KR20150122761A - Ｔ 세포 활성화 항원 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 T 세포 활성화 및 특정 표적 세포로의 방향지정을 위한 신규한 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 이중특이적 항원 결합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 생산 방법, 및 질환의 치료에 있어서 이러한 이중특이적 항원 결합 분자의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

Ｔ 세포 활성화 항원 결합 분자 {BISPECIFIC T CELL ACTIVATING ANTIGEN BINDING MOLECULES}
본 발명은 일반적으로 T 세포 활성화를 위한 신규한 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 이중특이적 항원 결합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 생산 방법, 및 질환의 치료에 있어서 이러한 이중특이적 항원 결합 분자의 사용 방법에 관한 것이다.
개별 세포 또는 특정 세포 유형의 선별적 파괴는 여러가지 임상 상황에서 흔히 바람직하다. 예를 들어, 종양 세포를 특이적으로 파괴하면서, 건강한 세포 및 조직을 온전하고 손상되지 않게 남기는 것이 암 요법의 일차 목적이다.
이를 달성하는 매력적인 방법은 종양에 대항하는 면역 응답을 유도함으로써, 면역 효과기 세포 예컨대 자연 살해 (NK) 세포 또는 세포독성 T 백혈구 (CTL) 가 종양 세포를 공격 및 파괴하게 하는 것이다. CTL 는 면역계의 가장 강력한 효과기 세포가 되는 것으로 여겨지지만, 종래의 치료 항체의 Fc 도메인에 의해 매개되는 효과기 메카니즘에 의해 활성화될 수 없다.
이와 관련하여, 한 "팔" 로는 표적 세포 상의 표면 항원에, 두번째 "팔" 로는 T 세포 수용체 (TCR) 복합체의 활성화, 불변 성분에 결합하도록 설계된 이중특이적 항체가 최근에 관심의 대상이 되었다. 그것의 표적 둘다에 대한 그러한 항체의 동시 결합은 표적 세포와 T 세포 사이의 일시적 상호작용을 강제하여, 임의의 세포독성 T 세포의 활성화 및 후속적인 표적 세포의 용해를 야기할 것이다. 이와 같이, 면역 응답은 표적 세포에게로 방향지정되고 (re-directed) 표적 세포에 의한 펩티드 항원 제시 또는 CTL 의 정상 MHC-제한된 활성화와 관련이 있을 T 세포의 특이성에 독립적이다. 이러한 맥락에서, CTL 이 표적 세포가 그들에게 이중특이적 항체를 제시할 때에만 활성화되는 것, 즉 면역학적 시냅스가 모방되는 것이 결정적이다. 표적 세포의 효율적 용해를 유발하기 위해 백혈구 사전조건화 (preconditioning) 또는 동시-자극을 요구하지 않는 이중특이적 항체가 특히 바람직하다.
여러 이중특이적 항체 포맷이 개발되었고, T 세포 매개 면역요법에 대한 그들의 적합성이 연구되었다. 이들 중에서, 소위 BiTE (이중특이적 T 세포 인게이저 (engager)) 분자가 매우 잘 특성분석되었고, 이미 임상에서 장래성을 보여줬다 (Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011) 에서 리뷰됨). BiTE 는 탠덤 scFv 분자이며, 여기에서 2 개의 scFv 분자가 굴곡성 링커에 의해 융합되어 있다. 또한 T 세포 맞물림 (engagement) 에 대해 평가되고 있는 이중특이적 포맷은 다이아바디 (diabody) (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) 및 그의 유도체, 예컨대 탠덤 다이아바디 (Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)) 를 포함한다. 더 최근의 개발은 소위 DART (이중 친화도 재표적화) 분자이며, 이는 다이아바디 포맷에 기초하지만 부가적 안정화를 위해 C-말단 다이설파이드 가교를 특색으로 한다 (Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)). 소위 triomabs 는, 전체 하이브리드 마우스/랫트 IgG 분자이고 또한 현재 임상 시험에서 평가되고 있으며, 더 큰 크기의 포맷에 해당한다 (Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010) 에서 리뷰됨).
개발되고 있는 여러가지 표맷은 면역요법에서 T 세포 방향지정 및 활성화에 기인하는 큰 잠재력을 보여준다. 그에 적합한 이중특이적 항체를 생성하는 과제는, 그러나, 결코 간단하지 않고, 항체의 효능, 독성, 적용성 및 생산성과 관련하여 충족되어야 하는 다수의 도전을 수반한다.
작은 구축물 예컨대, 예를 들어, BiTE 분자는 - 효과기 및 표적 세포를 효율적으로 교차연결시킬 수 있지만 - 매우 짧은 혈청 반감기를 가지므로, 환자에게 연속 주입에 의해 투여될 필요가 있다. IgG-유사 포맷은 다른 한편으로는 - 긴 반감기의 큰 유익을 갖지만 - IgG 분자에 내재하는 천연 효과기 기능과 연관되는 독성을 겪는다. 그들의 면역원성 잠재력은 성공적 치료제 개발을 위한 IgG-유사 이중특이적 항체, 특히 비-인간 포맷의 또다른 불리한 특색이 되는 것으로 여겨진다. 마지막으로, 올바르게 조립된 구축물의 수율을 감소시키고, 원하는 이중특이적 항체를 분리해내기 어려울 수 있는 다수의 비-기능적 부산물을 초래하는, 동시-발현시 상이한 특이성의 항체 중쇄 및 경쇄의 짝짓기오류로 인해, 이중특이적 항체의 일반적 개발에서 주된 도전은 임상적으로 충분한 양 및 순도로 이중특이적 항체 구축물을 생산하는 것이었다.
T 세포 매개 면역요법에 현재 이용가능한 이중특이적 항체와 연관되는 어려움 및 단점을 고려할 때, 그러한 분자의 신규한, 개선된 포맷에 대한 필요가 존재한다. 본 발명은 양호한 효능 및 생산성을 낮은 독성 및 유리한 약동학적 특성과 조합하는 T 세포 활성화 및 방향지정을 위해 설계된 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특히 하나 이상의 안키린 반복 모티프 (motif) 를 포함하는 결합 단백질을 포함하는 신규한 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 단일 도메인 가변 중쇄를 포함하는 신규한 이중특이적 항원 결합 분자가 또한 제공된다. 이러한 신규한 분자는 그들이 더 적은 부산물과 함께 생산될 수 있다는 이점을 가지며, 그 이유는 각각 안키린 모티프 또는 단일 도메인 가변 중쇄를 포함하는 결합체와 항체 중쇄 및 경쇄를 포함하는 결합체 사이에 짝짓기오류가 존재하지 않기 때문이다.
정전기 스티어링 효과를 통해 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛 (subunit) 의 연합을 촉진하는 수식 (modification) 을 포함하는 신규한 이중특이적 항원 결합 분자가 또한 제공된다. 그에 의해 Fc 도메인의 올바른 사슬 연합이 촉진되고, 이러한 분자의 생산 동안 원하지 않는 부산물이 더 적게 발생한다.
하나의 양상에서 본 발명은 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분 (moiety), 및 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서, 상기 하나의 항원 결합 부분은 Fab 분자이거나 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 (crossover) Fab 분자이고, 다른 항원 결합 부분은 단일 도메인 항원 결합 분자를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 구현예에서 상기 단일 도메인 항원 결합 분자는 단일 도메인 가변 중쇄이다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분, 및 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분을 포함하며, 상기 제 1 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자를 포함하고, 상기 제 2 항원 결합 부분은 단일 도메인 가변 중쇄로 이루어진다.
하나의 양상에서 본 발명은 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분, 및 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서, 상기 하나의 항원 결합 부분은 Fab 분자이거나 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 다른 항원 결합 부분은 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 그러한 구현예에서 상기 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 제 2 항원 결합 부분은 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이다.
하나의 그러한 구현예에서 상기 제 2 항원 부분은 2, 3, 4 또는 5 개의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질을 포함한다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인을 부가적으로 포함한다.
특정 구현예에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 1 개 이하의 항원 결합 부분이 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 존재한다 (즉 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 대한 1 가 결합을 제공한다). 특정 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 크로스오버 Fab 분자이다.
하나의 구현예에서 제 1 및 제 2 항원 결합 부분은, 임의로 펩티드 링커를 통해, 서로 융합되어 있다.
하나의 구현예에서 제 2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분을 부가적으로 포함한다.
하나의 그러한 구현예에서 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은 단일 도메인 가변 중쇄이다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
a) 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인;
b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자를 포함하는 제 1 항원 결합 부분으로서, 크로스오버 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 1 항원 결합 부분;
c) 단일 도메인 가변 중쇄를 포함하는 제 2 항원 결합 부분으로서, 단일 도메인 가변 중쇄가 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 2 항원 결합 부분; 및
d) 단일 도메인 가변 중쇄를 포함하는 제 3 항원 결합 부분으로서, 단일 도메인 가변 중쇄가 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 제 3 항원 결합 부분.
하나의 그러한 구현예에서 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이다.
하나의 그러한 구현예에서 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은 2, 3, 4 또는 5 개의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
a) 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인;
b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자를 포함하는 제 1 항원 결합 부분으로서, 크로스오버 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 1 항원 결합 부분;
c) 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질을 포함하는 제 2 항원 결합 부분으로서, 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 2 항원 결합 부분; 및
d) 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질을 포함하는 제 3 항원 결합 부분으로서, 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 제 3 항원 결합 부분.
하나의 구현예에서 상기 제 1 항원 결합 부분은 활성화 T 세포 항원에 결합하고, 상기 제 2 및 제 3 항원 결합 부분은 동일한 표적 세포 항원에 결합한다.
특정 구현예에서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 구체적인 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또다른 구체적인 구현예에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 특정 구현예에서 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다.
특정 구현예에서 Fc 도메인은 제 1 및 제 2 Fc 도메인 서브유닛의 연합을 촉진하는 수식을 포함한다. 구체적인 그러한 구현예에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내에 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 공동 (cavity) 에 위치가능한 융기 (protuberance) 를 생성하고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내에 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 융기가 내부에 위치가능한 공동을 생성한다.
특정 구현예에서 Fc 도메인은, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 특정 구현예에서 Fc 도메인은, 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 하나의 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235, 및 P329 의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 있다. 특정 구현예에서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3 개의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G 이다. 하나의 그러한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 구현예에서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 2 개의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 L235E 및 P329G 이다. 하나의 그러한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 그러한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이고, 아미노산 치환 L235E 및 S228P (SPLE) 를 포함한다.
하나의 구현예에서 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 구현예에서 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 구현예에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 구현예에서, Fc 수용체는 인간 FcγRIIa, FcγRI, 및/또는 FcγRIIIa 이다. 하나의 구현예에서, 효과기 기능은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 이다.
하나의 양상에서 본 발명은 제 1 및 제 2 항원 결합 부분 및 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하며, 상기 항원 결합 부분 중 하나는 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 분자이고, 다른 하나는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 분자이고; 상기 제 1 항원 결합 부분은 (a) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 펩티드 링커에 의해 연결되어 있는 단일 사슬 Fab 분자, 또는 (b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고; 상기 Fc 도메인은 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되고, 상기 제 1 서브유닛 및 상기 제 2 서브유닛은 이종이합체 형성에 정전기적으로 유리한 하나 이상의 하전된 아미노산을 포함하도록 수식되었다.
하나의 구현예에서, 상기 제 1 서브유닛은 아미노산 돌연변이 E356K, E357K 및 D399K 를 포함하고, 제 2 서브유닛은 아미노산 돌연변이 K370E, K409E 및 K439E 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 제 1 서브유닛은 아미노산 돌연변이 K392D, K409D 를 포함하고, 제 2 서브유닛은 아미노산 돌연변이 E356K, D399K (DDKK) 를 포함한다.
특정 구현예에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 1 개 이하의 항원 결합 부분이 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 존재한다 (즉 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 대한 1 가 결합을 제공한다). 특정 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 크로스오버 Fab 분자이다. 더욱더 특별한 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이다.
일부 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제 1 및 제 2 항원 결합 부분은, 임의로 펩티드 링커를 통해, 서로 융합되어 있다. 하나의 그러한 구현예에서, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 또다른 그러한 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 또다른 그러한 구현예에서, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 경쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 제 1 항원 결합 부분이 크로스오버 Fab 분자이고, (i) 제 2 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있거나 또는 (ii) 제 1 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 구현예에서, 부가적으로 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄 및 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄는, 임의로 펩티드 링커를 통해, 서로 융합될 수 있다.
하나의 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제 2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 또다른 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다.
하나의 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제 1 및 제 2 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있다.
특정 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 부분을 포함한다. 하나의 그러한 구현예에서, 제 3 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 특정 구현예에서, T 세포 활성화 항원 결합 분자의 제 2 및 제 3 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 또다른 특별한 구현예에서, T 세포 활성화 항원 결합 분자의 제 1 및 제 3 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있고, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분들은 직접 또는 적합한 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 하나의 구현예에서 제 2 및 제 3 항원 결합 부분 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 특정 구현예에서 면역글로불린 분자는 IgG 클래스 면역글로불린이다. 더욱더 특별한 구현예에서 면역글로불린은 IgG1 서브클래스 면역글로불린이다. 또다른 구현예에서, 면역글로불린은 IgG4 서브클래스 면역글로불린이다.
특정 구현예에서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 구체적인 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또다른 구체적인 구현예에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 특정 구현예에서 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다.
특정 구현예에서 Fc 도메인은, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 특정 구현예에서 Fc 도메인은, 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 하나의 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235, 및 P329 의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 있다. 특정 구현예에서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3 개의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G 이다. 하나의 그러한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 구현예에서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 2 개의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 L235E 및 P329G 이다. 하나의 그러한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 그러한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이고, 아미노산 치환 L235E 및 S228P (SPLE) 를 포함한다.
하나의 구현예에서 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 구현예에서 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 구현예에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 구현예에서, Fc 수용체는 인간 FcγRIIa, FcγRI, 및/또는 FcγRIIIa 이다. 하나의 구현예에서, 효과기 기능은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 이다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 결합할 수 있는 활성화 T 세포 항원은 CD3 이다. 다른 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 결합할 수 있는 표적 세포 항원은 종양 세포 항원이다. 하나의 구현예에서, 표적 세포 항원은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 암배아 항원 (CEA), 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), CD19, CD20 및 CD33.
본 발명의 또다른 양상에 따르면 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 망라한다. 본 발명은 또한 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서 숙주 세포는 진핵생물 세포, 특히 포유류 세포이다.
또다른 양상에서 a) 본 발명의 숙주 세포를 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 및 b) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 생산 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 망라한다.
본 발명은 또한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적 조성물의 사용방법을 망라한다. 하나의 양상에서 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학적 조성물을 제공한다. 하나의 양상에서 그것을 필요로 하는 개체에서의 질환의 치료에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학적 조성물이 제공된다. 구체적인 구현예에서 질환은 암이다.
그것을 필요로 하는 개체에서의 질환의 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도; 뿐만 아니라 개체에게 약학적으로 허용가능한 형태의 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서의 질환의 치료 방법이 또한 제공된다. 구체적인 구현예에서 질환은 암이다. 임의의 상기 구현예에서 개체는 바람직하게는 포유류, 특히 인간이다.
본 발명은 또한 표적 세포를 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재 하에 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해의 유도 방법을 제공한다.
도 1. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 (TCBs) 의 예시적 구성. (A) "1+1 IgG scFab, 한 팔 (one armed)" 의 도해, 및 (B) "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위 (one armed inverted)" 분자의 도해. "1+1 IgG scFab, 한 팔" 분자에서 T 세포 표적화 Fab 의 경쇄가 중쇄에 링커에 의해 연결되어 있으며, 한편 "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" 분자는 종양 표적화 Fab 에서 링커를 갖는다. (C) "2+1 IgG scFab" 분자의 도해. (D) "1+1 IgG scFab" 분자의 도해. (E) "1+1 IgG Crossfab" 분자의 도해. (F) "2+1 IgG Crossfab" 분자의 도해. (G) Crossfab 및 Fab 성분 ("역방위") 의 순서가 대안적인 "2+1 IgG Crossfab" 분자의 도해. (H) "1+1 IgG Crossfab 경쇄 (LC) 융합물" 분자의 도해. (I) "1+1 CrossMab" 분자의 도해. (J) "2+1 IgG Crossfab, 연결된 경쇄" 분자의 도해. (K) "1+1 IgG Crossfab, 연결된 경쇄" 분자의 도해. (L) "2+1 IgG Crossfab, 역방위, 연결된 경쇄" 분자의 도해. (M) "1+1 IgG Crossfab, 역방위, 연결된 경쇄" 분자의 도해. 검은색 점: 이종이합체화를 촉진하는 Fc 도메인 내의 임의적 수식.
도 2. "1+1 IgG scFab, 한 팔" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 1, 3, 5 참조), 비환원 (A) 및 환원 (B), 및 "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 7, 9, 11 참조), 비환원 (C) 및 환원 (D) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨).
도 3. "1+1 IgG scFab, 한 팔" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 1, 3, 5 참조) (A) 및 "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 7, 9, 11 참조) (B) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플 주입됨). (도면에서 Area 는 면적임. 이하 동일).
도 4. "1+1 IgG scFab, 한 팔" (항-EGFR/항-huCD3) (SEQ ID NOs 43, 45, 57 참조), 비환원 (A) 및 환원 (B), 및 "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (항-EGFR/항-huCD3) (SEQ ID NOs 11, 49, 51 참조), 비환원 (C) 및 환원 (D) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨).
도 5. "1+1 IgG scFab, 한 팔" (항-EGFR/항-huCD3) (SEQ ID NOs 43, 45, 47 참조) (A) 및 "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (항-EGFR/항-huCD3) (SEQ ID NOs 11, 49, 51 참조) (B) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플 주입됨).
도 6. (A, B) "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (항-FAP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 11, 51, 55 참조) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨), 비환원 (A) 및 환원 (B). (C) "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (항-FAP/항-huCD3) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플 주입됨).
도 7. (A) "2+1 IgG scFab, P329G LALA" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 5, 21, 23 참조), 비환원 (레인 2) 및 환원 (레인 3); (B) "2+1 IgG scFab, LALA" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조), 비환원 (레인 2) 및 환원 (레인 3); (C) "2+1 IgG scFab, wt" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 5, 13, 15 참조), 비환원 (레인 2) 및 환원 (레인 3); 및 (D) "2+1 IgG scFab, P329G LALA N297D" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 5, 25, 27 참조), 비환원 (레인 2) 및 환원 (레인 3) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨).
도 8. (A) "2+1 IgG scFab, P329G LALA" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 5, 21, 23 참조); (B) "2+1 IgG scFab, LALA" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조); (C) "2+1 IgG scFab, wt" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 5, 13, 15 참조); 및 (D) "2+1 IgG scFab, P329G LALA N297D" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 5, 25, 27 참조) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플 주입됨).
도 9. (A, B) "2+1 IgG scFab, P329G LALA" (항-EGFR/항-huCD3) (SEQ ID NOs 45, 47, 53 참조) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨), 비환원 (A) 및 환원 (B). (C) "2+1 IgG scFab, P329G LALA" (항-EGFR/항-huCD3) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플 주입됨).
도 10. (A, B) "2+1 IgG scFab, P329G LALA" (항-FAP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 57, 59, 61 참조) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨), 비환원 (A) 및 환원 (B). (C) "2+1 IgG scFab, P329G LALA" (항-FAP/항-huCD3) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플 주입됨).
도 11. (A, B) "1+1 IgG Crossfab, Fc(홀) P329G LALA / Fc(놉) wt" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 5, 29, 31, 33 참조) 의 SDS PAGE (4-12% Tris-Acetate (A) 또는 4-12% Bis/Tris (B), NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨), 비환원 (A) 및 환원 (B). (C) "1+1 IgG Crossfab, Fc(홀) P329G LALA / Fc(놉) wt" (항-MCSP/항-huCD3) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플 주입됨).
도 12. (A, B) "2+1 IgG Crossfab" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨), 비환원 (A) 및 환원 (B). (C) "2+1 IgG Crossfab" (항-MCSP/항-huCD3) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플 주입됨).
도 13. (A, B) "2+1 IgG Crossfab" (항-MCSP/항-cyCD3) (SEQ ID NOs 3, 5, 35, 37 참조) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨), 비환원 (A) 및 환원 (B). (C) "2+1 IgG Crossfab" (항-MCSP/항-cyCD3) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플 주입됨).
도 14. (A, B) "2+1 IgG Crossfab, 역방위" (항-CEA/항-huCD3) (SEQ ID NOs 33, 63, 65, 67 참조) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨), 비환원 (A) 및 환원 (B). (C) "2+1 IgG Crossfab, 역방위" (항-CEA/항-huCD3) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플 주입됨).
도 15. (A) "(scFv)2-Fc" 및 "(dsscFv)2-Fc" (항-MCSP (LC007)/항-huCD3 (V9)) 의 열 안정성. 동적 광 산란, 25-75℃ 의 온도 경사로에서 0.05℃/분 으로 측정됨. 검은색 곡선: "(scFv)2-Fc"; 회색 곡선: "(dsscFv)2-Fc". (B) "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 5, 21, 23 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 의 열 안정성. 동적 광 산란, 25-75℃ 의 온도 경사로에서 0.05℃/분 으로 측정됨. 검은색 곡선: "2+1 IgG scFab"; 회색 곡선: "2+1 IgG Crossfab".
도 16. (A) 다양한 Fc-돌연변이체와 인간 FcγRIIIa 의 상호작용, 및 (B) T 세포 이중특이적 구축물과 종양 표적 및 인간 CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(놉)-Avi/Fc(홀) 의 동시 결합의 확인을 위한 Biacore 검정 설정.
도 17. 인간 MCSP 의 D3 도메인 및 인간 CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(놉)-Avi/Fc(홀) 에 대한 T-세포 이중특이적 구축물의 동시 결합. (A) "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조), (B) "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 5, 21, 23 참조).
도 18. 인간 EGFR 및 인간 CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(놉)-Avi/Fc(홀) 에 대한 T-세포 이중특이적 구축물의 동시 결합. (A) "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 45, 47, 53 참조), (B) "1+1 IgG scFab, 한 팔" (SEQ ID NOs 43, 45, 47 참조), (C) "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (SEQ ID NOs 11, 49, 51 참조), 및 (D) "1+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 47, 53, 213 참조).
도 19. FACS 에 의해 측정된 주르카트 (Jurkat) 세포에서 발현된 CD3 (A), 또는 Colo-38 세포 상의 MCSP (B) 에 대한 "(scFv)2" 분자 (50 nM) 의 결합. 미처리 세포 및 오직 2 차 항체로 염색된 세포와 비교되는 평균 형광 강도가 나타나 있다.
도 20. FACS 에 의해 측정된 주르카트 세포에서 발현된 CD3 (A), 또는 Colo-38 세포 상의 MCSP (B) 에 대한 "2+1 IgG scFab, LALA" (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 구축물 (50 nM) 의 결합. 기준 항-CD3 IgG 로 처리된 세포 (명시된 바와 같음), 미처리 세포, 및 오직 2 차 항체로 염색된 세포와 비교되는 평균 형광 강도가 나타나 있다.
도 21. FACS 에 의해 측정된 주르카트 세포에서 발현된 CD3 (A), 또는 Colo-38 세포 상의 MCSP (B) 에 대한 "1+1 IgG scFab, 한 팔" (SEQ ID NOs 1, 3, 5 참조) 및 "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (SEQ ID NOs 7, 9, 11 참조) 구축물 (50 nM) 의 결합. 기준 항-CD3 또는 항-MCSP IgG 로 처리된 세포 (명시된 바와 같음), 미처리 세포, 및 오직 2 차 항체로 염색된 세포와 비교되는 평균 형광 강도가 나타나 있다.
도 22. FACS 에 의해 측정된 Colo-38 세포 상의 MCSP 에 대한 "2+1 IgG scFab, LALA" (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 이중특이적 구축물 및 상응하는 항-MCSP IgG 의 용량 의존적 결합.
도 23. 명시된 바와 같은 Colo-38 종양 표적 세포 (PBMCs 대 종양 세포의 E:T 비율 = 10:1) 의 존재 또는 부재 하의 1 nM 의 "2+1 IgG scFab, LALA" (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 또는 "(scFv)2" CD3-MCSP 이중특이적 구축물과의 인큐베이션 이후 인간 T 세포 상의 상이한 활성화 마커의 표면 발현 수준. 각각 15 또는 24 시간 인큐베이션 이후 CD8+ T 세포 상의 조기 활성화 마커 CD69 (A), 또는 후기 활성화 마커 CD25 (B) 의 발현 수준이 나타나 있다.
도 24. 명시된 바와 같은 Colo-38 종양 표적 세포 (E:T 비율 = 5:1) 의 존재 또는 부재 하의 1 nM 의 "2+1 IgG scFab, LALA" (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 또는 "(scFv)2" CD3-MCSP 이중특이적 구축물과의 인큐베이션 이후 인간 T 세포 상의 후기 활성화 마커 CD25 의 표면 발현 수준. 5 일 인큐베이션 이후 CD8+ T 세포 (A) 또는 CD4+ T 세포 (B) 상의 후기 활성화 마커 CD25 의 발현 수준이 나타나 있다.
도 25. 인간 MCSP-발현 MV-3 종양 표적 세포 (E:T 비율 = 3:1) 의 존재 또는 부재 하의 명시된 농도의 "2+1 IgG Crossfab" 이중특이적 구축물 (사이노몰구스 CD3 및 인간 MCSP 를 표적화; SEQ ID NOs 3, 5, 35, 37 참조) 과의 43 시간 인큐베이션 이후 2 가지 상이한 동물 (cyno Nestor, cyno Nobu) 로부터의 사이노몰구스 CD8+ T 세포 상의 후기 활성화 마커 CD25 의 표면 발현 수준. 대조군으로서, 기준 IgG (항-사이노몰구스 CD3 IgG, 항-인간 MCSP IgG) 또는 비생리적 자극 PHA-M 을 사용했다.
도 26. U87MG 종양 세포 (E:T 비율 = 5:1) 의 존재 하에 "2+1 IgG scFab, LALA" CD3-MCSP 이중특이적 구축물 (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 에 의해 18.5 시간 동안 활성화된 인간 pan T 세포에 의해 분비된 IFN-γ 수준. 대조군으로서, 상응하는 항-CD3 및 항-MCSP IgG 를 투여했다.
도 27. 인간 pan T 세포 (E:T 비율 = 5:1) 와의 공배양 및 상이한 농도의 "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 5, 21, 23 참조), "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "(scFv)2" 이중특이적 분자 및 상응하는 IgG 에 의한 20 시간 동안의 활성화 이후 MDA-MB-435 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 28. 인간 pan T 세포 (E:T 비율 = 5:1) 와의 공배양, 및 상이한 농도의 이중특이적 구축물 및 상응하는 IgG 에 의한 20 시간 동안의 활성화 이후 MDA-MB-435 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨). Fc-도메인이 상이한 "2+1 IgG scFab" 구축물 (야생형 Fc 도메인 (SEQ ID NOs 5, 13, 15 참조), 또는 (NK) 효과기 세포 기능을 폐지하도록 돌연변이된 Fc-도메인: P329G LALA (SEQ ID NOs 5, 21, 23 참조), P329G LALA N297D (SEQ ID NOs 5, 25, 27 참조) 을 가짐) 및 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 구축물을 비교했다.
도 29. 18.5 시간 동안 CD3-MCSP 이중특이적 "2+1 IgG scFab, LALA" (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 구축물, "(scFv)2" 분자 또는 상응하는 IgG 로 처리된 인간 pan T 세포 (E:T 비율 = 5:1) 와의 공배양 이후 Colo-38 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 30. 18 시간 동안 CD3-MCSP 이중특이적 "2+1 IgG scFab, LALA" (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 구축물, "(scFv)2" 분자 또는 상응하는 IgG 로 처리된 인간 pan T 세포 (E:T 비율 = 5:1) 와의 공배양 이후 Colo-38 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 31. 인간 pan T 세포 (E:T 비율 = 5:1) 와의 공배양, 및 상이한 농도의 CD3-MCSP 이중특이적 "2+1 IgG scFab, LALA" (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 구축물, "(scFv)2" 분자 또는 상응하는 IgG 에 의한 23.5 시간 동안의 활성화 이후 MDA-MB-435 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 32. 인간 pan T 세포 (E:T 비율 = 5:1) 와의 공배양 및 상이한 농도의 CD3-MCSP 이중특이적 "1+1 IgG scFab, 한 팔" (SEQ ID NOs 1, 3, 5 참조), "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (SEQ ID NOs 7, 9, 11 참조) 또는 "(scFv)2" 구축물, 또는 상응하는 IgG 에 의한 19 시간 동안의 활성화 이후 Colo-38 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 33. 20 시간 동안 "1+1 IgG scFab" CD3-MCSP 이중특이적 구축물 (SEQ ID NOs 5, 21, 213 참조) 또는 "(scFv)2" 분자로 처리된 인간 pan T 세포 (E:T 비율 = 5:1) 와의 공배양 이후 Colo-38 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 34. 인간 pan T 세포 (E:T 비율 = 5:1) 와의 공배양, 및 상이한 농도의 이중특이적 구축물 및 상응하는 IgG 에 의한 21 시간 동안의 활성화 이후 MDA-MB-435 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨). CD3-MCSP 이중특이적 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "1+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 5, 29, 31, 33 참조) 구축물, "(scFv)2" 분자 및 상응하는 IgG 를 비교했다.
도 35. 135 ng/㎖ 또는 1.35 ng/㎖ 의 "2+1 IgG Crossfab" CD3-MCSP 이중특이적 구축물 (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) (E:T 비율 = 25:1) 에 의한 인간 T 세포의 활성화에 의해 유도된 상이한 표적 세포 (MCSP-양성 Colo-38 종양 표적 세포, 골수 또는 지방 조직에서 유래하는 중간엽 줄기 세포, 또는 태반으로부터의 혈관주위세포; 명시된 바와 같음) 의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 36. 인간 PBMC 및 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG scFab, LALA" (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 및 "(scFv)2") 또는 당조작된 항-MCSP IgG (GlycoMab) 와의 공배양 이후 21h 의 밤새 인큐베이션 후에 측정된 Colo-38 종양 표적 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨). 효과기 대 표적 세포 비율은 25:1 (A) 로 고정되거나, 묘사된 바와 같이 달랐다 (B). PBMC 를 신선한 혈액 (A) 으로부터 또는 버피 코트 (Buffy Coat) (B) 로부터 단리했다.
도 37. 사이노몰구스 CD3 및 인간 MCSP 를 표적화하는 "2+1 IgG Crossfab" 구축물 (SEQ ID NOs 3, 5, 35, 37 참조) 의 시간-의존적 세포독성 효과. 24 h 또는 43 h 동안 일차 사이노몰구스 PBMC (E:T 비율 = 3:1) 와의 공배양 이후 인간 MCSP-발현 MV-3 세포로부터의 LDH 방출이 묘사되어 있다. 대조군으로서, 기준 IgG (항-cyno CD3 IgG 및 항-인간 MCSP IgG) 를 동일한 몰농도로 사용했다. PHA-M 은 (비생리적) T 세포 활성화에 대한 대조군으로서의 역할을 했다.
도 38. ~26 시간 동안 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "(scFv)2") 로 처리된 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 와의 공배양 이후 huMCSP-양성 MV-3 흑색종 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 39. 18 시간 동안 상이한 CD3-EGFR 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 45, 47, 53 참조), "1+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 47, 53, 213 참조) 및 "(scFv)2") 또는 기준 IgG 로 처리된 인간 pan T 세포 (E:T 비율 = 5:1) 와의 공배양 이후 EGFR-양성 LS-174T 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 40. 21 시간 동안 상이한 CD3-EGFR 이중특이적 구축물 ("1+1 IgG scFab, 한 팔" (SEQ ID NOs 43, 45, 47 참조), "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (SEQ ID NOs 11, 49, 51 참조), "1+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 47, 53, 213 참조) 및 "(scFv)2") 또는 기준 IgG 로 처리된 인간 pan T 세포 (E:T 비율 = 5:1) 와의 공배양 이후 EGFR-양성 LS-174T 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 41. 16 시간 동안 상이한 CD3-EGFR 이중특이적 구축물 ("1+1 IgG scFab, 한 팔" (SEQ ID NOs 43, 45, 47 참조), "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (SEQ ID NOs 11, 49, 51 참조) 및 "(scFv)2") 또는 기준 IgG 로 처리된 인간 pan T 세포 (A) 또는 인간 미감작 T 세포 (B) 와의 공배양 이후 EGFR-양성 LS-174T 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨). 효과기 대 표적 세포 비율은 5:1 이었다.
도 42. ~18 시간 동안 상이한 CD3-FAP 이중특이적 구축물 ("1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (SEQ ID NOs 11, 51, 55 참조), "1+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 57, 61, 213 참조), "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 57, 59, 61 참조) 및 "(scFv)2") 로 처리된 인간 pan T 세포 (E:T 비율 = 5:1) 와의 공배양 이후 FAP-양성 GM05389 섬유모세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 43. 6h 동안 표적 세포의 존재 (A) 또는 부재 (B) 하에 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG scFab, LALA" (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 및 "(scFv)2") 또는 상응하는 대조군 IgG 로 처리된 CD8+ T 세포 내의 CD107a/b 의 발현 수준, 뿐만 아니라 퍼포린 수준의 유동 세포측정 분석. 인간 pan T 세포를 5:1 의 효과기 대 표적 비율에서 Colo-38 종양 표적 세포의 존재 또는 부재 하에 9.43 nM 의 상이한 분자와 인큐베이션했다. 첫 1 시간의 인큐베이션 후에 모넨신을 첨가하여 단백질 수송을 방지함으로써 세포내 단백질 수준을 증가시켰다. 게이트를 묘사된 바와 같이 전부 CD107a/b 양성, 퍼포린-양성 또는 이중-양성 세포로 설정했다.
도 44. 5:1 의 효과기 대 표적 세포 비율에서 Colo-38 종양 표적 세포의 존재 또는 부재 하의 1 nM 의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG scFab, LALA" (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 또는 "(scFv)2") 또는 상응하는 대조군IgG 와의 인큐베이션 이후 CD8+ (A) 또는 CD4+ (B) 인간 T 세포의 상대 증식. CFSE-표지된 인간 pan T 세포를 FACS 에 의해 특성분석했다. 게이트를 비-증식성 세포 주위에 설정하고 기준로서 전체 측정된 세포 수에 상대적인 이러한 게이트의 세포 수를 사용하여 상대 증식 수준을 확인했다.
도 45. 24 시간 동안 Colo-38 종양 세포의 존재 (A) 또는 부재 (B) 하에 1 nM 의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG scFab, LALA" (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조) 또는 "(scFv)2") 또는 상응하는 대조군 IgG 에 의한 처리 이후 인간 PBMC 의 상청액 중 측정된 상이한 사이토카인의 수준. 효과기 대 표적 세포 비율은 10:1 이었다.
도 46. 24 시간 동안 Colo-38 종양 세포의 존재 (A, B) 또는 부재 (C, D) 하에 1 nM 의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG scFab", "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 또는 "(scFv)2") 또는 상응하는 대조군 IgG 에 의한 처리 이후 전혈의 상청액 중 측정된 상이한 사이토카인의 수준. 이중특이적 구축물 중에는 야생형 Fc 도메인 (SEQ ID NOs 5, 13, 15 참조), 또는 (NK) 효과기 세포 기능을 폐지하도록 돌연변이된 Fc 도메인 (LALA (SEQ ID NOs 5, 17, 19 참조), P329G LALA (SEQ ID NOs 5, 2, 23 참조) 및 P329G LALA N297D (SEQ ID NOs 5, 25, 27 참조)) 을 갖는 상이한 "2+1 IgG scFab" 구축물이 있었다.
도 47. CE-SDS 분석. 2+1 IgG Crossfab, 연결된 경쇄 (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 179 참조) 의 SDS PAGE 로서 제시된 전기영동도 (Electropherogram). (레인 1: 환원, 레인 2: 비환원).
도 48. 2+1 IgG Crossfab, 연결된 경쇄 (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 179 참조) (최종 산물) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피. 20 ㎍ 샘플을 주입했다.
도 49. ~ 44 시간 동안 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 연결된 LC (linked LC)" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 179 참조)) 로 처리된 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 에 의한 공배양 이후 MCSP-양성 MV-3 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨). 인간 PBMC 를 건강한 자원자의 신선한 혈액으로부터 단리했다.
도 50. ~22 시간 동안 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 연결된 LC" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 179 참조)) 로 처리된 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 에 의한 공배양 이후 MCSP-양성 Colo-38 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨). 인간 PBMC 를 건강한 자원자의 신선한 혈액으로부터 단리했다.
도 51. ~22 시간 동안 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 연결된 LC" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 179 참조)) 로 처리된 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 에 의한 공배양 이후 MCSP-양성 Colo-38 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨). 인간 PBMC 를 건강한 자원자의 신선한 혈액으로부터 단리했다.
도 52. ~22 시간 동안 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 연결된 LC" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 179 참조)) 로 처리된 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 에 의한 공배양 이후 MCSP-양성 WM266-4 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨). 인간 PBMC 를 건강한 자원자의 신선한 혈액으로부터 단리했다.
도 53. 인간 MCSP-발현 Colo-38 종양 표적 세포 (E:T 비율 = 10:1) 의 존재 또는 부재 하의 10 nM, 80 pM 또는 3 pM 의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 ("2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 연결된 LC" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 179 참조)) 와의 22 시간 인큐베이션 이후 인간 CD8+ T 세포 상의 조기 활성화 마커 CD69 (A) 및 후기 활성화 마커 CD25 (B) 의 표면 발현 수준. (도면에서 n.d. 는 확인되지 않음을 의미함. 이하 동일함).
도 54. CE-SDS 분석. (A) 1+1 IgG Crossfab; VL/VH 교환 (LC007/V9) (SEQ ID NOs 5, 29, 33, 181 참조) 의 SDS-PAGE 로서 제시된 전기영동도: a) 비환원, b) 환원. (B) 1+1 CrossMab; CL/CH1 교환 (LC007/V9) (SEQ ID NOs 5, 23, 183, 185 참조) 의 SDS-PAGE 로서 제시된 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (C) 2+1 IgG Crossfab, 역방위; CL/CH1 교환 (LC007/V9) (SEQ ID NOs 5, 23, 183, 187 참조) 의 SDS-PAGE 로서 제시된 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (D) 2+1 IgG Crossfab; VL/VH 교환 (M4-3 ML2/V9) (SEQ ID NOs 33, 189, 191, 193 참조) 의 SDS-PAGE 로서 제시된 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (E) 2+1 IgG Crossfab; CL/CH1 교환 (M4-3 ML2/V9) (SEQ ID NOs 183, 189, 193, 195 참조) 의 SDS-PAGE 로서 제시된 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (F) 2+1 IgG Crossfab, 역방위; CL/CH1 교환 (CH1A1A/V9) (SEQ ID NOs 65, 67, 183, 197 참조) 의 SDS-PAGE 로서 제시된 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (G) 2+1 IgG Crossfab; CL/CH1 교환 (M4-3 ML2/H2C) (SEQ ID NOs 189, 193, 199, 201 참조) 의 SDS-PAGE 로서 제시된 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (H) 2+1 IgG Crossfab, 역방위; CL/CH1 교환 (431/26/V9) (SEQ ID NOs 183, 203, 205, 207 참조) 의 SDS-PAGE 로서 제시된 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (I) "2+1 IgG Crossfab 경쇄 융합물" (CH1A1A/V9) (SEQ ID NOs 183, 209, 211, 213 참조) 의 SDS-PAGE 로서 제시된 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (J) "2+1 IgG Crossfab" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 217 참조) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨), 비환원 (왼쪽) 및 환원 (오른쪽). (K) "2+1 IgG Crossfab, 역방위" (항-MCSP/항-huCD3) (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 219 참조) 의 SDS-PAGE 로서 제시된 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (L) "1+1 IgG Crossfab" (항-CD33/항-huCD3) (SEQ ID NOs 33, 213, 221, 223 참조) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨), 환원 (왼쪽) 및 비환원 (오른쪽). (M) "2+1 IgG Crossfab" (항-CD33/항-huCD3) (SEQ ID NOs 33, 221, 223, 225 참조) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨), 환원 (왼쪽) 및 비환원 (오른쪽). (N) "2+1 IgG Crossfab" (항-CD20/항-huCD3) (SEQ ID NOs 33, 227, 229, 231 참조) 의 SDS PAGE (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, 쿠마시-염색됨), 비환원.
도 55. FACS 에 의해 확인된 주르카트 세포 (A) 에 의해 발현된 인간 CD3 에 대한, 또는 LS-174T 세포 (B) 에 의해 발현된 인간 CEA 에 대한 이중특이적 구축물 (CEA/CD3 "2+1 IgG Crossfab, 역방위 (VL/VH)" (SEQ ID NOs 33, 63, 65, 67 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 역방위 (CL/CH1)" (SEQ ID NOs 65, 67, 183, 197 참조)) 의 결합. 대조군으로서, 등가 최대 농도의 기준 IgG 및 표지된 2 차 항체 (염소 항-인간 FITC-접합된 AffiniPure F(ab')2 Fragment, Fcγ Fragment-Specific, Jackson Immuno Research Lab # 109-096-098) 로 인한 배경 염색을 또한 평가했다.
도 56. FACS 에 의해 확인된 주르카트 세포 (A) 에 의해 발현된 인간 CD3 에 대한, 또는 WM266-4 종양 세포 (B) 에 의해 발현된 인간 MCSP 에 대한 이중특이적 구축물 구축물 (MCSP/CD3 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 역방위" (SEQ ID NOs 5, 23, 183, 187 참조)) 의 결합.
