TWI704158B - 能夠特異性結合至cd40及fap之新穎雙特異性抗原結合分子 - Google Patents

能夠特異性結合至cd40及fap之新穎雙特異性抗原結合分子 Download PDF

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Abstract

本發明係關於新穎雙特異性抗原結合分子，其包括(a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，及(b)至少一個能夠特異性結合至靶細胞抗原(特別是纖維母細胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein；FAP))之抗原結合結構域；及本發明係關於產生該等分子之方法及使用該等分子之方法。

Description

能夠特異性結合至CD40及FAP之新穎雙特異性抗原結合分子
本發明係關於新穎雙特異性抗原結合分子，其包括(a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，及(b)至少一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域。特定而言，該等雙特異性抗原結合分子進一步包括(c) Fc區，該Fc區由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成。本發明另外係關於該等分子之產生方法及其使用方法。
在生成強力適應性免疫反應期間需要多種分子信號。信號1涉及使T細胞抗原受體(TCR)結合至呈遞於抗原呈遞細胞(APC)之表面上之其同族抗原。信號2包括使共刺激受體與T細胞與APC之間之其各別配體咬合。研究最充分之最重要共刺激效應物係腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員CD40及其配體CD40L (Elgueta R. 等人 ， Immunol Rev. 2009;229(1):152-72 )。包含CD40之TNFR家族之數個成員在初始T細胞活化之後用於維持APC及T細胞反應且由此在免疫系統之組織及功能中具有關鍵作用(Watts T.H. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23, 23-68)。不同共刺激TNFR家族成員之組合容許APC及T細胞活化及存活之依序及瞬時調控，從而增加免疫反應且同時維持APC及T細胞功能之嚴格控制。端視疾病狀況，經由共刺激TNF家族成員進行刺激可加劇或改善疾病。TNFR家族共刺激因子之活化或阻斷展示用於多個領域(包含癌症、感染性疾病、移植及自體免疫性)之若干治療應用中之前景。 在若干共刺激分子中，TNFR家族成員CD40藉由誘導APC之成熟、存活、抗原呈遞、細胞介素產生及共刺激分子表現而在觸發免疫反應中發揮關鍵作用，此然後將驅動促發炎性細胞介素之抗原特異性T細胞反應及NK細胞活化。CD40調控針對感染、腫瘤及自體抗原之免疫反應且其表現已顯示上APC (例如B細胞、樹突狀細胞(DC)、單核球及巨噬球)以及血小板及非造血源細胞(例如肌纖維母細胞、纖維母細胞、上皮細胞及內皮細胞)之表面上(Elgueta R. 等人 ， Immunol Rev. 2009;229(1):152-72 )。CD40配體CD40L表現於經活化CD4+ 輔助性T細胞、血小板、單核球細胞、天然殺手細胞、肥大細胞及嗜鹼性球上(Carbone E. 等人， J Exp Med. 1997;185(12): 2053-2060 或 Elgueta R. 等人， Immunol Rev. 2009;229(1):152-72 )。CD40及CD40L之表現因應於各種免疫刺激信號顯著上調且APC與CD4+ T細胞之間之CD40-CD40L相互作用有助於增加APC活化及抗原特異性CD8+ T細胞反應(Bevan MJ., Nat Rev Immunol. 2014;4(8):595-602 )。使用CD40激動性抗體可觀察到類似免疫刺激結果(Vonderheide RH 及 Glennie MJ., Clin Cancer Res. 2013;19(5):1035-43 )。 I型跨膜受體CD40與其天然配體CD40L (一種II型跨膜蛋白)或激動性抗體之咬合會促進CD40群聚並誘導銜接蛋白募集至細胞質受體結構域中。該等稱為TNF受體相關因子(TRAF)之銜接蛋白之募集使得協同活化促細胞分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)以及規範及不規範核因子κB (NFκB)信號傳導路徑(Elgueta R. 等人 ， Immunol Rev. 2009;229(1):152-72 )。繼而，此引起APC成熟及活化，然後最大化抗原特異性T細胞反應。最新研究展示激動性CD40抗體利用抗腫瘤免疫性之兩種不同作用模式。除經由活化適應性免疫系統所調介之腫瘤細胞殺死之間接作用模式外，激動性CD40抗體亦可經由誘導表現CD40之實體腫瘤細胞之細胞凋亡來誘導直接腫瘤細胞殺死(Eliopoulos AG. 等人 ， Mol Cell Biol.2000;20(15):5503-15 )。CD40抗體介導之直接腫瘤細胞殺死可提供腫瘤抗原之來源，該等腫瘤抗原可藉由APC處理並呈遞，該APC同時藉由經抗CD40抗體接合CD40來活化，然後可誘導腫瘤抗原特異性T細胞，此係一種稱為內源性接種疫苗之假設機制。考慮到CD40嚙合可確立有效抗癌免疫反應，故激動性CD40抗體已作為單一藥劑及與化學療法組合來成功地用於各種臨床前腫瘤模型(Vonderheide RH 及 Glennie MJ., Clin Cancer Res. 2013;19(5):1035-43 )。 迄今為止，在臨床試驗中探究以下6種CD40 mAb：在臨床I期研究中探究Chi Lob 7/4 (CD40激動性IgG1嵌合mAb；Cancer Research UK；Chowdhury F. 等人 ， Cancer Immunol Res. 2013;2:229-40 )、ADC1013 (全人類CD40激動性IgG1抗體；Alligator Bioscience及Johnson & Johnson;Mangsbo SM. 等人 ， Clin Cancer Res. 2015 Mar 1;21(5):1115-26 )、APX-005 (全人類化CD40激動性IgG1 mAb；Apexigen；Bjorck P. 等人 ， J Immunother Cancer.2015 ； 3( 增刊 2): P198 )、SEA-CD40 (CD40激動性IgG1嵌合mAb；Seattle Genetics；Gardai SJ. 等人 ， AACR 106th Annual Meeting 2015 ； 4 月 18-22 日 ， 文摘 2472 )以及RO7009789 (全人類CD40超激動性IgG2 mAb)，且在臨床II期研究中探究達西珠單抗(dacetuzumab) (CD40部分激動性IgG1嵌合mAb；Seattle Genetics；Khubchandani S. 等人 ， Curr Opin Investig Drugs. 2009;10:579-87 )。用於該等研究之合格患者患有實體腫瘤、經典何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)或無痛性淋巴瘤(包含濾泡性淋巴瘤)。該等CD40激動性抗體已展示以下不同活性：經由補體介導之細胞毒性(CMC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)獲得CD40+ 腫瘤細胞之Fc依賴性細胞毒性，活化APC以誘導抗腫瘤T細胞反應，以及活化巨噬球以消耗腫瘤及腫瘤基質。迄今為止，尚未明確闡釋此所觀察異質性。然而，最新研究指示，可至少部分地藉由抗CD40抗體在表位特異性、同型或Fc:FcγR相互作用方面之差異來闡釋此作用模式多樣性。舉例而言，CD40激動性抗體似乎在活體內需要使CD40 (藉由其Fab片段結合於靶細胞上)交聯至Fcγ受體(藉由其Fc片段結合於除靶細胞外之細胞上)，如已針對TNFR超家族之其他細胞凋亡誘導或免疫調節成員之特異性激動性抗體所闡述(Dahan R., Cancer Cell. 2016 Jun 13;29(6):820-31 ； Li F. 及 Ravetch J.V. Science, 2011;333, 1030-1034 ； Teng M.W 等人 ， J. Immunol. 2009;183, 1911-1920 )。所提出機制包含使CD40跨膜分子Fcγ受體調介性地群聚於靶細胞上且隨後增強CD40信號傳導以達成強力活體內效能。 激動性CD40抗體之臨床研發已提供有前景之初始結果。在第一臨床試驗中，CP-870,893已在晚期癌症患者中展示臨床效能。29名晚期癌症患者中之4名在接受CP-870,893之單一靜脈內輸注之後展示部分反應(Vonderheide RH., J Clin Oncol.2007 Mar 1;25(7):876-83 )。隨後在一年半中使用9個CP-870,893劑量治療之該4名患者中之一名保持完全緩解5年以上。然而，CP-870,893之最常見副效應係細胞介素釋放症候群及血栓栓塞性事件，從而在使用所用劑量時間表及投與途徑下，使用140名以上患者之1期臨床研究之組合數據僅指示有限臨床效能且建議經局部投與抗體(Vonderheide RH, Glennie M, Clin Cancer Res. 2013, 19(5), 1035-1043 )。單一藥劑反應之缺乏部分地係因由寬CD40表現引起之嚴重脫靶腫瘤效應而發生，其會產生劑量限制毒性(例如細胞介素釋放症候群)。在CD40由腫瘤特異性靶交聯時特異性活化APC之激動性CD40抗體之研發可減少副效應並降低劑量限制，從而提供可生成有效長效抗癌免疫性之新治療選擇。 可用臨床前及臨床數據明確證實，在臨床上亟需能夠誘導且增強對癌症之有效內源性免疫反應之有效CD40激動劑。然而，幾乎沒有效應限於單一細胞類型或經由單一機制進行之作用且經設計以闡明細胞間及細胞內信號傳導機制之研究已揭示增加程度之複雜性。已知CD40抗體因劑量限制毒性(例如細胞介素釋放症候群及血小板/內皮細胞活化)而僅可以相對較低劑量投與，從而產生靶APC上路徑之不充分活化及較窄治療指數。因此，需要較佳地作用於單一類型細胞上之「靶向」激動劑。 本發明係關於能夠特異性結合至CD40及靶細胞抗原之新雙特異性抗原結合分子。本發明之抗原結合分子組合能夠較佳結合至腫瘤特異性或腫瘤相關靶之部分與能夠激動性結合至CD40之部分，其中經由CD40活化APC係藉由交聯經由表現於腫瘤間質細胞上之靶細胞抗原(例如FAP)且潛在地亦經由在中間表現於二級淋巴樣組織上之FAP來提供。雙特異性抗原結合分子之FAP依賴性交聯將CD40表現細胞之活化限制於腫瘤組織中且潛在地亦限制於二級淋巴樣組織(例如腫瘤引流淋巴結)中。與能夠特異性結合至CD40及經活化T細胞上之免疫檢查點受體(例如CTLA-4或PD-1)之雙特異性抗原結合分子相比，靶向諸如FAP等腫瘤靶使得能夠主要在腫瘤間質及腫瘤引流淋巴結(其中與其他組織相比纖維母細胞表現增加含量之FAP)中進行CD40調介之APC活化。本發明之抗原結合分子可由此能夠不僅有效觸發CD40受體，且亦在期望位點處極具選擇性，同時克服FcγR交聯之需要，由此減少副效應。
本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其組合至少一個能夠特異性結合至共刺激TNF受體家族成員CD40之部分(抗原結合結構域)與至少一個靶向靶細胞抗原之抗原結合側。該等雙特異性抗原結合分子較為有利，此乃因其較佳地活化表現靶細胞抗原之位點處之共刺激CD40受體(因其能夠結合至靶細胞抗原)。 在一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，及 (b)至少一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域。 在一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包括(a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，(b)至少一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域，及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域。更特定而言，由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域包括減小效應物功能之突變。 在一態樣中，能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域結合至包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列或由其組成之多肽。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域係能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之抗原結合結構域。特定而言，能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域結合至包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列或由其組成之多肽。因此，在一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括(a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域及(b)至少一個能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域。 在一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包括：(i) CDR-H1，其包括SEQ ID NO:3之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括：(iv) CDR-L1，其包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包括SEQ ID NO:7之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包括SEQ ID NO:8之胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包括：(i) CDR-H1，其包括SEQ ID NO:11之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括：(iv) CDR-L1，其包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包括SEQ ID NO:15之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包括SEQ ID NO:16之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供如本文先前所定義之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括 (a) 重鏈可變區(VH FAP)，其包括與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括與SEQ ID NO:10之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包括與SEQ ID NO:17之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括與SEQ ID NO:18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。 特定而言，提供如本文先前所定義之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括：(a)重鏈可變區(VH FAP)，其包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括：重鏈可變區(VH CD40)，其包括(i)包括SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包括(iv)包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包括SEQ ID NO:23之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包括SEQ ID NO:24之胺基酸序列之CDR-L3。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域結合至小鼠CD40，且包括：重鏈可變區(VH CD40)，其包括(i)包括SEQ ID NO:27之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包括(iv)包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包括SEQ ID NO:31之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包括SEQ ID NO:32之胺基酸序列之CDR-L3。 另外，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括(a)包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，或(b)包括SEQ ID NO:33之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:34之胺基酸序列之VL。在一特定態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其中每一能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 重鏈可變區(VH CD40)，其包括 (i) CDR-H1，其包括選自由SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:35組成之群之胺基酸序列， (ii) CDR-H2，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:44，及 (iii) CDR-H3，其包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列， 及輕鏈可變區(VL CD40)，其包括 (iv) CDR-L1，其包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列， (v) CDR-L2，其包括SEQ ID NO:23之胺基酸序列，及 (vi) CDR-L3，其包括SEQ ID NO:24之胺基酸序列。 在又一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 重鏈可變區(VH CD40)，其包括 (i) CDR-H1，其包括選自由SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:261組成之群之胺基酸序列， (ii) CDR-H2，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:262及SEQ ID NO:263，及 (iii) CDR-H3，其包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列， 及輕鏈可變區(VL CD40)，其包括 (iv) CDR-L1，其包括SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:264及SEQ ID NO:265之胺基酸序列， (v) CDR-L2，其包括SEQ ID NO:23之胺基酸序列，及 (vi) CDR-L3，其包括SEQ ID NO:24之胺基酸序列。 另外，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173及SEQ ID NO:174，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177及SEQ ID NO:178。 特定而言，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (a)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之VL，或 (b)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之VL，或 (c)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之VL，或 (d)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之VL，或 (e)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之VL，或 (f)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之VL，或 (g)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之VL，或 (h)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之VL，或 (i)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之VL，或 (j)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之VL，或 (k)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之VL，或 (l)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之VL，或 (m)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之VL，或 (n)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之VL，或 (o)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之VL，或 (p)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之VL。 更特定而言，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO:171之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO:175之胺基酸序列之VL。在另一態樣中，提供如技術方案1至7中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187及SEQ ID NO:188。 特定而言，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (a)包括SEQ ID NO:179之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL，或 (b)包括SEQ ID NO:180之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL，或 (c)包括SEQ ID NO:181之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL，或 (d)包括SEQ ID NO:182之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL，或 (e)包括SEQ ID NO:179之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之VL，或 (f)包括SEQ ID NO:180之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之VL，或 (g)包括SEQ ID NO:181之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之VL，或 (h)包括SEQ ID NO:182之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之VL，或 (i)包括SEQ ID NO:183之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:187之胺基酸序列之VL，或 (j)包括SEQ ID NO:183之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:188之胺基酸序列之VL，或 (k)包括SEQ ID NO:184之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:187之胺基酸序列之VL，或 (l)包括SEQ ID NO:184之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:188之胺基酸序列之VL。 更特定而言，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO:179之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL，或其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO:182之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:64。 特定而言，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中每一能夠特異性結合至CD40之部分包括含有SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO:57之胺基酸序列之VL。 另外，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (i)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，其包括：包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184，及包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187及SEQ ID NO:188，及 (ii)至少一個能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域，其包括：包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (i)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，其包括：包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55，及包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:64，及 (ii)至少一個能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域，其包括：包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在一態樣中，雙特異性抗原結合分子係人類化或嵌合抗體。在另一態樣中，雙特異性抗原結合分子包括IgG Fc區、尤其IgG1 Fc區或IgG4 Fc區。特定而言，Fc區包括一或多個減小抗體至Fc受體之結合親和力及/或效應物功能之胺基酸取代。在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中Fc區係(i)人類IgG1子類之具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引進行編號)之Fc區，或(ii)小鼠IgG1子類之具有胺基酸突變D265A及P329G (根據Kabat EU索引進行編號)之Fc區。特定而言，Fc區係人類IgG1子類之具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引進行編號)之Fc區。 在另一態樣中，提供如本文先前所定義之雙特異性抗原結合分子，其中根據凸起與孔洞方法，Fc區之第一亞單元包括凸起且Fc區之第二亞單元包括孔洞。特定而言，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中(i) Fc區之第一亞單元包括胺基酸取代S354C及T366W (根據Kabat EU索引進行編號)且Fc區之第二亞單元包括胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引進行編號)，或(ii) Fc區之第一亞單元包括胺基酸取代K392D及K409D (根據Kabat EU索引進行編號)且Fc區之第二亞單元包括胺基酸取代E356K及D399K (根據Kabat EU索引進行編號)。更特定而言，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中Fc區之第一亞單元包括胺基酸取代S354C及T366W (根據Kabat EU索引進行編號)且Fc區之第二亞單元包括胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引進行編號)。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)至少兩個Fab片段，其能夠特異性結合至經與Fc連結之CD40，及 (b)至少一個抗原結合結構域，其能夠特異性結合至經與Fc區C-末端連結之FAP。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)至少兩個Fab片段，其能夠特異性結合至經與Fc區連結之CD40，及 (b)一個抗原結合結構域，其能夠特異性結合至經與Fc區之C-末端連結之FAP。 在一特定態樣中，能夠特異性結合至經與Fc區C-末端連結之FAP的抗原結合結構域係交叉fab片段。因此，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)至少兩個Fab片段，其能夠特異性結合至經與Fc區連結之CD40 ，及 (b)交叉fab片段，其能夠特異性結合至經與Fc區之C-末端連結之FAP 。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc區之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域之VH及VL，其中VH連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端，且其中VL連結至(a)之兩條重鏈中之另一者之C-末端。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc區之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)能夠特異性結合至FAP之交叉fab片段，其中VH-CL鏈連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 在又一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc區之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)能夠特異性結合至FAP之交叉fab片段，其中VL-CH1鏈連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 另外，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc區之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)兩個能夠特異性結合至FAP之Fab片段，其中一個Fab片段連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端，且另一Fab片段連結至(a)之兩條重鏈中之另一者之C-末端。 在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域之VH及VL，其中VH連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端，且其中VL連結至(a)之兩條重鏈中之另一者之C-末端。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)兩個能夠特異性結合至FAP之Fab片段，其中一個Fab片段連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端，且另一Fab片段連結至(a)之兩條重鏈中之另一者之C-末端。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)一個能夠特異性結合至FAP之Fab片段，其中Fab片段連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 在另一態樣中，能夠特異性結合至FAP之Fab片段或兩個Fab片段係交叉Fab片段，其各自包括VL-CH1鏈及VH-CL鏈，且其中VH-CL鏈或VL-CH1鏈連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括4個能夠特異性結合至CD40之Fab片段。在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中如本文先前所定義(a)之兩條重鏈中之每一者包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段中視情況藉由肽連接體彼此連結的兩條VH-CH1鏈。 在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段中視情況藉由肽連接體彼此連結之兩個VH-CH1鏈及Fc區亞單元， (b) 4條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域之VH及VL，其中VH連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端，且其中VL連結至(a)之兩條重鏈中之另一者之C-末端。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段中視情況藉由肽連接體彼此連結之兩個VH-CH1鏈及Fc區亞單元， (b) 4條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)一個能夠特異性結合至FAP之Fab片段或交叉Fab片段，其中Fab或交叉Fab片段連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段中視情況藉由肽連接體彼此連結之兩個VH-CH1鏈及Fc區亞單元， (b) 4條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)能夠特異性結合至FAP之交叉fab片段，其中該交叉fab片段之VH-CL鏈連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 在又一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段中視情況藉由肽連接體彼此連結之兩個VH-CH1鏈及Fc區亞單元， (b) 4條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)能夠特異性結合至FAP之交叉fab片段，其中該交叉fab片段之VL-CH1鏈連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 在另一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中一或多個能夠特異性結合至CD40之Fab片段包括：CL結構域，其在胺基酸位置123 (根據Kabat EU索引進行編號)包括精胺酸(R)且在胺基酸位置124 (根據Kabat EU索引進行編號)包括離胺酸(K)；及CH1結構域，其在胺基酸位置147 (根據Kabat EU索引進行編號)包括麩胺酸(E)且在胺基酸位置213 (根據Kabat EU索引進行編號)包括麩胺酸(E)。 根據本發明之另一態樣，提供編碼如本文先前所闡述之雙特異性抗原結合分子之經分離多核苷酸。本發明另外提供包括本發明之經分離多核苷酸之載體、尤其表現載體及包括本發明之經分離多核苷酸或表現載體之宿主細胞。在一些態樣中，宿主細胞係真核細胞、尤其哺乳動物細胞。 在另一態樣中，提供產生如本文先前所闡述之雙特異性抗原結合分子之方法，其包括：在適於表現雙特異性抗原結合分子之條件下培養如上文所闡述之宿主細胞，及分離雙特異性抗原結合分子。本發明亦涵蓋藉由本發明方法產生之特異性結合至CD40及FAP之雙特異性抗原結合分子。 本發明另外提供一種醫藥組合物，其包括如本文先前所闡述之雙特異性抗原結合分子及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。 本發明亦涵蓋用作藥劑之如本文先前所闡述之雙特異性抗原結合分子或包括雙特異性抗原結合分子之醫藥組合物。 在一態樣中，提供如本文先前所闡述之雙特異性抗原結合分子或本發明醫藥組合物，其用於 (i)藉由表現CD40之抗原呈遞細胞(APC)來誘導免疫刺激， (ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應， (iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡， (iv)治療癌症， (v)延遲癌症進展， (vi)延長患有癌症之患者之存活， (vii)治療感染。 在一具體態樣中，提供用於治療癌症之如本文先前所闡述之雙特異性抗原結合分子或本發明醫藥組合物。在另一具體態樣中，本發明提供用於治療癌症之如本文先前所闡述之雙特異性抗原結合分子，其中將雙特異性抗原結合分子併與用於癌症免疫療法之化學治療劑、輻射及/或其他藥劑組合投與。在另一態樣中，提供用於上調或延長細胞毒性T細胞活性之如本文先前所闡述之雙特異性抗原結合分子或本發明醫藥組合物。 在另一態樣中，本發明提供抑制個體中之腫瘤細胞之生長之方法，其包括向個體投與有效量之如本文先前所闡述之雙特異性抗原結合分子或本發明醫藥組合物以抑制腫瘤細胞之生長。在另一態樣中，本發明提供治療或延遲個體之癌症之方法，其包括向個體投與有效量之如本文先前所闡述之雙特異性抗原結合分子或本發明醫藥組合物。 亦提供如本文先前所闡述之雙特異性抗原結合分子之用途，其用以製造用於治療有需要之個體之疾病之藥劑，尤其用以製造用於治療癌症之藥劑；且提供治療個體之疾病之方法，其包括向該個體投與治療有效量之包括呈醫藥上可接受形式之本發明之雙特異性抗原結合分子的組合物。在一具體態樣中，疾病係癌症。在上述態樣中之任一者中，個體係哺乳動物、尤其人類。
定義 除非另外定義，否則本文所用之技術及科學術語具有與本發明所屬技術中通常所用含義相同之含義。出於詮釋本說明書之目的，將應用下列定義且若適當，以單數使用之術語亦將包含複數且反之亦然。 如本文中所使用，術語「抗原結合分子 」以其最廣泛意義係指特異性結合抗原決定子之分子。抗原結合分子之實例係抗體、抗體片段及支架抗原結合蛋白。 如本文中所使用，術語「能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域 」或「能夠特異性結合至靶細胞抗原之部分」係指特異性結合至抗原決定子之多肽分子。在一態樣中，抗原結合結構域能夠經由其靶細胞抗原來激活信號傳導。在一特定態樣中，抗原結合結構域能夠將其所附接之實體(例如CD40激動劑)引導至靶位點，例如引導至特定類型之具有抗原性決定之子腫瘤細胞或腫瘤間質。能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域包含如本文進一步所定義之抗體及其片段。另外，能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域包含如本文進一步所定義之支架抗原結合蛋白，例如基於所設計重複蛋白或所設計重複結構域之結合結構域(例如參見WO 2002/020565)。 對於抗體或其片段而言，術語「能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域」係指分子中包括特異性結合至一部分或所有抗原且與其互補之區域之部分。可(例如)藉由一或多個抗體可變結構域(亦稱為抗體可變區)來提供能夠特異性結合抗原之抗原結合結構域。特定而言，能夠特異性結合抗原之抗原結合結構域包括抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。在另一態樣中，「能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域」亦可為Fab片段或交叉Fab片段。 術語「抗體 」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包含(但不限於)單株抗體、多株抗體、單特異性及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望抗原結合活性即可。 本文所用之術語「單株抗體 」係指自實質上同源抗體群體獲得之抗體，亦即，包含該群體之個別抗體相同及/或結合相同表位，可能之變體抗體除外，例如含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生，該等變體通常以較小量存在。與通常包含針對不同決定子(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單一決定子。 本文所用之術語「單特異性 」抗體表示具有一或多個結合位點之抗體，每一結合位點結合至相同抗原之相同表位。術語「雙特異性 」意指，抗原結合分子能夠特異性結合至至少兩種不同抗原決定子。通常，雙特異性抗原結合分子包括兩個抗原結合位點，其中之每一者對不同抗原決定子具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩種抗原決定子、尤其兩種表現於兩種不同細胞上之抗原決定子。如本文所闡述之雙特異性抗原結合分子亦可形成多特異性抗體之一部分。 本申請案內所用之術語「價 」表示在對一種特定抗原決定子具有特異性之抗原結合分子中存在指定數量之對於一種特定抗原決定子具有特異性的結合位點。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」表示在抗原結合分子中分別存在對於某一抗原決定子具有特異性之2個結合位點、4個結合位點及個6結合位點。在本發明之特定態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子對於某一抗原決定子可為單價，此意指其對於該抗原決定子具有僅一個結合位點，或其可對於某一抗原決定子為二價或四價，此意指其對於該抗原決定子分別具有2個結合位點或4個結合位點。 術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用且係指具有實質上類似於天然抗體結構之結構之抗體。「天然抗體 」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG類抗體係約150,000道爾頓(dalton)之異源四聚體醣蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩條輕鏈及兩條重鏈構成。自N-末端至C-末端，每一重鏈依次具有可變區(VH) (亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域)及三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3) (亦稱為重鏈恆定區)。類似地，自N-末端至C-末端，每一輕鏈依次具有可變區(VL) (亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)及輕鏈恆定結構域(CL) (亦稱為輕鏈恆定區)。可將抗體之重鏈指定為5個類型中之一者，稱為α型(IgA)、δ型(IgD)、ε型(IgE)、γ型(IgG)或μ型(IgM)，其中之一些可進一步分為子類，例如γ1型(IgG1)、γ2型(IgG2)、γ3型(IgG3)、γ4型(IgG4)、α1型(IgA1)及α2型(IgA2)。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將該抗體之輕鏈分配為兩種類型中之一者，稱為卡帕型(κ)及拉姆達(λ)。 「抗體片段 」係指除完整抗體外之分子，其包括完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包含(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2 、二價抗體、三價抗體、四價抗體、交叉Fab片段、直鏈抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及單鏈抗體。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat Med 9, 129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，例如參見Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag, New York，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包括補救受體結合表位殘基且具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。二價抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段，例如參見EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9, 129-134 (2003)；及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。三價抗體及四價抗體亦闡述於Hudson等人，Nat Med 9, 129-134 (2003)中。單一結構域抗體係包括抗體中重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；例如參見美國專利第6,248,516 B1號)。可藉由各種技術來製備抗體片段，包含(但不限於)蛋白水解消解完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli)或噬菌體)來產生，如本文所闡述。 完整抗體之木瓜酶消解會產生兩個相同抗原結合片段(稱為「Fab」片段)，其各自含有重鏈及輕鏈可變結構域亦及輕鏈之恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH1)。如本文中所使用，因此，術語「Fab 片段 」係指包括輕鏈片段(包括輕鏈(CL)之VL結構域及恆定結構域)以及重鏈之VH結構域及第一恆定結構域(CH1)之抗體片段。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於在重鏈CH1結構域之羧基末端添加幾個殘基，包含一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab’-SH係其中恆定結構域之半胱胺酸殘基具有自由硫醇基團之Fab’片段。胃蛋白酶處理可產生具有兩個抗原組合位點之F(ab')2 片段(兩個Fab片段)及Fc區之一部分。根據本發明，術語「Fab片段」亦包含如下文所定義之「交叉Fab片段(cross-Fab fragment或crossover Fab fragment)」。 術語「交叉 Fab 片段 (cross-Fab fragment) 」或「xFab片段」或「交叉Fab片段(crossover Fab fragment)」係指其中重鏈及輕鏈之任一可變區或恆定區發生交換之Fab片段。交叉Fab分子可能具有兩種不同鏈組合物且包括於本發明之雙特異性抗體中：一方面，Fab重鏈及輕鏈之可變區發生交換，亦即交叉Fab分子包括由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)構成之肽鏈及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)構成之肽鏈。此交叉Fab分子亦稱為交叉Fab(VLVH) 。另一方面，在Fab重鏈及輕鏈之恆定區發生交換時，交叉Fab分子包括由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)構成之肽鏈及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)構成之肽鏈。此交叉Fab分子亦稱為交叉Fab(CLCH1) 。 「單鏈Fab片段」或「scFab 」係由抗體重鏈可變結構域(VH)、抗體恆定結構域1 (CH1)、抗體輕鏈可變結構域(VL)、抗體輕鏈恆定結構域(CL)及連接體組成之多肽，其中該等抗體結構域及該連接體在N-末端至C-末端方向上具有下列順序中之一者：a) VH-CH1-連接體-VL-CL、b) VL-CL-連接體-VH-CH1、c) VH-CL-連接體-VL-CH1或d) VL-CH1-連接體-VH-CL；且其中該連接體係具有至少30個胺基酸、較佳地32至50個胺基酸之多肽。經由CL結構域與CH1結構域之間之天然二硫鍵來穩定該等單鏈Fab片段。另外，可進一步藉由經由插入半胱胺酸殘基(例如在可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100，根據Kabat編號)以生成鏈間二硫鍵來穩定該等單鏈Fab分子。 「交叉單鏈Fab片段」或「x-scFab 」係由抗體重鏈可變結構域(VH)、抗體恆定結構域1 (CH1)、抗體輕鏈可變結構域(VL)、抗體輕鏈恆定結構域(CL)及連接體組成之多肽，其中該等抗體結構域及該連接體在N-末端至C-末端方向上具有下列順序中之一者：a) VH-CL-連接體-VL-CH1及b) VL-CH1-連接體-VH-CL；其中VH及VL一起形成特異性結合至抗原之抗原結合位點且其中該連接體係具有至少30個胺基酸之多肽。另外，可藉由經由插入半胱胺酸殘基(例如在可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100，根據Kabat編號)以生成鏈間二硫鍵來進一步穩定該等x-scFab分子。 「單鏈可變片段 (scFv )」係抗體之重鏈(VH )及輕鏈(VL )之可變區之融合蛋白，其使用具有10至約25個胺基酸之短連接體肽連結。連接體通常富含甘胺酸(用於撓性)以及絲胺酸或蘇胺酸(用於溶解性)，且可連結VH 之N-末端與VL 之C-末端，或反之亦然。儘管去除恆定區且引入連接體，但此蛋白質仍保留原始抗體之特異性。scFv抗體(例如)闡述於Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)中。另外，抗體片段包括具有VH結構域特性(亦即能夠與VL結構域一起組裝)或VL結構域特性(亦即能夠與VH結構域一起組裝)之單鏈多肽，該等組裝可形成功能抗原結合位點且由此提供全長抗體之抗原結合性質。 「支架抗原結合蛋白 」為業內已知，舉例而言，已使用纖連蛋白及經設計錨蛋白重複蛋白(DARPin)作為抗原-結合結構域之替代支架，例如參見Gebauer及Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及Stumpp等人，Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。在本發明之一態樣中，支架抗原結合蛋白係選自由以下組成之群：CTLA-4 (厄維體(Evibody))、脂質運載蛋白(Lipocalin) (抗運載蛋白(Anticalin))、蛋白質A源分子(例如蛋白質A之Z-結構域，親和體(Affibody))、A-結構域(高親和性多聚物(Avimer)/大抗體(Maxibody))、血清轉鐵蛋白(穿體(trans -body))；經設計錨蛋白重複蛋白(DARPin)、抗體輕鏈或重鏈之可變結構域(單一結構域抗體，sdAb)、抗體重鏈之可變結構域(奈米抗體，VH)、VNAR 片段、纖連蛋白(阿德奈汀(AdNectin))、C-型凝集素結構域(四連接素(Tetranectin))；新抗原受體β-內醯胺酶之可變結構域(VNAR 片段)、人類γ-晶體蛋白或泛素(親和素分子)；人類蛋白酶抑制劑之庫尼茲(kunitz)型結構域、微體(例如來自打結素(knottin)家族之蛋白質)、肽適配體及纖連蛋白(阿德奈汀)。CTLA-4 (細胞毒性T淋巴球相關抗原4)係在主要CD4+ T-細胞上表現之CD28-家族受體。其細胞外結構域具有可變結構域樣Ig摺疊。對應於抗體之CDR之環可經異源序列取代以賦予不同結合性質。經改造以具有不同結合特異性之CTLA-4分子亦稱為厄維體(例如US7166697B1)。厄維體與抗體之分離可變區(例如結構域抗體)具有大致相同之大小。關於其他細節，參見Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)。脂質運載蛋白係運輸小疏水性分子(例如類固醇、後膽色素(bilin)、類視色素及脂質)之細胞外蛋白家族。其於錐形結構之開口端具有含有諸多環之剛性β-摺疊二級結構，該結構可經改造以結合至不同靶抗原。抗運載蛋白之大小介於160個胺基酸與180個胺基酸之間，且源自脂質運載蛋白。關於其他細節，參見Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、US7250297B1及US20070224633。親和體係源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之蛋白A之支架，其可經改造以結合至抗原。結構域係由具有約58個胺基酸之三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化來生成文庫。關於其他細節，參見Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462及EP 1641818A1。高親和性多聚物係衍生自A-結構域支架家族之多結構域蛋白。具有約35個胺基酸之天然結構域呈現經界定二硫鍵結結構。藉由使由A-結構域家族展現之天然變化改組來生成多樣性。關於其他細節，參見Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)及Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (2007年6月)。轉鐵蛋白係單體血清運輸醣蛋白。轉鐵蛋白可藉由在允許表面環中插入肽序列經來改造以結合不同靶抗原。經改造轉鐵蛋白支架之實例包含穿體。關於其他細節，參見J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)。經設計錨蛋白重複蛋白(DARPin)係源自調介整合膜蛋白附接至細胞骨架之蛋白家族的錨蛋白。單一錨蛋白重複係序由兩個α-螺旋及β-轉角組成之33殘基基。其可藉由隨機化每一重複之第一α-螺旋及β-轉角中之殘基來進行改造以結合不同靶抗原。可藉由增加模組數量(親和力成熟方法)來增大其結合界面。關於其他細節，參見J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)及J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)及US20040132028A1。單一結構域抗體係由單一單體可變抗體結構域組成之抗體片段。第一單一結構域係衍生自來自駱駝科之抗體重鏈之可變結構域(奈米抗體或VH H片段)。另外，術語單一結構域抗體包含自主人類重鏈可變結構域(VH)或衍生自鯊魚之VNAR 片段。纖連蛋白係可經改造以結合至抗原之支架。阿德奈汀係由人類纖連蛋白III型(FN3)之15個重複單元之第10結構域之天然胺基酸序列的骨架組成。貝他三明治(beta.-sandwich)一端處之3個環可經改造以使阿德奈汀能夠特異性識別所關注治療靶。關於其他細節，參見Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)、US20080139791、WO2005056764及US6818418B1。肽適配體係由恆定支架蛋白(通常為硫氧還蛋白(TrxA))組成之組合識別分子，該蛋白質含有插入活性位點之限制性可變肽環。關於其他細節，參見Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)。微體係源自長度為25至50個胺基酸之天然微量蛋白，其含有3至4個半胱胺酸橋，微量蛋白之實例包含KalataBI及芋螺毒素(conotoxin)以及打結素。微量蛋白之環可經改造以包含多達25個胺基酸，此不會影響微量蛋白之總體摺疊。關於經改造打結素結構域之其他細節，參見WO2008098796。 「結合至相同表位之抗原結合分子 」 (作為參考分子)係指在競爭分析中將參考分子與其抗原之結合阻斷50%或更高之抗原結合分子，且反之，參考分子在競爭分析中將該抗原結合分子與其抗原之結合阻斷50%或更高。 術語「抗原結合結構域 」或「抗原結合位點」係指抗原結合分子中包括特異性結合一部分或所有抗原至且與其互補之區域之部分。在抗原較大之情形下，抗原結合分子可僅結合至抗原之特定部分，該部分稱為表位。可藉由(例如)一或多個可變結構域(亦稱為可變區)來提供抗原結合結構域。較佳地，抗原結合結構域包括抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。 如本文中所使用，術語「抗原決定子 」與「抗原」及「表位」同義，且係指多肽大分子上抗原結合部分結合形成抗原結合部分-抗原複合物之位點(例如胺基酸之鄰接序列段或由非鄰接胺基酸之不同區域構成之構象構形)。有用抗原決定子可發現於(例如)腫瘤細胞表面上、病毒感染細胞表面上、其他患病細胞表面上、免疫細胞表面上、游離於血清中及/或位於細胞外基質(ECM)中。除非另外指示，否則可在本文中用作抗原之蛋白質可為來自任一脊椎動物來源之任一天然形式之蛋白質，該脊椎動物來源包含哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。在一特定實施例中，抗原係人類蛋白質。在本文中提及具體蛋白質之情形下，該術語涵蓋「全長」蛋白、未處理蛋白以及任一形式之源自細胞處理之蛋白質。該術語亦涵蓋蛋白質之天然變體，例如剪接變體或等位基因變體。 「特異性結合 」意指該結合對抗原具有選擇性且可區別於不需要之相互作用或非特異性相互作用。抗原結合分子與特定抗原結合之能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟知之其他技術(例如表面電漿共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析) (Liljeblad等人，Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)))來量測。在一實施例中，抗原結合分子與無關蛋白質之結合程度小於抗原結合分子與抗原之結合之約10%，如藉由(例如) SPR所量測。在某些實施例中，結合抗原之分子具有≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM(例如10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)之解離常數(Kd)。 「親和力 」或「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間之非共價相互作用的總和強度。除非另外指示，否則如本文中所使用，「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如抗體與抗原)之間之1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(Kd)表示，解離常數係解離速率常數與締合速率常數(分別為k解離及k締合)之比率。因此，等效親和力可包括不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由業內已知之常用方法(包含闡述於本文中者)來量測親和力。量測親和力之特定方法係表面電漿共振(SPR)。 「親和力成熟 」抗體係指與不具有改變之親代抗體相比，在一或多個超變區(HVR)中具有一或多個改變之抗體，該等改變可改良抗體對抗原之親和力。 本文所用之「靶細胞抗原 」係指呈現於靶細胞、尤其腫瘤中之靶細胞(例如癌細胞或腫瘤間質細胞)之表面上之抗原決定子。因此，靶細胞抗原係腫瘤相關抗原。特定而言，靶細胞抗原不包含經活化T細胞上之免疫檢查點受體(例如CTLA-4、PD-1或PD-L1)。在某些實施例中，靶細胞抗原係腫瘤細胞之表面上之抗原。在一態樣中，腫瘤靶細胞抗原係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、CD19、CD20及CD33。特定而言，腫瘤靶細胞抗原係纖維母細胞活化蛋白(FAP)。 除非另外指示，否則術語「纖維母細胞活化蛋白 (FAP) 」 (亦稱為脯胺醯內肽酶FAP或Seprase (EC 3.4.21))係指來自任一脊椎動物來源之任一天然FAP，該脊椎動物來源包含哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹猴)及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」未處理FAP以及自處理細胞產生之任一形式的FAP。該術語亦涵蓋FAP之天然變體，例如剪接變體或等位基因變體。在一實施例中，本發明之抗原結合分子能夠特異性結合至人類、小鼠及/或食蟹猴FAP。人類FAP之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)登錄號Q12884 (第149版，SEQ ID NO:2)或NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2中。人類FAP之細胞外結構域(ECD)自胺基酸位置26延伸至位置760。加His標籤之人類FAP ECD之胺基酸序列展示於SEQ ID NO 142中。小鼠FAP之胺基酸序列展示於UniProt登錄號P97321 (第126版，SEQ ID NO:143)或NCBI RefSeq NP_032012.1中。小鼠FAP之細胞外結構域(ECD)自胺基酸位置26延伸至位置761。SEQ ID NO: 144展示加His標籤之小鼠FAP ECD之胺基酸。SEQ ID NO:145展示加His標籤之食蟹猴FAP ECD之胺基酸。較佳地，本發明之抗FAP結合分子結合至FAP之細胞外結構域。 術語「可變區 」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗原結合分子與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中各結構域包含4個保守框架區(FR)及3個超變區(HVR)。例如參見Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H. Freeman and Co.，第91頁(2007)。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。 本文所用之術語「超變區 」或「HVR」係指抗體可變結構域區中序列具有超變性及/或形成結構上經界定之環(「超變環」)中的每一者。通常，天然四鏈抗體包括六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包括來自超變環及/或來自「互補決定區」 (CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或涉及抗原識別。實例性超變環出現於胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處。(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)。) 實例性CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現於L1之胺基酸殘基24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35B、H2之50-65及H3之95-102處。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes ，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)。) 超變區(HVR)亦稱為互補決定區(CDR)，且該等術語在本文中可互換使用並係指可變區中形成抗原結合區之部分。此特定區域已由Kabat等人，U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 (1983)及Chothia等人，J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)進行闡述，其中定義包含在彼此比較時胺基酸殘基之重疊或子組。然而，在提及抗體或其變體之CDR時應用任一定義意欲在如本文所定義及使用之術語之範圍內。作為對比，涵蓋如由每一上文所引用參考文獻所定義之CDR之適當胺基酸殘基陳述於下表A中。構成特定CDR之確切殘基數將端視CDR之序列及大小而有所變化。在給出抗體之可變區胺基酸序列下，熟習此項技術者可以常規方式測定構成特定CDR之殘基。 表A. CDR定義1
Figure 107111767-A0304-0001
 1 表A中之所有CDR定義之編號皆係根據由Kabat等人(參見下文)所陳述之編號慣例。2 表A中所用之具有小寫字母「b」之「AbM」係指如藉由Oxford Molecular's 「AbM」抗體建模軟體所定義的CDR。 Kabat等人亦定義適用於任何抗體之可變區序列編號系統。熟習此項技術者可明確地將此「Kabat編號」系統指定給任何可變區序列，除序列本身外不依賴於任何實驗數據。如本文中所使用，「Kabat編號」係指由Kabat等人，U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983)所陳述之編號系統。除非另外指定，否則所提及之抗體可變區中之具體胺基酸殘基位置之編號係根據Kabat編號系統。 除VH中之CDR1外，CDR通常包括形成超變環之胺基酸殘基。CDR亦包括「特異性決定殘基」或「SDR」，其係接觸抗原之殘基。SDR含於CDR中稱為縮短-CDR (abbreviated-CDR)或a-CDR之區域內。實例性a-CDR (a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現於L1之胺基酸殘基31-34、L2之50-55、L3之89-96、H1之31-35B、H2之50-58及H3之95-102處。(參見Almagro及Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)。) 除非另外指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人所闡述進行編號(見上文)。 「框架 」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常係由4個FR結構域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列通常出現於VH (或VL)中之下列序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。 術語「嵌合 」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種的抗體。 抗體之「種類 」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5大類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等種類中之若干種可進一步分成子類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及µ。 「人類化 」抗體係指包括來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包括實質上全部之至少一個、且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之HVR (例如CDR)對應於非人類之彼等HVR，且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包括源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體之「人類化形式 」 (例如非人類抗體)係指已經受人類化之抗體。本發明涵蓋之「人類化抗體」之其他形係如下之彼等：其中恆定區相對於初始抗體之恆定區已另外經修飾或改變以生成本發明之尤其關於C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合之性質。 「人類 」抗體係具有對應於如下抗體之胺基酸序列的胺基酸序列者：其係由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他人類抗體編碼序列之非人類來源。此人類抗體之定義明確排除包括非人類抗原結合殘基之人類化抗體。 術語「Fc結構域」或「Fc 區 」在本文中用於定義抗體重鏈中含有恆定區之至少一部分的C-末端區域。該術語包含天然序列Fc區及變體Fc區。IgG Fc區包括IgG CH2及IgG CH3結構域。人類IgG Fc區之「CH2結構域」通常自約231位之胺基酸殘基延伸至約340位之胺基酸殘基。在一實施例中，碳水化合物鏈附接至CH2結構域。本文之CH2結構域可為天然序列CH2結構域或變體CH2結構域。「CH3結構域」包括Fc區中CH2結構域C-末端之殘基伸展部分(亦即來自IgG之約341位之胺基酸殘基至約447位之胺基酸殘基)。本文之CH3區可為天然序列CH3結構域或變體CH3結構域(例如在一個鏈中引入隆凸(「凸起」)且在另一鏈中相應地引入空腔(「孔洞」)之CH3結構域；參見美國專利第5,821,333號，其以引入方式明確併入本文中)。該等變體CH3結構域可用於促進如本文所闡述之兩個不相同抗體重鏈之異源二聚化。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，可存在或可不存在Fc區之C-末端離胺酸(Lys447)。除非在本文中另外指出，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據亦稱為EU索引之EU編號系統，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院，Bethesda, MD, 1991中所闡述。 「凸起與孔洞 」技術闡述於(例如) US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人， Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。通常，該方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「凸起」)且在第二多肽之界面處引入相應空腔(「孔洞」)，從而該隆凸可定位於空腔中以促進異源二聚體形成並防止同源二聚體形成。藉由使用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)代替來自第一多肽界面之較小胺基酸側鏈來構築隆凸。藉由使用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)代替較大胺基酸側鏈來在第二多肽之界面上產生尺寸與隆凸相同或類似之補償性空腔。可藉由(例如)使用位點特異性誘變或使用肽合成改變編碼多肽之核酸來製備隆凸及空腔。在一具體實施例中，凸起修飾包括Fc結構域之兩個亞單元中之一者中之胺基酸取代T366W，且孔洞修飾包括Fc結構域之兩個亞單元中之另一者中之胺基酸取代T366S、L368A及Y407V。在另一具體實施例中，Fc結構域中包括凸起修飾之亞單元另外包括胺基酸取代S354C，且Fc結構域中包括孔洞修飾之亞單元另外包括胺基酸取代Y349C。引入該兩個半胱胺酸殘基使得可在Fc區之兩個亞單元之間形成二硫橋，由此進一步穩定二聚體(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。 「等效於免疫球蛋白之Fc區之區域」意欲包含免疫球蛋白之Fc區之天然等位基因變體；以及具有產生取代、添加或缺失但不會實質上降低免疫球蛋白調介效應物功能(例如抗體依賴性細胞毒性)之能力之改變的變體。舉例而言，可自免疫球蛋白之Fc區之N-末端或C-末端缺失一或多個胺基酸，此並不實質性損失生物功能。可根據業內已知之一般規則來選擇該等變體以對活性具有最小效應(例如參見Bowie, J. U.等人，Science 247:1306-10 (1990))。 術語「效應物功能 」係指彼等可歸因於抗體之Fc區之生物活性，其可隨抗體同型而有所變化。抗體效應物功能之實例包含：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物調介之抗原呈遞細胞之抗原攝取、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調及B細胞活化。 可藉由抗體Fc區與Fc受體(FcR) (其係造血細胞上之特殊細胞表面受體)之相互作用來調介Fc受體結合依賴性效應物功能。Fc受體屬免疫球蛋白超家族，且已展示可調介經抗體塗覆之病原體之去除(藉由免疫複合物之吞噬作用)及經相應抗體塗覆之紅血球及各種其他細胞靶(例如腫瘤細胞)之裂解(經由抗體依賴性細胞介導之細胞毒性) (ADCC) (例如參見Van de Winkel, J.G.及Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524)。根據對免疫球蛋白同型之特異性來定義FcR：IgG抗體之Fc受體稱為FcγR。Fc受體結合闡述於(例如)以下文獻中：Ravetch, J.V.及Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492；Capel, P.J.等人，Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas, M.等人，J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341；及Gessner, J.E.等人，Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248。 受體與IgG抗體Fc區(FcγR)之交聯會觸發眾多種效應物功能，包含吞噬作用、抗體依賴性細胞毒性及發炎性媒介物釋放以及免疫複合物清除及抗體產生調控。在人類中，已表徵以下三類FcγR： - FcγRI (CD64)，其以高親和力結合單體IgG且表現於巨噬球、單核球、嗜中性球及嗜酸性球上。修飾IgG Fc區中之E233-G236、P238、D265、N297、A327及P329 (根據Kabat之EU索引進行編號)中之至少一個胺基酸殘基會減小與FcγRI之結合。將位置233-236之IgG2殘基替換成IgG1及IgG4殘基可使與FcγRI之結合減小10³倍並消除人類單核球對抗體敏化紅血球之反應(Armour, K.L.等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。 -FcγRII (CD32)，其以中低親和力結合複合IgG且廣泛表現。此受體可分成兩個亞型FcγRIIA及FcγRIIB。FcγRIIA發現於許多涉及殺死之細胞(例如巨噬球、單核球、嗜中性球)上且似乎能夠激活殺死過程。FcγRIIB似乎在抑制過程中發揮作用且發現於B細胞、巨噬球以及肥大細胞及嗜酸性球上。在B細胞上，其似乎用於阻抑進一步之免疫球蛋白產生及至(例如) IgE種類之同型切換。在巨噬球上，FcγRIIB用於抑制如經由FcγRIIA所調介之吞噬作用。在嗜酸性球及肥大細胞上，B形式可幫助阻抑該等細胞經由使IgE結合至其單獨受體所進行之活化。減小之FcγRIIA結合發現於(例如)包括在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292及K414 (根據Kabat之EU索引進行編號)中之至少一者處具有突變之IgG Fc區的抗體中。 - FcγRIII (CD16)，其以中低親和力結合IgG且以兩種類型存在。FcγRIIIA發現於NK細胞、巨噬球、嗜酸性球及一些單核球及T細胞上並介導ADCC。FcγRIIIB高度表現於嗜中性球上。減小之FcγRIIIA結合發現於(例如)包括在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338及D376 (根據Kabat之EU索引進行編號)中之至少一者處具有突變之IgG Fc區的抗體中。 人類IgG1上之結合位點對Fc受體之定位、上文所提及突變位點及量測與FcγRI及FcγRIIA之結合之方法闡述於Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604中。 術語「ADCC 」或「抗體依賴性細胞細胞毒性」係藉由Fc受體結合所介導之功能且係指藉由如本文所報告之抗體在效應細胞存在下裂解靶細胞。藉由量測抗體與Fcγ受體表現細胞(例如重組表現FcγRI及/或FcγRIIA之細胞或NK細胞(基本上表現FcγRIIIA))之結合來探究抗體誘導介導ADCC之初始步驟之能力。特定而言，量測與NK細胞上之FcγR之結合。 「活化 Fc 受體 」係在由抗體之Fc區結合後引發刺激具有受體之細胞實施效應物功能之信號傳導事件的Fc受體。活化Fc受體包含FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。特定活化Fc受體係人類FcγRIIIa (參見UniProt登錄號P08637，第141版)。 除非另外指示，否則本文所用之術語「CD40 」係指來自任一脊椎動物來源之任一天然CD40，該脊椎動物來源包含哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋未處理「全長」 CD40以及自處理細胞產生之CD40的任一形式。該術語亦涵蓋CD40之天然變體，例如剪接變體或等位基因變體。實例性人類CD40之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:1中(Uniprot P25942，第200版)且實例性小鼠CD40之胺基酸序列展示於SEQ ID NO: 146中(Uniprot P27512，第160版)。CD40抗原係50 kDa細胞表面醣蛋白，其屬腫瘤壞死因子受體(TNF-R)家族。(Stamenkovic等人(1989), EMBO J. 8: 1403-10)。CD40表現於許多正常細胞及腫瘤細胞類型(包含B淋巴球、樹突狀細胞、單核球、巨噬球、胸腺上皮、內皮細胞、纖維母細胞及平滑肌細胞)中。CD40表現於所有B-淋巴瘤及所有實體腫瘤之70%中且藉由成熟信號(例如IFN-γ及GM-CSF)上調於抗原呈遞細胞(APC)中。CD40活化亦誘導單核球分化成功能樹突狀細胞(DC)並經由APC-CD40誘導之細胞介素來增強NK細胞之細胞溶解活性。因此，CD40在藉由誘導APC之成熟引發及增強免疫反應、分泌輔助細胞介素、上調共刺激分子及增強效應物功能方面發揮重要作用。 本文所用之術語「CD40 激動劑 」包含任一激發CD40/CD40L相互作用之部分。此上下文中所用之CD40較佳地係指人類CD40，因此CD40激動劑較佳係人類CD40之激動劑。通常，該部分係激動性CD40抗體或抗體片段。 術語「抗 CD40 抗體 」、「抗CD40」、「CD40抗體」及「特異性結合至CD40之抗體」係指能夠以足夠親和力結合CD40以便該抗體可用作靶向CD40之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一態樣中，抗CD40抗體與不相關非CD40蛋白之結合程度小於該抗體與CD40之結合約10%，如(例如)藉由放射免疫分析(RIA)或流式細胞術(FACS)所量測。在某些實施例中，結合至CD40之抗體之解離常數(KD )為≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10-6 M或更小、例如10-68 M至10-13 M、例如10-8 M至10-10 M)。 術語「肽連接體 」係指包括一或多個胺基酸、通常約2至20個胺基酸之肽。業內已知肽連接體或闡述於本文中。適宜非免疫原性連接體肽係(例如) (G4 S)n 、(SG4 )n 或G4 (SG4 )n 肽連接體，其中「n」通常係介於1與10之間、通常介於2與4之間之數字、尤其2，亦即，該等肽係選自由以下組成之群：GGGGS (SEQ ID NO: 147)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:148)、SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:149)及GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:150)，但亦包含序列GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:151)、(G4S)3 (SEQ ID NO:152)、(G4S)4 (SEQ ID NO:153)、GSGSGSGS (SEQ ID NO:154)、GSGSGNGS (SEQ ID NO:155)、GGSGSGSG (SEQ ID NO:156)、GGSGSG (SEQ ID NO:157)、GGSG (SEQ ID NO:158)、GGSGNGSG (SEQ ID NO:159)、GGNGSGSG (SEQ ID NO:160)及GGNGSG (SEQ ID NO:161)。尤其關注之肽連接體係(G4S) (SEQ ID NO:147)、(G4 S)2 或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:148)、(G4S)3 (SEQ ID NO:152)及(G4S)4 (SEQ ID NO:153)。 如本申請案內所使用之術語「胺基酸 」表示天然羧基α-胺基酸之群，其包括丙胺酸(三字母代碼：ala，單字母代碼：A)、精胺酸(arg, R)、天門冬醯胺(asn, N)、天門冬胺酸(asp, D)、半胱胺酸(cys, C)、麩醯胺酸(gln, Q)、麩胺酸(glu, E)、甘胺酸(gly, G)、組胺酸(his, H)、異白胺酸(ile, I)、白胺酸(leu, L)、離胺酸(lys, K)、甲硫胺酸(met, M)、苯丙胺酸(phe, F)、脯胺酸(pro, P)、絲胺酸(ser, S)、蘇胺酸(thr, T)、色胺酸(trp, W)、酪胺酸(tyr, Y)及纈胺酸(val, V)。 「融合 」或「連結 」意指，某些組分(例如抗體之重鏈及Fab片段)藉由肽鍵直接連接或經由一或多個肽連接體進行連接。 就參考肽(蛋白質)序列而言，「胺基酸序列一致性百分比 (%) 」定義為在比對序列並引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分比後，候選序列中與參考肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、SAWI或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包含在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何算法。然而，出於本文目的，使用序列對比電腦程式ALIGN-2來生成胺基酸序列一致性%之值。ALIGN-2序列對比電腦程式係由Genentech, Inc.設計，且原始碼已與使用者文件一起編入美國版權局(U.S. Copyright Office)，Washington D.C., 20559中，其中其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech, Inc.，South San Francisco, California公開獲得，或可自源代碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包含數位UNIX V4.0D)中。所有序列對比參數皆係由ALIGN-2程式設定且不改變。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列對比之情形下，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)或對(against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (或者可表達為相對於、與或對給定胺基酸序列B具有或包括一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)計算如下： 100×分數X/Y 其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另外明確陳述，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%的值皆係根據前面緊接段落中所闡述使用ALIGN-2電腦程式獲得。 在某些實施例中，涵蓋本文提供所特異性抗原結合分子之胺基酸序列變體 。舉例而言，可期望改良含有TNF配體三聚體之抗原結合分子之結合親和力及/或其他生物性質。可藉由在編碼分子之核苷酸序列中引入適當修飾或藉由肽合成來製備含有TNF配體三聚體之抗原結合分子之胺基酸序列變體。該等修飾包含(例如)抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以獲得最終構築體，條件為最終構築體具有期望特性(例如抗原結合性)。用於取代誘變之所關注位點包含HVR及框架(FR)。保守取代提供於標題為「較佳取代」之表B中且在下文中參照胺基酸側鏈種類(1)至(6)來進一步闡述。可將胺基酸取代引入所關注分子及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係(例如)保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或經改良之ADCC或CDC。 表B
Figure 107111767-A0304-0002
 可根據常見側鏈性質將胺基酸分組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6)芳香族殘基：Trp、Tyr、Phe。 非保守性取代使得需要將該等種類之一種之成員與另一種類交換。 術語「胺基酸序列變體 」包含其中在親代抗原結合分子(例如人類化或人類抗體)之一或多個超變區殘基處存在胺基酸取代之實質性變體。通常，選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗原結合分子在某些生物性質(例如增加之親和力、降低之免疫原性)中具有修飾(例如改良)及/或實質上保留親代抗原結合分子之某些生物性質。實例性取代變體係親和力成熟抗體，其可便利地(例如)使用基於噬菌體顯示之親和力成熟技術(例如闡述於本文中者)生成。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且將變體抗原結合分子形式於噬菌體上並篩選特定生物活性(例如結合親和力)。在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生於一或多個HVR內，只要該等變化不會實質上降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。舉例而言，可對HVR作出不實質上降低結合親和力之保守改變(例如本文所提供之保守取代)。用於鑑別抗體上可靶向用於誘變之殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells (1989)Science , 244:1081-1085中所闡述。在此方法中，已鑑別出殘基或目標殘基群(例如帶電殘基，例如Arg、Asp、His、Lys及Glu)，並由中性或帶負電之胺基酸(例如丙胺酸或多丙胺酸)代替以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置引入其他取代。或者或另外，使用抗原-抗原結合分子複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間之接觸點。可靶向該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物或將其消除。可篩選變體以確定其是否含有期望性質。 胺基酸序列插入包含胺基-及/或羧基末端融合體(長度在一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽範圍內)以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包含具有N-末端甲二磺醯殘基之本發明之雙特異性抗原結合分子。分子之其他插入變體包含融合至多肽之N-或C-末端，此會增加雙特異性抗原結合分子之血清半衰期。 在某些實施例中，改變本文所提供之雙特異性抗原結合分子以增加或降低抗體之醣基化程度。可藉由改變胺基酸序列以便產生或去除一或多個醣基化位點來便利地獲得分子之醣基化變體。在含有TNF配體三聚體之抗原結合分子包括Fc區之情形下，可改變所附接碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包括具支鏈、二分枝寡糖，其通常藉由N-鍵聯附接至Fc區之CH2結構域的Asn297。例如參見Wright等人，TIBTECH 15:26-32 (1997)。該寡糖可包含多種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及附接至二分枝寡糖結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可修飾含有TNF家族配體三聚體之抗原結合分子中之寡醣以產生具有某些改良性質之變體。在一態樣中，提供本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體之變體，該變體具有缺乏附接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構。該等岩藻糖基化變體可具有改良之ADCC功能，例如參見美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)或第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。在另一態樣中，提供具有二等分寡醣之本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體之變體，舉例而言，其中附接至Fc區之二分枝寡醣由GlcNAc二等分。該等變體可具有減小之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能，例如參見WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546 (Umana等人)中。亦提供在附接至Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基的變體。該等抗體變體可具有改良之CDC功能且闡述於(例如) WO 1997/30087 (Patel等人)、WO 1998/58964 (Raju, S.)及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。在某些態樣中，可期望產生本發明之雙特異性抗原結合分子之半胱胺酸改造變體，例如「硫基MAb」，其中分子之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，經取代殘基在分子之可及位點處出現。藉由使用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此位於抗體之可及位點處且可用於使抗體偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)以產生免疫偶聯物。在某些態樣中，下列殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)、重鏈之A118 (EU編號)及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。經半胱胺酸改造之抗原結合分子可如(例如)美國專利第7,521,541號中所闡述來產生。 術語「多核苷酸 」係指經分離核酸分子或構築體，例如信使RNA (mRNA)、病毒源RNA或質體DNA (pDNA)。多核苷酸可包括習用磷酸二酯鍵或非習用鍵(例如醯胺鍵，例如發現於肽核酸(PNA)中)。術語「核酸分子」係指存在於多核苷酸中之任一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。 「經分離 」核酸分子或多核苷酸意欲為自其天然環境取出之核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明目的，編碼載體中所含多肽之重組多核苷酸可視為經分離多核苷酸。經分離多核苷酸之其他實例包含維持於異源宿主細胞中之重組多核苷酸或溶液中之經純化(部分地或實質上)多核苷酸。經分離多核苷酸包含通常含有多核苷酸分子之細胞中所含的多核苷酸分子，但該多核苷酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。經分離RNA分子包含本發明之活體內或活體外RNA轉錄物以及正鏈及負鏈形式及雙鏈形式。本發明之經分離多核苷酸或核酸進一步包含以合成方式產生之該等分子。另外，多核苷酸或核酸可為或可包含調控元件，例如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。 對於具有與本發明之參考核苷酸序列至少(例如) 95% 「一致」之核苷酸序列之核酸或多核苷酸而言，預計多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同，只是在參考核苷酸序列之每100個核苷酸中多核苷酸序列可包含最多5個點突變。換言之，為獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列之多核苷酸，參考序列中之最多5%之核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或可將最多為參考序列中之總核苷酸之5%數量之核苷酸插入參考序列中。參考序列之該等改變可發生在參考核苷酸序列之5’或3’末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列中之各殘基之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。作為實際情況，可使用已知電腦程式(例如上文針對多肽所論述者(例如ALIGN-2))按慣例確定任一特定多核苷酸分子序列與本發明核苷酸序列是否為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。 術語「表現盒 」係指以重組或合成方式生成之具有一系列允許轉錄靶細胞中之特定核酸之指定核酸元件的多核苷酸。可將重組表現盒納入質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現盒部分相對於其他序列尤其包含擬轉錄核酸序列及啟動子。在某些實施例中，本發明表現盒包括編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段之多核苷酸序列。 術語「載體 」或「表現載體」與「表現構築體」同義且係指用於引入可操作地締合於靶細胞中之特異性基因並引導其表現之DNA分子。該術語包含呈自複製核酸結構之載體以及納入引入其之宿主細胞基因體中的載體。本發明之表現載體包括表現盒。表現載體容許轉錄大量穩定mRNA。在表現載體位於靶細胞內部時，由基因編碼之核糖核酸分子或蛋白質立即藉由細胞轉錄及/或轉譯機制產生。在一實施例中，本發明之表現載體包括含有編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段之多核苷酸序列之表現盒。 術語「宿主細胞 」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指向其中引入外源核酸之細胞，包含該等細胞之子代。宿主細胞包含「轉化體」及「經轉化細胞」，其包含原代經轉化細胞及源自其之子代(與傳代次數無關)。子代之核酸含量可與親代細胞並不完全相同，而是可含有突變。本文包含經篩選或選擇用於原始經轉化細胞中之具有相同功能或生物活性的突變體子代。宿主細胞係任一類型之可用於生成本發明之雙特異性抗原結合分子之細胞系統。宿主細胞包含經培養細胞，例如哺乳動物經培養細胞，例如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉幾個例子)，且亦包含轉基因動物、轉基因植物或經培養植物或動物組織中所含之細胞。 藥劑之「有效量 」係指在投與該藥劑之細胞或組織中產生生理學變化所需之量。 藥劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量 」係指在所需時間內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。舉例而言，治療有效量之藥劑會消除、降低、延遲、最小化或防止疾病之不良效應。 「個體 (individual) 」或「個體(subject)」係哺乳動物。哺乳動物包含(但不限於)家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，例如猴子)、兔及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。特定而言，個體係人類。 術語「醫藥調配物 」係指如下製劑：其係呈使得其中所含活性成分之生物活性有效之形式，且不含對將投與調配物之個體具有不可接受之毒性的其他組分。 「醫藥上可接受之賦形劑 」係指醫藥組合物中除活性成分外對個體無毒之成分。醫藥上可接受之賦形劑包含(但不限於)緩衝劑、穩定劑或防腐劑。 術語「包裝插頁 」用於係指通常包含於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於治療產品之使用之警告的資訊。 如本文中所使用，「治療 (treatment) 」(及其語法變化形式，例如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指嘗試改變所治療個體之自然病程之臨床干預，且可出於預防目的或在臨床病理學病程期間實施。治療之期望效應包含(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明分子來延遲疾病發生或減緩疾病進展。 本文所用之術語「癌症 」係指增殖性疾病，例如淋巴瘤、淋巴細胞性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、表皮或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、何傑金氏病(Hodgkin's Disease)、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽管癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性神經膠母細胞瘤、星細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦脊髓膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤恩氏肉瘤(Ewings sarcoma)，包含上述癌症中任一者之難治性形式或上述癌症中一或多者之組合。 本文所用之術語「化學治療劑 」係指可用於治療癌症之化學化合物。在一態樣中，化學治療劑係抗代謝物。在一態樣中，抗代謝物係選自由以下組成之群：胺基喋呤(Aminopterin)、胺甲喋呤(Methotrexate)、培美曲塞(Pemetrexed)、雷替曲塞(Raltitrexed)、克拉屈濱(Cladribine)、氯法拉濱(Clofarabine)、氟達拉濱(Fludarabine)、巰基嘌呤(Mercaptopurine)、噴司他汀(Pentostatin)、硫鳥嘌呤(Thioguanine)、卡培他濱(Capecitabine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟尿苷(Floxuridine)及吉西他濱(Gemcitabine)。在一特定態樣中，抗代謝物係卡培他濱或吉西他濱。在另一態樣中，抗代謝物係氟尿嘧啶。在一態樣中，化學治療劑係影響微管形成之藥劑。在一態樣中，影響微管形成之藥劑係選自由以下組成之群：太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbin)、紫杉德(taxotere)、依託泊苷(etoposide)及替尼泊苷(teniposide)。在另一態樣中，化學治療劑係烷基化劑，例如環磷醯胺(cyclophosphamide)。在一態樣中，化學治療劑係細胞毒性抗生素，例如拓撲異構酶II抑制劑。在一態樣中，拓撲異構酶II抑制劑係多柔比星(doxorubicin)。本發明之雙特異性抗體 本發明提供具有諸如以下等尤其有利性質之新穎雙特異性抗原結合分子：可產生性、穩定性、結合親和力、生物活性、靶向效率、減小之毒性、可給予患者之延長劑量範圍及由此可能之增強效能。實例性雙特異性抗原結合分子 在一態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，及 (b)至少一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域，及 (c) Fc區，其由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成。 在一特定態樣中，該等雙特異性抗原結合分子之特徵在於靶向激動性結合至CD40。特定而言，雙特異性抗原結合分子係靶向腫瘤相關靶細胞抗原之CD40激動劑。在另一特定態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子包括由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成且包括減小效應物功能之突變的Fc區。使用包括減小或廢除效應物功能之突變之Fc區將預防非特異性激動作用(藉由經由Fc受體之交聯)且將預防CD40+ 細胞之ADCC。 如本文所闡述之雙特異性抗原結合分子優於能夠特異性結合至CD40之習用抗體，其中其選擇性誘導靶細胞(其通常係癌細胞或腫瘤間質)處之免疫反應。在一態樣中，腫瘤相關靶細胞抗原係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20及CD33。 在一特定態樣中，腫瘤相關靶細胞抗原係FAP。 該等雙特異性抗原結合分子之特徵在於與CD40之靶向FAP之激動性結合。在FAP表現細胞存在下，雙特異性抗原結合分子能夠活化抗原呈遞細胞(APC，實例2.1)，活化人類B細胞(實例2.1.1及2.1.3)、人類道迪細胞(實例2.1.2)及人類單核球源樹突狀細胞(moDC，實例2.1.4)。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括：重鏈可變區(VH CD40)，其包括(i)包括SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包括(iv)包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包括SEQ ID NO:23之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包括SEQ ID NO:24之胺基酸序列之CDR-L3。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括：重鏈可變區(VH CD40)，其包括(i)包括SEQ ID NO:27之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包括(iv)包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包括SEQ ID NO:31之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包括SEQ ID NO:32之胺基酸序列之CDR-L3。 在一態樣中，雙特異性抗原結合分子包括能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域且包括含有SEQ ID NO:25之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及含有SEQ ID NO:26之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)。 在另一態樣中，雙特異性抗原結合分子包括能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域且包括含有SEQ ID NO:33之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及含有SEQ ID NO:34之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:64。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO:47之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及含有SEQ ID NO:57之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173及SEQ ID NO:174，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177及SEQ ID NO:178。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (a)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之VL，或 (b)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之VL，或 (c)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之VL，或 (d)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之VL，或 (e)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之VL，或 (f)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之VL，或 (g)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之VL，或 (h)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之VL，或 (i)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之VL，或 (j)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之VL，或 (k)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之VL，或 (l)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之VL，或 (m)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之VL，或 (n)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之VL，或 (o)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之VL，或 (p)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之VL。 在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO:171之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO:175之胺基酸序列之VL。 在又一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187及SEQ ID NO:188。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (a)包括SEQ ID NO:179之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL，或 (b)包括SEQ ID NO:180之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL，或 (c)包括SEQ ID NO:181之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL，或 (d)包括SEQ ID NO:182之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL，或 (e)包括SEQ ID NO:179之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之VL，或 (f)包括SEQ ID NO:180之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之VL，或 (g)包括SEQ ID NO:181之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之VL，或 (h)包括SEQ ID NO:182之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之VL，或 (i)包括SEQ ID NO:183之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:187之胺基酸序列之VL，或 (j)包括SEQ ID NO:183之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:188之胺基酸序列之VL，或 (k)包括SEQ ID NO:184之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:187之胺基酸序列之VL，或 (l)包括SEQ ID NO:184之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:188之胺基酸序列之VL。 在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO:179之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL，或其中能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO:182之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO:185之胺基酸序列之VL。靶細胞抗原係 FAP 之雙特異性抗原結合分子 在一特定態樣中，靶細胞抗原係纖維母細胞活化蛋白(FAP)。FAP結合部分已闡述於WO 2012/02006中，該案件之全部內容以引用方式包含於本文中。尤其關注之FAP結合部分闡述於下文中。 在一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域結合至包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列或由組成之多肽。 在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之抗原結合結構域包括 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包括：(i) CDR-H1，其包括SEQ ID NO:3之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括：(iv) CDR-L1，其包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包括SEQ ID NO:7之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包括SEQ ID NO:8之胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包括：(i) CDR-H1，其包括SEQ ID NO:11之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括：(iv) CDR-L1，其包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包括SEQ ID NO:15之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包括SEQ ID NO:16之胺基酸序列。 特定而言，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中重鏈可變區(VH FAP)包括：(i) CDR-H1，其包括SEQ ID NO:3之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列；且輕鏈可變區(VL FAP)包括：(iv) CDR-L1，其包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包括SEQ ID NO:7之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包括之胺基酸序列SEQ ID NO:8。在另一態樣中，能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括：重鏈可變區(VH FAP)，其包括(i)包括SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括(iv)包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包括SEQ ID NO:15之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包括SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR-L3。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括：(a)重鏈可變區(VH FAP)，其包括與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括與SEQ ID NO:10之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列；或(b)重鏈可變區(VH FAP)，其包括與SEQ ID NO:17之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括與SEQ ID NO:18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。 在一態樣中，能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之輕鏈可變區，或能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含有SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區。結合至 CD40 及 FAP 之雙特異性抗原結合分子 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (i)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，其包括：包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55，及包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:64，及 (ii)至少一個能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域，其包括：包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (i)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，其包括：包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184，及包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187及SEQ ID NO:188，及 (ii)至少一個能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域，其包括：包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (i)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，其包括含有SEQ ID NO:171之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及含有SEQ ID NO:175之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)，及 (ii)至少一個能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域，其包括：包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在另一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (i)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，其包括含有SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:182之胺基酸之重鏈可變區(VH CD40)及含有SEQ ID NO:185之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)，及 (ii)至少一個能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域，其包括：包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括：重鏈可變區(VH CD40)，其包括SEQ ID NO: 25之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括：重鏈可變區VH，其包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列。 另外，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括：重鏈可變區(VH CD40)，其包括SEQ ID NO: 25之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括：重鏈可變區VH，其包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括：重鏈可變區(VH CD40)，其包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包括SEQ ID NO: 57之胺基酸序列，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括：重鏈可變區VH，其包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括：包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184，及包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187及SEQ ID NO:188，及 (ii)能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括：重鏈可變區VH，其包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列。雙特異性單價抗原結合分子 (1+1 形式 ) 在一態樣中，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其包括(a)一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，(b)一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域，及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域。 在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該分子包括(a)能夠特異性結合至CD40之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域。在一態樣中，靶細胞抗原係FAP。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該分子包括 (i)能夠特異性結合至CD40之第一Fab片段，其包括：包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55，及包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:64，及 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段，其包括：包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括含有SEQ ID NO:141之胺基酸序列之第一重鏈(HC1)，含有SEQ ID NO:140之胺基酸序列之第二重鏈(HC2)，含有SEQ ID NO:138之胺基酸序列之第一輕鏈及含有SEQ ID NO:137之胺基酸序列之第二輕鏈。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該分子包括 (i)能夠特異性結合至CD40之第一Fab片段，其包括：包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184，及包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187及SEQ ID NO:188，及 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段，其包括：包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該分子包括 (i)能夠特異性結合至CD40之第一Fab片段，其包括：包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184，及包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187及SEQ ID NO:188，及 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段，其包括：包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該分子包括：(i)能夠特異性結合至CD40之第一Fab片段，其包括含有SEQ ID NO:171之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及含有SEQ ID NO:175之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)；及(ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段，其包括含有SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及含有SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在另一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該分子包括：(i)能夠特異性結合至CD40之第一Fab片段，其包括含有SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:182之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及含有SEQ ID NO:185之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)；及(ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段，其包括含有SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及含有SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括含有SEQ ID NO:163之胺基酸序列之第一重鏈(HC1)，含有SEQ ID NO:164之胺基酸序列之第二重鏈(HC2)，含有SEQ ID NO:165之胺基酸序列之第一輕鏈及含有SEQ ID NO:162之胺基酸序列之第二輕鏈。對於結合至 CD40 為二價且對於結合至靶細胞抗原為單價之雙特異性抗原結合分子 (2+1 形式 ) 在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域， (b)一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域， 及 (c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域。 因此，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子對於CD40為二價且對於靶細胞抗原為單價。 在一態樣中，雙特異性抗原結合分子包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc結構域之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之VH及VL結構域，其中VH結構域及VL結構域各自經由肽連接體連結至兩條重鏈之一個C-末端。 在一特定態樣中，肽連接體包括選自SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:153之胺基酸序列。更特定而言，肽連接體包括SEQ ID NO:153。 在一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc結構域之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之VH及VL結構域，其中VH結構經由肽連接體連結至一條重鏈之C-末端且其中VL結構域經由肽連接體連結至第二重鏈之C-末端。 在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc結構域之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之VH及VL結構域，其中VH結構域經由肽連接體連結至Fc凸起重鏈之C-末端且其中VL結構域經由肽連接體連結至Fc孔洞重鏈之C-末端。 在一態樣中，雙特異性抗原結合分子包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc結構域之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之VH及VL結構域，其中VL結構域經由肽連接體連結至Fc凸起重鏈之C-末端且其中VH結構域經由肽連接體連結至Fc孔洞重鏈之C-末端。 在一態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩個Fab片段，其能夠特異性結合至經與Fc區連結之CD40，及 (b)一個抗原結合結構域，其能夠特異性結合至經與Fc區之C-末端之連結之FAP 。 在一特定態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc區之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域之VH及VL，其中VH連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端，且其中VL連結至(a)之兩條重鏈中之另一者之C-末端。 在另一態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域之VH及VL，其中VH連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端，且其中VL連結至(a)之兩條重鏈中之另一者之C-末端。 特定而言，VH結構域係包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)且VL結構域係包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。更特定而言，VH結構域係包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)且VL結構域係包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在一特定態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩條輕鏈，其各自包括SEQ ID NO:82之胺基酸序列；第一重鏈，其包括SEQ ID NO:88之胺基酸序列；及第二重鏈，其包括SEQ ID NO:89之胺基酸序列，或 (b)兩條輕鏈，其各自包括SEQ ID NO:133之胺基酸序列；第一重鏈，其包括SEQ ID NO:134之胺基酸序列；及第二重鏈，其包括SEQ ID NO:135之胺基酸序列。 在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc結構域之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之Fab片段，其中Fab片段經由肽連接體連結至一條重鏈之C-末端。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)一個能夠特異性結合至FAP之Fab片段，其中Fab片段連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 特定而言，能夠特異性結合之Fab片段係交叉fab片段。 在一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括：兩條各自包括SEQ ID NO:137之胺基酸序列之輕鏈，一條包括SEQ ID NO:138之胺基酸序列之輕鏈，包括SEQ ID NO:139之胺基酸序列之第一重鏈，及包括SEQ ID NO:136之胺基酸序列之第二重鏈。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)能夠特異性結合至FAP之包括VL-CH1鏈及VH-CL鏈之交叉fab片段，其中VH-CL鏈連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 在一態樣中，VH-CL鏈連結至FC凸起重鏈之C-末端。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)能夠特異性結合至FAP之包括VL-CH1鏈及VH-CL鏈之交叉fab片段，其中VL-CH1鏈連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 在一態樣中，VL-CH1鏈連結至FC凸起重鏈之C-末端。 在一特定態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩條各自包括SEQ ID NO:165之胺基酸序列之輕鏈，一條包括SEQ ID NO:162之胺基酸序列之輕鏈，包括SEQ ID NO:167之胺基酸序列之第一重鏈，及包括SEQ ID NO:168之胺基酸序列之第二重鏈，或 (b)兩條各自包括SEQ ID NO:248之胺基酸序列之輕鏈，一條包括SEQ ID NO:162之胺基酸序列之輕鏈，包括SEQ ID NO:251之胺基酸序列之第一重鏈，及包括SEQ ID NO:252之胺基酸序列之第二重鏈，或 (c)兩條各自包括SEQ ID NO:248之胺基酸序列之輕鏈，一條包括SEQ ID NO:138之胺基酸序列之輕鏈，包括SEQ ID NO:253之胺基酸序列之第一重鏈，及包括SEQ ID NO:252之胺基酸序列之第二重鏈，或 (d)兩條各自包括SEQ ID NO:248之胺基酸序列之輕鏈，一條包括SEQ ID NO:254之胺基酸序列之輕鏈，包括SEQ ID NO:255之胺基酸序列之第一重鏈，及包括SEQ ID NO:252之胺基酸序列之第二重鏈，或 (e)兩條各自包括SEQ ID NO:256之胺基酸序列之輕鏈，一條包括SEQ ID NO:254之胺基酸序列之輕鏈，包括SEQ ID NO:257之胺基酸序列之第一重鏈，及包括SEQ ID NO:258之胺基酸序列之第二重鏈。呈頭對尾形式 (2+1) 之雙特異性抗原結合分子 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)重鏈，其包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)重鏈，其包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域、能夠特異性結合至FAP之Fab片段之VL及CH1結構域及Fc區亞單元， (c)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (d)輕鏈，其包括能夠特異性結合至FAP之Fab片段之VH及CL結構域。 特定而言，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括包括SEQ ID NO:164之胺基酸序列之第一重鏈；包括SEQ ID NO:166之胺基酸序列之第二重鏈；各自包括SEQ ID NO:165之胺基酸序列之兩條輕鏈；及包括SEQ ID NO:162之胺基酸序列之輕鏈。對於結合至 CD40 為二價且對於結合至靶細胞抗原為二價之雙特異性抗原結合分子 (2+2 形式 ) 在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域， (b)兩個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域， 及 (c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域。 因此，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子對於CD40為二價且對於靶細胞抗原為二價。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)兩個能夠特異性結合至FAP之Fab片段，其中一個Fab片段連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端，且另一Fab片段連結至(a)之兩條重鏈中之另一者之C-末端。 在一特定態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)兩條輕鏈，其各自包括SEQ ID NO:86之胺基酸序列， 兩條輕鏈，其各自包括SEQ ID NO:87之胺基酸序列，及 兩條重鏈，其各自包括SEQ ID NO:90之胺基酸序列，或 (b)兩條輕鏈，其各自包括SEQ ID NO:137之胺基酸序列， 兩條輕鏈，其各自包括SEQ ID NO:138之胺基酸序列，及 兩條重鏈，其各自包括SEQ ID NO:136之胺基酸序列。對於結合至 CD40 為四價且對於結合至靶細胞抗原為單價之雙特異性抗原結合分子 (4+1 形式 ) 在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)四個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域， (b)一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域， 及 (c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域。 因此，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子對於CD40為四價且對於靶細胞抗原為單價。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中4個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域係Fab片段且其中之每兩者視情況經由肽連接體彼此融合於重鏈處。在一特定態樣中，肽連接體包括SEQ ID NO:148之胺基酸序列。更特定而言，抗原結合分子包括兩條各自包括VHCH1-肽連接體-VHCH1片段之重鏈。在一特定態樣中，肽連接體具有SEQ ID NO:148之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域包括VH及VL結構域，且其中VH結構域經由肽連接體連結至Fc結構域之第一亞單元之C-末端且VL結構域經由肽連接體連結至Fc結構域之第二亞單元之C-末端。 在一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包括 (a) 4條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域， (b)兩條重鏈，其中每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域，該結構域融合至能夠特異性結合至CD40之第二Fab片段之VH及CH1結構域；及Fc區亞單元，及 (c)能夠特異性結合至靶細胞抗原之VH及VL結構域，其中VH結構域經由肽連接體連結至一條重鏈之C-末端且其中VL結構域經由肽連接體連結至第二重鏈之C-末端。 在一特定態樣中，肽連接體包括選自SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:153之胺基酸序列。更特定而言，肽連接體包括SEQ ID NO:153。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a) 4條輕鏈，其每一輕鏈包括含有選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187及SEQ ID NO:188， (b)兩條重鏈，其中每一重鏈包括VH-CH1-VH-CH1及Fc區亞單元，且其中兩個VH結構域皆包括含有選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184，及 (c)能夠特異性結合至靶細胞抗原之VH及VL結構域，其中VH結構域經由肽連接體連結至一條重鏈之C-末端且其中VL結構域經由肽連接體連結至第二重鏈之C-末端。 在一態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a) 4個能夠特異性結合至CD40之Fab片段；(b)能夠特異性結合至FAP之VH及VL結構域；及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域。 特定而言，VH結構域係包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)且VL結構域係包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。更特定而言，VH結構域係包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)且VL結構域係包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 在一特定態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a) 4條輕鏈，其各自包括SEQ ID NO:82之胺基酸序列；第一重鏈，其包括SEQ ID NO:83之胺基酸序列；及第二重鏈，其包括SEQ ID NO:84之胺基酸序列，或 (b) 4條輕鏈，其各自包括SEQ ID NO:133之胺基酸序列；第一重鏈，其包括SEQ ID NO:131之胺基酸序列；及第二重鏈，其包括SEQ ID NO:132之胺基酸序列。 在另一特定態樣中，本發明提供能夠特異性結合至鼠類CD40之雙特異性抗原結合分子，其包括 (a) 4條輕鏈，其各自包括SEQ ID NO:97之胺基酸序列；第一重鏈，其包括SEQ ID NO:95之胺基酸序列；及第二重鏈，其包括SEQ ID NO:96之胺基酸序列。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a) 4條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域， (b)兩條重鏈，其中每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域，該結構域融合至能夠特異性結合至CD40之第二Fab片段之VH及CH1結構域；及Fc區亞單元，及 (c)一個能夠特異性結合至FAP之Fab片段，其中Fab片段連結至(b)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 特定而言，能夠特異性結合之Fab片段係交叉fab片段。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)一個能夠特異性結合至FAP之Fab片段，其中Fab片段連結至(a)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 特定而言，能夠特異性結合之Fab片段係交叉fab片段。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a) 4條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，其中VL包括含有選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187及SEQ ID NO:188，及 (b)兩條重鏈，每一重鏈包括VH-CH1-VH-CH1鏈及Fc區亞單元，其中兩個VH結構域皆包括含有選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184，及 (c)能夠特異性結合至FAP之包括VL-CH1鏈及VH-CL鏈之交叉Fab片段，其中VH-CL鏈連結至(b)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 在一態樣中，VH-CL鏈連結至FC凸起重鏈之C-末端。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a) 4條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，其中VL包括含有選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187及SEQ ID NO:188，及 (b)兩條重鏈，每一重鏈包括VH-CH1-VH-CH1鏈及Fc區亞單元，其中兩個VH結構域皆包括含有選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184，及 (c)能夠特異性結合至FAP之包括VL-CH1鏈及VH-CL鏈之交叉fab片段，其中VL-CH1鏈連結至(b)之兩條重鏈中之一者之C-末端。 在一態樣中，VL-CH1鏈連結至FC凸起重鏈之C-末端。 在一特定態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a) 4條各自包括SEQ ID NO:165之胺基酸序列之輕鏈，一條包括SEQ ID NO:162之胺基酸序列之輕鏈，包括SEQ ID NO:169之胺基酸序列之第一重鏈，及包括SEQ ID NO:170之胺基酸序列之第二重鏈，或 (b)兩條各自包括SEQ ID NO:243之胺基酸序列之輕鏈，一條包括SEQ ID NO:162之胺基酸序列之輕鏈，包括SEQ ID NO:244之胺基酸序列之第一重鏈，及包括SEQ ID NO:245之胺基酸序列之第二重鏈，或 (c)兩條各自包括SEQ ID NO:243之胺基酸序列之輕鏈，一條包括SEQ ID NO:162之胺基酸序列之輕鏈，包括SEQ ID NO:246之胺基酸序列之第一重鏈，及包括SEQ ID NO:247之胺基酸序列之第二重鏈，或 (d)兩條各自包括SEQ ID NO:248之胺基酸序列之輕鏈，一條包括SEQ ID NO:162之胺基酸序列之輕鏈，包括SEQ ID NO:249之胺基酸序列之第一重鏈，及包括SEQ ID NO:250之胺基酸序列之第二重鏈。對於結合至 CD40 為四價且對於結合至靶細胞抗原為二價之雙特異性抗原結合分子 (4+2 形式 ) 在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)四個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域， (b)兩個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域， 及 (c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域。 因此，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子對於CD40為四價且對於靶細胞抗原為二價。 在一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中4個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域係Fab片段且其中之每兩者視情況經由肽連接體彼此融合。在一特定態樣中，肽連接體包括SEQ ID NO:148之胺基酸序列。更特定而言，抗原結合分子包括兩條各自包括VHCH1-肽連接體-VHCH1片段之重鏈。在一特定態樣中，肽連接體具有SEQ ID NO:148之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域係Fab片段，且其中第一Fab片段經由肽連接體連結至Fc結構域之第一亞單元之C-末端且第二Fab片段經由肽連接體連結至Fc結構域之第二亞單元之C-末端。在一態樣中，兩個能夠特異性結合至靶細胞抗原之Fab片段係各自包括VL-CH1鏈及VH-CL鏈之交叉Fab片段，且其中VL-CH1鏈連結至兩條重鏈中之一者之C-末端。 在一特定態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包括4條各自包括SEQ ID NO:86之胺基酸序列之輕鏈；兩條各自包括SEQ ID NO:87之胺基酸序列之輕鏈；及兩條包括SEQ ID NO:85之胺基酸序列之重鏈。 在另一態樣中，本發明提供能夠特異性結合至鼠類CD40之雙特異性抗原結合分子，其包括4條各自包括SEQ ID NO:100之胺基酸序列之輕鏈；兩條各自包括SEQ ID NO:99之胺基酸序列之輕鏈；及兩條包括SEQ ID NO:98之胺基酸序列之重鏈。減小 Fc 受體結合及 / 或效應物功能之 Fc 結構域修飾 本發明之雙特異性抗原結合分子進一步包括由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域。 在某些態樣中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，由此生成Fc區變體。Fc區變體可包括人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或多個胺基酸位置包括胺基酸修飾(例如取代)。 Fc結構域賦予本發明之雙特異性抗體有益之藥物動力學性質，包含長血清半衰期(其有助於靶組織中之良好累積)及有益組織-血液分佈比率。然而，其同時可導致本發明之雙特異性抗體不期望地靶向表現Fc受體之細胞而非靶向較佳具抗原細胞。因此，與天然IgG Fc結構域、尤其IgG1 Fc結構域或IgG4 Fc結構域相比，在特定實施例中，本發明之雙特異性抗體之Fc結構域展現減小之Fc受體結合親和力及/或減小之效應物功能。更特定而言，Fc結構域係IgG1 Fc結構域。 在一該態樣中，Fc結構域(或包括該Fc結構域之本發明之雙特異性抗原結合分子)與天然IgG1 Fc結構域(或包括天然IgG1 Fc結構域之本發明之雙特異性抗原結合分子)相比展現小於50%、較佳地小於20%、更佳地小於10%及最佳地小於5%之Fc受體結合親和力，及/或與與天然IgG1 Fc結構域(或包括天然IgG1 Fc結構域之本發明之雙特異性抗原結合分子)相比展現小於50%、較佳地小於20%、更佳地小於10%及最佳地小於5%之效應物功能。在一態樣中，Fc結構域(或包括該Fc結構域之本發明之雙特異性抗原結合分子)並不實質上結合至Fc受體及/或誘導效應物功能。在一特定態樣中，Fc受體係Fcγ受體。在一態樣中，Fc受體係人類Fc受體。在一態樣中，Fc受體係活化Fc受體。在一具體態樣中，Fc受體係活化人類Fcγ受體、更具體而言人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa、最具體而言人類FcγRIIIa。在一態樣中，Fc受體係抑制性Fc受體。在一具體態樣中，Fc受體係抑制性人類Fcγ受體、更具體而言人類FcγRIIB。在一態樣中，效應物功能係CDC、ADCC、ADCP及細胞介素分泌中之一或多者。在一特定態樣中，效應物功能係ADCC。在一態樣中，與天然IgG1 Fc結構域相比，Fc結構域結構域展現實質上類似於新生Fc受體(FcRn)之結合親和力。在Fc結構域(或包括該Fc結構域之本發明之雙特異性抗原結合分子)展現大於約70%、尤其大於約80%、更尤其大於約90%之天然IgG1 Fc結構域(或包括天然IgG1 Fc結構域之本發明之雙特異性抗原結合分子)與FcRn之結合親和力時，可達成實質上類似於FcRn之結合。 在一特定態樣中，與未改造Fc結構域相比，改造Fc結構域以減小與Fc受體之結合親和力及/或減小效應物功能。在一特定態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子之Fc結構域包括一或多個胺基酸突變，該胺基酸突變減小Fc結構域對Fc受體之結合親和力及/或效應物功能。通常，相同之一或多個胺基酸突變存在於Fc結構域之兩個亞單元中。在一態樣中，胺基酸突變減小了Fc結構域與Fc受體之結合親和力。在另一態樣中，胺基酸突變將Fc結構域與Fc受體之結合親和力減小至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一態樣中，與包括未改造Fc結構域之本發明之雙特異性抗體相比，包括經改造Fc結構域之本發明之雙特異性抗原結合分子展現小於20%、尤其小於10%、更尤其小於5%之與Fc受體之結合親和力。在一特定態樣中，Fc受體係Fcγ受體。在其他態樣中，Fc受體係人類Fc受體。在一態樣中，Fc受體係抑制性Fc受體。在一具體態樣中，Fc受體係抑制性人類Fcγ受體、更具體而言人類FcγRIIB。在一些態樣中，Fc受體係活化Fc受體。在一具體態樣中，Fc受體係活化人類Fcγ受體、更具體而言人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa、最具體而言人類FcγRIIIa。較佳地，至該等受體中之每一者之結合有所減小。在一些態樣中，至補體組分之結合親和力、至C1q之特異性結合親和力亦有所減小。在一態樣中，至新生Fc受體(FcRn)之結合親和力並不減小。在Fc結構域(或包括該Fc結構域之本發明之雙特異性抗原結合分子)展現大於約70%之未改造形式之Fc結構域(或包括該未改造形式之Fc結構域之本發明之雙特異性抗原結合分子)與FcRn之結合親和力時，達成實質上類似之FcRn結合，亦即保留Fc結構域與該受體之結合親和力。Fc結構域或包括該Fc結構域之本發明之雙特異性抗原結合分子可展現大於約80%及甚至大於約90%之該親和力。在某些實施例中，與未改造Fc結構域相比，本發明之雙特異性抗原結合分子之Fc結構域經改造以具有減小之效應物功能。減小之效應物功能可包含(但不限於)下列中之一或多者：減小之補體依賴性細胞毒性(CDC)、減小之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、減小之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、減小之細胞介素分泌、減小之免疫複合物介導之抗原攝取(藉由抗原呈遞細胞)、減小之NK細胞結合、減小之巨噬球結合、減小之單核球結合、減小之多形核細胞結合、減小之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、減小之樹突狀細胞成熟或減小之T細胞引發。 具有減小之效應物功能之抗體包含具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包含在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包含在殘基265及297處經丙胺酸取代之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。闡述具有改良或降低之與FcR之結合的某些抗體變體。(例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312，及Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。 在本發明之一態樣中，Fc結構域在位置E233、L234、L235、N297、P331及P329包括胺基酸取代。在一些態樣中，Fc結構域包括胺基酸取代L234A及L235A (「LALA」)。在一該實施例中，Fc結構域係IgG1 Fc結構域、尤其人類IgG1 Fc結構域。在一態樣中，Fc結構域在位置P329包括胺基酸取代。在一更具體態樣中，胺基酸取代係P329A或P329G、尤其P329G。在一種實施例中，Fc結構域在位置P329包括胺基酸取代且包括選自由以下組成之群之另一胺基酸取代：E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在更特定實施例中，Fc結構域包括胺基酸突變L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」)。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全廢除人類IgG1 Fc結構域之Fcγ受體結合，如PCT專利申請案第WO 2012/130831 A1號中所闡述。該文件亦闡述製備該等突變體Fc結構域之方法及測定其性質(例如Fc受體結合或效應物功能)之方法。該抗體係具有突變L234A及L235A或突變L234A、L235A及P329G之IgG1 (根據Kabat等人之EU索引進行編號，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。 在一態樣中，Fc結構域係IgG4 Fc結構域。在一更具體實施例中，Fc結構域係包括位置S228 (Kabat編號)之胺基酸取代、尤其胺基酸取代S228P之IgG4 Fc結構域。在一更具體實施例中，Fc結構域係包括胺基酸取代L235E及S228P以及P329G之IgG4 Fc結構域。此胺基酸取代減小了IgG4抗體之活體內Fab臂交換(參見Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010))。 具有延長之半衰期及改良之與新生Fc受體(FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒中，Guyer, R.L.等人，J. Immunol. 117 (1976) 587-593及Kim, J.K.等人，J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)之結合之抗體闡述於US 2005/0014934中。彼等抗體包括具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代之Fc區。該等Fc變體包含在以下Fc區殘基之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826號)。關於Fc區變體之其他實例，亦參見Duncan, A.R.及Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。 可容易地(例如)藉由ELISA或藉由表面電漿共振(SPR)使用標準設備(例如BIAcore儀器(GE Healthcare))來測定與Fc受體之結合，且Fc受體(例如)可藉由重組表現獲得。適宜之該結合分析闡述於本文中。或者，可使用已知表現特定Fc受體之細胞系(例如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞)來評估Fc結構域或包括Fc結構域之細胞活化雙特異性抗原結合分子對Fc受體之結合親和力。可藉由業內已知方法量測Fc結構域或包括Fc結構域之本發明之雙特異性抗原結合分子之效應物功能。量測ADCC之適宜分析闡述於本文中。評價所關注分子之ADCC活性之活體外分析之其他實例闡述於以下文獻中：美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)。或者，可使用非放射性分析方法(例如參見用於流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。可用於該等分析之效應細胞包含末梢血單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內評價所關注分子之ADCC活性，例如在動物模型中評價，例如Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示之動物模型。 下列部分闡述本發明之雙特異性抗原結合分子之較佳態樣，該等分子包括減小Fc受體結合及/或效應物功能之Fc結構域修飾。在一態樣中，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其包括(a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域；(b)至少一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域；及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域，其中Fc結構域包括一或多個減小抗體與Fc受體、尤其與Fcγ受體之結合親和力之胺基酸取代。在另一態樣中，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其包括(a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域；(b)至少一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域；及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域，其中Fc結構域包括一或多個減小效應物功能之胺基酸取代。在特定態樣中，Fc結構域係人類IgG1子類之具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引進行編號)之Fc結構域。促進異源二聚化之 Fc 結構域修飾 本發明之雙特異性抗原結合分子包括融合至Fc結構域之兩個亞單元中之一者或另一者的不同抗原結合位點，由此Fc結構域之兩個亞單元可包括於兩條不同多肽鏈中。重組共表現該等多肽且隨後二聚化可產生兩種多肽之若干可能組合。為改良本發明之雙特異性抗原結合分子在重組產生中之產量及純度，由此可有利在本發明之雙特異性抗原結合分子之Fc結構域中引入促進期望多肽之締合之修飾。 因此，在特定態樣中，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其包括(a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域；(b)至少一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域；及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域，其中Fc結構域包括促進Fc結構域之第一亞單元及第二亞單元之締合之修飾。人類IgG Fc結構域之兩個亞單元間之最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用之位點位於Fc結構域的CH3結構域中。因此，在一態樣中，該修飾位於Fc結構域之CH3結構域中。 在一具體態樣中，該修飾係所謂的「凸起與孔洞」修飾，其在Fc結構域之兩個亞單元中之一者中包括「凸起」修飾，且在Fc結構域之兩個亞單元中之另一者中包括「孔洞」修飾。因此，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其包括(a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域；(b)至少一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域；及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域，其中根據凸起與孔洞方法Fc結構域之第一亞單元包括凸起且Fc結構域之第二亞單元包括孔洞。在一特定態樣中，Fc結構域之第一亞單元包括胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)且Fc結構域之第二亞單元包括胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引進行編號)。 凸起與孔洞技術闡述於(例如) US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。通常，該方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「凸起」)且在第二多肽之界面處引入相應空腔(「孔洞」)，從而該隆凸可定位於空腔中以促進異源二聚體形成並防止同源二聚體形成。藉由使用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)代替來自第一多肽界面之較小胺基酸側鏈來構築隆凸。藉由使用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)代替較大胺基酸側鏈來在第二多肽之界面上產生尺寸與隆凸相同或類似之補償性空腔。 因此，在一態樣中，在本發明之雙特異性抗原結合分子中Fc結構域之第一亞單元之CH3結構域中，使用具有較大側鏈體積之胺基酸殘基代替胺基酸殘基，由此在第一亞單元之CH3結構域內生成隆凸，該隆凸可定位於第二亞單元之CH3結構域內之空腔中，且在Fc結構域之第二亞單元之CH3結構域中，使用具有較小側鏈體積之胺基酸殘基代替胺基酸殘基，由此在第二亞單元之CH3結構域內生成空腔，在該空腔內可定位第一亞單元之CH3結構域內之隆凸。可藉由(例如)使用位點特異性誘變或使用肽合成改變編碼多肽之核酸來製備隆凸及空腔。在一具體態樣中，在Fc結構域之第一亞單元之CH3結構域中，使用色胺酸殘基(T366W)代替位置366之蘇胺酸殘基，且在Fc結構域之第二亞單元之CH3結構域中，使用纈胺酸殘基(Y407V)代替位置407之酪胺酸殘基。在一態樣中，在Fc結構域之第二亞單元中，另外使用絲胺酸殘基(T366S)代替位置366之蘇胺酸殘基且使用丙胺酸殘基(L368A)代替位置368之白胺酸殘基。 在又一態樣中，在Fc結構域之第一亞單元中，另外使用半胱胺酸殘基(S354C)代替位置354之絲胺酸殘基，且在Fc結構域之第二亞單元中，另外藉由半胱胺酸殘基(Y349C)代替位置349之酪胺酸殘基。引入該兩種半胱胺酸殘基使得在Fc結構域之兩個亞單元之間形成二硫橋，從而進一步穩定二聚體(Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15)。在一特定態樣中，Fc結構域之第一亞單元包括胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)且Fc結構域之第二亞單元包括胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引進行編號)。 在一替代態樣中，促進Fc結構域之第一亞單元及第二亞單元之締合之修飾包括調介靜電牽引效應的修飾，例如如PCT公開案WO 2009/089004中所闡述。通常，此方法涉及藉由帶電胺基酸殘基代替兩個Fc結構域亞單元界面處之一或多個胺基酸殘基，從而同源二聚體形成變得靜電不利，但異源二聚化靜電有益。 如本文所報告之雙特異性抗體之重鏈之C-末端可為終止於胺基酸殘基PGK之完整C-末端。重鏈之C-末端可為縮短之C-末端，其中已去除一或兩個C-末端胺基酸殘基。在一較佳態樣中，重鏈之C-末端係終止於PG之縮短之C-末端。在如本文所報告之所有態樣之一個態樣中，如本文所指定包括含有C-末端CH3結構域之重鏈之雙特異性抗體包括C-末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引進行編號)。在如本文所報告之所有態樣之一實施例中，如本文所指定包括含有C-末端CH3結構域之重鏈之雙特異性抗體包括C-末端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引進行編號)。Fab 結構域中之修飾 在一態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包括(a)能夠特異性結合至CD40之第一Fab片段；(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段；及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域，其中在一個Fab片段中，可變結構域VH及VL或恆定結構域CH1及CL中之任一者發生交換。根據Crossmab技術來製備雙特異性抗體。 在一個結合臂中具有結構域代替/交換之多特異性抗體(CrossMabVH-VL或CrossMabCH-CL)詳細闡述於WO2009/080252及Schaefer, W．等人，PNAS, 108 (2011) 11187-1191中。其顯著減少因針對第一抗原之輕鏈與針對第二抗原之錯誤重鏈之錯配產生之副產物(與不使用該結構域交換之方式相比)。 在一態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包括(a)能夠特異性結合至CD40之第一Fab片段；(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段；及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域，其中在一個Fab片段中，恆定結構域CL及CH1彼此代替，從而CH1結構域係輕鏈之一部分且CL結構域係重鏈之一部分。更特定而言，在能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段中，恆定結構域CL及CH1彼此代替，從而CH1結構域係輕鏈之一部分且CL結構域係重鏈之一部分。 在一特定態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包括(a)能夠特異性結合至CD40之第一Fab片段；(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，其中恆定結構域CL及CH1彼此代替，從而CH1結構域係輕鏈之一部分且CL結構域係重鏈之一部分。此一分子稱為單價雙特異性抗原結合分子。 在另一態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包括(a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc結構域之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈；及(b)兩個能夠特異性結合至靶細胞抗原之其他Fab片段，其中該等其他Fab片段各自經由肽連接體連結至之(a)之重鏈之C-末端。在一特定態樣中，其他Fab片段係可變結構域VL及VH彼此代替以便VH結構域係輕鏈之一部分且VL結構域係重鏈之一部分之Fab片段。 因此，在一特定態樣中，本發明包括一種雙特異性抗原結合分子，其包括(a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc結構域之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈；及(b)兩個能夠特異性結合至靶細胞抗原之其他Fab片段，其中該兩個能夠特異性結合至靶細胞抗原之其他Fab片段係交叉Fab片段，其中可變結構域VL及VH彼此代替且VL-CH鏈各自經由肽連接體連結至(a)之重鏈之C-末端。 在另一態樣中，且為進一步改良正確配對，雙特異性抗原結合分子(其包括(a)能夠特異性結合至CD40之第一Fab片段；(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段；及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域)可含有不同帶電胺基酸取代(所謂的「帶電殘基」)。將該等修飾引入交叉或非交叉CH1及CL結構域中。在一特定態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其中在一個CL結構域中，位置123 (EU編號)之胺基酸已由精胺酸(R)代替且位置124 (EU編號)之胺基酸已由離胺酸(K)取代，且其中在一個CH1結構域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)之胺基酸已由麩胺酸(E)取代。本發明之實例性抗體 在一態樣中，本發明提供特異性結合至CD40之新抗體及抗體片段。該等抗體具有優於已知CD40抗體之性質，該等性質使得其尤其適於納入包括能夠特異性結合至靶細胞抗原之另一抗原結合部分之雙特異性抗原結合分子中。新抗體之特徵進一步在於，其可以較高量及高效價產生，其展示高熱穩定性(如藉由聚集溫度Tagg 所量測)，或其擁有高人類化程度且可由此在人體中具有較小免疫原性。可藉由Abhinandan, K. R.及Martin, Andrew C. R. 2007,J. Mol. Biol . 2007, 369, 852-862中所闡述之方法來測定VH及VL序列相對於人類種系序列之人類化百分比。相應數據展示於表24及25中。 在一態樣中，提供特異性結合至CD40之抗體，其中該抗體包括 (i)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之輕鏈可變區VL， (ii)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之輕鏈可變區VL， (iii)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之輕鏈可變區VL， (iv)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之輕鏈可變區VL， (v)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之輕鏈可變區VL， (vi)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (vii)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (viii)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (viii)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (ix)包括SEQ ID NO:171之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (x)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:175之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (xi)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (xii)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:177之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (xiii)包括SEQ ID NO:172之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:178之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (xiv)包括SEQ ID NO:173之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (xv)包括SEQ ID NO:174之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:176之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。 在另一態樣中，提供與特異性結合至CD40之抗體競爭結合之抗體，其中該抗體包括如本文先前所定義(i)至(xv)之重鏈可變區VH及輕鏈可變區VL中之任一者。 在一態樣中，提供與特異性結合至CD40之抗體競爭結合之抗體，其中該抗體包括含有SEQ ID NO:171之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含有SEQ ID NO:175之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。 在另一態樣中，提供特異性結合至CD40之抗體，其中該抗體包括 (i)包括SEQ ID NO:179之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之輕鏈可變區VL， (ii)包括SEQ ID NO:180之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之輕鏈可變區VL， (iii)包括SEQ ID NO:181之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之輕鏈可變區VL， (iv)包括SEQ ID NO:182之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之輕鏈可變區VL， (v)包括SEQ ID NO:179之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之輕鏈可變區VL， (vi)包括SEQ ID NO:180之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (vii)包括SEQ ID NO:181之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或 (viii)包括SEQ ID NO:1182之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。 在另一態樣中，提供與特異性結合至CD40之抗體競爭結合之抗體，其中該抗體包括如本文先前所定義(i)至(viii)之重鏈可變區VH及輕鏈可變區VL中之任一者。 在一態樣中，提供與特異性結合至CD40之抗體競爭結合之抗體，其中該抗體包括含有SEQ ID NO:179之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含有SEQ ID NO:185之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。特定而言，提供特異性結合至CD40之抗體，其中該抗體包括含有SEQ ID NO:182之胺基酸序列之重鏈可變區VH及包括SEQ ID NO:185之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。多核苷酸 本發明另外提供編碼如本文所闡述之雙特異性抗原結合分子或其片段之經分離多核苷酸或編碼如本文所闡述之抗體的多核苷酸。 本發明之編碼雙特異性抗原結合分子之經分離多核苷酸可表示為編碼整個抗原結合分子之單一多核苷酸或表示為多個(例如兩個或更多個)共表現之多核苷酸。藉由共表現之多核苷酸編碼之多肽可經由(例如)二硫鍵或其他方式進行締合以形成功能抗原結合分子。舉例而言，可藉由來自免疫球蛋白之重鏈部分之單獨多核苷酸來編碼免疫球蛋白之輕鏈部分。在共表現時，重鏈多肽與輕鏈多肽締合形成免疫球蛋白。 在一些態樣中，經分離多核苷酸編碼如本文所闡述之本發明雙特異性分子中所包括之多肽。 在一態樣中，本發明係關於編碼包括以下之雙特異性抗原結合分子之經分離多核苷酸：(a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域；(b)至少一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域；及(c)由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成之Fc結構域。 在某些實施例中，多核苷酸或核酸係DNA。在其他實施例中，本發明多核苷酸係(例如)呈信使RNA (mRNA)形式之RNA。本發明RNA可為單鏈或雙鏈。重組方法 可(例如)藉由重組產生來獲得本發明之雙特異性抗原結合分子。對於重組產生而言，提供一或多種編碼雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之多核苷酸。分離一或多個編碼雙特異性抗原結合分子之多核苷酸並插入一或多個載體中以用於進一步在宿主細胞中選殖及/或表現。可易於使用習用程序分離並測序該多核苷酸。在本發明之一態樣中，提供包括本發明多核苷酸中之一或多者之載體、較佳地表現載體。熟習此項技術者所熟知之方法可用於構築含有雙特異性抗原結合分子(片段)之編碼序列以及適當轉錄/轉譯控制信號之表現載體。該等方法包含活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。例如參見闡述於以下文獻中之技術：Maniatis等人，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包含表現序列盒，在該表現序列盒中，編碼雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之多核苷酸(亦即編碼區)經選殖與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作締合。如本文中所使用，「編碼區」係由轉譯成胺基酸之密碼子組成之核酸部分。儘管「終止密碼子」 (TAG、TGA或TAA)並不轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區之一部分(若存在)，但任一毗鄰序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'非轉譯區及諸如此類)並非編碼區之一部分。兩個或更多個編碼區可存在於單一多核苷酸構築體中(例如位於單一載體上)或單獨多核苷酸構築體中(例如位於單獨(不同)載體上)。另外，任一載體皆可含有單一編碼區，或可包括兩個或更多個編碼區，舉例而言，本發明載體可編碼一或多種多肽，該一或多種多肽以後轉譯或共轉譯方式經由溶蛋白性裂解分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體、多核苷酸或核酸可編碼異源性編碼區，該等異源性編碼區融合或並不融合至編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段或其變體或衍生物之多核苷酸。異源性編碼區包含(但不限於)特定元件或基序，例如分泌信號肽或異源性功能結構域。可操作締合係如下情形：以使基因產物之表現處於調控序列之影響或控制下之方式來使基因產物之編碼區(例如多肽)與一或多個調控序列進行締合。兩個DNA片段(例如多肽編碼區及與其締合之啟動子)在以下情形下為「可操作締合」：誘導啟動子功能會引起編碼期望基因產物之mRNA之轉錄，且兩個DNA片段間之鍵聯性質並不干擾表現調控序列引導基因產物表現之能力或干擾DNA模板轉錄之能力。因此，若啟動子能夠實現編碼多肽之核酸之轉錄，則啟動子區域與該核酸可操作地締合。啟動子可為僅在預定細胞中引導DNA之實質性轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子外，其他轉錄控制元件(例如增強子、操作子、抑制子及轉錄終止子信號)亦可與多核苷酸可操作地締合以引導細胞特異性轉錄。 適宜啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。各種轉錄控制區已為熟習此項技術者所習知。該等轉錄控制區包含(但不限於)在脊椎動物細胞中發揮作用之轉錄控制區，例如(但不限於)來自巨細胞病毒(例如立即早期啟動子，與內含子-A連結)、猿猴病毒40 (例如早期啟動子)及反轉錄病毒(例如Rous肉瘤病毒)之啟動子及增強子區段。其他轉錄控制區包含衍生自脊椎動物基因者(例如肌動蛋白、熱激蛋白、牛生長激素及兔β-珠蛋白)以及能夠控制真核細胞中之基因表現之其他序列。其他適宜轉錄控制區包含組織特異性啟動子及增強子以及誘導型啟動子(例如誘導型啟動子四環素(tetracyclin))。類似地，各種轉譯控制元件已為熟習此項技術者所習知。該等轉譯控制元件包含(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子及衍生自病毒系統之元件(尤其內核糖體進入位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現序列盒亦可包含其他特徵，例如複製起點及/或染色體整合元件(例如反轉錄病毒長末端重複(LTR)或腺相關病毒(AAV)反轉末端重複(ITR))。 本發明之多核苷酸及核酸編碼區可與編碼引導由本發明多核苷酸編碼之多肽之分泌之分泌或信號肽的其他編碼區締合。舉例而言，若期望雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之分泌，則可將編碼信號序列之DNA置於編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之核酸的上游。根據信號假設，由哺乳動物細胞分泌之蛋白質具有信號肽或分泌前導序列，一旦在粗糙內質網中輸出生長蛋白鏈，則該信號肽或分泌前導序列自成熟蛋白質發生裂解。熟習此項技術者應瞭解，由脊椎動物細胞分泌之多肽通常具有融合至多肽之N-末端之信號肽，該信號肽自轉譯之多肽發生裂解而產生分泌或「成熟」形式之多肽。在某些實施例中，使用天然信號肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)，或使用依然能夠引導可操作地與該序列締合之多肽之分泌之該序列的功能衍生物。或者，可使用異源性哺乳動物信號肽或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)或小鼠β-葡萄糖苷酸酶之前導序列取代。 在編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之內部或末端處可包含編碼短蛋白質序列之DNA，該短蛋白質序列可用於促進後續純化(例如組胺酸標籤)或有助於標記融合蛋白。 在本發明之另一態樣中，提供包括一或多個本發明多核苷酸之宿主細胞。在某些態樣中，提供包括一或多個本發明載體之宿主細胞。多核苷酸及載體可單獨或組合納入本文所闡述分別與多核苷酸及載體相關之特徵中之任一者中。在一態樣中，宿主細胞包括(例如已轉化或轉染)含有多核苷酸之載體，該多核苷酸編碼本發明之雙特異性抗原結合分子(之一部分)。如本文中所使用，術語「宿主細胞」係指可經改造而生成本發明之融合蛋白或其片段之任一類細胞系統。適於複製抗原結合分子並支持其表現之宿主細胞已為業內所熟知。該等細胞可視需要經特定表現載體轉染或轉導，且可生長大量含有載體之細胞用於接種大規模發酵罐以獲得足量用於臨床應用之抗原結合分子。適宜宿主細胞包含原核微生物(例如大腸桿菌)或各種真核細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或諸如此類)。舉例而言，多肽可在細菌中產生，尤其在不需要醣基化時。在表現之後，可以可溶性部分形式自細菌細胞漿液分離多肽且可進一步純化。除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)係用於編碼多肽之載體之適宜選殖或表現宿主，包含醣基化路徑已進行「人類化」以產生具有部分地或完全人類醣基化模式之多肽之真菌及酵母菌株。參見Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)及Li等人，Nat Biotech 24, 210-215 (2006)。 用於表現(醣基化)多肽之適宜宿主細胞亦衍生自多細胞有機體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包含植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。亦可利用植物細胞培養物作為宿主。例如參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述用於在轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM 技術)。亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係經SV40 (COS-7)轉化之猴腎CV1細胞系、人類胚腎細胞系(293或293T細胞，如(例如) Graham等人，J Gen Virol 36, 59 (1977)中所闡述)、幼倉鼠腎細胞(BHK)、小鼠支持細胞(TM4細胞，如(例如) Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)中所闡述)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人類子宮頸上皮癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)、人類肺細胞(W138)、人類肝細胞(Hep G2)、小鼠乳房腫瘤細胞(MMT 060562)、TRI細胞(如(例如) Mather等人，Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)中所闡述)、MRC 5細胞及FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包含dhfr- CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，例如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適於蛋白質產生之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，例如參見Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C. Lo編輯，Humana Press, Totowa, NJ)，第255-268頁(2003)。宿主細胞包含培養細胞(僅舉幾個為例，例如哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞)，但亦包含含於轉基因動物、轉基因植物或培養植物或動物組織內之細胞。在一實施例中，宿主細胞係真核細胞、較佳地哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚胎腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。業內已知在該等系統中表現外源基因之標準技術。表現包括免疫球蛋白之重鏈或輕鏈之多肽之細胞可經改造以亦表現其他抗體鏈，從而表現之產物係具有重鏈及輕鏈之免疫球蛋白。 在一態樣中，提供產生本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之方法，其中該方法包括：在適於表現本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之條件下培養如本文所提供包括編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之多核苷酸的宿主細胞，及自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段。 可藉由業內已知之技術來純化如本文所闡述製得之本發明之雙特異性分子，例如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、粒徑篩析層析及諸如此類。用於純化特定蛋白質之實際條件部分地取決於諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素，且為熟習此項技術者所易知。對於親和層析純化而言，可使用結合雙特異性抗原結合分子之抗體、配體、受體或抗原。舉例而言，對於本發明之融合蛋白之親和層析純化而言，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。可基本上如實例中所闡述連續蛋白質A或G親和層析及粒徑篩析層析來分離抗原結合分子。可藉由各種熟知分析方法中之任一者來測定雙特異性抗原結合分子或其片段之純度，包含凝膠電泳、高壓液相層析及諸如此類。舉例而言，如實例中所闡述表現之雙特異性抗原結合分子展示為完整蛋白質並進行適當組合，如藉由還原及非還原SDS-PAGE所示。分析 可藉由業內已知之各種分析來表徵本文所提供之抗原結合分子之結合性質及/或生物活性。特定而言，藉由實例中更詳細闡述之分析來進行表徵。1. 結合分析 可(例如)藉由使用表現人類纖維母細胞活化蛋白(FAP)之鼠類纖維母細胞細胞系及流式細胞術(FACS)分析來評估本文所提供之雙特異性抗原結合分子與相應靶表現細胞之結合。可藉由使用如實例4.2.8中所闡述之拉吉細胞(Raji cell)來測定本文所提供之雙特異性抗原結合分子與CD40之結合。2. 活性分析 測試本發明之雙特異性抗原結合分子之生物活性。生物活性可包含雙特異性抗原結合分子之效能及特異性。藉由展示在結合靶抗原時經由CD40受體達成激動性信號傳導之分析來證實效能及特異性。另外，使用與雙特異性抗原結合分子一起培育之樹突狀細胞(DC)實施活體T細胞引發分析。醫藥組合物、調配物及投與途徑 在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包括本文所提供雙特異性抗原結合分子中之任一者以(例如)用於下述治療方法中之任一者中。在一實施例中，醫藥組合物包括本文所提供之任一雙特異性抗原結合分子及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。在另一實施例中，醫藥組合物包括本文所提供之任一雙特異性抗原結合分子及至少一種其他治療劑(例如如下文所闡述)。 本發明之醫藥組合物包括治療有效量之一或多種溶解或分散於醫藥上可接受之賦形劑中之雙特異性抗原結合分子。片語「醫藥或藥理學可接受」係指如下分子實體及組合物：在視需要投與諸如人類等動物時在所用劑量及濃度下通常對接受者無毒，亦即並不產生不良、過敏或其他不適反應。熟習此項技術者根據本揭示內容已知含有至少一種本發明之雙特異性抗原結合分子及視情況其他活性成分之醫藥組合物之製備，如藉由Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990 (以引用方式併入本文中)所例示。特定而言，該組合物係凍乾調配物或水溶液。如本文中所使用，「醫藥上可接受之賦形劑」包含熟習此項技術者已知之任一及所有溶劑、緩衝劑、分散介質、塗層、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、鹽、穩定劑及其組合。 非經腸組合物包含經設計用於藉由注射投與者，例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌內、鞘內或腹膜腔內注射。對於注射而言，可將本發明之雙特異性抗原結合分子調配於水溶液、較佳生理上相容之緩衝液(例如漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理學緩衝鹽水)中。該溶液可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑等調配劑。或者，雙特異性抗原結合分子可呈粉末形式，以便在使用之前使用適宜媒劑(例如無菌無致熱源水)構造。藉由將所需量之本發明之抗原結合分子與(視需要)下文列示之各種其他成分一起納入適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。無菌性可藉由(例如)經由無菌過濾膜進行過濾來容易地達成。通常，分散液係藉由將各種經滅菌活性成分納入含有基本分散介質及/或其他成分之無菌媒劑中來製備。在用於製備滅菌可注射溶液、懸浮液或乳液之滅菌粉末之情形下，較佳製備方法為真空乾燥或冷凍乾燥技術，其自先前經滅菌過濾之液體介質產生活性成分及任何其他期望成分之粉末。液體介質視需要應經適當緩衝且液體稀釋劑首先在注射之前使用足夠鹽水或葡萄糖調節為等滲。組合物在製造及儲存條件下必須穩定，且必須防止受到諸如細菌及真菌等微生物之污染作用。應瞭解，內毒素污染應保持最小在安全量，例如小於0.5 ng/mg蛋白質。適宜醫藥上可接受之賦形劑包含(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包含抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯苄烷銨；氯化苯銨松寧(benzethonium chloride)；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇、右旋糖酐或諸如此類。視情況，該懸浮液亦可含有適宜穩定劑或增加該等化合物之溶解度之試劑以容許製備高濃度溶液。另外，該等活性化合物之懸浮液可製備成適宜的油性注射懸浮液。適宜之親脂性溶劑或媒劑包含脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或脂質體。 活性成分亦可分別裝入藉由(例如)凝聚技術或藉由介面聚合製備之微膠囊(例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或粗滴乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版，Mack Printing Company，1990)。可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適宜實例包含含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質係呈成型物品之形式，例如膜或微膠囊。在特定實施例中，可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來延長可注射組合物之吸收。 本文之實例性醫藥上可接受之賦形劑進一步包含間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20透明質酸酶醣蛋白，例如rHuPH20 (HYLENEX® , Baxter International, Inc.)。某些實例性HASEGP及使用方法(包含rHuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一態樣中，將sHASEGP與一或多種額外糖胺多糖酶(例如軟骨素酶)組合。 實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包含闡述於美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中者，後一些調配物包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。 除先前所闡述之組合物外，抗原結合分子亦可調配為儲積製劑形式。可藉由植入(例如經皮下或經肌內)或藉由肌內注射來投與該等長效調配物。因此，舉例而言，可使用適宜聚合或疏水性材料(例如調配為存於可接受油中之乳液)或離子交換樹脂調配融合蛋白，或調配為難溶性衍生物，例如調配為難溶性鹽。 可藉助習用混合、溶解、乳化、囊封、包埋或凍乾過程來製造包括本發明之雙特異性抗原結合分子之醫藥組合物。醫藥組合物可以習用方式使用一或多種生理上可接受且有利於將蛋白質處理成可用於醫藥之製劑的載劑、稀釋劑、賦形劑或輔助劑加以調配。適宜調配物端視所選投與途徑而定。 可將雙特異性抗原結合分子調配成呈游離酸或鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥上可接受之鹽係實質上維持游離酸或鹼之生物活性之鹽。該等鹽包含酸加成鹽，例如使用蛋白組合物之游離胺基形成者，或使用無機酸(例如鹽酸或磷酸)或有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸)形成者。使用游離羧基形成之鹽亦可衍生自諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵等無機鹼或諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)等有機鹼。醫藥鹽往往較相應游離鹼形式更易溶於水性及其他質子溶劑中。 本文之組合物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定適應症之活性成分，較佳為具有彼此不會產生不利影響之補充活性者。該等活性成分適宜地以有效地用於預期目的之量以組合形式存在。 擬用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可藉由(例如)經由無菌過濾膜進行過濾來容易地達成。治療方法及組合物 本文所提供之任一雙特異性抗原結合分子可用於治療方法中。為用於治療方法中，可以與良好醫學實踐一致之方式來調配、投用及投與本發明之雙特異性抗原結合分子。在此上下文中需考慮之因素包含所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個體患者之臨床狀況、病因、醫藥之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師所知之其他因素。 在一態樣中，提供用作醫藥之本發明之雙特異性抗原結合分子。 在其他態樣中，提供用於以下之本發明之雙特異性抗原結合分子：(i)藉由CD40+抗原呈遞細胞(APC)來誘導免疫刺激，(ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應，(iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡，(iv)治療癌症，(v)延遲癌症進展，(vi)延長患有癌症之患者之存活，(vii)治療感染。在一特定態樣中，提供用於治療疾病、尤其用於治療癌症之本發明之雙特異性抗原結合分子。 在某些態樣中，提供用於治療方法中之本發明之雙特異性結合分子。在一態樣中，本發明提供用於治療有需要之個體之疾病之如本文所闡述之雙特異性結合分子。在某些態樣中，本發明提供用於治療患有疾病之個體之方法中之雙特異性結合分子，該方法包括向個體投與治療有效量之雙特異性結合分子。在某些態樣中，擬治療疾病係癌症。需要治療之個體(subject)、患者或「個體(individual)」通常係哺乳動物、更具體而言人類。 在一態樣中，提供用於以下之方法：i)藉由CD40+抗原呈遞細胞(APC)來誘導免疫刺激，(ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應，(iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡，(iv)治療癌症，(v)延遲癌症進展，(vi)延長患有癌症之患者之存活，或(vii)治療感染，其中該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之本發明之雙特異性抗原結合分子。 在另一態樣中，本發明提供本發明之雙特異性抗原結合分子在製造或製備藥劑中之用途，該藥劑用於治療有需要之個體之疾病。在一態樣中，該藥劑用於治療疾病之方法中，該方法包括向患有疾病之個體投與治療有效量之藥劑。在某些態樣中，擬治療疾病係增殖性病症、尤其癌症。癌症之實例包含(但不限於)膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食管癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌。癌症之其他實例包含癌瘤、淋巴瘤(例如何傑金氏淋巴瘤及非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma))、母細胞瘤、肉瘤及白血病。可使用本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體治療之其他細胞增殖病症包含(但不限於)位於以下部位中之贅瘤：腹部、骨、乳房、消化系統、肝、胰臟、腹膜、內分泌腺(腎上腺、甲狀旁腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼睛、頭頸、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾、胸部區域及泌尿生殖系統。亦包含癌前期病狀或病灶及癌症轉移。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌。熟習此項技術者易於認識到，在許多情形下，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體不能提供治癒，但可提供一定益處。在一些態樣中，具有一定益處之生理學變化亦視為治療有益。因此，在一些態樣中，提供生理學變化之本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體之量可視為「有效量」或「治療有效量」。 為預防或治療疾病，本發明之雙特異性抗原結合分子之適當劑量(在單獨使用或與一或多種其他治療劑組合使用時)取決於以下因素：擬治療疾病之類型、投與途徑、患者之體重、特定分子、疾病之嚴重程度及病程、投與本發明之雙特異性抗原結合分子係用於預防目的抑或治療目的、先前或同時之治療干預、患者之臨床史及對雙特異性抗原結合分子之反應及主治醫師之決定。在任一情形下，負責投與之執業醫師將決定組合物中活性成分之濃度及用於各個體之適當劑量。本文涵蓋各種投藥方案，包含(但不限於)在各個時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。 適宜地，將本發明之雙特異性抗原結合分子一次性或經一系列治療投與患者。端視疾病之類型及嚴重程度，不論(例如)藉由一或多次分開投與或藉由連續輸注來投與，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg至10 mg/kg)雙特異性抗原結合分子可為投與患者之初始候選劑量。端視上述因素，一個典型日劑量可介於約1 µg/kg至100 mg/kg之間或更高。對於經若干天或更長時間重複投與而言，端視病狀而定，治療通常持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。本發明之雙特異性抗原結合分子之一實例性劑量範圍為約0.005 mg/kg至約10 mg/kg。在其他實例中，每次投與之劑量亦可包括約1 μg/kg/體重、約5 μg/kg/體重、約10 μg/kg/體重、約50 μg/kg/體重、約100 μg/kg/體重、約200 μg/kg/體重、約350 μg/kg/體重、約500 μg/kg/體重、約1 mg/kg/體重、約5 mg/kg/體重、約10 mg/kg/體重、約50 mg/kg/體重、約100 mg/kg/體重、約200 mg/kg/體重、約350 mg/kg/體重、約500 mg/kg/體重至約1000 mg/kg/體重或更高及其中衍生之任一範圍。在來自本文所列示數值之衍生範圍之實例中，基於上述數值，可投與約0.1 mg/kg/體重至約20 mg/kg/體重、約5 μg/kg體重至約1 mg/kg體重等之範圍。因此，可向患者投與一或多個約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任一組合)之劑量。該等劑量可間歇性投與，例如每週一次或每三週一次(例如以便患者接受約兩次至約20次或(例如)約6次劑量之融合蛋白)。在一特定態樣中，每三週投與雙特異性抗原結合分子。可在開始時投與較高負荷劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展可容易地藉由習用技術及分析來監測。 通常以有效達成預期目的之量來使用本發明之雙特異性抗原結合分子。為用於治療或預防病狀，本發明之雙特異性抗原結合分子或其醫藥組合物應以治療有效量投與或應用。治療有效量之確定為熟習此項技術者所熟知，尤其可根據本文所提供之詳細揭示內容確定。對於全身性投與而言，最初可自活體外分析(例如細胞培養物分析)來估計治療有效劑量。然後可將劑量調配用於動物模型中以達成循環濃度範圍，該循環濃度範圍包含在細胞培養物中測定之IC50 。該資訊可用於更準確地確定人類可用之劑量。亦可自活體內數據(例如動物模型)使用業內熟知之技術來估計初始劑量。熟習此項技術者可易於基於動物數據來優化在人類中之投與。 可個別地調節劑量量及間隔以提供足以維持治療效應之本發明之雙特異性抗原結合分子之血漿濃度。用於藉由注射投與之常用患者劑量介於約0.1 mg/kg/天至50 mg/kg/天、通常約0.1 mg/kg/天至1 mg/kg/天之間。可藉由每天投與多個劑量來達成治療有效之血漿濃度。可(例如)藉由HPLC來量測血漿濃度。在局部投與或選擇性攝取之情形下，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體之有效局部濃度可與血漿濃度不相關。熟習此項技術者能夠無需過多實驗即優化治療有效之局部劑量。 本文所闡述本發明之雙特異性抗原結合分子之治療有效劑量通常提供治療益處且並不引起實質性毒性。可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定融合蛋白之毒性及治療效能。可使用細胞培養分析及動物研究來測定LD50 (對50%群體致死之劑量)及ED50 (對50%群體治療有效之劑量)。毒性及治療效應之間之劑量比率即為治療指數，其可表示為比率LD50 /ED50 。展現較大治療指數之雙特異性抗原結合分子較佳。在一態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體展現高治療指數。自細胞培養分析及動物研究獲得之數據可用於調配用於人類之劑量範圍。該劑量較佳地在具有極低毒性或無毒性之循環濃度(包含ED50 )的範圍內。該劑量端視諸如以下等各種因素可在此範圍內有所變化：所用劑型、所用投與途徑、個體之身體狀況及諸如此類。實際調配物、投與途徑及劑量可由個體醫師根據患者之病狀來選擇(例如參見Fingl等人，1975，The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1頁，其全部內容以引用方式併入本文中)。 使用本發明之融合蛋白治療患者之主治醫師知曉因毒性、器官功能障礙及諸如此類而終止、間斷或調節投與之方式及時間。與之相反，若臨床反應不夠(排除毒性)，則主治醫師亦應知曉調節治療至更高程度。在所關注病症之管控中所投與劑量之數量級應隨擬治療病狀之嚴重程度、投與途徑及諸如此類而有所變化。舉例而言，病狀之嚴重程度可部分地藉由標準預測評估方法來評估。另外，該劑量及(可能)劑量頻率亦應根據個體患者之年齡、體重及反應而有所變化。其他藥劑及治療 本發明之雙特異性抗原結合分子可與一或多種其他藥劑組合投與療法中。舉例而言，本發明之雙特異性抗原結合分子或本發明抗體可與至少一種其他治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋可經投與以用於治療需要治療之個體之症狀或疾病之任一藥劑。該其他治療劑可包括適用於所治療特定指徵之任一活性成分，較佳係具有並不不利地彼此影響之互補活性者。在某些實施例中，另一治療劑係另一抗癌劑，例如微管破壞劑、抗代謝物、拓撲異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷基化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞細胞凋亡活化劑或抗血管生成劑。在某些態樣中，另一治療劑係免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性或細胞生長抑制劑、細胞凋亡活化劑或增加細胞對細胞凋亡誘導劑之敏感性之藥劑。 因此，提供用於治療癌症之本發明之雙特異性抗原結合分子或包括其之醫藥組合物，其中將雙特異性抗原結合分子併與用於癌症免疫療法之化學治療劑、輻射及/或其他藥劑組合投與。 該等其他藥劑適於以對欲達成目的有效之量以組合形式存在。該等其他藥劑之有效量端視所用融合蛋白之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體通常以相同劑量及如本文所闡述之投與途徑來使用，或以本文所闡述劑量之約1%至99%來使用，或以憑經驗/臨床確定適宜之任一劑量及任一途徑來使用。 上述該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包含於同一或分開組合物中)及分開投與(在此情形下，可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後投與本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體)。製品 在本發明之另一態樣中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。該製品包括容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包含(例如)瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可自諸如玻璃或塑膠等眾多種材料形成。容器裝有自身或與另一組合物組合有效治療、預防及/或診斷病狀之組合物，且可具有無菌存取通道(舉例而言，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑係本發明之雙特異性抗原結合分子。 標記或包裝插頁指示該組合物用於治療選定病狀。此外，該製品可包括(a)含有組合物之第一容器，其中該組合物包括本發明之雙特異性抗原結合分子；及(b)含有組合物之第二容器，其中該組合物包括另一細胞毒性劑或治療劑。本發明此實施例中之製品可進一步包括指示組合物可用於治療特定病狀之包裝插頁。 或者或另外，該製品可進一步包括第二(或第三)容器，該容器包括醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包含自商業及使用者角度來看期望之其他材料，包含其他緩衝液、稀釋劑、濾膜、針及注射器。 表C (序列):
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 下列編號段落(para)根據第一優先級申請案闡述本發明態樣： 1. 一種雙特異性抗原結合分子，其包括 (a)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，及 (b)至少一個能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域。 2. 如段落1之雙特異性抗原結合分子，其另外包括 (c) Fc區，其由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成。 3. 如段落1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域結合至包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列或由其組成之多肽。 4. 如段落1至3中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合結構域係能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之抗原結合結構域。 5. 如段落1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域結合至包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列或由其組成之多肽。 6. 如段落1至5中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包括：(i) CDR-H1，其包括SEQ ID NO:3之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括：(iv) CDR-L1，其包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包括SEQ ID NO:7之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包括SEQ ID NO:8之胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包括：(i) CDR-H1，其包括SEQ ID NO:11之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括：(iv) CDR-L1，其包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包括SEQ ID NO:15之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包括SEQ ID NO:16之胺基酸序列。 7. 如段落1至6中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域包括 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包括與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括與SEQ ID NO:10之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包括與SEQ ID NO:17之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包括與SEQ ID NO:18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。 8. 如段落1至7中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括：重鏈可變區(VH CD40)，其包括(i)包括SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包括(iv)包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包括SEQ ID NO:23之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包括SEQ ID NO:24之胺基酸序列之CDR-L3。 9. 如段落1至7中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括：重鏈可變區(VH CD40)，其包括(i)包括SEQ ID NO:27之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包括(iv)包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包括SEQ ID NO:31之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包括SEQ ID NO:32之胺基酸序列之CDR-L3。 10. 如段落1至9中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (a)包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，或 (b)包括SEQ ID NO:33之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO:34之胺基酸序列之VL。 11. 如段落1至8中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:64。 12. 如段落1至8或11中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO:57之胺基酸序列之VL。 13. 如段落1至8中任一項之雙特異性抗原結合分子，其包括 (i)至少一個能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域，其包括：包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)：SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55，及包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:64，及 (ii)至少一個能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域，其包括：包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 14. 如段落2至13中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區係IgG、尤其IgG1 Fc區或IgG4 Fc區。 15. 如段落2至14中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區包括一或多個減小該抗體對Fc受體之結合親和力及/或效應物功能之胺基酸取代。 16. 如段落2至15中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區係(i)人類IgG1子類之具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引進行編號)之Fc區，或(ii)係小鼠IgG1子類之具有胺基酸突變D265A及P329G (根據Kabat EU索引進行編號)之Fc區。 17. 如段落2至16中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區包括促進該Fc區之該第一亞單元及該第二亞單元之締合之修飾。 18. 如段落2至17中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中根據凸起與孔洞方法，該Fc區之該第一亞單元包括凸起且該Fc區之該第二亞單元包括孔洞。 19. 如段落2至18中任一項之雙特異性抗體，其中 (i)該Fc區之該第一亞單元包括胺基酸取代S354C及T366W (根據Kabat EU索引進行編號)且該Fc區之該第二亞單元包括胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引進行編號)，或 (ii)該Fc區之該第一亞單元包括胺基酸取代K392D及K409D (根據Kabat EU索引進行編號)且該Fc區之該第二亞單元包括胺基酸取代E356K及D399K (根據Kabat EU索引進行編號)。 20. 如段落1至19中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)至少兩個Fab片段，其能夠特異性結合至經與Fc區連結之CD40 ，及 (b)至少一個抗原結合結構域，其能夠特異性結合至經與該Fc區之C-末端連結之FAP。 21. 如段落1至19中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc區之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域之VH及VL，其中該VH連結至(a)之該兩條重鏈中之一者之C-末端，且其中該VL連結至(a)之該兩條重鏈中之另一者之C-末端。 22. 如段落1至19中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)包括兩個能夠特異性結合至CD40之Fab片段及Fc區之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，及 (b)兩個能夠特異性結合至FAP之Fab片段，其中一個Fab片段連結至(a)之該兩條重鏈中之一者之C-末端，且另一Fab片段連結至(a)之該兩條重鏈中之另一者之C-末端。 23. 如段落1至19中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)能夠特異性結合至FAP之抗原結合結構域之VH及VL，其中該VH連結至(a)之該兩條重鏈中之一者之C-末端，且其中該VL連結至(a)之該兩條重鏈中之另一者之C-末端。 24. 如段落1至19中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)兩個能夠特異性結合至FAP之Fab片段，其中一個Fab片段連結至(a)之該兩條重鏈中之一者之C-末端，且另一Fab片段連結至(a)之該兩條重鏈中之另一者之C-末端。 25. 如段落1至19中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括 (a)兩條重鏈，每一重鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VH及CH1結構域及Fc區亞單元， (b)兩條輕鏈，每一輕鏈包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之VL及CL結構域，及 (c)一個能夠特異性結合至FAP之Fab片段，其中該Fab片段連結至(a)之該兩條重鏈中之一者之C-末端。 26. 如段落22至25中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP之該Fab片段或該兩個Fab片段係各自包括VL-CH1鏈及VH-CL鏈之交叉Fab片段，且其中該VL-CH1鏈連結至(a)之該兩條重鏈中之一者之C-末端。 27. 如段落1至26中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括4個能夠特異性結合至CD40之Fab片段。 28. 如段落23至27中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中(a)之該兩條重鏈中之每一者包括能夠特異性結合至CD40之Fab片段之兩個VH結構域及兩個CH1結構域。 29. 如段落23至28中任一項之雙特異性抗原結合分子，其中該等能夠特異性結合至CD40之Fab片段中之一或多者包括 CL結構域，其在胺基酸位置123 (根據Kabat EU索引進行編號)包括精胺酸(R)且在胺基酸位置124 (根據Kabat EU索引進行編號)包括離胺酸(K)，及 CH1結構域，其在胺基酸位置147 (根據Kabat EU索引進行編號)包括麩胺酸(E)且在胺基酸位置213 (根據Kabat EU索引進行編號)包括麩胺酸(E)。 30. 一種多核苷酸，其編碼如段落1至29中任一項之雙特異性抗原結合分子。 31. 一種表現載體，其包含如段落30之多核苷酸。 32. 一種宿主細胞，其包括如段落30之多核苷酸或如段落31之表現載體。 33. 一種產生雙特異性抗原結合分子之方法，其包括在適於表現該雙特異性抗原結合分子之條件下培養如段落32之宿主細胞，及分離該雙特異性抗原結合分子。 34. 一種醫藥組合物，其包括如段落1至29中任一項之雙特異性抗原結合分子及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。 35. 如段落1至29中任一項之雙特異性抗原結合分子或如段落34之醫藥組合物，其用作藥劑。 36. 如段落1至29中任一項之雙特異性抗原結合分子或如段落34之醫藥組合物，其用於 (i)藉由CD40+抗原呈遞細胞(APC)誘導免疫刺激， (ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應， (iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡， (iv)治療癌症， (v)延遲癌症進展， (vi)延長患有癌症之患者之存活， (vii)治療感染。 37. 如段落1至29中任一項之雙特異性抗原結合分子或如段落34之醫藥組合物，其用於治療癌症。 38. 一種如段落1至29中任一項之雙特異性抗原結合分子或如段落34之醫藥組合物之用途，其用以製造用於治療癌症之藥劑。 39. 一種治療患有癌症之個體之方法，其包括向該個體投與有效量之如段落1至29中任一項之雙特異性抗原結合分子或如段落34之醫藥組合物。 40. 如段落1至29中任一項之雙特異性抗原結合分子或如段落34之醫藥組合物，其用於上調或延長細胞毒性T細胞活性。 41. 如段落1至29中任一項之雙特異性抗原結合分子或如段落34之醫藥組合物，其用於治療癌症，其中該雙特異性抗原結合分子併與用於癌症免疫療法之化學治療劑、輻射及/或其他藥劑組合投與。實例 以下係本發明方法及組合物之實例。應理解，鑒於上文所提供之一般闡述可實踐各種其他實施例。重組 DNA 技術 使用標準方法來處理DNA，如Sambrook等人，Molecular cloning: A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所闡述。根據製造商說明書來使用分子生物試劑。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊在以下文獻中給出：Kabat, E.A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公開案第91-3242號。DNA 測序 藉由雙鏈測序來測定DNA序列。基因合成 期望基因區段係藉由PCR使用適當模板來生成，或藉由Geneart AG (Regensburg，Germany)自合成寡核苷酸及PCR產物藉由自動基因合成來合成。在沒有精確基因序列可用之情形下，基於來自最近同源物之序列來設計寡核苷酸引物，且藉由RT-PCR自源自適當組織之RNA來分離基因。將側接有獨特限制性內切酶裂解位點之基因區段選殖至標準選殖/測序載體中。自經轉化細菌純化質體DNA並藉由UV光譜測定濃度。藉由DNA測序來證實亞選殖基因片段之DNA序列。使用適宜限制性位點來設計基因區段以容許亞選殖於各別表現載體中。所有構築體皆經設計具有編碼前導肽之5’-端DNA序列，該前導肽用於靶向真核細胞中進行分泌之蛋白質。蛋白質純化 參照標準方案自經過濾細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，將抗體施加至蛋白質A Sepharose管柱(GE healthcare)並使用PBS洗滌。抗體之洗脫係在pH 2.8下達成，隨後立即中和試樣。在PBS中或在20 mM組胺酸、150 mM NaCl (pH 6.0)中藉由粒徑篩析層析(Superdex 200, GE Healthcare)將聚集蛋白質與單體抗體分離。彙集單體抗體部分，使用(例如) MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO)離心濃縮器濃縮(若需要)，冷凍並儲存於-20℃或-80℃下。提供部分試樣用於隨後藉由(例如) SDS-PAGE、粒徑篩析層析(SEC)或質譜進行蛋白質分析及分析型表徵。SDS-PAGE 根據製造商說明書使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)。特定而言，使用10%或4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast凝膠(pH 6.4)及NuPAGE® MES (還原凝膠，含有NuPAGE®抗氧化劑運行緩衝液添加劑)或MOPS (非還原凝膠)運行緩衝液。CE-SDS 藉由CE-SDS使用微流體Labchip技術(Caliper Life Science, USA)來分析雙特異性抗體及對照抗體之純度、抗體完整性及分子量。製備5 µl蛋白質溶液以用於使用HT蛋白質表現試劑套組根據製造商說明書來進行CE-SDS分析並在LabChip GXII系統上使用HT蛋白質表現晶片進行分析。使用LabChip GX軟體第3.0.618.0版分析數據。分析型粒徑篩析層析 用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之粒徑篩析層析(SEC)係藉由HPLC層析來實施。簡言之，將蛋白質A純化抗體施加至Agilent HPLC 1100系統上之Tosoh TSKgel G3000SW管柱之300 mM NaCl、50 mM KH2 PO4 /K2 HPO4 (pH 7.5)中，或施加至Dionex HPLC系統上之Superdex 200管柱(GE Healthcare)之2 × PBS中。藉由UV吸光度及峰面積積分來定量經洗脫蛋白質。BioRad凝膠過濾標準品151-1901用作標準品。質譜 此部分闡述對具有VH/VL或CH/CL交換(CrossMab)之多重特異性抗體之表徵，且重點在於其正確組裝。藉由去醣基化完整CrossMab及去醣基化/FabALACTICA或替代地去醣基化/GingisKHAN消解之CrossMab之電噴霧離子化質譜(ESI-MS)分析預期一級結構。 CrossMab係在1 mg/ml之蛋白質濃度下使用N-醣苷酶F在磷酸鹽或Tris緩衝液中在37℃下去醣基化最長17 h。FabALACTICA或GingisKHAN (Genovis AB；Sweden)消解係在由供應商供應之緩衝液中使用100 µg去醣基化CrossMab來實施。在質譜之前，經由HPLC在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上使試樣去鹽。經由ESI-MS在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上測定總質量。實例 1 靶向 CD40 及纖維母細胞活化蛋白 (FAP) 之雙特異性構築體之生成及產生 1.1 靶向 CD40 及纖維母細胞活化蛋白 (FAP) 之雙特異性抗原結合分子之生成 將編碼抗CD40結合劑之可變重鏈及輕鏈結構域(WO 2006/128103之SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:16)之cDNA與人類IgG1之相應恆定重鏈或輕鏈框內選殖至適宜表現質體中。藉由由MPSV核心啟動子及CMV增強子元件組成之嵌合MPSV啟動子來驅動重鏈及輕鏈之表現。表現盒亦在cDNA之3’端含有合成聚A信號。另外，質體載體含有複製起點(EBV OriP)以用於以游離方式維持質體。CD40 mAb及FAP mAb之可變結構域之胺基酸及核苷酸序列分別展示於表1及2中。 以以下形式來製備不同雙特異性CD40-FAP抗體：4+1及4+2形式，其由4個CD40結合部分以及一或兩個位於Fc中C-末端之FAP結合臂組成；或2+1及2+2形式，其由兩個CD40結合部分以及一或兩個位於Fc中C-末端之FAP結合臂組成(圖 1A 至 1D )。FAP結合劑28H1之生成及製備闡述於WO 2012/020006 A2中，該案件以引用方式併入本文中。為生成4+1及2+1分子，使用凸起與孔洞技術來達成異源二聚化。將S354C/T366W突變引入第一重鏈HC1中(Fc凸起重鏈)且將Y349C/T366S/L368A/ Y407V突變引入第二重鏈HC2中(Fc孔洞重鏈)。在4+2及2+2分子中，如WO 2010/145792 A1中所闡述之CrossMab技術可確保正確輕鏈配對。獨立於雙特異性形式，在所有情形下，根據WO 2012/130831 A1中所闡述之方法使用效應物沉默Fc (P329G；L234, L235A)來廢止與Fcγ受體之結合。雙特異性分子之序列展示於表3及4中。 除靶向人類受體之分子外，亦以相同形式生成識別鼠類抗原之代用分子。在該等情形下，藉由Fc中之DD/KK突變(在第一重鏈中引入Lys392Asp及Lys409Asp並在第二重鏈中引入Glu356Lys及Asp399Lys突變)根據闡述於Gunasekaran等人，J. Biol. Chem. 2010,19637-19646中之方法來達成4+1分子之異源二聚化，而藉由D270A/P329G突變根據闡述於Baudino等人，J. Immunol. (2008), 181, 6664-9.或WO 2016/030350 A1中之方法來抑制結合至Fc受體。 在由MPSV核心啟動子以及CMV啟動子增強子片段組成之嵌合MPSV啟動子之控制下瞬時表現所有基因。表現載體亦含有用於含EBNA (愛潑斯坦巴爾病毒(Epstein Barr Virus)核抗原)宿主細胞中之游離型複製之oriP區域。 表1：CD40抗體、FAP抗體及DP47抗體之可變結構域之胺基酸序列
Figure 107111767-A0304-0003
 表2：CD40抗體、FAP抗體及DP47抗體之可變結構域之核苷酸序列
Figure AA2
Figure AA2-1
Figure AA2-2
Figure AA2-3
Figure AA2-4
 表3：CD40 IgG及雙特異性抗原結合分子之胺基酸序列
Figure AA3
Figure AA3-1
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 表4：雙特異性抗原結合分子之核苷酸序列
Figure AA4
Figure AA4-1
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Figure AA4-3
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Figure AA4-43
 1.2 靶向 CD40 及纖維母細胞活化蛋白 (FAP) 之雙特異性抗原結合分子之產生 藉由使用聚乙烯亞胺(PEI)共轉染懸浮生長之HEK293-EBNA細胞與哺乳動物表現載體或使用eviFECT共轉染懸浮生長之CHO K1細胞與哺乳動物表現來產生分子。使用相應表現載體轉染細胞。 以HEK293 EBNA細胞中之產生而言，將HEK293 EBNA細胞懸浮培養在含有6 mM L-麩醯胺酸及250 mg/L G418之不含血清的Excell培養基中。以600 mL tubespin燒瓶(最大工作體積為400 mL)中之產生而言，在轉染之前24小時，接種6 x 108 個HEK293 EBNA細胞。對於轉染而言，將8 x 108 個細胞在210 × g下離心5 分鐘，且以20 mL預升溫CD CHO培養基置換上清液。將表現載體混合於20 mL CD CHO培養基中直至最終量為400 µg DNA。在添加1080 µL PEI溶液(2.7 µg/mL)之後，將混合物渦旋15秒且隨後在室溫下培育10分鐘。然後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至600 mL tubespin燒瓶中並在37℃及5% CO2 氣氛下於培育器中培育3小時。在培育之後，添加360 mL Excell培養基(含有6 mM L-麩醯胺酸、5 g/L Pepsoy及1.25 mM VPA)且將細胞培養24小時。在轉染之後一天，添加12% Feed 7及3 g/l葡萄糖。在7天之後，收集培養上清液以用於藉由在2500 × g下離心60分鐘 (Sigma 8K離心機)來進行純化。將溶液無菌過濾(0.22 µm過濾器)且添加疊氮化鈉直至最終濃度為0.01% w/v並保持於4℃下。 對於在懸浮適應性CHO K1細胞(適應於懸浮培養中之無血清生長)中之產生而言，使細胞在eviGrow培養基(evitria AG, Switzerland，一種化學成分限定、無動物組分、無血清培養基)中生長並使用eviFect (evitria AG, Switzerland)轉染。在轉染之後，將細胞在37℃及5% CO2 下保持於eviMake (evitria AG, Switzerland，一種化學成分限定、無動物組分、無血清培養基)中7天。 在7天之後，收集培養上清液以用於藉由在Rotanta 460 RC中以最大速度離心45分鐘來進行純化。無菌過濾(0.22 µm過濾器)溶液並保持於4℃下。藉由蛋白質A-HPLC或蛋白質A-生物層干涉量測法(Bio-Layer Interferometry；BLI)來測定培養基中之分子濃度。 藉由親和力層析使用蛋白質A親和力層析自細胞培養上清液純化所分泌蛋白質，隨後實施粒徑篩析層析步驟。對於親和力層析而言，將上清液加載於使用25 ml 20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉(pH 7.5)平衡之HiTrap MabSelect SuRe管柱(管柱體積(CV) = 5 mL, GE Healthcare)上。藉由使用至少10 CV 20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉(pH 7.5)進行洗滌來去除未結合蛋白質且在6 CV 20 mM檸檬酸鈉、100 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸(pH 3.0)中洗脫靶蛋白。藉由添加1/10之0.5 M pH 8.0磷酸鈉來中和蛋白質溶液。濃縮靶蛋白並過濾，然後加載於使用20 mM組胺酸、140 mM pH 6.0氯化鈉、0.01% Tween20平衡之HiLoad XK16/60 Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。藉由使用根據胺基酸序列計算之莫耳消光係數量測280 nm下之光學密度(OD)來測定經純化蛋白質試樣中之蛋白質濃度。 藉由CE-SDS分析在存在及不存在還原劑下來分析最終純化步驟之後之分子純度及分子量。根據製造商說明書來使用Caliper LabChip GXII系統(Caliper Lifescience)。 使用TSKgel G3000 SW XL分析型粒徑篩析管柱(Tosoh)在25℃下於25 mM磷酸鉀、125 mM氯化鈉、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v) NaN3 (pH 6.7)運行緩衝液中來分析分子聚集物含量。 表5：雙特異性CD40抗原結合分子之產量及品質
Figure 107111767-A0304-0006
 1.3 靶向 CD40 及纖維母細胞活化蛋白 (FAP) 之其他雙特異性抗原結合分子之生成 類似於實例1.1，製備雙特異性CD40-FAP抗體之不同類型之構築體。舉例而言，製備由一個CD40結合部分以及一個FAP結合部分組成之雙特異性抗體(圖 15A )。因使用如WO 2010/145792 A1中所闡述之CrossMab技術來確保正確輕鏈配對，故該形式稱為1+1 crossmab。製備另一稱為「頭對尾」之2+1形式，其中結合CD40之Fab融合至結合FAP之Fab之N-末端(圖 15B )，且產生另一由兩個CD40結合部分以及位於Fc中C-末端之任一結合FAP之交叉fab組成之2+1形式(圖1E)。另外，製備由4個CD40結合部分以及位於Fc中C-末端之一個結合FAP之交叉fab組成之4+1形式(圖 15C )。在所有該等構築體中，抗CD40結合劑之可變重鏈及輕鏈結構域對應於如WO 2006/128103中所闡述之CD40結合劑(該文件之SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:16)。FAP結合劑28H1之生成及製備闡述於WO 2012/020006 A2中，該案件以引用方式併入本文中。為生成1+1、2+1及4+1分子，使用凸起與孔洞技術來達成異源二聚化。將S354C/T366W突變引入第一重鏈HC1中(Fc凸起重鏈)且將Y349C/T366S/L368A/ Y407V突變引入第二重鏈HC2中(Fc孔洞重鏈)。另外，如WO 2010/145792 A1中所闡述之CrossMab技術可確保正確輕鏈配對。獨立於雙特異性形式，在所有情形下，根據WO 2012/130831 A1中所闡述之方法使用效應物沉默Fc (P329G；L234, L234A)來廢止與Fcγ受體之結合。雙特異性分子之胺基酸序列展示於表6中。 在由MPSV核心啟動子以及CMV啟動子增強子片段組成之嵌合MPSV啟動子之控制下瞬時表現所有基因。表現載體亦含有用於含EBNA (愛潑斯坦巴爾病毒核抗原)宿主細胞中之游離型複製之oriP區域。 表6：雙特異性抗原結合分子之胺基酸序列
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 雙特異性抗體之表現 藉由使用編碼4種不同肽鏈之表現載體瞬時轉染懸浮生長之HEK細胞來表現抗體。根據細胞供應商說明書使用抗體載體之Maxiprep (Qiagen)製劑、F17培養基(Invitrogen, USA)、Peipro (Polyscience Europe GmbH)及1-2百萬個活細胞/ml之初始細胞密度在無血清FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen)中來轉染至HEK293-F細胞(Invitrogen)中。在培養7天之後於振盪燒瓶或攪拌發酵器中藉由在14000 g下離心30分鐘來收穫細胞培養上清液並經由0.22 µm過濾器過濾。雙特異性抗體之純化 藉由親和力層析使用MabSelectSure-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden)層析自細胞培養上清液來純化抗體。簡言之，將無菌過濾之細胞培養上清液捕獲於使用PBS緩衝液(10 mM Na2 HPO4 、1 mM KH2 PO4 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡之MabSelect SuRe樹脂上，使用平衡緩衝液洗滌並使用25 mM pH 3.0檸檬酸鹽洗脫。在使用1 M pH 9.0 Tris中和之後，藉由粒徑篩析層析(Superdex 200, GE Healthcare)於20 mM組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0)中自單體抗體物質來分離聚集蛋白質。彙集單體蛋白質部分，視需要使用(例如) MILLIPORE Amicon Ultra (30KD MWCO)離心濃縮器濃縮並儲存於-80℃下。使用試樣等分試樣(例如)藉由CE-SDS、粒徑篩析層析、質譜及內毒素測定來進行後續分析表徵。1.4 靶向 CD40 及 FAP 之雙特異性構築體之表徵 1.4.1 與表現人類或小鼠 FAP 之鼠類纖維母細胞 使用表現人類纖維母細胞活化蛋白(huFAP)之細胞NIH/3T3-huFAP純系19或表現小鼠纖維母細胞活化蛋白(mFAP)之細胞NIH/3T3-mFAP純系26來測試與細胞表面FAP之結合。藉由使用表現載體pETR4921轉染小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3細胞系(ATCC CRL-1658)以在1.5 μg/mL嘌呤黴素(Puromycin)下分別表現所選huFAP或mFAP來生成NIH/3T3-huFAP純系19及NIH/3T3-mFAP純系26。使用並不使用FAP轉染且並不表現FAP之NIH/3T3野生型(wt)細胞作為陰性對照。 使用補充有10%胎牛血清(FBS) (life technologies，目錄號16140，批號1797306A)之1×達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM) (gibco，目錄號42430-025)培養NIH/3T3-huFAP、NIH/3T3-mFAP或NIH/3T3-wt細胞。對於NIH/3T3-huFAP及NIH/3T3-mFAP細胞而言，將1.5 µg/mL嘌呤黴素(gibco，目錄號A11138-03)添加至培養基中以用於選擇FAP表現細胞。藉由使用無酶細胞解離緩衝液(gibco，目錄號13151014)自板取出NIH/3T3細胞。將0.3×105 NIH/3T3-huFAP純系19、NIH/3T3-mFAP純系26或NIH/3T3-wt添加至圓底96孔板(greiner bio-one, cellstar，目錄號650185)每一孔之200 µl 1× DMEM (10% FBS)中。將板在1700 rpm下離心5分鐘且彈掉上清液。使用200 µL 4℃冷FACS緩衝液(eBioscience，目錄號00-4222-26)將細胞洗滌一次。將所有試樣以指示濃度範圍(一式兩份)再懸浮於50 µL/孔之含有雙特異性抗原結合分子(一級抗體)或同型對照抗體DP47之4℃冷FACS緩衝液中並在4℃下培育120分鐘。然後，使用200 µL 4℃冷FACS緩衝液將細胞洗滌三次。使用25 µL/孔之含有R-藻紅素(PE)偶聯之AffiniPure山羊抗人類IgG Fcγ片段特異性F(ab')₂片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-098)之4℃冷二級抗體溶液(二級抗體之1:50稀釋液)將細胞進一步染色並在4℃下於暗處培育60分鐘。使用200 µl FACS緩衝液洗滌細胞並再懸浮於含有0.2 μg/mL DAPI (Roche，目錄號10236276001)之85 µL/孔FACS-緩衝液中且在同一天使用5-雷射LSR-Fortessa (BD Bioscience，使用DIVA軟體)獲取。使用FlowJo第10版軟體(FlowJo LLC)實施數據分析。 如圖 2A 、 2B 及圖 17 中所展示，FAP單價或二價雙特異性抗體結合至表現FAP之人類及小鼠靶細胞。因此，僅靶向FAP之抗CD40抗原結合分子展示直接腫瘤靶向性質。具有C-末端FAP結合結構域之二價FAP構築體之結合強於具有C-末端FAP結合結構域之單價構築體，此可藉由二價FAP形式相對於單價FAP形式之親合力增益來予以闡釋。使用1+1形式(P1AE0192)觀察到最強FAP結合。據檢測，靶向FAP之抗體未結合至NIH/3T3-wt細胞。如針對不同雙特異性抗體所量測之EC50 值展示於下表7中。表 7 ： 呈不同雙特異性抗體形式之 28H1 之人類 FAP 結合表徵
Figure 107111767-A0304-0008
 1.4.2 與表現人類 CD40 之道迪細胞之結合 使用道迪細胞(具有高人類CD40表現程度之人類B淋巴母細胞細胞系，ATCC CCL-213)測試與細胞表面CD40之結合。使用補充有10 %胎牛血清(FBS) (life technologies，目錄號16140，批號1797306A)之1×達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM) (gibco，目錄號42430-025)培養道迪細胞。將0.3×105 個道迪細胞添加至圓底96孔板(greiner bio-one, cellstar，目錄號650185)之每一孔之200 µl 1× DMEM (含有10% FBS)中。將板在1700 rpm下離心5分鐘且彈掉上清液。使用200 µL 4℃冷FACS緩衝液(eBioscience，目錄號00-4222-26)將細胞洗滌一次。將所有試樣以指示濃度範圍(一式兩份)再懸浮於50 µL/孔之含有雙特異性抗原結合分子(一級抗體)或同型對照抗體DP47之4℃冷FACS緩衝液中並在4℃下培育120分鐘。然後，使用200 µL 4℃冷FACS緩衝液將細胞洗滌三次。使用25 µL/孔之含有R-藻紅素(PE)偶聯之AffiniPure山羊抗人類IgG Fcγ片段特異性F(ab')₂片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-098)之4℃冷二級抗體溶液(二級抗體之1:50稀釋液)將細胞進一步染色並在4℃下於暗處培育60分鐘。使用200 µl FACS緩衝液洗滌細胞並再懸浮於含有0.2 μg/mL DAPI (Roche，目錄號10236276001)之85 µL/孔FACS-緩衝液中且在同一天使用5-雷射LSR-Fortessa (BD Bioscience，使用DIVA軟體)獲取。使用FlowJo第10版軟體(FlowJo LLC)實施數據分析。 如圖 18 中所展示，所有繪示純系皆結合至CD40，但其與CD40陽性道迪細胞之結合強度(EC50 值以及信號強度)有所變化。與四價抗CD40抗體，雙價抗CD40抗體展示較高EC50 值且達到較高結合平臺，此可藉由每一抗體中具有更多被佔據CD40結合位點及四價CD40形式相對於二價CD40形式之親合力增益來予以闡釋。使用1+1形式(P1AE0192)觀察到最高EC50 值以及最低結合平臺。據檢測，陰性對照抗體未結合至道迪細胞。如針對不同雙特異性抗體所量測之EC50 值展示於下表8中。表 8 ： 呈不同雙特異性抗體形式之 CD40 抗體之人類 CD40 結合表徵
Figure 107111767-A0304-0009
 實例 2 靶向 FAP 之抗人類 CD40 結合分子之功能性質 2.1 靶向 FAP 之抗人類 CD40 結合分子對抗原呈遞細胞 (APC) 之 CD40 調介之活化 CD40連接誘導B細胞及樹突狀細胞(DC)之成熟以及活化並促進該等細胞類型之存活。在CD40信號傳導時，B細胞及DC表面上之細胞介素產生及共刺激分子表現有所增加(S. Quezada等人，Annu RevImmunol. 2004, 22, 307-328；S. Danese等人，Gut. 2004, 53, 1035-1043；G. Bishop等人，Adv Exp Med Biol. 2007, 597, 131-151)。 為測試不同FAP依賴性抗CD40抗體之激動性性質及FAP特異性，將自人類血沉棕黃層獲得之APC與FAP依賴性激動性抗人類CD40抗體及經FAP塗覆之珠粒或表現FAP之人類NIH/3T3細胞一起培育。藉由FACS量測APC活化且藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)來分析細胞上清液之細胞介素。2.1.1 使用 NIH/3T3-huFAP 細胞作為抗原源藉由靶向 FAP 之抗人類 CD40 結合分子所達成之人類 B 細胞活化 使用表現FAP之NIH/3T3細胞作為雙特異性抗原結合分子之抗原源。藉由使用編碼人類FAP之表現pETR4921質體在CMV啟動子下轉染小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)來生成NIH/3T3-huFAP細胞。利用27 Gy使用RS 2000輻照器(Rad Source Technologies)輻照NIH/3T3-huFAP細胞或NIH/3T3-wt細胞以防止細胞發生增殖。將於100 µl R10培養基(由Roswell Park Memorial Institute培養基(RPMI) 1640 (gibco，目錄號31870-025)組成，該培養基提供有10% FBS、1% (v/v)青黴素(Penicillin)-鏈黴素(Streptomycin) (gibco，目錄號15070-063)、1% (v/v) L-麩醯胺酸(gibco，目錄號25030-024)、1% (v/v)丙酮酸鈉(gibco，目錄號11360-039)、1% (v/v) MEM非必需胺基酸(gibco，目錄號11140-035)及50 µM β-巰基乙醇(gibco，目錄號31350-010))中之0.2×105 個經輻照NIH/3T3細胞接種至96孔平底板(TPP，目錄號92696)之每一孔中。 第二天，自Stiftung Zürcher Blutspendedienst SRK獲得血沉棕黃層。為分離末梢血單核細胞(PBMC)，將50 mL血沉棕黃層稀釋於相同體積之PBS (gibco，目錄號10010023)中。向50 mL聚丙烯離心管(TPP，目錄號91050)供應15 mL LymphoprepTM (STEMCELL Technologies，目錄號07851)且使25 mL血沉棕黃層/PBS溶液/管小心分層於LymphorepTM 上方。將管在室溫及低加速下以2000 rpm無間斷地離心24分鐘。然後，自界面收集PBMC，使用PBS洗滌三次，再懸浮於10 mL PBS中並使用Beckman Coulter細胞計數器Ac·T™ 5diff OV (Beckman Coulter，目錄號6605580)分析細胞之細胞類型及數量。在自PBMC分離B細胞之前，藉由使用CD14微珠粒(Miltenyi，目錄號130-050-201)磁標記CD14-陽性細胞來取出CD14-陽性部分且隨後使用autoMACS® Pro分離機(Miltenyi，目錄號130-092-545)進行分離。使用CD14-陰性部分利用Miltenyi B細胞分離套組II (目錄號130-091-151)進行後續B細胞分離及autoMACS® 分離。將於50 µl R10培養基中之1×105 個B細胞添加至每一孔之NIH/3T3細胞中。將於50 µl R10培養基中之靶向FAP之抗人類CD40抗體以介於1 µg/mL至0.3 ng/mL之間之濃度(3×稀釋系列)添加至B細胞中。作為陽性對照，使用FAP獨立性激動性抗人類CD40抗體RO7009789 (IgG2, INN：西裡魯單抗)及SGN-40 (IgG1, INN：達西珠單抗)。兩種抗體對於CD40皆係二價。因在文獻中闡述SGN-40抗體需要Fc受體交聯來達成生物活性(C. Law等人，Cancer Res 2005, 65, 8331-8338)且此機制亦針對RO7009789予以論述(R. Dahan等人，Cancer Cell 2016, 29, 1-12)，故在添加至B細胞中之前將該兩種抗體與交聯山羊抗人類IgG Fcγ片段特異性F(ab’)2 片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-006-008)一起培育30分鐘。在48小時之後，將細胞轉移至96孔圓底板中，使用PBS洗滌一次並與50 µl 3 µg/mL Fc受體阻斷小鼠IgG同型對照(ThermoFisher Scientific，目錄號10400C)在PBS中一起培育。在4℃下培育15分鐘之後，使用PBS洗滌細胞且向細胞中添加50 µl螢光標記抗體於PBS中之混合物。使用下列螢光標記抗體：抗人類CD83 BV421 (Biolegend，純系HB15e，目錄號305324)、抗人類CD80 BV605 (BD Biosciences，純系L307.4，目錄號563315)、抗HLA-ABC FITC (BD Biosciences，純系G46-2.6，目錄號555552)、抗人類CD14 PerCP-Cy5.5 (Biolegend，純系HCD14，目錄號325622)、抗人類CD3 PerCP-Cy5.5 (Biolegend，純系UCHT1，目錄號300430)、抗人類CD70 PE (Biolegend，純系113-16，目錄號355104)、抗人類CD86 PE-CF594 (BD Biosciences，純系FUN-1，目錄號562390)、抗HLA-DR APC (BD Biosciences，純系G46-6，目錄號559866)及抗人類CD19 APC-H7 (BD Biosciences，純系SJ25C1，目錄號560177)。為區分活細胞與死亡細胞，將細胞活力染料Zombie AquaTM (Biolegend，目錄號423102)添加至抗體混合物中。在4℃下培育30分鐘之後，使用PBS將細胞洗滌兩次且然後再懸浮於200 µl PBS中。在同一天使用5雷射LSR-Fortessa (BD Bioscience，使用DIVA軟體)分析細胞。使用FlowJo第10版軟體(FlowJo LLC)實施數據分析。分析活(aqua陰性)細胞(對於CD14及CD3為陰性且對於CD19為陽性)之CD70、CD80、CD83及CD86表現。圖 3A 至 3H 展示藉由人類CD40四價及FAP單價或二價雙特異性抗原結合分子達成之B細胞活化標記物CD70 (圖3A及3B)、CD80 (圖3C及3D)、CD83 (圖3E及3F)及CD86 (圖3G及3H)之FAP依賴性上調。FAP單價雙特異性抗體誘導類似於具有兩個FAP結合部分之分子之活化標記物表現之增加。使用NIH/3T3-FAP細胞，藉由雙特異性抗原結合分子達成之B細胞活化標記物上調與藉由FAP獨立性陽性對照抗體所誘導之上調相當。在不存在FAP (NIH/3T3-wt細胞)下，使用雙特異性抗原結合分子觀察到B細胞活化標記物並不增加，而陽性對照抗體則誘導該等標記物之表現發生上調。2.1.2 使用經 FAP 塗覆之 Dynabeads® 作為抗原源藉由靶向 FAP 之抗人類 CD40 結合分子所達成之人類道迪細胞活化 將於100 µl 1× DMEM + 10% FBS中之1×105 個道迪細胞添加至96孔平底板之每一孔中。代之以使用表現FAP之細胞作為抗原源，根據製造商說明書使用生物素化小鼠FAP (內部產生) (結合能力為6.5×104 個珠粒: 0.01 µg蛋白質)來塗覆鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin) Dynabeads® (ThermoFisher Scientific，目錄號：11205D)並以2:1之珠粒:細胞比率且以於50 µl R10培養基中之形式添加至道迪細胞中。使用經FAP塗覆之珠粒代替表現FAP之細胞可提供較穩定之可再生系統，此乃因細胞之波動品質及可影響APC活化狀態之細胞產物之分泌代表了潛在地歪曲結果的因素。作為對照，將未塗覆珠粒添加至道迪細胞中。將於50 µl R10培養基中之靶向FAP之抗人類CD40抗體或陽性對照抗體(闡述於部分2.1.1中)添加至道迪細胞中。在2天之後，藉由FACS遵循2.1.1中所指定之染色及分析程序來分析道迪細胞。 在與激動性抗CD40抗體一起培育2天之後分析之B細胞展示所有抗體之CD70表現皆有所增加(參見圖20A 及B )。具體分子之EC50 值匯總於下表9中。該等表現標記物之上調在靶向FAP之不同抗體之情形下依賴於FAP，且藉由該等FAP依賴性抗體誘導之表現增加高於藉由交聯CD40抗體(P1AD4470)誘導之增加。在不存在FAP (未塗覆珠粒)下，使用所繪示CD40單價或二價雙特異性抗體觀察到CD70並不增加，而四價CD40結合分子誘導CD70上調，但上調程度小於在FAP存在下時，從而指示四價CD40結合劑在道迪細胞中之較低但可檢測之FAP獨立性CD40活化。表 9 ： 使用經 FAP 塗覆之 Dynabeads® 之 人類道迪細胞活化
Figure 107111767-A0304-0010
 2.1.3 使用經 FAP 塗覆之 Dynabeads® 作為抗原源藉由靶向 FAP 之抗人類 CD40 結合分子所達成之人類 B 細胞活化 如部分2.1.1中所闡述自血沉棕黃層來分離B細胞且將於100 µl R10培養基中之1×105 個B細胞添加至96孔平底板之每一孔中。根據製造商說明書使用生物素化人類或小鼠FAP (內部產生) (結合能力為6.5×104 個珠粒: 0.01 µg蛋白質)來塗覆鏈黴抗生物素蛋白Dynabeads® (ThermoFisher Scientific，目錄號：11205D)並以2:1之珠粒:細胞比率且以於50 µl R10培養基中之形式添加至B細胞中。作為對照，將未塗覆珠粒添加至B細胞中。將於50 µl R10培養基中之靶向FAP之抗人類CD40抗體或陽性對照抗體(闡述於部分2.1.1中)添加至B細胞中。在2天之後，藉由FACS遵循2.1.1中所指定之染色及分析程序來分析B細胞。或者，將B細胞在激動性抗CD40抗體存在下培養5天且獲取110 µl上清液以使用人類IL-6 DuoSet ELISA套組(R&D，目錄號DY206-05)進行IL-6量測。眾所周知，在使用CD40配體刺激時，B細胞產生增加量之IL-6，而無需其他B細胞受體刺激(M. Duddy等人，J. Immunol. 2004, 172, 3422-3427)。如由製造商提供之方案中所闡述來實施ELISA，不同之處僅在於在每一分析步驟中使用推薦量之一半。藉由FACS遵循部分2.1.1中所指定之染色及分析程序來分析B細胞。 在與激動性抗CD40抗體一起培育2天之後分析之B細胞展示所有抗體之CD70、CD83及CD86表現皆有所增加(參見圖 4A 至4F 、圖 21A 及B 及圖 25A 至D )。具體分子之與CD86表現增加相關之EC50 值匯總於下表10中。該等表現標記物之上調在靶向FAP之不同抗體之情形下依賴於FAP，且藉由該等FAP依賴性抗體誘導之表現增加相對於或略低於藉由交聯CD40抗體P1AD4470誘導之增加。表 10 ： 使用經 FAP 塗覆之 Dynabeads® 之人類 B 細胞活化 ， 展示為 CD86 表現之增加
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 在使B細胞與經FAP塗覆之Dynabeads® 一起培育5天之後，靶向人類CD40及FAP之抗原結合分子誘導B細胞上之CD80表現發生FAP依賴性上調。藉由具有一或兩個FAP結合位點之抗人類CD40抗體誘導之CD80表現程度係相當的。使用陽性對照抗CD40抗體處理B細胞可引起類似程度之CD80上調。亦可使用雙特異性抗原結合分子檢測升高之FAP依賴性CD86表現。同樣，存在一或兩個FAP結合位點在此活化標記物之表現程度方面並無重大差異。與藉由交聯SGN-40 (達西珠單抗)或激動性CD40抗體西裡魯單抗(RO 7009789)誘導之CD86之FAP獨立性上調相比，藉由FAP依賴性雙特異性抗原結合分子誘導之CD86上調略有降低。對於CD70及CD83而言，使用靶向FAP及CD40之雙特異性抗體觀察到並無上調或僅極有限上調，而陽性對照抗體明確展示對該等B細胞活化標記物之效應(圖 5A 至5H )。圖 6A 及6B 展示不同激動性抗CD40抗體對B細胞IL-6產生之效應。在FAP存在下，上清液中之IL-6濃度有所升高且所測試所有激動性抗人類CD40抗體具有類似升高程度(與未處理(UT)條件相比，約增加6倍)。在將B細胞與未塗覆Dynabeads® 一起培育時，使用雙特異性抗原結合分子檢測到IL-6產生並未增加，從而證實該等分子之FAP依賴性。2.1.4 使用經人類 FAP 塗覆之 Dynabeads® 作為抗原源藉由靶向 FAP 之抗人類 CD40 結合分子所達成之人類單核球源 DC (moDC) 活化 藉由LymphoprepTM 密度離心自血沉棕黃層分離PBMC。隨後，使用如2.1.1中所闡述之CD14微珠粒及autoMACS® 分離分離單核球。為生成單核球源DC (moDC)，將3×106 個單核球以1×106 個細胞/mL之密度接種於6孔板(TPP，目錄號92006)之每一孔中。對於DC成熟而言，使用由補充有1% (v/v)青黴素-鏈黴素、2% (v/v)人類血清(在56℃下熱失活30分鐘) (Sigma-Aldrich，目錄號H4522，批號SLBP1687V)、20 ng/mL新添加重組人類顆粒球巨噬球群落刺激因子(GM-CSF) (Peprotech，目錄號300-03-20UG，批號081230H1213)及20 ng/mL新添加重組人類IL-4 (Peprotech，目錄號200-04-100UG，批號091514C3116)之RPMI 1640組成之moDC培養基。在5天之後，藉由輕微去除懸浮液及半黏附細胞自6孔板收穫moDC並再懸浮於含有人類IL-4及GM-CSF之新鮮moDC培養基中。將2×105 個moDC接種於96孔平底板之每一孔中之100 µl moDC培養基中。使用生物素化人類FAP塗覆鏈黴抗生物素蛋白Dynabeads® 並以2:1之珠粒/DC比率添加50 µl (如2.1.3中所闡述)。作為對照，將未塗覆珠粒添加至moDC中。將50 µl靶向FAP之抗人類CD40抗體以介於1 µg/mL至0.3 ng/mL之間之濃度(3×稀釋系列)添加至DC中。對於陽性FAP獨立性對照，使用激動性抗人類CD40抗體RO7009789及交聯CD40抗體。在添加Dynabeads® 及不同激動性抗人類CD40抗體之後2天，藉由FACS量測moDC活化。如2.1.1中所指定使用包括以下之螢光標記抗體及細胞活力染料Zombie AquaTM (Biolegend，目錄號423102)之混合物來實施FACS染色：抗人類CD86 BV421 (BD Biosciences，純系FUN-1，目錄號562432)、抗人類CD80 BV605 (BD Biosciences，純系L307.4，目錄號563315)、抗HLA-ABC FITC (BD Biosciences，純系G46-2.6，目錄號555552)、抗人類CD1c PerCp-Cy5.5 (BD Biosciences，純系F10/21A3，目錄號565424)、抗人類CD70 PE (Biolegend，純系113-16，目錄號355104)、抗人類CD11c PE-eF610 (eBioscience，純系3.9，目錄號61-0116-42)、抗人類CD83 PE-Cy7 (BD Biosciences，純系HB15e，目錄號561132)、抗人類CD209 APC (BD Biosciences，純系DCN46，目錄號551545)、抗人類CD3 Alexa Fluor 700 (eBioscience，純系OKT3，目錄號56-0037-42)、抗人類CD14 APC-H7 (BD Biosciences，純系M5E2，目錄號561384)。在同一天使用5-雷射LSR-Fortessa來分析細胞。使用FlowJo第10版軟體實施數據分析。選通單一活細胞之CD3陰性細胞及CD14陰性細胞。基於此群體，分析CD1c及CD11c陽性細胞中之活化標記物CD70、CD80、CD83及CD86之表現。 對於所有激動性抗人類CD40抗體而言，可觀察到moDC上之CD83具有明顯及類似之上調(圖 7E 至7F )。在FAP依賴性抗CD40抗體之情形下，檢測到呈FAP依賴性方式之此上調。使用靶向CD40及FAP之雙特異性抗原結合分子，CD80表現僅略有增加，然而，此增加具有FAP依賴性且與DC上藉由陽性對照抗體RO7009789誘導之CD80上調相當(圖 7C 及7D )。儘管與未處理DC相比與不同抗CD40抗體一起培育之DC上之CD86表現並不顯著改變(圖 7G 及7H )，但CD70表現因該等抗體之激動性效應而升高(圖 7A 及7B )。同樣，在FAP存在時，兩種FAP依賴性抗體僅展示活化性質且其對CD70之效應類似。然而，CD70表現上調之moDC之數量較低(最大為CD11c及CD1c陽性細胞之8%)。與雙特異性分子相比，RO7009789在此實驗設置中展示上調DC上之CD70之較高功效。2.1.5 使用經鼠類 FAP 塗覆之 Dynabeads® 作為抗原源藉由靶向 FAP 之抗人類 CD40 結合分子所達成之 HEK-Blue™ CD40L 細胞活化 使用HEK-Blue™ CD40L細胞(InvivoGen，目錄號hkb-cd40)作為報告基因細胞系來分析藉由靶向FAP之抗人類CD40結合分子調介之人類CD40刺激。HEK-Blue™ CD40L細胞穩定表現人類CD40受體及NFκB可誘導經分泌胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)。CD40L或激動性抗CD40抗體結合至表現於HEK-Blue™ CD40L細胞上之CD40受體可觸發引起NFκB-調介之SEAP產生之信號傳導級聯。所產生SEAP之量與CD40受體活化程度直接相關。可使用分光光度計在620-655 nm下量測上清液中之所分泌SEAP之含量。將於160 µl預升溫HEK-Blue™檢測培養基(InvivoGen，目錄號hb-det2)中之0.5×105 個HEK-Blue™ CD40L細胞接種於96孔平底板(TPP，目錄號92696)之每一孔中。使用生物素化鼠類FAP塗覆鏈黴抗生物素蛋白Dynabeads® 並於20 µl PBS中以2:1之珠粒:細胞比率進行添加(如2.1.3中所闡述)。作為對照，將未塗覆珠粒添加至報告基因細胞中。將於20 µl PBS中之靶向FAP之抗人類CD40抗體以介於6.89 nM至0.0032 nM之間之濃度(3×稀釋系列)添加至細胞中。作為對照分子，使用具有一或兩個DP47結構域代替FAP結合結構域之人類CD40四價抗體及FAP獨立性交聯CD40抗體(P1AD4470)。在37℃下培育8小時之後，藉由分光光度計在650 nm下量測上清液中之SEAP含量。 對於所有靶向FAP之激動性抗人類CD40抗體而言，皆觀察到明顯且相當之SEAP產生。在靶向FAP之人類CD40單價或二價雙特異性抗體之情形下，僅在FAP存在下檢測到SEAP產生。與之相比，使用靶向FAP之人類CD40四價雙特異性抗體處理之報告基因細胞獨立於FAP可用性來分泌SEAP。然而，在FAP存在下，在使用該等抗體處理之報告基因細胞之上清液中檢測到較高SEAP含量。此外，具有一或兩個DP47結構域代替FAP結合結構域之人類CD40四價陰性對照抗體在HEK-Blue™ CD40L細胞中於存在及不存在FAP下誘導相當之SEAP產生。與靶向FAP之人類CD40二價或四價雙特異性抗體相比，在經FAP塗覆之珠粒存在下，陽性對照抗體CD40 IgG (P1AD4470) + F(ab)誘導類似程度之SEAP產生(圖 8A 、8B 、 19A 及 B )。如針對CD40抗體以及針對不同雙特異性抗體所量測之EC50 值展示於下表11中。表 11 ： 使用經鼠類 FAP 塗覆之 Dynabeads® 之 HEK-Blue™ CD40L 細胞活化
Figure 107111767-A0304-0012
 2.2 藉由靶向 FAP 之抗 CD40 結合分子達成之 CD40 調介之 DC 活化及 T 細胞的後續引發 為證實FAP依賴性抗人類CD40抗體活化DC以有效引發T細胞之能力，確立活體外T細胞引發分析。對於該等分析而言，分離來自表現人類CD40受體之轉基因小鼠(huCD40tg小鼠) (具有類似人類及鼠類CD40受體表現模式之小鼠；C57BL/6背景；藉由Taconic生成)之脾之DC，使用SIINFEKL肽或卵白蛋白(OVA) (DEC-205受體調介之抗原攝取)致敏並與不同激動性抗人類CD40抗體一起培育。經由經FAP塗覆之Dynabeads® 提供FAP以展示雙特異性抗原結合分子之FAP依賴性。24小時後，自OT1小鼠之脾分離CD8陽性T細胞(該等小鼠之CD8-陽性T細胞皆擁有在H2-Kb背景中識別SIINFEKL之轉基因TCR；C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/Crl，查理士河(Charles River))，使用羧基螢光黃琥珀醯亞胺基酯(CFSE)進行標記並添加至致敏DC中。在實驗之第5天，分析經培養細胞之上清液中之DC及T細胞細胞介素且分析T細胞之活化及增殖能力。2.2.1 經由藉由靶向 FAP 之抗 CD40 結合分子活化之 SIINFEKL- 致敏 DC 所達成之 T 細胞引發 自huCD40tg小鼠之脾分離DC。為分離脾DC，將來自huCD40tg小鼠之脾置於6孔板中含有2.25 mL具有鈣2+ (gibco，目錄號14025-05)、250 µl 10 mg/mL膠原酶D溶液(最終濃度為1 mg/mL) (Sigma-Aldrich，目錄號11088866001)及12.5 µl 10 mg/mL DNase溶液(最終濃度為0.05 mg/mL) (Sigma-Aldrich, D5025-150KU，批號SLBR0535V)之漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)之一個孔中。使用具有21G針(Braun，目錄號4657527)之3 mL注射器(BD，目錄號309658)，使脾膨脹且隨後藉助剪刀切成較小切片。在37℃下培育25分鐘之後，添加50 µL 0.5 M乙二胺四乙酸(EDTA) (Applichem，目錄號A4892.1000)，隨後在37℃下實施第二培育步驟5分鐘。經由40 µm過濾器(Corning，目錄號352340)將含有脾細胞及較小脾組織切片之溶液過濾至50 mL聚丙烯離心管中。經由在末端具有3 mL注射器塞之過濾器來粉碎脾組織切片。在下一步驟中，將50 mL管在室溫下以1500 rpm離心5分鐘，棄除上清液且將1 mL 1×細胞裂解緩衝液(使用蒸餾水以1:10稀釋) (BD，目錄號555899)添加至脾細胞中以裂解紅色球。在室溫下培育4分鐘之後，添加20 mL R10，隨後在室溫下以1500 rpm實施離心步驟5分鐘。去除上清液，將脾細胞再懸浮於30 mL R10中且使用自動化EVE細胞計數器(VWR，目錄號734-2675)測定細胞計數以及存活率。根據製造商說明書使用小鼠CD11c UltraPure微珠粒(Miltenyi，目錄號130-108-338)藉由autoMACS® 分離來分離DC。隨後，將於50 µl R10中之0.25×105 個DC接種於96孔平底板之每一孔中。然後SIINFEKL肽(卵白蛋白殘基257-264) (Eurogentec，目錄號AS-60193-5，批號1360618)以1 pg/mL之亞最佳濃度將DC致敏。此有效量之抗原容許檢測源於不同活化DC之T細胞活化變化。作為陽性對照，為誘導獨立於其他DC活化刺激之高T細胞活化，向DC中添加濃度為1 ng/mL之SIINFEKL。未使用SIINFEKL抗原致敏之用作陰性對照。以2:1珠粒:細胞比率將於50 µL R10中之經人類FAP塗覆或未塗覆之Dynabeads® 添加至DC中。在下一步驟中，以介於1 µg/mL至1 ng/mL之間之濃度(10×稀釋系列)添加於50 µL R10中之不同激動性抗CD40抗體。在此實驗設置中，將含有兩個FAP結合位點之雙特異性抗人類CD40抗體與以下物質進行比較：具有兩個DP47結構域代替FAP結合結構域之其等效物、FAP獨立性RO7009789及交聯SGN-40以及鼠類CD40四價及FAP二價鼠類FAP依賴性雙特異性抗體(28H1 FAP結合劑)。在24小時之後，分離來自OT1小鼠之脾CD8-陽性細胞。為此，經由在末端具有3 mL注射器塞之40 µm過濾器將OT1小鼠之脾粉碎至50 mL管中。使用R10洗滌過濾器且將脾細胞在室溫下以1500 rpm離心5分鐘。向細胞中添加1 mL 1×細胞裂解緩衝液(使用蒸餾水以1:10稀釋)且在室溫下培育4分鐘之後添加20 mL R10。將管在室溫下以1500 rpm離心5分鐘且棄除上清液。將脾細胞再懸浮於30 mL R10中且使用自動化EVE細胞計數器測定細胞計數以及存活率。以陰性選擇製程使用小鼠CD8a+ T細胞分離套組(Miltenyi，目錄號130-104-075)及autoMACS® 分離根據製造商說明書來分離CD8-陽性細胞。然後使用預升溫PBS洗滌在分離之後發現於陰性部分中之CD8-陽性細胞，使用EVE細胞計數器計數且在預升溫PBS中將細胞數量調節至2×107 個細胞/mL。將10 mM CFSE溶液(CellTrace™ CFSE細胞增殖套組，ThermoFisher，目錄號C34554) 5000倍稀釋於預升溫PBS中並以1:1比率添加至再懸浮於PBS中之細胞中(CFSE最終濃度為1 µM)。在短暫渦旋之後，將細胞在室溫下培育5分鐘。藉由向細胞中添加40 mL預升溫R10培養基來停止標記反應。在使用PBS進行兩個洗滌步驟之後，將CD8-陽性細胞再懸浮於R10中且將於100 µl R10中之0.5×105 個細胞添加至致敏DC中。在實驗之第5天，使用0.5 µg/mL SIINFEKL及2 µg/mL抗小鼠CD28抗體(eBioscience，純系37.51，目錄號16-0281-86)再刺激T細胞以進行細胞內細胞介素染色(ICS)。在添加SIINFEKL及抗CD28之後一小時，向細胞中添加佈雷菲德菌素A (Brefeldin A) (BFA) (BD，目錄號51-2301KZ) (1:1000)以阻斷細胞內蛋白質傳輸。在另一4小時培育步驟之後，獲取150 µl上清液以進行基於Luminex™之多倍體細胞介素量測。為量測23種細胞介素之組，根據製造商說明書使用Bio-Plex Pro™小鼠細胞介素GrpI Panel 23-Plex套組(BioRad，目錄號M60009RDPD)。對於T細胞之流式細胞術分析而言，將96孔平底板中之細胞轉移至96孔圓底板中，使用PBS洗滌一次並與50 µl 3 µg/mL Fc受體阻斷小鼠IgG同型對照一起在PBS中培育。在4℃下培育15分鐘之後，使用PBS洗滌細胞且向細胞中添加50 µl螢光標記抗體於PBS中之混合物。使用下列抗體：抗小鼠CD86 BV785 (Biolegend，純系GL-1，目錄號105043)、抗I-A/I-E PerCp-Cy5.5 (Biolegend，純系M5/114.15.2，目錄號107626)、抗小鼠CD70 PE (eBioscience，純系FR70，目錄號12-0701-82)、抗小鼠CD3 PE-CF594 (BD Biosciences，純系145-2C11，目錄號562286)、抗小鼠CD25 PE-Cy7 (eBioscience，純系PC61.5，目錄號25-0251-82)、抗小鼠CD11c APC (BD Biosciences，純系HL3，目錄號561119)、抗小鼠CD44 Alexa Fluor 700 (BD Biosciences，純系IM7，目錄號560567)及抗小鼠CD8 APC-Cy7 (Biolegend，純系53-6.7，目錄號100714)。為區分活細胞與死亡細胞，將細胞活力染料Zombie AquaTM 添加至抗體混合物中。將細胞與細胞外染色抗體溶液一起在4℃下培育30分鐘。然後，使用PBS將細胞洗滌兩次，滲透化並使用抗小鼠IFNγ BV421 (Biolegend，純系XMG1.2，目錄號505830)利用Foxp3/轉錄因子染色緩衝液組(eBioscience，目錄號00-5523-00)根據製造商方案對IFNγ進行細胞內染色。將細胞再懸浮於200 µl PBS中並在同一天使用5-雷射LSR-Fortessa進行分析。使用FlowJo第10版軟體實施數據分析。分析顯示CD8及CD3表現之活細胞群體之CFSE染料稀釋、IFNγ產生、CD44及CD25表現。圖 9A 至 9H 展示，經較低量SIINFEKL致敏並使用不同激動性抗CD40抗體刺激之DC能夠誘導T細胞增殖。在FAP依賴性之情形下，僅在分析中提供FAP時誘導雙特異性抗CD40抗體增殖。藉由經具有四個CD40及兩個FAP結合部分之鼠類或人類形式雙特異性抗原結合分子刺激之DC誘導之增殖程度係相當的。此強烈表明，huCD40tg小鼠中之DC上之人類CD40受體表現之下游信號傳導並未受損。針對與經不同激動性抗CD40抗體刺激之DC一起共培養之T細胞觀察到，T細胞活化標記物CD44及CD25或IFNγ產生並不顯著上調。與未處理條件相比，僅使用較高量SIINFEKL致敏之DC顯示該等標記物之明顯變化。 上清液中之細胞介素濃度量測展示激動性抗CD40抗體對IL-2 (圖 9I )及IL-12(p40) (圖 9J )表現之效應。使用FAP依賴性人類抗CD40抗體，僅在FAP存在下檢測到升高之IL-12(p40)含量。然而，鼠類等效雙特異性抗原結合分子誘導顯著較高之IL-12(p40)分泌。在使用抗人類CD40及抗小鼠CD40雙特異性抗原結合分子時，IL-2分泌以FAP依賴性方式增加至類似程度。2.2.2 經由藉由靶向 FAP 之抗 CD40 結合分子活化之 OVA- 致敏 DC 所達成之 T 細胞引發 如部分2.2.1中所闡述，自huCD40tg小鼠之脾分離DC且將經FAP塗覆或未塗覆之Dynabeads® 以及不同激動性抗CD40抗體添加至脾DC中。使用OVA蛋白作為抗原以代替SIINFEKL (其無需藉由DC攝取及處理)來致敏DC。為促進以類鐸受體(TLR)刺激物獨立方式(額外TLR刺激可引起DC之較高整體活化，從而使得因激動性抗CD40抗體刺激而不可能檢測不同活化狀態)進行OVA攝取，根據製造商方案使用Ova抗原遞送試劑(Miltenyi，目錄號130-094-663)與生物素化抗小鼠DEC205抗體(Miltenyi，純系NLDC-145，目錄號130-101-854)之組合。簡言之，將DC與結合至DEC205受體(其高度表現於CD8-陽性交叉呈遞DC上)之生物素化抗體一起培育(M. Lahoud等人，Int Immunol. 2000, 12(5), 731-735)。然後，向細胞中添加Ova遞送試劑(與FITC及OVA偶合之抗生物素抗體)，從而產生OVA之DEC205受體調介之攝取。為提供陰性對照，僅使用抗DEC205抗體標記DC且並不添加OVA。第二天，自OT1小鼠分離CD8-陽性T細胞，使用CFSE進行標記並添加至DC中，如部分2.2.1中所闡述。在實驗之第5天，獲取150 µl上清液以用於使用小鼠IFN-γ DuoSet ELISA套組(R&D，目錄號DY485-05)進行IFNγ量測。如由製造商提供之方案中所闡述來實施ELISA。對於FACS分析T細胞而言，將96孔平底板中之細胞轉移至96孔圓底板中，使用PBS洗滌一次並與50 µl 3 µg/mL Fc受體阻斷小鼠IgG同型對照一起在PBS中培育。在4℃下培育15分鐘之後，使用PBS洗滌細胞且向細胞中添加50 µl螢光標記抗體於PBS中之混合物。使用下列抗體：抗小鼠CD4 BV421 (Biolegend，純系GK1.5，目錄號100438)、抗小鼠CD86 BV785 (Biolegend，純系GL-1，目錄號105043)、抗I-A/I-E PerCp-Cy5.5 (Biolegend，純系M5/114.15.2，目錄號107626)、抗小鼠CD70 PE (eBioscience，純系FR70，目錄號12-0701-82)、抗小鼠CD3 PE-CF594 (BD Biosciences，純系145-2C11，目錄號562286)、抗小鼠CD25 PE-Cy7 (eBioscience，純系PC61.5，目錄號25-0251-82)、抗小鼠CD11c APC (BD Biosciences，純系HL3，目錄號561119)、抗小鼠CD44 Alexa Fluor 700 (BD Biosciences，純系IM7，目錄號560567)及抗小鼠CD8 APC-Cy7 (Biolegend，純系53-6.7，目錄號100714)。為區分活細胞與死亡細胞，將細胞活力染料Zombie AquaTM 添加至抗體混合物中。將細胞與50 µl染色抗體混合物一起在4℃下培育30分鐘。然後，使用PBS將細胞洗滌兩次，再懸浮於200 µl PBS中並使用5-雷射LSR-Fortessa進行分析。使用FlowJo第10版軟體實施數據分析。分析活CD3-及CD8-陽性細胞之CFSE信號、CD25及CD44表現。圖 10A 至10C 、 11A 至11C 、12A 至12 C及22A 至22B 展示，與OVA遞送試劑一起培育並經靶向人類CD40及FAP之雙特異性抗原結合分子刺激之DC可顯著增強CD8陽性OT1 T細胞增殖(圖 10A 至 10C 及 22A 至 22B )以及T細胞活化標記物CD25 (圖 11A 至 11C )及CD44 (圖 12A 至 12C )之表現。該等效應係FAP依賴性。IFNγ ELISA結果證實了源於人類抗CD40 FAP-靶向抗體之增強之T細胞活化：在使用與經抗人類CD40 FAP靶向抗體處理之DC一起共培養之T細胞之條件中，IFNγ含量有所升高(圖 13A 至 13C )。鼠類抗CD40靶向FAP之抗體之效應係相當的，從而支持以下假設：huCD40tg小鼠模型提供用於量測激動性抗人類CD40抗體之效應之適宜系統。實例 3 靶向 FAP 之抗鼠類 CD40 結合分子之功能性質 3.1 藉由靶向 FAP 之抗鼠類 CD40 結合分子達成之鼠類 B 細胞之 CD40 調介之活體外活化 如部分2.2.1中所闡述來處理來自C57BL/6J小鼠之脾。使用小鼠B細胞分離套組(Miltenyi，目錄號130-090-862)根據製造商說明書自脾細胞分離鼠類B細胞。將於100 µl R10中之1×105 個B細胞接種至96孔平底板之每一孔中。以2:1之珠粒:細胞比率添加於50 µl R10中之經鼠類生物素化FAP (內部產生)塗覆之Dynabeads® (詳述闡述可參見2.1.3)或未塗覆Dynabeads(作為對照)。將於50 µl R10中之激動性抗鼠類CD40抗體添加至B細胞中。抗體濃度自1 µg/mL至0.3 ng/mL有所變化(3×稀釋系列)。在此實驗設置中，將攜載4個抗小鼠CD40結合位點及一或兩個FAP結合位點(28H1 FAP結合劑，等效於抗人類CD40雙特異性抗原結合分子中之FAP結合結構域)之雙特異性抗原結合分子與鼠類CD40二價FAP獨立性FGK4.5抗體(大鼠IgG2a, BioXcell目錄號BE0016-2)進行比較。FGK4.5之生物活性依賴於Fc受體交聯(L. Richman等人，Cancer Immunol Res. 2014, 2(1))，因此將FGK4.5在室溫下與山羊抗大鼠IgG (H+L)交聯抗體(Jackson ImmunoResearch，目錄號112-005-003，批號123801)一起預培育30分鐘。在48小時之後，藉由FACS分析B細胞之活化標記物表現。出於此目的，將B細胞轉移至96孔平底板中，使用PBS洗滌並與50 µl 3 µg/mL Fc受體阻斷小鼠IgG同型對照一起在PBS中培育。在4℃下培育15分鐘之後，使用PBS洗滌細胞且向細胞中添加50 µl螢光標記抗體於PBS中之混合物。使用下列抗體:抗小鼠CD19 BV605 (BD Biosciences，純系1D3，目錄號563148)、抗小鼠CD86 BV785 (Biolegend，純系GL-1，目錄號105043)、抗I-A/I-E PerCp-Cy5.5 (Biolegend，純系M5/114.15.2，目錄號107626)、抗小鼠CD70 PE (eBioscience，純系FR70，目錄號12-0701-82)、抗小鼠CD80 PE-CF594 (BD Biosciences，純系16-10A1，目錄號562504)、抗小鼠CD3 PE-Cy7 (BD Biosciences，純系145-2C11，目錄號552774)、抗小鼠NK1.1 PE-Cy7 (Biolegend，純系PK136，目錄號108714)、抗小鼠CD11c APC (BD Biosciences，純系HL3，目錄號561119)、抗小鼠CD45 Alexa Fluor 700 (eBioscience，純系30-F11，目錄號56-0451-82)、抗小鼠CD8 APC-Cy7 (Biolegend，純系53-6.7，目錄號100714)。為區分活細胞與死亡細胞，將細胞活力染料Zombie AquaTM 添加至抗體混合物中。將細胞在4℃下與染色混合物一起培育30分鐘，使用PBS洗滌兩次且然後再懸浮於200 µl PBS中。使用5-雷射LSR-Fortessa實施FACS分析且使用FlowJo第10版軟體實施數據分析。選通活單一細胞之CD11c-陰性細胞、CD3-陰性細胞及NK1.1-陰性細胞以排除非B細胞。分析CD8-陰性細胞、CD19-陽性細胞中之B細胞活化標記物CD70、CD80、CD83及CD86之表現。將鼠類B細胞與具有一或兩個FAP結合部分之靶向FAP之抗小鼠CD40抗體一起培育會增加B細胞活化標記物之表現。與使用交聯FGK4.5抗體之條件相比，在使用雙特異性抗原結合分子時之CD70表現僅略有增加(圖 14A 及 14B )。然而，表現高含量CD70之細胞之總數極低。在使用靶向鼠類CD40及FAP之雙特異性分子處理B細胞時，CD80表現以FAP依賴性方式發生上調(圖 14C 及 14D )。在CD80上調之情形下，雙特異性分子展示高於二價FAP獨立性FGK4.5抗體之功效。所測試所有激動性抗CD40抗體亦誘導CD86表現增加且所有抗體之表現程度係相當的(圖 14E 及 14F )。儘管使用擁有兩個FAP結合部分之四價抗小鼠CD40抗體之CD86上調係FAP依賴性，但使用具有僅一個FAP結合位點之雙特異性抗原結合分子可觀察到FAP獨立性效應。另外，使用所有測試之雙特異性抗原結合分子皆觀察到MHC-II表現之FAP獨立性上調(圖 14G 及 14H )。3.2 藉由靶向 FAP 之抗鼠類 CD40 結合分子達成之鼠類 DC 及 T 細胞之 CD40- 調介之活體內活化 自實施於Roche Glycart AG之活體內傳代獲得具有小鼠FAP表現之鼠類結腸腺癌MC38_ FAP轉染物腫瘤細胞系且在擴增之後寄存於Glycart內部細胞庫中。在含有10% FCS (PAA實驗室，Austria)、1mM丙酮酸鹽、1x NEAA及 6 μg/ml嘌呤黴素之DMEM中培養MC38_muFAP_invipa細胞。將細胞在37℃及5% CO2 下於水飽和氣氛中培養且在活體外傳代14時以95%之存活率注射。將2×106 個腫瘤細胞經皮下注射於100µl細胞懸浮液(50% RPMI培養基及50%基質膠)中。根據既定導則(GV-Solas；Felasa；TierschG)將33隻在開始實驗時為8-9週齡之C57Bl/6雌性小鼠(購自查理士河，Germany)維持於無特異性病原體條件下，且每天維持12 h光/12 h暗之循環。由地方政府審閱並批准實驗研究方案(P 2011-128)且在到達之後使動物維持一週以適應新環境並加以觀察。然後在其背部右側經皮下植入感應器以進行鑑別並維持一週以上以進行恢復。定期實施連續健康監測。為研究CD40在活體內之靶向FAP之活化，在研究第0天經皮下向小鼠注射2×106 個MC38-FAP。在第x天，在腫瘤達到200mm3 時，向每組之9隻小鼠將腹膜腔內注射200 µL不同化合物。向媒劑組中之小鼠注射組胺酸緩衝液且向治療組中之動物注射10 mg/kg FGK4.5或15 mg/kg FGK4.5 4+1。每天控制動物之臨床症狀並檢測不良效應(例如體重損失)。動物之終止準則為臨床病況、運動障礙及毛皮不潔。在注射療法後之時間點72h及8d，自每組之三隻小鼠收集腫瘤、脾、腫瘤引流淋巴結及腫瘤非引流淋巴結並藉由流式細胞術進行分析。另外，收集來自所有處死動物之血清以分析指示肝損傷之血清酶。 對於流式細胞儀分析而言，分別如部分2.1.1及部分3.1中所闡述，製備所有收集器官之單一細胞懸浮液並使用螢光標記抗體進行染色。為區分活細胞與死亡細胞，將細胞活力染料Zombie AquaTM 添加至抗體混合物中。將細胞在4℃下與染色混合物一起培育30分鐘，使用PBS洗滌兩次且再懸浮於200 µl PBS中。使用5-雷射LSR-Fortessa實施FACS分析且使用FlowJo第10版軟體實施數據分析。將DC鑑別為對於CD11c及MHC種類II為高度陽性之活單一細胞，且對於CD3、NK1.1及CD19為陰性。在注射療法後三天分析DC上之CD70及CD86表現(皆係DC活化標記物)。將活CD45-、CD3-及CD8-陽性單一細胞鑑別為CD8+ T細胞。分析CD8+ T細胞中之Ki67 FITC (eBioscience，純系SolA15，目錄號11-5698-82)表現且使用絕對細胞計數珠粒(Invitrogen，目錄號01-1234)測定腫瘤中之CD8+ T細胞總數。 如圖23A 至 23C 中所展示，在第3天，在注射單一腹膜腔內劑量之CD40之小鼠中指示肝細胞損傷之酶有所增加，但在注射FAP-CD40或僅媒劑之小鼠中並不增加。另外，與注射FAP-CD40 4+1或僅媒劑之小鼠相比，CD40治療小鼠在治療後三天之體重有所降低且脾重量有所增加(分別圖 23D 及 23E )，從而指示使用靶向FAP之CD40抗體治療之動物中之嚴重副效應少於使用親代CD40抗體治療之動物。儘管在程度上小於FGK4.5，但與媒劑治療小鼠相比，靶向FAP之抗CD40抗體亦誘導在治療後三天腫瘤引流淋巴結中之DC活化(CD86及CD70表現) (圖 24A 及24B )及在治療後8天腫瘤中之CD8+ T細胞增殖(Ki68表現及細胞數量) (圖 24C 及24D )的顯著增加。總而言之，與未靶向抗CD40親代抗體FGK4.5相比，呈4+1形式且具有FAP依賴性CD40活化之靶向FAP之抗CD40分子在具腫瘤小鼠中誘導強力DC及T細胞活化且全身性毒性有所減小。實例 4 抗 CD40 抗體 S2C6 之人類化變體之生成及產生 4.1 抗 CD40 抗體 S2C6 之人類化變體之第一生成 4.1.1 方法 抗CD40抗體S2C6揭示於WO 2000/075348中且具有SEQ ID NO:129之VH結構域及SEQ ID NO:130之VL結構域。如下文中所闡述來產生其變體。為鑑別在人類化抗CD40結合劑S2C6期間之適宜人類受體框架，使用兩種方法之組合。一方面，藉由以下步驟來採取經典方式：搜尋具有高序列同源性之受體框架，在此框架上接枝CDR，且評估可構想之回復突變。更明確而言，判斷所鑑別框架與親代抗體之每一胺基酸差異對結合劑之結構完整性之影響，且在適當時引入朝向親代序列之回復突變。結構評價係基於親代抗體及其人類化形式之Fv區同源性模型，該等模型係利用使用Biovia Discovery Studio Environment第4.5版實施之內部抗體結構同源性建模工具所產生。 另一方面，使用內部研發之電腦工具來預測人類化形式之VH及VL結構域相對於彼此之定向(參見WO 2016062734，其以引用方式併入本文中)。對該等結果與親代結合劑之預測VH-VL結構域定向進行比較以選擇在幾何結構上接近於起始抗體之框架組合。合理的做法係檢測VH-VL界面區域中可引起兩個結構域之配對之破壞性變化之可能胺基酸交換。4.1.2 受體框架及其變化形式之選擇 如下表 12 中所闡述來選擇受體框架：表 12 ： 受體框架
Figure 107111767-A0304-0013
 後-CDR3框架區係改編自人類IGHJ種系IGHJ6*01/02 (YYYYYGMDV WGQGTTVTVSS )及人類IGKJ種系IGKJ1*01 (WT FGQGTKVEIK )。以加下劃線形式來指示受體框架之相關部分。 基於結構考慮，在VH區之位置H48 (M＞I)及H71 (R＞V)及VL區之位置L36 (F＞Y)、L46 (R＞L)及L87 (Y＞F) (Kabat編號)引入自人類受體框架至親代結合劑中之胺基酸之回復突變。另外，將CDR-H2中之兩個位置鑑別為用於正向突變(亦即自親代結合劑胺基酸交換至人類受體種系以增加整體人類性質，即H60 (N＞A)及H64 (K＞Q))之有前景候選者。 為解決假定研究熱點(天門冬醯胺去醯胺化)，在VH中之位置H52b (N＞Q)及H54 (N＞A)及VL中之L27f (N＞Q)、L28 (G＞P)、L29 (N＞Q)及L30 (T＞I) (Kabat編號)引入關於親代結合劑之其他變化。 在下表 13 中，展示VH-VL配對矩陣：
Figure 107111767-A0304-0014
 回復突變具有前綴b ，正向突變具有前綴f ，且解決研究熱點之突變具有前綴d 4.1.3 所得人類化 CD40 抗體之 VH 及 VL 結構域 人類化CD40抗體之所得VH結構域可參見下表14中且人類化CD40抗體之所得VL結構域列示於下表15中。 表14：人類化CD40抗體之VH結構域之胺基酸序列
Figure 107111767-A0304-0015
 表15：人類化CD40抗體之VL結構域之胺基酸序列
Figure 107111767-A0304-0016
 將S2C6變體之重鏈及輕鏈可變區之人類化胺基酸序列回譯至DNA中且合成所得cNDA (GenArt)，且然後以與具有LALA及PG突變(白胺酸234至丙胺酸、白胺酸235至丙胺酸、脯胺酸329至甘胺酸，該等突變廢止效應物功能)之人類IgG1主鏈/人類CH1-鉸鏈-CH2-CH3之融合蛋白形式選殖至重鏈表現載體中，或以與人類C-κ之融合蛋白形式選殖至輕鏈表現載體中。然後將LC及HC質體共轉染至HEK293中並在7天之後藉由標準方法自上清液純化以純化抗體。4.2 抗 CD40 抗體 S2C6 之人類化變體之第二生成 4.2.1 方法 如同實例4.1中，為鑑別在人類化抗CD40結合劑S2C6期間之適宜人類受體框架，使用兩種方法之組合。一方面，藉由以下步驟來採取經典方式：搜尋具有高序列同源性之受體框架，在此框架上接枝CDR，且評估可構想之回復突變。更明確而言，判斷所鑑別框架與親代抗體之每一胺基酸差異對結合劑之結構完整性之影響，且在適當時引入朝向親代序列之回復突變。結構評價係基於親代抗體及其人類化形式之Fv區同源性模型，該等模型係利用使用Biovia Discovery Studio Environment第4.5版實施之內部抗體結構同源性建模工具所產生。 另一方面，使用內部研發之電腦工具來預測人類化形式之VH及VL結構域相對於彼此之定向(參見WO 2016062734，其以引用方式併入本文中)。對該等結果與親代結合劑之預測VH-VL結構域定向進行比較以選擇在幾何結構上接近於起始抗體之框架組合。合理的做法係檢測VH-VL界面區域中可引起兩個結構域之配對之破壞性變化之可能胺基酸交換。4.2.2 受體框架及其變化形式之選擇 如下文之表 16 及表 18 中所闡述來選擇兩種不同受體框架。表 16 ： 受體框架 1: 「 IGHV1-IGKV2D 」
Figure 107111767-A0304-0017
 後-CDR3框架區係改編自人類IGHJ種系IGHJ6*01/02 (YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS )及人類IGKJ種系IGKJ4*01/02 (LTFGGGTKVEIK )。以粗體腳本形式來指示受體框架之相關部分。 基於結構考慮，在VH區之位置H43 (Q＞K)、H44 (G＞S)、H69 (M＞L)、H71 (R＞V)、H73 (T＞K)、H88 (V＞A)及H105 (Q＞H)及VL區之位置L2 (I＞V)、L4 (M＞V)、L87 (Y＞F)及L104 (V＞L)引入自人類受體框架至親代結合劑中之胺基酸之回復突變。在一種變體中，包含突變T70S (VH)以研究此位置之略高親水性殘基之效應。 所有變體皆包含N54A突變(VH)以解決假定研究熱點(天門冬醯胺去醯胺化)。所有位置皆係根據Kabat EU編號方案所給出。 在下表 17 中，展示人類化變體VH-VL配對矩陣：
Figure 107111767-A0304-0018
 突變N54A適用於所有VH變體且並未明確提及。回復突變具有前綴b ，正向突變具有前綴f ，且其他突變具有前綴x 表 18 ： 受體框架 2 ：「 IGHV3-IGKV1 」
Figure 107111767-A0304-0019
 後-CDR3框架區係改編自人類IGHJ種系IGHJ6*01/02 (YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS )及人類IGKJ種系IGKJ4*01/02 (LTFGGGTKVEIK )。以粗體腳本形式來指示受體框架之相關部分。 基於結構考慮，在VH區之位置H44 (G＞S)、H49 (S＞G)、H71 (R＞V)、H78 (L＞A)、H94 (K＞R)及H105 (Q＞H)及VL區之位置L42 (K＞Q)、L43 (A＞S)及L87 (Y＞F)引入自人類受體框架至親代結合劑中之胺基酸之回復突變。另外，將CDR-H2中之4個位置鑑別為用於正向突變(亦即自親代結合劑胺基酸交換至人類受體種系以增加整體人類性質，即H60 (N＞G)、H61 (Q＞D)、H62 (K＞S)及H63 (F＞V))之有前景候選者。 所有變體皆包含N54A突變(VH)以解決假定研究熱點(天門冬醯胺去醯胺化)。所有位置皆係根據Kabat EU編號方案所給出。 在下表 19 中，展示人類化變體VH-VL配對矩陣：
Figure 107111767-A0304-0020
 回復突變具有前綴b ，正向突變具有前綴f 。 4.2.3 所得人類化 CD40 抗體之 VH 及 VL 結構域 基於受體框架1之人類化CD40抗體之所得VH及VL結構域可參見下表17且基於受體框架2之人類化CD40抗體之所得VH及VL結構域列示於下表18中。 表20：基於受體框架1之人類化CD40抗體之VH及VL結構域之胺基酸序列
Figure 107111767-A0304-0021
 表21：基於受體框架2之人類化CD40抗體之VH及VL結構域之胺基酸序列
Figure 107111767-A0304-0022
 4.2.4 呈 huIgG1_LALA_PG 形式之新人類化 CD40 抗體 基於VH及VL之新人類化變體，根據WO 2012/130831 A1中所闡述之方法，將新CD40抗體表示為具有效應物沉默Fc (P329G；L234, L235A)之huIgG1抗體以廢止與Fcγ受體之結合。 表22：表示為huIgG1_LALA_PG抗體之VH/VL組合之命名
Figure 107111767-A0304-0023
 呈人類IgG1_LALAPG抗體形式之人類化CD40抗體之全長序列可參見表20。表 23 ： 人類化 CD40 IgG1_LALAPG 抗體之胺基酸序列
Figure 107111767-A0304-0024
 4.2.5 呈 huIgG1_LALA_PG 形式之新人類化 CD40 抗體之產生 藉由使用編碼不同肽鏈之表現載體瞬時轉染懸浮生長之HEK293-F細胞來表現抗體。根據細胞供應商說明書使用抗體載體之Maxiprep (Qiagen, Germany)製劑、基於F17之培養基(Invitrogen, USA)、PEIpro (Polyscience Europe GmbH)及1-2百萬個活細胞/ml之初始細胞密度在無血清FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen)中來轉染至HEK293-F細胞(Invitrogen, USA)中。在培養7天之後於振盪燒瓶或攪拌發酵器中藉由在14000 g下離心30分鐘來收穫細胞培養上清液並經由0.22 µm過濾器過濾。 藉由親和力層析使用MabSelectSure-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden)層析自細胞培養上清液來純化抗體。簡言之，將無菌過濾之細胞培養上清液捕獲於使用PBS緩衝液(10 mM Na2 HPO4 、1 mM KH2 PO4 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡之MabSelect SuRe樹脂上，使用平衡緩衝液洗滌並使用25 mM pH 3.0檸檬酸鹽洗脫。在使用1 M pH 9.0 Tris中和之後，藉由粒徑篩析層析(Superdex 200, GE Healthcare)於20 mM組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0)中自單體抗體物質來分離聚集蛋白質。彙集單體蛋白質部分，視需要使用(例如) MILLIPORE Amicon Ultra (30KD MWCO)離心濃縮器濃縮並儲存於-80℃下。使用試樣等分試樣(例如)藉由CE-SDS、粒徑篩析層析、質譜及內毒素測定來進行後續分析表徵。 不同人類化CD40抗體之產量展示於表21中，且展示為在使用MabSelectSure-SepharoseTM 層析實施製備型親和力層析之後自產量計算之效價值。 藉由CE-SDS分析在存在及不存在還原劑下來分析最終純化步驟之後之分子純度及分子量。根據製造商說明書來使用Caliper LabChip GXII系統(Caliper Lifescience)。 使用TSKgel G3000 SW XL分析型粒徑篩析管柱(Tosoh)在25℃下於25 mM磷酸鉀、125 mM氯化鈉、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v) NaN3 (pH 6.7)運行緩衝液中來分析分子聚集物含量。 為直接對比所有抗體，藉由靜態光散射(SLS)且藉由量測因應於所施加溫度應力之固有蛋白質螢光來監測熱穩定性。將30 μg蛋白質濃度為1 mg/ml之經過濾蛋白質試樣一式兩份施加至Optim 2儀器(Avacta Analytical Ltd)中。使溫度以0.1℃/min自25℃斜升至85℃，且收集半徑及總散射強度。為測定固有蛋白質螢光，在266 nm下激發試樣且在275 nm與460 nm之間收集發射。對於所有抗體而言，聚集溫度(Tagg)介於64℃與69℃之間且提供於下文之表24或表25中。 具有不同框架之人類化CD40抗體之產量展示於下文之表24或表25中。 表24：基於受體框架2之人類化CD40抗體之產生效價、人類化及聚集溫度
Figure 107111767-A0304-0025
 表25：基於受體框架1之人類化CD40抗體之產生效價、人類化及聚集溫度
Figure 107111767-A0304-0026
 4.2.6 重組人類及食蟹猴 CD40 細胞外結構域蛋白之生成 選殖下列構築體並藉由瞬時表現於HEK293細胞中來進行表現： 1)具有C-末端His-AviTagTM 標籤(SEQ ID NO:266)之人類CD40細胞外結構域(SEQ ID NO:1之胺基酸21-193，NCBI登錄號NP_001241) 2)具有C-末端His-AviTagTM 標籤(SEQ ID NO:267)之食蟹猴(長尾猴(macaca fascicularis)) CD40細胞外結構域(胺基酸21-193，自Roche食蟹猴cDNA資料庫未公開資料)獲取食蟹猴CD40細胞外結構域序列) 藉由基因合成(Eurofins Genomics GmbH service, Germany)來生成用於結合分析之CD40細胞外結構域抗原，使用標準選殖程序經由獨特限制位點選殖至Roche內部表現載體中。藉由測序來驗證所有構築體之選殖。在CMV-啟動子之控制下表現所有抗原。為瞬時表現CD40細胞外結構域構築體，使用各別質體轉染懸浮液適應性HEK293-F細胞(Life Technologies, USA)：一般而言，使用總共500 μg質體DNA與PEIpro轉染試劑(Polysciences Europe GmbH, Germany)之複合物根據製造商說明書來轉染1L約2x106 細胞/ml HEK293-F細胞。在轉染之後，將HEK293-F細胞培育6天。隨後藉由離心收穫細胞且使用0.22 μm真空過濾系統(Millipore)過濾含有蛋白質之上清液。藉由IMAC親和力層析使用完整-His-標籤樹脂(Roche Diagnostics)來純化His-AviTagTM 加標籤蛋白。在使用50 mM Na2 PO4 、300 mM NaCl (pH 8.0)洗滌之後，使用補充有500 mM咪唑之洗滌緩衝液在pH 7.0下洗脫His- AviTagTM 融合蛋白。在20 mM Tris、150 mM NaCl (pH 7.4)中藉由粒徑篩析層析(Superdex 75, GE Healthcare)將聚集蛋白質與單體融合蛋白分離。彙集單體蛋白質部分，視需要使用(例如) MILLIPORE Amicon Ultra (10KD MWCO)離心濃縮器濃縮並儲存於-80℃下。使用試樣等分試樣(例如)藉由CE-SDS、粒徑篩析層析及質譜來進行後續分析表徵。CD40 細胞外結構域之生物素化 ： 藉由使用BirA生物素-蛋白質連接酶套組(Avidity LLC, USA)根據製造說明書來實施含有C-末端AviTagTM 之人類或食蟹猴CD40細胞外結構域構築體之酶促位點特異性生物素化。簡言之，將1/10體積之BiomixA (10×濃度：0.5M二羥乙甘胺酸緩衝液，pH 8.3)及BiomixB (10×濃度：100mM ATP, 100mM MgOAc, 500μM d-生物素)添加至含AviTagTM 蛋白質中，隨後在每10 nmol蛋白質中添加2.5 µg BirA連接酶。將反應混合物在30℃下培育1h並藉由粒徑篩析層析在 Superdex75製備級預充填HiLoad管柱(GE Healthcare, Sweden)上純化。4.2.7 人類 / 食蟹猴 CD40 結合之表面電漿共振光譜術分析 藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶合套組，使約12000個共振單位(RU)之捕獲系統(10 µg/ml山羊抗人類F(ab)’2 ；指令碼：28958325；GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden)在pH 5.0下偶合於CM5晶片(GE Healthcare BR-1005-30)上。試樣及系統緩衝液為PBS-T (10 mM磷酸鹽緩衝鹽水，包含0.05% Tween20，pH 7.4)。將流動槽設定於25℃ -且將試樣區組設定於12℃ -並使用運行緩衝液引發兩次。藉由以5 µl/min之流速注射50 nM溶液30 sec來捕獲抗體。藉由注射不同濃度之人類CD40細胞外結構域或食蟹猴CD40細胞外結構域溶液300 sec (流速為30 µl/min，始於300 nM，1:3稀釋液)來量測締合。監測解離期最長1200 sec並藉由自試樣溶液切換至運行緩衝液予以觸發。藉由使用甘胺酸pH 2.1溶液以30 µl/min之流速洗滌60 sec來再生表面。藉由扣除自山羊抗人類F(ab’)2 表面所獲得之反應來校正本體折射率差異。亦扣除空白注射(=雙重參照)。為計算表觀KD 及其他動力學參數，使用蘭格繆爾(Langmuir) 1:1模型。使用BiacoreTM B4000評估軟體(第1.1版)計算表觀Kd。4.2.8 用於表徵 CD40 特異性人類化抗體之細胞結合分析 使用胰蛋白酶自培養瓶剝離CD40陽性細胞(拉吉細胞)且使用Casy細胞計數器進行計數。在4℃下製粒之後，將細胞再懸浮於FACS緩衝液(於PBS中之2.5% FCS)中，調節至2.0E+06個細胞/mL，並分配至96孔PP V形底板中(25 µL/孔= 5.0E+04Zellen/孔)。 將CD40特異性抗體在FACS緩衝液中調節至20 µg/mL，從而使得最終濃度為10 µg/mL。將20µl添加至25µl細胞懸浮液中並在4℃下培育1 h。然後將細胞在FACS緩衝液中洗滌兩次。在洗滌之後，將細胞再懸浮於50 µL含有二級抗體(＜huIgG＞-Alexa488, c=10 µg/mL)之FACS-緩衝液中並在4℃下培育1h。然後將細胞在FACS緩衝液中洗滌兩次並再懸浮於70 µl/孔FACS緩衝液中以用於使用FACS Canto (BD, Pharmingen)進行量測。 在表26中，展示人類化CD40抗體與CD40表現細胞(拉吉細胞)之親和力(藉由Biacore量測)及細胞結合。 表26：人類化CD40抗體與CD40表現細胞之親和力及細胞結合
Figure 107111767-A0304-0027
 4.2.9 藉由 UHR-ESI-QTOF 質譜表徵抗體 藉由HPLC 在Sephadex G25 5x250 mm管柱(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)上使用40%乙腈/2%甲酸(v/v)來將試樣去鹽。藉由UHR-ESI-QTOF MS在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion, Ithaca, NY)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik, Bremen, Germany)上測定總質量。在900-4000 m/z (ISCID: 0.0 eV)下獲取數據。評估原始質譜並使用內部研發之軟體工具轉化成個別相對莫耳質量。4.2.10 抗體之熱穩定性評估 在20 mM組胺酸/組胺酸氯化物、140 mM NaCl (pH 6.0)中製備濃度為1 mg/mL之試樣，藉由經由0.4 µm過濾板離心來轉移至光學384孔板中並覆蓋石蠟油。藉由動態光散射在DynaPro讀板儀(Wyatt)上重複量測流體動力學半徑，同時將試樣以0.05℃/min之速率自25℃加熱至80℃。或者，將試樣轉移至10 µL微型比色皿陣列中且使用Optim1000儀器(Avacta Inc.)記錄在使用266 nm雷射激發時之動態光散射數據以及螢光數據，同時將其以0.1℃/min之速率自25℃加熱至90℃。聚集起始溫度定義為流體動力學半徑(DLS)或散射光強度(Optim1000)開始增加時之溫度。熔融溫度定義為展示螢光強度與波長之圖形中之拐點。實例 5 具有新人類化 CD40 抗體變體之雙特異性構築體之生成及產生 5.1 靶向 CD40 及纖維母細胞活化蛋白 (FAP) 之雙特異性抗原結合分子之生成 將如實例4中所闡述編碼VH結構域及VL結構域之cDNA與人類IgG1之相應恆定重鏈或輕鏈框內選殖至適宜表現質體中。藉由由MPSV核心啟動子及CMV增強子元件組成之嵌合MPSV啟動子來驅動重鏈及輕鏈之表現。表現盒亦在cDNA之3’端含有合成聚A信號。另外，質體載體含有複製起點(EBV OriP)以用於以游離方式維持質體。 類似於實例1，製備以下形式之不同雙特異性CD40-FAP抗體：4+1形式，其由四個CD40結合部分以及一個位於Fc中C-末端之FAP結合部分組成(圖 1A )；或2+1及2+2形式，其由兩個CD40結合部分以及一個位於Fc中C-末端之FAP結合部分(圖 1C 及 1E )或兩個位於Fc中C-末端之FAP結合部分(圖 1D )組成。另外，製備由一個CD40結合部分以及一個FAP結合部分組成之雙特異性抗體(圖 1F )。FAP結合劑28H1及4B9之生成及製備闡述於WO 2012/020006 A2中，該案件以引用方式併入本文中。為生成4+1及2+1分子，使用凸起與孔洞技術來達成異源二聚化。將S354C/T366W突變引入第一重鏈HC1中(Fc凸起重鏈)且將Y349C/T366S/L368A/ Y407V突變引入第二重鏈HC2中(Fc孔洞重鏈)。在2+2分子中，如WO 2010/145792 A1中所闡述之CrossMab技術可確保正確輕鏈配對。獨立於雙特異性形式，在所有情形下，根據WO 2012/130831 A1中所闡述之方法使用效應物沉默Fc (P329G；L234, 234A)來廢止與Fcγ受體之結合。雙特異性分子之序列展示於表 27 中。 在由MPSV核心啟動子以及CMV啟動子增強子片段組成之嵌合MPSV啟動子之控制下瞬時表現所有基因。表現載體亦含有用於含EBNA (愛潑斯坦巴爾病毒核抗原)宿主細胞中之游離型複製之oriP區域。 表27：雙特異性抗原結合分子之胺基酸序列
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 使用如實例4.2中所闡述之新人類化CD40抗體變體來製備其他雙特異性抗體。該等雙特異性抗體之具體序列展示於下表28中。特定而言，製備呈以下形式之不同雙特異性CD40-FAP抗體：4+1形式，其由4個CD40結合部分以及一個FAP結合部分(呈交叉fab片段形式，融合至Fc凸起鏈之C-末端)組成(圖 15F 及 15G )；或2+1形式，其由兩個CD40結合部分以及一個FAP結合部分(呈交叉fab片段形式)組成，其中VL-CH1鏈融合於Fc凸起鏈之C-末端(圖 15H )或一個呈交叉fab片段形式之FAP結合部分，其中VH-CL鏈融合於Fc凸起鏈之C-末端(圖 15I )。 表28：雙特異性抗原結合分子之胺基酸序列
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 5.2 靶向 CD40 及纖維母細胞活化蛋白 (FAP) 之雙特異性抗原結合分子之產生 藉由使用編碼4條不同肽鏈之表現載體瞬時轉染懸浮生長之HEK細胞來表現靶向CD40及纖維母細胞活化蛋白(FAP)之雙特異性抗原結合分子。根據細胞供應商說明書使用抗體載體之Maxiprep (Qiagen)製劑、F17培養基(Invitrogen, USA)、Peipro (Polyscience Europe GmbH)及1-2百萬個活細胞/ml之初始細胞密度在無血清FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen)中來轉染至HEK293-F細胞(Invitrogen)中。在培養7天之後於振盪燒瓶或攪拌發酵器中藉由在14000 g下離心30分鐘來收穫細胞培養上清液並經由0.22 µm過濾器過濾。 藉由親和力層析使用MabSelectSure-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden)層析自細胞培養上清液來純化雙特異性抗體。簡言之，將無菌過濾之細胞培養上清液捕獲於使用PBS緩衝液(10 mM Na2 HPO4 、1 mM KH2 PO4 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡之MabSelect SuRe樹脂上，使用平衡緩衝液洗滌並使用25 mM pH 3.0檸檬酸鹽洗脫。在使用1 M pH 9.0 Tris中和之後，藉由粒徑篩析層析(Superdex 200, GE Healthcare)於20 mM組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0)中自單體抗體物質來分離聚集蛋白質。彙集單體蛋白質部分，視需要使用(例如) MILLIPORE Amicon Ultra (30KD MWCO)離心濃縮器濃縮並儲存於-80℃下。使用試樣等分試樣(例如)藉由CE-SDS、粒徑篩析層析、質譜及內毒素測定來進行後續分析表徵。 表29：雙特異性CD40抗原結合分子之產量及品質
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 5.3 包括人類化 CD40 抗體變體及 FAP 之雙特異性抗體之表徵 5.3.1 與表現人類或小鼠 FAP 之鼠類纖維母細胞之結合 使用表現人類纖維母細胞活化蛋白(huFAP)之細胞NIH/3T3-huFAP純系19或表現小鼠纖維母細胞活化蛋白(mFAP)之細胞NIH/3T3-mFAP純系26來測試與細胞表面FAP之結合，如實例1.4.1中所闡述。如針對一些包括人類化CD40抗體變體之雙特異性抗原結合分子所量測之EC50 值展示於表7中。5.3.2 與 FAP 之結合 ( 表面電漿共振 ) 藉由表面電漿共振(SPR)評價雙特異性構築體結合人類FAP之能力。所有SPR實驗皆係在Biacore T200 (Biacore)上於25℃下使用HBS-EP作為運行緩衝液(0.01 M pH 7.4 HEPES、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%表面活性劑P20，Biacore)來實施。 藉由注射500 nM huFAP (60 s，以10 uL/min之流速)、10 nM鼠類FAP (20 s，以20 uL/min之流速)及10 nM cynoFAP (20s，以20 uL/min之流速)將加His標籤之人類二聚體FAP (重組FAP_ECD)捕獲於經抗His抗體(Qiagen目錄號34660)固定之CM5晶片(GE Healthcare)上。使用最高18000個共振單位(RU)之抗His抗體之固定含量。在捕獲步驟後，立即使雙特異性抗體以及對照分子在介於0.78-100 nM之間之濃度下以30 μL/分鐘之流速通過晶片表面280 s且解離期為180 s。藉由扣除參考流動槽中所獲得之反應來校正本體折射率索引差異，其中並未固定FAP。使用蘭格繆爾1:1曲線擬合來測定親合力。對於二價結合而言，使用相同1:1擬合來產生表觀KD值。表 30 ： 實例性雙特異性CD40 x FAP抗原結合分子與重組人類FAP_ECD (Biacore)之結合
Figure 107111767-A0304-0031
 注意：所有KD 皆依賴於具體實驗條件。5.3.3 與 CD40 之結合 ( 表面電漿共振 ) 藉由表面電漿共振(SPR)評價雙特異性構築體結合人類CD40之能力。所有SPR實驗皆係在Biacore T200 (Biacore)上於25℃下使用HBS-EP作為運行緩衝液(0.01 M pH 7.4 HEPES、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%表面活性劑P20，Biacore)來實施。 根據實例4.2.7，藉由以30 µl/min之流速注射各種濃度之人類CD40細胞外結構域溶液300 sec (始於300 nM，1:3稀釋)來量測締合。監測解離期最長1200 sec並藉由自試樣溶液切換至運行緩衝液予以觸發。藉由使用甘胺酸pH 2.1溶液以30 µl/min之流速洗滌60 sec來再生表面。藉由扣除自山羊抗人類F(ab’)2 表面所獲得之反應來校正本體折射率差異。亦扣除空白注射(=雙重參照)。為計算表觀KD 及其他動力學參數，使用蘭格繆爾1:1模型。使用BiacoreTM B4000評估軟體(第1.1版)計算表觀Kd。表 31 ： 實例性雙特異性CD40 x FAP抗原結合分子與重組人類CD40_ECD (Biacore)之結合
Figure 107111767-A0304-0032
 注意：所有KD 皆依賴於具體實驗條件。5.3.4 與人類 CD40 表現道迪細胞之結合 使用道迪細胞(一種具有高人類CD40表現程度之人類B淋巴母細胞細胞系，ATCC CCL-213)如實例1.4.2中所闡述來測試與細胞表面CD40之結合。如針對一些包括人類化CD40抗體變體之雙特異性抗原結合分子所量測之實例性EC50 值展示於表8中。5.3.5 包括人類化 CD40 抗體變體之雙特異性抗原結合分子之功能性質 根據實例2中所闡述之實驗來分析包括人類化CD40抗體變體之雙特異性抗原結合分子之功能性質。實例性數據提供於表9、10或11中，如本文先前所展示。
圖 1A 至 1F 展示特異性結合至人類CD40及FAP之雙特異性抗原結合分子之示意圖示。圖 1A 展示呈4+1形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由4個結合CD40之Fab結構域以及一個FAP結合部分組成，其中VH位於一條重鏈之C-末端且VL位於另一重鏈之C-末端(對於CD40為四價且對於FAP為單價)。黑點表示凸起與孔洞突變。圖 1B 展示呈4+2形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由4個結合CD40之Fab結構域以及兩個各自融合於重鏈C-末端之結合FAP的Fab結構域組成(對於CD40為四價且對於FAP為二價)。圖 1C 展示呈2+1形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由兩個結合CD40之Fab結構域以及一個FAP結合部分組成，其中VH位於一條重鏈之C-末端且VL位於另一重鏈之C-末端(對於CD40為二價且對於FAP為單價)。黑點表示凸起與孔洞突變。圖 1D 展示呈2+2形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由兩個結合CD40之Fab結構域以及兩個各自融合於重鏈C-末端之結合FAP之Fab結構域組成(對於CD40為二價且對於FAP為二價)。圖 1E 展示呈2+1形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由兩個結合CD40之Fab結構域以及一個融合於一條重鏈之C-末端之結合FAP之Fab結構域組成(對於CD40為二價且對於FAP為單價)。黑點表示凸起與孔洞突變。圖 1F 展示呈1+1形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由一個CD40結合臂以及一個FAP結合臂組成(對於CD40為單價且對於FAP為單價)。黑點表示凸起與孔洞突變。圖 2A 及 2B 展示呈靶向FAP之單價或二價形式之人類四價抗CD40抗體至FAP陰性腫瘤細胞(圖 2A )及FAP陽性腫瘤細胞(圖 2B )之結合。轉基因經修飾小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3-huFAP純系19表現高含量之人類纖維母細胞活化蛋白(huFAP)，而親代細胞系NIH/3T3-wt不表現huFAP。僅具有一或兩個FAP結合部分且係FAP靶向形式之四價抗CD40抗原結合分子有效結合至NIH/3T3-huFAP細胞(圖 2B )。二價FAP構築體之結合性強於單價構築體。與之相比，並未檢測到靶向FAP之抗CD40抗體結合至NIH/3T3-wt細胞(圖 2A )。將結合展示為經藻紅素(PE)標記之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab`)2片段(其用作二級檢測抗體)之中值螢光強度(MFI)。藉由流式細胞術量測MFI。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 3A 至 3H 展示靶向FAP之單價或二價抗CD40構築體對人類B細胞之活體外活化。使用NIH/3T3-FAP細胞，FAP單價雙特異性抗體誘導與靶向FAP之二價分子類似之B細胞活化標記物表現(CD70、CD80、CD83及CD86)之增加。此外，藉由靶向FAP之雙特異性抗原結合達成之分子B細胞活化標記物上調與藉由FAP獨立性陽性對照抗體誘導之上調相當。在不存在FAP (NIH/3T3-wt細胞)下，使用雙特異性抗原結合分子可觀察到B細胞活化標記物並不增加，而陽性對照抗體誘導活化標記物之上調。展示在與指示滴定抗體一起培育2天之後CD70 (圖 3A 及 3B )、CD80 (圖 3C 及 3D )、CD83 (圖 3E 及 3F )及CD86 (圖 3G 及 3H )陽性活B細胞之百分比。x軸展示抗體構築體之濃度。對NIH/3T3-FAP細胞之效應分別展示於圖 3A 、 3C 、 3E 及 3G 中，而對NIH/3T3-wt細胞之效應分別展示於圖 3B 、 3D 、 3F 及 3H 中。圖 4A 至 4F 及5A 至 5H 展示在培育2天(圖 4A 至 4F )或5天(圖 5A 至 5H )之後於經FAP塗覆或未塗覆之Dynabeads® 存在下靶向FAP之單價或二價人類抗CD40構築體對人類B細胞之活體外活化。在與經FAP塗覆之珠粒一起培育2天之後，FAP單價雙特異性抗體誘導與靶向FAP之二價分子類似之B細胞活化標記物表現(CD70、CD83及CD86)之增加。此外，藉由靶向FAP之雙特異性抗原結合達成之分子B細胞活化標記物上調與藉由FAP獨立性陽性對照抗體誘導之上調相當。在不存在FAP (未塗覆珠粒)下，使用雙特異性抗原結合分子可觀察到B細胞活化標記物並不增加，而陽性對照抗體誘導活化標記物之上調。在使B細胞與經FAP塗覆之Dynabeads® 一起培育5天之後，靶向FAP之人類抗CD40構築體誘導B細胞上之CD80及CD86 FAP表現之依賴性上調。與藉由RO7009789或交聯SGN-40誘導之CD86之FAP獨立性上調相比，藉由FAP依賴性雙特異性抗原結合分子誘導之CD86上調略有降低。對於CD70及CD83而言，使用靶向FAP及CD40之雙特異性抗體可觀察到並無上調或僅極有限上調，而陽性對照抗體明確展示對該等B細胞活化標記物之效應。展示在與指示滴定抗體一起培育2天或5天之後CD70 (分別為圖 4A 、 4B 、 5A 及 5B )、CD80 (分別為圖 5C 及 5D )、CD83 (分別為圖 4C 、 4D 、 5E 及 5F )及CD86 (分別為圖 4E 、 4F 、 5G 及 5H )陽性活B細胞之百分比。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 6A 及 6B 展示在培育5天之後於經FAP塗覆之顆粒(圖 6A )或未塗覆珠粒(圖 6B )存在下使用不同靶向FAP及未靶向之激動性抗CD40抗體處理之人類B細胞的IL-6分泌。在FAP存在下，與FAP獨立性陽性對照抗體RO7009789及SGN40相比，靶向FAP之單價以及二價抗CD40抗體誘導類似之增加之IL-6分泌。與之相比，使用未靶向陰性對照抗體處理之B細胞表現與未處理B細胞類似之低IL-6含量。在不存在FAP (未塗覆珠粒)下，使用雙特異性抗原結合分子檢測到IL-6產生並無增加。展示與指示滴定抗體一起培養5天之人類B細胞之上清液中藉由ELISA量測之IL-6量。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 7A 至 7H 展示在培育2天之後於經FAP塗覆或未塗覆之Dynabeads® 存在下靶向FAP之單價或二價人類抗CD40構築體對人類單核球源DC (moDC)之活體外活化。在經FAP塗覆之珠粒存在下，FAP單價雙特異性抗體誘導與靶向FAP之二價分子類似之DC活化標記物表現(CD70、CD80及CD83)之增加，而在不存在FAP (未塗覆珠粒)下，未檢測到活化標記物上調。此外，藉由靶向FAP之雙特異性抗原結合分子達成之CD80及CD83上調與藉由FAP獨立性陽性對照抗體誘導之上調相當。與所有其他測試抗體相比，使用RO709789觀察到DC上之CD70具有較高上調。與之相比，與未處理DC相比，與不同抗CD40抗體一起培育之DC上之CD86表現並不顯著改變。展示在與指示滴定抗體一起培育2天之後之CD70 (圖 7A 及 7B )、CD80 (圖 7C 及 7D )、CD83 (圖 7E 及 7F )及CD86 (圖 7G 及 7H )陽性活moDC之百分比。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 8A 及 8B 展示在培育8小時之後在經FAP塗覆或未塗覆之Dynabeads® 存在下靶向FAP之單價或二價人類抗CD40構築體對HEK-Blue™ CD40L細胞的活體外活化。在經FAP塗覆之珠粒存在下，FAP單價及CD40二價雙特異性抗體誘導與FAP及CD40二價雙特異性抗體類似之SEAP產生之增加，而在不存在FAP (未塗覆珠粒)下，未檢測到SEAP產生。此外，在FAP存在下觀察到靶向FAP之CD40四價抗體可上調SEAP產生。然而，在不存在FAP下於使用靶向FAP之CD40四價抗體處理之報告基因細胞之上清液中亦觀察到SEAP產生。與靶向FAP之人類CD40二價或四價雙特異性抗體在經FAP塗覆之珠粒存在下相比，具有一或兩個DP47結構域代替FAP結合結構域之人類CD40四價陰性對照抗體在存在及不存在FAP下於HEK-Blue™ CD40L細胞中誘導相當之SEAP產生且陽性對照抗體SGN-40 + F(ab)誘導類似程度之SEAP產生。展示650 nm波長下之吸光度，其與藉由SEAP水解之受質之量相關。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 9A 至 9H 展示藉由靶向FAP之抗CD40結合分子活化之SIINFEKL致敏(pulsed) DC之T細胞引發。自huCD40轉基因小鼠(人類CD40及小鼠CD40之類似表現模式)分離、使用低量SIINFEKL致敏並使用FAP依賴性雙特異性抗CD40抗體以及經FAP塗覆之珠粒刺激之DC誘導抗原特異性T細胞之強增殖。與之相比，在不存在FAP (未塗覆珠粒)下，使用靶向FAP之抗CD40抗體刺激之DC並不誘導T細胞增殖。藉由使用具有4個CD40及兩個FAP結合部分之鼠類或人類雙特異性抗原結合分子刺激之DC誘導之T細胞增殖程度係相當的。使用與經不同激動性抗CD40抗體預刺激之DC一起共培養之T細胞觀察到，T細胞活化標記物CD44及CD25或IFNγ產生並無顯著上調。與未處理條件相比，僅使用較高量SIINFEKL致敏之DC誘導該等標記物之明顯表現增加。展示與huCD40 tg DC (與指示滴定抗體一起預培育)一起共培養之增殖性(CFSE-低)、IFNγ、CD25及CD44陽性活CFSE標記之鼠類CD3+ CD8+ OT-1 T細胞之百分比。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 9I 及 9J 展示在藉由SIINFEKL-脈衝FAP靶向抗CD40抗體活化DC引發之T細胞之上清液中所量測IL-2及IL-12(p40)之濃度。在OT-1 T細胞及經低量SIINFEKL致敏並經FAP依賴性雙特異性抗CD40抗體以及經FAP塗覆之珠粒刺激之huCD40 tg DC之共培養物中，經檢測IL-2及IL-12(p40)含量大於與經靶向FAP之抗體在不存在FAP下預刺激之huCD40 tg DC一起共培養之OT-1 T細胞。此外，靶向FAP之鼠類二價抗CD40抗體誘導顯著高於人類等效雙特異性抗原結合分子之IL-12(p40)分泌。在使用抗人類CD40及抗小鼠CD40雙特異性抗原結合分子時，IL-2分泌皆以FAP依賴性方式增加至類似程度。展示藉由ELISA所量測與huCD40 tg DC (與指示滴定抗體一起預培育)一起共培養之鼠類CD3+ CD8+ OT-1 T細胞之上清液中之IL-2及IL-12(p40)量。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 10 至 12 展示藉由靶向FAP之抗CD40結合分子活化之OVA-脈衝DC之T細胞引發。自huCD40轉基因小鼠分離、使用DEC205-OVA偶聯物處理並使用FAP依賴性雙特異性抗CD40抗體以及經FAP塗覆之珠粒刺激之DC誘導抗原特異性T細胞之強增殖及CD25以及CD44表現。與之相比，在不存在FAP (未塗覆珠粒)或OVA (僅DEC)下，經靶向FAP之抗CD40抗體刺激之DC並不誘導T細胞增殖及活化。藉由經具有4個CD40及兩個FAP結合部分之鼠類或人類雙特異性抗原結合分子刺激之DC誘導之T細胞增殖及CD25以及CD44表現程度係相當的。經較高量SIINFEKL而非DEC205-OVA偶聯物致敏之DC亦誘導活化標記物CD25及CD44之較強T細胞增殖及表現。展示與huCD40 tg DC (與指示滴定抗體一起在存在或不存在OVA下預培育)一起共培養之增殖性(CFSE-低) (圖 10A 至 10C )、CD25 (圖 11A 至 11C )及CD44 (圖 12A 至 12C )陽性活CFSE標記鼠類CD3+ CD8+ OT-1 T細胞之百分比。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 13A 至 13C 展示在與藉由靶向FAP之抗CD40結合分子所活化OVA-脈衝DC一起共培養之T細胞之上清液中量測的IFNγ含量。在使用與經抗人類CD40 FAP靶向抗體在FAP存在下處理之DC一起共培養之T細胞之條件中，IFNγ含量有所升高(圖 13A )。另外，在使用抗人類CD40及抗小鼠CD40雙特異性抗原結合分子時，IFNγ分泌皆以FAP依賴性方式增加至類似程度。展示藉由ELISA所量測與huCD40 tg DC (與指示滴定抗體一起預培育)一起共培養之鼠類CD3+ CD8+ OT-1 T細胞之上清液中之IFNγ量。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 14A 至 14H 展示在培育2天之後在經FAP塗覆或未塗覆之Dynabeads® 存在下靶向FAP之單價或二價小鼠抗CD40構築體對鼠類B細胞的活體外活化。使用經FAP塗覆之珠粒，FAP單價雙特異性抗體誘導與靶向FAP之二價分子類似之B細胞活化標記物表現(CD70、CD80及CD86)之增加。此外，亦在經FAP獨立性陽性對照抗體FGK4.5處理之B細胞中觀察到顯著B細胞活化標記物上調。在FAP (未塗覆珠粒)不存在下，使用雙特異性抗原結合分子可觀察到B細胞活化標記物CD70及CD80並不增加。與之相比，陽性對照抗體誘導CD70及CD80之上調，不論FAP預處理如何。儘管使用擁有兩個FAP結合部分之四價抗小鼠CD40抗體之CD86上調係FAP依賴性，但使用具有僅一個FAP結合位點之雙特異性抗原結合分子可觀察到FAP獨立性效應。另外，使用所有測試之雙特異性抗原結合分子皆觀察到MHC-II表現之FAP獨立性上調。展示在與指示滴定抗體一起培育2天之後CD70 (圖 14A 及 14B )、CD80 (圖 14C 及 14D )、CD86 (圖 14E 及 14F )及MHCII (圖 14G 及 14H )陽性活B細胞之百分比。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 15A 至 G 展示 特異性結合至人類CD40及FAP或DP47之雙特異性抗原結合分子之示意圖示。圖 15A 展示呈4+1形式之雙特異性CD40-DP47抗體之示意圖示，該抗體由4個結合CD40之Fab結構域以及一個DP47結合部分組成，其中VH位於一條重鏈之C-末端且VL位於另一重鏈之C-末端(對於CD40為四價且對於DP47為單價)。黑點表示凸起與孔洞突變。圖 15B 展示呈4+2形式之雙特異性CD40-DP47抗體之示意圖示，該抗體由4個結合CD40之Fab結構域以及兩個各自融合於重鏈C-末端之結合DP47之Fab結構域組成(對於CD40為四價且對於DP47為二價)。圖 15C 展示呈1+1形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由一個CD40結合臂以及一個FAP結合臂組成(對於CD40為單價且對於FAP為單價)。圖 15D 展示呈2+1形式之實例性雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖，該抗體由兩個結合CD40之Fab結構域以及一個結合FAP之Fab結構域(作為兩個CD40結合臂中之一者之一部分)組成。圖 15E 展示呈4+1形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由4個結合CD40之Fab結構域以及一個融合於一條重鏈之C-末端之結合FAP之Fab結構域組成(對於CD40為四價且對於FAP為單價)。圖 15F 展示呈4+1形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由4個結合CD40之Fab結構域以及一個融合於一條重鏈之C-末端之結合FAP之Fab結構域組成。自鼠類S2C6 CD40結合結構域之內部人類化獲得VH2a及VL2a CD40結合結構域。圖 15G 展示呈4+1形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由4個結合CD40之Fab結構域以及一個融合於一條重鏈之C-末端之結合FAP之Fab結構域組成。自鼠類S2C6 CD40結合結構域之內部人類化獲得VH2d及VL2a CD40結合結構域。圖 15H 展示呈2+1形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由兩個CD40結合部分以及一個FAP結合部分(呈交叉fab片段形式)組成，其中VL-CH1鏈融合於Fc凸起鏈之C-末端。圖 15I 展示呈2+1形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由兩個CD40結合部分以及一個FAP結合部分(呈交叉fab片段形式)組成，其中VH-CL鏈融合於Fc凸起鏈之C-末端。圖 16A 展示親代鼠類FGK4.5抗體(P1AD3449)。圖 16B 至 E 展示特異性結合至小鼠CD40及FAP或DP47之雙特異性抗原結合分子之示意圖示。圖 16B 展示呈4+1形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由4個結合小鼠CD40之Fab結構域以及一個FAP結合部分組成，其中VH位於一條重鏈之C-末端且VL位於另一重鏈之C-末端(對於CD40為四價且對於FAP為單價)。黑點表示Fc中之DD/KK突變且藉由D270A/P329G突變來抑制結合至Fc受體。圖 16C 展示呈4+2形式之雙特異性CD40-FAP抗體之示意圖示，該抗體由4個結合小鼠CD40之Fab結構域以及兩個各自融合於重鏈C-末端之結合FAP之Fab結構域組成(對於CD40為四價且對於FAP為二價)。藉由D270A/P329G突變來抑制結合至Fc受體。圖 16D 展示呈4+1形式之雙特異性CD40-DP47抗體之示意圖示，該抗體由4個結合小鼠CD40之Fab結構域以及一個DP47結合部分組成，其中VH位於一條重鏈之C-末端且VL位於另一重鏈之C-末端(對於CD40為四價且對於DP47為單價)。黑點表示Fc中之DD/KK突變且藉由D270A/P329G突變來抑制結合至Fc受體。圖 16E 展示呈4+2形式之雙特異性CD40-DP47抗體之示意圖示，該抗體由4個結合小鼠CD40之Fab結構域以及兩個各自融合於重鏈C-末端之結合DP47之Fab結構域組成(對於CD40為四價且對於DP47為二價)。藉由D270A/P329G突變來抑制結合至Fc受體。圖 17 展示呈靶向FAP之單價或二價形式之人類四價、二價或單價抗CD40抗體至FAP陽性腫瘤細胞之結合。轉基因經修飾小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3-mFAP細胞系表現高含量之鼠類纖維母細胞活化蛋白(mFAP)。所有繪示構築體對NIH/3T3-mFAP細胞之結合強度(EC50 值以及信號強度)皆有所變化。僅具有一或兩個FAP結合部分且係FAP靶向形式之抗CD40抗原結合分子(P1AD4574及P1AD4465)有效結合至NIH/3T3-mFAP細胞。具有C-末端FAP結合結構域之二價FAP構築體之結合性強於具有C-末端FAP結合結構域之單價構築體。使用1+1形式觀察到最強FAP結合。將結合展示為經藻紅素(PE)標記之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab`)2片段(其用作二級檢測抗體)之中值螢光強度(MFI)。藉由流式細胞術量測MFI。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 18 展示呈靶向FAP之單價或二價形式之人類四價、二價或單價抗CD40抗體與道迪細胞(Daudi cell) (具有人類CD40之高表面表現程度之B淋巴母細胞細胞系)之結合。所有繪示構築體皆結合至CD40，但其對CD40陽性道迪細胞之結合強度(EC50 值以及信號強度)有所變化。與四價抗CD40抗體相比，雙價抗CD40抗體展示較高EC50 含量且達到較高結合平臺。使用1+1形式觀察到最高EC50 值以及最低結合平臺。使用FACS分析利用偶聯至藻紅素(PE)之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab`)2片段來檢測抗CD40抗體至細胞表面蛋白之結合。藉由流式細胞術量測MFI且藉由扣除空白對照之MFI來校正基線。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 19A 及 19B 展示在培育24小時之後在經FAP塗覆(圖 19A )或未塗覆之Dynabeads® (圖 19B )存在下靶向FAP之單價或二價人類抗CD40構築體對HEK-Blue™ CD40L細胞的活體外活化。在經FAP塗覆之珠粒存在下，FAP單價及CD40單價或二價雙特異性抗體誘導與FAP及CD40二價雙特異性抗體類似之SEAP產生之增加，而在不存在FAP (未塗覆珠粒)下，經檢測並無或具有較低SEAP產生。此外，在FAP存在下觀察到靶向FAP之CD40四價抗體可上調SEAP產生。然而，在不存在FAP下於使用靶向FAP之CD40四價抗體處理之報告基因細胞之上清液中亦觀察到SEAP產生。與靶向FAP之人類CD40二價或四價雙特異性抗體在經FAP塗覆之珠粒存在下相比，具有一個DP47結構域代替FAP結合結構域之人類CD40四價陰性對照抗體在存在及不存在FAP下於HEK-Blue™ CD40L細胞中誘導相當之SEAP產生且陽性對照抗體P1AD4470 + F(ab)誘導類似程度之SEAP產生。展示650 nm波長下之吸光度，其與藉由SEAP水解之受質之量相關。x軸展示抗體構築體之濃度。HEK-Blue™ CD40L細胞活化在經FAP塗覆之珠粒存在下之EC50 值匯總於表 11 中。所測試所有CD40四價抗體之EC50 值係相當的且低於所繪示CD40二價抗體之EC50 值。檢測1+1形式之最高EC50 值。圖 20A 及 20B 展示在培育2天之後在經FAP塗覆(圖 20A )或未塗覆之Dynabeads® (圖 20B )存在下靶向FAP之單價或二價人類抗CD40構築體對人類道迪細胞之活體外活化。使用經FAP塗覆之珠粒，FAP單價雙特異性抗體誘導與靶向FAP之二價分子類似之B細胞活化標記物CD70表現之增加。此外，藉由靶向FAP之雙特異性抗原結合達成之分子B細胞活化標記物上調高於藉由FAP獨立性陽性對照抗體誘導之上調。在不存在FAP (未塗覆珠粒)下，使用所繪示靶向FAP之CD40單價或二價雙特異性抗體可觀察到CD70並未增加，而四價CD40結合分子誘導CD70之上調，但誘導程度小於在FAP存在下之程度。展示在與指示滴定抗體一起培育2天之後CD70陽性活道迪細胞之百分比。x軸展示抗體構築體之濃度。在經FAP塗覆之珠粒存在下之活化EC50 值匯總於表 9 中。所有靶向FAP之CD40四價抗體之EC50 值係相當的且低於所繪示CD40二價抗體之EC50 值。針對陽性對照抗體P1AD4470及1+1形式檢測到最高EC50 值。圖 21A 及 21B 展示在培育2天之後在經FAP塗覆(圖 21A )或未塗覆之Dynabeads® (圖 21B )存在下靶向FAP之單價或二價人類抗CD40構築體對人類B細胞之活體外活化。使用經FAP塗覆之珠粒，FAP單價雙特異性抗體誘導與靶向FAP之二價分子類似之B細胞活化標記物CD86表現之增加。與藉由CD40抗體(P1AD4470)誘導之CD86之FAP獨立性上調相比，藉由FAP依賴性雙特異性抗原結合分子誘導之CD86上調略有降低。在不存在FAP (未塗覆珠粒)下，使用雙特異性抗原結合分子可觀察到CD86表現並不增加，而陽性對照抗體誘導活化標記物之上調。展示在與指示滴定抗體一起培育2天之後CD86陽性活B細胞之百分比。x軸展示抗體構築體之濃度。在經FAP塗覆之珠粒存在下之活化EC50 值匯總於表 10 中。所有靶向FAP之CD40四價抗體之EC50 值係相當的且低於所繪示靶向FAP之CD40二價抗體之EC50 值。檢測2+1、2+2及1+1形式之最高EC50 值。圖 22A 及 22B 展示在存在(圖 22A) 或不存在(圖 22B) FAP下藉由靶向FAP之抗CD40結合分子活化之OVA-脈衝DC之T細胞引發。自huCD40轉基因小鼠分離DC，使用DEC205-OVA偶聯物處理並使用FAP依賴性雙特異性抗CD40抗體以及經FAP塗覆之珠粒刺激，從而誘導抗原特異性T細胞之較強增殖。與之相比，在不存在FAP (未塗覆珠粒)下，使用靶向FAP之抗CD40抗體刺激之DC並不誘導或誘導較少T細胞增殖及活化。藉由使用具有一個、兩個或四個CD40及一或兩個FAP結合部分之人類雙特異性抗原結合分子刺激之DC誘導之T細胞增殖相當。使用較高量SIINFEKL代替DEC205-OVA致敏之DC偶聯誘導強T細胞增殖。展示與huCD40 tg DC (在OVA存在下與指示滴定抗體一起預培育)一起共培養之增殖性(CFSE-低)活CFSE標記之鼠類CD3+ CD8+ OT-1 T細胞之百分比(圖 22A 及 22B )。x軸展示抗體構築體之濃度。圖 23A 至 23E 及 24A 至 24D 展示注射表現FAP之鼠類結腸腺癌腫瘤細胞系(MC38-FAP)並使用FGK4.5 (P1AD3449)或FGK4.5 x FAP 4+1 (P1AD4520)或僅媒劑治療之小鼠中之酶血清含量、體重、脾重量、DC活化及T細胞增殖。與使用非靶向CD40 mAb (FGK4.5)治療之小鼠相比，使用FAP-CD40 (FGK4.5) 4+1 (亦即CD40四價及FAP單價雙特異性抗體)進行治療並不誘導肝損傷，此乃因並未觀察到指示肝損傷之血清酶增加。在圖 23A 中展示每組中3隻動物之丙胺酸胺基轉移酶(ALT)，在圖 23B 中展示麩胺酸去氫酶(GDH)且在圖 23C 中展示山梨醇去氫酶(SDH)。此外，與使用親代未靶向CD40抗體(P1AD3449)治療之小鼠相比，在使用FGK4.5 x FAP (P1AD4520)治療之小鼠中觀察到並無體重降低(圖 23D) 且 脾重量之增加較小(圖 23E )。與媒劑治療動物相比，在FGK4.5-及FGK4.5 x FAP 4+1治療動物中，在注射療法後三天腫瘤引流淋巴結中之DC活化(圖 24A 及 24B )及在注射療法後8天腫瘤中之T細胞增殖(圖 24C 及 24D )顯著增加。在圖 23A 至 23C 中，y軸展示血清酶含量(以單位/公升表示)且x軸展示使用FGK4.5、FGK4.5 x FAP 4+1或僅媒劑治療之個別小鼠。在圖 23D 中，y軸展示使用FGK4.5、FGK4.5 x FAP 4+1或僅媒劑治療之小鼠之體重(以克表示)且x軸展示腫瘤注射後天數。圖 23E 展示在注射療法後三天使用FGK4.5、FGK4.5 x FAP 4+1或僅媒劑治療之小鼠之脾重量。圖 24A 至 24D 分別展示在注射療法後3天及8天在腫瘤中腫瘤引流淋巴結中之DC之CD86 (圖 24A )及CD70表現(圖 24B )及CD8+ T細胞之Ki67表現(圖 24C )以及CD8+ T細胞之總數量(圖 24D )。((*p ＜ 0.05, **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001，未配對，雙尾司徒登氏測試(Student’s test))。圖 25A 及 25B 展示在培育2天之後在經FAP塗覆(圖 25A 及 25C )或未塗覆之Dynabeads® (圖 25B 及 25D )存在下靶向FAP之二價人類抗CD40構築體對人類B細胞之活體外活化。與藉由交聯CD40抗體(P1AA5145)誘導之CD70及CD86之FAP獨立性上調相比，藉由FAP依賴性雙特異性抗原結合分子誘導之CD70上調(圖 25A )及CD86上調(圖 25C )略有降低。在不存在FAP (未塗覆珠粒)下，使用雙特異性抗原結合分子可觀察到CD70 (圖 25B )或CD86(圖 25D )表現並不增加，而陽性對照抗體誘導活化標記物之上調。展示在與指示滴定抗體一起培育2天之後CD70或CD86陽性活B細胞之百分比。x軸展示抗體構築體之濃度。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
<120> 能夠特異性結合至CD40及FAP之新穎雙特異性抗原結合分子
<140> 107111767
<141> 107-04-03
<150> EP17164725.8
<151> 2017-04-04
<150> EP18158751.0
<151> 2018-02-27
<160> 269
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Figure 107111767-A0305-02-0341-1
Figure 107111767-A0305-02-0342-2
<210> 2
<211> 760
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Figure 107111767-A0305-02-0342-3
Figure 107111767-A0305-02-0343-5
Figure 107111767-A0305-02-0344-6
Figure 107111767-A0305-02-0345-7
Figure 107111767-A0305-02-0346-8
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-H1
<400> 3
Figure 107111767-A0305-02-0346-9
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-H2
<400> 4
Figure 107111767-A0305-02-0346-10
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-H3
<400> 5
Figure 107111767-A0305-02-0347-11
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-L1
<400> 6
Figure 107111767-A0305-02-0347-12
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-L2
<400> 7
Figure 107111767-A0305-02-0347-13
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-L3
<400> 8
Figure 107111767-A0305-02-0347-14
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)VH
<400> 9
Figure 107111767-A0305-02-0348-15
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)VL
<400> 10
Figure 107111767-A0305-02-0348-16
Figure 107111767-A0305-02-0349-17
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-H1
<400> 11
Figure 107111767-A0305-02-0349-18
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-H2
<400> 12
Figure 107111767-A0305-02-0349-19
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-H3
<400> 13
Figure 107111767-A0305-02-0350-20
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-L1
<400> 14
Figure 107111767-A0305-02-0350-21
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-L2
<400> 15
Figure 107111767-A0305-02-0350-22
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-L3
<400> 16
Figure 107111767-A0305-02-0350-23
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)VH
<400> 17
Figure 107111767-A0305-02-0351-24
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)VL
<400> 18
Figure 107111767-A0305-02-0351-25
Figure 107111767-A0305-02-0352-26
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H1
<400> 19
Figure 107111767-A0305-02-0352-27
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2
<400> 20
Figure 107111767-A0305-02-0352-28
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H3
<400> 21
Figure 107111767-A0305-02-0353-29
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-L1
<400> 22
Figure 107111767-A0305-02-0353-30
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-L2
<400> 23
Figure 107111767-A0305-02-0353-31
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-L3
<400> 24
Figure 107111767-A0305-02-0353-32
<210> 25
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 VH
<400> 25
Figure 107111767-A0305-02-0354-33
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 VL
<400> 26
Figure 107111767-A0305-02-0354-34
Figure 107111767-A0305-02-0355-35
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-H1
<400> 27
Figure 107111767-A0305-02-0355-36
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-H2
<400> 28
Figure 107111767-A0305-02-0355-37
Figure 107111767-A0305-02-0356-38
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-H3
<400> 29
Figure 107111767-A0305-02-0356-39
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-L1
<400> 30
Figure 107111767-A0305-02-0356-40
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-L2
<400> 31
Figure 107111767-A0305-02-0356-41
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-L3
<400> 32
Figure 107111767-A0305-02-0357-42
<210> 33
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 VH
<400> 33
Figure 107111767-A0305-02-0357-43
<210> 34
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 VL
<400> 34
Figure 107111767-A0305-02-0358-44
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H1 long
<400> 35
Figure 107111767-A0305-02-0358-45
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2(hVH_1,hVH_2)
<400> 36
Figure 107111767-A0305-02-0358-46
Figure 107111767-A0305-02-0359-47
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2(hVH_3)
<400> 37
Figure 107111767-A0305-02-0359-48
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2(hVH_4)
<400> 38
Figure 107111767-A0305-02-0359-49
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2(hVH_5)
<400> 39
Figure 107111767-A0305-02-0359-50
Figure 107111767-A0305-02-0360-51
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2(hVH_6)
<400> 40
Figure 107111767-A0305-02-0360-52
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2(hVH_7)
<400> 41
Figure 107111767-A0305-02-0360-53
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2(hVH_5_N288A)
<400> 42
Figure 107111767-A0305-02-0360-54
Figure 107111767-A0305-02-0361-55
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2(hVH_6_N288A)
<400> 43
Figure 107111767-A0305-02-0361-56
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2(hVH_7_N288A)
<400> 44
Figure 107111767-A0305-02-0361-57
<210> 45
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVH_1
<400> 45
Figure 107111767-A0305-02-0361-58
Figure 107111767-A0305-02-0362-59
<210> 46
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVH_2
<400> 46
Figure 107111767-A0305-02-0362-60
Figure 107111767-A0305-02-0363-61
<210> 47
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVH_3
<400> 47
Figure 107111767-A0305-02-0363-62
<210> 48
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVH_4
<400> 48
Figure 107111767-A0305-02-0364-63
<210> 49
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVH_5
<400> 49
Figure 107111767-A0305-02-0364-64
Figure 107111767-A0305-02-0365-65
<210> 50
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVH_6
<400> 50
Figure 107111767-A0305-02-0365-66
Figure 107111767-A0305-02-0366-67
<210> 51
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVH_7
<400> 51
Figure 107111767-A0305-02-0366-68
Figure 107111767-A0305-02-0367-69
<210> 52
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVH_2_N288A
<400> 52
Figure 107111767-A0305-02-0367-70
<210> 53
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVH_5_N288A
<400> 53
Figure 107111767-A0305-02-0368-71
<210> 54
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVH_6_N288A
<400> 54
Figure 107111767-A0305-02-0368-72
Figure 107111767-A0305-02-0369-73
<210> 55
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVH_7_N288A
<400> 55
Figure 107111767-A0305-02-0369-74
Figure 107111767-A0305-02-0370-75
<210> 56
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVK_1
<400> 56
Figure 107111767-A0305-02-0370-76
<210> 57
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVK_2
<400> 57
Figure 107111767-A0305-02-0371-77
<210> 58
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVK_3
<400> 58
Figure 107111767-A0305-02-0371-78
Figure 107111767-A0305-02-0372-79
<210> 59
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVK_4
<400> 59
Figure 107111767-A0305-02-0372-80
<210> 60
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVK_5
<400> 60
Figure 107111767-A0305-02-0373-81
<210> 61
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVK_6
<400> 61
Figure 107111767-A0305-02-0373-82
Figure 107111767-A0305-02-0374-83
<210> 62
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVK_7
<400> 62
Figure 107111767-A0305-02-0374-84
<210> 63
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVK_8
<400> 63
Figure 107111767-A0305-02-0375-85
<210> 64
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 hVK_9
<400> 64
Figure 107111767-A0305-02-0375-86
Figure 107111767-A0305-02-0376-87
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47-CDR H1
<400> 65
Figure 107111767-A0305-02-0376-88
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47-CDR H2
<400> 66
Figure 107111767-A0305-02-0376-89
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47-CDR H3
<400> 67
Figure 107111767-A0305-02-0377-90
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47-CDR L1
<400> 68
Figure 107111767-A0305-02-0377-91
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47-CDR L2
<400> 69
Figure 107111767-A0305-02-0377-92
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47-CDR L3
<400> 70
Figure 107111767-A0305-02-0377-93
<210> 71
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 VH
<400> 71
Figure 107111767-A0305-02-0378-94
<210> 72
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 VL
<400> 72
Figure 107111767-A0305-02-0378-95
Figure 107111767-A0305-02-0379-96
<210> 73
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 VH(核苷酸序列)
<400> 73
Figure 107111767-A0305-02-0379-97
<210> 74
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 VL(核苷酸序列)
<400> 74
Figure 107111767-A0305-02-0379-98
Figure 107111767-A0305-02-0380-99
<210> 75
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP 28H1 VH(核苷酸序列)
<400> 75
Figure 107111767-A0305-02-0380-100
<210> 76
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP 28H1 VL(核苷酸序列)
<400> 76
Figure 107111767-A0305-02-0380-101
<210> 77
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 VH(核苷酸序列)
<400> 77
Figure 107111767-A0305-02-0381-102
<210> 78
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 VL(核苷酸序列)
<400> 78
Figure 107111767-A0305-02-0381-103
<210> 79
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 VH(核苷酸序列)
<400> 79
Figure 107111767-A0305-02-0381-104
Figure 107111767-A0305-02-0382-105
<210> 80
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 VL(核苷酸序列)
<400> 80
Figure 107111767-A0305-02-0382-106
<210> 81
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 IgG重鏈
<400> 81
Figure 107111767-A0305-02-0382-107
Figure 107111767-A0305-02-0383-108
Figure 107111767-A0305-02-0384-109
<210> 82
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40輕鏈
<400> 82
Figure 107111767-A0305-02-0385-110
<210> 83
<211> 807
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc凸起_PGLALA-28H1 VH
<400> 83
Figure 107111767-A0305-02-0386-111
Figure 107111767-A0305-02-0387-112
Figure 107111767-A0305-02-0388-113
Figure 107111767-A0305-02-0389-114
<210> 84
<211> 799
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc孔洞_PGLALA-28H1 VL
<400> 84
Figure 107111767-A0305-02-0390-115
Figure 107111767-A0305-02-0391-116
Figure 107111767-A0305-02-0392-117
Figure 107111767-A0305-02-0393-118
<210> 85
<211> 904
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc_PGLALA-28H1 VLCH1 EE
<400> 85
Figure 107111767-A0305-02-0393-119
Figure 107111767-A0305-02-0394-120
Figure 107111767-A0305-02-0395-121
Figure 107111767-A0305-02-0396-122
Figure 107111767-A0305-02-0397-123
Figure 107111767-A0305-02-0398-124
<210> 86
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40輕鏈RK
<400> 86
Figure 107111767-A0305-02-0398-125
Figure 107111767-A0305-02-0399-126
<210> 87
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1 VHCL
<400> 87
Figure 107111767-A0305-02-0399-127
Figure 107111767-A0305-02-0400-128
<210> 88
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huCD40_Fc孔洞_PGLALA_28H1 VL
<400> 88
Figure 107111767-A0305-02-0400-129
Figure 107111767-A0305-02-0401-130
Figure 107111767-A0305-02-0402-131
Figure 107111767-A0305-02-0403-132
<210> 89
<211> 579
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huCD40_Fc凸起_PGLALA_28H1 VH
<400> 89
Figure 107111767-A0305-02-0403-133
Figure 107111767-A0305-02-0404-134
Figure 107111767-A0305-02-0405-135
Figure 107111767-A0305-02-0406-136
<210> 90
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huCD40-Fc_PGLALA_28H1_VLCH1 EE
<400> 90
Figure 107111767-A0305-02-0406-137
Figure 107111767-A0305-02-0407-138
Figure 107111767-A0305-02-0408-139
Figure 107111767-A0305-02-0409-140
<210> 91
<211> 806
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc凸起_PGLALA-DP47 VH
<400> 91
Figure 107111767-A0305-02-0409-141
Figure 107111767-A0305-02-0410-142
Figure 107111767-A0305-02-0411-143
Figure 107111767-A0305-02-0412-144
Figure 107111767-A0305-02-0413-145
<210> 92
<211> 799
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc孔洞_PGLALA-DP47 VL
<400> 92
Figure 107111767-A0305-02-0413-146
Figure 107111767-A0305-02-0414-147
Figure 107111767-A0305-02-0415-148
Figure 107111767-A0305-02-0416-149
Figure 107111767-A0305-02-0417-150
<210> 93
<211> 904
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc_PGLALA-DP47 VLCH1 EE
<400> 93
Figure 107111767-A0305-02-0417-151
Figure 107111767-A0305-02-0418-152
Figure 107111767-A0305-02-0419-153
Figure 107111767-A0305-02-0420-154
Figure 107111767-A0305-02-0421-155
<210> 94
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47VHCL
<400> 94
Figure 107111767-A0305-02-0421-156
Figure 107111767-A0305-02-0422-157
<210> 95
<211> 803
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-muCD40 VHCH1-FcKK_DAPG-28H1 VH
<400> 95
Figure 107111767-A0305-02-0422-158
Figure 107111767-A0305-02-0423-159
Figure 107111767-A0305-02-0424-160
Figure 107111767-A0305-02-0425-161
Figure 107111767-A0305-02-0426-162
<210> 96
<211> 795
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-muCD40 VHCH1-FcDD_DAPG-28H1 VL
<400> 96
Figure 107111767-A0305-02-0426-163
Figure 107111767-A0305-02-0427-164
Figure 107111767-A0305-02-0428-165
Figure 107111767-A0305-02-0429-166
Figure 107111767-A0305-02-0430-167
<210> 97
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40輕鏈
<400> 97
Figure 107111767-A0305-02-0430-168
Figure 107111767-A0305-02-0431-169
<210> 98
<211> 900
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-muCD40 VHCH1-Fc_DAPG-28H1 VLCH1
<400> 98
Figure 107111767-A0305-02-0431-170
Figure 107111767-A0305-02-0432-171
Figure 107111767-A0305-02-0433-172
Figure 107111767-A0305-02-0434-173
Figure 107111767-A0305-02-0435-174
<210> 99
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1 VHCL(mu)
<400> 99
Figure 107111767-A0305-02-0436-175
Figure 107111767-A0305-02-0437-176
<210> 100
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40輕鏈；'RK'
<400> 100
Figure 107111767-A0305-02-0437-177
Figure 107111767-A0305-02-0438-178
<210> 101
<211> 802
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-muCD40 VHCH1-FcKK_DAPG-DP47 VH
<400> 101
Figure 107111767-A0305-02-0438-179
Figure 107111767-A0305-02-0439-180
Figure 107111767-A0305-02-0440-181
Figure 107111767-A0305-02-0441-182
Figure 107111767-A0305-02-0442-183
<210> 102
<211> 795
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-mu CD40 VHCH1-FcDD_DAPG-DP47 VL
<400> 102
Figure 107111767-A0305-02-0442-184
Figure 107111767-A0305-02-0443-185
Figure 107111767-A0305-02-0444-186
Figure 107111767-A0305-02-0445-187
<210> 103
<211> 900
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-muCD40 VHCH1-Fc_DAPG-28H1 VLCH1
<400> 103
Figure 107111767-A0305-02-0446-188
Figure 107111767-A0305-02-0447-189
Figure 107111767-A0305-02-0448-190
Figure 107111767-A0305-02-0449-191
Figure 107111767-A0305-02-0450-192
<210> 104
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 VHCL(mu)
<400> 104
Figure 107111767-A0305-02-0450-193
Figure 107111767-A0305-02-0451-194
<210> 105
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 IgG重鏈(核苷酸序列)
<400> 105
Figure 107111767-A0305-02-0451-195
Figure 107111767-A0305-02-0452-196
<210> 106
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40輕鏈(核苷酸序列)
<400> 106
Figure 107111767-A0305-02-0452-197
Figure 107111767-A0305-02-0453-198
<210> 107
<211> 2421
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc凸起_PGLALA-28H1 VH
<400> 107
Figure 107111767-A0305-02-0453-199
Figure 107111767-A0305-02-0454-200
<210> 108
<211> 2397
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc孔洞_PGLALA-28H1 VL
<400> 108
Figure 107111767-A0305-02-0455-201
Figure 107111767-A0305-02-0456-202
<210> 109
<211> 2712
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc_PGLALA-28H1 VLCH1 EE
<400> 109
Figure 107111767-A0305-02-0456-203
Figure 107111767-A0305-02-0457-204
Figure 107111767-A0305-02-0458-205
<210> 110
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40輕鏈PK
<400> 110
Figure 107111767-A0305-02-0458-206
<210> 111
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1 VHCL
<400> 111
Figure 107111767-A0305-02-0459-207
<210> 112
<211> 1716
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huCD40_Fc孔洞_PGLALA_28H1 VL
<400> 112
Figure 107111767-A0305-02-0459-208
Figure 107111767-A0305-02-0460-209
<210> 113
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huCD40_Fc凸起_PGLALA_28H1 VH
<400> 113
Figure 107111767-A0305-02-0460-210
Figure 107111767-A0305-02-0461-211
<210> 114
<211> 2031
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huCD40-Fc_PGLALA_28H1_VLCH1 EE
<400> 114
Figure 107111767-A0305-02-0462-212
Figure 107111767-A0305-02-0463-213
<210> 115
<211> 2418
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc凸起_PGLALA-DP47 VH
<400> 115
Figure 107111767-A0305-02-0463-214
Figure 107111767-A0305-02-0464-215
Figure 107111767-A0305-02-0465-216
<210> 116
<211> 2397
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc孔洞_PGLALA-DP47 VL DNA
<400> 116
Figure 107111767-A0305-02-0465-217
Figure 107111767-A0305-02-0466-218
<210> 117
<211> 2712
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc_PGLALA-DP47 VLCH1 EE
<400> 117
Figure 107111767-A0305-02-0466-219
Figure 107111767-A0305-02-0467-220
Figure 107111767-A0305-02-0468-221
<210> 118
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 VHCL
<400> 118
Figure 107111767-A0305-02-0468-222
Figure 107111767-A0305-02-0469-223
<210> 119
<211> 2409
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-muCD40 VHCH1-FcKK_DAPG-28H1 VH
<400> 119
Figure 107111767-A0305-02-0469-224
Figure 107111767-A0305-02-0470-426
<210> 120
<211> 2385
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-muCD40 VHCH1-FcDD_DAPG-28H1 VL
<400> 120
Figure 107111767-A0305-02-0471-427
Figure 107111767-A0305-02-0472-428
<210> 121
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40輕鏈
<400> 121
Figure 107111767-A0305-02-0472-429
Figure 107111767-A0305-02-0473-430
<210> 122
<211> 2700
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-muCD40 VHCH1-Fc_DAPG-28H1 VLCH1
<400> 122
Figure 107111767-A0305-02-0473-431
Figure 107111767-A0305-02-0474-432
<210> 123
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1 VHCL(mu)
<400> 123
Figure 107111767-A0305-02-0475-433
<210> 124
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40輕鏈；'RK'
<400> 124
Figure 107111767-A0305-02-0475-434
Figure 107111767-A0305-02-0476-435
<210> 125
<211> 2406
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-muCD40 VHCH1-FcKK_DAPG-DP47 VH
<400> 125
Figure 107111767-A0305-02-0476-436
Figure 107111767-A0305-02-0477-437
<210> 126
<211> 2385
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-mu CD40 VHCH1-FcDD_DAPG-DP47 VL
<400> 126
Figure 107111767-A0305-02-0477-438
Figure 107111767-A0305-02-0478-439
Figure 107111767-A0305-02-0479-440
<210> 127
<211> 2700
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD40 VHCH1-muCD40 VHCH1-Fc_DAPG-28H1 VLCH1
<400> 127
Figure 107111767-A0305-02-0479-441
Figure 107111767-A0305-02-0480-442
Figure 107111767-A0305-02-0481-443
<210> 128
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 VHCL(mu)
<400> 128
Figure 107111767-A0305-02-0481-444
<210> 129
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40(S2C6)VH
<400> 129
Figure 107111767-A0305-02-0482-445
<210> 130
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40(S2C6)VL
<400> 130
Figure 107111767-A0305-02-0482-446
Figure 107111767-A0305-02-0483-447
<210> 131
<211> 808
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hVH3_CD40 VHCH1-VHCH1-Fc孔洞_PGLALA-4B9 VH
<400> 131
Figure 107111767-A0305-02-0483-448
Figure 107111767-A0305-02-0484-449
Figure 107111767-A0305-02-0485-450
Figure 107111767-A0305-02-0486-451
Figure 107111767-A0305-02-0487-452
<210> 132
<211> 799
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hVH3_CD40 VHCH1-VHCH1-Fc孔洞_PGLALA-4B9 VL
<400> 132
Figure 107111767-A0305-02-0487-453
Figure 107111767-A0305-02-0488-454
Figure 107111767-A0305-02-0489-455
Figure 107111767-A0305-02-0490-456
<210> 133
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hVK2_CD40輕鏈
<400> 133
Figure 107111767-A0305-02-0491-457
Figure 107111767-A0305-02-0492-458
<210> 134
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hVH3_CD40 VHCH1-Fc凸起_PGLALA-4B9 VH
<400> 134
Figure 107111767-A0305-02-0492-459
Figure 107111767-A0305-02-0493-460
Figure 107111767-A0305-02-0494-461
Figure 107111767-A0305-02-0495-462
<210> 135
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hVH3_CD40 VHCH1-Fc孔洞_PGLALA-4B9 VL
<400> 135
Figure 107111767-A0305-02-0495-463
Figure 107111767-A0305-02-0496-464
Figure 107111767-A0305-02-0497-465
<210> 136
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hVH3_CD40-Fc凸起_PGLALA_4B9_VLCH1 'EE'
<400> 136
Figure 107111767-A0305-02-0498-466
Figure 107111767-A0305-02-0499-467
Figure 107111767-A0305-02-0500-468
Figure 107111767-A0305-02-0501-469
<210> 137
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hVK2_CD40 LC,RK'
<400> 137
Figure 107111767-A0305-02-0501-470
Figure 107111767-A0305-02-0502-471
<210> 138
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B9 VHCL
<400> 138
Figure 107111767-A0305-02-0502-472
Figure 107111767-A0305-02-0503-473
<210> 139
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hVH3_CD40-Fc孔洞_PGLALA 'EE'
<400> 139
Figure 107111767-A0305-02-0503-474
Figure 107111767-A0305-02-0504-475
Figure 107111767-A0305-02-0505-476
Figure 107111767-A0305-02-0506-477
<210> 140
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hVH3_CD40-Fc孔洞_PGLALA 'EE'
<400> 140
Figure 107111767-A0305-02-0507-478
Figure 107111767-A0305-02-0508-479
Figure 107111767-A0305-02-0509-480
<210> 141
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B9-Fc凸起_PGLALA
<400> 141
Figure 107111767-A0305-02-0509-481
Figure 107111767-A0305-02-0510-482
Figure 107111767-A0305-02-0511-483
<210> 142
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu FAP胞外結構域+聚-lys-標籤+his6-標籤
<400> 142
Figure 107111767-A0305-02-0511-484
Figure 107111767-A0305-02-0512-485
Figure 107111767-A0305-02-0513-486
Figure 107111767-A0305-02-0514-487
<210> 143
<211> 761
<212> PRT
<213> 鼠類
<400> 143
Figure 107111767-A0305-02-0515-488
Figure 107111767-A0305-02-0516-489
Figure 107111767-A0305-02-0517-490
Figure 107111767-A0305-02-0518-491
<210> 144
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類FAP胞外結構域+聚-lys-標籤+his6-標籤
<400> 144
Figure 107111767-A0305-02-0518-492
Figure 107111767-A0305-02-0519-493
Figure 107111767-A0305-02-0520-494
Figure 107111767-A0305-02-0521-495
Figure 107111767-A0305-02-0522-496
<210> 145
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴FAP胞外結構域+聚-lys-標籤+his6-標籤
<400> 145
Figure 107111767-A0305-02-0522-497
Figure 107111767-A0305-02-0523-498
Figure 107111767-A0305-02-0524-499
Figure 107111767-A0305-02-0525-500
<210> 146
<211> 289
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 146
Figure 107111767-A0305-02-0525-501
Figure 107111767-A0305-02-0526-502
Figure 107111767-A0305-02-0527-503
<210> 147
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體G4S
<400> 147
Figure 107111767-A0305-02-0527-504
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體(G4S)2
<400> 148
Figure 107111767-A0305-02-0527-505
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體(SG4)2
<400> 149
Figure 107111767-A0305-02-0527-506
<210> 150
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體G4(SG4)2
<400> 150
Figure 107111767-A0305-02-0528-507
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體
<400> 151
Figure 107111767-A0305-02-0528-508
<210> 152
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體(G4S)3
<400> 152
Figure 107111767-A0305-02-0528-509
<210> 153
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體(G4S)4
<400> 153
Figure 107111767-A0305-02-0528-510
Figure 107111767-A0305-02-0529-511
<210> 154
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體
<400> 154
Figure 107111767-A0305-02-0529-512
<210> 155
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體
<400> 155
Figure 107111767-A0305-02-0529-513
<210> 156
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體
<400> 156
Figure 107111767-A0305-02-0529-514
<210> 157
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體
<400> 157
Figure 107111767-A0305-02-0530-515
<210> 158
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體
<400> 158
Figure 107111767-A0305-02-0530-516
<210> 159
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體
<400> 159
Figure 107111767-A0305-02-0530-517
<210> 160
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體
<400> 160
Figure 107111767-A0305-02-0530-518
<210> 161
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接體
<400> 161
Figure 107111767-A0305-02-0531-519
<210> 162
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1輕鏈交叉VHCL
<400> 162
Figure 107111767-A0305-02-0531-520
Figure 107111767-A0305-02-0532-521
<210> 163
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1(VLCH1)_FC凸起_PGLALA
<400> 163
Figure 107111767-A0305-02-0532-522
Figure 107111767-A0305-02-0533-523
Figure 107111767-A0305-02-0534-524
<210> 164
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40(VHCH1帶電)_Fc孔洞_PGLALA
<400> 164
Figure 107111767-A0305-02-0534-525
Figure 107111767-A0305-02-0535-526
Figure 107111767-A0305-02-0536-527
<210> 165
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40輕鏈(帶電)
<400> 165
Figure 107111767-A0305-02-0536-528
Figure 107111767-A0305-02-0537-529
<210> 166
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40(VHCH1帶電)_28H1(VLCH1)_FC孔洞_PGLALA
<400> 166
Figure 107111767-A0305-02-0538-530
Figure 107111767-A0305-02-0539-531
Figure 107111767-A0305-02-0540-532
Figure 107111767-A0305-02-0541-533
<210> 167
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40(VHCH1帶電)_Fc凸起_PGLALA_28H1(VLCH1)
<400> 167
Figure 107111767-A0305-02-0541-534
Figure 107111767-A0305-02-0542-535
Figure 107111767-A0305-02-0543-536
Figure 107111767-A0305-02-0544-537
<210> 168
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不含C-末端離胺酸之CD40(VHCH1帶電)_Fc孔洞_PGLALA
<400> 168
Figure 107111767-A0305-02-0544-538
Figure 107111767-A0305-02-0545-539
Figure 107111767-A0305-02-0546-540
<210> 169
<211> 904
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40(VHCH1帶電_CD40(VHCH1帶電)-Fc凸起_PGLALA_28H1 (VLCH1)
<400> 169
Figure 107111767-A0305-02-0546-541
Figure 107111767-A0305-02-0547-542
Figure 107111767-A0305-02-0548-543
Figure 107111767-A0305-02-0549-544
Figure 107111767-A0305-02-0550-545
Figure 107111767-A0305-02-0551-546
<210> 170
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40(VHCH1帶電_CD40(VHCH1帶電)-Fc孔洞_PGLALA
<400> 170
Figure 107111767-A0305-02-0551-547
Figure 107111767-A0305-02-0552-548
Figure 107111767-A0305-02-0553-549
Figure 107111767-A0305-02-0554-550
<210> 171
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1a(CD40)
<400> 171
Figure 107111767-A0305-02-0554-551
Figure 107111767-A0305-02-0555-552
<210> 172
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1b(CD40)
<400> 172
Figure 107111767-A0305-02-0555-553
<210> 173
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1c(CD40)
<400> 173
Figure 107111767-A0305-02-0556-554
<210> 174
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1d(CD40)
<400> 174
Figure 107111767-A0305-02-0556-555
Figure 107111767-A0305-02-0557-556
<210> 175
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1a(CD40)
<400> 175
Figure 107111767-A0305-02-0557-557
Figure 107111767-A0305-02-0558-558
<210> 176
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1b(CD40)
<400> 176
Figure 107111767-A0305-02-0558-559
<210> 177
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1c(CD40)
<400> 177
Figure 107111767-A0305-02-0558-560
Figure 107111767-A0305-02-0559-561
<210> 178
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1d(CD40)
<400> 178
Figure 107111767-A0305-02-0559-562
Figure 107111767-A0305-02-0560-563
<210> 179
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2a(CD40)
<400> 179
Figure 107111767-A0305-02-0560-564
<210> 180
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2b(CD40)
<400> 180
Figure 107111767-A0305-02-0561-565
<210> 181
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2c(CD40)
<400> 181
Figure 107111767-A0305-02-0561-566
Figure 107111767-A0305-02-0562-567
<210> 182
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2d(CD40)
<400> 182
Figure 107111767-A0305-02-0562-568
Figure 107111767-A0305-02-0563-569
<210> 183
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2ab(CD40)
<400> 183
Figure 107111767-A0305-02-0563-570
<210> 184
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2ac(CD40)
<400> 184
Figure 107111767-A0305-02-0564-571
<210> 185
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2a(CD40)
<400> 185
Figure 107111767-A0305-02-0564-572
Figure 107111767-A0305-02-0565-573
<210> 186
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2b(CD40)
<400> 186
Figure 107111767-A0305-02-0565-574
Figure 107111767-A0305-02-0566-575
<210> 187
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2ab(CD40)
<400> 187
Figure 107111767-A0305-02-0566-576
<210> 188
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2ac(CD40)
<400> 188
Figure 107111767-A0305-02-0567-577
<210> 189
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0400重鏈
<400> 189
Figure 107111767-A0305-02-0567-578
Figure 107111767-A0305-02-0568-579
Figure 107111767-A0305-02-0569-580
<210> 190
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0400輕鏈
<400> 190
Figure 107111767-A0305-02-0569-581
Figure 107111767-A0305-02-0570-582
<210> 191
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0401重鏈
<400> 191
Figure 107111767-A0305-02-0571-583
Figure 107111767-A0305-02-0572-584
Figure 107111767-A0305-02-0573-585
<210> 192
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0401輕鏈
<400> 192
Figure 107111767-A0305-02-0573-586
Figure 107111767-A0305-02-0574-587
<210> 193
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0402重鏈
<400> 193
Figure 107111767-A0305-02-0574-588
Figure 107111767-A0305-02-0575-589
Figure 107111767-A0305-02-0576-590
<210> 194
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0402輕鏈
<400> 194
Figure 107111767-A0305-02-0576-591
Figure 107111767-A0305-02-0577-592
<210> 195
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0403重鏈
<400> 195
Figure 107111767-A0305-02-0577-593
Figure 107111767-A0305-02-0578-594
Figure 107111767-A0305-02-0579-595
<210> 196
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0403輕鏈
<400> 196
Figure 107111767-A0305-02-0580-596
Figure 107111767-A0305-02-0581-597
<210> 197
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0404重鏈
<400> 197
Figure 107111767-A0305-02-0581-598
Figure 107111767-A0305-02-0582-599
Figure 107111767-A0305-02-0583-600
<210> 198
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0404輕鏈
<400> 198
Figure 107111767-A0305-02-0583-601
Figure 107111767-A0305-02-0584-602
<210> 199
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0405重鏈
<400> 199
Figure 107111767-A0305-02-0584-603
Figure 107111767-A0305-02-0585-604
Figure 107111767-A0305-02-0586-605
<210> 200
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0405輕鏈
<400> 200
Figure 107111767-A0305-02-0587-606
<210> 201
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0406重鏈
<400> 201
Figure 107111767-A0305-02-0588-607
Figure 107111767-A0305-02-0589-608
Figure 107111767-A0305-02-0590-609
<210> 202
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0406輕鏈
<400> 202
Figure 107111767-A0305-02-0590-610
Figure 107111767-A0305-02-0591-611
<210> 203
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0407重鏈
<400> 203
Figure 107111767-A0305-02-0591-612
Figure 107111767-A0305-02-0592-613
Figure 107111767-A0305-02-0593-614
<210> 204
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0407輕鏈
<400> 204
Figure 107111767-A0305-02-0593-615
Figure 107111767-A0305-02-0594-616
<210> 205
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0817重鏈
<400> 205
Figure 107111767-A0305-02-0595-617
Figure 107111767-A0305-02-0596-618
Figure 107111767-A0305-02-0597-619
<210> 206
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0817輕鏈
<400> 206
Figure 107111767-A0305-02-0597-620
Figure 107111767-A0305-02-0598-621
<210> 207
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0818重鏈
<400> 207
Figure 107111767-A0305-02-0598-622
Figure 107111767-A0305-02-0599-623
Figure 107111767-A0305-02-0600-624
<210> 208
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0818輕鏈
<400> 208
Figure 107111767-A0305-02-0600-625
Figure 107111767-A0305-02-0601-626
<210> 209
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0819重鏈
<400> 209
Figure 107111767-A0305-02-0601-627
Figure 107111767-A0305-02-0602-628
Figure 107111767-A0305-02-0603-629
<210> 210
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0819輕鏈
<400> 210
Figure 107111767-A0305-02-0604-630
Figure 107111767-A0305-02-0605-631
<210> 211
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0993重鏈
<400> 211
Figure 107111767-A0305-02-0605-632
Figure 107111767-A0305-02-0606-633
Figure 107111767-A0305-02-0607-634
<210> 212
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0993輕鏈
<400> 212
Figure 107111767-A0305-02-0607-635
Figure 107111767-A0305-02-0608-636
<210> 213
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0996重鏈
<400> 213
Figure 107111767-A0305-02-0608-637
Figure 107111767-A0305-02-0609-638
Figure 107111767-A0305-02-0610-639
<210> 214
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0996輕鏈
<400> 214
Figure 107111767-A0305-02-0610-640
Figure 107111767-A0305-02-0611-641
<210> 215
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0997重鏈
<400> 215
Figure 107111767-A0305-02-0612-642
Figure 107111767-A0305-02-0613-643
Figure 107111767-A0305-02-0614-644
<210> 216
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0997輕鏈
<400> 216
Figure 107111767-A0305-02-0614-645
Figure 107111767-A0305-02-0615-646
<210> 217
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0998重鏈
<400> 217
Figure 107111767-A0305-02-0615-647
Figure 107111767-A0305-02-0616-648
Figure 107111767-A0305-02-0617-649
<210> 218
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0998輕鏈
<400> 218
Figure 107111767-A0305-02-0617-650
Figure 107111767-A0305-02-0618-651
<210> 219
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0999重鏈
<400> 219
Figure 107111767-A0305-02-0618-652
Figure 107111767-A0305-02-0619-653
Figure 107111767-A0305-02-0620-654
<210> 220
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0999輕鏈
<400> 220
Figure 107111767-A0305-02-0621-655
Figure 107111767-A0305-02-0622-656
<210> 221
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1000重鏈
<400> 221
Figure 107111767-A0305-02-0622-657
Figure 107111767-A0305-02-0623-658
Figure 107111767-A0305-02-0624-659
<210> 222
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1000輕鏈
<400> 222
Figure 107111767-A0305-02-0624-660
Figure 107111767-A0305-02-0625-661
<210> 223
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1001重鏈
<400> 223
Figure 107111767-A0305-02-0625-662
Figure 107111767-A0305-02-0626-663
Figure 107111767-A0305-02-0627-664
<210> 224
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1001輕鏈
<400> 224
Figure 107111767-A0305-02-0628-665
<210> 225
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1002重鏈
<400> 225
Figure 107111767-A0305-02-0629-666
Figure 107111767-A0305-02-0630-667
Figure 107111767-A0305-02-0631-668
<210> 226
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1002輕鏈
<400> 226
Figure 107111767-A0305-02-0631-669
Figure 107111767-A0305-02-0632-670
<210> 227
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1003重鏈
<400> 227
Figure 107111767-A0305-02-0632-671
Figure 107111767-A0305-02-0633-672
Figure 107111767-A0305-02-0634-673
<210> 228
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1003輕鏈
<400> 228
Figure 107111767-A0305-02-0634-674
Figure 107111767-A0305-02-0635-675
<210> 229
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1004重鏈
<400> 229
Figure 107111767-A0305-02-0636-676
Figure 107111767-A0305-02-0637-677
Figure 107111767-A0305-02-0638-678
<210> 230
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1004輕鏈
<400> 230
Figure 107111767-A0305-02-0638-679
Figure 107111767-A0305-02-0639-680
<210> 231
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1005重鏈
<400> 231
Figure 107111767-A0305-02-0639-681
Figure 107111767-A0305-02-0640-682
Figure 107111767-A0305-02-0641-683
<210> 232
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1005輕鏈
<400> 232
Figure 107111767-A0305-02-0641-684
Figure 107111767-A0305-02-0642-685
<210> 233
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1006重鏈
<400> 233
Figure 107111767-A0305-02-0642-686
Figure 107111767-A0305-02-0643-687
Figure 107111767-A0305-02-0644-688
<210> 234
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1006輕鏈
<400> 234
Figure 107111767-A0305-02-0645-689
Figure 107111767-A0305-02-0646-690
<210> 235
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1007重鏈
<400> 235
Figure 107111767-A0305-02-0646-691
Figure 107111767-A0305-02-0647-692
Figure 107111767-A0305-02-0648-693
<210> 236
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1007輕鏈
<400> 236
Figure 107111767-A0305-02-0648-694
Figure 107111767-A0305-02-0649-695
<210> 237
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1125重鏈
<400> 237
Figure 107111767-A0305-02-0649-696
Figure 107111767-A0305-02-0650-697
Figure 107111767-A0305-02-0651-698
<210> 238
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1125輕鏈
<400> 238
Figure 107111767-A0305-02-0651-699
Figure 107111767-A0305-02-0652-700
<210> 239
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1126重鏈
<400> 239
Figure 107111767-A0305-02-0653-701
Figure 107111767-A0305-02-0654-702
Figure 107111767-A0305-02-0655-703
<210> 240
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1126輕鏈
<400> 240
Figure 107111767-A0305-02-0655-704
Figure 107111767-A0305-02-0656-705
<210> 241
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1135重鏈
<400> 241
Figure 107111767-A0305-02-0656-706
Figure 107111767-A0305-02-0657-707
Figure 107111767-A0305-02-0658-708
<210> 242
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE1135輕鏈
<400> 242
Figure 107111767-A0305-02-0658-709
Figure 107111767-A0305-02-0659-710
<210> 243
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2a(CD40)輕鏈(帶電)
<400> 243
Figure 107111767-A0305-02-0659-711
Figure 107111767-A0305-02-0660-712
<210> 244
<211> 904
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2a(CD40)(VHCH1帶電_VH2a(CD40)(VHCH1帶電)-Fc 凸起_PGLALA_28H1(VLCH1)
<400> 244
Figure 107111767-A0305-02-0661-713
Figure 107111767-A0305-02-0662-714
Figure 107111767-A0305-02-0663-715
Figure 107111767-A0305-02-0664-716
Figure 107111767-A0305-02-0665-717
<210> 245
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2a(CD40)(VHCH1帶電_VH2a(CD40)(VHCH1帶電)-Fc 孔洞_PGLALA
<400> 245
Figure 107111767-A0305-02-0665-718
Figure 107111767-A0305-02-0666-719
Figure 107111767-A0305-02-0667-720
Figure 107111767-A0305-02-0668-721
<210> 246
<211> 904
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2d(CD40)(VHCH1帶電_VH2d(CD40)(VHCH1帶電)-Fc 凸起_PGLALA_28H1(VLCH1)
<400> 246
Figure 107111767-A0305-02-0668-722
Figure 107111767-A0305-02-0669-723
Figure 107111767-A0305-02-0670-724
Figure 107111767-A0305-02-0671-725
Figure 107111767-A0305-02-0672-726
<210> 247
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2d(CD40)(VHCH1帶電_VH2d(CD40)(VHCH1帶電)-Fc 孔洞_PGLALA
<400> 247
Figure 107111767-A0305-02-0673-727
Figure 107111767-A0305-02-0674-728
Figure 107111767-A0305-02-0675-729
Figure 107111767-A0305-02-0676-730
<210> 248
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1a(CD40)輕鏈(帶電)
<400> 248
Figure 107111767-A0305-02-0676-731
Figure 107111767-A0305-02-0677-732
<210> 249
<211> 904
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1a(CD40)(VHCH1)_VH1a(CD40)(VHCH1)Fc凸起_PGLALA_28H1 (VLCH1)(帶電)
<400> 249
Figure 107111767-A0305-02-0677-733
Figure 107111767-A0305-02-0678-734
Figure 107111767-A0305-02-0679-735
Figure 107111767-A0305-02-0680-736
Figure 107111767-A0305-02-0681-737
<210> 250
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1a(CD40)(VHCH1)_VH1a(CD40)(VHCH1)-Fc孔洞_PGLALA(帶電)
<400> 250
Figure 107111767-A0305-02-0681-738
Figure 107111767-A0305-02-0682-739
Figure 107111767-A0305-02-0683-740
Figure 107111767-A0305-02-0684-741
<210> 251
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1a(CD40)(VHCH1)Fc凸起_PGLALA_28H1(VLCH1)(帶電)
<400> 251
Figure 107111767-A0305-02-0685-742
Figure 107111767-A0305-02-0686-743
Figure 107111767-A0305-02-0687-744
Figure 107111767-A0305-02-0688-745
<210> 252
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1a(CD40)(VHCH1)Fc孔洞_PGLALA(帶電)
<400> 252
Figure 107111767-A0305-02-0688-746
Figure 107111767-A0305-02-0689-747
Figure 107111767-A0305-02-0690-748
<210> 253
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1a(CD40)(VHCH1)Fc凸起_PGLALA_4B9(VLCH1)(帶電)
<400> 253
Figure 107111767-A0305-02-0690-749
Figure 107111767-A0305-02-0691-750
Figure 107111767-A0305-02-0692-751
Figure 107111767-A0305-02-0693-752
<210> 254
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B9輕鏈交叉VLCH1
<400> 254
Figure 107111767-A0305-02-0694-753
<210> 255
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1a(CD40)(VHCH1)Fc凸起_PGLALA_4B9(VHCL)(帶電)
<400> 255
Figure 107111767-A0305-02-0695-754
Figure 107111767-A0305-02-0696-755
Figure 107111767-A0305-02-0697-756
Figure 107111767-A0305-02-0698-757
<210> 256
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1a(CD40)輕鏈
<400> 256
Figure 107111767-A0305-02-0698-758
Figure 107111767-A0305-02-0699-759
<210> 257
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1a(CD40)(VHCH1)Fc凸起_PGLALA_4B9(VHCL)
<400> 257
Figure 107111767-A0305-02-0699-760
Figure 107111767-A0305-02-0700-761
Figure 107111767-A0305-02-0701-762
Figure 107111767-A0305-02-0702-763
<210> 258
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1a(CD40)(VHCH1)Fc孔洞_PGLALA
<400> 258
Figure 107111767-A0305-02-0703-764
Figure 107111767-A0305-02-0704-765
Figure 107111767-A0305-02-0705-766
<210> 259
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0816重鏈(對照)
<400> 259
Figure 107111767-A0305-02-0705-767
Figure 107111767-A0305-02-0706-768
Figure 107111767-A0305-02-0707-769
<210> 260
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE0816輕鏈(對照)
<400> 260
Figure 107111767-A0305-02-0707-770
Figure 107111767-A0305-02-0708-771
<210> 261
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H1(VH2ab)
<400> 261
Figure 107111767-A0305-02-0708-772
<210> 262
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2(VH2ab)
<400> 262
Figure 107111767-A0305-02-0708-773
<210> 263
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2(VH2ac)
<400> 263
Figure 107111767-A0305-02-0709-774
<210> 264
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-L1(VL2ab)
<400> 264
Figure 107111767-A0305-02-0709-775
<210> 265
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-L1(VL2ac)
<400> 265
Figure 107111767-A0305-02-0709-776
<210> 266
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu_CD40_ECD_His_Avi
<400> 266
Figure 107111767-A0305-02-0710-777
<210> 267
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cyno_CD40_ECD_His_Avi
<400> 267
Figure 107111767-A0305-02-0711-778
Figure 107111767-A0305-02-0712-779
<210> 268
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西裡魯單抗IgG2重鏈
<400> 268
Figure 107111767-A0305-02-0712-780
Figure 107111767-A0305-02-0713-781
Figure 107111767-A0305-02-0714-782
<210> 269
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西裡魯單抗IgG2輕鏈
<400> 269
Figure 107111767-A0305-02-0714-783
Figure 107111767-A0305-02-0715-784

Claims (33)

  1. 一種雙特異性抗原結合分子，其包括(a)至少一個能夠特異性結合至CD40之Fab片段，其包括重鏈可變區(VHCD40)，其包括(i)包括SEQ ID NO：19之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO：21之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VLCD40)，其包括(iv)包括SEQ ID NO：22之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包括SEQ ID NO：23之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包括SEQ ID NO：24之胺基酸序列之CDR-L3，(b)至少一個能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein；FAP)之Fab片段，其包括(I)重鏈可變區(VHFAP)，其包括：(i)包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列之CDR-H3，及輕鏈可變區(VLFAP)，其包括：(iv)包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包括SEQ ID NO：8之胺基酸序列之CDR-L3；或(II)重鏈可變區(VHFAP)，其包括：(i)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列之CDR-H3，及輕鏈可變區(VLFAP)，其包括：(iv)包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列CDR-L1，(v)包括SEQ ID NO：15之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之CDR-L3，及(c)Fc區，其係由能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元構成。
  2. 如請求項1之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之Fab片段結合至包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列之多肽或由該序列組成之多肽。
  3. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至FAP之Fab片段包括重鏈可變區(VHFAP)，其包括：(i)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VLFAP)，其包括：(iv)包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包括SEQ ID NO：15之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之CDR-L3。
  4. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至FAP之Fab片段包括(a)重鏈可變區(VHFAP)，其包括與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VLFAP)，其包括與SEQ ID NO：10之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，或(b)重鏈可變區(VHFAP)，其包括與SEQ ID NO：17之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VLFAP)，其包括與SEQ ID NO：18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
  5. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之Fab片段包括：包括SEQ ID NO：25之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：26之胺基酸序列之VL。
  6. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之Fab片段包括(i)重鏈可變區(VHCD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173及SEQ ID NO：174，及(ii)輕鏈可變區(VLCD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177及SEQ ID NO：178。
  7. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之Fab片段包括(i)重鏈可變區(VHCD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183及SEQ ID NO：184，及(ii)輕鏈可變區(VLCD40)，其包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187及SEQ ID NO：188。
  8. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之Fab片段包括(a)包括SEQ ID NO：171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：175之胺基酸序列之VL，或(b)包括SEQ ID NO：173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：177之胺基酸序列之VL，或(c)包括SEQ ID NO：174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：178之胺基酸序列之VL，或(d)包括SEQ ID NO：171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：177之胺基酸序列之VL，或(e)包括SEQ ID NO：171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：178之胺基酸序列之VL，或(f)包括SEQ ID NO：173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：175之胺基酸序列之VL，或(g)包括SEQ ID NO：173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：178之胺基酸序列之VL，或(h)包括SEQ ID NO：174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：175之胺基酸序列之VL，或(i)包括SEQ ID NO：174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：177之胺基酸序列之VL，或(j)包括SEQ ID NO：171之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：176之胺基酸序列之VL，或 (k)包括SEQ ID NO：172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：175之胺基酸序列之VL，或(l)包括SEQ ID NO：172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：176之胺基酸序列之VL，或(m)包括SEQ ID NO：172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：177之胺基酸序列之VL，或(n)包括SEQ ID NO：172之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：178之胺基酸序列之VL，或(o)包括SEQ ID NO：173之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：176之胺基酸序列之VL，或(p)包括SEQ ID NO：174之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：176之胺基酸序列之VL。
  9. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之Fab片段包括含有SEQ ID NO：171之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO：175之胺基酸序列之VL。
  10. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之Fab片段包括(a)包括SEQ ID NO：179之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：185之胺基酸序列之VL，或(b)包括SEQ ID NO：180之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：185之胺基酸序列之VL，或 (c)包括SEQ ID NO：181之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：185之胺基酸序列之VL，或(d)包括SEQ ID NO：182之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：185之胺基酸序列之VL，或(e)包括SEQ ID NO：179之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：186之胺基酸序列之VL，或(f)包括SEQ ID NO：180之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：186之胺基酸序列之VL，或(g)包括SEQ ID NO：181之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：186之胺基酸序列之VL，或(h)包括SEQ ID NO：182之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：186之胺基酸序列之VL，或(i)包括SEQ ID NO：183之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：187之胺基酸序列之VL，或(j)包括SEQ ID NO：183之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：188之胺基酸序列之VL，或(k)包括SEQ ID NO：184之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：187之胺基酸序列之VL，或(l)包括SEQ ID NO：184之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：188之胺基酸序列之VL。
  11. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該能夠特異性結合至CD40之Fab片段包括含有SEQ ID NO：179之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO：185之胺基酸序列之VL，或其中該能夠特異性結合至CD40之抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO：182之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO：185之胺基酸序列之VL。
  12. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其包括(i)至少一個能夠特異性結合至CD40之Fab片段，其包括：包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區(VHCD40)：SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183及SEQ ID NO：184，及包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區(VLCD40)：SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187及SEQ ID NO：188，及(ii)至少一個能夠特異性結合至FAP之Fab片段，其包括：包括SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈可變區(VHFAP)及包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VLFAP)，或包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之重鏈可變區(VHFAP)及包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VLFAP)。
  13. 如請求項1之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區係IgG，特別是IgG1 Fc區或IgG4 Fc區，且其中該Fc區包括一或多個可減低該抗體與Fc受體之結合親和力及/或效應物功能之胺基酸取代。
  14. 如請求項1之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區係(i)具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat EU索引進行編號)之人類IgG1子類。
  15. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括(a)至少兩個Fab片段，其能夠特異性結合至經與Fc區連結之CD40，及(b)一個Fab片段，其能夠特異性結合至經與該Fc區之C-末端連結之FAP。
  16. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括(a)至少兩個Fab片段，其能夠特異性結合至經與Fc區連結之CD40，及(b)交叉fab片段，其能夠特異性結合至經與該Fc區之C-末端連結之FAP。
  17. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子包括4個能夠特異性結合至CD40之Fab片段。
  18. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其用作藥劑。
  19. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其用於(i)藉由表現CD40之抗原呈遞細胞(antigen-presenting cell；APC)誘導免疫刺激，(ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應，(iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡，(iv)治療癌症，(v)延遲癌症進展，(vi)延長患有癌症之患者之存活，(vii)治療感染。
  20. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其用於治療癌症。
  21. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其用於治療癌症，其中該雙特異性抗原結合分子係併與用於癌症免疫療法之化學治療劑、輻射及/或其他藥劑組合投與。
  22. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至17中任一項之雙特異性抗原結合分子。
  23. 一種表現載體，其包含如請求項22之多核苷酸。
  24. 一種宿主細胞，其包括如請求項22之多核苷酸或如請求項23之表現載體。
  25. 一種產生雙特異性抗原結合分子之方法，其包括在適於表現該雙特異性抗原結合分子之條件下培養如請求項24之宿主細胞，及分離該雙特異性抗原結合分子。
  26. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至17中任一項之雙特異性抗原結合分子及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
  27. 如請求項26之醫藥組合物，其用作藥劑。
  28. 如請求項26之醫藥組合物，其用於(i)藉由表現CD40之抗原呈遞細胞(APC)誘導免疫刺激，(ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應，(iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡，(iv)治療癌症，(v)延遲癌症進展，(vi)延長患有癌症之患者之存活，(vii)治療感染。
  29. 如請求項26之醫藥組合物，其用於治療癌症。
  30. 如請求項26之醫藥組合物，其用於治療癌症，其中該雙特異性抗原結合分子係併與用於癌症免疫療法之化學治療劑、輻射及/或其他藥劑組 合投與。
  31. 一種如請求項1至17中任一項之雙特異性抗原結合分子或如請求項26之醫藥組合物之用途，其用以製造用於治療癌症之藥劑。
  32. 一種如請求項1至17中任一項之雙特異性抗原結合分子或如請求項26之醫藥組合物之用途，其用以製造用於以下之藥劑：(i)藉由表現CD40之抗原呈遞細胞(APC)誘導免疫刺激，(ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應，(iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡，(iv)治療癌症，(v)延遲癌症進展，(vi)延長患有癌症之患者之存活，(vii)治療感染。
  33. 一種如請求項1至17中任一項之雙特異性抗原結合分子或如請求項26之醫藥組合物之用途，其用以製造用於治療癌症之藥劑，其中該藥劑進一步包括用於免疫療法之化學治療劑及/或其他藥劑，或併與用於免疫療法之化學治療劑、輻射及/或其他藥劑組合投與。
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