EA037977B1 - Антитела к fap, способы их получения и применения - Google Patents

Антитела к fap, способы их получения и применения Download PDF

Info

Publication number
EA037977B1
EA037977B1 EA201790309A EA201790309A EA037977B1 EA 037977 B1 EA037977 B1 EA 037977B1 EA 201790309 A EA201790309 A EA 201790309A EA 201790309 A EA201790309 A EA 201790309A EA 037977 B1 EA037977 B1 EA 037977B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
antibody
fap
antibodies
human
Prior art date
Application number
EA201790309A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201790309A1 (ru
Inventor
Марина Бакак
Анне Фраймозер-Грундшобер
Ральф Хоссе
Кристиан Клайн
Эккехард Мёсснер
Валерия Г. Николини
Пабло Умана
Original Assignee
Роше Гликарт Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44629814&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA037977(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Роше Гликарт Аг filed Critical Роше Гликарт Аг
Publication of EA201790309A1 publication Critical patent/EA201790309A1/ru
Publication of EA037977B1 publication Critical patent/EA037977B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1075—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being against an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

В патенте описаны антитела к белку активации фибробластов (FAP), полинуклеотид, кодирующий тяжелую и легкую цепь антитела, содержащий его вектор, способ получения антитела культивированием клетки-хозяина и композиция для получения этого антитела. Кроме того, раскрыты способы применения указанного антитела, а таже фармацевтическая композиция, способы лечения и диагностирования заболеваний, отличающихся экспрессией FAP, и способы индукции клеточного лизиса опухолевой клетки или стромальной клетки опухоли.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к антителам, специфическим в отношении белка активации фибробластов (FAP). Кроме того, изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим указанные антитела, и к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим указанные полинуклеотиды. Изобретение относится также к способам получения антител и способам их применения для лечения заболевания.
Предпосылки создания изобретения Белок активации фибробластов (FAP) и антитела к FAP Человеческий белок активации фибробластов (FAP; GenBank, регистрационный номер ААС51668), известный также как сепраза, представляет собой ассоциированную с мембраной (интегральную мембранную) сериновую пептидазу с молекулярной массой 170 кДа (КФ 3.4.21.В28). Вместе с дипептидил-пептидазой IV (известной также как CD26; GenBank, регистрационный номер Р27487), близкородственным расположенным на клеточной поверхности ферментом, и другими пептидазами FAP принадлежит к семейству дипептидил-пептидаз IV (Yu и др., FEBS J 277, 2010, cc. 1126-1144). Он представляет собой гомодимер, содержащий две N-гликозилированных субъединицы с крупным С-концевым внеклеточным доменом, в котором локализован каталитический домен фермента (Scanlan и др., Proc Nail Acad Sci USA 91, 1994, cc. 5657-5661). FAP в его гликозилированной форме обладает как пост-пролилдипептидил-пептидазной, так и желатиназной активностью (Sun и др., Protein Expr Purif 24, 2002, cc. 274-281).
Человеческий FAP впервые был идентифицирован в культуре фибробластов с помощью моноклонального антитела (МАт) F19 (описано в WO 93/05804, АТСС номер НВ 8269). Гомологи этого белка обнаружены у некоторых видов, включая мышей (Niedermeyer и др., Int J Cancer 71, 1997, cc. 383-389), Niedermeyer и др., Eur J Biochem 254, 1998, cc. 650-654; GenBank, регистрационный номер ААН19190). FAP отличается уникальным распределением в тканях: обнаружена высокая повышающая регуляция его экспрессии на реактивных стромальных фибробластах в более чем 90% всех случаев первичных и метастатических эпителиальных опухолей, включая карциномы легкого, колоректальные карциномы, карциномы мочевого пузыря, яичника и молочной железы, при этом он, как правило, отсутствует в здоровых тканях взрослых индивидуумов (Rettig и др., Proc Nail Acad Sci USA 85, 1988, cc. 3110-3114; Garin-Chesa и др., Proc Natl Acad Sci USA 87, 1990, cc. 7235-7239). В более поздних исследованиях было установлено, что FAP экспрессируется не только в стромальных фибробластах, но также в некоторых типах злокачественных клеток эпителиального происхождения, и что экспрессия FAP прямо коррелирует со злокачественным фенотипом (Jin и др., Anticancer Res 23, 2003, cc. 3195-3198).
Благодаря его экспрессии при многих часто встречающихся типах рака и его ограниченной экспрессии в здоровых тканях, FAP рассматривался как перспективная антигенная мишень для визуализации, диагностирования и терапии различных карцином. Так, получено множество моноклональных антител к FAP, которые можно применять для исследовательских, диагностических и терапевтических целей.
Сибротузумаб/BIBH1 представляет собой гуманизированную версию антитела F19, которая специфически связывается с человеческим FAP (она описана в WO 99/57151), были разработаны другие гуманизированные или полностью человеческие антитела к антигену FAP с эпитопной специфичностью, характерной для F19 (они описаны у Mersmann и др., Int J Cancer 92, 2001, cc. 240-248; Schmidt и др., Eur J Biochem 268, 2001, cc. 1730-1738; WO 01/68708). Антитело OS4 представляет собой другую гуманизированную (с трансплантированными CDR) версию антитела F19 (Wuest и др., J Biotech 92, 2001, cc. 159168), при этом scFv 33 и scFv 36 обладают специфичностью связывания, отличной от специфичности, характерной для F19, и дают перекрестную реакцию с человеческим и мышиным белком FAP (Brocks и др., Mol Med 7, 2001, cc. 461-469). Позднее были разработаны другие мышиные антитела к FAP, а также их химерные и гуманизированные версии (WO 2007/077173, Ostermann и др., Clin Cancer Res 14, 2008, cc. 4584-4592).
Протеазы в строме опухоли посредством протеолитического расщепления компонентов внеклеточного матрикса (ЕСМ) облегчают такие процессы, как ангиогенез и/или миграция опухолевых клеток. Кроме того, строма опухоли играет важную роль в снабжении опухолей питательными веществами и кислородом, а также в инвазии и метастазах опухоли. Эти важные функции делают ее не только диагностической, но также и потенциальной терапевтической мишенью.
Данные, подтверждающие возможность направленного воздействия на строму опухоли in vivo с помощью антител к FAP, получены на фазе I клинического испытания с использованием меченного с помощью 131I антитела F19, которые продемонстрировали специфическое обогащение опухолей антителом и возможность обнаружения метастазов (Welt и др., J Clin Oncol 12, 1994, cc. 1193-1203). Аналогично этому на фазе I испытания сибротузумаба продемонстрировано специфическое накопление в опухоли меченного с помощью 131I антитела (Scott и др., Clin Cancer Res 9, 2003, cc. 1639-1647). Однако ранняя фаза II испытания неконъюгированного сибротузумаба на пациентах с метастатическим колоректальным раком была прекращена из-за отсутствия эффективности антитела в отношении ингибирования развития опухолей (Hofheinz и др., Onkologie 26, 2003, cc. 44-48). Кроме того, позднее разработано антитело к FAP, у которого не обнаружено противоопухолевое действие in vivo при применении в неконъюгированной форме (WO 2007/077173).
Таким образом, сохраняется потребность в улучшенных терапевтических подходах, включая применение для лечение различных типов рака антител с повышенной эффективностью, мишенью которых
- 1 037977 является FAP.
Гликозилирование антител
Олигосахаридный компонент может оказывать существенное влияние на свойства, имеющие отношение к эффективности терапевтического гликопротеина, включая физическую стабильность, устойчивость к воздействию протеаз, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетические параметры и специфическую биологическую активность. Указанные свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия олигосахаридов, но также от их специфических структур. Можно сделать определенные обобщения, касающиеся взаимосвязи между структурой олигосахарида и функцией гликопротеина. Например, некоторые структуры олигосахарида опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока в результате взаимодействий со специфическими связывающими углеводы белками, а другие могут связываться антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol. 14, 1996, cc. 975-981).
Антитела IgG1-типа, которые являются наиболее часто применяемыми в противораковой иммунотерапии антителами, представляют собой гликопротеины, которые имеют консервативный N-связанный сайт гликозилирования на Asn 297 в каждом СН2-домене. Два сложных биантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, располагаются между СН2-доменами, формируя обширные контакты с полипептидным каркасом, и их присутствие является важным для того, чтобы антитело могло осуществлять эффекторные функции, такие как антитело-обусловленная клеточно-зависимая цитотоксичность (ADCC) (Lifely M.R. и др., Glycobiology 5, 1995, cc. 813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev. 163, 1998, cc. 59-76; Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15, 1997, cc. 26-32). Опыты по конструированию белков позволили установить, что FcyR взаимодействуют с нижней шарнирной областью СН2-домена IgG (Lund и др., J. Immunol. 157, 1996, cc. 4963-4969).
Однако для связывания FcyR также требуется присутствие олигосахаридов, ковалентно связанных с консервативным Asn 297 в СН2-области. В работах Lund и др., J. Immunol. 157. 1996, cc. 4963-4969 и Wright и Morrison, Trends Biotech. 15, 1997, cc. 26-31 выдвинуто предположение о том, что-либо олигосахарид и полипептид оба непосредственно присутствуют в сайте связывания, либо олигосахарид требуется для поддержания активной конформации полипептида СН2. Таким образом, в качестве средства повышения аффинности взаимодействия между IgG1 и FcyR и для повышения ADCC-активности IgG1 можно применять модификацию структуры олигосахарида.
Одним из путей достижения значительного увеличения эффективности моноклональных антител является повышение их естественных клеточно-опосредуемых эффекторных функций путем конструирования их олигосахаридного компонента согласно методу, описанному у Umana и др., Nat Biotechnol 17, 1999, cc. 176-180 и в US № 6602684 (WO 99/54342), содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Umana с соавторами продемонстрировали, что сверхэкспрессия β(1,4)N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), т.е. гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов в клетках яичника китайского хомячка (СНО), значительно повышает ADCC-активность in vitro антител, продуцируемых в этих клетках. Сверхэкспрессия GnTIII в продуктивных клеточных линиях приводит к получению антител, обогащенных бисекционными олигосахаридами, которые, как правило, являются нефукозилированными и относятся к гибридному типу. Если в продуктивных клеточных линиях в дополнение к GnTIII происходит сверхэкспрессия маннозидазы II (ManII), то образуются антитела, обогащенные бисекционными нефукозилированными олигосахаридами комплексного типа (Ferrara и др., Biotechn Bioeng 93, 2006, cc. 851-861). Оба типа антител обладают в значительной степени усиленной ADCC по сравнению с антителами с немодифицированными гликанами, однако только антитела, в которых большинство N-гликанов относятся к комплексному типу, обладают способностью значительно увеличивать комплементзависимую цитотоксичность (Ferrara и др., Biotechn Bioeng 93, 2006, cc. 851-861). Изменения в составе связанного с Asn 297 углевода или его элиминация также влияют на связывание
Fc-домена антитела с FcY-рецептором (FcyR) и белком C1q системы комплемента, что является важным для ADCC и CDC соответственно (Umana и др., Nat Biotechnol 17, 1999, cc. 176-180; Davies и др., Biotechnol Bioeng 74, 2001, cc. 288-294; Mimura и др., J Biol Chem 276, 2001, cc. 45539-45547; Radaev и др., J Biol Chem 276, 2001, cc. 16478-16483; Shields и др., J Biol Chem 276, 2001, cc. 6591-6604; Shields и др., J Biol Chem 277, 2002, cc. 26733-26740; Simmons и др., J Immunol Methods 263, 2002, cc. 133-147).
Краткое описание изобретения
Одним из объектов изобретения является антитело, которое специфически связывается с белком активации фибробластов (FAP), где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 299 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 297.
Указанное антитело может содержать Fc-область, которая представляет собой Fc-область IgG, а именно человеческого IgG.
Кроме того, антитело может являться полноразмерным антителом класса IgG и содержать константную область человеческого антитела и представлять собой человеческое антитело.
- 2 037977
А также указанное антитело может представлять собой фрагмент антитела, выбранный из группы, включающей фрагмент scFv, фрагмент Fv, фрагмент Fab и фрагмент F(ab')2.
Другими объектами изобретения являются также относящиеся к антителам полинуклеотиды, содержащие их композиции, экспрессионные векторы и содержащие их клетки-хозяева.
Следующим объектом изобретения являются способ получения антител, которые могут специфически связываться с FAP, включающий:
a) культивирование указанной клетки-хозяина в среде и в условиях, которые обеспечивают экспрессию антитела, и
b) выделение антитела.
Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, характеризующихся экспрессией FAP, содержащая указанное антитело и фармацевтически приемлемый носитель.
Кроме того, в заявке описано применение антитела для производства лекарственного средства для лечения заболевания, отличающегося экспрессией FAP, или для производства лекарственного средства, предназначенного для индукции лизиса опухолевой клетки или стромальной клетки опухоли, где указанное заболевание может представлять собой рак.
Следующим объектом изобретения являются способы лечения индивидуума, страдающего заболеванием, которое отличается экспрессией FAP, например, рак, включающий введение индивидууму в эффективном количестве антитела или фармацевтической композиции.
А также способ индукции клеточного лизиса опухолевой клетки или стромальной клетки опухоли, где указанный способ включает контактирование опухолевой клетки или стромальной клетки с антителом.
Заявка также относится к способу диагностирования заболевания, которое отличается экспрессией FAP, у индивидуума, где указанный способ включает введение индивидууму в эффективном количестве диагностического агента, где указанный диагностический агент содержит указанное антитело и метку, которая позволяет выявлять комплекс, включающий диагностическое агента и FAP, и где указанное заболевание является раком или воспалительным процессом.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано на фиг. 1 - результаты анализов кинетических характеристик, полученные методом резонанса поверхностного плазмона (SPR), для Fab-фрагментов антител к FAP с созревшей аффинностью. Представлены обработанные наборы кинетических данных для клона 19G1, связывающегося с человеческим (hu) FAP (А), мышиным (mu) FAP (Б), для клона 20G8, связывающегося с hu FAP (В), mu FAP (Г), и для клона 4В9, связывающегося с hu FAP (Д) и mu FAP (E). Гладкими линиями обозначены результаты глобальной аппроксимации полученных данных с использованием модели взаимодействия 1:1;
на фиг. 2 - результаты анализов кинетических характеристик, полученные с помощью SPR, для Fabфрагментов антитела к FAP с созревшей аффинностью. Представлены наборы обработанных кинетических данных для клона 5В8, связывающегося с hu FAP (А) и mu FAP (Б), для клона 5F1, связывающегося с hu FAP (В), mu FAP (Г), и для клона 14В3, связывающегося с hu FAP (Д) и mu FAP (Е). Гладкими линиями обозначены результаты глобальной аппроксимации полученных данных с использованием модели взаимодействия 1:1;
на фиг. 3 - результаты анализов кинетических характеристик, полученные с помощью SPR, для Fabфрагментов антитела к FAP с созревшей аффинностью. Представлены наборы обработанных кинетических данных для клона 16F1, связывающегося с hu FAP (А) и mu FAP (Б), для клона 16F8, связывающегося с hu FAP (В), mu FAP (Г), и для клона О3С9, связывающегося с hu FAP (Д) и mu FAP (E). Гладкими линиями обозначены результаты глобальной аппроксимации полученных данных с использованием интерактивной модели 1:1;
на фиг. 4 - результаты анализов кинетических характеристик, полученные с помощью SPR, для Fabфрагментов антитела к FAP с созревшей аффинностью. Представлены наборы обработанных кинетических данных для клона O2D7, связывающегося с hu FAP (А) и mu FAP (Б), клона 28Н1, связывающегося с hu FAP (В), mu FAP (Г), обезьяны циномолгус (яванский макак-крабоед) cyno FAP (Д), и для клона 22A3, связывающегося с hu FAP (E), mu FAP (Ж) и cyno FAP (3). Гладкими линиями обозначены результаты глобальной аппроксимации полученных данных с использованием модели взаимодействия 1:1;
на фиг. 5 - результаты анализов кинетических характеристик, полученные с помощью SPR, для Fabфрагментов антитела к FAP с созревшей аффинностью. Представлены наборы обработанных кинетических данных для клона 29В11, связывающегося с hu FAP (A), mu FAP (Б), cyno FAP (В), и для клона 23С10, связывающегося с hu FAP (Г), mu FAP (Д) и cyno FAP (E). Гладкими линиями обозначены результаты глобальной аппроксимации полученных данных с использованием модели взаимодействия 1:1;
на фиг. 6 - результаты анализов кинетических характеристик, полученные с помощью SPR, для антител 3F2 (A), 4G8 (Б) и 3D9 (В) к FAP в виде Fab-фрагментов, связывающихся с FAP человека, мышей и обезьян циномолгус. Представлены наборы обработанных кинетических данных, гладкими линиями обозначены результаты глобальной аппроксимации полученных данных с использованием модели взаимо- 3 037977 действия 1:1;
на фиг. 7 - результаты анализов кинетических характеристик, полученные с помощью SPR, для антител к FAP 3F2 (A), 4G8 (Б) и 3D9 (В), связывающихся в виде человеческого IgG с FAP человека, мышей и обезьяны циномолгус. Представлены наборы обработанных кинетических данных, гладкими линиями обозначены результаты глобальной аппроксимации полученных данных с использованием модели взаимодействия 1:1;
на фиг. 8 - репрезентативные изображения полученных из организма человека образцов (А) немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) после иммуногистохимического окрашивания для выявления FAP с помощью мышиного антитела 2F3 в виде IgG2a, (Б) аденокарциномы ободочной кишки после иммуногистохимического окрашивания для выявления FAP с помощью мышиного антитела 2F3 в виде IgG2a, (В) аденокарциномы ободочной кишки после иммуногистохимического окрашивания для выявления FAP с помощью мышиного антитела 3D9 в виде IgG2a, и Г) аденокарциномы ободочной кишки после иммуногистохимического окрашивания для выявления FAP с помощью мышиного антитела 4G8 в виде IgG2a. FAP был выявлен в строме опухоли во всех образцах и с помощью всех антител (левые панели), в то время как не было обнаружено окрашивания при использовании применяемого в качестве контроля изотипа антитела (правые панели);
на фиг. 9 - результаты анализа связывания человеческих антител к FAP в виде IgG1 с экспрессирующими FAP клетками HEK 293, стабильно трансфектированными человечески (А) или мышиным (Б) FAP, полученные с помощью FACS;
на фиг. 10 - результаты анализа связывания человеческих антител к FAP в виде IgG1 с DPPIV (CD26) или HER2, экспрессируемыми стабильно трансфектированными клетками HEK 293, полученные с помощью FACS. Антитело к HER2 трастузумаб и антитело к CD26 применяли в качестве положительных контролей. Вторичное антитело, контроль IgG или вариант без антитела (только клетки) применяли в качестве отрицательных контролей;
на фиг. 11 - результаты анализа связывания человеческих антител к FAP в виде IgG1 с FAP на человеческих фибробластах (клеточная линия GM05389), полученные с помощью FACS. Вторичное антитело или вариант без антитела применяли в качестве отрицательных контролей;
на фиг. 12 - результаты анализа связывания человеческих антител к FAP в виде IgG1 с человеческими фибробластами (клеточная линия GM05389), различными человеческими опухолевыми линиями клеток или клетками HEK293, стабильно трансфектированными человеческим FAP, полученные с помощью FACS;
на фиг. 13 (А) и (Б) - уровни экспрессии FAP на поверхности легочных фибробластов линии GM05389 в различные моменты времени после инкубации с человеческими антителами к FAP в виде IgG1 3F2 или 4G8, полученные с помощью FACS. Не обнаружено существенного снижения уровней экспрессии FAP, свидетельствующих о интернализации FAP. Представлены данные для вторичного антитела, используемого качестве отрицательных контроля, при его индивидуальном применении;
на фиг. 14 - репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения окрашивания плазматической мембраны фибробластов легкого линии GM05389, полученные после связывания антитела к FAP 4G8 в виде IgG в течение 45 мин при 4°С (А), в течение 20 мин при 37°С (Б), в течение 1 ч при 37°С (В) или в течение 6 ч при 37°С (Г). Показано фоновое окрашивание, полученное при использовании в качестве контроля изотипа антитела к CD20 GA101. ЕЕА1 является меткой ранних эндосом. Продемонстрировано персистентное окрашивание FAP на поверхности плазматической мембраны вплоть до 6 ч после связывания с антителом к FAP 4G8;
на фиг. 15 - результаты очистки и анализа человеческого IgG дикого типа 28Н1. А) Стадия очистки аффинной хроматографией на белке А. Б) Стадия очистки гель-фильтрацией. В) Аналитический ДСНПААГ. Г) Аналитическая гель-фильтрация. Экспериментальная процедура описана в примере 1;
на фиг. 16 - результаты очистки и анализа созданного с помощью гликоинженерии человеческого IgG 28H1. А) Стадия очистки аффинной хроматографией на белке А. Б) Стадия очистки гельфильтрацией. В) Аналитический ДСН-ПААГ. Г) Аналитическая гель-фильтрация. Экспериментальная процедура описана в примере 1;
на фиг. 17 - результаты очистки и анализа человеческого IgG дикого типа 29В11. А) Стадия очистки аффинной хроматографией на белке А. Б) Стадия очистки гель-фильтрацией. В) Аналитический ДСНПААГ. Г) Аналитическая гель-фильтрация. Экспериментальная процедура описана в примере 1;
на фиг. 18 - результаты очистки и анализа созданного с помощью гликоинженерии человеческого IgG 29B11. А) Стадия очистки аффинной хроматографией на белке А. Б) Стадия очистки гельфильтрацией. В) Аналитический ДСН-ПААГ. Г) Аналитическая гель-фильтрация. Экспериментальная процедура описана в примере 1;
на фиг. 19 - результаты очистки и анализа человеческого IgG дикого типа 3F2. А) Стадия очистки аффинной хроматографией на белке А. Б) Стадия очистки гель-фильтрацией. В) Аналитический ДСНПААГ. Г) Аналитическая гель-фильтрация. Экспериментальная процедура описана в примере 1;
на фиг. 20 - результаты очистки и анализа созданного с помощью гликоинженерии человеческого IgG 3F2. А) Стадия очистки аффинной хроматографией на белке А. Б) Стадия очистки гель-фильтрацией.
- 4 037977
В) Аналитический ДСН-ПААГ. Г) Аналитическая гель-фильтрация. Экспериментальная процедура описана в примере 1;
на фиг. 21 - результаты очистки и анализа человеческого IgG дикого типа 4G8. А) Стадия очистки аффинной хроматографией на белке А. Б) Стадия очистки гель-фильтрацией. В) Аналитический ДСНПААГ. Г) Аналитическая гель-фильтрация. Экспериментальная процедура описана в примере 1;
на фиг. 22 - результаты очистки и анализа созданного с помощью гликоинженерии человеческого IgG 4G8. А) Стадия очистки аффинной хроматографией на белке А. Б) Стадия очистки гельфильтрацией. В) Аналитический ДСН-ПААГ. Г) Аналитическая гель-фильтрация. Экспериментальная процедура описана в примере 1;
на фиг. 23 - результаты анализа связывания антитела к FAP с созревшей аффинностью 28Н1 с человеческим FAP на клетках HEK293 в сравнении со связыванием родительского антитела к FAP 4G8;
на фиг. 24 - результаты анализа высвобождения LDH (лактатдегидрогеназа) для оценки ADCC, обусловленной антителами к FAP IgG-типа 28Н1 (с созревшей аффинностью) и 4G8, 3F8 (родительское) в качестве версии дикого типа (wt) и версией антитела, созданной с помощью гликоинженерии (ge), с использованием HEK293-hFAP в качестве клеток-мишеней и PBMNC в качестве эффекторных клеток (генотип F/F FcYRIIIa).
Подробное описание вариантов
I. Определения.
Человеческий акцепторный каркасный участок в контексте настоящего описания обозначает каркасный участок, содержащий аминокислотную последовательность каркасного участка вариабельной области легкой цепи (VL) или каркасного участка вариабельной области тяжелой цепи (VH), выведенную из каркасного участка человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркасного участка, указанного ниже. Человеческий акцепторный каркасный участок выведенный из каркасного участка человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркасного участка, может содержать такую же аминокислотную последовательность, что и указанные каркасные участки, или может нести замены в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах количество аминокислотных замен составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых вариантах человеческий акцепторный каркасный участок VL идентичен по последовательности каркасного участка человеческого иммуноглобулина VL или последовательности человеческого консенсусного каркасного участка.
Понятие аффинность относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между индивидуальным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, то в контексте настоящего описания понятие аффинность связывания относится к присущей компонентам связывающейся пары (например, к антителу и антигену) аффинности связывания, отражающей взаимодействие по типу 1:1. Аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно, как правило, характеризовать с помощью константы диссоциации (KD), которая представляет собой отношение констант скорости реакции диссоциации и ассоциации (koff и kon соответственно). Так, эквивалентные аффиности могут соответствовать различным константам скорости, если соотношение констант скорости остается таким же. Аффинность можно оценивать общепринятыми методами, известными в данной области, включая представленные в настоящем описании. Конкретные приведенные с целью иллюстрации примеры вариантов измерения аффинности связывания описаны ниже.
Понятие антитело с созревшей аффинностью относится к антителу с одним или несколькими изменениями (например, аминокислотными мутациями) в одном или нескольких из гипервариабельных участков (HVR) (например, CDR), по сравнению с родительским антителом, у которого отсутствуют указанные изменения, при этом указанные изменения приводят к повышению аффинности антитела к антигену. Как правило, антитело с созревшей аффинностью связывается с тем же эпитопом, что и родительское антитело.
Понятия антитело к FAP и антитело, которое связывается с белком активации фибробластов (FAP) относится к антителу, которое обладает способностью связываться с FAP с достаточной аффинностью, что позволяет применять антитело в качестве диагностического и/или терапевтического агента, мишенью которого является FAP. В одном из вариантов степень связывания антитела к FAP с неродственным, не представляющим собой FAP белком может быть менее примерно 10% от степени связывания антитела с FAP, по данным, полученным, например, с помощью радиоиммуноанализа (РИА) или проточной цитометрии (FACS). Согласно одному из вариантов степень связывания антитела к FAP с DPPIV, белком, близкородственным FAP (который обозначают также как CD26; GenBank, регистрационный номер Р27487), составляет менее примерно 15%, примерно 10 или 5% от степени связывания антитела с FAP по данным FACS. В конкретных вариантах антитело, которое связывается с FAP, характеризуется величиной константы диссоциации (KD), составляющей < 1 мкМ, < 100 нМ, < 10 нМ, < 1 нМ, < 0,1 нМ, < 0,01 нМ или < 0,001 нМ (например, 10-8М или менее, например, от 10-8М до 10-13М, например, от 10-9М до 10-13М). В конкретных вариантах антитело к FAP связывается с эпитопом FAP, консервативным для FAP из различных видов.
- 5 037977
В контексте настоящего описания понятие антитело используется в его наиболее широком смысле и относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью). Оно относится также к фрагментам антител, включающим Fc-область, и слитым белкам, которые содержат область, эквивалентную Fc-области иммуноглобулина.
Понятие фрагмент антитела относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примерами фрагментов антител являются (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, одноцепочечные молекулы антител (например, scFv), димерные и мультиспецифические антитела, полученные из фрагментов антител.
Понятие антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и референс-антитело, относится к антителу, которое блокирует связывание референс-антитела с его антигеном по данным анализа в конкурентном формате на 50% или более, и наоборот, референс-антитело блокирует связывание антитела с его антигеном по данным анализа в конкурентном формате на 50% или более. Пример анализа конкуренции представлен в настоящем описании.
В контексте настоящего описания понятие антигенсвязывающий центр относится к части антигенсвязывающей молекулы, которая содержит область, специфически связывающуюся и являющуюся комплементарной части антигена или полному антигену. Если антиген является крупным, то антигенсвязывающая молекула может связываться только с конкретной частью антигена, которую называют эпитопом. Антигенсвязывающий центр может представлять собой, например, один или несколько вариабельных доменов антитела (которые называют также вариабельными областями антитела). Предпочтительно антигенсвязывающий центр содержит вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH).
Понятие химерное антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из конкретного источника или конкретных видов, а остальная часть тяжелой и/или легкой цепи получена из другого источника или других видов. Например, в химерных антителах несвязывающие антиген компоненты можно получать из антител широкого разнообразия видов, включая приматов, таких как шимпанзе, и людей. Гуманизированные антитела представляют собой наиболее предпочтительную форму химерных антител.
Понятие класс антител относится к типу константного домена или константной области тяжелых цепей антитела. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно.
В контексте настоящего описания понятие цитотоксический агент относится к субстанции, которая ингибирует или препятствует клеточной функции и/или вызывает гибель или деструкцию клетки. Цитотоксические агенты включают (но, не ограничиваясь только ими) радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические средства или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); ингибирующие рост средства; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или обладающие ферментативной активностью токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты; и различные противоопухолевые или противораковые средства, указанные ниже.
В контексте настоящего описания понятие эффекторная функция относится к видам биологической активности, присущим Fc-области, которая варьирует в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются способность связываться с C1q и комплементзависимая цитотоксичность (CDC), способность связываться с Fc-рецептором, антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), антитело-обусловленный клеточно-зависимый фагоцитоз (ADCP), секреция цитокинов, опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, Вклеточного рецептора); и активация В-клеток.
Понятие эффективное количество агента, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному при применении в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата.
В контексте настоящего описания понятие Fc-область относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие относится к нативной последовательности Fc-областей и вариантам Fc-областей. В одном из вариантов Fcобласть тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Рго230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может либо присутствовать, либо может не
- 6 037977 присутствовать. Если специально не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, называемой также EU-индексом, которая описана у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие область, эквивалентная Fcобласти иммуноглобулина относится к встречающимся в естественных условиях аллельным вариантам Fc-области иммуноглобулина, а также вариантам, имеющим изменения, которые получают в результате замен, добавлений или делеций, но которые не снижают в значительной степени способность иммуноглобулина опосредовать эффекторные функции (такие как антитело-обусловленная клеточно-зависимая цитотоксичность). Например, одну или несколько аминокислот можно изымать путем делеции из Nконца или С-конца Fc-области иммуноглобулина без существенного снижения биологической функции. Такие варианты можно отбирать согласно общим правилам, которые известны в данной области, так, чтобы оказывать минимальное воздействие на активность (см., например, Bowie J. U. и др., Science 247, 1990, сс. 1306-1310).
