KR20220024460A - 다가 fzd 및 wnt 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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사크데브 시드후
유용 타오
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안틀라 테라퓨틱스 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 세포 상의 FZD 수용체 및 공동 수용체에 대한 다가 결합 분자에 의한 결합에 영향을 미치는 방법에 관한 것으로, 다가 결합 분자에 의한 세포 상의 FZD 수용체 및 공동 수용체 모두에 대한 결합은 Wnt 신호전달 경로를 활성화시킨다. 본 발명은 또한, FZD 수용체 결합 도메인 및 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 Fc 도메인의 어느 한쪽 말단 상의 Wnt 공동 수용체 결합 도메인을 포함하는 다가 결합 분자 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

다가 FZD 및 WNT 결합 분자 및 이의 용도
본 출원은 미국 35 U.S.C.119(e)에 따라 2019년 6월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 제 62/860,161 호에 기초하여 우선권을 주장하며, 그 전체 내용D은 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 방식으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다. 2020년 6월 10일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 115773_PC424WO_SL.txt이고, 크기는 279,203 바이트이다.
Wnt 신호전달 경로는 성인의 배아 발달 및 조직 항상성(homeostasis)에 중요하다. Wnt 리간드는 증식, 분화, 생존 및 이동과 같은 다양한 세포 과정을 조절하는 분비형 성장 인자이다. Wnt 리간드는 조직 줄기세포 자기 복제의 제어 및 많은 전구 세포 집단의 조절에 보편적으로 중요하다. Wnt 단백질의 소수성 및 고감도의 3차 구조는 생화학적 정제가 곤란하고, 시험관내 및 생체내 사용을 불가능하게 하였다.
19개의 Wnt 리간드는 10개의 프리즐드(Frizzled) 세포 표면 수용체(FZD)의 네트워크 및 상이한 세포내 신호전달 분지의 선택적 결합을 안내하는 여러 공동 수용체 중 하나와 상호작용하는 인간에 존재한다(Wodarz, A. 및 Nusse, R. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 59-88(1998), Angers, S and Moon, RT, transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 468-477(2009)). FZD는 7개의 소수성 막횡단 도메인과 시스테인이 풍부한 리간드 결합 도메인을 포함하는 보존된 구조적 특징을 갖는다. FZD는 Wnt 평면 세포 극성(PCP) 경로, 표준적인 Wnt/β-카테닌 경로, 및 Wnt/칼슘 경로로 알려진 세 가지 별개의 신호전달 경로에서 기능하는 것으로 알려져 있다. Wnt 신호전달 경로의 활성화는 또한 위에 나열된 세포 과정의 기초가 되는 세포 기계에 영향을 미치는 유전자의 발현을 조절하는 세포내 신호전달 캐스케이드의 차등 참여를 지시하기 위해 Wnt 공동 수용체의 존재를 필요로 한다. 예를 들어, Wnt 리간드는 프리즐드 수용체 및 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 5 및 6(LRP5/6) 공동 수용체 패밀리의 멤버에 결합하여, Wnt/β-카테닌 경로를 활성화하거나, 또는 수용체 티로신 키나제 유사 고아(orphan) 수용체 1 및 2(ROR1/2), 수용체 티로신 키나제(RYK) 또는 단백질 티로신 키나제 7(PTK7) 공동 수용체와 관련되어 Wnt/PCP 경로 또는 대체 β카테닌-독립 신호 경로를 개시한다. 종종 표준적인 경로라고도 하는 Wnt/ß-카테닌 경로는 전사 인자의 T-세포 인자/림프 인핸서 인자(LEF/TCF) 패밀리와 상호작용하여 상황별 유전자(context-specific genes)의 발현을 조절하는 전사 이펙터 β-카테닌의 번역 후 축적에서 최고조에 달한다.
Wnt는 기능을 위해 지질화가 필요하고(Janda et al., Science. 337, 59-64(2012); Kadowaki et al., Genes Dev. 10, 3116-3128(1996)), 이들의 소수성 특성은 생화학적 조작을 복잡하게 하고, 결과적으로 소수의 Wnt만이 정제되었다(Willert et al., Nature 423, 448-452(2003)). 더욱이, Wnt는 특히 과다발현되거나 고용량으로 적용될 때 본질적으로 다중 수용체에 대해 교차 반응성이고(He et al. Science. 275, 1652-1654 (1997); Andres et al. Wnt-프리즐드 상호 작용의 체계적인 매핑은 별개의 Wnt-프리즐드 쌍에 의한 기능적 선택성을 나타낸다. Journal of Biological (2015) (http://www.jbc.org/content/early/2015/01/20/jbc.M114. 12648.short에서 이용 가능).; Holmen et al., J. Biol. Chem 277, 34727-34735(2002).). 결과적으로, 프리즐드 수용체 복합체를 선택적으로 활성화하여 다양한 상황에서 각각의 특정 기능을 결정하거나 퇴행성(degenerative) 상태에 대한 치료 가능성을 평가하는 것은 불가능하였다. 본 명세서에 기술된 다가 결합 분자 및 방법은 미리 선택된 프리즐드 수용체-공동 수용체 복합체를 선택적으로 활성화한다. 본 명세서에 기술된 다가 결합 분자의 투여는 적절한 프리즐드 공동 수용체 복합체를 활성화함으로써 퇴행성 상태를 치료하는 것을 기도하고 있다.
FZD 수용체 및 공동 수용체 둘 모두에 대한 펩타이드의 결합이 Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 세포 상의 FZD 수용체 및 Wnt 공동 수용체에 대한 펩타이드의 결합에 영향을 미치는 방법이 본 명세서에 기재되어 있다.
Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 다가 결합 분자 및 그의 사용 방법이 또한 본 명세서에 기재되어 있다. 다가 결합 분자는 FZD 수용체와 Wnt 공동 수용체 둘 모두에 결합하여 Wnt 신호전달 경로를 활성화한다. 본 발명의 다가 결합 분자는 또한 본 명세서에서 "FZD 작용제" 또는 "FZDag"로 지칭된다. 본 발명의 분자가 FZD 및 LRP5/6에 결합하는 특정 실시형태에서, 분자는 "프리즐드 및 LRP5/6 작용제" 또는 "FLAgs"로 지칭될 수 있다. 다가 결합 분자는 CH3 도메인, 및 FZD 수용체를 결합하는 제1 결합 도메인 및 Wnt 공동 수용체를 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 Fc 도메인, 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 FZD 결합 도메인은 Fc 도메인의 한 말단에 연결되고, 공동 수용체 결합 도메인은 Fc 도메인의 다른 말단에 연결된다. 따라서, FZD 수용체에 대한 결합 도메인 및 공동 수용체에 대한 결합 도메인은 직접 연결되지 않고, 오히려 Fc 도메인 또는 CH3 도메인을 포함하는 이의 단편에 의해 분리된다. 결합 도메인의 이러한 구성은 예기치 않게 높은 수준의 Wnt 신호전달 경로 활성화를 생성한다. FZD 결합 도메인은 FZD 수용체에 대한 단일 결합 부위(파라토프)를 갖는 1가일 수 있거나, FZD 수용체에 대한 1 초과의 결합 부위를 갖는 다가일 수 있고, 예를 들어 결합 도메인은 2가, 3가 또는 4가일 수 있다. Wnt 공동 수용체 결합 도메인은 Wnt 공동 수용체에 대한 단일 결합 부위(파라토프)를 갖는 1가일 수 있거나, Wnt 공동 수용체에 대한 1보다 많은 결합 부위를 갖는 다가일 수 있으며, 예를 들어 결합 도메인은 2가, 3가 또는 4가일 수 있다.
다가 결합 분자를 생성하기 위한 본 발명의 방법은 시험관내 및 생체내에서 임의의 FZD 수용체 복합체의 선택적이고 강력한 활성화를 가능하게 한다. FZD 및 이들의 공동 수용체를 표적으로 하는 수백 개의 합성 항체 패널을 활용하여 1, 2 또는 복수의 FZD 수용체를 선택적이고 합리적으로 활성화 하기 위한 다가 결합 분자를 생성하였다. 본 발명의 다가 결합 분자는 매우 안정하고, 대규모 생산 및 용이한 정제가 가능하고, 예측 가능한 약물 동태를 갖고, 그리고 낮은 면역원성을 나타낼 것으로 생각된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자의 결합 도메인은 하나 이상의 FZD 수용체 및 LRP, 예를 들어, LRP 5 및/또는 LRP6에 결합하고, 또는 본 명세서에서 FLAg로 지칭된다. 특정 FZD 및 이들의 LRP 공동 수용체를 표적으로 하는 FLAg는 유도 분화 및 세포 치료를 개선하고, 조직 오르가노이드 성장을 유지하며, 생체 내에서 내인성 줄기세포를 동원하고, 손상 후 조직 복구를 촉진하고, 그리고 조직 퇴행 후 기능을 회복한다.
FZD 작용제의 Fc 도메인은 면역글로불린의 Fc 도메인일 수 있다. 면역글로불린은 IgG, 예를 들어, IgG1일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 다가 결합 분자는 펩타이드 이량체이고, 펩타이드는 이량체화 하는 Fc 도메인의 고유 능력을 통해, 또는 2개의 상이한 펩타이드의 특이적 집합을 가능하게 하는 Fc 내의 놉-인-홀 구성을 통해 이량체화되어 다가 결합 도메인을 생성한다. 놉-인-홀(knob-in-hole) 구성을 통해 펩타이드를 이량체화하는 방법은 WO2018/026942(발명자 Van Dyk et al.)에 설명되어 있으며, 이는 본 발명에서 참고로 포함된다.
본 명세서에 기재된 FZD 작용제의 다가 결합 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 각각의 수용체 또는 공동 수용체 표적의 동일한 에피토프에 대한 2개의 결합 부위를 갖는 2가 및 단일 특이적일 수 있다. 결합 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 각각의 표적 상의 상이한 에피토프를 결합하는 각 부위와 함께 2개의 결합 부위를 갖는 2가 및 이중 특이적일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, FZD 결합 도메인은 FZD 수용체 상의 동일하거나 상이한 에피토프에 결합하기 위한 2개의 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, FZD 결합 도메인은 FZD에 결합하는 하나 이상의 중쇄(heavy-chain) 가변 도메인(VH) 단편 및/또는 하나 이상의 경쇄(light-chain) 가변 도메인(VL) 단편을 포함한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, FZD 결합 도메인은 FZD에 결합하는 하나 이상의 단일 도메인 항체 단편으로 이루어진다. 본 발명의 다른 실시형태에서, FZD 결합 도메인은 FZD 수용체를 결합하는 FZD 리간드 또는 이의 단편을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, FZD 결합 도메인은 FZD를 결합하는 합성 펩타이드, 예를 들어, 아피바디(affibody), 안키린(ankyrin) 반복 단백질, 피브로넥틴 반복 단백질, 파이노머(fynomer) 또는 안티칼린(anticalin)을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서 FZD 다가 결합 도메인은 scFv를 포함하지 않는다. FZD 리간드는 예를 들어, FZD 수용체를 결합하는 Wnt 단백질 또는 노린(Norrin)의 단편, 또는 하나 이상의 FZD 수용체와 상호작용하도록 친화성 성숙된 또 다른 천연 또는 합성 펩타이드일 수 있다. 노린은 LRP5 및/또는 LRP6과 복합체를 형성하여 표준적인 Wnt 신호전달의 활성화와 관련된 FZD4 특이적 리간드이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 공동 수용체 결합 도메인은 공동 수용체 상의 동일하거나 상이한 에피토프에 결합하기 위한 2개의 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, Wnt 공동 수용체 결합 도메인은 Wnt 공동 수용체에 결합하는 하나 이상의 중쇄 가변 도메인(VH) 단편 및/또는 하나 이상의 경쇄 가변 도메인(VL) 단편을 포함한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 공동 수용체 결합 도메인은 공동 수용체에 결합하는 하나 이상의 단일 도메인 항체 단편으로 이루어진다. 본 발명의 일 실시형태에서, Wnt 공동 수용체 결합 도메인은 Wnt 공동 수용체를 결합하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 펩타이드는 Wnt 공동 수용체를 결합하는 천연 리간드의 단편이거나 Wnt를 결합하는 합성 펩타이드, 예를 들어 아피바디, 안키린 반복 단백질, 피브로넥틴 반복 단백질, 파이노머 또는 안티칼린이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 공동 수용체 결합 도메인은 공동 수용체(예를 들어, 공동 수용체 LRP5/6에 대한 리간드 Dkk1) 또는 친화성 성숙된 또 다른 천연 또는 합성 펩타이드를 결합하는 공동 수용체 리간드 또는 하나 이상의 공동 수용체와 상호 작용하도록 성숙된 또 다른 천연 또는 합성 펩타이드 친화성을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 공동 수용체 다가 결합 도메인은 scFv를 포함하지 않는다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 분자의 각 결합 도메인은 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 각각 포함하는 2개의 펩타이드에 의해 형성될 수 있으며, 여기서 한 펩타이드의 VH 및 VL은 디아바디를 형성하는 다른 펩타이드의 VL 및 VH와 쌍을 이룬다. 이러한 구성에서, 결합 도메인은 그의 표적에 결합하는 2개의 결합 부위를 가지며, 즉, FZD 결합 도메인은 FZD 수용체에 대한 2개의 결합 부위를 갖고, 공동 수용체 결합 도메인은 공동 수용체에 대한 2개의 결합 부위를 갖는다. 놉-인-홀 Fc 구성을 이용하여, VH 및 VL을 포함하는 펩타이드는 동일하지 않지만 쌍을 이루어 FZD 수용체 또는 공동 수용체 상의 2개의 상이한 부위에 결합할 수 있는 이중 특이적 결합 도메인을 형성하도록 조작될 수 있다(도 3a 참조).
본 발명의 일 실시형태에서, 다가 결합 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 Fc 도메인의 각 말단에서 디아바디를 형성하는 2개의 펩타이드를 포함한다. 각 디아바디는 각각의 FZD 수용체 또는 공동 수용체 표적 상에 에피토프에 대한 2개의 결합 부위를 갖는다. 디아바디는 결합 부위가 FZD 수용체 또는 공동 수용체 상의 동일한 에피토프에 결합하는 단일특이적일 수 있거나, 또는 디아바디는 FZD 수용체 또는 공동 수용체 상의 2개의 상이한 에피토프에 이중특이적 결합일 수 있다.
scFv 또는 디아바디를 형성하는 펩타이드는 FZD 수용체에 결합하는 항체 또는 Wnt 공동 수용체에 결합하는 항체로부터 유래될 수 있다. FZD 결합 도메인의 경우, 항체는 하나 이상의 FZD 수용체에 결합하고 Wnt 신호전달을 길항하거나 주어진 FZD 수용체(들)에 대한 Wnt 결합을 억제하는 항체일 수 있거나, 또는 항체는 FZD 수용체에 대한 Wnt 결합을 억제하지 않으면서 하나 이상의 FZD 수용체에 결합하는 항체일 수 있다. 공동 수용체 결합 도메인의 경우, 항체는 공동 수용체에 결합하고 Wnt 신호전달을 길항하거나 공동 수용체에 대한 Wnt 결합을 억제하는 항체일 수 있거나, 또는 항체는 공동 수용체에 대한 Wnt 결합을 억제하지 않으면서 공동 수용체에 결합하는 항체일 수 있다.
FZD 결합 도메인은 FZD 수용체 패밀리의 하나 이상의 멤버, 예를 들어 프리즐드 부류 수용체 1(FZD1), 프리즐드 부류 수용체 2(FZD2), 프리즐드 부류 수용체 3(FZD3), 프리즐드 부류 수용체 4(FZD4), 프리즐드 부류 수용체 5(FZD5), 프리즐드 부류 수용체 6(FZD6), 프리즐드 부류 수용체 & (FZD7), 프리즐드 부류 수용체 1 프리즐드 부류 수용체 8(FZD8), 프리즐드 부류 수용체(FZD 9), 또는 프리즐드 부류 수용체 10(FZD10)에 결합할 수 있다. 공동 수용체 결합 도메인은 임의의 Wnt 공동 수용체, 예를 들어 LRP5/6, PTK7, ROR1/2, RYK, GPR124, TSPAN12, 또는 CD133에 결합할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 공동 수용체 결합 도메인은 LRP5 및/또는 LRP6에 결합한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 공동 수용체 결합 도메인은 공동 수용체 상의 단일 에피토프, 예를 들어 Wnt1 또는 Wnt3a를 결합하는 LRP 단백질의 에피토프에 결합한다. 본 발명의 일 실시형태에서 공동 수용체 결합 도메인은 공동 수용체 상의 2 에피토프, 예를 들어 Wnt1에 결합하는 LRP 상의 에피토프 및 Wnt3a에 결합하는 에피토프에 결합한다.
본 발명의 일 실시형태는 본 명세서에 기재된 유효량의 다가 결합 분자의 존재 하에 체세포를 재 프로그래밍하기에 적합한 조건에서 체세포를 배양하는 것을 포함하는, 유도 만능(pluripotent) 줄기(iPS) 세포를 생성하는 방법을 포함한다. 다가 결합 분자는 다가 결합 분자가 없는 동일한 배양 조건에서 iPS 세포의 생성과 비교하여 iPS 세포의 생성을 촉진시키는 양으로 포함될 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시형태는 본 명세서에 기재된 유효량의 다가 결합 분자의 존재 하에 이들 세포를 배양함으로써 iPS 또는 기타 만능 줄기세포(PSC)의 분화를 다양한 계통으로 향하게 하는 방법이다.
본 발명의 일 실시형태는 배양 칵테일(cocktail)의 일부로서 본 명세서에 기재된 유효량의 다가 결합 분자의 존재 하에 오르가노이드 생성에 적합한 조건에서 조직 샘플을 배양하는 것을 포함하는 조직 오르가노이드 생성 방법을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 다가 결합 분자를 포함하는 배지에서 배양된 조직 오르가노이드를 생성하는 빈도는 다가 결합 분자가 없는 동일한 배지에서 배양된 오르가노이드에 비해 향상된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 조직 오르가노이드는 다가 결합 분자가 없는 동일한 배지에서 배양된 조직 샘플에 비해 다가 결합 분자를 포함하는 배지에서 배양될 때 더 빠르게 생성된다. 본 발명의 실시형태는 배양 칵테일의 일부로서 본 명세서에 기재된 유효량의 다가 결합 분자의 존재 하에 오르가노이드를 배양하는 것을 포함하는 조직 오르가노이드의 유지를 향상시키는 방법을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 다가 결합 분자를 포함하는 배지에서 배양된 조직 오르가노이드의 생존은 다가 결합 분자가 없는 동일한 배지에서 배양된 오르가노이드에 비해 길어진다.
본 발명의 양태는 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자의 제조 방법이다. 본 발명의 일 실시형태에서 다가 결합 분자는 다음 단계 a) 내지 e)에 의해서 생성된다:
a) C-말단 및 N-말단을 갖는 Fc 도메인을 선택하는 단계,
b) 하나 이상의 FZD 수용체에 결합하는 항체를 확인하는 단계,
c) 하나 이상의 Wnt 공동 수용체에 결합하는 항체를 확인하는 단계,
d) (i) 단계 a)의 Fc 도메인,
(ii) 단계 b)의 항체의 VL 및/또는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 하나 이상의 FZD 수용체를 결합하는 단계 b)의 항체로부터 유래된 VL 및/또는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및
(iii) 단계 c)의 항체의 VL 및 VH, 또는 단계 c)의 하나 이상의 Wnt 수용체에 결합하는 단계 c)의 항체로부터 유래된 VL 및 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 생성하는 단계, 및
e) 폴리펩타이드를 생성하기 위해 (d)의 핵산 분자를 발현시키는 단계로서, 폴리펩타이드는 이량체화되어 Fc 도메인, FZD 결합 도메인 및 Wnt 공동 수용체 결합 도메인을 포함하는 다가 결합 분자를 형성하고, FZD 결합 도메인은 단계 b)의 항체의 VL 및 VH를 포함하거나 또는 단계 b)의 항체로부터 유래되고 Fc 도메인의 한 말단에 연결되고, 그리고 Wnt 공동 수용체 결합 도메인은 단계 c)의 항체의 VL 및 VH를 포함하거나 단계 c)의 항체로부터 유래되고 Fc 도메인의 다른 말단에 연결되어 다중 특이적 결합 분자를 형성하는 핵산 분자의 발현단계.
단계 b)의 항체는 하나 이상의 FZD 수용체에 결합하고 Wnt 신호전달을 길항하거나 수용체에 대한 Wnt 결합을 억제하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 단계 b)의 항체는 Wnt 신호전달을 길항하거나 수용체에 대한 Wnt 결합을 억제하지 않으면서 하나 이상의 FZD 수용체에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 단계 (c)의 항체는 하나 이상의 Wnt 공동 수용체 중 하나 이상에 결합하고 Wnt 신호전달을 길항하거나 공동 수용체에 대한 Wnt 결합을 억제하거나, 또는 Wnt를 길항하거나 공동 수용체에 대한 Wnt 결합의 신호전달 또는 억제하지 않고 공동 수용체에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 결합 도메인은 링커를 통해 Fc 도메인에 연결될 수 있다. 본 발명의 모듈식 양태는 Fc 도메인의 말단에서 임의의 주어진 FZD 수용체 및 공동 수용체에 대한 항체의 결합 도메인을 혼합 및 매칭 가능하게 하여, 다중 프리즐드 수용체-공동 수용체 복합체와 결합할 수 있는 다가 결합 분자를 생성하거나 또는 Wnt 신호전달을 활성화하기 위해 단일 프리즐드 수용체-공동 수용체 복합체를 선택적으로 결합한다.
다가 결합 분자는 Fc 도메인 및 하나 이상의 FZD 수용체를 결합하는 결합 도메인 및 하나 이상의 Wnt 공동 수용체를 결합하는 제2 결합 도메인을 갖도록 구성된 펩타이드 이량체를 포함하고, 여기서 FZD 결합 도메인은 Fc의 한 말단에 연결되고, 공동 수용체 결합 도메인은 Fc의 다른 말단에 연결된다. 각 결합 도메인은 1가 또는 다가, 예를 들어 2가, 3가 또는 4가일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시형태는, 예를 들어 유도 만능 줄기(iPS) 세포를 생성하기 위해, 만능 줄기세포의 지시된 분화를 위해, 및 조직 오르가노이드를 생성 및/또는 유지하기 위해, 또는 이를 필요로 하는 대상체에서 조직 재생을 촉진하기 위해 다가 결합 분자를 사용하는 방법이다.
본 발명의 추가 실시형태는 재생 의학 및 불충분한 Wnt 신호전달과 관련된 장애 또는 질병을 위한 내인성 줄기/전구 세포 풀(pool)의 동원을 위한 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 방법이다.
도 1a는 인간 LRP6의 세포외 도메인(ECD)에 대한 결합을 위해 선택된 5개 항체의 결합 특이성을 도시한다. LRP6-결합 항체는 인간 LRP6의 재조합 세포외 도메인(ECD)을 결합한 항체를 선택함으로써 합성 항체 라이브러리로부터 선택되었다. 항체는 인간 LRP6, 마우스 LRP6 및 마우스 LRP5에 대한 결합을 위해 ELISA에 의해 분석되었다. Fc 펩타이드 및 소 혈청 알부민(BSA)에 대한 결합을 음성 대조군으로 포함시켰다.
도 1b는 IgG 2539 및 IgG 2542(100μM)가 Wnt1(일시적 형질감염) 및 Wnt3a(0.5μg/ml 정제된 단백질) 자극에 대한 반대 효과에 의해 LRP6 ECD의 상이한 부위를 결합함을 입증하는 Wnt 신호전달 활성화를 모니터링하는 루시퍼라제 리포터 모니터링의 결과를 도시한다. 항-MBP 항체는 대조군으로 작용한다.
도 2a는 FZD 결합 도메인(5019) 및 LRP6-W1(2942, L61) 또는 Fc 도메인의 동일한 말단의 -W3(2539, L63) 결합 도메인을 포함하는 대표적인 이중특이성 IgG(Bi-IgG) 및 이중특이성 디아바디(이중 디아바디)를 도시한다.
도 2b는 이중특이성 IgG(5019-2539 Bi-IgG 및 5019-2542 Bi-IgG)가, HEK293 세포에서 TOPFlash 루시퍼라제 리포터 분석에서 결정된 바와 같이, Wnt 신호전달을 활성화하지 않고 오히려 Wnt 신호전달의 길항제로 작용한다는 것을 입증한다.
