MX2014001238A

MX2014001238A - Anticuerpos contra poliubiquitina y métodos de uso.

Info

Publication number: MX2014001238A
Application number: MX2014001238A
Authority: MX
Inventors: Robert F Kelley; Vishva Dixit; Marissa L Matsumoto
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-08-06
Publication date: 2014-09-22
Also published as: JP2014531894A; US20230348581A1; US20210017260A1; US9321844B2; CN104011078B; EP2739651B1; JP2017200484A; US20160304591A1; US20130058955A1; EP2739651A1; WO2013022848A1; US11597761B2; BR112014002716A2; EP2739651A4; HK1201843A1; CN104011078A; KR20140054177A; US10738106B2; RU2630637C2; JP6411212B2

Abstract

La invención proporciona anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina y métodos para utilizar los mismos.

Description

ANTICUERPOS CONTRA POLIUBIQÜITINA Y MÉTODOS DE USO SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad según el punto 119(e) del artículo 35 del Código de Comercio de los Estados Unidos respecto de la solicitud provisional estadounidense con n° 61/515.729, presentada el 5 de agosto de 2011 que se ha incorporado por referencia en su totalidad en el presente documento .

LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un Listado de secuencias que se ha enviado en formato ASCII mediante EFS-Web y se incorpora por la presente por referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 6 de agosto de 2012, se denomina P4716RlWO.txt y tiene un tamaño de 128.429 bytes .

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina, y más particularmente a anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina que no se unen específicamente a la ubiquitina y que son específicos de la poliubiquitina lineal y a los métodos de utilizar los mismos.

ANTECEDENTES Ubiquitina es una proteína pequeña que tiene un papel regulador importante en una amplia variedad de rutas celulares. El papel mejor conocido de la ubiquitina es la degradación de proteínas, donde la unión covalente de la ubiquitina a una proteína diana permite que la proteína diana se reconozca y destruya mediante el proteosoma 26S [véase Wilkinson, Semin. Cell Devel. Biol. 11(3): 141-148 (2000)). La unión covalente de la ubiquitina, una proteína de 76 aminoácidos, a una proteína diana es un proceso enzimatico en tres etapas (Pickart, Annu. Rev. Biochem. 70: 503-533 (2001) ) . En primer lugar, la enzima activadora de ubiquitina forma un tioéster ubiquitina-El en una reacción dependiente de ATP. La ubiquitina se transfiere desde el tioéster ubiquitina-El hasta un miembro de la familia de enzimas conjugadoras de la ubiquitina (E2) en la segunda etapa. En la tercera etapa, mediante una ubiquitina-proteína ligasa (E3) , se forma un enlace isopeptídico entre el extremo carboxilo de la ubiquitina y el grupo e-amino de un resto lisina de la proteína diana. Enzimas denominadas desubiquitinasas eliminan los restos de ubiquitina de las proteínas diana (Guterman y Glickman, Curr. Prot . Pep. Sci. 5: 201-210 (2004)).

Ubiquitina contiene siete restos lisina (Lys6, Lysll, Lys27, Lys33, Lys29, Lys48, y Lys63) , y por tanto, la propia ubiquitina puede servir como proteína diana de la ubiquitinación (Peng y col., Nat. Biotechnol. 21: 921-926 (2003) ; Pickart y Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8:610-616 (2004) ). La molécula producida mediante ubiquitinación de una proteína ubiquitina se denomina una molécula de poliubiquitina, y puede comprender dos o más restos ubiquitina. La ubiquitinación de la ubiquitina se puede producir teóricamente en cualquiera de los siete restos lisina (Peng y col., Nat. Biotechnol. 21: 921-926 (2003)), de forma que existen diferentes especies de poliubiquitina que tienen enlaces de tipo isopeptídico con diferentes restos lisina incluidos en la ubiquitina. Se han notificado cadenas de poliubiquitina con uniones de tipo isopeptídico para los siete restos lisina. Iwai y Tokunaga, EMBO Reports 10:706-713 (2009) .

Se ha descubierto recientemente que también se forman cadenas lineales de poliubiquitina donde la glicina del extremo C de ubiquitina se conjuga con el grupo amino en ? de la metionina del extremo N de otra molécula de ubiquitina. Iwai y Tokunaga, EMBO Reports 10:706-713 (2009). La poliubiquitina lineal se forma mediante el complejo de ensamblaje de cadena lineal (LUBAC, por sus siglas en inglés) que está compuesta de dos proteínas anulares, H0IL-1L y HOIP. Tokunaga y col., Nat. Cell Biol. 11:123-132 (2009). Se cree que la poliubiquitina lineal no anclada genéticamente codificada no existe en las células porque su extremo C es vulnerable a la escisión mediante la isopeptidasa T. Iwai y Tokunada, EMBO Reports 10:706-713 (2009). Esta observación sugiere que la poliubiquitina lineal se ensambla sobre una proteína sustrato después de la traducción, y que estas moléculas de poliubiquitina lineales conjugadas son moduladores potenciales de la actividad y la función de la proteína. Id. Por ejemplo, se ha demostrado que la poliubiquitinación lineal del modulador esencial NF-^cB (NEMO) desempeña un papel en la activación de NF-??. Id.

Los anticuerpos que distinguieran la poliubiquitina lineal respecto de la poliubiquitina con diferentes uniones lisina serían útiles para analizar adicionalmente el papel de las cadenas lineales de poliubiquitina en la degradación y regulación de proteínas y en el direccionamiento y la modulación de la poliubiquitina lineal en las rutas mediadas por la poliubiquitina lineal.

COMPENDIO La invención proporciona anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina lineal y métodos para utilizar los mismos. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a una primera poliubiquitina que comprende una unión entre el extremo C y el extremo N, donde el anticuerpo no se une específicamente a una segunda poliubiquitina que comprende una unión de lisina. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente tanto a una primera poliubiquitina que comprende una unión entre el extremo C y el extremo N como a una segunda poliubiquitina que comprende una unión de lisina, donde el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina, y donde el anticuerpo se une a la segunda ubiquitina con una afinidad de enlace sustancialmente reducida si se compara con la afinidad de enlace del anticuerpo por la primera poliubiquitina.

En otra realización la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a una poliubiquitina unida por los extremos C y N, donde el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina. En un aspecto, el anticuerpo comprende al menos una secuencia hipervariable (HVR) seleccionada de HVR-L1, HVR-L2 , HVR-L3 , HVR-H1, HVR-H2 , y HVR-H3 de cualquiera de las SEC ID Nros: 1, 4, 19 y 50-57; SEC ID Nros : 2 y 58-63; SEC ID Nros: 3, 5, 6, 20, 21 y 64-72; SEC ID Nros : 7, 10, 13, 16, 22 y 73-81; SEC ID Nros: 8, 11, 14, 17, 23, 24 y 82-86; y SEC ID Nros : 9, 12, 15, 18 y 87-93, respectivamente.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende al menos una secuencia seleccionada de HVR-Ll, HVR-L2 y HVR-L3, donde HVR-Ll comprende la secuencia de aminoácidos RASQX1VX2X3X4 A (SEC ID N° : 39), donde el aminoácido ?? se selecciona entre los aminoácidos D, S y G, el aminoácido X2 se selecciona entre S y D, el aminoácido X3 se selecciona entre S, T y N y el aminoácido X4 se selecciona entre A y S; donde HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N": 2; y donde HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos QQX5X6X7X8X9PX10T (SEC ID N° : 40), donde el aminoácido X5 se selecciona entre S, Y y H, el aminoácido X6 se selecciona entre Y y F, donde el aminoácido X7 se selecciona entre T, Y y A, donde el aminoácido X8 se selecciona entre T, Y y S, el aminoácido X9 es opcional y, si está presente, es serina, y el aminoácido X10 se selecciona entre P y L, En otro aspecto, el anticuerpo comprende al menos una secuencia hipervariable (HVR) seleccionada de HVR-H1, HVR-H2, y HVR-H3 donde HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos X11 12X13X1 15X16X17X18 (SEC ID N° : 41), donde el aminoácido XX1 se selecciona entre T y N, el aminoácido Xi2 se selecciona entre F e I, el aminoácido X13 se selecciona entre S, T e Y, el aminoácido X14 se selecciona entre N, D, S e Y, donde el aminoácido Xi5 se selecciona entre T, Y, S y D, el aminoácido X16 se selecciona entre Y, D y S, el aminoácido Xi7 se selecciona entre I y M, y el aminoácido X18 se selecciona entre S y H, y donde HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos AX19 IX20X21X22X23X24X25 X26 (SEC ID N° : 42), donde el aminoácido X19 se selecciona entre S, G, W y E, donde el aminoácido X2o se selecciona entre T, S e Y, el aminoácido X2i se selecciona entre P y S, el aminoácido X22 se selecciona entre S e Y, el aminoácido X23 se selecciona entre G, S e Y, el aminoácido X24 se selecciona entre G y S, el aminoácido X25 se selecciona entre S e Y, y el aminoácido X2e se selecciona entre D y S, y HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos RX27X28X29X30X31X32X33X34 35 36X37D (SEC ID N° : 43) donde el aminoácido X27 se selecciona entre T, E y G, el aminoácido X28 se selecciona entre W, A e Y, el aminoácido X29 se selecciona entre L, G, V y S, el aminoácido X30 se selecciona entre L, S y W, el aminoácido X31 se selecciona entre R, K e Y. el aminoácido X32 se selecciona entre W, L, G e Y, el aminoácido X33 se selecciona entre V, L, A y G, el aminoácido X37 se selecciona entre M y F, y donde los aminoácidos X34( X35, y X36 son opcionales y, si están presentes, el aminoácido X34 es S, el aminoácido X35 se selecciona entre V y P, y el aminoácido X36 es A.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende al menos una secuencia hipervariable (HVR) seleccionada de HVR-Ll, HVR-L2 , y HVR-L3, donde HVR-Ll comprende la secuencia de aminoácidos RASQ X38 39X40X41X 2 3A (SEC ID N° : 44), donde el aminoácido X38 se selecciona entre D, A, E, G, L, N, S, T y V, el aminoácido X39 se selecciona entre V, A, L y S, el aminoácido X40 se selecciona entre S, F, G, L, R y V, donde el aminoácido X41 se selecciona entre T, G, I, N, S y V, el aminoácido X42 se selecciona entre A, H, Q, R, S, e Y, y el aminoácido X43 se selecciona entre V y L, y donde HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos SX44X45X46X47YX48 (SEC ID N° : 45), donde el aminoácido X44 se selecciona entre A y R, el aminoácido X45 se selecciona entre S, K, Q, y R, el aminoácido X46 se selecciona entre F e Y, el aminoácido X47 se selecciona entre L, A, F, G, H, I, K, M, N, P, R, S, V e Y, y el aminoácido X48 se selecciona entre S, A, D, F, G, H, V, W e Y y donde HVR-L3 comprende la secuencia QQ X49X5oX5iX52PP (SEC ID N° : 46) , donde el aminoácido X49 se selecciona entre H y S, el aminoácido X50 se selecciona entre Y, K, N, Q, R, S, V, y W, donde el aminoácido X51 se selecciona entre T, I, Q, R, S y V, y el aminoácido X52 se selecciona entre T, A, D, F, G, K, N, P, Q, R, S y V.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende al menos una secuencia hipervariable (HVR) seleccionada de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde HVR-Hl comprende la secuencia de aminoácidos X53X54X55YX56S (SEC ID N° : 47), donde el aminoácido X53 se selecciona entre A , F, K, M, Q, R y S , el aminoácido X54 se selecciona entre N y , donde el aminoácido X55 se selecciona entre T, A , I, L, , y V, y el aminoácido X56 se selecciona entre I, y V, y donde HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos AXsTXssTPXsgSGXeoTXsi (SEC ID N°:48), donde el aminoácido X57 se selecciona entre T y S, el aminoácido X58 se selecciona entre I, S y V, el aminoácido X59 se selecciona entre S y A, el aminoácido X60 se selecciona entre S, H, I, L, M y Q, el aminoácido X6i se selecciona entre D y N, y donde HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos X62WX63 s4RWVX65D (SEC ID N°:49) donde el aminoácido X62 se selecciona entre S y T, el aminoácido 63 se selecciona entre L e Y, el aminoácido X64 se selecciona entre L, I y V, el aminoácido Xes se selecciona entre M y F.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende una secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 1 o 4, una secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N°: 2, y una secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, 5 y 6, respectivamente. En otro aspecto, el anticuerpo comprende una secuencia de HVR-Hl de la SEC ID N° : 7, 10, 13 y 16, y una secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 11, 23 y 24, y una secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 12, respectivamente. En otro aspecto, el anticuerpo comprende una secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 1 y 50-56, una secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2 y 57-62 y una secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3 y 63-71, respectivamente. En otro aspecto, el anticuerpo comprende una secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 7 y 72-80, y una secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 8 y 81-85, y una secuencia de HVR-LH3 de la SEC ID N° : 9 y 86-92, respectivamente.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende secuencias HVR-Ll, HVR-L2, y HVR-L3 correspondientes a las definidas para los clones 1E2, 1D8, 1F4 o 1A10 de la Figura 1. En otro aspecto, el anticuerpo comprende secuencias HVR-H1, HVR-H2, y HVR-H3 correspondientes a las definidas para los clones 1E2, 1D8, 1F4 o 1A10 de la Figura 1. En otro aspecto, el anticuerpo comprende secuencias HVR-L1, HVR-L2, y HVR-L3 correspondientes a las definidas para los clones 1D8.3C2, 1D8.3F8 o 1D8.4F5 de la Figura 4. En otro aspecto, el anticuerpo comprende secuencias HVR-H1, HVR-H2, y HVR-H3 correspondientes a las definidas para los clones 1D8.3C2, 1D8.3F8 o 1D8.4F5 de la Figura 4.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N°: 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 10, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 11 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 12. En otro aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 19, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, la secuencia de HVR-Hl de la SEC ID N° : 10, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 23 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 12. En otro aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 20, la secuencia de HVR-Hl de la SEC ID N° : 10, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 11 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 12. En otro aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 20, la secuencia de HVR-Hl de la SEC ID N° : 10, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 11 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 12. En otro aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, la secuencia de HVR-Hl de la SEC ID N° : 7, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 8 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 9. En otro aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de HVR-Ll de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 seleccionada de la SEC ID N° : 2, 57 y 59, la secuencia de HVR-L3 seleccionada de la SEC ID N° : 3, 64 y 71, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N°: 7 o 79, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 8 o 81, y la secuencia de HVR-L3 seleccionada de la SEC ID N° : 9, 86, 88 u 89. En otro aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de HVR-Ll de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 57, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 7, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 8 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N" : 9. En otro aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de HVR-Ll de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 7, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 81 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 9. En otro aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de HVR-Ll de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 57, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 7, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 81 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 9. En determinados aspectos, cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento puede incluir una leucina como el primer aminoácido después del extremo C de HVR-H3 (por ejemplo, el aminoácido inmediatamente adyacente al extremo C de un HVR-H3, tal como 1E3, -TWLLRVMDL (SEC ID N°:96).

En otro aspecto, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera seleccionados de las SEC ID Nros: 25-28, 33-35, 94 y 193-195. En otro aspecto, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada seleccionados de las SEC ID Nros: 29-31, 36-38, 95 y 196-198.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y la cadena pesada que tienen una identidad de secuencia de al menos el 95% con una de las siguientes combinaciones de secuencias: SEC ID Nros25 y 29; SEC ID Nros: 26 y 30; SEC ID Nros: 27 y 31; SEC ID Nros : 28 y 32; SEC ID Nros : 33 y 36; SEC ID Nros: 34 y 37; SEC ID Nros : 35 y 38; SEC ID Nros : 95 y 95; SEC ID Nros : 193 y 196; SEC ID Nros : 194 y 197; y SEC ID Nros: 195 y 198.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo aislado, donde el anticuerpo se une al mismo determinante antigénico de la poliubiquitina unida del extremo C al extremo N que cualquiera de los anticuerpos anteriores, y donde el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo aislado que compite con uno cualquiera de los anticuerpos anteriores para unirse a poliubiquitina unida del extremo C al extremo N, donde el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina. En otra realización, la invención proporciona cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores, donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína poliubiquitinada unida del extremo C al extremo N. En otra realización, la invención proporciona cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores, donde el anticuerpo modula al menos una ruta de señalización mediada por poliubiquitina .

En un aspecto general, cualquiera de los anticuerpos anteriores es un anticuerpo monoclonal. En otro aspecto general, cualquiera de los anticuerpos anteriores es un anticuerpo humano. En otro aspecto general, cualquiera de los anticuerpos anteriores es un anticuerpo humanizado. En otro aspecto general, cualquiera de los anticuerpos anteriores es un anticuerpo quimérico. En otro aspecto general, cualquiera de los anticuerpos anteriores es un fragmento de anticuerpo que se une a poliubiquitina unida del extremo C al extremo N, En otra realización, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores, En otra realización, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores, En otra realización, la invención proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores, En otra realización, la invención proporciona una célula hospedadora que comprende un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores, En otra realización, la invención proporciona un método para producir cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores, que comprende cultivar la célula hospedadora anteriormente citada en condiciones en las que se produzca el anticuerpo. En un aspecto, el método comprende además recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora. En otro aspecto, el método comprende además purificar el anticuerpo.

En otra realización, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende cualquiera de los anticuerpos anteriores y un agente citotóxico. En otra realización, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la formulación farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional. En uno de dichos aspectos, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico .

En otra realización, la invención proporciona cualquiera de los anticuerpos anteriores para su uso como medicamento. En otra realización, la invención proporciona cualquiera de los anticuerpos anteriores para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionados con el ciclo celular. En un aspecto, la enfermedad o trastorno relacionados con el ciclo celular se seleccionan entre una enfermedad o trastorno asociados con una progresión creciente anómala del ciclo celular y una enfermedad o trastorno asociados con una progresión decreciente anómala del ciclo celular. En uno de dichos aspectos, la enfermedad o trastorno asociados con una progresión creciente anómala del ciclo celular es cáncer. En otro de dichos aspectos, la enfermedad o trastorno asociados con una progresión decreciente anómala del ciclo celular se seleccionan entre un trastorno degenerativo del músculo y un trastorno degenerativo del nervio.

En otra realización, la invención proporciona el uso de los anticuerpos anteriores en la fabricación de un medicamento. En un aspecto, el medicamento es para una enfermedad o trastorno seleccionado de cáncer, un trastorno degenerativo del músculo, y un trastorno degenerativo del nervio. En otra realización, la invención proporciona un método para tratar a un individuo que tiene una enfermedad o trastorno seleccionado de cáncer, un trastorno degenerativo del músculo, y un trastorno degenerativo del nervio, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores.

En otra realización, la invención proporciona un método para determinar la presencia de una poliubiquitina o una proteína poliubiquitinada en una muestra que se sospecha que contiene o que contiene una poliubiquitina o una proteína poliubiquitinada, que comprende exponer la misma a al menos uno de los anticuerpos anteriores y determinar la unión del al menos un anticuerpo a la poliubiquitina o una proteína poliubiquitinada de la muestra. En otra realización, la invención proporciona un método para separar una proteína poliubiquitinada unida del extremo C al extremo N de una proteína poliubiquitinada no unida del extremo C al extremo N en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con al menos uno de los anticuerpos anteriores. En otra realización, la invención proporciona un método para determinar la función y/o la actividad de una poliubiquitina unida del extremo C al extremo N en una célula o muestra que comprende poner en contacto la célula o muestra con al menos uno de los anticuerpos anteriores y evaluar el efecto de dicha etapa de puesta en contacto de la célula o la muestra.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los resultados de una mancha de fago en ELISA que demuestra las señales de unión relativas a una longitud de onda de 450 nm para los clones 1D8, 1E3, 1F4 y 1A10 con respecto a un panel de proteínas ubiquitina, tal como se describe en el Ejemplo IB. Cada uno de los clones de la biblioteca de Fab que contiene una marca gD y que presentan el Fab en el fago se evaluó para determinar su unión a un anticuerpo dirigido contra gD. Se utilizó un pocilio no revestido como control negativo.

Las Figuras 2A y 2B representan gráficamente las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de los Fab obtenidos en el Ejemplo 1. La Figura 2A representa gráficamente la secuencia de la cadena ligera de los clones 1E3, 1D8, 1F4 y 1A10 (SEC ID Nros : 25-28, respectivamente) . La Figura 2B representa gráficamente la secuencia de la cadena pesada de los clones 1E3, 1D8, 1F4 y 1A10 (SEC ID Nros: 29-32, respectivamente) . En ambas Figuras 2A y 2B, las secuencias de HVR para cada clon se han indicado mediante las regiones recuadradas, indicando el primer recuadro HVR-L1 (Figura 2A) o HVR-H1 (Figura 2B) , indicando el segundo recuadro HVR-L2 (Figura 2A) o HVR-H2 (Figura 2B) , e indicando el tercer recuadro HVR-L3 (Figura 2A) o HVR-H3 (Figura 2B) .

La Figura 3 representa gráficamente los resultados de la CI50 para una competición ELISA en fago para medir la afinidad de los Fab 1F4, 1D8 y 1E3 purificados por la diubiquitina lineal .

La Figura 4 muestra los resultados de un análisis mediante transferencia Western para determinar la capacidad de los Fab 1D8 y 1E3 para reconocer específicamente un panel de proteínas diubiquitina en un contexto inmovilizado.

Las Figuras 5A y 5B representan gráficamente las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de los clones madurados por afinidad obtenidos en el Ejemplo 2 derivados de la clasificación de la biblioteca de 1D8 madurado por afinidad. La Figura 5A representa gráficamente las secuencias de los clones madurados por afinidad 1D8.3C2, 1D8.3F8 y 1D8.4F5 (SEC ID Nros: 33-35, respectivamente). La Figura 5A divulga la secuencia 1D8 como la SEC ID N° : 26. La Figura 5B representa gráficamente el alineamiento de la secuencia de la cadena pesada de los clones madurados por afinidad 1D8.3C2, 1D8.3F8 y 1D8.4F5 (SEC ID Nros: 36-38, respectivamente) . La Figura 5B divulga la secuencia 1D8 como la SEC ID N° : 30. En ambas Figuras 5A y 5B, las secuencias de HVR para cada clon se han indicado mediante las regiones recuadradas, indicando el primer recuadro HVR-L1 (Figura 5A) o HVR-H1 (Figura 5B) , indicando el segundo recuadro HVR-L2 (Figura 5A) o HVR-H2 (Figura 5B) , e indicando el tercer recuadro HVR-L3 (Figura 5A) o HVR-H3 (Figura 5B) . Los cambios en los aminoácidos con respecto a la secuencia del 1D8 original se han destacado en gris.

La Figura 6 representa gráficamente los resultados de la CI50 para una competición ELISA en fago para medir la afinidad de los Fab 1D8, 1D8.3C2, 1D8.3F8 y 1D8.4F5 purificados por la diubiquitina lineal.

Las Figuras 7A y 7B representan gráficamente los resultados de los estudios que evalúan las características de especificidad de unión de los variantes mutantes madurados por afinidad comparados con el clon 1E3 original y los controles . La unión del clon original 1E3 y 11 variantes mutantes únicos madurados por afinidad expresados en fago se ensayaron para determinar su unión a un panel de proteínas ubiquitina mediante ELISA. Se utilizó la unión a un anticuerpo dirigido contra gD para evaluar la expresión en fago del Fab y se utilizaron pocilios sin revestir como control negativo.

Las Figuras 8A y 8B representan gráficamente los resultados de los estudios que evalúan las características de especificidad de unión de los variantes mutantes simples y imitantes dobles comparados con el clon 1E3 original y los controles, tal como se describe en el Ejemplo 3. La unión del clon original 1E3, 4 variantes mutantes únicos madurados por afinidad y 3 variantes mutantes dobles madurados por afinidad, expresados en fago, se ensayaron para determinar su unión a un panel de proteínas ubiquitina mediante ELISA. Se utilizó la unión a un anticuerpo dirigido contra gD para evaluar la expresión en fago del Fab y se utilizaron pocilios sin revestir como control negativo.

Las Figuras 9A y 9B representan gráficamente las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada del Fab 1E3, clones madurados por afinidad obtenidos en el Ejemplo 3 derivados de la segunda clasificación de la biblioteca de 1E3 madurado por afinidad (1F11 y 3F5) , la mutación Y102L observada en el clon 4E4 y el Fab con triple mutación que incorpora los cambios en los aminoácidos de los clones 1F11 y 3F5 y la mutación Y102L descrita en el Ejemplo 3P. La Figura 9A representa gráficamente las secuencias de la cadena ligera de los clones madurados por afinidad para 1E3, 1F11, 3F5, Y102L y 1F11/3F5/Y102L (SEQ ID Nros : 25, 193, 194, 195 y 94, respectivamente). La Figura 9B representa gráficamente el alineamiento de la secuencia de la cadena pesada de los clones madurados por afinidad para 1E3 , 1F11, 3F5, Y102L y 1F11/3F5/Y102L (SEQ ID Nros: 29, 196, 197, 198 y 95, respectivamente) . En ambas Figuras 9A y 9B, las posiciones de Kabat que son diana de la variación de aminoácidos en las segundas bibliotecas maduradas por afinidad para 1E3 se indican mediante las regiones recuadradas . Los cambios en los aminoácidos con respecto a la secuencia del 1E3 original se han destacado en gris .

La Figura 10 proporciona el análisis mediante transferencia Western de la unión de las IgG del 1E3 original y de los mutantes simple y doble a la diubiquitina lineal (diluciones en serie de 1000, 333, 111, 37 y 12 ng por carril) y diubiquitina con unión K63 (1000 ng por carril) .

La Figura 11 proporciona el análisis mediante transferencia Western de la unión de las IgG del 1E3 original y de los mutantes doble y triple a la diubiquitina lineal (diluciones en serie de 1000, 333, 111, 37 y 12 ng por carril) y diubiquitina con unión K63 (1000 ng por carril) .

La Figura 12 proporciona el análisis mediante transferencia Western de la unión de las IgG de Y102L, mutante Y1012L T110A y varias combinaciones de mutantes de Y102L, T110A, 3F5 y 1F11 a la diubiquitina lineal (diluciones en serie de 1000, 333, 111, 37 y 12 ng por carril) y diubiquitina con unión K63 (1000 ng por carril) .

La Figura 13 proporciona el análisis mediante transferencia Western de la unión de las IgG del 1E3 original y de los imitantes simple, doble y triple, tal como se describe en el Ejemplo 3M, a la diubiquitina lineal (diluciones en serie de 1000, 333, 111, 37 y 12 ng por carril) y diubiquitina con unión K63 (1000 ng por carril) .

La Figura 14 proporciona el análisis mediante transferencia Western de la unión de las IgG de 1E3 y 1F11/3F5/Y102L Y102L para diluciones en serie de dos veces a la diubiquitina lineal (1000, 500, 250, 125, 63, 31, y 16 ng/carril donde se indica un gradiente) o a la monoubiquitina, diubiquitina con unión Kll, diubiquitina con unión K48, y diubiquitina con unión K63 (1 µg/carril) . Como control se analizó la IgG dirigida contra K63, Apu3.A8, para determinar la unión a diluciones en serie de dos veces de diubiquitina con unión K63 (1000, 500, 250, 125, 63, 31, y 16 ng/carril donde se indica un gradiente) o a la monoubiquitina, diubiquitina lineal, diubiquitina con unión Kll, y diubiquitina con unión K48 (1 µg/carril) . El gel teñido con Coomassie (panel superior izquierda) proporciona una indicación de la posición hacia la que migra la ubiquitina en los geles.

La Figura 15 representa gráficamente los resultados de los experimentos donde monoubiquitina, poliubiquitina 2-7 lineal (dos a siete subunidades de ubiquitina de longitud) , poliubiquitina 2-7 con unión K48 (dos a siete subunidades de ubiquitina de longitud) , poliubiquitina 2-7 con unión K63 (dos a siete subunidades de ubiquitina de longitud) , y poliubiquitina con unión Kll (1 g cada por carril) se inmunotransfirieron con un anticuerpo P4D1 dirigido contra pan-ubiquitina (panel intermedio) o la IgG de 1F11/3F5/Y102L IgG (panel derecho) . La tinción de Coomassie reveló la composición de las muestras (panel izquierdo). Se muestra una exposición corta y larga de las transferencias Western.

Las Figuras 16A y 16B representan gráficamente los resultados de experimentos en los que lisatos de células HeLa S3 tratadas con concentraciones variables de TNFa y durante plazos de tiempo variables con MG132 5,8 uM se sometieron a inmunotransferencia con respecto a las cadenas de ubiquitina lineal con el anticuerpo híbrido 1F11/3F5/Y102L o cadenas de ubiquitina con unión K63 con el anticuerpo Apu3.A8. Como control, se analizaron en cada gel 250 ng de la poliubiquitina lineal 2-7 purificada y poliubiquitina con unión K63 (Figura 16A) . Para evaluar el nivel de activación de la ruta NF B, los lisatos se transfirieron para determinar los niveles de ???a (Figura 16B) . Como control de carga, los lisatos se transfirieron con ß-tubulina.

La Figura 17 representa gráficamente los resultados de experimentos de inmunoprecipitación con el anticuerpo híbrido 1F11/3F5/Y102L dirigido contra la poliubiquitina lineal, un control de isotipo, o un anticuerpo Apu3.A8 dirigido contra K63. Los experimentos IP se realizaron en urea 4 M y tampón IP en tres condiciones (una mezcla de todas las cadenas de ubiquitina, cadenas no lineares de ubiquitina, o solamente cadenas lineares de ubiquitina) . Como control, se analizaron en cada gel 1 µg de la poliubiquitina lineal 2-7 purificada y poliubiquitina 2-7 con unión K63.

Las Figuras 18A y 18B representan gráficamente los resultados de experimentos de inmunoprecipitación usando una mezcla 1:1 de poliubiquitina 2-7 lineal y poliubiquitina 2-7 con unión K63 con el anticuerpo 1F11/3F5/Y102L dirigido contra la poliubiquitina lineal o el anticuerpo Apu3.A8 dirigido contra K63 en concentraciones variables de urea o PBST que se inmunotransfirieron con uno cualquiera de IF11/3F5/Y102L (anti-lineal) o Apu3.A8 (anti-K63) . Como control, se analizaron en cada gel 1 µg de la poliubiquitina lineal 2-7 purificada y poliubiquitina 2-7 con unión K63. La Figura 18A muestra los resultados de los experimentos IP con urea O M, 2 M, 4 M y 6 M . La Figura 18B muestra los resultados de los experimentos IP con urea 6 M, 7 M, y 8 M.

La Figura 19 muestra los resultados de experimentos de inmunoprecipitación e inmunotransferencia usando una mezcla 1:1:1:1 de poliubiquitina 2-7 lineal, poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina con unión K48, y poliubiquitina 2-7 con unión K63 con el anticuerpo 1F11/3F5/Y102L dirigido contra poliubiquitina lineal, un control de isotipo, o el anticuerpo Apu3.A8 dirigido contra poliubiquitina con unión K63 reticulado con perlas de Proteína A en concentraciones variables de urea. Los anticuerpos utilizados en la inmunotransferencia fueron las IgG de 1F11/3F5/Y102L (antilineal), 2A3/2E6 (anti-Kll) , Apu2.07 (anti-K48) , O Apu3.A8 (anti-K63) . Como control, 1 g de cada poliubiquitina 2-7 lineal poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina 2-7 con unión K48, y poliubiquitina 2-7 con unión K63 purificadas se analizaron en cada gel .

La Figura 20 muestra los resultados de experimentos de inmunoprecipitación e inmunotransferencia usando una mezcla 1:1:1:1 de poliubiquitina 2-7 lineal, poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina con unión K48, y poliubiquitina 2-7 con unión K63 con el anticuerpo híbrido 1F11/3F5/Y102L dirigido contra poliubiquitina lineal, un control de isotipo, o el anticuerpo Apu3.A8 dirigido contra la igG de la poliubiquitina con unión K63 reticulado con perlas de Proteína G en concentraciones variables de urea. Los anticuerpos utilizados en la inmunotransferencia fueron las IgG de 1F11/3F5/Y102L (anti-lineal) , 2A3/2E6 (anti-Kll) , Apu2.07 (anti-K48), o Apu3.A8 (anti-K63) . Como control, 1 µg de cada poliubiquitina 2-7 lineal poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina 2-7 con unión K48, y poliubiquitina 2-7 con unión K63 purificadas se analizaron en cada gel.

La Figura 21A muestra los resultados de experimentos de inmunoprecipitación e inmunotransferencia de una mezcla 1:1:1:1 de poliubiquitina 2-7 lineal, poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina con unión K48, y poliubiquitina 2-7 con unión K63 con el anticuerpo 1F11/3F5/Y102L dirigido contra poliubiquitina lineal, un control de isotipo, o el anticuerpo Apu3.A8 dirigido contra poliubiquitina con unión K63 en concentraciones variables de urea. Los anticuerpos utilizados en la inmunotransferencia fueron las IgG de 1F11/3F5/Y102L (anti-lineal), 2A3/2E6 (anti-Kll), Apu2.07 (anti-K48) , o Apu3.A8 (anti-K63) . Como control, 500 ng de cada poliubiquitina 2-7 lineal poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina 2-7 con unión K48, y poliubiquitina 2-7 con unión K63 purificadas se analizaron en cada gel.

La Figura 2IB muestra los resultados de experimentos de inmunoprecipitación de una mezcla 1:1:1:1 de poliubiquitina 2-7 lineal, poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina con unión K48, y poliubiquitina 2-7 con unión K63 con el anticuerpo híbrido 1F11/3F5/Y102L dirigido contra poliubiquitina lineal, un control de isotipo, o el anticuerpo Apu3.A8 dirigido contra poliubiquitina con unión K63 en concentraciones variables de urea y separados mediante gel SDS-PAGE y con tinción de Coomassie. Se indican las regiones recortadas para realizar una espectrometría de masas AQUA.

La Figura 21C es un gráfico que indica la cantidad, en picomoles, de las uniones poliubiquitina identificadas mediante espectrometría de masas AQUA derivadas de la inmunoprecipitación con 1F11/3F5/Y102L como se muestra en la Figura 24B (región B y región C) y se describe en el Ejemplo 4D.

La Figura 2ID es un gráfico que indica la composición de la unión en las cadenas de poliubiquitina identificadas mediante espectrometría de masas AQUA derivadas de la inmunoprecipitación con 1F11/3F5/Y102L como se muestra en la Figura 24B (región B y región C) .

La Figura 21E es un gráfico que indica el porcentaje de cadenas lineales recuperadas en las inmunoprecipitaciones con 1F11/3F5/Y102L identificadas mediante espectrometría de masas AQUA.

La Figura 22A representa gráficamente inmunotransferencias con lisatos derivados de células 293T transíectadas con un plásmido que expresa un exceso de Hoil-1L y Hoip o bien un vector vacío. Las transferencias se sondearon para determinar la poliubiquitina lineal, Hoil-IL, Hoip, y ß-tubulina como se describe en el Ejemplo 4E.

La Figura 22B representa gráficamente los resultados de experimentos de inmunoprecipitación con lisatos derivados de células 293T transíectadas con un plásmido que expresa un exceso de Hoil-IL y Hoip o bien un vector vacío. Las inmunotransferencias se sondearon para determinar la poliubiquitina lineal o teñida con Coomassie. Las regiones indicadas en el gel teñido con Coomassie se recortaron para someterlas a espectrometría de masas AQUA.

La Figura 22C es un gráfico que indica la composición de la unión de la poliubiquitina, identificada mediante espectrometría de masas AQUA, en inmunoprecipitaciones con 1F11/3F5/Y102L derivadas de células que expresan un exceso de Hoil-IL/Hoip como se muestra en la Figura 22B.

La Figura 22D representa gráficamente la inraunofluorescencia de células HeLa S3 transfectadas con un plásmido que expresa un exceso de Hoil-IL y Hoip o un vector vacío y teñidas con el anticuerpo 1F11/3F5/Y102L dirigido contra poliubiquitina lineal. La adición de poliubiquitina lineal recombinante de cinco o siete subunidades (+) compite por la unión del anticuerpo contra la poliubiquitina lineal.

La Figura 23A-C representa gráficamente varias vistas de la estructura cocristalina del complejo formado entre el fragmento Fab 1F11/3F5/Y102L Fab y la diubiquitina lineal. A) 1F11/3F5/Y102L se muestra como un esbozo en la parte inferior de la figura y la diubiquitina lineal se representa gráficamente como un esbozo en el interior del modelo de espacio relleno, en la parte superior. Se indican las subunidades de ubiquitina proximal y distal y el enlace lineal. B) El epítopo de la diubiquitina lineal se muestra en color gris oscuro sobre la superficie de la diubiquitina que interactúa con 1F11/3F5/Y102L. Los restos que tienen al menos un 25% de su área superficial accesible a disolvente enterrada en la interfase entre la diubiquitina lineal y 1F11/3F5/Y102L y/o están comprendidos en 4,5 Á del Fab están indicados por el código de aminoácidos de una sola letra y el número de resto. La Figura 23B divulga los restos 31-37, 70-76 y 60-63 como SEQ ID Nros 379-381, respectivamente. B) El parátopo del Fab 1F11/3F5/Y102L se muestra en color gris oscuro sobre la superficie del Fab que interactúa con la diubiquitina. Los restos que tienen al menos un 25% de su área superficial accesible a disolvente enterrada en la interfase entre 1F11/3F5/Y102L y la diubiquitina y/o están comprendidos en 4,5 Á del Fab están indicados por el código de aminoácidos de una sola letra y el número de resto. La Figura 23C describe los restos 95-99 y 52-56 como SEQ ID Nros 378 y 377, respectivamente.

La Figura 24A-C muestra varias vistas cercanas de la estructura cocristalina del complejo formado entre el fragmento Fab 1F11/3F5/Y102L Fab y la diubiquitina lineal. A) Vista cercana que muestra los enlaces de hidrógeno formados entre la cadena secundaria de Gln56 de la cadena pesada y los grupos carbonilo de la cadena principal de Gly75 y Gly76. Diubiquitina se muestra de color gris claro y el Fab en gris oscuro. B) Interacción electrostática potencial entre la Lys52 de la cadena ligera y Asp32 y dipolo del extremo carboxi de la alfa hélice de la diubiquitina. Diubiquitina se muestra de color gris claro y el Fab en gris oscuro. C) Interacciones hidrófobas entre Leul02 de la cadena pesada y Val2 y Leu4 del marco 1 de la cadena pesada. Leul02 se encuentra en el extremo carboxilo de CDR H3. Diubiquitina se muestra de color gris claro y el Fab en gris oscuro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES DE LA INVENCIÓN I. DEFINICIONES Un "marco aceptor humano" para los fines de este documento es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco del dominio variable de cadena ligera (VL) o un marco del dominio variable de cadena pesada derivado de un marco de inmunoglobulina humana o de un marco de consenso humano, tal como se define más adelante. Un marco aceptor humano "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o de un marco de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos . En algunas realizaciones, el número de cambios en los aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos , 4 o menos , 3 o menos , o 2 o menos . En algunas realizaciones, El marco aceptor humano de VL tiene una secuencia idéntica a la secuencia VL del marco de inmunoglobulina humana o de un marco de consenso humano.

"Afinidad" se refiere a la fortaleza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su ligando de unión (por ejemplo, un antígeno) . Salvo que se indique otra cosa, tal como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja la interacción 1:1 entre miembros de una pareja de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su ligando Y se puede representar en general por su constante de disociación (Kd) . La afinidad se puede medir según métodos conocidos en la técnica, que incluyen los descritos en el presente documento. En lo sucesivo se describen realizaciones ilustrativas y a modo de ejemplo específicas para medir la afinidad de unión.

Un "anticuerpo madurado por afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR) , en comparación con un anticuerpo original que no tiene dichas alteraciones, siendo dichas alteraciones el resultado de una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

Un "anticuerpo agonista" tal como se utiliza en el presente documento es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

Un "anticuerpo agonista" o un "anticuerpo bloqueante" es un anticuerpo que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une específicamente. Algunos anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas inhiben de forma sustancial o completa la actividad del antigeno.

