KR20140054177A - 항-폴리유비퀴틴 항체 및 이용 방법 - Google Patents

항-폴리유비퀴틴 항체 및 이용 방법 Download PDF

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KR20140054177A
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로버트 에프. 켈리
마리사 엘. 마츠모토
비쉬바 딕싯
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 항-폴리유비퀴틴 항체 및 이들을 이용하는 방법을 제시한다.

Description

항-폴리유비퀴틴 항체 및 이용 방법{ANTI-POLYUBIQUITIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
관련된 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119 (e) 하에, 2011년 8월 5일자 제출된 U.S. 특허가출원 61/515,729에 우선권을 주장하고, 이것은 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 양식으로 제출되었고 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입되는 서열 목록을 내포한다. 2012년 8월 6일자에 만들어진 상기 ASCII 사본은 P4716R1WO.txt로 명명되고 128,429 바이트의 크기를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 항-폴리유비퀴틴 항체의 분야, 그리고 더욱 구체적으로, 모노유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않고 선형 폴리유비퀴틴에 특이적인 항-폴리유비퀴틴 항체 및 이들을 이용하는 방법에 관계한다.
배경
유비퀴틴은 매우 다양한 세포 경로에서 중요한 조절 역할을 갖는 소형 단백질이다. 이들 중에서 가장 잘 알려진 것은 단백질 분해에서 유비퀴틴의 역할인데, 여기서 표적 단백질에 유비퀴틴의 공유 부착은 표적된 단백질이 26S 프로테아좀에 의해 인식되고 파괴될 수 있도록 한다 (Wilkinson, Semin. Cell Devel. Biol. 11(3): 141-148 (2000) 참조). 표적 단백질에 유비퀴틴, 76 아미노산 단백질의 공유 부착은 3-단계 효소 과정 (Pickart, Annu. Rev. Biochem. 70: 503-533 (2001))이다. 먼저, 유비퀴틴-활성화 효소 E1이 유비퀴틴-E1 티오에스테르를 ATP-의존성 반응에서 형성한다. 유비퀴틴은 두 번째 단계에서, 유비퀴틴-E1 티오에스테르로부터 유비퀴틴-접합 효소 (E2) 패밀리의 구성원으로 이전된다. 세 번째 단계에서, 유비퀴틴-단백질 리가아제 (E3)의 도움으로, 유비퀴틴의 카르복실 말단 및 표적 단백질 상에서 리신 잔기의 ε-아미노 기 사이에 이소펩티드 결합이 형성된다. 탈유비퀴틴효소로 명명된 효소가 유비퀴틴 모이어티를 표적 단백질로부터 제거한다 (Guterman and Glickman, Curr. Prot. Pep. Sci. 5: 201-210 (2004)).
유비퀴틴은 7개의 리신 잔기 (Lys6, Lys11, Lys27, Lys33, Lys29, Lys48, 그리고 Lys63)을 내포하고, 그리고 따라서 유비퀴틴 자체가 유비퀴틴화를 위한 표적 단백질로서 기능할 수 있다 (Peng et al., Nat. Biotechnol. 21: 921-926 (2003); Pickart and Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8:610-616 (2004)). 유비퀴틴 단백질의 유비퀴틴화 직후에 생산된 분자는 폴리유비퀴틴 분자로 명명되고, 그리고 2개 또는 그 이상의 유비퀴틴 모이어티를 포함할 수 있다. 유비퀴틴의 유비퀴틴화는 이론적으로, 유비퀴틴 내에서 상이한 리신 잔기에 이소펩티드 결합을 갖는 상이한 종류의 폴리유비퀴틴이 존재하도록, 7개 리신 잔기 중의 하나에서 일어날 수 있다 (Peng et al., Nat. Biotechnol. 21: 921-926 (2003)). 7개 리신 잔기 모두에서 내부 이소펩티드 연쇄를 갖는 폴리유비퀴틴 사슬이 보고되었다. Iwai and Tokunaga, EMBO Reports 10:706-713 (2009).
최근에, 선형 폴리유비퀴틴 사슬 역시 형성되는 것으로 밝혀졌는데, 여기서 유비퀴틴의 C-말단 글리신은 다른 유비퀴틴 분자의 N-말단 메티오닌의 α-아미노 기에 접합된다. Iwai and Tokunaga, EMBO Reports 10:706-713 (2009). 선형 폴리유비퀴틴은 2개의 고리 핑거 단백질, HOIL-1L과 HOIP로 구성되는 선형 유비퀴틴 사슬 결합 복합체 (LUBAC)를 거쳐 형성된다. Tokunaga et al., Nat. Cell Biol. 11:123-132 (2009). 유전자 인코딩된, 비정착 선형 폴리유비퀴틴은 세포 내에 존재하지 않는 것으로 생각되는데, 그 이유는 이의 C-말단이 이소펩티다아제 T에 의한 개열에 취약하기 때문이다. Iwai and Tokunaga, EMBO Reports 10:706-713 (2009). 이러한 관찰은 선형 폴리유비퀴틴이 번역 이후에 기질 단백질 위에 조립되고, 그리고 접합된 선형 폴리유비퀴틴 분자가 단백질 활성과 기능의 잠재적 조절자라는 것을 암시한다 (Id). 가령, NF-kB 필수 조절자 (NEMO)의 선형 폴리유비퀴틴화는 NF-κB 활성화에서 일정한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Id).
선형 폴리유비퀴틴을 상이한 리신 연쇄의 폴리유비퀴틴과 구별하는 항체는 단백질 분해와 통제에서 선형 폴리유비퀴틴 사슬의 역할을 더욱 조사하고, 그리고 선형 폴리유비퀴틴-매개된 경로에서 선형 폴리유비퀴틴을 표적으로 하고 조절하는데 유용할 것이다.
요약
본 발명은 항-선형 폴리유비퀴틴 항체 및 이들을 이용하는 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 본 발명은 C-말단에서 N-말단 연쇄를 포함하는 첫 번째 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제시하고, 상기 항체는 리신 연쇄를 포함하는 두 번째 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명은 C-말단에서 N-말단 연쇄를 포함하는 첫 번째 폴리유비퀴틴 및 리신 연쇄를 포함하는 두 번째 폴리유비퀴틴 둘 모두에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제시하고, 상기 항체는 모노유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않고, 그리고 상기 항체는 첫 번째 폴리유비퀴틴에 대한 항체의 결합 친화성과 비교하여 실질적으로 감소된 결합 친화성으로 두 번째 폴리유비퀴틴에 결합한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제시하고, 상기 항체는 모노유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않는다. 한 양상에서, 항체는 각각 서열 번호: 1, 4, 19와 50-57; 서열 번호: 2와 58-63; 서열 번호: 3, 5, 6, 20, 21과 64-72; 서열 번호: 7, 10, 13, 16, 22와 73-81; 서열 번호: 8, 11, 14, 17, 23, 24와 82-86; 그리고 서열 번호: 9, 12, 15, 18과 87-93 중에서 하나의 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3에서 선택되는 적어도 하나의 초가변 (HVR) 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 항체는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하고, 여기서 HVR-L1은 아미노산 서열 RASQX1VX2X3X4VA (서열 번호: 39)를 포함하고, 여기서 아미노산 X1은 아미노산 D, S와 G에서 선택되고, 아미노산 X2는 S와 D에서 선택되고, 아미노산 X3은 S, T와 N에서 선택되고, 아미노산 X4는 A와 S에서 선택되고; 여기서 HVR-L2는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 여기서 HVR-L3은 아미노산 서열 QQX5X6X7X8X9PX10T (서열 번호: 40)을 포함하고, 여기서 아미노산 X5는 S, Y와 H에서 선택되고, 아미노산 X6은 Y와 F에서 선택되고, 아미노산 X7은 T, Y와 A에서 선택되고, 아미노산 X8은 T, Y와 S에서 선택되고, 아미노산 X9는 선택적이고 존재하면 세린이고, 아미노산 X10은 P와 L에서 선택된다.
다른 양상에서, 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3에서 선택되는 적어도 하나의 초가변 (HVR) 서열을 포함하고, 여기서 HVR-H1은 아미노산 서열 X11X12X13X14X15X16X17X18 (서열 번호: 41)을 포함하고, 여기서 아미노산 X11은 T와 N에서 선택되고, 아미노산 X12는 F와 I에서 선택되고, 아미노산 X13은 S, T와 Y에서 선택되고, 아미노산 X14는 N, D, S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X15는 T, Y, S와 D에서 선택되고, 아미노산 X16은 Y, D와 S에서 선택되고, 아미노산 X17은 I와 M에서 선택되고, 아미노산 X18은 S와 H에서 선택되고; 그리고 여기서 HVR-H2는 아미노산 서열 AX19 IX20X21X22X23X24X25TX26 (서열 번호: 42)을 포함하고, 여기서 아미노산 X19는 S, G, W와 E에서 선택되고, 아미노산 X20은 T, S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X21은 P와 S에서 선택되고, 아미노산 X22는 S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X23은 G, S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X24는 G와 S에서 선택되고, 아미노산 X25는 S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X26은 D와 S에서 선택되고, 그리고 여기서 HVR-H3은 아미노산 서열 RX27X28X29X30X31X32X33X34X35X36X37D (서열 번호: 43)을 포함하고, 여기서 아미노산 X27은 T, E와 G에서 선택되고, 아미노산 X28은 W, A와 Y에서 선택되고, 아미노산 X29는 L, G, V와 S에서 선택되고, 아미노산 X30은 L, S와 W에서 선택되고, 아미노산 X31은 R, K와 Y에서 선택되고, 아미노산 X32는 W, L, G와 Y에서 선택되고, 아미노산 X33은 V, L, A와 G에서 선택되고, 아미노산 X37은 M과 F에서 선택되고, 그리고 여기서 아미노산 X34, X35, 그리고 X36은 선택적으로 존재하고 존재하면, 아미노산 X34는 S이고, 아미노산 X35는 V와 P에서 선택되고, 그리고 아미노산 X36은 A이다.
다른 양상에서, 항체는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3에서 선택되는 적어도 하나의 초가변 (HVR) 서열을 포함하고, 여기서 HVR-L1은 아미노산 서열 RASQ X38X39X40X41X42X43A (서열 번호: 44)를 포함하고, 여기서 아미노산 X38은 D, A, E, G, L, N, S, T와 V에서 선택되고, 아미노산 X39는 V, A, L와 S에서 선택되고, 아미노산 X40은 S, F, G, L, R과 V에서 선택되고, 아미노산 X41은 T, G, I, N, S와 V에서 선택되고, 아미노산 X42는 A, H, Q, R, S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X43은 V와 L에서 선택되고, 그리고 여기서 HVR-L2는 아미노산 서열 SX44X45X46X47YX48 (서열 번호: 45)을 포함하고, 여기서 아미노산 X44는 A와 R에서 선택되고, 아미노산 X45는 S, K, Q와 R에서 선택되고, 아미노산 X46은 F와 Y에서 선택되고, 아미노산 X47은 L, A, F, G, H, I, K, M, N, P, R, S, V와 Y에서 선택되고, 아미노산 X48은 S, A, D, F, G, H, V, W와 Y에서 선택되고, 그리고 여기서 HVR-L3은 서열 QQ X49X50X51X52PPT (서열 번호: 46)를 포함하고, 여기서 아미노산 X49는 H와 S에서 선택되고, 아미노산 X50은 Y, K, N, Q, R, S, V와 W에서 선택되고, 아미노산 X51은 T, I, Q, R, S와 V에서 선택되고, 아미노산 X52는 T, A, D, F, G, K, N, P, Q, R, S와 V에서 선택된다.
다른 양상에서, 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3에서 선택되는 적어도 하나의 초가변 (HVR) 서열을 포함하고, 여기서 HVR-H1은 아미노산 서열 X53X54X55YX56S (서열 번호: 47)를 포함하고, 여기서 아미노산 X53은 A, F, K, M, Q, R과 S에서 선택되고, 아미노산 X54는 N과 W에서 선택되고, 아미노산 X55는 T, A, I, L, M과 V에서 선택되고, 아미노산 X56은 I, M과 V에서 선택되고, 그리고 여기서 HVR-L2는 아미노산 서열 AX57X58TPX59SGX60TX61 (서열 번호:48)을 포함하고, 여기서 아미노산 X57은 T와 S에서 선택되고, 아미노산 X58은 I, S와 V에서 선택되고, 아미노산 X59는 S와 A에서 선택되고, 아미노산 X60은 S, H, I, L, M과 Q에서 선택되고, 아미노산 X61은 D와 N에서 선택되고, 그리고 여기서 HVR-H3은 아미노산 서열 X62WX63X64RWVX65D (서열 번호: 49)를 포함하고, 여기서 아미노산 X62는 S와 T에서 선택되고, 아미노산 X63은 L과 Y에서 선택되고, 아미노산 X64는 L, I와 V에서 선택되고, 아미노산 X65는 M과 F에서 선택된다.
다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 1 또는 4의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 그리고 서열 번호: 3, 5와 6에서 선택되는 HVR-L3 서열을 각각 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 7, 10, 13과 16에서 선택되는 HVR-H1 서열, 서열 번호: 11, 23과 24에서 선택되는 HVR-H2 서열, 그리고 서열 번호: 12의 HVR-H3 서열을 각각 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 1과 50-56에서 선택되는 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2와 57-62에서 선택되는 HVR-L2 서열, 그리고 서열 번호: 3과 63-71에서 선택되는 HVR-L3 서열을 각각 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 7과 72-80에서 선택되는 HVR-H1 서열, 서열 번호: 8과 81-85에서 선택되는 HVR-H2 서열, 그리고 서열 번호: 9와 86-92에서 선택되는 HVR-H3 서열을 각각 포함한다.
다른 양상에서, 항체는 도 1A에서 클론 1E2, 1D8, 1F4 또는 1A10에 대해 진술된 것들에 상응하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 도 1B에서 클론 1E2, 1D8, 1F4 또는 1A10에 대해 진술된 것들에 상응하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 도 4A에서 클론 1D8.3C2, 1D8.3F8 또는 1D8.4F5에 대해 진술된 것들에 상응하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 도 4B에서 클론 1D8.3C2, 1D8.3F8 또는 1D8.4F5에 대해 진술된 것들에 상응하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 10의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 11의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 12의 HVR-H3 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 19의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 10의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 23의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 12의 HVR-H3 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 20의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 10의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 11의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 12의 HVR-H3 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 20의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 10의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 11의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 12의 HVR-H3 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 7의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 8의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 9의 HVR-H3 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2, 57과 59에서 선택되는 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3, 64와 71에서 선택되는 HVR-L3 서열, 서열 번호: 7 또는 79의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 8 또는 81의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 9, 86, 88 또는 89에서 선택되는 HVR-L3 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 57의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 7의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 8의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 9의 HVR-H3 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 7의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 81의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 9의 HVR-H3 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 57의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 7의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 81의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 9의 HVR-H3 서열을 포함한다. 일정한 양상에서, 본원에서 설명된 임의의 항체는 HVR-H3의 C-말단 단부 후 첫 번째 아미노산 (가령, HVR-H3의 C-말단 단부에 바로 인접한 아미노산)으로 류신을 포함할 수 있다, 예를 들면, 1E3, -TWLLRVMD L (서열 번호:96).
다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 25-28, 33-35, 94와 193-195에서 선택되는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항체는 서열 번호: 29-31, 36-38, 95와 196-198에서 선택되는 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 항체는 서열의 하기 조합 중에서 하나의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄와 중쇄 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호 25와 29; 서열 번호: 26과 30; 서열 번호: 27과 31; 서열 번호: 28과 32; 서열 번호: 33과 36; 서열 번호: 34와 37; 서열 번호: 35와 38; 서열 번호: 94와 95; 서열 번호: 193과 196; 서열 번호: 194와 197; 그리고 서열 번호: 195와 198.
다른 구체예에서, 본 발명은 단리된 항체를 제시하고, 상기 항체는 C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴 상에서 전술한 임의의 항체와 동일한 항원성 결정인자에 결합하고, 그리고 상기 항체는 모노유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명은 C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴에 결합에 대해 전술한 임의의 항체와 경쟁하는 단리된 항체를 제시하고, 상기 항체는 모노유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명은 C-에서 N-말단 연결된 폴리유비퀴틴화 단백질에 특이적으로 결합하는 전술한 임의의 단리된 항체를 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 폴리유비퀴틴-매개된 신호전달 경로를 조절하는 전술한 임의의 단리된 항체를 제시한다.
일반적인 양상에서, 전술한 임의의 항체는 단일클론 항체이다. 다른 일반적인 양상에서, 전술한 임의의 항체는 인간 항체이다. 다른 일반적인 양상에서, 전술한 임의의 항체는 인간화 항체이다. 다른 일반적인 양상에서, 전술한 임의의 항체는 키메라 항체이다. 다른 일반적인 양상에서, 전술한 임의의 항체는 C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴에 결합하는 항체 단편이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 임의의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산를 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 임의의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 임의의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 임의의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제시한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 임의의 항체를 생산하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 앞서 언급된 숙주 세포를 상기 항체가 생산되는 조건 하에 배양하는 것을 포함한다. 한 양상에서, 상기 방법은 항체를 숙주 세포로부터 회수하는 것을 더욱 포함한다. 다른 양상에서, 상기 방법은 항체의 정제를 더욱 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 임의의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체를 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 임의의 항체 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 제제를 제시한다. 한 양상에서, 제약학적 제제는 추가의 치료제를 더욱 포함한다. 한 가지 이와 같은 양상에서, 추가의 치료제는 화학치료제이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 약제로서 이용하기 위한 전술한 임의의 항체를 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 세포 주기-관련된 질환 또는 장애를 치료하는데 이용하기 위한 전술한 임의의 항체를 제시한다. 한 양상에서, 세포 주기-관련된 질환 또는 장애는 비정상적으로 증가된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애 및 비정상적으로 감소된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애에서 선택된다. 한 가지 이와 같은 양상에서, 비정상적으로 증가된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애는 암이다. 다른 이와 같은 양상에서, 비정상적으로 감소된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애는 퇴행성 근육 질환 및 퇴행성 신경 질환에서 선택된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 약제의 제조에서 전술한 임의의 항체의 용도를 제시한다. 한 양상에서, 약제는 암, 퇴행성 근육 질환, 그리고 퇴행성 신경 질환에서 선택되는 질환 또는 장애를 위한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 암, 퇴행성 근육 질환, 그리고 퇴행성 신경 질환에서 선택되는 질환 또는 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 전술한 임의의 항체의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 폴리유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴화 단백질을 내포하는 것으로 의심되는 샘플 내에서 폴리유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴화 단백질의 존재를 결정하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 이를 전술한 항체 중에서 적어도 하나에 노출시키고, 그리고 샘플 내에서 폴리유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴화 단백질에 적어도 하나의 항체의 결합을 결정하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 샘플 내에서 C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴화 단백질을 비-C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴화 단백질로부터 분리하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 샘플을 전술한 항체 중에서 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 세포 또는 샘플 내에서 C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴의 기능 및/또는 활성을 결정하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 세포 또는 샘플을 전술한 항체 중에서 적어도 하나의 항체와 접촉시키고, 그리고 이러한 세포 또는 샘플에 대한 상기 접촉 단계의 효과를 산정하는 것을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 실시예 1B에서 설명된 바와 같이, 유비퀴틴 단백질의 패널에 대한 클론 1D8, 1E3, 1F4와 1A10의 450 nm 파장에서 상대적 결합 신호를 보여주는 파지 스팟 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 Fab 라이브러리 클론은 각각, gD 태그를 내포하고, 그리고 파지 상에서 Fab의 전시는 항-gD 항체에 결합에 의해 산정되었다. 코팅되지 않은 웰은 음성 대조로서 이용되었다.
도 2A와 2B는 실시예 1에서 획득된 Fab의 경쇄와 중쇄 아미노산 서열을 도시한다. 도 2A는 클론 1E3, 1D8, 1F4와 1A10의 경쇄 서열 (각각, 서열 번호: 25-28)을 도시한다. 도 2B는 클론 1E3, 1D8, 1F4와 1A10의 중쇄 서열 정렬 (각각, 서열 번호: 29-32)을 도시한다. 도 2A와 2B 둘 모두에서, 각 클론에 대한 HVR 서열은 박스 표시된 영역에 의해 표시되는데, 첫 번째 박스는 HVR-L1 (도 2A) 또는 HVR-H1 (도 2B)을 표시하고, 두 번째 박스는 HVR-L2 (도 2A) 또는 HVR-H2 (도 2B)를 표시하고, 그리고 세 번째 박스는 HVR-L3 (도 2A) 또는 HVR-H3 (도 2B)을 표시한다.
도 3은 선형 디유비퀴틴에 대한 정제된 1F4, 1D8과 1E3 Fab의 친화성을 측정하는 파지 IC50 경쟁 ELISA의 결과를 도시한다.
도 4는 고정된 환경 내에서 디유비퀴틴 단백질의 패널을 특이적으로 인식하는 1D8과 1E3 Fab의 능력을 결정하기 위한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시한다.
도 5A와 5B는 1D8 친화성 성숙 라이브러리 분류로부터 실시예 2에서 획득된 친화성 성숙된 클론의 경쇄와 중쇄 아미노산 서열을 도시한다. 도 5A는 친화성 성숙된 클론 1D8.3C2, 1D8.3F8과 1D8.4F5의 경쇄 서열 (각각, 서열 번호: 33-35)을 도시한다. 도 5A는 1D8 서열을 서열 번호: 26으로서 개시한다. 도 5B는 친화성 성숙된 클론 1D8.3C2, 1D8.3F8과 1D8.4F5의 중쇄 서열 정렬 (각각, 서열 번호: 36-38)을 도시한다. 도 5B는 1D8 서열을 서열 번호: 30으로서 개시한다. 도 5A와 5B 둘 모두에서, 각 클론에 대한 HVR 서열은 박스 표시된 영역에 의해 표시되는데, 첫 번째 박스는 HVR-L1 (도 5A) 또는 HVR-H1 (도 5B)을 표시하고, 두 번째 박스는 HVR-L2 (도 5A) 또는 HVR-H2 (도 5B)를 표시하고, 그리고 세 번째 박스는 HVR-L3 (도 5A) 또는 HVR-H3 (도 5B)을 표시한다. 1D8 부모 서열에 상대적인 아미노산 변화는 회색으로 강조된다.
도 6은 선형 디유비퀴틴에 대한 1D8, 1D8.3C2, 1D8.3F8과 1D8.4F5 Fab의 친화성을 측정하는 파지 IC50 경쟁 ELISA의 결과를 도시한다.
도 7A와 7B는 부모 1E3 클론 및 대조와 비교하여, 돌연변이 친화성 성숙된 변이체의 결합 특이성 특징을 산정하는 연구의 결과를 도시한다. 파지 상에서 전시된 부모 1E3 클론 및 11개의 단일 돌연변이 친화성 성숙된 변이체의 결합은 ELISA에서 유비퀴틴 단백질의 패널에 결합에 대해 조사되었다. 항-gD 항체에 결합은 파지 상에서 Fab 전시를 산정하는데 이용되고, 그리고 코팅되지 않은 웰은 음성 대조로서 이용되었다.
도 8A와 8B는 실시예 3에서 설명된 바와 같이, 부모 1E3 클론 및 대조와 비교하여, 단일 돌연변이와 이중 돌연변이 변이체의 결합 특이성 특징을 산정하는 연구의 결과를 도시한다. 파지 상에서 전시된 부모 1E3 클론, 4개의 단일 돌연변이 친화성 성숙된 변이체 및 3개의 이중 돌연변이 친화성 성숙된 변이체의 결합은 ELISA에서 유비퀴틴 단백질의 패널에 결합에 대해 조사되었다. 항-gD 항체에 결합은 파지 상에서 Fab 전시를 산정하는데 이용되고, 그리고 코팅되지 않은 웰은 음성 대조로서 이용되었다.
도 9A와 9B는 1E3 Fab, 두 번째 1E3 친화성 성숙 라이브러리 분류로부터 실시예 3에서 획득된 친화성 성숙된 클론 (1F11과 3F5), 클론 4E4에서 관찰된 Y102L 돌연변이, 그리고 실시예 3P에서 설명된 바와 같이 클론 1F11과 3F5로부터 아미노산 변화 및 Y102L 돌연변이를 함입하는 삼중 돌연변이 Fab의 경쇄와 중쇄 아미노산 서열을 도시한다. 도 9A는 1E3, 1F11, 3F5, Y102L과 1F11/3F5/Y102L에 대한 친화성 성숙된 클론의 경쇄 서열 (각각, 서열 번호: 25, 193, 194, 195와 94)을 도시한다. 도 9B는 1E3, 1F11, 3F5, Y102L과 1F11/3F5/Y102L에 대한 친화성 성숙된 클론의 중쇄 서열 정렬 (각각, 서열 번호: 29, 196, 197, 198과 95)을 도시한다. 도 9A와 9B 둘 모두에서, 1E3에 대한 두 번째 친화성 성숙 라이브러리 내에 아미노산 변이에 대해 표적된 Kabat 위치는 박스 표시된 영역에 의해 표시된다. 1E3 부모 서열에 상대적인 아미노산 변화는 회색으로 강조된다.
도 10은 선형 디유비퀴틴 (레인 마다 1000, 333, 111, 37과 12 ng의 계단 희석액) 및 K63-연결된 디유비퀴틴 (레인 마다 1000 ng)에 부모 1E3, 단일, 그리고 이중 돌연변이 IgG의 결합의 웨스턴 블롯 분석을 제공한다.
도 11은 선형 디유비퀴틴 (레인 마다 1000, 333, 111, 37과 12 ng의 계단 희석액) 및 K63-연결된 디유비퀴틴 (레인 마다 1000 ng)에 부모 1E3, 이중, 그리고 삼중 돌연변이 IgG의 결합의 웨스턴 블롯 분석을 제공한다.
도 12는 선형 디유비퀴틴 (레인 마다 1000, 333, 111, 37과 12 ng의 계단 희석액) 및 K63-연결된 디유비퀴틴 (레인 마다 1000 ng)에 Y102L, Y1012L T110A 돌연변이체 및 Y102L, T110A, 3F5와 1F11 IgG의 다양한 돌연변이체 조합의 결합의 웨스턴 블롯 분석을 제공한다.
도 13은 선형 디유비퀴틴 (레인 마다 1000, 333, 111, 37과 12 ng의 계단 희석액) 및 K63-연결된 디유비퀴틴 (레인 마다 1000 ng)에 실시예 3M에서 설명된 바와 같은 부모 1E3, 단일, 이중, 그리고 삼중 돌연변이 IgG의 결합의 웨스턴 블롯 분석을 제공한다.
도 14는 선형 디유비퀴틴의 2-배 계단 희석액 (구배가 지시되는 경우에 1000, 500, 250, 125, 63, 31, 그리고 16 ng/레인) 또는 모노유비퀴틴, K11-연결된 디유비퀴틴, K48-연결된 디유비퀴틴, 그리고 K63-연결된 디유비퀴틴 (1 μg/레인)에 1E3과 1F11/3F5/Y102L IgG의 결합의 웨스턴 블롯 분석을 제공한다. 대조로서, 항-K63 IgG, Apu3.A8은 K63-연결된 디유비퀴틴의 2-배 계단 희석액 (구배가 지시되는 경우에 1000, 500, 250, 125, 63, 31, 그리고 16 ng/레인) 또는 모노유비퀴틴, 선형 디유비퀴틴, K11-연결된 디유비퀴틴, 그리고 K48-연결된 디유비퀴틴 (1 μg/레인)에 결합에 대해 분석되었다. 쿠마시 염색된 겔 (상부 왼쪽 패널)은 각각의 조사된 유비퀴틴이 겔 내에서 어디로 이동하는 지의 지시를 제공한다.
도 15는 모노유비퀴틴, 선형 폴리유비퀴틴 2-7 (길이에서 2 내지 7개 유비퀴틴 아단위), K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (길이에서 2 내지 7개 유비퀴틴 아단위), K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (길이에서 2 내지 7개 유비퀴틴 아단위), 그리고 K11-연결된 폴리유비퀴틴 (각 레인 마다 1 μg)은 범-유비퀴틴 항체 P4D1 (중간 패널) 또는 1F11/3F5/Y102L IgG (오른쪽 패널)로 면역블롯팅되는 실험의 결과를 도시한다. 쿠마시 염색은 샘플의 조성을 드러냈다 (왼쪽 패널). 웨스턴 블롯의 길고 짧은 노출이 도시된다.
도 16A와 16B는 5.8 μM MG132와 함께 변하는 농도의 TNFα로 변하는 양의 시간 동안 처리된 HeLa S3 세포의 용해물이 선형 유비퀴틴 사슬의 경우에 하이브리드 항체 1F11/3F5/Y102L로, 또는 K63-연결된 유비퀴틴 사슬의 경우에 Apu3.A8 항체로 면역블롯팅되는 실험의 결과를 도시한다. 대조로서, 각각 250 ng의 정제된 선형 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7이 각 겔 상에 이동되었다 (도 16A). NFκB 경로 활성화의 수준을 산정하기 위해, 이들 용해물은 IκBα 수준에 대해 블롯팅되었다 (도 16B). 부하 대조로서, 이들 용해물은 β-튜불린에 대해 블롯팅되었다.
도 17은 하이브리드 항-선형 폴리유비퀴틴 항체 1F11/3F5/Y102L, 아이소타입 대조, 또는 항-K63 항체 Apu3.A8을 이용한 면역침전 실험의 결과를 도시한다. 이들 IP 실험은 3가지 조건 (모든 유비퀴틴 사슬의 혼합물, 선형 유비퀴틴 사슬 없음, 또는 단지 선형 유비퀴틴 사슬) 하에 4 M 요소 IP 완충액에서 수행되었다. 대조로서, 각각 1 μg의 정제된 선형 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7이 각 겔 상에 이동되었다.
도 18A와 18B는 IF11/3F5/Y102L (항-선형) 또는 Apu3.A8 (항-K63)로 면역블롯팅된 변하는 농도의 요소 또는 PBST에서 항-선형 폴리유비퀴틴 항체 1F11/3F5/Y102L 또는 항-K63 항체 Apu3.A8을 이용하여, 선형 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7의 1:1 혼합물로부터 면역침전 실험의 결과를 도시한다. 대조로서, 각각 1 μg의 정제된 선형 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7이 각 겔 상에 이동되었다. 도 18A는 0M, 2M, 4M과 6M 요소에서 IP 실험의 결과를 도시한다. 도 18B는 6M, 7M, 그리고 8M 요소에서 IP 실험의 결과를 도시한다.
도 19는 변하는 농도의 요소에서 단백질 A 비드에 교차 연결된 항-선형 폴리유비퀴틴 항체 1F11/3F5/Y102L, 아이소타입 대조, 또는 항-K63 폴리유비퀴틴 항체 Apu3.A8을 이용하여, 선형 폴리유비퀴틴 2-7, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7의 1:1:1:1 혼합물로부터 면역침전과 면역블롯팅 실험의 결과를 도시한다. 면역블롯팅에 이용된 항체는 1F11/3F5/Y102L (항-선형), 2A3/2E6 (항-K11), Apu2.07 (항-K48), 또는 Apu3.A8 (항-K63) IgG이었다. 대조로서, 각각 1 μg의 정제된 선형 폴리유비퀴틴 2-7, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7이 각 겔 상에 이동되었다.
도 20은 변하는 농도의 요소에서 단백질 G 비드에 교차 연결된 하이브리드 항-선형 폴리유비퀴틴 항체 1F11/3F5/Y102L, 아이소타입 대조, 또는 항-K63 폴리유비퀴틴 IgG 항체 Apu3.A8을 이용하여, 선형 폴리유비퀴틴 2-7, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7의 1:1:1:1 혼합물로부터 면역침전과 면역블롯팅 실험의 결과를 도시한다. 면역블롯팅에 이용된 항체는 1F11/3F5/Y102L (항-선형), 2A3/2E6 (항-K11), Apu2.07 (항-K48), 또는 Apu3.A8 (항-K63) IgG이었다. 대조로서, 각각 1 μg의 정제된 선형 폴리유비퀴틴 2-7, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7이 각 겔 상에 이동되었다.
도 21A는 변하는 농도의 요소에서 항-선형 폴리유비퀴틴 항체 1F11/3F5/Y102L, 아이소타입 대조, 또는 항-K63 폴리유비퀴틴 항체 Apu3.A8을 이용하여, 선형 폴리유비퀴틴 2-7, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7의 1:1:1:1 혼합물로부터 면역침전과 면역블롯팅 실험의 결과를 도시한다. 면역블롯팅에 이용된 항체는 1F11/3F5/Y102L (항-선형), 2A3/2E6 (항-K11), Apu2.07 (항-K48), 또는 Apu3.A8 (항-K63) IgG이었다. 대조로서, 각각 500 ng의 정제된 선형 폴리유비퀴틴 2-7, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7이 각 겔 상에 이동되었다.
도 21B는 변하는 농도의 요소에서 하이브리드 항-선형 폴리유비퀴틴 항체 1F11/3F5/Y102L, 아이소타입 대조, 또는 항-K63 폴리유비퀴틴 항체 Apu3.A8을 이용하고, 그리고 SDS-PAGE 겔에 의해 분리되고 쿠마시 염색된, 선형 폴리유비퀴틴 2-7, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7의 1:1:1:1 혼합물로부터 면역침전 실험의 결과를 도시한다. 질량 분석 AQUA를 위해 절제된 영역은 표시된다.
도 21C는 도 24B (영역 B와 영역 C)에서 도시되고 실시예 4D에서 설명된 바와 같은 1F11/3F5/Y102L 면역침전으로부터 질량 분석 AQUA에 의해 확인된 폴리유비퀴틴 연쇄의 피코몰에서 양을 표시하는 그래프이다.
도 21D는 도 24B (영역 B와 영역 C)에서 도시된 바와 같은 1F11/3F5/Y102L 면역침전으로부터 질량 분석 AQUA에 의해 확인된 폴리유비퀴틴 사슬의 연쇄 조성을 표시하는 그래프이다.
도 21E는 질량 분석 AQUA에서 확인된 1F11/3F5/Y102L 면역침전에서 회수된 선형 사슬의 퍼센트를 표시하는 그래프이다.
도 22A는 Hoil-1L과 Hoip를 과다-발현하는 플라스미드 또는 빈 벡터로 형질감염된 293T 세포로부터 용해물로 면역블롯을 도시한다. 이들 블롯은 실시예 4E에서 설명된 바와 같이, 선형 폴리유비퀴틴, Hoil-1L, Hoip, 그리고 β-튜불린에 대해 탐침되었다.
도 22B는 Hoil-1L과 Hoip를 과다-발현하는 플라스미드 또는 빈 벡터로 형질감염된 293T 세포의 용해물로부터 면역침전 실험의 결과를 도시한다. 면역블롯은 선형 폴리유비퀴틴에 대해 탐침되거나 또는 쿠마시 염색되었다. 쿠마시-염색된 겔 상에서 표시된 영역은 질량 분석 AQUA를 위해 절제되었다.
도 22C는 도 22B에서 도시된 바와 같이, Hoil-1L/Hoip 과다-발현 세포로부터 1F11/3F5/Y102L 면역침전에서 질량 분석 AQUA에 의해 확인된 폴리유비퀴틴 연쇄 조성을 표시하는 그래프이다.
도 22D는 Hoil-1L과 Hoip를 과다-발현하는 플라스미드 또는 빈 벡터로 형질감염되고 항-선형 폴리유비퀴틴 항체 1F11/3F5/Y102L로 염색된 HeLa S3 세포의 면역형광을 도시한다. 5개 또는 7개 아단위의 재조합 선형 폴리유비퀴틴의 부가 (+)는 항-선형 폴리유비퀴틴 항체의 결합에 대해 경쟁한다.
도 23은 1F11/3F5/Y102L Fab 단편과 선형 디유비퀴틴 사이에 형성된 복합체의 공동-결정 구조의 다양한 모습을 도시한다. A) 1F11/3F5/Y102L은 도면의 하부에서 카툰 다이어그램 (cartoon diagram)으로서 도시되고, 그리고 선형 디유비퀴틴은 정상에서 공간-채움된 모형 내에 카툰 다이어그램으로서 도시된다. 근위와 원위 유비퀴틴 아단위 및 선형 연쇄가 표시된다. B) 선형 디유비퀴틴 상에서 에피토프는 1F11/3F5/Y102L과 상호작용하는 디유비퀴틴의 표면 상에서 어두운 회색으로 도시된다. 용매 접근가능 표면적의 적어도 25%가 선형 디유비퀴틴과 1F11/3F5/Y102L의 중간면에서 매몰되고 및/또는 Fab의 4.5 Å 내에 있는 잔기는 한 문자 아미노산 코드 및 잔기 번호에 의해 표시된다. 도 23B는 잔기 31-37, 70-76과 60-63을 각각 서열 번호 379-381로서 개시한다. C) 1F11/3F5/Y102L Fab 상에서 파라토프 (paratope)는 디유비퀴틴과 상호작용하는 Fab의 표면 상에서 어두운 회색으로 도시된다. 용매 접근가능 표면적의 적어도 25%가 1F11/3F5/Y102L과 디유비퀴틴의 중간면에서 매몰되고 및/또는 디유비퀴틴의 4.5 Å 내에 있는 잔기는 한 문자 아미노산 코드 및 잔기 번호에 의해 표시된다. 도 23C는 잔기 95-99와 52-56을 서열 번호 378과 377로서 각각 개시한다.
도 24는 1F11/3F5/Y102L Fab 단편과 선형 디유비퀴틴 사이에 형성된 복합체의 공동-결정 구조의 추가적인 클로즈업 모습을 도시한다. A) 중쇄의 Gln56의 측쇄 및 Gly75와 Gly76의 주쇄 카르보닐 기 사이에 형성된 수소 결합을 보여주는 클로즈업. 디유비퀴틴은 밝은 회색으로 도시되고, 그리고 Fab는 어두운 회색으로 도시된다. B) 경쇄의 Lys52 및 디유비퀴틴의 알파 나선의 카르복시-말단 단부로부터 Asp32와 쌍극자 사이에 전위 정전 상호작용. 디유비퀴틴은 밝은 회색으로 도시되고, 그리고 Fab는 어두운 회색으로 도시된다. C) 중쇄의 Leu102 및 중쇄의 뼈대 1의 Val2와 Leu4 사이에 소수성 상호작용. Leu102는 CDR H3의 카르복실-말단 단부에 있다. 디유비퀴틴은 밝은 회색으로 도시되고, 그리고 Fab는 어두운 회색으로 도시된다.
발명의 구체예의 상세한 설명
I. 정의
본원에서 "수용자 인간 뼈대"는 하기에 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 뼈대 또는 인간 공통 뼈대로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 뼈대 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 뼈대의 아미노산 서열을 포함하는 뼈대이다. 인간 면역글로불린 뼈대 또는 인간 공통 뼈대"로부터 유래된" 수용자 인간 뼈대는 이와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 아미노산 서열 변화를 내포할 수 있다. 일부 구체예에서, 아미노산 변화의 숫자는 10 또는 그 이하, 9 또는 그 이하, 8 또는 그 이하, 7 또는 그 이하, 6 또는 그 이하, 5 또는 그 이하, 4 또는 그 이하, 3 또는 그 이하, 또는 2 또는 그 이하이다. 일부 구체예에서, VL 수용자 인간 뼈대는 서열에서, VL 인간 면역글로불린 뼈대 서열 또는 인간 공통 뼈대 서열과 동일하다.