도 2c 내지 2g는 Fc 도메인이 놉/홀 구성(K/H)인 이중특이성 디아바디의 결합을 도시한다. 2개의 생성된 디아바디 5019-2539-K/H(FZD/LRP6-W3) 및 5019-2542-K/H(FZD/LRP6-W1)는 원래 IgG의 FZD 결합 프로필과 매우 약하지만 LRP6 결합 활성을 유지한다. 도 2c는 정제된 FZD-LRP6 디아바디: 5019-2539-K/H 및 5019-2542-K/H를 도시한다. 도 2d는 FZD4, FZD5, 및 FZD7에 대한 5019-디아바디의 FZD 수용체 결합 프로파일을 도시한다. 5019 FZD IgG는 이전에 FZD1, 2, 4, 5, 7, 8에 결합하는 것으로 특성화되었다. 도 2e는 이중특이성 FZD/LRP6 디아바디 5019-2539-K/H의 FZD 수용체 결합 프로파일을 도시한다. 도 2f는 이중특이성 FZD/LRP6 디아바디 5019-2542-K/H의 FZD 수용체 결합 프로파일을 도시한다. 도 2g는 Fc 도메인의 한 말단에 결합 도메인을 갖는 호모(2539-Fc 및 2542-Fc) 및 헤테로-디아바디(5019-2539-Fc 및 5019-2542-Fc)가 LRP6 세포외 도메인과 상호작용함을 입증한다. 도 2h는, 바이오-레이어 간섭법(BLI, Bio-Layer Interferometry) 분석에서 측정된 바와 같이, 용액 내 FZD CRD 및 LRP6 ECD에 대한 디아바디 5019-2539-K/H 및 5019-2542-K/H의 공동 결합을 보여준다.
도 2i는 5019-2539-K/H 또는 5019-2542-K/H를 나타내지 않으며, 여기서 결합 도메인을 형성하는 FZD 및 LRP6 수용체 디아바디는 Fc의 동일한 면에 존재하며, Wnt 매개 경로를 활성화하는 FZD 작용제이다. 결과는 5019-2539-K/H 디아바디(LRP6의 Wnt3 부위에 대해 선택적)가 10nM 및 50nM에서 Wnt3-매개 경로 활성화를 완전히 차단하는 반면, 5019-2542-K/H는, HEK293 세포에서 TOPFlash 루시퍼라제 리포터 분석을 이용하여 밝혀진 바와 같이, 덜 효과적이다.
도 2j는 디아바디 또는 scFv를 포함하는 결합 도메인을 갖는 4가 결합 분자의 루시페라제 활성의 비교를 도시한다. 항-FZD scFv 및 항-LRP 디아바디(FP*+P*-L61+3)를 포함하는 결합 도메인을 갖는 분자는 항-FZD 디아바디 및 항-LRP 디아바디(FP+P-L61+3)를 포함하는 결합 도메인을 갖는 분자와 유사한 활성을 나타냈다. 대조적으로, FP +P-L61+3 분자와 비교하여, 항-FZD 디아바디를 포함하지만 양 말단에 항-LRP6 scFv(FP +P-L61*+3*) 또는 scFv(FP*+P*-L61*+3*)를 포함하는 분자의 경우 활성이 현저히 감소하였다.
도 2k 및 도 2l은, BLI 측정에 의해 비교할 수 있는 바와 같이, 디아바디 또는 scFv를 포함하는 결합 도메인을 갖는 4가 결합 분자간의 활성 차이가 친화성의 차이로 인한 것이 아닌 것과 파라토프가 디아바디 또는 scFv 형식으로 제시되었는지 여부에 관계없이 LRP6 및 FZD 이소폼에 결합하는 고친화성 결합을 입증한다.
도 3a는 4가 결합 분자의 개략도이고, 여기서 호모(동일한 에피토프 인식) 또는 헤테로(별도의 에피토프 인식) 디아바디로 구성된 2개의 FZD 결합 도메인은 Fc 도메인의 한쪽 끝에 연결되고, 그리고 호모 또는 헤테로 디아바디로 구성된 2개의 LRP6 결합 도메인은 Fc 도메인의 다른 쪽 끝에 연결된다.
도 3b는 FZD4, FZD5 및 FZD7 ECD에 대한 다가 결합 분자 5019-Fc-2539(FP+P-L63+3) 및 5019-Fc-2542(FP +P-L61+ 1)에 의한 결합을 도시한다. FZD 수용체에 대한 결합은 BLI 분석을 이용하여 검출된다.
도 3c는 4가 결합 분자 5019-Fc-2539(FP +P-L63+3), 5019-Fc-2542(FP +P-L61+1), 5019-K/H-2539-2542(FP +P-L61+3) 및 정제된 Wnt3A(0.5 μg/ml)에 의한 Wnt-β카테닌 신호전달 경로의 활성화를 도시한다. 분자의 농도가 표시된다. 4가 결합 분자는 pBAR 루시페라제 리포터 분석을 이용하여 측정된 HEK293T 세포에서 Wnt-β카테닌 경로를 강력하게 활성화하는 작용제이다. 5019-Fc-2539 호모디아바디는 여러 FZD 수용체(5019: FZD1,2,4,5,7,8)와 LRP6(2539)의 Wnt3a 부위에 결합하고 정제된 Wnt 리간드에 필적하는 수준으로 리포터를 활성화한다. LRP6의 두 Wnt 결합 부위에 결합하는 5019-K/H-2539:2542 헤테로디아바디가 더 효과적이다.
도 3d는 Fc를 통해 단일특이성 LRP6 호모디아바디(5019-Fc-2539, 5019-Fc-2542) 또는 이중특이성 LRP6 헤테로디아바디(5019-K/H-2539-2542, 5019Ag 또는 FP +P-L61+3이라고도 함)에 연결된 FZD 호모디아바디(5019)를 갖는 다가 결합 분자에 의한 Wnt-β카테닌 경로 활성화를 도시한다.
도 3e는 FZD 수용체 또는 LRP6 공동 수용체에 대한 1가 결합 도메인을 포함하는 분자에 의한 Wnt-β카테닌 신호전달의 활성화를 도시한다. Wnt-β카테닌 경로 활성화는 HEK293T 세포에서 수행된 pBAR 루시페라제 리포터 분석을 이용하여 검출되었다. 5019-MBP-K/H-2539-2542는 FZD에 대한 1가 결합 도메인을 포함하고 여전히 Wnt 경로를 활성화하지만, 5019Ag(동일한 에피토프에 대한 2개의 FZD 결합 도메인 포함)에 비해 효능이 8배 감소한다. C-말단에 하나의 LRP6-W3 결합 도메인만 보유하는 5019-K/H-2539-MBP는 훨씬 낮은 효능을 나타낸다. 중요하게는, 2개의 모노-FZD: 모노-LRP6 디아바디 5019-MBP-K/H-2539-MBP 및 5019-MBP-K/H-MBP-2542 뿐만 아니라 1개의 LRP6-W1 부위 디아바디 5019-K/H-MBP-2542에 대해 최소 작용 활성이 검출되었다.
도 3f는 4가 결합 분자에 의한 Wnt-β카테닌 경로 활성화를 도시하고, 여기서 WNT3A 결합 부위를 표적으로 하는 항-LRP5 파라토프는 WNT1 결합 부위를 표적으로 하는 항-LRP6 파라토프를 대체하여 공동 수용체와 FP +P-L61+ 3(EC50 = 4nM)와 유사하게 관찰된 활성을 모두 동원할 수 있는 분자(FP +P-L5/63)를 생성하였다.
도 4a는 내인성 FZD4 수용체(-FZD4)가 없거나 Fc 도메인의 일측에 있는 FZD4에 특이적인 FZD 결합 도메인과 Fc 도메인(FZD4Ag: 5038Ag/5038-K/H-2539-2542, 5044Ag/5044-K/H-2539-2542, 5048Ag/5048-K/H-2539-2542, 5063Ag/-H253Ag, 5080Ag/50180-K/H-2539-2542, 5081Ag/5081-K/H-2539-2542)의 타측에 있는 LRP6(2539 및 2542)에 대한 공동 수용체 결합 도메인에 특이적인 FZD 결합 도메인(이 경우 동형 디아바디)을 갖는 다가 결합 분자에 의해 FZD4 수용체(+FZD4)를 발현하도록 변형된 리포터 세포에서의 Wnt-β카테닌 경로 활성화를 도시한다. 대조군은 다가 결합 분자 5019Ag(5019-K/H-2539-2542) 및 FZD4의 내인성 작용제인 노린(Norrin)이다. 결과는 5019Ag/5019-K/H-2539:2542(pan-FZD 작용제) 내의 5019 FZD 결합 도메인(FZD1,2,4,5,7,8 인식)을 FZD4에 대한 선택적 결합 도메인으로 대체하면 선택적 FZD4 작용제의 개발을 가능하게 한다는 사실을 입증하였다. HEK293T 세포를 나열된 FZD 작용제를 인코딩하고 FZD4 및 LRP6 cDNA를 포함하거나 포함하지 않는 플라스미드인 pBARL(Wnt-β 카테닌 루시퍼라제 리포터) 및 Rluc(정규화 대조군)로 형질감염시켰다. 노린(Norrin)은 FZD4의 활성화에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. HEK293T 세포는 FZD4의 낮은 수준 내지 검출 불가능한 수준을 발현하므로 FZD4 작용제는 형질감염된 FZD4 cDNA의 존재 하에서만 리포터 유전자를 활성화할 수 있었다. 대조적으로, pan-FZDag 5019-K/H-2539:2542는 이들 세포에서 내인적으로 발현된 다른 프리즐드의 활성화를 통해 FZD4의 부재 또는 존재 하에 Wnt-β카테닌 신호전달을 강력하게 활성화한다.
도 4b는 Fc의 일측에 있는 FZD2(2876,2890), FZD2/7(2886), FZD6(2747), 또는 FZD9/10(2969, 2974)에 특이적인 결합 도메인(호모 디아바디)을 갖고, Fc의 타측에 있는 2539 및 2542 항체 단편에 의해 형성된 LRP6 헤테로디아바디를 갖는 다가 결합 분자에 의한 Wnt-β카테닌 경로 활성화를 도시한다. Wnt-β카테닌 경로 활성화는 HEK293T 세포에서 pBARL 분석을 이용하여 평가되었다.
도 4c는 FZD에 대해 범-특이적이고 FZD 및 Wnt-β카테닌 신호전달에 대한 Wnt 결합을 차단하는 IgG로부터 유래된 FZD 결합 도메인을 갖는 다가 결합 분자에 의한 Wnt 경로 활성화를 도시한다. 이들 분자의 LRP6 결합 도메인은 Fc의 c-말단에 있으며, LRP6의 Wnt3 및 Wnt1 결합 부위를 각각 인식하는 파라토프를 갖는 항체 2539 및 2542에 의해 형성된 디아바디로 구성된다.
도 4d는 FZD에 대해 범-특이적이고 FZD에 대한 Wnt 결합을 차단하지 않고 Wnt3-유도 경로 활성화를 길항하지 않는 IgG로부터 유래된 FZD 결합 도메인을 갖는 다가 결합 분자에 의한 Wnt 경로 활성화를 도시한다. 이들 분자의 LRP6 결합 도메인은 Fc의 c-말단에 있고, 항체 2539 및 2542에 의해 형성된 디아바디로 구성되며, 이들은 LRP6의 Wnt3 및 Wnt1 결합 부위를 각각 인식하는 파라토프를 갖는다.
도 5는 본 발명의 3개의 4가 결합 분자의 FZD/LRP6 결합 거동의 비교를 도시한다. 5019-Fc-2539, 5019-Fc-2542, 5019-Fc-2539-2542는 FZD에 견고하게 결합하지만, 더 약한 LRP6 상호작용(좌측 그래프) 또는 FZD/LRP6 공동 결합(중간 그래프)을 나타낸다. 5019-K/H-2539-2542(우측 그래프)의 FZD 결합 프로필은 FZD4, FZD5 및 FZD7을 인식한다는 것을 보여준다.
도 6a는 Wnt1과의 결합을 매개하는 것으로 알려진 LRP5/6의 상부 2개 프로펠러(E1-E2), 및 원형질막에 인접하고 Wnt3와의 상호작용을 매개하는 것으로 알려져 있는 LRP5/6의 하부 2개 프로펠러(E3-E4)의 결합을 예시한다. 도 6a는 또한 LRP5/6와 상호작용하는 Wnt1, 그리고 LRP5/6 및 FZD 수용체와 상호작용하는 Wnt3을 예시한다.
도 6b는 다가 결합 분자 5019-Fc-2539, 5019-Fc-2542 및 5019-K/H-2539-2542에 의한 FZD 수용체와 LRP5/6 수용체의 가능한 상호작용의 예시이다.
도 6c는 다가 결합 분자가 pBAR 루시페라제 리포터 분석을 이용하여 측정된 바와 같이, HEK293T 세포에서 Wnt-β카테닌 경로를 강력하게 활성화시키는 작용제라는 것을 입증한다. 5019-Fc-2539 호모디아바디는, 복수의 FZD 수용체(5019는 FZD1, 2, 4, 5, 7, 8에 결합) 및 LRP6(2539)의 Wnt3a 부위에 결합하고, 리포터를 정제된 Wnt 리간드에 필적하는 수준으로 활성화 한다. LRP6의 Wnt3a 및 Wnt1 결합 부위 모두에 결합하는 5019-K/H-2539:2542 헤테로디아바디가 더 효과적이다.
도 6d는 5019-K/H-2459:2460, 놉-인-홀 구성의 Fc 도메인을 갖고 범 FZD-특이적(5019)인 FZD 결합 도메인(호모디아바디)을 갖는 4가 결합 분자, 및 LRP5의 두 부위(2459는 Wnt1 결합 부위를 결합하고, 2460은 Wnt3 결합 부위를 결합)에 대해 이중특이성(헤테로디아바디)인 공동 수용체 결합 도메인은 또한 HEK293T 세포에서 Wnt-β카테닌 경로를 활성화 한다는 것을 입증한다.
도 7a는 5019-K/H-2539:2542(FZD1,2,4,5,7,8을 인식하는 pan-FZD 작용제) 내의 FZD 결합 도메인을 FZD5(#2928)에 특이적인 FZD 결합 도메인으로 대체함으로써 선택적 FZD5 작용제가 생성되었다. HPAF-II 세포는 증식을 위해 FZD5 신호전달에 따라 달라진다는 것으로 나타났다. Wnt 분비 억제제 LGK974(아실-트랜스퍼라제 포큐파인 표적)를 사용하여 Wnt-FZD5 신호전달을 차단하면 세포 주기가 정지되고 증식이 억제된다. 증식은 외인성 Wnt3a 조절 배지의 첨가 또는 본 명세서에 기재된 FZD5 선택적 작용제(2928-K/H-2539:2542) 또는 pan-FZD 작용제(5019-K/H-2539:2542)의 첨가로 구제될 수 있다. FZD4 선택적 작용제 5038-K/H-2539:2542는 단지 적당한 구조 능력을 갖는다.
도 7b는 FZD2-특이적 FLag를 사용한 C3H10T1/2 세포의 자극이 Pan-FZD FLAg로 달성된 것과 유사한 수준으로 골형성 마커 알칼리성 포스파타제(ALPL)의 강력한 유도를 한 반면, FZD5-특이적 FLAg는 최소한의 활성을 보였다.
도 8a 및 8b는 본 발명의 pan-FZDag(FP+P-L61+3)가 외인성 Wnt3A 조절 배지를 완전히 대체하여, Wnt 분비가 LGK974, 포큐파인의 작은 분자 억제제(좌측 아래 사진)로 차단될 때, 장(intestinal) 오르가노이드의 성장 억제를 구제한다는 것을 입증한다. 생쥐에서 분리된 장 오르가노이드는 재조합 R-스폰딘의 존재 하에 성장하고 패널 세포에 의해 분비되는 Wnt 리간드의 존재를 필요로 한다. 도 8a는 LGK974를 사용한 Wnt 생성의 억제가 오르가노이드 사멸로 이어지는 것을 도시한다(우측 위 사진). Wnt3A 조절 배지(우측 아래 사진) 또는 FZDag(좌측 아래 사진)의 외인성 적용은 LGK974의 존재 하에 오르가노이드 성장을 구제한다. 좌측 위 사진은 대조군으로 LGK974 없이 DMSO로 처리된 오르가노이드를 도시한다. 도 8b는 Promega의 CellTiter Glow® Assay를 사용하여 정량화된 Wnt3A 조절 배지 또는 FZDag(FP+P-L61+3)를 적용하여 오르가노이드 사멸로 이어지는 LGK974에 의한 Wnt 생성 억제를 구제할 수 있음을 입증한다.
도 9a 및 9b는 pan-FZDag 5019-KH-2539-2542(FP +P-L61+ 3)를 형성하기 위해 놉-인투-홀 형태로 이량체화하는 펩타이드를 인코딩하는 플라스미드의 예를 도시한다. 도 9a는 "놉" 돌연변이를 포함하는 Fc 영역, pan-FZD 항체 #5019의 VH 및 VL, 및 LRP 항체 #2542의 VL 및 LRP 항체 #2539의 VH를 포함하는 펩타이드를 인코딩하는 플라스미드를 도시한다. 도 9b는 "홀" 돌연변이, pan-FZD 항체 #5019의 VH 및 VL, 및 LRP 항체 #2542의 VH 및 LRP 항체 #2539의 VL을 포함하는 Fc 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 펩타이드를 인코딩하는 플라스미드를 도시한다. 이들 플라스미드에 의해 인코딩된 펩타이드는, 범 특이적 FZD 항체 #5019의 VH 및 VL의 쌍 형성에 의해 생성된 호모디아바디, 및 LRP 항체 #2539의 VH 및 다른 펩타이드의 LRP 항체 #2542의 VL을 갖는 한 펩타이드로부터 LRP6 항체 #2539의 VL 및 LRP 항체 #2542의 VH의 쌍 형성에 의해 생성된 이중특이적 헤테로디아바디를 포함하는 4가 결합 도메인을 갖는 헤테로 이량체를 형성한다.
도 9c는 헤테로 이량체 놉-인투-홀 구성 5019-K/H-2539:2542(FP+P-L61+3)의 개략도이다. Fc 내의 놉-인-홀 구성을 이용하여 분자의 모듈성을 최대 4개의 서로 다른 결합 부위까지 증가시킬 수 있다. 이 분자(5019-K/H-2539:2542)의 경우, pan-FZD 호모디아바디는 Fc 도메인의 일측에 조작되고, Wnt3(2539) 및 Wnt1(2542) LRP6 결합 부위를 포함하는 헤테로디아바디는 Fc 도메인의 타측에 조작된다.
도 10a 및 10b는 5019-놉-2539:2542 다가 결합 분자의 핵산 서열(SEQ ID NO: 21 및 추가의 3'TGA, 및 이의 상보적 서열) 도메인의 주석이다.
도 11a-f는 Wnt-β카테닌 경로의 활성화제로서 FZD 및 LRP6 Wnt1 및 Wnt3 결합 부위(FLAg)를 결합하는 4가 결합 분자의 설계 및 검증을 도시한다. 도 11a는 항-FZD Fab 억제성(상부) 및 특이적 활성(하부)을 도시한다. 도 11b는 디아바디-Fc 형식으로 표시된 LRP6 Ab에 의한 Wnt1 또는 Wnt3A 신호전달의 억제를 도시한다. 도 11c는 4가 FLAg의 분자 구조를 도시한다. 도 11d는 범-특이적 FLAg 단백질(FP+P-L61+1, FP +P-L63+3 및 FP +P-L61+ 3)(x축)의 연속 희석에 의한, HEK293T 세포에서 LEF/TCF 리포터 유전자(y-축)의 활성화에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다. 도 11e는 지시된 농도의 pan-FLAg(FP+P-L61+3)로 30분간 처리 후 RKO 세포에서 β카테닌 단백질의 수준을 도시한다. 도 11f는 10 nM pan-FLAg(FP+P-L61+3)로 처리된 RKO 세포에서 β카테닌 및 인산화 흩어진(Dishevelled)-2(p-Dvl2) 단백질 수준의 시간 경과를 도시한다.
도 12a 내지 도 12d는 FLAG FP +P-L61+3 결합 및 활성의 특성화 및 해부를 도시한다. 도 12a 및 12b는 인간 LRP6 ECD에 대한 10개 인간 FZD CRD 중 9개에 대한 FP +P-L61+3의 결합 동역학을 도시한다. 도 12c는 FP +P-L61+3이 통상적인 IgG와 유사하게 거동하고 용량 및 pH 의존적 방식으로 FcRn과 상호작용함을 입증한다. 도 12d는 FP +P-L61+3이 또한 보상체(C1q), 자연 살해 세포 마커 CD16a, B 세포 마커 CD32a, 및 단핵구 및 대식세포 마커 CD64를 포함하는 다른 Fc 이펙터와의 상호작용에 대해 IgG와 유사하게 거동함을 입증한다.
도 13a 및 13b는 3일 동안 30 nM FP +P-L61+3을 사용한 처리가 중배엽 마커 BRACHYURY의 강력한 유도를 유발하고, 다능성 마커 OCT4의 발현을 6μM에서GSK3 억제제 CHIR99021을 사용한 처리와 유사한 수준으로 감소시켰음을 입증한다.
도 14는 비히클, C59 또는 pan-FLAg(FP +P-L61+3) + C59로 처리된 LGR5-GFP 마우스의 소장 절편의 대표적인 형광 이미지를 표시한다. LGR5-GFP는 선와(crypt) 바닥의 줄기세포에서 발현된다. 세포 핵은 DAPI로 대조 염색되었다.
본 명세서에는, Fc 도메인, FZD 결합 도메인, 및 Wnt 공동 수용체에 대한 결합 도메인을 포함하는 다가 결합 분자가 기재되어 있으며, 여기서 결합 도메인은 Fc 도메인의 반대쪽 말단에 부착된다. 본 발명의 다가 결합 분자는 Wnt 신호전달 경로의 작용제이고, 본 명세서에서는 대안적으로 FZD 작용제 또는 FZDag로 지칭된다. Wnt 리간드는 FZD 수용체와 공동 수용체의 클러스터링을 촉진함으로써 기능한다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된 다중특이적 분자는 FZD 수용체 및 Wnt 공동 수용체에 동시에 결합하여 Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 것으로 여겨진다.
본 명세서에 기재된 Wnt 신호전달 경로를 활성화하기 위한 다가 결합 분자의 모듈성 및 유효성은 1가 FZD 및 LRP5/6 결합 리간드로 이루어진 선행 기술에 기재된 Wnt 대체물과 대조되며, 여기서 결합 리간드는 Fc 도메인의 반대편 말단에 부착되지 않는다. 본 발명의 일 실시형태에서, FZD 결합 도메인은 하나 이상의 FZD 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 폴리펩타이드로부터 유래된 결합 모이어티를 포함하고, 공동 수용체 결합 도메인은 공동 수용체, 예를 들어, LRP5/6, ROR1/2, RYK 또는 PTK7에 결합하는 결합 모이어티를 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 하나 이상의 FZD 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 폴리펩타이드는 하나 이상의 FZD 수용체의 시스테인 풍부(rich) 도메인(CRD)에 결합한다.
FZD 수용체의 아미노산 서열 및 FZD 수용체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 FZD 또는 Wnt 공동 수용체 LRP5/6, ROR1/2, RYK 또는 PTK7를 결합하는 항체 및 항체 라이브러리는 쉽게 입수 가능하거나 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 공개 번호 2015/0232554, 발명자 Gurney 등 및 미국 공개 번호 2016/0194394, 발명자 Sidhu 등 및 US 20190040144, 발명자 Pan 등; 미국 공개 번호 2017/0166636, 발명자 Wu 등; 미국 공개 번호 2016/0208018, 발명자 Chen 등, 미국 공개 번호 2016/0053022, 발명자 Maceda 등, 미국 공개 번호 2015/031293, 발명가 Damelin 등).
선택된 표적에 결합하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 생성하는 방법은 당업계, 예를 들어 Sidhu 등의 Methods in Enzymology (2000) 328: 333-336에 공지되어 있다. 예를 들어, FZD 또는 Wnt 공동 수용체를 결합하는 아피바디의 라이브러리는 당업계에 공지된 프로토콜에 따라 얻어질 수 있고(예를 들어, 미국 특허 번호 5,831,012 및 Lofblom 등, FEBS Letters 584 (2010) 2670-2680 참조); FZD 또는 Wnt 공동 수용체를 결합하는 펩타이드의 선택에 사용되는 안키린 반복 단백질의 라이브러리는 당업계에 공지된 프로토콜에 따라 얻어질 수 있고(예를 들어, WO 02/020565, 발명자 Stumpp 등 참조); 및 FZD 또는 Wnt 공동 수용체를 결합하는 펩타이드의 선택을 위해 사용되는 피브로넥틴 반복 단백질의 라이브러리는 또한 당업계에 공지된 프로토콜에 따라 얻어질 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 9,200,273, 발명자 Diem 및 Jacobs 참조). FZD 또는 Wnt 공동 수용체에 결합하는 펩타이드는 또한 파이노머, 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된 작은 결합 단백질 또는 인간 아포지단백질 D를 기반으로 하는 인공 수용체 단백질 "안티칼린"일 수 있으며, 공지된 방법을 이용하여 생성할 수 있다(예를 들어, Silacci 등, J. Biol. Chem (2014) 289(20):14392-8 및 Vogt and Skerra, ChemBioChem (2004) 5, 191-199 참조).