도 57. FACS 에 의해 확인된 주르카트 세포 (A) 에 의해 발현된 인간 CD3 에 대한, 또는 LS-174T 세포 (B) 에 의해 발현된 인간 CEA 에 대한 "1+1 IgG Crossfab 경쇄 융합물" (SEQ ID NOs 183, 209, 211, 213 참조) 의 결합.
도 58. FACS 에 의해 확인된 주르카트 세포 (A) 에 의해 발현된 인간 CD3 에 대한, 또는 WM266-4 종양 세포 (B) 에 의해 발현된 인간 MCSP 에 대한 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 217 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 역방위" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 219 참조) 구축물 의 결합.
도 59. 명시된 농도의 CD3/MCSP "1+1 CrossMab" (SEQ ID NOs 5, 23, 183, 185 참조), "1+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 5, 29, 33, 181 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 구축물과의 24 시간 인큐베이션 이후 인간 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 상의 조기 활성화 마커 CD69 (A) 또는 후기 활성화 마커 CD25 (B) 의 표면 발현 수준. 명시된 바와 같이 MV-3 표적 세포의 존재 또는 부재 하에 검정을 수행했다.
도 60. ~41 시간 동안 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 217 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 역방위" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 219 참조) 로 처리된 사이노몰구스 PBMC (E:T 비율 = 3:1, CD3+ 수로 정규화됨) 와의 공배양 이후 huMCSP-양성 MV-3 종양 세포의 존재 또는 부재 하의 2 가지 상이한 사이노몰구스 원숭이 (A 및 B) 로부터의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 상의 조기 활성화 마커 CD25 의 표면 발현 수준.
도 61. 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 와의 공배양 및 상이한 농도의 "2+1 IgG Crossfab, 역방위 (VL/VH)" (SEQ ID NOs 33, 63, 65, 67 참조) vs. "2+1 IgG Crossfab, 역방위 (CL/CH1)" (SEQ ID NOs 65, 67, 183, 197 참조) 구축물에 의한 28 시간 동안의 활성화 이후 MKN-45 (A) 또는 LS-174T (B) 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 62. 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 와의 공배양 및 상이한 농도의 "2+1 IgG Crossfab (VL/VH)" (SEQ ID NOs 33, 189, 191, 193 참조) vs. "2+1 IgG Crossfab (CL/CH1)" (SEQ ID NOs 183, 189, 193, 195 참조) 구축물에 의한 26 시간 동안의 활성화 이후 WM266-4 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 63. 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 와의 공배양 및 상이한 농도의 "2+1 IgG Crossfab (VH/VL)" (SEQ ID NOs 33, 189, 191, 193 참조) vs. "2+1 IgG Crossfab (CL/CH1)" (SEQ ID NOs 183, 189, 193, 195 참조) 구축물에 의한 27 시간 동안의 활성화 이후 MV-3 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 64. 명시된 바와 같이 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 와의 공배양 및 상이한 농도의 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조), "1+1 CrossMab" (SEQ ID NOs 5, 23, 183, 185 참조), 및 "1+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 5, 29, 33, 181 참조) 에 의한 21 시간 동안의 활성화 이후 인간 MCSP-양성 WM266-4 (A) 또는 MV-3 (B) 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 65. 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 와의 공배양 및 상이한 농도의 "1+1 IgG Crossfab LC 융합물" (SEQ ID NOs 183, 209, 211, 213 참조) 에 의한 28 시간 동안의 활성화 이후 MKN-45 (A) 또는 LS-174T (B) 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 66. 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 와의 공배양 및 상이한 농도의 "1+1 IgG Crossfab LC 융합물" (SEQ ID NOs 183, 209, 211, 213 참조) vs. 표적화되지 않은 "2+1 IgG Crossfab" 기준에 의한 24 시간 동안의 활성화 이후 MC38-huCEA 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 67. "2+1 IgG Crossfab (V9)" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 역방위 (V9)" (SEQ ID NOs 5, 23, 183, 187 참조), "2+1 IgG Crossfab (항-CD3)" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 217 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 역방위 (항-CD3)" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 219 참조) 구축물로 처리된 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 와의 공배양 이후 인간 MCSP-양성 MV-3 (A) 또는 WM266-4 (B) 종양 세포의 살해 (LDH 방출에 의해 측정됨).
도 68. MCSP TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위) 분자의 도해.
도 69. MCSP TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위, SEQ ID NOs 278, 319, 320, 321) 의 CE-SDS 분석. MCSP TCB 의 SDS-Page 로서 제시된 전기영동도: A) 비환원, B) 환원.
도 70. MCSP TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위, SEQ ID NOs 278, 319, 320, 321) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피, 크로마토그램 A280 (TSKgel G3000 SW XL [Tosoh]; 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7; 20ug 샘플을 주입했다.
도 71. CEA TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위 ) 분자의 도해.
도 72. CEA TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위, SEQ ID NOs 288, 322, 323, 324)) 분자의 CE-SDS 분석. CEA TCB 의 SDS-Page 로서 제시된 전기영동도: A) 비환원, B) 환원.
도 73. CEA TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위 SEQ ID NOs 288, 322, 323, 324)) 분자의 분석적 크기 배제 크로마토그래피, 크로마토그램 A280 (TSKgel G3000 SW XL [Tosoh]; 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7; 20ug 샘플을 주입했다.
도 74. A375 세포 (MCSP+) (A) 및 주르카트 (CD3+ 세포) (B) 에 대한 MCSP TCB (SEQ ID NOs 278, 319, 320, 321) 의 결합. "표적화되지 않은 TCB": CD3 과 맞물리나 (engaging) 제 2 항원과 맞물리지 않는 이중특이적 항체.
도 75. A375 (높은 MCSP) (A), MV-3 (중간 MCSP) (B), HCT-116 (낮은 MCSP) (C) 및 LS180 (MCSP 음성) (D) 표적 세포 (E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 인큐베이션 시간 24 h) 의 MCSP TCB 항체 (SEQ ID NOs 278, 319, 320, 321) 에 의해 유도된 T-세포 살해. "표적화되지 않은 TCB": CD3 과 맞물리나 제 2 항원과 맞물리지 않는 이중특이적 항체.
도 76. MCSP TCB 항체 (SEQ ID NOs 278, 319, 320, 321) 에 의해 유도된 MV3 흑색종 세포 (E:T = 10:1, 24 h 인큐베이션) 의 T 세포-매개 살해 이후 인간 CD8+ (A, B) 및 CD4+ (C, D) T 세포 상의 CD25 및 CD69 의 상향조절. "표적화되지 않은 TCB": CD3 과 맞물리나 제 2 항원과 맞물리지 않는 이중특이적 항체.
도 77. MCSP TCB 항체 (SEQ ID NOs 278, 319, 320, 321) 에 의해 유도된 MV3 흑색종 세포 (E:T = 10:1, 24 h 인큐베이션) 의 T 세포 매개되는 살해 이후 인간 PBMC 에 의한 IL-2 (A), IFN-γ (B), TNFα (C), IL-4 (D), IL-10 (E) 및 그란자임 (Granzyme) B (F) 의 분비. "표적화되지 않은 TCB": CD3 과 맞물리나 제 2 항원과 맞물리지 않는 이중특이적 항체.
도 78. LS180 (중간 CEA 종양 세포) (A) 및 주르카트 (CD3+ 세포) (B) 에 대한 CEA TCB (SEQ ID NOs 288, 322, 323, 324) 의 결합.
도 79. MKN45 (높은 CEA) (A), LS180 (중간 CEA) (B), HT-29 (낮은 CEA) (C) (E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 인큐베이션 시간 24 h) 의 CEA TCB (SEQ ID NOs 288, 322, 323, 324) 에 의해 유도된 T-세포 살해. "표적화되지 않은 TCB": CD3 과 맞물리나 제 2 항원과 맞물리지 않는 이중특이적 항체.
도 80. CEA TCB (SEQ ID NOs 288, 322, 323, 324) 에 의해 유도된 LS180 대장 샘암종 세포 (E:T = 10:1, 24 h 인큐베이션) 의 T 세포-매개 살해 이후 인간 CD8+ (A, B) 및 CD4+ (C, D) T 세포 상의 CD25 및 CD69 의 상향조절. "표적화되지 않은 TCB": CD3 과 맞물리나 제 2 항원과 맞물리지 않는 이중특이적 항체.
도 81. CEA TCB (SEQ ID NOs 288, 322, 323, 324) 에 의해 유도된 LS180 대장 샘암종 세포 (E:T = 10:1, 24 h 인큐베이션) 의 T 세포 매개되는 살해 이후 IFN-γ (A), TNFα (B), 그란자임 B (C), IL-4 (D), IL-10 (E) 의 분비. "표적화되지 않은 TCB": CD3 과 맞물리나 제 2 항원과 맞물리지 않는 이중특이적 항체.
도 82. 비결합 항체로서 DP47 GS 및 항 CD3 항체로서 인간화 CH2527 을 함유하는 DP47 GS TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위 = "표적화되지 않은 TCB", SEQ ID NOs 325, 326, 327, 328) 의 CE-SDS 분석. DP47 GS TCB 의 SDS-Page 로서 제시된 전기영동도: A) 비환원, B) 환원.
도 83. 비결합 항체로서 DP47 GS 및 항 CD3 항체로서 인간화 CH2527 을 함유하는 DP47 GS TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위= "표적화되지 않은 TCB", SEQ ID NOs 325, 326, 327, 328) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피, 크로마토그램 A280 (TSKgel G3000 SW XL [Tosoh]; 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7; 20ug 샘플을 주입했다.
도 84. 비-성숙된 부모 (부모) 클론 (M4-3 ML2) 과 비교되는 친화도 성숙된 항-MCSP 클론의 정렬.
도 85. aVH TCB 분자의 도해.
도 86. CE-SDS 분석. aVH TCB (SEQ ID NOs 369, 370, 371) 의 SDS-Page 로서 제시된 전기영동도: A) 비환원, B) 환원.
도 87. MV-3 세포 (MCSP+) (A) 및 주르카트 (CD3+ 세포) (B) 에 대한 aVH TCB (SEQ ID NOs 369, 370, 371) 의 결합.
도 88. 인큐베이션 (E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC) 이후 24 h (A) 및 48 h (B) 에 탐지된 MV-3 흑색종 세포의 aVH TCB 항체 (SEQ ID NOs 369, 370, 371) 에 의해 유도된 T-세포 살해.
도 89. 다르핀 TCB 분자의 도해.
도 90. CE-SDS 분석. 다르핀 TCB (SEQ ID NOs 376, 377, 378) 의 SDS-Page 로서 제시된 전기영동도: A) 비환원, B) 환원.
도 91. KPL-4 세포 (Her2+) (A) 및 주르카트 (CD3+ 세포) (B) 에 대한 다르핀 TCB 의 결합.
도 92. 인큐베이션 (E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC) 이후 24 h (A) 및 48 h (B) 에 탐지된 KPL-4 세포의 다르핀 TCB 항체 (SEQ ID NOs 376, 377, 378) 에 의해 유도된 T-세포 살해.
도 93. hIgG1 DDKK TCB 분자의 도해.
도 94. CE-SDS 분석. hIgG1 DDKK TCB (SEQ ID NOs 372, 373,374,375) 의 SDS-Page 로서 제시된 전기영동도: A) 비환원, B) 환원.
도 95. MV-3 흑색종 세포 (MCSP+) (A) 및 주르카트 (CD3+ 세포) (B) 에 대한 hIgG1 DDKK TCB (SEQ ID NOs 372, 373,374,375) 의 결합.
도 96. 인큐베이션 (E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC) 이후 24 h (A) 및 48 h (B) 에 탐지된 MV-3 (중간 MCSP) 의 hIgG1 DDKK TCB 항체 (SEQ ID NOs 372, 373,374,375) 에 의해 유도된 T-세포 살해.
정의
용어들은, 하기에서 달리 정의되지 않는 한, 당업계에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 분자" 는 최대한 넓은 의미에서 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 나타낸다. 항원 결합 분자들의 예시는 면역글로불린 및 그의 유도체, 예를 들어 조각이 있다.
용어 "이중특이적" 은 항원 결합 분자가 2 개 이상의 구별되는 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 일반적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2 개의 항원 결합 자리를 포함하는데, 이들 각각은 상이한 항원 결정인자에 대해 특이적이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 2 개의 항원 결정인자, 특별하게는 2 가지 구별되는 세포 상에 발현되는 2 가지 항원 결정인자에 동시에 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합가" 는 항원 결합 분자 내 특정 갯수의 항원 결합 자리가 존재함을 나타낸다. 마찬가지로, 용어 "항원에 대한 1 가 결합" 은 항원 결합 분자 내 항원에 특이적인 항원 결합 자리가 1 개 (1 개를 초과하지 않음) 존재함을 의미한다.
"항원 결합 자리" 는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자의 자리, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 나타낸다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 자리는 상보성 결정 영역 (CDR) 유래의 아미노산 잔기를 포함한다. 천연 면역글로불린 분자는 전형적으로 2 개의 항원 결합 자리를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 has 단일 항원 결합 자리를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 부분" 은 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 항원 결합 부분은 그것이 부착되어 있는 독립체 (예를 들어 제 2 항원 결합 부분) 를 표적 자리, 예를 들어 항원 결정인자를 보유하는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 기질에게로 유도할 수 있다. 또다른 구현예에서 항원 결합 부분은 그것의 표적 항원, 예를 들어 T 세포 수용체 복합체 항원을 통하는 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 항원 결합 부분은 본원에서 상세히 설명할 항체 및 그의 조각, 뿐만 아니라 결합 단백질 및 스카폴드를 포함한다. 특별한 항원 결합 부분은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 기타 항원 결합 부분은 하나 이상의 안키린 반복 모티프 및 단일 도메인 항원 결합 (SDAB) 분자를 포함하는 결합 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 부분은 본원에서 추가로 정의하며, 당업계에 공지되어 있는 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 임의의 다섯가지 아이소타입을 포함한다: α, β, ε, γ 및 μ. 유용한 경쇄 불변 영역은 임의의 두가지 아이소타입을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결정인자" 는 "항원" 및 "에피토프" 와 동의어이며, 항원 결합 부분이 결합하여, 항원 결합 부분-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 자리 (예를 들어, 연속적인 스트렛치의 아미노산, 또는 비연속적 아미노산의 상이한 영역들로 만들어진 구조적 입체배치) 를 나타낸다. 유용한 항원 결정인자는 예를 들어 종양 세포의 표면, 바이러스-감염 세포의 표면, 기타 질환에 걸린 세포의 표면, 면역 세포의 표면, 혈액의 혈청 중 유리되어 및/또는 세포외 매트릭스 (ECM) 에서 발견될 수 있다. 본원에서 항원으로 지칭되는 단백질들 (예를 들어, MCSP, FAP, CEA, EGFR, CD33, CD3) 은 달리 언급되지 않는다면 영장류 (예를 들어, 인간) 및 쥐과동물 (예를 들어, 마우스 및 래트) 과 같은 포유류를 포함해 임의의 척추동물 공급원 유래의 임의의 천연 형태 단백질일 수 있다. 특별한 구현예에서, 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정 단백질 언급시, 용어는 "전장" 의, 비가공 단백질 뿐만 아니라 세포에서의 가공과정 결과 제공되는 임의의 형태의 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 단백질의 자연 발생 변이체들, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 항원으로서 적합한 예시되는 인간 단백질은, 이에 제한되지 않으나, 하기의 것을 포함한다: 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 이는 또한 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 로서 알려져 있음 (UniProt no. Q6UVK1 (버전 70), NCBI RefSeq no. NP_001888.2); 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 이는 또한 Seprase 로서 알려져 있음 (Uni Prot nos. Q12884, Q86Z29, Q99998, NCBI Accession no. NP_004451); 암배아 항원 (CEA), 이는 또한 암배아 항원-관련 세포 부착 분자 5 로서 알려져 있음 (UniProt no. P06731 (버전 119), NCBI RefSeq no. NP_004354.2); CD33, 이는 또한 gp67 또는 Siglec-3 로서 알려져 있음 (UniProt no. P20138, NCBI Accession nos. NP_001076087, NP_001171079); 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 이는 또한 ErbB-1 또는 Her1 로서 알려져 있음 (UniProt no. P0053, NCBI Accession nos. NP_958439, NP_958440), 및 CD3, 특히 CD3 의 엡실론 서브유닛 (인간 서열에 대해 UniProt no. P07766 (버전 130), NCBI RefSeq no. NP_000724.1, SEQ ID NO: 265; 또는 사이노몰구스 [필리핀 원숭이 (Macaca fascicularis)] 서열에 대해 UniProt no. Q95LI5 (버전 49), NCBI GenBank no. BAB71849.1, SEQ ID NO: 266 참조). 특정 구현예에서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 종으로부터의 활성화 T 세포 항원 또는 표적 항원 중에서 보존되어 있는 활성화 T 세포 항원 또는 표적 세포 항원의 에피토프에 결합한다.
"특이적 결합" 은 해당 결합이 항원에 대해 선택적이며, 원치 않거나 또는 비-특이적인 상호작용으로부터 구별될 수 있음을 의미한다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 항원 결합 부분의 능력은 효소-연계 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 기타 기술들, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 (BIAcore 기기 상에서 분석) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적인 결합 검정 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) 을 통해 측정될 수 있다. 하나의 구현예에서, 무관한 단백질에 대한 항원 결합 부분의 결합 정도는 예를 들어 SPR 로 측정되는 항원에 대한 항원 결합 부분의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, 항원에 결합하는 항원 결합 부분 또는 항원 결합 부분을 포함하는 항원 결합 분자는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하 (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M) 의 해리 상수 (KD) 를 갖는다.
"친화도" 는 분자의 단일 결합 자리 (예를 들어, 수용체) 및 그의 결합 파트너 (예를 들어, 리간드) 사이의 비-공유적 상호작용의 총합 강도를 나타낸다. 달리 언급되지 않으면, 본원에 사용된 바와 같이 "결합 친화도" 는 결합쌍 (예를 들어, 항원 결합 부분과 항원, 또는 수용체와 그의 리간드) 의 구성원들 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X 의 그의 파트너 Y 에 대한 친화도는 일반적으로 해리 및 연합 속도 상수 (각각 koff 및 kon) 의 비율인 해리 상수 (KD) 로 나타낼 수 있다. 따라서, 동등한 친화도는 속도 상수의 비율이 동일한 한 상이한 속도를 포함할 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 널리 공지된 방법으로 측정될 수 있다. 친화도 측정을 위한 특별한 방법은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 이다.
"감소된 결합", 예를 들어 Fc 수용체에 대한 감소된 결합은 예를 들어 SPR 에 의해 측정되는 각각의 상호작용에 관한 친화도의 감소를 나타낸다. 명확성을 위해 이 용어는 또한 0 (또는 분석 방법의 탐지 한계 미만) 으로의 친화도의 감소, 즉 상호작용의 완전한 폐지를 포함한다. 반대로, "증가된 결합" 은 각각의 상호작용에 관한 친화도의 증가를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "활성화 T 세포 항원" 은 항원 결합 분자와의 상호작용시 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 T 백혈구, 특히 세포독성 T 백혈구의 표면 위에 발현되는 항원 결정인자를 나타낸다. 구체적으로, 항원 결합 분자와 활성화 T 세포 항원의 상호작용은 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 유발함으로써 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서 활성화 T 세포 항원은 CD3 이다.
본원에서 사용되는 "T 세포 활성화" 는 하기로부터 선택되는, T 백혈구, 특히 세포독성 T 백혈구의 하나 이상의 세포성 응답을 나타낸다: 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 측정하는 적합한 검정법은 본원에 기재된 기술에서 알려져 있다.
본원에서 사용되는 "표적 세포 항원" 은 표적 세포, 예를 들어 종양에서의 세포 예컨대 암 세포 또는 종양 기질의 세포의 표면 위에 제시되는 항원 결정인자를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 항원 결합 부분 등과 관련하여 용어 "제 1" 및 "제 2" 는 각 유형의 부분들이 하나 이상 있을 때 구분의 편의를 위해 사용된다. 그러한 용어의 사용은 달리 언급하지 않으면 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정 순서 또는 배열을 지칭하려는 의도가 아니다.
"Fab 분자" 는 면역글로불린의 중쇄 ("Fab 중쇄") 의 VH 및 CH1 도메인 및 경쇄 ("Fab 경쇄") 의 VL 및 CL 도메인으로 이루어지는 단백질을 나타낸다.
"융합된" 은 구성요소들 (예를 들어, Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛) 이 펩티드 결합에 의해 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결되어 있음을 의미한다.
"크로스오버" Fab 분자 (또한 "Crossfab" 로 명명됨) 는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되어 있는 Fab 분자를 의미하며, 즉 크로스오버 Fab 분자는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 사슬, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 사슬을 포함한다. 명확성을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자에서, 중쇄 불변 영역을 포함하는 펩티드 사슬이 본원에서 크로스오버 Fab 분자의 "중쇄" 로서 언급된다. 반대로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자에서, 중쇄 가변 영역을 포함하는 펩티드 사슬이 본원에서 크로스오버 Fab 분자의 "중쇄" 로서 언급된다.
용어 "면역글로불린 분자" 는 자연 발생 항체의 구조를 가진 단백질을 나타낸다. 예를 들어, IgG 계열의 면역글로불린은 디설파이드-결합되어 있는 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사합체 당단백질이다. N- 로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭되는, 가변 영역 (VH) 및 후속하는 중쇄 불변 영역으로도 지칭되는 3 개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3) 을 갖는다. 유사하게, N- 로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 영역 (VL) 에 이어, 경쇄 불변 영역으로도 지칭되는 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 (IgA), (IgD), (IgE), (IgG), 또는 (IgM) 로 지칭되는 다섯가지 유형들 중 하나로 정해지며, 이들 중 일부는 예를 들어 γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2) 과 같은 서브타입으로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 지칭되는 두가지 유형들 중 하나로 정해질 수 있다. 면역글로불린은 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결되어 있는 2 개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 본질적으로 이루어진다.
본원에서 용어 "항체" 는 가장 광의의 의미로 사용되며, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 및 항체 조각을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 조각" 은 온전항 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자들을 나타낸다. 항체 조각의 예시는 Fv, Fab, Fab', Fab-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자들 (예를 들어, scFv), 및 단일-도메인 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 조각의 리뷰에 대해서는, 하기의 참고문헌을 참조한다: Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). scFv 조각의 리뷰에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Plckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; 및 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458 을 참조한다. 살비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하며, 생체내 반감기가 증가되어 있는 Fab 및 F(ab')2 조각의 논의에 대해서는, 미국 특허 번호 5,869,046 를 참조. 디아바디는 2 가 또는 이중특이적일 수 있는 2 개의 항원-결합 자리를 가진 항체 조각이다. 참고문헌은, 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). 트리아바디 (triabody) 및 테트라바디 (tetrabody) 는 또한 하기 문헌에 기재되어 있다: Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 조각이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 참고문헌은, 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1). 항체 조각은, 본원에 기재된 바와 같은 온전한 항체의 단백질 가수분해 소화 및 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 대장균 또는 파지) 에 의한 생산을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "항원 결합 도메인" 은 특이적으로 결합하고, 항원의 일부분 또는 전부에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부분을 나타낸다. 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 항체 가변 도메인 (항체 가변 영역으로도 지칭됨) 에 의해 제공될 수 있다. 특별하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH) 을 포함한다.
용어 "하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질" 은 본원에 참조로 포함되는 WO 2002/020565 및 WO 2012069655 에 기재된 바와 같은 결합 단백질을 나타낸다. 이러한 결합 단백질은 또한 "다르핀 (DARPins)" (설계된 안키린 반복 단백질 (designed ankyrin repeat proteins) 에 대한 두문자어) 으로 언급되고, 전형적으로 고도 특이적 및 높은-친화도 표적 단백질 결합을 나타내는 유전자 조작된 항체 모방 단백질이다. 그것은 천연 안키린 단백질에서 유래하고, 하나 이상의 반복 모티프로 이루어진다. HER2 를 표적화하는, 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 예시적 결합 단백질이 Zahnd, C. et al, J. Mol. Biol. (2007) 369, 1015-1028 에 기재되어 있다. 기타 결합 단백질 예컨대 Fibronectin Type III 도메인 기반 Adenctins, Lipocalin-기반 Anticalins, 유비퀴틴-기반 Affilins, Transferrin-기반 Transbodies, Protein A 도메인 기반 Affibodies, 테트라넥틴 도메인 기반 TrimerX, Cys-풍부 도메인 기반 MicroProteins, Fyn SH3 도메인 기반 Fynomers, EGFR A 도메인 기반 Avimers, 센티린-기반 Centyrins, Kuniz 도메인 기반 칼리비터 및 무작위화된 결합 영역 및 항체-유사 거동을 갖는 기타 스카폴드 단백질이 또한 본 발명에 포함된다.
용어 "단일 도메인 항원 결합 분자" 는 EP0656946 (전문이 본원에 참조로 포함됨) 에 기재된 바와 같은 단일 단량체성 가변 항체 도메인으로 이루어지는 항체 조각을 나타낸다. 전체 항체와 같이, 그것은 특정 항원에 선별적으로 결합할 수 있다. 오직 12-15 kDa 의 분자량을 갖는 단일-도메인 항체는 2 개의 단백질 중쇄 및 2 개의 경쇄로 구성되는 보통 항체 (150-160 kDa) 보다 훨씬 작고, 심지어는 Fab 조각 (~50 kDa, 하나의 경쇄 및 중쇄의 절반) 및 단일-사슬 가변 조각 (~25 kDa, 2 개의 가변 도메인, 경쇄로부터 하나 및 중쇄로부터 하나) 보다 작다. 특히 단일 도메인 항원 결합 분자는 자율적 가변 중쇄 (aVH) 항체로도 언급되는 하나의 가변 도메인 (VH) 으로 이루어지는 단일 도메인 가변 중쇄이다. 이러한 펩티드는 항원에 대한 친화도가 전체 항체와 유사하지만, 더욱 열-저항성이고 세제 및 고농도의 우레아에 대해 안정적이다. 비슷하게 낮은 분자 질량은 더 양호한 조직 내 투과성, 및 그들이 신장으로 제거되므로 짧은 혈장 반감기를 초래한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항원에 대한 항체의 결합에 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 나타낸다. 본래 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH 및 VL) 은 유사한 구조를 갖고 있는데, 각 도메인은 4 개의 보존성 프레임워크 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (HVR) 을 갖는다. 참고문헌은, 예를 들어 Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원-결합 특이성 부여에 충분할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "과가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열에서 과도하게 가변적이고/이거나 구조적으로 정의된 루프 ("과가변 루프") 를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 나타낸다. 일반적으로, 본래 4-쇄 항체는 6 개의 HVR 을 포함하며; VH 중 3 개 (H1, H2, H3), 및 VL 중 3 개 (L1, L2, L3) 가 있다. HVR 은 일반적으로 과가변 루프 및/또는 상보성 결정 영역 (CDR) 유래의 아미노산 잔기를 포함하는데, CDR 은 최고 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 있어 가장 많이 관여된다. VH 에서 CDR1 을 제외하고, CDR 은 일반적으로 과가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 과가변 영역 (HVR) 은 또한 "상보성 결정 영역" (CDR) 으로도 지칭되며, 이들 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분들을 지칭함에 있어서 본원에서 호환되어 이용된다. 그러한 특별한 영역은 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)] 및 [Chothia et al., J Mol Biol196:901-917 (1987)] 에 기재된 바 있고, 여기서 해당 정의는 서로 비교시 아미노산 잔기들의 중복 또는 서브셋트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체의 CDR 또는 그의 변이체를 지칭함에 있어서 임의의 정의가 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위에 속하는 것을 의도로 한다. 각각의 상기 인용된 참고문헌에서 정의한 CDR 을 포함하는 적절한 아미노산 잔기들이 하기 표 A 에 비교를 위해 제공된다. 특별한 CDR 을 포함하는 정확한 잔기 갯수는 CDR 의 서열 및 크기에 따라 가변적일 수 있다. 당업자는 어떤 잔기가 주어진 항체의 가변 영역 아미노산 서열에 대해 특별한 CDR 을 포함할 것인지에 대해 쉽게 결정할 수 있다.
표 A. CDR 정의1
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1 표 A 에서의 모든 CDR 정의들의 번호매김은 Kabat 등이 정한 번호매김 규칙에 따른 것임. (하기 참조).
2 표 A 에서 사용된 소문자 "b" 가 있는 "AbM" 는 Oxford Molecular 에서 정의한 "AbM" 항체 모델링 소프트웨어에 의해 정해진 CDR 을 나타낸다.
Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변 영역 서열에 대한 번호매김 시스템을 정의했다. 당업자는 임의의 서열 자체에 대한 임의의 실험적 데이터에 의존하지 않고도 임의의 가변 영역 서열에 "Kabat 번호매김" 의 그러한 시스템을 분명하게 적용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "Kabat 번호매김" 은 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 에 제시된 번호매김 시스템을 나타낸다. 달리 언급되지 않으면, 항체 가변 영역에서 특정 아미노산 잔기 위치의 번호매김을 언급하는 것은 Kabat 번호매김 시스템에 따른다.
서열 목록의 폴리펩티드 서열은 Kabat 번호매김 시스템에 따라 번호매김되지 않는다. 그러나, 당업자는 서열 목록의 서열 번호매김을 Kabat 번호매김으로 변환할 수 있을 것이다.
"골격" 또는 "FR" 은 과가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 네가지 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 하기의 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
항체 또는 면역글로불린의 "클래스" 는 그의 중쇄에 의해 보유되는 유형의 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 나타낸다. 이들은 다섯가지 주된 클래스의 항체이다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 이들 중 몇가지는 추가로 서브클래스 (아이소타입) 로 나뉘어질 수 있는데, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 이 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 지칭된다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역" 은 불변 영역의 적어도 한 부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 이용된다. 상기 용어는 자연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계는 약간씩 가변적일 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 Cys226 로부터, 또는 Pro230 로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 연장되어 있는 것으로 정의된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에 달리 언급되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서의 아미노산 잔기의 번호매김은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991] 에 기재되어 있는 바와 같이, EU 지수로도 언급되는 EU 번호매김 시스템에 따른다. Fc 도메인의 "서브유닛" 은 본원에서 이합체 Fc 도메인, 즉 안정한 자체 연합이 가능한 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 형성하는 2 개의 폴리펩티드 중 하나를 나타낸다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 영역을 포함한다.
"Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 연합을 촉진하는 수식" 은 단독이합체를 형성하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드의 동일한 폴리펩티드와의 연합을 감소시키거나 또는 방해하는 Fc 도메인 서브유닛의 펩티드 골격 또는 번역후 수식의 취급이다. 본원에 사용된 바와 같은 연합을 촉진하는 수식은 특히 연합을 바라는 두 Fc 도메인 서브유닛 (즉, Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛) 각각에 대한 독립적인 수식을 포함하는데, 여기서 해당 수식은 서로간에 상보적이어서 두 Fc 도메인 서브유닛의 연합을 촉진하게 된다. 예를 들어, 연합을 촉진하는 수식은 Fc 도메인 서브유닛들 중 하나 또는 두가지 모두의 구조 또는 전하를 변경할 수 있고, 그의 연합이 입체배치적으로 또는 정전기적으로 각각 선호되도록 만들게 된다. 따라서, (이종)이합체화는 제 1 Fc 도메인 서브유닛를 포함하는 폴리펩티드 및 제 2 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드 사이에서 일어나, 각각의 서브유닛에 융합되는 추가 구성요소들 (예를 들어, Fab 분자) 이 동일하지 않다는 점에서 동일한 것이 아닐 수 있다. 일부 구현예에서, 연합을 촉진하는 수식은 Fc 도메인 내에 아미노산 돌연변이, 구체적으로는 아미노산 치환을 포함한다. 특별한 구현예에서, 연합을 촉진하는 수식은 Fc 도메인의 두 서브유닛 각각에서 독립적인 아미노산 돌연변이, 구체적으로는 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 연합을 촉진하는 수식은, 예를 들어 PCT 공개 WO 2009/089004 에 기재된 바와 같은, 정전기 스티어링 효과를 매개하는 수식을 포함한다. 일반적으로, 이러한 방법은 2 개의 Fc 도메인 서브유닛의 경계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 하전된 아미노산 잔기에 의한 대체를 수반하며, 그에 따라 동종이합체 형성은 정전기적으로 불리해지지만 이종이합체화는 정전기적으로 유리해진다.
용어 "효과기 기능" 은 항체 아이소타입마다 상이한, 항체의 Fc 영역으로 기인한 생물학적 활성을 나타낸다. 항체 효과기 기능의 예시는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포의 식세포작용 (ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체) 의 하향조절 및 B 세포 활성화.
본원에서 사용되는 용어 "조작하다, 조작된, 조작함" 은, 자연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 그의 조각의 펩티드 골격 또는 번역후 수식의 임의의 취급을 포함하는 것으로 간주된다. 조작함은 아미노산 서열, 글리코실화 패턴, 또는 개별 아미노산의 측쇄기의 수식 뿐만 아니라 이들 접근법들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산 돌연변이" 는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 수식을 포함하는 것을 의미한다. 최종 구축물이 원하는 특징, 예를 들어 Fc 수용체에 대한 결합 감소, 또는 또다른 펩티드에 대한 연합 증가를 보유하고 있는 한, 치환, 결실, 삽입 및 수식의 임의의 조합이 최종 구축물에 귀착하도록 실시될 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특별한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들어 Fc 영역의 결합 특성의, 변경을 목적으로, 비보존성 아미노산 치환, 즉 한 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 가진 또다른 아미노산으로 치환하는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산에 의한, 또는 20 가지 표준 아미노산의 자연 발생 아미노산 유도체 (예를 들어, 4-히드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-히드록시라이신) 에 의한 치환을 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당업계에 널리 공지된 유전자적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 유전자적 방법은 자리-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함한다. 유전자적 조작 외의 방법, 예컨대 화학적 수식에 의한 아미노산의 측쇄기의 변경 방법이 또한 유용한 것으로 간주된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 가리킴에 있어서 다양한 지정방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인의 위치 329 에서의 프롤린의 글리신으로의 치환이 329G, G329, G329, P329G, 또는 Pro329Gly 로 표기될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드" 는 아미노산 결합 (펩티드 결합으로도 공지됨) 에 의해 선형적으로 연결되어 있는 단량체 (아미노산) 로 이루어진 분자를 나타낸다. 용어 "폴리펩티드" 는 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬을 지칭하고, 생성물의 특정 길이를 지칭하지는 않는다. 따라서, 둘 이상의 아미노산의 사슬을 지칭하기 위해 사용되는 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 임의의 기타 용어가 "폴리펩티드" 의 정의에 속하며, 용어 "폴리펩티드" 는 임의의 그러한 용어들 대신 또는 그와 호환하여 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드" 는 또한, 이에 제한되지 않으나, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 유도체화, 공지된 보호/차단기, 단백질가수분해기, 단백질 가수분해 절단 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 수식을 포함하는 폴리펩티드의 발현후 수식 산물을 나타낸다. 폴리펩티드는 자연 생물학적 공급원으로부터 유도되거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 정해진 핵산 서열로부터 번역되어야 하는 것은 아니다. 이는 화학적 합성에 의한 것을 포함하는 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 약 3 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 20 개 이상, 25 개 이상, 50 개 이상, 75 개 이상, 100 개 이상, 200 개 이상, 500 개 이상, 1,000 개 이상, 또는 2,000 개 이상의 아미노산 크기의 것일 수 있다. 폴리펩티드는 정해진 3-차원적 구조를 가질 수 있지만, 반드시 그러한 구조를 가져야 하는 것은 아니다. 정해진 3-차원 구조를 가진 폴리펩티드는 폴딩되어 있다고 언급되며, 정해진 3-차원 구조를 보유하지 않은 폴리펩티드는 수많은 상이한 구조배치를 취할 수 있으며, 언폴딩되어 있다고 지칭된다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 변이체, 또는 그의 유도체는 그의 본래 환경 중에 있지 않은 폴리펩티드를 지칭하는 것을 의도로 한다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그의 본래 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 재조합적으로 제조된 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현된 단백질은 본 발명의 목적에 있어서 단리된 것으로 간주되는데, 이는 그들이 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분획화 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 자연 또는 재조합 폴리펩티드이기 때문이다.
"기준 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성" 이란, 서열을 나란히 정렬하고 갭을 도입하여, 필요에 따라, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하고, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후, 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당해 기술분야의 통상의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램의 저작자는 Genentech, Inc. 이고, 소스 코드는 사용자 문서와 함께 미국 저작권청 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559 소재) 에 제출되었는데, 여기서, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 South San Francisco, California 소재의 Genentech, Inc. 로부터 공개적으로 입수가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D 를 포함한 UNIX 운영 체제 상에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 달라지지 않는다. ALIGN-2 를 아미노산 서열 비교에 이용하는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B와의 또는 이에 대한 주어진 아미노산 서열 A 의 % 아미노산 서열 동일성 (이것은 주어진 아미노산 서열 B 와의 또는 이에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 대체하여 표현될 수 있다) 은 다음과 같이 산출된다:
100 × 분수 X/Y
여기서, X 는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 에 의해 그 프로그램의 A 와 B 의 정렬에서 동일한 매치 (match) 로서 채점된 아미노산 잔기의 수이고, Y 는 B 내의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A 의 길이가 아미노산 서열 B 의 길이와 동일하지 않은 경우, B 에 대한 A 의 % 아미노산 서열 동일성은 A 에 대한 B 의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않은 것으로 인식될 것이다. 구체적으로 달리 명시되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 바로 직전 단락에서 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수득된다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA), 바이러스-유래 RNA, 또는 플라스미드 DNA (pDNA) 를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 통상적 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적 결합 (예를 들어 펩티드 핵산 (PNA) 에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합) 을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자" 는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어 DNA 또는 RNA 조각을 언급한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 본래 환경으로부터 제거되어진 핵산 분자, DNA 또는 RNA 를 지칭하는 것으로 의도로 한다. 예를 들어, 벡터에 포함되어 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적에 있어서 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예시는 용액 중의 이종성 숙주 세포 또는 정제된 (부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드 중에 유지되는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하나, 폴리뉴클레오티드 분자가 염색체외에 또는 그의 본래 염색체 좌와는 상이한 염색체 좌에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물 뿐만 아니라 포지티브 및 네거티브 가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 그러한 합성되어 제조된 분자를 포함한다. 추가로, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 있는 그대로 존재하거나 또는 프로모터, 리보솜 결합 자리 또는 전사 종결자와 같은 조절 요소들을 포함할 수 있다.
본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과, 예를 들어, 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 의해, 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 100 개 당 점 돌연변이 5 개 이하를 포함할 수 있다는 점을 제외하면 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일하다는 것이 의도된다. 다시 말하면, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열 내의 5% 이하의 뉴클레오티드가 결실되거나 또다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열 내의 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 이러한 기준 서열의 변경은 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 그러한 말단 위치 사이의 어디에서든, 기준 서열 내의 잔기 사이에 개별적으로 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 기 내에 배치되어 발생할 수 있다. 현실적으로, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 위에서 폴리펩티드에 대해 논의된 것 (예를 들어 ALIGN-2) 을 사용하여 관습적으로 확인될 수 있다.
용어 "발현 카세트" 는 표적 세포 내에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 요소를 포함하는 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스티드 DNA, 바이러스, 또는 핵산 조각 내로 통합될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 기타 서열 중에서, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터" 는 "발현 구축물" 과 동의어이며, 표적 세포에서 작동적으로 연결되어 있는 특정 유전자의 도입 및 발현 지령에 이용되는 DNA 분자를 나타낸다. 상기 용어는 자체-복제 핵산 구조물로서의 벡터 뿐만 아니라 도입될 숙주 세포의 게놈으로 혼입되는 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 대량의 안정한 mRNA 의 전사를 가능케 한다. 발현 벡터가 일단 표적 세포의 내부에 있게 되면, 해당 유전자에 의해 인코딩되는 리보핵산 또는 단백질이 세포 전사 및/또는 번역 처리기관에 의해 생산된다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주," 및 "숙주 세포 배양" 은 호환하여 사용되며, 외인성 핵산이 도입되어 있는 세포 및 그의 후손을 나타낸다. 숙주 세포는 일차 형질전환 세포 및 계대 횟수와 무관하게 그로부터 유도된 후손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포" 를 포함한다. 후손은 부모 세포와 핵산 내용물에 있어서 완전히 동일한 필요는 없고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 본래 형질전환 세포에 대해 스크리닝 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이 후손들이 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 생성에 이용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양 세포, 예를 들어 포유류 배양 세포, 언급하자면 예컨대 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수 세포, P3X63 마우스 골수 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 식물 세포를 포함하나, 또한 트랜스펙션 동물, 트랜스펙션 식물 또는 배양 식물 또는 동물 조직에 포함되는 세포도 포함한다.
"활성화 Fc 수용체" 는 항체의 Fc 도메인에 의한 참여 후 수용체-보유 세포의 효과기 기능 수행을 자극하는 신호전달 이벤트를 이끌어내는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcRIIIa (CD16a), FcRI (CD64), FcRIIa (CD32), 및 FcRI (CD89) 을 포함한다.