Каркасные участки или FR-участки представляют собой участки вариабельных областей, отличные от остатков гипервариабельных участков (HVR) (или CDR). FR вариабельной области, как правило, представлены четырьмя FR-доменами: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR, как правило, расположены в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)FR3-H3(L3)-FR4.
В контексте настоящего описания понятия полноразмерное антитело, интактное антитело и полное антитело используют взаимозаменяемо, и они относятся к антителу, имеющему строение, практически сходное со строением нативного антитела, или имеющему тяжелые цепи, которые содержат указанную в настоящем описании Fc-область.
В контексте настоящего описания понятия клетка, клеточная линия и клеточная культура используются взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство указанных клеток. Так, понятия трансформанты и трансформированные клетки - это клетки-хозяева, которые включают первичные рассматриваемые клетки, а также культуры, выведенные из них, независимо от количества пересевов. Потомство может не быть строго идентичным родительской клетке по составу нуклеиновых кислот, а может нести мутации. Под данное понятие подпадает мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, что и отобранная путем скрининга или селекции исходная трансформированная клетка. Согласно одному из вариантов клетку-хозяина конструируют так, чтобы с ее помощью получать антитело с модифицированными олигосахаридами. В конкретных вариантах клетки-хозяева подвергали дополнительным манипуляциям для экспрессии повышенных уровней одного или нескольких полипептидов, обладающих активностью β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII). Клетки-хозяева представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, такие как СНО-клетки, BHK-клетки, NSO-клетки, SP2/0-клетки, клетки миеломы линии YO, клетки мышиной миеломы линии Р3Х63, PER-клетки, PER.C6-клетки или клетки гибридомы, клетки дрожжей, клетки насекомых и растительные клетки, а также клетки, находящиеся в организме трансгенного животного, трансгенного растения или культивируемой растительной или животной ткани.
Человеческое антитело представляет собой антитело, которое несет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого в организме человека или в человеческой клетке, или полученное из источника кроме человека, в котором продуцируются популяции человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Из указанного понятия человеческого антитела специально исключено гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.
Человеческий консенсусный каркасный участок представляет собой каркасный участок, в который входят наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в выбранных последовательностях каркасных участков VL или VH иммуноглобулина. Как правило, выбор последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина осуществляют из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, описанную у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., NIH Publication 91-3242, Bethesda MD, т.т. 13, 1991. В одном из вариантов VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I согласно Kabat и др., выше. В одном из вариантов VH подгруппа представляет собой подгруппу III согласно Kabat и др., выше.
Понятие гуманизированное антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В конкретных вариантах гуманизированное антитело должно содержать практически все по меньшей мере из одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в котором(ых) все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все из FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, полученной из человеческого антитела. Понятие гуманизиро- 7 037977 ваная форма антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подвергнуто гуманизации.
Понятие гипервариабельный участок или HVR в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательность которых являются гипервариабельной, и/или которые образуют структуры в виде петель (гипервариабельные петли). Как правило, нативные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, H2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR, как правило, содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из определяющих комплементарность участков (CDR), последние отличаются наиболее выраженной вариабельностью последовательности и/или участвуют в распознавании антигенов. Кроме CDR1 в VH CDR, как правило, содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. Понятие гипервариабельные участки (HVR) относится также к определяющим комплементарность участкам (CDR), и эти понятия используют взаимозаменяемо касательно положений вариабельной области, которые формируют антигенсвязывающие центры. Эта конкретная область описана у Kabat и др., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1983 и у Chothia и др., J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917, причем эти определения относятся к перекрывающимся аминокислотным остаткам или поднаборам аминокислотных остатков при их сравнении друг с другом. Однако в контексте настоящего описания подразумевается возможность применения любого определения CDR антитела или его вариантов. Соответствующие аминокислотные остатки, из которых состоят CDR, как они определены в каждой из процитированных выше ссылок, представлены в сравнении ниже в табл. 1. Точные номера остатков, которые образуют конкретный CDR, должны варьироваться в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области на основе данных об аминокислотной последовательности вариабельной области антитела легко могут определить, какие остатки входят в конкретный CDR.
Таблица 1. Определения CDR1
Кэб от Хотиа AbM2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-32
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
Нумерация всех входящих в CDR остатков в табл. 1 дана в соответствии с номенклатурой, предложенной Кэботом с соавторами (см. ниже).
Обозначение AbM с прописной буквой b, использованное в табл. 1, относится к CDR, как они определены программой для моделирования антител AbM компании Oxford Molecular Group.
Кэбот с соавторами предложили также систему нумерации (номенклатуру) последовательностей вариабельных областей, которую можно применять для любого антитела. Обычный специалист в данной области может однозначно применять эту систему нумерации по Кэботу к любой последовательности вариабельной области, не имея никаких экспериментальных данных, кроме сведений о самой последовательности. В контексте настоящего описания понятие нумерация по Кэботу относится к системе нумерации, описанной у Kabat и др., Sequence of Proteins of Immunological Interest, изд-во U.S. Dept. of Health and Human Services, 1983. Если не указано иное, то ссылки на нумерацию положений конкретных аминокислотных остатков в вариабельной области антитела даны в соответствии с системой нумерации по Кэботу.
CDR содержат также определяющие специфичность остатки или SDR, которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR входят в области CDR, обозначенные как укороченные CDR или a-CDR. В целом, только от 1/5 до 1/3 остатков в данном CDR принимают участие в связывании антигена. Определяющие специфичность остатки в конкретном CDR можно идентифицировать, например, путем компьютерной обработки межатомных контактов при трехмерном моделировании и определения вариабельности последовательности в данном положении остатка с использованием методов, описанных у Padlan и др., FASEB J. 9(1), 1995, cc. 133-139. Приведенные в качестве примера a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) находятся на аминокислотных остатках 31-34 в L1, 50-55 в L2, 89-96 в L3, 31-35В в H1, 50-58 в Н2 и 95-102 в Н3 (см. Almagro и Fransson, Front. Biosci 13, 2008, cc. 1619-1633).
Конъюгат антитела представляет собой антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом.
Индивидуум или субъект представляет собой млекопитающее. Млекопитающее представляет собой (но, не ограничиваясь только ими) одомашненных животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, люди и приматы кроме человека, такие как мартышки), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). В конкретных вариантах индивидуум или субъект представляет собой человека.
Выделенное антитело представляет собой антитело, которое отделено от компонентов его естест- 8 037977 венного окружения. В некоторых вариантах антитело очищено до уровня чистоты, превышающего 95% или 99% по данным, полученным, например, с помощью электрофоретических методов (например, ДСНПААГ, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографических методов (например, ионообменная ЖХВР или ЖХВР с обращенной фазой). Обзор методов, предназначенных для оценки чистоты антител, см., например, у Flatman и др., J. Chromatogr. В 848, 2007, cc. 79-87.
Выделенный полинуклеотид означает молекулу полинуклеотида, которая отделена от компонентов ее естественного окружения. Выделенный полинуклеотид представляет собой молекулу полинуклеотида, находящуюся в клетке, которая, как правило, содержит молекулу полинуклеотида, но при этом молекула полинуклеотида присутствует вне хромосомы или локализована в хромосоме в локусе, отличном от локуса ее локализации в хромосоме в естественных условиях.
Понятие выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело к FAP относится к одной или нескольким полинуклеотидным молекулам, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или его фрагменты), включая указанную(ые) полинуклеотидную(ые) молекулу(ы), которая(ые) находится(ятся) в одном векторе или в разных векторах, и указанная(ые) полинуклеотидная(ые) молекула(ы) присутствует в одной ил нескольких областях в клетке-хозяине.
Понятие моноклональное антитело в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих встречающиеся в естественных условиях мутации или возникающих в процессе производства препарата моноклонального антитела, указанные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты антигена. Таким образом, прилагательное моноклональный определяет особенность антитела, характеризуя его как полученное из практически гомогенной популяции антител, а не сконструированное в соответствии с требованиями к получению антитела с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела можно создавать с помощью различных технологий, включая (но, не ограничиваясь только ими) метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы на основе трансгенных животных, которые содержат все или часть локусов иммуноглобулина, указанные методы и другие, приведенные в качестве примера методы получения моноклональных антител, представлены в настоящем описании.
Понятие оголенное антитело относится к антителу, не конъюгированному с гетерологичным фрагментом (например, цитотоксичным фрагментом) или радиоактивной меткой. Оголенное антитело может присутствовать в фармацевтической композиции.
Понятие нативные антитела относятся к встречающимся в естественных условиях молекулам иммуноглобулинов с различными структурами. Например, нативные антитела в виде IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь в направлении от N- к С-концу содержит вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой расположены три константных домена (CH1, CH2 и СН3), которые называют также константной областью тяжелой цепи. Аналогично этому каждая легкая цепь в направлении от N- к С-концу содержит вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой расположен константный легкий (CL) домен, который называют также константной областью легкой цепи. Легкая цепь может относиться к одному из двух типов, обозначенных как каппа (к) или лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности ее константного домена.
Понятие не обладает значительной перекрестной реактивностью означает, что молекула (например, антитело) не распознает или не связывается специфически с антигеном, отличным от фактического антигена-мишени молекулы (например, антигеном, близкородственным антигену-мишени), прежде всего по сравнению с антигеном-мишенью. Например, уровень связывания антитела с антигеном, отличным от фактического антигена-мишени, может составлять от менее чем примерно 10% до менее чем примерно 5%, или уровень связывания с указанным антигеном, отличным от фактического антигена-мишени, может составлять менее чем примерно 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% или 0,1%, предпочтительно менее чем примерно 2%, 1% или 0,5% и наиболее предпочтительно уровень связывания с антигеном, отличным от фактического антигена-мишени, может составлять менее чем примерно 0,2% или 0,1%.
Понятие листовка-вкладыш в упаковке относится к инструкциям, которые обычно находятся в поступающих в продажу упаковках терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или мерах предосторожности при применении указанных терапевтических продуктов.
Понятие родительское антитело относится к антителу, применяемому в качестве исходного или
- 9 037977 основы для получения варианта.
Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности относительно полипептидной референс-последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательностикандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в полипептидной референс-последовательности, после выравнивания последовательностей и интродукции при необходимости брешей для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и при этом какие-либо консервативные замены не учитываются при оценке идентичности последовательностей. Сравнительный анализ для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными путями, которые находятся в компетенции специалиста в данной области, например, с использованием публично доступных компьютерных программ, таких как программа BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей величину % идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием предназначенной для сравнения последовательностей компьютерной программы ALIGN-2. Предназначенная для сравнения последовательностей компьютерная программа ALIGN-2 разработана фирмой Genentech, Inc., и исходный код помещен на хранение вместе с документацией для пользователя в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под регистрационным номером U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 представляет собой публично доступную программу фирмы Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, шт. Калифорния, или ее можно компилировать из исходного кода. Программу ALIGN-2 можно компилировать для применения в операционной системе UNIX, включая цифровую версию UNIX V4.0D. В программе ALIGN-2 все параметры для сравнения последовательностей являются заданными и не должны изменяться.
В ситуации, когда ALIGN-2 применяют для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотных последовательностей данной аминокислотной последовательности А относительно или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью Б (которую другими словами можно обозначать как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или отличается определенным % идентичности аминокислотной последовательности относительно или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью Б), рассчитывают следующим образом:
100* частное X/Y, где X обозначает количество аминокислотных остатков, оцененных программой сравнительного анализа последовательностей ALIGN-2 как идентичные совпадения при сравнительном анализе последовательностей А и Б с помощью указанной программы, и где Y обозначает общее количество аминокислотных остатков в Б. Должно быть очевидно, что, когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, то % идентичности аминокислотной последовательности А относительно аминокислотной последовательности Б не должен быть равен % идентичности аминокислотной последовательности Б относительно аминокислотной последовательности А. Если специально не указано иное, то в контексте настоящего описания все величины % идентичности аминокислотных последовательностей получают согласно процедуре, описанной в последнем из предшествующих параграфов, с помощью компьютерной программы ALIGN-2.
Аналогично этому под нуклеотидной кислотой или полинуклеотидом, имеющей/имеющим нуклеотидную последовательность, которая, например, на 95% идентична нуклеотидной референспоследовательности подразумевают, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична референс-последовательности за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов нуклеотидной референспоследовательности. Другими словами, при получении полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 95% нуклеотидной референспоследовательности, вплоть до 5% нуклеотидов в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другой нуклеотид, или вплоть до 5% нуклеотидов от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти изменения референс-последовательности могут иметь место в положениях на 5'-или 3'-конце нуклеотидной референс- последовательности или в ином положении между этими концевыми положениями, которые встраивают либо индивидуально между остатками в референс-последовательности, либо в одну или несколько из смежных групп в референс-последовательности. На практике решение вопроса о том, идентичен ли конкретный полинуклеотид или полипептид по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидной последовательности или полипептидной последовательности можно решать, как правило, с использованием известных компьютерных программ, например, указанных выше.
Понятие фармацевтическая композиция относится к препарату, который находится в такой форме, что он обеспечивает биологическую активность входящего в его состав действующего вещества, которое должно обладать эффективностью, и который не содержит дополнительных компонентов, которые обладают неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому следует вводить композицию.
Фармацевтически приемлемый носитель относится к ингредиенту в фармацевтической компози- 10 037977 ции, отличному от действующего вещества, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемые носители включают (но, не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
Понятие белок активации фибробластов (FAP) в контексте настоящего описания относится к любому нативному FAP из любого позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человеческий, см. GenBank, регистрационный номер ААС51668) и грызуны (например, мышиный, см. GenBank, регистрационный номер ААН19190), если специально не указано иное. Понятие относится к полноразмерному непроцессированному FAP, а также к любой форме FAP, образовавшейся в результате процессинга в клетке. Понятие относится также к встречающимся в естественных условиях вариантам FAP, например, сплайсинговым вариантам или аллельным вариантам. Предпочтительно антитело к FAP связывается с внеклеточным доменом FAP. Приведенные в качестве примера аминокислотные последовательности эктодоменов человеческого, мышиного FAP и FAP обезьяны циномолгус (с С-концевым полилизином и 6xHis-меткой) представлены в SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, и SEQ ID NO: 321 соответственно.
В контексте настоящего описания понятие лечение (и его грамматические вариации, такие как лечить или процесс лечения) относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики или в процессе развития клинической патологии. Требуемыми действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезни и ремиссия, или улучшение прогноза. В некоторых вариантах антитела применяют для задержки развития болезни или замедления прогрессирования болезни.
Понятие вариабельная область или вариабельный домен относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, которая участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит 4 консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, можно выделять, используя VH- или VL-домен антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL- или VH-доменов соответственно (см., например, Portolano и др., J. Immunol. 150, 1993, cc. 880-887; Clarkson и др., Nature 352, 1991, cc. 624-628).
В контексте настоящего описания понятие вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая обладает способностью амплифицировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связна. Понятие относится к вектору как самореплицирующейся содержащей нуклеиновую кислоту структуре, а также к вектору, встроенному в геном клетки-хозяина, в которую интродуцирован вектор. Некоторые векторы обладают способностью контролировать экспрессию нуклеиновых кислот, с которым они функционально связаны. Такие векторы в контексте настоящего описания обозначают как экспрессионные векторы.
В контексте настоящего описания понятие полипептид, обладающий активностью GnTIII относится к полипептидам, которые могут катализировать добавление остатка N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) в в-1-4-связи к β-связанному маннозиду триманнозильного ядра N-связанных олигосахаридов. Этот процесс включает слияние полипептидов, обладающих ферментативной активностью, сходной но не обязательно идентичной с активностью β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III, известной также как β-1,4-маннозил-гликопротеин-4-бета-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза (КФ 2.4.1.144) согласно номенклатуре Комитета по номенклатуре Международного союза по биохимии и молекулярной биологии (NC-IUBMB)), при оценке с помощью конкретного биологического анализа как в случае зависимости от дозы, так и без зависимости от дозы. В случае, когда существует зависимость от дозы, фермент не должен быть обязательно идентичен GnTIII, а скорее он должен быть практически подобен ей в отношении зависимости данной активности от дозы по сравнению с GnTIII (т.е. полипептид-кандидат должен обладать более высокой активностью или не более чем примерно в 25 раз пониженной активностью, предпочтительно не более чем примерно в 10 раз пониженной активностью, и еще более предпочтительно не более чем примерно в 3 раза пониженной активностью по сравнению с GnTIII).
В контексте настоящего описания понятие домен локализации в комплексе Гольджи относится к аминокислотной последовательности расположенного в комплексе Гольджи полипептида, который ответствен за заякоривание полипептида в области, находящейся внутри комплекса Гольджи. Как правило, домены локализации содержат аминоконцевые хвосты фермента.
В контексте настоящего описания понятие инженерия (создание), созданный с помощью инженерии, процесс создания с помощью инженерии, прежде всего с приставкой глико, а также понятие инженерия гликозилирования (гликоинженерия, конструирование схемы гликозилирования), относятся
- 11 037977 к любой манипуляции, которой подвергают схему гликозилирования встречающегося в естественных условиях или рекомбинантного полипептида, или его фрагмента. Конструирование схемы гликозилирования включает метаболическое конструирование механизма гликозилирования клетки, в том числе генетические манипуляции, касающиеся путей олигосахаридного синтеза, с целью получения измененного гликозилирования гликопротеинов, экспрессируемых в клетках. Кроме того, инженерия гликозилирования включает воздействия мутаций и клеточного окружения на гликозилирование. В одном из вариантов инженерию гликозилирования осуществляют с целью изменения гликозилтрансферазной активности. В конкретном варианте инженерия позволяет изменять активность глюкозаминилтрансферазы и/или активность фукозилтрансферазы.
В контексте настоящего описания понятие Fc-обусловленная клеточно-зависимая цитотоксичность относится к антитело-обусловленной клеточно-зависимой цитотоксичности (ADCC) и клеточнозависимой цитотоксичности, опосредованной растворимым слитым с Fc белком, который содержит человеческую Fc-область. Это представляет собой механизм иммунитета, приводящий к лизису меченных (антителом) клеток человеческими иммунокомпетентными эффекторными клетками.
Понятие человеческие иммунокомпетентные эффекторные клетки означает популяцию лейкоцитов, несущих на поверхности Fc-рецепторы, с помощью которых они связываются с Fc-областью антител или со слитыми с Fc белками и осуществляют эффекторные функции. Такая популяция может включать (но, не ограничиваясь ими) периферические мононуклеарные клетки (РВМС) и/или естественные клеткикиллеры (NK).
В контексте настоящего описания понятие меченные (антителом) клетки относится к клеткам, с которыми специфически связываются антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-область (например, антитела или их фрагменты, которые содержат Fc-область), или слитые с Fc белки. Антигенсвязывающие молекулы или слитые с Fc белки связываются с клетками-мишенями посредством N-концевого по отношению к Fc-области белкового фрагмента.
В контексте настоящего описания понятие повышенная Fc-обусловленная клеточно-зависимая цитотоксичность относится к любому увеличению количества меченных (антителом) клеток, подвергнутых лизису в данный момент времени при данной концентрации антитела или слитого с Fc белка, в среде, окружающей клетки-мишени, с помощью указанного выше механизма Fc-опосредованной клеточнозависимой цитотоксичности и/или снижению концентрации антитела или слитого с Fc белка в среде, окружающей клетки-мишени, необходимой для лизиса данного количества меченных (антителом) клеток в данный момент времени с помощью механизма Fc-обусловленной клеточно-зависимой цитотоксичности. Повышение уровня Fc-обусловленной клеточно-зависимой цитотоксичности оценивают относительно клеточно-зависимой цитотоксичности, опосредованной той же антигенсвязывающей молекулой или тем же слитым с Fc белком, которая/который продуцируется в таком же типе клеток-хозяев, с использованием одних и тех же стандартных методов получения, очистки, приготовления композиций и хранения (которые известны специалистам в данной области), но которая/который не продуцировалась/продуцировался клеткой-хозяином, сконструированной так, чтобы она имела измененную схему гликозилирования (например, так, чтобы в ней происходила экспрессия гликозилтрансферазы GnTIII или других гликозилтрансфераз), с помощью методов, представленных в настоящем описании.
Под антителом, обладающим повышенной антитело-обусловленной клеточно-зависимой цитотоксичностью ('ADCC) подразумевается антитело, как оно определено выше, обладающее ADCC при определении с помощью любого приемлемого метода, известного обычным специалистам в данной области. Один из приемлемых методов анализа in vitro ADCC заключается в том, что:
1) для анализа применяют клетки-мишени, для которых известно, что они экспрессируют антигенмишень, распознаваемый антигенсвязывающим центром антитела;
2) для анализа в качестве эффекторных клеток используют человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), выделенные из крови произвольно выбранных здоровых доноров;
3) анализ осуществляют с помощью следующего протокола:
I) РВМС выделяют с помощью стандартных методов центрифугирования в градиенте плотности и суспендируют 5х 106 клеток/мл в RPMI-среде для культуры клеток;
II) выращивают клетки-мишени с помощью стандартных методов культивирования тканей, собирают на экспоненциальной фазе роста, когда жизнеспособность составляет более 90%, промывают в RPMI-среде для культуры клеток, меченной 100 мкКи 51Cr, дважды промывают с помощью среды для культуры клеток и ресуспендируют в среде для культуры клеток с плотностью 10 клеток/мл;
III) переносят по 100 мкл указанной выше конечной суспензии клеток-мишеней в каждую лунку 96луночного титрационного микропланшета;
IV) готовят серийные разведения с концентрацией антител от 4000 до 0,04 нг/мл в среде для культуры клеток и добавляют 50 мкл полученных растворов антител к клеткам-мишеням в 96-луночном титрационном микропланшете, оценивая в трех повторностях различные концентрации антител во всем указанном выше диапазоне концентраций;
V) для создания контролей с максимальным высвобождением (MR) используют 3 дополнительные лунки в планшете, которые содержат меченые клетки-мишени, с добавлением 50 мкл 2 об.% водного
- 12 037977 раствора неионогенного детергента (Nonidet, фирма Sigma, Сент-Луис), вместо раствора антитела (указанного в п. IV, выше);
VI) для создания контролей со спонтанным высвобождением (SR), используют 3 дополнительные лунки в планшете, которые содержат меченые клетки-мишени, с добавлением 50 мкл RPMI-среды для культуры клеток вместо раствора антитела (указанного в п. IV, выше);
VII) затем 96-луночный титрационный микропланшет центрифугируют при 50xg в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С;
VIII) добавляют в каждую лунку по 50 мкл суспензии РВМС (указанной в п.1, выше), получая соотношение эффекторные клетки: клетки-мишени 25:1, и планшеты помещают в инкубатор в атмосферу, содержащую 5% СО2, и выдерживают при 37°С в течение 4 ч;
IX) собирают бесклеточный супернатант из каждой лунки и количественно оценивают выделенную в процессе эксперимента радиоактивность (ER) с помощью счетчика гамма-лучей;
X) рассчитывают процент специфического лизиса для каждой концентрации антитела согласно формуле (ER-MR)/(MR-SR)x100, где ER обозначает среднюю радиоактивность, рассчитанную (см. π.ΙΧ, выше) для указанной концентрации антитела, MR означает среднюю радиоактивность, рассчитанную (см. π.ΙΧ, выше) для MR-контролей (см. n.V, выше), a SR означает среднюю радиоактивность, рассчитанную (см. π.ΙΧ, выше) для SR-контролей (см. n.VI. выше);
4) повышенную ADCC определяют либо как увеличение максимального процента специфического лизиса, обнаруженного при использовании указанного выше диапазона концентраций антитела, и/или как снижение концентрации антитела, необходимой для достижения половины от максимального процента специфического лизиса, обнаруженного при использовании указанного выше диапазона концентраций антитела. Повышение ADCC оценивают относительно измеренной с помощью вышеописанного анализа ADCC, опосредованной одним и тем же антителом, которое продуцировали в одном и том же типе клеток-хозяев, с использованием одних и тех же стандартных методов получения, очистки, приготовления композиций и хранения, которые известны специалистам в данной области, но которое не продуцировалось клеткой-хозяином, сконструированной для сверхэкспрессии GnTIII.
II. Композиции и методы.
Белок активации фибробластов (FAP) экспрессируется в большинстве опухолей, но практически отсутствует в здоровых тканях взрослых индивидуумов, поэтому антитела, мишенью которых является этот антиген, имеют большой терапевтический потенциал. В настоящем изобретении предложены антитела, которые связываются с FAP, в частности, антитела, обладающие высокой аффинностью и сильными эффекторными функциями. Их можно применять, например, для диагностирования или лечения заболеваний, отличающихся экспрессией FAP, таких как рак.
А. Примеры антител к FAP.
В настоящем изобретении предложены антитела, которые специфически связываются с белком активации фибробластов (FAP). В частности, в настоящем изобретении предложены антитела, которые специфически связываются с FAP, где антитела создают с помощью гликоинженерии так, чтобы они обладали повышенной эффекторной функцией.
Антитело к FAP может содержать по меньшей мере один (например, один, два, три, четыре, пять или шесть) определяющий комплементарность участок (CDR) тяжелой или легкой цепи, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO:
115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO:
127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO:
139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO:
151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO:
163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO:
175 и SEQ ID NO: 177, или их варианты или укороченные формы, которые содержат по меньшей мере определяющие специфичность остатки (SDR) указанного CDR.
Указанный CDR может представлять собой CDR тяжелой цепи, прежде всего CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 141. А также антитело может содержать по меньшей мере один CDR тяжелой цепи и по меньшей мере один CDR легкой цепи, прежде всего CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 141, CDR3 легкой цепи, выбранный из группы,
- 13 037977 включающей SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ
ID NO: 173, SEQ ID NO: 175 и SEQ ID NO: 177.
Или антитело может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR тяжелой цепи (HCDR), последовательности которых выбраны из (a) HCDR1, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, и SEQ ID NO: 33; (б) HCDR2, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131 и SEQ ID NO: 133; и (в) HCDR3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 141. Кроме того, антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 33; (б) CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131 и SEQ ID NO: 133; и (в) CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 141, или их варианты или укороченные формы, содержащие по меньшей мере SDR указанных CDR.
А также антитело может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR легкой цепи (LCDR), последовательности которых выбраны из (a) LCDR, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 149; (б) LCDR2, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, и SEQ ID NO: 161; и (в) LCDR3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175 и SEQ ID NO: 177. И антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит (a) CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 149; (6) CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159 и SEQ ID NO: 161; и (в) CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175 и SEQ ID NO: 177, или их варианты или укороченные формы, содержащие по меньшей мере SDR указанных CDR.
Антитело так же может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 33; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131 и SEQ ID NO: 133; и CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 141, вариабельную область легкой це- 14 037977 пи, которая включает CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 149; CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159 и SEQ ID NO: 161; и CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175 и SEQ ID NO: 177, или их варианты или укороченные формы, содержащие по меньшей мере SDR указанных CDR.
И антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 33; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131 и SEQ ID NO: 133; и CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 141, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 149; CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159 и SEQ ID NO: 161; и CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175 и SEQ ID NO: 177, где по меньшей мере один из указанных CDR выбран из группы, включающей SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 и SEQ ID NO: 177.
А также указанное антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 33; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID N0: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131 и SEQ ID NO: 133; и CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 141, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 149; CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159 и SEQ ID NO: 161; и CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175 и SEQ ID NO: 177, где по меньшей мере один из указанных CDR не представляет собой CDR, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO:
107, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ IDNO:
145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ IDNO:
157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ IDNO:
169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173 и SEQ ID NO: 175.
И указанное антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает
- 15 037977
CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 27; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 107; и CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 141, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 149; CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159 и SEQ ID NO: 161; и CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173 и SEQ ID NO: 175, или их варианты или укороченные формы, содержащие по меньшей мере SDR указанных CDR.
Указанное антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID N0: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 23; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 101; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 135, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 143, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 151, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 163. В другом варианте антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 23; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 103; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 137, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 145, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 153, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 165. Или указанное антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которого представлена в которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 23; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 101; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 137, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 147, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 155, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 167. В другом варианте конкретном варианте антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 23; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 105; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 135, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 147, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 155, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 169. В другом варианте конкретном варианте антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 23; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 101; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 137, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 149, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 157, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 167. Указанное антитело также может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 29; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129 и SEQ ID NO: 131; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 135, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 143, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 151, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 163. И указанное антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 33; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO:
- 16 037977
67, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 127 и SEQ ID NO: 133; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 137, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 147, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 155, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 167. А также указанное антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 23; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 101; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 135, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 143, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 151, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 177. Указанное антитело также может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 23; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 109; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 135, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 143, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 151, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 163. В другом варианте конкретном варианте антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 23; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 111; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 135, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 143, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 151, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 163. В другом варианте конкретном варианте антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 23; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 89 и SEQ ID NO: 131; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 135, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 143, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 151, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 163. В другом варианте конкретном антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 23; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 113; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 135, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 143, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 151, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 163. В другом варианте конкретном варианте антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 31; CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 127; и CDR3 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 137, и вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 147, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 155, и CDR3 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 167.
Стоит отметить, что указанное антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO:
235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO:
259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO:
283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO:
307 и SEQ ID NO: 311. Или указанное антитело может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231,
SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255,
SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279,
SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303,
SEQ ID NO: 307 и SEQ ID NO: 311.
- 17 037977
Кроме того, последовательность VH, которая идентична по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, может содержать замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, и при этом антитело к FAP, содержащее указанную последовательность, может сохранять способность связываться с FAP. В целом существует возможность того, чтобы от 1 до 10 аминокислот были заменены, встроены и/или удалены в SEQ ID NO: 197, 201, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, 287, 291, 295, 299, 303, 307 или 311. Замены, инсерции или делеции могут затрагивать области, расположенные вне HVR или CDR (т.е. в FR). VH может содержать один, два или три CDR тяжелой цепи, выбранных для HCDR1, HCDR2 и HCDR3 из следующего набора последовательностей: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139 и 141.
Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ
ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ
ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ
ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ
ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305 и SEQ ID NO: 309. Оно может включать вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей: SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID
NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID
NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID
NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID
NO: 305 и SEQ ID NO: 309.
Последовательность VL, которая идентична по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, может содержать замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, и при этом антитело к FAP, содержащее указанную последовательность, сохраняет способность связываться с FAP. Существует возможность того, чтобы от 1 до 10 аминокислот были заменены, встроены и/или удалены в SEQ ID NO: 193, 195, 199, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 289, 293, 297, 301, 305 или 309. Замены, инсерции или делеции могут затрагивать области, расположенные вне HVR или CDR (т.е. в FR). VL может содержать один, два или три CDR легкой цепи, выбранных для LCDR1, LCDR2 и LCDR3 из следующего набора последовательностей: SEQ ID NO: 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 и 177.
Антитело к FAP может содержать VH и VL, указанные в любом из представленных вариантов. Антитело также может включать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO:
219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO:
243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO:
267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO:
291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 и SEQ ID NO: 311, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности, которая выбрана из группы, включающей: SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225,
SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249,
SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273,
SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297,
SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305 и SEQ ID NO: 309. А также антитело может содержать последовательности VH и VL, представленные в SEQ ID NO: 197, 201, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, 287, 291, 295, 299, 303, 307 или 311, и SEQ ID NO 193, 195, 199, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 289, 293, 297, 301, 305 или 309 соответственно, включая пост-трансляционные модификации указанных последовательностей.
Кроме того, антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO:
- 18 037977
223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO:
247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO:
271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO:
295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 и SEQ ID NO: 311, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей: SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213,
SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237,
SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261,
SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285,
SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305 и SEQ ID NO: 309, при этом по меньшей мере одна из указанных вариабельных областей не содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO:
209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO:
221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO:
233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO:
245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 253 и SEQ ID NO: 255.
Антитело также может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223,
SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247,
SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271,
SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295,
SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 и SEQ ID NO: 311, вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей: SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ
ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ
ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ
ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ
ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305 и SEQ ID NO: 309, при этом по меньшей мере одна из указанных вариабельных областей содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID N0:279, SEQ ID N0:283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 и SEQ ID NO: 311.
И антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID
NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID
NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID
NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251 и SEQ ID NO: 255, вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности, которая выбрана из группы, включающей: SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249 и SEQ ID NO: 253.
Кроме того антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 197, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 193 или SEQ ID NO: 195 или содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 201 или SEQ ID NO: 203, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 199. А также антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 207, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 205. Антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 211, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 209. А также содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 219, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 217. Антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279,
- 19 037977
SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 и SEQ ID NO: 311, или вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 293. И, кроме того, антитело может содержать а) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 303 и SEQ ID NO: 307, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 195, или б) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 299 или SEQ ID NO: 311, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 205, или в) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 197, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 293. Указанное антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 259, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 195. Оно может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 263, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 195, или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 307, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305, или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 267, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 265. Указанное антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 299, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205. Дополнительно указанное антитело может содержать Fc-область или область, эквивалентную Fc-области иммуноглобулина.
Fc-область может быть предпочтительно Fc-область IgG, наиболее предпочтительно Fc-область IgG1.
Указанное антитело может представлять собой полноразмерное антитело, предпочтительно антитело IgG-класса, наиболее предпочтительно антитело IgG1-изотипа. Кроме того, антитело может представлять собой фрагмент антитела, выбранный из группы, включающей: scFv-фрагмент, Fv-фрагмент, Fabфрагмент и F(ab')2-фрагмент. А именно оно может представлять собой фрагмент антитела, имеющий Fcобласть, или слитый белок, который содержит область, эквивалентную Fc-области иммуноглобулина. А также может представлять собой моноклональное антитело.
А также антитело может представлять собой химерное, более конкретно гуманизированное антитело и человеческое антитело. Указанное антитело может содержать человеческую константную область и человеческую Fc-область, предпочтительно Fc-область человеческого IgG, наиболее предпочтительно Fc-область человеческого IgG1.
Кроме того, указанное антитело может содержать константную область тяжелой цепи, причем, константная область тяжелой цепи представляет собой константную область человеческого IgG, предпочтительно константную область человеческого IgG1, содержащую Fc-область и константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 313. Указанное антитело может содержать константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 315, или содержать константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 313, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 315.
Антитело, которое специфически связывается с FAP, может содержать а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231,
SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255,
SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279,
SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303,
SEQ ID NO: 307 и SEQ ID NO: 311, или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID
NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID
NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID
NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID
NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305 и SEQ ID NO: 309, или их
- 20 037977 комбинацию, и б) Fc-область или область, эквивалентную Fc-области иммуноглобулина.
Указанное антитело может содержать Fc-область, причем указанная Fc-область представляет собой созданную с помощью гликоинженерии Fc-область. В другом случае антитело может представлять собой созданное с помощью гликоинженерии антитело с модифицированными олигосахаридами в Fc-области. Антитело может иметь повышенное относительное содержание бисекционных олигосахаридов в Fcобласти по сравнению с не подвергнутым гликоинженерии антителом. А именно, по меньшей мере примерно 10%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45%, примерно 50%, примерно 55%, примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 100%, предпочтительно по меньшей мере примерно 50%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 70% Nсвязанных олигосахаридов в Fc-области антитела могут быть бисекционными. Бисекционные олигосахариды могут быть гибридного или комплексного типа.
Антитело может иметь повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым гликоинженерии антителом. А именно, по меньшей мере примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45%, примерно 50%, примерно 55%, примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 100%, предпочтительно по меньшей мере примерно 50%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 70% N-связанных олигосахаридов в Fc-области антитела являются нефукозилированными. Нефукозилированные олигосахариды могут быть гибридного или комплексного типа.
Антитело может иметь повышенное относительное содержание бисекционных нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым гликоинженерии антителом. В частности, антитело может содержать Fc-область, в которой по меньшей мере примерно 10%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45%, примерно 50%, примерно 55%, примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 100%, предпочтительно по меньшей мере примерно 15%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 35% или по меньшей мере примерно 50% N-связанных олигосахаридов являются бисекционными нефукозилированными. Бисекционные нефукозилированные олигосахариды могут быть гибридного или комплексного типа.
Антитело может также обладать повышенной эффекторной функцией и/или повышенной аффинностью связывания с Fc-рецептором. Повышенная эффекторная функция и/или повышенная аффинность связывания с Fc-рецептором могут являться результатом, например, гликоинженерии и/или созревания аффинности антител. Повышенная эффекторная функция и/или повышенная аффинность связывания с Fc-рецептором может быть результатом гликоинженерии Fc-области антитела. Кроме того, повышенная эффекторная функция и/или повышенная аффинность связывания с Fc-рецептором может быть результатом комбинации повышения аффинности и гликоинженерии. Повышенная эффекторная функция может представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) повышенную(ые) одну или несколько из следующих функций: повышенная Fc-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (включая повышенную антитело-обусловленную клеточно-зависимую цитотоксичность), повышенный антителообусловленный клеточно-зависимый фагоцитоз (ADCP), повышенная секреция цитокинов, повышенное опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, повышенное связывание с NK-клетками, повышенное связывание с макрофагами, повышенное связывание с моноцитами, повышенное связывание с полиморфоядерными клетками, повышенная непосредственная передача сигнала, индуцирующего апоптоз, повышенное перекрестное связывание связанных с мишенью антител, повышенное созревание дендритных клеток или повышенное Т-клеточное примирование. Повышенная эффекторная функция может представлять собой повышенную ADCC. Повышенная аффинность связывания с Fc-рецептором может представлять собой повышенное связывание с активирующим Fc-рецептором, наиболее предпочтительно с FcγRШa-рецептором.
Антитело, может не обладать клинически значимым уровнем токсичности при введении индивидууму в терапевтически эффективном количестве.
Антитело, может представлять собой антитело с созревшей аффинностью. Связывание антитела с белком активации фибробластов может характеризоваться величиной константы диссоциации (KD) более низкой чем примерно от 1 мкМ до 0,001 нМ, в частности величиной KD более низкой чем примерно 100 нМ, более низкой чем примерно 10 нМ, более низкой чем примерно 1 нМ или более низкой чем примерно 0,1 нМ. Антитело может связываться с FAP человека, мышей и обезьян циномолгус или с FAP человека и обезьян циномолгус. Более конкретно антитело может связываться с FAP человека, мышей и обезьян циномолгус характеризоваться величиной KD более низкой чем примерно 200 нМ, более низкой чем примерно 100 нМ, более предпочтительно более низкой чем примерно 10 нМ или более низкой чем примерно 1 нМ, наиболее предпочтительно более низкой чем примерно 0,1 нМ. Величины KD определяют методом резонанса поверхностного плазмона с использованием антител в виде Fab или IgG, предпочтительно в виде IgG.
- 21 037977
Антитело к FAP может связываться с FAP в человеческих тканях. А также может давать перекрестную реакцию с человеческим и мышиным FAP. Но антитело может не давать существенную перекрестную реакцию с другими представителями семейства дипептидилпептидаз IV, в частности с DPPIV/CD26.
Кроме того антитело может не индуцировать интернализацию FAP при связывании указанного антитела с FAP, экспрессируемым на поверхности клетки.
Конкретным вариантом является антитело, которое специфически связывается с FAP, может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219,
SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO:243,
SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO:267,
SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO:291,
SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 и SEQ ID NO: 311, вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ
ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ
ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ
ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305 и SEQ
ID NO: 309, и Fc-область человеческого IgG, и где необязательно указанное антитело может подвергаться гликоинженерии для повышения эффекторной функции и/или аффинности связывания с Fcрецептором. Кроме того, антитело, которое специфически связывается с FAP, может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO:
235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO:
259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO:
283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO:
307 и SEQ ID NO: 311, вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225,
SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO:249,
SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO:273,
SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO:297,
SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305 и SEQ ID NO: 309, и Fc-область человеческого IgG, и где указанное антитело имеет повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов и/или повышенное относительное содержание бисекционных олигосахаридов в указанной Fc-области.
Антитело, которое специфически связывается с FAP, можно получать из родительского антитела, которое содержит CDR1 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 3, CDR2 тяжелой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 35, CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 141, CDR1 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 145, CDR2 легкой цепи, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 153 и CDR3 легкой цепи, выбранный из группы включающей SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173 и SEQ ID NO: 175, и где антитело несет по меньшей мере одну аминокислотную замену или делецию по меньшей мере в одном из CDR тяжелой или легкой цепи родительского антитела. Например, антитело может нести по меньшей мере одну, например, от примерно одной до примерно десяти (т.е. примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10), и предпочтительно от примерно двух до примерно пяти замен в одном или нескольких гипервариабельных участках или CDR (т.е., в 1, 2, 3, 4, 5 или 6 гипервариабельных участках или CDR) родительского антитела. Согласно конкретным вариантам любую(ые) одну или несколько аминокислоту(т) родительского антитела, описанного выше, заменяют или изымают путем делеции в следующих положениях CDR:
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 3): положения 2 и 3,
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 35): положения 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9,
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 145): положения 7, 8 и 9,
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 153): положения 1, 2, 3, 4 и 5,
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO 165, 167, 169, 171, 173 или 175): положения 4, 5, 6 и 7.
Замены могут представлять собой консервативные замены, указанные в настоящем описании. Можно осуществлять в любой комбинации любую(ые) одну или несколько следующих замен или делеций:
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 3): Y2F, Н или S, А3Т,
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 35): A1G, S3G, I, W или L, G4V, S, A или T, S5G или N, G6T или A, G7R, S, A, E или N, S8Y, L, R, I, N, Q, I или удалены в результате делеции, Т9 удален в результате де- 22 037977 леции,
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 145): S7T, S8R или S9N,
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 153): Y1N, I или Q, G2V, A3G, S4T или Y, S5R, T или I,
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 165, 167, 169, 171, 173 или 175): G4A, Q, N, L или H5I, L, V, Q, N или 16м, I7L.
Кроме того, в одном или нескольких каркасных участках либо тяжелой, либо легкой цепи антител могут быть сделаны добавления, делеции и/или замены по сравнению с родительским антителом. Указанная по меньшей мере одна аминокислотная замена по меньшей мере в одном CDR может принимать участие в повышении аффинности связывания антитела по сравнению с его родительским антителом. Аффинность к FAP указанного антитела повышается по меньшей мере примерно в 2-10 раз по сравнению с родительским антителом (при его сравнении антитела с родительским антителом в одном формате, например, в формате Fab). Кроме того, антитело, выведенное из родительского антитела, может обладать любыми из особенностей, индивидуально или в сочетании, которые описаны в предыдущих параграфах).
Полинуклеотиды могут, кодировать антитела, которые специфически связываются с FAP. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, который образует часть антитела к FAP, может кодировать тяжелую цепь антитела и/или легкую цепь антитела, которые образуют часть антитела к FAP, которое описано выше.
Выделенный полинуклеотид может содержать последовательность, которая кодирует один или несколько (например, один, два, три, четыре, пять или шесть) определяющих комплементарность участков (CDR) тяжелой или легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 и 177, или их вариант или укороченную форму, содержащую по меньшей мере определяющие специфичность остатки (SDR) указанного CDR. Полинуклеотид может также содержать последовательность, которая кодирует три CDR тяжелой цепи (например, HCDR1, HCDR2 и HCDR3) или три CDR легкой цепи (например, LCDR1, LCDR2 и LCDR3), выбранные из SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 и 177, или их вариант или укороченную форму, содержащую по меньшей мере SDR каждого из указанных трех определяющих комплементарность участков. Кроме того, полинуклеотид может содержать последовательность, которая кодирует три CDR тяжелой цепи (например, HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и три CDR легкой цепи (например, LCDR1, LCDR2 и LCDR3), выбранные из SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163,
165, 167, 169, 171, 173, 175 и 177. Полинуклеотид может содержать, кодирующий один или несколько CDR, может содержать последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична одной или нескольким нуклеотидным последовательностям CDR, представленным в SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100,
102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144,
146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 179, 180, 181, 182, 183,
184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191 и 192. Полинуклеотид может содержать последовательность, коди- рующую вариабельную область тяжелой цепи, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO:
219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO:
243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO:
267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO:
291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 и SEQ ID NO: 311, и/или последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO:
213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO:
237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO:
261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO:
285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305 и SEQ ID NO: 309. Полинуклеотид, который кодирует вариабельную область тяжелой цепи и/или легкой цепи, может содержать последовательность, выбранную из группы нуклеотидных последовательностей вариабельных областей, включающей SEQ ID NO: 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308,
- 23 037977
310 и 312, или их комбинацию.
Полинуклеотид может содержать последовательность, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203,
SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227,
SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251,
SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275,
SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299,
SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 и SEQ ID NO: 311, и последовательность, которая кодирует константную область тяжелой цепи, в частности константной области человеческой тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область тяжелой цепи человеческого IgG, в частности, константную область тяжелой цепи человеческого IgG1, содержащего Fc-область. Указанная константная область тяжелой цепи может содержать последовательность SEQ ID NO: 313. В другом конкретном варианте полинуклеотид может содержать последовательность, которая кодирует вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221,
SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO:245,
SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO:269,
SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO:293,
SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305 и SEQ ID NO: 309, и последовательность, которая кодирует константную область легкой цепи, в частности константной области человеческой легкой цепи. Константная область легкой цепи может содержать последовательность SEQ ID NO: 315.
Композиция может содержать первый выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ
ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ
ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ
ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ
ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 и SEQ ID NO: 311, и второй выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221,
SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO:245,
SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO:269,
SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO:293,
SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305 и SEQ ID NO: 309.
А также композиция, которая содержит первый выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO:
228, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO:
252, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO:
276, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO:
300, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 308 и SEQ ID NO: 312, и второй выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO:
222, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 242,SEQ ID NO:
246, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO:
270, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO:
294, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 306 и SEQ ID NO: 310.
Антитело к FAP может обладать любыми из особенностей, индивидуально или в сочетании, которые описаны ниже в разделах 1-6.
1. Аффинность антител.
Антитело, представленное в настоящем описании, может иметь величину константы диссоциации (KD) составляющую < 1 мкМ, < 100 нМ, < 10 нМ, < 1нМ, < 0,1 нМ, < 0,01 нМ или < 0,001 нМ (например, 10-8М или менее, например, от 10-8М до 10-13 М, например, от 10-9 М до 10-13 М). Предпочтительно связывание антител, представленных в настоящем описании, с белком активации фибробластов (FAP), в частности с человеческим FAP, характеризуется величиной KD, составляющей менее 1 нМ, при определении методом резонанса поверхностного плазмона (SPR).
Ко можно измерить, используя метод резонанса поверхностного плазмона. Указанный анализ мож- 24 037977 но осуществлять, например, с помощью устройства BIACORE®-T100 (фирма GE Healthcare) при 25°С, используя СМ5-чипы для иммобилизации антигена. В целом, метод состоит в следующем: биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (СМ5, фирма GE Healthcare) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антитело к His (Penta His, фирма Qiagen) разводят в 10 мМ ацетате натрия, рН 5 до концентрации 40 мкг/мл перед инъекцией со скоростью потока 10 мкл/мин до достижения примерно 9000 единиц ответа (RU) сшитого белка. После инъекции антитела к His инъецируют 1М этаноламин для того, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Затем меченный His антиген инъецируют со скоростью 10 мкл/мин в концентрации 10 нМ в течение 20 с (для оценки Fab-фрагментов) или в концентрации 20 нМ в течение 25 с (для оценки антител типа IgG) и захватывают через его His-метку с помощью иммобилизованного антитела к His. Белковые и ДНК последовательности приемлемых конструкций антигена FAP представлены в SEQ ID NO: 317-322. Для кинетических измерений серийные разведения антитела (двукратные разведения в диапазоне от 6,25 нМ до 200 нМ для Fab-фрагментов или пятикратные разведения в диапазоне от 3,2 пМ до 10 нМ для IgG) в 10 мМ HEPES, 150мМ NaCl, 3 мМ ЭДТК, 0,05% сурфактанта Р20, рН 7,4 инъецируют при 25°С со скоростью потока 90 мкл/мин. Используют следующие параметры: продолжительность реакции ассоциации 180 с, продолжительность реакции диссоциации 300 с (для Fab) или 900 с (для IgG), регенерация с помощью 10 мМ глицина, рН 2 в течение 60 с между каждым циклом. Константы скорости реакции ассоциации (kon) и константы скорости реакции диссоциации (koff) рассчитывают с помощью простой модели связывания 1:1 Ленгмюра (программа для оценки BIACORE® T100) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции диссоциации (Ко) рассчитывают в виде отношения koff/kon (см., например, Chen и др., J. Mol. Biol. 293, 1999, cc. 865- 881).
2. Фрагменты антител.
Антитело, представленное в настоящем описании, может представлять собой фрагмент антитела. Фрагменты антитела представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) Fab-, Fab'-, Fab'-SH-, F(ab')2-, Fv- и scFv-фрагменты и другие фрагменты, описанные ниже. Обзор конкретных фрагментов антител см. у Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, cc. 129-134 или Carter, Nat. Rev. Immunol. 6, 2006, cc. 343-357.
Одноцепочечные Fv- или scFv-фрагменты содержат VH-домен и VL-домен в виде одноцепочечной полипептидной цепи. Как правило, VH- и VL-домены сцеплены линкерной последовательностью. Обзор scFv-фрагментов см, например, у Pluckthun в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, под ред. Rosenburg и Moore (изд-во Springer-Verlag, New York), т. 113, 1994, cc. 269-315; см. также WO 93/16185 и US №№ 5571894 и 5587458. Обсуждение Fab- и F(ab')2-фрагментов, содержащих остатки эпитопа, связывающегося с рецептором спасения, и обладающих удлиненным временем полужизни in vivo, см. в US № 5869046.
Димерные антитела (диабоди) представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими центрами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими (см., например, ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, cc. 129-134 и Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 6444-6448). Тримерные антитело (триабоди) и тетрамерные антитела (тетрабоди) описаны также у Hudson и др. Nat. Med. 9, 2003, cc. 129-134.
Минитело представляет собой двухвалентное гомодимерное производное scFv, которое содержит константную область, как правило, СН3-домен иммуноглобулина, предпочтительно IgG-типа, более предпочтительно IgG1, в качестве области димеризации. Как правило, константная область сцеплена с scFv через шарнирную область и/или линкерную область. Примеры белков минител представлены у Hu и др., Cancer Res. 56, 1996, cc. 3055-3061.
Одноцепочечные антитела представляют собой фрагменты антител, которые содержат весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. Одноцепочечное антитело может представлять собой человеческое одноцепочечное антитело (фирма Domantis, Inc., Валтам, шт. Массачусетс см., например, US № 6248516 В1).
Фрагменты антител можно получать различными методами, включая (но, не ограничиваясь только ими) протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получать с использованием рекомбинантных клеток-хозяев (например, Е. coli или фага), как указано в настоящем описании.
3. Химерные и гуманизированные антитела.
Антитело, указанное в настоящем описании, может представлять собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в US № 4816567 и у Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, cc. 6851-6855. Например, химерное антитело содержит нечеловеческую вариабельную область (например, вариабельную область из антитела мышей, крыс, хомяков, кроликов или приматов кроме человека, таких как обезьяны) и человеческую константную область. В другом примере химерное антитело представляет собой антитело переключенного класса, класс или подкласс которого изменен по сравнению с родительским антителом. К химерным антителам относятся также их антигенсвязывающие фрагменты.
Химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, нечеловеческое
- 25 037977 антитело гуманизируют для уменьшения иммуногенности для людей с сохранением специфичности и аффинности родительского нечеловеческого антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в котором(ых) HVR, например, CDR (или их фрагменты) выводят из нечеловеческого антитела, a FR (или их фрагменты) выводят из последовательностей человеческих антител. Гуманизированное антитело необязательно может содержать также по меньшей мере часть человеческой константной области. Некоторые остатки FR в гуманизированном антителе можно заменить на соответствующие остатки из нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого выведены остатки HVR), например, для сохранения или повышения специфичности или аффинности антитела. Для гуманизации можно применять различные методы, включая (но, не ограничиваясь только ими) (а) трансплантацию полных нечеловеческих вариабельных доменов в человеческие константные области с получением химерных антител, (б) трансплантацию только нечеловеческих (например, из антитела-донора) CDR в человеческий (например, антитела-реципиента) каркасный участок и константные области с сохранением или без сохранения имеющих решающее значение остатков каркасного участка (например, остатков, важных для сохранения высокой аффинности связывания антигена или функций антитела), (в) трансплантацию только нечеловеческих определяющих специфичность участков (SDR или a-CDR; остатков, имеющих решающее значение для взаимодействия антитело-антиген) в человеческие каркасные или константные области, или (г) трансплантацию полных нечеловеческих вариабельных доменов, но маскируя их сегментом, напоминающим человеческий, путем замены поверхностных остатков. Гуманизированные антитела и методы их получения обобщены, например, у Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, cc. 1619-1633, и они описаны также, например, у Riechmann и др., Nature 332, 1988, cc. 323-329; Queen и др., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86, 1989, cc. 10029-10033; US №№. 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Jones и др., Nature 321, 1986, cc. 522-525; Morrison и др., Proc. Nail. Acad. Sci. 81, 1984, cc. 6851-6855; Morrison и Oi, Adv. Immunol. 44, 1988, cc. 65-92; Verhoeyen и др., Science 239, 1988, cc. 1534-1536; Padlan, Molec. Immun. 31(3), 1994, cc. 169-217; Kashmiri и др., Methods 36, 2005, cc. 25-34 (описание трансплантации SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28, 1991, cc. 489-498 (описание нанесения нового покрытия); Dall'Acqua и др., Methods 36, 2005, cc. 43-60 (описание перестановки FR); и Osbourn и др., Methods 36, 2005, cc. 61-68 и у Klimka и др., Br. J. Cancer 83, 2000, cc. 252-260 (описание подхода на основе целенаправленной селекции для перестановки FR).
Человеческие каркасные участки, которые можно применять для гуманиазации, включают (но, не ограничиваясь только ими): каркасные участки, выбранные на основе метода наилучшего подбора (см., например, Sims и др., J. Immunol. 151, 1993, с. 2296); каркасные участки, выведенные из консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных областей легких или тяжелых цепей (см., например, Carter и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1992, с. 4285; и Presta и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2623); человеческие зрелые (подвергнутые соматической мутации) каркасные участки или каркасные участки человеческой зародышевой линии (см., например, Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, cc. 1619-1633); и каркасные участки, полученные в результате скрининга FRбиблиотек (см., например, Васа и др., J. Biol. Chem. 272, 1997, cc. 10678-10684) и Rosok и др., J. Biol. Chem. 271, 1996, cc. 22611-22618).
4. Человеческие антитела.
Антитело, указанное в настоящем описании, может представлять собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно получать различными методами, известными в данной области. Человечески антитела описаны в целом у van Dijk и van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, cc. 368-74 и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20, 2008, cc. 450-459.
Человеческие антитела можно получать путем введения иммуногена трансгенному животному, которое модифицировано таким образом, что продуцирует интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на контрольное заражение антигеном. Указанные животные, как правило, содержат все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, которыми заменены эндогенные локусы иммуноглобулина, или которые присутствуют вне хромосом или интегрированы произвольно в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные локусы иммуноглобулина, как правило, инактивированы. Обзор методов получения человеческих антител в трансгенных животных см. у Lonberg, Nat. Biotech. 23, 2005, cc. 1117-1125. Они описаны также, например, в US №№ 6075181 и 6150584 в которых описана технология XENOMOUSE™; US № 5770429, в котором описана технология HuMAB®; US 7041870, в котором описана технология K-М MOUSE® и в публикации заявки на патент США № 2007/0061900, в котором описана технология VELOCIMOUSE®. Человеческие вариабельные области интактных антител, полученные в таких животных, можно дополнительно модифицировать, например, объединяя с человеческой константной областью из другого антитела.
Человеческие антитела можно получать также с помощью методов, основанных на применении гибридом. Описаны клеточные линии человеческой миеломы и мышиной-человеческой гетеромиеломы, предназначенные для получения человеческих моноклональных антител (см., например, Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, с. 3001; Brodeur и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,
- 26 037977
1987, cc. 51-63 (изд-во Marcel Dekker, Inc., New York); и Boerner и др., J. Immunol., 147, 1991, c. 86). Человеческие антитела, созданные с помощью технологии, основанной на применении человеческих Вклеточных гибридом, описаны также у Li и др., Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 103, 2006, cc. 3557-3562. Дополнительные методы представляют методы, описанные, например, в US № 7189826 (описание получения моноклональных человеческих антител типа IgM из клеточных линий гибридом) и у Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4), 2006, cc. 265-268 (описание человеческих-человеческих гибридом). Технология, основанная на применении человеческих гибридом (Trioma-технология), описана также у Vollmers и Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3), 2005, cc. 927-937 и Vollmers и Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3), 2005, cc. 185-191.
Человеческие антитела можно создавать также путем выделения последовательностей вариабельных доменов Fv-клона, выбранных из фаговых дисплейных библиотек, для создания которых использовали человеческие антитела. Указанные последовательности вариабельных доменов затем можно объединять с требуемым человеческим константным доменом. Методики отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.
5. Полученные из библиотек антитела.
Антитела можно выделять путем скрининга комбинаторных библиотек антител с требуемой активностью или видами активности. Например, в данной области известны разнообразные методы для создания фаговых дисплейных библиотек и скрининга указанных библиотек в отношении антител, обладающих требуемыми характеристиками связывания. Указанные методы обобщены, например, у Hoogenboom и др., в: Methods in Molecular Biology, под ред. O'Brien и др., изд-во, Human Press, Totowa, NJ, 178, 2001, cc. 1-37 и описаны также, например, у McCafferty и др., Nature 348, cc. 552-554; Clackson и др., Nature 352, 1991, cc. 624-628; Marks и др., J. Mol. Biol. 222, 1992, cc. 581-597); Marks и Bradbury, в: Methods in Molecular Biology, под ред. Lo и др., изд-во, Human Press, Totowa, NJ, 248, 2003, cc. 161-175; Sidhu и др., J. Mol. Biol. 338(2), 2004, cc. 299-310; Lee и др., J. Mol. Biol. 340(5), 2004, cc. 1073-1093; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34), 2004, cc. 12467-12472; и Lee и др., J. Immunol. Methods 284(1-2), 2004, cc. 119-132.
При осуществлении некоторых методов фагового дисплея популяции VH- и VL-генов клонируют по отдельности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинируют произвольно в фаговых библиотеках, которые затем подвергают скринингу в отношении антигенсвязывающего фага согласно методу, описанному у Winter и др., Ann. Rev. Immunol., 12, 1994, cc. 433-455. Фаг, как правило, экспонирует фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv), либо в виде Fabфрагментов. Библиотеки, полученные из иммунизированных источников, включают антитела, обладающие высокой аффинностью к иммуногену, при этом отсутствует необходимость в создании гибридом. В альтернативном варианте можно клонировать необработанную (наивную) популяцию (например, из организма человека), получая один источник антител к широкому спектру чужих, а также своих антигенов без какой-либо иммунизации, что описано у Griffiths и др., EMBO J, 12, 1993, cc. 725-734. И, наконец, необработанные (наивные) библиотеки можно получать также методами синтеза путем клонирования неперегруппированных сегментов V-гена из стволовых клеток и с помощью ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность, для кодирования гипервариабельных CDR3-участков и для осуществления перегруппировки in vitro согласно методу, описанному у Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol., 227, 1992, cc. 381-388.
Фаговые библиотеки человеческих антител описаны, например, в следующих патентных публикациях: US № 5750373 и публикации заявок на патент США №№ 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.
Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, рассматриваются как человеческие антитела или фрагменты человеческих антител.
6. Мультиспецифические антитела.
Антитело, представленное в настоящем описании, может представлять собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые обладают способностью специфически связываться по меньшей мере с двумя различными сайтами. Одна из связывающихся специфичностей связывается с FAP, а другая с любым другим антигеном. Согласно конкретным вариантам биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами FAP. Биспецифические антитела можно использовать также для локализации цитотоксических агентов в клетках, экспрессирующих FAP. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или в виде фрагментов антител.