본 명세서에 기재된 항원 결합 펩타이드의 공급원으로서 적합한 항체는 원하는 활성(들)을 갖는 폴리펩타이드에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지(phage) 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 Hoogenboom 등의 Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)에서 검토되었고, 예를 들어 다음 문헌에서 추가로 기재되어 있다: McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson 등, Nature 352: 624-628 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003); Sidhu 등, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310(2004); Lee 등, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093(2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472(2004); 및 Lee 등, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004). 특정 파지 표시 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 임의로 재조합되며, 이는 그 다음 Winter 등, Ann. Immunol., 12: 433-455(1994)에 기재된 항원-결합 파지에 대해 스크린될 수 있다. 파지는 일반적으로 단일 사슬 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 항체 단편을 표시한다. 면역화된 소스의 라이브러리는 하이브리도마를 구성할 필요 없이 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브한 레퍼토리는 Griffiths 등, EMBO J, 12:725-734(1993)에 기술된 바와 같이 면역화 없이 광범위한 비 자기 항원 및 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 나이브한 라이브러리는 또한, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992)에 기술된 바와 같이, 줄기세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관 내 재배열을 수행함으로써 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하는 특허 문헌은, 예를 들어 미국특허 5,750,373, 및 미국 특허 공개 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360가 있다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 명세서에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
따라서 당업자는 Fc 도메인을 용이하게 제조하고, Fc 도메인의 N 및 C 말단에 원하는 특이성을 갖는 다가 FZD 결합 도메인 및 Wnt 공동 수용체 결합 도메인을 혼합 및 매칭하여 원하는 FZD 수용체 및 공동 수용체를 결합하도록 특정 Wnt 경로를 활성화하는 다가 결합 분자를 제조한다. 이러한 특정 작용제는 세포 증식, 분화, 오르가노이드 생존 및 유지, 생체 내 조직 재생을 향상시키는 강력한 도구 역할을 한다. 이러한 특정 작용제는 또한 이러한 공정과 관련된 FZD 특이성을 프로파일링하기 위한 강력한 도구 역할을 한다. 예를 들어, 본 명세서에 나타난 바와 같이, FZD4Ag가 아닌 FZD5Ag는 LGK974-처리된 RNF43 돌연변이 PDAC 세포주의 성장 결함을 구제하여, 이 과정에서 FZD4 수용체보다 FZD5의 중요성을 강조한다.
본 발명의 일 실시형태는 FZD 수용체 및 공동 수용체 둘 모두에 대한 펩타이드의 결합이 세포에서 Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 세포 상의 FZD 수용체 및 Wnt 공동 수용체에 대한 펩타이드의 결합을 수행하는 방법이다. 이 방법은 C-말단 및 N-말단을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 Fc 도메인 또는 이의 단편을 선택하는 단계, Fc 도메인의 한 말단에서 FZD 수용체를 결합하는 제1 다가 결합 도메인을 연결하는 단계, Fc 도메인의 다른 말단 상의 Wnt 공동 수용체에 결합하는 제2 다가 결합 도메인을 연결하여 다가 결합 분자를 형성하는 단계, 및 그 다음 다가 결합 분자를 Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 조건하에서 상기 FZD 수용체 및 공동 수용체를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 다가 결합 도메인은 하나 이상의 FZD 수용체, FZD 수용체 또는 공동 수용체의 리간드, 또는 FZD 수용체 또는 공동 수용체에 결합하는 이의 단편에 결합하는 단일사슬 가변 단편(ScFv)을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 결합 도메인은 하나 이상의 FZD 수용체, FZD 수용체 또는 공동 수용체의 리간드, 또는 FZD 수용체 또는 공동 수용체에 결합하는 이의 단편에 결합하는 단일 사슬 가변 단편(ScFv)을 포함하지 않는다.
본 발명의 일 실시형태에서, FZD 또는 공동 수용체 다가 결합 도메인 중 적어도 하나는 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 갖는 2개의 펩타이드를 갖는 디아바디를 포함하며, 여기서 VH 및 VL은 결합 도메인이 2개의 에피토프 결합 부위를 갖도록 한 펩타이드의 VH 및 VL은 다른 펩타이드의 VL 및 VH와 쌍을 이룬다. VH 및 VL 도메인은 FZD 수용체 또는 공동 수용체 상의 Wnt 결합 부위에 결합하는 항체의 VH 및 VL일 수 있다. 항체, 공급원 항체로부터 유래된 VH 또는 VL은 공급원 항체의 VH 및 VL과 50%, 55%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있고 여전히 항체에 의해 결합된 FZD 수용체 또는 공동 수용체 부위에 대한 결합을 유지한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 다가 결합 분자는 표 1의 다가 결합 분자를 포함한다(표 1은 표 1A 및 1B를 포함한다: 표 1A는 본 발명의 예시된 다가 결합 분자의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타내고; 표 1B는 예시된 다가 결합 분자의 다양한 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다). 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 다가 결합 분자는 본질적으로 표 1의 다가 결합 분자로 이루어진다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 다가 결합 분자는 표 1의 다가 결합 분자로 이루어진다. 본 발명의 일 실시형태에서 다가 결합 분자는 SEQ ID NO: 77을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 79를 포함하는 제2 펩타이드를 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 다가 결합 분자는 SEQ ID NO: 81을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 또는 SEQ ID NO:83을 포함하는 제2 펩타이드를 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서 다가 결합 분자는 SEQ ID NO: 77을 포함하는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO: 79를 포함하는 제2 펩타이드로 본질적으로 이루어지고 FZD2 및 LRP 5/6에 결합한다. 본 발명의 일 실시형태에서 다가 결합 분자는 SEQ ID NO: 81을 포함하는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO: 83을 포함하는 제2 펩타이드로 본질적으로 구성되고 FZD7 및 LRP 5/6에 결합한다. 본 발명의 일 실시형태에서 다가 결합 분자는 SEQ ID NO: 77로 이루어진 제1 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 79로 이루어진 제2 폴리펩타이드로 이루어진다. 본 발명의 일 실시형태에서, 다가 결합 분자는 SEQ ID NO: 81로 이루어진 제1 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 83으로 이루어진 제2 폴리펩타이드로 이루어진다.
본 발명의 일 실시형태에서 다가 결합 도메인은 표 1의 분자의 VL 및 VH 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서 다가 분자의 다가 결합 도메인은 본질적으로 표 1의 분자의 하나 이상의 VL 및 VH 도메인으로 구성된다. 본 발명의 일 실시형태에서 다가 분자의 다가 결합 도메인은 표 1의 분자의 VL 및 VH 도메인 중 하나 이상으로 이루어진다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 다가 분자의 결합 도메인은 표 1에 기재된 분자의 VH 및 VL과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 표 1에 기재된 분자에 의해 결합된 항원에 대한 결합을 유지한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 다가 결합 도메인은 FZD2를 결합하는 SEQ ID NOS: 77 및 79의 VL 및 VH 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 다가 결합 도메인은 FZD7를 결합하는 SEQ ID NOS: 81 및 83의 VL 및 VH 도메인 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 다가 분자의 다가 결합 도메인은 FZD2를 결합하는 SEQ ID NOS: 77 및 79의 VL 및 VH 도메인 중 하나 이상으로 본질적으로 이루어진다. 본 발명의 일 실시형태에서, 다가 분자의 다가 결합 도메인은 FZD7를 결합하는 SEQ ID NOS: 81 및 83의 VL 및 VH 도메인 중 하나 이상으로 본질적으로 구성된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 다가 분자의 다가 결합 도메인은 FZD2를 결합하는 SEQ ID NOS: 77 및 79의 VL 및 VH 도메인 중 하나 이상으로 이루어진다. 본 발명의 일 실시형태에서, 다가 분자의 다가 결합 도메인은 FZD7를 결합하는 SEQ ID NOS: 81 및 83의 VL 및 VH 도메인 중 하나 이상으로 이루어진다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 다가 분자의 결합 도메인은 SEQ ID NOS: 77 및 79의 VH 및 VL 도메인과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VH 및 VL 도메인을 포함하고 FZD2의 결합을 유지한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 다가 분자의 결합 도메인은 SEQ ID NOS: 81 및 83의 VH 및 VL 도메인과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VH 및 VL 도메인을 포함하고, FZD7에 대한 결합을 유지한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 다가 분자의 결합 도메인은 표 1에 기재된 분자의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 다가 분자의 결합 도메인은 표 1에 기재된 분자의 CDR과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 CDR을 포함하고, 표 1에 기재된 분자에 의해 결합된 항원에 대한 결합을 유지한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 다가 분자의 결합 도메인은 SEQ ID NO: 77, 79, 81, 또는 83의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 다가 분자의 결합 도메인은 SEQ ID NO: 77 또는 79의 CDR과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 CDR을 포함하고, FZD2에 대한 결합을 유지하거나, 또는 SEQ ID NO: 81 또는 83의 CDR과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 CDR을 포함하고 FZD7에 대한 결합을 유지한다.
본 발명의 다가 결합 분자에 의해 결합되는 FZD 수용체는 FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, 또는 FZD10일 수 있다. FZD 수용체는 FZD1, FZD2, FZD4, FZD5, FZD7 또는 FZD8일 수 있다. 다가 결합 분자는 하나의 FZD 수용체에만 결합할 수 있거나 하나보다 많은 FZD 수용체에 대해 범-특이적 결합일 수 있다. FZD 다가 결합 도메인은 예를 들어, FZD1, FZD2, FZD4, FZD5, FZD7 및 FZD8에 결합할 수 있다. FZD 다가 결합 도메인은 하나의 FZD 수용체, 예를 들어, FZD2, FZD4, FZD5, 또는 FZD6에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, FZD 결합 도메인은 단일특이적이고 FZD 수용체 상의 단일 에피토프에 결합한다. 본 발명의 일 실시형태에서, FZD 결합 도메인은 이중특이적이고 FZD 수용체 상의 2개의 에피토프에 결합한다.
공동 수용체 결합 도메인은 임의의 Wnt 공동 수용체, 예를 들어, LRP5/6, 또는 ROR1/2에 결합할 수 있다. 다가 공동 수용체 결합 도메인은 예를 들어, LRP5/6, PTK7, ROR1/2, RYK, GPR12, TSPAN12 또는 CD133에 결합할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 공동 수용체 다가 결합 도메인은 LRP5 또는 LRP6에 결합한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 공동 수용체 다가 결합 도메인은 공동 수용체 상의 단일 에피토프, 예를 들어 Wnt1 또는 Wnt3를 결합하는 LRP5/6의 에피토프에 결합한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 공동 수용체 다가 결합 도메인은 공동 수용체 내의 2개의 에피토프, 예를 들어 Wnt1에 결합하는 LRP5/6 상의 에피토프 및 Wnt3에 결합하는 에피토프에 결합한다. 본 발명의 다가 결합 분자에 의해 결합된 Wnt 공동 수용체는 LRP5 또는 LRP6, PTK7, ROR1, ROR2, RYK, GPR124, TSPAN12 또는 CD133일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서 다가 결합 분자는 Fc 도메인을 포함하고, 여기서 Fc 도메인은 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 또는 이의 단편의 Fc 도메인이다. 본 발명의 일 실시형태에서 면역글로불린은 IgG이다. 본 발명의 일 실시형태에서 IgG는 IgG1이다.
본 발명의 일 실시형태는 FZD 수용체 및 Wnt 공동 수용체를 갖는 세포를 Wnt 신호전달을 활성화 하는데 효과적인 양으로 본 발명의 다가 결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 방법이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 다가 결합 도메인 중 적어도 하나는 FZD 수용체 또는 공동 수용체를 결합하는 scFv를 포함하거나, FZD 수용체 또는 공동 수용체의 리간드 또는 상기 리간드의 단편을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서 다가 결합 도메인 중 적어도 하나는 FZD 수용체 또는 공동 수용체를 결합하는 scFv를 포함하지 않고, FZD 수용체 또는 공동 수용체의 리간드 또는 상기 리간드의 단편을 포함하지 않는다.
본 발명의 일 실시형태에서, FZD 다가 결합 도메인은 FZD 디아바디를 포함하고, 공동 수용체 다가 결합 도메인은 공동 수용체 디아바디를 포함하고, 여기서 디아바디는 각각 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 2개의 펩타이드를 포함하고, 결합 도메인은 한 펩타이드의 VH 및 VL을 다른 펩타이드의 VL 및 VH와 쌍을 이루어 형성함으로써 형성된다.
FZD 결합 도메인의 VH 및 VL은 FZD 수용체를 결합하고, Wnt 신호전달을 길항하거나 FZD 수용체에 대한 Wnt 리간드의 결합을 억제하는 항체로부터 유래될 수 있다. FZD 결합 도메인의 VH 및 VL은 FZD 수용체에 대한 Wnt 리간드의 결합을 길항하거나 억제하지 않고 FZD 수용체를 결합하는 항체로부터 유래될 수 있다.
공동 수용체 결합 도메인의 VH 및 VL은 공동 수용체를 결합하고 Wnt 신호전달을 길항하거나 공동 수용체에 대한 Wnt 리간드의 결합을 억제하는 항체로부터 유래될 수 있다. 공동 수용체 결합 도메인의 VH 및 VL은 Wnt 신호전달을 길항하거나 공동 수용체에 대한 Wnt 리간드의 결합을 억제하지 않고 공동 수용체에 결합하는 항체로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 다가 결합 분자에서, 결합 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 2가일 수 있고 2가 결합 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 FZD 수용체 또는 공동 수용체에 대해 이중특이적일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 결합 도메인은 모두 2가 및 이중특이적이며, 각 결합 도메인은 각각의 표적 FZD 수용체 또는 공동 수용체 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 결합 분자는 FZD 수용체에 대해 2가이고 이중특이적(2개의 상이한 에피토프에 결합)인 FZD 결합 도메인을 포함할 수 있거나, 또는 결합 분자는 공동 수용체에 대해 2가이고 이중특이적인 공동 수용체 결합 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서 FZD 결합 도메인은 다가 결합 분자의 Fc 도메인의 N-말단에 부착되고, 공동 수용체 결합 도메인은 Fc 도메인의 C-말단에 부착된다. 본 발명의 일 실시형태에서 FZD 결합 도메인은 다가 결합 분자의 Fc 도메인의 C-말단에 부착되고, 공동 수용체 결합 도메인은 Fc 도메인의 N-말단에 부착된다.
또한 본 발명의 실시형태는 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자, 예를 들어, 표 1의 다가 결합 분자, 예를 들어 SEQ ID NO: 76 및 SEQ ID NO: 78, 또는 SEQ ID NO: 80 및 SEQ ID NO: 82, 이들의 VH 및 VL 도메인(예를 들어, SEQ ID NO: 84, 85, 86 및 87)를 인코딩하는 핵산 분자, 및 다가 결합 분자, 그의 VH 및 Fc 도메인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트 및 벡터를 갖는 VL 및 VH 도메인을 포함하는 디아바디, 및 이러한 VL 및 VH를 포함하는 디아바디이다. 핵산 분자는 벡터에 삽입되어 적절한 숙주 세포에서 발현될 수 있고, 이어서 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 세포로부터 다가 결합 분자가 분리될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "벡터"는 핵산 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하도록 조작될 수 있는 핵산 전달 비히클 또는 플라스미드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 삽입되었을 때, 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 발현 벡터라고 한다. 벡터는 형질전환(transformation), 형질도입(transduction) 또는 형질감염(transfection)에 의해 숙주 세포에 삽입되고, 그 결과 운반된 유전 물질이 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 벡터는 플라스미드; 파지미드; 코스미드; 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체; λ파지 또는 M13 파지와 같은 파지 및 동물 바이러스 등을 포함하는 것으로 당업계에 알려져 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 동물 바이러스에는 역전사효소 바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스), 수두 바이러스(chicken pox virus), 배큘로바이러스, 유두종 바이러스 및 파포바 바이러스(예를 들어, SV40)가 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 프로모터, 예를 들어 바이러스 또는 진핵생물 프로모터, 예를 들어 CMV 프로모터, 신호 펩타이드, 예를 들어 TRYP2 신호 펩타이드, 전사 개시 인자, 인핸서, 선택 요소 및 리포터 유전자를 비롯하여 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자의 발현을 제어하는 다중 성분을 함유할 수 있으나, 상기 열거한 것들에 제한되지 않는다. 또한, 벡터는 복제 개시 부위(들)를 포함할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 대장균 및 고초균과 같은 원핵 세포, 효모 및 아스페르길루스와 같은 진균 세포, S2 초파리 세포 및 Sf9와 같은 곤충 세포, 또는 인간 세포, 예를 들어 섬유아세포 세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포 또는 HEK293 세포를 비롯한 동물 세포를 포함하는 벡터를 가져올 수 있는 세포를 지칭하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시형태는 본 명세서에 기재된 FZD 작용제 및 약제학상 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 약제학적 조성물은 Wnt 경로를 활성화하는 추가 제제, 예를 들어 노린(Norrin) 또는 R-Spondin을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제로 구성되거나 본질적으로 구성될 수 있다. 적합한 담체 및 이들의 제형은 Remington: Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A. R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1995에 기재되어 있다. 전형적으로, 약제학적으로 허용되는 염의 적절한 양은 제형이 등장성이 되도록 하기 위해 제형에 사용된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이 있으나 이에 제한되지는 않는다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가 담체는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 서방성 제제를 포함하며, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름, 리포솜 또는 마이크로입자의 형태이다. 특정 담체는 예를 들어 투여 경로 및 투여되는 FZD 작용제의 농도에 따라 더 바람직할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
Wnt-신호전달은 세포 및 조직 분화를 조절하는 유비쿼터스 경로이다. 예를 들어, 눈 발달과 관련하여 특정 Wnt-경로인 Norrin-FZD4 경로는 망막 혈관신생(angiogenesis) 역할을 하는 것으로 확인되었다. Norrin-FZD4 경로를 통한 신호전달은 망막 혈관계의 발달 및 유지에 필요하다. 이 경로의 유전자에 영향을 미치는 돌연변이는 노리병(Norrie Disease), 가족성 삼출성 유리체망막병증(FEVR), 가성교종(Pseudoglioma) 및 골다공증 증후군과 같은 여러 소아 유리체망막병증(pediatric vitreoretinopathies)을 유발할 수 있다. 또한, 미숙아 망막병증(ROP, Retinopathy of Prematurity)은 이 경로의 돌연변이와 관련이 있으며, Wnt-경로 돌연변이는 코트병 및 지속성 태아 혈관계(PFV, Coats Disease and Persistent Fetal Vasculature)에서 보고되었다. Norrin-FZD 경로는 또한 CNS 혈관 발달과 관련이 있다. 노린(Norrin), FZD4, Lrp5 및 공동 수용체 Tetraspanin-12(Tspan-12)의 유전적 절제는 망막 및 소뇌 혈관 모두에서 혈관신생 결함 및 장벽 파괴를 초래한다(Cho et al. (2017) Neuron 95, 1056-1073; Zhou et al., (2014) J Clin Invest 124:3825-3846). 본 발명의 FZD4 작용제, 특히 Fc 수용체의 한쪽 말단에 FZD4 결합 도메인 및 Fc 도메인의 다른 쪽 말단에 LRP5 및/또는 LRP6에 대한 결합 도메인을 포함하는 FZD4 FLAg가 장벽을 강화하고 혈관신생을 용이하게 하고, 예를 들어 FZD4 FLAgs를 사용한 치료는 망막 혈관계 및/또는 혈액 망막 장벽(BRB) 및 혈액 뇌 장벽(BBB)의 발달 및 유지를 용이하게 할 것이라는 것이 본 명세서에서 구체적으로 고려된다. 따라서, 본 발명의 양태는 국소 또는 전신 투여를 통해 유효량의 FZD4 FLAg로 눈 조직, 예를 들어 망막 조직을 처리함으로써 망막 혈관계를 촉진 및/또는 유지하는 방법이다. 또한 본 발명의 양태는 전신 투여 후 BBB를 유효량의 FZD4 FLAg로 처리함으로써 BBB 혈관계를 촉진 및/또는 유지하는 방법이다. 본 발명의 추가 양태는 유효량의 FZD4 FLAg를, 망막 또는 뇌 혈관신생 감소를 특징으로 하는 장애를 갖는 대상체에 투여함으로써 상기 대상체를 치료하는 방법이다. 대상체는 태아일 수 있다.
병리학적으로 낮은 수준의 Wnt 신호전달은 골다공증, 다낭성 신장 질환 및 신경변성 질환과 연관되어 있다. Wnt 경로의 제어된 활성화는 조직 복구 및 상처 치유와 같은 재생 과정을 촉진하는 것으로 나타났다. Zhao J, Kim KA 및 Abo A, Trends Biotechnol. 27(3):131-6(2009년 3월). Logan CY and Nusse R, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20:781-810 (2004); Nusse R., Cell Res. 15(1 ):28-32 (Jan. 2005); Clevers H, Cell 127(3):469-80 (2006년 11월 3일) 참조. 골다공증이나 점막염에서 Wnt 신호전달의 역할을 보여주기 위한 개념 증명(Peoof-of-concept) 실험이 수행되었다. 또한, Wnt 신호전달의 증가는 당뇨병 및 기타 대사 질환의 치료에 유익할 가능성이 있다고 제안되었다. Wnt 신호전달 감소는 대사 질환과 관련이 있다. 기능 상실(Loss-of-function) LRP6R611C 돌연변이는 인간의 조기 관상 동맥 질환, 대사 증후군 및 골다공증을 유발한다. Main A et al, Science 315:1278 (2007). "LRP5 기능 상실 돌연변이는 인간의 골다공증, 포도당 대사 장애 및 고 콜레스테롤혈증과 관련이 있다." Saarinnen et al., Clin Endocrinol 72:481 (2010). LRP5와 apoE가 모두 결핍된 마우스에서 심각한 고 콜레스테롤혈증, 손상된 지방 내성 및 진행성 죽상동맥경화증. Magoori K. et al., JBC 1 1331(2003). LRP5는 마우스에서 정상적인 콜레스테롤 대사 및 포도당 유도 인슐린 분비에 필수적이다. Fujino et al., PNAS 100:229(2003). TCF7L2 변이체는 제2 유형 당뇨병의 위험이 있다. Grant et al., Nat Genet 38:320(2006); Florez et al., N Engl J Med 355:241 (2006). Wnt 신호전달의 증가는 대사 질환 치료에 유익할 수 있다. 따라서, 대사 질환이 있는 대상체에게 본 발명의 다가 결합 분자를 투여하는 것은 대상체의 대사 질환을 치료하는 데 유용하다.
염증성 장 질환(IBP)은 결장 및 소장의 염증 상태의 그룹이다. IBD의 주요 유형은 크론병과 궤양성 대장염이다. RSP01 단백질은 동물 모델에서 염증성 장 질환을 개선하는 것으로 나타났다. Zhao J et al., Gastroenterology 132:1331(2007). 따라서, 본 발명의 다가 결합 분자, 예를 들어 FZD7, 예를 들어 12735-K/H-2539-2542에 결합하는 다가 결합 분자를, IBD를 갖는 대상체에 투여하는 것은 대상체의 IBD를 치료하는 데 유용하다.
따라서, 본 발명의 일 실시형태는 본 발명의 FZD 작용제의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 감소된 Wnt 신호전달과 관련된 병태를 갖는 대상체를 치료하는 방법이다. 이러한 병태는 예를 들어 골다공증, 다낭성 신장 질환, 신경퇴행성 질환, 점막염, 단장 증후군, 위장관 점막의 세균 전위, 장독소성 또는 장병성 감염성 설사, 복강(celiac) 질병, 비열대 스프루(sprue), 유당 불내증, 및 식이 노출로 인해 점막 융모를 둔화시키는 기타 병태, 흡수 장애, 위축성 위염 및 당뇨병, 골절, 조직 재생, 예를 들어 조직 복구 및 상처 치유뿐만 아니라 당뇨병 및 흑색종과 같은 대사 질환일 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료할 수 있는 손상된 조직의 예로는 장 조직, 심장 조직, 간 조직, 신장 조직, 골격근, 뇌 조직, 뼈 조직, 결합 조직 및 피부 조직이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 다가 결합 분자는 낮은 Wnt 신호전달을 특징으로 하는 질병 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 다가 결합 분자는 Wnt 신호전달을 증가시키고 대상체의 질병 또는 병태를 개선하는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다.
점막염은 암 치료의 임상적 합병증이다. 점막염은 빠르게 증식하는 세포에 대한 방사선 조사 또는 화학요법의 세포독성 효과로 인해 발생한다. 점막염은 주로 장 및 구강 점막에 영향을 미치는 상피 손상으로 구성된다. 임상 징후는 구강의 심한 통증, 메스꺼움, 설사, 영양실조, 심한 경우 패혈증 및 사망이다. 증상은 종종 암 치료의 용량 제한으로 이어질 수 있다. 고형 종양에 대한 화학요법 또는 방사선 요법과 관련된 구강 또는 위장관 점막염에 대해 현재 사용할 수 있는 치료법이 없다.
구강 점막염은 암 치료의 일반적이고 종종 쇠약하게 하는 합병증이다. 두경부암으로 방사선 치료를 받는 환자의 50%와 5-FU로 치료받은 환자의 10 내지 15%가 3 내지 4등급 구강 점막염에 걸린다. RSP01은 동물 모델에서 구강 점막염을 개선하는 것으로 나타났다. Zhao J et al., PNAS 106:2331(2010).
