CN114423784A - 多价fzd和wnt结合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述影响多价结合分子与细胞上的FZD受体和Wnt共受体结合的方法，其中所述多价结合分子与细胞上的FZD受体和共受体两者的结合激活Wnt信号通路。本文还描述激活Wnt信号通路的多价结合分子及其使用方法，所述多价结合分子包含在Fc结构域的任一端上的FZD受体结合结构域和Wnt共受体结合结构域。

Description

多价FZD和WNT结合分子及其用途
背景技术
本申请要求2019年6月11日提交的美国临时申请号62/860,161的基于35U.S.C.119(e)的权益，其全部内容通过引用并入本文。
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式进行电子提交，并且通过引用以其整体并入本文。所述ASCII副本创建于2020年6月10日，命名为115773_PC424WO_SL.txt，大小为279,203字节。
Wnt信号通路对于成人的胚胎发育和组织内稳态是至关重要的。Wnt配体是分泌的生长因子，其调节各种细胞进程，例如增殖、分化、存活和迁移。Wnt配体对于控制组织干细胞自我更新和调节许多祖细胞群是普遍重要的。Wnt蛋白的疏水性和敏感的三级结构使其生化纯化具有挑战性，并且无法在体内和体外使用。
在人类中存在19种Wnt配体，它们与10个卷曲蛋白细胞表面受体(FZD)和几种指导不同细胞内信号传导分支的选择性参与的共受体之一的网络相互作用(Wodarz,A.和Nusse,R.Annu.Rev.Cell Dev.Biol.14,59–88(1998)；Angers,S和Moon,R.T.,transduction.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.10,468–477(2009))。FZD具有保守的结构特征，包括七个疏水跨膜结构域和富含半胱氨酸的配体结合结构域。已知FZD在三种不同的信号通路中起作用，称为Wnt平面细胞极性(PCP)通路、典型Wnt/β-连环蛋白通路、和Wnt/钙通路。Wnt信号通路的激活还需要Wnt共受体的存在，以指示细胞内信号传导级联的差异性参与，调节影响作为上述列举的细胞进程的基础的细胞机制的基因的表达。例如，Wnt配体与卷曲蛋白受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(LRP5/6)共受体家族的成员结合，以激活Wnt/β-连环蛋白通路，或与涉及受体酪氨酸激酶(RYK)或蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)共受体的受体酪氨酸激酶样孤儿受体1和2(ROR1/2)一起，以启动Wnt/PCP通路或可替换的不依赖β连环蛋白的信号通路。Wnt/β-连环蛋白通路，有时也称为典型通路，在转录效应子β-连环蛋白的翻译后积累中达到顶峰，β-连环蛋白与转录因子T细胞因子/淋巴增强因子(LEF/TCF)家族相互作用，以调节特定背景基因的表达。
发明内容
Wnt需要脂化来发挥功能(Janda等人,Science.337,59–64(2012)；Kadowaki等人,Genes Dev.10,3116–3128(1996))，其疏水性使生化操作复杂化；因此，仅少数Wnt被纯化(Willert等人,Nature 423,448–452(2003)。此外，Wnt对多种受体具有固有的交叉反应性，特别是当过表达或以高剂量应用时(He等人Science.275,1652–1654(1997)；Andres等人Systematic mapping of Wnt-Frizzled interactions reveals functionalselectivity by distinct Wnt-Frizzled pairs.Journal of Biological(2015)(获得自http://www.jbc.org/content/early/2015/01/20/jbc.M114.12648.short)；Holmen等人,J.Biol.Chem.277,34727–34735(2002)。)。因此，不可能选择性地激活卷曲蛋白受体复合物以确定在不同情况下各自的特定功能或评估其对退行性病况的治疗潜力。如本文所述的多价结合分子和方法选择性地激活预选的卷曲蛋白受体-共受体复合物。预期如本文所述的多价结合分子的施用通过激活合适的卷曲蛋白共受体复合物来治疗退行性病况。
本文描述影响肽与细胞上的FZD受体和Wnt共受体结合的方法，其中肽与FZD受体和共受体两者的结合激活Wnt信号通路。
本文还描述激活Wnt信号通路的多价结合分子及其使用方法。多价结合分子与FZD受体和Wnt共受体两者结合，从而激活Wnt信号通路。本发明的多价结合分子在本文中也称为“FZD激动剂”或“FZDag”。在其中本发明的分子结合FZD和LRP5/6的特定实施方案中，该分子可以被称为“卷曲蛋白和LRP5/6激动剂”或“FLAg”。多价结合分子包含Fc结构域或其包含CH3结构域的片段、以及结合FZD受体的第一结合结构域和结合Wnt共受体的第二结合结构域，其中FZD结合结构域与Fc结构域的一末端连接，并且共受体结合结构域与Fc结构域的另一末端连接。因此，用于FZD受体的结合结构域和用于共受体的结合结构域不直接连接，而是由Fc结构域、或其包含CH3结构域的片段分开。结合结构域的这种构象产生出乎意料的高水平的Wnt信号通路激活。FZD结合结构域可以是具有FZD受体的单个结合位点(互补位)的一价的、或者可以是具有FZD受体的超过一个结合位点的多价的，例如，结合结构域可以是二价、三价或四价的。Wnt共受体结合结构域可以是具有Wnt共受体的单个结合位点(互补位)的一价的、或者可以是具有Wnt共受体的超过一个结合位点的多价的，例如，结合结构域可以是二价、三价或四价的。
如本文所述的用于产生多价结合分子的方法使得能够在体外和体内选择性地且强力地激活任何FZD受体复合物。利用靶向FZD及其共受体的数百种合成抗体的组，我们产生用于选择性地且合理地激活一个、两个或多个FZD受体的多价结合分子。本发明的多价结合分子是高度稳定的，适于大规模生产和容易纯化，具有可预测的药代动力学，并预期表现出低免疫原性。
在本发明的一个实施方案中，如本文所述的多价结合分子的结合结构域与一个以上的FZD受体和LRP例如LRP5和/或LRP6结合，并且在本文中可替代地称为FLAg。靶向特定FZD及其LRP共受体的FLAg将改善定向分化和细胞疗法，维持组织类器官的生长，并在体内动员内源性干细胞，促进损伤后的组织修复，并在组织变性后恢复功能。
FZD激动剂的Fc结构域可以是免疫球蛋白的Fc结构域。免疫球蛋白可以是IgG，例如IgG1。在本发明的一个实施方案中，多价结合分子是肽二聚体，其中所述肽通过Fc结构域的内在能力二聚化或通过Fc内的杵臼(knob-in-hole)构象而二聚化，从而允许两种不同肽的特异性组装，以产生多价结合结构域。通过杵臼构象使肽二聚化的方法描述于WO2018/026942，发明人Van Dyk等人，通过引用并入本文。
如本文所述的FZD激动剂的多价结合结构域中的一者或两者可以是二价和单特异性的，对于它们各自的受体或共受体靶标的相同表位具有两个结合位点。结合结构域中的一者或两者可以是具有两个结合位点的二价和双特异性的，其中每个位点在其各自的靶标上结合不同的表位。
在本发明的一个实施方案中，FZD结合结构域可包含两个单链可变片段(scFv)，用于结合FZD受体上的相同或不同表位。在本发明的其他实施方案中，FZD结合结构域包含结合FZD的一个以上的重链可变结构域(VH)片段和/或一个以上的轻链可变结构域(VL)片段。在本发明的其他实施方案中，FZD结合结构域由一个以上的与FZD结合的单结构域抗体片段组成。在本发明的其他实施方案中，FZD结合结构域包含结合FZD受体的FZD配体或其片段。在本发明的一个实施方案中，FZD结合结构域包含结合FZD的合成肽，例如，亲和体、锚蛋白重复蛋白、纤连蛋白重复蛋白、fynomer、或anticalin。在本发明的一个实施方案中，FZD多价结合结构域不包含scFv。FZD配体可以是例如结合FZD受体的Wnt蛋白的片段或Norrin的片段，或可以是另一种亲和力成熟至与一个以上的FZD受体相互作用的天然或合成肽。Norrin是一种FZD4特异性配体，其与LRP5和/或LRP6形成复合体，与典型Wnt信号传导的激活相关。
在本发明的一个实施方案中，共受体结合结构域可包含两个单链可变片段(scFv)，用于结合共受体上的相同或不同表位。在本发明的其他实施方案中，Wnt共受体结合结构域包含结合Wnt共受体的一个以上的重链可变结构域(VH)片段和/或一个以上的轻链可变结构域(VL)片段。在本发明的其他实施方案中，共受体结合结构域由一个以上的与共受体结合的单结构域抗体片段组成。在本发明的一个实施方案中，Wnt共受体结合结构域包含结合Wnt共受体的肽，其中所述肽是结合Wnt共受体的天然存在的配体的片段或是结合Wnt共受体的合成肽，例如亲和体、锚蛋白重复蛋白、纤连蛋白重复蛋白、fynomer、或anticalin。在本发明的另一个实施方案中，共受体结合结构域包含结合共受体的共受体配体或其片段(例如，共受体LRP5/6的配体Dkk1)或另一种亲和力成熟至与一个以上的共受体相互作用的天然或合成肽。
在本发明的一个实施方案中，共受体多价结合结构域不包含scFv。
在本发明的一个实施方案中，本文描述的分子的每个结合结构域可以由两条肽形成，每条肽包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，其中来自一条肽的VH和VL与另一条肽的VL和VH配对形成双体抗体。在这种构象中，结合结构域具有两个与其靶标结合的结合位点，即，FZD结合结构域具有FZD受体的两个结合位点，并且共受体结合结构域具有共受体的两个结合位点。使用杵臼Fc构象，可以工程化包含VH和VL的肽，使它们互不相同，但仍然配对形成能够结合FZD受体或共受体上的两个不同位点的双特异性结合结构域(参见图3A)。
在本发明的一个实施方案中，多价结合结构域的一者或两者包含两个在Fc结构域的每个末端上形成双体抗体的肽。每个双体抗体在其各自的FZD受体或共受体靶标上具有表位的两个结合位点。双体抗体可以是其中结合位点结合FZD受体或共受体上的相同表位的单特异性的，或者双体抗体可以双特异性地结合FZD受体或共受体上的两个不同表位。
形成scFv或双体抗体的肽可以源自与FZD受体结合的抗体或源自与Wnt共受体结合的抗体。对于FZD结合结构域，抗体可以是与一个以上的FZD受体结合并拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt与给定的FZD受体(一个以上)结合的抗体，或者抗体可以是与一个以上的FZD受体结合而不抑制Wnt与FZD受体结合的抗体。对于共受体结合结构域，抗体可以是与共受体结合并拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt与共受体结合的抗体、或抗体可以是与共受体结合而不抑制Wnt与共受体结合的抗体。
FZD结合结构域可以结合FZD受体家族的一个以上的成员，例如，卷曲蛋白类受体1(FZD1)、卷曲蛋白类受体2(FZD2)、卷曲蛋白类受体3(FZD3)、卷曲蛋白类受体4(FZD4)、卷曲蛋白类受体5(FZD5)、卷曲蛋白类受体6(FZD6)、卷曲蛋白类受体&(FZD7)、卷曲蛋白类受体1卷曲蛋白类受体8(FZD8)、卷曲蛋白类受体9(FZD9)、或卷曲蛋白类受体10(FZD10)。共受体结合结构域可以结合任何Wnt共受体，例如LRP5/6、PTK7、ROR1/2、RYK、GPR124、TSPAN12、或CD133。在本发明的一个实施方案中，共受体结合结构域结合LRP5和/或LRP6。在本发明的一个实施方案中，共受体结合结构域结合共受体上的单表位，例如，结合Wnt1或Wnt3a的LRP蛋白的表位。在本发明的一个实施方案中，共受体结合结构域结合共受体上的两个表位，例如，LRP上的与Wnt1结合的表位和与Wnt3a结合的表位。
本发明的一个实施方案包括产生诱导性多能干细胞(iPS)的方法，该方法包括在存在有效量的如本文所述的多价结合分子的情况下，在适于对体细胞进行重编程的条件下培养体细胞。与在没有多价结合分子的相同培养条件下iPS细胞的产生相比，可以以加速iPS细胞的产生的量包含多价结合分子。
本发明的另一个实施方案是通过在存在有效量的如本文所述的多价结合分子的情况下培养这些细胞来使iPS或其它多能干细胞(PSC)向各种谱系直接分化的方法。
本发明的一个实施方案包括产生组织类器官(tissue organoid)的方法，该方法包括在存在有效量的如本文所述的多价结合分子作为培养混合物的一部分的情况下，在适于产生类器官的条件下培养组织样品。在一个实施方案或本发明中，与在没有多价结合分子的相同培养基中培养的类器官相比，在包含多价结合分子的培养基中培养的组织类器官的产生频率提高。在一个实施方案或本发明中，与在没有多价结合分子的相同培养基中培养的组织样品相比，当在包含多价结合分子的培养基中培养时，组织类器官的产生更快。
本发明的一个实施方案包括用于增强组织类器官的维持的方法，该方法包括在存在有效量的如本文所述的多价结合分子作为培养混合物的一部分的情况下培养类器官。如本文所述，与在没有多价结合分子的相同培养基中培养的类器官相比，在包含多价结合分子的培养基中培养的组织类器官的存活得以延长。
本发明的一个方面是如本文所述的多价结合分子的制备方法。在本发明的一个实施方案中，多价结合分子是通过以下方式产生的，
a)选择具有C末端和N末端的Fc结构域，
b)识别与一个以上的FZD受体结合的抗体和
c)识别与一个以上的Wnt共受体结合的抗体，
d)产生包含以下的核酸分子：编码(i)步骤a的Fc结构域的核苷酸序列、(ii)编码步骤b的抗体的VL和/或VH、或源自结合一个以上的FZD的步骤b的抗体的VL和/或VH的核苷酸序列、以及(iii)编码步骤c的抗体的VL和VH、或源自与步骤c的一个以上的Wnt受体结合的步骤c的抗体的VL和VH的核苷酸序列，
e)表达(d)的核酸分子以产生多肽，其中该多肽二聚化形成包含Fc结构域、FZD结合结构域和Wnt共受体结合结构域的多价结合分子，其中该FZD结合结构域包含步骤b的抗体的VL和VH或源自步骤b的抗体，并与Fc结构域的一末端连接，Wnt共受体结合结构域包含步骤c的抗体的VL和VH或源自步骤c的抗体，并与Fc结构域的另一末端连接，从而形成多特异性结合分子。
步骤(b)中的抗体可以是与一个以上的FZD受体结合并拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt与受体结合的抗体或抗体片段。步骤(b)中的抗体可以是与一个以上的FZD受体结合而不拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt与受体结合的抗体或抗体片段。步骤(c)中的抗体可以是与一个以上的Wnt共受体结合并拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt与共受体结合、或与共受体结合而不拮抗Wnt信号转导或抑制Wnt与共受体的结合的抗体或抗体片段。结合结构域可通过接头连接至Fc结构域。本发明的模块化方面允许在Fc结构域的末端混合和匹配针对任何给定的FZD受体和共受体的抗体的结合结构域，以产生多价结合分子，该多价结合分子可以结合多个卷曲蛋白受体-共受体复合物或选择性地结合单个卷曲蛋白受体-共受体复合物以激活Wnt信号传导。
多价结合分子包含构象为具有Fc结构域和结合一个以上的FZD受体的结合结构域以及结合一个以上的Wnt共受体的第二结合结构域的肽二聚体，其中FZD结合结构域与Fc的一末端连接，共受体结合结构域与Fc的另一末端连接。每个结合结构域可以是单价或多价的，例如二价、三价或四价。
本发明的另一个实施方案为使用多价结合分子例如用于产生诱导性多能干(iPS)细胞、用于定向分化多能干细胞、和用于产生和/或维持类器官，或在有需要的受试者中增强组织再生的方法。
本发明的另外的实施方案是激活Wnt信号通路的方法，以动员内源性干/祖细胞池，用于再生医学以及用于与Wnt信号传导不足有关的病症或疾病。
附图说明
图1A描述选择的五种抗体与人LRP6的胞外结构域(ECD)结合的结合特异性。通过选择与人LRP6的重组胞外结构域(ECD)结合的抗体，从合成抗体库中选择LRP6结合抗体。通过ELISA检测抗体与人LRP6、小鼠LRP6、和小鼠LRP5的结合。将与Fc肽和牛血清白蛋白(BSA)的结合包括在内作为阴性对照。
图1B描述监测Wnt信号激活的荧光素酶报告基因试验结果，表明IgG2539和IgG2542(100μM)通过对Wnt1(瞬时转染)和Wnt3a(0.5μg/ml纯化的蛋白)刺激的相反作用与LRP6 ECD上的不同位点结合。抗MBP抗体用作对照。
图2A描述代表性的双特异性IgG(Bi-IgG)和双特异性双体抗体(bi-diabody)，其在Fc结构域的同一端包含FZD结合结构域(5019)和LRP6-W1(2942,L61)或W3(2539,L63)结合结构域。
图2B表明如在HEK293细胞中的TOPFlash荧光素酶报告基因试验中所确定的，双特异性IgG(5019-2539Bi-IgG和5019-2542Bi-IgG)不激活Wnt信号传导，而是用作Wnt信号传导的拮抗剂。
图2C-2G描述双特异性双体抗体的结合，其中Fc结构域为杵臼构像(K/H)。两种由此获得的双体抗体5019-2539-K/H(FZD/LRP6-W3)和5019-2542-K/H(FZD/LRP6-W1)保留原始IgG的FZD结合特性以及LRP6的结合活性，尽管非常弱。图2C描述纯化的FZD-LRP6双体抗体：5019-2539-K/H和5019-2542-K/H。图2D描述5019双体抗体与FZD4、FZD5、和FZD7的FZD受体结合曲线(profile)。5019FZD IgG先前表征为与FZD1、2、4、5、7、8结合。图2E描述双特异性FZD/LRP6双体抗体5019-2539-K/H的FZD受体结合曲线。图2F描述双特异性FZD/LRP6双体抗体5019-2542-K/H的FZD受体结合曲线。图2G表明在Fc结构域的一末端上具有结合结构域的同源双体抗体(2539-Fc和2542-Fc)和异源双体抗体(5019-2539-Fc和5019-2542-Fc)与LRP6胞外结构域的相互作用。图2H表明如通过生物层干涉法(BLI)试验中所确定的，双体抗体5019-2539-K/H和5019-2542-K/H在溶液中与FZD CRD和LRP6 ECD的共结合。
图2I表明其中形成结合结构域的FZD和LRP6受体双体抗体存在于Fc的同一侧，5019-2539-K/H或5019-2542-K/H都不是激活Wnt介导的通路的FZD激动剂。结果说明，如在HEK293细胞中使用TOPFlash荧光素酶报告基因试验中所揭示的，5019-2539-K/H双体抗体(对LRP6上的Wnt3位点具有选择性)在10nM和50nM时完全阻断了Wnt3介导的通路的激活，然而5019-2542-K/H效果较差。
图2J描述具有包含双体抗体或scFv的结合结构域的四价结合分子的荧光素酶活性的比较。具有包含抗FZD scFv和抗LRP双体抗体(FP*+P*-L61+3)的结合结构域的分子表现与具有包含抗FZD双体抗体和抗LRP双体抗体(FP+P-L61+3)的结合结构域的分子相似的活性。相反，与FP+P-L61+3相比，含有抗FZD双体抗体和抗LRP6 scFv(FP+P-L61*+3*)或在两端含有scFv(FP*+P*-L61*+3*)的分子，分子活性显著降低。
图2K和图2L表明具有包含双体抗体或scFv的结合结构域的四价结合分子之间活性的差异不是由于亲和力的差异引起的，因为BLI测定显示不论互补位是以双体抗体还是scFv形式出现，与LRP6和FZD同种型的结合具有相当的高亲和力。
图3A是代表四价结合分子的示意图，其中包含同源(识别相同表位)或异源(识别不同的表位)双体抗体的两个FZD结合结构域与Fc结构域的一端连接并且包含同源或异源双体抗体的两个LRP6结合结构域与Fc结构域的另一端连接。
图3B描述多价结合分子5019-Fc-2539(FP+P-L63+3)和5019-Fc-2542(FP+P-L61+1)与FZD4、FZD5和FZD7 ECD的结合。使用BLI试验检测与FZD受体的结合。
图3C显示通过四价结合分子5019-Fc-2539(FP+P-L63+3)；5019-Fc-2542(FP+P-L61 +1)；5019-K/H-2539-2542(FP+P-L61+3)、和纯化的Wnt3A(0.5μg/ml)的Wnt-β连环蛋白信号通路的激活。显示分子的浓度。如使用pBAR荧光素酶报告基因试验所测定的，四价结合分子是强烈地激活HEK293T细胞中的Wnt-β连环蛋白通路的激动剂。5019-Fc-2539同源双体抗体与多个FZD受体(5019:FZD1、2、4、5、7、8)和与LRP6上的Wnt3a位点(2539)结合，并将报告基因激活至与纯化的Wnt配体相当的水平。与LRP6上的两个Wnt结合位点结合的5019-K/H-2539:2542异源双体抗体更有效。
图3D描述通过多价结合分子的Wnt-β连环蛋白通路激活，该多价结合分子具有通过Fc与单特异性LRP6同源双体抗体(5019-Fc-2539、5019-Fc-2542)或双特异性LRP6异源双体抗体(5019-K/H-2539-2542，也称为5019Ag或FP+P-L61+3)任一者连接的FZD同源双体抗体(5019)。
图3E描述通过包含FZD受体或LRP6共受体任一者的单价结合结构域的分子的Wnt-β连环蛋白信号传导的激活。使用在HEK293T细胞中进行的pBAR荧光素酶报告基因试验来检测Wnt-β连环蛋白通路的激活。5019-MBP-K/H-2539-2542包含一个用于FZD的单价结合结构域并且仍激活Wnt通路，但是相对于5019Ag(其包含两个与相同表位结合的FZD结合结构域)而言，其功效降低了8倍。在C末端仅保留一个LRP6-W3结合结构域的5019-K/H-2539-MBP表现的功效要低得多。重要的是，在两个单FZD:单LRP6双体抗体5019-MBP-K/H-2539-MBP和5019-MBP-K/H-MBP-2542以及一个LRP6-W1位点双体抗体5019-K/H-MBP-2542中检测到最低激动活性。
图3F描述通过四价结合分子的Wnt-β连环蛋白通路激活，其中靶向WNT3A结合位点的抗LRP5互补位被靶向WNT1结合位点的抗LRP6互补位代替，以产生可以募集两个共受体并且观察到活性与FP+P-L61+3相似(EC50＝4nM)的分子(FP+P-L5/63)。
图4A描述在没有内源性FZD4受体(-FZD4)或修饰以表达FZD4受体(+FZD4)的报告基因细胞中通过多价结合分子的Wnt-β连环蛋白通路激活，该多价结合分子具有对Fc结构域一侧的FZD4具有特异性的FZD结合结构域(这种情况下为同源双体抗体)、和具有对Fc结构域另一侧的LRP6(2539和2542)具有特异性的共受体结合结构域(FZD4Ag:5038Ag/5038-K/H-2539-2542、5044Ag/5044-K/H-2539-2542、5048Ag/5048-K/H-2539-2542、5063Ag/5063-K/H-2539-2542、5080Ag/50180-K/H-2539-2542、5081Ag/5081-K/H-2539-2542)。对照是多价结合分子5019Ag(5019-K/H-2539-2542)和FZD4的内源性激动剂Norrin。结果表明，用FZD4的选择性结合结构域替换5019Ag/5019-K/H-2539:2542(泛FZD激动剂)中的5019FZD结合结构域(识别FZD1、2、4、5、7、8)，使得能够开发选择性FZD4激动剂。用编码所列出的FZD激动剂并且具有或不具有FZD4和LRP6 cDNA的质粒pBARL(Wnt-β连环蛋白荧光素酶报告基因)和Rluc(标准化对照)转染HEK293T细胞。Norrin用作FZD4的激活的阳性对照。HEK293T细胞表达低至不可检测水平的FZD4，因此FZD4激动剂只能在存在转染的FZD4 cDNA的情况下激活报告基因。与此相反，在不存在或存在FZD4的情况下，泛FZDag 5019-K/H-2539:2542通过激活这些细胞中的其他内源表达的卷曲蛋白，强烈地激活Wnt-β连环蛋白信号传导。
图4B显示通过多价结合分子的Wnt-β连环蛋白通路激活，该多价结合分子具有在Fc一侧对FZD2(2876、2890)、FZD2/7(2886)FZD6(2747)或FZD9/10(2969、2974)具有特异性的结合结构域(同源双体抗体)，以及在Fc另一侧的由2539和2542抗体片段形成的LRP6异源双体抗体具有特异性的结合结构域。在HEK293T细胞中使用pBARL试验评估Wnt-β连环蛋白通路激活。
图4C描述通过多价结合分子的Wnt通路激活，该多价结合分子具有对FZD具有泛特异性的FZD结合结构域，并且源自阻断Wnt与FZD和Wnt-β连环蛋白信号传导结合的IgG。这些分子中的LRP6结合结构域位于Fc的c末端并由抗体2539和2542形成的双体抗体组成，它们具有分别识别LRP6上的Wnt3和Wnt1结合位点的互补位。
图4D描述通过多价结合分子的Wnt通路激活，该多价结合分子具有对FZD为泛特异性的FZD结合结构域，并且源自不阻断Wnt与FZD结合并且不拮抗Wnt3诱导的通路激活的IgG。这些分子中的LRP6结合结构域位于Fc的c末端并由抗体2539和2542形成的双体抗体组成，它们具有分别识别LRP6上的Wnt3和Wnt1结合位点的互补位。
图5描述本发明的三个四价结合分子的FZD/LRP6结合行为的比较。5019-Fc-2539、5019-Fc-2542、5019-Fc-2539-2542与FZD紧密结合，但显示较弱的LRP6相互作用(左图)或FZD/LRP6共结合(中图)。5019-K/H-2539-2542的FZD结合曲线(右图)显示其识别FZD4、FZD5和FZD7。
图6A是已知介导与Wnt1结合的LRP5/6的顶部两个螺旋桨(propeller)(E1-E2)和接近质膜并已知介导与Wnt3相互作用的LRP5/6的底部2个螺旋桨(E3-E4)的示意图。图6A还说明Wnt1与LRP5/6和FZD受体相互作用以及Wnt3与LRP5/6和FZD受体相互作用。
图6B是通过多价结合分子5019-Fc-2539、5019-Fc-2542和5019-K/H-2539-2542的FZD受体和LRP5/6受体可能相互作用的示意图。
图6C表明如使用pBAR荧光素酶报告基因试验所测定的，多价结合分子是在HEK293T细胞中强烈激活Wnt-β连环蛋白通路的激动剂。5019-Fc-2539同源双体抗体结合多个FZD受体(5019结合FZD1、2、4、5、7、8)并与LRP6上的Wnt3a位点结合(2539)，并将报告基因激活至与纯化的Wnt配体相当的水平。与LRP6上的Wnt3a和Wnt1结合位点二者结合的5019-K/H-2539:2542异源双体抗体更有效。
图6D显示5019-K/H-2459:2460，一种四价结合分子，其具有杵臼构象的Fc结构域，并具有泛FZD特异性(5019)的FZD结合结构域(同源双体抗体)和对LRP5上的两个位点具有双特异性(异源双体抗体)的共受体结合结构域(2459结合Wnt1结合位点和2460结合Wnt3结合位点)，也激活HEK293T细胞中的Wnt-β连环蛋白通路。
图7A表明用对FZD5(#2928)具有特异性的FZD结合结构域替换5019-K/H-2539:2542(识别FZD1、2、4、5、7、8的泛FZD激动剂)中的FZD结合结构域，产生选择性的FZD5激动剂。已经显示HPAF-II细胞增殖依赖于FZD5信号传导。使用Wnt分泌抑制剂LGK974(靶向酰基转移酶Porcupine)阻断Wnt-FZD5信号传导导致细胞周期停滞和增殖抑制。可以通过添加外源Wnt3a条件培养基或添加如本文所述的FZD5选择性激动剂(2928-K/H-2539:2542)或泛FZD激动剂(5019-K/H-2539:2542)来挽救增殖。FZD4选择性激动剂5038-K/H-2539:2542仅具有适度的挽救能力。