Методы создания мультиспецифических антител включают (но, не ограничиваясь только ими) рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, которые обладают различными специфичностями (см. Milstein и Cuello, Nature 305, 1983, с. 537, WO 93/08829 и Traunecker и др., EMBO J. 10, 1991, с. 3655), и конструирование на основе технологии knob-in-hole (взаимодействие по типу выступ-впадина) (см., например, US № 5731168). Мультиспецифические антитела можно получать также путем создания обусловленных электростатическим действием эффектов для создания молекул антител с гетеродимерной Fc-областью (WO 2009/089004А1); путем поперечного сшивания
- 27 03Ί9ΊΊ двух или большего количеств антител или их фрагментов (см., US № 4676980 и Brennan и др., Science 229, 1985, с. 81); с использованием лейциновых молний для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny и др., J. Immunol. 148(5), 1992, cc. 1547-1553); с использованием технологии диабоди (димерных антител) для создания фрагментов биспецифических антител (см., например, Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, cc. 6444-6448); и с использованием димеров одноцепочечных Fv (scFv) (см., например, Gruber и др., J. Immunol., 152, 1994, с. 5368); путем получения триспецифических антител согласно методу, описанному, например, у Tutt и др., J. Immunol. 147, 1991, с. 60.
Возможно конструирование антитела с тремя или большим количеством антигенсвязывающих центров, включая антитела-осьминоги (см., например, US 2006/0025576A1).
Антитело или его фрагмент может включать также Fab двойного действия или DAF, которые содержат антигенсвязывающий центр, который связывается с FAP, а также с другим, отличным от него антигеном (см. например, US 2008/0069820).
7. Варианты антител.
Конкретными вариантами осуществления могут быть варианты аминокислотных последовательностей антител. Например, может требоваться повышение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антител можно получать путем интродукции соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Указанные модификации включают, например, делеции и/или инсерции и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечной конструкции можно использовать любую комбинацию делеций, инсерций и замен, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, способностью связывать антиген.
а) Полученные путем замены, инсерции и делеции варианты.
Конкретными вариантами могут быть варианты антител, которые имеют одну или несколько аминокислотных замен. Представляющими интерес сайтами для замещающего мутагенеза являются HVR и FR.
Аминокислотные замены могут приводить к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую сходные структурные и/или химические свойства, например, консервативные аминокислотные замены. Консервативные аминокислотные замены можно создавать на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы используемых для этой цели остатков. Например, к неполярным (гидрофобным) аминокислотам относятся аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; к полярным нейтральным аминокислотам относятся глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; к положительно заряженным (основным) аминокислотам относятся аргинин, лизин и гистидин; и к отрицательно заряженным (кислотным) аминокислотам относятся аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. Консервативные замены представлены в табл. 2 под заголовком предпочтительные замены. Более важные замены представлены в табл. 2 под заголовком приведенные в качестве примера замены, и как дополнительно описано ниже, со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно интродуцировать в представляющее интерес антитело и продукты подвергать скринингу в отношении требуемой активности, например, сохранения/повышения способности к связыванию антигена, пониженной иммуногенности или улучшенной ADCC или CDC.
Таблица 2
Исходный остаток Приведенные в качестве примера замены Предпочтительные замены
Ala (A) Val; Leu; lie Val
Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys
Asn (N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys(C) Ser; Ala Ser
Gin (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gin Asp
Gly (θ) Ala Ala
His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg
lie (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин Leu
Leu (L) Норлейцин; lie; Val; Met; Ala; Phe lie
Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; lie Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; lie; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин Leu
Аминокислоты можно группировать на основе общих свойств боковых цепей следующим образом: (1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
- 28 037977 (2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Под неконсервативными заменами подразумевают замену представителя одного из указанных классов на представителя из другого класса. Например, аминокислотные замены могут приводить также к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую другие структурные и/или химические свойства, например, замена аминокислоты из одной группы (например, полярной) на другую аминокислоту из другой группы (например, основной). Приемлемость вариации можно определять экспериментально путем системного осуществления инсерций, делеций или замен аминокислот в полипептидной молекуле с помощью методов рекомбинантной ДНК и оценки активности полученных в результате рекомбинантных вариантов.
Один тип полученного в результате замены варианта может включать замену одного или нескольких остатков в гипервариабельном участке родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, образовавшийся(еся) вариант(ы), выбранный(ые) для дальнейшего изучения, должен(ны) иметь модификации (например, улучшения) определенных биологических свойств (например, повышенная аффинность, пониженная иммуногенность) относительно родительского антитела и/или должен(ны) практически сохранять определенные биологические свойства родительского антитела. Примером полученного в результате замены варианта может быть антитело с созревшей аффинностью, которое можно легко получать, например, с помощью методов созревания аффинности на основе фагового дисплея, которые указаны в настоящем описании. В целом, метод состоит в следующем: один или несколько остатков HVR подвергают мутации и представляющие собой варианты антитела экспонируют на фаге и подвергают скринингу в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания).
Изменения (например, замены) можно осуществлять в HVR, например, для повышения аффинности антитела. Указанные изменения можно делать в горячих точках в HVR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации в процессе соматического мутагенеза (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207, 2008, cc. 179-196), и/или SDR (a-CDR), осуществляя оценку полученного варианта VH или VL в отношении аффинности связывания. Созревание аффинности путем создания и повторной селекции вторичных библиотек описано, например, у Hoogenboom и др., в: Methods in Molecular Biology, под ред. O'Brien и др., изд-во, Human Press, Totowa, NJ, 178, 2001, cc. 1-37). Согласно некоторым вариантам созревания аффинности вносят разнообразие в гены вариабельных областей, выбранные для созревания, с помощью любого из многочисленных методов (таких, например, как ПЦР пониженной точности, перестановка цепи или сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов). Затем создают вторичную библиотеку. Затем библиотеку подвергают скринингу для идентификации любых вариантов антител с требуемой аффинностью. Другой метод внесения разнообразия включает подходы, связанные с HVR, при осуществлении которых рандомизируют несколько остатков в HVR (например, 4-6 остатков одновременно). Конкретные остатки HVR, участвующие в связывании антигена, можно идентифицировать, например, с помощью мутагенеза на основе сканирования аланином или посредством моделирования. В частности, мишенями часто являются CDR-H3 и CDR-L3.
Согласно некоторым вариантам замены, инсерции или делеции могут иметь место в одном или нескольких HVR, если указанные изменения не существенно снижают способность антитела связываться с антигеном. Например, в HVR можно осуществлять консервативные изменения (например, указанные в настоящем описании консервативные замены), которые не приводят к существенному снижению аффинности связывания. Указанные изменения могут находиться вне горячих (активных) точек HVR или SDR. Некоторые из описанных выше вариантов последовательностей VH и VL каждый HVR либо является неизмененным, либо содержат не более одной, двух или трех аминокислотных замен.
Ценным методом для идентификации остатков или участков антитела, которые можно подвергать мутагенезу, является метод, получивший называние аланин-сканирующий мутагенез, он описан у Cunningham и Wells, Science, 244, 1989, cc. 1081-1085. При осуществлении этого метода идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (например, аланин или полиаланин) для определения того, оказывает ли такая замена влияние на взаимодействие антитела с антигеном. В аминокислотные положения, для которых продемонстрирована функциональная чувствительность к начальным заменам, можно интродуцировать дополнительные замены. В альтернативном или дополнительном варианте может оказаться ценным анализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Указанные участвующие в контакте остатки и соседние остатки можно рассматривать в качестве мишеней или исключать из рассмотрения в качестве кандидатов для замены. Полученные варианты можно подвергать скринингу для определения, обладают ли они требуемыми свойствами.
Инсерции аминокислотных последовательностей включают амино- и/или карбоксиконцевые слия- 29 037977 ния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или большее количество остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примером результата осуществления терминальных инсерций является антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние N- или С-конца антитела с ферментом (как, например, в случае ADEPT (антитело-направленный фермент пролекарственной терапии) или с полипептидом, который удлиняет время полужизни антитела в сыворотке.
б) Варианты гликозилирования.
В некоторых случаях можно осуществлять модификации олигосахарида в антителе для создания вариантов антител с определенными улучшенными свойствами.
Объектом могут быть гликоформы антител к FAP, обладающие повышенной эффекторной функцией, включая антитело-обусловленную клеточно-зависимую цитотоксичность. Инженерия гликозилирования антител описана ранее (см., например, US № 6602684, полностью включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Методы получения антител к FAP с использованием клеток-хозяев, которые имеют измененную активность генов, участвующих в гликозилировании, также подробно представлены в настоящем описании (см. раздел, озаглавленный Методы рекомбинации и композиции, ниже).
Молекула IgG несет два N-связанных олигосахарида в Fc-области, по одному на каждой тяжелой цепи. Как любой гликопротеин, антитело продуцируется в виде популяции гликоформ, которые имеют одинаковый полипептидный каркас, но различные олигосахариды, присоединенные к сайтам гликозилирования. Олигосахариды, присутствующие в норме в Fc-области сывороточного IgG, относятся к сложному биантенному типу (Wormald и др., Biochemistry 36, 1997, сс. 130-138) с низким содержанием концевой сиаловой кислоты и двурассекающего N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) и с различными уровнями концевого галоктозилирования и корового фукозилирования (фукозы, присоединенной с остатку GlcNAc в стебле биантенной олигосахаридной структуры). В некоторых исследованиях было высказано предположение, что для связывания с FcyR внутри олигосахаридного ядра требуется минимальная углеводная структура (Lund и др., J. Immunol. 157, 1996, cc. 4963-4969).
В мышиных или хомячковых клеточных линиях, которые применяют в промышленности и научных исследованиях для получения антител, как правило, происходит присоединение требуемых олигосахаридных детерминант к Fc-сайтам. Однако IgG, экспрессируемые этими клеточными линиями, не содержат двурассекающего GlcNAc, обнаруженного в небольших количествах в сывороточных IgG (Lifely и др., Glycobiology 318, 1995, cc. 813-822). В пути N-связанного гликозилирования двурассекающий GlcNAc добавляется с помощью GnTIII (Schachter, Biochem. Cell Biol. 64, 1986, cc.163-168).
Umana с соавторами использовали одну антителопродуцирующую линию СНО-клеток, которая ранее была создана для экспрессии под воздействием внешней регуляции различных уровней клонированного гена фермента GnTIII (Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc. 176-180). Этот подход использовали прежде всего для доказательства строгой корреляции между экспрессией гликозилтрансферазы (например, GnTIII) и ADCC-активностью модифицированного антитела. Таким образом, антитела к FAP могут содержать Fc-область или область, эквивалентную Fc-области, с измененным гликозилированием в результате изменения уровня экспрессии гена гликозилтрансферазы в антителопродуцирующей клеткехозяине. Изменение уровня генной экспрессии может представлять собой повышение GnTIII-активности. Повышенная GnTIII-активность приводит к повышению процентного содержания бисекционных олигосахаридов, а также к снижению процентного содержания фукозизлированных олигосахаридов в Fcобласти антитела. Это антитело или его фрагмент обладает повышенной аффинностью связывания с Fcрецептором и повышенной эффекторной функцией.
Получают антитела с бисекционными олигосахаридами, например, антитела, в которых биантенный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антитела, бисекционнируется с помощью GlcNAc. Указанные варианты антител могут отличаться пониженным фукозилированием и/или повешенной ADCCфункцией. Примеры указанных вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878 (на имя JeanMairet с соавторами); US № 6602684 (на имя Umana с соавторами) и US 2005/0123546 (на имя Umana с соавторами).
Антитела к FAP могут иметь повышенное относительное содержание бисекционных олигосахаридов в Fc-области в результате модификации их олигосахаридов с помощью способов, предлагаемых в заявке. В одном из вариантов процент бисекционных N-связанных олигосахаридов в Fc-области антител к FAP составляет по меньшей мере от примерно 10% до примерно 100%, в частности, по меньшей мере примерно 50%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80% или по меньшей мере примерно 90-95% от общего содержания олигосахаридов. Бисекционные олигосахариды могут быть гибридного или комплексного типа.
Антитела к FAP также могут иметь повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области в результате модификации их олигосахаридов с помощью способов, предлагаемых в настоящей заявке. В одном из вариантов процент нефукозилированных олигосахаридов составляет от по меньшей мере примерно 20% до примерно 100%, в частности по меньшей мере примерно 50%, предпочтительно от по меньшей мере примерно 60% до примерно 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 75%. Нефукозилированные олигосахариды могут быть гибридного или комплексно
- 30 037977 го типа.
Количество фукозы определяют, рассчитывая среднее количество фукозы в сахарной цепи на Asn297, относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), осуществляя измерения с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии согласно методу, описанному в WO 2008/077546). Asn297 обозначает остаток аспарагина, локализованный в положении 297 в Fc-области (согласно EU-нумерации остатков в Fc); однако Asn297 может быть локализован в пределах примерно +3 аминокислоты в обратном или прямом направлении относительно положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, что связано с минорными вариациями в последовательности антител. Относительное количество фукозы представляет собой процент содержащих фукозу структур относительно всех гликоструктур, идентифицированных в обработанном N-гликозидазой F образце (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), которое измеряют с помощью MALDI-TOF-MC. Указанные варианты фукозилирования могут обладать повышенной ADCC.
Методология гликоинженерии, которую можно применять для антител к FAP, описана подробно в US № 6602684, опубликованной заявке на патент США № 2004/0241817 А1, опубликованной заявке на патент США 2003/0175884 А1, предварительной заявке на патент США № 60/441307 и WO 2004/065540, полное содержание каждого документа включено в настоящее описание в качестве ссылки. В альтернативном варианте антитела к FAP можно подвергать гликоинженерии таким образом, чтобы они имели пониженное количество фукозных остатков в Fc-области, с использованием методик, описанных в опубликованной заявке на патент США № 2003/0157108 (на имя фирмы Genentech) или ЕР 1176195 A1 , WO 03/084570, WO 03/085119 и опубликованных заявках на патент США №№ 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2004/132140, у Niwa и др., J Immunol Methods 306, 2006, cc. 151-160, в US № 6946292 (на имя фирмы Kyowa). Сконструированные с помощью гликоинженерии антитела к FAP можно получать также в экспрессионных системах, которые продуцируют модифицированные гликопротеины, например, описанных в опубликованной заявке на патент США № 60/344169 и WO 03/056914 (на имя фирмы GlycoFi, Inc.) или WO 2004/057002 и WO 2004/024927 (на имя фирмы Greenovation).
Дополнительными примерами публикаций, касающихся дефукозилированных вариантов антител или вариантов антител с дефицитом фукозы являются: WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2002/0164328; US 2004/0109865; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki и др., J. Mol. Biol. 336, 2004, cc. 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, c. 614). Примерами клеточных линий, которые обладают способностью продуцировать дефукозилированные антитела, являются Lec13 СНО-клетки с дефицитом белкового фукозилирования (Ripka и др., Arch. Biochem. Biophys. 249, 1986, cc. 533-545; заявка на патент США № US 2003/0157108 A1, на имя Presta L; и d WO 2004/056312 А1, на имя Adams с соавторами, прежде всего в примере 11), и клеточные линии с выключенным геном, например, СНО-клетки с выключенным геном альфа-1,6фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, с. 614); Kanda Y. и др., Biotechnol. Bioeng., 94(4), 2006, cc. 680-688; и WO 2003/085107).
Антитела к FAP могут иметь повышенное относительное содержание бисекционных нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области. Бисекционные нефукозилированные олигосахариды могут быть либо гибридными, либо комплексными. В частности, способы, предлагаемые в заявке, можно применять для получения антител к FAP, в которых по меньшей мере от примерно 10% до примерно 100%, предпочтительно по меньшей мере примерно 15%, более предпочтительно по меньшей мере от примерно 20% до примерно 25% и наиболее предпочтительно от по меньшей мере примерно 30% до примерно 35% олигосахаридов в Fc-области антигенсвязывающей молекулы являются бисекционными нефукозилированными. Антитела к FAP также могут содержать Fc-область, в которой по меньшей мере от примерно 10% до примерно 100%, предпочтительно по меньшей мере примерно 15%, более предпочтительно по меньшей мере от примерно 20% до примерно 25% и наиболее предпочтительно от по меньшей мере примерно 30% до примерно 35% олигосахаридов в Fc-области антитела являются бисекционными гибридными нефукозилированными.
Антитело, представленное в настоящем описании, можно изменить для повышения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Добавление или делецию сайтов гликозилирования в антителе удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, что создают или удаляют один или несколько сайтов гликозилирования.
Предложены также варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области. Указанные варианты антител могут обладать повышенной CDCфункцией. Указанные варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087 (на имя Patel с соавторами); WO 1998/58964 (на имя Raju S.) и WO 1999/22764 (на имя Raju S.).
Для повышения ADCC или других эффекторных функций антител к FAP можно также повышать аффинность антигенсвязывающей молекулы к FAP, например, путем созревания аффинности или других методов повышения аффинности (см., Tang и др., J. Immunol. 179, 2007, cc. 2815-2823) или с помощью аминокислотных модификаций в Fc-области, описанных ниже. Кроме того, можно применять также комбинации этих подходов.
- 31 037977
в) Варианты Fc-области.
Стоит отметить, что можно интродуцировать в Fc-область антитела, представленного в настоящем описании, одну или несколько аминокислотных модификаций, создавая тем самым вариант Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность человеческой Fc-области (например, Fcобласти человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), включающую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких аминокислотных положениях.
Некоторые варианты относятся к варианту антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его перспективным кандидатом для применения, для которых является важным время полужизни антитела in vivo, однако некоторые эффекторные функции (такие как связанные с комплементом и ADCC) не являются необходимыми или являются вредными. Можно осуществлять анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo для подтверждения снижения/истощения CDCи/или ADCC-активности. Например, можно осуществлять анализы связывания Fc-рецептора (FcR) для гарантии того, что у антитела отсутствует способность к связыванию с FcyR (и поэтому, вероятно, отсутствует ADCC-активность), но сохраняется способность связываться с FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, т.е. NK-клетки, экспрессируют только FcyRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Данные об экспрессии FcR на гематопоэтические клетках обобщены в табл. 3 на с. 464 у Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 1991, cc. 457-492. Примеры анализов in vitro (но, не ограничиваясь только ими) ADCC-активности представляющей интерес молекулы описаны в US № 5500362 (см., например, Hellstrom I. и др., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 1986, cc. 7059-7063 и Hellstrom I. и др., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82, 1985, cc. 1499-1502); № 5821337 (см., Bruggemann M. и др., J. Exp. Med. 166, 1987, cc. 1351-1361). В альтернативном варианте можно применять нерадиоактивные методы (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ на основе проточной цитометрии (фирма CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, шт. Калифорния); и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96® (фирма Promega, Мэдисон, шт. Висконсин). Пригодными для таких анализов эффекторными клетками являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клеткикиллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, на животной модели, например, как описано у Clynes и др., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95, 1998, cc. 652-656). Можно осуществлять также анализы связывания C1q для подтверждения того, что антитело не может связывать C1q и поэтому у него отсутствует CDC-активность (см., например, описание ELISA для оценки связывания C1q и С3с в WO 2006/029879 и WO 2005/100402). Для оценки активации комплемента можно осуществлять CDC-анализ (см., например, Gazzano-Santoro и др., J. Immunol. Methods 202, 1996, с. 163; Cragg M.S. и др., Blood 101, 2003, cc. 10451052; и Cragg M.S. и M.J. Glennie, Blood 103, 2004, cc. 2738-2743). Определения FcRn-связывания и клиренса/времени полужизни in vivo можно осуществлять также с использованием методов, известных в данной области (см., например, Petkova S.B. и др., Int'l. Immunol. 18(12), 2006, cc. 1759-1769).
Антитела с пониженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или нескольких следующих остатков в Fc-области: 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (US № 6737056). К указанным мутантам Fc относятся мутанты Fc с заменами в двух или большем количестве аминокислот в положениях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант DANA Fc-области, несущий замену остатков 265 и 297 на аланин (US №. 7332581).
Описаны некоторые варианты антител с повышенной или пониженной способностью связываться с FcR (см., например, US № 6737056; WO 2004/056312 и Shields и др., J. Biol. Chem. 9(2), 2001, cc. 65916604).
Вариант антитела может содержать Fc-область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые повышают ADCC, например, замены в положениях 298, 333, и/или 334 Fc-области (EUнумерация остатков).
Кроме того, в Fc-области осуществляют изменения, которые приводят к измененной (т.е. либо повышенной, либо пониженной) способности связывать C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), что описано, например, в US № 6194551, WO 99/51642 и у Idusogie и др., J. Immunol. 164, 2000, cc. 4178-4184.
Антитела с удлиненным временем полужизни и повышенной способностью к связыванию с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который ответствен за перенос материнских IgG эмбриону (Guyer и др., J. Immunol. 117, 1976, с. 587 и Kim и др., J. Immunol. 24, 1994, с. 249), описаны в US № 2005/0014934A1 (на имя Hinton с соавторами.). Эти антитела содержат Fc-область с одной или несколькими заменами, которые повышают связывание Fc-области с FcRn. Указанные варианты Fc включают варианты с заменами одного или нескольких следующих остатков Fc-области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замену остатка 434 в Fcобласти (US № 7371826).
Дополнительные примеры, касающиеся вариантов Fc-области, описаны также в заявках на патент США №№. 60/439498; 60/456041; 60/514549 или в WO 2004/063351 (вариант Fc-областей с повышенной аффинностью связывания в результате аминокислотной модификации); или в заявке на патент США №
- 32 037977
10/672,280 или в WO 2004/099249 (варианты Fc с измененной способностью к связыванию с FcyR в результате аминокислотной модификации), у Duncan и Winter, Nature 322, 1988, cc. 738-740; в US №
5648260; US № 5624821 и WO 94/29351.
г) Сконструированные с использованием цистеина варианты антител.
Стоит отметить, что может оказаться желательным конструировать антитела с использованием цистеина, например, тиоМАт, в которых один или несколько остатков в антителе заменены на остатки цистеина. Замененные остатки могут присутствовать в доступных сайтах антитела. Путем замены указанных остатков на цистеин реактивные тиольные группы вносятся в доступные сайты антитела и могут использоваться для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как фрагменты лекарственных средств или фрагменты линкера - лекарственного средства, для создания конъюгата антитела, указанного ниже в настоящем описании. В конкретных вариантах любой один или несколько следующих остатков можно заменять на цистеин: V205 (нумерации по Кэботу) легкой цепи; А118 (EU-нумерация) тяжелой цепи; и S400 (EU-нумерация) Fc-области тяжелой цепи. Сконструированные с помощью цистеина антитела можно создавать, например, согласно методу, описанному в US №7521541.
д) Производные антител.
В конкретных вариантах антитело, представленное в настоящем описании, можно дополнительно модифицировать таким образом, чтобы оно содержало дополнительные небелковые фрагменты, известные в данной области и легкодоступные. Фрагменты, пригодные для дериватизации антитела, включают (но, не ограничиваясь только ими) водорастворимые полимеры. Примерами водорастворимых полимеров являются (но, не ограничиваясь только ими) полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры) и декстран- или поли(н-винилпиролидон) полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущество при производстве благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьироваться и, если присоединено более одного полимера, то они могут представлять собой одинаковые или различные молекулы. В целом, количество и/или тип полимеров, применяемых для дериватизации, можно определять с учетом таких особенностей (но, не ограничиваясь только ими), как конкретные свойства или функции антитела, подлежащего усовершенствованию, предполагается ли применение производного антитела в терапии в определенных условиях, и т.д.
Другим вариантом могут быть конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, которые можно избирательно нагревать, воздействуя на него излучением. В одном из вариантов небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam и др., Proc. Nail. Acad. Sci. USA 102, 2005, cc. 11600-11605). Излучение может иметь любую длину волны и включает (но, не ограничиваясь только ими) длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой клетки, ближайшие к конъюгату: антитело-небелковый фрагмент, уничтожаются.
Б. Методы рекомбинации и композиции.
Антитела можно получать с использованием методов рекомбинации и композиций, например, описанных в US № 4816567. Одним из вариантов является выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело к FAP, указанное в настоящем описании. Указанный полинуклеотид может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). Другим вариантом является один или несколько векторов (например, клонирующие векторы или экспрессионные векторы), содержащие указанный полинуклеотид. Другим является клетка-хозяин, содержащая указанный полинуклеотид или указанный вектор. Согласно одному из указанных вариантов клетка-хозяин содержит (например, является трансформированной с помощью указанных векторов): (1) вектор, включающий полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, полицистронный вектор), или (2) первый вектор, включающий полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, включающий полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. Кроме того, клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую клетку, прежде всего клетку млекопитающего, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО), клетку почки детеныша хомяка (BHK) или лимфоидную клетку (например, клетку Y0, NS0, Sp20). Одним из вариантов может быть также способ получения антитела к FAP, заключающийся в том, что культивируют клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид, который кодирует антитело, описанное выше, в условиях, пригодных для экспрессии антитела, и необязательно выделяют антитело из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).
Для рекомбинантного получения антитела к FAP один или несколько полинуклеотид(ов), который(ые) кодирует(ют) антитело, например, описанное выше, выделяют и встраивают в один или не- 33 037977 сколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Можно применять методы, хорошо известные специалистам в данной области, для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующую последовательность антитела к FAP наряду с соответствующими контролирующими транскрипцию/трансляцию сигналами. Эти методы включают методики in vitro рекомбинантной ДНК, методики синтеза и методики in vivo рекомбинации/генетической рекомбинации (см., например, методики, описанные у Maniatis и др., Molecular Cloning A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989; и Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology, изд-во Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989).
Согласно одному из вариантов один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело к FAP, можно экспрессировать под контролем конститутивного промотора или в другом варианте в регулируемой экспрессионной системе. Приемлемыми регулируемыми экспрессионными системами являются (но, не ограничиваясь только ими) регулируемая тетрациклином экспрессионная система, индуцируемая экдизоном экспрессионная система, регулируемая lac экспрессионная система, индуцируемая глюкокортикоидом экспрессионная система, система, включающая индуцируемый температурой промотор, и индуцируемая металлом металлотионеина экспрессионная система. Если несколько различных полинуклеотидов, которые кодируют антитело, введены в систему клетки-хозяина, то некоторые из них могут экспрессироваться под контролем конститутивного промотора, а другие под контролем регулируемого промотора.
Приемлемыми клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии кодирующих антитела векторов, являются прокариотические или эукариотические клетки, указанные в настоящем описании. Например, антитела можно получать в бактериях, в частности, когда гликозилирование и связанная с Fc эффекторная функция не требуются. Данные, касающиеся экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях, приведены, например, в US №№ 5648237, 5789199 и 5840523 (см. также у Charlton, Methods in Molecular Biology, под ред. B.K.C. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, cc. 245-254, описание экспрессии фрагментов антитела в Е. coli.) После экспрессии антитело можно выделять из пасты бактериальных клеток в виде растворимой фракции и можно дополнительно очищать.
Помимо прокариотических организмов в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, которые кодируют антитела, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были гуманизированы, что позволяет получать антитело с частично или полностью человеческой схемой гликозилирования (см. Gerngross, Nat. Biotech. 22, 2004, cc. 1409-1414 и Li и др., Nat. Biotech. 24, 2006, cc. 210-215). Указанные системы экспрессии предложены также в заявке на патент США № 60/344169 и WO 03/056914 (методы получения напоминающего человеческий гликопротеин в нечеловеческой эукариотической клетке-хозяине).
Клетки-хозяева, которые можно использовать для экспрессии гликозилированного антитела, получают также из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных животных). Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, а также можно применять клетки растений. Были выявлены многочисленные бакуловирусные штаммы и соответствующие пригодные для них в качестве хозяев клетки насекомых, прежде всего для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. В качестве хозяев можно применять также культуры растительных клеток (см., например, US №№ 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).
В качестве хозяев можно применять также клетки позвоночных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью ОВ40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (293 или клетки линии 293, субклонированные с целью выращивания в суспензионной культуре, Graham и др., J. Gen. Virol., 36, 1977, с. 59); клетки почки детеныша хомяка (ВНК); клетки Сертоли мыши (ТМ4-клетки, описанные, например, у Mather, Biol. Reprod., 23, 1980, cc. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76,); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени бычьей крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например, у Mather и др., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, cc. 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другими ценными линиями клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая DHFR--CHO-клетки (Urlaub и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с. 4216); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор конкретных линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно применять для производства антител, см., например, у Yazaki и Wu, в: Methods in Molecular Biology под ред. В.К.С. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, cc. 255-268.
Стабильная экспрессия, как правило, является более предпочтительной, чем кратковременная экспрессия, поскольку с ее помощью, как правило, получают более воспроизводимые результаты, а также она более пригодна для крупномасштабного производства; однако в компетенции специалиста в данной области является решение вопроса о том, когда для конкретной ситуации более пригодной является
- 34 037977 кратковременная экспрессия.