항체-의존형 세포-매개 세포독성 (ADCC) 은 면역 효과기 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 분해를 유도하는 면역 메카니즘이다. 표적 세포는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 그의 유도체가 일반적으로는 Fc 영역의 N-말단인 단백질 일부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 사용되는 용어 "감소된 ADCC" 는 상기 정의된 ADCC 의 메카니즘에 의해 표적 세포를 둘러싸는 배지 중의 주어진 항체 농도에서 주어진 시간에 분해되는 표적 세포 갯수의 감소 및/또는 ADCC 의 메카니즘에 의해 주어진 시간 내에 주어진 갯수의 표적 세포의 분해를 달성하기 위해 필요한, 표적 세포를 둘러싼 배지 중의 항체 농도 증가로 정의된다. ADCC 에서의 감소는 (당업자에게 공지되어 있는) 동일한 표준 제조, 정제, 제형화 및 저장 방법을 사용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생산되지만, 조작되지 않은 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC 와 비교한다. 예를 들어, ADCC 를 감소시키는 그의 Fc 도메인 아미노산 치환을 포함하는 항체에 의해 매개되는 ADCC 에서의 감소는 Fc 도메인에서의 그러한 아미노산 치환이 없는 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC 와 비교한다. ADCC 를 측정하는 적합한 검정법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (참고문헌은, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2006/082515 또는 PCT 특허 출원 번호 PCT/EP2012/055393).
약제의 "유효량" 은 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 초래하는데 필요한 양을 나타낸다.
약제, 예를 들어 약학적 조성물의 "치료 유효량" 은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 투여 기간에서 유효한 양을 나타낸다. 의약의 치료 유효량은 질환의 불리한 영향을 제거, 감소, 지연, 최소화 또는 방해한다.
"개체" 또는 "대상체" 는 포유류이다. 포유류는 가축 동물 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 쥐과동물 (예를 들어, 마우스 및 래트) 를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특별하게는, 개체 또는 대상체가 인간이다.
용어 "약제학적 조성물" 은 그 안에 포함되어 있는 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하게 되도록 하고, 해당 제형물이 투여될 대상체에게 허용불가하게 독성인 추가성인 구성요소들을 전혀 포함하지 않는 형태의 제제를 나타낸다.
"약제학적으로 허용되는 담체" 는 대상체에게 무독성인, 활성 성분 이외의 약학적 조성물 중의 성분을 나타낸다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료" (및 그의 문법적 활용 형태, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료함") 는 치료할 개체에서의 질환의 자연적인 진행을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상 병리학적 과정 동안에 실시될 수 있다. 바랄 수 있는 치료 효과는, 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감쇠, 전이 예방, 질환 진행 속도 감속, 질환 상태의 개선 및 일시적 완화 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 질환 발생을 지연시키거나 또는 질환 진행을 둔화시키는데 이용된다.
용어 "패키지 삽입물" 은 치료 제품의 상용 패키지에 통상적으로 포함되어 있는 지침을 지칭하는데, 이는 지침, 용도, 투여량, 투여, 병용요법, 사용 금지 사요 및/또는 해당 치료 제품 사용과 관련된 경고사항과 관련된 정보를 포함한다.
구현예의 상세한 설명
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 포맷
대부분의 항체는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄로 구성된다. 2 가지 사슬 모두 통상적으로 평평한 또는 오목한 항원-결합 자리에 기여한다. 이들 통상적 항체에 더하여, 라마, 기타 낙타과, 및 상어는 또한 오직 중쇄로 구성되는 항체를 생산한다. 이러한 특이한 중쇄 항체의 항원-결합 자리는 aVH (자율적 가변 중쇄) 또는 단일 도메인 가변 중쇄로 지명되는 단일 도메인만으로 형성된다. 단일 도메인 가변 중쇄는 재조합 단백질로서 용이하게 생산된다. 단일 도메인 가변 중쇄의 기타 유리한 특색은 그것의 작은 크기, 높은 용해도, 열 안정성, 리폴딩 능력, 및 양호한 조직 침투성을 포함한다. 단일 도메인 항체는 예를 들어 Wesolowski et al, Med Microbiol Immunol (2009) 198:157-174 에 기재되어 있다. 단일 도메인 가변 중쇄 항체의 생산 방법은 예를 들어 WO2012152823 및 WO2012056000 에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
이러한 단일 도메인 가변 중쇄 항체는 경쇄를 결여하고, 또한 CH1-도메인을 결여할 수 있다. 그러므로, 단일 도메인 가변 중쇄 항체의 항원-결합 자리는 오직 단일 도메인에 의해 형성된다.
단일 도메인 항원 결합 (SDAB) 분자는 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 분자를 포함한다. 예는 중쇄 가변 도메인, 자연적으로 경쇄가 없는 결합 분자, Nanobodies(™), 통상적 4-사슬 항체 유래의 단일 도메인, 조작된 도메인 및 항체 유래의 것 이외의 단일 도메인 스카폴드를 포함하나 그에 제한되지 않는다. SDAB 분자는 최첨단 기술에 속하는 것, 또는 임의의 장래의 단일 도메인 분자일 수 있다. SDAB 분자는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 어류, 상어, 염소, 토끼, 및 소를 포함하나 그에 제한되지 않는 임의의 종에서 유래할 수 있다. 이 용어는 또한 낙타과 및 상어 이외의 종으로부터의 자연 발생적 단일 도메인 항체 분자를 포함한다.
하나의 양상에서, SDAB 분자는 어류에서 발견되는 면역글로불린의 가변 영역에서 유래하는 것, 예컨대, 예를 들어, 상어의 혈청에서 발견되는 신규한 항원 수용체 (NAR) 로서 알려진 면역글로불린 동종형에서 유래하는 것일 수 있다. NAR ("IgNAR") 의 가변 영역에서 유래하는 단일 도메인 분자의 생산 방법이 WO 03/014161 및 Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909 에 기재되어 있다.
또다른 양상에 따르면, SDAB 분자는 경쇄가 없는 중쇄로서 알려진 자연 발생적 단일 도메인 항원 결합 분자이다. 그러한 단일 도메인 분자는, 예를 들어, WO 9404678 및 Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448 에 공개되어 있다. 명확성을 이유로, 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 분자에서 유래하는 이러한 가변 도메인은 본원에서 4 개 사슬 면역글로불린의 통상적 VH 와 구별하기 위해 VHH 또는 Nanobody(™) 로서 알려져 있다. 그러한 VHH 분자는 낙타과 종, 예를 들어 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카 및 과나코에서 유래할 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 분자를 생산할 수 있다; 그러한 VHHs 는 본 발명의 범위 내에 있다.
SDAB 분자는 예를 들어 EP0656946 에서 기재되었고, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로 포함된다.
SDAB 분자는 재조합, CDR-그래프팅 (graft), 인간화, 낙타화, 탈-면역화 및/또는 시험관내 생성 (예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 선별) 될 수 있다. 단일-도메인 항체는 원하는 항원으로 단봉낙타, 낙타, 라마, 알파카 또는 상어의 면역화하고, 후속적으로 중쇄 항체에 대해 코딩하는 mRNA 를 단리하여 수득될 수 있다. 역 전사 및 폴리머라제 연쇄 반응에 의해, 수백만 개의 클론을 함유하는 단일-도메인 항체의 유전자 라이브러리가 생성된다. 스크리닝 기술 예컨대 파지 디스플레이 및 리보솜 디스플레이는 항원에 결합하는 클론을 식별하는 것을 도는다. 상이한 방법은 사전에 면역화되지 않은 동물로부터의 유전자 라이브러리를 사용한다. 그러한 미감작 라이브러리는 통상적으로 원하는 항원에 대한 친화도가 낮은 항체만을 함유하므로, 부가적 단계로서 무작위 돌연변이유발에 의한 친화도 성숙을 적용하는 것이 필요하다. 가장 강력한 클론이 식별되었을 때, 그들의 DNA 서열은 예를 들어 효소를 향한 안정성을 개선하기 위해 최적화된다. 또다른 목적은 항체에 대항하는 인간 유기체의 면역 반응을 방지하기 위한 인간화이다. 인간화는 문제가 안되며, 이는 낙타과 VHH 및 인간 VH 조각 사이의 상동성 때문이다. 최종 단계는 대장균, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 기타 적합한 유기체에서의 최적화된 단일-도메인 항체의 번역이다. 대안적으로, 단일-도메인 항체는 4 개의 사슬을 갖는 통상적 쥐과 또는 인간 IgG 로부터 제조될 수 있다. 그 과정은 유사하며, 면역화된 또는 미감작 공여체로부터의 유전자 라이브러리 및 가장 특이적인 항원의 식별을 위한 디스플레이 기술을 포함한다.
하나의 구현예에서 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분, 및 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서,
상기 하나의 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 다른 항원 결합 부분은 단일 도메인 항원 결합 분자로 이루어지는,
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 구현예에서, 단일-도메인 항원 결합 분자는 인간 단일-도메인 결합 분자이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
하나의 구현예에서 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분, 및 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서,
상기 하나의 항원 결합 부분은 Fab 분자이거나 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 다른 항원 결합 부분은 단일 도메인 가변 중쇄로 이루어지는,
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분은 Fab 분자이거나 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분은 단일 도메인 가변 중쇄로 이루어지는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
본 발명의 이중특이적 항체는 하나 이상의 크로스오버-Fab 조각을 포함할 수 있다. 크로스오버 Fab 조각은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되어 있는 Fab 조각이다. 크로스오버 Fab 조각을 포함하는 이중특이적 항체 포맷은, 예를 들어, WO2009080252, WO2009080253, WO2009080251, WO2009080254, WO2010/136172, WO2010/145792 및 EP 특허 출원 번호 11178371.8 에서 기재되었고, 상기 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 단일 도메인 항원 결합 분자를 포함하는 결합 단백질을 포함하고, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 1 개 이하의 항원 결합 부분을 포함한다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 분자 또는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자를 포함하는 또다른 항원 결합 부분에 융합되어 있는, 단일 도메인 항원 결합 분자를 포함하는 하나의 항원 결합 부분을 포함한다. 임의로 항원 결합 부분은 펩티드 링커를 통해 서로 융합되어 있다.
하나의 구현예에서 상기 단일 도메인 항원 결합 분자는 크로스오버 Fab 분자의 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다.
하나의 구현예에서 상기 단일 도메인 항원 결합 분자는 크로스오버 Fab 분자의 경쇄의 N-말단에 융합되어 있다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분을 부가적으로 포함한다.
하나의 구현예에서 상기 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은 단일 도메인 항원 결합 분자이다. 하나의 구현예에서 상기 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은 위에 정의된 바와 같은 단일 도메인 가변 중쇄이다.
본 발명의 하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서 상기 Fc 도메인은 IgG, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4, Fc 도메인이다. 구체적인 구현예에서 Fc 도메인은 아래 개요서술되어 있는 바와 같은 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 연합을 촉진하는 수식을 추가로 포함할 수 있다. 다른 구체적인 구현예에서 Fc 도메인은 아래 개요서술되어 있는 바와 같은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
a) 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인;
b) Fab 분자 또는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자를 포함하는 제 1 항원 결합 부분으로서, Fab 분자 또는 크로스오버 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 1 항원 결합 부분;
c) 단일 도메인 가변 중쇄를 포함하는 제 2 항원 결합 부분으로서, 단일 도메인 가변 중쇄가 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 2 항원 결합 부분; 및
d) 단일 도메인 가변 중쇄를 포함하는 제 3 항원 결합 부분으로서, 단일 도메인 가변 중쇄가 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 제 3 항원 결합 부분.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
a) 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인;
b) Fab 분자 또는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자를 포함하는 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분으로서, Fab 분자 또는 크로스오버 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 1 항원 결합 부분;
c) 단일 도메인 가변 중쇄를 포함하는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분으로서, 단일 도메인 가변 중쇄가 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 2 항원 결합 부분; 및
d) 단일 도메인 가변 중쇄를 포함하는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분으로서, 단일 도메인 가변 중쇄가 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 제 3 항원 결합 부분.
하나의 구현예에서 상기 제 2 및 제 3 항원 결합 부분은 동일한 표적 세포 항원에 결합한다.
하나의 구현예에서 상기 제 1 및/또는 제 2 항원 결합 부분은 Fc-도메인에 힌지 영역을 통해 직접 연결되어 있다. 또다른 구현예에서 상기 제 1 및/또는 제 2 항원 결합 부분은 펩티드 링커를 통해 Fc-도메인에 연결되어 있다.
임의의 상기 구현예에 따르면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분 (예를 들어 항원 결합 부분, Fc 도메인) 은 직접 또는 본원에 기재되어 있거나 당업계에 공지되어 있는 다양한 링커, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로약 2-20 개 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 적합한, 비-면역원성 펩티드 링커는, 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커 (n 은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4 의 수임) 를 포함한다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 369, 370 및 371 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NOs: 369, 370 및 371 을 포함한다.
항체 외에도, 표적 분자에 특이적으로 결합하는데 사용될 수 있는 기타 결합 단백질 또는 결합 도메인이 존재한다 (예를 들어 Binz, H.K., Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005). 하나의 그러한 신규한 클래스의 결합 단백질 또는 결합 도메인은 설계된 반복 단백질 또는 설계된 반복 도메인에 기초한다 (WO 2002/020565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C, Forrer, P., Grutter, M.G., and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004; Stumpp, M.T., Binz, H.K and Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008).
안키린 반복 단백질은 1987 년도에 사카로마이세스 세레비지애, 노랑 초파리 (Drosophila melanogaster) 및 예쁜 꼬마선충 (Caenorhabditis elegans) 에서의 4 개의 그러한 단백질 사이의 서열 비교를 통해 확인되었다. Breeden 및 Nasmyth 는 swi6p, cdcl0p, notch 및 lin-12 의 서열에서 대략 33 개 잔기의 반복 단위의 복수의 카피를 보고했다 (Breeden and Nasmyth, 1987). 안키린 단백질에서의 이러한 반복 단위의 24 개 카피의 후속 발견은 이러한 반복 단위의 안키린 반복으로서의 명명을 초래했다 (Lux et al., 1990). 이후, 이러한 반복 단위는 상이한 유기체 및 바이러스의 수백 개의 단백질에서 확인되었다 (Bork, 1993; SMART database, Schultz et al., 2000). 이들 단백질은 핵, 세포질 또는 세포외 공간에 위치한다. 이는 이들 단백질의 안키린 반복 도메인이 다이설파이드 가교에 독립적이고, 따라서 환경의 산화 상태에 독립적이라는 사실과 일치한다. 단백질 1 개 당 반복 단위의 개수는 2 내지 20 개로 다양하다 (SMART database, Schultz et al., 2000). 반복 단위의 최소 개수는 안정적 폴딩된 도메인을 형성하는데 요구되는 것으로 보인다 (Zhang and Peng, 2000). 다른 한편으로는, 6 개 상한의 반복 단위가 하나의 폴딩된 도메인에 존재하는 것에 대한 일부 증거가 존재한다 (Michaely and Bennet, 1993).
WO 2002/020565 는 안키린 반복 단백질의 큰 라이브러리를 구축할 수 있는 방법 및 그들의 일반적 응용을 기재한다. 이러한 설계된 반복 도메인은 반복 단백질의 모듈식 본질을 활용하고, 도메인의 소수성 중심을 차폐함으로써 설계된 반복 도메인의 응집을 방지하는 N-말단 및 C-말단 캡핑 모듈을 보유한다 (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K. 및 Pluckthun, A., FEBS letters 539, 2-6, 2003). WO 2012069655 는 설계된 안키린 반복 도메인의 C- 또는 N-말단 캡핑 모듈 또는 C- 또는 N- 말단 캡핑 반복을 개선함으로써 최적화된 반복 단백질을 기재한다.
기타 결합 단백질 예컨대 Fibronectin Type III 도메인 기반 Adenctins, Lipocalin-기반 Anticalins, 유비퀴틴-기반 Affilins, Transferrin-기반 Transbodies, Protein A 도메인 기반 Affibodies, 테트라넥틴 도메인 기반 TrimerX, Cys-풍부 도메인 기반 MicroProteins, Fyn SH3 도메인 기반 Fynomers, EGFR A 도메인 기반 Avimers, 센티린-기반 Centyrins, Kuniz 도메인 기반 칼리비터 및 무작위화된 결합 영역 및 항체-유사 거동을 갖는 기타 스카폴드 단백질이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분, 및 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서, 상기 하나의 항원 결합 부분은 Fab 분자이거나 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 다른 항원 결합 부분은 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
하나의 바람직한 구현예에서 상기 다른 항원 결합 부분은 2 개의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이다. 또다른 구현예에서 상기 다른 항원 결합 부분은 3, 4 또는 5 개의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분, 및 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서, 상기 제 1 항원 결합 부분은 Fab 분자이거나 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 제 2 항원 결합 부분은 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
하나의 바람직한 구현예에서 상기 제 2 항원 결합 부분은 2 개의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이다. 또다른 구현예에서 상기 제 2 항원 결합 부분은 3, 4 또는 5 개의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이다.
바람직하게는 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이상의 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질을 포함하고, 상기 반복 도메인은 안키린 반복 공통 서열 DxxGxTPLHLAaxxGpxpaVpxLLpxGADVNAx 을 포함하고, 여기에서 "x" 는 임의의 아미노산을 나타내고, "" 는 임의의 아미노산 또는 결실을 나타내고, "a" 는 무극성 측쇄를 갖는 아미노산을 나타내고, "p" 는 극성 측쇄를 갖는 잔기를 나타낸다. 하나의 구현예에서 상기 반복 도메인은 안키린 반복 공통 서열 DxxGxTPLHLAxxxGxxxVVxLLLxxGADVNAx 을 포함하고, 여기에서 "x" 는 임의의 아미노산을 나타낸다. 하나의 구현예에서 상기 반복 도메인은 안키린 반복 서열 모티프 Dl lGlTPLHLAAl 1GHLEIVEVLLK2GADVNA1 을 포함하고, 여기에서 1 은 군: A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y 로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고; 2 는 군: H, N 및 Y 로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타낸다.
본 발명의 이중특이적 항체는 하나 이상의 크로스오버-Fab 조각을 포함한다. 크로스오버 Fab 조각은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되어 있는 Fab 조각이다. 크로스오버 Fab 조각을 포함하는 이중특이적 항체 포맷은, 예를 들어, WO2009080252, WO2009080253, WO2009080251, WO2009080254, WO2010/136172, WO2010/145792 및 EP 특허 출원 번호 11178371.8 에 기재되어 있고, 상기 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이상의 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질을 포함하고, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 1 개 이하의 항원 결합 부분을 포함한다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 분자 또는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자를 포함하는 또다른 항원 결합 부분에 융합되어 있는, 하나 이상의 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질을 포함하는 하나의 항원 결합 부분을 포함한다. 임의로 항원 결합 부분은 펩티드 링커를 통해 서로 융합되어 있다.
하나의 구현예에서 상기 하나 이상의 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질은 크로스오버 Fab 분자의 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다.
하나의 구현예에서 상기 하나 이상의 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질은 크로스오버 Fab 분자의 경쇄의 N-말단에 융합되어 있다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분을 부가적으로 포함한다.
하나의 구현예에서 상기 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이다. 하나의 구현예에서 상기 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은 위에 정의된 바와 같은 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이다. 하나의 구현예에서 상기 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은 2, 3, 4 또는 5 개의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이다.
본 발명의 하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서 상기 Fc 도메인은 IgG, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4, Fc 도메인이다. 구체적인 구현예에서 Fc 도메인은 아래 개요서술되어 있는 바와 같은 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 연합을 촉진하는 수식을 추가로 포함할 수 있다. 다른 구체적인 구현예에서 Fc 도메인은 아래 개요서술되어 있는 바와 같은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
a) 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인,
b) Fab 분자 또는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자를 포함하는 제 1 항원 결합 부분으로서, Fab 분자 또는 크로스오버 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 1 항원 결합 부분;
c) 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질을 포함하는 제 2 항원 결합 부분으로서, 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 2 항원 결합 부분; 및
d) 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질을 포함하는 제 3 항원 결합 부분으로서, 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 제 3 항원 결합 부분.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
a) 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인;
b) Fab 분자 또는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자를 포함하는 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분으로서, Fab 분자 또는 크로스오버 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 1 항원 결합 부분;
c) 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질을 포함하는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분으로서, 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 2 항원 결합 부분; 및
d) 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질을 포함하는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분으로서, 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 제 3 항원 결합 부분.
하나의 구현예에서 상기 제 2 및 제 3 항원 결합 부분은 동일한 표적 세포 항원에 결합한다.
하나의 구현예에서 상기 제 1 및/또는 제 2 항원 결합 부분은 힌지 영역을 통해 Fc-도메인에 직접 연결되어 있다. 또다른 구현예에서 상기 제 1 및/또는 제 2 항원 결합 부분은 펩티드 링커를 통해 Fc-도메인에 연결되어 있다.
임의의 상기 구현예에 따르면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분 (예를 들어 항원 결합 부분, Fc 도메인) 은 직접 또는 본원에 기재되어 있거나 당업계에 공지되어 있는 다양한 링커, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로약 2-20 개 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 적합한, 비-면역원성 펩티드 링커는, 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커 (n 은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4 의 수임) 를 포함한다.
Fc 도메인
본 발명의 일부 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인을 포함한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 예를 들어, 면역글로불린 G (IgG) 분자의 Fc 도메인은 이합체이며, 이러한 이합체의 각각의 서브유닛은 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2 개의 서브유닛은 서로 안정적 연합을 할 수 있다. 하나의 구현예에서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 1 개 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정 구현예에서 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또다른 구현예에서 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 더욱 구체적인 구현예에서, Fc 도메인은 위치 S228 (Kabat 번호지정) 에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P 를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 이러한 아미노산 치환은 생체내에서 IgG4 항체의 Fab 팔 교환을 감소시킨다 (Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010) 참조). 추가의 특별한 구현예에서 Fc 도메인은 인간이다. 인간 IgG1 Fc 영역의 예시적 서열은 SEQ ID NO: 149 에 제시되어 있다.
이종이합체화를 촉진하는 Fc 도메인 수식
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 항원 결합 부분을 포함하고, 하나의 구현예에서 Fc 도메인의 2 개의 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합되어 있으며, 그에 따라 Fc 도메인의 2 개의 서브유닛은 전형적으로 2 개의 비-동일한 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 이들 폴리펩티드의 재조합 동시-발현 및 후속적 이합체화는 2 개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 초래한다. 재조합 생산에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선하기 위해, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 원하는 폴리펩티드의 연합을 촉진하는 수식을 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정 구현예에서 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 연합을 촉진하는 수식을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2 개의 서브유닛 사이의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 자리는 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다. 따라서, 하나의 구현예에서 상기 수식은 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다.
구체적인 구현예에서 상기 수식은 소위 "놉-인투-홀" 수식이며, Fc 도메인의 2 개의 서브유닛 중 하나에서 "놉" 수식 및 Fc 도메인의 2 개의 서브유닛 중 다른 하나에서 "홀" 수식을 포함한다.
놉-인투-홀 기술은 예를 들어 US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001) 에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이합체 형성을 촉진하고 동종이합체 형성을 방해하도록 제 1 폴리펩티드의 경계면에 융기 ("놉") 및 제 2 폴리펩티드의 경계면에 상응하는 공동 ("홀") 을 도입하여, 융기가 공동 내에 위치할 수 있게 하는 것을 수반한다. 융기는 제 1 폴리펩티드의 경계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예를 들어 티로신 또는 트립토판) 로 대체함으로써 구축된다. 융기에 대한 동일한 또는 유사한 크기의 보상적 공동은 제 2 폴리펩티드의 경계면에서 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄 (예를 들어 알라닌 또는 트레오닌) 로 대체함으로써 생성된다.
따라서, 특정 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내에 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 공동에 위치가능한 융기를 생성하고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내에 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 융기가 내부에 위치가능한 공동을 생성한다.
예를 들어 자리 지정 돌연변이유발에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 변경함으로써 융기 및 공동을 생성할 수 있다.
구체적인 구현예에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 위치 366 에서의 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기 (T366W) 로 대체되고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 위치 407 에서의 티로신 잔기가 발린 잔기 (Y407V) 로 대체된다. 하나의 구현예에서, Fc 도메인의 제 2 서브유닛에서 부가적으로 위치 366 에서의 트레오닌 잔기가 세린 잔기 (T366S) 로 대체되고, 위치 368 에서의 류신 잔기가 알라닌 잔기 (L368A) 로 대체된다.
추가의 구현예에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛에서 부가적으로 위치 354 에서의 세린 잔기가 시스테인 잔기 (S354C) 로 대체되고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛에서 부가적으로 위치 349 에서의 티로신 잔기가 시스테인 잔기 (Y349C) 로 대체된다. 이들 2 개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2 개의 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 초래하여, 이합체를 추가로 안정화시킨다 (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
특정 구현예에서 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 부분은 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 ("놉" 수식을 포함함) 에 융합되어 있다 (임의로 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 부분을 통해). 이론에 구속되는 것을 바라지 않으면서, Fc 도메인의 놉-함유 서브유닛에 대한 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 부분의 융합은 (추가로) 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 2 개의 항원 결합 부분을 포함하는 항원 결합 분자의 생성을 최소화할 것이다 (2 개의 놉-함유 폴리펩티드의 입체 충돌).
하나의 구현예에서 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 연합을 촉진하는 수식은 예를 들어 PCT 공개 WO 2009/089004 에 기재되어 있는 바와 같은 정전기 스티어링 효과를 매개하는 수식을 포함한다. 일반적으로, 이러한 방법은 2 개의 Fc 도메인 서브유닛의 경계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 하전된 아미노산 잔기에 의한 대체를 수반하여, 동종이합체 형성은 정전기적으로 불리해지지만 이종이합체화는 정전기적으로 유리해진다.
하나의 양상에서 본 발명은 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
제 1 및 제 2 항원 결합 부분으로서, 그 중 하나는 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 분자이고, 다른 하나는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 분자이고,
제 1 항원 결합 부분은
(a) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 펩티드 링커에 의해 연결되어 있는 단일 사슬 Fab 분자, 또는
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자인
제 1 및 제 2 항원 결합 부분; 및
안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인으로서,
제 1 서브유닛 및 상기 제 2 서브유닛이 이종이합체 형성에 정전기적으로 유리한 하나 이상의 하전된 아미노산을 포함하도록 수식된 Fc 도메인.
하나의 구현예에서, 상기 제 1 서브유닛은 아미노산 돌연변이 E356K, E357K 및 D399K 를 포함하고, 제 2 서브유닛은 아미노산 돌연변이 K370E, K409E 및 K439E 를 포함한다.
또다른 구현예에서 상기 제 1 서브유닛은 아미노산 돌연변이 K392D, K409D 를 포함하고, 제 2 서브유닛은 아미노산 돌연변이 E356K, D399K (DDKK) 를 포함한다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분은 다양한 입체배치로 서로 융합될 수 있다. 예시적 입체배치가 도 1 에 묘사되어 있다.
일부 구현예에서, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다.
특별한 그러한 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 그러한 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 및 제 2 항원 결합 부분, 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인, 및 임의로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 이루어지고, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 더욱더 구체적인 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 단일 사슬 Fab 분자이다. 대안적으로, 특정 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 크로스오버 Fab 분자이다. 임의로, 제 1 항원 결합 부분이 크로스오버 Fab 분자인 경우, 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄 및 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄는 부가적으로 서로 융합될 수 있다.
대안적 그러한 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 그러한 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 및 제 2 항원 결합 부분, 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인, 및 임의로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 이루어지고, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있다. 더욱더 구체적인 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 단일 사슬 Fab 분자이다. 대안적으로, 특정 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 크로스오버 Fab 분자이다.
또다른 그러한 구현예에서, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 경쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 그러한 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 및 제 2 항원 결합 부분, 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인, 및 임의로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 이루어지고, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 경쇄의 N-말단에서 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄의 C-말단에 융합되어 있고, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 더욱더 구체적인 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 크로스오버 Fab 분자이다.
다른 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다.
특별한 그러한 구현예에서, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 그러한 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 및 제 2 항원 결합 부분, 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인, 및 임의로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 이루어지고, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 더욱더 구체적인 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 크로스오버 Fab 분자이다. 임의로, 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄 및 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄는 부가적으로 서로 융합될 수 있다.
특정 이들 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있다. 다른 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있다.
항원 결합 부분은 직접 또는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20 개 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 또는 서로 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다. 적합한, 비-면역원성 펩티드 링커는, 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함한다. "n" 은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4 의 수이다. 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄를 서로 융합시키는데 특히 적합한 펩티드 링커는 (G4S)2 이다. 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄를 연결시키는데 적합한 예시적 펩티드 링커는 EPKSC(D)-(G4S)2 (SEQ ID NOs 150 및 151) 이다. 부가적으로, 링커는 면역글로불린 힌지 영역 (의 일부) 을 포함할 수 있다. 특히 항원 결합 부분이 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는 경우, 그것은 부가적 펩티드 링커의 존재 또는 부재 하에 면역글로불린 힌지 영역 또는 그의 일부를 통해 융합될 수 있다.
표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 단일 항원 결합 부분을 갖는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 (예를 들어 도 1A, 1B, 1D, 1E, 1H, 1I, 1K 또는 1M 에 제시된 바와 같음) 는, 특히 높은 친화도 항원 결합 부분의 결합 후에 표적 세포 항원의 내재화가 예상되는 경우에, 유용하다. 그러한 경우에, 표적 세포 항원에 특이적인 하나 초과의 항원 결합 부분의 존재는 표적 세포 항원의 내재화를 향상시켜, 그에 의해 그것의 이용가능성을 감소시킬 수 있다.
그러나, 많은 다른 경우에, 예를 들어 표적 자리에 대한 표적화를 최적화하거나 표적 세포 항원의 가교를 허용하기 위해, 표적 세포 항원에 특이적인 둘 이상의 항원 결합 부분을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 (도 1C, 1F, 1G, 1J 또는 1L 에 제시되어 있는 예를 참조) 를 갖는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 부분을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 3 항원 결합 부분은 제 1 또는 제 2 항원 결합 부분과 동일한 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있다. 특정 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있고, 제 2 및 제 3 항원 결합 부분은 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있다.
하나의 구현예에서, 제 3 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 특정 구현예에서, 제 2 및 제 3 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 하나의 그러한 구현예에서 제 1 항원 결합 부분은 단일 사슬 Fab 분자이다. 특별한 그러한 구현예에서 제 1 항원 결합 부분은 크로스오버 Fab 분자이다. 임의로, 제 1 항원 결합 부분이 크로스오버 Fab 분자인 경우, 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄 및 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄는 부가적으로 서로 융합될 수 있다.
제 2 및 제 3 항원 결합 부분은 직접 또는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정 구현예에서 제 2 및 제 3 항원 결합 부분은 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합되어 있다. 구체적인 구현예에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 하나의 구현예에서 제 2 및 제 3 항원 결합 부분 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 특정 구현예에서 면역글로불린 분자는 IgG 클래스 면역글로불린이다. 더욱더 특별한 구현예에서 면역글로불린은 IgG1 서브클래스 면역글로불린이다. 또다른 구현예에서 면역글로불린은 IgG4 서브클래스 면역글로불린이다. 추가의 특별한 구현예에서 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 구현예에서 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화 면역글로불린이다. 하나의 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 면역글로불린 분자, 및 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 부분으로 본질적으로 이루어지고, 상기 항원 결합 부분은 단일 사슬 Fab 분자 또는 크로스오버 Fab 분자, 특히 면역글로불린 중쇄 중 하나의 N-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 융합된 크로스오버 Fab 분자이다.
대안적 구현예에서, 제 1 및 제 3 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있고, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 그러한 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1, 제 2 및 제 3 항원 결합 부분, 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인, 및 임의로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 이루어지고, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있고, 제 3 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 특별한 그러한 구현예에서 제 1 항원 결합 부분은 크로스오버 Fab 분자이다. 임의로, 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄 및 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄는 부가적으로 서로 융합될 수 있다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 일부에서, 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄 및 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄는, 임의로 링커 펩티드를 통해, 서로 융합되어 있다. 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 입체배치에 따라, 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄는 그것의 C-말단에서 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있거나, 또는 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄는 그것의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있다. 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄의 융합은 매치되지 않는 (unmatched) Fab 중쇄 및 경쇄의 짝짓기오류를 추가로 감소시키고, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 일부의 발현에 필요한 플라스미드의 수를 또한 감소시킨다.
특정 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 Fab 경쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 펩티드 링커와 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 중쇄와 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VL-CL-링커-VH-CH1-CH2-CH2(-CH4)), 및 제 2 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 를 포함한다. 일부 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 Fab 경쇄 폴리펩티드 (VL-CL) 를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서 폴리펩티드는, 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해, 공유적으로 연결되어 있다.
일부 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 Fab 경쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 펩티드 링커와 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 중쇄와 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 2 Fab 중쇄와 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VL-CL-링커-VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 를 포함한다. 이들 구현예 중 하나에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 Fab 경쇄 폴리펩티드 (VL-CL) 를 추가로 포함한다. 이들 구현예에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드 (CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제 3 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 및 제 3 Fab 경쇄 폴리펩티드 (VL-CL) 를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 폴리펩티드는, 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해, 공유적으로 연결되어 있다.
특정 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 Fab 경쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하고 (즉 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되어 있는 크로스오버 Fab 중쇄), 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VL-CH1-CH2-CH2(-CH4)), 및 제 2 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 를 포함한다. 일부 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 중쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CL) 및 Fab 경쇄 폴리펩티드 (VL-CL) 를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서 폴리펩티드는, 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해, 공유적으로 연결되어 있다.
대안적 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 Fab 중쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하고 (즉 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되어 있는 크로스오버 Fab 중쇄), 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CL-CH2-CH2(-CH4)), 및 제 2 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 를 포함한다. 일부 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 경쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드 (VL-CH1) 및 Fab 경쇄 폴리펩티드 (VL-CL) 를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서 폴리펩티드는, 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해, 공유적으로 연결되어 있다.
일부 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 Fab 경쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하고 (즉 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되어 있는 크로스오버 Fab 중쇄), 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 2 Fab 중쇄와 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 를 포함한다. 다른 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 Fab 중쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하고 (즉 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되어 있는 크로스오버 Fab 중쇄), 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 2 Fab 중쇄와 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CL-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 를 포함한다. 다른 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 경쇄 가변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하고 (즉 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되어 있는 크로스오버 Fab 중쇄), 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 를 포함한다. 다른 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 중쇄 가변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하고 (즉 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되어 있는 크로스오버 Fab 중쇄), 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3(-CH4)) 를 포함한다.
이들 구현예 중 일부에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 중쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하는 크로스오버 Fab 경쇄 폴리펩티드 (VH-CL), 및 Fab 경쇄 폴리펩티드 (VL-CL) 를 추가로 포함한다. 이들 구현예 중 다른 일부에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 경쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하는 크로스오버 Fab 경쇄 폴리펩티드 (VL-CH1), 및 Fab 경쇄 폴리펩티드 (VL-CL) 를 추가로 포함한다. 이들 구현예 중 다른 일부에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 경쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 폴리펩티드와 공유하는 폴리펩티드 (VL-CH1-VL-CL), Fab 중쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 폴리펩티드와 공유하는 폴리펩티드 (VH-CL-VL-CL), Fab 경쇄 폴리펩티드가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 가변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드 (VL-CL-VL-CH1), 또는 Fab 경쇄 폴리펩티드가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 가변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드 (VL-CL-VH-CL) 를 추가로 포함한다.
이들 구현예에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드 (CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제 3 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 및 제 3 Fab 경쇄 폴리펩티드 (VL-CL) 를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 폴리펩티드는, 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해, 공유적으로 연결되어 있다.
하나의 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 Fab 경쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 경쇄 가변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드 (즉 경쇄 불변 영역이 중쇄 불변 영역에 의해 대체되어 있는 크로스오버 Fab 경쇄) (VL-CL-VL-CH1), 제 2 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)), 및 제 1 Fab 중쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CL) 를 포함한다. 또다른 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 Fab 경쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 중쇄 가변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드 (즉 경쇄 가변 영역이 중쇄 가변 영역에 의해 대체되어 있는 크로스오버 Fab 경쇄) (VL-CL-VH-CL), 제 2 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)), 및 제 1 Fab 경쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 제 1 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드 (VL-CH1) 를 포함한다. 이들 구현예에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드 (CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제 3 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드 (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 및 제 3 Fab 경쇄 폴리펩티드 (VL-CL) 를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 폴리펩티드는, 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해, 공유적으로 연결되어 있다.
임의의 상기 구현예에 따르면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분 (예를 들어 항원 결합 부분, Fc 도메인) 은 직접 또는 본원에 기재되어 있거나 당업계에 공지되어 있는 다양한 링커, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로약 2-20 개 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 적합한, 비-면역원성 펩티드 링커는, 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커 (n 은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4 의 수임) 를 포함한다.
하나의 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 372, 373, 374 및 375 와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NOs: 372, 373, 374 및 375 을 포함한다.
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 수식
Fc 도메인은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에게 표적 조직 내 양호한 축적 및 유리한 조직-혈액 분포 비율에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하는 유리한 약동학적 특성을 제공한다. 그러나, 그것은 동시에 바람직한 항원-보유 세포에 대해 보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 원하지 않는 표적화를 초래할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 동시-활성화는 사이토카인 방출을 초래할 수 있으며, 이는, 항원 결합 분자의 T 세포 활성화 특성 및 긴 반감기와 조합하여, 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 전신 투여시 심각한 부작용을 초래한다. T 세포 이외의 (Fc 수용체-보유) 면역 세포의 활성화는 심지어는 예를 들어 NK 세포에 의한 T 세포의 잠재적 파괴로 인해 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효능을 감소시킬 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 그러한 구현예에서 Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자) 은 천연 IgG1 Fc 도메인 (또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자) 에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도, 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인 (또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자) 에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 구현예에서, Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자) 은 실질적으로 Fc 수용체에 결합하고/거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정 구현예에서 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 구현예에서 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 구현예에서 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 구현예에서 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더욱 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa 이다. 하나의 구현예에서 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP, 및 사이토카인 분비의 군으로부터 선택되는 하나 이상이다. 특정 구현예에서 효과기 기능은 ADCC 이다. 하나의 구현예에서 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교시 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 실질적으로 유사한 결합 친화도를 나타낸다. FcRn 에 대한 실질적으로 유사한 결합은 Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자) 이 FcRn 에 대해 천연 IgG1 Fc 도메인 (또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자) 의 결합 친화도의 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 더욱 특히 약 90% 초과를 나타낼 때 달성된다.
특정 구현예에서 Fc 도메인은, 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2 개의 서브유닛 각각에 존재한다. 하나의 구현예에서 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시킨다. 하나의 구현예에서 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 2-배 이상, 5-배 이상, 또는 10-배 이상 감소시킨다. 구현예에서 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 존재하는 경우, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 10-배 이상, 20-배 이상, 또는 심지어는 50-배 이상 감소시킬 수 있다. 하나의 구현예에서 조작된 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 비해 20% 미만, 특히 10% 미만, 더욱 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 특정 구현예에서 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 구현예에서 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 구현예에서 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 구현예에서 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더욱 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa 이다. 바람직하게는, 각각의 이들 수용체에 대한 결합이 감소된다. 일부 구현예에서 보체 성분에 대한 결합 친화도, 구체적으로 C1q 에 대한 결합 친화도가 또한 감소된다. 하나의 구현예에서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn 에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도의 보존은 Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자) 이 FcRn 에 대해 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인 (또는 상기 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자) 의 결합 친화도의 약 70% 초과를 나타낼 때 달성된다. Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 상기 친화도의 약 80% 초과, 심지어는 약 90% 초과를 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 감소된 효과기 기능은 하기 중 하나 이상을 포함하나 그에 제한되지 않을 수 있다: 감소된 보체 의존적 세포독성 (CDC), 감소된 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 감소된 항체-의존적 세포성 포식작용 (ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원-제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개 항원 흡수, NK 세포에 대한 감소된 결합, 마크로파지에 대한 감소된 결합, 단핵구에 대한 감소된 결합, 다형핵 세포에 대한 감소된 결합, 감소된 직접 신호전달 유도 세포자멸사, 표적-결합된 항체의 감소된 가교, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T 세포 프라이밍. 하나의 구현예에서 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP, 및 감소된 사이토카인 분비의 군으로부터 선택되는 하나 이상이다. 특정 구현예에서 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC 이다. 하나의 구현예에서 감소된 ADCC 은 조작되지 않은 Fc 도메인 (또는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자) 에 의해 유도되는 ADCC 의 20% 미만이다.
하나의 구현예에서 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 하나의 구현예에서 Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329 의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 구체적인 구현예에서 Fc 도메인은 L234, L235 및 P329 의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A 을 포함한다. 하나의 그러한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 구현예에서 Fc 도메인은 위치 P329 에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 구체적인 구현예에서 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G 이다. 하나의 구현예에서 Fc 도메인은 위치 P329 에서 아미노산 치환 및 E233, L234, L235, N297 및 P331로부터 선택되는 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 구체적인 구현예에서 추가의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S 이다. 특정 구현예에서 Fc 도메인은 위치 P329, L234 및 L235 에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특별한 구현예에서 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G ("P329G LALA") 을 포함한다. 하나의 그러한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 특허 출원 번호 PCT/EP2012/055393 에 기재된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 폐지한다. PCT/EP2012/055393 은 또한 그러한 돌연변이체 Fc 도메인의 제조 방법 및 그것의 특성 예컨대 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능의 확인 방법을 기재한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 구현예에서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 구현예에서 IgG4 Fc 도메인은 위치 S228 에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P 을 포함한다. Fc 수용체에 대한 그것의 결합 친화도 및/또는 그것의 효과기 기능을 추가로 감소시키기 위해, 하나의 구현예에서 IgG4 Fc 도메인은 위치 L235 에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E 을 포함한다. 또다른 구현예에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329 에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G 을 포함한다. 특정 구현예에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329 에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G 을 포함한다. 그러한 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 그들의 Fcγ 수용체 결합 특성은 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 특허 출원 번호 PCT/EP2012/055393 에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 임의로 P329G 을 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의로 P329G 을 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
특정 구현예에서 Fc 도메인의 N-글리코실화가 제거되었다. 하나의 그러한 구현예에서 Fc 도메인은 위치 N297 에서 아미노산 돌연변이, 특히 아스파라긴을 알라닌 (N297A) 또는 아스파르트산 (N297D) 으로 대체하는 아미노산 치환을 포함한다.