图7B表明用FZD2特异性FLag刺激C3H10T1/2细胞导致成骨标志物碱性磷酸酶(ALPL)的强烈诱导达到类似于用泛FZD FLAg诱导实现的那些水平，而FZD5特异性FLAg表现出最小的活性。
图8A和8B表明当用作为Porcupine的小分子抑制剂(左下图)的LGK974阻止Wnt分泌时，本发明的泛FZDag(FP+P-L61+3)完全替代外源Wnt3A条件培养基，以挽救肠类器官的生长抑制。从小鼠中分离出的肠类器官在重组R-Spondin存在下生长，并需要存在由潘氏细胞(paneth cells)分泌的Wnt配体。图8A显示使用LGK974抑制Wnt的产生导致类器官死亡(右上图)。在LGK974存在下，外源施加Wnt3A条件培养基(右下图)或FZDag(左下图)挽救类器官的生长。左上方的照片显示用不含LGK974的DMSO作为对照处理的类器官。图8B表明，如使用CellTiter
Figure BDA0003489681800000131
Assay,Promega所定量的，通过施加Wnt3A条件培养基或FZDag(FP+P-L61 +3)可以挽救LGK974抑制Wnt产生而导致的类器官死亡。
图9A和9B描述编码以杵臼构象二聚化以形成泛FZDag 5019-KH-2539-2542(FP+P-L61+3)的肽的质粒的实例。图9A描述编码包含含有“杵”突变的Fc区、泛FZD抗体#5019的VH和VL、以及LRP抗体#2542的VL和LRP抗体#2539的VH的肽的质粒。图9B描述编码肽的质粒，其包含编码含有“臼”突变的Fc区、泛FZD抗体#5019的VH和VL、以及LRP抗体#2542的VH和LRP抗体#2539的VL的核酸。由这些质粒编码的肽形成具有四价结合结构域的异源二聚体，该四价结合结构域包含通过将泛特异性FZD抗体#5019的VH和VL配对产生的同源双体抗体和通过将来自一条肽的LRP6抗体#2539的VL和LRP抗体#2542的VH与另一条肽的LRP抗体#2539的VH和LRP抗体#2542的VL配对产生的双特异性异源双体抗体。
图9C是异源二聚体杵臼构象5019-K/H-2539:2542(FP+P-L61+3)的代表性示意图。使用Fc内的杵臼构象，可以将分子的模块性增加至4个不同的结合位点。对于这种分子(5019-K/H-2539:2542)，在Fc结构域的一侧工程化泛FZD同源双体抗体，在Fc结构域的另一侧工程化包含Wnt3(2539)和Wnt1(2542)LRP6结合位点的异源双体抗体。
图10A和10B是5019-杵-2539:2542多价结合分子的核酸序列的结构域的注释(SEQID NO:21加上另外的3'TGA及其互补序列)。
图11A-F描述结合FZD和LRP6 Wnt1和Wnt3结合位点(FLAg)作为Wnt-β连环蛋白通路的激活剂的四价结合分子的设计和验证。图11A描述抗FZD Fab抑制作用(上)和比活性(下)。图11B描述双体抗体-Fc形式中所示的LRP6Ab对Wnt1或Wnt3A信号传导的抑制。图11C描述四价FLAg的分子架构(architecture)。图11D显示通过连续稀释泛特异性FLAg蛋白(FP +P-L61+1,FP+P-L63+3和FP+P-L61+3)(x轴)在HEK293T细胞中激活LEF/TCF报告基因(y轴)的剂量反应曲线。图11E描述用指定浓度的泛FLAg(FP+P-L61+3)处理30分钟后RKO细胞中β-连环蛋白的水平。图11F描述用10nM泛FLAg(FP+P-L61+3)处理的RKO细胞中β-连环蛋白和磷酸化的散乱蛋白-2(p-Dvl2)蛋白水平的时间过程。
图12A-图12D描述FLAG FP+P-L61+3结合和活性的表征和分解。图12A和12B显示FP+P-L61+3与10个人FZD CRD中的9个和人LRP6 ECD的结合动力学。图12C表明FP+P-L61+3表现类似于常规IgG，并且以剂量和pH依赖性方式与FcRn相互作用。图12D表明FP+P-L61+3在与其他Fc效应子的相互作用的表现也类似于IgG，其他Fc效应子包括补体(C1q)、天然杀伤细胞标志物CD16a、B细胞标志物CD32a、以及单核细胞和巨噬细胞标志物CD64。
图13A和13B表明用30nM FP+P-L61+3处理三天引起中胚层标志物BRACHYURY的强烈诱导，并且多能性标志物OCT4的表达降低至与用GSK3抑制剂CHIR99021在6μM下的处理相当的水平。
图14显示用溶媒(vehicle)、C59或泛FLAg(FP+P-L61+3)+C59处理的LGR5-GFP小鼠的小肠切片的代表性荧光图像。LGR5-GFP在隐窝底部的干细胞中表达。细胞核用DAPI复染。
具体实施方式
本文描述的是包含Fc结构域、FZD结合结构域和Wnt共受体的结合结构域的多价结合分子，其中结合结构域连接至Fc结构域的相对的两端。本发明的多价结合分子是Wnt信号通路的激动剂，在本文中可替代地称为FZD激动剂或FZDag。Wnt配体通过促进FZD受体与共受体的聚集而起作用。不希望受理论的束缚，预期如本文所述的多特异性分子同时结合FZD受体和Wnt共受体，从而激活Wnt信号通路。
如本文所述的用于激活Wnt信号通路的多价结合分子的模块性和有效性与由单价FZD和LRP5/6结合配体组成的现有技术中描述的Wnt替代物相反，其中结合配体未连接至Fc结构域的相对的两端。在本发明的一个实施方案中，FZD结合结构域包含源自与一种以上的FZD受体特异性结合的抗体或多肽的结合部分，并且共受体结合结构域包含与例如LRP5/6、ROR1/2、RYK或PTK7等共受体结合的结合部分。在本发明的一个实施方案中，特异性结合一种以上的FZD受体的抗体或多肽结合一种以上的FZD受体的富含半胱氨酸的结构域(CRD)。
FZD受体的氨基酸序列和编码FZD受体的核苷酸序列，以及结合FZD或Wnt共受体LRP5/6、ROR1/2、RYK或PTK7的抗体和抗体文库是容易获得的或可以使用本领域众所周知的方法产生的(参见例如，美国公开号2015/0232554，发明人Gurney等人和美国公开号2016/0194394，发明人Sidhu等人和美国公开号20190040144，发明人Pan等人；美国公开号：2017/0166636，发明人Wu等人；美国公开号2016/0208018，发明人Chen等人；美国公开号2016/0053022，发明人Macheda等人；美国公开号2015/031293，发明人Damelin等人)。
产生与选择的靶标结合的肽或多肽的方法是本领域众所周知的，参见例如Sidhu等人Methods in Enzymology(2000)328:333-336。例如，可以根据本领域已知的方案获得结合FZD或Wnt共受体的亲和体文库(参见，例如，美国专利号5,831,012和Lofblom等人，FEBS Letters 584(2010)2670-2680)；可根据本领域已知的方案获得用于选择结合FZD或Wnt共受体的肽的锚蛋白重复蛋白文库(参见例如，WO 02/020565，发明人Stumpp等人)；还可根据本领域已知的方案获得用于选择结合FZD或Wnt共受体的肽的纤连蛋白重复蛋白文库(参见例如，美国专利号9,200,273，发明人Diem和Jacobs。结合FZD或Wnt共受体的肽也可以是fynomer、源自人Fyn SH3结构域的小结合蛋白或基于人载脂蛋白D的人工受体蛋白“anticalins”，并且可以使用本领域已知方法产生，参见例如，Silacci等人,J.Biol.Chem(2014)289(20):14392-8和Vogt和Skerra,ChemBioChem(2004)5,191-199)。
可以通过筛选组合文库中具有所需活性或多种活性的多肽来分离适合作为如本文所述的抗原结合肽的来源的抗体。例如，用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库中具有所需结合特性的抗体的多种方法是本领域已知的。此类方法例如在Hoogenboom等人于Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2001)中进行了综述，并且进一步描述于例如McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,HumanPress,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中。在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的库(repertoires)，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以按照Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述来筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常显示抗体片段，呈单链Fv(scFv)片段或Fab片段任一者。来自免疫源的文库无需构建杂交瘤即可提供针对免疫原的高亲和力抗体。可选地，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)中所述，在没有任何免疫的情况下克隆天然库(naive repertoire)(例如，从人)以提供针对广泛的非自身以及自身抗原的抗体的单一来源。最后，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述，还可以通过从干细胞克隆未重排的V基因片段，并使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排来合成天然文库。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373，和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936、和2009/0002360。从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
因此，本领域技术人员将容易地制备Fc结构域并混合和匹配在Fc结构域的N和C末端具有期望的特异性的多价FZD结合结构域和Wnt共受体结合结构域，以制备多价结合分子来结合所需的FZD受体和共受体，从而激活特定的Wnt通路。这些特异性激动剂将作为增强体内细胞增殖、分化、类器官存活和维持、以及组织再生的有力工具。这些特定的激动剂还用作分析这些过程中涉及的FZD特异性的有力工具。例如，如本文所示，FZD5Ag而非FZD4Ag挽救经LGK974处理的RNF43突变体PDAC细胞系的生长缺陷，突出了在该过程中FZD5相对于FZD4受体的重要性。
本发明的一个实施方案是影响肽与细胞上的FZD受体和Wnt共受体结合的方法，其中所述肽与FZD受体和共受体的结合激活细胞中的Wnt信号通路。该方法包括选择具有C末端和N末端的Fc结构域或其包含CH3结构域的片段，将结合FZD受体的第一多价结合结构域连接在Fc结构域的一末端上，以及将结合Wnt共受体的第二多价结合结构域连接在Fc结构域的另一末端上，从而形成多价结合分子，然后在激活Wnt信号通路的条件下使多价结合分子与表达所述FZD受体和共受体的细胞接触。
在本发明的一个实施方案中，多价结合结构域可以包含与一个以上的FZD受体结合的单链可变片段(ScFv)、FZD受体或共受体的配体、或其结合FZD受体或共受体的片段。在另一个实施方案中，结合结构域不包含与一个以上的FZD受体结合的单链可变片段(ScFv)、FZD受体或共受体的配体、或其结合FZD受体或共受体的片段。
在本发明的一个实施方案中，FZD或共受体多价结合结构域中的至少之一包含具有两条肽的双体抗体，每条肽具有与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，其中来自一条肽的VH和VL与另一条肽的VL和VH配对，从而使结合结构域具有两个表位结合位点。VH和VL结构域可以是与FZD受体或共受体上的Wnt结合位点结合的抗体的VH和VL。源自抗体、即源抗体、的VH或VL与源抗体的VH和VL可具有50％、55％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，并且仍然保留与由抗体结合的FZD受体或共受体位点的结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的多价结合分子包含表1的多价结合分子(表1包括表1A和1B：表1A显示本发明的示例性多价结合分子的核苷酸序列和氨基酸序列；表1B显示编码示例性多价结合分子的各个结构域的核苷酸序列)。在本发明的一个实施方案中，本发明的多价结合分子基本上由表1的多价结合分子组成。在本发明的一个实施方案中，本发明的多价结合分子由表1的多价结合分子组成。在本发明的一个实施方案中，多价结合分子包含含有SEQ ID NO:77的第一多肽和含有SEQ ID NO:79的第二肽。在本发明的一个实施方案中，多价结合分子包含含有SEQ ID NO:81的第一多肽、或含有83的第二肽。在本发明的一个实施方案中，多价结合分子基本上由含有SEQ ID NO:77的第一肽和含有SEQ ID NO:79的第二肽组成并结合至FZD2和LRP 5/6。在本发明的一个实施方案中，多价结合分子基本上由含有SEQ ID NO:81的第一肽和含有SEQ ID NO:83的第二肽组成并结合至FZD7和LRP 5/6。在本发明的一个实施方案中，多价结合分子由以下组成：由SEQ ID NO:77组成的第一多肽和由SEQ ID NO:79组成的第二多肽。在本发明的一个实施方案中，多价结合分子由以下组成：由SEQ ID NO:81组成的第一多肽和由SEQ ID NO:83组成的第二多肽。
在本发明的一个实施方案中，多价结合结构域包含表1的分子的一个以上的VL和VH结构域。在本发明的一个实施方案中，多价分子的多价结合结构域基本上由表1的分子的一个以上的VL和VH结构域组成。在本发明的一个实施方案中，多价分子的多价结合结构域由表1的分子的一个以上的VL和VH结构域组成。在本发明的一个实施方案中，如本文所述的多价分子的结合结构域包含与表1中所列分子的VH和VL具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性的VH和VL结构域，并保留与由表1所列分子结合的抗原的结合。在本发明的一个实施方案中，多价结合结构域包含结合FZD2的一个以上的SEQ ID NOS:77和79的VL和VH结构域。在本发明的一个实施方案中，多价结合结构域包含结合FZD7的一个以上的SEQ ID NOS:81和83的VL和VH结构域。
在本发明的一个实施方案中，多价分子的多价结合结构域基本上由结合FZD2的一个以上的SEQ ID NOS:77和79的VL和VH结构域组成。在本发明的一个实施方案中，多价分子的多价结合结构域基本上由结合FZD7的一个以上的SEQ ID NOS:81和83的VL和VH结构域组成。
在本发明的一个实施方案中，多价分子的多价结合结构域由结合FZD2的一个以上的SEQ ID NO:77和79的VL和VH结构域组成。在本发明的一个实施方案中，多价分子的多价结合结构域由结合FZD7的一个以上的SEQ ID NO:81和83的VL和VH结构域组成。
在本发明的一个实施方案中，如本文所述的多价分子的结合结构域包含与SEQ IDNOS:77和79的VH和VL结构域具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性的VH和VL结构域，并保持与FZD2的结合。在本发明的一个实施方案中，如本文所述的多价分子的结合结构域包含与SEQ ID NOS:81和83的VH和VL结构域具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性的VH和VL结构域，并保持与FZD7的结合。
在本发明的一个实施方案中，如本文所述的多价分子的结合结构域包含表1中列出的分子的一个以上的互补决定区(CDR)。在本发明的一个实施方案中，如本文所述的多价分子的结合结构域包含与表1所列分子的CDR具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性的CDR，并保持与由表1所示的分子结合的抗原的结合。在本发明的一个实施方案中，如本文所述的多价分子的结合结构域包含一个以上的SEQ ID NO:77、79、81或83的互补决定区(CDR)。在本发明的一个实施方案中，如本文所述的多价分子的结合结构域包含与SEQ ID NO:77或79的CDR具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性的CDR，并保持与FZD2的结合，或者包含与SEQ ID NO:81或83的CDR具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性的CDR，并保持与FZD7的结合。
由本发明的多价结合分子结合的FZD受体可以是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、或FZD10。FZD受体可以是FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7或FZD8。多价结合分子可以仅结合一个FZD受体，或者可以泛特异性结合超过一个FZD受体。FZD多价结合结构域可以结合例如FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7和FZD8。FZD多价结合结构域可以特异性结合一个FZD受体，例如FZD2、FZD4、FZD5、或FZD6。
在本发明的一个实施方案中，FZD结合结构域是单特异性的并且结合FZD受体上的单个表位。在本发明的一个实施方案中，FZD结合结构域是双特异性的并且结合FZD受体上的两个表位。
共受体结合结构域可以结合任何Wnt共受体，例如LRP5/6、或ROR1/2。多价共受体结合结构域可以结合例如LRP5/6、PTK7、ROR1/2、RYK、GPR12、TSPAN12或CD133。在本发明的一个实施方案中，共受体多价结合结构域结合LRP5或LRP6。
在本发明的一个实施方案中，共受体多价结合结构域与共受体上的单个表位结合，例如结合Wnt1或Wnt3的LRP5/6的表位。在本发明的一个实施方案中，共受体多价结合结构域结合共受体内的两个表位，例如，LRP5/6上的与Wnt1结合的表位和与Wnt3结合的表位。由本发明的多价结合分子结合的Wnt共受体可以是LRP5或LRP6、PTK7、ROR1、ROR2、RYK、GPR124、TSPAN12或CD133。
在本发明的一个实施方案中，多价结合分子包含Fc结构域，其中Fc结构域是免疫球蛋白的Fc结构域或其包含CH3结构域的片段。在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG。在本发明的一个实施方案中，IgG是IgG1。
本发明的一个实施方案是用于激活细胞中Wnt信号通路的方法，该方法包括使具有FZD受体和Wnt共受体的细胞以有效激活Wnt信号传导的量与本发明的多价结合分子接触。
在本发明的一个实施方案中，至少一个多价结合结构域包含结合FZD受体或共受体的scFv，或包含FZD受体或共受体的配体或所述配体的片段。在本发明的一个实施方案中，至少一个多价结合结构域不包含结合FZD受体或共受体的scFv，并且不包含FZD受体或共受体的配体或所述配体的片段。
在本发明的一个实施方案中，FZD多价结合结构域包含FZD双体抗体，并且共受体多价结合结构域包含共受体双体抗体，其中双体抗体包含两条多肽，每一条包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，其中通过将来自一条肽的VH和VL与另一条肽的VL和VH配对形成结合结构域，从而形成结合结构域。
FZD结合结构域的VH和VL可以源自结合FZD受体并拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt配体与FZD受体结合的抗体。FZD结合结构域的VH和VL可以源自结合FZD受体而不拮抗或抑制Wnt配体与FZD受体结合的抗体。
共受体结合结构域的VH和VL可以源自结合共受体并拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt配体与共受体结合的抗体。共受体结合结构域的VH和VL可以源自结合共受体而不拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt配体与共受体的结合的抗体。
在本发明的多价结合分子中，结合结构域的一者或两者可以是二价的，并且二价结合结构域的一者或两者可以对FZD受体或共受体为双特异性的。在本发明的一个实施方案中，两个结合结构域都是二价和双特异性的，每个结合结构域结合它们各自的靶标FZD受体或共受体上的两个不同表位。例如，结合分子可以包含对于FZD受体是二价和双特异性(结合两个不同的表位)的FZD结合结构域，或者结合分子可以包含对于共受体是二价和双特异性的共受体结合结构域。
在本发明的一个实施方案中，FZD结合结构域连接至多价结合分子的Fc结构域的N末端，共受体结合结构域连接至Fc结构域的C末端。在本发明的一个实施方案中，FZD结合结构域连接至多价结合分子的Fc结构域的C末端，共受体结合结构域连接至Fc结构域的N末端。
本发明的另一个实施方案是编码如本文所述的多价结合分子的核酸分子，所述多价结合分子例如，表1的多价结合分子，例如SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:78、或者SEQ IDNO:80和SEQ ID NO:82，它们的VH和VL结构域(例如，SEQ ID NO:84、85、86和87)，以及包含VL和VH结构域的双体抗体，包括表达盒和包含编码多价结合分子、它们的VH、和Fc结构域、以及包含此类VL和VH的双体抗体的核酸分子的载体。可以将核酸分子插入载体并在合适的宿主细胞中表达，然后使用本领域众所周知的方法从细胞中分离多价结合分子。如本发明中所使用的，术语“载体”是指可被工程化以包含核酸分子，例如编码如本文所述的多价结合分子的核酸序列的核酸递送运载体或质粒。当插入多核苷酸时可以表达蛋白的载体称为表达载体。可以通过转化、转导或转染将载体插入宿主细胞，从而可以在宿主细胞中表达携带的遗传物质。载体是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；粘粒(cosmid)；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或源自P1的人工染色体(PAC)；噬菌体，例如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒等。动物病毒可包括但不限于逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、水痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、以及乳多空病毒(例如SV40)。载体可包含控制如本文所述多价结合分子表达的多种组分，包括但不限于启动子例如病毒或真核启动子如CMV启动子、信号肽如TRYP2信号肽、转录起始因子、增强子、选择元件、和报告基因。此外，载体还可包含复制起始位点。
如本发明所用，术语“宿主细胞”是指可以导入载体的细胞，包括但不限于例如大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等原核细胞、例如酵母和曲霉菌等真菌细胞、例如S2果蝇细胞和Sf9等昆虫细胞，或动物细胞，包括人细胞，例如成纤维细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、或HEK293细胞。
本发明的一个实施方案是药物组合物，其包含如本文所述的FZD激动剂和药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以进一步包含激活Wnt通路的额外的试剂，例如，Norrin或R-Spondin。药物组合物可以由如本文所述的多价结合分子和药学上可接受的载体或赋形剂组成，或基本上由其组成。合适的载体及其制剂描述于Remington:The Science andPractice of Pharmacy(第19版)ed.A.R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,Pa.1995。通常，在制剂中使用适量的药学上可接受的盐以使制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和右旋糖溶液。溶液的pH优选为约5至约8，并且更优选为约7至约7.5。其他载体包括持续释放制剂，例如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为定型制品的形式，例如膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员显而易见的是，某些载体可以是更优选的，这取决于例如施用途径和所施用的FZD激动剂的浓度。
Wnt信号传导是调节细胞和组织分化的普遍存在的通路。例如，关于眼发育，已识别特定的Wnt通路，即Norrin-FZD4通路，在视网膜血管生成中起作用。通过Norrin-FZD4通路的信号传导对于视网膜血管系统的发育和维持是必要的。影响该通路基因的突变可导致几种小儿玻璃体视网膜病变，例如Norrie病、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、以及假神经胶质瘤和骨质疏松症综合征。此外，早产儿视网膜病变(ROP)与该通路的突变有关，在Coats病和持续性胎儿脉管系统(PFV)中已报道Wnt通路突变。Norrin-FZD通路也与CNS血管发育有关。Norrin、FZD4、Lrp5和共受体四跨膜蛋白12(Tetraspanin-12,Tspan-12)的遗传消融导致视网膜和小脑血管的血管生成缺陷和屏障破坏(Cho等人(2017)Neuron 95,1056-1073；Zhou等人,(2014)J Clin Invest 124:3825–3846)。本文特别考虑本发明的FZD4激动剂，特别是在Fc受体的一端上包含FZD4结合结构域并且在Fc结构域的另一侧上包含LRP5和/或LRP6的结合结构域的FZD4 FLAg，其增强屏障功能并促进血管生成，例如，用FZD4 FLAg治疗会促进视网膜血管系统和/或血液视网膜屏障(BRB)和血脑屏障(BBB)的发育和维持。因此，本发明的一个方面是一种通过局部或全身施用有效量的FZD4 FLAg治疗眼组织例如视网膜组织来促进和/或维持视网膜脉管系统的方法。本发明的另一方面是通过在全身施用后用有效量的FZD4 FLAg治疗BBB来促进和/或维持BBB脉管系统的方法。本发明的另一方面是通过向受试者施用有效量的FZD4 FLAg来治疗患有以视网膜或脑血管生成减少为特征的病症的受试者的方法，其中所述有效量是在受试者中足以增加视网膜或脑血管生成的量。受试者可以是胎儿。