Также существует способ модификации профиля гликозилирования антител к FAP, которые продуцируются клеткой-хозяином, заключающийся в том, что экспрессируют в клетке-хозяине один или несколько полинуклеотид(ов), кодирующий(их) антитело к FAP, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующий(их) полипептид, который обладает гликозилтрансферазной активностью, или вектор, содержащий указанные полинуклеотиды. Как правило, любой тип культивируемой клеточной линии, включая описанные выше клеточные линии, можно применять для создания клеточных линий для производства антител к FAP с измененной схемой гликозилирования. Предпочтительными клеточными линиями являются СНО-клетки, BHK-клетки, NS0-клетки, SP2/0-клетки, клетки миеломы YO, клетки мышиной миеломы Р3Х63, PER-клетки, PER. C6-клетки или клетки гибридомы и другие клетки млекопитающих. Полипептиды с гликозилтрансферазной активностью включают β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (GnTII), α-маннозидазу II (ManII), в(1,4)-галактозилтрансферазу (GalT), e(1,2)-Nацетилглюкозаминилтрансферазу I (GnTI) и β(1, 2)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу II (GnTII). В одном из вариантов в клетке-хозяине экспрессируют комбинацию полинуклеотидов, кодирующих гликозилтрансферазную активность (например, GnTIII и Man II). Кроме того, способ заключается также в том, что экспрессируют один или несколько полинуклеотид(ов), который(ые) кодирует(ют) антитело к FAP, в клетке-хозяине, в которой ген гликозилтрансферазы разрушен или иным образом деактивирован (например, в клетке-хозяине, в которой активность гена, кодирующего коровую а1-6-фукозилтрансферазу, выключена). В конкретном варианте антитела к FAP можно получать в клетке-хозяине, в которой происходит также экспрессия полинуклеотида, кодирующего полипептид, обладающий GnTIII-активностью, с целью модификации схемы гликозилирования указанных антител. В конкретном варианте полипептид, обладающий GnTIII-активностью, представляет собой слитый полипептид, который содержит домен локализации в комплексе Гольджи гетерологичного полипептида, присутствующего в комплексе Гольджи. В другом предпочтительном варианте экспрессия антитела к FAP в клетке-хозяине, в которой происходит экспрессия полинуклеотида, кодирующего полипептид, обладающий GnTIII-активностью, приводит к образованию антител к FAP, которые обладают повышенной аффинностью связывания с Fcрецептором и/или повышенной эффекторной функцией. Таким образом, одним из вариантов является клетка-хозяин, которая содержит (а) один или несколько выделенный(ых) полинуклеотид(ов), содержащий(их) последовательность, которая кодирует полипептид, обладающий GnTIII-активностью; и (б) один или несколько выделенный(ых) полинуклеотид(ов), который(ые) кодирует(ют) антитело к FAP. В конкретном варианте полипептид, обладающий GnTIII-активностью, может представлять собой слитый полипептид, который содержит каталитический домен GnTIII и домен локализации в комплексе Гольджи полипептида, присутствующего в комплексе Гольджи. Предпочтительно домен локализации в комплексе Гольджи представляет собой домен локализации в комплексе Гольджи маннозидазы II. Методы создания указанных слитых полипептидов и их применение для получения антител с повышенными эффекторными функциями описаны в WO 2004/065540, в предварительной заявке на патент США № 60/495142 и в опубликованной заявке на патент США 2004/0241817, полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Клетка-хозяин дополнительно может содержать выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует полипептид, обладающей активностью маннозидазы II (ManII). Полинуклеотид(ы), кодирующий(ие) полипептиды(ы), типа полинуклеотид(ов), кодирующего(их) антитело к FAP, можно экспрессировать под контролем конститутивного промотора или в альтернативном варианте в регулируемой системе экспрессии. Указанные системы хорошо известны в данной области и включают описанные выше системы.
Клетки-хозяева, которые содержат кодирующую последовательность антитела к FAP и/или кодирующую последовательность полипептидов, обладающих гликозилтрансферазной активностью, и которые экспрессируют биологически активные генные продукты, можно определять, например, с помощью гибридизации ДНК-ДНК или ДНК-РНК; по присутствию или отсутствию функций определенных маркерных генов; путем оценки уровня транскрипции, измеряемого по экспрессии соответствующих мРНКтранскирптов в клетке-хозяине; или путем выявления генного продукта с помощью иммуноанализа или по его биологической активности - т.е. методов, хорошо известных в данной области. Активность GnTIII или Man II можно определять, например, применяя лектин, который связывается с продуктами биосинтеза GnTIII или ManII соответственно. Примером указанного лектина является лектин Е4-РНА, который связывается предпочтительно с олигосахаридами, содержащими двурассекающий GlcNAc. Продукты биосинтеза (т.е. специфические олигосахаридные структуры) полипептидов, обладающих активностью GnTIII или ManII, можно выявлять также с помощью масс-спектрометрического анализа олигосахаридов, высвобождающихся из гликопротеинов, которые продуцируются клетками, экспрессирующими указанные полипептиды. В альтернативном варианте можно использовать функциональный анализ, в котором измеряют повышенную способность связываться с Fc-рецептором или повышенную эффекторную функцию, опосредуемую антителами, которые продуцируются клетками, созданными с использованием полинуклеотида, который кодирует полипептид, обладающий активностью GnTIII.
Способ получения антитела к FAP, которое имеет модифицированные олигосахариды, может за
- 35 037977 ключаться в том, что (а) культивируют клетку-хозяина, созданную для экспрессии по меньшей мере одного полинуклеотида, который кодирует полипептид, обладающий гликозилтрансферазной активностью, в условиях, которые обеспечивают получение антитела к FAP, где указанный полипептид, обладающий гликозилтрансферазной активностью, экспрессируется в количестве, достаточном для модификации олигосахаридов в Fc-области указанного антитела к FAP, продуцируемого указанной клеткой-хозяином; и (б) выделяют антитело к FAP. В одном из вариантов полипептид, обладающий гликозилтрансферазной активностью, представляет собой GnTIII. В другом варианте присутствуют два полипептида, обладающих гликозилтрансферазной активностью. В конкретном варианте два пептида, обладающих гликозилтрансферазной активностью, представляют собой GnTIII и ManII. В другом варианте полипептид, обладающий гликозилтрансферазной активностью, представляет собой слитый полипептид, который содержит каталитический домен GnTIII. В более конкретном варианте слитый полипептид дополнительно содержит домен локализации в комплексе Г ольджи полипептида, присутствующего в комплексе Г ольджи. В частности, домен локализации в комплексе Гольджи представляет собой домен локализации маннозидазы II или GnTI, наиболее предпочтительно домен локализации маннозидазы II. В альтернативном варианте домен локализации в комплексе Гольджи выбирают из группы, включающей: домен локализации маннозидазы I, домен локализации GnTII и домен локализации коровой а1-6-фукозилтрансферазы.
В конкретном варианте модифицированное антитело к FAP, продуцируемое клеткой-хозяином или полученное с помощью способа, описанного выше, имеет константную область IgG или ее фрагмент, содержащий Fc-область. В другом конкретном антитело к FAP представляет собой гуманизированное или человеческое антитело или его фрагмент, содержащий Fc-область.
Антитело к FAP с измененной схемой гликозилирования, продуцируемое клеткой-хозяином или полученное с помощью способа, описанного выше, как правило, отличается повышенной аффинностью связывания Fc-рецептора и/или повышенной эффекторной функцией в результате модификации клеткихозяина (например, в результате экспрессии гена гликозилтрансферазы). Предпочтительно повышенная аффинность связывания Fc-рецептора представляет собой повышенное связывание с активирующим Fcрецептором, наиболее предпочтительно с FcYRIIIa-рецептором. Повышенная эффекторная функция предпочтительно представляет собой повышение одной или нескольких следующих функций: повышенная антитело-обусловленная клеточно-зависимая цитотоксичность, повышенный антителообусловленный клеточно-зависимый фагоцитоз (ADCP), повышенная секреция цитокинов, повышенное опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, повышенное связывание с NK-клетками, повышенное связывание с макрофагами, повышенное связывание с полиморфоядерными клетками (PMNC), повышенное связывание с моноцитами, повышенное перекрестное связывание связанных с мишенью антител, повышенная непосредственная передача сигнала, индуцирующего апоптоз, повышенное созревание дендритных клеток и повышенное Т-клеточное примирование.
В. Анализы.
Антитела к FAP, представленные в настоящем описании, можно идентифицировать, подвергать скринингу или характеризовать их физические/химические свойства и/или виды биологической активности различными анализами, известными в данной области.
1. Анализы связывания и другие анализы.
Антитело можно тестировать в отношении его антигенсвязывающей активности, например, с помощью известных методов, таких как ELISA, Вестерн-блоттинг и т.д.
А также можно использовать анализы в конкурентном формате для идентификации антитела, которое конкурирует с другим специфическим антителом к FAP за связывание с FAP. В конкретных вариантах такое конкурирующие антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается другое специфическое антитело к FAP. Подробное описание примеров методов картирования эпитопов, с которыми связывается антитело, представлено у Morris, Epitope Mapping Protocols, в: Methods in Molecular Biology, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 66, 1996.
Например, при осуществлении анализа в конкурентном формате иммобилизованный FAP инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с FAP (например, антитело 3F2, описанное в примерах), и второе немеченое антитело, у которого оценивают способность конкурировать с первым антителом за связывание с FAP. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридом. В качестве контроля иммобилизованный FAP инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не содержащем второе немеченое антитело. После инкубации в условиях, обеспечивающих связывание первого антитела с FAP, избыток несвязанного антитела удаляют и измеряют количество метки, ассоциированной с иммобилизованным FAP. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным FAP, существенно понижено в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это свидетельствует о том, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с FAP (см. Harlow и Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, гл. 14, 1988).
2. Анализы активности.
- 36 037977
Методы анализа могут быть предназначены для идентификации антител к FAP, обладающих биологической активностью. Биологическая активность может представлять собой, например, лизис клетокмишеней, антитело-обусловленную клеточно-зависимую цитотоксичность (ADCC), комплементзависимую цитотоксичность (CDC) или индукцию апоптоза. Изобретение относится также к антителам, которые обладают указанной биологической активностью in vivo и/или in vitro.
Антитело можно тестировать в отношении указанной биологической активности. Примеры анализов, предназначенных для тестирования ADCC, описаны выше (см., например, раздел Определения: Антитела, обладающие повышенной ADCC) и в примере 11. Анализы, предназначенные для оценки лизиса клеток (например, на основе оценки высвобождения LDH) или апоптоза (например, с помощью TUNEL-анализа) хорошо известны в данной области. Анализы, предназначенные для измерения ADCC или CDC, описаны также в WO 2004/065540 (см. пример 1 в указанной заявке), полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Г. Конъюгаты антител.
Заявку можно отнести также к конъюгатам, которые содержат антитело к FAP, указанное в настоящем описании, конъюгированное с одним или несколькими цитотоксическими агентами, такими как химиотерапевтические или лекарственные средства, ингибиторы роста, токсины (например, белковые токсины, обладающие ферментативной активностью токсины бактерий, грибов, растений или животных, или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.
Согласно одному из вариантов в конъюгате антитело-лекарственное средство (ADC) антитело конъюгировано с одним или несколькими лекарственными средствами, включая (но, не ограничиваясь только ими) майтансиноид (см. US №№ 5208020, 5416064 и европейский патент ЕР 0425235 В1); ауристатин, такой как лекарственное средство на основе монометилауристатина с фрагментами DE и DF (ММАЕ (малеимидокапроил-монометилауристатин Е) и MMAF (монометилауристатин F)) (см. US №№ 5635483, 5780588 и 7498298); доластатин; калихеамицин или его производные (см. US №№ 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296; Hinman и др., Cancer Res. 53, 1993, cc. 3336-3342; и Lode и др., Cancer Res. 58, 1998, cc. 2925-2928); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz и др., Current Med. Chem. 13, 2006, сс. 477-523; Jeffrey и др., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16, 2006, cc. 358-362; Torgov и др., Bioconj. Chem. 16, 2005, cc. 717-721; Nagy и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2000, cc. 829-834; Dubowchik и др., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12, 2002, cc. 1529-1532; King и др., J. Med. Chem. 45, 2002, cc. 4336-4343; и US № 6630579); метотрексат; виндезин; таксан, такой как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тесетаксел и ортатаксел; трихотецен; и CC1065.
В другом варианте конъюгат антитела может содержать антитело, представленное в настоящем описании, конъюгированное с обладающим ферментативной активностью токсином или его фрагментом, включая (но, не ограничиваясь только ими) цепь А дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модеццина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены.
В другом варианте конъюгат антитела может содержать антитело, представленное в настоящем описании, конъюгированное с радиоактивным атомом с образованием радиоконъюгата. Для получения радиоконъюгатов можно применять широкое разнообразие радиоактивных изотопов. Их примерами являются At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu. Когда радиоконъюгат применяют для целей выявления, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, tc99m или I123, или спин-метку для визуализации методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (который называют также магнитно-резонансной томографией, МРТ), например, йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
Конъюгаты, включающие антитело и цитотоксический агент, можно создавать с использованием целого ряда бифункциональных связывающих белки агентов, таких как N-сукцинимuдил-3-(2пиридилдитиол)пропионат (SPDP), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогенсан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бисазидосоединения (такие как бис(пара-азидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис(пара-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина можно получать согласно методу, описанному у Vitetta и др., Science, 238, 1987, с. 1098. Меченная с помощью С14 1-изотиоцианатобензил-3-метил диэтилентриаминпента уксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгации радионуклеотида с антителом (см. WO 94/11026). Линкер может представлять собой отщепляемый ликер, который облегчает высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно применять неустойчивый в кислой среде линкер, чувствительный к действию пептидаз линкер, фотолабильный линкер, диметильный линкер или содержащий дисульфид линкер (Chari и др., Cancer Res. 52, 1992, сс. 127-131;
- 37 037977
US № 5208020).
Конъюгаты антител представляют собой прежде всего (но, не ограничиваясь только ими) конъюгаты, полученные с использованием перекрестносшивающих агентов, включая (но, не ограничиваясь только ими) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SLAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфоSMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые поступают в продажу (например, от фирмы Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США).
Д. Способы и композиции для диагностики и выявления.
Любое из антител к FAP, представленных в настоящем описании, можно применять для выявления присутствия FAP в биологическом образце. Понятие выявление в контексте настоящего описания предусматривает количественное или качественное определение. В конкретных вариантах биологический образец представляет собой клетку или ткань, например, клетки или ткани из головного мозга, молочной железы, ободочной кишки, почки, печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы, скелетной мышцы, кожи, тонкого кишечника, желудка или матки, включая также клетки или ткани опухолей указанных органов.
Одним из вариантов может быть антитело к FAP, предназначенное для применения в способе диагностирования или выявления. Следующим объектом может быть способ выявления присутствия FAP в биологическом образце. В конкретных вариантах способ может заключаться в том, что приводят в контакт биологический образец, необязательно в сочетании с контрольным образцом, с антителом к FAP, представленным в настоящем описании, в условиях, пригодных для связывания антитела к FAP с FAP, и выявляют образование комплекса между антителом к FAP и FAP. Указанный способ может представлять собой способ in vitro или in vivo. В одном из вариантов антитело к FAP применяют для отбора индивидуумов, которых можно лечить с помощью антитела FAP, например, если FAP является биомаркером для отбора пациентов.
Примерами нарушений, которые можно диагностировать с помощью антитела являются нарушения, ассоциированные с экспрессией FAP, такие как рак и некоторые воспалительные состояния.
Способ диагностирования заболевания у индивидуума заключается в том, что вводят указанному индивидууму в эффективном количестве диагностический агент, при этом диагностический агент содержит антитело к FAP, представленное в настоящем описании, и метку, как правило, визуализирующее средство, что позволяет выявлять комплекс диагностического агента и FAP.
Конкретными вариантами могут быть меченые антитела к FAP. Метки могут представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) метки или фрагменты, которые выявляют непосредственно (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагменты, такие как ферменты или легенды, которые выявляют косвенным путем, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Примерами меток являются (но, не ограничиваясь только ими) радиоизотопы 32Р, 14С, 125I, 3Н и 131I, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (US № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза из хрена (HRP), щелочная фосфатаза, βгалактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, оксидазы сахарина, например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, оксидазы гетероциклических соединений, такие как уреказа и ксантиноксидаза, комплексы с ферментом, в которых применяют перекись водорода для окисления предшественника красителя, такого, например, как HRP, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спин-метки, бактериофаги в качестве меток, стабильные свободные радикалы и т.п.
Е. Фармацевтические композиции.
Фармацевтические композиции антитела к FAP, представленного в настоящем описании, можно получить путем смешения антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. A. Osol, 1980) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, они включают (но, не ограничиваясь только ими) буферы, такие как фосфатный, цитратный, ацетатный буферы, а также буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и мета-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (содержащие менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; содержащие металл комплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхност- 38 037977 но-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ).
В контексте настоящего описания фармацевтически приемлемые носители могут включать также диспергирующие агенты интерстициальных лекарственных средств, такие как растворимые активные в нейтральной среде гликопротеины гиалуронидаз (sHASEGP), например, человеческие растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, фирма Baxter International, Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и методы их применения, в том числе rHuPH20, описаны в публикациях патентов США №№ 2005/0260186 и 2006/0104968. sHASEGP можно объединять с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.
Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в US № 6267958. Водные композиции антител включают композиции, описанные в US № 6171586 и WO 2006/044908, последние композиции включают гистидин-ацетатный буфер.
Композиция может содержать также более одного действующего вещества, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно вещества с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Например, если подлежащее лечению заболевание представляет собой рак, то может оказаться желательным дополнительно применять одно или несколько противораковых средств, например, химиотерапевтическое средство, ингибитор пролиферации опухолевых клеток или активатор апоптоза раковых клеток. Такие действующие вещества должны присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для решения поставленной задачи.
Действующие вещества можно включать также в микрокапсулы, например, полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например, в гидроксипропилметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. A. Osol, 1980.
Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие антитело, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например, пленки или микрокапсулы.
Композиции, предназначенные для применения in vivo, должны быть стерильными. Это легко можно осуществлять путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
Представленные в настоящем описании молекулы могут входить в состав различных форм лекарственных средств, включая (но, не ограничиваясь ими) жидкие растворы или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, суппозитории, полимерные микрокапсулы или микропузырьки, липосомы и вводимые путем инъекции или инфузии растворы. Предпочтительная форма зависит от пути введения и терапевтического применения, но, как правило, они представляют собой растворы, которые можно вводить путем инъекции или инфузии.
Ж. Способы и композиции для терапевтического применения.
Любые антитела к FAP или фармацевтические композиции, содержащие антитела к FAP, представленные в настоящем описании, можно применять в терапевтических методах.
Антитела к FAP, представленные в настоящем описании, можно применять для лечения заболеваний, отличающихся экспрессией FAP, прежде всего аномальной экспрессией (например, сверхэкспрессией или другой схемой экспрессии в клетке) FAP по сравнению со здоровой тканью из клеток такого же типа. Аномальная экспрессия FAP (например, сверхэкспрессия) характерна для многих человеческих опухолей по сравнению с неопухолевой тканью из клеток такого же типа. Так, антитела к FAP, указанные в настоящем описании, наиболее предпочтительно можно применять для предупреждения образования опухолей, уничтожения опухолей и ингибирования роста опухолей или метастазов. Антитела к FAP, представленные в настоящем описании, можно применять для лечения любой опухоли, экспрессирующей FAP. Конкретными злокачественными заболеваниями, которые можно лечить с помощью антител к FAP, представленных в настоящем описании, являются, например, рак легкого, рак ободочной кишки, рак желудка, рак молочной железы, рак головы и шеи, рак кожи, рак печени, рак почки, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак головного мозга, рак скелетной мускулатуры.
Антитела к FAP, представленные в настоящем описании, можно применять для ингибирования роста опухоли или уничтожения опухолевых клеток. Например, антитела к FAP могут связываться с FAP, который находится на мембране или клеточной поверхности раковых клеток (опухолевые клетки или клетки стромы опухоли) и вызывать, например, ADCC или другое опосредуемое эффектором уничтожение раковых клеток.
В альтернативном варианте антитела к FAP можно применять для блокады функции FAP, прежде всего путем физического интерферирующего воздействия на его связывание с другим соединением. Например, антигенсвязывающие молекулы можно применять для блокады ферментативной активности FAP (например, активности сериновой пептидазы, желатиназы, коллагеназы), опосредуемого FAP расщепления компонентов внеклеточного матрикса (ЕСМ) и/или опосредуемой FAP инвазиции или миграции кле
- 39 037977 ток.
Антитело к FAP может быть предназначено для применения в качестве лекарственного средства FAP, а также для применения при лечении заболевания, отличающегося экспрессией FAP. Конкретные варианты относятся к антителу к FAP, предназначенному для применения в способе лечения индивидуума, страдающего заболеванием, отличающимся экспрессией FAP, который заключается в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело к FAP. В одном из указанных вариантов способ заключается также в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, описанное ниже. Кроме того антитело к FAP может быть предназначено для применения для индукции лизиса клетки. Следующие варианты относятся к антителу к FAP, предназначенному для применения в способе индукции лизиса клетки у индивидуума, который заключается в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело к FAP для индукции лизиса клетки. Индивидуум в контексте любого из указанных выше вариантов предпочтительно представляет собой человека. Заболевание, отличающееся экспрессией FAP в контексте любого из указанных выше вариантов предпочтительно представляет собой рак, наиболее предпочтительно рак, выбранный из группы, включающей рак легкого, рак ободочной кишки, рак желудка, рак молочной железы, рак головы и шеи, рак кожи, рак печени, рак почки, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак головного мозга, рак скелетной мускулатуры. Клетка в контексте любого из указанных выше вариантов предпочтительно представляет собой клетку, присутствующую в опухоли, например, опухолевую клетку или клетку стромы опухоли, наиболее предпочтительно опухолевую клетку. Экспрессия FAP в контексте любого из указанных выше вариантов предпочтительно представляет собой аномальную экспрессию, например, сверхэкпрессию или другую схему экспрессии в клетке, по сравнению со здоровой тканью из клеток такого же типа.
Следующим объектом является применение антитела к FAP для производства или приготовления лекарственного средства. Согласно одному из вариантов лекарственное средство предназначено для лечения заболевания, отличающегося экспрессией FAP. Согласно другому варианту лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения заболевания, отличающегося экспрессией FAP, который заключается в том, что вводят индивидууму, который страдает заболеванием, отличающимся экспрессией FAP, лекарственное средство в эффективном количестве. Согласно одному из указанных вариантов способ дополнительно заключается также в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, описанное ниже. Согласно другому варианту лекарственное средство предназначено для индукции лизиса клетки. Согласно следующему варианту лекарственное средство предназначено для применения в способе индукции лизиса клетки у индивидуума, который заключается в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело к FAP для индукции лизиса клетки. Индивидуум в контексте любого из указанных выше вариантов предпочтительно представляет собой человека. Заболевание, отличающееся экспрессией FAP в контексте любого из указанных выше вариантов предпочтительно представляет собой рак, наиболее предпочтительно рак, выбранный из группы, включающей рак легкого, рак ободочной кишки, рак желудка, рак молочной железы, рак головы и шеи, рак кожи, рак печени, рак почки, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак головного мозга, рак скелетной мускулатуры. Клетка в контексте любого из указанных выше вариантов предпочтительно представляет собой клетку, присутствующую в опухоли, например, опухолевую клетку или клетку стромы опухоли, наиболее предпочтительно опухолевую клетку. Экспрессия FAP в контексте любого из указанных выше вариантов предпочтительно представляет собой аномальную экспрессию, например, сверхэкпрессию или другую схему экспрессии в клетке, по сравнению со здоровой тканью из клеток такого же типа.
Следующим объектом может быть способ лечения заболевания, отличающегося экспрессией FAP. В одном из вариантов способ заключается в том, что вводят индивидууму, который страдает указанным заболеванием, отличающимся экспрессией FAP, в эффективном количестве антитело к FAP. Согласно одному из указанных вариантов способ дополнительно заключается в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, описанное ниже. Следующим вариантом может быть способ индукции лизиса клетки у индивидуума. Согласно одному из вариантов способ заключается в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело к FAP для индукции лизиса клетки. Индивидуум в контексте любого из указанных выше вариантов может представлять собой человека. Заболевание, отличающееся экспрессией FAP в контексте любого из указанных выше вариантов предпочтительно представляет собой рак, наиболее предпочтительно рак, выбранный из группы, включающей рак легкого, рак ободочной кишки, рак желудка, рак молочной железы, рак головы и шеи, рак кожи, рак печени, рак почки, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак головного мозга, рак скелетной мускулатуры. Клетка в контексте любого из указанных выше вариантов предпочтительно представляет собой клетку, присутствующую в опухоли, например, опухолевую клетку или клетку стромы опухоли, наиболее предпочтительно опухолевую клетку. Экспрессия FAP в контексте любого из указанных выше вариантов предпочтительно представляет собой аномальную экспрессию, например, сверхэкпрессию или другую схему экспрессии в клетке, по сравнению со здоровой тканью из клеток такого же типа.
- 40 037977
Следующим объектом могут быть фармацевтические композиции, содержащие антитело к FAP, представленное в настоящем описании, например, для применения в любом из указанных выше терапевтических способов. В одном из вариантов фармацевтическая композиция содержит любое из антител к FAP, представленных в настоящем описании, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. В другом варианте фармацевтическая композиция содержит любое из антител к FAP, представленных в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, описанное ниже.
Антитела можно применять либо индивидуально, либо в сочетании с другими агентами. Например, антитело можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством. Согласно конкретным вариантам дополнительное терапевтическое средство представляет собой противораковое средство, например, химиотерапевтическое средство, ингибитор пролиферации опухолевых клеток или активатор апоптоза опухолевых клеток.
Такие комбинированные терапии, указанные выше, предусматривают совместное введение (когда два или большее количество терапевтических средств включены в одну и ту же или различные композиции) и раздельное введение, в каждом случае введение антитела можно осуществлять до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства или адъюванта. Антитела можно применять также в сочетании с лучевой терапией.
Антитело (и любое дополнительное терапевтическое средство), можно вводить любыми приемлемыми путями, включая парентеральный, внутрилегочный и интраназальный и при необходимости применять для местной обработки, введения в повреждение. Парентеральное введение включает внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Внутривенное введение, как правило, является предпочтительным. Однако, по-видимому, внутрибрюшинный путь должен являться наиболее предпочтительным, например, при лечении колоректальных опухолей. Дозирование можно осуществлять любым приемлемым путем, например, путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости, в том числе, от того, является ли лечение кратковременным или хроническим. Можно применять различные схемы дозирования, включая (но, не ограничиваясь только ими) однократное или несколько введений в различные моменты времени, болюсное введение и пульсирующую инфузию.
Антитела можно включать в состав композиций, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину заболевания, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам. Антитело можно, но это не является обязательным, включать в композицию в сочетании с одним или несколькими другими агентами, которые в настоящее время применяют для лечения рассматриваемого заболевания. Эффективное количество указанных других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в композиции, типа нарушения или лечения и других указанных выше факторов. Их, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием таких же путей введения, которые указаны в настоящем описании, или в количестве, составляющем от 1 до 99% от дозы, указанной в настоящем описании, или в любой дозе и с помощью любого пути, который по данным эмпирической/клинической оценки является пригодным.
Для предупреждения или лечения заболевания приемлемая доза антитела (при его применении индивидуально или в сочетании с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими средствами), должна зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, серьезности и течения болезни, применяют ли антитело для превентивных или терапевтических целей, предшествующей терапии, истории болезни пациента и ответа на антитело, а также предписания лечащего врача. Антитело можно вводить пациенту однократно или в виде серий обработок. В зависимости от типа и серьезности заболевания примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-10 мг/кг) антитела может представлять собой начальную возможную дозу для введения пациенту, например, с помощью одной или нескольких отдельных обработок или с помощью непрерывной инфузии. Одним из примеров типичных суточных доз может являться доза, составляющая от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. При использовании повторных введений в течение нескольких дней или более длительного периода времени, в зависимости от состояния, лечение, как правило, следует продолжать до достижения подавления симптомов заболевания. Одним из примеров доз антитела является доза, составляющая от примерно 0,05 до примерно 10 мг/кг. Так, пациенту можно вводить одну или несколько следующих доз: примерно 0,5, 2,0, 4,0 или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Указанные дозы можно вводить дробно, например, каждую неделю или каждые три недели (например, так, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати, например, примерно шесть доз антитела). Можно применять начальную повышенную ударную дозу с последующим введением одной или нескольких более низких доз. Однако можно применять другие схемы введения доз. С помощью общепринятых методов и анализов можно легко осуществлять мониторинг действия указанной терапии.
Очевидно, что любые из вышеуказанных комбинаций или терапевтических методов можно применять с использованием конъюгата антитела, вместо или в дополнение к антителу к FAP.
- 41 037977
З. Изделия.
Изделие может содержать продукты, применяемые для лечения, предупреждения и/или диагностирования указанных выше нарушений. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовкувкладыш в упаковку, которые размещены на контейнере или вложены в него. Приемлемыми контейнерами являются, например, банки, пузырьки, шприцы, пакеты для внутривенного раствора и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело. На этикетке или листовкевкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать (а) первый контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит антитело; и (б) второй контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Согласно другому варианту изделие может содержать листовку-вкладыш в упаковке, которая содержит информацию о том, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. В альтернативном или дополнительном варианте изделие может дополнительно включать второй (или третий) контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Как должно быть очевидно, любое из указанных выше изделий может включать конъюгат антитела вместо или в дополнение к антителу к FAP.
III. Примеры.
Ниже представлены примеры способов и композиций, предлагаемых в изобретении. Как должно быть очевидно, можно осуществлять на практике различные другие варианты с учетом представленного выше описания в целом.
Пример 1. Методы рекомбинантной ДНК.
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии применяли согласно инструкциям производителей. Последовательности ДНК определяли посредством секвенирования двух цепей. В некоторых случаях требуемые сегменты генов создавали на фирме Geneart AG (Регенсбург, Германия) из синтетических олигонуклеотидов и ПЦР-продуктов посредством автоматического синтеза генов. Сегменты генов, фланкированные единичными сайтами, распознаваемыми рестриктазами, клонировали в плазмидах pGA18 (ampR). Плазмидную ДНК очищали из трансформированных бактерий и определяли концентрацию с помощью УФ-спектроскопии. Последовательность ДНК субклонированных фрагментов генов подтверждали ДНК-секвенированием. Создавали сегменты генов с требуемыми сайтами рестрикции, позволяющими субклонироовать их в соответствующих экспрессионных векторах.
Общую информацию, касающуюся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческих иммуноглобулинов, см. у: Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во NIH, публикация No 91-3242, 1991. Для экспрессии все конструкции обозначали, начиная с 5'-концевой ДНК-последовательности, кодирующей лидерный пептид, который придает белкам способность секретироваться в эукариотических клетках. В SEQ ID NO: 323-331 представлены примеры лидерных пептидов и полинуклеотидных последовательностей, кодирующих их.