상기 및 PCT 특허 출원 번호 PCT/EP2012/055393 에 기재된 Fc 도메인에 더하여, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상이 치환된 것을 또한 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 그러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 둘 이상에서 치환된 Fc 돌연변이체, 예를 들어 잔기 265 및 297 이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 특허 번호 7,332,581).
돌연변이체 Fc 도메인은 당업계에 널리 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 수식에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 인코딩 DNA 서열의 자리-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 올바른 뉴클레오티드 변화는 예를 들어 서열분석에 의해 확인될 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은 예를 들어 ELISA 에 의해, 또는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 표준 기기장치 예컨대 BIAcore 기구 (GE Healthcare) 를 사용하여 용이하게 확인될 수 있고, Fc 수용체는 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 적합한 그러한 결합 검정이 본원에 기재되어 있다. 대안적으로, Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도는 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주, 예컨대 FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 사용하여 평가될 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효과기 기능은 당업계에 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC 를 측정하기 위한 적합한 검정이 본원에 기재되어 있다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하는 시험관내 검정의 기타 예가 미국 특허 번호 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) 및 Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); 미국 특허 번호 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987) 에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (예를 들어, 유동 세포분석법에 관한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI) 참조). 그러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심의 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 동물 모델 예컨대 Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998) 에 공개된 것에서 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 보체 성분, 구체적으로 C1q 에 대한 Fc 도메인의 결합이 감소된다. 따라서, 일부 구현예에서 여기에서 Fc 도메인은 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작되고, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC 를 포함한다. C1q 결합 검정을 수행하여 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 C1q 에 결합할 수 있고 따라서 CDC 활성을 갖는지 여부를 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402 에 기재된 C1q 및 C3c 결합 ELISA 를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); and Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004) 참조).
항원 결합 부분
본 발명의 항원 결합 분자는 이중특이적이며, 즉 그것은 2 개의 구별되는 항원 결정인자에 특이적 결합을 할 수 있는 2 개 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 본 발명에 따르면, 항원 결합 부분은 Fab 분자 (즉 각각 가변 및 불변 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄로 구성되는 항원 결합 도메인), 단일 도메인 항원 결합 (SDAB) 분자, 또는 단백질 스카폴드, 예컨대 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질 (예를 들어 다르핀) 이다. 하나의 구현예에서 상기 Fab 분자 또는 단일 도메인 항원 결합 (SDAB) 분자는 인간이다. 또다른 구현예에서 상기 Fab 분자 또는 단일 도메인 항원 결합 (SDAB) 분자는 인간화된 것이다. 또다른 구현예에서 상기 Fab 분자는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
항원 결합 부분 중 하나 이상은 단일 사슬 Fab 분자 또는 크로스오버 Fab 분자이다. 그러한 수식은 상이한 Fab 분자로부터의 중쇄 및 경쇄의 짝짓기오류를 방지하여, 그에 의해 재조합 생산에서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 특정 단일 사슬 Fab 분자에서, Fab 경쇄의 C-말단은 Fab 중쇄의 N-말단에 펩티드 링커에 의해 연결되어 있다. 펩티드 링커는 기능적 항원 결합 부분을 형성하는 Fab 중쇄 및 경쇄의 배열을 허용한다. Fab 중쇄 및 경쇄를 연결하는데 적합한 펩티드 링커는, 예를 들어, (G4S)6-GG (SEQ ID NO: 152) 또는 (SG3)2-(SEG3)4-(SG3)-SG (SEQ ID NO:153) 를 포함한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 특정 크로스오버 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되어 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 또다른 크로스오버 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있다.
본 발명에 따른 특정 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원, 특히 종양 세포 항원, 및 활성화 T 세포 항원에 동시 결합할 수 있다. 하나의 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원 및 활성화 T 세포 항원에 동시 결합함으로써 T 세포 및 표적 세포를 교차연결시킬 수 있다. 더욱더 특별한 구현예에서, 그러한 동시 결합은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 초래한다. 하나의 구현예에서, 그러한 동시 결합은 T 세포의 활성화를 초래한다. 다른 구현예에서, 그러한 동시 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현의 군으로부터 선택되는 T 백혈구, 특히 세포독성 T 백혈구의 세포성 응답을 초래한다. 하나의 구현예에서, 표적 세포 항원에 대한 동시 결합이 없는 활성화 T 세포 항원에 대한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합은 T 세포 활성화를 초래하지 않는다.
하나의 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포에게로 방향지정할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 방향지정은 표적 세포에 의한 MHC-매개 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성에 독립적이다.
특히, 본 발명의 임의의 구현예에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 구현예에서 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
활성화 T 세포 항원 결합 부분
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 부분 (본원에서 또한 "활성화 T 세포 항원 결합 부분" 으로도 언급됨) 을 포함한다. 특정 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 1 개 이하의 항원 결합 부분을 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 대한 1 가 결합을 제공한다. 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 평범한 Fab 분자 또는 수식된 Fab 분자, 즉 단일 사슬 또는 크로스오버 Fab 분자, 또는 단일 도메인 항원 결합 (SDAB) 분자, 또는 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질일 수 있다. 구현예에서 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 하나 초과의 항원 결합 부분이 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함되어 있는 경우, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 부분은 바람직하게는 수식된 Fab 분자이다.
특정 구현예에서 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 인간 CD3 (SEQ ID NO: 265) 또는 사이노몰구스 CD3 (SEQ ID NO: 266), 가장 특히 인간 CD3 이다. 특정 구현예에서 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 인간 및 사이노몰구스 CD3 에 교차반응성이다 (즉 특이적으로 결합한다). 일부 구현예에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3 의 엡실론 서브유닛이다.
하나의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 CD3 의 에피토프 결합에 대해 모노클로날 항체 H2C 와 경쟁할 수 있다 (PCT 공개 번호 WO2008/119567 에 기재됨). 또다른 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 CD3 의 에피토프 결합에 대해 모노클로날 항체 V9 와 경쟁할 수 있다 (Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992) 및 US 특허 번호 6,054,297 에 기재됨). 또다른 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 CD3 의 에피토프 결합에 대해 모노클로날 항체 FN18 와 경쟁할 수 있다 (Nooij et al., Eur J Immunol 19, 981-984 (1986) 에 기재됨). 특정 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 CD3 의 에피토프 결합에 대해 모노클로날 항체 SP34 와 경쟁할 수 있다 (Pessano et al., EMBO J 4, 337-340 (1985) 에 기재됨). 하나의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 모노클로날 항체 SP34 와 동일한 CD3 의 에피토프에 결합한다. 하나의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 163 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 165 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 167 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 171 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 173 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 175 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 추가의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 169 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 177 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 249 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 251 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 253 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 257 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 259 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 261 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 하나의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 CD3 의 에피토프 결합에 대해 SEQ ID NO: 249 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 251 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 253 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 257 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 259 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 261 의 경쇄 CDR3 을 포함하는 항원 결합 부분과 경쟁할 수 있다. 하나의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 249 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 251 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 253 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 257 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 259 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 261 의 경쇄 CDR3 을 포함하는 항원 결합 부분과 동일한 CD3 의 에피토프에 결합한다. 추가의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 255 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 263 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 CD3 의 에피토프 결합에 대해 SEQ ID NO: 255 의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 263 의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 부분과 경쟁할 수 있다. 하나의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 255 의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 263 의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 부분과 동일한 CD3 의 에피토프에 결합한다. 또다른 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 255 의 중쇄 가변 영역 서열의 인간화 버전 및 SEQ ID NO: 263 의 경쇄 가변 영역 서열의 인간화 버전을 포함한다. 하나의 구현예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 249 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 251 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 253 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 257 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 259 의 경쇄 CDR2, SEQ ID NO: 261 의 경쇄 CDR3, 및 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 골격 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271 및 SEQ ID NO: 272 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276 의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 을 포함한다.
하나의 구현예에서 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 299 의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 SEQ ID NO: 273 및 SEQ ID NO: 297 의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
하나의 구현예에서 활성화 T 세포 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 269 의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 SEQ ID NO: 273 의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
표적 세포 항원 결합 부분
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 부분 (본원에서 또한 "표적 세포 항원 결합 부분" 으로서도 언급됨) 을 포함한다. 특정 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 2 개의 항원 결합 부분을 포함한다. 특별한 그러한 구현예에서, 각각의 이들 항원 결합 부분은 동일한 항원 결정인자에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 2 개 이하의 항원 결합 부분을 포함한다.
표적 세포 항원 결합 부분은 보통의 Fab 분자 또는 수식된 Fab 분자, 즉 단일 사슬 또는 크로스오버 Fab 분자, 또는 단일 도메인 항원 결합 (SDAB) 분자, 또는 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질일 수 있다. 표적 세포 항원 결합 부분은 특정 항원 결정인자에 결합하고, 표적 자리에, 예를 들어 항원 결정인자를 보유하는 특정 유형의 종양 세포에 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 유도할 수 있다.
특정 구현예에서 표적 세포 항원 결합 부분은 병리 조건과 연관되는 항원, 예컨대 종양 세포 상에 또는 바이러스-감염된 세포 상에 제시된 항원에게로 유도된다. 적합한 항원은 세포 표면 항원, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 세포 표면 수용체이다. 특정 구현예에서 항원은 인간 항원이다. 구체적인 구현예에서 표적 세포 항원은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 암배아 항원 (CEA), CD19, CD20 및 CD33 의 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 MCSP 의 에피토프 결합에 대해 모노클로날 항체 LC007 (SEQ ID NOs 75 및 83, 및 전문이 본원에 참조로 포함되는 유럽 특허 출원 번호 EP 11178393.2 참조) 와 경쟁할 수 있는 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 하나의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 69 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 71 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 73 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 77 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 79 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 81 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 추가의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 75 와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 83 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 MCSP 의 에피토프 결합에 대해 모노클로날 항체 M4-3 ML2 와 경쟁할 수 있는 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 부분을 포함한다 (SEQ ID NOs 239 및 247, 및 전문이 본원에 참조로 포함되는 유럽 특허 출원 번호 EP 11178393.2 참조). 하나의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 모노클로날 항체 M4-3 ML2 와 동일한 MCSP 의 에피토프에 결합한다. 하나의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 233 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 235 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 237 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 241 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 243 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 245 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 추가의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 239 와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 특히 약 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 247 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 특히 약 98%, 99% 또는 100%, 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 모노클로날 항체 M4-3 ML2 의 친화도 성숙된 버전의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7, 특히 2, 3, 4 또는 5 개의, 아미노산 치환이 있는 SEQ ID NO: 239 의 중쇄 가변 영역 서열; 및 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7, 특히 2, 3, 4 또는 5 개의, 아미노산 치환이 있는 SEQ ID NO: 247 의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. MCSP, 특히 인간 MCSP 에 대한 결합이 보존되는 한, 가변 영역 서열 내의 임의의 아미노산 잔기는 CDR 영역 내의 아미노산 잔기를 포함하는 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직한 변이체는 미치환 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 부분의 결합 친화도와 적어도 동일한 (또는 더 강한) MCSP 에 대한 결합 친화도를 갖는 것이다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 1 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 3 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 추가의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 7 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 9 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 11 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 13 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 15 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 17 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 19 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 21 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 23 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 25 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 27 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 29 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 31 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 33 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 29 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 3 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 33 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 35 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 3 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 37 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 39 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 3 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 41 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 29 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 3 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 179 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 29 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 33 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 181 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 23 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 183 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 185 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 23 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 183 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 187 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 33 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 189 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 191 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 193 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 183 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 189 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 193 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 195 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 189 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 193 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 199 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 201 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 23 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 215 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 217 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 5 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 23 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 215 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 219 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다.
하나의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304 및 SEQ ID NO: 306 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315, 및 SEQ ID NO: 316 의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 을 포함한다.
하나의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 282 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285 및 SEQ ID NO: 286 의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 을 포함한다.
하나의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 280 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 281 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 282 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 284 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 285 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 286 의 경쇄 CDR3 을 포함한다.
추가의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 305 및 SEQ ID NO: 307 의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 317 의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
하나의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 279 의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 SEQ ID NO: 283 의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
추가의 구현예에서, MCSP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 279 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 283 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 278 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 319 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 320 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 SEQ ID NO: 321 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 369 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 370 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 SEQ ID NO: 371 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 372 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 373 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 374 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 SEQ ID NO: 375 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
구체적인 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, 및 SEQ ID NOs 329 내지 388 의 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 EGFR 의 에피토프 결합에 대해 모노클로날 항체 GA201 와 경쟁할 수 있는 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 WO 2006/082515 를 참조한다. 하나의 구현예에서, EGFR 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 85 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 87 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 89 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 93 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 95 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 97 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 추가의 구현예에서, EGFR 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 91 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 99 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다.
또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 43 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 45 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 47 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 추가의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 49 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 51 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 11 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 53 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 45 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 47 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다.
구체적인 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54 및 SEQ ID NO: 12 의 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP) 에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 FAP 의 에피토프 결합에 대해 모노클로날 항체 3F2 와 경쟁할 수 있는 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 WO 2012/020006 참조. 하나의 구현예에서, FAP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 101 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 103 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 105 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 109 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 111 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 113 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 추가의 구현예에서, FAP 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 107 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 115 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다.
또다른 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 55 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 51 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 11 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 추가의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 57 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 59 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 61 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다.
구체적인 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 52 및 SEQ ID NO: 12 의 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 암배아 항원 (CEA) 에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CEA 의 에피토프 결합에 대해 모노클로날 항체 BW431/26 (유럽 특허 번호 EP 160 897, 및 Bosslet et al., Int J Cancer 36, 75-84 (1985) 에 기재됨) 와 경쟁할 수 있는 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CEA 의 에피토프 결합에 대해 모노클로날 항체 CH1A1A (SEQ ID NOs 123 및 131 참조) 와 경쟁할 수 있는 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 특허 공개 번호 WO 2011/023787 을 참조한다. 하나의 구현예에서, CEA 에 특이적인 항원 결합 부분은 모노클로날 항체 CH1A1A 와 동일한 CEA 의 에피토프에 결합한다. 하나의 구현예에서, CEA 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 117 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 119 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 121 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 125 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 127 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 129 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 추가의 구현예에서, CEA 에 특이적인 항원 결합 부분 SEQ ID NO: 123 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 특히 약 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 131 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 특히 약 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서, CEA 에 특이적인 항원 결합 부분은 모노클로날 항체 CH1A1A 의 친화도 성숙된 버전의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, CEA 에 특이적인 항원 결합 부분은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7, 특히 2, 3, 4 또는 5 개의, 아미노산 치환이 있는 SEQ ID NO: 123 의 중쇄 가변 영역 서열; 및 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7, 특히 2, 3, 4 또는 5 개의, 아미노산 치환이 있는 SEQ ID NO: 131 의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. CEA, 특히 인간 CEA 에 대한 결합이 보존되는 한, 가변 영역 서열 내의 임의의 아미노산 잔기는 CDR 영역 내의 아미노산 잔기를 포함하는 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 바람직한 변이체는 미치환 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 부분의 결합 친화도와 적어도 동일한 (또는 더 강한) CEA 에 대한 결합 친화도를 갖는 것이다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 63 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 65 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 67 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 33 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 65 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 67 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 183 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 197 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 183 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 203 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 205 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 207 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 183 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 209 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 211 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 213 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다.
구체적인 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212 및 SEQ ID NO: 214 의 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, CEA 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 및 SEQ ID NO: 292 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 및 SEQ ID NO: 296 의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 을 포함한다.
하나의 구현예에서, CEA 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 290 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 291 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 292 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 294 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 295 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 296 의 경쇄 CDR3 을 포함한다.
하나의 구현예에서, CEA 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 289 의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 SEQ ID NO: 293 의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
추가의 구현예에서, CEA 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 289 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 293 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 288 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 322 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 323 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 SEQ ID NO: 324 와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다 .
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD33 에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 하나의 구현예에서, CD33 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 133 의 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 135 의 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 137 의 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 141 의 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 143 의 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 145 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 추가의 구현예에서, CD33 에 특이적인 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 139 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 147 과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다.
하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 33 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 213 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 221 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 223 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 33 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 221 의 폴리펩티드 서열, SEQ ID NO: 223 의 폴리펩티드 서열 및 SEQ ID NO: 225 의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 그의 변이체를 포함한다.
구체적인 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224 및 SEQ ID NO: 226 의 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387 및 388 에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 것 뿐만 아니라 그의 기능적 조각 또는 변이체를 포함한다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전체 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 또는 동시-발현되는 복수의 (예를 들어, 둘 이상의) 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 동시-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드는, 예를 들어, 다이설파이드 결합 또는 기타 수단을 통해 연합하여 기능적 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 형성할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 부분의 경쇄 부분은 항원 결합 부분의 중쇄 부분, Fc 도메인 서브유닛 및 임의로 또다른 항원 결합 부분 (의 일부) 을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 동시-발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 연합하여 항원 결합 부분을 형성할 것이다. 또다른 예에서, 2 개의 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 및 임의로 하나 이상의 항원 결합 부분 (의 일부) 을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 부분은 2 개의 Fc 도메인 서브유닛 중 다른 하나 및 임의로 항원 결합 부분 (의 일부) 을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 동시-발현될 때, Fc 도메인 서브유닛은 연합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제 1 및 제 2 항원 결합 부분, 및 2 개의 서브유닛으로 이루어지는 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 조각을 인코딩하며, 상기 제 1 항원 결합 부분은 단일 사슬 Fab 분자이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제 1 항원 결합 부분 및 Fc 도메인의 서브유닛을 인코딩한다. 더욱 구체적인 구현예에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 Fab 분자가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제 2 항원 결합 부분의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 인코딩한다. 더욱 구체적인 구현예에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄가 카르복시 말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제 1 항원 결합 부분, 제 2 항원 결합 부분의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 인코딩한다. 더욱 구체적인 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 Fab 분자가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄와 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제 1 및 제 2 항원 결합 부분, 및 2 개의 서브유닛으로 이루어지는 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 조각을 인코딩하며, 상기 제 1 항원 결합 부분은 크로스오버 Fab 분자이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제 1 항원 결합 부분의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 인코딩한다. 더욱 구체적인 구현예에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄 가변 영역이 카르복시 말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 구체적인 구현예에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄 가변 영역이 카르복시 말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제 2 항원 결합 부분의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 인코딩한다. 더욱 구체적인 구현예에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄가 카르복시 말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제 1 항원 결합 부분의 중쇄, 제 2 항원 결합 부분의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 인코딩한다. 더욱 구체적인 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄와 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 구체적인 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄와 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 구체적인 구현예에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 가변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 구체적인 구현예에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 가변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제 3 항원 결합 부분의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 인코딩한다. 더욱 구체적인 구현예에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄가 카르복시 말단 펩티드 결합을 Fc 도메인 서브유닛과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 부분의 경쇄를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제 1 항원 결합 부분의 경쇄 및 제 2 항원 결합 부분의 경쇄를 인코딩한다. 더욱 구체적인 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄와 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 구체적인 구현예에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 가변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 구체적인 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄 가변 영역이 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄와 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 구체적인 구현예에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄가 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 경쇄 가변 영역과 공유하고, 이는 다음으로 카르복시-말단 펩티드 결합을 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, SEQ ID NOs 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 및 263 에 제시된 가변 영역 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284,285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327 및 328 에 제시된 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 또한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387 또는 388 에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 264, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387 또는 388 에 제시된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, SEQ ID NOs 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 또는 263 에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 가변 영역 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284,285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327 또는 328 에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 보존적 아미노산 치환이 있는 SEQ ID NOs 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 또는 263 의 가변 영역 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 망라한다. 본 발명은 또한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 보존적 아미노산 치환이 있는 SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284,285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327 또는 328 의 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 망라한다.
특정 구현예에서 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA 이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 이며, 예를 들어, 메신저 RNA (mRNA) 형태이다. 본 발명의 RNA 는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 예를 들어 고상 펩티드 합성 (예를 들어, Merrifield 고상 합성) 또는 재조합 제조로 수득될 수 있다. 재조합 제조를 위해서는, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 (조각) 를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 단리되며, 숙주 세포에서의 부가적 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 통상적 과정을 사용하여 쉽게 단리될 수 있고, 서열분석될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업계에 널리 공지된 방법이 적절한 전사/번역 제어 신호와 함께 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 (조각) 의 서열의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터 구축에 이용될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)] 에 기재된 기술들 참조. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 중 일부일 수 있거나, 또는 핵산 조각일 수 있다. 발현 벡터는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 (조각) (즉, 코딩 영역) 을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터 및/또는 기타 전사 또는 번역 제어 구성원들이 작동적으로 연결되어 있도록 클로닝된 발현 카세트를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "코딩 영역" 은 아미노산으로 번역될 코돈들로 이루어진 핵산의 일부분이다. "정지 코돈" (TAG, TGA, 또는 TAA) 은 아미노산으로 번역되지 않지만, 존재하는 경우 코딩 영역의 일부분의 간주될 수 있지만, 예를 들어 프로모터, 리보좀 결합 자리, 전사 종결자, 인트론, 5' 및 3' 비번역 영역 등과 같은 임의의 측부 서열은 코딩 서열의 일부분이 아니다. 둘 이상의 코딩 영역이 예를 들어 단일 벡터 상의 단일 폴리뉴클레오티드 구축물 중에, 또는 별도 (상이한) 벡터 상의 별도 폴리뉴클레오티드 구축물 중에 존재할 수 있다. 나아가, 임의의 벡터가 단일 코딩 영역을 포함할 수 있거나, 또는 둘 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있는데, 예를 들어 본 발명의 벡터가 단백질가수분해 절단을 통해 번역 이후에 또는 번역과 함께 분리되어 나갈 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 추가로, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 (조각) 을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 변이체 또는 유도체에 융합되어 있거나 또는 그렇지 않은 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역은 분비 신호 펩티드와 같은 특화되어 있는 구성원 또는 모티프 또는 이종성 관능성 도메인을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 유전자 산물, 예를 들어 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이, 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현이 있어날 수 있도록 위치할 때 작동가능한 연결이 존재한다. 2 개의 DNA 조각 (예컨대, 폴리펩티드 코딩 영역 및 그에 관련하여 연결되어 있는 프로모터) 는, 프로모터 기능의 유도 결과 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA 의 전사가 제공되며, 두 DNA 조각들 사이의 연결의 본성이 발현 조절 서열들의 유전자 산물 발현 지령 능력에 방해가 되거나 또는 DNA 주형의 전사되는 능력을 방해하지 않는다면, "작동적으로 연결" 되어 있는 것이다. 따라서, 프로모터 영역은 해당 프로모터가 해당 핵산의 전사를 실행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 작동적으로 연결되어 있는 것이다. 프로모터는 예정된 세포에서만 DNA 의 실질적 전사를 지령하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 외 기타 전사 제어 구성원들, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호는 세포-특이적 전사를 지령할 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결되어 있다. 적합한 프로모터 및 기타 전사 조절 영역들은 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역들이 당업자에게 공지되어 있다. 여기에는, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예컨대 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, 인핸서 분절 (예를 들어, 즉시 초기 프로모터, 인트론-A 와 병용), 원숭이 바이러스 40 (예를 들어, 조기 프로모터), 및 레트로바이러스 (예컨대, 라우스 육종 바이러스) 를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 기타 전사 조절 영역은 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들 뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 기타 서열도 포함한다. 부가적 적합한 전사 조절 영역은 조직-특이적 프로모터 및 인핸서 뿐만 아니라 유도성 프로모터 (예를 들어, 테트라싸이클린에 의해 유도되는 프로모터) 를 포함한다. 유사하게 다양한 번역 조절 구성요소들이 당업자에게 공지되어 있다. 여기에는, 리보솜 결합 자리, 번역 개시 및 종결 코돈 및 바이러스 시스템으로부터 유도된 구성요소들 (특히, 내부 리보솜 진입 자리 또는 CITE 서열로도 지칭되는 IRES) 을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 발현 카세트는 또한 복제 기원 및/또는 염색체 통합 구성요소, 예컨대 레트로바이러스 장 말단 반복부 (LTR) 또는 아데노-연합 바이러스 (AAV) 역전 종결 반복부 (ITR) 와 같은 기타 특징적 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 분비를 지령하는 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 부가적 코팅 영역과 연합되어 있을 수 있다. 예를 들어, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 분비가 필요한 경우, 신호 서열을 인코딩하는 DNA 는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 인코딩하는 핵산 또는 그의 조각의 상류에 위치될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비되는 단백질은, 조면 소포체를 통과해 성장하는 단백질 사슬의 방출이 일단 개시되면, 성숙형 단백질로부터 절단되어 나가는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖게 된다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 신호 펩티드를 갖고 있다는 것을 알 텐데, 이는 번역되는 폴리펩티드로부터 떨어져 나와 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙형" 형태를 제공하게 된다. 특정 구현예에서, 본래의 신호 펩티드, 예를 들어 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드가 사용되거나, 또는 그에 작동적으로 연결되어 있는 폴리펩티드의 분비를 지령하는 능력을 보유하고 있는 상기 서열의 관능성 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종성 포유류 신호 펩티드 또는 그의 관능성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열이 인간 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 또는 마우스-글루쿠로니아자에의 리더 서열로 대체될 수 있다. 분비 신호 서열 펩티드의 예시 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 식별 번호 154-162 에 제시되어 있다.
이후의 정제를 촉진하거나 또는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 표지를 돕는데 이용될 수 있는 짧은 단백질 서열 (예를 들어 히스티딘 태그) 을 인코딩하는 DNA 가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 (조각) 인코딩 폴리뉴클레오티드 내에 또는 그 말단에 포함될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 각각 폴리뉴클레오티드 및 벡터와 관련하여 본원에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 한가지 그러한 구현예에서, 숙주 세포는 (예를 들어, 형질전환 또는 트랜스펙션되어) 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 (의 일부분) 을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포" 는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 나타낸다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 복제 및 발현을 뒷받침하기에 적합한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있다. 그러한 세포는 특별한 발현 벡터로 적절하게 트랜스펙션 또는 형질유도될 수 있고, 대량의 벡터 포함 세포가 임상적 응용을 위해 충분한 양의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하기 위한 대규모 시딩을 위해 배양될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 대장균과 같은 원핵 미생물, 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 곤충 세포 등과 같은 다양한 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않을 때 박테리아에서 생산될 수 있다. 발현 후, 폴리펩티드는 가용 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 이후 정제될 수 있다. 원핵생물에 추가하여, 곰팡이 또는 효모와 같은 진핵성 미생물이, 그의 글리코실화 경로가 "인간화" 되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 가진 폴리펩티드를 제공하게 되는 균류 및 효모 균주를 포함하여, 폴리펩티드-인코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참고문헌은, [Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)], 및 [Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)]. (글리코실화된) 폴리펩티드의 발현을 위해 적합한 숙주 세포가 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예시는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포돕포라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해서 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주들이 동정되어 있다. 식물 세포 배양이 또한 숙주세포로서 이용될 있다. 참고문헌은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스펙션 식물에서 항체 제조를 위한 PLANTIBODY™ 기술을 기재하고 있음). 척추동물 세포가 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응시킨 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 또다른 예시는 SV40 로 형질전환시킨 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 태아 신장 세포주 (293 또는 293T 세포, 이는 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있음: Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), 어린 햄스터 신장 세포 (BHK), 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 (TM4 세포, 이는 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있음: Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), 원숭이 신장 세포 (CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 자궁경부암 세포 (HELA), 개 신장 세포 (MDCK), 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포 (Hep G2), 마우스 유방 종양 세포 (MMT 060562), TRI 세포 (이는 예를 들어 다음의 문헌에 기재되어 있음: Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유류 숙주 세포주는 세포를 포함하여 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); 및 골수세포 세포주, 예컨대 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0 을 포함한다. 단백질 제조에 적합한 특정 포유류 숙주 세포의 리뷰에 대해서는, 예를 들어 하기 문헌을 참조: Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., 인간 Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). 숙주 세포는 예를 들어 포유류 배양 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포 및 식물 세포를 포함하며, 일부만을 언급하겠지만 트랜스펙션 동물, 트랜스펙션 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직을 포함한다. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 태아 신장 (HEK) 세포 또는 림프구 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다.
상기 시스템에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술은 당업계에 공지되어 있다. 항체와 같이 항원 결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포가 유전자조작될 수 있으며, 나머지 항체 사슬을 발현시켜 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 모두 가진 항체가 되도록 한다.
한 구현예에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제조 방법이 제공되는데, 여기서 상기 방법은 본원에 제공된 바와 같은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함한다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 구성요소들은 서로 유전자적으로 융합되어 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 그의 구성요소들이 서로 직접 융합되거나 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 고안될 수 있다. 링커의 조성 및 길이는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 결정될 수 있고, 효능에 대해 시험될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 상이한 구성요소들 사이에서의 링커 서열의 예시는 본원에 제공되는 서열에서 찾을 수 있다. 부가적 서열이 또한 포함되어 절단 자리를 원하는 융합체의 개별 구성성분, 예를 들어 엔도펩티다아제 인식 서열을 분리하도록 할 수 있다.
특정 구현예에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나 이상의 항원 결합 부분은 항원 결정인자에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 자연 또는 비자연 발생 항체 및 그의 조각의 일부일 수 있고, 그로부터 유도될 수 있다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체의 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Harlow and Lane, "Antibody, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 비-자연 발생 항체는 고상-펩티드 합성을 사용하여 구축되거나, 재조합적으로 제조될 수 있거나 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,186,567 에 기재된 바와 같이 제조) 또는 예를 들어 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 재조합적 라이브러리를 스크리닝하여 수득될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 McCafferty 에게 허여된 미국 특허 번호 5,969,108).
임의의 동물 종의 항체, 항체 조각, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역이 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 이용될 수 있다. 본 발명에 유용한 비-제한적인 항체, 항체 조각, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 쥐과동물, 영장류 또는 인간 기원의 것일 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 인간 사용을 의도로 하는 거라면, 항체의 불변 영역이 인간 기원의 것인 키메라 형태의 항체가 이용될 수 있다. 인간화되거나 또는 완전히 인간 형태인 항체가 또한 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Winter 에게 허여된 미국 특허 번호 5,565,332). 인간화는 (a) 중요한 골격 잔기들 (예를 들어, 우수한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 유지하는데 중요한 것들) 의 존재 또는 부재 하에 비-인간 (예를 들어, 공여자 항체) CDR 를 인간 (예를 들어, 수용자 항체) 골격 및 불변 영역에 그라프팅함, (b) 비-인간 특이성 결정 영역 (SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기들) 만을 인간 골격 및 불변 영역에 그라프팅함, 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기들의 치환에 의해 이들을 인간형 섹션으로 "은폐" 시킴을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 인간화된 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)], 및 추가로 예를 들어 문헌들, Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods36, 25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 그라프팅을 기재함); Padlan, Mol Immunol28, 489-498 (1991) ("재표면화 (resurfacing)" 를 기재함); DallAcqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) ("FR 셔플링 (shuffling)" 을 기재함); 및 Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "인도받는 선별 (guided selection)" 접근법을 설명) 에 기재되어 있고, 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) and Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)] 에 기재되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법으로 제조되는 인간 모노클로날 항체의 일부분을 형성할 수 있고, 그로부터 유도될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Monoclonal antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 항원 공격에 대한 응답에서 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 온전한 항체를 생산하도록 수식된 트랜스펙션 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 인간-유도성 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택되는 Fv 클론 가변 영역 서열들을 분리함으로써 생성될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., 인간 Press, Totowa, NJ, 2001); 및 McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). 파지는 일반적으로 단일쇄 Fv (scFv) 조각 또는 Fab 분자으로서의 항체 조각을 디스플레이한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 유용한 항원 결합 분자는 예를 들어 본원에 전문이 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 출원 공보 2004/0132066 에 개시된 방법에 따라 강화된 결합 친화도를 갖는다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 능력은 효소-연계 면역흡수 검정 (ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 기타 기술, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 기술 (BIACORE T100 시스템 상에서 분석) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적인 결합 검정 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) 을 통해 측정될 수 있다. 경쟁 검정은 특별한 항원에 대한 결합에 대한 기준 항체와 경쟁하는 항체, 항체 조각, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들어 CD3 결합에 대해 V9 항체와 경쟁하는 항체를 밝혀내기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 그러한 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 동일 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체배좌적 에피토프) 에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 맵핑을 위한 상세한 예시적 방법은, 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)] 에 제공되어 있다. 예시 경쟁 검정에서, 고정된 항원 (예를 들어 CD3) 은 항원에 결합하는 제 1 표지 항체 (예를 들어 V9 항체) 및 항원 결합에 대해 제 1 항채와 결합하는 그의 능력을 시험하게 되는 제 2 비표지 항체를 함유하는 용액 중에서 인큐베이션된다. 제 2 항체는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 항원을 제 1 표지 항체를 함유하나, 제 2 비표지 항체는 함유하지 않는 용액 중에 인큐베이션한다. 제 1 항체의 항원에 대한 결합을 허용하는 조건 하의 인큐베이션 후, 과량의 비결합 항체를 제거하고, 고정된 항원과 연합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 항원과 연합된 표지의 양이 시험 샘플에서 대조군 샘플에 비해 실질적으로 감소되었다면, 제 2 항체가 항원과의 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁함을 나타낸다. 참고문헌은, Harlow and Lane (1988) Antibody: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
본원에 기재된 바와 같이 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등과 같은 당업계에 공지된 기술으로 정제될 수 있다. 특정 단백질의 정제에 사용되는 실제 조건은 부분적으로는 전체 전하, 소수성 등과 같은 요인들에 좌우될 것이며, 당업자에게는 자명할 것이다. 친화도 크로마토그래피 정제를 위해, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화도 크로마토그래피 정제를 위해, Protein A 또는 Protein G 가 있는 매트릭스가 사용될 수 있다. 순차적인 Protein A 또는 G 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피가 이용되어 실시예에 기재되어 있는 것과 본질적으로 같은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 단리하는데 이용될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하는 임의의 다양한 널리 공지된 분석 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 실시예에서 설명되는 바와 같이 발현되는 중쇄 융합 단백질은 환원 SDS-PAGE 에 제시되는 바와 같이 온전하고 적절하게 조립된 것으로 나타났다 (예를 들어, 도 2 참조). T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 경쇄, 중쇄 및 중쇄/경쇄 융합 단백질의 분자량에 해당하는 약 Mr 25,000, Mr 50,000 및 Mr 75,000 에서 3 개의 밴드가 나왔다.
검정
본원에서 제공되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 당업계에 공지된 다양한 검정법을 사용하여 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 동정, 스크리닝 또는 특징분석될 수 있다.
친화도 검정
Fc 수용체 또는 표적 항원에 대한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화도는 BIAcore 기기 (GE Healthcare) 와 같은 표준 기기, 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 것과 같은 수용체 또는 표적 단백질을 이용하여, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 에 의해 실시예에 제공된 방법에 따라 결정될 수 있다. 대안적으로, 상이한 수용체 또는 표적 항원에 대한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합은 예를 들어 유세포분석 (FACS) 에 의해 특별한 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여 평가될 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적 설명 및 예시적 구현예들이 하기 상세한 설명 및 실시예에 기재될 것이다.
하나의 구현예에 따르면, KD 는 BIACORE®T100 기기 (GE Healthcare) 를 사용하여 25℃ 에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된다.
Fc-부분 및 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해, His-태그된 재조합 Fc-수용체가 CM5 칩에 부동화된 항-펜타 His 항체 (Qiagen) 에 의해 포획되고, 이중특이적 구축물이 분석물로 이용된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, GE Healthcare) 을 N-에틸-N-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 를 사용하여 공급사의 지침에 따라 활성화시킨다. 항 펜타-His 항체를 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0 를 사용하여 40 ㎍/㎖ 로 희석시킨 후, 유속 5 ㎕/분으로 주입해 커플링된 단백질의 약 6500 응답 단위 (RU) 를 달성한다. 리간드의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입해 원치않는 기들을 차단한다. 후속적으로, Fc-수용체를 60 초 동안 4 또는 10 nM 에서 포획한다. 동역학적 측정을 위해, 이중특이적 구축물의 4-배 계열 희석물 (500 nM 내지 4000 nM 범위) 을 HBS-EP (GE Healthcare, 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Surfactant P20, pH7.4) 에 25℃ 에서 유속 30 ㎕/분으로 120 초 동안 주입한다.
표적 항원에 대한 친화도를 확인하기 위해, 항 펜타-His 항체에 대해 기재된 바와 같이 활성화된 CM5-센서 칩에 부동화된 항 인간 Fab 특이적 항체 (GE Healthcare) 에 의해 이중특이적 구축물을 포획한다. 커플링된 단백질의 최종 양은 약 12000 RU 이다. 이중특이적 구축물이 90 초 동안 300 nM 에서 포획된다. 표적 항원을 250 내지 1000 nM 범위의 농도로 유속 30 ㎕/분으로 180 초 동안 플로우 셀을 통해 통과시킨다. 해리를 180 초 동안 모니터링한다.
벌크 굴절률 차이 (bulk refractive index difference) 를 기준 플로우 셀에서 수득된 응답을 뺄셈하여 보정한다. 정상 상태 응답을 사용하여 Langmuir 결합 등온선의 비-선형 곡선 핏팅에 의해 해리 상수 KD 를 유도해 냈다. 연합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff) 를 연합 및 해리 센서그램을 동시에 핏팅함으로써 단순한 일대일 Langmuir 결합 모델 (BIACORE T100 Evaluation Software version 1.1.1) 을 사용하여 계산한다. 평행 해리 상수 (KD) 는 비율 koff/kon 로서 계산된다. 예를 들어, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999) 를 참조한다.
활성 검정
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 생물학적 활성은 실시예에 기재된 다양한 검정에 의해 측정될 수 있다. 생물학적 활성은 예를 들어 T 세포 증식의 유도, T 세포에서의 신호전달 유도, T 세포에서의 활성화 마커의 발현 유도, T 세포에 의한 사이토카인 분비의 유도, 표적 세포 예컨대 종양 세포의 용해의 유도, 및 종양 퇴행 및/또는 생존 개선의 유도를 포함할 수 있다.
조성물, 제형물 및 투여 경로
추가의 구현예에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 하기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에서 제공되는 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에서 제공되는 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 또다른 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에서 제공되는 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 예를 들어 하기 기재되는 것과 같은 하나 이상의 부가적 치료제를 함유한다.
추가로, 생체내 투여에 적합한 형태의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제조 방법이 제공되는데, 상기 방법은 (a) 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하는 단계, 및 (b) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제형화함으로써, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제제가 생체내 투여용으로 제형화되는 단계를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해 또는 분산되어 있는 치료 유효량의 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 함유한다. 어구 "약제학적으로 또는 약학적으로 허용되는" 은 예를 들어 적절하게 인간과 같은 동물에 투여시 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 허용가능하게 무독성인, 즉 불리하거나, 알러지성이거나 또는 기타 의도하지 않은 반응을 제공하지 않는 분자 본체 및 조성물을 나타낸다. 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 임의로 부가적 활성 성분을 함유하는 약학적 조성물의 제조는 본원에 참고문헌으로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990] 에 예시된 바와 같이 본 개시 내용의 맥락에서 당업자에게 공지되어 있다. 나아가, 동물 (예를 들어 인간) 투여를 위해, 해당 제제는 FDA Office of Biological Standards 또는 다른 국가의 해당 기관에서 요구하는 멸균율, 발열성, 일반적인 안전 및 순도 기준을 충족시켜야 하는 것으로 이해될 것이다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형물 또는 수용액이다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체" 는 당업자에게 공지된 바와 같은 임의의 모든 용매, 완충제, 분산매, 코팅, 계면활성제, 산화방지제, 보존제 (예를 들어, 항박테리아제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 산화방지제, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 당화제, 풍미제, 염료, 그러한 물질들 및 이들의 조합물 (참고문헌은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, 본원에 참고문헌으로 포함됨) 을 포함한다. 임의의 통상적 담체가 활성 성분과 비상용적이지 않은 한, 치료 또는 약학적 조성물에서의 그의 사용이 고려될 것이다.
조성물은 그것이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여될 지 여부 및 주사와 같이 투여 경로를 위해 멸균이 되어야 하는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 함유할 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 (및 임의의 부가적 치료제) 는 당업자에게 공지된 바와 같이 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병소내, 두개내, 관절내, 전립선내, 비장내, 신장내, 흉막내, 기관내, 비강내, 유리체강내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 복강내, 피하, 결막내, 소낭내, 점막에, 심막내, 배꼽내, 안구내, 경구, 국소적으로, 국부에, 흡입에 의해 (예를 들어, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 표적 세포를 직접 잠기게 하는 지엽적인 관류, 카테터를 통해, 세정을 통해, 크림으로, 지질 조성물로 (예를 들어, 리포좀), 또는 기타 방법 또는 상기 언급된 것들의 임의의 조합으로 투여될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, 본원에 참고문헌으로 포함됨). 비경구 투여, 특히 정맥내 주사가 가 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 같은 폴리펩티드 분자 투여에 가장 일반적으로 이용된다.