짧은 창자 증후군(SBS)은 소장의 광범위한 부분의 기능적 또는 해부학적 손실로 인해 발생하여 소화 및 흡수 능력이 심각하게 손상된다. 매년 많은 사람들이 외상, 염증성 장질환, 악성종양, 장간막 허혈 등을 포함한 다양한 장애로 소장의 긴 부분 절제술을 받는다. 방사선과 같은 다양한 비수술적 절차는 기능적 단장 증후군을 유발할 수 있다. 단장 증후군에 대한 현재 치료법에는 식이 요법, 전체 비경구 영양(TPN), 장 이식 및 비이식 복부 수술이 포함된다. 이러한 치료가 SBS 환자의 개선된 결과에 기여했지만, 장 기능 저하의 근본적인 문제를 부분적으로만 교정한다. 현재 치료법은 SBS 환자에서 남아 있는 소장의 회복을 가속화할 수 없다. Seetharam 및 Rodrigues, The Saudi Journal of Gastroenterology 17, 229-235(2011) 참조.
성체 포유동물의 장은 가장 빠르게 자가 재생되는 조직 중 하나를 구성하며, 여기서 장 점막은 증식성 선와 및 분화된 융모로 접힌 연속 구조를 포함한다. 점막 파괴에 대한 반응으로, 숙주는 치유 반응을 시작하여 점막 완전성의 회복 및 점막 구조의 재생을 초래한다. 이 과정은 장 줄기세포의 증식에 따라 크게 달라진다. Neal et al., Journal of Surgical Research 167, 1-8(2010); van der Flier and Clevers, Annual Review of Physiology 71, 241-261 (2009).
따라서, 장 줄기세포의 활성을 조절하는 인자는 장내 손상에 대한 숙주의 반응 능력에서 지배적인 역할을 한다. Wnt 단백질은 장 줄기세포의 증식을 지원하는 가장 중요한 성장 인자이기 때문에, Wnt 신호전달을 강화하면 장 상피의 증식이 증가한다. 이것은 소장 융모의 수를 증가시키고 점막 흡수 표면적을 증가시킨다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 다가 결합 분자는 단장 증후군이 있는 사람에게 투여된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 다가 결합 분자는 FZD7, 예를 들어 본 명세서에 기재된 12735-K/H-2539-2542를 결합한다. 다가 결합 분자는 위장 점막 흡수 표면적을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다. 본 발명의 다가 결합 분자의 투여는, 인시던트(incident) 단장 증후군이 있는 사람이 장관 영양(enteral feeding)에 적응할 때, 또는 SBS가 우세한 사람이 장관 영양으로부터 영양소를 흡수할 때, 또는 사람이 체중을 유지하기 위해 매일 필요한 총 비경구 영양소 투여량을 감소시킬 때, 성공적인 결과를 가져온다.
박테리아 전위의 예방. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 장내 세균에 의해 유발된 패혈증의 위험이 있는 사람에게 투여된다. 다가 결합 분자는 위장 점막 완전성을 증가시키기에 충분한 양으로 투여되어 장내 세균이 사람의 혈류로 통과하는 것을 방지한다. 위장 점막 완전성(인간 집단에 대해 정상적인 위장 점막 완전성과 비교하여)의 저하는 중환자에서 혈류 감염 및 패혈증의 주요 원인이다. 다가 결합 분자의 투여는 본 발명의 다가 결합 분자가 투여되지 않은 환자보다 중환자실(ICU) 환자에서 균혈증 및 패혈증의 더 적은 경우가 관찰될 때 성공적인 결과를 가져온다.
장 독소성 또는 장병성 감염성 설사 중 또는 후에 회복이 가속화된다. 전염성 설사는 소아과의 주요 문제이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 다가 결합 분자는 설사가 끝나는 시간 또는 정상적인 배변에 이르는 시간을 단축시키기에 충분한 양으로 투여된다. 본 발명의 다가 결합 분자는 경구 또는 비경구 재수화(rehydration) 및 때때로 항생제를 포함하는 표준 치료에 추가하여 투여될 수 있다. 다가 결합 분자의 투여는, 본 발명의 다가 결합 분자가 투여되지 않은 소아 환자와 비교하여 소아 환자에서 입원 감소, 입원 단축, 또는 탈수 및 전해질 이상 합병증의 발생률 감소가 관찰되는 경우. 성공적인 결과를 가져온다.
복강 질병, 비열대성 스프루, 유당 불내증 및 식이 노출로 인해 점막 융모가 둔해지고 흡수 장애를 일으키는 기타 병태. 일 실시형태에서, 본 발명의 다가 결합 분자는 점막 흡수 표면적을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다. 본 발명의 다가 결합 분자는, 표준적인 치료에 추가하여 투여될 수 있고, 이는 주로 불쾌한 식품 및 때때로 영양 보조식품을 회피하는 것이다. 본 발명의 다가 결합 분자의 투여는, 복강 질환, 비열대성 스프루, 유당 불내성 또는 기타 병태가 있는 사람이 장관 영양 공급에 적응할 경우, 또는 병태 중 어느 하나를 가진 사람이 장관 영양공급으로부터 영양소를 흡수할 경우, 또는 사람이 체중을 유지하기 위해 매일 필요한 총 비경구 영양소의 양을 감소할 경우, 성공적인 결과를 가져온다,
위축성 위염, 구체적으로 환경 화생성(metaplastic) 위축성 위염이라고 하는 형태. 위축성 위염은 현재 비타민 B12 주사로 치료되는 노인들에게 흔한 질환이다. 환자는 유암종과 선암의 위험성이 높아진다. 다가 결합 분자의 투여는, 종양 발생이 감소될 때, 카르시노이드의 경우, 화생성 G 세포로부터의 가스트린 생성을 감소시킴으로써 성공적인 결과를 가져온다는 사실이 의료 전문가에 의해 관찰되었다. 종양이 Wnt 경로의 증가에 의해 활성화된다고 의료 전문가가 결정한 경우, 다가 결합 분자를 대상체에게 투여해서는 안 된다.
본 발명의 FZD 작용제는 예를 들어 주사(예를 들어, 피하, 정맥내, 복강내 등)에 의해, 국소적으로 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 기타 자연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자는 제약학적으로 허용되는, 바람직하게는 수성 담체에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 조성물은 완충제, 결합제, 블라스팅(blasting)제, 희석제, 향미제, 윤활제 등과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물에 사용될 수 있는 부형제의 광범위한 목록은 예를 들어 A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients(Kibbe, 2000)에서 가져올 수 있다. 다가 결합 분자는 또한 사이토카인과 같은 면역 자극 물질과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태는 체세포를 재 프로그래밍하기에 적합한 조건 하에 체세포를 배양하는 것을 포함하는 유도 만능 줄기(iPS) 세포를 생성하는 방법을 포함하며, 여기서 상기 배양 조건은 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자를 추가로 포함한다. 만능 줄기세포를 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Takahashi and Yamanaka, (2006), Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors, Cell 126, 663-676; Takahashi et al. (2007) Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors Cell 131, 861-872; Yu et al. (2007) 참조. 인간 체세포에서 유래한 유도 만능 줄기세포주. Science 318, 1917-1920; 미국 특허 번호 8,546,140, 및; 미국 특허 번호 8,268,620. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 다가 결합 분자는 iPS 세포의 생성을 촉진하기에 충분한 양으로 배양 배지에 포함된다.
본 발명의 일 실시형태는, 지향성(directed) 분화에 적합한 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함하는, 다능성 또는 만능 줄기세포(PSC) 또는 유도 만능 줄기(iPS) 세포의 지향성 분화 방법을 포함하며, 여기서 상기 배양 조건은 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자의 유효량을 추가로 포함한다. 마우스 및 인간 PSC에 대한 연구에 의해 상이한 계통으로 PSC 분화를 유도할 수 있는 Wnt를 비롯한 성장 인자의 추가에 대한 특정 접근 방식을 확인하였다. Wnt 신호전달의 활성화를 포함하는 PSC의 지향성 분화 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Lam et al. (2014) Semin Nephol 34(4); 445-461; Yuceret al. (2017년 9월 6일) Scientific Reports 7, 논문 번호 10741 참조. 본 명세서에 기술된 다가 결합 분자를 사용하여, PSC의 분화를 지향하도록 Wnt 신호전달 경로의 활성화에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있는 것으로 간주된다.
본 발명의 일 실시형태는 본 명세서에 기재된 다가 결합 펩타이드의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 이러한 대상체에서 Wnt 신호전달을 활성화함으로써, 이를 필요로 하는 대상체에서 조직 재생을 향상시키는 방법이다.
본 발명의 일 실시형태는 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자의 유효량을 투여함으로써, 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 골다공증 또는 골절이 있는 대상체에서 골 치유 및/또는 재생을 향상시키는 방법을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 다가 결합 분자는 FZD2에 결합하는 결합 도메인 및 LRP5 또는/및 LRP6에 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 1가 또는 다가, 예를 들어 2가, 3가 또는 4가, 및 단일특이적 또는 다중특이적, 예를 들어 이중특이적일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체의 골 치유 및/또는 재생을 향상시키기 위한 다가 결합 분자는 예를 들어 2890-놉-2539-2542(SEQ ID NO: 77) 및 2890-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 79)(함께 2890-K/H-2539:2542 또는 2890Ag를 형성함)를 포함한다.
대상체는 인간, 비인간 영장류, 말, 소, 개, 고양이, 설치류 등을 포함하는 모든 동물(포유 동물)일 수 있으나 이에 제한되지 않다. 일반적으로 대상체는 인간이다.
본 명세서에 기재된 다가 결합 분자를 투여하기 위한 효과적인 투여량 및 일정은 경험적으로 결정될 수 있고, 그러한 결정을 내리는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 당해 분야의 숙련가는 투여되어야 하는 이러한 FZD 작용제의 투여량이 예를 들어 항체를 투여받을 대상체, 투여 경로, 사용되는 FZD 작용제의 특정 유형 및 투여되는 기타 약물에 따라 달라질 것이라는 것을 이해할 것이다. FZD 작용제에 대한 적절한 투여량 선택에 대한 지침은 항체의 치료적 사용에 관한 문헌, 예를 들어 문헌[Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone, eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 및 303-357페이지; Smith, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber, eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389에 기재되어 있다. 조성물의 투여를 위한 투여량 범위는 원하는 효과를 얻기에 충분히 많다. 투여량은 원치 않는 교차 반응, 아나필락시(anaphylactic) 반응 등과 같은 부작용을 일으킬 정도로 많아서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 연령, 상태, 성별 및 환자의 염증 정도에 따라 달라질 것이며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 금기 사항이 있는 경우 개별 의사가 조정할 수 있다. 투여량은 다양할 수 있으며, 하루 또는 수일 동안 매일 1회 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 개인의 요구는 다양하지만, 벡터의 유효량의 최적 범위의 결정은 당업계의 기술 범위 내에 있다.
최근에, 상이한 조직의 총체적 해부학 및 세포 유형 조성물을 개괄하는 "오르가노이드"라고 하는 소형 장기를 배양하기 위한 방법이 개발되었다. 놀랍게도, 전체 오르가노이드는 마우스로부터 단리된 장의 LGR5+ 줄기세포로 처음 입증된 바와 같이 단일 조직 줄기세포로부터 생성될 수 있다. Wnt-ßcatenin 경로를 활성화하는 배지 내의 구성 성분은 오르가노이드 유도체화, 성장, 생존 및 유지에 필요한 것으로 알려져 있다. 따라서, 정제되거나 또는 조절된 배지로 제공되는 R-스폰딘(Spondin) 및 Wnt 리간드는 상이한 조직으로부터 오르가노이드를 성장시키는 데 보편적으로 필요하다. 그러나 정제된 Wnt 단백질은 일반적으로 비활성이 낮고 오르가노이드의 성장을 유지할 수 없다. 이와 같이 당업자는 Wnt3A 조절 배지의 첨가, 또는 소분자, 예를 들어, GSK3 억제제의 첨가에 의존하여 오르가노이드를 생성한다. 그러나 Wnt3A 조절 배지의 생성은 노동 집약적이며, 조절 배지의 특성이 일관되지 않으며, 소분자 GSK3 억제제가 독성 수준으로 경로를 강력하게 활성화할 수 있다. 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자는 생성 및 정제가 용이하고 일관된 재현성 특성을 가지며, 원하는 FZD 수용체(들) 및 공동 수용체(들) 조합을 선택적으로 결합함으로써 Wnt를 특이적으로 활성화하기 때문에, 이러한 문제를 해결한다.
본 발명의 일 실시형태는 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자의 유효량으로 조직을 배양하는 것을 포함하는 조직 오르가노이드를 생성하는 방법을 포함한다. 오르가노이드는 조직 배양 접시에서 해당 기관의 속성을 연구하는 데 사용할 수 있도록, 해당 생체 내 기관을 모방하는 3D 다세포 시험관내 조직 구성이다. 오르가노이드를 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 위장관의 다양한 기관에 있는 성체 줄기세포로부터 유래된 상피 오르가노이드는 예를 들어, 위장관의 다양한 기관에 있는 성체 줄기세포에서 파생된 상피 오르가노이드는 세포를 유지하고 세포 유형의 생체 내 유사 보상체를 생성하기 위해 Wnt 신호전달 작용제를 필요로 한다. Wnt 신호전달은 또한 3D 배양에서 내이(inner ear) 오르가노이드 발달을 향상시키고 신장 오르가노이드 생성에 사용되었다. 예를 들어, Natalie de Souza (2018) Nature Methods 15(1): 23; DeJonge et al. (2016) PLosOne 11(9), e0162508; Akkerman and Defize, (2017) Bioessays 39, 4, 1600244 참조. 본 발명의 다가 결합 분자는 배양에서 그들의 성장, 생존 및 유지를 향상시키기에 충분한 양으로 오르가노이드의 배양 배지에 포함될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 일 실시형태는 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자의 유효량을 함유하는 배양 배지를 포함하는 조직 오르가노이드의 배양을 향상시키는 방법을 포함한다.
또한 본 발명의 양태는 본 명세서에 기재된 다가 결합 분자의 제조 방법이다. 본 발명의 일 실시형태에서 다가 결합 분자는 다음 단계 a) 내지 e)에 의해서 생성된다:
a) C-말단 및 N-말단을 갖는 Fc 도메인을 선택하는 단계,
b) 하나 이상의 FZD 수용체에 결합하는 펩타이드를 확인하거나, 또는 하나 이상의 FZD 수용체에 결합하는 항체를 확인하는 단계,
c) 하나 이상의 Wnt 공동 수용체에 결합하는 항체를 확인하거나, 또는 하나 이상의 Wnt 공동 수용체에 결합하는 항체를 확인하는 단계,
d) (i) 단계 a)의 Fc 도메인,
(ii) 단계 b)의 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 단계 b)의 항체의 VL 및/또는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 하나 이상의 FZD 수용체를 결합하는 단계 b)의 항체로부터 유래된 VL 및/또는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및
(iii) 단계 c)의 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 단계 c)의 항체의 VL 및/또는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 하나 이상의 Wnt 공동 수용체에 결합하는 단계 c)의 항체로부터 유래된 VL 및/또는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 생성하는 단계, 및
e) 폴리펩타이드를 생성하기 위해 (d)의 핵산 분자를 발현시키는 단계로서, 폴리펩타이드는 이량체화되어 (i) Fc 도메인, (ii) FZD 결합 도메인 및 (iii) Wnt 공동 수용체 결합 도메인을 포함하는 4가 결합 분자를 형성하고, 그 결과 FZD 결합 도메인은 단계 b)의 펩타이드, 또는 단계 b의 VL 및/또는 VH를 포함하고, Fc 도메인의 한 말단에 연결되고, 그리고 Wnt 공동 수용체 결합 도메인은 단계 c)의 펩타이드 또는 단계 c)의 VL 및/또는 VH를 포함하고, Fc 도메인의 다른 말단에 연결되어 다중특이적 결합 분자를 형성하는 핵산 분자의 발현단계.
FZD 수용체 중 하나 이상에 결합하는 펩타이드는 합성 폴리펩타이드, 예를 들어 합성 펩타이드, 아피바디, 안키린 반복 단백질, 피브로넥틴 반복 단백질, 파이노머, 또는 안티칼린 또는 FZD 수용체를 결합하는 자연 발생 단백질의 펩타이드일 수 있다. 자연 존재 단백질은, 예를 들어 Wnt, 예를 들어 Wnt-1, Wnt-2, Wnt-2b, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7a/b, Wnt-7b, Wnt-8a, Wnt-8b, Wnt-9a, Wnt-9b, Wnt-10a, Wnt-10b, Wnt-11, Wnt-16b일 수 있다. 단계 b)의 펩타이드는 FZD 상의 하나 이상의 부위에 결합하는 다가, 예를 들어 2가, 3가 또는 4가일 수 있고, 단일 에피토프에 결합하는 단일특이적이거나 FZD 상의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 다중특이적일 수 있다.
Wnt 공동 수용체 중 하나 이상에 결합하는 펩타이드는 합성 펩타이드, 예를 들어, 아피바디, 안키린 반복 단백질, 피브로넥틴 반복 단백질, 파이노머, 또는 안티칼린, 또는 Wnt 공동 수용체에 결합하는 자연 존재 단백질의 펩타이드일 수 있다. 자연 존재 단백질은 예를 들어 Wnt, 예를 들어, Wnt-1, Wnt-2, Wnt-2b, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7a/b, Wnt-7b, Wnt-8a, Wnt-8b, Wnt-9a, Wnt-9b, Wnt-10a, Wnt-10b, Wnt-11 또는 Wnt-16b, 또는 Dickkopf-1일 수 있다.
단계 c)의 펩타이드는 Wnt 공동 수용체 상의 하나를 초과하는 에피토프에 대한 다가 결합, 예를 들어 2가, 4가 결합일 수 있고, 단일 에피토프에 대한 단일특이적 결합 또는 Wnt 공동 수용체 상의 하나를 초과하는 에피토프에 대한 다중특이적 결합일 수 있다.
FZD 수용체에 결합하는 자연 발생 단백질 및 Wnt 공동 수용체를 결합하는 자연 존재 단백질은 동일한 단백질일 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 b)의 펩타이드 또는 항체는 FZD2를 결합할 수 있고, 단계 c)의 펩타이드는 Wnt5a의 펩타이드일 수 있고, 그리고 단계 c)의 항체는 Wnt5a에 결합하는 공동 수용체 상의 부위에 결합하는 항체일 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 b)의 펩타이드 또는 항체는 FZD4를 결합할 수 있고, 단계 c)의 펩타이드는 노린(Norrin), Wnt1, Wnt8, 또는 Wnt5a 중 하나 이상의 펩타이드일 수 있고, 그리고 단계 c)의 항체는 노린(Norrin), Wnt1, Wnt8 또는 Wnt5a에 결합하는 공동 수용체의 부위에 결합하는 항체일 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 b)의 펩타이드 또는 항체는 FZD5를 결합할 수 있고, 단계 c)의 펩타이드는 Wnt7a, Wnt5a, Wnt10b 또는 Wnt2 중 하나 이상의 펩타이드일 수 있고, 그리고 단계 c)의 항체는 Wnt7a, Wnt5a, Wnt10b 또는 Wnt2 중 하나 이상에 결합하는 공동 수용체의 부위에 결합하는 항체일 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 c)의 펩타이드 또는 항체는 LRP6 및/또는 LRP5를 결합하고, 예를 들어 펩타이드는 노린(Norrin), Wnt1 및/또는 Wnt3a의 펩타이드일 수 있고, 그리고 단계 c)의 항체는 노린(Norrin), Wnt1 및/또는 Wnt3a에 결합하는 LRP6 및/또는 LRP5 상의 부위에 결합하는 항체일 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 c)의 펩타이드 또는 항체는 LRP6를 결합할 수 있고, 예를 들어 펩타이드는 Wnt1 또는 Wnt3a, 또는 둘 모두의 펩타이드일 수 있고, 그리고 항체는 Wnt1 또는 Wnt3a를 결합하는 LRP6 상의 부위를 결합하는 항체일 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 c)의 펩타이드 또는 항체는 ROR1 및/또는 ROR2를 결합한다.
일 실시형태에서, 단계 c)의 펩타이드 또는 항체는 RYK를 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 c)의 펩타이드 또는 항체는 PTK7를 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 b)의 펩타이드 또는 항체는 하나 이상의 FZD 수용체에 결합하고 Wnt 신호전달을 길항하거나 수용체에 대한 Wnt 결합을 억제하는 펩타이드 또는 항체일 수 있다. 일 실시형태에서, 단계 b)의 펩타이드 또는 항체는 Wnt 신호전달을 길항하거나 수용체에 대한 Wnt 결합을 억제하지 않으면서 하나 이상의 FZD 수용체에 결합하는 펩타이드 또는 항체일 수 있다. 일 실시형태에서, 단계 c)의 펩타이드 또는 항체는 Wnt 공동 수용체 중 하나 이상에 결합하고 Wnt 신호전달을 길항하거나 공동 수용체에 대한 Wnt 결합을 억제하는 펩타이드 또는 항체일 수 있다. 일 실시형태에서, 단계 c)의 펩타이드 또는 항체는 Wnt 신호전달을 길항하거나 공동 수용체에 대한 Wnt 결합을 억제하지 않고 Wnt 공동 수용체에 결합하는 펩타이드 또는 항체일 수 있다. 결합 도메인은 링커를 통해 Fc 도메인에 연결될 수 있다. 본 발명의 모듈식 양태는 Fc 도메인의 반대 말단에 있는 임의의 주어진 FZD 수용체 및 Wnt 공동 수용체에 결합하는 펩타이드 또는 항체 VH 및 VL의 혼합 및 매칭을 가능하게 하여 다중 프리즐드 수용체-공동 수용체 복합체를 선택적으로 결합할 수 있는 다가 결합 분자를 생성거나 또는 프리즐드 수용체-공동 수용체 복합체를 선택적으로 결합하여 Wnt 신호전달을 활성화한다.
본 발명의 실시형태는, 다음 단계를 포함하는, Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 다가 결합 분자의 제조 방법이다:
a) C-말단 및 N-말단을 갖는 Fc 도메인, 예를 들어 CH3 도메인, 예를 들어 IgG, 예를 들어 IgG1을 포함하는 면역글로불린의 Fc 도메인을 선택하는 단계,
b) 하나 이상의 FZD 수용체에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 확인하는 단계,
c) Wnt 공동 수용체에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 확인하는 단계,
d) (i) 선택된 Fc 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열,
(ii) 단계 b)의 항체로부터 유래된 VL 및/또는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및
(iii) 단계 c)의 항체로부터 유래된 VL 및/또는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 생성하는 단계,
d) (i) Fc 도메인, (ii) FZD 결합 도메인 및 (iii) Wnt 공동 수용체 결합 도메인을 포함하는 다가 결합 분자를 형성하도록 Fc 도메인을 통해 이량체화하는 폴리펩타이드를 생성하기 위해 (d)의 핵산 분자를 발현하고, 그 결과 FZD 결합 도메인이 Fc 도메인의 한 말단에 연결되고, 그리고 Wnt 공동 수용체 결합 도메인이 Fc 도메인의 다른 말단에 연결되어 다가 결합 분자를 형성하는 단계.
바람직한 실시형태에서, 다가 결합 분자는 핵산 분자에 의해 인코딩된 2개의 폴리펩타이드의 이량체이며, 여기서 Fc 도메인은 홀 구성의 놉(knob)에 있다. 결합 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 다가 결합 도메인일 수 있다. 단계 b)의 항체는 FZD 수용체를 결합하는 항체 단편일 수 있다. 단계 d)(ii)의 VH 및/또는 VL은 단계 b)의 항체의 VH 및/또는 VL과 동일할 수 있다. 단계 c)의 항체는 Wnt 공동 수용체를 결합하는 항체 단편일 수 있다. 단계 d)(iii)의 VH 및/또는 VL은 단계 c)의 항체의 VH 및/또는 VL과 동일할 수 있다.
본 발명의 다가 분자는 "놉-인-홀" 구성으로 2개의 폴리펩타이드를 이량체화함으로써 생성될 수 있다. 놉-인-홀 구성은 FZD 수용체 또는 공동 수용체 상의 상이한 에피토프 또는 동일한 FZD 수용체 또는 공동 수용체 패밀리의 상이한 멤버에 결합하는 결합 모이어티를 포함하는 펩타이드의 회합(association)을 촉진함으로써 본 발명의 모듈성을 증가시킨다. 예를 들어, 도 3a 참조. 놉을 통해 홀 디자인 내부로 Fc 분자를 조작하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 WO2018/026942, 발명자 Van Dyk 등, Carter P. (2001) J. Immunol. 방법 248, 7-15; Ridgway 등. (1996) Protein Eng. 9, 617-621; Merchant A.M., 등. (1998) Nat. Biotechnol. 16, 677-681 및; (1997) J. Mol. Biol. 270, 26-35 참조.
본 발명의 또 다른 실시형태는 세포 상의 FZD 수용체와 공동 수용체의 상호작용을 촉진하여 세포에서 Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 방법으로서, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) C-말단 및 N-말단을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 Fc 도메인 또는 이의 단편을 선택하는 단계;
b) Fc 도메인의 한 말단에서 FZD 수용체를 결합하는 제1 다가 결합 도메인을 연결하고, Fc 도메인의 다른 말단에서 Wnt 공동 수용체에 결합하는 제2 결합 도메인을 연결하여 결합분자를 형성하는 단계; 및
c) FZD 수용체 및 공동 수용체 모두가 다가 결합 분자에 결합하여 Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 조건 하에 상기 다가 결합 분자를 상기 FZD 수용체 및 Wnt 공동 수용체를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계.
결합 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 1가 또는 다가, 예를 들어 2가, 3가 또는 4가일 수 있다. FZD 결합 도메인은 FZD를 결합하는 자연 존재 단백질의 펩타이드, 합성 펩타이드, 예를 들어 아피바디, 안키린 반복 단백질, 피브로넥틴 반복 단백질, 파이노머, 또는 FZD를 결합하는 안티칼린, FZD를 결합하는 VH 및/또는 VL 단편, FZD를 결합하는 scFV, 또는 FZD를 결합하는 디아바디를 포함할 수 있다. Wnt 공동 수용체 결합 도메인은 Wnt 공동 수용체를 결합하는 자연 존재 단백질의 펩타이드, 합성 펩타이드, 예를 들어, 아피바디, 안키린 반복 단백질, 피브로넥틴 반복 단백질, 파이노머 또는 Wnt 공동 수용체에 결합하는 안티칼린, Wnt 공동 수용체를 결합하는 VH 및/또는 VL 단편, Wnt 공동 수용체를 결합하는 scFV, 또는 Wnt 공동 수용체를 결합하는 디아바디를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태는 Fc 도메인 및 2개의 결합 도메인을 포함하는 분자이며, 제1 도메인은 FZD 수용체에 결합하고 제2 도메인은 Wnt 공동 수용체에 결합하고, 이들 2개의 모이어티는 Fc 도메인, 또는 CH3 도메인을 포함하는 이의 단편에 의해 함께 연결되며, 여기서 한 도메인은 Fc 수용체의 N-말단에 연결되고, 다른 도메인은 Fc 수용체의 C-말단에 연결된다. 결합 도메인은 직접적으로 또는 펩타이드 링커, 예를 들어 폴리펩타이드 링커, 또는 비펩타이드성 링커를 통해 Fc 수용체에 연결될 수 있다. 적절한 링커, 예를 들어 XTEN 링커는 당업계에 잘 알려져 있다(WO2013120683, 발명자 Schellenberger 등 참조).
본 발명의 일 실시형태는 FZD 수용체 및 그의 공동 수용체를 발현하는 세포를 본 발명에 따른 유효량의 다가 분자와 접촉시키는 것을 포함하는 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 방법이다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된 다가 분자는 FZD 수용체 및 그의 공동 수용체 둘 모두에 결합함으로써 FZD 수용체 및 공동 수용체(들)에 대한 Wnt 분자의 결합을 모방하는 복합체를 형성하는 것으로 간주되고, 이는 차례로 Wnt 신호전달 경로를 활성화한다.
본 발명의 다가 결합 분자는, 예를 들어 깁슨(Gibson) 어셈블리에 의해 재조합적으로 제조될 수 있거나(Gibson et al.(2009). Nature Methods. 6(5): 343-345 및 Gibson DG.(2011). Methods in Enzymology. 498: 349-361 참조), 또는 분자는 예를 들어 Applied Biosystems, Inc., Beckman 등에 의한 자동화 합성 장치와 같은 상업용 합성 장치를 사용하여 합성적으로 제조될 수 있다. 합성기를 사용하여 자연 존재 아미노산을 비천연 아미노산으로 대체할 수 있다. 특정 서열 및 제조 방법은 편의성, 경제성, 요구되는 순도 등에 의해 결정될 것이다. 원하는 경우, 합성 동안 또는 발현 동안 펩타이드 내로 다양한 기가 도입될 수 있으며, 이는 다른 분자 또는 표면에 대한 연결을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 결합 도메인은 펩타이드 링커, 예를 들어 XTEN 링커를 통해 Fc 도메인에 부착된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 링커는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 99, 95, 97, 98, 99 또는 100개 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 링커는 5 내지 75개, 5 내지 50개, 5 내지 25개, 5 내지 20개, 5 내지 15개, 또는 5 내지 10개 아미노산 길이이다. 링커가 있거나 없는 Fc 도메인은 다가 결합 분자가 FZD 수용체 및 이의 공동 수용체 둘 모두에 결합하여 Wnt 신호전달 경로를 활성화할 수 있도록 하는 길이 및 유연성을 갖는다. 본 발명의 일 실시형태에서, 링커가 있거나 없는 Fc 도메인, 또는 CH3 도메인을 포함하는 그의 단편은 100개 초과 아미노산, 125개 초과 아미노산, 150개 초과 아미노산, 175개 초과 아미노산 또는 200개 초과 아미노산이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하고 "펩타이드"에 대한 언급은 하나 이상의 펩타이드 및 이의 등가물, 예를 들어 당업자에게 공지된 폴리펩타이드 등에 대한 언급을 포함한다.
"친화성 성숙된" 항체 또는 "항체의 성숙"은 그러한 변경을 보유하지 않는 모 항체 또는 공급원 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하며, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화성 또는 분자의 다른 원하는 특성의 개선을 초래한다.
"포함하는"은 인용된 요소가 조성물/방법/키트에 필요하지만, 청구범위의 범위 내에서 조성물/방법/키트 등을 형성하기 위해 다른 요소가 포함될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 당업게에서 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, 다가 결합 분자를 포함하는 조성물은, 임의의 부정적인 단서에 포함되는 요소를 제외하고, 다가 결합 분자 외에 다른 요소, 예를 들어 다가 결합 분자에 결합된 예를 들어 공유 결합된 폴리펩타이드, 소분자 또는 핵산과 같은 관능적 모이어티; 다가 결합 분자 조성물의 안정성을 촉진하는 제제, 다가 결합 분자 조성물의 용해도를 촉진하는 제제, 보조제 등을 포함할 수 있는 조성물이다. 은 당업계에서 용이하게 이해될 것이다.
"본질적으로 구성되는"이라는 문구는 본 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특정 재료 또는 단계에 대해 기재된 조성물 또는 방법의 범위의 제한을 의미한다. 예를 들어, 개시된 서열을 "본질적으로 구성하는" 다가 결합 분자는 개시된 서열의 아미노산 서열 플러스 또는 마이너스 약 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 인용된 결합 아미노산 잔기보다 약 5개 잔기, 4개 잔기, 3개 잔기, 2개 또는 약 1개 잔기, 또는 인용된 결합 아미노산 잔기보다 약 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 더 많은 잔기를 그것이 유래된 서열에 기초한 서열의 경계에서 갖는다는 것을 의미한다.
"구성되는"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분의 조성물, 방법 또는 키트로부터의 배제를 의미한다. 예를 들어, 개시된 서열을 "구성하는" 다가 결합 분자는 개시된 아미노산 서열로만 구성된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 중간 값이 하한 단위의 10분의 1까지 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 기재된 값 또는 기재된 범위 내의 중간 값과, 그 기재된 범위 내의 다른 기재된 값 또는 중간 값과의 사이의 각각의 더 작은 범위는 본 발명에 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 제외될 수 있으며, 더 작은 범위에 어느 하나, 둘 다 포함되지 않거나 둘 모두가 더 작은 범위에 포함되지 않는 각 범위도 본 발명에 포함되며, 여기서 기재된 범위에서 특별히 제외된 제한이 적용된다. 기재된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노 말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시 말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 일정한 영역을 규정한다. 일반적으로, 인간으로부터 얻어진 항체 분자는 분자에 존재하는 중쇄의 성질에 따라 서로 다른 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 부류 중 어느 것과도 관련이 있다. 특정 부류에는 IgG1, IgG2 등과 같은 하위 부류도 있다. 또한, 인간에서 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다.
상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 중쇄 가변 도메인 VH 및 경쇄 가변 도메인 VL 각각 내의 3개의 고도로 분기된 스트레치(stretch)는 "프레임워크 영역" 또는 "FR"으로 공지된 보다 보존된 플랭킹(flanking) 스트레치 사이에 개재된다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린에서 CDR 사이에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 의미한다. VH 도메인은 일반적으로 VH 프레임워크 영역 1(FR1), VH 프레임워크 영역 2(FR2), VH 프레임워크 영역 3(FR3), 및 VH 프레임워크 영역 4(FR4)로 지칭되는 4개의 FR을 갖는다. 마찬가지로, VL 도메인은 전형적으로 본 명세서에서 VL 프레임워크 영역 1(FR1), VL 프레임워크 영역 2(FR2), VL 프레임워크 영역 3(FR3), 및 VL 프레임워크 영역 4(FR4)로 지칭되는 4개의 FR을 갖는다. 항체 분자에서, VL 도메인의 3개 CDR(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)과 VH 도메인의 3개 CDR(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 3차원 공간에서 서로 결합하여 항체 가변영역 내에 항원 결합 부위를 형성한다. 항원 결합 부위의 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적이다. VL 및 VH 도메인의 아미노산 서열은 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 따라 넘버링될 수 있고, 그 안의 CDR 및 FR은 식별/규정된다(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) the INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM (IMGT numbering system; Lefranc et al., 2003, Development and Comparative Immunology 27:55-77). 당해 분야의 숙련가는 IMGT 넘버링 시스템, 카바트 넘버링과 같은 일상적으로 사용되는 넘버링 시스템에 따라 VL 도메인 및 VH 도메인의 아미노산 잔기 넘버링 및 그 안의 CDR 및 FR 식별에 대한 지식을 보유할 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"(또는 간단히 "항체 부분" 또는 "항체 단편")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편, 부분 또는 도메인을 지칭한다. 전장(full-length) 항체의 단편이 항체의 항원 결합 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 다음과 같은 것들이 있다:
(i) VL, VH, CL1 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편;
(ii) 힌지(hinge) 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 F(ab)' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편;
(iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편;
(iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편;
(v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al. (1989) Nature 241:544-546); 및
(vi) 분리된 상보적 결정 영역(CDR).
또한, Fv 단편의 2 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 인코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 연속 사슬로 만들 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어 Bird et al.(1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci 참조). USA 85:5879-5883 참조). 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것을 의도한다. 디아바디와 같은 다른 형태의 단일 사슬 항체도 또한 포함된다(예를 들어, Holliger et al. (1993) PNAS. USA 90:6444-6448 참조).
"아피바디"는 단일클론 항체를 모방하는 고 친화도로 다수의 표적 단백질 또는 펩타이드에 결합하도록 조작된 작은 단일 도메인 단백질이다. 그들은 포도상 구균 단백질 A의 IgG 결합 도메인 중 하나의 스캐폴드를 기반으로 하는 3개의 나선 다발로 구성된다. 이 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 구성되며, 이 중 13개는 무작위로 지정되어 많은 수의 리간드 변이체를 포함하는 아피바디 라이브러리를 생성한다. 예를 들어, U.S. Pat. 5,831,012 및 Lofblom et al. FEBS Letters 584 (2010) 2670-2680 참조. 아피바디 분자 모방 항체는 약 6 kDa의 분자량을 갖는다.
본 명세서에 사용된 "디아바디"는 이량체 항체 단편이다. 디아바디의 각 폴리펩타이드에서, 중쇄 가변 도메인(VH)은 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결되지만, 단일 사슬 Fv 단편과 달리, VL과 VH 사이의 링커는 분자내 쌍형성에는 너무 짧고, 따라서 각 항원 결합 부위는 한 폴리펩타이드의 VH 및 VL과 다른 폴리펩타이드의 VH 및 VL의 쌍형성에 의해 형성된다. 예를 들어 도 3a 참조. 따라서 디아바디는 2개의 항원 결합 부위를 가지며, 단일특이성 또는 이중특이성일 수 있다. (예를 들어, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123; Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5 참조).
본 명세서에 사용된 작용제, 예를 들어 다가 결합 분자 또는 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 "유효량"은 원하는 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료 유효량은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상의 발병률 및/또는 중증도를 감소시키고, 그의 하나 이상의 특징을 안정화시키고 및/또는 발병을 지연시키는 양이다.
본 명세서에 사용된 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 이의 단편, 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며, 일반적으로 특정 3차원 구조적 특성과 특정 전하 특성을 갖는다. 해리 상수가 ≤10μM일 때 항체는 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. 예를 들어, ≤100 nM, 바람직하게는 ≤10 nM, 보다 바람직하게는 ≤1 nM이다.
면역글로불린 분자의 불변 영역은 또한 단편 결정화 가능 영역, "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"으로도 불린다. Fc 도메인은 항체의 두 중쇄의 제2 및 제3 불변 도메인으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편으로 구성되며, IgG의 Fc 도메인에는 고도로 보존된 N-글리코실화 부위가 있다. Fc 단편의 글리코실화는 Fc 수용체-매개 활성에 필수적이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 다가 분자의 Fc 도메인은 ADCC 또는 CDC-의존적 사멸에 대해 다가 분자를 결합하는 세포를 표적화하지 않도록 조작된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 다가 결합 분자의 Fc 도메인은 놉-인-홀 구성의 펩타이드 이량체이다. 펩타이드 이량체는 헤테로 이량체일 수 있다.
용어 "개인", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 진단, 치료 또는 치료법이 필요한 임의의 포유동물 대상체, 특히 인간을 지칭한다.
"LRP", "LRP 단백질" 및 "LRP 수용체"는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 패밀리의 멤버를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 이들 수용체는 수용체-매개 세포내이입(endocytosis) 과정에서 리간드를 결합하고 내재화하는 단일-통과 막횡단 단백질이다. LRP 단백질 LRP5(GenBank Accession No. NM 002335.2) 및 LRP6(GenBank Accession No. NM 002336.2)은 Wnt-ßcatenin 신호전달 경로의 활성화에 필요한 Wnt 수용체 복합체에 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리펩타이드 단편"은 아미노 말단 및/또는 카르복시-말단 결실을 갖지만 나머지 아미노산 서열은, 예를 들어, 전장 cDNA 시퀀스로부터 추론된 자연 발생 서열의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩타이드를 지칭한다,
본 명세서에 사용된 용어 "파라토프"는 에피토프에 결합하는 항체의 가변 영역 내의 항원 결합 부위를 포함한다.
용어 "치료", "치료하는" 등은 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 사용된다. 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고 및/또는 질병 및/또는 질병에 기인할 수 있는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "치료"는 포유동물의 질병의 모든 치료를 포함하며, (a) 질병에 걸리기 쉬우나 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질병이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질병을 억제하는 것, 즉 질병의 발달을 저지하는 것; 또는 (c) 질병을 경감시키는 것, 즉 질병의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다. 치료제는 질병 발명 또는 상처의 전, 후, 도중에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 감소시키는 경우, 진행 중인 질병의 치료가 특히 중요하다. 이러한 치료는 영향을 받은 조직에서 기능이 완전히 상실되기 전에 수행하는 것이 바람직하다. 대상체 요법은 질병의 증상 단계 동안, 그리고 어떤 경우에는 질병의 증상 단계 후에 투여될 수 있다.
Wnt 신호전달을 활성화시키는 본 발명의 다가 결합 분자의 능력은 다수의 분석에 의해 확인될 수 있다. 본 발명의 다가 결합 분자는 일반적으로 FZD 수용체의 천연 리간드에 의해 개시되는 것과 유사하거나 동일한 반응 또는 활성을 개시한다. 본 발명의 다가 결합 분자는 Wnt 신호전달 경로, 예를 들어 표준적인 Wnt-β카테닌 신호전달 경로를 활성화한다. 본 명세서에 사용된 용어 "활성화"는 본 발명의 FZD 작용제의 부재 하에 수준과 비교하여 Wnt 신호전달 경로, 예를 들어 Wnt-β카테닌 신호전달 경로의 세포내 수준의 측정 가능한 증가를 지칭한다.
Wnt-β카테닌 활성화 수준을 측정하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이들 방법은 다음을 측정하는 분석이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다: Wnt-βcatenin 표적 유전자 발현; LEF/TCF 리포터 유전자 발현(예를 들어, TopFLASH, superTopFLASH, pBAR); β카테닌 안정화; LRP5/6 인산화; 세포질로부터 세포막으로의 Axin 전위 및 LRP5/6에 대한 결합. 표준적인 Wnt-βcatenin 신호전달 경로는 궁극적으로 전사 인자 TCF1, TCF7L1, TCF7L2 및 LEF를 통해 유전자 발현의 변화를 초래한다. Wnt 활성화에 대한 전사 반응은 많은 세포와 조직에서 특징지어진다. 이와 같이, 당업계에 잘 알려진 방법에 의한 전체 전사 프로파일링은 Wnt-β카테닌 신호전달 활성화를 평가하는데 이용될 수 있다.
Wnt-반응성 유전자 발현의 변화는 일반적으로 TCF 및 LEF 전사 인자에 의해 매개된다. TCF 리포터 분석은 Wnt-β카테닌 신호전달 수준을 결정하기 위해 TCF/LEF 제어 유전자의 전사 변화를 평가한다. TCF 리포터 분석은 Korinek, V.등, 1997에 의해 처음 기술되었다. TOP/FOP라고도 알려진 이 방법은 최적의 TCF 모티프 CCTTTGATC의 3개 카피 또는 돌연변이 모티프 CCTTTGGCC의 3개 카피를 사용하는 것을 포함하며, 이는 내인성 β카테닌/TCF의 트랜스활성화 활성을 결정하기 위해 루시페라제 발현(각각 pTOPFLASH 및 pFOPFLASH)을 구동하는 최소 c-Fos 프로모터의 업스트림(upstream)이다. 이 두 리포터 활성(TOP/FOP)의 더 높은 비율은 더 높은 ß카테닌/TCF 활성을 나타낸다. 이 리포터의 더 새롭고 더 감도 높은 버전은 pBAR이라고 하며 TCF 모티프의 12개 반복을 포함한다(Biechele and Moon, Methods Mol Biol. 2008;468:99-110, PMID: 19099249).
분자 및 세포 생화학의 일반적인 방법은 다음과 같은 분자 클로닝(Molecular Cloning)과 같은 표준 교과서에서 찾을 수 있다: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., CSH Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998).
"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인들 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv 및 기타 항체 단편에 대한 검토는 James D. Marks, Antibody Engineering, Chapter 2, Oxford University Press(1995)(Carl K. Borrebaeck, Ed.)를 참조한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 널리 공지되고 일반적으로 사용된다. 표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)에 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 사양에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어 Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) 참조. 본 명세서에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학과 관련하여 이용되는 명명법 및 실험실 절차 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것이다. 표준 기술은 화학 합성, 화학 분석, 약제 준비, 제형, 전달 및 환자 치료에 사용된다.
실시예 I
1. 다가 FZD 작용제의 개발.
FZD 디아바디를 포함하는 제1 결합 도메인 및 공동 수용체 디아바디를 포함하는 제2 결합 도메인을 갖는 다가 결합 분자를 제조하기 위해, 본 발명에서는 기존의 파지-디스플레이 기술을 이용하여 FZD 수용체의 시스테인 풍부 도메인(CRD)에 결합한 항체를 선택함으로써 합성 Fab 파지 라이브러리(라이브러리 F, 미국 공개 번호 2016/0194394, 발명자 Sidhu 등 참조)로부터 FZD 특이적 항체를 확인하였다. 필요에 따라 친화성 또는 특이성 성숙을 수행하였다. 예를 들어, pan-FZD 결합 항체 #5019(FZD1, 2, 4, 5, 7 및 8을 인식함)는 FZD4 CRD를 항원으로 사용하여 FZD7 유래 항체로부터 성숙되었다. 본 발명의 이전 연구에서는 또한 FZD4(5038, 5044, 5048, 5062, 5063, 5080, 5081) 또는 FZD5(2928)에 대해 완전히 특이적인 여러 항체를 확인하였다(예를 들어, US20160194394, 발명자 Sidhu 등 및 WO2017127933A1 발명자 Pan 등).
이들 FZD 항체를 사용하여 FZD 특이적 디아바디를 제조하였다. 디아바디는 단일 사슬 가변 단편(scFv)과 유사한 항체 형태이고, 각 VL 및 VH를 인코딩하는 2개 펩타이드의 이량체이지만, scFv와 달리 폴리펩타이드 내의 VH와 VL 사이의 링커는 너무 짧아서 VH 및 VL 도메인 간의 분자내 상보성을 가능하게 한다. 따라서, 한 폴리펩타이드의 VH-VL 단편은 2개의 항원 결합 파라토프를 기능적으로 재구성하는 방식으로 또 다른 폴리펩타이드의 VH-VL 단편과 이량체화된다. 동일한 VL 및 VH를 갖는 폴리펩타이드의 이량체를 형성함으로써 호모디아바디를 형성함으로써, 또는 상이한 VL 및 VH 도메인을 갖는 2개의 폴리펩타이드로부터 이량체를 형성하여 헤테로디아바디를 형성함으로써, 파라토프가 동일하거나 동일하지 않은 디아바디를 생성하였다.
LRP6 항체는 또한 인간 LRP6의 재조합 세포외 도메인(ECD)에 결합하는 것들을 선택함으로써 합성 항체 라이브러리로부터 선택되었다. 독특한 CDR 영역을 가진 5개의 Fab가 확인되었다. IgG 형태로 전환된 후, 이들은 모두 인간 LRP6 결합과 마우스 LRP6 결합을 나타낸다. ELISA를 통해 LRP5 결합이 검출되지 않았으며, 이는 이러한 항체가 LRP6 특이적임을 입증한다(도 1a). LRP6 ECD에는 반복과 같은 4개의 EGF(상피 성장 인자)와 교대하는 4개의 β-프로펠러 모티프가 포함되어 있다. 처음 2개의 β-프로펠러 모티프는 Wnt1 결합에 관여하는 것으로 생각되고, 마지막 2개는 Wnt3 결합에 관여하여 항체 결합에 대한 2개의 잠재적 에피토프를 생성하는 것으로 생각된다. 도 6a 참조. 에피토프 결합 결과, 이들 5개의 항체가 LRP6 상의 2개 개별 부위에 결합하고, Wnt1 결합 부위를 결합하는 항체 2538, 2542 및 2543과 LRP6의 Wnt3 결합 부위를 결합하는 2539 및 2540을 갖는 2개의 그룹으로 나눌 수 있음을 시사한다. 일반적으로 LRP6-Wnt1 부위에 결합하는 항체는 Wnt1 유도 Wnt 경로 활성화를 차단할 것으로 예상된다.
FZD에 특이적인 호모디아바디를 함유하는 Fc N-말단 결합 도메인을 제조하기 위해, 선택된 FZD 항체의 VH 및 VL 단편 VH-1, VH-2, VL-1 및 VL-2를 상응하는 파지미드 템플레이트로부터 PCR에 의해 증폭시키고 단리하였다. 그 다음, 깁슨(Gibson) 어셈블리를 이용하여 단리된 단편(VH-1 및 VL-2)을 Fc-놉 영역(pSCST 백본)을 포함하는 EcoRI/XhoI 프리컷 벡터에 도입하였다(Gibson et al.(2009). Nature Methods. 6 (5): 343-345 and Gibson DG. (2011). Methods in Enzymology. 498: 349-361). 깁슨 어셈블리는 또한 Fc-홀 영역을 포함하는 EcoRI/XhoI 프리컷 벡터에 단편(VH-2 및 VL-1)을 도입하는 데 사용되었다. 올바른 조립은 DNA 시퀀싱을 이용하여 검증되었다. 2개의 플라스미드(한 쌍, Fc-놉 및 Fc-홀)를 사용하여 Fc 도메인의 C-말단에 제2 결합 도메인을 도입하였다.
Fc-놉 및 Fc-홀 구성은 결합 도메인 중 하나가 헤테로디아바디인 다가 결합 도메인을 생성하는 데 필요하였다. 그러나, Fc-놉 및 Fc-홀 구성은 Fc 도메인의 N 및 C 말단 모두에 호모디아바디를 포함하는 결합 분자를 제조하는 데 필요하지 않았으므로, 이러한 결합 분자의 경우, VH 및 VL은 야생형 Fc 영역에 연결되었고 단 하나의 플라스미드를 사용하여 호모이량체를 형성하는 VH-VL 함유 폴리펩타이드를 생성하였다. 선택적으로, 링커, 예를 들어 펩타이드 링커 또는 비-펩타이드 링커는 결합 도메인과 Fc 도메인 사이에 존재할 수 있다.
C-말단 결합 도메인을 생성하기 위해, LRP5/6 항체를 확인하고 FZD 디아바디를 생성하기 위해 상기 기재된 것과 동일한 프로토콜에 따라 LRP5/6 디아바디를 생성하였다. C-말단 결합 도메인은 LRP 항체에 대한 상응하는 파지미드 템플레이트로부터 VH-3, VH-4, VL-3 및 VL-4 단편을 PCR 증폭한 다음 증폭된 단편을 단리함으로써 생성되었다. 위에서 기술한 바와 같이, 깁슨 어셈블리는 VH-3 및 VL-4 단편을 위에서 기술한 Fc-놉 플라스미드의 PpuMI/BamHI 부위에 도입하는 데 사용되었다. 깁슨 어셈블리를 사용하여 다른 VH-4 및 VL-3 단편을 Fc-홀 플라스미드의 PpuMI/BamHI 컷에 삽입하였다.