Получение (созданных с помощью гликоинженерии) антител.
Последовательности ДНК тяжелых и легких цепей полноразмерного антитела получали субклонированием вариабельных областей в рамке считывания либо с константной областью тяжелой цепи, либо константной областью легкой цепи, предварительно встроенной в соответствующий экспрессионный вектор млекопитающих (вектор-реципиент). Экспрессия находилась под контролем промотора MPSV, и вектор нес синтетическую сигнальную последовательность поли-А-хвоста на 3'-конце CDS. Кроме того, каждый вектор содержал OriP-последовательность EBV.
Антитела получали путем котрансфекции клеток линии HEK293-EBNA экспрессионными векторами млекопитающих, предназначенными для экспрессии антител, используя опосредуемую фосфатом кальция трансфекцию. Находящиеся на экспоненциальной фазе роста клетки линии HEK293-EBNA трансфектировали с помощью метода, предусматривающего применение фосфата кальция. В другом варианте HEK293-клетки, выращенные в виде суспензионной культуры, трансфектировали полиэтиленимином (ПЭИ). Для получения немодифицированного не подвергнутого гликоинженерии антитела клетки трансфектировали только экспрессионными векторами тяжелой и легкой цепи антитела в соотношении 1:1.
Для получения антител, подвергнутых гликоинженерии, клетки котрансфектировали двумя допол
- 42 037977 нительными плазмидами, одна из которых предназначена для экспрессии слитого полипептида, обладающего GnTШ-активностью (экспрессионный вектор GnT-III), а вторая предназначена для экспрессии маннозидазы II (экспрессионный вектор маннозидазы II из комплекса Гольджи) в соотношении 4:4:1:1 соответственно. Клетки выращивали в виде прикрепленных монослойных культур в Т-колбах, используя культуральную среду DMEM, дополненную 10% FCS, и осуществляли их трансфекцию при конфлюэнтности от 50 до 80%. Для трансфекции за 24 ч до осуществления трансфекции в Т150-колбу высевали 15 миллионов клеток в 25 мл культуральной среды DMEM, дополненной FCS (конечная концентрация 10 об.%), и клетки выдерживали при 37°С в течение ночи в инкубаторе в атмосфере 5% СО2. Для трансфекции каждой Т150-колбы приготавливали раствор, содержащий ДНК, CaCl2 и воду, путем смешения 94 мкг общей плазмидной ДНК вектора, взятой поровну из экспрессионных векторов легкой и тяжелой цепи, воды до конечного объема 469 мкл и 469 мкл раствора 1М CaCl2. К этому раствору добавляли раствор, содержащий 938 мкл 50 мМ HEPES, 280 мМ NaCl, 1,5 мМ Na2HPO4, pH 7,05, немедленно перемешивали в течение 10 с и давали выстояться при комнатной температуре в течение 20 с. Суспензию разводили 10 мл среды DMEM, дополненной 2% FCS, и вносили в Т150-колбу вместо находящейся в ней среды. Затем дополнительно вносили 13 мл среды для трансфекции. Клетки инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение примерно 17-20 ч, затем среду заменяли 25 мл DMEM, 10% FCS. Кондиционированную среду собирали примерно через 7 дней после замены среды путем центрифугирования в течение 15 мин при 210xg, раствор стерилизовали фильтрацией (фильтр 0,22 мкм) и добавляли азид натрия в конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и выдерживали при 4°С.
Секретируемые антитела дикого типа или афукозилированные созданные с помощью гликоинженерии антитела очищали из супернатантов клеточной культуры с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А (HiTrap ProtA, фирма GE Healthcare). В целом, метод состоял в следующем: колонку уравновешивали 20 мМ фосфатом натрия, 20 мМ цитратом натрия, рН 7,5, вносили супернатант клеток, затем осуществляли первую отмывку, используя 20 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, рН 7,5 и вторую отмывку, используя 13,3 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, 500 мМ хлорид натрия рН 5,45. Антитела элюировали 20 мМ цитратом натрия, 100 мМ хлоридом натрия, 100 мМ глицином, рН 3. При осуществлении последующей стадии гель-фильтрации на колонке HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare) заменяли буфер на раствор, содержащий 25 мМ фосфат калия, 125 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин, рН 6,7, или в другом варианте на буфер, содержащий 140 мМ хлорид натрия, 20 мМ гистидин, рН 6,0, и собирали чистые мономерные антитела типа IgG1. При необходимости между двумя стандартными стадиями очистки осуществляли дополнительную стадию катионообменной хроматографии.
Концентрацию белка в очищенных белковых образцах определяли, измеряя оптическую плотность (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу антител анализировали с помощью ДСН-ПААГ в присутствии восстановителя (5мМ 1,4-дитиотреитол) и без него и осуществляли окрашивание кумасси (SimpleBlue™ SafeStain фирма Invitrogen). Систему геля NuPAGE® Pre-Cast (фирма Invitrogen, США) применяли согласно инструкции производителя (4-20% трис-глициновые гели или 3-12% Бис-Трис). Содержание агрегатов в образцах антител анализировали с помощью аналитической колонки для гельфильтрации Супердекс200 10/300GL (фирма GE Healthcare, Швеция) и подвижного буфера 2мМ MOPS, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN3, рН 7,3 при 25°С. Целостность аминокислотного каркаса восстановленных легких и тяжелых цепей антитела подтверждали с помощью масс-спектрометрии с использованием наноэлектроспрея (NanoElectrospray Q-TOF) после удаления N-гликанов путем обработки ферментом гликозидазой F пептида-N (фирма Roche Molecular Biochemicals).
Результаты очистки и анализа антител дикого типа и созданных с помощью гликоинженерии человеческих антител IgG-типа 28Н1, 29В11, 3F2 и 4G8 представлены на фиг. 15-22. Данные о выходе приведены в следующей таблице:
Выход [мг/л]
Дикий тип Созданное с помощью глико инженерии
28Н1 hu IgG 46 40
29В11 hu IgG 10 14
3F2 hu IgG 144 7
4G8 hu IgG 55 12,6
Олигосахариды, связанные с Fc-областью антител, анализировали с помощью описанного ниже метода MALDI TOF-MC. Олигосахариды высвобождали из антител путем расщепления ферментом PNG азой F. Полученный после расщепления раствор, содержащий высвободившиеся олигосахариды, либо непосредственно подготавливали для анализа с помощью MALDI TOF-MC, либо дополнительно расщепляли гликозидазой EndoH перед подготовкой образца для анализа с помощью MALDI TOF-MC.
Анализ гликоструктуры (созданных с помощью гликоинженерии) антител Для определения относительных соотношений содержащих фукозу и несодержащих фукозу (афукозилированных) олигосахаридных структур высвободившиеся гликаны очищенных образцов антител анализировали с помощью
- 43 037977
MALDI-Tof-масс-спектрометрии. Образец антитела (примерно 50 мкг) инкубировали в течение ночи при 37°С с 5 мед. N-гликозидазы F (фирма QAbio; PNGазаF: E-PNG01) в 2мМ Трис, рН 7,0 для высвобождения олигосахарида из белкового каркаса. Для деаминирования гликанов добавляли уксусную кислоту до конечной концентрации 150 мМ и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Для анализа с помощью MALDI TOF-масс-спектрометрии 2 мкл образца смешивали на MALDI-мишени с 2 мкл матриксного раствора DHB (2,5-дигидробензойная кислота (фирма Bruker Daltonics, № 201346), растворенной в смеси 50% этанола/5мМ NaCl при 4 мг/мл), и анализировали с помощью MALDI TOF-масс-спектрометра Autoflex II (фирма Bruker Daltonics). Как правило, в одном эксперименте получали и обобщали 50-300 изображений. Полученные спектры оценивали с помощью программы для flex-анализа (фирма Bruker Daltonics) и массы определяли для каждого обнаруженного пика. Затем пики оценивали в отношении содержащих фукозу и несодержащих фукозу (нефокозилированных) структур путем сравнения рассчитанных масс и теоретически ожидаемых масс для соответствующих структур (например, комплексных, гибридных структур и олигоманнозных или с высоким содержанием маннозы структур соответственно, с фукозой и без фукозы).
Для определения относительного содержания гибридных структур образцы антител расщепляли одновременно с помощью N-гликозидазы F и эндогликозидазы Н (фирма QAbio; EndoH: E-EH02). Nгликозидаза F обеспечивает высвобождение всех N-связанных структур гликанов (комплексных, гибридных структур и олигоманнозных или с высоким содержанием маннозы структур) из белкового каркаса, а эндогликозидаза Н расщепляет все гибридные типы гликанов дополнительно между двумя остатками Nацетилглюкозамина (GlcNAc) на редуцирующем конце гликана. Этот продукт расщепления затем обрабатывали и анализировали с помощью MALDI TOF-масс-спектрометрии так же, как описано выше для расщепления образца N-гликозидазой F. Путем сравнения схемы, полученной в результате расщепления N-гликозидазой F и в результате расщепления комбинацией N-гликозидаза F/Endo H, уровень снижения сигналов конкретной углеводной структуры применяли для определения относительного содержания гибридных структур. Относительное содержание каждой углеводной структуры рассчитывали из соотношения высоты пика индивидуальной структуры и суммы высот пиков всех обнаруженных олигосахаридов. Количество фукозы определяли как процент содержащих фукозу структур относительно всех углеводных структур, идентифицированных в образце, обработанном N-гликозидазой F (например, комплексных, гибридных структур и олигоманнозных или с высоким содержанием маннозы структур соответственно). Количество нефукозилированных структур определяли как процент структур, в которых отсутствовала фукоза, относительно всех углеводных структур, идентифицированных в образце, обработанном N-гликозидазой F (например, комплексных, гибридных структур и олигоманнозных или с высоким содержанием маннозы структур соответственно).
Уровни нефукозилированных структур различных антител дикого типа и созданных с помощью гликоинженерии антител к FAP представлены в следующей таблице:
Нефукозилированные структуры [%]
Антитело Дикий тип Созданное с помощью гликоинженерии
Hu IgG 28Н1 10 40
Ни IgG 29В11 5 27
Ни IgG 3F2(YS) 2,4 64
Ни IgG 4G8 3,8 78
Пример 2. Конструирование характерных для определенного класса Fab-библиотек.
Характерные для определенного класса антител библиотеки в Fab-формате конструировали на основе генов человеческой зародышевой линии, используя следующие варианты спаривания V-области: Vk3_20 легкой каппа-цепи с VH3_23 тяжелой цепи для библиотеки DP47-3 и Vk1_17 легкой каппа-цепи с VH1_69 тяжелой цепи для библиотеки DP88-3 (см. SEQ ID NO: 1 и 2).
Обе библиотеки рандомизировали касательно CDR3 легкой цепи (L3) и CDR3 тяжелой цепи (Н3) и осуществляли сборку, используя по 3 фрагмента на библиотеку, с помощью сплайсинга с использованием перекрывающихся удлиняющих сегментов (SOE). Фрагмент 1 содержал 5'-конец гена антитела, включая рандомизированный L3, фрагмент 2 представлял собой центральный константный фрагмент, простирающийся от L3 до Н3, а фрагмент 3 содержал рандомизированный Н3 и 3'-область гена антитела.
Для создания входящих в библиотеку фрагментов для DP47-3-библиотеки применяли следующие комбинации праймеров: фрагмент 1 (LMB3 -LibL1b_new), фрагмент 2 (MS63 - MS64), фрагмент 3 (Lib2H - fdseqlong) (см. табл. 3). Для создания входящих в библиотеку фрагментов для DP88-3-библиотеки применяли следующие комбинации праймеров: фрагмент 1 (LMB3 -RJH_LIB3), фрагмент 2 (RJH31 - RJH32) и фрагмент 3 (LIB88_2 - fdseqlong) (см. табл. 4).
- 44 037977
Таблица 3
Праймеры, применявшиеся для создания DP47-3-библиотеки SEQ ID NO
LMB3 CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC 332
LibLlbnew CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGTMNNGGGMNNMNNMNNACC CTGCTGACAGTAATACACTGC 333
MS63 TTTCGCACAGTAATATACGGCCGTGTCC 334
MS64 ACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGG 335
Lib2H GGCCGTATATTACTGTGCGAAANNKNNKNNKNNKNNKTTTGAC TACTGGGGCCAAGGAAC 336
fdseqlong GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG 337
Таблица 4
Праймеры, применявшиеся для создания DP88-3-библиотеки SEQ ID NO
Праймеры, применявшиеся для создания DP88-3-библиотеки SEQ ID NO
LMB3 CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC 332
RJHLIB3 GACTTTGGTGCCCTGGCCAAACGT MNN GGG MNN MNN ACC MNN CTGCAAGCAGTAATAGGTGGCAAAATC 338
RJH31 ACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAG 339
RJH32 TCTCGCACAGTAATACACGGCGGTGTCC 340
LIB882 GGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGA -[(33% GAC Asp; 26% GGT Gly; 10% GAA Gin; 9% CGT Arg; 7% Lys; 6% GTT Vai; 5% TCT Ser; 4% CTG Leu)l - (23% GGT Gly; 17% TAC Tyr; 16% TCT Ser; 11% GCT Ala; 9% CGT Arg; 7% AAC Asn; 6% ACT Thr; 6% GTT Vai; 5% CCGPro)8]TTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCC 341
fdseqlong GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG 337
Протокол ПЦР для получения входящих в библиотеки фрагментов включал: начальную денатурацию в течение 5 мин при 94°С; 25 циклов по 1 мин при 94°С, 1 мин при 58°С и 1 мин при 72°С; и конечное удлинение в течение 10 мин при 72°С. Для ПЦР-сборки в качестве матрицы использовали эквимолярные соотношения трех фрагментов. Протокол ПЦР-сборки включал: начальную денатурацию в течение 3 мин при 94°С; и 5 циклов по 30 с при 94°С, 1 мин при 58°С и 2 мин при 72°С. На этой стадии добавляли праймеры, комплементарные последовательности, расположенной вне фрагментов 1-3, и осуществляли дополнительные 20 циклов перед конечным удлинением в течение 10 мин при 72°С.
После сборки с получением достаточных количеств полноразмерных рандомизированных Fabконструкций Fab-конструкции расщепляли с помощью NcoI/NotI в случае DP47-3-библиотеки и с помощью NcoI/NheI в случае DP88-3-библиотеки наряду с обработанным аналогичным образом акцепторным фагмидным вектором. В случае DP47-3-библиотеки 22,8 мкг Fab-библиотеки лигировали с 16,2 мкг фагмидного вектора. В случае DP88-3-библиотеки 30,6 мкг Fab-библиотеки лигировали с 30,6 мкг фагмид ного вектора.
Очищенные полученные в результате лигирования смеси использовали для осуществления 68 трансформаций с использованием DP47-3-библиотеки и 64 трансформаций с использованием DP88-3библиотеки соответственно с получением конечных размеров библиотек 4,2x10 DP47-3 и 3,3х109 DP883.
Фагмидные частицы, презентующие Fab-библиотеки, высвобождали (спасали) и очищали с помощью ПЭГ/NaCl для применения для селекций.
Пример 3. Селекция клонов антител к FAP (первичные селекции).
Селекции осуществляли в отношении эктодомена человеческого или мышиного белка активации фибробластов (FAP), которые клонировали против хода транскрипции относительно полилизиновой и 6xhis-метки (см. SEQ ID NO: 317 и 319). Перед осуществлением селекций антигенами сенсибилизировали пробирки для иммуноанализов (иммунопробирки) в концентрации либо 10, либо 5 мкг/мл в зависимости от цикла селекции. Селекции осуществляли согласно следующему протоколу: (I) связывание ~ 1012 фагмидных частиц библиотеки DP47-3 с иммобилизованным человеческим или мышиным FAP в течение 2 ч; (II) отмывка иммунопробирок с использованием 5x5 мл ЗФР/Твин 20 и 5x5 мл ЗФР; (III) элюция фаговых частиц путем добавления 1 мл 100 мМ ТЭА (триэтиламин) в течение 10 мин и нейтрализация путем добавления 500 мкл 1М Трис/HCl, рН 7,4; и (IV) повторное заражение находящихся на log-фазе роста клеток is. coli линии TG1, заражение фагом-хелпером VCSM13 и последующее осаждение с помощью ПЭГ/NaCl фагмидных частиц, применяемых в последующих циклах селекции.
Селекции осуществляли с применением трех или четырех циклов, используя понижающиеся концентрации, применения в качестве антигена человеческий FAP, и в некоторых случаях используя мышиный FAP в концентрации 5 мкг/мл в конечном цикле селекции. Специфические связывающие агенты определяли по наличию сигналов, в 5 раз превышающих фоновый сигнал, и идентифицировали с помощью ELISA. Планшеты Maxisorp фирмы NUNC сенсибилизировали 10 мкг/мл человеческого или мышиного FAP с последующим добавлением содержащих Fab-фрагменты супернатантов бактерий и определяли специфическое связывание Fab-фрагментов посредством их Flag-меток, используя в качестве вторичного антитела антитело к Flag/HRP.
- 45 037977
Позитивные по данным ELISA клоны экспрессировали в бактериях в виде 1-миллилитровых культур в 96-луночном формате и супернатанты подвергали скринингу в отношении кинетических характеристик с использованием устройства BIACORE T100.
Величины KD оценивали с помощью резонанса поверхностного плазмона, используя устройство BIACORE® T100 (фирма GE Healthcare), при 25°С с применением специфического в отношении человеческого F(ab')2-фрагмента захватывающего антитела (фирма Jackson ImmunoResearch, №109-005-006), иммобилизованного путем аминного сочетания на СМ5-чипах, и с последующим захватом Fabфрагментов из бактериального супернатанта или из препаратов очищенных Fab-фрагментов. В целом, метод состоял в следующем: биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма GE Healthcare) активировали с помощью гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)) карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Специфическое в отношении человеческого F(ab')2-фрагмента захватывающее антитело разводили 10 мМ ацетатом натрия, рН 5,0 до концентрации 50 мкг/мл перед инъекцией со скоростью потока 10 мкл/мин до получения примерно вплоть до 10000 единиц ответа (RU) сшитого захватывающего антитела. После инъекции захватывающего антитела инъецировали 1М этаноламин для того, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений Fab-фрагменты из бактериального супернатанта или очищенные Fab-фрагменты инъецировали со скоростью потока 10 мкл/мин в течение 300 с и осуществляли диссоциацию в течение 300 с для стабилизации фонового захвата. Уровни захвата находились в пределах 100 - 500 RU. На следующей стадии человеческий или мышиный FAP, представляющий собой анализируемую субстанцию, разведенный в HBS-EP+ (фирма GE Healthcare, 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТК, 0,05% сурфактанта Р20, рН 7,4), инъецировали либо в одной концентрации, либо в виде серий концентраций (в зависимости от аффинности клона в диапазоне от 100 нМ до 250 пМ) при 25°С со скоростью потока 50 мкл/мин. Продолжительность реакции ассоциации составляла 120 или 180 с, продолжительность реакции диссоциации составляла 300-600 с. Поверхность сенсорного чипа регенерировали путем инъекции глицина, рН 1,5 в течение 30 с при скорости потока 90 мкл/мин и последующей инъекцией NaOH в течение 20 с такой же скоростью потока Скорость реакции ассоциации (kon) и скорость реакции диссоциации (koff) рассчитывали с помощью простой (1:1) модели связывания Лэнгмюра (программа BIACORE® T100 Evaluation или программа Scrubber (фирма BioLogic)) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия скорости диссоциации (KD) рассчитывали в виде соотношения koff/kon.
Пример 4. Конструирование библиотеки для созревания аффинности антител к FAP.
Конструировали три библиотеки для созревания аффинности на основе предварительно отобранных антител, полученных при первичных селекциях антител к FAP. Более конкретно их создавали на основе (I) клона 2D9 антитела к FAP (библиотека a.m.FAP2D9) (см. SEQ ID NO: 229 и 231), (II) клона 4В8 антитела к FAP (библиотека a.m.FAP4B8) (см. SEQ ID NO: 233 и 235) и (III) обладающих перекрестной реактивностью клонов 7А1, 13В2, 13С2, 13Е8, 14С10 и 17А11 (библиотека a.m.FAPpool) (см. SEQ ID NO: 237 и 239, соответствующие последовательностям вариабельных областей клона 7А1; SEQ ID NO: 241 и 243, соответствующие последовательностям вариабельных областей клона 13С2; SEQ ID NO: 245 и 247, соответствующие последовательностям вариабельных областей клона 13Е8; SEQ ID NO: 249 и 251, соответствующие последовательностям вариабельных областей клона 14С10; и SEQ ID NO: 253 и 255, соответствующие последовательностям вариабельных областей клона 17А11).
Каждая из указанных библиотек состояла из двух подбиблиотек, в которых были рандомизированы либо CDR1 и CDR2 легкой цепи (L1/L2), либо CDR1 и CDR2 тяжелой цепи (Н1/Н2) соответственно. Указанные подбиблиотеки объединяли при осуществлении трансформации. Каждую из указанных подбиблиотек конструировали с помощью четырех последующих стадий амплификации и сборки.
Для L1/L2-библиотеки протокол амплификации и сборки включал: (I) амплификацию фрагмента 1 (LMB3 - DPK22_CDR1_rand_ba_opt) и фрагмента 2 (DPK22_CDR1_fo - DPK22_Ck_BsiWI_ba); (II) сборку фрагментов 1 и 2 с помощью внешних праймеров LMB3 и DPK22_Ck_BsiWI_ba для создания матрицы для фрагмента 3; (III) амплификацию фрагмента 3 (LMB3 -DPK22_CDR2_rand_ba) и фрагмента 4 (DPK22_CDR2_fo-DPK22_Ck_BsiWI_ba); и (IV) конечную сборку фрагментов 3 и 4 с помощью тех же внешних праймеров, которые указаны выше (см. в табл. 5 последовательности праймеров).
Таблица 5
Праймеры, применяемые в Ы/Е2-библиотеках для созревания аффинности при создании антител к FAP с созревшей аффинностью SEQ ID NO
LMB3 CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC 332
DPK22_CDRl_rand_ba_opt CAGGTTTCTGCTGGTACCAGGCTAAGTAGCTGCT GCTAACACTCTGACTGGCCCTGCAAG 342
DPK22 CDR1 fo TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTG 343.
DPK22 Ck Bs/WI ba GGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCC 344
DPK22_CDR2_rand_ba CTGTCTGGGATGCCAGTGGCCCTGCTGGAGGCG CCATAGATGAGGAGCCTGGGAGCCTG 345
DPK22 CDR2 fo AGGGCCACTGGCATCCCAGACAG 346
- 46 037977
Жирный шрифт: 60% оснований представляют собой исходные основания, а 40% оснований рандомизированы в виде смеси М.
Подчеркнуты: 60% оснований представляют собой исходные основания, а 40% оснований рандомизированы в виде смеси N.
Для Н1/Н2-библиотек протокол амплификации и сборки включал: (I) амплификацию фрагмента 1 (RJH53 - DP47_CDR1_rand_ba_opt) и фрагмента 2 (DP47_CDR1_fo - MS52); (II) сборку фрагментов 1 и 2 с помощью внешних праймеров RJH53 и MS52 для создания матрицы для фрагмента 3; (III) амплификацию фрагмента 3 (RJH53 - DP47_CDR2_rand_ba) и фрагмента 4 (DP47_CDR2_fo - MS52); и (IV) конечную сборку фрагментов 3 и 4 с помощью тех же внешних праймеров, которые указаны выше (см. в табл. 6 последовательности праймеров).
Таблица 6
Праймеры, применяемые в Н1/Н2-библиотеках для созревания аффинности при создании антител к FAP с созревшей аффинностью SEQ ID NO
RJH53 CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC 347
DP47_CDRl_rand_ba_opt GAGCCTGGCGGACCCAGCTCATGGCATAACTGCT AAAGGTGAATCCGGAGGC 348
DP47 CDR1 fo ATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTC 349
MS52 GAAGACCGATGGGCCTTTGGTGCTAG 350
DP47_CDR2_rand_ba CCTTCACGGAGTCTGCGTAGTATGTGCTACCACC ACTACCACTAATAGCTGAGACCCACTCCAGCCCC TTCCC 351
DP47_CDR2_fo ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGG 352
Жирный шрифт: 60% оснований представляют собой исходные основания, а 40% оснований рандомизированы в виде смеси М.
Подчеркнуты: 60% оснований представляют собой исходные основания, а 40% оснований рандомизированы в виде смеси N.
Продукты, полученные после конечной сборки, расщепляли с помощью NcoI/BsiWI в случае L1/L2подбиблиотек a.m.FAP2D9 и a.m.FAP4B8, с помощью MunI и NheI в случае Н1/Н2-подбиблиотек a.m.FAP2D9 и a.m.FAP4B8, а также с помощью NcoI/BamHI в случае L1/L2-библиотеки a.m.FAPpool и с помощью BspEI/PstI в случае Н1/Н2-библиотек a.m.FAPpool соответственно, наряду с обработанными аналогичным образом акцепторными векторами, основой который являлись препараты плазмид, содержащих клоны 2D9, 4В8 или эквимолярную смесь клонов 7А1, 13В2, 13С2, 13Е8, 14С10 и 17А11 соответ ственно. В каждом случае лигировали взятые в указанных ниже количествах расщепленные рандомизированные (частично) V-области и расщепленный(ые) акцепторный(ые) вектор(ы) для соответствующих библиотек (мкг V-области/мкг вектора): a.m.FAP2D9 L1/L2-подбиблиотека (5,7/21,5), a.m.FAP2D9 Н1/Н2-подбиблиотека (4,1/15,5), a.m.FAP4B8 L1/L2-подбиблиотека (6,5/24,5), a.m.FAP4B8 Н1/Н2подбиблиотека (5,7/21,5), a.m.FAPpool L1/L2-подбиблиотека (4,4/20), a.m.FAPpool Н1/Н2-подбиблиотека (3,4/15,5).
Очищенные полученные в результате лигирования подбиблиотеки L1/L2 и Н1/Н2 объединяли и применяли для 60 трансформаций с использованием каждой из трех библиотек для созревания аффинности, получая следующие конечные размеры библиотек: 6,2х109 в случае a.m.FAP2D9, 9,9x109 в случае a.m.FAP4B8 и 2,2 х 109 в случае a.m.FAPpool.
Фагмидные частицы, презентирующие эти Fab-библиотеки, высвобождали (спасали) и очищали с помощью ПЭГ/NaCl для применения для вторичных селекции.
Конструирование дополнительных библиотек для созревания аффинности антител к FAP (на основе клонов 3F2, 3D9, 4G8, 4В3 и 2С6).
Создавали 4 дополнительные библиотеки для созревания аффинности на основе предварительно отобранных обладающих перекрестной реактивностью антител из первой группы антител к FAP с созревшей аффинностью, а именно клонов 3F2, 3D9, 4G8, 4ВЗ и 2С6 (см. SEQ ID NO соответствуют последовательностям вариабельных областей соответствуют последовательностям вариабельных областей соответствуют последовательностям вариабельных областей соответствуют последовательностям вариабельных областей
197, которые
201, которые
207, которые
211, которые
219, которые
195
199
205
209
217 и и и и и клона 3F2; SEQ ID NO клона 3D9; SEQ ID NO клона 4G8; SEQ ID NO клона 4В3; SEQ ID NO соответствуют последовательностям вариабельных областей клона 2С6). Более конкретно основой четырех библиотек являлись 1) клоны антител к FAP 3F2, 4G8 и 4В3 (VH-библиотека с рандомизированными CDR 1 и 2 вариабельной области тяжелой цепи, т.е. Н1/Н2-библиотека), 2) клоны антител к FAP 3D9 и 2С6 (VL-библиотека с рандомизированными CDR 1 и 2 вариабельной области легкой цепи, т.е. L1/L2библиотека), 3) клон антитела к FAP 3F2 (L3-библиотека со слабой рандомизацией CDR3 легкой цепи, т.е. L3-библиотека) и 4) клон антитела к FAP 3F2 (Н3-библиотека со слабой рандомизацией CDR3 тяжелой цепи, т.е. Н3-библиотека). Первые две библиотеки конструировали точно в соответствии с методом, изложенным для первой группы антител к FAP с созревшей аффинностью, т.е. для L1/L2- и Н1/Н2библиотек соответственно. В отличие от этого для L3- и НЗ-библиотек с созревшей аффинностью на ос- 47 037977 нове клона 3F2 применяли два новых праймера для интродукции слабой рандомизации в L3 (AM_3F2_DPK22_L3_ba: CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGT CGGGGGAAGCA TAATACCCTGCT GACAGTAATACACTGC, где из подчеркнутых оснований 60% представляют собой исходные основания, а 40% - смесь N (смесь четырех нуклеотидов А, С, G и Т)) и Н3 (AM_3F2_DP47_H3_fo: GGCCGTATATTACTGTGCG AAA GGG TGG TTT GGT GGT ТТТ ААС TACTGGGGCCAAGGAAC где из подчеркнутых оснований 60% представляют собой исходные основания, а 40% оснований представляют собой смесь N, из выделенных курсивом оснований 60% представляют собой исходные основания, а 40% оснований представляют собой G, а также из подчеркнутых оснований, выделенных курсивом, 60% оснований представляют собой указанные основания, а 40% оснований представляют собой смесь K (смесь двух нуклеотидов G и Т)) родительского клона. Библиотеки имели следующие размеры: Н1/Н2библиотека (1,13х1010), L1/L2-библиотека (5,6х109), L3-библиотека (2,3х1010) и Н3-библиотека (2,64х1010).
Пример 5. Селекция клонов антител к FAP с созревшей аффинностью.