비경구 조성물은 주사, 예를 들어 피하, 피내, 병소내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척추강내 또는 복강내 주사에 의한 투여용으로 고안된 것을 포함한다. 주사를 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 수용액 중에, 바람직하게는 생리적으로 상용적인 완충액, 예컨대 Hanks' 용액, Ringer's 용액 또는 생리적 식염수 중에 제형화될 수 있다. 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 처방제를 함유할 수 있다. 대안적으로, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 무발열성 물을 이용하여 사용 전 내용물을 만들게 되는 분말 형태일 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요에 따라 하기 설명하는 다양한 기타 성분들과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 혼입하여 제조된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 기본적인 분산매 및/또는 기타 성분들을 포함하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사 용액, 현탁액 또는 에멀전을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 그의 사전 멸균-여과 액체 매질로부터 활성 성분 및 임의의 부가적 원하는 성분들의 분말을 제공하게 되는 진공-건조 또는 냉동-건조 기술이다. 액체 매질은 필요에 따라 적합하게 완충화되어야 하고, 액체 희석물은 충분한 식염수 또는 글루코오스를 사용하여 주사 전에 먼저 등장성이 되도록 하게 된다. 조성물은 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준, 예를 들어 0.5 ng/mg 단백질이 되도록 유지되어야 한다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 하기의 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산들; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제 (예컨대, 옥타데실메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코오스, 만노오스 또는 텍스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 상대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 더욱 농축된 용액 제조가 가능하도록 화합물의 용해도를 증가시키는 시약을 함유할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물들의 현탁액은 적당한 오일 주입 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예컨대 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 클레에이트 또는 트리글리세리드 또는 리포좀을 함유한다.
활성 성분은 예를 들어 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐의 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀전, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀전에서의 계면 중합에 의해 또는 코아세르베이션 (coacervation) 기술에 의해 제조되는 마이크로캡슐 내에 엔트랩될 수 있다. 그러한 기술들은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)] 에 기재되어 있다. 서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예시는 매트릭스가 성형된 성형품, 예를 들어 필름 또는 미아크로캡슐의 형태인, 폴리펩티드를 포함하는 고체 수소성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함한다. 특별한 구현예에서, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합과 같은 흡수를 지연시키는 의약의 조성물 중에 사용하여 주사 용액의 흡수 지연을 가져올 수 있다.
상기 기재된 조성물에 추가하여, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 또한 데포제 (depot preparation) 로 제형화될 수 있다. 그러한 장기간 작용 제형물은 이식 (예를 들어, 피하 또는 점막내) 에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들어 허용가능한 오일 중의 에멀전으로서) 또는 이온 교환 수지, 또는 난용성 유도체, 예를 들어 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 함유하는 약학적 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 에멀전화, 캡슐화, 엔트랩핑 또는 동결건조 프로세스에 의해 제조될 수 있다. 약학적 제형물은 단백질의 약학적으로 이용가능한 제제로의 가공을 촉진하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형물은 선택되는 투여 경로에 좌우된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 유리된 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태의 제형물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 유리된 산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 염이다. 여기에는 산 부가염, 예를 들어 단백질계 조성물의 유리된 아미노기로 형성된 것 또는 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산으로 형성된 것을 포함한다. 유리된 카르복실기로 형성된 염은 또한 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 페릭 히드록시드와 같은 무기 염기; 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로케인과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 자유 염기 형태보다 수성 및 기타 양자성 용매에 더욱더 가용성인 경향이 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공되는 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 치료 방법에 이용될 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 예를 들어 암 치료에서 면역치료제로서 이용될 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 양호한 의료 행위가 실시되는 곳에서 제형화, 조제 및 투여될 수 있다. 그러한 맥락에서 고려되는 요인들은 치료할 특정 장애, 치료할 특정 포유류, 개별 환자의 의학적 상태, 장애의 원인, 의약의 전달 자리, 투여 방법, 투여 일정 및 의료 실시에 있어 공지된 기타 요인들을 포함한다.
한 구현예에서, 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 추가의 구현예에서, 질환 치료에 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 치료가 필요한 개체에게 질환 치료에 사용하기 위해 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 개체에게 치료 유효량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는 질환을 가진 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, 치료될 질환은 증식 장애이다. 특별한 구현예에서, 질환은 암이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은, 치료될 질환이 암이라면, 개체에게 치료 유효량의 하나 이상의 부가적 치료제, 예를 들어 항암제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 개체에서 개체에게 유효량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 것을 포함하는, 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용하기 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 임의의 상기 구현예에 따른 "개체" 는 포유류, 바람직하게는 인간이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 의약 제조 또는 준비에서의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 의약은 치료가 필요한 개체에서 질환 치료를 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 의약은 질환이 있는 개체에게 치료 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는 질환의 치료 방법에서의 사용을 위한 것이다. 특정 구현예에서, 치료될 질환은 증식 장애이다. 특별한 구현예에서, 질환은 암이다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은, 치료될 질환이 암이라면, 개체에게 치료 유효량의 하나 이상의 부가적 치료제, 예를 들어 항암제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 의약은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 의약은 개체에게 유효량의 의약을 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 것을 포함하는, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 상기 임의의 구현예에 따라 "개체" 는 포유류, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 질환의 치료 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 상기 질환을 가진 개체에게 치료 유효량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 형태로 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 함유하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 특정 구현예에서, 치료될 질환은 증식 장애이다. 특별한 구현예에서, 질환이 암이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은, 치료될 질환이 암이라면, 개체에게 치료 유효량의 하나 이상의 부가적 치료제, 예를 들어 항암제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 구현예에서 "개체" 는 포유류, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해의 유도 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서 상기 방법은 표적 세포를 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재 하에 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 추가의 양상에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해의 유도 방법이 제공된다. 하나의 그러한 구현예에서, 상기 방법은 개체에게 유효량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, "개체" 는 인간이다.
특정 구현예에서, 치료될 질환은 증식 장애, 특별하게는 암이다. 암의 비제한적 예시는, 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 경부암, 자궁내막암, 식도암, 대장암, 결장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평상피암, 뼈암, 및 신장암을 포함한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하여 치료될 수 있는 기타 세포 증식 장애는 하기와 같은 곳에 위치한 신생물이나, 이에 제한되지는 않는다: 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비샘 (신장, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 안구, 두경부, 신경계 (중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부, 및 비뇨생식계. 또한, 암이 되기 전의 상태 또는 병변 및 암 전이도 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 신장 세포암, 피부암, 폐암, 결장암, 유방암, 뇌암, 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 당업자는 많은 경우에 있어서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 치료를 제공하지 않을 수는 있으나, 부분적인 유익만을 제공할 수도 있다는 점을 쉽게 알 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, 소정의 유익이 있는 생리학적 변화가 또한 치료면에서 유익한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 구현예에서, 생리학적 변화를 제공하는 일정량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 "유효량" 또는 "치료 유효량" 으로 간주된다. 치료가 필요한 대상체, 환자 또는 개체가 일반적으로 포유류, 더욱 특별하게는 인간이다.
일부 구현예에서, 유효량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 세포에 투여된다. 다른 구현예에서, 치료 유효량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 질환 치료를 위해 개체에 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 (단독으로 또는 하나 이상의 기타 부가적 치료제와 병용될 때) 의 적정 투여량은 치료될 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 유형, 질환의 중증도 및 경과, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 과거 또는 현재의 치료적인 개입, 환자의 임상 병력 및 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 응답성 및 담당의의 재량에 좌우될 것이다. 투여를 담당하는 실무자는 어떤 경우라도 개체 대상체를 위한 조성물 중 활성 성분(들)의 농도 및 적정 투여량(들)을 결정하게 될 것이다. 여기서, 다양한 시점에서의 단독 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 인퓨젼 (pulse infusion) 을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 투여 일정이 고려될 것이다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 단번에 또는 일련의 치료에 따라 환자에게 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 ㎎/㎏ (예를 들어, 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏) 의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 예를 들어 1 회 이상의 개별 투여에 의한 것이든 또는 연속적인 주입에 의한 것이든 환자에 대한 투여를 위한 최초 후보 투여량이 될 수 있다. 한가지 일반적인 1 일 투여량은 언급한 요인들을 고려하여 약 1 ㎍/kg 내지 100 ㎎/㎏ 이상이 될 것이다. 상태에 따라 수일간 또는 그 이상의 반복되는 투여를 위해서는, 원하는 질환 억제가 나타날 때까지 치료가 일반적으로 계속될 것이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 한가지 예시 투여량은 약 0.005 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 의 범위가 될 것이다. 기타 비제한적 예시에서, 투여량은 투여시마다 약 1 마이크로그램/체중 ㎏, 약 5 마이크로그램/체중 ㎏, 약 10 마이크로그램/체중 ㎏, 약 50 마이크로그램/체중 ㎏, 약 100 마이크로그램/체중 ㎏, 약 200 마이크로그램/체중 ㎏, 약 350 마이크로그램/체중 ㎏, 약 500 마이크로그램/체중 ㎏, 약 1 밀리그램/체중 ㎏, 약 5 밀리그램/체중 ㎏, 약 10 밀리그램/체중 ㎏, 약 50 밀리그램/체중 ㎏, 약 100 밀리그램/체중 ㎏, 약 200 밀리그램/체중 ㎏, 약 350 밀리그램/체중 ㎏, 약 500 밀리그램/체중 ㎏, 내지 약 1000 ㎎/체중 ㎏ 또는 그 이상인 범위, 및 거기에 속해 나올 수 있는 임의의 범위를 포함한다. 본원에 열거된 수치로부터 유도가능한 범위의 비제한적 예시에서, 상기 기재된 수치값을 근거로 하여 약 5 ㎎/체중 ㎏ 내지 약 100 ㎎/체중 ㎏, 약 5 마이크로그램/체중 ㎏ 내지 약 500 밀리그램/체중 ㎏ 등의 범위가 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 5.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ (또는, 이들의 임의의 조합) 의 1 회 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 그러한 투여량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3 개월마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20 회, 또는 예를 들어 약 6 회 투여량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수용하게 됨). 초기의 더 많은 로딩 투여량에 이어, 한 회 이상의 더 적은 투여량이 투여될 수 있다. 그러나, 기타 투여량 계획도 유용할 수 있다. 그러한 요법의 프로세스는 통상적 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 의도하는 목적 달성에 유효한 양으로 사용될 것이다. 질환 상태를 치료 또는 예방하려는 사용을 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자, 또는 그의 약제학적 조성물은 치료 유효량으로 투여 또는 적용될 수 있다. 치료 유효량의 결정은 당업자의 재량, 특히 본원에 제공된 상세한 설명의 개시 내용에 비추어 잘 결정될 것이다. 전신 투여를 위해, 치료 유효량은 최초에는 세포 배양 검정과 같은 시험관내 검정으로 추산될 수 있다. 이어서, 세포 배양에서 결정되는 것과 같은 IC50 를 포함하는 순환 농도 범위를 알기 위해 동물 모델에서 투여량이 제형화될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 유용한 투여량을 정확하게 결정하기 위해 이용될 수 있다.
초기 투여량은 또한 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 생체내 데이터, 예를 들어 동물 모델로부터 추산될 수 있다. 당업자는 동물 데이터를 기준으로 인간에 대한 투여를 쉽게 최적화할 수 있을 것이다.
투여량 및 간격은 치료 유효성 유지에 충분한 혈장 수준의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하기 위해 개체마다 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여에 유용한 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 ㎎/㎏/day, 일반적으로 약 0.5 내지 1 ㎎/㎏/day 의 범위이다. 치료 유효 혈장 수준은 각 투여일마다 여러번의 투여로 달성될 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어 HPLC 로 측정될 수 있다.
국부 투여 (local administration) 또는 선택적 흡수의 경우, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 유효한 국부 농도는 혈장 농도와 상관이 없을 수 있다. 당업자는 기약없는 실험없이도 치료 유효 국부 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 치료 유효 투여량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 실질적 독성을 유발하지 않고 치료적 유익을 제공할 것이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 검정 및 동물에서의 연구는 LD50 (집단의 50% 가 살상되는 투여량) 및 ED50(집단의 50% 에서 치료적으로 유효한 투여량) 의 결정에 이용될 수 있다. 독성 및 치료 유효성 사이의 투여량 비율은 치료 지수인데, 이는 비율 LD50/ED50 로 나타내어질 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 바람직하다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 검정 및 동물 연구에서 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위해 적합한 투여량을 제형화하는데 이용될 수 있다. 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50 를 포함하는 범위의 순환 농도 범위에 있다. 투여량은 다양한 요인들, 예를 들어 사용되는 투여량, 이용되는 투여 경로, 대상체의 상태 등에 따라 상기 범위 내에서 가변적일 수 있다. 정확한 제형물, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 비추어 담당의사에 의해 선택될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Fingl et al., 1975: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1, 그의 전문이 본원에 참고문헌으로 포함됨).
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하여 치료하는 환자의 담당의사는 독성, 장기의 기능이상 등으로 인해 투여를 중단, 개입 또는 조정하는 방법 및 시기를 알 것이다. 역으로, 담당의사는 또한 임상적 응답성 (독성은 배제함) 이 충분하지 않을 경우 더 높은 수준으로 치료하도록 조정할 수 있을 것이다. 관심대상인 장애의 관리에서 투여되는 투여량의 규모는 치료할 상태의 중증도, 투여 경로 등에 따라 변할 수 있다. 상태의 중증도는 예를 들어 표준 예후 평가 방법에 의해 부분적으로라도 평가될 수 있다. 나아가, 투여량 및 아마도 투여 빈도도 또한 개별 환자의 연령, 체중 및 응답성에 따라 변할 것이다.
기타 약제 및 치료
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 치료요법에서 하나 이상의 기타 약제와 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이상의 부가적 치료제와 병용투여될 수 있다. 용어 "치료제" 는 치료가 필요한 개체에서 병후 또는 질환 치료를 위해 투여되는 임의의 약제를 포함한다. 그러한 부가적 약제는 치료하려는 특정 징후에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 주지 않는 보충적 활성을 가진 것을 함유할 수있다. 특정 구현예에서, 부가적 치료제는 면역조절제, 세포정지제, 세포 유착의 억제제, 세포독성제, 세포 아폽토시스의 활성화제 또는 아폽토시스 유발제에 대한 세포의 감수성을 증가시키는 약제이다. 특별한 구현예에서, 부가적 치료제는 항암제, 예를 들어 미소관 (microtubule) 교란제, 대사교란제, 토포이소머라아제 저해제, DNA 인터킬레이터, 알킬화제, 호르몬 치료제, 키나아제 저해제, 수용체 안타고니스트, 종양 세포 아폽토시스의 활성화제 또는 항혈관형성제이다.
그러한 기타 약제들은 의도하는 목적에 유효한 양으로 병용되어 존재한다. 그러한 기타 약제의 유효량은 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 기타 요인들에 좌우된다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 본원에 기재된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99% 로, 또는 적절히 경험적으로/임상적으로 결정된 임의의 투여량 및 투여 경로로 투여된다.
상기 언급한 그러한 병용 요법은 병용 투여 (두가지 이상의 치료제가 동일 또는 별개 조성물에 포함되어 있음) 및, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 투여를 부가적 치료제 및/또는 아쥬반트 투여의 이전에, 동시에 및/또는 이후에 실시할 수 있는 분리 투여를 포함한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 또한 방사선 치료요법과 병용하여 사용될 수 있다.
제조품
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 포함하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기에 장착된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 성형될 수 있다. 용기는 자체로 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또다른 조성물과 조합하여 조성물을 담지하고 있으며, 멸균 접근 포트가 있을 수 있다 (용기가 정맥내 용액 백 또는 예를 들어, 피하 주사침으로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알로 존재할 수 있음). 조성물 중의 하나 이상의 활성제가 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택한 상태 치료에 사용된다는 것을 명시한다. 나아가, 제조품은 (a) 조성물이 포함되어 있는 제 1 용기로서, 해당 조성물이 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 함유하고 있는 것; 및 (b) 조성물이 포함되어 있는 제 2 용기로서, 해당 조성물이 부가적 세포독성제 또는 그렇지 않으면 치료를 함유하고 있는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 그러한 구현예에서의 제조품은 추가로 조성물이 특정 상태 치료에 사용될 수 있음을 명시하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조품은 추가로, 약제학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 주사용 세균발육저지수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액을 포함하고 있는 제 2 (또는 제 3) 의 용기를 포함할 수 있다. 이는 판매 및 사용자 입장에서 바람직한 기타 물질들, 예컨대 기타 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예시이다. 상기 제공된 일반적인 상세한 설명 하에 다양한 기타 구현예가 실시가능할 수 있다는 점이 이해될 것이다.
일반적인 방법
재조합 DNA 기술
문헌 [Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 DNA 를 취급했다. 분자 생물학용 시약들을 제조사의 지침에 따라 사용했다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 일반적인 정보는 하기 문헌에서 제공된다: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242.
DNA 서열분석
DNA 서열을 이중 가닥 서열분석으로 확인했다.
유전자 합성
필요한 원하는 유전자 분절을 적절한 주형을 사용하는 PCR 에 의해 생성하거나, 또는 Geneart AG (Regensburg, 독일) 에 의해, 합성 올리고뉴클레오티드 및 자동화된 유전자 합성에 의한 PCR 생성물로부터 합성했다. 정확한 유전자 서열을 구할 수 없는 경우, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 가장 비슷한 상동체 유래의 서열을 근거로 고안했으며, RT-PCR 에 의해 적절한 조직 기원의 RNA 로부터 단리해 냈다. 단일 제한 엔도뉴클라아제 절단 자리 양측면의 유전자 분절을 표준 클로닝/서열분석 벡터에 클로닝했다. 플라스미드 DNA 를 형질전환 박테리아로부터 정제하고, 농도를 UV 분광분석법으로 확인했다. 서브클로닝된 유전자 조각의 DNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인했다. 유전자 분절을 적절한 제한 자리로 고안하여 각 발현 벡터로의 서브클로닝을 가능하도록 했다. 모든 구축물들은 진핵 세포에서의 분비를 위한 단백질을 표적으로 하는 리더 펩티드 (leader peptide) 를 코딩하는 5-말단 DNA 서열을 사용하여 고안했다. SEQ ID NOs 154-162 는 각각 예시적 리더 펩티드 및 그것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
PBMC 유래의 일차 인간 pan T 세포의 단리
말초혈 단핵구 세포 (PBMC) 를 지역의 혈액 은행 또는 건강한 인간 공여자 유래의 신선한 혈액으로부터 수득된 풍부화된 림프구 제제 (버피 코트; buffy coats) 로부터의 Histopaque 밀도 원심분리로 제조했다. 간략하게, 혈액을 멸균 PBS 로 희석하고, Histopaque 구배 (Sigma, H8889) 상에서 조심스럽게 층을 이루도록 했다. 실온에서 30 분 동안 450 x g 의 원심분리 후 (브레이크는 꺼 둠), PBMC 함유 중간층 위의 혈장 부분을 제거했다. PBMC 를 새로운 50 ㎖ 팔콘 튜브로 옮기고, 관에 50 ㎖ 의 총 부피가 되도록 PBS 를 채워 넣었다. 혼합물을 실온에서 10 분 동안 400 x g (브레이크를 켜 둠) 로 원심분리했다. 상청액을 제거하고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS 로 2 회 세정했다 (4℃ 에서 10 분 동안 350 x g 로 원심분리 단계). 결과로서 수득한 PBMC 집단을 자동으로 계수하고 (ViCell), 검정을 시작할 때까지 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민 (Biochrom, K0302) 을 함유하는 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO2 로 하여 저장했다.
PBMC 로부터의 T 세포 풍부화는 Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec #130-091-156) 를 이용하여, 제조사의 지침에 따라 실시했다. 간략하게, 세포 펠렛을 천만 세포 당 40 ㎕ 차가운 완충액 중에 희석하고 (0.5% BSA, 2 mM EDTA 이 있는 PBS, 멸균 여과), 천만 세포 당 10 ㎕ Biotin-Antibody Cocktail 을 사용하여 10 분 동안 4℃ 에서 인큐베이션했다. 천만 세포 당 30 ㎕ 차가운 완충액 및 20 ㎕ 항-Biotin 자석 비드를 첨가하고, 혼합물을 15 분 더 4℃ 에서 인큐베이션했다. 현 부피의 10 내지 20 배를 첨가해 세포를 세정하고, 300 x g 에서 10 분 동안 후속 원심분리 단계를 실시했다. 일억 까지의 세포를 500 ㎕ 완충액 중에 재현탁했다. 표지되지 않은 인간 pan T 세포의 자력에 의한 분리를, LS 칼럼 (Miltenyi Biotec #130-042-401) 을 제조사의 지침에 따라 사용하여 실시했다. 결과로서 수득한 T 세포 집단을 자동으로 계수하고 (ViCell), 검정을 시작할 때까지 인큐베이터 내 37℃, 5% CO2 에서 AIM-V 중에 저장했다 (24 시간 이내).
PBMC 유래의 일차 인간 미감작 T 세포의 단리
말초혈 단핵구 세포 (PBMC) 를 지역의 혈액 은행 또는 건강한 인간 공여자 유래의 신선한 혈액으로부터 수득된 풍부화된 림프구 제제 (버피 코트; buffy coats) 로부터의 Histopaque 밀도 원심분리로 제조했다. PBMC 유래의 T-세포 풍부화는 Miltenyi Biotec 사의 Naive CD8+ T 세포 분리 키트 (#130-093-244) 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 실시했으며, 여기서 CD8+ T 세포의 최종 분리 단계는 생략했다 (일차 인간 pan T 세포의 단리에 대한 설명 참조).
비장세포 유래의 쥐과 pan T 세포의 단리
비장을 C57BL/6 마우스로부터 단리하고, MACS 완충액 (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) 을 함유하는 GentleMACS C-튜브 (Miltenyi Biotech #130-093-237) 내로 옮기고, 제조사의 지침에 따라 GentleMACS Dissociator 로 해리시켜 단일-세포 현탁액을 수득했다. 세포 현탁액을 예비-분리 필터를 통해 통과시켜 남은 미해리 조직 입자를 제고했다. 400 x g 에서 4 분 동안 4℃ 에서 원심분리 후에, ACK 용해 완충액을 첨가하여 적혈구를 용해시켰다 (5 분 동안 실온에서 인큐베이션). 남은 세포를 MACS 완충액으로 2 회 세정하고, 계수하고, 쥐과 pan T 세포의 단리에 사용했다. 음성 (자기) 선별을 Miltenyi Biotec (#130-090-861) 로부터의 Pan T Cell Isolation Kit 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 수행했다. 결과적인 T 세포 집단을 자동으로 계수하고 (ViCell), 추가의 검정에 바로 사용했다.
헤파린처리 혈액 유래의 1 차 시노몰구스 (cynomolgus) 원숭이 PBMC 의 단리
말초혈 단핵구 세포 (PBMC) 를 하기와 같이 건강한 시노몰구스 원숭이 공여자 유래의 신선한 혈액으로부터 밀도 원심분리하여 제조했다: 헤파린 처리한 혈액을 멸균 PBS 를 사용하여 1:3 로 희석하고, Lymphoprep 배지 (Axon Lab #1114545) 를 멸균 PBS 를 사용하여 90% 까지 희석했다. 두 배 부피의 희석 혈액을 한 배 부피의 희석 밀도 구배 상에 층을 형성하도록 하고, PBMC 분획을 실온에서 30 분 동안 브레이크 없이 520 x g 로 원심분리하여 분리했다. PBMC 밴드를 새로운 50 ㎖ 팔콘 튜브로 옮기고, 4℃ 에서 10 분 동안 400 x g 로 원심분리하여 멸균 PBS 를 사용하여 세정했다. 한 번의 저속 원심분리 (15 분 동안 150 x g, 4℃) 를 실시해 혈소판을 제거하고, 결과로서 수득한 PBMC 집단을 자동으로 계수하고 (ViCell), 추가의 검정에 바로 사용했다.
표적 세포
MCSP-표적 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 평가를 위해, 하기의 종양 세포주를 이용했다: 인간 흑색종 세포주 WM266-4 (ATCC #CRL-1676), 악성 흑색종의 전이 자리에서 유도되었고, 높은 수준의 인간 MCSP 를 발현함; 및 인간 흑색종 세포주 MV-3 (The Radboud University Nijmegen Medical Centre 에서 기증), 중간 수준의 인간 MCSP 발현.
CEA-표적 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 평가를 위해, 하기의 종양 세포주를 이용했다: 인간 위암 세포주 MKN45 (DSMZ #ACC 409), 매우 높은 수준의 인간 CEA 를 발현함; 인간 여성 코카서스인종 대장 선암 세포주 LS-174T (ECACC #87060401), 중간 내지 낮은 수준의 인간 CEA 를 발현함; 인간 골수성 췌장암 세포주 Panc-1 (ATCC #CRL-1469), (매우) 낮은 수준의 인간 CEA 를 발현함; 및 쥐과동물 대장 암종 세포주 MC38-huCEA, 인간 CEA 을 안정하게 발현하도록 연구실에서 조작됨.
추가로, 인간 T 세포 백혈병 세포주, Jurkat (ATCC #TIB-152) 를 사용하여 상이한 이중특이적 구축물의 세포 상의 인간 CD3 에 대한 결합을 평가했다.
실시예 1
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제조, 정제 및 특징분석
중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 각각의 수용자 포유류 발현 벡터 내에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 프레임에 맞춰 (in frame) 서브클로닝했다. 항체 발현을 MPSV 프로모터로 추진했고, 합성 polyA 신호 서열은 CDS 의 3' 말단에 위치한다. 또한 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유했다.
HEK293 EBNA 세포를 포유류 발현 벡터로 동시-트랜스펙션시킴으로써 분자들을 생산했다. 지수 성장하는 HEK293 EBNA 세포를 칼슘 포스페이트 방법을 사용하여 트랜스펙션했다. 대안적으로, 현탁액으로 성장하는 HEK293 EBNA 세포를 폴리에틸렌이민 (PEI) 을 사용하여 트랜스펙션했다. "1+1 IgG scFab, 한 팔 / 한 팔 역방위" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:1:1 비율 ("벡터 중쇄" : "벡터 경쇄" : "벡터 중쇄-scFab") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다. "2+1 IgG scFab" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:2:1 비율 ("벡터 중쇄" : "벡터 경쇄" : "벡터 중쇄-scFab") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다. "1+1 IgG Crossfab" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:1:1:1 비율 ("벡터 제 2 중쇄" : "벡터 제 1 경쇄" : "벡터 경쇄 Crossfab" : "벡터 제 1 중쇄-중쇄 Crossfab") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다. "2+1 IgG Crossfab" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:2:1:1 비율 ("벡터 제 2 중쇄" : "벡터 경쇄" : "벡터 제 1 중쇄-중쇄 Crossfab" : "벡터 경쇄 Crossfab") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다. "2+1 IgG Crossfab, 연결된 경쇄" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:1:1:1 비율 ("벡터 중쇄" : "벡터 경쇄" : "벡터 중쇄 (CrossFab-Fab-Fc)" : "벡터 연결 경쇄") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다. "1+1 CrossMab" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:1:1:1 비율 ("벡터 제 1 중쇄" : "벡터 제 2 중쇄" : "벡터 제 1 경쇄" : "벡터 제 2 경쇄") 로 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다. "1+1 IgG Crossfab 경쇄 융합물" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:1:1:1 비율 ("벡터 제 1 중쇄" : "벡터 제 2 중쇄" : "벡터 경쇄 Crossfab" : "벡터 제 2 경쇄") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다.
칼슘 포스페이트를 사용하는 트랜스펙션을 위해, 세포를 10% (v/v) FCS 로 보충된 DMEM 배양 배지를 사용하여 T-플라스크 내에서 부착성 단층 배양물로서 성장시키고, 50 내지 80% 세포포화도일 때 트랜스펙션했다. T150 플라스크의 트랜스펙션을 위해, 천오백만 개의 세포를 트랜스펙션 24 시간 전에 FCS (10% v/v 최종) 로 보충된 25 ㎖ DMEM 배양 배지에 시딩하고, 세포를 5% CO2 분위기의 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 밤새 정치시켰다. 트랜스펙션될 각각의 T150 플라스크에 대해, DNA, CaCl2 및 물의 용액을 해당 비율로 분할된 94 ㎍ 총 플라스미드 벡터 DNA, 최종 부피가 469 ㎕ 가 되게 하는 물 및 469 ㎕ 의 1M CaCl2 용액을 혼합함으로써 제조했다. 이 용액에, 938 ㎕ 의 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, pH 7.05 의 1.5 mM Na2HPO4 용액을 첨가하고, 즉시 10 초 동안 혼합하고, 실온에서 20 초 동안 정치시켰다. 현탁액을 2% (v/v) FCS 로 보충된 DMEM 10 ㎖ 로 희석하고, 기존 배지 대신 T150 를 첨가했다. 후속적으로, 부가적 13 ㎖ 의 트랜스펙션 배지를 첨가했다. 세포를 37℃, 5% CO2 에서 약 17 내지 20 시간 동안 인큐베이션하고, 그 후 배지를 25 ㎖ DMEM, 10% FCS 로 교체했다. 조건화된 배양 배지를 배지 교환 약 7 일 후 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 수확하고, 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 보충하여 최종 농도가 0.01 % (w/v) 이 되게 하고, 4℃ 에서 유지했다.
폴리에틸렌이민 (PEI) 을 사용하는 트랜스펙션을 위해 HEK293 EBNA 세포를 무혈청 CD CHO 배양 배지에서 현탁액으로 배양했다. 500 ㎖ 쉐이크 플라스크 내에서의 생산을 위해, 4 억 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 전에 시딩했다. 트랜스펙션을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 20 ㎖ 미리 데운 CD CHO 배지로 교체했다. 발현 벡터를 20 ㎖ CD CHO 배지에서 최종량 200 ㎍ DNA 까지 혼합했다. 540 ㎕ PEI 의 첨가 후, 혼합물을 15 초 동안 볼텍싱 (vortex) 하고, 후속적으로 10 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ㎖ 쉐이크 플라스크에 옮기고, 5% CO2 분위기의 인큐베이터 내에서 3 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 인큐베이션 시간 후, 160 ㎖ F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양했다. 트랜스펙션 다음날, 1 mM 발프로산 및 7% Feed 1 (Lonza) 를 첨가했다. 7 일의 배양 후에, 상청액을 수집하여 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 정제하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 보충하여 최종 농도가 0.01 % w/v 가 되게 하고, 4℃ 에서 유지했다.
분비된 단백질을 세포 배양 상청액으로부터 Protein A 친화도 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 정제했다.
친화도 크로마토그래피를 위해, 상청액을 25 ㎖ 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5 또는 40 ㎖ 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 평형화시킨 HiTrap Protein A HP 칼럼 (CV = 5 ㎖, GE Healthcare) 에 로딩했다. 미결합 단백질을 10 칼럼 부피 이상의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드 pH 7.5 로 세정한 후, 6 칼럼 부피의 10 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드 pH 5.45 를 사용하는 부가적 세정 단계에 의해 제거했다. 후속적으로, 칼럼을 20 ㎖ 10mM MES, 100 mM 나트륨 클로라이드, pH 5.0 로 세정하고, 표적 단백질을 6 칼럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM 나트륨 클로라이드, 100 mM 글리신, pH 3.0 으로 용리시켰다. 대안적으로, 표적 단백질을 20 칼럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 내지 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 2.5 를 사용하여 용리시켰다. 단백질 용액을 1/10 의 0.5 M 나트륨 포스페이트, pH 8 를 첨가함으로써 중화시켰다. 표적 단백질을 농축하고, 여과하고, 그 후 25 mM 칼륨 포스페이트, 125 mM 나트륨 클로라이드, 100 mM 글리신 용액 pH 6.7으로 평형화시킨 HiLoad Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare) 에 로딩했다. 1+1 IgG Crossfab 의 정제를 위해, 칼럼을 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액 pH 6.0 을 사용하여 평형화시켰다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 확인했다. 이중특이적 구축물의 순도 및 분자량을 SDS-PAGE 에 의해 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 Coomassie (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen 사) 로 염색하여 NuPAGE Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 을 제조사의 지침 (4-12% 트리스-아세테이트 겔 또는 4-12% Bis-Tris) 에 따라 사용하여 분석했다. 대안적으로는, 분자의 순도 및 분자량을 CE-SDS 분석에 의해 환원제의 존재 및 부재 하에 Caliper LabChip GXII 시스템 (Caliper Lifescience) 을 제조사의 지침에 따라 사용하여 분석했다.
단백질 샘플의 응집물 함량을 Superdex 200 10/300GL 분석적 크기-배제 크로마토그래피 칼럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 25℃ 에서 2 mM MOPS, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) NaN3, pH 7.3 전개 완충액으로 분석했다. 대안적으로, 항체 샘플의 응집물 함량을 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기-배제 칼럼 (Tosoh) 을 사용하여 25℃ 에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.02% (w/v) NaN3, pH 6.7 전개 완충액에서 분석했다.
도 2-14 는 SDS PAGE 및 분석적 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 보여주며, 표 2A 는 상이한 이중특이적 구축물의 제조의 수율, Protein A 이후 응집물 함량 및 최종 단량체 함량을 보여준다.
도 47 은 항-CD3/항-MCSP 이중특이적 "2+1 IgG Crossfab, 연결된 경쇄" 구축물 (SEQ ID NOs 3, 5, 29 및 179 참조) 의 CE-SDS 분석의 결과를 보여준다. 2 ㎍ 샘플을 분석에 사용했다. 도 48 은 최종 산물의 분석적 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 보여준다 (20 ㎍ 샘플 주입됨).
도 54 는 다양한 구축물의 CE-SDS 및 SDS PAGE 분석의 결과를 보여주고, 표 2A 는 상이한 이중특이적 구축물의 제조의 수율, Protein A 이후 응집물 함량 및 최종 단량체 함량을 보여준다.
표 2A. 수율, Protein A 이후 응집물 함량 및 최종 단량체 함량.
Figure pct00002
Figure pct00003
대조군으로서, 이중특이적 항원 결합 분자를 선행 기술 탠덤 scFv 포맷 ("(scFv)2") 으로 탠덤 scFv 를 Fc 도메인에 융합시킴으로써 ("(scFv)2-Fc") 생성했다. 분자를 HEK293-EBNA 세포에서 생산하고, Protein A 친화도 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자에 대해 위에 기재된 바와 유사한 방식으로 정제했다. 높은 응집물 형성으로 인해, 높은 단량체 함량이 높은 단백질을 수득하기 위해 샘플 중 일부를 HiLoad Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare) 으로부터 용리 및 농축된 샘플을 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드, pH 6.7 로 평형화시킨 Superdex 10/300 GL 칼럼 (GE Healthcare) 에 적용함으로써 추가로 정제해야 했다. 후속적으로, 단백질 농도, 순도 및 분자량, 및 응집물 함량을 위에 기재된 바와 같이 확인했다.
대조군 분자에 대한 수율, 제 1 정제 단계 이후 응집물 함량, 및 최종 단량체 함량이 표 2B 에 제시되어 있다. 제 1 정제 단계 (Protein A) 이후 응집물 함량의 비교는 "(scFv)2-Fc" 및 다이설파이드 가교-안정화된 "(dsscFv)2-Fc" 분자에 비해 IgG Crossfab 및 IgG scFab 구축물의 우수한 안정성을 시사한다.
표 2B. 수율, Protein A 이후 응집물 함량 및 최종 단량체 함량.
Figure pct00004
단백질의 열 안정성을 동적 광 산란 (DLS) 에 의해 모니터링했다. 단백질 농도가 1 ㎎/㎖ 인 30 ㎍ 의 여과된 단백질 샘플을 Dynapro 플레이트 판독기 (Wyatt Technology Corporation; USA) 에 두 차례 적용했다. 온도를 25℃ 에서 75℃ 로 0.05℃/분 으로 상승시키면서, 반경 및 총 산란 강도를 수집한다. 결과가 도 15 및 표 2C 에 제시되어 있다. "(scFv)2-Fc" (항MCSP/항 huCD3) 분자의 경우 2 개의 응집 점이 49℃ 및 68℃ 에서 관찰되었다. "(dsscFv)2-Fc" 구축물은 도입된 다이설파이드 가교의 결과로서 증가된 응집 온도 (Tagg) (57℃) 를 갖는다 (도 15A, 표 2C). "2+1 IgG scFab" 및 "2+1 IgG Crossfab" 구축물은 둘다 60℃ 보다 높은 온도에서 응집하며, 이는 "(scFv)2-Fc" 및 "(dsscFv)2-Fc" 포맷에 비해 그들의 우수한 열 안정성을 입증한다 (도 15B, 표 2C).
표 2C. 동적 광 산란에 의해 확인되는 열 안정성.
Figure pct00005
실시예 2
Fc 수용체 및 표적 항원 결합의 표면 플라스몬 공명 분석
방법
모든 표면 플라스몬 공명 (SPR) 실험을 Biacore T100 에서 25℃ 에서 HBS-EP 를 전개 완충액 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20, Biacore, Freiburg/Germany) 으로서 사용하여 수행한다.
상이한 Fc-변이체의 FcR 결합의 분석
검정 설정이 도 16A 에 제시되어 있다. 상이한 Fc-변이체와 인간 FcγRIIIa-V158 및 쥐과 FcγRIV 의 상호작용을 분석하기 위해 대략 6,500 공명 단위 (RU) 의 항-Penta His 항체 (Qiagen) 의 직접 커플링을 CM5 칩에서 pH 5.0 에서 표준 아민 커플링 키트 (Biacore, Freiburg/Germany) 를 사용하여 수행한다. HuFcγRIIIa-V158-K6H6 및 muFcγRIV-aviHis-비오틴을 60 초 동안 각각 4 및 10 nM 에서 포획한다.
상이한 Fc-돌연변이를 포함하는 구축물을 플로우 셀 (flow cell) 을 통해 120 초 동안 1000 nM 의 농도로 30 ㎕/분 의 유속으로 통과시킨다. 해리를 220 초 동안 모니터링한다. 벌크 굴절률 차이를 기준 플로우 셀에서 수득된 응답을 뺄샘하여 보정한다. 여기에서, HuFcγRIIIa-V158-K6H6 또는 muFcγRIV-aviHis-비오틴 대신에 HBS-EP 를 주입한 부동화된 항-Penta His 항체가 있는 표면 위에 Fc-변이체를 유동시킨다. 인간 FcγRIIIa-V158 및 쥐과 FcγRIV 에 대한 친화도를 야생형 Fc 에 대해 500 - 4000 nM 범위의 농도를 사용하여 확인했다.
정상 상태 응답을 사용하여 Langmuir 결합 등온선의 비-선형 곡선 핏팅에 의해 해리 상수 KD 를 유도했다. 동역학 상수를 Biacore T100 Evaluation Software (vAA, Biacore AB, Uppsala/Sweden) 를 사용하여 유도하여, 1:1 Langmuir 결합에 대한 반응속도식을 수치 적분법에 의해 핏팅했다.
결과
Fc 변이체와 인간 FcγRIIIa 및 쥐과 FcγRIV 의 상호작용을 표면 플라스몬 공명에 의해 모니터링했다. 포획된 huFcγRIIIa-V158-K6H6 및 muFcγRIV-aviHis-비오틴에 대한 결합은 모든 분석된 Fc 돌연변이체에 대해 야생형 (wt) Fc 도메인을 포함하는 구축물에 비해 유의하게 감소된다.
인간 Fcγ-수용체에 대한 결합이 가장 낮은 Fc 돌연변이체는 P329G L234A L235A (LALA) 및 P329G LALA N297D 였다. LALA 돌연변이 단독은 huFcγRIIIa-V158-K6H6 에 대한 결합을 폐지하기에 충분하지 않았다. 오직 LALA 돌연변이만을 보유하는 Fc 변이체는 2.100 nM 의 인간 FcγRIIIa 에 대한 잔류 결합 친화도를 가졌으며, 한편 wt Fc 는 인간 FcγRIIIa 수용체에 600 nM 의 친화도로 결합했다 (표 3). 2 가지 KD 값 모두 1:1 결합 모델에 의해, 단일 농도를 사용하여 유도했다.
인간 FcγRIIIa-V158 및 쥐과 FcγRIV 에 대한 친화도는 오직 wt Fc 에 대해서만 분석할 수 있었다. KD 값이 표 3 에 나열되어 있다. 쥐과 FcγRIV 에 대한 결합은 모든 분석된 Fc 돌연변이체에서 거의 완전히 제거되었다.
표 3. 인간 FcγRIIIa-V158 및 쥐과 FcγRIV 에 대한 Fc-변이체의 친화도.
Figure pct00006
*하나의 농도 (1000 nM) 를 사용하여 확인됨
(표에서 n.d. 는 확인되지 않음을 의미함. 이하 동일)
종양 항원 및 CD3 에 대한 동시 결합의 분석
종양 항원 및 인간 CD3ε 에 대한 T-세포 이중특이적 구축물의 동시 결합의 분석을 표준 커플링 절차를 사용하여 센서 칩 SA 위에 1650 공명 단위 (RU) 의 MCSP 의 비오티닐화된 D3 도메인을 직접 커플링하여 수행했다. 인간 EGFR 을 표준 아미노 커플링 절차를 사용하여 부동화시켰다. pH 5.5 에서 CM5 센서 칩 위에 8000 RU 가 부동화되었다. 검정 설정이 도 16B 에 제시되어 있다.
