JP2017200484A - 抗ポリユビキチン抗体および使用方法 - Google Patents

抗ポリユビキチン抗体および使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】抗ポリユビキチン抗体および抗ポリユビキチン抗体を使用する方法の提供。【解決手段】Ｃ末端からＮ末端への結合を含む第１のポリユビキチンに特異的に結合する単離された抗体であって、リジン結合を含む第２のポリユビキチンに特異的に結合しない、抗体を提供する。該抗体は、モノユビキチンに特異的に結合せず、かつ第１のポリユビキチンに対する結合親和性と比較して、大幅に減少した結合親和性で第２のポリユビキチンに結合する抗体。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１１年８月５日に出願された米国仮出願第６１／５１５，７２９号の優先権を主張するものであり、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じてＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。該ＡＳＣＩＩの複写は、２０１２年８月６日に作成され、名前はＰ４７１６Ｒ１ＷＯ．ｔｘｔであり、大きさは１２８，４２９バイトである。
発明の分野
本発明は、抗ポリユビキチン抗体の分野、より具体的にはモノユビキチンには特異的に結合せず、直鎖状ポリユビキチンに特異的である抗ポリユビキチン抗体および抗ポリユビキチン抗体を使用する方法に関する。
ユビキチンは、様々な細胞経路で重要な調節的役割を持つ小さなタンパク質である。これらのうちで最も知られているのは、タンパク質分解におけるユビキチンの役割であり、標的タンパク質へのユビキチンの共有結合により、標的タンパク質が２６Ｓプロテアソームにより認識され、破壊されることが可能になる（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．１１（３）：１４１−１４８（２０００）を参照）。７６アミノ酸タンパク質のユビキチンの標的タンパク質への共有結合は、３段階の酵素プロセスである（Ｐｉｃｋａｒｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：５０３−５３３（２００１））。まず、ユビキチン活性化酵素Ｅ１が、ＡＴＰ依存性反応においてユビキチン−Ｅ１チオエステルを形成する。第２段階で、ユビキチンは、ユビキチン−Ｅ１チオエステルからユビキチン複合酵素（Ｅ２）ファミリーのメンバーに転移される。第３段階で、ユビキチン−タンパク質リガーゼ（Ｅ３）の補助により、ユビキチンのカルボキシル末端と標的タンパク質上のリジン残基のε−アミノ基との間にイソペプチド結合が形成される。デユビキチナーゼと呼ばれる酵素が、標的タンパク質からユビキチン部分を取り除く（Ｇｕｔｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｌｉｃｋｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｐｅｐ．Ｓｃｉ．５：２０１−２１０（２００４））。
ユビキチンは、７つのリジン残基（Ｌｙｓ６、Ｌｙｓ１１、Ｌｙｓ２７、Ｌｙｓ３３、Ｌｙｓ２９、Ｌｙｓ４８、およびＬｙｓ６３）を含有するため、ユビキチン自体がユビキチン化の標的タンパク質としての役割を果たし得る（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：９２１−９２６（２００３）、Ｐｉｃｋａｒｔ ａｎｄ Ｆｕｓｈｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：６１０−６１６（２００４））。ユビキチンタンパク質のユビキチン化の際に産生される分子は、ポリユビキチン分子と呼ばれ、２つ以上のユビキチン部分を含み得る。ユビキチンのユビキチン化は、理論的には７つのリジン残基のいずれにおいても生じ（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：９２１−９２６（２００３））、そのため、ユビキチン内の異なるリジン残基へのイソペプチド結合を有する異なる種のポリユビキチンが存在する。７つのすべてのリジン残基で内部イソペプチド結合を有するポリユビキチン鎖が報告されている。Ｉｗａｉ ａｎｄ Ｔｏｋｕｎａｇａ，ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０：７０６−７１３（２００９）。
近年、ユビキチンのＣ末端グリシンが別のユビキチン分子のＮ末端メチオニンのαアミノ基に複合される、直鎖状ポリユビキチン鎖もまた形成されることが発見された。Ｉｗａｉ ａｎｄ Ｔｏｋｕｎａｇａ，ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０：７０６−７１３（２００９）。直鎖状ポリユビキチンは、ＨＯＩＬ−１ＬおよびＨＯＩＰの２つのリングフィンガータンパク質からなる直鎖状ユビキチン鎖アセンブリ複合体（ＬＵＢＡＣ）によって形成される。Ｔｏｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：１２３−１３２（２００９）。遺伝的にコードされた固定されていない直鎖状ポリユビキチンは、そのＣ末端がイソペプチダーゼにより切断されやすいため、細胞中には存在しないと考えられている。Ｔ．Ｉｗａｉ ａｎｄ Ｔｏｋｕｎａｇａ，ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０：７０６−７１３（２００９）。この所見は、直鎖状ポリユビキチンが翻訳後に基質タンパク質上に組立てられ、複合された直鎖状ポリユビキチン分子がタンパク質活性および機能の潜在的な調節因子であることを示唆している。上記参照。例えば、ＮＦ−ｋＢ必須調節因子（ＮＥＭＯ）の直鎖状ポリユビキチン化が、ＮＦ−κＢ活性化において役割を果たすことが示されている。上記参照。
異なるリジン結合のポリユビキチンに対して直鎖状ポリユビキチンを区別する抗体は、タンパク質分解および調節における直鎖状ポリユビキチン鎖の役割をさらに調べ、直鎖状ポリユビキチンが媒介する経路において直鎖状ポリユビキチンを標的とし、調節するのに有用であろう。
本発明は、抗直鎖状ポリユビキチン抗体および抗ポリユビキチン抗体を使用する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、Ｃ末端からＮ末端への結合を含む第１のポリユビキチンに特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は、リジン結合を含む第２のポリユビキチンには特異的に結合しない。別の実施形態において、本発明は、Ｃ末端からＮ末端への結合を含む第１のポリユビキチンおよびリジン結合を含む第２のポリユビキチンの両方に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は、モノユビキチンには特異的に結合せず、かつ第１のポリユビキチンに対する抗体の結合親和性と比較して、大幅に減少した結合親和性で第２のポリユビキチンに結合する。
別の実施形態において、本発明は、Ｃ−Ｎ末端結合型ポリユビキチンに特異的に結合する単離された抗体を提供し、その抗体は、モノユビキチンには特異的に結合しない。一態様において、抗体は、それぞれ配列番号１、４、１９、および５０〜５７、配列番号２および５８〜６３、配列番号３、５、６、２０、２１、および６４〜７２、配列番号７、１０、１３、１６、２２、および７３〜８１、配列番号８、１１、１４、１７、２３、２４、および８２〜８６、ならびに配列番号９、１２、１５、１８、および８７〜９３のうちのいずれかの、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つの超可変（ＨＶＲ）配列を含む。
別の態様において、抗体は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１がアミノ酸配列ＲＡＳＱＸ１ＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＶＡ（配列番号３９）を含み、式中、アミノ酸Ｘ１がアミノ酸Ｄ、Ｓ、およびＧから選択され、アミノ酸Ｘ２がＳおよびＤから選択され、アミノ酸Ｘ３がＳ、Ｔ、およびＮから選択され、アミノ酸Ｘ４がＡおよびＳから選択され、ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３がアミノ酸配列ＱＱＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＰＸ１０Ｔ（配列番号４０）を含み、式中、アミノ酸Ｘ５がＳ、Ｙ、およびＨから選択され、アミノ酸Ｘ６がＹおよびＦから選択され、アミノ酸Ｘ７がＴ、Ｙ、およびＡから選択され、アミノ酸Ｘ８がＴ、Ｙ、およびＳから選択され、アミノ酸Ｘ９は任意であり、存在する場合、セリンであり、アミノ酸Ｘ１０がＰおよびＬから選択される。
別の態様において、抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つの超可変（ＨＶＲ）配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１がアミノ酸配列Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８（配列番号４１）を含み、式中、アミノ酸Ｘ１１がＴおよびＮから選択され、アミノ酸Ｘ１２がＦおよびＩから選択され、アミノ酸Ｘ１３がＳ、Ｔ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ１４がＮ、Ｄ、Ｓ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ１５がＴ、Ｙ、Ｓ、およびＤから選択され、アミノ酸Ｘ１６がＹ、Ｄ、およびＳから選択され、アミノ酸Ｘ１７がＩおよびＭから選択され、アミノ酸Ｘ１８がＳおよびＨから選択され、ＨＶＲ−Ｈ２がアミノ酸配列ＡＸ１９ＩＸ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５ＴＸ２６（配列番号４２）を含み、式中、アミノ酸Ｘ１９がＳ、Ｇ、Ｗ、およびＥから選択され、アミノ酸Ｘ２０がＴ、Ｓ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ２１がＰおよびＳから選択され、アミノ酸Ｘ２２がＳおよびＹから選択され、アミノ酸Ｘ２３がＧ、Ｓ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ２４がＧおよびＳから選択され、アミノ酸Ｘ２５がＳおよびＹから選択され、アミノ酸Ｘ２６がＤおよびＳから選択され、ＨＶＲ−Ｈ３がアミノ酸配列ＲＸ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｄ（配列番号４３）を含み、式中、アミノ酸Ｘ２７がＴ、Ｅ、およびＧから選択され、アミノ酸Ｘ２８がＷ、Ａ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ２９がＬ、Ｇ、Ｖ、およびＳから選択され、アミノ酸Ｘ３０がＬ、Ｓ、およびＷから選択され、アミノ酸Ｘ３１がＲ、Ｋ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ３２がＷ、Ｌ、Ｇ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ３３がＶ、Ｌ、Ａ、およびＧから選択され、アミノ酸Ｘ３７がＭおよびＦから選択され、アミノ酸Ｘ３４、Ｘ３５、およびＸ３６は任意に存在し、存在する場合、アミノ酸Ｘ３４がＳであり、アミノ酸Ｘ３５がＶおよびＰから選択され、アミノ酸Ｘ３６がＡである。
別の態様において、抗体は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つの超可変（ＨＶＲ）配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１がアミノ酸配列ＲＡＳＱＸ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ａ（配列番号４４）を含み、式中、アミノ酸Ｘ３８がＤ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ３９がＶ、Ａ、Ｌ、およびＳから選択され、アミノ酸Ｘ４０がＳ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ４１がＴ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ４２がＡ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ４３がＶおよびＬから選択され、ＨＶＲ−Ｌ２がアミノ酸配列ＳＸ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７ＹＸ４８（配列番号４５）を含み、式中、アミノ酸Ｘ４４がＡおよびＲから選択され、アミノ酸Ｘ４５がＳ、Ｋ、Ｑ、およびＲから選択され、アミノ酸Ｘ４６がＦおよびＹから選択され、アミノ酸Ｘ４７がＬ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ４８がＳ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され、ＨＶＲ−Ｌ３が配列ＱＱＸ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２ＰＰＴ（配列番号４６）を含み、式中、アミノ酸Ｘ４９がＨおよびＳから選択され、アミノ酸Ｘ５０がＹ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、およびＷから選択され、アミノ酸Ｘ５１がＴ、Ｉ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ５２がＴ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＶから選択される。
別の態様において、抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つの超可変（ＨＶＲ）配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１がアミノ酸配列Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５ＹＸ５６Ｓ（配列番号４７）を含み、式中、アミノ酸Ｘ５３がＡ、Ｆ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、およびＳから選択され、アミノ酸Ｘ５４がＮおよびＷから選択され、アミノ酸Ｘ５５がＴ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ５６がＩ、Ｍ、およびＶから選択され、ＨＶＲ−Ｌ２がアミノ酸配列ＡＸ５７Ｘ５８ＴＰＸ５９ＳＧＸ６０ＴＸ６１（配列番号４８）を含み、式中、アミノ酸Ｘ５７がＴおよびＳから選択され、アミノ酸Ｘ５８がＩ、Ｓ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ５９がＳおよびＡから選択され、アミノ酸Ｘ６０がＳ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＱから選択され、アミノ酸Ｘ６１がＤおよびＮから選択され、ＨＶＲ−Ｈ３がアミノ酸配列Ｘ６２ＷＸ６３Ｘ６４ＲＷＶＸ６５Ｄ（配列番号４９）を含み、式中、アミノ酸Ｘ６２がＳおよびＴから選択され、アミノ酸Ｘ６３がＬおよびＹから選択され、アミノ酸Ｘ６４がＬ、Ｉ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ６５がＭおよびＦから選択される。
別の態様において、抗体は、配列番号１または４のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、ならびに配列番号３、５、および６から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列をそれぞれ含む。別の態様において、抗体は、配列番号７、１０、１３、および１６から選択されるＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１、２３、および２４から選択されるＨＶＲ−Ｈ２配列、ならびに配列番号１２のＨＶＲ−Ｈ３配列をそれぞれ含む。別の態様において、抗体は、配列番号１および５０〜５６から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２および５７〜６２から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、ならびに配列番号３および６３〜７１から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列をそれぞれ含む。別の態様において、抗体は、配列番号７および７２〜８０から選択されるＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８および８１〜８５から選択されるＨＶＲ−Ｈ２配列、ならびに配列番号９および８６〜９２から選択されるＨＶＲ−Ｈ３配列をそれぞれ含む。
別の態様において、抗体は、図１Ａでクローン１Ｅ２、１Ｄ８、１Ｆ４、または１Ａ１０について示されるものに対応するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。別の態様において、抗体は、図１Ｂでクローン１Ｅ２、１Ｄ８、１Ｆ４、または１Ａ１０について示されるものに対応するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。別の態様において、抗体は、図４Ａでクローン１Ｄ８．３Ｃ２、１Ｄ８．３Ｆ８、または１Ｄ８．４Ｆ５について示されるものに対応するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。別の態様において、抗体は、図４Ｂでクローン１Ｄ８．３Ｃ２、１Ｄ８．３Ｆ８、または１Ｄ８．４Ｆ５について示されるものに対応するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。
別の態様において、抗体は、配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１０のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号１２のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。別の態様において、抗体は、配列番号１９のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１０のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２３のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号１２のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。別の態様において、抗体は、配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号２０のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１０のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号１２のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。別の態様において、抗体は、配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号２０のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１０のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号１２のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。別の態様において、抗体は、配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号９のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。別の態様において、抗体は、配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２、５７、および５９から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３、６４、および７１から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号７または７９のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８または８１のＨＶＲ−Ｈ２配列、ならびに配列番号９、８６、８８、または８９から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。別の態様において、抗体は、配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５７のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号９のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。別の態様において、抗体は、配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８１のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号９のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。別の態様において、抗体は、配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５７のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８１のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号９のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。ある種の態様において、本明細書に記載の抗体のいずれかは、ＨＶＲ−Ｈ３のＣ末端後の最初のアミノ酸（例えば、１Ｅ３等のＨＶＲ−Ｈ３のＣ末端に直接隣接したアミノ酸、−ＴＷＬＬＲＶＭＤＬ（配列番号９６）としてロイシンが含まれ得る。
別の態様において、抗体は、配列番号２５〜２８、３３〜３５、９４、および１９３〜１９５から選択される軽鎖アミノ酸配列を含む。別の態様において、抗体は、配列番号２９〜３１、３６〜３８、９５、および１９６〜１９８から選択される重鎖アミノ酸配列を含む。
別の態様において、抗体は、配列番号２５および２９、配列番号２６および３０、配列番号２７および３１、配列番号２８および３２、配列番号３３および３６、配列番号３４および３７、配列番号３５および３８、配列番号９５および９５、配列番号１９３および１９６、配列番号１９４および１９７、ならびに配列番号１９５および１９８の配列のうちの１つの組み合わせのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つ軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、本発明は、前述の抗体のうちのいずれか１つと同じＣ−Ｎ末端結合型ポリユビキチン上の抗原決定基に結合する、単離された抗体を提供し、その抗体は、モノユビキチンには特異的に結合しない。別の実施形態において、本発明は、Ｃ−Ｎ末端結合型ポリユビキチンへの結合について、前述の抗体のうちのいずれか１つと競合する、単離された抗体を提供し、その抗体は、モノユビキチンには特異的に結合しない。別の実施形態において、本発明は、前述の単離された抗体のいずれかを提供し、その抗体は、Ｃ−Ｎ末端結合型ポリユビキチン化タンパク質に特異的に結合する。別の実施形態において、本発明は、前述の単離された抗体のいずれかを提供し、その抗体は、少なくとも１つのポリユビキチン媒介性シグナル伝達経路を調節する。
１つの一般的な態様において、前述の抗体のいずれかは、モノクローナル抗体である。別の一般的な態様において、前述の抗体のいずれかは、ヒト抗体である。別の一般的な態様において、前述の抗体のいずれかは、ヒト化抗体である。別の一般的な態様において、前述の抗体のいずれかは、キメラ抗体である。別の一般的な態様において、前述の抗体のいずれかは、Ｃ−Ｎ末端結合型ポリユビキチンに結合する抗体断片である。
別の実施形態において、本発明は、前述の抗体のいずれかをコードする単離された核酸を提供する。別の実施形態において、本発明は、前述の抗体のいずれかをコードする単離された核酸を含むベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、前述の抗体のいずれかをコードする単離された核酸を含む宿主細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、前述の抗体のいずれかをコードする単離された核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
別の実施形態において、本発明は、抗体が産生される条件下で上記の宿主細胞を培養することを含む、前述の抗体のいずれかを産生する方法を提供する。一態様において、本方法は、宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む。別の態様において、本方法は、抗体の精製をさらに含む。
別の実施形態において、本発明は、前述の抗体のいずれかおよび細胞傷害性薬剤を含む、免疫複合体を提供する。別の実施形態において、本発明は、前述の抗体のいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤を提供する。一態様において、薬学的製剤は、さらなる治療剤をさらに含む。そのような一態様において、さらなる治療剤は、化学療法剤である。
別の実施形態において、本発明は、医薬としての使用のための、前述の抗体のいずれかを提供する。別の実施形態において、本発明は、細胞周期関連疾患または障害の治療に使用するための、前述の抗体のいずれかを提供する。一態様において、細胞周期関連疾患または障害は、細胞周期進行の異常な亢進に関連する疾患または障害、および細胞周期進行の異常な低下に関連する疾患または障害から選択される。そのような一態様において、細胞周期進行の異常な亢進に関連する疾患または障害は、癌である。別のそのような態様において、細胞周期進行の異常な低下に関連する疾患または障害は、変性筋障害および変性神経障害から選択される。
別の実施形態において、本発明は、医薬の製造における、前述の抗体のいずれかの使用を提供する。一態様において、医薬は、癌、変性筋障害、および変性神経障害から選択される疾患または障害のためのものである。別の実施形態において、本発明は、個体に有効量の前述の抗体のいずれかを投与することを含む、癌、変性筋障害、および変性神経障害から選択される疾患または障害を有する個体を治療する方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、ポリユビキチンまたはポリユビキチン化タンパク質を含有することが疑われる試料中のポリユビキチンまたはポリユビキチン化タンパク質の存在を判定する方法を提供し、それを前述の抗体のうちの少なくとも１つの抗体に曝露し、該試料中のポリユビキチンまたはポリユビキチン化タンパク質へのうちの少なくとも１つの抗体の結合を判定することを含む。別の実施形態において、本発明は、試料中の非Ｃ−Ｎ末端結合型ポリユビキチン化タンパク質からＣ−Ｎ末端結合型ポリユビキチン化タンパク質を分離する方法を提供し、その試料を前述の抗体のうちの少なくとも１つと接触させることを含む。別の実施形態において、本発明は、細胞または試料中のＣ−Ｎ末端結合型ポリユビキチンの機能および／または活性を判定する方法を提供し、その細胞または試料を前述の抗体のうちの少なくとも１つと接触させることと、その細胞または試料への該接触するステップの効果を評価することと、を含む。
実施例１Ｂに記載される、ユビキチンタンパク質のパネルへのクローン１Ｄ８、１Ｅ３、１Ｆ４、および１Ａ１０の４５０ｎｍの波長での相対的な結合シグナルを示す、ファージスポットＥＬＩＳＡの結果を示す。ＦａｂライブラリークローンのそれぞれがｇＤタグを含み、ファージ上のＦａｂの提示が抗ｇＤ抗体への結合により評価された。非被覆ウェルを陰性対照として用いた。 実施例１において得られたＦａｂの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を示す。図２Ａは、クローン１Ｅ３、１Ｄ８、１Ｆ４、および１Ａ１０（それぞれ、配列番号２５〜２８）の軽鎖配列を示す。図２Ｂは、クローン１Ｅ３、１Ｄ８、１Ｆ４、および１Ａ１０（それぞれ、配列番号２９〜３２）の重鎖配列アラインメントを示す。図２Ａおよび２Ｂの両方において、それぞれのクローンのＨＶＲ配列がボックス領域で示され、第１のボックスがＨＶＲ−Ｌ１（図２Ａ）またはＨＶＲ−Ｈ１（図２Ｂ）を示し、第２のボックスがＨＶＲ−Ｌ２（図２Ａ）またはＨＶＲ−Ｈ２（図２Ｂ）を示し、第３のボックスがＨＶＲ−Ｌ３（図２Ａ）またはＨＶＲ−Ｈ３（図２Ｂ）を示す。 直鎖状ジユビキチンに対する精製１Ｆ４、１Ｄ８、および１Ｅ３のＦａｂの親和性を測定するファージＩＣ５０競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。 固定化された状況におけるジユビキチンタンパク質のパネルを特異的に認識する１Ｄ８および１Ｅ３のＦａｂの能力を判定するためのウエスタンブロット解析の結果を示す。 １Ｄ８の親和性成熟ライブラリー分類から実施例２において得られた親和性成熟クローンの軽鎖および重鎖アミノ酸配列を示す。図５Ａは、親和性成熟クローン１Ｄ８．３Ｃ２、１Ｄ８．３Ｆ８、および１Ｄ８．４Ｆ５の軽鎖配列（それぞれ、配列番号３３〜３５）を示す。図５Ａは、配列番号２６として１Ｄ８配列を開示する。図５Ｂは、親和性成熟クローン１Ｄ８．３Ｃ２、１Ｄ８．３Ｆ８、および１Ｄ８．４Ｆ５（それぞれ、配列番号３６〜３８）の重鎖配列アラインメントを示す。図５Ｂは、配列番号３０として１Ｄ８配列を開示する。図５Ａおよび５Ｂの両方において、それぞれのクローンのＨＶＲ配列がボックス領域で示され、第１のボックスがＨＶＲ−Ｌ１（図５Ａ）またはＨＶＲ−Ｈ１（図５Ｂ）を示し、第２のボックスがＨＶＲ−Ｌ２（図５Ａ）またはＨＶＲ−Ｈ２（図５Ｂ）を示し、第３のボックスがＨＶＲ−Ｌ３（図５Ａ）またはＨＶＲ−Ｈ３（図５Ｂ）を示す。１Ｄ８親配列に対するアミノ酸の変化は、灰色で強調表示される。 直鎖状ジユビキチンに対する１Ｄ８、１Ｄ８．３Ｃ２、１Ｄ８．３Ｆ８、および１Ｄ８．４Ｆ５のＦａｂの親和性を測定するファージＩＣ５０競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。 親１Ｅ３クローンおよび対照と比較して、突然変異の親和性成熟変異体の結合特異性の特性を評価する研究結果を示す。ファージ上に示された親１Ｅ３クローンおよび１１の単一突然変異の親和性成熟変異体の結合が、ＥＬＩＳＡにおけるユビキチンタンパク質のパネルへの結合について試験された。抗ｇＤ抗体への結合を用いて、ファージ上のＦａｂ表示を評価し、非被覆ウェルを陰性対照として用いた。 実施例３に記載される、親１Ｅ３クローンおよび対照と比較して、単一突然変異および二重突然変異の変異体の結合特異性の特性を評価する研究結果を示す。ファージ上に示された親１Ｅ３クローン、４つの単一突然変異の親和性成熟変異体および３つの二重突然変異の親和性成熟変異体の結合が、ＥＬＩＳＡにおけるユビキチンタンパク質のパネルへの結合について試験された。抗ｇＤ抗体への結合を用いて、ファージ上のＦａｂ表示を評価し、非被覆ウェルを陰性対照として用いた。 １Ｅ３ Ｆａｂ、第２の１Ｅ３親和性成熟ライブラリー分類から実施例３において得られた親和性成熟クローン（１Ｆ１１および３Ｆ５）、クローン４Ｅ４において観察されたＹ１０２Ｌ突然変異体、ならびにクローン１Ｆ１１および３Ｆ５からのアミノ酸変化を組み込む三重突然変異体、ならびに実施例３Ｐに記載されるＹ１０２Ｌ突然変異体の、軽鎖および重鎖アミノ酸配列を示す。図９Ａは、１Ｅ３、１Ｆ１１、３Ｆ５、Ｙ１０２Ｌ、および１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌに対する親和性成熟クローンの軽鎖配列（それぞれ、配列番号２５、１９３、１９４、１９５、および９４）を示す。図９Ｂは、１Ｅ３、１Ｆ１１、３Ｆ５、Ｙ１０２Ｌ、および１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌに対する親和性成熟クローンの重鎖配列アラインメント（それぞれ、配列番号２９、１９６、１９７、１９８、および９５）を示す。図９Ａおよび９Ｂの両方において、１Ｅ３に対する第２の親和性成熟ライブラリーにおけるアミノ酸の変動に対して標的にされるＫａｂａｔ位置が、ボックス領域で示される。１Ｅ３親配列に対するアミノ酸の変化が、灰色で強調表示される。 直鎖状ジユビキチン（１レーン当たり１０００、３３３、１１１、３７、および１２ｎｇの段階希釈）およびＫ６３結合型ジユビキチン（１レーン当たり１０００ｎｇ）に対する、親１Ｅ３、単一、および二重突然変異ＩｇＧの結合のウエスタンブロット解析を提供する。 直鎖状ジユビキチン（１レーン当たり１０００、３３３、１１１、３７、および１２ｎｇの段階希釈）およびＫ６３結合型ジユビキチン（１レーン当たり１０００ｎｇ）に対する、親１Ｅ３、二重、および三重突然変異ＩｇＧの結合のウエスタンブロット解析を提供する。 直鎖状ジユビキチン（１レーン当たり１０００、３３３、１１１、３７、および１２ｎｇの段階希釈）およびＫ６３結合型ジユビキチン（１レーン当たり１０００ｎｇ）に対する、Ｙ１０２Ｌ、Ｙ１０１２Ｌ Ｔ１１０Ａ突然変異ならびにＹ１０２Ｌ、Ｔ１１０Ａ、３Ｆ５、および１Ｆ１１のＩｇＧの様々な突然変異の組み合わせの結合のウエスタンブロット解析を提供する。 実施例３Ｍに記載される、直鎖状ジユビキチン（１レーン当たり１０００、３３３、１１１、３７、および１２ｎｇの段階希釈）およびＫ６３結合型ジユビキチン（１レーン当たり１０００ｎｇ）に対する、親１Ｅ３、単一、二重、および三重突然変異ＩｇＧの結合のウエスタンブロット解析を提供する。 直鎖状ジユビキチンの２倍段階希釈（勾配が示されるところでは、１０００、５００、２５０、１２５、６３、３１、および１６ｎｇ／レーン）、またはモノユビキチン、Ｋ１１結合型ジユビキチン、Ｋ４８結合型ジユビキチン、およびＫ６３結合型ジユビキチン（１μｇ／レーン）に対する、１Ｅ３および１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２ＬのＩｇＧの結合のウエスタンブロット解析を提供する。対照として、抗Ｋ６３のＩｇＧ、Ａｐｕ３．Ａ８が、Ｋ６３結合型ジユビキチンの２倍段階希釈（勾配が示されるところでは、１０００、５００、２５０、１２５、６３、３１、および１６ｎｇ／レーン）、またはモノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、Ｋ１１結合型ジユビキチン、およびＫ４８結合型ジユビキチン（１μｇ／レーン）への結合について分析された。クマシー染色ゲル（左上パネル）は、試験されたユビキチンのそれぞれがゲル中を移動する場所の指示を与える。 モノユビキチン、直鎖状ポリユビキチン２−７（長さが２から７のユビキチンサブユニット）、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７（長さが２から７のユビキチンサブユニット）、Ｋ６３結合型ポリユビキチン２−７（長さが２から７のユビキチンサブユニット）、およびＫ１１結合型ポリユビキチン（レーン当たりそれぞれ１μｇ）が、パンユビキチン抗体Ｐ４Ｄ１（中央パネル）または１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧ（右パネル）で免疫ブロットされた実験結果を示す。クマシー染色は、試料の組成物を明らかにした（左パネル）。ウエスタンブロットの長いおよび短い曝露が示される。 様々な濃度のＴＮＦαで、５．８μＭのＭＧ１３２で異なる時間に対して処理されたＨｅＬａ Ｓ３細胞の溶解物が、ハイブリッド抗体１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌを有する直鎖状ユビキチン鎖またはＡｐｕ３．Ａ８抗体を有するＫ６３結合型ユビキチン鎖に対して免疫ブロットされた実験結果を示す。対照として、各２５０ｎｇの精製された直鎖状ポリユビキチン２−７およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７を、それぞれのゲル上で操作した（図１６Ａ）。ＮＦκＢ経路の活性化のレベルを評価するために、溶解物をＩκＢαレベルについてブロットした（図１６Ｂ）。負荷対照として、溶解物をβチューブリンについてブロットした。 ハイブリッド抗直鎖状ポリユビキチン抗体１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ、アイソタイプ対照、または抗Ｋ６３抗体Ａｐｕ３．Ａ８を用いた、免疫沈降実験の結果を示す。ＩＰ実験は、３つの条件下（すべてのユビキチン鎖の混合物、直鎖状ユビキチン鎖なし、または直鎖状ユビキチン鎖のみ）で、４Ｍの尿素ＩＰ緩衝液中で行われた。対照として、各１μｇの精製された直鎖状ポリユビキチン２−７およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７を、それぞれのゲル上で操作した。 様々な濃度の尿素またはＰＢＳＴにおいて、抗直鎖状ポリユビキチン抗体１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌまたは抗Ｋ６３抗体Ａｐｕ３．Ａ８を含む、１：１の直鎖状ポリユビキチン２−７とＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の混合物を用いて、ＩＦ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ（抗直鎖状）またはＡｐｕ３．Ａ８（抗Ｋ６３）のいずれかを用いて免疫ブロットされた免疫沈降実験の結果を示す。対照として、各１μｇの精製された直鎖状ポリユビキチン２−７およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７を、それぞれのゲル上で操作した。図１８Ａは、０Ｍ、２Ｍ、４Ｍ、および６Ｍの尿素中のＩＰ実験の結果を示す。図１８Ｂは、６Ｍ、７Ｍ、および８Ｍの尿素中のＩＰ実験の結果を示す。 様々な濃度の尿素において、プロテインＡビーズに交差結合された抗直鎖状ポリユビキチン抗体１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ、アイソタイプ対照、または抗Ｋ６３ポリユビキチン抗体Ａｐｕ３．Ａ８を含む、１：１：１：１の直鎖状ポリユビキチン２−７、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の混合物を用いた、免疫沈降および免疫ブロット実験の結果を示す。免疫ブロットに用いられた抗体は、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ（抗直鎖状）、２Ａ３／２Ｅ６（抗Ｋ１１）、Ａｐｕ２．０７（抗Ｋ４８）、またはＡｐｕ３．Ａ８（抗Ｋ６３）のＩｇＧであった。対照として、各１μｇの精製された直鎖状ポリユビキチン２−７、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７を、それぞれのゲル上で操作した。 様々な濃度の尿素において、プロテインＧビーズに交差結合されたハイブリッド抗直鎖状ポリユビキチン抗体１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ、アイソタイプ対照、または抗Ｋ６３ポリユビキチンＩｇＧ抗体Ａｐｕ３．Ａ８を含む、１：１：１：１の直鎖状ポリユビキチン２−７、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の混合物を用いた、免疫沈降および免疫ブロット実験の結果を示す。免疫ブロットに用いられた抗体は、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ（抗直鎖状）、２Ａ３／２Ｅ６（抗Ｋ１１）、Ａｐｕ２．０７（抗Ｋ４８）、またはＡｐｕ３．Ａ８（抗Ｋ６３）のＩｇＧであった。対照として、各１μｇの精製された直鎖状ポリユビキチン２−７、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７を、それぞれのゲル上で操作した。 様々な濃度の尿素において、抗直鎖状ポリユビキチン抗体１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ、アイソタイプ対照、または抗Ｋ６３ポリユビキチン抗体Ａｐｕ３．Ａ８を含む、１：１：１：１の直鎖状ポリユビキチン２−７、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の混合物からの、免疫沈降および免疫ブロット実験の結果を示す。免疫ブロットに用いられた抗体は、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ（抗直鎖状）、２Ａ３／２Ｅ６（抗Ｋ１１）、Ａｐｕ２．０７（抗Ｋ４８）、またはＡｐｕ３．Ａ８（抗Ｋ６３）のＩｇＧであった。対照として、各５００ｎｇの精製された直鎖状ポリユビキチン２−７、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７を、それぞれのゲル上で操作した。 様々な濃度の尿素中の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびクマシー染色によって分離した、ハイブリッド抗直鎖状ポリユビキチン抗体１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ、アイソタイプ対照、または抗Ｋ６３ポリユビキチン抗体Ａｐｕ３．Ａ８を含む、１：１：１：１の直鎖状ポリユビキチン２−７、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の混合物からの、免疫沈降実験の結果を示す。質量分光分析ＡＱＵＡのために切り取られた領域を示す。 図２４Ｂ（領域Ｂおよび領域Ｃ）に示され、実施例４Ｄに記載されるように、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌの免疫沈降からの質量分光分析ＡＱＵＡにより特定されたポリユビキチン結合のピコモルで量を示すグラフである。 図２４Ｂ（領域Ｂおよび領域Ｃ）に示されるように、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌの免疫沈降からの質量分光分析ＡＱＵＡにより特定されたポリユビキチン鎖の結合組成物を示すグラフである。 質量分光分析ＡＱＵＡにより特定された１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌの免疫沈降物中で回収された直鎖のパーセントを示すグラフである。 プラスミド過剰発現Ｈｏｉｌ−１ＬおよびＨｏｉｐまたは空ベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの溶解物を用いて免疫ブロットを示す。ブロットは、実施例４Ｅに説明されるように、直鎖状ポリユビキチン、Ｈｏｉｌ−１Ｌ、Ｈｏｉｐ、およびβチューブリンについてプローブした。 プラスミド過剰発現Ｈｏｉｌ−１ＬおよびＨｏｉｐまたは空ベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の溶解物からの免疫沈降実験の結果を示す。免疫ブロットは、直鎖状ポリユビキチンについてプローブするか、またはクマシー染色した。クマシー染色したゲル上に示された領域が、質量分光分析ＡＱＵＡのために切り取られた。 図２２Ｂに示される、Ｈｏｉｌ−１Ｌ／Ｈｏｉｐの過剰発現細胞からの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ免疫沈降において、質量分光分析ＡＱＵＡにより特定されたポリユビキチン結合組成物を示すグラフである。 プラスミド過剰発現Ｈｏｉｌ−１ＬおよびＨｏｉｐまたは空ベクターでトランスフェクトされ、抗直鎖状ポリユビキチン抗体１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌで染色された、ＨｅＬａ Ｓ３細胞の免疫蛍光を示す。５または７のサブユニット（＋）の組換え直鎖状ポリユビキチンの添加は、抗直鎖状ポリユビキチン抗体の結合に対して競合する。 １Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ Ｆａｂ断片と直鎖状ジユビキチンとの間に形成された複合体の共結晶構造の様々な図を示す。Ａ）図の下で漫画図として１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌを示し、上で空間充填モデル内に漫画図として直鎖状ジユビキチンを示す。近位および遠位ユビキチンのサブユニットおよび直鎖状結合を示す。Ｂ）１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌと相互作用するジユビキチンの表面にある直鎖状ジユビキチン上のエピトープを、濃い灰色で示す。直鎖状ジユビキチンおよび１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌの接触面で埋められた溶媒の接触可能表面領域の少なくとも２５％を有し、および／またはＦａｂの４．５A内である残基は、一文字のアミノ酸コードおよび残基番号によって示される。図２３Ｂは、配列番号３７９〜３８１として、それぞれ、残基３１〜３７、７０〜７６、および６０〜６３を開示する。Ｃ）ジユビキチンと相互作用するＦａｂの表面にある１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ Ｆａｂ上のパラトープを、濃い灰色で示す。１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌおよびジユビキチンの接触面で埋められた溶媒の接触可能表面領域の少なくとも２５％を有し、および／またはジユビキチンの４．５A内である残基は、一文字のアミノ酸コードおよび残基番号によって示される。図２３Ｃは、配列番号３７８および３７７として、それぞれ、残基９５〜９９および５２〜５６を開示する。 １Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ Ｆａｂ断片と直鎖状ジユビキチンとの間に形成された複合体の共結晶構造のさらなる拡大図を示す。Ａ）重鎖のＧｌｎ５６の側鎖とＧｌｙ７５およびＧｌｙ７６の主鎖カルボニル基との間に形成された水素結合を示す拡大図。薄い灰色でジユビキチンを示し、濃い灰色でＦａｂを示す。Ｂ）軽鎖のＬｙｓ５２およびＡｓｐ３２とジユビキチンのアルファヘリックスのカルボキシ末端からの双極子との間の可能性のある静電相互作用。薄い灰色でジユビキチンを示し、濃い灰色でＦａｂを示す。Ｃ）重鎖のＬｅｕ１０２と重鎖のフレームワーク１のＶａｌ２およびＬｅｕ４との間の疎水性相互作用。Ｌｅｕ１０２は、ＣＤＲ Ｈ３のカルボキシ末端にある。薄い灰色でジユビキチンを示し、濃い灰色でＦａｂを示す。
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるようなヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでよく、またはアミノ酸配列変化を含んでよい。幾つかの実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。幾つかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列が同一である。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。本明細書で使用される場合、別様に示されない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体および抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本来の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示および例となる実施形態は、以下で説明される。
「親和性成熟」抗体とは、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）中に１つ以上の改変を有する抗体であって、そのような改変を有さない親抗体と比較して、そのような改変が、抗原に対する抗体の親和性における改善をもたらすものを指す。
本明細書で使用される「アゴニスト抗体」は、対象となるポリペプチドの機能的な活性のうちの少なくとも１つを模倣する抗体である。
「アンタゴニスト抗体」または「遮断抗体」は、それが特異的に結合する抗原の生物学的活性を阻止するかまたは低下させる抗体である。ある種の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。
本明細書中で「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびそれらが所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片が含まれるが、これらに限定されない。
「抗体断片」とは、無傷の抗体が結合する抗原と結合する無傷の抗体の一部を含む無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
参照抗体と「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に、競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。例となる競合アッセイが、本明細書で提供される。
「抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体」および「直鎖状結合型ポリユビキチンに結合する抗体」という用語は、直鎖状結合型ポリユビキチンを標的とする診断薬剤および／または治療的薬剤として有用であるように十分な親和性で直鎖状結合型ポリユビキチンに結合することができる抗体を指す。一実施形態において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体の、非関連の非直鎖状結合型ポリユビキチンタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体の直鎖状結合型ポリユビキチンの結合の約１０％未満である。ある種の実施形態において、直鎖状結合型ポリユビキチンに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある種の実施形態において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、異なる種由来の直鎖状結合型ポリユビキチン間で保存されている直鎖状結合型ポリユビキチンのエピトープに結合する。