Wnt信号传导的病理学低水平与骨质疏松症、多囊肾病和神经退行性疾病有关。已经显示Wnt通路的受控激活可以促进再生过程，例如组织修复和伤口愈合。Zhao J,Kim KA,和Abo A,Trends Biotechnol.27(3):131-6(2009年3月)。也可以参见,Logan CY和NusseR,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.20:781-810(2004)；Nusse R.,Cell Res.15(1):28-32(2005年1月)；Clevers H,Cell 127(3):469-80(2006年11月3日)。已经进行概念验证实验，以显示Wnt信号传导在骨质疏松症或粘膜炎中的作用。此外，已经提出增加Wnt信号传导可对糖尿病和其他代谢疾病的治疗有益。Wnt信号传导的减少与代谢性疾病有关。功能丧失的LRP6R611C突变导致人类早期冠状动脉疾病、代谢综合征和骨质疏松症。Main A等人,Science315:1278(2007)."LRP5 loss-of-function mutation is associated withosteoporosis,impaired glucose metabolism and hypercholesterolaemia in human."Saarinnen等人,Clin Endocrinol 72:481(2010)。在缺乏LRP5和apoE二者的小鼠中，存在严重的高胆固醇血症、脂肪耐受性受损和晚期动脉粥样硬化。Magoori K.等人,JBC 1 1331(2003).LRP5is essential for normal cholesterol metabolism and glucose-inducedinsulin secretion in mice.Fujino等人,PNAS 100:229(2003).TCF7L2 variantconfers risk of type 2diabetes.Grant等人,Nat Genet 38:320(2006)；Florez等人,NEngl J Med 355:241(2006)。Wnt信号传导的增加对于治疗代谢性疾病是有益的。因此，向患有代谢疾病的受试者施用本发明的多价结合分子可用于治疗受试者的代谢疾病。
炎症性肠病(IBP)是结肠和小肠的一组炎性病况。IBD的主要类型是克罗恩氏病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎。RSP01蛋白已显示改善动物模型中的炎症性肠病。Zhao J等人,Gastroenterology 132:1331(2007)。因此，向患有IBD的受试者施用本发明的多价结合分子，例如结合FZD7的多价结合分子，如12735-K/H-2539-2542，对于治疗受试者的IBD是有用的。
因此，本发明的一个实施方案是一种用于治疗患有与减少的Wnt信号传导有关的病况的受试者的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明的FZD激动剂。病况可以是例如骨质疏松症、多囊肾病、神经退行性疾病、粘膜炎、短肠综合征、胃肠道粘膜中的细菌易位、肠毒素或肠病性传染性腹泻、乳糜泻、非热带性口炎性腹泻、乳糖不耐症和其中饮食暴露引起粘膜绒毛钝化和吸收不良的其他病症、萎缩性胃炎和糖尿病、骨折、例如组织修复和伤口愈合等组织再生以及例如糖尿病等代谢性疾病、和黑色素瘤，可以使用本发明的方法治疗的受损组织的实例包括但不限于肠组织、心脏组织、肝组织、肾脏组织、骨骼肌、脑组织、骨骼组织、结缔组织和皮肤组织。本发明的多价结合分子可以施用于患有以低Wnt信号传导为特征的疾病或病况的受试者。将本发明的多价结合分子以有效增加Wnt信号传导和改善受试者疾病或病况的量施用于受试者。
粘膜炎是癌症治疗的临床并发症。粘膜炎是由放射或化学疗法对快速增殖细胞的细胞毒性作用引起的。粘膜炎由主要影响肠和口腔粘膜的上皮损害组成。临床症状是口腔严重疼痛、恶心、腹泻、营养不良，严重时还会导致败血症和死亡。这些症状通常会导致癌症治疗的剂量限制。目前没有针对实体瘤的化学疗法或放射疗法相关的口服或胃肠道-粘膜炎治疗。
口腔粘膜炎是癌症治疗的常见且常常使人衰弱的并发症。接受对头颈癌的放射疗法的患者中有50％且接受5-FU治疗的患者中有10-15％患有3-4级口腔粘膜炎。RSP01已显示改善动物模型中的口腔粘膜炎。Zhao J等人,PNAS 106:2331(2010)。
短肠综合征(SBS)是由于小肠大段的功能或解剖学丧失所致，因此消化和吸收能力受到严重损害。每年，许多人因各种病症，包括创伤、炎症性肠病、恶性肿瘤、肠系膜缺血等，接受小肠的长段切除。各种非手术程序如放射线会导致功能性短肠综合征。目前，短肠综合征的疗法包括饮食方法、全肠外营养(TPN)、肠移植、和非移植腹部手术。尽管这些治疗有助于改善SBS患者的预后，但它们只能部分纠正肠功能降低的潜在问题。当前没有疗法可以加速SBS患者剩余小肠的恢复。参见Seetharam和Rodrigues，The Saudi Journal ofGastroenterology 17,229-235(2011)。
成年哺乳动物的肠道构成最快速的自我更新组织之一，其中肠粘膜包括折叠成增生性隐窝和分化绒毛的连续结构。响应于粘膜破坏，宿主启动愈合反应，导致粘膜完整性恢复和粘膜结构再生。这个过程在很大程度上取决于肠干细胞的增殖。Neal等人,Journal ofSurgical Research 167,1-8(2010)；van der Flier和Clevers,Annual Review ofPhysiology 71,241-261(2009)。
因此，调节肠干细胞活性的因子在宿主对肠道内损伤的反应能力中起主要作用。由于Wnt蛋白是支持肠干细胞增殖的最重要的生长因子，因此增强Wnt信号传导将增加肠上皮细胞的增殖。这将导致小肠绒毛数目增加和粘膜吸收表面积增加。
因此，在一个实施方案中，将本发明的多价结合分子施用于患有短肠综合征的人。在本发明的一个实施方案中，本发明的多价结合分子结合FZD7，例如如本文所述的12735-K/H-2539-2542。以足以增加胃肠粘膜吸收表面积的量施用多价结合分子。当患有突发性短肠综合征的人适应肠内喂食时、或当患有流行SBS的人从肠内喂食中吸收营养时、或当人减少维持其体重日常所需的总肠外营养的量时，本发明的多价结合分子的施用获得成功的预后。
预防细菌易位。在一个实施方案中，将本发明的抗体施用于处于肠道细菌引起败血病风险的人。以足以增加胃肠粘膜完整性的量施用多价结合分子，从而防止肠道细菌进入人的血液。胃肠道粘膜完整性下降(与正常人群的胃肠粘膜完整性相比)是重症患者血液感染和败血症的主要原因。当在重症监护病房(ICU)患者中观察到的菌血症和败血症病例少于未施用本发明的多价结合分子的患者时，施用多价结合分子具有成功的预后。
在肠毒素或肠病感染性腹泻期间或之后加速恢复。感染性腹泻是一个主要的儿科问题。在一个实施方案中，以足以缩短至腹泻结束或至正常排便的时间的量施用本发明的多价结合分子。除了包括口服或肠胃外补液，有时还包括抗生素的护理标准以外，还可以施用本发明的多价结合分子。当在小儿患者中观察到与未施用本发明的多价结合分子的儿科患者相比，在减少住院次数、缩短住院时间或降低脱水并发症和电解质异常的发生率时，多价结合分子的施用具有成功的预后。
乳糜泻、非热带性口炎性腹泻、乳糖不耐症和其中饮食暴露引起粘膜绒毛变钝和吸收不良的其他病况。在一个实施方案中，以足以增加粘膜吸收表面积的量施用本发明的多价结合分子。本发明的多价结合分子可以在标准护理之外施用，该标准护理主要是避免令人讨厌的食物，有时避免膳食补充剂。当患有乳糜泻、非热带性口炎性腹泻、乳糖不耐症或其他病况的人适应肠内喂食，或患有任何病况的人从肠内喂食中吸收营养时，或当人减少其维持体重日常所需的总肠外营养的量时，本发明的多价结合分子的施用将获得成功的预后。
萎缩性胃炎，特别是称为环境型化生性萎缩性胃炎的形式。萎缩性胃炎是老年人的常见病，目前通过维生素B12注射治疗。患者患类癌肿瘤和腺癌的风险增加。医学专家观察到，在类癌的情况下，通过降低由化生性G细胞的胃泌素产生，降低肿瘤的发生率时，多价结合分子的施用具有成功的预后。如果医学专家确定肿瘤是否被Wnt通路的增加激活，则不应将多价结合分子施用于受试者。
本发明的FZD激动剂可以例如通过注射(例如皮下、静脉内、腹膜内等)、局部、或口服施用。取决于施用途径，可以将活性化合物包被在材料中以保护化合物免受酸和可使化合物失活的其他自然条件的作用。如本文所述的多价结合分子可以溶解或悬浮在药学上可接受的载体，优选为水性载体中。此外，组合物可以包含赋形剂，例如缓冲剂、粘合剂、推进剂(blasting agent)、稀释剂、调味剂、润滑剂等。可以在这种组合物中使用的赋形剂的宽泛列表可以例如来自于A.Kibbe,Handbook of Pharmaceutical Excipients(Kibbe,2000)。多价结合分子也可以与免疫刺激物质如细胞因子一起施用。
本发明的一个实施方案包括产生诱导性多能干(iPS)细胞的方法，该方法包括在适合于重编程体细胞的条件下培养体细胞，其中所述培养条件还包含如本文所述的多价结合分子。用于产生多能干细胞的方法在本领域是众所周知的，参见例如Takahashi和Yamanaka,(2006),Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic andAdult Fibroblast Cultures by Defined Factors,Cell 126,663–676；Takahashi等人(2007)Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts byDefined Factors Cell 131,861–872；Yu等人(2007).Induced pluripotent stem celllines derived from human somatic cells.Science 318,1917-1920；美国专利号8,546,140,和；美国专利号8,268,620。在本发明的一个实施方案中，本发明的多价结合分子以足以加速iPS细胞生成的量包含在培养基中。
本发明的一个实施方案包括用于多能或多潜能干细胞(PSC)或诱导性多能干细胞(iPS)的定向分化的方法，包括在适于定向分化的条件下培养细胞，其中所述培养条件还包含有效量的如本文所述的多价结合分子。小鼠和人PSC的研究已经确定了添加包括Wnt在内的生长因子的特定方法，这些生长因子可以诱导PSC分化为不同的谱系。包括Wnt信号传导的激活的用于PSC的定向分化的方法是本领域已知的，参见例如，Lam等人(2014)SeminNephol 34(4)；445-461；Yucer等人(2017年9月6日)Scientific Reports 7，文章编号10741。可以预期的是，如本文所述的多价结合分子可用于影响Wnt信号通路的激活，以定向PSC的分化。
本发明的一个实施方案是通过向有需要的受试者施用有效量的如本文所述的多价结合肽来激活该受试者中的Wnt信号传导，增强有需要的受试者中组织再生的方法。
本发明的一个实施方案包括通过施用有效量的如本文所述的多价结合分子来增强有需要的受试者例如患有骨质疏松症或骨折的受试者的骨愈合和/或再生的方法。在一个具体的实施方案中，本发明的多价结合分子包含与FZD2结合的结合结构域和与LRP5或/和LRP6结合的结合结构域。结合结构域可以是单价或多价的，例如二价、三价或四价，并且是单特异性或多特异性的，例如双特异性。在本发明的一个实施方案中，用于增强有需要的受试者的骨愈合和/或再生的多价结合分子包含例如2890-knob-2539-2542(SEQ ID NO:77)和2890-hole-2539-2542(SEQ ID NO:79)(一起形成2890-K/H-2539:2542或2890Ag)。
受试者可以是任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、马、牛、狗、猫、啮齿类动物等。通常，受试者是人。
可以凭经验确定施用如本文所述的多价结合分子的有效剂量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。本领域技术人员将理解，必须施用的此类FZD激动剂的剂量将取决于例如将接受抗体的受试者、施用途径、所使用的FZD激动剂的特定类型和其他正在施用的药物而变化。在有关抗体的治疗用途的文献中找到选择合适剂量的FZD激动剂的指南，例如，Handbook of Monoclonal Antibodies,Ferrone,eds.,Noges Publications,Park Ridge,N.J.,(1985)ch.22and pp.303-357；Smith,Antibodies in Human Diagnosisand Therapy,Haber,eds.,Raven Press,New York(1977)pp.365-389。施用组合物的剂量范围是那些足够大以产生所需效果的剂量范围。剂量不应太大而引起不利的副作用，例如不良的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随着患者的年龄、状况、性别和炎症程度而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在有任何禁忌症的情况下，剂量可由个体医师调整。剂量可以变化，并且可以每天一次或多次剂量施用，持续一天或几天。尽管个体需求变化，但是确定载体有效量的最佳范围在本领域技术范围内。
近年来，已经开发出用于培养称为“类器官”的微型器官的方法，该方法概括了不同组织的大体解剖学和细胞类型组成。值得注意的是，可以从单个组织干细胞中产生完整的类器官，如首次从小鼠中分离出的肠LGR5+干细胞所证明的那样。已知激活Wnt-β连环蛋白通路的培养基中的成分是类器官衍生、生长、存活和维持所需的。因此，作为条件培养基而纯化或提供的R-spondin和Wnt配体对于来自不同组织中的类器官的生长是普遍需要的。然而，纯化的Wnt蛋白通常具有低的比活性，并且不能维持类器官的生长。因此，本领域技术人员依赖于Wnt3A条件培养基的添加、或依赖于例如GSK3抑制剂等小分子的添加来产生类器官。但是Wnt3A条件培养基的制造是劳动密集型的，条件培养基的特性是不一致的，并且小分子GSK3抑制剂可以强烈地激活通路至有毒水平。如本文所述的多价结合分子解决了这些问题，因为它们易于制造和纯化，具有一致的可再现特性，并且通过选择性地结合所需的FZD受体和共受体的组合而特异性激活Wnt。
本发明的一个实施方案包括产生组织类器官的方法，该方法包括以有效量的如本文所述的多价结合分子培养组织。类器官是模仿其相应的体内器官的3D多细胞体外组织构建体，因此可用于在组织培养皿中研究该器官的各个方面。产生类器官的方法是本领域众所周知的，并且例如源自胃肠道各器官中成年干细胞的上皮类器官几乎所有都需要既可以维持细胞、又可以产生细胞类型的体内样补体的Wnt信号传导激动剂(其他信号传导因子中，包括嵌入基质胶)。Wnt信号传导也增强3D培养中的内耳类器官的发育，并且已经用于肾脏类器官的产生，参见例如Natalie de Souza(2018)Nature Methods 15(1):23；DeJonge等(2016)PLosOne 11(9),e0162508；Akkerman和Defize,(2017)Bioessays 39,4,1600244。本发明的多价结合分子可以以足以增强其在培养中的生长、存活和维持的量包含在类器官的培养基中。这样，本发明的实施方案包括用于增强组织类器官的培养的方法，所述组织类器官包含含有有效量的如本文所述的多价结合分子的培养基。
本发明的另一个方面是如本文所述的多价结合分子的制备方法。在本发明的一个实施方案中，多价结合分子通过以下方式产生：
a)选择具有C末端和N末端的Fc结构域
b)识别与一个以上的FZD受体结合的肽，或识别与一个以上的FZD受体结合的抗体，和
c)识别与一个以上的Wnt共受体结合的肽或识别与一个以上的Wnt共受体结合的抗体，
d)产生包含以下的核酸分子：编码(i)步骤a的Fc结构域的核苷酸序列、(ii)编码结合一个以上的FZD受体的步骤b的肽的核苷酸序列、或编码结合一个以上的FZD受体的步骤b的抗体的VL和/或VH的核苷酸序列、或编码结合一个以上的FZD受体的源自步骤b的抗体的VL和/或VH的核苷酸序列、和(iii)编码结合一个以上的Wnt共受体的步骤c的肽的核苷酸序列、或编码结合一个以上的Wnt共受体的步骤c的抗体的VL和/或VH的核苷酸序列、或编码结合一个以上的Wnt共受体的源自步骤c的抗体的VL和/或VH的核苷酸序列。
e)表达(d)的核酸分子以产生多肽，其中所述多肽二聚化形成四价结合分子，所述四价结合分子包含(i)Fc结构域、(ii)FZD结合结构域和(iii)Wnt共受体结合结构域，其中，使得FZD结合结构域包含步骤b的肽、或步骤b的VL和/或VH，并连接至Fc结构域的一末端，Wnt共受体结合结构域包含步骤c的肽或步骤c的VL和/或VH，并连接至Fc结构域的另一末端，从而形成多特异性结合分子。
与一个以上的FZD受体结合的肽可以是合成的多肽，例如合成肽、亲和体、锚蛋白重复蛋白、纤连蛋白重复蛋白、fynomer、或anticalin或结合FZD受体的天然存在蛋白的肽。天然存在蛋白可以是例如Wnt，例如Wnt-1、Wnt-2、Wnt-2b、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7a/b、Wnt-7b、Wnt-8a、Wnt-8b、Wnt-9a、Wnt-9b、Wnt-10a、Wnt-10b、Wnt-11、Wnt-16b。步骤b的肽可以是多价的，与FZD上的超过一个位点结合，例如二价、三价或四价的，并且可以是与FZD上的单个表位结合的单特异性的、或与FZD上的超过一个表位结合的多特异性的。
与一个以上的Wnt共受体结合的肽可以是合成肽，例如亲和体、锚蛋白重复蛋白、纤连蛋白重复蛋白，fynomer、或anticalin、或结合Wnt共受体的天然存在蛋白的肽。天然存在蛋白可以是例如Wnt，例如Wnt-1、Wnt-2、Wnt-2b、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7a/b、Wnt-7b、Wnt-8a、Wnt-8b、Wnt-9a、Wnt-9b、Wnt-10a、Wnt-10b、Wnt-11或Wnt-16b、或Dickkopf-1。
步骤c的肽可以是多价的，与Wnt共受体上的超过一个表位结合，例如二价、三价或四价的，并且可以是与Wnt共受体上的单个表位结合的单特异性的、或与Wnt共受体上的超过一个表位结合的多特异性的。
结合FZD受体的天然存在蛋白和结合Wnt共受体的天然存在蛋白可以是相同的蛋白。
在一个实施方案中，步骤b的肽或抗体可以与FZD2结合，并且步骤c的肽可以是Wnt5a的肽，步骤c的抗体可以是结合与Wnt5a结合的共受体上的位点的抗体。
在一个实施方案中，步骤b的肽或抗体可以与FZD4结合，并且步骤c的肽可以是Norrin、Wnt1、Wnt8或Wnt5a中的一种以上的肽，并且步骤c的抗体可以是结合与Norrin、Wnt1、Wnt8、或Wnt5a结合的共受体上的位点的抗体。
在一个实施方案中，步骤b的肽或抗体可以与FZD5结合，并且步骤c的肽可以是Wnt7a、Wnt5a、Wnt10b、或Wnt2中的一种以上的肽，并且步骤c的抗体可以是结合共受体上位点的抗体，所述位点与Wnt7a、Wnt5a、Wnt10b、或Wnt2中的一种以上结合。
在一个实施方案中，步骤c的肽或抗体结合LRP6和/或LRP5，例如，所述肽可以是Norrin、Wnt1和/或Wnt3a的肽，并且步骤c的抗体可以是与LRP6/LRP5上的位点结合的抗体，所述位点与Norrin、Wnt1和/或Wnt3a结合。
在一个实施方案中，步骤c的肽或抗体可以与LRP6结合，例如，肽可以是Wnt1或Wnt3a或两者的肽，并且抗体可以是结合与Wnt1或Wnt3a结合的LRP6上的位点的抗体。
在一个实施方案中，步骤c的肽或抗体结合ROR1和/或ROR2。
在一个实施方案中，步骤c的肽或抗体可以结合RYK。
在一个实施方案中，步骤c的肽或抗体可以结合PTK7。
在一个实施方案中，步骤(b)中的肽或抗体可以是与一个以上的FZD受体结合并拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt与受体结合的肽或抗体。在一个实施方案中，步骤(b)中的肽或抗体可以是与一个以上的FZD受体结合而不拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt与受体结合的肽或抗体。在一个实施方案中，步骤(c)中的肽或抗体可以是与一个以上的Wnt共受体结合并拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt与共受体结合的肽或抗体。在一个实施方案中，步骤(c)的肽或抗体可以是与Wnt共受体结合而没有拮抗Wnt信号传导或抑制Wnt与共受体结合的肽或抗体。结合结构域可以通过接头连接至Fc结构域。本发明的模块化方面允许在Fc结构域的相对末端上混合并匹配与任何给定的FZD受体和Wnt共受体结合的肽或抗体VH和VL，以产生多价结合分子，所述多价结合分子可结合多个卷曲蛋白受体–共受体复合物，或选择性地结合单个卷曲蛋白受体–共受体复合物以激活Wnt信号传导。
本发明的一个实施方案是激活Wnt信号通路的多价结合分子的制备方法，其包括：
a)选择具有C末端和N末端的Fc结构域，例如包含CH3结构域的免疫球蛋白的Fc结构域，例如IgG，例如IgG1，
b)识别对一个以上的FZD受体具有结合特异性的抗体和
c)识别对Wnt共受体具有结合特异性的抗体；
d)产生核酸分子，其包含
(i)编码所选择的Fc结构域的核苷酸序列，
(ii)编码源自步骤b的抗体的VL和/或VH的核苷酸序列，和
(iii)编码源自步骤c的抗体的VL和/或VH的核苷酸序列，
d)表达(d)的核酸分子，以产生通过Fc结构域二聚化形成多价结合分子的多肽，该多价结合分子包含(i)Fc结构域，(ii)FZD结合结构域和(iii)Wnt共受体结合结构域，使得FZD结合结构域与Fc结构域的一末端连接，而Wnt共受体结合结构域与Fc结构域的另一末端连接，从而形成多价结合分子。在一个优选的实施方案中，多价结合分子是由核酸分子编码的两条多肽的二聚体，其中Fc结构域处于杵臼构象中。结合结构域中的一者或两者可以是多价结合结构域。步骤b的抗体可以是结合FZD受体的抗体片段。步骤d)(ii)中的VH和/或VL可以与步骤b)抗体的VH和/或VL相同。步骤c的抗体可以是结合Wnt共受体的抗体片段。步骤d)(iii)中的VH和/或VL可以与步骤c)的抗体的VH和/或VL相同。
本发明的多价分子可以通过将两条多肽以“杵臼”构象二聚而产生。通过促进包含结合部分的肽的缔合，杵臼构象增加了本发明的模块性，所述结合部分结合FZD受体或共受体或相同的FZD受体或共受体家族的不同成员上的不同表位，参见例如图3A。通过杵臼设计用于Fc分子工程化的方法在本领域中是众所周知的，参见，例如，WO2018/026942，发明人Van Dyk等人，Carter P.(2001)J.Immunol.Methods 248,7–15；Ridgway等人(1996)Protein Eng.9,617–621；Merchant A.M.,等人(1998)Nat.Biotechnol.16,677–681和；等人,(1997)J.Mol.Biol.270,26–35。
本发明的另一个实施方案是一种用于促进细胞上的FZD受体和共受体的相互作用从而激活细胞中的Wnt信号通路的方法，其包括：a)选择具有C末端和N末端的Fc结构域或其包含CH3结构域的片段，b)在Fc结构域的一末端上连接结合FZD受体的第一多价结合结构域，并连接在Fc结构域的另一末端上结合Wnt共受体的第二结合结构域，从而形成结合分子；c)其中在FZD受体和共受体均结合至多价结合分子的条件下，使所述多价结合分子与表达所述FZD受体和Wnt共受体的细胞接触，从而激活Wnt信号通路。结合结构域中的一者或两者可以是单价或多价的，例如二价、三价、或四价的。FZD结合结构域可包含结合FZD的天然存在蛋白的肽，结合FZD的合成肽，例如亲和体、锚蛋白重复蛋白、纤连蛋白重复蛋白、fynomer、或anticalin，结合FZD的VH和/或VL片段，结合FZD的scFV，或结合FZD的双体抗体。Wnt共受体结合结构域可包含与Wnt共受体结合的天然存在蛋白的肽，与Wnt共受体结合的合成肽，例如亲和体、锚蛋白重复蛋白、纤连蛋白重复蛋白、fynomer、或anticalin，与Wnt共受体结合的VH和/或VL片段，与Wnt共受体结合的scFV，或与Wnt共受体结合的双体抗体。
本发明的一个实施方案是包含Fc结构域和两个结合结构域的分子，第一结构域结合FZD受体，第二结构域结合Wnt共受体，并且这两个部分通过Fc结构域或其包含CH3结构域的片段连接在一起，其中一个结构域连接至Fc受体的N末端，并且另一个结构域连接至Fc受体的C末端。结合结构域可以直接或通过例如多肽接头等肽接头或非肽接头连接至Fc受体。合适的接头是本领域众所周知的，例如XTEN接头(参见WO2013120683，发明人Schellenberger等人)。
本发明的一个实施方案是用于激活Wnt信号通路的方法，该方法包括使表达FZD受体及其共受体的细胞与有效量的本发明的多价分子接触。不希望受理论的束缚，预期如本文所述的多价分子结合FZD受体及其共受体两者，从而形成模拟Wnt分子与FZD受体和共受体结合的复合物，依次激活Wnt信号通路。
本发明的多价结合分子可以重组制备，例如通过Gibson组装(参见Gibson等人(2009)..Nature Methods.6(5):343–345和Gibson DG.(2011).Methods inEnzymology.498:349–361)，或者可以例如使用商业合成设备，例如Applied Biosystems,Inc.、Beckman等的自动合成器合成制备这些分子。通过使用合成器，天然存在的氨基酸可以被非天然氨基酸取代。特定的顺序和制备方式将由便利性、经济性、所需的纯度等确定。如果需要，可以在合成期间或表达期间将各种基团引入肽中，允许与其他分子或表面连接。
在一些实施方案中，结合结构域通过例如XTEN接头等肽接头连接至Fc结构域。在一些实施方案中，肽接头包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或至少100个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度在5至75、5至50、5至25、5至20、5至15、或5至10个氨基酸之间。具有或不具有接头的Fc结构域的长度和柔韧性允许多价结合分子结合FZD受体及其共受体，从而激活Wnt信号通路。在本发明的一个实施方案中，具有或不具有接头的Fc结构域或其包含CH3结构域的片段大于100个氨基酸、大于125个氨基酸、大于150个氨基酸、大于175个氨基酸或大于200个氨基酸。
必须注意，如本文和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指出，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，提及“肽”包括提及一个以上的肽及其等同物，例如本领域技术人员已知的多肽等。
“亲和力成熟的”抗体或“抗体的成熟度”是指在一个以上的高变区(HVR)中具有一个以上的改变的抗体，与不具有这种改变的亲本或源抗体相比，这种改变导致抗体对抗原的亲和力或对分子的其他所需特性的改善。
“包含”是指在组合物/方法/试剂盒中要求所列举的要素，但是在权利要求的范围内，可以包括其他要素以形成组合物/方法/试剂盒等。例如，如本领域中将容易理解的，除任何负面条件所涵盖的元素之外，包含多价结合分子的组合物是除多价结合分子外还可以包含其他元素的组合物，例如与多价结合分子结合例如共价结合的诸如多肽、小分子或核酸等的功能部分；促进多价结合分子组合物的稳定性的试剂，促进多价结合分子组合物的溶解性的试剂，佐剂等。
“基本上由...组成”是指将所描述的组合物或方法的范围限制为不会实质性地影响本发明的基本和新颖的(一个以上)特征的指定材料或步骤。例如，“基本上由”所公开的序列“组成”的多价结合分子在基于该序列所源自的序列的该序列的边界处具有所公开的序列加上或减去约5个氨基酸残基的氨基酸序列，例如少于所列举的结合氨基酸残基约5个残基、4个残基、3个残基、2个残基或约1个残基，或多于所列举的结合氨基酸残基约1个残基、2个残基、3个残基、4个残基或5个残基。
“由...组成”是指从组合物、方法或试剂盒中排除未在权利要求中指定的任何要素、步骤或成分。例如，“由”所公开的序列“组成”的多价结合分子仅由所公开的氨基酸序列组成。
在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文另外明确指出，否则也具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一。在规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且其中在较小范围内包含上下限中任一个、不包含上下限或包含上下限两者的每个范围也包含在本发明内，受规定范围内任何具体排除的限制。在所述范围包括上下限的一个或两个的情况下，排除那些所包括的上下限中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
已知基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分限定恒定区，主要负责效应子功能。通常，从人获得的抗体分子与IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任何一种有关，它们之间不同之处在于分子中存在的重链性质。某些类别也具有子类别，例如IgG1、IgG2等。此外，在人类中，轻链可以是κ链或λ链。
被称为互补决定区(CDR)的重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL各自内的三个高度发散的片段插入被称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼片段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白的CDR之间和与CDR相邻的氨基酸序列。VH结构域通常具有四个FR，在本文中称为VH框架区1(FR1)、VH框架区2(FR2)、VH框架区3(FR3)、和VH框架区4(FR4)。类似地，VL结构域通常具有四个FR，在本文中称为VL框架区1(FR1)、VL框架区2(FR2)、VL框架区3(FR3)、和VL框架区4(FR4)。在抗体分子中，VL结构域的三个CDR(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)和VH结构域的三个CDR(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)在三维空间中相对于彼此交错，从而在抗体可变区内形成抗原结合位点。抗原结合位点的表面与结合的抗原的三维表面互补。根据Kabat编号系统(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)或国际免疫遗传信息系统(IMGT编号系统；Lefranc等人,2003,Development andComparative Immunology 27:55-77)，可以编号VL和VH结构域的氨基酸序列，并识别/定义其中的CDR和FR。根据常规使用的编号系统，例如IMGT编号系统、Kabat编号系统等，本领域普通技术人员将具有对VL结构域和VH结构域的氨基酸残基进行编号并鉴定其中的CDR和FR的知识。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“抗体片段”)是指保留与抗原特异性结合的能力的抗体的一个以上的片段、部分或结构域。已经显示全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。抗体的术语“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL1和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，是包含在铰链区通过二硫键连接的两个F(ab)'片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989)Nature 241:544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由各自的基因编码，但可以使用重组方法通过合成的接头使它们连接成为一条连续的链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也意图包含在抗体的术语“抗原结合部分”内。也包含其他形式的单链抗体，例如双体抗体(参见例如，Holliger等人(1993)PNAS.USA 90:6444-6448)。
“亲和体”是经工程化以高亲和力模仿单克隆抗体与大量靶蛋白或肽结合的小的单结构域蛋白。它们由三螺旋束组成，该螺旋束基于葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域之一的支架。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个被随机化以生成具有大量配体变体的亲和体库。参见，例如，美国专利号5,831,012和Lofblom等人FEBS Letters 584(2010)2670-2680。亲和体分子模拟抗体的分子量为约6kDa。
如本文所用，“双体抗体”是二聚抗体片段。在双体抗体的每条多肽中，重链可变结构域(VH)与轻链可变结构域(VL)连接，但与单链Fv片段不同，VL和VH之间的接头对于分子内配对而言太短，因此，每个抗原结合位点通过一条多肽的VH和VL与另一条多肽的VH和VL配对而形成，参见例如图3A。双体抗体因此具有两个抗原结合位点，并且可以是单特异性的或双特异性的。(参见例如，Holliger,P.,等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.,等人(1994)Structure 2:1121-1123；Kontermann和Dubel eds.,Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.790pp.(ISBN 3-540-41354-5)。
如本文所用，例如多价结合分子或包含该分子的药物组合物等试剂的“有效量”，是指在所需剂量和时间段有效达到期望结果的量。在一些实施方案中，治疗有效量是减少疾病、病症、和/或病况的一种以上的症状的发生率和/或严重性，稳定疾病、病症、和/或病况的一种以上的症状的一种以上的特征，和/或延迟疾病、病症、和/或病况的一种以上的症状发作的量。
如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或其片段、或T细胞受体的任何蛋白决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。当解离常数≤10μM，例如，≤100nM，优选≤10nM，更优选≤1nM时，则认为抗体与抗原特异性结合。
免疫球蛋白分子的恒定区也称为片段可结晶区、“Fc区”或“Fc结构域”。Fc结构域由两个相同的蛋白片段组成，分别来自抗体两条重链的第二和第三恒定结构域，IgG的Fc结构域具有高度保守的N-糖基化位点。Fc片段的糖基化对于Fc受体介导的活性是必要的。在本发明的一个实施方案中，对多价分子的Fc结构域进行工程化，使得其不靶向结合ADCC或CDC依赖性死亡的多价分子的细胞。在本发明的一个实施方案中，多价结合分子的Fc结构域是杵臼构象中的肽二聚体。该肽二聚体可以是异源二聚体。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指期望对其进行诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人。
本文中所用的“LRP”、“LRP蛋白”和“LRP受体”是指低密度脂蛋白受体相关蛋白家族的成员。这些受体是单次跨膜蛋白，在受体介导的内吞作用中结合并内化配体。LRP蛋白LRP5(GenBank登录号NM 002335.2)和LRP6(GenBank登录号NM 002336.2)包含在Wnt-β连环蛋白信号通路激活所需的Wnt受体复合物中。
如本文所用，术语“多肽片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但是其中剩余的氨基酸序列与例如从全长cDNA序列推导的天然存在的序列中的相应位置相同。
如本文所用，术语“互补位”包括与表位结合的抗体的可变区中的抗原结合位点。
本文使用的术语“治疗”(treatment和treating等)通常表示获得期望的药理和/或生理效果。在完全或部分预防疾病或其症状方面，该效果可以是预防性的，和/或对于疾病和/或由疾病引起的副作用的部分或完全治愈方面，该效果可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)减轻疾病，即引起疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。特别令人感兴趣的是治疗进行中的疾病，其中该治疗稳定或减轻了患者的不良临床症状。期望在受影响的组织中功能完全丧失之前进行这种治疗。可以在疾病的症状阶段期间以及在某些情况下在疾病的症状阶段之后施用该治疗。
本发明的多价结合分子激活Wnt信号传导的能力可以通过多种测定来证实。本发明的多价结合分子通常引发与FZD受体的天然配体引发的反应或活性相似或相同的反应或活性。本发明的多价结合分子激活Wnt信号通路，例如典型Wnt-β连环蛋白信号通路。如本文所用，术语“激活”是指与不存在本发明的FZD激动剂的水平相比，例如Wnt-β连环蛋白信号通路等Wnt信号通路的细胞内水平的可测定的增加。
用于测量Wnt-β连环蛋白活化水平的各种方法是本领域已知的。这些包括但不限于测定以下的分析：Wnt-β连环蛋白靶基因表达；LEF/TCF报告基因表达(例如TopFLASH、superTopFLASH、pBAR)；β连环蛋白稳定化；LRP5/6磷酸化；Axin从细胞质易位至细胞膜并与LRP5/6结合。典型Wnt-β连环蛋白信号通路最终通过转录因子TCF1、TCF7L1、TCF7L2和LEF导致基因表达的改变。在许多细胞和组织中已经表征了对Wnt激活的转录应答。这样，通过本领域众所周知的方法进行的全局转录谱可用于评估Wnt-β连环蛋白信号传导的激活。
Wnt应答基因表达的改变通常由TCF和LEF转录因子介导。TCF报告基因试验评估TCF/LEF控制基因的转录变化，以确定Wnt-β连环蛋白信号传导的水平。TCF报告基因试验首先由Korinek,V.等人,1997进行描述。该方法也称为TOP/FOP，涉及使用最佳TCF基序CCTTTGATC的三个拷贝、或突变基序CCTTTGGCC的三个拷贝，位于上游的最小的c-Fos启动子驱动荧光素酶表达(分别为pTOPFLASH和pFOPFLASH)，以确定内源性β连环蛋白/TCF的反式激活活性。这两种报告基因活性(TOP/FOP)的比率越高，表明β连环蛋白/TCF活性越高。该报告基因的一个更新且更敏感的版本称为pBAR，包含12个TCF基序重复序列(Biechele和Moon,Methods Mol Biol.2008；468:99-110,PMID:19099249)。
分子和细胞生物化学中的一般方法可以在诸如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版.(Sambrook等人,CSH Laboratory Press 2001)；ShortProtocols in Molecular Biology,第4版.(Ausubel等人eds.,John Wiley&Sons 1999)；Protein Methods(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors for GeneTherapy(Wagner等人eds.,Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy eds.,Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits ed.,Academic Press1997)；和Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)等的标准教科书中找到。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链中。通常，Fv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使scFv形成期望的抗原结合结构。有关scFv和其他抗体片段的综述，请参见James D.Marks,AntibodyEngineering,Chapter 2,Oxford University Press(1995)(Carl K.Borrebaeck,Ed.)。
除非另有定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，与如本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的术语和上述内容的技术是本领域众所周知的和常用的。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文所述进行。前述技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法来进行，并且如本说明书通篇所引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见例如，Sambrook等人Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(1989))。与如本文所述的与分析化学、合成有机化学、以及药学和药物化学结合使用的术语和上述内容的实验室程序和技术是本领域众所周知的和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、递送和患者治疗。
实施例I
1.多价FZD激动剂的开发
为了制备具有包含FZD双体抗体的第一结合结构域和包含共受体双体抗体的第二结合结构域的多价结合分子，我们通过使用常规噬菌体展示技术选择与FZD受体的富含半胱氨酸结构域(CRD)结合的那些，从合成的Fab噬菌体文库中识别了FZD特异性抗体(文库F；参见美国公开号2016/0194394，发明人Sidhu等人)。根据需要进行亲和力或特异性成熟。例如，使用FZD4 CRD作为抗原，从源自FZD7的抗体中使泛FZD结合抗体#5019(识别FZD1、2、4、5、7和8)成熟。我们先前的工作还鉴定了对FZD4(5038、5044、5048、5062、5063、5080、5081)或对FZD5(2928)完全特异的几种抗体(参见，例如，US20160194394，发明人Sidhu等人和WO2017127933A1，发明人Pan等人)。
这些FZD抗体用于制备FZD特异性双体抗体。双体抗体是类似于单链可变片段(scFv)的抗体形式，但它是两条肽的二聚体，每条肽编码VL和VH，但是，与scFv不同，多肽内VH和VL之间的接头太短而不允许VH和VL结构域之间进行分子内互补。因此，一条多肽的VH-VL片段与另一多肽的VH-VL片段二聚化，从而在功能上重建两个抗原结合互补位。通过形成具有相同VL和VH的多肽的二聚体从而形成同源双体抗体，或由具有不同VL和VH的两条多肽形成二聚体从而形成异源双体抗体，产生具有相同或不同的互补位的双体抗体。
还通过选择那些结合人LRP6的重组胞外结构域(ECD)的抗体，从合成抗体文库中选择LRP6抗体。识别具有独特CDR区的五个Fab。转换为IgG形式后，它们都显示出人LRP6结合以及小鼠LRP6结合。通过ELISA未检测到LRP5结合，表明这些抗体具有LRP6特异性(图1A)。LRP6 ECD包含四个β-螺旋桨基序，这些基序与四个表皮生长因子(EGF)样重复序列交替出现。前两个β-螺旋桨基序被认为与Wnt1结合有关，而后两个β-螺旋桨基序被认为与Wnt3结合有关，从而产生了两个潜在的抗体结合表位。参见图6A。表位结合结果表明，这五种抗体结合LRP6上的两个独立位点，并且可以分为两组，其中抗体2538、2542、和2543结合LRP6上的Wnt1结合位点，并且2539和2540结合LRP6上的Wnt3结合位点。通常，与LRP6-Wnt1位点结合的抗体预期阻止Wnt1诱导的Wnt通路激活。
为了制备包含对FZD具有特异性的同源双体抗体的Fc N末端结合结构域，所选择的FZD抗体的VH和VL片段，VH-1、VH-2、VL-1和VL-2，通过PCR从相应的噬菌粒模板扩增并分离。然后利用Gibson组装将分离的片段(VH-1和VL-2)引入包含Fc杵区(pSCST主链)的EcoRI/XhoI预切载体中(参见Gibson等人(2009).Nature Methods.6(5):343–345和GibsonDG.(2011)Methods in Enzymology.498:349–361)。Gibson组装也用于将片段(VH-2和VL-1)引入包含Fc臼区的EcoRI/XhoI预切载体中。使用DNA测序验证正确的组装。然后使用两个质粒(一对，Fc杵和Fc臼)在Fc结构域的C末端引入第二结合结构域。
需要Fc杵和Fc臼构象来产生多价结合结构域，其中结合结构域之一是异源双体抗体。然而，不需要Fc杵和Fc臼构象来制备在Fc结构域的N和C末端均包含同源双体抗体的结合分子，因此对于此类结合分子，VH和VL连接至野生型Fc区，并且仅一个质粒用于产生含VH-VL的多肽以形成同源二聚体。任选地，接头，例如肽接头，或非肽接头，可以存在于结合结构域和Fc结构域之间。
为了产生C-端结合结构域，识别LRP5/6抗体，并按照与上述产生FZD双体抗体相同的方案产生LRP5/6双体抗体。通过从相应的LRP抗体噬菌粒模板中通过PCR扩增VH-3、VH-4、VL-3和VL-4片段，然后分离扩增的片段，产生C末端结合结构域。如上所述，然后利用Gibson组装将VH-3和VL-4片段引入上述杵臼质粒的PpuMI/BamHI位点。使用Gibson组装将其他VH-4和VL-3片段插入杵臼质粒的PpuMI/BamHI酶切处。
具有不同的VL和VH序列的两个质粒(一对，Fc杵和Fc臼)用于产生双特异性，即能够结合两个不同位点的FZD或共受体结合结构域。因为不需要产生杵臼构象来产生具有单特异性结合结构域的二聚体，所以如果每个结合结构域都是单特异性的，则仅使用包含野生型Fc序列的单个质粒。
图9A描述编码包含具有“杵”突变的Fc区、泛FZD抗体#5019的VH和VL、以及LRP抗体#2542的VL和LRP抗体#2539的VH的肽的质粒。图9B描述编码包含编码具有“臼”突变的Fc区的核酸、泛FZD抗体#5019的VH和VL、和LRP抗体#2542的VH和LRP抗体#2539的VL的肽的质粒。由这些质粒编码的肽形成异源二聚体，所述异源二聚体具有包含源自泛特异性FZD抗体#5019的同源双体抗体的多价结合位点，和包含通过将来自一条肽的LRP抗体#2539的VL和LRP抗体#2542的VH和另一条肽的LRP抗体#2539的VH和LRP抗体#2542的VL配对而产生的双特异性异源双体抗体的多价结合位点。
然后对所得质粒进行测序，并根据制造商的说明使用PureLink HiPure PlasmidFilter Maxiprep试剂盒(Invitrogen)制备经测序验证的质粒。然后将质粒转染至Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific)中，并按照制造商的说明将FectoPRO试剂(Polyplus)用于抗体表达。通常，使用200ml细胞的规模进行小批量抗体生产。
通常，在转染后80h，通过离心收集Expi 293F细胞培养基以沉淀细胞和细胞碎片。将上清液转移至干净的瓶中，并用10xPBS缓冲液缓冲。与适量的蛋白A磁珠(GEHealthcare)孵育1h后，洗涤磁珠，并根据制造商的说明洗脱结合分子。最后，将缓冲液更换为PBS。
2.异源二聚体多价结合分子
使用上述方法，我们还产生四价异源二聚体分子，其包含完整的双特异性双体抗体，所述双体抗体与Fc结构域(杵/臼)的N末端和C末端的每一个融合，(图2A和3A)。特别地，我们产生四价结合分子，所述四价结合分子具有源自Fc结构域N末端上的抗体5019的结合FZD的同源双体抗体和源自Fc结构域C末端上的LRP6-W1抗体2542(5019-Fc-2542)或LRP6-W3抗体2539(5019-Fc-2539)的同源双体抗体。令人惊讶地，两种四价分子都激活Wnt通路，但是5019-Fc-2542的效率要低得多(图3C)。不希望受到理论的束缚，这种差异可以反映LRP6-W1和LRP6-W3结合以激活Wnt信号传导的能力的差异。已经观察到，与Wnt结合至LRP6-W1位点相比，LRP6-W3位点与Wnt结合在激活Wnt信号传导方面更有效。
我们还产生四价三特异性结合分子，其具有结合源自Fc结构域的N末端上的抗体5019的结合FZD的同源双体抗体和源自Fc结构域的C末端上的LRP6-W1抗体2542和LRP6-W3抗体2539的LRP异源双体抗体(5019-K/H-2539-2542，命名为5019Ag)(图5)。与具有单特异性LRP6同源双体抗体的分子相比，5019Ag在激活Wnt信号传导方面出乎意料地有效(图3C)。由pBAR荧光素酶报告基因试验确定纳摩尔量的所有三种形式都激活Wnt信号传导(图3D)，表明它们是有效的Wnt模拟物。不希望受到理论的束缚，预期强Wnt3A位点和弱Wnt1位点的结合比两个强Wnt3A位点的结合更有效。具有FZD结合结构域和LRP结合结构域的两个最佳多价结合分子“FLAg”具有个位数的纳摩尔效能(EC50～5nM)，实际上与纯化的Wnt3A的效能相同，并显示出钟形剂量响应特性(图11D)。我们将其解释为表明最大刺激需要FLAg的多价结合，而在较高浓度下效率下降可能归因于与FZD或LRP6的单价结合。我们用FP+P-L61+3处理表达低水平β连环蛋白的RKO细胞(Major等人Science.316,1043–1046(2007))，这导致β连环蛋白水平和作为Wnt-FZD通路激活的标志物的DVL2的磷酸化的剂量和时间依赖性增加(图11E和图11F)。因此，四价FLAg是用作FZD和LRP6的合成激动剂的模块化、可工程化的人Ab形式。
为了确认最佳FLAg FP+P-L61+3的工程亲和力和特异性，我们使用生物层干涉法(BLI)来测定其与10个人FZD CRD中的9个以及与人LRP6 ECD的结合动力学(图12A和图12B)。FLAg以皮摩尔范围(KD＝10-800pM)的亲和力与由源自亲本泛FZD互补位的FZD双体抗体识别的六个FZD结合(Pavlovic等人2018)，但未检测到与其他三个FZD结合。此外，对LRP6的亲和力在纳摩尔范围内(KD＝12nM)(图12B)。然后，我们使用BLI评估FLAg与各种Fc受体的结合。
FLAg与常规IgG类似地表现，并且以剂量和pH依赖性方式与FcRn相互作用(图12C)。天然IgG在pH 6而不是pH 7.4时与FcRn结合，这使得在胞饮作用期间可以循环利用，从而在体内具有长的半衰期。FLAg还与IgG类似地表现为与包括补体(C1q)、天然杀伤细胞标志物CD16a、B细胞标志物CD32a、以及单核细胞和巨噬细胞标志物CD64在内的其他Fc效应子相互作用(图12D。我们得出结论，FLAg包含功能性Fc部分，该部分应赋予效应子功能并在体内具有长的半衰期。
四价FP+P-L61+3FLAg的模块化设计允许我们通过用与不相关抗原麦芽糖结合蛋白(MBP)结合的空互补位替换每一个互补位，来剖析四个互补位中每个对内在激动剂活性的贡献。我们产生包含Fc结构域和连接至一个Fc结构域末端的FZD结合结构域以及连接至另一个Fc末端的LRP结合结构域的“单结合”分子，但在双体抗体中没有两个用于FZD或LRP的结合位点，结合结构域仅具有单一或一个结合位点、和一个控制麦芽糖结合蛋白结合位点“MBP”。将一个MBP结合位点引入分子的至少一个结合结构域，以产生五个单结合分子。在N末端包含一个FZD和一个MBP结合位点的5019-MBP-K/H-2539-2542仍然激活Wnt通路，但与5019Ag相比功效降低了8倍(图3E)。同样，在C末端仅保留一个LRP6-W3位点的5019-K/H-2539-MBP与5019Ag相比表现为Wnt激活要少得多(图3E)。检测两个MBP-FZD/MBP-LRP6分子5019-MBP-K/H-2539-MBP和5019-MBP-K/H-MBP-2542以及具有一个LRP6-W1双体抗体的分子5019-K/H-MBP-2542的最小激动活性(图3E)。这些β连环蛋白信号传导试验的结果表明，通过为WNT1结合位点禁用一个抗FZD互补位或抗LRP6互补位显著降低最大刺激，而通过禁用WNT3A结合位点的抗LRP6互补位，或同时禁用一个抗FZD互补位以及多个抗LRP6互补位中任何一个完全消除最大刺激。我们还将靶向WNT3A结合位点的抗LRP5互补位替换为靶向WNT1结合位点的抗LRP6互补位，以产生可募集共受体和观察到的类似于FP+P-L61+3活性的活性的分子(FP+P-L5/63)(图3F，EC50＝4nM)。综上所述，这些数据表明，使用能够通过共同表位募集两个FZD和通过两个截然不同的表位募集LRP6的分子实现最佳激动剂活性，但是可以通过禁用抗FZD或抗LRP6互补位之一来将活性调节至中等水平。此外，通过将两个抗FZD互补位与LRP5和LRP6中每个的一个互补位相结合，产生可以募集FZD和两个不同共受体的分子。
我们还通过将双体抗体对替换为成对的较少约束的分子内单链可变片段(scFvs)来探索由分子间双体抗体形式施加的几何和空间约束的要求(图2J)。与FP+P-L61+3相比，包含抗FZD scFv(FP*+P*-L61+3)的FLAg表现出相似的活性，而对于包含抗LRP6 scFv(FP+P-L61 *+3*)或在两端包含scFv(FP*+P*-L61*+3*)的FLAg的活性显著降低。这些活性上的差异不是由于亲和力的差异所致，如BLI测定显示的，无论互补位是以双体抗体还是scFv形式存在，与LRP6和FZD同种型的结合具有相当高的亲和力(图2K和图2L)。综上所述，这些结果显示，最佳FZD/LRP6信号传导复合物的组装需要特定的化学计量和几何形状，并且约束对于LRP6来说尤其精确，这需要在由双体抗体形式指定的特定的几何形状中两个不同的表位的结合。值得注意的是，对于FZD结合的较宽松的约束使得能够以单个抗FZD互补位显著激活(图2D)，这为通过在与异源二聚体Fc的N末端的抗FZD互补位结合中借由额外的互补位募集不同的细胞表面蛋白而进一步增强特异性或改变信号传导打开了大门。
3.其他双特异性抗体形式
在Fc结构域的相同末端上构建包含抗体#5019的FZD结合结构域和抗体#2942的LRP6-W1结合结构域(5019/2942)或抗体#2539的LRP6-W3结合结构域(5019/2539)的双特异性分子，并纯化相应的蛋白(图2A)，并使用pBAR荧光素酶报告基因试验测定Wnt信号传导的激活。这些分子未能激活Wnt信号传导。值得注意的是，两个双特异性分子均拮抗Wnt配体的活性(图2B)。不希望受到理论的束缚，这些双特异性分子的两个互补位之间的距离和柔韧性可能不会以合适的几何形状募集FZD和LRP6受体进行激活。
还使用杵臼构象产生包含连接至Fc结构域的相同末端的FZD双体抗体和LRP双体抗体的双特异性分子。测定这些指定的双体抗体5019-2539-K/H(FZD/LRP-W3)和5019-2542-K/H(FZD/LRP-W1)的FZD和LRP结合以及Wnt通路的激活。两个双体抗体都保留了原始抗体的FZD结合特性以及LRP6结合活性(图2D-2G)。这两个分子都分别与FZD受体和LRP共受体结合。如通过BLI试验所确定的，5019-2542-K/H显示在溶液中与FZD和LRP的共结合(图2H)，但是在5019-2539-K/H中未观察到显著的共结合。在pBAR荧光素酶报告基因试验中确定的5019-2539-K/H和5019-2542-K/H都不激活Wnt信号传导，类似于从仅结合FZD受体(5019-Fc)或共受体(2539-Fc)的同源双体抗体中获得的结果(图2I)。此外，5019-2539-K/H(FZD/LRP-W3)和5019-2542-K/H(FZD/LRP-W1)都有效抑制Wnt3a介导的通路激活(图2I)。
4.Wnt通路信号传导分析
使用pBAR荧光素酶报道系统在HEK293细胞中测定Wnt通路激活，该系统忠实地监测β连环蛋白的转录激活(Biechele和Moon,Methods Mol Biol.2008；468:99-110,PMID:19099249)。简而言之，将稳定表达pBARLS和pSL9 Ef1α-海肾(Renilla)荧光素酶构建体的HEK293T细胞以1.5E4个细胞/孔接种在96孔板中。接种后24小时，用指定浓度的指定的FZD激动剂或PBS溶媒对照一式三份处理细胞。处理后16.5小时，根据制造商的方案，裂解细胞并使用双荧光素酶报告基因试验系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega#E1960)测定发光。将萤火虫发光标准化为每个孔的海肾发光，以控制细胞数量。
我们检测包含源自抗体片段(抗体#5019)的N末端FZD双体抗体的多价分子的激动剂活性，所述抗体片段识别几个通过Fc结构域连接至Fc结构域的C末端上的LRP结合结构域的FZD受体(FZD1、2、4、5、7和8)。C末端LRP结合结构域包含源自两个LRP6抗体#2539和#2542之一的双体抗体，其分别与Wnt3位点和Wnt1位点结合(图6B)。纳摩尔量的表示为5019-Fc-2539和5019-Fc-2542的这些多价结合分子激活Wnt-β连环蛋白通路(图6C)，但是，当与5019-Fc-2542相比时，用具有靶向Wnt3位点的LRP6抗体的分子5019-Fc-2539处理细胞引起的活化大约高10倍(分别是背景的200倍对20倍)(图6C)。
重要地，使用在Fc部分内工程化的杵臼系统，我们产生多价结合分子(图1C)，该多价结合分子在一端包含用于泛FZD结合结构域的同源双体抗体(#5019)，在另一端包含用于以Wnt1(#2542)和Wnt3(#2539)5019-K/H-2539:2542的结合位点形成LRP6结合结构域的异源双体抗体(图6B)。这种构象能够在分子内引入具有不同的选择性和亲和力特性的四个不同的结合位点，即四价和三特异性的。当在HEK293细胞中的β-连环蛋白荧光素酶报告基因试验中进行检测时，该分子的激活作用比5019-Fc-2539高2倍，或比背景高约400倍(图6C)。
我们还用杵臼系统内的等效LRP5结合位点(源自二者都结合LRP5的2459和2460抗体的双体抗体)和结合FZD1、2、4、5、7、8的相同的泛FZD双体抗体(5019)替换LRP6的结合位点。该分子5019-K/H-2459:2460还可以激活HEK293T细胞中的Wnt-β连环蛋白通路(图6D)，尽管其功效比具有LRP6双体抗体的激动剂低。
5.选择性FZD激动剂的表征(具有源自选择性FZD和共受体抗体片段的结合结构域的激动剂模块性)
为了评估我们的单特异性FZD激动剂的活性，我们使用依赖于特定FZD异构体的基于细胞的检测方法。我们制备仅与十个FZD受体之一结合的多价结合分子。我们先前的工作识别了对FZD4完全特异的几种抗体(5038、5044、5048、5062、5063、5080、5081)(参见，例如，US20160194394，发明人Sidhu等人和WO2017127933A1，发明人Pan等人)。使用Fc杵臼系统产生包含FZD4特异性的FZD结合结构域和含有源自抗体2539和2542的双特异性异源双体抗体的LRP6结合结构域的多价结合分子。这些分子可以通过β-连环蛋白通路激活FZD4信号传导，但只有与FZD4 cDNA一起共转染HEK293细胞时才可以。这些FZD4结合分子在未修饰的表达低水平FZD4的HEK293T细胞中不能激活FZD4信号传导或β连环蛋白通路。因此，该实验证明分子对FZD4的特异性。5019-K/H-2539-2542(上述泛FZD激动剂)即使在没有FZD4的情况下，也可以激活HEK293T细胞中的传导信号(图4A)。该结果并不令人惊讶，因为Wnt介导的β-连环蛋白信号传导HEK293T细胞的活化通过FZD1、2和7(Voloshanenko等人FASEB2017FASEB J.2017Nov；31(11):4832-4844；PMID:28733458)和5919FZD抗体结合所有三个受体而发生。
此外，我们使用FZD5特异性抗体2928的结合结构域产生FZD5特异性多价结合分子，我们先前将其表征为仅结合FZD5(Steinhart等人Nat Med.2017年1月；23(1):60-68,PMID:27869803；WO2017127933A1，发明人Pan等人)。我们先前证明几种RNF43突变型胰腺导管腺癌(PDAC)细胞系的增殖仅依赖于FZD5信号传导(Steinhart等人2017,PMID:27869803)。确实，在三个RNF43突变体PDAC系中进行全基因组CRISPR必需性/适应性筛选显示，FZD5是其生长的最重要基因之一，而具有WT RNF43的PDAC细胞系并未表现出对FZD5的这种要求。当用抑制Wnt配体的棕榈酰化和活性的Porcupine抑制剂(PORCNi；例如LGK-974)处理RNF43突变细胞时，RNF43突变细胞会停止增殖。
用泛-FZDag 5019-K/H-2539-2542或选择性FZD5激动剂2928-K/H-2539-2542对RNF43突变细胞的共处理导致被LGK974阻断的细胞增殖的强力挽救。这些结果表明，这两种分子可以在这些细胞中激活FZD5并诱导Wnt信号传导，从而模拟内源性Wnt配体的作用(图7B)。相反，添加FZD4特异性激动剂5038-K/H-2539-2542或FZD2特异性激动剂无法挽救LGK974介导的增殖抑制。
RNAseq分析显示FZD2是间充质干细胞系CH3H10T1/2(小鼠ENCODE)中的主要同种型，表明FZD2可能负责Wnt蛋白在间充质细胞成骨分化过程中的确定作用(Day等人Dev.Cell.8,739–750(2005))。用FZD2特异性FLAg刺激C3H10T1/2细胞导致将成骨标志物碱性磷酸酶(ALPL)强烈诱导至与用泛FZD FLAg刺激达到的水平相似的水平，而FZD5特异性FLAg表现出最小的活性(图7B)。
6.与四价结合分子的共靶向
除了将FZD多价结合结构域和共受体结合结构域与Fc结构域混合和匹配以实现期望的组合之外，当前系统中四价互补位的存在为用一个分子同时靶向两个FZD受体和两个共受体提供机会，确保在体内应用时共定位。考虑到上面显示的5019-MBP-K/H-2539:2542的激动活性，通过结合Fc结构域的N末端的异源双体抗体中的结合区域，生成具有选择性FZD受体结合结构域的多价结合分子。例如，源自抗体5038(结合FZD4)和2928(结合FZD5)的结合结构域将产生FZD4和FZD5共靶向分子。还可以产生具有针对特定或多个共受体的共受体结合结构域的结合分子。例如，LRP6/LRP5共靶向结合结构域可通过将源自Fc结构域的C末端上的2459(结合LRP6上的Wnt1结合位点)和2539(结合LRP6上的Wnt3a结合位点)的结合结构域结合而产生。同样，共受体结合结构域可包含与另一种共受体例如ROR1/2结合的LRP6的结合位点，以在单个细胞中启动典型和非典型Wnt信号通路的激活。
本文还考虑了具有源自组织特异性抗体的组织特异性结合结构域的多价结合分子，所述组织特异性结合结构域将多价结合分子募集至所需组织，然后将在此通过结合FZD受体和共受体来激活Wnt信号传导。当期望的效果可能需要限于特定组织时，在再生治疗中使用多价结合分子时，这被认为是特别有用的。总而言之，四价模式允许更多的设计灵活性，以满足多种功能需求。
7.具有FZD结合结构域和共受体结合结构域的多价结合分子可以替代Wnt配体以维持肠类器官培养物。
如下检测如本文所述的FZD激动剂对类器官存活和维持的作用。处死一只8周龄的雌性C57BL/6小鼠，并收集小肠隐窝以进行类器官分离(O'Rourke等人2016.Isolation,Culture,and Maintenance of Mouse Intestinal Stem Cells.Bio Protoc.20:4)。通过机械解离使类器官培养物通过(O’Rourke 2016)，并在48孔板中包埋在25μl的生长因子减少的基质胶(Growth Factor Reduced Matrigel)(Corning，356231)中。针对每种实验条件，一式三份地铺板类器官。将具有实验条件的完全类器官培养基(O’Rourke 2016)(1μMLGK-974+/-40％Wnt3a条件培养基或+/-50nM泛Fzd-5056(靶向FZD1、2、4、6、7、8的FZDag但结合不与Wnt配体竞争的表位))在继代当天添加至每个孔中，并每2-3天更换一次。一周后，将150μl的Cell Titer Glo 3D(Promega)添加至每个孔中的150μl培养基中。类器官在RT下在摇摆平台上裂解30分钟。从每个孔中一式两份测定20μl裂解液的发光读数。将每种条件下的平均发光读数标准化为DMSO条件，以计算存活率。
作为普遍存在的干细胞生态位(niche)因子，Wnt和R-spondin是从许多组织衍生和维持三维培养类器官所需的。在体外，在R-spondin的存在下，潘氏细胞分泌的Wnt蛋白足以支持小鼠小肠类器官的生长。然而，如果PORCNi LGK974阻止Wnt的释放和活性，则类器官将不会增殖并最终死亡。在本文中，我们证明本发明的泛FZD多价结合分子FZDag(FP+P-L61 +3)可以在LGK974存在的情况下挽救并维持类器官的生长，表明该分子在功能上模仿Wnt配体(图8)，并且可以替代Wnt蛋白来支持组织类器官的生长。因为Wnt配体是许多人类组织类器官生长所需的介质的完整的组分，所以当本发明的抗体来源的FZD激动剂包含在培养基中时，预期其促进不同组织的类器官的衍生、存活和维持，从而减轻与使用条件培养基或纯化的Wnt蛋白相关的限制。
8.多价结合分子促进骨骼再生
大鼠闭合性股骨骨折模型用于评估本发明的多价结合分子的再生特性，所述多价结合分子具有结合FZD2的第一多价结合结构域和结合LRP5或LRP的共受体结合结构域。第一多价结合结构域可以特异性结合FZD2，例如2890-hole-2539-2542和2890-knob-2539-2542的结合结构域(例如，由SEQ ID NO:84和85编码)或可以结合FZD2和其他FZD受体。
在单侧闭合性股骨中骨干骨折后，向大鼠施用溶媒或多价结合分子(参见Bonnarens和Einhorn,J.Orthop.Res.2,97–101(1984))。简而言之，将18号注射器针头穿过髁突插入骨髓腔中。然后，通过在大腿前部(侧面)产生钝的冲击负荷，形成股骨的横向骨折。骨折后一天，每周两次向大鼠皮下注射生理盐水溶媒体或多价结合分子，共7周。终止时，去除髓内钉，并通过microCT分析骨折的股骨。
在该模型中，与仅通过溶媒进行的骨再生相比，具有结合FZD2的多价结构域和结合LRP5或LRP6的第二多价结合结构域的多价结合分子显著增加骨的再生。
实施例II-靶向FZD和LRP6的合成抗体
我们先前应用噬菌体展示以使用九种重组FZD CRD作为抗原(不能纯化FZD3 CRD)来得到数百个合成抗体(Steinhart等人Nat.Med.23,60(2016)；Pavlovic等人MAbs(2018),doi:10.1080/19420862.2018.1515565)。系统表征揭示连续的特异性谱，一些Ab表现出广泛的特异性，例如以识别FZD1/2/4/5/7/8的泛FZD Ab(FP)为例(图11A)，其他Ab显示出更多限制的特异性，并且一些是单特异性(图11B)。功能表征显示一些抗体与Wnt竞争并抑制β连环蛋白信号传导，而其他抗体则是非竞争性的并且不干扰Wnt信号传导(图11B)。总而言之，我们充分表征了161种抗FZD抗体，包括47种Wnt信号传导抑制剂。出乎意料的是，如本文讨论，无论它们是否与Wnt竞争并抑制Wnt信号传导，我们通过使用这些抗FZD抗体作为FZD结合结构域的来源结合LRP结合结构域例如与LRP5/6上的Wnt1和/或Wnt3a结合位点结合的结合结构域所产生的所有多价结合分子都是Wnt通路的激动剂。
实施例III-FLAg在细胞、类器官和动物中的表型效果
已经确定FLAg选择性地结合FZD和LRP以激活Wnt相关的信号通路，我们探索了这些信号在祖干细胞(PSC)、类器官和动物中的表型效果。Wnt-β连环蛋白信号传导活性的调节对于大多数PSC分化方案都是必不可少的(Huggins等人Methods Mol.Biol.1481,161–181(2016))。使用WNT3A条件培养基或GSK3的小分子抑制剂治疗人PSC，激活β连环蛋白信号传导，导致原条诱导(primitive streak induction)，并促进中胚层命运特化(mesodermalfate specification)(Davidson等人PNAS U.S.A.109,4485–4490(2012))。我们在这种情况下评估FLAg的活性，发现用30nM FP+P-L61+3对人PSC进行三天的处理引起中胚层标志物BRACHYURY的强烈诱导，而多能效能标志物OCT4的表达降低至与6μM的GSK3抑制剂CHIR99021处理的水平相当的水平(图13A和图13B)。
FP+P-L61+3识别小鼠FZD和LRP6，并且其包含与FcRn相互作用的Fc。预期Fc在体内赋予分子长的Ab样半衰期。因此，我们测试FP+P-L61+3是否可以与小鼠中的内源性受体相互作用并积累到足以激活β连环蛋白信号传导和动员内源性干细胞活性的水平。在肠干细胞生态位中，间充质细胞分泌的Wnt蛋白诱导隐窝底部干细胞中的β连环蛋白靶基因表达，指导其自我更新，并且靶基因LGR5经常用作各种组织中的干细胞的标志物。用LGK974处理LGR5-GFP小鼠会消融Wnt的产生，并导致隐窝干细胞中LGR5表达和连接的GFP信号迅速消失。突出地，通过腹膜内注射与FP+P-L61+3共同处理后，GFP表达得以挽救(图14右图)。我们得出结论，FP+P-L61+3具有足够的半衰期和生物利用度，在没有内源性Wnt的情况下，能够使β连环蛋白活化在促进肠干细胞自我更新的水平。
实施例IV-材料和方法：
1.Ab选择和筛选
如(Persson等人J.Mol.Biol.425,803–811(2013))所述，噬菌体展示的合成文库F用于选择与Wnt受体结合的Fab。简而言之，将带Fc标签的ECD蛋白(R&D Systems)固定在Maxisorp免疫板(ThermoFisher,目录号12-565-135)上，并用于与库噬菌体池进行阳性结合选择，该库噬菌体池首先暴露于类似固定的Fc蛋白，以耗尽非特异性的结合物(binders)。经过四轮结合选择后，制备克隆噬菌体，并通过噬菌体ELISA进行评估(Birtalan等人J.Mol.Biol.377,1518–1528(2008))。与Fc相比，与抗原结合显示至少10倍大的信号的克隆被认为是经过进一步表征的特异性的结合物。
2.重组蛋白和试剂
FZD1(5988-FZ-050)、FZD2(1307-FZ-050)、FZD4(5847-FZ-050)、FZD5(1617-FZ-050)、FZD7(6178-FZ-050)、FZD8(6129-FZ-050)、FZD9(9175-FZ-050)、FZD10(3459-FZ-050)的带Fc标签的融合体购自R&D Systems。使用pFUSE-hIgG1-Fc2载体(Invivogen)从Expi293细胞中表达并纯化FZD6的带Fc标签的ECD(残基19-132，UniprotO60353-1)，在Superdex200(10/300)柱(GE Healthcare)上通过尺寸排阻色谱从聚集蛋白中分离出单个原体种(promoter specie)。人(1505-LR-025)和小鼠(2960-LR-025)LRP6和小鼠LRP5(7344-LR-025/CF)的带Fc标签的ECD融合蛋白购自R&D Systems。WNT1(SRP4754-10ug)、WNT2b(3900-WN-010/CF)、WNT5a(645-WN-010/CF)和WNT3A(5036-WN-010/CF)购自R&D Systems，并如(PMID:12717451)所述制备WNT3A条件培养基。其他蛋白和化学药品购自以下供应商：FcRN(R&D,8693-FC)、C1q(Sigma,C1740)、CD16a(R&D,4325-FC)、CD32a(R&D,1330-CD/CF)、CD64(R&D,1257-FC)、LGK974(Cayman Chemicals)、Porcupine抑制剂C59(DalriadaTherapeutics)、和CHIR99021(Sigma Aldrich)。
3.FZD和LRP的四价结合分子、“FLAg”、和抗体克隆
编码抗体(Ab)可变结构域的DNA片段通过PCR从噬菌粒DNA模板扩增，或通过化学合成(Twist Biosciences)构建。将DNA片段克隆至设计用于产生κ轻链和人IgG1重链的哺乳动物表达载体(pSCSTa)中。双特异性双体抗体和IgGs包含“杵臼”异源二聚体Fc的优化版本(Ridgway等人Protein Eng.9,617–621(1996))。将FLAg和双体抗体-Fc融合体以VH-VL方向排列，其中可变结构域由短GGGGS(例如SEQ ID NO:2的氨基酸121-125)接头隔开，这有利于VH和VL结构域之间的分子间缔合，因此有利于双体抗体的形成。为了产生双体抗体-Fc融合构建体，将双体抗体链与人IgG1 Fc融合。FLAg蛋白被构建为VH-x-VL-y-[人IgG1 Fc]-z-VH-x-VL，其中接头是x＝GGGGS(例如SEQ ID NO:2的氨基酸121-125)，y＝LEDKTHTKVEPKSS(SEQ ID NO:4的氨基酸232至245)和z＝SGSETPGTSESATPESGGG(SEQ ID NO:4的氨基酸473至501)。以这种形式，人IgG1 Fc或杵臼IgG1 Fc片段跨越位置234-478(Kabat编号)。对于scFv-Fc融合体，可变结构域以VL-VH方向排列并通过长GTTAASGSSGGSSSGA(SEQ ID NO:75)接头连接，这有利于VH和VL结构域之间的分子内缔合，因此有利于scFv的形成。对于所有构建体，将整个编码区与分泌信号肽一起框内克隆至哺乳动物表达载体中。
4.蛋白表达与纯化
通过瞬时转染在Expi293F(ThermoFisher)细胞中产生抗原、Ab和FLAg蛋白。简而言之，将细胞在带挡板的细胞培养瓶中的Expi293表达培养基(Gibco)中生长至约2.5×106细胞/ml的密度，并使用FectoPRO转染试剂(Polyplus-transfection)并使用标准制造方案(ThermoFisher)用合适的载体转染。使表达在37℃和8％CO2下以125rpm摇动进行5天。表达后，通过离心去除细胞，并使用重组蛋白A琼脂糖凝胶(rProtein A Sepharose)(GEHealthcare)从条件培养基中纯化蛋白。将纯化的蛋白缓冲交换至PBS或配制的稳定缓冲液(36.8mM柠檬酸、63.2mM Na2HPO4、10％海藻糖、0.2M L-精氨酸、0.01％Tween-80、pH6.0)中进行储存。通过在280nm处的吸光度确定蛋白浓度，并通过SDS-PAGE分析确认纯度。
5.体外结合检测
使用Octet HTX仪器(ForteBio)进行BLI检测。为了测定与抗原的结合，在AHQ BLI传感器(18-5001，ForteBio)上捕获FZD受体(FZD-Fc蛋白)的带Fc标签的融合体，以实现0.6-1nm的BLI响应，用人Fc使剩余的Fc结合位点饱和(009-000-008,JacksonImmunoResearch)。将涂有FZD的或对照(涂有Fc的)传感器转移至检测缓冲液(PBS、1％BSA、0.05％Tween20)中的100nM Ab或FLAg中，并监测缔合300秒。然后将传感器转移至检测缓冲液中，并监测解离额外300秒。摇动速度为1000rpm，温度为25℃。在295秒的缔合时间后获取端点响应值。通过从FZD-Fc信号中减去Fc信号，然后将数据标准化为最高结合信号，来分析端点数据。
为了测定与Fc受体的结合，通过胺偶联将Ab或FLAg固定在AR2G传感器(18-5092，ForteBio)上，以实现0.6-3nm的BLI响应，并用乙醇胺淬灭剩余的位点。涂覆的传感器在检测缓冲液(PBS、1％BSA、0.05％Tween20)中平衡，并转移至Fc受体溶液中。监测缔合600秒，将传感器转移至检测缓冲液中，并监测解离600秒。除非另有说明，否则分别在50nM或300nM在pH7.4下检测CD64和所有其他Fc受体。摇动速度为1000rpm，温度为25℃。在缔合阶段结束时获取端点响应值，并将其标准化为同种型对照。除了固定FcRN并在溶液中评估Ab或FLAg的系列稀释度(0.1–225nM)以外，以类似的方式进行稳态FcRN结合的检测。缔合和解除缔合时间分别为600或1200秒。
使用ProteOn XPR36系统(Bio-Rad)进行表面等离子体共振(SPR)检测。使用标准胺偶联化学方法将FZD-Fc或LRP-Fc蛋白固定在GLC传感器表面(176-5011)。以40μl/min注入检测缓冲液(PBS、0.05％Tween20、0.5％BSA)中的Ab或FLAg，并监测缔合150秒。然后以100μl/min的速度注入检测缓冲液，并监测解离900秒。在25℃下进行检测。使用1:1Langmuir模型进行分析，并使用ProteOn Manager软件全局拟合以确定kon和koff值。KD计算为koff/kon的比率。
6.表位分组(epitope binning)
使用Octet HTX仪器(ForteBio)进行BLI表位分组实验。将具有FZD(FZD-Fc)或具有LRP6(LRP6-Fc)蛋白的Fc融合体分别固定在AHQ(18-5001,ForteBio)或AR2G(18-5092,ForteBio)BLI传感器上。将涂覆的传感器转移至检测缓冲液(PBS、1％BSA、0.05％Tween20)中的100nM Ab中240秒，以实现结合位点饱和。然后将传感器转移至检测缓冲液中的100nM竞争性Ab中180秒。测定暴露于竞争性Ab后20秒的响应，并在未封闭的抗原涂覆的传感器上将其标准化为结合信号。摇动速度为1000rpm，温度为25℃。
7.细胞系
HPAF-II和HEK293T细胞系在补充有10％FBS(ThermoFisher)和青霉素/链霉素(ThermoFisher#15140-163)的含有4.5g/L D-葡萄糖、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺(ThermoFisher#12430-054)的DMEM中维持。CHO细胞在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM/F12(ThermoFisher#11320-033)中维持。将细胞在37℃和5％CO2下维持。
8.流式细胞术
如前所述，用10nM抗FZD Fab对CHO细胞系进行细胞的间接免疫荧光染色(Steinhart等人2017Nat Med.Jan；23(1):60-68,PMID:27869803)。使用Alexa Fluor488AffiniPure F(ab')2作为二抗(Jackson ImmunoResearch，109-545-097)。抗c-MycIgG1 9E10(一抗，ThermoFisher，MA1-980)和Alexa Fluor 488IgG(二抗，LifeTechnologies，A11001)用作表达对照。所有试剂均按照制造商的说明使用。
9.荧光素酶报告基因试验
用编码pBAR1报告基因的慢病毒转导HEK293T细胞(Biechele和Moon于WntSignaling Signal Signal：Pathway Methods and Mammalian Models,E.E.Vincan,Ed.(Humana Press,Totowa,NJ,2008),第99-110页)并以海肾荧光素酶为对照，以产生Wnt-β连环蛋白信号传导报告基因细胞系。在转染或刺激前，将120μl中的1-2x103细胞接种至96孔板的每个孔中24小时。第二天，添加FLAg或Ab蛋白，并在刺激15-20小时后，裂解细胞，并使用Envision读板仪(PerkinElmer)根据双重荧光素酶方案(Promega)测定发光。对于FZD4特异性激动剂试验，在添加FLAg蛋白之前，将FZD4 cDNA转染6小时。对于Wnt抑制检测，通过cDNA转染引入Wnt1或在添加Ab蛋白之前应用WNT3A蛋白6小时。所有测定至少重复三次。
10.蛋白免疫印迹检测
用裂解缓冲液(1％Nonidet P-40、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.1％脱氧胆酸、50mM Tris(pH7.4)、0.1mM EGTA、0.1mM EDTA、20mM氟化钠(NaF)、1:500蛋白酶抑制剂(Sigma)和1mM原钒酸钠(Na3VO4))溶解H1 ESC。将裂解液在4℃下孵育30分钟，以14,000×g离心10分钟，在SDS样品缓冲液中煮沸，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到硝酸纤维素膜上，并用指定的Ab进行蛋白免疫印迹。通过基于化学发光的检测系统(ECL；ThermoFisher)进行Ab检测。
11.结晶紫增殖检测
以每孔500个细胞接种HPAF-II细胞，并在24小时后在添加或不添加100nM FLAg的同时添加100nM LGK974。每隔一天更换一次培养基并更新药物治疗。处理7天后，将细胞用冰冷的甲醇固定。用25％甲醇中的0.5％结晶紫溶液染色细胞，用10％乙酸脱色，并通过测定590nm处的吸光度进行定量。
12.免疫荧光
将用FLAg和CHIR99021处理3天的H1 hES用冷PBS洗涤，并用4％PFA固定20分钟。用PBS冲洗固定细胞，用0.3％triton渗透10分钟，并用1％BSA封闭1小时。将细胞与用于BRACHYURY(R&D systems AF2085；山羊；1:100稀释)或OCT3/4(Santa Cruz sc5279；小鼠；1:100稀释)的一抗在1％BSA中孵育2小时，并与Alexa Fluor 488标记的驴抗山羊或AlexaFluor 568标记的驴抗小鼠Ab一起孵育1小时(图13A)。使用Fluoromount(Sigma-Aldrich)安装盖玻片，并在Zeiss LSM700共聚焦显微镜上使用60×油镜进行分析(图13B)。使用ImageJ和Photoshop CS6(Adobe Systems，Mountain View，CA)组装图像。
13.肠隐窝自我更新检测
8-10周龄的Lgr5-EGFP-IRES-creERT2(B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J)小鼠购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。所有实验均根据多伦多大学动物护理和使用委员会(the Animal Care and Use Committee)批准的方案进行，并符合加拿大动物护理委员会(Canadian Council on Animal Care)的规定和ARRIVE准则(动物研究：体内实验报告)。FP+P-L61+3或阴性对照Ab在37mM柠檬酸、63mM Na2HPO4、10％海藻糖、0.2M的L-精氨酸、0.01％聚山梨酯80、pH6.0中重建。Porcupine抑制剂C59用在ddH2O中与0.1％Tween80混合的0.5％甲基纤维素重建。将小鼠(雄性和雌性)分为三组(每组5-7只)：溶媒、对照(C59和对照Ab)或FLAg(C59和FP+P-L61+3)。在第1天，通过腹膜内注射溶媒、或10mg/kg对照Ab或FP+P-L61+3处理小鼠。治疗对研究者是遮盲的，直到实验结束为止，并且每两天重复进行一次，共进行三次治疗。从第2天开始，给溶媒组或两个实验组灌胃施用溶媒或50mg/kg C59，每天两次，间隔8小时，施用4天。在第6天，处死小鼠。收集整个肠组织，用冷PBS清洗，用PBS、30％蔗糖脱水，用4％多聚甲醛固定并包埋在最佳切割温度化合物(OCT)中。将8μm OCT冷冻切片用于免疫组织学。使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)分析肠EGFP隐窝。在图14中描述了用溶媒、C59或泛FLAg(FP+P-L61+3)+C59处理的LGR5-GFP小鼠的小肠切片的代表性荧光图像。LGR5-GFP在隐窝底部的干细胞中表达。细胞核用DAPI复染。
本领域技术人员将仅使用常规实验就将认识到或能够确定如本文所述具体过程的许多等同物。这样的等同物被认为在本发明的范围内。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种替换、变更和修改。其他方面、优点和修改在本发明的范围内。通过本申请引用的所有参考文献、已发布的专利和公开的专利申请的内容通过引用并入本文。可以为本发明及其实施方案选择那些专利、申请和其他文件的适当的组分、过程和方法。
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序列表
<110> 安托拉诊疗公司(ANTLERA THERAPEUTICS INC.)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacatcggt tcttcttcta tccactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttattctg cttttgcctc tacttcttat 180
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ttcccgttcg gttttgcttt ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360
ggtggaggtg gcagtgatat ccagatgacc cagtccccga gctccctgtc cgcctctgtg 420
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705 710 715 720
Val Glu Ile Lys
<210> 7
<211> 2184
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacatcggt tcttcttcta tccactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttattctg cttttgcctc tacttcttat 180
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ggtggaggtg gcagtgatat ccagatgacc cagtccccga gctccctgtc cgcctctgtg 420
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tatcaacaga aaccaggaaa agctccgaag cttctgattt actcggcatc cagcctctac 540
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gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
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<211> 728
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Tyr Ser Ala Phe Ala Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Tyr His Phe Pro Phe Gly Phe Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
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Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
130 135 140
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp
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Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala
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Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser
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Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
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210 215 220
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Leu Glu Asp Lys Thr His Thr Lys Val
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Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
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Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
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Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
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Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val
485 490 495
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
500 505 510
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val
515 520 525
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Tyr Ser
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Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
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Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Arg
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Gly Ser Lys Lys Pro Tyr Phe Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
595 600 605
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Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg
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Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
690 695 700
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Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 2175
<212> DNA
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<400> 9
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<210> 10
<211> 725
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Tyr
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Ala Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser
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Lys Val Glu Pro Lys Thr Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met
565 570 575
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala
580 585 590
His Tyr Phe Pro Trp Ala Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
595 600 605
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
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Lys Val Glu Ile Lys
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ttctctggtt gggctatgga ctactggggt caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcgggt 1860
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gatagggtca ccatcacctg ccgtgccagt cagtccgtgt ccagcgctgt agcctggtat 1980
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<211> 731
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln
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Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser
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Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr
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Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
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Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Leu Glu Asp Lys Thr His Thr
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Asn Cys Pro Pro Cys
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Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr
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Val Arg Gly Ser Lys Lys Pro Tyr Phe Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<213> 智人
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290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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<212> DNA
<213> 智人
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165 170 175
Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp
180 185 190
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
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Tyr Cys Gln Gln His Trp Ser Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr
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Lys Val Glu Ile Lys Leu Glu Asp Lys Thr His Thr Lys Val Glu Pro
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Lys Thr Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
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485 490 495
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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515 520 525
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Trp Ala Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
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Gln Tyr Tyr Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
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Lys
<210> 31
<211> 2181
<212> DNA
<213> 智人
<400> 31
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<213> 智人
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agcagtctgc agccggaaga cttcgcaact tattactgtc agcaagcttc ttacgctccg 2160
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<211> 732
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Tyr Ser Ala Phe Ala Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Tyr His Phe Pro Phe Gly Phe Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp
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Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala
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Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser
180 185 190
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210 215 220
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Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
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Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Ser Ser Ser Ile His Trp Val
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565 570 575
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Ser
580 585 590
Gly Val Ser His Tyr Gly Ser Val Tyr Tyr Ser Trp Trp Ala Leu Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
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Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 智人
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Gly Ser Ser
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<210> 58
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 58
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa tggtactacg ctccgatcac gttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 59
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<400> 59
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacatctct tattattata tgcactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttcttctt attatggctc tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgctcttgg 300
tgggcttggg cttttgacta ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcg 354
<210> 60
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人
<400> 60
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cattactctg tttacgcttc tctgatcacg 300
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa 330
<210> 61
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<400> 61
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacatctct tattattata tccactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttattctt cttctagcta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgctcttct 300
tacgcttggg ctattgacta ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcg 354
<210> 62
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人
<400> 62
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa tctggttggt ggggtgtttc tctgatcacg 300
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa 330
<210> 63
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<400> 63
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacatctct tattattata tccactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttatcctt cttctggcta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgctcttct 300
ttctactggg ctatggacta ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcg 354
<210> 64
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 64
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa tcttacgctg cttacctgtt cacgttcgga 300
cagggtacca aggtggagat caaa 324
<210> 65
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacatctct tattattcta tgcactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttcttctt attatagctc tacttcttat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcttctgg 300
tacccgggta tggactactg gggtcaagga accctggtca ccgtctcctc g 351
<210> 66
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 66
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cattggtctt acccgatcac gttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 67
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<400> 67
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacctctct tattattata tgcactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttattctt attctggcta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgctcttct 300
ttcgcttggg cttttgacta ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcg 354
<210> 68
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 68
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa ggtggttggg gtccgttcac gttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 69
<211> 345
<212> DNA
<213> 智人
<400> 69
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacatctct tattcttcta tccactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttatcctt cttatagctc tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgctactac 300
gctatggact actggggtca aggaaccctg gtcaccgtct cctcg 345
<210> 70
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 70
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa gctttctact acccgatcac gttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 71
<211> 387
<212> DNA
<213> 智人
<400> 71