상이한 VL 및 VH 서열을 갖는 2개의 플라스미드(한 쌍, Fc-놉 및 Fc-홀)를 사용하여 이중특이성, 즉 2개의 상이한 부위에 결합할 수 있는 FZD 또는 공동 수용체 결합 도메인을 생성하였다. 단일특이적 결합 도메인을 갖는 이량체를 생성하기 위해 놉-인투-홀 구성이 필요하지 않았기 때문에, 각 결합 도메인이 단일특이적이면 야생형 Fc 서열을 함유하는 단일 플라스미드만 사용하였다.
도 9a는 "놉" 돌연변이를 포함하는 Fc 영역, panFZD 항체 #5019의 VH 및 VL, 및 LRP 항체 #2542의 VL, 및 LRP 항체 #2539의 VH를 포함하는 펩타이드를 인코딩하는 플라스미드를 도시한다. 도 9b는 "홀" 돌연변이, panFZD 항체 #5019의 VH 및 VL, 및 LRP 항체 #2542의 VH 및 LRP 항체 #2539의 VL을 포함하는 Fc 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 펩타이드를 인코딩하는 플라스미드를 도시한다. 이들 플라스미드에 의해 인코팅된 펩타이드는 범 특이적 FZD 항체 #5019로부터 유래된 호모디아바디를 포함하는 다가 결합 부위, 및 하나의 펩타이드로부터 LRP 항체 #2539의 VL 및 LRP 항체 #2542의 VH를 다른 펩타이드의 LRP 항체 #2539의 VH 및 LRP 항체 #2542의 VL과 쌍을 형성함으로써 생성된 이중특이적 헤테로 다이아바디를 포함하는 다가 결합 부위를 갖는 헤테로 이량체를 형성한다.
이어서, 생성된 플라스미드를 시퀀싱하고, 제조업체의 지침에 따라 PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit(Invitrogen)를 사용하여 시퀀싱된 검증 플라스미드를 제조하였다. 그 다음, 플라스미드를 Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific)에 형질감염시키고, FectoPRO 시약(Polyplus)을 제조업체의 지침에 따라 항체 발현에 사용하였다. 일반적으로, 소규모 뱃치(batch) 항체 생성에는 200ml 세포 규모가 사용되었다.
전형적으로, 형질감염 80시간 후에, Expi 293F 세포 배양 배지를 원심분리에 의해 수집하여 세포 및 세포 파편을 펠릿화하였다. 상청액을 깨끗한 병으로 옮기고 10xPBS 완충액으로 완충시켰다. 적절한 양의 단백질 A 비드(GE Healthcare)와 함께 1시간 인큐베이션한 후, 비드를 세척하고 결합 분자를 제조업체 지침에 따라 용리하였다. 마지막으로 완충액을 PBS로 교체하였다.
2. 헤테로 이량체 다가 결합 분자
상기 기재된 방법을 이용하여, 본 발명에서는 또한 Fc 도메인(놉-홀)의 N-말단 및 C-말단 각각에 융합된 온전한 이중특이성 디아바디를 함유하는 4가 헤테로 이량체 분자를 생성하였다(도 2a 및 3a). 특히, 본 발명에서는 Fc 도메인의 N-말단에 항체 5019로부터 유래된 FZD 결합 호모디아바디 및 LRP6-W1 항체 2542(5019-Fc-2542) 또는 Fc 도메인의 C-말단에 LRP6-W3 항체 2539(5019-Fc-2539)로부터 유래된 호모디아바디를 갖는 4가 결합 분자를 생성하였다. 놀랍게도, 두 4가 분자 모두는 Wnt 경로를 활성화했지만, 5019-Fc-2542는 훨씬 더 낮은 효능을 가졌다(도 3c). 이론에 구애받지 않고, 이러한 차이는 Wnt 신호전달을 활성화하기 위한 LRP6-W1 및 LRP6-W3 결합 능력의 차이를 반영할 수 있다. LRP6-W3 부위의 Wnt 결합은 Wnt가 LRP6-W1 부위에 결합하는 것보다 Wnt 신호전달을 활성화하는 데 더 효과적인 것으로 관찰되었다.
본 발명에서는, 또한 Fc 도메인의 N-말단 상의 항체 5019로부터 유래된 FZD 결합 호모디아바디 및 Fc 도메인의 C-말단 상의 LRP6-W1 항체 2542 및 LRP6-W3 항체 2539로부터 유래된 LRP 헤테로디아바디를 갖는 4가 삼중특이적 결합 분자(5019-K/H-2539-2542, 5019Ag로 명명)를 생성하였다(도 5). 5019Ag는 단일특이적 LRP6 호모디아바디를 갖는 분자와 비교하여 Wnt 신호전달을 활성화하는 데 예기치 않게 효과적이다(도 3c). 세 가지 형태 모두의 나노몰량은 pBAR 루시페라제 리포터 분석에 의해 결정된 Wnt 신호전달을 활성화하여(도 3D), 효과적인 Wnt 모방체임을 나타낸다. 이론에 얽매이지 않고, 강력한 Wnt3A 부위와 약한 Wnt1 부위를 함께 결합하는 것이 2개의 강력한 Wnt3A 부위를 결합하는 것보다 더 효과적인 것으로 생각된다. FZD 결합 도메인과 LRP 결합 도메인을 갖는 2개의 최상의 다가 결합 분자인 "FLAgs"는 정제된 Wnt3A의 효능과 거의 동일한 한자리 나노몰 효능(EC50 ~5 nM)을 가졌으며 벨 모양의 용량 반응 프로파일을 표시하였다(도 11d). 본 발명에서는 이것을 최대 자극이 FLAg의 다가 결합을 필요로 하고 더 높은 농도에서 감소된 효능이 FZD 또는 LRP6에 대한 1가 결합에 기인할 가능성이 있음을 나타내는 것으로 해석한다. 본 발명에서는, Wnt-FZD 경로 활성화의 특징인 β카테닌 단백질 수준과 DVL2의 인산화 및 β카테닌 단백질 수준의 용량- 및 시간- 의존적 증가를 유발하는 FP+P-L61+3으로 낮은 수준의 β카테닌을 발현하는 RKO 세포(Major et al. Science. 316, 1043-1046 (2007))를 처리하였다(도 11e 및 도 11f). 따라서 4가 FLAg는 FZD 및 LRP6의 합성 작용제로 기능하는 모듈식의 조작 가능한 인간 Ab 양식(modalities)이다.
최적의 FLAg FP +P-L61+3의 조작된 친화성 및 특이성을 확인하기 위해, 본 발명에서는 바이오-레잉 간섭법(BLI)을 이용하여 10개의 인간 FZD CRD 중 9개 및 인간 LRP6 ECD에 대한 그의 결합 동역학을 측정하였다(도 12a 및 도 12b). FLAg는 모체 pan-FZD 파라토프(Pavlovic et al. 2018)에서 유래된 FZD 디아바디에 의해 인식되는 6개의 FZD에 대해 피코몰 범위(KD = 10-800pM)의 친화도로 결합하였지만 다른 3개의 FZD에는 검출 가능하게 결합하지 않았다. 더욱이, LRP6에 대한 친화도는 나노몰 범위(KD = 12 nM)에 있었다(도 12b). 그 다음 BLI를 사용하여 다양한 Fc 수용체에 대한 FLAg 결합을 평가하였다.
FLAg는 통상적인 IgG와 유사하게 거동하고 용량 및 pH 의존적 방식으로 FcRn과 상호작용하였다(도 12c). 천연 IgG는 pH 6에서 FcRn에 결합하지만 pH 7.4에서는 결합하지 않으며, 이는 포액작용(pinocytosis) 동안 재활용을 가능하게 하고 결과적으로 생체내 긴 반감기를 가능하게 한다. FLAg는 또한 보상체(C1q), 자연 살해 세포 마커 CD16a, B 세포 마커 CD32a, 및 단핵구 및 대식세포 마커 CD64를 포함하는 다른 Fc 이펙터와의 상호작용에 대해 IgG와 유사하게 거동하였다(도 12d). 본 발명에서는, FLAg가 생체 내에서 이펙터 기능과 긴 반감기를 부여해야 하는 기능적 Fc 모이어티를 포함한다고 결론지었다.
본 발명에서는, 4가 FP +P-L61+3 FLAg의 모듈식 설계를 통해, 관련 없는 항원 말토오스 결합 단백질(MBP)에 결합하는 널(null) 파라토프로 대체함으로써 고유 작용제 활성에 대한 4개의 파라토프 각각의 기여도를 분석할 수 있었다. 본 발명에서는, 하나의 Fc 도메인 말단에 부착된 Fc 도메인 및 FZD 결합 도메인 및 다른 Fc 도메인 말단에 부착된 LRP 결합 도메인을 포함하는 "단일 결합" 분자를 생성하였지만, 디아바디 내에 FZD 또는 LRP에 대한 2개의 결합 부위를 갖는 것보다, 결합 도메인은 오직 단일 또는 단일 결합 부위와 하나의 제어 말토스-결합-단백질 결합 부위 "MBP"를 가졌다. 하나의 MBP 결합 부위를 분자의 적어도 하나의 결합 도메인에 도입하여 5개의 단일 결합 분자를 생성하였다. N-말단에 하나의 FZD와 하나의 MBP 결합 부위를 포함하는 5019-MBP-K/H-2539-2542는 여전히 Wnt 경로를 활성화하지만 5019Ag와 비교하여 효능이 8배 감소합니다(도 3e). 유사하게, C-말단에 하나의 LRP6-W3 부위만 보유하는 5019-K/H-2539-MBP는 5019Ag에 비해 훨씬 적은 Wnt 활성화를 나타낸다(도 3e). 2개의 MBP-FZD/MBP-LRP6 분자 5019-MBP-K/H-2539-MBP 및 5019-MBP-K/H-MBP-2542 및 하나의 LRP6-W1 디아바디, 5019-K/H-MBP-2542를 갖는 분자에 대해 최소 작용 활성이 검출되었다(도 3e). 이러한 β카테닌 신호전달 분석의 결과는 최대 자극이 WNT1 결합 부위에 대해 하나의 항-FZD 파라토프 또는 항-LRP6 파라토프를 비활성화함으로써 크게 감소되었고, WNT3A 결합 부위에 대한 항-LRP6 파라토프를 비활성화함으로서 또는 동시에 하나의 항-FZD 파라토프와 항-LRP6 파라토프 중 하나를 비활성화함으로써 완전히 제거되었다. 본 발명에서는, 또한 WNT1 결합 부위를 표적으로 하는 항-LRP6 파라토프를 WNT3A 결합 부위를 표적으로 하는 항-LRP5 파라토프로 대체하여, 공동 수용체와 FP +P-L61+3의 것과 유사한 활성을 관찰할 수 있는 분자(FP +P-L5/63)를 생성하였다(도 3f, EC50 = 4 nM). 종합하면, 이들 데이터는 최적의 작용제 활성이 공통 에피토프를 통해 2개의 FZD 및 2개의 별개의 에피토프를 통해 LRP6을 동원할 수 있는 분자로 달성되지만, 활성은 항-FZD 또는 항-LRP6 중 하나를 비활성화함으로써 중간 수준으로 조절될 수 있음을 보여주었다. 더욱이, FZD 및 2개의 상이한 공동 수용체를 동원할 수 있는 분자는 LRP5 및 LRP6에 대해 각각 1개의 파라토프와 2개의 항-FZD 파라토프를 결합하여 생성되었다.
본 발명에서는, 또한 디아바디 쌍을 덜 구속된 분자내 단일 사슬 가변 단편(scFv)의 쌍으로 대체함으로써 분자간 디아바디 형식에 의해 부과된 기하학적 및 공간적 제약에 대한 요건을 조사하였다(도 2j). FP +P-L61+3과 비교하여, 항-FZD scFv(FP*+P*-L61+3)를 포함하는 FLAg는 유사한 활성을 나타내는 반면, 항-LRP6 scFv(FP+P-L61*+3*) 또는 양쪽 끝의 scFv(FP *+P*-L61*+3*))를 포함하는 FLAg의 활성은 크게 감소되었다. 파라토프가 디아바디 또는 scFv 형식으로 제시되었는지 여부에 관계없이, LRP6 및 FZD 이소폼에 필적할만한 고 친화성 결합을 나타내므로, 이러한 활성 차이는 친화도의 차이로 인한 것이 아니다(도 2k 및 도 2l). 종합하면, 이러한 결과는 최적의 FZD/LRP6 신호전달 복합체의 집합을 위해 특정 화학량론 및 기하학이 필요하고, 제약 조건이 디아바디 형식에 의해 지시되는 특정 기하학에서 2개의 별개 에피토프의 결합을 요구하는 LRP6에 대해 특히 정확하다는 것을 보여주었다. 특히, FZD 결합에 대한 더 느슨한 제약은 단일 항-FZD 파라토프로 상당한 활성화를 가능하게 하고(도 2d), 이는 헤테로 이량체 Fc의 N-말단에서 항-FZD 파라토프와 함께 추가 파라토프를 통해 다른 세포 표면 단백질을 동원함으로써 특이성을 추가로 향상시키거나 신호전달을 변경하기 위한 문을 연다.
3. 기타 이중특이성 항체 형태
Fc 도메인의 동일한 말단에서 항체 #5019의 FZD 결합 도메인 및 항체 #2942(5019/2942)의 LRP6-W1 결합 도메인 또는 항체 #2539(5019/2539)의 LRP6-W3 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자가 구축되고, 해당 단백질은 정제되고(도 2a), pBAR 루시페라제 리포터 분석을 이용하여 Wnt 신호전달의 활성화에 대해 분석되었다. 이 분자는 Wnt 신호전달을 활성화하지 못하였다. 특히, 두 이중특이성 분자는 Wnt 리간드의 활성을 길항하였다(도 2b). 이론에 얽매이지 않고, 이러한 이중특이성 분자의 두 파라토프 사이의 거리와 유연성은 활성화에 적합한 기하학적 구조에서 FZD 및 LRP6 수용체를 동원하지 않을 수 있다.
FZD 디아바디 및 Fc 도메인의 동일한 말단에 부착된 LRP 디아바디를 포함하는 이중특이적 분자는 또한 홀 구성의 놉을 사용하여 생성되었다. 5019-2539-K/H(FZD/LRP-W3) 및 5019-2542-K/H(FZD/LRP-W1)로 명명된 이러한 디아바디는 FZD 및 LRP 결합 및 Wnt 경로 활성화에 대해 분석되었다. 두 디아바디 모두는 원래 항체의 FZD 결합 프로필과 LRP6 결합 활성을 유지하였다(도 2d-2g). 두 분자 모두 FZD 수용체와 LRP 공동 수용체에 개별적으로 결합되었다. 5019-2542-K/H는 BLI 분석(도 2h)으로 결정된 바와 같이 용액에서 FZD 및 LRP 둘 모두에 공동 결합을 나타냈지만, 5019-2539-K/H에서는 큰 공동 결합이 관찰되지 않았다. 5019-2539-K/H 또는 5019-2542-K/H는, pBAR 루시퍼라제 리포터 분석에서 결정된 바와 같이, FZD 수용체(5019-Fc) 또는 공동 수용체(2539-Fc)에만 결합된 호모디아바디로 얻어진 결과와 유사한 Wnt 신호전달을 활성화하지 못하였다(도 2l). 또한, 5019-2539-K/H(FZD/LRP-W3) 및 5019-2542-K/H(FZD/LRP-W1) 모두는 Wnt3a 매개 경로 활성화를 효과적으로 억제하였다(도 2l).
4. Wnt 경로 신호전달 분석
Wnt 경로 활성화는 β카테닌의 전사 활성화를 충실하게 모니터링하는 pBAR 루시퍼라제 리포터 시스템을 이용하여 HEK293 세포에서 분석되었다(Biechele and Moon, Methods Mol Biol. 2008;468:99-110, PMID: 19099249). 간단히 말해서, pBARLS 및 pSL9 Ef1α-Renilla Luciferase 구축물을 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포를 1.5E4 세포/웰로 96웰 플레이트에 접종되었다. 접종 24시간 후, 세포를 표시된 농도 또는 PBS 비히클 대조군에서 3중으로 표시된 FZD 작용제로 처리하였다. 처리 16.5시간 후, 세포를 용해하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega #E1960)을 이용하여 발광성을 측정하였다. 반딧불(Firefly) 발광은 세포 수를 제어하기 위해 각 웰에 대해 레닐라(Renilla) 발광으로 정규화되었다.
본 발명에서는, 여러 FZD 수용체(FZD 1, 2, 4, 5, 7, 8)를 인식하는 항체 단편(항체 #5019)에서 유래된 N-말단 FZD 디아바디를 함유하는 다가 분자의 작용제 활성을 분석하였다. Fc 도메인을 통해 Fc 도메인의 C-말단에 있는 LRP 결합 도메인에 연결된다. C-말단 LRP 결합 도메인은 각각 Wnt3 부위 및 Wnt1 부위에 결합하는 2개의 LRP6 항체 #2539 및 #2542 중 하나로부터 유래된 디아바디를 포함하였다(도 6b). 5019-Fc-2539 및 5019-Fc-2542로 표시된 이러한 다가 결합 분자의 나노몰량은 Wnt-β카테닌 경로를 활성화하였지만(도 6c), Wnt3 부위, 5019-Fc-2539를 표적으로 하는 LRP6 항체를 보유하는 분자로 세포를 처리하면, 5019-Fc-2542와 비교할 때 대략 10배 더 높은 활성화를 유도하였다(각각 배경에 비해 200배 대 20배)(도 6c).
중요하게는, 본 발명에서는, Fc 모이어티 내에서 조작된 놉-홀 시스템을 사용하여, 일측 말단에 pan-FZD 결합 도메인에 대한 호모디아바디(#5019) 및 타측 말단에 Wnt1 (#2542) 및 Wnt3(#2539) 5019-K/H-2539:2542 에 대한 결합 부위가 있는 LRP6 결합 도메인을 형성하는 헤테로디아바디를 포함하는 다가 결합 분자(도 1c)를 생성하였다(도 6b). 이 구성은 다른 선택성 및 친화성 프로필, 즉, 4가 및 삼중 특이성을 갖는 분자 내 4개의 다른 결합 부위의 통합을 가능하게 하였다. HEK293 세포에서 β-카테닌 루시퍼라제 리포터 분석에서 테스트할 때, 이 분자는 5019-Fc-2539보다 2배 더 높은 활성화 또는 배경에 비해 약 400배 더 높은 활성화를 나타낸다(도 6c).
본 발명에서는 또한 FZD1, 2, 4, 5, 7, 8 (5019)를 결합하는 동일한 pan-FZD 디아바디와 함께 놉-인-홀 시스템 내의 동등한 LRP5 결합 부위(둘 모두 LRP5를 결합하는 2459 및 2460 항체로부터 유래된 디아바디)에 대한 LRP6의 결합 부위를 대체하였다. 이 분자 5019-K/H-2459:2460은 또한 HEK293T 세포에서 Wnt-β카테닌 경로를 활성화할 수 있었지만(도 6d), LRP6 디아바디를 포함하는 작용제보다 효능이 낮다.
5. 선택적 FZD 작용제의 특성화(선택적 FZD 및 공동 수용체 항체 단편에서 유래된 결합 도메인을 갖는 작용제 모듈성)
단일특이성 FZD 작용제의 활성을 평가하기 위해, 본 발명에서는 특정 FZD 이소폼에 의존하는 세포 기반 분석을 이용하였다. 본 발명에서는 10개의 FZD 수용체 중 하나에만 결합하는 다가 결합 분자를 제조하였다. 본 발명자의 이전 연구에서는 FZD4(5038, 5044, 5048, 5062, 5063, 5080, 5081)에 대해 완전히 특이적인 여러 항체를 확인하였다(예를 들어, US 2016 0194394, 발명자 Sidhu 등 및 WO 20371279, 발명자 Pan 등 참조). FZD4 특이적인 FZD 결합 도메인을 포함하는 다가 결합 분자 및 항체 2539 및 2542로부터 유래된 이중특이적 헤테로디아바디를 포함하는 LRP6 결합 도메인은 Fc 놉-인-홀 시스템을 이용하여 생성되었다. 이 분자는 ß-카테닌 경로를 통해 FZD4 신호전달을 활성화할 수 있지만 FZD4 cDNA와 함께 HEK293 세포에 동시 형질감염된 경우에만 가능하다. 이러한 FZD4 결합 분자는 낮은 수준의 FZD4를 발현하는 비 변형 HEK293T 세포에서 FZD4 신호전달 또는 β-카테닌 경로를 활성화할 수 없다. 따라서, 이 실험은 FZD4에 대한 분자의 특이성을 입증한다. 5019-K/H-2539-2542(상기 기재된 pan-FZD 작용제)는 FZD4가 없는 경우에도 HEK293T 세포에서 신호전달을 활성화할 수 있다(도 4a). 이 결과는 ß-카테닌 신호전달 HEK293T 세포의 Wnt 매개 활성화가 FZD1, 2 및 7(Voloshanenko et al. FASEB 2017 FASEB J. 2017 Nov; 31(11):4832-4844; PMID: 28733458)을 통해 발생하고, 항체가 3개 수용체 모두에 결합하기 때문에 놀라운 일이 아니다
또한, 본 발명에서는 FZD5 특이적 항체 2928의 결합 도메인을 사용하여 FZD5 특이적 다가 결합 분자를 생성하였으며, 이는 이전에 FZD5에만 결합하는 것으로 특성화되었다(Steinhart 등, Nat Med. 2017 Jan; 23(1): 60-68, PMID: 27869803, WO2017127933A1, 발명자 Pan 등). 본 발명에서는 이전에 여러 RNF43 돌연변이 췌관 선암종(PDAC) 세포주가 증식을 위해 FZD5 신호에만 의존한다는 것을 입증하였다(Steinhart et al. 2017, PMID: 27869803). 실제로, 3개의 RNF43 돌연변이 PDAC 세포주에서 게놈 전체의 CRISPR 필수성/적합성 스크린은 FZD5가 그들의 성장에 가장 필수적인 유전자 중 하나인 것을 나타냈지만, WT RNF43이 있는 PDAC 세포주는 FZD5에 대한 이러한 요건을 나타내지 않았음을 보여주었다. RNF43 돌연변이 세포를 Wnt 리간드의 팔미토일화(palmitoylation) 및 활성을 억제하는 포큐파인(Porcupine) 억제제(PORCNi; LGK-974와 같은)로 처리하면 RNF43 돌연변이 세포가 증식을 정지한다.
pan-FZDag 5019-K/H-2539-2542 또는 선택적 FZD5 작용제 2928-K/H-2539-2542를 사용한 RNF43 돌연변이 세포의 공동 처리는 LGK974에 의해 차단된 세포 증식의 강력한 구제를 유도하였다. 이들 결과는 이들 두 분자가 FZD5를 활성화할 수 있고, 이들 세포에서 Wnt 신호전달을 유도함으로써 내인성 Wnt 리간드의 작용을 모방할 수 있음을 입증한다(도 7b). 대조적으로, FZD4 특이적 작용제 5038-K/H-2539-2542 또는 FZD2 특이적 작용제의 첨가는 LGK974에 의해 매개되는 증식 억제를 구제할 수 없었다.
RNAseq 분석은 FZD2가 중간엽 줄기세포주 CH3H10T1/2(마우스 ENCODE)에서 우세한 이소폼임을 보여주었고, 이는 FZD2가 중간엽 세포의 골형성 분화 동안 Wnt 단백질의 확립된 역할에 관여할 수 있음을 시사한다(Day et al. Dev. Cell.8, 739-750(2005)). FZD2-특이적 FLAg로 C3H10T1/2 세포를 자극하면 Pan-FZD FLAg로 달성된 것과 유사한 수준으로 골형성 마커 알칼리성 인산 가수분해효소(ALPL)가 강력하게 유도된 반면, FZD5-특이적 FLAg는 최소 활성을 나타냈다(도 7b).
6. 4가 결합 분자와의 공동 표적화
원하는 조합을 달성하기 위해 FZD 다가 결합 도메인 및 공동 수용체 결합 도메인을 Fc 도메인과 혼합 및 매칭시키는 것 외에도, 현재 시스템에서 4가 파라토프의 존재는 2개의 FZD 수용체와 2개의 공동 수용체를 하나의 분자로 동시에 표적화할 수 있는 기회를 제공하여 생체내 적용 시 공동 국소화를 보장한다. 상기 나타낸 5019-MBP-K/H-2539:2542의 작용 활성을 고려하여, Fc 도메인의 N-말단에서 헤테로디아바디 내의 결합 영역을 조합함으로써 선택적 FZD 수용체에 대한 결합 도메인을 갖는 다가 결합 분자를 생성한다. 예를 들어, 항체 5038(FZD4에 결합) 및 2928(FZD5에 결합)로부터 유래된 결합 도메인은 FZD4 및 FZD5 공동 표적 분자를 생성한다. 결합 분자는 또한 특이적 또는 다중 공동 수용체에 대한 공동 수용체 결합 도메인을 갖도록 생성될 수 있다. 예를 들어, LRP6/LRP5 공동-표적화 결합 도메인은 Fc 도메인의 C-말단에 있는 2459(LRP6의 Wnt1 결합 부위에 결합) 및 2539(LRP6의 Wnt3a 결합 부위에 결합) 항체로부터 유래된 결합 도메인을 조합함으로써 생성될 수 있다. 마찬가지로, 공동 수용체 결합 도메인은 단일 세포에서 표준 및 비 표준적인 Wnt 신호전달 경로 모두의 활성화를 개시하기 위해 또 다른 공동 수용체, 예를 들어, ROR1/2와 조합된 LRP6에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서는, 다가 결합 분자를 원하는 조직으로 동원한 다음 FZD 수용체 및 공동 수용체를 결합함으로써 Wnt 신호전달을 활성화할 조직 특이적 항체로부터 유래된 조직 특이적 결합 도메인을 갖는 다가 결합 분자가 고려된다. 이것은 원하는 효과가 특정 조직에 제한될 필요가 있을 때 재생 치료에서 다가 결합 분자를 사용할 때 특히 유용한 것으로 간주된다. 요약하면, 4가 모드는 다양한 기능 요건을 충족하기 위해 더 많은 설계 유연성을 가능하게 한다.
