CN114480413B

CN114480413B - 一种活化肿瘤免疫应答的基因修饰干细胞制备方法

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Publication number: CN114480413B
Application number: CN202210043637.3A
Authority: CN
Inventors: 刘广洋; 刘拥军; 张晨亮; 李欣; 米一
Original assignee: Beijing Beilai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Beilai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2042-01-14
Also published as: CN114480413A

Abstract

本发明提供了一种活化肿瘤免疫应答的间充质干细胞及其应用，属于生物医药领域。本发明通过采用基因工程手段使间充质干细胞表达抗CTLA‑4单克隆抗体融合蛋白，特异性结合高表达CTLA‑4的Treg细胞，通过阻断CTLA‑4与B7‑1/2(CD80/86)的结合，从而抑制肿瘤细胞免疫逃逸，达到治疗肿瘤相关疾病的目的，为肿瘤等疾病的治疗提供了较为理想的新方法。

Description

一种活化肿瘤免疫应答的基因修饰干细胞制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种活化肿瘤免疫应答的基因修饰干细胞制备方法。

背景技术

细胞是构成人体的基本单位，数目庞大且功能不同的细胞相互协同以维持人体的正常生理功能。在正常生理状态下，人体细胞的生长、分裂、寿命、运动和生物学功能会受到严格的管理和控制，主要遵循三个基本规律：1.未被允许的情况不能进行分裂；2.每个细胞都有自己固定的物理范围，不得随意在体内移动；3.每个细胞都有预定的寿命。一旦以上一种或者全部规则被打破，细胞就会处于病理的不受控状态，如果不能被及时纠正，最终会发展为“完全失控”的状态，即为癌症的发生。因此癌细胞具有不受控制的分裂、丧失正常生物学功能、细胞寿命比预期要长很多、侵袭其他组织以及通过竞争血液和养分来影响其他组织的正常功能等特点。

肿瘤细胞由自体正常细胞逐步突变而来，因此其细胞表面蛋白跟自体正常细胞高度相似，缺乏激活免疫系统的非己信号因子(例如：PAMP)。同时，肿瘤细胞可以对肿瘤组织内的微环境进行改造，使肿瘤组织内呈现一种免疫抑制的状态。例如肿瘤细胞可以分泌抑制型细胞因子IL-10和TGF-b，同时高表达CTLA-4L和PD-1L，抑制活化的CTLs。其次，炎症反应也可以促进肿瘤的发生。肿瘤相关的炎症反应包括在肿瘤发生前已经存在的炎症(例如慢性感染，化学物质刺激等)，以及伴随肿瘤发生产生的炎症反应。这些炎症反应可以在肿瘤组织局部释放大量抑制型细胞因子，并募集巨噬细胞、中性粒细胞以及MDSC等起抑制作用的细胞。例如，肿瘤组织中的巨噬细胞可以通过多种途径对免疫系统进行压制。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic T Lymphocyte-AssociatedAntigen-4，CTLA-4)，又称CD152，是由CTLA-4基因编码的T细胞表面跨膜蛋白，其基因定位于2号染色体长臂3区3带(2q33)。CTLA-4是目前已知最重要的免疫抑制性受体之一，主要表达在活化的CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞及激活的B淋巴细胞表面。CTLA-4可与APC，如树突状细胞(DC)表面的B7家族分子(B7-1/CD80、B7-2/CD86)特异结合，作为协同刺激信号抑制T细胞的增殖活化；阻抑细胞周期演进；降低IL-2、IFN-γ、IL-4等细胞因子的分泌及IL-2受体的表达，从而负性调节T细胞的增殖。CTLA-4在静止T细胞中表达水平很低，但当T细胞被显著激活2-3天后其表达水平显著上调，从而防止T细胞的过度活化，使机体的免疫反应控制在一个平稳的水平。CTLA-4的结构与CD28的结构极为相似，都能与B7-1/B7-2分子特异性结合，但CD28与B7结合对T细胞活化起正向调节作用，相反的，CTLA-4作为CD28的拮抗剂与B7结合后，对T细胞的活化起负性调节作用，通过抑制T细胞活性使肿瘤细胞逃脱机体的免疫监视和制裁。因此，CTLA-4被认为是抑制机体抗肿瘤的免疫分子，是目前肿瘤靶向免疫治疗的热点及方向。而CTLA-4单抗的研发针对该信号通路，通过抑制CTLA-4与B7分子的特异结合，从而达到调节肿瘤免疫的作用。