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacttttct tcttcttcta tacactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttcttctt cttatggcta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcggtggt 300
tctggtgttt ctcattacgg ttctgtttac tactcttggt gggctttgga ctactggggt 360
caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcg 387
<210> 72
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 72
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa gcttcttacg ctccgatcac gttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 73
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人
<400> 73
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacctctct tattattata tgcactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttattctt cttatggcta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgctggtct 300
catgtttctg gtcattactc tggtatggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcg 366
<210> 74
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 74
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa tcttcttatt ctctgatcac gttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 75
Gly Thr Thr Ala Ala Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala
1 5 10 15
<210> 76
<211> 2169
<212> DNA
<213> 智人
<400> 76
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacatctat tattcttcta tccactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttatcctt attatggcta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgctactac 300
cattacggtt tggactactg gggtcaagga accctggtca ccgtctcctc gggtggaggt 360
ggcagtgata tccagatgac ccagtccccg agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg 420
gtcaccatca cctgccgtgc cagtcagtcc gtgtccagcg ctgtagcctg gtatcaacag 480
aaaccaggaa aagctccgaa gcttctgatt tactcggcat ccagcctcta ctctggagtc 540
ccttctcgct tctctggtag ccgttccggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg 600
cagccggaag acttcgcaac ttattactgt cagcaatctt actggcattc ttacctgatc 660
acgttcggac agggtaccaa ggtggagatc aaactcgagg acaaaactca cacaaaagtg 720
gagcccaaaa cttctgataa gacccatact tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg cgaggagcag 960
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccaatggtgt ttgacctgcc cccatcccgg 1140
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcatgg tcaagggctt ctatcccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctgtacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
cgctggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaagcg gcagcgagac tcccgggacc 1440
tcagagtccg ccacacccga aagtggtggc ggagaggttc agctggtgga gtctggcggt 1500
ggcctggtgc agccaggggg ctcactccgt ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaacatc 1560
tcttattctt ctatccactg ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgca 1620
tatatttctt cttattatgg ctatacttat tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 1680
ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt aagagctgag 1740
gacactgccg tctattattg tgctcgcgct cattacttcc cgtgggctgg tgctatggac 1800
tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcgggtg gaggtggcag tgatatccag 1860
atgacccagt ccccgagctc cctgtccgcc tctgtgggcg atagggtcac catcacctgc 1920
cgtgccagtc agtccgtgtc cagcgctgta gcctggtatc aacagaaacc aggaaaagct 1980
ccgaagcttc tgatttactc ggcatccagc ctctactctg gagtcccttc tcgcttctct 2040
ggtagccgtt ccgggacgga tttcactctg accatcagca gtctgcagcc ggaagacttc 2100
gcaacttatt actgtcagca atactactgg ccgatcacgt tcggacaggg taccaaggtg 2160
gagatcaaa 2169
<210> 77
<211> 723
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Tyr Tyr Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr His Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
115 120 125
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
130 135 140
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln
145 150 155 160
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu
165 170 175
Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp
180 185 190
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
195 200 205
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Trp His Ser Tyr Leu Ile Thr Phe Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Leu Glu Asp Lys Thr His Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Pro Lys Thr Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Met Val Phe Asp Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
465 470 475 480
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val
485 490 495
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
500 505 510
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His Trp Val
515 520 525
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser
530 535 540
Tyr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
545 550 555 560
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
565 570 575
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala His Tyr
580 585 590
Phe Pro Trp Ala Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
595 600 605
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
610 615 620
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
625 630 635 640
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
645 650 655
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr
660 665 670
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe
675 680 685
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
690 695 700
Cys Gln Gln Tyr Tyr Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
705 710 715 720
Glu Ile Lys
<210> 78
<211> 2187
<212> DNA
<213> 智人
<400> 78
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacatctat tattcttcta tccactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttatcctt attatggcta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgctactac 300
cattacggtt tggactactg gggtcaagga accctggtca ccgtctcctc gggtggaggt 360
ggcagtgata tccagatgac ccagtccccg agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg 420
gtcaccatca cctgccgtgc cagtcagtcc gtgtccagcg ctgtagcctg gtatcaacag 480
aaaccaggaa aagctccgaa gcttctgatt tactcggcat ccagcctcta ctctggagtc 540
ccttctcgct tctctggtag ccgttccggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg 600
cagccggaag acttcgcaac ttattactgt cagcaatctt actggcattc ttacctgatc 660
acgttcggac agggtaccaa ggtggagatc aaactcgagg acaaaactca cacaaaagtt 720
gagcccaaat cttctgataa gacccataat tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccaatccgg 1140
gagctgatga ccagcaacca ggtcagcctg agctgcgccg tcaaaggctt ctatcccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctcgtgagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaagcg gcagcgagac tcccgggacc 1440
tcagagtccg ccacacccga aagtggtggc ggagaggttc agctggtgga gtctggcggt 1500
ggcctggtgc agccaggggg ctcactccgt ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaacatc 1560
tcttcttatt atatccactg ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgca 1620
tctatttatt cttcttatgg ctatacttct tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 1680
ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt aagagctgag 1740
gacactgccg tctattattg tgctcgcact gttcgtggat ccaaaaaacc gtacttctct 1800
ggttgggcta tggactactg gggtcaagga accctggtca ccgtctcctc gggtggaggt 1860
ggcagtgata tccagatgac ccagtccccg agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg 1920
gtcaccatca cctgccgtgc cagtcagtcc gtgtccagcg ctgtagcctg gtatcaacag 1980
aaaccaggaa aagctccgaa gcttctgatt tactcggcat ccagcctcta ctctggagtc 2040
ccttctcgct tctctggtag ccgttccggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg 2100
cagccggaag acttcgcaac ttattactgt cagcaatact cttggggtcc gttcacgttc 2160
ggacagggta ccaaggtgga gatcaaa 2187
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<211> 729
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Tyr Tyr Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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260 265 270
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275 280 285
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ile Arg Glu Leu Met Thr
370 375 380
Ser Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
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Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val
515 520 525
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530 535 540
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<212> PRT
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<211> 728
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<400> 83
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<210> 88
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<400> 88
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caactcctct ttttatttta tgcactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcaact gtttatcctt atcttgacta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcgcgttt 300
ccgggttctt accatcctat ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360
<210> 89
<211> 2175
<212> DNA
<213> 智人
<400> 89
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caactcctct ttttatttta tgcactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcaact gtttatcctt atcttgacta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcgcgttt 300
ccgggttctt accatcctat ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360
ggtggaggtg gcagtgatat ccagatgacc cagtccccga gctccctgtc cgcctctgtg 420
ggcgataggg tcaccatcac ctgccgtgcc agtcagtccg tgtccagcgc tgtagcctgg 480
tatcaacaga aaccaggaaa agctccgaag cttctgattt actcggcatc cagcctctac 540
tctggagtcc cttctcgctt ctctggtagc cgttccggga cggatttcac tctgaccatc 600
agcagtctgc agccggaaga cttcgcaact tattactgtc agcaatcttc ttattctctg 660
atcacgttcg gacagggtac caaggtggag atcaaactcg aggacaaaac tcacacaaaa 720
gtggagccca aaacttctga taagacccat acttgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgcgaggag 960
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccaatgg tgtttgacct gcccccatcc 1140
cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgca tggtcaaggg cttctatccc 1200
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctgtaca gcaagctcac cgtggacaag 1320
agccgctggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaaa gcggcagcga gactcccggg 1440
acctcagagt ccgccacacc cgaaagtggt ggcggagagg ttcagctggt ggagtctggc 1500
ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcaac 1560
atctcttatt cttctatcca ctgggtgcgt caggccccgg gtaagggcct ggaatgggtt 1620
gcatatattt cttcttatta tggctatact tattatgccg atagcgtcaa gggccgtttc 1680
actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac aaatgaacag cttaagagct 1740
gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc gctcattact tcccgtgggc tggtgctatg 1800
gactactggg gtcaaggaac cctggtcacc gtctcctcgg gtggaggtgg cagtgatatc 1860
cagatgaccc agtccccgag ctccctgtcc gcctctgtgg gcgatagggt caccatcacc 1920
tgccgtgcca gtcagtccgt gtccagcgct gtagcctggt atcaacagaa accaggaaaa 1980
gctccgaagc ttctgattta ctcggcatcc agcctctact ctggagtccc ttctcgcttc 2040
tctggtagcc gttccgggac ggatttcact ctgaccatca gcagtctgca gccggaagac 2100
ttcgcaactt attactgtca gcaatactac tggccgatca cgttcggaca gggtaccaag 2160
gtggagatca aatga 2175
<210> 90
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<400> 90
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caactcctct ttttatttta tgcactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcaact gtttatcctt atcttgacta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcgcgttt 300
ccgggttctt accatcctat ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360
<210> 91
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 91
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa tcttcttatt ctctgatcac gttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 92
<211> 2193
<212> DNA
<213> 智人
<400> 92
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caactcctct ttttatttta tgcactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcaact gtttatcctt atcttgacta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcgcgttt 300
ccgggttctt accatcctat ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360
ggtggaggtg gcagtgatat ccagatgacc cagtccccga gctccctgtc cgcctctgtg 420
ggcgataggg tcaccatcac ctgccgtgcc agtcagtccg tgtccagcgc tgtagcctgg 480
tatcaacaga aaccaggaaa agctccgaag cttctgattt actcggcatc cagcctctac 540
tctggagtcc cttctcgctt ctctggtagc cgttccggga cggatttcac tctgaccatc 600
agcagtctgc agccggaaga cttcgcaact tattactgtc agcaatcttc ttattctctg 660
atcacgttcg gacagggtac caaggtggag atcaaactcg aggacaaaac tcacacaaaa 720