El término "anticuerpo" en el presente documento se utiliza en su sentido más amplio y abarca diferentes estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitación anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos) , y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad de unión al antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente a un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno con el que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab1, Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo scFv) ; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia se refiere a una anticuerpo que bloquea en un 50% o más la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición, e inversamente, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un 50% o más en un ensayo de competición. Se proporciona en el presente documento un ensayo de competición ilustrativo .

Los términos "anticuerpo dirigido contra poliubiquitina linealmente unida" y "un anticuerpo que se une a la poliubiquitina linealmente unida" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a la poliubiquitina linealmente unida con una afinidad suficiente para que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico y/o diagnóstico en el direccionamiento de la poliubiquitina linealmente unida. En una realización, la extensión de la unión de un anticuerpo dirigido contra una poliubiquitina linealmente unida a una proteína poliubiquitina no linealmente unida es inferior a aproximadamente el 10% de la unión del anticuerpo a la poliubiquitina linealmente unida tal como se determina, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo (RIA) . En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une a la poliubiquitina linealmente unida tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 µ?, = 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, o = 0,001 nM (por ejemplo 10"8 M o menos, por ejemplo de 10~8 M a 10"13 M, por ejemplo, de 10~9 M a 10"13 M) . En determinadas realizaciones, un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida se une a un epítopo de la poliubiquitina linealmente unida que se ha conservado en la poliubiquitina linealmente unida procedente de diferentes especies.

Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo dirigido contra poliubiquitina" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse especificamente a una molécula de poliubiquitina.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "anticuerpo dirigido contra ubiquitina" y "anticuerpo dirigido contra monoubiquitina" se utilizan de manera indistinta, y se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a una molécula de ubiquitina.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena ligera y/o pesada se ha derivado de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena ligera y/o pesada se ha derivado de una fuente o especie diferente .

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que tiene su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas clases se puede subdividir en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAlf e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente .

El término "agente citotóxico" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o causa la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de of Lu) ; agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes) ; agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas ; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o enzimas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos o variantes del mismo; y los diferentes agentes antxneoplásicos y anticancerosos descritos a continuación.

Un "trastorno" es cualquier dolencia que se beneficiaría del tratamiento con un anticuerpo de la invención. Esto incluye trastornos crónicos y agudos o enfermedades que incluyen dichas patologías que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos a tratar en el presente documento incluyen cáncer y trastornos hipotróficos incluyendo, pero sin limitación, trastornos degenerativos del músculo y trastornos degenerativos del nervio.

"Funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas que se pueden atribuir a la región Fe de un anticuerpo, que varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras incluyen: Unión a Clq y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) ; unión al receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; infrarregulación de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) ; y activación de linfocitos B.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "región F" en el presente documento se utiliza para definir una región del externo C de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones naturales de la secuencia Fe y las regiones variantes de Fe. En una realización, una región Fe de la cadena pesada de una IgG se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina del extremo C (Lys447) de la región Fe puede estar presente o no estarlo. Salvo que se especifique de otra forma en el presente documento, la numeración de los restos de aminoácidos en la región Fe o en la región constante se ha hecho de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, tal como se describe en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5* ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Marco" o "FR" se refiere a los restos en el dominio variable diferentes a los restos de la región hipervariable (HVR) . El FR de un dominio variable está compuesto por lo general de cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 , y FR4. De acuerdo con ello, las secuencias HVR y FR suelen aparecer en la siguiente secuencia en la VH (o VL) : FR1-H1 (Ll) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a la estructura de un anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe tal como se ha definido en el presente documento.

Los términos "célula hospedadora" , "línea celular hospedadora" y "cultivo de célula hospedadora" se utilizan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de dichas células. Las células hospedadoras incluyen 11transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula primaria transformada y la progenie derivada de lo anterior sin tener en cuenta el número de pasos. Puede que la progenie no sea completamente idéntica en su contenido de ácido nucleico comparada con la célula progenitora, sino que puede contener mutaciones . Se incluye en el presente documento la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula originalmente transformada.

Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o se ha derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprenden restos de unión a antigeno de origen no humano.

Un "marco de consenso humano" es un marco que representa los restos de aminoácidos que se encuentran con más frecuencia en una selección de secuencias marco de la VL o la VH de una inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de la VL o la VH de una inmunoglobulina humana procede de un subgrupo de secuencias del dominio variable . En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo según Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, publicación de los NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En una realización, de la VL, el subgrupo es un subgrupo kappa I según Kabat y col . , más arriba . En una realización, de la VH, el subgrupo es un subgrupo III según Kabat y col., más arriba.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende restos de aminoácidos procedentes de HVR no humanas y restos de aminoácidos de FR humanas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, de los que todas o prácticamente todas las HVR (por ejemplo, las CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o prácticamente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización .

El término "región hipervariable" o "HVR," tal como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones en un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en su secuencia Y/o conforman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos nativos tetracatenarios comprenden seis HVR: tres en la VH (Hl, H2, H3) , y tres en la VL (Ll, L2, L3) . las HVR comprenden por lo general restos de aminoácidos procedentes de los bucles hipervariables y/o procedentes de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR) , siendo estas últimas las secuencias de mayor variabilidad y/o estando implicadas en el reconocimiento de los antígenos. Se encuentran ejemplos de bucles hipervariables en los restos de aminoácidos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) , 91-96 (L3) , 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) , y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987).) CDR ilustrativas (CDR-L1, CDR-L2 , CDR-L3 , CDR-H1, CDR-H2 , y CDR-H3) se encuentran en los restos de aminoácidos 24-34 de Ll, 50-56 de L2, 89-97 de L3 , 31-35B de Hl, 50-65 de H2 , y 95-102 de H3. (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden por lo general restos de aminoácidos procedentes de los bucles hipervariables. Las CDR comprenden también "restos determinantes de la especificidad" o "SDR", que son restos que entran en contacto con el antígeno. Los SDR están incluidos en las regiones de las CDR denominadas CDR abreviadas, o a-CDR. a-CDR ilustrativas (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2, y a-CDR-H3) se encuentran en los restos de aminoácidos 31-34 de Ll, 50-55 de L2, 89-96 de L3 , 31-35B de Hl, 50-58 de H2 , y 95-102 de H3. (Véase Almagro y Fransson, Front . Biosci. 13:1619-1633 (2008).) Salvo que se indique de otra forma, los restos de HVR y otros restos del dominio variable (por ejemplo, restos FR) se numeran en el presente documento según Kabat y col . , más arriba.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más molécula (s) heteróloga (s) , incluyendo pero sin limitación un agente citotóxico.

Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros, y caballos) , primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos) , conejos, y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) . En determinadas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo "aislado" es un anticuerpo que se ha separado de un componente de su entorno natural . En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica hasta una pureza mayor del 95% o 99% tal como se determina mediante, por ejemplo, técnicas electroforéticas (por ejemplo, SDS-PAGE, focalización isoeléctrica (IEF) , electroforesis capilar) o cromatográficas (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase invertida) . Para una revisión de los métodos para evaluar la pureza de un anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman y col., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a un ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente fuera del cromosoma o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosóinica natural . "Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera (o fragmentos de las mismas) de un anticuerpo, incluyendo molécula o molécula (s) de ácido nucleico en un vector único o vectores separados, y dicha (s) molécula (s) de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula hospedadora.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "poliubiquitina linealmente unida" y "poliubiquitina unida por los extremos C y N" son indistintos, y se refieren a una molécula de poliubiquitina que comprende al menos un enlace isopéptido entre el extremo C (por ejemplo, la glicina del extremo C) de un resto ubiquitina y el grupo a-amino del extremo N (por ejemplo, la metionina del extremo N) de otra molécula de ubiquitina.

Tal como se usa en el presente documento, "unión de lisina" indica una unión entre un resto de ubiquitina y otro resto de ubiquitina que implica un resto lisina (por ejemplo, K6, Kll, K27, K29, K33, K48, y/o K63).

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto las posibles variantes de anticuerpos, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o aparecen durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, estando presente por lo general dicha variante en cantidades muy pequeñas. A diferencia con las preparaciones de anticuerpos policlonales , que incluyen de manera habitual diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante de un antigeno. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se ha obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y esto no se debe de tomar como una necesidad de preparar el anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención se pueden fabricar a partir de una variedad de técnicas, incluyendo pero sin limitación el método del hibridoma, métodos de ADN recombinante , métodos de expresión en fago, y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todo o parte de los loci de la inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos métodos y otros métodos ilustrativos para fabricar anticuerpos monoclonales.

Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o una radioetiqueta. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.

"Anticuerpos naturales" se refieren a las moléculas de inmunoglobulina que se producen de manera natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Desde el extremo N al extremo C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH) , también denominada un dominio variable pesado o un dominio variable de cadena pesada, seguida por tres dominios constantes (CHl, CH2, y CH3) . De igual forma, desde el extremo N al extremo C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL) , también denominada un dominio variable ligero o un dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL) . La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, denominados kappa (?) y lambda (?) , en función de la secuencia de aminoácidos de su dominio constante .

El término "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, tratamiento combinado, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos.

"Porcentaje (%) de identidad en la secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos de una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos de la secuencia de polipéptido de referencia, tras alineación de las secuencias e introducción de huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin tener en cuenta las posibles sustituciones conservativas como parte de la identidad en la secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia se puede conseguir de diferentes formas que están comprendidas en el conocimiento del experto en la materia, por ejemplo. usando programas informáticos disponibles para el público tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para alinear secuencias, incluyendo los algoritmos necesarios para conseguir el alineamiento máximo para la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Para los fines del presente documento, sin embargo, los valores del % de identidad en la secuencia se han generado mediante el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc., y el código fuente, junto con las instrucciones para su uso, se han depositado en la oficina estadounidense para los derechos de autor (U.S. Copyright Office) Washington D.C., 20559, donde está registrado con el número de registro de derechos de autor n° TXU510087. El programa informático ALIG -2 está disponible para el público de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa informático ALIGN-2 se deberá compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluido el UNIX V4.0D digital. El programa informático ALIGN-2 configura todos los parámetros de comparación de secuencias, que no varían.

Cuando ALIGN-2 se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada comparada con, o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que alternativamente se puede redactar como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o que incluye un determinado % de identidad de la secuencia de aminoácidos comparada con, o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula de la siguiente forma: 100 veces la fracción X/Y donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como emparejamientos idénticos mediante el programa informático de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento de A y B realizado por dicho programa, y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no es el mismo que el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de A con respecto a B. Salvo que se indique específicamente de otra forma, todos los valores de % de identidad de la secuencia de aminoácidos utilizados en el presente documento se han obtenido como se ha descrito en el párrafo inmediatamente anterior mediante el programa informático ALIGN-2.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación en forma tal que permite que la actividad biológica de un principio activo incluido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se administre la formulación.

Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente incluido en una formulación farmacéutica, diferente al principio activo, que no sea tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante, o conservante .

Tal como se usa en el presente documento, el término "poliubiquitina" se define como todas las especies de cadenas poliméricas naturales y sintéticas humanas de ubiquitina comprendidas en las clases humanas y sintéticas de diferentes uniones poliméricas de ubiquitina, incluyendo, pero sin limitación, poliubiquitina lineal, poliubiquitina con unión K6, poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina con unión K27, poliubiquitina con unión K29, poliubiquitina con unión K33, poliubiquitina con unión K48 y poliubiquitina con unión K63. La poliubiquitina puede tener cualquier longitud, e incluye al menos dos restos de ubiquitina.

Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "tratando") se refieren a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que está siendo tratado, y se puede realizar tanto como profilaxis o durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, evitar la aparición o la recurrencia de una enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, evitar la metástasis, disminuir la velocidad de evolución de la enfermedad, mejora o alivio de la patología, y remisión o mejora del pronóstico. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar el progreso de una enfermedad.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "ubiquitina" y "monoubiquitina" se utilizan de forma indistinta, y se refieren a cualquier ubiquitina natural procedente de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) , salvo que se indique de otra forma. El término abarca ubiquitina no procesada de "longitud completa" así como cualquier forma de ubiquitina acortada o modificada después de la traducción que sea resultado del procesamiento en la célula, con la excepción de moléculas comprendidas por múltiples restos de ubiquitina. El término también abarca variantes naturales de la ubiquitina, por ejemplo, variantes por corte y empalme o variantes alélicas . La secuencia de aminoácidos de una ubiquitina humana a modo de ejemplo se muestra en la SEC ID N°:97: MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFA GKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG (SEC ID N° : 97). La ubiquitina tiene al menos un resto lisina en su aminoácido 6, aminoácido 11, aminoácido 27, aminoácido 29, aminoácido 33, aminoácido 48, y/o aminoácido 63 (marcado en negrita en la SEC ID N° : 97, anterior) .

Tal como se usa en el presente documento, el término "ruta de la ubiquitina" se refiere a una ruta bioquímica en una célula o bien reconstituida in vitro que incluye ubiquitina y/o poliubiquitina.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que está implicado en la unión entre el anticuerpo y el antígeno. Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen por lo general estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) . (Véase, por ejemplo, Kind y col. Kuby Immunology, 6a ed. , W.H. Freeman y Co. , página 91 (2007) ) . Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Adicionalmente, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar utilizando un dominio VH o VL procedente de un anticuerpo que se une al antigeno para cribar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Consulte, por ejemplo, Portolano y col., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson y col., Nature 352:624-628 (1991).

El término "vector" , tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar a otro ácido nucleico al que está unido. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado al genoma de una célula hospedadora en la que se ha introducido. Algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos con los que está operativamente unido. En el presente documento estos vectores se denominan "vectores de expresión" .

II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS En un aspecto, La invención está basada, en parte, en la creación de anticuerpos que pueden reconocer específicamente una primera molécula de ubiquitina que contiene una primera unión de la poliubiquitina pero sin unirse específicamente a una segunda molécula de poliubiquitina que contiene una segunda unión de la poliubiquitina. En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a la poliubiquitina lineal o a la poliubiquitina unida entre el extremo C y el extremo N. Los anticuerpos de la invención son útiles tanto en investigación como, por ejemplo, en diagnóstico o tratamiento, por ejemplo, de enfermedades y trastornos relacionados con una progresión anómala del ciclo celular.

Las propiedades únicas de los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina lineal de la invención los convierten en especialmente útiles para distinguir entre formas de poliubiquitina unidas de manera diferente en un sistema celular sin necesitar una manipulación genética laboriosa y costosa, o bien métodos biofísicos tales como la espectrometría de masas . Los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida de la invención se pueden utilizar para caracterizar la función o funciones y actividades de las poliubiquitinas lineales específicas tanto in vitro como in vivo. Los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida de la invención se pueden utilizar para determinar el papel de las poliubiquitinas lineales específicas en el desarrollo y patogénesis de la enfermedad. Los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida de la invención se pueden utilizar adicionalmente para tratar enfermedades en las que una o más poliubiquitinas lineales específicas están reguladas de manera anómala o tienen un funcionamiento anómalo sin interferir con la actividad normal de las poliubiquitinas para las que no son específicos los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina.

Se ha descrito la implicación del sistema de la ubiquitina en la ruta NFK-B. Karin y col., Nature Rev. Immunol. 5:749-759 (2005) y Chen, Z.J., Nature Cel Biol. 7:758-765 (2005). Se ha demostrado que la estimulación de células con citoquinas proinflamatorias da como resultado la poliubiquitinación unida a K63 de las proteínas RIP1 y NEMO que dan como resultado la activación de la quinasa ??? (IKK) . Tokunaga y col., Nature Cell Biol. 11:123-132 (2009). A continuación, IKK se poliubiquitina con poliubiquitina con unión K48 y posteriormente se degrada, llevando a la activación de NFK-B. Id. También se ha demostrado recientemente que LUBAC activa la ruta NFK-B pero no la ruta JNK mediante la poliubiquitinación lineal de NFK-B. Id. NF-KB también desempeña un papel en el proliferación celular y en el ciclo celular. Muchos cánceres muestran la activación anómala de NF-?? y la supresión de NF-?? suprime la proliferación de células cancerosas. Garg y Aggarwal, Leukemia 16: 1053-68 (2002)). La presencia de poliubiquitina unida linealmente en proteínas tales como NF-?? desempeña un papel importante en la modulación de la actividad de NF-?? y en la evolución del ciclo celular. De esta manera, los anticuerpos y Fab de la invención proporcionan un medio terapéutico útil para modular trastornos y patologías en las que la regulación del ciclo celular es anómala. En una realización, los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina lineal de la invención se utilizan para tratar enfermedades y trastornos en los que la evolución del ciclo celular está regulada en exceso de forma anómala, dando como resultado un exceso de división celular, tal como el cáncer. En otra realización, los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina lineal de la invención se utilizan para tratar enfermedades y trastornos en los que la evolución del ciclo celular está regulada en defecto de forma anómala, dando como resultado un defecto de división celular y el agotamiento o destrucción paralelos del tejido. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, trastornos degenerativos del músculo y trastornos degenerativos del nervio (incluyendo, pero sin limitación, síndrome de Charcot Marie Tooth, poliomielitis, esclerosis lateral amiotrófica, y síndrome de Guillain-Barre) .

Tal como se usa en el presente documento, los términos "trastorno de proliferación celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que están asociados con algún grado de proliferación celular anómala. En una realización, el trastorno de proliferación celular es cáncer.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento/proliferación celular no regulados. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y no de Hodgkin) , blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer espinocelular, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma espinocelular del pulmón. cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de apéndice, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o de útero, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos , y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

El término "tumor" tal como se usa en el presente documento se refiere a todo el crecimiento y proliferación de células neoplásicas. tanto maligno como benigno, y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer," "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no se excluyen mutuamente entre sí tal como se hace referencia en el presente documento .

El término "trastorno degenerativo del músculo" se refiere o describe el estado fisiológico en animales que comprenden músculos que se caracteriza de forma típica por el deterioro o debilitamiento de la musculatura esquelética y/o lisa de forma tal que la función muscular normal se ve reducida. Los ejemplos de trastornos degenerativos del músculo, pero no se limitan a, distrofia muscular, distrofia miotónica, miotonía congénita, caquexia, sarcopenia, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Isaac, síndrome de la persona rígida, parálisis periódica familiar, miopatía, miotonía, rabdomiolisis , atrofia muscular, y varios tipos de debilidad del músculo y rigidez del músculo.

El término "trastorno degenerativo del nervio" se refiere o describe el estado fisiológico en animales que comprenden nervios que se caracteriza de forma típica por el deterioro del tejido nervioso o el deterioro de la comunicación entre las células del tejido nervioso. Los ejemplos de trastornos degenerativos del nervio incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neurodegenerativas (incluyendo, pero sin limitación, enfermedad con cuerpos de Lewy, síndrome posterior a poliomielitis, síndrome de Shy-Draeger, atrofia olivopontocerebelar, enfermedad de Parkinson, atrofia multisistémica, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Guillain-Barre, síndrome de Charcot Marie Tooth, degeneración estratonigral , y destrucción de células/tejidos nerviosos causada o asociada con tauopatías, enfermedades priónicas, parálisis bulbar, enfermedad de las neuronas motoras, demencia, y trastornos heterodegenerativos del tejido nervioso (incluyendo, pero sin limitación, enfermedad de Canavan, enfermedad de Huntington, ceroidolipofuscinosis neuronal, enfermedad de Alexander, síndrome de Tourette, síndrome del cabello acerado de Menkes, síndrome de Cockayne, síndrome de Halervorden-Spatz, enfermedad de Lafora síndrome de Rett, degeneración hepatolenticular, síndrome de Lesch-Nyhan, y síndrome de Unverricht-Lundborg .

En otro aspecto, los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina lineal de la invención son útiles como reactivos para la detección y el aislamiento de la poliubiquitina linealmente unida, tal como la detección de poliubiquitina en varios tipos de células y tejidos, incluyendo la determinación de la densidad y la distribución de poliubiquitina en poblaciones celulares y en el interior de una célula dada, y clasificación celular basada en la presencia o cantidad de poliubiquitina. En otro aspecto más, Los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida de la invención son útiles para el desarrollo de antagonistas contra la poliubiquitina con modelos de actividad de bloqueo similar a las de los anticuerpos sujetos de la invención. Como ejemplo adicional, los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida de la invención se pueden utilizar para identificar otros anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina que se unen prácticamente a los mismos determinantes antigénicos de la poliubiquitina tal como los anticuerpos ilustrados en el presente documento, incluyendo epítopos lineales y de conformación.

Los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida de la invención se pueden utilizar en ensayos basados en las rutas fisiológicas en las que la poliubiquitina está implicada para seleccionar moléculas pequeñas antagonistas de la función de la poliubiquitina linealmente unida. Por ejemplo, puesto que se sabe que las cadenas de la poliubiquitina linealmente unida son necesarias para la activación de NFKB, (Tokunaga y col ., Nature Cell Biol. 11:123-132 (2009)), la actividad de los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida para modular (en exceso o en defecto) la activación de NFKB en células o tejidos tratados se pueden comparar con la actividad de uno o más antagonistas potenciales de células pequeñas de la poliubiquitina linealmente unida en la modulación de la activación de NFKB.

A. Anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida ilustrativos En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a la poliubiquitina lineal o a la poliubiquitina unida del extremo C al extremo N. En determinadas realizaciones, un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida se une específicamente a la poliubiquitina unida del extremo C al extremo N, pero no se une específicamente a la monoubiquitina. En determinadas realizaciones, un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida se une específicamente a la poliubiquitina unida del extremo C al extremo N, pero no se une específicamente a la poliubiquitina que tiene una unión lisina (es decir, uniones K6, Kll, K27, K29, K33, K48, y/o K63) .

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida que comprende una región HVR-Hl que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 7, 10, 13, 16, 22 y 73-81. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-H2 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 8, 11, 14, 17, 23, 24 y 82-86. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-H3 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 9, 12, 15, 18 y 87-93.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-Hl que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 7, 10, 13, 16, 22 y 73-81, y una región HVR-H2 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros : 8, 11, 14, 17, 23, 24 y 82-86. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-Hl que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 7, 10, 13, 16, 22 y 73-81, y una región HVR-H3 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 9, 12, 15, 18 y 87-93. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-H2 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 8, 11, 14, 17, 23, 24 y 81-85 una región HVR-H3 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 9, 12, 15, 18 y 86-92.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-L1 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 1, 4, 19 y 50-57. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-L2 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 2 y 58-62. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-L3 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 3, 5, 6, 20, 21 y 64-72.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-L1 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 1, 4, 19 y 50-57 una región HVR-L2 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 2 y 58-63. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-L1 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 1, 4, 19 y 50-57 una región HVR-L3 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 3, 5, 6, 20, 21 y 64-72. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-L2 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 2 y 58-63 una región HVR-L3 que comprende la secuencia de al menos una de las SEC ID Nros: 3, 5, 6, 20, 21 y 64-72.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o todos los seis de los siguientes : (i) una secuencia HVR-H1 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 7, 10, 13, 16, 22 y 73-81; (ii) una secuencia HVR-H2 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 8, 11, 14, 17, 23, 24 y 82-86; (iii) una secuencia HVR-H3 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 9, 12, 15, 18 y 87-93; (iv) una secuencia HVR-L1 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 1, 4, 19 y 50-57; (v) una secuencia HVR-L2 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 2 y 58-63; y (vi) una secuencia HVR-L3 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 3, 5, 6, 20, 21 y 64-72.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a una poliubiquitina linealmente unida con elevada afinidad, pero se une a poliubiquitina con cualquier otro enlace lisina con una afinidad sustancialmente reducida, que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o todos los seis de los siguientes: (i) una secuencia HVR-H1 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 7, 10, 13, 16, 22 y 73-81 ; (ii) una secuencia HVR-H2 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 8, 11, 14, 17, 23, 24 y 82-86; (iii) una secuencia HVR-H3 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 9, 12, 15, 18 y 87-93; (iv) una secuencia HVR-L1 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 1, 4, 19 y 50-57; (v) una secuencia HVR-L2 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 2 y 58-63; y (vi) una secuencia HVR-L3 que comprende al menos una secuencia de SEC ID Nros: 3, 5, 6, 20, 21 y 64-72.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden secuencias HVR de cadena pesada tal como se representa gráficamente en las Figuras 2B, 5B, o 9B. En una realización, los anticuerpos comprenden secuencias HVR de cadena ligera tal como se representa gráficamente en las Figuras 2A, 5A, o 9A. En una realización, los anticuerpos comprenden secuencias HVR de cadena pesada tal como se representa gráficamente en las Figuras 2B, 5B, o 9B y secuencias HVR de cadena ligera tal como se representa gráficamente en las Figuras 2A, 5A, o 9A. En una realización, los anticuerpos comprenden secuencias HVR de cadena ligera tal como se representan en las Tablas 5 y 7. En una realización, la invención proporciona anticuerpos que comprenden secuencias HVR de cadena pesada tal como se representa en las Tablas 5 y 7. En una realización, los anticuerpos comprenden secuencias HVR de cadena pesada tal como se representa en las Tablas 5 y 7 y secuencias HVR de cadena ligera tal como se representa en las Tablas 5 y 7.

Algunas realizaciones de los anticuerpos de la invención comprenden un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 4D5 humanizado (huMab4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE.UU.) (también citada en la patente de los EE.UU. N° 6.407.213 y en Lee y col., J. Mol. Biol. (2004), 340 (5) : 1073-93) tal como se representa en la SEQ ID N°: 98 siguiente. 1 Aspa Ale Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107 (SEQ ID NO: 98) (los restos HVR están subrayados) En una realización, la secuencia del dominio variable de cadena ligera del huMAb4D5-8 se modifica en una o más posiciones 28, 30, 31, 53, 66, y 91 (Asp, Asn, Thr, Phe, Arg, e His como se indica en negrita/cursiva anteriormente, respectivamente) . En una realización, la secuencia huMAb4D5-8 modificada comprende Ser en la posición 28, Ser en la posición 30, Ser en la posición 31, Ser en la posición 53, Gly en la posición 66, y/o Ser en la posición 91. De acuerdo con ello, en una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia representada en la SEQ ID N°: 99 siguiente: 1 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107 (SEQ ID NO: 99) (los restos HVR están subrayados) Los restos sustituidos con respecto a huMAb4D5-8 se han indicado en negrita/cursiva anterior.

Los anticuerpos de la invención pueden comprender cualquier secuencia de dominio variable marco, siempre que se retenga sustancialmente la actividad enlazante con la poliubiquitina linealmente unida. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una secuencia consenso marco de cadena pesada del subgrupo III. En una realización de estos anticuerpos, la secuencia consenso marco comprende una sustitución en la posición 71, 73, 78 y/o 102. En algunas realizaciones de estos anticuerpos, la posición 71 es A, 73 es T 78 es A y/o 102 es L. En una realización, estos anticuerpos comprenden secuencias marco de dominio variable de cadena pesada de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE.UU.) (también citada en la patente de los EE.UU. Nros 6.407.213 y 5.821.337, y Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340 (5) : 1073-93) . En una realización, estos anticuerpos comprenden además secuencias de consenso marco de cadena ligera ?? humana. En una realización, estos anticuerpos comprenden al menos una, dos o todas las secuencias HVR de cadena ligera de las SEC ID Nros : 1-6, 19-21 y 50-72. En una realización, estos anticuerpos comprenden secuencias HVR de cadena ligera de huMAb4D5-8 tal como se describe en la patente de los Estados Unidos Nros 6.407.213 y 5.821.337). En una realización, estos anticuerpos comprenden secuencias del dominio variable de cadena ligera de huMAb4D5-8 (SEC ID N° : 98 y 99) (HERCEPTIN5, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE.UU.) (también citada en la patente de los EE.UU. Nros 6.407.213 y 5.821.337, y Lee y col., J. Mol. Biol. (2004), 340(5) :1073-93) .

En una realización, un anticuerpo de la invención se madura por afinidad para obtener la afinidad de enlace objetivo deseada. En un ejemplo, un anticuerpo de la invención madurado por afinidad que se une específicamente a la poliubiquitina linealmente unida con alta afinidad, pero que se une a la poliubiquitina que tiene una unión lisina con una afinidad sustancialmente reducida comprende una sustitución en la posición del aminoácido 32 de HVR-H1. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención madurado por afinidad que se une específicamente a la poliubiquitina linealmente unida que tiene una unión lisina con una afinidad sustancialmente reducida comprende una sustitución en HVR-H2, en las posiciones de aminoácido 50, 54 y/o 56. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención madurado por afinidad que se une específicamente a la poliubiquitina linealmente unida que tiene una unión lisina con una afinidad sustancialmente reducida comprende una sustitución en HVR-H3, en la posición del aminoácido 103. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención madurado por afinidad que se une específicamente a la poliubiquitina linealmente unida con alta afinidad, pero que se une a la poliubiquitina que tiene otras uniones lisina con una afinidad sustancialmente reducida comprende una sustitución en HVR-L1, en las posiciones de aminoácido 28, 30, 31 y/o 32. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención madurado por afinidad que se une específicamente a la poliubiquitina linealmente unida con alta afinidad, pero que se une a la poliubiquitina que tiene otras uniones lisina con una afinidad sustancialmente reducida comprende una sustitución en HVR-L3, en las posiciones de aminoácido 92, 93 y/o 94. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención madurado por afinidad que se une específicamente a la poliubiquitina linealmente unida con alta afinidad, pero que se une a la poliubiquitina que tiene otras uniones lisina con una afinidad sustancialmente reducida comprende una sustitución en HVR-L2, en la posición del aminoácido 52.

En una realización, un anticuerpo de la invención comprende al menos una secuencia del dominio variable de una cadena pesada de las SEC ID Nros: 29-32, 36-38, 95 y 196-198. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende al menos un dominio variable de una cadena ligera de las SEC ID Nros: 25-28, 33-35, 94 y 193-195. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende al menos una secuencia de la SEQ ID Nros: 29-32, 36-38, 95 y 196-198 y también comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende al menos una secuencia de la SEQ ID Nros: 25-28, 33-35, 94 y 193-195. En otras realizaciones, un anticuerpo de la invención corresponde a un número particular de clon que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia HVR-H1, HVR-H2, y HVR-H3 tal como se define en las Figuras 2B, 5B o 9B para dicho número de clon. En otras realizaciones, un anticuerpo de la invención corresponde a un número particular de clon que comprende un dominio variable de cadena ligera una secuencia HVR-L1, HVR-L2, y HVR-L3 tal como se define en las Figuras 2A, 5A o 9A para dicho número de clon. En otras realizaciones, un anticuerpo de la invención corresponde a un número particular de clon que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia HVR-H1, HVR-H2, y HVR-H3 tal como se define en las Figuras 2B, 5B o 9B para dicho número de clon y que comprende también un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia HVR-L1, HVR-L2, y HVR-L3 tal como se define en las Figuras 2A, 5A o 9A para dicho número de clon.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados para unirse a la poliubiquitina linealmente unida. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo determinante antigénico de la poliubiquitina linealmente unida como cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados .

Tal como se usa en el presente documento, los anticuerpos de la invención se unen específicamente a una poliubiquitina aislada que tiene una unión entre el extremo C y el extremo N. Tal como se usa en el presente documento, los anticuerpos de la invención se unen específicamente también a poliubiquitina que tiene una unión lineal entre el extremo C y el extremo N cuando dicha poliubiquitina está unida a una proteína heteróloga.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida está humanizado. En una realización, un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y comprende además un marco aceptor humano, por ejemplo un marco de la inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano. En otra realización, un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y comprende además una VH que comprende una secuencia FR1, FR2, FR3, o FR4 de cualquiera de las SEC ID Nros: 29-32, 36-38 y 95. En otra realización, un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y comprende además una VL que comprende una secuencia FR1, FR2, FR3, o FR4 de cualquiera de las SEC ID N : 25-28, 33-35, 94 y 193-195.

En otro aspecto, un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene una identidad de secuencia de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, O 100% con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las DEC ID Nros. 29-32, 26-38, 95 y 196-198. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene una identidad de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) , inserciones, o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida que comprende dicha secuencia retiene la capacidad de unirse a la poliubiquitina linealmente unida. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o borrado en una cualquiera de las SEC ID Nros: 29-32, 36-38, 95 y 196-198. En determinadas realizaciones, sustituciones inserciones, o deleciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR) . De manera opcional, el anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida comprende la secuencia VH de cualquiera de las SEC ID Nros: 29-32, 36-38, 95 y 196-198, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de dicha secuencia.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene una identidad de secuencia de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las DEC ID Nros: 25-28, 33-35, 94 y 193-195. En determinadas realizaciones, una secuencia VL que tiene una identidad de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) , inserciones, o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida que comprende dicha secuencia retiene la capacidad de unirse a la poliubiquitina linealmente unida. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o borrado en cualquiera de las SEC ID M™*: 25-28, 33-35, 94 y 193-195. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones, o deleciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR) . De manera opcional, el anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida comprende la secuencia VL en cualquiera de las SEC ID Nros: 25-28, 33-35, 94 y 193-195, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de dicha secuencia.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida, donde el anticuerpo comprende VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, y una VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL de cualquiera de las SEC ID Nros: 29-32, 36-38, 95 y 196-198 como SEQ ID Nros : 25-28, 33-35, 94 y 193-195, respectivamente, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de dichas secuencias.

En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una realización, un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo, o F(ab')2; En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgGl intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo tal como se ha definido en el presente documento.

Se proporcionan composiciones que comprenden al menos un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida o al menos un polinucleótido que comprende secuencias que codifican un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida. En determinadas realizaciones, una composición puede ser una composición farmacéutica. Tal como se usa en el presente documento, las composiciones que comprenden uno o más anticuerpos que se unen a una o más poliubiquitinas y/o a uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican no o más anticuerpos que se unen a una o más poliubiquitinas. Estas composiciones pueden comprender adicionalmente portadores adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables incluyendo tampones, que son bien conocidos en la materia.

En un aspecto adicional, un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos, de forma única en combinación, tal como se describe en las Secciones 1-7 siguientes: 1. Afinidad del anticuerpo En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 µ?, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, = 0,01 nM, o = 0,001 nM (por ejemplo 10" M o menos, por ejemplo de 10"8 M a 10~13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10"13 M) .

En una realización, Kd se mide mediante un ensayo de unión con antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno tal como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión en disolución de los Fab del antígeno se miden equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado (125I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, y a continuación capturar el antígeno unido con una placa revestida de anticuerpo contra Fab (véase, por ejemplo, Chen y col., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Para establecer las condiciones del ensayo, placas multipocillo MICROTITER* (Thermo Scientific) se revistieron durante la noche con 5 ug/ml de un anticuerpo contra Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloqueó con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no adsorbente (Número de Catálogo 269620) , se mezclaron 100 pM o 26 pM [125I] de antígeno con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la evaluación del anticuerpo dirigido contra VEGF, Fab-12, en Presta y col., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés se incuba a continuación durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más prolongado (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora) . A continuación, la disolución se eliminó y la placa se lavó ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-20<B) al 0,1% en PBS . Una vez las placas se han secado, se añadieron 150 µ?/pocillo de reactivo de gammagrafía (MICROSCI T-20 ™; Packard) , y las placas se contaron en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos . Las concentraciones de cada Fab que proporcionaron valores inferiores o iguales al 20% de la unión máxima se seleccionaron para su uso en ensayos de unión competitiva.

De acuerdo con otra realización, Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial mediante un BIACORE®-2000 o un BIACORE *-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con, por ejemplo, obleas CM5 con antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (UR) . Brevemente, obleas biosensoras con dextrano carboximetilado (CM5 , BIACORE, Inc.) se activaron con clorhidrato de i\J-etil-N'- (3- dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluyó con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 ug/ml (-0,2 µ?) antes de inyectar a un caudal de 5 µ?/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyectó etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las medidas cinéticas se inyectaron diluciones de dos veces en serie de Fab 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) al 0,05% (PBST) a 25°C a un caudal de aproximadamente 25 µ?/min. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) se calcularon un modelo sencillo de unión uno-a-uno de Langmuir (BIACORE ß versión de evaluación del Software 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en el equilibrio (Kd) se calcula como el cociente koff/kon. Consulte, por ejemplo, Chen y col., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la constante de asociación supera 106 M"1 s"1 en el ensayo de resonancia de plasmón superficial, entonces la constante de asociación se puede determinar mediante el uso de una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o disminución en la intensidad de emisión de la fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm paso de banda) a 25 °C de un anticuerpo contra el antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno determinadas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con retención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO ™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. Otras sustancias químicas de acoplamiento dirigidas al antígeno en la superficie de la oblea (por ejemplo, estreptavidina/biotina, interacción hidrófoba, o química de disulfuro) también están fácilmente disponibles en lugar de la metodología de acoplamiento de amina (oblea CM5) descrita anteriormente, tal como entenderán los expertos en la materia. 2. Fragmentos de anticuerpo En determinadas realizaciones, un anticuerpo provisto en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, y fragmentos scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de algunos fragmentos de anticuerpos, véase Hudson y col., Nat. Med. 9:129-134 (2003) . Para una revisión de fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds . , (Springer-Verlag, Nueva York) , pp. 269-315 (1994) ; véase también el documento 93/16185; y las patentes de los Estados Unidos con números 5.571.894 y 5.587.458. Para una discusión sobre fragmentos Fab y F(ab')2 ue comprenden restos del epíteto natural de unión al receptor y que tienen una semivida aumentada in vivo, véase la patente de los Estados Unidos n° 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con sitios de unión a dos antlgenos que pueden ser bivalentes o biespecíficos . Consulte, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 193/01161; Hudson y col., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)). Los triacuerpos y los tetracuerpos también se han descrito en Hudson y col., Nat. Med. 9:129-134 (2003) .

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o parte del dominio variable de cadena pesada o todo o parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., altham, MA; véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 6.248.516 Bl) .

Los fragmentos de anticuerpo se pueden fabricar mediante distintas técnicas, que incluyen pero sin limitación la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como su producción mediante células hospedadoras recombinantes (por ejemplo E. coli o fagos) , tal como se describe en el presente documento . 3. Anticuerpos quiméricos y humanizados En determinadas realizaciones, un anticuerpo provisto en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se han descrito algunos anticuerpos quiméricos por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n° 4.816.567; y en Morrison y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de ratón, rata, hámster, conejo, o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo de "clase cambiada" en el que la clase o subclase se ha cambiado por la del anticuerpo progenitor. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Usualmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir su inmunogenicidad para seres humanos, reteniendo al mismo tiempo la especificidad y la afinidad del anticuerpo no humano progenitor. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables cuyas HVR, por ejemplo, CDR, (o sus porciones) se han derivado de un anticuerpo no humano, y los FR (o sus porciones) se han derivado de secuencias de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una parte de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos restos FR de un anticuerpo humanizado se han sustituido por los correspondiente restos de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se han derivado los restos HVR) , por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los métodos para fabricarlos se han revisado, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se han descrito adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); Queen y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de los Estados Unidos n° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321, y 7.087.409; Kashmiri y col., Methods 36:25-34 (2005) (que describe un injerto SDR (a-CDR) ) ; Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe la "renovación"); Dall'Acqua y col., Methods 36:43-60 (2005) (que describe el "intercambio de FR" ) ; y Osburn y col., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka y col., Br. J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (que describe la solución de "selección guiada" para el intercambio de FR) .

Las regiones marco humanas que se pueden utilizar para humanización incluyen, pero no están limitadas a: regiones marco seleccionadas usando el método del "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims y col. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones marco derivadas de la secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadenas ligeras y pesadas (véase, por ejemplo, Cárter y col. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta y col., J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones marco maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones marco de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones marco derivadas del cribado de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca y col., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok y col., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)). 4. Anticuerpos humanos En determinadas realizaciones, un anticuerpo provisto en el presente documento es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar usando varias técnicas conocidas en la materia. Los anticuerpos humanos se han descrito en general en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 5:368-74 (2001) y en Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) .

Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuestas a un estimulo antigénico. Dichos animales contienen de forma típica todo o parte de los loci de la inmunoglobulina humana, que sustituyen los loci endógenos de la inmunoglobulina, o que están presentes fuera del cromosoma o integrados de forma aleatoria en el cromosoma de los animales. En dichos ratones transgénicos, por lo general se han desactivado los loci endógenos de la inmunoglobulina. Para una revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005) . Véase también, por ejemplo, las patentes estadounidenses con números 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de los Estados Unidos n° 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB®; la patente de los Estados Unidos n° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE®, y en la publicación de la solicitud estadounidense con número US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®) . Las regiones variables humanas de los anticuerpos intactos generados mediante dichos animales se pueden modificar adicionalmente, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.

Los anticuerpos humanos también se pueden fabricar por métodos basados en hibridomas. Se han descrito las líneas celulares del mieloma humano y del heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner y col., J. Immunol., 147: 86 (1991) ) . Los anticuerpos humanos generados mediante tecnología del hibridoma de linfocitos B también se ha descrito en Li y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) . Los métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM monoclonales humanos procedentes de líneas celulares de hibridoma) , y en Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4 ): 265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano) . La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) también se ha descrito en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3) : 927-937 (2005) y en Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

Los anticuerpos humanos también se pueden generar aislando secuencias del dominio variable del clon Fv seleccionadas de bibliotecas de expresión en fago derivadas de ser humano. Dichas secuencias del dominio variable se pueden combinar a continuación con un dominio constante humano deseado. Se describen a continuación técnicas para seleccionar anticuerpos humanos procedentes de bibliotecas de anticuerpos . 5. Anticuerpos suministrados por bibliotecas.

Los anticuerpos de la invención se pueden aislar mediante el cribado de bibliotecas combinatorias para detectar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen en la técnica una variedad de métodos para generar bibliotecas de expresión en fago y para cribar dichas bibliotecas para seleccionar anticuerpos que posean las características de enlace deseadas. Dichos métodos se han revisado, por ejemplo, en Hoogenboom y col. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien y col., ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se han descrito adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty y col., Nature 348:552-554; Clackson y col., Nature 352: 624-628 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu y col., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee y col., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 101 (34): 12467-12472 (2004); y Lee y col., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) .

En determinados métodos de expresión en fago, los repertorios de genes VH y VL se clonan de forma independiente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan de forma aleatoria en bibliotecas de fagos, que a continuación se pueden cribar para seleccionar fagos que se unen al antígeno tal como se describe en Winter y col., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)). Los fagos expresan de forma típica fragmentos de anticuerpo, tanto fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o como fragmentos de Fab. Las bibliotecas procedentes de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin la necesidad de construir hibridomas. Alternativamente, se pueden clonar repertorios no expuestos (por ejemplo, procedentes de ser humano) para proporcionar una sola fuente de anticuerpos a una amplia gama de autoantígenos y no autoantígenos sin inmunización alguna como describen Griffiths y col., EMBO J, 12: 725-734 (1993)). Finalmente, también se pueden preparar de forma sintética bibliotecas no expuestas clonando segmentos del gen V no reordenados procedentes de citoblastos, y usando cebadores de la PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 muy variables y para realizar el reordenamiento in vitro, tal como describen Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)). Las publicaciones de patente que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: patente de los Estados Unidos n° 5.750.373, y las publicaciones de la patente de los Estados Unidos n° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran en el presente documento como anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos. 6. Anticuerpos multiespecíficos En determinadas realizaciones, un anticuerpo provisto en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos sitios diferentes. En determinadas realizaciones, una de las especificidades de enlace es para la poliubiquitina linealmente unida y la otra es para cualquier otro antígeno. En determinadas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de la poliubiquitina linealmente unida. Los anticuerpos biespecíficos se pueden utilizar también para localizar agentes citotóxicos en células que expresan la poliubiquitina linealmente unida. Los anticuerpos biespecíficos se pueden reparar como anticuerpos de longitud o fragmentos de anticuerpos.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la expresión simultánea recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina con diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), el documento WO 93/08829, y Traunecker y col., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y la tecnología de "botón en ojal" véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 5.731.168). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden preparar diseñando efectos electrostáticos inducidos para fabricar anticuerpos FC- moléculas heterodiméricas (documento WO 2009/089004A1) ; reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos n° 4.676.980, y en Brennan y col., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecífieos (véase, por ejemplo, Kostelny y col., J. Immunol., 148 (5) : 1547-1553 (1992) ; mediante el uso de tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpos biespecífieos (véase, por ejemplo, Hollinger y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando Fv monocatenarios (sFv) diméricos (véase, por ejemplo Gruber y col., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparar anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt y col., J. Immunol. 147: 60 (1991) .

Los anticuerpos diseñados mediante ingeniería genética que incluyen tres o más sitios funcionales de unión a antígeno incluyendo los "anticuerpos de pulpo", también se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1) .

El anticuerpo o fragmento del mismo en el presente documento también incluye un "Fab de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a la poliubiquitina linealmente unida así como a otro antígeno diferente (véase, US 2008/0069820, por ejemplo) . 7. Variantes de anticuerpos En determinadas realizaciones, se contemplan variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/o el resto de propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo se pueden preparar introduciendo las modificaciones adecuadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones, y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción, y sustitución se puede realizar para conseguir la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, la unión a antígeno. a) Variantes de sustitución, inserción y deleción En determinadas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácidos . Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y los FR. En la Tabla 1 se muestran sustituciones conservativas bajo el encabezamiento de "sustituciones conservativas". En la Tabla 1 se proporcionan más cambios sustanciales bajo el encabezamiento de "sustituciones ilustrativas", que se describen adicionalmente a continuación con referencia a las clases de cadena de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se pueden introducir en un anticuerpo de interés, y los productos se pueden cribar para seleccionar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada, inmunogenidad disminuida, o una ADCC o CDC mejoradas.

TABLA 1 Los aminoácidos se pueden agrupar según propiedades comunes de las cadenas secundarias : (1) hidrofóbicas : Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílicas neutras: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidas: Asp, Glu; (4) básicas: His, Lys, Arg; (5) restos que afectan la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromáticas Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservativas conllevarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos en la región hipervariable de un anticuerpo progenitor (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) . En general, la variante o variantes resultantes seleccionadas para estudios adicionales tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, aumento en la eficacia, inmunogenicidad) con respecto al anticuerpo progenitor y/o retendrá sustancialmente algunas propiedades biológicas del anticuerpo progenitor. Una variante de sustitución ilustrativa es un anticuerpo madurado por afinidad, que se puede generar de forma conveniente, por ejemplo, usando técnicas de maduración por afinidad basadas en expresión en fago tales como las descritas en el presente documento. Brevemente, uno o más restos HVR se mutan y los anticuerpos variantes se expresan en fago y se criban para seleccionar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión) .

Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en los "puntos calientes" de la HVR, es decir, restos codificados por codones que experimentan mutación con frecuencia elevada durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o en los SDR (a-CDR) , y a continuación se ensaya la variante de VH o VL para determinar la afinidad de enlace . La maduración por afinidad mediante la construcción y reselección a partir de bibliotecas secundarias se describe en, por ejemplo, en Hoogenboom y col. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien y col., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001) ) . En algunas realizaciones de la maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para maduración por cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a error, intercambio de cadenas, o mutagénesis dirigida al oligonucleótido) . A continuación se crea una segunda biblioteca. A continuación, la biblioteca se criba para identificar cualesquiera variantes de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica soluciones dirigidas a HVR, donde se aleatorizan varios restos de HVR (por ejemplo, 4-6 restos a la vez) . Los restos de HVR implicados en la unión al antígeno se pueden identificar de manera específica, por ejemplo, utilizando mutagénesis con barrido de alanina o modelización. En particular, CDR-H3 y CDR-L3 suelen ser dianas habituales .

En determinadas realizaciones, se pueden producir sustituciones inserciones, o deleciones en una o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo en las HVR alteraciones conservativas (por ejemplo, las sustituciones conservativas que se proporcionan en el presente documento) que no reducen sustancialmente la afinidad de enlace. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de la HVR, o de los SDR. En determinadas realizaciones de las secuencias variantes de VH y VL proporcionadas anteriormente, cada HVR bien está inalterada, o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Un método útil para identificar los restos o regiones de un anticuerpo que pueden ser dianas para mutagénesis es el denominado "mutagénesis con barrido de alanina" , tal como describen Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) se identifican y sustituyen por una aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción entre el anticuerpo y en antígeno se ve afectada. Se pueden introducir sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional con respecto a las sustituciones iniciales. Alternativamente, o adicionalmente , una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos restos de contacto y restos vecinos pueden ser una diana o eliminarse como candidatos para la sustitución. Las variantes se pueden cribar para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en el extremo amino y/o carboxilo con una longitud comprendida entre un resto a polipéptidos que contienen cientos o más de restos, así como inserciones intrasecuencia de uno o varios restos de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones en los extremos incluyen un anticuerpo con un resto metionilo en el extremo N. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión del extremo N o C del anticuerpo con una enzima (por ejemplo, ADEPT) o con un polipéptido que aumente la semivida en suero del anticuerpo. b) Variantes de glicosilación En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se altera para aumentar o disminuir la medida en la que el anticuerpo está glicosilado. La adición o deleción de sitios de glicosilación en un anticuerpo se puede llevar a cabo de forma conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de forma que se creen o eliminen uno o más sitios de glicosilación .

Si el anticuerpo comprende una región Fe, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero comprenden habitualmente un oligosacárido ramificado bicatenario que está generalmente unido mediante un enlace N al Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Consulte, por ejemplo, Wright y col. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, mañosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc) , galactosa, y ácido siálico, asi como una fucosa unida a GlcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido bicatenario. En algunas realizaciones, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención con el fin de crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En una realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede estar comprendida entre 1% y 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% o de 20% a 40%. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa incluida en la cadena de azúcar en Asn297, con respecto a la suma de todas las glicoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y con alto contenido en mañosa) tal como se determina mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, tal como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al resto asparagina situado aproximadamente en la posición 297 de la región Fe (numeración Eu de los restos de la región Fe) ; sin embargo, Asn297 también se puede situar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones en la secuencia de los anticuerpos de menor importancia. Dichas variantes de fucosilación pueden tener mejorada la función ADCC. Consulte, por ejemplo, las publicaciones de la patente de los Estados Unidos nros US 2003/0157108 (Presta, L . ) ; US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "defucosiladas" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki y col. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki y col. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen las células CHO Lecl3 deficientes en fucosilación de proteínas Ripka y col., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Sol. Pat . EE.UU. N° US 2003/0157108 Al, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 Al, Adams y col., especialmente en el Ejemplo 11) , y las líneas celulares inactivadas genéticamente tal como el gen de la alfa-1,6- fucosiltransferasa, FUT8, células CHO inactivadas (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki y col. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. y col., Biotechnol. Bioeng., 94 (4 ): 680-688 (2006) ; y WO 2003/085107) .

Las variantes de anticuerpo están provistas adicionalmente de oligosacáridos bisecados, por ejemplo, donde un oligosacárido bicatenario unido a la región Fe del anticuerpo está bisecado por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tender una función de fucosilacion reducida y/o una ADCC mejorada. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpo se han descrito, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet y col.); la patente de los Estados Unidos con n° 6.602.684 (Umana y col.); y el documento US 2005/0123546 (Umana y col.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un resto galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener mejorada la función CDC. Dichas variantes de anticuerpo se han descrito, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel y col.); el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y el documento WO 1999/22764 (Raju, S.) . c) Variantes de región Fe En determinadas realizaciones, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de esta manera una variante de región Fe . La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de región Fe humana (por ejemplo, una región Fe de IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos .

En determinadas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo que tiene algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que las convierte en un candidato deseable en aplicaciones donde la semivida del anticuerpo in vivo es importante pero algunas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/agotamiento de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (careciendo análogamente de actividad ADCC) , pero reteniendo la capacidad de unión a FcRn. Las células principales para mediar ADCC, las células NK, expresan solamente FCYRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FCYRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Inmuno1. , 9:457-492 (1991) . Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC en una molécula de interés se han descrito en la patente de los Estados Unidos N° 5.500.362 (véase, por ejemplo Hellstrom, I y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (véase Bruggemann, M y col., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayo no radioactivos (véase por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96F (Promega, Madison, WI) . Las células efectoras útiles para dicho ensayo incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citotóxicos naturales (NK) Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a Clq para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a Clq y por tanto carece de actividad CDC.

Consulte, por ejemplo, ELISA para la unión a Clq y a C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede llevar a cabo un ensayo CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. y col., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Las determinaciones de la unión a FcRn y del aclaramiento/semivida in vivo también se pueden llevar a cabo usando métodos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Petkova, S.B. y col., Int'l. Immunol. 18(12) :1759-1769 (2006) ) .

Los anticuerpos con una función efectora reducida incluyen aquellos que tienen sustituciones en uno o más de los siguientes restos de la región Fe: 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de los Estados Unidos 6.737.056). Dichos mutantes de Fe incluyen mutantes de Fe con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el mutante de Fe denominado "DANA" con sustitución en los restos 265 y 297 a alanina (patente de los Estados Unidos n° 7.332.581).

Se describen algunas variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a FcR. (Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 6.737.056; el documento WO 2004/056312, y Shields y col., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) ) .

En determinadas realizaciones, la variante de anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fe (numeración Eu de los restos) .

En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región Fe que dan como resultado una alteración en la unión a Clq y/o en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (es decir, aumento o disminución) , por ejemplo, tal como se ha descrito en la patente de los Estados Unidos n° 6.194.551, el documento WO 99/51642, y en Idusogie y col., J. Immunol. 16 : 4178-4184 (2000) ) .

Los anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor Fe neonatal (Fc n) , que es responsable de la transferencia de las IgG de la madre al feto (Guyer y col, J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim y col., J. Immunol. 24:249 (1994)), se han descrito en el documento US2005/0014934A1 (Hinton y col.). Dichos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Dichas variantes de Fe incluyen aquellas que tienen sustituciones en uno o más de los siguientes restos de la región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del resto 434 en la región Fe (patente de los Estados Unidos n° 7.371.826).

Véase también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); la patente de los Estados Unidos n" 5.648.260; la patente de los Estados Unidos n° 5.624.821; y el documento WO 94/29351 que se refiere a otros ejemplos de variantes en la región Fe. d) Variantes de anticuerpo de cisteina diseñadas mediante ingeniería genética En determinadas realizaciones, puede ser deseable crear anticuerpos con cisteina diseñados mediante ingeniería genética, por ejemplo, "thioMAbs," donde uno o más restos de un anticuerpo se han sustituido por restos cisteina. En realizaciones particulares, los restos sustituidos se encuentran en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir dichos restos por cisteina, los grupos tiol reactivos se colocan por tanto en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden utilizar para conjugar el anticuerpo con otros restos, tal como restos de fármaco o restos de unión a fármaco, para crear un inmunoconjugado, tal como se describe más adelante en el presente documento. En determinadas realizaciones, se pueden sustituir uno o más de los siguientes restos por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; Al18 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fe de la cadena pesada. Los anticuerpos con cisteína diseñados mediante ingeniería genética se pueden generar como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n° 7.521.541. e) Derivados de anticuerpos En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento puede estar modificado adicionalmente para contener restos adicionales no proteínicos que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) , copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli (alcohol vinílico) , polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1 , 3 , 6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido málico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros aleatorios) , y dextrano o poli (n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copollmeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilenados (por ejemplo, glicerol) , poli (alcohol vinílico) , y mezclas de los mismos. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación por su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se une más de un polímero, dichas moléculas pueden ser iguales o diferentes. Por lo general, El número y/o tipo de polímeros utilizados para derivatización pueden determinarse basándose en consideraciones que incluyen, pero sin limitación, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, de si el derivado de anticuerpo se utilizará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

En otra realización, se proporcionan conjugados de anticuerpo y restos no proteínicos que se pueden haber calentado selectivamente por exposición a radiación. En una realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005) ) . La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan las células normales, pero calientan el resto no proteínico a una temperatura a la cual las células cercanas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.

B. Métodos y composiciones recombinantes Los anticuerpos se pueden producir mediante el uso de métodos y composiciones recombinantes. por ejemplo, tal como se ha descrito en la patente de los Estados Unidos n° 4.816.567. En una realización, se proporciona ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo) . En una realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En una realización adicional, se proporciona una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico. En una de dichas realizaciones, una célula hospedadora comprende (por ejemplo, se ha transformado con) : (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una realización, la célula hospedadora es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfoide (por ejemplo, una célula YO, NSO, Sp20) . En una realización, se proporciona un método para preparar un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida, donde el método comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, tal como se ha proporcionado anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora (o del medio de cultivo de la célula hospedadora) .

Para la producción recombinante de un anticuerpo contra la poliubiquitina linealmente unida, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, se aisla e inserta en uno o más vectores para clonación y/o expresión posterior en una célula hospedadora. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar rápidamente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótido que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo) .

Las células hospedadoras adecuadas para la clonación o expresión de los vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando las funciones de glicosilación y efectora Fe no son necesarias. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos nros" 5.648.237, 5.789.199, y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed. , Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describen la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coJi.) Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son hospedadores adecuados de clonación y expresión para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas rutas de glicosilación se han "humanizado" dando como resultado la producción de un anticuerpo con un modelo de glicosilación parcial o completamente humano. Véase Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li y col., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de un anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden utilizar junto con células de insecto, especialmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda .

También se pueden utilizar cultivos vegetales como hospedadores . Consulte, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos nros- 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978, y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas) .

Las células de vertebrado también se pueden utilizar como hospedadores. Por ejemplo, pueden ser útiles las líneas celulares de mamífero que están adaptadas a crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares de mamífero útiles son la línea de riñon de mono CV1 transformada mediante SV40 (COS-7) ; línea de riñon de embrión humano (293 o células 293 como se describe, por ejemplo, en Graham y col., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de cría de hámster (BHK) ; células de sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1) ; células de riñon de mono verde africano (VER076) ,- células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA) ; células de riñon canino ( DCK) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A) ; células de pulmón humano ( 138) ; células de hígado humano (Hep G2) ; tumor mamario murino (MMT 060562) ; células TRI, como se ha descrito, por ejemplo, en Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5, y células FS4. Otras líneas celulares de hospedadores mamíferos incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) , incluyendo células DHFR" CHO (Urlaub y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de líneas celulares de hospedadores mamíferos adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ) , pp. 255-268 (2003).

C. Ensayos Los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida proporcionada en el presente documento se pueden identificar, seleccionar, o caracterizar según sus propiedades físicas y químicas y/o actividades biológicas mediante varios ensayos conocidos en la técnica. 1. Ensayos de unión y otros ensayos En un aspecto, se ensaya un anticuerpo de la invención para determinar su actividad de enlace al antígeno, por ejemplo, por métodos conocidos tales como ELISA, transferencia Western, etc.

En otro aspecto, se pueden utilizar ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compite con, por ejemplo, cualquiera de los Fab o anticuerpos descritos en el presente documento tales como 1E3, 1D8, 1F4, 1A10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 2A2 , 2C11, 2H5, 3E4, 4C9, 4E4, 4G7, 3F5, 3A7 y 4C10 o anticuerpos híbridos tal como se describe en el presente documento, por ejemplo 4E4/T110A, 4C9/T110A, 4G7/Y102G, 1F11/3F5, 1F11/3E4. 1F11/4G7, 2C11/3E4, 2C11/3F5, 2C11/4G7, 2H5/3E4, 2H5/3F5, 2H5/4G7, 1F11/3F5/Y102L para unión a la poliubiquitina linealmente unida. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) al que se une cualquiera de los Fab o anticuerpos descritos en el presente documento tales como 1E3, 1D8, 1F4, 1A10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 2A2 , 2C11, 2H5, 3E4, 4C9, 4E4, 4G7 , 3F5, 3A7 y 4C10 o anticuerpos híbridos tal como se describe en el presente documento, por ejemplo 4E4/T110A, 4C9/T110A, 4G7/Y102G, 1F11/3F5, 1F11/3E4. 1F11/4G7, 2C11/3E4, 2C11/3F5, 2C11/4G7, 2H5/3E4, 2H5/3F5, 2H5/4G7, 1F11/3F5/Y102L para unión a la poliubiquitina linealmente unida. Los métodos ilustrativos detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo se proporcionan en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," en Methods in Molecular Biology vol . 66 (Humana Press, Totowa, NJ) .

En un ensayo de competición ilustrativo, la poliubiquitina linealmente unida inmovilizada se incuba en una disolución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a la poliubiquitina linealmente unida (por ejemplo, los anticuerpos 1E3, 1D8, 1F4, 1A10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 2A2 , 2C11, 2H5, 3E4 , 4C9, 4E4, 4G7, 3F5, 3A7 y 4C10 o los anticuerpos híbridos 4E4/T110A, 4C9/T110A, 4G7/Y102G, 1F11/3F5, 1F11/3E4. 1F11/4G7, 2C11/3E4, 2C11/3F5, 2C11/4G7, 2H5/3E4, 2H5/3F5, 2H5/4G7, 1F11/3F5/Y102L para unirse a la poliubiquitina linealmente unida y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a ensayo para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo para unirse a la poliubiquitina linealmente unida. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, la poliubiquitina linealmente unida inmovilizada se incuba en una disolución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Tras su incubación en condiciones que permiten la unión del primer anticuerpo a la poliubiquitina linealmente unida, se elimina el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de etiqueta asociada con la poliubiquitina linealmente unida inmovilizada. Si la cantidad de etiqueta asociada con la poliubiquitina linealmente unida inmovilizada se encuentra sustancialmente reducida en la muestra de ensayo comparada con la muestra control, esto indica, entonces, que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo para unirse a la poliubiquitina linealmente unida. Véase Harlow y Lañe (1988) Antibodies : A Laboratory Manual cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . 2. Ensayos de actividad En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, modular la velocidad de degradación de las proteínas poliubiquitinadas linealmente unidas en una célula o te ido, y modular la velocidad de evolución del ciclo celular de una célula. También se proporcionan anticuerpos que tienen una actividad biológica de ese tipo in vivo y/o in vitro.

En determinadas realizaciones, se ensaya un anticuerpo de la invención para determinar ese tipo de actividad biológica.

D. Inmunoconjugados La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida del presente documento conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tal como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteínicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal, o animal, o sus fragmentos), o isótopos radiactivos.

En una realización, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) donde el anticuerpo está conjugado con uno o más fármacos, incluyendo pero sin limitarse a maitansinoide (véanse las patentes de los Estados Unidos con nros- 5.208.020 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 Bl) ; una auristatina tal como los restos DE y DF del fármaco monometilauristatina (MMAE yd MMAF) (véanse las patentes de los Estados Unidos con nros' 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.2988); una dolastatina; una calicamicina o derivado de la misma (véanse las patentes de los Estados Unidos con nros- 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, y 5.877.296; Hinman y col., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode y col., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorubicina (véase Kratz y col., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey y col., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov y col., Bioconj . Chem. 16:717-721 (2005); Nagy y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 97:829-834 (2000); Dubowchik y col., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King y col., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y la patente de los Estados Unidos n° 6.630.579; metotrexato; vindesina, un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otra realización, un inmoconjugado comprende un anticuerpo descrito en el presente documento conjugado con una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo pero sin limitación a la cadena de la difteria A, fragmentos activos no de unión de la toxina diftérica, cadena de la exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos .

En otra realización, un inmoconjugado comprende un anticuerpo descrito en el presente documento conjugado con un átomo radioactivo para formar un radioconjugado . Está disponible una variedad de isótopos radioactivos para la producción de radioconjugados . Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re18S, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el radiocon ugado se utiliza para detección puede comprender un átomo radioactivo para estudios de gammagrafía, por ejemplo tc99m o 1123, o una marca de espín para adquisición de imágenes mediante resonancia magnética nuclear, IMR) , tal como de nuevo yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13 nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , ciclohexano-l-carboxilato de succinimidil-4- (N-maleimidometilo) (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados funcionales de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HC1) , ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído) , compuestos bis azido (tales como (p-azidobenzoil) hexanediamina) , derivados de bis-azonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoilo) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2, 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-diflúor-2 , 4-nitrobenceno) . Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino como se describe en Vitetta y col . , Science 238:1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ilustrativo para conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. La molécula enlazadora puede ser una "molécula enlazadora escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico a la célula. Por ejemplo, se puede utilizar una molécula enlazadora lábil en medio ácido, una molécula enlazadora sensible a peptidasa, una molécula enlazadora fotolábil, una molécula enlazadora que contiene dimetilo o disulfuro (Chari y col., Cáncer Res. 52:127-131 (1992); patente de los Estados Unidos n° 5.208.020).

Los inmunocon ugados de ADC del presente documento contemplan de manera expresa pero no se limitan a aquellos conjugados preparados con reactivos reticulantes entre los que se incluyen, pero sin limitación, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS , sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfona) benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE.UU. ) .

E. Métodos y composiciones para diagnóstico y detección En determinadas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de la poliubiquitina linealmente unida en una muestra biológica. El término "detectar" tal como se utiliza en el presente documento abarca la detección cuantitativa y cualitativa. En determinadas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tales como, pero sin limitación, una célula tumoral, una célula muscular o una célula nerviosa.

En una realización, se proporciona un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida para su uso en mu método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de la poliubiquitina linealmente unida en una muestra biológica. En determinadas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida tal como se describe en el presente documento en condiciones que permitan la unión del anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida a una poliubiquitina o proteína poliubiquitinada, y detectar si se ha formado un complejo entre el anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida y la poliubiquitina o proteína poliubiquitinada. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo . En una realización, se utiliza un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida para seleccionar sujetos candidatos para tratamiento con un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida, por ejemplo, donde la poliubiquitina linealmente unida es un biomarcador para la selección de pacientes .

Los trastornos ilustrativos que se pueden diagnosticar mediante un anticuerpo de la invención incluyen enfermedades o trastornos relacionados con el ciclo celular, que pueden ser una enfermedad o trastorno asociados con una progresión creciente anómala del ciclo celular o una enfermedad o trastorno asociados con una progresión decreciente anómala del ciclo celular. En un aspecto, una enfermedad o trastorno asociados con una progresión creciente anómala del ciclo celular es cáncer. En otro aspecto, una enfermedad o trastorno asociados con una progresión decreciente anómala del ciclo celular es, por ejemplo, un trastorno degenerativo del músculo o un trastorno degenerativo del nervio.

En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos contra la poliubiquitina linealmente unida. Las marcas incluyen, pero no se limitan a, las marcas o restos que se detectan directamente (tal como marcas fluorescentes, cromofóricas, densas en electrones, quimioluminiscentes, y radioactivas) , así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, mediante una reacción enzimática o interacción molecular. Las marcas ilustrativas incluyen pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H, y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras ratas o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de los Estados Unidos n° 4.737.456), luciferina, 2, 3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, oxidadas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar un colorante precursor tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/avidina, marcas de espín, marcas de bacteriófago, radicales libres estables, y similares.

F. Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida tal como se describe en el presente documento se preparar mezclando dicho anticuerpo que tienen el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. 1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables por lo general no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen, pero sin limitación: tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a 10 restos) ; proteínas, tal como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo Zn-proteína) ; y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG) . Los portadores farmacéuticamente aceptables en el presente documento incluyen además agentes para la dispersión intersticial de fármacos tales como las glicoproteínas de hialuronidasa neutras-activas (sHASEGP) , por ejemplo, glicoproteínas de hialuronidasa humana soluble PH-20, tal como rHuPH20 (HYLENEX , Baxter International, Inc.). Algunas sHASEGP ilustrativas y métodos para su uso, incluyendo rHuPH20, se han descrito en las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos con nroa- 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, un sHASEGP se combina con una o más glicosaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas .

Se han descrito en la patente de los Estados Unidos n° 6.267.958 formulaciones de anticuerpo liofilizado ilustrativas. Las formulaciones acuosas de anticuerpo incluyen las descritas en la patente de los Estados Unidos n° 6.171.586 y el documento WO2006/044908 , incluyendo estas últimas formulaciones un tampón histidina-acetato .

La formulación del presente documento puede contener también más de un principio activo necesario para la indicación particular que se está tratando, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no afectan negativamente a otras. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente uno o más agentes quimioterapéuticos . Dichos principios activos están presentes de forma adecuada combinados en cantidades que son eficaces para los fines previstos.

Los principios activos pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli (metacrilato de metilo) , respectivamente, en sistemas de administración de fármaco en forma coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Dichas técnicas se han descrito en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) .

Se pueden preparar preparaciones de liberación continua. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación continua incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que tienen la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas.

Las formulaciones a utilizar para administración in vivo son por lo general estériles. La esterilidad se puede conseguir con facilidad, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

G. Métodos y composiciones terapéuticos Cualquiera de los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida proporcionados en el presente documento se puede utilizar en métodos terapéuticos.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida para su uso como medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida para su uso en el tratamiento de trastornos asociados con una regulación anómala del ciclo celular (incluyendo, pero sin limitación, trastornos de proliferación tales como cáncer y trastornos de hipotrofia que incluyen, pero sin limitación, trastornos degenerativos del músculo y trastornos degenerativos del nervio. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida para su uso en un método de tratamiento. En determinadas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida para su uso en un método de tratamiento de un individuo que tiene una trastorno relacionado con una regulación anómala del ciclo celular, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida. En una de dichas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe más adelante. En realizaciones adicionales, la invención proporciona un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida para su uso en la modulación de la regulación del ciclo celular de forma que se ajuste la velocidad del ciclo celular. En determinadas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida para su uso en un método de modulación de la velocidad de evolución del ciclo celular en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida para modular la evolución del ciclo celular y ajustar de esta forma la velocidad de división celular. Un "individuo" de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores es preferentemente un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida en la fabricación o preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento es para el tratamiento de trastornos asociados con una regulación anómala del ciclo celular (incluyendo, pero sin limitación, trastornos de proliferación tales como cáncer y trastornos de hipotrofia que incluyen, pero sin limitación, trastornos degenerativos del músculo y trastornos degenerativos del nervio) . En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método para tratar un trastorno asociado con una regulación anómala del ciclo celular que comprende administrar a un individuo que tiene dicho trastorno una cantidad eficaz de dicho medicamento. En una de dichas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe más adelante. En una realización adicional, el medicamento es para modular la velocidad de evolución del ciclo celular. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método para modular la velocidad de evolución del ciclo celular en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para ajustar la velocidad de división celular. Un "individuo" de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar un trastorno asociado con una regulación anómala del ciclo celular. En una realización, el método comprende administrar a un individuo que tiene dicho trastorno asociado con una regulación anómala del ciclo celular una cantidad eficaz de un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida. En una de dichas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, tal como se describe más adelante. Un "individuo" de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida proporcionados en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina linealmente unida proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe más adelante.

Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar tanto solos como combinados con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención se puede administrar simultáneamente con al menos un agente terapéutico adicional. En determinadas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico . un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y la ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapacona; lapacol; colchicinas ; ácido betulínico; una camptotequina (incluyendo el análogo sintético topotecán (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotequina, escopolectina, y 9-aminocamptotequina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus derivados análogos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiína; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicamicina, especialmente calicamicina gamma II y calicamicina omega II (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl . , 33: 183-186 (1994)); dineimicina, incluyendo dineimicina A, una esperamicina; así como el cromóforo neocarzinostatina y cromoproteínas relacionadas tales como los cromóforos del antibiótico enediina) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas. peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; ácido fólico y análogos tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostañolona propionato, epitiostanol, mepitiostaño, testolactona; antiadrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; recuperador del ácido fólico tal como el ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; y epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansinas y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2 , 2 ' , 2 " -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente la toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXA ETM exento de Cremophor, formulación de nanopartículas de paclitaxel diseñada mediante ingeniería genética con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , y TAXOTERE® doxetaxel (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo; gemcitabina (GEMZAR®) ; 6-tioguanina; mercaptopurina,· metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBA ®) ; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatino; leucovovín; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®) ; sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura de una pauta terapéutica con oxaliplatino (ELOXATINTM) combinado con 5-FU y leucovovín.

También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular, reducir, bloquear, o inhibir los efectos de las hormonas que estimulan el crecimiento del cáncer, y que se encuentran frecuentemente en forma de tratamientos sistémicos para todo el cuerpo. Puede tratarse de las propias hormonas. Lo ejemplos incluyen los antiestrógenos y los moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SER ) , incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®) , raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4 -hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno FARESTON®; antiprogesteronas; reguladores por defecto del receptor de estrógenos (ERD) ; agentes que funcionan para suprimir o acallar los ovarios, por ejemplo, agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteneizante (LHRH) tal como leuprólido acetato LUPRON® y ELIGARD®, goserelina acetato, buserelina acetato y tripterelina; otros antiandrógenos tales como flutamida; nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, (5) -imidazoles, aminoglutetimida, NEGASE® megestrol acetato, AROMASIN® exemestano, formestanie, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, y ARIMIDEX® anastrozol. Además, dicha definición de agentes quimioterapéuticos incluye bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , DIDROCAL® etidronato, NE-58095, ZOMETA® ácido zoledrónico/zoledronato, FOSAMAX® alendronato, AREDIA® pamidronato, SKELID® tiludronato, o ACTONEL® risedronato; así como troxacitabina (un análogo de citosina en el nucleósido 1 , 3 -dioxolano) ; oligonucleótidos de sentido contrario, especialmente aquellos que inhiben la expresión de genes en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular anómala, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y el receptor del factor del crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas para terapia genética, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna LEUVECTIN®, y la vacuna VAXID®; el inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; lapatinib ditosilato (un inhibidor de molécula pequeña de la tirosina quinasa doble para ErbB-2 y EGFR también conocido como G 572016) ; y las sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores .

Dichos tratamientos combinados indicados anteriormente abarcan la administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma formulación o en formulaciones independientes) , y la administración independiente, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede tener lugar antes de, simultáneamente, y/o después de, la administración del agente y/o auxiliar terapéutico adicional . Los anticuerpos de la invención también se pueden utilizar combinados con radioterapia.

Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, intrapulmonar, e intranasal, y, si se desea para un tratamiento local, administración intralesional . Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es a corto plazo o crónica. Se contemplan en el presente documento diferentes pautas de administración incluyendo pero sin limitación administraciones únicas o múltiples en diferentes puntos temporales, administración en bolo e infusión en pulsos.

Los anticuerpos de la invención se formularán, dosificarán, y administrarán de una forma consistente con la buena práctica médica. Los factores a tener en cuenta en este contexto incluyen el trastorno particular que se va a tratar, el mamífero particular que se va a tratar, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el calendario de administración, y el resto de factores conocidos de los profesionales sanitarios. No es necesario formular el anticuerpo con uno o más agentes actualmente utilizados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión, sino que esto es opcional. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y el resto de factores descritos anteriormente. Estos por lo general se utilizan en las mismas dosis y con las rutas de administración descritas en el presente documento, o aproximadamente de 1 al 99% de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y mediante cualquier ruta que se haya determinado de manera empírica/clínica como adecuada.

La ubicación de la diana de unión de un anticuerpo de la invención se puede tener en cuenta en la preparación y administración del anticuerpo. Cuando la diana de unión es una molécula intracelular, algunas realizaciones de la invención proporcionan que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se introduzca en el interior de la célula donde se localiza la diana de unión. En una realización, un anticuerpo de la invención se puede expresar intracelularmente como un intracuerpo. El término "intracuerpo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se expresa intracelularmente y que es capaz de unirse selectivamente a una molécula diana, tal como se describe en Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004); las patentes de los Estados Unidos con números 6.004.940 y 6.329.173; la publicación de la solicitud estadounidense con número 2003/0104402, y la Publicación PCT n° WO 2003/077945. La expresión intracelular de un anticuerpo se lleva a cabo introduciendo un ácido nucleico que codifica el anticuerpo deseado o porción de unión a antígeno del mismo (que carece de la secuencia líder de tipo natural y las señales secretoras normalmente asociadas con el gen que codifica dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno) en una célula diana. Se puede utilizar cualquier método normalizado para introducir ácidos nucleicos en una célula incluyendo, pero sin limitación, microinyección, inyección balística, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, liposomas, y transfección con vectores retrovíricos , adenovíricos y adenoasociados y vectores de vaccinia que transportan el ácido nucleico de interés . Se pueden administrar a una célula diana uno o más ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un anticuerpo contra la poliubiquitina de la invención, de forma que se expresen uno o más anticuerpos que puedan unirse intracelularmente a una poliubiquitina y modular una o más rutas celulares mediadas por poliubiquitina.

En otra realización, se proporcionan anticuerpos internalizantes. Anticuerpos que poseen determinadas características que potencian la administración de anticuerpos al interior de las células, o que se pueden modificar para que tengan tales propiedades. Las técnicas para lograr esto son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, se sabe que la cationización de un anticuerpo facilita su captación en el interior de las células (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 6.703.019).

También se pueden utilizar lipofecciones o liposomas para suministrar el anticuerpo al interior de las células. Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpo, es por lo general ventajoso el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas de péptido que retienen la capacidad de unirse a la secuencia de la proteína diana, Dichos péptidos se pueden sintetizar químicamente y/o producirse mediante tecnología del ADN recombinante . Consulte, por ejemplo, Marasco y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90: 7889-7893 (1993)).

La entrada de polipéptidos moduladores en las células diana se puede potenciar mediante métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, algunas secuencias, como las derivadas de Tat de VIH o el homodominio de la proteína de Antennapedia pueden capturar directamente de modo eficaz las proteínas heterólogas a través de las membranas celulares. Consulte, por ejemplo, Chen y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 4325-4329 (1999) ) .

Cuando la diana de unión está situada en el cerebro, algunas realizaciones de la invención proporcionan que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo atraviesen la barrera hematoencefálica . Algunas enfermedades neurodegenerativas están asociadas con un aumento en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, de forma que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno pueden introducirse fácilmente en el cerebro. Cuando la barrera hematoencefálica está intacta existen diferentes soluciones conocidas en la materia para transportar moléculas a través de la misma, incluyendo, pero sin limitación, métodos físicos, métodos basados en lipidos, y métodos basados en receptores y canales.

Los métodos físicos para transportar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no se limitan a, rodear completamente la barrera hematoencef lica, o creando aperturas en la barrera hematoencefálica. Los métodos de rodeo incluyen, pero no se limitan a, inyecciones directas en el cerebro (véase, por ejemplo, Papanastassiou y col., Gene Therapy 9: 398-406 (2002); administración intersticial potenciada por infusión/convección (véase, por ejemplo, Bobo y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)), e implantar un dispositivo de administración en el cerebro (véase, por ejemplo, Gilí y col., Nature Med. 9: 589-595 (2003) ; y Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical) . Los métodos para crear aperturas en la barrera incluyen, pero no se limitan a, ultrasonidos (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense con número 2002/0038086, presión osmótica (por ejemplo, mediante la administración de manitol hipertónico Neuwelt, E.A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, vols. 1 y 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), permeabilización mediante por ejemplo, bradiquinina o permeabilizante A-7 (véanse por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos nros' 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206, y 5.686.416), y transfección de neuronas que forman un puente en la barrera hematoencefálica con vectores que contienen genes que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense con número 2003/0083299) .

Los métodos basados en lípidos para transportar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno a través de la barrera hematoencef lica incluyen, pero no se limitan a, encapsular el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en liposomas que están acoplados a los fragmentos de unión de anticuerpo que se unen a los receptores del endotelio vascular de la barrera hematoencefálica (véase por ejemplo, la publicación de la solicitud estadounidense con número 20020025313) , y revestir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno con partículas de lipoproteína de baja densidad (véase, por ejemplo, la publicación de la solicitud estadounidense con número 20040204354) o la apolipoproteína E (véase por ejemplo, la publicación de la solicitud estadounidense con número 20040131692) .

Los métodos basados en receptores y canales para transportar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no se limitan a, utilizar bloqueantes glucocorticoides para aumentar la permeabilidad la barrera hematoencefálica (véase por ejemplo, la publicación de la solicitud estadounidense con números 2002/0065259, 2003/0162695, y 2005/0124533); activación de los canales del potasio (véase por ejemplo, la publicación de la solicitud estadounidense con número 2005/0089473) ; la inhibición de transportadores del fármaco ABC (véase por ejemplo, la publicación de la solicitud estadounidense con número 2003/0073713) ; revestir anticuerpos con una transferrina y modular la actividad del uno o más receptores de transferrina (véase por ejemplo, la publicación de la solicitud estadounidense con número 2003/0129186) , y cationizar los anticuerpos (véase por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 5.004.697).

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación adecuada del anticuerpo de la invención (cuando se utiliza solo o combinado con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, tratamientos anteriores, antecedentes clínicos del paciente y respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico a cargo del paciente. El anticuerpo se administra de manera adecuada al paciente en una vez o a lo largo de una serie de tratamientos . Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis de aproximadamente 1 g/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosis inicial posible para su administración al paciente, ya sea por ejemplo, en una o más administraciones independientes, o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica puede estar comprendida entre 1 g/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o un plazo más prolongado, dependiendo de la dolencia, el tratamiento por lo general se mantendrá hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ilustrativa del anticuerpo estará en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/k9 a aproximadamente 10 mg/kg. De esta manera, una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) se puede administrar al paciente. Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo cada semana y cada tres semanas (por ejemplo de forma que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo aproximadamente seis dosis del anticuerpo) . Se puede administrar una dosis inicial más elevada, seguida por una o más dosis inferiores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas terapéuticas . El progreso de este tratamiento se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores se puede llevar a cabo utilizando un inmunoconjugado de la invención en lugar de, o además de un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida.

H. Artículos de fabricación En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado al envase. Los envases adecuados incluyen por ejemplo, frascos, viales, jeringas, bolsas para solución IV, etc. Los envases pueden estar formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la dolencia y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa para solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que se puede perforar mediante la aguja de una jeringa hipodérmica) . Al menos un principio activo de la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la dolencia de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en su interior donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en su interior donde la composición comprende un agente citotóxico adicional u otro agente terapéutico. El artículo de fabricación de esta realización de la invención puede comprender adicionalmente un prospecto que indica que las composiciones se pueden utilizar para tratar una dolencia particular.

Alternativamente, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua para inyección bacteriostática (BWFI) , suero salino tamponado con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas .

Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores pueden incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar de, o además de un anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina linealmente unida.

III. EJEMPLOS Se muestran a continuación ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden llevar a la práctica otras muchas realizaciones, dada la descripción general proporcionada anteriormente .

EJEMPLO 1 : Aislamiento y caracterización de anticuerpos dirigidos contra la poliubiquitina lineal A) Generación del antigeno El antígeno usado para clasificar las bibliotecas de expresión en fago fue la diubiquitina lineal (Boston Biochem) . La diubiquitina lineal es una fusión de cabeza a cola de dos ubiquitinas a través de un enlace peptídico entre el extremo carboxi de la primera ubiquitina y el extremo amino de la segunda ubiquitina.

B) Clasificación de biblioteca sin exposición anterior La biblioteca de expresión en fago de Fab de YSGX sin exposición anterior se sometió a cuatro rondas de clasificación contra la diubiquitina lineal. No se observó enriquecimiento después de cuatro rondas de clasificación (véase la Tabla 2) . La biblioteca de expresión en fago de Fab de YSGX contiene aminoácidos aleatorizados en las CDR de las tres cadenas pesadas y el L3 de CDR de cadena ligera [véase la solicitud publicada de patente estadounidense n° 2005-0106667 y en Fellouse F. y col. JMB 373:924-40 (2007)), y está basado en un anticuerpo humanizado 4D5.

La biblioteca de expresión en fago de Fab de YSGX sin exposición anterior de la cadena ligera común se sometió a cuatro rondas de clasificación contra la diubiquitina lineal. Se observó un enriquecimiento de veinticinco veces después de cuatro rondas de clasificación (véase la Tabla 2) . La biblioteca de expresión en fago de Fab de YSGX de la cadena ligera común contiene aminoácidos aleatorizados en las CDR de las tres cadenas pesadas como se describe para la biblioteca de YSGX (véase la solicitud publicada de patente estadounidense n° 2005-0106667 y en Fellouse F. y col. JMB 373:924-40 (2007)), sin embargo, la secuencia de la cadena ligera está fijada como una versión modificada del anticuerpo humanizado 4D5.

La biblioteca de expresión en fago de Fab de VH sin exposición anterior se sometió a cuatro rondas de clasificación contra la diubiquitina lineal. Se observó un enriquecimiento de ochocientas veces después de cuatro rondas de clasificación (véase la Tabla 1) . La biblioteca de expresión en fago de Fab de VH contiene aminoácidos aleatorizados en las CDR de las tres cadenas pesadas (véase la solicitud publicada de patente estadounidense n° 2005/0119455 y en Lee C.W. y col. JMB 340:1073-93 (2004)), y está basado en un anticuerpo humanizado 4D5.

La diubiquitina lineal (Boston Biochem) se inmovilizó en una inmunoplaca Maxisorb ( U C) de 96 pocilios. Las placas se revistieron durante la noche a 4°C con 5 g/ml de diubiquitina lineal en tampón de carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6. Las placas revestidas se bloquearon con 200 µ?/pocillo de leche al 2,5% en suero salino tamponado con fosfato (PBS) que contienen Tween 20 al 0,05% (PBST) durante una hora a 25°C con agitación. Las bibliotecas de fagos sin exposición anterior se precipitaron a partir de disoluciones madre en glicerol con un volumen 1/5 de polietilenglicol al 20% (PEG) /NaCl 2,5 M, se volvieron a suspender en leche al 2,5%/PBST, y se incubaron durante 25° C durante una hora mientras la placa estaba en bloqueo. Después de una hora, el tampón de bloqueo se vertió de la placa y se añadieron 100 µ?/pocillo de fago en leche al 2,5%/PBST, y se incubó durante cuatro horas a 25°C con agitación. Tras la unión, la placa se lavó diez veces con PBST rellenando manualmente los pocilios y vertiendo el tampón entre los lavados. Los fagos se eluyeron con 150 µ?/pocillo de HCl 50 mM/ClK 500 mM durante 30 minutos a 25°C con agitación. La elución se neutralizó con 150 µ?/pocillo de Tris 1 M, pH 7,5 y posteriormente se propagó en Escherichia coli XLl-Blue (Agilent) [E. coli) con la adición del fago auxiliar M13K07.

Los fagos amplificados se utilizaron en rondas adicionales de selección contra la diubiquitina lineal como se ha descrito anteriormente. En las rondas de la dos a la cuatro, se añadieron diferentes formas de ubiquitina soluble al fago para contraselección. En la segunda ronda se utilizaron 10 g/ml de monoubiquitina soluble (Boston Biochem) . En las rondas tercera y cuarta, se utilizaron 10 µg ml de cadenas de cada uno de monoubiquitina soluble (Boston Biochem) . diubiquitina con unión Kll (Genentech) , poliubiquitina 2-7 con unión K48 (Boston Biochem) , y poliubiquitina 2-7 con unión K63 (Boston Biochem) . Se calculó el enriquecimiento para las rondas de la dos a la cuatro comparando el número de fagos recuperados con la diubiquitina lineal comparado con un pocilio sin revestir. Se observó enriquecimiento en las rondas de la dos a la cuatro para la biblioteca de la cadena ligera común y para la biblioteca de VH, pero no para la biblioteca de YSGX (véase la Tabla 2) .

TABLA 2 Se cribaron noventa y seis clones individuales de la segunda ronda de clasificación de la biblioteca de VH, 192 clones de la tercera ronda de clasificación de la biblioteca de VH, 96 clones de la cuarta ronda de clasificación de la biblioteca de VH, y 192 clones de la cuarta ronda de clasificación de la biblioteca de la cadena ligera común. Puesto que no se observó enriquecimiento para la biblioteca de YSGX, no se cribaron clones procedentes de esta biblioteca. Los clones individuales se hicieron crecer en un formato de 96 pocilios en 1 mi de caldo 2YT que contiene 50 µg/ml de carbenicilina y lxlO10 fago/ml de fago auxiliar M13K07 a 37°C durante la noche con agitación. Las células se aglomeraron por centrifugación a 3000 rpm durante diez minutos. Los sobrenadantes de dichos cultivos se utilizaron en enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) de alto rendimiento en manchas de fagos para determinar su unión a la diubiquitina lineal (Boston Biochem) , monoubiquitina (Boston Biochem) , diubiquitina con unión Kll (Genentech) , poliubiquitina 2-7 con unión K48 (Boston Biochem) , poliubiquitina 2-7 con unión K63 (Boston Biochem) , un anticuerpo contra gD (Genentech) , o un pocilio sin revestir. Todas las bibliotecas de Fab contienen una etiqueta gD carboxiterminal en la cadena ligera que permite la evaluación del nivel de expresión mediante su unión a un anticuerpo contra gD. El panel de proteínas ubiquitina se inmovilizó en inmunoplacas Maxisorb (NU C) de 384 pocilios. Las placas se revistieron durante la noche a 4°C con 2 µg/ml de cada proteína en tampón de carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6. Las placas revestidas se bloquearon con 60 µ?/pocillo de leche al 2,5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. Después de una hora, el tampón de bloqueo se vertió de la placa y se añadieron 20 µ?/pocillo de PBST y 10 µ?/pocillo de sobrenadante de fago. Las placas se incubaron durante una hora a 25 °C con agitación. A continuación, la placa se lavó seis veces con PBST rellenando manualmente los pocilios y vertiendo el tampón de lavado. Se utilizó una dilución 1:5.000 de un anticuerpo secundario dirigido contra M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (GE Healthcare) en PBST para la detección de la unión al fago, se añadieron 30 µ?/pocillo de la dilución secundaria, y la placa se incubó durante 30 minutos a 25°C con agitación. A continuación, la placa se lavó seis veces con PBST y dos con PBS, en ambos casos manualmente. El anticuerpo secundario unido se detectó mediante el uso de un sustrato TMB (KPL) seguido por inactivación rápida con igual volumen de ácido fosfórico 1 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm.

De la biblioteca de la cadena ligera común se identificaron varios aglutinantes específicos débiles específicos de la diubiquitina lineal {véase la FIG. 1) . Se secuenciaron los dominios variables de cadena ligera y pesada de dichos clones. Se identificaron dos únicas secuencias (1F4 (SEC ID Nros:27 y 31) y 1A10 (SEC ID Nros:28 y 31)), sin embargo, basándose en la secuencia de la cadena ligera se determinó que uno de dichos clones (1F4) procedía realmente de la biblioteca YSGX que no contiene una cadena ligera fija (véase la FIG. 2A) . Se identificaron varios clones de la biblioteca VH que mostraban una fuerte unión a la diubiquitina lineal con una unión más débil a la poliubiquitina con unión K63 {véase la FIG. 1) . Se secuenciaron los dominios variables de cadena pesada de dichos clones de la biblioteca VH. Se esperaba que las secuencias de Hl de CDR, H2 de CDR y H3 de CDR fueran específicas de los clones, mientras, las secuencias marco de la cadena pesada deberían ser idénticas, según el diseño de la biblioteca VH. Se esperaba que la totalidad de la secuencia de la cadena ligera (tanto la región marco como las CDR) fueran invariantes según el diseño de la biblioteca. La secuencia de Ll de la CDR es RASQDVSTAVA (SEC ID N°:l), La secuencia de L2 de la CDR es SASFLYS(SEC ID N° : 2) , y la secuencia de L3 de la CDR es QQSYTTPPT (SEC ID N°:3). Se identificaron dos secuencias únicas de cadena pesada (1D8 (SEC ID N°:30) e 1E3 (SEC ID N°:29)) (véase la FIG. 2B) .

C) Conversión de los fagémidos en expresión de Fab monovalente Los clones fagémidos 1D8 y 1E3 de la biblioteca VH se convirtieron del formato bivalente Fab-cremallera a la presentación de Fab monovalente para fines de maduración por afinidad. La cremallera de leucina entre el extremo del dominio constante CH1 y el principio del gen III (gpIII) se eliminó mediante mutagénesis de Kunkel (véase Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)). El oligonucleótido mutagénico F220-delzip (TCTTGTGACAAAACTCACAGTGGCGGTGGCTCTGGT) (SEC ID N°:100) se combinó con 1 g del ADN fagémido de 1D8 o 1E3 de Kunkel.

Los clones 1A10 y 1F4 procedentes de la biblioteca de la cadena ligera común y de la biblioteca YSGX, respectivamente, se convirtieron del formato bivalente Fab-C a la presentación de Fab monovalente para fines de maduración por afinidad. La cisteína entre el extremo del dominio constante CH1 y gpIII se eliminó mediante mutagénesis de Kunkel. El oligonucleótido mutagénico F1120-delCGRP (TGTGACAAAACTCACCTCAGTGGCGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAG ) (SEC ID N°:101) se combinó con 1 g del ADN fagémido de 1A10 o 1F4 de Kunkel. Los fagémidos de Fab monovalentes resultantes se utilizaron para producir fagos para determinar los CI50 por ELISA.

D) CI50 de fagos mediante ELISA La expresión en fago de los Fab monovalentes de 1D8, 1E3, 1A10, y 1F4 se ensayó en una CI50 mediante ELISA para obtener una estimación de la afinidad relativa para la diubiquitina lineal. Se llevó a cabo un título inicial de ELISA para determinar la cantidad de fago para la que se obtendría una señal de DO450 = 0 , 5. La diubiquitina lineal (Boston Biochem) se inmovilizó en inmunoplacas Maxisorb ( U C) de 96 pocilios. La diubiquitina lineal se revistió durante la noche a 4°C con 1 µg en tampón de carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6. Las placas revestidas se bloquearon con 200 µ?/pocillo de leche al 2,5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. Se realizaron doce diluciones en serie de dos veces del fago en leche al 2,5% en PBST desde D0268 = 4,0 hasta D0268 = 0,002. Después de una hora, el tampón de bloqueo se vertió de la placa y se añadieron 100 µ?/pocillo de cada dilución de fago y se incubó durante 15 minutos a 25°C con agitación. A continuación, la placa se lavó seis veces con PBST mediante un lavador de placas. Se utilizó una dilución 1:5000 de un anticuerpo secundario dirigido contra M13 conjugado con HRP (GE Healthcare) en PBST para la detección de la unión al fago, se añadieron 100 µ?/pocillo de la dilución secundaria, y la placa se incubó durante 30 minutos a 25°C con agitación. A continuación, la placa se lavó doce veces con PBST mediante un lavador de placas y dos veces manualmente con PBS . El anticuerpo secundario unido se detectó mediante el uso de un sustrato TMB (KPL) seguido por inactivación rápida con igual volumen de ácido fosfórico 1 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm. La concentración de fago a la cual la DO450 = 0, 5 era D02G8 = 1,0 de fago para el clon 1F4, una D0268 = 0,125 para el clon 1D8, y una D0268 = 0,5 para el clon 1E3. Para el clon 1A10, incluso para una D02ss = 4,0 del fago, la DO450 solo fue 0,376. Esta unión es bastante débil y, por tanto, no se continuó con el clon 1A10. Diluciones en serie de dos veces de diubiquitina lineal soluble desde 10 uM a 5 nM para el clon 1F4 y diluciones en serie de tres veces de diubiquitina lineal soluble desde 10 µ? a 56 p para los clones 1D8 y 1E3 junto con las concentraciones seleccionadas de fago en leche al 2,5% en PBST se incubaron durante una hora a 25°C con agitación. A continuación se determinó la cantidad de fago no unido para cada concentración de diubiquitina lineal mediante incubación de las mezclas en una inmunoplaca axisorb de 96 pocilios previamente revestida con 1 g/ml de diubiquitina lineal y bloqueada con leche al 2,5% en PBST. La mezcla fago/diubiquitina lineal se cultivó en la placa durante 15 minutos t 25°C con agitación. A continuación, la placa se lavó seis veces con PBST mediante un lavador de placas . Se utilizó una dilución 1:5000 de un anticuerpo secundario dirigido contra M13 conjugado con HRP (GE Healthcare) en PBST para la detección de la unión al fago, se añadieron 100 µ?/pocillo de la dilución secundaria, y la placa se incubó durante 30 minutos a 25°C con agitación. A continuación, la placa se lavó doce veces con PBST mediante un lavador de placas y dos veces manualmente con PBS . El anticuerpo secundario unido se detectó mediante el uso de un sustrato TMB (KPL) seguido por inactivación rápida con igual volumen de ácido fosfórico 1 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm. La absorbancia se representó gráficamente frente a la concentración de diubiquitina lineal y se muestra que, para 1F4 la CI50 es mayor de 10 µ? (véase la FIG. 3), para 1D8 , la CI50 es casi 5 µ? (véase la FIG. 3), y para 1E3 , la CI50 es 80 u (véase la FIG. 3) .

E) Producción de Fab Los clones derivados de las bibliotecas de expresión en fagos de Fab se expresaron bajo el control del promotor de la fosfatasa alcalina (PhoA) de E. coli. Tanto la cadena pesada como la cadena ligera contienen una secuencia señal stll bacteriana en el extremo amino para permitir la secreción en E. coli y que se expresa a partir de un único vector fagémido. El extremo carboxilo de la cadena pesada se fusiona en el marco con el extremo C del producto génico III (gpIII) del bacteriófago M13, permitiendo la expresión de un fragmento de Fab monovalente en el fago. Para expresar el Fab soluble se introdujo un codón de detención en los fagémidos monovalentes 1D8 y 1E3 entre el extremo del dominio constante CH1 del Fab y el inicio del gpIII. Los oligonucleótidos mutagénicos : 5' -FabdelzipTAA (CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAAAGTGGCGGTGG CTCTGGTTCCGGTG) (SEC ID N° :102) y 3 ' -Fabde1zipTAA (CACCGGAACCAGAGCCACCGCCACTTTATGTGTGAGTT TTGTCACAAGATTTGGG) (SEC ID N°:103) se utilizaron para insertar el codón de detención mediante el kit de mutagénesis dirigida al emplazamiento QuikChange® Lightning (Agilent) . Los plásmidos de expresión de Fab soluble resultantes se transformaron en la cepa 62A7 de E. coli (Genentech) y se plaquearon en agar sólido que contenía carbenicilina. Se utilizaron colonias individuales para inocular 25 mi de caldo 2YT que contenía 50 g/ml de carbenicilina. El cultivo se hizo crecer durante la noche a 37°C y se utilizaron 5 mi para inocular 500 mi de medio C.R.A.P. completo (3,57 g de (NH4)2S04, 0,71 g de citrato de sodio 2H20, 1,07 g de KC1, 5,36 g de extracto de levadura (certificado), 5,36 g de Hycase SF (Sheffield) , el pH se ajustó a 7,3 mediante adición de KOH y el volumen se ajustó a 872 mi con agua ultrapura, se sometió a autoclavado, se enfrió a 55°C, a lo que se añadió (por 1) 110 mi de MOPS 1 M pH 7,3, 11 mi de glucosa al 50%, y 7 mi de MgS04 1 M) con 550 pg/ml de carbenicilina. Los cultivos se hicieron crecer durante 24 horas a 30°C con agitación. Las células se cosecharon mediante centrifugación y los aglomerados se almacenaron a -20°C. El Fab se purificó volviendo a suspender el aglomerado celular en 35 mi de tampón lavado frío (suero salino tamponado con fosfato (PBS) + NaCl 150 mM) que contenía 10 pg/ml de ADNasal (Invitrogen) , 0,2 mg/ml de lisozima (USB), y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) (Calbiochem) . El aglomerado se volvió a suspender mediante vortización rápida. Para permitir una lisis completa, las células se incubaron durante 15 minutos a 25°C. Los residuos celulares se aglomeraron mediante centrifugación y el lisato se cargó en una columna de 1 mi de proteína A-sefarosa (GE Healthcare) previamente equilibrada con tampón de lavado frío. La columna se lavó con 50 mi de tampón de lavado frío, se eluyó con 3 mi de ácido acético 0,1 M, y se neutralizó con 150 µ? de Tris 1 M, pH 11,0. El Fab se concentró mediante unidades de filtro de centrífuga Amicon Ultra-15 (corte de 10 kDa, Millipore) . La concentración resultante de Fab se determinó espectrofotométricamente (1 D028o = 1#5 mg/ml).

F) Transferencia Western de Fab Los Fab 1D8 y 1E3 (del E emplo 1E) se ensayaron para determinar su unión a la diubiquitina lineal (Boston Biochem) , monoubiquitina (Boston Biochem) , diubiquitina con unión Kll (Genentech) , diubiquitina con unión K 8 (Boston Biochem) , y diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) en una transferencia Western. 1 g de cada proteína en tampón LDS IX (Invitrogen) con agente reductor se calentó a 70°C durante diez minutos y se analizó en geles NuPAGE Bis Tris 1,0 mm 4-12% en tampón MES (Invitrogen) por duplicado. Los geles se transfirieron a 30 V constantes durante 1,5 horas mediante transferencia en húmedo con metanol al 10% y tampón de transferencia NuPAGE IX (Invitrogen) a 0,2 µp? de nitrocelulosa (Invitrogen) . Los sitios de unión no específicos de las membranas se bloquearon mediante incubación en leche al 5% en PBST durante 1,5 horas a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se incubaron en 5 µg/ml de Fab 1D8 o 1E3 en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. La membrana se lavó tres veces en PBST con agitación. Los Fab se detectaron incubando la membrana en una dilución 1:10000 de anticuerpo secundario de cabra específico dirigido contra Fab humano conjugado con HRP (Sigma Aldrich) en leche al 5% en PBST durante una hora a 25 °C con agitación. A continuación, las membranas se lavaron tres veces en PBST seguido por un lavado en PBS . El anticuerpo secundario se detectó usando sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico (Thermo Scientific) seguido por exposición de las manchas de la película. El Fab 1E3 detecta solamente la diubiquitina lineal pero no la monoubiquitina, diubiquitina con unión Kll, diubiquitina con unión K48, o la diubiquitina con unión K63 (véase la FIG. 4) . El Fab 1D8 Fab no detectó ninguna de las formas de la ubiquitina mediante transferencia Western (véase la FIG. 4) .

G) Análisis por afinidad de los Fab aislados 1D8 y 1E3 La afinidad de los Fab 1D8 y 1E3 (del Ejemplo 1E) se analizó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) mediante un equipo BIACORE™ 3000 (GE Healthcare) . Aproximadamente 120 unidades de resonancia (UR) de diubiquitina lineal (Boston Biochem) , diubiquitina con unión K48 (Boston Biochem) , y diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) se inmovilizaron en la celda de flujo dos, celda de flujo tres, y celda de flujo cuatro, respectivamente, de un chip CM5 usando el protocolo de acoplamiento de amina suministrado por el fabricante. La celda de flujo uno se activó y se bloqueó mediante etanolamina sin proteína inmovilizante para su uso como resta de referencia.

Diluciones en serie de dos veces (0,5-500 nm) del Fab 1E3 en Hepes 10 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, y Tween 20 al 0,01%(HBST) se inyectaron (60 µ? en total) a un caudal de 30 µ?/minuto) en cada celda de flujo usando HBST como tampón de análisis. Se registró la señal de cada celda de flujo y se restó la señal de la referencia. Se reconocieron diferentes condiciones de regeneración. Incluso con HC1 10 mM, la superficie del chip no se pudo regenerar en su totalidad a los valores iniciales. Cuando se ensayó glicina 10 mM a pH 1,7 esto alteró la superficie del chip y disminuyó la capacidad de unión.

Se ensayó una solución alternativa mediante el uso de un método de captura de Fab en un equipo BIACORE™ 3000 (GE Healthcare). Aproximadamente 11.000 unidades de resonancia (UR) de un anticuerpo de captura dirigido contra Fab humano (GE Healthcare) se inmovilizaron en las celdas de flujo uno y dos de un chip CM5 usando el protocolo de acoplamiento de amina suministrado por el fabricante. 10 µ? de Fab 10 µg/ml en Hepes 10 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, y Tween 20 al 0,01% (HBST) se inyectaron a un caudal de 10 µ?/minuto) en la celda de flujo dos, dando como resultado la captura de aproximadamente 430 UR del Fab. La celda de captura uno tenía solamente el anticuerpo de captura para servir como resta de referencia. Diluciones en serie de dos veces (1-1000 nM) de diubiquitina lineal (Boston Biochem) o diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) en HBST se inyectaron (60 µ? en total a un caudal de 30 µ?/minuto) en las celdas de flujo uno y dos. Se registró la señal de cada celda de flujo y se restó la señal de la referencia. Tras un periodo de disociación de cuatro minutos, la superficie del chip se regeneró con dos inyecciones de 30 µ? de glicina 10 mM, pH 2,1 a un caudal de 30 µ?/minuto. Los datos fueron difíciles de ajustar a cualquier modelo de unión por que la diubiquitina no se disoció completamente del chip. Además, las velocidades de asociación fueron muy rápidas y la unión no alcanzó una meseta ni siquiera para la concentración de diubiquitina más elevada utilizada. Por tanto, es difícil estimar una KD para estos Fab.

EJEMPLO 2 - Maduración por afinidad de 1F4, 1D8, y 1E3 A) Generación de un molde de detención Se insertó un codón de detención TAA independientemente en cualquiera de las Ll de la CDR, L2 de la CDR, L3 de la CDR, H3 de la CDR, o ambas L3 y H3 de las CDR (dando como resultado moldes de detención de Ll, L2, L3, H3 , y L3/H3, respectivamente) para la síntesis de bibliotecas mediante la mutagénesis de Kunkel. Los codones de detención fuerzan la diversidad dentro de un bucle concreto de la CDR requiriendo la reparación de la detención para conseguir la expresión del Fab de longitud completa y su expresión en el fago. Los oligonucleótidos del codón de detención listados a continuación se combinaron con 1 g del ADN del fagémido monovalente de Kunkel correspondiente. Los moldes de detención del fagémido Fab monovalente resultantes se utilizaron en la generación de bibliotecas de maduración por afinidad.

Para los clones 1D8 y 1E3 , el oligonucleótido mutagénico de detención para Ll de CDR utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 24 (numeración de Kabat) en Ll de la CDR de la cadena ligera fue 4D5LCl.stop (GTCACCATCACCTGCTAAGCCAGTCAGGATGTG) (SEC ID N°:104). Para los clones 1D8 y 1E3 , el oligonucleótido mutagénico de detención para L2 de CDR utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 50 (numeración de Kabat) en L2 de la CDR de la cadena ligera fue 4D5LC2. stop (GAAGCTTCTGATTTACTAAGCATCCTTCCTCTAC) (SEC ID N°:105). Para los clones 1D8 y 1E3 , el oligonucleótido mutagénico de detención para L3 de CDR utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 89 (numeración de Kabat) en L3 de la CDR de la cadena ligera fue 4D5LC3.stop (GCAACTTATTACTGTTAACAATCTTATACTACTC) (SEC ID N°:106). El oligonucleótido mutagénico de detención para H3 de CDR utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 95 (numeración de Kabat) en H3 de la CDR del clon 1D8 de la cadena pesada fue VH3.1D8.H3stop (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTTAAGCCGGGTCCCGCTTGTTGTCG) (SEC ID N°:107). El oligonucleótido mutagénico de detención para H3 de CDR utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 98 (numeración de Kabat) en H3 de la CDR del clon 1E3 de la cadena pesada fue 413Vh5SRo6 (GAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTGAGGCCTCGTAACTGCCCCCCTACGTTATG GACTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTC) (SEC ID N°:108).

Para el clon 1F4, el oligonucleótido mutagénico de detención para Ll de CDR utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 27 (numeración de Kabat) en Ll de la CDR de la cadena ligera fue CLC.Llstop (CATCACCTGCCGTGCCAGTTAATCCGTGTCCAGCGCTGTAG) (SEC ID N°:109). Para el clon 1F4, el oligonucleótido mutagénico de detención para L2 de CDR utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 52 (numeración de Kabat) en L2 de la CDR de la cadena ligera fue CLC.L2stop (CTTCTGATTTACTCGGCATAAAGCCTCTACTCTGGAGTC) (SEC ID N°:110). Para el clon 1F4, el oligonucleótido mutagénico de detención para L3 de CDR utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 90 (numeración de Kabat) en L3 de la CDR de la cadena ligera fue CLC4.1F4.L3stop (GCAACTTATTACTGTCAGTAATATTATTATTATTCTCCG) (SEC ID N°:lll). El oligonucleótido mutagénico de detención para H3 de CDR utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 94 (numeración de Kabat) en H3 de la CDR del clon 1F4 de la cadena pesada fue CLC4.1F4.H3stop (GCCGTCTATTATTGTGCTTAAGGTTACGTTTGGAAAGGTG) (SEC ID N°:112).

B) Generación de bibliotecas de maduración por afinidad Se generaron un total de diez bibliotecas de maduración por afinidad para cada clon (1F4, 1D8, y 1E3) . Todas las bibliotecas se generaron mediante mutagénesis de Kunkel (véase Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)). En el caso de aleatorización suave, se sintetizaron oligonucleótidos degenerados de forma que el resto natural se retendría el 50% del tiempo y el 50% del tiempo se codificaría uno de los 19 aminoácidos restantes. Para conseguir la aleatorización suave, se diseñaron oligonucleótidos de forma que determinadas posiciones de nucleótidos estuvieran ocupadas el 70% del tiempo con la base indicada y el 10% del tiempo ocupadas por una de las otras tres bases (Gallop y col., J. Med. Chem. 37:1233 (1994)).

Para dichos oligonucleótidos que siguen donde se incluyó dicha aleatorización suave en una base particular, la presencia de la aleatorización suave viene indicada por la presencia de un número en dicha posición de base. El número "5" indica que la base adenina está presente en el 70% del tiempo en dicha posición, mientras que las bases guanina, citosina, y timina están presentes, cada una de ellas, el 10% del tiempo. De igual forma, el número "6" se refiere a guanina, "7" a citosina, y "8" a timina, donde en cada caso, cada una de las otras tres bases está presente solamente el 10% del tiempo. En el caso de aleatorización rigurosa, se sintetizaron oligonucleótidos degenerados de forma tal que se permite la diversidad de aminoácidos que aparece en determinadas posiciones de los anticuerpos humanos naturales . En este caso, se utilizaron codones degenerados donde la letra "R" codifica guanina o adenina, WY" codifica timina o citosina, "M" codifica adenina o citosina, "K" codifica guanina o timina, "S" codifica guanina o citosina, "W" codifica adenina o timina, "H" codifica adenina, citosina, o timina, "B" codifica guanina, timina, o citosina, "V" codifica guanina, citosina, o adenina, "D" codifica guanina, adenina, o timina, y WN" codifica guanina, adenina, citosina, o timina.

Se generaron diez bibliotecas para 1F4 que se designaron Ll, L2, L3, L1/L2/L3, H3 , L3/H3, L1/H2, L2/H1, H2/H3, y L3/H1/H2. La biblioteca Ll de 1F4 tenía las posiciones 28 -33 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. Los oligonucleótidos mutagénicos de Ll, Flll-Ll (ACCTGCCGTGCCAGTCAGI^TRKTRVWA WTHTGTAGCCTGGTATCAACAGAAAC) (SEC ID N°:113) y F202-L1 (ACCTGCCGTGCCAGTCAGRDTRKTRVWA WT HTCTGGCCTGGTATCAACAGAAAC) (SEC ID N°:114) se mezclaron en una relación 1:2 dando como resultado una "mezcla de oligos de Ll" y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención de Ll de 1F4 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L2 de 1F4 tenía las posiciones 50, 53, y 55 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. Los oligonucleótidos mutagénicos de Ll, F201-L2 (CCGAAGCTTCTGATTTA CKBGGCATCCAVCCTCTACTCTGGAGTCCCT) (SEC ID N°:115) y F203-L2 (CCGAAGCTTCTGATTTACKBGGCATCCAVCCTCGMATCTGGAGTCCCTTCTCGC) (SEC ID N°:116) se mezclaron en una relación 1:1 dando como resultado una "mezcla de oligos de L2" y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de L2 de 1F4 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L3 de 1F4 tenia las posiciones 91 - 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. Los oligonucleótidos mutagénicos F133a (GCAACTTA TTACTGTCAGCAATMTDMCRVTNHTCCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC) (SEC ID N° : 117 ) , F133b (GCAACTTATTACTGTCAGCAATMTDMCRVTNHTC CTTWTACGTTCGGACAGGGTACC) (SEC ID N°:118), F133c (GCAACTTATT ACTGTCAGCAASRTDMCRVTNHTCCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC) (SEC ID N°:119), F133d (GCAACTTATTACTGTCAGCAASRTD CRVTNHTCCTT WTACGTTCGGACAGGGTACC) (SEC ID N°:120) se mezclaron en una relación 1:1:1:1 ratio dando como resultado una "mezcla de oligos de L3 rigurosa" . Los oligonucleótidos mutagénicos F563-L3softl (ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCT777ACGTTCGGACAGGGTACC) (SEC ID N°:121), F564-L3soft2 (ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCTTWTACGT TCGGACAGGGTACC) (SEC ID N°:122), y F565-L3so£t3 (ACTTATTACTGTCAGCAA 878857577577CCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC) (SEC ID N°:123) se mezclaron en una relación 1:0,5:1 dando como resultado una "mezcla de oligos de L3 suave" . La "mezcla de oligos de L3 rigurosa" , la "mezcla de oligos de L3 suave" , y el oligonucleótido mutagénico 1F4.L3 soft (GCAACTTATTACTGTCAG CAA857857857857878CCG788ACGTTCGGACAGGGTACCAAG) (SEC ID N°:124) se mezclaron a continuación en una relación 1:1:1 dando como resultado una "mezcla de oligos de L3 total" y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de L3 de 1F4 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca H3 de 1F4 tenía las posiciones 95, 97, 99, 100, y 100a (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. El oligonucleótido mutagénico CLC.1F4.H3soft (GACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGC668TAC688TGG555668678ATGGACTACTGG GGTCAAGGAACC) (SEC ID N°:125) se combinó con 20 ]ig de ADN de Kunkel del molde de detención de H3 de 1F4 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L3/H3 de 1F4 tenía las posiciones 91 - 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. Tenía también las posiciones 95, 97, 99, 100, y 100a (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de L3 total" y el oligonucleótido mutagénico CLC.1F4.H3soft (SEC ID N°:126) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:1 y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención de L3/H3 de 1F4 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L1/H2 de 1F4 tenía las posiciones 28 - 33 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. Tenía también las posiciones 50, 52, 53, 54, y 28 (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de Ll" anteriormente descrita y el oligonucleótido mutagénico CLC4.1F4.H2soft (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCA878ATT857TCT857857AG CTATACT878TATGCCGATAGCGTCAAGGGCCG) (SEC ID N°:126) se mezclaron en una relación 1:1 y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención de Ll de 1F4 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L2/H1 de 1F4 tenía las posiciones 50, 53, y 55 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. También tenía las posiciones 30 - 33 (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de L2" anteriormente descrita y el oligonucleótido mutagénico CLC4.1F .Hlsoft (GCAGCTTCTGGCTTCAACTTT857878857857ATGCACTGGGTGCGTCAGGCC) (SEC ID N°:127) se mezclaron en una relación 1:1 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de L2 de 1F4 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

La biblioteca H2/H3 de 1F4 tenía las posiciones 50, 52, 53, 54, 58, 95, 97, 99, 100, y 100a (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. Los oligonucleótidos mutagénicos CLC4.1F4.H2soft (SEC ID N°:126) y CLC4.1F4. H3soft (SEC ID N°:125) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:1 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de H3 de 1F4 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L1/L2/L3 de 1F4 tenía las posiciones 28 -33, 50, 53, y 55 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. También tenía las posiciones 91 - 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. La "mezcla de oligos de Ll" , la "mezcla de oligos de L2", y la "mezcla de oligos de L3 total" se mezclaron en una relación 1:1:1 y se combinaron con 20 pg de ADN de Kunkel del molde de detención de L3 de 1F4 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

La biblioteca L3/H1/H2 de 1F4 tenía las posiciones 91 -96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. Tenía también las posiciones 30 - 33, 50, 52, 53, 54, y 58 (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de L3 total", CLC4.1F4. Hlsoft (SEC ID N°:127) y CLC4.1F4. H2soft (SEC ID N°:126) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:1:1 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de L3 de 1F4 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

Se generaron diez bibliotecas para 1D8 que se designaron Ll, L2, L3, L1/L2/L3, H3 , L3/H3, L1/H2, L2/H1, H2/H3, y L3/H1/H2. La biblioteca Ll de 1D8 tenía las posiciones 28 -33 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. Los oligonucleótidos mutagénicos de Ll, Flll-Ll (SEC ID N°:113) y F202-L1 (SEC ID N°:114) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:2 dando como resultado una "mezcla de oligos de Ll" y se combinaron con 20 ig de ADN de Kunkel del molde de detención de Ll de 1D8 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

La biblioteca L2 de 1D8 tenía las posiciones 50, 53, y 55 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. Los oligonucleótidos mutagénicos de L2, F201-L2 (SEC ID N°:115) y F203-L2 (SEC ID N°:116) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:1 dando como resultado una "mezcla de oligos de L2" y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención de L2 de 1D8 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L3 de 1D8 tenía las posiciones 91 - 94 y' 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. Los oligonucleótidos mutagénicos F133a (SEC ID N°:117), F133b (SEC ID N°:118), F133c (SEC ID N°:119), y F133d (SEC ID N°:120) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:1:1:1 dando como resultado una "mezcla de oligos de L3 rigurosa" . Los oligonucleótidos mutagénicos F563-L3softl (SEC ID N°:121), F564-L3soft2 (SEC ID N°:122), y F565-L3soft3 (SEC ID N°:123) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:0,5:1 dando como resultado una "mezcla de oligos de L3 suave" . La "mezcla de oligos de L3 rigurosa" y la "mezcla de oligos de L3 suave" se mezclaron a continuación en una relación 1:1 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de L3 de 1D8 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca H3 de 1D8 tenía las posiciones 96 - 100c (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. El oligonucleótido mutagénico VH3.1D8. H3soft (GCCGTCTATTATTGTGCTCG TGAG678668878565788788878688ATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC) (SEC ID N°:128) se combinó con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de H3 de 1D8 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L3/H3 de 1D8 tenía las posiciones 91 - 94 y 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. También tenía las posiciones 96 - 100c (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de L3 suave", la "mezcla de oligos de L3 rigurosa" , y el oligonucleótido mutagénico VH3.1D8. H3soft (SEC ID N°:128) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 0,5:0,5:1 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de L3/H3 de 1D8 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L1/H2 de 1D8 tenía las posiciones 28 - 33 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. Tenía también las posiciones 50, 52, 53, 54, y 58 (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de Ll" anteriormente descrita y el oligonucleótido mutagénico VH3.1D8. H2soft (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCT668ATT878CCT857668 GGTTATACT657TATGCCGATAGCGTCAAGGGCCG) (SEC ID N°:129) se mezclaron en una relación 1:1 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de Ll de 1D8 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L2/H1 de 1D8 tenía las posiciones 50, 53, y 55 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. También tenía las posiciones 30 - 33 (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de L2" anteriormente descrita y el oligonucleótido mutagénico VH3.1D8. Hlsoft (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTC577657857657ATTCACTGGGTGCGTCAGGCC) ( SEC ID N°:130) se mezclaron en una relación 1:1 y se combinaron con 20 pg de ADN de Kunkel del molde de detención de L2 de 1D8 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

La biblioteca H2/H3 de 1D8 tenía las posiciones 50, 52, 53, 54, 58, y 96 - 100c (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. Los oligonucleótidos mutagénicos VH3.1D8. H2soft (SEC ID N°:129) y VH3.1D8. H3soft (SEC ID N°:128) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:1 y se combinaron con 20 xg de ADN de Kunkel del molde de detención de H3 de 1D8 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L1/L2/L3 de 1D8 tenía las posiciones 28 -33, 50, 53, y 55 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. También tenía las posiciones 91 - 94 y 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. La "mezcla de oligos de Ll" , la "mezcla de oligos de L2", la "mezcla de oligos de L3 rigurosa", y la "mezcla de oligos de L3 suave" se mezclaron en una relación 1:1:0,5:0,5 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de L3 de 1D8 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L3/H1/H2 de 1D8 tenía las posiciones 91 -94 y 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. Tenía también las posiciones 30 - 33, 50, 52, 53, 54, y 58 (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de L3 rigurosa", la "mezcla de oligos de L3 suave", VH3.1D8. Hlsoft (SEC ID N°:130) y VH3.1D8. H2soft (SEC ID N°:129) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 0,5:0,5:1:1 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de L3 de 1D8 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

Se generaron diez bibliotecas para 1E3 que se designaron Ll, L2, L3, L1/L2/L3, H3 , L3/H3, L1/H2, L2/H1, H2/H3, y L3/H1/H2. La biblioteca Ll de 1E3 tenía las posiciones 28 -33 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. Los oligonucleótidos mutagénicos de Ll, Flll-Ll (SEC ID N°:113) y F202-L1 (SEC ID N°:114) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:2 dando como resultado una "mezcla de oligos de Ll" y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención de Ll de 1E3 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

La biblioteca L2 de 1E3 tenía las posiciones 50, 53, y 55 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. Los oligonucleótidos mutagénicos de L2, F201-L2 (SEC ID N°:115) y F203-L2 (SEC ID N°:116) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1 : 1 dando como resultado una "mezcla de oligos de L2" y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de L2 de 1E3 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L3 de 1E3 tenía las posiciones 91 - 94 y 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. Los oligonucleótidos mutagénicos F133a (SEC ID N°:117), F133b (SEC ID N°:118), F133C (SEC ID N°:119), y F133d (SEC ID N°:120) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:1:1:1 dando como resultado una "mezcla de oligos de L3 rigurosa" . Los oligonucleótidos mutagénicos F563-L3softl (SEC ID N°:121), F564-L3soft2 (SEC ID N°:122), y F565-L3soft3 (SEC ID N°:123) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:0,5:1 dando como resultado una "mezcla de oligos de L3 suave" . La "mezcla de oligos de L3 rigurosa" y la "mezcla de oligos de L3 suave" se mezclaron a continuación en una relación 1:1 y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención de L3 de 1E3 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

La biblioteca H3 de 1E3 tenía las posiciones 95, 97, 98, 99, y 100a (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. El oligonucleótido mutagénico VH4.1E3.H3soft (GACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGT577TGG788788565TGG688ATGGACTACTGG GGTCAAGGAACCCTG) (SEC ID N°:131) se combinó con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de H3 de 1E3 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

La biblioteca L3/H3 de 1E3 tenía las posiciones 91 - 94 y 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. Tenía también las posiciones 95, 97, 98, 99, y 100a (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de L3 suave", la "mezcla de oligos de L3 rigurosa" , y el oligonucleótido mutagénico VH .1E3.H3soft (SEC ID N°:131) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 0,5:0,5:1 y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención de L3/H3 de 1E3 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L1/H2 de 1E3 tenía las posiciones 28 - 33 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. Tenía también las posiciones 50, 52, 53, 54, y 58 (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de Ll" anteriormente descrita y el oligonucleótido mutagénico VH4.1E3.H2soft (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCT878ATT577CCT878878GGTTCTA CT657TATGCCGATAGCGTCAAGGGCCG) (SEC ID N°:132) se mezclaron en una relación 1:1 y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención de Ll de 1E3 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

La biblioteca L2/H1 de 1E3 tenía las posiciones 50, 53, y 55 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. También tenía las posiciones 30 - 33 (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de L2" anteriormente descrita y el oligonucleótido mutagénico VH4.1E3.Hlsoft (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTC878558577857ATTAGCTGGGTGCGTCAGGCC) (SEC ID N°:133) se mezclaron en una relación 1:1 y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención de L2 de 1E3 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

La biblioteca H2/H3 de 1E3 tenía las posiciones 50, 52, 53, 54, 58, 95, 97, 98, 99, y 100a (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. Los oligonucleótidos mutagénicos VH4.1E3. H2soft (SEC ID N°:132) y VH4.1E3.H3soft (SEC ID N°:133) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 1:1 y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención de H3 de 1E3 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

La biblioteca L1/L2/L3 de 1E3 tenía las posiciones 28 -33, 50, 53, y 55 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales. También tenía las posiciones 91 - 94 y 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. La "mezcla de oligos de Ll" , la "mezcla de oligos de L2", la "mezcla de oligos de L3 rigurosa", y la "mezcla de oligos de L3 suave" se mezclaron en una relación 1:1:0,5:0,5 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de L3 de 1E3 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L3/H1/H2 de 1E3 tenía las posiciones 91 - 94 y 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera bien aleatorizadas rigurosamente para permitir la diversidad de aminoácidos que aparece en dichas posiciones de los anticuerpos humanos naturales o bien aleatorizadas suavemente. Tenia también las posiciones 30 - 33, 50, 52, 53, 54, y 58 (numeración de Kabat) de la cadena pesada con una aleatorización suave. La "mezcla de oligos de L3 rigurosa", la "mezcla de oligos de L3 suave", VH4.1E3. Hlsoft (SEC ID N°:133) y VH4.1E3.H2soft (SEC ID N°:132) descritos anteriormente se mezclaron en una relación 0,5:0,5:1:1 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención de L3 de 1E3 (descrito en el Ejemplo 2A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

Las reacciones de mutagénesis se electroporaron en E. coli XLl-Blue (Agilent) electrocompetentes y se recuperaron en 25 mi de medio SOC durante 45 minutos a 37 °C con agitación. Se extrajeron veinte microlitros y se plaquearon diluciones en serie de diez veces en placas de agar sólido que contenían carbenicilina y se hicieron crecer durante la noche a 37°C para determinar el tamaño de la biblioteca. El resto del cultivo se transfirió a 500 mi de caldo 2YT que contiene 50 µg/ml de carbenicilina y lxlO10 fago/ml de fago auxiliar M13K07. Las placas se incubaron durante una hora a 37°C con agitación. Se añadieron 50 pg/ml de kanamicina, y los cultivos se hicieron crecer durante 7 horas más a 37 °C con agitación. A continuación, la temperatura se varió a 30°C y los cultivos se hicieron crecer durante 22 horas más. Cada una de las bibliotecas contenia al menos ~9,5 x 109 unidades formadoras de colonias (UFC) . Los fagos se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo mediante dos rondas de precipitación con un volumen 1/5 de polietilenglicol al 20% (PEG) /NaCl 2,5 M.

C) Clasificación de las bibliotecas de maduración por afinidad Las bibliotecas de maduración por afinidad 1F4, 1D8, y 1E3 se sometieron a cuatro rondas de clasificación. Cada una de las diez sub-bibliotecas se clasificó en paralelo para la primera ronda y posteriormente se combinaron para las clasificaciones dos a cuatro. La primera ronda fue una clasificación en placa con diubiquitina lineal inmovilizada en una inmunoplaca Maxisorb (NU C) de 96 pocilios. Las placas se revistieron durante la noche a 4°C con 5 µg/ml de diubiquitina lineal (Boston Biochem) en tampón de carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6. Las placas revestidas se bloquearon con 200 µ?/pocillo de leche al 2,5% en PBS que contienen Tween 20 al 0,05% (PBST) durante una hora a 25°C con agitación. Las bibliotecas de fagos se diluyeron hasta una DO = 2,0 en leche al 2,5% en PBST y se añadieron 30 g/ml de poliubiquitina 2-7 con unión K63 (Boston Biochem) para contraselección. Después de una hora, el tampón de bloqueo se vertió de la placa y se añadieron 100 µ?/pocillo del fago y se incubó durante tres horas a 25 °C con agitación. Tras la unión, la placa se lavó 20 veces con PBST rellenando manualmente los pocilios y vertiendo el tampón entre los lavados. Los fagos se eluyeron con 150 µ?/pocillo de HCl 50 mM/ClK 500 mM durante 30 minutos a 25 °C con agitación. La elución se neutralizó con 150 µ?/pocillo de Tris 1 , pH 7,5 y posteriormente se propagó en (E. coli) XLl-Blue (Agilent) con la adición del fago auxiliar M13K07.

Los fagos amplificados se utilizaron en rondas adicionales de selección contra la diubiquitina lineal en la clasificación realizada en placas. No fue posible una clasificación en disolución porque la biotinilación de la diubiquitina lineal interfería con la unión a Fab. Se aumentó el rigor de las últimas clasificaciones de tres formas: añadiendo 30 g/ml de monoubiquitina soluble, poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina 2-7 con unión K48, y poliubiquitina 2-7 con unión K63 al fago para contraselección; aumentando el número y la duración de los lavados de las placas, y disminuyendo la cantidad de fago utilizado y la duración de la unión al fago. La segunda clasificación se llevó a cabo exactamente igual a la primera clasificación, salvo que se amplió la ubiquitina soluble para incluir las cadenas anteriormente listadas, la cantidad de fago utilizada fue D0268 = 1#0, la duración de la unión al fago se redujo a 2 horas, y el número de lavados de las placas se aumentó a 30. La tercera clasificación se llevó a cabo exactamente igual a la segunda clasificación, salvo que la duración de la unión al fago se redujo a 1,5 horas y el número de lavados de la placa se aumentó a 40 seguido por cuatro lavados adicionales de 15 minutos cada uno con agitación a 25°C con cinco lavados rápidos realizados entre medias de cada lavado de 15 minutos. La cuarta clasificación se llevó a cabo exactamente igual a la tercera clasificación, salvo que la cantidad de fago utilizada fue D0268 = 0,5, la duración de la unión al fago se redujo a 1 hora, y los lavados incluyeron 40 lavados rápidos seguidos por cuatro lavados de 15 minutos con agitación a 37°C. Se calculó el enriquecimiento para las rondas de la dos a la cuatro comparando el número de fagos recuperados con la diubiquitina lineal comparado con un pocilio sin revestir. Se observó enriquecimiento en las rondas de la dos a la cuatro para las tres bibliotecas (véase la Tabla 3) .

TABLA 3 Después de cuatro rondas de clasificación, se recogieron 96 clones individuales de la tercera ronda de clasificación de 1F4, de la segunda ronda de clasificación de 1D8, de la tercera ronda de clasificación de 1D8, de la cuarta ronda de clasificación de 1D8, y de la tercera ronda de clasificación de 1E3 y se hicieron crecer en un formato de 96 pocilios en 1 mi de caldo 2YT que contiene 50 pg/ml de carbenicilina y lxlO10 fago/ml de fago auxiliar M13K07. Los sobrenadantes de dichos cultivos se utilizaron en ensayos ELISA de alto rendimiento en manchas de fagos para determinar su unión a la diubiquitina lineal (Boston Biochem) , monoubiquitina (Boston Biochem) , diubiquitina con unión Kll (Genentech) , diubiquitina con unión K48 (Boston Biochem) , diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) , un anticuerpo contra gD (Genentech) , o un pocilio sin revestir (como se ha descrito en el Ejemplo IB) . De la tercera ronda de clasificación de 1F4, todos los clones eran aglutinantes muy débiles de la diubiquitina lineal mostrando DO450 inferiores a 0,4 y por tanto se descartaron. De la segunda ronda de clasificación de 1D8 los 93 clones fueron específicos de la diubiquitina lineal, pero la secuenciación desveló que todos eran la secuencia 1D8 progenitora de tipo natural. De la tercera ronda de clasificación de 1D8 48 de los clones fueron específicos de la diubiquitina lineal, pero la secuenciación desveló que todos salvo dos eran la secuencia 1D8 progenitora de tipo natural. Los dos clones no progenitores 1D8.3C2 (SEC ID Nros: 33 y 36) y 1D8.3F8 (SEC ID Nros : 34 y 37) (véanse las FIGs . 5A y 5B) se ensayaron para determinar las CI50 mediante ELISA como en el ejemplo ID y se demostró que las CI50 para la diubiquitina lineal estaban en el intervalo µ? bajo, solamente ligeramente mejorado con respecto a 1D8 (véase la FIG. 6) . De la cuarta ronda de clasificación de 1D8, 94 de los clones mostraron una fuerte unión tanto a la diubiquitina lineal como a la diubiquitina con unión K63 (DO450 superior a 1,0 para la forma lineal, DO450 superior a 0,5 para la forma K63) y por tanto se descartaron. Solo un clon, 1D8.4F5 (SEC ID Nros: 35 y 38) (véanse las FIGs. 5A y 5B) mostró una fuerte unión a la diubiquitina lineal con poca unión a la diubiquitina con unión K63 (DO450 ~1.3, DO450 ~ 0,1 para K63) .

La CI50 del fago para 1D8.4F5 también se midió mediante ELISA como en el ejemplo ID y se determinó que era ~ 2 µ?, solamente ligeramente mejor que el clon 1D8 progenitor (véase la FIG. 6) . De la tercera ronda de clasificación de 1E3 33 de los clones fueron específicos de la diubiquitina lineal, sin embargo, todos eran aglutinantes muy débiles (DO450 inferior a 0,5) y por tanto se descartaron. 27 clones más mostraron una fuerte unión a la diubiquitina lineal (D045o superior a 0,5 pero inferior a 1,0), sin embargo, también mostraron una mayor unión a la diubiquitina con unión K63 (DO450 superior a 0,1) y por tanto se descartaron.

EJEMPLO 3 - Segunda maduración por afinidad de 1E3 A) Generación de un molde de detención B) Se insertó un codón de detención TAA independientemente en cualquiera de las Ll de la CDR, L2 de la CDR, L3 de la CDR, Hl de la CDR, H2 de la CDR, y H3 de la CDR (dando como resultado moldes de detención de Ll, L2, L3 , Hl, H2, y H3 , respectivamente) para la síntesis de bibliotecas mediante la mutagénesis de Kunkel . Los codones de detención fuerzan la diversidad dentro de un bucle concreto de la CDR requiriendo la reparación de la detención para conseguir la expresión del Fab de longitud completa y su expresión en el fago. Los oligonucleótidos del codón de detención listados a continuación se combinaron con 1 g del ADN del fagémido monovalente de Kunkel 1E3. Los moldes de detención del fagémido Fab monovalente resultantes se utilizaron en la generación de bibliotecas de maduración por afinidad.

El oligonucleótido mutagénico utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 31 (numeración de Kabat) en Ll de la CDR de la cadena ligera 1E3 fue E3.Llstop (GCCAGTCAGGATGTG TCCTAAGCTGTAGCCTGGTATCAAC) (SEC ID N°:134). El oligonucleótido mutagénico utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 53 (numeración de Kabat) en L2 de la CDR de la cadena ligera 1E3 fue E3.L2stop (CTGATTTACTCGGCATCCTAACTCTACTCTGGAGTCCCTTC) (SEC ID N°:135). El oligonucleótido mutagénico utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 93 (numeración de Kabat) en L3 de la CDR de la cadena ligera 1E3 fue E3.L3stop (CTTATTACT GTCAGCAATCTTATTAAACTCCTCCCACGTTCGGACAG) (SEC ID N°:136). El oligonucleótido mutagénico utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 32 (numeración de Kabat) en Hl de la CDR de la cadena ligera 1E3 fue E3.Hlstop (GGCTTCACCTTC AGTAATTAATATATTAGCTGGGTGCGTC) (SEC ID N°:137). El oligonucleótido mutagénico utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 54 (numeración de Kabat) en H2 de la CDR de la cadena ligera 1E3 fue E3.H2stop (GTTGCTTCTATTACTCCTTAAAGCGGTTCTACTGACTATG) (SEC ID N°:138). El oligonucleótido mutagénico utilizado para insertar un codón de detención TAA en la posición 99 (numeración de Kabat) en H3 de la CDR de la cadena ligera 1E3 fue E3.H3stop (GCTCGTACCTGGTTGCTCTAATGGGTTATGGACTACTGG) (SEC ID N° :139) .

B) Generación de una biblioteca NNK de posición única Puesto que el primer intento de maduración por afinidad de 1F4 e 1D8 solo dio como resultado mejoras modestas en la afinidad con CI50 aún en el intervalo de bajo µ?, la investigación se centró en el clon 1E3 que tenía un valor de CI50 inicial de 80 nM. El primer intento de maduración por afinidad de 1E3 produjo muchos clones que mostraron una fuerte unión tanto a la diubiquitina lineal como a la diubiquitina con unión K63. Sin embargo, se abordó una hipótesis diferente para minimizar la diubiquitina con unión K63 limitando el número de mutaciones incorporada a los clones únicos. Se utilizó la aleatorización de NNK en una posición única para incorporar un único cambio de aminoácido en una CDR cada vez . Se generaron seis bibliotecas CDR únicas designadas como Ll, L2, L3, Hl, H2, y H3 donde se permitió a un único resto de cualquier clon retener el resto natural o cambiarlo a cualquier otro de los 19 aminoácidos.

La biblioteca Ll tenía las posiciones 28 - 34 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente de manera individual usando el codón NK para permitir los 20 aminoácidos. Los oligonucleótidos mutagénicos de Ll E3. Ll .1 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAG NKGTGTCCACTGCTG TAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGG) (SEC ID N°:140), E3.L1.2 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGAT NKTCCACTGCTGTAGCCTGGTATC AACAGAAACCAGG) (SEC ID N°:141), E3.L1.3 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTG KACTGCTGTAGCCTGGTATCA ACAGAAACCAGG) (SEC ID N°:142), E3.L1.4 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCNNKGCTGTAGCCTGGTATCAA CAGAAACCAGG) (SSEC ID N°:143), E3.L1.5 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCACTNNKGTAGCCTGGTATCA ACAGAAACCAGG) (SEC ID N°:144), E3.L1.6 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCACTGCTNNKGCCTGGTATCAA CAGAAACCAGG) (SEC ID N°:145), y E3.L1.7 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCACTGCTGTA NKTGGTATCAA CAGAAACCAGG) (SEC ID N°:146) se mezclaron en una relación 1:1:1:1:1:1:1 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención 1E3 Ll (descrito en el Ejemplo 3A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L2 tenia las posiciones 50 - 56 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente de manera individual usando el codón NNK para permitir los 20 aminoácidos. Los oligonucleótidos mutagénicos de L2 E3. L2.1 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTAC KGCATCCTTCCTCTACTCTG GAGTCCCTTCTCGCTTCTCTG) (SEC ID N°:147), E3.L2.2 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGN KTCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (SEC ID N°:148), E3.L2.3 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCA KTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (SEC ID N°:149), E3.L2.4 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCC NKCTCTACTCTGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (SEC ID N°:150), E3.L2.5 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCNNKTACTCTGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (SEC ID N°:151), E3 -L2.6 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTC NKTCTGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (SEC ID N°:152), y E3.L2.7 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACISrNKGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (SEC ID N°:153) se mezclaron en una relación 1:1:1:1:1:1:1 y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención 1E3 L2 (descrito en el Ejemplo 3A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca L3 tenía las posiciones 91 - 96 (numeración de Kabat) de la cadena ligera aleatorizadas rigurosamente de manera individual usando el codón K para permitir los 20 aminoácidos. Los oligonucleótidos mutagénicos de L3 E3. L3.1 (GCAACTTATTACTGTCAGCAA NKTATACTACTCCTCCCACG TTCGGACAGGGTACCAAG) (SEC ID N°:154), E3 ,L3.2 (GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTNWKACTACTCCTCCCACGTTCGGACA GGGTACCAAG) (SEC ID N°:155), E3.L3.3 (GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTAT NKACTCCTCCCACGTTCGGACA GGGTACCAAG) (SEC ID N°:156), E3.L3.4 (GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTATACT KCCTCCCACGTTCGGACA GGGTACCAAG) (SEC ID N°:157), E3.L3.5 (GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTATACTACT NKCCCACGTTCGGACA GGGTACCAAG) (SEC ID N°:158), y E3.L3.6 (GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTATACTACTCCT NKACGTTCGGACA GGGTACCAAG) (SEC ID N°:159) se mezclaron en una relación 1:1:1:1:1:1 y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención 1E3 L3 (descrito en el Ejemplo 3A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca Hl tenía las posiciones 30 - 35 (numeración de Kabat) de la cadena pesada aleatorizadas rigurosamente de manera individual usando el codón K para permitir los 20 aminoácidos. Los oligonucleótidos mutagénicos de Hl E3. Hl .1 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCN KAATACTTATATTAGCT GGGTGCGTCAGGCCCCG) (SEC ID N°:160), E3. Hl .2 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGT KACTTATATTAGCTGGGTGCG TCAGGCCCCG) (SEC ID N°:161), E3. Hl .3 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAAT KTATATTAGCTGGGTGCG TCAGGCCCCG) (SEC ID N°:162), E3. Hl . (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAATACT KATTAGCTGGGTGCG TCAGGCCCCG) (SEC ID N°:163), E3. Hl .5 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAATACTTAT KAGCTGGGTGCG TCAGGCCCCG) (SEC ID N°:164), y E3. Hl .6 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAATACTTATATT KTGGGTGCG TCAGGCCCCG) (SEC ID N°:165) se mezclaron en una relación 1:1:1:1:1:1 y se combinaron con 20 g de ADN de Kunkel del molde de detención 1E3 Hl (descrito en el Ejemplo 3A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel.

La biblioteca H2 tenía las posiciones 49 - 58 (numeración de Kabat) de la cadena pesada aleatorizadas rigurosamente de manera individual usando el codón NNK para permitir los 20 aminoácidos. Los oligonucleótidos mutagénicos de H2 E3.H2.1 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTNNKTCTATTACTCCTTCTAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (SEC ID N°:166), E3.H2.2 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTNNKATTACTCCTTCTAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (SEC ID N°:167), E3.H2.3 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCT KACTCCTTCTAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (SEC ID N°:168), E3.H2.4 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATT KCCTTCTAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (SEC ID N°:169), E3.H2.5 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACT KTCTAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (SEC ID N°:170), E3.H2.6 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCT KAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (SEC ID N°:171), E3.H2.7 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCT NKGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (SEC ID N°:172), E3.H2.8 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGC NKTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (SEC ID N°:173), E3.H2.9 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGCGGT KACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (SEC ID N°:174), E3.H2.10 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGCGGTTCT NKG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (SEC ID N°:175), y E3.H2.ll (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGCGGTTCTACT KTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (SEC ID N°:176) se mezclaron en una relación 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1 y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención 1E3 H2 (descrito en el Ejemplo 3A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

La biblioteca H3 tenía las posiciones 95 - 102 (numeración de Kabat) de la cadena pesada aleatorizadas rigurosamente de manera individual usando el codón NK para permitir los 20 aminoácidos. Los oligonucleótidos mutagénicos de H3 E3.H3.1 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGT NKTGGTTGCTCCGGTGGGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (SEC ID N°:177), E3.H3.2 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACC KTTGCTCCGGTGGGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (SEC ID N°:178), E3.H3.3 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGNNKCTCCGGTGGGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (SEC ID N°:179), E3.H3.4 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTG KCGGTGGGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (SEC ID N°:180), E3.H3.5 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTC KTGGGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (SEC ID N°:181), E3.H3.6 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGG NKGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (SEC ID N°:182), E3.H3.7 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGNNKATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (SEC ID N°:183), E3.H3.8 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGGTTNNKGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (SEC ID N°:184), E3.H3.9 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGGTTATG NKTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (SEC ID °:185), y E3.H3.10 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGGTTATGGAC KT GGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (SEC ID N°:186) se mezclaron en una relación 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1 y se combinaron con 20 µg de ADN de Kunkel del molde de detención 1E3 H3 (descrito en el Ejemplo 3A) para generar la biblioteca mediante mutagénesis de Kunkel .

Las reacciones de mutagénesis se electroporaron en E. coli XLl-Blue (Agilent) electrocompetentes y se recuperaron en 25 mi de medio SOC durante 45 minutos a 37°C con agitación. Se extrajeron veinte microlitros y se plaquearon diluciones en serie de diez veces en placas de agar sólido que contenían carbenicilina y se hicieron crecer durante la noche a 37°C para determinar el tamaño de la biblioteca. El resto del cultivo se transfirió a 500 mi de caldo 2YT que contiene 50 g/ml de carbenicilina y lxlO10 fago/ml de fago auxiliar M13K07. Las placas se incubaron durante una hora a 37°C con agitación. Se añadieron 50 g/ml de kanamicina, y los cultivos se hicieron crecer durante 7 horas más a 37°C con agitación. A continuación, la temperatura se varió a 30 °C y los cultivos se hicieron crecer durante 22 horas más. Cada una de las bibliotecas contenía al menos -1,5 x 1010 unidades formadoras de colonias (UFC) . Los fagos se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo mediante dos rondas de precipitación con un volumen 1/5 de polietilenglicol al 20% (PEG) /NaCl 2,5 M.

Sesenta y cuatro clones individuales procedentes de cada una de las seis bibliotecas se secuenciaron para garantizar que la diversidad de aminoácidos de la biblioteca reflejaba el diseño con precisión. Todas las bibliotecas fueron tal como fueron diseñadas .

C) Clasificación de las bibliotecas de maduración por afinidad Las seis bibliotecas de maduración por afinidad NNK de CDR se sometieron a tres rondas de clasificación en paralelo contra bien diubiquitina lineal o diubiquitina con unión K63. Las placas se revistieron durante la noche a 4°C con 5 µg/ml de diubiquitina lineal (Boston Biochem) o diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) en tampón de carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6. Las placas revestidas se bloquearon con 200 µ?/pocillo de leche al 2,5% en PBS que contienen Tween 20 al 0,05% (PBST) durante una hora a 25°C con agitación. Las bibliotecas de fagos se diluyeron hasta una DO = 1,0 en leche al 2,5% en PBST. Después de una hora, el tampón de bloqueo se vertió de la placa y se añadieron 100 µ?/pocillo del fago y se incubó durante 1,5 horas a 25°C con agitación. Tras la unión, la placa se lavó 10 veces con PBST rellenando manualmente los pocilios y vertiendo el tampón entre los lavados. Los fagos se eluyeron con 100 µ?/pocillo de HC1 50 mM/ClK 500 mM durante 30 minutos a 25°C con agitación. La elución se neutralizó con 100 µ?/pocillo de Tris 1 M, pH 7,5 y posteriormente se propagó en (E. coli) XLl-Blue (Agilent) con la adición del fago auxiliar M13K07.

Los fagos amplificados se utilizaron en rondas adicionales de selección contra diubiquitina lineal o diubiquitina con unión K63 en la clasificación realizada en placas. No fue posible una clasificación en disolución porque la biotinilación de la diubiquitina lineal interfería con la unión a Fab 1E3. La rigurosidad de las últimas clasificaciones se aumentó de dos formas: aumentando el número y la duración de los lavados de la placa; y disminuyendo la cantidad de fago utilizado y la duración de la unión al fago. La segunda clasificación se llevó a cabo exactamente igual a la primera clasificación, salvo que la cantidad de fago utilizada fue D02g8 = 0,5 y el número de lavados de la placa se aumentó a 21 incubándose el último lavado a 25°C con agitación durante 5 minutos. La tercera clasificación se llevó a cabo exactamente igual a la segunda clasificación, salvo que la duración de la unión al fago se redujo a una hora y el número de lavados de la placa se aumentó a 30. Para la clasificación con diubiquitina lineal, esto fue seguido por cuatro lavados adicionales de 15 minutos con agitación a 25 °C, con cinco lavados rápidos realizados entre medias de cada lavado de 15 minutos. A continuación, se llevó a cabo un lavado de una hora con agitación a 25 °C seguido por cinco lavados rápidos. Se calculó el enriquecimiento para las rondas de la dos y tres comparando el número de fagos recuperados con la diubiquitina lineal o la diubiquitina con unión K63 comparado con un pocilio sin revestir. Se observó un fuerte enriquecimiento en las rondas dos y tres para las tres bibliotecas clasificadas contra la diubiquitina lineal pero solo se observó un enriquecimiento modesto para la diubiquitina con unión K63 (véase la Tabla 4) .

TABLA 4 Después de tres rondas de clasificación, se recogieron 64 clones individuales de cada una de las seis bibliotecas de la segunda ronda de clasificación de la diubiquitina lineal. La tercera ronda de clasificación de la diubiquitina lineal. y de la tercera ronda de clasificación de la diubiquitina con unión K63 y se hicieron crecer en un formato de 96 pocilios en 1 mi de caldo 2YT que contiene 50 g/ml de carbenicilina y lxlO10 fago/ml de fago auxiliar M13K07. Los sobrenadantes de dichos cultivos se utilizaron en ensayos ELISA de alto rendimiento en manchas de fagos para determinar su unión a un revestimiento de 1 µg/ mi de diubiquitina lineal (Boston Biochem) , diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) , un anticuerpo contra gD (Genentech) , o un pocilio sin revestir como se ha descrito anteriormente (Ejemplo IB) . Los dominios variables de estos clones también se secuenciaron (véanse la Tabla 5 - diubiquitina lineal y la tabla 6 - diubiquitina con unión K63. La secuenciación de los clones H3 reveló que una mutación TllOA estaba presente en algunos clones fuera de la región a la que se dirigía la aleatorización en el diseño de la biblioteca además de la mutación prevista. Esto es probablemente debido a un error en la síntesis del oligonucleótido o a un error de la mutagénesis.

D) ELISA de competición con fagos en manchas únicas Se llevaron a cabo ensayos ELISA de competición con fagos en manchas únicas para determinar qué clones tuvieron la mayor mejora en su afinidad por la diubiquitina lineal en comparación con el clon 1E3 progenitor. Se utilizaron los sobrenadantes de fagos procedentes de los ensayos ELISA en manchas de fagos (Ejemplo 3C) . El ensayo ELISA de competición se llevó a cabo como se ha descrito para la determinación de CI50 mediante ELISA (Ejemplo ID) excepto que se utilizaron sobrenadantes de fagos en lugar del fago purificado y solamente se utilizó una concentración (25 nM) de diubiquitina lineal soluble (Boston Biochem) . También se llevó a cabo la competición para cada clon sin añadir nada de diubiquitina lineal para determinar la señal de unión del fago en ausencia de cualquier antígeno competidor. El porcentaje de inhibición de la unión en presencia de la diubiquitina lineal 25 nM se calculó como [1- (DO450 para 25 nM lineal/DO450 para no lineal)] x 100%. El clon progenitor 1E3 mostró una inhibición porcentual variable de la unión comprendida en un intervalo entre 20% y 75% de inhibición en presencia de diubiquitina lineal 25 nM (véase la Tabla 5) . Esto fue debido a la variabilidad de la DO450 para la unión de la diubiquitina lineal en ausencia de cualquier diubiquitina lineal soluble en competencia. Los clones que demostraron un 60 por ciento de inhibición, o más, o aquellos que fueron aislados varias veces durante la clasificación con diubiquitina lineal fueron seleccionados para realizar análisis adicionales por determinación de la CI50en fago mediante ELISA.

La Tabla 5 siguiente muestra las secuencias de Ll, L2, L3, Hl, H2 y H3 de CDR procedentes de clones aislados en la clasificación de las bibliotecas de Ll, L2, L3, Hl, H2 y H3 NNK de 1E3, respectivamente frente a la diubiquitina lineal. También se muestran las señales de D045o procedentes de las manchas del ELISA de competición en ausencia y presencia de diubiquitina lineal soluble 25 nM. El porcentaje de inhibición de la unión en presencia de la diubiquitina lineal 25 nM se calculó como [1- (D0450 para 25 nM lineal/DO450 para no lineal)] x 100%. La Tabla 6 siguiente muestra las secuencias de Ll, L2f L3 , Hl, H2 y H3 de CDR procedentes de clones aislados en la clasificación de las bibliotecas de Ll, L2, L3, Hl, H2 y H3 K de 1E3 , respectivamente, contra la diubiquitina con unión K63.

La Tabla 5 divulga las secuencias de Ll de la CDR como las SEC ID Nros:l, 56, 199, 200, 200, 57, 201, 202, 202, 203, 204, 204-207, 207, 208, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 209, 209, 54, 54, 54, 54, 210, 55, 55, 53, 211, 212, 212, 212-214, 52, 52, 215, 215, 215, 216, 216, 217, 217, 217, 218, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, l y l, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 5 divulga las secuencias de L2 de la CDR como las SEC ID Nros:2, 59, 59, 58, 58, 58, 219, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 220, 220, 220, 220, 221, 221-223, 223-226, 226, 226, 62, 227, 228, 228, 229, 61, 61, 230-233, 233-237, 237, 238, 238, 238, 239, 239, 239, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2 y 2, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 5 divulga las secuencias de L3 de la CDR como las SEC ID Nros:3, 6, 6, 240, 240, 240-242, 66, 66, 66, 66, 243, 68, 244, 244-247, 247, 248, 248, 248, 70, 64, 64, 64, 64, 249, 250, 250, 71, 71, 251, 72, 72, 72, 72, 72, 72, 72, 69, 65, 65, 65, 252, 252, 252, 252, 252, 67, 67, 67, 67, 67, 67, 67, 67, 253, 3, 3, 3, 3 y 254, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 5 divulga las secuencias de Hl de la CDR como las SEC ID Nros:255, 256, 73, 79, 79, 257, 257, 75, 75, 75, 75, 77, 77, 77, 77, 77, 77, 77, 258, 258, 259, 81, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 78, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 80, 80, 80, 260, 260, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255 y 255, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 5 divulga las secuencias de H2 de la CDR como las SEC ID Nros:8, 17, 84, 261, 261, 261, 261, 261-263, 85, 83, 83, 264, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 86, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8 y 8, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 5 divulga las secuencias de H3 de la CDR como las SEC ID Nros : 265-269 , 269, 270-273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 274, 274, 274, 274, 274-278, 278, 278, 278-281, 281, 282, 282, 282, 282, 265, 265, 265, 265, 265, 265 y 265, respectivamente, en orden de aparición.

TABLA 5 - Clones seleccionados de dlUb en la 3* clasificación Ll NNK COR 11 24 25 n «% Inhibición R A S Q¡WTTT77] Pocilio 46.AS4674? 6742 ; R A S Q A V s T A V A tolo 32 SM674? i.267 0587 552S R A S Q i V s T A V A ¾>AS4<5?4? 0251 0.135 46.22 R A S O G v s T A V A 4? AB4KW7 0316 017 ti 0 R A Sü V s T A V A S6Aa4S747 .;¾».;;.' * tm -¦¦ ? 81.34* '' ? R A S Q' V s T A V A 168 36.AB4874? 01S1 46.45 R A S O H y s T A V A 23ABÍ4S747 0237 0. 17 50.63 R A S O S V s T A V A 4SAB4674? 0439 0138 5 18 R A S O á V s T A V A 41,??4ß?4? 0.291 0207 28 «7 R A S O f V s T A V A ¾> A8I 87 7 0833 034» 448? R A S Q;V V s T A V A 1 A9467*7 0247 0-15 3» 27 R A S Q't V s T A V A 81ABMÉ74? 0286 01 8 5564 R A S O D s T A V A 25,Á8¡4«74? 0.22S 0. 95 31.11 R A S O 0 Ii; s T A V A 37.AB48747 0.2*34 0.1» 3333 R A S Q D s T A V A 48.AS4674? 0118 22.HH R A S O 0 ¾ s T A V A 02AB46S7 0204 o osa m se R A S Q ? V f T A v A B5 9 674? 0272 0156 430! A S O. 0 V G T A V A 1A5 tO AS 46747 0.263 014 4677 R A S O D V G T A A 1SABI4§747 03SS 0211 4534 R A S Q D V G T A V A 1 A84S74? 0104 0.080 1058 R A S O D V 6 T A V A OH) 0 31 ®» R A S O 0 V G T A V A 35AS4B747 021 {i * SS<Ü1 R A $ Q 0 v G T A V A 03A846747 023ß (I 133 4364 R A S O D V T A V A UAB46747 0.195 013? 2974 R A S O D V L T A V A 18A8546747 0.187 01* 215» R A S O 0 R T A V A 3SABI4674? :,:;:S..77ft.*':. n, ; . :¦ t«5: .:. , R A S O D R T A V A 1D3 50?ß4874? 03 0 1» 4733 R A S O D V ft T A V A 58 A8f 46747 012 5420 R A S Q 0 V R T A V A 24.??4ß747 o ee s 00» 30 R A S O D V V T A A 20??4ß747 0281 0182 3523 R A S Q 0 V s c A V A 43AS4¾74? ; .¦ .ft#3¦; 0,'·?42?·· 77.4S- R A S O 0 y s G A V A 107 15 AS 46747 ¦>¾<ÍJKt.;: ^ .i e.m . .. ¾853.... 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ABI48748 01S1 0091 4972 s s 67AB!46747 0981 0635 3527 s s 74 ABI 46747 0229 01 3 5066 s s 76 AB14874? 0312 0167 4647 s s 77 ABI46747 0314 0189 3981 s s 79 ABI46747 1.021 079 2262 s s 94.ABI46747 0153 0099 3529 s s 96 ABI4S747 0415 025 3976 s s 02 ABI4S748 0332 0109 L : 67.17 s s 2A2 12 ASI46748 0.26 0 4 56.15 s s 24.ABÍ46748 0108 0094 1296 s s 65 ABI4S74? 0162 0115 2901 s s W ABÍ467 ? 0.248 0113 5407 s 5 8 ABÍ S747 0176 0 67 5.11 s s SS ABI4S747 0222 0102 5405 s s 80 ABI46747 2.066 141 31.45 s A S F A Y s 26 ABI4S748 0.408 0166 5931 s A S F A Y s 86 A8I46747 0759 0309 5929 s A S F ift Y s 82 AB4S747 031 0163 4742 s A S F T Y s 1 ABI4S748 0.1S7 0104 4439 s A S s 85 ABI4S747 0234 0 61 3120 s A S F ? Y s 15ABS48748 0129 0 os 3796 s A S F 1 Y s S3 ABI4S747 02S6 0135 4925 s A S F K Y s 13 ABI46748 0062 0063 -161 s A S F Y s 30 AB¡ 46748 0092 0062 3261 s A S F Y s 25 A614674S 0.364 0132 ' M7 : s A S F M Y s 2C1 26 AB14674S 0217 o;©» 64.06 s A S F N Y 3 2C4 04 ABI4574S 0139 0087 3741 s A S f P Y s 05 ABI45748 0168 0117 3036 s A S F P Y s 87 A6I S747 0197 0136 30.96 s A S F R Y s 09 ABI 45746 0:573 0.219 s A S F :¾ Y 3 2A9 20 ABI4S748 0328 0 s 5122 s A S F S Y s 17 ABI S74S 0312 0146 532 s A S F V Y 3 19 ABI 6748 02 0 33 ¦3350 s A 3 F Y Y 3 95 ABI 4674? 0251 0134 4661 s A S f L Y A OS A8I4S748 0122 0055 4672 s A S F t Y D 27 A6Í46748 0087 008 805 s A S F L Y D 73 ABM3747 0381 0 78 5328 s A S F L Y ?': 72 ?6?45747 03 0 77 4309 s A S r L Y G 75 ???46747 0259 0142 4721 s A S F L Y H 78 ABI46747 0232 0113 5129 s A S F L Y V 03 ABI 46748 1115 0789 2924 3 A S F L Y V 66. ABI 46747 0349 0 77 4928 s A S F L Y m 68 ABI 46747 0.3S7 0153 5831 s A S F L Y w 22 ABI45748 0098 0062 3673 s A S F L Y WL 16 ABÍ4S748 0128 0087 3203 s A S F L Y Y 21 ABI4S74S 0Q94 0077 1S09 s A S F L Y 29 AB!4S748 S45 059 3018 s A S F L Y Y 01 ABI4S747 037S 0186 5053 s A 3 F t Y 3 70 A6I46747 0238 0151 3655 s A S F L Y S 83 AB! 45747 0394 01S4 53.30 s A S F L Y S 84 ABI4S747 036S 0185 4945 s A S F L Y 3 90 ABI 46747 0115 0066 4310 s A S F L Y S 92 ABI43747 0138 0 Q93 3261 s A S F L Y S 01 ABI4S748 0 0 14 1857 A S F L Y S 08 ABI 46748 012 0068 4333 s A S F L Y S 14 ABI 46748 0112 0071 3661 s A 3 F L Y S 18 ABI4S74S 0838 0698 1671 s A S F L Y s 31 ABI46748 0145 0091 3724 s A S F L Y s 32 ABI 46748 0153 0097 36 SO s A 3 F L Y s TABLA 5 (CONT.) -Clones seleccionados de diUb en la 32 clasificación Ll NNK COR 97 nodlUb 28 nM % Inhibición Q QjS Y T T P T Pocilio 01 ABI 46748 014 0.114 1857 Q Q S Y T T P P T 67.ABI 46748 ::¾32 .:. : ·::¾3,? ,;- ™ Q Q 3 Y T T P P T 79.A3146748 0.208 0117 43.75 Q Q S Y T T P P T 85.A31 6748 0285 0129 54.74 Q Q s Y T T P P T 87.A3143748 0134 007 4776 Q O s Y T T P T T TABLA 5 (CONT.) - Clones seleccionados de diUb en la 31 clasificación Hl NNK 30 no diUb 25 nM lio ¦% Inhibición T Y 1 s | Poci Y i s Y 1 s 3A5 Y s Y 1 s 3D6 Y 1 s Y 1 s Y 1 s Y ! s Y 1 s 387 Y I s Y I s Y 1 s Y 1 s Y ! s 3C9 Y 1 s Y i s Y i s Y 1 s Y i s Y 1 3 Y 1 s 3F1 Y 1 s 3A7 Y 1 s Y i s Y 1 s Y 1 s Y 1 s Y ! s Y 1 s 1 s Y 1 s Y i s Y í s Y ¡ s Y I s Y 1 s 302 Y ¡ s Y 1 s 381 Y 1 s Y 1 s Y 1 s Y 1 s Y 1 s Y ! s Y i s Y 1 s Y s Y M s 3E Y s Y V s Y V s Y i s Y f s Y I s Y 1 s Y 1 s Y I s Y 1 s Y I s Y 1 s Y I s Y i s Y ! s Y ! s TABLA 5 (CONT,)-Clonesselecc¡onadosded¡Ubenla32clas¡ficación HZNNK CDRH2 y 58 no diUb 25 n % Inhibición | A S I T P S S G S T D | 84 A3I46749 0108 0081 2500 A T I T P s s G S T D 94 A3146749 0.373 0.122 :":::'«r:29 A s :S T P s s G S T D 3H10 69ABI46749 0145 0.083 4315 A s .V T P s s G S T D 74.A3I46749 0168 0.097 4226 A s V T P 5 s G S T D 02 A8Í4S750 0367 0167 5450 A s V T P s s 6 S T D 07ABI46750 0345 0.168 5145 A s V T P s s G S T D 16A3I46750 0235 0.151 3574 A s V T P s s G S T D 70ABI46749 0047 0.044 638 A s I T P * s s s T D 75A8I46749 0207 0093 5507 A s I T P s s G H T D 14 ABÍ46750 :¾0.23S 0.083 : 60.59 A s I T P s s G 1 T D 482 93A3I46749 0.236 ao9i.: 61.44 A s I T P s s G L T D 3H9 22A3I48750 0SS2 : W 6270 A s I T P s s 6 L T D 66 ASI 46749 0183 0.074 5956 A s I T P s s G y T 0 65AB146749 0185 0.131 2957 A s I T P s s G Q T D 3F5 72.A3146749 0102 0.089 1275 A s I T P s s G Q T D 73A8I46749 012S 0083 34.13 A s ! T P s s G Q T 0 81 AB146749 0261 0.11 5785 A s I T P s s G Q T D 90??!4ß74d 0243 O.OSS 5926 A s I T P s s 6 O T 0 92 3I46749 0 44 0.084 4167 A s l T P s s G-a T D 95ABÍ46749 0213 0094 5587 A s ¡ T P s s G 0 T D 96ABI46749 0243 0154 3663 A s ¡ T P s 3 G Q T 0 11 ABH6750 029 0.161 4448 A s I I P s s G Q T D 1SABI46750 0.34 0.191 4382 A s I T P s s G Q T D 23A8I46750 024 0126 4750 A s l T P s s G Q T D 29.ABI46750 0.162 : 65153 : A s 1 T P s s G S T N 4C5 01 A3I46749 A s 1 T P s 3 G 3 T 0 67 A3I46749 A s 1 T P s 3 G S T D 68 A3I46749 A s 1 T P s s G S T D 71 ABI46749 A s 1 T P s 3 G S T D 76.A3I46749 A s 1 T P s s G S T D 77 A8I46749 A s 1 T P s s G S T 0 78ABI46749 A s 1 T P s s G S T 0 79 ASI 46749 A s 1 T P s s G S T D 80 A3I46749 A s 1 T P s s G S T D 82 ABI46749 A s l T P s s G S T D 83 ABI4 749 A s 1 T P s s G S T D 85A3I46749 A s 1 T P s 3 G S T Q 86A3I46749 A s 1 T P s s G S T D 87 ABI46749 A s 1 T P s 3 G S T D 88 ABI46749 A s I T P s s G S T D 89A3I46749 A s 1 T P s s G S T D 91 A3I46749 A s 1 T P s 3 G S T D 01 ABI46750 A s 1 T P s 3 6 S T D 05A8I46750 A s 1 T P s s G S T D 06A3I46750 A s 1 T P s 3 G 3 T D 09ABI46750 A s j T P s s G S T D 10A3I4675Q A s i T P s s G S T D 12A8!46750 A s j T P s 3 G 3 T D 13ABÍ46750 A s 1 T P s 3 G S T D 15AB1467S0 A s ¡ T P s 3 G 3 T D 17A3I46750 A s ! T P s 3 G S T D 18ABI46 50 A s i T P s s G S T D 20ABI46750 A s T P s 3 G 3 T D 21 AB146750 A s 1 T P s s G S T D 24 ABI4675G A s I T P s s G S T D 25 A3I467S0 A s 1 T P s 3 G S T D 26A3Í46750 A s 1 T P s s G S T D 27 ABI46750 A s 1 T P s s G S T D 28ABI46750 A s 1 T P s 3 G 3 T 0 30ABÍ46750 A s 1 T P s 3 G S T D 31 A3I46 50 A s i T P s 3 G S T D 32A8I46750 A s i T P s 3 G S T D La Tabla 6 divulga las secuencias de Ll de la CDR como las SEC ID Nros:l, 283, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 284, 54, 285, 285-288, 55, 55, 55, 53, 289, 289, 290, 290, 290, 290, 290, 290-294, 327, 295, 295, 295, 295-297, 297, 1, 1, 1, 1, 1, 1 y 1, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 6 divulga las secuencias de L2 de la CDR como las SEC ID Nros:2, 298, 299, 60, 60, 300, 302-305, 305-307, 307, 307-309, 309, 309, 310, 310-314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 315, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2 y 2, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 6 divulga las secuencias de L3 de la CDR como las SEC ID Nros:3, 6, 6, 6, 6, 6, 316-318, 318, 319, 66, 66, 320, 321, 321, 321, 321-324, 324, 324, 325, 301, 326, 301, 326, 382, 328, 328, 329, 64, 64, 330, 330, 331, 331, 331, 331, 331, 71, 71, 71, 71, 71, 71, 332, 69, 333, 333, 67, 67, 67, 67, 67, 334, 334, 334, 335, 335, 335, 3, 3, 3 y 3, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 6 divulga las secuencias de Hl de la CDR como las SEC ID Nros:255, 336, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337-340, 340-343, 343, 343, 343, 343, 343, 344, 344, 344, 344, 344, 344, 81, 81, 81, 81, 81, 81, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76 y 255, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 6 divulga las secuencias de H2 de la CDR como las SEC ID Nros:8, 346, 347, 345, 348, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349-351, 351, 351, 351, 352, 352, 352, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 354, 8, 8, 8, 8, 8 y 8, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 6 divulga las secuencia de H3 de la CDR como las SEC ID Nros : 355-358 , 358, 359, 359-362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362-367, 355, 355, 355, 355, 355, 355, 355, 355, 355 y 355, respectivamente, en orden de aparición. "O" es un TAA de detención ocre y "q" es un TAG de detención ámbar que se puede sustituir por Gln (Q) por ejemplo mediante el uso de líneas celulares con AR t supresor.

TABLA 6 - Clones seleccionados de diUb K63 en la 33 clasificación Ll NNK 26 05 07 11 22 25 28 32 36 41 48 49 50 51 52 53 54 55 57 58 62 64 42 06 18 31 20 16 24 39 43 47 04 34 AS! 46771 R A s ü V s 63 ASI 46771 R A s Q D s 09.AB146771 R A s Q D V 3 2. ABl 46771 R A 3 Q D V s 27.AB 46771 R Q D s 29 ABl 46771 R A s Q o V s 3S AS46771 R A s Q s 56 AB! 46771 R A s Q D s 33.AS46771 R A s Q D 23.ABI46771 R A 3 Q D s 30.A8146771 R A s Q f) V 3 59 AB! 46771 R A s Q D y s 08 ABl 46771 R A s Q s 02 AB! 46771 R A s Q D y s 10.AS46771 R A s Q D V s 1Ó.ABI46771 R A s Q s 40. ABl 46771 R A s Q v 3 38.AB! 46771 R A s Q D V 3 T A L A 17.AB! 46771 R A s Q y s I A s A 61 AB! 46771 R A s 0 y s T A s A 03. AB! 46771 R A S Q D V 3 T A y A 13. ABl 46771 R A 3 Q D V 3 T A y A 14 ABl 46771 R A s Q D V s T A V A 21 AB! 46771 R A S 0 D y s A v A 45 AB! 46771 a A s Q D V s T A v A 46 AB! 46771 R A s Q D V s T A y A 60. AB! 46771 R A s Q D V s A V A TABLA 6 (CONT.) -Clones seleccionados de diUb 63 en la 3¾ clasificación 12 NNK SOASi 46771 s A 3 F L Y - 89ABÍ46771 3 A 3 F L Y « 91A6146771 3 A 3 F L Y 93AB! 46771 S A S F L Y « 96ABÍ46771 3 A S F L Y w 1JA6S46772 S A s r L Y w 15A3Í46772 3 A 3 F L Y 16.ABÍ46772 S A S F L Y 23 ABÍ46772 S A S F L Y w 31 A8U6772 S A 3 F L Y w 1S Bi46772 3 A S F L Y v S6AB!46771 S A S F L Y S S7ABÍ 46771 S A 3 F L Y S SSABi 46771 s A S F L Y 3 92AB! 46771 s A 3 F L y S 95ABI 6771 s A S F L Y S 01ABM6772 3 A 3 F L Y S 02ABI46772 S A 3 F L Y S 04ABI46772 3 A S F L Y S 07 ABf 46772 S A 3 F L Y S 0SABÍ4ÍS772 S A S F L Y S 12ABÍ46772 S A S F L Y s 22ABi-¾7í2 S A s F L Y s 2SA8I46772 s A s F L Y s TABLA 6 (CONT.) -Clones seleccionados de diUb K63 en la 33 clasificación L3 NNK CDR L3 1E3 W Q S Y T T P T p l 54.ABs46772 Q Q 3 Y T T P P T 56 ABÍ46772 Q Q S Y T T P P T 67 ABS 6772 O O s Y T T P P T 82 AB-46772 Q Q s Y T T P P T TABLA 6 (CONT.) - Clones seleccionados de diUb K63 en la 33 clasificación Hl NNK 30 35 1E3 Wl í Y Si 53 AB 46773 s Y T Y s 04 AB 46773 s 1 Y s 01 AB46773 s ti T Y 1 s TABLA 6 (CONT.) -Clones seleccionados de diUb 63 en la 35 clasificación H2 NNK CO H2 1E3 T I A S i T P s S G S o 69ABI46773 A S 1 T P s Y G s T D 70 A6I48773 A S ¡ T P s Y G s T D 73ABÍ46773 A S 1 T P s Y G s T 0 75ABI46773 A S 1 T P s Y G s T D 76A.B! 46773 A S I T P s Y s T 0 77A6Í45773 A S í T P s Y G s T D 79ABÍ 46773 A S ! T P s Y s T 0 80ABI46773 A S i T P s Y G s T D 82ABÍ46773 A S 1 T P s Y s T 0 83 ABÍ46773 A S i P s Y G s D 85ABÍ46773 A S 1 T P s Y s T D 87ABI46773 A i P s Y s 0 90ABI46773 A S i T P s Y G s T 0 68ABÍ46773 A P s s 0 S9ABI46773 A S 1 T P s S G s T D 9SABÍ46773 A S í T P s S 3 T 0 0ÍABI46774 A S ! T P s S G s T 0 21 ABÍ46774 A 1 P s s 25ABI46774 A S ! T P s S G s T D TABLA 6 (CONT.) - Clones seleccionados de diUb K63 en la 33 clasificación H3 NNK 95 CDR 102 "3 1E2¡ | r y I G Q G T L V T V S S 75 ABi 6774 1 Vi D Y vv G G 7 7 V s s 40. ABi 46774 vv VV D Y vv G Q G T L V V s 3 54 ABi 46774 T vv L VV V D Y vv G Q G T L V A V s s 55 ABi 46774 T Y R V M D Y vv G Q G T V A V s s 47 ABi 46774 T vv L 1 R VV V V! D Y vv G Q G T L V 7 V s s SS. ABi 46774 T v u 1 R VV Vi 0 Y vv G Q G T V V 8 s S9.AB! 46774 T VV L i VV V M D Y vv G Q G 7 L V V s s 57 ABI 46774 T v L L R G V M D Y vv G Q G 7 L V T V s s 33 ABi 46774 T vv L L vv y F; D v vv y s s 34 ABi 46774 T vv L L R vv V D Y vv y s s 35.ABI 46774 T v D Y vv V s s 36 ABi 46774 T vv L L R vv V ? D vv s s 37.ABÍ 46774 T vv L L vv V D Y vv V s s 42.ABÍ 46774 T vv L L R w V J. D v V s s 43. ABI 46774 T vv L L vv V F'- D vv y s s 44 ABi 46774 vv L L vv V D Y vv V s 5 45.AB! 46774 T vv L vv V F D Y vv y 3 s 46 ABi 46774 T vv L L R vv V :F- D Y vv y s s 48 ABi 46774 T L L v V ?. D Y vv y s s 49 ABi 46774 T vv L L R w V Q Y vv V s s 51 ABi 46774 L R w V¦ 'F Q Y vv V s s 53 AB¡46?74 T v L L R w ¦r D v V s s 56 ABi 46774 T w L L R vv V 0 Y w V s s 59 ABi 46774 vv L R VV V 0 v V s s 61 ABÍ46774 T vv R v V v y s s 62 ABi 46774 w L L R v V D v y s s 64 AB! 46774 T w R v V w y s s 65 ASÍ 46774 T vv L L R w V D v y s s 66 ABi 46774 T vv L R v V D v s 3 6S ABi 46774 R v V ¦Fi D v V s s 69 ABI 46774 T v L L v V F D v G Q G T L V A V s s 70 ABi 46774 w R v V w G G y A y s s 72 ABi 46774 T v L L R vv V D vv G G G T L y A y s s 73 ABi 46774 v L t R v V F D v G 0 G 7 y A V s s 76 ABi 46774 7 w L L R v y F i D w G Q G L y A V s 3 78 ABi 46774 v L L R vv V D v G Q G T L V A s s 80 ABi 46774 vv R vv vv G Q G y A y s s 81 ABÍ46774 T v L L w V ifV D vv G 0 G L y A V s s S2AB! 46774 v R v V D Y v G a ¦3 A V s 3 S3 ABi 46774 T v L L R vv D Y v G Q G T L V V s s 85 ABi 46774 T v L L R vv D Y vv G C 3 T ¥ s s S7. ABi 46774 T v L L R vv D Y vv G 0 G T A y s s 60. ABi 46774 T w L L R v V D Y vv G ü G T L A V s s 92 ABi 6774 T v L R vv V D Y vv G 0 G T t V A s s 95 ABi 46774 T vv L R vv V D Y vv G G G T V s s 95. ABi 46774 T V/ L L R vv V F D Y vv G Q G T L V A s s 93A6! 46774 T v L L R vv V D Y v G Ü G T L V V s s 5S.ABÍ 46774 T w L L R vv V m; D Y v G G G T L V T V s s 39. ASi 46774 T v L vv V D A : v G G G T V 7 V s s 79.AB? 46774 T v L L R v V Vi D Q . V/ G G G T L. V A V s s 52 ABi 6774 T v L L R w V Vi D Y vv G G G T y Á y s s 3S.ABÍ 46774 T v L L R vv V f,1 D Y vv G G G T y T s s 60. ABi 46774 T vv L L R vv V D Y vv G G G T L. V A V s s 63 ABi 46774 T vv L R vv V D Y vv G G G T L y ? y s s 67 ABi 46774 7 v L L R v V D Y vv G G G T L y T y s s 71. ABi 46774 T v R w V a D Y v G G G T V T y s s 77 ABi 46774 7 v L R w V ·,' D Y v G Q G í L V T V s s 64 ABi 46774 T v L L R vv V D Y w G Q G L V T V s s 86 ABi 46774 T L L R v V Vi D Y vv G Q G T L V T y s s 91 ABi 46774 T v t R v Vi D Y w G Q G T L V T y s s 94 ABi 46774 T w L L R v vv G Q G T L V V s s CI50 de fago mediante ELISA Ocho clones procedentes de la biblioteca Ll, seis de la biblioteca L2, nueve de la biblioteca L3, nueve de la biblioteca Hl, cinco de la biblioteca H2, y siete de la biblioteca H3 se ensayaron para determinar la CI50 mediante ELISA tal como se ha descrito en el Ejemplo ID. Se utilizaron diluciones en serie de tres veces de diubiquitina lineal (Boston Biochem) desde 500 nM a 0,23 nM. En cada experimento, el clon 1E3 T se incluyó para comparación. El valor de la CI50 para 1E3 varía entre los experimentos, sin embargo se pudieron identificar los clones con mayor afinidad para la diubiquitina lineal que para el clon progenitor. En un intento de identificar los mutantes que tenían una afinidad mejorada para la diubiquitina lineal con una unión mínima a la diubiquitina con unión K63, los clones ensayados en la determinación de la CI50 mediante ELISA se restringieron teniendo en cuenta si su valor de CI50 había mejorado en comparación con el 1E3 original, bien se aislaran en la clasificación con la diubiquitina con unión K63 (Ejemplo 3C) o bien por su señal de unión a la diubiquitina con unión K63 en el ELISA en manchas de fagos (Ejemplo 3C) . Los clones con valores mejorados de la CI50 comparados con los de 1E3 que fueron aislados varias veces en la clasificación con la diubiquitina lineal pero que no se aislaron en la clasificación con la diubiquitina con unión K63 y que no demostraron unión a la diubiquitina con unión K63 en el ELISA de las manchas (DO450 inferior a 0,1) se seleccionaron para análisis adicional (1F11, 2A2, 2C11, 2H5, 3E4, 4C9, 4E4, y 4G7) (véase la Tabla 7) . Si un clon con un valor de CI5o mejorado que fue aislado varias veces en la clasificación con diubiquitina lineal, solo se aislaba una vez en la clasificación con diubiquitina con unión K63, y no demostró unión a la diubiquitina con unión K63 en el ELISA de las manchas de fago, entonces se tuvo en cuenta para análisis adicionales (3F5) (véase la Tabla 7) . Los clones 3A7 y 4C10 que se aislaron varias veces en las clasificaciones tanto con diubiquitina lineal como con diubiquitina con unión K63 se seleccionaron como controles negativos. Estos 11 clones junto con 1E3 se analizaron adicionalmente en un ELISA de especificidad en fago. La Tabla 7 siguiente muestra las secuencias de Ll, L2, L3 , Hl, H2 y H3 de CDR procedentes de clones de la clasificación de las bibliotecas de Ll, L2, L3, Hl, H2 y H3 K de 1E3, respectivamente, contra la diubiquitina lineal que se caracterizaron adicionalmente mediante la determinación de la CI50 mediante ELISA. Se proporcionan los valores de la CI50 y las veces de mejora con respecto al valor de CI50 del 1E3 parental . La unión a la diubiquitina con unión K63 se define por tener una DO450 superior a 0,1 en el ELISA en las manchas de fago. También se muestra la inhibición porcentual de la unión en la presencia de diubiquitina lineal soluble 25 nM en el ELISA de competición realizados en manchas de fagos. Se indica el número de veces en que cada clon fue aislado en las clasificaciones de la biblioteca con la diubiquitina lineal o la diubiquitina con unión K63.

La Tabla 7 divulga las secuencias de Ll de la CDR como las SEC ID Nros:l, 1 y 50-57, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 7 divulga las secuencias de L2 de la CDR como las SEC ID Nros:2 y 58-63, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 7 divulga las secuencias de L3 de la CDR como las SEC ID Nros:3, 3, 64, 65, 3 y 66-72, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 7 divulga las secuencias de Hl de la CDR como las SEC ID Nros:255 y 73-81, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 7 divulga las secuencias de H2 de la CDR como las SEC ID Nros:8 y 82-86, respectivamente, en orden de aparición. La Tabla 7 divulga las secuencias de H3 de la CDR como las SEC ID Nros : 368-372 , 368 y 373-375, respectivamente, en orden de aparición.

TABLA 7 CO L1 34 clon CDR CI50 (nm) ! Veces de mejora 4 Unión K63 % % IInnhhiibbición ¾ lineal aislado NiKÉ3^islado WT 1E3 34 R A s O D V s T A A 5 1E3 ÜJP 40 R A s 0 0 V s T A V A V A si 43 3 21 1A5 L1 30 12 R A s Q D V G T A 1Í.7 U 24 1 5 R A s Q D V s T Y V A no &3 3 0 61 2 0 1?8 L1 33 1 1 R A s Q D V s T Q V no 183 L1 25 15 R A s O D V s 1 A V no 69 1 1 islado.

C0 L3 clon CI50 (nm) Veces de mejora 89 97 Unión K63 % Inhibición Na lineal aislado ¾ K63 aislado WJ 1E3 34 Q Q S Y T T P P T WT 1E3 dup 40 Q Q s y T T P P T 2C9 L3 11 3.4 Q Q S Y T p P T sí 65 2 2C11 L3 26 1.4 Q Q S Y T k P P T no 72 3 0 WT 1E3 dup L3 26 Q ü S Y T T P P T 202 L3 20 1.3 Q Q s T T P P T no 63 4 2 2E1 L3 16 1.6 0 Q S Y T s P P T si- 71 8 5 2E2 13 56 0.5 Q Q s ;;«:: t T P P T nc 72 1 1 2F8 L3 15 1.7 0 Q S Y T P P P T si66 1 1 2F10 L3 29 0.9 Q Q s Y m T P P T rio 69 1 0 2G11 L3 14 1.9 Q Q S Y T e- P P T si€1 2 6 2H5 L3 15 1.7 Q Q S Y T N P P T no 77 7 0 CDRH1 clon COR CI50(nm) Veces de mejora 30 35 Unión K63 % Inhibición Ns lineal aislado Ns K63 aislado '?? 1E3 H1 43 s N T Y S 3A5 H1 73 06 Fi N T Y ¡ S no 69 1 0 3A7 H1 ts 2.9 S N L Y I s si 77 14 14 38? H1 33 13 u T Y 1 s no 68 4 0 3B11 H1 18 24 s u Vi Y 1 s sí 70 10 10 3C9 H1 53 08 R n T Y I s no 66 7 0 3D2 H1 SO 01 S fi M Y s no 70 1 0 3D6 H1 56 08 K N T Y 1 s no 68 .2 0 10 3E4 H1 21 20 s N T Y M s no 72 3 0 3F1 H1 30 1.4 s H i Y s no 62 1 6 CORH2 clon CP I50(nm)£ Veces de mejora 58Unión 63 % Inhibición i ?ß lineal aislado Ns K63 aislado «? 1E3 4§ A 15 JF5 H2 18 2* A no 59 11 1 3H9 H2 44 1.1 A no 61 2 0 3tU0 H2 33 1.5 A. no 67 1 0 4B2 H2 92 0.5 A rio 61 1 0 4C5 H2 SO 0.6 A no 66 1 0 20 don CPR CISO inmj Veces de mejora a -•¡Unión K63 «Inhibición N* lineal ai-la<ÍofN|8K63sistado F) Especi icidad de fago mediante ELISA 1F11, 2A2, 2C11, 2H5 , 3E4, 4C9, 4E4, 4G7, 3F5, 3A7 , y 4C10 junto con el clon progenitor 1E3 se ensayaron en un ELISA de especificidad de fago contra monoubiquitina (Boston Biochem) , diubiquitina lineal (Boston Biochem) , diubiquitina con unión Kll (Genentech) , diubiquitina con unión K48 (Boston Biochem) , diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) , un anticuerpo contra gD (Genentech) , o un pocilio sin revestir. El panel de proteínas ubiquitina se inmovilizó en inmunoplacas Maxisorb (NUNC) de 96 pocilios (véanse las Figs. 7A y 7B) . Las placas se revistieron durante la noche a 4°C con l g/ml de cada proteína en tampón de carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6. Las placas revestidas se bloquearon con 200 µ?/pocillo de leche al 2,5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. Se realizaron seis diluciones en serie de dos veces del fago desde D0268 = 1/ 0 a D0268 = 0,03 en leche al 2,5% en PBST. Después de una hora, el tampón de bloqueo se vertió sobre la placa y se añadieron 100 µ? de las diluciones en serie del fago. Las placas se incubaron durante una hora a 25°C con agitación. A continuación, la placa se lavó seis veces con PBST mediante un lavador de placas. Se utilizó una dilución 1:5.000 de un anticuerpo secundario dirigido contra M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (GE Healthcare) en PBST para la detección de la unión al fago, se añadieron 100 µ?/pocillo de la dilución secundaria, y la placa se incubó durante 1,25 horas a 25°C con agitación. A continuación, la placa se lavó seis veces con PBST utilizando un lavador de placas y dos veces manualmente con PBS. El anticuerpo secundario unido se detectó mediante el uso de un sustrato TMB (KPL) seguido por inactivación rápida con igual volumen de ácido fosfórico 1 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm.

Los clones 3A7 y 4C10 que se aislaron múltiples veces en las clasificaciones tanto con diubiquitina lineal como con diubiquitina con unión K63 se utilizaron como controles negativos. Ambos demostraron una unión significativa a un fago con unión K63 para una D0268 = 1 0 (DO450 = 0, 44 y DO450 = 0,5 para 3A7 y 4C10, respectivamente (véanse las FIGs . 7A y 7B) . 2A2, que fue aislado dos veces en la clasificación con diubiquitina con unión K63 mostró niveles intermedios en la unión a diubiquitina con unión K63 (DO450 = 0, 2 para una D02ss = 1,0 de fago). El resto de los clones mostraron una unión insignificante a la diubiquitina con unión K63 (DO450 < 0,16 para una D02ss = 1/0 de fago) .

G) Clonación de imitantes dobles de cadena ligera / cadena pesada Los clones que mostraron valores mejorados de la CI50 comparados con los del progenitor 1E3 (Ejemplo 3E) y que mostraron una unión insignificante a la diubiquitina con unión K63 en el ELISA de especificidad de fago (Ejemplo 3F) se seleccionaron para análisis adicional. Esto incluye los mutantes de cadena ligera 1F11, 2C11, y 2H5, y los mutantes de cadena pesada 3E4, 3F5, y 4G7. Para observar si se producía un efecto aditivo en la mejora de afinidad se construyeron mutantes dobles combinando diferentes combinaciones de mutaciones de la cadena ligera y pesada. Los dominios variables de cadena ligera se eliminaron mediante digestión de los fagémidos con EcoRV y Kpnl, y se clonaron a continuación en los diferentes fagémidos mutantes de cadena pesada utilizando los mismos sitos.

H) CI so mediante ELISA de fagos mutantes dobles Los mutantes dobles 1F11/3E4, 1F11/3F5, 1F11/4G7, 2C11/3E4, 2C11/3F5, 2C11/4G7, 2H5/3E4, 2H5/3F5, y 2H5/4G7 se compararon con sus correspondientes mutantes únicos y el 1E3 progenitor en una determinación de la CI50 en fago mediante ELISA tal como se ha descrito anteriormente (Ejemplos ID y 3E) . Los mutantes dobles 1F11/3F5 y 2H5/3F5 demostraron una mejora aditiva en la afinidad con respecto a sus mutantes únicos individuales (véase la Tabla 8) . 2C11/3F5 estaba en el límite de aditividad. Él mutante único 3F5 proporcionó, en este ensayo particular, un valor de la CI50 (9 nM) inferior al de los otros dos experimentos (12 o 13 nM) lo que podría llevar a considerar 2C11/3F5 (CI50 de 10 nM) como no aditivo.

Por tanto, también 2C11/3F5 fue seleccionado para análisis adicional . i CI50 (nM) CDR Mutación WT 29 1F1 1 14 L2 S52K 3E4 44 H1 I34M 3F5 12 H2 S56Q 4G7 23 H3 Y102G 1 F11/3E4 12 L2>H 1 S52K 134M 1F11/3F5 5 L2 H2 S52 S56Q 1F11/4G7 13 L2.«3 S52K Y102G WT 24 2C11 20 L3 T94Q 3E4 33 H1 I34 3F5 9 H2 S66Q 4G7 16 H3 Y102G 2C 11/3E4 24 L3iH1 T94Q 134M 2C 11/3F5 10 L3/H2 T94Q S56Q 2C 11/4G7 31 L3 H3 T94Q Y102G WT 25 2H5 17 L3 T94N 3E4 26 H 1 I34M 3F5 13 H2 S56Q 4G7 19 H3 Y102G 2H5/3E4 26 L3/H1 T94N 134 2H5/3F5 8 L3/H2 T94N S56Q 2H5/4G7 23 L3iH3 T94N Y102G Especificidad mediante ELISA de fagos mutantes dobles Los imitantes dobles 1F11/3F5, 2C11/3F5, y 2H5/3F5 se compararon con sus correspondientes mutantes únicos y el 1E3 progenitor en un ensayo de especificidad de fago mediante ELISA tal como se ha descrito en el Ejemplo 3F. Todos los mutantes dobles mostraron una unión insignificante a la diubiquitina con unión K63 (DO450 < 0,1 para una D0268 = 1/ 0 de fago) (véanse las FiGs. 8A y 8B) .

J) Producción de Fab mutante doble El clon progenitor (1E3) , los mutantes únicos (1F11, 2C11, 2H5, 3F5) y los dobles mutantes (1F11/3F5, 2C11/3F5, 2H5/3F5) se clonaron con construcciones de expresión de Fab insertando un codón de detención TAA en los fagémidos al final del dominio CH1 tal como se ha descrito en el Ejemplo 1E. Estos Fabs se expresaron en E. coli y se purificaron tal como se ha descrito en el Ejemplo 1E.

K) Conversión al fozmato IgG El clon progenitor (1E3) , los mutantes únicos (1F11, 2C11, 2H5, 3F5) y los dobles mutantes (1F11/3F5, 2C11/3F5, 2H5/3F5) también se expresaron en células HEK293 en forma de inmunoglobulinas humanas (IgG) . Se generaron construcciones de expresión clonando los dominios variables de Fab en construcciones de expresión de pRK de mamífero que codificaban las cadenas pesada y ligera de la IgGl kappa humana (Gorman y col., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). Las igG se purificaron mediante cromatografía por afinidad en columnas de proteína A-sefarosa según metodologías estandarizadas tal como se ha descrito en el Ejemplo 1E para la purificación de Fab.

L) Biacore de mutante doble .

La afinidad de los Fab mutantes dobles (del Ejemplo 3J) se analizó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) mediante un equipo BIACORE™ 3000 (GE Healthcare) y unión directa tal como se ha descrito en el Ejemplo 1G. Aproximadamente 150 unidades de resonancia (UR) de diubiquitina lineal (Boston Biochem) , diubiquitina con unión K48 (Boston Biochem) , y diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) se inmovilizaron en la celda de flujo dos, celda de flujo tres, y celda de flujo cuatro, respectivamente, de un chip CM5 usando el protocolo de acoplamiento de amina suministrado por el fabricante. La celda de flujo uno se activó y se bloqueó mediante etanolamina sin proteína inmovilizante para su uso como resta de referencia. Incluso con glicina 10 mM, pH 1,7 la superficie del chip no se pudo regenerar en su totalidad a los valores iniciales y se observó un aumento en las UR sugiriendo que la superficie del chip se había alterado.

Se ensayó una hipótesis alternativa utilizando un método de captura de IgG con las IgG del Ejemplo 3K mediante un equipo BIACORE™ 3000 (GE Healthcare). Aproximadamente 8.000 unidades de resonancia (UR) de un anticuerpo de captura dirigido contra Fe humano (GE Healthcare) se inmovilizaron en las celdas de flujo uno y dos de un chip CM5 usando el protocolo de acoplamiento de amina suministrado por el fabricante. 60 µ? de IgG 1 g/ml en Hepes 10 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, y Tween 20 al 0,01%(HBST) se inyectaron a un caudal de 30 µ?/minuto) en la celda de flujo dos, dando como resultado la captura de aproximadamente 750 UR de la IgG. La celda de captura uno tenía solamente el anticuerpo de captura para servir como resta de referencia. Diluciones en serie de dos veces (3,9-500 nM) de diubiquitina lineal (Boston Biochem) o diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) en HBST se inyectaron (60 µ? en total a un caudal de 30 µ?/minuto) en las celdas de flujo uno y dos. Se registró la señal de cada celda de flujo y se restó la señal de la referencia. Tras un periodo de disociación de cuatro minutos, la superficie del chip se regeneró con una inyección de 15 µ? de MgCl2 3 M a un caudal de 30 µ?/minuto. De forma muy similar al experimento de captura de Fab mediante Biacore (véase el Ejemplo 1G) , los datos fueron difíciles de ajustar a cualquier modelo de unión por que la diubiquitina no se disoció completamente del chip. Además, las velocidades de asociación fueron muy rápidas y la unión no alcanzó una meseta ni siquiera para la concentración de diubiquitina más elevada utilizada. Por tanto, es difícil estimar una KD para estas IgG.

M) Transferencias Western de diubiquitina purificada con imitantes dobles Para ordenar la afinidad y especificidad de los mutantes dobles, las IgG descritas en el Ejemplo 3K se analizaron en una transferencia Western para determinar su unión a la diubiquitina lineal (Boston Biochem) y la diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) . 1 de diubiquitina con unión K63 y cinco diluciones en serie de tres veces de diubiquitina lineal (1000, 333, 111, 37, 12 ng) en tampón LDS IX (Invitrogen) con agente reductor se calentó a 70°C durante diez minutos y se analizó en geles NuPAGE Bis Tris 1,0 mm 4-12% en tampón MES (Invitrogen) . Los geles se transfirieron a 30 V constantes durante 1 hora mediante transferencia en húmedo con metanol al 10% y tampón de transferencia NuPAGE IX (Invitrogen) a 0,2 µp? de nitrocelulosa (Invitrogen). Los sitios de unión no específicos de las membranas se bloquearon mediante incubación en leche al 5% en PBST durante 1 hora a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se incubaron en 1 g/ml de IgG de 1E3 1F11, 2C11, 2H5, 3F5, 1F11/3F5, 2C11/3F5, o 2H5/3F5 en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. Las membranas se lavaron tres veces en PBST con agitación. Las IgG se detectaron incubando la membrana en una dilución 1:10.000 de anticuerpo secundario de cabra específico dirigido contra Fab humano conjugado con colorante IR 800-CW (Sigma Aldrich) en leche al 5% en PBST durante 30 minutos a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se lavaron tres veces en PBST seguido por un lavado en PBS . El anticuerpo secundario se detectó y se cuantificó mediante el sistema de obtención de imágenes infrarrojas LICOR Odyssey (LI-COR Biosciences) .

Los mutantes únicos 1F11 y 3F5 fueron mucho más sensibles que el 1E3 progenitor, mientras que los mutantes únicos 2C11 y 2H5 solo mejoraron ligeramente (véase la FIG. 10) . El mutante doble 1F11/3F5 tuvo una mejora aditiva en la sensibilidad con respecto a los respectivos mutantes individuales, mientras que 2C11/3F5 y 2H5/3F5 no resultaron mejor que 3F5 solo.

N) Clonación de mutantes triples Para observar si se podía conseguir una mejora adicional en la afinidad mediante la combinación de tres mutaciones, se generaron los mutantes triples 1F11/2C11/3F5 y 1F11/2H5/3F5. Los oligonucleótidos mutagénicos 5'-lFll S52K (CCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCAAAGTTCCTCTA CTCTGGAGTCCC) (SEC ID N°:187) y 3'-lFll S52K (GGGACTCCAGAGTAG AGGAACTTTGCCGAGTAAATCAGAAGCTTCGG) (SEC ID N°:188) se combinaron con cualquiera de las construcciones de cadena ligera 2C11 o 2H5 de pRK procedentes del Ejemplo 3K y se utilizó el kit de mutagénesis dirigida al emplazamiento QuikChange® Lightning (Agilent) para generar las cadenas ligeras del mutante doble. A continuación se generaron mutantes triples combinando las construcciones de pRK de cadena ligera del mutante doble con la construcción de pRK de cadena pesada 3F5 y las IgG se expresaron en células HEK293 y se purificaron tal como se ha descrito en el Ejemplo 3K.

O) Transferencias Western de diubiquitina purificada con mutantes triples Para ordenar la afinidad y especificidad de los mutantes triples 1F11/2C11/3F5 y 1F11/2H5/3F5 , las IgG descritas en el Ejemplo 3N se analizaron en una transferencia Western para determinar su unión a la diubiquitina lineal (Boston Biochem) y la diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) tal como se ha descrito en el Ejemplo 3M. Ninguno de 1F11/2C11/3F5 ni 1F11/2H5/3F5 fueron más sensibles que el mutante doble 1F11/3F5 (véase la FIG. 11) .

P) Clonación de imitantes triples adicionales Un mutante de H3, 4E4 que había demostrado un valor mejorado de la CI50 con respecto al 1E3 progenitor en el Ejemplo 3E no se tuvo inicialmente en cuenta cuando se prepararon los mutantes dobles porque presentó una pequeña cantidad de unión a la diubiquitina con unión K63 en el ELISA de especificidad (DO450 = 0,16 para una D0268 = 1/ 0 de fago, véase el Ejemplo 3F) . Puesto que ninguno de los mutantes de IgG ensayados hasta el momento había demostrado ninguna unión a la diubiquitina con unión K63 en las transferencias Western, el clon 4E4 se analizó adicionalmente . 4E4 era un clon de H3 que realmente contenía dos mutaciones, Y102L inmediatamente adyacente a H3 de la CDR y T110A en el marco 4. Para determinar si una mutación no intencionada en T110A tenía algún efecto sobre la afinidad, la cadena pesada tanto del mutante único Y102L como del doble mutante Y102L T110A se preparó en el contexto de la cadena pesada del 1E3 progenitor o la cadena pesada del mutante 3F5. Para insertar la mutación Y102L, los oligonucleótidos mutagénicos 5'-Y102L (CGGTGGGTTATGGACCTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCCTCGGCCTCC) (SEC ID N°:189) y 3'-Y102L (GGAGGCCGAGGAGA CGGTGACCAGGGTTCCTTGACCCCACAGGTCCATAACCCACCG) (SEC ID N°:190) se combinaron con cualquiera de las construcciones de expresión de pRK para la cadena pesada de igG de 1E3 o 3F5 y los mutantes se sintetizaron mediante el uso del kit de mutagénesis dirigida al emplazamiento QuikChange® Lightning (Agilent) . Para insertar las mutaciones Y102L T110A, los oligonucleótidos mutagénicos 5'-Y102L T110A (CGGTGGGTTATGGACCTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCGCGGTCTCCTCGGCCTCC) (SEC ID N°:191) y 3'-Y102L T110A (GGAGGCCGAGGAGACCGCGACCAGG GTTCCTTGACCCCACAGGTCCATAACCCACCG) (SEC ID N°:192) se combinaron con cualquiera de las construcciones de expresión de pRK para la cadena pesada de IgG de 1E3 o 3F5 y los mutantes se sintetizaron mediante el uso del kit de mutagénesis dirigida al emplazamiento QuikChange® Lightning (Agilent) . Las construcciones de pRK para la cadena pesada de IgG resultantes se combinaron con cualquiera de las construcciones de pRK para la IgG de la cadena ligera del progenitor 1E3 o el mutante 1F11 y las IgG resultantes se expresaron en células HEK293 y se purificaron tal como se ha descrito en el Ejemplo 3K.