상이한 T-세포 이중특이적 구축물이 60 초 동안 200 nM 에서 포획되었다. 후속적으로 인간 CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(놉)-Avi/Fc(홀) 을 농도 2000 nM 및 유속 40 ㎕/분 으로 60 초 동안 통과시켰다. 기준 플로우 셀에서 수득된 응답을 뺄셈하여 벌크 굴절률 차이를 보정했다 재조합 CD3ε 를 포획된 T-세포 이중특이적 구축물이 없이 MCSP 또는 EGFR 부동화된 D3 도메인이 있는 표면 위에 유동시켰다.
결과
종양 항원 및 인간 CD3ε 둘다에 대한 동시 결합을 표면 플라스몬 공명에 의해 분석했다 (도 17, 도 18). 모든 구축물은 종양 항원 및 CD3 에 동시에 결합할 수 있었다. 대부분의 구축물에서 인간 CD3ε 의 주입 후 결합 수준 (RU) 은 구축물 단독의 주입 후에 달성된 결합 수준보다 높았으며, 이는 종양 항원 및 인간 CD3ε 이 둘다 구축물에 결합되었음을 반영한다.
실시예 3
세포 위의 각각의 표적 항원에 대한 이중특이적 구축물의 결합
주르카트 세포 (ATCC #TIB-152) 위의 CD3, 및 표적 세포 위의 각각의 종양 항원에 대한 상이한 이중특이적 구축물의 결합을 wFACS 에 의해 확인했다. 간략히, 세포를 수확하고, 계수하고, 생활력에 대해 체크했다. 15 - 20 만 세포/웰 (0.1% BSA 를 함유하는 PBS; 90 ㎕) 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 명시된 농도의 이중특이적 구축물 및 상응하는 IgG 대조군 (10 ㎕) 과 함께 30 분 동안 4℃ 에서 인큐베이션했다. 더 나은 비교를 위해, 모든 구축물 및 IgG 대조군을 동일한 몰농도로 정규화했다. 인큐베이션 후에, 세포를 원심분리하고 (5 분, 350 x g), 150 ㎕ PBS (0.1% BSA 를 함유) 로 세정하고, 재현탁시키고, 추가 30 분 동안 4℃ 에서 12 ㎕/웰 의 FITC- 또는 PE-접합된 2 차 항체와 함께 인큐베이션했다. 결합된 구축물을 FACSCantoII (Software FACS Diva) 를 사용하여 탐지했다. "(scFv)2" 분자를 FITC-접합된 항-His 항체 (Lucerna, #RHIS-45F-Z) 를 사용하여 탐지했다. 모든 기타 분자에 대해, FITC- 또는 PE-접합된 AffiniPure F(ab')2 Fragment 염소 항-인간 IgG Fcγ Fragment Specific (Jackson Immuno Research Lab # 109-096-098 / 작업 용액 1:20, 또는 #109-116-170 / 작업 용액 1:80, 각각) 을 사용했다. 세포를 120 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 의 첨가 및 350 x g 에서 5 분 동안 원심분리에 의해 세정했다. 두번째 2 세정 단계를 150 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 로 수행했다. 다르게 명시되지 않으면, 세포를 100 ㎕/웰 고정 완충액 (BD #554655) 으로 15 분 동안 4℃ 에서 어둠 속에서 고정하고, 6 분 동안 400 x g 에서 원심분리하고, 샘플을 FACS CantoII 로 측정하기 전까지 200 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 중에서 유지했다. EC50 값을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산했다.
첫번째 실험에서, 인간 MCSP 및 인간 CD3 을 표적화하는 상이한 이중특이적 구축물을 유동 세포분석법에 의해 주르카트 상에 발현된 인간 CD3, 인간 T 세포 백혈병 세포, 또는 Colo-38 인간 흑색종 세포 상의 인간 MCSP 에 대한 결합에 대해 분석했다.
결과가 도 19-21 에 제시되어 있으며, 이 도면들은 이중특이적 분자, 대조군 IgG, 오직 2 차 항체와 함께 인큐베이션된, 또는 미처리 상태로 둔 세포의 평균 형광 강도를 보여준다.
도 19 에 나타난 바와 같이, "(scFv)2" 분자의 항원 결합 부분 둘다, 즉 CD3 (도 19A) 및 MCSP (도 19B) 에서, 대조군 샘플에 비해 분명한 결합 신호가 관찰된다.
"2+1 IgG scFab" 분자 (SEQ ID NOs 5, 17, 19) 는 huColo-38 세포 상의 MCSP 에 대한 양호한 결합을 보여준다 (도 20A). CD3 부분은 기준 항-인간 CD3 IgG 보다 약간 더 양호하게 CD3 에 결합한다 (도 20B).
도 21A 에 나타난 바와 같이, 2 가지 "1+1" 구축물은 세포 상의 인간 CD3 에 대한 비슷한 결합 신호를 나타낸다. 기준 항-인간 CD3 IgG 는 약간 더 약한 신호를 나타낸다. 또한, 시험된 구축물 둘다 ("1+1 IgG scFab, 한 팔" (SEQ ID NOs 1, 3, 5) 및 "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (SEQ ID NOs 7, 9, 11)) 는 세포 상의 인간 MCSP 에 대한 비슷한 결합을 보여준다 (도 21B). 기준 항-인간 MCSP IgG 로 수득된 결합 신호는 약간 더 약하다.
또다른 실험에서, 정제된 "2+1 IgG scFab" 이중특이적 구축물 (SEQ ID NOs 5, 17, 19) 및 상응하는 항 인간 MCSP IgG 을 유동 세포분석법에 의해 Colo-38 인간 흑색종 세포 상의 인간 MCSP 에 대한 용량-의존적 결합에 대해 분석하여, 이중특이적 구축물이 MCSP 에 그것의 "팔" 중 하나 또는 둘다를 통해 결합하는지 여부를 확인했다. 도 22 에 나타난 바와 같이, "2+1 IgG scFab" 구축물은 MCSP IgG 와 동일한 결합 패턴을 나타낸다.
또다른 실험에서, 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3 에 대한, 또는 LS-174T 세포에 의해 발현된 인간 CEA 에 대한, Crossfab 조각에서 VL/VH (SEQ ID NOs 33, 63, 65, 67 참조) 또는 CL/CH1 교환된 (SEQ ID NOs 66, 67, 183, 197 참조) CD3/CEA "2+1 IgG Crossfab, 역방위" 이중특이적 구축물의 결합을 평가했다. 대조군으로서, 등가 최대 농도의 상응하는 IgG 및 표지된 2 차 항체 (염소 항-인간 FITC-접합된 AffiniPure F(ab')2 Fragment, Fcγ Fragment-Specific, Jackson Immuno Research Lab # 109-096-098) 로 인한 배경 염색을 또한 평가했다. 도 55 에 나타난 바와 같이, 2 가지 구축물 모두 인간 CEA 에 대한, 뿐만 아니라 세포 상의 인간 CD3 에 대한 양호한 결합을 나타낸다. "2+1 IgG Crossfab, 역방위 (VL/VH)" 및 "2+1 IgG Crossfab, 역방위 (CL/CH1)" 구축물 각각에 대해 계산된 EC50 값은 4.6 및 3.9 nM (CD3), 및 9.3 및 6.7 nM (CEA) 이었다.
또다른 실험에서, 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3 에 대한, 또는 WM266-4 세포에 의해 발현된 인간 MCSP 에 대한 CD3/MCSP "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 역방위" (SEQ ID NOs 5, 23, 183, 187 참조) 구축물의 결합을 평가했다. 도 56 은 세포 상의 MCSP 에 대한 2 가지 구축물 모두의 결합이 비슷하게 양호했으며, 한편 CD3 에 대한 "역방위" 구축물의 결합이 기타 구축물에 비해 감소되었다는 것을 보여준다. "2+1 IgG Crossfab, 역방위" 및 "2+1 IgG Crossfab" 구축물 각각에 대해 계산된 EC50 값은 6.1 및 1.66 nM (CD3), 및 0.57 및 0.95 nM (MCSP) 이었다.
추가의 실험에서, 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3 에 대한, 및 LS-174T 세포에 의해 발현된 인간 CEA 에 대한 "1+1 IgG Crossfab 경쇄 (LC) 융합물" 구축물 (SEQ ID NOs 183, 209, 211, 213) 의 결합을 확인했다. 대조군으로서, 등가 최대 농도의 상응하는 항-CD3 및 항-CEA IgG 및 표지된 2 차 항체 (염소 항-인간 FITC-접합된 AffiniPure F(ab')2 Fragment, Fcγ Fragment-Specific, Jackson Immuno Research Lab #109-096-098) 로 인한 배경 염색을 또한 평가했다. 도 57 에 나타난 바와 같이, CEA 에 대한 "1+1 IgG Crossfab LC 융합물" 의 결합은 크게 감소된 것으로 보이지만, CD3 에 대한 결합은 기준 IgG 와 적어도 비슷했다.
최종 실험에서, 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3 에 대한, 및 WM266-4 종양 세포에 의해 발현된 인간 MCSP 에 대한 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 217) 및 "2+1 IgG Crossfab, 역방위" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 219) 구축물의 결합을 확인했다. 도 58 에 나타난 바와 같이, 인간 CD3 에 대한 결합은 기타 구축물에 비해 "2+1 IgG Crossfab, 역방위" 에서 감소되었으나 인간 MCSP 에 대한 결합은 비슷하게 양호했다. "2+1 IgG Crossfab" 및 "2+1 IgG Crossfab, 역방위" 구축물 각각에 대해 계산된 EC50 값은 10.3 및 32.0 nM (CD3), 및 3.1 및 3.4 nM (MCSP) 이었다.
실시예 4
이중특이적 구축물의 맞물림 이후 일차 인간 T 세포 상의 표면 활성화 마커의 FACS 분석
정제된 huMCSP-huCD3-표적화 이중특이적 "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 5, 17, 19) 및 "(scFv)2" 분자를 유동 세포분석법에 의해 CD8+ T 세포 상의 조기 표면 활성화 마커 CD69, 또는 후기 활성화 마커 CD25 를 상향조절하는 그들의 잠재력에 대해 시험했다.
간략히, MCSP-양성 Colo-38 세포를 세포 해리 완충액 (Cell Dissociation Buffer) 으로 수확하고, 계수하고, 생활력 (vi능력) 에 대해 체크했다. 세포를 AIM-V 배지 중 0.3 x 106 (생활력 있는) 세포/㎖ 로 조정하고, 100 ㎕ 의 이러한 세포 현탁액/웰 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트 (명시된 바와 같음) 내로 피펫팅했다. 50 ㎕ 의 (희석된) 이중특이적 구축물을 세포-함유 웰에 첨가하여 1 nM 의 최종 농도를 얻었다. 인간 PBMC 효과기 세포를 건강한 공여자의 신선한 혈액으로부터 단리하고, AIM-V 배지 중 6 x 106 (생활력 있는) 세포/㎖ 로 조정했다. 50 ㎕ 의 이러한 세포 현탁액을 검정 플레이트 (상기 참조) 의 웰마다 첨가하여 10:1 의 최종 E:T 비율을 얻었다. 이중특이적 구축물이 배타적으로 종양 항원 huMCSP 를 발현하는 표적 세포의 존재 하에 T 세포를 활성화시킬 수 있는지 여부를 분석하기 위해, 1 nM 의 각각의 이중특이적 분자, 뿐만 아니라 PBMC 를 함유하는, 그러나 표적 세포는 함유하지 않는 웰을 포함시켰다.
15 h (CD69), 또는 24 h (CD25) 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션 후에, 세포를 원심분리하고 (5 분, 350 x g), 150 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 로 2 회 세정했다. CD8 (마우스 IgG1,κ; 클론 HIT8a; BD #555635), CD69 (마우스 IgG1; 클론 L78; BD #340560) 및 CD25 (마우스 IgG1,κ; 클론 M-A251; BD #555434) 에 대한 표면 염색을 4℃ 에서 30 분 동안 공급사의 제안에 따라 수행했다. 세포를 150 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 로 2 회 세정하고, 15 분 동안 4℃ 에서 100 ㎕/웰 고정 완충액 (BD #554655) 을 사용하여 고정시켰다. 원심분리 후에, 샘플을 200 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 에 재현탁시키고, FACS CantoII 기계 (Software FACS Diva) 를 사용하여 분석했다.
도 23 은 각각 15 시간 또는 24 시간 인큐베이션 후에 CD8+ T 세포 상의 조기 활성화 마커 CD69 (A), 또는 후기 활성화 마커 CD25 (B) 의 발현 수준을 나타낸다. 2 가지 구축물 모두 배타적으로 표적 세포의 존재 하에 활성화 마커 둘다의 상향조절을 유도한다. "(scFv)2" 분자는 이 검정에서 "2+1 IgG scFab" 구축물보다 약간 더욱 활성으로 보인다.
정제된 huMCSP-huCD3-표적화 이중특이적 "2+1 IgG scFab" 및 "(scFv)2" 분자를 유동 세포분석법에 의해 인간 MCSP-발현 종양 세포의 존재 하에 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포 상의 후기 활성화 마커 CD25 를 상향조절하는 그들의 잠재력에 대해 추가로 시험했다. 실험 절차는 위에 기재된 바와 같았으며, 인간 pan T 효과기 세포를 5:1 의 E:T 비율로 사용했고, 인큐베이션 시간은 5 일이었다.
도 24 는 2 가지 구축물 모두 배타적으로 표적 세포의 존재 하에 CD8+ (A) 뿐만 아니라 CD4+ (B) T 세포 둘다 상의 CD25 의 상향조절을 유도하는 것을 보여준다. "2+1 IgG scFab" 구축물은 이 검정에서 "(scFv)2" 분자에 비해 CD25 의 상향조절을 더 적게 유도하는 것으로 보인다. 일반적으로, CD25 의 상향조절은 CD4+ T 세포 상에서보다 CD8+ T 세포 상에서 더욱 현저하다.
또다른 실험에서, 사이노몰구스 CD3 및 인간 MCSP 를 표적화하는 정제된 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 35, 37) 을 종양 표적 세포의 존재 하에 CD8+ T 세포 상의 표면 활성화 마커 CD25 를 상향조절하는 그것의 잠재력에 대해 분석했다. 간략히, 인간 MCSP-발현 MV-3 종양 표적 세포를 세포 해리 완충액으로 수확하고, 세정하고, 2% FCS 및 1% GlutaMax 를 함유하는 DMEM 에 재현탁시켰다. 30 000 세포/웰 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석물을 명시된 농도 (도 25) 로 첨가했다. 이중특이적 구축물 및 상이한 IgG 대조군을 동일한 몰농도로 조정했다. 2 마리의 건강한 동물의 혈액으로부터 단리된 사이노몰구스 PBMC 효과기 세포를 첨가하여 3:1 의 최종 E:T 비율을 얻었다. 43 h 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션 후에, 세포를 350 x g 에서 5 분 동안 원심분리하고, PBS (0.1% BSA 를 함유) 로 2 회 세정했다. CD8 (Miltenyi Biotech #130-080-601) 및 CD25 (BD #557138) 에 대한 표면 염색을 공급사의 제안에 따라 수행했다. 세포를 150 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 로 2 회 세정하고, 15 분 동안 4℃ 에서 100 ㎕/웰 고정 완충액 (BD #554655) 을 사용하여 고정시켰다. 원심분리 후에, 샘플을 200 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 에 재현탁시키고, FACS CantoII 기계 (Software FACS Diva) 를 사용하여 분석했다.
도 25 에 나타난 바와 같이, 이중특이적 구축물은 표적 세포의 존재 하에 오직 CD8+ T 세포 상의 CD25 의 농도-의존적 상향조절을 유도한다. 항 cyno CD3 IgG (클론 FN-18) 가 또한 교차연결되지 않으면서 CD8+ T 세포 상의 CD25 의 상향조절을 유도할 수 있다 (cyno Nestor 로 수득된 데이타 참조). 최대 농도의 이중특이적 구축물의 경우에는 (표적 세포의 부재 하에) cyno T 세포의 과활성화가 존재하지 않는다.
또다른 실험에서, CD3-MCSP "2+1 IgG Crossfab, 연결된 경쇄" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 179 참조) 를 종양 표적 세포의 존재 하에 CD8+ T 세포 상의 조기 활성화 마커 CD69 또는 후기 활성화 마커 CD25 를 상향조절하는 그것의 잠재력에 대해 CD3-MCSP "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 와 비교했다. 일차 인간 PBMC (위에 기재된 바와 같이 단리됨) 를 MCSP-양성 Colo38 표적 세포의 존재 또는 부재 하에 적어도 22 h 동안 명시된 농도의 이중특이적 구축물과 함께 인큐베이션했다. 간략히, MCSP-양성 표적 세포 (또는 배지) 를 함유하는 넓적 바닥 96-웰 플레이트의 웰마다 30 만 개의 일차 인간 PBMC 를 플레이팅했다. 최종 효과기 대 표적 세포 (E:T) 비율은 10:1 이었다. 세포를 명시된 농도의 이중특이적 구축물 및 대조군과 함께 명시된 인큐베이션 시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션했다. 효과기 세포를 CD8, 및 CD69 또는 CD25 에 대해 염색하고, FACS CantoII 에 의해 분석했다.
도 53 은 이 실험의 결과를 보여준다. 2 가지 2+1 IgG Crossfab 분자 (연결된 경쇄가 있거나 없음) 사이에 CD69 (A) 또는 CD25 상향조절 (B) 에 대해 탐지된 유의한 차이가 존재하지 않았다.
또다른 실험에서, CD3/MCSP "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "1+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 5, 29, 33, 181 참조) 구축물을 종양 표적 세포의 존재 하에 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 상의 CD69 또는 CD25 를 상향조절하는 그들의 잠재력에 대해 "1+1 CrossMab" 구축물 (SEQ ID NOs 5, 23, 183, 185 참조) 과 비교했다. 검정을 위에 기재된 바와 같이, 인간 MCSP 발현 MV-3 종양 세포의 존재 또는 부재 하에, 24 h 의 인큐베이션 시간으로 수행했다.
도 59 에 나타난 바와 같이, "1+1 IgG Crossfab" 및 "2+1 IgG Crossfab" 구축물은 "1+1 CrossMab" 분자보다 활성화 마커의 더욱 현저한 상향조절을 유도했다.
최종 실험에서, CD3/MCSP "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 217 참조) 및 "2+1 IgG Crossfab, 역방위" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 219 참조) 구축물을 종양 표적 세포의 존재 하에 2 가지 상이한 사이노몰구스 원숭이로부터의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 상의 CD25 를 상향조절하는 그들의 잠재력에 대해 평가했다. 검정을 위에 기재된 바와 같이, 인간 MCSP 발현 MV-3 종양 세포존재 또는 부재 하에, 3:1 의 E:T 비율 및 약 41 h 의 인큐베이션 시간으로 수행했다.
도 60 에 나타난 바와 같이, 2 가지 구축물 모두 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상의 CD25 를 농도-의존적 방식으로 상향조절할 수 있었으며, 2 가지 표맷 사이에 유의한 차이가 없었다. 항체가 없고 표적 세포가 없는 대조군 샘플은 항체가 있으나 표적 세포가 없는 샘플과 비슷한 신호를 제공했다 (제시되지 않음).
실시예 5
CD3 이중특이적 구축물에 의한 인간 pan T 세포의 활성화시 인터페론-γ 분비
인간 MCSP 및 인간 CD3 을 표적화하는 정제된 "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 5, 17, 19) 를 상청액 내로의 인간 인터페론 (IFN)-γ 의 방출에 의해 측정되는, 인간 MCSP-양성 U-87MG 세포의 존재 하에 T 세포 활성화를 유도하는 그것의 잠재력에 대해 분석했다. 대조군으로서, 항-인간 MCSP 및 항-인간 CD3 IgG 를 사용했고, 동일한 몰농도로 조정했다. 간략히, huMCSP-발현 U-87MG 교아 세포종 성상 세포종 표적 세포 (ECACC 89081402) 를 세포 해리 완충액으로 수확하고, 세정하고, AIM-V 배지 (Invitrogen #12055-091) 에 재현탁시켰다. 20 000 세포/웰 을 둥근 바닥 96-웰-플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석물을 첨가하여 1 nM 의 최종 농도를 얻었다. 버피 코트로부터 단리된 인간 pan T 효과기 세포를 첨가하여 5:1 의 최종 E:T 비율을 얻었다. 37℃, 5% CO2 에서 18.5 h 의 밤새 인큐베이션 후에, 검정 플레이트를 5 분 동안 350 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 새로운 96-웰 플레이트 내로 옮겼다. 상청액 중 인간 IFN-γ 수준을 ELISA 에 의해 제조사의 지침에 따라 측정했다 (Becton Dickinson, #550612 로부터의 BD OptEIA 인간 IFN-γ ELISA Kit II).
도 26 에 나타난 바와 같이, 기준 IgG 는 IFN-γ 분비의 영 내지 약한 유도를 나타내지만, "2+1 IgG scFab" 구축물은 인간 T 세포를 활성화시켜 IFN-γ 를 분비하게 할 수 있었다.
실시예 6
T 세포 상의 CD3 및 종양 세포 상의 MCSP 또는 EGFR 을 표적화하는 교차연결된 이중특이적 구축물에 의해 매개되는 방향 지정된 T 세포 세포독성 (LDH 방출 검정)
첫번째 1 일련의 실험에서, CD3 및 MCSP 을 표적화하는 이중특이적 구축물을 세포 상의 그들의 각각의 표적 항원에 대한 항원 결합 부분의 결합을 통한 구축물의 교차연결 이후 종양 표적 세포에서 T 세포-매개 세포자멸사를 유도하는 그들의 잠재력에 대해 분석했다 (도 27-38).
하나의 실험에서 인간 CD3 및 인간 MCSP, 및 상응하는 "(scFv)2" 분자를 표적화하는 정제된 "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 5, 21, 23) 및 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33) 구축물을 비교했다. 간략히, huMCSP-발현 MDA-MB-435 인간 흑색종 표적 세포를 세포 해리 완충액으로 수확하고, 세정하고, AIM-V 배지 (Invitrogen # 12055-091) 에 재현탁시켰다. 30 000 세포/웰 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 구축물의 각각의 희석물을 명시된 농도로 첨가했다. 모든 구축물 및 상응하는 대조군 IgG 을 동일한 몰농도로 조정했다. 인간 pan T 효과기 세포를 첨가하여 5:1 의 최종 E:T 비율을 얻었다. 인간 pan T 세포의 활성화에 대한 양성 대조군으로서, 1 ㎍/㎖ PHA-M (Sigma #L8902; 강낭콩 (Phaseolus vulgaris) 으로부터 단리된 이소렉틴의 혼합물) 을 사용했다. 정규화를 위해, 표적 세포의 최대 용해 (= 100%) 를 표적 세포와 최종 농도의 1% Triton X-100 와의 인큐베이션에 의해 확인했다. 최소 용해 (= 0%) 는 효과기 세포와 함께, 그러나 구축물 또는 항체 없이, 동시-인큐베이션된 표적 세포를 나타낸다. 37℃, 5% CO2 에서 20 h 의 밤새 인큐베이션 후에, 상청액 내로의 세포자멸사/괴사 표적 세포의 LDH 방출을 LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, #11 644 793 001) 로 제조사의 지침에 따라 측정했다.
도 27 에 나타난 바와 같이, 2 가지 "2+1" 구축물 모두 표적 세포에서 "(scFv)2" 분자와 비슷한 세포자멸사를 유도한다.
또한, 그들의 Fc 도메인에서 상이한 정제된 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33) 및 "2+1 IgG scFab" 구축물, 뿐만 아니라 "(scFv)2" 분자를 비교했다. Fc 도메인 내의 상이한 돌연변이 (L234A+L235A (LALA), P329G 및/또는 N297D, 명시된 바와 같음) 는 야생형 (wt) Fc 도메인을 함유하는 구축물에 의해 유도되는 (NK) 효과기 세포 기능을 감소 또는 폐지한다. 실험 절차는 위에 기재된 바와 같았다.
도 28 은 모든 구축물이 표적 세포에서 "(scFv)2" 분자와 비슷한 세포자멸사를 유도한다는 것을 보여준다.
도 29 는 종양 표적 세포에서 T 세포-매개 세포자멸사를 유도하는 그들의 잠재력에 대한 정제된 "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 5, 17, 19) 및 "(scFv)2" 분자의 비교의 결과를 보여준다. 실험 절차는 위에 기재된 바와 같았으며, huMCSP-발현 Colo-38 인간 흑색종 표적 세포를 5:1 의 E:T 비율, 및 18.5 h 의 밤새 인큐베이션으로 사용했다. 도면에 나타난 바와 같이, "2+1 IgG scFab" 구축물은 "(scFv)2" 분자와 비슷한 세포독성 활성을 보여준다.
유사하게, 도 30 은 huMCSP-발현 Colo-38 인간 흑색종 표적 세포를 5:1 의 E:T 비율, 및 18 h 의 인큐베이션 시간으로 사용했을 때, 정제된 "2+1 IgG scFab" 구축물 (SEQ ID NOs 5, 17, 19) 및 "(scFv)2" 분자의 비교의 결과를 보여준다. 도면에 나타난 바와 같이, "2+1 IgG scFab" 구축물은 (scFv)2 분자와 비슷한 세포독성 활성을 보여준다.
도 31 은 huMCSP-발현 MDA-MB-435 인간 흑색종 표적 세포를 5:1 의 E:T 비율 및 23.5 h 의 밤새 인큐베이션으로 사용했을 때 정제된 "2+1 IgG scFab" 구축물 (SEQ ID NOs 5, 17, 19) 및 "(scFv)2" 분자의 비교의 결과를 보여준다. 도면에 나타난 바와 같이, 구축물은 표적 세포에서 "(scFv)2" 분자와 비슷하게 세포자멸사를 유도한다. "2+1 IgG scFab" 구축물은 최고 농도에서 감소된 효능을 나타낸다.
게다가, 2 가지 표적 모두, 인간 CD3 및 인간 MCSP 에 대해 1 가인 상이한 이중특이적 구축물, 뿐만 아니라 상응하는 "(scFv)2" 분자를 T 세포-매개 세포자멸사를 유도하는 그들의 잠재력에 대해 분석했다. 도 32 는 huMCSP-발현 Colo-38 인간 흑색종 표적 세포를 5:1 의 E:T 비율, 및 19 h 의 인큐베이션 시간으로 사용했을 때, "1+1 IgG scFab, 한 팔" (SEQ ID NOs 1, 3, 5) 및 "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (SEQ ID NOs 7, 9, 11) 구축물에 대한 결과를 보여준다. 도면에 나타난 바와 같이, 2 가지 "1+1" 구축물 모두 "(scFv)2" 분자보다 활성이 적으며, 이 검정에서 "1+1 IgG scFab, 한 팔" 분자는 "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" 분자보다 우수하다.
도 33 은 huMCSP-발현 Colo-38 인간 흑색종 표적 세포를 5:1 의 E:T 비율, 및 20 h 의 인큐베이션 시간으로 사용했을 때 "1+1 IgG scFab" 구축물 (SEQ ID NOs 5, 21, 213) 에 대한 결과를 보여준다. 도면에 나타난 바와 같이, "1+1 IgG scFab" 구축물은 "(scFv)2" 분자보다 세포독성이 더 적다.
추가의 실험에서, 정제된 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33), "1+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 5, 29, 31, 33) 및 "(scFv)2" 분자를 세포 상의 2 가지 표적 항원 CD3 및 MCSP 모두의 결합을 통한 구축물의 교차연결 이후 종양 표적 세포에서 T 세포-매개 세포자멸사를 유도하는 그들의 잠재력에 대해 분석했다. huMCSP-발현 MDA-MB-435 인간 흑색종 세포를 표적 세포로서 사용했고, E:T 비율은 5:1 이었고, 인큐베이션 시간은 20 h 었다. 결과가 도 34 에 제시되어 있다. "2+1 IgG Crossfab" 구축물은 표적 세포에서 "(scFv)2" 분자와 비슷하게 세포자멸사를 유도한다. 1- 및 2 가 "IgG Crossfab" 포맷의 비교는 2 가 포맷이 훨씬 더 강략하다는 것을 보여준다.
또다른 실험에서, 정제된 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33) 구축물을 상이한 (종양) 표적 세포에서 T 세포-매개 세포자멸사를 유도하는 그것의 잠재력에 대해 분석했다. 간략히, MCSP-양성 Colo-38 종양 표적 세포, 중간엽 줄기 세포 (골수, Lonza #PT-2501 또는 지방 조직, Invitrogen #R7788-115 에서 유래) 또는 혈관주위세포 (태반; PromoCell #C-12980 에서 유래) (명시된 바와 같음) 를 세포 해리 완충액으로 수확하고, 세정하고, AIM-V 배지 (Invitrogen #12055-091) 에 재현탁시켰다. 30 000 세포/웰 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석물을 명시된 농도로 첨가했다. 건강한 공여자의 신선한 혈액으로부터 단리된 인간 PBMC 효과기 세포를 첨가하여 25:1 의 최종 E:T 비율을 얻었다. 37℃, 5% CO2 에서 4 h 의 인큐베이션 후에, 상청액 내로의 세포자멸사/괴사 표적 세포의 LDH 방출을 LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, #11 644 793 001) 로 제조사의 지침에 따라 측정했다.
도 35 에 나타난 바와 같이, 유의한 T-세포 매개 세포독성은 오직 Colo-38 세포에서만 관찰될 수 있었다. 이러한 결과는 Colo-38 세포는 유의한 수준의 MCSP 를 발현하지만, 중간엽 줄기 세포 및 혈관주위세포는 MCSP 를 오직 매우 약하게만 발현하는 것과 일치한다.
정제된 "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 5, 17, 19) 구축물 및 "(scFv)2" 분자를 또한 그것의 Fc 도메인에서 감소된 비율의 푸코실화된 N-글리칸을 갖는 당조작된 항-인간 MCSP IgG 항체 (MCSP GlycoMab) 와도 비교했다. 이 실험에서 huMCSP-발현 Colo-38 인간 흑색종 표적 세포 및 인간 PBMC 효과기 세포를 25:1 의 고정된 E:T 비율로 (도 36A), 또는 20:1 내지 1:10 의 상이한 E:T 비율로 (도 36B) 사용했다. 상이한 분자를 도 36A 에 명시된 농도로, 또는 1667 pM 의 고정된 농도로 (도 36B) 사용했다. 21 h 인큐베이션 후에 판독을 수행했다. 도 36 A 및 B 에 나타난 바와 같이, 2 가지 이중특이적 구축물 모두 MSCP GlycoMab 보다 더 높은 효능을 나타낸다.
또다른 실험에서, 사이노몰구스 CD3 및 인간 MCSP 를 표적화하는 정제된 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 35, 37) 를 분석했다. 간략히, 인간 MCSP-발현 MV-3 종양 표적 세포를 세포 해리 완충액으로 수확하고, 세정하고, 2% FCS 및 1% GlutaMax 를 함유하는 DMEM 에 재현탁시켰다. 30 000 세포/웰 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 구축물 또는 기준 IgG 의 각각의 희석물을 명시된 농도로 첨가했다. 이중특이적 구축물 및 상이한 IgG 대조군을 동일한 몰농도로 조정했다. 건강한 사이노몰구스의 혈액으로부터 단리된 사이노몰구스 PBMC 효과기 세포를 첨가하여 3:1 의 최종 E:T 비율을 얻었다. 24 h 또는 43 h 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션 후에, 상청액 내로의 세포자멸사/괴사 표적 세포의 LDH 방출을 LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, #11 644 793 001) 로 제조사의 지침에 따라 측정했다.
도 37 에 나타난 바와 같이, 이중특이적 구축물은 표적 세포로부터 농도-의존적 LDH 방출을 유도한다. 효과는 24 h 후에 보다 43 h 후에 더 강하다. 항-cynoCD3 IgG (클론 FN-18) 가 또한 교차연결되지 않으면서 표적 세포의 LDH 방출을 유도할 수 있다.
도 38 은 MCSP-발현 인간 흑색종 세포주 (MV-3) 를 표적 세포로서 및 인간 PBMC 를 효과기 세포로서 10:1 의 E:T 비율 및 26 h 의 인큐베이션 시간으로 사용했을 때, 정제된 "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33) 및 "(scFv)2" 구축물의 비교의 결과를 보여준다. 도면에 나타난 바와 같이, "2+1 IgG Crossfab" 구축물은 EC50 의 면에서 "(scFv)2" 분자보다 더욱 강력하다.
두번째 일련의 실험에서, CD3 및 EGFR 을 표적화하는 이중특이적 구축물을 세포 상의 그들의 각각의 표적 항원에 대한 항원 결합 부분의 결합을 통한 구축물의 교차연결 이후 종양 표적 세포에서 T 세포-매개 세포자멸사를 유도하는 그들의 잠재력에 대해 분석했다 (도 39-41).
하나의 실험에서 CD3 및 EGFR 을 표적화하는 정제된 "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 45, 47, 53) 및 "1+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 47, 53, 213) 구축물, 및 상응하는 "(scFv)2" 분자를 비교했다. 간략히, 인간 EGFR-발현 LS-174T 종양 표적 세포를 트립신으로 수확하고, 세정하고, AIM-V 배지 (Invitrogen # 12055-091) 에 재현탁시켰다. 30 000 세포/웰 을 둥근 바닥 96-웰-플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석물을 명시된 농도로 첨가했다. 모든 구축물 및 대조군을 동일한 몰농도로 조정했다. 인간 pan T 효과기 세포를 첨가하여 5:1 의 최종 E:T 비율을 얻었다. 인간 pan T 세포의 활성화에 대한 양성 대조군으로서, 1 ㎍/㎖ PHA-M (Sigma #L8902) 을 사용했다. 정규화를 위해, 표적 세포의 최대 용해 (= 100%) 를 표적 세포와 최종 농도의 1% Triton X-100 와의 인큐베이션에 의해 확인했다. 최소 용해 (= 0%) 는 효과기 세포와 함께, 그러나 구축물 또는 항체 없이, 동시-인큐베이션된 표적 세포를 나타낸다. 37℃, 5% CO2 에서 18 h 의 밤새 인큐베이션 후에, 상청액 내로의 세포자멸사/괴사 표적 세포의 LDH 방출을 LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, #11 644 793 001) 로 제조사의 지침에 따라 측정했다.
도 39 에 나타난 바와 같이, "2+1 IgG scFab" 구축물은 "(scFv)2" 분자와 비슷한 세포독성 활성을 보여주지만, "1+1 IgG scFab" 구축물은 활성이 적다.
또다른 실험에서 정제된 "1+1 IgG scFab, 한 팔" (SEQ ID NOs 43, 45, 47), "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (SEQ ID NOs 11, 49, 51), "1+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 47, 53, 213), 및 "(scFv)2" 분자를 비교했다. 실험 조건은 위에 기재된 바와 같았으며, 예외적으로 인큐베이션 시간은 21 h 였다.
도 40 에 나타난 바와 같이, "1+1 IgG scFab" 구축물은 이 검정에서 "(scFv)2" 분자보다 약간 더 낮은 세포독성 활성을 나타낸다. 2 가지 "1+1 IgG scFab, 한 팔 (역방위)" 구축물은 모두 "(scFv)2" 분자보다 분명히 활성이 더 적다.
추가의 실험에서 정제된 "1+1 IgG scFab, 한 팔" (SEQ ID NO 43, 45, 47) 및 "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (SEQ ID NOs 11, 49, 51) 구축물 및 "(scFv)2" 분자 를 비교했다. 이 실험에서 인큐베이션 시간은 16 h 였고, 결과가 도 41 에 나타나 있다. 인간 pan T 세포와 인큐베이션된, 2 가지 "1+1 IgG scFab, 한 팔 (역방위)" 구축물은 모두 "(scFv)2" 분자보다 활성이 더 적으나, 표적 세포로부터 LDH 의 농도-의존적 방출을 나타낸다 (도 41A). PBMC 로부터 단리된 미감작 T 세포와 LS-174T 종양 세포의 동시-배양시, 구축물은 오직 기저 활성을 보였으며 - 그 중에서 가장 활성인 것은 "(scFv)2" 분자였다 (도 41B).
추가의 실험에서, CD3 및 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP) 을 표적화하는 정제된 "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" (SEQ ID NOs 11, 51, 55), "1+1 IgG scFab" (57, 61, 213), 및 "2+1 IgG scFab" (57, 59, 61), 및 상응하는 "(scFv)2" 분자를 세포 상의 그들의 각각의 표적 항원에 대한 2 가지 표적화 부분 둘다의 결합을 통한 구축물의 교차연결 이후 인간 FAP-발현 섬유모세포 GM05389 세포에서 T 세포-매개 세포자멸사를 유도하는 그들의 잠재력에 대해 분석했다. 간략히, 인간 GM05389 표적 세포를 그 전날 트립신으로 수확하고, 세정하고, AIM-V 배지 (Invitrogen #12055-091) 에 재현탁시켰다. 30 000 세포/웰 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션하여 세포를 회수하고 부착하게 허용했다. 다음 날, 세포를 원심분리하고, 상청액을 폐기하고, 신선한 배지, 뿐만 아니라 구축물의 각각의 희석물 또는 기준 IgG 을 명시된 농도로 첨가했다. 모든 구축물 및 대조군을 동일한 몰농도로 조정했다. 인간 pan T 효과기 세포를 첨가하여 5:1 의 최종 E:T 비율을 얻었다. 인간 pan T 세포의 활성화에 대한 양성 대조군으로서, 5 ㎍/㎖ PHA-M (Sigma #L8902) 을 사용했다. 정규화를 위해, 표적 세포의 최대 용해 (= 100%)을 표적 세포와 최종 농도의 1% Triton X-100 와의 인큐베이션에 의해 확인했다. 최소 용해 (= 0%) 는 효과기 세포와 함께, 그러나 구축물 또는 항체 없이, 동시-인큐베이션된 표적 세포를 나타낸다. 37℃, 5% CO2 에서 18 h 의 부가적 밤새 인큐베이션 후에, 상청액 내로의 세포자멸사/괴사 표적 세포의 LDH 방출을 LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, #11 644 793 001) 로 제조사의 지침에 따라 측정했다.
도 42 에 나타난 바와 같이, "2+1 IgG scFab" 구축물은 EC50 값의 면에서 "(scFv)2" 분자와 비슷한 세포독성 활성을 보여준다. "1+1 IgG scFab, 한 팔 역방위" 구축물은 이 검정에서 시험된 기타 구축물보다 활성이 더 적다.
또다른 세트의 실험에서, CD3/MCSP "2+1 IgG Crossfab, 연결된 경쇄" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 179 참조) 를 CD3/MCSP "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 와 비교했다. 간략히, 표적 세포 (인간 Colo-38, 인간 MV-3 or WM266-4 흑색종 세포) 를 검정하는 날에 세포 해리 완충액으로 (또는 검정을 시작하기 하루 전에 트립신으로) 수확하고, 세정하고, 적당한 세포 배양물 배지 (2% FCS 및 1% Glutamax 를 포함하는 RPMI1640) 에 재현탁시켰다. 20 000 - 30 000 세포/웰 을 넓적 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석물을 명시된 바와 같이 첨가했다 (3 회 반복). PBMCs 를 효과기 세포로서 첨가하여 10:1 의 최종 효과기-대-표적 세포 (E:T) 비율을 얻었다. 모든 구축물 및 대조군을 동일한 몰농도로 조정했고, 인큐베이션 시간은 22 h 였다. LDH 방출의 탐지 및 정규화를 위에 기재된 바와 같이 수행했다.
도 49 내지 52 는 MV-3 흑색종 세포 (도 49), Colo-38 세포 (도 50 및 51) 또는 WM266-4 세포 (도 52) 를 이용하여 수행한 4 가지 검정의 결과를 나타낸다. 도 49 에 나타난 바와 같이, 연결된 경쇄가 있는 구축물은 표적 세포로서 MV-3 세포를 사용하는 검정에서 연결된 경쇄가 없는 구축물에 비해 효능이 더 적었다. 도 50 및 51 에 나타난 바와 같이, 연결된 경쇄가 있는 구축물은 표적 세포로서 높은 MCSP 발현 Colo-38 세포를 사용하는 검정에서 연결된 경쇄가 없는 구축물에 비해 더욱 강력했다. 마지막으로, 도 52 에 나타난 바와 같이, 높은 MCSP-발현 WM266-4 세포를 표적 세포로서 사용했을 때 2 가지 구축물 사이에 유의한 차이가 존재하지 않았다.
또다른 실험에서, V 영역 (VL/VH, SEQ ID NOs 33, 63, 65, 67 참조) 또는 C 영역 (CL/CH1, SEQ ID NOs 65, 67, 183, 197 참조) 이 교환된 Crossfab 조각에서 2 가지 CEA-표적화 "2+1 IgG Crossfab, 역방위" 구축물을 비교했다. 검정을 위에 기재된 바와 같이 수행했으며, 인간 PBMC 를 효과기 세포로서 및 인간 CEA-발현 표적 세포를 사용했다. 표적 세포 (MKN-45 또는 LS-174T 종양 세포) 를 트립신-EDTA (LuBiosciences #25300-096) 으로 수확하고, 세정하고, 1% Glutamax (LuBiosciences #35050087) 및 2% FCS 를 포함하는 RPMI1640 (Invitrogen #42404042) 에 재현탁시켰다. 30 000 세포/웰 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 이중특이적 구축물을 명시된 농도로 첨가했다. 모든 구축물 및 대조군을 동일한 몰농도로 조정했다. 인간 PBMC 효과기 세포를 첨가하여 10:1 의 최종 E:T 비율을 얻었으며, 인큐베이션 시간은 28 h 였다. EC50 값을 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 계산했다.
도 61 에 나타난 바와 같이, CL/CH1 교환된 구축물은 2 가지 표적 세포주 모두에 대해 VL/VH 교환된 구축물보다 약간 더 양호한 활성을 나타낸다. CL/CH1-교환 구축물 및 VL/VH-교환 구축물 각각에 대해 계산된 EC50 값은 MKN-45 세포에 대해 115 및 243 pM, 및 LS-174T 세포에 대해 673 및 955 pM 이었다.
유사하게, V 영역 (VL/VH, SEQ ID NOs 33, 189, 191, 193 참조) 또는 C 영역 (CL/CH1, SEQ ID NOs 183, 189, 193, 195 참조) 이 교환된 Crossfab 조각에서 2 가지 MCSP-표적화 "2+1 IgG Crossfab" 구축물을 비교했다. 검정을 위에 기재된 바와 같이 수행했으며, 인간 PBMC 를 효과기 세포로서 및 인간 MCSP-발현 표적 세포를 사용했다. 표적 세포 (WM266-4) 를 세포 해리 완충액으로 수확하고 (LuBiosciences #13151014), 세정하고, 1% Glutamax (LuBiosciences #35050087) 및 2% FCS 를 포함하는 RPMI1640 (Invitrogen #42404042) 에 재현탁시켰다. 30 000 세포/웰 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 구축물을 명시된 농도로 첨가했다. 모든 구축물 및 대조군을 동일한 몰농도로 조정했다. 인간 PBMC 효과기 세포를 첨가하여 10:1 의 최종 E:T 비율을 얻었고, 인큐베이션 시간은 26 h 였다. EC50 값을 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 계산했다.
도 62 에 나타난 바와 같이, 2 가지 구축물 모두 비슷한 활성을 나타냈으며, CL/CH1 교환된 구축물은 약간 더 낮은 EC50 값을 갖는다 (VL/VH-교환 구축물의 경우 16.8 pM 에 비해, CL/CH1-교환 구축물의 경우 12.9 pM).
도 63 은 인간 MCSP-발현 MV-3 표적 세포로 수행한 유사한 검정의 결과를 보여준다. 다시, 2 가지 구축물 모두 비슷한 활성을 나타내며, CL/CH1 교환된 구축물은 약간 더 낮은 EC50 값을 갖는다 (VL/VH-교환 구축물의 경우에 대략 82.2 pM 에 비해 CL/CH1-교환 구축물의 경우 대략 11.7 pM). 정확한 EC50 값은 계산될 수 없었으며, 이는 살해 곡선이 화합물의 높은 농도에서 정점지속기 (plateau) 에 도달하지 않았기 때문이다.
추가의 실험에서, CD3/MCSP "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33 참조) 및 "1+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NOs 5, 29, 33, 181 참조) 구축물을 CD3/MCSP "1+1 CrossMab" (SEQ ID NOs 5, 23, 183, 185 참조) 과 비교했다. 검정을 위에 기재된 바와 같이 수행했으며, 인간 PBMC 를 효과기 세포로서 및 WM266-4 또는 MV-3 표적 세포 (E:T 비율 = 10:1) 및 21 h 의 인큐베이션 시간을 사용했다.
도 64 에 나타난 바와 같이, "2+1 IgG Crossfab" 구축물은 이 검정에서 가장 강력한 분자이며, 그에 뒤이어 "1+1 IgG Crossfab" 및 "1+1 CrossMab" 이다. 이러한 순위는 높은 MCSP 발현 WM266-4 세포에 비해 중간 수준의 MCSP 를 발현하는 MV-3 세포에서 더욱더 현저하다. "2+1 IgG Crossfab", "1+1 IgG Crossfab" 및 "1+1 CrossMab" 각각에 대해 MV-3 세포에 대해 계산된 EC50 값은 9.2, 40.9 및 88.4 pM 였고, WM266-4 세포에 대해 계산된 EC50 값은 33.1, 28.4 및 53.9 pM 였다.
추가의 실험에서, 상이한 농도의 "1+1 IgG Crossfab LC 융합물" 구축물 (SEQ ID NOs 183, 209, 211, 213) 을 MKN-45 또는 LS-174T 종양 표적 세포 및 인간 PBMC 효과기 세포를 사용하여 10:1 의 E:T 비율 및 28 시간의 인큐베이션 시간으로 시험했다. 도 65 에 나타난 바와 같이, "1+1 IgG Crossfab LC 융합물" 구축물은 MKN-45 표적 세포에서 세포자멸사를 유도했으며, 계산된 EC50 은 213 pM 이지만, LS-174T 세포에서 계산된 EC50 은 1.56 nM 이며, 이는 일정한 기간 내의 이중특이적 구축물의 효능에 대한 상이한 종양 항원 발현 수준의 영향을 보여준다.
또다른 실험에서, "1+1 IgG Crossfab LC 융합물" 구축물 (SEQ ID NOs 183, 209, 211, 213) 을 표적화되지 않은 "2+1 IgG Crossfab" 분자와 비교했다. MC38-huCEA 종양 세포 및 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 및 24 시간의 인큐베이션 시간을 사용했다. 도 66 에 나타난 바와 같이, "1+1 IgG Crossfab LC 융합물" 구축물은 표적 세포의 세포자멸사를 농도-의존적 방식으로 유도했으며, 계산된 EC50 값은 대략 3.2 nM 이다. 그와 대조적으로, 표적화되지 않은 "2+1 IgG Crossfab" 은 오직 최고 농도에서만 표적 세포의 항원-독립적 T 세포-매개 살해를 나타냈다.
최종 실험에서, "2+1 IgG Crossfab (V9)" (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33), "2+1 IgG Crossfab, 역방위 (V9)" (SEQ ID NOs 5, 23, 183, 187), "2+1 IgG Crossfab (항-CD3)" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 217), "2+1 IgG Crossfab, 역방위 (항-CD3)" (SEQ ID NOs 5, 23, 215, 219) 를 비교했으며, 인간 MCSP-양성 MV-3 또는 WM266-4 종양 세포 및 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1), 및 약 24 시간의 인큐베이션 시간을 사용하여. 도 67 에 나타난 바와 같이, "2+1 IgG Crossfab, 역방위" 구축물의 T 세포-매개 살해는 CD3 결합체 둘다에 대해 "2+1 IgG Crossfabt" 구축물에 의해 유도되는 것보다 약간 더 강하거나 적어도 그와 동일한 것으로 보인다. 계산된 EC50 값은 다음과 같았다:
Figure pct00007
실시예 7
CD107a/b 검정
둘다 인간 MCSP 및 인간 CD3 을 표적화하는, 정제된 "2+1 IgG scFab" 구축물 (SEQ ID NOs 5, 17, 19) 및 "(scFv)2" 분자를 유동 세포분석법에 의해 인간 MCSP-발현 종양 세포의 존재 또는 부재 하에 CD107a 및 세포내 퍼포린 수준을 상향조절하는 그들의 잠재력에 대해 시험했다.
간략히, 제 1 일에, 30 000 Colo-38 종양 표적 세포/웰 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2 에서 밤새 인큐베이션하여 그들이 부착하게 했다. 일차 인간 pan T 세포를 제 1 일 또는 제 2 일에 기재된 바와 같이 버피 코트로부터 단리했다.
제 2 일에, 15 만 효과기 세포/웰 첨가하여 5:1 의 최종 E:T 비율을 얻었다. FITC-접합된 CD107a/b 항체, 뿐만 아니라 상이한 이중특이적 구축물 및 대조군을 첨가한다. 상이한 이중특이적 분자 및 항체를 동일한 몰농도로 조정하여 9.43 nM 의 최종 농도를 얻었다. 37℃, 5% CO2 에서 1 h 인큐베이션 단계 후에, 모넨신을 첨가하여 분비를 저해할 뿐만 아니라 엔도솜 및 라이소솜 내의 pH 를 중화시켰다. 5 h 의 부가적 인큐베이션 시간 후에, 세포를 4℃ 에서 30 분 동안 표면 CD8 발현에 대해 염색했다. 세포를 염색 완충액 (PBS / 0.1% BSA) 으로 세정하고, 고정시키고, 20 분 동안 BD Golgi Stop 이 있는 BD Cytofix/Cytoperm Plus Kit (BD Biosciences #554715) 를 사용하여 투과성화시켰다. 세포를 1 x BD Perm/Wash 완충액을 사용하여 2 회 세정하고, 퍼포린에 대한 세포내 염색을 4℃ 에서 30 분 동안 수행했다. 1 x BD Perm/Wash 완충액을 사용하는 최종 세정 단계 후에, 세포를 PBS / 0.1% BSA 에 재현탁시키고, FACS CantoII 에서 분석했다 (모든 항체를 BD Biosciences 또는 BioLegend 로부터 구입함).
게이트를 명시된 바와 같이 전부 CD107a/b 양성, 퍼포린-양성 또는 이중-양성 세포로 설정했다 (도 43). "2+1 IgG scFab" 구축물은 표적 세포의 존재 하에서만 T 세포를 활성화시키고 CD107a/b 및 세포내 퍼포린 수준을 상향조절할 수 있었지만 (도 43A), "(scFv)2" 분자는 표적 세포의 부재 하에서도 T 세포의 활성화의 (약한) 유도를 나타낸다 (도 43B). 2 가 기준 항-CD3 IgG 는 "(scFv)2" 분자 또는 기타 이중특이적 구축물에 비해 더 낮은 수준의 활성화를 초래한다.
실시예 8
증식 검정
둘다 인간 CD3 및 인간 MCSP 를 표적화하는, 정제된 "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NOs 5, 17, 19) 및 "(scFv)2" 분자를 유동 세포분석법에 의해 인간 MCSP-발현 종양 세포의 존재 및 부재 하에 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 증식을 유도하는 그들의 잠재력에 대해 시험했다.
간략히, 갓 단리된 인간 pan T 세포를 따뜻한 PBS 중 1 백만 세포/㎖ 로 조정하고, 1 μM CFSE 로 실온에서 10 분 동안 염색했다. 염색 부피를 10% FCS 및 1% GlutaMax 를 함유하는 RPMI1640 배지의 첨가에 의해 2 배로 만들었다. 실온에서 추가 20 분 동안 인큐베이션 후에, 세포를 미리-데운 배지로 3 회 세정하여 남은 CFSE 를 제거했다. MCSP-양성 Colo-38 세포를 세포 해리 완충액으로 수확하고, 계수하고, 생활력에 대해 체크했다. 세포를 AIM-V 배지 중 0.2 x 106 (생활력 있는) 세포/㎖ 로 조정하고, 둥근 바닥 96-웰 플레이트 (명시된 바와 같음) 내로 100 ㎕/웰 의 이러한 세포 현탁액을 피펫팅했다. 50 ㎕ 의 (희석된) 이중특이적 구축물을 세포-함유 웰에 첨가하여 1 nM 의 최종 농도를 얻었다. CFSE-염색된 인간 pan T 효과기 세포를 AIM-V 배지 중 2 x 106 (생활력 있는) 세포/㎖ 로 조정했다. 50 ㎕ 의 이러한 세포 현탁액을 검정 플레이트 (상기 참조) 의 웰마다 첨가하여 5:1 의 최종 E:T 비율을 얻었다. 이중특이적 구축물이 종양 항원 huMCSP 를 발현하는 표적 세포의 존재 하에서만 T 세포를 활성화시킬 수 있는지 여부를 분석하기 위해, 1 nM 의 각각의 이중특이적 분자 뿐만 아니라 PBMC 를 함유하나, 표적 세포를 함유하지 않는 웰을 포함시켰다. 37℃, 5% CO2 에서 5 일 동안 인큐베이션 후에, 세포를 원심분리하고 (5 분, 350 x g), 0.1% BSA 를 포함하는 150 ㎕/웰 PBS 로 2 회 세정했다. CD8 (마우스 IgG1,κ; 클론 HIT8a; BD #555635), CD4 (마우스 IgG1,κ; 클론 RPA-T4 ; BD #560649), 또는 CD25 (마우스 IgG1,κ; 클론 M-A251; BD #555434) 에 대한 표면 염색을 4℃ 에서 30 분 동안, 공급사의 제안에 따라 수행했다. 세포를 150 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 로 2 회 세정하고, 200 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 에 재현탁시키고, FACS CantoII 기계 (Software FACS Diva) 를 사용하여 분석했다. 게이트를 비-증식성 세포 주위에 설정하고 기준로서 전체 측정된 세포 수에 상대적인 이러한 게이트의 세포 수를 사용하여 상대 증식 수준을 확인했다.
도 44 는 모든 구축물이 표적 세포의 존재 하에서만 "(scFv)2" 분자와 비슷하게 CD8+ T 세포 (A) 또는 CD4+ T 세포 (B) 의 증식을 유도하는 것을 보여준다. 일반적으로, 이 검정에서 활성화된 CD8+ T 세포는 활성화된 CD4+ T 세포보다 더 많이 증식한다.
실시예 9
사이토카인 방출 검정
둘다 인간 MCSP 및 인간 CD3 을 표적화하는, 정제된 "2+1 IgG scFab" 구축물 (SEQ ID NOs 5, 17, 19) 및 "(scFv)2" 분자를 종양 표적 세포의 존재 또는 부재 하에 사이토카인의 T 세포-매개 데 노보 (de novo) 분비를 유도하는 그들의 능력에 대해 분석했다.
간략히, 인간 PBMC 를 버피 코트로부터 단리하고, 둥근 바닥 96-웰 플레이트 내로 웰마다 삼십만 개의 세포를 플레이팅했다. 인간 MCSP 를 발현하는 Colo-38 종양 표적 세포를 첨가하여 10:1 의 최종 E:T-비율을 얻었다. 이중특이적 구축물 및 IgG 대조군을 1 nM 최종 농도로 첨가하고, 세포를 37℃, 5% CO2 에서 24 h 동안 인큐베이션했다. 다음 날, 세포를 5 분 동안 350 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 후속적 분석을 위해 새로운 딥-웰 96-웰-플레이트 내로 옮겼다. CBA 분석을 Human Th1/Th2 Cytokine Kit II (BD #551809) 를 사용하여 FACS CantoII 에 대한 제조사의 지침에 따라 수행했다.
도 45 는 상청액에서 측정된 상이한 사이토카인의 수준을 보여준다. 표적 세포의 존재 하에 T 세포 활성화시 분비되는 주된 사이토카인은 IFN-γ 이다. "(scFv)2" 분자는 "2+1 IgG scFab" 구축물보다 약간 더 높은 수준의 IFN-γ 를 유도한다. 동일한 경향이 인간 TNF 에 대해 발견될 것이나, 이러한 사이토카인의 전체 수준은 IFN-γ 에 비해 훨씬 더 낮았다. 표적 세포의 존재 (또는 부재) 하에 T 세포의 활성화시 Th2 사이토카인 (IL-10 및 IL-4) 의 유의한 분비가 존재하지 않았다. Colo-38 표적 세포의 부재 하에, TNF 분비의 오직 매우 약한 유도가 관찰되었으며, 이는 "(scFv)2" 분자로 처리된 샘플에서 최고였다.
두번째 실험에서, 인간 MCSP 및 인간 CD3 을 표적화하는 하기 정제된 이중특이적 구축물을 분석했다: "2+1 IgG Crossfab" 구축물 (SEQ ID NOs 3, 5, 29, 33), "(scFv)2" 분자, 뿐만 아니라 야생형 또는 돌연변이된 (LALA, P329G 및/또는 N297D, 명시된 바와 같음) Fc 도메인을 포함하는 상이한 "2+1 IgG scFab" 분자. 간략히, 건강한 공여자로부터의 280 ㎕ 전혈을 딥-웰 96-웰 플레이트의 웰마다 플레이팅했다. 인간 MCSP 를 발현하는, 30 000 Colo-38 종양 표적 세포, 뿐만 아니라 상이한 이중특이적 구축물 및 IgG 대조군을 1 nM 최종 농도로 첨가했다. 세포를 24 h 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션하고, 그 후 5 분 동안 350 x g 에서 원심분리했다. 상청액을 후속적 분석을 위해 새로운 딥-웰 96-웰-플레이트 내로 옮겼다. CBA 분석을 FACS CantoII 에 대한 제조사의 지침에 따라, 하기 CBA Flex Sets 의 조합을 사용하여 수행했다: 인간 그란자임 B (BD #560304), 인간 IFN-γ Flex Set (BD #558269), 인간 TNF Flex Set (BD #558273), 인간 IL-10 Flex Set (BD #558274), 인간 IL-6 Flex Set (BD #558276), 인간 IL-4 Flex Set (BD #558272), 인간 IL-2 Flex Set (BD #558270).
도 46 은 상청액에서 측정된 상이한 사이토카인의 수준을 보여준다. Colo-38 종양 세포의 존재하에 분비된 주된 사이토카인은 IL-6 이었으며, 그에 뒤이어 IFN-γ 였다. 게다가, 표적 세포의 존재 하에 T 세포의 활성화시 그란자임 B 의 수준이 또한 강하게 증가했다. 일반적으로, "(scFv)2" 분자는 표적 세포의 존재 하에 더 높은 수준의 사이토카인 분비를 유도했다 (도 46, A 및 B). 표적 세포의 존재 (또는 부재) 하에 T 세포의 활성화시 Th2 사이토카인 (IL-10 및 IL-4) 의 유의한 분비가 존재하지 않았다.
이러한 검정에서, 표적 세포의 분재 하에서도, 상이한 "2+1 IgG scFab" 구축물에 의해 유도되는 IFN-γ 의 약한 분비가 존재했다 (도 46, C 및 D). 이들 조건 하에, 야생형 또는 돌연변이된 Fc 도메인을 갖는 "2+1 IgG scFab" 구축물 사이에 유의한 차이가 관찰될 수 없었다.
실시예 10
항-MCSP 항체 M4-3 / ML2 의 친화도 성숙
올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이유발 절차를 통해 친화도 성숙을 수행했다. 이러한 절차를 위해 Hoogenboom, (Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-4137) 에 의해 기재된 바와 유사하게 중쇄 변이체 M4-3, 및 경쇄 변이체 ML2 를 파지미드 벡터 내로 클로닝했다. 첫째로 고전적 상동성 모델링을 통해 항체의 3D 모델을 생성하고 그 후 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDRs) 의 용매 접근가능한 잔기를 확인함으로써, 무작위화될 잔기를 식별했다. 표 4 에 제시된 바와 같은 트리뉴클레오티드 합성에 기초하는 무작위화에 의한 올리고뉴클레오티드를 Ella-biotech (Munich, Germany) 으로부터 구입했다. 3 개의 독립적 서브라이브러리를 고전적 PCR 을 통해 생성했고, CDR-H1 과 함께 CDR-H2, 또는 CDR-L1 과 함께 CDR-L2 에서의 무작위화로 구성되었고, CDR-L3 은 별개의 접근으로 무작위화했다. 이들 라이브러리의 DNA 조각을 제한 소화 및 결찰을 통해 파지미드 내로 클로닝하고, 후속적으로 TG1 박테리아 내로 전기천공시켰다.
라이브러리 선별
이와 같이 생성된 항체 변이체를 사상 파지 입자로부터 각각의 입자 내에 포장된 M13 의 유전자 III 산물에 대한 융합물로서 1 가 방식으로 표시했다. 파지-표시된 변이체를 그 후 그들의 생물학적 활성 (여기에서: 결합 친화도) 에 대해 스크리닝하고, 하나 이상의 개선된 활성을 갖는 후보를 추가 개발에 사용했다. 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 방법을 Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093) 에서 찾을 수 있다.
모든 친화도 성숙 라이브러리를 사용하는 선별을 하기 절차에 따라 용액 중에서 수행했다: 1. 1㎖ 의 총 부피에서 0.5 h 동안 100 nM 비오티닐화된 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his (SEQ ID NO. 390) 에 대한 각각의 친화도 성숙 라이브러리의~ 1012 파지미드 입자의 결합, 2. 10 분 동안 5.4 × 107 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드의 첨가에 의한 비오티닐화된 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his 및 특이적으로 결합된 파지 입자의 포획, 3. 5-10x 1㎖ PBS/Tween20 및 5-10x 1㎖ PBS 를 사용하는 비드의 세정, 4. 10 분 동안 1㎖ 100mM TEA (트리에틸아민) 의 첨가에 의한 파지 입자의 용리 및 500ul 1M Tris/HCl pH 7.4 의 첨가에 의한 중화, 5. 지수 성장하는 대장균 TG1 박테리아의 재-감염, 헬퍼 파지 VCSM13 에 의한 감염 및 그 후 후속적 선별 라운드 (rounds) 에서 사용될 파지미드 입자의 PEG/NaCl 침전. 선별을 일정한 또는 감소하는 (10-7M 에서부터 2x10-9M 로) 항원 농도를 사용하여 3-5 라운드에 걸쳐 수행했다. 라운드 2 에서, 항원: 파지 복합체의 포획을 스트렙타비딘 비드 대신 뉴트라비딘 플레이트를 사용하여 수행했다. 특이적 결합체를 ELISA 에 의해 다음과 같이 확인했다: 100 ul/웰 의 10nM 비오티닐화된 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his 을 뉴트라비딘 플레이트 위에 코팅했다. Fab-함유 박테리아 상청액을 첨가하고, 결합하는 Fab 를 항-Flag/HRP 2 차 항체를 사용하여 그들의 Flag-태그를 통해 탐지했다. ELISA-양성 클론을 가용성 Fab 조각으로서 96-웰 포맷으로 박테리아 발현시키고, 상청액을 ProteOn XPR36 (BioRad) 을 사용하는 SPR-분석에 의한 동역학적 스크리닝 실험에 적용했다. 최고 친화도 상수를 갖는 Fab 를 발현하는 클론을 확인하고, 상응하는 파지미드를 서열분석했다.
표 4 (배제되는 것은 항상 Cys, 및 Met 였다. 올리고뉴클레오티드가 역방향 프라이머였던 경우에 Lys 가 상부에서 배제되었다)
Figure pct00008
도 84 는 비-성숙된 부모 클론 (M4-3 ML2) 과 비교되는 친화도 성숙된 항-MCSP 클론의 정렬을 보여준다. 중쇄 무작위화를 오직 CDR1 및 2 에서만 수행했다. 경쇄 무작위화를 CDR1 및 2 에서, 그리고 독립적으로 CDR3 에서 수행했다.
선별 동안, 골격에서 몇몇 돌연변이가 발생했으며, 예컨대 클론 G3 에서 F71Y 또는 클론 E10 에서 Y87H 이다.
인간 IgG1 의 생산 및 정제
친화도 성숙된 변이체의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 각각의 수용자 포유류 발현 벡터 내에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 프레임에 맞춰 (in frame) 서브클로닝했다. 항체 발현은 MPSV 프로모터로 추진되었고, 합성 polyA 신호 서열을 CDS 의 3' 말단에서 보유한다. 또한 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유했다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유류 발현 벡터로 동시-트랜스펙션시킴으로써 분자들을 생산했다. 세포를 1:1 비율의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다. 트랜스펙션을 위해 HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 무혈청 현탁액으로 배양했다. 500 ㎖ 쉐이크 플라스크 내에서의 생산을 위해 4 억 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 전에 시딩했다. 트랜스펙션을 위해 세포를 5 분 동안 210 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 미리-데운 20 ㎖ CD CHO 배지로 교체했다. 발현 벡터를 20 ㎖ CD CHO 배지에서 최종량 200 ㎍ DNA 까지 혼합했다. 540 ㎕ PEI 의 첨가 후에 용액을 15 초 동안 볼텍싱 (vortex) 하고, 후속적으로 10 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 뒤에 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ㎖ 쉐이크 플라스크로 옮기고, 5 % CO2 분위기의 인큐베이터 내에서 37 ℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 시간 후에 160 ㎖ F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양했다. 트랜스펙션 다음날 1 mM 발프로산 및 7 % Feed 1 을 첨가했다. 7 일 배양 후에 상청액을 수집하여 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 정제하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 0.01 % w/v 의 최종 농도로 첨가하고, 4℃ 에서 유지했다.
분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 친화도 크로마토그래피에 의해 Protein A 를 사용하여 정제했다. 상청액을 40 ㎖ 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 평형화시킨 HiTrap Protein A HP 칼럼 (CV=5 mL, GE Healthcare) 에 로딩했다. 미결합 단백질을 10 칼럼 부피 이상의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 세정하여 제거했다. 표적 단백질이 20 칼럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 내지 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 2.5 에 걸친 기울기 동안 용리되었다. 단백질 용액을 1/10 의 0.5 M 나트륨 포스페이트, pH 8 를 첨가함으로써 중화시켰다. 표적 단백질을 농축시키고, 여과하고, 그 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액 pH 6.0 으로 평형화시킨 HiLoad Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare) 에 로딩했다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 확인했다. 분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재 하에 CE-SDS 분석에 의해 분석했다. Caliper LabChip GXII 시스템 (Caliper lifescience) 을 제조사의 지침에 따라 사용했다. 2ug 샘플을 분석에 사용한다. 항체 샘플의 응집물 함량을 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기-배제 칼럼 (Tosoh) 을 사용하여 25℃ 에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7 전개 완충액에서 분석한다.
표 5: 친화도 성숙된 항-MCSP IgG 의 생산 및 정제
Figure pct00009
친화도 확인
ProteOn 분석
표면 플라스몬 공명에 의해 ProteOn XPR36 기계 (BioRad) 를 사용하여 25℃ 에서 항-인간 F(ab')2 조각 특이적 포획 항체 (Jackson ImmunoResearch # 109-005-006) 를 아민 커플링에 의해 CM5 칩에 부동화시키고, 후속적으로 박테리아 상청액 또는 정제된 Fab 제제로부터 Fab 를 포획함으로써 KD 를 측정했다. 간략히, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, GE Healthcare) 을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 를 사용하여 공급사의 지침에 따라 활성화시킨다. 항-인간 F(ab')2 조각 특이적 포획 항체를 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0 를 사용하여 50 ㎍/㎖ 로 희석시킨 후, 10 ㎕/분 의 유속으로 주입하여 커플링된 포획 항체의 약 10.000 이하의 응답 단위 (RU) 를 달성한다. 포획 항체의 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입해 미반응 기들을 차단한다. 동역학적 측정을 위해, 박테리아 상청액으로부터의 Fab 또는 정제된 Fab 를 10ul/분 의 유속으로 300 초 동안 주입하고, 포획 기준선 안정화를 위해 300 초 동안 해리시킨다. 포획 수준은 100 - 500 RU 범위였다. 후속적 단계에서, 인간 MCSP(D3 도메인)-avi-his 분석물을 50 ㎕/분 의 유속으로 25℃ 에서 HBS-EP+ (GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Surfactant P20, pH 7.4) 내로 희석된 단일 농도로서 또는 농도 시리즈 (100nM 내지 250pM 범위의 클론 친화도에 따라) 로서 주입한다. 센서칩의 표면을 90ul/분 에서 30 초 동안 글라이신 pH 1.5 의 주입, 그에 뒤이어 동일한 유속에서 20 초 동안 NaOH 의 주입에 의해 재생시켰다. 연합 및 해리 센서그램의 동시 핏팅에 의해 단순 원-투-원 (one-to-one) Langmuir 결합 모델 (ProteOn XPR36 Evaluation Software 또는 Scrubber 소프트웨어 (BioLogic)) 을 사용하여 연합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff) 를 계산했다. 평형 해리 상수 (KD) 를 비율 koff/kon 로서 계산했다. 이러한 데이타를 사용하여 친화도 성숙된 변이체와 부모 항체의 비교 결합 친화도를 확인했다. 표 6a 는 이들 검정으로부터 생성된 데이타를 나타낸다.
인간 IgG1 포맷으로 변환하기 위해 경쇄에 대해 G3, E10, C5, 중쇄에 대해 D6, A7, B7, B8, C1 을 선택했다. 경쇄의 CDR1 및 2 를 CDR3 와 독립적으로 무작위화시켰으므로, 수득된 CDR 은 IgG 변환 동안 조합되었다.
IgG 포맷에서 다시 인간 MCSP 항원 (SEQ ID NO. 390) 에 대한 친화도, 게다가 또한 사이노몰구스 상동체 (SEQ ID NO. 389) 에 대한 친화도를 측정했다. 정확히 Fab 조각에 대해 기재된 방법, 포유류 생산으로부터 방금 정제된 IgG 를 사용했다.
표 6a : MCSP 친화도 성숙된 클론: Proteon 데이타
Figure pct00010
Biacore T200 를 사용하는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의한 친화도 확인
친화도 성숙된 IgG 의 친화도 및 결합력을 확인하는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 실험을 Biacore T200 에서 25 ℃ 에서 전개 완충액으로서 HBS-EP (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20, Biacore, Freiburg/Germany) 를 사용하여 수행했다.
인간 및 사이노몰구스 MCSP 에 대한 상이한 항MCSP IgG 의 상호작용의 결합력을 분석하기 위해 항-Penta His 항체 (Qiagen) 의 대략 9,500 공명 단위 (RU) 의 D3 직접 커플링을 CM5 칩에서 pH 5.0 에서 표준 아민 커플링 키트 (Biacore, Freiurg/Germany) 를 사용하여 수행했다. 항원이 각각 60 초 동안 30 nM 에서 10 ㎕/분 으로 포획되었다. IgG 를 0.0064 - 100 nM 의 농도로 30 ㎕/분 의 유속으로 플로우 셀을 통하여 280 초에 걸쳐 통과시켰다. 해리를 180 초 동안 모니터링했다. 기준 플로우 셀에서 수득된 응답을 뺄샘하여 벌크 굴절률 차이를 보정했다. 여기에서, 인간 MCSP D3 또는 사이노몰구스 MCSP D3 대신에 HBS-EP 를 주입한 부동화된 항-Penta His 항체가 있는 표면 위에 IgG 를 유동시켰다.
친화도 측정을 위해 부동화된 항 인간 Fc 가 있는 CM5 센서칩 표면 위에 IgG 를 포획시켰다. 표준 아민 커플링 키트 (Biacore, Freiburg/Germany) 를 사용하여 pH 5.0 에서 대략 9,500 공명 단위 (RU) 의 직접 부동화에 의해 포획 IgG 를 센서칩 표면에 커플링시켰다. IgG 를 25 초 동안 10 nM 에서 30 ㎕/분 으로 포획했다. 인간 및 사이노몰구스 MCSP D3 를 2 - 500 nM 의 농도로 30 ㎕/분 의 유속으로 플로우 셀을 통하여 120 초에 걸쳐 통과시켰다. 해리를 60 초 동안 모니터링했다. 농도 166 및 500 nM 에 대한 연합 및 해리를 각각 1200 및 600 초 동안 모니터링했다. 기준 플로우 셀에서 수득된 응답을 뺄샘하여 벌크 굴절률 차이를 보정했다. 여기에서, 항 MCSP IgG 대신에 HBS-EP 를 주입한 부동화된 항-인간 Fc 항체가 있는 표면 위에 항원을 유동시켰다.
동역학 상수를 Biacore T200 Evaluation Software (vAA, Biacore AB, Uppsala/Sweden) 를 사용하여 유도하여, 1:1 Langmuir 결합에 대한 반응속도식을 수치 적분법에 의해 핏팅했다.
Biacore T200 를 사용하여 표면 플라스몬 공명 측정에 의해 인간 및 사이노몰구스 MCSP D3 에 대한 더 높은 친화도가 확인되었다. 또한 결합력 측정은 2 가 결합에서의 3 배 이하의 증가를 보여줬다 (표 6b).
표 6b. 인간 MCSP-D3 및 사이노몰구스 MCSP D3 에 대한 항 MCSP IgG 의 친화도 및 결합력.
Figure pct00011
실시예 11
항 MCSP 항체로서 M4-3(C1) ML2(G3) 및 항 CD3 항체로서 인간화 CH2527 을 함유하는 MCSP TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위) 의 제조
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 결과적인 가변 영역을 각각의 수용자 포유류 발현 벡터 내에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 프레임에 맞춰 서브클로닝했다. 항체 발현은 MPSV 프로모터로 추진되었고, 합성 polyA 신호 서열을 CDS 의 3' 말단에서 보유한다. 또한 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유류 발현 벡터로 동시-트랜스펙션시킴으로써 분자들을 생산했다. 세포를 1:2:1:1 비율 ("벡터 중쇄 Fc(홀)" : "벡터 경쇄" : "벡터 경쇄 Crossfab" : "벡터 중쇄 Fc(놉)-FabCrossfab") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다.
트랜스펙션을 위해 HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 무혈청 현탁액으로 배양했다. 500 ㎖ 쉐이크 플라스크 내에서의 생산을 위해 4 억 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 전에 시딩했다. 트랜스펙션을 위해 세포를 5 분 동안 210 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 미리-데운 20 ㎖ CD CHO 배지로 교체했다. 발현 벡터를 20 ㎖ CD CHO 배지에서 최종량 200 ㎍ DNA 까지 혼합했다. 540 ㎕ PEI 의 첨가 후에 용액을 15 초 동안 볼텍싱하고, 후속적으로 10 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 뒤에 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ㎖ 쉐이크 플라스크로 옮기고, 5 % CO2 분위기의 인큐베이터 내에서 37 ℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 시간 후에 160 ㎖ F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양했다. 트랜스펙션 다음날 1 mM 발프로산 및 7 % Feed 1 을 첨가했다. 7 일 배양 후에 상청액을 수집하여 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 정제하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 0.01 % w/v 의 최종 농도로 첨가하고, 4℃ 에서 유지했다.
분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 친화도 크로마토그래피에 의해 Protein A 를 사용하여 정제했다. 상청액을 40 ㎖ 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 평형화시킨 HiTrap Protein A HP 칼럼 (CV=5 mL, GE Healthcare) 에 로딩했다. 미결합 단백질을 10 칼럼 부피 이상의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 세정하여 제거했다. 표적 단백질이 20 칼럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 내지 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 2.5 에 걸친 기울기 동안 용리되었다. 단백질 용액을 1/10 의 0.5 M 나트륨 포스페이트, pH 8 를 첨가함으로써 중화시켰다. 표적 단백질을 농축시키고, 여과하고, 그 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액 pH 6.0 으로 평형화시킨 HiLoad Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare) 에 로딩했다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 확인했다.
분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재 하에 CE-SDS 분석에 의해 분석했다. Caliper LabChip GXII 시스템 (Caliper lifescience) 을 제조사의 지침에 따라 사용했다. 2ug 샘플을 분석에 사용했다.
항체 샘플의 응집물 함량을 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기-배제 칼럼 (Tosoh) 을 사용하여 25℃ 에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7 전개 완충액에서 분석했다.
표 7a: MCSP TCB 의 요약 생산 및 정제
Figure pct00012
도 68 은 MCSP TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위) 분자의 도해를 보여준다.
도 69 및 표 7b 는 MCSP TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위) 분자 (SEQ ID NOs: 278, 319, 320 및 321) 의 CE-SDS 분석을 보여준다.
표 7b: MCSP TCB 의 CE-SDS 분석
Figure pct00013
도 70 은 MCSP TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위) 분자 (SEQ ID NOs: 78, 319, 320 및 321) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피를 보여준다.
실시예 12
항 CEA 항체로서 CH1A1A 98/99 2F1 및 항 CD3 항체로서 인간화 CH2527 을 함유하는 CEA TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위) 의 제조
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 결과적인 가변 영역을 각각의 수용자 포유류 발현 벡터 내에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 프레임에 맞춰 서브클로닝했다. 항체 발현은 MPSV 프로모터로 추진되었고, 합성 polyA 신호 서열을 CDS 의 3' 말단에서 보유한다. 또한 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유류 발현 벡터로 동시-트랜스펙션시킴으로써 분자들을 생산했다. 세포를 1:2:1:1 비율 ("벡터 중쇄 Fc(홀)" : "벡터 경쇄" : "벡터 경쇄 Crossfab" : "벡터 중쇄 Fc(놉)-FabCrossfab") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다.
트랜스펙션을 위해 HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 무혈청 현탁액으로 배양했다. 500 ㎖ 쉐이크 플라스크 내에서의 생산을 위해 4 억 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 전에 시딩했다. 트랜스펙션을 위해 세포를 5 분 동안 210 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 미리-데운 20 ㎖ CD CHO 배지로 교체했다. 발현 벡터를 20 ㎖ CD CHO 배지에서 최종량 200 ㎍ DNA 까지 혼합했다. 540 ㎕ PEI 의 첨가 후에 용액을 15 초 동안 볼텍싱하고, 후속적으로 10 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 뒤에 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ㎖ 쉐이크 플라스크로 옮기고, 5 % CO2 분위기의 인큐베이터 내에서 37 ℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 시간 후에 160 ㎖ F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양했다. 트랜스펙션 다음날 1 mM 발프로산 및 7 % Feed 1 을 첨가했다. 7 일 배양 후에 상청액을 수집하여 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 정제하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 0.01 % w/v 의 최종 농도로 첨가하고, 4℃ 에서 유지했다.
분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 친화도 크로마토그래피에 의해 Protein A 를 사용하여 정제했다. 상청액을 40 ㎖ 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 평형화시킨 HiTrap Protein A HP 칼럼 (CV=5 mL, GE Healthcare) 에 로딩했다. 미결합 단백질을 10 칼럼 부피 이상의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 세정하여 제거했다. 표적 단백질이 20 칼럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 내지 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 2.5 에 걸친 기울기 동안 용리되었다. 단백질 용액을 1/10 의 0.5 M 나트륨 포스페이트, pH 8 를 첨가함으로써 중화시켰다. 표적 단백질을 농축시키고, 여과하고, 그 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액 pH 6.0 으로 평형화시킨 HiLoad Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare) 에 로딩했다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 확인했다.
분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재 하에 CE-SDS 분석에 의해 분석했다. Caliper LabChip GXII 시스템 (Caliper lifescience) 을 제조사의 지침에 따라 사용했다. 2ug 샘플을 분석에 사용했다.
항체 샘플의 응집물 함량을 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기-배제 칼럼 (Tosoh) 을 사용하여 25℃ 에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7 전개 완충액에서 분석했다.
표 8: CEA TCB 의 요약 생산 및 정제
Figure pct00014
도 71 은 CEA TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위) 분자의 도해를 보여준다.
도 72 및 표 9 는 CEA TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위) 분자 (SEQ ID NOs: 288, 322, 323 및 324) 의 CE-SDS 분석을 보여준다.
표 9: CEA TCB 의 CE-SDS 분석
Figure pct00015
도 73 은 CEA TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위) 분자 (SEQ ID NOs: 288, 322, 323 및 324) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피를 보여준다.
실시예 13
MCSP- 및 CD3-발현 세포에 대한 GA903 TCB 의 결합
GA903 TCB 의 결합을 MCSP-발현 인간 악성 흑색종 세포주 (A375) 및 CD3-발현 불멸화된 T 백혈구 라인 (주르카트) 에 대해 시험했다. 간략히, 세포를 수확하고, 계수하고, 생활력에 대해 체크하고, FACS 완충액 (100 ㎕ PBS 0.1% BSA) 에 2x106 세포/㎖ 로 재현탁시켰다. 100 ㎕ 의 세포 현탁액 (0.2x106 세포를 함유) 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트 내에서 30 분 동안 4℃ 에서 증가하는 농도의 MCSP TCB (2.6 pM - 200 nM) 와 함께 인큐베이션하고, 차가운 PBS 0.1% BSA 로 2 회 세정하고, 추가 30 분 동안 4℃ 에서 PE-접합된 AffiniPure F(ab')2 Fragment 염소 항-인간 IgG Fcg Fragment Specific 2 차 항체 (Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170) 와 함께 재인큐베이션하고, 차가운 PBS 0.1% BSA 로 2 회 세정하고, 즉시 FACS 에 의해 FACS CantoII (Software FACS Diva) 를 사용하여 살아 있는, DAPI-음성, 세포를 게이팅함으로써 분석했다. 결합 곡선을 GraphPadPrism5 를 사용하여 수득했다 (도 74 A, A375 세포에 대한 결합, EC50 = 3381 pM; 도 74 B, 주르카트 세포에 대한 결합).
실시예 14
MCSP TCB 항체에 의해 유도되는 T-세포 살해
상이한 수준의 MCSP (A375 = MCSP 높음, MV-3 = MSCP 중간, HCT-116 = MCSP 낮음, LS180 = MCSP 음성) 를 발현하는 종양 세포주의 패널을 사용하여 평가되는 MCSP TCB 항체에 의해 매개되는 T-세포 살해. 간략히, 표적 세포를 트립신/EDTA 로 수확하고, 세정하고, 넓적 바닥 96-웰 플레이트를 사용하여 25 000 세포/웰 의 밀도로 플레이팅했다. 세포를 밤새 부착되게 했다. 건강한 인간 공여자로부터 수득된 농축된 백혈구 제제 (버피 코트) 의 Histopaque 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 제조했다. 신선한 혈액을 멸균 PBS 로 희석하고, Histopaque 기울기 (Sigma, #H8889) 위에 레이어링했다. 원심분리 (450 x g, 30 분, 실온) 후에, PBMC-함유 경계상 위의 혈장을 버리고, PBMC 를 새로운 팔콘 튜브 내에 옮기고, 후속적으로 50 ㎖ 의 PBS 를 채웠다. 혼합물을 원심분리 (400 x g, 10 분, 실온) 하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS 로 2 회 세정했다 (원심분리 단계 350 x g, 10 분). 결과적인 PBMC 집단을 자동으로 (ViCell) 계수하고, 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민 (Biochrom, K0302) 을 함유하는 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO2 에서 세포 인큐베이터 내에서 추가 사용 전까지 (24 시간 이하) 저장했다. 살해 검정을 위해, 항체를 명시된 농도로 첨가했다 (1 pM - 10 nM 범위, 3 회 반복). PBMC 를 표적 세포에 10:1 의 최종 E:T 비율로 첨가했다. 37℃, 5% CO2 에서 24 시간의 인큐베이션 후에 세포자멸사/괴사 세포에 의해 세포 상청액 내로 방출된 LDH 의 정량화에 의해 표적 세포 살해를 평가했다 (LDH 탐지 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001). 표적 세포의 최대 용해 (= 100%) 가 표적 세포와 1% Triton X-100 의 인큐베이션에 의해 달성되었다. 최소 용해 (= 0%) 는 이중특이적 구축물 없이 효과기 세포와 동시-인큐베이션된 표적 세포를 나타낸다. 결과는 MCSP TCB 가 MCSP+ 표적 세포주의 강한 표적-특이적 살해를 유도했고, MCSP- 세포주의 살해를 유도하지 않았다는 것을 보여준다, 도 75 A-D. GraphPadPrism5 를 사용하여 계산된 살해 검정과 관련된 EC50 값이 표 10 에 제공되어 있다.