本明細書で使用される場合、「抗ポリユビキチン抗体」という用語は、ポリユビキチン分子に特異的に結合することができる抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「抗ユビキチン抗体」および「抗モノユビキチン抗体」は、互換的に使用され、ユビキチン分子に特異的に結合することができる抗体を指す。
「キメラ」抗体という用語は、重および／または軽鎖の一部が特定の起源または種から由来するが、重および／または軽鎖の残りは、異なる起源または種から由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
本明細書で使用される、「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞の機能を阻害または阻止し、および／または細胞死もしくは細胞破壊を生じる物質を指す。細胞傷害性薬剤としては、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体）；化学療法剤または薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤）；成長阻害剤；抗素およびその断片、例えば、核酸分解酵素；構成物質；小分子毒素または細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素等の毒素（それらの断片および／またはその変異体を含む）；ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍もしくは抗癌剤が含まれるが、これらに限定されない。
「障害」は、本発明の抗体による治療から利益を得るであろう任意の状態である。これには、問題になっている障害に哺乳動物がかかりやすい病的状態を含む、慢性および急性の障害または疾患が含まれる。本明細書で治療されるべき障害の非限定的な例は、癌、ならびに変性筋障害および変性神経障害が含まれるが、これらに限定されない、発育不全障害が含まれる。
「エフェクター機能」とは、抗体のイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、ならびにＢ細胞の活性化を含む。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的または予防的結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を指す。
本明細書中で「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異Ｆｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボニル末端まで伸長する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。別様に、本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般的に、ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４でＶＨ（またはＶＬ）の配列に現れる。
「完全長抗体」、「無傷の抗体」、および「全抗体」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、または本明細書中で定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫が含まれる。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞および子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一ではない場合があり、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞によって産生される、またはヒト抗体のレパートリーまたは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト起源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３にあるサブグループである。一実施形態において、ＶＬについて、サブグループは、上記のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施形態において、ＶＨについて、サブグループは、上記のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩＩＩである。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある種の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化された抗体を指す。
本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列において超可変であるか、および／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的には、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、およびＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的には、超可変ループおよび／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、および／または抗原認識に関与している。例となる超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、および９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。例となるＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、およびＨ３の９５−１０２に生じる。（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは、一般的には、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮ＣＤＲ，またはａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例となるａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、およびａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、およびＨ３の９５−１０２に生じる。（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照のこと）。別様に示されない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上記のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号付けされる。
「免疫複合体」は、細胞傷害性薬剤を含むが、これに限定されない、１つ以上の異種分子に複合された抗体である。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、個体または対象はヒトである。
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により決定される、９５％以上または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９−８７（２００７）を参照のこと。
「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外またはその天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
「抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体の重および軽鎖（またはその断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター内のそのような核酸分子（複数を含む）を含み、そのような核酸分子（複数を含む）は、宿主細胞内の１つ以上の位置に存在する。
本明細書で使用される、「直鎖状結合型ポリユビキチン」および「Ｃ末端からＮ末端結合型ポリユビキチン」という用語は、互換可能であり、１つのユビキチン部分のＣ末端（例えば、Ｃ末端グリシン）と別のユビキチン部分のＮ末端α−アミノ基（例えば、Ｎ末端メチオニン）との間に少なくとも１つのイソペプチド結合を含むポリユビキチン分子を指す。
本明細書で使用される「リジン結合」は、１つのユビキチン部分とリジン残基（例えば、Ｋ６、Ｋ１１、Ｋ２７、Ｋ２９、Ｋ３３、Ｋ４８、および／またはＫ６３）を含む別のユビキチン部分との間の結合を示す。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、例えば、天然に生じる突然変異を含み、またはモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、可能性のある変異体抗体を除き、一般的に少量で存在している変異体等と同一であり、および／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的には含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」という形容は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例となる方法は、本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」とは、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射性標識に複合していない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい。
「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖とからなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
「パッケージ挿入物」という用語は、適応、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、および／またはそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている指示書を指すために使用される。
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、いかなる保存的置換を配列同一性の一部として考慮しないとした後の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲内にある種々の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公に入手可能なソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者は、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のためには、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作製され、ソースコードは、米国著作権庁、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類と共に出願され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上で、使用のためにコンパイルされなければならない。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、またはそれに対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、またはそれに対して所定のアミノ酸配列同一性％を持つまたは含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は、次のように計算される：

分率Ｘ／Ｙの１００倍

式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なることが理解されるであろう。別様に特に記述されない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて、直前の段落で説明したように得られる。
「薬学的製剤」という用語は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する対象には許容できない毒性のある他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」とは、対象に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ポリユビキチン」という用語は、ユビキチンの異なるポリマー結合のヒトおよび合成クラスに含まれる天然ヒトおよび合成のポリマー鎖のすべての種として定義され、これには、直鎖状ポリユビキチン、Ｋ６結合型ポリユビキチン、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ２７結合型ポリユビキチン、Ｋ２９結合型ポリユビキチン、Ｋ３３結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン、およびＫ６３結合型ポリユビキチンが含まれるが、これらに限定されない。ポリユビキチンは、どのような長さを有してもよく、少なくとも２つのユビキチン部分を含む。
本明細書で使用される「治療」（および「治療する」または「治療している」等の文法上の変形）は、治療される個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程中のいずれかで実行することができる。治療の望ましい効果としては、疾患の発症または再発を予防すること、症状の緩和、疾患のいかなる直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を低下させること、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるかまたは疾患の進行を遅らせるために使用される。
本明細書で使用される「ユビキチン」および「モノユビキチン」という用語は、互換可能に使用され、別様に示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物由来の任意の天然型ユビキチンを指す。この用語は、「完全長」の未処理のユビキチン、ならびに複数のユビキチン部分を含む分子を除いて、細胞中でのプロセシングから生じた任意の短縮型かまたは翻訳後修飾型のユビキチンを網羅する。その用語はまた、天然に存在するユビキチンの変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体を包含する。例となるヒトユビキチンのアミノ酸配列は、配列番号９７に示される：ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ（配列番号９７）。ユビキチンは、アミノ酸６、アミノ酸１１、アミノ酸２７、アミノ酸２９、アミノ酸３３、アミノ酸４８、および／またはアミノ酸６３（上記配列番号９７に太字で記載）に、少なくとも１つのリジン残基を有する。
本明細書で使用される「ユビキチン経路」という用語は、ユビキチンおよび／またはポリユビキチンを含む細胞または再構成されたインビトロ中の生化学的経路を指す。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は、一般的に類似の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照のこと）。単一のＶＨまたはＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬまたはＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために抗原に結合する抗体由来のＶＨまたはＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照のこと。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが結合される別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。その用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように結合されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
ＩＩ．組成物および方法
一態様において、本発明は、第１のポリユビキチン結合を含む第１のポリユビキチン分子を特異的に認識することができるが、第２のポリユビキチン結合を含む第２のポリユビキチン分子には特異的に結合することができない抗体の作成に一部が基づく。ある種の実施形態において、直鎖状ポリユビキチンまたはＣ末端−Ｎ末端結合型ポリユビキチンに特異的に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、研究、および例えば、異常な細胞周期進行に関連する疾患および障害の診断または治療の両方において有用である。
本発明の抗直鎖状ポリユビキチン抗体の固有の特性は、面倒で高価な遺伝子操作、または質量分析等の生物物理学的手法に頼らずに、細胞系のポリユビキチンの異なる結合型の区別に、それらを特に有用にしている。本発明の抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、特異的直鎖状ポリユビキチンの機能（複数を含む）と活性を、インビトロおよびインビボの両方で、特徴付けするために使用することができる。本発明の抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体はまた、疾患の発症および病態における特異的直鎖状ポリユビキチンの役割を決めることに使用することもできる。本発明の抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、１つ以上の特異的直鎖状ポリユビキチンが、異常に制御されるかまたは異常に機能している疾患を、抗ポリユビキチン抗体が特的でないポリユビキチンの正常な活性に干渉することなしに治療するためにさらに使用することができる。
ＮＦκ−Ｂ経路におけるユビキチン系の関与が記載されている。Ｋａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：７４９−７５９（２００５）およびＣｈｅｎ，Ｚ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌ Ｂｉｏｌ．７：７５８−７６５（２００５）。炎症性サイトカインによる細胞の刺激は、ＲＩＰ１およびＮＥＭＯタンパク質のＫ６３結合型ポリユビキチン化をもたらし、それがＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）の活性化をもたらすことが示されている。Ｔｏｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：１２３−１３２（２００９）。次いで、ＩＫＫは、Ｋ４８結合型ポリユビキチンによりポリユビキチン化され、それに続いて、分解され、ＮＦκ−Ｂの活性化をもたらす。上記参照。最近、ＬＵＢＡＣは、ＮＦκ−Ｂの直鎖状ポリユビキチン化によってＮＦκ−Ｂ経路を活性化するが、ＪＮＫ経路を活性化しないことも示された。上記参照。ＮＦ−κＢはまた、細胞増殖および細胞周期でも役割を果たす。多くの癌は、ＮＦ−κＢの異常活性化を示し、ＮＦ−κＢの抑制は、癌細胞増殖を抑制する。Ｇａｒｇ ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １６：１０５３−６８（２００２）。ＮＦ−κＢ等のタンパク質における直鎖状結合型ポリユビキチンの存在は、ＮＦ−κＢ活性および細胞周期進行の調節において重要な役割を果たす。したがって、本発明の抗体およびＦａｂは、細胞周期の制御が異常である障害および疾患の調節のための有用な治療的手段を提供する。一実施形態において、本発明の抗直鎖状ポリユビキチン抗体は、細胞周期進行が異常に上方制御され、癌等の非常に多くの細胞分裂を生じる疾患および障害を治療するために用いられる。別の実施形態において、本発明の抗直鎖状ポリユビキチン抗体は、細胞周期進行が異常に下方制御され、細胞分裂が不足して、付随する組織の萎縮または破壊を生じる疾患および障害を治療するために用いられる。そのような疾患の例としては、変性筋障害および変性神経障害（シャルコーマリートゥース症候群、急性灰白髄炎、筋萎縮性側索硬化症、およびギランバレー症候群が含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、異常な細胞増殖のある程度関連付けられている障害を指す。一実施形態において、細胞増殖性障害は癌である。
「癌」および「癌性」という用語は、調節されていない細胞成長／増殖により一般的に特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、または説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、虫垂癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病、およびその他のリンパ増殖性疾患、および様々な型の頭頸部癌が含まれる。
本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、悪性または良性に関わらず、すべての新生細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、および「腫瘍」という用語は、本明細書で指すように相互排他的ではない。
「変性筋障害」という用語は、正常な筋肉の機能が低下した骨格筋および／または平滑筋の増悪または衰弱により一般的に特徴付けられる筋肉含有動物における生理的状態を指すか、または説明する。変性筋障害の例としては、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、先天性筋強直症、悪液質、サルコペニア、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アイザック症候群、全身硬直症候群、家族性周期性四肢麻痺、ミオパチー、ミオトニア、横紋筋融解症、筋萎縮、および様々な型の筋力低下および筋肉硬直が含まれる。
「変性神経障害」という用語は、神経組織の変質または神経組織における細胞間のコミュニケーションの悪化によって一般的に特徴付けられる筋肉含有動物における生理的状態を指すか、または説明する。変性神経障害の例としては、神経変性疾患（レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイドレーゲル症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ギランバレー症候群、シャルコーマリートゥース症候群、線条体黒質変性症、およびタウオパシー、プリオン病、球麻痺、運動ニューロン疾患、認知症により引き起こされるかまたは関連する神経細胞／組織破壊、ならびに神経系へテロ変性障害（カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス症候群、コケーン症候群、ハレルフォルデン−スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ−ナイハン症候群、およびウンフェルリヒト−ルントボルグ病が含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
別の態様において、本発明の抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、細胞集団および与えられた細胞内のポリユビキチン密度および分布の決定ならびにポリユビキチンの存在または量に基づく細胞選別を含む、様々な細胞型および組織におけるポリユビキチンの検出等の直鎖状結合型ポリユビキチンの検出および単離のための試薬としての用途を見出す。なお別の態様において、本発明の抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、本発明の対象抗体のものと類似の遮断活性パターンを持つポリユビキチンアンタゴニストの開発に有用である。さらなる例として、本発明の抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、本明細書に例示される抗体と実質的に同じポリユビキチンの抗原決定基（直鎖状および立体構造エピトープを含む）に結合する他の抗ポリユビキチン抗体の特定に使用可能である。
本発明の抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、ポリユビキチンが直鎖状結合型ポリユビキチン機能の小分子アンタゴニストをスクリーニングすることに関与している、生理学的経路に基づくアッセイで使用することができる。例えば、直鎖状結合型ポリユビキチン鎖は、ＮＦκＢの活性化のために必要であることが知られているため（Ｔｏｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：１２３−１３２（２００９））、処置された細胞または組織におけるＮＦκＢの活性化を調節（上方制御または下方制御）するための抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体の活性は、ＮＦκＢの活性化を調節における直鎖状結合型ポリユビキチンの１つ以上の可能性のある小分子アンタゴニストの活性と比較することができる。
Ａ．例となる抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体
一態様において、本発明は、直鎖状またはＣ末端−Ｎ末端結合型ポリユビキチンに結合する単離された抗体を提供する。ある種の実施形態において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、Ｃ末端−Ｎ末端結合型ポリユビキチンに特異的に結合するが、モノユビキチンには特異的に結合しない。ある種の実施形態において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、Ｃ末端−Ｎ末端結合型ポリユビキチンに特異的に結合するが、リジン結合（すなわち、Ｋ６結合、Ｋ１１結合、Ｋ２７結合、Ｋ２９結合、Ｋ３３結合、Ｋ４８結合、および／またはＫ６３結合）を有するポリユビキチンには特異的に結合しない。
一態様において、本発明は、配列番号７、１０、１３、１６、２２、および７３〜８１のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ１領域を含む、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号８、１１、１４、１７、２３、２４、および８２〜８６のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ２領域を含む、抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号９、１２、１５、１８、および８７〜９３のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ３領域を含む、抗体を提供する。
一態様において、本発明は、配列番号７、１０、１３、１６、２２、および７３〜８１のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ１領域、ならびに配列番号８、１１、１４、１７、２３、２４、および８２〜８６のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ２領域を含む、抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号７、１０、１３、１６、２２、および７３〜８１のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ１領域、ならびに配列番号９、１２、１５、１８、および８７〜９３のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ３領域を含む、抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号８、１１、１４、１７、２３、２４、および８１〜８５のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ２領域、ならびに配列番号９、１２、１５、１８、および８６〜９２のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ３領域を含む、抗体を提供する。
一態様において、本発明は、配列番号１、４、１９、および５０〜５７のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ１領域を含む、抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号２および５８〜６２のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ２領域を含む、抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号３、５、６、２０、２１、および６４〜７２のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ３領域を含む、抗体を提供する。
一態様において、本発明は、配列番号１、４、１９、および５０〜５７のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ１領域、ならびに配列番号２および５８〜６３のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ２領域を含む、抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号１、４、１９、および５０〜５７のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ１領域、ならびに配列番号３、５、６、２０、２１、および６４〜７２のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ３領域を含む、抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号２および５８〜６３のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ２領域、ならびに配列番号３、５、６、２０、２１、および６４〜７２のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ３領域を含む、抗体を提供する。
一態様において、本発明は、以下のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つすべてを含む、抗体を提供する。
（ｉ）配列番号７、１０、１３、１６、２２、および７３〜８１のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ１配列、
（ｉｉ）配列番号８、１１、１４、１７、２３、２４、および８２〜８６のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ２配列、
（ｉｉｉ）配列番号９、１２、１５、１８、および８７〜９３のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ３配列、
（ｉｖ）配列番号１、４、１９、および５０〜５７のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ１配列、
（ｖ）配列番号２および５８〜６３のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ２配列、ならびに
（ｖｉ）配列番号３、５、６、２０、２１、および６４〜７２のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ３配列。
一態様において、本発明は、直鎖状結合型ポリユビキチンに高い親和性で特異的に結合するが、幾つかの他のリジン結合ポリユビキチンには、大幅に低下した親和性で結合し、以下のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つすべてを含む、抗体を提供する。
（ｉ）配列番号７、１０、１３、１６、２２、および７３〜８１のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ１配列、
（ｉｉ）配列番号８、１１、１４、１７、２３、２４、および８２〜８６のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ２配列、
（ｉｉｉ）配列番号９、１２、１５、１８、および８７〜９３のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ３配列、
（ｉｖ）配列番号１、４、１９、および５０〜５７のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ１配列、
（ｖ）配列番号２および５８〜６３のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ２配列、ならびに
（ｖｉ）配列番号３、５、６、２０、２１、および６４〜７２のうちの少なくとも１つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ３配列。
一態様において、本発明は、図２Ｂ、５Ｂ、または９Ｂに示される重鎖ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、図２Ａ、５Ａ、または９Ａに示される軽鎖ＨＶＲ配列を含む。一実施形態において、抗体は、図２Ｂ、５Ｂ、または９Ｂに示される重鎖ＨＶＲ配列、および図２Ａ、５Ａ、または９Ａに示される軽鎖ＨＶＲ配列を含む。一実施形態において、抗体は、表５および７に示される軽鎖ＨＶＲ配列を含む。一実施形態において、本発明は、表５および７に示される重鎖ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、表５および７に示される重鎖ＨＶＲ配列、ならびに表５および７に示される軽鎖ＨＶＲ配列を含む。
本発明の抗体の幾つかの実施形態は、以下の配列番号９８に示されるように、ヒト化４Ｄ５抗体（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８）（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（また、米国特許第６，４０７，２１３号およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３において参照される）の軽鎖可変ドメインを含む。
Figure 2017200484
一実施形態において、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８軽鎖可変ドメイン配列は、位置２８、３０、３１、５３、６６、および９１（それぞれ上記に太字／斜字体で示される、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ）の１つ以上で改変されている。一実施形態において、改変されたｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８配列は、位置２８にＳｅｒ、位置３０にＳｅｒ、位置３１にＳｅｒ、位置５３にＳｅｒ、位置６６にＧｌｙ、および／または位置９１にＳｅｒを含む。したがって、一実施形態において、本発明の抗体は、以下の配列番号９９に示される配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
Figure 2017200484
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８に関して置換された残基は、上記に太字／斜字体で示される。
本発明の抗体は、直鎖状結合型ポリユビキチンへの結合活性が実質的に保持されているという条件で、任意の適切なフレームワーク可変ドメイン配列を含むことができる。例えば、幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトサブグループＩＩＩの重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３、７８、および／または１０２に置換を含む。これらの抗体の幾つかの実施形態において、位置７１はＡであり、７３はＴであり、７８はＡであり、および／または１０２はＬである。一実施形態において、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（また、米国特許第６，４０７，２１３号および第５，８２１，３３７号、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３において参照される）の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。一実施形態において、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列をさらに含む。一実施形態において、これらの抗体は、配列番号１〜６、１９〜２１、および５０〜７２の軽鎖ＨＶＲ配列のうちの少なくとも１つ、２つ、またはすべてを含む。一実施形態において、これらの抗体は、米国特許第６，４０７，２１３号および第５，８２１，３３７号）に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖ＨＶＲ配列を含む。一実施形態において、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（配列番号９８および９９）（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（また、米国特許第６，４０７，２１３号および第５，８２１，３３７号、ならびにＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３において参照される）の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
一実施形態において、本発明の抗体は、所望の標的結合親和性を得るために親和性成熟している。一例において、直鎖状結合型ポリユビキチンに高い親和性で特異的に結合するが、リジン結合を有するポリユビキチンに大幅に低下した親和性で結合する本発明の親和性成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１のアミノ酸位置３２に置換を含む。別例において、リジン結合を有する直鎖状結合型ポリユビキチンに大幅にに低下した親和性で特異的に結合する本発明の親和性成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ２のアミノ酸位置５０、５４、および／または５６に置換を含む。別例において、リジン結合を有する直鎖状結合型ポリユビキチンに大幅に低下した親和性で特異的に結合する本発明の親和性成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ３のアミノ酸位置１０３に置換を含む。別例において、直鎖状結合型ポリユビキチンに高い親和性で特異的に結合するが、他のリジン結合を有するポリユビキチンに大幅に低下した親和性で結合する本発明の親和性成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｌ１のアミノ酸位置２８、３０、３１、および／または３２に置換を含む。別例において、直鎖状結合型ポリユビキチンに高い親和性で特異的に結合するが、他のリジン結合を有するポリユビキチンに大幅に低下した親和性で結合する本発明の親和性成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｌ３のアミノ酸位置９２、９３、および／または９４に置換を含む。別例において、直鎖状結合型ポリユビキチンに高い親和性で特異的に結合するが、他のリジン結合を有するポリユビキチンに大幅に低下した親和性で結合する本発明の親和性成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｌ２のアミノ酸位置５２に置換を含む。
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２９〜３２、３６〜３８、９５、および１９６〜１９８のうちの少なくとも１つの重鎖可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２５〜２８、３３〜３５、９４、および１９３〜１９５のうちの少なくとも１つの軽鎖可変ドメインを含む。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２９〜３２、３６〜３８、９５、および１９６〜１９８のうちの少なくとも１つの配列を含む重鎖可変ドメインを含み、配列番号２５〜２８、３３〜３５、９４、および１９３〜１９５のうちの少なくとも１つの配列を含む軽鎖可変ドメインも含む。他の実施形態において、特定のクローン番号に対応する本発明の抗体は、図２Ｂ、５Ｂ、または９Ｂでそのクローン番号について示されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、特定のクローン番号に対応する本発明の抗体は、図２Ａ、５Ａ、および９Ａでそのクローン番号について示されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、特定のクローン番号に対応する本発明の抗体は、図２Ｂ、５Ｂ、または９Ｂでそのクローン番号について示されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変ドメインを含み、図２Ａ、５Ａ、および９Ａでそのクローン番号について示されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変ドメインも含む。
一態様において、本発明は、直鎖状結合型ポリユビキチンに結合するための上記の抗体のいずれかと競合する抗体を提供する。一態様において、本発明は、上記の抗体のいずれかと同じ直鎖状結合型ポリユビキチン上の抗原決定基に結合する抗体を提供する。
本明細書に示されるように、本発明の抗体は、Ｃ末端−Ｎ末端結合を有する単離されたポリユビキチンに特異的に結合する。本明細書に示されるように、本発明の抗体はまた、そのポリユビキチンが異種タンパク質に付着している場合、直鎖状Ｃ末端−Ｎ末端結合を有するポリユビキチンに特異的に結合する。
上記の実施形態のいずれかにおいて、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、ヒト化されている。一実施形態において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、上記の実施形態のいずれかにおけるＨＶＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。別の実施形態において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、上記の実施形態のいずれかにおけるＨＶＲを含み、配列番号２９〜３２、３６〜３８、および９５のうちのいずれかのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４配列を含むＶＨをさらに含む。別の実施形態において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、上記の実施形態のいずれかにおけるＨＶＲを含み、配列番号２５〜２８、３３〜３５、９４、および１９３〜１９５のうちのいずれかのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４配列を含むＶＬをさらに含む。
別の態様において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、配列番号２９〜３２、２６〜３８、９５、および１９６〜１９８のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある種の実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、直鎖状結合型ポリユビキチンに結合する能力を保持する。ある種の実施形態において、合計１から１０のアミノ酸が、配列番号２９〜３２、３６〜３８、９５、および１９６〜１９８のうちのいずれか１つにおいて、置換、挿入、および／または欠失している。ある種の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲ外の（すなわち、ＦＲ内の）領域で生じる。任意に、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、配列番号２９〜３２、３６〜３８、９５、および１９６〜１９８のうちのいずれかのＶＨ配列を含み、これには、その配列の翻訳後修飾が含まれる。
別の態様において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体が提供され、その抗体は、配列番号２５〜２８、３３〜３５、９４、および１９３〜１９５のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある種の実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、直鎖状結合型ポリユビキチンに結合する能力を保持する。ある種の実施形態において、合計１から１０のアミノ酸が、配列番号２５〜２８、３３〜３５、９４、および１９３〜１９５のうちのいずれか１つにおいて、置換、挿入、および／または欠失している。ある種の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲ外の（すなわち、ＦＲ内の）領域で生じる。任意に、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、配列番号２５〜２８、３３〜３５、９４、および１９３〜１９５のうちのいずれかのＶＬ配列を含み、これには、その配列の翻訳後修飾が含まれる。
別の態様において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体が提供され、その抗体は、上で提供される実施形態のいずれかにあるようなＶＨ、および上で提供される実施形態のいずれかにあるようなＶＬを含む。一実施形態において、抗体は、それぞれ、配列番号２９〜３２、３６〜３８、９５、および１９６〜１９８ならびに配列番号２５〜２８、３３〜３５、９４、および１９３〜１９５のうちのいずれかにあるようなＶＨおよびＶＬ配列を含み、これらの配列の翻訳後の修飾を含む。
本発明のさらなる態様において、上記の実施形態のいずれかによる抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施形態において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態において、抗体は、完全長抗体、例えば、無傷のＩｇＧ１抗体、または本明細書において定義された他の抗体クラスまたはアイソタイプである。
少なくとも１つの抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体、または抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体をコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。ある種の実施形態において、組成物は、薬学的組成物であり得る。本明細書で使用される、組成物は、１つ以上のポリユビキチンに結合する１つ以上の抗体および／または１つ以上のポリユビキチンに結合する１つ以上の抗体をコードする配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、適切な担体、例えば、当技術分野で周知である、緩衝液を含む薬学的に許容される賦形剤等をさらに含み得る。
さらなる態様において、以下のセクション１〜７で説明されるように、上記の実施形態のいずれかによる抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、単独でまたは組み合わせて、任意の特徴を組み込むことができる。
１．抗体親和性
ある種の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
一実施形態において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、対象となる抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて行われる放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを平衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することにより抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５μｇ／ｍＬの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩被覆して、その後、２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（約２３℃）で２〜５時間、遮断する。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、段階希釈した対象となるＦａｂと混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次いで、対象となるＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えば、約６５時間）継続する場合がある。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば、１時間）インキュベートする。次いで、溶液を取り除き、プレートをＰＢＳ中の０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）γカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数する。最大結合の２０％以下となる濃度のそれぞれのＦａｂを選択して、競合結合アッセイに用いる。
別の実施形態によると、約１０応答単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して表面プラズモン共鳴アッセイを用いてＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化させる。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μＬ／分の流量で注入する。抗原の注入後、未反応群をブロックするために、１Ｍのエタノールアミンを注入する。動態測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を２５℃で、およそ２５μＬ／分の流量で、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合および解離のセンサーグラムを同時に当てはめることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオン速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、オン速度は、分光計、例えば、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、増加濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２、２５℃で、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加または減少を測定する蛍光消光技術を用いて決定され得る。チップ表面への標的抗原に対する他の結合化学（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、疎水性相互作用、またはジスルフィド化学）はまた、当業者によつて理解されるように、上述のアミン結合法（ＣＭ５チップ）の代わりにすぐに利用できる。
２．抗体断片
ある種の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片、ならびに下記の他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある種の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈuｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと、また、国際公開第９３／１６１８５号、および米国特許第５，５７１，８９４号および第５，５８７，４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。
ダイアボディは、２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディおよびテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部を含む抗体断片である。ある種の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照のこと）。
抗体断片は、本明細書に記載されるように、無傷の抗体の分解、ならびに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生が含まれるが、これらに限定されない、様々な技術により作製することができる。
３．キメラおよびヒト化抗体
ある種の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある種の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。一般的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持したまま、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復もしくは改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体およびそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に総説され、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、および第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ））グラフティングを記述）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記述）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記述」）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１−６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）にさらに記載されている。
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３））を参照のこと、軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、およびＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８））、およびＦＲライブラリー由来のフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６））が含まれるが、これらに限定されない。
４．ヒト抗体
ある種の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて産生することができる。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、無傷のヒト抗体またはヒト可変領域を持つ無傷の抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。そのような動物は、一般的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含む。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照のこと。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号、ならびにＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照のこと。そのような動物により生成される無傷の抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに改変され得る。
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１））を参照のこと。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）にも記載されている。さらなる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記述）およびＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記述）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）およびＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより生成され得る。次いで、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が以下に説明される。
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性（複数を含む）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするために、当技術分野で周知である。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に総説され、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）にさらに記載されている。
ある種のファージディスプレイ法において、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、次いで、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブなレパートリーは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されるように、いかなる免疫付与なしで、広範囲の非自己抗原および自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなレパートリーはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号、および第２００９／０００２３６０号が含まれる。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
６．多重特異性抗体
ある種の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の実施形態において、結合特異性の１つは、直鎖状結合型ポリユビキチンに対してであり、他方は、任意の他の抗原に対してである。ある種の実施形態において、二重特異性抗体は、直鎖状結合型ポリユビキチンの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまた、直鎖状結合型ポリユビキチンを発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局所化するために用いることもできる。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照のこと）、国際公開第９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１））、ならびに「ノブインホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ−へテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体もしくは断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）、二重特異性抗体を産生するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと）、二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと）、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと）、および、例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されるように、三重特異性抗体を調製することによって作製することができる。
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照のこと）。
本明細書中の抗体または断片はまた、直鎖状結合型ポリユビキチンならびに別の異なる抗原（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照のこと）に結合する抗原結合部位を含む「２重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含む。
７．抗体変異体
ある種の実施形態において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成により調製することができる。そのような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、および／または挿入および／または置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが、最終構築物に達するためになされ得るが、但し、最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有するものとする。
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
ある種の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲおよびＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示される。より実質的な変更が、表１の「例示的置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下にさらに説明される。アミノ酸置換は、対象となる抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされた。
［表１］
Figure 2017200484
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
置換変異体の１つの種類は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般的には、さらなる研究のために選択され得られた変異体（複数を含む）は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の減少）を有し、および／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例となる置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるもの等のファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、１つ以上のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗体が、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
変更（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善させるために、ＨＶＲで行うことができる。そのような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で突然変異を受けるコドンによりコードされた残基で（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照のこと）、および／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨまたはＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し、再度選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施形態において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ任意の抗体変異体を特定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するもう１つの方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基が、例えば、アラニンスキャン突然変異誘発またはモデリングを使用して、特定的に定められ得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的とされる。
ある種の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）をＨＶＲにおいてなすことができる。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」またはＳＤＲの外側であり得る。上で提供される変異体ＶＨおよびＶＬ配列のある種の実施形態において、それぞれのＨＶＲは不変であるか、または１つ、２つ、または３つ以下のアミノ酸置換が含まれているかのいずれかである。
突然変異誘発に対して標的とされ得る抗体の残基または領域の特定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により説明されるように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法において、残基または標的残基の基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ等の荷電残基）が特定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置換され、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを判定する。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との間の接触点を特定する。そのような接触残基および隣接残基が、置換の候補として標的とされるか、または排除され得る。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを判定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さにわたる、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合を含む。
ｂ）グリコシル化変異体
ある種の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される度合いを増大または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作成されるかまたは取り除かれるようにアミノ酸配列を変えることにより簡便に達成することができる。
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに結合する炭水化物を変えることができる。哺乳動物細胞により産生された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般に結合させられる分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６−３２（１９９７）を参照のこと。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。幾つかの実施形態において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、ある種の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的にまたは間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体のフコース量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であり得る。フコース量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定されるＡｓｎ２９７に結合したすべての糖構造の合計（例えば、複合、ハイブリッド、および高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中のおよそ位置２９７（Ｆｃ領域の残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、抗体中のわずかな配列の変動のため、Ａｓｎ２９７はまた、位置２９７の約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、位置２９４〜３００に位置する場合がある。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関連する刊行物の例には、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が含まれる。脱フコシル化抗体を産生する細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、および国際公開第２００４／０５６３１２ Ａ１号、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、特に実施例１１）、およびノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、および国際公開第２００３／０８５１０７号）が含まれる。
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分された二分オリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。そのような抗体変異体は、低減したフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）、および米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内のうちの少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体もまた提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、および国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある種の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによって、Ｆｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置でアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
ある種の実施形態において、本発明は、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣ等）が不要または有害である用途のための望ましい候補にする、エフェクター機能のすべてではないが幾つかを有する抗体変異体を企図する。インビトロおよび／またはインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（それ故、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照のこと）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ、およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような、動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイをまた、抗体がＣ１ｑに結合できない、それ故、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うこともできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号および国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５−１０５２（２００３）、およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合およびインビボでのクリアランス／半減期の測定もまた、当技術分野で公知の方法を用いて行うこともできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照のこと）。
エフェクター機能が減少した抗体には、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ突然変異体には、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、および３２７のうちの２つ以上での置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲへの改善または減少した結合を有するある種の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、およびＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照のこと）。
ある種の実施形態において、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４での置換（残基のＥＵ番号付け）を有するＦｃ領域を含む。
幾つかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、Ｆｃ領域に、Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に変化（すなわち、改善または減少のいずれか）をもたらす、変化がなされる。
増加した半減期を持ち、胎児への母体ＩｇＧの移動を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、およびＦｃ領域変異体の他の例に関しては、国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある種の実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の接触可能部位で起こる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が、それによって抗体の接触可能部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、免疫複合体を作成するために、薬物部分またはリンカー薬物部分等の他の部分に抗体を複合させるために使用され得る。ある種の実施形態において、以下の残基のいずれか１つまたはそれ以上がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
ｅ）抗体誘導体
ある種の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、水溶性ポリマーを含むが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーもしくはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中におけるその安定性のために製造の際に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、１を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じかまたは異なる分子であり得る。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、改善されるべき抗体の特定の性質または機能、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうかを含むが、これらに限定されない、考慮事項に基づいて決定することができる。
別の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体および非タンパク質性部分の複合体が、提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長であってよいが、通常の細胞に害を与えないが、抗体非タンパク質性部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質性部分を加熱する波長が含まれるが、これらに限定されない。
Ｂ．組換え方法および組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるように、組換え方法および組成物を用いて産生することができる。一実施形態において、本明細書に記載される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードし得る。さらなる実施形態において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター、を含む（例えば、これらで形質転換される）。一実施形態において、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体を作製する方法が提供され、本方法は、上述のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意に、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収すること、を含む。
抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体の組換え産生のために、例えば、上述のように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニングおよび／または発現のために１つ以上のベクターに挿入される。そのような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物または真核生物を含む。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌中で産生され得る。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、および第５，８４０，５２３号を参照のこと。（また、大腸菌における抗体断片の発現を説明している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照のこと）。発現の後、抗体は、可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌等の真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニングまたは発現宿主であり、そのグリコシル化経路は、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照のこと。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）由来である。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にスポドプテラフルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞もまた宿主として用いてもよい。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３もしくは２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＹ０、ＮＳ０、およびＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適したある種の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照のこと。
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体は、特定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質および／または生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴付けることができる。
１．結合アッセイおよび他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等の公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
別の態様において、競合アッセイが、例えば、Ｆａｂ、または本明細書に記載の抗体のいずれか、例えば、１Ｅ３、１Ｄ８、１Ｆ４、１Ａ１０、１Ｄ８．３Ｃ２、１Ｄ８．３Ｆ８． １Ｄ８．４Ｆ５、１Ｆ１１、２Ａ２、２Ｃ１１、２Ｈ５、３Ｅ４、４Ｃ９、４Ｅ４、４Ｇ７、３Ｆ５、３Ａ７、および４Ｃ１０等、または本明細書に記載のハイブリッド抗体、例えば、直鎖状結合型ポリユビキチンへの結合については、４Ｅ４／Ｔ１１０Ａ、４Ｃ９／Ｔ１１０Ａ、４Ｇ７／Ｙ１０２Ｇ、１Ｆ１１／３Ｆ５、１Ｆ１１／３Ｅ４．１Ｆ１１／４Ｇ７、２Ｃ１１／３Ｅ４、２Ｃ１１／３Ｆ５、２Ｃ１１／４Ｇ７、２Ｈ５／３Ｅ４、２Ｈ５／３Ｆ５、２Ｈ５／４Ｇ７、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ等と競合する抗体を特定するために用いられ得る。ある種の実施形態において、そのような競合抗体は、Ｆａｂ、または本明細書に記載の抗体のいずれか、例えば、１Ｅ３、１Ｄ８、１Ｆ４、１Ａ１０、１Ｄ８．３Ｃ２、１Ｄ８．３Ｆ８．１Ｄ８．４Ｆ５、１Ｆ１１、２Ａ２、２Ｃ１１、２Ｈ５、３Ｅ４、４Ｃ９、４Ｅ４、４Ｇ７、３Ｆ５、３Ａ７、および４Ｃ１０等、または本明細書に記載のハイブリッド抗体、例えば、直鎖状結合型ポリユビキチンへの結合については、４Ｅ４／Ｔ１１０Ａ、４Ｃ９／Ｔ１１０Ａ、４Ｇ７／Ｙ１０２Ｇ、１Ｆ１１／３Ｆ５、１Ｆ１１／３Ｅ４．１Ｆ１１／４Ｇ７、２Ｃ１１／３Ｅ４、２Ｃ１１／３Ｆ５、２Ｃ１１／４Ｇ７、２Ｈ５／３Ｅ４、２Ｈ５／３Ｆ５、２Ｈ５／４Ｇ７、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ等のいずれかによって結合されるのと同じエピトープ（例えば、直鎖状または構造型エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例となる方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６） “Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。
例となる競合アッセイにおいて、固定化した直鎖状結合型ポリユビキチンが、直鎖状結合型ポリユビキチンに結合する第１の標識化抗体（例えば、抗体１Ｅ３、１Ｄ８、１Ｆ４、１Ａ１０、１Ｄ８．３Ｃ２、１Ｄ８．３Ｆ８．１Ｄ８．４Ｆ５、１Ｆ１１、２Ａ２、２Ｃ１１、２Ｈ５、３Ｅ４、４Ｃ９、４Ｅ４、４Ｇ７、３Ｆ５、３Ａ７、および４Ｃ１０、または直鎖状結合型ポリユビキチンへの結合については、ハイブリッド抗体４Ｅ４／Ｔ１１０Ａ、４Ｃ９／Ｔ１１０Ａ、４Ｇ７／Ｙ１０２Ｇ、１Ｆ１１／３Ｆ５、１Ｆ１１／３Ｅ４．１Ｆ１１／４Ｇ７、２Ｃ１１／３Ｅ４、２Ｃ１１／３Ｆ５、２Ｃ１１／４Ｇ７、２Ｈ５／３Ｅ４、２Ｈ５／３Ｆ５、２Ｈ５／４Ｇ７、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ等、ならびに直鎖状結合型ポリユビキチンへの結合について第１の抗体と競合する能力について試験される第２の非標識化抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化した直鎖状結合型ポリユビキチンが、第１の標識された抗体を含むが、第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。直鎖状結合型ポリユビキチンへの第１の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の非結合抗体が除去され、固定化された直鎖状結合型ポリユビキチンに結合した標識の量が測定される。固定化された直鎖状結合型ポリユビキチンに結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、第２の抗体が直鎖状結合型ポリユビキチンへの結合に対して、第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと。
２．活性アッセイ
一態様において、生物学的活性を有するそれらの抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体を特定するために、アッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、細胞または組織における直鎖状結合型ポリユビキチン化タンパク質の分解の速度を調節することと、細胞の細胞周期進行の速度を調節することと、を含み得る。インビボおよび／またはインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
ある種の実施形態において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
Ｄ．免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤または薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体等の１つ以上の細胞傷害性薬剤に複合化された本明細書中の抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体を含む免疫複合体を提供する。
一実施形態において、免疫複合体は、抗体が１つ以上の薬物に複合化される抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であって、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、および欧州特許第０ ４２５ ２３５ Ｂ１号を参照のこと）、モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）等のアウリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号、第５，７８０，５８８号、および第７，４９８，２９８号を参照のこと）、ドラスタチン、カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、および第５，８７７，２９６号を参照のこと、Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３）；およびＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８（１９９８））、ダウノマイシンまたはドキソルビシン等のアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７−５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８−３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７−７２１（２００５）、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９−８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９−１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６−４３４３（２００２）、および米国特許第６，６３０，５７９号を参照のこと）、メトトレキサート；ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセル等のタキサン、トリコテセン、ならびにＣＣ１０６５が含まれるが、これらに限定されない、１つ以上の薬物と複合化される。
別の実施形態において、免疫複合体は、酵素的に活性な毒素またはその断片に複合化した、本明細書に記載の抗体を含み、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテスフォーディタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカアメリカーナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカチャランチアインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリスインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、免疫複合体は、放射性複合体を形成するために放射性原子に複合化された本明細書に記載される抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性複合体の産生のために利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性複合体が検出のために使用される場合、シンチグラフィー試験のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば、再度、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄を含んでよい。
抗体と細胞傷害性薬剤の複合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルズベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネート等）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）等を用いて作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞中の細胞毒素薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
本明細書において、免疫複合体またはＡＤＣは、市販の（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）が含まれるが、これらに限定されない、クロスリンカー試薬を用いて調製される複合体を限定されないが明示的に熟考している。
Ｅ．診断および検出のための方法および組成物
ある種の実施形態において、本明細書で提供される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体のいずれも、生物学的試料中の直鎖状結合型ポリユビキチンの存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。ある種の実施形態において、生物学的試料は、腫瘍細胞、筋細胞、または神経細胞等の細胞または組織を含む。
一実施形態において、診断または検出の方法に使用される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体が提供される。さらなる態様において、生物学的試料中の直鎖状結合型ポリユビキチンの存在を検出する方法が提供される。ある種の実施形態において、本方法は、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体のポリユビキチンまたはポリユビキチン化タンパク質への結合を許容する条件下で、生物学的試料を本明細書に記載される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体と接触させることと、複合体が抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体とポリユビキチンまたはポリユビキチン化タンパク質との間に形成されているかどうかを検出することと、を含む。そのような方法は、インビトロまたはインビボでの方法であり得る。一実施形態において、例えば、直鎖状結合型ポリユビキチンが患者の選択のためのバイオマーカーである等、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体が抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体による治療にふさわしい対象を選択するために使用される。
本発明の抗体を用いて診断され得る例となる障害は、細胞周期関連疾患または障害が含まれ、それらは細胞周期進行の異常な亢進に関連する疾患または障害、または細胞周期進行の異常な低下に関連する疾患または障害であり得る。一態様において、細胞周期進行の異常な亢進に関連する疾患または障害は癌である。別の態様において、細胞周期進行の異常な低下に関連する疾患または障害は、例えば、変性筋障害または変性神経障害である。
ある種の実施形態において、標識された抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体が提供される。標識としては、（例えば、蛍光、発色、高電子密度、化学発光、および放射性標識等）直接的に検出される標識または部分、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用を介して間接的に検出される酵素またはリガンド等の部分が含まれるが、これらに限定されない。例となる標識としては、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば、希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおひょびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウルカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離ラジカル等を酸化する過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたものが含まれるが、これらに限定されない。
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体の薬学的製剤は、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で、所望の程度の純度を有するような抗体を１つ以上の任意の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、概して、使用される投薬量および濃度で受容者に毒性でなく、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中の例となる薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある種の例となるｓＨＡＳＥＧＰおよび使用法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号および第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の１つ以上のさらなるグルコサミノグリカンと組み合わされる。
例となる凍結乾燥抗体製剤は、米国特許６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号および国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸塩緩衝液を含む。
本明細書中の製剤はまた、治療されている特定の徴候のために必要に応じて、１つを超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含んでもよい。例えば、１つ以上の化学療法剤をさらに提供することが望ましい場合がある。そのような活性成分は、好適には、意図した目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル中、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、あるいはマクロエマルジョン中に封入され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透明マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形状である。
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に滅菌である。滅菌は、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成され得る。
Ｇ．治療方法および組成物
本明細書で提供される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体のいずれをも、治療方法で使用してもよい。
一態様において、医薬として使用するための抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体が提供される。さらなる態様において、異常な細胞周期制御に関連する障害（癌等の増殖障害、ならびに変性筋障害および変性神経障害が含まれるが、これらに限定されない、発育不全障害が含まれるが、これに限定されない）の治療に使用される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体が提供される。ある種の実施形態において、治療の方法に使用される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体が提供される。ある種の実施形態において、本発明は、異常な細胞周期制御に関連する障害を有する個体を治療する方法に使用される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体を提供し、本方法は、個体に有効量の抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体を投与することを含む。そのような一実施形態において、本方法は、例えば、以下に記述されるように、個体に有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤を投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、本発明は、細胞周期進行の速度が調節されるような細胞周期制御を調節することに使用される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、個体における細胞周期進行の速度を調節する方法に使用される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体を提供し、本方法は、細胞周期進行を調節し、それによって細胞分裂の速度を調節するために、個体に有効量の抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体を投与することを含む。上記の実施形態のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
さらなる態様において、本発明は、医薬の製造または調製における抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体の使用を提供する。一実施形態において、本医薬は、異常な細胞周期制御に関連する障害（癌等の増殖障害、ならびに変性筋障害および変性神経障害が含まれるが、これらに限定されない、発育不全障害が含まれるが、これに限定されない）の治療のためのものである。さらなる実施形態において、本医薬は、異常な細胞周期制御に関連する障害を治療する方法に使用されるものであり、本方法は、そのような障害を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む。そのような一実施形態において、本方法は、例えば、以下に記述されるように、個体に有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤を投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、本医薬は、細胞周期進行の速度を調節するためのものである。さらなる実施形態において、本医薬は、細胞分裂の速度を調節するために、個体に有効量の医薬を投与することを含む、個体における細胞周期進行の速度を調節する方法で使用するためのものである。上記の実施形態のいずれかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
さらなる態様において、本発明は、異常な細胞周期制御に関連する障害を治療するための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、そのような異常な細胞周期制御に関連する障害を有する個体に有効量の抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体を投与することを含む。そのような一実施形態において、本方法は、以下に記載されるように、個体に有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤を投与することをさらに含む。上記の実施形態のいずれかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
さらなる態様において、本発明は、例えば、上記の治療方法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体のいずれかを含む、薬学的製剤を提供する。一実施形態において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態において、薬学的製剤は、例えば、以下に記載されるように、本明細書で提供される抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体のいずれかと、少なくとも１つのさらなる治療剤とを含む。
本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与され得る。ある種の実施形態において、さらなる治療剤は、化学療法剤である。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミドＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン等のスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ等のアジリジン類；アルトレートアミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチローロメラミンを含むエチレンイミン類およびメチラメラミン類；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロロナファジン、チョロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン等のニトロスレアス；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照のこと）；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン；アンドロゲン類、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；フロリン酸等の葉酸リプレニッシャー；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシン類等のメイタンシノイド類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テニュアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカーバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈoｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上述したもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびに上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニソロンの併用療法の略称であるＣＨＯＰ、ならびに５−ＦＵおよびロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を有する治療レジメンの略称であるＦＯＬＦＯＸが含まれる。
また、癌の成長を促進し得るホルモンの作用を調節、低減、遮断、または阻害するように働き、しばしば全身性の、または全身処置の形態である、抗ホルモン剤が、この定義には含まれる。それらはそれ自体がホルモンであり得る。例には、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）が含まれ、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方調節剤（ＥＲＤ）；卵巣を抑止または停止させる機能がある薬剤、例えば、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン、およびトリプテレリン；その他の抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド；ならびに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールが含まれる。加えて、そのような化学療法剤の定義には、クロドネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロン酸、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロン酸、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロン酸、またはＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロン酸、ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、不粘着細胞の増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１組成剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；トシル酸ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６としても知られているＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。
上記のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の製剤に含まれる）、および本発明の抗体の投与が、追加の治療剤および／またはアジュバントの投与の前、同時、および／またはその後に起き得る別々の投与を包含する。本発明の抗体はまた、放射線治療と併用して用いることもできる。
本発明の抗体（および任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、および鼻腔内、ならびに局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間かまたは長期であるかどうかに部分的に依存し、例えば、静脈内または皮下注射等の注射による、任意の適切な経路によるものであり得る。様々な時間ポイント上の単一または複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されない、様々な投与スケジュールが本明細書で企図される。
本発明の抗体は、良好な医療行為に合致した様式で製剤化され、投与され、投薬されるであろう。この文脈において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、および医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防または治療のために、現在使用中の１つ以上の薬剤と共に製剤化される。有効量のそのような他の薬剤は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療の種類、および上記した他の要因に依存する。これらは、一般的には、本明細書に記載されるのと同じ用量および投与経路において、または本明細書に記載される用量の約１〜９９％で、または経験的に／臨床的に妥当であると判定された任意の用量および任意の経路により使用される。
本発明の抗体の結合標的の位置が、抗体の調製および投与において考慮され得る。結合標的が細胞内分子である場合、本発明のある種の実施態様は、結合標的が存在している細胞内に導入されるべき抗体またはそれらの抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本発明の抗体は、細胞内抗体として細胞内部に発現され得る。本明細書で使用される「細胞内抗体」という用語は、Ｍａｒａｓｃｏ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１１−１５（１９９７）、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４：１６３−１７０（２００４）、米国特許第６，００４，９４０号および第６，３２９，１７３号、米国特許出願公開第２００３／０１０４４０２号、およびＰＣＴ公報国際公開第２００３／０７７９４５号に記載されるように、細胞内部に発現され、かつ標的分子に選択的に結合可能である抗体またはその抗原結合部位を指す。細胞内抗体の細胞内部発現は、所望の抗体またはその抗原結合部位をコードする核酸（通常は抗原結合断片の抗体をコードする遺伝子に付随した野生型リーダー配列および分泌シグナルを欠いている）を、標的細胞に導入することによって達成される。細胞内に核酸を導入する任意の標準的な方法が用いることができ、マイクロインジェクション、弾道インジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、および対象となる核酸を運ぶレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびワクシニアベクターを用いたトランスフェクションを含む。ポリユビキチンに細胞内結合し、かつ１つ以上のポリユビキチン媒介性細胞経路を調節することができる１つ以上の細胞内抗体が発現されるように、本発明の抗ポリユビキチン抗体のすべてまたは一部をコードする１つ以上の核酸が、標的細胞に送達され得る。
別の実施形態において、内部移行する抗体が提供される。抗体は、細胞への抗体の送達を促進する特定の特性を有し得るか、またはそのような特性を有するように改変することができる。これを達成するための技術は、当技術分野で知られている。例えば、抗体のカチオン化は、細胞への取り込みを促進することが知られている（例えば、米国特許第６，７０３，０１９号を参照のこと）。リポフェクションまたはリポソームもまた、細胞に抗体を送達するために使用することもできる。抗体断片が使用される場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が一般的に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ペプチド分子は、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するように設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成することができ、および／または組換えＤＮＡ技術により製造することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照のこと。
標的細胞へのモジュレーターポリペプチドの移行は、当技術分野で公知の方法によって向上させることができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔまたはアンテナペディアホメオドメインタンパク質由来のもの等のある種の配列を、細胞膜を介した異種タンパク質の効率的な取り込みへ向かわせることができる。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：４３２５−４３２９（１９９９）を参照のこと。
結合標的が脳に位置している場合、本発明のある種の実施態様では、血液脳関門を通過するための抗体または抗原結合断片を提供する。ある種の神経変性疾患は、抗体または抗原結合断片が容易に脳に導入することができるような、血液脳関門の透過性の増加と関連している。血液脳関門が無傷のままである場合、それを通過して分子を輸送するために、幾つかの当技術分野で知られたアプローチが存在し、物理的方法、脂質に基づく方法、ならびに受容体およびチャネルに基づく方法が含まれるが、これらに限定されない。
血液脳関門を通過して抗体または抗原結合断片を輸送する物理的方法としては、完全に血液脳関門を迂回するか、または血液脳関門の開口部を作成することが含まれるが、これらに限定されない。迂回方法としては、脳内に直接注射（例えば、Ｐａｐａｎａｓｔａｓｓｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：３９８−４０６（２００２）を参照のこと；間質性注入／対流強化送達（例えば、Ｂｏｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２０７６−２０８０（１９９４）を参照のこと）、および脳内送達装置の移植（例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−５９５（２００３）を参照のこと；ならびにＧｌｉａｄｅｌ Ｗａｆｅｒｓ（商標）、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）が含まれるが、これらに限定されない。関門の開口部を作成するための方法としては、超音波（例えば、米国特許出願公開第２００２／００３８０８６号を参照のこと）、浸透圧（例えば、高張性マンニトールの投与による（Ｎｅｕｗｅｌｔ，Ｅ．Ａ．，Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，ｖｏｌｓ．１ ＆ ２，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）））、例えば、ブラジキニンまたは透過処理装置Ａ−７による透過処理（例えば、米国特許第５，１１２，５９６号、第５，２６８，１６４号、第５，５０６，２０６号、および第５，６８６，４１６号を参照のこと）、および抗体または抗原結合断片をコードする遺伝子を含有するベクターを用いた、血液脳関門をまたぐ神経細胞のトランスフェクション（例えば、米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
血液脳関門を横切って抗体または抗原結合断片を輸送する、脂質に基づいた方法には、血液脳関門の血管内皮細胞上の受容体に結合する抗体結合断片に結合されているリポソーム中に抗体または抗原結合断片を封入すること（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照のこと）と、低密度リポソーム粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照のこと）で、またはアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照のこと）で抗体または抗原結合断片を被覆することと、が含まれるが、これらに限定されない。
血液脳関門を横切って抗体または抗原結合断片を輸送する受容体およびチャネルに基づく方法としては、血液脳関門の透過性を高めるためにグルココルチコイド阻害剤を用いること（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、第２００３／０１６２６９５号、および第２００５／０１２４５３３号を参照のこと）、カリウムチャネルを活性化すること（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照のこと）、ＡＢＣ薬物輸送体を阻害すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を参照のこと）、トランスフェリンで抗体を被覆し、１つ以上のトランスフェリン受容体の活性を調節すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号を参照のこと）、抗体をカチオン化すること（例えば、米国特許第５，００４，６９７号を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
疾患の予防または治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で、または１つ以上の他のさらなる治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および経過、抗体を予防または治療目的のために投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴および抗体に対する応答性、および担当医の判断に依存するであろう。抗体は、患者に対して、単回、または一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体の約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日あたりの投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は、概して、疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例となる抗体の用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（またはこれらのいずれかの組み合わせ）が患者に投与され得る。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週または３週ごと（例えば、患者が約２から約２０、または例えば、抗体の約６投与量を受けるように）投与してもよい。初期の高負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量レジメンが有用である場合がある。この治療法の進行は、従来の方法および試験により容易にモニタリングされる。
上記の製剤または治療方法のいずれをも、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体の代わりか、またはそれに加えて、本発明の免疫複合体を用いて行うことができることが理解される。
Ｈ．製造品
本発明の別の態様において、上述の障害の治療、予防、および／または診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器およびラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等を含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な物質から形成され得る。容器は、疾患の治療、予防、および／または診断に有効である、それ自体か、または別の組成物と混合される組成物を収容し、滅菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が最適な状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を含む組成物を含む第１の容器、および（ｂ）組成物がさらなる細胞傷害性またはその他の治療剤を含む組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用することができることを示すパッケージ挿入物をさらに含み得る。あるいは、またはさらに、製造品は、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝液を含む第２（または第３）の容器をさらに含んでもよい。これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質をさらに含んでもよい。
上記の製造品のいずれも、抗直鎖状結合型ポリユビキチン抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫複合体を含み得ることが理解される。
ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上で提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施形態が実施され得ることが理解される。
実施例１：抗直鎖状ポリユビキチン抗体の単離および特徴付け
Ａ）抗原生成
ファージディスプレイライブラリーを選別するために使用される抗原は、直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）であった。直鎖状ジユビキチンは、第１のユビキチンのカルボキシ末端と第２のユビキチンのアミノ末端との間のペプチド結合を介した２つのユビキチンの頭尾融合である。
Ｂ）ナイーブライブラリー選別
ナイーブＹＳＧＸ Ｆａｂファージディスプレイライブラリーは、直鎖状ジユビキチンに対して４ラウンドの選別を施された。４ラウンドの選別後に濃縮は観察されなかった（表２を参照のこと）。ＹＳＧＸ Ｆａｂファージディスプレイライブラリーは、すべての３つの重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲ Ｌ３におけるランダム化アミノ酸を含んでおり（米国特許出願公開第２００５−０１０６６６７号およびＦｅｌｌｏｕｓｅ Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＪＭＢ ３７３：９２４−４０（２００７）を参照のこと）、ヒト化抗体４Ｄ５に基づいている。
ナイーブな一般的な軽鎖ＹＳＧＸ Ｆａｂファージディスプレイライブラリーは、直鎖状ジユビキチン直鎖状ジユビキチンに対して４ラウンドの選別を施された。２４倍濃縮が４ラウンドの選別後に観察された（表２を参照のこと）。一般的な軽鎖ＹＳＧＸ Ｆａｂファージディスプレイライブラリーは、ＹＳＧＸライブラリーについて記載されるように、すべての３つの重鎖ＣＤＲにおけるランダム化アミノ酸を含んでいる（米国特許出願公開第２００５−０１０６６６７およびＦｅｌｌｏｕｓｅ Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＪＭＢ ３７３：９２４−４０（２００７）を参照のこと）が、軽鎖配列は、ヒト化抗体４Ｄ５の修飾バージョンとして固定化される。
ナイーブＶＨ Ｆａｂファージディスプレイライブラリーは、直鎖状ジユビキチンに対して４ラウンドの選別を施された。８００倍濃縮が４ラウンドの選別後に観察された（表１を参照のこと）。ＶＨ Ｆａｂファージディスプレイライブラリーは、すべての３つの重鎖ＣＤＲにおけるランダム化アミノ酸を含んでおり（米国特許出願公開第２００５／０１１９４５５号およびＬｅｅ Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．ＪＭＢ ３４０：１０７３−９３（２００４）を参照のこと）、ヒト化抗体４Ｄ５に基づいている。
直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）が、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂ免疫プレート（ＮＵＮＣ）上で固定化された。プレートを、５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中の５μｇ／ｍＬの直鎖状ジユビキチンで、４℃で一晩被覆した。被覆したプレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２００μＬ／ウェルの２．５％のミルクで、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。ナイーブファージライブラリーを、１／５量の２０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／２．５ＭのＮａＣｌでグリセロール原液から沈殿させ、２．５％のミルク／ＰＢＳＴ中で再懸濁させ、プレートを２５℃で１時間ブロックしながらインキュベートした。１時間後、ブロッキング緩衝液をプレートから除去し、２．５％のミルク／ＰＢＳＴ中に１００μＬ／ウェルのファージを加えて、２５℃で４時間振とうさせながらインキュベートした。結合後、ウェルを手動で充填し、洗浄の間に緩衝液を除去することによって、プレートをＰＢＳＴで１０回洗浄した。ファージは、２５℃で３０分間振とうさせながら、１５０μＬ／ウェルの５０ｍＭのＨＣｌ／５００ｍＭのＫＣｌで溶出した。溶出液は、１５０μＬ／ウェルの１Ｍのトリス、ｐＨ７．５で中和され、続いて、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加したＸＬ１ブルー（Ａｇｉｌｅｎｔ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において増殖させた。
増幅されたファージを、上記の直鎖状ジユビキチンに対するさらなるラウンドの選択のために使用した。ラウンド２〜４において、異なる形態の可溶性ユビキチンを、対抗選択のためにファージに付加した。第２のラウンドにおいて、１０μｇ／ｍＬの可溶性モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を使用した。第３および第４ラウンドにおいて、１０μｇ／ｍＬの可溶性モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ１１結合型ジユビキチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７鎖（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）をそれぞれ使用した。被覆されていないウェルと比較した、直鎖状ジユビキチンで回収されたファージ数を比較することによって、ラウンド２から４に対する濃縮が計算された。ラウンド２から４において、一般的な軽鎖ライブラリーおよびＶＨライブラリーに対して濃縮が観察されたが、ＹＳＧＸライブラリーに対しては観察されなかった（表２を参照のこと）。
［表２］
Figure 2017200484
ＶＨライブラリーの第２ラウンドの選別から９６の個々のクローン、ＶＨライブラリーの第３ラウンドの選別から１９２のクローン、ＶＨライブラリーの第４ラウンドの選別から９６のクローン、および一般的な軽鎖ライブラリーの第４ラウンドの選別から１９２のクローンが、スクリーニングされた。ＹＳＧＸライブラリーに対する濃縮は見られなかったため、このライブラリーからのクローンはスクリーニングされなかった。個々のクローンを、９６ウェル形式で、３７℃で一晩振とうさせながら、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１×１０１０ファージ／ｍＬのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファオージを含有する１ｍＬの２ＹＴブロス中で増殖した。細胞を、３０００ｒｐｍで１０分間回転させることによって沈殿させた。それらの培養物からの上清が、直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ１１結合型ジユビキチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ６３結合型ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ｇＤ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、または非被覆ウェルへの結合に対して、ハイスループットファージスポットの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で使用された。Ｆａｂライブラリーのすべては、抗ｇＤ抗体結合によってディスプレイレベルの評価を可能にする、軽鎖上にカルボキシ末端ｇＤタグを含有する。ユビキチンタンパク質のパネルは、３８４ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂ免疫プレート（ＮＵＮＣ）上に固定化された。プレートを、５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中の２μｇ／ｍＬのそれぞれのタンパク質で、４℃で一晩被覆した。被覆したプレートを、ＰＢＳＴ中の６０μＬ／ウェルの２．５％のミルクで、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。１時間後、ブロッキング緩衝液をプレートから除去し、２０μＬ／ウェルのＰＢＳＴおよび１０μＬ／ウェルのファージを加えた。プレートを、２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートした。次いで、ウェルを手動で充填し、洗浄緩衝液を除去することによって、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。ＰＢＳＴ中の１：５，０００で希釈した抗Ｍ１３西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をファージ結合の検出のために使用した。３０μＬ／ウェルの二次希釈物を添加し、プレートを２５℃で３０分間振とうさせながらインキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴで６回、ＰＢＳで２回、共に手動で洗浄した。結合した二次抗体を、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を用いて検出し、続いて、等量の１Ｍのリン酸で反応停止処理を行った。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
一般的な軽鎖ライブラリーから、幾つかの弱い直鎖状ジユビキチンに特異的な結合剤が特定された（図１を参照のこと）。これらのクローンの軽鎖および重鎖可変ドメインが配列決定された。２つの固有の配列（１Ｆ４（配列番号２７および３１）および１Ａ１０（配列番号２８および３１））が特定されたが、軽鎖配列に基づいて、これらのクローンのうちの１つ（１Ｆ４）が、実際には、固定化された軽鎖を含有しないＹＳＧＸライブラリー由来であったことが判定された（図２Ａを参照のこと）。ＶＨライブラリーから、強力な直鎖状ジユビキチン結合とともにＫ６３結合型ポリユビキチンへのさらに弱い結合を示す幾つかのクローンが特定された（図１を参照のこと）。これらのＶＨライブラリークローンの重鎖可変ドメインが配列決定された。ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、およびＣＤＲ Ｈ３配列は、クローン特異的であることが期待されるが、一方、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨライブラリー設計に基づくと、同一であるはずである。全軽鎖配列（フレームワークおよびＣＤＲの両方）は、ライブラリー設計により不変であることが期待される。ＣＤＲ Ｌ１配列は、ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）であり、ＣＤＲ Ｌ２配列は、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）であり、ＣＤＲ Ｌ３配列は、ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号３）である。２つの固有の重鎖配列が特定された（１Ｄ８（配列番号３０）および１Ｅ３（配列番号２９））（図２Ｂを参照のこと）。
Ｃ）ファージミドの一価Ｆａｂディスプレイへの変換
ＶＨライブラリーからの１Ｄ８および１Ｅ３のファージミドクローンは、親和性成熟を目的として、二価Ｆａｂ−ｚｉｐ形式から一価Ｆａｂディスプレイに変換された。ＣＨ１定常ドメインの終わりと遺伝子ＩＩＩ（ｇｐＩＩＩ）の開始までの間のロイシンジッパーは、クンケル突然変異生成を用いて除去した（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８（１９８５）を参照のこと）。変異原性オリゴヌクレオチドＦ２２０−ｄｅｌｚｉｐ（ＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴ）（配列番号１００）が、１μｇの１Ｄ８または１Ｅ３のファージミドクンケルＤＮＡと組み合わされた。
一般的な軽鎖ライブラリーおよびＹＳＧＸライブラリーからの１Ａ１０および１Ｆ４クローンはそれぞれ、親和性成熟を目的として、二価Ｆａｂ−Ｃ形式から一価Ｆａｂディスプレイに変換された。ＣＨ１定常ドメインおよびｇｐＩＩＩの末端間のシステインは、クンケル突然変異生成を用いて除去した。変異原性オリゴヌクレオチドＦ１１２０−ｄｅｌＣＧＲＰ（ＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＧ）（配列番号１０１）を、１μｇの１Ａ１０または１Ｆ４のファージミドクンケルＤＮＡと組み合わさせた。得られた一価Ｆａｂファージミドを用いて、ＩＣ５０ ＥＬＩＳＡのためのファージを産生した。
Ｄ）ファージＩＣ５０ ＥＬＩＳＡ
１Ｄ８、１Ｅ３、１Ａ１０、および１Ｆ４に対する一価Ｆａｂをディスプレイするファージを、ＩＣ５０ ＥＬＩＳＡにおいて試験して、直鎖状ジユビキチンに対する相対的親和性の推定値を得た。初期力価ＥＬＩＳＡを行い、ＯＤ４５０＝０．５のシグナルが達成するファージ量を決定した。直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）が、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂ免疫プレート（ＮＵＮＣ）上で固定化された。５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中の直鎖状ジユビキチンを、１μｇ／ｍＬで、４℃で一晩被覆した。被覆したプレートを、ＰＢＳＴ中の２００μＬ／ウェルの２．５％のミルクで、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。ファージの１２回の２倍段階希釈が、ＰＢＳＴ中の２．５％のミルク中でＯＤ２６８＝４．０からＯＤ２６８＝０．００２までなされた。１時間後、ブロッキング緩衝液をプレートから除去し、１００μＬ／ウェルのそれぞれのファージ希釈を加えて、２５℃で１５分間振とうさせながらインキュベートした。次いで、プレートを、プレート洗浄機を用いてＰＢＳＴで６回洗浄した。ＰＢＳＴ中の１：５０００で希釈した抗Ｍ１３ファージ−ＨＲＰ複合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をファージ結合の検出のために使用した。１００μＬ／ウェルの二次希釈物を添加し、プレートを２５℃で３０分間振とうさせながらインキュベートした。次いで、プレートを、プレート洗浄機を用いてＰＢＳＴで１２回、手動で、ＰＢＳで２回洗浄した。結合した二次抗体は、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を用いて検出し、続いて、等量の１Ｍのリン酸で反応停止処理を行った。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＯＤ４５０＝０．５であるファージの濃度は、クローン１Ｆ４についてはＯＤ２６８＝１．０であり、クローン１Ｄ８についてはＯＤ２６８＝０．１２５であり、クローン１Ｅ３についてはＯＤ２６８＝０．５であった。クローン１Ａ１０については、ファージＯＤ２６８＝４．０でさえ、ＯＤ４５０は、わずか０．３７６であった。この結合は、非常に弱く、したがって、クローン１Ａ１０は、さらに追跡されなかった。クローン１Ｆ４については、１０μＭから５ｎＭまでの２倍段階希釈の可溶性直鎖状ジユビキチン、およびＰＢＳＴ中の２．５％のミルク中の選択されたファージ濃度に加えて、クローン１Ｄ８および１Ｅ３については、１０μＭから５６ｐＭまでの３倍段階希釈の可溶性直鎖状ジユビキチンを、２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートした。次いで、それぞれの直鎖状ジユビキチン濃度で非結合ファージ量を、１μｇ／ｍＬの直鎖状ジユビキチンで被覆され、ＰＢＳＴ中２．５％のミルクでブロックされた、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂ免疫プレートにより、その混合物をインキュベートすることによって測定した。ファージ／直鎖状ジユビキチンの混合物は、２５℃で１５分間振とうさせながらプレート上でインキュベートした。次いで、プレートを、プレート洗浄機を用いてＰＢＳＴで６回洗浄した。ＰＢＳＴ中の１：５０００で希釈した抗Ｍ１３ファージ−ＨＲＰ複合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をファージ結合の検出のために使用した。１００μＬ／ウェルの二次希釈物を添加し、プレートを２５℃で３０分間振とうさせながらインキュベートした。次いで、プレートを、プレート洗浄機を用いてＰＢＳＴで１２回、手動で、ＰＢＳで２回洗浄した。結合した二次抗体を、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を用いて検出し、続いて、等量の１Ｍのリン酸で反応停止処理を行った。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。吸光度を可溶性直鎖状ジユビキチン濃度に対してプロットし、１Ｆ４については、ＩＣ５０が１０μＭよりも多く（図３を参照のこと）、１Ｄ８については、ＩＣ５０がほぼ５μＭであり（図３を参照のこと）、１Ｅ３については、ＩＣ５０が８０ｎＭであることを示す（図３を参照のこと）。
Ｅ）Ｆａｂ産生
Ｆａｂファージディスプレイライブラリー由来のクローンを、大腸菌アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）プロモーターの制御下で発現させる。軽鎖および重鎖の両方が、大腸菌内で分泌させるために、アミノ末端細菌ｓｔＩＩシグナル配列を含み、単一のファージミドベクターから発現させる。重鎖カルボキシル末端は、Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子産物ＩＩＩ（ｇｐＩＩＩ）のＣ末端にインフレームで融合させ、ファージ上の一価Ｆａｂ断片の表示を可能にする。可溶性Ｆａｂを発現させるために、停止コドンが、ＦａｂのＣＨ１定常ドメインの終わりとｇｐＩＩＩの開始までの間の１Ｄ８および１Ｅ３の一価ファージミドに導入された。変異原性オリゴヌクレオチド：５’−ＦａｂｄｅｌｚｉｐＴＡＡ（ＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＡＡＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧ ＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧ）（配列番号１０２）および３’−ＦａｂｄｅｌｚｉｐＴＡＡ （ＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴ ＴＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧ）（配列番号１０３）が、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して停止コドンを挿入するために使用された。得られた可溶性Ｆａｂ発現プラスミドは、大腸菌株６２Ａ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に形質転換され、カルベニシリンを含有する固形寒天上に平面培養された。単一コロニーが、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する２５ｍＬの２ＹＴブロスを植菌するために使用された。培養物を３７℃で一晩増殖させ、５ｍＬが５００ｍＬの完全Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地（３．５７ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇの酵母エキス（認定）、５．３６ｇのＨｙｃａｓｅ ＳＦ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）、ｐＨはＫＯＨの添加で７．３まで調整され、体積は超純水で８７２ｍＬに調整され、オートクレーブ滅菌し、５５℃まで冷却され、それに（１Ｌ当たり）１１０ｍＬの１ＭのＭＯＰＳ ｐＨ７．３、１１ｍＬの５０％のグルコース、および７ｍＬの１ＭのＭｇＳＯ４が添加された）に５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを植菌するために使用された。培養物を３０℃で２４時間振とうさせながら増殖させた。細胞を遠心分離により収穫し、ペレットを−２０℃で保存した。Ｆａｂは、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＵＳＢ）、および１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する、３５ｍＬの冷却した洗浄緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）＋１５０ｍＭのＮａＣｌ）に細胞ペレットを再懸濁することにより精製した。ペレットを急速にボルテックスすることにより再懸濁した。完全な溶解を可能にするため、細胞を２５℃で１５分間インキュベートした。細片を遠心分離によりペレット化し、溶解液を冷却洗浄緩衝液で事前に平衡化した１ｍＬのプロテインＡ−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上にロードした。カラムは、５０ｍＬの冷却洗浄緩衝液で洗浄し、３ｍＬの０．１Ｍ 酢酸で溶出し、１５０μＬの１Ｍのトリス、ｐＨ１１．０で中和した。Ｆａｂは、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５の遠心式フィルターユニット（１０ｋＤａのカットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。得られたＦａｂ濃度を、分光光度法で測定した（１ ＯＤ２８０＝１．５ｍｇ／ｍＬ）。
Ｆ）Ｆａｂウエスタンブロット
１Ｄ８および１Ｅ３のＦａｂ（実施例１Ｅから）が、ウエスタンブロットにおいて、直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ１１結合型ジユビキチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｋ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）への結合について試験された。還元剤を含む１×ＬＤＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１μｇのそれぞれのタンパク質を、７０℃で１０分間加熱し、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル上で２通りに泳動した。ゲルを、１０％のメタノールおよび１×ＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での湿式移動によって、一定の３０Ｖで１．５時間、０．２μｍのニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移動した。膜上の非特異的結合部位を、ＰＢＳＴ中の５％のミルクでのインキュベーションによって、２５℃で１．５時間振とうさせながらブロックした。次いで、この膜を、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の５μｇ／ｍＬの１Ｄ８または１Ｅ３のＦａｂ中で、２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートした。この膜を、振とうさせながらＰＢＳＴ中で３回洗浄した。Ｆａｂを、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：１００００で希釈したヤギ抗ヒトＦａｂ断片特異的ＨＲＰ複合二次抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で膜を２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートすることにより検出した。次いで、膜をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中で１回洗浄した。二次抗体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出し、続いて、フィルムへブロットを露光した。１Ｅ３ Ｆａｂは、直鎖状ジユビキチンのみ検出するが、モノユビキチン、Ｋ１１結合型ジユビキチン、Ｋ４８結合型ジユビキチン、またはＫ６３結合型ジユビキチンは検出しない（図４を参照のこと）。１Ｄ８ Ｆａｂは、ウエスタンブロットによるいかなる形態のユビキチンも検出しなかった（図４を参照のこと）。
Ｇ）単離された１Ｄ８および１Ｅ３のＦａｂの親和性分析
１Ｄ８および１Ｅ３ Ｆａｂ（実施例１Ｅから）の親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析された。約１２０共鳴単位（ＲＵ）の直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）が、製造者により供給されたアミンカップリングプロトコルを用いてＣＭ５チップのフローセル２、フローセル３、フローセル４のそれぞれに固定化された。フローセル１は活性化され、固定タンパク質なしでエタノールアミンによりブロックされ、参照減算として使用された。１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（ＨＢＳＴ）中の１Ｅ３ Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．５〜５００ｎＭ）が、ＨＢＳＴをランニング緩衝液として用いてそれぞれのフローセル上に注入された（３０μＬ／分の流量で合計６０μＬ）。それぞれのフローセルにおいてシグナルが記録され、基準シグナルが減算された。異なる再生条件を調査した。１０ｍＭのＨＣｌを用いても、チップ表面を、ベースラインまで完全に再生することができなかった。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７を試験した場合、これはチップ表面を変化させ、結合能力を減少させた。
代替的なアプローチが、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＦａｂ捕捉方法を用いて試験された。約１１，０００共鳴単位（ＲＵ）の抗ヒトＦａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が、製造業者によって供給されたアミン結合プロトコルを用いてＣＭ５チップのフローセル１および２上に固定化された。１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（ＨＢＳＴ）中の１０μＬの１０μｇ／ｍＬ Ｆａｂが、フローセル２上に１０μＬ／分の流量で注入され、約４３０ＲＵのＦａｂの捕捉物を得た。フローセル１は、その上に捕捉抗体のみを有し、参照減算としての役割を果たした。ＨＢＳＴ中の直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）またはＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の２倍段階希釈（１〜１０００ｎＭ）が、フローセル１および２上に注入された（３０μＬ／分の流量で合計６０μＬ）。それぞれのフローセルにおいてシグナルが記録され、基準シグナルが減算された。４分間の解離時間の後、チップ表面を、３０μＬ／分の流量で、３０μＬの１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．１の２つの注入で再生した。データは、ジユビキチンが完全にチップから解離しなかったため、いずれの結合モデルにもフィットさせることは困難であった。さらに、会合速度は、非常に速く、結合は、最高濃度のジユビキチンを使用しても停滞期には達しなかった。したがって、これらのＦａｂに対するＫＤを推定することは困難である。
実施例２−１Ｆ４、１Ｄ８、および１Ｅ３の親和性成熟
Ａ）停止テンプレートの生成
ＴＡＡ停止コドンが、クンケル突然変異生成を用いたライブラリー合成のために、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ３のいずれか、またはＣＤＲ Ｌ３およびＨ３の両方に別々に挿入された（それぞれ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ３、およびＬ３／Ｈ３の停止テンプレートを生じた）。停止コドンは、完全長Ｆａｂ発現を得て、ファージ上に表示するために、停止の修復を必要とすることにより、特定のＣＤＲループ内に多様性を余儀なくする。以下に列挙される停止コドンの変異原性オリゴヌクレオチドを、１μｇの対応する一価ファージミドクンケルＤＮＡと合わせた。得られた一価Ｆａｂファージミド停止プレートは、親和性成熟ライブラリーの生成のために使用された。
クローン１Ｄ８および１Ｅ３については、軽鎖のＣＤＲ Ｌ１内の位置２４（Ｋａｂａｔ番号付け）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用されたＣＤＲ Ｌ１停止変異原性オリゴヌクレオチドは、４Ｄ５ＬＣ１．ｓｔｏｐ（ＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧ）（配列番号１０４）であった。クローン１Ｄ８および１Ｅ３については、軽鎖のＣＤＲ Ｌ２内の位置５０（Ｋａｂａｔ番号付け）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用されたＣＤＲ Ｌ２停止変異原性オリゴヌクレオチドは、４Ｄ５ＬＣ２．ｓｔｏｐ（ＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＡＡＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣ）（配列番号１０５）であった。クローン１Ｄ８および１Ｅ３については、軽鎖のＣＤＲ Ｌ３内の位置８９（Ｋａｂａｔ番号付け）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用されたＣＤＲ Ｌ３停止変異原性オリゴヌクレオチドは、４Ｄ５ＬＣ３．ｓｔｏｐ（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＡＣＴＣ）（配列番号１０６）であった。クローン１Ｄ８の重鎖のＣＤＲ Ｈ３内の位置９５（Ｋａｂａｔ番号付け）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用されたＣＤＲ Ｈ３停止変異原性オリゴヌクレオチドは、ＶＨ３．１Ｄ８．Ｈ３ｓｔｏｐ（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＴＡＡＧＣＣＧＧＧＴＣＣＣＧＣＴＴＧＴＴＧＴＣＧ）（配列番号１０７）であった。クローン１Ｅ３の重鎖のＣＤＲ Ｈ３内の位置９８（Ｋａｂａｔ番号付け）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用されたＣＤＲ Ｈ３停止変異原性オリゴヌクレオチドは、４１３Ｖｈ５ＳＲｏ６（ＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＡＧＧＣＣＴＣＧＴＡＡＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＡＣＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＡＣＴＡＧＴＣ）（配列番号１０８）であった。
クローン１Ｆ４については、軽鎖のＣＤＲ Ｌ１内の位置２７（Ｋａｂａｔ番号付け）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用されたＣＤＲ Ｌ１停止変異原性オリゴヌクレオチドは、ＣＬＣ．Ｌ１ ｓｔｏｐ（ＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＴＧＴＡＧ）（配列番号１０９）であった。クローン１Ｆ４については、軽鎖のＣＤＲ Ｌ２内の位置５２（Ｋａｂａｔ番号付け）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用されたＣＤＲ Ｌ２停止変異原性オリゴヌクレオチドは、ＣＬＣ．Ｌ２ｓｔｏｐ（ＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＡＡＡＧＣＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣ）（配列番号１１０）であった。クローン１Ｆ４については、軽鎖のＣＤＲ Ｌ３内の位置９０（Ｋａｂａｔ番号付け）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用されたＣＤＲ Ｌ３停止変異原性オリゴヌクレオチドは、ＣＬＣ４．１Ｆ４．Ｌ３ｓｔｏｐ（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＴＣＣＧ）（配列番号１１１）であった。クローン１Ｆ４の重鎖のＣＤＲ Ｈ３内の位置９４（Ｋａｂａｔ番号付け）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用されたＣＤＲ Ｈ３停止変異原性オリゴヌクレオチドは、ＣＬＣ４．１Ｆ４．Ｈ３ｓｔｏｐ（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＴＡＡＧＧＴＴＡＣＧＴＴＴＧＧＡＡＡＧＧＴＧ）（配列番号１１２）であった。
Ｂ）親和性成熟ライブラリーの生成
合計１０の親和性成熟ライブラリーが、それぞれのクローン（１Ｆ４、１Ｄ８、および１Ｅ３）に対して生成された。すべてのライブラリーは、クンケル突然変異生成によって生成された（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８（１９８５）を参照のこと）。ソフトランダム化の場合には、野生型残基が５０％の時間で保持され、かつ５０％の時間は残りの１９アミノ酸の１つがコードされるであろうように、縮重オリゴヌクレオチドが合成された。ソフトランダム化を達成するために、あるヌクレオチド位置が指定の塩基でその時間の７０％を占め、時間の１０％が３つの他の塩基の１つで占められるように、オリゴヌクレオチドが設計された（Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３（１９９４））。そのようなソフトランダム化が、特定の塩基で含まれていたオリゴヌクレオチドについて、ソフトランダム化の存在はその塩基位置の番号の存在で示される。番号「５」は、塩基のアデニンがその位置で時間の７０％存在し、一方、塩基のグアニン、シトシン、およびチミンはそれぞれ、時間の１０％存在する。同様に、番号「６」は、グアニンを指し、「７」はシトシン、「８」はチミンを指し、それぞれの場合において、他の３つの塩基のそれぞれは、時間の１０％のみ存在する。ハードランダム化の場合、縮重オリゴヌクレオチドは、天然型ヒト抗体内の特定の位置に見出されるアミノ酸の多様性が可能になるように合成された。この場合、縮重コドンは、文字「Ｒ」は、グアニンまたはアデニンをコードし、「Ｙ」は、チミンまたはシトシンをコードし、「Ｍ」は、アデニンまたはシトシンをコードし、「Ｋ」は、グアニンまたはチミンをコードし、「Ｓ」は、グアニンまたはシトシンをコードし、「Ｗ」は、アデニンまたはチミンをコードし、「Ｈ」は、アデニン、シトシン、またはチミンをコードし、「Ｂ」は、グアニン、チミン、またはシトシンをコードし、「Ｖ」は、グアニン、シトシン、またはアデニンをコードし、「Ｄ」は、グアニン、アデニン、またはチミンをコードし、「Ｎ」は、グアニン、アデニン、シトシン、またはチミンをコードする。
１０のライブラリーが、１Ｆ４に対して生成され、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３、Ｈ３、Ｌ３／Ｈ３、Ｌ１／Ｈ２、Ｌ２／Ｈ１、Ｈ２／Ｈ３、およびＬ３／Ｈ１／Ｈ２と命名された。１Ｆ４ Ｌ１ライブラリーは、軽鎖の位置２８〜３３（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。Ｌ１変異原性オリゴヌクレオチドＦ１１１−Ｌ１（ＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＲＤＴＲＫＴＲＶＷＡＮＷＴＨＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣ）（配列番号１１３）およびＦ２０２−Ｌ１（ＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＲＤＴＲＫＴＲＶＷＡＮＷＴＨＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣ）（配列番号１１４）を、１：２の比率で混合し、「Ｌ１オリゴ混合物」を得、１Ｆ４ Ｌ１停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｆ４ Ｌ２ライブラリーは、軽鎖の位置５０、５３、および５５（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。Ｌ２変異原性オリゴヌクレオチドＦ２０１−Ｌ２（ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＫＢＧＧＣＡＴＣＣＡＶＣＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴ）（配列番号１１５）およびＦ２０３−Ｌ２（ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＫＢＧＧＣＡＴＣＣＡＶＣＣＴＣＧＭＡＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣ）（配列番号１１６）を、１：１の比率で混合し、「Ｌ２オリゴ混合物」を得、１Ｆ４ Ｌ２停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｆ４ Ｌ３ライブラリーは、軽鎖の位置９１〜９６（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドＦ１３３ａ（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＭＴＤＭＣＲＶＴＮＨＴＣＣＴＹＫＧＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号１１７）、Ｆ１３３ｂ（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＭＴＤＭＣＲＶＴＮＨＴＣＣＴＴＷＴＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号１１８）、Ｆ１３３ｃ（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＳＲＴＤＭＣＲＶＴＮＨＴＣＣＴＹＫＧＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号１１９）、Ｆ１３３ｄ（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＳＲＴＤＭＣＲＶＴＮＨＴＣＣＴＴＷＴＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号１２０）を、１：１：１：１の比率で混合し、「Ｌ３ハードオリゴ混合物」を得た。変異原性オリゴヌクレオチドＦ５６３−Ｌ３ソフト１（ＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡ８７８８５７５７７５７７ＣＣＴ７７７ＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号１２１）、Ｆ５６４−Ｌ３ソフト２（ＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡ８７８８５７５７７５７７ＣＣＴＴＷＴＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号１２２）、およびＦ５６５−Ｌ３ソフト３（ＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡ８７８８５７５７７５７７ＣＣＴＹＫＧＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号１２３）を、１：０．５：１の比率で混合し、「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」を得た。次いで、「Ｌ３ハードオリゴ混合物」、「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」、および変異原性オリゴヌクレオチド１Ｆ４．Ｌ３ソフト（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡ８５７８５７８５７８５７８７８ＣＣＧ７８８ＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧ）（配列番号１２４）を、１：１：１の比率で混合し、「Ｌ３全オリゴ混合物」を得、１Ｆ４ Ｌ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｆ４ Ｈ３ライブラリーは、重鎖の位置９５、９７、９９、１００、および１００ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドＣＬＣ．１Ｆ４．Ｈ３ソフト（ＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＣ６６８ＴＡＣ６８８ＴＧＧ５５５６６８６７８ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣ）（配列番号１２５）を、１Ｆ４ Ｈ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｆ４ Ｌ３／Ｈ３ライブラリーは、軽鎖の位置９１〜９６（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。それはまた、重鎖の位置９５、９７、９９、１００、および１００ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。「Ｌ３全オリゴ混合物」および上述の変異原性オリゴヌクレオチドＣＬＣ．１Ｆ４．Ｈ３ソフト（配列番号１２６）を、１：１の比率で混合し、１Ｆ４ Ｌ３／Ｈ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｆ４ Ｌ１／Ｈ２ライブラリーは、軽鎖の位置２８〜３３（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。それはまた、重鎖の位置５０、５２、５３、５４、および５８（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の「Ｌ１オリゴ混合物」および変異原性オリゴヌクレオチドＣＬＣ４．１Ｆ４．Ｈ２ソフト（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＡ８７８ＡＴＴ８５７ＴＣＴ８５７８５７ＡＧＣＴＡＴＡＣＴ８７８ＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧ）（配列番号１２６）を、１：１の比率で混合し、１Ｆ４ Ｌ１停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｆ４ Ｌ２／Ｈ１ライブラリーは、軽鎖の位置５０、５３、および５５（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。それはまた、重鎖の位置３０〜３３（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の「Ｌ２オリゴ混合物」および変異原性オリゴヌクレオチドＣＬＣ４．１Ｆ４．Ｈ１ソフト（ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＴＴＴ８５７８７８８５７８５７ＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣ）（配列番号１２７）を、１：１の比率で混合し、１Ｆ４ Ｌ２停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｆ４ Ｈ２／Ｈ３ライブラリーは、重鎖の位置５０、５２、５３、５４、５８、９５、９７、９９、１００、および１００ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の変異原性オリゴヌクレオチドＣＬＣ４．１Ｆ４．Ｈ２ソフト（配列番号１２６）およびＣＬＣ４．１Ｆ４．Ｈ３ソフト（配列番号１２５）を、１：１の比率で混合し、１Ｆ４ Ｈ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｆ４ Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３ライブラリーは、軽鎖の位置２８〜３３、５０、５３、および５５（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。それはまた、軽鎖の位置９１〜９６（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。「Ｌ１オリゴ混合物」、「Ｌ２オリゴ混合物」、および「Ｌ３全オリゴ混合物」を、１：１：１の比率で混合し、１Ｆ４ Ｌ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｆ４ Ｌ３／Ｈ１／Ｈ２ライブラリーは、軽鎖の位置９１〜９６（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。それはまた、重鎖の位置３０〜３３、５０、５２、５３、５４、および５８（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の「Ｌ３全オリゴ混合物」、ＣＬＣ４．１Ｆ４．Ｈ１ソフト（配列番号１２７）、およびＣＬＣ４．１Ｆ４．Ｈ２ソフト（配列番号１２６）を、１：１：１の比率で混合し、１Ｆ４ Ｌ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１０のライブラリーが、１Ｄ８に対して生成され、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３、Ｈ３、Ｌ３／Ｈ３、Ｌ１／Ｈ２、Ｌ２／Ｈ１、Ｈ２／Ｈ３、およびＬ３／Ｈ１／Ｈ２と命名された。１Ｄ８ Ｌ１ライブラリーは、軽鎖の位置２８〜３３（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。上述のＬ１変異原性オリゴヌクレオチドＦ１１１−Ｌ１（配列番号１１３）およびＦ２０２−Ｌ１（配列番号１１４）を、１：２の比率で混合し、「Ｌ１オリゴ混合物」を得、１Ｄ８ Ｌ１停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｄ８ Ｌ２ライブラリーは、軽鎖の位置５０、５３、および５５（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。上述のＬ２変異原性オリゴヌクレオチドＦ２０１−Ｌ２（配列番号１１５）およびＦ２０３−Ｌ２（配列番号１１６）を、１：１の比率で混合し、「Ｌ２オリゴ混合物」を得、１Ｄ８ Ｌ２停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｄ８ Ｌ３ライブラリーは、軽鎖の位置９１〜９４および９６（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。上述の変異原性オリゴヌクレオチドＦ１３３ａ（配列番号１１７）、Ｆ１３３ｂ（配列番号１１８）、Ｆ１３３ｃ（配列番号１１９）、およびＦ１３３ｄ（配列番号１２０）を、１：１：１：１の比率で混合し、「Ｌ３ハードオリゴ混合物」を得た。上述の変異原性オリゴヌクレオチドＦ５６３−Ｌ３ソフト１（配列番号１２１）、Ｆ５６４−Ｌ３ソフト２（配列番号１２２）、およびＦ５６５−Ｌ３ソフト３（配列番号１２３）を、１：０．５：１の比率で混合し、「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」を得た。次いで、「Ｌ３ハードオリゴ混合物」および「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」を、１：１の比率で混合し、１Ｄ８ Ｌ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｄ８ Ｈ３ライブラリーは、重鎖の位置９６〜１００ｃ（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドＶＨ３．１Ｄ８．Ｈ３ソフト（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＡＧ６７８６６８８７８５６５７８８７８８８７８６８８ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣ）（配列番号１２８）を、１Ｄ８ Ｈ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｄ８ Ｌ３／Ｈ３ライブラリーは、軽鎖の位置９１〜９４および９６（Ｋａｂａｔ番号付け）を、ハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。それはまた、重鎖の位置９６〜１００ｃ（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」、「Ｌ３ハードオリゴ混合物」、および変異原性オリゴヌクレオチドＶＨ３．１Ｄ８．Ｈ３ソフト（配列番号１２８）を、０．５：０．５：１の比率で混合し、１Ｄ８ Ｌ３／Ｈ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｄ８ Ｌ１／Ｈ２ライブラリーは、軽鎖の位置２８〜３３（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。それはまた、重鎖の位置５０、５２、５３、５４、および５８（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の「Ｌ１オリゴ混合物」および変異原性オリゴヌクレオチドＶＨ３．１Ｄ８．Ｈ２ソフト（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴ６６８ＡＴＴ８７８ＣＣＴ８５７６６８ＧＧＴＴＡＴＡＣＴ６５７ＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧ）（配列番号１２９）を、１：１の比率で混合し、１Ｄ８ Ｌ１停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｄ８ Ｌ２／Ｈ１ライブラリーは、軽鎖の位置５０、５３、および５５（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。それはまた、重鎖の位置３０〜３３（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の「Ｌ２オリゴ混合物」および変異原性オリゴヌクレオチドＶＨ３．１Ｄ８．Ｈ１ソフト（ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣ５７７６５７８５７６５７ＡＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣ）（配列番号１３０）を、１：１の比率で混合し、１Ｄ８ Ｌ２停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｄ８ Ｈ２／Ｈ３ライブラリーは、重鎖の位置５０、５２、５３、５４、５８、および９６〜１００ｃ（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の変異原性オリゴヌクレオチドＶＨ３．１Ｄ８．Ｈ２ソフト（配列番号１２９）およびＶＨ３．１Ｄ８．Ｈ３ソフト（配列番号１２８）を、１：１の比率で混合し、１Ｄ８ Ｈ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｄ８ Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３ライブラリーは、軽鎖の位置２８〜３３、５０、５３、および５５（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。それはまた、軽鎖の位置９１〜９４および９６（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。「Ｌ１オリゴ混合物」、「Ｌ２オリゴ混合物」、「Ｌ３ハードオリゴ混合物」、および「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」を、１：１：０．５：０．５の比率で混合し、１Ｄ８ Ｌ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｄ８ Ｌ３／Ｈ１／Ｈ２ライブラリーは、軽鎖の位置９１〜９４および９６（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。それはまた、重鎖の位置３０〜３３、５０、５２、５３、５４、および５８（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の「Ｌ３ハードオリゴ混合物」、「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」、ＶＨ３．１Ｄ８．Ｈ１ソフト（配列番号１３０）、およびＶＨ３．１Ｄ８．Ｈ２ソフト（配列番号１２９）を、０．５：０．５：１：１の比率で混合し、１Ｄ８ Ｌ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１０のライブラリーが、１Ｅ３に対して生成され、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３、Ｈ３、Ｌ３／Ｈ３、Ｌ１／Ｈ２、Ｌ２／Ｈ１、Ｈ２／Ｈ３、およびＬ３／Ｈ１／Ｈ２と命名された。１Ｅ３ Ｌ１ライブラリーは、軽鎖の位置２８〜３３（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。上述のＬ１変異原性オリゴヌクレオチドＦ１１１−Ｌ１（配列番号１１３）およびＦ２０２−Ｌ１（配列番号１１４）を、１：２の比率で混合し、「Ｌ１オリゴ混合物」を得、１Ｅ３ Ｌ１停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｅ３ Ｌ２ライブラリーは、軽鎖の位置５０、５３、および５５（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。上述のＬ２変異原性オリゴヌクレオチドＦ２０１−Ｌ２（配列番号１１５）およびＦ２０３−Ｌ２（配列番号１１６）を、１：１の比率で混合し、「Ｌ２オリゴ混合物」を得、１Ｅ３ Ｌ２停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｅ３ Ｌ３ライブラリーは、軽鎖の位置９１〜９４および９６（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。上述の変異原性オリゴヌクレオチドＦ１３３ａ（配列番号１１７）、Ｆ１３３ｂ（配列番号１１８）、Ｆ１３３ｃ（配列番号１１９）、およびＦ１３３ｄ（配列番号１２０）を、１：１：１：１の比率で混合し、「Ｌ３ハードオリゴ混合物」を得た。上述の変異原性オリゴヌクレオチドＦ５６３−Ｌ３ソフト１（配列番号１２１）、Ｆ５６４−Ｌ３ソフト２（配列番号１２２）、およびＦ５６５−Ｌ３ソフト３（配列番号１２３）を、１：０．５：１の比率で混合し、「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」を得た。次いで、「Ｌ３ハードオリゴ混合物」および「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」を、１：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｌ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｅ３ Ｈ３ライブラリーは、重鎖の位置９５、９７、９８、９９、および１００ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドＶＨ４．１Ｅ３．Ｈ３ソフト（ＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴ５７７ＴＧＧ７８８７８８５６５ＴＧＧ６８８ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧ）（配列番号１３１）を、１Ｅ３ Ｈ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｅ３ Ｌ３／Ｈ３ライブラリーは、軽鎖の位置９１〜９４および９６（Ｋａｂａｔ番号付け）を、ハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。それはまた、重鎖の位置９５、９７、９８、９９、および１００ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」、「Ｌ３ハードオリゴ混合物」、および変異原性オリゴヌクレオチドＶＨ４．１Ｅ３．Ｈ３ソフト（配列番号１３１）を、０．５：０．５：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｌ３／Ｈ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｅ３ Ｌ１／Ｈ２ライブラリーは、軽鎖の位置２８〜３３（Ｋａｂａｔ番号付け）を、ハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。それはまた、重鎖の位置５０、５２、５３、５４、および５８（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の「Ｌ１オリゴ混合物」および変異原性オリゴヌクレオチド ＶＨ４．１Ｅ３．Ｈ２ソフト（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴ８７８ＡＴＴ５７７ＣＣＴ８７８８７８ＧＧＴＴＣＴＡＣＴ６５７ＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧ）（配列番号１３２）を、１：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｌ１停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｅ３ Ｌ２／Ｈ１ライブラリーは、軽鎖の位置５０、５３、および５５（Ｋａｂａｔ番号付け）を、ハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。それはまた、重鎖の位置３０〜３３（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の「Ｌ２オリゴ混合物」および変異原性オリゴヌクレオチドＶＨ４．１Ｅ３．Ｈ１ソフト（ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣ８７８５５８５７７８５７ＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣ）（配列番号１３３）を、１：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｌ２停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｅ３ Ｈ２／Ｈ３ライブラリーは、重鎖の位置５０、５２、５３、５４、５８、９５、９７、９８、９９、および１００ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の変異原性オリゴヌクレオチドＶＨ４．１Ｅ３．Ｈ２ソフト（配列番号１３２）およびＶＨ４．１Ｅ３．Ｈ３ソフト（配列番号１３３）を、１：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｈ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｅ３ Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３ライブラリーは、軽鎖の位置２８〜３３、５０、５３、および５５（Ｋａｂａｔ番号付け）を、ハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にした。それはまた、軽鎖の位置９１〜９４および９６（Ｋａｂａｔ番号付け）をハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。「Ｌ１オリゴ混合物」、「Ｌ２オリゴ混合物」、「Ｌ３ハードオリゴ混合物」、および「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」を、１：１：０．５：０．５の比率で混合し、１Ｅ３ Ｌ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
１Ｅ３ Ｌ３／Ｈ１／Ｈ２ライブラリーは、軽鎖の位置９１〜９４および９６（Ｋａｂａｔ番号付け）を、ハードランダム化し、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見出されるアミノ酸の多様性を可能にするか、またはソフトランダム化した。それはまた、重鎖の位置３０〜３３、５０、５２、５３、５４、および５８（Ｋａｂａｔ番号付け）をソフトランダム化した。上述の「Ｌ３ハードオリゴ混合物」、「Ｌ３ソフトオリゴ混合物」、ＶＨ４．１Ｅ３．Ｈ１ソフト（配列番号１３３）、およびＶＨ４．１Ｅ３．Ｈ２ソフト（配列番号１３２）を、０．５：０．５：１：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｌ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）と合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
突然変異誘発反応物は、エレクトロコンピテントのＸＬ１ブルー（Ａｇｉｌｅｎｔ）大腸菌中に電気穿孔され、３７℃で４５分間振とうさせながら、２５ｍＬのＳＯＣ培地に回収された。２０マイクロリットルを取り出し、１０倍段階希釈物をカルベニシリンを含有する固体寒天プレート上に平面培養し、３７℃で一晩成長させて、ライブラリーの大きさを判定した。残りの培養物を、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１×１０１０ファージ／ｍＬのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含有する５００ｍＬの２ＹＴブロスに移した。細胞は、３７℃で１時間振とうさせながら感染させた。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加し、培養物を３７℃でさらに７時間振とうさせながら増殖させた。次いで、温度を３０℃までシフトさせ、培養物をさらに２２時間増殖させた。ライブラリーはそれぞれ、少なくとも約９．５×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有した。ファージを、２０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／２．５ＭのＮａＣｌの１／５量により２ラウンドの沈降により培養上清から精製した。
Ｃ）親和性成熟ライブラリーの選別
１Ｆ４、１Ｄ８、および１Ｅ３の親和性成熟ライブラリーは、４ラウンドの選別を受けた。１０のサブライブラリーのそれぞれは、第１ラウンドのために平行して選別され、選別２から４についてはプールした。第１ラウンドは、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂ免疫プレート（ＮＵＮＣ）上に固定化された直鎖状ジユビキチンによるプレートベースの選別であった。プレートを、５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中の５μｇ／ｍＬの直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）で、４℃で一晩被覆した。被覆したプレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳ中の２００μＬ／ウェルの２．５％のミルクで、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。ファージライブラリーは、ＰＢＳＴ中の２．５％のミルクで、ＯＤ＝２．０まで希釈され、３０μｇ／ｍＬのＫ６３結合型ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）が、対抗選択のために添加された。１時間後、ブロッキング緩衝液をプレートから除去し、１００μＬ／ウェルのファージを加えて、２５℃で３時間振とうさせながらインキュベートした。結合後、ウェルを手動で充填し、洗浄の間に緩衝液を除去することによって、プレートをＰＢＳＴで２０回洗浄した。ファージを、２５℃で３０分間振とうさせながら、１５０μＬ／ウェルの５０ｍＭのＨＣｌ／５００ｍＭのＫＣｌで溶出した。溶出液は、１５０μＬ／ウェルの１Ｍのトリス、ｐＨ７．５で中和され、続いて、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加したＸＬ１ブルー（Ａｇｉｌｅｎｔ）大腸菌において増殖させた。
増幅されたファージを、プレートベースの選別において、直鎖状ジユビキチンに対するさらなるラウンドの選択のために使用した。直鎖状ジユビキチンのビオチン化がＦａｂ結合により妨害されたため、溶液ベースの選別は不可能であった。後者の選別のストリンジェンシーを、３つの方法、すなわち、３０μｇ／ｍＬの可溶性モノユビキチン、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７を対抗選択のためにファージに添加することと、プレート洗浄の回数および時間を増加することと、使用するファージの量およびファージ結合の時間を減少させることと、によって増大させた。第２の選別は、添加された可溶性ユビキチンが上記の鎖を含むように拡大され、使用されたファージの量は、ＯＤ２６８＝１．０であり、ファージ結合の時間は、２時間に減少させ、プレート洗浄の回数が、３０まで増加されたことを除いて、第１の選別と全く同じように行われた。第３の選別は、ファージ結合の時間が１．５時間に減少させ、プレート洗浄の回数が４０まで増加され、続いて、２５℃で振とうさせながら、１５分ごとに４回のさらなる洗浄を行い、それぞれの１５分間の洗浄の間に５回の迅速な洗浄を行ったことを除いて、第２の選別と全く同じように行われた。第４の選別は、使用されたファージの量をＯＤ２６８＝０．５に減少させ、ファージ結合の時間は、１時間に減少させ、洗浄には、４０回の迅速な洗浄を含み、続いて、３７℃で振とうさせながら４回の１５分間の洗浄を行ったことを除いて、第３の選別と全く同じように行われた。被覆されていないウェルと比較した、直鎖状ジユビキチンで回収されたファージ数を比較することによって、ラウンド２から４に対する濃縮が計算された。すべての３つのライブラリーに対してラウンド２から４で濃縮が観察された（表３を参照のこと）。
［表３］
Figure 2017200484
４ラウンドの選別後に、９６の個々のクローンが、１Ｆ４の第３ラウンドの選別、１Ｄ８の第２ラウンドの選別、１Ｄ８の第３ラウンドの選別、１Ｄ８の第４ラウンドの選別、および１Ｅ３の第３ラウンドの選別から選ばれ、９６ウェル形式で、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１×１０１０ファージ／ｍＬのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含有する１ｍＬの２ＹＴブロスで増殖させた。それらの培養物からの上清が、直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ１１結合型ジユビキチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｋ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ｇＤ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、または非被覆ウェル（実施例１Ｂに記載）への結合に対して、ハイスループットファージスポットＥＬＩＳＡで使用された。１Ｆ４の第３ラウンドの選別から、すべてのクローンが０．４未満のＯＤ４５０を示す非常に弱い直鎖状ジユビキチン結合剤であり、そのため、追跡されなかった。１Ｄ８の第２ラウンドの選別から、９３のクローンが、直鎖状ジユビキチンに特異的であったが、配列決定は、すべてが親の野生型１Ｄ８配列であったことを示した。１Ｄ８の第３ラウンドの選別から、４８のクローンが、直鎖状ジユビキチンに特異的であったが、配列決定は、すべてが親の野生型１Ｄ８配列であったことを示した。２つの非親クローン１Ｄ８．３Ｃ２（配列番号３３および３６）ならびに１Ｄ８．３Ｆ８（配列番号３４および３７）（図 ５Ａおよび５Ｂを参照のこと）は、実施例１Ｄと同様に、ファージＩＣ５０のＥＬＩＳＡによって試験され、直鎖状ジユビキチンに対して低いμＭ範囲でＩＣ５０を有し、１Ｄ８を上回ってわずかに改善されたことが示された（図６を参照のこと）。１Ｄ８の第４ラウンドの選別から、９４のクローンが、直鎖状ジユビキチンおよびＫ６３結合型ジユビキチンの両方に対して強い結合を示し（直鎖状については１．０を上回るＯＤ４５０、Ｋ６３については０．５を上回るＯＤ４５０）、そのため、追跡されなかった。１つのクローン、１Ｄ８．４Ｆ５（配列番号３５および３８）（図 ５Ａおよび５Ｂを参照のこと）のみが、Ｋ６３結合型ジユビキチン結合がほとんどない、強い直鎖状ジユビキチン結合を示した（Ｋ６３については、約１．３のＯＤ４５０、約０．１のＯＤ４５０）。１Ｄ８．４Ｆ５に対するファージＩＣ５０はまた、実施例１Ｄと同様に、ＥＬＩＳＡによって測定され、約２μＭであり、親クローン１Ｄ８よりもわずかに良好であると判定された（図６を参照のこと）。１Ｅ３の第３ラウンドの選別から、３３のクローンは、直鎖状ジユビキチンに特異的であったが、それらはすべて、非常に弱い結合剤であり（０．５未満のＯＤ４５０）、そのため、追跡されなかった。さらに２７のクローンは、直鎖状ジユビキチン（０．５を上回るが１．０未満のＯＤ４５０）へのより強力な結合を示したが、それらはまた、Ｋ６３結合型ジユビキチン（０．１を上回るＯＤ４５０）への結合が増加したことを示し、そのため、追跡されなかった。
実施例３−１Ｅ３の第２の親和性成熟
Ａ）停止テンプレートの生成
ＴＡＡ停止コドンが、クンケル突然変異生成を用いたライブラリー合成のために、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、およびＣＤＲ Ｈ３のいずれかに別々に挿入された（それぞれ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３停止テンプレートを生じた）。停止コドンは、完全長Ｆａｂ発現を得て、ファージ上に表示するために、停止の修復を必要とすることにより、特定のＣＤＲループ内に多様性を余儀なくする。以下に列挙される停止コドンの変異原性オリゴヌクレオチドを、１μｇの１Ｅ３一価ファージミドクンケルＤＮＡと合わせた。得られた一価Ｆａｂファージミド停止プレートは、親和性成熟ライブラリーの生成のために使用された。
１Ｅ３軽鎖のＣＤＲ Ｌ１内の位置３１（Ｋａｂａｔ番号付け）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用された変異原性オリゴヌクレオチドは、Ｅ３．Ｌ１ｓｔｏｐ（ＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＴＡＡＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣ）（配列番号１３４）であった。１Ｅ３軽鎖のＣＤＲ Ｌ２内の位置５３（Ｋａｂａｔ番号付けけ）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用された変異原性オリゴヌクレオチドは、Ｅ３．Ｌ２ｓｔｏｐ（ＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＡＡＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣ）（配列番号１３５）であった。１Ｅ３軽鎖のＣＤＲ Ｌ３内の位置９３（Ｋａｂａｔ番号付けけ）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用された変異原性オリゴヌクレオチドは、Ｅ３．Ｌ３ｓｔｏｐ（ＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＴＡＡＡＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧ）（配列番号１３６）であった。１Ｅ３軽鎖のＣＤＲ Ｈ１内の位置３２（Ｋａｂａｔ番号付けけ）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用された変異原性オリゴヌクレオチドは、Ｅ３．Ｈ１ｓｔｏｐ（ＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＡＴＴＡＡＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣ）（配列番号１３７）であった。１Ｅ３軽鎖のＣＤＲ Ｈ２内の位置５４（Ｋａｂａｔ番号付けけ）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用された変異原性オリゴヌクレオチドは、Ｅ３．Ｈ２ｓｔｏｐ（ＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＡＡＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧ）（配列番号１３８）であった。１Ｅ３軽鎖のＣＤＲ Ｈ３内の位置９９（Ｋａｂａｔ番号付けけ）でＴＡＡ停止コドンを挿入するために使用された変異原性オリゴヌクレオチドは、Ｅ３．Ｈ３ｓｔｏｐ（ＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＡＡＴＧＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧ）（配列番号１３９）であった。
Ｂ）単一の位置ＮＮＫライブラリーの生成
１Ｆ４および１Ｄ８の親和性成熟での初めての試みが、依然として低μＭ範囲のＩＣ５０である親和性の穏やかな改善を生じたため、８０ｎＭの開始ＩＣ５０を有したクローン１Ｅ３に焦点を当てられた。１Ｅ３の親和性成熟での初めての試みは、直鎖状およびＫ６３結合型ジユビキチンの両方への強力な結合を示す多くのクローンを産生した。したがって、単一クローンに取り込まれる突然変異体の数を制限することによってＫ６３結合型ジユビキチン結合を最小限に抑えるための異なるアプローチが行われた。単一の位置ＮＮＫのランダム化を使用して、単一のアミノ酸変化を１つのＣＤＲに一度に取り込んだ。いずれか１つのクローン内の単一の残基が野生型残基を保持するか、または他の１９のアミノ酸のうちのいずれか１つに変化させることを許された、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と命名された６つの単一のＣＤＲライブラリーが生成された。
Ｌ１ライブラリーは、軽鎖の位置２８〜３４（Ｋａｂａｔ番号付けけ）を、ＮＮＫコドンを用いて個々にハードランダム化し、全２０のアミノ酸を可能にした。Ｌ１変異原性オリゴヌクレオチド
Ｅ３．Ｌ１．１（ＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＮＮＫＧＴＧＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧ）（配列番号１４０）、
Ｅ３．Ｌ１．２（ＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＮＮＫＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧ）（配列番号１４１）、
Ｅ３．Ｌ１．３（ＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＮＮＫＡＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧ）（配列番号１４２）、
Ｅ３．Ｌ１．４（ＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＮＮＫＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧ）（配列番号１４３）、
Ｅ３．Ｌ１．５（ＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＣＴＮＮＫＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧ）（配列番号１４４）、
Ｅ３．Ｌ１．６（ＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＣＴＧＣＴＮＮＫＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧ）（配列番号１４５）、および
Ｅ３．Ｌ１．７（ＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＡＮＮＫＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧ）（配列番号１４６）を、１：１：１：１：１：１：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｌ１停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例３Ａに記載）を合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
Ｌ２ライブラリーは、軽鎖の位置５０〜５６（Ｋａｂａｔ番号付けけ）を、ＮＮＫコドンを用いて個々にハードランダム化し、全２０のアミノ酸を可能にした。Ｌ２変異原性オリゴヌクレオチド
Ｅ３．Ｌ２．１（ＧＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＮＮＫＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧ）（配列番号１４７）、
Ｅ３．Ｌ２．２（ＧＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＮＮＫＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧ）（配列番号１４８）、
Ｅ３．Ｌ２．３（ＧＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＮＮＫＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧ）（配列番号１４９）、
Ｅ３．Ｌ２．４（ＧＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＮＮＫＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧ）（配列番号１５０）、
Ｅ３．Ｌ２．５（ＧＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＴＣＮＮＫＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧ）（配列番号１５１）、
Ｅ３．Ｌ２．６（ＧＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＮＮＫＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧ）（配列番号１５２）、および
Ｅ３．Ｌ２．７（ＧＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＮＮＫＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧ）（配列番号１５３）を、１：１：１：１：１：１：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｌ２停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例３Ａに記載）を合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
Ｌ３ライブラリーは、軽鎖の位置９１〜９６（Ｋａｂａｔ番号付けけ）を、ＮＮＫコドンを用いて個々にハードランダム化し、全２０のアミノ酸を可能にした。Ｌ３変異原性オリゴヌクレオチド
Ｅ３．Ｌ３．１（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＮＮＫＴＡＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧ）（配列番号１５４）、
Ｅ３．Ｌ３．２（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＣＴＮＮＫＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧ）（配列番号１５５）、
Ｅ３．Ｌ３．３（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＮＮＫＡＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧ）（配列番号１５６）、
Ｅ３．Ｌ３．４（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＮＮＫＣＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧ）（配列番号１５７）、
Ｅ３．Ｌ３．５（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＡＣＴＮＮＫＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧ）（配列番号１５８）、および
Ｅ３．Ｌ３．６（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＮＮＫＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧ）（配列番号１５９）を、１：１：１：１：１：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｌ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例３Ａに記載）を合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
Ｈ１ライブラリーは、重鎖の位置３０〜３５（Ｋａｂａｔ番号付けけ）を、ＮＮＫコドンを用いて個々にハードランダム化し、全２０のアミノ酸を可能にした。Ｈ１変異原性オリゴヌクレオチド
Ｅ３．Ｈ１．１（ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＮＮＫＡＡＴＡＣＴＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧ）（配列番号１６０）、
Ｅ３．Ｈ１．２（ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＮＮＫＡＣＴＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧ）（配列番号１６１）、
Ｅ３．Ｈ１．３（ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＡＴＮＮＫＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧ）（配列番号１６２）、
Ｅ３．Ｈ１．４（ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＡＴＡＣＴＮＮＫＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧ）（配列番号１６３）、
Ｅ３．Ｈ１．５（ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＡＴＡＣＴＴＡＴＮＮＫＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧ）（配列番号１６４）、および
Ｅ３．Ｈ１．６（ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＡＴＡＣＴＴＡＴＡＴＴＮＮＫＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧ）（配列番号１６５）を、１：１：１：１：１：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｈ１停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例３Ａに記載）を合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
Ｈ２ライブラリーは、重鎖の位置４９〜５８（Ｋａｂａｔ番号付けけ）を、ＮＮＫコドンを用いて個々にハードランダム化し、全２０のアミノ酸を可能にした。Ｈ２変異原性オリゴヌクレオチド
Ｅ３．Ｈ２．１（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＮＮＫＴＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ）（配列番号１６６）、
Ｅ３．Ｈ２．２（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＮＮＫＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ）（配列番号１６７）、
Ｅ３．Ｈ２．３（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＮＮＫＡＣＴＣＣＴＴＣＴＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ）（配列番号１６８）、
Ｅ３．Ｈ２．４（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＮＮＫＣＣＴＴＣＴＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ）（配列番号１６９）、
Ｅ３．Ｈ２．５（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＣＴＮＮＫＴＣＴＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ）（配列番号１７０）、
Ｅ３．Ｈ２．６（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＮＮＫＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ）（配列番号１７１）、
Ｅ３．Ｈ２．７（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＮＮＫＧＧＴＴＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ）（配列番号１７２）、
Ｅ３．Ｈ２．８（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＡＧＣＮＮＫＴＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ）（配列番号１７３）、
Ｅ３．Ｈ２．９（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＡＧＣＧＧＴＮＮＫＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ）（配列番号１７４）、
Ｅ３．Ｈ２．１０（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＡＧＣＧＧＴＴＣＴＮＮＫＧＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ）（配列番号１７５）、および
Ｅ３．Ｈ２．１１（ＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＣＴＮＮＫＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ）（配列番号１７６）を、１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｈ２停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例３Ａに記載）を合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
Ｈ３ライブラリーは、重鎖の位置９５〜１０２（Ｋａｂａｔ番号付けけ）を、ＮＮＫコドンを用いて個々にハードランダム化し、全２０のアミノ酸を可能にした。Ｈ３変異原性オリゴヌクレオチド
Ｅ３．Ｈ３．１（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＮＮＫＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ）（配列番号１７７）、
Ｅ３．Ｈ３．２（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＮＮＫＴＴＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ）（配列番号１７８）、
Ｅ３．Ｈ３．３（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＧＧＮＮＫＣＴＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ）（配列番号１７９）、
Ｅ３．Ｈ３．４（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＮＮＫＣＧＧＴＧＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ）（配列番号１８０）、
Ｅ３．Ｈ３．５（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＣＮＮＫＴＧＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ）（配列番号１８１）、
Ｅ３．Ｈ３．６（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＧＧＮＮＫＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ）（配列番号１８２）、
Ｅ３．Ｈ３．７（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＮＮＫＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ）（配列番号１８３）、
Ｅ３．Ｈ３．８（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＮＮＫＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ）（配列番号１８４）、
Ｅ３．Ｈ３．９（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＡＴＧＮＮＫＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ）（配列番号１８５）、および
Ｅ３．Ｈ３．１０（ＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＮＮＫＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ）（配列番号１８６）を１：１：１：１：１：１：１：１：１：１の比率で混合し、１Ｅ３ Ｈ３停止テンプレートの２０μｇのクンケルＤＮＡ（実施例３Ａに記載）を合わせて、クンケル突然変異生成によるライブラリーを生成した。
突然変異誘発反応物は、エレクトロコンピテントのＸＬ１ブルー（Ａｇｉｌｅｎｔ）大腸菌中に電気穿孔され、３７℃で４５分間振とうさせながら、２５ｍＬのＳＯＣ培地に回収された。２０マイクロリットルを取り出し、１０倍段階希釈物をカルベニシリンを含有する固体寒天プレート上に平面培養し、３７℃で一晩成長させて、ライブラリーの大きさを判定した。残りの培養物を、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１×１０１０ファージ／ｍＬのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含有する５００ｍＬの２ＹＴブロスに移した。細胞は、３７℃で１時間振とうさせながら感染させた。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加し、培養物を３７℃でさらに７時間振とうさせながら増殖させた。次いで、温度を３０℃までシフトさせ、培養物をさらに２２時間増殖させた。ライブラリーはそれぞれ、少なくとも約１．５×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有した。ファージを、２０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／２．５ＭのＮａＣｌの１／５量により２ラウンドの沈降により培養上清から精製した。
６つのライブラリーのそれぞれからの６４の個々のクローンを、設計に正確に反映させたライブラリーにおいて、アミノ酸の多様性を確認するために配列決定した。ライブラリーのすべてが設計された通りであった。
Ｃ）親和性成熟ライブラリーの選別
６つのＣＤＲ ＮＮＫ親和性成熟ライブラリーは、直鎖状ジユビキチンまたはＫ６３結合型ジユビキチンのいずれかに対して、平行して３ラウンドの選別を受けた。プレートを、５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中の５μｇ／ｍＬの直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）またはＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）で、４℃で一晩被覆した。被覆したプレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳ中の２００μＬ／ウェルの２．５％のミルクで、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。ファージライブラリーを、ＰＢＳＴ中の２．５％のミルクで、ＯＤ＝１．０に希釈した。１時間後、ブロッキング緩衝液をプレートから除去し、１００μＬ／ウェルのファージを加えて、２５℃で１．５時間振とうさせながらインキュベートした。結合後、ウェルを手動で充填し、洗浄の間に緩衝液を除去することによって、プレートをＰＢＳＴで１０回洗浄した。ファージは、２５℃で３０分間振とうさせながら、１００μＬ／ウェルの５０ｍＭ ＨＣｌ／５００ｍＭ ＫＣｌで溶出した。溶出液は、１００μＬ／ウェルの１Ｍのトリス、ｐＨ７．５で中和され、続いて、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加したＸＬ１ブルー（Ａｇｉｌｅｎｔ）大腸菌において増殖させた。
増幅されたファージを、プレートベースの選別において、直鎖状ジユビキチンまたはＫ６３結合型ジユビキチンに対するさらなるラウンドの選択のために使用した。直鎖状ジユビキチンのビオチン化が１Ｅ３ Ｆａｂ結合により妨害されたため、溶液ベースの選別は不可能であった。後者の選別のストリンジェンシーを、２つの方法、すなわち、プレート洗浄の回数および時間を増加することと、使用されたファージの量およびファージ結合の時間を減少させることと、によって増大させた。第２の選別は、使用されたファージの量がＯＤ２６８＝０．５であり、プレート洗浄の回数が２１まで増加され、最後に洗浄したものを２５℃で５分間振とうさせながらインキュベートしたことを除いて、第１の選別と全く同じように行われた。第３の選別は、ファージ結合の時間が１時間に減少され、プレート洗浄の回数が３０まで増加されたことを除いて、第２の選別と全く同じように行われた。直鎖状ジユビキチンの選別については、この後に、２５℃で振とうさせながら、１５分ごとに４回のさらなる洗浄を行い、それぞれの１５分間の洗浄の間に５回の迅速な洗浄を行うことが続いた。次いで、２５℃で振とうさせながら１時間の洗浄後に、５回の迅速な洗浄を行った。被覆されていないウェルと比較した、直鎖状ジユビキチンまたはＫ６３結合型ジユビキチンで回収されたファージ数を比較することによって、ラウンド２および３に対する濃縮が計算された。直鎖状ジユビキチンに対して選別された６つすべてのライブラリーに対するラウンド２および３において強い濃縮が観察され、Ｋ６３結合型ジユビキチンについては、穏やかな濃縮が認められた（表４を参照のこと）。
［表４］
Figure 2017200484
３ラウンドの選別後、６４の個々のクローンが、直鎖状ジユビキチンの第２ラウンドの選別、直鎖状ジユビキチンの第３ラウンドの選別、Ｋ６３結合型ジユビキチンの第３ラウンドの選別から６つのライブラリーのそれぞれから選ばれ、９６ウェル形式で、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１×１０１０ファージ／ｍＬのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含有する１ｍＬの２ＹＴブロスで増殖させた。前述のように、それらの培養物からの上清が、１μｇ／ｍＬの被覆された直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ｇＤ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、または非被覆ウェル（実施例１Ｂ）への結合に対して、ハイスループットファージスポットＥＬＩＳＡで使用された。これらのクローンの可変ドメインはまた、配列決定された（表５−直鎖状ジユビキチンおよび表６−Ｋ６３結合型ジユビキチンを参照のこと）。Ｈ３クローンの配列決定は、Ｔ１１０Ａ突然変異体が、意図された突然変異体に加えて、ライブラリー設計におけるランダム化の標的とされる領域の外側で幾つかのクローン中に存在したことを示した。これは、オリゴヌクレオチドの合成エラーまたは突然変異生成のエラーによる可能性が高い。
Ｄ）単一スポット競合ファージＥＬＩＳＡ
単一スポット競合ファージＥＬＩＳＡを、どのクローンが親１Ｅ３クローンと比較して直鎖状ジユビキチンに対する親和性における最大の改善があったかを判定するために行った。ファージスポットＥＬＩＳＡ（実施例３Ｃ）からのファージ上清が使用された。競合ＥＬＩＳＡは、精製されたファージの代わりにファージ上清が使用され、単一の濃度（２５ｎＭ）の可溶性直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）のみを使用したことを除いて、ＩＣ５０ ＥＬＩＳＡ（実施例１Ｄ）について記載されるように行われた。競合はまた、いかなる可溶性直鎖状ジユビキチンも添加することなく、それぞれのクローンに対して行い、あらゆる競合抗原の不在下でのファージ結合シグナルを判定した。２５ｎＭの直鎖状ジユビキチンの存在下で、結合のパーセント阻害が、［１−（２５ｎＭの直鎖状に対するＯＤ４５０／直鎖状なしに対するＯＤ４５０）］×１００％として計算された。１Ｅ３の親クローンは、２５ｎＭの直鎖状ジユビキチンの存在下で、２０％〜７５％の範囲の阻害の結合の可変阻害パーセントを示した（表５を参照のこと）。これは、あらゆる競合する可溶性直鎖状ジユビキチンの不在下で、直鎖状ジユビキチンと結合するためのＯＤ４５０の可変性のためであった。６０阻害パーセントもしくはそれ以上を示すクローンまたは直鎖状ジユビキチンの選別において何度も単離されたものが、ファージＩＣ５０ ＥＬＩＳＡによるさらなる分析のために選択された。
以下の表５は、直鎖状ジユビキチンに対する、１Ｅ３ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３ ＮＮＫライブラリーの選別から単離されたクローンからの、それぞれＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を示す。また、２５ｎＭの可溶性直鎖状ジユビキチンの不在下および存在下での、競合スポットＥＬＩＳＡからのＯＤ４５０シグナルも示される。２５ｎＭの直鎖状ジユビキチンの存在下で、結合のパーセント阻害が、［１−（２５ｎＭの直鎖状に対するＯＤ４５０／直鎖状なしに対するＯＤ４５０）］×１００％として計算された。以下の表６は、Ｋ６３結合型ジユビキチンに対する、１Ｅ３ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３ ＮＮＫライブラリーの選別から単離されたクローンからの、それぞれＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を示す。
表５は、出現順に、配列番号１、５６、１９９、２００、２００、５７、２０１、２０２、２０２、２０３、２０４、２０４〜２０７、２０７、２０８、５０、５０、５０、５０、５０、５０、２０９、２０９、５４、５４、５４、５４、２１０、５５、５５、５３、２１１、２１２、２１２、２１２−２１４、５２、５２、２１５、２１５、２１５、２１６、２１６、２１７、２１７、２１７、２１８、１、１、１、１、１、１、１、１、１、１、１、１、１、１、および１として、それぞれＣＤＲ Ｌ１配列を開示する。表５は、出現順に、配列番号２、５９、５９、５８、５８、５８、２１９、６０、６０、６０、６０、６０、６０、６０、６０、６０、６０、２２０、２２０、２２０、２２０、２２１、２２１〜２２３、２２３〜２２６、２２６、２２６、６２、２２７、２２８、２２８、２２９、６１、６１、２３０〜２３３、２３３〜２３７、２３７、２３８、２３８、２３８、２３９、２３９、２３９、２、２、２、２、２、２、２、２、２、２、２、および２として、それぞれＣＤＲ Ｌ２配列を開示する。表５は、出現順に、配列番号３、６、６、２４０、２４０、２４０〜２４２、６６、６６、６６、６６、２４３、６８、２４４、２４４〜２４７、２４７、２４８、２４８、２４８、７０、６４、６４、６４、６４、２４９、２５０、２５０、７１、７１、２５１、７２、７２、７２、７２、７２、７２、７２、６９、６５、６５、６５、２５２、２５２、２５２、２５２、２５２、６７、６７、６７、６７、６７、６７、６７、６７、２５３、３、３、３、３、および２５４として、それぞれＣＤＲ Ｌ３配列を開示する。表５は、出現順に、配列番号２５５、２５６、７３、７９、７９、２５７、２５７、７５、７５、７５、７５、７７、７７、７７、７７、７７、７７、７７、２５８、２５８、２５９、８１、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７８、７６、７６、７６、７６、７６、７６、７６、７６、７６、７６、８０、８０、８０、２６０、２６０、２５５、２５５、２５５、２５５、２５５、２５５、２５５、２５５、２５５、２５５、２５５、２５５、および２５５として、それぞれＣＤＲ Ｈ１配列を開示する。表５は、出現順に、配列番号８、１７、８４、２６１、２６１、２６１、２６１、２６１〜２６３、８５、８３、８３、２６４、８２、８２、８２、８２、８２、８２、８２、８２、８２、８２、８２、８６、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、８、および８として、それぞれＣＤＲ Ｈ２配列を開示する。表５は、出現順に、配列番号２６５〜２６９、２６９、２７０−２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７３、２７４、２７４、２７４、２７４、２７４〜２７８、２７８、２７８、２７８〜２８１、２８１、２８２、２８２、２８２、２８２、２６５、２６５、２６５、２６５、２６５、２６５、および２６５として、それぞれＣＤＲ Ｈ３配列を開示する。
［表５］
Figure 2017200484
Figure 2017200484
Figure 2017200484
Figure 2017200484
Figure 2017200484
Figure 2017200484
表６は、出現順に、配列番号１、２８３、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、５０、２８４、５４、２８５、２８５〜２８８、５５、５５、５５、５３、２８９、２８９、２９０、２９０、２９０、２９０、２９０、２９０〜２９４、３２７、２９５、２９５、２９５、２９５〜２９７、２９７、１、１、１、１、１、１、および１として、それぞれＣＤＲ Ｌ１配列を開示する。表６は、出現順に、配列番号２、２９８、２９９、６０、６０、３００、３０２〜３０５、３０５〜３０７、３０７、３０７〜３０９、３０９、３０９、３１０、３１０〜３１４、３１４、３１４、３１４、３１４、３１４、３１４、３１４、３１４、３１４、３１４、３１５、２、２、２、２、２、２、２、２、２、２、２、２、２、２、２、２、および２として、それぞれＣＤＲ Ｌ２配列を開示する。表６は、出現順に、配列番号３、６、６、６、６、６、３１６〜３１８、３１８、３１９、６６、６６、３２０、３２１、３２１、３２１、３２１〜３２４、３２４、３２４、３２５、３０１、３２６、３０１、３２６、３８２、３２８、３２８、３２９、６４、６４、３３０、３３０、３３１、３３１、３３１、３３１、３３１、７１、７１、７１、７１、７１、７１、３３２、６９、３３３、３３３、６７、６７、６７、６７、６７、３３４、３３４、３３４、３３５、３３５、３３５、３、３、３、および３として、それぞれＣＤＲ Ｌ３配列を開示する。表６は、出現順に、配列番号２５５、３３６、３３７、３３７、３３７、３３７、３３７、３３７、３３７、３３７、３３７、３３７、３３７、３３７、３３７〜３４０、３４０〜３４３、３４３、３４３、３４３、３４３、３４３、３４４、３４４、３４４、３４４、３４４、３４４、８１、８１、８１、８１、８１、８１、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７４、７６、７６、７６、７６、７６、７６、７６、７６、７６、７６、および２５５として、それぞれＣＤＲ Ｈ１配列を開示する。表６は、出現順に、配列番号８、３４６、３４７、３４５、３４８、３４９、３４９、３４９、３４９、３４９、３４９、３４９、３４９、３４９、３４９、３４９、３４９、３４９〜３５１、３５１、３５１、３５１、３５２、３５２、３５２、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５３、３５４、８、８、８、８、８、および８として、それぞれＣＤＲ Ｈ２配列を開示する。表６は、出現順に、配列番号３５５〜３５８、３５８、３５９、３５９〜３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２、３６２−３６７、３５５、３５５、３５５、３５５、３５５、３５５、３５５、３５５、３５５、および３５５として、それぞれＣＤＲ Ｈ３配列を開示する。「Ｏ」は、オーカー停止ＴＡＡであり、「ｑ」は、例えば、抑制ｔＲＮＡ細胞株を用いてＧｌｎ（Ｑ）に置き換えられ得るアンバー停止ＴＡＧである。
［表６］
Figure 2017200484
Figure 2017200484
Figure 2017200484
Figure 2017200484
Figure 2017200484
Figure 2017200484
Ｅ）ファージＩＣ５０ ＥＬＩＳＡ
実施例１Ｄで記載される、Ｌ１ライブラリーからの８つのクローン、Ｌ２ライブラリーからの６つ、Ｌ３ライブラリーからの９つ、Ｈ１ライブラリーからの９つ、Ｈ２ライブラリーからの５つ、およびＨ３ライブラリーからの７つが、ファージＩＣ５０ ＥＬＩＳＡにおいて試験された。５００ｎＭ〜０．２３ｎＭの直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の８つの３倍段階希釈物が使用された。それぞれの実験において、野生型１Ｅ３クローンが比較のために含められた。１Ｅ３に対するＩＣ５０値は、実験の間に変化するが、親クローンよりも直鎖状ジユビキチンに対してより高い親和性を示すクローンが特定され得る。最小のＫ６３ジユビキチン結合を有する直鎖状ジユビキチンに対する改善された親和性を持つ突然変異体を特定するために、ＩＣ５０ ＥＬＩＳＡにおいて試験されたクローンは、それらが親１Ｅ３と比較して改善されたＩＣ５０値を有するかどうか、それらがＫ６３結合型ジユビキチン選別において単離されたかどうか（実施例３Ｃ）、ならびにファージスポットＥＬＩＳＡにおけるＫ６３結合型ジユビキチンへの結合に対するシグナル（実施例３Ｃ）を考慮することによって絞り込まれた。直鎖状ジユビキチン選別において複数回単離されたが、Ｋ６３結合型ジユビキチン選別においては単離されず、スポットＥＬＩＳＡにおいてＫ６３結合型ジユビキチン結合がない（０．１未満のＯＤ４５０）ことを示した１Ｅ３と比較して改善されたＩＣ５０値を有するクローンが、さらなる分析のために選択された（１Ｆ１１、２Ａ２、２Ｃ１１、２Ｈ５、３Ｅ４、４Ｃ９、４Ｅ４、および４Ｇ７）（表７を参照のこと）。直鎖状ジユビキチン選別において複数回単離された改善されたＩＣ５０を有するクローンが、Ｋ６３結合型ジユビキチン選別において１回のみ単離され、ファージスポットＥＬＩＳＡにおいてＫ６３結合型ジユビキチン結合がないことを示した場合、さらなる分析が考慮された（３Ｆ５）（表７を参照のこと）。直鎖状ジユビキチン選別およびＫ６３結合型ジユビキチン選別の両方において複数回単離されたクローン３Ａ７および４Ｃ１０が、陰性対照として選択された。１Ｅ３と同様にこれらの１１のクローンが、ファージ特異性ＥＬＩＳＡにおいてさらに試験された。以下の表７は、ファージＩＣ５０ ＥＬＩＳＡによりさらに特徴付けされた直鎖状ジユビキチンに対する、１Ｅ３ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３ ＮＮＫライブラリーの選別からのクローンのＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列をそれぞれ示す。親１Ｅ３のＩＣ５０を上回るＩＣ５０および改善倍率が与えられる。Ｋ６３結合型ジユビキチンへの結合は、ファージスポットＥＬＩＳＡにおいて、０．１を上回るＯＤ４５０を有するものとして定義される。また、ファージスポット競合ＥＬＩＳＡにおいて、２５ｎＭの可溶性直鎖状ジユビキチンの存在下で、結合におけるパーセント阻害も示される。それぞれのクローンが、直鎖状ジユビキチンまたはＫ６３結合型ジユビキチンに対する、ライブラリー選別において単離された回数が示される。
表７は、出現順に、配列番号１、１、および５０〜５７として、それぞれＣＤＲ Ｌ１配列を開示する。表７は、出現順に、配列番号２および５８〜６３として、それぞれＣＤＲ Ｌ２配列を開示する。表７は、出現順に、配列番号３、３、６４、６５、３、および６６〜７２として、それぞれＣＤＲ Ｌ３配列を開示する。表７は、出現順に、配列番号２５５および７３〜８１として、それぞれＣＤＲ Ｈ１配列を開示する。表７は、出現順に、配列番号８および８２〜８６として、それぞれＣＤＲ Ｈ２配列を開示する。表７は、出現順に、配列番号３６８〜３７２、３６８、および３７３〜３７５として、それぞれＣＤＲ Ｈ３配列を開示する。
［表７］
Figure 2017200484
Figure 2017200484
Figure 2017200484
Ｆ）ファージ特異性ＥＬＩＳＡ
１Ｆ１１、２Ａ２、２Ｃ１１、２Ｈ５、３Ｅ４、４Ｃ９、４Ｅ４、４Ｇ７、３Ｆ５、３Ａ７、および４Ｃ１０が、親クローン１Ｅ３ともに、モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ１１結合型ジユビキチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｋ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ｇＤ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、または非被覆ウェルに対して、ファージ特異性ＥＬＩＳＡにおいて試験された。ユビキチンタンパク質のパネルが、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂ免疫プレート（ＮＵＮＣ）上に固定化された（図７Ａおよび７Ｂを参照のこと）。プレートを、５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中の１μｇ／ｍＬのそれぞれのタンパク質で、４℃で一晩被覆した。被覆したプレートを、ＰＢＳＴ中の２００μＬ／ウェルの２．５％のミルクで、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。ＯＤ２６８＝１．０からＯＤ２６８＝０．０３のファージの６回の２倍段階希釈が、ＰＢＳＴ中の２．５％のミルク中でなされた。１時間後、ブロッキング緩衝液をプレートから除去し、１００μＬのファージ段階希釈物を添加した。プレートを、２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートした。次いで、プレートをプレート洗浄機を用いてＰＢＳＴで６回洗浄した。ＰＢＳＴ中で１：５，０００で希釈した抗Ｍ１３西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をファージ結合の検出のために使用した。１００μＬ／ウェルの二次希釈物を添加し、プレートを２５℃で１．２５時間振とうさせながらインキュベートした。次いで、プレートを、プレート洗浄機を用いてＰＢＳＴで６回、手動でＰＢＳを用いて２回洗浄した。結合した二次抗体は、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を用いて検出し、続いて、等量の１Ｍのリン酸で反応停止処理を行った。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
直鎖状ジユビキチン選別およびＫ６３結合型ジユビキチン選別の両方において複数回単離されたクローン３Ａ７および４Ｃ１０が、陰性対照として使用された。ファージＯＤ２６８＝１．０（３Ａ７および４Ｃ１０については、それぞれＯＤ４５０＝０．４４およびＯＤ４５０＝０．５）で、有意なＫ６３結合型結合を両方とも示した（図７Ａおよび７Ｂを参照のこと）。Ｋ６３結合型ジユビキチン選別において２回単離された２Ａ２は、中間レベルのＫ６３結合型結合を示した（ファージＯＤ２６８＝１．０でＯＤ４５０＝０．２）。すべての他のクローンは、ごくわずかな無視できるＫ６３結合型ジユビキチン結合を示した（ファージＯＤ２６８＝１．０でＯＤ４５０＜０．１６）。
Ｇ）軽鎖／重鎖の二重突然変異体のクローニング
親１Ｅ３（実施例３Ｅ）を上回る改善されたＩＣ５０を示し、ファージ特異性ＥＬＩＳＡ（実施例３Ｆ）においてごくわずかな無視できるＫ６３結合型ジユビキチン結合を示したクローンが、さらなる検討のために選択された。これらには、軽鎖変異体１Ｆ１１、２Ｃ１１、および２Ｈ５、ならびに重鎖変異体３Ｅ４、３Ｆ５、および４Ｇ７が含まれた。親和性改善において相加的作用があったかどうかを確認するために、二重突然変異体を、軽および重鎖変異体の異なる組み合わせを組み合わせて構築した。軽鎖可変ドメインを、ファージミドをＥｃｏＲＶおよびＫｐｎＩで消化させることによって除去し、次いで、同じ部位を用いて様々な重鎖変異体にクローン化した。
Ｈ）二重突然変異体ファージＩＣ５０ ＥＬＩＳＡ
二重突然変異体１Ｆ１１／３Ｅ４、１Ｆ１１／３Ｆ５、１Ｆ１１／４Ｇ７、２Ｃ１１／３Ｅ４、２Ｃ１１／３Ｆ５、２Ｃ１１／４Ｇ７、２Ｈ５／３Ｅ４、２Ｈ５／３Ｆ５、および２Ｈ５／４Ｇ７を、前述したように（実施例１Ｄおよび３Ｅ）、ファージＩＣ５０ ＥＬＩＳＡにおいて、それぞれの単一突然変異体および親１Ｅ３と比較した。二重突然変異体１Ｆ１１／３Ｆ５および２Ｈ５／３Ｆ５は、それらの個々の単一突然変異体を上回る親和性における相加的改善を示した（表８を参照のこと）。２Ｃ１１／３Ｆ５は、限界すれすれのの相加であった。この特定のアッセイにおいて、単一突然変異体３Ｆ５は、２Ｃ１１／３Ｆ５（１０ｎＭのＩＣ５０）が相加でないように思われ得る他の２つの実験（１２または１３ｎＭ）におけるよりも低いＩＣ５０（９ｎＭ）を得た。したがって、２Ｃ１１／３Ｆ５もまた、さらなる検討のために選択された。
［表８］
Figure 2017200484
Ｉ）二重突然変異体特異性ＥＬＩＳＡ
二重突然変異体１Ｆ１１／３Ｆ５、２Ｃ１１／３Ｆ５、および２Ｈ５／３Ｆ５を、実施例３Ｆにあるように、ファージ特異性ＥＬＩＳＡにおいて、それらのそれぞれの単一突然変異体および親１Ｅ３と比較した。すべての二重突然変異体は、ごくわずかな無視できるＫ６３結合型ジユビキチン結合を示した（ファージＯＤ２６８＝１．０でＯＤ４５０＜０．１）（図８Ａおよび８Ｂを参照のこと）。
Ｊ）二重突然変異体のＦａｂ産生
実施例１Ｅに記載されるように、親クローン（１Ｅ３）、単一突然変異体（１Ｆ１１、２Ｃ１１、２Ｈ５、３Ｆ５）、および二重突然変異体（１Ｆ１１／３Ｆ５、２Ｃ１１／３Ｆ５、２Ｈ５／３Ｆ５）は、ＣＨ１ドメインの末端でＴＡＡ停止コドンをファージミドに挿入することによって、Ｆａｂ発現構築物としてクローン化した。これらのＦａｂは、実施例１Ｅに記載されるように、大腸菌で発現され、精製された。
Ｋ）ＩｇＧ形式への変換
親クローン（１Ｅ３）、単一突然変異体（１Ｆ１１、２Ｃ１１、２Ｈ５、３Ｆ５）、および二重突然変異体（１Ｆ１１／３Ｆ５、２Ｃ１１／３Ｆ５、２Ｈ５／３Ｆ５）はまた、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）としてＨＥＫ２９３細胞中に発現された。発現構築物は、Ｆａｂ可変ドメインを、ヒトカッパＩｇＧ１の重鎖および軽鎖をコードするｐＲＫ哺乳動物の発現構築物にクローニングすることによって生成された（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ．２：３−１０（１９９０））。ＩｇＧは、実施例１ＥでＦａｂ精製について記載されるように、標準的な手法によるプロテインＡ−セファロースカラム上の親和性クロマトグラフィーによって精製された。
Ｌ）二重突然変異体のＢｉａｃｏｒｅ
（実施例３Ｊからの）二重突然変異体Ｆａｂの親和性を、実施例１Ｇに記載されるように、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および直接結合によって分析された。約１５０共鳴単位（ＲＵ）の直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）が、製造者により供給されたアミンカップリングプロトコルを用いてＣＭ５チップの別々のフローセル２、フローセル３、フローセル４のそれぞれに固定化された。フローセル１は活性化され、固定タンパク質なしでエタノールアミンによりブロックされ、対照減算として使用された。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７を用いても、チップ表面を、ベースラインまで完全に再生することができず、ＲＵの増加がみられ、チップ表面が変化したことを示唆した。
代替的なアプローチが、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において実施例３ＫからのＩｇＧを用いたＩｇＧ捕捉方法を用いて試験された。約８，０００共鳴単位（ＲＵ）の抗ヒトＦａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が、製造業者によって供給されたアミン結合プロトコルを用いてＣＭ５チップのフローセル１および２上に固定化された。１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（ＨＢＳＴ）中の６０μＬの１μｇ／ｍＬ Ｆａｂが、フローセル２に３０μＬ／分の流量で注入され、約７５０ＲＵのＦａｂの捕捉をもたらした。フローセル１は、その上に捕捉抗体のみを有し、参照減算としての役割を果たした。ＨＢＳＴ中の直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）またはＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の２倍段階希釈物（３．９〜５００ｎＭ）が、フローセル１および２上に注入された（３０μＬ／分の流量で合計６０μＬ）。それぞれのフローセルにおいてシグナルが記録され、参照シグナルが減算された。４分間の解離時間の後、チップ表面を、３０μＬ／分の流量で、１５μＬの３ＭのＭｇＣｌ２の１つの注入で再生した。Ｆａｂ捕捉Ｂｉａｃｏｒｅの実験（実施例１Ｇを参照のこと）とほぼ同様に、データは、ジユビキチンが完全にチップから解離しなかったため、いずれの結合モデルにも当てはめることは困難であった。さらに、会合速度は、非常に速く、結合は、最高濃度のジユビキチンを使用しても停滞期には達しなかった。したがって、これらのＩｇＧに対するＫＤを推定することは困難である。
Ｍ）二重突然変異体を用いた精製されたジユビキチンのウエスタンブロット
二重突然変異体の親和性および特異性をランク付けするために、実施例３Ｋに記載されるＩｇＧが、直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）およびＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）への結合に対してウエスタンブロットにおいて試験された。１μｇのＫ６３結合型ジユビキチンおよび還元剤を含む１×ＬＤＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の５つの３倍段階希釈の直鎖状ジユビキチン（１０００、３３３、１１１、３７、１２ｎｇ）を、７０℃で１０分間加熱し、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル上で泳動された。ゲルは、１０％のメタノールおよび１×ＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での湿式移動によって、一定の３０Ｖで１時間、０．２μｍのニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移動させた。膜上の非特異的結合部位を、ＰＢＳＴ中の５％のミルクでのインキュベーションによって、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。次いで、膜を、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１μｇ／ｍＬの１Ｅ３、１Ｆ１１、２Ｃ１１、２Ｈ５、３Ｆ５、１Ｆ１１／３Ｆ５、２Ｃ１１／３Ｆ５、または２Ｈ５／３Ｆ５ ＩｇＧ中で、２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートした。この膜を、振とうさせながらＰＢＳＴ中で３回洗浄した。ＩｇＧは、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：１０，０００で希釈したヤギ抗ヒトＦｃ断片特異的ＩＲ Ｄｙｅ８００ＣＷ複合二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中で膜を２５℃で３０分間振とうさせながらインキュベートすることにより検出した。次いで、膜をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中で１回洗浄した。二次抗体は、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像システム（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出され、定量化された。
単一突然変異体１Ｆ１１および３Ｆ５は、親１Ｅ３よりもかなりなお感受性が高かったが、一方、単一突然変異体２Ｃ１１および２Ｈ５は、わずかに改善されただけであった（図１０を参照のこと）。二重突然変異体１Ｆ１１／３Ｆ５は、それぞれの単一突然変異体を上回る感受性のさらなる改善があったが、一方、２Ｃ１１／３Ｆ５および２Ｈ５／３Ｆ５は、３Ｆ５のみよりも少しも良好ではなかった。
Ｎ）三重突然変異体のクローニング
親和性におけるさらなる改善が三重突然変異体を組み合わせることによって達成され得るかどうかを確認するために、１Ｆ１１／２Ｃ１１／３Ｆ５および１Ｆ１１／２Ｈ５／３Ｆ５の三重突然変異体が精製された。変異原性オリゴヌクレオチド５’−１Ｆ１１ Ｓ５２Ｋ（ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＡ ＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣ）（配列番号１８７）および３’−１Ｆ１１ Ｓ５２Ｋ（ＧＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＴＡＧＡＧＧＡＡＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＡＡＡＴＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＧＧ）（配列番号１８８）を、実施例３Ｋからの２Ｃ１１または２Ｈ５のｐＲＫ軽鎖構築体およびＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、二重突然変異体軽鎖を生成した。次いで、三重突然変異体が、二重突然変異体軽鎖ｐＲＫ構築体を３Ｆ５重鎖ｐＲＫ構築体と組み合わせることによって生成され、ＩｇＧが、実施例３Ｋに記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞中で発現され、精製された。
Ｏ）三重突然変異体を用いた精製されたジユビキチンのウエスタンブロット
三重突然変異体１Ｆ１１／２Ｃ１１／３Ｆ５および１Ｆ１１／２Ｈ５／３Ｆ５の親和性および特異性をランク付けするために、実施例３Ｎに記載されるＩｇＧが、実施例３Ｍに記載されるように、直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）およびＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）への結合に対してウエスタンブロットにおいて試験された。１Ｆ１１／２Ｃ１１／３Ｆ５および１Ｆ１１／２Ｈ５／３Ｆ５のいずれも、二重突然変異体１Ｆ１１／３Ｆ５ほど感受性は高くなかった（図１１を参照のこと）。
Ｐ）さらなる三重突然変異体のクローニング
実施例３Ｅにおいて親１Ｅ３を上回る改善されたＩＣ５０値を示した、一つのＨ３突然変異体、４Ｅ４は、特異性ＥＬＩＳＡにおいて少量のＫ６３結合型ジユビキチン結合があったため（ファージＯＤ２６８＝１．０でＯＤ４５０＝０．１６、実施例３Ｆを参照のこと）、二重突然変異体を作製する際に、当初は考慮されなかった。今までのところ、試験されたＩｇＧ突然変異体のいずれも、ウエスタンブロットにおいていかなるＫ６３結合型ジユビキチン結合を示さなかったため、４Ｅ４クローンがさらに分析された。４Ｅ４は、フレームワーク４においてＣＤＲ Ｈ３およびＴ１１０Ａに直接隣接した２つの突然変異体、Ｙ１０２Ｌを実際に含んだＨ３クローンであった。意図的でないＴ１１０Ａ突然変異体が親和性においていかなる効果があったかどうかを判定するために、Ｙ１０２Ｌ単一突然変異体およびＹ１０２Ｌ Ｔ１１０Ａ二重突然変異体の両方の重鎖が、１Ｅ３親重鎖または突然変異体３Ｆ５重鎖において作製された。挿入するために、Ｙ１０２Ｌ突然変異体の変異原性オリゴヌクレオチド５’−Ｙ１０２Ｌ（ＣＧＧＴＧＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣ）（配列番号１８９）および３’−Ｙ１０２Ｌ（ＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧＧＴＣＣＡＴＡＡＣＣＣＡＣＣＧ）（配列番号１９０）が１Ｅ３または３Ｆ５のＩｇＧ重鎖ｐＲＫ発現構築体のいずれかと組み合わせられ、突然変異体が、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて合成された。挿入するために、Ｙ１０２Ｌ Ｔ１１０Ａ突然変異体の変異原性オリゴヌクレオチド５’−Ｙ１０２Ｌ Ｔ１１０Ａ（ＣＧＧＴＧＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＧＣＧＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣ）（配列番号１９１）および３’−Ｙ１０２Ｌ Ｔ１１０Ａ（ＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＣＣＧＣＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧＧＴＣＣＡＴＡＡＣＣＣＡＣＣＧ）（配列番号１９２）が１Ｅ３または３Ｆ５のＩｇＧ重鎖ｐＲＫ発現構築体のいずれかと組み合わせられ、突然変異体が、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて合成された。得られた重鎖ＩｇＧ ｐＲＫ構築体は、親１Ｅ３または突然変異体１Ｆ１１のいずれかの軽鎖ＩｇＧ ｐＲＫ構築体と組み合わせられ、得られたＩｇＧは、実施例３Ｋに記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞において発現され、精製された。
次いで、これらの突然変異体（Ｙ０１２Ｌ対Ｙ１０２Ｌ Ｔ１１０Ａ、３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ対３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ Ｔ１１０Ａ、１Ｆ１１／Ｙ１０２Ｌ対１Ｆ１１／Ｙ１０２Ｌ Ｔ１１０Ａ、および１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ対１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ Ｔ１１０Ａ）は、実施例３Ｍに記載されるように、直鎖状またはＫ６３結合型ジユビキチンへの結合に対してウエスタンブロットにおいて並列して比較された。概して、Ｙ１０２Ｌと組み合わせてＴ１１０Ａを有するものは、Ｙ１０２Ｌのみと比較して感受性を著しく改善しなかった（図１２を参照のこと）。また、ファージＩＣ５０から、Ｔ１１０Ａのみ（クローン４Ｅ１）が親１Ｅ３と比較して親和性を改善しないことは分かっている（表７を参照のこと）。したがって、Ｙ１０２Ｌ突然変異体のみがさらなる分析のために考慮された。
次いで、三重突然変異体１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌが、実施例３Ｍに記載されるように、直鎖状またはＫ６３結合型ジユビキチンへの結合に対してウエスタンブロットにおいて、親１Ｅ３、単一突然変異体（１Ｆ１１、３Ｆ５、Ｙ１０２Ｌ）のそれぞれ、ならびに二重突然変異体（１Ｆ１１／３Ｆ５、１Ｆ１１／Ｙ１０２Ｌ、３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ）と並列して比較された。三重突然変異体は、直鎖状ジユビキチンへの結合に対して、親クローン１Ｅ３、単一突然変異体のすべて、および二重突然変異体のすべてよりもさらに感受性が高かった（図１３を参照のこと）。さらに、Ｋ６３結合型ジユビキチンへの結合がないことを示し、特異性が維持されることを示した。
実施例４−親和性成熟抗直鎖状ポリユビキチン抗体の特徴付け
Ａ）精製されたジユビキチン鎖のＩｇＧのウエスタンブロット
１Ｅ３親 ＩｇＧおよび１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧが、ウエスタンブロットにおいて純粋なジユビキチン鎖を検出するその能力について試験された。還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１Ｘ ＬＤＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１μｇから１６ｎｇの直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の７回の２倍段階希釈、ならびにモノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ１１結合型ジユビキチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｋ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の各１μｇを、７０℃で１０分間加熱し、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で３重に泳動した。１つのゲルを、すべてのタンパク質を検出するためにＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅクマシー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。親和性を知るための比較のために、２回目のウエスタンブロットは、Ｋ６３結合型ジユビキチンに対して８．７ｎＭの既知のＫＤを有する抗Ｋ６３抗体、Ａｐｕ３．Ａ８を用いて行われた（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ １３４：６６８−６７８を参照のこと）。このウエスタンのために、１μｇから１６ｎｇのＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の７回の２倍段階希釈、ならびにモノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ１１結合型ジユビキチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、およびＫ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の各１μｇを、上記のようにゲル上に泳動した。３つのゲルを、１０％のメタノールおよび１×ＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での湿式移動によって、一定の３０Ｖで１時間、０．２μｍのニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に個々に移動させた。膜上の非特異的結合部位を、ＰＢＳＴ中の５％のミルクでのインキュベーションによって、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。次いで、膜を、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１μｇ／ｍＬの１Ｅ３、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ、またはＡｐｕ３．Ａ８中で２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートした。この膜を、振とうさせながらＰＢＳＴ中で３回洗浄した。ＩｇＧは、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：１００００で希釈したヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＨＲＰ複合Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中で膜を２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートすることにより検出した。次いで、膜をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中で１回洗浄した。二次抗体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出し、続いて、フィルムへブロットを露光した。
１Ｅ３の検出限界は、直鎖状ジユビキチンの約２５０ｎｇであった（図１４を参照のこと）。対照的に、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌは、はるかに感受性が高く、わずかに３１ｎｇの直鎖状ジユビキチンを検出することができた。さらに、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌは、非常に特異的であり、試験された他の形態のあらゆるユビキチンと結合しないことを示した。比較として、８．７ｎＭのＫＤを有するＡｐｕ３．Ａ８の検出限界は、約６２ｎｇであった。したがって、直鎖状ジユビキチンに対する１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２ＬのＫＤは、低いｎＭの範囲である可能性が高い。
Ｂ）精製されたポリユビキチン鎖のＩｇＧのウエスタンブロット
直鎖状特異的抗体が、直鎖状ジユビキチン抗原に対して生成され、そのため、それらは恐らくは結合そのものを認識したか、または直鎖状結合から生じるジユビキチンの構造のため近接近して配置される近位および遠位ユビキチン上の周囲表面残基を認識した。ジユビキチンは抗原の最小認識単位であり、直鎖状ポリユビキチンが反復「モノマー」単位としてジユビキチンを持つポノマー鎖であるため、抗体もまた、ポリユビキチン型と結合するはずである。これを検証するために、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧを、ウエスタンブロットにおいて純粋なポリユビキチン鎖を検出するその能力について試験した。還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１Ｘ ＬＤＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、直鎖状ポリユビキチン２−７（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｋ１１結合型ポリユビキチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の各１μｇを、７０℃で１０分間加熱し、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で３重に泳動した。１つのゲルを、すべてのタンパク質を検出するためにＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅクマシー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。他の２つのゲルは、１０％のメタノールおよび１×ＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での湿式移動によって、一定の３０Ｖで１時間、０．２μｍのニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に別々に移動させた。膜上の非特異的結合部位を、ＰＢＳＴ中の５％のミルクでのインキュベーションによって、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。次いで、膜は、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１μｇ／ｍＬの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧまたは１：２００で希釈したマウス汎ユビキチン抗体、Ｐ４Ｄ１（非結合特異的、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で、２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートした。この膜を、振とうさせながらＰＢＳＴ中で３回洗浄した。１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧは、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：１００００で希釈したヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＨＲＰ複合Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中で膜を２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートすることにより検出した。Ｐ４Ｄ１ ＩｇＧは、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：１０，０００で希釈したヤギ抗マウスＦｃγ特異的ＨＲＰ複合Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中で膜を２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートすることにより検出した。次いで、膜をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中で１回洗浄した。二次抗体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出し、続いて、フィルムへブロットを露光した。対照汎ユビキチン抗体、Ｐ４Ｄ１は、モノユビキチン、直鎖状ポリユビキチン２−７（わずかであるが）、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７を認識するが、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧは、直鎖状ポリユビキチンのみを認識する（図１５を参照のこと）。したがって、直鎖状ジユビキチンと全く同様に、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ抗体は、直鎖状結合を含むポリユビキチン鎖を検出することができるが、他の結合のポリユビキチン鎖を認識しない。
Ｃ）ＴＮＦαで処理した細胞溶解物のＩｇＧのウエスタンブロット
ＨｅＬａ Ｓ３細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％のグリシン／ヒポキサンチン／チミジン（ＧＨＴ）溶液、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した５０：５０のＦ−１２：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の懸濁培養中で増殖させた。実験前日、細胞を１：２に分割した。細胞は、０．３８×１０６細胞／ｍＬの密度に達するまで一晩増殖させた（９８％の生存能力）。細胞はそれぞれ、１．５Ｌの３つのフラスコに分けられた。フラスコ１は、５．８μＭのＭＧ１３２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で１０分間前処理された。フラスコ２および３は、前処理を受けなかった。時間ゼロで、フラスコ２および３はまた、５．８μＭのＭＧ１３２でも処理された。さらに、時間ゼロで、フラスコ１および３は、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理され、フラスコ２は、５００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで処理された。時間ゼロ、５分、および２０分で、４４４ｍＬの細胞を、それぞれのフラスコから取り出し、４℃で５分間、８００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を吸引した。細胞を、４０ｍＬの冷ＰＢＳで直ちに洗浄し、４℃で５分間、８００ｒｐｍでペレット化し、上清を吸引した。それぞれのペレットを、１３ｍＬの冷溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、２５μＭのＭＧ１３２、５０ｍＭのＮａＦ、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）、およびＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ））中で、４℃で１０分間振動させながら溶解した。細片を、１０，０００ｘｇ、４℃で５分間、回転させることによってペレット化した。溶解物を、１３３μＬのプロテインＡダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、４℃で１時間振動させながら前もって除去した。ビーズを、２０００ｒｐｍで５分間回転させることによってペレット化した。上清を除去し、−８０℃で保存した。
直鎖状ポリユビキチン鎖は、ＮＦκＢ経路においてシグナル伝達の役割を果たすことが示唆されている。したがって、上の溶解物は、ウエスタンブロットにおいて、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌでプローブされた。還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１３μＬのそれぞれの溶解物を、７０℃で１０分間加熱し、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で２通りに泳動した。特異性の対照として、２５０ｎｇの精製された直鎖状（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＫ６３結合型ポリユビキチン鎖（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）をゲル上で泳動した。ゲルを、１０％のメタノールおよび１×ＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での湿式移動によって、一定の３０Ｖで１時間、０．４５μｍのニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に個々に移動させた。膜上の非特異的結合部位を、ＰＢＳＴ中の５％のミルクでのインキュベーションによって、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。次いで、膜を、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１μｇ／ｍＬの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２ＬまたはＡｐｕ３．Ａ８ 抗Ｋ６３中で２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートした。この膜を、振とうさせながらＰＢＳＴ中で３回洗浄した。ＩｇＧを、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：１０，０００で希釈したヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＨＲＰ複合Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中で膜を２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートすることにより検出した。次いで、膜をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中で１回洗浄した。二次抗体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出し、続いて、フィルムへブロットを露光した。さらなるウエスタンブロットが、ＮＦκＢ経路の活性化を評価するために、ＩκＢαレベルについてプローブすることによって行われた。ＴＮＦαシグナル伝達時、これは、ＮＦκＢの阻害剤、ＩκＢαのユビキチンおよび分解をもたらす。還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の５μＬの上記の溶解物を、７０℃で１０分間加熱し、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で２通りに泳動した ゲルを、２０％のメタノールおよび１×ＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での湿式移動によって、一定の３０Ｖで２時間、Ｉｎｖｉｔｒｏｌｏｎ ＰＶＤＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移動させた。膜は、ＰＢＳＴ中の５％のミルクで、２５℃で１時間振とうさせながらブロックし、次いで、負荷対照として、１：１０００で希釈した抗ＩκＢα（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）および抗βチューブリン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体で４℃で一晩振とうさせながらプローブした。翌日、ブロットを、振とうさせながらＰＢＳＴ中で３回洗浄した。ＩｇＧを、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：１０，０００で希釈したヤギ抗ウサギＦｃγ特異的ＨＲＰ複合Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中で膜を２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートすることにより検出した。次いで、膜をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中で１回洗浄した。二次抗体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出し、続いて、フィルムへブロットを露光した。
１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで刺激され、ＭＧ１３２による前処理のない細胞において、直鎖状ポリユビキチン鎖の量は、時間ゼロから５分〜２０分間増加する（図１６Ａを参照のこと）。対照的に、３つのすべての時点でさらになお豊富であったＫ６３結合型ポリユビキチン鎖は、ゼロから５分間の増加、次いで、２０分間で再び出発レベルまでの減少を示した。５００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで刺激され、ＭＧ１３２による前処理のない細胞において、直鎖状ポリユビキチン鎖は、ゼロから２０分まで増加する同じパターンを示したが、それぞれの時点で直鎖状鎖の度数は、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで処理された細胞と比較して増加した。対照的に、Ｋ６３結合型鎖は、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで処理された細胞と比較して同じパターンおよび度数を示した。５．８μＭのＭＧ１３２で１０分間前処理され、次いで、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで前処理された細胞において、直鎖状鎖およびＫ６３結合型鎖の両方のレベルは、３つの時点にわたってほぼ一定していた。ＩκＢαに対するブロットは、すべて３つの実験条件下で、ＴＮＦα処理時に経時的なＩκＢαの分解によって証明されるように、ＮＦκＢ経路が活性化されるが、ＭＧ１３２の前処理が場合に、より多くの活性化の程度を示す（図１６Ｂを参照のこと）。これは、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌが内因性直鎖状ポリユビキチン鎖を認識することができることを示し、これらの鎖がＴＮＦα刺激時にＨｅＬａ Ｓ３細胞において上方制御されることを示唆している。
Ｄ）直鎖状ポリユビキチン鎖の免疫沈降
１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧを、直鎖状ポリユビキチン鎖を免疫沈降することができるかどうかを確認するために試験した。陽性対照として、Ａｐｕ３．Ａ８ 抗Ｋ６３抗体も、Ｋ６３結合型鎖の免疫沈降をモニタリングするために使用された。陰性対照として、非関連ヒトカッパＩｇＧ１抗体がアイソタイプの対照として使用された。３つの免疫沈降（ＩＰ）条件が試験された。すべての鎖を含んだ反応物１において、モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、直鎖状ポリユビキチン２−７（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｋ１１結合型ポリユビキチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の各２μｇを混合した。直鎖状鎖を欠いた反応物２において、モノユビキチン、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の各２μｇを混合した。反応物３は、２μｇの直鎖状ポリユビキチン２−７鎖のみから構成された。それぞれの反応物は、５００μＬの４Ｍの尿素ＩＰ緩衝液（４Ｍの尿素、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）中で希釈された。反応物は、５０μＬのプロテインＡダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２５℃で３時間回転させて 前もって清浄化された。次いで、ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、上清を、新しいチューブに移した。２０μｇの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ 抗直鎖状、Ａｐｕ３．Ａ８ 抗Ｋ６３、またはアイソタイプ対照ＩｇＧをそれぞれのＩＰ反応物に添加し、２５℃で一晩回転させてインキュベートした。翌日、１００μＬのプロテインＡダイナビーズをそれぞれの反応物に添加し、ＩｇＧを、２５℃で１５分間回転させて捕捉した。次いで、ビーズを、４Ｍの尿素ＩＰ緩衝液の各１ｍＬで３回洗浄し、続いて、ＰＢＳの各１ｍＬで２回洗浄した。最終の洗浄中、チューブ壁に結合されるあらゆるタンパク質が溶出するのを回避するために、ビーズを新しいチューブに移した。ビーズを、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む３０μＬの１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、７０℃で１０分間加熱し、免疫沈降されたタンパク質を溶出した。次いで、ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、上清を半分に分割し、２つの４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に２通りに装填した。陽性および陰性対照として、精製された直鎖状ポリユビキチン２−７（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の各１μｇも、ゲル上に泳動した。ゲルは、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で泳動し、次いで、１０％のメタノールおよび１×ＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での湿式移動によって、一定の３０Ｖで１時間、０．２μｍのニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に個々に移動した。膜上の非特異的結合部位を、ＰＢＳＴ中の５％のミルクでのインキュベーションによって、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。次いで、膜を、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１μｇ／ｍＬの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２ＬまたはＡｐｕ３．Ａ８ 抗Ｋ６３中で、２５℃で１．５時間振とうさせながらインキュベートした。この膜を、振とうさせながらＰＢＳＴ中で３回洗浄した。ＩｇＧは、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：１０，０００で希釈したヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＨＲＰ複合Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中で膜を２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートすることにより検出した。次いで、膜をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中で１回洗浄した。二次抗体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出し、続いて、フィルムへブロットを露光した。１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌは、４Ｍの尿素中で直鎖状ポリユビキチン鎖を免疫沈降することができるが、Ｋ６３結合型鎖を破壊することもできる場合のこれらの条件下で特異的ではない（図１７を参照のこと）。
異なる濃度の尿素が特異性を改善するのに役立ち得るかどうかを判定するために、免疫沈降が、異なる緩衝液条件下で行われた。直鎖状ポリユビキチン２−７およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の各２μｇを混合し、０、２、４、または６Ｍの尿素を含む５００μＬのＩＰ緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で希釈された。さらなるＩＰが、５００μＬのＰＢＳＴを用いて行われた。反応物は、５０μＬのプロテインＡダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２５℃で３０分間回転させて 前もって清浄化された。次いで、ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、上清を、新しいチューブに移した。２０μｇの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ 抗直鎖状またはＡｐｕ３．Ａ８ 抗Ｋ６３ ＩｇＧをそれぞれのＩＰ反応物に添加し、２５℃で１時間回転させてインキュベートした。次に、１００μＬのプロテインＡダイナビーズをそれぞれの反応物に添加し、ＩｇＧを、２５℃で１５分間回転させて捕捉した。次いで、ビーズを、各１ｍＬのＩＰにおいて使用された対応する緩衝液（０、２、４、もしくは６Ｍの尿素ＩＰ緩衝液またはＰＢＳＴ）で３回洗浄し、続いて、各１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。最終の洗浄中、チューブ壁に結合されるあらゆるタンパク質が溶出するのを回避するために、ビーズを新しいチューブに移した。ビーズを、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む２０μＬの１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、７０℃で１０分間加熱し、免疫沈降されたタンパク質を溶出した。次いで、ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、上清を半分に分割し、２つの４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に２通りに装填した。陽性および陰性対照として、精製された直鎖状ポリユビキチン２−７およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の各１μｇも、ゲル上に泳動した。ゲルは、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で泳動し、次いで、１０％のメタノールおよび１×ＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での湿式移動によって、一定の３０Ｖで１時間、０．２μｍのニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に個々に移動した。膜上の非特異的結合部位を、ＰＢＳＴ中の５％のミルクでのインキュベーションによって、２５℃で１時間振とうさせながらブロックした。次いで、膜を、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１μｇ／ｍＬの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２ＬまたはＡｐｕ３．Ａ８ 抗Ｋ６３中で、２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートした。この膜を、振とうさせながらＰＢＳＴ中で３回洗浄した。ＩｇＧは、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：１０，０００で希釈したヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＨＲＰ複合Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中で膜を２５℃で１時間振とうさせながらインキュベートすることにより検出した。次いで、膜をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中で１回洗浄した。二次抗体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出し、続いて、フィルムへブロットを露光した。尿素の濃度がＩＰ緩衝液中で増加すると、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２ＬのＩＰは、より特異的になる（図１８Ａを参照のこと）。６Ｍの尿素で、ほんの少しのＫ６３結合型ポリユビキチンしか、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧによりプルダウンされず、なおかつ、相当量の直鎖状ポリユビキチンをプルダウンすることができる。
より高濃度の尿素が特異性をさらに改善するのに役立ち得るかどうかを判定するために、ＩＰを、６、７、または８Ｍの尿素ＩＰ緩衝液を用いて繰り返した。直鎖状ポリユビキチン２−７およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の各２μｇを混合し、６、７、または８Ｍの尿素を含む５００μＬのＩＰ緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で希釈した。反応物は、５０μＬのプロテインＡダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２５℃で１５分間回転させて 前もって清浄化された。次いで、ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、上清を、新しいチューブに移した。２０μｇの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ 抗直鎖状、Ａｐｕ３．Ａ８ 抗Ｋ６３、またはアイソタイプ対照ＩｇＧをそれぞれのＩＰ反応物に添加し、２５℃で一晩回転させてインキュベートした。次に、１００μＬのプロテインＡダイナビーズをそれぞれの反応物に添加し、ＩｇＧを、２５℃で１５分間回転させて捕捉した。次いで、ビーズを、各１ｍＬのＩＰにおいて使用された対応する緩衝液（６、７、または８Ｍの尿素ＩＰ緩衝液）で３回洗浄し、続いて、各１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。最終の洗浄中、チューブ壁に結合されるあらゆるタンパク質が溶出するのを回避するために、ビーズを新しいチューブに移した。ビーズを、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む３０μＬの１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、７０℃で１０分間加熱し、免疫沈降されたタンパク質を溶出した。次いで、ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、上清を半分に分割し、２つの４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に２通りに装填した。陽性および陰性対照として、精製された直鎖状ポリユビキチン２−７およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の各１μｇも、ゲル上に泳動した。ゲルは、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で泳動し、前の段落に記載されるように、ウエスタンブロットが行われた。あるブロットが、直鎖状鎖を検出するために１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌでプローブされ、もう一方のブロットが、Ｋ６３結合型鎖を検出するためにＡｐｕ３．Ａ８ 抗Ｋ６３でプローブされた。６Ｍの尿素において、前述のＩＰにおいて見られるように、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌによってプルダウンされる少量のＫ６３結合型鎖がある（図１８Ｂを参照のこと）。７Ｍの尿素において、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌは、アイソタイプ対照と同様に振る舞い、いかなるＫ６３結合型鎖もプルダウンしないが、出発物室中に存在したものと比較する場合、相当量の直鎖状ポリユビキチンを免疫沈降する能力をなおも維持する。しかしながら、８Ｍの尿素において、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌによってプルダウンされる直鎖状鎖の量は、著しく減少する。したがって、７Ｍの尿素が、Ｋ６３結合型鎖を減少させることなく、相当量の直鎖状鎖をプルダウンする間の均衡を保つ最も特異的な条件である。
前述のＩＰにおいて、プルダウンに使用されたＩｇＧの重鎖は、ビーズから溶出され、ウエスタンブロットにおいて使用される二次抗体によって検出される。このバンドは、しばしば、プルダウン物質のバンドを不明瞭にし得る。ブロットをより鮮明にし、Ｋ６３結合型鎖がプルダウンされないことを絶対的に確信するために、ＩｇＧは、ＩＰ前にビーズに架橋された。２０μｇの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌまたはアイソタイプ対照ＩｇＧを、ＰＢＳＴ中の２００μＬのプロテインＡダイナビーズで、２５℃で３０分間回転させてインキュベートした。ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、８００μＬの複合緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄した。ＩｇＧ結合ビーズは、複合緩衝液中の１ｍＬの５ｍＭのビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ３）中で再懸濁され、架橋のために、２５℃で３０分間回転させてインキュベートした。ＩｇＧがビーズに架橋される間に、ＩＰ反応が設定された。直鎖状ポリユビキチン２−７、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の各４μｇを混合し、０、４、または７Ｍの尿素を含む５００μＬのＩＰ緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で希釈された。混合物は、５０μＬのプロテインＡダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２５℃で４５分間回転させて 前もって清浄化された。３０分後、架橋反応は、４８μＬの１Ｍのトリス、ｐＨ７．５の添加および２５℃で１５分間回転させるインキュベーションによって、反応停止を行った。架橋ビーズは、ＩＰにおいて使用された相当量の尿素（すなわち、０、４、または７Ｍの尿素）を含む８００μＬのＩＰ緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ＩｇＧ架橋ビーズは、 前もって清浄化されたＩＰ反応物中で、２５℃で１時間回転させて再懸濁された。次いで、ＩｇＧ架橋ビーズは、相当量の尿素を含む１ｍＬのＩＰ緩衝液で３回洗浄し、続いて、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。最終の洗浄中、チューブ壁に結合されるあらゆるタンパク質が溶出するのを回避するために、ビーズを新しいチューブに移した。ビーズを、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む５０μＬの１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、７０℃で１０分間加熱し、免疫沈降されたタンパク質を溶出した。次いで、ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、上清を半分に分割し、４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に４重に装填した。陽性および陰性対照として、精製された直鎖状ポリユビキチン２−７、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の各１μｇも、ゲル上に泳動した。ゲルは、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で泳動し、この実施例において、上記のように、ウエスタンブロットが行われた。あるブロットは直鎖状鎖を検出するために１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌでプローブされ、あるブロットはＫ１１結合型鎖を検出するために２Ａ３／２Ｅ６ 抗Ｋ１１でプローブされ、あるブロットはＫ４８結合型鎖を検出するためにＡｐｕ２．０７ 抗Ｋ４８でプローブされ、あるブロットはＫ６３結合型鎖を検出するためにＡｐｕ３．Ａ８ 抗Ｋ６３でプローブされた。ＩＰにおける物質量を出発インプット中に存在する物質量と比較するとき、全体的にはるかに少ない直鎖状ポリユビキチンが、前述の段落においてビーズ上に捕捉された遊離ＩｇＧを用いて行われたＩＰと比較して、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌを用いたそれぞれのＩＰにおいてプルダウンされた（図１９を参照のこと）。これは、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２ＬがＦｃドメインにおける通常の結合部位に加えて、重鎖可変ドメインにおいて第２のプロテインＡ結合部位を含有するヒトＩｇＧ１ ＶＨ３サブグループのメンバーであるという事実によるものであり得る。したがって、抗原結合前のプロテインＡビーズへのＩｇＧの事前カップリングおよび架橋結合が、この抗体の結合能力を減退させ得る。これらの事前カップリングおよび架橋結合条件下で、４Ｍの尿素は、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌが、いかなるＫ１１−、Ｋ４８−、またはＫ６３結合型鎖を減少させることなく、直鎖状鎖を破壊することができる最も特異的な条件である。
プルダウンされた直鎖状鎖の減少が、重鎖可変ドメインにおけるさらなるプロテインＡ結合部位によるものであったかどうかを調べるために、プロテインＧビーズに架橋結合されたＩｇＧを用いてＩＰが行われた。タンパク質Ｇはまた、ヒトＩｇＧ１において２つの結合部位を有するが、両方とも、定常ドメイン（ＣＨ１およびＦｃ）内である。プロテインＧダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がＩｇＧを事前カップリングおよび架橋結合するために使用されたことを除いて、上述のように、ＩＰが繰り返された。プロテインＡに架橋結合されたＩｇＧを用いた実験と比較して、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌによってより多くの直鎖状ポリユビキチン鎖がそれぞれの条件においてプルダウンされた（図２０を参照のこと）。４Ｍの尿素で抗Ｋ６３ブロットの過剰曝露時に、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌによってプルダウンされた少量のＫ６３結合型鎖がある。したがって、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２ＬがプロテインＧビーズに事前カップリングされる時、７Ｍの尿素が最も特異的な条件であるように思われるが、これは、ビーズ上にその後捕捉される遊離ＩｇＧを用いてＩＰが行われる時と比較して、より少ない直鎖状ポリユビキチンのプルダウンを犠牲にして成り立つ（図１８Ｂと比較）。ＶＨドメインへのプロテインＡビーズの事前カップリングおよび架橋結合よりも著しく少ないが、ＣＨ１ドメインへのプロテインＧビーズの事前カップリングおよび架橋結合はまた、隣接したＶＨドメインの立体障害により直鎖状ポリユビキチンへの結合も減退させ得る可能性がある。
遊離ＩｇＧを用いたＩＰ、続いて、プロテインＡビーズによる捕捉が、基質として異なる結合のポリユビキチン鎖の混合物を用いて繰り返され、ウエスタンブロットおよび質量分析法によってより広範囲にわたって分析された。直鎖状ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ１１結合型ポリユビキチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の各２μｇを混合し、０、４、５、６、または７Ｍの尿素を含む５００μＬのＩＰ緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で希釈された。ウエスタンブロットのためのもの、そして質量分光分析のためのものである、２通りでそれぞれのＩＰが行われた。反応物は、５０μＬのプロテインＡダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２５℃で１５分間回転させて 前もって清浄化された。次いで、ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、上清を、新しいチューブに移した。２０μｇの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ 抗直鎖状またはアイソタイプ対照ＩｇＧをそれぞれのＩＰ反応物に添加し、２５℃で１時間回転させてインキュベートした。次に、１００μＬのプロテインＡダイナビーズをそれぞれの反応物に添加し、ＩｇＧを、２５℃で１５分間回転させて捕捉した。次いで、ビーズを、各１ｍＬのＩＰにおいて使用された対応する緩衝液（０、４、５、６、または７Ｍの尿素ＩＰ緩衝液）で３回洗浄し、続いて、各１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。最終の洗浄中、チューブ壁に結合されるあらゆるタンパク質が溶出するのを回避するために、ビーズを新しいチューブに移した。ビーズを、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む５０μＬの１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、７０℃で１０分間加熱し、免疫沈降されたタンパク質を溶出した。次いで、ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、上清を分割し、ウエスタンブロットのために、４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に４重に装填した。陽性および陰性対照として、精製された直鎖状ポリユビキチン２−７、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７、およびＫ６３結合型ポリユビキチン２−７の各５００μｇも、ゲル上に泳動した。ＩＰの別のセットを、質量分光ＡＱＵＡ分析のために、４〜１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に泳動した。ゲルは、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で泳動し、この実施例において、上記のように、ウエスタンブロットが行われた。ブロットは、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ抗直鎖状ポリユビキチン、２Ａ３／２Ｅ６抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ａｐｕ２．０７抗Ｋ４８結合型ポリユビキチン、およびＡｐｕ３．Ａ８抗Ｋ６３ポリユビキチン抗体でプローブされた（図２１Ａを参照のこと）。質量分光分析ＡＱＵＡのために別のゲルがＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｓａｆｅ ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色された（図２１Ｂを参照のこと）。尿素の不在下で、Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌはすべての結合の鎖を免疫沈降させることができる（図２１Ａを参照のこと）。尿素の濃度がＩＰ緩衝液中で増加するため、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２ＬのＩＰは、より特異的になる。７Ｍの尿素で、Ｋ１１結合型、Ｋ４８結合型、またはＫ６３結合型ポリユビキチンを、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧによりプルダウンしないが、それでも、出発インプットに対して相当量の直鎖状ポリユビキチンをプルダウンすることができる。
クマシー染色されたゲルの領域ＢおよびＣが切除され、ゲル内トリプシン消化に供され、質量分光分析ＡＱＵＡによって分析された（図２１Ｂを参照のこと）。ゲルピースは、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム／５０％のメタノールを用いて汚れを取り除き、アセトニトリル（ＡＣＮ）で乾燥させた。トリプシンの効果的な摂取を可能にするために、ゲルピースは、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム／５％のＣＡＮ中で希釈された２０ｎｇ／μＬの修飾化シークエンシンググレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）とともに氷上で２時間インキュベートされた。３７℃で一晩消化が行われ、５０％のＡＣＮ／５％のギ酸（ＦＡ）の添加によって停止された。２ラウンドの抽出（１回目−５０％のＡＣＮ／５％ ＦＡ、２回目−１００％のＡＣＮ）前に、同位体標識された内部標準ペプチド（１ｐｍｏｌ）をそれぞれの試料に添加した。抽出されたペプチドを、完全に乾燥させ、質量分光分析の少なくとも３０分前に１０％のＡＣＮ／５％のＦＡ／０．０１％のＨ２Ｏ２中に再懸濁した。試料は、Ｔｈｅｒｍｏ ＡＱＵＡＳＩＬ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ）上に直接装填し、５％から９０％の緩衝液Ｂ（９８％のＡＣＮ／０．１％のＦＡ）の２６分間の勾配にわたって２００μＬ／分の流量で、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００キャピラリーＬＣを用いて分離した。分析分光検出は、ユビキチン配列の標識および非標識ペプチドの両方を検出するために、セグメント化された多重反応モニタリング（ＭＲＭ）法を用いて、ＡＢＩ ４０００ ＱＴＲＡＰ上で行われた。ＡＢＩ Ｍｕｌｔｉｑｕａｎｔ１．１ソフトウェアを用いて、それぞれのペプチドの標識化バージョンと非標識化バージョンの間のピーク面積を比較することによる定量法が行われた。ユビキチンの７つのリシンおよびアミノ末端の修飾に対応するＧＧシグネチャーペプチドの存在量を測定することによって、７Ｍの尿素が、直鎖状ポリユビキチン鎖の免疫沈降に対して最も特異的な条件であることが確認された（図２１Ｃおよび２１Ｄを参照のこと）。７Ｍの尿素において、抗体は、より長い鎖（テトラユビキチンからヘプタユビキチン）を含有する領域Ｂからのインプット中に存在する直鎖状鎖の６７％を回収することができるが、領域Ｃ内に見出される短い鎖（ジユビキチンおよびトリユビキチン）を回収する際に、直鎖状鎖のわずか２％が回収され、あまり効率的ではない（図２１Ｅを参照のこと）。これは、二価抗体からの結合力、およびより長い鎖に見出された多重結合による可能性が高い。
Ｅ）ＬＵＢＡＣの過剰発現