7. FZD 결합 도메인 및 공동 수용체 결합 도메인을 갖는 다가 결합 분자는 Wnt 리간드를 대체하여 장 오르가노이드 배양을 유지할 수 있다.
오르가노이드 생존 및 유지에 대해 본 명세서에 기재된 FZD 작용제의 효과를 하기와 같이 분석하였다. 8주령 암컷 C57BL/6 마우스를 희생시키고, 오르가노이드 단리를 위해 소장 선와를 수집하였다(O'Rourke et al. 2016. Isolation, Culture, and Maintenance of Mouse Intestinal Stem Cells. Bio Protoc. 20:4). 오르가노이드 배양물은 기계적 해리(O'Rourke 2016)에 의해 통과되었고, 48-웰 플레이트에 25㎕의 Growth Factor Reduced Matrigel(Corning, 356231)에 매립되었다. 오르가노이드는 각 실험 조건에 대해 3중으로 플레이팅되었다. 실험 조건(1μM LGK-974 +/- 40% Wnt3a 조절 배지 또는 +/- 50nM panFzd-5056(FZD1, 2, 4, 6, 7, 8을 표적화하지만 Wnt 리간드와 경쟁하지 않는 에피토프에 결합하는 FZDag)을 구비한 완전한 오르가노이드 배지(O'Rourke 2016)를 계대 당일 각 웰에 추가하고 2-3일마다 교체하였다. 일주일 후, 150 ㎕의 Cell Titer Glo 3D(Promega)를 각 웰의 150 ㎕의 배지에 첨가하였다. 오르가노이드는 실온에서 30분 동안 록킹(rocking) 플랫폼에서 용해되었다. 발광 판독값은 각 웰에서 20㎕의 용해물에 대해 이중으로 측정되었다. 각 조건에 대한 평균 발광 판독값을 DMSO 조건으로 정규화하여 생존력을 계산하였다.
광범위한 줄기세포 니치(niche) 인자이기 때문에, Wnt 및 R-스폰딘은 많은 조직으로부터의 3차원 배양 오르가노이드의 유도체화 및 유지에 필요하다. 시험관 내에서 파네트(paneth) 세포에 의해 분비되는 Wnt 단백질은 R-스폰딘의 존재하에서 마우스 소장 오르가노이드의 성장을 지원하기에 충분하다. 그러나 Wnt 방출 및 활성이 PORCNi LGK974로 차단되면, 오르가노이드가 증식하지 못하고 결국 죽을 수 있다. 여기에서, 본 발명자들은, 본 발명의 pan-FZD 다가 결합 분자인 FZDag(FP+P-L61+3)가 LGK974의 존재 하에 오르가노이드의 성장을 구제하고 유지할 수 있음을 입증하는데, 이는 분자가 기능적으로 Wnt 리간드를 모방하고(도 8), 조직 오르가노이드의 성장을 지원하기 위해 Wnt 단백질을 대체할 수 있음을 시사한다. Wnt 리간드는 많은 인간 조직 오르가노이드를 성장시키는 데 필요한 배지의 불가결한 성분이기 때문에, 본 발명의 항체-유래 FZD 작용제는 배양 배지에 포함될 때 상이한 조직의 오르가노이드의 유도체화, 생존 및 유지를 촉진하고 그에 의해 조건 배지 또는 정제된 Wnt 단백질의 사용과 관련된 제한 사항을 완화할 것으로 기대된다.
8. 다가 결합 분자는 뼈 재생을 촉진한다.
래트(rat) 폐쇄형 대퇴골 골절 모델을 사용하여 FZD2를 결합하는 제1 다가 결합 도메인, 및 LRP5 또는 LRP 6에 결합하는 공동 수용체 결합 도메인을 갖는 본 발명의 다가 결합 분자의 재생 특성을 평가한다. 제1 다가 결합 도메인은 FZD2, 예를 들어, 2890-홀-2539-2542 및 2890-놉-2539-2542의 결합 도메인(예를 들어, SEQ ID NO: 84 및 85에 의해 인코딩됨)을 특이적으로 결합할 수 있거나 FZD2 및 다른 FZD 수용체를 결합할 수 있다.
일측성(unilateral) 폐쇄 대퇴골 중간 골간 골절 후 래트에게 비히클 또는 다가 결합 분자를 투여한다(참조: Bonnarens, and Einhorn, J. Orthop. Res. 2, 97-101 (1984)). 간단히 말해서, 18 게이지 주사기 바늘이 관절돌기(condyles)를 통해 골수관에 삽입된다. 대퇴골의 가로 골절은 대퇴부의 전방(측면)에서 둔한 충격 하중을 통해 생성된다. 골절 후 1일, 래트에 식염수 비히클 또는 다가 결합 분자를 7주 동안 매주 2회 피하 주사한다. 종료 시, 골수내 핀을 제거하고 골절된 대퇴골을 마이크로CT로 분석한다.
FZD2를 결합하는 다가 도메인, 및 LRP5 또는 LRP6에 결합하는 제2 다가 결합 도메인을 갖는 다가 결합 분자는 비히클 단독에 의한 골 재생과 비교하여 이 모델에서 골 재생을 크게 증가시킨다.
실시예 II - FZD 및 LRP6을 표적으로 하는 합성 항체
본 발명에서는, 이전에 항원으로서 9개의 재조합 FZD CRD를 사용하여FZD3 CRD는 정제될 수 없음) 수백 개의 합성 Ab를 유도하기 위해 파지 디스플레이를 적용하였다((Steinhart et al. Nat. Med. 23, 60(2016); Pavlovic et al. MAbs (2018), doi: 10.1080/19420862.2018.1515565). 체계적인 특성화는 FZD1/2/4/5/7/8(도 11a)을 인식하는 pan-FZD Ab(FP)에 의해 예시되는 광범위한 특이성을 표시하는 일부 Ab와 함께 특이성 프로파일의 연속체를 나타내었고, 다른 Ab는 더 제한된 특이성을 나타내며, 일부는 단일특이적이다(도 11b). 기능적 특성화는 일부 항체가 Wnt와 경합하고 β카테닌 신호전달을 억제하는 반면, 다른 항체는 비경쟁적이며 Wnt 신호전달을 방해하지 않는 것으로 밝혀졌다(도 11b). 전체적으로, 본 발명에서는 Wnt 신호전달의 47개 억제제를 포함하여 161개의 항-FZD 항체를 완전히 특성화하였다. 예상외로, 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 이들이 Wnt와 경합하고 Wnt 신호전달을 억제하는지 여부에 관계없이, LRP 결합 도메인, 예를 들어 LRP 5/6의 Wnt1 및/또는 Wnt3a 결합 부위를 결합하는 결합 도메인과 함께 FZD 결합 도메인의 공급원으로서 이러한 항-FZD 항체를 사용함으로써 생성된 모든 다가 결합 분자는 Wnt 경로의 작용제이었다.
실시예 III - 세포, 오르가노이드 및 동물에서 FLAg의 표현형 효과
FLAg가 FZD 및 LRP와 선택적으로 관여하여 Wnt-연관 신호전달 경로를 활성화한다는 것을 확립한 후, 본 발명자들은 전구 줄기세포(PSC), 오르가노이드 및 동물에서 이러한 신호의 표현형 효과를 조사하였다. Wnt-β카테닌 신호전달 활성의 조절은 대부분의 PSC 분화 프로토콜에 필수적이다(Huggins et al. Methods Mol. Biol. 1481, 161-181(2016)). WNT3A 조절 배지 또는 GSK3의 소분자 억제제를 사용한 인간 PSC의 처리는 β카테닌 신호전달을 활성화하고 원시 줄무늬 유도를 유도하고, 그리고 중배엽 페이트 선별화(fate specification)를 촉진한다(Davidson et al. PNAS U.S.A. 109, 4485-4490 (2012)). 본 발명에서는, 이러한 맥락에서 FLAg 활성을 평가했으며, 3일 동안 30 nM FP +P-L61+3으로 인간 PSC를 처리하면, 중배엽 마커 BRACHYURY의 강력한 유도를 유발하고 다능성 마커 OCT4의 발현을 6μM에서 GSK3 억제제 CHIR99021로 처리한 것과 유사한 수준으로 감소시킨다는 것을 확인하였다(도 13a 및 도 13b).
FP +P-L61+3은 마우스 FZD 및 LRP6을 인식하고, FcRn과 상호작용하는 Fc를 함유한다. Fc는 생체내에서 분자에 긴 Ab-유사 반감기를 부여하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명에서는, FP +P-L61+3이 마우스의 내인성 수용체와 상호작용하고 β카테닌 신호전달을 활성화하고 내인성 줄기세포 활성을 동원하기에 충분한 수준으로 축적될 수 있는지 여부를 테스트하였다. 장 줄기세포 니치 내에서, 중간엽 세포가 분비하는 Wnt 단백질은 선와 하부의 줄기세포에서 β카테닌 표적 유전자의 발현을 유도하여 자가 재생을 지시하며, 표적 유전자 LGR5는 다양한 조직에서 줄기세포의 표지자로 자주 사용된다. LGK974로 LGR5-GFP 마우스를 처리하면 Wnt 생성이 제거되고, 선와 줄기세포에서 LGR5 발현 및 연결된 GFP 신호가 신속히 소멸된다. 놀랍게도, GFP 발현은 복강내 주사에 의한 FP +P-L61+3과의 공동 처리시 구제되었다(도 14 우측 패널).
본 발명에서는, FP +P-L61+3이 내인성 Wnt가 없을 때 장 줄기세포의 자가 재생을 촉진하는 수준에서 β카테닌 활성화를 가능하게 하기에 충분한 반감기와 생체 이용률을 가지고 있다고 결론지었다.
실시예 IV - 재료 및 방법:
1. Ab 선택 및 스크린
파지 디스플레이 합성 라이브러리 F는, 기술된 바와 같이 Wnt 수용체에 결합하는 Fab를 선택하는 데 사용되었다(Persson et al. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013)). 간단히 말해서, Fc 태그된 ECD 단백질(R&D Systems)을 Maxisorp 면역판(ThermoFisher, 카탈로그 번호 12-565-135)에 고정하고, 비특이적 결합제를 고갈시키기 위해 유사하게 고정된 Fc 단백질에 먼저 노출된 라이브러리 파지 풀과의 양성 결합 선택에 사용되었다. 4 라운드의 결합 선택 후, 클론 파지가 제조되고 파지 ELISA에 의해 평가되었다(Birtalan et al. J. Mol. Biol. 377, 1518-1528 (2008)). Fc와 비교하여 항원에 대한 결합을 위해 적어도 10배 더 큰 신호를 나타내는 클론은 추가 특성화 대상인 특이적 결합제로 간주되었다.
2. 재조합 단백질 및 시약
FZD1 (5988-FZ-050), FZD2 (1307-FZ-050), FZD4 (5847-FZ-050), FZD5 (1617-FZ-050), FZD7 (6178-FZ-050), FZD8 (6129-FZ-050), FZD9 (9175-FZ-050), FZD10 (3459-FZ-050)의 FZD1의 Fc-태그된 융합체는 R&D Systems에서 구입하였다. FZD6의 Fc-태그된 ECD(잔기 19-132, UniprotO60353-1)는 pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터(Invivogen)를 사용하여 Expi293 세포로부터 발현 및 정제되었고, 그리고 단일 프로토머 종은 Superdex 200(10/300) 컬럼(GE Healthcare) 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 응집된 단백질로부터 분리되었다. 인간(1505-LR-025) 및 마우스(2960-LR-025) LRP6 및 마우스 LRP5(7344-LR-025/CF)의 Fc-태그딘 ECD 융합 단백질은 R&D Systems에서 구입하였다. WNT1(SRP4754-10ug), WNT2b(3900-WN-010/CF), WNT5a(645-WN-010/CF) 및 WNT3A(5036-WN-010/CF)는 R&D Systems에서 구입하였으며, WNT3A 조절 배지는 설명된 대로 제조되었다(PMID:12717451). 기타 단백질 및 화학 물질은 다음 공급업체에서 구입하였다: FcRN (R&D, 8693-FC), C1q (Sigma, C1740), CD16a (R&D, 4325-FC), CD32a (R&D, 1330-CD/CF), CD64 (R&D, 1257-FC), LGK974 (Cayman Chemicals), the Porcupine Inhibitor C59 (Dalriada Therapeutics), 및 CHIR99021 (Sigma Aldrich).
3. FZD 및 LRP, "FLAgs" 및 항체 클로닝을 위한 4가 결합 분자
항체(Ab) 가변 도메인을 인코딩하는 DNA 단편은 파지미드 DNA 템플레이트로부터 PCR에 의해 증폭되거나 화학적 합성(Twist Biosciences)에 의해 구축되었다. DNA 단편을 카파 경쇄 및 인간 IgG1 중쇄의 생성을 위해 설계된 포유동물 발현 벡터(pSCSTa)에 클로닝되었다. 이중특이성 디아바디와 IgG는 "놉-인-홀" 헤테로 이량체 Fc의 최적화된 버전을 포함하였다(Ridgway et al. Protein Eng. 9, 617-621 (1996)). FLAg 및 디아바디-Fc 융합체는 VH와 VL 도메인 간의 분자간 결합을 촉진하고 따라서 디아바디 형성을 선호하는 짧은 GGGGS(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 아미노산 121-125) 링커에 의해 분리된 가변 도메인과 함께 VH-VL 방향으로 배열되었다. 디아바디-Fc 융합 구축물을 생성하기 위해, 디아바디 사슬을 인간 IgG1 Fc에 융합시켰다. FLAg 단백질은 VH-x-VL-y-[인간 IgG1 Fc]-z-VH-x-VL로서 구축되었으며, 여기서 링커는 x= GGGGS(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 아미노산 121-125), y= LEDKTHTKVEPKSS (SEQ ID NO: 4의 아미노산 232 내지 245), 및 z= SGSETPGTSESATPESGGG (SEQ ID NO: 4의 아미노산 473 내지 501)이다. 이 형식에서, 인간 IgG1 Fc 또는 놉-인-홀(knob-in-hole) IgG1 Fc 단편은 위치 234-478(Kabat 넘버링)에 걸쳐 있다. scFv-Fc 융합의 경우, 가변 도메인은 VL-VH 배향으로 배열되었고, 긴 GTTAASGSSGGSSSGA(SEQ ID NO: 75) 링커에 의해 연결되었는데, 이는 VH와 VL 도메인 간의 분자내 결합을 촉진하고 그에 따라 scFv 형성을 촉진한다. 모든 구축물에 대해, 전체 코딩 영역을 분비 신호 펩타이드와 프레임 내로 포유동물 발현 벡터에 클로닝하였다.
4. 단백질 발현 및 정제
항원, Ab 및 FLAg 단백질은 일시적 형질감염에 의해 Expi293F(ThermoFisher) 세포에서 생성되었다. 간단히 말해서, 세포는 배플 부착 세포 배양 플라스크의 Expi293 발현 배지(Gibco)에서 약 2.5 x 106 세포/ml의 밀도로 성장되고, 표준 제조 프로토콜(ThermoFisher)을 이용하여 FectoPRO 형질감염 시약(Polyplus-형질감염)을 사용하여 적절한 벡터로 형질감염되었다. 발현은 125 rpm에서 진탕과 동시에 37℃ 및 8% CO2에서 5일 동안 진행되도록 하였다. 발현 후, 세포는 원심분리에 의해 제거되었고, 단백질은 rProtein A Sepharose(GE Healthcare)를 사용하여 조절된 배지로부터 정제되었다. 정제된 단백질은 저장을 위해 PBS 또는 제형화된 안정화 완충액(36.8mM 시트르산, 63.2mM Na2HPO4, 10% 트레할로스, 0.2M L-아르기닌, 0.01% Tween-80, pH 6.0)으로 완충액 교환되었다. 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정되었고, 순도는 SDS-PAGE 분석에 의해 확인되었다.
5. 시험관 내 결합 분석
Octet HTX 기기(ForteBio)를 사용하여 BLI 분석을 수행하였다.
항원에 대한 결합을 측정하기 위해, FZD 수용체(FZD-Fc 단백질)의 Fc-태그 융합을 AHQ BLI 센서(18-5001, ForteBio)에서 캡처하여 0.6 내지 1 nm의 BLI 반응을 달성하고, 나머지 Fc-결합 부위는 인간 Fc(009-000-008, Jackson ImmunoResearch)로 포화되었다. FZD 코팅 또는 대조용(Fc 코팅) 센서를 분석 완충액(PBS, 1% BSA, 0.05% Tween20) 중 100nM Ab 또는 FLAg로 옮기고 300초 동안 연관성을 모니터링하였다. 그 다음, 센서를 분석 완충액으로 옮기고 해리를 추가로 300초 동안 모니터링하였다. 진탕 속도는 1,000 rpm이었고 온도는 25℃이었다. 종점 응답 값은 연관 시간 295초 후에 취해졌다. FZD-Fc 신호로부터 Fc 신호를 뺀 다음 데이터를 가장 높은 결합 신호로 정규화하여 종말점 데이터를 분석하였다.
Fc 수용체에 대한 결합을 측정하기 위해, Ab 또는 FLAg를 아민 결합에 의해 AR2G 센서(18-5092, ForteBio)에 고정화하여 0.6 내지 3 nm의 BLI 반응을 달성하고, 나머지 부위를 에탄올아민으로 급냉하였다. 코팅된 센서를 분석 완충액(PBS, 1% BSA, 0.05% Tween20)에서 평형화하고 Fc 수용체 용액으로 옮겼다. 600초 동안 결합을 모니터링하고, 센서를 분석 완충액으로 옮기고, 해리를 600초 동안 모니터링하였다. 명시되지 않는 한, CD64 및 다른 모든 Fc 수용체를 pH 7.4에서 각각 50nM 또는 300nM에서 분석하였다. 진탕 속도는 1,000rpm이고, 온도는 25℃이었다. 종말점 반응 값은 연관 단계가 끝날 때 취하여 이소형 대조군에 대해 정규화되었다. 정상 상태 FcRN 결합 분석은, FcRN이 고정되고, Ab 또는 FLAg의 연속 희석액(0.1 내지 225 nM)이 용액에서 평가되었다는 점을 제외하고, 유사한 방식으로 수행되었다. 결합 및 분리 시간은 각각 600초 또는 1,200초이었다.
표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석은 ProteOn XPR36 시스템(Bio-Rad)을 이용하여 수행되었다. FZD-Fc 또는 LRP-Fc 단백질은 표준 아민 결합 화학법을 사용하여 GLC 센서 표면(176-5011)에 고정되었다. 분석 완충액(PBS, 0.05% Tween20, 0.5% BSA) 중 Ab 또는 FLAg를 40 ㎕/분으로 주입하고 150초 동안 회합을 모니터링하였다. 그 다음, 분석 완충액을 100μl/분으로 주입하고 해리를 900초 동안 모니터링하였다. 분석은 25℃에서 수행되었다. 분석은 1:1 Langmuir 모델을 사용하여 수행되었으며, ProteOn Manager 소프트웨어를 사용하여 kon 및 koff 값을 결정하기 위해 전역적으로 적합하다. KD는 koff/kon의 비율로 계산되었다.
6. 에피토프 비닝(binning)
Octet HTX 기기(ForteBio)를 사용하여 BLI 에피토프 비닝 실험을 수행하였다. FZD(FZD-Fc) 또는 LRP6(LRP6-Fc) 단백질과의 Fc 융합은 AHQ(18-5001, ForteBio) 또는 AR2G(18-5092, ForteBio) BLI 센서에 각각 고정되었다. 코팅된 센서는 결합 부위의 포화를 달성하기 위해 240초 동안 분석 완충액(PBS, 1% BSA, 0.05% Tween20) 중 100nM Ab로 옮겼다. 그 다음, 센서를 180초 동안 분석 완충액에서 100nM 경쟁 Ab로 옮겼다. 경합 Ab에 대한 노출 후 20초의 반응을 측정하고 차단되지 않은 항원 코팅 센서의 결합 신호에 대해 정규화하였다. 진탕 속도는 1,000rpm이었고, 온도는 25℃이었다.
7. 세포주
HPAF-II 및 HEK293T 세포주는 4.5g/L D-글루코스, 피루브산 나트륨, L-글루타민(ThermoFisher #12430-054)을 함유하는 DMEM에서 유지되었고, 10% FBS(ThermoFisher) 및 페니실린/스트렙토마이신(ThermoFisher #15140-163)으로 보충되었다. CHO 세포는 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12(ThermoFisher #11320-033)에서 유지되었다. 세포는 37℃ 및 5% CO2에서 유지되었다.
8. 유세포 분석
세포의 간접 면역형광 염색은 이전에 기술된 바와 같이 CHO 세포주에 대해 10nM 항-FZD Fab로 수행하였다(Steinhart et al. 2017 Nat Med. Jan; 23(1):60-68, PMID: 27869803). Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2를 2차 항체로 사용하였다(Jackson ImmunoResearch, 109-545-097). Anti-c-Myc IgG1 9E10(1차 항체, ThermoFisher, MA1-980) 및 Alexa Fluor 488 IgG(2차 항체, Life Technologies, A11001)를 발현을 위한 대조군으로 사용하였다. 모든 시약은 제조업체의 지침에 따라 사용되었다.
9. 루시퍼라제 리포터 분석
HEK293T 세포는 pBARls 리포터를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입되었고(Biechele and Moon in Wnt Signaling: Pathway Methods and Mammalian Models, E. Vincan, Ed. (Humana Press, Totowa, NJ, 2008), pp. 99-110 ), Wnt-β카테닌 신호전달 리포터 세포주를 생성하기 위해 대조군으로서 레닐라 루시퍼라제(Renilla Luciferase)가 형질도입되었다. 120 μl의 1-2 x 103 세포를 형질감염 또는 자극 전에 24시간 동안 96-웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 다음 날, FLAg 또는 Ab 단백질을 첨가하고, 자극 15 내지 20시간 후, 세포를 용해시키고 Envision 플레이트 판독기(PerkinElmer)를 사용하여 이중 루시페라제 프로토콜(Promega)에 따라 발광성을 측정하였다. FZD4-특이적 작용제 분석의 경우, FLAg 단백질을 첨가하기 전에 FZD4 cDNA를 6시간 동안 형질감염시켰다. Wnt 억제 분석을 위해, Wnt1은 cDNA 형질감염에 의해 도입되거나 WNT3A 단백질은 Ab 단백질의 첨가 전에 6시간 동안 적용되었다. 모든 분석은 적어도 3회 반복되었다.
10. 웨스턴 블롯 분석
H1 ESC를 용해 완충액(1% Nonidet P-40, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.1% 데옥시콜린산, 50mM Tris(pH 7.4), 0.1mM EGTA, 0.1mM EDTA, 20mM 나트륨 플루오라이드(NaF)), 1:500 프로테아제 억제제(Sigma) 및 1mM 나트륨 오르토바나데이트(Na3VO4))으로 가용화시켰다. 용해물을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리하고, SDS 샘플 완충액에서 끓이고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 다음, 지시된 Ab를 사용하여 웨스턴 블롯팅하였다. Ab 검출은 화학발광 기반 검출 시스템(ECL; ThermoFisher)에 의해 수행되었다.
11. 크리스탈 바이올렛 증식 분석
HPAF-II 세포를 웰당 500개 세포로 접종하고, 24시간 후, 100 nM FLAg의 유무에 관계없이 100 nM LGK974를 첨가하였다. 배지를 변경하고 약물 치료를 격일로 갱신하였다. 7일 처리 후 세포를 얼음 냉각 메탄올로 고정하였다. 세포를 25% 메탄올 중 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하고, 10% 아세트산에서 탈염색하고, 590 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.
12. 면역형광
FLAg 및 CHIR99021으로 3일 동안 처리한 H1 hES를 차가운 PBS로 세척하고, 4% PFA로 20분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 린스하고, 0.3% 트리톤으로 10분 동안 투과처리하고, 1% BSA로 1시간 동안 차단하였다. 세포를 1% BSA에서 BRACHYURY(R&D systems AF2085; 염소; 희석액 1:100) 또는 OCT3/4(Santa Cruz sc5279, 마우스, 1:100 희석)에 대한 1차 Ab와 함께 2시간 동안 및 Alexa Fluor 488-표지된 당나귀 항염소 또는 Alexa Fluor 568-표지된 당나귀 항-마우스 Ab와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다(도 13a). Fluoromount(Sigma-Aldrich)를 사용하여 커버슬립을 장착하고, 60x 오일 대물렌즈를 사용하여 Zeiss LSM700 공초점 현미경으로 분석하였다(도 13b). ImageJ 및 포토샵 CS6(Adobe Systems, Mountain View, CA)을 사용하여 이미지를 조립하였다.