专利CN201911250591.7公开了一种纳米抗体基因修饰的间充质干细胞及其制备方法与应用，该间充质干细胞含有、和/或表达、和/或分泌纳米抗体，所述的抗体包括免疫检查点抑制剂，优选自PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、TIGIT抗体和VISTA抗体中的一种或多种。该间充质干细胞或该间充质干细胞的培养提取物，迁移至目标靶位的同时，使得纳米抗体能够在较短时间精准到达病灶区，提高病灶区纳米抗体的浓度和有效量，并减弱病灶区纳米抗体的衰竭现象，还促进间充质干细胞分泌其他有益成分，提高间充质干细胞介导的细胞免疫治疗，提高免疫相关性疾病的治疗效果。专利CN201580045089.6则公开了一种基因修饰间充质干细胞(MSC)及其在肿瘤治疗中的医学用途，该MSC包含一种或多种外源核酸分子，其中外源核酸分子包括编码一种或多种免疫应答刺激细胞因子或免疫应答调节细胞因子的区域，该区域可操作地连接于启动子或启动子/增强子组合，本发明涵盖所述细胞在调节肿瘤微环境以吸引免疫效应细胞并促进其激活和/或记忆表型过继的用途。本发明另一方面涉及所述细胞在包括联合施用间充质干细胞与抗肿瘤免疫治疗剂的抗肿瘤治疗中的用途，抗肿瘤免疫治疗剂如检查点抑制剂；免疫细胞，例如T细胞，如具有人工T细胞受体，例如嵌合抗原受体(CAR-T)的T细胞，或外源T细胞受体(TCR)转导的细胞，NK细胞或巨噬细胞/单核细胞；或癌症疫苗。

治疗性单克隆抗体药物具有先进的抗癌功能，但是抗体的免疫原性、肿瘤靶点长期使用的耐受性以及单纯性阻断信号转导通路的长期效果等问题仍有待进一步研究，多数单抗治疗肿瘤需要100mg以上的起始剂量，因此易引起多种严重副作用，且很难实现对肿瘤细胞的长期有效抑制和杀伤作用。

基于此，亟需一种新的方法解决上述单抗的不足，用于制备活化肿瘤免疫应答的药物。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种活化肿瘤免疫应答的间充质干细胞及其应用。本发明通过采用基因工程手段使间充质干细胞表达CTLA-4单抗融合蛋白，特异性结合高表达CTLA-4的Treg细胞，从而抑制肿瘤细胞免疫逃逸，达到治疗肿瘤相关疾病的目的。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种抗CTLA-4单克隆抗体融合蛋白(简称“CTLA-4单抗融合蛋白”或“融合蛋白”)的编码核苷酸，所述的编码核苷酸包含编码CTLA-4抗体的核苷酸。

具体地，所述的编码CTLA-4抗体的核苷酸包含编码CTLA-4抗体轻链可变区VL的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、和编码CTLA-4抗体重链可变区VH的SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

所述的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为：

GAAATTGTACTTACTCAGAGTCCCGGCACACTCAGTCTGTCACCAGGAGAGAGGGCGACTCTTTCATGCCGCGCAAGTCAGAGCGTAGGTAGCAGTTACCTTGCGTGGTATCAACAAAAGCCCGGCCAGGCACCCCGCCTTCTTATATACGGTGCGTTTTCTCGCGCTACAGGCATCCCAGACCGATTCTCTGGATCTGGGTCCGGTACGGATTTCACTTTGACAATATCCAGGTTGGAACCGGAGGACTTTGCGGTGTATTATTGCCAACAATACGGGAGCTCCCCTTGGACGTTCGGGCAGGGGACCAAAGTCGAAATCAAG；

所述的SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为：

CAAGTACAACTCGTCGAGTCCGGCGGTGGGGTAGTGCAGCCTGGTAGAAGTCTCCGATTGTCTTGTGCCGCAAGCGGCTTCACCTTCAGTAGCTATACAATGCATTGGGTTCGACAAGCCCCAGGCAAGGGGTTGGAGTGGGTCACTTTCATCAGTTATGATGGCAACAATAAATACTACGCGGACTCAGTGAAAGGTCGCTTTACTATTTCCCGAGATAATTCAAAGAATACACTTTATTTGCAAATGAATTCACTGAGAGCAGAGGATACAGCGATATACTACTGTGCTAGAACGGGTTGGTTGGGGCCCTTCGACTACTGGGGCCAAGGGACACTTGTCACGGTCTCTTCA；

所述的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为：

GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCGTGGGCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACGGCGCCTTCAGCAGGGCCACCGGCATCCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGGCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG；

所述的SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为：

CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCAGGAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGACCTTCATCAGCTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGGACCGGCTGGCTGGGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC。

进一步具体地，所述的编码CTLA-4抗体的核苷酸还包含编码信号肽的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、编码接头的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

具体地，所述的编码核苷酸还包含编码人免疫球蛋白IgG1的Fc片段的核苷酸，所述的编码IgG1的Fc片段的核苷酸为SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

进一步具体地，所述的编码核苷酸为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列。

具体地，所述的编码核苷酸编码CTLA-4单抗融合蛋白，所述的CTLA-4单抗融合蛋白包含CTLA-4抗体和人免疫球蛋白IgG1的Fc片段。

进一步具体地，所述的CTLA-4抗体包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的信号肽、SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的接头、SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的CTLA-4抗体轻链可变区VL、和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CTLA-4抗体重链可变区VH。

