «400» 126
Меї Ні 5ег Тгтр Сіи Агу Гей Айа Маї І еи Ма! І ей І єи Су Аа Аа бо 1 5 10 15
Аа Суз Айа Аа Рго Рго Аго Стпу Ага Пе Геи Спіу Спу Агу Сім Аа 20 25 0)
Сім Аа Ні АЇа Агу Рго Туг Меї Ага 5ег Маї Сіп Гей Авп Спу Аа 35 40 45 Нізі єи Суз Спу Сіу Маї І єи Маї Аа Спи СіІп Тр Маї І еи 5ег Аа 50 55 60
Аа Ні Суз І єи Си Авр Аа Аа Азр Су І уз Маї Сіп Ма! І єи І єи 65 70 75 80
Су Аїа Ні 5ег І еи Зег Сп Рго Спи Рго зе" Гуз Агу І єи Туг Авр 85 90 95
Маї Гей Агу Аїа Маї Рго Ні Рго Ар Зег Сп Рго Авр Тпг Пе Авр 100 105 110
Ніз Арі еп еп еи ЇЇ еи Стій І єи бег Спи Гуз Аа ТНг І ви Спу Рго 115 120 125
Аа Маї Агу Рго І єи Рго Тгтр Сп Аго Маї Авр Агу Азр Маї Аа Рго 130 135 140
Сіу Ти еи Суз Авр Маї Аа Сіу Тгтр Су Пе Маї Авп Ніз Аіа Спу 145 150 155 160
Аг Агу Рго Азвр 5ег І єм Сп Нів Маї І еи І еи Рго Маї Геи Авр Агд 165 170 175
Аа Тиг Суз Авзп Аго Ага ТНг Ніз Нів Ар Сту Аа Пе Тнг См Аго 180 185 190
Ї єи Меї Суз Аа Сім бег Азп Агу Ага Авр 5ег Суз І уз СпПу Авзр 5ег 195 200 205
СіІу Су Рго І єи МаїЇ Суз Спу Спу Ма! І єи Спи Спіу Маї Ма! Тнг 5ег 210 215 220
Сіу Зег Агу Маї Суз Стпу Авп Аг Гуз Гуз Рго Спу Пе Туг ТНиг Ага 225 230 235 240 маї Ага 5ег Туг Аа Аа Тгр Іе Азвр 5ег Маї І еи Аа
Ко) 245 250 «2105» 127 «2115 115 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 127
Сп Маї Стій Ї ви Сп Стій бег Спу Аа Сі І єи Маї Гуз Рго Сіпу Аїа 1 5 10 15
Бе Маї Гуз І ви Зег Сувз І уз Аа 5ег Спу Туг Тит Ріє Тнг Зег Туг 20 25 0)
Туг Меї Туг Ттр Маї Гуз Сіи Ага Рго Спу Спіп Спу Геи Спи Тер Пе 35 40 45 сСіу Спи Пе Авп Рго ТНг Авп Спу Спу Тпг Авзп Ріє Авп Си Гув Ріе бо
Гуз Зег Гуз Аа ТНАг ГГ еи Тнг Маї Авр Тнг Зег Зег Азп ТНг Аїа Туг 65 70 75 80
Меї ап І єи Зег 5ег І єи ТНг бег Сім Авр 5ег Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95 50 Аа Агу Сіи Спіу Спу РНє Аа Туг Ттр Сіу Сип Спу Тиг ГГ єи Маї ТНг 100 105 110 маї Зег Аа 115 «2105» 128 55 «2115 107 «2125 ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція 60 «400» 128
Азр Іе Маї Меї Тниг Сп 5ег Сіп Гув Рпе Меї 5ег ТАг Зег Маї Спу 1 5 10 15
Азр Аг Ма! 5ег Ма! Тниг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авп Маї А5р Тиг Авр 20 25 0)
Маї Аіа Тгтр Ре Сп Сп Гуз Рго Спу Сп 5ег Рго Агу Су Геи Пе 35 40 45
Туг Зег Аа Зег 5ег Ага Туг Зег Спу Маї Рго Авр Ага Рпе ТАиг Спу 50 55 60
Зег Сіу Зег Сіу ТНиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе 5ег Азп Маї Сіп 5ег 1065 70 75 80
Сім Авр І єм Аа Спи Туг Рне Суз Сіп Сп Туг Авп Авп Туг Рго Гей 85 90 95
Тиг Ре ау Зег СпПу Тиг Гуз Маї Сім Пе Гув 100 105 «210» 129 «211» 464 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 129
Меї СІу Ттр Зег Суз Ге Іе І єи РНе І єм Маї Аа Тнг Аа Тнг Спу 1 5 10 15
Аа Туг АІа Сіп Маї Стій Ї ви Сп Сп бег Спу Аа Сі І еи Маї ГГ ув 20 25 0)
Рго Сту Аа 5ег Маї Гуз І еи Зег Суз ГІ ув Аа 5ег Спу Туг Тиг Рпе 35 40 45
Тниг Зег Туг Туг Меї Туг Тгр Ма! Гуз Спи Ага Рго Спу Сип Сну Гей 50 55 60 сім Тер Пе Спу Спи Пе Авп Рго Тнг Авп Стпу Спу ТАг Авп Рне Авп 65 70 75 80
Сім Гуз РНе Гуз 5ег І уз АІа ТНг Гей Тнг Маї Азр ТНг 5ег 5ег Авп 85 90 95
Тиг Ага Туг Меї Сп Геи Зег Зег І ви ТНг Зег Сім Авр Зег Аа Маї 100 105 110
Туг Туг Сув Аа Ага Спи СПу Спу Ре Аа Туг Ттр Сіу Сип СІу ТНг 115 120 125
Ї еи Маї Тнг Маї Зег Аа Аа 5ег ТАг Гуз Спу Рго Зег Маї Ріє Рго 130 135 140
Ї еи Аа Рго 5ег Зег Гуз Бег Ти Бег Спу Спу ТНиг Аїа Аа І еи Су 145 150 155 160
Сувз І єи Ма! Гуз Азр Туг РНе Рго Сіи Рго Маї Тнг Маї Зег Ттр Авп 165 170 175 зЗег Сіу Аа І еи ТАг Зег Сіу Маї Ні5 Тнг Ріє Рго Аа Маї І ви Сип 180 185 190
Зег Зег Спу І ей Туг 5ег І ви бег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег Зег 195 200 205 зег І ви Спу Тиг Сп Тиг Туг Пе Сувз Авп Маї Авп Нізв ГГ ув Рго Зег 210 215 220
Авп ТАг Гуз Маї Азвр Гуз Гуз Маї Сім Рго Гуз Зег Су Авр Гуз ТИг 225 230 235 240
Ні5 Тниг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сім Геи І ви СПу Спу Рго Зег 245 250 255
Маї Рне Геи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТАг І еи Меї Пе 5ег Ага 260 265 270
ТАг Рго Си Маї Тиг Суз Маї Маї Ма! Азр Маї 5ег Ніз Спи Авр Рго 275 280 285
Сім Ма! Гу5 Рне Азп Тгр Туг Маї Азр ау Маї Спи Маї Ні Азп Аа 290 295 00 (510) Гуз Тнг Гуз Рго Ага Спи См Сп Туг Авп Зег ТАг Туг Ага Маї Ма!
305 з10 315 з20 зег Ма! І єм Тниг Ма! І єи Ніз Сип Авр Тгр Геи Авп Стпу Гуз Спи Туг 325 330 335
І уз Суз І уз Ма! Зег Авп І уз Аа І єм Рго Аа Рго Пе Спи Гуз ТНг 340 345 350
Пе Зег Гуз Аа Гуз СПу Сип Рго Ага Сім Рго Сіп Маї Туг Тиг Гей 355 360 365
Рго Рго 5Зег Агу Спи Спи Меї Тниг Гуз Авп Сп Ма! Зег І ви Тиг Сув 370 375 380
Ї еи Ма! Гуз Спу Рне Туг Рго 5ег Азр Іе Аа Ма! Спи Тер СПИ 5ег 385 390 395 400
Азп Стпу Сп Рго См Авп Авп Туг Гуз Тег Тйг Рго Рго Ма! І еи Азр 405 до 415 зЗег Авр Сіу Зег РНе Ріє І єм Туг Зег Гуз І єи Тнг Маї Азр Гуз Бег 420 425 430
Аг9 Тр Сп Сп Спу Авп Маї Рпе Зег Суз Зег Ма! Меї Ніз Сім Аа 435 440 445
Ї еи Нів Авп Ніз Тут Тиг Сп Гув 5ег І еи Зег І єи Зег Рго Сіпу Гув 450 455 460 «2105» 130 «2115 233 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 130
Меї СІу Ттр Зег Суз Ге Іе І єи РНе І єи Маї Аа Тнг Аа Тиг Су 1 5 10 15 маї Ні Зег Азр Пе Ма! Меї Тнг ап Зег Сіп Гу5 Рпе Меї Зег ТНг 20 25 0) зЗег Ма! Спу Азр Агу Маї 5ег Маї Тнг Суз І уз Аа 5ег СіІп Авп Маї
Азр Тпиг Авр Маї Ага Тр Рне Сп Сп Гув Рго СпПу Сип 5ег Рго Ага 60 35 спіуГеи Пе Туг бег Аа бег Зег Агу Туг Зег Спу Маї Рго Авр Ага 65 70 75 80
Рпе Тниг апу Зег Спу Зег Спіу Тиг Авр РНе ТНг І єи ТАг Пе Зег Авп 85 90 95 маї Сіп Бег Спи Авр ГГ еи Аа Сім Туг Рпе Суз Сп Сп Туг Абп Авп 40 100 105 110
Туг Ро Геи Тиг Ре Сіу Зег Спу Тниг Гуз Ма! Спи Пе Гуз Агу Тиг 115 120 125 маї Аа Аа Ро 5ег Маї РНе Іе Ре Рго Рго 5ег Азр Сіи Сіп І ей 130 135 140 45 Гуз 5ег СпПу ТНг Аа 5ег Маї Маї Сув І єи Геи Авп Авп РнНе Туг Рго 145 150 155 160
Аго Си Аїа Гуз Маї Сіп Тер Гуз Маї Авр Авп Аїа І єи Сіп 5ег Спу 165 170 175
Авп Зег Сп Спи Зег Ма! Тиг Спи Сп Авр зег І уз Авр Зег ТАг Туг 50 180 185 190 зегі ви Бег Зег ТигГеи ТНг І єи Зег Гуз Аа Авр Туг Сти Гуз Нів 195 200 205
Гуз Маї Туг АІа Суз Спи Маї Тнг Ні Сіп Су І еи Бег Зег Рго Маї 210 215 220 55 ТигГув 5ег Ре Азп Ага сапу Сім Сув 225 230 «2105» 131 «2115 115 «212» ПРТ 60 -213» Штвтучна послідовність
«223» Синтетична конструкція «400» 131
Сі Маї Сип І єи Маї Сип Зег Сіу Рго Спи Гей Гуз Гуз Рго Сіу Аа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Спу Туг Тиг Рпе Тнг Авп Туг 20 25 0)
Сіу Меї Авп Тр Маї Аго ап Аа Рго Спу Спп СПу Геи Спи Тгтр Меї 35 40 45 сапу Тер Пе Авп Тит Туг Тиг Спу Спи ТАг Тнг Туг Авіа Спи Авр Ре 50 55 60
Гуз Спу Агу РНе Маї Рне 5ег ей Авр ТНг Зег Ма! бег Тнг Аа Туг 65 70 75 80
Ї еи СіІп Пе 5ег Зег І еи І уз Аа Спи Ар ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Сім Ага Спи Сту Спу Ма! Авп Авп Ттр Сіу Сп Су Тк Геи Маї ТнНг 100 105 110 маї Зег Зег 115 «2105» 132 «2115 115 «2125 ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 132
Сі Маї Сип І єи Маї Сип Зег Сіу Рго Спи Гей Гуз Гуз Рго Сіу Аа 1 5 10 15 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Спу Туг Тиг Рпе Тнг Авп Туг
Ко) 20 25 Зо
Сіу Меї Авп Тр Маї Аго ап Аа Рго Спу Спп СПу Геи Спи Тгтр Меї
Сіу Тгтр Пе Азп Тиг Туг Тиг Спу Спи ТНг ТНиг Туг Авіа Сім Авр Рпе 60 35 Гуз Спу Агу РНе Маї Рне 5ег ей Авр ТНг Зег Ма! бег Тнг Аа Туг 65 70 75 80
Ї еи СіІп Пе 5ег Зег І еи І уз Аа Спи Ар ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95 сій Ага Спи сту Спу Ма! Зег Азп Тгтр Спу Сип СТу ТАг єи Маї ТНг 40 100 105 110 маї Зег Зег 115 «2105 133 «2115 106 45 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 133 50 Ав5р Іе Сп Ма! ТНг Сп бег Рго Зег Зег І ви 5ег Аа 5ег Маї СпПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тпг Пе Тнг Суз Пе Тиг 5ег Тиг Авр Іе Сім Зег Авр 20 25 0)
Меї Авп Тгр Туг Сп Сп Гуз Рго Спу Гуз Маї Рго Гуз І еи ГГ єи Пе 55 35 40 45 зЗег Сіу Сіу Авп ТНг Гей Агу Рго Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Бег Спу 50 55 60
Зег Сіу Зег Сіу ТНиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе бЗег 5ег І еи Сп Рго 65 70 75 80 60 Спи Авр Маї Аа Тиг Туг Туг Сувз І еи Сп Зег А5р 5ег І єи Рго Туг
85 90 95
Тиг Рне Саіу Сип ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 134 «2115» 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 134
Азр Іе Сп Ма! ТАиг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тпг Пе Тнг Суз Пе Тиг 5ег Тиг Авр Іе Сім Зег Авр 20 25 0)
Меї Авп Тгр Туг Сп Сп Гуз Рго Спу Гуз Маї Рго Гуз І єи Г еи Пе 35 40 45 зЗег Сіу Сіу Авп ТНг Гей Агу Рго Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Бег Спу 50 55 60
Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе Зег 5ег І єи Сп Рго 65 70 75 80
Сім Авр Маї Аа Тнг Туг Туг Суз І єи Сп бег Спи 5ег І єи Рго Туг 85 90 95
Тиг Рне Саіу Сип ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 135 «-2115» 106 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220»
Зо «223» Синтетична конструкція «400» 135
Азр Іе Сп Ма! ТАиг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Азр Аг Маї Тпг Пе Тнг Суз Пе Тиг Зег ТАг Зег Пе Сіи Зег Авр 20 25 Зо
Меї Авп Тгр Туг Сп Сп Гуз Рго Спу Гуз Маї Рго Гуз І єи Г еи Пе 35 40 45 зЗег Сіу Сіу Авп ТНг Гей Агу Рго Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Бег Спу 50 55 60
Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе Зег 5ег І єи Сп Рго 65 70 75 80
Сім Авр Маї Аа Тнг Туг Туг Суз І еи Сп бег Авр Зег І еи Рго Туг 85 90 95
Тиг Рне Саіу Сип ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 136 «2115 115 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична конструкція «400» 136
Сіп Пе Сп Гей Маї Сип бег Спу Ріо Сім І єи Гуз І ув Рго Спіу СИ 1 5 10 15 Тиг Маї Гуз Пе Зег Сувз Гуз Аа 5ег СПу Туг ТАг Рне Тнг Азп Туг 20 25 зо
Сіу Меї Авп Тр Маї Гуз Сп Аа Рго Сту Гуз СПУ І еи Гуз Ттр Меї 35 40 45
Сіу Тгтр Пе Азп Тиг Туг Тиг Спу Спи ТНг Тнг Туг Авіа Азр Авр Ре бо 50 55 60
Гуз Спу Агу РНе Маї Рне 5ег І еи Спи Тнк 5ег АІа 5Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї еєи Спи Пе Авп Авт І єи І уз Авп Сім Авр Меї Аа Тнг Туг Рне Суз 85 90 95 ам Агу Сім Спу СПу Ма! Авр Авп Тр Спу Сип Спу ТАг ТНг Гей Тег 100 105 110 маї Зег Зег 115 «2105» 137 «2115 107 «2125» ПРТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 137
Сім Те Тк Маї Тиг Сп 5ег Рго Аа 5ег І єи Зег Меї Аа Пе Спу 1 5 10 15
Сім Гуз Ма! Тит Пе Аго Суз Пе Тиг Зег ТНиг Азр Пе Азр Авр Авр зо 20 Меї Авп Тр Туг Сп Сп Гуз Рго Сіу Сім Рго Рго Гуз І єи І єи Пе 35 40 45
Зег Сіу Спіу Авп ТНг І єи Ага Рго Сіу Маї Рго бег Агу РНе 5ег 5ег 50 55 бо
Зег Спіу Туг Спу Аіа Азр Ріє Маї РНне Тнг Пе Азр Азп Меї І єи бЗег 25 Х65 70 75 80
Сім Авр Маї АІа Азр Туг Туг Суз І еи Сип бег Авр Авп І єи Рго Туг 85 90 95
Тиг Ре Сіу Спу Спу ТАг Аг І єи Спи Пе Гув 100 105 «2105» 138 -4005» 138 000 «2105» 139 «2115 23 0«212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 139 шунаїсс асскіддідс їдс 23 «2105» 140 «2115» 19 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 140 діадаадно йсаадаад 19 «2105 141 «2115 22 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 141 сагдісатад ісасідгсіс ад 22 «2105 142 «2115 21 «212» ДНК 60 213» Штучна послідовність
«223» Синтетична конструкція «4005 142 даддсассіс садаюнаа с 21 «2105» 143 «2115» 23 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 143 асідсісасі ддаюаао9зд аад 23 «2105» 144 «211» 47 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 144 дсаасідсаа сіддадіаса Нсасаааїї днсісіссс ацдісісс 47 «2105» 145 «211» 44 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 145 доаагасадії ддідсадсаї садсссдіїї дашссадс пад 44 «2105» 146