Селекции осуществляли в отношении эктодомена человеческого или мышиного белка активации фибробластов (FAP), который клонировали против хода транскрипции относительно полилизиновой и 6хhis-меткu (см. SEQ ID NO: 317 и 319). Перед осуществлением селекций антигенами сенсибилизировали иммунопробирки в концентрации либо 10, либо 5, либо 2 мкг/мл в зависимости от библиотеки и цикла селекции. Селекции осуществляли согласно следующему протоколу: (I) связывание ~1012 фагмидных частиц библиотеки a.m.FAP2D9, a.m.FAP4B8 или a.m.FAPpool с иммобилизованным человеческим или мышиным FAP в течение 2 ч; (II) отмывка иммунопробирок с использованием 10-20x5 мл ЗФР/Твин 20 и 10-20х5 мл ЗФР (в зависимости от библиотеки и цикла селекции); (III) элюция фаговых частиц путем добавления 1 мл 100 мМ ТЭА (триэтиламин) в течение 10 мин и нейтрализация путем добавления 500 мкл 1М Трис/HCl, рН 7,4; и (IV) повторное заражение находящихся на log-фазе клеток Е. coli линии TG1, заражение фагом-хелпером VCSM13 и последующее осаждение с помощью ПЭГ/NaCl фагмидных частиц, применяемых в последующих циклах селекции.
Селекции осуществляли с применением двух циклов и условия регулировали для каждой из трех библиотек индивидуально. Более детально, параметры селекции были следующими: a.m.FAP2D9 (5 мкг/мл человеческого FAP и 20 отмывок в целом для цикла 1, 1 мкг/мл человеческого FAP и 30 отмывок в целом для цикла 2), a.m.FAP4B8 (1 мкг/мл мышиного FAP и 30 отмывок в целом для цикла 1, 0,2 мкг/мл человеческого FAP и 40 отмывок в целом для цикла 2) и a.m.FAPpool (5 мкг/мл человеческого FAP и 30 отмывок в целом для цикла 1, 5 мкг/мл мышиного FAP и 30 отмывок в целом для цикла 2). Специфические связывающие агенты определяли по наличию сигналов, в 5 раз превышающих фоновый сигнал, и идентифицировали с помощью ELISA. Планшеты Maxisorp фирмы NUNC сенсибилизировали 1 мкг/мл или 0,2 мкг/мл человеческого или мышиного FAP с последующим добавлением содержащих Fabфрагменты супернатантов бактерий и определяли специфическое связывание Fab-фрагментов посредством их Flag-меток, используя в качестве вторичного антитела антитело к Flag/HRP.
Позитивные по данным ELISA клоны экспрессировали в бактериях в виде 1-миллилитровых культур в 96-луночном формате и супернатанты подвергали скринингу в отношении кинетических характеристик с использованием устройства BIACORE T100 согласно описанному выше методу (см. пример 3).
Дополнительная селекция клонов антител к FAP с созревшей аффинностью.
Селекции осуществляли в отношении эктодомена человеческого или мышиного белка активации фибробластов (FAP), который клонировали против хода транскрипции относительно 6хлизиновой и 6xhis-метки (см. SEQ ID NO: 317 и 319). Перед осуществлением селекции антигенами сенсибилизировали иммунопробирки в концентрации либо 1, либо 0,2 , либо 0,02 мкг/мл в зависимости от библиотеки и цикла селекции. Селекции и основанный на применении ELISA скрининг осуществляли согласно методу, описанному для первой группы антител к FAP с созревшей аффинностью. Вторичный скрининг осуществляли с использованием биосенсора ProteOn XPR36 (фирма Biorad) и константы скорости реакции и аффинность определяли, анализируя препараты Fab с созревшей аффинностью с использованием этого же инструмента. Величины KD оценивали с помощью резонанса поверхностного плазмона, используя устройство ProteOn XPR36 (фирма Biorad), при 25°С с применением специфического в отношении человеческого F(ab')2-фрагмента захватывающего антитела (фирма Jackson ImmunoResearch, №109-005006), иммобилизованного на GLM-чипах, и с последующим захватом Fab-фрагментов из бактериального супернатанта или из препаратов очищенных Fab-фрагментов. В целом, метод состоял в следующем: биосенсорные GLM-чипы (фирма Biorad) активировали в течение 5 мин с помощью гидрохлорида Nэтил-N'-(3-диметиламинопропил))карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS). Специфическое в отношении человеческого F(αb')2-фрагмента захватывающее антитело разводили с помощью 10 мМ ацетата натрия, рН 5,0 до концентрации 24 мкг/мл перед инъекцией в течение 5 мин до получения примерно вплоть до 10000 единиц ответа (RU) сшитого захватывающего антитела. После инъекции захватывающего антитела инъецировали 1M этаноламин для того, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений Fab-фрагменты из бактериального супернатанта инъецировали со скоростью потока 30 мкл/мин в течение 100 с. Уровни захвата находились в пределах 250 RU.
- 48 037977
На следующей стадии инъецировали серийные разведения человеческого, мышиного FAP или FAP обезьян циномолгус в качестве анализируемого вещества (двукратное разведение, наиболее высокая концентрация 25 нМ), разведенные в ЗФР / 0,005% Твин-20, при 25°С со скоростью потока 50 мкл/мин. Продолжительность реакции ассоциации составляла 240 с, продолжительность реакции диссоциации составляла 600-1800 с. Поверхность сенсорного чипа регенерировали путем инъекции 0,85% Н3РО4 в течение 30 с со скоростью потока 100 мкл/мин с последующей инъекцией 50мМ NaOH в течение 30 с такой же скоростью потока. Скорость реакции ассоциации (kon) и скорость реакции диссоциации (koff) рассчитывали с помощью простой (1:1) модели связывания Лэнгмюра (программа ProteOn manager, версия 2.1) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия скорости диссоциации (KD) рассчитывали в виде соотношения koff/kon.
Идентифицировали следующее клоны с созревшей аффинностью: 19G1 (см. SEQ ID NO: 257 и 259), 20G8 (см. SEQ ID NO: 281 и 263), 4В9 (см. SEQ ID NO: 265 и 267), 5В8 (см. SEQ ID NO: 269 и 271), 5F1 (см. SEQ ID NO: 273 и 275), 14В3 (см. SEQ ID NO: 277 и 279), 16F1 (см. SEQ ID NO: 281 и 283), 16F8 (см. SEQ ID NO: 285 и 287), ОЗС9 (см. SEQ ID NO: 289 и 291), 22АЗ (см. SEQ ID NO: 301 и 303) и 29В11 (см. SEQ ID NO: 305 и 307) (все эти клоны отбирали из Н1/Н2-библиотеки и получали из родительского клона 3F2), O2D7 (см. SEQ ID NO: 293 и 295) (отобран из L3-библиотеки, основой которой является родительский клон 3F2) и 28Н1 (см. SEQ ID NO: 297 и 299) и 23С10 (см. SEQ ID NO: 309 и 311 из табл. 3) (эти два клона отбирали из Н1/Н2-библиотеки и получали из родительского клона 4G8).
На фиг. 1-5 представлены сенсограммы, полученные методом резонанса поверхностного плазмона, для отобранных Fab-фрагментов с созревшей аффинностью, которые связываются с иммобилизованным FAP, а в табл. 7 представлены соответствующие значения аффинности. Отобранные Fab характеризовались аффинностью в широком диапазоне от пикомолярных до наномолярных значений и обладали перекрестной реактивностью к человеческому (hu) и мышиному (mu) FAP, а также FAP обезьяны циномолгус (cyno), по данным, полученным для отобранных клонов. Для анализа специфичности Fab-фрагменты с созревшей аффинностью, связывающиеся с FAP, превращали в формат Fab-IL2-Fab и в антитела типа IgG. Наличие специфичности связывания подтверждали по отсутствию связывания с белком DPPIV, близким гомологом FAP, при его экспрессии на HEK293- или СНО-клетках (см. пример 9).
Таблица 7. Обобщение данных о кинетических константах равновесия реакций (KD) антител к FAP с созревшей аффинностью в виде Fab-фрагментов (одновалентное связывание)
Антитело Аффинность (KD) к hu FAP [пМ] Аффинность (KD) к mu FAP [пМ] Аффинность (KD) к су no FAP [пМ]
19G1 76 2600 n.d.
20G8 69 2800 n.d.
4В9 157 3300 n.d.
5B8 690 3200 n.d.
5F1 243 4100 n.d.
14B3 377 3800 n.d.
16F1 193 3400 n.d.
16F8 301 3800 n.d.
ОЗС9 160 3700 n.d.
O2D7 619 8300 n.d.
28Н1 200 9 3600
22АЗ 34 655 522
29B11 35 436 23
23С10 1600 125 990
Пример 6. Конверсия в формат IgG Fab-фрагментов, связывающихся с FAP.
Родительские Fab-фрагменты 3F2, 4G8 и 3D9 и производные Fab с созревшей аффинностью 3F2 и 4G8 превращали в формат человеческого IgG1, формат мышиного IgG2a и формат человеческого IgG1.
Последовательности ДНК тяжелых и легких цепей полноразмерных антител получали либо путем субклонирования вариабельных областей в рамке считывания с соответствующей константной областью тяжелой цепи и константной областью легкой цепи, которые предварительно встраивали в различные экспрессионные векторы-реципиенты млекопитающих, либо рекомбинантно путем слияния короткого сегмента последовательности, гомологичного сайту встраивания векторов-реципиентов. Рекомбинацию осуществляли согласно руководству In-Fusion Cloning System фирмы Invitrogen.
Во всех векторах экспрессия антитела находилась под контролем промотора MPSV, и все векторы несли синтетическую сигнальную последовательность поли-А-хвоста на 3'-конце CDS. Кроме того, каждый вектор содержал OriP-последовательность EBV.
Пример 7. Biacore-анализ антител к FAP типа IgG.
Далее определяли и сравнивали аффинность связывающихся с FAP Fab-фрагментов 3F2, 4G8 и 3D9, а также антител к FAP, полученных в результате конверсии в человеческий IgG, в отношении FAP чело
- 49 037977 века, мышей и обезьян циномолгус с помощью анализа на основе резонанса поверхностного плазмона, (SPR), который осуществляли при 25°С с использованием устройства BIACORE® T100 (фирма GE Healthcare). Для этой цели внеклеточный домен FAP человека, мышей или обезьян циномолгус (SEQ ID NO: 317-322) захватывали с помощью иммобилизованного антитела к His (Penta His, фирма Qiagen, № 34660), а антитела использовали в качестве анализируемого вещества. Для иммобилизации биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма GE Healthcare) активировали с помощью гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламиноnропил)) карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антитело Penta His разводили 10 мМ ацетатом натрия, рН 5,0 до концентрации 40 мкг/мл перед инъекцией со скоростью потока 10 мкл/мин до получения примерно вплоть до 9000 единиц ответа (RU) сшитого белка. После инъекции лиганда инъецировали 1М этаноламин для того, чтобы блокировать непрореагировавшие группы.
Для кинетических измерений внеклеточный домен FAP человека, мышей или обезьян циномолгус инъецировали со скоростью 10 мкл/мин в концентрации 10 нМ в течение 20 с (в случае Fab-фрагментов) или 20 нМ в течение 25 с (в случае IgG) и захватывали через их His-метку с помощью иммобилизованного антитела Penta His. Серийные разведения антитела (двукратные разведения от 6,25 до 200 нМ в случае Fab-фрагментов или пятикратные разведения от 3,2 пМ до 10 нМ в случае IgG) инъецировали в HBSEP+ (фирма GE Healthcare, 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТК, 0,05% сурфактанта Р20, рН 7,4) при 25°С со скоростью потока 90 мкл/мин. Использовали следующие параметры: продолжительность реакции ассоциации 180 с, диссоциации - 300 с (в случае Fab) или 900 с (в случае IgG), регенерация 10 мМ глицином, рН 2 в течение 60 с между каждым циклом. Скорость реакции ассоциации (kon) и скорость реакции диссоциации (kof) рассчитывали с помощью простой (1:1) модели связывания Лэнгмюра (программа BIACORE® T100, версия 1.1.1) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации (модельные параметры включали локальное значение Rmax и RI=0). Константу равновесия скорости диссоциации (KD) рассчитывали, как соотношение koff/kon.
Характеризующие связывание значения KD представлены в табл. 8. На фиг. 6 А-В представлены соответствующие результаты анализов кинетических характеристик, полученные с помощью SPR, для Fabфрагментов, на фиг. 7 А-В для антител типа IgG.
Таблица 8. Обобщение данных о кинетических константах равновесия реакций (KD) антител к FAP 3F2,
4G8 и 3D9 в виде Fab-фрагментов и в виде IgG
Конструкция Человеческий FAP Мышиный FAP Су no FAP
IgG 3F2 Авидность: 39пМ Авидность: 29пМ Авидность: 42пМ
IgG 4G8 Авидность: 51пМ Авидность: 1пМ Авидность: 59пМ
IgG 3D9 Авидность: 93пМ Авидность: 96пМ Авидность: 96пМ
Fab-фрагмент 3F2 Аффинность: 13нМ Аффинность: 14нМ Аффинность: ПнМ
Fab-фрагмент 4G8 Аффинность: 74нМ Аффинность: 7нМ или менее Аффинность: 56нМ
Fab-фрагмент 3D9 Аффинность: 133 пМ Аффинность: 32нМ Аффинность: 143нМ
Пример 8. Связывание антител к FAP 3F2, 4G8 и 3D9, изученное на срезах тканей человеческих опухолей.
Осуществляли эксперименты по выявлению и сравнению экспрессии FAP в свежезамороженных тканях человеческих опухолей (ткани рака молочной железы, аденокарциномы ободочной кишки и NSCLC) с использованием антител клонов 3F2,4G8 и 3D9 в виде мышиного IgG2a.
Применяли один микромассив свежезамороженных тканей (ТМА) (AST 274), в который входили образцы тридцати различных опухолей по два пятна для каждой, который получали из банка опухолей Roche TRS Pathology & Tissue Biomarkers. В ТМА входили 10 инвазивных карцином протоков молочной железы, 10 колоректальных карцином и 10 образцов немелкоклеточного рака легкого, полученных от фирмы Asterand Ltd, Ройстон, Великобритания.
Для иммуногистохимического окрашивания (ИГХ) использовали следующие антитела: моноклональное мышиное антитело к человеческому FAP, клон 3F2 (15,8 нг/мл, разведенное в разбавителе для антител фирмы Ventana), моноклональное мышиное антитело к человеческому FAP, клон 4G8 (1000 нг/мл, разведенное в разбавителе для антител фирмы Ventana) и моноклональное мышиное антитело к человеческому FAP, клон 3D9 (1000 нг/мл, разведенное в разбавителе для антител фирмы Ventana). Поликлональный мышиный IgG2a, концентрация 100 мкг/мл (поставщик: фирма DAKO, X0943, лот № 00058066) применяли для контроля изотипа.
Окрашивание осуществляли согласно стандартным протоколам на устройстве Ventana Benchmark XT, используя набор для обнаружения Ventana Ultra-View с HRP-системой для обнаружения (содержащей универсальный мультиметр HRP (Universal HRP Multimer) и DAB для окрашивания). Контрастное окрашивание осуществляли с помощью гематоксилина II (фирма Ventana, гематоксилин Майера) и реа- 50 037977 гента Blueing (фирма Ventana) в течение 8 мин.
ТМА анализировали полуколичественно и оценивали общий уровень экспрессии FAP (интенсивность окрашивания), а также локализацию экспрессии FAP в опухолевой ткани.
При применении всех трех антител к FAP во всех образцах опухолевых тканей (рак молочной железы, колоректальный рак и рак легкого), которые можно было оценивать, обнаружена интенсивность сигнала окрашивания FAP от средней до высокой в стромальном компоненте опухоли. Удалось оценить с помощью антител по меньшей мере 7 из 10 образцов каждой опухоли. Остальные образцы не удалось оценить, поскольку центральная масса ткани включала складчатые артефакты, включающие только здоровую ткань, или отсутствовала.
Как и ожидалось, сигнал FAP по-разному локализовался в стромальном компоненте опухолей. Обнаружено небольшое различие в интенсивности сигнала между клоном 3F2 и клонами 3D9 и 4G8. Несколько более сильный сигнал обнаружен при применении клонов 3D9 и 4G8, однако различие было очень небольшим.
На фиг. 8 А-Г представлены репрезентативные микрофотографии образцов тканей человеческих опухолей, которые иммуногистохимически окрашивали в отношении FAP с использованием мышиных антител к FAP типа IgG2a клонов 3F2, 3D9 или 4G8 или применяемого в качестве контроля изотипа антитела.
Пример 9. Связывание антител к FAP с FAP на клетках.
Связывание человеческих антител типа IgG1 клонов 3F2, 4В3 и 4G8 с человеческим и мышиным FAP, экспрессируемым на стабильно трансфектированных клетках HEK293, измеряли с помощью FACS. В целом, метод состоял в следующем: 150000 клеток на лунку инкубировали с взятыми в указанных концентрациях антителами к FAP 3F2, 4В3 и 4G8 в круглодонном 96-луночном планшете в течение 30 мин при 4°С и отмывали однократно ЗФР/0,1% БСА. Связанное антитело выявляли с помощью конъюгированного с ФИТЦ F(ab')2-фрагмента козьего античеловеческого антитела AffiniPure, F(ab')2специфического (фирма Jackson Immuno Research Lab, №109-096-097, используя следующий рабочий раствор: разведенная в соотношении 1:20 смесь ЗФР/0,1% БСА, свежеприготовленная) после инкубации в течение 30 мин при 4°С, применяя устройство FACS CantoII (программа FACS Diva). Результаты представлены на фиг. 9. Определяли значения EC50 при связывании, составляющем половину от максимального, которые характеризовали связывание с человеческим или мышиным FAP, и они представлены в табл. 9.
Таблица 9. Связывание антител к FAP с FAP на клетках (значения ЕС50)
Значения ЕС50 на клетках [нМ]
Человеческий FAP Мышиный FAP
3F2 IgG 4,8 1,0
4ВЗ IgG 5,5 1,6
4G8 IgG 5,0 1,7
Специфичность антител к FAP.
Для оценки специфичности связывания полученных на основе фагового дисплея антител связывание с клетками HEK293, стабильно экспрессирующими DPPIV (близкий гомолог FAP, который экспрессируется в здоровых тканях) или HER2, оценивали для антител к FAP типа человеческого IgG1 клонов 3F2, 4В3 и 4G8. В целом, метод состоял в следующем: 200000 клеток на лунку (HEK293-DPPIV или в качестве контроля HEK293-HER2) инкубировали с 30 мкг/мл антител к FAP 3F2, 4В3 или 4G8 в круглодонном 96-луночном планшете в течение 30 мин при 4°С и отмывали однократно ЗФР/0,1 % БСА. В качестве положительных контролей использовали трастузумаб (антитело к HER2) или конъюгированное с фикоэритрином (ФЭ) мышиное античеловеческое антитело к CD26/DPPIV (CD26 = DPPIV, мышиный IgG1, к, фирма BD Biosciences, №555437, клон М-А261). Связанное антитело выявляли с помощью конъюгированного с ФЭ F(ab')2-фрагмента козьего античеловеческого антитела AffmiPure типа IgG, Fcyспецифического (фирма Jackson Immuno Research Lab, № 109-116-170, используя следующий рабочий раствор: разведенная в соотношении 1:20 смесь ЗФР/0,1% БСА, свежеприготовленная) после инкубации в течение 30 мин при 4°С, применяя устройство FACS CantoII (программа FACS Diva). Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 10. Ни у одного из антител к FAP не выявлено выраженное связывание с DPPIV или HER2, их сигналы находились в диапазоне, соответствующем отрицательным контролям (только вторичное антитело, применяемое в качестве контроля изотипа антитело или вариант без антитела).
Связывание антител к FAP с FAP на человеческих фибробластах Связывание человеческих антител типа IgG1 с человеческим FAP, экспрессируемым на линии клеток человеческих фибробластов GM05389 (получена из легкого человеческого плода, National Institute of General Medical Sciences, Камден, шт. Нью-Джерси), оценивали с помощью FACS. В целом, метод состоял в следующем: 200000 клеток на лунку инкубировали с 30 мкг/мл антител к FAP 3F2 или 4G8 в круглодонном 96-луночном планшете в течение 30 мин при 4°С и однократно отмывали ЗФР/0,1% БСА. Связанное антитело выявляли с помощью конъюгированного с ФИТЦ F(ab')2-фрагмента козьего античеловеческого антитела AffiniPure типа
- 51 037977
IgG, FcY-специфического (фирма Jackson Immuno Research Lab, № 109-096-098, используя следующий рабочий раствор: разведенная в соотношении 1:20 смесь ЗФР/0,1% БСА, свежеприготовленная) после инкубации в течение 30 мин при 4°С, применяя устройство FACS CantoII (программа FACS Diva). Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 11. Оба антитела к FAP сильно связывались с FAP, экспрессируемым на человеческих фибробластах.
Связывание антител к FAP с FAP на человеческих опухолевых клетках.
Связывание человеческих антител типа IgG1 с человеческим FAP, экспрессируемым на линии клеток человеческих фибробластов GM05389 и на стабильно трансфектированных клетках HEK293 сравнивали с экспрессией FAP на человеческих линиях раковых клеток ACHN, Colo205, MDA-MB231, MDAМВ435 и KPL4 с помощью FACS.
В целом, метод состоял в следующем: 200000 клеток на лунку инкубировали с 10 мкг/мл антител к FAP 3F2 или 4G8 в круглодонном 96-луночном планшете в течение 30 мин при 4° С и однократно отмывали ЗФР/0,1% БСА. Связанное антитело выявляли с помощью конъюгированного с ФИТЦ F(ab')2фрагмента козьего античеловеческого антитела AffiniPure типа IgG, F(ab')2-специфического (фирма Jackson Immuno Research Lab, № 109-096-097, используя следующий рабочий раствор: разведенная в соотношении 1:20 смесь ЗФР/0,1% БСА, свежеприготовленная) после инкубации в течение 30 мин при 4°С, применяя устройство FACS CantoII (программа FACS Diva). Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 12. Данные свидетельствуют о том, что антитела 3F2 и 4G8 связываются специфически с FAP, для которого характерна выраженная сверхэкспрессии на фибробластах, и на стабильно трансфектированных клетках HEK293; однако лишь слабое связывание можно обнаружить при использовании линий человеческих опухолевых клеток ACHN, Colo205, MDA-MB231, MDA-MB435 и KPL4.
Пример 10. Анализ с помощью FACS интернализации FAP при связывании с антителом к FAP.
Для нескольких известных в данной области антител к FAP описана способность индуцировать интернализацию FAP при связывании (например, описано у Baum и др., J Drug Target 15, 2007, сс. 399-406; Bauer и др., Journal of Clinical Oncology, 2010, труды ежегодной конференции ASCO (издание после конференции), т. 28 (приложение от 20 мая), реферат №. 13062 (2010); Ostermann и др., Clin Cancer Res 14, 2008, сс. 4584-4592).
Поэтому при создании изобретения анализировали способность вызывать интернализацию антител, предлагаемых в изобретении. В целом, метод состоял в следующем: клетки линии GM05389 (фибробласты человеческого легкого), которые культивировали в среде ЕМЕМ + 15% FCS, отделяли, промывали, подсчитывали, оценивали жизнеспособность и высевали с плотностью 0,2 млн клеток/лунку в 12луночные планшеты. На следующий день антитела к FAP 4G8 и 3F2 (фиг. 13А) или только 4G8 (фиг. 13Б) разводили до концентрации 10 мкг/мл в холодной среде, клетки охлаждали на льду и добавляли соответственно разведенные антитела (0,5 мл/лунку) или только среду. Затем клетки инкубировали в течение 30 мин в холодной комнате при острожном встряхивании, после чего добавляли 0,5 мл теплой среды и дополнительно инкубировали клетки при 37°С в течение указанных периодов времени. Через различные промежутки времени клетки переносили на лед, отмывали однократно холодным ЗФР и инкубировали с 0,4 мл вторичного антитела (конъюгированнный с Alexa Fluor 633 козий античеловеческий IgG, фирма Molecular Probes, № А-21091, 2 мг/мл, для применение разведение 1:500) в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки отмывали дважды ЗФР/0,1% БСА, переносили в 96-луночный планшет, центрифугировали в течение 4 мин при 4°С, 400xg и клеточный дебрис ресуспендировали путем интенсивного перемешивания. Клетки фиксировали с помощью 100 мкл 2% ПФА (параформальдегид). Для оценки с помощью FACS клетки ресуспендировали в 200 мкл/образец ЗФР/0,1% БСА и количественно анализировали с помощью протокола для планшетов на устройстве FACS CantoII (программа FACS Diva). Результаты этих экспериментов представлены на фиг. 13 А и Б, и они демонстрируют, что антитела к FAP 4G8 и 3F2 не индуцируют интернализацию FAP на фибробластах.
Анализ интернализации FAP при связывании с антителом к FAP путем иммунофлуоресценции.
Клетки линии GM05389 (фибробласты человеческого легкого) выращивали на стеклянных покровных стеклах в среде ЕМЕМ + 15% FCS. Перед обработкой клетки отмывали трижды ЗФР и выращивали в минимальной среде ЕМЕМ + 0,1% БСА в течение 2 ч. Антитело к FAP (4G8 в виде IgG) или антитело к CD20 (GA101, применяемое в качестве контроля изотипа) разводили в холодной среде ЕМЕМ до конечной концентрации 10 мкг/мл. После выдерживания в минимальной среде клетки охлаждали на льду, дважды промывали холодным ЗФР и инкубировали с разведенными антителами (0,5 мл/лунку) в течение 45 мин при 4°С при постоянном перемешивании, позволяя связываться с поверхностью. Затем клетки отмывали дважды холодным ЗФР и либо фиксировали холодным ПФА (Т0, параформальдегид, 4% в ЗФР, рН 7,4), либо дополнительно инкубировали при 37°С в течение 20 мин, 1 ч, 3 чи6 чв среде ЕМЕМ + 10% FCS. В каждый указанный момент времени клетки отмывали дважды холодным ЗФР и фиксировали ПФА в течение 20 мин на льду. После фиксации клетки отмывали 4 раза холодным ЗФР, повышали проницаемость с помощью 0,03% тритона и инкубировали с антителом к ЕЕА1 (маркер ранних эндосом) в течение 45 мин при комнатной температуре в блокирующем буфере (ЗФР + 10% FCS). Затем клетки отмывали трижды ЗФР и инкубировали с флуросцентно меченными вторичными антителами (ослиное ан- 52 037977 тимышиное антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 594, и козье античеловеческое антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 488) при комнатной температуре в течение еще 45 мин. Клетки окончательно промывали и приготавливали препараты на предметных стеклах, используя заливочную среду Immuno
Mount.
На фиг. 14 А-Г представлены репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения, демонстрирующие окрашивание FAP плазматических мембран на фибробластах легкого линии GM05389, полученные после связывания антитела к FAP 4G8 в виде IgG в течение 45 мин при 4°С (А), в течение 20 мин при 37°С (Б), в течение 1 ч при 37°С (В) или в течение 6 ч при 37°С (Г). Для антитела к CD20 GA101, которое применяли в качестве контроля изотипа, обнаружено фоновое окрашивание. ЕЕА1 метит ранние эндосомы. Следует отметить сохранение окрашивание FAP поверхности плазматической мембраны вплоть до 6 ч после связывания с антителом к FAP 4G8.
Пример 11. Biacore-анализ антител к FAP типа IgG с созревшей аффинностью.
Антитела к FAP в виде Fab-фрагментов с созревшей аффинностью, выведенные из 3F2 и 4G8, конвертировали в кроличьи антитела в виде IgG. Затем оценивали аффинность к FAP конвертированных из антител с созревшей аффинностью 3F2 и 4G8 кроличьих антител к FAP типа IgG1 и изучали для FAP человека, мышей и обезьян циномолгус с помощью SPR-анализа при 25°С (Biacore-анализ). Для этой цели внеклеточный домен FAP человека, мышей и обезьян циномолгус (SEQ ID NO: 317-322) захватывали с помощью иммобилизованного антитела к His (Penta His, фирма Qiagen, № 34660) и антитела применяли в качестве анализируемых субстанций. IgG разводили в соотношении 1:5, начиная с концентрации 10 нМ, до концентрации 3,2 пМ. Использовали следующие параметры: продолжительность реакции ассоциации 180 с, продолжительность реакции диссоциации 900 с, скорость потока 90 мкл/мин. Регенерация с помощью 10 мМ глицина, рН 2 в течение 60 с. Кривые аппроксимировали с помощью модели 1:1, получая значения KD (локальное значение Rmax, RI=0).
Пример 12. Связывание антител к FAP с созревшей аффинностью с FAP на клетках.
Связывание человеческого антитела с созревшей аффинностью типа IgG1, такого как 28Н1, меченного А1еха-647 (1,89 мг/мл, 1,83 моля красителя /моль белка), которое получали из родительского антитела 4G8, с человеческим FAP, экспрессируемым на стабильно транфектированных клетках HEK293, оценивали количественно с помощью FACS. В целом, метод состоял в следующем: 200000 клеток на лунку инкубировали с взятыми в указанных концентрациях 2 мкг/мл и 10 мкг/мл родительским антителом 4G8 и антителом к FAP с созревшей аффинностью 28Н1 в круглодонном 96-луночном планшете, инкубировали в течение 30 мин при 4°С и отмывали однократно ЗФР/0,1% БСА. Связанное антитело выявляли после инкубации в течение 30 мин при 4°С, используя устройство FACS CantoII (программа FACS Diva). Полученные результаты демонстрируют, что для обоих антител характерно сильное связывание с клетками HEK293, трансфектированными человеческим FAP (фиг. 23).
Пример 13. Связывание антител к FAP с созревшей аффинностью с FAP на человеческих фибробластах.
Связывание антител с созревшей аффинностью типа IgG1, выведенных из 3F2, с человеческим FAP, экспрессируемым на клеточной линии человеческих фибробластов GM05389 (получена из легкого человеческого плода, National Institute of General Medical Sciences, Камден, шт. Нью-Джерси), оценивали с помощью FACS. В целом, метод состоял в следующем: 200000 клеток на лунку инкубировали с 30 мкг/мл антитела к FAP с созревшей аффинностью 3F2 в круглодонном 96-луночном планшете в течение 30 мин при 4°С и однократно отмывали ЗФР/0,1% БСА. Связанное антитело выявляли с помощью конъюгированного с ФИТЦ F(ab')2-фрагмента козьего античеловеческого антитела AffmiPure типа IgG, Fcyспецифического (фирма Jackson Immuno Research Lab, № 109-096-098, используя следующий рабочий раствор: разведенная в соотношении 1:20 смесь ЗФР/0,1% БСА, свежеприготовленная) после инкубации в течение 30 мин при 4°С, применяя устройство FACS CantoII (программа FACS Diva). Определяли значения ЕС50 при связывании, составляющем половину от максимального, которые характеризовали связывание с человеческим и мышиным FAP.