gttgagccca aatcttctga taagacccat aattgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccaatc 1140
cgggagctga tgaccagcaa ccaggtcagc ctgagctgcg ccgtcaaagg cttctatccc 1200
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctcgtga gcaagctcac cgtggacaag 1320
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaaa gcggcagcga gactcccggg 1440
acctcagagt ccgccacacc cgaaagtggt ggcggagagg ttcagctggt ggagtctggc 1500
ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcaac 1560
atctcttctt attatatcca ctgggtgcgt caggccccgg gtaagggcct ggaatgggtt 1620
gcatctattt attcttctta tggctatact tcttatgccg atagcgtcaa gggccgtttc 1680
actataagcg cagacacatc caaaaacaca gcctacctac aaatgaacag cttaagagct 1740
gaggacactg ccgtctatta ttgtgctcgc actgttcgtg gatccaaaaa accgtacttc 1800
tctggttggg ctatggacta ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcgggtgga 1860
ggtggcagtg atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 1920
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag tccgtgtcca gcgctgtagc ctggtatcaa 1980
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttactcgg catccagcct ctactctgga 2040
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 2100
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaat actcttgggg tccgttcacg 2160
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa tga 2193
<210> 93
<211> 730
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ser Ser Phe Tyr
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Val Tyr Pro Tyr Leu Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Phe Pro Gly Ser Tyr His Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
115 120 125
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
130 135 140
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp
145 150 155 160
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala
165 170 175
Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser
180 185 190
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
195 200 205
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Leu Ile Thr Phe Gly
210 215 220
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Leu Glu Asp Lys Thr His Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Asn Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ile Arg Glu Leu Met
370 375 380
Thr Ser Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
465 470 475 480
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu
485 490 495
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
500 505 510
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Ser Tyr Tyr Ile His Trp
515 520 525
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Tyr
530 535 540
Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
545 550 555 560
Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn
565 570 575
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val
580 585 590
Arg Gly Ser Lys Lys Pro Tyr Phe Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr Trp
595 600 605
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
610 615 620
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
625 630 635 640
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val
645 650 655
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
660 665 670
Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
675 680 685
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
690 695 700
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Trp Gly Pro Phe Thr
705 710 715 720
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
725 730
<210> 94
<211> 724
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ser Ser Phe Tyr
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Val Tyr Pro Tyr Leu Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Phe Pro Gly Ser Tyr His Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
115 120 125
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
130 135 140
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp
145 150 155 160
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala
165 170 175
Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser
180 185 190
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
195 200 205
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Leu Ile Thr Phe Gly
210 215 220
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Leu Glu Asp Lys Thr His Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Thr Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Met Val Phe Asp Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
465 470 475 480
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu
485 490 495
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
500 505 510
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His Trp
515 520 525
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser
530 535 540
Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
545 550 555 560
Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn
565 570 575
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala His
580 585 590
Tyr Phe Pro Trp Ala Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
595 600 605
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
610 615 620
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
625 630 635 640
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln
645 650 655
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu
660 665 670
Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp
675 680 685
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
690 695 700
Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
705 710 715 720
Val Glu Ile Lys

Claims (18)

1.一种激活细胞中Wnt信号通路的方法，所述方法包括使具有卷曲蛋白2(FZD2)受体或卷曲蛋白7(FZD7)和Wnt共受体的细胞与多价结合分子接触，其中所述多价结合分子包含：
(a)具有C末端和N末端的Fc结构域或其包含CH3结构域的片段，
(b)(i)具有至少两个结合位点的FZD2结合结构域，其中至少一个结合位点结合至FZD2受体，包含与2890-hole-2539-2542的轻链可变结构域(VL)(具有由SEQ ID NO:85编码的氨基酸序列)具有50％、55％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性、或者2890-hole-2539-2542的VL的CDR的轻链可变结构域(VL)，并且包含含有2890-hole-2542的重链可变结构域(VH)(具有由SEQ ID NO:84编码的氨基酸序列)、或者2890-hole-2539-2542或12735-hole-2539-2542的VH的CDR的重链可变结构域(VH)，或者(ii)具有至少两个结合位点的FZD7结合结构域，其中至少一个结合位点结合至FZD7受体，包含与12735-hole-2539-2542的轻链可变结构域(VL)(具有由SEQ ID NO:87编码的氨基酸序列)具有50％、55％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性、或者12735-hole-2539-2542的VH的CDR的轻链可变结构域(VL)，并且包含含有12735-hole-2539-2542的重链可变结构域(VH)(具有由SEQ ID NO:86编码的氨基酸序列)、或者12735-hole-2539-2542的VH的CDR的重链可变结构域(VH)，和
(c)具有至少两个结合位点的Wnt共受体结构域，其中至少一个结合位点结合至Wnt共受体，
其中所述FZD2或FZD7结合结构域连接至所述Fc结构域的一末端或其片段的一末端，所述Wnt共受体结合结构域连接至所述Fc结构域的另一末端或其片段的另一末端。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述FZD2或FZD7结合结构域包含：
(a)(i)结合所述FZD2受体的双体抗体，所述双体抗体包含两条肽，每条肽包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，其中来自一条肽的VH和VL与另一条肽的VL和VH配对，从而形成双体抗体，并且其中所述VL包含2890-hole-2539-2542的VL(具有由SEQID NO:85编码的氨基酸序列)或2890-hole-2539-2542的VL的CDR，所述VH包含2890-hole-2542的VH(具有由SEQ ID NO:84编码的氨基酸序列)或2890-hole-2539-2542的VH的CDR，或者(ii)结合所述FZD7受体的双体抗体，所述双体抗体包含两条肽，每条肽包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，其中来自一条肽的VH和VL与另一条肽的VL和VH配对，从而形成双体抗体，并且其中所述VL包含12735-hole-2539-2542的VL(具有由SEQ IDNO:87编码的氨基酸序列)或12735-hole-2539-2542的VL的CDR，所述VH包含12735-hole-2539-2542的VH(具有由SEQ ID NO:86编码的氨基酸序列)或12735-hole-2539-2542的VH的CDR，或
(b)(i)scFv，其包含含有2890-hole-2539-2542的VL(具有由SEQ ID NO:85编码的氨基酸序列)或2890-hole-2539-2542的VL的CDR的VL，和包含含有2890-hole-2542的VH(具有由SEQ ID NO:84编码的氨基酸序列)或2890-hole-2539-2542的VH的CDR的VH区，并结合FZD2受体，或者(ii)scFv，其包含含有12735-hole-2539-2542的VL(具有由SEQ ID NO:87编码的氨基酸序列)或者2890-hole-2539-2542或12735-hole-2539-2542的VL的CDR的VL，和包含含有12735-hole-2539-2542的VH(具有由SEQ ID NO:86编码的氨基酸序列)或12735-hole-2539-2542的VH的CDR的VH区，并结合FZD7受体，并且
所述Wnt共受体结合结构域包含：
(c)结合所述Wnt共受体的双体抗体，所述双体抗体包含两条肽，每条肽包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，其中来自一条肽的VH和VL与另一条肽的VL和VH配对，从而形成双体抗体，或，
(de)结合所述共受体的包含VL和VH区的scFv，或
(e)所述共受体的内源性配体或结合所述共受体的此类配体的片段。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述Wnt共受体结合结构域结合至所述Wnt共受体上的Wnt配体结合位点。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Wnt共受体结合结构域结合至Wnt3和/或Wnt1结合位点。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述Fc结构域为IgG Fc结构域。
6.一种多价结合分子，其中所述多价结合分子包含：
(a)具有C末端和N末端的Fc结构域或其包含CH3结构域的片段，
(b)(i)具有至少两个结合位点的FZD2结合结构域，其中至少一个结合位点包含含有2890-hole-2539-2542的轻链可变结构域(VL)(具有由SEQ ID NO:85编码的氨基酸序列)或者2890-hole-2539-2542的VL的CDR的轻链可变结构域(VL)，并包含含有2890-hole-2542的重链可变结构域(VH)(具有由SEQ ID NO:84编码的氨基酸序列)或者2890-hole-2539-2542的VH的CDR的重链可变结构域(VH)，并结合至FZD2受体，或者(ii)具有至少两个结合位点的FZD7结合结构域，其中至少一个结合位点包含含有12735-hole-2539-2542的轻链可变结构域(VL)(具有由SEQ ID NO:87编码的氨基酸序列)或12735-hole-2539-2542的VL的CDR的轻链可变结构域(VL)，并包含含有12735-hole-2539-2542的重链可变结构域(VH)(具有由SEQID NO:86编码的氨基酸序列)或者2890-hole-2539-2542或12735-hole-2539-2542的VH的CDR的重链可变结构域(VH)，并结合至FZD7受体，和
(c)具有至少两个结合位点的Wnt共受体结合结构域，其中至少一个结合位点结合至Wnt共受体，
其中FZD2或FZD7结合结构域连接至所述Fc结构域的一末端，和所述Wnt共受体结合结构域连接至所述Fc结构域的另一末端。
7.根据权利要求6所述的多价结合分子，其中所述FZD2或FZD7结合结构域包含：
(a)(i)结合所述FZD2受体的双体抗体，所述双体抗体包含两条肽，每条肽包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，其中来自一条肽的VH和VL与另一条肽的VL和VH配对，从而形成双体抗体，并且其中所述VL包含2890-hole-2539-2542的VL(具有由SEQID NO:85编码的氨基酸序列)或2890-hole-2539-2542的VL的CDR，所述VH包含2890-hole-2542的VH(由SEQ ID NO:84编码)或2890-hole-2539-2542的VH的CDR，或者(ii)结合所述FZD7受体的双体抗体，所述双体抗体包含两条肽，每条肽包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，其中来自一条肽的VH和VL与另一条肽的VL和VH配对，从而形成双体抗体，并且其中所述VL包含12735-hole-2539-2542的VL(具有由SEQ ID NO:87编码的氨基酸序列)或12735-hole-2539-2542的VL的CDR，所述VH包含12735-hole-2539-2542的VH(具有由SEQ ID NO:86编码的氨基酸序列)或12735-hole-2539-2542的VH的CDR，或
(b)(i)scFv，其包含结合FZD2受体的VL和VH区，其中所述VL包含2890-hole-2539-2542的VL(具有由SEQ ID NO:85编码的氨基酸序列)或者2890-hole-2539-2542或12735-hole-2539-2542的VL的CDR，和所述VH包含2890-hole-2542的VH(具有由SEQ ID NO:86编码的氨基酸序列)或2890-hole-2539-2542的VH的CDR，或者(ii)scFv，其包含结合FZD7受体的VL和VH区，其中所述VL包含12735-hole-2539-2542的VL(具有由SEQ ID NO:87编码的氨基酸序列)或12735-hole-2539-2542的VL的CDR，和所述VH包含12735-hole-2539-2542的VH(具有由SEQ ID NO:86编码的氨基酸序列)或12735-hole-2539-2542的VH的CDR，和
所述Wnt共受体结合结构域包含：
(d)结合所述共受体的双体抗体，所述双体抗体包含两条肽，每条肽包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，其中来自一条肽的VH和VL与另一条肽的VL和VH配对，从而形成双体抗体，其中所述VL包含2890-hole-2539-2542、2890-knob-2539-2542、12735-hole-2539-2542或12735-knob-2539-2542的VL(具有由SEQ ID NO:50或52编码的氨基酸序列)或者2890-hole-2539-2542或12735-hole-2539-2542或12735-knob-2539-2542的VL的CDR，所述VH包含2890-hole-2542、2890-knob-2542、12735-hole-2539-2542或12735-knob-2539-2542的VH(具有由SEQ ID NO:49或53编码的氨基酸序列)、或者2890-hole-2539-2542或12735-hole-2539-2542的VH的CDR，或
(e)scFv，其包含结合所述共受体的VL和VH区，其中所述VL包含2890-hole-2539-2542、2890-knob-2539-2542或12735-hole-2539-2542、或12735-knob-2539-2542的VL(具有由SEQ ID NO:50或52编码的氨基酸序列)或者2890-hole-2539-2542或12735-hole-2539-2542的VL的CDR，和所述VH包含2890-hole-2542、2890-hole-2539-2542或12735-hole-2539-2542或12735-knob-2539-2542的VH(具有由SEQ ID NO:49或53编码的氨基酸序列)、或者2890-hole-2539-2542或12735-hole-2539-2542的VH的CDR。
8.根据权利要求6所述的多价结合分子，其中所述结合结构域中的至少之一是双特异性的。
9.根据权利要求6所述的多价结合分子，其包含含有SEQ ID NO:77的第一肽和含有SEQID NO:79的第二肽并结合FZD2。
10.根据权利要求6所述的多价结合分子，其包含含有SEQ ID NO:81的第一肽和含有SEQ ID NO:83的第二肽并结合FZD7。
11.根据权利要求6所述的多价结合分子，其包含基本上由SEQ ID NO:77组成的第一肽和基本上由SEQ ID NO:79组成的第二肽并结合FZD2。
12.根据权利要求6所述的多价结合分子，其包含基本上由SEQ ID NO:81组成的第一肽和基本上由SEQ ID NO:83组成的第二肽。
13.一种药物组合物，其包含根据权利要求6至12中任一项所述的多价结合分子和药学上可接受的载体。
14.一种用于在有需要的受试者中增强组织再生或治疗患有与减少的Wnt信号传导有关的病况的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用足以增强组织再生或缓解与所述病况相关的症状的量的根据权利要求6至12中任一项所述的多价结合分子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述组织为骨骼组织或肠组织。
16.一种促进细胞上的FZD2或FZD7受体和Wnt共受体的相互作用从而激活所述细胞中Wnt信号通路的方法，所述方法包括：
a)选择具有C末端和N末端的Fc结构域或其包含CH3结构域的片段；
b)在所述Fc结构域的一末端上连接二价FZD2或FZD7受体结合结构域，所述二价FZD2或FZD7受体结合结构域包含结合2890-hole-2539-2542的FZD2受体或12735-hole-2539-2542的FZD7受体的VL(分别具有由SEQ ID NO85或87编码的氨基酸序列)或者2890-hole-2539-2542或12735-hole-2539-2542的VL的CDR，和VH包含2890-hole-2542或12735-hole-2539-2542的VH(分别具有由SEQ ID NO:84或86编码的氨基酸序列)的VH、或者2890-hole-2539-2542或12735-hole-2539-2542的VH的CDR，并在所述Fc结构域的另一末端上连接二价Wnt共受体结合结构域，从而形成四价结合分子；
c)在其中所述四价结合分子结合至所述FZD2或FZD7受体和所述Wnt共受体的条件下，使所述四价结合分子与表达所述FZD2或FZD7受体和所述Wnt共受体的细胞接触，从而激活所述Wnt信号通路。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述二价FZD2或FZD7受体结合结构域包含双体抗体，所述双体抗体包含2890-hole-2539-2542的或12735-hole-2539-2542的VL(具有由SEQ ID NO 85或87编码的氨基酸序列)或者2890-hole-2539-2542的或12735-hole-2539-2542的VL的CDR，VH包含2890-hole-2542的或12735-hole-2539-2542的VH(具有由SEQ IDNO 84或86编码的氨基酸序列)、或者2890-hole-2539-2542的或12735-hole-2539-2542的VH的CDR，所述二价Wnt受体结合结构域包含结合Wnt共受体的双体抗体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述结合Wnt共受体的双体抗体与所述Wnt共受体上的Wnt1或Wnt3a结合位点之一或两者结合。
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