"친화성"은 분자 (가령, 항체)와 이의 결합 상대 (가령, 항원)의 단일 결합 부위 사이에 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (가령, 항체와 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 상대 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (Kd)에 의해 표시될 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯하여, 당분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 구체예는 하기에서 설명된다.
"친화성 성숙된" 항체는 변경을 보유하지 않는 부모 항체와 비교하여, 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 (HVRs)에서 하나 또는 그 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하고, 이런 변경은 항원에 대한 항체의 친화성에서 향상을 유발한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "효현제 항체"는 관심되는 폴리펩티드의 기능적 활성 중에서 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
"길항제 항체" 또는 "차단 항체"는 자신이 특이적으로 결합하는 항원의 생물학적 활성을 저해하거나 또는 감소시키는 항체이다. 일정한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전하게 저해한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 이용되고, 그리고 요망되는 항원-결합 활성을 나타내기만 하면, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다가특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체), 그리고 항체 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 본래 항체가 결합하는 항원에 결합하는 본래 항체의 일부를 포함하는, 본래 항체가 아닌 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (가령, scFv); 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다가특이적 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
참고 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 항원에 참고 항체의 결합을 50% 또는 그 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 그리고 역으로, 참고 항체는 경쟁 검정에서 항원에 이러한 항체의 결합을 50% 또는 그 이상 차단한다. 모범적인 경쟁 검정은 본원에서 제시된다.
용어 "항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체" 및 "선형 연결된 폴리유비퀴틴에 결합하는 항체"는 이러한 항체가 선형 연결된 폴리유비퀴틴을 표적으로 하는 진단제 및/또는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 구체예에서, 관련 없는, 비-선형 연결된 폴리유비퀴틴 단백질에 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체의 결합의 정도는 예로서, 방사면역검정 (RIA)에 의해 측정될 때, 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 항체의 결합의 약 10% 이하이다. 일정한 구체예에서, 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (가령, 10-8 M 또는 그 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 일정한 구체예에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 상이한 종으로부터 선형 연결된 폴리유비퀴틴 사이에 보존되는 선형 연결된 폴리유비퀴틴의 에피토프에 결합한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항-폴리유비퀴틴 항체"는 폴리유비퀴틴 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항-유비퀴틴 항체"와 "항-모노유비퀴틴 항체"는 교체가능하게 이용되고, 그리고 유비퀴틴 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 그리고 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 그리고 IgA2로 더욱 세분된다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ, 그리고 μ로 불린다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 저해하거나 또는 예방하고 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제에는 방사성 동위원소 (가령, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물 (가령, 메토트렉사트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 개재성 작용제); 성장 저해제; 효소와 이들의 단편, 예를 들면, 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예를 들면, 소형 분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소뿐만 아니라 이들의 단편 및/또는 변이체; 그리고 하기에 개시된 다양한 항종양 또는 항암 작용제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
"질환"은 본 발명의 항체를 이용한 치료로부터 이익을 얻는 임의의 장애이다. 여기에는 포유동물을 문제의 질환에 걸리게 쉽게 만드는 병리학적 장애를 비롯한 만성과 급성 질환 또는 장애가 포함된다. 본원에서 치료되는 질환의 무제한적 실례에는 암, 그리고 퇴행성 근육 질환 및 퇴행성 신경 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 발육 부전 질환이 포함된다.
"효과기 기능"은 항체 아이소타입에 따라 변하는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 실례에는 C1q 결합과 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균 작용; 세포 표면 수용체 (가령, B 세포 수용체)의 하향 통제; 그리고 B 세포 활성화가 포함된다.
작용제, 예를 들면, 제약학적 제제의 "효과량"은 요망되는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 용량에서 및 기간 동안, 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 내포하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 이용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변이 Fc 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226에서부터, 또는 Pro230에서부터 카르복실-말단까지 뻗어있다. 하지만, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역 내에 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 바와 같이, EU 인덱스로 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"뼈대" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로, 4개의 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 그리고 FR4. 따라서 HVR과 FR 서열은 일반적으로, VH (또는 VL)에서 하기의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "본래 항체" 및 "완전 항체"는 본원에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 고유 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 내포하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 외인성 핵산이 도입된 세포뿐만 아니라 이런 세포의 후손을 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 여기에는 계대의 횟수에 상관없이 일차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손이 포함된다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전하게 동일하지 않고 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다.
"인간 공통 뼈대"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 뼈대 서열의 선별에서 가장 공통적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 뼈대이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선별은 가변 도메인 서열의 소집단으로부터이다. 일반적으로, 서열의 소집단은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에서와 같은 소집단이다. 한 구체예에서, VL의 경우에, 소집단은 Kabat et al., supra에서와 같이 소집단 카파 I이다. 한 구체예에서, VH의 경우에, 소집단은 Kabat et al., supra에서와 같이 소집단 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이고, 여기서 HVR (가령, CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 항체의 것들에 상응하고, 그리고 FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪는 항체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성이고 및/또는 구조적으로 정의된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 고유한 4개-사슬 항체는 6개의 HVR을 포함한다; VH에서 3개 (H1, H2, H3), 그리고 VL에서 3개 (L1, L2, L3). HVR은 일반적으로, 초가변 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDRs)으로부터 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 최대 서열 가변성이고 및/또는 항원 인식에 관련된다. 모범적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 그리고 96-101 (H3)에서 발생한다. (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) 모범적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 그리고 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 그리고 H3의 95-102에서 발생한다. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) VH에서 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로, 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한, "특이성 결정 잔기" 또는 "SDRs"를 포함하는데, 이들은 항원과 접촉하는 잔기이다. SDR은 약칭된-CDR, 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역 내에 포함된다. 모범적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 그리고 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58, 그리고 H3의 95-102에서 발생한다. (Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참조.) 달리 지시되지 않으면, 가변 도메인 (가령, FR 잔기) 내에 HVR 잔기 및 기타 잔기는 본원에서 Kabat et al., supra에 따라 넘버링된다.
"면역접합체"는 세포독성제가 포함되지만 이에 국한되지 않는 하나 또는 그 이상의 이종기원성 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "피험체"는 포유류이다. 포유류에는 가축 (가령, 소, 양, 고양이, 개, 그리고 말), 영장류 (가령, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (가령, 생쥐와 쥐)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 개체 또는 피험체는 인간이다.
"단리된" 항체는 자연 환경의 요소로부터 분리된 것이다. 일부 구체예에서, 항체는 예로서, 전기영동 (가령, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (가령, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정될 때, 95% 또는 99% 순도 이상까지 정제된다. 항체 순도의 산정을 위한 방법의 검토를 위해, 예로서 Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
"단리된" 핵산은 자연 환경의 요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 내포하는 세포 내에 포함된 핵산 분자를 포함하지만, 이러한 핵산 분자는 염색체외에, 또는 자연 염색체 장소와 상이한 염색체 장소에서 존재한다.
"항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자 (또는 이들의 단편)뿐만 아니라 단일 벡터 또는 별개의 벡터 내에 이런 핵산 분자(들), 그리고 숙주 세포 내에 하나 또는 그 이상의 장소에 존재하는 이런 핵산 분자(들)를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "선형 연결된 폴리유비퀴틴" 및 "C-말단에서 N-말단 연결된 폴리유비퀴틴"은 교체가능하고, 그리고 한 유비퀴틴 모이어티의 C-말단 (가령, C-말단 글리신) 및 다른 유비퀴틴 모이어티의 N-말단 α-아미노 기 (가령, N-말단 메티오닌) 사이에 적어도 하나의 이소펩티드 결합을 포함하는 폴리유비퀴틴 분자를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "리신 연쇄"는 한 유비퀴틴 모이어티 및 리신 잔기를 수반하는 다른 유비퀴틴 모이어티 (가령, K6, K11, K27, K29, K33, K48, 및/또는 K63) 사이에 연쇄를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 예로서, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 지향된다. 따라서 수식어 "단일클론"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 획득되는 항체의 특징을 지시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 가령, 본 발명에 따라서 이용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있고, 단일클론 항체를 만들기 위한 이런 방법 및 기타 모범적인 방법은 본원에서 설명된다.
"나신 항체"는 이종기원성 모이어티 (가령, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 나신 항체는 제약학적 제제 내에 존재할 수 있다.
"고유 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 가령, 고유 IgG 항체는 이황화-결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이형사합체 당단백질이다. N-에서부터 C-말단까지, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 불리는 가변 영역 (VH), 그 이후에 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 그리고 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-에서부터 C-말단까지, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 불리는 가변 영역 (VL), 그 이후에 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ)와 람다 (λ)로 불리는 2가지 유형 중에서 한 가지가 부여될 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 치료적 산물의 이용과 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포하는, 이들 치료적 산물의 상업적 포장 내에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭하는데 이용된다.
참고 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"는 최대 퍼센트 서열 동일성을 획득하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면 갭을 도입한 이후, 그리고 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않고, 참고 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적으로 정렬은 당분야의 평균적 기술 범위 내에 있는 다양한 방법에 의해, 예를 들면, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 하지만, 본원에서, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 산출된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저작되었고, 그리고 소스 코드가 사용자 문서와 함께 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright Registration No. TXU510087 하에 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California로부터 공개적으로 입수가능하거나, 또는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯하여, UNIX 운영 체제에서 이용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B에 대한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (이것은 대안으로, 소정의 아미노산 서열 B에 대한 일정한 % 아미노산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 하기와 같이 계산된다:
100 x 분수 X/Y
여기서 X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해, 상기 프로그램의 A와 B 정렬에서 동일한 정합으로서 기록된 아미노산 잔기의 총수이고, 그리고 여기서 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우에, A 대 B의 % 아미노산 서열 동일성은 B 대 A의 % 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않은 것으로 인지될 것이다. 달리 명시되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 앞 단락에서 설명된 바와 같이 획득된다.
용어 "제약학적 제제"는 그 내에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태이고, 그리고 이러한 제제가 투여되는 개체에 받아들이기 어려운 독성을 유발하는 추가의 요소를 내포하지 않는 제조물을 지칭한다.
"제약학적으로 허용되는 담체"는 개체에 비독성인, 제약학적 제제 내에서 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 제약학적으로 허용되는 담체에는 완충액, 부형제, 안정제, 또는 보존제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "폴리유비퀴틴"은 선형 폴리유비퀴틴, K6-연결된 폴리유비퀴틴, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K27-연결된 폴리유비퀴틴, K29-연결된 폴리유비퀴틴, K33-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴 및 K63-연결된 폴리유비퀴틴이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 유비퀴틴의 상이한 중합성 연쇄의 인간과 합성 부류에 속하는 유비퀴틴의 모든 종류의 고유 인간과 합성 중합성 사슬로서 정의된다. 폴리유비퀴틴은 임의의 길이를 가질 수 있고, 그리고 적어도 2개의 유비퀴틴 모이어티를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 이형, 예를 들면, "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연적인 경과를 변경하기 위한 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 그리고 예방을 위해 또는 임상적 병리의 경과 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 경감, 질환의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 저하, 질환 상태의 개선 또는 완화, 그리고 관해 또는 향상된 예후가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추는데 이용된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "유비퀴틴"과 "모노유비퀴틴"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 달리 지시되지 않으면, 포유류, 예를 들면, 영장류 (가령, 인간) 및 설치류 (가령, 생쥐와 쥐)를 비롯한 임의의 척추동물 근원으로부터 임의의 고유 유비퀴틴을 지칭한다. 상기 용어는 복수의 유비퀴틴 모이어티로 구성되는 분자를 제외하고, "전장" 미가공 유비퀴틴뿐만 아니라 세포 내에서 가공으로부터 발생하는 유비퀴틴의 임의의 단축된 또는 번역후 변형된 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, 유비퀴틴의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 절단접합 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 모범적인 인간 유비퀴틴의 아미노산 서열은 서열 번호:97에서 진술된다: MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG (서열 번호: 97). 유비퀴틴은 아미노산 6, 아미노산 11, 아미노산 27, 아미노산 29, 아미노산 33, 아미노산 48, 및/또는 아미노산 63에서 적어도 하나의 리신 잔기를 갖는다 (상기 서열 번호: 97에서 굵은 글씨체로 표시됨).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "유비퀴틴 경로"는 유비퀴틴 및/또는 폴리유비퀴틴을 포함하는 세포 내에서, 또는 시험관내에서 재현된 생화학적 경로를 지칭한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH와 VL)은 일반적으로, 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인은 4개의 보존된 뼈대 영역 (FRs) 및 3개의 초가변 영역 (HVRs)을 포함한다. (예로서, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 공여하는데 충분할 수 있다. 더 나아가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각, 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예로서, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)을 참조한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연결된 다른 핵산을 증폭할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 자신이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 함입된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
II. 조성물과 방법
한 양상에서, 본 발명은 첫 번째 폴리유비퀴틴 연쇄를 내포하는 첫 번째 폴리유비퀴틴 분자를 특이적으로 인식할 수 있지만 두 번째 폴리유비퀴틴 연쇄를 내포하는 두 번째 폴리유비퀴틴 분자에 특이적으로 결합하지 않는 항체의 창출에 부분적으로 기초된다. 일정한 구체예에서, 선형 폴리유비퀴틴 또는 C-말단에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합하는 항체가 제시된다. 본 발명의 항체는 연구, 그리고 예로서 비정상적인 세포 주기 진행에 관련된 질환과 장애의 진단 또는 치료 둘 모두에서 유용하다.
본 발명의 항-선형 폴리유비퀴틴 항체는 독특한 성질로 인하여, 번거롭고 값비싼 유전자 조작 또는 생물물리학적 방법, 예를 들면, 질량 분석에 의존하지 않고, 세포 시스템 내에서 폴리유비퀴틴의 상이한 연결된 형태를 구별하는데 특히 유용하다. 본 발명의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 시험관내와 생체내 둘 모두에서 특정한 선형 폴리유비퀴틴의 기능(들)과 활성을 특징짓는데 이용될 수 있다. 본 발명의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 또한, 질환의 발달과 병인에서 특정한 선형 폴리유비퀴틴의 역할을 결정하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 이러한 항-폴리유비퀴틴 항체가 특이적이지 않은 폴리유비퀴틴의 정상적인 활성을 간섭하지 않으면서, 하나 또는 그 이상의 특정한 선형 폴리유비퀴틴이 비정상적으로 통제되거나 또는 비정상적으로 기능하는 질환을 치료하는데 더욱 이용될 수 있다.
NFκ-B 경로에서 유비퀴틴 시스템의 관여가 보고되었다. Karin et al., Nature Rev. Immunol. 5:749-759 (2005) 및 Chen, Z.J., Nature Cel Biol. 7:758-765 (2005). 친염증성 사이토킨으로 세포의 자극은 IκB 키나아제 (IKK)의 활성화를 유발하는 RIP1과 NEMO 단백질의 K63-연결된 폴리유비퀴틴화를 발생시키는 것으로 밝혀졌다. Tokunaga et al., Nature Cell Biol. 11:123-132 (2009). IKK는 이후, K48-연결된 폴리유비퀴틴으로 폴리유비퀴틴화되고 차후 분해되어, NFκ-B의 활성화를 유발한다 (Id). 최근에, 또한 LUBAC는 NFκ-B의 선형 폴리유비퀴틴화를 통해, NFκ-B 경로를 활성화시키지만 JNK 경로를 활성화시키지 못하는 것으로 밝혀졌다 (Id). NF-κB는 또한, 세포 증식과 세포 주기에서 일정한 역할을 한다. 많은 암은 NF-κB의 비정상적인 활성화를 전시하고, 그리고 NF-κB의 억제는 암 세포 증식을 억제한다. Garg and Aggarwal, Leukemia 16: 1053-68 (2002). NF-κB와 같은 단백질 상에서 선형-연결된 폴리유비퀴틴의 존재는 NF-κB 활성과 세포 주기 진행의 조절에서 중요한 역할을 수행한다. 따라서 본 발명의 항체와 Fab는 세포 주기 통제가 비정상적인 질환 및 질환 상태의 조절을 위한 유용한 치료적 수단을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항-선형 폴리유비퀴틴 항체는 세포 주기 진행이 비정상적으로 상향 통제되어, 너무 많은 세포 분열이 초래되는 질환과 장애, 예를 들면, 암을 치료하는데 이용된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항-선형-연결된 폴리유비퀴틴 항체는 세포 주기 진행이 비정상적으로 하향 통제되어, 너무 적은 세포 분열 및 조직의 부수적인 소모 또는 파괴가 초래되는 질환과 장애를 치료하는데 이용된다. 이런 질환의 실례에는 퇴행성 근육 질환 및 퇴행성 신경 질환 (샤르코마리 투스 증후군, 급성 회백수염, 근위축성 측삭 경화증, 그리고 귈랑-바레 증후군이 포함되지만 이들에 국한되지 않음)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "세포 증식성 질환"과 "증식성 질환"은 상당한 정도의 비정상적인 세포 증식과 연관되는 질환을 지칭한다. 한 구체예에서, 세포 증식성 질환은 암이다.
용어 "암"과 "암성"은 통제되지 않은 세포 성장/증식에 의해 전형적으로 특징되는 포유류에서 생리학적 장애를 지칭하거나 설명한다. 암의 실례에는 암종, 림프종 (가령, 호지킨과 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종, 그리고 백혈병이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 암의 더욱 구체적인 실례에는 편평 상피세포 암, 소-세포 폐 암, 비-소세포 폐 암, 폐의 선암종, 폐의 편평 상피암종, 복막의 암, 간세포 암, 위장 암, 충수 암, 췌장 암, 교아종, 자궁경부 암, 난소 암, 간 암, 방광 암, 간암, 유방 암, 대장 암, 결장직장 암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장 암, 간 암, 전립선 암, 음문 암, 갑상선 암, 간 암종, 백혈병 및 기타 림프증식성 질환, 그리고 다양한 유형의 두경부 암이 포함된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "종양"은 악성 또는 양성인지에 상관없이, 모든 신생물 세포 성장과 증식, 그리고 모든 전-암성과 암성 세포와 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 질환", "증식성 질환" 및 "종양"은 본원에서 지칭될 때, 상호 배타적이지 않다.
용어 "퇴행성 근육 질환"은 정상적인 근육 기능이 감소되도록 골격근 및/또는 평활근의 악화 또는 약화에 의해 전형적으로 특징되는 근육-포함 동물에서 생리학적 장애를 지칭하거나 설명한다. 퇴행성 근육 질환의 실례에는 근이영양증, 근긴장성 이영양, 선천성 근강직증, 악액질, 근육감소증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 아이작 증후군, 강직 인간 증후군, 가족성 주기성 마비, 근질환, 근긴장, 횡문근융해, 근육 위축, 그리고 다양한 유형의 근육 약화와 근육 경직이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
용어 "퇴행성 신경 질환"은 신경 조직의 악화 또는 신경 조직 내에 세포 사이에 소통의 저하에 의해 전형적으로 특징되는 신경-포함 동물에서 생리학적 장애를 지칭하거나 설명한다. 퇴행성 신경 질환의 실례에는 신경퇴행성 질환 (루이체 질환, 소아마비후 증후군, 샤이-드래거 증후군, 올리브교소뇌위축, 파킨슨병, 다계통 위축증, 근위축성 측삭 경화증, 귈랑-바레 증후군, 샤르코마리 투스 증후군, 선상체흑질 변성, 그리고 타우병증에 의해 유발되거나 이와 연관된 신경 세포/조직 파괴가 포함되지만 이들에 국한되지 않음), 프리온 질환, 연수마비, 운동 뉴런 질환, 치매, 그리고 신경계 이형퇴행성 질환 (카나반병, 헌팅턴병, 뉴런 쎄로이드 지질갈색소증, 알렉산더병, 투렛 증후군, 멘케스 꼬인 모발 증후군, 콕케인 증후군, 할러보르덴-스파츠 증후군, 라포라 질환, 레트 증후군, 간렌즈핵 변성, 레시-나이헌 증후군, 그리고 운베리히트-룬드보그 증후군이 포함되지만 이들에 국한되지 않음)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
다른 양상에서, 본 발명의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 세포 집단에서 및 소정의 세포 내에서 폴리유비퀴틴 밀도와 분포의 결정, 그리고 폴리유비퀴틴의 존재 또는 양에 기초된 세포 분류를 비롯하여, 선형 연결된 폴리유비퀴틴의 검출과 단리, 예를 들면, 다양한 세포 유형과 조직에서 폴리유비퀴틴의 검출을 위한 시약으로서 유용성을 갖는다. 또 다른 양상에서, 본 발명의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 본 발명의 요부 항체의 것들과 유사한 차단 활성 패턴을 갖는 폴리유비퀴틴 길항제의 개발에 유용하다. 추가의 실례로서, 본 발명의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 선형과 입체형태 에피토프를 비롯하여, 본원에서 예시된 항체와 실질적으로 동일한 폴리유비퀴틴 항원성 결정인자(들)에 결합하는 다른 항-폴리유비퀴틴 항체를 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 폴리유비퀴틴이 선형 연결된 폴리유비퀴틴 기능의 소형 분자 길항제를 스크리닝하는데 관련되는 생리학적 경로에 기초된 검정에서 이용될 수 있다. 가령, 선형 연결된 폴리유비퀴틴 사슬이 NFκB 활성화에 필수적인 것으로 알려져 있기 때문에 (Tokunaga et al., Nature Cell Biol. 11:123-132 (2009)), 처리된 세포 또는 조직에서 NFκB 활성화를 조절하는 (상향- 또는 하향-통제하는) 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체의 활성은 NFκB 활성화를 조절하는데 있어서 선형 연결된 폴리유비퀴틴의 하나 또는 그 이상의 잠재적 소형 분자 길항제의 활성과 비교될 수 있다.
A. 모범적인 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체
한 양상에서, 본 발명은 선형 또는 C-말단에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴에 결합하는 단리된 항체를 제시한다. 일정한 구체예에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 C-말단에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합하지만 모노유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않는다. 일정한 구체예에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 C-말단에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합하지만 리신 연쇄 (즉, K6-, K11-, K27-, K29-, K33-, K48-, 및/또는 K63-연쇄)를 갖는 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않는다.
한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 7, 10, 13, 16, 22와 73-81 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H1 영역을 포함하는 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 제시한다. 한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 8, 11, 14, 17, 23, 24와 82-86 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H2 영역을 포함하는 항체를 제시한다. 한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 9, 12, 15, 18과 87-93 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H3 영역을 포함하는 항체를 제시한다.
한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 7, 10, 13, 16, 22와 73-81 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H1 영역, 그리고 서열 번호: 8, 11, 14, 17, 23, 24와 82-86 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H2 영역을 포함하는 항체를 제시한다. 한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 7, 10, 13, 16, 22와 73-81 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H1 영역, 그리고 서열 번호: 9, 12, 15, 18과 87-93 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H3 영역을 포함하는 항체를 제시한다. 한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 8, 11, 14, 17, 23, 24와 81-85 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H2 영역 및 서열 번호: 9, 12, 15, 18과 86-92 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H3 영역을 포함하는 항체를 제시한다.
한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 1, 4, 19와 50-57 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L1 영역을 포함하는 항체를 제시한다. 한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 2와 58-62 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L2 영역을 포함하는 항체를 제시한다. 한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 3, 5, 6, 20, 21과 64-72 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L3 영역을 포함하는 항체를 제시한다.
한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 1, 4, 19와 50-57 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L1 영역 및 서열 번호: 2와 58-63 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L2 영역을 포함하는 항체를 제시한다. 한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 1, 4, 19와 50-57 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L1 영역 및 서열 번호: 3, 5, 6, 20, 21과 64-72 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L3 영역을 포함하는 항체를 제시한다. 한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 2와 58-63 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L2 영역 및 서열 번호: 3, 5, 6, 20, 21과 64-72 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L3 영역을 포함하는 항체를 제시한다.
한 양상에서, 본 발명은 하기 중에서 적어도 하나, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 6개 모두를 포함하는 항체를 제시한다:
(i) 서열 번호: 7, 10, 13, 16, 22와 73-81 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H1 서열;
(ii) 서열 번호: 8, 11, 14, 17, 23, 24와 82-86 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H2 서열;
(iii) 서열 번호: 9, 12, 15, 18과 87-93 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H3 서열;
(iv) 서열 번호: 1, 4, 19와 50-57 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L1 서열;
(v) 서열 번호: 2와 58-63 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L2 서열; 그리고
(vi) 서열 번호: 3, 5, 6, 20, 21과 64-72 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L3 서열.
한 양상에서, 본 발명은 높은 친화성으로 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합하지만 실질적으로 감소된 친화성으로 일부 다른 리신 연쇄를 갖는 폴리유비퀴틴에 결합하고, 하기 중에서 적어도 하나, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 6개 모두를 포함하는 항체를 제시한다:
(i) 서열 번호: 7, 10, 13, 16, 22와 73-81 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H1 서열;
(ii) 서열 번호: 8, 11, 14, 17, 23, 24와 82-86 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H2 서열;
(iii) 서열 번호: 9, 12, 15, 18과 87-93 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H3 서열;
(iv) 서열 번호: 1, 4, 19와 50-57 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L1 서열;
(v) 서열 번호: 2와 58-63 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L2 서열; 그리고
(vi) 서열 번호: 3, 5, 6, 20, 21과 64-72 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-L3 서열.
한 양상에서, 본 발명은 도 2B, 5B, 또는 9B에서 도시된 바와 같은 중쇄 HVR 서열을 포함하는 항체를 제시한다. 한 구체예에서, 항체는 도 2A, 5A, 또는 9A에서 도시된 바와 같은 경쇄 HVR 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 도 2B, 5B, 또는 9B에서 도시된 바와 같은 중쇄 HVR 서열 및 도 2A, 5A, 또는 9A에서 도시된 바와 같은 경쇄 HVR 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 표 5와 7에서 설명된 바와 같은 경쇄 HVR 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명은 표 5와 7에서 설명된 바와 같은 중쇄 HVR 서열을 포함하는 항체를 제시한다. 한 구체예에서, 항체는 표 5와 7에서 설명된 바와 같은 중쇄 HVR 서열 및 표 5와 7에서 설명된 바와 같은 경쇄 HVR 서열을 포함한다.
본 발명의 항체의 일부 구체예는 하기 서열 번호: 98에서 진술된 바와 같은 인간화 4D5 항체 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (또한, U.S. Pat. No. 6,407,213 및 Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93에서 인용됨)의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (서열 번호: 98) (HVR 잔기는 밑줄로 표시된다)
한 구체예에서, huMAb4D5-8 경쇄 가변 도메인 서열은 위치 28, 30, 31, 53, 66, 그리고 91 (각각, 상기에 굵은 글씨체/이탤릭체로 표시된 Asp, Asn, Thr, Phe, Arg, 그리고 His) 중에서 하나 또는 그 이상에서 변형된다. 한 구체예에서, 변형된 huMAb4D5-8 서열은 위치 28에서 Ser, 위치 30에서 Ser, 위치 31에서 Ser, 위치 53에서 Ser, 위치 66에서 Gly, 및/또는 위치 91에서 Ser을 포함한다. 따라서 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 하기 서열 번호: 99에서 진술된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다:
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (서열 번호: 99) (HVR 잔기는 밑줄로 표시된다)
huMAb4D5-8에 대하여 치환된 잔기는 상기에 굵은 글씨체/이탤릭체로 표시된다.
본 발명의 항체는 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 대한 결합 활성이 실질적으로 유지되기만 하면, 임의의 적절한 뼈대 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 소집단 III 중쇄 뼈대 공통 서열을 포함한다. 이들 항체의 한 구체예에서, 뼈대 공통 서열은 위치 71, 73, 78 및/또는 102에서 치환을 포함한다. 이들 항체의 일부 구체예에서, 위치 71은 A이고, 73은 T이고, 78은 A이고 및/또는 102는 L이다. 한 구체예에서, 이들 항체는 huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (또한, U.S. Pat. No. 6,407,213 & 5,821,337, 그리고 Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93에서 인용됨)의 중쇄 가변 도메인 뼈대 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 이들 항체는 인간 κI 경쇄 뼈대 공통 서열을 더욱 포함한다. 한 구체예에서, 이들 항체는 서열 번호: 1-6, 19-21과 50-72의 경쇄 HVR 서열 중에서 적어도 하나, 2개 또는 전부를 포함한다. 한 구체예에서, 이들 항체는 U.S. Pat. No. 6,407,213 & 5,821,337에서 설명된 바와 같은 huMAb4D5-8의 경쇄 HVR 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 이들 항체는 huMAb4D5-8 (서열 번호: 98과 99) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (또한, U.S. Pat. No. 6,407,213 & 5,821,337, 그리고 Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93에서 인용됨)의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체는 요망되는 표적 결합 친화성을 획득하기 위해 친화성 성숙된다. 한 가지 실례에서, 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하지만 리신 연쇄를 갖는 폴리유비퀴틴에 실질적으로 감소된 친화성으로 결합하는 친화성 성숙된 본 발명의 항체는 HVR-H1 아미노산 위치 32에서 치환을 포함한다. 다른 실례에서, 리신 연쇄를 갖는 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 실질적으로 감소된 친화성으로 특이적으로 결합하는 본 발명의 친화성 성숙된 항체는 HVR-H2 아미노산 위치 50, 54 및/또는 56에서 치환을 포함한다. 다른 실례에서, 리신 연쇄를 갖는 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 실질적으로 감소된 친화성으로 특이적으로 결합하는 본 발명의 친화성 성숙된 항체는 HVR-H3 아미노산 위치 103에서 치환을 포함한다. 다른 실례에서, 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하지만 다른 리신 연쇄를 갖는 폴리유비퀴틴에 실질적으로 감소된 친화성으로 결합하는 본 발명의 친화성 성숙된 항체는 HVR-L1 아미노산 위치 28, 30, 31 및/또는 32에서 치환을 포함한다. 다른 실례에서, 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하지만 다른 리신 연쇄를 갖는 폴리유비퀴틴에 실질적으로 감소된 친화성으로 결합하는 본 발명의 친화성 성숙된 항체는 HVR-L3 아미노산 위치 92, 93 및/또는 94에서 치환을 포함한다. 다른 실례에서, 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하지만 다른 리신 연쇄를 갖는 폴리유비퀴틴에 실질적으로 감소된 친화성으로 결합하는 본 발명의 친화성 성숙된 항체는 HVR-L2 아미노산 위치 52에서 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 29-32, 36-38, 95와 196-198 중에서 적어도 하나의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 25-28, 33-35, 94와 193-195 중에서 적어도 하나의 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 29-32, 36-38, 95와 196-198 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 또한 서열 번호: 25-28, 33-35, 94와 193-195 중에서 적어도 하나의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 특정 클론 번호에 상응하는 본 발명의 항체는 상기 클론 번호에 대해 도 2B, 5B 또는 9B에서 진술된 바와 같은 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 특정 클론 번호에 상응하는 본 발명의 항체는 상기 클론 번호에 대해 도 2A, 5A와 9A에서 진술된 바와 같은 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 특정 클론 번호에 상응하는 본 발명의 항체는 상기 클론 번호에 대해 도 2B, 5B 또는 9B에서 진술된 바와 같은 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 또한 상기 클론 번호에 대해 도 2A, 5A와 9A에서 진술된 바와 같은 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 결합에 대해 전술한 임의의 항체와 경쟁하는 항체를 제시한다. 한 양상에서, 본 발명은 선형 연결된 폴리유비퀴틴 상에서 전술한 임의의 항체와 동일한 항원성 결정인자에 결합하는 항체를 제시한다.
본원에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 항체는 C-말단에서 N-말단 연쇄를 갖는 단리된 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합한다. 본원에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 항체는 또한, 선형 C-말단에서 N-말단 연쇄를 갖는 폴리유비퀴틴이 이종기원성 단백질에 부착될 때, 상기 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합한다.
상기 구체예 중에서 한 구체예에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 인간화된다. 한 구체예에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 상기 구체예 중에서 한 구체예에서와 같은 HVR을 포함하고, 그리고 수용자 인간 뼈대, 예를 들면, 인간 면역글로불린 뼈대 또는 인간 공통 뼈대를 더욱 포함한다. 다른 구체예에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 상기 구체예 중에서 한 구체예에서와 같은 HVR을 포함하고, 그리고 서열 번호: 29-32, 36-38과 95 중에서 하나의 FR1, FR2, FR3, 또는 FR4 서열을 포함하는 VH를 더욱 포함한다. 다른 구체예에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 상기 구체예 중에서 한 구체예에서와 같은 HVR을 포함하고, 그리고 서열 번호: 25-28, 33-35, 94와 193-195 중에서 하나의 FR1, FR2, FR3, 또는 FR4 서열을 포함하는 VL을 더욱 포함한다.
다른 양상에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 서열 번호: 29-32, 26-38, 95와 196-198 중에서 하나의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참고 서열에 관해 치환 (가령, 보존성 치환), 삽입, 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 29-32, 36-38, 95와 196-198 중의 하나에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실된다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (즉, FR)에서 일어난다. 선택적으로, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 번역후 변형을 포함하는, 서열 번호: 29-32, 36-38, 95와 196-198 중에서 하나의 VH 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체가 제시되고, 여기서 상기 항체는 서열 번호: 25-28, 33-35, 94와 193-195 중에서 하나의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참고 서열에 관해 치환 (가령, 보존성 치환), 삽입, 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 선형-연결된 폴리유비퀴틴에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 25-28, 33-35, 94와 193-195 중의 하나에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실된다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (즉, FR)에서 일어난다. 선택적으로, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 번역후 변형을 포함하는, 서열 번호: 25-28, 33-35, 94와 193-195 중의 하나에서 VL 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체가 제시되고, 여기서 상기 항체는 앞서 제시된 임의의 구체예에서와 같은 VH, 그리고 앞서 제시된 임의의 구체예에서와 같은 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 번역후 변형을 포함하는, 서열 번호: 29-32, 36-38, 95와 196-198 및 서열 번호: 25-28, 33-35, 94와 193-195 중의 하나에서 VH와 VL 서열을 각각 포함한다.
본 발명의 다른 양상에서, 상기 구체예 중에서 한 구체예에 따른 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 단일클론 항체이다. 한 구체예에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 항체 단편, 예를 들면, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 다른 구체예에서, 항체는 전장 항체, 예를 들면, 본래 IgG1 항체 또는 본원에서 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 아이소타입이다.
적어도 하나의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체, 또는 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 제시된다. 일정한 구체예에서, 조성물은 제약학적 조성물일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 조성물은 하나 또는 그 이상의 폴리유비퀴틴에 결합하는 하나 또는 그 이상의 항체 및/또는 하나 또는 그 이상의 폴리유비퀴틴에 결합하는 하나 또는 그 이상의 항체를 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 당분야에 널리 공지된 적절한 담체, 예를 들면, 완충액을 비롯한 제약학적으로 허용되는 부형제를 더욱 포함할 수 있다.
추가의 양상에서, 상기 구체예 중에서 한 구체예에 따른 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 하기 섹션 1-7에서 설명된 바와 같이, 임의의 특질을 단독으로 또는 조합으로 통합할 수 있다:
1. 항체 친화성
일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (가령, 10-8 M 또는 그 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
한 구체예에서, Kd는 하기 검정에 의해 설명된 바와 같이 관심되는 항체의 Fab 이형 및 이의 항원으로 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용해 결합 친화성은 Fab를 적정 연속의 표지되지 않은 항원의 존재에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 평형시키고, 이후 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 평판으로 포획함으로써 측정된다 (예로서, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) 참조). 검정을 위한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER® 멀티-웰 평판 (Thermo Scientific)은 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 하룻밤 동안 코팅되고, 그리고 차후에, 실온 (대략 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 PBS에서 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비-흡착성 평판 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 관심되는 Fab의 계단 희석액 (가령, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 산정과 일치)과 혼합된다. 관심되는 Fab는 이후, 하룻밤 동안 배양된다; 하지만, 배양은 평형이 도달되도록 담보하기 위해 더욱 긴 기간 (가령, 약 65시간) 동안 지속될 수도 있다. 그 이후, 혼합물은 실온에서 배양 (가령, 1시간 동안)을 위해 포획 평판으로 이전된다. 용액은 이후, 제거되고, 그리고 평판은 PBS에서 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척된다. 평판이 건조될 때, 150 μl/웰의 신틸란트 (MICROSCINT-20 TM; Packard)가 첨가되고, 그리고 이들 평판은 TOPCOUNT TM 감마 계수기 (Packard)에서 10분 동안 계산된다. 최대 결합의 20%에 동등 또는 그 이하를 제공하는 각 Fab의 농도가 경쟁적 결합 검정에서 이용을 위해 선택된다.
다른 구체예에 따라서, Kd는 예로서, ~10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25℃에서 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용한 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 측정된다. 간단히 말하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)은 공급업체의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)를 달성하기 위한 5 μl/분의 유속으로 주입에 앞서, 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석된다. 항원의 주입 이후에, 1 M 에탄올아민이 반응되지 않은 기를 차단하기 위해 주입된다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2-배 계단 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)이 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제 (PBST)를 포함하는 PBS에서, 25℃에서 대략 25 μl/분의 유속으로 주입된다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 결합과 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써 간단한 1-대-1 Langmuir 결합 모델 (BIACORE ® Evaluation Software version 3.2)을 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 koff/kon으로서 계산된다. 예로서, Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999)을 참조한다. 온-레이트 (on-rate)가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1 s-1을 초과하면, 온-레이트는 교반 큐벳이 구비된 분광계, 예를 들면, 흐름 정지식 분광 광도계 (Aviv Instruments) 또는 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광 광도계 (ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같은 증가하는 농도의 항원의 존재에서, PBS, pH 7.2에서 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 이용함으로써 결정될 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 칩 표면에 표적 항원에 대한 다른 커플링 화학 (가령, 스트렙타비딘/비오틴, 소수성 상호작용, 또는 이황화 화학) 역시 전술한 아민 커플링 방법 (CM5 칩) 대신에 쉽게 가용하다.
2. 항체 단편
일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편에는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 그리고 scFv 단편, 그리고 하기에 설명된 기타 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 항체 단편의 검토를 위해, Hudson et al. Nat . Med . 9:129-134 (2003)를 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예로서, Pluckth
Figure pct00001
n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)를 참조한다; 또한, WO 93/16185; 그리고 U.S. Patent No. 5,571,894와 5,587,458을 참조한다. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab와 F(ab')2 단편의 논의를 위해, U.S. Patent No. 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예로서, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 그리고 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)을 참조한다. 트리아바디와 테트라바디 역시 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에서 설명된다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 일정한 구체예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예로서, U.S. Patent No. 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에서 설명된 바와 같이, 본래 항체의 단백분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (가령, 대장균 (E. coli) 또는 파지)에 의한 생산이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
3. 키메라와 인간화 항체
일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 항체는 키메라 항체이다. 일정한 키메라 항체는 예로서, U.S. Patent No. 4,816,567; 그리고 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)에서 설명된다. 한 실례에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (가령, 생쥐, 쥐, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 실례에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 전환된" 항체이다. 키메라 항체에는 이들의 항원-결합 단편이 포함된다.