13. 장 선와 자가 재생 분석
8 내지 10주령 Lgr5-EGFP-IRES-creERT2(B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J) 마우스는 The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 구입하였다. 모든 실험은 토론토 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었으며, 캐나다 동물 관리 위원회의 규정 및 ARRIVE 지침(동물 연구: 생체 실험 보고)을 준수하였다. FP +P-L61+3 또는 음성 대조군 Ab는 37 mM 시트르산, 63 mM Na2HPO4, 10% 트레할로스, 0.2M L-아르기닌, 0.01% 폴리소르베이트 80, pH 6.0에서 재구성되었다. Porcupine Inhibitor C59는 ddH2O 중 0.1% Tween 80과 혼합된 0.5% 메틸셀룰로오스로 재구성되었다. 마우스(수컷 및 암컷)를 3그룹(그룹당 5 내지 7마리): 비히클, 대조군(C59 및 대조군 Ab) 또는 FLAg(C59 및 FP+P-L61+3)로 나누었다. 1일째에, 비히클, 또는 10 mg/kg 대조군 Ab 또는 FP +P-L61+3으로 마우스를 복강내 주사하여 처리하였다. 실험이 끝날 때까지 연구자에게 알리지 않고 총 3회 처리 동안 2일마다 반복되었다. 2일째부터, 비히클 또는 50 mg/kg C59를 비히클 그룹 또는 두 실험 그룹에 각각 4일 동안 8시간 간격으로 1일 2회 위관 영양법(gavage)으로 투여하였다. 6일째에, 마우스를 희생시켰다. 전체 장 조직을 수집하고, 차가운 PBS로 세척하고, PBS, 30% 수크로스로 탈수하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 최적 절단 온도 화합물(OCT)에 포매(embedded)하였다. 8 μm OCT 동결 절편을 면역조직 실험에 사용하였다. 공초점 현미경(Zeiss LSM700)을 사용하여 장 EGFP 선와를 분석하였다. 비히클, C59 또는 pan-FLAg(FP +P-L61+3) + C59로 처리된 LGR5-GFP 마우스의 소장 절편의 대표적인 형광 이미지가 도 14에 도시되어 있다. LGR5-GFP는 선와 바닥의 줄기세포에서 발현된다. 세포 핵은 DAPI로 대조 염색되었다.
당업자는 일상적인 실험만을 이용하여 본 명세서에 기재된 특정 절차에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 대한 다양한 대체, 변경 및 수정이 이루어질 수 있다. 다른 양태, 이점 및 수정은 본 발명의 범위 내에 있다. 본 출원을 통해 인용된 모든 참고 문헌, 발행된 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 여기에 참조로 포함된다. 이러한 특허, 출원 및 기타 문서의 적절한 성분, 프로세스 및 방법은 본 발명 및 그 실시예에 대해 선택될 수 있다.
[표 1A]
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[표 1B]
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[표 2]
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[표 3]
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SEQUENCE LISTING <110> ANTLERA THERAPEUTICS INC. <120> MULTIVALENT FZD AND WNT BINDING MOLECULES AND USES THEREOF <130> 115773.PC424WO <140> <141> <150> 62/860,161 <151> 2019-06-11 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2169 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caacatcggt tcttcttcta tccactgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttattctg cttttgcctc tacttcttat 180 gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240 ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgctaccat 300 ttcccgttcg gttttgcttt ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360 ggtggaggtg gcagtgatat ccagatgacc cagtccccga gctccctgtc cgcctctgtg 420 ggcgataggg tcaccatcac ctgccgtgcc agtcagtccg tgtccagcgc tgtagcctgg 480 tatcaacaga aaccaggaaa agctccgaag cttctgattt actcggcatc cagcctctac 540 tctggagtcc cttctcgctt ctctggtagc cgttccggga cggatttcac tctgaccatc 600 agcagtctgc agccggaaga 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gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc acgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaagcg gcagcgagac tcccgggacc 1440 tcagagtccg ccacacccga aagtggtggc ggagaggttc agctggtgga gtctggcggt 1500 ggcctggtgc agccaggggg ctcactccgt ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaacatc 1560 tcttattctt ctatccactg ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgca 1620 tatatttctt cttattatgg ctatacttat tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 1680 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt aagagctgag 1740 gacactgccg tctattattg tgctcgcgct cattacttcc cgtgggctgg tgctatggac 1800 tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcgggtg gaggtggcag tgatatccag 1860 atgacccagt ccccgagctc cctgtccgcc tctgtgggcg atagggtcac catcacctgc 1920 cgtgccagtc agtccgtgtc cagcgctgta gcctggtatc aacagaaacc aggaaaagct 1980 ccgaagcttc tgatttactc ggcatccagc ctctactctg gagtcccttc tcgcttctct 2040 ggtagccgtt ccgggacgga 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actgccgtct attattgtgc tcgctcttgg 300 tgggcttggg cttttgacta ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcgggtgga 360 ggtggcagtg atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 420 agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag tccgtgtcca gcgctgtagc ctggtatcaa 480 cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttactcgg catccagcct ctactctgga 540 gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 600 ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac attactctgt ttacgcttct 660 ctgatcacgt tcggacaggg taccaaggtg gagatcaaac tcgaggacaa aactcacaca 720 aaagttgagc ccaaatcttc tgataagacc cataattgcc caccgtgccc agcacctgaa 780 ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 840 tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 900 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 960 gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1020 ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1080 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140 atccgggagc tgatgaccag caaccaggtc agcctgagct gcgccgtcaa aggcttctat 1200 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctcg tgagcaagct caccgtggac 1320 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aaagcggcag cgagactccc 1440 gggacctcag agtccgccac acccgaaagt ggtggcggag aggttcagct ggtggagtct 1500 ggcggtggcc tggtgcagcc agggggctca ctccgtttgt cctgtgcagc ttctggcttc 1560 aacatctctt cttattatat ccactgggtg cgtcaggccc cgggtaaggg cctggaatgg 1620 gttgcatcta tttattcttc ttatggctat acttcttatg ccgatagcgt caagggccgt 1680 ttcactataa gcgcagacac atccaaaaac acagcctacc tacaaatgaa cagcttaaga 1740 gctgaggaca ctgccgtcta ttattgtgct cgcactgttc gtggatccaa aaaaccgtac 1800 ttctctggtt gggctatgga ctactggggt caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcgggt 1860 ggaggtggca gtgatatcca gatgacccag tccccgagct ccctgtccgc ctctgtgggc 1920 gatagggtca ccatcacctg ccgtgccagt cagtccgtgt 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ccgatagcgt caagggccgt 1680 ttcactataa gcgcagacac atccaaaaac acagcctacc tacaaatgaa cagcttaaga 1740 gctgaggaca ctgccgtcta ttattgtgct cgcactgttc gtggatccaa aaaaccgtac 1800 ttctctggtt gggctatgga ctactggggt caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcgggt 1860 ggaggtggca gtgatatcca gatgacccag tccccgagct ccctgtccgc ctctgtgggc 1920 gatagggtca ccatcacctg ccgtgccagt cagtccgtgt ccagcgctgt agcctggtat 1980 caacagaaac caggaaaagc tccgaagctt ctgatttact cggcatccag cctctactct 2040 ggagtccctt ctcgcttctc tggtagccgt tccgggacgg atttcactct gaccatcagc 2100 agtctgcagc cggaagactt cgcaacttat tactgtcagc aatactcttg gggtccgttc 2160 acgttcggac agggtaccaa ggtggagatc aaa 2193 <210> 24 <211> 731 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg 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ttacctgttc 660 acgttcggac agggtaccaa ggtggagatc aaactcgagg acaaaactca cacaaaagtg 720 gagcccaaaa cttctgataa gacccatact tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg cgaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccaatggtgt ttgacctgcc cccatcccgg 1140 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcatgg tcaagggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctgtacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 cgctggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaagcg gcagcgagac tcccgggacc 1440 tcagagtccg ccacacccga aagtggtggc ggagaggttc agctggtgga gtctggcggt 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cgttccggga cggatttcac tctgaccatc 600 agcagtctgc agccggaaga cttcgcaact tattactgtc agcaaggtgt ttacctgttc 660 acgttcggac agggtaccaa ggtggagatc aaactcgagg acaaaactca cacaaaagtg 720 gagcccaaaa cttctgataa gacccatact tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg cgaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccaatggtgt ttgacctgcc cccatcccgg 1140 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcatgg tcaagggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctgtacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 cgctggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaagcg 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tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caacatctct tcttattata tccactgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttattctt cttatggcta tacttcttat 180 gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240 ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcactgtt 300 cgtggatcca aaaaaccgta cttctctggt tgggctatgg actactgggg tcaaggaacc 360 ctggtcaccg tctcctcg 378 <210> 54 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caacatctct tattattata tgcactgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatct atttattctt attatggcta tacttattat 180 gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240 ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgctcttct 300 ttctcttggg ctatggacta ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcg 354 <210> 55 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct 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900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccaatccgg 1140 gagctgatga ccagcaacca ggtcagcctg agctgcgccg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctcgtgagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaagcg gcagcgagac tcccgggacc 1440 tcagagtccg ccacacccga aagtggtggc ggagaggttc agctggtgga gtctggcggt 1500 ggcctggtgc agccaggggg ctcactccgt ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaacatc 1560 tcttcttatt atatccactg ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgca 1620 tctatttatt cttcttatgg ctatacttct tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 1680 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt aagagctgag 1740 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gtagcctggt atcaacagaa accaggaaaa 1980 gctccgaagc ttctgattta ctcggcatcc agcctctact ctggagtccc ttctcgcttc 2040 tctggtagcc gttccgggac ggatttcact ctgaccatca gcagtctgca gccggaagac 2100 ttcgcaactt attactgtca gcaatactac tggccgatca cgttcggaca gggtaccaag 2160 gtggagatca aatga 2175 <210> 90 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caactcctct ttttatttta tgcactgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcaact gtttatcctt atcttgacta tacttattat 180 gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240 ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcgcgttt 300 ccgggttctt accatcctat ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360 <210> 91 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctgg agtcccttct 180 cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240 gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa tcttcttatt ctctgatcac gttcggacag 300 ggtaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 92 <211> 2193 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caactcctct ttttatttta tgcactgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcaact gtttatcctt atcttgacta tacttattat 180 gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240 ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcgcgttt 300 ccgggttctt accatcctat ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360 ggtggaggtg gcagtgatat ccagatgacc cagtccccga gctccctgtc cgcctctgtg 420 ggcgataggg tcaccatcac ctgccgtgcc agtcagtccg tgtccagcgc tgtagcctgg 480 tatcaacaga aaccaggaaa agctccgaag cttctgattt actcggcatc cagcctctac 540 tctggagtcc cttctcgctt ctctggtagc cgttccggga cggatttcac tctgaccatc 600 agcagtctgc agccggaaga cttcgcaact tattactgtc agcaatcttc 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Val 435 440 445 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly 465 470 475 480 Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu 485 490 495 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 500 505 510 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Ser Tyr Tyr Ile His Trp 515 520 525 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Tyr 530 535 540 Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 545 550 555 560 Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn 565 570 575 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val 580 585 590 Arg Gly Ser Lys Lys Pro Tyr Phe Ser Gly Trp Ala Met Asp Tyr Trp 595 600 605 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 610 615 620 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 625 630 635 640 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val 645 650 655 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 660 665 670 Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 675 680 685 Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 690 695 700 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Trp Gly Pro Phe Thr 705 710 715 720 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 725 730 <210> 94 <211> 724 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ser Ser Phe Tyr 20 25 30 Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Val Tyr Pro Tyr Leu Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Phe Pro Gly Ser Tyr His Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 115 120 125 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 130 135 140 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp 145 150 155 160 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala 165 170 175 Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser 180 185 190 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 195 200 205 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Leu Ile Thr Phe Gly 210 215 220 Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Leu Glu Asp Lys Thr His Thr Lys 225 230 235 240 Val Glu Pro Lys Thr Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 245 250 255 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 290 295 300 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 305 310 315 320 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 325 330 335 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 340 345 350 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 355 360 365 Pro Arg Glu Pro Met Val Phe Asp Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 370 375 380 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro 385 390 395 400 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 405 410 415 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 435 440 445 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly 465 470 475 480 Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu 485 490 495 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 500 505 510 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His Trp 515 520 525 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser 530 535 540 Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 545 550 555 560 Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn 565 570 575 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala His 580 585 590 Tyr Phe Pro Trp Ala Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 595 600 605 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 610 615 620 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 625 630 635 640 Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln 645 650 655 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu 660 665 670 Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp 675 680 685 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 690 695 700 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 705 710 715 720 Val Glu Ile Lys

Claims (18)

  1. 프리즐드2(FZD2) 수용체 또는 프리즐드7(FZD7) 및 Wnt 공동 수용체를 갖는 세포를 다가 결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 방법으로서, 상기 다가 결합 분자는,
    (a) C-말단 및 N-말단을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 Fc 도메인, 또는 그의 단편,
    (b) (i) 적어도 2개의 결합 부위를 갖는 FZD2 결합 도메인으로서, 적어도 하나의 결합 부위는 FZD2 수용체에 결합하고, 2890-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 85에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 2890-홀-2539-2542의 VL의 CDR과 50%, 55%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 그리고 2890-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 85에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VH, 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 FZD2 결합 도메인; 또는
    (ii) 적어도 2개의 결합 부위를 갖는 FZD7 수용체로서, 적어도 하나의 결합 부위는 FZD7 수용체에 결합하고, 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 87에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 12735-홀-2539-2542의 VH의 CDR과 50%, 55%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 그리고 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 86에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VH의 VH, 또는 12735-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 FZD7 결합 도메인; 및
    (c) 적어도 2개의 결합 부위를 갖는 Wnt 공동 수용체 도메인으로서, 적어도 하나의 결합 부위가 Wnt 공동 수용체에 결합하는 Wnt 공동 수용체 도메인을 포함하고,
    FZD2 또는 FZD7 결합 도메인은 Fc 도메인의 하나의 말단 또는 이의 단편의 하나의 말단에 부착되고, 그리고 Wnt 공동 수용체 결합 도메인은 Fc 도메인의 다른 말단 또는 이의 단편의 다른 말단에 부착되는, Wnt 신호전달 경로의 활성화 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    FZD2 또는 FZD7 결합 도메인은,
    (a)(i) FZD2 수용체를 결합하는 디아바디로서, 상기 디아바디는 2개의 펩타이드를 포함하며, 각 펩타이드는 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, 하나의 펩타이드로부터의 VH 및 VL은 다른 펩타이드의 VL 및 VH와 쌍을 이루어 디아바디를 형성하고, VL은 2890-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 85에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 2890-홀-2539-2542의 VL의 CDR을 포함하고, 그리고 VH는 2890-홀-2542의 VH(SEQ ID NO: 84에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐), 또는 2890-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 디아바디, 또는
    (ii) FZD7 수용체를 결합하는 디아바디로서, 상기 디아바디는 2개의 펩타이드를 포함하고, 각 펩타이드는 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, 하나의 펩타이드로부터의 VH 및 VL은 다른 펩타이드의 VL 및 VH와 쌍을 이루어 디아바디를 형성하고, 그리고 VL은 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 87에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 12735-12735-2539-2542의 VL의 CDR을 포함하고, VH는 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 86에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 가짐)의 VH, 또는 12735-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 디아바디, 또는
    (b) (i) 2890-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 85에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 2890-홀-2539-2542의 VL의 CDR을 포함하는 VL 및 2890-홀-2542(SEQ ID NO: 84에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VH 또는 2890-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 VH 영역을 포함하고, FZD2 수용체를 결합하는, scFV, 또는
    (ii) 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 87에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542의 VL의 CDR을 포함하는 VL 및 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 86에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VH, 또는 12735-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 VH 영역을 포함하고, 그리고 FZD7 수용체를 결합하는 scFv를 포함하고; 그리고
    Wnt 공동 수용체 결합 도메인은,
    (c) Wnt 공동 수용체를 결합하는 디아바디로서, 상기 디아바디는 2개의 펩타이드를 포함하고, 각 펩타이드는 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, 하나의 펩타이드로부터의 VH 및 VL은 다른 펩타이드의 VL 및 VH와 쌍을 이루어 디아바디를 형성하는 디아바디, 또는
    (de) 공동 수용체를 결합하는 VL 및 VH 영역을 포함하는 scFv, 또는
    (e) 공동 수용체의 내인성 리간드 또는 공동 수용체를 결합하는 그러한 리간드의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 Wnt 신호전달 경로의 활성화 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    Wnt 공동 수용체 결합 도메인이 Wnt 공동 수용체 상의 Wnt 리간드 결합 부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 Wnt 신호전달 경로의 활성화 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    Wnt 공동 수용체 결합 도메인은 Wnt3 및/또는 Wnt1 결합 부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 Wnt 신호전달 경로의 활성화 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    Fc 도메인은 IgG Fc 도메인 것을 특징으로 하는 Wnt 신호전달 경로의 활성화 방법.
  6. (a) C-말단 및 N-말단을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 Fc 도메인, 또는 그의 단편,
    (b) (i) 적어도 2개의 결합 부위를 갖는 FZD2 결합 도메인으로서, 적어도 하나의 결합 부위는 2890-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 85에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 2890-홀-2539-2542의 VL의 CDR이 있는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 2890-홀-2542(SEQ ID NO: 84에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VH, 또는 2890-홀-2539-2542의 VH의 CDR이 있는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하고, 그리고 FZD2 수용체에 결합하는 FZD2 결합 도메인, 또는
    (ii) VL 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 87에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐) 또는 12735-홀-2539-2542의 VL의 CDR이 있는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 그리고 및 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 86에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VH 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542의 VH의 CDR이 있는 중쇄 가변 도메인(VH)를 포함하고, 그리고 FZD7 수용체에 결합되는 FZD7 결합 도메인, 및
    (c) 적어도 하나의 결합 부위가 Wnt 공동 수용체에 결합하는 적어도 2개의 결합 부위를 갖는 Wnt 공동 수용체 결합 도메인을 포함하고,
    FZD2 또는 FZD7 결합 도메인은 Fc 도메인의 하나의 말단에 부착되고, Wnt 공동 수용체 결합 도메인은 Fc 도메인의 다른 말단에 부착되는 것을 특징으로 하는 다가 결합 분자.
  7. 제6항에 있어서,
    FZD2 또는 FZD7 결합 도메인은,
    (a)(i) FZD2 수용체를 결합하는 디아바디로서, 상기 디아바디는 2개의 펩타이드를 포함하며, 각 펩타이드는 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, 하나의 펩타이드로부터의 VH 및 VL은 다른 펩타이드의 VL 및 VH와 쌍을 이루어 디아바디를 형성하고, VL은 2890-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 85에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 2890-홀-2539-2542의 VL의 CDR을 포함하고, VH는 2890-홀-2542(SEQ ID NO: 84로 인코딩됨)의 VH, 또는 2890-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 디아바디, 또는
    (ii) FZD7 수용체를 결합하는 디아바디로서, 상기 디아바디는 2개의 펩타이드를 포함하고, 각 펩타이드는 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, 하나의 펩타이드로부터의 VH 및 VL은 다른 펩타이드의 VL 및 VH와 쌍을 이루어 디아바디를 형형하고, VL은 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 87에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 12735-홀-2539-2542의 VL의 CDR을 포함하고, 그리고 VH는 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 86에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 가짐)의 VH, 또는 12735-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 디아바디, 또는
    (b) (i) FZD2 수용체를 결합하는 VL 및 VH 영역을 포함하는 scFv로서, VL은 2890-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 85에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542의 VL의 CDR을 포함하고, 그리고 VH는 2890-홀-2542(SEQ ID NO: 86에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VH, 또는 2890-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 scFv, 또는
    (ii) FZD7 수용체를 결합하는 VL 및 VH 영역을 포함하는 scFv로서, VL은 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 87에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 12735-홀-2539-2542의 VL의 CDR을 포함하고, VH는 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 86에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VH, 또는 12735-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 scFv를 포함하고, 그리고
    Wnt 공동 수용체 결합 도메인은,
    (d) 공동 수용체를 결합하는 디아바디로서, 상기 디아바디는 2개의 펩타이드를 포함하고, 각 펩타이드는 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하고, 하나의 펩타이드로부터의 VH 및 VL은 다른 펩타이드의 VL 및 VH와 쌍을 이루어 디아바디를 형성하고, VL은 2890-홀-2539-2542, 2890-놉-2539-2542, 12735-홀-2539-2542 또는 12735-놉-2539-2542(SEQ ID NO: 50 또는 52)의 VL 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542 또는 12735-놉-2539-2542의 VL의 CDR포함하고, 그리고 VH는 2890-홀-2542, 2890-놉-2542, 12735-홀-2539-2542 또는 12735-놉-2539-2542(SEQ ID NO: 49 또는 53에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐) 의 VH, 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 디아바디, 또는
    (e) 공동 수용체에 결합하는 VL 및 VH 영역을 포함하는 scFv로서, VL은 2890-홀-2539-2542, 2890-놉-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542 또는 12735-놉-2539-2542(SEQ ID NO : 50 또는 52에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐) 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542의 VL의 CDR을 포함하고, 그리고 VH는 2890-홀-2542, 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542 또는 12735-놉-2539-2542(SEQ ID NO: 49 또는 53에 의해 각각 인코딩된 아미노산을 가짐), 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하는 scFv
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 결합 분자.
  8. 제6항에 있어서,
    결합 도메인 중 적어도 하나가 이중특이적인 것을 특징으로 하는 다가 결합 분자.
  9. 제6항에 있어서,
    SEQ ID NO: 77을 갖는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO: 79를 갖는 제2 펩타이드를 포함하고, FZD2를 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 결합 분자.
  10. 제6항에 있어서,
    SEQ ID NO: 81을 갖는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO: 83을 갖는 제2 펩타이드를 포함하고, FZD7를 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 결합 분자.
  11. 제6항에 있어서,
    본질적으로 SEQ ID NO: 77로 이루어진 제1 펩타이드 및 본질적으로 SEQ ID NO: 79로 본질적으로 이루어진 제2 펩타이드를 포함하고, FZD2를 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 결합 분자.
  12. 제6항에 있어서,
    본질적으로 SEQ ID NO: 81로 이루어진 제1 펩타이드 및 본질적으로 SEQ ID NO: 83으로 이루어진 제2 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 결합 분자.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항의 다가 결합 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
  14. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항의 다가 결합 분자를, 조직 재생을 촉진하고 상기 병태와 관련된 증상을 경감하기에 충분한 양으로 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 조직 재생을 필요로 하는 대상체의 조직 재생을 촉진하거나, 또는 감소된 Wnt 신호전달과 관련된 병태를 갖는 대상체의 치료 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    조직이 뼈 조직 또는 장 조직인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  16. 세포 상의 FZD2 또는 FZD7 수용체와 Wnt 공동 수용체의 상호작용을 촉진하여 세포에서 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 방법으로서,
    a) C-말단 및 N-말단을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 Fc 도메인 또는 이의 단편을 선택하는 단계,
    b) Fc 도메인의 한 말단에, 2890-홀-2539-2542의 FZD2 수용체 또는 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 85 또는 87에 의해 각각 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 FZD7 수용체를 결합하는 VL 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542의 VL의 CDR, 및 2890-홀-2542 또는 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 84 또는 86에 의해 각각 인코딩되는 아미노산 서열을 가짐)의 VH, 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-구멍-2539-2542의 VH의 CDR을 갖는 VH를 포함하는 2가 FZD2 또는 FZD7 수용체 결합 도메인을 연결하고, 그리고 Fc 도메인의 다른 말단에, 2가 Wnt 공동 수용체 결합 도메인을 연결하여 4가 결합 분자를 형성하는 단계;
    c) 4가 결합 분자가 FZD2 또는 FZD7 수용체 및 Wnt 공동 수용체에 결합하여 Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 조건 하에, 상기 4가 결합 분자를 상기 FZD2 또는 FZD7 수용체 및 Wnt 공동 수용체를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, Wnt 신호전달 경로의 활성화 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    2가 FZD2 또는 FZD7 수용체 결합 도메인은 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 85 또는 87에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VL 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542의 VL의 CDR을 포함하는 디아바디를 포함하고, 그리고 VH는 2890-홀-2542 또는 12735-홀-2539-2542(SEQ ID NO: 84 또는 86에 의해 각각 인코딩된 아미노산 서열을 가짐)의 VH, 또는 2890-홀-2539-2542 또는 12735-홀-2539-2542의 VH의 CDR을 포함하고, 그리고 2가 Wnt 수용체 결합 도메인은 Wnt 공동 수용체를 결합하는 디아바디를 포함하는 것을 특징으로 하는 Wnt 신호전달 경로의 활성화 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    Wnt 공동 수용체를 결합하는 디아바디가 Wnt 공동 수용체 상의 Wnt1 또는 Wnt3a 결합 부위 중 하나 또는 둘 모두에 결합하는 것을 특징으로 하는 Wnt 신호전달 경로의 활성화 방법.

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