Estos mutantes (Y012L vs . Y102L T110A, 3F5/Y102L vs . 3F5/Y102L T110A, 1F11/Y102L vs . 1F11/Y102L T110A, y 1F11/3F5/Y102L vs . 1F11/3F5/Y102L T110A) se compararon a continuación en paralelo en una transferencia Western para determinar la unión a la diubiquitina lineal o a la diubiquitina con unión K-63 tal como se ha descrito en el Ejemplo 3M. En general, tener la mutación T110A combinada con la mutación Y102L no mejoró significativamente la sensibilidad en comparación con Y102L sola (véase la FIG. 12) . También, de la CI50 del fago se sabía que T110A sola (clon 4E1) no mejoraba la afinidad en comparación con el 1E3 progenitor (véase la Tabla 7) . Por tanto, la mutación Y102L sola se tuvo en cuenta para análisis adicionales.

A continuación, el mutante triple 1F11/3F5/Y102L se comparó con el 1E3 progenitor, cada uno de los mutantes únicos (1F11, 3F5, Y102L) , así como con los mutantes dobles (1F11/3F5, 1F11/Y102L, 3F5/Y102L) en paralelo en una transferencia Western para determinar la unión a la diubiquitina lineal o a la diubiquitina con unión K-63 tal como se ha descrito en el Ejemplo 3M. El mutante triple fue más sensible que el clon 1E3 progenitor, todos los mutantes únicos, y todos los mutantes dobles en la unión a la diubiquitina lineal (véase la FIG. 13) . Además, no mostró unión a la diubiquitina con unión K63, indicando que se mantenía la especificidad.

EJEMPLO 4 - Caracterización del anticuerpo dirigido contra la poliubiquitina lineal madurado por afinidad A) Transferencia Western de IgG contra cadenas de diubiquitina purificada Las IgG del 1E3 progenitor y de 1F11/3F5/Y102L se analizaron para determinar su capacidad para detectar cadenas de diubiquitina pura mediante una transferencia Western. Siete diluciones en serie de dos veces de diubiquitina lineal (Boston Biochem) desde 1 g a 16 ng y 1 g de cada una de monoubiquitina (Boston Biochem) , diubiquitina con unión Kll (Genentech) , diubiquitina con unión K48 (Boston Biochem) , y diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) en tampón LDS IX (Invitrogen) con agente reductor (Invitrogen) se calentaron a 70 °C durante diez minutos y se analizó en geles NuPAGE Bis Tris 1,0 mm (Invitrogen) al 4-12% en tampón MES (Invitrogen) por triplicado, ün gel se tiño con colorante SimplyBlue Coomassie (Invitrogen) para detectar todas las proteínas. Por comparación, para conocer algo sobre la afinidad, se llevó a cabo una segunda transferencia Western con el anticuerpo dirigido contra K63, Apu3.A8, que tenía un valor conocido de KD de 8,7 para la diubiquitina con unión K63 (véase Newton, K. y col. (2008) Cell 134:668-678). Para esta transferencia Western, siete diluciones en serie de dos veces de diubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) desde 1 pg a 16 ng y 1 g de cada una de monoubiquitina (Boston Biochem) , diubiquitina lineal (Boston Biochem) , diubiquitina con unión Kll (Genentech) , y diubiquitina con unión K48 (Boston Biochem) se analizaron sobre el gel como se ha descrito anteriormente. Los tres geles se transfirieron individualmente a 30 V constantes durante una hora mediante transferencia en húmedo con metanol al 10% y tampón de transferencia NuPAGE IX (Invitrogen) a 0,2 m de nitrocelulosa (Invitrogen) . Los sitios de unión no específicos de las membranas se bloquearon mediante incubación en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se incubaron en 1 g/ml de IgG de 1E3 1F11/3F5/Y102L, o Apu3.A8 en leche al 5% en PBST durante una hora a 25 °C con agitación. Las membranas se lavaron tres veces en PBST con agitación. Las IgG de Fab se detectaron incubando las membranas en una dilución 1:10000 de anticuerpo secundario F(ab')2 de cabra específico dirigido contra Fcy humano conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch) en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se lavaron tres veces en PBST seguido por un lavado en PBS. El anticuerpo secundario se detectó usando sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico (Thermo Scientific) seguido por exposición de las manchas de la película.

El límite de detección para 1E3 fue -250 ng de la diubiquitina lineal (véase la FIG. 14) . Por el contrario, 1F11/3F5/Y102L fue mucho más sensible y pudo detectar una cantidad tan pequeña como 31 ng de diubiquitina lineal. Además, 1F11/3F5/Y102L fue muy específico, no demostrando unión a ninguna otra de las formas de ubiquitina ensayadas . Para comparar, el límite de detección del Apu3.A8, que tiene una KD de 8,7 nM, era -62 ng. Por tanto, el valor de KD de 1F11/3F5/Y102L para la diubiquitina lineal está probablemente en el intervalo bajo de nM.

B) Transferencia Western de IgG contra cadenas de poliubiquitina purificada Se generaron anticuerpos específicos de la unión lineal contra un antígeno de la diubiquitina lineal con la esperanza de que reconocieran tanto la propia unión o los restos superficiales circundantes de las ubiquitinas proximal y distal que se colocan muy cerca una de otra debido a la conformación de la diubiquitina que es el resultado del enlace lineal. Puesto que la diubiquitina es la unidad de reconocimiento del antígeno de menor tamaño y la poliubiquitina lineal es una cadena polimérica que tiene la diubiquitina como la unidad "monomérica" repetitiva, los anticuerpos también deberían unirse a la forma poliubiquitina. Para estudiar esto, la IgG de 1F11/3F5/Y102L se analizó para determinar su capacidad para detectar cadenas de poliubiquitina pura mediante una transferencia Western. 1 µg de cada uno de monoubiquitina soluble (Boston Biochem) . poliubiquitina 2-7 lineal (Enzo Lifesciences) , poliubiquitina con unión Kll (Genentech) , poliubiquitina 2-7 con unión K48 (Boston Biochem) , y poliubiquitina 2-7 con unión K63 (Boston Biochem) en tampón LDS IX (Invitrogen) con agente reductor (Invitrogen) se calentó a 70 °C durante diez minutos y se analizó en geles NuPAGE Bis Tris 1,0 mm (Invitrogen) 4-12% en tampón MES (Invitrogen) por triplicado. Un gel se tiño con colorante SimplyBlue Coomassie (Invitrogen) para detectar todas las proteínas. Los otros dos geles se transfirieron por separado a 30 V constantes durante una hora mediante transferencia en húmedo con metanol al 10% y tampón de transferencia NuPAGE IX (Invitrogen) a 0,2 µt? de nitrocelulosa (Invitrogen) . Los sitios de unión no específicos de las membranas se bloquearon mediante incubación en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. A continuación se incubaron las membranas en 1 µg/ml de IgG de 1F11/3F5/Y102L IgG o en una dilución 1:200 de un anticuerpo dirigido contra pan-ubiquitina de ratón, P4D1 (sin especificidad de unión, Santa Cruz Biotechnology) en leche al 5% en PBST durante una hora a 25 °C con agitación. Las membranas se lavaron tres veces en PBST con agitación. La IgG de 1F11/3F5/Y102L se detectó incubando la membrana en una dilución 1:10000 de anticuerpo secundario F(ab')2 de cabra específico dirigido contra FCY humano conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch) en leche al 5% en PBST durante una hora a 25 °C con agitación. La IgG de P4D1 se detectó incubando la membrana en una dilución 1:10.000 de anticuerpo secundario F(ab')2 de cabra específico dirigido contra FCY humano conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch) en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se lavaron tres veces en PBST seguido por un lavado en PBS. Los anticuerpos secundarios se detectaron usando sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico (Thermo Scientific) seguido por exposición de las manchas de la película. Aunque el anticuerpo de control dirigido contra la pan-ubiquitina, P4D1 reconoce la monoubiquitina, la poliubiquitina 2-7 lineal (si bien es cierto que mal) , poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina 2-7 con unión K48, y la poliubiquitina 2-7 con unión K63, la IgG de 1F11/3F5/Y102L IgG solamente reconoce la poliubiquitina lineal (véase la FIG. 15) . De esta manera, análogamente a la diubiquitina lineal, el anticuerpo 1F11/3F5/Y102L puede detectar las cadenas de poliubiquitina que contienen el enlace lineal, pero no reconoce las cadenas de poliubiquitina que contienen otros enlaces.

C) Transferencia de IgG para lisatos de células tratadas con TNFoc Se hicieron crecer células HeLa S3 en un cultivo en una suspensión 50:50 de F-12: medio Eagle modificado por Dulbecco (DME ) suplementado con suero de ternera fetal (FBS) al 10%, L-glutamina 2 mM, disolución al 1% de glicina/hipoxantina/timidina (GHT) , y penicilina/estreptomicina al 1%. El día antes del experimento las células se dividieron a 1:2. Las células se hicieron crecer durante la noche hasta alcanzar una densidad de 0,38 x 106 células/ml (98% viabilidad) . Las células se dividieron entre tres matraces de 1,5 1 de células cada uno. El matraz 1 se pretrató con MG132 5,8 µ? (Cayman Chemicals) durante 10 minutos. Los matraces 2 y 3 no recibieron pretratamiento . A tiempo cero, los matraces 2 y 3 también se trataron con MG132 5,8 uM. Además, a tiempo cero, los matraces 1 y 3 se trataron con 100 ng/ml de TNF (Shenandoah Biotechnology) y el matraz 2 se trató con 500 ng/ml de TNFa. A tiempo cero, cinco minutos, y 20 minutos, 444 mi de células se extrajeron de cada matraz, se centrifugaron a 800 rpm durante cinco minutos a 4°C, y los sobrenadantes se aspiraron. Las células se lavaron inmediatamente con 40 mi de PBS frío, se aglomeraron a 800 rpm durante cinco minutos a 4°C, y los sobrenadantes se aspiraron. Cada aglomerado se lisó en 13 mi de tampón de lisis frío (Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 1%, N-etilmaleimida (NEM) 10 mM, MG132 25 µ?, NaF 50 mM, comprimidos de cóctel inhibidor de proteasa completo (Roche) , y comprimidos de cóctel inhibidor de fosfatasa PhosSTOP (Roche)) durante 10 minutos a 4°C con agitación de vaivén. Los residuos se aglomeraron por centrifugación a 10.000 x g durante cinco minutos a 4°C. Los lisados se prelimpiaron con 133 µ? de Protein A Dynabeads (Invitrogen) durante 1 hora a 4°C con agitación de vaivén. Las perlas se aglomeraron por centrifugación 2000 rpm durante diez minutos. El sobrenadante se eliminó y se almacenó a -80°C.

Se había sugerido que las cadenas de poliubiquitina lineal desempeñan un papel de señalización en la ruta NF B. Por tanto, los lisatos anteriores se sondearon con 1F11/3F5/Y102L en una transferencia Western. Treinta µ? de cada lisato en tampón de muestra LDS IX (Invitrogen) con agente reductor (Invitrogen) se calentaron a 70°C durante diez minutos y se analizó en geles NuPAGE Bis Tris 1,0 mm (Invitrogen) 4-12% en tampón MES (Invitrogen) por triplicado.

Como controles de especificidad, se analizaron en el gel 250 ng de cadenas purificadas de poliubiquitina lineal (Enzo Lifesciences) y de poliubiquitina con unión K63 (Boston Biochem) . Los geles se transfirieron individualmente a 30 V constantes durante una hora mediante transferencia en húmedo con metanol al 10% y tampón de transferencia NuPAGE IX (Invitrogen) a 0,45 µt? de nitrocelulosa (Invitrogen) . Los sitios de unión no específicos de las membranas se bloquearon mediante incubación en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se incubaron en 1 g/ml de 1F11/3F5/Y102L o anticuerpo Apu3.A8 contra K63 en leche al 5% en PBST durante una hora a 25 °C con agitación. Las membranas se lavaron tres veces en PBST con agitación. Las IgG de Fab se detectaron incubando las membranas en una dilución 1:10.000 de anticuerpo secundario F(ab')2 de cabra específico dirigido contra Fcy humano conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch) en leche al 5% en PBST durante una hora a 25 °C con agitación. A continuación, las membranas se lavaron tres veces en PBST seguido por un lavado en PBS. El anticuerpo secundario se detectó usando sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico (Thermo Scientific) seguido por exposición de las manchas de la película. Se llevó a cabo una transferencia Western adicional para evaluar la activación de la ruta NFKB por sondeo de los niveles de ??? . Tras la señalización con TNFa, esto conduce a la ubiquitinación y a la degradación del inhibidor de NFKB, IKBOÍ. Cinco µ? de los lisatos anteriores en tampón de muestra LDS IX (Invitrogen) con agente reductor (Invitrogen) se calentaron a 70°C durante diez minutos y se analizaron en un gel NuPAGE Bis Tris 1,0 mm (Invitrogen) 4-12% en tampón MES (Invitrogen) por triplicado. El gel transfirió a 30 V constantes durante dos horas mediante transferencia en húmedo con metanol al 20% y tampón de transferencia NuPAGE IX (Invitrogen) a PVDF Invitrolon (Invitrogen) . La membrana se bloqueó en leche al 5% en PBST durante una hora a 25 °C con agitación, y a continuación se sondeó con diluciones 1:1000 de anticuerpo contra ???a (Cell Signaling) y contra ß-tubulina (Cell Signaling) como control de carga a 4°C durante la noche con agitación. Al día siguiente, las transferencias se lavaron tres veces en PBST con agitación. Las IgG se detectaron incubando las membranas en una dilución 1:10.000 de anticuerpo secundario F(ab')2 de cabra específico dirigido contra Fcy de conejo conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch) en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se lavaron tres veces en PBST seguido por un lavado en PBS . El anticuerpo secundario se detectó usando sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico (Thermo Scientific) seguido por exposición de las manchas de la película.

En las células estimuladas con 100 ng/ml de TNFOÍ y sin pretratamiento con G132, la cantidad de cadenas de poliubiquitina lineal aumenta desde el tiempo cero a cinco minutos a 20 minutos (véase la FIG. 16A) . Por el contrario, las cadenas de poliubiquitina con unión K63 que eran mucho más abundantes en los tres puntos temporales mostraron un aumento de cero a cinco minutos y a continuación una disminución hasta los niveles de partida a los 20 minutos. En las células estimuladas con 500 ng/ml de TNFa y sin pretratamiento con MG132, las cadenas de poliubiquitina lineal demostraron el mismo modelo de aumento desde cero a 20 minutos, sin embargo, la abundancia de cadenas lineales en cada punto temporal aumentó en comparación con las células tratadas con 100 ng/ml de TNFa. Por el contrario, las cadenas con unión K63 demostraron el mismo modelo y abundancia en comparación con las células tratadas con 100 ng/ml de TNFa. En las células pretratadas durante 10 minutos con G132 5,8 uM y a continuación 100 ng/ml de TNFa, los niveles de las cadenas tanto lineales como con unión K63 permanecieron constantes para los tres puntos temporales. La transferencia para ??? demuestra que, para las tres condiciones experimentales, la ruta NFKB está activada como se evidencia por la degradación de IKBOÍ con el tiempo después del tratamiento con TNFa, sin embargo, la extensión de la activación es mayor en ausencia de pretratamiento con MG132 (véase la FIG. 16B) . Esto demuestra que 1F11/3F5/Y102L puede reconocer cadenas endógenas de poliubiquitina lineal y sugiere que estas cadenas están reguladas en exceso en células HeLa S3 tras el estímulo son TNFa.

D) Inmunoprecipitacion de cadenas de poliubiquitina lineal La IgG de 1F11/3F5/Y102L se analizó para ver si podía inmunoprecipitar cadenas de poliubiquitina lineal. Como control positivo también se utilizó el anticuerpo Apu3.A8 dirigido contra K63 para realizar un seguimiento de la inmunoprecipitacion de las cadenas con unión K63. Como control negativo se utilizó un anticuerpo IgGl kappa humano no relacionado como control de isotipo. Se ensayaron tres condiciones de inmunoprecipitacion. En la reacción 1 que contenía todas las cadenas, se mezclaron 2 g de cada uno de monoubiquitina soluble (Boston Biochem) . poliubiquitina 2-7 lineal (Enzo Lifesciences) , poliubiquitina con unión Kll (Genentech) , poliubiquitina 2-7 con unión K48 (Boston Biochem) , y poliubiquitina 2-7 con unión K63 (Boston Biochem) . En la reacción 2 que carecía de las cadenas lineales, se mezclaron 2 pg de cada uno de monoubiquitina, poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina 2-7 con unión K48, y poliubiquitina 2-7 con unión K63. La reacción 3 consistió en 2 g de cadenas de poliubiquitina 2-7 lineal solas. Cada reacción se diluyó en 500 µ? de tampón urea 4 M IP (4 M urea, Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 135 mM, Tritón X-100 al 1%, glicerol al 10%, EDTA 1 mM, MgCl2 1,5 mM) . Las reacciones se prelimpiaron con 50 µ? de Protein A Dynabeads (Invitrogen) durante 3 horas a 25 °C con rotación. A continuación las perlas se capturaron con un soporte magnético y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Veinte g de 1F11/3F5/Y102L contra el enlace lineal, de anticuerpo Apu3.A8 contra K63, o una IgG de control de isotipo se añadieron a cada reacción IP y se incubaron durante la noche a 25 °C con rotación. Al día siguiente, 100 µ? de Protein A Dynabeads se añadieron a cada reacción, y las IgG se capturaron durante 15 minutos a 25 °C con rotación. Las perlas se lavaron a continuación tres veces cada una con 1 mi de tampón urea 4 M IP seguido por dos lavados cada uno con 1 mi de PBS . Durante el lavado final, las perlas se transfirieron a tubos nuevos para evitar eluir las proteínas unidas a las paredes del tubo. Las perlas se volvieron a suspender en 30 µ? de tampón de muestra LDS IX (Invitrogen) con agente reductor (Invitrogen) y se calentaron a 70°C durante 10 minutos para eluir las proteínas inmunoprecipitadas . A continuación, las perlas se capturaron con un soporte magnético y el sobrenadante se dividió por la mitad y se cargó por duplicado en dos geles de 1,0 mra Bis Tris NuPAGE 4-12% (Invitrogen). Como controles positivos y negativos, también se analizaron en los geles 1 µg de cada uno de poliubiquitina lineal (Enzo Lifesciences) y de poliubiquitina 2-7 con unión K63 (Boston Biochem) . Los geles se analizaron en tampón MES y a continuación se transfirieron individualmente a 30 V constantes durante una hora mediante transferencia en húmedo con metanol al 10% y tampón de transferencia NuPAGE IX (Invitrogen) a 0,2 µp? de nitrocelulosa (Invitrogen). Los sitios de unión no específicos de las membranas se bloquearon mediante incubación en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se incubaron en 1 g/ml de 1F11/3F5/Y102L o anticuerpo Apu3.A8 contra K63 en leche al 5% en PBST durante 1,5 horas a 25°C con agitación. Las membranas se lavaron tres veces en PBST con agitación. Las IgG de Fab se detectaron incubando las membranas en una dilución 1:10.000 de anticuerpo secundario F(ab')2 de cabra específico dirigido contra FCY humano conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch) en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se lavaron tres veces en PBST seguido por un lavado en PBS . El anticuerpo secundario se detectó usando sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico (Thermo Scientific) seguido por exposición de las manchas de la película. 1F11/3F5/Y102L puede inmunoprecipitar cadenas de poliubiquitina lineal en urea 4M; sin embargo, no es específica en estas condiciones ya que también es capaz de desplegar las cadenas con unión K63 (véase la FIG. 17) .

Para determinar si las diferentes concentraciones de urea podrían ayudar a mejorar la especificidad, se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones bajo diferentes condiciones de tampón. Dos g de cada uno de poliubiquitina 2-7 lineal y poliubiquitina 2-7 con unión K63 se mezclaron y se diluyeron con 500 µ? de tampón IP (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 135 m , Tritón X-100 al 1%, glicerol al 10%, EDTA 1 mM, MgCl2 1,5 mM)que contenía urea 0, 2, 4, o 6 M. Se llevó a cabo una IP adicional usando 500 µ? de PBST. Las reacciones se prelimpiaron con 50 µ? de Protein A Dynabeads (Invitrogen) durante 30 minutos a 25 °C con rotación. A continuación las perlas se capturaron con un soporte magnético y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Veinte pg de 1F11/3F5/Y102L contra el enlace lineal o de anticuerpo Apu3.A8 contra K63 se añadieron a cada reacción IP y se incubaron a 25°C con rotación durante una hora. A continuación, se añadieron 100 µ? de Protein A Dynabeads se añadieron a cada reacción, y las IgG se capturaron durante 15 minutos a 25°C con rotación. Las perlas se lavaron a continuación tres veces cada una con 1 mi del correspondiente tampón utilizado en la IP (tampón de urea 0, 2, 4, o 6 M o PBST) seguido por dos lavados cada uno con 1 mi de PBS . Durante el lavado final, las perlas se transfirieron a tubos nuevos para evitar eluir las proteínas unidas a las paredes del tubo. Las perlas se volvieron a suspender en 20 µ? de tampón de muestra LDS IX (Invitrogen) con agente reductor (Invitrogen) y se calentaron a 70°C durante 10 minutos para eluir las proteínas inmunoprecipitadas . A continuación, las perlas se capturaron con un soporte magnético y el sobrenadante se dividió por la mitad y se cargó por duplicado en dos geles Bis Tris NuPAGE 4-12% (Invitrogen) de 1,0 mm. Como controles positivos y negativos, también se analizaron en los geles 1 g de cada uno de poliubiquitina lineal y de poliubiquitina 2-7 con unión K63. Los geles se analizaron en tampón MES y a continuación se transfirieron individualmente a 30 V constantes durante una hora mediante transferencia en húmedo con metanol al 10% y tampón de transferencia NuPAGE IX (Invitrogen) a 0,2 pm de nitrocelulosa (Invitrogen) . Los sitios de unión no específicos de las membranas se bloquearon mediante incubación en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se incubaron en 1 g/ml de 1F11/3F5/Y102L o anticuerpo Apu3.A8 contra K63 en leche al 5% en PBST durante una hora a 25 °C con agitación. Las membranas se lavaron tres veces en PBST con agitación. Las IgG de Fab se detectaron incubando las membranas en una dilución 1:10.000 de anticuerpo secundario F(ab')2 de cabra específico dirigido contra FCY humano conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch) en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. A continuación, las membranas se lavaron tres veces en PBST seguido por un lavado en PBS . El anticuerpo secundario se detectó usando sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico (Thermo Scientific) seguido por exposición de las manchas de la película. A medida que aumenta la concentración de urea en el tampón IP, el 1F11/3F5/Y102L IP se vuelve más específico (véase la FIG. 18A) . para urea 6 M, muy poca poliubiquitina con unión K63 se desplegó mediante la IgG de 1F11/3F5/Y102L que por tanto siguió pudiendo desplegar una cantidad significativa de poliubiquitina lineal.

Para ver si concentraciones aún más grandes de urea podrian mejorar adicionalmente la especificidad, se repitieron las IP utilizando tampón de urea IP 6, 7, u 8 M. Dos g de cada uno de poliubiquitina 2-7 lineal y poliubiquitina 2-7 con unión K63 se mezclaron y se diluyeron con 500 µ? de tampón IP (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 135 mM, Tritón X-100 al 1%, glicerol al 10%, EDTA 1 mM, MgCl2 1,5 mM)que contenia urea 6, 7, o 8 M. Las reacciones se prelimpiaron con 50 µ? de Protein A Dynabeads (Invitrogen) durante 15 minutos a 25°C con rotación. A continuación las perlas se capturaron con un soporte magnético y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Veinte g de 1F11/3F5/Y102L contra el enlace lineal, de anticuerpo Apu3.A8 contra K63, o una IgG de control de isotipo se añadieron a cada reacción IP y se incubaron durante una hora a 25°C con rotación. A continuación, se añadieron 100 µ? de Protein A Dynabeads se añadieron a cada reacción, y las IgG se capturaron durante 15 minutos a 25°C con rotación. Las perlas se lavaron a continuación tres veces cada una con 1 mi del correspondiente tampón utilizado en la IP (tampón de urea IP 6, 7, u 8 M) seguido por dos lavados cada uno con 1 mi de PBS. Durante el lavado final, las perlas se transfirieron a tubos nuevos para evitar eluir las proteínas unidas a las paredes del tubo. Las perlas se volvieron a suspender en 30 µ? de tampón de muestra LDS IX (Invitrogen) con agente reductor (Invitrogen) y se calentaron a 70 °C durante 10 minutos para eluir las proteínas inmunoprecipitadas . A continuación, las perlas se capturaron con un soporte magnético y el sobrenadante se dividió por la mitad y se cargó por duplicado en dos geles Bis Tris NuPAGE 4-12% (Invitrogen) de 1,0 mm. Como controles positivos y negativos, también se analizaron en los geles 1 g de cada uno de poliubiquitina lineal y de poliubiquitina 2-3 con unión K63. Los geles se analizaron en tampón MES y las transferencias Western se llevaron a cabo como se ha descrito en el párrafo anterior. Una transferencia se sondeó con 1F11/3F5/Y102L para detectar cadenas lineales y la otra se sondeó con Apu3.A8 contra K63 para detectar cadenas con unión K63. En urea 6M, hay una pequeña cantidad de cadenas con unión K63 desplegadas por 1F11/3F5/Y102L, tal como se observó en las IP anteriores (véase la FIG. 18B) . En urea 7 M, 1F11/3F5/Y102L se comporta exactamente igual al control de isotipo y no despliega ninguna cadena con unión K63; sin embargo, sigue reteniendo la capacidad de IP una cantidad significativa de poliubiquitina lineal cuando se compara con la que estaba presente en el material de partida. En urea 8 M. sin embargo, la cantidad de cadenas lineales desplegadas por 1F11/3F5/Y102L se reduce drásticamente. De esta manera, urea 7 M es la condición más especifica que representan un equilibrio entre desplegar una cantidad significativa de cadenas lineales sin arrastras cadenas con unión K63.

En las IP anteriores, la cadena pesada de las IgG utilizadas en el despliegue se eluye de las perlas y se detecta mediante el anticuerpo secundario utilizado en las transferencias Western. Frecuentemente, esta banda puede oscurecer el material desplegado. Para que las transferencias sean más limpias y estar completamente seguro de que no se despliegan cadenas con unión K63, las IgG se reticularon a las perlas antes de las IP. Veinte µg de 1F11/3F5/Y102L o una IgG de control de isotipo se incubaron con 200 µ? de Protein A Dynabeads en PBST durante 30 minutos a 25°C con rotación. Las perlas se capturaron con un soporte magnético y se lavaron dos veces con 800 µ? de tampón de conjugación (fosfato de sodio 20 mM pH 7,5 NaCl 150 mM) . Las perlas acopladas a IgG se volvieron a suspender en 1 mi de suberato de bis (sulfosuccinimidilo) 5 mM (BS3) en tampón de conjugación y se incubaron a 25°C con rotación durante 30 minutos para reticulación. Mientras las IgG se reticulaban con las perlas, se configuraron las reacciones de IP. Cuatro pg de cada poliubiquitina 2-7 lineal, poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina 2-7 con unión K48, y poliubiquitina 2-7 con unión K63 se mezclaron y se diluyeron con 500 µ? de tampón IP (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 135 mM, Tritón X-100 al 1%, glicerol al 10%, EDTA 1 mM, MgCl2 1,5 mM) que contenía urea 0, 4, o 7 M. Las mezclas se prelimpiaron con 50 µ? de Protein A Dynabeads durante 45 minutos a 25°C con rotación. Después de 30 minutos, la reacción de reticulación se inactivo rápidamente por adición de 48 µ? de Tris 1 M pH 7,5 e incubación a 25°C con rotación durante 15 minutos. Las perlas reticuladas se lavaron tres veces con 800 µ? de tampón IP que contenía la cantidad correspondiente de urea a utilizar en la IP (es decir, urea 0, 4, o 7 M) . Tras el lavado, las perlas reticuladas a IgG se volvieron a suspender en las reacciones IP prelimpias y se incubaron a 25°C con rotación durante una hora. A continuación, las perlas reticuladas a IgG se lavaron tres veces con 1 mi de tampón IP que contenía la cantidad correspondiente de urea seguido por dos lavados con 1 mi de PBS . Durante el lavado final, las perlas se transfirieron a tubos nuevos para evitar eluir las proteínas unidas a las paredes del tubo. Las perlas se volvieron a suspender en 50 µ? de tampón de muestra LDS IX (Invitrogen) con agente reductor (Invitrogen) y se calentaron a 70°C durante 10 minutos para eluir las proteínas inmunoprecipitadas . A continuación, las perlas se capturaron con un soporte magnético y el sobrenadante se dividió y se cargó por cuadruplicado en geles Bis Tris NuPAGE 4-12% (Invitrogen) de 1,0 mm. También se analizaron en los geles, como control positivo y negativo, 1 g de cada poliubiquitina 2-7 lineal poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina con unión K48 y poliubiquitina 2-7 con unión K63. Los geles se analizaron en tampón MES y las transferencias Western se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente en este ejemplo. Una transferencia se sondeó con 1F11/3F5/Y102L para detectar cadenas lineales, una transferencia se sondeó con 2A3/2E6 contra Kll para detectar cadenas con unión Kll, una transferencia se sondeó con Apu2.07 contra K48 para detectar cadenas con unión K48, y una transferencia se sondeó con Apu3.08 contra K63 para detectar cadenas con unión K63. Cuando se compara la cantidad de material en las IP con la cantidad de material presente en las entradas iniciales, en su conjunto mucha menos poliubiquitina lineal se desplegó en cada IP debido a 1F11/3F5/Y102L comparado con las IP realizadas con IgG libre que posteriormente era capturada en las perlas, en los párrafos anteriores (véase la FIG. 19) .

Esto podría deberse al hecho que 1F11/3F5/Y102L es un miembro del subgrupo de VH3 de IgGl humana que contiene un segundo sitio de unión de la Proteína A en el dominio variable de la cadena pesada, además del sitio de unión habitual en el dominio Fe. Por lo tanto, el preacoplamiento y la reticulación de las IgG a las perlas de Proteína A antes de la unión al antígeno podría disminuir la capacidad de unión de este antígeno. En estas condiciones de preacoplamiento y reticulación, urea 4M es la condición más específica en la que 1F11/3F5/Y102L es capaz de desplegar cadenas lineales sin afectar a ninguna de las cadenas con unión Kll, K48, o K63.

Para ver si la reducción en las cadenas lineales desplegadas se debía al sitio de unión de la Proteína A adicional en el dominio variable de la cadena pesada, se llevaron a cabo las IP utilizando IgG reticuladas a perlas de Proteína G. La Proteína G también tiene dos sitios de unión en la IgGl humana, pero ambos están en los dominios constantes (CH1 y Fe) . Las IP se repitieron como se ha descrito anteriormente excepto en que se utilizaron Protein G Dynabeads (Invitrogen) para preacoplar y reticular las IgG. Para cada condición, se desplegaron muchas más cadenas de poliubiquitina lineal mediante 1F11/3F5/Y102L comparado con los experimentos realizados con las IgG reticuladas a la Proteína A (véase la FIG. 20) . Después de una sobre exposición a las transferencias anti K63 a urea 4 M existe una pequeña cantidad de cadenas con unión K63 desplegadas por 1F11/3F5/Y102L. De este modo, urea 7 M parece ser la condición más específica cuando 1F11/3F5/Y102L está preacoplada a perlas de Proteína G; sin embargo, esto es así a expensas de desplegar menos poliubiquitina lineal comparado con cuando se realizaban las IP con IgG libre que posteriormente se capturaba con cuentas (comparar con la FIG. 18B) . Es posible que el preacoplamiento y la reticulación de perlas de Proteína G al dominio CH1 pueda también disminuir la unión a la poliubiquitina lineal mediante impedimento estérico del dominio VH vecino, aunque de manera menos significativa que preacoplar y reticular perlas de Proteína A al dominio VH.

Las IP que utilizan IgG libre con captura posterior con perlas de Proteína A se repitieron usando una mezcla de cadenas de poliubiquitina con diferentes enlaces según el sustrato y se analizaron más extensamente mediante transferencia Western y espectrometría de masas. Dos g de cada poliubiquitina 2-7 lineal (Boston Biochem) , poliubiquitina con unión Kll (Genentech) , poliubiquitina 2-7 con unión K48 (Boston Biochem) , y poliubiquitina 2-7 con unión K63 (Boston Biochem) se mezclaron y se diluyeron con 500 µ? de tampón IP (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 135 mM, Tritón X-100 al 1%, glicerol al 10%, EDTA 1 mM, MgCl2 1,5 mM) que contenía urea 0, 4, 5, 6 o 7 M. Cada IP se llevó a cabo por duplicado, una vez para el análisis mediante transferencia Western y otra vez para espectrometría de masas . Las reacciones se prelimpiaron con 50 µ? de Protein A Dynabeads (Invitrogen) durante 15 minutos a 25°C con rotación. A continuación las perlas se capturaron con un soporte magnético y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Veinte µg de 1F11/3F5/Y102L contra el enlace lineal o una IgG de control de isotipo se añadieron a cada reacción IP y se incubaron durante una hora a 25°C con rotación. A continuación, se añadieron 100 µ? de Protein A Dynabeads se añadieron a cada reacción, y las IgG se capturaron durante 15 minutos a 25°C con rotación. Las perlas se lavaron a continuación tres veces cada una con 1 mi del correspondiente tampón utilizado en la IP (tampón de urea IP 0, 4, 5, 6, u 7 M) seguido por dos lavados cada uno con 1 mi de PBS. Durante el lavado final, las perlas se transfirieron a tubos nuevos para evitar eluir las proteínas unidas a las paredes del tubo. Las perlas se volvieron a suspender en 50 µ? de tampón de muestra LDS IX (Invitrogen) con agente reductor (Invitrogen) y se calentaron a 70°C durante 10 minutos para eluir las proteínas inmunoprecipitadas . A continuación, las perlas se capturaron con un soporte magnético y el sobrenadante se dividió y se cargó por cuadruplicado en geles Bis Tris NuPAGE 4-12% (Invitrogen) de 1,0 mm para realizar las transferencias Western. También se analizaron en los geles, como control positivo y negativo, 500 ng de cada poliubiquitina 2-7 lineal poliubiquitina con unión Kll, poliubiquitina 2-7 con unión K48, y poliubiquitina 2-7 con unión K63 también se analizaron en los geles. El otro conjunto de IP se analizaron en geles Bis Tris NuPAGE 1,0 mm 4-12% (Invitrogen) para análisis mediante espectrometría de masas AQUA. Los geles se analizaron en tampón MES y las transferencias Western se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente en este ejemplo. Las transferencias se sondearon con el anticuerpo 1F11/3F5/Y102L dirigido contra poliubiquitina lineal, 2A3/2E6 dirigido contra poliubiquitina con unión Kll, Apu2.07 dirigido contra poliubiquitina con unión K48, y Apu3.A8 dirigido contra poliubiquitina con unión K63 (véase la FIG. 21A) . El resto de los geles para su análisis mediante espectrometría de masas AQUA se tiñeron con colorante SimplyBlue Coomasie Safe (Invitrogen) (véase la FIG. 21B) . En ausencia de urea, F11/3F5/Y102L puede IP cadenas con todo tipo de enlaces (véase la FIG. 21A) . A medida que aumenta la concentración de urea en el tampón IP, el 1F11/3F5/Y102L IP se vuelve más específico. Para urea 7 M, nada de poliubiquitina con unión Kll, K48 o K63 se desplegó mediante la IgG de 1F11/3F5/Y102L que por tanto siguió pudiendo desplegar una cantidad significativa de poliubiquitina lineal con respecto a la entrada inicial.

Las regiones B y C del gel teñido con Coomasie se recortaron, se sometieron a digestión tríptica en el propio gel, y se analizaron mediante espectrometría de masas AQUA (véase la FIG. 21B) . Los trozos de gel se destiñeron con bicarbonato de amonio 50 mM / metanol 50% y a continuación se desecaron con acetonitrilo (ACN) . Para permitir una captación eficaz de tripsina, los trozos de gel se incubaron en hielo durante 2 h con 20 ng/µ? de tripsina modificada de calidad secuenciación (Promega, Madison WI) diluida en bicarbonato de amonio 50 mM / ACN al 5%. Las digestiones se realizaron durante la noche a 37°C y se detuvieron mediante la adición de ACN al 50% / ácido fórmico (AF) al 5%. Se añadieron a cada muestra péptidos normalizados marcados internamente con isótopo (1 pmol) antes de dos rondas de extracción (Primera -50% ACN/5% AF Segunda - 100% ACN) . Los péptidos extraídos se secaron completamente, y se volvieron a suspender en ACN 10% / AF 5% / H202 0,01% durante al menos 30 minutos antes del análisis mediante espectrometría de masas. Las muestras se cargaron directamente en una columna C18 Thermo AQUASIL (2,1 X 150 m) y se separaron usando una LC capilar Agilent 1200 a un caudal de 200 µ?/min durante 26 minutos de gradiente de 5% a 90% de tampón B (98% ACN/0,1% AF) . La detección mediante la espectrometría de masas se llevó a cabo en un equipo ABI 4000 QTRAP usando un método de seguimiento de reacción múltiple segmentada (MR ) para detectar los péptidos tanto etiquetados como no etiquetados que cubren la secuencia de ubiquitina. La cuantificación se llevó a cabo comparando áreas de pico entre versiones etiquetada y no etiquetada de cada péptido mediante el programa informático ABI Multiquant 1.1. Al medir las abundancias de los péptidos en la firma del CG correspondientes a la modificación de las siete lisinas de la ubiquitina y del extremo amino, se confirmó que urea 7 M era la condición más específica para la inmunoprecipitación de cadenas de poliubiquitina lineal (véanse las FIGS. 21C y 21D) . En urea 7 M, el anticuerpo puede recuperar el 67% de las cadenas lineales presentes en la entrada desde la región B que contiene las cadenas más largas (de tetraubiquitina a heptaubiquitina) ; sin embargo, es menos eficaz para recuperar las cadenas cortas que se encuentran en la región C (diubiquitina y triubiquitina) , recuperando solamente un 2% de las cadenas (véase la FIG. 21E) . Esto probablemente se debe a la avidez por el anticuerpo bivalente y los múltiples enlaces que aparecen en las cadenas más largas .

E) Expresión en exceso de LUBAC El complejo de ensamblaje de ubiquitina lineal (LUBAC, por sus siglas en inglés) es una E3 ligasa que se ha demostrado que ensambla cadenas de poliubiquitina lineal (Kirisako, T. y col. (2006) EMBO J. 25:4877-4887) . Los marcos de lectura abiertos (ORF) de dos de los miembros de este complejo, Hoil-IL y Hoip, se sintetizaron (Blue Heron Biotechnology) y se clonaron en el vector de expresión mamífero pBI-CMVl (Clonetech) que contenía un promotor CMV bidireccional . Hoil-IL se clonó en el sitio de clonación múltiple (MCS) 1 utilizando los sitios de las enzimas de restricción MluI y EcoRV, y Hoip se clonó en el MCS2 utilizando los sitios de las enzimas de restricción EcoRI y PstI. La construcción se verificó mediante secuenciación de los ORF. La construcción resultante, pBI-CMVl-HoillL-Hoip, o el vector vacío se transfectaron a células 293T. Las células 293T se dividieron a 1:20 en 20 placas de diez cm dos días antes de la transfección y se hicieron crecer a 37 °C en C02 al 5%. El día de la transfección, 150 µ? de Lipofectamine 2000 se diluyeron en 2,5 mi de medio Opti-ME que carecía de suero para cada plásmido a transíectar. Análogamente, 50 g de bien el vector vacío pBI-CMVl o de BI-CMVl-HoillL-Hoip se diluyeron en 2,5 mi de medio Opti-MEM que carecía de suero. Estas diluciones se incubaron a 25 °C durante cinco minutos. La Lipofectamine diluida y el ADN diluido se combinaron, se mezclaron suavemente por inversión, y se incubaron a 25°C durante 30 minutos. 500 µ? de la mezcla ADN/Lipofectamine se añadieron a continuación a cada una de las placas de diez cm (diez placas por plásmido) . Cuarenta y ocho horas después de la transfección, los medios se recogieron y las células se rascaron de las placas. Las células se centrifugaron a 10.000 rpm durante diez minutos a 4°C. Los sobrenadantes se retiraron y las células se lavaron en 40 mi de PBS frío. Las células se centrifugaron a 10.000 rpm durante diez minutos a 4°C. Los sobrenadantes se retiraron y las células se volvieron a suspender en 4 mi de tampón de lisis que contenía urea 8 M, Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 25 mM, 10 µ?/ml de proteasa HALT e inhibidores de la fosfatasa (Thermo Scientific) , EDTA 5 mM, y NEM 2 mM. Los lisados se sometieron a sonicación durante un corto periodo de tiempo para reducir la viscosidad y a continuación se congelaron a -80°C. Para determinar si Hoil-IL y Hoip se expresaban en exceso y si esto conducía a un aumento en el ensamblaje de la cadena de poliubiquitina lineal, los Usados se analizaron mediante transferencia Western. Un µ? de cada lisado se mezcló con tampón de muestra LDS que contenxa agente reductor y a continuación se cargaron en un gel NuPAGE Bis Tris 1,0 mm (Invitrogen) 4-12% y se analizaron en tampón MES (Invitrogen) por cuadruplicado. Los geles se transfirieron individualmente a 30 V durante dos horas en tampón de transferencia NuPAGE IX que contenía metanol al 10% a nitrocelulosa 0,45 µp?. Las membranas se bloquearon en leche al 5% en PBST durante una hora a 25 °C con agitación, y a continuación se incubaron con el anticuerpo primario. La primera transferencia se sondeó con 1 µ/ml de IgG de 1F11/3F5/Y102L dirigido contra la polyUb lineal en leche al 5% en PBST. La segunda transferencia se sondeó con una dilución 1:500 de un anticuerpo dirigido contra Hoil-1L/RBCK (Abcam ab38540) en leche al 5% en PBST. La tercera transferencia se sondeó con 1 µg/ml de anticuerpo dirigido contra Hoip/RNF31 (Abcam ab85294) en leche al 5% en PBST. La cuarta transferencia se sondeó con una dilución 1:1000 de un anticuerpo dirigido contra ß-tubulina (Cell Signaling 9F3, número de catálogo 2128) en leche al 5% en PBST. Las transferencias uno, dos y tres se incubaron con sus anticuerpos primarios respectivos durante una hora a 25 °C con agitación. La transferencia anti- -tubulina se incubó durante la noche a 4°C con rotación. A continuación, las transferencias se lavaron tres veces en PBSTO .05 y a continuación se incubaron a una dilución 1:10.000 del anticuerpo secundario en leche al 5% en PBST durante una hora a 25°C con agitación. La transferencia anti-polyUb lineal se sondeó con un anticuerpo de cabra secundario dirigido contra F(ab')2-HRP humano (Jackson Immunoresearch) y las otras tres transferencias se sondearon con un anticuerpo secundario de cabra dirigido contra F(ab)'2-HRP de conejo (Jackson Immunoresearch) . A continuación, las transferencias se lavaron seis veces con PBST y una vez con PBS. El anticuerpo secundario se detectó usando sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico (Thermo Scientific) seguido por exposición de las manchas de la película. La transferencia contra ß-tubulina demostró que se utilizaron cantidades equivalentes de células en las transfecciones y que cantidades equivalentes de lisado se cargaron en el gel (véase la FIG. 22A) . Las transferencias anti-Hoil-lL y anti-Hoip muestran que cuando pBI-CMVl-HoillL-Hoip se transfecta con ambos Hoil-IL y Hoip se expresan en exceso comparado con los niveles endógenos de las dos proteínas. Finalmente, la expresión en exceso de Hoil-IL y Hoip conduce a un aumento importante en las cadenas de polyUb lineal, tal como se esperaba. Dado que estas se detectan mediante IgG de 1F11/3F5/Y102L, esto indica que este anticuerpo puede reconocer las cadenas de polyUb lineal endógenas sintetizadas enzimáticamente .

Además de sondear estos lisados mediante transferencia Western, también se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones de polyUb lineal. 500 µ? de los lisados anteriores se diluyeron en urea 7 M con 71 µ? de Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 25 mM. A continuación, los lisados se prelimpiaron con 200 µ? de Protein A Dynabeads (Invitrogen) en urea 7 M, Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 25 mM durante una hora a 25°C con rotación. Las perlas se capturaron con un soporte magnético y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Los lisados prelimpios se centrifugaron a continuación a 14.000 rpm durante cinco minutos para aglomerar cualquier precipitado. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos y se añadieron 40 g de IgG de 1F11/3F5/Y102L o una IgG de control de isotipo. A continuación, las inmunoprecipitaciones se incubaron durante la noche a 25 °C con rotación. Al día siguiente, las IgG se capturaron mediante la adición de 200 µ? de Protein A Dynabeads (Invitrogen) en urea 7 M, Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 25 mM durante 15 minutos a 25°C con rotación.

Las perlas se capturaron con un soporte magnético y se lavaron cinco veces con 1 mi de urea 7 M, Tris 50 m pH 7,5, NaCl 25 mM y a continuación tres veces con 1 mi de PBS. Después del lavado final, las perlas se transfirieron a tubos nuevos para evitar eluir las proteínas adheridas a las paredes del tubo. A continuación, las perlas se volvieron a suspender en 30 µ? de tampón de muestra LDS IX con agente reductor (Invitrogen) y se eluyeron a 70°C durante 10 minutos. Se analizaron dos geles Bis Tris NuPAGE 1,0 mm 4-12%: uno para la transferencia Western y el otro para la tinción de Coomassie para realizar el análisis mediante espectrometría de masas AQUA. Para la transferencia Western, un 10% de cada IP se analizó junto con el 0,1% de cada lisado. Para la espectrometría de masas, un 90% de cada IP se analizó junto con el 1% de cada lisado. La transferencia Western con 1F11/3F5/Y102L se llevó a cabo como se ha descrito en el párrafo anterior, salvo que la transferencia se realizó durante una hora. El gel para el análisis mediante espectrometría de masas AQUA se tiñó con colorante Simply Blue Safe Stain (Invitrogen) . La transferencia Western muestra que la IgG de 1F11/3F5/Y102L puede inmunoprecipitar cadenas de polyUb lineal procedentes de lisados de células (véase la FIG. 22B) . Se desplegaron más cadenas desde los Usados de expresión en exceso de LUBAC que con el vector solo, lo que es consistente con los niveles mucho más elevados de cadenas lineales presentes cuando LUBAC está expresado en exceso.

Las regiones de alto peso molecular del gel se recortaron (véase la FIG. 22B) y se sometieron a espectrometría de masas AQUA como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4D. En las muestras del vector de control, en las muestras de entrada, no se identificaron uniones de poliubiquitina lineal (véase la Tabla 9) . La mayoría de las cadenas de poliubiquitina identificadas fueron las de uniones K48 y K63.

TABLA 9 Consistente con esto, la poliubiquitina no lineal se desplegó en la IP tanto con el anticuerpo dirigido contra el enlace lineal o el anticuerpo de control de isotipo. En las células que expresaban un exceso de LUBAC, los niveles de enlaces de poliubiquitina lineal alcanzan 4808 pmoles que es similar en su abundancia a las uniones K63 (5075 pmoles) . Cuando se utiliza el anticuerpo dirigido contra el enlace lineal en la IP, esta se enriquece significativamente en enlaces lineales, desplegándose adicionalmente algunos enlaces Kll, K48 y K63 (véase la FIG. 22C) . Esto probablemente se debe a la presencia de cadenas con enlaces mixtos, o sustratos modificados con múltiples cadenas homogéneas de enlaces diferentes, ya que solamente 7 y 4 picomoles de las uniones K48 K63, respectivamente, se desplegaron mediante el anticuerpo dirigido contra el enlace lineal procedente de las células con el vector de control (véase la Tabla 9) . Adicionalmente, solamente se identificó 1 pmol de uniones K48 y ninguna unión K68 en la IP con el anticuerpo control de isotipo procedente de las células que expresaban LUBAC en exceso, indicando que estas uniones son simplemente no adherentes. Esto demuestra que el anticuerpo dirigido contra el enlace lineal puede enriquecer las cadenas endógenas de poliubiquitina lineal (véase la FIG. 22C) .

Para determinar si 1F11/3F5/Y102L es funcional en inmunofluorescencia, células HeLa que expresaban un exceso de Hoil-IL y Hoip se tiñeron con el anticuerpo. Las células HeLa (5.000 células/100 µ?/pocillo) se sembraron en una placa de 96 pocilios de fondo transparente con paredes negras y se hicieron crecer durante 24 h. Las células se transíectaron con plásmidos Hoil/Hoip durante 18 h usando Lipofectamine 2000 de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las células se enjuagaron con PBS, se fijaron con metanol enfriado en hielo a -20°C durante 10 minutos, se permeabilizaron con PBS/Triton X-100 L 0,1 % a temperatura ambiente durante 5 min, y a continuación se bloquearon con PBS/Triton X-100 L al 0,3 %/BSA al 5 % a temperatura ambiente durante 1 hora. El anticuerpo contra la ubiquitina lineal (1 µg/ml) se incubó con o sin cadenas de poliubiquitina (5 µg/ml) a temperatura ambiente durante 1 hora y a continuación se utilizó para etiquetar células a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de 6 lavados (10 min cada uno) con PBS/Triton X-100 al 0,05 %, las células se tiñeron con anticuerpo de burro dirigido contra IgG humana conjugado con DyLight 88 (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories) a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, las células se lavaron 6 veces (10 min cada una) con PBS que contenía Tritón X-100 al 0,05 %, se tiñeron con Hoechst (1:10,000) a temperatura ambiente durante 10 min y se lavaron con PBS. La placa se cubrió con un precinto negro y se tomaron imágenes con un sistema de captura de imagen ImageXpress Micro. Las células no transfectadas no mostraron ninguna señal cuando se tiñeron con 1F11/3F5/Y102L pero las células que expresaban Hoil-IL y Hoip en exceso mostraron un modelo de tinción del citoplasma en forma de puntos (véase la FIG. 22D) . Esta tinción era específica de las cadenas de poliubiquitina lineal ya que se podía bloquear mediante la adición de poliubiquitina lineal recombinante .

EJEMPLO 5 - Análisis estructural de la unión de Fab a la diubiquitina lineal.

Para comprender mejor la interacción entre el Fab dirigido contra el enlace lineal y la poliubiquitina lineal, el Fab de 1F11/3F5/Y102L se cristalizó simultáneamente con la diubiquitina lineal. El fragmento Fab de 1F11/3F5/Y102L se expresó en E. coli y se purificó en una columna de Proteína A como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1E. El Fab se purificó adicionalmente en una columna SP HiTrap de 5 mi (GE Healthcare) en ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES) 20 mM, pH 5,5 con un gradiente lineal 0-100% de MES 20 rtiM, pH 5,5, NaCl 0,5 M. Las fracciones que contenían el fragmento Fab se combinaron y analizaron en una columna de dimensionamiento S75 de 320 mi (GE Healthcare) en Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. Las fracciones que contenían el fragmento Fab se combinaron y se concentraron hasta 22 mg/ml.

Una fusión cabeza-a-cola de dos subunidades de ubiquitina mediante un enlace peptídico formal también se expresó en E. coli. Células BL21-Gold (Agilent Technologies) se transformaron con un plásmido de expresión de la diubiquitina lineal construido en un vector pET15b (Novagen) . Esta construcción tiene una etiqueta Hiss en el extremo N (SEC ID N° : 376) seguida por un sitio de escisión de trombina bajo el control del promotor T7 y el operador lac. Un cultivo nocturno de BL21-Gold transformadas con el plásmido de expresión pET15b-diubiquitina lineal que crecieron en medio LB se diluyó 50 veces en 1 1 de caldo Terrific calentado que contenía glicerol al 1%, MOPS 0,1 M, pH 7,3, y 50 g/ml de carbenicilina. El cultivo se hizo crecer a 37 °C con agitación a 250 rpm en un matraz de ultrarrendimiento de 2.5 1 (Thomson) hasta una DO600 = 1, 64. La expresión se indujo añadiendo IPTG 0,5 mM y el cultivo se hizo crecer durante la noche a 16°C con agitación a 250 rpm. Al día siguiente, las células se aglomeraron por centrifugación a 8K rpm durante 10 minutos y los aglomerados se congelaron en nitrógeno líquido.

Las células se volvieron a suspender y se Usaron en Tris 40 mM, pH 8,0, NaCl 0,3 M, y comprimidos de inhibidor de la proteasa Complete exento de EDTA (Roche) mediante microfluidización tres veces. Los residuos celulares se aglomeraron por centrifugación a 10K rpm durante 1 hora y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 µ? de baja unión a proteínas. El Hiss-diUb ('His6' descrito como la SEC ID N° : 376) se purificó en una columna de Ni-NTA agarosa de 5 mi (Qiagen) . La columna se lavó con 12 volúmenes de columna de Tampón A (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 1 M, imidazol 20 mM) y se eluyó con cuatro volúmenes de columna de Tampón B (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 1 M, imidazol 250 mM) . La expresión de la diubiquitina era elevada, de manera que se superó la capacidad de unión de la columna y parte de la diubiquitina se eluyó en el lavado con el Tampón A. Por tanto, el material de lavado se llevó a una segunda columna de Ni-NTA agarosa de 5 mi y se purificó como se ha descrito anteriormente. La etiqueta Hise (SEC ID N° : 376) se eliminó mediante escisión con 1800 unidades de trombina (GE Healthcare) a 4°C durante 3 días con diálisis en Tris 25 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM usando una conducción de diálisis 3500 MWCO (Spectrum Medical) . El material dializado y escindido se dividió por la mitad, y la diubiquitina libre se separó de la etiqueta His6 (SEC ID N° : 376) usando dos columnas de Ni-NTA agarosa de 5 mi. Se recogió el flujo procedente de todos los lavados. Las columnas se lavaron con 4 volúmenes de columna de Tampón C (Tris 25 mM, pH 8,0, NaCl 0,5 M) , cuatro volúmenes de columna de Tampón D (Tris 25 mM, pH 8,0, NaCl 0,5 M, imidazol 20 mM) , y a continuación un volumen de columna de Tampón E (Tris 25 mM, pH 8,0, NaCl 0,5 M, imidazol 250 mM) . Se controló la presencia de la diubiquitina sin etiqueta analizando muestras del flujo a través de la columna y de cada lavado en un gel Novex tris-glicina 18% (Invitrogen) y tinción con colorante Simply Blue Safe Stain (Invitrogen) . La mayoría de la diubiquitina sin etiqueta estaba presente en el flujo a través de la columna, se lavó con tampón C, y se lavó con tampón D. Estos se combinaron, se concentraron y se purificaron adicionalmente en una columna de dimensionamiento S75 de 320 mi (GE Healthcare) en Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. Las fracciones que contenían la diubiquitina se combinaron y se concentraron hasta 15,3 mg/ml.

El complejo Fab/diubiquitina se configuró utilizando un exceso molar de tres veces de diubiquitina lineal sobre Fab, y se incubó a 4°C durante la noche. A continuación, el complejo se purificó en una columna de dimensionamiento S75 de 320 mi (GE Healthcare) en Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM.

Las fracciones que contenían el complejo se combinaron y se concentraron hasta 20 mg/ml.

Se hicieron crecer cristales utilizando el método de difusión de vapor con gota sedente en gotas que contenían 0,2 µ? de complejo Fab de lFll/3F5/Y102L/diubiquitina lineal (20 mg/ml de complejo en Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) y 0,2 µ? de licor madre (isopropanol al 20%, MES 0,1 M, pH 6,0, polietilenglicol (PEG) 2K monometil éter (MME) al 20%) . Los cristales iniciales crecieron en estas condiciones a 19°C durante 27 días. Los cristales se optimizaron mediante gota sedente en un micropuente con 2 µ? de complejo Fab de lFll/3F5/Y102L/diubiquitina lineal (20 mg/ml de complejo en Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) y 3 µ? de licor madre (isopropanol al 18%, MES 0,09 M, pH 6,0, PEG 2K MME al 19,8%, bromuro de sodio 10 mM) . Los cristales crecieron a 19 °C durante cinco días y se pudieron manipular para obtener cristales difractores simples. Los cristales se crioprotegieron mediante isopropanol al 20%, MES 0,1 M, pH 6,0, PEG 2K MME al 20% con PEG 2K MME al 25-30% adicional. Los datos cristalográficos se recogieron en un equipo Berkeley Advanced Light Source con línea de haz 5.0.2 y se procesaron mediante HKL2000. Los cristales pertenecían al grupo espacial Pl, siendo las dimensiones de la celdilla unidad a=53 Á, b=60 Á, c=96 Á, a=87°, ß=77°, y ?=72°, con dos complejos en la unidad asimétrica. La estructura se resolvió mediante sustitución molecular mediante el programa Phaser y las coordenadas de una variante del fragmento Fab 4D5 humanizado (código PDB para 4D5 : 1FVE) y de la monoubiquitina humana (código PDB: 1UBQ) . La construcción del modelo se llevó a cabo en Coot y la estructura se refino mediante Phenix. La resolución de la estructura es 2,43 Á y el complejo se refino hasta un valor de R de 22,8% y Rfree de 25,0% (véase la FIG . 23A) .

El análisis de la estructura indica que la mayoría de la unión a la diubiquitina está mediada a través de contactos con las CDR de la cadena pesada. Entre la cadena pesada y la diubiquitina hay 785 Á2 de área superficial enterrada, en contraste con nada de área superficial enterrada entre la cadena ligera y la diubiquitina. El epítopo y parátopo estructural se define por los restos que tienen enterrados al menos el 25% de su área superficial accesible al disolvente durante la unión (véase al FIG. 23B y C) y/o que tienen al menos un átomo a una distancia máxima de 4,5 Á desde la cadena que interactúa (véanse las Tablas 10 y 11) .

TABLA 10 - Restos con al menos un 25% de su área superficial accesible al disolvente enterrado en la interfase (la Tabla 10 describe los restos 52-57 y 96-100 como las SEC ID Nros 377 y 378, respectivamente) .

Fab HC (chain C) DiUb íchain A) N31 L8 Nterm Ub T32 T9 Nterm Ub Y33 E34 Nterm Ub T52 I36 Nterm Ub P53 (Kabat# P52a) P37 Nterm Ub S54 (S53) Q40 Nterm Ub S55 (S54) R42 Nterm Ub G56 (G55) V70 Nterm Ub Q57 (Q56) L71 Nterm Ub T74 (T73) L73 Nterm Ub T96 (T95) R74 Nterm Ub W97 (W96) G75 Nterm Ub L98 (L97) M1 Cterm Ub L99 (L98) P19 Cterm Ub R100 (R99) S57 Cterm Ub D58 Cterm Ub N60 Cterm Ub 161 Cterm Ub Q62 Cterm Ub K63 Cterm Ub TABLA 11 - Restos que tienen al menos un átomo a una distancia máxima de 4,5 Á desde Fab o diUb (la Tabla 11 describe los restos 52-57, 96-100, 31-37, 70-76 y 60-63 como SEQ ID Nros 377-381, respectivamente) .

Fab HC íchain C Fab LC (chain B) DiUb (chain A) N31 Y49 L8 Nterm Ub T32 S50 T9 Nterm Ub Y33 F53 Q31 Nterm Ub T52 Y55 D32 Nterm Ub P53 (Kabat# P52a) S56 K33 Nterm Ub S54 (S53) E34 Nterm Ub S55 (S54) G35 Nterm Ub G56 (G55) I36 Nterm Ub Q57 (Q56) P37 Nterm Ub T74 (T73) Q40 Nterm Ub T96 (T95) R42 Nterm Ub W97 (W96) V70 Nterm Ub L98 (L97) L71 Nterm Ub L99 (L98) R72 Nterm Ub R100 (R99) L73 Nterm Ub R74 Nterm Ub G75 Nterm Ub G76 Nterm Ub M1 Cterm Ub P19 Cterm Ub S57 Cterm Ub D58 Cterm Ub N60 Cterm Ub 161 Cterm Ub Q62 Cterm Ub K63 Cterm Ub Existen 15 restos de la cadena pesada y solamente cinco restos de la cadena ligera que constituyen el parátopo de Fab. El epítopo de la diubiquitina consiste en 18 restos desde la Ub distal (extremo C implicado en el enlace) y 8 restos procedentes de la ubiquitina proximal (extremo N implicado en el enlace) . La interfase de contacto también está constituida por nueve enlaces de hidrógeno entre la cadena pesada y la diubiquitina, y tres enlaces de hidrógeno entre la cadena ligera y la diubiquitina (véase la Tabla 12) .

En lugar de conformar un contacto exclusivo con la propia unión lineal, parece que la especificidad se deriva de múltiples interacciones con restos superficiales procedentes de las ubiquitinas tanto proximal como distal .

TABLA 12 - Resumen de los enlaces H entre Fab y diUb diUb (chain A) Fab LC íchain B) Nterm Ub E34 0 Y49 OH Nterm Ub E34 OE2 Y49 OH Nterm Ub G35 0 S50 OG diUb íchain A) Fab HC íchain C) Nterm Ub Q40 NE2 R100 N (Kabat# R99) Nterm Ub R42 NH1 N31 ND2 Nterm Ub R74 N Y33 OH Nterm Ub R74 0 R100 NH2 (R99) Nterm Ub G75 0 Q57 NE2 (Q56) Nterm Ub G76 0 Q57 NE2 (Q56) Cterm Ub Q62 NE2 P53 O (P52a) Cterm Ub Q62 OE2 G56 N (G55) Cterm Ub K63 S55 O (S54) A pesar de que las cadenas de la poliubiquitina lineal libre y la poliubiquitina con unión K63 libre adoptan estructuras similares, debido a que Lys63 y el extremo amino libre situado a solo ~6 Á de distancia en la estructura de la monoubiquitina (código PDB 1UBQ) , este anticuerpo se une preferentemente a cadenas lineales. Esta especificidad se consigue mediante el reconocimiento doble de las orientaciones relativas de las subunidades tanto proximal como distal de la ubiquitina. El reconocimiento de la ubiquitina proximal se consiguió mediante la interacción de los restos H2 de la CDR con el bucle 60s de la subunidad proximal. En particular, se establecen dos enlaces de hidrógeno entre la cadena secundaria de Gln62 de la ubiquitina proximal, implicando ambos restos H2 de la CDR. Uno se establece entre el oxígeno carbonilo de la cadena principal de Pro52a y la amina de la cadena secundaria de Gln62. El otro se establece entre la amida de la cadena principal de Gly55 y el carbonilo de la cadena secundaria de Gln62. Existe también un tercer enlace de hidrógeno entre el carbonilo de la cadena principal de Ser54 y la amida de la cadena principal de Lys63. Además de estos tres enlaces de hidrógeno, también tienen lugar numerosas interacciones de Van der Waals entre H2 de CDR y la ubiquitina proximal. Aunque la ubiquitina distal de la diubiquitina con unión K63 podría teóricamente enlazarse al anticuerpo con la misma orientación, la ubiquitina proximal rotaría ligeramente debido a la diferencia de ~6 Á en la posición de Metí y Lys63. Esta rotación probablemente perturbaría los enlaces de hidrógeno y las interacciones de Van der Waals entre H2 de CDR y el bucle de 60. Por tanto, la especificidad se codifica mediante el reconocimiento de las orientaciones espaciales relativas de las ubiquitinas proximal y distal resultantes del enlace lineal.

Esta estructura ilustra también por qué las mutaciones particulares seleccionadas en la maduración por afinidad ayudan a aumentar la afinidad. En H2 de CDR, la mutación que consigue la mejora más significativa en la sensibilidad según las transferencias Western fue S56Q (véase la FIG. 13, clon 3F5) . La estructura muestra que Gln56 establece dos enlaces de hidrógeno: uno con el oxígeno carbonilo de Gly75 de la ubiquitina distal y el segundo con el oxígeno carbonilo de Gly76 de la ubiquitina distal, que participa en el enlace lineal entre las ubiquitinas distal y proximal (véase la FIG. 24A) . La cadena secundaria más corta de Ser probablemente no alcanza estos restos para establecer enlaces de hidrógeno. La mutación que consigue la segunda mejora más importante en la sensibilidad según las transferencias Western fue S52K en la CDR L2 (véase la FIG. 13, clon 1F11) . Lys52 se sitúa cerca de Asp32 ubicada en el extremo carboxilo de la hélice alfa de la ubiquitina distal. Aunque Lys52 está demasiado lejos para constituir un puente salino con la cadena secundaria de Asp32, puede establecer una interacción electrostática favorable dado que también está orientada hacia el extremo negativo del dipolo de la hélice (véase la FIG. 24B) . La tercera mutación que mejora la sensibilidad del anticuerpo fue Y102L en H3 de la CDR (véase la FIG. 13, clon Y102L) . Aunque este resto no entra en contacto con la diubiquitina, puede ayudar a estabilizar una conformación favorable en H3 de CDR para mejorar la unión. Leul02 se intercala entre Val2 y Leu4 del marco 1 de la cadena pesada (véase la FIG. 24C) . La cadena secundaria más hidrófoba de Leu podría proporcionar una interacción más favorable con Val2 y Leu4 que Tyr y podría ayudar a colocar el resto de la H3 de CDR para entrar en contacto con la diubiquitina.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle mediante la ilustración y los ejemplos con fines de claridad y comprensión, las descripciones y ejemplos no deben tomarse como limitantes del alcance de la invención. Las divulgaciones de todas las patentes y bibliografía científica citada en el presente documento se han incorporado expresamente por referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una primera poliubiquitina que comprende una unión entre el extremo C y el extremo N, donde el anticuerpo no se une específicamente a una segunda poliubiquitina que comprende una unión de lisina.

2. Un anticuerpo aislado que se une específicamente tanto a una primera poliubiquitina que comprende una unión entre el extremo C y el extremo N como a una segunda poliubiquitina que comprende una unión de lisina, donde el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina, y donde el anticuerpo se une a la segunda ubiquitina con una afinidad de enlace sustancialmente reducida si se compara con la afinidad de enlace del anticuerpo por la primera poliubiquitina.

3. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una poliubiquitina unida por los extremos C y N, donde el anticuerpo no se une específicamente a la monoubiquitina.

4. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende al menos una secuencia hipervariable (HVR) seleccionada de HVR-Ll, HVR-L2 , HVR-L3 , HVR-H1, HVR-H2 , y HVR-H3 de cualquiera de las SEC ID Nros: 1, 4, 19 y 50-57; SEC ID N° : 2 y 58-63, ; SEC ID Nros: 3, 5, 6, 20, 21 y 64-72; SEC ID Nros : 7, 10, 13, 16, 22 y 73-81; SEC ID Nros: 8, 11, 14, 17, 23, 24 y 82-86; y SEC ID Nros: 9, 12, 15, 18 y 87-93, respectivamente.

5. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende al menos una secuencia seleccionada de HVR-Ll, HVR-L2 y HVR-L3, donde HVR-Ll comprende la secuencia de aminoácidos RASQX1VX2X3X4VA (SEC ID N°: 39), donde el aminoácido Xi se selecciona entre los aminoácidos D, S y G, el aminoácido X2 se selecciona entre S y D, el aminoácido X3 se selecciona entre S, T y N y el aminoácido X4 se selecciona entre A y S, donde HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 2; y donde HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos ???5?e?7?8?9???? (SEC ID N° : 40), donde el aminoácido X5 se selecciona entre S, Y y H, el aminoácido X6 se selecciona entre Y y F, donde el aminoácido X7 se selecciona entre T, Y y A, donde el aminoácido X8 se selecciona entre T, Y y S, el aminoácido X9 es opcional y, si está presente, es S, y el aminoácido Xi0 se selecciona entre P Y L,

6. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende al menos una secuencia seleccionada de HVR-H1, HVR-H2, y HVR-H3 donde HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos X11X12X13 14X15 16X17X18 (SEC ID N° : 41), donde el aminoácido XX1 se selecciona entre T y N, el aminoácido Xi2 se selecciona entre F e I, el aminoácido Xi3 se selecciona entre S, T e Y, el aminoácido Xi4 se selecciona entre N, D, S e Y, donde el aminoácido X15 se selecciona entre T, Y, S y D, el aminoácido Xi6 se selecciona entre Y, D y S, el aminoácido Xi7 se selecciona entre I y M, y el aminoácido Xi8 se selecciona entre S y H, y donde HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos AXi9 IX20 21 22 23 2 X25TX26 (SEC ID N° : 42), donde el aminoácido Xi9 se selecciona entre S, G, W y E, donde el aminoácido X2o se selecciona entre T, S e Y, el aminoácido X2i se selecciona entre P y S, el aminoácido X22 se selecciona entre S e Y, el aminoácido X23 se selecciona entre G, S e Y, el aminoácido X24 se selecciona entre G y S, el aminoácido X25 se selecciona entre S e Y, y el aminoácido X26 se selecciona entre D y S, y HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos 27X28 29 30X31X32 33 34 35 36 37D (SEC ID N° : 43) donde el aminoácido X27 se selecciona entre T, E y G, el aminoácido X28 se selecciona entre W, A e Y, el aminoácido X29 se selecciona entre L, G, V y S, el aminoácido X30 se selecciona entre L, S y W, el aminoácido X3i se selecciona entre R, K e Y. el aminoácido X32 se selecciona entre , L, G e Y, el aminoácido X33 se selecciona entre V, L, A y G, el aminoácido X37 se selecciona entre M y F, y donde los aminoácidos X34, X35 , y X3e son opcionales y, si están presentes, el aminoácido X34 es S, el aminoácido X35 se selecciona entre V y P, y el aminoácido X36 es A.

7. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende al menos una secuencia seleccionada de HVR-Ll, HVR-L2 y HVR-L3, donde HVR-Ll comprende la secuencia de aminoácidos RASQ X38X39X40 41 42X 3 (SEC ID N° : 44), donde el aminoácido X38 se selecciona entre D, A, E, G, L, N, S, T y V, el aminoácido X39 se selecciona entre V, A, L y S, el aminoácido X40 se selecciona entre S, F, G, L, R y V, donde el aminoácido X4i se selecciona entre T, G, I, N, S y V, el aminoácido X42 se selecciona entre A, H, Q, R, S, e Y, y el aminoácido X43 se selecciona entre V y L, y donde HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos 8X44X45X46X47YX48 (SEC ID N° : 45), donde el aminoácido X44 se selecciona entre A y R, el aminoácido X45 se selecciona entre S, K, Q, y R, el aminoácido X4G se selecciona entre F e Y, el aminoácido X47 se selecciona entre L, A, F, G, H, I, K, M, N, P, R, S, V e Y, y el aminoácido X 8 se selecciona entre S, A, D, F, G, H, V, W e Y y donde HVR-L3 comprende la secuencia QQ X49X50X51X52PPT (SEC ID N° : 46), donde el aminoácido X49 se selecciona entre H y S, el aminoácido X50 se selecciona entre Y, K, N, Q, R, S, V, y W, donde el aminoácido X51 se selecciona entre T, I, Q, R, S y V, y el aminoácido X52 se selecciona entre T, A, D, F, G, K, N, P, Q, R, S y V.

8. El anticuerpo de la reivindicación 3 , que comprende al menos una secuencia seleccionada de HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3, donde HVR-Hl comprende la secuencia de aminoácidos X53X54X55YX56S (SEC ID N° : 47), donde el aminoácido X53 se selecciona entre A, F, K, M, Q, R y S, el aminoácido X5 se selecciona entre N y W, donde el aminoácido X55 se selecciona entre T, A, I, L, M, y V, y el aminoácido X56 se selecciona entre I, M y V, y donde HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos AX57X58 PX59SGX60 X61 (SEC ID N°:48), donde el aminoácido X57 se selecciona entre T y S, el aminoácido X5a se selecciona entre I, S y V, el aminoácido X59 se selecciona entre S y A, el aminoácido XSo se selecciona entre S, H, I, L, y Q, el aminoácido X61 se selecciona entre D y N, y donde HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos X62WX63XS4RWVX65D (SEC ID N° : 49), donde el aminoácido X62 se selecciona entre S y T, el aminoácido X63 se selecciona entre L e Y, el aminoácido X64 se selecciona entre L, I y V, y el aminoácido 65 se selecciona entre y F.

9. El anticuerpo de la reivindicación 3, una secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 1 o 4, una secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2, y una secuencia de HVR-L3 seleccionada de las SEC ID Nros: 3, 5 y 6, respectivamente.

10. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende una secuencia de HVR-H1 seleccionada entre las SEC ID Nros: 7, 10, 13 y 16 y una secuencia de HVR-H2 seleccionada de la SEC ID N° : 8, 11, 14 y 17, y una secuencia de HVR-H3 seleccionada de la SEC ID Nros: 9, 12, 15 y 18, respectivamente.

11. El anticuerpo de la reivindicación 3 , una secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 1 o 19, una secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N°: 2, y una secuencia de HVR-L3 seleccionada de las SEC ID Nros: 3, 20 y 21, respectivamente.

12. El anticuerpo de la reivindicación 3, una secuencia de HVR-H1 de la SEC ID F: 10 o 22, y una secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N°: 11, 23 y 24, una secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 12, respectivamente.

13. El anticuerpo de la reivindicación 3 , que comprende una secuencia de HVR-L1 seleccionada entre las SEC ID Nros: 1 y 50-57, una secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2 y 58-63, una secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3 y 64-72, respectivamente.

14. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende una secuencia de HVR-H1 seleccionada entre las SEC ID Nros: 7 y 73-81, y una secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 8 y 82-86, y una secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 9 y 87-93, respectivamente .

15. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende las secuencias HVR-L1, HVR-L2, y HVR-L3 correspondientes a las definidas para los clones 1E3, 1D8, 1F4, 1A10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 3F5, Y102L, 1F11/3F5/Y102L en las Figuras 2A, 5A o 9A.

16. El anticuerpo de la reivindicación 3 , que comprende las secuencias HVR-H1, HVR-H2, y HVR-H3 correspondientes a las definidas para los clones 1E3, 1D8, 1F4, 1A10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 3F5, Y102L, 1F11/3F5/Y102L en las Figuras 2B, 5B o 9B.

17. El anticuerpo de la reivindicación 3 , que comprende las secuencias HVR-L1, HVR-L2, y HVR-L3 correspondientes a las definidas para los clones descritos en la Tabla 5.

18. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende las secuencias HVR-H1, HVR-H2, y HVR-H3 correspondientes a las definidas para los clones descritos en la Tabla 5.

19. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N°: 1, la secuencia de HVR- L2 de la SEC ID N° : 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N°: 3, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 10, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 11 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 12.

20. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 19, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 10, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 23 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 12.

21. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 20, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 10, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 11 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 12.

22. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de HVR-Ll de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 21, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 22, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 24 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 12.

23. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de HVR-Ll de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR- L2 de la SEC ID N° : 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 7, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 8 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N°: 9.

24. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de HVR-Ll de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 seleccionada de la SEC ID N° : 2, 58 y 60, la secuencia de HVR-L3 seleccionada de la SEC ID N° : 3, 65 y 72, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 7 o 80, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 8 u 82 y la secuencia de HVR-H3 seleccionada entre la SEC ID N° : 9, 87, 89 u 90.

25. El anticuerpo de la reivindicación 24, que comprende la secuencia de HVR-L1 de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 58, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 7, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N°: 8 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 9.

26. El anticuerpo de la reivindicación 24, que comprende la secuencia de HVR-Ll de la SEC ID N°: 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N° : 2, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 7, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 82 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID N° : 9.

27. El anticuerpo de la reivindicación 24, que comprende la secuencia de HVR-Ll de la SEC ID N° : 1, la secuencia de HVR-L2 de la SEC ID N°: 58, la secuencia de HVR-L3 de la SEC ID N° : 3, la secuencia de HVR-H1 de la SEC ID N° : 7, la secuencia de HVR-H2 de la SEC ID N° : 82 y la secuencia de HVR-H3 de la SEC ID F: 9.

28. El anticuerpo de la reivindicación 27, donde el primer aminoácido después del extremo C de HVR-H3 es una leucina.

29. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera seleccionados de las SEC ID Nros: 25-28, 33-35, 94 y 193-195.

30. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada seleccionados de las SEC ID Nros: 29-32, 36-38, 95 y 196-198.

31. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y la cadena pesada que tienen una identidad de secuencia de al menos el 95% con una de las siguientes combinaciones de secuencias: SEC ID Nros 25 y 29; SEC ID Nros: 26 y 30; SEC ID Nros : 27 y 31; SEC ID Nros: 28 y 32; SEC ID Nros : 33 y 36; SEC ID Nros : 34 y 37; SEC ID Nros : 35 y 38; SEC ID Nros 94 y 95; SEC ID Nros : 193 y 196; SEC ID Nros : 194 y 197; y SEC ID Nros : 195 y 198.

32. El anticuerpo de la reivindicación 31 que comprende las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y la cadena pesada de las SEC ID Nros: 94 y 95.

33. Un anticuerpo aislado que se une al mismo determinante antigénico de la poliubiquitina unida del extremo C al extremo N que el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-32, donde el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina.

34. Un anticuerpo aislado que compite con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-32 por la unión a poliubiquitina, donde el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina.

35. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-32, donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína poliubiquitinada unida del extremo C al extremo N.

36. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-32, donde el anticuerpo modula al menos una ruta de señalización mediada por poliubiquitina.

37. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-32, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, o un fragmento de anticuerpo que se une a poliubiquitina unida del extremo C al extremo N.

38. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

39. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 38.

40. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 38.

41. Un método para producir el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-37, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 31 en condiciones en las que se produzca el anticuerpo.

42. El método de reivindicación 41, que comprende además recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora.

43. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-37 y un agente citotóxico.

44. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-37 y un portador farmacéuticamente aceptable.

45. La formulación farmacéutica de la reivindicación 44, que comprende además un agente terapéutico adicional.

46. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-37 para su uso como medicamento.

47. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-37 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionados con el ciclo celular.

48. El anticuerpo de la reivindicación 47, donde la enfermedad o trastorno relacionados con el ciclo celular se seleccionan entre una enfermedad o trastorno asociados con una progresión creciente anómala del ciclo celular y una enfermedad o trastorno asociados con una progresión decreciente anómala del ciclo celular.

49. El anticuerpo de la reivindicación 48, donde la enfermedad o trastorno asociados con una progresión creciente anómala del ciclo celular es cáncer.

50. El anticuerpo de la reivindicación 48, donde la enfermedad o trastorno asociados con una progresión decreciente anómala del ciclo celular se seleccionan entre un trastorno degenerativo del músculo y un trastorno degenerativo del nervio.

51. El uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-37 en la fabricación de un medicamento.

52. El uso de la reivindicación 51, donde el medicamento es para una enfermedad o trastorno seleccionado de cáncer, un trastorno degenerativo del músculo, y un trastorno degenerativo del nervio.

53. Un método para tratar a un individuo que tiene una enfermedad o trastorno seleccionado de cáncer, un trastorno degenerativo del músculo, y un trastorno degenerativo del nervio, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-37.

5 . Un método para determinar la presencia de una poliubiquitina o una proteína poliubiquitinada en una muestra que se sospecha que contiene una poliubiquitina o una proteína poliubiquitinada, que comprende exponer la misma a al menos uno de los anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-37 y determinar la unión del al menos un anticuerpo a la poliubiquitina o una proteína poliubiquitinada de la muestra.

55. Un método para separar una proteína poliubiquitinada unida del extremo C al extremo N de una proteína poliubiquitinada no unida del extremo C al extremo N en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-37.

56. Un método para determinar la función y/o la actividad de una poliubiquitina unida del extremo C al extremo N en una célula o muestra que comprende poner en contacto la célula o muestra con al menos un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-37 y evaluar el efecto de dicha etapa de puesta en contacto de la célula o la muestra.