进一步具体地，所述的人免疫球蛋白IgG1的Fc片段为SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

进一步具体地，所述的CTLA-4单抗融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

又一方面，本发明提供了一种包含上述编码核苷酸的载体。

具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。

又一方面，本发明提供了一种包含上述编码核苷酸或上述载体的宿主细胞。

具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞，优选为间充质干细胞。

具体地，所述的核苷酸或载体通过基因工程技术导入所述的宿主细胞。

进一步具体地，所述的基因工程技术包括但不限于病毒转染、脂质体转染、电转移、基因编辑或mRNA转染的技术，优选为采用慢病毒载体系统。

又一方面，本发明提供了生产上述CTLA-4单抗融合蛋白的方法，所述的方法包括在使得所述融合蛋白表达的情况下，培养上述宿主细胞。

又一方面，本发明提供了一种间充质干细胞，所述的间充质干细胞包含上述编码核苷酸或上述载体。

具体地，所述的间充质干细胞为骨髓组织、脂肪组织、脐带组织或胎盘组织来源的间充质干细胞。

又一方面，本发明提供了一种上述间充质干细胞的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

(1)构建包含上述编码核苷酸序列的慢病毒表达载体；

(2)将步骤(1)得到的慢病毒表达载体感染宿主细胞，包装得到成熟慢病毒；

(3)收获步骤(2)得到的成熟慢病毒，感染间充质干细胞，筛选感染成功的细胞。

在本发明某些实施例中，首先利用慢病毒载体系统构建CTLA-4单抗融合蛋白的慢病毒表达质粒，其中，CTLA-4单抗融合蛋白是CTLA-4抗体与IgG1的重链Fc片段组成的融合蛋白，CTLA-4单抗融合蛋白编码基因的3'-末端先后连接IRES序列和EGFP基因，形成CTLA-4:Fc-I-EGPF序列，共同处于LV-EGFP慢病毒载体中CMV启动子的下游；其次，将慢病毒表达质粒与慢病毒框架质粒pGag/Pol、pRev、Pvsv-g混合，通过LTX脂质体导入HEK293T细胞中完成基因转录后，慢病毒载体被成功包装并释放到HEK293T细胞培养基的上清中，然后收集含有重组慢病毒载体的上清液；最终，用收获的上清中的重组慢病毒感染间充质干细胞，24h后加入嘌呤霉素筛选得到感染成功的间充质干细胞。通过间充质干细胞核糖体表达CTLA-4单抗融合蛋白，并在信号肽的指导下分泌到细胞外，特异性结合高CTLA-4的Treg细胞，从而抑制肿瘤细胞免疫逃逸，达到治疗肿瘤相关疾病的目的。

又一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含上述编码核苷酸、载体、宿主细胞和/或间充质干细胞。

具体地，所述的药物组合物还包含任选的药学上可接受的载体。

进一步具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。

具体地，所述的药物组合物可以单独、依次或者同时与其他药物联合施用，联合施用的其他药物非限制性的选自青霉素、阿莫西林、苄青霉素、氨苄青霉素、阿奇霉素、红霉素、克拉霉素、头孢羟氨苄、头孢克肟、四环素、米诺环素、利福平、利福布汀、氨苯磺胺、氨基糖甙、杆菌肽、多粘菌素B、奥硝唑、视黄醇、视黄醛、异维甲酸、维胺酯、阿达帕、他扎罗汀、雌激素、孕激素、糖皮质激素、抗雄性激素、维生素D3类似物如卡泊三醇和他卡西醇、糖皮质激素类药物如泼尼松和甲泼尼松、他克莫司、吡美莫司、环孢素A、霉酚酸酯、白三烯B4抑制剂、IL-1抑制剂、IL-2抑制剂、IL-1β抑制剂，IL-6抑制剂、IL-8抑制剂、IL-12抑制剂、IL-23抑制剂、IL-17抑制剂、TNF抑制剂、GM-CSF抑制剂、CD19抑制剂、CD20抑制剂。联合治疗的方法还包括与光动力疗法、激光疗法、果酸疗法的联合施用。

又一方面，本发明提供了上述编码核苷酸、载体、宿主细胞和/或间充质干细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物、试剂盒和/或医疗装置中的应用。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

(1)本发明所得到的经修饰的间充质干细胞能够共表达人CTLA-4单抗融合蛋白，利用间充质干细胞对肿瘤部位的靶向作用及损伤部位的修复能力，通过基因修饰的方法，使间充质干细胞特异表达CTLA-4单抗融合蛋白至肿瘤部位而发挥作用。所述的间充质干细胞可特异性抑制CTLA4和CD86的结合，从而抑制肿瘤细胞免疫逃逸，达到治疗肿瘤相关疾病的目的。

(2)间充质干细胞具有较好的免疫调节能力和组织损伤修复能力，本发明为肿瘤等疾病的治疗提供了较为理想的新方法。

附图说明

图1为LV-CTLA-4:Fc质粒信息示意图。

图2为实施例4荧光表达检测结果图。

图3为融合蛋白IgG1蛋白表达检测结果图。

图4为CTLA4单抗对CTLA4和CD86的结合抑制曲线图。

图5为间充质干细胞分泌CTLA-4抗体含量检测结果图。

图6为间充质干细胞对CTLA4和CD86的结合抑制检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学用语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有的其他技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968,IUPAC-IUB委员会)中所述。

与重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)、酶促反应和纯化技术结合使用的示例性技术是本领域已知的。许多这样的技术和程序描述于，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，以及其他许多地方。

本发明所述的“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

本发明所述的“宿主细胞”是可用于表达核酸，例如本发明的核酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如，大肠杆菌(E.coli)，或其可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。

本发明所述的“间充质干细胞”(MSCs)来源于发育早期中胚层，具有多种细胞功能，包括受损组织的修复及再生、参与机体免疫调节、促进血管新生、炎症部位归巢和靶向作用以及抑制肿瘤生长。与成人组织相比，从脐带等组织中分离出的MSCs具有更好的体外生长潜力和更高的再生能力，MSC被定义为具有一些共同的基本特性，如体外可塑性粘附，表面标志CD73、CD90和CD105的表达以及体外成骨、成脂、成软骨的分化能力。除了这些典型的MSCs特征之外，脐带来源的MSCs可以产生和释放更多的转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮因子-α(VEGF-α)和表皮生长因子(EGF)。

肿瘤微环境中如成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、促炎因子白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的大量分泌有助于MSCs聚集于肿瘤部位，而免疫细胞与肿瘤间质内的MSCs的相互作用可以激活MSCs的免疫调节能力。MSCs可以分泌多种免疫调节剂，如一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的代谢产物等，与诱导免疫耐受和T细胞Th1向Th2免疫应答的转变有关。此外，MSCs可以通过PD-1激活凋亡机制以及与相应配体PD-L1和PD-L2的相互作用来抑制效应器T细胞的增殖。处理对调节性T细胞的免疫抑制和抗炎作用外，MSCs还参与转化巨噬细胞的过程。

除了与肿瘤间质中不同类型的细胞作用外，MSCs还可以直接或间接与癌细胞相互作用，基于MSCs可以向肿瘤部位归巢的特性，MSCs被认为是输送抗肿瘤药物的理想候选者，是一种潜在的临床方法。

本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键链接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA、IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可以分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL或LCVR)和重链可变区(VH或HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

术语“互补决定区”(CDR)指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。本发明中使用“Kabat编号规则”(参见Kabat等(1991))确定CDR的氨基酸序列边界。

术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体对预先确定的抗原表位的结合。通常，抗体以约小于10^-8M，例如约小于10^-9M、10^-10M、10^-11M或更小的亲和力(KD)结合。其中，“KD”指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。

术语“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，其为生理学上相容的。在一个实施方案中，载体适合胃肠外施用。可选地，载体可以适合于静脉内、腹膜内、肌肉内或舌下施用。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和无菌粉末以用于临时制备无菌注射溶液或分散液。对于药学上的活性物质使用此类介质和试剂在本领域是众所周知的。除非任何常规介质或试剂与该活性化合物不相容，否则涵盖其在本发明的药物组合物中的使用。

在某些实施例中，本发明所述的CTLA-4单抗融合蛋白可通过培养包含所述的核酸分子或载体的宿主细胞或包含编码所述CTLA-4单抗融合蛋白的核苷酸序列的基因修饰细胞得到。

实施例1.体外构建慢病毒表达质粒

利用第四代慢病毒载体系统LV-EGFP(购自OriGene公司)构建CTLA-4单抗融合蛋白的慢病毒表达质粒，并以LV-EGFP空质粒作为对照。

其中，CTLA-4单抗融合蛋白是CTLA-4抗体与IgG1的重链Fc片段组成的融合蛋白(SEQ ID NO:15)。所述的CTLA-4抗体包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的信号肽、SEQID NO:11所示的氨基酸序列的接头、SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的CTLA-4抗体轻链可变区VL、和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CTLA-4抗体重链可变区VH；所述的人免疫球蛋白IgG1的Fc片段为SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

CTLA-4单抗融合蛋白的编码基因(SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列)包括CTLA-4抗体的核苷酸序列和编码IgG1重链Fc片段的核苷酸序列，其中，所述的编码CTLA-4抗体的核苷酸包含编码信号肽的核苷酸SEQ ID NO:1所示的序列、编码接头的核苷酸SEQID NO:2所示的序列、编码CTLA-4抗体轻链可变区VL的核苷酸SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的序列、和编码CTLA-4抗体重链可变区VH的核苷酸SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的序列；编码IgG1重链Fc片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

CTLA-4单抗融合蛋白编码基因(SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列)的3'-末端先后连接IRES序列和EGFP基因，形成CTLA-4-OS1:Fc-I-EGFP或CTLA-4-OS2:Fc-I-EGFP序列，共同处于CMV启动子下游(载体示意图见图1)。

具体地，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的编码CTLA-4抗体轻链可变区的核苷酸序列由SEQ ID NO:16所示的WT序列优化得到，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的编码CTLA-4抗体重链可变区的核苷酸序列由SEQ ID NO:17所示的WT序列优化得到。同时，利用所述的WT序列构建CTLA-4-WT:Fc-I-EGFP序列(该序列与CTLA-4:Fc-I-EGFP序列不同之处在于：编码CTLA-4抗体轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:16所示的WT序列，编码CTLA-4抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:17所示的WT序列，其余序列与CTLA-4-OS1:Fc-I-EGFP或CTLA-4-OS2:Fc-I-EGFP序列相同)。

按照上述基因结构，利用常规的基因工程手段将目的基因片段插入LV-EGFP质粒的相应位点，得到慢病毒表达质粒LV-CTLA-4-OS1:Fc、LV-CTLA-4-OS2:Fc和LV-CTLA-4-WT:Fc。

实施例2.病毒制备及收获

将实施例1制备的LV-CTLA-4-OS1:Fc、LV-CTLA-4-OS2:Fc或LV-CTLA-4-WT:Fc质粒分别与慢病毒框架质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G，通过LTX脂质体转染到HEK293T细胞中，成功包装的重组慢病毒载体释放到HEK293T细胞培养上清液中，收获含有重组慢病毒载体的细胞培养上清液。同时制备对照LV-EGFP病毒。

实施例3.基因修饰间充质干细胞的制备

将实施例2制备的含有包装病毒的HEK293T细胞培养上清进行收集，加入已培养并达到融合度70-80％的间充质干细胞，使用收获的HEK293T细胞培养上清继续培养间充质干细胞；经37℃CO₂培养24h后，将完成病毒感染的间充质干细胞培养上清弃去并更换含嘌呤霉素的新鲜培养基继续培养，48h后即可筛选出得到成功感染的间充质干细胞EGFP-MSC、CTLA-4-OS1:Fc-MSC、CTLA-4-OS2:Fc-MSC、CTLA-4-WT:Fc-MSC。

实施例4.流式细胞法检测基因修饰干细胞表达绿色荧光蛋白

将实施例3获得的细胞按1×10^4/cm²培养至T25细胞培养瓶，24h后通过流式细胞法检测间充质干细胞绿色荧光通道信号(结果见图2)，发现LV-EGFP、LV-CTLA-4-OS1:Fc、LV-CTLA-4-OS2:Fc及LV-CTLA-4-WT:Fc慢病毒感染后的间充质干细胞均绿色荧光通道信号阳性率均超过85％，而正常间充质干细胞(hUC-MSC)在绿色荧光通道没有信号。表明LV-EGPF、LV-CTLA-4-OS1:Fc、LV-CTLA-4-OS2:Fc及LV-CTLA-4-WT:Fc慢病毒均可成功感染间充质干细胞，感染率达到85％以上。

实施例5.ELISA检测细胞分泌的融合蛋白IgG1蛋白含量

采用invitrogen公司Human IgG1 ELISA Kit(BMS2092)用于检测细胞培养上清中分泌的融合蛋白IgG1含量。该试剂盒采用人IgG1固相夹心ELISA(酶联免疫吸附测定)检测匹配抗体对之间结合的靶标量。IgG1特异性抗体已预先包被在酶标板中，然后将细胞上清液样品、标准品或对照加入这些孔中并与固定(捕获)抗体结合，通过添加二抗形成夹心结构，添加底物溶液与酶-抗体-靶标复合物反应以产生可测量的信号。该信号的强度与原始样本中存在的目标浓度成正比。

将实施例3获得的基因修饰间充质干细胞培养72小时后收获细胞上清，并将细胞培养上清加入IgG1 ELISA试剂盒，检测融合蛋白中IgG1蛋白含量，结果发现，LV-CTLA-4-OS1:Fc慢病毒感染后的间充质干细胞(CTLA-4-OS1:Fc-MSC)高表达IgG1，且表达量高达29.4±3.54ng/mL，LV-CTLA-4-OS2:Fc(CTLA-4-OS2:Fc-MSC)与LV-CTLA-4-WT:Fc(CTLA-4-WT:Fc-MSC)的IgG1表达量与LV-CTLA-4-OS1:Fc相比没有显著差异(P>0.05)，而正常hUC-MSC及EGFP-MSC不表达IgG1(结果见图3)。

实施例6.CTLA-4抗体含量检测

采用Vazyme公司Human CTLA4/CD86试剂盒(DD2206)用于检测细胞培养上清中分泌的融合蛋白对CTLA4和CD86的结合抑制效果。采用Tag1-CTLA4和Tag2-CD86两种蛋白，以及两株抗体，分别为：Anti-Tag1(标记荧光供体Eu，AntiTag1-Eu)；Anti-Tag2(标记荧光受体A2，Anti-Tag2-A2)。当CTLA4和CD86发生相互作用时，Anti-Tag1-Eu和Anti-Tag2-A2距离靠近，可发生荧光共振能量转移(FRET)，从而在320nm的激发光激发下发射出620nm(供体)、665nm(受体)荧光；通过荧光酶标仪可检测上述荧光信号。加入细胞上清后，融合蛋白中CTLA4抗体可阻断CTLA4/CD86的相互作用从而破坏FRET形成，抑制强度和FRET信号(665/620)成反比。

将实施例3获得的基因修饰间充质干细胞培养72小时后收获细胞上清，并将细胞培养上清加入CTLA4/CD86试剂盒，检测融合蛋白对CTLA4/CD86的抑制情况；将CTLA4单抗(试剂盒自带)进行倍比稀释后其665nm的荧光值除以620nm的荧光值，获得665/620值。以log10[标准品浓度]为横坐标，665/620的值为纵坐标，曲线拟合进行曲线的制作，结果发现，经倍比稀释后的CTLA4单抗与FRET信号(665/620)成反比，其IC50＝1.06nM(结果见图4)；在此基础上根据665/620值计算样品中融合蛋白的含量，实验结果如图5所示，正常hUC-MSC及EGFP-MSC培养上清无法阻断CTLA4/CD86，其单抗含量为0nM，而CTLA-4-OS1:Fc-MSC培养上清可以显著阻断PD-L1/PD-1的结合，其含量为1.04±0.15nM，CTLA-4-OS2:Fc-MSC含量为0.89±0.13nM，CTLA-4-WT:Fc-MSC的含量为0.76±0.10nM，与WT相比，OS1组细胞表达CTLA-4抗体水平增加了35％(P<0.01)(结果见图5)。

实施例7.检测基因修饰干细胞对CTLA4和CD86的结合抑制

采用Vazyme公司Human CTLA4/CD86试剂盒(DD2206)用于检测基因修饰干细胞对CTLA4和CD86的结合抑制效果。将实施例3获得的各组细胞按1×10^4/cm²加入96孔板中，24小时后吸弃上清液，加入20μL D-hank’s溶液；空白孔加入20μL D-hank’s溶液。每孔分别加入Anti-Tag1(标记荧光供体Eu，AntiTag1-Eu)；Anti-Tag2(标记荧光受体A2，Anti-Tag2-A2)两种抗体，将Anti-Tag1-Eu和Anti-Tag2-A2以体积1:1混合均匀，加入反应体系，室温孵育2小时上机检测FRET信号，并计算665/620(简称FRET)。

采用下列公式对CTLA4/CD86结合抑制率进行计算：

结合抑制率＝[FRET(空白孔)-FRET(样品孔)]/FRET(空白孔)*100％。

结果发现，正常hUC-MSC及EGFP-MSC细胞无法阻断CTLA4/CD86，结合抑制率为0.08±0.15％；而CTLA-4-OS1:Fc-MSC细胞可以显著阻断CTLA4/CD86的结合，其结合抑制率为84.25±6.94％，CTLA-4-OS2:Fc-MSC细胞结合抑制率为71.5±8.5％，CTLA-4-WT:Fc-MSC细胞的结合抑制率为52.75±10.99％；与WT相比，OS1组细胞对CTLA4/CD86阻断能力增加了59.7％(P<0.01)(结果见图6)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京贝来生物科技有限公司

<120> 一种活化肿瘤免疫应答的基因修饰干细胞制备方法

<130> 20220113

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

atgcaggccc tggtgctact cctctgcatt ggagccctcc tcgggcacag cagctgc 57

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

ggagggggtg gctcaggcgg cggaggctct gggggcgggg gatctggcgg aggtggctca 60

<210> 3

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

gaaattgtac ttactcagag tcccggcaca ctcagtctgt caccaggaga gagggcgact 60

ctttcatgcc gcgcaagtca gagcgtaggt agcagttacc ttgcgtggta tcaacaaaag 120

cccggccagg caccccgcct tcttatatac ggtgcgtttt ctcgcgctac aggcatccca 180

gaccgattct ctggatctgg gtccggtacg gatttcactt tgacaatatc caggttggaa 240

ccggaggact ttgcggtgta ttattgccaa caatacggga gctccccttg gacgttcggg 300

caggggacca aagtcgaaat caag 324

<210> 4

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

caagtacaac tcgtcgagtc cggcggtggg gtagtgcagc ctggtagaag tctccgattg 60

tcttgtgccg caagcggctt caccttcagt agctatacaa tgcattgggt tcgacaagcc 120

ccaggcaagg ggttggagtg ggtcactttc atcagttatg atggcaacaa taaatactac 180

gcggactcag tgaaaggtcg ctttactatt tcccgagata attcaaagaa tacactttat 240

ttgcaaatga attcactgag agcagaggat acagcgatat actactgtgc tagaacgggt 300

tggttggggc ccttcgacta ctggggccaa gggacacttg tcacggtctc ttca 354

<210> 5

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

gagatcgtgc tgacccagag ccccggcacc ctgagcctga gccccggcga gagggccacc 60

ctgagctgca gggccagcca gagcgtgggc agcagctacc tggcctggta ccagcagaag 120

cccggccagg cccccaggct gctgatctac ggcgccttca gcagggccac cggcatcccc 180

gacaggttca gcggcagcgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatcag caggctggag 240

cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtacggca gcagcccctg gaccttcggc 300

cagggcacca aggtggagat caag 324

<210> 6

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctg 60

agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacacca tgcactgggt gaggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtgaccttc atcagctacg acggcaacaa caagtactac 180

gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccatct actactgcgc caggaccggc 300

tggctgggcc ccttcgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354

<210> 7

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa atga 684

<210> 8

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

atgcaggccc tggtgctact cctctgcatt ggagccctcc tcgggcacag cagctgcgaa 60

attgtactta ctcagagtcc cggcacactc agtctgtcac caggagagag ggcgactctt 120

tcatgccgcg caagtcagag cgtaggtagc agttaccttg cgtggtatca acaaaagccc 180

ggccaggcac cccgccttct tatatacggt gcgttttctc gcgctacagg catcccagac 240

cgattctctg gatctgggtc cggtacggat ttcactttga caatatccag gttggaaccg 300

gaggactttg cggtgtatta ttgccaacaa tacgggagct ccccttggac gttcgggcag 360

gggaccaaag tcgaaatcaa gggagggggt ggctcaggcg gcggaggctc tgggggcggg 420

ggatctggcg gaggtggctc acaagtacaa ctcgtcgagt ccggcggtgg ggtagtgcag 480

cctggtagaa gtctccgatt gtcttgtgcc gcaagcggct tcaccttcag tagctataca 540

atgcattggg ttcgacaagc cccaggcaag gggttggagt gggtcacttt catcagttat 600

gatggcaaca ataaatacta cgcggactca gtgaaaggtc gctttactat ttcccgagat 660

aattcaaaga atacacttta tttgcaaatg aattcactga gagcagagga tacagcgata 720

tactactgtg ctagaacggg ttggttgggg cccttcgact actggggcca agggacactt 780

gtcacggtct cttcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 840

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1260

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1380

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc acgaggctct gcacaaccac 1440

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1479

<210> 9

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

atgcaggccc tggtgctact cctctgcatt ggagccctcc tcgggcacag cagctgcgag 60

atcgtgctga cccagagccc cggcaccctg agcctgagcc ccggcgagag ggccaccctg 120

agctgcaggg ccagccagag cgtgggcagc agctacctgg cctggtacca gcagaagccc 180

ggccaggccc ccaggctgct gatctacggc gccttcagca gggccaccgg catccccgac 240

aggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag gctggagccc 300

gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag tacggcagca gcccctggac cttcggccag 360

ggcaccaagg tggagatcaa gggagggggt ggctcaggcg gcggaggctc tgggggcggg 420

ggatctggcg gaggtggctc acaggtgcag ctggtggaga gcggcggcgg cgtggtgcag 480

cccggcagga gcctgaggct gagctgcgcc gccagcggct tcaccttcag cagctacacc 540

atgcactggg tgaggcaggc ccccggcaag ggcctggagt gggtgacctt catcagctac 600

gacggcaaca acaagtacta cgccgacagc gtgaagggca ggttcaccat cagcagggac 660

aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg aacagcctga gggccgagga caccgccatc 720

tactactgcg ccaggaccgg ctggctgggc cccttcgact actggggcca gggcaccctg 780

gtgaccgtga gcagcgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 840

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1260

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1380

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc acgaggctct gcacaaccac 1440

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1479

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Cys Ile Gly Ala Leu Leu Gly His

1 5 10 15

Ser Ser Cys

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 12

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 12

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 14

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 15

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 15

Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Cys Ile Gly Ala Leu Leu Gly His

1 5 10 15

Ser Ser Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

35 40 45

Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly

100 105 110

Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

260 265 270

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

275 280 285

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

290 295 300

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

305 310 315 320

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

325 330 335

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

340 345 350

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

355 360 365

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

370 375 380

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

385 390 395 400

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

405 410 415

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

420 425 430

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

435 440 445

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

450 455 460

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

465 470 475 480

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485 490

<210> 16

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 16

gagatagttc ttacacaatc tcctgggact ttatctttat ctccaggcga acgtgctacg 60

ttatcatgta gagcttcaca atcagtcggt tcttcttatc tagcatggta tcagcagaaa 120

cctggacaag cacccagact tttgatttat ggtgcgtttt caagagcaac agggatacca 180

gatcgatttt cagggtcagg atctggaact gattttacgc ttactattag cagattggaa 240

ccagaagatt ttgctgtcta ttattgccaa caatatggta gtagtccttg gacatttggt 300

caaggtacaa aagtagagat caaa 324

<210> 17

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 17

caagttcaac ttgtagaaag tggaggagga gttgttcaac caggaagatc attgcgatta 60

tcatgtgccg caagtgggtt taccttttca agttacacta tgcattgggt acgtcaagct 120

cctggtaaag gcttagagtg ggttaccttc atttcatatg atggcaataa caaatactat 180

gcagattctg tgaaaggacg tttcacaatt tctcgcgaca attcaaagaa taccttgtat 240

ttacagatga atagcttacg tgctgaagat acagcgattt actattgtgc cagaactggt 300

tggttaggtc cgtttgacta ttggggacaa ggaacactag tgactgttag ctctaag 357

<210> 18

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 18

atgcaggccc tggtgctact cctctgcatt ggagccctcc tcgggcacag cagctgcgag 60

atagttctta cacaatctcc tgggacttta tctttatctc caggcgaacg tgctacgtta 120

tcatgtagag cttcacaatc agtcggttct tcttatctag catggtatca gcagaaacct 180

ggacaagcac ccagactttt gatttatggt gcgttttcaa gagcaacagg gataccagat 240

cgattttcag ggtcaggatc tggaactgat tttacgctta ctattagcag attggaacca 300

gaagattttg ctgtctatta ttgccaacaa tatggtagta gtccttggac atttggtcaa 360

ggtacaaaag tagagatcaa aggagggggt ggctcaggcg gcggaggctc tgggggcggg 420

ggatctggcg gaggtggctc acaagttcaa cttgtagaaa gtggaggagg agttgttcaa 480

ccaggaagat cattgcgatt atcatgtgcc gcaagtgggt ttaccttttc aagttacact 540

atgcattggg tacgtcaagc tcctggtaaa ggcttagagt gggttacctt catttcatat 600

gatggcaata acaaatacta tgcagattct gtgaaaggac gtttcacaat ttctcgcgac 660

aattcaaaga ataccttgta tttacagatg aatagcttac gtgctgaaga tacagcgatt 720

tactattgtg ccagaactgg ttggttaggt ccgtttgact attggggaca aggaacacta 780

gtgactgtta gctctaagga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 840

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 900

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 960

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1020

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1080

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1140

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1200

cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1260

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1320

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1380

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcacgaggc tctgcacaac 1440

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1482

Claims

1.一种CTLA-4单抗融合蛋白的编码核苷酸，其特征在于：所述的编码核苷酸包含编码CTLA-4抗体的核苷酸；所述的编码CTLA-4抗体的核苷酸包含编码CTLA-4抗体轻链可变区VL的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、和编码CTLA-4抗体重链可变区VH的SEQID NO:4或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

所述的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为：

所述的SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为：

所述的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为：

所述的SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为：

CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCAGGAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGACCTTCATCAGCTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGGACCGGCTGGCTGGGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC；

所述的编码CTLA-4抗体的核苷酸还包含编码信号肽的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、编码接头的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

所述的编码核苷酸还包含编码人免疫球蛋白IgG1的Fc片段的核苷酸，所述的编码IgG1的Fc片段的核苷酸为SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的编码核苷酸，其特征在于：所述的编码核苷酸为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列。

3.一种包含权利要求1-2任一项所述的编码核苷酸的载体。

4.一种包含权利要求1-2任一项所述的编码核苷酸或权利要求3所述的载体的宿主细胞，所述的宿主细胞非动物品种或植物品种。

5.一种生产CTLA-4单抗融合蛋白的方法，其特征在于：所述的方法包括在使得所述的融合蛋白表达的情况下，培养权利要求4所述的宿主细胞。

6.一种间充质干细胞，其特征在于：所述的间充质干细胞包含权利要求1-2任一项所述的编码核苷酸或权利要求3所述的载体。

7.一种权利要求6所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：

（1）构建包含权利要求1-2任一项所述的编码核苷酸序列的慢病毒表达载体；

（2）将步骤（1）得到的慢病毒表达载体感染宿主细胞，包装得到成熟慢病毒；

（3）收获步骤（2）得到的成熟慢病毒，感染间充质干细胞，筛选感染成功的细胞。

8.一种药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物包含权利要求1-2任一项所述的编码核苷酸、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的宿主细胞和/或权利要求6所述的间充质干细胞。

9.权利要求1-2任一项所述的编码核苷酸、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的宿主细胞和/或权利要求6所述的间充质干细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物、试剂盒和/或医疗装置中的应用。