일정한 구체예에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 부모 비-인간 항체의 특이성과 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR(들), 예를 들면, CDR(들) (또는 이들의 일부)가 비-인간 항체로부터 유래되고, 그리고 FR(들) (또는 이들의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 또는 그 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 또한, 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 구체예에서, 인간화 항체 내에 일부 FR 잔기는 예로서, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 향상시키기 위해, 비-인간 항체 (가령, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이들을 만드는 방법은 예로서, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되고, 그리고 예로서, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent No. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321과 7,087,409; Kashmiriet al., Methods 36:25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 이식을 설명); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("재포장 (resurfacing)"을 설명); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 설명); 그리고 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 "지침 선별" 접근법을 설명)에서 더욱 설명된다.
인간화에 이용될 수 있는 인간 뼈대 영역에는 하기가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: "최적 적합 (best-fit)" 방법을 이용하여 선별된 뼈대 영역 (예로서, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993) 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 소집단의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 뼈대 영역 (예로서, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 그리고 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993) 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 뼈대 영역 또는 인간 생식계열 뼈대 영역 (예로서, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참조); 그리고 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 뼈대 영역 (예로서, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참조).
4. 인간 항체
일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에서 전반적으로 설명된다.
인간 항체는 항원성 공격에 응하여 인간 가변 영역을 갖는 본래 인간 항체 또는 본래 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이런 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 좌위를 대체하거나, 또는 염색체외에 존재하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위 통합되는 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 내포한다. 이런 유전자도입 생쥐에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화된다. 유전자도입 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법의 검토를 위해, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조한다. 또한, 예로서, XENOMOUSETM 기술을 설명하는 U.S. Patent No. 6,075,181과 6,150,584; HuMab® 기술을 설명하는 U.S. Patent No. 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 설명하는 U.S. Patent No. 7,041,870, 그리고 VelociMouse® 기술을 설명하는 U.S. Patent Application Publication No. US 2007/0061900을 참조한다. 이런 동물에 의해 산출된 본래 항체로부터 인간 가변 영역은 예로서, 상이한 인간 불변 영역과 합동함으로써 더욱 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한, 하이브리도마-기초된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종과 생쥐-인간 이형골수종 세포주가 보고되었다. (예로서, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 그리고 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) 참조.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술에 의해 산출된 인간 항체는 또한, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 설명된다. 추가의 방법에는 예로서, U.S. Patent No. 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)은 또한, Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 설명된다.
인간 항체는 또한, 인간-유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 산출될 수도 있다. 이런 가변 도메인 서열은 이후, 요망되는 인간 불변 도메인과 합동될 수 있다. 인간 항체를 항체 라이브러리로부터 선별하기 위한 기술은 하기에 설명된다.
5. 라이브러리-유래된 항체
본 발명의 항체는 요망되는 활성 또는 활성을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 가령, 파지 전시 라이브러리를 산출하고, 그리고 요망되는 결합 특징을 갖는 항체에 대해 이런 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있다. 이런 방법은 예로서, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 검토되고, 그리고 예로서, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 그리고 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에서 더욱 설명된다.
일정한 파지 전시 방법에서, VH와 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별개로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되는데, 이들은 이후, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 설명된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로, 항체 단편을 단일-사슬 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 전시한다. 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이, 면역원에 대한 높은-친화성 항체를 제공한다. 대안으로, 미경험 레퍼토리는 Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 의해 설명된 바와 같이, 임의의 면역화 없이 넓은 범위의 비-자기 항원 및 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 클로닝 (가령, 인간으로부터)될 수 있다. 최종적으로, 미경험 라이브러리는 또한, Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992)에 의해 설명된 바와 같이, 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 줄기 세포로부터 클로닝하고, 그리고 고도 가변성 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성하기 위한 무작위 서열을 내포하는 PCR 프라이머를 이용함으로써 합성적으로 만들어질 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 공보에는 예로서, US Patent No. 5,750,373, 그리고 US Patent Publication No. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 그리고 2009/0002360이 포함된다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다가특이적 항체
일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 항체는 다가특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체이다. 다가특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 일정한 구체예에서, 이들 결합 특이성 중에서 하나는 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 대한 것이고, 그리고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 일정한 구체예에서, 이중특이적 항체는 선형 연결된 폴리유비퀴틴의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한, 세포독성제를 선형 연결된 폴리유비퀴틴을 발현하는 세포로 국한시키는데 이용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다가특이적 항체를 만들기 위한 기술에는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현 (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO 93/08829, 그리고 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 참조), 그리고 "구멍안 손잡이 (knob-in-hole)" 공학 (예로서, U.S. Patent No. 5,731,168 참조)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다중-특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이형이합체 분자를 만들기 위해 정전 스티어링 효과 (electrostatic steering effect)를 실행하고 (WO 2009/089004A1); 2개 또는 그 이상의 항체 또는 단편을 교차-연결하고 (예로서, US Patent No. 4,676,980, 그리고 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) 참조); 이중-특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 이용하고 (예로서, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 참조); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위해 "디아바디" 기술을 이용하고 (예로서, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참조); 그리고 단일-사슬 Fv (sFv) 이합체를 이용하고 (예로서, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조); 그리고 예로서, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 설명된 바와 같은 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들어질 수 있다.
"문어 항체"를 비롯하여, 3개 또는 그 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 공학적 항체 역시 본원에서 포함된다 (예로서, US 2006/0025576A1 참조).
본원에서 항체 또는 단편에는 또한, 선형 연결된 폴리유비퀴틴뿐만 아니라 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"가 포함된다 (예로서, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체
일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 항체의 아미노산 서열 변이체가 예기된다. 가령, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 성질을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 변형을 상기 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이런 변형에는 예로서, 항체의 아미노산 서열로부터 결실, 및/또는 항체의 아미노산 서열 내로 삽입 및/또는 항체의 아미노산 서열 내에 잔기의 치환이 포함된다. 최종 구조체가 요망되는 특징, 예를 들면, 항원-결합을 갖는다면, 최종 구조체에 도달하기 위해 결실, 삽입, 그리고 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.
a) 치환, 삽입, 그리고 결실 변이체
일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제시된다. 치환성 돌연변이유발을 위한 관심되는 부위에는 HVR과 FR이 포함된다. 보존성 치환은 "보존성 치환"의 표제 하에 표 1에서 제공된다. 더욱 실질적인 변화는 "모범적인 치환"의 표제 하에 표 1에서 제공되고, 그리고 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기에 더욱 설명된다. 아미노산 치환은 관심되는 항체 내로 도입될 수 있고, 그리고 산물은 요망되는 활성, 예를 들면, 유지된/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 향상된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
원래 잔기 모범적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 공통의 측쇄 성질에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존성 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교체하는 것을 수반할 것이다.
한 유형의 치환 변이체는 부모 항체 (가령, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선별된 결과의 변이체(들)는 부모 항체에 비하여 일정한 생물학적 성질 (가령, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)에서 변형 (가령, 향상)을 갖고 및/또는 부모 항체의 일정한 생물학적 성질을 실질적으로 유지할 것이다. 모범적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체이고, 이것은 예로서, 파지 전시-기초된 친화성 성숙 기술, 예를 들면, 본원에서 설명된 것들을 이용하여 편의하게 산출될 수 있다. 간단히 말하면, 하나 또는 그 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 그리고 변이체 항체가 파지 상에서 전시되고 특정 생물학적 활성 (가령, 결합 친화성)에 대해 스크리닝된다.
변경 (가령, 치환)은 예로서, 항체 친화성을 향상시키기 위해 HVR에서 만들어질 수 있다. 이런 변경은 HVR "핫스팟", 다시 말하면, 신체 성숙 과정 동안 높은 빈도의 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (예로서, Chowdhury, Methods Mol . Biol. 207:179-196 (2008) 참조), 및/또는 SDR (a-CDR)에서 만들어질 수 있고, 결과의 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 조사된다. 이차 라이브러리를 작제하고 이들로부터 재선별함에 의한 친화성 성숙은 예로서, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).)에서 설명된다. 친화성 성숙의 일부 구체예에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (가령, 오류-유발 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지향된 돌연변이유발)에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 이후, 이차 라이브러리가 창출된다. 라이브러리는 이후, 요망되는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-지향된 접근법을 수반하는데, 여기서 여러 HVR 잔기 (가령, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련되는 HVR 잔기는 예로서, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3과 CDR-L3이 종종 표적된다.
일정한 구체예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이런 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않으면, 하나 또는 그 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 가령, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존성 변경 (가령, 본원에서 제시된 바와 같은 보존성 치환)이 HVR 내에서 만들어질 수 있다. 이런 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수도 있다. 앞서 제시된 변이체 VH와 VL 서열의 일정한 구체예에서, 각 HVR은 변경되지 않거나, 또는 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 내포한다.
돌연변이유발을 위해 표적될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 설명된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹 (가령, 하전된 잔기, 예를 들면, arg, asp, his, lys, 그리고 glu)은 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는 지를 결정하기 위해, 확인되고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가령, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가의 치환이 최초 치환에 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 장소에서 도입될 수 있다. 대안으로, 또는 부가적으로, 항체와 항원 사이에 접촉 지점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이런 접촉 잔기와 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 요망되는 성질을 내포하는 지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기에서부터 100개 또는 그 이상의 잔기를 내포하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에서 변하는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 실례에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체에는 항체의 N- 또는 C-말단에, 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (가령, ADEPT의 경우) 또는 폴리펩티드의 융합이 포함된다.
b). 당화 변이체
일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 항체는 항체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다. 항체에 당화 부위의 부가 또는 결실은 하나 또는 그 이상의 당화 부위가 창출되거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편의하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 거기에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 고유 항체는 전형적으로, 가지형, 바이안테너리 올리고당을 포함하고, 이것은 일반적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연쇄에 의해 부착된다. 예로서, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)를 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 그리고 시알산뿐만 아니라 바이안테너리 올리고당 구조의 "줄기 (stem)" 내에 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체 내에 올리고당의 변형은 일정한 향상된 성질을 갖는 항체 변이체를 산출하기 위해 만들어질 수 있다.
한 구체예에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제시된다. 가령, 이런 항체 내에 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코오스의 양은 예로서, WO 2008/077546에서 설명된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석에 의해 측정될 때 Asn 297에 부착된 모든 당구조의 총합 (가령, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노오스 구조)에 비하여, Asn297에서 당 사슬 내에 푸코오스의 평균량을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내에서 약 위치 297에 소재하는 아스파라긴 잔기를 지칭한다 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링); 하지만, Asn297은 또한, 항체 내에 경미한 서열 변이로 인해, 위치 297의 상류 또는 하류 약 ± 3 아미노산, 다시 말하면, 위치 294와 300 사이에 소재할 수도 있다. 이런 푸코실화 변이체는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예로서, US Patent Publication No. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코오스-결함" 항체 변이체와 관련된 간행물의 실례에는 하기가 포함된다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 실례에는 단백질 푸코실화 결함 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; 그리고 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11), 그리고 적중 세포주, 예를 들면, 알파-1,6-푸코실전이효소 유전자, FUT8, 적중 CHO 세포 (예로서, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 그리고 WO2003/085107 참조)가 포함된다.
항체 변이체는 예로서, 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테너리 올리고당이 GlcNAc에 의해 양분되는 양분된 올리고당이 더욱 제공된다. 이런 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체의 실례는 예로서, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US Patent No. 6,602,684 (Umana et al.); 그리고 US 2005/0123546 (Umana et al.)에서 설명된다. Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토오스 잔기를 갖는 항체 변이체 역시 제시된다. 이런 항체 변이체는 향상된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체는 예로서, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 그리고 WO 1999/22764 (Raju, S.)에서 설명된다.
c). Fc 영역 변이체
일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제시된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어 Fc 영역 변이체가 산출될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (가령, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (가령, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 효과기 기능 중에서 전부가 아닌 일부를 갖는 항체 변이체를 예기하고, 이들 기능은 항체 변이체를 항체의 생체내 반감기가 중요하지만 일정한 효과기 기능 (가령, 보체와 ADCC)가 불필요하거나 또는 유해한 적용을 위한 바람직한 후보로 만든다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확증하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 가령, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합을 결여 (따라서 아마도 ADCC 활성을 결여)하지만, FcRn 결합 능력을 유지하는 것을 담보하기 위해 수행될 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포, NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII와 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 464 페이지의 표 3에서 요약된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 산정하기 위한 시험관내 검정의 무제한적 실례는 U.S. Patent No. 5,500,362 (예로서, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참조) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참조)에서 설명된다. 대안으로, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수도 있다 (예로서, 유세포분석을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 그리고 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI)). 이런 검정을 위한 유용한 효과기 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 대안으로, 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 개시된 것과 같은 동물 모델에서 산정될 수도 있다. C1q 결합 검정은 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성을 결여한다는 것을 확증하기 위해 수행될 수 있다. 예로서, WO 2006/029879와 WO 2005/100402에서 C1q와 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 산정하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (예로서, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 그리고 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참조). FcRn 결합과 생체내 소거/반감기 결정 역시 당분야에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (예로서, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참조).
감소된 효과기 기능을 갖는 항체에는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327과 329 중에서 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 것들이 포함된다 (U.S. Patent No. 6,737,056). 이런 Fc 돌연변이체에는 잔기 265와 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 (US Patent No. 7,332,581)를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297과 327 중에서 2개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체가 포함된다.
FcR에 향상된 또는 감소된 결합을 갖는 일정한 항체 변이체가 설명된다 (예로서, U.S. Patent No. 6,737,056; WO 2004/056312, 그리고 Shields et al., J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001) 참조.)
일정한 구체예에서, 항체 변이체는 ADCC를 향상시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 변경은 예로서, US Patent No. 6,194,551, WO 99/51642, 그리고 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (즉, 향상된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유발하는 Fc 영역에서 만들어진다.
증가된 반감기 및 태아에 모계 IgG의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 향상된 결합을 갖는 항체 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))는 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에서 설명된다. 이들 항체는 FcRn에 Fc 영역의 결합을 향상시키는, 그 내부에 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이런 Fc 변이체에는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중에서 하나 또는 그 이상에서 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것들이 포함된다 (US Patent No. 7,371,826).
또한, Fc 영역 변이체의 다른 실례와 관련하여, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. Patent No. 5,648,260; U.S. Patent No. 5,624,821; 그리고 WO 94/29351을 참조한다.
d). 시스테인 공학적 항체 변이체
일정한 구체예에서, 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는 시스테인 공학적 항체, 예를 들면, "thioMAbs"를 창출하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구체예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기가 항체의 접근가능 부위에서 위치되고, 그리고 본원에서 더욱 설명된 바와 같이, 항체를 다른 모이어티, 예를 들면, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합하여, 면역접합체를 창출하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 하기 잔기 중에서 하나 또는 그 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 그리고 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 공학적 항체는 예로서, U.S. Patent No. 7,521,541에서 설명된 바와 같이 산출될 수 있다.
e). 항체 유도체
일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 항체는 당분야에 공지되고 쉽게 가용한 추가의 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적절한 모이어티에는 물 용해성 중합체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 물 용해성 중합체의 무제한적 실례에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동일중합체 또는 무작위 공중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동일중합체, 프로릴프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (가령, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 그리고 이들의 혼합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정성으로 인하여, 제조 시에 이점을 갖는다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 그리고 가지형 또는 비가지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 숫자는 변할 수 있고, 그리고 하나 이상의 중합체가 부착되면, 이들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용된 중합체의 숫자 및/또는 유형은 향상되는 항체의 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건 하에 치료에 이용되는 지의 여부 등이 포함되지만 이들에 기초되지 않는 고려 사항에 기초하여 결정될 수 있다.
다른 구체예에서, 항체 및 방사선에 노출에 의해 선별적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제시된다. 한 구체예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 그리고 여기에는 통상의 세포를 손상시키지 않지만, 항체-비단백질성 모이어티에 인접하는 세포가 사멸되는 온도까지 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
B. 재조합 방법과 조성물
항체는 예로서, U.S. Patent No. 4,816,567에서 설명된 바와 같이, 재조합 방법과 조성물을 이용하여 생산될 수 있다. 한 구체예에서, 본원에서 설명된 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제시된다. 이런 핵산은 항체 (가령, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 추가의 구체예에서, 이런 핵산을 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터 (가령, 발현 벡터)가 제시된다. 추가의 구체예에서, 이런 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제시된다. 이와 같은 한 구체예에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 첫 번째 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 두 번째 벡터를 포함한다 (가령, 이들로 형질전환된다). 한 구체예에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프상 세포 (가령, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 구체예에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 만드는 방법이 제시되고, 여기서 상기 방법은 앞서 제시된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 그리고 선택적으로, 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 것을 포함한다.
항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체의 재조합 생산을 위해, 예로서 전술한 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포 내에서 추가적인 클로닝 및/또는 발현을 위해 단리되고 하나 또는 그 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이런 핵산은 전통적인 절차 (가령, 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)를 이용하여 쉽게 단리되고 염기서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포에는 본원에서 설명된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 가령, 항체는 특히, 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편과 폴리펩티드의 발현을 위해, 예로서 U.S. Patent No. 5,648,237, 5,789,199, 그리고 5,840,523을 참조한다. (또한, 대장균 (E. coli)에서 항체 단편의 발현을 설명하는 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254를 참조한다.) 발현 후, 항체는 가용성 분획물 내에 박테리아 세포 페이스트로부터 단리되고, 그리고 더욱 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예를 들면, 섬유상 진균 또는 효모는 당화 경로가 "인간화"된 진균과 효모 균주를 비롯하여, 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이고, 부분적으로 또는 완전하게 인간 당화 패턴을 갖는 항체의 생산이 산출된다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 그리고 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)을 참조한다.
당화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물과 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례에는 식물과 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다수의 배큘로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양액 역시 숙주로서 이용될 수 있다. 예로서, US Patent No. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 그리고 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명)를 참조한다.
척추동물 세포 역시 숙주로서 이용될 수 있다. 가령, 현탁 상태에서 성장하도록 개조된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계열 (COS-7); 인간 태아 신장 계열 (예로서, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)에서 설명된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 생쥐 세르톨리 세포 (예로서, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에서 설명된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버펄로 쥐 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562); 예로서, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에서 설명된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 그리고 FS4 세포. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주에는 DHFR- CHO 세포를 비롯한 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 그리고 골수종 세포주, 예를 들면, Y0, NS0와 Sp2/0가 포함된다. 항체 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해, 예로서 Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다.
C. 검정
본원에서 제시된 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 당분야에 공지된 다양한 검정에 의해 그들의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 특징화될 수 있다.
1. 결합 검정 및 기타 검정
한 양상에서, 본 발명의 항체는 예로서, 공지된 방법, 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 항원 결합 활성에 대해 조사된다.
다른 양상에서, 경쟁 검정은 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 결합에 대해, 예로서 본원에서 설명된 임의의 Fab 또는 항체, 예를 들면, 1E3, 1D8, 1F4, 1A10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 2A2, 2C11, 2H5, 3E4, 4C9, 4E4, 4G7, 3F5, 3A7과 4C10 또는 본원에서 설명된 바와 같은 하이브리드 항체, 예를 들면, 4E4/T110A, 4C9/T110A, 4G7/Y102G, 1F11/3F5, 1F11/3E4. 1F11/4G7, 2C11/3E4, 2C11/3F5, 2C11/4G7, 2H5/3E4, 2H5/3F5, 2H5/4G7, 1F11/3F5/Y102L과 경쟁하는 항체를 확인하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 경쟁 항체는 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 결합에 대해, 본원에서 설명된 임의의 Fab 또는 항체, 예를 들면, 1E3, 1D8, 1F4, 1A10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 2A2, 2C11, 2H5, 3E4, 4C9, 4E4, 4G7, 3F5, 3A7과 4C10 또는 본원에서 설명된 바와 같은 하이브리드 항체, 예를 들면, 4E4/T110A, 4C9/T110A, 4G7/Y102G, 1F11/3F5, 1F11/3E4. 1F11/4G7, 2C11/3E4, 2C11/3F5, 2C11/4G7, 2H5/3E4, 2H5/3F5, 2H5/4G7, 1F11/3F5/Y102L에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (가령, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위한 상세한 모범적인 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에서 제공된다.
모범적인 경쟁 검정에서, 고정된 선형 연결된 폴리유비퀴틴은 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 결합하는 첫 번째 표지된 항체 (가령, 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 결합의 경우에 항체 1E3, 1D8, 1F4, 1A10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 2A2, 2C11, 2H5, 3E4, 4C9, 4E4, 4G7, 3F5, 3A7과 4C10 또는 하이브리드 항체 4E4/T110A, 4C9/T110A, 4G7/Y102G, 1F11/3F5, 1F11/3E4. 1F11/4G7, 2C11/3E4, 2C11/3F5, 2C11/4G7, 2H5/3E4, 2H5/3F5, 2H5/4G7, 1F11/3F5/Y102L), 그리고 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 결합에 대해, 첫 번째 항체와 경쟁하는 능력에 대해 조사되는 두 번째 표지되지 않은 항체를 포함하는 용액에서 배양된다. 두 번째 항체는 하이브리도마 상층액 내에 존재할 수 있다. 대조로서, 고정된 선형 연결된 폴리유비퀴틴은 첫 번째 표지된 항체를 포함하지만 두 번째 표지되지 않은 항체를 포함하지 않는 용액에서 배양된다. 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 첫 번째 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 배양 후, 과잉의 결합되지 않은 항체가 제거되고, 그리고 고정된 선형 연결된 폴리유비퀴틴과 결합된 표지의 양이 측정된다. 고정된 선형 연결된 폴리유비퀴틴과 결합된 표지의 양이 대조 샘플에 비하여 검사 샘플에서 실질적으로 감소되면, 이것은 두 번째 항체가 선형 연결된 폴리유비퀴틴에 결합에 대해, 첫 번째 항체와 경쟁한다는 것을 지시한다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)를 참조한다.
2. 활성 검정
한 양상에서, 생물학적 활성을 갖는 이들의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 확인하기 위한 검정이 제시된다. 생물학적 활성에는 예로서, 세포 또는 조직 내에서 선형 연결된 폴리유비퀴틴화 단백질의 분해의 속도 조절, 그리고 세포의 세포 주기 진행의 속도 조절이 포함될 수 있다. 생체내에서 및/또는 시험관내에서 이런 생물학적 활성을 갖는 항체 역시 제시된다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 항체는 이런 생물학적 활성에 대해 조사된다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한, 하나 또는 그 이상의 세포독성제, 예를 들면, 화학치료제 또는 약물, 성장 저해제, 독소 (가령, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 포함하는 면역접합체를 제시한다.
한 구체예에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드 (U.S. Patent No. 5,208,020, 5,416,064 및 European Patent EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예를 들면, 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE와 DF (MMAE와 MMAF) (U.S. Patent No. 5,635,483과 5,780,588, 그리고 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아마이신 또는 이의 유도체 (U.S. Patent No. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 그리고 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 그리고 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998) 참조); 안트라사이클린, 예를 들면, 다우노마이신 또는 독소루비신 (Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 그리고 U.S. Patent No. 6,630,579 참조); 메토트렉사트; 빈데신; 탁산, 예를 들면, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 토세탁셀, 그리고 오르타탁셀; 트리코테센; 그리고 CC1065가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 하나 또는 그 이상의 약물에 접합되는 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
다른 구체예에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 그리고 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (Momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (Sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 그리고 트리코테센이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에서 설명된 바와 같은 항체를 포함한다.
다른 구체예에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에서 설명된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산에 가용하다. 실례에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 방사성접합체가 검출에 이용될 때, 이것은 섬광 조영 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면, tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상 (일명, 자기 공명 영상, mri)을 위한 스핀 표지, 예를 들면, 이번에도 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질 커플링 작용제, 예를 들면, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체 (가령, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (가령, 디숙신이미딜 수버레이트), 알데히드 (가령, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (가령, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (가령, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (가령, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 그리고 비스-활성 플루오르 화합물 (가령, 1,5-디플루오르-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어질 수 있다. 가령, 리신 면역독소는 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에서 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 모범적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포 내로 세포독성 약물의 방출을 조장하는 "개열가능 링커"이다. 가령, 산-불안정성 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 이황화-내포 링커 (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); U.S. Patent No. 5,208,020)가 이용될 수 있다.
본원에서 면역접합체 또는 ADC는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 그리고 술포-SMPB, 그리고 상업적으로 구입가능한 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (가령, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A로부터)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 가교-링커 시약으로 제조된 이런 접합체를 명백히 예기하지만, 이들에 국한되지 않는다.
E. 진단과 검출을 위한 방법과 조성물
일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 임의의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 생물학적 샘플 내에서 선형 연결된 폴리유비퀴틴의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 일정한 구체예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 종양 세포, 근육 세포 또는 신경 세포를 포함한다.
한 구체예에서, 진단 또는 검출의 방법에서 이용을 위한 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체가 제시된다. 추가의 양상에서, 생물학적 샘플 내에서 선형 연결된 폴리유비퀴틴의 존재를 검출하는 방법이 제시된다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 폴리유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴화 단백질에 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 본원에서 설명된 바와 같은 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체와 접촉시키고, 그리고 복합체가 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체 및 폴리유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴화 단백질 사이에 형성되는 지를 검출하는 것을 포함한다. 이런 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 구체예에서, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 예로서, 선형 연결된 폴리유비퀴틴이 환자의 선별을 위한 바이오마커인 경우에, 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 이용한 치료에 유자격한 개체를 선별하는데 이용된다.
본 발명의 항체를 이용하여 진단될 수 있는 모범적인 질환에는 세포 주기-관련된 질환 또는 장애가 포함되고, 이들은 비정상적으로 증가된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애, 또는 비정상적으로 감소된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애일 수 있다. 한 양상에서, 비정상적으로 증가된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애는 암이다. 다른 양상에서, 비정상적으로 감소된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애는 예로서, 퇴행성 근육 질환 또는 퇴행성 신경 질환이다.
일정한 구체예에서, 표지된 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체가 제시된다. 표지에는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (가령, 형광, 발색, 전자밀도, 화학발광, 그리고 방사성 표지)뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예를 들면, 효소 또는 리간드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 모범적인 표지에는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H와 131I, 형광단, 예를 들면, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인과 이의 유도체, 로다민과 이의 유도체, 단실, 엄벨리페론, 루시페라아제, 예를 들면, 개똥벌레 루시페라아제와 박테리아 루시페라아제 (U.S. Patent No. 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 염료 전구체를 산화시키는데 과산화수소를 이용하는 효소, 예를 들면, HRP, 락토퍼옥시다아제, 또는 마이크로퍼옥시다아제, 비오틴/아비딘과 커플링된 당류 옥시다아제, 예를 들면, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 그리고 글루코오스-6-인산염 탈수소효소, 헤테로환상 옥시다아제, 예를 들면, 요산분해효소와 크산틴 옥시다아제, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정된 유리 라디칼 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
F. 제약학적 제제
본원에서 설명된 바와 같은 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체의 제약학적 제제는 요망되는 정도의 순도를 갖는 이런 항체를 하나 또는 그 이상의 선택적 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), 냉동 건조된 제제 또는 수성 용액의 형태로 제조된다. 제약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로, 이용된 용량과 농도에서 수용자에 비독성이고, 그리고 여기에는 하기가 포함된다: 완충액, 예를 들면, 인산염, 구연산염, 그리고 기타 유기산; 아스코르브산과 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (가령, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 염화물; 헥사메토늄 염화물; 벤잘코늄 염화물; 벤제토늄 염화물; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 그리고 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 이하) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류, 그리고 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당류, 예를 들면, 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 복합체 (가령, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원의 모범적인 제약학적으로 허용되는 담체에는 개재성 약물 분산 작용제, 예를 들면, 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예를 들면, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)이 더욱 포함된다. rHuPH20을 비롯한 일정한 모범적인 sHASEGP와 이용 방법은 US Patent Publication No. 2005/0260186과 2006/0104968에서 설명된다. 한 양상에서, sHASEGP는 하나 또는 그 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예를 들면, 콘드로이티나아제와 합동된다.
모범적인 냉동 건조된 항체 제제는 US Patent No. 6,267,958에서 설명된다. 수성 항체 제제에는 US Patent No. 6,171,586과 WO2006/044908에서 설명된 것들이 포함되고, 후자 제제는 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제제는 또한, 치료되는 특정 징후에 필요한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 부정적인 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 내포할 수 있다. 가령, 하나 또는 그 이상의 화학치료제를 더욱 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 활성 성분은 합동해서, 의도된 목적에 효과적인 양으로 적절히 존재한다.
활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템 (가령, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 예로서, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 각각 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 개시된다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제조물의 적절한 실례에는 항체를 내포하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이들 매트릭스는 정형된 물품, 예를 들면, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 이용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 무균은 예로서, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
G. 치료적 방법과 조성물
본원에서 제시된 임의의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체는 치료적 방법에 이용될 수 있다.
한 양상에서, 약제로서 이용을 위한 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체가 제시된다. 추가의 양상에서, 비정상적인 세포 주기 통제와 연관된 질환 (암과 같은 증식 질환, 그리고 퇴행성 근육 질환 및 퇴행성 신경 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 발육 부전 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않음)을 치료하는데 이용하기 위한 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체가 제시된다. 일정한 구체예에서, 치료의 방법에서 이용을 위한 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체가 제시된다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 비정상적인 세포 주기 통제와 연관된 질환을 앓는 개체를 치료하는 방법에서 이용하기 위한 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 제시하고, 상기 방법은 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다. 이와 같은 한 구체예에서, 상기 방법은 예로서, 하기에 설명된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 더욱 포함한다. 추가의 구체예에서, 본 발명은 세포 주기 진행의 속도가 조정되도록 세포 주기 통제를 조절하는데 이용하기 위한 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 제시한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 개체에서 세포 주기 진행의 속도를 조절하는 방법에서 이용하기 위한 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 제시하고, 상기 방법은 세포 주기 진행을 조절하고, 따라서 세포 분열의 속도를 조정하기 위해 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다. 상기 구체예 중에서 한 구체예에 따른 "개체"는 바람직하게는, 인간이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 조제에서 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체의 용도를 제시한다. 한 구체예에서, 약제는 비정상적인 세포 주기 통제와 연관된 질환 (암과 같은 증식 질환, 그리고 퇴행성 근육 질환 및 퇴행성 신경 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 발육 부전 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않음)의 치료를 위한 것이다. 추가의 구체예에서, 약제는 비정상적인 세포 주기 통제와 연관된 질환을 치료하는 방법에서 이용을 위한 것이고, 상기 방법은 상기 약제의 효과량을 이런 질환을 앓는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 이와 같은 한 구체예에서, 상기 방법은 예로서, 하기에 설명된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 더욱 포함한다. 추가의 구체예에서, 약제는 세포 주기 진행의 속도를 조절하기 위한 것이다. 추가의 구체예에서, 약제는 개체에서 세포 주기 진행의 속도를 조절하는 방법에서 이용하기 위한 것이고, 상기 방법은 세포 분열의 속도를 조정하는데 효과적인 양의 약제를 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다. 상기 구체예 중에서 한 구체예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 비정상적인 세포 주기 통제와 연관된 질환을 치료하기 위한 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체의 효과량을 비정상적인 세포 주기 통제와 연관된 이런 질환을 앓는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 이와 같은 한 구체예에서, 상기 방법은 하기에 설명된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 더욱 포함한다. 상기 구체예 중에서 한 구체예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 예로서, 전술한 임의의 치료적 방법에서 이용을 위한 본원에서 제시된 임의의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체를 포함하는 제약학적 제제를 제시한다. 한 구체예에서, 제약학적 제제는 본원에서 제시된 임의의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다른 구체예에서, 제약학적 제제는 본원에서 제시된 임의의 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체 및 예로서, 하기에 설명된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 치료에서 단독으로 또는 다른 작용제와 공동으로 이용될 수 있다. 가령, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, 추가의 치료제는 화학치료제이다.
"화학치료제"는 암의 치료에서 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 실례에는 알킬화제, 예를 들면, 티오테파 및 CYTOXAN® 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올멜라민을 비롯한 에틸렌이민과 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라탁신 및 불라탁시논); 델타-9-테트라히드로카나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파촌; 라파촐; 콜히친; 베툴린산; 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄포테신, 스코폴레틴, 그리고 9-아미노캄포테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신과 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189와 CB1-TM1 포함); 엘루테로빈; 판크라티스타틴; 사크로딕티인; 스폰지스타틴; 질소 겨자, 예를 들면, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 산화물 염산염, 메팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 겨자; 니트로소우레아, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들면, 에네디인 항생제 (가령, 칼리케아마이신, 특히 칼리케아마이신 감마1I 및 칼리케아마이신 오메가I1 (예로서, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994) 참조); 디네마이신 A를 비롯한 디네마이신; 에스페라마이신; 그리고, 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 에네디인 항생성 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들면, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예를 들면, 메토트렉사트 및 5-플루오르우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들면, 데노프테린, 메토트렉사트, 프테로프테린, 트리메트렉사트; 퓨린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제, 예를 들면, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들면, 폴리닉산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉사트; 데포파민; 디메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들면, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, TAXOL® 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM 파클리탁셀의 크레모포르-없는, 알부민-공학적 나노입자 제제 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 그리고 TAXOTERE® 도세탁셀 (Rh
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ne-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈 (GEMZAR®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉사트; 백금 유사체, 예를 들면, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉사트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라아제 저해제 RFS 2000; 디플루오르메틸오르티닌 (DMFO); 레티노이드, 예를 들면, 레티노산; 카페시타빈 (XELODA®); 이들 중에서 한 가지의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 그리고, 이들 중에서 2가지 또는 그 이상의 조합, 예를 들면, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 복합 요법에 대한 약어인 CHOP, 그리고 5-FU와 류코보빈과 복합된 옥살리플라틴 (ELOXATINTM)으로 치료 섭생에 대한 약어인 FOLFOX가 포함된다.
또한, 이러한 정의에는 암의 성장을 증진할 수 있는 호르몬의 효과를 통제하거나, 감소시키거나, 차단하거나, 또는 저해하는 기능을 하고, 그리고 종종, 온몸, 또는 전신 치료의 형태인 항-호르몬제가 포함된다. 이들은 그 자체로 호르몬일 수 있다. 실례에는 예로서, 타목시펜 (NOLVADEX® 타목시펜 포함), EVISTA® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 그리고 FARESTON® 토레미펜을 비롯한 항-에스트로겐 및 선별적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERMs); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절자 (ERDs); 난소를 억제하거나 또는 폐쇄하는 기능을 하는 작용제, 예를 들면, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효현제, 예를 들면, LUPRON®과 ELIGARD® 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 기타 항-안드로겐, 예를 들면, 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 그리고 부신에서 에스트로겐 생산을 통제하는 아로마타아제 효소를 저해하는 아로마타아제 저해제, 예를 들면, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE® 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN® 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, RIVISOR® 보로졸, FEMARA® 레트로졸, 그리고 ARIMIDEX® 아나스트로졸이 포함된다. 이에 더하여, 화학치료제의 이런 정의에는 비스포스포네이트, 예를 들면, 클로드로네이트 (가령, BONEFOS® 또는 OSTAC®), DIDROCAL® 에티드로네이트, NE-58095, ZOMETA® 졸레드론산/졸레드로네이트, FOSAMAX® 알렌드로네이트, AREDIA® 파미드로네이트, SKELID® 틸루드로네이트, 또는 ACTONEL® 리세드로네이트; 그리고 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 관련되는 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 저해하는 것들, 예를 들면, PKC-알파, Raf, H-Ras, 그리고 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들면, THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들면, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신과 VAXID® 백신; LURTOTECAN® 토포이소머라아제 1 저해제; ABARELIX® rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (ErbB-2 및 GW572016으로 알려져 있는 EGFR 이중 티로신 키나아제 소형-분자 저해제); 그리고 이들 중에서 한 가지의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
전술한 이런 복합 요법은 합동 투여 (여기서 2가지 또는 그 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제제 내에 포함된다) 및 별개 투여를 포괄하고, 어떤 경우든, 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 어쥬번트의 투여 이전에, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 일어날 수 있다. 본 발명의 항체는 또한, 방사선 요법과 공동으로 이용될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내, 비내, 그리고 국소 치료가 요망되면, 병소내 투여를 비롯한 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여가 포함된다. 약액주입은 부분적으로 투여가 단기 또는 장기인지에 따라, 임의의 적절한 루트에 의해, 예를 들면, 주사, 예를 들면, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 달성될 수 있다. 다양한 시점에 걸쳐 단일 또는 복수 투여, 볼러스 투여, 그리고 펄스 주입 (pulse infusion)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 약액주입 일정이 본원에서 예기된다.
본 발명의 항체는 모범의료행위지침 (good medical practice)과 부합하는 방식으로 조제되고, 약액주입되고, 그리고 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려 인자에는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 그리고 의사에게 공지된 기타 인자가 포함된다. 항체는 반드시 그러할 필요는 없지만, 문제의 질환을 예방하거나 또는 치료하는데 현재 이용되고 있는 하나 또는 그 이상의 작용제로 선택적으로 조제된다. 이런 다른 작용제의 효과량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 그리고 앞서 논의된 다른 인자에 좌우된다. 이들은 일반적으로, 동일한 용량에서 및 본원에서 설명된 바와 같은 투여 루트로 이용되거나, 또는 본원에서 설명된 용량의 약 1 내지 99%로 이용되거나, 또는 적절한 것으로 경험적으로/임상적으로 결정되는 임의의 용량에서 및 임의의 루트에 의해 이용된다.
본 발명의 항체의 결합 표적의 장소가 항체의 제조와 투여에 고려된다. 결합 표적이 세포내 분자일 때, 본 발명의 일정한 구체예는 결합 표적이 소재하는 세포 내로 도입되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제시한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 세포내에서 인트라바디로서 발현될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인트라바디"는 Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004); U.S. Patent No. 6,004,940과 6,329,173; U.S. Patent Application Publication No. 2003/0104402, 그리고 PCT Publication No. WO2003/077945에서 설명된 바와 같이, 세포내에서 발현되고 표적 분자에 선별적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 일부를 지칭한다. 인트라바디의 세포내 발현은 요망되는 항체 또는 이의 항원-결합 일부를 인코딩하는 핵산 (항원-결합 단편의 항체를 인코딩하는 유전자와 통상적으로 연관되는 야생형 리더 서열 및 분비 신호를 결여)을 표적 세포 내로 도입함으로써 실행된다. 현미주사, 발리스틱 주사, 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포좀, 그리고 관심되는 핵산을 운반하는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스와 우두 벡터로 형질감염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 핵산을 세포 내로 도입하는 임의의 표준 방법이 이용될 수 있다. 본 발명의 항-폴리유비퀴틴 항체의 전부 또는 일부를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산은 폴리유비퀴틴에 세포내 결합하고 하나 또는 그 이상의 폴리유비퀴틴-매개된 세포 경로를 조절할 수 있는 하나 또는 그 이상의 인트라바디가 발현되도록, 표적 세포에 전달될 수 있다.