直鎖状ユビキチンアセンブリ複合体（ＬＵＢＡＣ）は、直鎖状ポリユビキチン鎖を組み立てることが示されているＥ３リガーゼである（Ｋｉｒｉｓａｋｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００６） ＥＭＢＯ Ｊ．２５：４８７７−４８８７）。この複合体のメンバーのうちの２つ、Ｈｏｉｌ−１ＬおよびＨｏｉｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が合成され（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、双方向性ＣＭＶプロモーターを含むｐＢＩ−ＣＭＶ１哺乳類発現ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）にクローン化された。Ｈｏｉｌ−１Ｌは、制限酵素部位ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＶを用いて多重クローニング部位（ＭＣＳ）１にクローン化され、Ｈｏｉｐは、制限酵素部位ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いてＭＣＳ２にクローン化された。ＯＲＦを配列決定することによって、構築体が確認された。得られた構築体、ｐＢＩ−ＣＭＶ１−Ｈｏｉｌ１Ｌ−Ｈｏｉｐ、または空ベクターを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた。２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの２日前に、２０個の１０ｃｍプレートに１：２０に分割し、３７℃で、５％ ＣＯ２中で増殖させた。トランスフェクション当日に、１５０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を、トランスフェクトされるべきそれぞれのプラスミドに対して血清を欠いている２．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈した。また、５０μｇのｐＢＩ−ＣＭＶ１空ベクターまたはｐＢＩ−ＣＭＶ１−Ｈｏｉｌ１Ｌ−Ｈｏｉｐを、血清を欠いている２．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈した。これらの希釈物を、２５℃で５分間インキュベートした。希釈されたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよび希釈されたＤＮＡを合わせて、反転して穏やかに混合し、２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、５００μＬのＤＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物をそれぞれ、１０ｃｍプレート（プラスミド当たり１０個のプレート）に添加した。トランスフェクションから４８時間後、培地を収集し、細胞をプレートから削り取った。細胞を、１０，０００ｒｐｍで、４℃で１０分間スピンダウンした。上清を取り除き、細胞を４０ｍＬの冷ＰＢＳ中で洗浄した。細胞を、１０，０００ｒｐｍで、４℃で１０分間スピンダウンした。上清を取り除き、細胞を、８Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス ｐＨ７．５、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０μＬ／ｍＬのＨＡＬＴプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および２ｍＭのＮＥＭを含有する４ｍＬの溶解緩衝液中で再懸濁した。溶解物を短時間超音波で分解して、粘性を低減させ、次いで、−８０℃で冷凍した。Ｈｏｉｌ−１ＬおよびＨｏｉｐを過剰発現したか、およびこれが直鎖状ポリユビキチン鎖アセンブリの増加をもたらすかどうかを判定するために、溶解物をウエスタンブロットによって分析した。１μＬのそれぞれの溶解物を、還元試薬を含むＬＤＳ試料緩衝液と混合し、次いで、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥビストリス１．０ｍｍゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に装填し、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に４重に泳動した。ゲルは、１０％のメタノールを含む１×ＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液中で、３０Ｖで２時間、０．４５μｍのニトロセルロースに個々に移動した。膜を、ＰＢＳＴ中５％のミルク中で、２５℃で１時間振とうさせながらブロックし、次いで、一次抗体でインキュベートした。第１のブロットは、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１μ／ｍＬの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ抗直鎖状ポリユビキチンＩｇＧでプローブした。第２のブロットは、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：５００で希釈した抗Ｈｏｉｌ−１Ｌ／ＲＢＣＫ抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ３８５４０）でプローブした。第３のブロットは、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１μｇ／ｍＬの抗Ｈｏｉｐ／ＲＮＦ３１抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ８５２９４）でプローブした。第４のブロットは、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：１０００で希釈した抗βチューブリン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９Ｆ３ ＃２１２８）でプローブした。ブロット１、２、および３は、２５℃で１時間振とうさせながらそれぞれの一次抗体でインキュベートした。抗βチューブリンブロットは、４℃で一晩回転させてインキュベートした。次いで、ブロットを、ＰＢＳＴ０．０５中で３回洗浄し、次いで、２５℃で１時間振とうさせながら、ＰＢＳＴ中５％のミルク中の１：１０，０００で希釈した二次抗体でインキュベートした。抗直鎖状ポリユビキチンブロットは、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）’２−ＨＲＰ二次（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でプローブし、その他の３つのブロットは、ヤギ抗ウサギＦ（ａｂ）’２−ＨＲＰ二次（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でプローブした。次いで、ブロットをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳで１回洗浄した。二次抗体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出し、続いて、フィルムへブロットを露光した。抗βチューブリンブロットは、等量の細胞がトランスフェクションにおいて使用され、等量の溶解物がゲル上で装填されたことを示した（図２２Ａを参照のこと）。抗Ｈｏｉｌ−１Ｌおよび抗Ｈｏｉｐブロットは、ｐＢＩ−ＣＭＶ１−Ｈｏｉｌ１Ｌ−Ｈｏｉｐがトランスフェクトされる場合に、Ｈｏｉｌ−１ＬおよびＨｏｉｐの両方が２つのタンパク質の内因性レベルと比較して過剰発現されることを示す。最終的に、Ｈｏｉｌ−１ＬおよびＨｏｉｐの過剰発現は、期待通りに、直鎖状ポリユビキチン鎖のレベルの劇的な増加をもたらす。これらが１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧによって検出されることを考えると、この抗体が内因性の酵素的に合成された直鎖状ポリユビキチン鎖を認識することができることを示す。
ウエスタンブロッドによってこれらの溶解物をプローブすることに加えて、直鎖状ポリユビキチンの免疫沈降もまた、実施された。５００μＬの上記の溶解物は、７１μＬの５０ｍＭのトリス ｐＨ７．５、２５ｍＭのＮａＣｌを用いて７Ｍの尿素に希釈した。次いで、溶解物は、７Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス ｐＨ７．５、２５ｍＭのＮａＣｌ中の２００μＬのプロテインＡダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２５℃で１時間回転させて 前もって清浄化された。ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、上清を、新しいチューブに移した。次いで、 前もって清浄化された溶解物を、１４，０００ｒｐｍで５分間回転させて、任意の沈殿物をペレット化した。上清を、新しいチューブに移し、４０μｇの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧまたはアイソタイプ対照ＩｇＧを添加した。次いで、免疫沈降物を、２５℃で一晩回転させながらインキュベートした。翌日、ＩｇＧは、２５℃で１５分間回転させて、７Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス ｐＨ７．５、２５ｍＭのＮａＣｌ中の２００μＬのプロテインＡダイナビーズの添加によって捕捉された。ビーズは、磁石スタンドで捕捉され、１ｍＬの７Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス ｐＨ７．５、２５ｍＭのＮａＣｌで５回洗浄し、次いで、１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した。最終の洗浄後、チューブ壁に貼り付いているあらゆるタンパク質が溶出するのを回避するために、ビーズを新しいチューブに移した。次いで、ビーズは、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む３０μＬの１×ＬＤＳ試料緩衝液中で再懸濁し、７０℃で１０分間溶出した。ウエスタンブロットのためのものおよび質量分光ＡＱＵＡ分析のためにクマシー染色されるものである２つの４〜１２％のＮｕＰＡＧＥビストリス１．０ｍｍゲルを泳動した。ウエスタンブロットについては、１０％のそれぞれのＩＰを、０．１％のそれぞれの溶解物と共に泳動した。質量分光については、９０％のそれぞれのＩＰを、１％のそれぞれの溶解物と共に泳動した。１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌを用いたウエスタンブロットは、移動を１時間行ったことを除いて、上記の段落において記載されるように行った。質量分光ＡＱＵＡ分析のためのゲルは、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された。ウエスタンブロットは、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ ＩｇＧが細胞溶解物から直鎖状ポリユビキチン鎖を免疫沈降させることができることを示す（図２２Ｂを参照のこと）。ベクターのみからよりもより多くの鎖がＬＵＢＡＣ過剰発現の溶解物から引き出され、これは、ＬＵＢＡＣを過剰発現するときに存在するより高いレベルの直鎖状鎖と一致する。
ゲルの高分子量領域が切除され（図２２Ｂを参照のこと）、実施例４Ｄにおいて上述のように、質量分光分析ＡＱＵＡに供された。ベクター対照試料において、直鎖状ポリユビキチン結合が、インプット試料において特定された（表９を参照のこと）。特定されたポリユビキチン鎖の大部分は、Ｋ４８およびＫ６３結合のものであった。
［表９］
Figure 2017200484
これに一致して、直鎖状ポリユビキチンは、抗直鎖状抗体またはアイソタイプ対照抗体を用いたＩＰにおいてプルダウンされなかった。ＬＵＢＡＣの過剰発現された細胞において、直鎖状ポリユビキチン結合のレベルは、４８０８ｐｍｏｌに達し、これは、Ｋ６３結合への存在量と同様である（５０７５ｐｍｏｌ）。抗直鎖状抗体がＩＰのために使用される場合、プルダウンされる幾つかのさらなるＫ１１、Ｋ４８、およびＫ６３結合を有する直鎖状結合に対してかなり濃縮される（図２２Ｃを参照のこと）。これは、Ｋ４８およびＫ６３結合のわずか７および４ｐｍｏｌがそれぞれ、ベクター対照細胞から抗直鎖状抗体によってプルダウンされたため、混合した結合鎖および異なる結合の多重の均一鎖で修飾される基質の存在による可能性が高い（表９を参照のこと）。さらに、わずか１ｐｍｏｌのＫ４８結合およびＫ６８結合なしは、これらの結合が単に粘着性がないことを示す、ＬＵＢＡＣを過剰発現した細胞からのアイソタイプ対照抗体を用いたＩＰにおいて特定された。これは、抗直鎖状抗体が内因性直鎖状ポリユビキチン鎖に対して濃縮することができることを示す（図２２Ｃを参照のこと）。
１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌが免疫蛍光に対して機能的であるかどうかを判定するために、Ｈｏｉｌ−１ＬおよびＨｏｉｐを過剰発現するＨｅＬａ細胞を抗体で染色した。ＨｅＬａ細胞（５，０００細胞／１００μＬ／ウェル）を、透明な底の黒色壁の９６ウェルプレート中で播種し、２４時間増殖させた。製造業者のプロトコルに従って、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、細胞をＨｏｉｌ／Ｈｏｉｐプラスミドで１８時間トランスフェクトした。細胞をＰＢＳですすぎ、−２０℃で１０分間、氷冷メタノールで固定し、ＰＢＳ／０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で、室温で５分間浸透させ、次いで、ＰＢＳ／０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／５％のＢＳＡで、室温で１時間ブロックした。直鎖状ユビキチン抗体（１μｇ／ｍＬ）を、ポリユビキチン鎖（５μｇ／ｍＬ）を用いるか、または用いることなく、室温で１時間インキュベートし、次いで、室温で１時間細胞を標識化するために使用した。ＰＢＳ／０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて６回洗浄した後（それぞれ１０分間）、細胞を、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８−複合ロバ抗ヒト抗体（１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、室温で１時間染色した。次いで、細胞を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳを用いて６回洗浄し（それぞれ１０分間）、室温で１０分間、Ｈｏｅｃｈｓｔ（１：１０，０００）で染色し、ＰＢＳで洗浄した。プレートを黒色シールで覆い、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ画像システムを用いて画像化した。非形質転換細胞は、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌで染色された場合にいかなるシグナルも示さなかったが、Ｈｏｉｌ−１ＬおよびＨｏｉｐを過剰発現する細胞は、細胞質を点状染色するパターンを示した（図２２Ｄを参照のこと）。この染色は、組み換え直鎖状ポリユビキチンの添加によってブロックされ得るため、直鎖状ポリユビキチン鎖に対して特異的であった。
実施例５−直鎖状ジユビキチンに対するＦａｂ結合の構造的分析
抗直鎖状Ｆａｂと直鎖状ポリユビキチンとの相互作用をさらに理解するために、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ Ｆａｂを、直鎖状ジユビキチンと共結晶した。１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２ＬのＦａｂ断片を、大腸菌において発現させ、実施例１Ｅにおいて上述のように、プロテインＡカラム上で精製した。Ｆａｂは、０〜１００％の直鎖状勾配の２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．５、０．５ＭのＮａＣｌを有する、２０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ５．５中の５ｍＬのＳＰ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でさらに精製された。Ｆａｂ断片を含む画分がプールされ、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の３２０ｍＬのＳ７５サイジングカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で泳動させた。Ｆａｂ断片を含む画分がプールされ、２２ｍｇ／ｍＬまで濃縮された。
標準的ペプチド結合（直鎖状ジユビキチン）を介して２つのユビキチンサブユニットの頭尾融合もまた、大腸菌で発現された。ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞を、ｐＥＴ１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に構築された直鎖状ジユビキチン発現プラスミドで形質転換した。この構築体は、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号３７６）を有し、続いて、Ｔ７プロモーターおよびｌａｃオペレーターの制御下で、トロンビン切断部位を有する。ＬＢ培地内で増殖されたｐＥＴ１５ｂ−直鎖状ジユビキチン発現プラスミドで形質転換されたＢＬ２１−Ｇｏｌｄの一晩の培養物を、１％のグリセロール、０．１ＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．３、および５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する１Ｌの加温したＴｅｒｒｉｆｉｃブロス中に５０倍希釈した。培養物を、２．５Ｌの高収量（ｕｌｔｒａ−ｙｉｅｌｄ）フラスコ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）中で、ＯＤ６００＝１．６４まで３７℃で、２５０ｒｐｍで振とうさせながら増殖した。発現を、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって誘発させ、培養物を、１６℃で一晩、２５０ｒｐｍで振とうさせながら増殖した。翌日、細胞を、８Ｋｒｐｍで１０分間回転させることによってペレット化し、ペレットを液体窒素中で凍結させた。細胞を、３回のマイクロ流動化によって、４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．３ＭのＮａＣｌ、および完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ）中で再懸濁し、溶解した。細胞残屑を、１０Ｋｒｐｍで１時間回転させることによってペレット化し、上清を、０．４５μＭの低タンパク質結合フィルターを通して濾過した。Ｈｉｓ６−ジユビキチン（配列番号３７６として開示された「Ｈｉｓ６」）を、５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）カラム上で精製した。カラムを、１２カラム体積の緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）で洗浄し、４カラム体積の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール）で溶出した。ジユビキチンの発現は、カラムの結合能力を超えるように高く、幾つかのジユビキチンが、緩衝液Ａによる洗浄液で溶出された。したがって、洗浄物質を、第２の５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム上で泳動させ、上述のように精製した。Ｈｉｓ６タグ（配列番号３７６）を、４℃で３日間、１８００単位のトロンビン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で切断することによって除去し、その間、３５００ＭＷＣＯ透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２に透析した。透析し、切断した物質を、半分に分割し、遊離のジユビキチンを、２つの５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムを用いてＨｉｓ６タグ（配列番号３７６）から分離した。フロースルーおよびすべての洗浄物を回収した。カラムを、４カラム容量の緩衝液Ｃ（２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ）、４カラム容量の緩衝液Ｄ（２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）、および１カラム容量の緩衝液Ｅ（２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール）で洗浄した。脱タグ化ジユビキチンの存在は、フロースルーおよび１８％のＮｏｖｅｘトリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でそれぞれの洗浄物からの試料を泳動し、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色することによってモニタリングされた。脱タグ化ジユビキチンの大部分は、フロースルー、緩衝液Ｃによる洗浄物、および緩衝液Ｄによる洗浄物中に存在した。これらはプールし、濃縮して、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の３２０ｍＬのＳ７５サイズのカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。ジユビキチンを含有する画分をプールし、１５．３ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
Ｆａｂ／ジユビキチン複合体を、Ｆａｂに対して３倍モル過剰の直鎖状ジユビキチンを用いて設定し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、複合体を、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の３２０ｍＬのＳ７５サイズのカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。複合体を含有する画分がをプールし、２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
結晶は、０．２μＬの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ Ｆａｂ／直鎖状ジユビキチン複合体（２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の２０ｍｇ／ｍＬの複合体）および０．２μＬの母液（２０％のイソプロパノール、０．１ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２Ｋモノメチルエーテル（ＭＭＥ））を含有する液滴中でシッティングドロップ蒸気拡散法を用いて増殖させた。１９℃で２７日間にわたって、これらの条件下で初期結晶を成長させた。結晶を、２μＬの１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌ Ｆａｂ／直鎖状ジユビキチン複合体（２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の２０ｍｇ／ｍＬの複合体）および３μＬの母液（１８％のイソプロパノール、０．０９ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１９．８％のＰＥＧ ２Ｋ ＭＭＥ、１０ｍＭの臭化ナトリウム）を含むマイクロブリッジを用いたシッティングドロップ法において最適化した。１９℃で５日間にわたって、結晶を成長させ、操作して、単一の回折結晶を得ることができた。結晶を、さらなる２５〜３０％のＰＥＧ ２Ｋ ＭＭＥを含む２０％のイソプロパノール、０．１ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０％のＰＥＧ ２Ｋ ＭＭＥを用いて凍結防止した。結晶学的データが、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ ｂｅａｍｌｉｎｅ ５．０．２で回収され、ＨＫＬ２０００を用いて処理された。結晶は、ａ＝５３A、ｂ＝６０A、ｃ＝９６A、α＝８７°、β＝７７°、およびγ＝７２°のユニット細胞寸法と、非対称ユニットの２つの複合体を有する、Ｐ１空間群に属した。プログラムＰｈａｓｅｒと、ヒト化４Ｄ５Ｆａｂ断片（４Ｄ５ではＰＤＢコード：１ＦＶＥ）およびヒトモノユビキチン（ＰＤＢコード：１ＵＢＱ）の変異体の配位を用いた分子置換により、構造を解析した。Ｃｏｏｔにモデル構築を行い、Ｐｈｅｎｉｘを用いて構造を改良した。構造の分解は２．４３Aであり、複合体は、２２．８％のＲおよび２５．０％のＲｆｒｅｅに改良されている（図２３、パネルＡを参照のこと）。
構造の分析は、ジユビキチンへの結合の大部分が、重鎖ＣＤＲとの接触を通して媒介されることを示す。軽鎖とジユビキチンとの間に埋没した表面積がないのに対して、重鎖とジユビキチンとの間には、７８５A２の埋没した表面積がある。構造的エピトープおよびパラトープは、結合する際に少なくとも２５％のそれらの溶媒接触可能表面積を埋没する（図２３のパネルＢおよびＣを参照のこと）、および／または４．５Aの相互作用する鎖内に少なくとも１つの原子を有する（表１０および１１を参照のこと）残基として定義される。
［表１０］
少なくとも２５％の溶媒接触可能表面積が接触面で埋没する残基（表１０は、配列番号３７７および３７８として、それぞれ、残基５２〜５７および９６〜１００を開示する）
Figure 2017200484
［表１１］
４．５ÅのＦａｂまたはジユビキチン内に少なくとも１つの原子を有する残基（表１１は、配列番号３７７〜３８１として、それぞれ、残基５２〜５７、９６〜１００、３１〜３７、７０〜７６、および６０〜６３を開示する）
Figure 2017200484
Ｆａｂパラトープを構成する、１５個の重鎖残基およびわずか５個の軽鎖残基がある。ジユビキチンエピトープは、遠位ユビキチン（結合に関与するＣ末端）からの１８個の残基と、近位ユビキチン（結合に関与するＮ末端）からの８個の残基とからなる。接触界面はまた、重鎖とジユビキチンとの間の９個の水素結合と、軽鎖とジユビキチンとの間の３個の水素結合とからなる（表１２を参照のこと）。
直鎖状結合自体による排他的に接触するというよりもむしろ、特異性は、近位ユビキチンおよび遠位ユビキチンの両方からの表面残基との複数の相互作用から生じるように思われる。
［表１２］
Ｆａｂとジユビキチンとの間の水素結合の要約
Figure 2017200484
Ｌｙｓ６３により類似の構造を採用する遊離直鎖状ポリユビキチンおよび遊離Ｋ６３結合型ポリユビキチン鎖、ならびにモノユビキチン構造（ＰＤＢコード１ＵＢＱ）においてわずか約６A離れて位置した遊離アミノ末端にもかかわらず、この抗体は、直鎖状鎖と選択的に結合する。この特異性は、近位ユビキチンおよび遠位ユビキチンの両方の相対配向の二重認識を通して達成される。近位ユビキチンの認識は、ＣＤＲ Ｈ２残基と近位サブユニットの６０ループとの相互作用を通して達成される。特に、２つの水素結合は、近位ユビキチンのＧｌｎ６２の側鎖で作製され、両方ともＣＤＲ Ｈ２の残基に関与する。１つは、Ｐｒｏ５２ａの主鎖のカルボニル酸素とＧｌｎ６２の側鎖アミンとの間にある。もう１つは、Ｇｌｙ５５の主鎖アミドとＧｌｎ６２の側鎖カルボニルとの間にある。また、Ｓｅｒ５４の主鎖カルボニルとＬｙｓ６３の主鎖アミドとの間に第３の水素結合もある。これらの３つの水素結合に加えて、多くのファンデルワールス相互作用はまた、ＣＤＲ Ｈ２と近位ユビキチンとの間に生じる。Ｋ６３結合型ジユビキチンの遠位ユビキチンが、理論上、抗体に対して同じ配向に結合し得るが、近位ユビキチンは、Ｍｅｔ１およびＬｙｓ６３の位置における約６Aの差のため、わずかに回転され得る。この回転は、水素結合およびＣＤＲ Ｈ２と６０ループとの間のファンデルワールス相互作用を妨害する可能性が高いであろう。したがって、特異性は、直鎖状結合から得られる近位および遠位ユビキチンの相対的な空間的配向の認識によりコードされる。
この構造はまた、親和性成熟において選択された特定の突然変異体が親和性の増加に役立つ理由も説明する。ＣＤＲ Ｈ２において、ウエスタンブロットにおいて感受性の最も有意な改善をなした突然変異体は、Ｓ５６Ｑであった（図１３、クローン３Ｆ５を参照のこと）。この構造は、Ｇｌｎ５６が、遠位ユビキチンのＧｌｙ７５のカルボニル酸素を有するものと遠位ユビキチンのＧｌｙ７６のカルボニル酸素を有するものとの２つの水素結合を形成するを示し、これらは、遠位ユビキチンと近位ユビキチンとの間の直鎖状結合に関与する（図２４、パネルＡを参照のこと）。Ｓｅｒの短い側鎖は、これらの残基に到達せず、水素結合を形成しない場合がある。ウエスタンブロットにおいて感受性の２番目に大きい改善をなした突然変異体は、ＣＤＲ Ｌ２中のＳ５２Ｋであった（図１３、クローン１Ｆ１１を参照のこと）。Ｌｙｓ５２は、遠位ユビキチンのアルファヘリックスのカルボキシ末端で見出されるＡｓｐ３２に近接して置かれる。Ｌｙｓ５２が、Ａｓｐ３２の側鎖を持つ塩橋を形成するには離れすぎているが、ヘリックス双極子の負の末端に向かって配向されることを考慮すると、望ましい静電相互作用を形成し得る（図２４、パネルＢを参照のこと）。抗体の感受性を改善した第３の突然変異体は、ＣＤＲ Ｈ３中のＹ１０２Ｌであった（図１３、クローンＹ１０２Ｌを参照のこと）。この残基は、ジユビキチンと接触しないが、改善された結合に対して望ましいＣＤＲ Ｈ３の構造を安定させるのに役立ち得る。Ｌｅｕ１０２は、重鎖のフレームワーク１のＶａｌ２とＬｅｕ４との間に挿入する（図２４、パネルＣを参照のこと）。Ｌｅｕのより疎水性のある側鎖は、ＴｙｒよりもＶａｌ２およびＬｅｕ４とのより望ましい相互作用を提供し、ジユビキチンに接触するために、ＣＤＲ Ｈ３の残部を位置付けるのに役立ち得る。
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明したが、説明および実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。

Claims (56)

  1. Ｃ末端からＮ末端への結合を含む第１のポリユビキチンに特異的に結合する単離された抗体であって、リジン結合を含む第２のポリユビキチンに特異的に結合しない、抗体。
  2. Ｃ末端からＮ末端への結合を含む第１のポリユビキチンおよびリジン結合を含む第２のポリユビキチンの両方に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体は、モノユビキチンに特異的に結合せず、かつ前記第１のポリユビキチンに対する前記抗体の結合親和性と比較して、大幅に減少した結合親和性で前記第２のポリユビキチンに結合する、抗体。
  3. Ｃ−Ｎ末端結合型ポリユビキチンに特異的に結合する単離された抗体であって、モノユビキチンに特異的に結合しない、抗体。
  4. 配列番号１、４、１９、および５０〜５７、配列番号２および５８〜６３、配列番号３、５、６、２０、２１、および６４〜７２、配列番号７、１０、１３、１６、２２、および７３〜８１、配列番号８、１１、１４、１７、２３、２４、および８２〜８６、ならびに配列番号９、１２、１５、１８、および８７〜９３のうちのいずれかの、それぞれＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つの超可変（ＨＶＲ）配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  5. ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１がアミノ酸配列ＲＡＳＱＸ１ＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＶＡ（配列番号３９）を含み、式中、アミノ酸Ｘ１がアミノ酸Ｄ、Ｓ、およびＧから選択され、アミノ酸Ｘ２がＳおよびＤから選択され、アミノ酸Ｘ３がＳ、Ｔ、およびＮから選択され、アミノ酸Ｘ４がＡおよびＳから選択され、ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３がアミノ酸配列ＱＱＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＰＸ１０Ｔ（配列番号４０）を含み、式中、アミノ酸Ｘ５がＳ、Ｙ、およびＨから選択され、アミノ酸Ｘ６がＹおよびＦから選択され、アミノ酸Ｘ７がＴ、Ｙ、およびＡから選択され、アミノ酸Ｘ８がＴ、Ｙ、およびＳから選択され、アミノ酸Ｘ９は任意であり、存在する場合、Ｓであり、アミノ酸Ｘ１０がＰおよびＬから選択される、請求項３に記載の抗体。
  6. ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１がアミノ酸配列Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８（配列番号４１）を含み、式中、アミノ酸Ｘ１１がＴおよびＮから選択され、アミノ酸Ｘ１２がＦおよびＩから選択され、アミノ酸Ｘ１３がＳ、Ｔ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ１４がＮ、Ｄ、Ｓ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ１５がＴ、Ｙ、Ｓ、およびＤから選択され、アミノ酸Ｘ１６がＹ、Ｄ、およびＳから選択され、アミノ酸Ｘ１７がＩおよびＭから選択され、アミノ酸Ｘ１８がＳおよびＨから選択され、ＨＶＲ−Ｈ２がアミノ酸配列ＡＸ１９ＩＸ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５ＴＸ２６（配列番号４２）を含み、式中、アミノ酸Ｘ１９がＳ、Ｇ、Ｗ、およびＥから選択され、アミノ酸Ｘ２０がＴ、Ｓ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ２１がＰおよびＳから選択され、アミノ酸Ｘ２２がＳおよびＹから選択され、アミノ酸Ｘ２３がＧ、Ｓ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ２４がＧおよびＳから選択され、アミノ酸Ｘ２５がＳおよびＹから選択され、アミノ酸Ｘ２６がＤおよびＳから選択され、ＨＶＲ−Ｈ３がアミノ酸配列ＲＸ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｄ（配列番号４３）を含み、式中、アミノ酸Ｘ２７がＴ、Ｅ、およびＧから選択され、アミノ酸Ｘ２８がＷ、Ａ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ２９がＬ、Ｇ、Ｖ、およびＳから選択され、アミノ酸Ｘ３０がＬ、Ｓ、およびＷから選択され、アミノ酸Ｘ３１がＲ、Ｋ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ３２がＷ、Ｌ、Ｇ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ３３がＶ、Ｌ、Ａ、およびＧから選択され、アミノ酸Ｘ３７がＭおよびＦから選択され、アミノ酸Ｘ３４、Ｘ３５、およびＸ３６は任意に存在し、存在する場合、アミノ酸Ｘ３４がＳであり、アミノ酸Ｘ３５がＶおよびＰから選択され、アミノ酸Ｘ３６がＡである、請求項３に記載の抗体。
  7. ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１がアミノ酸配列ＲＡＳＱＸ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ａ（配列番号４４）を含み、式中、アミノ酸Ｘ３８がＤ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ３９がＶ、Ａ、Ｌ、およびＳから選択され、アミノ酸Ｘ４０がＳ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ４１がＴ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ４２がＡ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ４３がＶおよびＬから選択され、ＨＶＲ−Ｌ２がアミノ酸配列ＳＸ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７ＹＸ４８（配列番号４５）を含み、式中、アミノ酸Ｘ４４がＡおよびＲから選択され、アミノ酸Ｘ４５がＳ、Ｋ、Ｑ、およびＲから選択され、アミノ酸Ｘ４６がＦおよびＹから選択され、アミノ酸Ｘ４７がＬ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、およびＹから選択され、アミノ酸Ｘ４８がＳ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され、ＨＶＲ−Ｌ３が配列ＱＱＸ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２ＰＰＴ（配列番号４６）を含み、式中、アミノ酸Ｘ４９がＨおよびＳから選択され、アミノ酸Ｘ５０がＹ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、およびＷから選択され、アミノ酸Ｘ５１がＴ、Ｉ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ５２がＴ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＶから選択される、請求項３に記載の抗体。
  8. ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１がアミノ酸配列Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５ＹＸ５６Ｓ（配列番号４７）を含み、式中、アミノ酸Ｘ５３がＡ、Ｆ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、およびＳから選択され、アミノ酸Ｘ５４がＮおよびＷから選択され、アミノ酸Ｘ５５がＴ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ５６がＩ、Ｍ、およびＶから選択され、ＨＶＲ−Ｌ２がアミノ酸配列ＡＸ５７Ｘ５８ＴＰＸ５９ＳＧＸ６０ＴＸ６１（配列番号４８）を含み、式中、アミノ酸Ｘ５７がＴおよびＳから選択され、アミノ酸Ｘ５８がＩ、Ｓ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ５９がＳおよびＡから選択され、アミノ酸Ｘ６０がＳ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＱから選択され、アミノ酸Ｘ６１がＤおよびＮから選択され、ＨＶＲ−Ｈ３がアミノ酸配列Ｘ６２ＷＸ６３Ｘ６４ＲＷＶＸ６５Ｄ（配列番号４９）を含み、式中、アミノ酸Ｘ６２がＳおよびＴから選択され、アミノ酸Ｘ６３がＬおよびＹから選択され、アミノ酸Ｘ６４がＬ、Ｉ、およびＶから選択され、アミノ酸Ｘ６５がＭおよびＦから選択される、請求項３に記載の抗体。
  9. 配列番号１または４のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、ならびに配列番号３、５、および６から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列をそれぞれ含む、請求項３に記載の抗体。
  10. 配列番号７、１０、１３、および１６から選択されるＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８、１１、１４、および１７から選択されるＨＶＲ−Ｈ２配列、ならびに配列番号９、１２、１５、および１８から選択されるＨＶＲ−Ｈ３配列をそれぞれ含む、請求項３に記載の抗体。
  11. 配列番号１または１９のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、ならびに配列番号３、２０、および２１から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列をそれぞれ含む、請求項３に記載の抗体。
  12. 配列番号１０または２２のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１、２３、および２４から選択されるＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１２のＨＶＲ−Ｈ３配列をそれぞれ含む、請求項３に記載の抗体。
  13. 配列番号１および５０〜５７から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２および５８〜６３から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３および６４〜７２から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列をそれぞれ含む、請求項３に記載の抗体。
  14. 配列番号７および７３〜８１から選択されるＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８および８２〜８６から選択されるＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号９および８７〜９３から選択されるＨＶＲ−Ｈ３配列をそれぞれ含む、請求項３に記載の抗体。
  15. 図２Ａ、５Ａ、または９Ａでクローン１Ｅ３、１Ｄ８、１Ｆ４、１Ａ１０、１Ｄ８．３Ｃ２、１Ｄ８．３Ｆ８、１Ｄ８．４Ｆ５、１Ｆ１１、３Ｆ５、Ｙ１０２Ｌ、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌについて示されるものに対応するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  16. 図２Ｂ、５Ｂ、または９Ｂでクローン１Ｅ３、１Ｄ８、１Ｆ４、１Ａ１０、１Ｄ８．３Ｃ２、１Ｄ８．３Ｆ８、１Ｄ８．４Ｆ５、１Ｆ１１、３Ｆ５、Ｙ１０２Ｌ、１Ｆ１１／３Ｆ５／Ｙ１０２Ｌについて示されるものに対応するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  17. 表５に記載されるクローンについて示されるものに対応するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  18. 表５に記載されるクローンについて示されるものに対応するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  19. 配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１０のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号１２のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  20. 配列番号１９のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１０のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２３のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号１２のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  21. 配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号２０のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１０のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号１２のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  22. 配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号２１のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号２２のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２４のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号１２のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  23. 配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号９のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  24. 配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２、５８、および６０から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３、６５、および７２から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号７または８０のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８または８２のＨＶＲ−Ｈ２配列、ならびに配列番号９、８７、８９、または９０から選択されるＨＶＲ−Ｈ３配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  25. 配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５８のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号９のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む、請求項２４に記載の抗体。
  26. 配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８２のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号９のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む、請求項２４に記載の抗体。
  27. 配列番号１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５８のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８２のＨＶＲ−Ｈ２配列、および配列番号９のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む、請求項２４に記載の抗体。
  28. ＨＶＲ−Ｈ３のＣ末端後の最初のアミノ酸は、ロイシンである、請求項２７に記載の抗体。
  29. 配列番号２５〜２８、３３〜３５、９４、および１９３〜１９５から選択される軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  30. 配列番号２９〜３２、３６〜３８、９５、および１９６〜１９８から選択される重鎖アミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  31. 配列番号２５および２９、配列番号２６および３０、配列番号２７および３１、配列番号２８および３２、配列番号３３および３６、配列番号３４および３７、配列番号３５および３８、配列番号９４および９５、配列番号１９３および１９６、配列番号１９４および１９７、ならびに配列番号１９５および１９８の配列の組み合わせのうちの１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つ軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  32. 配列番号９４および９５の前記軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の抗体。
  33. 請求項１〜３２のいずれかに記載の抗体と同じＣ−Ｎ末端結合型ポリユビキチン上の抗原決定基に結合する、単離された抗体であって、モノユビキチンに特異的に結合しない、抗体。
  34. ポリユビキチンへの結合について、請求項１〜３２のいずれかに記載の抗体と競合する、単離された抗体であって、モノユビキチンに特異的に結合しない、抗体。
  35. 前記抗体は、Ｃ−Ｎ末端結合型ポリユビキチン化タンパク質に特異的に結合する、請求項１〜３２のいずれかに記載の単離された抗体。
  36. 前記抗体は、少なくとも１つのポリユビキチン媒介性シグナル伝達経路を調節する、請求項１〜３２のいずれかに記載の単離された抗体。
  37. 前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはＣ−Ｎ末端結合型ポリユビキチンに結合する抗体断片である、請求項１〜３２のいずれかに記載の単離された抗体。
  38. 請求項１〜３２のいずれかに記載の抗体をコードする、単離された核酸。
  39. 請求項３８に記載の核酸を含む、ベクター。
  40. 請求項３８に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  41. 前記抗体が産生される条件下で、請求項３１に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜３７のいずれかに記載の抗体を産生する方法。
  42. 前記宿主細胞から前記抗体を回収することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体および細胞傷害性薬剤を含む、免疫複合体。
  44. 請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
  45. さらなる治療剤をさらに含む、請求項４４に記載の薬学的製剤。
  46. 医薬としての使用のための、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体。
  47. 細胞周期関連疾患または障害の治療に使用するための、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体。
  48. 前記細胞周期関連疾患または障害は、細胞周期進行の異常な亢進に関連する疾患または障害、および細胞周期進行の異常な低下に関連する疾患または障害から選択される、請求項４７に記載の抗体。
  49. 前記細胞周期進行の異常な亢進に関連する疾患または障害が癌である、請求項４８に記載の抗体。
  50. 前記細胞周期進行の異常な低下に関連する疾患または障害が、変性筋障害および変性神経障害から選択される、請求項４８に記載の抗体。
  51. 医薬の製造における、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  52. 前記医薬が、癌、変性筋障害、および変性神経障害から選択される疾患または障害のためのものである、請求項５１に記載の使用。
  53. 癌、変性筋障害、および変性神経障害から選択される疾患または障害を有する個体を治療する方法であって、前記個体に有効量の請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
  54. ポリユビキチンまたはポリユビキチン化タンパク質を含有することが疑われる試料中のポリユビキチンまたはポリユビキチン化タンパク質の存在を判定する方法であって、その試料を請求項１〜３７のいずれかに記載の少なくとも１つの抗体に曝露し、前記試料中のポリユビキチンまたはポリユビキチン化タンパク質への前記少なくとも１つの抗体の結合を判定することを含む、方法。
  55. 試料中の非Ｃ−Ｎ末端結合型ポリユビキチン化タンパク質からＣ−Ｎ末端結合型ポリユビキチン化タンパク質を分離する方法であって、前記試料を請求項１〜３７のいずれかに記載の少なくとも１つの抗体と接触させることを含む、方法。
  56. 細胞または試料中のＣ−Ｎ末端結合型ポリユビキチンの機能および／または活性を判定する方法であって、前記細胞または試料を請求項１〜３７のいずれかに記載の少なくとも１つの抗体と接触させることと、前記細胞または試料への前記接触するステップの効果を評価することと、を含む、方法。
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