Зо «211» 47 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 146 дсаасідсаа сіддадсдіа сдсссаддіс садсюсадс адісідад 47 «210» 147 «211» 48 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 147 дадсссндо ддадосіда ддадасоадід асідаддне сндассс 48 «2105» 148 «211» 47 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 148 дсаасідсаа сіддадіаса Псааасаїйї дддідассс ааїсісс 47 «2105» 149 «211» 44 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 149 60 доаагасадиії ддідсадсаї садсссдсі ташссадс Н9а 44
«2105» 150 «2115 53 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 150 дсаасідсаа сідчадсдіа сдссдадаїд аадсіддідо ааісідвддда ада 53 -2105 151 «2115» 46 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 151 дадсссндо9 ддадосіда ддадасодід асідсддне сідассс 48 «-2105 152 «2115 10 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетический пептид «220» «221» МІЗС ГЕАТОВЕ «2235 М-кінц. Мса «220» «2215 МОО ВЕ5 «222» (9)..(9) «223» ІГув(ОМР) «4005» 152
Пе Аго Аг Маї Зег Туг Зег РНе Гуз ГГ ув 1 5 10 2105 153 «2115» 234 0«212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 153
Меї Гуз Ніз Сип Ні Сіп Нів Сп Нів Сіп Ні Сип Нів Сип Меї Ніб 1 5 10 15
Сіп Зег ТАг Аїа Аа Аа Спу Сип Спу Сип Спи Авр Рго Авп з5ег ей 20 25 зо
Ага Ніз Гуз Туг Азп Ре Пе Аїа Азвр Маї Ма! Сім Гуз Пе Аа Рго 35 40 45
Аа Маї Маї Ні Пе Сі І еи Туг Ага Гуз ГГ еи Рго Ре Зег Гуз Аг9 бо
Сіи Маї Рго Маї Аа бег Спу Зег Сіу Ре Пе Маї Зег Спи Авр Спу 65 70 75 80 50 Ї еи Пе Маї Тк Авп Аїа Ні Маї Ма! Тнг Авп Гуз Азп Агу Маї І ув 85 90 95 маї спи Геи Гуз Авп Сту Аа ТАиг Туг Спи Аїа Гуз Пе Гуз Авр Маї 100 105 110
Азр Сл Гуз Аа Азр Пе Аїа ГГ еи Іе Гуз Пе Авр Нів Сітп Спу Гув 55 115 120 125
Ї еи Рго Маї Геи І єи Ї єи Спу Агу Зег 5ег Си Гей Агу Рго Спіу Спи 130 135 140
РНе Маї Маї Аа Пе Спу бег Рго Рне 5ег І єи Сіп Азп ТНг Маї Тиг 145 150 155 160 60 Тнгапу Пе Маї Зег Ти Тнг ап Агу Спу Спу Гуз Спи Гей Спу Ге
165 170 175
Агу Авп 5ег Азр Меї Азвр Туг Пе Сіп Тиг Авр Аїа Іе Пе Авп Туг 180 185 190
Сіу Азп бег Сіу Спу Рго І еи Маї Авп ГГ еи Авр Сіу Спи Маї Пе Спу 195 200 205
Пе Авп ТНг І еи Гуз Маї Тниг Аа Стпу Пе 5ег РНе Аа Пе Рго Зег 210 215 220
Азр Гуз Пе Гуз Гу Ре Геи Тиг Спи Зег 225 230 «2105 154 «2115» 228 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 154
Меї Спу Зег Зег Нів Ні Нів Нів Нів Нів Зег 5ег Спу Геи Маї Рго 1 5 10 15
Аг Стпу Зег Ніз Меї Авр Рго Авп зег І ви Ага Нів Г ув Туг Азп Рпе 20 25 0)
Пе Аа Азвр Маї Маї Спи Гуз Пе Аїйа Рго Аїа Маї Маї Нів Пе Сі 35 40 45
Ї еи Рнеє Аг Гуз І єи Рго РНе зе" Гуз Агу Си Маї Рго Маї Аа 5ег 50 55 60 ау Зег ау Ре Іе мМаї Зег Спи Азр Сту ГГ еи Пе Маї ТНиг Авп Аа 65 70 75 80
Ні Маї Маї Тниг Авп Гуз Ні Ага Маї Гуз Маї Сіи І еи Гуз Авп Сіу 85 90 95
Аа Тиг Туг Сім Аа Гуз ІПе Гуз Авр Маї Азр Сти Гуз Аїа Авр Пе 100 105 110
Аа Геи Пе Гуз Пе Авр Ні Сіп Спу Гуз ГГ еи Рго Маї І єи ЇГ еи Гей 115 120 125
Сіу Агу бег Зег Спи ГГ еи Агу Рго Спу Спи РНе Маї Маї Аа Пе Спу 130 135 140
Бег Рго Ре 5ег І еи Сп Авп ТАг Маї Тиг Тиг Сіу Пе Маї Зег ТНг 145 150 155 160
Тиг ап Агу Спу Спу Гуз СП Гей Спіу Геи Агу Авп бег Азр Меї Азр 165 170 175
Туг Пе Сп ТАг Авр Аа Іе Пе Авп Туг СПу Авп Зег Сіу Спу Рго 180 185 190
Ї еи Маї Авп Гей Авр Стпу Спи Ма! Пе Слпу Пе Авп ТнНг І єи Гуз Маї 195 200 205
ТАг Аа Спу Пе Зег Рнеє Аїа Іе Рго бег Азр І уз Іе І уз І уз Ре 210 215 220
Гей Тиг си 5Бег 225 «2105 155 «2115 480 «2125 ПРТ «213» Ми5 тивсши5 «400» 155
Меї Сіп 5ег І еи Агу Тит ТНг Гей І єи зегі еи ЇЇ єи Геї и Ге ЇЇ еи 1 5 10 15
Аа Аа Ро 5ег І єи Ага І єи Рго 5ег Спу Тиг Стпу Агу 5ег Аа Рго 20 25 0)
Аа АІа Тнг Ма! Сув Рго Спи Ні Суз Авр Рго ТНиг Агу Суз Аа Рго 35 40 45
Рго Рго Тнг Азр Суз Сім Спіу Сіу Агу Маї Ага Азр Аа Суз Спіу Суб 50 55 60 60 Сув Сіи МаїЇ Суз Сіу Аа Гей Спи Спу Аа Аіа Суз СПУ Ї и Сп Сі
65 70 75 80
Спу Рго Сувз Спіу Спи Спу Гей Сп Сувз Маї Ма! Рго РНне Сіу Маї Рго 85 90 95
Аа 5ег Аа Тиг Маї Ага Аг Ага Аїа Сп Айа Сіу І еи Суз Ма! Суб 100 105 110
Аа 5ег 5ег Сіи Рго Ма!Ї Сув Спіу Зег Авр Аїйа Гуз ТНг Туг Тиг Авп 115 120 125
Ї еи Сувз ап І єи Ага Аїа Ага 5ег Агу Аго 5ег Спи Гуз І еи Ага Сп 130 135 140
Рго Рго Маї Пе Маї І єи Сип Агу Спу Аіа Суб Спу СіІп Спу Сп Спи 145 150 155 160
Азр Рго Авп 5ег Гей Аг Ні Гуз Туг Азп РНе Іе Аїа Ар Маї Маї 165 170 175
Сп Гуз Пе Аа Рго Аїйа Маї Маї Ні Пе Спи І еи Туг Ага Гуз І ви 180 185 190
Рго РНе Зег Гуз Агу Сіи Маї Рго Маї Аа бег Спіу бег Спу Рпе Пе 195 200 205 ма! Зег Си Азр Су І ей Пе Маї Тнг Авп Аїа Ніз Маї Ма! Тнг Авп 210 215 220
Гуз Авп Аг Маї Гуз Маї Спи Геи Гуз Авп Сіу Аа ТНиг Туг Сіи Аа 225 230 235 240
Гуз Пе Гуз Авр Маї Азвр Сім Гуз Аа Авр Іе Аїа ГГ еи Іе Гуз Пе 245 250 255
Авр Ніз Сп С1у Гуз І еи Рго Маї Геи І єи Гей Спу Агу Зег Зег Си 260 265 270
І еи Агу Рго Сіу Сім Рне Маї Маї Аїа Пе Спу 5ег Рго РНе 5ег І еи 275 280 285
Сіп Азп ТНг Маї Тик ТАиг Стпу Пе Маї Зег Тк Тиг Сп Агу Спу Спу 290 295 00
Гуз Спи Г єи Слу І єи Агоу Авп 5ег Авр Меї Азр Туг Пе Сіп ТАг Ар 305 з10 315 з2г0
Аа Іе Пе Авзп Туг Спу Авп 5ег Сіу Спу Рго І єи Маї Авп І еи А5р 325 330 335
Сіу Спи Ма! Пе Спу Пе Авп ТНг ГГ еи Гуз Маї Тнг Аа Слу Пе Зег 340 345 350
Рпє Аїа Іе Рго 5ег Авр Гуз Пе Гуз І уз РНе ГГ еи Тнг Спи 5ег Нів 355 360 365
Азр Аго ап Аа Гуз Спу Гуз Аа Маї Тниг Гуз Гув Гуз Туг Пе Спу 370 375 380
Пе Агу Меї Меї 5ег І єи Тнг 5ег з5ег І уз Айва І уз Спи І ей Гуз Азр 385 390 395 400
Ага Ніз Ага Ар РнНе Рго Азр Маї І єи 5ег СПУ Аїа Туг Пе Пе Сім 405 до 415 ма! Ме Рго Азр ТНг Рго Аа Спи Аа Спу Спу І єи Гуз Спи Авп Ар 420 425 430 ма! Ме Пе Зег Пе Азп Стпу Сп 5ег Маї Ма! Тнг Аіа Авп Азр Маї 435 440 445 зЗег А5р Ма! Пе І уз І уз Сім Азп ТНг Гей Азп Меї Маї Ма! Агу Ага 450 455 460
Спіу Авп Сім Авр Пе Ма! Пе Тиг Ма! Пе Рго Спи Спи Пе Авр Рго 465 470 475 480 «2105 156 «2115» 104 «212» ПРТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 156
Аа 5ег Тиг Гуз СПУ Рго 5ег Ма! Рне Рго Г еи Аа Рго 5ег Зег Гуз 601 5 10 15 зЗег Тиг Зег Сіу СІу Тнг Аа Аа І єи Слу Суз І єи Маї Гуз Авр Туг 20 25 0)
Рпє Рго Си Рго Маї Тнг Маї Зег Тгтр Авзп Зег Спу Аа Геи Тнг Зег 35 40 45 ау Маї Нів Тнг Рне Рго Аїа Маї І еи Сп бег 5ег СПУ І ви Туг Зег 50 55 60
Ї еи Зег Зег Маї Ма! Тниг Маї Рго Зег Зег Зег І еи Спу Тиг Сіп ТНг 65 70 75 80
Туг Пе Суз Авп Маї Авп Нів Гуз Рго 5ег Авп ТНг Гуз Маї Авр ГГ ув 85 90 95
Гуз МаїЇ Спи Рго Гуз бег Сувз Авр 100 «-2105» 157 «2115 10 15. к212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 157 ам Рго Гуз Зег Су Авр Гуз Тнг Ні ТНг 1 5 10 «2105 158 «2115» 9 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 158
Рго Аїа Рго Сім І еи Гей Спіу Спу Рго
Зо 1 5 «2105 159 «2115 213 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 159
Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15
Ар Ага Маї ТАг Пе Тнг Суз Ага Аа 5ег Зег Зег Ма! Спи РНе Іе 20 25 0)
Ні Ттр Туг ап Ссіп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз Рго ГГ еи Пе Зег 35 40 45
Аа Тнг бег Авп І єи Аа бег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне Зег СПУ Зег бо сСіу Зег Спу Тиг Азр Ре Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І и Сіп Рго Спи 65 70 75 80
Азр Ре Аа ТАг Туг Туг Суз Сип Сп Тер Зег 5ег Аа Рго Тгр ТНг 85 90 95 50 Рпе Стпу Сп Спу Тнг Гуз Маї Спи Пе Гуз Агу ТНиг Маї Аа Аїа Рго 100 105 110 зЗег Ма! Ріє ЇІе Рпє Рго Рго бег Авр Спи Сіп І еи Гув Зег СПУ ТНг 115 120 125
Аа 5ег Маї Ма! Суз І єи І еи Азп Азп Рне Туг Рго Аг9 Сім Аїа І ув 55 130 135 140 маї Сіп Тер Гуз Маї Авр Авзп Аа І єи Сіп Зег Спіу Авп 5ег Сп Спи 145 150 155 160 зЗег Ма! Тиг Спи Сп Авр 5ег Гуз Авр 5ег Тнг Туг Зег І ви Бег Зег 165 170 175 60 0 ТигГеи Ті єи Зег Гуз Аа Авр Туг Сім Гуз Нів Гуз Маї Туг Аа
180 185 190
Сувз Сіи Маї Тнк Ні Сіп Спу І и бег Зег Рго Ма! ТНг Гуз бЗег РНе 195 200 205
Азп Агу спу Спи Сув 210 -2105» 160 «211» 223 «212» ПРТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція -4005» 160
Сім Маї Сіп І еи Маї Сип Зег Слпу АІа Сім Маї Гуз Гуз Рго Сіу Аа 1 5 10 15
Зег Маї Гуз Ма! Зег Сув Гуз АІа 5ег СПу Туг Гу5 Рпе ТНг Авр 5ег
Зо
Сім Меї Ніз Тгр Маї Аг Сіп Аа Рго Спу Сп Спіу Геи Спи Тр Пе
Сіу Спу Маї Авр Рго Сім ТАг Спи Стпу Айа Аа Туг Авп ап Г ув Рпе 20 50 55 бо
Гуз Спу Ага Аа ТАг Пе Тниг Агу Авр ТАг Зег ТНг Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї ем СіШ І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95 25 Ти г Ага Сіу Туг Азр Туг Авр Туг Аа І єи Авр Туг Ттр Спу Сп Спу 100 105 110
ТА єи Маї Тнг Маї бЗег 5ег Аа 5ег ТНг Гуз Спу Рго бег Ма! Рпе 115 120 125
Рго І єи Айїа Рго 5ег 5ег І уз 5ег ТНг бег Спіу Спу ТНг Аа Ага І еи
Ко) 130 135 140
Спу Суз І еи Маї І уз Авр Туг Рне Рго Си Рго Маї Тнг Маї 5ег Тр 145 150 155 160
Азп Зег ау Аа І єи Тиг Зег Спу Маї Ні Тиг РнНе Рго Аїа Маї І єи 165 170 175 35 ап бег Зег Спу І єи Туг Зег І єи бег Зег Маї Ма! Тнг Маї Ро 5ег 180 185 190 зЗег ЗегІ еи Спу Тиг Сп ТНг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нів Гуз Рго 195 200 205 зЗег Авп ТПг Гуз Маї Ар Гуз Гуз Маї Сім Рго Гуз 5ег Суз Авр

Claims (41)

210 215 220 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язує НІГАТ, причому антитіло містить зв'язуючий домен, що містить наступні шість НМЕ: (а) НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОБЕМН (ЗЕО ІО МО: 7); (б) НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗМОРЕТЕСААММОКЕКа (5ЕО ІО МО: 8); (с) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗУОМОМАЇ ОМ (ЗЕО ІО МО: 3); (а) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність КАЗЗ5МЕРІН (ЗЕО ІЮ МО: 9); БО (є) НУВ-12, що містить амінокислотну послідовність АТОМІ АЗ (5ЕО ІО МО: 10); (у НУВ-І3, що містить амінокислотну послідовність ФОМУЗЗАРУМТ (ЗЕО ІЮ МО: 11).
2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що вказане антитіло містить домен МН, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5БЕО ІЮ МО: 21, та домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 22.
3. Антитіло за п. 2, яке відрізняється тим, що домен МН містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 21, а домен Мі. містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 22.
4. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що вказане антитіло є 60 моноклональним, гуманізованим або химерним.
5. Антитіло за будь-яким з пп. 1-4, яке відрізняється тим, що вказане антитіло являє собою фрагмент антитіла, який зв'язується з НІГА1.
6. Антитіло за п. 5, яке відрізняється тим, що фрагмент антитіла вибраний з групи, що складається з фрагментів Бар, Бар'-5Н, Ем, зсЕм та (Бар)2.
7. Антитіло за п. б, яке відрізняється тим, що фрагмент антитіла являє собою Га.
8. Антитіло за п. 7, яке відрізняється тим, що Бар містить усічення у верхньому шарнірі константної ділянки важкого ланцюга.
9. Антитіло за п. 8, яке відрізняється тим, що константна ділянка важкого ланцюга закінчується положенням 221 (нумерація ЕМ).
10. Антитіло за будь-яким з пп. 5-9, яке відрізняється тим, що вказане антитіло містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 160.
11. Антитіло за будь-яким з пп. 5-10, яке відрізняється тим, що вказане антитіло містить амінокислотну послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 159.
12. Антитіло за будь-яким з пп. 1-11, яке відрізняється тим, що вказане антитіло специфічно зв'язується з епітопом НІГАТ, причому епітоп НІГАї містить щонайменше одну амінокислоту білка НІГАТ, вибрану з групи, що складається з Аг9190, І еи192, Рго193, Рпе194 та Аг9197.
13. Антитіло за п. 1 або 12, яке відрізняється тим, що епітоп НІГА!1 містить щонайменше одну амінокислоту білка НІГАТ, вибрану з групи, що складається з І еи192, Рго193 та Аг9197.
14. Антитіло за п. 13, яке відрізняється тим, що епітоп НІгГАТ1 містить амінокислоти НІігА1 Ї ем192, Рго193 та Аг9197.
15. Антитіло за п. 14, яке відрізняється тим, що епітоп НІгГАї1 містить амінокислоти НігА!1 Аг9190, Ї еи192, Рго193, Рпе194 та Аг9197.
16. Антитіло за будь-яким з пп. 1-15, яке відрізняється тим, що вказане антитіло являє собою біспецифічне антитіло.
17. Виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло за будь-яким з пп. 1-16.
18. Спосіб отримання антитіла, при цьому вказаний спосіб включає культивування клітини- хазяїна, що містить вектор, який містить виділену нуклеїнову кислоту за п. 17, та виділення антитіла з клітини-хазяїна або культурального середовища клітини-хазяїна.
19. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-16 та додатково Зо містить щонайменше один фармацевтично прийнятний носій, наповнювач або розбавлювач.
20. Фармацевтична композиція за п. 19, яка відрізняється тим, що вказана композиція є ліофілізованою.
21. Комбінована терапія, яка включає антитіло за будь-яким з пп. 1-16 та антагоніст фактора 0, причому антагоніст фактора 0 являє собою антитіло проти фактора 0.
22. Комбінована терапія за п. 21, яка відрізняється тим, що антитіло проти фактора О являє собою лампалізумаб.
23. Комбінована терапія за п. 21 або 22, яка відрізняється тим, що антагоніст проти фактора Ю вводять послідовно.
24. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-16 при лікуванні пов'язаного з НІГАТ порушення або хвороби ока.
25. Застосування за п. 24, яке відрізняється тим, що пов'язане з НІГАТ порушення або хвороба ока являють собою вікову макулярну дегенерацію (ВМД), діабетичну ретинопатію, ретинопатію недоношених або поліпоподібну хоріоїдальну васкулопатію.
26. Застосування за п. 25, яке відрізняється тим, що пов'язане з НІГАТ порушення або хвороба ока являють собою ранню суху ВМД, проміжну суху ВМД або запущену суху ВМД.
27. Застосування за п. 26, яке відрізняється тим, що запущена суха ВМД являє собою географічну атрофію.
28. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-16 для виготовлення лікарського засобу для лікування пов'язаного з НігГА!1 порушення або хвороби ока.
29. Застосування за п. 28, яке відрізняється тим, що пов'язане з НІГАТ порушення або хвороба ока являють собою ВМД, діабетичну ретинопатію, ретинопатію недоношених або поліпоподібну хоріоїдальну васкулопатію.
30. Застосування за п. 29, яке відрізняється тим, що пов'язане з НіІГА1 порушення або хвороба ока являють собою ранню суху ВМД, проміжну суху ВМД або запущену суху ВМД.
31. Застосування за п. 30, яке відрізняється тим, що запущена суха ВМД являє собою географічну атрофію.
32. Спосіб лікування пов'язаного з НІГАТ порушення або хвороби ока у суб'єкта-людини, яка має в цьому потребу, при цьому вказаний спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості вказаного антитіла за будь-яким з пп. 1-16.
33. Спосіб за п. 32, в якому пов'язане з НІГАТ порушення або хвороба ока являють собою ВМД, діабетичну ретинопатію, ретинопатію недоношених або поліпоподібну хоріоїдальну васкулопатію.
34. Спосіб за п. 33, в якому пов'язане з НіІгГАї порушення являє собою ранню суху ВМД, проміжну суху ВМД або запущену суху ВМД.
35. Спосіб за п. 34, в якому запущена суха ВМД являє собою географічну атрофію.
36. Спосіб за будь-яким з пп. 32-35, що додатково включає етап введення антагоніста фактора р, причому антагоніст фактора О являє собою антитіло проти фактора 0.
37. Спосіб за п. 36, в якому антитіло проти фактора О являє собою лампалізумаб.
38. Спосіб або застосування за будь-яким з пп. 28-37, в якому антитіло вводять у скловидне тіло, окулярно, всередину ока, біля склери, у субтеноновий простір, у супрахоріоїдальний простір або місцево.
39. Спосіб або застосування за п. 38, в якому антитіло вводять у скловидне тіло шляхом ін'єкції.
40. Спосіб або застосування за будь-яким з пп. 28-37, який відрізняється тим, що вказане антитіло вводять системою доставки тривалої дії.
41. Спосіб або застосування за п. 40, який відрізняється тим, що система доставки тривалої дії являє собою твердий імплантат на основі РІСА або систему доставки з портом, що імплантується. ФГ ТА : їх й й || и. ТІ БЕ і ; Я і | | І я І! Е с кзшес:весУвоисс:ввноувпзІиеЕавнвсВиввх Е мен нн нн ; Н т ТМ хе що те : ФВ ши ши ШЕ 0 й. її зш. 1 Ж Кен не: нин З Інн: З ЗНИНННННН: З ик ЗМ ше Же ИН Же Зк же Ве В ШЕ Не НК 3 1 ШЕУ М Е: В Б; У ЕС В Ж ЕЕ 5 : Б | ї ЦІ | о | | ї || | і | | чн Е пече кииваЕннкуУ хе ЕЕ ВВ ЕЕ : Н Киее
ФА их дніІМтТниМа я Ї Як Соя пт, й МД КХ М Є. Ух
Дю. яю, КС тиж х пн ее г ск жи Ж Р-Н аа и ОН жу ек У ОКУ я ХХ сх о с нн НН КК он Петя 00 и ект ВИТ я " с БУ оо НИ ЗИ Ву НиШЯНе їжу и ТЯ тк у пи до Мох ХУ, "їх ді хи ЕОМ ХУ : Я ва ДОМА мВ т ТАМ Оки ломи НКУ М ТІ ще ШОК х х, мк ПИШЕ ХК ХХ ек ЕН Фу МЕ Оу МТ йо: у их Ки м ІОХ ях т з т й за я М пе їн сли ШО МО мя ві Кох з М КО хх Ох, ОК ау У ЕНН ве Ж З шк АХ май Те іде ДИ КІ кс веух пгт у ці ІК Миченнй БК В, сестру луски продукти ЗЕМмуУх рецеп щоавдеипланНнв. вним ем ке ее ЧНО ЯНГ а ЗЕ НИ хх КУЗК у ЗВ. 1 Що КЕ Н ї і В Н ї Н гео Її Н В Н ї ще ї ї ОО ХМ. Кк дк Її КОКО ЖМНІМК званих БОКИ На. ї ЯНВ россасю ї Ос ; дах: НАХ Н совсснх. ЗНО ї З ЗКУ Н ВаВВЄ щан Н сонна ек КУ Н НВ Зо : МН зрессою ЗУ ЗНУ Ще ї СОКИ ех ї ВК МНК ЗОНИ УКВ ро якою ЗБАИНЯ о ме НЯ Вин НИК Ши ДУХ КІ Н ОХ ЗК М зм ще ДЕ МО СВ зве ДЖ ЗБ зраае БОМ ЗБЕ т ПО сина МО ВИНА МНН ж днк ЗИ ЗДЯНУ. ТЕ урекНИк КУвКх аино нни МНН ВИННИХ у МВ: ЗЕ ЯК: З НЕ и Ме в І ду т: З не їх зкін, АН МОВ М В Я ВХ КО ЕК КК я ІМ ЕЕ ше кою не ан ї ЯК Зо. о хх Ді Ян я КН НН. ЗНАНИХ тк тик ан Не. ях ПЕН ин У З ЖИ КН ЩО ЗИМ НО За Зх х НИХ Звинне ме Зони нини ЖННОУ Б Хан З ВК Щ ск ШИ НІ Не Ж В В т «рн ЗНМ Зк ж ЕС Ма Зк ри ин З ЗОЯ Ж нин заея НЕ ще Во Зо ни ВН В М ТВКн Кен В: ах й ,ЕшНек За ще но Мо сжих ВИОМННИ: дню: МАО. ДНК кн Зоя жене ни ВИНИ МНН НН ще УНН Зниини ЗНУ жо; ЗВО ПОВИ Вк НИ ДН еВ КВН НН З ВО НН х а и а ние ВЕ Я З. ТВ медее о Шен. МНЕ звдввою пи З Зо Мо ЗИ ЗАКО З І Ве ШК ше М КЕ пи зе и не щи З шко я. БЕОИЕ Увеню: жавних ВО. Хе зводвах МНН ТОВ АК Зо хи. Ок ЗОН КИ ППП тн ме Бе: Веннноо. ЗХ ВВНВ ан пе НК ВЕ В и ВК, я о. ВЕ. Я КВОННЄ. Зно НК. КОХ МНК ВК ОВ ВК. ІПООО Зененх мине зо он зе Зо М 000 У диву о ек вино я 19832 не соми нн ши и ВИ КС мо есе ми а о в Кн З В М НЯ Я СУ о А А ЗБ -х хх ії ЗОЖОєі Н Пуфетр іа щові МН Мох К х хі їі. іа 7 ! їж Ж ї Н 2 І Н КУ дх х ТЕМ В. о і КУ БУ МЕ. Бу Ке сс Ж
ФІГ. ЗА «З З ХХ хоч З
КІМ. х ї їх і ї х їх Е Е ї Кк Н ї х ї ях су: 1 Тк п ДО ІБ ПО ІЗ З УЖ ИН. я п Як а Ху один. ККД ПК ЗНМ них ККД, фс ЗОН: й, сах и пе ЗОН. Я Що - БО В я два зв щ ПЕК Ко ЗК нзаех Б хх Мн ЗА: ман ВОМ ЗВ пек Б п См не з ДО ; їх Зони: ЗеВавих: МКК еф ЗОМ ЗХ КОВО: ЗБЕ кт ІЕЕ МО В мне за В я КО Я ти: ЗНО Вена: З З З ПОД Й БЕ ПЕ ХО Дня: нн ЗХ В Кеш ДН МЕ ІОН ЗХ о ни МНН ЗБ ОО ох м Б з Б в ЕК ІПН я дня Зии МН ЗНА Мама: ЗХ З Не кА Кн Вриоио ВН нн Ми М нн ТИВ ее щН а Яни не В о о ях кни ЗДИННннх нею ЗА ЗНИК ин: ЗК: ЗНИК. ЗНИК ев: АХ. нн Ж о НН: нн: МКК. З о ши о и НН М ще ЗЗКНКИВНОХ Зивноннах и М и М: М ВН ши ІВ Ну ди нин З и о МК Яке Хинии Ми МНК ВИННА ВН НН ЗНМ. НН КОН ПИШИ ха нн: Син нини ЗШ: ИН нУ ЗННННННи: нн». НН: ЗОН. ПИЛИ щЯУ о но ОО З ИН: ЗОНОЮ: НВ ня. ПВ и ин Мини Ми МАКИ нн НН КН З. ЕІ Е ХНН М М НН НЕ НН ОО. МНН ЗОНУ дооюнх ПЕКИ Інн ня Ви МН ЗИ ние Мн МН ВН Я З ПИ ОН Мне М ВО М М Ми ОН МН ком ВИНО в ПЕ В Ме МО М В НО В М В тУ ау ОВ б кода Я 5 в жй ЖЕ ях ях же хо Кох я зни в ме ще - й в 5 й Е; х ї в с х чех х. с з У ще М ЕВ КК Я в Ех От - КУ - ще «Ух ще ще Ж КУ ї че КЗ де ще - У
Кк Її Шо М З 1 Ї т. зей В КЕ ЕХ КЗ у 3 І: ї Її ї ї КК ї ПИ ї ПОПОЕИШМ ї ППП ИИ Н М маки її Уо: «Не» 1 КОКООЯ Її З ! ЕЕ турах ЗВ КІ НОвак: Знов ПВ: заах «ще ІН: ВОВК. КЕЙ ЕСЕ й І п ЗО КО ТЯ Б т ЗНОВ: рн: "ОКО: доввоовюювох ЗХ щ Кров вних Ко Зо ЗНи ЗК. Ко Я ХВ: ЗВ Ви З они МО КОЖ. 7 зве: Б т ин: ДВК ОВ он Мо ЗХ ЗО. нон: их Хиденнвою: З. ВИ ММ Є КВ ЗДВНн: СЯ Ве Шк ЗЕ. М ЗА ВОК: ЗИ ЕСеВ Ви Кох Івана ЗХ ЗО БО БО МО КО ЩЕ ОВ Знак з З МН ОО БЕ ик ХУ Ох ВН. ЗОВ ОМВК ЗиОХ ПИТИ КОТ - кс: ІНВ УКОННО М: м ни На ЕН Я Ото хе ВЕН В Зх М в и БО Бе я ЕЕ нин: З ЗОН Мн о ПОН Ку Ух КН ня ОКХ Ме нн НН ПММ Кит х Енн ЗИ НН шнек ЗИ НЯ ЛИПИ Кс ор ки. Мене» ок ДИВО оленя МИпИПИ и ЗИ ше ТВО зве ВЕНИ Зони Зв ЗБ КО ЗВ до ІН Не Ви шинаик З НН ДЕ ОЯ ВХ ць ТВ: Знн: Ви ни Ме ЕНН КИ За: М ІБН: ЗОН ни М ни Я: В КК рий КЕНЕ: НО оо: В НН КИПИИИ о ВН: хе Е: Дн ЗК щи ех МБ МН ДННорХ НН: сах: НН В дО що не я Зх Ж І ях де ЗО НЕ я З ВЕ МНН НЕ Ки ЗК и МОНЕ ИШИЛИМ Зре Бо В мае Б ЗОВ ши о ни нн М и ВОНН ЗК. ПО ЗЕ М о не НН ИН ВЕК Во ІВ ЗИ но Зоре он во: ИН ИНКя вною: ТВОЯ: Я ОН; Зв ВН ЗНи ЗНИННИ ЗО ек не УОЗ зн ании: ОН вони Зник ИН МЕНЯ мно ЗИМВНОВОМ. М они Мене и Ме и ВВ си МНН ВО Іони: ЗНИК: ук ЗОВНОВНи ОНКО Оки Кр НН Ки: Зони МНК ЗИ: їх ЕХ по: ЗОН НиХ ЗБ он рон Ки МК: нн нн КО ЗО Ки: ЗК. г УНН ІЗ: ж НН В В М М І НК НН ВН ак ї а іч к Я р КЕ як щх ех с ше ше ши ше ше ше ши ше хх щ - ї Бе во. т Я Ку У ех У Ух х Ж хх 2. ХУ х сх Ку вот ї ек М саКЯ з щх Кк жк же ГО ї чк зх. ЩЕ Ж КЗ ка КУ Д ФГ Яд Акцепт» - і ї д еддеч ЕНН НО Взнор ЕН ТЕЛМО аа нен КВ КВК вк СОЯ їх. МОМ ВИ й Й Е й г КО МИ ТО лк зи живи едЕтИМ хм Мих. кс а 7? з : ша БАМмО Б М: ШК м І Бівхая Мова ння ш- о В най ОНИ о МОЯ ФММ Ж МО Я КЗ ; х У ї рі т з : у й ре в в и рн о в Тікич пре. хх жі У вето кущ инеьуєацетил
Олю. ге жі вими кг Мол динітрефеній зе ща ФВ Гра Бо ФГ з ее їх ІЗ З - Н ЗЕ е х : к-е- Я дими 7 ОЗ Б оду і петиттнн : ва кож і пе: : дня дк. ш ї М і Ж НМ. : : ри печу с 1 В й і ШИ : ож Мої їх : ТЕ соя док ї -е- ЗА УЖ ІЗ її її. її кож оЗінМм Н що ЗЕ оду ща і ЩО І Ж фе її Н т Н Б ОО Ж Со ром ї т Її щ й І г ще ї х : А сх ї косих УМ із в жк ов родом Я В НЕ КВ їжі Н Е ї ГУ ше ЕК няння м ї Їх С Н Молаим ї щ ї що ВІ їх ще : що Я тити нитки М очи ї Ж Ва кт х ав: Сто тим й РО Ве. Кк й ВМО хе ЯН: сх ОБ М У ще. НУ як, го Ба ЕЕ Я о Ге х : В я Б я у сх ТВА У с : п игВ КК КО З З ГУ Я хЯ п0О0ОЖ5 сво МЕ но РО З ї МУ В г : Б ОСС ЖК т. 15 ВЕ х щі пови я її Е ! Я Ме ІЗ І, ОО ЖЩЕх г. З її : її дк і ях пт Й ТЕ ог Мо Х КУ У КУ хх : сх о ЩЕ п а го ще ща гу КУ гоОЖЕ вк ВЗ ях х г я; і ше ШЕ. ЕЕ о хо Нх ОВ сля Го и с Н Хо. ху Як: я ЕЕ В ОБО ВО - яак ВЕ що я їх Пе КЕ я БК 3 хх М: Ко З ВЕ З с мя ПО ЩЕ З хх У -х ож МІ Ва ЗІ ще Ух З: МЕ ВК її КІ Ж т КЕ ту ВВА ту ВЕ щ М о КІ Кк ях ЕЕ Ж М Ве хх В -к шЕОЮО ОТ ЕІ КЕ ЗБ Ко КВ. у Ех г. У У а В щі ХХ ка ік ОО г х ОВО КІ ош--е 3 ВЕ Я в В Е ДЕ Ше зе ШЕ ШЕ. ж М Е ВО З В Еш ЩЕ Зк її Б зв БО ОО З її КС Ше ах х я КЕ Ву Мк БО Ж с у Кк Я т БВ ШЕ СНИ З : ВШ І ВЕ: Ше ШИ ШЕ. Фр ще я СХ КЕ ВН КУ У хо ЖІ ВК Ба З В а І Ж ве ГУ : є Ку кох Я УоУ КВ я ЩЕ : соя дкнне і ВИ ВІ ЯК у кое я го КО Ся км ою ня ВОК ВВ І ВВИВ : КІВ ВИК БК а ща я ОСЯХ щу ЩЕ ЩА 5 ее т з олввіовья 01 ВК дж а ВО Як ех Я ЩЕ ЩІ 2 З «У «ЖЕ ХХ ме ку МЕ їх йрохм:..-ХУКИА ПІ КЗ Я ще ВВ ВВ ВК ВИЙ с ХУ і хо ЩЕ о де КК ОКУ ККККККХХ. ЩОБ ми: ВК. ЗВ СОВВМ - «ХЕ БУ - «Е і т хуя Я В ПУ КО сх Я ху ах -о й но: ви М НЮХ І У АЖ - Ух д. е звана ння З т ХЕ ай Кк «ЕЕ СЯ х. Ве х Но Я - я КАЗНИ В: ВС В Й х пох и Кх ФІ БА КУ КУ НОВ.
ДН. 5 аа «ІМК я ї І фев хахНе. ее Кене кокон тро я дит, реа ЗАКО ие :ї ши и соки ПК З нд ВІ тече ул икі 0 ВЕБ Топ яЖ ОНИ НУК ГА тва що Ко» | де КИ В Я ХНУ рссвве ХаЗсУ І керу пах це ша ШЕ вк тн НЕ НОВО 1 НМ | ОВ о Я в 4 я 5 зни ТУ домени о Ж 4 ЕХ щ и х М Кк і х х х А КИ: У зн Ох УК диму хх с ХНУ х ОВЕН і пах я ще Ж зх Х а с У роя ІЗ А Х ії Е: х Її і ле со ї їх З ї КЕ х пли ха і х х ве ших з із й і А Кі і З сі м ї і Кг а ХХ одну ще х че нн вно ума Зхну- У У х ї Бу і хо й і х Я свх З х, І; соб еу км їх ж ві ково і а нене в ні УК фено щі У ЗУ ха те туман керу т ет мої о ех кА УЬКА. Го З я т ее ше м щи " 1 ще мим сус сук М ПИ Кай ТОБ сита и уче кр о у кріюонох Мою Ко іа Ки ПІНИ ЛЯ дл Я Я тв, ех раккнУує ЗА п З т шо і ге ке Мн вен ше вим
ОКУ : ї се НЕ НЧ: хх ФУ фунти детет и тк пит пні тттт «вда й 4 1 знято АК НЦО В ОК т МК Яке» Як їх ФІ ттти тя тт У у ї жна й З ю Б ої Геефре ТВ ММК ІМАХ В К-ч СЕ ХНИ Х По юю за нн ЧИ Тож... Ко НОМЕР ЗК 0 ї а хижХНТЯ с я рн УК КАК ОН КА ШИ роз заасо вон ЕВ У НО я с х КТ оок-- ВНД СІ Б ВН хи ПК моооооютююююююююююююгю сх усю яд х Гінонкннь с х У і й се ух і х.
У ОККО ОО вок 1 Б: З ше: хх 1 УМ, их 4 х їх КУ і Б ке о в Н в ш зе Бе хв дк н Зх ї хви ОХ ду ВАЦАЯ їх 1 Ба і хх ЩО і Б Ш Е А Ж вже ї й Кк шкНКа 3 шк м. ; їв вк я ен сху аа х іч і М КІ Ха їх 1 е шк Жоже о Ж Е КК олив Ї РЕК ПУ МУКУ у юю и тую тує нор У их, ЗК ксвии КН юр ку Ке зп 0 і за ве он що а ча оо Кн оно роя сфуту в Фа рю ній - ЕВКШУ Би ЕМОоВі АЖ В: ву ВНІ: КН я Ох ККЗ : БЕБІ і.
За МАВ. ко З: КЖ Ж п.
М БО КМ Ух АЖ те пи УК - ВНОВУ Косова о ЕВ Б ПАЮ по МК ля дк Ж ї в ж й Б ше й в ВНУ я» АЖ се Раш я ую ОВНА ИКИНАВУ ШИМИ ВУ НО ВЗН КНІЮ ОВК ох МИЛЕ нм БЕВаООоТІ УВА КАТІ ве АБ ЖІ МЕККА ВМ то яю си РЕВЕ «Б вті Ко УЗ БНАУ Ми І. їх МОЕОЯКе Мо СЯ - гТтВвижВр ЖАВ як вкатіжівЗм Б що ав УВУ рою з рве и» же кох вав я ЕЕ Ві жі ме чні Шов хів ху с шввЕТВБАК НИКА Таки ТР ЇЇ ВВЕ ВУ МУЩІ В пе нях» ЗБ» ЖЕ ВКВКУН В МОВО У ЕК. зе» сіро Же пе ЕН, ча ЕД 5 Мт: . Би КО НН У В нн НН т ДИНЯ Б ВО з песо МОВВ Мшлею о зи ж ЖЕ ЖЕК кН ВК с СО ВО Бяяей о омю Ж БВ. жа о ЖУК Ж КЕ зх некУне ОВ сх я. ай т ФО сних ї ВОК У ТКА У ЕОМ АК ЗВО Е ВЕ хакі МНЕ МКУ сх ше 7: які НААТЕ і НН й Б шко вав МНВК м ВВ а ОВ пом ї ВЕ тА во ЯАЖЕ кон каипяшж ем ЕК шини х І ВУ и ів ЖЖ ТММ ОВ» я Ї НВК КВ я пдтя ш ЩУР ак ВВЕ ав Я ЖЕ ТВО РУК ВІКА УВУ ЕМ ВХ ге ячін, з БО жідакіся няних Б ОЗВОВР о ОБУ БІТ ООН ЕВея хе меш: НН ОБ З на Би щи сит т ВР Ам ОК ТК с: жи й в Як не НЕ ВВЕ пох ВЕЖІ ле питіли с- МОВА АК яв ві ВОМ ХНУ МАКВАЮ УМО нд зх ВОК Б за НЗОНМКХ 5 пили пох о МОЯ її ЗОШ а ХХ кл, паж ЖК її г о а ОЕМ ВК ШЕ Ж: мі ШБОСМО МВ, з ТОК Кк МОМ ЗБЕ ВВЕ МОМ ХК
ЯНГ УА ФІГ УВ не Я: НУЄ вве , С Вюдое х і зав у мії й х й смути си рів СК. в стики под У зх іще 2 зіБИЯВ ЕІ Но ВовА я займ: жи. з я те 5 Яні Іо Кі КЕ ще нн ро Нм ІВУБЕ НАМИ БЕН ще АХІЕНІ «І ЗИМА Що УМУХ птах хх р хх ї УКХ ДТ ЖІ ММ ХМК ЗАТУХ Щ З з х пІЗзндто серих Ма З зу щі шк ї х ж і х МКМ ТК УК ом ТИХІ: с ї Пух І Кох й Й їУ х ШКО сході х го У У МЕ Ей А с Я ї ро У хо КюВ ї 5 | А -Е З х хо х в Н А ї Х з М Кк УМХ і: їх сакщхий ОО БЯМе 3 п ЖЖ хх ре їх Кк ! Б ї Ж 4 Х Й : -6 ї ХОКК у о і Е їх ех М Ж - Б : КК ІЗ о вання ї : 1 : у і - 3 - : А У тт тні ДК и С ПЕН я і - МЕ Ж -ї хх 5 З вн и У 54 ї т ца НУ х З як те Та жк ї ТЕ гео ММК дЕкіцай я Іва аоговА влвАВ дені го пд ФНОВА КИМ БМ МІ й ЕЕ о о АВ вивих ОО М й и. Зиро ЖА МУ зу зрос сти Ха ХЖО ш? моОомч ОК ЖУ ЖЖ ою ДО Дл п МОЖ МОМ кл Фо МОМ хи М, руху ХАКдусв тоте вежм охе юю що МОДИ КОС записники вкаІниц;ивииВкхиМших Косснеуєхновадувко КІ ке мот ши іга мМ М тп А СТВІ ВВ АТ ОКХ, 7 кн ЩО: Ж "Щі: Її Д. ВО» Н В похо ош 0 МОВО Я т КО З гуакт у В. ший : соус ЗК мо ОК як ії чмІщшшншВвишАВОМч ВА Вже ОВ ТЕ чешж п двІЕВвВБО ВАЗУ лика КБ шк вт ох у Ех кам см охо М 1. де оо ту дх у м ок тяеокоох с ВИ и я Кайат МОМ жимі АКТ ТКА ОК КВ ж КЕ Ов З їх пак МАМО, т ОО КОБМУНУ МОИс ки, хо емо п ою у о се М м М ДА КО о с пу дитя о шо их їм ПРОМО о м ЖЕ дю т З Мамероза Клнщва. щОХ ЖЖ М шо сх МОЖ ОВ Ж В ж хх вши им ІМии щих Хосе єн пед КІ вкл зва ОВОУВиВАВБОКУВО ОТ ВВА я и и ші ша шив ши АБО ча С ни акне й лож ни в кн в В В В КИ М НЕК ЖИ А ж кВ МОВА вки ОоВОВИТВЕТЮТ ОВК ЮЕ Ха дек АД СОУ ВОЗООТВЕТЬТІнНУЮВЕРВЕ май ОВО ЗКоХаКИ ВО ВООЗ іі млйаєннх 5 2, ЖЖ Же ож жов ху ж ЩО ОМОМОКОВОВ ве В в в В С НН ООН У жо ж тім у ою У ЙО КОЮ хх хол мої мли их ки Кононенка в КУ ТТ им Кк МІХ ЦИМ К КО косять ТО о ОБ ВМІ воБр т в хо Блоку Ме со КшНІШКТ 0, и «ЯНА Зк Ко що К и АТ 7 т жи опа кл УК ів нУМмох У шт шок мк схо ю ПАНИ. У ММ шву. ще поп Н м Ух Я вих т тупо КЕ МО з кВ НЯ ІЕЦО МК М Ки їж рос ша век БНО
Те 3З ПКТ КЕН Мт КЕ КО здо бах УК шо ро А ен с о ОЛЯ ас п Я хни оно Я ОВУ М о в ОН Я Кур ха Ба КУ мом хм вв о МІ КОМ МОм ОшОЖО МОМ От м й Ж МТА ТУ МОЛІ Бут В ОО "Біо Вік УК СКАЖЕТЕ НУУНІ АВ ов ов: ВИДИ пн В УНН о НН У 7 т о с ще ІА Ба, 5 у ОКА Ток ТОВ Шо Кинуяи: бт тя ХА мет до МІ мож га до жи ЩО М мод м хо кот Вір У Тх ме ЕТЦ ОВС АУКкККОсАШУКУ ВКА МІК ПВЕК У МАВ Ме Ехо шИВаЕУкКвІ А екв ат г ии У в А В кат УМОВА саваКМИ КАНІВ ВВА нн ООН Пе не в о НН В НВ ЗВ киневвенен: переви Кі ее о ее В в в в КВ В и С ОК ху ман бо м хм і ВО У ВВ оо Я и си НОЯ А ВВ ке ВВЕ т ВАК У ше деоенох лит: кону ВА З БЕ ОВ ВИ х БОКОВА еВ ХІД оо ятука ї ст КН и ин В у В А оч ех : ау пр т г В ТО ВІТА Меч о У и ло шок; її СУМИ Со Ку я т хх КУ Зо та КО з КУ КО ЕК ВВЕ ЗК Зо А ЗНИК ЗБ З ЗВ ЕВ А НЕ ДИНЯ файлу сх мої моїх ИН ОО о и ВК и ИЕ сгоово ту тись ШІ які шо г Кам п І М кое и К СВО НЕТ ІТ ВТ Ж ТАТІ ВІ З ПОВ кеневО п ук ЕНН ПО СХ ОВ КМ кос де Момгромокаовтна МБО ОД МОХ ше ще м Ж ОХ МОЗМ да Ми МО МО ЖОМОМО Ж М Ж Ж ОФОМОУ Модерн юне кі ВІВ ТАУУСАК ОА т Ул мМ я ЕМО І хонтакт З ВИ Б ОД У т св ВВ У о тм т ОВ кое в мк КІ АЧХ схожа лови ков. кт пк ри Зх чит я ск ок Ко ни о ОВ на ВВЕ А У Ух пр У ТОМ ОК у Мох ТЕ ож сх вом шрот х с Во Ве ит с лис зх сх ПАКЕХЛО МКК я оо ВОЗ ОО БАС ХУ У ПВЕК в Уа БО БОМ В СОБКО ВЕ ен ш КВТ АСУ Ж У ВЕК т ЛЬ СТ Оу ТОВ БК ОБИ КУН ВИ.
МВ с А Фев ФГ ЯН ЗВ : у су зуб 3. я г. вище з їх с ззкхх Я Кінетичний зиавіз дного микяу Кінетичний анавіз одного цакяу ; - с дія Ту. ех кі єму міки ми кт Я Зезвд: Зак стрепиютвоюм ВОАС Лігама Зако струни ДиНО МЕНА ЗА лякх Я Візнанякує дю єю хг Додон: КУН ЧЕ Анже ЕаЗКУЛ І МЮУ Ма омнкох тях і Ж ни. кадавоі ва З іфж о ване МК І Ікеа: ВБВИІКК ; ї Її Ждім я зи СА дей З Тих ож, Ї а кві завеН хек, ї - В Ед ТЯ ПК ння їх ікони шоп - ік аднм п І ї Б: Хр Кк. во БУ ХТУМУ ОД ї хвий х р зва Н виг щоОовбЗ ан ; ЕЕ ї Кі Ж «в я Е Н я мона я" ; х т х. ш Я БУ ві й ЗМІ і ах ДИНИ х Дек іш узане ще Я пн х КУ ї ї Ї ше і а і 8 А Е дО Е м Же ШЕ зав ї ч5І бу дет ТЕ й Е Мов зим КА; За 4 дод МОНЛНМ Й а Мо Е ра а п ЕК о он МОЖ тити т ДЖЕ КУ КИТ у Кт мини а я А ЗМ 2 М п іх 3 щих би з І Мак Е ще ас :
се ани дор -- ОС ФО и КУ ж х що Ж, С ветичний аманіз здного цикпу Кінетичний аналіз вдо циклу Піввигх Звхои: сети кін ком НИКА атм ГНезна: лакові. спаесуаціааном зикНтА з ель тми. АнзяйттаВ ЗКУ мІ о: днанн гайте їя дохо 150. роках 1 Ка ВЛІВО . і їкх БЕ лЯ шк В 3 Каце ДВЗ НОЇ Баш | су ду З МН ВОДЯНЕ ФОТО Кн вн ша онов а пркр везня са Ж їі ки Е ко. дак ех - щі я З ВІ БЕ: ана ! ШЕ Я зв | ж ї Ше: розв ШЕ нні - 8 ! і ще ва й ї е Я оп
«. Йем | х о р ! Ф 4 Ні і г. Я них Її нут ру ТОлеВ сан ! оовимет тя они и а З аа а а я ав зо 000 На ! х м В Є ння ас ФНГ Од ФО НВ нн нн ння нан а а нн а Н ! НИВА фиговаї ковкуВОВНІЇ ! Е кВА Ваг КЕНКУВЕННЕ ; Аатиєми мМаеача КИ В і Фі ДЕК Карівнти МЕЗВНЬ Зн назниай ім ЩО аВО ва Е Вриятеи Пюдскка МА їмо. Щ от. 3 НЕ А ї хе -ва с: дат « Е орали ЕК ве: ЗУ, до Я яке: Бу о. і «ог КИЙ їх Іполит у я ол ТК яв і с За У ї Би Не М уся сер Не: ау Ра ссво, шк Еш; й . 5 1 з и Шк че АКТУ ЕЕ ЩА 0 еневе їв 1 о. «вве: М Кох Во. я «вве: ВУ ко в мех А ЕЕ у вне шви, -ж-НС АНА Ії м у ле Не ТА сш че «ен: ТОЗА ж щх . х КУ Сн ех у ЕЕ: ; З я | хх і Б Коозкя х З х зд в ї З. З ве х с Зп ДЯ х кА я З ж З ом оо оку ї на ОН м ї 3 и о Й Й Маси ен А І! , 4. шк Мк : ЕК КУ Я 5 я нн: ан вав вк; Мекка ники ик иа ВЯ з ин Ї її жк і; а | Ви НУ: З 15 Я Мена ВНАУ е тож дами а КИЕАЗ ТМ; | | Людська МИ ДІ НАВ, Кава ТАКА АТАК ТРАКТАТ КК КАРАТКТТТТТТКТТЯ ДдклллкккаААААККАЛАКНЮТАКТЯ о А я ко ОКА Кіно доміно КВУ НУК Вари УТ й я нн в в п п в в Же Х Ж З х таж: я сх: - Й ту 1 ОО кенача ВЧ в М ! ! З дО ЗА Оу а аа РЕ ї ск Ж ве НН НА З ЕЕ т ЯН Е Се воре я Бен ТО ї З а ШЕ В НО З Е и УЗН по ваз 7 КВН Е ТЕО ї ТЕЖ х й Н ЕН у КВУ М з Кая І іх 5 Ко Ка ще куми 1 ї У ее А ІЗ ї- ї й І МУума З СОЯ ТЕ ї 5 . їх хара КВК КК ШУ Х - и сах З лю ТУТ КЕ ООЯЯ й ще не МЕ ВО хх іУ 7 чи ої ш док Ж де ї пов дак ЗА у і кох ХЕ 3 пе ші МАК и ши ІК СКК зак ї Я Тит Мк ої
Ко. ВД х ку ко, и Я х 1 ОО й Хе, КЕ тан Е КЕ ку КУ ІК Мк, : КшЕетн: У й дж : км КЗ й ї й і 00 КЯ : ще ин З З я ой іх пе Б М ач і БУ х ще ля а Ка ФТІ ТЕ КЗ і і ї зе сн ОО НН: 1 Хек, сло одрев ТК Кві слоти х в ух о ТЕМІ тих АК х ї дм ха в р В з. І ї Дому нан во оман а м са М кОасннИ за і Н квщах УЖ БУ дохокею ХО жо ММХ і : а я 8 Те хе: ТХ Н їх Му иа ї а ї яп Ії Ж оддлляллдджляляволл удвддлдтляжиютитлювлтя нежиле КАХ Аля я ТУ УК У УА У У У У А УМ я Мк У АЛ У У АЛ МАЛУ УК КАЛУ У У У НУК УМ М ен нн нин ФВ хх КЕ: Кк Їжа БЕ ЗЕ пе пе пюдснка БРА би щі 1 Є екв дже уві вих ко й кун КО ВВ ПЕ рок; Ще Х УЖ ДКЗ кю жи МН х чо ї КЗ л, ї З У. КО овуку 5 на -кї Каштан ів В НЗ хо веж тю Кв ЧЕ й; як пт, УМА бро і: З ж у М ща ї Си : що ї я і --е- «у. Е пок, с. дош : ж І т : не ;. кож мА жи Е: Ба З Її НН: НУ САН Б ха Її шк тк Косик АК Ве З с Но ВШ Ва їх ті ТУ ї не ЗА че ї ої их х. Квас Ба 3 хх ЙО М В с: ій ХХ Бо Ко Е Я гі ія ЧА оч ї Ж Я ої Ой о. 0 ЖЕ НЬТеМ ! БУ Ех ще ІЗ Я п. С Я МА І: с: Ме. і г ше: . хі у. й ще У ПЕД ТИ и ин ОБ В да з НКУ ди веду опо БІЛА Х Б Ж ке по ую От У УК ! 7 Ж де ей Меігрест сти ки З Кая ох КК Ау т ж т ЗК З по кн п п вв в п в в ВО ВОО не ті З : мА зак кун док ке тво хмКя і ; Бе БІ зва БВ ТО. мае Е З ї 5 Кб юю АХ ї і УщЕ Е г НП
МУК З віБ5нНо ме Варізнти МОЯ РОБ ; Вихідне |З . "З івовпм ог ке й Й вен ! ОО 38 7 ша й овроємх зок дннй 5 ОВО о, В 80. Пюдська НЕАТ С Ох ї АВМ он ; же | КИ і Я рлвци чи А о Я оо 1200 1809 - г Час і ФІГ 125 : Варіанти МР гав 0 ЛюдськаннА! ши ОВІ5НнНЕехахнНиА? 00 кОм с Кавід 0-4 КДівАВ шини ши ши ше с СН ши жи: шшш: пе
НУВАЗ НІНУ Варіанти ПУБ ОБО
: ж. ява нм . : д ши ЕЙ Е Пюдевка НА й ше З Я Ж Ме се сз Я Ж вхо дек. Ї КОС же. НІ дей сон, о докосвико ге Ко Е ЕЕ: : шо шин Й Я -х зЗаа я а ПК в ; Ше що сх А : т Я6о. й ше В вк Еш. ОВО Ж ; : 0: ана й о що 1200 зо : чає ї ФІОТ одержані 00000 Пюдська Ниді Е оОВіБ5НехахниА? ком 0 Квідббят 00 КД СО | 4.6 | 3.5 06. чт нн ни пи и пили я Еко : ху 3 КЗ : щи чі ! г. 1 д й «кни аа АНА и Аніта анна оленя щі ши ще вав .
. і Людська НЕД ща
. і йо ененннн ЄВ БО ово є. ше 586 нм. 1 не ШЕ ВВ ДЕ: : ЖЕ р ре . шо | оовнм ЗЕМ . В й са плн п ми в в я : в зве вою ї2о8 чево
. Має | ! ФІ14В Герань оф) лвосписово віка ВЕЛЕС МЕР ОНИ ВСЕ КО 0 Я Бов за жоз о ояєжо, ВАР ве ла жол ев І ЕР ЖОВ : зе жі і З. їх . боб сс : ШЕ ВВ жах ОВО шин шани а ни шви
З ж Я Й ж 5 Б, ; ої ОБ 'ЕВО ще: БР Ед в ше -10 а -В -ї ше ред ідніютио ФІЛІЯ ши ше нн не ЗИ НН о вВізнвмав | 59 онізнеУа раю | ВО АР ЕОТаю 00 ВО ооЕРОЕОТаю ЯЗ де Его 000 76. о 5РЕЕтаво 00075 су ЯНА МОМЖМХИ кор Кк ОО ПОМ В ВО МО содою ОКО Я Й Зіна Мои дрож Мо Ух як МОЖ МОМ ХК от пу ЖК ОД мод ую меж СІ ЩО 3 МО А ШУМ Ох У бю соту - ТУКА ЗЛОТИХ же жу сжоах ффрясяю хе ОТ МО МОМ ШО жру МО ХУ ОКО ТУ І І Бу МОЖУ 23 Об Ох ж Ох ОХ їх , їх счврттчх вам душа ві А ТТ Кг мищасЗ Утім КкАи У: ді Каеснкжсн якшхевк Ка Бім рВА УМ ВЕвВАТ КСО ВМ АХ й тУкеї хх тож ко пев до бжее ях гових оо В ДВ Я з Р КА х ВИК в Й то В оз і авт ВК ОК Ох АЖ Мих тої Ай тож ЇМ ЇМ хо как а ен Но КВ У дк у Км пої пісі АВ ВЕМАТ М Зо Ж еВ ХУ Кк КОКО У птн коре пн У КІ ЕВ ХК ВЕБ А їм КД ЖЕД ВО ФК Ди см ШКО ло ШУ ЖК м ФО ЖК дог Ме Ж ХО Ж ДУ Мі од б МОМ ШУ М МО УТ Ж ММ обу де псмеврсекаснов екшн ЕУасиинІкпавс:иВпк:вавВоІвнЕККи Мкоренномсон бен о МІ бака кКІ ру ІКЕСОеВВНЕХх ЦВІТЕ Вк й ОКУ т т це ФУ Ух я Ж ду ої 1 и ВА ШВИ 5 хг домоло гу Холод о: т 5 ЗМУ пиши шквал о Ва МЕ ще БОЛЯТЬ ТІ ТВ Я масу мо сту є МУ мо от з. кох лу КК с сти и о Ме я ори Енн с ни пн ЕН ЕК НН и и и а С п МК ЕНН СВ КОС М ВО В и СВ В М В ЗЕ С КО ВКДЖКО «АВК І ВИНО ООН нк й з й осв М ВО ОМООЖЕ ху хе сам ех оси ФЖОЖМ МО ще: ж В ОКХ де дж М КОЖ ЩІ о ЖОВ А ОМОС0хОч ОХ лР ОЖХ Ох МНомерзахномом сени я сих хм : Не нон не У Но о о и НЕ ННЯ ЖЕ М М ТД комознеусновкикеи КА сх ой ом й мМ ож ЖК Ж ж ОТ КОС Кусто КО ЗЕ БОКК ЯМІ нина ни єм З й ПОВИ у БВ й пут іх до КИ КУ - п х коди кох УВУ ВК у а пох М ПІК У най Гео АКТ ж Кк СВУ Е 5 Ну ОБ : ха: їк ПОПЛЮТЮ САТ ЮМ вжи ч їх мом а ус вв я ВО В НВК т ЗУ а чані дао УуйУ вся КК Кк мк оз Ж 0 МИНОНУЗ НО ІВ Кх ЧНГО158 ЦЕН Криту! В В я КК Мука Еко За нен НН В А В КН Ве СН еАЯ іму х а КАМ - дк омо ою у є зи МОМОТ ШОК Ож ОВ ЩО КОЖ В ВЕ ОМ ОВ Оп М ОБ Ж В ВХ г. н п; шо є 10 Ж дого см у 1 Мою що сш. їх 1 дош ум тром м що дО ва ФАТУ ЦК МК ДО ТОХІ Меси ЮДИ Божа У МЕ вон 2 МВ Кп і Мо ви А ВІК КЕ Вт А МУ У ВАВ: й аура їх Оле шо дя м й я й зу ву хо: : шк ее НН НК пехАт ля дК ям Кк пл ОК «а ЖЕ Вч т ВУ КАН вав тв ВЕБ ЕаМ еВ ог ірдадт ту не в А а о аа в ВИ оф о м В ЕН ная вини МИ З В С З М ЕК В и З В С М З М иа знв и з З ПОЗА не ЗИ п а АН ПТ КТ о У о оо ЗК о ор мох Е: КЕ Я ВККС З ц и. як о Миакноав Кат, ВМО МІ ЖЕ У ЖІ ЖЖ хе УЖОЄМ ОТО МІ ОМЕ ОМ Моз. Мф Кщ хро мк кол ло жк хо ух ТЯ їм мо щодо у ож от: Б МИМО пАКНАК теІтчїттчУхки випивали курки Ки В шок «ух их КОЖ и и и А в а и с ом я сх ти пеонсмжкуєковЕмиевонмя кс фо мА ВВ ЗВІТІ ОиВкЕваВвЕТтТІВВБОВВЕТЬХ ОМ алу щш поле Х г сх ВВ В о о ВВ ВВ г оо ще уя кі шокової ву ка ЧЕБЗКЯХ І МЕЖ МКК КІЗ Ту ер св как о Ех Кік БІ С о пи у мА Ат: В еп В ВК уро у куми жі шу ху М ПАНЕ М КА Б ОБОУУ мі КАК КЕ У Ж дак. ки РрІКкВИЕМЕКМ ТОМ ПЕ КН ЕМ Ви УДК Я ІЄ малих Ох пох х тх ; хо. з св ву Х х под що ОК о ох сума Ким Тит ту пу ООха Ой ШУ рожа Ж п; МОЖ ХМ Ос) ХО ХУ Ю) їх ТОМ ФУ ФЮ ЖЕ Ж) ЖК ЕХ Ук У Нам кати У ж ош ш ш шо М ж Ж ЖОВ ОМ БО ша ІК БО І І ФО ОКО У голом пить. МЕ ОУН му хм м ут А е томи лю Мр ж жо хи Ср ОК ЖІ КЕДИ і миски фснгенсуєелюдее віку. ОВК Т І УС ж ІБ ОО Я кеена ЩЕ с т АДЕУХ х БОЮ В ОК ВЕТО У то т т мох ВчЕВО НЕМЕКЯВ сах КК кул си ки ОН ох хто точи Кк кі ех НТ ЕУ ІБ АБУТА МТ дви я У що В КО БщИх М ще я то ях ЧНІ БА ФЕ 168 Кінетичний аналіз адиого циклу Кінетвонає вна одеого циклу Вігакіде лях штурм ам люк: МВА Мои Вігани: Захопло третин нника.
ЕНУА ТНОтих Внайн кзвча ТУ Хозппікиви і а; ЗМ зх тва до - ще соку Пр жк вевев іме ! З Кор ядевті лм ЗІНкн аа Ж ЖИВА НІ Зойнм З Кене ян де ЗОБУ КЕ» дали Ше ях ковани я - ; ко.
ГИ З Іон Ї Ж р З що ГИ ой ЩІ Ех і : БО Е СУ і і ш З ї і хЗ З щем її 5 З Ї й я жі " Божі й ДЕ я ї я х я Я ННЯ ї і гу 4 і Еш ЖІ с в БОКОВА й КО З й ТЯ 1 Її 7-й ; ооуАЇ Зшнм Її ах дв 3 я г і МАХ т ацА їб хх а Зв; звніа ше Я 4 пан ект х ож ока а пок о ов ок АН ЖК роту р ете ом рр ур с ук кур увх ункфт ур я кто укусу й ЗО БЮ ВО НК ОЗ КК БМВ Я що о Я0О ВО ОВО ЗА» Ов задо чав Часті Зк аи їКЕ у ФС Ффіг16б Кінетизний знавліз вднога циклу Кінетичний ананіх одного циклу Нв лакопі скота ин нин НЕ АТ Нині Певна виє. стра пхля аком мини: КНЕАЗ ВЕНИ «ді Авт тав МІВИ ТУ Дмапі ав ВРОВІУХ ІК За ,. ; г :хе 00 жи За пи 7 жо вел ше здаі Яви Зеетл ЗБІНКХ, і Каша ІН що З ХВО м пі КО ек Кк Е ї ях 5. і 5 за Н 4 ї вк ! ж в 5 "Ж вв у РУ З ам У З я ВІ і ХХ вв Я в і ; в ко дЕ 3 Її : - і ГУ т 21 вввй ко с: в ї шт : 5 4 і -к шо лу І 5 авА хо СНИ у КЗ й м З 5 Е Ж ; щ їз і т очі ї са і зм 2 «ех ва ян З ХАН Й Ме Р М.М.
Трави Я п 5 в са ОД КИ б. ковка й оди ноу ЗА па кванта Мои со ра и КВК щ ОЖОО За НЕ ЖК ОО ЗО НМ БВ в жа 435 ва об Зо ЯЩщМК БК ОБ має ко чаш
ФУ МКК або «м'які» ОЮЛІОТеКИ С є важких ланцюга ї 2 легких ланцюга З Її Е ій як : пркенесвнв вет ов я тот у вне ши ан о імен ліз.
МАСА по е о Еревую Ж ожив М ОН ОО я МАЛ є ї Розчин сортукання о 5000 Брю мА СБУ М о Звикання. г що жерткосю відс . ЩО : 5 Її софту ЕК ОБ 8 я шок М ! - ОотиНеННА ЮЛ НМ - ЗОДОХ 3 ї хоподний конкурент НИВІ . т ілибоке секвенування пе ся х Ь кун а Матері МЕМ чі З ЕТ Карта нтенсявності МКК отекя ЩО Ех шошюошюяюя : і КК сх : ке не КЕ - 4 ОХ з ЯКУ К У Го (З еко в б. УМА чт МВА З ДИН ВВЕ оо ВВ 00 о пон по МБ ПИЯКНХ соми ОХ о я по - В о Ко ПЕ тк о ВОК ДОП ЕІ ди Ше З ВН нн ко КОКО ЕК ВВ х ПОПОВ І ПИ МПД мли ШТ ІП ВВ ПИ ПИ ШТ вн в ВО ПИТИ ДИЛИ як БО С ВН ПИШТН К ИН ВИТ ПИШИ ПИШИ ПИЛИ ПОТОП ТИ ЕКОН ППП ТИН ИН ТИПИ ЦЕ ЛИСИЦИП ПИ ПІК ПИ ДИЛИ пор пе ПИКА ПІК вв - ВВЕ ни ДАО Коня МП ЛЮАНЕМ ПЛ ЛИПИ КИ, ІДИ ІННИ ПИШЕ В оосоовв у - ВЕН тн НМ, МЖК ПУПИПИ ЕВ Пи, ДІТИ ПИЛОК ДИТИ ПЕТ кос ОО и КО ВВ и ОПТ ЕМ КФК ПЕК «ЛЕ ЛИН МП НЯ ПЕ «МОМ о п ДК До в ШИК ПІД нене. ИМЕНИ КТ КК ТЕКИ ЕМ и ТИ ПІ МЕ ОЛИВКИ КК и пл ТИПИ ПИ ПИ ППО ПИПИ ВИМИ ПИМИЛИНИНН ІТИ МТ т ОП ТИКИ КК ПЕ ДЕ ЕК НЕ мот ще ПИТИ . МНН НН В Ж ДИТ ЛИНИХИИ я де ПІШИТИ ОО вв ШИНЕЛІ лики тил ОН в в Я ОО плити Я ДИТ ВВ 2. ШЕ КД ЩО ВВ в В ПНЯ Е ШИНИ І не с ВЕС Бе СТИ ПЕКИ ТИ М ЖК ОВО МО Пд пон ВК ФАО ППД о У ОО пи ДПП КТ ПД ДИНИ - ВОМ 00 ЕД ВИ т ДИЖ З ш ПИ ванни о шт Я ПОКИ НИКИ дк СМ шк ПЕТ ДІЛІ КАХ е сс и В в ння МОСК Пи вовни Ши и В В С я ПОКШМЕН пе Ж ЕЕ: ос НЕОУ ЗВ ЗХ пеаИМтиК ИЙ М Мт ШИМОН шт КО ЖЕО Пи ВК ОХ ЗО ПИПЛІК ле СИЛИ -Е ТОК ПИВА оо З «Х ПІШЛИ ЛО УДММИ и ПК ППД ШИК о, ПЕН ПК Шия Он о НН и и Ше НН «ПИЛИ и КИ в ВХ ОЛШИОЕУ ШИПИ ПОДА Ен ПЕТ ВИ . КОХ ПИШЕ КН В ПП Ен Б ІТИ ПИШЕ . В нн они КК и он РОС ї ПІН ПЕК ПЕПТИДИ НП ДН ТТИТІИЛИ ТЕМИ и ПОКУПКИ ПЕК р в ПЕТ І дин ЛЕ ШИН ПМК Ки тних ШИШИОХ ОО ПИЛИ ЕЕ п о ЛЕ Пеня Кн ОК ПИШИШИ. ПЕЛИЦЕЦИИНИИ УМ, о НН и по ЕШВВ МК В вних ПКЕЕ : БО т ВВ ОВ ПЕН не ДОК о ШИ рин ИН в. ХХ ПЕКИ я он ПЛІТ КИ КК ИН ШНК «Й МЕЦИЕИИИИИИТИ ПЕКИ ММ ТИПИ З с ВН ТЕ ОК КН ПОС ЕВ Вк о о Я х.- В С ВО о В : І ОК КЕ о ВВ в ВВ шо о о " Я ОБ Б хо ОВ я ОХ ВОМ ВВ ПИЛИП ВВ В Я В ОЛІЙНИК, ПЕВ МУ СО а ПЕМт З КЕКВ и с В в ПТ ВВ я МИХ КЛКХКХ Кк ЖК Й ве ня КЕ й Й | полежання НУК Й Позвоженци ЗМК Екіпсиенния НУ кис крофінтя о хе: НА «кекси мтя задеаеенеМ са ПТшОМАХ те Я ка и м ку ПДК Кука ЗМ а ЗІ кН 4 Ж С хх ха -Ї ОБ у хо с пи и сте її аву уд жк жк ж. су ее НА и ЗК охо Що. Ж З ВАеУ КИ ж. мк Фіг ВВ ік, Ус г й сокіл Й іш - НН сідали ті ММ Кт тут в Карізінтенсивності МККОБКУНОТеки НО її п 3435 Я Як Мі зах хх Ще є се КЗ х Е й НЯ ЕІ НУ ек іхУ МшБ-АНУа ЖИ і їй ПИТ ВВ КИ Ват плит ВД и ПИШИ п, ЗБ попи пох, КИЕВ ПИ, я т. ВЕН ВИН Ми в ПИТ ПИТИ ТИ ПИ лили ой ХК ЛИШ по ше Енн МНН .- ОМ Дим ПИЛИ ПИШИ МИМО ТИМ Ох ! ПДК т В ВВ ВО ЕК ЕЕ Подає Бо В и нин ТВОЯ «ВЕК ПМК ПО І. ВУ ИН ВК ПЕД ПК Ви ООН ЕЕ в дО щ ОО ВУ ок НННЯ СЕМИ КІМ п ВВ ВВ ИН, ПК их вану ПТ КИ НН ОВ - МЕ ПППМунОпу В ШК Пе т ПИЛУ РУК І В УМО ЕНН Овни СО ПОКЕИ ОО УЖ за и Вин и ИМ, КМ ОК ОВНС Кв ПИШИ ТВ ПЕТ ВИ с ВВ с о ИН ПИШИ Шо ВВ ТИПИ ШИПИ ВВ КОНЯ М пило М КАК 5 ШИНИ ПИЛИ ШИТТЯ М МИ ВК ВОК ОВ оо В ВО плн ЖИ ІДИ ШО и НН я а я ще В пл, ПЕКЕИ НИ й ВОК СПІПФ Ми я
-. ММА А МКК ПИШИ ВК и т СИВИНИ "ВМ ОО МЕНЕ МО В о. ка о п о БО МОЯ ПИШИ ВХ ОСИ ТВА сил о: вн Ван ОКОМ ння ФОН су БО ОУН т ДЕКО С ВВ СПИ ВВ ПЕТ дк ОБ ТОУНЛНЬ ПЕШИШНТ, ТС Вени НН що ЗУ ОК ОО: 0 В НЕ 2 ВН ТО ДЕ КИ ОВТ ЛЕ ж: ПНО Не ВВЕ ," МН Сп М 2 ВН СК мили и и ВИЙ НМ В ЗК А ВХ к ВОМ Кх Ох С хо КОКО Ве т ТЯ й ШК оо о М ТУ ох КК Сон ВН НН З КО ОН МО ПИВ по ОМ попи ПОДКЦИН тю Ж ді ВК ших ТИВ ПК КИ СО о: Он ВВ МІП: х У рановя ЛІТИН ПІДЖИМХ ПЛИТКИ ПЕОМ х ТО ВВ На 3 о ТЕКИ ХО ЖК Ж МАКИ ПОЕМИ, ПИЛМЕЩИМОГО С З. ВВЕ лити, ПЕ ВК я ШІ Си і я В мн ШО ПОКИ ох ОК ко ВКМ КОТ ПИЛИ ПИШЕ ОКО ВЕ о рН КИ я ОО и п М що КІ ПІДЕ КИ и, ОК одн ОВ с. ОЕМ оно - ПОКИ Ки ВИТ т ВТ Ж Ин и и Я о С СТВ ШИ Б ОК ВО, В ЕЕ КЕ КН - ПРИШИК, я НН ННЯ дя ЕЛЕ Ох ВВНВнНН ПІП ОНЕК н Я Кон Я М КИ пдв АЗК Ех вн НН и ВЕК ВВ ВВА МВВ КНИШ Т, ло ВЕК ОККО КВН КК ОМ ВВ я замикати ТК У В ОН М с: ВИНИК ОЯН - "В оо ВО я хи ВН ОО З ОО о о о с ВИК и ни ОО НН КЕ ТИПИ ВВ В КОМ со нання дО Кей и В М ПЦТИМИКК нин Ох он М в ВН Я ТИЖ о В ОН НЯ ПМПК ВХ СОУ ШИПИ КИ ИН ИН СЕ ОТ ПК ПІШКИ ВИК ВВВВВХ ня о ОК КЕШ Нв КИ В МО нн НД М В ЛИ Б в в НИК о В НН и Ой КК НЕ СПИ ОДН Ви С ОН и ОККО и а І Я Де КИ и ШИ МКК . ЩО ПИВ З ПОН ВВ НЕО ПЕК М "Зо МО оо НН нин нини МКМ: Ух ПІНЕТКИ и ВВ І І Укохиама М фколожони МВ Й 22. імноожжена НМЕ І фор заефіцнух хх 4 Й ма хе я и Аа «Фкекцкицци 1. ДЗ ЯКА ТМ я Е УВО засачеНни РЕ ЩА Зк ек г у Же Щи. ЗМ. зх ОКО Я а а НОТА Ко яд ПОКИ, ЗО 37 ск «КЛ, зЗик: а щи ПИ
ВК. х «ХВ ЩЕ з. Ж од
КК. Б КО а Я и З Зо Ж ек
Е ЕК ; ВУЯ ОБАМИ КУМ нн макс ин и и с пива ї пеню Що : щ : : ЗК і Е Я Х і Подано вався ОК Я У У КК ум у Ук К тки нн Н ех Її м ї : Я «МКМ, т В Я Н ен кв ОД НИ А НН НИ Я ї й Е 1 раї х З т ї : - і х : : нн мон понині нннннння кон о осінні знов но на нос Н дж : : ї Сея ! : х Н нн о конем зна нн кн нок км м ово і ЗЕ ! х : сх : нн нн и вний ї ЕК : ї ен М п жуть, ї ЗИ І і : ї ООН ї х ! Н Кк І з ооджаук тк Її НИ че нччелух і г ї.МК де вкиЯх ВЕК 3 ОКХ х ї їх шк ї пиши, 224 Н жк Ї : : і і ї Люк 1 х ї Н і и і же і й ! : Е : : ВЕ ; х : Ж : і
Бак. ши ше ши шш ши ш- ше НН НИ ин : З : : х : ах х : | Е т шив Я Н І 8 Фк кАААХКККА КАК АКА КАК АКА КК КАК АААКАЮЮЮ АК КК КК АКА ЮК КИМ Кк яки кю ююююююях Н сушу В й : і БК ї : х Й Н оон о пон В в ї ки дж ї ї я : ек а М п о о Ов ЧНІ, ЕНАНОК КВУ Мме йвВіД кі КО ІМ і пек вин нн п п па НОВ ВІН ОоВ а ЗЕ ВЛВБ- КОН ІА ож ж сКЕ ТМ дод то СНО а Т.О я е ле КУ тях аа я тк и вом я АЕС Ка ТОВ Іво ша і кю чи жк рух паж у УК Е сени и Я зда -- деп СС а ВВІВ а Бак ВЕ Кон я киев тях фі вихух, ОВУ т кя хо ак» очи - ВІВ за АВ С НОВ ЗОВ Из РАШКУТО у хм и, ал з па З ТЕО; АР СОХНОЮ «о ща АЗК 4 Ко 1 АВЕОДОСчЕМНСТ МЕНЕ зав В НАТО утих кОДАТЕ як КЗ ту г. жу тка шо г тяж в АРЕСО НОЗ АЮ шт ЗОВ пе зок ри, Кит хо я УЖ: 4 кН з АВЕСДЛЄУ ОС Я З ЗВО БАЗ зако ст оку в зву ет пробучках і т году «ше з дРЕЗ Са Т НОВ жа ОВ КН а іа коту му УЖЕ у х КІ гу бу г ВІЗУ ТК ОВ ТОБ БА океан ея сх жовт долю г холи ях АРЕВЛСКНСЯ ЗЕ Их що Зло У Кл кох вдих КОМИ ХУ. те ожу г: - «Ж АРЕСВАКСУ СО ФО хз МОЯ мм а у В хх Ето жк жалю 4 сур уд «зву ІБН ВІЧНУ АРБЕСІ 535 ЕВ ваше
ЕЙ й 1 д Долі ННЦ чИ й пе мТМч МІВ
ХЕ. ко ванню льня лина лем Оо пани Ена пуд КУ КК ЕК о Кіра а КУМ: ної з пт зно змо Ж ОШОЗ ТОЖ ОТ ВІ пк ви Км мив при ості соки вжи тскАв ІМК РрвУессКих зижшеєАН ЗізмІсвиві АКОТ свй ВУ МУК шо ЕВ ВИХ; біта ЕшвкЕВаритІапА киУ БИ МЕП Х Аа ше мт«а вав ша жа: у швАВО М УЖЕ раю ви жрксзоЮмВ сбошмІДВВВБІБАВУСВИУТІТИКАВЙ ВЖЕ РІНЦ арок бо ши пива ва жо внУІТтКскниАВ Вих вІіВиЕКвх жиющлінта сібшіІйаЕВіІ ВАК ІЧЕАно ВУ ККЕІКИЖОоСКИХ ечишісжтща зісчмтаткикві вк Опт ІРДВАХ кУКЕ що "МОМ пн Кр) ВХ Не На и о в В а МУ авикіІ:сжшАтТАМІКкНАЛУКАКЕІДСВОВЕУВЕГТІ ВЕДЕ змаш и дви ЗАТЕ КкІНУВВЕЕІжсВоВвуУВКЕ трек акказіша і АК: ківі ЕУкзавасчсиЗиВІюк :тіІВншЕЕВКА арЕсаісаки врвЕті А ЇАВІКвкІКУвКЕВАкЕоВаВаАТВЕхЬ І Ві КЕЕА аква еини звигпі ката схвЕвкавЕаВАтВЄтТЬВІ ВВА ВЕВКА дев Івнау вві кдІЗУЧЬКВЕШУВЕВЕасЕВВЗІШЕТ КІВ ЕЕХ коза Нною важка АЗаУвшВвВ КВ БВ і ЖОМУ ЕК А. АКЖОЛУМІНОМЮ АЕВКРІБВАТЕНЬАВКУРВВІНИА ОВЕС КТЕЬТ ШВОМ В ек іму ш: ПЕ А Кн в В а КВ ве о вівнеах ж ж по о кв ко Кк ОЩЕУКІК УЗ вели ВеНЕ г ЖК тА Н.О МТ Кк Ві Кк ВЕНИ ТВ дЕЧиЗОВс КИ СТОК М ШЕ В АВ 0 Ток тек ше ОО ВМО НЯНЯ Ж дкчиахНа Ж ок У су АВ ВІ пл В У ОК ОБО ПУ МСЕ ХХ зезІенМй тече ад І ЕОМ ЗАКОНІВ КЕ запа лиІ КЕ г ж тою в АЮ МЕ КІ Ж М б КО МОЛ ВИХ ЕВ АЖ БЖ жор Ак о катка СВБ КУ КВ Зріла ж У со АЮ щі МВВ Кк БЕКОН юю юю ою: т ЯН кі Карізйкльна діпачка тиж оланцюта алюловічмнннт УМО КУМ с Ден У в НН В С с а М ЗЕ З В В М ВИ о ОВ І щряєсх ЩевікавсАЖКЕКнСАВУКЕВсВАсСКТЕТВКЕМУХ ВАВ вижили кУуспійпзаавскЕКкВвАКкУсКкАаАдвІтТтЕчрвЕІВМНАУВ КЕ ЕОМ БУ цшІ ВАТУ А ВУ КиВИКА ВІККА МЕТА Ех лена вч ЕИи ВКМ Кв Ви КІВ м У ВА РЕСІЮШЗІЮВ ЕвЕУпьМаБО»АВсВККЕсвАУКкуУсКкоАсУКОКВЕЕНННМХУВОАВХ девзьміюх БУуцшіУщшаЗзАВсСККкРВЕАВЕКУДСКАВСсСККЕВИиЕММИХ ВИ ВЕКФЕКО НК сУпІУЗСАпУКЕВВОАВМкиЗИКкА ВИКО ВЕ ВНУ В А ВЕ вРЕФаВеХНЮ мі МиВшАВИКК ІА ВВА В У КОЮ. Ко М УЮ М що АСВ ОШЕ пк КВ он пом МИ шен вхо В Шивер книжн ІЗ ксИсЗаВикиВас:всвскзаивкикЕСсСТкксЕвЕВВХ шив пеоЕміваУврЕТВААМИККВЩщЕ ТІ ДТ т В ви жі КВ інв єсаю: чевЕшівОУпвкІ Ода жнакеКкИВА І пи ВУ ор А ШО В АРЕНІ: с вмів ЕВвАКкВІККкЕКкВАТаТЕВОДТаАТЕтТ жі ден вежа севвитЕсвачвакикакАТІ КОТІВ еко саиУ Фа жжіІ вана ААсМОаКЕ шва тат ВХ ві В дЕЕВисатоІ спаівшізшипеветавАа чакра та отв тет АХ ЕВ АрЕСЬСІТаКІУ ші жі ЗшкхИвІс Ка мАХВВКнКкОЕАТАТЕВтТАЇвтАІКВІ В ерЕФІСЗУКОХІ псезвшіІсвУреЕктІкивкУуВакекаиАТІ КИ ВуУдхК В ОЗ Сх меж піна тАТ тв, жав та ут ва ПЕЧУНИ МОУ ТТ, знав ваша тамуУ ВУ А, Олю ва вх ож св В о БВБО ДЕМОК ВВ дЕБЗЗСяІЖО зіва ИтАнуІтКТКВаУпиВКАК о Вже тв НО МОТО вза сІнНИи ЗовБЕЕВтвУКи рних. «джу з ото в ж ВЕ М ОК дешЗісЗТьО ВОВНА оТВаВ ЮК, сеУ ав таж ж у бо ІЕЕ А КЕ ОНКО ЕВ ККІІ пила ЕЗТАЖСУ ВІВСА оо укл Кому шов ЕКО У МИУ Ту. зРЕФІПаєуаКиЯ ЗІБ ОЗ ВІЛЮКРТА ЧУЖЕ ЖАВ ЮК 60 жЖ ЕТ вок ж В в КНМЖКМКК ОМ двевіВТтНОЮ ЗсЕаЕИтАСЖУЮ ТЕНи 0. пай ж МК шва БЕЖ НМ гоз'яд
ФІ. ОЗА І осаарасю и ни ин ин тки тт тим нитка и ния они юки ни ння я Ки Дно ния КИ кн они и ин рин Сх ОО М В М ВВ ОО В ВО В В В МО ОВ ООН А АВ В ве и ВВ Пов В В В М в р ее ов о ВО о ОО ОО ОО п ВВ ОО КО и В в в и В КИ КО БІК ЗЕ яК Б ПОМ МЕ па ВАН ВК М М а В В ОО НО ин я ВН н.с Б БОМ ЛІ ОО ння Пн ЗО шия М і ВНИХ АРК Н Її Ї : 1 вин он нн : ПУ аА М ЕХ ії спючк Її ж ії пкт ії код з і тод КУ : «яму ту ї окуні роя їх В ше: ни ШО Я | В сивим ри пт п М ВН пес ЗИ п п : дер ро ни Н з їх ак ке я щодо щи Ж лев морів 3; ББаСЬНОЮ р я Й пз Їй паз? ня ої паж чаї І пий що о : нет пуття они кино ин нн п Во ТАН Дон Її ВРЕБЛЄВНОЯ 00523 ОО 0 о о03 фа б Омо 0 о ОО; во: ЩЕ Інна КИМ С Ве о ВЕДЕ Нв В КН ПЕ ОМ паза Данчиньян, : Н авррікч кцх х ї Н ї ї щ пи пон пивна РЕ НУ Н хлів За Її м «п ! зле Її я задо! ол ! укр тож Н пІЗНЕ ! вх п ій 035 | жа пн оо ЗВ. ! і дЕЕВІСТНОЇ ії вл У ія і п ї хаб т ша тд що ши - МК ХТО, і ее АК РОЩМККХ ї паби: ЕЗ З І ЗІ КО 0ЬОБ. і Мк КУК І етснітднннтттнтиттттниня ння ненні фінти тні нені фуннняннятннняя ин тфрнтнтнтн тні жк іжинннифннттнтянінфнтнтннннтннянн штир Тих я. Я пр ие зве ; В А АРЕСАСУНСЯ і КОЗЕ по ба: 5 В паж що БУДУЮ Гн пон ннв пнннн пн нн п спо нн пен п пах ОО ОО Ї ашриз ть Її дке тод ї- ш я і хзк : РА Н : : Н АРЕБЯК АН іо Блю ВА ПО СпУХ ОО РНК ОЇ ба» обов кава і вв пи на МИ В а п а по а пав В и В ДОМОВ сх ї вав аганея ВІЗ пд ії пз і дека і АС й зони оолвсваєзтномя 0ОБЛЯ 000028 0539 0833 05 о55 06) В ї проник Н ву -х ї ит пра вес тух щі ї БРЕБДОЗАНСЯЗ ОЗ а ії Б ОЯЯ о ХВ ПОМ пов! вав Керн в нн п поптетятяннятнтн вин пи : діри ки уд зт і под т ве їж і мех ї шо скор з ек о Воло ноВ 559 пз 1 ба 05 о ОВ | по апа 508. : ЕК іІКлИз це пок мох і вжива: як Ж жи не Е К є Н ЕВАНС Е ща ПЛ ВО п Е ПОКЬ ОБО де ої За? ! Е В кн в п в в в в в в в В м о Н меді я Н шок - їх щз Її ду Її жулих Н 2 пух кя і ; Н ; : ! - нн ин в в п ОВ Ї дня г БЕК ОБЖ; пла ї пяЯх Е па | пай сах І ОО ЗА і Н ооо оо оон песни нн ння о й нн нн сни ни пн ання нен Додон інет няття Н реа до г їх д 3, до код хх дух сом речи ! 000 0ЕБНСЮВ ро ва їй. ОО рн б Як і Се ї 3 : МНЕ ОЗОА ох Варівнти 1ЗНОЕУААРЕО В зрнею нйннністе праг НА Ж Нюх Уолт мідна АХ шипа р Вар я ВІЗКУ В КЕ ПТК УМ ен яке АБЕКЖСВЕЮ и У АЕЕФЬСВНОЇ сн і у ЦЯ зе ВРЕОЛЕДННИХ чек з яке ДАВНЯ ОВК ВТ ВН В Й сс Й Й ше ь ха ДЕБЕТ ЛЮЯ ще в щк древню В а їх як ВЕБВЛСВНОЇ Ж ук т, ШЕ щі зе АЕБФІОВНКВ х : У хх ВЕБ МОХ Зв З дани і: В в т ке АВС т ще. ек ВЕБ ОМІ КОХ х Ї Б зе КЕНЕ
- У. не КОНЯ з я м кон Х Ж І! у КЗ Кк ея їй У С Е У ж Не зу. У че ; Й Я, в, що уокннснов її вин НН НК КК В вс в З В їх їдитвтн
Що Б 2 Ж : ТИ Ж Ж най ко ВИБР : Е що Бо -і Панама мззснияй дат ео
Зо. хх С г к І їх Не х І Дівлящ я плаче Я Хо у. ЗГНХ В поле БЕдЯ х ї х лорі Ч «у с ; : Й кім смажимо пре лока Кк : м ле в м уж. нахилу КО ТОК як є МО жа тва м гі я ро шддх дах КУ Я т - У МАЕ ПЕ х мит шим тим ПАМ. Км М ЛЕК Водами блог я інж нам им ЧЕ 3 ЖЖ й ОжбтЖтних ЗУ ІШК т іму ТИМ юхМмЕ де р. я каша М в пф ВВ Оя и УДО а :
Жар. є з ЖЕ: шо ви и ЩО в В Парамеер азам Суду х у « ІЗ же: х : Ж зх хх т Дівдазанї МНежОЕ яке у тОоща фах ФО Ох - я цк у - Кущ нахил ТИ пу СУ Я їх й КЗ їОЛМКК Мам НУХ Е.КАК НІВ 33 її М -ї дош т ло Ми дл пафос нік НЯ що ми Що і я іднтянлом ка фу ск де ся 0 | і В; З С т рев ан Н и нни о БИ НИ МЕНЯ Ж ожЖ о бдкожюй Мах я ОТ не КЗ й -ї ся ЗЖМОО г ДО рум мм муху у у В п Я - Ніна: ик Ж СОЗлИНИНВ : х ЕаКУ : пт и лив В ФО Дудюттчмтит тити тет Б В г КЗ я тем, 3 х ї Я Як їх с х шх дих ї - х ак я Же вих в: Ук о ча жо. Бо г Я Перамену Звання Кін лкнека ве : к: Ж Ж ва х о, ХЕ й з 4 казан НУРЯМ я З хи 1, ща дк нк слу оди ОО у х я КУ ТІК ВК о х Е я т ть м я ї вк Є, жах . щк о. ЩО А не У -ї Хроеб. нахвне Ки З 5 м В З Чия АЙ УВУ МКУ й ПЕКИ не нн Ми ВН «М їх ВЗ ее В Я : ЩІ чув най ЗК мк г С ККД Уч ре КВК НЕ т ет ри кед ФІСІ30 ори Я ря ї хх ІЗ ї 1 ге х ІЗ р КК нн о св Не шк ша «роя ІНАУ КЕ З УШИНН Ж ж х ї пи сенси, х ря Є Дав нневвкаснннонннппновонновннвнонннонвоннн х КЕ ТОЖ хх шк вих букси ки Ким ки вою щ - Пара мае Знамення зна ее Мо АО ІЗ Кк кр ях ка пожік, її ї. х а кое те в НЕ 5 У ч їзду ке грог щ : х од сук тру шко» ; а ОО дО кВ АХ і ї У ях ха ям : й ше 0000 нив мати з ще п ях код ко МНН. МАК ше п ЗО У онндддяднжніджжкнну уст сєттюстюеюсттеесовиестнт нт : ша М Ше Г-з в Зм «ВІ БОЖУ хе ОК й От Її да ОМ пл ї о італ М и ІС й ЗЕ ЛШ умову жуки я ВЕ ж Од ро вен Нивки пк лем Ж Е
М. р 2 ЖЖ он х: й т ск їх х : ОВК Ого я вв Ку Ше ІН ке : щ НІ і: 1. нниккіжюжькк нижні кнкжькжьюжнна я ЩЕ з 4 АКА ЛКК чан Мово. х і Врхамет Зав бух г ї й БК «м ТК значенню Сама пох - їє х. хі Е ї х «ВДАННЯ ТЕЛ МВ
КОД. їх їв шк В ОЖОМООХ ч . я ц х -- ВХ В п За з Ка ан В ПУ ар вок о мох ь, З Я жом міка Ж осУух: ок Ж род нн ро БОННІ КОХ и | ши ет а сдо КАК КН СПО АІХЖЕ. пишні й я ще і ча інет я Ше же за свт одну укум уми поккккк кун і м Ь. я в. ш тир тк Туя КАтя ТВ ТИ ТЕТВ жд ї5а в КО й т пок ККН НН КАТ тет МК тт тижня, Зоо Е -ї ШК : те 8 в сна ни в ЗЕ : СОН Тк Лоб ! ж шк» й - їх м кн а а : : : : 55 Зм о Єви куне В В : Пера 0 начення сно У є У т Шо нання ще й т х З изд У пу ту дих о» Я ІОВ кЕЗК я Б г : х ї ке їх іа, доз ї ща і я КІщ Ен СЛ Ж ЛВ Ко ючи хх ву ж Й 5 ще ха годе г ше ж ВО ЯМ ь : Коб нак ДАВ паща не : і вла ох ще | ще шия ОО М КЕ ХА БУКВ Ж КАНВА БЕ З КИ сек що ї щ Ід НАМ прБуКЕи сулуй Жожо х ПЕК ТТН ПЕК ПЕК тИищЕ роги тТтщИ тех яко і | " З У НН ФЕН І 25 ща Ж не МНЕ Н зе Зх Ж Шик не низ Ме і зе їх Кс Її Я ; ша І о Ж дк Ї 5 окр 5 є 5 око Я і ЖТівремеюк Знавевни Зв она ІЗ ЩО Е ше ще зок : і 1 уми У пт во ке ій їх в оранки я ВИ Я ВХ ХЕ зро. З оте шу пе я шпат БОЖЕ: У ЕВ ПЕ ТО Ку х і: з - ток х мс муси котру, гр МКС ювазвія нм я я Коєфонаюину ОЛЯ 00 ЖОВ З І МЕ А ОККО ТАТУ я Код ре деки Ж - фону ен зве жи и шо В В В НІ Бо ТАКИ ХК КО З ІЗ Еккімакінй мА Ін м 0 І Г КЕ. З «лугу ПЕ ЕКН КЕ ПТУ ТЕН ЕН ИВ Он ж ко Оя : пе ІВ : му ія й З жи У н ї м З к Н ше стати дитини тт - Ще КЗ я ій - ЩЕ Ме ЕС нин и іеУ ї Р Н х г х З Вадзвете Сусукисмуіму КУ шибок З щу х. : Парето лначення су УХЕОХ ке і; -. 5 КЗ Е З Я их ї ї- 7 х ІЗ З ЛУ В Пдоих ЯКІ х і Дена ЕЕ КАН Б-Я С Сх соя Ко з Я . ї кове Заза фреш ох й ші У МИ 1 За КО ЖМОТ ркуюх с за ї й Фо по йй -щ 0000 Кові ние АКНЕ пом У п нн вк ОО ИИ й - а де дом В Яков ск «ВО ЯЯ ана гу ож і пише ложку . : - В АК кн М з В в а а, ІДИ А М НЯ КУ ЕН У я і 1 х ч роя у іднтнтілн. на сет - й й ФГ ЯЯА ЦТК ОДНА ЩЯ со Н.М АНУ 1 СМ ВЕН СМ ШЕВВ рнний ПН у рин пін інн ів нні ки ки інн п іі і нн кінні Знов нн вв спини ния УК Н ч Її ї : ї В Н ї Н ї Ще дю й до й о - : Н Н : Н о ук. 01000 ВХ ЗІ В. з Дек аку лах аее З КЕ що : Хх смена но мон сн нні мине нн нини пит номен НЕХЗУЯ : не ї дою ї : ї Н Я НК нен ВК ВК дн МВ сн На жя ще ліг шКНЕ кох проду подано : студ -кі се ї Н Ї Я : ЕС НН ИНА ЕВ хх А Зк; пов ах зано ВК ЦЕ щ з Н тру ув осн зас косво кспомм с посох мен во ан она ра ВОМ : рр сом пре хх пек Я і : і
ЧНГ. 246 ІОН дев ПСОНМВ ої нама КОЖЕН Маха ОЗКОЖМНИМО Її Мехжий ої МО ої сах КВ он мання мес і 5 ПАСМ ПОЗ НИ Во НОСА Ек шк ; нн ни Мо НВНЕ ВЖЕ, : с ї і Кен зам Ппудох Траву с дернини сіл за рми кі ск сі ОН нн СНИ и Ки ЗК НН СОБІ СОН ВОЮ Ки МК РУКУ : : ї : ї ї Ї Е Кен КН зд пра ізктдрожнух спа хикак кв дей Я Я : : : Ук г пе УМА ИМК, ЕТИКИ Не на КУ ТАС, ПО ТОК и МУК и ол ВАК Ох ІАМЕЕНВ МИХ АХ ОН ПОБУ РІ ро ЗУ НЕШНИ - ! нн пн пиши по нин пи пон Ми ся Се ІНК щ ДИ зав: і зії давнини З ВІК. вовтв х яке з і пз хо яв з етни шини и и пня шо нн о кв в М ПЕ в ІМК а вже : : Н : і : Н Н Н Н пгжту ПЕ ІЕМ лоді тиви З ійз зиму у т у мот хі БЖ нн нн В ЕВ... ЕВ КИ НВ, с нн ння В одн ВВ зи к ФГ З5А Кокуха пий ри прикол І . . й ! ит ув у тити ї і щу : М : КІ Н ї нок авонсо ЗсМод вн Сни плн КО АН А пек ви Аа Он сан ОН доти Янаті ЗК: Нахни ОСБОЗННМ ЇЇ Ббхни КОМІ: Махвх я ОК БНУ АВ - чне МОЖ; К ПОБТЕ Б КО ї ЗдІ панк пли ян сакодютоях ЗНЖКЕ пре ВА Ка ЕІ ва 000 в: бо домі 00 ве ет ВМ кон ними смів: Мис МН ни: Зно Зм пим се ОМ о соні зичу ни ї ТО З ПЕНИХ пав НН ПІІ ФЛ, ЗК ЧЕ ЕНН ММ ФГ ав КК резрекоі ЗК Ул лак кахицу З кранах УДК 1 хх хі В-Я х ; М пив и п п ПО ин Ер АТ Ї Ме а ме Тк пі ж іншо 000 ї ШИЯ Ана ПЕЗОТНК Ї Нахви С СОМИ: Мах ОБООНУ Махвя храмом стеж.
ОКО пе п о В ВЧ АК Ви нео увая вв о зм мон Зоо Вино МИМО мн НВ о верюмльв БЖ у ван н МЕД сон нн НИ п нн НН ОО уд ках оливи зни вив мин вовни ЗВИК кві чи зів о р зі віх зно фін ння і іо й ш-к ШЕ ШИ: НН: НЕ НН: НН НН С НН ї сут.
Ей - З ФІ, БА ФГ ЗВ Я Кока татревання нтактного ек ну хх чІдх ему х МТ Я Х х ож зва х : о г: і он ця - 80 З г т й 5 х Ко жу и - Е: ЖАТ КУ щш їх ї що чХ Е Х ре Я д Е х Й Ка дою, хек М: ун Що М це.
Ж мо ОБ чИх о КІЗ Е КУ Е «вені КИ у 7 ни сек уо ЕЕ Е і пад оо рен х : в Кт ехо о КЕ | «ве пу ВИ Вояж еко йод й А птн Бо -й В рі ІЗ Ко щ В ек ожини уз м ких Кк Й й й Би Мо хво Я вк інд Нінене нові, мем Х поротечна концентовній ва дипавкою мк мн Бас т у у не аку ях. «ФІ х ка, х НАОрізианія зидетеина НА ІС5О варіанта АРК із зрілон зфіиніст я Ккспеухнанк аЖе - дао фр К 4 ЕЕ ; Хо ее ПІБ КІ УА : З ше с я ВІВ ЩЕ я 3 ДОА В щи м що дова АК З Шо. шин. : ее ВИК КО МВА ВІ і ва за АЕЕФ ОЇ НО ТЕНВАЯ ВУ хо Я ее . НИ шу ел ми то ВЕ Б ке АБО ЕКО КУ о ї Же Я. шк . . ЕЙ же вер ОовеунНе ну Е НИ КК с ВВЕФІСВЕ НО ЯВ х ее КУ Ж ше Й КУ ХЖошх бо б З - ; 7 п що й Ко У з т ; ен пн пн М и й в В Я як ма Антаитй
ФГ ув НІбре аналіз евдигенно Нед НО варіантв АРЕЮ із зрівсю афінвістю Експеримент В що М кЕ зам ес ВН В У в ж шасі их - яка кн Я жа ВІ ВНЕ Во КО й В ко АЕС ОЗ ЯНА ов; ВА х З с я АЕС ОВ ТОННУ КЕ в я о. як ДЕКО НОЙ 8 ж Бе є АКТУ ЦО КИ Ж ко ще ОВ. - У К» т о я ко ток 2 де вх Ех днвнненнни давнини нина кання «нн «3 В В З Ж КЕ КевіАвтитнм у ФС Взрійнпт а милою адінністе проти ЕВ дивпіня зктенет За ОБО де гечнНя ТАЗ етоде ооо ооо ооо ой сооодооо ворот ооо ово зорю В ооо ов пово оро ово оо п орав олоо ро раоос водо ддеоо ода МОДЕМ КИ ДТП ЕН ШЕ ПИ КИМ ДИИИИИИ ПИ ИПИИИПИИ ДИМ ПИШНИМИ НН ОВУ ни и а о і ВН НН КК НН В в НН Кн МН пн и НК я ШИНИ ніх ОО КНИШ ПИПТУП ИН ИИИИИИИеКпшши и ПИТИ ППП ТИПШИИИ ШИ ППР Ин В Ву фо вк со ЗО З о ЯН ин АНЯ о ПИТ ФП ШИПИ КК ПОВ НН Оу ж ОНА ШИ ОК КК КИ М НК В и В ПН о пн В и о и КЗ КК НН ВН ВН в КЕ НВ о ак;
Й.» ЖІШИКИКИИИИНИ НИКИ ПІКИ и вини еп ИН ЦИ ЗПП Ди ПУНКТ ОТя, а я ВИН В. п Пе ВЕ і. У ї ві5нНишІ АТЕВ і Н І Н Ї Н Н Н зкОка же КК 1 : па ОО: з Я код шеросуххЇ сшуім поч: : пучки и ія БТ Зах 50 їЬБЯ тва | 5ааЗ 583 ОЗ і ВУБНЕЮ і ! ЩІ | Н ! і і Н да СНИ її і З і 1 Я : В АР КВ ЕК зах «й її ж як і «ж і вза зд ввів! з 1 : вия жк сов Е ЗАКО ОБЯВ 125 п ва ЗК ЗО: Я пБНахЯї | Н Н | і : : і ря Н пожити ококтототитттт В ннваваннннння нилпин,ивччєнишиниши ї ивоя я тофу їх хх. уки х ха м яко Н кут А го о шах З лух ої соя т АРЕЕДСЖАНСЇУМ о РБЯВІйІ 1 Бе пло ОЗ 1? Зав В х Ч 7 Н : і НЕ і ! і Й Я і ї у не ще 1. у ч жвої жк лу Н у атоояк Кох якої - ші РО АРЕОІСЗЯАНОЇ орі оНаї: ТК; ' ОВ о БРВ 75.79 55 ЗВУ ни ВИН ПИВО ЗАНОВН ЗИ МВ ЗАМИН МОН ЗАМКА ЗНОВ У тн ФІ ІВ ! 5 і ТОБТО КО ЕВЕТ ню о ідкк. З Н ія щи а тя М шо гу я МАМІ рю «Ах С ВИ КЕ тю іш Мак с: і зразок КзОАмМЄс кві о КОМ 01 ЕМО. Мія ВК : ! : ; Н ін; В і ЯвАМк | і нгібжвано и а а и сн коном вн в и в в ї 1 дж її дод я : яке Н рок : ск : ї Н НЕВЖЕ. ОЕМ Її ВЕ ї ка и ИН НН НН С НН КАН нн о п в п пп п вн в КО ОД НН нн и ва НН А В КН АНА Е : вх шої си воеєміухо ле : : г ї . з : і г. ВІнНЕУссУ 0 аю 0 ЗО ат Б В п МЕ ВИК НННАЖЯ 13 ОНИ ря ом а ово в вав п-- помоонон зни мо оо пом о в по оо пня знов о ох з оо п нн а і ВІ де ДЕН ВВЕ БОББУО ї ТК БВ. о А НИМИ Н : : сюжет дню сумо ско Волга ї пек Ж жу : ще : Одже та Я с ТЕ : АТБ Р ВО О ще І ща шя БВ нка :
"щі Її ЯНГ ЗА Пюдсека НЧАЙ КН ОогЗ Пак АКА АВ АВС ЕКСЕРАВСВЕОРЕЕВК КОСОВА УПАВ КАСОВИХ МОСК КАТУКККАА ОС УСААЕВУСЮВХ МТКАММЧЯ АААБКВЕВН ЕН ОВ АННИ С МНВК КАВУ КЕ АВ ДЦ ЕКО ВЕК АНА КЕ ЗАМКУ ТЕБЕ УКХ ВЕУ ЕВОХ ЗОН ЕВ и ВК Я ШЕ ВАТА КК ЕКОНОМ ТК АК КОВІ ЕРІО СУ ВЕВО ТРАС БМ УУ КАЧКУ ВК ТОМУ КВОТ УВК созЕо ТВ еВ т ча ФГ зов Мпа ча нт сим Мін Купив ІА КК ги АМКУ КИ ЕНН МОБ ЄКХ МОХ ЖК КВ МУ ІАЕ КОСУ У Кк ВАВ ОВНАК во УК Аа АКТУ ВЕН ОА АВЕНЮ Он о а а В Аа ХНЕУ КАВОВУ ха НО БА ВХВЕСА С ЕАК ЕХ В и І ОС НЕК ЕКО КНЕУ ПАН КУТ У ПДК ОН ВК ХВ ОО Вх КЕН ОАКОСКАУТВВЕ УНК ЗАЛ КОВКОЮ УНК БАБИН АК ОВБІМОЮВМ АКУЛ У ТЕЧЕ КМ ХМК МИНУТИ аеро тий я хуя ж жк ще Її. 30 дове М. У ХОЧ КОЮ ТЕТ АТЕ ТИКИ ПИ М АКА, ВО ШИК МКАС АТ ТК КОКИКИК НКТ АК КЕКІ АНТ А ЛЮК т МІШКА див Ко М КМ УК МИ ІК НЕ КЕШ У ВЕК ВУАН ТОВ ЯЕ Ем а ре и В и НН в ЕК ЯМИ КН НН НН І НН ея ЕШЛІ ЛЕИ. ЛАВИ вд м ВИНЕН ЕФЕ КЕН р, МЕТА а вВлвЖИ дути і зи пе ТК ВЕК кер БЕ ЧО МО ТД вк Мт КЕКВ КК ЯК ВЕК ЕКО ТВ
ПИ. ШИНИ В В Не ща ще Мк 1 фе пТЬоя хору вет юки рушник ВВ НМ БИ ХПЛ МКМ и ХО ДК КИ ЮК ЮТ їх 2 ЗИ ВІшИЕ БИрУВОВеВ и ВО р Кок БЕК МУК ГК Дямен ки ЕН СХ кре ресол тином щі ШОЕ да ОА хх г шов х : ще із т пох, ВАВ г вия я КЕ, я Б - рес ЕТ А В К ЖКОН КИ КОК СОМ ЕН ВА КК МЕС В КН шМІПЖО он Ко кН Ки вн ОН р и ой ВІДНО ВЕ и Й и в КН ладен соти и ау орЕюу м ко Ан КН в НО Ен КИ А М НЯ ЩІ кмину Кн и ЗЕ НМ КИ в: о о Нв КВ що вот . ярит щи ниж пиши кужут косекошоеснє ККУ о я Я тоже не і Я - т МИ ІТ и вІйИЕ ен а КК А а В вБІКОВ.МИ КУ КОФТА Ю У ОМВО ВК У УЖ СБС НО ТУ
UAA201804022A 2015-10-30 2016-10-27 ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ'ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА UA123773C2 (uk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562248871P 2015-10-30 2015-10-30
US201662345669P 2016-06-03 2016-06-03
US201662411113P 2016-10-21 2016-10-21
PCT/US2016/059110 WO2017075212A1 (en) 2015-10-30 2016-10-27 Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA123773C2 true UA123773C2 (uk) 2021-06-02

Family

ID=57256463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201804022A UA123773C2 (uk) 2015-10-30 2016-10-27 ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ'ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА

Country Status (34)

Country Link
US (5) US10421821B2 (uk)
EP (2) EP3922649B1 (uk)
JP (2) JP6750010B2 (uk)
KR (2) KR102440160B1 (uk)
CN (2) CN108290957B (uk)
AU (2) AU2016344399B2 (uk)
BR (1) BR112018007703A2 (uk)
CA (2) CA3001362C (uk)
CL (3) CL2018001139A1 (uk)
CO (1) CO2018005393A2 (uk)
CR (1) CR20180296A (uk)
DK (1) DK3368578T3 (uk)
ES (1) ES2870141T3 (uk)
HK (1) HK1256094A1 (uk)
HR (1) HRP20210736T1 (uk)
HU (1) HUE054093T2 (uk)
IL (3) IL295097A (uk)
LT (1) LT3368578T (uk)
MA (1) MA43113B1 (uk)
MX (2) MX2018004509A (uk)
MY (1) MY196448A (uk)
NZ (1) NZ741780A (uk)
PE (1) PE20181009A1 (uk)
PH (1) PH12018500887A1 (uk)
PL (1) PL3368578T3 (uk)
PT (1) PT3368578T (uk)
RS (1) RS61871B1 (uk)
RU (2) RU2750285C2 (uk)
SG (2) SG11201803356SA (uk)
SI (1) SI3368578T1 (uk)
TW (2) TWI747850B (uk)
UA (1) UA123773C2 (uk)
WO (1) WO2017075212A1 (uk)
ZA (2) ZA201802382B (uk)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016344133A1 (en) * 2015-10-30 2018-05-17 Genentech, Inc. Anti-Factor D antibody formulations
CA3001362C (en) 2015-10-30 2020-10-13 Genentech, Inc. Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof
JP7164521B2 (ja) 2016-06-21 2022-11-01 オリオン・オフサルモロジー・エルエルシー 炭素環式プロリンアミド誘導体
CN114685453A (zh) 2016-06-21 2022-07-01 奥瑞恩眼科有限责任公司 杂环脯氨酰胺衍生物
CN109415732B (zh) 2016-07-01 2024-01-02 豪夫迈·罗氏有限公司 用于调节htra1表达的反义寡核苷酸
CA3085211A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Companion diagnostic for htra1 rna antagonists
TW202039585A (zh) * 2018-11-16 2020-11-01 美商雙子治療公司 靶向htra1之基於抗體之療法及使用方法
US20230312729A1 (en) * 2019-06-26 2023-10-05 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Egfr antigen binding fragments and compositions comprising same
IL296256A (en) 2020-03-13 2022-11-01 Genentech Inc Antibodies against interleukin-33 and uses thereof
CN118339187A (zh) * 2021-12-31 2024-07-12 上海宏成药业有限公司 抗pd-1抗体及其用途

Family Cites Families (230)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
CA1188246A (en) 1981-08-31 1985-06-04 Jerry L. Gregory Immobilized microbe recycle apparatus
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
EP0451221B1 (en) 1989-08-31 1994-10-12 City Of Hope Chimeric dna-rna catalytic sequences
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
ATE190981T1 (de) 1989-10-24 2000-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte nukleotide
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
PT98562B (pt) 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
EP0549686A4 (en) 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
EP0552178B1 (en) 1990-10-12 1997-01-02 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Modified ribozymes
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
US20030206899A1 (en) 1991-03-29 2003-11-06 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
WO1993010260A1 (en) 1991-11-21 1993-05-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
DE69233803D1 (de) 1992-10-28 2011-03-31 Genentech Inc Verwendung von vaskulären Endothelwachstumsfaktor-Antagonisten
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
CA2159629A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
EP0717766B1 (en) 1993-09-09 1998-04-01 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent with alkoxy or aryloxy amide surfactant
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5891628A (en) 1994-06-03 1999-04-06 Brigham And Women's Hospital Identification of polycystic kidney disease gene, diagnostics and treatment
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2225313A1 (en) 1995-06-21 1997-01-09 Martek Biosciences Corporation Combinatorial libraries of labeled biochemical compounds and methods for producing same
US5837492A (en) 1995-12-18 1998-11-17 Myriad Genetics, Inc. Chromosome 13-linked breast cancer susceptibility gene
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6274376B1 (en) 1996-02-20 2001-08-14 Smithkline Beecham Corporation ClpL
EP0828003A3 (en) 1996-09-06 2003-01-15 SmithKline Beecham plc Human serine protease
US5800998A (en) 1996-11-12 1998-09-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Assays for diagnosing type II diabetes in a subject
ATE321855T1 (de) 1997-01-14 2006-04-15 Human Genome Sciences Inc Tumor-nekrose-faktor rezeptor 5
US7122636B1 (en) 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
DK1695985T3 (da) 1997-04-07 2011-06-14 Genentech Inc Fremgangsmåde til dannelse af humaniserede antistoffer ved tilfældig mutagenese
DK0973804T3 (da) 1997-04-07 2007-05-07 Genentech Inc Anti-VEGF-antistoffer
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
AU757627B2 (en) 1997-06-24 2003-02-27 Genentech Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
TW589189B (en) 1997-08-04 2004-06-01 Scras Kit containing at least one double-stranded RNA combined with at least one anti-viral agent for therapeutic use in the treatment of a viral disease, notably of viral hepatitis
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6274720B1 (en) 1997-12-31 2001-08-14 Incyte Genomics, Inc. Human preproneurotensin/neuromedin N
US6956107B2 (en) 1998-02-20 2005-10-18 Tanox, Inc. Inhibitors of complement activation
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
EP1073755A2 (en) 1998-04-28 2001-02-07 Axys Pharmaceuticals, Inc. Novel serine protease capable of selective cleavage of insulin-like growth factor binding protein
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
WO2000008134A2 (en) 1998-08-03 2000-02-17 Novartis Ag HUMAN HtrA SERINE PROTEASE
KR20060067983A (ko) 1999-01-15 2006-06-20 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2000044914A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
EP2275541B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
PT1222292E (pt) 1999-10-04 2005-11-30 Medicago Inc Metodo para regulacao da transcricao de genes exogenos na presenca de azoto
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US7504256B1 (en) 1999-10-19 2009-03-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing polypeptide
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EA013224B1 (ru) 2000-10-06 2010-04-30 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Клетки, продуцирующие композиции антител
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
PT1354034E (pt) 2000-11-30 2008-02-28 Medarex Inc Roedores transgénicos transcromossómicos para produção de anticorpos humanos
AUPR670701A0 (en) 2001-07-30 2001-08-23 Prince Henry's Institute Of Medical Research Novel serine protease
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
AU2002337935B2 (en) 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
JP2003135075A (ja) 2001-11-05 2003-05-13 Research Association For Biotechnology 新規な全長ｃＤＮＡ
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
KR100708398B1 (ko) 2002-03-22 2007-04-18 (주) 에이프로젠 인간화 항체 및 이의 제조방법
JP4832719B2 (ja) 2002-04-09 2011-12-07 協和発酵キリン株式会社 ＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する抗体組成物含有医薬
ES2362419T3 (es) 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
AU2003236017B2 (en) 2002-04-09 2009-03-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
WO2003085107A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules à génome modifié
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
PT1572744E (pt) 2002-12-16 2010-09-07 Genentech Inc Variantes de imunoglobulina e utilizações destas
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
MXPA05012723A (es) 2003-05-30 2006-02-08 Genentech Inc Tratamiento con anticuerpos anti-vgf.
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk HYBRID PROTEIN COMPOSITION
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
SG10202008722QA (en) 2003-11-05 2020-10-29 Roche Glycart Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2360186B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
US20060009360A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Robert Pifer New adjuvant composition
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP1907576B1 (en) 2005-06-08 2014-07-23 University of Pittsburgh of the Commonwealth System of Higher Education SUSCEPTIBILITY GENES FOR AGE-RELATED MACULOPATHY (ARM) ON CHROMOSOME 10q26
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP2009536527A (ja) 2006-05-09 2009-10-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 最適化されたスキャフォールドを備えた結合ポリペプチド
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
EP2081596A4 (en) 2006-10-06 2010-07-21 Univ Utah Res Found METHOD FOR DETECTING DISEASES AND PATHOLOGICAL DISEASES OF IL AND TREATMENT THEREOF
EP2097455B1 (en) 2006-11-02 2014-10-22 Genentech, Inc. Humanized anti-factor d antibodies
WO2008094370A2 (en) * 2006-12-22 2008-08-07 University Of Utah Research Foundation Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008103299A2 (en) 2007-02-16 2008-08-28 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Methods and compositions for prognosing, detecting, and treating age-related macular degeneration
WO2008101160A2 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Genentech, Inc. Htra1-pdz and htra3-pdz modulators
AR066660A1 (es) 2007-05-23 2009-09-02 Genentech Inc Prevencion y tratamiento de condiciones del ojo asociadas con su complemento
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
EP2044951A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-08 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA The use of substances for the treatment of loss of eyesight in humans with glaucoma and other degenerative eye diseases
WO2009046405A2 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 University Of Utah Research Foundation Antibodies to htra1 and methods of using the same
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
CR20170001A (es) 2008-04-28 2017-08-10 Genentech Inc Anticuerpos anti factor d humanizados
DK3216803T3 (da) 2008-06-25 2020-06-02 Novartis Ag Stabile og opløselige antistoffer, der hæmmer vegf
US9567637B2 (en) * 2009-04-20 2017-02-14 The University Of Tokyo Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease
KR20140076611A (ko) 2011-10-13 2014-06-20 어드밴스드 테크놀러지 머티리얼즈, 인코포레이티드 재료의 실질적인 멸균 저장, 운송 및 분배를 위한 라이너식 운송 및 분배 컨테이너
TW201321414A (zh) * 2011-10-14 2013-06-01 Genentech Inc 抗－ＨｔｒＡ１抗體及其使用方法
CA3001362C (en) 2015-10-30 2020-10-13 Genentech, Inc. Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
IL258627A (en) 2018-06-28
IL295097A (en) 2022-09-01
EP3368578B1 (en) 2021-03-17
AU2019204537A1 (en) 2019-07-18
TWI747850B (zh) 2021-12-01
US20170145113A1 (en) 2017-05-25
ES2870141T3 (es) 2021-10-26
KR20180069069A (ko) 2018-06-22
EP3922649C0 (en) 2024-01-17
SG11201803356SA (en) 2018-05-30
HUE054093T2 (hu) 2021-08-30
JP2019506135A (ja) 2019-03-07
CL2021000163A1 (es) 2021-08-06
RU2018119014A3 (uk) 2019-12-02
ZA202001985B (en) 2022-12-21
JP6944552B2 (ja) 2021-10-06
KR20190131624A (ko) 2019-11-26
ZA201802382B (en) 2020-08-26
US10421821B2 (en) 2019-09-24
US20240067752A1 (en) 2024-02-29
US11512143B2 (en) 2022-11-29
PT3368578T (pt) 2021-05-06
CN108290957B (zh) 2022-06-17
CA3001362A1 (en) 2017-05-04
NZ741780A (en) 2019-11-29
RU2021117293A (ru) 2021-06-23
CA3001362C (en) 2020-10-13
RS61871B1 (sr) 2021-06-30
CL2018001139A1 (es) 2019-02-22
KR102162324B1 (ko) 2020-10-07
SI3368578T1 (sl) 2021-08-31
US10421822B2 (en) 2019-09-24
JP6750010B2 (ja) 2020-09-02
BR112018007703A2 (pt) 2018-11-06
CR20180296A (es) 2018-08-10
CO2018005393A2 (es) 2018-06-12
RU2750285C2 (ru) 2021-06-25
AU2016344399A1 (en) 2018-05-10
AU2019204537B2 (en) 2021-04-22
LT3368578T (lt) 2021-05-25
MY196448A (en) 2023-04-12
MA43113A (fr) 2018-09-05
HK1256094A1 (zh) 2019-09-13
CA3088612A1 (en) 2017-05-04
WO2017075212A1 (en) 2017-05-04
PE20181009A1 (es) 2018-06-26
DK3368578T3 (da) 2021-05-25
EP3368578A1 (en) 2018-09-05
AU2016344399B2 (en) 2019-03-28
MX2022002954A (es) 2022-04-06
US20190375856A1 (en) 2019-12-12
PL3368578T3 (pl) 2021-07-26
IL258627B (en) 2022-06-01
US20190048097A1 (en) 2019-02-14
CN115160439A (zh) 2022-10-11
JP2020099329A (ja) 2020-07-02
CN108290957A (zh) 2018-07-17
CA3088612C (en) 2022-04-12
MX2018004509A (es) 2018-08-01
MA43113B1 (fr) 2021-06-30
US20230383008A1 (en) 2023-11-30
TW202229360A (zh) 2022-08-01
RU2018119014A (ru) 2019-12-02
SG10202001808VA (en) 2020-04-29
IL270793A (en) 2020-01-30
PH12018500887A1 (en) 2018-10-29
TW201722992A (zh) 2017-07-01
HRP20210736T1 (hr) 2021-06-11
KR102440160B1 (ko) 2022-09-02
EP3922649B1 (en) 2024-01-17
CL2020002103A1 (es) 2020-10-23
EP3922649A1 (en) 2021-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA123773C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ'ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА
UA128035C2 (uk) Антитіло, що специфічно зв'язує pd-1, і спосіб його застосування
EA012835B1 (ru) Антитела против фактора роста эндотелия сосудов (vegf) и способы их применения
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
KR20170126855A (ko) 알쯔하이머병에서 인간화된 타우 항체
EA030436B1 (ru) АНТИТЕЛА К IL-23p19 ИЛИ ИХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ФРАГМЕНТЫ, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЭТИ АНТИТЕЛА, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ, ЭКСПРЕССИОННЫЕ ВЕКТОРЫ И КЛЕТКИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ
CN107207591A (zh) 血脑屏障受体抗体及使用方法
AU2010279892B8 (en) Humanized anti-amyloid-b oligomer antibody
CN112512571A (zh) 抗il-27抗体及其用途
EP2463369A1 (en) Humanized anti-amyloid-b oligomer antibody
US20240199732A1 (en) Anti-IL-27 Antibodies and Uses Thereof
JP2023503513A (ja) 生理学的鉄過剰の処置
CN109689870A (zh) 用于治疗自身免疫疾病的抗体
WO2019118906A2 (en) Monoclonal antibodies targeting phf1 and at8 epitopes of human tau protein
AU2013227987A1 (en) Anti-hepcidin antibodies and methods of use
UA100888C2 (uk) Гуманізоване антитіло проти фактора d та його застосування