다른 구체예에서, 내재화 항체가 제시된다. 항체는 세포 내로 항체의 전달을 증강시키는 일정한 특징을 갖거나, 또는 이런 특징을 갖도록 변형될 수 있다. 이것을 달성하기 위한 기술은 당분야에 공지되어 있다. 가령, 항체의 카치온화 (cationization)는 세포 내로 이의 흡수를 조장하는 것으로 알려져 있다 (예로서, U.S. Patent No. 6,703,019 참조). 리포펙션 또는 리포좀 역시 항체를 세포 내로 전달하는데 이용될 수 있다. 항체 단편이 이용되는 경우에, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 저해 단편이 일반적으로 유리하다. 가령, 항체의 가변-영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 유지하는 펩티드 분자가 설계될 수 있다. 이런 펩티드는 화학적으로 합성되고 및/또는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 예로서, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893 (1993)을 참조한다.
표적 세포 내로 조절자 폴리펩티드의 진입은 당분야에 공지된 방법에 의해 증강될 수 있다. 가령, 일정한 서열, 예를 들면, HIV Tat 또는 안테나페디아 (Antennapedia) 호메오도메인 단백질로부터 유래된 것들은 세포 막을 가로질러 이종기원성 단백질의 효과적인 흡수를 주도할 수 있다. 예로서, Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4325-4329 (1999)를 참조한다.
결합 표적이 뇌 내에 소재할 때, 본 발명의 일정한 구체예는 뇌-혈관 장벽을 가로지르는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제시한다. 일정한 신경퇴행성 질환은 뇌-혈관 장벽의 투과성에서 증가와 연관되고, 따라서 항체 또는 항원-결합 단편이 뇌로 쉽게 도입될 수 있다. 뇌-혈관 장벽이 본래 상태일 때, 물리적 방법, 지질-기초된 방법, 그리고 수용체와 채널-기초된 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 이를 가로질러 분자를 수송하기 위한 몇몇 공지된 접근법이 존재한다.
뇌-혈관 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 물리적 방법에는 완전히, 또는 뇌-혈관 장벽 내에 구멍을 발생시킴으로써 뇌-혈관 장벽을 우회하는 것이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 우회 방법에는 뇌 내로 직접 주사 (예로서, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002) 참조); 개재성 융합/대류-증강된 전달 (예로서, Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994) 참조), 그리고 뇌 내에 전달 장치 이식 (예로서, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); 그리고 Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical 참조)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 장벽 내에 구멍을 발생시키는 방법에는 초음파 (예로서, U.S. Patent Publication No. 2002/0038086 참조), 삼투압 (가령, 긴장 과도의 만니톨의 투여에 의해 (Neuwelt, E.A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, vols. 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), 예로서, 브래디키닌 또는 막투과제 A-7에 의한 투과화 (예로서, U.S. Patent No. 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 그리고 5,686,416 참조), 그리고 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 유전자를 내포하는 벡터로, 뇌-혈관 장벽에 걸쳐 있는 뉴런의 형질감염 (예로서, U.S. Patent Publication No. 2003/0083299 참조)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
뇌-혈관 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 지질-기초된 방법에는 뇌-혈관 장벽의 관 내피 세포층 (vascular endothelium) 상에 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링된 리포좀 내에 항체 또는 항원-결합 단편 캡슐화 (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 20020025313 참조), 그리고 저-밀도 지방단백질 입자 (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 20040204354 참조) 또는 아포리포단백질 E (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 20040131692 참조)에서 항체 또는 항원-결합 단편 코팅이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
뇌-혈관 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 수용체와 채널-기초된 방법에는 뇌-혈관 장벽의 투과성을 증가시키는 글루코코르티코이드 차단제 이용 (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 2002/0065259, 2003/0162695, 그리고 2005/0124533 참조); 칼륨 채널 활성화 (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 2005/0089473 참조); ABC 약물 수송체 저해 (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 2003/0073713 참조); 트랜스페린으로 항체 코팅 및 하나 또는 그 이상의 트랜스페린 수용체의 활성 조절 (예로서, U.S. Patent Application Publication No. 2003/0129186 참조), 그리고 항체 양이온화 (예로서, U.S. Patent No. 5,004,697 참조)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
질환의 예방 또는 치료를 위하여, 본 발명의 항체의 적절한 용량 (단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 추가의 치료제와 공동으로 이용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 심각도와 경과, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는 지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상 전력과 항체에 대한 반응, 그리고 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 항체는 적절하게는, 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에 투여된다. 질환의 유형과 심각도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (가령, 0.1mg/kg-10mg/kg)의 항체가 예로서, 1회 또는 그 이상의 별개 투여, 또는 연속 주입인지에 상관없이, 환자에 투여를 위한 최초 후보 용량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일 용량은 전술한 인자에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위에서 변할 지도 모른다. 수일 또는 그 이상에 걸쳐 반복 투여의 경우에, 질환에 따라, 치료는 일반적으로, 질환 증상의 요망되는 억제가 나타날 때까지 지속될 것이다. 항체의 한 가지 모범적인 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 따라서 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합)의 1회 또는 그 이상의 분량이 환자에 투여될 수 있다. 이런 분량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (가령, 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예로서, 약 6회 분량의 항체를 받도록 하기 위해). 더욱 많은 최초 부하 분량, 그 이후에 1회 또는 그 이상의 더욱 적은 분량이 투여될 수도 있다. 하지만, 다른 투약 섭생이 유용할 수도 있다. 이러한 요법의 진행은 전통적인 기술과 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
전술한 임의의 제제 또는 치료적 방법은 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체 대신에 또는 이에 더하여, 본 발명의 면역접합체를 이용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
H. 제조 물품
본 발명의 다른 양상에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 재료를 내포하는 제조 물품이 제시된다. 제조 물품은 용기 및 용기 위에 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적절한 용기에는 예로서, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 가방 등이 포함된다. 용기는 다양한 재료, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로 또는 질환을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 다른 조성물과 합동되는 조성물을 보관하고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (가령, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통되는 마개가 달린 정맥내 용액 가방 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내에 적어도 하나의 활성 작용제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 질환을 치료하는데 이용된다는 것을 지시한다. 게다가, 제조 물품은 (a) 그 내에 조성물이 포함된 첫 번째 용기, 여기서 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함하고; 그리고 (b) 그 내에 조성물이 포함된 두 번째 용기를 포함할 수 있고, 여기서 상기 조성물은 추가의 세포독성 치료제 또는 다른 치료제를 포함한다. 본 발명의 이러한 구체예에서 제조 물품은 조성물이 특정 질환을 치료하는데 이용될 수 있다는 것을 지시하는 포장 삽입물을 더욱 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 부가적으로, 제조 물품은 제약학적으로-허용되는 완충액, 예를 들면, 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 (또는 세 번째) 용기를 더욱 포함할 수 있다. 이것은 기타 완충액, 희석제, 충전제, 바늘, 그리고 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 더욱 포함할 수 있다.
전술한 임의의 제조 물품은 항-선형 연결된 폴리유비퀴틴 항체 대신에 또는 이에 더하여, 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법과 조성물의 실시예이다. 앞서 제공된 전반적인 설명을 고려하면, 다양한 다른 구체예가 실시될 수 있을 것으로 이해된다.
실시예 1: 항-선형 폴리유비퀴틴 항체의 단리와 특징화
A) 항원 산출
파지 전시 라이브러리를 분류하는데 이용된 항원은 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem)이었다. 선형 디유비퀴틴은 첫 번째 유비퀴틴의 카르복시 말단 및 두 번째 유비퀴틴의 아미노 말단 사이에 펩티드 결합을 통한 2개 유비퀴틴의 두미 융합 (head to tail fusion)이다.
B) 미경험 라이브러리 분류
미경험 YSGX Fab 파지 전시 라이브러리는 선형 디유비퀴틴에 대한 4 라운드의 분류에 종속되었다. 4 라운드의 분류 후 농화 (enrichment)가 관찰되지 않았다 (표 2 참조). YSGX Fab 파지 전시 라이브러리는 3개의 중쇄 CDR 모두 및 경쇄 CDR L3에서 무작위화된 아미노산을 내포하고 (U.S. Published Patent Application No. 2005-0106667 및 Fellouse F. et al. JMB 373:924-40 (2007) 참조), 그리고 인간화 항체 4D5에 기초된다.
미경험 공통 경쇄 YSGX Fab 파지 전시 라이브러리는 선형 디유비퀴틴에 대해 4 라운드의 분류에 종속되었다. 4 라운드의 분류 후 25-배 농화가 관찰되었다 (표 2 참조). 공통 경쇄 YSGX Fab 파지 전시 라이브러리는 YSGX 라이브러리에 대해 설명된 바와 같이, 3개의 중쇄 CDR 모두에서 무작위화된 아미노산을 내포하지만 (U.S. Published Patent Application No. 2005-0106667 및 Fellouse F. et al. JMB 373:924-40 (2007) 참조), 경쇄 서열은 인간화 항체 4D5의 변형된 이형으로서 고정된다.
미경험 VH Fab 파지 전시 라이브러리는 선형 디유비퀴틴에 대해 4 라운드의 분류에 종속되었다. 4 라운드의 분류 후 800-배 농화가 관찰되었다 (표 1 참조). VH Fab 파지 전시 라이브러리는 3개의 중쇄 CDR 모두에서 무작위화된 아미노산을 내포하고 (U.S. Published Patent Application No. 2005/0119455 및 Lee C.W. et al. JMB 340:1073-93 (2004) 참조), 그리고 인간화 항체 4D5에 기초된다.
선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem)은 96-웰 Maxisorb 면역평판 (NUNC) 상에 고정되었다. 평판은 4℃에서 하룻밤 동안, 50 mM 탄산나트륨 완충액, pH 9.6에서 5 μg/mL 선형 디유비퀴틴으로 코팅되었다. 코팅된 평판은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 0.05% Tween 20을 내포하는 인산염 완충된 염수 (PBS) (PBST)에서 200 μL/웰의 2.5% 우유로 차단되었다. 미경험 파지 라이브러리는 1/5 부피의 20% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)/2.5M NaCl로 글리세롤 스톡으로부터 침전되고, 2.5% 우유/PBST에서 재현탁되고, 그리고 평판이 차단된 상태에서, 25℃에서 1시간 동안 배양되었다. 1시간 후, 차단 완충액이 평판으로부터 버려지고, 2.5% 우유/PBST에서 100 μL/웰의 파지가 첨가되고, 그리고 진탕하면서, 25℃에서 4시간 동안 배양되었다. 결합 후, 평판은 웰을 수동으로 채우고 세척 간에 완충액을 버림으로써 PBST로 10회 세척되었다. 파지는 진탕하면서, 25℃에서 30분 동안 150 μL/웰의 50 mM HCl/500 mM KCl로 용리되었다. 용리액은 150 μL/웰의 1 M Tris, pH 7.5로 중화되고, 그리고 M13K07 보조 파지의 첨가로 XL1-Blue (Agilent) 대장균 (Escherichia coli) (E. coli)에서 차후 증식되었다.
증폭된 파지는 앞서 설명된 바와 같이, 선형 디유비퀴틴에 대한 추가 라운드의 선별에 이용되었다. 라운드 2 내지 4에서, 상이한 형태의 가용성 유비퀴틴이 반대 선별 (counterselection)을 위해 파지에 첨가되었다. 두 번째 라운드에서, 10 μg/mL의 가용성 모노유비퀴틴 (Boston Biochem)이 이용되었다. 세 번째와 네 번째 라운드에서, 각각 10 μg/mL의 가용성 모노유비퀴틴 (Boston Biochem), K11-연결된 디유비퀴틴 (Genentech), K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem)과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 사슬 (Boston Biochem)이 이용되었다. 농화는 코팅되지 않은 웰과 비교하여 선형 디유비퀴틴으로 회수된 파지의 숫자를 비교함으로써 라운드 2 내지 4 동안 계산되었다. 농화는 라운드 2 내지 4에서 공통 경쇄 라이브러리와 VH 라이브러리의 경우에 관찰되지만, YSGX 라이브러리의 경우에 관찰되지 않았다 (표 2 참조).
라이브러리 라운드 2 라운드 3 라운드 4
공통 경쇄 YSGX 2X 2X 25X
YSGX 0X 0X 0X
VH 3X 120X 800X
VH 라이브러리의 두 번째 라운드의 분류로부터 96개 개별 클론, VH 라이브러리의 세 번째 라운드의 분류의 192개 클론, VH 라이브러리의 네 번째 라운드의 분류로부터 96개 클론, 그리고 공통 경쇄 라이브러리의 네 번째 라운드의 분류로부터 192개 클론이 스크리닝되었다. YSGX 라이브러리의 경우에 농화가 관찰되지 않았기 때문에, 이러한 라이브러리로부터 어떤 클론도 스크리닝되지 않았다. 개별 클론은 진탕하면서, 37℃에서 하룻밤 동안 50 μg/mL 카르베니실린 및 1x1010 파지/mL M13K07 보조 파지를 내포하는 1 mL의 2YT 액체배지에서 96-웰 판형에서 성장되었다. 세포는 3000 rpm에서 10분 동안 회전시킴으로써 펠릿화되었다. 이들 배양액으로부터 상층액은 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem), 모노유비퀴틴 (Boston Biochem), K11-연결된 디유비퀴틴 (Genentech), K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem), K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem), 항-gD 항체 (Genentech), 또는 코팅되지 않은 웰에 결합에 대한 고처리량 파지 스팟 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에서 이용되었다. 모든 Fab 라이브러리는 항-gD 항체 결합에 의한 전시 수준의 산정을 가능하게 하는, 경쇄 상에 카르복시-말단 gD 태그를 내포한다. 유비퀴틴 단백질의 패널은 384-웰 Maxisorb 면역평판 (NUNC) 상에 고정되었다. 평판은 4℃에서 하룻밤 동안, 50 mM 탄산나트륨 완충액, pH 9.6에서 2 μg/mL의 각 단백질로 코팅되었다. 코팅된 평판은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 60 μL/웰의 2.5% 우유로 차단되었다. 1시간 후, 차단 완충액이 평판으로부터 버려지고, 그리고 20 μL/웰의 PBST 및 10 μL/웰의 파지 상층액이 첨가되었다. 평판은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 배양되었다. 평판은 이후, 웰을 수동으로 채우고 세척 완충액을 버림으로써 PBST로 6회 세척되었다. PBST에서 항-M13 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-접합된 이차 항체 (GE Healthcare)의 1:5,000 희석액이 파지 결합의 검출에 이용되었다. 30 μL/웰의 이차 희석액이 첨가되고, 그리고 평판은 진탕하면서, 25℃에서 30분 동안 배양되었다. 평판은 이후, PBST로 6회 및 PBS로 2회 (둘 모두 수동으로) 세척되었다. 결합된 이차 항체는 TMB 기질 (KPL)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 동등 부피의 1 M 인산으로 진정되었다. 흡광도는 450 nm에서 판독되었다.
공통 경쇄 라이브러리로부터, 몇몇 약한 선형 디유비퀴틴-특이적 접합제가 확인되었다 (도 1 참조). 이들 클론의 경쇄와 중쇄 가변 도메인은 염기서열분석되었다. 하지만, 2개의 독특한 서열 (1F4 (서열 번호:27과 31) 및 1A10 (서열 번호:28과 31))이 경쇄 서열에 기초하여 확인되었는데, 이들 클론 중에서 하나 (1F4)는 실제로, 고정된 경쇄를 내포하지 않는 YSGX 라이브러리로부터 유래되는 것으로 결정되었다 (도 2A 참조). VH 라이브러리로부터, K63-연결된 폴리유비퀴틴에 더욱 약한 결합과 함께 강한 선형 디유비퀴틴 결합을 보이는 몇몇 클론이 확인되었다 (도 1 참조). 이들 VH 라이브러리 클론의 중쇄 가변 도메인은 염기서열분석되었다. CDR H1, CDR H2, 그리고 CDR H3 서열은 클론-특이적인 것으로 예상되는 반면, 중쇄 뼈대 서열은 VH 라이브러리 설계에 기초하여 동일해야 한다. 전체 경쇄 서열 (뼈대와 CDR 둘 모두)은 라이브러리 설계에 기인한 불변체인 것으로 예상된다. CDR L1 서열은 RASQDVSTAVA (서열 번호:1)이고, CDR L2 서열은 SASFLYS (서열 번호:2)이고, 그리고 CDR L3 서열은 QQSYTTPPT (서열 번호:3)이다. 2개의 독특한 중쇄 서열 (1D8 (서열 번호:30) 및 1E3 (서열 번호:29))이 확인되었다 (도 2B 참조).
C) 파지미드의 일가 Fab 전시로의 전환
VH 라이브러리로부터 1D8과 1E3 파지미드 클론은 친화성 성숙 목적으로, 이가 Fab-zip 형식에서 일가 Fab 전시로 전환되었다. CH1 불변 도메인의 단부 및 유전자 III (gpIII)의 출발 지점 사이에 류신 지퍼는 Kunkel 돌연변이유발을 이용하여 제거되었다 (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985) 참조). 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F220-delzip (TCTTGTGACAAAACTCACAGTGGCGGTGGCTCTGGT) (서열 번호:100)는 1 μg의 1D8 또는 1E3 파지미드 Kunkel DNA와 합동되었다.
각각, 공통 경쇄 라이브러리와 YSGX 라이브러리로부터 1A10과 1F4 클론은 친화성 성숙 목적으로, 이가 Fab-C 형식에서 일가 Fab 전시로 전환되었다. CH1 불변 도메인의 단부 및 gpIII 사이에 시스테인은 Kunkel 돌연변이유발을 이용하여 제거되었다. 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F1120-delCGRP (TGTGACAAAACTCACCTCAGTGGCGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAG) (서열 번호:101)는 1 μg의 1A10 또는 1F4 파지미드 Kunkel DNA와 합동되었다. 결과의 일가 Fab 파지미드는 IC50 ELISA를 위한 파지를 생산하는데 이용되었다.
D) 파지 IC 50 ELISA
1D8, 1E3, 1A10, 그리고 1F4에 대한 일가 Fab를 전시하는 파지는 선형 디유비퀴틴에 대한 상대적 친화성의 추정치를 얻기 위해 IC50 ELISA에서 조사되었다. 최초 역가 ELISA는 OD450 = 0.5의 신호가 달성되는 파지의 양을 결정하기 위해 수행되었다. 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem)은 96-웰 Maxisorb 면역평판 (NUNC) 상에 고정되었다. 선형 디유비퀴틴은 4℃에서 하룻밤 동안, 50 mM 탄산나트륨 완충액, pH 9.6에서 1 μg/mL로 코팅되었다. 코팅된 평판은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 200 μL/웰의 2.5% 우유로 차단되었다. OD268 = 4.0에서 OD268 = 0.002로 파지의 12가지 2-배 계단 희석액이 PBST에서 2.5% 우유에서 만들어졌다. 1시간 후, 차단 완충액이 평판으로부터 버려지고, 그리고 100 μL/웰의 각 파지 희석액이 첨가되고 진탕하면서, 25℃에서 15분 동안 배양되었다. 평판은 이후, 평판 세척기를 이용하여 PBST로 6회 세척되었다. PBST에서 항-M13 파지-HRP-접합된 이차 항체 (GE Healthcare)의 1:5000 희석액이 파지 결합의 검출에 이용되었다. 100 μL/웰의 이차 희석액이 첨가되고, 그리고 평판은 진탕하면서, 25℃에서 30분 동안 배양되었다. 평판은 이후, 평판 세척기를 이용하여 PBST로 12회 및 수동으로 PBS로 2회 세척되었다. 결합된 이차 항체는 TMB 기질 (KPL)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 동일 부피의 1 M 인산으로 진정되었다. 흡광도는 450 nm에서 판독되었다. OD450 = 0.5인 파지의 농도는 클론 1F4의 경우에 파지 OD268 = 1.0, 클론 1D8의 경우에 OD268 = 0.125, 그리고 클론 1E3의 경우에 OD268 = 0.5이었다. 클론 1A10의 경우에, 심지어 파지 OD268 = 4.0에서 OD450이 단지 0.376이었다. 이러한 결합은 매우 약하고, 따라서 클론 1A10은 더 이상 추적되지 않았다. 클론 1F4의 경우에 10 μM에서부터 5 nM까지 가용성 선형 디유비퀴틴의 2-배 계단 희석액 및 클론 1D8과 1E3의 경우에 10 μM에서부터 56 pM까지 가용성 선형 디유비퀴틴의 3-배 계단 희석액 + PBST에서 2.5% 우유에서 선별된 파지 농축액은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 배양되었다. 각 선형 디유비퀴틴 농도에서 결합되지 않은 파지의 양은 이후, 1 μg/mL 선형 디유비퀴틴으로 코팅되고 PBST에서 2.5% 우유로 차단된 96-웰 Maxisorb 면역평판과 함께, 혼합물을 배양함으로써 측정되었다. 파지/선형 디유비퀴틴 혼합물은 진탕하면서, 25℃에서 15분 동안 평판 상에서 배양되었다. 평판은 이후, 평판 세척기를 이용하여 PBST로 6회 세척되었다. PBST에서 항-M13 파지-HRP-접합된 이차 항체 (GE Healthcare)의 1:5000 희석액이 파지 결합의 검출에 이용되었다. 100 μL/웰의 이차 희석액이 첨가되고, 그리고 평판은 진탕하면서, 25℃에서 30분 동안 배양되었다. 평판은 이후, 평판 세척기를 이용하여 PBST로 12회 및 수동으로 PBS로 2회 세척되었다. 결합된 이차 항체는 TMB 기질 (KPL)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 동일 부피의 1 M 인산으로 진정되었다. 흡광도는 450 nm에서 판독되었다. 흡광도는 가용성 선형 디유비퀴틴 농도에 대해 플롯팅되고, 그리고 1F4의 경우에 IC50이 10 μM보다 크고 (도 3 참조), 1D8의 경우에 IC50이 5 μM에 근접하고 (도 3 참조), 그리고 1E3의 경우에 IC50이 80 nM (도 3 참조)라는 것을 보여준다.
E) Fab 생산
Fab 파지 전시 라이브러리로부터 유래된 클론은 대장균 (E. coli) 알칼리성 포스파타아제 (PhoA) 프로모터의 제어 하에 발현된다. 경쇄와 중쇄 둘 모두 대장균 (E. coli)에서 선별을 가능하게 하는 아미노-말단 박테리아 stII 신호 서열을 내포하고 단일 파지미드 벡터로부터 발현된다. 중쇄 카르복실 말단은 M13 박테리오파지의 유전자 산물 III (gpIII)의 C-말단에 인-프레임 (in-frame) 융합되고 파지 상에서 일가 Fab 단편의 전시를 허용한다. 가용성 Fab를 발현하기 위하여, 종결 코돈이 Fab의 CH1 불변 도메인의 단부 및 gpIII의 출발 지점 사이에서 1D8과 1E3 일가 파지미드 내로 도입되었다. 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드: 5'-FabdelzipTAA (CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAAAGTGGCGGTGGCTCTGGTTCCGGTG) (서열 번호:102) 및 3'-FabdelzipTAA (CACCGGAACCAGAGCCACCGCCACTTTATGTGTGAGTTTTGTCACAAGATTTGGG) (서열 번호:103)가 QuikChange® Lightning 특정부위 돌연변이유발 키트 (Agilent)를 이용하여 종결 코돈을 삽입하는데 이용되었다. 결과의 가용성 Fab 발현 플라스미드는 대장균 (E. coli) 균주 62A7 (Genentech) 내로 형질전환되고, 그리고 카르베니실린을 내포하는 고체 아가 상에 도말되었다. 단일 집락이 50 μg/mL 카르베니실린을 내포하는 25 mL의 2YT 액체배지를 접종하는데 이용되었다. 배양액은 37℃에서 하룻밤 동안 성장되고, 5 mL가 500 mL의 완전 C.R.A.P. 배지 (3.57 g (NH4)2SO4, 0.71 g 구연산나트륨 2H2O, 1.07 g KCl, 5.36 g 효모 추출물 (인증됨), 5.36 g Hycase SF (Sheffield), pH가 KOH의 첨가에 의해 7.3으로 조정되고, 그리고 부피가 초순수로 872 mL로 조정되고, 고압증기멸균되고, 55℃로 냉각되고, 여기에 (L당) 110 mL 1M MOPS pH 7.3, 11 mL 50% 글루코오스, 그리고 7 mL 1M MgSO4가 첨가됨)를 50 μg/mL 카르베니실린으로 접종하는데 이용되었다. 배양액은 진탕하면서, 30℃에서 24시간 동안 성장되었다. 세포는 원심분리에 의해 수확되고, 그리고 펠릿은 -20℃에서 보관되었다. Fab는 10 μg/mL DNaseI (Invitrogen), 0.2 mg/mL 리소자임 (USB), 그리고 1 mM 페닐메틸술포닐 불화물 (PMSF) (Calbiochem)을 내포하는 35 mL의 차가운 세척 완충액 (인산염 완충된 염수 (PBS) + 150 mM NaCl)에서 세포 펠릿을 재현탁함으로써 정제되었다. 이들 펠릿은 빠르게 와동함으로써 재현탁되었다. 완전한 용해를 허용하기 위해, 세포는 25℃에서 15분 동안 배양되었다. 세포 잔해물은 원심분리에 의해 펠릿화되고, 그리고 용해물은 차가운 세척 완충액으로 미리 평형화된 1 mL 단백질 A-세파로오스 (GE Healthcare) 칼럼 상에 부하되었다. 칼럼은 50 mL의 차가운 세척 완충액으로 세척되고, 3 mL의 0.1 M 아세트산으로 용리되고, 그리고 150 μL의 1 M Tris, pH 11.0로 중화되었다. Fab는 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 단위 (10 kDa 컷-오프, Millipore)를 이용하여 농축되었다. 결과의 Fab 농도는 분광광도법 (1 OD280 = 1.5 mg/mL)으로 측정되었다.
F) Fab 웨스턴 블롯
1D8과 1E3 Fab (실시예 1E로부터)는 웨스턴 블롯에서 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem), 모노유비퀴틴 (Boston Biochem), K11-연결된 디유비퀴틴 (Genentech), K48-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem), 그리고 K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)에 결합에 대해 조사되었다. 환원제를 포함하는 1X LDS 완충액 (Invitrogen)에서 1 μg의 각 단백질은 70℃에서 10분 동안 가열되고, 그리고 MES 완충액 (Invitrogen)에서 4-12% NuPAGE Bis Tris 1.0 mm 겔 상에 이중으로 이동되었다. 겔은 10% 메탄올과 1X NuPAGE 이전 완충액 (Invitrogen)에서 0.2 μm 니트로셀룰로오스 (Invitrogen)로의 습식 이전 (wet transfer)에 의해 30 V 상수에서 1.5시간 동안 이전되었다. 막 상에서 비-특이적 결합 부위는 진탕하면서, 25℃에서 1.5시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 배양에 의해 차단되었다. 막은 이후, 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 5 μg/mL의 1D8 또는 1E3 Fab에서 배양되었다. 막은 진탕하면서, PBST에서 3회 세척되었다. 이들 Fab는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 염소 항-인간 Fab 단편-특이적 HRP-접합된 이차 항체 (Sigma Aldrich)의 1:10000 희석액에서 막을 배양함으로써 검출되었다. 막은 이후, PBST에서 3회, 그 이후에 PBS에서 1회 세척되었다. 이차 항체는 Super Signal West Pico 화학발광 기질 (Thermo Scientific)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 필름에 대한 블롯의 노출이 수행되었다. 1E3 Fab는 선형 디유비퀴틴만 검출하고 모노유비퀴틴, K11-연결된 디유비퀴틴, K48-연결된 디유비퀴틴, 또는 K63-연결된 디유비퀴틴을 검출하지 못한다 (도 4 참조). 1D8 Fab는 웨스턴 블롯에 의해 어떤 형태의 유비퀴틴도 검출하지 못하였다 (도 4 참조).
G) 단리된 1D8과 1E3 Fab의 친화성 분석
1D8과 1E3 Fab (실시예 1E로부터)의 친화성은 BIACORE™ 3000 (GE Healthcare)을 이용한 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 분석되었다. 대략 120 공명 단위 (RUs)의 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem), K48-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)과 K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)은 제조업체에 의해 제공된 아민 커플링 프로토콜을 이용하여, CM5 칩의 유식 세포 2, 유식 세포 3, 그리고 유식 세포 4 상에 각각 고정되었다. 유식 세포 1은 활성화되고 고정화 단백질 없이 에탄올아민 차단되어, 참고 감산 (reference subtraction)에 이용되었다. 10 mM Hepes, pH 7.2, 150 mM NaCl, 그리고 0.01% Tween 20 (HBST)에서 1E3 Fab의 2-배 계단 희석액 (0.5-500 nM)은 HBST를 이동 완충액으로 이용하여 각 유식 세포 위에 주입되었다 (30 μL/분의 유속에서 60 μL 총량). 각 유식 세포에 대한 신호는 기록되고, 그리고 참고 신호는 감산되었다. 상이한 재생 조건이 조사되었다. 심지어 10 mM HCl에서도, 칩 표면은 기준선으로 완전하게 재생될 수 없었다. 10 mM 글리신, pH 1.7이 조사될 때, 이것은 칩 표면을 변화시키고 결합능을 감소시켰다.
대안적 접근법은 BIACORE™ 3000 (GE Healthcare) 상에서 Fab 포획 방법을 이용하여 조사되었다. 대략 11,000 공명 단위 (RUs)의 항-인간 Fab 포획 항체 (GE Healthcare)가 제조업체에 의해 공급된 아민 커플링 프로토콜을 이용하여 CM5 칩의 유식 세포 1과 2 상에 고정되었다. 10 mM Hepes, pH 7.2, 150 mM NaCl, 그리고 0.01% Tween 20 (HBST)에서 10 μL의 10 μg/mL Fab가 유식 세포 2 위에 10 μL/분의 유속으로 주입되고, 대략 430 RU의 Fab가 포획되었다. 유식 세포 1은 자기 위에서 포획 항체만을 갖고 참고 감산으로서 역할하였다. HBST에서 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem) 또는 K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)의 2-배 계단 희석액 (1-1000 nM)이 유식 세포 1과 2 위에 주입되었다 (30 μL/분의 유속에서 60 μL 총량). 각 유식 세포에 대한 신호가 기록되고, 그리고 참고 신호가 감산되었다. 4분의 해리 기간 이후에, 칩 표면은 30 μL/분의 유속에서 30 μL의 10 mM 글리신, pH 2.1의 2회 주입으로 재생되었다. 데이터는 임의의 결합 모델에 적합시키기 어려웠는데, 그 이유는 디유비퀴틴이 칩으로부터 완전하게 해리되지 않았기 때문이다. 이에 더하여, 결합 속도가 매우 빨랐고, 그리고 결합이 이용된 디유비퀴틴의 최고 농도에서도 안정 상태에 도달하지 못하였다. 이런 이유로, 이들 Fab에 대한 KD를 추정하는 것이 어렵다.
실시예 2 - 1F4, 1D8, 그리고 1E3의 친화성 성숙
A) 종결 주형 산출
TAA 종결 코돈이 Kunkel 돌연변이유발을 이용한 라이브러리 합성을 위해 CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H3, 또는 CDR L3과 H3 둘 모두 내로 별도로 삽입되었다 (각각, L1, L2, L3, H3, 그리고 L3/H3 종결 주형이 산출됨). 종결 코돈은 전장 Fab 발현과 파지 상에서 전시를 획득하기 위해 종결의 수복을 요구함으로써, 특정 CDR 루프 내에 다양성을 강제한다. 하기에 열거된 종결 코돈 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 1 μg의 상응하는 일가 파지미드 Kunkel DNA와 합동되었다. 결과의 일가 Fab 파지미드 종결 주형은 친화성 성숙 라이브러리 산출에 이용되었다.
클론 1D8과 1E3의 경우에, 경쇄의 CDR L1 내에 위치 24 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 CDR L1 종결 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 4D5LC1.종결 (GTCACCATCACCTGCTAAGCCAGTCAGGATGTG) (서열 번호:104)이었다. 클론 1D8과 1E3의 경우에, 경쇄의 CDR L2 내에 위치 50 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 CDR L2 종결 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 4D5LC2.종결 (GAAGCTTCTGATTTACTAAGCATCCTTCCTCTAC) (서열 번호:105)이었다. 클론 1D8과 1E3의 경우에, 경쇄의 CDR L3 내에 위치 89 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 CDR L3 종결 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 4D5LC3.종결 (GCAACTTATTACTGTTAACAATCTTATACTACTC) (서열 번호:106)이었다. 클론 1D8의 중쇄의 CDR H3 내에 위치 95 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 CDR H3 종결 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 VH3.1D8.H3종결 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTTAAGCCGGGTCCCGCTTGTTGTCG) (서열 번호:107)이었다. 클론 1E3의 중쇄의 CDR H3 내에 위치 98 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 CDR H3 종결 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 413Vh5SRo6 (GAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTGAGGCCTCGTAACTGCCCCCCTACGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTC) (서열 번호:108)이었다.
클론 1F4의 경우에, 경쇄의 CDR L1 내에 위치 27 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 CDR L1 종결 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 CLC.L1종결 (CATCACCTGCCGTGCCAGTTAATCCGTGTCCAGCGCTGTAG) (서열 번호:109)이었다. 클론 1F4의 경우에, 경쇄의 CDR L2 내에 위치 52 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 CDR L2 종결 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 CLC.L2종결 (CTTCTGATTTACTCGGCATAAAGCCTCTACTCTGGAGTC) (서열 번호:110)이었다. 클론 1F4의 경우에, 경쇄의 CDR L3 내에 위치 90 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 CDR L3 종결 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 CLC4.1F4.L3종결 (GCAACTTATTACTGTCAGTAATATTATTATTATTCTCCG) (서열 번호:111)이었다. 클론 1F4의 중쇄의 CDR H3 내에 위치 94 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 CDR H3 종결 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 CLC4.1F4.H3종결 (GCCGTCTATTATTGTGCTTAAGGTTACGTTTGGAAAGGTG) (서열 번호:112)이었다.
B) 친화성 성숙 라이브러리 산출
총 10개의 친화성 성숙 라이브러리가 각 클론 (1F4, 1D8, 그리고 1E3)에 대해 산출되었다. 모든 라이브러리는 Kunkel 돌연변이유발에 의해 산출되었다 (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985) 참조). 연성 무작위화의 경우에, 50%의 시간 동안 야생형 잔기가 유지되고 50%의 시간 동안 나머지 19개 아미노산 중에서 하나가 인코딩되는 축중성 올리고뉴클레오티드가 합성되었다. 연성 무작위화를 달성하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 일정한 뉴클레오티드 위치가 70%의 시간 동안 지정된 염기에 의해 점유되고 10%의 시간 동안 3가지 다른 염기 중에서 하나에 의해 점유되도록 설계되었다 (Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233 (1994)). 하기의 올리고뉴클레오티드의 경우에, 이런 연성 무작위화가 특정 염기에서 포함되는 경우에, 연성 무작위화의 존재는 상기 염기 위치에서 번호의 존재에 의해 지시된다. 번호 "5"는 염기 아데닌이 상기 위치에서 70%의 시간 동안 존재하고, 반면 염기 구아닌, 시토신, 그리고 티민은 각각 10%의 시간 동안 존재한다는 것을 지시한다. 유사하게, 번호 "6"은 구아닌을 지칭하고, "7"은 시토신을 지칭하고, 그리고 "8"은 티민을 지칭하는데, 여기서 각 경우에, 다른 3가지 염기 각각은 10%의 시간 동안만 존재한다. 경성 무작위화의 경우에, 축중성 올리고뉴클레오티드는 자연 인간 항체 내에 일정한 위치에서 발견되는 아미노산 다양성이 허용되도록 합성되었다. 이러한 경우에, 축중성 코돈이 이용되는데, 여기서 문자 "R"은 구아닌 또는 아데닌을 인코딩하고, "Y"는 티민 또는 시토신을 인코딩하고, "M"은 아데닌 또는 시토신을 인코딩하고, "K"는 구아닌 또는 티민을 인코딩하고, "S"는 구아닌 또는 시토신을 인코딩하고, "W"는 아데닌 또는 티민을 인코딩하고, "H"는 아데닌, 시토신, 또는 티민을 인코딩하고, "B"는 구아닌, 티민, 또는 시토신을 인코딩하고, "V"는 구아닌, 시토신, 또는 아데닌을 인코딩하고, "D"는 구아닌, 아데닌, 또는 티민을 인코딩하고, 그리고 "N"은 구아닌, 아데닌, 시토신, 또는 티민을 인코딩한다.
1F4에 대한 10개의 라이브러리가 산출되고 L1, L2, L3, L1/L2/L3, H3, L3/H3, L1/H2, L2/H1, H2/H3, 그리고 L3/H1/H2로 명명되었다. 1F4 L1 라이브러리는 경쇄의 위치 28 - 33 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. L1 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F111-L1 (ACCTGCCGTGCCAGTCAGRDTRKTRVWANWTHTGTAGCCTGGTATCAACAGAAAC) (서열 번호:113) 및 F202-L1 (ACCTGCCGTGCCAGTCAGRDTRKTRVWANWT HTCTGGCCTGGTATCAACAGAAAC) (서열 번호:114)는 1:2 비율에서 혼합되어 "L1 올리고 믹스"를 산출하고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해, 1F4 L1 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1F4 L2 라이브러리는 경쇄의 위치 50, 53, 그리고 55 (Kabat 넘버링)가, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. L2 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F201-L2 (CCGAAGCTTCTGATTTACKBGGCATCCAVCCTCTACTCTGGAGTCCCT) (서열 번호:115) 및 F203-L2 (CCGAAGCTTCTGATTTACKBGGCATCCAVCCTCGMATCTGGAGTCCCTTCTCGC) (서열 번호:116)는 1:1 비율에서 혼합되어 "L2 올리고 믹스"를 산출하고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1F4 L2 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1F4 L3 라이브러리는 경쇄의 위치 91 - 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F133a (GCAACTTA TTACTGTCAGCAATMTDMCRVTNHTCCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC) (서열 번호:117), F133b (GCAACTTATTACTGTCAGCAATMTDMCRVTNHTC CTTWTACGTTCGGACAGGGTACC) (서열 번호:118), F133c (GCAACTTATT ACTGTCAGCAASRTDMCRVTNHTCCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC) (서열 번호:119), F133d (GCAACTTATTACTGTCAGCAASRTDMCRVTNHTCCTT WTACGTTCGGACAGGGTACC) (서열 번호:120)는 1:1:1:1 비율에서 혼합되어 "L3 경성 올리고 믹스"를 산출하였다. 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F563-L3연성1 (ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCT777ACGTTCGGACAGGGTACC) (서열 번호:121), F564-L3연성2 (ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCTTWTACGT TCGGACAGGGTACC) (서열 번호:122), 그리고 F565-L3연성3 (ACTTATTACTGTCAGCAA 878857577577CCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC) (서열 번호:123)은 1:0.5:1 비율에서 혼합되어 "L3 연성 올리고 믹스"가 산출되었다. "L3 경성 올리고 믹스", "L3 연성 올리고 믹스", 그리고 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 1F4.L3 연성 (GCAACTTATTACTGTCAG CAA857857857857878CCG788ACGTTCGGACAGGGTACCAAG) (서열 번호:124)은 이후, 1:1:1 비율에서 혼합되어 "L3 전체 올리고 믹스"를 산출하고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1F4 L3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1F4 H3 라이브러리는 중쇄의 위치 95, 97, 99, 100, 그리고 100a (Kabat 넘버링)가 연성 무작위화되었다. 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 CLC.1F4.H3연성 (GACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGC668TAC688TGG555668678ATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC) (서열 번호:125)은 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1F4 H3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1F4 L3/H3 라이브러리는 경쇄의 위치 91 - 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 95, 97, 99, 100, 그리고 100a (Kabat 넘버링)가 연성 무작위화되었다. 전술한 "L3 전체 올리고 믹스" 및 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 CLC.1F4.H3연성 (서열 번호:126)은 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1F4 L3/H3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1F4 L1/H2 라이브러리는 경쇄의 위치 28 - 33 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 50, 52, 53, 54, 그리고 58 (Kabat 넘버링)이 연성 무작위화되었다. 전술한 "L1 올리고 믹스" 및 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 CLC4.1F4.H2연성 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCA878ATT857TCT857857AG CTATACT878TATGCCGATAGCGTCAAGGGCCG) (서열 번호:126)은 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1F4 L1 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1F4 L2/H1 라이브러리는 경쇄의 위치 50, 53, 그리고 55 (Kabat 넘버링)가, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 30 - 33 (Kabat 넘버링)이 연성 무작위화되었다. 전술한 "L2 올리고 믹스" 및 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 CLC4.1F4.H1연성 (GCAGCTTCTGGCTTCAACTTT857878857857ATGCACTGGGTGCGTCAGGCC) (서열 번호:127)은 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1F4 L2 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1F4 H2/H3 라이브러리는 중쇄의 위치 50, 52, 53, 54, 58, 95, 97, 99, 100, 그리고 100a (Kabat 넘버링)가 연성 무작위화되었다. 전술한 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 CLC4.1F4.H2연성 (서열 번호:126) 및 CLC4.1F4.H3연성 (서열 번호:125)은 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1F4 H3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1F4 L1/L2/L3 라이브러리는 경쇄의 위치 28 - 33, 50, 53, 그리고 55 (Kabat 넘버링)가, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 이것은 또한, 경쇄의 위치 91 - 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. "L1 올리고 믹스", "L2 올리고 믹스", 그리고 "L3 전체 올리고 믹스"는 1:1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1F4 L3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1F4 L3/H1/H2 라이브러리는 경쇄의 위치 91 - 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 30 - 33, 50, 52, 53, 54, 그리고 58 (Kabat 넘버링)이 연성 무작위화되었다. 전술한 "L3 전체 올리고 믹스", CLC4.1F4.H1연성 (서열 번호:127) 및 CLC4.1F4.H2연성 (서열 번호:126)은 1:1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1F4 L3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1D8에 대한 10개의 라이브러리가 산출되고 L1, L2, L3, L1/L2/L3, H3, L3/H3, L1/H2, L2/H1, H2/H3, 그리고 L3/H1/H2로 명명되었다. 1D8 L1 라이브러리는 경쇄의 위치 28 - 33 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 전술한 L1 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F111-L1 (서열 번호:113) 및 F202-L1 (서열 번호:114)은 1:2 비율에서 혼합되어 "L1 올리고 믹스"를 산출하고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1D8 L1 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1D8 L2 라이브러리는 경쇄의 위치 50, 53, 그리고 55 (Kabat 넘버링)가, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 전술한 L2 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F201-L2 (서열 번호:115) 및 F203-L2 (서열 번호:116)는 1:1 비율에서 혼합되어 "L2 올리고 믹스"를 산출하고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1D8 L2 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1D8 L3 라이브러리는 경쇄의 위치 91 - 94와 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. 전술한 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F133a (서열 번호:117), F133b (서열 번호:118), F133c (서열 번호:119), 그리고 F133d (서열 번호:120)는 1:1:1:1 비율에서 혼합되어 "L3 경성 올리고 믹스"를 산출하였다. 전술한 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F563-L3연성1 (서열 번호:121), F564-L3연성2 (서열 번호:122), 그리고 F565-L3연성3 (서열 번호:123)은 1:0.5:1 비율에서 혼합되어 "L3 연성 올리고 믹스"를 산출하였다. "L3 경성 올리고 믹스" 및 "L3 연성 올리고 믹스"는 이후, 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1D8 L3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1D8 H3 라이브러리는 중쇄의 위치 96 - 100c (Kabat 넘버링)가 연성 무작위화되었다. 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 VH3.1D8.H3연성 (GCCGTCTATTATTGTGCTCG TGAG678668878565788788878688ATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC) (서열 번호:128)은 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1D8 H3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1D8 L3/H3 라이브러리는 경쇄의 위치 91 - 94와 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 96 - 100c (Kabat 넘버링)가 연성 무작위화되었다. 전술한 "L3 연성 올리고 믹스", "L3 경성 올리고 믹스", 그리고 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 VH3.1D8.H3연성 (서열 번호:128)은 0.5:0.5:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1D8 L3/H3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1D8 L1/H2 라이브러리는 경쇄의 위치 28 - 33 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 50, 52, 53, 54, 그리고 58 (Kabat 넘버링)이 연성 무작위화되었다. 전술한 "L1 올리고 믹스" 및 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 VH3.1D8.H2연성 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCT668ATT878CCT857668 GGTTATACT657TATGCCGATAGCGTCAAGGGCCG) (서열 번호:129)은 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1D8 L1 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1D8 L2/H1 라이브러리는 경쇄의 위치 50, 53, 그리고 55 (Kabat 넘버링)가, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 30 - 33 (Kabat 넘버링)이 연성 무작위화되었다. 전술한 "L2 올리고 믹스" 및 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 VH3.1D8.H1연성 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTC577657857657ATTCACTGGGTGCGTCAGGCC) (서열 번호:130)은 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1D8 L2 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1D8 H2/H3 라이브러리는 중쇄의 위치 50, 52, 53, 54, 58, 그리고 96 - 100c (Kabat 넘버링)가 연성 무작위화되었다. 전술한 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 VH3.1D8.H2연성 (서열 번호:129) 및 VH3.1D8.H3연성 (서열 번호:128)은 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1D8 H3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1D8 L1/L2/L3 라이브러리는 경쇄의 위치 28 - 33, 50, 53, 그리고 55 (Kabat 넘버링)가, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 이것은 또한, 경쇄의 위치 91 - 94와 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. "L1 올리고 믹스", "L2 올리고 믹스", "L3 경성 올리고 믹스", 그리고 "L3 연성 올리고 믹스"는 1:1:0.5:0.5 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1D8 L3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1D8 L3/H1/H2 라이브러리는 경쇄의 위치 91 - 94와 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 30 - 33, 50, 52, 53, 54, 그리고 58 (Kabat 넘버링)이 연성 무작위화되었다. 전술한 "L3 경성 올리고 믹스", "L3 연성 올리고 믹스", VH3.1D8.H1연성 (서열 번호:130) 및 VH3.1D8.H2연성 (서열 번호:129)은 0.5:0.5:1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1D8 L3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
10개의 라이브러리가 1E3에 대해 산출되고 L1, L2, L3, L1/L2/L3, H3, L3/H3, L1/H2, L2/H1, H2/H3, 그리고 L3/H1/H2로 명명되었다. 1E3 L1 라이브러리는 경쇄의 위치 28 - 33 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 전술한 L1 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F111-L1 (서열 번호:113) 및 F202-L1 (서열 번호:114)은 1:2 비율에서 혼합되어 "L1 올리고 믹스"를 산출하고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 L1 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1E3 L2 라이브러리는 경쇄의 위치 50, 53, 그리고 55 (Kabat 넘버링)가, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 전술한 L2 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F201-L2 (서열 번호:115) 및 F203-L2 (서열 번호:116)는 1:1 비율에서 혼합되어 "L2 올리고 믹스"를 산출하고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 L2 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1E3 L3 라이브러리는 경쇄의 위치 91 - 94와 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. 전술한 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F133a (서열 번호:117), F133b (서열 번호:118), F133c (서열 번호:119), 그리고 F133d (서열 번호:120)는 1:1:1:1 비율에서 혼합되어 "L3 경성 올리고 믹스"를 산출하였다. 전술한 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 F563-L3연성1 (서열 번호:121), F564-L3연성2 (서열 번호:122), 그리고 F565-L3연성3 (서열 번호:123)은 1:0.5:1 비율에서 혼합되어 "L3 연성 올리고 믹스"를 산출하였다. "L3 경성 올리고 믹스" 및 "L3 연성 올리고 믹스"는 이후, 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 L3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1E3 H3 라이브러리는 중쇄의 위치 95, 97, 98, 99, 그리고 100a (Kabat 넘버링)가 연성 무작위화되었다. 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 VH4.1E3.H3연성 (GACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGT577TGG788788565TGG688ATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTG) (서열 번호:131)은 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 H3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1E3 L3/H3 라이브러리는 경쇄의 위치 91 - 94와 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 95, 97, 98, 99, 그리고 100a (Kabat 넘버링)가 연성 무작위화되었다. 전술한 "L3 연성 올리고 믹스", "L3 경성 올리고 믹스", 그리고 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 VH4.1E3.H3연성 (서열 번호:131)는 0.5:0.5:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 L3/H3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1E3 L1/H2 라이브러리는 경쇄의 위치 28 - 33 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 50, 52, 53, 54, 그리고 58 (Kabat 넘버링)이 연성 무작위화되었다. 전술한 "L1 올리고 믹스" 및 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 VH4.1E3.H2연성 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCT878ATT577CCT878878GGTTCTA CT657TATGCCGATAGCGTCAAGGGCCG) (서열 번호:132)는 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 L1 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1E3 L2/H1 라이브러리는 경쇄의 위치 50, 53, 그리고 55 (Kabat 넘버링)가, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 30 - 33 (Kabat 넘버링)이 연성 무작위화되었다. 전술한 "L2 올리고 믹스" 및 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 VH4.1E3.H1연성 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTC878558577857ATTAGCTGGGTGCGTCAGGCC) (서열 번호:133)은 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 L2 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1E3 H2/H3 라이브러리는 중쇄의 위치 50, 52, 53, 54, 58, 95, 97, 98, 99, 그리고 100a (Kabat 넘버링)가 연성 무작위화되었다. 전술한 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 VH4.1E3.H2연성 (서열 번호:132) 및 VH4.1E3.H3연성 (서열 번호:133)은 1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 H3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1E3 L1/L2/L3 라이브러리는 경쇄의 위치 28 - 33, 50, 53, 그리고 55 (Kabat 넘버링)가, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되었다. 이것은 또한, 경쇄의 위치 91 - 94와 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. "L1 올리고 믹스", "L2 올리고 믹스", "L3 경성 올리고 믹스", 그리고 "L3 연성 올리고 믹스"는 1:1:0.5:0.5 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 L3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
1E3 L3/H1/H2 라이브러리는 경쇄의 위치 91 - 94와 96 (Kabat 넘버링)이, 자연 인간 항체 내에 이들 위치에서 발견되는 아미노산 다양성을 허용하기 위해 경성 무작위화되거나, 또는 연성 무작위화되었다. 이것은 또한, 중쇄의 위치 30 - 33, 50, 52, 53, 54, 그리고 58 (Kabat 넘버링)이 연성 무작위화되었다. 전술한 "L3 경성 올리고 믹스", "L3 연성 올리고 믹스", VH4.1E3.H1연성 (서열 번호:133) 및 VH4.1E3.H2연성 (서열 번호:132)은 0.5:0.5:1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 L3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 2A에 설명됨).
돌연변이유발 반응물은 전기적격 XL1-Blue (Agilent) 대장균 (E. coli) 내로 전기천공되고, 그리고 진탕하면서, 37℃에서 45분 동안 25 mL의 SOC 배지에서 회수되었다. 라이브러리 크기를 결정하기 위해, 20 마이크로리터가 제거되고, 10-배 계단 희석액이 카르베니실린을 내포하는 고체 아가 평판 위에 도말되고, 그리고 37℃에서 하룻밤 동안 성장되었다. 남아있는 배양액은 50 μg/mL 카르베니실린 및 1x1010 파지/mL M13K07 보조 파지를 내포하는 500 mL의 2YT 액체배지로 이전되었다. 세포는 진탕하면서, 37℃에서 1시간 동안 감염되었다. 50 μg/mL의 카나마이신이 첨가되고, 그리고 배양액은 진탕하면서, 37℃에서 추가의 7시간 동안 성장되었다. 온도는 이후, 30℃로 변하고, 그리고 배양액은 추가의 22시간 동안 성장되었다. 라이브러리는 각각, 적어도 ~9.5 x 109 집락 형성 단위 (CFUs)를 내포하였다. 파지는 1/5 볼륨의 20% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)/2.5M NaCl로 2 라운드의 침전에 의해, 배양 상층액으로부터 정제되었다.
C) 친화성 성숙 라이브러리 분류
1F4, 1D8, 그리고 1E3 친화성 성숙 라이브러리는 4 라운드의 분류를 겪었다. 10개의 하위-라이브러리 각각은 첫 번째 라운드의 경우에 병렬로 분류되고, 이후 분류 2 내지 4 동안 모아졌다. 첫 번째 라운드는 96-웰 Maxisorb 면역평판 (NUNC) 상에 고정된 선형 디유비퀴틴을 이용한 평판-기초된 분류이었다. 평판은 4℃에서 하룻밤 동안, 50 mM 탄산나트륨 완충액, pH 9.6에서 5 μg/mL 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem)으로 코팅되었다. 코팅된 평판은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 0.05% Tween 20을 내포하는 PBS (PBST)에서 200 μL/웰의 2.5% 우유에 의해 차단되었다. 파지 라이브러리는 PBST에서 2.5% 우유에서 OD = 2.0으로 희석되고, 그리고 30 μg/mL의 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem)이 반대 선별을 위해 첨가되었다. 1시간 후, 차단 완충액이 평판으로부터 버려지고, 100 μL/웰의 파지가 첨가되고, 그리고 진탕하면서, 25℃에서 3시간 동안 배양되었다. 결합 후, 평판은 웰을 수동으로 채우고 세척 간에 완충액을 버림으로써 PBST로 20회 세척되었다. 파지는 진탕하면서, 25℃에서 30분 동안 150 μL/웰의 50 mM HCl/500 mM KCl로 용리되었다. 용리액은 150 μL/웰의 1 M Tris, pH 7.5로 중화되고, 그리고 M13K07 보조 파지의 첨가로 XL1-Blue (Agilent) 대장균 (E. coli)에서 차후 증식되었다.
증폭된 파지는 평판-기초된 분류에서 선형 디유비퀴틴에 대한 선별의 추가의 라운드에 이용되었다. 용액-기초된 분류는 가능하지 않았는데, 그 이유는 선형 디유비퀴틴의 비오틴화가 Fab 결합을 간섭했기 때문이다. 후자 분류의 엄밀도는 3가지 방식으로 증가되었다: 반대 선별을 위해, 30 μg/mL 가용성 모노유비퀴틴, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7을 파지에 첨가함으로써; 평판 세척의 횟수와 지속 기간을 증가시킴으로써; 그리고 이용된 파지의 양 및 파지 결합의 지속 기간을 감소시킴으로써. 두 번째 분류는 첨가된 가용성 유비퀴틴이 상기 열거된 사슬을 포함하도록 확대되고, 이용된 파지의 양이 OD268 = 1.0이고, 파지 결합의 지속 기간이 2시간으로 감소되고, 그리고 평판 세척의 횟수가 30으로 증가된 점을 제외하고, 첫 번째 분류와 정확하게 동일하게 수행되었다. 세 번째 분류는 파지 결합의 지속 기간이 1.5시간으로 감소되고, 그리고 평판 세척의 횟수가 40회로 증가되고, 그 이후에 진탕하면서, 25℃에서 각각 15분의 추가 4회 세척이 수행되고, 각 15분 세척 간에 5회 빠른 세척이 수행되는 점을 제외하고, 두 번째 분류와 정확하게 동일하게 수행되었다. 네 번째 분류는 이용된 파지의 양이 OD268 = 0.5로 감소되고, 파지 결합의 지속 기간이 1시간으로 감소되고, 그리고 세척이 40회 빠른 세척, 그 이후에 진탕하면서, 37℃에서 4회 15분 세척을 포함하는 점을 제외하고, 세 번째 분류와 정확하게 동일하게 수행되었다. 농화는 코팅되지 않은 웰과 비교하여 선형 디유비퀴틴으로 회수된 파지의 숫자를 비교함으로써 라운드 2 내지 4 동안 계산되었다. 농화는 3가지 라이브러리 모두에 대해 라운드 2 내지 4에서 관찰되었다 (표 3 참조).
라이브러리 라운드 2 라운드 3 라운드 4
1F4 AM 143X 500X 5000X
1D8 AM 850X 1400X 5500X
1E3 AM 45X 167X 60X
4 라운드의 분류 후, 96개의 개별 클론이 1F4 세 번째 라운드 분류, 1D8 두 번째 라운드 분류, 1D8 세 번째 라운드 분류, 1D8 네 번째 라운드 분류, 그리고 1E3 세 번째 라운드 분류로부터 선택되고, 그리고 50 μg/mL 카르베니실린 및 1x1010 파지/mL M13K07 보조 파지를 내포하는 1 mL의 2YT 액체배지에서 96-웰 판형에서 성장되었다. 이들 배양액으로부터 상층액은 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem), 모노유비퀴틴 (Boston Biochem), K11-연결된 디유비퀴틴 (Genentech), K48-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem), K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem), 항-gD 항체 (Genentech), 또는 코팅되지 않은 웰 (실시예 1B에서 설명된 바와 같음)에 결합에 대한 고처리량 파지 스팟 ELISA에서 이용되었다. 1F4 세 번째 라운드 분류로부터, 모든 클론은 0.4 이하의 OD450을 보이는 매우 약한 선형 디유비퀴틴 접합제이고, 따라서 추적되지 않았다. 1D8 두 번째 라운드 분류로부터, 클론 중에서 93개는 선형 디유비퀴틴-특이적이었지만, 염기서열분석은 모두가 부모 야생형 1D8 서열이라는 것을 드러냈다. 1D8 세 번째 라운드 분류로부터, 클론 중에서 48개는 선형 디유비퀴틴-특이적이었지만, 염기서열분석은 2개를 제외한 모두가 부모 야생형 1D8 서열이라는 것을 드러냈다. 이들 2개의 비-부모 클론 1D8.3C2 (서열 번호: 33과 36) 및 1D8.3F8 (서열 번호: 34와 37) (도 5A와 5B 참조)은 실시예 1D에서처럼 파지 IC50 ELISA에 의해 조사되고, 그리고 1D8보다 단지 약간 향상된, 선형 디유비퀴틴에 대한 낮은 μM 범위에서 IC50을 갖는 것으로 증명되었다 (도 6 참조). 1D8 네 번째 라운드 분류로부터, 클론 중에서 94개는 선형 디유비퀴틴과 K63-연결된 디유비퀴틴 둘 모두에 강한 결합 (선형의 경우에 1.0 이상의 OD450, K63의 경우에 0.5 이상의 OD450)을 보이고, 따라서 추적되지 않았다. 단지 하나의 클론, 1D8.4F5 (서열 번호: 35와 38) (도 5A와 5B 참조)만 강한 선형 디유비퀴틴 결합을 보이고 K63-연결된 디유비퀴틴 결합을 거의 보이지 않았다 (OD450 ~1.3, K63의 경우에 OD450 ~ 0.1). 1D8.4F5에 대한 파지 IC50 역시 실시예 1D에서와 같이 ELISA에 의해 측정되고, 그리고 부모 클론 1D8보다 약간 나은 ~ 2 μM인 것으로 결정되었다 (도 6 참조). 1E3 세 번째 라운드 분류로부터, 클론 중에서 33개가 선형 디유비퀴틴-특이적이었지만, 이들 모두 매우 약한 접합제 (0.5 이하의 OD450)이고, 따라서 추적되지 않았다. 추가의 27개 클론은 선형 디유비퀴틴에 더욱 강한 결합 (0.5 이상, 하지만 1.0 이하의 OD450)을 보였지만, 이들은 또한, K63-연결된 디유비퀴틴에 증가된 결합 (0.1 이상의 OD450)을 보이고, 따라서 추적되지 않았다.
실시예 3 - 1E3의 두 번째 친화성 성숙
A) 종결 주형 산출
TAA 종결 코돈이 Kunkel 돌연변이유발을 이용한 라이브러리 합성을 위해 CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2, 그리고 CDR H3 내로 별도로 삽입되었다 (각각, L1, L2, L3, H1, H2, 그리고 H3 종결 주형이 산출됨). 종결 코돈은 전장 Fab 발현과 파지 상에서 전시를 획득하기 위해 종결의 수복을 요구함으로써, 특정 CDR 루프 내에 다양성을 강제한다. 하기에 열거된 종결 코돈 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 1 μg의 1E3 일가 파지미드 Kunkel DNA와 합동되었다. 결과의 일가 Fab 파지미드 종결 주형은 친화성 성숙 라이브러리 산출에 이용되었다.
1E3 경쇄의 CDR L1 내에 위치 31 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 E3.L1종결 (GCCAGTCAGGATGTG TCCTAAGCTGTAGCCTGGTATCAAC) (서열 번호:134)이었다. 1E3 경쇄의 CDR L2 내에 위치 53 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 E3.L2종결 (CTGATTTACTCGGCATCCTAACTCTACTCTGGAGTCCCTTC) (서열 번호:135)이었다. 1E3 경쇄의 CDR L3 내에 위치 93 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 E3.L3종결 (CTTATTACT GTCAGCAATCTTATTAAACTCCTCCCACGTTCGGACAG) (서열 번호:136)이었다. 1E3 경쇄의 CDR H1 내에 위치 32 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 E3.H1종결 (GGCTTCACCTTC AGTAATTAATATATTAGCTGGGTGCGTC) (서열 번호:137)이었다. 1E3 경쇄의 CDR H2 내에 위치 54 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 E3.H2종결 (GTTGCTTCTATTACTCCTTAAAGCGGTTCTACTGACTATG) (서열 번호:138)이었다. 1E3 경쇄의 CDR H3 내에 위치 99 (Kabat 넘버링)에서 TAA 종결 코돈을 삽입하는데 이용된 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드는 E3.H3종결 (GCTCGTACCTGGTTGCTCTAATGGGTTATGGACTACTGG) (서열 번호:139)이었다.
B) 단일 위치 NNK 라이브러리 산출
1F4와 1D8의 친화성 성숙에서 첫 번째 시도가 낮은 μM 범위에 있는 IC50으로 친화성에서 단지 보통 정도의 향상을 유발했기 때문에, 80 nM의 출발 IC50을 갖는 클론 1E3이 집중되었다. 1E3 친화성 성숙에서 첫 번째 시도는 선형과 K63-연결된 디유비퀴틴 둘 모두에 강한 결합을 보이는 많은 클론을 생산하였다. 이런 이유로, 단일 클론 내로 함입된 돌연변이의 숫자를 제한함으로써, K63-연결된 디유비퀴틴 결합을 최소화시키는 상이한 접근법이 채택되었다. 단일 아미노산 변화를 하나의 CDR 내로 한 번에 함입하기 위해 단일 위치 NNK 무작위화가 이용되었다. L1, L2, L3, H1, H2, 그리고 H3으로 명명된 6개의 단일 CDR 라이브러리가 산출되었는데, 여기서 임의의 한 클론 내에 단일 잔기는 야생형 잔기를 유지하거나, 또는 다른 19개 아미노산 중에서 한 가지로 변하도록 허용되었다.
L1 라이브러리는 경쇄의 위치 28 - 34 (Kabat 넘버링)가, 20개 아미노산 모두를 허용하기 위해 NNK 코돈을 이용하여 개별적으로 경성 무작위화되었다. L1 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드
E3.L1.1 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGNNKGTGTCCACTGCTG TAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGG) (서열 번호:140),
E3.L1.2 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATNNKTCCACTGCTGTAGCCTGGTATC AACAGAAACCAGG) (서열 번호:141),
E3.L1.3 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGNNKACTGCTGTAGCCTGGTATCA ACAGAAACCAGG) (서열 번호:142),
E3.L1.4 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCNNKGCTGTAGCCTGGTATCAA CAGAAACCAGG) (서열 번호:143),
E3.L1.5 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCACTNNKGTAGCCTGGTATCA ACAGAAACCAGG) (서열 번호:144),
E3.L1.6 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCACTGCTNNKGCCTGGTATCAA CAGAAACCAGG) (서열 번호:145), 그리고
E3.L1.7 (CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCACTGCTGTANNKTGGTATCAA CAGAAACCAGG) (서열 번호:146)은 1:1:1:1:1:1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 L1 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 3A에서 설명됨).
L2 라이브러리는 경쇄의 위치 50 - 56 (Kabat 넘버링)이, 20개 아미노산 모두를 허용하기 위해 NNK 코돈을 이용하여 개별적으로 경성 무작위화되었다. L2 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드
E3.L2.1 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACNNKGCATCCTTCCTCTACTCTG GAGTCCCTTCTCGCTTCTCTG) (서열 번호:147),
E3.L2.2 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGNNKTCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (서열 번호:148),
E3.L2.3 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCANNKTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (서열 번호:149),
E3.L2.4 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCNNKCTCTACTCTGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (서열 번호:150),
E3.L2.5 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCNNKTACTCTGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (서열 번호:151),
E3.L2.6 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCNNKTCTGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (서열 번호:152), 그리고
E3.L2.7 (GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACNNKGGAGTCCCTT CTCGCTTCTCTG) (서열 번호:153)은 1:1:1:1:1:1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 L2 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 3A에서 설명됨).
L3 라이브러리는 경쇄의 위치 91 - 96 (Kabat 넘버링)이, 20개 아미노산 모두를 허용하기 위해 NNK 코돈을 이용하여 개별적으로 경성 무작위화되었다. L3 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드
E3.L3.1 (GCAACTTATTACTGTCAGCAANNKTATACTACTCCTCCCACG TTCGGACAGGGTACCAAG) (서열 번호:154),
E3.L3.2 (GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTNNKACTACTCCTCCCACGTTCGGACA GGGTACCAAG) (서열 번호:155),
E3.L3.3 (GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTATNNKACTCCTCCCACGTTCGGACA GGGTACCAAG) (서열 번호:156),
E3.L3.4 (GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTATACTNNKCCTCCCACGTTCGGACA GGGTACCAAG) (서열 번호:157),
E3.L3.5 (GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTATACTACTNNKCCCACGTTCGGACA GGGTACCAAG) (서열 번호:158), 그리고
E3.L3.6 (GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTATACTACTCCTNNKACGTTCGGACA GGGTACCAAG) (서열 번호:159)는 1:1:1:1:1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 L3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 3A에서 설명됨).
H1 라이브러리는 중쇄의 위치 30 - 35 (Kabat 넘버링)가, 20개 아미노산 모두를 허용하기 위해 NNK 코돈을 이용하여 개별적으로 경성 무작위화되었다. H1 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드
E3.H1.1 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCNNKAATACTTATATTAGCT GGGTGCGTCAGGCCCCG) (서열 번호:160),
E3.H1.2 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTNNKACTTATATTAGCTGGGTGCG TCAGGCCCCG) (서열 번호:161),
E3.H1.3 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAATNNKTATATTAGCTGGGTGCG TCAGGCCCCG) (서열 번호:162),
E3.H1.4 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAATACTNNKATTAGCTGGGTGCG TCAGGCCCCG) (서열 번호:163),
E3.H1.5 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAATACTTATNNKAGCTGGGTGCG TCAGGCCCCG) (서열 번호:164), 그리고
E3.H1.6 (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAATACTTATATTNNKTGGGTGCG TCAGGCCCCG) (서열 번호:165)은 1:1:1:1:1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 H1 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 3A에서 설명됨).
H2 라이브러리는 중쇄의 위치 49 - 58 (Kabat 넘버링)이, 20개 아미노산 모두를 허용하기 위해 NNK 코돈을 이용하여 개별적으로 경성 무작위화되었다. H2 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드
E3.H2.1 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTNNKTCTATTACTCCTTCTAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (서열 번호:166),
E3.H2.2 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTNNKATTACTCCTTCTAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (서열 번호:167),
E3.H2.3 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTNNKACTCCTTCTAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (서열 번호:168),
E3.H2.4 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTNNKCCTTCTAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (서열 번호:169),
E3.H2.5 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTNNKTCTAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (서열 번호:170),
E3.H2.6 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTNNKAGCGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (서열 번호:171),
E3.H2.7 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTNNKGGTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (서열 번호:172),
E3.H2.8 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGCNNKTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (서열 번호:173),
E3.H2.9 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGCGGTNNKACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (서열 번호:174),
E3.H2.10 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGCGGTTCTNNKG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (서열 번호:175), 그리고
E3.H2.11 (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGCGGTTCTACT NNKTATGCCGATAGCGTCAAGGGC) (서열 번호:176)은 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 H2 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 3A에서 설명됨).
H3 라이브러리는 중쇄의 위치 95 - 102 (Kabat 넘버링)가, 20개 아미노산 모두를 허용하기 위해 NNK 코돈을 이용하여 개별적으로 경성 무작위화되었다. H3 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드
E3.H3.1 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTNNKTGGTTGCTCCGGTGGGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (서열 번호:177),
E3.H3.2 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCNNKTTGCTCCGGTGGGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (서열 번호:178),
E3.H3.3 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGNNKCTCCGGTGGGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (서열 번호:179),
E3.H3.4 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGNNKCGGTGGGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (서열 번호:180),
E3.H3.5 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCNNKTGGGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (서열 번호:181),
E3.H3.6 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGNNKGTTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (서열 번호:182),
E3.H3.7 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGNNKATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (서열 번호:183),
E3.H3.8 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGGTTNNKGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (서열 번호:184),
E3.H3.9 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGGTTATGNNKTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (서열 번호:185), 그리고
E3.H3.10 (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGGTTATGGACNNKT GGGGTCAAGGAACCCTGGTC) (서열 번호:186)는 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1 비율에서 혼합되고, 그리고 Kunkel 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 산출하기 위해 1E3 H3 종결 주형의 20 μg의 Kunkel DNA와 합동되었다 (실시예 3A에서 설명됨).
돌연변이유발 반응물은 전기적격 XL1-Blue (Agilent) 대장균 (E. coli) 내로 전기천공되고, 그리고 진탕하면서, 37℃에서 45분 동안 25 mL의 SOC 배지에서 회수되었다. 라이브러리 크기를 결정하기 위해, 20 마이크로리터가 제거되고, 10-배 계단 희석액이 카르베니실린을 내포하는 고체 아가 평판 위에 도말되고, 그리고 37℃에서 하룻밤 동안 성장되었다. 남아있는 배양액은 50 μg/mL 카르베니실린 및 1x1010 파지/mL M13K07 보조 파지를 내포하는 500 mL의 2YT 액체배지로 이전되었다. 세포는 진탕하면서, 37℃에서 1시간 동안 감염되었다. 50 μg/mL의 카나마이신이 첨가되고, 그리고 배양액은 진탕하면서, 37℃에서 추가의 7시간 동안 성장되었다. 온도는 이후, 30℃로 변하고, 그리고 배양액은 추가의 22시간 동안 성장되었다. 라이브러리는 각각, 적어도 ~1.5 x 1010 집락 형성 단위 (CFUs)를 내포하였다. 파지는 1/5 볼륨의 20% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)/2.5M NaCl로 2 라운드의 침전에 의해, 배양 상층액으로부터 정제되었다.
6개 라이브러리 각각으로부터 64개의 개별 클론은 라이브러리 내에 아미노산 다양성이 설계를 정확하게 반영하는 지를 담보하기 위해 염기서열분석되었다. 이들 라이브러리 모두 지정된 바와 같았다.
C) 친화성 성숙 라이브러리 분류
6개의 CDR NNK 친화성 성숙 라이브러리는 선형 디유비퀴틴 또는 K63-연결된 디유비퀴틴에 대해 병렬로 3 라운드의 분류를 겪었다. 평판은 4℃에서 하룻밤 동안, 50 mM 탄산나트륨 완충액, pH 9.6에서 5 μg/mL 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem) 또는 K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)으로 코팅되었다. 코팅된 평판은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 0.05% Tween 20을 내포하는 PBS (PBST)에서 200 μL/웰의 2.5% 우유로 차단되었다. 파지 라이브러리는 PBST에서 2.5% 우유에서 OD = 1.0으로 희석되었다. 1시간 후, 차단 완충액이 평판으로부터 버려지고, 그리고 100 μL/웰의 파지가 첨가되고 진탕하면서, 25℃에서 1.5시간 동안 배양되었다. 결합 후, 평판은 웰을 수동으로 채우고 세척 간에 완충액을 버림으로써 PBST로 10회 세척되었다. 파지는 진탕하면서, 25℃에서 30분 동안 100 μL/웰의 50 mM HCl/500 mM KCl로 용리되었다. 용리액은 100 μL/웰의 1 M Tris, pH 7.5로 중화되고, 그리고 M13K07 보조 파지의 첨가로 XL1-Blue (Agilent) 대장균 (E. coli)에서 차후 증식되었다.
증폭된 파지는 평판-기초된 분류에서 선형 디유비퀴틴 또는 K63-연결된 디유비퀴틴에 대한 선별의 추가의 라운드에 이용되었다. 용액-기초된 분류는 가능하지 않았는데, 그 이유는 선형 디유비퀴틴의 비오틴화가 1E3 Fab 결합을 간섭했기 때문이다. 후자 분류의 엄밀도는 2가지 방식으로 증가되었다: 평판 세척의 횟수와 지속 기간을 증가시킴으로써; 그리고 이용된 파지의 양 및 파지 결합의 지속 기간을 감소시킴으로써. 두 번째 분류는 이용된 파지의 양이 OD268 = 0.5이고, 그리고 평판 세척의 횟수가 21로 증가되고 최종 세척액이 진탕하면서, 25℃에서 5분 동안 배양된 점을 제외하고, 첫 번째 분류와 정확하게 동일하게 수행되었다. 세 번째 분류는 파지 결합의 지속 기간이 1시간으로 감소되고, 그리고 평판 세척의 횟수가 30회로 증가된 점을 제외하고, 두 번째 분류와 정확하게 동일하게 수행되었다. 선형 디유비퀴틴 분류의 경우에, 이것은 그 이후에 진탕하면서, 25℃에서 각각 15분의 추가 4회 세척이 수행되고, 각 15분 세척 간에 5회 빠른 세척이 수행되었다. 그 다음, 진탕하면서 25℃에서 1시간 세척이 수행되고, 그 이후에 5회 빠른 세척이 수행되었다. 농화는 코팅되지 않은 웰과 비교하여 선형 디유비퀴틴 또는 K63-연결된 디유비퀴틴으로 회수된 파지의 숫자를 비교함으로써 라운드 2와 3 동안 계산되었다. 강한 농화는 선형 디유비퀴틴에 대하여 분류된 6개 라이브러리 모두에 대해 라운드 2와 3 동안 관찰되었고, K63-연결된 디유비퀴틴의 경우에 단지 보통 정도의 농화만 관찰되었다 (표 4 참조).
라이브러리 선형 diUb
라운드 2 		선형 diUb
라운드 3 		K63 diUb
라운드 2 		K63 diUb
라운드 3
L1 10,000X 1,000X 0X 3-5X
L2 10,000X 1,000X 0X 3-5X
L3 10,000X 1,000X 0X 3-5X
H1 10,000X 1,000X 0X 3-5X
H2 10,000X 1,000X 0X 10X
H3 10,000X 1,000X 0X 10X
3 라운드의 분류 후, 64개의 개별 클론이 선형 디유비퀴틴 두 번째 라운드 분류, 선형 디유비퀴틴 세 번째 라운드 분류, 그리고 K63-연결된 디유비퀴틴 세 번째 라운드 분류로부터 6개 라이브러리 각각에 대해 선택되고, 그리고 50 μg/mL 카르베니실린 및 1x1010 파지/mL M13K07 보조 파지를 내포하는 1 mL의 2YT 액체배지에서 96-웰 판형에서 성장되었다. 이들 배양액으로부터 상층액은 1 μg/mL 코팅된 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem), K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem), 항-gD 항체 (Genentech), 또는 앞서 설명된 바와 같은 코팅되지 않은 웰 (실시예 1B)에 결합에 대한 고처리량 파지 스팟 ELISA에서 이용되었다. 이들 클론의 가변 도메인 역시 염기서열분석되었다 (표 5 - 선형 디유비퀴틴 및 표 6 - K63-연결된 디유비퀴틴 참조). H3 클론의 염기서열분석은 T110A 돌연변이가 일부 클론에서, 의도된 돌연변이에 추가하여, 라이브러리 설계에서 무작위화를 위해 표적된 영역의 외부에 존재한다는 것을 드러냈다. 이것은 아마도, 올리고뉴클레오티드 합성 오류 또는 돌연변이유발 오류에 기인한다.
D) 단일 스팟 경쟁 파지 ELISA
단일 스팟 경쟁 파지 ELISA는 어떤 클론이 부모 1E3 클론과 비교하여 선형 디유비퀴틴에 대한 친화성에서 최대 향상을 갖는 지를 결정하기 위해 수행되었다. 파지 스팟 ELISA (실시예 3C)로부터 파지 상층액이 이용되었다. 경쟁 ELISA는 파지 상층액이 정제된 파지 대신에 이용되고, 그리고 단지 단일 농도 (25 nM)의 가용성 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem)이 이용된 점을 제외하고, IC50 ELISA (실시예 1D)에 대해 설명된 바와 같이 수행되었다. 경쟁은 또한, 임의의 경쟁 항원의 부재에서 파지 결합 신호를 결정하기 위해, 임의의 가용성 선형 디유비퀴틴의 첨가 없이 각 클론에 대해 수행되었다. 25 nM 선형 디유비퀴틴의 존재에서 결합에서 저해 퍼센트는 [1-(25 nM 선형에 대한 OD450/선형 없음에 대한 OD450)] x 100%로서 계산되었다. 1E3 부모 클론은 25 nM 선형 디유비퀴틴의 존재에서 20% 내지 75% 저해 범위에서 결합의 가변적인 저해 퍼센트를 보였다 (표 5 참조). 이것은 임의의 경쟁 가용성 선형 디유비퀴틴의 부재에서 선형 디유비퀴틴에 결합에 대한 OD450에서 가변성에 기인하였다. 60 퍼센트 저해 또는 그 이상을 보이는 클론 또는 선형 디유비퀴틴 분류에서 여러 번 단리된 클론은 파지 IC50 ELISA에 의한 추가 분석을 위해 선별되었다.
하기 표 5는 선형 디유비퀴틴에 대하여 각각, 1E3 L1, L2, L3, H1, H2와 H3 NNK 라이브러리의 분류로부터 단리된 클론으로부터 CDR L1, L2, L3, H1, H2와 H3 서열을 도시한다. 또한, 25 nM 가용성 선형 디유비퀴틴의 존재와 부재에서 경쟁 스팟 ELISA로부터 OD450 신호가 도시된다. 25 nM 선형 디유비퀴틴의 존재에서 결합에서 저해 퍼센트는 [1-(25 nM 선형에 대한 OD450/선형 없음에 대한 OD450)] x 100%로서 계산되었다. 하기 표 6은 K63-연결된 디유비퀴틴에 대하여 각각, 1E3 L1, L2, L3, H1, H2와 H3 NNK 라이브러리의 분류로부터 단리된 클론으로부터 CDR L1, L2, L3, H1, H2와 H3 서열을 도시한다.
표 5는 CDR L1 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 1, 56, 199, 200, 200, 57, 201, 202, 202, 203, 204, 204-207, 207, 208, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 209, 209, 54, 54, 54, 54, 210, 55, 55, 53, 211, 212, 212, 212-214, 52, 52, 215, 215, 215, 216, 216, 217, 217, 217, 218, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1 및 1로서 개시한다. 표 5는 CDR L2 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 2, 59, 59, 58, 58, 58, 219, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 220, 220, 220, 220, 221, 221-223, 223-226, 226, 226, 62, 227, 228, 228, 229, 61, 61, 230-233, 233-237, 237, 238, 238, 238, 239, 239, 239, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2 및 2로서 개시한다. 표 5는 CDR L3 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 3, 6, 6, 240, 240, 240-242, 66, 66, 66, 66, 243, 68, 244, 244-247, 247, 248, 248, 248, 70, 64, 64, 64, 64, 249, 250, 250, 71, 71, 251, 72, 72, 72, 72, 72, 72, 72, 69, 65, 65, 65, 252, 252, 252, 252, 252, 67, 67, 67, 67, 67, 67, 67, 67, 253, 3, 3, 3, 3 및 254로서 개시한다. 표 5는 CDR H1 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 255, 256, 73, 79, 79, 257, 257, 75, 75, 75, 75, 77, 77, 77, 77, 77, 77, 77, 258, 258, 259, 81, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 78, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 80, 80, 80, 260, 260, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255 및 255로서 개시한다. 표 5는 CDR H2 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 8, 17, 84, 261, 261, 261, 261, 261-263, 85, 83, 83, 264, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 86, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8 및 8로서 개시한다. 표 5는 CDR H3 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 265-269, 269, 270-273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 274, 274, 274, 274, 274-278, 278, 278, 278-281, 281, 282, 282, 282, 282, 265, 265, 265, 265, 265, 265 및 265로서 개시한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008

표 6은 CDR L1 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 1, 283, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 284, 54, 285, 285-288, 55, 55, 55, 53, 289, 289, 290, 290, 290, 290, 290, 290-294, 327, 295, 295, 295, 295-297, 297, 1, 1, 1, 1, 1, 1 및 1로서 개시한다. 표 6은 CDR L2 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 2, 298, 299, 60, 60, 300, 302-305, 305-307, 307, 307-309, 309, 309, 310, 310-314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 315, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2 및 2로서 개시한다. 표 6은 CDR L3 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 3, 6, 6, 6, 6, 6, 316-318, 318, 319, 66, 66, 320, 321, 321, 321, 321-324, 324, 324, 325, 301, 326, 301, 326, 382, 328, 328, 329, 64, 64, 330, 330, 331, 331, 331, 331, 331, 71, 71, 71, 71, 71, 71, 332, 69, 333, 333, 67, 67, 67, 67, 67, 334, 334, 334, 335, 335, 335, 3, 3, 3 및 3으로서 개시한다. 표 6은 CDR H1 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 255, 336, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337-340, 340-343, 343, 343, 343, 343, 343, 344, 344, 344, 344, 344, 344, 81, 81, 81, 81, 81, 81, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76 및 255로서 개시한다. 표 6은 CDR H2 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 8, 346, 347, 345, 348, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349-351, 351, 351, 351, 352, 352, 352, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 354, 8, 8, 8, 8, 8 및 8로서 개시한다. 표 6은 CDR H3 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 355-358, 358, 359, 359-362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362-367, 355, 355, 355, 355, 355, 355, 355, 355, 355 및 355로서 개시한다. "O"는 황토색 종결 TAA이고, 그리고 "q"는 호박색 종결 태그이고, 이것은 예로서, 억제자 tRNA 세포주의 이용으로 Gln (Q)에 의해 대체될 수 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014

E) 파지 IC 50 ELISA
L1 라이브러리로부터 8개 클론, L2 라이브러리로부터 6개 클론, L3 라이브러리로부터 9개 클론, H1 라이브러리로부터 9개 클론, H2 라이브러리로부터 5개 클론, 그리고 H3 라이브러리로부터 7개 클론은 실시예 1D에서 설명된 바와 같이 파지 IC50 ELISA에서 조사되었다. 500 nM에서부터 0.23 nM까지 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem)의 8가지 3-배 계단 희석액이 이용되었다. 각 실험에서, WT 1E3 클론이 비교를 위해 배양되었다. 1E3에 대한 IC50 값이 실험마다 변하긴 하지만, 부모 클론보다 선형 디유비퀴틴에 대한 높은 친화성을 보이는 클론이 확인될 수 있다. 최소 K63 디유비퀴틴 결합으로 선형 디유비퀴틴에 대한 향상된 친화성을 갖는 돌연변이체를 확인하기 위한 시도에서, IC50 ELISA에서 조사된 클론은 그들이 부모 1E3과 비교하여 향상된 IC50 값을 갖는 지의 여부, 그들이 K63-연결된 디유비퀴틴 분류 (실시예 3C)에서 단리되는 지의 여부, 그리고 파지 스팟 ELISA (실시예 3C)에서 K63-연결된 디유비퀴틴에 결합에 대한 그들의 신호를 고려하여 좁혀졌다. 선형 디유비퀴틴 분류에서 여러 번 단리되지만 K63-연결된 디유비퀴틴 분류에서 단리되지 않고, 그리고 스팟 ELISA에서 K63-연결된 디유비퀴틴 결합 없음 (0.1 이하의 OD450)을 보이는, 1E3과 비교하여 향상된 IC50 값을 갖는 클론은 추가 분석을 위해 선별되었다 (1F11, 2A2, 2C11, 2H5, 3E4, 4C9, 4E4, 그리고 4G7) (표 7 참조). 향상된 IC50을 갖는 클론이 선형 디유비퀴틴 분류에서 여러 번 단리되고, K63-연결된 디유비퀴틴 분류에서 단지 1회 단리되고, 그리고 파지 스팟 ELISA에서 K63-연결된 디유비퀴틴 결합 없음을 보이면, 이것은 추가 분석에 고려되었다 (3F5) (표 7 참조). 선형 디유비퀴틴과 K63-연결된 디유비퀴틴 분류 둘 모두에서 여러 번 단리된 클론 3A7과 4C10은 음성 대조로서 선택되었다. 이들 11개 클론은 1E3과 함께, 파지 특이성 ELISA에서 더욱 조사되었다. 하기 표 7은 파지 IC50 ELISA에 의해 더욱 특징화되는 선형 디유비퀴틴에 대하여, 각각 1E3 L1, L2, L3, H1, H2와 H3 NNK 라이브러리의 분류로부터 클론의 CDR L1, L2, L3, H1, H2와 H3 서열을 도시한다. IC50 및 부모 1E3 IC50에 비하여 배수적 향상이 제시된다. K63-연결된 디유비퀴틴에 결합은 파지 스팟 ELISA에서 0.1 이상의 OD450을 갖는 것으로 정의된다. 또한, 파지 스팟 경쟁 ELISA에서 25 nM 가용성 선형 디유비퀴틴의 존재에서 결합에서 저해 퍼센트가 제시된다. 각 클론이 선형 디유비퀴틴 또는 K63-연결된 디유비퀴틴에 대한 라이브러리 분류에서 단리된 횟수가 표시된다.
표 7은 CDR L1 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 1, 1 및 50-57로서 개시한다. 표 7은 CDR L2 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 2와 58-63으로서 개시한다. 표 7은 CDR L3 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 3, 3, 64, 65, 3 및 66-72로서 개시한다. 표 7은 CDR H1 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 255 및 73-81로서 개시한다. 표 7은 CDR H2 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 8 및 82-86로서 개시한다. 표 7은 CDR H3 서열을 각각, 출현의 순서에서 서열 번호 368-372, 368 및 373-375로서 개시한다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017

F) 파지 특이성 ELISA
1F11, 2A2, 2C11, 2H5, 3E4, 4C9, 4E4, 4G7, 3F5, 3A7, 그리고 4C10은 부모 클론 1E3과 함께, 모노유비퀴틴 (Boston Biochem), 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem), K11-연결된 디유비퀴틴 (Genentech), K48-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem), K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem), 항-gD 항체 (Genentech), 또는 코팅되지 않은 웰에 대해 파지 특이성 ELISA에서 조사되었다. 유비퀴틴 단백질의 패널은 96-웰 Maxisorb 면역평판 (NUNC) 상에 고정되었다 (도 7A와 7B 참조). 평판은 4℃에서 하룻밤 동안, 50 mM 탄산나트륨 완충액, pH 9.6에서 1 μg/mL의 각 단백질로 코팅되었다. 코팅된 평판은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 200 μL/웰의 2.5% 우유로 차단되었다. OD268 = 1.0에서부터 OD268 =0.03까지 파지의 6가지 2-배 계단 희석액이 PBST에서 2.5% 우유에서 만들어졌다. 1시간 후, 차단 완충액이 평판으로부터 버려지고, 그리고 100 μL의 파지 계단 희석액이 첨가되었다. 평판은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 배양되었다. 평판은 이후, 평판 세척기를 이용하여 PBST로 6회 세척되었다. PBST에서 항-M13 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-접합된 이차 항체 (GE Healthcare)의 1:5,000 희석액이 파지 결합의 검출에 이용되었다. 100 μL/웰의 이차 희석액이 첨가되고, 그리고 평판은 진탕하면서, 25℃에서 1.25시간 동안 배양되었다. 평판은 이후, 평판 세척기를 이용하여 PBST로 6회 및 수동으로 PBS로 2회 세척되었다. 결합된 이차 항체는 TMB 기질 (KPL)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 동일 부피의 1 M 인산으로 진정되었다. 흡광도는 450 nm에서 판독되었다.
선형 디유비퀴틴과 K63-연결된 디유비퀴틴 분류 둘 모두에서 여러 번 단리된 클론 3A7과 4C10이 음성 대조로서 이용되었다. 이들 둘 모두 파지 OD268 = 1.0에서 유의미한 K63-연결된 결합을 보였다 (3A7과 4C10에 대해, 각각 OD450 = 0.44와 OD450 = 0.5) (도 7A와 7B 참조). K63-연결된 디유비퀴틴 분류에서 2회 단리된 2A2는 중간 수준의 K63-연결된 결합 (파지 OD268 = 1.0에서 OD450 = 0.2)을 보였다. 모든 다른 클론은 미미한 K63-연결된 디유비퀴틴 결합을 보였다 (파지 OD268 = 1.0에서 OD450 < 0.16).
G) 경쇄/중쇄 이중 돌연변이체 클로닝
부모 1E3에 비하여 향상된 IC50 (실시예 3E)을 보이고 파지 특이성 ELISA (실시예 3F)에서 미미한 K63-연결된 디유비퀴틴 결합을 보이는 클론은 추가 고려를 위해 선택되었다. 이들에는 경쇄 돌연변이체 1F11, 2C11과 2H5 및 중쇄 돌연변이체 3E4, 3F5와 4G7가 포함되었다. 친화성 향상에서 부가 효과 (additive effect)가 있는 지를 조사하기 위해, 경쇄와 중쇄 돌연변이의 상이한 조합을 합동하는 이중 돌연변이체가 작제되었다. 경쇄 가변 도메인은 EcoRV와 KpnI로 파지미드를 소화시킴으로써 제거되고, 이후 동일한 부위를 이용하여 다양한 중쇄 돌연변이체 파지미드 내로 클로닝되었다.
H) 이중 돌연변이체 파지 IC 50 ELISA
이중 돌연변이체 1F11/3E4, 1F11/3F5, 1F11/4G7, 2C11/3E4, 2C11/3F5, 2C11/4G7, 2H5/3E4, 2H5/3F5, 그리고 2H5/4G7은 앞서 설명된 바와 같이 파지 IC50 ELISA에서 그들의 개별 단일 돌연변이체 및 부모 1E3과 비교되었다 (실시예 1D과 3E). 이중 돌연변이체 1F11/3F5와 2H5/3F5는 그들의 개별 단일 돌연변이체에 비하여 친화성에서 부가 향상을 보였다 (표 8 참조). 2C11/3F5는 경계선 부가이었다. 이러한 특정 검정에서 단일 돌연변이체 3F5는 다른 2가지 실험 (12 또는 13 nM)에서보다 더욱 낮은 IC50 (9 nM)을 제공하였는데, 이것은 2C11/3F5 (10 nM의 IC50)을 부가적이지 않게 보이도록 만들 수 있었다. 이런 이유로, 2C11/3F5 역시 추가 고려를 위해 선택되었다.
Figure pct00018
I) 이중 돌연변이체 파지 특이성 ELISA
이중 돌연변이체 1F11/3F5, 2C11/3F5, 그리고 2H5/3F5는 실시예 3F에서처럼 파지 특이성 ELISA에서 그들의 개별 단일 돌연변이체 및 부모 1E3과 비교되었다. 모든 이중 돌연변이체는 미미한 K63-연결된 디유비퀴틴 결합을 보였다 (파지 OD268 = 1.0에서 OD450 < 0.1) (도 8A와 8B 참조).
J) 이중 돌연변이 Fab 생산
부모 클론 (1E3), 단일 돌연변이체 (1F11, 2C11, 2H5, 3F5) 및 이중 돌연변이체 (1F11/3F5, 2C11/3F5, 2H5/3F5)는 실시예 1E에서 설명된 바와 같이 CH1 도메인의 단부에서 TAA 종결 코돈을 파지미드 내로 삽입함으로써 Fab 발현 구조체로서 클로닝되었다. 이들 Fab는 실시예 1E에서 설명된 바와 같이 대장균 (E. coli)에서 발현되고 정제되었다.
K) IgG 형식으로 전환
부모 클론 (1E3), 단일 돌연변이체 (1F11, 2C11, 2H5, 3F5) 및 이중 돌연변이체 (1F11/3F5, 2C11/3F5, 2H5/3F5)는 또한, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린 (IgGs)으로서 발현되었다. 발현 구조체는 인간 카파 IgG1의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 pRK 포유류 발현 구조체 내로 Fab 가변 도메인을 클로닝함으로써 산출되었다 (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). IgG는 실시예 1E에서 Fab 정제에 대해 설명된 바와 같이, 표준 방법에 의해 단백질 A-세파로오스 칼럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
L) 이중 돌연변이체 Biacore
이중 돌연변이 Fab (실시예 3J로부터)의 친화성은 실시예 1G에서 설명된 바와 같이, BIACORE™ 3000 (GE Healthcare)을 이용한 표면 플라스몬 공명 (SPR) 및 직접 결합에 의해 분석되었다. 대략 150 공명 단위 (RUs)의 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem), K48-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)과 K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)은 제조업체에 의해 공급된 아민 커플링 프로토콜을 이용하여 CM5 칩의 유식 세포 2, 유식 세포 3, 그리고 유식 세포 4 상에 각각 고정되었다. 유식 세포 1은 활성화되고 고정화 단백질 없이 에탄올아민 차단되어 참고 감산에 이용되었다. 심지어 10 mM 글리신, pH 1.7에서도, 칩 표면은 기준선으로 완전하게 재생될 수 없었고, 그리고 칩 표면이 변경되었음을 암시하는 RU에서 변화가 관찰되었다.
대안적 접근법은 BIACORE™ 3000 (GE Healthcare) 상에서 실시예 3K로부터 IgG로 IgG 포획 방법을 이용하여 조사되었다. 대략 8,000 공명 단위 (RUs)의 항-인간 Fc 포획 항체 (GE Healthcare)가 제조업체에 의해 공급된 아민 커플링 프로토콜을 이용하여 CM5 칩의 유식 세포 1과 2 상에 고정되었다. 10 mM Hepes, pH 7.2, 150 mM NaCl, 그리고 0.01% Tween 20 (HBST)에서 60 μL의 1 μg/mL의 IgG가 유식 세포 2 위에 30 μL/분의 유속으로 주입되고, 대략 750 RU의 IgG가 포획되었다. 유식 세포 1은 자기 위에서 포획 항체만을 갖고 참고 감산으로서 역할하였다. HBST에서 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem) 또는 K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)의 2-배 계단 희석액 (3.9-500 nM)이 유식 세포 1과 2 위에 주입되었다 (30 μL/분의 유속에서 60 μL 총량). 각 유식 세포에 대한 신호가 기록되고, 그리고 참고 신호가 감산되었다. 4분의 해리 기간 이후에, 칩 표면은 30 μL/분의 유속에서 15 μL의 3M MgCl2의 1회 주입으로 재생되었다. Fab 포획 Biacore 실험 (실시예 1G 참조)과 매우 유사하게, 데이터는 임의의 결합 모델에 적합시키기 어려웠는데, 그 이유는 디유비퀴틴이 칩으로부터 완전하게 해리되지 않았기 때문이다. 이에 더하여, 결합 속도가 매우 빨랐고, 그리고 결합이 이용된 디유비퀴틴의 최고 농도에서도 안정 상태에 도달하지 못하였다. 이런 이유로, 이들 IgG에 대한 KD를 추정하는 것이 어렵다.
M) 이중 돌연변이체를 이용한, 정제된 디유비퀴틴의 웨스턴 블롯
이중 돌연변이체의 친화성과 특이성을 등급짓기 위하여, 실시예 3K에서 설명된 IgG는 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem) 및 K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)에 결합에 대해 웨스턴 블롯에서 조사되었다. 1 μg의 K63-연결된 디유비퀴틴 및 환원제를 포함하는 1X LDS 완충액 (Invitrogen)에서 선형 디유비퀴틴의 5가지 3-배 계단 희석액 (1000, 333, 111, 37, 12 ng)이 70℃에서 10분 동안 가열되고 MES 완충액 (Invitrogen)에서 4-12% NuPAGE Bis Tris 1.0 mm 겔 상에 이동되었다. 겔은 10% 메탄올과 1X NuPAGE 이전 완충액 (Invitrogen)에서 0.2 μm 니트로셀룰로오스 (Invitrogen)로의 습식 이전 (wet transfer)에 의해 30 V 상수에서 1시간 동안 이전되었다. 막 상에서 비-특이적 결합 부위는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 배양에 의해 차단되었다. 막은 이후, 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 1 μg/mL의 1E3, 1F11, 2C11, 2H5, 3F5, 1F11/3F5, 2C11/3F5, 또는 2H5/3F5 IgG에서 배양되었다. 막은 진탕하면서, PBST에서 3회 세척되었다. 이들 IgG는 진탕하면서, 25℃에서 30분 동안 PBST에서 5% 우유에서 염소 항-인간 Fc 단편-특이적 IR Dye 800CW-접합된 이차 항체 (Rockland Immunochemicals)의 1:10,000 희석액에서 막을 배양함으로써 검출되었다. 막은 이후, PBST에서 3회, 그 이후에 PBS에서 1회 세척되었다. 이차 항체는 LI-COR Odyssey 적외선 화상 시스템 (LI-COR Biosciences)을 이용하여 검출되고 정량되었다.
단일 돌연변이체 1F11과 3F5는 부모 1E3보다 훨씬 민감한 반면, 단일 돌연변이체 2C11과 2H5는 단지 약간 향상되었다 (도 10 참조). 이중 돌연변이체 1F11/3F5는 개별 단일 돌연변이체에 비하여 민감성에서 부가 향상을 갖는 반면, 2C11/3F5와 2H5/3F5는 3F5 단독보다 나을 것이 없었다.
N) 삼중 돌연변이체 클로닝
친화성에서 추가의 향상이 3가지 돌연변이를 합동함으로써 달성될 수 있는 지를 알아보기 위하여, 1F11/2C11/3F5와 1F11/2H5/3F5 삼중 돌연변이체가 산출되었다. 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 5'-1F11 S52K (CCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCAAAGTTCCTCTACTCTGGAGTCCC) (서열 번호:187) 및 3'-1F11 S52K (GGGACTCCAGAGTAGAGGAACTTTGCCGAGTAAATCAGAAGCTTCGG) (서열 번호:188)는 실시예 3K로부터 2C11 또는 2H5 pRK 경쇄 구조체와 합동되고, 그리고 이중 돌연변이체 경쇄를 산출하기 위해 QuikChange® Lightning 특정 부위 돌연변이유발 키트 (Agilent)가 이용되었다. 삼중 돌연변이체는 이후, 이중 돌연변이체 경쇄 pRK 구조체를 3F5 중쇄 pRK 구조체와 합동함으로써 산출되고, 그리고 IgG는 실시예 3K에서 설명된 바와 같이 HEK293 세포에서 발현되고 정제되었다.
O) 삼중 돌연변이체를 이용한, 정제된 디유비퀴틴의 웨스턴 블롯
삼중 돌연변이체 1F11/2C11/3F5와 1F11/2H5/3F5의 친화성과 특이성을 등급짓기 위해, 실시예 3N에서 설명된 IgG는 실시예 3M에서 설명된 바와 같이 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem) 및 K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)에 결합에 대해 웨스턴 블롯에서 조사되었다. 1F11/2C11/3F5와 1F11/2H5/3F5 중에서 어느 것도 이중 돌연변이체 1F11/3F5보다 민감하지 않았다 (도 11 참조).
P) 추가의 삼중 돌연변이체 클로닝
실시예 3E에서 부모 1E3에 비하여 향상된 IC50 값을 보인 H3 돌연변이체, 4E4는 이중 돌연변이체를 만들 때 당초 고려되지 않았는데, 그 이유는 이것이 특이성 ELISA에서 적은 양의 K63-연결된 디유비퀴틴 결합을 가졌기 때문이다 (파지 OD268 = 1.0에서 OD450 = 0.16, 실시예 3F 참조). 지금까지 조사된 IgG 돌연변이체 중에서 어느 것도 웨스턴 블롯에서 K63-연결된 디유비퀴틴 결합을 나타내지 않았기 때문에, 4E4 클론이 더욱 분석되었다. 4E4는 2가지 돌연변이, CDR H3에 바로 인접하게 Y102L 및 뼈대 4에서 T110A를 실제로 내포하는 H3 클론이었다. 의도하지 않은 T110A 돌연변이가 친화성에 영향을 주는 지를 결정하기 위하여, Y102L 단일 돌연변이체 및 Y102L T110A 이중 돌연변이체 중쇄 둘 모두 1E3 부모 중쇄 또는 돌연변이체 3F5 중쇄의 배경에서 만들어졌다.
Y102L 돌연변이를 삽입하기 위해, 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 5'-Y102L (CGGTGGGTTATGGACCTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCC) (서열 번호:189) 및 3'-Y102L (GGAGGCCGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTTGACCCCACAGGTCCATAACCCACCG) (서열 번호:190)이 1E3 또는 3F5 IgG 중쇄 pRK 발현 구조체와 합동되고, 그리고 돌연변이체는 QuikChange® Lightning 특정 부위 돌연변이유발 키트 (Agilent)를 이용하여 합성되었다. Y102L T110A 돌연변이를 삽입하기 위해, 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 5'-Y102L T110A (CGGTGGGTTATGGACCTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCGCGGTCTCCTCGGCCTCC) (서열 번호:191) 및 3'-Y102L T110A (GGAGGCCGAGGAGACCGCGACCAGG GTTCCTTGACCCCACAGGTCCATAACCCACCG) (서열 번호:192)가 1E3 또는 3F5 IgG 중쇄 pRK 발현 구조체와 합동되고, 그리고 돌연변이체는 QuikChange® Lightning 특정 부위 돌연변이유발 키트 (Agilent)를 이용하여 합성되었다. 결과의 중쇄 IgG pRK 구조체는 부모 1E3 또는 돌연변이체 1F11 경쇄 IgG pRK 구조체와 합동되고, 그리고 결과의 IgG는 실시예 3K에서 설명된 바와 같이, HEK293 세포에서 발현되고 정제되었다.
이들 돌연변이체 (Y012L 대 Y102L T110A, 3F5/Y102L 대 3F5/Y102L T110A, 1F11/Y102L 대 1F11/Y102L T110A, 그리고 1F11/3F5/Y102L 대 1F11/3F5/Y102L T110A)는 이후, 실시예 3M에서 설명된 바와 같이, 선형 또는 K63-연결된 디유비퀴틴에 결합에 대해 웨스턴 블롯에서 나란히 비교되었다. 일반적으로, Y102L과 공동으로 T110A 돌연변이를 갖는 것은 Y102L 단독과 비교하여 민감성을 유의미하게 향상시키지 못하였다 (도 12 참조). 또한, 파지 IC50으로부터, T110A 단독 (클론 4E1)은 부모 1E3과 비교하여 친화성을 향상시키지 못하는 것으로 알려져 있다 (표 7 참조). 이런 이유로, Y102L 돌연변이 단독이 추가 분석에 고려되었다.
이후, 삼중 돌연변이체 1F11/3F5/Y102L가 실시예 3M에서 설명된 바와 같이, 선형 또는 K63-연결된 디유비퀴틴에 결합에 대해 웨스턴 블롯에서 부모 1E3, 각각의 단일 돌연변이체 (1F11, 3F5, Y102L), 그리고 이중 돌연변이체 (1F11/3F5, 1F11/Y102L, 3F5/Y102L)와 나란히 비교되었다. 상기 삼중 돌연변이체는 선형 디유비퀴틴에 결합에 대해 부모 클론 1E3, 모든 단일 돌연변이체, 그리고 모든 이중 돌연변이체보다 민감하였다 (도 13 참조). 이에 더하여, 이것은 K63-연결된 디유비퀴틴에 결합 없음을 보이고 특이성이 지속된다는 것을 지시하였다.
실시예 4 - 친화성 성숙된 항-선형 폴리유비퀴틴 항체의 특징화
A) 정제된 디유비퀴틴 사슬의 IgG 웨스턴 블롯
1E3 부모와 1F11/3F5/Y102L IgG는 웨스턴 블롯에서 순수한 디유비퀴틴 사슬을 검출하는 그들의 능력에 대해 조사되었다. 환원제 (Invitrogen)를 포함하는 1X LDS 완충액 (Invitrogen)에서 1 μg 내지 16 ng의 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem)의 7가지 2-배 계단 희석액, 그리고 각각 1 μg의 모노유비퀴틴 (Boston Biochem), K11-연결된 디유비퀴틴 (Genentech), K48-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)과 K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)이 70℃에서 10분 동안 가열되고 MES 완충액 (Invitrogen)에서 4-12% Bis Tris NuPAGE 1.0 mm 겔 (Invitrogen) 상에 삼중으로 이동되었다. 하나의 겔은 모든 단백질을 검출하기 위해 SimplyBlue 쿠마시 염료 (Invitrogen)에 의해 염색되었다. 친화성의 개념을 얻기 위한 비교를 위해, 두 번째 웨스턴 블롯이 K63-연결된 디유비퀴틴에 대한 8.7 nM의 공지된 KD를 갖는 항-K63 항체, Apu3.A8로 수행되었다 (Newton, K. et al. (2008) Cell 134:668-678 참조). 이러한 웨스턴을 위해, 1 μg 내지 16 ng의 K63-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)의 7가지 2-배 계단 희석액, 그리고 각각 1 μg의 모노유비퀴틴 (Boston Biochem), 선형 디유비퀴틴 (Boston Biochem), K11-연결된 디유비퀴틴 (Genentech)과 K48-연결된 디유비퀴틴 (Boston Biochem)이 전술한 바와 같이 겔 상에 이동되었다. 이들 3가지 겔은 10% 메탄올과 1X NuPAGE 이전 완충액 (Invitrogen)에서 0.2 μm 니트로셀룰로오스 (Invitrogen)로의 습식 이전 (wet transfer)에 의해 30 V 상수에서 1시간 동안 개별적으로 이전되었다. 막 상에서 비-특이적 결합 부위는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 배양에 의해 차단되었다. 막은 이후, 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 1 μg/mL의 1E3, 1F11/3F5/Y102L, 또는 Apu3.A8에서 배양되었다. 막은 진탕하면서, PBST에서 3회 세척되었다. 이들 IgG는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 염소 항-인간 Fcγ-특이적 HRP-접합된 F(ab')2 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)의 1:10000 희석액에서 막을 배양함으로써 검출되었다. 막은 이후, PBST에서 3회, 그 이후에 PBS에서 1회 세척되었다. 이차 항체는 Super Signal West Pico 화학발광 기질 (Thermo Scientific)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 필름에 대한 블롯의 노출이 수행되었다.
1E3의 검출 한계는 ~250 ng의 선형 디유비퀴틴이었다 (도 14 참조). 대조적으로, 1F11/3F5/Y102L은 훨씬 민감하고 적게는 31 ng의 선형 디유비퀴틴을 검출할 수 있었다. 이에 더하여, 1F11/3F5/Y102L은 고도로 특이적이었고, 조사된 임의의 다른 형태의 유비퀴틴에 결합 없음을 보였다. 비교를 위하여, 8.7 nM의 KD를 갖는 Apu3.A8의 검출 한계는 ~62 ng이었다. 이런 이유로, 선형 디유비퀴틴에 대한 1F11/3F5/Y102L의 KD는 아마도, 낮은 nM 범위 내에 있다.
B) 정제된 폴리유비퀴틴 사슬의 IgG 웨스턴 블롯
선형-특이적 항체는 선형 디유비퀴틴 항원에 대해 산출되고, 따라서 이들은 아마도, 선형 연쇄로부터 발생하는 디유비퀴틴의 입체형태에 기인한 아주 인접하게 배치되는 근위와 원위 유비퀴틴 상에서 연쇄 자체 또는 주변 표면 잔기를 인식한다. 디유비퀴틴이 항원의 가장 작은 인식 단위이고, 그리고 선형 폴리유비퀴틴이 디유비퀴틴을 반복 "단위체" 단위로서 갖는 중합성 사슬이기 때문에, 이들 항체는 폴리유비퀴틴 형태에도 결합할 것이다. 이를 검사하기 위해, 1F11/3F5/Y102L IgG는 웨스턴 블롯에서 순수한 폴리유비퀴틴 사슬을 검출하는 능력에 대해 조사되었다. 환원제 (Invitrogen)를 포함하는 1X LDS 완충액 (Invitrogen)에서 각각 1 μg의 모노유비퀴틴 (Boston Biochem), 선형 폴리유비퀴틴 2-7 (Enzo Lifesciences), K11-연결된 폴리유비퀴틴 (Genentech), K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem)과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem)이 70℃에서 10분 동안 가열되고 MES 완충액 (Invitrogen)에서 4-12% Bis Tris NuPAGE 1.0 mm 겔 (Invitrogen) 상에 삼중으로 이동되었다. 하나의 겔은 모든 단백질을 검출하기 위해 SimplyBlue 쿠마시 염료 (Invitrogen)에 의해 염색되었다. 다른 2개의 겔은 10% 메탄올과 1X NuPAGE 이전 완충액 (Invitrogen)에서 0.2 μm 니트로셀룰로오스 (Invitrogen)로의 습식 이전 (wet transfer)에 의해 30 V 상수에서 1시간 동안 개별적으로 이전되었다. 막 상에서 비-특이적 결합 부위는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 배양에 의해 차단되었다. 막은 이후, 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 1 μg/mL의 1F11/3F5/Y102L IgG 또는 생쥐 범-유비퀴틴 항체, P4D1 (비-연쇄 특이적, Santa Cruz Biotechnology)의 1:200 희석액에서 배양되었다. 막은 진탕하면서, PBST에서 3회 세척되었다. 1F11/3F5/Y102L IgG는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 염소 항-인간 Fcγ-특이적 HRP-접합된 F(ab')2 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)의 1:10000 희석액에서 막을 배양함으로써 검출되었다. P4D1 IgG는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 염소 항-생쥐 Fcγ-특이적 HRP-접합된 F(ab')2 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)의 1:10,000 희석액에서 막을 배양함으로써 검출되었다. 막은 이후, PBST에서 3회, 그 이후에 PBS에서 1회 세척되었다. 이차 항체는 Super Signal West Pico 화학발광 기질 (Thermo Scientific)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 필름에 대한 블롯의 노출이 수행되었다. 대조 범-유비퀴틴 항체, P4D1은 모노유비퀴틴, 선형 폴리유비퀴틴 2-7 (비록 불량하긴 하지만), K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7, 그리고 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7을 인식하는 반면, 1F11/3F5/Y102L IgG는 단지 선형 폴리유비퀴틴만을 인식한다 (도 15 참조). 따라서 선형 디유비퀴틴에서처럼, 1F11/3F5/Y102L 항체는 선형 연쇄를 내포하는 폴리유비퀴틴 사슬을 검출할 수 있지만, 다른 연쇄의 폴리유비퀴틴 사슬을 인식하지 못한다.
C) TNFα-처리된 세포 용해물의 IgG 웨스턴 블롯
HeLa S3 세포는 10% 우 태아 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 1% 글리신/히폭산틴/티미딘 (GHT) 용액, 그리고 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 50:50 F-12: Dulbecco의 변형된 Eagle Media (DMEM)에서 현탁 배양 동안 성장되었다. 실험 전날, 세포는 1:2 분할되었다. 이들 세포는 0.38 x 106 세포/mL (98% 생존)의 밀도에 도달할 때까지 하룻밤 동안 성장되었다. 이들 세포는 각각 1.5 L 세포의 3개 플라스크 내로 분배되었다. 플라스크 1은 10분 동안 5.8 μM MG132 (Cayman Chemicals)로 전처리되었다. 플라스크 2와 3은 전처리가 없었다. 0시에서, 플라스크 2와 3은 또한, 5.8 μM MG132로 처리되었다. 이에 더하여, 0시에서, 플라스크 1과 3은 100 ng/mL TNFα (Shenandoah Biotechnology)로 처리되고, 그리고 플라스크 2는 500 ng/mL TNFα로 처리되었다. 0시, 5분, 그리고 20분에서, 444 mL의 세포가 각 플라스크로부터 제거되고, 4℃에서 5분 동안 800 rpm으로 스핀 다운되고, 그리고 상층액이 흡출되었다. 세포는 40 mL의 차가운 PBS로 즉시 세척되고, 4℃에서 5분 동안 800 rpm으로 펠릿화되고, 그리고 상층액이 흡출되었다. 각 펠릿은 진동시키면서, 13 mL의 차가운 용해 (lysis) 완충액 (20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM N-에틸말레이미드 (NEM), 25 μM MG132, 50 mM NaF, 완전 프로테아제 저해제 칵테일 정제 (Roche), 그리고 PhosSTOP 포스파타아제 저해제 칵테일 정제 (Roche))에서 4℃에서 10분 동안 용해되었다. 부스러기는 4℃에서 5분 동안 10,000 x g로 회전함으로써 펠릿화되었다. 용해물은 진동시키면서, 4℃에서 1시간 동안 133 μL의 단백질 A Dynabeads (Invitrogen)로 안정성이 사전에 보증되었다. 비드는 5분 동안 2000 rpm으로 회전함으로써 펠릿화되었다. 상층액이 제거되고 -80℃에서 보관되었다.
선형 폴리유비퀴틴 사슬은 NFκB 경로에서 신호전달 역할을 하는 것으로 제안되었다. 이런 이유로, 상기 용해물은 웨스턴 블롯에서 1F11/3F5/Y102L로 탐침되었다. 환원제 (Invitrogen)를 포함하는 1X LDS 샘플 완충액 (Invitrogen)에서 13 μL의 각 용해물은 70℃에서 10분 동안 가열되고 MES 완충액 (Invitrogen)에서 4-12% Bis Tris NuPAGE 1.0 mm 겔 (Invitrogen) 상에 이중으로 이동되었다. 특이성 대조로서, 250 ng의 정제된 선형 (Enzo Lifesciences)과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 사슬 (Boston Biochem)이 겔 상에 이동되었다. 겔은 10% 메탄올과 1X NuPAGE 이전 완충액 (Invitrogen)에서 0.45 μm 니트로셀룰로오스 (Invitrogen)로의 습식 이전 (wet transfer)에 의해 30 V 상수에서 1시간 동안 개별적으로 이전되었다. 막 상에서 비-특이적 결합 부위는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 배양에 의해 차단되었다. 막은 이후, 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 1 μg/mL의 1F11/3F5/Y102L 또는 Apu3.A8 항-K63에서 배양되었다. 막은 진탕하면서, PBST에서 3회 세척되었다. 이들 IgG는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 염소 항-인간 Fcγ-특이적 HRP-접합된 F(ab')2 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)의 1:10,000 희석액에서 막을 배양함으로써 검출되었다. 막은 이후, PBST에서 3회, 그 이후에 PBS에서 1회 세척되었다. 이차 항체는 Super Signal West Pico 화학발광 기질 (Thermo Scientific)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 필름에 대한 블롯의 노출이 수행되었다. IκBα 수준을 탐침함으로써 NFκB 경로의 활성화를 산정하기 위해 추가의 웨스턴 블롯이 수행되었다. TNFα 신호전달 시에, 이것은 NFκB의 저해제, IκBα의 유비퀴틴화와 분해를 유발한다. 환원제 (Invitrogen)를 포함하는 1X LDS 샘플 완충액 (Invitrogen)에서 5 μL의 상기 용해물은 70℃에서 10분 동안 가열되고 MES 완충액 (Invitrogen)에서 4-12% Bis Tris NuPAGE 1.0 mm 겔 (Invitrogen) 상에 이중으로 이동되었다. 겔은 20% 메탄올과 1X NuPAGE 이전 완충액 (Invitrogen)에서 Invitrolon PVDF (Invitrogen)로의 습식 이전 (wet transfer)에 의해 30 V 상수에서 2시간 동안 이전되었다. 막은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 차단되고, 이후 진탕하면서, 4℃에서 하룻밤 동안 부하 대조로서 항-IκBα (Cell Signaling)와 항-β-튜불린 (Cell Signaling) 항체의 1:1000 희석액으로 탐침되었다. 다음 날, 블롯은 진탕하면서, PBST에서 3회 세척되었다. 이들 IgG는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 염소 항-토끼 Fcγ-특이적 HRP-접합된 F(ab')2 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)의 1:10,000 희석액에서 막을 배양함으로써 검출되었다. 막은 이후, PBST에서 3회, 그 이후에 PBS에서 1회 세척되었다. 이차 항체는 Super Signal West Pico 화학발광 기질 (Thermo Scientific)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 필름에 대한 블롯의 노출이 수행되었다.
100 ng/mL TNFα로 자극되고 MG132로 전처리되지 않은 세포에서, 선형 폴리유비퀴틴 사슬의 양은 0시에서부터 5분 내지 20분까지 증가한다 (도 16A 참조). 대조적으로, 3가지 시점 모두에서 훨씬 풍부했던 K63-연결된 폴리유비퀴틴 사슬은 0시에서부터 5분까지 증가를 보이고, 이후 20분 시점에서 출발 수준으로 하락하였다. 500 ng/mL TNFα로 자극되고 MG132로 전처리되지 않은 세포에서, 선형 폴리유비퀴틴 사슬은 0시에서부터 20분까지 증가의 동일한 패턴을 보였지만, 각 시점에서 선형 사슬의 존재비 (abundance)는 100 ng/mL TNFα로 처리된 세포와 비교하여 증가되었다. 대조적으로, K63-연결된 사슬은 100 ng/mL TNFα로 처리된 세포와 비교하여, 동일한 패턴과 존재비를 보였다. 5.8 μM MG132, 이후 100 ng/mL TNFα로 10분 동안 전처리된 세포에서, 선형과 K63-연결된 사슬 둘 모두의 수준은 3가지 시점에서 상당히 불변하였다. IκBα에 대한 블롯은 3가지 실험 조건 모두에서 NFκB 경로가 시간의 흐름에서 TNFα 처리 시에 IκBα의 분해에 의해 증거되는 바와 같이 활성화된다는 것을 보여주긴 하지만, 활성화의 정도는 MG132 전처리의 부재에서 더욱 크다 (도 16B 참조). 이것은 1F11/3F5/Y102L이 내인성 선형 폴리유비퀴틴 사슬을 인식할 수 있다는 것을 증명하고, 그리고 이들 사슬이 TNFα 자극 시에 HeLa S3 세포에서 상향 통제된다는 것을 암시한다.
D) 선형 폴리유비퀴틴 사슬의 면역침전
1F11/3F5/Y102L IgG는 선형 폴리유비퀴틴 사슬을 면역침전시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 조사되었다. 양성 대조로서, Apu3.A8 항-K63 항체 역시 K63-연결된 사슬의 면역침전을 모니터링하는데 이용되었다. 음성 대조로서, 무관한 인간 카파 IgG1 항체가 아이소타입 대조로서 이용되었다. 3가지 면역침전 (IP) 조건이 조사되었다. 모든 사슬을 내포하는 반응물 1에서, 각각 2 μg의 모노유비퀴틴 (Boston Biochem), 선형 폴리유비퀴틴 2-7 (Enzo Lifesciences), K11-연결된 폴리유비퀴틴 (Genentech), K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem)과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem)이 혼합되었다. 선형 사슬을 결여하는 반응물 2에서, 각각 2 μg의 모노유비퀴틴, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7이 혼합되었다. 반응물 3은 2 μg의 선형 폴리유비퀴틴 2-7 사슬 단독으로 구성되었다. 각 반응물은 500 μL의 4 M 요소 IP 완충액 (4 M 요소, 20 mM Tris, pH 7.5, 135 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 1 mM EDTA, 1.5 mM MgCl2)에서 희석되었다. 이들 반응물은 회전하면서, 25℃에서 3시간 동안 50 μL의 단백질 A Dynabeads (Invitrogen)로 안정성이 사전에 보증되었다. 비드는 이후, 자성 스탠드에서 포획되고, 그리고 상층액이 새로운 튜브로 이전되었다. 20 μg의 1F11/3F5/Y102L 항-선형, Apu3.A8 항-K63, 또는 아이소타입 대조 IgG가 각 IP 반응물에 첨가되고 회전하면서, 25℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 다음 날, 100 μL의 단백질 A Dynabeads가 각 반응물에 첨가되고, 그리고 이들 IgG가 회전하면서, 25℃에서 15분 동안 포획되었다. 비드는 이후, 각각 1 mL의 4M 요소 IP 완충액으로 3회 세척되고, 그 이후에 각각 1 mL의 PBS로 2회 세척되었다. 최종 세척 동안, 비드는 튜브 벽에 결합된 임의의 단백질의 용리를 피하기 위해 새로운 튜브로 이전되었다. 비드는 환원제 (Invitrogen)를 포함하는 30 μL의 1X LDS 샘플 완충액 (Invitrogen)에서 재현탁되고, 그리고 면역침전된 단백질을 용리하기 위해 70℃에서 10분 동안 가열되었다. 비드는 이후, 자성 스탠드에서 포획되고, 그리고 상층액이 절반씩 분할되고 2개의 4-12% Bis Tris NuPAGE 1.0 mm 겔 (Invitrogen) 위에 이중으로 부하되었다. 양성과 음성 대조로서, 각각 1 μg의 정제된 선형 폴리유비퀴틴 2-7 (Enzo Lifesciences)과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem) 역시 겔 상에 이동되었다. 이들 겔은 MES 완충액 (Invitrogen)에서 이동되고, 이후 10% 메탄올과 1X NuPAGE 이전 완충액 (Invitrogen)에서 0.2 μm 니트로셀룰로오스 (Invitrogen)로의 습식 이전 (wet transfer)에 의해 30 V 상수에서 1시간 동안 개별적으로 이전되었다. 막 상에서 비-특이적 결합 부위는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 배양에 의해 차단되었다. 막은 이후, 진탕하면서, 25℃에서 1.5시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 1 μg/mL의 1F11/3F5/Y102L 또는 Apu3.A8 항-K63에서 배양되었다. 막은 진탕하면서, PBST에서 3회 세척되었다. 이들 IgG는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 염소 항-인간 Fcγ-특이적 HRP-접합된 F(ab')2 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)의 1:10,000 희석액에서 막을 배양함으로써 검출되었다. 막은 이후, PBST에서 3회, 그 이후에 PBS에서 1회 세척되었다. 이차 항체는 Super Signal West Pico 화학발광 기질 (Thermo Scientific)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 필름에 대한 블롯의 노출이 수행되었다. 1F11/3F5/Y102L은 4M 요소에서 선형 폴리유비퀴틴 사슬을 면역침전시킬 수 있지만 이들 조건 하에 특이적이지 않은데, 그 이유는 이것이 K63-연결된 사슬 역시 풀다운할 수 있기 때문이다 (도 17 참조).
상이한 농도의 요소가 특이성을 향상시키는데 도움을 줄 수 있는 지를 결정하기 위하여, 상이한 완충액 조건 하에 면역침전이 수행되었다. 각각 2 μg의 선형 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7이 혼합되고 0, 2, 4, 또는 6 M 요소를 내포하는 500 μL의 IP 완충액 (20 mM Tris, pH 7.5, 135 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 1 mM EDTA, 1.5 mM MgCl2)으로 희석되었다. 추가의 IP가 500 μL의 PBST를 이용하여 수행되었다. 반응물은 회전하면서, 25℃에서 30분 동안 50 μL의 단백질 A Dynabeads (Invitrogen)로 안정성이 사전에 보증되었다. 비드는 이후, 자성 스탠드에서 포획되고, 그리고 상층액이 새로운 튜브로 이전되었다. 20 μg의 1F11/3F5/Y102L 항-선형 또는 Apu3.A8 항-K63 IgG가 각 IP 반응물에 첨가되고 회전하면서, 25℃에서 1시간 동안 배양되었다. 그 다음, 100 μL의 단백질 A Dynabeads가 각 반응물에 첨가되고, 그리고 이들 IgG가 회전하면서, 25℃에서 15분 동안 포획되었다. 비드는 이후, IP에서 이용된 각각 1 mL의 상응하는 완충액 (0, 2, 4, 또는 6 M 요소 IP 완충액 또는 PBST)으로 3회, 그 이후에 각각 1 mL의 PBS로 2회 세척되었다. 최종 세척 동안, 비드는 튜브 벽에 결합된 임의의 단백질의 용리를 피하기 위해 새로운 튜브로 이전되었다. 비드는 환원제 (Invitrogen)를 포함하는 20 μL의 1X LDS 샘플 완충액 (Invitrogen)에서 재현탁되고, 그리고 면역침전된 단백질을 용리하기 위해 70℃에서 10분 동안 가열되었다. 비드는 이후, 자성 스탠드에서 포획되고, 그리고 상층액이 절반씩 분할되고 2개의 4-12% Bis Tris NuPAGE 1.0 mm 겔 (Invitrogen) 위에 이중으로 부하되었다. 양성과 음성 대조로서, 각각 1 μg의 정제된 선형 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 역시 겔 상에 이동되었다. 이들 겔은 MES 완충액 (Invitrogen)에서 이동되고, 이후 10% 메탄올과 1X NuPAGE 이전 완충액 (Invitrogen)에서 0.2 μm 니트로셀룰로오스 (Invitrogen)로의 습식 이전 (wet transfer)에 의해 30 V 상수에서 1시간 동안 개별적으로 이전되었다. 막 상에서 비-특이적 결합 부위는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 배양에 의해 차단되었다. 막은 이후, 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 1 μg/mL의 1F11/3F5/Y102L 또는 Apu3.A8 항-K63에서 배양되었다. 막은 진탕하면서, PBST에서 3회 세척되었다. 이들 IgG는 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 염소 항-인간 Fcγ-특이적 HRP-접합된 F(ab')2 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)의 1:10,000 희석액에서 막을 배양함으로써 검출되었다. 막은 이후, PBST에서 3회, 그 이후에 PBS에서 1회 세척되었다. 이차 항체는 Super Signal West Pico 화학발광 기질 (Thermo Scientific)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 필름에 대한 블롯의 노출이 수행되었다. 요소의 농도가 IP 완충액에서 증가되기 때문에, 1F11/3F5/Y102L IP는 더욱 특이적으로 된다 (도 18A 참조). 6 M 요소에서 극히 적은 K63-연결된 폴리유비퀴틴이 1F11/3F5/Y102L IgG에 의해 풀다운되긴 하지만, 이것은 유의미한 양의 선형 폴리유비퀴틴을 여전히 풀다운할 수 있다.
더욱 높은 농도의 요소가 특이성을 더욱 향상시킬 수 있는 지를 확인하기 위해, 이들 IP는 6, 7, 또는 8 M 요소 IP 완충액을 이용하여 반복되었다. 각각 2 μg의 선형 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7이 혼합되고 6, 7, 또는 8 M 요소를 내포하는 500 μL의 IP 완충액 (20 mM Tris, pH 7.5, 135 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 1 mM EDTA, 1.5 mM MgCl2)으로 희석되었다. 반응물은 회전하면서, 25℃에서 15분 동안 50 μL의 단백질 A Dynabeads (Invitrogen)로 안정성이 사전에 보증되었다. 비드는 이후, 자성 스탠드에서 포획되고, 그리고 상층액이 새로운 튜브로 이전되었다. 20 μg의 1F11/3F5/Y102L 항-선형, Apu3.A8 항-K63, 또는 아이소타입 대조 IgG가 각 IP 반응물에 첨가되고 회전하면서, 25℃에서 1시간 동안 배양되었다. 그 다음, 100 μL의 단백질 A Dynabeads가 각 반응물에 첨가되고, 그리고 이들 IgG가 회전하면서, 25℃에서 15분 동안 포획되었다. 비드는 이후, IP에서 이용된 각각 1 mL의 상응하는 완충액 (6, 7, 또는 8 M 요소 IP 완충액)으로 3회, 그 이후에 각각 1 mL의 PBS로 2회 세척되었다. 최종 세척 동안, 비드는 튜브 벽에 결합된 임의의 단백질의 용리를 피하기 위해 새로운 튜브로 이전되었다. 비드는 환원제 (Invitrogen)를 포함하는 30 μL의 1X LDS 샘플 완충액 (Invitrogen)에서 재현탁되고, 그리고 면역침전된 단백질을 용리하기 위해 70℃에서 10분 동안 가열되었다. 비드는 이후, 자성 스탠드에서 포획되고, 그리고 상층액이 절반씩 분할되고 2개의 4-12% Bis Tris NuPAGE 1.0 mm 겔 (Invitrogen) 위에 이중으로 부하되었다. 양성과 음성 대조로서, 각각 1 μg의 정제된 선형 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 역시 겔 상에 이동되었다. 이들 겔은 MES 완충액 (Invitrogen)에서 이동되고, 그리고 웨스턴 블롯이 상기 단락에서 설명된 바와 같이 수행되었다. 한 블롯은 선형 사슬을 검출하기 위해 1F11/3F5/Y102L로 탐침되고, 그리고 다른 블롯은 K63-연결된 사슬을 검출하기 위해 Apu3.A8 항-K63으로 탐침되었다. 6 M 요소에서, 이전 IP에서 관찰된 바와 같이 적은 양의 K63-연결된 사슬이 1F11/3F5/Y102L에 의해 풀다운된다 (도 18B 참조). 7 M 요소에서, 1F11/3F5/Y102L은 아이소타입 대조처럼 행동하고 K63-연결된 사슬을 풀다운하지 않지만, 출발 물질에서 존재했던 것과 비교할 때 유의미한 양의 선형 폴리유비퀴틴을 IP하는 능력을 여전히 유지한다. 하지만, 8 M 요소에서, 1F11/3F5/Y102L에 의해 풀다운되는 선형 사슬의 양은 극적으로 감소된다. 따라서 7 M 요소는 K63-연결된 사슬을 줄이지 않으면서 유의미한 양의 선형 사슬을 풀다운하는 것 사이에서 균형을 유지하는 가장 특정한 조건이다.
이전 IP에서, 풀다운에 이용된 IgG의 중쇄는 비드로부터 용리되고, 그리고 웨스턴 블롯에서 이용된 이차 항체에 의해 검출된다. 이러한 띠는 종종, 풀다운 물질의 띠를 모호하게 할 수 있다. 블롯을 더욱 선명하게 만들고 어떤 K63-연결된 사슬도 풀다운되지 않도록 절대적으로 보증하기 위해, 이들 IgG는 IP에 앞서 비드에 교차 연결되었다. 20 μg의 1F11/3F5/Y102L 또는 아이소타입 대조 IgG는 회전하면서, 25℃에서 30분 동안 PBST에서 200 μL의 단백질 A Dynabeads와 함께 배양되었다. 비드는 자성 스탠드에서 포획되고 800 μL의 접합 완충액 (20 mM 인산나트륨 pH 7.5, 150 mM NaCl)으로 2회 세척되었다. IgG-커플링된 비드는 접합 완충액에서 1 mL의 5 mM 비스(술포숙신이미딜)수베르산염 (BS3)에서 재현탁되고 교차 연결을 위해 회전하면서, 25℃에서 30분 동안 배양되었다. 이들 IgG를 비드에 교차 연결하는 동안, IP 반응물이 셋업되었다. 각각 4 μg의 선형 폴리유비퀴틴 2-7, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7이 혼합되고 0, 4, 또는 7 M 요소를 내포하는 500 μL의 IP 완충액 (20 mM Tris, pH 7.5, 135 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 1 mM EDTA, 1.5 mM MgCl2)으로 희석되었다. 혼합물은 회전하면서, 25℃에서 45분 동안 50 μL의 단백질 A Dynabeads로 안정성이 사전에 보증되었다. 30분 후, 교차 연결 반응은 48 μL의 1 M Tris pH 7.5의 첨가 및 회전하면서, 25℃에서 15분 동안 배양에 의해 진정되었다. 교차 연결된 비드는 IP에서 이용되는 상응하는 양의 요소 (즉, 0, 4, 또는 7 M 요소)를 내포하는 800 μL의 IP 완충액으로 3회 세척되었다. 세척 후, IgG-교차 연결된 비드는 안정성이 사전에 보증된 IP 반응물에서 재현탁되고 회전하면서, 25℃에서 1시간 동안 배양되었다. IgG-교차 연결된 비드는 이후, 상응하는 양의 요소를 내포하는 1 mL의 IP 완충액으로 3회, 그 이후에 1 mL의 PBS로 2회 세척되었다. 최종 세척 동안, 비드는 튜브 벽에 결합된 임의의 단백질의 용리를 피하기 위해 새로운 튜브로 이전되었다. 비드는 환원제 (Invitrogen)를 포함하는 50 μL의 1X LDS 샘플 완충액 (Invitrogen)에서 재현탁되고, 그리고 면역침전된 단백질을 용리하기 위해 70℃에서 10분 동안 가열되었다. 비드는 이후, 자성 스탠드에서 포획되고, 그리고 상층액이 분할되고 4-12% Bis Tris NuPAGE 1.0 mm 겔 (Invitrogen) 위에 사중으로 부하되었다. 양성과 음성 대조로서, 각각 1 μg의 정제된 선형 폴리유비퀴틴 2-7, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 역시 겔 상에 이동되었다. 이들 겔은 MES 완충액 (Invitrogen)에서 이동되고, 그리고 웨스턴 블롯이 본 실시예에서 전술한 바와 같이 수행되었다. 한 블롯은 선형 사슬을 검출하기 위해 1F11/3F5/Y102L로 탐침되고, 한 블롯은 K11-연결된 사슬을 검출하기 위해 2A3/2E6 항-K11로 탐침되고, 한 블롯은 K48-연결된 사슬을 검출하기 위해 Apu2.07 항-K48로 탐침되고, 그리고 한 블롯은 K63-연결된 사슬을 검출하기 위해 Apu3.A8 항-K63으로 탐침되었다. IP에서 물질의 양을 출발 입력에서 존재하는 물질의 양과 비교할 때, 이전 단락에서 비드 상에서 차후 포획된 유리 IgG로 수행된 IP와 비교하여, 1F11/3F5/Y102L로 수행된 각 IP에서 전체적으로 훨씬 적은 선형 폴리유비퀴틴이 풀다운되었다 (도 19 참조). 이것은 1F11/3F5/Y102L이 Fc 도메인 내에 통상의 결합 부위에 더하여, 중쇄 가변 도메인 내에 두 번째 단백질 A 결합 부위를 내포하는 인간 IgG1 VH3 소집단의 구성원이라는 사실에 기인할 지도 모른다. 이런 이유로, 항원 결합에 앞서 단백질 A 비드에 이들 IgG의 프리커플링 (precoupling)과 교차 연결은 상기 항체의 결합능을 감소시킬 수 있다. 이들 프리커플링과 교차 연결 조건 하에, 4 M 요소는 1F11/3F5/Y102L이 K11-, K48-, 또는 K63-연결된 사슬을 줄이지 않으면서 선형 사슬을 풀다운할 수 있는 가장 특정한 조건이다.
풀다운된 선형 사슬에서 감소가 중쇄 가변 도메인 내에 추가의 단백질 A 결합 부위에 기인한 것인 지를 확인하기 위해, 이들 IP는 단백질 G 비드에 교차 연결된 IgG를 이용하여 수행되었다. 단백질 G는 또한, 인간 IgG1 상에 2개의 결합 부위를 갖지만, 둘 모두 불변 도메인 (CH1과 Fc) 내에 있다. 이들 IP는 단백질 G Dynabeads (Invitrogen)가 IgG의 프리커플링과 교차 연결에 이용되는 점을 제외하고, 전술한 바와 같이 반복되었다. 단백질 A에 교차 연결된 IgG로 실험과 비교하여, 훨씬 많은 선형 폴리유비퀴틴 사슬이 1F11/3F5/Y102L에 의해 각 조건에서 풀다운되었다 (도 20 참조). 4 M 요소에서 항-K63 블롯의 과다-노출 시에, 적은 양의 K63-연결된 사슬이 1F11/3F5/Y102L에 의해 풀다운된다. 따라서 7 M 요소는 1F11/3F5/Y102L이 단백질 G 비드에 프리커플링될 때 가장 특정한 조건인 것으로 보이지만, 이것은 비드 상에서 차후 포획되는 유리 IgG로 이들 IP가 수행될 때와 비교하여, 더욱 적은 선형 폴리유비퀴틴을 풀다운하는 희생을 감수하면서 이루어진다 (도 18B과 비교). CH1 도메인에 단백질 G 비드의 프리커플링과 교차 연결은 또한, 비록 VH 도메인에 단백질 A 비드의 프리커플링과 교차 연결보다 덜 유의미하긴 하지만, 이웃하는 VH 도메인의 입체 장애 (steric hindrance)를 통해, 선형 폴리유비퀴틴에 결합을 감소시키는 것이 가능하다.
유리 IgG를 이용한 IP, 그 이후에 단백질 A 비드로 차후 포획은 상이한 연쇄의 폴리유비퀴틴 사슬의 혼합물을 기질로서 이용하여 반복되고 웨스턴 블롯과 질량 분석에 의해 더욱 광범위하게 분석되었다. 각각 2 μg의 선형 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem), K11-연결된 폴리유비퀴틴 (Genentech), K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem)과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 (Boston Biochem)이 혼합되고 0, 4, 5, 6 또는 7 M 요소를 내포하는 500 μL의 IP 완충액 (20 mM Tris, pH 7.5, 135 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 1 mM EDTA, 1.5 mM MgCl2)으로 희석되었다. 각 IP는 웨스턴 블롯을 위해 및 질량 분석 분석을 위해, 이중으로 수행되었다. 반응물은 회전하면서, 25℃에서 15분 동안 50 μL의 단백질 A Dynabeads (Invitrogen)로 안정성이 사전에 보증되었다. 비드는 이후, 자성 스탠드에서 포획되고, 그리고 상층액이 새로운 튜브로 이전되었다. 20 μg의 1F11/3F5/Y102L 항-선형 또는 아이소타입 대조 IgG가 각 IP 반응물에 첨가되고 회전하면서, 25℃에서 1시간 동안 배양되었다. 그 다음, 100 μL의 단백질 A Dynabeads가 각 반응물에 첨가되고, 그리고 이들 IgG은 회전하면서, 25℃에서 15분 동안 포획되었다. 비드는 이후, IP에서 이용된 각각 1 mL의 상응하는 완충액 (0, 4, 5, 6, 또는 7 M 요소 IP 완충액)으로 3회, 그 이후에 각각 1 mL의 PBS로 2회 세척되었다. 최종 세척 동안, 비드는 튜브 벽에 결합된 임의의 단백질의 용리를 피하기 위해 새로운 튜브로 이전되었다. 비드는 환원제 (Invitrogen)를 포함하는 50 μL의 1X LDS 샘플 완충액 (Invitrogen)에서 재현탁되고, 그리고 면역침전된 단백질을 용리하기 위해 70℃에서 10분 동안 가열되었다. 비드는 이후, 자성 스탠드에서 포획되고, 그리고 상층액이 분할되고 웨스턴 블롯을 위한 4-12% Bis Tris NuPAGE 1.0 mm 겔 (Invitrogen) 위에 사중으로 부하되었다. 양성과 음성 대조로서, 각각 500 ng의 정제된 선형 폴리유비퀴틴 2-7, K11-연결된 폴리유비퀴틴, K48-연결된 폴리유비퀴틴 2-7과 K63-연결된 폴리유비퀴틴 2-7 역시 겔 상에 이동되었다. 다른 세트의 IP는 질량 분석 AQUA 분석을 위해 4-12% Bis Tris NuPAGE 1.0 mm 겔 (Invitrogen) 상에 이동되었다. 이들 겔은 MES 완충액 (Invitrogen)에서 이동되고, 그리고 웨스턴 블롯이 본 실시예에서 전술한 바와 같이 수행되었다. 이들 블롯은 1F11/3F5/Y102L 항-선형 폴리유비퀴틴, 2A3/2E6 항-K11-연결된 폴리유비퀴틴, Apu2.07 항-K48-연결된 폴리유비퀴틴, 그리고 Apu3.A8 항-K63 폴리유비퀴틴 항체로 탐침되었다 (도 21A 참조). 질량 분석 AQUA를 위한 다른 겔은 SimplyBlue Coomasie Safe 염료 (Invitrogen)로 염색되었다 (도 21B 참조). 요소의 부재에서, F11/3F5/Y102L은 모든 연쇄의 사슬을 IP할 수 있다 (도 21A 참조). 요소의 농도가 IP 완충액에서 증가됨에 따라서, 1F11/3F5/Y102L IP는 더욱 특이적으로 된다. 7 M 요소에서, 어떤 K11-연결된, K48-연결된, 또는 K63-연결된 폴리유비퀴틴도 1F11/3F5/Y102L IgG에 의해 풀다운되지 않고, 그리고 이것은 출발 입력에 비하여 유의미한 양의 선형 폴리유비퀴틴을 여전히 풀다운할 수 있다.
쿠마시 염색된 겔의 영역 B와 C는 절제되고, 겔내 트립신 소화 (in-gel tryptic digestion)에 종속되고, 그리고 질량 분석 AQUA에 의해 분석되었다 (도 21B 참조). 겔 조각은 50 mM 암모늄 중탄산염/50% 메탄올을 이용하여 탈염되고, 이후 아세토니트릴 (ACN)로 건조되었다. 트립신의 효과적인 흡수를 허용하기 위해, 겔 조각은 50mM 암모늄 중탄산염/5% ACN에서 희석된 20 ng/μL 변형된 시퀀싱 등급 트립신 (Promega, Madison WI)과 함께, 얼음 위에서 2시간 동안 배양되었다. 소화는 37℃에서 하룻밤 동안 수행되고 50% ACN/5% 포름산 (FA)의 첨가에 의해 종결되었다. 동위원소 표지된 내부 표준 펩티드 (1 pmol)가 2 라운드의 추출 (일차 - 50% ACN/5% FA 이차 - 100% ACN)에 앞서 각 샘플에 첨가되었다. 추출된 펩티드는 완전하게 건조되고, 그리고 질량 분석에 앞서 적어도 30분 동안 10% ACN/5% FA/0.01% H2O2에서 재현탁되었다. 샘플은 Thermo AQUASIL C18 칼럼 (2.1 X 150mm) 위에 직접적으로 부하되고 5% 내지 90% 완충액 B (98% ACN/0.1% FA)의 26분 구배에 걸쳐 200 μl/분의 유속에서 Agilent 1200 모세관 LC를 이용하여 분리되었다. 질량 분석 검출은 유비퀴틴의 서열을 보호하는 표지된 펩티드와 표지되지 않은 펩티드 둘 모두를 검출하기 위한 분절화 복수 반응 모니터링 (MRM) 방법을 이용하여 ABI 4000 QTRAP에서 수행되었다. 정량은 ABI Multiquant 1.1 소프트웨어를 이용하여, 각 펩티드의 표지된 이형과 표지되지 않은 이형 사이에 피크 면적을 비교함으로써 수행되었다. 유비퀴틴의 7개 리신 및 아미노 말단의 변형에 상응하는 -GG 신호 펩티드의 존재비를 측정함으로써, 7M 요소는 선형 폴리유비퀴틴 사슬의 면역침전을 위한 가장 특정한 조건인 것으로 확증되었다 (도 21C와 21D 참조). 7M 요소에서, 상기 항체는 더욱 긴 사슬 (테트라유비퀴틴 내지 헵타유비퀴틴)을 내포하는 영역 B로부터 입력 내에 존재하는 선형 사슬 중에서 67%를 회수할 수 있지만, 영역 C에서 발견되는 짧은 사슬 (디유비퀴틴과 트리유비퀴틴)을 회수하는데 덜 효과적인데, 선형 사슬 중에서 단지 2%만 회수되었다 (도 21E 참조). 이것은 아마도, 이가 항체로부터 친화력 및 더욱 긴 사슬에서 발견되는 복수 연쇄에 기인한다.
E) LUBAC의 과다발현
선형 유비퀴틴 결합 복합체 (LUBAC)는 선형 폴리유비퀴틴 사슬을 조립하는 것으로 증명된 E3 리가아제이다 (Kirisako, T. et al. (2006) EMBO J. 25:4877-4887). 이러한 복합체의 구성체 중에서 2가지, Hoil-1L과 Hoip의 개방 해독 틀 (ORFs)이 합성되고 (Blue Heron Biotechnology), 그리고 양지향성 CMV 프로모터를 내포하는 pBI-CMV1 포유류 발현 벡터 (Clonetech) 내로 클로닝되었다. Hoil-1L은 제한 효소 부위 MluI과 EcoRV를 이용하여 복수 클로닝 부위 (MCS) 1 내로 클로닝되고, 그리고 Hoip는 제한 효소 부위 EcoRI와 PstI를 이용하여 MCS2 내로 클로닝되었다. 상기 구조체는 ORF를 염기서열분석함으로써 확인되었다. 결과의 구조체, pBI-CMV1-Hoil1L-Hoip, 또는 빈 벡터는 293T 세포 내로 형질감염되었다. 293T 세포는 형질감염 2일전에 20개의 10 cm 평판 내로 1:20 분할되고 37℃와 5% CO2에서 성장되었다. 형질감염 당일에, 150 μL의 리포펙타민 2000이 형질감염되는 각 플라스미드에 대한 혈청을 결여하는 2.5 mL의 Opti-MEM 배지 내로 희석되었다. 또한, 50 μg의 pBI-CMV1 빈 벡터 또는 pBI-CMV1-Hoil1L-Hoip는 혈청을 결여하는 2.5 mL의 Opti-MEM 배지 내로 희석되었다. 이들 희석액은 25℃에서 5분 동안 배양되었다. 희석된 리포펙타민 및 희석된 DNA는 합동되고, 역위에 의해 부드럽게 혼합되고, 그리고 25℃에서 30분 동안 배양되었다. 500 μL의 DNA/리포펙타민 혼합물이 이후, 각각 10 cm 평판 (플라스미드마다 10개 평판)에 첨가되었다. 형질감염후 48시간 시점에, 배지는 수집되고, 그리고 세포는 평판으로부터 벗겨진다. 이들 세포는 4℃에서 10분 동안 10,000 rpm으로 스핀 다운되었다. 상층액이 제거되고, 그리고 이들 세포는 40 mL의 차가운 PBS에서 세척되었다. 이들 세포는 4℃에서 10분 동안 10,000 rpm으로 스핀 다운되었다. 상층액이 제거되고, 그리고 이들 세포는 8M 요소, 50 mM Tris pH 7.5, 25 mM NaCl, 10 μL/mL HALT 프로테아제와 포스파타아제 저해제 (Thermo Scientific), 5 mM EDTA, 그리고 2 mM NEM을 내포하는 4mL의 용해 완충액에서 재현탁되었다. 용해물은 점성을 감소시키기 위해 짧게 초음파처리되고, 이후 -80℃에서 동결되었다. Hoil-1L과 Hoip가 과다발현되는 지, 그리고 이것이 선형 폴리유비퀴틴 사슬 조립에서 증가로 이어지는 지를 결정하기 위해, 용해물은 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 1 μL의 각 용해물은 환원제를 내포하는 LDS 샘플 완충액과 혼합되고, 이후 4-12% NuPAGE Bis Tris 1.0 mm 겔 (Invitrogen) 위에 부하되고, 그리고 MES 완충액 (Invitrogen)에서 사중으로 이동되었다. 겔은 10% 메탄올을 내포하는 1X NuPAGE 이전 완충액에서 30V에서 2시간 동안 개별적으로 0.45 μm 니트로셀룰로오스로 이전되었다. 막은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 차단되고, 이후 일차 항체에서 배양되었다. 첫 번째 블롯은 PBST에서 5% 우유에서 1 μ/mL 1F11/3F5/Y102L 항-선형 폴리Ub IgG로 탐침되었다. 두 번째 블롯은 PBST에서 5% 우유에서 항-Hoil-1L/RBCK 항체 (Abcam ab38540)의 1:500 희석액으로 탐침되었다. 세 번째 블롯은 PBST에서 5% 우유에서 1 μg/mL 항-Hoip/RNF31 항체 (Abcam ab85294)로 탐침되었다. 네 번째 블롯은 PBST에서 5% 우유에서 항-β-튜불린 항체 (Cell Signaling 9F3 #2128)의 1:1000 희석액으로 탐침되었다. 블롯 1, 2와 3은 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 그들의 개별 일차 항체에서 배양되었다. 항-β-튜불린 블롯은 회전하면서, 4℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 이들 블롯은 이후, PBST0.05에서 3회 세척되고, 이후 진탕하면서, 25℃에서 1시간 동안 PBST에서 5% 우유에서 이차 항체의 1:10,000 희석액에서 배양되었다. 항-선형 폴리Ub 블롯은 염소 항-인간 F(ab)'2-HRP 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)로 탐침되고, 그리고 다른 3개의 블롯은 염소 항-토끼 F(ab)'2-HRP 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)로 탐침되었다. 이들 블롯은 이후, PBST로 3회 및 PBS로 1회 세척되었다. 이차 항체는 Super Signal West Pico 화학발광 기질 (Thermo Scientific)을 이용하여 검출되고, 그 이후에 필름에 대한 블롯의 노출이 수행되었다. 항-β-튜불린 블롯은 동등한 양의 세포가 형질감염에서 이용되고, 그리고 당량의 용해물이 겔 위에 부하되었다는 것을 증명한다 (도 22A 참조). 항-Hoil-1L과 항-Hoip 블롯은 pBI-CMV1-Hoil1L-Hoip가 형질감염될 때, Hoil-1L과 Hoip 둘 모두 이들 두 단백질의 내인성 수준에 비하여 과다발현된다는 것을 보여준다. 최종적으로, Hoil-1L과 Hoip의 과다발현은 예상된 바와 같이, 선형 폴리Ub 사슬의 수준에서 극적인 증가를 유발한다. 이들이 1F11/3F5/Y102L IgG에 의해 검출되는 것을 고려하면, 이것은 상기 항체가 내인성, 효소적으로 합성된, 선형 폴리Ub 사슬을 인식할 수 있다는 것을 지시한다.
웨스턴 블롯에 의해 이들 용해물을 탐침하는 것에 더하여, 선형 폴리Ub의 면역침전 역시 수행되었다. 500 μL의 상기 용해물은 71 μL의 50 mM Tris pH 7.5, 25 mM NaCl을 이용하여 7M 요소에 희석되었다. 이들 용해물은 이후, 회전하면서 25℃에서 1시간 동안 7M 요소, 50 mM Tris pH 7.5, 25 mM NaCl에서 200 μL의 단백질 A Dynabeads (Invitrogen)로 안정성이 사전에 보증되었다. 비드는 자성 스탠드로 포획되고, 그리고 상층액이 새로운 튜브로 이전되었다. 안정성이 사전에 보증된 용해물은 이후, 임의의 침전을 펠릿화하기 위해 5분 동안 14,000 rpm에서 회전되었다. 상층액이 새로운 튜브로 이전되고, 그리고 40 μg의 1F11/3F5/Y102L IgG 또는 아이소타입 대조 IgG가 첨가되었다. 면역침전물은 이후, 회전하면서 25℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 다음 날, 이들 IgG는 회전하면서, 25℃에서 15분 동안 7M 요소, 50 mM Tris pH 7.5, 25 mM NaCl에서 200 μL의 단백질 A Dynabeads의 첨가에 의해 포획되었다. 비드는 자성 스탠드에서 포획되고, 그리고 1 mL의 7M 요소, 50 mM Tris pH 7.5, 25 mM NaCl로 5회, 이후 1 mL의 PBS로 3회 세척되었다. 최종 세척 후, 비드는 튜브 벽에 들러붙는 임의의 단백질의 용리를 피하기 위해 새로운 튜브로 이전되었다. 비드는 이후, 환원제 (Invitrogen)를 포함하는 30 μL의 1X LDS 샘플 완충액에서 재현탁되고 70℃에서 10분 동안 용리되었다. 2개의 4-12% NuPAGE Bis Tris 1.0 mm 겔이 이동되었다: 하나는 웨스턴 블롯을 위해, 그리고 다른 하나는 질량 분석 AQUA 분석을 위한 쿠마시 염색을 위해. 웨스턴 블롯의 경우에, 10%의 각 IP가 0.1%의 각 용해물과 함께 이동되었다. 질량 분석의 경우에, 90%의 각 IP가 1%의 각 용해물과 함께 이동되었다. 1F11/3F5/Y102L로 웨스턴 블롯은 이전이 1시간 동안 수행된 점을 제외하고, 상기 단락에서 설명된 바와 같이 수행되었다. 질량 분석 AQUA 분석을 위한 겔은 Simply Blue Safe 염료 (Invitrogen)로 염색되었다. 웨스턴 블롯은 1F11/3F5/Y102L IgG가 세포 용해물로부터 선형 폴리Ub 사슬을 면역침전시킬 수 있다는 것을 증명한다 (도 22B 참조). 더욱 많은 사슬이 벡터 단독으로부터보다 LUBAC 과다발현 용해물로부터 풀다운되는데, 이것은 LUBAC가 과다발현될 때 존재하는 훨씬 높은 수준의 선형 사슬과 일관한다.
표시된 겔의 고분자량 영역은 절제되고 (도 22B 참조) 실시예 4D에서 전술한 바와 같이 질량 분석 AQUA에 종속되었다. 벡터 대조 샘플에서, 선형 폴리유비퀴틴 연쇄 없음이 입력 샘플에서 확인되었다 (표 9 참조). 확인된 폴리유비퀴틴 사슬의 대부분은 K48과 K63 연쇄이었다.
벡터 입력 벡터 아이소타입 IP 벡터 선형 IP LUBAC OE 입력 LUBAC OE 아이소타입 IP LUBAC OE 선형 IP
선형 0 0 0 4808 0 598
K11 1085 0 0 700 0 12
K48 15680 2 7 12420 1 111
K63 5128 0 4 5075 0 76
이것과 일관하게, 어떤 선형 폴리유비퀴틴도 항-선형 항체 또는 아이소타입 대조 항체를 이용한 IP에서 풀다운되지 않았다. LUBAC 과다-발현된 세포에서, 선형 폴리유비퀴틴 연쇄의 수준은 4808 pmol에 도달하는데, 이것은 존재비에서 K63 연쇄 (5075 pmol)와 유사하다. 항-선형 항체가 IP에 이용될 때, 이것은 선형 연쇄를 유의미하게 농화하고 일부 추가의 K11, K48과 K63 연쇄가 풀다운된다 (도 22C 참조). 이것은 아마도, 상이한 연쇄의 복수 동질성 사슬로 변형된 혼성 연쇄 사슬 또는 기질의 존재에 기인하는데, 그 이유는 K48과 K63 연쇄의 단지 7과 4 pmol만 각각, 벡터 대조 세포로부터 항-선형 항체에 의해 풀다운되었기 때문이다 (표 9 참조). 부가적으로, 단지 1 pmol의 K48 연쇄 및 K68 연쇄 없음이 LUBAC 과다-발현된 세포로부터 아이소타입 대조 항체를 이용한 IP에서 확인되었는데, 이것은 이들 연쇄가 단순히 점착성이 없다는 것을 지시하였다. 이것은 항-선형 항체가 내인성 선형 폴리유비퀴틴 사슬을 농화할 수 있다는 것을 증명한다 (도 22C 참조).
1F11/3F5/Y102L이 면역형광에 기능적인 지를 결정하기 위해, Hoil-1L과 Hoip를 과다-발현하는 HeLa 세포가 상기 항체로 염색되었다. HeLa 세포 (5,000 세포/100 μl/웰)는 투명한 바닥, 검은 벽 96-웰 평판에서 파종되고 24시간 동안 성장되었다. 이들 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라, 리포펙타민 2000을 이용하여 18시간 동안 Hoil/Hoip 플라스미드로 형질감염되었다. 이들 세포는 PBS로 씻겨지고, -20℃에서 10분 동안 얼음같이 차가운 메탄올로 고정되고, 실온에서 5분 동안 PBS/0.1 % Triton X-100으로 투과되고, 이후 실온에서 1시간 동안 PBS/0.3 % Triton X-100/5 % BSA로 차단되었다. 선형 유비퀴틴 항체 (1 μg/ml)는 실온에서 1시간 동안 폴리-유비퀴틴 사슬 (5 μg/ml)과 함께 또는 이들 없이 배양되고, 이후 실온에서 1시간 동안 세포를 표지하는데 이용되었다. PBS/0.05 % Triton X-100으로 6회 세척 (각각 10분) 후, 이들 세포는 실온에서 1시간 동안 DyLight488-접합된 당나귀 항-인간 항체 (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories)로 염색되었다. 이들 세포는 이후, 0.05 % Triton X-100을 내포하는 PBS로 6회 (각각 10분) 세척되고, 실온에서 10분 동안 Hoechst (1:10,000)로 염색되고, 그리고 PBS로 세척되었다. 평판은 검은 봉인으로 덮어지고 ImageXpress Micro 영상 시스템을 이용하여 영상되었다. 형질감염되지 않은 세포는 1F11/3F5/Y102L로 염색될 때 어떤 신호도 보이지 않지만, Hoil-1L과 Hoip를 과다-발현하는 세포는 세포질 반점 염색 패턴을 보였다 (도 22D 참조). 이러한 염색은 선형 폴리유비퀴틴 사슬에 대해 특이적이었는데, 그 이유는 이것이 재조합 선형 폴리유비퀴틴의 첨가에 의해 차단될 수 있었기 때문이다.
실시예 5 - 선형 디유비퀴틴에 Fab 결합의 구조 분석
항-선형 Fab와 선형 폴리유비퀴틴의 상호작용을 더욱 많이 이해하기 위하여, 1F11/3F5/Y102L Fab는 선형 디유비퀴틴과 공동-결정화되었다. 1F11/3F5/Y102L의 Fab 단편은 대장균 (E. coli)에서 발현되고 실시예 1E에서 전술한 바와 같이, 단백질 A 칼럼 위에서 정제되었다. 상기 Fab는 20 mM MES, pH 5.5, 0.5 M NaCl의 0-100% 선형 구배를 갖는 20 mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES), pH 5.5에서 5 mL SP HiTrap 칼럼 (GE Healthcare) 위에서 더욱 정제되었다. Fab 단편을 내포하는 분획물은 모아지고 25 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl에서 320 mL S75 사이징 칼럼 (GE Healthcare) 위에서 이동되었다. Fab 단편을 내포하는 분획물은 모아지고 22 mg/mL로 농축되었다.
표준 펩티드 결합을 통한 2개 유비퀴틴 아단위의 두미 융합 (선형 디유비퀴틴) 역시 대장균 (E. coli)에서 발현되었다. BL21-Gold (Agilent Technologies) 세포는 pET15b 벡터 (Novagen)에서 작제된 선형 디유비퀴틴 발현 플라스미드로 형질전환되었다. 이러한 구조체는 T7 프로모터 및 lac 오퍼레이터의 제어 하에 N-말단 His6 태그 (서열 번호: 376), 그 이후에 트롬빈 개열 부위를 갖는다. LB 배지에서 성장된 pET15b-선형 디유비퀴틴 발현 플라스미드로 형질전환된 BL21-Gold의 하룻밤 배양액은 1% 글리세롤, 0.1 M MOPS, pH 7.3, 그리고 50 μg/mL 카르베니실린을 내포하는 1L의 가온된 Terrific 액체배지 내로 50-배 희석되었다. 배양액은 250 rpm에서 진탕하면서, 37℃에서 2.5L 초-수율 플라스크 (Thomson)에서 OD600 = 1.64까지 성장되었다. 발현은 0.5 mM IPTG를 첨가함으로써 유도되고, 그리고 배양액은 250 rpm에서 진탕하면서, 16℃에서 하룻밤 동안 성장되었다. 다음 날, 이들 세포는 8K rpm에서 10분 동안 회전시킴으로써 펠릿화되고, 그리고 이들 펠릿은 액체 질소에서 동결되었다. 세포는 재현탁되고, 그리고 3회 미세유동화에 의해 40 mM Tris, pH 8.0, 0.3 M NaCl 및 완전 EDTA-없음 프로테아제 저해제 정제 (Roche)에서 용해되었다. 세포 잔해물은 10K rpm에서 1시간 동안 회전시킴으로써 펠릿화되고, 그리고 상층액이 0.45 μM 낮은 단백질-결합 필터를 통해 여과되었다. His6-diUb ('His6'은 서열 번호: 376으로서 개시됨)는 5 mL Ni-NTA 아가로오스 (Qiagen) 칼럼 위에서 정제되었다. 칼럼은 12 칼럼 부피의 완충액 A (20 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCl, 20 mM 이미다졸)로 세척되고 4 칼럼 부피의 완충액 B (20 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCl, 250 mM 이미다졸)로 용리되었다. 디유비퀴틴의 발현은 칼럼의 결합능을 초과할 만큼 높았고, 그리고 일부 디유비퀴틴은 완충액 A로 세척에서 용리되었다. 따라서 세척 물질은 두 번째 5 mL Ni-NTA 아가로즈 칼럼 위에서 이동되고 전술한 바와 같이 정제되었다. His6 태그 (서열 번호: 376)는 3500 MWCO 투석 관 (Spectrum Medical)을 이용하여 25 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2 내로 투석하면서, 4℃에서 3일 동안 1800 단위의 트롬빈 (GE Healthcare)으로 개열함으로써 제거되었다. 투석되고 개열된 물질은 절반씩 분할되고, 그리고 유리 디유비퀴틴은 2개의 5 mL Ni-NTA 아가로오스 칼럼을 이용하여 His6 태그 (서열 번호: 376)로부터 분리되었다. 통과액 및 모든 세척액은 수집되었다. 칼럼은 4 칼럼 부피의 완충액 C (25 mM Tris, pH 8.0, 0.5 M NaCl), 4 칼럼 부피의 완충액 D (25 mM Tris, pH 8.0, 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸), 그리고 이후, 1 칼럼 부피의 완충액 E (25 mM Tris, pH 8.0, 0.5 M NaCl, 250 mM 이미다졸)로 세척되었다. 태그 제거된 디유비퀴틴의 존재는 18% Novex 트리스-글리신 겔 (Invitrogen) 상에 통과액 및 각 세척액으로부터 샘플을 이동시키고, 그리고 Simply Blue Safe 염료 (Invitrogen)로 염색함으로써 모니터링되었다. 태그 제거된 디유비퀴틴의 대부분은 통과액, 완충액 C로 세척액, 그리고 완충액 D로 세척액 내에 존재하였다. 이들은 모아지고, 농축되고, 그리고 25 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl에서 320 mL S75 사이징 칼럼 (GE Healthcare) 위에서 더욱 정제되었다. 디유비퀴틴을 내포하는 분획물은 모아지고 15.3 mg/mL로 농축되었다.
Fab/디유비퀴틴 복합체는 3-배 몰 과잉의 선형 디유비퀴틴 대 Fab를 이용하여 셋업되고 4℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 복합체는 이후, 25 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl에서 320 mL S75 사이징 칼럼 (GE Healthcare) 위에서 정제되었다. 복합체를 내포하는 분획물은 모아지고 20 mg/mL로 농축되었다.
결정은 0.2 μL의 1F11/3F5/Y102L Fab/선형 디유비퀴틴 복합체 (25 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl에서 20 mg/mL 복합체) 및 0.2 μL의 모액 (20% 이소프로판올, 0.1 M MES, pH 6.0, 20% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 2K 모노메틸에테르 (MME))을 내포하는 드롭 (drop)에서 시팅 드롭 증기 확산 (sitting drop vapor diffusion) 방법을 이용하여 성장되었다. 초기 결정은 19℃에서 27일 동안 이들 조건 하에 성장하였다. 결정은 2 μL의 1F11/3F5/Y102L Fab/선형 디유비퀴틴 복합체 (25 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl에서 20 mg/mL 복합체) 및 3 μL의 모액 (18% 이소프로판올, 0.09 M MES, pH 6.0, 19.8% PEG 2K MME, 10 mM 브롬화나트륨)을 포함하는 마이크로브리지를 이용하여 시팅 드롭에서 최적화되었다. 결정은 19℃에서 5일 동안 성장하고, 그리고 단일, 회절 결정을 획득하기 위해 조작될 수 있었다. 결정은 추가의 25-30% PEG 2K MME과 함께, 20% 이소프로판올, 0.1 M MES, pH 6.0, 20% PEG 2K MME를 이용하여 저온 보호되었다. 결정학적 데이터가 Berkeley Advanced Light Source beamline 5.0.2에서 수집되고 HKL2000을 이용하여 처리되었다. 결정은 단위 세포 치수 a=53 Å, b=60 Å, c=96 Å, α=87°, β=77°, 그리고 γ=72°를 갖는 P1 공간 군 (space group)에 속하였고, 2개의 복합체가 비대칭 단위에 있었다. 이러한 구조는 프로그램 Phaser, 그리고 인간화 4D5 Fab 단편 (4D5에 대한 PDB 코드: 1FVE)과 인간 모노유비퀴틴 (PDB 코드: 1UBQ)의 변이체의 좌표를 이용한 분자 대체 (molecular replacement)에 의해 해결되었다. 모델 구축은 Coot에서 수행되고, 그리고 구조는 Phenix를 이용하여 정밀화되었다. 상기 구조의 해결은 2.43 Å이고, 그리고 복합체는 22.8%의 R 및 25.0%의 Rfree로 정밀화되었다 (도 23. 패널 A 참조).
상기 구조의 분석은 디유비퀴틴에 결합의 대부분이 중쇄 CDR과의 접촉을 통해 매개된다는 것을 지시한다. 경쇄와 디유비퀴틴 사이에 매몰된 표면적 없음과 대조적으로, 중쇄와 디유비퀴틴 사이에 785 Å2의 매몰된 표면적이 존재한다. 구조 에피토프와 파라토프는 결합 시에 그들의 용매 접근가능 표면적의 적어도 25% (도 23 패널 B와 C 참조)를 매몰하고 및/또는 상호작용 사슬의 4.5 Å 내에 적어도 하나의 원자 (표 10과 11 참조)를 갖는 잔기로서 정의된다.
표 10 - 용매 접근가능 표면적의 적어도 25%가 중간면에서 매몰된 잔기 (표 10에서는 잔기 52-57과 96-100을 각각, 서열 번호 377과 378로서 개시한다)
Figure pct00019

표 11 - 적어도 1개 원자가 Fab 또는 diUb의 4.5Å 내에 있는 잔기 (표 11에서는 잔기 52-57, 96-100, 31-37, 70-76과 60-63을 각각, 서열 번호 377-381로서 개시한다)
Figure pct00020

Fab 파라토프를 구성하는 15개 중쇄 잔기 및 단지 5개 경쇄 잔기가 존재한다. 디유비퀴틴 에피토프는 원위 Ub로부터 18개 잔기 (연쇄에 관련된 C-말단) 및 근위 유비퀴틴으로부터 8개 잔기 (연쇄에 관련된 N-말단)로 구성된다. 접촉 중간면은 또한, 중쇄와 디유비퀴틴 사이에 9개의 수소 결합 및 경쇄와 디유비퀴틴 사이에 3개의 수소 결합으로 구성된다 (표 12 참조).
선형 연쇄 자체와 배타적인 접촉을 만들기 보다는, 특이성은 근위와 원위 유비퀴틴 둘 모두로부터 표면 잔기와의 복수 상호작용으로부터 유래되는 것으로 보인다.
표 12 - Fab와 diUb 사이에 H-결합의 요약
Figure pct00021

모노유비퀴틴 구조 (PDB 코드 1UBQ) 내에서 Lys63 및 단지 ~6 Å 이격된 유리 아미노-말단에 기인한 유사한 구조를 채택하는 유리 선형 폴리유비퀴틴과 유리 K63-연결된 폴리유비퀴틴 사슬에도 불구하고, 이러한 항체는 선형 사슬에 우선적으로 결합한다. 이러한 특이성은 근위와 원위 유비퀴틴 아단위 둘 모두의 상대적 방향의 이중 인식을 통해 달성된다. 근위 유비퀴틴의 인식은 CDR H2 잔기와 근위 아단위의 60 루프의 상호작용을 통해 달성된다. 특히, 2개의 수소 결합이 근위 유비퀴틴의 Gln62의 측쇄로 만들어지고, 이들 둘 모두 CDR H2의 잔기를 수반한다. 하나는 Pro52a의 주쇄 카르보닐 산소 및 Gln62의 측쇄 아민 사이에 있다. 다른 하나는 Gly55의 주쇄 아미드 및 Gln62의 측쇄 카르보닐 사이에 있다. 또한, Ser54의 주쇄 카르보닐 및 Lys63의 주쇄 아미드 사이에 세 번째 수소 결합이 있다. 이들 3개의 수소 결합에 더하여, 다수의 반 데르 발스 상호작용 역시 CDR H2와 근위 유비퀴틴 사이에서 발생한다. 비록 K63-연결된 디유비퀴틴의 원위 유비퀴틴이 이론적으로, 동일한 방향에서 항체에 결합할 수 있지만, 근위 유비퀴틴은 Met1과 Lys63의 위치에서 ~6 Å 차이로 인하여 약간 회전될 것이다. 이러한 회전은 아마도, CDR H2와 60의 루프 사이에 수소 결합 및 반 데르 발스 상호작용을 파괴할 것이다. 이런 이유로, 특이성은 선형 연쇄로부터 발생하는 근위와 원위 유비퀴틴의 상대적인 공간적 방향의 인식에 의해 인코딩된다.
상기 구조는 또한, 친화성 성숙에서 선별된 특정 돌연변이가 친화성을 증가시키는데 도움을 주는 이유를 설명한다. CDR H2에서, 웨스턴 블롯에서 민감성에서 가장 유의미한 향상을 유발하는 돌연변이는 S56Q이었다 (도 13, 클론 3F5 참조). 상기 구조는 Gln56이 2개의 수소 결합을 만든다는 것을 증명한다: 원위 유비퀴틴의 Gly75의 카르보닐 산소와의 수소 결합 및 원위 유비퀴틴의 Gly76의 카르보닐 산소와의 두 번째 수소 결합, 이것은 원위와 근위 유비퀴틴 사이에서 선형 연쇄에 참여한다 (도 24, 패널 A 참조). Ser의 더욱 짧은 측쇄는 아마도, 이들 잔기가 수소 결합을 만드는데 이르지 못하도록 할 것이다. 웨스턴 블롯에서 민감성에서 두 번째로 큰 향상을 유발하는 돌연변이는 CDR L2에서 S52K이었다 (도 13, 클론 1F11 참조). Lys52는 원위 유비퀴틴의 알파 나선의 카르복시-말단 단부에서 발견되는 Asp32에 인접하게 배치된다. 비록 Lys52가 Asp32의 측쇄와 염 가교 (salt bridge)를 만들기에는 너무 멀리 떨어져 있긴 하지만, 이것이 나선 쌍극자 (helix dipole)의 음성 단부를 향하여 배향된다는 점을 고려하면, 우호적인 정전 상호작용을 만들지도 모른다 (도 24, 패널 B 참조). 항체의 민감성을 향상시키는 세 번째 돌연변이는 CDR H3에서 Y102L이었다 (도 13, 클론 Y102L 참조). 비록 이러한 잔기가 디유비퀴틴에 접촉하진 않지만, 이것은 향상된 결합을 위한 CDR H3의 우호적인 입체형태를 안정화시키는데 도움을 줄 수 있다. Leu102는 중쇄의 뼈대 1의 Val2와 Leu4 사이에 끼어들어간다 (도 24, 패널 C 참조). Leu의 더욱 소수성 측쇄는 Tyr보다는 Val2와 Leu4와의 더욱 우호적인 상호작용을 제공할 수 있고, 그리고 디유비퀴틴과의 접촉을 만들도록 CDR H3의 나머지 부분을 위치시키는데 도움을 줄지도 모른다.
비록 전술한 발명이 이해의 명료의 목적으로 예시와 실례에 의해 상당히 상세하게 설명되긴 했지만, 상세한 설명과 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 모든 특허와 과학 문헌의 개시는 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
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<221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Leu, Gly, Val or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu, Ser or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Arg, Lys or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Trp, Leu, Gly or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Val, Leu, Ala or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Val, Pro or not present <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Met or Phe <400> 43 Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ala Xaa Asp 1 5 10 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Asp, Ala, Glu, Gly, Leu, Asn, Ser, Thr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Val, Ala, Leu or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser, Phe, Gly, Leu, Arg or Val <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Thr, Gly, Ile, Asn, Ser or Val <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ala, His, Gln, Arg, Ser or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Val or Leu <400> 44 Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 1 5 10 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Ala or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser, Lys, Gln or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Phe or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu, Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Val, Trp or Tyr <400> 45 Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> His or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Tyr, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Val or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Thr, Ile, Gln, Arg, Ser or Val <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Thr, Ala, Asp, Phe, Gly, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser or Val <400> 46 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Pro Thr 1 5 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ala, Phe, Lys, Met, Gln, Arg or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Asn or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Thr, Ala, Ile, Leu, Met or Val <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ile, Met or Val <400> 47 Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Ser 1 5 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ile, Ser or Val <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ser, His, Ile, Leu, Met or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Asp or Asn <400> 48 Ala Xaa Xaa Thr Pro Xaa Ser Gly Xaa Thr Xaa 1 5 10 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Leu or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Leu, Ile or Val <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Met or Phe <400> 49 Xaa Trp Xaa Xaa Arg Trp Val Xaa Asp 1 5 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Tyr Val Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Gln Val Ala 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Ala 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Arg Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Gly Ala Val Ala 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Arg Ala Ser Gln Ala Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Arg Ala Ser Gln Leu Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Ser Ala Lys Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Ser Arg Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Ser Ala Arg Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Ser Ala Ser Phe Ser Tyr Ser 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Ser Ala Ser Phe Met Tyr Ser 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Ser Ala Ser Phe Asn Tyr Ser 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Gln Gln Ser Tyr Thr Ala Pro Pro Thr 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Gln Gln Ser Tyr Thr Gln Pro Pro Thr 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Gln Gln Ser Arg Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Pro Thr 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Gln Gln Ser Val Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Gln Gln Ser Tyr Thr Pro Pro Pro Thr 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Gln Gln Ser Tyr Val Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Gln Gln Ser Tyr Thr Gly Pro Pro Thr 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Gln Gln Ser Tyr Thr Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 73 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Phe Asn Thr Tyr Ile Ser 1 5 <210> 74 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Ser Asn Leu Tyr Ile Ser 1 5 <210> 75 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Gln Asn Thr Tyr Ile Ser 1 5 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 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<400> 88 Thr Trp Leu Leu Arg Trp Val Phe Asp 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Thr Trp Leu Leu Arg Trp Val Met Asp 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Thr Trp Leu Leu Arg Trp Val Met Asp 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Thr Trp Leu Leu Arg Trp Val Met Asp 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Thr Trp Leu Leu Arg Trp Val Met Asp 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Thr Trp Leu Leu Arg Trp Val Phe Asp 1 5 <210> 94 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 94 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Lys Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 95 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Pro Ser Ser Gly Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 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Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 100 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 tcttgtgaca aaactcacag tggcggtggc tctggt 36 <210> 101 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 tgtgacaaaa ctcacctcag tggcggtggc tctggttccg gtgattttga ttatgaaaag 60 <210> 102 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacataa agtggcggtg gctctggttc cggtg 55 <210> 103 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 caccggaacc agagccaccg ccactttatg tgtgagtttt gtcacaagat ttggg 55 <210> 104 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 gtcaccatca cctgctaagc cagtcaggat gtg 33 <210> 105 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 gaagcttctg atttactaag catccttcct ctac 34 <210> 106 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 gcaacttatt actgttaaca atcttatact actc 34 <210> 107 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 gccgtctatt attgtgctcg ttaagccggg tcccgcttgt tgtcg 45 <210> 108 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgt gaggcctcgt aactgccccc ctacgttatg 60 gactactggg gtcaaggaac actagtc 87 <210> 109 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 catcacctgc cgtgccagtt aatccgtgtc cagcgctgta g 41 <210> 110 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 cttctgattt actcggcata aagcctctac tctggagtc 39 <210> 111 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 gcaacttatt actgtcagta atattattat tattctccg 39 <210> 112 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 gccgtctatt attgtgctta aggttacgtt tggaaaggtg 40 <210> 113 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> a, c, t or g <400> 113 acctgccgtg ccagtcagrd trktrvwanw thtgtagcct ggtatcaaca gaaac 55 <210> 114 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> a, c, t or g <400> 114 acctgccgtg ccagtcagrd trktrvwanw thtctggcct ggtatcaaca gaaac 55 <210> 115 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 ccgaagcttc tgatttackb ggcatccavc ctctactctg gagtccct 48 <210> 116 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 ccgaagcttc tgatttackb ggcatccavc ctcgmatctg gagtcccttc tcgc 54 <210> 117 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (31)..(31) <223> a, c, t or g <400> 117 gcaacttatt actgtcagca atmtdmcrvt nhtcctykga cgttcggaca gggtacc 57 <210> 118 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (31)..(31) <223> a, c, t or g <400> 118 gcaacttatt actgtcagca atmtdmcrvt nhtccttwta 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (25)..(48) <223> a, c, t or g <400> 128 gccgtctatt attgtgctcg tgagnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnat ggactactgg 60 ggtcaaggaa cc 72 <210> 129 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (25)..(27) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (31)..(33) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (37)..(42) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (52)..(54) <223> a, c, t or g <400> 129 ggtaagggcc tggaatgggt tgctnnnatt nnncctnnnn nnggttatac tnnntatgcc 60 gatagcgtca agggccg 77 <210> 130 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (22)..(33) <223> a, c, t or g <400> 130 gcagcttctg gcttcacctt cnnnnnnnnn nnnattcact gggtgcgtca ggcc 54 <210> 131 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (28)..(30) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (34)..(42) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (46)..(48) <223> a, c, t or g <400> 131 gacactgccg tctattattg tgctcgtnnn tggnnnnnnn nntggnnnat ggactactgg 60 ggtcaaggaa ccctg 75 <210> 132 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (25)..(27) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (31)..(33) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (37)..(42) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (52)..(54) <223> a, c, t or g <400> 132 ggtaagggcc tggaatgggt tgctnnnatt nnncctnnnn nnggttctac tnnntatgcc 60 gatagcgtca agggccg 77 <210> 133 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (22)..(33) <223> a, c, t or g <400> 133 gcagcttctg gcttcacctt cnnnnnnnnn nnnattagct gggtgcgtca ggcc 54 <210> 134 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 gccagtcagg atgtgtccta agctgtagcc tggtatcaac 40 <210> 135 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 ctgatttact cggcatccta actctactct ggagtccctt c 41 <210> 136 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 cttattactg tcagcaatct tattaaactc ctcccacgtt cggacag 47 <210> 137 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 ggcttcacct tcagtaatta atatattagc tgggtgcgtc 40 <210> 138 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 gttgcttcta ttactcctta aagcggttct actgactatg 40 <210> 139 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 gctcgtacct ggttgctcta atgggttatg gactactgg 39 <210> 140 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (23)..(24) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 140 catcacctgc cgtgccagtc agnnkgtgtc cactgctgta gcctggtatc aacagaaacc 60 agg 63 <210> 141 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (26)..(27) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 141 catcacctgc cgtgccagtc aggatnnktc cactgctgta gcctggtatc aacagaaacc 60 agg 63 <210> 142 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (29)..(30) <223> a, 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<220> <221> modified_base <222> (28)..(29) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 149 gctccgaagc ttctgattta ctcggcannk ttcctctact ctggagtccc ttctcgcttc 60 tctg 64 <210> 150 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (31)..(32) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 150 gctccgaagc ttctgattta ctcggcatcc nnkctctact ctggagtccc ttctcgcttc 60 tctg 64 <210> 151 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (34)..(35) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 151 gctccgaagc ttctgattta ctcggcatcc ttcnnktact ctggagtccc ttctcgcttc 60 tctg 64 <210> 152 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (37)..(38) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 152 gctccgaagc ttctgattta 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (28)..(29) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 156 gcaacttatt actgtcagca atcttatnnk actcctccca cgttcggaca gggtaccaag 60 <210> 157 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (31)..(32) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 157 gcaacttatt actgtcagca atcttatact nnkcctccca cgttcggaca gggtaccaag 60 <210> 158 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (34)..(35) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 158 gcaacttatt actgtcagca atcttatact actnnkccca cgttcggaca gggtaccaag 60 <210> 159 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (37)..(38) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 159 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (31)..(32) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 163 gcagcttctg gcttcacctt cagtaatact nnkattagct gggtgcgtca ggccccg 57 <210> 164 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (34)..(35) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 164 gcagcttctg gcttcacctt cagtaatact tatnnkagct gggtgcgtca ggccccg 57 <210> 165 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (37)..(38) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 165 gcagcttctg gcttcacctt cagtaatact tatattnnkt gggtgcgtca ggccccg 57 <210> 166 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (22)..(23) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 166 ggtaagggcc 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Claims (56)

  1. C-말단에서 N-말단 연쇄를 포함하는 첫 번째 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에 있어서, 상기 항체는 리신 연쇄를 포함하는 두 번째 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  2. C-말단에서 N-말단 연쇄를 포함하는 첫 번째 폴리유비퀴틴 및 리신 연쇄를 포함하는 두 번째 폴리유비퀴틴 둘 모두에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에 있어서, 상기 항체는 모노유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않고, 그리고 상기 항체는 첫 번째 폴리유비퀴틴에 대한 항체의 결합 친화성과 비교하여 실질적으로 감소된 결합 친화성으로 두 번째 폴리유비퀴틴에 결합하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  3. C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에 있어서, 상기 항체는 모노유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  4. 청구항 3에 있어서, 각각 서열 번호: 1, 4, 19와 50-57; 서열 번호: 2와 58-63; 서열 번호: 3, 5, 6, 20, 21과 64-72; 서열 번호: 7, 10, 13, 16, 22와 73-81; 서열 번호: 8, 11, 14, 17, 23, 24와 82-86; 그리고 서열 번호: 9, 12, 15, 18과 87-93 중에서 하나의 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3에서 선택되는 적어도 하나의 초가변 (HVR) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  5. 청구항 3에 있어서, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하고, 여기서 HVR-L1은 아미노산 서열 RASQX1VX2X3X4VA (서열 번호: 39)를 포함하고, 여기서 아미노산 X1은 아미노산 D, S와 G에서 선택되고, 아미노산 X2는 S와 D에서 선택되고, 아미노산 X3은 S, T와 N에서 선택되고, 아미노산 X4는 A와 S에서 선택되고; 여기서 HVR-L2는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 여기서 HVR-L3은 아미노산 서열 QQX5X6X7X8X9PX10T (서열 번호: 40)을 포함하고, 여기서 아미노산 X5는 S, Y와 H에서 선택되고, 아미노산 X6은 Y와 F에서 선택되고, 아미노산 X7은 T, Y와 A에서 선택되고, 아미노산 X8은 T, Y와 S에서 선택되고, 아미노산 X9는 선택적이고 존재하면 S이고, 아미노산 X10은 P와 L에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  6. 청구항 3에 있어서, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하고, 여기서 HVR-H1은 아미노산 서열 X11X12X13X14X15X16X17X18 (서열 번호: 41)을 포함하고, 여기서 아미노산 X11은 T와 N에서 선택되고, 아미노산 X12는 F와 I에서 선택되고, 아미노산 X13은 S, T와 Y에서 선택되고, 아미노산 X14는 N, D, S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X15는 T, Y, S와 D에서 선택되고, 아미노산 X16은 Y, D와 S에서 선택되고, 아미노산 X17은 I와 M에서 선택되고, 아미노산 X18은 S와 H에서 선택되고; 그리고 여기서 HVR-H2는 아미노산 서열 AX19 IX20X21X22X23X24X25TX26 (서열 번호: 42)을 포함하고, 여기서 아미노산 X19는 S, G, W와 E에서 선택되고, 아미노산 X20은 T, S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X21은 P와 S에서 선택되고, 아미노산 X22는 S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X23은 G, S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X24는 G와 S에서 선택되고, 아미노산 X25는 S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X26은 D와 S에서 선택되고, 그리고 여기서 HVR-H3은 아미노산 서열 RX27X28X29X30X31X32X33X34X35X36X37D (서열 번호: 43)을 포함하고, 여기서 아미노산 X27은 T, E와 G에서 선택되고, 아미노산 X28은 W, A와 Y에서 선택되고, 아미노산 X29는 L, G, V와 S에서 선택되고, 아미노산 X30은 L, S와 W에서 선택되고, 아미노산 X31은 R, K와 Y에서 선택되고, 아미노산 X32는 W, L, G와 Y에서 선택되고, 아미노산 X33은 V, L, A와 G에서 선택되고, 아미노산 X37은 M과 F에서 선택되고, 그리고 여기서 아미노산 X34, X35, 그리고 X36은 선택적으로 존재하고 존재하면, 아미노산 X34는 S이고, 아미노산 X35는 V와 P에서 선택되고, 그리고 아미노산 X36은 A인 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  7. 청구항 3에 있어서, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하고, 여기서 HVR-L1은 아미노산 서열 RASQ X38X39X40X41X42X43A (서열 번호: 44)를 포함하고, 여기서 아미노산 X38은 D, A, E, G, L, N, S, T와 V에서 선택되고, 아미노산 X39는 V, A, L와 S에서 선택되고, 아미노산 X40은 S, F, G, L, R과 V에서 선택되고, 아미노산 X41은 T, G, I, N, S와 V에서 선택되고, 아미노산 X42는 A, H, Q, R, S와 Y에서 선택되고, 아미노산 X43은 V와 L에서 선택되고, 그리고 여기서 HVR-L2는 아미노산 서열 SX44X45X46X47YX48 (서열 번호: 45)을 포함하고, 여기서 아미노산 X44는 A와 R에서 선택되고, 아미노산 X45는 S, K, Q와 R에서 선택되고, 아미노산 X46은 F와 Y에서 선택되고, 아미노산 X47은 L, A, F, G, H, I, K, M, N, P, R, S, V와 Y에서 선택되고, 아미노산 X48은 S, A, D, F, G, H, V, W와 Y에서 선택되고, 그리고 여기서 HVR-L3은 서열 QQ X49X50X51X52PPT (서열 번호: 46)를 포함하고, 여기서 아미노산 X49는 H와 S에서 선택되고, 아미노산 X50은 Y, K, N, Q, R, S, V와 W에서 선택되고, 아미노산 X51은 T, I, Q, R, S와 V에서 선택되고, 아미노산 X52는 T, A, D, F, G, K, N, P, Q, R, S와 V에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  8. 청구항 3에 있어서, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하고, 여기서 HVR-H1은 아미노산 서열 X53X54X55YX56S (서열 번호: 47)를 포함하고, 여기서 아미노산 X53은 A, F, K, M, Q, R과 S에서 선택되고, 아미노산 X54는 N과 W에서 선택되고, 아미노산 X55는 T, A, I, L, M과 V에서 선택되고, 아미노산 X56은 I, M과 V에서 선택되고, 그리고 여기서 HVR-L2는 아미노산 서열 AX57X58TPX59SGX60TX61 (서열 번호:48)을 포함하고, 여기서 아미노산 X57은 T와 S에서 선택되고, 아미노산 X58은 I, S와 V에서 선택되고, 아미노산 X59는 S와 A에서 선택되고, 아미노산 X60은 S, H, I, L, M과 Q에서 선택되고, 아미노산 X61은 D와 N에서 선택되고, 그리고 여기서 HVR-H3은 아미노산 서열 X62WX63X64RWVX65D (서열 번호: 49)를 포함하고, 여기서 아미노산 X62는 S와 T에서 선택되고, 아미노산 X63은 L과 Y에서 선택되고, 아미노산 X64는 L, I와 V에서 선택되고, 아미노산 X65는 M과 F에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  9. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 1 또는 4의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 그리고 서열 번호: 3, 5와 6에서 선택되는 HVR-L3 서열을 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  10. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 7, 10, 13과 16에서 선택되는 HVR-H1 서열, 서열 번호: 8, 11, 14와 17에서 선택되는 HVR-H2 서열, 그리고 서열 번호: 9, 12, 15와 18에서 선택되는 HVR-H3 서열을 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  11. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 1 또는 19의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 그리고 서열 번호: 3, 20과 21에서 선택되는 HVR-L3 서열을 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  12. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 10 또는 22의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 11, 23과 24에서 선택되는 HVR-H2 서열, 서열 번호: 12의 HVR-H3 서열을 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  13. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 1과 50-57에서 선택되는 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2와 58-63에서 선택되는 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3과 64-72에서 선택되는 HVR-L3 서열을 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  14. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 7과 73-81에서 선택되는 HVR-H1 서열, 서열 번호: 8과 82-86에서 선택되는 HVR-H2 서열, 서열 번호: 9와 87-93에서 선택되는 HVR-H3 서열을 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  15. 청구항 3에 있어서, 도 2A, 5A 또는 9A에서 클론 1E3, 1D8, 1F4, 1A10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 3F5, Y102L, 1F11/3F5/Y102L에 대해 진술된 것들에 상응하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  16. 청구항 3에 있어서, 도 2B, 5B 또는 9B에서 클론 1E3, 1D8, 1F4, 1A10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 3F5, Y102L, 1F11/3F5/Y102L에 대해 진술된 것들에 상응하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  17. 청구항 3에 있어서, 표 5에서 설명된 클론에 대해 진술된 것들에 상응하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  18. 청구항 3에 있어서, 표 5에서 설명된 클론에 대해 진술된 것들에 상응하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  19. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 10의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 11의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 12의 HVR-H3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  20. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 19의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 10의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 23의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 12의 HVR-H3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  21. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 20의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 10의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 11의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 12의 HVR-H3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  22. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 21의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 22의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 24의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 12의 HVR-H3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  23. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 7의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 8의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 9의 HVR-H3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  24. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2, 58과 60에서 선택되는 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3, 65와 72에서 선택되는 HVR-L3 서열, 서열 번호: 7 또는 80의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 8 또는 82의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 9, 87, 89 또는 90에서 선택되는 HVR-H3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  25. 청구항 24에 있어서, 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 58의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 7의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 8의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 9의 HVR-H3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  26. 청구항 24에 있어서, 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 2의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 7의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 82의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 9의 HVR-H3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  27. 청구항 24에 있어서, 서열 번호: 1의 HVR-L1 서열, 서열 번호: 58의 HVR-L2 서열, 서열 번호: 3의 HVR-L3 서열, 서열 번호: 7의 HVR-H1 서열, 서열 번호: 82의 HVR-H2 서열 및 서열 번호: 9의 HVR-H3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  28. 청구항 27에 있어서, HVR-H3의 C-말단 후 첫 번째 아미노산은 류신인 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  29. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 25-28, 33-35, 94와 193-195에서 선택되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  30. 청구항 3에 있어서, 서열 번호: 29-32, 36-38, 95와 196-198에서 선택되는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  31. 청구항 3에 있어서, 서열의 하기 조합 중에서 하나의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄와 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체: 서열 번호 25와 29; 서열 번호: 26과 30; 서열 번호: 27과 31; 서열 번호: 28과 32; 서열 번호: 33과 36; 서열 번호: 34와 37; 서열 번호: 35와 38; 서열 번호: 94와 95; 서열 번호: 193과 196; 서열 번호: 194와 197; 그리고 서열 번호: 195와 198.
  32. 청구항 31에 있어서, 서열 번호: 94와 95의 경쇄와 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  33. C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴 상에서 청구항 1 내지 32중 어느 한 항의 항체와 동일한 항원성 결정인자에 결합하는 단리된 항체에 있어서, 상기 항체는 모노유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  34. 폴리유비퀴틴에 결합에 대해 청구항 1 내지 32중 어느 한 항의 항체와 경쟁하는 단리된 항체에 있어서, 상기 항체는 모노유비퀴틴에 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  35. 청구항 1 내지 32중 어느 한 항에 있어서, C-에서 N-말단 연결된 폴리유비퀴틴화 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  36. 청구항 1 내지 32중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폴리유비퀴틴-매개된 신호전달 경로를 조절하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  37. 청구항 1 내지 32중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴에 결합하는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  38. 청구항 1 내지 32중 어느 한 항의 단리된 항체를 인코딩하는 단리된 핵산.
  39. 청구항 38의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  40. 청구항 38의 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  41. 청구항 1 내지 37중 어느 한 항의 단리된 항체를 생산하는 방법에 있어서, 청구항 31의 숙주 세포를 상기 항체가 생산되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 항체를 숙주 세포로부터 회수하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 청구항 1 내지 37중 어느 한 항의 단리된 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
  44. 청구항 1 내지 37중 어느 한 항의 단리된 항체 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 제제.
  45. 청구항 44에 있어서, 추가의 치료제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 제제.
  46. 청구항 1 내지 37중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 이용되는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  47. 청구항 1 내지 37중 어느 한 항에 있어서, 세포 주기-관련된 질환 또는 장애를 치료하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  48. 청구항 47에 있어서, 세포 주기-관련된 질환 또는 장애는 비정상적으로 증가된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애 및 비정상적으로 감소된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  49. 청구항 48에 있어서, 비정상적으로 증가된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애는 암인 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  50. 청구항 48에 있어서, 비정상적으로 감소된 세포 주기 진행과 연관된 질환 또는 장애는 퇴행성 근육 질환 및 퇴행성 신경 질환에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 항체.
  51. 약제의 제조에서 청구항 1 내지 37중 어느 한 항의 단리된 항체의 용도.
  52. 청구항 51에 있어서, 약제는 암, 퇴행성 근육 질환, 그리고 퇴행성 신경 질환에서 선택되는 질환 또는 장애를 위한 것을 특징으로 하는 용도.
  53. 암, 퇴행성 근육 질환, 그리고 퇴행성 신경 질환에서 선택되는 질환 또는 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법에 있어서, 청구항 1 내지 37중 어느 한 항의 단리된 항체의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 폴리유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴화 단백질을 내포하는 것으로 의심되는 샘플 내에서 폴리유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴화 단백질의 존재를 결정하는 방법에 있어서, 이를 청구항 1 내지 37중 어느 한 항의 적어도 하나의 항체에 노출시키고, 그리고 샘플 내에서 폴리유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴화 단백질에 적어도 하나의 항체의 결합을 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 샘플 내에서 C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴화 단백질을 비-C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴화 단백질로부터 분리하는 방법에 있어서, 샘플을 청구항 1 내지 37중 어느 한 항의 적어도 하나의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 세포 또는 샘플 내에서 C-에서 N-말단-연결된 폴리유비퀴틴의 기능 및/또는 활성을 결정하는 방법에 있어서, 세포 또는 샘플을 청구항 1 내지 37중 어느 한 항의 적어도 하나의 항체와 접촉시키고, 그리고 이러한 세포 또는 샘플에 대한 상기 접촉 단계의 효과를 산정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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