Пример 14. Антитело-обусловленная клеточно-зависимая цитотоксичность, связанная с созданными с помощью гликоинженерии антителами к FAP типа IgG1.
Человеческие антитела к FAP типа IgG1, выведенные из 4G8 или 3F2, создавали путем гликоинженерии посредством котрансфекции плазмидами, кодирующими GnTIII и ManII, согласно методу, описанному в примере 1. Затем созданные с помощью гликоинженерии родительские антитела 4G8 и 3F2 и антитело с созревшей аффинностью 28Н1 в виде человеческого IgG1 сравнивали с помощью ADCCанализа в отношении их способности опосредовать повышенную антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность по сравнению с их не подвергнутыми гликоинженерии версиями дикого типа.
В целом, метод состоял в следующем: собирали в качестве клеток-мишеней HEK293-клетки, стабильно трансфектированные человеческим FAP, отмывали и ресуспендировали с культуральной среде, окрашивали свежеприготовленным кальцеином AM (фирма Molecular Probes) при 37°С в течение 30 мин, отмывали трижды, подсчитывали количество клеток и разводили до 300000 клеток/мл. Эту суспензию переносили в круглодонный 96-луночный планшет (=30000 клеток/мл), добавляли разведение соответст- 53 037977 вующего антитела и инкубировали в течение 10 мин для облегчения связывания тестируемого антитела с клетками до контакта с эффекторными клетками. Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней составляло 25:1 в случае РВМС. Совместную инкубацию осуществляли в течение 4 ч. В качестве выходных данных определяли высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH) в супернатанте после расщепления атакуемых клеток. LDH из супернатанта совместной культуры собирали и анализировали с помощью набора для выявления LDH (фирма Roche Applied Science). Превращение субстрата с помощью фермента LDH измеряли с использованием ридера абсорбции для ELISA (программа SoftMaxPro, длины референсволн: 490 нм, 650 нм). Как продемонстрировано на фиг. 24 все тестируемые антитела к FAP обладали способностью индуцировать ADCC в отношении клеток HEK293-hFAP. Созданные с помощью гликоинженерии версии (ge) обладали всегда более выраженной активностью по сравнению с соответствующей не подвергнутой гликоинженерии версией дикого типа (wt).
Хотя изобретение выше описано достаточно подробно с помощью иллюстраций и примеров, приведенных для целей лучшего понимания, описание и примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Все процитированные в настоящем описании патентные и научные публикации полностью включены в него в качестве ссылки.

Claims (22)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антитело, которое специфически связывается с белком активации фибробластов (FAP), где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 299, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 297.
  2. 2. Антитело по п.1, где указанное антитело содержит Fc-область.
  3. 3. Антитело по п.2, где указанная Fc-область представляет собой Fc-область IgG.
  4. 4. Антитело по любому из пп.1-3, где указанное содержит Fc-область человеческого IgG.
  5. 5. Антитело по любому из пп.1-4, где указанное антитело представляет собой полноразмерное антитело класса IgG.
  6. 6. Антитело по любому из пп.1-5, где указанное антитело содержит константную область человеческого антитела.
  7. 7. Антитело по пп.1-6, где указанное антитело представляет собой человеческое антитело.
  8. 8. Антитело по п.1, где указанное антитело представляется собой фрагмент антитела, выбранный из группы, включающей фрагмент scFv, фрагмент Fv, фрагмент Fab и фрагмент F(ab')2.
  9. 9. Выделенный полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела и лёгкую цепь антитела по любому из пп.1-8.
  10. 10. Композиция для получения антитела по любому из пп.1-8, которая содержит первый выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, который содержит последовательность SEQ ID NO: 299, и второй выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, который содержит последовательность SEQ ID NO: 297.
  11. 11. Вектор для экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела, содержащий полинуклеотид по п.9.
  12. 12. Клетка-хозяин для получения антитела по любому из пп.1-8, содержащая полинуклеотид по п.9, композицию п. 10, или вектор по п.11.
  13. 13. Способ получения антитела по любому из пп.1-8, где указанный способ включает:
    a) культивирование клетки-хозяина по п.12 в среде и в условиях, которые обеспечивают экспрессию антитела, и
    b) выделение антитела.
  14. 14. Антитело, которое специфически связывается с FAP, где указанное антитело получают способом по п.13.
  15. 15. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, характеризующихся экспрессией FAP, содержащая антитело по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.
  16. 16. Применение антитела по любому из пп.1-8 для производства лекарственного средства для лечения заболевания, отличающегося экспрессией FAP.
  17. 17. Применение по п. 16, где указанное заболевание представляет собой рак.
  18. 18. Применение антитела по любому из пп.1-8 для производства лекарственного средства, предназначенного для индукции лизиса опухолевой клетки или стромальной клетки опухоли.
  19. 19. Способ лечения индивидуума, страдающего заболеванием, которое отличается экспрессией FAP, включающий введение индивидууму в эффективном количестве антитела по одному из пп.1-8 или фармацевтической композиции по п.15.
  20. 20. Способ по п.19, где указанное заболевание представляет собой рак.
  21. 21. Способ индукции клеточного лизиса опухолевой клетки или стромальной клетки опухоли, где указанный способ включает контактирование опухолевой клетки или стромальной клетки с антителом по любому из пп.1-8.
  22. 22. Способ диагностирования заболевания, которое отличается экспрессией FAP, у индивидуума,
    - 54 037977 где указанный способ включает введение индивидууму в эффективном количестве диагностического агента, где указанный диагностический агент содержит антитело по одному из пп.1-8 и метку, которая позволяет выявлять комплекс, включающий диагностическое агента и FAP, и где указанное заболевание является раком или воспалительным процессом.
EA201790309A 2010-08-13 2011-08-09 Антитела к fap, способы их получения и применения EA037977B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10172842 2010-08-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201790309A1 EA201790309A1 (ru) 2017-06-30
EA037977B1 true EA037977B1 (ru) 2021-06-18

Family

ID=44629814

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300239A EA034742B1 (ru) 2010-08-13 2011-08-09 Антитела к fap, полинуклеотид, вектор и клетка для их получения и их применения
EA201790309A EA037977B1 (ru) 2010-08-13 2011-08-09 Антитела к fap, способы их получения и применения

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300239A EA034742B1 (ru) 2010-08-13 2011-08-09 Антитела к fap, полинуклеотид, вектор и клетка для их получения и их применения

Country Status (37)

Country Link
US (5) US9011847B2 (ru)
EP (2) EP3333194B1 (ru)
JP (4) JP5793568B2 (ru)
KR (2) KR101673653B1 (ru)
CN (2) CN105884898B (ru)
AR (2) AR082629A1 (ru)
AU (1) AU2011288487B2 (ru)
BR (1) BR112013003361B8 (ru)
CA (1) CA2806021C (ru)
CL (2) CL2013000369A1 (ru)
CO (1) CO6670523A2 (ru)
CR (2) CR20180142A (ru)
DK (1) DK2603530T3 (ru)
EA (2) EA034742B1 (ru)
EC (1) ECSP13012440A (ru)
ES (1) ES2655616T3 (ru)
HK (1) HK1181402A1 (ru)
HR (1) HRP20172004T1 (ru)
HU (1) HUE036077T2 (ru)
IL (2) IL224355B (ru)
LT (1) LT2603530T (ru)
MA (1) MA34519B1 (ru)
MX (1) MX358859B (ru)
MY (2) MY175341A (ru)
NO (1) NO2603530T3 (ru)
NZ (2) NZ703653A (ru)
PE (2) PE20171512A1 (ru)
PH (1) PH12017501417A1 (ru)
PL (1) PL2603530T3 (ru)
PT (1) PT2603530T (ru)
RS (1) RS56702B1 (ru)
SG (1) SG187746A1 (ru)
SI (1) SI2603530T1 (ru)
TW (2) TWI556827B (ru)
UA (2) UA113712C2 (ru)
WO (1) WO2012020006A2 (ru)
ZA (2) ZA201600552B (ru)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5695059B2 (ja) 2009-09-29 2015-04-01 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性デス受容体アゴニスト抗体
CN105884898B (zh) 2010-08-13 2022-10-11 罗切格利卡特公司 抗成纤维细胞激活蛋白抗体及使用方法
KR101667096B1 (ko) 2011-02-10 2016-10-18 로슈 글리카트 아게 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
BR112014004168A2 (pt) 2011-08-23 2017-12-12 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso do anticorpo biespecífico, célula hospedeira procariótica ou eucariótica, método de produção de anticorpo e invenção
SG2014008577A (en) 2011-08-23 2014-04-28 Roche Glycart Ag Bispecific antigen binding molecules
EP3321286B1 (en) 2011-08-23 2021-01-06 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP6290209B2 (ja) * 2012-08-07 2018-03-07 ロシュ グリクアート アーゲー 低下した及び増加したエフェクター機能を有するように操作された２つの抗体を含む組成物。
BR112015002085A2 (pt) 2012-08-08 2017-12-19 Roche Glycart Ag proteína, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produzir a proteína, composição farmacêutica, uso da proteína, método de tratamento e invenção
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
KR20150064068A (ko) 2012-10-08 2015-06-10 로슈 글리카트 아게 2개의 Fab 단편을 포함하는 FC-부재 항체 및 이용 방법
JP6499087B2 (ja) 2013-02-26 2019-04-10 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
WO2014131711A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
KR20160117463A (ko) * 2014-02-06 2016-10-10 에프. 호프만-라 로슈 아게 인터루킨-10 면역접합체
CR20160333A (es) 2014-02-06 2016-09-05 F Hoffman-La Roche Ag Proteinas de fusión de interleucina-2 y usos de las mismas
GB201402006D0 (en) * 2014-02-06 2014-03-26 Oncomatryx Biopharma S L Antibody-drug conjugates and immunotoxins
WO2015164723A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain
MA44179B1 (fr) 2014-05-13 2020-10-28 Univ Pennsylvania Compositions comprenant un virus adeno-associe exprimant des constructions a double anticorps et leurs utilisations
RU2017116020A (ru) * 2014-10-08 2018-11-12 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Комбинированная терапия биспецифичными антителами, специфичными к fap и dr5, и химиотерапевтические агенты
CN113372434A (zh) 2014-11-14 2021-09-10 豪夫迈·罗氏有限公司 包含tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
KR20240024318A (ko) 2014-11-20 2024-02-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 CD3 ABD 엽산 수용체 1(FolR1) 및 PD-1 축 결합 길항물질의 조합 요법
EP3242683A1 (en) * 2015-01-09 2017-11-15 Mabimmune Diagnostics AG Novel anti-fibroblast activation protein (fap) antibodies and uses derived thereof
GB201500875D0 (en) 2015-01-19 2015-03-04 Philogen Spa Antibodies for treatment and diagnosis
CN107207579B (zh) 2015-03-31 2022-02-25 豪夫迈·罗氏有限公司 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
EP3356403A2 (en) * 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor
KR102146319B1 (ko) 2015-10-02 2020-08-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 tim3에 특이적인 이중특이성 항체
CN106928368B (zh) * 2015-12-30 2020-10-13 广西医科大学 一种FAP纳米抗体Nb57
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
WO2017194442A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
EP3243836A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
CN106018780B (zh) * 2016-05-17 2017-12-26 扬州大学 一种基于f1蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒
EP3468963B1 (en) 2016-06-12 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Dihydropyrimidinyl benzazepine carboxamide compounds
RU2021127872A (ru) 2016-06-30 2021-11-09 Онкорус, Инк. Доставка терапевтических полипептидов посредством псевдотипированных онколитических вирусов
JP2018035137A (ja) 2016-07-13 2018-03-08 マブイミューン ダイアグノスティックス エイジーＭａｂｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ａｇ 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）結合薬剤およびその使用
WO2018114754A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with targeted 4-1bb (cd137) agonists
BR112019007267A2 (pt) 2016-12-20 2019-07-09 Hoffmann La Roche anticorpo biespecífico anti-cd20/anti-cd3, produto farmacêutico, composição farmacêutica que compreende um anticorpo biespecífico anti-cd20/anti-cd3, uso de combinação de anticorpo biespecífico anti-cd20/anti-cd3 e um agonista de 4-1bb e método de tratamento ou retardamento da progressão de câncer em pacientes
WO2018127473A1 (en) 2017-01-03 2018-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
MA47215A (fr) 2017-01-09 2019-11-13 Bioxcel Therapeutics Inc Procédés prédictifs et diagnostiques pour le cancer de la prostate
WO2018178055A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
JP7205995B2 (ja) 2017-03-29 2023-01-17 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激性ｔｎｆ受容体に対する二重特異性抗原結合分子
WO2018178074A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Trimeric antigen binding molecules specific for a costimulatory tnf receptor
PE20191494A1 (es) 2017-04-03 2019-10-21 Hoffmann La Roche Inmunoconjugados de un anticuerpo anti-pd-1 con un il-2 mutante o con il-15
TWI704158B (zh) * 2017-04-04 2020-09-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 能夠特異性結合至cd40及fap之新穎雙特異性抗原結合分子
CN116375876A (zh) 2017-04-05 2023-07-04 豪夫迈·罗氏有限公司 特异性结合pd1和lag3的双特异性抗体
WO2018189220A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 F. Hoffmann-La Roche Ag An interleukin-2 immunoconjugate, a cd40 agonist, and optionally a pd-1 axis binding antagonist for use in methods of treating cancer
WO2019057181A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Dingfu Biotarget Co., Ltd. METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2019067425A1 (en) 2017-09-26 2019-04-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CARDIAC DISEASE BY REDIRECTED T-CELL IMMUNOTHERAPIES
MA50505A (fr) * 2017-11-01 2020-09-09 Hoffmann La Roche Anticorps 2 + 1 bispécifiques (contorsbodies)
EP3703746A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG Novel tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
CN111315781A (zh) 2017-11-01 2020-06-19 豪夫迈·罗氏有限公司 用靶向性ox40激动剂的组合疗法
CN109796532A (zh) * 2017-11-17 2019-05-24 科济生物医药（上海）有限公司 靶向成纤维激活蛋白α的结合单元及其应用
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
JP2021508477A (ja) 2017-12-29 2021-03-11 オンコラス， インコーポレイテッド 治療用ポリペプチドの腫瘍溶解性ウイルス送達
BR112020015568A2 (pt) 2018-03-13 2020-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonista de 4-1bb (cd137), produto farmacêutico, composição farmacêutica, uso de uma combinação de um agonista de 4-1bb e método para tratar ou retardar a progressão do câncer
TW202003561A (zh) 2018-03-13 2020-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
CR20200459A (es) 2018-04-13 2020-11-11 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno dirigidas a her2 que comprendan 4-1bbl
KR20210010508A (ko) * 2018-05-16 2021-01-27 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 섬유아세포 활성 단백질에 결합하는 단백질
JP2021528988A (ja) 2018-07-04 2021-10-28 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 新規の二重特異性アゴニスト４−１ｂｂ抗原結合分子
KR20210069675A (ko) 2018-10-01 2021-06-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-fap 클론 212를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자
CN112654641A (zh) 2018-10-01 2021-04-13 豪夫迈·罗氏有限公司 具有与cd40的三价结合的双特异性抗原结合分子
AU2019410073A1 (en) 2018-12-21 2021-06-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor-targeted agonistic CD28 antigen binding molecules
TW202030204A (zh) 2018-12-21 2020-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 靶向腫瘤之超促效cd28抗原結合分子
CN113677403A (zh) 2019-04-12 2021-11-19 豪夫迈·罗氏有限公司 包含脂质运载蛋白突变蛋白的双特异性抗原结合分子
CN114127123A (zh) 2019-06-26 2022-03-01 豪夫迈·罗氏有限公司 结合cea的抗体与4-1bbl的融合
CN114531878A (zh) 2019-06-27 2022-05-24 豪夫迈·罗氏有限公司 新颖icos抗体及包含它们的肿瘤靶向抗原结合分子
JP2022541753A (ja) 2019-07-08 2022-09-27 ３ベー ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー 線維芽細胞活性化タンパク質リガンドを含む化合物およびその使用
WO2021005131A1 (en) 2019-07-08 2021-01-14 3B Pharmaceuticals Gmbh Compounds comprising a fibroblast activation protein ligand and use thereof
EP3763726A1 (en) 2019-07-08 2021-01-13 3B Pharmaceuticals GmbH Compounds comprising a fibroblast activation protein ligand and use thereof
AU2020352986A1 (en) * 2019-09-23 2022-03-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibody against canine fibroblast activation protein that cross-reacts with mouse and human fibroblast activation protein (FAP)
CN115052663A (zh) 2020-01-08 2022-09-13 辛瑟斯治疗股份有限公司 Alk5抑制剂缀合物及其用途
CN114929734A (zh) 2020-01-09 2022-08-19 豪夫迈·罗氏有限公司 新型含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
CN115551540A (zh) 2020-05-11 2022-12-30 豪夫迈·罗氏有限公司 使用经修饰的pbmc和免疫缀合物的组合疗法
US20230250193A1 (en) * 2020-06-17 2023-08-10 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Antibodies to fibroblast activation protein and b7h3
PE20231361A1 (es) 2020-06-23 2023-09-05 Hoffmann La Roche Moleculas agonistas de union al antigeno cd28 que se dirigen a her2
JP2023531067A (ja) 2020-06-25 2023-07-20 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ３／抗ｃｄ２８二重特異性抗原結合分子
CN112540176B (zh) * 2020-07-08 2021-09-28 深圳霁因生物医药转化研究院 用于诊断fap表达异常相关疾病的试剂盒、方法及计算机可读存储介质
TW202219067A (zh) 2020-07-24 2022-05-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於表現抗體多聚體融合之方法
EP4198050A1 (en) 2020-08-11 2023-06-21 Kanaph Therapeutics Inc. Fusion protein comprising il-12 and anti-cd20 antibody and use thereof
WO2022101458A1 (en) 2020-11-16 2022-05-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with fap-targeted cd40 agonists
EP4050018A1 (en) 2021-01-07 2022-08-31 3B Pharmaceuticals GmbH Compounds comprising a fibroblast activation protein ligand and use thereof
JP2024503637A (ja) 2021-01-07 2024-01-26 ３ベー ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー 線維芽細胞活性化タンパク質リガンドを含む化合物およびその使用
CN117157312A (zh) 2021-03-30 2023-12-01 豪夫迈·罗氏有限公司 蛋白酶活化的多肽
WO2022221193A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Affinia Therapeutics Inc. Recombinant aav for treatment of neural disease
WO2023113806A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Affinia Therapeutics, Inc. Recombinant aav for treatment of neural disease
WO2022223824A1 (en) * 2021-04-23 2022-10-27 Philogen S.P.A Anti-fibroblast activation protein antibodies
KR20240011714A (ko) 2021-04-27 2024-01-26 제너레이션 바이오 컴퍼니 치료용 항체를 발현하는 비바이러스성 dna 벡터 및 이의 용도
AR126009A1 (es) 2021-06-02 2023-08-30 Hoffmann La Roche Moléculas agonistas de unión al antígeno cd28 que se dirigen a epcam
EP4148067A1 (en) 2021-09-08 2023-03-15 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the expression of an antibody-multimer-fusion
WO2023073225A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using a hla-a2/wt1 x cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
TW202339797A (zh) 2021-12-14 2023-10-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用ｈｌａ－ａ２ｍａｇｅ－ａ４ｘｃｄ３雙特異性抗體及４－１ｂｂ（ｃｄ１３７）促效劑治療癌症
WO2023117834A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic ltbr antibodies and bispecific antibodies comprising them
WO2023177655A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
WO2023186756A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Interferon gamma variants and antigen binding molecules comprising these
CN114685673A (zh) * 2022-03-29 2022-07-01 深圳医爱健康管理有限公司 成纤维细胞激活蛋白抗体及使用方法
WO2024027771A1 (zh) * 2022-08-03 2024-02-08 南京维立志博生物科技有限公司 靶向FAP和TGFβ的抗体融合蛋白及其用途
WO2024074727A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Genethon Immunotherapy of skeletal myopathies using anti-fap car-t cells

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030143229A1 (en) * 1998-04-30 2003-07-31 Boehringer Ingelheim International Gmbh FAPalpha -specific antibody with improved producibility
WO2007077173A1 (en) * 2006-01-05 2007-07-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
WO2011020783A2 (en) * 2009-08-17 2011-02-24 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
AU2782292A (en) 1991-09-18 1993-04-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Activated stromal fibroblast-specific antibody, f19 and methods of using the same
CA2116774C (en) 1991-09-19 2003-11-11 Paul J. Carter Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
JP3095175B2 (ja) 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
WO1998058964A1 (en) 1997-06-24 1998-12-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
IL136544A0 (en) 1997-12-05 2001-06-14 Scripps Research Inst Humanization of murine antibody
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
EP0953639A1 (en) * 1998-04-30 1999-11-03 Boehringer Ingelheim International GmbH FAPalpha-specific antibody with improved producibility
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
DK2270150T4 (da) 1999-04-09 2019-08-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle.
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
MXPA02003456A (es) 1999-10-04 2002-10-23 Medicago Inc Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos.
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
CA2395660A1 (en) 1999-12-29 2001-07-12 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
JP2003530092A (ja) 2000-03-17 2003-10-14 ベーリンガー インゲルハイム ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト ヒトＦＡＰ−α−特異抗体
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
JP4936299B2 (ja) 2000-08-21 2012-05-23 メレクシス・テクノロジーズ・ナムローゼフェンノートシャップ 磁場方向検出センサ
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
PL218428B1 (pl) 2000-10-06 2014-12-31 Kyowa Hakko Kogyo Kk Komórka, sposoby wytwarzania przeciwciał, leki zawierające przeciwciała, komórka CHO i przeciwciało klasy IgG
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
KR20100018071A (ko) 2001-08-03 2010-02-16 글리카트 바이오테크놀로지 아게 항체 의존적 세포 독성이 증가된 항체 글리코실화 변이체
KR100988949B1 (ko) 2001-10-25 2010-10-20 제넨테크, 인크. 당단백질 조성물
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US8932825B2 (en) 2001-12-27 2015-01-13 Glycofi Inc. Method to engineer mammalian-type carbohydrate structures
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
CA2481657A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
US7749753B2 (en) 2002-04-09 2010-07-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Cells in which activity of the protein involved in transportation of GDP-fucose is reduced or lost
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
NZ556507A (en) 2002-06-03 2010-03-26 Genentech Inc Synthetic antibody phage libraries
PT1539966E (pt) 2002-09-12 2010-09-14 Greenovation Biotech Gmbh Método de produção de proteínas
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
ES2347241T3 (es) 2002-12-16 2010-10-27 Genentech, Inc. Variantes de inmunoglobulina y sus utilizaciones.
JP4559358B2 (ja) 2002-12-20 2010-10-06 グリーンオベーション バイオテク ゲーエムベーハー コケ細胞における異種グリコシル化タンパク質の産生
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
CA2513797C (en) 2003-01-22 2016-05-03 Glycart Biotechnology Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk HYBRID PROTEIN COMPOSITION
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
US9296820B2 (en) 2003-11-05 2016-03-29 Roche Glycart Ag Polynucleotides encoding anti-CD20 antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
ES2697327T3 (es) 2003-11-06 2019-01-23 Seattle Genetics Inc Compuesto intermedio para la preparación de conjugados que comprenden derivados de auristatina y un enlazador
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
SG172616A1 (en) 2004-04-13 2011-07-28 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
JP4948413B2 (ja) 2004-09-23 2012-06-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン操作抗体および結合体
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
DK2059533T3 (da) 2006-08-30 2013-02-25 Genentech Inc Multispecifikke antistoffer
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
JP5695059B2 (ja) 2009-09-29 2015-04-01 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性デス受容体アゴニスト抗体
EP2483316A1 (en) * 2009-10-02 2012-08-08 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Anti-fibroblast activation protein antibodies and methods and uses thereof
CN105884898B (zh) 2010-08-13 2022-10-11 罗切格利卡特公司 抗成纤维细胞激活蛋白抗体及使用方法
KR101667096B1 (ko) 2011-02-10 2016-10-18 로슈 글리카트 아게 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
JP6290209B2 (ja) 2012-08-07 2018-03-07 ロシュ グリクアート アーゲー 低下した及び増加したエフェクター機能を有するように操作された２つの抗体を含む組成物。
BR112015002085A2 (pt) 2012-08-08 2017-12-19 Roche Glycart Ag proteína, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produzir a proteína, composição farmacêutica, uso da proteína, método de tratamento e invenção
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
MX2015014538A (es) 2013-05-07 2016-02-05 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigenos trimericas.
RU2017116020A (ru) 2014-10-08 2018-11-12 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Комбинированная терапия биспецифичными антителами, специфичными к fap и dr5, и химиотерапевтические агенты

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030143229A1 (en) * 1998-04-30 2003-07-31 Boehringer Ingelheim International Gmbh FAPalpha -specific antibody with improved producibility
WO2007077173A1 (en) * 2006-01-05 2007-07-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
WO2011020783A2 (en) * 2009-08-17 2011-02-24 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAUM PATRICK; MUELLER DAFNE; RUEGER RONNY; KONTERMANN ROLAND E: "Single-chain Fv immunoliposomes for the targeting of fibroblast activation protein-expressing tumor stromal cells.", JOURNAL OF DRUG TARGETING, TAYLOR & FRANCIS, GB, vol. 15, no. 6, 1 July 2007 (2007-07-01), GB, pages 399 - 406, XP008133377, ISSN: 1061-186X *
MERSMANN M, ET AL.: "HUMAN ANTIBODY DERIVATIVES AGAINST THE FIBROBLAST ACTIVATION PROTEIN FOR TUMOR STROMA TARGETING OF CARCINOMAS", INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, JOHN WILEY & SONS, INC., US, vol. 92, no. 02, 15 April 2001 (2001-04-15), US, pages 240 - 248, XP008049876, ISSN: 0020-7136, DOI: 10.1002/1097-0215(200102)9999:9999<::AID-IJC1170>3.0.CO;2-U *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201300239A1 (ru) 2013-08-30
KR101673653B1 (ko) 2016-11-08
EP3333194A1 (en) 2018-06-13
MY184879A (en) 2021-04-29
CL2013000369A1 (es) 2014-08-08
AU2011288487B2 (en) 2015-10-01
TW201634480A (zh) 2016-10-01
JP2015180632A (ja) 2015-10-15
BR112013003361A2 (pt) 2017-06-13
EP3333194B1 (en) 2021-03-17
JP5793568B2 (ja) 2015-10-14
TW201206477A (en) 2012-02-16
JP2018099120A (ja) 2018-06-28
ES2655616T3 (es) 2018-02-20
CL2016002116A1 (es) 2017-05-12
AR082629A1 (es) 2012-12-19
KR101780131B1 (ko) 2017-09-19
DK2603530T3 (en) 2018-01-15
US10577429B2 (en) 2020-03-03
NZ703653A (en) 2016-09-30
MY175341A (en) 2020-06-19
CO6670523A2 (es) 2013-05-15
JP2013542714A (ja) 2013-11-28
NO2603530T3 (ru) 2018-04-07
US9011847B2 (en) 2015-04-21
LT2603530T (lt) 2018-01-25
MX358859B (es) 2018-09-05
PE20171512A1 (es) 2017-10-20
SG187746A1 (en) 2013-03-28
US20220281995A1 (en) 2022-09-08
EP2603530A2 (en) 2013-06-19
US11332545B2 (en) 2022-05-17
EA034742B1 (ru) 2020-03-16
SI2603530T1 (en) 2018-02-28
ZA201600551B (en) 2018-05-30
CR20130038A (es) 2013-04-29
MA34519B1 (fr) 2013-09-02
IL244000A0 (en) 2016-04-21
IL224355B (en) 2019-03-31
HUE036077T2 (hu) 2018-06-28
TWI556827B (zh) 2016-11-11
US10253110B2 (en) 2019-04-09
PH12017501417A1 (en) 2020-07-13
CN103154038B (zh) 2016-05-11
UA113712C2 (xx) 2017-02-27
MX2013001268A (es) 2013-04-10
PE20131209A1 (es) 2013-10-25
TWI599578B (zh) 2017-09-21
WO2012020006A2 (en) 2012-02-16
US20160060356A1 (en) 2016-03-03
CN105884898A (zh) 2016-08-24
KR20150039890A (ko) 2015-04-13
CR20180142A (es) 2018-04-05
JP2020141674A (ja) 2020-09-10
JP7017599B2 (ja) 2022-02-08
US20120128591A1 (en) 2012-05-24
CA2806021A1 (en) 2012-02-16
EP2603530B1 (en) 2017-11-08
AU2011288487A1 (en) 2013-01-31
RS56702B1 (sr) 2018-03-30
US20200079873A1 (en) 2020-03-12
BR112013003361B8 (pt) 2022-01-25
PT2603530T (pt) 2018-01-09
US20160060357A1 (en) 2016-03-03
ZA201600552B (en) 2017-03-29
UA112416C2 (uk) 2016-09-12
CN105884898B (zh) 2022-10-11
HK1181402A1 (zh) 2013-11-08
CN103154038A (zh) 2013-06-12
ECSP13012440A (es) 2013-05-31
NZ605980A (en) 2015-01-30
HRP20172004T1 (hr) 2018-02-09
WO2012020006A3 (en) 2012-04-12
EA201790309A1 (ru) 2017-06-30
CA2806021C (en) 2019-05-21
AR117658A2 (es) 2021-08-25
KR20130066669A (ko) 2013-06-20
BR112013003361B1 (pt) 2021-10-13
PL2603530T3 (pl) 2018-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7017599B2 (ja) 抗ｆａｐ抗体及び使用の方法
JP5841149B2 (ja) 抗テネイシンｃａ２抗体及び使用の方法
JP2013542714A5 (ru)
AU2017251851B2 (en) Anti-FAP antibodies and methods of use
JP7089483B2 (ja) 修飾された抗テネイシン抗体及び使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM