EA012835B1 - Антитела против фактора роста эндотелия сосудов (vegf) и способы их применения - Google Patents

Антитела против фактора роста эндотелия сосудов (vegf) и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA012835B1
EA012835B1 EA200600344A EA200600344A EA012835B1 EA 012835 B1 EA012835 B1 EA 012835B1 EA 200600344 A EA200600344 A EA 200600344A EA 200600344 A EA200600344 A EA 200600344A EA 012835 B1 EA012835 B1 EA 012835B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
amino acid
uese
acid sequence
binding
Prior art date
Application number
EA200600344A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600344A1 (ru
Inventor
Жермен Фах
Ханспитер Гербер
Вей-Чинг Лианг
Фредерик А. Феллуз
Сачдев С. Сидха
Кристиан Виесманн
Original Assignee
Дженентек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дженентек, Инк. filed Critical Дженентек, Инк.
Publication of EA200600344A1 publication Critical patent/EA200600344A1/ru
Publication of EA012835B1 publication Critical patent/EA012835B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

Изобретение относится к антителам против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и их вариантам, включая антитела с высокой аффинностью связывания с VEGF. Изобретение также касается способов применения метода фагового дисплея с нативными библиотеками для получения и селекции антител против VEGF с заданными характеристиками связывания и другими видами биологической активности, которые могут быть использованы в диагностике и терапии соответствующих заболеваний.

Description

Область техники
Данное изобретение относится в общем к полипептидным последовательностям и антителам против УЕСЕ с полезными свойствами для целей исследования, терапии и диагностики.
Предпосылки создания изобретения
Ангиогенез и УЕСЕ.
Ангиогенез является важным клеточным событием, при котором эндотелиальные клетки сосудов пролиферируют, удаляются и реорганизуются с образованием новых сосудов на основе ранее существовавшей сосудистой сети. Имеются неоспоримые доказательства того, что улучшение снабжения сосудов является обязательным для нормальных и патологических пролиферативных процессов (Ео1ктап аиб К1адкЬгап (1987) 8с1епсе 235: 442-447). Доставка кислорода и питательных веществ, а также удаление продуктов катаболизма представляют собой стадии, ограничивающие скорость в большинстве процессов роста, происходящих в многоклеточных организмах. Таким образом, общепринято, что сосудистый компартмент является необходимым, но не достаточным не только для развития органа и дифференцировки в процессе эмбриогенеза, но также для заживления ран и репродуктивных функций у взрослых.
Ангиогенез также участвует в патогенезе различных нарушений, включая, но без ограничения, пролиферативные ретинопатии, возрастную дегенерацию жёлтого пятна, опухоли, ревматоидный артрит (КА) и псориаз. Ангиогенез представляет собой каскадный процесс, состоящий из 1) деградации внеклеточного матрикса локального места после высвобождения протеазы; 2) пролиферации эндотелиальных клеток капилляров и 3) миграции капиллярных канальцев к ангиогенному раздражителю. Ееггага е1 а1. (1992) Епбосгше Кеу. 13: 18-32.
Ввиду большой важности ангиогенеза в физиологии и патологии большое количество работ посвящено выявлению факторов, способных регулировать этот процесс. Было предположено, что процесс ангиогенеза регулируется с помощью равновесия между про- и антиангиогенными молекулами и нарушается при различных заболеваниях, особенно при раке. Сагтейе! апб 1аш (2000) Ыа1иге 407: 249-257.
Сообщалось, что сосудисто-эндотелиальный фактор роста (УЕСЕ), сильный митоген для эндотелиальных клеток сосудов, является основным регулятором как нормального, так и аномального ангиогенеза. Ееггага аиб Иау1к-8ту1й (1997) Епбосгше Кеу. 18: 4-25; Ееггага (1999) 1. Мо1. Меб. 77: 527-543. По сравнению с другими факторами роста, которые участвуют в процессе образования сосудов, УЕСЕ является уникальным по своей специфичности в отношении эндотелиальных клеток в сосудистой системе. Недавно полученные данные показывают, что УЕСЕ является необходимым для васкулогенеза. Сагтейе! е! а1. (1996) Ыа1иге 380: 435-439; Ееггага е! а1. (1996) Ыа1иге 380: 439-442. Кроме того, УЕСЕ требуется для циклической пролиферации кровеносных сосудов. Ееггага е! а1. (1998) №1Шге Меб. 4: 336-340; СегЬег е! а1. (1999) Уинге Меб. 5: 623-628.
Помимо того, что УЕСЕ является ангиогенным фактором при ангиогенезе и васкулогенезе, он, в качестве плейотропного фактора роста, проявляет многие биологические эффекты в других биологических процессах, таких как продолжительность жизни эндотелиальных клеток, проницаемость и вазодилатация сосудов, хемотаксис моноцитов и инфлюкс калия. Ееггага апб Оа\'1к-8ту111 (1997), см. выше. Кроме того, недавно сообщалось о митогенном действии УЕСЕ на некоторые типы не эндотелиальных клеток, такие как ретинальные пигментные эпителиальные клетки, клетки панкреатических протоков и клетки Шванна (8сЕтеапп). Сиетп е! а1. (1995) 1. Се11. РЬ.укю1. 164: 385-394; ОЬещ-\Уе1к11 е! а1. (1997) Мо1. Се11. Епбосппок 126: 125-132; 8опбе11 е! а1. (1999) 1. Жигокск 19: 5731-5740.
Важное доказательство также подразумевает решающую роль УЕСЕ в развитии состояний или заболеваний, которые включают патологический ангиогенез. мРНК УЕСЕ сверхэкспрессируется большинством изученных человеческих опухолей (Вегктап е! а1. 1. С1ш 1пуек! 91: 153-159 (1993); Вготеп е! а1. Нитап Ра1йо1. 26: 86-91 (1995); Вготеп е! а1. Сапсег Кек. 53: 4727-4735 (1993); Ма!!егп е! а1. Вгб. 1. Сапсег. 73: 931-934 (1996); и Эго гак е! а1., Ат 1. Ра1йо1. 146: 1029-1039 (1995)). Также концентрация УЕСЕ в глазной жидкости хорошо коррелирует с наличием активной пролиферации кровеносных сосудов у пациентов с диабетической ретинопатией и другими типами ретинопатии, связанными с ишемией (А1е11о е! а1. N. Епд1. 1. Меб. 331: 1480-1487 (1994)). Кроме того, недавние исследования продемонстрировали локализацию УЕСЕ в хороидальных неоваскулярных мембранах пациентов, поражённых АМЭ (Боре/ е! а1. 1пуек!. Ор111а1то. У1к. 8ск 37: 855-868 (1996)).
Признание УЕСЕ в качестве основного регулятора ангиогенеза при патологических состояниях привело к многочисленным попыткам блокировать активность УЕСЕ. Ингибирование анти-УЕСЕрецепторных антител, растворимые рецепторные конструкции, антисмысловая стратегия, аптамеры РНК против УЕСЕ и низкомолекулярные ингибиторы УЕСЕ рецепторной тирозинкиназы (КТК) - все были предложены для применения в качестве препятствия передаче УЕСЕ сигнала (81ете1к!ег е! а1. Сапсег Ме1ак1ак1к Кеу. 17: 241-248 (1998)). Действительно, показано, что нейтрализующие антитела против УЕСЕ подавляют рост ряд человеческих опухолевых клеточных линий в бестимусных (голых) мышах (К1т е! а1. №1Шге 362: 841-844 (1993); \Уаггеп е! а1. 1. С1ш. 1пуек!. 95: 1789-1797 (1995); Вогдк!гбт е! а1. Сапсег Кек. 56: 4032-4039 (1996); и Ме1пук е! а1. Сапсег Кек. 56: 921-924 (1996)) и также ингибируют интраокулярный ангиогенез на моделях ишемических ретинальных нарушений (Абат1к е! а1. Агс11. Орй1йа1то1. 114: 66-71 (1996)). Следовательно, моноклональные антитела против УЕСЕ или другие ингибиторы дей
- 1 012835 ствия УЕСЕ являются весьма перспективными кандидатами для лечения солидных опухолей и различных интраокулярных неоваскулярных нарушений. Хотя молекула УЕСЕ активируется в опухолевых клетках, а его рецепторы активируются в опухолевых инфильтрованных эндотелиальных клетках сосудов, экспрессия УЕСЕ и его рецепторов остаётся низкой в нормальных клетках, которые не ассоциируются с ангиогенезом.
Терапевтические антитела.
Моноклональные антитела можно получать методом рекомбинантной ДНК. Широкое применение нашли моноклональные антитела, в частности моноклональные антитела грызунов, однако нечеловеческие антитела часто являются антигенными в организме человека. В уровне техники делались попытки решить эту проблему путём создания химерных антител, в которых нечеловеческий антигенсвязывающий домен связан с человеческим константным доменом (СаЫ11у е! а1., патент США 4816567). Можно выбрать изотип человеческого константного домена, чтобы адаптировать химерное антитело к участию в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС, АЗКЦ) и в комплементзависимой цитотоксичности. При дальнейших попытках корригировать антигенсвязывающие функции и свести к минимуму применение гетерологичных последовательностей в человеческих антителах были получены гуманизированные антитела к различным антигенам, в которых последовательность, значительной меньшая, чем интактный человеческий вариабельный домен, заменена в областях на соответствующую последовательность нечеловеческого вида. Например, (СЭК) остатки грызунов замещали соответствующие сегменты человеческого антитела. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельной области (СЭК) и, возможно, некоторые остатки каркасной области (ЕК) заменены на остатки аналогичных сайтов антител грызунов. 1опек е! а1., Ха!ите 321: 522-525 (1986); Шесйшапи е! а1., Ха!ите 332: 323-327 (1988); Уегйоеуеп е! а1. 8с1епсе 239: 15341536 (1988).
Было успешно получено несколько анти-УЕСЕ антител, которые проявили заметную УЕСЕингибирующую активность как ίη νίίτο, так и ίη νινο. Ргек1а е! а1. (1997) Сапсег Кекеатсй 57: 4593-4599; Сйеп е! а1. (1999) 1. Мо1. Βίο1. 293: 865-881. Одно специфичное гуманизированное анти-УЕСЕ антитело, антитело АуаШи™, в настоящее время применяется в некоторых клинических испытаниях для лечения различных солидных опухолей; а другой высокоаффинный вариант гуманизированного анти-УЕСЕ антитела в настоящее время проходит клинические испытания для лечения возрастной дегенерации жёлтого пятна (АМЭ), связанной с хороидальной неоваскуляризацией.
Перед применением терапевтического антитела для лечения человека обычно необходимы преклинические исследования для оценки эффективности и/или токсичности антитела. В идеале антитела, подвергающиеся таким исследованиям, способны распознавать и с высокой эффективностью реагировать с намеченным антигеном, эндогенным к животному-хозяину, такому как мышь или нечеловеческий примат.
Фаговый дисплей.
Метод фагового дисплея предоставил мощный инструмент для получения и селекции новых белков, которые связываются с лигандом, таким как антиген. Используя метод фагового дисплея, можно получать большие библиотеки вариантов белков и быстро отсортировать в них такие последовательности, которые связываются с нацеленным антигеном с высокой аффинностью. Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты полипептидов, сливается с нуклеотидной последовательностью, кодирующей оболочечный вирусный белок, такой как белок гена III или белок гена УШ. Получены моновалентные системы фагового дисплея, в которых нуклеотидные последовательности, кодирующие белок или полипептид, сливаются с нуклеотидной последовательностью, кодирующей часть белка гена III (Вакк, 8., Рто!еш8, 8: 309 (1990); Бочшап аиб \Уе118. Мебюбк: А Сотрашоп !о Мебюбк ίη Епхуто1оду. 3: 205 (1991)). В моновалентной системе фагового дисплея наблюдаются низкие уровни экспрессии генного слияния, а также экспрессия белков гена III дикого типа, так что инфективность частиц сохраняется. Методы получения пептидных библиотек и скрининга этих библиотек раскрываются во многих патентах (например, в патентах США 5723286, 5432018, 5580717, 5427908 и 5498530).
Демонстрация экспрессии пептидов на поверхности нитевидного фага и экспрессии функциональных фрагментов антитела в периплазме Е.соН важно для развития фагового дисплея антител (8тй11 е! а1., 8с1епсе (1985), 228: 1315; 8кегга апб Р1иск!йип, 8с1епсе (1988), 240: 1038). Библиотеки антител или антигенсвязывающих полипептидов получают различными путями, включая изменение единичного гена с помощью инсерции случайной ДНК-последовательности или клонированием семейства родственных генов. Методы визуализации антител или антигенсвязывающих фрагментов методом фагового дисплея описаны в патентах США 5575373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 и 5658727. Затем проводят скрининг библиотеки на экспрессию антител или антигенсвязывающих белков с заданными характеристиками.
Метод фагового дисплея имеет ряд преимуществ перед обычными методами гибридом и рекомбинантными методами получения антител с заданными характеристиками. Этот метод позволяет создавать большие библиотеки антител с различными последовательностями за меньшее время и без использования животных. Получение гибридом или получение гуманизированных антител, весьма вероятно, может потребовать нескольких месяцев. Кроме того, так как не требуется никакой иммунизации, можно созда
- 2 012835 вать фаговые библиотеки антител для антигенов, которые являются токсичными или обладают низкой антигенностью (НодепЬоот, 1ттипо1сс11пк|ис5 (1988), 4: 1-20). Можно также использовать фаговые библиотеки антител для создания и идентификации новых терапевтических антител.
Библиотеки фагового дисплея использовали для создания человеческих антител при использовании иммунизированных, неиммунизированных людей, последовательностей зародышевой линии или популяции 1д наивных В клеток (ВагЬах & Вийоп, Тгепбх Вю1ес11 (1996), 14: 230; ОпГГйНх е1 а1., ЕМВО 1. (1994), 13: 3245; Уаидйап е1 а1., Ыа1. Вю1ес11. (1996), 14: 309; \Ут1ег ЕР 0368684 В1). Библиотеки антигенсвязывающих участков иммуноглобулинов, экспрессируемых наивными, или неимунными, клетками, получают с применением ряда лимфоидных тканей. Некоторые из этих библиотек выпускаются промышленно, как, например, библиотеки, полученные методом СатЬпбде АпбЬобу Тес1то1о§у апб МогрНохух (Уаидйап е1 а1.(1996) Ыа1иге Вю1ес11 14: 309; Кпарр1к е1 а1. (1999) 1. Мо1. Вю1. 296: 57). Однако разнообразие многих из этих библиотек ограничено.
Способность идентифицировать и изолировать высокоаффинные антитела с помощью библиотеки фагового дисплея важно для выделения новых антител для терапевтического применения. Выделение высокоаффинных антител при использовании библиотеки зависит от размера библиотеки, эффективности продуцирования в бактериальных клетках и разнообразия библиотеки. См., например, Кпарр1к е1 а1., 1. Мо1. Вю1. (1999), 296: 57. Размер библиотеки уменьшается при неэффективности продуцирования вследствие неподходящего складывания (скручивания) антитела или антигенсвязывающего белка и присутствия стоп-кодонов. Экспрессию в бактериальных клетках может быть ингибирована, если антитело или антигенсвязывающий домен складываются неподходящим образом. Экспрессию можно повысить с помощью мутаций остатков в поворотах на поверхности границы раздела вариабельной/константной областей, или в выбранных остатках СЭК. (Эепд е1 а1., 1. Вю1. С1ет. (1994), 269: 9533, и1пс11 е1 а1., ΡΝΑ3 (1995), 92: 11907-11911; ЕогхЬегд е1 а1., 1. Вю1. С1ет. (1997), 272: 12430). Последовательность каркасной области является фактором обеспечения подходящего складывания, когда фаговые библиотеки антител продуцируются в бактериальных клетках.
Создание разнообразной библиотеки антител или антигенсвязывающих белков также важно для изоляции высокоаффинных антител. Библиотеки с разнообразием в ограниченных СЭВ были созданы различными методами. См., например, Тот1шхоп, №1Ц1ге Вю1ес11. (2000), 18: 989-994. Области СЭВ3 отчасти представляют интерес, так как часто обнаруживается, что они участвуют в связывании с антигеном. Области СЭВ3 тяжёлой цепи очень различны (меняются) по размеру, последовательности и структурной конформации.
Можно создавать разнообразие рандомизацией СЭВ областей вариабельного домена тяжёлой и лёгкой цепей, используя все 20 аминокислот в каждом положении. Предполагалось, что применение всех 20 аминокислот даст в результате большое разнообразие последовательностей вариантов антител и повысит возможность идентификации новых антител (ВагЬах, ΡΝΑ3 91: 3809 (1994); Уе11оп. Ό.Ε., 1. 1ттипо1о§у, 155: 1994 (1995); 1аскхоп, кВ., 1. 1ттипо1о§у, 154: 3310 (1995) и На^ктх, В.Е., 1. Мо1. Вю1о§у, 226: 889 (1992)).
Также были предприняты попытки создать разнообразие, ограничивая группу аминокислотных замен в некоторых СЭВ, с целью отразить аминокислотное распределение в природных антителах. См., например, Оаггагб & Неппег, Оепе (1993), 128: 103; Кпарр1к е1 а1., 1. Мо1. Вю1. (1999), 296: 57. Однако эти попытки проходят с переменным успехом, результаты не являются систематическими и количественными. Задачей было создание разнообразия в СЭВ при минимальном числе аминокислотных замен.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение охватывает новые антитела и полипептидные последовательности. Настоящее изобретение также включает антитела, способные связываться с УЕСЕ грызунов и человеческим УЕСЕ с величинами Кб до 10-кратного (на порядок) увеличения каждого значения и способные ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ. Согласно одному варианту изобретения антитело способно связываться с любым, или с обоими, из С1у88А1а (С88А) или С1у883ег (0883) человеческих мутантных УЕСЕ с величиной Кб в пределах значения, 10-кратного (на порядок выше) по сравнению с Кб немутантного человеческого УЕСЕ.
Настоящее изобретение охватывает антитела, способные связываться с человеческим УЕСЕ и мышиным УЕСЕ со значениями Кб, равными или более низкими чем 10 нМ при 25°С, и способные ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения значения Кб равны или ниже 2 нМ. Согласно другому варианту изобретения значения Кб равны или ниже 0.1 нМ. Согласно другому варианту изобретения антитело по данному изобретению связывает УЕСЕ со значениями Кб не более примерно 1 нМ или не более примерно 500 пМ.
Настоящее изобретение также охватывает антитела, которые способны связываться с человеческим УЕСЕ и с любым, или с обоими, из С88А или С883 мутантов человеческого УЕСЕ с величиной Кб 10 нМ или менее и которые способны ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ. В другом варианте изобретения антитела связываются с человеческим УЕСЕ и с любым, или с обоими, из С88А или С883 мутантов человеческого УЕСЕ с величиной Кб 10 нМ или менее.
Согласно другому варианту изобретения скорость ассоциации (коп) связывания антитела по данно
- 3 012835 му изобретению с человеческим и/или мышиным УЕСЕ 1.0 или выше (10 М'1с'1). Согласно ещё одному варианту изобретения скорость ассоциации составляет 5.0 или более (10 М-1Ус-1). Согласно ещё одному варианту изобретения скорость ассоциации составляет 10.0 или более (10 М-1Ус-1).
Согласно другому варианту изобретения антитела по данному изобретению контактируют менее чем с 80% общей площади поверхности (Ангстрем2) С88 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения антитела по данному изобретению контактируют менее чем с 70% общей площади поверхности (Ангстрем2) С88 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения антитела по данному изобретению контактируют менее чем с 60% общей площади поверхности (Ангстрем2) С88 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения антитела по данному изобретению контактируют менее чем с 1% общей площади поверхности (Ангстрем2) С88 человеческого УЕСЕ. Такие антитела в общем способны также связываться с мышиным УЕСЕ.
Рецептор УЕСЕ, связывание которого с УЕСЕ нужно ингибировать, может быть УЕСЕ рецептором 1 (ЕН-1), УЕСЕ рецептором 2 (ΚΌΚ) или обоими рецепторами.
Согласно одному варианту изобретения антитело по данному изобретению контактирует со спиралью из 20-30 остатков УЕСЕ. Согласно ещё одному варианту изобретения антитело по данному изобретению контактирует со спиралью из 20-30 остатков УЕСЕ и с петлёй из 80-90 остатков человеческого УЕСЕ.
Согласно одному варианту изобретения антитело по данному изобретению обладает относительной аффинностью к или способно контактировать с любым из остатков Е17, М18, 022. Υ25, Ό63, Ь66, С104 и Р106 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения антитело по данному изобретению обладает относительной аффинностью к или способно контактировать с Е17, М18, 022, Υ25, Ό63, Ь66, С104 и Р106 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения антитело по данному изобретению обладает дополнительной относительной аффинностью к или способно контактировать с остатками Е17 и Υ21 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения антитело по данному изобретению обладает относительной аффинностью к или способно контактировать с Υ25 УЕСЕ.
Согласно другому варианту изобретения антитело по данному изобретению обладает относительной аффинностью к или способно контактировать с М18 и 089 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения антитело по данному изобретению обладает относительной аффинностью к или способно контактировать с М17, Υ21 и Υ25 человеческого УЕСЕ. Согласно предпочтительному варианту изобретения антитело по данному изобретению представляет собой комбинацию из трёх или более любых вышеописанных вариантов изобретения.
В другом варианте изобретения антитело по данному изобретению содержит функциональный эпитоп по данному описанию. Согласно другому варианту изобретения функциональный эпитоп антитела по данному изобретению включает остатки Е17 и 183 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения функциональный эпитоп включает остатки Е17 и 183 и 089 человеческого УЕСЕ. Согласно одному варианту изобретения функциональный эпитоп антитела по данному изобретению включает остатки Е17 и М18 человеческого УЕСЕ. В другом варианте изобретения функциональный эпитоп включает остатки Е17, М18 и 189 человеческого УЕСЕ. Согласно одному варианту изобретения функциональный эпитоп антитела по данному изобретению включает остатки Е17, Υ21 и Υ25 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения функциональный эпитоп включает остатки Е17, Υ21, 022, Υ25, Ό63 и 183 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения функциональный эпитоп включает остатки Е17, Υ21, Υ25 и 089 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения функциональный эпитоп включает остатки Е17, М18, Ό19, Υ21, Υ25, 089, 191, Κ101, Е103 и С104 человеческого УЕСЕ. Согласно ещё одному варианту изобретения функциональный эпитоп включает остатки Е17, Υ21, 022, Υ25, Ό63, 183 и 089 человеческого УЕСЕ. Функциональный эпитоп антитела по данному изобретению может включать комбинацию из любых остатков, выбранных из группы, состоящей из Е17, М18, Υ21, 022, Υ25, Κ48, Ό63, Ь66, М81, 183, Н86, 089, 191, С104 и Р106 человеческого УЕСЕ. Согласно другому варианту изобретения функциональный эпитоп включает остатки Е17, М18, Υ21, 022, Υ25, Κ48, Ό63, Ь66, М81, 183, Н86, 089, 191, С104 и Р106 человеческого УЕСЕ.
Согласно одному варианту изобретения антитело по данному изобретению содержит область 0ΌΡН3, включающую непрерывную аминокислотную последовательность Х1Х2ЕХ4Х5Х6Х7 (8Е0 ΙΌ N0: 915), где
Х1 обозначает Υ или Е;
Х2 обозначает У или А;
Х4 обозначает Е или Υ;
Х5 обозначает Ь или А;
Х6 обозначает Р или А; или
Х7 обозначает Υ или Е.
Согласно другому варианту изобретения антитело дополнительно содержит область (участок) ΌΒН2, включающую непрерывную аминокислотную последовательность СХ2ТРХ5С (8Е0 ΙΌ N0: 1), где
Х2 обозначает Ι или У либо другую гидрофобную аминокислоту и
Х5 обозначает любой аминокислотный остаток.
- 4 012835
Согласно ещё одному варианту изобретения антитело дополнительно содержит область (участок) СЭК-НЕ включающую непрерывную аминокислотную последовательность Χ|Χ2Χ3ζΙΗ (3ЕЦ ΙΌ N0: 2), где
Χι обозначает любой аминокислотный остаток;
Χι2 обозначает Υ или Е; и
Х3 обозначает или Ь.
Согласно одному предпочтительному варианту изобретения антитело дополнительно содержит области СЭК-Ы, СЭК-Ь2 и СЭК-Е3 любого из антител на фиг. 7. Согласно другому варианту изобретения участок СЭК-Ы локализован приблизительно в остатках 28-33; участок СЭК-Е2 локализован приблизительно в остатках 50-55; участок СЭК-ЬЗ локализован приблизительно в остатках 91-96. Согласно другому варианту изобретения участок СЭК-Н1 локализован приблизительно в остатках 30-33; участок СЭК-Н2 локализован приблизительно в остатках 50-58; участок СЭК-Н3 локализован приблизительно в остатках 94-100а. Согласно одному предпочтительному варианту изобретения антитело содержит каркасные области антитела С6, антитела 06-23 или антитела 06-31. Согласно другому варианту изобретения антитело содержит области СЭК лёгкой цепи или вариабельные области лёгкой цепи антитела 06, антитела 06-23 или антитела 06-31.
Согласно одному варианту изобретения антитело по данному изобретению представляет собой ан титело, содержащее:
(а) область (участок) СЭК-Ы, содержащую непрерывную ΧιΧ2Χ3Χ4Χ5Ε (3ЕС) ΙΌ N0: 916), где
Χ1 и Х2 обозначают любую аминокислоту;
либо Х3, либо Х4, либо оба Х3 и Х4 обозначают К;
Х5 обозначает 3 или А;
(б) область (участок) СЭК-Е2, содержащую непрерывную Х!Х2Х3 (3ЕО ΙΌ N0: 917), где
Χ1 обозначает 3, или А, или 0; и
Х2 и Х3 обозначают любую аминокислоту;
(с) область (участок) СПК-Ь3, содержащую непрерывную 3ΧιΧ2Χ3ΡΕ (3ЕО ΙΌ N0: 918), где
Χ1 и Х2 обозначают любую аминокислоту и
Х3 обозначает 3 или А.
Согласно одному предпочтительному варианту изобретения антитело содержит каркасные области антитела В20-4.1 или антитела В20-4. Согласно другому варианту изобретения антитело содержит области СЭК или вариабельную область тяжёлой цепи В20. Согласно другому варианту изобретения Х1Х2Х3 (3ЕЦ ΙΌ N0: 917) области СЭК-Ь2 кодируется ΧιΆ3Χ4ΕΧ6 (3ЕЦ ΙΌ N0: 919), где Х4 и Х6 обозначают любую аминокислоту. Согласно другому варианту изобретения участок СЭК-Ы локализован приблизительно в остатках 28-33; участок СЭК-Е2 локализован приблизительно в остатках 50-55; и участок СЭКЬ3 локализован приблизительно в остатках 91-96. Согласно другому варианту изобретения участок СЭКН1 локализован приблизительно в остатках 30-33; участок СЭК-Н2 локализован приблизительно в остатках 50-58; и участок СЭК-Н3 локализован приблизительно в остатках 94-100а.
Также рассматривается антитело, содержащее последовательность СЭК-Н3 любого из антител на фиг. 7, 24-29 и 34-43, и, возможно, дополнительно содержащее СЭК-Н2 и/или СЭК-Н1 того же антитела на фиг. 2, 7, 24-29 и 34-43. Также рассматривается антитело, выбранное из ряда, состоящего из антитела группы 06, антитела группы В20, антитела группы ΥΆΌ3 и антитела группы Υ3. Кроме того, другое антитело по данному изобретению представляет собой антитело, содержащее вариабельную область любого из антител на фиг. 2, 7, 24-29 и 34-43.
Согласно одному предпочтительному варианту изобретения антитела по данному изобретению синтезируют скорее методами рекомбинантной ДНК, нежели непосредственно продуцируются гибридомой или образуют из последовательности антитела, продуцируемого гибридомой. В одном предпочтительном варианте изобретения антитело связывается с 11УЕ0Е с величиной Кб не более примерно 2 нМ, не более примерно 1 нМ или не более примерно 500 пМ. Согласно одному варианту изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело. Согласно другому варианту изобретения антитело является полиспецифическим антителом (например, биспецифическим антителом).
Ещё в одном варианте изобретения высокоаффинное анти-УЕ0Е антитело также способно связываться с УЕ0Е нечеловеческих млекопитающих с величиной Кб, сравнимой с или, по меньшей мере, в пределах значения, на порядок более высокого, чем величина Кб его связывания с 11УЕ0Е. Такие антитела с высокой аффинностью перекрёстного связывания (между видами) особенно применимы для преклинического исследования, а также для целей диагностики и терапии. Некоторые антитела, предполагаеаминокислотную аминокислотную аминокислотную последовательность последовательность последовательность мые для терапевтического применения, получены с применением нацеленного человеческого антигена в качестве иммуногена. Полученное антитело может быть зависящим от вида, т.е. хотя оно специфически связывается с человеческим антигеном, оно может быть значительно менее эффективно при связывании с гомологом этого антигена в нечеловеческом млекопитающем. Это, как найдено в данном описа
- 5 012835 нии, остаётся открытым, в особенности в тех случаях, когда на этом нечеловеческом млекопитающем должны проводиться преклинические испытания. Примером является анти-УЕСЕ антитело, антитело Луакйп™, применяемое для лечения рака. Хотя антитело ΛναδΙίη проявляет высокую аффинность связывания с человеческим УЕСЕ (т.е. Кб 1.8 нМ), аффинность связывания с мышиным УЕСЕ непригодна для проведения экспериментов на мышиных моделях.
В одном аспекте антитела являются синтетическими антителами, содержащими по меньшей мере один вариант СЭЕ в вариабельных доменах, причём вариант СЭЕ содержит вариантную аминокислоту по меньшей мере в одном доступном для растворителя аминокислотном положении с большим разнообразием аминокислот, при этом вариантная аминокислота кодируется неслучайным набором кодонов и по меньшей мере 70% аминокислот, кодируемых неслучайным набором, являются нацеленными аминокислотами в данном положении в вариабельных доменах известных антител. Антитело может иметь вариабельный домен тяжёлой цепи, который содержит по меньшей мере 1, 2 или 3 вариантных СОЕ, выбранных из группы, состоящей из СЭЕ-НЕ Н2 и Н3. Предпочтительно вариабельный домен тяжёлой цепи содержит вариантный СЭЕ-Н3. Антитело может также содержать вариабельный домен лёгкой цепи, который включает по меньшей мере 1, 2 или 3 вариантных СОЕ, выбранных из группы, состоящей из СИЕЬ1, Ь2 и Ь3.
Согласно другому варианту антитело по данному изобретению связывается с человеческим УЕСЕ и УЕСЕ грызунов с заданной аффинностью, но не связывается с любым или со всеми гомологами, родственными УЕСЕ, выбранными из группы, состоящей из человеческого УЕСЕ-В, человеческого УЕСЕ-Ό и человеческого Р1СЕ-2.
Согласно одному предпочтительному варианту изобретения антитело по данному изобретению представляет собой комбинацию трёх или более любых вышеописанных вариантов изобретения. Согласно другому варианту изобретения антитело ЕаЬ по настоящему изобретению конъюгируется с агентом, который повышает период полужизни ЕаЬ антитела. Согласно одному предпочтительному варианту изобретения агент представляет собой полипептид, содержащий последовательность П1СЬРЕ^ССЬ^. В предпочтительном варианте изобретения антитела по данному изобретению не связываются с Р1СЕ, УЕСЕ-Ό или УЕСЕ-В.
Изобретение также включает способ отбора 11УЕСЕ антитела из библиотеки синтетических антител, включающий: а) создание библиотеки синтетических антител с намеченным разнообразием по меньшей мере в одной из областей СИЕ; б) контактирование библиотеки с 11УЕСЕ с образованием связующих элементов; в) отделение связующих элементов от несвязующих, элюцию связующих из нацеленного 11УЕСЕ и инкубацию связующих в растворе с уменьшающимися количествами нацеленного 11УЕСЕ с концентрацией от примерно 0.1 до 1000 нМ; и г) отбор связующих, которые могут связываться с нацеленным 11УЕСЕ. находящимся в самых низких концентрациях, и которые обладают аффинностью примерно 500 пМ-2 нМ.
Также рассматриваются варианты синтетических антител с повышенной аффинностью связывания с ЙУЕСЕ, или с УЕСЕ нечеловеческого вида, или с обоими. В данном описании рассматриваются различные формы антитела и его варианты. Например, мутантное антитело может быть полноразмерным антителом (например, содержащим константную область человеческого иммуноглобулина) или фрагментом антитела (например, ЕаЬ или Е(аЬ')2). Кроме того, мутантное антитело может быть мечено детектируемой меткой, иммобилизовано на твёрдой фазе и/или конъюгировано с гетерологичным соединением (таким как цитотоксический агент).
Рассматривается применение антитела в диагностике и терапии. В одном варианте диагностического применения изобретение включает способ определения присутствия важного (представляющего интерес) белка, заключающийся в экспозиции образца, предположительно содержащего белок, с мутантным антителом и в определении связывания мутантного антитела с образцом. Для подобного применения данное изобретение предусматривает набор, содержащий мутантное антитело, и инструкции по применению мутантного антитела для детектирования белка.
Далее данное изобретение включает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело; вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, возможно, функционально связанную с регуляторными последовательностями, распознаваемыми клеткой-хозяином, трансформированной с помощью вектора; клетку-хозяина, трансформируемую с помощью вектора; способ продуцирования антитела, включающий культивирование этой клетки-хозяина таким образом, чтобы экспрессировалась нуклеиновая кислота, и, возможно, регенерацию мутантного антитела из культуры клетки-хозяина (например, из культуральной среды клеток-хозяев).
Изобретение также включает композицию, содержащую антитело и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Эта композиция для терапевтического применения является стерильной и может быть лиофилизирована. Также рассматривается применение антитела или полипептида по данному изобретению для получения препарата для лечения показания по данному описанию. Композиция может дополнительно содержать второй терапевтический агент, такой как химиотерапевтический агент, цитотоксический агент или антиангиогенный агент.
Кроме того, данное изобретение включает способ лечения млекопитающего, заключающийся во
- 6 012835 введении млекопитающему эффективного количества антитела. Млекопитающее для лечения по данному способу может быть нечеловеческим млекопитающим, например приматом, подходящим для сбора преклинических данных, или грызуном (например, мышью, или крысой, или кроликом). Нечеловеческое млекопитающее может быть здоровым (например, в токсикологических исследованиях) или может страдать от нарушения, которое следует лечить представляющим интерес антителом. В одном варианте изобретения млекопитающее страдает от или имеет повышенный риск развития аномального ангиогенеза (например, патологического ангиогенеза). В одном конкретном варианте изобретения нарушение представляет собой рак, выбранный из группы, состоящей из колоректального рака, почечно-клеточной карциномы, рака яичников, рака лёгкого, немелкоклеточного рака лёгкого (Ы8СЬС), бронхоальвеолярного рака и рака поджелудочной железы. В одном варианте изобретения нарушением является болезнь, вызванная окулярной неоваскуляризацией, например, диабетическая слепота, первичная диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация жёлтого пятна и рубеоз. В другом варианте изобретения млекопитающее страдает от или имеет повышенный риск развития отёка (например, отёка, обусловленного опухолями мозга, отёка, обусловленного ударом, или церебрального отёка). В другом варианте изобретения млекопитающее страдает от или имеет повышенный риск развития нарушения или заболевания, выбранного из группы, состоящей из ревматоидного артрита, воспалительного кишечного заболевания, стойкого асцита, псориаза, саркоидоза, артериального артериосклероза, сепсиса, ожогов и панкреатита. Согласно другому варианту изобретения млекопитающее страдает от или имеет повышенный риск развития заболевания мочеполовой системы, выбранного из группы, состоящей из поликистозного заболевания яичников (ΡΘΌ), эндометриоза и фибромы матки. Количество вводимого антитела является количеством, терапевтически эффективным для лечения нарушения. В исследованиях с увеличением дозы млекопитающему можно вводить различные дозы антитела. В другом варианте изобретения терапевтически эффективное количество антитела вводят больному человеку для лечения нарушения у этого пациента. В одном предпочтительном варианте изобретения антитела по данному изобретению, применимые для лечения воспалительных или иммунных заболеваний по данному описанию (например, ревматоидного артрита), представляют собой РаЬ или δοΡν антитела, в особенности антитела РаЬ или δοΡν из антител группы Об или В20. Антитела, которые не вызывают агрегации УЕСР и не агрегируются сами, такие как антитела группы В20 класса 1дО, особенно применимы для лечения воспалительных или иммунных заболеваний. Следовательно, такие антитела можно использовать при получении лекарственного препарата для лечения воспалительного или иммунного заболевания. Млекопитающее, страдающее от или имеющее повышенный риск развития нарушения или болезни по данному описанию, можно лечить, вводя второй терапевтический агент одновременно, последовательно или в комбинации с антителом по данному изобретению. Следует понимать, что в дополнение ко второму терапевтическому агенту можно вводить млекопитающему или использовать в производстве лекарственного препарата для этих показаний другие терапевтические агенты.
Эти антитела и полипептиды можно применять для выяснения роли участия стромальных клетокхозяев в росте имплантированных опухолей-не-хозяев, как, например, в мышиных моделях, которым имплантированы человеческие опухоли. Эти антитела и полипептиды можно применять в методах идентификации человеческих опухолей, при которых можно избежать анти-УЕСР лечения, наблюдая или контролируя рост опухоли, имплантированной грызуну или кролику после лечения анти-УЕСР антителами по данному изобретению. Антитела и полипептиды по данному изобретению можно также использовать для изучения и оценки комбинированной терапии с применением анти-УЕСР антител по данному изобретению и других терапевтических агентов. Антитела и полипептиды по данному изобретению можно использовать для изучения роли УЕСР в других заболеваниях, вводя антитела и полипептиды животному, страдающему от заболевания, и определения, облегчаются ли один или более симптомов данного заболевания.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 представляет собой схематическую иллюстрацию различных типов фрагментов антитела, используемых в фаговом дисплее.
На фиг. 2 сравниваются изменения в СЭК. тяжёлой цепи антитела 114Ό5 матрицы и четырёх выбранных новых синтетических антител (8ЕР ΙΌ N0: 921-928). Также сравнивается связывание четырёх антител с УЕСР.
На фиг. 3 показана способность рецепторов УЕСР (Р111-62 и ΚΌΚ) блокировать связывание новых анти-УЕСР антител с УЕСР. В качестве контроля используют Υ0959Α, анти-УЕСР вариант.
На фиг. 4 показано, что антитело Сб специфично связывается как с ЙУЕСР, так и с тУЕСР, но не с родственными УЕСР антигенами.
На фиг. 5 показано, что Сб эффективно блокирует как связывание ЙУЕСР, так и связывание тУЕСР с ΚΌΚ рецептором. В качестве контроля используют РаЬ-12 и Υ0317.
На фиг. б показано действие Сб на индуцированную УЕСР пролиферацию НИУЕС.
На фиг. 7 проиллюстрированы стадии образования высокоаффинных анти-УЕСР антител и дан список остатков и аффинностей связывания с различными Сб вариантами с повышенной (улучшенной) аффинностью (8ЕР ΙΌ N0: 44-84).
- 7 012835
На фиг. 8 дано сравнение связывания с УЕСЕ Об, 66-23 и ЕаЬ-12. Скорость ассоциации (оп га!е) как ЙУЕОЕ, так и тУЕОЕ измеряют во времени; приводятся расчётные коп, ко££ и Κά.
На фиг. 9 сравниваются скорости ассоциации (при связывании) с УЕОЕ Об и дополнительно усовершенствованных вариантов О6-23.
На фиг. 10 показано влияние антагонистов УЕОЕ (О6-23 и Е111-3Ес) на вес тела и выживание новорождённых мышей.
На фиг. 11 показано действие О6-23 на рост опухоли у бестимусных (голых) мышей с ксенотрансплантированными человеческими опухолевыми клетками (клетками ΚΜ12 и клетками 8\У480). определяемое объёмом опухоли в зависимости от дней лечения.
На фиг. 12 показана экспрессия УЕОЕ (как 11УЕ6Е. так и тУЕОЕ) в ксенотрансплантате ΚΜ12 мышей в присутствии или отсутствие О6-23.
На фиг. 13 показано влияние антагонистов УЕОЕ (О6-23 и Е111-3Ес) на рост опухоли у бестимусных мышей с ксенотрансплантированной мышиной опухолью (ББ2). определяемое объёмом опухоли в зависимости от дней лечения.
На фиг. 14А и В показаны кодоны, предназначенные для считывания кодонов О6 и О6-23 методом дробовика (шотган-эксперимент). В случае каждого считывания вырожденные методом шотган кодоны для (А) тяжёлой и (В) лёгкой цепи предназначены для кодирования дикого типа аминокислоты и аланина (т1) при замене на аланин (а1ашпе-8сап) или аналогичную аминокислоту (т4) при замене на гомологи (йото1од-8сап) как для О6, так и для О6-23 ЕаЬ. Считываемые при шотган-эксперименте кодоны представлены с помощью кода ГОВ (К=О/Т, М=А/С, Я=А/О, 8=О/С, У=А/С/О, ^=А/Т, У=С/Т). Большее количество замен (т2, т3 и т5) в некоторых остатках вызвано природой генетического кода. В случае аланина дикого типа шотган-кодон (кодон, считываемый в шотган-эксперименте) предназначен для кодирования аланина и глицина. Каждый остаток в СЭЯ обозначается с помощью однобуквенного кода для аминокислоты, затем идёт число, обозначающее её положение по номенклатуре КаЬа! е1 а1., 1987. Положения, в которых последовательности О6 и О6-23 различаются, показаны двумя буквами, например, О89К обозначает положение 89, которое занимает О1п или Ьук в О6 или О6-23, соответственно. Звёздочками (*) показаны считываемые кодоны как для аланина, так и для гомолога, кодирующие обычную замену.
На фиг. 15 приводятся сведения о создании библиотек О6 и О6-23 со считыванием методом дробовика (шотган). Библиотеки со считыванием методом дробовика создают с целью мутировать кодоны для указанных остатков в тяжёлой (11с) или лёгкой (1с) цепи О6 и О6-23 с применением шотган-кодонов для замены на аланин или гомолог (фиг. 14А и 14В). Всего создано восемь библиотек с применением мутагенных олигонуклеотидов, показанных в примере 1. Теоретическое разнообразие каждой библиотеки, общее число комбинаций аминокислот, кодируемых мутагенными олигонуклеотидами, превышает по меньшей мере в 100 раз существующее в настоящее время разнообразие создаваемой библиотеки.
На фиг. 16А и 16В показаны результаты сканирования (считывания) методом шотган тяжёлой цепи О6 и О6-23. Влияние каждой мутации (фиг. 14А и В) на СЭЯ остатки тяжёлой цепи (А) О6 и (В) О6-23 оценивают, рассчитывая отношения \\1/ти1 (масса/мутация) с применением последовательностей функциональных клонов, либо с помощью библиотек для замены на аланин (т1, т2, т3), либо библиотек для замены на гомолог (т4 и т5), выделенных после отбора по связыванию либо с 11УЕОЕ (нацеленный отбор), либо с анти-дО 1ад антителом (отбор с визуализацией, дисплей-отбор). Для количественной оценки воздействия каждой мутации на аффинность связывания О6 и О6-23 с 11УЕОЕ отношение функций (Е\\1/ти1) в каждом сайте мутации получают делением отношения Е\\1/ти1 при нацеленном отборе на это отношение при отборе с визуализацией (дисплей-отборе). Вредные воздействия указываются значениями Е\\1/ти1 выше 1.0, а мутации, которые вызывают заметные разрушительные воздействия (Е\\1/ти1 >10), выделены жирным шрифтом. Некоторые мутации не наблюдаются при нацеленном отборе и для их \\1/тг11 отношения можно определить лишь нижний предел; поэтому значение Е\\1/ти1 указывается как более значительный показатель.
На фиг. 17А и В показаны результаты сканирования (считывания) методом шотган лёгкой цепи О6 и О6-23. Влияние каждой мутации (фиг. 14А и В) на СЭЯ остатки лёгкой цепи (А) О6 и (В) О6-23 оценивают, рассчитывая отношения \\1/ти1 (масса/мутация) с применением последовательностей функциональных клонов, либо с помощью библиотек для замены на аланин (т1, т2, т3), либо библиотек для замены на гомолог (т4 и т5), выделенных после отбора по связыванию либо с ЙУЕОЕ (нацеленный отбор), либо с анти-дО 1ад антителом (отбор с визуализацией, дисплей-отбор). Для количественной оценки воздействия каждой мутации на аффинность связывания О6 и О6-23 с 11УЕОЕ отношение функций (Е\\1/ти1) в каждом сайте мутации получают делением отношения Е\\1/ти1 при нацеленном отборе на это отношение при отборе с визуализацией (дисплей-отборе). Вредные воздействия указываются значениями Е\\1/ти1 выше 1.0, а мутации, которые вызывают заметные разрушительные воздействия (Е\\1/ти1 >10), выделены жирным шрифтом.
На фиг. 18 даётся сравнение активностей связывания ЕаЬО6 и О6 с точковыми мутациями с 11УЕОЕ с величинами функций (Е\\1/ти1) с применением считывания с помощью шотган-эксперимента. Относительные активности связывания каждого мутантного белка с 11УЕОЕ оценивают отношением
- 8 012835
1С5о,тиДС5о,теъ мерой уменьшения складок при активности связывания с 11УЕ0Е. вызванного каждой толковой мутацией.
Значения ΙΟ50.ν для Об и 06-23 равны 2.5 нМ и 20 пМ соответственно. По оценкам ошибка в соотношении. не вводящем стандартную ошибку. составляет ±5%. Отношения для заметно вредных мутаций нельзя рассчитать точно. так как при наивысшей концентрации 11УЕ0Е (1 и 0.1 мкМ для Об и 06-23 соответственно). применяемой в анализе. не наблюдается никакого ингибирования. и это отношение было показано только в виде нижнего предела (>400 и >5000 для мутантных Об и 06-23 соответственно) уменьшения складок при связывании с 11УЕ0Е. Значения функций (Е\\1/ши1) для шотган-эксперимента взяты из фиг. 16 и 17. Значения 000ιηι.ιΙ-\νΙ для обоих методов сканирования мутагенеза рассчитывают по уравнению. приведённому в пояснении к фиг. 22А и В.
На фиг. 19 даны относительные аффинности связывания. так как. по определению методом фагового ЕЫ8А. йУЕ0Е|-|09 мутант фага с единичной аланиновой заменой связывается с различными вариантами анти-11УЕ0Е антител или 11УЕ0Е рецепторов (06. 06-23 и В20-4 ЕаЬ. моноклональным антителом А4.6.1 и рецепторами ЕН-1 (1-3). Ρ1ΐ-1ϋ2 и ΚΌΚ.-Ι§. соответственно). Влияние 11УЕ0Е мутантов фага с единичной аланиновой заменой на аффинность анти-ЬУЕ0Е антитела и ЬУЕ0Е рецептора оценивают как относительные 1С50 значения. рассчитывая как 1С50.а1а/1С50.„1 из фагового ЕЫ8А. Число больше 1.0 указывает на уменьшение аффинности связывания. а любой вариант со значительными относительными величинами 1С50. более высокими чем 10. выделен жирным шрифтом. Значения 1С50.„£ для 06 и 06-23. соответственно. составляют 2.5 нМ и 20 пМ соответственно. По оценкам ошибка в соотношении. не вводящем стандартную ошибку. составляет ±5%. Так как для фагового ЕЬ18А требуется значительное связывание мутантной фагмиды с нацеленным белком для получения измеримого сигнала. несвязующие (ΝΒ) нельзя точно количественно определить. но можно интерпретировать. что они обладают в значительной степени пониженной аффинностью связывания (величина 1С50 более 1000). Звёздочка (*) показывает. что данные аланиновых замен в 11УЕ0Е для ЕаЬ-12 и 11УЕ0Е рецепторов взяты из Ми11ег е! а1.. (1997) ΡΝΑ8 И8А 94: 7192-7197 и Ь1 е! а1.. (2000) Сапсег Век. 57: 4593-4599.
На фиг. 20А и В показаны результаты шотган-эксперимента для тяжёлой цепи ЕаЬ06 и 06-23. Величины Е\\1/ти1 определят воздействие аланиновых (чёрные столбцы) замен или замен на гомологи (белые столбцы) в областях СЭВ тяжёлой цепи РаЬ06 и 06-23 на аффинность связывания с 11УЕ0Е. Данные шотган-эксперимента (дробление генома) для (А) тяжёлой цепи ЕаЬ06 взяты из фиг. 16А. и для (В) тяжёлой цепи ЕаЬ06-23 взяты из фиг. 16В.
На фиг. 21А и В даны результаты шотган-эксперимента для лёгкой цепи ЕаЬ06 и 06-23. Величины Е\\1/1пи1 определяют воздействие аланиновых (чёрные столбцы) замен или замен на гомологи (белые столбцы) в областях СЭВ лёгкой цепи ЕаЬ06 и 06-23 на аффинность связывания с 11УЕ0Е. Данные шотган-эксперимента (дробление генома) для (А) лёгкой цепи ЕаЬ06 взяты из фиг. 17А. и для (В) лёгкой цепи ЕаЬ06-23 взяты из фиг. 17В.
На фиг. 22 А и В даны величины ЭЭ0А1а-\\1 из шотган-эксперимента для ЕаЬ06 и 06-23. Величины 0Э0А1а-\\1. измеряющие действие аланиновых замен в областях СОВ (А) ЕаЬ06 и (В) ЕаЬ06-23 на аффинность связывания с 11УЕ0Е. рассчитывают по биофизическому уравнению ^^ОΑ1а-νΐ=ВΤ1η(Κа.νί/Κа.Α1а)=ВΤ1η(Рνί/Α1а). описанному ранее (ХУеНк е! а1.. (2000) РЫА8 И8А 97: 8950-8954). а величины Е\\!/А1а взяты из фиг. 16 и 17.
На фиг. 23 показаны результаты сенсограмм для инъекции 100 нМ ЕаЬ при 25°С в 11УЕ0Е. иммобилизованный на чипе В1Асоге. Показано увеличение скорости ассоциации (оп га!е) для 06 варианта с аланиновой заменой в положении 58 области СОВ-Н2. Дополнительное увеличение скорости ассоциации (оп га!е) можно также наблюдать для этого варианта в случае замещения на валин в положении 51 СЭВН2. Эта фигура построена с применением программы 0тарйРаб Рпкт версия 4.0 (1ι11ρ://\ν\ν\ν.βπιρ1ιраб.сот).
На фиг. 24 показаны аминокислотные последовательности лёгкой цепи 06 ЕаЬ и тяжёлой цепи 06 ЕаЬ соответственно (8Еф ΙΌ N0: 28-29). Подчёркнуты остатки в СПВ1-ЬС. СЭВ2-ЕС и СПВ3-ЬС или СЭВ1-НС. СЭВ2-НС или СЭВ3-НС по номенклатуре КаЬа!.
На фиг. 25 показаны аминокислотные последовательности лёгкой цепи 06-23 ЕаЬ и тяжёлой цепи 06-23 ЕаЬ. соответственно. а также аминокислотные последовательности лёгких цепей 06-31 и 06-8 ЕаЬ (8Е0 ΙΌ N0: 30-33). Подчёркнуто положение участков СЭВ по номенклатуре КаЬа!.
На фиг. 26 показаны аминокислотные последовательности лёгкой и тяжёлой цепей 06-23.1 ЕаЬ и 06-23.2 ЕаЬ (8Еф ΙΌ N0: 34-36). Подчёркнуто положение участков СЭВ по номенклатуре КаЬа!.
На фиг. 27 показана аминокислотная последовательность лёгкой и тяжёлой цепей В20 ЕаЬ (8Еф ΙΌ N0: 37-38). Подчёркнуто положение участков СЭВ по номенклатуре КаЬа!.
На фиг. 28 даны краткие сведения о высокоаффинных связующих УЕ0Е. полученных с применением библиотеки на основе В20 (8Еф ΙΌ N0: 85-140).
На фиг. 29 показана аминокислотная последовательность лёгкой и тяжёлой цепей В20-4 и В20-4.1 ЕаЬ (8Еф ΙΌ N0: 39-41).
На фиг. 30 показано повышение аффинности ЕаЬ 06 против тУЕ0Е с помощью рандомизации лёг
- 9 012835 кой цепи. (А) сенсограммы для инъекции 500 нМ ЕаЬ при 37°С в В1Асоге чип с иммобилизованным на нём тУЕСЕ показывают повышение скорости диссоциации (оГГ) и скорости ассоциации (оп); (В) строят график зависимости полученной (экспериментальной) скорости (КоЬ8, 8'1) образования комплекса между С6 и вариантами ЕаЬ и тУЕСЕ, как скорости понижения интенсивность флуоресценции, от концентрации тУЕСЕ (нМ), и константу скорости ассоциации (оп та!е) (х109 М-1Ус-1) рассчитывают исходя из наклона кривой псевдопервого порядка.
На фиг. 31 показано, что С6 может эффективно блокировать связывание с Е11-1 рецептором как ЙУЕСЕ, так и тУЕСЕ. В качестве контрольных используют ЕаЬ-12 и Υ0317.
На фиг. 32 показаны скорости ассоциации (оп та1е§), диссоциации (оГГ га1е§), значения Кб и 1С50 для взаимодействий белок ЕаЬ-человеческий УЕСЕ или белок ЕаЬ-мышиный УЕСЕ при 25°С и при 37°С, определённые методами поверхностного плазмонного резонанса (8РК.) с применением В1Асоге, или анализом связывания в растворе с применением конкурентного анализа ЕЫ8А или метода тушения флуоресценции с ЕаЬ-12 и Υ0317 для сравнения. ΝΒ обозначает не-связующее. ΝΏ обозначает не определялось.
На фиг. 33А-Е показано ингибирование роста опухоли НМ7 у бестимусных мышей после введения антитела С6, антитела С6-31, антитела Υ0317 и антитела Ауакбп™ в (А) дозе 0.1 мг/кг дважды в неделю; (В) дозе 0.25 мг/кг дважды в неделю; (С) дозе 0.5 мг/кг дважды в неделю; (Ό) дозе 2 мг/кг дважды в неделю; и (Ό) дозе 5 мг/кг дважды в неделю. В качестве контрольного антитела используют антитело против аллергии к пыльце.
На фиг. 34 суммированы варианты различных (А) лёгких цепей и (В) тяжёлых цепей С6 с учётом последовательности и 1С50 анализа (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 361-488). 1С50 дикого типа отражает среднее из значений, полученных в разных опытах. Положения с изменяющимися аминокислотами показаны жирным шрифтом. Остатки, отличные от остатков С6 дикого типа, выделены. Остатки обозначены с помощью однобуквенного кода для аминокислоты и числа, показывающего её положение по номенклатуре КаЬа! е1 а1., 1987.
На фиг. 35 суммированы варианты различных (А) лёгких цепей и (В) тяжёлых цепей С6-23 с учётом последовательности и 1С50 анализа (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 141-272). 1С50 дикого типа отражает среднее из значений, полученных в разных опытах. Положения с изменяющимися аминокислотами показаны жирным шрифтом. Остатки, отличные от остатков С6 дикого типа, выделены. Остатки обозначены с помощью однобуквенного кода для аминокислоты и числа, показывающего её положение по номенклатуре КаЬа! е1 а1., 1987.
На фиг. 36 показаны участки аминокислотных последовательностей антител ΥΛΌ8-Ε ΥΛΌ8-2 и ΥΛΌ8-3 и других клонов (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 489-560). Представлены последовательности трёх связующих 11УЕСЕ. выбранных из библиотеки ΥΛ^8-II. Остатки, которые не были рандомизированы в библиотеке, закрашены серым.
На фиг. 37 показаны аминокислотные последовательности группы антител ΥΛ^8 ряда (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 273-332). Представлены последовательности уникальных клонов, полученные сортингом библиотеки ΥΛ^8-Λ против 11УЕСЕ. Остатки, которые не были рандомизированы в библиотеке, закрашены серым.
На фиг. 38 показаны аминокислотные последовательности группы антител ΥΛ^8 ряда (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 333-360). Представлены последовательности уникальных клонов, полученные сортингом библиотеки ΥΛ^8-В против 11УЕСЕ. Остатки, которые не были рандомизированы в библиотеке, закрашены серым.
На фиг. 39 показаны ЕаЬ последовательности антител ΥΛ^8-2 и ΥΛ^8-3 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 19-24). Жирным шрифтом показаны остатки вариабельной области. Подчёркнутые участки показывают аппроксимируемые остатки (ΌΗ-ΕΕ С )1/-1.2, (ΌΗ-Ε.χ СОК-Н1, СОВ-112 или С‘1)2-11.3.
На фиг. 40 показаны ΝΝΚ варианты антитела ΥΛ^8-2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 723-794). х указывает СТОПкодон или не считываемую последовательность.
На фиг. 41 показаны аминокислотные последовательности группы антител ряда Υ8 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 795-914). Они представляют собой последовательности связующих, полученных селекцией библиотеки Υδ-А и У8-В.
На фиг. 42 показаны СОВ последовательности анти-УЕСЕ антител из Υ8 библиотек (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 561-722). Клоны 1-52 отбирают из библиотеки В, тогда как клоны 53-63 отбирают из библиотеки А. Слева направо колонки 1-5 СВК.-Ь3 относятся к положениям 91, 92, 93, 94 и 96, соответственно; колонки 1-5 С02-Н1 относятся к положениям 28, 30, 31, 32 и 33; колонки 1-6 СЭВ-Н2 относятся к положениям 50, 52, 53, 54, 56 и 58; и колонки 1-15 СОК.-Н3 относятся к положениям 95, 96, 97, 98, 99, 100 и 100-а по номенклатуре КаЬаЕ
На фиг. 43 показана последовательность Υ81 ЕаЬ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 42-43). Участки, выделенные жирным шрифтом, показывают остатки в вариабельной области.
- 10 012835
Подробное описание предпочтительных вариантов изобретения
I. Определения.
Термин антитело применяется в самом широком смысле и конкретно охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, пока они проявляют нужную биологическую активность.
Полипептид ряда Об по данному изобретению представляет собой полипептид, включающий антитело по данному изобретению, который получен из последовательности антитела Об или антитела, образованного из Об, по любой из фиг. 2, 7, 24-2б и 34-35 и который связывается с человеческим УЕСЕ с нужной аффинностью по данному изобретению (например, 10 нМ или менее, 2 нМ или менее, 1 нМ или менее, 0.1 нМ или менее, 500 пМ или менее для ЕаЬ варианта антитела при 25°С).
Полипептид ряда В20 по данному изобретению представляет собой полипептид, включающий антитело по данному изобретению, который получен из последовательности антитела В20 или антитела, образованного из В20, по любой из фиг. 27-29 и который связывается с УЕОЕ с нужной аффинностью по данному изобретению.
Полипептид ряда ΥΑΌ8 или полипептид ΥΑΌ8 по данному изобретению представляет собой полипептид, включающий антитело по данному изобретению, который получен из последовательности антитела ΥΑΌ8 по любой из фиг. 3б-40 и который связывается с УЕОЕ с нужной аффинностью по данному изобретению.
Полипептид ряда ΥΑΌ8-2 или полипептид ΥΑΌ8-2 по данному изобретению представляет собой полипептид, включающий антитело по данному изобретению, который получен из последовательности антитела ΥΑΌ8-2 по любой из фиг. 3б или 39 и который связывается с УЕОЕ с нужной аффинностью по данному изобретению.
Полипептид ряда ΥΑΌ8-3 или полипептид ΥΑΌ8-3 по данному изобретению представляет собой полипептид, включающий антитело по данному изобретению, который получен из последовательности антитела ΥΑΌ8-3 по любой из фиг. 3б или 39 и который связывается с УЕОЕ с нужной аффинностью по данному изобретению.
Полипептид ряда Υ8 или полипептид Υ8 по данному изобретению представляет собой полипептид, включающий антитело по данному изобретению, который получен из последовательности антитела Υ8 по любой из фиг. 41-43 и который связывается с УЕОЕ с нужной аффинностью по данному изобретению Согласно одному предпочтительному варианту изобретения полипептид ряда О, полипептид ряда В20, полипептид ряда ΥΆΌ8, полипептид ряда ΥΆΌ8-2, полипептид ряда ΥΆΌ8-3 или полипептид ряда Υ8 связывается с человеческим УЕОЕ и УЕОЕ нечеловеческого млекопитающего с величиной Кб, верхний предел которой в 10 раз больше нижнего. Согласно одному эксперименту величины КО для этих антител, связывающихся с человеческим УЕОЕ и мышиным УЕОЕ, составляют 10 нМ или менее. В другом эксперименте эти антитела связываются с человеческим УЕОЕ и мышиным УЕОЕ с величинами Кб 2 нМ или менее. В другом эксперименте эти антитела связываются с человеческим УЕОЕ с величинами Кб 1 нМ или менее. Аффинность таких полипептидов ряда Об, ряда В20, ряда ΥΑΌ8 и Υ8 в отношении УЕОЕ можно улучшить такими методами, как например фаговый дисплей, представленный в данном описании.
Выражение вариабельный домен (вариабельная область) антитела относится к участкам лёгкой и тяжёлой цепей молекул антитела, которые включают аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (ΟΌΚ; т.е. ΟΌΚ.1, ΟΌΚ2 и ΟΌΚ.3) и каркасных участков (ЕК). Ун относится к вариабельному домену тяжёлой цепи. У|, относится к вариабельному домену лёгкой цепи. Согласно способам по изобретению аминокислотные положения, относящиеся к ΟΌΚ и к ЕК, можно определить по номенклатуре КаЬа! (8сс.|испес5 οί РгсИепъ οί 1ттипо1ощса1 1п1сгсз1 (Ναΐίοηαΐ ΙιΜίΙιιΚδ οί Неа11й, ВеШекба, ΜΌ., 1987 и 1991). Нумерация аминокислот в антителах или антигенсвязывающих фрагментах также соответствует номенклатуре КаЬа1.
Применяемый в данном описании термин гипервариабельные участки (ΟΌΚ; т.е. ΟΌΚ1, ΟΌΚ2 и ΟΌΚ3) относится к аминокислотным остаткам вариабельного домена антитела, присутствие которых необходимо для связывания с антителом. Каждый вариабельный домен содержит обычно три участка ΟΌΚ, называемых ΟΌΚ1, ΟΌΚ2 и ΟΌΚ3. Каждый гипервариабельный участок может содержать аминокислотные остатки гипервариабельного участка по КаЬа! (т.е. примерные остатки 24-34 (Ь1), 50-5б (Ь2) и 89-97 (Ь3) в вариабельном домене лёгкой цепи и 31-35 (Н1), 50-б5 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжёлой цепи; КаЬа! (8ес.|иепсе5 οί Рго1еш8 οί Рптшю^щса! 1п1еге51 54Ь Еб. РиЬНс НеаИй 8егу1се, №1юпа1 1п8Йи1е8 οί Неа11й, ВеШекба, ΜΌ.(1991)) и/или такие остатки из гипервариабельной петли (т.е. примерные остатки 2б-32 (Ь1), 50-52 (Ь2) и 91-9б (Ь3) в вариабельном домене лёгкой цепи и 2б-32 (ΗΙ), 53-55 (Н2) и 9б-101 (Н3) в вариабельном домене тяжёлой цепи; СЫЫа апб Ьекк 1. Μο1. Βίο1. 19б: 901917(1987)). В некоторых примерах гипервариабельный участок может включать аминокислоты как ΟΌΚ участка по КаЬа1, так и гипервариабельной петли. Например, ΟΌΚ-Η1 тяжёлой цепи антитела 4Ό5 включает аминокислоты 2б-35.
Каркасные участки (далее в данном описании ЕК) представляют собой отличные от остатков ΟΌΚ
- 11 012835 остатки вариабельного домена. Обычно каждый вариабельный домен содержит четыре РК, определяемых как РК1, РК2, РК3 и РК4. Если СОК участки определяют по КаЬа1, РК остатки лёгкой цепи позиционируют примерно в остатках 1-23 (ЪСРК1), 35-49 (ЬСРК2), 57-88 (ЬСРКЗ) и 98-107 (ЬСРК4), а РК остатки тяжёлой цепи позиционируют примерно в остатках 1-30 (НСРК1), 36-49 (НСРК2), 66-94 (НСРКЗ) и 103-113 (НСРК4) тяжёлой цепи. Если участки СОК содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель, РК остатки лёгкой цепи позиционируют примерно в остатках 1-25 (ЪСРК1), 3349 (ЬСРК2), 53-90 (ЬСРК3) и 97-107 (ЬСРК4), а РК остатки тяжёлой цепи позиционируют примерно в остатках 1-25 (НСРК1), 33-52 (НСРК2), 56-95 (НСРК3) и 102-113 (НСРК4) тяжёлой цепи. В некоторых примерах, когда СОК содержит аминокислоты как их СОК по КаЬа1, так и аминокислоты из гипервариабельной петли, остатки РК корректируют соответствующим образом. Например, СОК-Н1 включает аминокислоты Н26-Н35, РК1 остатки тяжёлой цепи находятся в положениях 1-25, а РК2 остатки находятся в положениях 36-49.
Применяемый термин набор кодонов относится к различным нуклеотидным триплетам, применяемым для кодирования нужных вариантов аминокислот. Набор олигонуклеотидов можно синтезировать, например, твердофазным синтезом, включая последовательности, которые представляют все возможные комбинации нуклеотидных триплетов, обеспечиваемые набором кодонов и кодирующие заданную группу аминокислот. Стандартной формой обозначения кодонов является код ШВ, известный в уровне техники и представленный в данном описании. Набор кодонов обычно изображают тремя заглавными буквами курсивом, например, ΝΝΚ, NN8, ΧΥΖ, ОУК и т.д. Таким образом неслучайный набор кодонов по данному описанию относится к набору кодонов, который кодирует выбранную аминокислоту, которая отвечает частично, предпочтительно, полностью критериям отбора аминокислот по данному описанию. Синтез олигонуклеотидов с выбранной вырожденностью нуклеотидного кода в некоторых положениях хорошо известна в уровне техники, например, подход ТК1М (Кпаррек е! а1; 1. Μοί. Вю1. (1999), 296: 57-86; Саггагб & Неппег, Сепе (1993), 128: 103). Такие наборы олигонуклеотидов, имеющих определённые наборы кодонов, можно синтезировать на продажных синтезаторах нуклеиновых кислот (выпускаемых, например, Аррйеб Вюзуз1етз, Роз1ег Сйу, СА), или их можно приобрести (например, от ЬПе Тее11по1още8. КоскуШе, МО). Следовательно, набор синтезированных олигонуклеотидов, имеющих конкретный набор кодонов, обычно содержит множество олигонуклеотидов с различными последовательностями, причём различие устанавливается с помощью набора кодонов по всей последовательности. Олигонуклеотиды, применяемые по изобретению, имеют последовательности, которые допускают гибридизацию нуклеотидной матрицы вариабельного домена и также могут, но не обязательно, включать сайты рестриктаз, применимые, например, для целей клонирования.
Фрагмент Ру является фрагментом антитела, который содержит полный сайт распознавания антигена и связывания с антигеном. Этот участок состоит из димера тесно связанных одного вариабельного домена тяжёлой цепи и одного вариабельного домена лёгкой цепи, эта связь может быть ковалентной по природе, например, в зсРу. Именно в этой конфигурации взаимодействуют три СОК участка каждого вариабельного домена, идентифицируя сайт связывания антигена на поверхности димера УН-УЪ. Вместе шесть СОК участков или их набор сообщают антителу специфичность связывания с антигеном. Однако даже единичный вариабельный домен (или половина Ру, содержащая только три СОК, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя обычно с более низкой аффинностью, чем полный сайт связывания.
Фрагмент РаЬ содержит вариабельный и константный домен лёгкой цепи и вариабельный домен и первый константный домен (СН1) тяжёлой цепи. Фрагменты антитела Р(аЬ')2 содержат пару РаЬ фрагментов, которые обычно ковалентно связаны между собой близ карбокси-концов с помощью цистеиновых остатков шарнирных участков. В уровне техники также известны другие соединения фрагментов антитела.
Одноцепочечный Ру или зсРу фрагменты антитела содержат УН и У|, домены антитела, причём эти домены присутствуют в единственной полипептидной цепи. Обычно РМ полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между УН и Уъ доменами, который даёт возможность зсРу образовывать нужную структуру для связывания с антигеном. Обзор о зсРу см. Р1иск1йип в Рйагтасо1о§у о! Мопос1опа1 АпйЬоФез, Уо1. 113, КозепЬигд апб Мооге ебз. 8ргшдег-Уег1ад, Νον Υο^к, рр. 269-315 (1994).
Термин б1аЬобу относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причём эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжёлой цепи (УН), связанный с вариабельным доменом лёгкой цепи (Уь) в той же самой полипептидной цепи (УН и Уь). Используя линкер, слишком короткий, чтобы можно было осуществить спаривание между двумя доменами одной и той же цепи, домены принуждают спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. О1аЬобу более подробно описаны, например, в ЕР 404 097; \УО 93/11161; и НоШпдег е! а1., Ргос. Асаб. 8а. И8А, 90: 6444-6448 (1993).
Выражение линейные антитела относится к антителам, описанным в Ζараΐа е! а1., Рго1еш Епд., 8(10): 1057-1062 (1995). Короче, эти антитела содержат пару тандемных повторов Рб сегментов (УН-СН1УН-СН1), которые, вместе с полипептидами комплементарной лёгкой цепи, образуют пару антигенсвязывающих участков. Линейные антитела могут быть биспецифическими и моноспецифическими.
- 12 012835
Термин моноклональное антитело по данному описанию относится к антителу, полученному от популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, направленными против единичного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от обычного (поликлонального) антитела, препараты, которые, как правило, включают различные антитела против различных детерминант (эпитопов), причём каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антигене. Определение моноклональное указывает на характер антитела как полученного из практически гомогенной популяции антител, его не следует истолковывать как требование получать антитело каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению можно получать методом гибридом, впервые описанным КоЫет е! а1., №1Шгс 256: 495 (1975), или их можно получать методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4816567). Моноклональные антитела можно также выделять из фаговых библиотек антител, например, методами, описанными в С1асккои е! а1., Ыа!иге 352: 624-628 (1991) и Маткк е! а1., 1. Мо1. Бю1. 222: 581-597 (1991).
Моноклональные антитела по данному описанию могут включать химерные антитела (иммуноглобулины), в которых участок тяжёлой и/или лёгкой цепи идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу, тогда как остаток цепи (цепей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах от других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, пока они проявляют заданную биологическую активность (патент США 4816567; и Моткой е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 81: 6851-6855 (1984)).
Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части гуманизированные антитела являются человеческими иммуноглобулинами (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельного участка реципиента заменены на остатки гипервариабельного участка нечеловеческого вида (донорного антитела), такого как мышиное, крысиное, кроличье или нечеловеческого примата, имеющие заданную специфичность, аффинность и способность. В некоторых примерах остатки Γν каркасной области (ГК) человеческого иммуноглобулина заменены на соответствующие нечеловеческие остатки. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не обнаруженные в антителе-реципиенте или в донорном антителе. Эти модификации осуществляют для дальнейшего уточнения характеристик антитела. Вообще гуманизированное антитело содержит практически все по меньшей мере из одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям нечеловеческого иммуноглобулина, и все или практически все ГК области являются ГК областями последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело, возможно, также содержит по меньшей мере часть константной области (Гс) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина. Подробнее см. 1оиек е! а1., Ыа!иге 321: 522-525 (1986); Шесйтаии е! а1., Ыа!иге 332: 323-329 (1988); и Ртек!а, Сигг. Ор. 8!тис!. Вю1. 2: 593-596 (1992).
Видозависимое антитело представляет собой антитело, которое обладает более сильной аффинностью связывания с антигеном млекопитающего первого вида, чем с гомологом этого антигена млекопитающего второго вида. Обычно видозависимое антитело специфически связывается с человеческим антигеном (например, имеет величину аффинности связывания (Кб) не более примерно 1х10-7 М, предпочтительно не более 1х10-8 М и наиболее предпочтительно не более 1х10-9 М), но имеет величину аффинности связывания с гомологом антигена второго нечеловеческого млекопитающего по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 500 раз, или по меньшей мере примерно в 1000 раз слабее, чем его аффинность связывания с человеческим антигеном. Зависимое от вида антитело может быть любым из различных видов антител по определению выше, но предпочтительно является гуманизированным или человеческим антителом.
Применяемое в данном описании выражение мутантное антитело или вариант антитела относится к варианту аминокислотной последовательности видозависимого антитела, в котором один или более аминокислотных остатков видозависимого антитела модифицирован. Такие мутанты непременно обладают менее чем 100%-ной идентичностью или сходством последовательности с видозависимым антителом. В предпочтительном варианте изобретения мутантное антитело имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 75% идентичную или сходную с аминокислотной последовательностью вариабельного домена либо тяжёлой, либо лёгкой цепи видозависимого антитела, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95%. Идентичность или сходство в отношении этой последовательности определяется по данному описанию как процентное содержание аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, идентичных (т. е. тот же самый остаток) или сходных (т.е. аминокислотный остаток той же группы, созданной на основании общих свойств боковой цепи, см. ниже) остаткам видозависимого антитела, после выравнивания последова
- 13 012835 тельностей и, при необходимости, введения гэпов, для достижения максимального процента идентичности. Ни один (ни одну) из Ν-концевых, С-концевых или внутренних удлиняющих сегментов, делеций или инсерций в последовательность антитела вне вариабельного домена не следует интерпретировать как влияющие на идентичность или сходство (подобие) последовательностей.
Для повышения периода полужизни антител или полипептида, содержащего аминокислотные последовательности по данному изобретению, можно присоединить к антителу эпитоп связывания с рецептором-мусорщиком (особенно к фрагменту антитела), как описано, например, в патенте США 5739277. Например, нуклеодидную молекулу, кодирующую эпитоп связывания с рецептором-мусорщиком, можно связывать в рамке считывания с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептидную последовательность по данному изобретению, таким образом, чтобы слитый (составной) белок, экспрессируемый при использовании созданной нуклеотидной молекулы содержал эпитоп связывания с рецептороммусорщиком и полипептидную последовательность по данному изобретению. Применяемое в данном описании выражение эпитоп связывания с рецептором-мусорщиком относится к эпитопу Ес области молекулы 1дС (например, 1§С1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4), отвечающий за повышение ίη νίνο периода полужизни в сыворотке молекулы 1дС (например, СНс11С, У. с1 а1., (2000) Αηη. Κβν. 1ттипо1. 18: 739-766, табл. 1). Антитела с заменами в их Ес области и повышенный период полужизни в сыворотке также описаны в №0 00/42072 (Рге§1а, Ь.), №0 02/060919; 8Ые1б«, К.Ь, е1 а1., (2001) ,1ВС 276(9): 6591-6604; Ηίηίοη, Р.К., (2004) 1ВС 279(8): 6213-6216). В другом варианте изобретения период полужизни в сыворотке можно также увеличить, например, присоединяя другие полипептидные последовательности. Например, антитела по данному изобретению или другой полипептид, содержащий аминокислотные последовательности по данному изобретению, можно присоединять к сывороточному альбумину или участку сывороточного альбумина, который связывается с ЕсКп рецептором или пептидом, связывающим сывороточный альбумин, таким образом, что сывороточный альбумин связывается с антителом или полипептидом, такие полипептидные последовательности описаны, например, в №0 01/45746. В одном предпочтительном варианте изобретения присоединяемый пептид для сывороточного альбумина содержит аминокислотную последовательность П1СЬРК№ССЬ№. В другом варианте изобретения период полужизни ЕаЬ по данному изобретению увеличивают этими методами. См. также Оеши^ М.8., е1 а1., (2002) 1ВС 277(38): 35035-35043 о пептидных последовательностях для связывания сывороточного альбумина.
Выделенное (изолированное) антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или регенерировано из компонентов его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой материалы, которые мешают применению антитела в диагностике или терапии, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворы. В предпочтительных вариантах изобретения антитело очищают (1) так, чтобы степень чистоты была 95 вес.% антитела по методу Лаури (Ьо^гу), наиболее предпочтительно более 99 вес.%, (2) до степени чистоты, достаточной, чтобы получить, по меньшей мере, 15 остатков Νконцевой или внутренней аминокислотной последовательности, используя секвенатор с вращающейся чашкой, или 3) до гомогенности методом 8П8-РАСЕ в условиях восстановления или без восстановления с применением окрашивания Кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитело ίη δίΐιι в рекомбинантных клетках, так как по меньшей мере один компонент природного окружения антитела будет отсутствовать. Обычно, однако, выделенное антитело получают с применением по меньшей мере одной стадии очистки.
Ангиогенный фактор или агент представляет собой фактор роста, который стимулирует рост кровеносных сосудов, например, промотирует ангиогенез, рост эндотелиальных клеток, стабильность кровеносных сосудов и/или васкулогенез и т.д.
Например, ангиогенные факторы включают, но без ограничения, УЕСЕ и членов семейства УЕСЕ, Р1СЕ, семейства РОСЕ, семейства фактора роста фибробластов (ЕСЕ), Т1Е лиганды (ангиопоэтины), эфрины, Ое1-1, факторы роста фибробластов: кислые (аЕСЕ) и основные (ЬЕСЕ), фоллистатин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Е), фактор роста гепатоцитов (НСЕ)/фактор рассеяния (8Е), интерлейкин-8 (1Ь-8), лептин, мидкин, плацентарный фактор роста, фактор роста эндотелиальных клеток тромбоцитарного происхождения (РО-ЕССЕ), тромбоцитарный фактор роста, особенно РОСЕ-ВВ или РОСЕК-бета, плейотропин (₽ΤΝ), програнулин, пролиферин, трансформирующий фактор ростаальфа (ТСЕ-альфа), трансформирующий фактор роста-бета (ТСЕ-бета), фактор некроза опухолевых клеток-альфа (ΤΝΒ-альфа), сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕСЕ)/ фактор сосудистый проницаемости (УРЕ) и т.д. Они также включают факторы, которые ускоряют заживление ран, например гормон роста, инсулиноподобный фактор роста-Ι (1СЕ-1), У1СЕ, эпидермальный фактор роста (ЕСЕ), СТСЕ и членов его семейства и ТСЕ-альфа и ТСЕ-бета. См., например, 1<1ад5Ьгип амб Ό' Атоге, Аппи. Кеу. РЬу8ю1., 53: 217-39 (1991); 81геП аиб Ое1таг 0ηοο^№, 22: 3172-3179 (2003); Ееггага & А1На1о, №11иге Мебюте 5(12): 1359-1364 (1999); Тошш е1 а1., 0ηοο§οηο, 22: 6549-6556 (2003) (например, табл. 1, в которой перечислены известные ангиогенные факторы); и 8а1о Ιηΐ. ί. С1т. 0псо1., 8: 200-206 (2003).
Выражение антиангиогенный агент или ангиогенный ингибитор относится к низкомолекулярному веществу, полинуклеотиду, полипептиду, выделенному белку, рекомбинантному белку, антителу или их конъюгатам или составным (слитым) белкам, которые ингибируют ангиогенез, васкулогенез или
- 14 012835 нежелательную сосудистую проницаемость либо непосредственно, либо опосредованно. Следует понять, что антиангиогенный агент включает те агенты, которые связывают и блокируют ангиогенную активность ангиогенного фактора или его рецептор. Например, антиангиогенный агент представляет собой антитело или другой антагонист ангиогенного агента по определению выше, например, антитела к УЕСЕ-А или к рецептору УЕСЕ-А (например, рецептор КИК или рецептор Е1!-1), анти-РИСЕК ингибиторы, такие как С1ееνес™ (иматиниба мезилат). Антиангиогенные агенты также включают нативные ангиогенные ингибиторы, например, ангиостатин, эндостатин и т.д. СМ., например, К1адкЬгап апб Ό' Атоге, Аппи. Кеу. РЬ.у8ю1., 53: 217-39 (1991); 8(геЧ апб Пе!таг, Опсодепе, 22: 3172-3179 (2003) (например, табл. 3, в которой перечисляется антиангиогенная терапия при злокачественной меланоме); Ееггага & А1йа1о, ЫаШге Мебюте 5(12): 1359-1364 (1999); Тошш е! а1., Опсодепе, 22: 6549-6556 (2003) (например, табл. 2, в которой перечислены известные ангиогенные факторы); и 8а!о Ш!. I. СИп. Опсо1., 8: 200206 (2003) (например, табл. 1, в которой перечисляются антиангиогенные агенты, применяемые в клинических испытаниях).
Кб или величину (значение) Кб по данному изобретению в одном предпочтительном варианте изобретения определяют радиоиммунным анализом связывания УЕСЕ (ША, РИА), осуществляемым с применением ЕаЬ варианта антитела и молекулой УЕСЕ, как описано в нижеприведённом анализе, в котором измеряют аффинность связывания ЕаЬ с УЕСЕ в растворе, уравновешивая ЕаЬ с минимальной концентрацией меченого (12¾ УЕСЕ(109) в присутствии титрованного ряда немеченого УЕСЕ, затем захватывая связанный УЕСЕ с помощью планшета, покрытого антителом против ЕаЬ (СНеп. е! а1., (1999) I. Мо1. Вю1. 293: 865-881). Для определения условий анализа микротитрационные планшеты (Иупех) в течение ночи покрывают 5 мкг/мл захватывающего антитела против ЕаЬ (Сарре1 ЬаЬк) в 50 мМ карбоната натрия (рН 9.6), а затем блокируют 2%-ным (об./вес.) раствором альбумина бычьей сыворотки в РВ8 от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно при 23°С). В неадсорбирующем планшете (Ыипс #4269620), 100 пМ или 26 пМ |Ι2Ί| УЕСЕ(109) смешивают с интересующим ЕаЬ в серийном разведении, например, с ЕаЬ-12 (Ргек!а е! а1., (1997) Сапсег Кек. 57: 4593-4599). Затем представляющий интерес ЕаЬ инкубируют в течение ночи; однако инкубация может продолжаться 65 часов, чтобы гарантировать достижение равновесия. Затем смеси переносят в планшет для улавливания (захвата) с целью инкубации при комнатной температуре в течение часа. Затем раствор удаляют и планшет восемь раз отмывают с помощью 0.1% Тчееп-20 в РВ8. Когда планшеты высушены, добавляют 150 мкл/лунка сцинтиллятора (Мюго8ст!-20; Раскагб) и планшеты считают на гамма-счётчике Торсоип! (Раскагб) мин. Концентрации каждого ЕаЬ, который даёт 20% или менее максимального связывания, выбирают для применения в анализах конкурентного связывания. Согласно другому варианту изобретения Кб или величину Кб измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса на ВМсоге™ - 2000 или ВМсоге™ - 3000 (Высоте, Шс., Р1кса!ачау, N1) при 25°С с иммобилизованными НУЕСЕ (8-109) СМ5 чипами при ~10 относительных единиц (единиц ответа) (гекропке иш!к) (КИ). Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (СМ5, ВМсоге Шс.) активируют с помощью гидрохлорида №этил-№-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭС) и Ν-гидроксисукцинимида (ΝΗ8) в соответствии с инструкциями производителя. Человеческий УЕСЕ разводят с помощью 10 мМ ацетата натрия, рН 4.8, до 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/мин для получения, приблизительно, 10 единиц ответа (гекропке иш!к) (КИ) сопряжённого белка. После инъекции человеческого УЕСЕ, инъецируют 1М этаноламина с целью блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения ЕаЬ (от 0.78 нМ до 500 нМ) инъецируют в РВ8 с 0.05% Тчееп 20 (РВ8Т) при 25°С при скорости потока, приблизительно, 25мкл/мин. Скорости ассоциации (коп) и скорости диссоциации (ко££) рассчитывают, используя простую модель связывания Ленгмюра один к одному (Высоте Еуа1иа1юп 8ойчаге уегкюп 3.2), одновременной подгонкой сенсограмм (диаграмм чувствительности) ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Кб) рассчитывают как отношение ко££/коп. См., например, СНеп, Υ., е! а1., (1999) I. Мо1. Вю1. 293: 865-881. Если скорость ассоциации превышает 106 М-1с-1 в вышеприведённом методе поверхностного плазмонного резонанса, тогда скорость ассоциации можно определить методом тушения флуоресценции, который позволяет измерять повышение или снижение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение= 295 нм; эмиссия (излучение)=340 нм, 16 нм полоса пропускания) при 25°С 20 нМ анти-УЕСЕ антитела (ЕаЬ форма) в РВ8, рН 7.2, в присутствии повышающихся концентраций короткой формы человеческого УЕСЕ (8-109) или мышиного УЕСЕ, измеряемой на спектрометре, таком как спектрофотометр, снабжённый вводом с отключением потока !пк1гитеп1к) или спектрофотометр 8000-серии 8ЕМ-Аш1псо (Тйегшо8рес1гошс) с кюветой с перемешиванием.
Согласно данному изобретения оп га!е или скорость ассоциации, или коп, предпочтительно измеряют тем же методом поверхностного плазмонного резонанса, описанным выше, на ВМсоге™ - 2000 или ВМсоге™ - 3000 (Высоте, Шс., Р1кса!ачау, N1) при 25°С с иммобилизованными НУЕСЕ (8-109) СМ5 чипами при ~10 единиц ответа (относительных единиц) (гекропке иш!к) (КИ). Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (СМ5, Высоте Шс.) активируют с помощью гидро- 15 012835 хлорида №этил-№-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭС) и Ν-гидроксисукцинимида (ΝΗ8) в соответствии с инструкциями производителя. Человеческий УЕСР разводят с помощью 10 мМ ацетата натрия, рН 4.8, до 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/мин для получения приблизительно 10 относительных единиц (гезропзе ιιηίΐδ) (КИ) сопряжённого (составного) белка. После инъекции человеческого УЕСР, инъецируют 1М этаноламина с целью блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения РаЬ (от 0.78 до 500 нМ) инъецируют в ΡΒ8 с 0.05% Т\гееп 20 (ΡΒ8Τ) при 25°С при скорости потока, приблизительно, 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (коп) и скорости диссоциации (ко££) рассчитывают, используя простую модель связывания Ленгмюра один к одному (В1Асоге Еуа1иа1юп 8оП\\'аге геШоп 3.2), одновременной подгонкой сенсограмм (диаграмм чувствительности) ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Кб) рассчитывают как отношение к,££/ко11. См., например, Скеп, Υ., е1 а1., (1999) 1. Мо1. Вю1. 293: 8б5-881. Однако, если скорость ассоциации превышает 10б М-1с-1 в вышеприведённом методе поверхностного плазмонного резонанса, тогда скорость ассоциации можно определить методом тушения флуоресценции, который позволяет измерять повышение или снижение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение=295 нм; эмиссия (излучение)=340 нм, 1б нм полоса пропускания) при 25°С 20 нМ анти-УЕСР антитела (РаЬ форма) в ΡΒ8, рН 7.2, в присутствии повышающихся концентраций короткой формы человеческого УЕСР (8-109) или мышиного УЕСР, измеряемой на спектрометре, таком как спектрофотометр, снабжённый отключением потока (Ανίν 1п81гитеп18). или спектрофотометр 8000-серии 8ЬМ-Аттсо (Тйегто8рес1гошс) с кюветой с перемешиванием.
Выражение функциональный эпитоп по данному изобретению относится к аминокислотным остаткам антигена, которые вносят энергетический вклад в связывание антитела. Мутация любого из участвующих энергетически остатков антигена (например, мутация УЕСР дикого типа с применением аланиновых замен или замен на его гомолог) нарушает связывание антитела таким образом, что отношение относительных аффинностей (1С50 мутантного УЕСР/1С50 УЕСР дикого типа) становится выше 5 (пример 2). В предпочтительном варианте изобретения отношение относительных аффинностей определяют методом ЕЫ8А связывания в растворе с помощью фагового дисплея. Коротко говоря, 9б-луночные иммунопланшеты Мах1зогр (ΝυΝΟ в течение ночи при 4°С покрывают испытуемой формой РаЬ антитела с концентрацией 2 мкг/мл в ΡΒ8 и блокируют ΡΒ8, 0.5% В8А и 0.05% Т\гееп 20 (ΡΒΤ) в течение 2 ч при комнатной температуре. Серийное разведение полученного методом фагового дисплея мутанта ЬУЕСР с аланиновыми точковыми мутациями (форма, содержащая остатки 8-109) или кУЕСР (8-109) дикого типа в РВТ сначала инкубируют на покрытых РаЬ планшетах в течение 15 мин при комнатной температуре, и планшеты отмывают ΡΒ8, 0.05% Тетееп 20 (ΡΒ8Τ). Связанный фаг детектируют с применением конъюгата моноклонального антитела против М13 с пероксидазой хрена (Атегзйат Рйагтааа), разведённого 1:5000 в РВТ, проявляемого субстратом 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ, Кикедаагб & Реггу ЬаЬз, СабкегзЬигд, МО) примерно в течение 5 мин, гасят 1.0 М Н3РО4 и читают на спектрофотометре при 450 нм. Отношение величин 1С50 (1С50,а1а/1С50,„£) представляет собой коэффициент кратности снижения аффинности связывания (относительная аффинность связывания).
При анализе конкурентного связывания планшеты Мах1зогЬ покрывают и блокируют, как описано выше, а серийные трёхкратные разведения немеченого УЕСР(109) готовят в буфере ΡΒδ/Тетееп в планшете Шпс. Добавляют [125Ι] УЕСР(109), а затем представляющий интерес РаЬ с постоянной концентрацией. Конечные концентрации представляющего интерес РаЬ составляют 100 и 10 пМ, соответственно. После инкубации (как описано выше) связанный УЕСР захватывается и количественно рассчитывается, как описано выше. Данные связывания анализируют с помощью компьютерной программы методом Скэтчарда (Р. Мипзоп е1 а1., (1980) Апа1. Β^оскет. (1980) 107: 220-239) для определения константы диссоциации при связывании, Кб.
Применяемый в данном описании термин библиотека относится к множеству последовательностей антитела или фрагментов антитела (например, полипептидов по данному изобретению), или нуклеиновых кислот, которые кодируют эти последовательности, причём последовательности различаются комбинацией вариантных аминокислот, которые вводятся в эти последовательности по методам данного изобретения.
Фаговый дисплей представляет собой метод, при котором вариантные полипептиды визуализуются в виде белков, слитых по меньшей мере с частью белка, содержащегося в плёнке (покрытии) планшета, на поверхности фаговых частиц, например, частиц нитевидного фага. Использование фагового дисплея лежит в основе того факта, что большие библиотеки рандомизированных вариантов белков можно быстро и эффективно сортировать по тем последовательностям, которые связываются с нацеленным антигеном с высокой аффинностью. Дисплей (визуализация) пептидных и белковых библиотек на фаге используют для скрининга миллионов полипептидов на полипептиды со свойствами специфического связывания. Методы поливалентного фагового дисплея применяют для визуализации малых случайных пептидов и малых белков путём слияния (химеризации) либо с геном III, либо с геном УШ нитевидного фага. ^е11з апб Ьо^тап, Сигг. Орт. 81гисГ ΒΕΙ, 3: 355-3б2 (1992) и цитируемые там ссылки. При моновалентном фаговом дисплее белковую или пептидную библиотеку сливают с геном III или его участком и
- 1б 012835 экспрессируют с низкими уровнями в присутствии белка гена III дикого типа таким образом, что частицы фага визуализуют одну копию или ни одной копии слитых белков. Эффект авидности снижается по сравнению с поливалентным фагом, так что сортинг осуществляется за счёт природной аффинности лиганда, и применяются фагмидные векторы, которые упрощают манипуляции с ДНК. Ьо^тап апб ХУеВк, Мебюбк: А сотрашоп 1о Мебюбк ίη Еп/утоВду, 3: 205-216 (1991).
Фагмида представляет собой плазмидный вектор, содержащий бактериальный ориджин репликации, например, Со1Е1, и копию межгенной области бактериофага. Фагмиду можно использовать на любом бактериофаге, включая нитевидный бактериофаг и лямбдоидный бактериофаг. Плазмида также обычно содержит селективный маркёр устойчивости к антибиотику. Сегменты ДНК, клонированные в эти векторы, можно размножать в виде плазмид. Когда клетки, в которых находятся эти векторы, включают все гены, необходимые для продуцирования фаговых частиц, способ репликации плазмид меняется на репликацию свёртывающегося цикла с образованием копий одной нити плазмидной ДНК и упаковкой фаговых частиц. Фагмида может образовывать инфекционные или неинфекционные фаговые частицы. Этот термин включает фагмиды, которые содержат ген оболочечного белка фага или его фрагмент, связанный с геном гетерологичного полипептида в виде генного слияния, так что гетерологичный полипептид визуализуется на поверхности фаговой частицы.
Термин фаговый вектор означает двухнитевую репликативную форму бактериофага, содержащую гетерологичный ген и способную к репликации. Фаговый вектор содержит ориджин репликации фага, делающий возможной репликацию фага и образование фаговых частиц. Фаг предпочтительно представляет собой нитевидный бактериофаг, такой как фаг М13, £1, £б, Р£3 или производный от них, или лямбдоидный фаг, такой как лямбда, 21, рЫ80, рЫ81, 82, 424, 434 и т.д. или производный от них.
Применяемое в данном описании выражение положение, доступное для растворителя относится к положению аминокислотного остатка в вариабельных областях тяжёлой и лёгкой цепей источника антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которое определяется, исходя из структуры, множества (ансамбля) структур и/или моделированной структуры антитела или антигенсвязывающего фрагмента, как потенциально доступное для подхода молекулы и/или для контакта с молекулой, такой как антиген, специфический в отношении антитела. Эти положения обычно находятся в СОЕ участках и на внешнем участке белка. Доступные для растворителя положения антитела или антигенсвязывающего фрагмента по данному описанию можно определит, используя ряд известных в уровне техники алгоритмов. Предпочтительно, доступные для растворителя положения определяют в координатах по 3-мерной модели антитела, предпочтительно используя компьютерную программу, такую как программа Ιΐ'ϊδίμΙιΙΙΙ (Ассе1гук, 8ап П1едо, СА). Положения, доступные для растворителя, можно также определить, используя известные в технике алгоритмы (например, Ьее апб Еюйатбк, I. Мо1. Вю1. 55, 379 (1971) и Соппо11у, I. Арр1. Сгук!. 16, 548 (1983)). Определение доступных для растворителя положений можно осуществлять, используя программу, пригодную для моделирования белка и информацию о 3-мерной структуре антитела. Программа, которую можно использовать для этих целей, включает программу 8УВУЬ Вюро1утег Моби1е (Тпрок Аккос1а1ек). Обычно и предпочтительно, если алгоритм (программа) требует, чтобы пользователь ввёл параметр размера, размер образца, который используют в расчётах, устанавливают в радиусе около 1.4 ангстрем или менее. Кроме того, методы определения доступных для растворителя областей и площадей с помощью программ для персональных компьютеров, описанных Расюк ((1994) АЕУОМОЬ/СОЫТОиЕ: площади поверхности и объёмы молекул на персональных компьютерах. Сотри!. С1ет. 18(4): 377-386; и (1995). Уапайопк о£ 8ш£асе Агеак апб Уо1итек т ΌίκΙίικΙ Мо1еси1аг §иг£асек о£ Вюто1еси1ек. I. Мо1. Мобе1. 1: 46-53).
Термин лечение относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже имеет нарушение, а также тех, у которых нарушение следует предупредить.
Термин нарушение, расстройство представляет собой любое состояние, на которое лечение с применением антитела оказывает благотворное воздействие. Например, млекопитающие, страдающие от или нуждающиеся в профилактике аномального ангиогенеза (избыточный (интенсивный), неадекватный или неконтролируемый ангиогенез) или сосудистой проницаемости. Нарушение включает хронические и острые нарушения или заболевания, включая патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающего к рассматриваемому нарушению. Неограничивающие примеры нарушений, которые можно лечить по данному описанию, включают злокачественные или доброкачественные опухоли; нелейкемические и лимфоидные злокачественные опухоли; нейронные, глиальные, астроцитные, гипоталамные и другие гландулярные, макрофагальные, эпителиальные, стромальные и бластоцельные нарушения; и воспалительные, ангиогенные и иммуногенные нарушения.
Термин аномальный ангиогенез встречается в случае, если кровеносные сосуды либо растут интенсивно, или недостаточно, или неподходящим образом (например, локализация, время или начало ангиогенеза нежелательно с медицинской точки зрения) в состоянии болезни, либо таким образом, что это вызывает состояние болезни. Интенсивный (избыточный), неадекватный или неконтролируемый ангиогенез имеет место, когда происходит рост новых кровеносных сосудов, который способствует ухудшению болезненного состояния или вызывает болезненное состояние, такое как рак, в особенности васку
- 17 012835 ляризованные солидные опухоли и метастатические опухоли (включая рак толстой кишки, лёгкого (в особенности мелкоклеточный рак лёгкого) или простаты), заболевания, вызванные окулярной неоваскуляризацией, особенно диабетическая слепота, ретинопатии, первичная диабетическая ретинопатия или возрастная дегенерация жёлтого пятна и рубеоз; псориаз, псориатический артрит, гемоангиобластома, такая как гемангиома; воспалительные почечные заболевания, такие как гломерулонефрит, особенно мезангиопролиферативный гломерулонефрит, гемолитико-уремический синдром, диабетическая нефропатия или гипертензивный нефросклероз; различные воспалительные заболевания, такие как артрит, особенно ревматоидный артрит, воспалительное кишечное заболевание, псориаз, саркоидоз, артериальный артериосклероз и заболевания после трансплантации, эндометриоз или хроническая астма и более 70 других состояний. Новые кровеносные сосуды могут питать больные ткани, разрушать нормальные ткани и, в случае рака, новые сосуды могут допустить попадание опухолевых клеток в кровоток и в другие органы (метастазы опухоли). Недостаточный ангиогенез встречается тогда, когда имеет место неадекватный рост кровеносных сосудов, который приводит к ухудшению болезненного состояния, например, при болезнях, таких как заболевание коронарной артерии, удар и замедленное заживление ран. Кроме того, язвы, удары и сердечные приступы могут возникать в результате отсутствия ангиогенеза, который обычно необходим для естественного заживания. Настоящее изобретение рассматривает лечение таких пациентов с повышенным риском заболевания вышеперечисленными болезнями.
Другие пациенты, которые являются кандидатами на получение антител или пептидов по данному изобретению, являются пациентами с повышенным риском развития, аномальной пролиферации фиброваскулярной ткани, розовых угрей, синдрома приобретённого иммунодефицита, артериальной окклюзии, атопического кератита, болезни Бехчета, кровяных опухолей, обструктивного заболевания сонной артерии, хороидальной неоваскуляризации, хронического воспаления, хронической почечной недостаточности, хронического увеита, хронический витрит, усталости от ношения контактных линз, отторжения трансплантата роговицы, корнеальной васкуляризации, неоваскуляризации трансплантата роговицы, болезни Крона, болезни Илза, эпидемического кератоконъюнктивита, грибковых язв, герпесных инфекций, инфекций опоясывающего лишая, синдромов гипервязкости, саркомы Капоши, лейкемии, липидной дегенерации, болезни Лайма, краевого кератоза, язва Мурена, микобактериальных инфекций, отличных от проказы, миопии, глазной неоваскулярной болезни, ямок в диске зрительного нерва (оптических ямок), синдрома Ослера-Вебера (Ослера-Вебера-Рандю), остеоартрита, болезни Педжета, рагк ρΐαηίΐίδ. пемфигоида, филектенулёза, осложнений после облучения лазером, полиартериита, протозойных инфекций, эластомы, р1етудшш кетаШЦ ысса, радиальной кератотомии, ретинальной неоваскуляризации, ретинопатии недоношенных, ретролентальной фиброплазии, саркоида, склерита, серповидноклетчатой анемии, синдрома Сегрена, солидных опухолей, болезни Старгартса (81агдай8), болезни Стивена-Джонсона, кератит верхних конечностей, краевой дегенерации Терриена, токсоплазмоза, травмы, опухолей саркомы Юинга, опухолей нейробластомы, опухолей остеосаркомы, опухолей ретинобластомы, опухолей рабдомиосаркомы, язвенного колита, закупорки вен, дефицита витамина А и саркоидоза Вегенера, нежелательного ангионеза, связанного с диабетом, паразитарными болезнями, аномального заживления ран, послеоперационной гипертрофии, поражения или травмы, подавления роста волос, ингибирования овуляции и образования жёлтого тела, ингибирования имплантации и ингибирования развития эмбриона в матке.
Антиангиогенная терапия применима при обычном лечении отторжения трансплантата, воспаления лёгких, нефротического синдрома, преэклампсии, экссудативного перикардита, такого, который связан с перикардитом, плеврального выпота, заболеваний и нарушений, характеризующихся нежелательной сосудистой проницаемостью, например, отёка, обусловленного опухолями мозга, злокачественных асцитов, синдрома Мейгса, воспаления лёгких, нефротического синдрома, экссудативного перикардита, плеврального выпота, проницаемостью, связанной с сердечно-сосудистыми заболеваниями, такими как состояние после инфаркта миокарда и удара и т.п.
Другие зависящие от ангиогенеза заболевания по данному изобретению включают ангиофиброму (аномальная кровь в сосудах, предрасположенных к кровотечению), неоваскулярную глаукому (рост кровеносных сосудов глаза), артериовенозные мальформации (аномальное сообщение между артериями и венами), не срастающиеся переломы (переломы, которые не заживают), артериосклерозные бляшки (отвердение артерий), пиогенную гранулёму (общее кожное поражение, состоящее из кровеносных сосудов), склеродермию (форму соединительнотканой болезни), гемангиому (опухоль, состоящая из кровеносных сосудов), трахому (основная причина слепоты в странах третьего мира), гемартроза, спаек сосудов и гипертрофических рубцов (образование аномальных рубцов).
Термин УЕОБ или 11УЕСЕ по данному описанию относится к содержащему 165 аминокислот человеческому сосудисто-эндотелиальному фактору роста и родственным содержащим 121, 189 и 206 аминокислот человеческим сосудисто-эндотелиальным факторам роста, описанным Ьеипд е! а1. 8с1епсе, 246: 1306 (1989), и Ноиск е! а1. Мо1. Епбостш., 5: 1806 (1991),наряду с их природными аллельными и процессированными формами. Термин УЕОЕ также относится к факторам УЕОЕ нечеловеческого вида, такого как мышь, крыса или примат. Иногда УЕОЕ конкретного вида указан терминами, такими как 11УЕСЕ для человеческого УЕОЕ, шУЕОЕ для мышиного УЕОЕ и т.д. Термин УЕОЕ также использует
- 18 012835 ся в отношении усечённых (процессированных) форм полипептида, содержащих аминокислоты 8-109 или 1-109 из содержащего 165 аминокислот человеческого сосудисто-эндотелиального фактора роста. Ссылка на любую из этих форм УЕСЕ может быть в данном изобретении, например, как УЕСЕ (8-109), УЕСЕ (1-109) или УЕСЕ165. Положения аминокислот для усечённого нативного УЕСЕ имеют нумерацию, указанную в последовательности нативного УЕСЕ. Например, аминокислотное положение 17 (метионин) в усечённом нативном УЕСЕ также является положением 17 (метионин) в нативном УЕСЕ. Усечённый нативный УЕСЕ имеет аффинность связывания с КОК и Е11-1 рецепторами, сравнимую с аффинностью связывания нативного УЕСЕ.
Термин вариант УЕСЕ по данному описанию относится к полипептиду УЕСЕ, который включает одну или более аминокислотных мутаций в нативной последовательности УЕСЕ. Возможно, одна или более аминокислотных мутаций включают аминокислотную (ые) замену(ы). Для более краткого обозначения УЕСЕ вариантов по данному описанию следует заметить, что номера относятся к аминокислотному положению по всей аминокислотной последовательности предполагаемого нативного УЕСЕ (предоставленного в Ьеипд е! а1., см выше, и Ноиск е! а1., см. выше).
Термины рак и раковый относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется неконтролируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкемию. Более конкретные примеры этих типов рака включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак лёгкого, немелкоклеточный рак лёгкого, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, цервикальный рак, рак яичника, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой (ободочной) кишки, колоректальный рак, эндометриальный рак, рак слюнных желёз, рак почки, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак печени и различные типы рака головы и шеи. Млекопитающее для целей лечения относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, нечеловеческих приматов, и животных в зоопарках, спортивных животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д.
Термин противоопухолевая композиция относится к композиции, применимой при лечении рака, содержащей, по меньшей мере, один активный терапевтический агент, например, противораковый агент. Примеры терапевтических агентов (противораковых агентов) включают, но без ограничения, химиотерапевтические агенты, ингибиторы роста, цитотоксические агенты, агенты, применяемые в лучевой терапии, антиангиогенные агенты, апоптотические агенты, антитубулиновые агенты и другие агенты для лечения рака, такие как анти-НЕК-2 антитела, анти-СО20 антитела, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (ЕСЕК) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор НЕК1/ЕСЕК (например, эрлотиниб (Татсеуа™), ингибиторы тромбоцитарного фактора роста (например, С1ееуес™ (иматиниба мезилат)), ингибитор СОХ-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связываются с одной или более следующих мишеней: ЕтЬВ2, ЕтЬВЗ, ЕтЬВ4, РЭСЕК-бета, В1у§, ЛРК1Ь, ВСМА или УЕСЕ рецептор(ы), ТКЛ1Ь/Лро2, и другие биоактивные и органические агенты, и т.д. Изобретение также включает их комбинации.
Термин меченный эпитопом по данному описанию относится к мутантному антителу, слитому с эпитопной меткой. У полипептида эпитопной метки достаточно остатков для того, чтобы создать эпитоп, против которого может быть создано антитело, но этот полипептид достаточно короток для того, чтобы препятствовать активности мутантного антитела. Эпитопная метка предпочтительно также совершенно уникальна, поэтому антитело против него практически не реагирует перекрёстно с другими эпитопами. Подходящий полипептидный хвост в общем содержит по меньшей мере 6 аминокислотных остатков, и обычно около 8-50 аминокислотных остатков (предпочтительно примерно 9-30 остатков). Примеры включают Е1и НА хвостовой полипептид и антитело к нему 12СА5 (Е1е1б е! а1. Мо1. Се11. Вю1. 8: 2159-2165 (1988)); метку с-тус и антитела против неё 8Е9, 3С7, 6Е10, П4, В7 и 9Е10 (Еуап е! а1. Мо1. Се11. Вю1. 5(12): 3610-3616 (1985); и гликопротеиновый Ό (§Ό) хвост и антитело к нему (РаЬогаку е! а1., Рто1еш Епдтееттд 3(6): 547-553)). В некоторых вариантах изобретения эпитопная метка представляет собой эпитоп связывания с рецептором-мусорщиком.
Термин цитотоксический агент по данному описанию относится к веществу, которое ингибирует или предупреждает функцию клеток и/или вызывает нарушение клетки. Предполагается, что термин включает радиоактивные изотопы (например, I131, I125, Υ90 и Ке186), химиотерапевтические агенты и токсины, такие как ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты.
Химиотерапевтический агент представляет собой химическое соединение, применимое для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и СΥТΟXАN® циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа и карбоквон, метуредопа (теШтебора) и уредопа (игебора); этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (в особенности буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетиче- 19 012835 ские аналоги адоцелезин (або/е1ехт), карцелезин и бицелезин); криптофицины (в частности криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги К\У-289 и СВ-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотный мустин, такой как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, этрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мехлоретамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новембицин, фенестрин, преднимустин, трофосфамид, урацил-мустард; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гамма 11 и калихеамицин омега 11 (см., например, Адпете, СНет 1п!1. Еб. Епд1., 33; 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсдерамицин; а также неокарциностатин хромофор и родственные антибиотические хромофоры хромопротеина энедиина), аклациномизины, актиномицины, отрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-норлейцин, АПВ1АМ1СШ® доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофенольную кислоту, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин (/тох!а!т), зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5 флуорацил (5-ЕИ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналины, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан, компенсатор (пополнитель) фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатрексат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; эльфорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лониданин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидамнол; нитраерин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2этилгидразид; прокарбазин; РЗК® комплекс полисахаридов (ШЗ №11ига1 Ргобис!х, Еидепе, ОВ); разоксан; ризоксин; сизофиран, спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно Т-2 токсин, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ага-С); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, ТАХОЬ® паклитаксел (Впх!о1-Муегх 3с.|шЬЬ Опсо1о§у, Ргтсе!оп, Ν.Ι), АВВАXАNΕ™ не содержащий кремофора препарат паклитаксела с наночастицами альбумина (Атепсап Рйагтасеибса1 Райпегх, ЗсйаитЬегд, Шток), и ТАХОТЕВЕ® доксетаксел (ВНопе-Рои1епс Вогег, Ап!опу, Егапсе); хлорамбуцил; СЕМХАВ® гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; платиновые аналоги, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (УР-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; NЛУΕ^ВINΕ® винорелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (Сатр!охаг, СРТ-11) (включая схему лечения иринотеканом с 5-ЕИ и леуковорином); ингибитор топоизомеразы ВЕЗ 2000; дифторметилорнитин (ЭМЕО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; комбретастатин; леуковорин (ЬУ); оксалиплатин, включая схему лечения с оксалиплатином (ЕОЬЕОХ); ингибиторы РКС-альфа, ВаГ, Н-Вах, ЕСЕВ (например, эрлотиниб (Тагсеуа™)) и УЕСЕ-А, которые снижают пролиферацию клеток, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных агентов.
Также данное определение охватывает антигормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормонов, такие как селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (ЗЕВМ), включая, например, тамоксифен (включая NО^УА^ΕX® тамоксифен), ралоксифен, дролоксифен, 4гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, ЬУ117018, онапристон и ЕАВΕ3ТОN торемифен; ингибиторы ароматазы, которые регулируют продуцирование эстрогена в надпочечниках, например, такие как 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, МЕСАЗЕ® мегестрола ацетат, ЛВОМАЗШ® эксеместан, форместан, фадрозол, В1У13ОВ® ворозол, ЕЕМАВА® летрозол и АВ1МГОЕХ® анастрозол; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, леупролид и гозелерин; а также троксацитабин (1,3-диоксолановый нуклеозид, аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, те, которые ингибируют экспрессию генов, при которой пути передачи сигнала связаны с аберрантной пролиферацией клеток, например, такие как РКС-альфа, ВаГ и Н-Вах; рибозимы, такие как ингибиторы экспрессии УЕСЕ (например, ЛNСIОΖΥМΕ® рибозим) и ингибитор экспрессии НЕВ2; вакцины, такие как генно-терапевтические вакцины, такие как, например, вакцина АЬЬОУЕСТШ®, вакцина ЬЕИУЕСТШ®, и вакцина УАХТО®; РВОЕЕЕК1Х® г1Ь-2; ингибитор ^υВТОТΕСЛN® топоизомеразы 1; АВАВЕЫХ® гтВН; винорелбин и эсперамицины (см. патент США 4675187), и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных агентов.
Термин пролекарство, применяемый в данном изобретении, относится к предшественнику или производному фармацевтически активного вещества, которое менее токсично в отношении опухолевых
- 20 012835 клеток по сравнению с исходным лекарственным веществом и способно ферментативно активироваться или превращаться в более активную исходную форму. См., например, ХУПтап. Ргобгцдк ш Сапсег С11етоШегару Вюсйетюа1 8ос1е1у Тгапкас!юпк, 14, рр. 375-382, 6151Н Меейпд Ве1Гак1 (1986) и 8!е11а е! а1., Ргобгцдк: А С11етюа1 Арргоасй !о Тагде!еб Эгид Эекуегу, Э1гес1еб Эгид Эекуегу, Вогскагб! е! а1., (еб.), рр. 247-267, Нитапа Ргекк (1985). Пролекарства по данному изобретению включают, но без ограничения, фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, пролекарства, модифицированные с помощью Ό-аминокислот, гликозилированные пролекарства, β-лактамсодержащие пролекарства, необязательно замещённые феноксиацетамидсодержащие пролекарства или необязательно замещённые фенилацетамидсодержащие пролекарства, 5-флуороцитозиновые и другие 5-флуороуридиновые пролекарства, которые можно превратить в более активное цитотоксическое лекарственное вещество. Примеры цитотоксических лекарственных веществ, которые могут быть дериватизированы в форму пролекарства по данному изобретению, включают, но без ограничения, описанные выше химиотерапевтические агенты.
Для лечения ревматоидного артрита пациента можно лечить антителом по изобретению в сочетании с любым из нижеприведённых лекарств: ОМАКОМ (модифицирующие болезнь противоревматические препараты (например, метотрексат), Ν8ΛΙ или ΝΞΛΙΩ (нестероидные противовоспалительные препараты или средства, НСПВП или НСПВС), НИМ1КА™ (адалимубаб; АЬЬой ЬаЬога!опек), АКАУА® (лефлюномид), КЕМ1САОЕ® (инфликсимаб; Сеп!осог 1пс., оГ Ма1уегп, Ра), Е№КЕЬ™ (этанерцепт; 1ттипех, УА), ингибиторы СОХ-2. Препаратами ЭМАКО, обычно применяемыми при КА, являются гидроксихлорокин, сульфасалазин, метотрексат, лефлюномид, этанерцепт, инфликсимаб, азатиоприн, Όпеницилламин, золото (перорально), золото (внутримышечно), миноциклин, циклоспорин, иммуноадсорбция с использованием белка А стафилококка. Адалимубаб представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое связывается с ΤΝΡα. Инфликсимаб является химерным моноклональным антителом, которое связывается с ΤΝΡα. Этанерцепт представляет собой слитый белок иммуноадгезин, состоящий из внеклеточного лигандсвязывающего участка человеческого рецептора фактора некроза опухолей (Т№К) протяжённостью 75 кДа (р75), связанного с Ес областью человеческого 1дС1. Об общепринятых способах лечения КА см., например, Сшбейпек Гог 111е тападетеп! оГ гйеита!о1б агШпйк АгШпйк & Кйеитайкт 46(2): 328-346 (ЕеЬгиагу, 2002). В конкретном варианте изобретения пациента с КА лечат с применением антитела СЭ20 по изобретению в сочетании с метотрексатом (МТХ). Типичная доза МТХ составляет около 7.5-25 мг/кг/неделя. МТХ можно вводить перорально или подкожно.
При анкилозирующем спондилоартрите и болезни Крона пациента можно лечить антителом по изобретению в сочетании, например, с Кетюабе® (инфликсимаб; от Сеп!осог 1пс., оГ Ма1уегп, Ра.), ЕNВКЕ^ (этанерцепт; 1ттипех, УА).
Для лечения 8ЬЕ пациенту можно давать антитело по изобретению в сочетании, например, с высокой дозой кортикостероидов и/или циклофосфамида (НЭСС).
Для лечения псориаза пациенту можно вводить антитело по изобретению в сочетании с препаратами местного действия, такими как стероиды местного действия, антралин, кальципотриен, клобетазол и тазаротен, или с метотрексатом, ретиноидами, циклоспорином, РИУА и ИУВ. В одном варианте изобретения больного псориазом лечат антителом с последовательным или одновременным введением циклоспорина.
Выделенная нуклеотидная молекула представляет собой нуклеотидную молекулу, которую идентифицируют и отделяют, по меньшей мере, от одной загрязняющей нуклеотидной молекулы, с которой она обычно ассоциируется в природном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная нуклеотидная молекула находится в иной форме или в ином окружении, нежели в природе. Выделенные нуклеотидные молекулы отличаются от нуклеотидной молекулы, существующей в природных клетках. Однако выделенная нуклеотидная молекула включает нуклеотидную молекулу, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют антитело, где, например, нуклеотидная молекула находится в хромосоме в положении, отличном от её положения в природных клетках.
Выражение регуляторные последовательности относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Контролирующие последовательности, применимые для прокариот, например, включают промотор, возможно оператор, и сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота функционально связана, когда она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК для препоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде пребелка, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он позиционирован таким образом, чтобы облегчить трансляцию. Вообще функционально связанный означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются непрерывными и, в случае секреторного лидера, непре
- 21 012835 рывными и в фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть непрерывными. Связывание выполняется лигированием в соответствующих сайтах рестрикции. Если таких сайтов нет, то, в соответствии с обычной практикой, используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.
Применяемые в данном описании выражения клетка, линия клеток, клеточная линия и культура клеток (клеточная культура) применяются взаимозаменяемо (поочерёдно) и все эти выражения включают потомство. Так, слова трансформант и трансформированная клетка включают клетки и культуры первичного субъекта, полученные при его использовании вне зависимости от числа пассажей. Понятно также, что все потомки могут не быть полностью идентичными по составу ДНК вследствие умышленных или случайных мутаций. Охватывается мутантное потомство, имеющее ту же самую функцию или биологическую активность, которая найдена в первоначально трансформированной клетке. Из контекста будет ясно, где предполагаются определённые обозначения.
ΙΙ. Способы осуществления изобретения.
Синтетические высокоаффинные антитела против УЕ0Е.
Изобретение по данному описанию охватывает новые анти-УЕ0Е антитела с высокой аффинностью связывания с УЕ0Е. Типичные способы получения антител более подробно описаны в следующих разделах.
Новые антитела против УЕ0Е выбирают, используя антиген УЕ0Е млекопитающего первого вида. Предпочтительно антигеном является человеческий УЕ0Е (ЙУЕ0Е). Однако в качестве первого нацеленного антигена могут применяться УЕ0Е других видов, такие как мышиный УЕ0Е (тУЕ0Е). УЕ0Е антигены млекопитающих различных видов можно выделять из природных источников. В других вариантах изобретения антиген получают методом рекомбинантной ДНК или другими известными в уровне техники методами.
Выбранное антитело обычно имеет достаточно сильную аффинность к первому УЕ0Е антигену. Например, антитело может связывать 11УЕ0Е с величиной Кб не более примерно 5 нМ, предпочтительно не более примерно 2 нМ и более предпочтительно не выше примерно 500 пМ. Аффинности антител можно определить, например, методом поверхностно-плазмонного резонанса (такого как анализ ЫАсоге, описанный в примерах); твердофазным иммуносорбентным анализом (ЕЫ3А); конкурентными анализами (например, ША, РИА).
Также антитело можно анализировать другими методами анализа биологической активности, например, чтобы оценить его эффективность в качестве терапевтического средства. Такие анализы известны в уровне техники и зависят от нацеленного антигена и предполагаемого применения антитела. Примеры включают анализ ингибирования НИУЕС (описанный ниже, в примерах); анализы ингибирования фактора некроза опухолевых клеток (описанные, например, в \У0 89/06692); анализы антителозависимой клеточной цитотоксичности (ЛИСС) и комплементзависимой клеточной цитотоксичности (СИС) (патент США 5500362); и анализ агонистической активности или гемопоэз (см. \У0 95/27062).
Для скрининга антител, которые связываются с конкретным эпитопом на представляющем интерес антигене, можно проводить обычный анализ кросс-блокирования, такой, который описан в ЛпйЬоб1е8, А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1б 3рппд НагЬог ЬаЬога1огу, Еб Наг1о\\' апб Иау1б Ьапе (1988). Или же для того, чтобы определить, связывается ли антитело с интересующим нас эпитопом, можно осуществлять эпитопное картирование, например, описанное в Сйатре е1 а1., 1. Бю1. Сйет. 270: 1388-1394 (1995).
Затем определяют видоспецифичности новых антител. Аффинность связывания антитела с гомологом антигена, применяемую для того, чтобы выбрать антитело (если гомолог из млекопитающего второго вида), оценивают такими методами, как описанные выше. В предпочтительных вариантах изобретения млекопитающее второго вида является нечеловеческим млекопитающим, которому антитело вводят в преклинических исследованиях. Соответственно, млекопитающее второго вида может быть нечеловеческим приматом, таким как макака-резус, макака циномолгус, бабуин, шимпанзе и макака. В другом варианте изобретения млекопитающим второго вида может быть, например, грызун (например, мышь или крыса), кошка или собака.
Хотя предпочтительным методом определения по данному изобретению видозависимости (и оценки мутантных антител с улучшенными свойствами; см. ниже) является количественный расчёт аффинности связывания антитела, в других вариантах изобретения вместо определения аффинности связывания, или в дополнение к определению аффинности связывания, оцениваются одно или более биологических свойств синтетического антитела и вариантных антител. Примеры таких биологических анализов даны выше. Такие анализы в особенности применимы там, где они предоставляют данные, относящиеся к терапевтической эффективности антитела. Обычно, хотя не обязательно, антитела, которые проявляют улучшенные свойства в таких анализах, обладают также повышенной аффинностью связывания. Так, в одном варианте изобретения, в котором избранным анализом является анализ биологической активности, иной, нежели аффинность связывания, видозависимое антитело обычно использует имеющий биологическую активность материал (например, антиген, клетку, ткань, орган или целое животное) млекопитающего второго вида, которая по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере в 500 раз, или по меньшей мере примерно в 1000 раз менее эффективна, чем его (видеоспецифического антитела) био
- 22 012835 логическая активность в соответствующем анализе с применением реагентов, полученных из млекопитающего первого вида.
Видозависимое антитело затем изменяют таким образом, чтобы получить мутантное антитело, имеющее более сильную аффинность связывания с антигеном млекопитающего второго вида, чем видозависимое антитело. Мутантное антитело предпочтительно имеет аффинность связывания с антигеном от нечеловеческого млекопитающего, которое по меньшей мере примерно в 10 раз сильнее, предпочтительно по меньшей мере примерно в 20 раз сильнее, более предпочтительно по меньшей мере примерно в 50 раз сильнее и иногда по меньшей мере примерно в 100 раз или в 200 раз сильнее, чем аффинность связывания видозависимого антитела с антигеном. Повышение аффинности антитела, желательное или требуемое, зависит от начальной аффинности связывания видозависимого антитела. Если используемый анализ является анализом биологической активности, мутантное антитело предпочтительно имеет биологическую активность в выбранном методе анализа, которая по меньшей мере примерно в 10 раз лучше, предпочтительно по меньшей мере примерно в 20 раз лучше, более предпочтительно по меньшей мере примерно в 50 раз лучше и иногда по меньшей мере примерно в 100 раз или в 200 раз лучше, чем биологическая активность видозависимого антитела в этом анализе.
Для получения мутантного антитела одно или более изменений (например, замен) вводятся в одну или более гипервариабельных областей видоспецифического антитела. Или же, или помимо этого, одно или более изменений (например, замен) остатков каркасной области можно ввести в видозависимое антитело, если они приведут к улучшению аффинности связывания мутантных антител с антигеном млекопитающего второго вида. Примеры остатков для модификации каркасной области включают такие остатки, которые прямо связываются с антигеном нековалентным связыванием (Ат1! е! а1. 8с1еисе 233: 747753 (1986)); взаимодействуют с/влияют на конформацию СОК (С'боЙиа е! а1. б. Мо1. Вю1. 196: 901-917 (1987)); и/или принимают участие в У|-Уц интерфейсе (находятся на границе раздела) (ЕР 239400В1). В некоторых вариантах изобретения модификация одного или более таких остатков каркасной области приводит к повышению аффинности связывания антитела с антигеном млекопитающего второго вида. Например, в данном варианте изобретения можно изменить примерно от одного до пяти остатков каркасной области. Иногда этого может быть достаточно для того, чтобы получить мутантное антитело, пригодное для применения в преклинических испытаниях, даже если в нём не изменён ни один из остатков гипервариабельной области. Однако обычно мутантное антитело содержит дополнительное(ые) изменение(ия) в гипервариабельной области.
Остатки в гипервариабельной области, которые изменяются, можно изменять случайно (рандомизированно), особенно если исходная аффинность связывания видозависимого антитела с антигеном от млекопитающего второго вида такова, что такие рандомизированно продуцированные антитела можно легко подвергнуть скринингу.
Один полезный метод получения таких мутантных антител называется аланиновый сканирующий мутагенез (Сиппипдйат апб ^е11к 8с1еисе 244: 1081-1085 (1989)). В этом случае один или более остатков гипервариабельной области заменяют на аланиновый(е) или полиаланиновый(е) остаток (остатки) для того, чтобы повлиять на взаимодействие аминокислот с антигеном млекопитающего второго вида. Этот(эти) остаток(остатки) гипервариабельной области, проявляющий(ие) функциональную восприимчивость к заменам, затем уточняют, вводя дополнительные или другие мутации в сайты замен или вместо сайтов замен. Таким образом, хотя сайт для введения варианта аминокислотной последовательности задан, сама по себе природа (характер) мутации не обязательно должен быть предопределён. Полученные таким образом а1а-мутанты подвергают скринингу на их биологическую активность по данному описанию.
Другой метод получения таких мутантных антител включает созревание аффинности с применением фагового дисплея (На^ктк, е! а1., б. Мо1. Вю1. 254: 889-896 (1992) и Ьо^тап е! а1. ВюсйетШгу 30(45): 10832-10837 (19911)). Короче говоря, несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) подвергают мутациям с целью получить все возможные замены в каждом сайте. Мутантные антитела, полученные таким образом, визуализуют моновалентное антитело при использовании фаговых частиц нитевидных фагов в виде слияний с генным III продуктом М13, упакованных внутри каждой частицы. Мутанты, полученные методом фагового дисплея, затем подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания), раскрываемому в данном описании.
Данное изобретение также включает более систематический метод идентификации аминокислотных остатков для модификации. Согласно данному методу идентифицируют остатки гипервариабельной области видозависимого антитела, которые участвуют в связывании с антигеном млекопитающего первого вида и эти остатки гипервариабельной области включают в связывание гомолога этого антигена от млекопитающего второго вида. Для того чтобы это осуществить, проводят аланиновый сканирующий мутагенез остатков гипервариабельной области видозависимого антитела, причём каждый а1а-мутант проверяется на связывание с антигеном млекопитающего первого и второго вида. Или же в полученных методом РСА кристаллических структурах комплексов антитело-антиген анализируют контактирующие остатки, а также остатки окружения (как описано в Примерах). Тем самым идентифицируются остатки гипервариабельной области, участвующие в связывании антигена млекопитающего первого вида (на
- 23 012835 пример, человека), и остатки гипервариабельной области, участвующие в связывании гомолога антигена от млекопитающего второго вида (например, нечеловеческого млекопитающего). Предпочтительно такой(ие) остаток(ки) гипервариабельной области, которые принимают заметное участие в связывании антигена млекопитающего второго вида (например, нечеловеческого млекопитающего), но не антигена млекопитающего первого вида (например, человека), выбирают в качестве кандидатов для модификации. В другом варианте такой(ие) остаток(ки) гипервариабельной области, которые принимают заметное участие в связывании антигена как млекопитающего второго вида, так и млекопитающего первого вида, выбирают в качестве возможных модифицируемых остатков (см. далее пример). Ещё в одном дополнительном, но менее предпочтительном варианте изобретения такие остатки, участвующие в связывании антигена млекопитающего первого вида, но не млекопитающего второго вида, выбирают для модификации. Такая модификация может включать делецию остатка или инсерцию одного или более остатков, прилегающих к этому остатку. Однако обычно модификация включает замену остатка на другую аминокислоту.
Обычно начинают с консервативной замены, такой как приведённая ниже под заголовком предпочтительные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности (например, аффинности связывания), тогда вводят более значительные изменения, в представленной ниже таблице обозначенные как типичные замены, или замены, подробнее описанные ниже в ссылке на классы аминокислот, и продукт подвергают скринингу.
Предпочтительные замены
Исходный остаток Типичные замены Предпочтительные замены
Пе(1) норлейцин
Ьеи (Ь) норлейцин
Уа1 (V) норлейцин
Ещё более значительные модификации биологических свойств антител осуществляют, выбирая замены, которые значительно отличаются по своему действию на сохранение (а) структуры полипептидного остова в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (б) заряда или гидрофобности молекулы в нацеленном сайте или (в) размера боковой цепи. Природные остатки делятся на группы на основе свойств боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, те!, а1а, уа1, 1еи, 11е;
(2) нейтральные гидрофильные: суз, зег, 111Г азп, д1п;
(3) кислые: азр, д1и;
(4) основные: Н1з, 1уз, агд;
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: д1у, рго; и (6) ароматические: !гр, 1уг, рНе.
Неконсервативные замены влекут за собой обмен члена одного из этих классов на другой класс.
В другом варианте изобретения сайты, выбранные для модификации, представляют собой сайты, в которых с применением фагового дисплея (см. выше) осуществляется созревание аффинности.
Нуклеотидные молекулы, кодирующие мутантные аминокислотные последовательности, получают различными методами, известными в технике. Эти методы включают, но без ограничения, опосредованный олигонуклеотидами (или сайт-направленный) мутагенез, ПЦР мутагенез и кассетный мутагенез ранее полученного мутантного или немутантного варианта видозависимого антитела. Предпочтительным методом получения мутантов является сайт-направленный мутагенез (см., например, Кипке1, Ргос. Асаб. 8с1. И8А 82: 488 (1985)).
В некоторых вариантах изобретения мутантное антитело содержит только единичный заменённый остаток в гипервариабельной области. В других вариантах изобретения заменено два или более остатков в гипервариабельной области видозависимого антитела, например примерно произведено от двух до десяти замен в гипервариабельной области. Например, муринизированный вариант антитела против УЕСР из представленного ниже примера содержит четыре замены в гипервариабельной области.
Обычно мутантное антитело с улучшенными биологическими свойствами имеет аминокислотную последовательность, по меньшей степени на 75% идентичную или аналогичную (сходную) аминокислотной последовательности вариабельного домена либо тяжёлой, либо лёгкой цепи видозависимого антитела, более предпочтительно по меньшей степени на 80%, более предпочтительно по меньшей степени на 85%, более предпочтительно по меньшей степени на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей степени на 95%. Идентичность или сходство в отношении данной последовательности определяется в данном описании как процентное содержание аминокислотных остатков в кандидатной (предполагаемой) последовательности, которые идентичны (т.е. тот же самый остаток) остаткам видозависимого антитела или сходны (т.е. аминокислотный остаток является остатков из той же самой группы на основе общих свойств боковой цепи, см. выше) с остатками видозависимого антитела, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, для достижения максимальной идентичности последовательностей в про
- 24 012835 центах. Подразумевается, что ни одно из Ν-концевых, С-концевых или внутренних расширений, ни одна из делеций или инсерций в последовательность антитела вне вариабельного домена не влияют на идентичность или сходство последовательностей.
После получения мутантного антитела определяют биологическую активность этой молекулы по сравнению с видозависимым антителом. Как отмечается выше, это может включать определение аффинности и/или другой биологической активности антитела. В предпочтительном варианте изобретения готовят панель мутантных антител как указано выше и подвергают скринингу на аффинность связывания с антигеном млекопитающего второго вида. Одно или более мутантных антител, выбранных в результате этого первоначального скрининга, необязательно проверяют с помощью одного или более дополнительных методов анализа на биологическую активность для подтверждения того, что мутантное(ые) антитело(а) с повышенной аффинностью связывания действительно применимы, например, в преклинических исследованиях. В предпочтительных вариантах изобретения мутантное антитело сохраняет способность связываться с антигеном млекопитающего первого вида с аффинностью связывания, аналогичной аффинности связывания с видозависимым антителом. Этого можно достичь, избегая того, чтобы изменялись остатки гипервариабельной области, участвующие в связывании антигена млекопитающего первого вида. В других вариантах изобретения мутантное антитело может иметь заметно изменённую аффинность связывания с антигеном млекопитающего первого вида (например, аффинность связывания с этим антигеном предпочтительно лучше, но может быть хуже, чем у видозависимого антитела).
Выбранное(ые) таким образом мутантное(ые) антитело(а) можно подвергать дальнейшим модификациям, часто зависящим от предполагаемого применения антитела. Такие модификации могут включать дальнейшее изменение аминокислотной последовательности, слияние с гетерологическим(и) полипептидом(ами) и/или ковалентные модификации, такие как модификации, представленные выше. Что касается изменений аминокислотных последовательностей, типичные модификации представлены выше. Например, любой цистеиновый остаток, не включённый в сохранение надлежащей конформации мутантного антитела, также может быть заменён, обычно на серин, для повышения устойчивости к окислению молекулы и предупреждения аберрантного перекрёстного связывания. Напротив, цистеиновую(ые) связь(и) можно добавлять к антителу для повышения его устойчивости (в особенности если антитело является фрагментом антитела, таким как фрагмент Εν). Другой тип аминокислотного мутанта имеет изменённый паттерн гликозилирования. Этого можно достичь делецией одного или более углеводных фрагментов, которые присутствуют в антителе, и/или добавлением одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в антителе. Гликозилирование антител обычно является либо Ν-, либо Огликозилированием. Ν-гликозилирование обычно относится к связыванию углеводного фрагмента с боковой цепью аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X обозначает любую аминокислоту, кроме пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной частицы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой их этих трипептидных последовательностей в полипептиде создаёт потенциальный сайт гликозилирования. О-гликозилирование относится к связыванию одного из сахаров Νацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы с гидроксиламинокислотой, обычно серином или треонином, хотя также можно использовать 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Введение сайтов гликозилирования в антитело удобно выполнять, изменяя аминокислотную последовательность таким образом, чтобы она содержала одну из вышеприведённых трипептидных последовательностей (для Ν-связанных сайтов гликозилирования). Изменение можно также сделать путём добавления или замены с помощью одного или более сериновых или треониновых остатков к или в последовательности первоначального антитела (для О-связанных сайтов гликозилирования).
Методы получения антител, которые могут быть видозависимыми и, следовательно, требуют модификации по представленным в данном описании способам, следующие.
А. Получение высокоаффинных антител против УЕОЕ из синтетической фаговой библиотеки антител.
Изобретение также включает способ получения и селекции новых высокоаффинных анти-УЕОЕ антител уникальным методом фагового дисплея. Метод включает получение синтетических фаговых библиотек антител на единичной каркасной матрице, дизайн достаточного разнообразия в вариабельных доменах, визуализация полипептидов с разнообразными (диверсифицированными) вариабельными доменами, селекцию кандидатных антител с высокой аффинностью к нацеленному УЕОЕ антигену и выделение отобранных антител.
Подробности методов фагового дисплея можно найти, например, в предварительной заявке США 60/385338 (поданной 3 июня 2002 г.) и родственных заявках, полное содержание которых специально вводится в данное описание в качестве ссылки.
В одном аспекте библиотеки антител, используемые в данном изобретении, можно создавать мутацией доступных для растворителя и/или высокодиверсных (с высоким разнообразием) положений по меньшей мере в одной СЭЯ области вариабельного домена антитела. Некоторые из или все СЭЯ могут быть мутантными, полученными методами по данному описанию. В некоторых вариантах изобретения предпочтительно получать библиотеки разнообразных антител с помощью мутаций положений в СЭЯ
- 25 012835
Н1, С0В-Н2 и СЭ2-Н3 с образованием отдельной библиотеки, или с помощью мутаций положений в СИВ-Ь3 и СЭ2-Н3 с образованием отдельной библиотеки, или с помощью мутаций положений в СОКЕ-3 и СИВ-НЕ СИВ-Н2 и СИВ-Н3 с образованием отдельной библиотеки.
Библиотеку вариабельных доменов антитела можно создать, например, с мутациями в доступных для растворителя и/или высокодиверсных (с высоким разнообразием) положений в СИВ-Н1, СИВ-Н2 и СИВ-Н3. Другую библиотеку можно создать с мутациями в СИВ-Ь1, СОВ-Б2 и СОВ-Б3. Эти библиотеки можно также использовать в сочетании друг с другом для создания связующих нужной аффинности. Например, после одного или более раундов селекции библиотек (вариабельных доменов) тяжёлых цепей для связывания с нацеленным антигеном, библиотеку лёгких цепей можно поместить в популяцию связующих тяжёлой цепи для следующих раундов селекции с целью увеличения аффинности связующих.
Предпочтительно, библиотеку создают заменой первоначальных аминокислот вариантными аминокислотами в СИВ-Н3 области вариабельного домена последовательности тяжёлой цепи. Полученная библиотека может содержать множество последовательностей антитела, в которой разнообразие (множественность) последовательностей находится главным образом в СИВ-Н3 области последовательности тяжёлой цепи.
В одном аспекте библиотеку создают в контексте (окружении) последовательности гуманизированного антитела 4И5, или каркасной аминокислотной последовательности гуманизированного антитела 405. Предпочтительно, библиотеку создают заменой, по меньшей мере, остатков 95-100а тяжёлой цепи на аминокислоты, кодируемые набором кодонов ИУК, где набор кодонов ИУК используют для кодирования набора вариантных аминокислот для любого из этих положений. Пример набора олигонуклеотидов, применимого для создания этих замен, содержит последовательность (ОУК)7. В некоторых вариантах изобретения библиотеку создают заменой, по меньшей мере, остатков 95-100а тяжёлой цепи на аминокислоты, кодируемые наборами кодонов как ИУК, так и ΝΝΕ. Примером набора олигонуклеотидов, применимого для создания этих замен, является последовательность (ОУК)-(ШМ<). В другом варианте изобретения библиотеку создают заменой, по меньшей мере, остатков 95-100а тяжёлой цепи на аминокислоты, кодируемые наборами кодонов как ИУК, так и ΝΝΙ<. Пример набора олигонуклеотидов, применимого для создания этих замен, содержит последовательность (ОУК)5(ШМ<). Другой пример подходящих олигонуклеотидных последовательностей, применимых для создания этих замен, содержит последовательность (ΝΝΒ)6. Другие примеры подходящих олигонуклеотидных последовательностей специалист может определить в соответствии с критериями по данному описанию.
В другом варианте изобретения использую различные дизайны СИВ-Н3 для выделения высокоаффинных связующих и для выделения связующих для множества эпитопов. Интервалы протяжённости (длины) СИВ-Н3, полученные в этой библиотеке, составляют 11-13 аминокислот, хотя можно получать также СИВ-Н3 иной длины. Разнообразие НЗ можно расширить, используя наборы кодонов ΝΝΒ, ИУК и ШУК, а также более ограниченное разнообразие на Ν- и/или С-концах.
Многообразие (разнообразие) можно также получить в областях СИВ-Н1 и СЭК-Н2. Дизайн разнообразия СОВ-Н1 и Н2 следует стратегии нацеливания на то, чтобы имитировать спектр природных антител, описанный с модификацией, которая сосредоточена на разнообразии, более близко совпадающем с природным разнообразием, чем предыдущий дизайн.
Для разнообразия в СИВ-Н3 можно по отдельности создать множественные библиотеки с Н3 различной длины, а затем объединить, чтобы выбрать связующие для нацеленных антигенов. Множественные библиотеки можно объединять и осуществлять сортинг, используя методы твердофазной селекции и сортинга в растворе, описанные ранее и представленные ниже, в данном описании. Можно использовать многочисленные стратегии сортинга. Например, один вариант включает сортинг на мишени, связанной с твёрдой фазой, с последующим сортингом по метке, которая может присутствовать в слитом полипептиде (например, анти-дИ метка), а затем другой сортинг на мишени, связанной с твёрдой фазой. Или же, библиотеки можно сортировать сначала на мишени, связанной с твёрдой поверхностью, затем элюированные связующие сортируют, связывая с уменьшающимися концентрациями нацеленного антигена. Использование комбинаций различных методов сортинга обеспечивает минимизацию селекции лишь высокоэкспрессирующихся последовательностей и селекцию ряда различных высокоаффинных клонов.
Высокоаффинные связующие для нацеленного УЕСЕ антигена можно выделять из библиотек. Ограничение разнообразия в Н1/Н2 области снижает вырожденность примерно в 104-105 раз, а обеспечение большего разнообразия Н3 даёт связующие с более высокой аффинностью. Использование библиотек с различными типами разнообразия в СИВ-Н3 (например, полученных с применением ИУК и ШУТ) обеспечивает выделение связующих, которые могут связываться с различными эпитопами нацеленного антигена.
С помощью связующих, выделенных из описанных выше объединённых библиотек, было найдено, что аффинность можно дополнительно улучшить, обеспечивая ограниченное разнообразие в лёгкой цепи. Разнообразие лёгкой цепи создают в данном варианте изобретения следующим образом:
в СОВ-Ь1: аминокислоту в положении 28 кодируют при использовании ВОТ; аминокислоту в положении 29 кодируют с помощью ВКТ; аминокислоту в положении 30 кодируют с помощью ВУУ; аминокислоту в положении 31 кодируют с помощью АШУ; аминокислоту в положении 32 кодируют с по
- 26 012835 мощью ТНТ; необязательно, аминокислоту в положении 33 кодируют с помощью СТО; аминокислоту в положении 50 кодируют с помощью КВО; аминокислоту в положении 53 кодируют с помощью АУС; и, необязательно, аминокислоту в положении 55 кодируют с помощью ОМА;
в СОК-Ь3: аминокислоту в положении 91 кодируют при использовании ТМТ или 8КТ или обоих; аминокислоту в положении 92 кодируют при использовании ОМС; аминокислоту в положении 93 кодируют при использовании КУТ; аминокислоту в положении 94 кодируют при использовании ТРТ; и аминокислоту в положении 9б кодируют при использовании ТУТ или УКО или обоих.
В другом варианте изобретения создают библиотеку или библиотеки с разнообразием в областях СЭК-Ш, СЭК-Н2 и СЭЕ-Н3. В этом варианте изобретения разнообразие в СЭЕ-Н3 получают, используя ряд длин участков Н3 и, главным образом, наборы кодонов ΧΥΖ и ΝΝΙ< или ΝΝ8. Для специфичности клоны можно подвергнуть скринингу против заданного нацеленного антигена, а также других ненацеленных антигенов. Эти связующие с нацеленным УЕОЕ антигеном затем можно подвергнуть скринингу на аффинность ЕЫ8А анализом конкурентного связывания в растворе или конкурентным спот-анализом. Связующие с высокой аффинностью можно выделят из библиотек с использованием наборов кодонов ΧΥΖ, как описано выше. Эти связующие можно легко получать в культуре клеток в виде антител или антигенсвязывающих фрагментов с высоким выходом.
В некоторых вариантах изобретения может понадобиться получать библиотеки с большим разнообразием протяжённости области СЭК-Н3. Например, может быть желательным получить библиотеки областями СЭК-Н3 длиной около 7-19 аминокислот.
Высокоаффинные связующие из библиотек в этих вариантах изобретения легко получают с высоким выходом в культуре бактериальных и эукариотических клеток. Можно создать векторы для того, чтобы легко удалять последовательности, такие как дЭ метки, последовательность вирусного оболочечного белкового компонента, и/или для того, чтобы добавлять в константные области последовательности для обеспечения продуцирования полноразмерных антител или антигенсвязывающих фрагментов с высоким выходом.
Библиотеку с мутациями в СЭК-Н3 можно объединять с библиотекой, содержащей варианты других СЭК, например, СЭК-Ы, СПК-Ь2, СЭК-Е3 и СЭК-Н1 и/или СЭК-Н2. Так, например, в одном варианте изобретения библиотеку СЭК-Н3 можно объединять с библиотекой СЭК-Е3, созданной в контексте последовательности гуманизированного 4Ό5 антитела с вариантными аминокислотами в положениях 28, 29, 30, 31 и/или 32 с применением заданных наборов кодонов. В другом варианте изобретения библиотеку с мутациями в СЭК-Н3 можно объединять с библиотекой, содержащей вариант СЭК-Н1 и/или СЭКН2 вариабельных доменов тяжёлой цепи. В одном варианте изобретения библиотеку СЭК-Н1 создают с использованием последовательности гуманизированного антитела 4Ό5 с вариантами аминокислот в положениях 28, 30, 31, 32 и 33. Можно создать библиотеку СЭК-Н2 с использованием последовательности гуманизированного антитела 4Ό5 с вариантами аминокислот в положениях 50, 52, 53, 54, 5б и 58 с помощью заданных наборов кодонов.
В. Векторы, клетки-хозяева и методы рекомбинантной ДНК.
Анти-УЕОЕ антитело по изобретению можно получать методом рекомбинантной ДНК с применением легкодоступных методов и материалов.
Для получения антитела против УЕОЕ методами рекомбинантной ДНК нуклеиновую кислоту, кодирующую его, выделяют и встраивают в реплицируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификация ДНК) или для экспрессии. ДНК, кодирующая антитело, легко выделяется или синтезируется обычными методами (например, с применением олигонуклеотидных зондов, способных связываться специфично с ДНК, кодирующими тяжёлую и лёгкую цепи антитела). Многие векторы являются доступными. Вектор обычно включает, но без ограничения, один или более из следующих компонентов: сигнальную последовательность, ориджин репликации, один или более маркерных генов, энхансер, промотор и последовательность терминации транскрипции.
(ί) Сигнальная последовательность.
Антитело по данному изобретению можно получать методом рекомбинантной ДНК не только непосредственно, но также в виде слитого (составного, химерного) полипептида с гетерологическим полипептидом, который, предпочтительно, представляет собой сигнальную последовательность другого полипептида, имеющую специфический сайт расщепления на Ν-конце зрелого белка или полипептида. Выбранная предпочтительная гетерологическая сигнальная последовательность представляет собой последовательность, которая распознаётся и процессируется (т.е. расщепляется сигнальной пептидазой) в клетке-хозяине. В случае прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют нативную сигнальную последовательность антитела, сигнальная последовательность заменяется на прокариотическую сигнальную последовательность, выбранную, например, из группы лидерные пептиды щелочной фосфатазы, пенициллиназы, 1рр или термоустойчивого энтеротоксина II. Для секреции в дрожжах нативную сигнальную последовательность можно заменить, например, на лидер инвертазы дрожжей, лидер глюкоамилазы С. а1Ысап8 или на сигнал, описанный в XVО 90/13б4б. Для экспрессии в клетках млекопитающих доступными являются сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидеры, например дЭ сигнал герпес-вируса.
- 27 012835
ДНК такой области-предшественника лигируют в рамке считывания с ДНК. кодирующей антитело.
(ίί) Ориджин репликации.
Как экспрессирующий. так и клонирующий векторы содержат нуклеотидную последовательность. которая позволяет вектору реплицироваться в одной или более выбранных клеток-хозяев. Обычно эта последовательность в клонирующих векторах является последовательностью. которая позволяет вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина и включает ориджины репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности общеизвестны для различных бактерий. дрожжей и вирусов. Ориджин репликации плазмиды рВВ322 пригоден для большинства грамотрицательных бактерий. ориджин плазмиды 2μ применим для дрожжей. а ориджины различных вирусов (8У40. полиомы. аденовируса. У8У или ВРУ) пригодны для клонирования векторов в клетках млекопитающих. Вообще ориджин репликации не является необходимым для векторов экспрессии млекопитающих (ориджин репликации 8У40 обычно используют только потому. что он содержит ранний промотор).
(ш) Ген селекции.
Экспрессирующие и клонирующие векторы могут содержать ген селекции. также называемый селективным (селектируемым) маркёром. Типичные гены селекции кодируют белок. который (а) придаёт устойчивость к антибиотикам или другим токсинам. например ампициллину. неомицину. метотрексату или тетрациклину. (б) восполняет ауксотрофную недостаточность; или (в) поставляет важные нутриенты (питательные вещества). не поступающие из комплексных сред. например. ген. кодирующий Όаланинрацемазу для Васйй.
В одном примере селекционной схемы используется лекарственное вещество для прекращения роста клетки-хозяина. Такие клетки. которые успешно трансформируются при использовании гетерологического гена. продуцируют белок. который сообщает устойчивость к лекарству и. тем самым. сохраниться при этой схеме селекции. В примерах такой доминантной селекции используют лекарственные вещества неомицин. микофенольную кислоту и гиромицин.
Другим примером подходящих селективных маркёров для клеток млекопитающих являются такие селективные маркёры. которые делают возможной идентификацию компетентных клеток. поглощающих нуклеиновую кислоту антитела. такие как ОНЕВ. тимидинкиназа. металлотионеин-Ι и -ΙΙ. предпочтительно. металлотионеиновые гены приматов. аденозиндеаминаза. орнитиндекарбоксилаза и т.д.
Например. клетки. трансформированные с применением гена селекции ОНЕВ. сначала идентифицируют. культивируя все трансформанты в культуральной среде. которая содержит метотрексат (М!х). конкурентный антагонист ОНЕВ. В случае использования ОНЕВ дикого типа подходящей клеткойхозяином является клеточная линия яичников китайского хомячка (СНО). дефицитная по ОНЕВ активности.
Или же клетки-хозяева (в особенности хозяева дикого типа. которые содержат эндогенный ОНЕВ). трансформированные или котрансформированные при использовании последовательностей ДНК. кодирующих антитело. белок ОНЕВ дикого типа и другой селективный маркёр. такой как аминогликозид 3'фосфотрансфераза (АРН). можно отбирать. выращивая клетки в среде. содержащей агент для селекции селективного маркёра. такой как аминогликозидный антибиотик. например канамицин. неомицин или 0418. См. патент США 4965199.
Геном селекции. подходящим для применения в дрожжах. является ген 1гр 1. присутствующий в плазмиде дрожжей УВр7 (8йпсйсотЬ е! а1.. №!иге. 282: 39 (1979)). Ген 1гр1 предоставляет селективный маркёр для мутантного штамма дрожжей. не способного расти в триптофане. например АТСС №. 44076 или РЕР4-1. бопек. 0епейск 85: 12 (1977). Наличие повреждения гена 1гр 1 в геноме клетки-хозяина дрожжевой клетке в этом случае создаёт эффективное окружение для обнаружения трансформации с помощью выращивания в отсутствие триптофана. Аналогично. штаммы дрожжей. дефицитные по Ьеи-2. (АТСС 20622 или 38626). дополняются известными плазмидами. несущими ген Ьеи-2.
Кроме того. векторы. полученные из 1.6 мкм круговой плазмиды рКЭ1. можно использовать для трансформации дрожжей К1цуеготусе8. Или же о системе экспрессии для получения в крупных масштабах телячьего химозина сообщалось для К.1асЙ8. Уап беп Вегд. Вю/Тесйпо1оду. 8: 135 (1990). Также описывались многокопийные векторы устойчивой экспрессии для секреции зрелого рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина при использовании промышленных штаммов К1цуеготусе8. Е1еег е! а1.. Вю/Тесйпо1оду. 9: 968 (1991).
(ίν) Промотор.
Экспрессирующий и клонирующий векторы обычно содержат промотор. узнаваемый организмомхозяином и функционально связывающийся с нуклеиновой кислотой антитела. Промоторы. пригодные для применения с прокариотическими хозяевами. включают промотор рйоА. промоторные системы βлактамазы и лактозы. щелочную фосфатазу. промоторную систему триптофана (!гр) и гибридные промоторы. такие как промотор !ас. Однако применимы другие известные бактериальные промоторы. Промоторы для применения в бактериальных системах также содержат последовательность Шайна-Дальгарно (8.Ό.). функционально связанную с ДНК. кодирующей антитело.
- 28 012835
Промоторные последовательности известны для эукариот. В сущности все эукариотические гены содержат АТ-богатую область, расположенную примерно на расстоянии 25-30 оснований 3'-5' от сайта инициации транскрипции. Другой последовательностью, обнаруженной на расстоянии 70-80 основании 3'-5' от начала транскрипции многих генов, является область СЫСААТ, где N может быть любым нуклеотидом. На 3' конце большинства эукариотических генов находится последовательность ААТААА, которая может быть сигнальной для присоединения поли(А) хвоста к 3' концу кодирующей последовательности. Все эти последовательности соответствующим образом вводятся в экспрессирующие векторы эукариот.
Примеры подходящих промоторных последовательностей для применения в клетках-хозяевах дрожжевых клетках включают промоторы гена 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, таких енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, пирувата декарбоксилазы, фосфофруктокиназы, глюкоза-6-фосфатизомеразы, 3-фосфоглицератмутазы, пируваткиназы, триозофосфатизомеразы, фосфоглюкозоизомеразы и глюкокиназы.
Другие промоторы дрожжей, которые являются индуцибельными промоторами, имеющими дополнительное преимущество вследствие транскрипции, контролируемой условиями выращивания, представляют собой промоторы для алкогольдегидрогеназы, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, расщепляющих ферментов, ассоциированных с азотным обменом (метаболизмом), металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы. Векторы и промоторы, подходящие для применения в экспрессии в клетках дрожжей, подробнее описаны в ЕР 73657. Энхансеры дрожжей также преимущественно применяются с промоторами дрожжей.
Транскрипция антитела с применением векторов в клетках-хозяевах млекопитающих осуществляется, например, под контролем промоторов, полученных из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус куриной оспы, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус бычьей папилломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и, наиболее предочтительно, вируса зелёной мартышки 40 (8У40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например, промотора актина или промотора иммуноглобулина, промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев.
Ранний и поздний промоторы вируса 8У 40 обычно получают в виде фрагмента рестрикции 8У 40, которые также содержат вирусный ориджин репликации. Ближайший ранний промотор человеческого цитомегаловируса обычно получают в виде фрагмента рестрикции НшбШ Е. Система экспрессии ДНК в клетках-хозяевах млекопитающих с использованием вируса бычьей папилломы в качестве вектора раскрывается в патенте США 4419446. Модификация этой системы описана в патенте США 4601978. См. также Ееуек е! а1., Ыа!иге 297: 598-601 (1982) об экспрессии кДНК человеческого β-интерферона в мышиных клетках под контролем промотора тимидинкиназы герпес-вируса. Или же в качестве промотора можно использовать длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.
(ν) Энхансерные элементы.
Транскрипция кДНК, кодирующей антитело по данному изобретению, высшими эукариотами часто повышается при инсерции энхансера в вектор. В настоящее время известно много энхансерных последовательностей генов млекопитающих (глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина и инсулина). Однако обычно используют эукариотический вирусный энхансер. Примеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне ориджина репликации (п.о. 100-270), ранний промотор энхансер цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовируса. См. также Уапгу, №1иге 297: 17-18 (1982) об энхансерных элементах для активации эукариотических промоторов. В результате сплайсинга энхансер может располагаться в векторе в положении 5' или 3' к последовательности, кодирующей антитело, но, предпочтительно, он расположен в сайте 5' от промотора.
(νί) Компонент терминации транскрипции.
Экспрессирующие векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (клетки дрожжей, грибов, насекомых, растений, животных, человека или ядросодержащие клетки других многоклеточных организмов), также содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такими последовательностями являются обычно имеющиеся на 5' и, иногда, 3', нетранслируемые области эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемом участке мРНК, кодирующей антитело. Одним применимым компонентом терминации транскрипции является область полиаденилирования бычьего гормона роста. См. \УО 94/11026 и раскрываемый в этой заявке вектор экспрессии.
(νίί) Селекция (отбор) и трансформация клеток-хозяев.
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии ДНК в векторах по данному описанию представляют собой прокариотические клетки, клетки дрожжей или высших эукариот, описанные выше. Подходящие для этой цели прокариоты включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Еп!егоЬас1ег1асеае, такие как ЕксНепсЫа, например, Е.соН, Еп!егоЬас1ег, ЕгШша, К1еЬк1е11а, Рго1еик, 8а1топе11а, например, 8а1топе11а 1урЫтигшт, 8еггаНа, напри
- 29 012835 мер, 8еггайа тагсексапк, и 8Ыде11а, а также ВасШ1, такие как В. киЫШк и В. НсНешГотик (например, В. НсНешГотик 41Р, раскрываемые в ΌΌ 266,710, опубликованном 12 апреля 1989 г.), Ркеиботопак, такие как Р. аегидшока, и 8!гер!отусек. Одними из предпочтительных Е.соН хозяев для клонирования являются Е.со11 294 (АТСС 31 446), хотя также пригодны другие штаммы, такие как Е.со11 В, Е.соН Х1776 (АТСС 31537) и Е.со11 А3110 (АТСС 27325). Эти примеры являются скорее иллюстративными, нежели ограничивающими.
Помимо прокариот, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, являются эукариотические микробы, такие как нитевидные грибы или дрожжи. 8ассНаготусек сегеу181ае, или обычные пекарские дрожжи, являются наиболее общеупотребительными среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев. Однако общедоступными и применяемыми по данному описанию являются микроорганизмы других родов, видов и штаммов, такие как 8сН1/окассНагошусек ротЬе; хозяева К1иууеготусек, например, такие как К.1асйк, К.ГгадШк (АТСС 12424), К.ЬиЦапсик (АТСС 16045), Клуюкегатп (АТСС 24178), К.^аИй (АТСС 56500), К.бгокорйагит (АТСС 36906), К.Легто!о1егапк, и К.татапик, уаггсгола (ЕР 402226); Р1сЫа рак(ог1к (ЕР 183070); Сапб1ба; ТпсНобегта гееыа (ЕР 244234); Ыеигокрога сгакка; 8сйтапшотусек, такие как 8сН\уапшотусек осс1беп1аПк; и нитевидные грибы, например, такие как Ыеигокрога, РешсШшт, То1урос1абшт, и хозяева Акрегдй1ик, такие как А.шби1апк и А.шдег.
Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии гликозилированного антитела, получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают растительные клетки и клетки насекомых. Идентифицированы многие бакуловирусные штаммы и варианты и соответствующие клеткихозяева разрешённых насекомых, таких как 8робор!ега Ггид1регба (гусеница), Аебек аедурй (комар), Лебек а1Ьор!с1ик (комар), ЭгокорННа те1аподак!ег (фруктовая мушка), и ВотЬух топ. Общеизвестно множество вирусных штаммов для трансфекции, например, Ь-1 вариант ЛШодгарНа саНГогшса ИРУ и штамм Вт-5 ВотЬух топ ИРУ, и такие вирусы можно использовать в качестве вирусов по описанию данного изобретения, в частности, для трансфекции клеток 8робор!ега Ггид1регба. В качестве растений-хозяев можно также использовать хлопок, пшеницу, картофель, сою, петунью и табак.
Однако наибольший интерес вызывают клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (тканевой культуре) стало обычной процедурой. Примерами применяемых клеточных линий млекопитающих являются линия почечных клеток обезьян СУ1, трансформированная с помощью 8У40 (С08-7, АТСС СКЕ 1651); почечная линия клеток человеческого эмбриона (293 или 293 клетки, субклонированных для выращивания в суспензионной культуре клеток, СгаНат е! а1., б. Сеп Упо1 36: 59 (1977)); почечные клетки детёныша хомяка (ВНК, АТСС ССЬ 10); клетки яичников китайского хомячка/ЭНЕК (СНО, Иг1аиЬ е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8Л 77: 4216 (1980)); мышиные кеПоН клетки (ТМ4, МаЛег, Вю1. Кергоб 23: 243-251 (1980)); почечные клетки обезьян (СУ1 АТСС ССЬ 70); почечные клетки африканской зелёной мартышки (УЕКО-76, АТСС СКЕ-1587); человеческие клетки цервикальной карциномы (НЕЬА, АТСС ССЬ 2); почечные клетки собак (МОСК, АТСС ССЬ 34); клетки печени крыс буффало (ВКЕ 3А, АТСС СКЬ 1442); клетки лёгких человека (А138, АТСС ССЬ 75); клетки печени человека (Нер С2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС ССЬ51); ТК1 клетки (МаЛег е! а1., Аппа1к Ν.Υ. Асаб. 8ск 383: 44-68 (1982)); клетки МКС 5; Е84 клетки; и клеточная линия человеческой гепатомы (Нер С2).
Клетки-хозяева трансформируют вышеописанной экспрессией или клонированием векторов для продуцирования антител и культивируют в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для индуцирования промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих заданные последовательности.
(νίίί) Культивирование клеток-хозяев.
Клетки-хозяева, используемые для продуцирования антитела по данному изобретению, можно культивировать в различных средах. Продажные среды, такие как Нат'к Е10 (среда Хэма) (81дта), минимальная поддерживающая среда (М1шта1 Еккеп!1а1 Мебшт) ((МЕМ), (81дта), КРМ1-1640 (81дта), и среда Игла, модифицированная по Дульбекко ((ЭМЕМ), 81дта) применимы для культивирования клеток-хозяев. Кроме того, любую из сред, описанных в Нат е! а1., Ме1Н. Епх. 58: 44 (1979), Вагпек е! а1., Апа1. Вюскет.102: 255 (1980), Патентах США 4767704; 4657866; 4927762; 4560655; или 5122469; АО 90/03430; АО 87/00195; или в Патенте Ке (заменяющем) США 30985, можно использовать в качестве культуральных сред для клеток-хозяев. Любую из этих сред можно дополнить при необходимости гормонами и/или другими факторами роста (таким как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (таким как хлористый натрий, соли кальция, магния и фосфат), буферами (такими как НЕРЕ8), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как препарат СЕИТАМ^С1И™), следовыми элементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующими в микромолярных конечных концентрациях) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Можно также включать, в соответствующих количествах, любые другие необходимые добавки, известные специалистам в данной области техники. Условия в культуре, такие как температура, рН и т.п. такие, которые ранее применялись в случае клетки-хозяина, выбранной для экспрессии и которые очевидны для рядового специалиста.
- 30 012835 (ίχ) Очистка антител.
При использовании методов рекомбинантной ДНК антитело можно получать внутриклеточно, в периплазматическом пространстве, или непосредственно секретировать в среду. Если антитело продуцируется внутриклеточно, в качестве первой стадии, частицы клеточного дебриса, либо клетки-хозяева, либо лизированные фрагменты, удаляют, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. СаПег е1 а1., Вю/Тес1то1оду 10: 163-167 (1992) описывают методику выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство Е.со11. Коротко говоря, клеточную пасту размораживают в присутствии ацетата натрия (рН 3.5), ЕЭТА и фенилметилсульфонилфторида (РМ8Е) примерно в течение 30 мин. Затем клеточный дебрис удаляют центрифугированием. Если антитело секретируется в среду, супернатанты из этих систем экспрессии обычно сначала концентрируют на промышленном фильтре для концентрирования белка, например, на ультрафильтрационной установке Аписом или М1Шроге РеШсот Ингибитор протеаз, такой как РМ8Е, может быть введён на любой из предыдущих стадий для ингибирования протеолиза, а антибиотики можно вводить для предупреждения роста случайных примесей.
Композицию антитела, приготовленную из клеток, можно очищать, например, хроматографией на гидроксилапатите, гель-электрофорезом, диализом и аффинной хроматографией, причём предпочтительным методом очистки является аффинная хроматография. Пригодность протеина А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Ес домена иммуноглобулина, который присутствует в антителе.
Протеин А можно использовать для очистки антител на основе человеческих γ1, γ2 или γ4 тяжёлых цепей (Ьшбтагк е1 а1., 1. Iттиηο1. Ме111. 62: 1-13 (1983)). Протеин С рекомендуют для всех изотипов мышей и для человеческого γ 3 (Си88 е! а1., ЕМВ0 1. 5: 1567-1575 (1986)). Матрицей, с которой чаще всего связывается лиганд аффинности, является агароза, но применимы и другие матрицы. Устойчивые к механическим воздействиям матрицы, такие как стекло с контролируемыми порами или сополимер стирола с дивинилбензолом, позволяют увеличивать скорость потока и сокращать время процесса по сравнению с агарозой. Если антитело содержит домен СН3, для очистки можно применять смолу ВакегЬоЫ АВХ™ (1. Т. Вакег, РЫШрзЬигд, N1). Другие методы очистки белков, такие как фракционирование на ионо-обменной колонке, осаждение метанолом, обращённо-фазовая ВЭЖХ, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарин 8ЕРНАК08Е™, хроматография на анионообменной или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, δΌδ-РАСЕ и осаждение сульфатом аммония, также можно применять в зависимости от выделяемого антитела.
После любой(ых) стадии(й) предварительной очистки можно провести хроматографию смеси, содержащей представляющее интерес антитело и примеси, с гидрофобным взаимодействием при низких рН, используя буфер для элюции при рН около 2.5-4.5, предпочтительно при низких концентрациях соли (например, от около 0-0.25 М соли).
С. Фармацевтические рецептуры.
Терапевтические препараты антитела готовят для хранения, смешивая антитело нужной степени чистоты с возможными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Βет^ηдΐοη'8 РНагтасеибса1 8с1ег1се5 1611' ебНющ 0§о1, А. Еб. (1980), в виде лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксическими в отношении реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмоний хлорид; гексаметоний хлорид; бензалконий хлорид; бензетоний хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярный (менее примерно 10 остатков) полипептид; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЕЭТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Ζη-белок); и/или неионные поверхностноактивные вещества, такие как Т№ЕЕ№М, РЕиК0Н1С8™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ, РЕС).
Препарат по данному описанию может также содержать более одного активного соединения, необходимого для лечения по конкретным показаниям, предпочтительно может содержать активные соединения с комплементарной активностью, которые не оказывают вредного влияния друг на друга. Например, может быть желательным дополнительный иммунодепрессант (иммуносупрессор). Соответственно, такие молекулы присутствуют в комбинации в количествах, эффективных для предполагаемых целей.
Активные ингредиенты можно также помещать в микрокапсулу, приготовленную, например, методом коацервации или межфазной полимеризации, например, микрокапсулу из гидроксиметилцеллюлозы или желатиновую микрокапсулу и капсулу из полиметилметакрилата, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы раскрываются в Βет^ηдιοη'8 РНагтасен11са1 8с1ег1се5
- 31 012835 ебШоп, 0ко1, А. Еб. (1980).
Препараты для применения ш у1уо должны быть стерильны. Этого легко достичь, фильтруя через стерильные фильтрационные мембраны.
Можно готовить препараты пролонгированного действия. Подходящие примеры препаратов пролонгированного действия (с пролонгированным высвобождением) включают полупроницаемые матрицы из твёрдых гидрофобных полимеров, содержащие антитела, причём эти матрицы имеют определённую форму, например, плёнки или микрокапсула. Примеры матриц пролонгированного действия включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США 3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и γ-этил-Ь-глутамата, неразрушающиеся сополимеры этилена с винилацетатом, разрушающиеся сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как ЕиРК0Х ИЕР0Т™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот и лейпролида ацетата), и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляная кислота. Тогда как полимеры, такие как сополимер этилена с винилацетатом или сополимер молочной и гликолевой кислот, позволяют высвобождать молекулу в течение более 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки за более короткие периоды времени. Когда инкапсулированные антитела остаются в организме продолжительное время, они могут денатурироваться или агрегироваться под воздействием влаги при 37°С, что приводит к утрате биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. Можно разработать разумную стратегию стабилизации в зависимости от механизма процесса. Например, если найдено, что механизм агрегации представляет собой образование межмолекулярной 3-3 связи за счёт тио-дисульфидного взаимодействия, стабилизацию можно осуществить модификацией сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислых растворов, с помощью контроля содержания влаги, с помощью подходящих добавок и путём создания полимерных матриц особого состава.
Ό. Нетерапевтическое применение антител.
Антитела по изобретению можно применять в качестве агентов для аффинной очистки. В данном методе антитела иммобилизуют общеизвестными в технике методами на твёрдой фазе, такой как смола Сефадекс или фильтровальная бумага. Иммобилизованное антитело контактирует с образцом, содержащим антиген, который нужно очистить, а затем подложку (носитель) отмывают подходящим растворителем, который удаляет практически весь материал в образце за исключением очищаемого антигена, который связан с иммобилизованным антителом. Наконец, подложку отмывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, рН 5.0, который высвобождает антиген из соединения его с антителом.
Антитела по данному изобретению можно также применять в диагностике, например, для детектирования экспрессии представляющего интерес антигена в конкретных клетках, тканях или в сыворотке.
Для применения в диагностике антитело обычно метят детектируемой частицей. Имеется множество меток, которые можно разбить на следующие группы.
(а) Радиоизотопы, такие как 353, 14С, 125Ι, 3Н и 131Ι. Антитело можно метить радиоизотопом, например, используя методы, описанные в СиггепГ Рго1осо15 ш ^типокду, Уо1ите§ 1 апб 2, СоНдеп е! а1., Еб. \V^1еу-Iпιе^5С^епсе. №\ν Уогк, №\ν Уогк, РиЬк. (1991), и радиоактивность можно измерять, считая сцинтилляции.
(б) Флуоресцентные метки, такие как хелаты редкоземельных металлов (хелаты европия) или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, лиссамин, фикоэритрин и Техас красный. Флуоресцентные метки можно конъюгировать с антителом, например, методами, описанными выше, в Сиггеп! РгоФсок ш Ептипокду. Флуоресценцию можно определять количественно, например, с помощью флуориметра.
(в) Имеются различные ферментные метки для субстрата, и в патенте США 4275149 даётся обзор некоторых из них. Фермент обычно катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое можно измерять различными методами. Например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, которое можно измерять на спектрофотометре. Или же фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Методы количественного определения изменения флуоресценции описаны выше. В результате химической реакции хемилюминесцентный субстрат становится электронно-возбуждённым и затем излучает свет, который можно измерять (например, с помощью хемилюминометра), или отдаёт энергию флуоресцентному акцептору. Примеры ферментных меток включают люциферазы (например, люциферазу светляков; патент США 4737456), люциферин, 2,3дигадрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (НКР0), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы сахаридов (например, оксидазу глюкозы, оксидазу галоктозы и глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.п. Методы конъюгации ферментов с антителами описаны в 0'3иШуап е! а1., МеГкобк Гог Ргерагабоп оГ Епхуте-АпиЬобу Соп)нда1е5 Гог ихе т Епхуте Iт^ттоа55ау. в МеЛобк т Епхут. (еб ί. Ьапдопе & Н. Уап Уипакк), Асабетк Ргекк, Хеи Уогк, 73: 147-166 (1981).
Примеры комбинаций фермент-субстрат включают, например:
- 32 012835 (ΐ) пероксидазу (из) хрена (НКРО) с водород пероксидазой (пероксид водорода) в качестве субстрата, где водород пероксидаза окисляет предшественник красителя (например, орто-фенилендиамин (ОРО) или 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорид (ТМВ));
(ίί) щелочную фосфатазу (АР) с паранитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата; и (ίίί) β-Ό-галактозидазу ф-Э-Са1) с хромогенным субстратом (например, п-нитрофенил-β-Όгалактозидазой) или флуорогенным субстратом 4-метилумбеллиферил-в-О-галактозидазой.
Специалистам в данной области техники доступны многие другие комбинации фермент-субстрат. Общий обзор по этой теме см. в патентах США 4275149 и 4318980.
Иногда метку конъюгируют с антителом опосредованно. Специалисту известно множество таких методов. Например, антитело можно конъюгировать с биотином и любую метку из трёх вышеприведённых групп (категорий) можно конъюгировать с авидином и наоборот. Биотин селективно связывается с авидином и, таким образом, метку можно конъюгировать с антителом таким опосредованным способом. Или же, для осуществления непрямой конъюгации метки с антителом антитело конъюгируют с малым гаптеном (например, дигоксином), а один из различных типов представленных выше меток конъюгируют с антителом против гаптена (например, антителом против дигоксина). Таким образом можно осуществить непрямую конъюгацию метки с антителом.
В другом варианте изобретения нет необходимости метить антитело, а его присутствие можно детектировать, используя меченое антитело, которое связывается с данным антителом.
Антитела по настоящему изобретению можно применять в любом известном методе анализа, таком как анализ конкурентного связывания, прямой или непрямой сэндвич-анализы и методы иммунопреципитации. 2о1а, Мопос1опа1 ЛпбЬоб1е8: А Мапиа1 о£ ТесЬтсцлез, рр. 147-157 (СКС Рге55. 1пс. 1987).
Анализы конкурентного связывания основаны на способности меченого стандарта конкурировать с испытуемым образцом, анализируемым на связывание с ограниченным количеством антитела. Количество антигена в испытуемом образце обратно пропорционально количеству стандарта, которое связывается (становится связанным) с антителами. Для того чтобы упростить определение количества стандарта, которое становится связанным, обычно уменьшают растворимость антител (делают антитела нерастворимыми) перед конкурентным связыванием или после конкурентного связывания, так чтобы стандарт и анализируемый образец, которые связываются с антителами, можно было отделить стандартными методами от стандарта и анализируемого образца, которые остаются несвязанными.
Сэндвич-анализы включают применение двух антител, каждое из которых способно связываться с разным иммуногенным участком, или эпитопом, детектируемого белка. В сэндвич-анализе тестируемый образец для анализа (аналит) связывается первым антителом, которое иммобилизовано на твёрдой подложке, а затем второе антитело связывается с аналитом, тем самым образуя нерастворимый трёхчастный комплекс. См., например, патент США 4376110. Само второе антитело может быть мечено детектируемой частицей (прямой сэндвич-анализ), или его можно измерять, используя антитело против иммуноглобулина, меченое детектируемой частицей (непрямой сэндвич-анализ). Например, один тип сэндвичанализа представляет собой анализ ЕЬ1§А, в этом случае детектируемой частицей является фермент.
При иммунохимическом анализе образец опухоли может быть свежим или замороженным или может быть заключён в парафин и фиксирован с применением консерванта, например, такого как формалин.
Антитела можно также использовать для диагностики 1п у1уо. Обычно антитело метят радионуклидом (таким как 1П1п, 99Тс, 14С, 1311, 1251, 3Н, 32Р или 35§) или красителем, так чтобы можно было локализовать опухоль, используя иммуносцинтографию.
В одном варианте изобретения способ детектирования УЕСЕ в биологическом образце (например, ткани, крови, сыворотках, ликворе) или приготовленном биологическом образце может содержать стадию контактирования антитела по данному изобретению с образцом и наблюдения за антителом против УЕСЕ, связанным с УЕСЕ в образце. В другом варианте изобретения способ детектирования УЕСЕ в организме субъекта содержит стадию введения антитела по данному изобретению субъекту и наблюдения за антителом против УЕСЕ, связанным с УЕСЕ в организме субъекта или определения количества антитела против УЕСЕ, связанного с УЕСЕ в организме субъекта (например, человека, мыши, кролика, крысы и т. д.).
Е. Диагностические наборы.
Для удобства антитело по настоящему изобретению можно поставлять в наборе, т. е. в виде упакованной комбинации реагентов в заданных количествах с инструкциями по проведению диагностики. Если антитело мечено ферментом, набор включает субстраты и кофакторы, требующиеся для ферментов (например, субстрат, который предоставляет детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, могут включаться другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, буфер для блокирования и буфер для лизиса) и т. п. Относительные количества различных реагентов могут изменяться в широких пределах, чтобы создавались концентрации реагентов в растворе, которые в значительной степени оптимизировали чувствительность анализа. В частности, реагенты могут поставляться в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, включающих эксципиенты, при растворении которых образуются рас
- 33 012835 творы соответствующей концентрации.
Г. 1п νί\Ό применение антител.
Предполагается, что антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения млекопитающего. В одном варианте изобретения антитело вводят нечеловеческому млекопитающему, например, с целью получения преклинических данных. Примеры нечеловеческих млекопитающих, которых можно лечить (обрабатывать), включают нечеловеческих приматов, собак, кошек, грызунов и других млекопитающих, на которых проводят преклинические испытания. Такие млекопитающие могут представлять собой общепринятые животные модели заболевания, которое надо лечить с помощью антитела, или их можно использовать для изучения токсичности представляющего интерес антитела. В каждом таком варианте изобретения на животных можно проводить исследования по повышению дозы. Если антитело является анти-УЕСГ антителом, его можно вводить грызуну-хозяину, например, в модель солидной опухоли.
Кроме того, или в качестве альтернативы, антитело используют для лечения человека, например, больного, страдающего заболеванием или нарушением, которое может облегчить введение антитела. Состояний, которые можно лечить с помощью антитела, множество, они включают состояния, возникающие или обостряющиеся в результате аномального ангиогенеза, например, избыточного (интенсивного), неадекватного (неподходящего) или неконтролируемого ангиогенеза. Такие состояния включают, например, рак, такой как колоректальный рак и Ы8СЬ8 и другие состояния, описанные выше, и воспалительные заболевания, такие как ревматоидный артрит и другие описанные выше заболевания.
Ниже даны ссылки на работы, в которых описывают лимфомы и СЬЬ, их диагнозы, лечение и стандартные медицинские процедуры для определения эффективности лечения. Сапе11ок СР, Ь1к!ег, ТА, 8к1аг 1Б: Т1е Ьутрйотак. \У.В. 8аипбегк Сотрапу, РЫ1абе1рЫа, 1998; νаи Вейеп К. апб СаЬапШак, Г: С1шюа1 МашГек!а!юпк, 81адтд апб Тгеа!теп! оГ Шп-Нобдкт'к Ьутрйота, С1ар. 70, рр 1293-1338, в: Нета!о1оду, Вайс Ргтс1р1ек апб Ргасйсе, 3гб еб. НоГГтап е! а1. (еббогк). СйигсЫП ЬМпдйопе, РЫ1абе1рЫа, 2000; и Ка1, К. апб Ра!е1, Ό: Скгошс Ьутрйосуйс Ьеикет1а, С1ар. 72, рр. 1350-1362, в: Нета!о1оду, Вайс Ргтс1р1ек апб Ргасйсе, 3гб еб. НоГГтап е! а1. (еббогк). СкпгсНШ ЬМпдк!опе, РЫ1абе1рЫа, 2000.
Характеристики для оценки эффективности или успеха лечения аутоиммунного или родственного аутоиммунному заболевания известны врачу, специалисту по соответствующим заболеваниям. Обычно врач-специалист наблюдает за уменьшением признаков и симптомов конкретного заболевания. Ниже представлены примеры этого.
В одном варианте изобретения способы и композиции по изобретению применимы для лечения ревматоидного артрита. РА (КА) характеризуется воспалением многих суставов, дефектами хрящей и эрозией костей, которые ведут к разрушению суставов и, наконец, к утрате функции суставов. Кроме того, так как КА является системным заболеванием, он может действовать на другие ткани, такие как лёгкие, глаза и костный мозг.
Антитела, связывающие УЕСГ, можно использовать в качестве терапии первой линии у пациентов с ранним РА (т.е. наивных в отношении метотрексата (МТХ)), или в комбинации, например, с МТХ или циклофосфамидом. Или антитела можно использовать в качестве терапии второй линии при лечении пациентов, резистентных к ОМАКЭ и/или МТХ, например, в комбинации с МТХ. В одном предпочтительном варианте изобретения антитела по изобретению, связывающие УЕСГ, вводят млекопитающим, резистентным к ОМАКЭ и/или МТХ. Антитела против УЕСГ применяют для предупреждения и контроля суставного поражения, уменьшения структурного поражения, ослабления боли, связанной с воспалением при РА, и вообще для уменьшения признаков и симптомов с целью смягчения тяжёлой формы РА. Больного РА можно лечить антителами против УЕСГ по данному изобретению до, после лечения или одновременно с лечением другими лекарствами, применяемыми при лечении РА (см. ниже комбинированную терапию). В одном варианте изобретения больных, которым ранее не помогли модифицирующие болезнь противоревматические лекарства, и/или у которых наблюдался неадекватный ответ на один метотрексат, лечат анти-УЕСГ связывающим антителом. В другом варианте больным вводят антитело против УЕСГ по данному изобретению плюс циклофосфамид или анти-УЕСГ связывающим антителом плюс метотрексат.
Один метод оценки эффективности лечения РА опирается на критерии Американского Колледжа ревматологии (АСК), по которым, среди прочего, определяют выраженное в процентах улучшение в болезненных и опухших суставах. Больного РА можно оценивать, например, как АСК 20 (улучшение 20%) по сравнению с состоянием в отсутствие лечения антитела (например, с фоновыми значениями перед лечением) или с состоянием при лечении плацебо. Другие способы оценки эффективности лечения антителом включают оценку рентгенологического изменения, например, по шкале 8йагр, применяемой для оценки структурного повреждения, такого как эрозия кости и сужение суставной щели. Состояние больных также можно оценивать с точки зрения предупреждения или улучшения состояния нетрудоспособности по шкале опросника состояния здоровья |НАС|. шкале А1МС, 8Г-36 во временные периоды в ходе или после лечения. Критерии АСК 20 могут включать 20%-ное улучшение (уменьшение) как числа хрупких (болезненных) суставов, так и числа опухших суставов, плюс 20%-ное улучшение по меньшей мере 3 из 5 дополнительных показателей:
- 34 012835
1) оценка боли пациентом по визуальной аналоговой шкале (УА8),
2) общая оценка пациентом активности заболевания (УА8),
3) общая оценка врачом активности заболевания (УА8),
4) самооценка пациентом нетрудоспособности по опроснику состояния здоровья (НАО) и
5) реагенты в острой фазе, СКР или Е8К.
АСК 50 и 70 определяются аналогично.
Предпочтительно больному вводят количество анти-УЕСР связывающего антитела по изобретению, индивидуально или в сочетании с другими агентами для лечения ревматоидного артрита, эффективное для достижения, по меньшей мере, оценки АСК 20, предпочтительно, по меньшей мере, АСК 30, более предпочтительно, по меньшей мере, АСК 50, ещё более предпочтительно, по меньшей мере, АСК 70, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, АСК 75 или выше.
Псориатический артрит имеет уникальные и различимые радиографические особенности. При псориатическом артрите эрозию суставов и сужение суставной щели можно также оценивать по шкале Шарпа (8йагр). Связывающие антитела против УЕСР по данному описанию можно применять для предупреждения поражения суставов, а также для уменьшения признаков и симптомов нарушения.
Антитело вводят любыми подходящими способами, включая перентеральный, подкожный, интраперитонеальный, внутрилёгочный и интраназальный способы введения, и, если требуется для местной иммуносупрессии, введение в очаг (место) поражения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное (внутрибрюшинное) или подкожное введение. Кроме того, антитело можно вводит в пульсовом режиме, в частности, с уменьшающимися дозами антитела. Предпочтительно, дозы вводят в виде инъекций, наиболее предпочтительно, в виде внутривенных или подкожных инъекций, частично в зависимости от того, является ли введение кратким или постоянным.
При предупреждении или лечении заболевания подходящая доза антитела зависит от типа заболевания, которое надо лечить, тяжести и течения заболевания, от того, вводится антитело с целью предупреждения или лечения заболевания, от предыдущего лечения, анамнеза пациента и ответа на антитело и от решения лечащего врача. Антитело вводится пациенту соответствующим образом однократно или многократно.
В зависимости от типа и тяжести заболевания пациенту в качестве возможной начальной дозы вводят примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0.1-20 мг/кг) антитела, либо в один или в несколько приёмов, либо в виде непрерывной инфузии. Типичная суточная доза может составлять примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от указанных выше факторов. В случае многократного приёма в течение нескольких дней или в течение более продолжительного времени, лечение продолжают до тех пор, пока не будет наблюдаться желательное ослабление симптомов заболевания. Однако могут применяться другие схемы лечения. За ходом этого лечения легко следить обычными методами и с помощью обычных анализов. Типичная схема лечения антителом против ЬРА-1 или против ШАМ-1 раскрывается в XVО 94/04188. Типичные схемы лечения и терапевтические комбинации для лечения рака можно найти в предварительной заявке США б0/474480, поданной 30 мая 2003 г.
Композицию антитела можно готовить, дозировать и вводить так, как это принято в надлежащей медицинской практике. Факторы, принимаемые во внимание в данном контексте, включают конкретное подлежащее лечению нарушение, конкретного, подлежащего лечению млекопитающего, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, место доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные в медицинской практике. Терапевтически эффективное количество антитела, которое нужно ввести, определяется этими соображениями и представляет собой минимальное количество, необходимое для предупреждения, ослабления или лечения заболевания или нарушения. Антитело, не обязательно, но возможно, готовят с одним или более агентов, применяющихся в настоящее время для предупреждения или лечения обсуждаемого заболевания. Эффективное количество этих других агентов зависит от имеющегося в рецептуре количества антитела, характера нарушения или лечения и от других факторов, обсуждавшихся выше. Эти агенты обычно применяются в тех же дозах и вводятся теми же способами, которые обсуждаются выше в данном описании, или в количествах, составляющих примерно 1-99% от применяющихся доз. Обычно смягчение или лечение заболевания или нарушения включает уменьшение одного или более симптомов или медицинских проблем, связанных с заболеванием или нарушением. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарства поможет достичь один или несколько из следующих результатов: уменьшить число раковых клеток; уменьшить размер опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени и/или прекратить) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать метастаз опухоли; и/или до некоторой степени уменьшить один или более симптомов, обусловленных раком. По степени, с какой лекарство может предупреждать рост и/или вызывать гибель живых раковых клеток, оно может быть цитостатическим или цитотоксическим. В некоторых вариантах композицию по данному изобретению можно использовать для предупреждения начала заболевания или нарушения у человека или млекопитающего.
- 35 012835
С. Промышленные изделия.
В другом варианте изобретения включается промышленное изделие, содержащее материалы, пригодные для лечения нарушений, описанных выше. Промышленное изделие содержит контейнер и этикетку. Подходящий контейнер включает, например, флаконы, ампулы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного вливания или пузырёк с пробкой, прокалываемой гиподермической иглой для инъекций). Активным агентом композиции является антитело. Этикетка на контейнере, или приложенная к контейнеру, указывает, что композиция применяется для лечения выбранного состояния. Промышленное изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы, кроме того, он может включать другие материалы, нужные с коммерческой точки зрения или с точки зрения потребителя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыш в упаковку с инструкциями по применению.
В данное описание во всей полноте вводятся предварительные заявки США, на приоритет которых претендует заявка на данное изобретение: 60/491877, поданная 1 августа 2003 г.; 60/516495, поданная 1 ноября 2003 г.; 60/570912, поданная 12 мая 2004 г.; 60/571239, поданная 13 мая 2004 г.; 60/576315, поданная 1 июня 2004 г.; и 60/580757, поданная 18 июня 2004 г.
Предполагается, что нижеприведённые примеры представлены для того, чтобы проиллюстрировать на практике настоящее изобретение, но ни в коем случае не для того, чтобы его ограничить. Раскрытие всех цитируемых в данном описании ссылок на патентную и научную литературу специально вводится ссылкой во всей полноте.
Примеры
Создание фаговых библиотек синтетических антител.
Всего создают два типа комбинаторных библиотек антител, различающихся источником спектра антител. До настоящего времени большинство библиотек являются библиотеками природных антител, в которых используют природные спектры в качестве источника их разнообразия, где гены в качестве матричной РНК иммунных клеток наивных или иммунизированных животных или человека амплифицируют и клонируют в вектор для фагового дисплея или других методов визуализации, таких как рибосомный или дрожжевой дисплей. Природные антитела обычно имеют сложные каркасы, которые вместе с последовательностями вариабельных СОК и с рекомбинацией лёгкой цепи и тяжёлой цепи создают разнообразие библиотеки. Размер библиотеки определяет производительность библиотек, так как спектр обычно больше, чем размер библиотеки (Магкз е! а1.). С другой стороны, синтетическая библиотека является новым отделением библиотеки, в которой создано разнообразие (диверсивность) и встроено в библиотеку с синтетической ДНК. Используют единичные или множественные (сложные) остовы (каркасы). В случае библиотеки с единичным каркасом источник диверсивности (разнообразия) зависит единственно от вырожденности ДНК, предназначенной для создания различных СОК петель. Как дизайн разнообразия (диверсивности), так и размер библиотек являются решающими для производительности библиотек, которую можно определять аффинностью антител, обнаруженных при использовании библиотек.
Мы разработали стратегию создания фаговой библиотеки синтетических антител на матрице единственного каркаса. Остатки выбирают из СОК петель, которые либо экспонируются с растворителем (доступны для растворителя), либо являются высоковариабельными в спектре природных антител по данным КаЬа!, и рандомизируют, имитируя природное разнообразие с применением специально созданных кодонов. Мы также исследовали ограничение рандомизации тяжёлой цепи, которая часто вносит вклад в основное связывающее взаимодействие с антигеном в природных антителах, и нашли, что его достаточно для того, чтобы найти связующие для наивных мишеней. Одной из причин ограничить диверсивность (разнообразие) является то, что расхождение между вырожденностью ДНК и реальным размером фаговой библиотеки не является чрезмерно большим и пространство последовательности заполняется с достаточной плотностью.
Первую библиотеку создают на основе гуманизированного 4Ό5 с рандомизированной тяжёлой цепью и фиксированной лёгкой цепью в формате одноцепочечного Ру (зсРу). Для нацеленного антигена мышиного УЕСР (тУЕСР) найдено много уникальных связующих.
Обычно библиотеки затем усовершенствуют тонкой настройкой разнообразия СОК-Н1 и Н2 или лёгкой цепи таким образом, чтобы точнее имитировать природное разнообразие, и изучая дизайн разнообразия (диверсивности) СОК-Н3 в формате РаЬ дисплея. См. фиг. 1 для иллюстрации различных типов библиотек антител. Мы нашли библиотеки с различными дизайнами СОК-Н3 сходного размера, приводящие в результате к связующим ЙУЕСР и тУЕСР с суб-нМ аффинностью (ниже нМ). Аффинность этих связующих можно дополнительно улучшать с помощью второй стадии рандомизации СОК их лёгких цепей.
Подробнее о стратегии и методах создания библиотек синтетических антител с единственной матрицей см., например, предварительную заявку США 60/385338 (поданную 3 июня 2002 г.), содержание
- 36 012835 которой во всей полноте вводится в данное описание в качестве ссылки. Таким образом, новые антитела с аффинностью как к человеческому УЕСЕ, так и к мышиному УЕСЕ можно найти в фаговых библиотеках разнообразных синтетических антител на основе матрицы с единым каркасом.
Пример 1. Антитела, полученные из С6 и В20.
(а) Селекция высокоаффинных анти-УЕСЕ ЕаЬ клонов.
Методики селекции высокоаффинных клонов ЕаЬ против УЕСЕ состоит из различных комбинаций сортинга со связыванием на твёрдой фазе и в растворе. При сортинге со связыванием на твёрдой фазе пэннинг фаговой библиотеки антител осуществляют с использованием нацеленного антитела, нанесённого на лунки 96-луночного ΝϋΝΠ планшета Мах1когр с концентрацией 5 мкг/мл. В методе сортинга со связыванием в растворе фаговую библиотеку инкубируют с понижающейся концентрацией биотинилированного антигена в растворе, который затем захватывается нейтравидином, нанесённым на лунки 96луночного планшета Мах1когр (2-5 мкг/мл). Понижающаяся концентрация делает возможной большую жёсткость пэннинга для того, чтобы извлекать более тесно связанные связующие. Для нацеленного антигена тУЕСЕ разрабатывают стратегию двухстадийного сортинга, а именно на стадии 1 потенциальные связующие выделяют из наивных библиотек твердофазной селекцией, а затем, на стадии 2, эти связующие с более сильной аффинностью можно отделять от более слабых прогрессивным способом связывания в растворе с понижающейся концентрацией нацеленного антигена. Для того чтобы провести быстрый тщательный отбор этих связующих, используют высокопроизводительный анализ конкурентного связывания ктд1е-кро! ЕЬКА. В этом анализе используют низкие количества шУЕСЕ (25 нМ) для скрининга 16 клонов из каждой библиотеки после 3-его раунда сортинга.
В результате применения объединенного метода сортинга на твёрдой фазе и в растворе в качестве связующих с высокой аффинностью идентифицируют три ЕаЬ клона, С6, В29 и С3, все из ΝΝΚ библиотеки. И после 5-го раунда сортинга вся библиотека поглощается С клоном. Интересно, что В20, из библиотеки ΝΥΓ, обнаружен одним лишь сортингом со связыванием в растворе. Это наводит на мысль, что большее количество клонов можно обнаружить, применяя различные стратегии методов сортинга, которые могут влиять на различные клоны. При появлении библиотек различных дизайнов должно также идентифицироваться больше связывающихся с УЕСЕ клонов с различными последовательностями. Четыре уникальных клона с различными последовательностями первоначально были охарактеризованы по своей аффинности связывания с мышиным или человеческим УЕСЕ анализом конкурентного связывания ЕЫ8А при 25°С. Данные ТС50, полученные методами связывания с фагом, представляют оценку их аффинности, и найдено, что С6 является связующим с наивысшей аффинностью с Κ.'50 0.5-1 нМ как к человеческому, так и к мышиному УЕСЕ (фиг. 2).
(б) Активности и свойства.
Для изучения свойств и активностей отобранных новых антител против УЕСЕ проводят ряд ш νίΙΐΌ анализов.
Блокирование эпитопов.
Во-первых, клоны фаговых антител исследуют на их возможные эпитопы связывания на УЕСЕ. Используют метод блокирования фага, когда связывание фаговых клонов (при постоянной концентрации) с лунками, покрытыми плёнкой шУЕСЕ, измеряют в присутствии либо целого внеклеточного домена (ЕСО) КОК, либо второго домена Е1!-1 (Е1!-1С2), оба при повышающихся концентрациях, соответственно. Целый ЕСО КОК или Е1!-1 содержит семь иммуноглобулиноподобных доменов и связывает УЕСЕ через второй и третий домен. Один второй домен Е1!-1 может связываться с УЕСЕ с Кб 2 нМ с известными эпитопами на УЕСЕ, если исходить из опубликованной кристаллической структуры комплекса УЕСЕУЕСЕК (\У|ектапп е! а1. (1997) Се11. 91: 695-704). Величина Кб связывания КОК ЕСО с УЕСЕ составляет около 5 нМ. Мы ожидали, что связывание фаговых клонов должно уменьшаться при продолжении прибавления рецепторов, если эпитопы для антитела на фаге в значительной степени перекрываются с рецептором.
Для анализа блокирования на уровне белка с очищенным ЕаЬ, экспрессированным при использовании Е.сой, (мышиный или человеческий УЕСЕ), рецептор УЕСЕ, иммобилизованный на планшете нанесением плёнки Е1!-1 ЕСО фрагмента Цд домен 1-5) (Е1!-1С1-5), непосредственно экспрессированного при использовании бакуловируса, или экспрессированного клетками 293 слияния КОКЧд, которое представляет КОК ЕСО Цд домен 1-7) в виде Есу слияния, захватывается антителом козы против человеческого ЦС Есу Цасккоп [тшипоЕекеагсй ЬаЬ. \Мек( Сгоге, РА), нанесённым на 96-луночный иммунопланшет Мах1когр и блокированным 0.5% В8А и 0.02% Тчееп 20. Биотинилированный экспрессированный клетками бактерий НУЕСЕ или шУЕСЕ, 0.2 нМ, сначала инкубируют с трёхкратными серийными разведениями анти-УЕСЕ ЕаЬ, С6, ЕаЬ-12 (ЕаЬ антитела Агакйп™) или Υ0317 в РВ8 с 0.05% Тчееп 20 (РВ8Т). После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре смесь переносят в планшет с иммобилизованным УЕСЕ рецептором и инкубируют 10 мин. УЕСЕ-А, который не блокируется антителом против УЕСЕ, захватывается в лунках, покрытых рецептором УЕСЕ, и детектируется с помощью конъюгата стрептавидин-НКР и проявляется субстратом ТМВ, как описано выше.
Как показано на фиг. 3, четыре клона блокируют до различной степени с помощью Е1!-1С2 и КОК.
- 37 012835
Результаты анализа блокирования наводят на мысль, что эти четыре клона могут иметь различные эпитопы связывания на УЕОЕ, которые, тем не менее, перекрываются с рецепторсвязывающим эпитопам. Аффинность клонов антитела не коррелирует с эффективностью блокирования рецептором в этом анализе блокирования. В качестве контроля используют Υ0959, фаговый клон с известным эпитопом. Среди других четырёх новых клонов, по-видимому, О6 и В20 содержат эпитопы, которые в достаточной степени перекрываются с эпитопами как к Е11-11, так и к КОЯ, так как их связывание с тУЕОЕ значительно снижается в присутствии рецепторных фрагментов. Разница эффективности (сомножителя, фактора) блокирования мала, но остаётся постоянной во многих анализах. Предполагают, что О6 или В20 содержит эпитопы, которые соответствуют эпитопам рецептора на УЕОЕ значительно лучше, чем ЕаЬ-12 или его варианты, Υ0317 и Υ0959 (Ми11ег, Υ.Ά., е1 а1., (1998) 81гнс1иге 6: 1153-1167). Поэтому мы приступили к получению ЕаЬ белка, чтобы подтвердить связывание и изучить эпитоп. Первым для дальнейшего исследования выбирают О6, так как он имеет наивысшую аффинность как к тУЕОЕ, так и к ЕУЕОЕ.
Специфичность связывания и нейтрализующая активность.
Для определения специфичности связывания клона О6 ЕаЬ проводят анализы ЕЬ8А с применением человеческого, мышиного, крысиного и кроличьего УЕОЕ-А165, а также гомологов УЕОЕ, включая мышиный и человеческий плацентарный фактор роста (Р1ОЕ-2), тУЕОЕ-Ο и человеческий УЕОЕ-В. Человеческий и мышиный плацентарный фактор роста (Р1ОЕ-2), мышиный УЕОЕ-О, крысиный УЕОЕ-А и человеческий УЕОЕ-В получают от Я & Ώ ууЧет. Испытуемые антигены наносят на ΝϋΝΕ 96-луночный иммунопланшет Мах1§огр с концентрацией 2 мкг/мл. Связывание с повышением концентрации белка О6 ЕаЬ определяют с помощью конъюгата протеин О-пероксидаза хрена и субстрата. Например, белок ЕаЬ получают при использовании Е.со11, содержащих конструкцию плазмиды экспрессии О6 ЕаЬ, под контролем промотора щелочной фосфатазы и секреции лидерных последовательностей 8Ш, и очищают на аффинной колонке с протеином О. Связывание О6 ЕаЬ с УЕОЕ и его гомологами определяют прямым анализом ЕЬ18А. Лунки, покрытые гомологом УЕОЕ (концентрация 2 мкг/мл в РВ8) блокируют с помощью 0.5% В8А и 0.05% Т\\гееп 20 при 25°С. ЕаЬ при повышении концентрации инкубируют с покрытыми гомологом УЕОЕ лунками в течение 1 ч при 25°С и определяют с применением коньюгата антитела против человеческого ЕаЬ с пероксидазой хрена, разведённого буфером РВТ, затем проявляют субстратом ТМВ. Анализы связывания в растворе также проводят для некоторых белков, инкубируя 0.5 нМ О6 ЕаЬ при повышающихся концентрациях гомолога УЕОЕ в течение 1-2 ч при 25°С, а несвязанный ЕаЬ захватывают в лунках, покрытых тУЕОЕ-А и измеряют. Как показано на фиг. 4, белок О6 ЕаЬ одинаково связывается как с тУЕОЕ, так и с ЕУЕОЕ (около 0.6 и 1.4 нМ соответственно). Кроме того, О6 антитело совсем не связывается с другими гомологами УЕОЕ, и, следовательно, является высокоспецифическим в отношении УЕОЕ. О6 ЕаЬ связывается с крысиным или кроличьим УЕОЕ с аффинностью, аналогичной его аффинности к тУЕОЕ (данные не показаны).
Для того чтобы проверить, что О6 не только связывается с УЕОЕ с высокой аффинностью, но также способно эффективно блокировать связывание УЕОЕ с УЕОЕ рецепторами, проводят анализы блокирования, в которых проверяют либо ЕУЕОЕ, либо тУЕОЕ на связывание с КОЯ в присутствии увеличивающихся концентраций клона О6 ЕаЬ. Также в качестве контрольных берут два антитела против ЕУЕОЕ, ЕаЬ-12 (ЕаЬ АтаЧт™) и Υ0317, которые способны эффективно блокировать ЕУЕОЕ, но ни один из них не связывается с тУЕОЕ и не блокирует его активность. Как показано на фиг. 5, О6 активно блокирует связывание ЕУЕОЕ с КОЯ с эффективностью, аналогичной эффективности ЕаЬ-12 или Υ0317. Помимо этого, О6 может заметно блокировать связывание тУЕОЕ с КОЯ. Для сравнения, ни ЕаЬ-12, ни Υ0317 не проявляют никакого блокирующего действия в отношении тУЕОЕ.
Таким образом, новое антитело против УЕОЕ О6 по данному изобретению является высокоаффинным анти-УЕОЕ антителом, способным связывать и блокировать УЕОЕ как человеческого, так и мышиного вида.
Клеточный анализ.
Для того чтобы далее определить специфичность связывания и активность блокирования нового антитела О6, проводят клеточный анализ с применением эндотелиальных клеток пупочной вены человека (НИУЕС), в котором проверяют способность различных антител против УЕОЕ блокировать клеточную пролиферацию, индуцированную человеческим или мышиным УЕОЕ. Обычно 96-луночные планшеты для тканевых культур засевают при плотности 3000 НИУЕС на лунку и выдерживают в среде для анализа (Е12ГОМЕМ 50:50, дополненная 1.5% (об./об.) очищенной с помощью диафильтра фетальной бычьей сывороткой) в течение 24 ч. Концентрацию УЕОЕ, применяемую для стимуляции роста клеток, определяют при начальным фильтровании с целью определить количество УЕОЕ, которое может индуцировать 90% максимального синтеза ДНК. Затем добавляют свежую среду для анализа с фиксированным количеством УЕОЕ (конечная концентрация 0.1 нМ) и с повышающейся концентрацией ЕаЬ против УЕОЕ. Инкубируют 24 ч, клетки выдерживают в пульсовом режиме с 0.51 мкК и на лунку [3Н] тимидина в течение 24 ч, а затем собирают на 96-луночном фильтр-планшете для подсчёта с помощью гаммасчётчика ТорСошИ. В этот момент проводят измерения синтеза ДНК, вводя третированный тимидин. В этом анализе антителами против УЕОЕ, служащими в качестве контрольных, являются ЕаЬ-12 и Υ0317.
- 38 012835
Как показано на фиг. 6, антитело С6 заметно снижает способность как ЙУЕСЕ, так и тУЕСЕ промотировать пролиферацию НИУЕС. Эксперимент с основным фактором роста фибробластов (ЬЕСЕ) служит в качестве контроля для того, чтобы продемонстрировать, что ни один из применяемых в данном анализе анти-УЕСЕ ЕаЬ не обладает никакой неспецифической токсичности в отношении клеток-хозяев.
(в) Повышение аффинности антител С6 и В20 против УЕСЕ.
Для дальнейшего улучшения аффинности связывания выбирают два новых клона антител, С6 и В20. Для повышения аффинности рандомизируют несколько выбранных остатков СОК лёгкой цепи, так как оба клона происходят из библиотеки с рандомизированной лишь тяжёлой цепью и фиксированной лёгкой цепью. Выбирают остатки, экспонированные с поверхностью СОК, и высокоразнообразные остатки по данным КаЬа! природных последовательностей антител. Выбирают сайт-направленный мутагенез со специально созданными вырожденными кодонами для получения аминокислотного разнообразия, которое имитирует природный иммунный спектр в каждом СОК сайте лёгкой цепи (фиг. 7). Сначала осуществляют сортинг, добавляя библиотеку к иммобилизованному на Махькогр 96-луночном планшете ЙУЕСЕ или тУЕСЕ с целью максимально регенерировать связующие, а затем проводят сортинг в растворе с понижающейся концентрацией биотинилированного ЙУЕСЕ или тУЕСЕ в виде двух раздельных путей селекции. Концентрацию биотинилированного УЕСЕ выбирают с учётом начальной аффинности клона для того, чтобы проверить давления сортинга. Давление при селекции также повышается за счёт инкубации фаговых связующих с 1000-кратным избытком небиотинилированного антигена в растворе в течение различных периодов времени при различной температуре после начальной инкубации фаговой библиотеки с биотинилированным УЕСЕ и перед захватом покрытыми нейтравидином лунками 96луночного Махькогр планшета.
В качестве примера вышеописанного процесса С6 с аффинностью 1 нМ подвергают дальнейшему улучшению аффинности. В первом раунде сортинга используют метод захвата всех клонов, которые ещё связаны с УЕСЕ, твердой фазной, а затем, во втором раунде сортинга, фаговую библиотеку инкубируют с 1 нМ УЕСЕ. Затем используют связывание в растворе 1 нМ биотинилированного ЙУЕСЕ для того, чтобы выбрать большинство связующих. Перед захватом (улавливанием) добавляют 1 мкМ небиотинилированный ЙУЕСЕ и инкубируют при КТ в течение 15 мин, чтобы вытеснить в результате конкуренции быстро диссоциирующие связующие. Затем в следующих раундах сортинга (3-ий и 4-ый) подают большее давление селекции для сортинга в растворе, используя менее биотинилированный ЙУЕСЕ (0.1 нМ) для селекции и 100 нМ небиотинилированного ЙУЕСЕ при 37°С в течение 30 мин или более продолжительное время (2 или 6 ч), чтобы вытеснить в результате конкуренции связующие с высокой скоростью диссоциации и извлечь связующие с низкой скоростью диссоциации.
Такую же стратегию используют для улучшения клона В20, за исключением того, что используют менее жёсткие условия вследствие его более низкой аффинности против ЙУЕСЕ (1С50 - 150 нМ). Методы и условия селекции тУЕСЕ аналогичны методам и условиям, которые применялись в случае ЙУЕСЕ. Обогащение рассчитывают по отношению титров элюированного фага к селекции без биотинилированной мишени. После сортинга для быстрого скрининга клонов с улучшенной аффинностью используют описанный выше высокопроизводительный кшд1е-кро! анализ конкурентного связывания ЕЫ8А.
В данном анализе низкие количества ЙУЕСЕ или тУЕСЕ (10 нМ) применяют для скрининга 51 клона из фаговой библиотеки на основе С6 и 110 клонов из фаговой библиотеки на основе В20 с контрольными связующими дикого типа С6 апб В20.
Отбирают несколько улучшенных клонов С6, в целом названных вариантов С6-11, они проявляют заметно повышенную аффинность связывания как с человеческим, так и с мышиным УЕСЕ, более чем в сто раз более высокую, если сравнивать с величинами 1С50 клонов дикого типа (фиг. 7). Найдено, что клоны со многими уникальными последовательностями имеют повышенную аффинность, это наводит на мысль, что существует много лёгких цепей, которые могут разместить (приспособить) тяжёлую цепь выбранных клонов. Интересно также отметить, что меняются специфичности связывания некоторых клонов. Это позволяет думать, что лёгкая цепь способна модулировать взаимодействие тяжёлой цепи с её антигеном в степени, достаточной для изменения её специфичности. Что касается последовательностей клонов, большинство клонов С6-11 отличаются от С6 только в третьей области СОК лёгкой цепи (СПК-Ь3).
С целью генерации белка ЕаЬ или белка 1дС для анализов на аффинность и активность мы клонировали вариабельную область в плазмиду экспрессии ЕаЬ для экспрессии в Е.сой или клетку млекопитающего (фагмидный вектор, модифицированный с помощью делеции последовательности, кодирующей Сконцевой домен оболочечного белка фага р3, и добавления последовательности терминации для связывания с рибосомой, около 20 нуклеотидов 5'-3' от стоп-кодона на конце первого константного домена тяжёлой цепи). ЕаЬ белок генерируют, выращивая трансформированные клетки 34В8 Е.сой в средах АР5 при 30°С в течение 24 ч, как описано выше (Ргек!а, Ь. е! а1., (1997) Сапсег Кек 57: 4593-4599). 1дС очищают на колонках с протеином А, а ЕаЬ очищают аффинной хроматографией с применением протеина С. Как правило, выход ЕаЬ составляет 5-10 мг/л при выращивании в малых масштабах в колбах при встряхивании (вибрация) и 0.5-3 г/л при выращивании в ферментёре. Продукция 1дС достаточно высока, 10-50
- 39 012835 мг/л при культивировании в малых масштабах, с некоторыми различиями от клона к клону.
Три С6-11 улучшенных клона, С6-8, С6-23 и С6-31 (см. на фиг. 7 изменения в СОВ лёгкой цепи), выбирают для получения ЕаЬ белка с целью измерения аффинности, эпитопного картирования с помощью рецепторного связывания и изучения активности с помощью ингибирования роста НиУЕС. Для определения аффинности анти-тУЕСЕ ЕаЬ мы используем метод поверхностного плазмонного резонанса на В1Асоге™ - 2000 или В1Асоге™ - 3000 (В1Асоге, 1пс., Р1хса!а^ау, N1) при 25 и 37°С с иммобилизованными чипами тУЕСЕ или НУЕСЕ СМ5 при ~100 единицах ответа (относительных, гехропхе ипй, ВИ), как описано (СНеп, Υ., е! а1., (1999) I. Мо1. Вю1. 293: 865-881). Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (СМ5, В1Асоге 1пс.) активируют гидрохлоридом №этил-№-(3диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭС) и Ν-гидроксисукцинимидом (ΝΉ3) согласно инструкциям поставщика. Человеческий или мышиный УЕСЕ разбавляют 10 мМ ацетатом натрия, рН 4.8, до 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) перед инъекцией при скорости потока 5 мкл/мин, для достижения примерно 100 единиц ответа (относительных) (ВИ) связанного белка. Затем инъецируют 1М этаноламин для того, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения ЕаЬ (от 100 до 0.78 нМ или от 3 нМ до 500 нМ) инъецируют в РВЗ с 0.05% Т\уееп 20 (РВЗТ) при 25°С при скорости потока около 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (коп) и диссоциации (коГГ) рассчитывают, используя простую модель связывания Ленгмюра один к одному (В1Асогс Еуа1иа1юп ЗоП\уаге вариант 3.2), одновременной подгонкой сенсограмм (диаграмм чувствительности) ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Кб) рассчитывают как отношение коГГ/коп.
Так как С6 варианты с улучшенными коп аффинности не приводят к удовлетворительным статистическим данным с применением подходящей модели связывания по оценке методом В1Асоге, проводят также конкурентный анализ связывания в растворе с применением белков фагового дисплея для измерения относительной аффинности этих антител в равновесном состоянии. УЕСЕ, визуализованный на фаге, инкубируют в серийном разведении ЕаЬ при комнатной температуре в течение 20 ч до достижения равновесия, и несвязанный УЕСЕ-фаг быстро (10 мин) улавливают (захватывают) с помощью С6 ЕаЬ и измеряют с применением конъюгата анти-М13-НВР и субстрата ТМВ, как описано выше. Анализ конкурентного связывания в растворе проводят также во втором формате, при этом ЕаЬ визуализируют на фаге и он взаимодействует с разведениями УЕСЕ до достижения равновесия (20 ч), а несвязанный ЕаЬ улавливают УЕСЕ, нанесённым на 96-луночный планшет, и измеряют, как описано выше. Два значения 1С50 усредняют, получают аффинность связывания в виде конечных значений 1С50. Связывание ЕаЬ с тУЕСЕ анализируют только во втором формате, вследствие отсутствия реагента для визуализации тУЕЕС фага.
В начальных ЗРВ экспериментах отмечается значительное улучшение к<,п. Например, мы нашли, что С6-23 имеет наиболее значительное улучшение скорости ассоциации при 25 и при 37°С как против человеческого, так и против мышиного УЕСЕ, и малое уменьшение скорости диссоциации (фиг. 8). коп для С6-31 также улучшается по сравнению с С6 (данные не показаны). Кроме того, анализ конкурентного связывания в растворе подтверждает, что С-23 является клоном с наивысшей аффинностью с величиной 1С50 20 пМ против НУЕСЕ и тУЕСЕ (фиг. 7).
Также изучают тушение флуоресценции для определения скоростей коп антител ряда С6 с более высокой аффинностью. Таким образом, три ЕаЬ со зрелой аффинностью (С6-8, С6-23 и С6-31) очищают в виде ЕаЬ белков, и их аффинность к тУЕСЕ сравнивают с С6 методом тушения флуоресценции в растворе по скорости ассоциации (оп га!е, коп) (табл. 1 и фиг. 30А и В).
Таблица 1
Клон Аффинность
ко„ (ΙΟν1) 12.,,,(10%1) Κά (нМ)
Об 1.75 (1.93) 1.6 0.91
06-23 56.6 1.21 0.021
06-31 21.6 0.35 0.016
06-8 16.8 1.29 0.077
Тушение флуоресценции осуществляют следующим образом. Для определения скорости ассоциации используют изменение интенсивности флуоресценции при образовании комплекса ЕаЬ с УЕСЕ, как описано для определения скорости ассоциации вариантов ЕаЬ и УЕСЕ (Магут !З. апб Ьотап Н.В. (2003) ВюсНепихГгу 42: 7077-7083). Сначала мы на спектрофотометре 8000-серии ЗЬМ-Аттсо (ТНегтоЗрес1гошс), добавляя 100 нМ УЕСЕ в перемешиваемую кювету, содержащую 20 нМ ЕаЬ в РВЗ, рН 7.2, при 25°С, определяем, что интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 280 нм комплекса С6 (или варианты)-УЕСЕ ниже суммы отдельных компонентов. Затем, повышая концентрации УЕСЕ (100-400 нМ), смешивают его с равными объёмами 40 нМ ЕаЬ в спектрофотометре, снабжённом вводом с отключением (перекрыванием) потока (Ау1у 1пх!гитеп!х), для наблюдения за скоростью уменьшения интенсивности флуоресценции при 25°С. В каждом эксперименте делают девять измерений для каждой концентрации и строят одноэкспоненциальную кривую. Затем полученную скорость наносят на кривую псевдопервого порядка в зависимости от концентрации УЕСЕ, и угол наклона (тангенс) и есть скорость ассоциации. Проводят два-три независимых эксперимента, разница составляет в пределах 50%.
- 40 012835
Расчётные коп улучшенных клонов по методу 8РЕ в ~3-6 раз ниже величин, полученных методом тушения флуоресценции в растворе, тогда как измерения коп для ЕаЬ исходного С6 методом 8РЕ являются статистически надёжными с разницей в 1.2 раза по сравнению с методами флуоресцентного тушения. Возможно, применение 8РЕ метода на В1Асоге для измерений быстрой ассоциации ограничено сложной динамикой потока, или возможны некоторые отличия в поведении белков в исходном клоне и в клонах с улучшенной аффинностью, хотя в этих белках не наблюдается агрегации. На основании данных флуоресцентного анализа три ЕаЬ показывают увеличение скорости ассоциации по сравнению с С6 в 6, 8 или в 20 раз для С6-8, С6-31 или С6-23, соответственно. ЕаЬ-С6-31 также показывает ~4-кратное улучшение (увеличение) скорости диссоциации, и в результате аффинность ЕаЬ-С6-31 (Кб=16 пМ) и ЕаЬ-С6-23 (Кб=21 пМ) в ~40-60 раз выше по сравнению с исходным С6 (Кб=910 пМ). Это согласуется с данными конкурентного анализа в растворе, которые показывают 20-60-кратное улучшение величины 1С50 для С631 (30 пМ) или С6-23 (10 пМ) по сравнению с С6 (0.67 нМ). Мы применили стратегию созревания аффинности лёгкой цепи к пяти другим последовательностям тяжёлых цепей и наблюдали 10-30-кратное повышение аффинности (данные не показаны). В отличие от С6, многие улучшенные клоны принимают новые последовательности для всех трёх СОЕ областей лёгких цепей. Таким образом, мы нашли, что три С6 варианта повышают аффинность связывания как с человеческим, так и с мышиным УЕСЕ по сравнению с С6, преимущественно, за счёт повышения скорости ассоциации (оп га!е или коп). С6-23 имеет наивысшую скорость ассоциации, за ним следует С6-8, а потом С6-31. Увеличение скорости диссоциации (о££ га!е или ко££) составляет 2-3 раза для С6-23 и 8 или 13 раз для С6-31 в отношении 1УЕСЕ или тУЕСЕ соответственно. По сравнению с ЕаЬ-12 и Υ0317, С6 и С6-23 имеет заметно отличающуюся кинетику связывания (фиг. 32). С6-23 имеет величину Кб, аналогичную Υ0317, но более быструю кинетику с быстрой скоростью ассоциации более 10 (М-1с-1), и умеренной скоростью диссоциации (о££ га!е или ко££) 1-2х 10-4 с-1, тогда как Υ0317имеет медленную коп 3х 104 М-1с-1 и очень медленную ко££ ~5х 10-6с-1 (фиг. 32).
В методе конкурентного связывания в растворе применяют биотинилированный белок антигена, уравновешиваемый с серийными разведениями очищенных белков ЕаЬ или 1дС, и несвязанный биотинантиген захватывают (улавливают) иммобилизованными ЕаЬ или 1дС, нанесёнными на планшеты Мах1когЬ и детектируют НЕР, конъюгированной со стрептавидином. Или же белки ЕаЬ или 1дС уравновешивают с серийными разведениями белка антигена, а несвязанный ЕаЬ или 1дС улавливают с помощью иммобилизованного антигена и детектируют конъюгатом протеин А-НЕР.
Для анализа УЕСЕ рецепторного блокирования с применением очищенного ЕаЬ рецептор УЕСЕ иммобилизуют на планшете, непосредственно покрывая плёнкой Е11-1 ЕСО фрагмента (1д домен-5) (Е1!-1п1-к), или сначала покрывая антителом козы против человеческого 1дС Есу (1асккоп 1ттипоЕекеагс11 ЬаЬ. \Уек1 Сгоуе, РА), затем обрабатывая рецептором слияния КОЕ-1дС, который представляет КОЕ ЕСО (1д домен 1-7) в виде димера, на 96-луночном иммунопланшете Мах1когр. Затем планшет блокируют с помощью 0.5% В8А и 0.02% Тетееп 20. Концентрации ниже наномолярных биотинилированного 1УЕСЕ или тУЕСЕ с концентрацией 0.2 нМ инкубируют в трёхкратной серийном разведении анти-УЕСЕ ЕаЬ, С6, С6-11 (С6-8, 23, и 31), ЕаЬ-12 или Υ0317 в РВ8Т. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре, смеси переносят на планшет, содержащий УЕСЕ рецептор и инкубируют 10 мин. УЕСЕ-А, который не блокирован анти-УЕСЕ, улавливается в лунках, покрытых рецептором УЕСЕ, обнаруживается с помощью конъюгата стрептавидин-НЕР и проявляется субстратом ТМВ, как описано выше. Результаты показывают, что, по сравнению с исходным С6, отобранные С6-11 ЕаЬ действительно обладают повышенной блокирующей активностью как в отношении 1 УЕСЕ, так и в отношении тУЕСЕ. Сильное блокирование наблюдается в обоих клонах, С6 и В20, фагового дисплея, это наводит на мысль, что их эпитопы связывания на УЕСЕ перекрываются с эпитопами для рецепторов. Показано также, что С6 ЕаЬ эффективно блокирует связывание как человеческого, так и мышиного УЕСЕ с Е11-1 ЕСО (фиг. 31). Для сравнения, ЕаЬ-12 может блокировать связывание с рецептором только 1 УЕСЕ, но не тУЕСЕ, в соответствии со специфичностью связывания. Вариант ЕаЬ-12 с повышенной аффинностью к 1УЕСЕ (Кб=20 пМ), Υ0317, несомненно проявляет слабую аффинность к тУЕСЕ (Кб ~300 нМ при 25°С, Υ. С1еп апб Н. Ьо^тап, неопубликованные данные) и слабую рецептор-блокирующую активность в отношении тУЕСЕ при высоких концентрациях.
Ингибирование активности УЕСЕ в анализе роста эндотелиальных клеток (НиУЕС) осуществляют, как описано выше. Как и С6, С6-11 специфично ингибирует рост эндотелиальных клеток пупочной вены человека, стимулированный человеческим и мышиным УЕСЕ, но не рост, стимулированный человеческим основным фактором роста фибробластов (ЬЕСЕ). Концентрация, требующаяся для ингибирования 50% роста клеток, стимулированного как человеческим, так и мышиным УЕСЕ (НиУЕС 1С50), коррелирует с аффинностью, измеренной методами В1Асогс или связывания в растворе ЕЬ18А при 37°С. По сравнению с С6, С6-23 и С6-31 показывают по меньшей мере 100-кратное улучшение ингибирования роста НиУЕС, стимулированного 1УЕСЕ или тУЕСЕ. ЕаЬ-12 и Υ0317 ЕаЬ в тех же анализах служат в качестве контроля. ЕаЬ-12 не обнаруживает измеримого связывания с тУЕСЕ, тогда как Υ0317 ЕаЬ может связывать тУЕСЕ с аффинностью 350 нМ. Следовательно, как ожидалось, Υ0317 и ЕаЬ-12 не оказывают ингибирующего действия на опосредованный тУЕСЕ рост НИУЕС. Мы показали, что многие С6-11
- 41 012835 варианты с различной лёгкой цепью могут иметь повышенную (улучшенную) аффинность, а анализ связывания в растворе позволяет также прогнозировать результат эффективности в качестве ингибитора в анализе клеток НиУЕС.
Связывание Сб-23 с УЕСР сравнивают со связыванием Сб, а также РаЬ-12. как показано на фиг. 8, Сб-23 имеет значительно улучшенную скорость ассоциации при связывании как с НУЕСР, так и с тУЕСР. Хотя скорость диссоциации Сб-23 практически аналогична скорости диссоциации Сб, общая Кб Сб-23 по меньшей мере примерно в 7 раз лучше, чем Кб Сб как в отношении НУЕСР, так и в отношении тУЕСР.
Пример 2. Картирование сайтов связывания УЕСР на антителах Сб и Сб-23.
Функциональное картирование Сб и Сб-23 методом шотган аланин- и гомолог-сканирующего мутагенеза.
Функциональное картирование Сб и Сб-23 методом шотган аланин- и гомолог-сканирующего мутагенеза осуществляют для того, чтобы идентифицировать остатки, важные для связывания НУЕСР и нахождения остатков, которые можно улучшить дополнительно для связывания УЕСР. Мы получили комбинаторные фаговые библиотеки, которые делают возможным, чтобы СОК остатки тяжёлой цепи или лёгкой цепи в отдельных библиотеках были аланиновыми или дикого типа (аланин-сканирующий мутагенез), либо гомологичной аминокислотой или дикого типа (гомолог-сканирующий мутагенез).
Мутагенные олигонуклеотиды для шотган-сканирующих библиотек.
Следующие мутагенные олигонуклеотиды для создания шотган аланин (А)- и гомолог (Н)сканирующих библиотек для рандомизации остатков СОК в антителах Сб и Сб-23 создают с применением ранее описанных шотган-кодонов (Уа)бо5 е! а1. (2002) 1. Мо1. Βώ1 320: 415-428). Эквимолекулярная вырожденность ДНК представлена кодом ЮТ (К=С/Т, М=А/С, К=А/С, 8=С/С, У=А/С/С, ЭД=А/Т, Υ=Ο/Γ), а вырожденные кодоны представлены жирным шрифтом. Все следующие олигонуклеотиды получены в группе синтеза ДНК СепеШесН.
Олиго Последовательность
Н1-А ССА ОСТ ТСТ ССС ТТС АСС АТТ КСС СМТ КМТ К8С АТА САС ТОО СТС СОТ САО (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3)
Н2-А ААС ССС СТС САА ТСС ОТТ ССА С8Т АТТ ИСТ ССТ С8Т С8Т ОСТ КМТ АСТ КМТ ТАТ ОСС САТ АСТ СТС ААС ССС (КЕО ГО ΝΟ: 4)
НЗ-А АСТ ССС СТС ТАТ ТАТ ТОТ ОСА ССС ΚΥΤ С¥Т ΚΥΤ ΚΥΤ ЯСА КМТ ОСТ АТО ОАС ТАС ОСТ САА (5ЕО ГО ΝΟ: 5)
Ы-А АСС ТСС ССТ ССС АОТ ЯМА СМТ СУТ КСС КСТ СЯТ СТА ОСС ТОО ТАТ САА САС ААА С (5Е0 ГО ΝΟ: б)
Ь2-А ССО ААО СТТ СТС АТТ КМТ КСС ОСА ТСС ΚΥΤ СТС КМТ ТСТ СОА ОТС ССТ ТСТ СОС (5ЕС) ГО ΝΟ: 7)
БЗ-А1 ССА АСТ ТАТ ТАС ТОТ 8МА САА КСС КМТ КСТ КСТ ССТ ЯСА ТТС ОСА ХАС ООТ АСС (СЕО ГО ΝΟ: 8)
Ь3-А2 ССА АСТ ТАТ ТАС ТСТ КМА САА СЯТ КМТ СЯТ КМС ССТ К8С АСС ТТС ОСА САО ОСТ АСС (ЯЕО ГО ΝΟ: 9)
Н1-Н ОСА ОСТ ТСТ ОСС ТТС АСС КСС САМ Т\УС ΥΚΟ АТА САС ТОО ОТС ООТ САО (8ЕО ГО ΝΟ: 10)
Н2-Н ААС СЮС ССТ САА ТСС СТТ ССА СЯТ КТТ А8С 8СА КСТ СЯТ С8Т ТЗУС А8С ГЛУС ТАТ ССС САТ АСС СТС ААС ССС (8Е0 ГО ΝΟ: 11)
ΙΪ3-ΤΪ АСТ ССС СТС ТАТ ТАТ ТОТ ОСА ССС ГЛУС КТТ Т1УС ГЛУС МТС ЯСА ТЛЛС ССТ АТО ОАС ТАС ТОО ОСТ САА (ЯЕО ГО ΝΟ: 12)
ы-н АСС ТСС СОТ ССС АОТ 8АА САМ КТТ КСС А8С КСТ ОТА ОСС ТОО ТАТ САА САО ААА С (8Е<2 ГО ΝΟ: 13)
Е2-Н ССС ААО СТТ СТО АТТ ТЛУС КСС ОСА ТСС ТЛЛС СТС Т УГС ТСТ СОА ОТС ССТ ТСТ ССС (8Е0 ГО ΝΟ: 14)
Ι.3-Η1 ССА АСТ ТАТ ТАС ТСТ УАК УАК КСС 1ЛУС А8С АЯС ССТ ЯСА АСС ТТС ООА САО ООТ АСС (ЯЕО ГО ΝΟ: 15)
ЕЗ-Н2 ОСА АСТ ТАТ ТАС ТОТ УАК УАК СЯТ 1ЛУС КСТ КАС ССТ ТКС АСС ТТС ОСА САС СОТ АСС (ЗЕО ГО ΝΟ: 16)
Фагмидные векторы-матрицы для создания шотган-сканирующих библиотек.
(А) Фагмида рУ350-2Ь.
В качестве матрицы для создания шотган-сканирующей библиотеки тяжёлой цепи Сб служит фагмида рУ0350-2Ь, которую ранее использовали для визуализации 114Ό5 РаЬ, гуманизированного антитела против внеклеточного домена (ЕСЭ) ЕСР-родственного связывающего рецептора 2 (Έγ0Β2), моновалентно на поверхности М13 бактериофага, и содержащая стоп-кодон (ТАА) во всех трёх областях СОК тяжёлой цепи (Нс).
Более конкретно, фагмиду рУ0350-2Ь получают при использовании фагмиды р80б43. Фагмидный вектор, р80б43 (также известный как рйСНат-д3, например, патент США 5б88ббб, пример 8), содержит ориджины репликации рΒК322 и £1 и гены устойчивости к ампициллину, промотор щелочной фосфатазы Е.со11 (рНоА) (Βη55 е! а1., (1990) РгоЮиъ 8: 309-314) и последовательность, кодирующую сигнальную последовательность секреции 81П, слитую с остатками 1-191-человеческого гормона роста (НСН), и последовательность, кодирующую С-концевые остатки 2б7-421 протеина III фага М13 (далее в данном описании сР3 или рШ). Фагмида р80б43 также содержит сайт ХЬа! и амбер стоп-кодон после остатка 191 НСН. Сигнальная последовательность секреции зШ может экспортировать белок в периплазматическое про
- 42 012835 странство бактериальной клетки (например, участок лёгкой цепи (ЬС) антитела). Последовательность, кодирующую человеческий гормон роста (1ОН), удаляют из вектора р80б43 и заменяют на нуклеотидный фрагмент №П/ХЬа1, кодирующий фрагмент ЕаЬ гуманизированного антитела против Нег2 (последовательность ΜΌ5), лигированный в рамке считывания с сигналом секреции 51ΙΙ (НитАЬ4О5-8, см. Сайет е! а1., (1992) ΡΝΑ8 89: 4285-4289 или патент США 5821337, о последовательности). Амбер стопкодон между фрагментом тяжёлой цепи и сР3 удаляют (делеция), и показано, что эта модификация повышает уровни дисплея ЕаЬ на фаге.
Антитело 114Ω5 является гуманизированным антителом, которое специфично распознаёт ассоциированный с раком антиген, известный как Нег-2 (егЬВ2). Последовательность И4б5 получают полимеразной цепной реакцией, используя последовательность 1штАЬ4О5 вариант 8 (НнтАЬ4Э5-8) и праймеры, созданные таким образом, чтобы получить 5' ΝάΙ сайт и 3' ХЬа1 сайт в продукте ПЦР (РСК) (Сайет е! а1., (1992) ΡΝΑ8 89: 4285-4289). Продукт ПЦР расщепляют с применением ΝάΙ и ХЬа1 и лигируют в фагмидный вектор р80б43. Нуклеотидная последовательность 11405 кодирует модифицированные СЭК области мышиного моноклонального антитела, специфичного в отношении Нег-2, в каркасе ЕаЬ с большей частью человеческой согласованной последовательностью. Конкретно, последовательность содержит лёгкую цепь каппа (ЬС область) 3'-5' (против хода транскрипции) от доменов УН и СН1 (НС область). Способ получения антитела против Нег-2 и идентичность последовательностей вариабельных доменов представлены в патентах США 5821337 и б054297. Плазмиду р80б43, содержащую гуманизированное 4Ό5 (вариант 8), модифицируют далее. Например, эпитопный хвост гликопротеина Ό вируса герпеса типа 1 (дЬ хвост - МАОРХКЕКОКПЬОО (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 17)) добавляют в рамке считывания к С-концу ЬС, используя сайт-направленный мутагенез. После стоп-код она по ходу транскрипции от ЬС, сайт связывания рибосомы и нуклеотидную молекулу, кодирующую κίΙΙ сигнальную последовательность, лигируют с Ν-концом НС последовательности. Соответственно, последовательность НС находится в рамке считывания с С-концевым доменом р3 (сР3), минорного оболочечного белка фага М13. Таким образом, ЕаЬ, визуализованный (дисплей) на фаге, можно продуцировать при использовании одной конструкции. Этот ЕаЬ фагмидный вектор назван рУ0350-2Ь и схематически иллюстрируется на фиг. 1. Ген лёгкой цепи в рУ0350-2Ь модифицируют далее мутацией немногих других аминокислотных остатков, например Агдбб в О1у и 893 в А1а.
Для генерации Е(аЬ)'2, визуализируемого (дисплей) на фаге, вектор РУ0350-4 модифицируют далее, вводя последовательность димеризуемой лейциновой застёжки ОСЫ4 (ОКМКрЬЕПКУЕЕЬЬ8ККГНЬЕЫЕУАКЬККЬУОЕКО) (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18) между последовательностями НС и сР3 с помощью кассетного мутагенеза. ОСЫ4 лейциновая застёжка несёт два набора ЬС/НС-сР3 слитых полипептидов вместе в периплазме Е.той и презентирует димер на поверхности фага. Этот Е(аЬ)'2 фагмидный вектор, названный рУ0350-4, также схематически проиллюстрирован на фиг. 1.
Для конструкции шотган-сканирующей библиотеки тяжёлой цепи Об-23 создают фагмиду рV04482, вводя последовательность СОК-Ь3 Об-23 в фагмиду рУ0350-2Ь по методу мутагенеза Кункеля (Кипке1 е! а1., (1991) Ме11юб5 Еηζутο1 204: 125-139)). Фагмиду рV0448-1 также получают при использовании рУ0350-2Ь в качестве матрицы для шотган-сканирующей библиотеки лёгкой цепи Об и Об-23, которая содержит вариабельный домен тяжёлой цепи Об и стоп-кодон (ТАА) во всех трёх СЭК в лёгкой цепи.
Конструкция шотган-сканирующих библиотек.
Фаг-дисплейные библиотеки конструируют, используя описанный метод мутагенеза Кункеля (Кипке1 е! а1., 1991, см. выше). Всего создают восемь библиотек: 1сА-Об, ИсА-Об.23, 1сА-Об и 1сА-Об.23 являются аланин-сканирующими библиотеками тяжёлой цепи (1с) или лёгкой цепи (1с) Об и Об-23; 1сНОб, ИсН-Об.23, 1сН-Об, 1сН-Об.23 являются гомолог-сканирующими библиотеками. Репарацию матрицы, содержащей ТАА стоп-кодон во всех трёх областях СЭК тяжёлой или лёгкой цепей, осуществляют одновременно в ходе реакции мутагенеза с помощью вышеуказанных мутагенных олигонуклеотидов с применением созданных вырожденных кодонов. После мутагенеза проводят электропорацию 10 мкг ДНК в клетки Е.^Н 88320 (-1011 клеток) (81бйц е! а1., (2000) Ме11юб5 Еηζутο1 328: 333-3б3), которые выращивают в течение ночи при 30°С в бульоне 2ΥΧ дополненном хелперным фагом М13-КО7 (Νον Епд1апб Вю1аЬ§), 50 мкг/мл карбенициллина и канамицина. Размеры библиотеки составляют 2-5 х109. Фаг концентрируют из культуральных сред преципитацией с помощью РЕО(ПЭГ)/ЫаС1 и ресуспендируют в фосфатно-солевом буферном растворе (РВ8), как описано ранее (81бйц е! а1., 2000, см. выше).
Сортинг и скрининг библиотек.
Нацеленный белок, УЕОЕ, или антитело против дЬ хвоста (метки) (полученное исследовательскими группами Оепеп1есй) иммобилизуют на ΝυΝΕ (Кο8к^1бе, Ьептагк) 9б-луночных иммунопланшетах Мах^тр в течение ночи при 4°С, и перед сортингом планшеты блокируют альбумином бычьей сыворотки (В8А, 81дта) в течение 2 ч при комнатной температуре (КТ). Полученные выше фаговые библиотеки (~1013 фаг/мл) инкубируют в покрытых плёнкой мишени иммунопланшетах в течение 1 ч при КТ для того, чтобы обеспечить связывание фага. Затем планшеты отмывают 15 раз буфером РВ8 и 0.05% Т\\ееп 20 (Р8Т) и связанный фаг элюируют 15 мин 0.1 М раствором НС1 и нейтрализуют 1.0 М ТгЬ основанием. Элюированный фаг культивируют в Е^й ХЬЬЫие (81га1адепе) для следующего раунда селекции.
- 43 012835
Индивидуальные клоны, отобранные в результате второго раунда пэннинга, выращивают в 96луночном планшете в течение ночи при 37°С со 150 мкл бульона 2ΥΤ, дополненного 50 мкг/мл карбенициллина и хелперным фагом М13-УС8 (1:2500)(8!та1адепе). Культуральные супернатанты используют непосредственно в фаговых конкурентных твердофазных иммуноферментных анализах (фаговые ЕЫ8А) для скрининга функциональных фаг-дисплейных С6 или С6-23 ЕаЬ вариантов, связывающихся с нацеленными белками, нанесёнными на планшет (8ί61ιιι е! а1., 2000, см выше). Клоны, которые показывают позитивные результаты в фаговом ЕЬ18А в отношении УЕСЕ антигена и антитела против дО метки, подвергают анализу ДНК последовательностей.
Секвенирование и анализ ДНК.
Функциональные клоны, обнаруженные при описанном выше скрининге, выращивают в 96луночных планшетах со 100 мкл 2ΥΤ бульона и 50 мкг/мл карбенициллина при 37°С в течение 2 ч. Небольшое количество культуральных супернатантов (1~2 мкл) служит в качестве матриц при ПЦР (СепеАтр РСК® 8ук!ет 9700, Аррйеб ВюкуЧетк) для амплификации фрагментов фагмидной ДНК, содержащих гены лёгкой и тяжёлой цепей с секвенирующими праймерами для добавления М13 (-21) универсальных последовательностей на 5' конце амплифицированных фрагментов, тем самым облегчается применение М13 прямых праймеров в реакциях секвенирования. Амплифицированные фрагменты ДНК в 96-луночном формате секвенируют с применением набора для секвенирования В1д-Эуе !егтта!ог кес.|иепстд теасбопк и анализируют на АВ1 Рпкт 3700 96-капиллярном анализаторе ДНК (РЕ Вюкук!етк, Еок!ет Сйу, СА) в группе секвенирования ДНК Сепеп!есй. Последовательности анализируют с применением программы ЗССОиЫТ, как описано ранее (\Уе188 е! а1., (2000) РЫАЗ И8А 97: 8950-8954).
Функциональные клоны с нижеприведёнными в скобках номерами, отобранные из каждой библиотеки против УЕСЕ антигена, подвергают анализу ДНК последовательности: 1 сА-С6 (107), 1 сА С6-23 (124), 1сА-С6 (111), 1сА-С6-23 (102), 1сН-С6 (111), 1сН-С6-23 (135), 1сН-С6 (106), 1сН-С6-23 (97). Для клонов из селекции на связывание с антителом против др хвоста (метки): 1сА-С6 (108), 1сА-С6-23 (130), 1сА-С6 (116), 1сА-С6-23 (98), 1сН-С6 (120), 1сН-С6-23 (122), 1сН-С6 (111), 1сН-С6-23 (102).
Точковые мутации и измерение аффинности ЕаЬ С6 и С6-23.
Для генерации мутантов С6 и С6-23 ЕаЬ для измерений аффинности мы используем модифицированную ранее плазмиду экспрессии ЕаЬ из фаг-дисплейного вектора с применением промотора щелочной фосфатазы Е.сой (р1оА) (Ртек!а е! а1., (1997) Сапсег Кек 57: 4593-4599). Каждую точковую мутацию конструируют методом сайт-направленного мутагенеза Кункеля (Кипке1) (Кипке1 е! а1., 1991, см. выше) с применением олигонуклеотидов, созданных таким образом, чтобы в областях СОК была точковая мутация. Для получения мутантов плазмиды экспрессии трансформируют в 34В8 Е.со11 и отбирают единичную колонию и выращивают в полной среде С.К.А.Р. (Ргек!а е! а1., 1997, см. выше), дополненной 25 мкг/мл карбенициллина, при 30°С в течение 24 ч. Экспрессированные рекомбинантные белки очищают, пропуская через колонку с протеином С с высокой степенью очистки (Атегкйат РНагтааа) и определяют количественно УФ-спектроскопией при 280 нм (Ргек!а е! а1., 1997, см. выше). Аффинности связывания мутантов С6 и С6-23 ЕаЬ оценивают методом конкурентного связывания в растворе ЕЬ18А с фагом, визуализирующим 1 УЕСЕ, как описано. Кратное уменьшение активности связывания фага дикого типа, визуализующего УЕСЕ, вызванное каждой точковой мутацией, определяют как частное от деления 1С50 для С6 или С6-23 точковой мутации на 1С50 дикого типа С6 или С6-23 ЕаЬ, соответственно.
Анализ связывания В1АСОКЕ™ для ЕаЬС6 и С6-23 вариантов.
Для кинетики связывания мы используем измерения методом поверхностного плазмонного резонанса (8КР) с применением В1Асоге™ - 3000 (В1Асоге, 1пс., Р1кса!а^ау, N1), описанные ранее (Каг1ккоп & Еай, (1997) 1 1ттипо1 Ме!йобк 200: 121-133). Биосенсорные датчики (чипы) на основе карбоксиметилированного декстрана (СМ5, В1Асоге 1пс,) активируют №этил-№-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлоридом (ЕЭС) и Ν-гидроксисукцинимидом (ΝΗ8) согласно инструкциям изготовителя. Человеческий УЕСЕ (1УЕСЕ) разводят 10 мМ ацетата натрия, рН 4.8, до 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/мин для достижения примерно 100 единиц ответа (относительных единиц, КИ) связанного белка. Затем вводят 1М этаноламина для того, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные разведения С6 или С6-23 ЕаЬ вариантов (от 0.7 нМ до 100 нМ) инъецируют в РВ8 с 0.05% Т\тееп 20 (РВ8Т) при 25°С при скорости потока 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (коп) и скорости диссоциации (ко[1) рассчитывают, используя простую модель связывания Ленгмюра один к одному (В1Асоге Еуа1иа!юп 8оП\таге уегкюп 3.2). Константу равновесной диссоциации (Кб) рассчитывают как отношение ко£(/коп. Исходя из селекции фаговой библиотеки, по-видимому, два остатка в 0ΌΡ2 тяжёлой цепи, предпочтительно, должны быть аланином или гомологичной аминокислотой: НС-У58 предпочтительно должен быть аланином, НС-151 предпочтительно должен быть валином для связывания УЕСЕ. Следовательно, мы получили мутантный белок ЕаЬ с единичной мутацией для подтверждения выводов (данных) из фаговых библиотек. На верхней диаграмме фиг. 9 видно, что анализ В1Асоге показывает, что мутация С6-23-У58А (С6-23.1) (50 нМ) при связывании с чипом, покрытым УЕСЕ, улучшает скорость ассоциации при связывании по сравнению сС6-23, который уже имеет значительно улучшенную скорость ассоциации по сравнению с С6. На нижней диаграмме показан В1Асогс
- 44 012835 анализ мутантного С6-У58А (С6-1) или С6-151У (С6-2) с чипом, покрытым УЕСР. Оба имеют улучшенную скорость (константу) ассоциации по сравнению с С6. На самом деле, двойной мутант (Υ 58А/151У) оказывает аддитивное действие на улучшение скорости ассоциации С6 и С6-23.
Результаты шотган-сканирования С6 и С6-23.
Результаты обоих экспериментов шотган-сканирования антител С6 и С6-23 показывают, что боковые цепи СОК тяжёлых цепей доминируют во взаимодействиях связывания с ЬУЕСР. При картировании на рентгеновскую кристаллическую структуру С6 РаЬ функционально важные остатки в комбинации представляют участок структурного эпитопа, который определяется остатками, находящимися в прямом контакте с ЬУЕСР. Результаты шотган аланин-сканирующего мутагенеза выявляют функциональный эпитоп, содержащий экспонированный с растворителем (доступный для растворителя) гребень, который состоит из остатков Υ32, ^33, С54, У96, Р97, Р98, Ь99 и Υ100а на тяжёлой цепи и Υ49 на лёгкой цепи. Интересно, что число функционально важных остатков, выявленных с применением шотган гомологсканирующего мутагенеза значительно меньше и содержится в группе функционально важных остатков, выявленных при использовании шотган аланин-сканирующего мутагенеза. Этими горячими точками являются ^33, С54, У97 и Ь99, которые составляют небольшой пэтч, перекрывающийся при обоих сканированиях, наводя на мысль, что эта поверхность находится в близком (точном) контакте с антигеном ЬУЕСР, так что даже замены на гомологичные аминокислоты являются деструктивными. С55 заменяют на аланин только при гомолог-сканирующем мутагенезе, и эта замена оказывается высокодеструктивной, так что мы полагаем, что С55 также входит в этот пэтч.
Другие функционально важные остатки, выявленные при обоих методах сканирования на тяжёлой цепи, С50 и Т52, не являются частью поверхности С6, экспонируемой с растворителем, так как они согласно информации о структуре заглублены внутрь (скрыты внутри), играя роль каркасных (леса) боковых цепей, которые упакованы напротив остатков в функциональном эпитопе, чтобы поддерживать этот эпитоп в конформации, компетентной в отношении связывания (С. ^езтагт, неопубликованные данные). Что касается Р95 в СОК-Н3 С6, определённо аланиновая замена в этом положении при аланинсканирующем мутагенезе является деструктивной; тем не менее, этот остаток способен выдержать замену на тирозин при гомолог-сканирующем мутагенезе, это наводит на мысль, что его роль состоит в сохранении структурной целостности антигенсвязывающего сайта, что также подтверждается структурной информацией.
Относительно Υ32, Р98 и Υ100а структурная информация демонстрирует, что эти остатки поверхности являются решающими и представляют 30% общей площади скрытой поверхности тяжёлой цепи при связывании ЬУЕСР. Аланиновые замены в этих остатках определённо являются деструктивными для аффинности со значительными отношениями функций (Рте4/ти!) более 30, но интересно отметить, что они резистентны к заменам на гомологичные аминокислоты (Туг вместо РЬе и наоборот), это наводит на мысль, что ароматические кольца для этих положений осуществляют важные взаимодействия с ЬУЕСР антигеном, а добавление или удаление гидроксильной группы не оказывает большого влияния, в этом отличие от вышеописанных каркасных остатков.
Оба метода шотган-эксперимента сканирующего мутагенеза позволяют определить новые мутации в тяжёлой цепи для дальнейшего улучшения аффинности, а именно, 151У и Υ58А. Эти любопытные наблюдения подтверждают, получая точковые мутанты РаЬ и проверяя аффинность связывания методами конкурентного анализа ЕЫ8А и В1Асоге™ (фиг. 23 и фиг. 18). Так как 151У и Υ58А не являются членами структурного эпитопа (С. ^езтапщ неопубликованные данные), то было высказано предположение, что улучшение аффинности, особенно константы (скорости) ассоциации, с помощью единичной или двойной мутации вызвано не введением нового контакта с антигеном ЬУЕСР, но, вероятно, оптимизацией структурной целостности петли СОК-2Н, что делает её более компетентной для связывания с антигеном.
С учётом структурного эпитопа остатки СОК лёгкой цепи С6 представляют 25% общей поверхности структурного эпитопа (878 Ангстрем2) (С. ^езтапщ неопубликованные данные). Интересно отметить, что единственным остатком, который обнаруживается как функционально важный в обоих шотгансканированиях, является Υ49 в СОК-Ь2, занимающий только 2% общей поверхности структурного эпитопа, это означает, что большинство остатков структурного эпитопа в лёгкой цепи не участвует в энергетическом контакте с ЬУЕСР антигеном. Эти данные предполагают, что лёгкая цепь С6 более важна с точки зрения структурной, нежели функциональной, так как она всё ещё сохраняет ту же последовательность, что и 4Ό5, матрица используемая для визуализации библиотеки антител на фаге, из которого первым делом выделяют С6 (СаПег е! а1., 1992).
Пример 3. Антитела, образованные из С6 и С6-23.
(а) Библиотеки для селекции.
Дополнительные антитела против УЕСР получают сортингом фага из полученных шотган аланини гомолог-сканирующих библиотек, описанных в примере 2. В частности, допускают, что в конкретных остатках сканированные остатки могут быть либо остатком дикого типа, либо аланином (аланинсканирующий мутагенез), либо остатком дикого типа, либо гомологом (гомолог-сканирующий мутагенез) (фиг. 14А и В). Для С6 шотган аланин- и гомолог-сканирующий мутагенез осуществляют отдельно в лёгкой цепи и тяжёлой цепи С6, в результате получают четыре библиотеки. Для С623 шотган аланин- и
- 45 012835 гомолог-сканирующий мутагенез осуществляют в лёгкой цепи С623, а шотган гомолог-сканирующий мутагенез осуществляют в тяжёлой цепи С623, в результате получают три библиотеки. Шотган аланинсканирующую библиотеку С623 не создают потому, что, как обсуждалось выше, С623 является высокоаффинным антителом, причём большинство его остатков являются важными для связывания, расположенными в тяжёлой цепи. Мутация остатков тяжёлой цепи в аланин, что означает усечение боковых цепей аминокислот тяжёлых цепей, наиболее вероятно, разрушило бы связывание и привело бы к вариантам с более низкой аффинностью.
(б) Селекция антител против УЕСЕ.
В первом раунде для селекции используют стратегию сортинга в планшетах. Человеческий УЕСЕ (ЕУЕСЕ, предоставленный СепеШесй Векеагск Сгоирк) иммобилизуют на 96-луночных иммунопланшетах Мах1когр (ШиШС) инкубацией лунок с 5 мкг/мл белка-мишени в течение ночи при 4°С. Планшеты блокируют 1% альбумином бычьей сыворотки (В8А, 81дта) в течение 30 мин при ВТ, после чего прибавляют 1% Ттеееп 20 и выдерживают ещё 30 мин. Описанные выше фаговые библиотеки инкубируют на иммунопланшетах, покрытых ЕУЕСЕ, при концентрации ~1Е13 фага/мл в течение 1 ч при ВТ при перемешивании, чтобы обеспечить связывание фаг-дисплейного ЕаЬ с мишенью. После связывания планшеты отмывают 15 раз с помощью РВ8, дополненного 0.05% Ттеееп 20. Связанный фаг элюируют, инкубируя лунки с 0.1М НС1 в течение 30 мин. Элюаты нейтрализуют 1.0 М Тпк основанием, рН 11. Е.со11 ХЬ1Ь1ие (81га!адепе) инфицируют элюированным фагом и М13-К07 хелперным фагом (Шете Епд1апб Вю1аЬк). Фаг выращивают в течение ночи для следующего раунда селекции.
Бактериальную культуру центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 мин на центрифуге 8огуа11 С8А при 4°С и супернатанты объединяют. Фаг осаждают из сред, добавляя 1/5 объёма РЕС/ШаС1. Инкубируют 5 мин на льду и фаг, содержащий культуральные среды, центрифугируют при 10 тыс. об/мин в течение 15 мин на центрифуге 8огуа11 С8А при 4°С и супернатант отбрасывают. Оставшиеся пеллеты (осадок) фага ресуспендируют в РВ8 и центрифугируют при 15 тыс. об/мин в течение 5 мин на центрифуге 88-34 центрифуге при 4°С для осаждения нерастворимого материала. Супернатант переносят в новую пробирку и концентрацию фага определяют по оптической плотности при 268 нм.
Следующие раунды сортинга осуществляют сортингом в растворе, повышая жёсткость условий. Очищенный фаг инкубируют с биотинилированным ЕУЕСЕ в течение 1 ч при ВТ в РВ8 с 0.05% Ттеееп 20 и 0.5% 8ирегЬ1оск (Р1егсе). После 3-10-кратного разведения суперблоком смесь добавляют в лунки, покрытые нейтравидином, блокированным 1% В8А (81дта) и Ттеееп 20. Конъюгированный с ЕУЕСЕ биотин оставляют связывать иммобилизованный нейтравидин в течение 10 мин. После захвата (улавливания) планшеты отмывают 10-15 раз с помощью 0.05% Ттеееп 20 в РВ8. Для определения фонового, т.е. неспецифического, связывания на фаге с нейтравидином в покрытые лунки добавляют контрольную реакционную смесь, не содержащую ЕУЕСЕ. Жёсткость (условий) повышают с каждым раундом, понижая концентрацию антигена в растворе, а также концентрацию фага или повышая температуру. Увеличение числа отмываний также является способом достижения более жёстких условий. Для третьего и четвёртого раунда сортинга небиотинилированный ЕУЕСЕ добавляют к реакционной смеси биотин-ЕУЕСЕ и библиотечного фага для конкуренции с низкоаффинными связующими. Добавляя 1000-кратный избыток конкурента за 30 мин при 37°С перед захватом (улавливанием), можно дополнительно повышать жёсткость в последних раундах, чтобы выбрать связующие с высокой аффинностью. Манипулируя со связыванием и числом захватов (улавливаний), можно дополнительно от раунда к раунду повышать жёсткость условий.
В случае С623 начальная концентрация биотинилированного ЕУЕСЕ составляет 1 нМ для шотган библиотеки тяжёлой цепи и 0.2 нМ для шотган-сканирующей библиотеки лёгкой цепи. Концентрацию понижают до 0.5 нМ и 0.1 нМ, соответственно, в последнем раунде. В случае С6, имеющего более низкую начальную аффинность, чем С623, сортинг библиотеки проводят в менее жёстких начальных условиях: 5 нМ для библиотек тяжёлых цепей и 2 нМ для библиотек лёгких цепей, которые понижают до 1.75 и 0.5 нМ соответственно в последнем раунде сортинга.
Для изучения обогащения ЕУЕСЕ-специфичных ЕаЬ, визуализуемых на фаге, 90 мкл Е.со11 ХЬ-Ыие (81га!адепе) инфицируют с помощью 10 мкл фага, элюированного из реакционных смесей после связывания захваченных (уловленных) библиотек, а также контрольных (фон) смесей в течение 30 мин при 37°С. 5 мкл культуры помещают в планшеты с карбенициллином и инкубируют при 37°С в течение ночи. Число фаговых частиц в элюате можно рассчитать, исходя из числа колоний при каждой элюции. После последних двух раундов сортинга 50 мкл вышеуказанной культуры фагмидсодержащий бактерий помещают в планшеты, дополненные карбенициллином, и выращивают в течение ночи при 37°С. Полученные клоны подвергают скринингу.
(в) 81пд1е-кро1 конкурентный анализ ЕЫ8А.
Для скрининга на высокоаффинные клоны проводят 81пд1е-кро1 конкурентный анализ ЕЫ8А в 96луночном формате. Для обоих антител произвольно выбирают около ста клонов из последних двух раундов селекции и подвергают скринингу этим методом. Клоны Е.со11 ХЬ1-Ь1ие, содержащие фагмиды, выращивают в 400 мкл густого 2УΤ бульона, дополненного карбенициллином и хелперным фагом М13- 46 012835
К07 (№\ν Епд1апб В1о1аЬк). встряхивая в течение ночи при 37°С. Культуральный супернатант каждого клона разводят пять раз с помощью 0.05% Тггееп 20 и 0.5% В8А в РВ8 с добавлением или без добавления 11УЕ0Е. Инкубируют 1 ч. встряхивая при ВТ. 80 мкл реакционной смеси переносят в иммунопланшеты. покрытые плёнкой 11УЕ0Е. и инкубируют 10 мин. Планшет отмывают 8 раз 0.05% Тетееп 20 в РВ8 и инкубируют 30 мин со 100 мкл конъюгата антитела против М13 с пероксидазой хрена (№\ν Епд1апб Вю1аЬ§). разведённого в 5000 раз в РВ8. дополненном 0.05% Тггееп 20 и 0.5% альбумином бычьей сыворотки (81дта). Планшеты отмывают ещё 8 раз и проявляют ТМВ субстратом в течение 5 мин. Реакцию прекращают. добавляя 1.0 М Н3РО4 и считывают на спектрофотометре при 450 нм. Для оценки относительной аффинности рассчитывают отношение оптической плотности в присутствии 11УЕ0Е к оптической плотности в отсутствие 11УЕ0Е. Низкое отношение наводит на мысль. что большинство ЕаЬ визуализуется на связанном с ЬУЕ0Е фаге в растворе. В результате небольшое количество ЕаЬ может связываться с 11УЕ0Е. иммобилизованным на иммунопланшете. Отбирают клоны. у которых отношение ниже дикого типа (^Т) 06 или 0623. и их супернатанты используют для заражения ХЬ1-Ь1ие. Штриховые культуры содержащих фагмиды бактерий наносят на планшеты с карбенициллином и выращивают в течение ночи при 37°С для секвенирования.
Селекция библиотек тяжёлой цепи 06 даёт в результате не более трёх уникальных последовательностей вне анализированных 33 клонов. это предполагает. что большинство изменений в тяжёлой цепи 06 приводит к утрате аффинности связывания. Кроме того. все уникальные варианты тяжёлой цепи получены из гомолог-сканирующей библиотеки. По-видимому. аланиновая мутация остатков тяжёлой цепи 06 может привести к резкой утрате связывания. Интолерантность к изменениям при селекции аминокислотных последовательностей подтверждает точку зрения. что тяжёлая цепь 06 содержит много остатков. важных (ключевых) для связывания с УЕ0Е. Результаты 5тд1е-5ро1 анализа приведены в табл. 2.
Таблица 2
Результаты 8ш§1е- 0623 06
βροί анализа
Библиотека ЬСА1а ЬСНот НС Нот ЬС А1а и Нот НС А1а и Нот
Число клонов для £4 84 88 88 96
скрининга
Критерии селекции Клоны со значительно более низким отношением
(Сигнал +1гУЕ0Е/ Сигнал -ЬУЕОЕ), чем \УТ
Усечение (Си! Ой) Си1 ой = 2-кратное уменьшение Сиг о£Г= 5- СиГой=УУТ
разрезание кратное отношение
уменьшение
Число клонов с 33 17 29 56 33
отношением < 5¥Т
Число уникальных 17 12 18 53 3
клонов ..... ....... .................
Результаты 5тд1е-5ро1 анализа вариантов 06 и 0623. Аналогичные критерии селекции применяют для обеих библиотек. Однако более низкое значение си! о££ используют для библиотеки 06 ЬС по сравнению с библиотекой 06 НС. так как ожидалось. что НС варианты покажут меньшее улучшение аффинности по сравнению с ^Т. чем ЬС варианты. 06 аланин- и гомолог-сканирующие библиотеки объединяют перед скринингом вариантов тяжёлой и лёгкой цепи. Число уникальных клонов из выбранного пула определяют секвенированием ДНК. ЬС=лёгкая цепь. НС=тяжёлая цепь. \АТ=дикого типа. Нот=гомолог-сканирующая библиотека. А1а=аланин-сканирующая библиотека.
(г) Секвенирование и анализ ДНК.
Клоны. отобранные методом Цпд1е-8ро! скрининга. выращивают в 96-луночных планшетах со 100 мкл бульона 2УТ. дополненного карбенициллином. в течение 2 ч. 1 мкл культуры подвергают ПЦР (РСВ) (0епеАтр® РСВ 8у5!ет 9700. АррНеб ВюкуЧетк) для амплификации ДНК. кодирующей лёгкую цепь или тяжёлую цепь различных клонов. Праймеры. используемые при ПЦР. созданы таким образом. чтобы добавлять М13 универсальные последовательности на 5' конце амплифицированного фрагмента. С помощью добавления этой последовательности прямые праймеры М13 можно использовать в последующих реакциях секвенирования. После амплификации в 96-луночном формате фрагменты ДНК секвенируют в группе секвенирования ДНК 0епеп!есН применением набора для секвенирования В1д-0уе !егтша!ог 5ес.|иепстд геасйопк и анализируют на ΑΒI РгЬш 3700 96-капиллярном анализаторе ДНК (РЕ Вю5у51ет5. Ео51ег Сл(у. СА). Последовательности тяжёлой и лёгкой цепей выравнивают и идентичные последовательности выделяют. На основании их последовательности отбирают клоны для определения аффинности с помощью измерения ТС50.
(д) Измерение аффинности фаговых клонов.
Значения Ιί.\0 для фаговых клонов определяют конкурентным фаговым ЕЫ8А. Единичную колонию выбранных клонов выращивают в 5 мл сред 2УТ. дополненных 50 мкг/мл карбенициллина. в тече
- 47 012835 ние 5 ч. Затем культуру инфицируют хелперным фагом М13-К07 (Νο\ν Епдктб В1о1аЬ§) в течение 1 ч и переносят в 25 мл культуры, дополненной 50 мкг/мл карбенициллина и 50 мкг/мл канамицина. Фаг выращивают в течение ночи при 37°С. После очистки фага, как описано выше, фаг серийно разводят с помощью 0.05% Т\геег1 20 и 0.5% В8А в РВ8 и инкубируют на иммунопланшете, покрытом 1УЕСЕ, для оценки связывания антигена при различных концентрациях фага. Разведение фага, которое даёт ~70% насыщающего сигнала, используют в анализе определения 1С50. Фаг инкубируют с возрастающей концентрацией 1УЕСЕ в течение ночи при 37°С. Несвязанный фаг захватывают на иммунопланшете, покрытом 1УЕСЕ, в течение 10 мин. Планшет отмывают и связанный фаг детектируют с помощью конъюгата антитела против М13 с пероксидазой хрена (Νο\ν Епдктб Вю1аЬ§) с последующим проявлением ТМВ, как описано выше. Концентрация 1 УЕСЕ, которая ингибирует 50% связывания фага с иммобилизованным антигеном, представляет собой 1С50. Строят график: сигналы, которые указывают на связывание фага, в зависимости от концентрации 1 УЕСЕ, и эти данные хорошо ложатся на кривую конкурентного связывания, построенную методами нелинейной регрессии, что позволяет определять 1С50.
На фиг. 34 и 35 представлены значения 1С50 вариантов С6 и С6-23, соответственно, а также изменения в последовательностях по сравнению с С6 или С6-23. Из пула С6 идентифицируют много связующих с явно лучшей аффинностью, чем С6 дикого типа. Много вариантов С6 с большей аффинностью получают из гомолог-сканирующей библиотеки лёгкой цепи (фиг. 34А). Однако из гомолог-сканирующей библиотеки тяжёлой цепи выбирают два варианта С6 с более высокой аффинностью (фиг. 34В).
Некоторые С6 проявляют повышение аффинности до стократного, судя по определению 1С50. Немногие выбранные варианты тяжёлой цепи С6 отличаются несколькими (небольшим количеством) остатками от дикого типа С6. Эти мутации тяжёлой цепи локализованы в СОК-Н1 и СЭК-Н2. Консервативная природа тяжёлой цепи и, в частности, СЭК.-Н3 подтверждает, что большинство остатков, важных для связывания С6 с 1УЕСЕ, находятся в этой области. Значительно больше мутаций в лёгкой цепи С6 вариантов. Они расположены, главным образом, в областях СОК-Б1 и СПК-Ь3, это указывает, что изменяющиеся остатки СОК-Б2 ослабляют связывание вместо того, чтобы повышать аффинность. Повидимому, комбинация мутаций в СЭК-БЗ и СОК-Б3 является предпочтительной для связывания, что делает возможным значительное улучшение аффинности по сравнению с антителом дикого типа.
Большинство вариантов С623 проявляют сходную или слегка пониженную аффинность по сравнению с антителом дикого типа в соответствии с их значениями 1С50 (фиг. 35). Варианты с наилучшей аффинностью получены как в из гомолог- так из аланин-сканирующей шотган библиотеки лёгкой цепи. Только малое число связующих с высокой аффинностью идентифицируют в пуле шотган-сканирующей библиотеки тяжёлой цепи. Что касается С6, остатки тяжёлой цепи являются консервативными, и только немного мутаций имеется в исследованных клонах. У вариантов лёгкой цепи наблюдается паттерн мутаций, сходный с С6 вариантами, а именно, большинство мутаций локализовано в областях СЭК-БЗ и СОК-Б3.
Пример 4. Аланин-сканирующий мутагенез 1УЕСЕ с целью картирования сайтов связывания антитела против УЕСЕ.
Для того чтобы понять молекулярные принципы кросс-реактивности С6 и С6-23 и для картирования их функциональных эпитопов, определяют относительные аффинности связывания С6 или С6-23 ЕаЬ для отдельных 1УЕСЕ мутантов с аланиновой заменой по сравнению с 1УЕСЕ дикого типа, применяя визуализирующий 1УЕСЕ фаговый ЕЫ8А, описанный ранее (Ми11ег е1 а1., (1997) РНА8 И8А 94: 7192-7197). Мутации 1УЕСЕ осуществляют в сайтах около антитело-связывающих эпитопов Е13-1, ΚΌΚ, антитела АгаЧт™ и Υ0317 по методу мутагенеза Кункеля (Κиηке1) и фаговый дисплей отдельного мутанта провидят, как описано ранее (Ми11ег е1 а1., (1997) РNΑ8 И8А 94: 7192-7197). Фаговый анализ ЕЫ8А связывания в растворе используют для определения относительной аффинности связывания каждого УЕСЕ мутанта по сравнению с дикого типа (\\3) УЕСЕ с ЕаЬ С6-23, С6-23. Коротко говоря, 96луночные иммунопланшеты МахЕогр (ΝϋΝΟ) покрывают в течение ночи при 4°С плёнкой С6 или С6-23 ЕаЬ с концентрацией 2 мкг/мл в РВ8, и блокируют с помощью РВ8, 0.5% В8А и 0.05% Т\геег1 20 (РВТ) в течение 2 ч при комнатной температуре. Серийные разведения фаг-дисплейных мутантов 1УЕСЕ в РВТ сначала инкубируют на покрытых С6-ЕаЬ планшетах в течение 15 мин при комнатной температуре, и планшеты отмывают РВ8, 0.05% Т\гее1'1 20 (РВ8Т). Связанный фаг детектируют с помощью конъюгата моноклонального антитела против М13 с пероксидазой хрена (Атегайат Рйагтааа), разведённого 1:5000 в РВТ, проявляют субстратом 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ, ЕЗгкедаагб & Репу ЬаЬ§, СаййегаЬшд, МО) примерно 5 мин, разбавляют (гасят) 1.0 М Н3РО4 и читают на спектрофотометре при 450 нм. Рассчитывают величины относительной 1С50 (1С50,А1а/1С50,„1) для определения кратности снижения аффинности связывания и оценки энергетического вклада индивидуальных боковых цепей 1 УЕСЕ во взаимодействие с С6 или С6-23 ЕаЬ.
Отношения 1С50 представляют энергетический вклад индивидуальной боковой цепи во взаимодействие с С6 ЕаЬ (фиг. 19). Общий фолдинг аланиновых мутантов, в особенности тех, у которых значительно ослаблено (понижено) связывание с С6, подтверждают их связыванием, близким к связыванию белка дикого типа, с другими молекулами, которые имеют различные эпитопы на УЕСЕ, такие как антитело Ανа8ΐ^η™, Υ0317 или Е13-1, картированные ранее (фиг. 19). Очевидно, что С6 имеет отдельный эпи
- 48 012835 топ по сравнению с антителом АуаШп™, продуцируемым гибридомой. Все функционально важные для связывания с 06 остатки 1УЕ0Е являются консервативными для человеческого и мышиного УЕ0Е, что частично объясняет их кросс-реактивность. С другой стороны, ЕаЬ антитела АуаШп™ (ЕаЬ-12) и Υ0317, утрачивают большую часть связывания с УЕ0Е с аланиновой заменой остатка 01у88, который представляет собой 3ег в тУЕ0Е. Для визуализации эпитопа на молекуле УЕ0Е функционально важные остатки для связывания с 06 выделяют на поверхности кристаллической структуры 1УЕ0Е в соответствии с их относительными к 06. Эпитоп 06, картированный к пэтчу, который является консервативным для человеческого и мышиного УЕ0Е и отмечен (очерчен) несколькими энергетически важными остатками, Р1е17, Туг21, Туг25, Пе83 и 01п89, которые находятся в тесной близости друг с другом (кластер). Это является показателем функционального эпитопа со взаимодействием горячая точка.
Далее мы сравниваем функциональный эпитоп 06 со структурным эпитопом ЕаЬ-12 (то же, что и Υ0317) или Е1!-Э2, остатками УЕ0Е, которые становятся скрытыми при образовании комплекса с этими молекулами. Интересно отметить, что функциональный эпитоп 06 на УЕ0Е совпадает со структурным эпитопом Ε11-1Ό2 более близко, чем структурный эпитоп ЕаЬ-12. Далее, 06 имеет общую сходную горячую точку, что и Е1!-1 для УЕ0Е, так как остатки Р1е17, Туг21 и Туг25 являются в высшей степени энергетически важными для обоих взаимодействий (фиг. 19). С другой стороны, ЕаЬ-12 или
Υ0317сосредоточен на неконсервативном и функционально важном остатке, 01у88, что, как полагают, является причиной отсутствия его связывания с тУЕ0Е. По-видимому, полученное из фаговой библиотеки антитело 06 нацеливает консервативный эпитоп на УЕ0Е почти так же, как УЕ0Е рецептор, тогда как гибридома для 1 УЕ0Е избегает генерирования аутореактивного антимышиного антитела. Однако существует достаточное перекрывание между двумя эпитопами 06 и ЕаЬ-12, так как связывание 06 и ЕаЬ-12 (Υ0317) с 1УЕ0Е взаимно эксклюзивным (данные не показаны).
Сравнение важных сайтов на 1УЕ0Е для связывания 06 и 06-23 показывает, что остатки, вносящий наибольший энергетический вклад, Е17, Υ21 и Υ25 на спирали из 20-30 остатков, и Ц89А на петле из 8090 остатков, остаются теми же самыми, за исключением того, что, по-видимому, при связывании изменяется воздействие (эффект) остатков (фиг. 19). Например, замена на аланин остатков Υ21 и Ц89 гораздо важнее для (сильнее влияет на) 06-23, чем для 06. Имеются сайты, относительное влияние боковой цепи которых при связывании с 06-23 умеренно уменьшается по сравнению с 06, например Ι83, Н86 и Ι91 А.
Не наблюдается новых функционально важных остатков для варианта с улучшенной аффинностью, 06-23, но наблюдается шаффлинг энергетических вкладов среди этих функционально важных остатков в обоих антителах, который согласуется со структурным открытием, что идентичные положения 1 УЕ0Е скрываются (прячутся) при образовании комплекса с 06 или 06-23 (структурные данные приведены ниже). При картировании этих функционально важных остатков наряду с другими умеренными вкладчиками на структуре 1УЕ0Е они появляются в виде непрерывного пэтча в структурном эпитопе Е1!-1И2, будучи высококонсервативными между человеческим и мышиным УЕ0Е, это объясняет тот факт, что оба антитела имеют одинаковую аффинность к обоим УЕ0Е. При сравнении отпечатка как структурного, так и функционального эпитопа для 06 на структуре 1УЕ0Е чётко видно, что остатки СИК тяжёлой цепи являются остатками, которые осуществляют контакт с положениями на УЕ0Е, в которых аланиновая мутация является диеструктивной, таких как спираль из 20-30 остатков и петля из 80-90 остатков 1УЕ0Е, тогда как остатки СИК лёгкой цепи контактируют с петлёй из 60-70 остатков 1УЕ0Е, где боковые цепи не являются столь важными функционально.
Разведение фага, которое даёт субмаксимальный сигнал связывания (50-70%), используют в конкурентном анализе в растворе, в котором фаг дикого типа или мутантного 1 УЕ0Е в РВТ буфере сначала инкубируют с повышающейся концентрацией конкурентного 06 или 06-23 ЕаЬ в течение 1-2 ч при комнатной температуре, затем смеси переносят в планшеты с иммобилизованным 06-ЕаЬ для захвата несвязанного фага на 15 мин, а связанный фаг обнаруживают, как описано выше. Конкурентные кривые строят в соответствии с программой построения кривой методом нелинейной регрессии по четырём параметрам (Ка1е1бадгарй, 3упегду 3ойиаге) для определения величин ^50, которые рассчитывают как концентрацию 06 или 06-23 ЕаЬ на стадии связывания в растворе, которая ингибирует 50% фага от связывания с иммобилизованным 06 ЕаЬ. Отношение Ιί.'50 мутантного 1УЕ0Е к Ιί.'50 1УЕ0Е дикого типа является относительной кратной разницей аффинностей связывания. В случае мутантов, связывание которых с иммобилизованным на планшете 06-ЕаЬ резко уменьшено, ЕаЬ12 (Ргек!а, 1997) или Е1!-1И1-5 используют в качестве покрытия для захвата мутантного фага после инкубации с 06 или 06-23 ЕаЬ. Связывание 1УЕ0Е-фага с 06, 06-23 ЕаЬ, ЕаЬ12, ЕаЬ и Ε11-1Ό1-5 является обоюдно (взаимно) эксклюзивным, как показывают испытания с УЕ0Е фагом дикого типа.
Пример 5. Структурное картирование сайтов связывания УЕ0Е на 06 и 06-23 и сайтов связывания 06 на УЕ0Е методом кристаллографии.
Экспрессия, очистка, кристаллизация и структурный анализ.
Остатки 8-109 человеческого УЕ0Е экспрессируют, проводят рефолдинг и очищают, как описано ранее (СЬпШпдег, Н.^., е! а1., (1996). Рго!. 3!гис!. Еипс!. 0епе!. 26, 353-357).
ЕаЬ экспрессируют в Е.сой и клеточную массу оттаивают в РВ3, 25 мМ ЕИТА, 1 мМ РМ3Е.
- 49 012835
Смесь гомогенизируют, а затем дважды пропускают через микрофлюидизатор. Затем суспензию центрифугируют при 12 тыс. об/мин в течение 60 мин. Белок наносят на колонку с протеином С, предварительно уравновешенную РВ8 при скорости потока 5 мл/мин. Колонку промывают РВ8 до базовой линии, а затем элюируют \νί!1ι 0.58% уксусной кислотой. Фракции, содержащие С6 ЕаЬ, объединяют и непосредственно наносят на колонку с 8Р-сефарозой, уравновешенную 20 мМ МЕ8, рН 5.5. Белок элюируют в солевом градиенте 0-0.25 М №С1.
С6, элюированный с колонки с 8Р-сефарозой, смешивают с НУЕСЕ8-109 и далее очищают на колонке с 8ирегбех 200, уравновешенной 30 мМ Тпк-С1, рН 7.5 и 0.4 М №С1. Фракции, содержащие комплекс, объединяют, концентрируют и используют при кристаллизации. Кристаллы выращивают при 19°С методом паровой диффузии на подложке в виде капель. Буфер для кристаллизации, содержащий 2.0 сульфата аммония и 5% изопропанола, смешивают с равным объёмом белкового раствора (8 мг/мл белка). Кристаллы появляются через 3 дня и принадлежат к пространственной группе Р3121 с параметрами элементарных ячеек а=117.9 Ангстрем и с=212.6 Ангстрем. Эти кристаллические формы содержат 1 комплекс, содержащий димер УЕСЕ и 2 молекулы ЕаЬ в асимметрической ячейке.
Кристаллы замачивают в маточном растворе, погружают в искусственный маточный раствор, содержащий 25% глицерина, и быстро замораживают в жидком азоте. Набор отражений с разрешением 2.8 Ангстрем собирают на 88КЬ 8упсНго1гоп 8оигсе на линии лучей 9-1. Данные предварительно обрабатывают с помощью программ ΩΗΝΖΟ и 8САЕЕРАСК (О!чточкк1, Ζ. (1993). ΩΞΝΖΟ. В Эа1а Со11ес1юп апб Ргосекктд, Ь. 8ачуег, Ν. Иааск, апб 8. Вайеу, ебк. (^атпд!оп, ИК: 1993)).
Определение и уточнение структуры.
Структуру решают молекулярным замещением, используя координаты УЕСЕ (из РОВ код 1ЕЬТ), константного и вариабельного доменов антитела в 1ВЛ (база данных ВгоокНагеп) и программу АМоКе (ССР4 1994). Модель конструируют с помощью программы 0 и уточняют с помощью программы Ке£шас (ССР4 1994). Конечные Квеличин и Ксвоб. составляют 19.87 и 23.92% соответственно.
Следующие программы использованы для вычисления площади поверхности взаимодействия КЕ8АКЕА версия 3.2. 05/08/93 и АКЕА^ОЕ версия 3.2: 19/12/95. Эти программы являются частью ССР4 серии СоПаЬогаЦуе Сошри1айопа1 Рго)ес1 ШшЬег 4. 1994 (ТНе ССР4 8ш!е: Ргодгашк £ог Рго!ет Сгук1а11одгарйу Ас1а Сгук!. Ό50, 760-763).
Площадь поверхности каждого остатка антитела против УЕСЕ, которая является скрытой в УЕСЕ (А), даётся ниже вместе с процентным содержанием площади скрытой поверхности в общей площади поверхности остатка. Также даётся площадь поверхности каждого остатка антитела к УЕСЕ, скрытой в УЕСЕ (Ангстрем2), вместе с процентным содержанием скрытой поверхности в общей площади поверхности остатка. См. ниже значения для комплексов: С6:УЕСЕ, С6-23:УЕСЕ, ЕаЬ-12:УЕСЕ, ΥΛ^8-1:УЕСЕ и ΥЛ^8-2:УЕСЕ. Во всех случаях, так как УЕСЕ является димером, номера остатков УЕСЕ, относящиеся к мономеру 1 (димерного УЕСЕ), суть 8-109, а номера остатков УЕСЕ, относящиеся к мономеру 2 (димерного УЕСЕ), суть 1008-1109. В первом столбце каждой приведённой ниже таблицы даны номера изученного белка (либо УЕСЕ, либо анти-УЕСЕ антитело) (например, для раздела (а) ниже, РНЕ А 17 относится к Е17, ΕΥ8 А1048 относится к К48; МЕТ А1081 относится к МЕТ 81 УЕСЕ). Во втором столбце даётся скрытая поверхность этого остатка (Ангстрем2). В третьем столбце даётся скрытая поверхность этого остатка в процентах от площади поверхности всего остатка.
(а) комплекс УЕСЕ: С6.
Таблица 3
Остатки УЕСЕ, находящиеся в контакте с С6
Остаток Νο скрытая поверхность скрытая поверхность в %
РНЕ А 17 17.00 54.84% от 31.00
МЕТА 18 59.00 57.84% от 102.00
ΤΥΒ.Α21 62.00 100.00% от 62.00
ϋίΝ А 22 65.00 48.51 % от 134.00
ТУЕ А 25 54.00 70.13% от 77.00
АЗР А 63 54.00 68.35% от 79.00
ОШ А 64 31.00 23.66% от 131.00
ЬЕиАбб 33.00 73.33 % от 45.00
СУ5 А 104 10.00 34.48 % от 29.00
РК.0 А 106 49.00 48.51 % от 101.00
ЬУЗ А1048 40.00 86.96% от 46.00
МЕТА1081 17.00 94.44 % от 18.00
1ЬЕ А1083 25.00 89.29% от 28.00
ЬУЗ Л1084 1.00 0.88% от 114.00
РКО А1О85 2.00 3.77% от 53.00
ΗΙ5Α1086 103.00 53.65% от 192.00
ΟΕΝΑ1087 19.00 12.18% от 156.00
ОЬУАЮ88 13.00 38.24% от 34.00
ОЪИ А1089 119.00 88.15% от 135.00
ΗΙ3 А1090 22.00 20.37 % от 108.00
1ЬЕА1091 30.00 47.62% от 63.00
^IЕЕ-ЛКЕЛ цепи А: 825.0 (7.47% от 11043.0 общей площади этой цепи)
- 50 012835
Таблица 4
Остатки С6, находящиеся в контакте с УЕСЕ
Остатки 1:211 относятся к лёгкой цепи.
Остатки 1001: 1223 относятся к тяжёлой цепи.
Остаток Νο скрытая поверхность скрытая поверхность в %
АЗР В 28 38.00 38.00% от 100.00
ЗЕК В 30 23.00 47.92% от 48.00
ΤΥΚΒ49 19.00 65.52% от 29.00
РНЕ В 53 25.00 21.55% от 116.00
ТУК В 92 70.00 94.59% от 74.00
ТНКВ93 19.00 38.00% от 50.00
ЗЕК В1030 17.00 21.52% от 79.00
Α3ΡΒ1031 96.00 84.21 % от 114.00
ТУК В1032 24.00 41.38% от 58.00
ТКРВ1ОЗЗ 52.00 77.61 % от 67.00
ΙΙΈΒ1051 14.00 29.79% от 47.00
РКО В1053 38.00 97.44% от 39.00
АЬА В1054 26.00 42.62% от 61.00
ΟΕΥΒ1055 49.00 96.08% от 51.00
СЬУ В1056 39.00 97.50% от 40.00
ΤΥΚΒ1057 38.00 22.35 % от 170.00
РНЕВ1099 2.00 100.00% от 2.00
РНЕ В1101 101.00 90.99% от 111.00
РНЕ В1102 109.00 84.50% от 129.00
ьвивиоз 10.00 62.50% от 16.00
РКОВ1Ю4 5.00 13.16% от 38.00
ТУК В1105 42.00 66.67 % от 63.00
П1ЕЕ-АКЕА цепи В: 856.0 (4.44% от 19280.0 общей площади этой цепи).
Общая ОТЕЕ-АКЕА: 1681.0 (5.54% от 30323.0 общей площади всех цепей).
(б) комплекс УЕСЕ: С6-23.
Таблица 5 Остатки УЕСЕ, находящиеся в контакте с С6-23
Остатки 8: 109 относятся к мономеру 1 (димера УЕСЕ). Остатки 1008: 1109 относятся к мономеру 2 (димера УЕСЕ).
Остаток Νο скрытая поверхность скрытая поверхность в %
ЬУЗ А 48 35.00 64.81% от 54.00
МЕТ А 81 23.00 95.83% от 24.00
1ЬЕ А 83 18.00 90.00% от 20.00
ЬУЗ А 84 1.00 1.04 % от 96.00
РКО А 85 2.00 4.76 % от 42.00
ΗΙ5Α86 114.00 55.34% от 206.00
ΟΣΝ А 87 18.00 11.18% от 161.00
ОЬУА88 14.00 42.42% от 33.00
СЬЫ А 89 116.00 87.88% от 132.00
ΗΙ8 А 90 22.00 16.30% от 135.00
ΙΕΕΑ91 33.00 49.25% от 67.00
РНЕА1017 24.00 68.57% от 35.00
МЕТА1018 56.00 46.67% от 120.00
ΤΥΚΑ1021 72.00 100.00% от 72.00
ОЬЫАЮ22 68.00 56.20 % от 121.00
ТУК А1025 58.00 67.44 % от 86.00
СУ8А1061 3.00 16.67 % от 18.00
АЗР А1063 46.00 58.97 % от 78.00
ОЬУ А1065 7.00 18.92% от 37.00
ЬЕиАЮбб 38.00 70.37 % от 54.00
оьилпоз 5.00 6.17% от 81.00
СУЗ А1104 16.00 72.73 % от 22.00
АКО А1105 2.00 1.80% от 111.00
РКО А1106 67.00 68.37% от 98.00
ОТЕЕ-АКЕА цепи А: 858.0 (7.65% от 11223.0 общей площади для этой цепи).
- 51 012835
Таблица 6
Остатки О6-23, находящиеся в контакте с УЕОЕ
Остатки 1: 211 относятся к лёгкой цепи.
Остатки 1001: 1223 относятся к лёгкой цепи.
Остаток Νο скрытая поверхность скрытая поверхность в %
АЗР В 28 25.00 27.17% от 92.00
ЗЕК. В 30 44.00 75.86% от 58.00
ΊΉΚΒ31 6.00 10.91 % от 55.00
ΑΙΑ. В 32 1.00 33.33 % от 3.00
ΤΥΚΒ 49 21.00 58.33 % от 36.00
РНЕ В 53 21.00 19.27% от 109.00
ТУК В 92 72.00 71.29% от 101.00
ЗЕК В1030 18.00 24.00% от 75.00
А8РВ1031 96.00 84.21 % от 114.00
ТУК В1032 28.00 48.28 % от 58.00
ТКРВ1ОЗЗ 47.00 73.44% от 64.00
1ЬЕВ1051 14.00 32.56% от 43.00
РВОВ 1053 29.00 65.91% от 44.00
АТА В1054 28.00 57.14% от 49.00
ОТУ В1055 51.00 89.47% от 57.00
ОЬУВЮ56 34.00 97.14% от 35.00
ΤΥΚΒ1057 37.00 21.76% от 170.00
РНЕ В1099 1.00 33.33% от 3.00
РНЕВ1101 113.00 86.92 % от 130.00
РНЕ В1102 101.00 84.17% от 120.00
ЬЕивпоз 12.00 80.00% от 15.00
РИО В1104 4.00 8.00% от 50.00
ΤΥΚΒ1105 54.00 68.35 % от 79.00
О1ЕЕ-АЯЕА цепи В: 857.0 (4.38% от 19547.0 общей площади для этой цепи).
Общая ЦТЕЕ-АЯЕА: 1715.0 (5.54% от 30323.0 общей площади всех цепей).
(в) УЕОЕ: ЕаЬ-12.
Таблица 7 Остатки УЕОЕ, находящиеся в контакте с ЕаЬ-12 (РОВ код 1Ь|1)
Остатки 8: 109 относятся к мономеру 1 (димера УЕОЕ). Остатки 1008: 1109 относятся к мономеру 2 (димера УЕОЕ).
Остаток Νο скрытая поверхность скрытая поверхность в %
ТУКА 45 30.00 48.39 % от 62.00
ЬУ8 А 48 23.00 41.82% от 55.00
ΟΕΝΑ79 13.00 38.24% от 34.00
ТУК А 45 30.00 48.39 % от 62.00
ТУ5 А 48 23.00 41.82 % от 55.00
ΟΕΝΑ79 13.00 38.24% от 34.00
ΙΕΕΑ80 1.00 100.00% от 1.00
МЕТА 81 37.00 100.00% от 37.00
АКО А 82 53.00 85.48 % от 62.00
1ЬЕ А 83 30.00 71.43% от 42.00
ΕΥ3 А 84 11.00 20.00 % от 55.00
ИЗА 86 77.00 37.93% от 203.00
ОЬК А 87 119.00 80.95 % от 147.00
СЬУ А 88 38.00 100.00% от 38.00
ΟΕΝΑ89 134.00 100.00 % от 134.00
НЕЗ А 90 114.00 93.75 % от 80.00
ΙΤΕΑ 91 75.00 100.00% от 33.00
ОТУ А 92 33.00 62.41 % от 133.00
ОТи А 93 83.00 50.00% от 10.00
МЕТ А 94 5.00 55.56 % от 45.00
РНЕА1017 25.00 55.56% от 45.00
ΤΥΚΑ1021 16.00 21.92% от 73.00
ЦТЕЕ-АКЕА цепи А: 917.0 (8.42% от 10895.0 общей площади для этой цепи).
- 52 012835
Таблица 8
Остатки ГаЬ-12, находящиеся в контакте с УЕСГ
Остатки 8: 109 относятся к мономеру 1 (димера УЕСГ).
Остатки 1008: 1109 относятся к мономеру 2 (димера УЕСГ).
Остаток Νο скрытая поверхность скрытая поверхность в %
ТУК В 91 4.00 40.00 % от 10.00
ЗЕК В 92 12.00 25.00% от 48.00
ТНКВ93 2.00 4.44% от 45.00
УАЕВ94 34.00 37.36% от 9100
ТКРВ96 19.00 86.36% от 22.00
ТНК В1030 5.00 11.36% от 44.00
Α3ΝΒ1031 85.00 80.19% от 106.00
ΊΎΚΒ1032 22.00 52.38% от 42.00
ΟΕΥΒ1033 9.00 100.00% от 9.00
ТКР В1050 53.00 91.38% от 58.00
Α3ΝΒ1052 31.00 86.11 % от 36.00
ТНКВ1О53 3.00 75.00% от 4.00
ΤΥΚΒ1Ο54 93.00 51.96% от 179.00
ТНКВ1055 6.00 7.41 % от 81.00
ТНК В1059 29.00 53.70 % от 54.00
ΤΥΚΒ1099 12.00 100.00% от 12.00
РКО В1100 13.00 81.25% от 16.00
ΗΙ3Β110Ι 58.00 56.31 % от 103.00
ΤΥΚΒ1102 122.00 95.31% от 128.00
ТУК В1103 34.00 18.68% от 182.00
СТУВ1104 41.00 50.62% от 81.00
ЗЕК В1105 4.00 6.67 % от 60.00
ЗЕК В1106 41.00 77.36 % от 53.00
ΗΙ3Β1107 4.00 23.53 % от 17.00
ТКРВ1108 96.00 97.96% от 98.00
П1ГГ-АКЕА цепи В: 832.0 (4.29% от 19409.0 общей площади для этой цепи). Общая П1ГГ-АКЕА: 1749.0 (5.77% от 30304.0 общей площади всех цепей).
Остатки, скрытая площадь поверхности которых превышает 5 Ангстрем2 и/или составляет более 5% от всей площади, рассматриваются как имеющие значительный контакт. Эти результаты помогают описать области в УЕСГ и области в антителах, которые контактируют друг с другом. Наряду с функциональными данными, относящимися к связыванию УЕСГ, представленными ранее, можно наблюдать общие особенности антител ряда С6 и антител ряда В20 (структурные данные не приводятся). Антитела С6, С6-23 и В20, а также другие, связываются как с мышиным, так и с человеческим УЕСГ с относительно высокой аффинностью, в отличие от ГаЬ-12 или ΥΟ317 (данные не представлены). Мутации С88А или С888 человеческого УЕСГ очень сильно влияют на связывание ГаЬ-12 или ΥΟ317 с УЕСГ, в то время как на антитела ряда С6 и антитела ряда В20 (структурные данные не показаны) они практически не оказывают влияния. Кроме того, связывание антител, таких как ГаЬ-12, с УЕСГ приводит в результате к тому, что 100% площади поверхности С88 становится скрытой, тогда как в результате связывания С6 и С6-23 скрытой становится менее 66% площади С88. Полагают поэтому, что, хотя частичный контакт с С88 является приемлемым для антител, имеющих свойство распознавать как мышиный, так и человеческий УЕСГ с хорошей аффинностью, не похоже, что антитела, которые контактируют с человеческим УЕСГ таким образом, что площадь поверхности С1у88 человеческого УЕСГ становится скрытой на 80% или более, будут связываться как с мышиным, так и с человеческим УЕСГ с хорошей аффинностью. Результаты картирования функционального эпитопа показывают также, что отпечаток (футпринт) антител ряда С на УЕСГ отличается от ГаЬ-12 тем, что он имеет больший контакт, продолжающийся в спираль из 20-30 аминокислотных остатка УЕСГ (примерные номера остатков 10-30 человеческого УЕСГ), а также контактирующие остатки в петле из остатков 80-90 (примерно, остатки 80-94 человеческого УЕСГ). Результаты структурных исследований хорошо коррелируют с результатами функциональных исследований (см. фиг. 19) в том, что мутации некоторых остатков в спирали из 20-30 аминокислотных остатков понижают связывание антител ряда С6 и В20. Функциональные исследования, описанные на фиг. 19, показывают, что антитела ряда С6 и В20 хорошо взаимодействуют с остатками, важными для связывания как с Г1!-1, так и с КОК по сравнению с А4.6.1
Пример 6. Библиотеки разнообразных четырёхчленов.
Для того чтобы исследовать, можно ли использовать малые субпопуляции природных аминокислот для генерации антигенсвязывающих поверхностей, мы конструируем фаг-дисплейные библиотеки наивных тяжёлых цепей или антигенсвязывающих фрагментов (ГаЬ) на основе гуманизированного ЕаЬ4Э5 (30), который распознаёт внеклеточный домен человеческой рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВ2 (Гепб1у, В.М., е! а1., (1990), Сапсег Кек. 50: 1550-8). Сначала ранее описанную фагмиду модифицируют для дисплея (визуализации) бивалентного ЕаЬ4Э5 (ЕаЬ'-/|р) на поверхности бактериофага М13. Ген, кодирующий ГаЬ'-/1р, сливают с С-концевым доменом гена-3 минорного оболочечного белка М13 и экспресси
- 53 012835 руют под контролем промотора рНоА (Ьее, У., е! а1., (2004) I. 1ттипо1. МеГйобх 284: 119-132). Фагмиду модифицируют с помощью единичной мутации в лёгкой цепи (В66С) и введения ТАА стоп-кодонов во все три СОВ тяжёлой цепи. Для конструкции каждой библиотеки полученную фагмиду (рУ-0116с) используют в качестве стоп-матрицы в реакции мутагенеза с олигонуклеотидами, созданными таким образом, чтобы одновременно провести репарацию стоп-кодонов и ввести намеченные мутации в намеченные сайты, как описано выше (З1бйи, З.З. е! а1., (2004) I. Мо1. Вю1. 338(2): 299-310; З1бйи, З.З. е! а1., (2000) Мебюбх ш Епхуто1о§у 328: 333-363).
а) Создание библиотеки КМТ.
Положения, доступные для растворителя в СОВ тяжёлой цепи, кодируемой фагмидой, заменяют на единственный тип вырожденного кодона, КМТ, который продуцирует равные пропорции четырёх аминокислот (Υ, А, Ό, З). Число возможных четырёхчленных комбинаций из 20 природных аминокислот слишком велико, чтобы его можно было тщательно исследовать, и поэтому мы выбирали комбинации, которые удовлетворяют двум критериям. Во-первых, мы ограничились комбинациями, которые можно оценить с помощью стандартных методов синтеза ДНК. Во-вторых, мы гарантировали, чтобы каждый набор четырёхчленов содержал, по меньшей мере, одну малую аминокислоту (глицин, серин или аланин), так как мы рассуждали, что малые остатки придадут конформационную гибкость и предупредят создание пространственных препятствий. Всего выбирают 18 положений для рандомизации: положения 28 и 30-33 в СОВ-Н1; положения 50, 52, 53, 54, 56 и 58 в СЭВ-Н2 и положения 95-100а в СЭВ-Н3. Каждая созданная библиотека содержит ~1010 уникальных членов и, следовательно, разнообразие библиотек лишь примерно на один порядок меньше, чем максимальное теоретическое разнообразие (418=7х1010). Название библиотеки КМТ соответствует используемому вырожденному кодону; эквимолярная вырожденность ДНК представлена кодом ГОВ (К=С/Т, М=А/С, В=а/с, З=С/С, ^=А/Т, Υ=Ο/Γ).
б) Сортинг и анализы связывания КМТ библиотеки.
Фаг из библиотеки наивной тяжёлой цепи подвергают циклическому процессу, состоящему из раундов селекции на связывание либо с человеческим сосудисто-эндотелиальным фактором роста (НУЕСЕ) или другими антигенами в 96-луночных иммунопланшетах Мах1хогр (ΝϋΝΟ) в качестве мишени для улавливания, как описано ранее (З1бйи, З.З. е! а1., (2004) I. Мо1. Вю1. 338(2): 299-310; З1бйи, З.З. е! а1., (2000) Мебюбх ш Епхуто1о§у 328: 333-363). Связанный фаг элюируют с помощью 0.1 М НС1 в течение 10 мин и элюат нейтрализуют 1.0 М Тпх основанием. Фаг выращивают в Е.сой ХЬ1-Ь1ие (З!га!адепе) с добавлением хелперного фага М13-К07 (№\ν Епд1апб Вю1аЬх).
После трёх раундов селекции отдельные клоны выращивают в 96-луночном формате в 500 мкл бульона 2ΥΊζ дополненного карбенициллином и М13-КО7. Культуральные супернатанты используют в фаговых ЕЬ1ЗА анализах для обнаружения позитивных клонов, которые связаны с планшетами, покрытыми антигеном, но не с планшетами, покрытыми ВЗА (З1бйи, З.З. е! а1., (2004) см. выше). Проводят анализ ДНК последовательностей позитивных клонов для оценки антигенспецифического связывания с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫЗА) (З1бйи, З.З. е! а1., (2004) см. выше). Проводят скрининг примерно 100 клонов против каждого антигена и клоны со специфическим связыванием идентифицируют в каждом случае. Секвенирование ДНК выявляет число уникальных клонов, выделенных против каждого антигена. По меньшей мере одна тирозинсодержащая библиотека является результативной против каждого антигена. В частности, библиотека-КМТ результативна против 3 из 4 антигенов и генерирует 11 уникальных клонов против человеческого сосудисто-эндотелиального фактора роста (НУЕСЕ).
в) Вторая КМТ-Библиотека-разнообразие (диверсивность) лёгкой цепи.
Мы создали новые варианты КМТ библиотеки, в которой разнообразие (диверсивность) СЭВ-Н1 и СЭВ-Н2 такое же, как описанное выше, но разнообразие СЭВ-Н3 повышается за счёт того, что между остатками 94 и 100Ь допускается инсерция вариантов всевозможной длины в интервале 3-15 остатков. Все вместе, объединённые библиотеки содержат разнообразие (диверсивность) ~1010 уникальных членов, которые подвергают циклической селекции на связывание с НУЕСЕ. Фаговый ЕЫЗА позволяет идентифицировать 93 НУЕСЕ связующих, а секвенирование ДНК выявляет 15 уникальных последовательностей (фиг. 36). Большинство клонов содержит последовательности СЭВ-Н3 с семью встроенными остатками, но мы также идентифицировали два клона, которые содержат более протяжённые инсерции. Уникальные клоны анализируют конкурентным фаговым анализом ЕЫЗА (З1бйи, З.З. е! а1., (2004) см. выше) и определяют расчётные значения аффинности в интервале 10 микромоль (данные не приведены).
г) Созревание аффинности уникальных клонов из второй КМТ библиотеки.
Далее мы исследуем, могут ли низкоаффинные анти-УЕСЕ клоны стать клонами со зрелой аффинностью, чтобы получать ЕаЬ с аффинностями, сравнимыми с аффинностями природных антител. Для этого мы проводим рекомбинацию 15 тяжёлых цепей (фиг. 36) с применением библиотеки лёгкой цепи, в которой 12 доступных растворителю положений заменяют тем же самым КМТ кодоном четырёхчлена. Конкретно, рандомизируют следующие положения лёгкой цепи: положения 28-32 в СОВ-Ы, положения 50 и 53 в СОВ-Ь2 и положения 91-94 и 96 в СОВ-Ь3. Библиотеки содержат ~1010 уникальных членов, что значительно превышает теоретическое разнообразие возможных лёгких цепей (412=2х107). Фагмиду, вы
- 54 012835 бранную для дисплея последовательности тяжёлой цепи и вышеуказанной лёгкой последовательности, модифицируют, вводя ТАА стоп-кодоны во все три области СОК лёгкой цепи.
Полученную фагмиду используют в качестве стоп-матрицы в реакции мутагенеза, при которой происходит репарация стоп-кодонов и вводятся намеченные мутации, как описано выше.
Фаг из библиотек лёгкой цепи инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре в РВ8, 0.05% Т\гееп 20 (81дта), 0.5% 8ирегЬ1оск (Р1егсе) со 100 нМ ЬУЕСР, биотинилированного с помощью реагента 8и1Го^Н8-ЬС-В|о1т (Р1егсе). Биотинилированный ЬУЕСР и связанный фаг улавливают в течение 5 мин нейтравидином (Р1егсе), иммобилизованным на иммунопланшетах Мах1зогр. Планшеты отмывают с помощью РВ8, 0.05% Т\гееп 20 и связанный фаг элюируют и выращивают для дополнительных раундов селекции, как описано выше.
После селекции индивидуальные клоны выращивают в 96-луночном формате в 500 мкл бульона 2ΥΤ, дополненного карбенициллином и М13-КО7. Культуральные супернатанты используют в фаговом ЕЫ8А для обнаружения позитивных клонов, которые связаны с планшетами с плёнкой антигена, но не с плёнкой В8А (81бйи, 8.8. е! а1., (2004) см. выше). Проводят анализ последовательностей ДНК позитив ных клонов.
ЬУЕСР в растворе используют для селекции в очень жёстких условиях. Мы секвенировали 256 и идентифицировали 64 уникальных лёгких цепи, соединённых с 9 из 15 тяжёлых цепей (верхние 9 последовательностей на фиг. 36). Конкурентные фаговые ЕЬ18А анализы используют для оценки аффинностей клонов (81бйи, 8.8. е! а1., (2004) см. выше). Такие анализы ЕЫ8А обычно проводят следующим образом. Фаговые клоны выращивают из единичной колонии, выращивая 40 мл 2ΥΤ культуры, дополненной карбенициллином и хелперным фагом К7 в течение ночи при 30°С. Фаг, очищенный преципитацией с помощью РЕС/№С1, сначала серийно разводят в РВ8Т и проверяют на связывание с планшетом, покрытым плёнкой антигена (ЬУЕСР или тУЕСР). Разведение, которое даёт 50-70% насыщающего сигнала, используют в анализе связывания в растворе, в котором фаг сначала инкубируют с возрастающей концентрацией антигена в течение 1-2 ч, а затем переносят на планшет, покрытый антигеном, для захвата несвязанного фага в течение 10-15 мин. 1С50 рассчитывают как концентрацию антигена, которая ингибирует 50% фага от связывания с иммобилизованным антигеном. Три фаговых клона с наиболее высокой аффинностью представляют собой ΥА^81. УАЭ82 и УАЭ83, причём эти клоны превращаются в РаЬ.
д) Аффинности связывания с УАО81, 2 и 3 РаЬ.
УАО81, 2 и 3 очищают в виде РаЬ белков для детального анализа. Последовательности этих РаЬ приведены ниже. См. также фиг. 39.
Лёгкая цепь УАЭ81
ΟίρΜΤρ5Ρ53Ι^Α5ναθΕνΤΠΌΚΑ5ςΑ5Υ5£νΑ'ΛΎ04ΚΡΟΚΑΡΚΙ1Τι·ΑΑΣΥΕΥ8ΰνΡ5ΚΡ5α8α8 67Т>РТЬта5Е9РЕОРАТУТСОЗЗАЗРАТРаОС!ТКУЕ1КК7УААР5УНГРРЗПЕОЬК5СТА5У¥СШ!
ЯР¥РКЕАКУ9’Л'КУОНАЬр26№рЕ8УТЕОП8КОЗТУ5Ь88ТЪТЬ5К.АОтеКПК\гУАСЕ УТН9СЕ88РУТК8ЖКСЕС (8ЕЦ ГО ΝΟ: 19)
Тяжёлая цепь УАЭ81 νΚφΑΡσΚΟΕΕίΥνΑΥΙΑΡδΥΟΥΤΟΥΑηδΚΟΚΡΤΙδΑΟΤδΚΝΤΑΥΕΟΜΝδΕΚΑΕΟΤΑνΥ УС8В.88ОА8У8У5АМОУТО0ОТЬУТУ88А8ТКСР8УРРЬАР58КЗТ56ОТААЬССЬУК ОУРРЕРУТУ8УЛ880АЬТ80УНРРАУЬ088аЬУ8Ь88УУТУР888ЬОТОТУ1СМУКНКР8К ТКУТЖКУЕРКЗСЕКТН (8ЕО ГО ΝΟ: 20)
Лёгкая цепь УАЭ82
П19МТС)8Р88Е8Л8УаОК.УТ1ТСКА8С8УАУАУАУА’90КРОКАРК1.ЕП-ОА8УЕУ5СЛР 8ΚΕ8Ο8Ο8ΟΤΟΡΤΕΤΙ88ΕρΡΕΏΡΑΤΥΥΟ00ΑΥ88ΡϋΤΡ0ςθΤΚνΕΙΚίΙΤνΑΑΡ8νΗΓΡΡ8 ПЕОЕ1ШЗТА8УУСЕЕ1ЖЕЕТКЕАКУОАЖ\Т)МАЕрЗСЧ8фЕ8УТЕфП8КП8ТУ8Е88ТЕ ТЕ8КАОУЕКНКУУАСЕУТНф6Ь88РУТК8 РЖСЕС (ЗЕф ГО ΝΟ: 21)
Тяжёлая пепЬУАО82 МКК.М1АГТ,ЕА8МЕУР8ТАТМАУАЕУОЬУЕ8(ЗОаЕУрРС}С.8Ек1.3САА8С1РА1ЯТ>У]ЭП1\У νΚΟΑΡΟΚΟ£ΕλννΑϋΙΑΡΥΑΟΑΤΑΥΑΙ>8νΚΟΚΕΗ8ΑΕ·Τ8ΚΝΤΑΥΕφΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑν УУС8К88УАУУААМОУ\УОфСТЬУТУ88А8ТКОР8УГРЕАР88К8Т8СОТААЕССЕУКО УРРЕРУ8АУА<ЗА1,Т8СУ.НТЕРАУЕ(283О1.УЗЕ88УУТУР888ЕОТС/ГУ1СНУЕНКР8КТК УОККУЕРКЗСВКТН (8Еф ГО ΝΟ: 22)
Лёгкая цепь УАЭ83 ΟΐρΜΤρ8Ρ88Ε8Α8νΕιϋΕνΤΙΤΕΚΑ8ρΑ8ΥΥϋνΑλ¥ΥΡ9ΚΡΟΚΑΜ<ΧΕΙΥΑΑ8ΥΕΥ3νϋ Р81<1’868С5СгГ1)ЕТЕТ138ЕЕрРЕ1)ЕАТУ¥С:С)рУУУАРАТР6<;)ОТКУЕ1ККТУААР8\Т1Р ΡΡ8ΟΕρΕΚ8ΟΤΑ8ννθΕΕΝΝΓΥΡΚΕΑΚνςψΚνθΝΑΕφ8ΟΝ8φΕ8νΤΕ0Ο8ΚΟ8ΤΥ8Ε8 8ТЕТЕ8КΑΡΥΕΚΗΚνΥАСЕУТНрСтТ.ЗЗРУТК 8РМЕЮЕС (ЗЕр ГО ΝΟ: 23)
Тяжёлая цепь ΥΛΩ83 МККН1АРЕЬА8МЕУР81АТМАУАЕУфЬУЕ$С6СЬУрРОО8ЕКЬ8САА8ОР818ВУО1Н^ νκρΑΡΟΚΟΕΕΨνΑΑΙΑΡΥ8Ο8ΤΥΥΑη8νκσΚΡΤΙ8ΑΟΤ8ΚΝΤΑΥΕ0ΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥ УС8К88УАУУ8АМПУтедСТЕУТУ88А8ТК0Р8УЕРЕАР88К8Т8ООТААЕ<ЗСШКПУ ЕРЕРУТУ8\Ш86АЕТ86УТГГРРАУ1ф88СтЕУ8Е88УУТУР388Т.6ТуТУ1С№'ЧНКР8Ж КУОККУЕРКЗСГОКТН (8ЕГ) ГО ΝΟ: 24)
Белки РаЬ очищают от культур Е.со11 в колбе (матрасе) для культур с вибрацией, как описано выше
- 55 012835 (Ми11ег, У.А. е! а1., (1998) 81гис!иге 6: 1153-1167).
Обычно вариабельные домены клонируют в векторы, намеченные для экспрессии ЕаЬ в Е.соН или транзиторной экспрессии 1дС в клетках млекопитающих. Вектор экспрессии ЕаЬ получен с применением фаг-диспленой фагмиды делецией последовательности, кодирующей сРЗ и добавлением П последовательности терминатора (ССТСССТТСССССССССССТТТТТТАТ) (8ЕС) ГО N0: 920), около 20 нуклеотидов 5'-3' от стоп-кодона на конце СН1. Белок ЕаЬ генерируют, выращивая трансформированные клетки 34В8 Е.сой в средах АР5 при 30°С в течение 24 ч, как описано в Ргек!а, Ь.С., е! а1., (1997) Сапсег Кек. 57, 4593-4599. ЕаЬ очищают протеин С аффинной хроматографии. Выход продукции по ЕаЬ обычно составляет 5-10 мг/л при выращивании в малых масштабах в колбе при встряхивании (вибратор) и 0.5-3 г/л при выращивании в ферментёре.
Кинетические величины связывания для очищенных ЕаЬ, полученные методом поверхностного плазмонного резонанса, показаны ниже. НУЕСЕ8-109 или тУЕСЕ иммобилизуют на чипах (сенсорах) СМ5 при ~100 относительных единиц (единиц ответа) (КИ) на В1Асоге™ - 3000, как описано ранее (СНеп, Υ., е! а1., (1999) б. Мо1. Вю1. 293: 865-881). Серийные разведения белков ЕаЬ (3-500 нМ) инъецируют и взаимодействие связывания в проточной кювете с НУЕСЕ или тУЕСЕ корректируют, вычитая ответ (взаимодействие) в проточной кювете сравнения. Для кинетического анализа используют модель Ленгмюра 1:1 с раздельным уточнением коп и коГГ. Значения Кб определяют отношением коп и коГГ. Все три ЕаЬ связываются с высокой аффинностью с НУЕСЕ, но только два проявляют заметную (поддающуюся оценке) аффинность к высокогомологичному мышиному УЕСЕ (тУЕСЕ, идентичность аминокислот 90%). Мы сделали вывод, что УАЭ82 и УАЭ83 распознают УЕСЕ по сходному механизму, так как у них наблюдается высокая гомология последовательностей в СОК областях и они связываются как с человеческим, так и с мышиным УЕСЕ. Напротив, в случае УАП81, по-видимому, имеем уникальный способ распознавания антигена, так как он содержит совершенно отличные последовательности участков СОК и не распознаёт тУЕСЕ.
Кинетический анализ связывания ЕаЬ с иммобилизованным УЕСЕ
РаЬ коп (С’М *) койГО1) К4(нМ)
ЪУЕСтР тпУЕСР ИУЕОР тУЕСР ЪЛ-’ЕСР тУЕСР
УАЧ81 3x103 РЮ1 5x1 О'4 ΝΏ1 1.8 + 0.3 >1000
ΥΑΓ>82 1Х106 8x10й 1х 10'2 4х 103 10±2 5.0 ±0.8
ΥΑΙ383 1x10й 2x10й Зх 10 ’ 5х 10‘3 2.0 ± 0.4 3.7 ±0.6
Значения не определялись из-за низкой аффинности взаимодействия.
Пример 7. Кристаллизация, определение и уточнение структуры УАЭ81 и УАЭ82.
Авторы хотели изучить структурный принцип распознавания антигена и, таким образом, кристаллические структуры УАЭ81 и УАЭ82 в комплексе с НУЕСЕ.
а) Приготовление белка ЕаЬ для анализа кристаллической структуры.
Полный клеточный бульон получают при ферментации 10 л Е.соН. Клетки лизируют в гомогенизаторе Мап!оп-Саи1ш. Суспензию центрифугируют и супернатант наносят на колонку с протеином АСефарозой (Сепеп!есН, 1пс.), элюируют 0.1 М уксусной кислотой. рН доводят до 4.0 с помощью 1.0 М Тпк, рН 8.0, и элюат наносят на колонку с 8Р-8ерНагоке (РНаттасба). Колонку отмывают уравновешивающим буфером (20 мМ МЕ8, рН 5.5) и белок ЕаЬ элюируют в градиенте ΝηΟ в уравновешивающем буфере. Остатки 8-109 человеческого УЕСЕ экспрессируют, проводят рефолдинг и очищают, как описано ранее (СНпкНпдет, Н.А., е! а1., (1996). Рго!. 8ггис!. Еипб. Сепе!. 26, 353-357).
Комплекс между ЕаЬ и рецепторсвязывающим фрагментом НУЕСЕ получают и очищают, как описано ранее (Ми11ег, У.А., (1998), см. выше). Комплекс (в РВ8, 25 мМ ЕЭТА) концентрируют до оптической плотности А280=10. Проводят эксперименты с висячей каплей методом паровой диффузии с 10 мкл капель, состоящих из раствора белка и бурового (резервуарного, содержащего буфер + осадитель, преципитант) раствора в отношении 1:1. Резервуарный раствор для комплекса УАЭ81 содержит 0.2 М сульфата аммония, 25% РЕС 3350 (вес./об.), 0.1 М НЕРЕ8, рН 7.5. Резервуарный раствор для кристаллов комплекса УАП82 содержит 1.0 М хлорида лития, 10% РЕС 6000 (вес./об.), 0.1 М МЕ8, рН 6.0. Через 1-2 недели при 19°С вырастают кристаллы в виде пластин или игл для комплекса УАЭ81 или ΥΛ^82, соответственно.
Кристаллы инкубируют в буровом (резервуарном) растворе с 25% глицерина перед быстрым замораживанием. Набор отражений получают с монокристалла с линией пучка 5.0.2 Абνаηсеб ЬбдН! 8оигсе (Вегке1еу) для УАЭ81 и с линией пучка 9.2 8!апГогб 8упсНтоНоп Кабба!юп ЬаЬота!огу (81апГотб ипшеткйу) для УАЭ82. Данные предварительно обрабатывают с помощью программ ОЕ^О и 8САЕЕРАСК (О1\уто\уккт Ζ. (1997). МебНобк Епхуто1 276: 307-326). Структуру решают молекулярным замещением, используя программу АМоКе (ССР4 1994, Ас!а Сгук!. Ό50, 760-763) и координаты решённого ранее комплекса ЕаЬ-УЕСЕ (РЭВ, ввод 1В61). Структуру уточняют с помощью программ КЕЕМАС (ССР4 1994, см. выше). Модели корректируют вручную, используя программу О (ботек, Т.А. е! а1. (1991)
- 56 012835
Ас!а Сгук1а11одга А 47 (Р!2): 969-995). Следующие программы используют для расчёта площадей поверхности взаимодействия в ЕЕ8АЕЕА версия 3.2: 05/08/93 и АЕЕА1МОЬ версия 3.2: 19/12/95. Эти программы являются частью ССР4 серии Со11аЬога1гуе Сотри!а11опа1 Рго_)ес!, ЫитЬег 4. 1994 (Т1е ССР4 8ш!е: Ргодгатк £ог Рго!ет Сгук!а11одгарНу Ас!а Сгук!. Ό50, 760-763). Кристаллические структуры УАЭ81 и ΥΛΟ82 в комплексе 1УЕСЕ решают и уточняют при разрешении 2.65 и 2.8 Ангстрем, соответственно (табл. 9).
Таблица 9
Сбор и уточнение данных для комплексов ΥА^§1 и ΥА^§2 с 1УЕСЕ А. Элементарная ячейка
Пространственная труппа а (А)
Ь(А) с (А) β (град·)
ΥΑΟ31 ΥΑΏ52
Р2, С222,
83.3 96.5
112.5 149.6
105.8 117.4
105.8
В. Дифракционные данные
С. Уточнение ка
Разрешение (А) 50-2.6 (2.7-2.б)а 50-2.6(2.7- 2.б)‘
Число рефлексов 156868 111731
Число независимых 41828 20861
рефлексов
АеЭ (фактор 0.066 (0.356)’ 0.076 (0399)*
расходимости)
Комплектность (%) 99.9 (99.1)“ 97.3 (83.2)а
Р С р с Лч'огк > 0.212, 0271 0.218,0.254
Число не Н атомов 8104 4077
Число молекул Н2О 110 0
Точность 0.011 0.011
1.3
1.2 определения длин связей (А) (среднеквадратично е отклонение тяпбв)
Точность определения углов (град.) а Значения для разрешения во внешней оболочке даны в скобках.
Ь Етегде=ХЬк1|1Ьк1 - <1Ьк1>|/ХЬк1<1Ьк1>, где I обозначает интенсивность отражения 1к1, а <11к1> обозначает среднюю интенсивность для многократных наблюдений.
с Е„огк=2|Ео-Ес|/2Ео, где Ео и Ес обозначают проученные и вычисленные амплитуды структурного фактора, соответственно. Е£гее обозначает Е фактор для произвольно выбранных 5% рефлексий, которые не используются для уточнений.
Площадь поверхности каждого остатка анти-УЕСЕ антитела, скрытая в УЕСЕ (Ангстрем2), приводится ниже вместе с процентным содержанием скрытой поверхности в общей площади поверхности остатка. Также даётся площадь поверхности каждого остатка антитела к УЕСЕ, скрытой в УЕСЕ (Ангстрем2), вместе с процентным содержанием скрытой поверхности в общей площади поверхности остатка. См. ниже значения для комплексов: ΥА^§-1:УЕСЕ и ΥА^§-2:УЕСЕ. Во всех случаях, так как УЕСЕ является димером, номера остатков УЕСЕ, относящиеся к мономеру 1 (димерного УЕСЕ), суть 8-109, а номера остатков УЕСЕ, относящиеся к мономеру 2 (димерного УЕСЕ), суть 1008-1109. В первом столбце каждой приведённой ниже таблицы даны номера изученного белка (либо УЕСЕ, либо анти-УЕСЕ антитело) (например, для раздела (а) ниже ТУЕ А 45 относится к Υ45, ΕΥ8 А1016 относится к К16 УЕСЕ). Во втором столбце даётся скрытая поверхность этого остатка (Ангстрем2). В третьем столбце даётся скрытая поверхность этого остатка в процентах от площади поверхности всего остатка.
- 57 012835 (а) УЕСЕ: УА^8-1.
Таблица 10
Остатки УЕСЕ, находящиеся в контакте с УА^8-1
Остаток Νο скрытая поверхность скрытая поверхность в %
ТУК А 45 8.00 20.51 % от 39.00
1ЬЕ А 46 36.00 37.89% от 95.00
ЬУЗ А 48 14.00 20.90% от 67.00
6ΕΝ А 79 31.00 81.58% от 38.00
МЕТА 81 24.00 75.00% от 32.00
АКСА 82 7.00 14.58% от 48.00
1ЬЕА83 33.00 76.74% от 43.00
ЬУЗ А 84 25.00 40.98% от 61.00
РКО А 85 8.00 14.55% от 55.00
ΗΙ5Α86 107.00 54.04% от 198.00
СЬК А 87 110.00 71.43% от 154.00
СЬУА88 38.00 95.00% от40.00
СЬЫ А 89 103.00 88.79% от 116.00
НК А 90 93.00 75.61 % от 123.00
1ЬЕА91 71.00 89.87% от 79.00
<ЭЬУА92 12.00 60.00% от 20.00
СШ А 93 21.00 17.50% от 120.00
ΕΥ8Α1016 31.00 25.20% от 123.00
РНЕА1017 21.00 46.67% от 45.00
МЕТА1018 14.00 10.14% от 138.00
Α3ΝΑ1062 10.00 28.57 % от 35.00
АЗР А1063 6.00 6.38% от 94.00
СЬС А1064 89.00 49.17% от 181.00
ьуз ан 07 0.00 0.00% от 165.00
ИГОЕ-АВЕА цепи А: 912.0 (8.16% от 11170.0 общей площади этой цепи).
Общая ИГОЕ-АВЕА: 912.0 (8.16% от 11170.0 общей площади всех цепей) (б) УЕСЕ: Υ/\Ι)8-2.
Таблица 11
Остатки УЕСЕ, находящиеся в контакте с УА^8-1
Остаток Νο скрытая поверхность скрытая поверхность в %
1ЬЕ А 46 6.00 8.82% от 68.00
ЬУЗ А 48 39.00 60.94% от 64.00
ΟΙ.Ν А 79 17.00 45.95 % от 37.00
МЕТА 81 29.00 96.67% от 30.00
ТЬЕАЗЗ 32,00 86.49% от 37.00
РКО А 85 22.00 38.60% от 57.00
ЮЗА 86 128.00 64.00% от 200.00
США 87 32.00 23.88% от 134.00
СЬУ А 88 22.00 64.71% от 34.00
США 89 119.00 88.15% от 135.00
ΗΙ5Α90 20.00 21.74% от 92.00
П.ЕА91 55.00 67.07% от 82.00
ΕΥ8Α1016 1.00 0.87 % от 115.00
РНЕА1017 45.00 90.00% от 50.00
МЕТА1018 47.00 40.52% от 116.00
ΤΥΚ.Α1021 7.00 8.97% от 78.00
Α3ΡΑ1Ο63 27.00 36.49 % от 74.00
СЬУ А1065 6.00 13.33% от 45.00
ьЕилюбб 32.00 55.17% от 58.00
СУЗ А1104 3.00 12.50% от 24.00
АКО ΑΙ105 7.00 5.65 % от 124.00
РКО А1106 29.00 37.66% от 77.00
ИГОЕ-АВЕА цепи А: 725.0 (6.17% от 11744.0 общей площади этой цепи).
Общая ИГОЕ-АВЕА: 725.0 (6.17% от 11744.0 общей площади всех цепей).
Остатки, скрытая площадь поверхности которых превышает 5 Ангстрем2 и/или составляет более 5% от всей площади, рассматриваются как имеющие значительный контакт. Эти результаты помогают описать области в УЕСЕ и области в антителах, которые контактируют друг с другом. Наряду с функциональными данными, относящимися к связыванию УЕСЕ, представленными ранее, можно наблюдать общие особенности антител ряда С6 и антител УА^8-2 и УА^8-3. Связывание антител, таких как ЕаЬ-12 и УА^8-1 с УЕСЕ приводит к тому, что становится скрытым, соответственно, 100 и 95% остатка С88, тогда как связывание С6, С6-23 и УА^8-2 приводит к тому, что скрытой становится только 66% поверхности С88.
Каркасы ЕаЬ остаются практически неизменными по сравнению со структурой исходного ЕаЬ4Э5; Са каркасные атомы УА^81 и УА^82 накладываются на ЕаЬ4Э5 со среднеквадратичным отклонением
- 58 012835 (гткб) 0.87 и 0.55 Ангстрем соответственно. Т1е Са атомы молекул 1УЕ0Е в двух структурах накладываются друг на друга с величинами гткб 0.7 Ангстрем для 87Са положений. Наивысшая девиация 3.7 Ангстрем наблюдается в остатке глутаминовой кислоты 64. Петля, содержащая этот остаток, имеет неустранимую гибкость, как показано Ми11ег е! а1., см. выше.
В обоих комплексах узнавание антигена полностью опосредуется контактом с СИК петлях. Если говорить о площади скрытой поверхности, ΥΛΌ31 использует как тяжёлую (498 Ангстрем2), так и лёгкую цепь (407 Ангстрем2), тогда как ΥА^32 в основном использует тяжёлую цепь (543 Ангстрем2) и малый вклад лёгкой цепи (157 Ангстрем2). Следует отметить, что остатки в рандомизированных положениях отвечают практически за всю скрытую площадь поверхности (98 и 100% для ΥА^31 и ΥА^32 соответственно), и, кроме того, площадь скрытой поверхности почти полностью включают атомы боковых цепей (82 и 80% для ΥА^31 и ΥА^32 соответственно). Таким образом, оба ЕаЬ, связанные с антигеном за счёт взаимодействий, которые почти полностью опосредуются боковыми цепями, расположенными в положениях, рандомизированных в библиотеках.
Со стороны 1УЕ0Е, структурные эпитопы для связывания с ΥА^31 и ΥА^32 перекрываются с друг с другом, а также со структурным эпитопом для связывания с доменом 2 рецептора 1 УЕ0Е Е1!-1 (Е1!-1С2) Антитела ΥΛ^31 ΥА^32 могут ингибировать связывание Е1! с человеческим УЕ0Е ш уйго (данные не приводятся), и ожидается, что они также ингибируют связывание КОК с человеческим УЕ0Е. Тем не менее, имеется значительная разница между структурными эпитопами для двух ЕаЬ. В частности, из 11 остатков, различающихся между человеческим и мышиным УЕ0Е, только остаток 88 контактирует с ЕаЬ, но взаимодействия с участием этого остатка, объясняют различные аффинности ΥА^31 и ΥА^32 к тУЕ0Е. В комплексе ΥА^32 01у88 частично экспонируется с растворителем, тогда как в комплексе ΥА^31 он полностью скрыть в интерфейсе (поверхности раздела). Мышиный УЕ0Е содержит более объёмный остаток серина в положении 88; эта замена легко размещается в комплексе ΥА^32, но в модели ΥА^31 введение цепи серинового остатка в скрытое положение 01у88 потребовало бы более значительной реаранжировки для сохранения комплекса.
Как описано выше, оба фрагмента ЕаЬ связываются с антигеном за счёт контактов, почти исключительно включающих боковые цепи в различных сайтах. В общем, области СИК антител ΥА^31 и ΥА^32 содержат 66 остатков, образованных с помощью рандомизированных кодонов, и эти остатки почти поровну распределяются среди четырёх типов аминокислот, допустимых при создании библиотеки. Однако, когда мы рассматриваем субпопуляцию остатков, которые контактируют с антигеном, существует чёткая тенденция в том, что 16 остатков тирозина составляют 50% контактирующих остатков. Действительно, все, кроме двух, остатков тирозина, выбранные в областях СИК антител ΥА^31 и ΥА^32, контактируют с антигеном, и всё говорит о том, что тирозиновые остатки вносят вклад 71% скрытой площади поверхности при образовании комплекса с 1УЕ0Е. Таким образом, боковая цепь практически каждого выбранного тирозинового остатка участвует в прямом опосредовании распознавания антигена, а другие выбранные аминокислоты, по-видимому, играют вспомогательную роль.
Несмотря на преобладание тирозина в синтетических антигенсвязывающих сайтах, исследование содержания тяжёлых (неводородных) атомов скрытой площади поверхности показывает, что интерфейсы (поверхности раздела) ЕаЬ-1 УЕ0Е не более гидрофобны, чем поверхность раздела между 1 УЕ0Е и Е1!-1С2. Со стороны 1УЕ0Е состав тяжёлых атомов скрытой площади поверхности очень похож во всех трёх случаях, он состоит, преимущественно, из углерода, но также содержит значительные количества азота и кислорода. В скрытых площадях поверхности ЕаЬ атомы азота почти совершенно отсутствуют, так как боковые цепи, разрешённые в библиотеках, представляют собой лишь углерод, кислород и водород. Тем не менее, оба ЕаЬ скрывают большое количество атомов кислорода при связывании с 1УЕ0Е, и в обоих случаях пропорция скрытой площади поверхности, вносимой углеродом, значительно меньше, чем эта пропорция, вносимая углеродом в скрытую площадь поверхности Е1!-1С2. Таким образом, преобладание тирозина в синтетических СИК не даёт высокогидрофобных поверхностей раздела ЕаЬ-антиген с доминирующими взаимодействиями ароматических колец. Напротив, тирозиновые остатки осуществляют специфичные контакты с широким рядом разнообразных остатков на поверхности 1 УЕ0Е, и в этих взаимодействиях задействованы как гидроксильные группы боковой цепи, так и ароматические кольца.
Таким образом, мы преодолеваем сложность природной иммунной системы, используя точно определённые синтетические библиотеки, и в результате мы смогли исследовать особую роль, которую тирозин играет в антигенсвязывающих сайтах. Мы генерировали библиотеки с ограниченным разнообразием и выявили разнообразные поверхности на закрепленном остове (лесах), образованном каркасными участками, и скрытые СИК остатки. Наши результаты чётко демонстрируют, что в подходящем поддерживающем окружении боковая цепь тирозина способна опосредовать большинство контактов, необходимых для распознавания антигена. Таким образом, по-видимому, повышенное содержание тирозина в природных антигенсвязывающих сайтах есть следствие того, что боковая цепь особенно хорошо подходит для осуществления продуктивных контактов с антигеном.
Это предположение также согласуется с химической природой тирозина. Как отмечалось выше, боковая цепь тирозина достаточно велика для того, чтобы занять большие объёмы пространства лишь с
- 59 012835 немногими торсионными углами и для него возможно образование водородных связей, возможны гидрофобные взаимодействия и взаимодействие за счёт электростатического притяжения с положительно заряженными группами ^ет1ш, М., е! а1., (2003) 1. Μο1. Вю1. 334: 733-749). Кроме того, незаряженная боковая цепь тирозина позволяет избежать электростатического отталкивания, а его умеренная гидрофильность даёт возможность хорошо приспосабливаться как к гидрофильному, так и к гидрофобному окружению ^ет1ш, (2003), см. выше; Кадоу, Ι., е! а1., (2002) в ТИе Αηί^Ьοб^е8, ебк. Ζаηей^, М. & Сарга, 1. (Тау^г & ЕапсЦ, Ε-οιΠοιι №\ν ΥοΑ), рр.43-б7; М1ап, Ι8., е! а1., (1991) 1. Μο1. Вю1.. 217: 133-151).
Мы также наблюдали, что, хотя аланиновый и сериновый остатки не имеют многих непосредственных контактов с антигеном, они допускают пространственную и конформационную гибкость, которая может быть решающей для подходящего позиционирования больших боковых цепей тирозиновых остатков. Таким образом, эти малые остатки могут способствовать вспомогательной функции - облегчать продуктивные контакты между тирозином и антигеном. Следует отметить, что, вероятно не случайно, в природных антигенсвязывающих сайтах имеется также избыток серина (М1ап, (1991), см. выше). Наконец, недостаток контактов с антигеном, опосредованных аспартатом, наводит на мысль, что возможна дальнейшая минимизация разнообразия этих синтетически антигенсвязывающих сайтов.
Пример 8. Антитела против УЕОЕ из библиотек ¥АЭ8-Л и ¥АЭ8-В.
(а) Создание фаг-дсплейных библиотек ЕаЬ ¥АЭ8-А и ¥АЭ8-В.
Две фаг-дисплейных библиотеки (ΥΑ^8-А и ΥΑ^8-В) создают, как в общем описано в примере б, с применением описанной ранее фагмиды, предназначенной для визуализации ЕаЬ фрагментов, димеризованных с помощью домена лейциновой застёжки, встроенного между тяжёлой цепью ЕаЬ и Сконцевым доменом минорного оболочечного белка гена-3 (Р3С), за исключением того, что следующие положения 4Ό5 рандомизируют следующим образом:
Библиотека Рандомизированные положения
СПКН1 С.Г)КН2 СЙКНЗ
ΥΑΟ8-Α 28, 30,31,32,33 50,52, 53, 54,56, 58 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100а
ΥΑΒ8-Β 28, 30,31,32,33 50, 52,53,54, 56, 58 95, 96, 97,98, 99, 100, 100а
Для библиотеки ΥΑ^8-Α проводят две отдельных реакции мутагенеза. В первой реакции разнообразие вводят в СИК-Н1, СИК-Н2 и СИК-Н3 с помощью олигонуклеотидов ΥΑ^8-Н1, ΥΑ^8-Н2 и ΥΑ^8-Н3-7 соответственно. Это приводит к введению вырожденных кодонов, которые кодируют четыре аминокислоты: тирозин, аланин, аспартат (аспарагиновая кислота) и серин (ΥΑ^8). Во второй реакции разнообразие вводят в СИК-Н1, СИК-Н2 и СИК-Н3 с применением олигонуклеотидов ΥТN8-Н1, ΥΊΝ8Н2 и ΥΊΝ8Ή3-7 соответственно. Это приводит к введению вырожденных кодонов, которые кодируют четыре аминокислоты: тирозин, треонин, аспарагин и серин (ΥΓΝ8). Две реакционные смеси объединяют.
Для библиотеки ΥΑ^8-В проводят 13 отдельных реакций мутагенеза. Реакции приводит к введению вырожденных кодонов, которые кодируют четыре аминокислоты: тирозин, аланин, аспартат и серин (ΥΑ^8). В каждой реакции разнообразие вводят в СИК-Н1 и СИК-Н2 с помощью олигонуклеотидов ΥΑ^8-Н1 и ΥΑ^8-Н2. В каждой реакции для введения разнообразия (диверсивности) в СИК-Н3 используют один из следующих олигонуклеотидов: ΥΑ^8-Н3-3, ΥΑ^8-Н3-4, ΥΑ^8-Н3-5, ΥΑ^8-Н3-б, ΥΑ^8Н3-7, ΥΑ^8-Н3-8, ΥΑ^8-Н3-9, ΥΑ^8-Н3-10, ΥΑ^8-Н3-11, ΥΑ^8-Н3-12, ΥΑ^8-Н3-13, ΥΑ^8-Н3-14 или ΥΑ^8-Н3-15. 13 реакционных смесей объединяют.
В случае обеих библиотек объединённые реакционные смеси после реакций мутагенеза подвергают электропорации в Е.тоЕ 88320 (81бЪц е! а1., см. выше). Трансформированные клетки выращивают в течение ночи в присутствии хелперного фага М13-КО7 (№\ν Епд1апб Вю1аЬ§, Веуег1у, МА) для получения фаговых частиц, которые инкапсулируют фагмидную ДНК и визуализуют фрагменты ЕаЬ на своей поверхности. Размер обеих библиотек ΥΑ^8-Α и ΥΑ^8-Β составляет 7х 109.
(б) Селекция специфических антител против-ИУЕОЕ из наивных библиотек ΥΑ^8-Α и ΥΑ^8-Β.
Фаг из библиотеки ΥΑ^8-Α и ΥΑ^8-Β по отдельности вводят в циклические процессы, осуществляемые через раунды селекции на связывание для обогащения клонами, связывающимися с 1УЕОЕ. Селекцию на связывание проводят, применяя описанные ранее методы (81бЕц е! а1., см. выше).
9б-луночные Мах^ш иммунопланшеты ΝυΝί.' в течение ночи при 4°С покрывают плёнкой захватываемой мишени (5 мкг/мл) и блокируют в течение 2 ч с помощью В8А (81дта). Фаг выращивают в течение ночи при 37°С, концентрируют преципитацией с помощью РЕО/ИаС1 и ресуспендируют в РВ8, 0.5% В8А, 0.05% Т\уееп 20 (81дта), как описано ранее (81бЬц е! а1., см. выше). В покрытые плёнкой иммунопланшеты добавляют растворы фагов (~1012 фаг/мл). Инкубируют в течение 2 ч, обеспечивая связывание фага, планшеты отмывают 10 раз с помощью РВ8, 0.05% Тетееп 20. Связанные фаги элюируют 0.1 М раствором НС1 в течение 10 мин и элюат нейтрализуют 1.0 М Тгй основанием. Элюированный фаг амплифицируют в Е.тоЕ ХЫ-Ыие и используют в дальнейших раундах селекции.
Библиотеки подвергают 4 раундам селекции против каждого нацеленного белка. Индивидуальные клоны из каждого раунда выращивают в 9б-луночном формате в 500 мкл бульона 2ΥΓ, дополненного
- б0 012835 карбенициллином и М13-УС8, а культуральные супернатанты непосредственно используют в фаговых анализах ЕЫ8А (81бйи е1 а1., см. выше) для обнаружения фаг-дисплейных ЕаЬ, которые связываются с нацеленным белком, но не с белком, с иммобилизованным на планшетах В8А. Клон считают специфическим связующим, если сигнал ЕЬ18А на нацеленных покрытых планшетах по меньшей мере в 20 раз больше, чем на планшетах, покрытых В8А.
Специфические связующие секвенируют, и последовательности уникальных клонов показаны на фиг. 37 и 38 для библиотек УАЭ8-А и УАЭ8-В соответственно. Последовательности на фиг. 37 получают сортингом с применением человеческого УЕСЕ8-109. Последовательности на фиг. 38 получают сортингом с применением мышиного УЕСЕ.
Пример 9. ΝΝΚ варианты УΑ^82.
(а) Создание фаг-дисплейных библиотек ЕаЬ рандомизацией выбранных положений антитела против УЕСЕ УΑ^82 с применением кодона ΝΝΚ.
Фаг-дисплейные библиотеки ЕаЬ конструируют, применяя фагмидный вектор, который в результате приводит к дисплею ЕаЬ частиц, димеризованных с помощью домена лейциновой застёжки между тяжёлой цепью ЕаЬ и С-концевым доменом минорного оболочечного белка гена-3 (Р3С). Этот вектор содержит последовательность УΑ^82. Вариабельные домены гуманизированного антитела УΑ^82 экспрессируются под контролем индуцируемого 1РТС промотора Р1ас.
Библиотеку ΝΝΚ создают с рандомизированными остатками в тяжёлой цепи СПК-3 УΑ^82. Специфическими остатками, которые рандомизируют, являются остатки 50, 95, 97, 99, 100 и 100а тяжёлой цепи.
В каждом из рандомизированных положений кодон дикого типа заменяют вырожденным ΝΝΚ кодоном Щ=А/Т/С/С, ^С/Т в эквимолярном отношении), который кодирует все 20 природных аминокислот. Библиотеки создают по способу Кункеля (Κиηке1) ^шке^ Т.А., КоЬейз, Ю. & Ζакοи^, К.А., МеШобз Епхуто1. (1987), 154, 367-382) описанными выше методами (81бйи, 8.8., Еоутащ Н.В., Сиηη^ηдйат, В.С. & №е11§, 1.А., МеШобз Епхущо1. (2000), 328, 333-363). Для генерации ΝΝΚ библиотеки используют уникальную версию стоп матрицы дисплейного вектора ЕаЬ. Мы используем матричную фагмиду, несущую ген, кодирующий ΥΑ^82 ГаЬ с помощью ТАА стоп кодонов, встроенных в положения 30, 33, 52, 54, 56, 57, 60, 102, 103, 104, 107, 108 тяжёлой цепи. Мутагенные олигонуклеотиды с вырожденными ΝΝΚ кодонами в диверсифицируемых положениях используют для одновременного введения диверсивности (разнообразия) СПК и репарации стоп-кодонов. Разнообразие (диверсивность) вводят в СЭК-Н3 с применением олигонуклеотида, названного
ΝΝΚ-Ш (ССА ССТ ТСТ ССС ТТС ССТ АТТ ТАТ САТ ТАТ САТ АТА САС ТСС СТС ССТ),
ΝΝΚ-НЗ (СТС САА ТСС СТТ ССА ΝΝΚ АТТ ССТ ССА ТАТ ССТ ССТ ССТ АСТ ССТ ТАТ ССС САТ А0С СТС) (81 У) ΙΌ Ν0: 26) и
ΝΝΚ-№ (СТС ТАТ ТАТ ТСТ АСС ССС ΝΝΚ ТСТ ΝΝΚ ССТ ΝΝΚ ΝΝΚ ΝΝΚ ССТ АТС САС ТАС ТСС) (81 У) ГО Ν0: 27).
Мутагенные олигонуклеотиды с вырожденными кодонами для всех трёх областей СПК тяжёлой цепи встраивают одновременно в одной реакции мутагенеза, так что одновременное введение мутагенного олигонуклеотида приводит к намеченному разнообразию (диверсивности) в каждом положении и одновременной репарации всех ТАА стоп-кодонов, тем самым получают открытую рамку считывания, которая кодирует члена библиотеки ЕаЬ, слитого с гомодимеризующей лейциновой застёжкой и Р3С. Отметим, что олигонуклеотид ΝΝΚ-Ш не содержит никакого вырожденного кодона и его добавляют в реакционную смесь для проведения реакции мутагенеза с целью репарации ТАА стоп-кодонов и введения последовательности ΥΑ^82 дикого типа.
Реакционные смеси после мутагенеза подвергают электропорации в Е.соН 88320 (81бйи е( а1., см. выше), и трансформированные клетки выращивают в течение ночи в присутствии хелперного фага М13Κ07 (Ыеу Еп^НЫ Вю1аЬ§, Веуег1у, МА) для получения фаговых частиц, которые инкапсулируют фагмидную ДНК и визуализуют фрагменты ЕаЬ на своей поверхности. Каждая библиотека содержит более 7х 109 уникальных членов.
(б) Селекция специфических антител против 1УЕСЕ из библиотеки ΝΝΚ.
Фаг из библиотеки ΝΝΚ участвует в циклическом процессе, состоящий из нескольких раундов селекции на связывание, для обогащения клонами, связывающимися с человеческим УЕСЕ. Селекцию на связывание проводят описанными ранее методами (81б1ш е( а1., см. выше).
На 96-луночных иммунопланшетах МахЕогр NυNС в течение ночи при 4°С иммобилизуют мишень для захвата (5 мкг/мл) и блокируют в течение 2 ч 8ирегЬ1оск ТВ8 (буфер 1г15-ЬиГГегеб §а1те) (Р1егсе). Выращивают в течение ночи при 37°С, фаг концентрируют преципитацией с помощью РЕС/№1С1 и ресуспендируют в 8ирегЬ1оск ТВ8, 0.05% Τνееη 20 (81дта), как описывают ранее (81бйи е( а1., см. выше). Растворы фагов (~1012 фаг/мл) добавляют в покрытые плёнкой иммунопланшеты. Инкубируют в течение 2 ч, чтобы обеспечить связывание фага, планшеты отмывают 10 раз с помощью РВ8, 0.05% Т\уеег1 20. Связанный фаг элюируют 0.1 М раствором НС1 в течение 10 мин и элюат нейтрализуют 1.0 М Тп$ основанием. Элюированный фаг амплифицируют в Е.сой ХЫ-Ыие и используют для последующих раундов
- 61 012835 селекции.
Библиотеки подвергают 5 раундам селекции против УЕСЕ. Индивидуальные клоны из каждого раунда выращивают в 96-луночном формате в 500 мкл бульона 2УТ, дополненного карбенициллином и М13-УС8, а культуральные супернатанты непосредственно используют в фаговых анализах ЕЫ8А (81бНи е! а1., см. выше) для обнаружения фаг-дисплейных ЕаЬ, которые связаны с нацеленным белком, но не с иммобилизованным на планшетах В8А. Специфическими связующими называют те фаговые клоны, у которых сигнал ЕЫ8А на планшетах с плёнкой мишени, по меньшей мере, в 15 раз больше, чем на планшетах, покрытых В8А. Индивидуальные клоны подвергают скринингу после 3-5 раундов селекции на связывание с УЕСЕ.
В индивидуальных клонах, представляющих собой специфические связующие, анализируют ДНК последовательности, последовательности рандомизированных положений СИК показаны на фиг. 40. Аффинность различных вариантов УАЭ8 оценивают методом конкурентного фагового ЕЫ8А по двум точкам. Три лучших клона продуцируют в виде растворимого ЕаЬ и проверяют на аффинность к НУЕСЕ. Данные ВМсоге получают по СНеп е! а1., I. Мо1. Вю1. (1999), 293(4): 865-81. Коротко говоря, аффинность связывания вычисляют с применением констант ассоциации и диссоциации, измеряемых с помощью системы поверхностного плазмонного резонанса ВМсоге™ - 3000 (Высоте, Шс., Р1кса!ачау, ΝΙ). Биосенсорный чип активируют для ковалентного связывания УЕСЕ, используя №этил-№-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (ЕЭС) и Ν-гидроксисукцинимид (ΝΉ8) в соответствии с инструкциями производителя (Высоте, Шс., Р1кса!ачау, ΝΙ). НУЕСЕ или шУЕСЕ с помощью буферного обмена поступает в 10 мМ ацетат натрия, рН 4.8, и этот раствор разводят примерно до 30 мг/мл. Аликвоты УЕСЕ инъецируют при скорости потока 2 мкл/мин до достижения примерно 200-300 относительных единиц (гекропке иш!к, КИ) связанного белка. Раствор 1 М этаноламина инъецируют в качестве блокирующего агента. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения. ЕаЬ инъецируют в буфер РВ8/Т\гееп (0.05% Тчееп 20 в фосфатно-солевом буферном растворе) при 25°С при скорости потока 10 мкл/мин. Значения равновесной константы диссоциации, Кб, из измерений методом поверхностного плазмонного резонанса рассчитывают как ко££/коп. Данные Высоте™ приведены ниже.
Название клона ЬУЕОР (нМ) тУЕОН (нМ)
ΝΝΚ-1 0.60 0.24
ΝΝΚ-2 2.0 13
ΝΝΚ-1 6.0
Пример 10. Двучленные библиотеки разно(много)образия.
(а) Создание фаг-дисплейных ЕаЬ библиотек с остатками в областях СЭК, рандомизированными только как Туг или 8ег.
Фаг-дисплейные библиотеки ЕаЬ конструируют, применяя фагмидный вектор, который в результате приводит к дисплею бивалентных ЕаЬ частиц, димеризованных с помощью домена лейциновой застёжки, встроенного между тяжёлой цепью ЕаЬ и С-концевым доменом минорного оболочечного белка гена3 (Р3С). Этот вектор содержит вариабельные домены гуманизированного антитела 4Ό5, которые экспрессируются под контролем ГРТС-индуцибельного промотора Р!ас, как описано ранее. Гуманизированное антитело 4Ό5 представляет собой антитело, которое содержит главным образом каркасные участки человеческой консенсусной последовательности в тяжёлой и лёгкой цепях и СЭК участки мышиного моноклонального антитела, специфического в отношении Нег-2. Способ получения антитела против Нег2 и идентичность последовательностей вариабельного домена представлены в патентах США 5821337 и 6054297.
Создают две библиотеки. Библиотеку У8-А создают с рандомизированными остатками во всех трёх областях СЭК тяжёлой цепи, тогда как библиотеку У8-В создают с рандомизированными остатками во всех трёх областях СЭК тяжёлой цепи и в СИК3 лёгкой цепи. Специфические рандомизированные остатки представлены ниже.
Библиотека Рандомизированные положения
сорхз СПКН1 СОРН2 ΟϋΚΗ3
Υ8-Α 28,30,31, 32,33 50, 52, 53, 54, 56, 58 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100а
Υ8-Β 91-94, 96 28, 30,31, 32, 33 50, 52, 53, 54, 56, 58 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100а
В каждом из рандомизированных положений кодон дикого типа заменяют вырожденным кодоном ТМТ (М=А/С в эквимолярном соотношении), который кодирует Туг и 8ег в эквимолярном соотношении. Кроме того, длина СЭК-Н3 варьируется с помощью олигонуклеотидов, которые заменяют 7 кодонов дикого типа между положениями 101-107 с варьирующимся числом ТМТ кодонов (7-20 для библиотеки У8-А и 7-15 для Библиотеки У8-В). Кроме того, СЭК-Е3 из библиотеки У8-В рандомизируют таким образом, что 50% членов библиотеки содержат делецию в положении номер 91, тогда как другие 50% содержат остаток С1п дикого типа в этом положении.
Библиотеки создают по методу Кункеля (Кипке1) (Кипке1, Т.А., КоЬейк, Ю. & Ζο^μ, К.А., Ме!Нобк ЕпгушоЕ (1987), 154, 367-382) с помощью ранее описанных методов (81бНи, 8.8., Ьочшап, Н.В., Сип
- 62 012835 шпдйат, В.С. & ^е11к, ГА., Ме!1обк Епхуто1. (2000), 328, 333-363). Уникальный вариант стоп-матрицы ЕаЬ дисплейного вектора используют для генерации библиотек Υδ-А и Υδ-В. Мы используем матричную фагмиду, обозначенную рУ0350-4, со стоп-кодоном ТАА, встроенным в положения 30, 33, 52, 54, 56, 57, 60, 102, 103, 104, 107, 108 тяжёлой цепи. Никаких стоп-кодонов не вводится в 0ΌΡ3 лёгкой цепи. Мутагенные олигонуклеотиды с вырожденными кодонами ТМТ в положениях, которые должны быть диверсифицированы, используют для одновременного введения разнообразия СОК и репарации стоп-кодонов. Для обеих библиотек много(разно)образие вводят в СЭК-Н1 и СЭК-Н2 с помощью олигонуклеотидов Н1 и Н2 соответственно. Для библиотеки Υδ-А разнообразие вводят в СОК-Н3 с помощью эквимолярной смеси олигонуклеотидов. Для библиотеки Υδ-В разнообразие вводят в СЭК-Н3 с помощью эквимолярной смеси олигонуклеотидов. Для библиотеки Υδ-В разнообразие вводят в СОК-Ь3 с применением эквимолярной смеси олигонуклеотидов. Мутагенные олигонуклеоиды для всех СОК, подлежащих рандомизации, вводят одновременно в единой реакции мутагенеза, так чтобы одновременное включение всех мутагенных олигонуклеотидов привело к введению намеченного разнообразия в каждое положение и к одновременной репарации всех ТАА стоп-кодонов, тем самым образуется открытая рамка считывания, которая кодирует член библиотеки ЕаЬ, слитый с гомодимеризующей лейциновой застёжкой и Р3С.
Реакционные смеси после мутагенеза подвергают электропорации в Е.сой 88320 (81бйи е! а1., см. выше), и трансформированные клетки выращивают в течение ночи в присутствии хелперного фага М13КО7 (№\у Епд1апб Вю1аЬк, Веуег1у, МА) для получения фаговых частиц, которые инкапсулируют фагмидную ДНК и визуализуют фрагменты ЕаЬ на своей поверхности. Каждая библиотека содержит более 5х 109 уникальных членов.
(б) Селекция специфических антител из наивных библиотек Υ8^ и Υ8-β.
Фаг из библиотеки Υ8^ или Υ8-β вводят в циклический процесс, состоящий из нескольких раундов селекции на связывание, для обогащения клонами, связывающимися с представляющими интерес мишенями. Нацеленные белки, человеческий УЕСЕ8-109 и мышиный УЕСЕ, анализируют отдельно с помощью каждой библиотеки. Селекцию на связывание проводят описанными ранее методами (8|б1ш е! а1., см. выше).
На 96-луночных иммунопланшетах Мах1когр NυNС в течение ночи при 4°С иммобилизуют мишень для захвата (5 мкг/мл) и блокируют в течение 2 ч буфером 8ирегЬ1оск ТВ 8 (буфер 1пк-ЬиГГегеб кайпе) (Р1егсе). Выращивают в течение ночи при 37°С, фаг концентрируют преципитацией с помощью РЕС/№1С1 и ресуспендируют в 8ирегЬ1оск ТВ8, 0.05% Т\уееп 20 (81дта), как описано ранее (81бйи е! а1., см. выше).
Растворы фагов (~1012 фаг/мл) добавляют в покрытые плёнкой иммунопланшеты. Инкубируют в течение 2 ч, чтобы обеспечить связывание фага, планшеты отмывают 10 раз с помощью РВ8, 0.05% Т\уееп 20. Связанный фаг элюируют 0.1 М раствором НС1 в течение 10 мин и элюат нейтрализуют 1.0 М Тпк основанием. Элюированный фаг амплифицируют в Е.сой ХЬ1-Ь1ие и используют для последующих раундов селекции.
Библиотеки подвергают 5 раундам селекции против каждого нацеленного белка и в каждом раунде получают титры связывания фага либо с нацеленным белком, либо с эталонными (контрольными) лунками, покрытыми 8ирегЬ1оск ТВ8. Титр фага, связанного с лунками с иммобилизованной мишенью, делённый на титр фага, связанного с контрольными лунками, определяют как соотношение обогащения, количественно выражающее специфическое связывание фаговых пулов с нацеленным белком; более высокое соотношение обогащения указывает на более высокое специфическое связывание. Соотношения обогащения наблюдают после 3, 4 или 5 раундов селекции.
Индивидуальные клоны из каждого раунда выращивают в 96-луночном формате в 500 мкл бульона 2ΥΤ, дополненного карбенициллином и М13-УС8, а культуральные супернатанты непосредственно используют в фаговых анализах ЕЬ18А (81бйи е! а1., см. выше) для обнаружения фаг-дисплейных ЕаЬ, которые связаны с нацеленным белком, но не с планшетами с иммобилизованным В8А. Специфическими связующими называют те фаговые клоны, у которых сигнал ЕЫ8А на планшетах с плёнкой мишени по меньшей мере в 15 раз больше, чем на планшетах, покрытых В8А. Индивидуальные клоны подвергают скринингу после 2 раундов селекции на связывание с УЕСЕ или после 5 раундов селекции для других нацеленных белков. Эти данные используют для расчёта процентного содержания специфических связующих и результатов для каждой библиотеки против каждого нацеленного белка. Каждая библиотека даёт связующие против каждого нацеленного белка.
В индивидуальных клонах, представляющих собой специфические связующие, анализируют ДНК последовательности, и последовательности рандомизированных положений СОК показаны на фиг. 41. Можно видеть, что для каждого нацеленного белка возможно выбрать специфические связующие, которые содержат только Туг или 8ег в рандомизированных положениях (хотя наблюдаются некоторые непредусмотренные мутации, которые, по-видимому, образуются в процессе создания библиотеки, вероятно, из-за примесей в нуклеотидах). Кроме того, последовательности специфических связующих являются уникальными в отношении нацеленного белка, против которого их отбирают.
У двух связующих из перечисленных на фиг. 41 (1УЕСЕ связующие #3 и #18) проверяют аффин
- 63 012835 ность к 11УЕ0Е и тУЕ0Е. Данные Высоте получают по СЬеп е! а1.. б. Мо1. Вю1. (1999). 293(4): 865-81. Коротко говоря. аффинность связывания 11УЕ0Е связующих #3 и #18 и тУЕ0Е вычисляют с применением констант ассоциации и диссоциации. измеряемых с помощью системы поверхностного плазмонного резонанса Высоте™ - 2000 (ЫАсоге. Шс.. Р1кса!а^ау. N6). Биосенсорный чип активируют для ковалентного связывания УЕ0Е. используя №этил-Ы'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (ЕЭС) и №гидроксисукцинимид (N48) в соответствии с инструкциями производителя (ЫАсоге. Шс.. Р1кса1а^ау. N6). ЬУЕ0Е или тУЕ0Е с помощью буферного обмена вводят в 10 мМ ацетат натрия. рН 4.8. и этот раствор разводят примерно до 30 мг/мл. Аликвоты УЕ0Е инъецируют при скорости потока 2 мкл/мин до достижения примерно 200-300 относительных единиц (гекропке ипйк. ВИ) связанного белка. Раствор 1 М этаноламина инъецируют в качестве блокирующего агента. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения. ЕаЬ инъецируют в буфер РВ8/Т\гееп (0.05% Т\гееп 20 в фосфатносолевом буферном растворе) при 25°С при скорости потока 10 мкл/мин. Значения равновесной константы диссоциации. Кб. из измерений методом поверхностного плазмонного резонанса рассчитывают как ко££/коп. Данные Высоте™ приведены ниже.
Клон#3 ЬУЕСР покрытие на чипе шУЕСгР по крытие на чипе
ка(М'с'» 1.6 х 10“ Не обнару живается
К®1) (диссоциация) 7 х ]02 Не обнару живается
ка 46+/-17 нМ Не обнару живается
Клон #18 ЬУЕОР покрытие на чипе шУЕСР по крытие на чипе
адм®1) (ассоциация) к? 4х 104
кСс1) (диссоциация) 8 χ 10’3 2x10
К4 64+/-7 нМ 600+/-200 нМ
Пример 11. Дополнительные антитела Υ8 против УЕ0Е.
Конструкция и сортинг библиотек.
Фагмида. предназначенная для дисплея бивалентного ЕаЬ4Э5 на поверхности бактериофага М13. используется для создания библиотек. как описано выше. Олигонуклеотид-направленный мутагенез используют для замены положений в СОВ на ТМТ вырожденные кодоны (М=А/С в равных пропорциях). Положения. выбранные для рандомизации. представлены ниже.
Библиотека Рандомизированные положения
сокьз СОКН1 СЭВН2 сэкнз
Υ8-Α 28, 30,31, 32, 33 50, 52, 53, 54, 56, 58 95-100 заменяют на 7- 20 остатков
Υ8-Β 91- 94, 96 28, 30, 31, 32,33 50, 52, 53, 54, 56, 58 95-100а заменяют на 7- 15 остатков
В СЭВ-Н3 положения 95-100а заменяют случайными петлями всевозможной длины в интервале 720 остатков (библиотека А) или 7-15 остатков (библиотека В). Каждая библиотека содержит ~1010 членов уникальных клонов и. следовательно. действительное разнообразие библиотеки сравнимо с максимальным числом уникальных последовательностей. кодируемых дизайном библиотеки (4х 109).
Фаг из библиотек вводят в циклический процесс. состоящий из раундов селекции на связывание с антигеном в 96-луночных иммунопланшетах Мах1когр (ЛЦЛС) в качестве мишени для улавливания. как описано ранее (81бйи. 8.8. е! а1.. (2000) Мебюбк ίπ Епхуто1оду 328: 333-363). После пяти раундов селекции фаг продуцируют. используя индивидуальные клоны. выращенные в 96-луночном формате. а культуральные супернатанты используют в фаговом ЕБ68А для обнаружения клонов со специфическим связыванием. Определяют. что специфически связывающиеся клоны представляют собой ЕаЬ-фаг. связанный с родственным антигеном. но не обнаруживает заметного (детектируемого) связывания с семью другими белками.
Конкурентный фаговый ЕЫ8А.
Для оценки аффинности связывания ЕаЬ используют модифицированный фаговый ЕЫ8А (81бйи. (2000). см. выше; ОекЕауек. К.. е! а1.. (2002) СЬет. Вю1 9: 495-505). Фаговые анализы ЕЫ8А проводят на планшетах покрывают антигеном. как описано выше. Фрагменты фаг-дисплейного антитела используют в серийном разведении в РВ8. 0.5% (вес./об.) В8А. 0.1% (об./об.) Т\гееп 20. и измеряют связывание для определения концентрации. дающей ~50% сигнала при насыщении. Фиксированную субнасыщающую
- 64 012835 концентрацию фага предварительно инкубируют в течение 2 ч с серийными разведениями антигена, а затем переносят в аналитические планшеты, покрытые антигеном. Инкубируют 15 мин, планшеты отмывают РВ8, 0.05% Тетееп 20 и инкубируют 30 мин с конъюгатом пероксидаза хрена/анти-М13 антитело (разведение 1:5000) (Рйагтааа). Планшеты отмывают, проявляют субстратом ТМВ (Кбкедаагб апб Репу ЬаЬога!ог1ек), гасят 1.0 М Н3РО4 и читают на спектрофотометре при 450 нм. Аффинность связывания ГаЬ измеряют как величины 1С50, определяемые как концентрация антигена, которая блокирует ~50% связывания фага с иммобилизованным антигеном. Секвенированием ДНК 184 связывающихся клонов выявляет 63 уникальных последовательности, показанных на фиг. 42. Интересно отметить, что клоны из библиотеки В проявляют гомологию в последовательностях выбранных СПК-Ь3 и СИК-Н3. Напротив, последовательности СОК-Н3 клонов из библиотеки А обнаруживают гомологию друг с другом, но очень отличаются от последовательностей из библиотеки В. Таким образом, по-видимому, природа последовательности СПК-Ь3 влияет на селекцию последовательностей СИК-Н3 и, в результате, два различных класса антител против 1УЕСГ получают при использовании двух различных библиотек. Проводят скрининг клонов методом конкурентного фагового ЕЫ8А и обнаруживают, что значения 1С50 находятся в приблизительном интервале от 60 нМ до более чем 5.1 мкМ.
Очистка и анализ аффинности белка.
Три клона антител против 1 УЕСГ с наивысшей найденной аффинностью (верхние три последовательности на фиг. 42) очищают в виде свободных ГаЬ белков. ГаЬ белки очищают от Е.сой, как описано ранее (Ми1ег, Υ.Ά., е! а1., (1998) 81гис!иге 6: 1153-1167). См. фиг. 43 для последовательности Υ81 ГаЬ. Кинетику связывания очищенных ГаЬ (обозначенных ГаЬ^81, ЕаЬ-У82 и ЕаЬ-У83) изучают методом поверхностного плазмонного резонанса. Кинетику связывания определяют методом поверхностного плазмонного резонанса с применением В1Асоге™ - 3000 с помощью 1УЕСГ, иммобилизованного на СМ5 чипе при ~500 относительных единиц, как описано ранее (Сйеп, Υ., е! а1., (1999) б. Мо1. Вю1. 293: 865881). Серийные разведения белков ГаЬ инъецируют, и реакции (взаимодействия) связывания корректируют, вычитая реакцию (взаимодействие) на проточной кювете сравнения. Для кинетического анализа используют модель Ленгмюра 1:1с общей подгонкой коГГ и коп. Значения Кб определяют из отношений коп и когг.
Υ81 Υ32 Υ33
КГ1 .с’1) 5± 1 6±1 5± 1
кг (КУ3 .с1) 2.8 ±0.1 11.7 ±0.4 9.4 ± 0.1
Ко(нМ) 60 + 20 220 ± 60 190 ±40
ГаЬ Υ81 проявляет наивысшую аффинность к 1УЕСГ (Кс=60 нМ), тогда как два других ГаЬ связываются примерно в 5 раз менее прочно вследствие более высоких скоростей (констант) диссоциации. Последовательности Εηό-Υ81 и Εηό-Υ82 и отличаются только в трёх положениях, и следовательно, эти три различия отвечают за улучшенную аффинность ГаЬ^81 по сравнению с Εηό-Υ82.
Иммуногистохимия.
Далее мы исследуем специфичность ГаЬ Υ81, используя белок для визуализации УЕСГ в клетках млекопитающих, трансфецированных при использовании гена, кодирующего УЕСГ, слитый с зелёным флуоресцентным белком (СГР). Человеческие клетки А673, экспрессирующие мышиный УЕСГ-СГР, окрашивают и визуализуют, как описано (Ребеп, А.А., е! а1., (2004) б. Се11. Вю1 164: 1065-1076). На плюс УЕСГ панели Εηό-Υ81 преинкубируют в течение 5 мин с 5-кратным избытком УЕСГ, а затем инкубируют с клетками. Иммуногистохимическое окрашивание с применением Εηό-Υ81 точно перекрывается с сигналом флуоресценции от слияния УЕСГ-СГР (данные не показаны). Кроме того, сигнал полностью блокируется инкубацией ГаЬ^81 с 1УЕСГ перед окрашиванием.
Иммунопреципитация.
Мы также проводили иммунопреципитацию эндогенного 1 УЕСГ и сравнивали превращение ГаЬΥ81 в Εηό-Υ81 высокоспецифичного природного моноклонального антитела против 1УЕСГ (А4.6.1) (К1т, К.6., е! а1., (1992) Сго^!й Гас!ог 7: 53-64). Клетки А673 метят с помощью метаболизма (метаболически) и проводят иммунопреципитацию из сред, описанных ранее (К1т, К.6., е! а1., см. выше), используя 15 мкг поликлонального антитела против СГР (С1оп!есй), ГаЬ^81 или моноклонального антитела А4.6.1. Иммунные комплексы элюируют при кипении и разрешают с помощью δΌδ-РАСЕ на 14% акриламидном геле в условиях восстановления. Гель сушат, а затем экспонируют в планшете с фосфовизуализатором в течение ночи. Оба антитела, осаждённые в виде иммунопреципитатов, дают идентичный набор полос, которые, по-видимому, представляют 1 УЕСГ вариантов, полученных альтернативным сплайсингом мРНК (данные не показаны). Вместе эти результаты показывают, что ГаЬ^81 связывается с 1УЕСГ с высокой аффинностью и специфичностью, сравнимыми с аффинностью и специфичностью природного антитела, даже в комплексной клеточной среде.
Пример 12. 1п νί\Ό активности антител против УЕСГ.
С6-23 ингибирует рост и выживаемости новорождённых мышей.
Новорождённым мышам (С57/ВБ6) интраперитонеально (и.п., 1.р.) инъецируют ежедневно с 1 дня после рождения С6-23 1дС (50 мг/кг) или Г1!-1(1-3) Гс (50 мг/кг), или соответствующие контрольные вещества, др120-Гс, РВ8 или ничего не инъецируют. Ежедневно определяют вес тела и коэффициент вы
- 65 012835 живаемости. Как показано на фиг. 10, С6-23 снижает вес тела так же сильно, как тЕ1!-1(1-3)Ес, который известен как антагонист тУЕСЕ. Кроме того, коэффициенты выживаемости крыс в двух группах также равны по величине. Важно отметить, что результаты С6-23 конкретно показывают, что тУЕСЕ требуется для роста и выживания новорождённых мышей, тогда как эффект Е1!-1(1-3) Ес является менее специфический, так как известно, что он блокирует не только тУЕСЕ, но также плацентарный фактор роста (Р1СЕ) и УЕСЕ-В.
С6-23 эффективно ингибирует рост опухолевых ксенотрансплантатов у бестимусных мышей. КМ12 и 8У480, две человеческие клеточные линии колоректального рака, сначала выращивают в клеточной культуре и около 10 клеток из каждой клеточной линии инъецируют в хозяина - голую мышь. Когда опухоль достигнет в размере 100 мм3 (через 1 неделю после инъекции), инъецируют С6-23 или контроль (10 мг/кг) дважды в неделю (в каждой группе по шесть бестимусных мышей). Размеры опухоли определяют до дня 13 после инъекции антитела. Как показано на фиг. 11, С6-23 заметно эффективно уменьшает объём опухоли как КМ12 (левый график) и 8\У480 (правый график) клеточные линии.
Экспрессию генов как ЬУЕСЕ, так и тУЕСЕ изучают на мышах с КМ12 ксенотрансплантатом. Образцы опухолей и прилегающих тканей извлекают и для количественного подсчёта генной экспрессии используют Тадтап. В этих моделях ксенотрансплантата ЬУЕСЕ происходит из имплантированных человеческих КМ12 опухолевых клеток, тогда как тУЕСЕ происходит из прилегающих стромальных клеток-хозяев. Как показано на фиг. 12, образцы мышиного происхождения, обработанные С6-23 в день 3 и день 13, имеют более высокие уровни экспрессии генов как ЬУЕСЕ, так и тУЕСЕ по сравнению с контрольными группами. Результаты показывают, что, хотя у мышей, получающих С6-23, уменьшается рост опухоли и значительно снижается количество кровеносных сосудов, в ответ на снижение ангиогенеза активируется экспрессия тУЕСЕ и ЬУЕСЕ. Это также показывает, что в месте расположения опухоли имеется значительная инфильтрация мышиными стромальными клетками, которая является главным источником УЕСЕ для ангиогенеза опухоли. Следовательно, в преклинической животной модели, такой как модель ксенотрансплантата по данному описанию, антитело, способное к перекрёстной реакции и блокирующее как ЬУЕСЕ, так и тУЕСЕ, является необходимым для изучения их эффективности.
Мышиные (Ьете1к) клетки рака лёгких (ЪЬ2) также используют на модели бестимусных мышей для проверки ингибирующего эффекта С6-23. Около 106 клеток ЬЬ2 в виде препарата матригеля вводят подкожно в бок 5-недельных бестимусных мышей с врождённым отсутствием естественных клетоккиллеров. Затем одной группе из шести мышей вводят 10 мг/кг С6-23, инъецируя 1.р. (интраперитонеально) дважды в неделю в течение 19 дней. Также для обработки групп из шести мышей используют другие контрольные агенты (т.е. тЕ1!(1-3)-1дС, гад-10). Как показано на фиг. 13, С6-23 значительно снижает скорость роста опухоли с фармакологическим эффектом, сравнимым с фармакологическим эффектом тЕ1!(1-3)-1дС, который, как известно, является очень мощным агентом для блокирования не только тУЕСЕ, но также других ангиогенных факторов тР1СЕ и тУЕСЕ-В. Измеряют также сывороточные уровни биоактивного С6-23. Результаты показывают, что их уровни (62-121 мкг/мл) хорошо укладываются в интервал, ожидаемый для лекарственных препаратов, нейтрализующих антитело против УЕСЕ.
Клетки НМ-7 (американская коллекция типовых культур, АТСС) также используют для изучения ингибитора роста опухоли в бестимусных мышах. С6 1дС антитело, С6-31 1дС антитело, антитело авастин (Ауакйп), Υ0317 1дС антитело, применяемые в данном исследовании, экспрессируют и очищают от СНО клеток. Клетки НМ-7 выдерживают в культуре со средой Е12: ОМЕМ, дополненной 10% ЕВ8 и 1% пенициллином-стрептомицином и 1% глутамина. Клетки выращивают при 37°С в 5% СО2 до достижения монослоя, собирают, считают, отмывают и ресуспендируют в стерильном матригеле с концентрацией 25х106 клеток на мл. Ксенотрансплантаты пересаживают 4-6-недельным самкам мышей Ве1де Ж1бе ΧΙΌ (бестимусным мышам с врождённым отсутствием естественных клеток-киллеров), инъецируя 5х106 НМ7 культивированных клеток в дорсальный бок мышей и оставляют расти. Через 48 ч опухоли становятся ощутимыми (пальпируются) у всех мышей, и произвольно выбирают группу (п=10) для контроля в день 0. Остальных мышей делят на 23 группы, и дважды в неделю им инъецируют различные антитела против УЕСЕ. Группам проводят следующее лечение. Группа А (п=10х1): мышам дважды в неделю вводят контрольное антитело МАВ (антитело против пыльцы) в 0.1 мл в виде интраперитонеальной инъекции в высокой дозе (5 мг/кг). Группа В (п=10х5): мышам дважды в неделю вводят С6 1дС антитело в 0.1 мл интраперитонеальной инъекцией в одинаковой дозе (0.1, 0.25, 0.5, 2 или 5 мг/кг). Группа С (п=10х5): мышам дважды в неделю вводят Υ0317 1дС антитело в 0.1 мл интраперитонеальной инъекцией в одинаковой дозе (0.1, 0.25, 0.5, 2 или 5 мг/кг). Группа Ό (п=10х5): мышам дважды в неделю вводят антитело авастин (Ауакйп™) в 0.1 мл интраперитонеальной инъекцией в одинаковой дозе (0.1, 0.25, 0.5, 2 или 5 мг/кг). Группа Е (п=10х5): мышам дважды в неделю вводят С6-31 1дС антитело в 0.1 мл интраперитонеальной инъекцией в одинаковой дозе (0.1, 0.25, 0;5, 2 или 5 мг/кг). Мышей (п=10 контрольные и пролеченные животные) умерщвляют в день 4, 7, 11, 14, 17 и 21 после начала введения инъекций, опухоли иссекают и взвешивают.
Результаты показывают, что наблюдается значительное подавление роста опухоли, когда вводят антитела С6, С6-31, Υ0317 и Ауакйп™ (р<0.5) (фиг. 33А-Е). Опухоли, иссечённые из мышей, обработанных
- 66 012835 антителом против УЕСЕ, меньше по размеру и являются менее васкуляризованными по сравнению с опухолями, иссекаемыми из контрольных мышей. Как обсуждалось выше, антитело С6 и антитело С623, в отличие от антитела авастин (АуахЕп) и антитела Υ0317, могут связываться как с человеческим УЕСЕ, так и с мышиным УЕСЕ, включая УЕСЕ в мышиных стромальных клетках, который может активироваться при имплантации человеческих колоректальных опухолей в мышиные модели. Непосредственное сравнение активности антител С6 и С6-31, которые связываются с аналогичными эпитопами, показывает, что в большинстве точек антитело с более высокой аффинностью к УЕСЕ-А, антитело С6-31, имеет более высокие показатели ингибирования роста опухоли.

Claims (72)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с фактором роста эндотелия сосудов (УЕСЕ) мыши и человека с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и способные ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ, причем функциональный эпитоп человеческого УЕСЕ, с которым связываются антитело или его ЕаЬ фрагмент, содержит остатки Е17, 183 и 089.
  2. 2. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с УЕСЕ мыши и человека с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ, причем функциональный эпитоп человеческого УЕСЕ, с которым связываются антитело или его ЕаЬ фрагмент, содержит остатки Е17 и М18 человеческого УЕСЕ.
  3. 3. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.2, связывающие функциональный эпитоп, содержащий остатки Е17 и М18 и 089 человеческого УЕСЕ.
  4. 4. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с УЕСЕ мыши и человека с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ, причем функциональный эпитоп человеческого УЕСЕ, с которым связываются антитело или его ЕаЬ фрагмент, содержит остатки Е17, Υ21 и Υ25.
  5. 5. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.4, связывающие функциональный эпитоп, содержащий остатки Е17, Υ21, 022, Υ25, И63 и 183 человеческого УЕСЕ.
  6. 6. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.4, связывающие функциональный эпитоп, содержащий остатки Е17, Υ21, Υ25 и 089 человеческого УЕСЕ.
  7. 7. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-4, связывающие функциональный эпитоп, содержащий остатки Е17, Υ21, 022, Υ25, И63, 183 и 089 человеческого УЕСЕ.
  8. 8. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.2-4, связывающие функциональный эпитоп, содержащий остатки Е17, М18, И19, Υ21, Υ25, Р89, 191, К101, Е103 и С104 человеческого УЕСЕ.
  9. 9. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1, 2 или 4, связывающие функциональный эпитоп, содержащий комбинацию остатков, выбранных из группы, состоящей из Е17, М18, Υ21, 022, Υ25, К48, И63, Ь66, М81, 183, Н86, Р89, 191, С104 и Р106 человеческого УЕСЕ.
  10. 10. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.2-4, связывающие функциональный эпитоп, содержащий остатки Е17, М18, Υ21, 022, Υ25, К48, И63, Ь66, М81, 183, Н86, Р89, 191, С104 и Р106 человеческого УЕСЕ.
  11. 11. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-10, где рецептор представляет собой УЕСЕ рецептор 2 (КИВ).
  12. 12. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-10, где рецептор представляет собой УЕСЕ рецептор 1 (Е1!-1).
  13. 13. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-10, способные ингибировать связывание УЕСЕ с УЕСЕ рецептором 1 и УЕСЕ рецептором 2.
  14. 14. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-10, способные связываться с мышиным и человеческим УЕСЕ с величинами Кб, равными 10 нМ или ниже.
  15. 15. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-10, способные связываться с мышиным и человеческим УЕСЕ с величинами Кб, равными 2 нМ или ниже.
  16. 16. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-10, способные связываться с человеческим УЕСЕ с константой ассоциации (коп) 1.0 или выше (10 М-1с-1).
  17. 17. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с УЕСЕ мыши и человека с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ, и содержащие последовательность СИВ-Н3 любого из антител на фиг. 2, 7, 24-29 и 34-43.
  18. 18. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.17, дополнительно содержащие последовательность СИВН1 и последовательность СИВ-Н2 любого из антител на фиг. 2, 7, 24-29 и 34-43.
  19. 19. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.18, где:
    (a) СИВ-Н1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность 0У\У1Н (ЗЕО 1И NО: 261);
    (b) СИВ-Н2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность СIТΡΛССΥΊУΥА^3УКС (ЗЕО 1И 474) и (c) СИВ-Н3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ЕУЕЕ^ΡΥЛМ^Υ (ЗЕО
    - 67 012835
    ΙΌ ΝΟ: 475).
  20. 20. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.18, дополнительно содержащие вариабельный домен легкой цепи, содержащий СЦЯ-Ы, СОЯ-Ь2 и СОЯ-Ь3 следующей структуры:
    (a) СЦЯ-Ы содержит непрерывную аминокислотную последовательность К.А80ОУ8ТАУА (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 48);
    (b) СОЯ-Ь2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность 8А8ЕЕ-У8 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 49) и (c) СОЯ-Ь3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность КРОГАН РЕТ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 940).
  21. 21. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.18, где:
    (a) СЭЯ-Н1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность Άδ^ΙΗ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 936);
    (b) СЭЯ-Н2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ОΆΓУРΥ§ОΥТN (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 937) и (c) СЦЯ-Н3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ^ОН8Т8Р^ (+ЕО ΙΌ ΝΟ: 931).
  22. 22. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.18, где:
    (a) СЦЯ-Н1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность О8^Е (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 938);
    (b) СЦЯ-Н2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ОΆI^ΕΕООΥТΗ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 939) и (c) СЦЯ-Н3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ^ОН8Т8Р^ (+ЕО ΙΌ ΝΟ: 931).
  23. 23. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с УЕОЕ мыши и человека, с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, где антитело способно ингибировать связывание УЕОЕ с рецептором УЕОЕ и содержит последовательности вариабельной области тяжелой цепи, или легкой цепи, или обеих цепей любого из антител на фиг. 2, 7, 24-29 и 34-43.
  24. 24. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.23, содержащие следующую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжёлой цепи (УН) и первого константного домена тяжёлой цепи (СН1):
    ΕV^^VΕ8αΟС^V^ΡС5^δ^^¢^8СΑΑ5Οт5^ΥXVII^νκ^ΑΡΟΚ^Ε\VVΑСΠ,ΡΑ6СΟΥΤ УУАО5УКОКГТ18АРТ8ККГАУЕСМК8ЕКАЕГТАУУУСАКРУ1ти>УАМОУ\УС0ОТЕ ντν55Α5ΤΚ0Ρ3νΚΡΙΑΡ58Κ5Τ80ΟΤΑΑΕΟ(ΧνΚϋΥΡΡΕΡντν5λνΝ5ΟΑΕΤ50νΗΤΡΡΑ УЕ985ОЕУ5Е58УУТУР855ЬОТ0ТУ1СМУКНКРЗМТКУОККУЕРК5СПКТН (8Е(} ГО N0:29).
  25. 25. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.23 или 24, содержащие следующую аминокислотную последовательность лёгкой цепи:
    ^I^ΜΤ^5Ρ88^8Α8Vα^ΚVΤΓΓСΚΑ8^^V8ΤΑVΑ5VΥ^^ΚΡΟΚΑΡΚ^^IΥ8Α8Ε^Υ8ΟVΡ8 КР5С568ОТОЕГЕТ158ТбРЕБРАТУ¥Сб05УТТРРТРО0<}ТК\Т1ККТУААР8У'Т1ЕРР.8П ЕС2ЪК8СтТА5УУСи.К'МРУРКЕАКУ0У\'К\ГОМАЬр8С№0Е8УТЕрО8КО8Т¥5Ь55ТЬТЬ 8КАОУЕКНКУУАСЕУТНССЬ85РУТК8Н<ГК6ЕС (Ж} ПЭ N0: 28).
  26. 26. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.23 или 24, содержащие следующую аминокислотную последовательность лёгкой цепи:
    Τ)^ΜΤΰ8Ρ88Ε8Α8ναϋΚ\ΤΊΤαΤ^θν8ΤΑνΑ\νΥφ0ΚΡΟΚΑΡΚΕΕ]ΎδΑ8ΕΕΥ8σνΡ8 КР5О8а5С1Т>ЕТЕТТ88Е0РЕЕРАТУУСЦ0САО8РЕТРОС2бТКУЕ1ККТУААР8УЕ1ЕРР8Г Ε^^Κ8ΟΤΑ8VVС^^NNΕΥΡΒΕΑΚV^^VΚV^NΑ^^86N8^Ε8VΤΕ^^8Κ^8ΤΥ8^88Τ^Τ^ 8КАОУЕКНКУУАСЕУТНООЕ88РУТК8РЫКОЕС (8Е0 ГО N0: 33).
  27. 27. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.23 или 24, содержащие следующую аминокислотную последовательность лёгкой цепи:
    ΟΙφΜΤφ8Ρ88Ε8Α8νθΟΒνΤΤΓ€ΚΑ5φϋν5ΤΑνΑ\νΥφ9ΚΡΟΚΑΡΚΙΧΓΥ8Α8ΡΕΥ8θνΡ5 ΚΓ8σ8Ο5ΟΤΟΕΤΕΤΙ85ΕςΡΕΟΡΑΤΥΥσΚφΟΥΑΝΡ’Λ'ΓΤΡΟ<2σΤΚνΕΙΚΚΤν.ΑΑΡ8νΡΙΡΡΡ3 ^Ε^^Κ8СТΑ8VVС^^NNΡΥΡΚΡΕΑΚV^ΨΚV^NΑ^^8ΟN8^Ε8VΤΕ^^5Κ^8ΤΥ8^85Τ ЬТЕЗКАОУЕКНКУУАСЕУТНЦСЕЗБРУТКБИЖСЕС (8Е<2 ГО N0: 30).
  28. 28. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.23 или 24, содержащие следующую аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (УЬ):
    - 68 012835
    ΟΙφΜΓφ8Ρ58Ε8Α£νθΟΚνΤΪΤ€1<Α5φθν8ΤΑνΑ\\ΥΟΟΚΡΟΚΑΡΚΕΕΙΥ5Α8ΡΕΥ86νΡ3ΚΡ8
    СЗОЗОТОРГЕТКЗиЗРЕОРАТУУСффОУОМРРТРСгООТКУЕККТУААРЗУНЕРРЗСЕфЕКЗ σΤΛ5νναΧΝΝΡΥΡΚΕΛΚνρνί,·χνθΝΑΙ.ς5αΝ5ΌΕ8νΤΕςθ8Κη5ΤΥ8Ε33ΤΡΊ·Ε3ΚΑΟΥΕΚ
    НКУУАС ЕУТНООЬЗЗРУТКЗРЫКОЕС (8Ε<2 ГО ΝΟ: 32).
  29. 29. Антитело или его РаЬ фрагмент по п.23, содержащие следующую аминокислотную последовательность лёгкой цепи:
    ШОМТОЗРЗЗЕЗАЗУбОКУТГГСВАЗфОУЗТАУАХУУОфКРСКАРКЕЬГУЗАЗЕЕУЗОУРЗ
    ΕΡ5Ο3630ΤΟΕΓΕΤΙ53Ε0ΡΕΟΡΑΤΥΥ€Κ0ΟΡΑΝΡΡΤΡΟ0ΟΤΚνΕΙΚΚΤνΑΛΡ5νΡΙΕΡΡ8Ο
    ΕφΕΚ8ΟΤΑ3νν€ΕΕΚΝΡ\ΤΚΕΑΚνςχνΚνθΝΑΕφ8ίΐΝ8φΕ5νΤΕςϋ8ΚΟ5ΤΥ8Ε33ΤΕΤΕ
    ЗКАОУЕКНКУУАСЕУТНООЪЗЗРУТКЗРККОЕС (ЗЕО ГО ΝΟ: 34).
  30. 30. Антитело или его РаЬ фрагмент по п.23 или 29, содержащие следующую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжёлой цепи:
    ΕνΟΕνΡΛΟΟΟΊ.νΟΡΩΟβΕΚΙ^ΟΑΑδΟΕ’ΤΕ^ΕΥ’Λ’ΙΗΛννΚΟ/ΧΡΟΚΕΕΧννΑΟνΤΡΑΟΟΥΤΥ
    ΥΑΟ3νκσΕΓΓ13ΑΟΤ5ΚΝΤΑΥΕ0ΜΝ3ΕΗΑΕϋΤΑνΥΥ€ΑΚΕνΡΡΙΡΥΑΜϋΥΧνσ0σΤΕν
    ТУЗЗАЗТКОРЗУРРЕАРЗЗКЗТЗООТААЕОСЕУКОУЕРЕРУТУЗТОГЗОАЕТЗОУНТРРАУ
    ΕΌ88σΕΥ8Ε$5νντνΡ588ΕΟΤΌΤΥΙΟΝνΝΗΚΡ8ΝΤΚνθΚΚνΕΡΚ30ϋΚΤΗ (ЗЕО ГО N0:
    35) .
  31. 31. Антитело или его РаЬ фрагмент по п.23 или 29, содержащие следующую аминокислотную последовательность лёгкой цепи:
    ЕУфЕУЕЗааСЕУОРСЮЗЕКЕЗСААЗОРЧЧЗОУХУШУЛ/РОАРОКЕЕУ/УАОУТРАОСУТА ΥΑΟ8νΚΟΚΡΤΙ8ΑΟΤ8ΚΝΤΑΥΕ0ΜΝ8ΕΚΑΕϋΤΆνΥΥΕΑΚΡνΡΡΕΡΥΑΜϋΥ5νθ0ΟΤΕν ТУ88А8ТКОР8УЕРЕАР88К8Т8СОТААЕССЕУКП¥РРЕРУТУ85УНЗОАЕТ80УНТЕРАУ Ε088ΟΕΥ8Ε33νντν₽338ΕΟΤ0ΤΎΙ0ΝνΝΗΚΡ8ΝΤΚνΏΚΚνΕΡΚ5ΟϋΚΤΗ (8Εφ ГО ΝΟ:
    36) .
  32. 32. Антитело или его РаЬ фрагмент по п.23, содержащие следующую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжёлой цепи (УН):
    Εν0ΕνΕ86σθΕν0ΡΟΟ8ΕΚΕ5ΟΑΑ8ΟΓΠΝΑ5™ΕννΚ0ΑΡΟΚΟΕΕνννθΑΙΥΡΥ8ΟΥΤΝΥ
    ΑΡ8νΚΟΚΕΤΙ8ΑΠΤ8ΚΝΤΑΥΕ0ΜΝ8ΕΚΑΕΠΤΑνΥΥ0ΑΚΧ¥ΟΗ8Τ8Ρ5νΑΜΡΥνν60ΟΤΕνΤ У58А5ТКОР5УЕРЕАР88К5Т800ТААЕОСЕУКО¥ЕРЕРУТУ83¥№САЕТ8ОУН1ТРАУЕ088
    ΟΕΥ8Ε88ννΤνΡ838ΕΟΤ0ΤΥΙΟΝνΝΗΚΡ8ΝΤΚνθΚΚνΕΡΚ36Χ>ΚΤΗ (8ЕО ГО ΝΟ: 38).
  33. 33. Антитело или его РаЬ фрагмент по п.23 или 32, содержащие следующую аминокислотную последовательность лёгкой цепи:
    О10МТ05Р88Е8А8У0ОКУТ1ТСКА30ОУ8ТАУАУ/¥00КРОКАРКЕЕ1¥5А5РЕУ.8СУР5
    ΚΡ5Ο5Ο8ΟΤϋΓΤΕΤΙ55Ε0ΡΕΟΡΑΤΥΥσ008ΥΤΤΡΡΤΡΟ0ΟΤΚνΕΙΚΛΤνΑΛΡ.8νΡΙΡΡΡ8η
    ΕςΕΚ8σΤΑ8νν0ΕΕΝΝΡΥΡΗ.ΕΑΚνΌΧνκνθΝΑΤ.,Ό8ΟΝ8φΕ8\ΠΈ0Ο8Κ08τΎ5Ε88ΤΕΤΕ
    8ΚΑΟΥΕΚΙΙΚνΎΑΟΕ\ΠΉφαΕ88ΡνΤΚ3ΡΝΚΟΕΟ (8Εφ ГО ΝΟ: 37) или ϋΙΟΜΤρ8Ρ83Ε8Α8νθΟΚνΤΙΤΟΙ<Α8ρνΐΚΚ8ΕΑννΥΟΟΚ₽ΟΚΑΡΚΕΕίΥΑΑ8ΝΕΑ3σνΡ8
    ВРЗОЗСЗбТОРГЕТКЗЕОРЕОРАТУУСфОЗПТЗРЕТРОООТКУЫКкТУААРЗУПРРРЗО Ε0ΕΚ8ΟΤΑ8νν0ΕΕΝΝΓΥΡΚΕΑΚν0ΧνκνθΝΑΕς8ΟΝ30Ε8νΤΕ0Ο5ΚΟ5ΤΥ3Ε88ΤΕΤΕ 8ΚΑΟΥΕΚΗΚνΥΑΟΕνΤΗΟΟΕ88ΡνΤΚ5ΕΝΚΟΕΟ (8Ε0 ГО ΝΟ: 39).
  34. 34. Антитело или его РаЬ фрагмент по п.23, содержащие следующую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжёлой цепи (УН):
    Εν0ΕνΕ8Ο€Κ7ΕνςΡΟΟ8ΕΚΕ80ΑΑ8ΟΕ8ΙΝΟ3ΧνΐΡ3ννκςΑΡΟΚΟΕΕΧννθΑΐννΡΡ(3(3ΥΓΗΥΑ ϋ.8νΚΟΚΡΤ18ΑΓ>Τ3ΚΝΤΑΥΕςΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚνν'ΟΗ8'Γ8Ρ^ΆΕ№ΥΥ'αςθΊΈντν8 8Α8ΤΚσΡ8νΡΡΕΑΡ88Κ8Τ80ΟΤΑΑΕ<3€ΕνΚΟΥΕΡΕΡντνδΧνΝ8ΟΑΕΤ3θνΗΤΡΡΑνΕ0386 ΙΎ8Ε88νντνΡ888ΕΟΤΟΤΥΤΟΝνΝΗΚΡ8ΝΤΚνθΚΚνΕΡΚ80ϋΚπΐ (ЗЕф ГО ΝΟ: 41).
  35. 35. Антитело или его РаЬ фрагмент по п.23 или 34, содержащие следующую аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (УЬ):
    ОК)МТф8Р88Е8А8УСОКУТГТСКАЗОУ1КК8ЕА^ООКРС1КАРКЕЕ1УААЗМ.А8С.УР8кР8 Ο8Ο3σΤΟΡΤΕΊΊ55ΕΌΡΕΟΡΑΊΎΥΟ0φ8ΝΤ8ΡΕΤΡΟφΟΤΚνΕ1ΚΡΤνΑΑΡ8νΡΙΡΡΡ8ΟΕ0ΕΚ8 ΟΤΑ5ννθ1Ι.ΝΝΡΎΡ№ΑΚν0ν('Κ\Ί)ΝΑΤ.ρ86Ν8φΕ8νΊΈ0Ο8Κη8ΤΥ.8Ε88ΤΕΤΕ8ΚΑΟΥΕΚ НКУУАСЕУТН0ОЕ88РУТК8ЕМКОЕС (8Εζ) ГО ΝΟ: 40).
  36. 36. Антитело или его РаЬ фрагмент, способные связываться с УЕСР мыши и человека с величинами
    - б9 012835
    Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и содержащие вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, в которых вариабельный домен тяжелой цепи содержит СИК-Ш, СИК-Н2 и СИК-Н3 следующей структуры:
    (a) СИК-Н1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ΌΥΥΙΕ (3ЕЦ ΙΌ N0: 261);
    (b) СОК-Н2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность 0IТРА00ΥТΥ^^1)36^01 (3ЕС) ΙΌ N0: 474) и (c) СОК-Н3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ЕУЕЕ^РΥАМ^Υ (3ЕЦ ΙΌ N0: 475);
    а вариабельный домен легкой цепи содержит СОК-Ь1, СОК-Ь2 и СОК-Ь3 следующей структуры:
    (б) СОК-Ь1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность КА3ЦОУ3ТАУА (3ЕЦ ΙΌ N0: 48);
    (е) СОК-Ь2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность 3А3Е^Υ3 (3ЕЦ ΙΌ N0: 49) и (Г) СОК-Ь3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ^^3ΥТТРРТ (3ЕЦ ΙΌ N0: 363), причем указанные антитело или его ЕаЬ фрагмент способны ингибировать связывание УЕ0Е с рецептором УЕ0Е.
  37. 37. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с УЕ0Е мыши и человека с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и содержащие вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, в которых вариабельный домен тяжелой цепи содержит СОК-Н1, СОК-Н2 и СОК-Н3 следующей структуры:
    (a) СОК-Н1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ΌΥνΗ (3ЕЦ ΙΌ N0: 261);
    (b) СОК-Н2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность 0IТРА00ΥТΥ^^1)36^01 (3ЕО ΙΌ N0: 474) и (c) СОК-Н3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ЕУЕЕ^РΥАМ^Υ (3ЕЦ ΙΌ N0: 475);
    а вариабельный домен легкой цепи содержит СОК-Ь1, СОК-Ь2 и СОК-Ь3 следующей структуры:
    (б) СОК-Ь1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность КА3ЦОУ3ТАУА (3ЕЦ Ш N0: 48);
    (е) СОК-Ь2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность 3А3Е^Υ3 (3ЕЦ ΙΌ N0: 49) и (Г) СОК-Ь3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность К^0ΥАNРVТ (3ЕЦ ΙΌ N0: 143), причем указанные антитело или его ЕаЬ фрагмент способны ингибировать связывание УЕ0Е с рецептором УЕ0Е.
  38. 38. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с УЕ0Е мыши и человека с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и содержащие вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, в которых вариабельный домен тяжелой цепи содержит СОК-Н1, СОК-Н2 и СОК-Н3 следующей структуры:
    (a) СОК-Н1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ΌΥΥΙΕ (3ЕЦ ΙΌ N0: 261);
    (b) СОК-Н2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность 0IТРА00ΥТΥ^^1)36^01 (3ЕО ΙΌ N0: 474) и (c) СОК-Н3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ЕУЕЕ^РΥАМ^Υ (3ЕЦ ΙΌ N0: 475);
    а вариабельный домен легкой цепи содержит СОК-Ь1, СОК-Ь2 и СОК-Ь3 следующей структуры:
    (б) СОК-Ь1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность КА3ЦОУ3ТАУА (3ЕЦ Ш N0: 48);
    (е) СОК-Ь2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность 3А3Е^Υ3 (3ЕЦ ΙΌ N0: 49) и (Г) СОК-Ь3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ^^0Υ0NРЕТ (3ЕЦ ΙΌ N0: 52), причем указанные антитело или его ЕаЬ фрагмент способны ингибировать связывание УЕ0Е с рецептором УЕ0Е.
  39. 39. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с УЕ0Е мыши и человека с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и содержащие вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, в которых вариабельный домен тяжелой цепи содержит СОК-Н1, СОК-Н2 и СОК-Н3 следующей структуры:
    (а) СОК-Н1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ΌΥΥΙΕ (3ЕЦ ΙΌ N0: 261);
    - 70 012835 (b) СЭЕ-Н2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность СIТРАССΥТУ33^1)8334(., (8ЕС) ГО ЫО: 474) и (c) СГОЕ-Н3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность ЕУЕЕ^РΥАМ^Υ (8Е0 ГО ЫО: 475);
    а вариабельный домен легкой цепи содержит СГОЕ-БЗ, СЭЕ-Б2 и СЭЕ-Б3 следующей структуры:
    (б) СГОЕ-БЗ содержит непрерывную аминокислотную последовательность ЕА8рПУ8ТАУА (8ЕО ГО ЫО: 48);
    (е) СГОЕ-Е2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность 8Λ8Е^У8 (8ЕО ГО ЫО: 49) и (£) СЭЕ-Б3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность РРСАС8РБТ (8ЕО ГО ЫО: 68), причем указанные антитело или его ЕаЬ фрагмент способны ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ.
  40. 40. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с УЕСЕ мыши и человека с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и содержащие вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, в которых вариабельный домен тяжелой цепи содержит СГОЕ-НЕ СГОЕ-Н2 и СГОЕ-Н3 следующей структуры:
    (a) СГОЕ-Н1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность Λ8\VIН (8ЕО ГО ЫО: 936);
    (b) СГОЕ-Н2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность САΓУРΥ8СΥТN (8ЕО ГО ЫО: 937) и (c) СГОЕ-Н3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность \УСН8Т8Р\У (8ЕО ГО ЫО: 931);
    а вариабельный домен легкой цепи содержит СГОЕ-БЗ, СЭЕ-Б2 и СЭЕ-Б3 следующей структуры:
    (б) СГОЕ-БЗ содержит непрерывную аминокислотную последовательность ЕА8рПУ8ТАУА (8ЕО ГО ЫО: 85);
    (е) СГОЕ-Б2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность 8Λ8Е^У8 (8ЕО ГО ЫО: 86) и (£) СЭЕ-БЗ содержит непрерывную аминокислотную последовательность ^^8УТТРРТ (8ЕО ГО ЫО: 87), причем указанные антитело или его ЕаЬ фрагмент способны ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ.
  41. 41. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с УЕСЕ мыши и человека с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и содержащие вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, в которых вариабельный домен тяжелой цепи содержит СЭЕ-Н1, СГОЕ-Н2 и СГОЕ-Н3 следующей структуры:
    (a) СГОЕ-Н1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность С8^Е (8ЕО ГО ЫО: 938);
    (b) СГОЕ-Н2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность САI^РЕССΥТН (8ЕО ГО ЫО: 939);
    (c) СГОЕ-Н3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность \УСН8Т8Р\У (8ЕО ГО ЫО: 931);
    а вариабельный домен легкой цепи содержит СЭЕ-Ь1, СЭЕ-Б2 и СЭЕ-Б3 следующей структуры:
    (б) СГОЕ-БЗ содержит непрерывную аминокислотную последовательность ЕАЗРУЗЕЕЗЬА (8ЕО ГО ЫО: 117);
    (е) СГОЕ-Б2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность АА8ЫЪА8 (8ЕО ГО ЫО: 118) и (£) СГОЕ-БЗ содержит непрерывную аминокислотную последовательность ОО8ЫТ8РБТ (8ЕО ГО ЫО: 119), причем указанные антитело или его ЕаЬ фрагмент способны ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ.
  42. 42. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с УЕСЕ мыши и человека с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и содержащие вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, в которых вариабельный домен тяжелой цепи содержит СГОЕ-НЕ СГОЕ-Н2 и СГОЕ-Н3 следующей структуры:
    (a) СГОЕ-Н1 содержит непрерывную аминокислотную последовательность Λ8\VIН (8ЕО ГО ЫО: 936);
    (b) СГОЕ-Н2 содержит непрерывную аминокислотную последовательность САΓУРΥ8СΥТЫ (8ЕО ГО ЫО: 937);
    (c) СГОЕ-Н3 содержит непрерывную аминокислотную последовательность \УСН8Т8Р\У (8ЕО ГО ЫО: 931);
    а вариабельный домен легкой цепи содержит СЭЕ-Ь1, СГОЕ-БЗ и СЭЕ-Б3 следующей структуры:
    - 71 012835 (б) СЭК-Ы содержит непрерывную аминокислотную последовательность КА8ОУ1КК8ЬА (8ЕЦ ΙΌ 117);
    (е) СЭК-ЬЗ содержит непрерывную аминокислотную последовательность АА81МЪА8 (8ЕЦ ΙΌ №О: 118);
    (Г) СЭК-ЬЗ содержит непрерывную аминокислотную последовательность 008№Г8РЬТ (8ЕЦ ΙΌ 119), причем указанные антитело или его ЕаЬ фрагмент способны ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ.
  43. 43. Антитело или его ЕаЬ фрагмент, способные связываться с УЕСЕ мыши и человека с величинами
    Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ, содержащие последовательность СПК-Н3, выбранную из группы, включающей: ЕУЕЕЬРУ (8ЕЦ ΙΌ NО: 929), ЕУЕЕЬРУАМПУ (8ЕС) ΙΌ ^: 930), АСН8Т8РА (8ЕС) ΙΌ 931) и АСН8Т8РААМПУ (8ЕЕ) ΙΌ
    932).
  44. 44. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-43, отличающиеся тем, что антитело является моноклональным антителом.
  45. 45. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-43, отличающиеся тем, что антитело является биспецифическим антителом.
  46. 46. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-43, отличающиеся тем, что антитело является синтетическим антителом.
  47. 47. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-43, способные связываться с УЕСЕ человека с величиной Кб не более чем примерно 2 нМ.
  48. 48. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.47, отличающиеся тем, что величина Кб составляет не более чем примерно 1 нМ.
  49. 49. Антитело или его ЕаЬ фрагмент по п.48, отличающиеся тем, что величина Кб составляет не более чем примерно 500 пМ.
  50. 50. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-49.
  51. 51. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.50.
  52. 52. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.51.
  53. 53. Способ получения антитела или его ЕаЬ фрагмента по любому из пп.1-49, включающий выращивание клетки-хозяина по п.52 в условиях, обеспечивающих экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело.
  54. 54. Способ по п.53, дополнительно включающий регенерацию антитела из культуры клеткихозяина.
  55. 55. Способ по п.54, отличающийся тем, что антитело выделяют из культуральной среды клеткихозяина.
  56. 56. Способ селекции антитела против НУЕСЕ, которое способно связываться с УЕСЕ мыши и человека с величинами Кб, отличающимися не более чем в 10 раз, и ингибировать связывание УЕСЕ с рецептором УЕСЕ, включающий:
    а) создание библиотеки синтетических антител с заданным разнообразием по меньшей мере в одной из СОК;
    б) обеспечение контактирования указанной библиотеки с УЕСЕ человека;
    в) отделение образовавшихся комплексов от свободных антител и УЕСЕ человека, элюцию антител из указанных комплексов и их инкубацию в растворе с уменьшающимися количествами УЕСЕ человека с концентрацией от примерно 0,1 до 1000 нМ и
    г) отбор антител, которые могут связываться с УЕСЕ человека в самых низких концентрациях и обладают аффинностью примерно 500 пМ-2 нМ.
  57. 57. Применение антитела или его ЕаЬ фрагмента по любому из пп.1-49 для лечения нарушения, обусловленного патологическим ангиогенезом у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении.
  58. 58. Применение по п.57, отличающееся тем, что нарушение представляет собой рак, заболевание, вызванное окулярной неоваскуляризацией, поликистозное заболевание яичников, эндометриоз и фиброму матки.
  59. 59. Применение по п.58, отличающееся тем, что рак выбран из группы, включающей рак молочной железы, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак лёгкого, неходжкинскую лимфому (ΝΉΕ), рак почки, рак предстательной железы, рак печени, рак головы и шеи, меланому, рак яичников, мезотелиому и множественную миелому.
  60. 60. Способ лечения нарушения, обусловленного патологическим ангиогенезом у млекопитающего, включающий введение антитела или его ЕаЬ фрагмента по любому из пп.1-49 млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении.
  61. 61. Способ по п.60, отличающийся тем, что лечение дополнительно включает введение второго терапевтического агента, выбранного из группы, состоящей из антиангиогенного агента, противоопухолевой композиции, химиотерапевтического агента и цитотоксического агента.
    - 72 012835
  62. 62. Способ по п.61, отличающийся тем, что антиангиогенный агент представляет собой антитело против УЕСЕ человека, способное связываться с тем же УЕСЕ эпитопом, что и антитело А4.6.1.
  63. 63. Применение по п.58, отличающееся тем, что нарушение, вызванное окулярной неоваскуляризацией, представляет собой диабетическую слепоту, ретинопатию, первичную диабетическую ретинопатию, возрастную дегенерацию жёлтого пятна или рубеоз.
  64. 64. Способ лечения млекопитающего, страдающего от повышенного риска развития воспалительного или иммунного нарушения, включающий введение млекопитающему антитела или его ЕаЬ фрагмента по любому из пп.1-49.
  65. 65. Способ по п.64, отличающийся тем, что воспалительное или иммунное нарушение представляет собой ревматоидный артрит, псориаз или псориатический артрит.
  66. 66. Способ лечения млекопитающего, страдающего от повышенного риска развития отека, включающий введение млекопитающему антитела или его ЕаЬ фрагмента по любому из пп.1-49.
  67. 67. Способ по п.66, отличающийся тем, что отек представляет собой церебральный отек, отек, связанный с опухолями мозга, или отек, связанный с инсультом.
  68. 68. Способ определения наличия УЕСЕ в биологическом образце, включающий:
    а) обеспечение контактирования образца с антителом по любому из пп.1-49 и
    б) определение связывания антитела с образцом, что свидетельствует о наличии УЕСЕ в образце.
  69. 69. Способ по п.68, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой ткань, кровь, сыворотку или спинно-мозговую жидкость.
  70. 70. Диагностический набор, включающий контейнер и антитело или его ЕаЬ фрагмент по любому из пп.1-49.
  71. 71. Набор по п.70, дополнительно содержащий инструкции по применению антитела для определения наличия УЕСЕ в биологическом образце.
  72. 72. Набор по п.71, где биологический образец представляет собой ткань, кровь, сыворотку или спинно-мозговую жидкость.
EA200600344A 2003-08-01 2004-07-30 Антитела против фактора роста эндотелия сосудов (vegf) и способы их применения EA012835B1 (ru)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US49187703P 2003-08-01 2003-08-01
US51649503P 2003-11-01 2003-11-01
US57091204P 2004-05-12 2004-05-12
US57123904P 2004-05-13 2004-05-13
US57631504P 2004-06-01 2004-06-01
US58075704P 2004-06-18 2004-06-18
PCT/US2004/024662 WO2005012359A2 (en) 2003-08-01 2004-07-30 Anti-vegf antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600344A1 EA200600344A1 (ru) 2006-08-25
EA012835B1 true EA012835B1 (ru) 2009-12-30

Family

ID=34120173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600344A EA012835B1 (ru) 2003-08-01 2004-07-30 Антитела против фактора роста эндотелия сосудов (vegf) и способы их применения

Country Status (17)

Country Link
US (9) US20050106667A1 (ru)
EP (2) EP1648939A2 (ru)
JP (2) JP4845732B2 (ru)
KR (6) KR101644717B1 (ru)
CN (1) CN104761643A (ru)
AU (1) AU2004262006C1 (ru)
BR (1) BRPI0412637A (ru)
CA (2) CA2932216A1 (ru)
EA (1) EA012835B1 (ru)
HK (1) HK1211600A1 (ru)
IL (2) IL173317A (ru)
MX (1) MXPA06001319A (ru)
NO (1) NO20061014L (ru)
NZ (2) NZ545135A (ru)
OA (1) OA13225A (ru)
SG (2) SG193170A1 (ru)
WO (1) WO2005012359A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2802960C2 (ru) * 2019-07-19 2023-09-05 Синоселлтех Лтд. Fab ФРАГМЕНТ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ VEGF И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

Families Citing this family (330)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2002337935B2 (en) * 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
AU2003287099A1 (en) * 2002-11-08 2004-06-03 Kin-Ping Wong Extract of trapa natans and methods of using the same
US7758859B2 (en) 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
US8604185B2 (en) 2004-07-20 2013-12-10 Genentech, Inc. Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use
US7740846B2 (en) 2004-07-20 2010-06-22 Genentech, Inc. Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use
SV2006002342A (es) * 2004-12-17 2006-06-01 Genentech Inc Terapia de antiogenesis para enfermedades autoinmunes en pacientes que tuvieron la terapia anterior interrumpida
FR2893622B1 (fr) 2005-11-24 2007-12-21 Commissariat Energie Atomique Composition a base de caprolactame,procede de fabrication d'un element d'etancheite,et reservoir
US8957187B2 (en) 2005-12-02 2015-02-17 Genentech, Inc. Binding polypeptides and uses thereof
CN101370832B (zh) * 2005-12-02 2014-07-02 健泰科生物技术公司 结合多肽及其用途
AU2012204022C1 (en) * 2005-12-02 2014-02-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides and uses thereof
US20070237764A1 (en) * 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
KR20080077261A (ko) * 2005-12-06 2008-08-21 도만티스 리미티드 Ｅｇｆｒ 및/또는 ｖｅｇｆ에 대해 결합 특이성이 있는리간드 및 그의 사용 방법
RU2008128134A (ru) 2005-12-15 2010-01-20 Дженентек, Инк. (Us) Способы и композиции для получения направленности на полиубиквитин
SI1973950T1 (sl) * 2006-01-05 2015-01-30 Genentech, Inc. Anti-EphB4 protitelesa in postopki njihove uporabe
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
US7989160B2 (en) 2006-02-13 2011-08-02 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling
AR059851A1 (es) 2006-03-16 2008-04-30 Genentech Inc Anticuerpos de la egfl7 y metodos de uso
CA2646611A1 (en) 2006-03-21 2008-05-22 Genentech, Inc. Combinatorial therapy
US7655417B2 (en) * 2006-05-31 2010-02-02 Hanwha Chemical Corporation VCAM-1 specific monoclonal antibody
SG175615A1 (en) * 2006-06-06 2011-11-28 Genentech Inc Anti-dll4 antibodies and methods using same
WO2008022746A1 (en) * 2006-08-21 2008-02-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor therapy with an anti-vegf antibody
WO2008027236A2 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
EP3357932A1 (en) 2006-09-29 2018-08-08 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
US8052968B2 (en) 2006-10-16 2011-11-08 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in diagnostic and therapeutic methods
CU23636A1 (es) 2006-11-01 2011-03-21 Ct Ingenieria Genetica Biotech Anticuerpos recombinantes contra el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf)
RU2482877C2 (ru) * 2006-12-11 2013-05-27 Дженентек, Инк. Композиции и способы для лечения опухоли
TW200831538A (en) * 2006-12-19 2008-08-01 Genentech Inc VEGF-specific antagonists for adjuvant and neoadjuvant therapy and the treatment of early stage tumors
KR20090104847A (ko) * 2007-02-01 2009-10-06 제넨테크, 인크. 혈관신생 억제제와의 조합 요법
EP2468776A3 (en) 2007-02-09 2012-11-14 Genentech, Inc. Anti-Robo4 antibodies and uses therefor
BRPI0807952A2 (pt) * 2007-02-20 2014-06-10 Anaptysbio Inc Sistemas de hipermutação somática
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
US7977313B2 (en) * 2007-04-27 2011-07-12 Affinergy, Inc. Methods and compositions for promoting localization of pharmaceutically active agents to bone
GB0709333D0 (en) * 2007-05-15 2007-06-20 Smart Targeting Ltd Binding protein
JP2010530359A (ja) * 2007-05-17 2010-09-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド ニューロピリンのフラグメントおよびニューロピリン−抗体複合体の結晶構造
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
US20090011060A1 (en) * 2007-07-06 2009-01-08 Peter Koepke Campsiandra angustifolia extract and methods of extracting and using such extract
US7879369B2 (en) 2007-09-18 2011-02-01 Selvamedica, Llc Combretum laurifolium Mart. extract and methods of extracting and using such extract
AU2013205269B2 (en) * 2007-11-09 2016-05-19 Affitech Research As Anti-VEGF antibody compositions and methods
ES2572356T3 (es) * 2007-11-09 2016-05-31 Peregrine Pharmaceuticals Inc Composiciones de anticuerpos dirigidos contra VEGF y procedimientos
TW200924796A (en) 2007-11-09 2009-06-16 Genentech Inc Activin receptor-like kinase-1 compositions and methods of use
AU2015200714B2 (en) * 2007-11-30 2017-01-12 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
AU2013204108B2 (en) * 2007-11-30 2014-11-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
TWI468417B (zh) 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
US8227577B2 (en) * 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8133488B2 (en) 2008-01-18 2012-03-13 Genentech, Inc. Methods and compositions for targeting polyubiquitin
UA127472C2 (uk) 2008-03-18 2023-09-06 Дженентек, Інк. Комбінація кон'югата анти-her2-антитіло-лікарський засіб і хіміотерапевтичного засобу і спосіб застосування
PL2274008T3 (pl) 2008-03-27 2014-07-31 Zymogenetics Inc Kompozycje i sposoby hamowania PDGFRbeta i VEGF-A
KR20110014607A (ko) * 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
NZ589434A (en) 2008-06-03 2012-11-30 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2297208A4 (en) 2008-06-03 2012-07-11 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
PL3216803T3 (pl) 2008-06-25 2020-10-19 Novartis Ag Stabilne i rozpuszczalne przeciwciała hamujące vegf
CN102203258A (zh) * 2008-07-02 2011-09-28 新兴产品开发西雅图有限公司 TGF-β拮抗剂多靶点结合蛋白
CA2729949A1 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100029491A1 (en) * 2008-07-11 2010-02-04 Maike Schmidt Methods and compositions for diagnostic use for tumor treatment
WO2010025414A2 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Genentech, Inc. Diagnostics and treatments for vegf-independent tumors
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
PE20110707A1 (es) 2008-10-14 2011-10-11 Genentech Inc Variantes de inmunoglobulinas
WO2010056893A1 (en) * 2008-11-13 2010-05-20 Imclone Llc Humanization and affinity-optimization of antibodies
DK2361085T4 (en) 2008-11-22 2018-10-08 Hoffmann La Roche USE OF ANTI-VEGF ANTIBODY IN COMBINATION WITH CHEMOTHERY TO TREAT CANCER CANCER
SG172355A1 (en) 2008-12-23 2011-07-28 Genentech Inc Methods and compositions for diagnostic use in cancer patients
US8124740B2 (en) 2009-03-25 2012-02-28 Genentech, Inc. Anti- α5 β1 antibodies and uses thereof
BRPI1014089A2 (pt) * 2009-04-02 2016-04-19 Roche Glycart Ag anticorpos multiespecíficos que compreendem anticorpos de comprimento completo e fragmentos fab de cadeia simples
JP5616428B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-29 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 三価の二重特異性抗体
US20100266589A1 (en) * 2009-04-20 2010-10-21 Eric Hedrick Adjuvant cancer therapy
CA2759538C (en) 2009-04-20 2018-07-24 Oxford Biotherapeutics Ltd Antibodies specific to cadherin-17
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
AU2010273585B2 (en) 2009-07-13 2015-04-23 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
WO2011014457A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Genentech, Inc. Combination treatments
NZ597531A (en) * 2009-07-31 2014-05-30 Genentech Inc Inhibition of tumor metastasis using bv8- or g-csf-antagonists
JP5756802B2 (ja) 2009-08-13 2015-07-29 クリスタル バイオサイエンス インク．Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ． 最小ｃｄｒを有する抗体を産生するトランスジェニック動物
MX2012001716A (es) 2009-08-14 2012-04-02 Genentech Inc Marcadores biologicos para monitorizar la respuesta del paciente a los antagonistas vegf.
AR077848A1 (es) 2009-08-15 2011-09-28 Genentech Inc Terapia anti-angiogenesis para el tratamiento de cancer de mama previamente tratado
BR112012004710A2 (pt) 2009-09-01 2016-08-16 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo e uso das mesmas
CA2773662A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Genentech, Inc. Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent
NZ598962A (en) 2009-09-16 2014-12-24 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
WO2011033006A1 (en) 2009-09-17 2011-03-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for diagnostics use in cancer patients
CA2775765A1 (en) * 2009-10-05 2011-04-14 Opsonic Therapeutics Inc. High affinity adaptor molecules for redirecting antibody specifity
MX2012004415A (es) 2009-10-15 2012-05-08 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
HUE029661T2 (en) 2009-10-16 2017-03-28 Oncomed Pharm Inc A therapeutic combination and use of DLL4 antagonist antibodies and antihypertensive agents
MX367621B (es) * 2009-10-21 2019-08-28 Genentech Inc Polimorfismos geneticos en degeneracion macular relacionada con la edad.
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
WO2011056502A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
JP6184695B2 (ja) 2009-12-04 2017-08-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体、抗体アナログ、組成物、及び方法
WO2011071577A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Genentech, Inc. Anti-vegf-c antibodies and methods using same
WO2011075185A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Oligasis Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates
WO2011084750A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Genentech, Inc. Antibody formulation
PL2516465T3 (pl) 2009-12-23 2016-11-30 Przeciwciała anty-bv8 i ich zastosowania
WO2011088111A1 (en) * 2010-01-12 2011-07-21 Genentech, Inc. ANTI-PlGF ANTIBODIES AND METHODS USING SAME
AU2011221229B2 (en) 2010-02-23 2015-06-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-angiogenesis therapy for the treatment of ovarian cancer
CN102167740B (zh) * 2010-02-25 2014-06-04 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗vegf单克隆抗体、其制备方法及用途
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
BR112012026174A2 (pt) 2010-04-15 2019-09-24 Genentech Inc anticorpo isolado, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, doença ou disfunção, uso do anticorpo, método de tratamento, de determinação e de separação
WO2011153243A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Anti-angiogenesis therapy for treating gastric cancer
WO2011153224A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
US8834883B2 (en) 2010-06-14 2014-09-16 Vaccinex, Inc. Anti-VEGF antibodies and uses thereof
KR20130126576A (ko) 2010-07-19 2013-11-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 항암요법에 반응할 가능성이 증가된 환자를 확인하는 방법
KR20130055647A (ko) 2010-07-19 2013-05-28 에프. 호프만-라 로슈 아게 항암요법에 반응할 가능성이 증가된 환자를 확인하는 방법
US20130177500A1 (en) 2010-07-23 2013-07-11 Trustee Of Boston University Anti-despr inhibitors as therapeutics for inhibition of pathological angiogenesis and tumor cell invasiveness and for molecular imaging and targeted delivery
AU2011285852B2 (en) 2010-08-03 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201208703A (en) 2010-08-17 2012-03-01 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated CD20 antibody with an anti-VEGF antibody
CA2807278A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann - La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
PE20140229A1 (es) 2010-08-26 2014-03-27 Abbvie Inc Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
SG10201408229WA (en) 2010-08-31 2015-02-27 Genentech Inc Biomarkers and methods of treatment
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
AU2011318574B2 (en) * 2010-10-20 2016-03-03 Oxford Biotherapeutics Ltd. Antibodies
CN103228674B (zh) 2010-11-10 2019-07-05 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于神经疾病免疫疗法的方法和组合物
EP2640377B1 (en) 2010-11-15 2018-12-26 Five Prime Therapeutics, Inc. Fgfr1 extracellular domain combination therapies
US20130236467A1 (en) * 2010-11-24 2013-09-12 Jeremy Griggs Multispecific antigen binding proteins targeting hgf
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CU23895B1 (es) 2010-12-28 2013-05-31 Biorec Sa Anticuerpos recombinantes contra el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) obtenidos mediante mutagénesis de regiones variables
WO2012092539A2 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
US9217040B2 (en) 2011-01-14 2015-12-22 The Regents Of The University Of California Therapeutic antibodies against ROR-1 protein and methods for use of same
WO2012106615A1 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Xoma Technology Ltd. Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
MX341921B (es) 2011-02-28 2016-09-07 Hoffmann La Roche Proteinas de union a antigeno.
MX354359B (es) 2011-03-29 2018-02-28 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
CN103857395A (zh) 2011-04-01 2014-06-11 基因泰克公司 Akt抑制剂化合物和阿比特龙的组合及使用方法
JP6250533B2 (ja) 2011-04-20 2017-12-20 アクセレロン ファーマ インコーポレイテッドＡｃｃｅｌｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ． エンドグリンポリペプチドおよびその使用
US20140178398A1 (en) 2011-05-03 2014-06-26 Genentech, Inc Vascular disruption agents and uses thereof
MX2013014687A (es) 2011-06-30 2014-02-17 Genentech Inc Formulaciones de anticuerpo anti-c-met.
US20130022551A1 (en) 2011-07-22 2013-01-24 Trustees Of Boston University DEspR ANTAGONISTS AND AGONISTS AS THERAPEUTICS
ES2797448T3 (es) 2011-08-01 2020-12-02 Bio Rad Laboratories Sistema de captura de células
EP2739651B1 (en) 2011-08-05 2019-02-20 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin antibodies and methods of use
KR20140068877A (ko) 2011-08-17 2014-06-09 제넨테크, 인크. 불응성 종양에서의 혈관신생의 억제
CN103930111A (zh) 2011-09-19 2014-07-16 霍夫曼-拉罗奇有限公司 包含c-met拮抗剂和b-raf拮抗剂的组合治疗
ES2707580T3 (es) 2011-09-23 2019-04-04 Oncomed Pharm Inc Agentes de unión a VEGF/DLL4 y usos de los mismos
CN104066748A (zh) 2011-11-21 2014-09-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗c-met抗体的纯化
WO2013082511A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Genentech, Inc. Methods for overcoming tumor resistance to vegf antagonists
AR089067A1 (es) 2011-12-05 2014-07-30 Hoffmann La Roche Biomarcadores en el plasma sanguineo para terapias de combinacion de bevacizumab destinadas al tratamiento del cancer de mama
WO2013096812A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Genentech, Inc. Articles of manufacture and methods for co-administration of antibodies
AU2012362326A1 (en) 2011-12-30 2014-07-24 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against IL-13 and/or IL-17
CA2862835A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Genentech, Inc. Biological markers for identifying patients for treatment with vegf antagonists
WO2013119966A2 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Genentech, Inc. Single-chain antibodies and other heteromultimers
US20150098988A1 (en) 2012-03-13 2015-04-09 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy for the treatment of ovarian cancer
SG11201406184XA (en) 2012-03-30 2014-10-30 Genentech Inc Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
WO2013152252A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
TW201823460A (zh) * 2012-05-29 2018-07-01 美商再生元醫藥公司 生產細胞株增強子
EP2855528B1 (en) 2012-05-31 2019-06-19 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-l1 axis binding antagonists and vegf antagonists
NZ702244A (en) 2012-06-08 2017-06-30 Hoffmann La Roche Mutant selectivity and combinations of a phosphoinositide 3 kinase inhibitor compound and chemotherapeutic agents for the treatment of cancer
WO2013188403A1 (en) * 2012-06-11 2013-12-19 Syngenta Participations Ag Producing solids and related mother liquors
RU2015102026A (ru) 2012-06-26 2016-08-10 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Биомаркеры в плазме крови для комбинированных терапий с использованием бевацизумаба при лечении рака молочной железы
EP2867253B1 (en) 2012-06-27 2016-09-14 F. Hoffmann-La Roche AG Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
BR112014028368A2 (pt) 2012-06-27 2017-11-14 Hoffmann La Roche método de produção de conjugado de região fc de anticorpo, conjugado de região fc de anticorpo e formulação farmacêutica
HUE056217T2 (hu) 2012-07-13 2022-02-28 Roche Glycart Ag Bispecifikus anti-VEGF/anti-ANG-2 antitestek és ezek alkalmazása szemészeti érbetegségek kezelésében
ES2723885T3 (es) 2012-07-19 2019-09-03 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpos anti-Siglec-15
SG11201500903XA (en) 2012-08-07 2015-03-30 Genentech Inc Combination therapy for the treatment of glioblastoma
MX357675B (es) 2012-08-13 2018-07-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-jagged y métodos de uso.
WO2014071018A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a dll4 antagonist
SG11201503412RA (en) 2012-11-01 2015-05-28 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20140154255A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
ES2771478T3 (es) 2013-02-18 2020-07-06 Vegenics Pty Ltd Moléculas de unión a ligando y usos de las mismas
KR20150118159A (ko) 2013-02-22 2015-10-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 치료 방법 및 약물 내성의 예방 방법
CN105246511A (zh) 2013-03-06 2016-01-13 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗和预防癌症药物抗性的方法
KR102127085B1 (ko) 2013-03-13 2020-06-26 제넨테크, 인크. 항체 제제
EP2968565A2 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Genentech, Inc. Methods of treating cancer and preventing cancer drug resistance
JP2016522793A (ja) 2013-03-15 2016-08-04 アッヴィ・インコーポレイテッド ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質
JP2016520528A (ja) 2013-03-15 2016-07-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 癌の治療及び抗癌剤耐性の防止方法
SG11201508358RA (en) 2013-04-09 2015-11-27 Boston Biomedical Inc 2-acetylnaphtho[2,3-b]furan -4,9-dione for use on treating cancer
US9775881B2 (en) 2013-05-23 2017-10-03 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of treating mesothelioma by administration of compounds comprising FGFR1 ECD
US10391490B2 (en) 2013-05-31 2019-08-27 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells
KR101541478B1 (ko) * 2013-05-31 2015-08-05 동아쏘시오홀딩스 주식회사 항-vegf 항체 및 이를 포함하는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물
CN107318267B (zh) 2013-08-12 2021-08-17 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗补体相关的病症的组合物和方法
US10456470B2 (en) 2013-08-30 2019-10-29 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
US10617755B2 (en) 2013-08-30 2020-04-14 Genentech, Inc. Combination therapy for the treatment of glioblastoma
PL3041513T3 (pl) 2013-09-08 2021-01-25 Kodiak Sciences Inc. Obojnaczojonowe polimerowe koniugaty czynnika viii
BR112016006929A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-19 Hoffmann La Roche Anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de preparação de anticorpo, de tratamento de pacientes e de geração de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
KR20220013459A (ko) 2013-10-25 2022-02-04 악셀레론 파마 인코포레이티드 섬유화 질환을 치료하기 위한 엔도글린 펩티드
US10294295B2 (en) 2013-11-27 2019-05-21 Inis Biotech Llc Methods for modulating angiogenesis of cancers refractory to anti-VEGF treatment
EP3080611B1 (en) 2013-12-13 2018-11-14 The General Hospital Corporation Soluble high molecular weight (hmw) tau species and applications thereof
US20160130336A1 (en) * 2013-12-31 2016-05-12 Development Center For Biotechnology Anti-vegf antibodies and use thereof
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
TWI558399B (zh) 2014-02-26 2016-11-21 美國禮來大藥廠 癌症之組合療法
TW201622744A (zh) 2014-03-04 2016-07-01 美國禮來大藥廠 癌症之組合療法
EP3116909B1 (en) 2014-03-14 2019-11-13 Novartis Ag Antibody molecules to lag-3 and uses thereof
EP3122900A1 (en) 2014-03-24 2017-02-01 F. Hoffmann-La Roche AG Cancer treatment with c-met antagonists and correlation of the latter with hgf expression
WO2015153514A1 (en) 2014-03-31 2015-10-08 Genentech, Inc. Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
EA201692109A1 (ru) 2014-05-01 2017-03-31 Дженентек, Инк. Варианты антител к фактору d и их применение
US9388239B2 (en) 2014-05-01 2016-07-12 Consejo Nacional De Investigation Cientifica Anti-human VEGF antibodies with unusually strong binding affinity to human VEGF-A and cross reactivity to human VEGF-B
US20230190750A1 (en) 2014-06-13 2023-06-22 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
EP3169801A1 (en) 2014-07-14 2017-05-24 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
EP3925622A1 (en) 2014-09-13 2021-12-22 Novartis AG Combination therapies
EP3193932B1 (en) 2014-09-15 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody formulations
CA2963281A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Novartis Ag Combination therapies
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
EP4245376A3 (en) 2014-10-14 2023-12-13 Novartis AG Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof
JP6849590B2 (ja) 2014-10-17 2021-03-24 コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッドＫｏｄｉａｋ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． ブチリルコリンエステラーゼ両性イオン性ポリマーコンジュゲート
JP6827415B2 (ja) 2014-10-31 2021-02-10 メレオ バイオファーマ ５ インコーポレイテッド 疾患の処置のための併用療法
EA201791029A1 (ru) 2014-11-10 2017-12-29 Дженентек, Инк. Антитела против интерлейкина-33 и их применение
CN107250158B (zh) 2014-11-19 2022-03-25 基因泰克公司 抗转铁蛋白受体/抗bace1多特异性抗体和使用方法
US10882920B2 (en) 2014-11-19 2021-01-05 Genentech, Inc. Antibodies against BACE1 and use thereof for neural disease immunotherapy
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
EP3233918A1 (en) 2014-12-19 2017-10-25 Novartis AG Combination therapies
JP2018508183A (ja) 2014-12-23 2018-03-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 化学療法耐性癌を治療及び診断する組成物及び方法
EP3294335B1 (en) 2015-05-12 2023-07-05 Syntimmune Inc. Humanized affinity matured anti-fcrn antibodies
MX2017015618A (es) 2015-06-03 2018-08-15 Boston Biomedical Inc Composiciones que comprenden un inhibidor de la autorrenovación y diferenciación de células madre cancerosas y un agente inmunoterapéutico para su uso en el tratamiento del cáncer.
TW201711702A (zh) 2015-06-04 2017-04-01 應克隆公司 使用針對纖維母細胞生長因子受體３（ｆｇｆｒ３）之化合物的療法
EP3303397A1 (en) 2015-06-08 2018-04-11 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cancer using anti-ox40 antibodies and pd-1 axis binding antagonists
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
TW201716439A (zh) 2015-07-20 2017-05-16 美國禮來大藥廠 Ｈｅｒ３抗體
EP3328418A1 (en) 2015-07-29 2018-06-06 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to pd-1
LT3317301T (lt) 2015-07-29 2021-07-26 Novartis Ag Kombinuotos terapijos, apimančios antikūno molekules prieš lag-3
US20180207273A1 (en) 2015-07-29 2018-07-26 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
SG10201911226QA (en) * 2015-09-23 2020-01-30 Genentech Inc Optimized variants of anti-vegf antibodies
EP3353204B1 (en) 2015-09-23 2023-10-18 Mereo BioPharma 5, Inc. Bi-specific anti-vegf/dll4 antibody for use in treating platinum-resistant ovarian cancer
EP3368578B1 (en) 2015-10-30 2021-03-17 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof
CN108289951A (zh) 2015-10-30 2018-07-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-因子d抗体和缀合物
EP3368090A1 (en) 2015-10-30 2018-09-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-factor d antibody variant conjugates and uses thereof
US20170137535A1 (en) 2015-10-30 2017-05-18 Genentech, Inc. Anti-factor d antibody formulations
MA43186B1 (fr) 2015-11-03 2022-03-31 Janssen Biotech Inc Anticorps se liant spécifiquement à pd-1 et leurs utilisations
MX2018007423A (es) 2015-12-17 2018-11-09 Novartis Ag Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-1 y usos de las mismas.
CN108712911A (zh) 2015-12-30 2018-10-26 科达制药股份有限公司 抗体及其缀合物
WO2017119434A1 (ja) 2016-01-06 2017-07-13 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ Ｖｅｇｆとｎｒｐ１との結合を阻害する抗体
US11007259B2 (en) 2016-01-06 2021-05-18 Order-Made Medical Research Inc. High-affinity anti-VEGF antibody
US10894823B2 (en) 2016-03-24 2021-01-19 Gensun Biopharma Inc. Trispecific inhibitors for cancer treatment
AU2017250296A1 (en) 2016-04-15 2018-11-01 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
JP2019511541A (ja) 2016-04-15 2019-04-25 イーライ リリー アンド カンパニー 結腸直腸癌の処置における使用のためのラムシルマブとメレスチニブとの組み合わせ
AU2017248766A1 (en) 2016-04-15 2018-11-01 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
WO2017180461A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Eli Lilly And Company Combination therapy of ramucirumab and abemaciclib for use in treatment of mantle cell lymphoma
EA201892427A1 (ru) 2016-04-25 2019-10-31 ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИ-FcRn АНТИТЕЛА С СОЗРЕВШЕЙ АФФИННОСТЬЮ
US20190183972A1 (en) 2016-06-03 2019-06-20 Imclone Llc Combination of ramucirumab and pembrolizumab for the treatment of certain cancers
US20190252037A1 (en) 2016-07-07 2019-08-15 The European Molecular Biology Laboratory Viral Polypeptide Fragments That Bind Cellular POL II C-Terminal Domain (CTD) and Their Uses
WO2018009811A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Genentech, Inc. Use of human epididymis protein 4 (he4) for assessing responsiveness of muc 16-positive cancer treatment
EP3481963A1 (en) 2016-07-08 2019-05-15 Genentech, Inc. Methods for diagnosing and treating cancer by means of the expression status and mutational status of nrf2 and downstream target genes of said gene.
WO2018011344A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Method and means for detecting the level of total vegf-a
US20210293786A1 (en) * 2016-08-08 2021-09-23 Konica Minolta, Inc. Method Relating to Evaluation of Tumor Tissue of Experimental Animal
CN110248674B (zh) * 2016-09-07 2021-10-26 萨辛生命科学有限公司 针对vegf的合成抗体及其用途
MX2019003563A (es) 2016-09-29 2019-08-12 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Construcciones de inmunoglobulina heterodimericas y metodos de preparacion de las mismas.
US20200062850A1 (en) 2016-10-28 2020-02-27 Imclone Llc Combination of an anti-vegfr-2 antibody and an anti-pd-l1 antibody for the treatment of cancer
EP3541383B1 (en) 2016-11-16 2021-01-06 Eli Lilly and Company Combination therapy for cancer with exon 14 skipping mutation(s) or exon 14 skipping phenotype
WO2018093668A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Eli Lilly And Company Therapy for metatastic colorectal cancer using anti-vegfr-2 and anti-vegf-d antibodies
TN2019000161A1 (en) 2016-11-18 2020-10-05 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Anti-pd-1/anti-her2 natural antibody structure-like bispecific antibody of heterodimeric form and preparation thereof
CA3045306A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Boston Biomedical, Inc. Naphthofuran derivatives, preparation, and methods of use thereof
US10537637B2 (en) 2017-01-05 2020-01-21 Gensun Biopharma Inc. Checkpoint regulator antagonists
ES2953595T3 (es) 2017-03-01 2023-11-14 Hoffmann La Roche Procedimientos diagnósticos y terapéuticos para el cáncer
AU2018240375C1 (en) 2017-03-22 2024-02-01 Ascendis Pharma A/S Hydrogel cross-linked hyaluronic acid prodrug compositions and methods
CA3056248A1 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Genentech, Inc. Optimized antibody compositions for treatment of ocular disorders
JP2020520923A (ja) 2017-05-17 2020-07-16 ボストン バイオメディカル， インコーポレイテッド がんを処置するための方法
PE20200717A1 (es) 2017-06-22 2020-07-21 Novartis Ag Moleculas de anticuerpo que se unen a cd73 y usos de las mismas
EP3642240A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis AG Antibody molecules to cd73 and uses thereof
CN111295245B (zh) 2017-08-29 2021-03-16 伯乐实验室有限公司 用于分离和分析细胞的系统和方法
WO2019057946A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 F. Hoffmann-La Roche Ag MULTI-CYCLIC AROMATIC COMPOUNDS AS D-FACTOR INHIBITORS
CN107727847A (zh) * 2017-09-30 2018-02-23 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 一种血管内皮因子检测试剂盒及其使用方法
CN107703290A (zh) * 2017-09-30 2018-02-16 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法
WO2019098385A1 (ja) 2017-11-20 2019-05-23 コニカミノルタ株式会社 薬剤評価方法
WO2019153200A1 (zh) 2018-02-08 2019-08-15 北京韩美药品有限公司 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
CA3090878A1 (en) 2018-02-11 2019-08-15 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-pd-1/anti-vegf natural antibody structure-like heterodimeric form bispecific antibody and preparation thereof
AU2019237774B2 (en) * 2018-03-19 2023-03-23 Pharmabcine Inc Anti-VEGFR-2 antibody
WO2019195770A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-nrp2 antibodies
AU2019254237A1 (en) 2018-04-16 2020-12-03 Onquality Pharmaceuticals China Ltd. Method for preventing or treating side effects of cancer therapy
WO2019225787A1 (ko) 2018-05-24 2019-11-28 에이비엘바이오 주식회사 항-b7-h3 항체 및 그 용도
SG11202011633SA (en) 2018-05-24 2020-12-30 Janssen Biotech Inc Psma binding agents and uses thereof
TW202015726A (zh) 2018-05-30 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Ｅｎｔｐｄ２抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
EP3813880A4 (en) 2018-06-29 2022-07-13 Gensun Biopharma Inc. ANTITUMORS IMMUNOTEST POINT REGULATOR ANTAGONISTS
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
EP3867646A1 (en) 2018-10-18 2021-08-25 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic and therapeutic methods for sarcomatoid kidney cancer
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
CA3120474A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 23Andme, Inc. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
US10633693B1 (en) 2019-04-16 2020-04-28 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for leakage control in a particle capture system
AR118720A1 (es) 2019-04-19 2021-10-27 Janssen Biotech Inc Métodos para tratar el cáncer de próstata con un anticuerpo anti-psma / cd3
CN114269376A (zh) 2019-05-03 2022-04-01 豪夫迈·罗氏有限公司 用抗pd-l1抗体治疗癌症的方法
US11273439B2 (en) 2019-05-07 2022-03-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for target material retrieval from microwells
CA3138881A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for automated single cell processing
US20230074615A1 (en) * 2019-05-21 2023-03-09 The Regents Of The University Of California Mmp-9 antibodies and methods of use thereof
US11332546B2 (en) 2019-05-21 2022-05-17 The Regents Of The University Of California Protease inhibitory antibodies and methods of use thereof
CA3138949A1 (en) * 2019-06-26 2020-12-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for target material retrieval from microwells
WO2020260595A1 (en) 2019-06-26 2020-12-30 Oncurious Nv Combination treatment of medulloblastoma using a placental growth factor inhibitor and a chemotherapeutic agent
US10851157B2 (en) 2019-07-01 2020-12-01 Gensun Biopharma, Inc. Antagonists targeting the TGF-β pathway
CN114008075A (zh) * 2019-07-19 2022-02-01 神州细胞工程有限公司 人源化抗vegf单克隆抗体
MX2022000780A (es) * 2019-07-19 2022-02-14 Sinocelltech Ltd Fragmento fab del anticuerpo anti-vegf humanizado y uso del mismo.
BR112022000945A2 (pt) 2019-07-22 2022-03-08 Hoffmann La Roche Métodos para avaliar se uma paciente tem endometriose ou está em risco de desenvolver endometriose, para selecionar uma paciente para terapia e para monitorar uma paciente que sofre de endometriose ou que está sendo tratada para endometriose
WO2021013786A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 F. Hoffmann-La Roche Ag S100a6 as blood biomarker for the non-invasive diagnosis of endometriosis
KR20220016210A (ko) 2019-07-22 2022-02-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 자궁내막증의 비-침습적 진단용 혈액 생물표지자로써 s100a9
JP7315781B2 (ja) 2019-07-22 2023-07-26 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 子宮内膜症の非侵襲的診断のための血液バイオマーカーとしてのｓ１００ａ１２
CN114144674A (zh) 2019-07-22 2022-03-04 豪夫迈·罗氏有限公司 P物质作为用于子宫内膜异位症的非侵入性诊断的血液生物标志物
CN114502590A (zh) 2019-09-18 2022-05-13 诺华股份有限公司 Entpd2抗体、组合疗法、以及使用这些抗体和组合疗法的方法
CN114746120A (zh) * 2019-10-03 2022-07-12 Atyr 医药公司 包含抗nrp2抗体的组合物和方法
US11912784B2 (en) 2019-10-10 2024-02-27 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
EP4058459A1 (en) 2019-11-15 2022-09-21 F. Hoffmann-La Roche AG Derivatization of beta-lactam antibiotics for massspec measurements in patient samples
CA3162181A1 (en) * 2019-11-21 2021-05-27 Unity Biotechnology Antibodies directed to tie-2 and methods of use
IL296256A (en) 2020-03-13 2022-11-01 Genentech Inc Antibodies against interleukin-33 and uses thereof
EP4127724A1 (en) 2020-04-03 2023-02-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
JP2023522278A (ja) 2020-04-23 2023-05-29 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 抗体－免疫アッセイでの使用のためのコロナヌクレオカプシド抗原
KR20230018425A (ko) 2020-05-29 2023-02-07 23앤드미 인코포레이티드 항-cd200r1 항체 및 이의 사용 방법
CN116234824A (zh) 2020-06-22 2023-06-06 阿尔米雷尔有限公司 抗il-36抗体及其使用方法
JP2023531537A (ja) 2020-06-30 2023-07-24 メンドゥス・ベスローテン・フェンノートシャップ 卵巣癌ワクチンでの白血病由来細胞の使用
WO2022003156A1 (en) 2020-07-02 2022-01-06 Oncurious Nv Ccr8 non-blocking binders
EP3943946A1 (en) 2020-07-20 2022-01-26 F. Hoffmann-La Roche AG Gdf-15 for predicting the disease severity of a patient with covid-19
AU2021341526A1 (en) 2020-09-14 2023-04-27 Ichnos Sciences SA Antibodies that bind to il1rap and uses thereof
EP4237441A1 (en) 2020-11-02 2023-09-06 F. Hoffmann-La Roche AG Sars-cov-2 nucleocapsid antibodies
TW202224682A (zh) 2020-11-13 2022-07-01 美商建南德克公司 用於治療實性瘤之方法與包含ｋｒａｓｇ１２ｃ抑制劑及ｖｅｇｆ抑制劑之組成物
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
US20240018248A1 (en) 2020-12-02 2024-01-18 Vib Vzw An ltbr agonist in combination therapy against cancer
IL303448A (en) 2020-12-08 2023-08-01 Genentech Inc Methods and compositions including a KRASG12C inhibitor and an EGFR inhibitor for the treatment of solid tumors
US20240052044A1 (en) 2020-12-24 2024-02-15 Vib Vzw Non-blocking human ccr8 binders
EP4267617A1 (en) 2020-12-24 2023-11-01 Vib Vzw Human ccr8 binders
WO2022136650A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Oncurious Nv Murine cross-reactive human ccr8 binders
CN116723854A (zh) 2021-01-22 2023-09-08 门德斯有限公司 肿瘤疫苗接种方法
BR112023015097A2 (pt) 2021-01-28 2023-10-03 Janssen Biotech Inc Proteínas de ligação a psma e usos das mesmas
AR124914A1 (es) * 2021-02-18 2023-05-17 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Nuevo anticuerpo anti-pad4
AU2022235341A1 (en) 2021-03-12 2023-09-21 Mendus B.V. Methods of vaccination and use of cd47 blockade
CN112961243B (zh) * 2021-03-24 2022-04-29 山东兴瑞生物科技有限公司 一种vegf抗体、重组aav病毒及其应用
WO2022207628A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Scf as blood biomarker for the non-invasive diagnosis of endometriosis
WO2022207685A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Psp94 as blood biomarker for the non-invasive diagnosis of endometriosis
EP4330436A1 (en) 2021-04-30 2024-03-06 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods and compositions for cancer
WO2022243210A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag sFRP4 AS BLOOD BIOMARKER FOR THE NON-INVASIVE DIAGNOSIS OF ADENOMYOSIS
US20220389120A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Gensun Biopharma Inc. Multispecific antagonists
WO2023279092A2 (en) 2021-07-02 2023-01-05 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating cancer
CN117715936A (zh) 2021-07-28 2024-03-15 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗癌症的方法和组合物
WO2023072904A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Monoclonal antibodies specific for sars-cov-2 rbd
WO2023080900A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Genentech, Inc. Methods and compositions for classifying and treating kidney cancer
CN116925234B (zh) * 2022-04-02 2024-05-31 合肥星眸生物科技有限公司 一种编码抗vegf-a和ang-2双特异性抗体的aav载体
WO2023198848A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Vib Vzw An ltbr agonist in combination therapy against cancer
WO2023213758A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Hiv gp41 variants for immunodiagnostic assays
WO2023247752A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for diagnosing endometriosis and for classifying the stage of endometriosis
WO2024017982A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Leukotriene a4 hydrolase (lta4h) as (blood) biomarker for the diagnosis of polycystic ovarian syndrome
WO2024017983A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Meteorin-like protein (metrnl) as (blood) biomarker for the diagnosis of polycystic ovarian syndrome
WO2024017985A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Fibroblast growth factor binding protein 1 (fgfbp1) as (blood) biomarker for the diagnosis of polycystic ovarian syndrome
CN115850470B (zh) * 2022-12-12 2023-07-07 三门峡市眼科医院 Vegf抗体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997045450A1 (en) * 1996-05-31 1997-12-04 Health Research Inc. Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in antiangiogenic therapy
US6416758B1 (en) * 1999-04-28 2002-07-09 Board Of Regents, The University Of Texax System Antibody conjugate kits for selectively inhibiting VEGF

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
FR2596047B1 (fr) 1986-03-21 1988-05-13 Charbonnages Ste Chimique Procede de production de styrene
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
US5750373A (en) * 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US5688666A (en) 1988-10-28 1997-11-18 Genentech, Inc. Growth hormone variants with altered binding properties
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5427908A (en) * 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5723286A (en) * 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
GB9015198D0 (en) * 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) * 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
JP3672306B2 (ja) 1991-04-10 2005-07-20 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート ファージミドを使用するヘテロ二量体受容体ライブラリー
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP1400536A1 (en) * 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5270170A (en) * 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
DK1136556T3 (da) 1991-11-25 2005-10-03 Enzon Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multivalente antigen-bindende proteiner
US5733743A (en) * 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
DE69315847T2 (de) 1992-08-21 1998-06-25 Genentech Inc Verfahren zur behandlung einer durch lfa-1 vermittelten störung
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5837242A (en) * 1992-12-04 1998-11-17 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
US5534615A (en) * 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5650727A (en) * 1995-04-07 1997-07-22 Wizaed Devices, Inc. Circuit continuity testing device
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP1325932B9 (en) 1997-04-07 2006-07-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US6884879B1 (en) * 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US6190908B1 (en) * 1998-08-12 2001-02-20 The Scripps Research Institute Modulation of polypeptide display on modified filamentous phage
WO2000034337A1 (en) * 1998-12-10 2000-06-15 Tsukuba Research Laboratory, Toagosei Co., Ltd. Humanized monoclonal antibodies against vascular endothelial cell growth factor
KR100940380B1 (ko) 1999-01-15 2010-02-02 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6794132B2 (en) * 1999-10-02 2004-09-21 Biosite, Inc. Human antibodies
CN100399030C (zh) 1999-11-16 2008-07-02 杰南技术公司 用于vegf的elisa
CN1299833A (zh) * 1999-12-30 2001-06-20 华西医科大学口腔医学研究所 抗人血管内皮生长因子单链抗体及其制备方法
ES2649037T3 (es) 2000-12-12 2018-01-09 Medimmune, Llc Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas
DE60236646D1 (de) * 2001-04-13 2010-07-22 Human Genome Sciences Inc Anti-VEGF-2 Antikörper
EP1385862A4 (en) 2001-04-13 2005-03-02 Human Genome Sciences Inc VASCULAR ENDOTHEL GROWTH FACTOR 2
CN1187373C (zh) * 2002-03-20 2005-02-02 上海中信国健药业有限公司 人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体及其制法和药物组合物
NZ556507A (en) * 2002-06-03 2010-03-26 Genentech Inc Synthetic antibody phage libraries
WO2004065416A2 (en) * 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
KR20180132969A (ko) 2003-05-30 2018-12-12 제넨테크, 인크. 항-ｖｅｇｆ 항체를 사용한 치료
US7758859B2 (en) * 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20070237764A1 (en) * 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
TWI468417B (zh) * 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
AU2009288167B2 (en) * 2008-09-03 2015-10-22 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
JP2013508287A (ja) 2009-10-14 2013-03-07 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗体を親和性成熟する方法
EP2739651B1 (en) 2011-08-05 2019-02-20 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin antibodies and methods of use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997045450A1 (en) * 1996-05-31 1997-12-04 Health Research Inc. Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in antiangiogenic therapy
US6416758B1 (en) * 1999-04-28 2002-07-09 Board Of Regents, The University Of Texax System Antibody conjugate kits for selectively inhibiting VEGF

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BREKKEN ROLF A. ET AL.: "Vascular endothelial growth factor as a marker of tumor endothelium", CANCER RESEARCH, vol. 58, no. 9, 1 May 1998 (1998-05-01), pages 1952-1959, XP000918910, ISSN: 0008-5472, the whole document *
CHEN Y. ET AL.: "Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody: crystal structure of an affinity-matured fab in complex with antigen", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, LONDON, GB, vol. 293, no. 4, 5 November 1999 (1999-11-05), pages 865-881, XP004461879, ISSN: 0022-2836, abstract, table 6 *
KLOHS WAYNE D. ET AL.: "Antiangiogenic agents", CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, vol. 19, no. 6, December 1999 (1999-12), pages 544-549, XP001206158, ISSN: 0958-1669, page 544, right-hand column, paragraph 3 *
MORRISON KIM L. ET AL.: "Combinatorial alanine-scanning", CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY, vol. 5, no. 3, June 2001 (2001-06), pages 302-307, XP002325957, ISSN: 1367-5931, the whole document *
POPKOV MIKHAIL ET AL.: "Rabbit immune repertoires as sources for therapeutic monoclonal antibodies: The impact of kappa allotype-correlated variation in cysteine content on antibody libraries selected by phage display", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 325, no. 2, 10 January 2003 (2003-01-10), pages 325-335, XP002325954, ISSN: 0022-2836, abstract, page 326, left-hand column, paragraphs 2, 3 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2802960C2 (ru) * 2019-07-19 2023-09-05 Синоселлтех Лтд. Fab ФРАГМЕНТ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ VEGF И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

Also Published As

Publication number Publication date
SG193170A1 (en) 2013-09-30
CA2932216A1 (en) 2005-02-10
WO2005012359A3 (en) 2005-12-15
US20100189719A1 (en) 2010-07-29
US20060280747A1 (en) 2006-12-14
IL173317A0 (en) 2006-06-11
KR20060067950A (ko) 2006-06-20
JP2011046732A (ja) 2011-03-10
CA2533297A1 (en) 2005-02-10
KR101644717B1 (ko) 2016-08-01
JP4845732B2 (ja) 2011-12-28
NZ575674A (en) 2010-08-27
KR20160052799A (ko) 2016-05-12
IL243914A0 (en) 2016-04-21
AU2004262006B2 (en) 2011-12-22
EP1648939A2 (en) 2006-04-26
US7691977B2 (en) 2010-04-06
US8492527B2 (en) 2013-07-23
BRPI0412637A (pt) 2006-09-26
KR101359142B1 (ko) 2014-02-07
IL173317A (en) 2016-02-29
US20070141065A1 (en) 2007-06-21
AU2004262006A1 (en) 2005-02-10
AU2004262006C1 (en) 2012-10-18
NO20061014L (no) 2006-04-24
EP2420512A2 (en) 2012-02-22
WO2005012359A2 (en) 2005-02-10
EP2420512A3 (en) 2013-08-21
US20120322982A1 (en) 2012-12-20
KR101446849B1 (ko) 2014-10-15
US20130266581A1 (en) 2013-10-10
AU2004262006A2 (en) 2005-02-10
NZ545135A (en) 2009-10-30
US20150232549A1 (en) 2015-08-20
KR20120074336A (ko) 2012-07-05
EA200600344A1 (ru) 2006-08-25
US9353177B2 (en) 2016-05-31
SG145725A1 (en) 2008-09-29
MXPA06001319A (es) 2006-05-04
JP5162644B2 (ja) 2013-03-13
CN104761643A (zh) 2015-07-08
OA13225A (en) 2006-12-13
KR20110059806A (ko) 2011-06-03
CA2533297C (en) 2016-06-07
US20110020346A1 (en) 2011-01-27
US20050106667A1 (en) 2005-05-19
US8092797B2 (en) 2012-01-10
HK1211600A1 (en) 2016-05-27
US7811785B2 (en) 2010-10-12
JP2007526756A (ja) 2007-09-20
KR20140048973A (ko) 2014-04-24
US9018357B2 (en) 2015-04-28
US20170073405A1 (en) 2017-03-16
US8101177B2 (en) 2012-01-24
KR20130098436A (ko) 2013-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA012835B1 (ru) Антитела против фактора роста эндотелия сосудов (vegf) и способы их применения
KR101699432B1 (ko) 섬유아세포성장인자수용체 ２에 대한 모노클로날 항체
US8975381B2 (en) Anti-VEGF antibodies
CA2678181C (en) Antibodies against erbb3 and uses thereof
US20180002437A1 (en) Humanized anti-trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof
JP2019047807A (ja) Ｐｄｇｆ受容体ベータ結合ポリペプチド
JP5908972B2 (ja) 新規な抗原結合タンパク質
CN108368179A (zh) 使用pd-1轴结合拮抗剂和抗cea/抗cd3双特异性抗体治疗cea阳性癌症的方法
US20050282233A1 (en) Multivalent antibody materials and methods for VEGF/PDGF family of growth factors
CN105960414A (zh) 治疗散发性包涵体肌炎的方法
KR20150063447A (ko) 알파-시누클레인을 인식하는 항체
EA013677B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
CN107771076A (zh) 使用pd‑1轴结合拮抗剂和紫杉烷治疗局部晚期或转移性乳腺癌的方法
CN107188963A (zh) 新的抗dr5抗体
UA123773C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ&#39;ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА
CN108137705A (zh) 一种因子xiia的单克隆抗体抑制剂
JP2022514693A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
JP2022514786A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
CN102875676A (zh) 全人源抗人vegf单抗分子及其应用
AU2012201667B2 (en) Anti-VEGF antibodies