표 10. MCSP TCB 항체에 의해 유도되는 MCSP-발현 종양 세포의 T-세포 매개되는 살해에 대한 EC50 값 (pM).
Figure pct00016
실시예 15
MCSP TCB 항체에 의해 유도되는 MCSP-발현 종양 세포의 T 세포-살해 후에 CD8+ 및 CD4+ 효과기 세포 상의 CD25 및 CD69 상향조절
MCSP TCB 항체에 의해 매개되는 MCSP-발현 MV-3 종양 세포의 T-세포 살해 후에 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화를 FACS 분석에 의해 T 세포 활성화 마커 CD25 (후기 활성화 마커) 및 CD69 (조기 활성화 마커) 를 인지하는 항체를 사용하여 평가했다. 항체 및 살해 검정 조건은 본질적으로 위에 기재된 바와 같았으며 (실시예 14), 동일한 항체 농도 범위 (1 pM - 10 nM, 3 회 반복), E:T 비율 10:1 및 인큐베이션 시간 24 h 을 사용했다.
인큐베이션 후에, PBMC 를 둥근 바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, 350 x g 에서 5 분 동안 원심분리하고, PBS (0.1% BSA 를 함유) 로 2 회 세정했다. CD8 (FITC 항-인간 CD8 BD # 555634), CD4 (PECy7 항-인간 CD4, BD # 557852), CD69 (PE 항-인간 CD69 Biolegend #310906) 및 CD25 (APC 항-인간 CD25 BD #555434) 에 대한 표면 염색을 공급사의 지침에 따라 수행했다. 세포를 150 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 로 2 회 세정하고, 15 분 동안 4℃ 에서 100 ㎕/웰 고정 완충액 (BD #554655) 을 사용하여 고정시켰다. 원심분리 후에, 샘플을 DAPI 를 함유하는 200 ㎕/웰 PBS 0.1% BSA 에 재현탁시켜 죽은 세포를 FACS 측정에서 배제했다. 샘플을 BD FACS Fortessa 에서 분석했다. 결과는 MCSP TCB 가 살해 후에 CD8+ T 세포 (도 76 A, B) 및 CD4+ T 세포 (도 76 C, D) 상의 활성화 마커 (CD25, CD69) 의 강한 표적-특이적 상향조절을 유도했다는 것을 보여준다.
실시예 16
MCSP TCB 항체에 의해 유도되는 MCSP-발현 종양 세포의 T 세포-살해 후에 인간 효과기 세포에 의한 사이토카인 분비
MCSP TCB 항체에 의해 유도되는 MCSP-발현 MV-3 종양 세포의 T-세포 살해 후에 인간 PBMC 에 의한 사이토카인 분비를 살해 검정 후에 세포 상청액의 FACS 분석에 의해 평가했다.
동일한 항체를 사용하고 살해 검정을 본질적으로 위에 기재된 바와 같이 (실시예 14 및 15), 10:1 의 E:T 비율 및 24 h 의 인큐베이션 시간을 사용하여 수행했다.
인큐베이션 시간의 마지막에, 플레이트를 5 분 동안 350 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 새로운 96-웰 플레이트 내에 옮기고, 후속적 분석 전까지 -20℃ 에서 저장했다. 세포 상청액 내로 분비된 그란자임 B, TNFα, IFN-γ, IL-2, IL-4 및 IL-10 을 BD CBA 인간 Soluble Protein Flex Set 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 FACS CantoII 에서 탐지했다. 하기 키트를 사용했다: BD CBA 인간 그란자임 B BD CBA 인간 그란자임 B Flex Set #BD 560304; BD CBA 인간 TNF Flex Set #BD 558273; BD CBA 인간 IFN-γ Flex Set #BD 558269; BD CBA 인간 IL-2 Flex Set #BD 558270; BD CBA 인간 IL-4 Flex Set #BD 558272; BD CBA 인간 IL-10 Flex Set #BD 558274.
결과는 MCSP TCB 가 살해 후에 IL-2, IFN-γ, TNFα, 그란자임 B 및 IL-10 (그러나 IL-4 는 아님) 의 분비를 유도했음을 보여준다, 도 77 A-F.
이들 실시예는 MCSP CD3 이중특이적 항체가 다음과 같았음을 보여준다:
ㆍ MCSP+ A375 세포에 대한 양호한 결합을 보였다
ㆍ MCSP+ 표적 세포주의 강한 표적-특이적 살해를 유도했고, MCSP- 세포주의 살해를 유도하지 않았다
ㆍ 살해 후에 CD8+ 및 CD4+ T 세포 상의 활성화 마커 (CD25, CD69) 의 강한 표적-특이적 상향조절을 유도했다
ㆍ 살해 후에 IL-2, IFN-g, TNF-a, GrB 및 IL-10 (IL-4 는 아님) 의 분비를 유도했다
실시예 17
CEA- 및 CD3-발현 세포에 대한 CEA TCB 의 결합
CEA TCB 의 결합을 CEA-발현 대장 샘암종 세포 (LS180) 및 CD3-발현 불멸화된 T 백혈구 라인 (주르카트) 에 대해 시험했다. 간략히, 세포를 수확하고, 계수하고, 생활력에 대해 체크하고, FACS 완충액 (100 ㎕ PBS 0.1% BSA) 에 2x106 세포/㎖ 로 재현탁시켰다. 100 ㎕ 의 세포 현탁액 (0.2x106 세포를 함유) 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트 내에서 30 분 동안 4℃ 에서 증가하는 농도의 CEA TCB (3 pM - 200 nM) 와 함께 인큐베이션하고, 차가운 PBS 0.1% BSA 로 2 회 세정하고, 추가 30 분 동안 4℃ 에서 PE-접합된 AffiniPure F(ab')2 Fragment 염소 항-인간 IgG Fcg Fragment Specific 2 차 항체 (Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170) 와 함께 재인큐베이션하고, 차가운 PBS 0.1% BSA 로 2 회 세정하고, 즉시 FACS 에 의해 FACS CantoII (Software FACS Diva) 를 사용하여 살아 있는, DAPI-음성, 세포를 게이팅함으로써 분석했다. 결합 곡선을 GraphPadPrism5 를 사용하여 수득했다 (도 78 A, LS180 세포에 대한 결합; 도 78 B, 주르카트 세포에 대한 결합).
실시예 18
CEA TCB 항체에 의해 유도되는 T-세포 살해
CEA TCB 항체에 의해 매개되는 T-세포 살해를 MKN45 (높은 CEA), LS180 (중간 CEA) 및 HT-29 (낮은 CEA) 인간 종양 세포에 대해 평가했다. 인간 PBMC 를 효과기로서 사용하고, 이중특이적 항체와의 인큐베이션의 24 h 에 살해를 탐지했다. 간략히, 표적 세포를 트립신/EDTA 로 수확하고, 세정하고, 넓적 바닥 96-웰 플레이트를 사용하여 25 000 세포/웰 의 밀도로 플레이팅했다. 세포를 밤새 부착되게 했다. 건강한 인간 공여자로부터 수득된 농축된 백혈구 제제 (버피 코트) 의 Histopaque 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 제조했다. 신선한 혈액을 멸균 PBS 로 희석하고, Histopaque 기울기 (Sigma, #H8889) 위에 레이어링했다. 원심분리 (450 x g, 30 분, 실온) 후에, PBMC-함유 경계상 위의 혈장을 버리고, PBMC 를 새로운 팔콘 튜브 내에 옮기고, 후속적으로 50 ㎖ 의 PBS 를 채웠다. 혼합물을 원심분리 (400 x g, 10 분, 실온) 하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS 로 2 회 세정했다 (원심분리 단계 350 x g, 10 분). 결과적인 PBMC 집단을 자동으로 (ViCell) 계수하고, 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민 (Biochrom, K0302) 을 함유하는 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO2 에서 세포 인큐베이터 내에서 추가 사용 전까지 (24 시간 이하) 저장했다. 살해 검정을 위해, 항체를 명시된 농도로 첨가했다 (0.2 pM - 20 nM 범위, 3 회 반복). PBMC 를 표적 세포에 10:1 의 최종 E:T 비율로 첨가했다. 37℃, 5% CO2 에서 24 h 및 48 h 의 인큐베이션 후에 세포자멸사/괴사 세포에 의해 세포 상청액 내로 방출된 LDH 의 정량화에 의해 표적 세포 살해를 평가했다 (LDH 탐지 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001). 표적 세포의 최대 용해 (= 100%) 가 표적 세포와 1% Triton X-100 의 인큐베이션에 의해 달성되었다. 최소 용해 (= 0%) 는 이중특이적 구축물 없이 효과기 세포와 동시-인큐베이션된 표적 세포를 나타낸다. 결과는 CEA TCB 가 CEA+ 표적 세포주의 강한 표적-특이적 살해를 유도했다는 것을 보여준다, 도 79 A-C. GraphPadPrism5 를 사용하여 계산된 살해 검정과 관련된 EC50 값이 표 11 에 제공되어 있다.
표 11. CEA TCB 항체에 의해 유도되는 CEA-발현 종양 세포의 T-세포 매개되는 살해에 대한 EC50 값 (pM).
Figure pct00017
실시예 19
CEA TCB 항체에 의해 유도되는 CEA-발현 종양 세포의 T 세포-살해 후에 CD8+ 및 CD4+ 효과기 세포 상의 CD25 및 CD69 상향조절
CEA TCB 항체에 의해 매개되는 CEA-발현 LS180 종양 세포의 T-세포 살해 후에 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화를 FACS 분석에 의해 T 세포 활성화 마커 CD25 (후기 활성화 마커) 및 CD69 (조기 활성화 마커) 를 인지하는 항체를 사용하여 평가했다. 항체 및 살해 검정 조건은 본질적으로 위에 기재된 바와 같았으며 (실시예 18), 동일한 항체 농도 범위 (0.2 pM - 20 nM, 3 회 반복), E:T 비율 10:1 및 인큐베이션 시간 24 h 을 사용했다.
인큐베이션 후에, PBMC 를 둥근 바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, 350 x g 에서 5 분 동안 원심분리하고, PBS (0.1% BSA 를 함유) 로 2 회 세정했다. CD8 (FITC 항-인간 CD8, BD # 555634), CD4 (PECy7 항-인간 CD4, BD # 557852), CD69 (PE 항-인간 CD69, Biolegend #310906) 및 CD25 (APC 항-인간 CD25, BD #555434) 에 대한 표면 염색을 공급사의 지침에 따라 수행했다. 세포를 150 ㎕/웰 PBS (0.1% BSA 를 함유) 로 2 회 세정하고, 15 분 동안 4℃ 에서 100 ㎕/웰 고정 완충액 (BD #554655) 을 사용하여 고정시켰다. 원심분리 후에, 샘플을 DAPI 를 함유하는 200 ㎕/웰 PBS 0.1% BSA 에 재현탁시켜 죽은 세포를 FACS 측정에서 배제했다. 샘플을 BD FACS Fortessa 에서 분석했다. 결과는 CEA TCB 가 살해 후에 CD8+ (도 80 A, B) 및 CD4+ T 세포 상의 활성화 마커 (CD25, CD69) 의 강한 표적-특이적 상향조절을 유도했다는 것을 보여준다 (도 80 C, D).
실시예 20
CEA TCB 에 의해 유도되는 CEA-발현 종양 세포의 T 세포-살해 후에 인간 효과기 세포에 의한 사이토카인 분비
CEA TCB 에 의해 유도되는 CEA-발현 LS180 종양 세포의 T-세포 살해 후에 인간 PBMC 에 의한 사이토카인 분비를 살해 검정 후에 세포 상청액의 FACS 분석에 의해 평가했다.
동일한 항체를 사용하고 살해 검정을 본질적으로 위에 기재된 바와 같이 수행했으며 (실시예 18 및 19), 10:1 의 E:T 비율 및 24 h 의 인큐베이션 시간을 사용했다.
인큐베이션 시간의 마지막에, 플레이트를 5 분 동안 350 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 새로운 96-웰 플레이트 내에 옮기고, 후속적 분석 전까지 -20℃ 에서 저장했다. 세포 상청액 내로 분비된 그란자임 B, TNFα, IFN-γ, IL-4 및 IL-10 을 BD CBA 인간 Soluble Protein Flex Set 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 FACS CantoII 에서 탐지했다. 하기 키트를 사용했다: BD CBA 인간 그란자임 B BD CBA 인간 그란자임 B Flex Set #BD 560304; BD CBA 인간 TNF Flex Set #BD 558273; BD CBA 인간 IFN-γ Flex Set #BD 558269; BD CBA 인간 IL-4 Flex Set #BD 558272; BD CBA 인간 IL-10 Flex Set #BD 558274.
결과는 CEA TCB 가 살해 후에 IFN-γ, TNFα, 그란자임 B, IL-4 및 IL-10 의 분비를 유도했다는 것을 보여준다, 도 81 A-E.
이들 실시예는 CEA CD3 이중특이적 항체가 다음과 같았음을 보여준다:
ㆍ CEA+ 세포에 대한 양호한 결합을 보였다
ㆍ CEA+ 표적 세포주의 강한 표적-특이적 살해를 유도했다.
ㆍ 살해 후에 CD8+ 및 CD4+ T 세포 상의 활성화 마커 (CD25, CD69) 의 강한 표적-특이적 상향조절을 유도했다
ㆍ 살해 후에 IL-2, IFN-g, TNF-a, GrB 및 IL-10 (IL-4 는 아님) 의 분비를 유도했다
실시예 21
비결합 항체로서 DP47 GS 및 항 CD3 항체로서 인간화 CH2527 을 함유하는 DP47 GS TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위 = "표적화되지 않은 TCB") 의 제조
"표적화되지 않은 TCB" 를 상기 실험에서 대조군로서 사용했다. 이중특이적 항체는 CD3e 와 맞물리지만, 다른 항원에 결합하지 않고, 그러므로 T 세포를 표적 세포에 교차연결시킬 수 없다 (그리고 후속적으로 살해를 유도할 수 없다). 그러므로 그것은 검정에서 음성 대조군으로서 사용되어 비특이적 T 세포 활성화를 모니터링했다.
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 결과적인 가변 영역을 각각의 수용자 포유류 발현 벡터 내에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 프레임에 맞춰 서브클로닝했다. 항체 발현은 MPSV 프로모터에 의해 추진되고, 합성 polyA 신호 서열을 CDS 의 3' 말단에서 보유한다. 또한 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유류 발현 벡터로 동시-트랜스펙션시킴으로써 분자들을 생산했다. 세포를 1:2:1:1 비율 ("벡터 중쇄 Fc(홀)" : "벡터 경쇄" : "벡터 경쇄 Crossfab" : "벡터 중쇄 Fc(놉)-FabCrossfab") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다.
트랜스펙션을 위해 HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 무혈청 현탁액으로 배양했다. 500 ㎖ 쉐이크 플라스크 내에서의 생산을 위해 4 억 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 전에 시딩했다. 트랜스펙션을 위해 세포를 5 분 동안 210 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 미리-데운 20 ㎖ CD CHO 배지로 교체했다. 발현 벡터를 20 ㎖ CD CHO 배지에서 200 g DNA 의 최종량으로 혼합했다. 540 ㎕ PEI 의 첨가 후에 용액을 15 초 동안 볼텍싱하고, 후속적으로 10 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 뒤에 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ㎖ 쉐이크 플라스크로 옮기고, 5 % CO2 분위기의 인큐베이터 내에서 37 ℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 시간 후에 160 ㎖ F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양했다. 트랜스펙션 다음날 1 mM 발프로산 및 7 % Feed 1을 첨가했다. 7 일 배양 후에 상청액을 수집하여 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 정제하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 0.01 % w/v 의 최종 농도로 첨가하고, 4℃ 에서 유지했다.
분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 친화도 크로마토그래피에 의해 Protein A 를 사용하여 정제했다. 상청액을 40 ㎖ 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 평형화시킨 HiTrap Protein A HP 칼럼 (CV=5 mL, GE Healthcare) 에 로딩했다. 미결합 단백질을 10 칼럼 부피 이상의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 세정하여 제거했다. 표적 단백질이 20 칼럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 내지 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 2.5 에 걸친 기울기 동안 용리되었다. 단백질 용액을 1/10 의 0.5 M 나트륨 포스페이트, pH 8 를 첨가함으로써 중화시켰다. 표적 단백질을 농축시키고, 여과하고, 그 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액 pH 6.0 으로 평형화시킨 HiLoad Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare) 에 로딩했다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 확인했다.
분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재 하에 CE-SDS 분석에 의해 분석했다. Caliper LabChip GXII 시스템 (Caliper lifescience) 을 제조사의 지침에 따라 사용했다. 2ug 샘플을 분석에 사용한다.
항체 샘플의 응집물 함량을 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기-배제 칼럼 (Tosoh) 을 사용하여 25℃ 에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7 전개 완충액에서 분석했다.
표 12: DP47 GS TCB 의 요약 생산 및 정제
Figure pct00018
도 82 및 표 13 은 비결합 항체로서 DP47 GS 및 항 CD3 항체로서 인간화 CH2527 을 함유하는 DP47 GS TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위) (SEQ ID NOs: 325, 326, 327 및 328) 의 CE-SDS 분석을 보여준다.
표 13: DP47 GS TCB 의 CE-SDS 분석
Figure pct00019
도 83 은 비결합 항체로서 DP47 GS 및 항 CD3 항체로서 인간화 CH2527 을 함유하는 DP47 GS TCB (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 역방위) (SEQ ID NOs: 325, 326, 327 및 328) 의 분석적 크기 배제 크로마토그래피를 보여준다.
실시예 22: AVH TCB 의 제조
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 결과적인 가변 영역을 각각의 수용자 포유류 발현 벡터 내에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 프레임에 맞춰 서브클로닝했다. 항체 발현은 MPSV 프로모터로 추진되었고, 합성 polyA 신호 서열을 CDS 의 3' 말단에서 보유한다. 또한 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유류 발현 벡터로 동시-트랜스펙션시킴으로써 분자들을 생산했다. 세포를 1:1:1 비율 ("벡터 중쇄 AVH-Fc(홀)" : "벡터 경쇄 antiCD3" : "벡터 중쇄 AVH-Fab(antiCD3)-Fc(놉)") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다.
트랜스펙션을 위해 HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 무혈청 현탁액으로 배양했다. 500 ㎖ 쉐이크 플라스크 내에서의 생산을 위해 4 억 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 전에 시딩했다. 트랜스펙션을 위해 세포를 5 분 동안 210 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 미리-데운 20 ㎖ CD CHO 배지로 교체했다. 발현 벡터를 20 ㎖ CD CHO 배지에서 최종량 200 ㎍ DNA 까지 혼합했다. 540 ㎕ PEI 의 첨가 후에 용액을 15 초 동안 볼텍싱하고, 후속적으로 10 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 뒤에 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ㎖ 쉐이크 플라스크로 옮기고, 5 % CO2 분위기의 인큐베이터 내에서 37 ℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 시간 후에 160 ㎖ F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양했다. 트랜스펙션 다음날 1 mM 발프로산 및 7 % Feed 1 을 첨가했다. 7 일 배양 후에 상청액을 수집하여 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 정제하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 0.01 % w/v 의 최종 농도로 첨가하고, 4℃ 에서 유지했다.
분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 친화도 크로마토그래피에 의해 Protein A 를 사용하여 정제했다. 상청액을 40 ㎖ 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 평형화시킨 HiTrap Protein A HP 칼럼 (CV=5 mL, GE Healthcare) 에 로딩했다. 미결합 단백질을 10 칼럼 부피 이상의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 세정하여 제거했다. 표적 단백질이 20 칼럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 내지 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 2.5 에 걸친 기울기 동안 용리되었다. 단백질 용액을 1/10 의 0.5 M 나트륨 포스페이트, pH 8 를 첨가함으로써 중화시켰다. 표적 단백질을 농축시키고, 여과하고, 그 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액 pH 6.0 으로 평형화시킨 HiLoad Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare) 에 로딩했다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 확인했다.
분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재 하에 CE-SDS 분석에 의해 분석했다. Caliper LabChip GXII 시스템 (Caliper lifescience) 을 제조사의 지침에 따라 사용했다. 2ug 샘플을 분석에 사용했다.
항체 샘플의 응집물 함량을 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기-배제 칼럼 (Tosoh) 을 사용하여 25℃ 에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7 전개 완충액에서 분석했다.
표 14: aVH TCB 의 요약 생산 및 정제
Figure pct00020
도 85 는 aVH TCB 분자의 도해를 보여준다.
도 86 및 표 15 는 CD3 결합 부분 및 MCSP 에 결합하는 2 개의 aVH 부분을 갖는 Crossfab 조각을 함유하는 VH TCB 분자 (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA) (SEQ ID NOs: 369, 370 및 371) 의 CE-SDS 분석을 보여준다.
표 15: aVH TCB 의 CE-SDS 분석
Figure pct00021
실시예 23: MCSP- 및 CD3-발현 세포에 대한 aVH TCB 의 결합
aVH TCB 의 결합을 MCSP-발현 인간 흑색종 세포주 (MV-3) 및 CD3-발현 불멸화된 T 백혈구 라인 (주르카트) 에 대해 시험했다. 간략히, 세포를 수확하고, 계수하고, 생활력에 대해 체크하고, FACS 완충액 (100 ㎕ PBS 0.1% BSA) 에 2x106 세포/㎖ 로 재현탁시켰다. 100 ㎕ 의 세포 현탁액 (0.2x106 세포를 함유) 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트 내에서 30 분 동안 4℃ 에서 증가하는 농도의 aVH TCB (2 pM - 170 nM) 와 함께 인큐베이션하고, 차가운 PBS 0.1% BSA 로 2 회 세정하고, 추가 30 분 동안 4℃ 에서 PE-접합된 AffiniPure F(ab')2 Fragment 염소 항-인간 IgG Fcg Fragment Specific 2 차 항체 (Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170) 와 함께 재인큐베이션하고, 차가운 PBS 0.1% BSA 로 2 회 세정하고, 즉시 FACS 에 의해 FACS CantoII (Software FACS Diva) 를 사용하여 분석했다. 결합 곡선을 GraphPadPrism5 를 사용하여 수득했다 (도 87 A, MV3 세포에 대한 결합; 도 87 B, 주르카트 세포에 대한 결합).
실시예 24: aVH TCB 항체에 의해 유도되는 T-세포 살해
aVH TCB 항체에 의해 매개되는 T-세포 살해를 MCSP-발현 인간 흑색종 종양 세포 (MV-3) 및 인간 PBMC 를 사용하여 인큐베이션의 24 h 및 48 h 에서 평가했다. 간략히, 표적 세포를 트립신/EDTA 로 수확하고, 세정하고, 넓적 바닥 96-웰 플레이트를 사용하여 25 000 세포/웰 의 밀도로 플레이팅했다. 세포를 밤새 부착되게 했다. 건강한 인간 공여자로부터 수득된 농축된 백혈구 제제 (버피 코트) 의 Histopaque 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 제조했다. 신선한 혈액을 멸균 PBS 로 희석하고, Histopaque 기울기 (Sigma, #H8889) 위에 레이어링했다. 원심분리 (450 x g, 30 분, 실온) 후에, PBMC-함유 경계상 위의 혈장을 버리고, PBMC 를 새로운 팔콘 튜브 내에 옮기고, 후속적으로 50 ㎖ 의 PBS 를 채웠다. 혼합물을 원심분리 (400 x g, 10 분, 실온) 하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS 로 2 회 세정했다 (원심분리 단계 350 x g, 10 분). 결과적인 PBMC 집단을 자동으로 (ViCell) 계수하고, 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민 (Biochrom, K0302) 을 함유하는 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO2 에서 세포 인큐베이터 내에서 추가 사용 전까지 (24 시간 이하) 저장했다. 살해 검정을 위해, 항체를 명시된 농도로 첨가했다 (110 pM - 80 nM 범위, 3 회 반복). PBMC 를 표적 세포에 10:1 의 최종 E:T 비율로 첨가했다. 37℃, 5% CO2 에서 24 h 및 48 h 의 인큐베이션 후에 세포자멸사/괴사 세포에 의해 세포 상청액 내로 방출된 LDH 의 정량화에 의해 표적 세포 살해를 평가했다 (LDH 탐지 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001). 표적 세포의 최대 용해 (= 100%) 가 표적 세포와 1% Triton X-100 의 인큐베이션에 의해 달성되었다. 최소 용해 (= 0%) 는 이중특이적 구축물 없이 효과기 세포와 동시-인큐베이션된 표적 세포를 나타낸다. 결과는 aVH TCB 가 MCSP+ 표적 세포주의 강한 표적-특이적 살해를 유도했다는 것을 보여준다, 도 88 A, B. GraphPadPrism5 를 사용하여 계산된 살해 검정과 관련된 EC50 값이 표 16 에 제공되어 있다.
표 16. aVH TCB 항체에 의해 유도되는 MCSP-발현 종양 세포 (MV-3) 의 T-세포 매개되는 살해에 대한 EC50 값 (pM).
Figure pct00022
도면의 간단한 설명
도 87. MV-3 세포 (MCSP+) (A) 및 주르카트 (CD3+ 세포) (B) 에 대한 aVH TCB 의 결합.
도 88. 인큐베이션 (E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC) 후 24 h (A) 및 48 h (B) 에 탐지되는 MV-3 흑색종 세포의 aVH TCB 항체에 의해 유도되는 T-세포 살해.
실시예 25: 안키린 반복 단백질(다르핀)- TCB 의 제조
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 결과적인 가변 영역을 각각의 수용자 포유류 발현 벡터 내에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 프레임에 맞춰 서브클로닝했다. 항체 발현은 MPSV 프로모터로 추진되었고, 합성 polyA 신호 서열을 CDS 의 3' 말단에서 보유한다. 또한 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유류 발현 벡터로 동시-트랜스펙션시킴으로써 분자들을 생산했다. 세포를 1:1:1 비율 ("벡터 중쇄 다르핀-Fc(홀)" : "벡터 경쇄 antiCD3" : "벡터 중쇄 다르핀-Fab(antiCD3)-Fc(놉)") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다.
트랜스펙션을 위해 HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 무혈청 현탁액으로 배양했다. 500 ㎖ 쉐이크 플라스크 내에서의 생산을 위해 4 억 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 전에 시딩했다. 트랜스펙션을 위해 세포를 5 분 동안 210 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 미리-데운 20 ㎖ CD CHO 배지로 교체했다. 발현 벡터를 20 ㎖ CD CHO 배지에서 최종량 200 ㎍ DNA 까지 혼합했다. 540 ㎕ PEI 의 첨가 후에 용액을 15 초 동안 볼텍싱하고, 후속적으로 10 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 뒤에 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ㎖ 쉐이크 플라스크로 옮기고, 5 % CO2 분위기의 인큐베이터 내에서 37 ℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 시간 후에 160 ㎖ F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양했다. 트랜스펙션 다음날 1 mM 발프로산 및 7 % Feed 1 을 첨가했다. 7 일 배양 후에 상청액을 수집하여 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 정제하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 0.01 % w/v 의 최종 농도로 첨가하고, 4℃ 에서 유지했다.
분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 친화도 크로마토그래피에 의해 Protein A 를 사용하여 정제했다. 상청액을 40 ㎖ 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 평형화시킨 HiTrap Protein A HP 칼럼 (CV=5 mL, GE Healthcare) 에 로딩했다. 미결합 단백질을 10 칼럼 부피 이상의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 세정하여 제거했다. 표적 단백질이 20 칼럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 내지 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 2.5 에 걸친 기울기 동안 용리되었다. 단백질 용액을 1/10 의 0.5 M 나트륨 포스페이트, pH 8 를 첨가함으로써 중화시켰다. 표적 단백질을 농축시키고, 여과하고, 그 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액 pH 6.0 으로 평형화시킨 HiLoad Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare) 에 로딩했다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 확인했다.
분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재 하에 CE-SDS 분석에 의해 분석했다. Caliper LabChip GXII 시스템 (Caliper lifescience) 을 제조사의 지침에 따라 사용했다. 2ug 샘플을 분석에 사용했다.
항체 샘플의 응집물 함량을 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기-배제 칼럼 (Tosoh) 을 사용하여 25℃ 에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7 전개 완충액에서 분석했다.
도 89 는 다르핀- TCB 분자의 도해를 보여준다.
표 17: 다르핀- TCB 의 요약 생산 및 정제
Figure pct00023
도 90 및 표 18 은 CD3 결합 부분 및 HER2 에 결합하는 2 개의 다르핀 부분을 갖는 Crossfab 조각을 함유하는 다르핀-TCB 분자 (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA) (SEQ ID NOs: 376, 377 및 378) 의 CE-SDS 분석을 보여준다.
표 18: 다르핀 TCB 의 CE-SDS 분석
Figure pct00024
실시예 26: Her2- 및 CD3-발현 세포에 대한 다르핀 TCB 의 결합
다르핀 TCB 의 결합을 Her2-발현 인간 흑색종 세포주 (KPL-4) 및 CD3-발현 불멸화된 T 백혈구 라인 (주르카트) 에 대해 시험했다. 간략히, 세포를 수확하고, 계수하고, 생활력에 대해 체크하고, FACS 완충액 (100 ㎕ PBS 0.1% BSA) 에 2x106 세포/㎖ 로 재현탁시켰다. 100 ㎕ 의 세포 현탁액 (0.2x106 세포를 함유) 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트 내에서 30 분 동안 4℃ 에서 증가하는 농도의 다르핀 TCB (3 pM - 200 nM) 와 함께 인큐베이션하고, 차가운 PBS 0.1% BSA 로 2 회 세정하고, 추가 30 분 동안 4℃ 에서 PE-접합된 AffiniPure F(ab')2 Fragment 염소 항-인간 IgG Fcg Fragment Specific 2 차 항체 (Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170) 와 함께 재인큐베이션하고, 차가운 PBS 0.1% BSA 로 2 회 세정하고, 즉시 FACS 에 의해 FACS CantoII (Software FACS Diva) 를 사용하여 분석했다. 결합 곡선을 GraphPadPrism5 를 사용하여 수득했다 (도 91 A, KPL-4 세포에 대한 결합; 도 91 B, 주르카트 세포에 대한 결합).
실시예 27: 다르핀 TCB 항체에 의해 유도되는 T-세포 살해
다르핀 TCB 항체에 의해 매개되는 T-세포 살해를 Her2-발현 인간 흑색종 종양 세포 (KPL4) 및 인간 PBMC 를 사용하여 인큐베이션의 24 h 및 48 h 에서 평가했다. 간략히, 표적 세포를 트립신/EDTA 로 수확하고, 세정하고, 넓적 바닥 96-웰 플레이트를 사용하여 25 000 세포/웰 의 밀도로 플레이팅했다. 세포를 밤새 부착되게 했다. 건강한 인간 공여자로부터 수득된 농축된 백혈구 제제 (버피 코트) 의 Histopaque 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 제조했다. 신선한 혈액을 멸균 PBS 로 희석하고, Histopaque 기울기 (Sigma, #H8889) 위에 레이어링했다. 원심분리 (450 x g, 30 분, 실온) 후에, PBMC-함유 경계상 위의 혈장을 버리고, PBMC 를 새로운 팔콘 튜브 내에 옮기고, 후속적으로 50 ㎖ 의 PBS 를 채웠다. 혼합물을 원심분리 (400 x g, 10 분, 실온) 하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS 로 2 회 세정했다 (원심분리 단계 350 x g, 10 분). 결과적인 PBMC 집단을 자동으로 (ViCell) 계수하고, 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민 (Biochrom, K0302) 을 함유하는 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO2 에서 세포 인큐베이터 내에서 추가 사용 전까지 (24 시간 이하) 저장했다. 살해 검정을 위해, 항체를 명시된 농도로 첨가했다 (2 pM - 20 nM 범위, 3 회 반복). PBMC 를 표적 세포에 10:1 의 최종 E:T 비율로 첨가했다. 37℃, 5% CO2 에서 24 h 및 48 h 의 인큐베이션 후에 세포자멸사/괴사 세포에 의해 세포 상청액 내로 방출된 LDH 의 정량화에 의해 표적 세포 살해를 평가했다 (LDH 탐지 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001). 표적 세포의 최대 용해 (= 100%) 가 표적 세포와 1% Triton X-100 의 인큐베이션에 의해 달성되었다. 최소 용해 (= 0%) 는 이중특이적 구축물 없이 효과기 세포와 동시-인큐베이션된 표적 세포를 나타낸다. 결과는 다르핀 TCB 가 Her2+ 표적 세포주의 강한 표적-특이적 살해를 유도했다는 것을 보여준다, 도 92 A, B. GraphPadPrism5 를 사용하여 계산된 살해 검정과 관련된 EC50 값이 표 19 에 제공되어 있다.
표 19. 다르핀 TCB 항체에 의해 유도되는 Her2-발현 종양 세포 (KPL-4) 의 T-세포 매개되는 살해에 대한 EC50 값 (pM).
Figure pct00025
실시예 28: hIgG1 DDKK TCB 의 제조
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 결과적인 가변 영역을 각각의 수용자 포유류 발현 벡터 내에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 프레임에 맞춰 서브클로닝했다. 항체 발현은 MPSV 프로모터로 추진되었고, 합성 polyA 신호 서열을 CDS 의 3' 말단에서 보유한다. 또한 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유류 발현 벡터로 동시-트랜스펙션시킴으로써 분자들을 생산했다. 세포를 1:1:2:1 비율 ("벡터 중쇄 Fc(KK)" : "벡터 경쇄 Crossfab" : "벡터 경쇄" : "벡터 중쇄 Fc(KK) FabCrossfab") 의 해당 발현 벡터로 트랜스펙션했다.
트랜스펙션을 위해 HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 무혈청 현탁액으로 배양했다. 500 ㎖ 쉐이크 플라스크 내에서의 생산을 위해 4 억 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 전에 시딩했다. 트랜스펙션을 위해 세포를 5 분 동안 210 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 미리-데운 20 ㎖ CD CHO 배지로 교체했다. 발현 벡터를 20 ㎖ CD CHO 배지에서 최종량 200 ㎍ DNA 까지 혼합했다. 540 ㎕ PEI 의 첨가 후에 용액을 15 초 동안 볼텍싱하고, 후속적으로 10 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 뒤에 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ㎖ 쉐이크 플라스크로 옮기고, 5 % CO2 분위기의 인큐베이터 내에서 37 ℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 시간 후에 160 ㎖ F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양했다. 트랜스펙션 다음날 1 mM 발프로산 및 7 % Feed 1 을 첨가했다. 7 일 배양 후에 상청액을 수집하여 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 정제하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 0.01 % w/v 의 최종 농도로 첨가하고, 4℃ 에서 유지했다.
분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 친화도 크로마토그래피에 의해 Protein A 를 사용하여 정제했다. 상청액을 40 ㎖ 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 평형화시킨 HiTrap Protein A HP 칼럼 (CV=5 mL, GE Healthcare) 에 로딩했다. 미결합 단백질을 10 칼럼 부피 이상의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 로 세정하여 제거했다. 표적 단백질이 20 칼럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 7.5 내지 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드, pH 2.5 에 걸친 기울기 동안 용리되었다. 단백질 용액을 1/10 의 0.5 M 나트륨 포스페이트, pH 8 를 첨가함으로써 중화시켰다. 표적 단백질을 농축시키고, 여과하고, 그 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액 pH 6.0 으로 평형화시킨 HiLoad Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare) 에 로딩했다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 확인했다.
분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재 하에 CE-SDS 분석에 의해 분석했다. Caliper LabChip GXII 시스템 (Caliper lifescience) 을 제조사의 지침에 따라 사용했다. 2ug 샘플을 분석에 사용했다.
항체 샘플의 응집물 함량을 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기-배제 칼럼 (Tosoh) 을 사용하여 25℃ 에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7 전개 완충액에서 분석했다.
DDKK 돌연변이가 있는 Fc 를 보유하는 인간 IgG1 을 사용하여 이종이합체성 T 세포 이중특이적 분자를 생성했따. 제 1 정제 단계 후에 주된 집단은 Fc(KK) 를 함유하는 동종 이합체성 분자였다. 이러한 LMW 불순물은 주로 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있고, 올바른 이종이합체가 농축될 수 있다.
표 20: hIgG1 DDKK TCB 의 요약 생산 및 정제
Figure pct00026
도 93 은 hIgG1 DDKK - TCB 분자의 도해를 보여준다.
도 94 및 표 21 은 CD3 결합 부분 및 2 개의 MCSP 결합 부분을 갖는 Crossfab 조각을 함유하는 hIgG1 DDKK -TCB 분자 (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA) (SEQ ID NOs: 372, 373, 374 및 375) 의 CE-SDS 분석을 보여준다.
표 21: hIgG1 DDKK TCB 의 CE-SDS 분석
Figure pct00027
실시예 29: MCSP- 및 CD3-발현 세포에 대한 hIgG1 DDKK TCB 의 결합
hIgG1 DDKK TCB 의 결합을 MCSP-발현 인간 흑색종 세포주 (MV-3) 및 CD3-발현 불멸화된 T 백혈구 라인 (주르카트) 에 대해 시험했다. 간략히, 세포를 수확하고, 계수하고, 생활력에 대해 체크하고, FACS 완충액 (100 ㎕ PBS 0.1% BSA) 에 2x106 세포/㎖ 로 재현탁시켰다. 100 ㎕ 의 세포 현탁액 (0.2x106 세포를 함유) 을 둥근 바닥 96-웰 플레이트 내에서 30 분 동안 4℃ 에서 증가하는 농도의 hIgG1 DDKK TCB (2 pM - 170 nM) 와 함께 인큐베이션하고, 차가운 PBS 0.1% BSA 로 2 회 세정하고, 추가 30 분 동안 4℃ 에서 PE-접합된 AffiniPure F(ab')2 Fragment 염소 항-인간 IgG Fcg Fragment Specific 2 차 항체 (Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170) 와 함께 재인큐베이션하고, 차가운 PBS 0.1% BSA 로 2 회 세정하고, 즉시 FACS 에 의해 FACS CantoII (Software FACS Diva) 를 사용하여 분석했다. 결합 곡선을 GraphPadPrism5 를 사용하여 수득했다 (도 95 A, MV-3 세포에 대한 결합, EC50 = 12803 pM; 도 95 B, 주르카트 세포에 대한 결합).
실시예 30: hIgG1 DDKK TCB 항체에 의해 유도되는 T-세포 살해
hIgG1 DDKK TCB 항체에 의해 매개되는 T-세포 살해를 MCSP-발현 인간 흑색종 종양 세포 (MV-3) 및 인간 PBMC 를 사용하여 인큐베이션의 24 h 및 48 h 에서 평가했다. 간략히, 표적 세포를 트립신/EDTA 로 수확하고, 세정하고, 넓적 바닥 96-웰 플레이트를 사용하여 25 000 세포/웰 의 밀도로 플레이팅했다. 세포를 밤새 부착되게 했다. 건강한 인간 공여자로부터 수득된 농축된 백혈구 제제 (버피 코트) 의 Histopaque 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 제조했다. 신선한 혈액을 멸균 PBS 로 희석하고, Histopaque 기울기 (Sigma, #H8889) 위에 레이어링했다. 원심분리 (450 x g, 30 분, 실온) 후에, PBMC-함유 경계상 위의 혈장을 버리고, PBMC 를 새로운 팔콘 튜브 내에 옮기고, 후속적으로 50 ㎖ 의 PBS 를 채웠다. 혼합물을 원심분리 (400 x g, 10 분, 실온) 하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS 로 2 회 세정했다 (원심분리 단계 350 x g, 10 분). 결과적인 PBMC 집단을 자동으로 (ViCell) 계수하고, 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민 (Biochrom, K0302) 을 함유하는 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO2 에서 세포 인큐베이터 내에서 추가 사용 전까지 (24 시간 이하) 저장했다. 살해 검정을 위해, 항체를 명시된 농도로 첨가했다 (0.02 pM - 20 nM 범위, 3 회 반복). PBMC 를 표적 세포에 10:1 의 최종 E:T 비율로 첨가했다. 37℃, 5% CO2 에서 24 h 및 48 h 의 인큐베이션 후에 세포자멸사/괴사 세포에 의해 세포 상청액 내로 방출된 LDH 의 정량화에 의해 표적 세포 살해를 평가했다 (LDH 탐지 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001). 표적 세포의 최대 용해 (= 100%) 가 표적 세포와 1% Triton X-100 의 인큐베이션에 의해 달성되었다. 최소 용해 (= 0%) 는 이중특이적 구축물 없이 효과기 세포와 동시-인큐베이션된 표적 세포를 나타낸다. 결과는 hIgG1 DDKK TCB 가 MCSP+ 표적 세포주의 강한 표적-특이적 살해를 유도했다는 것을 보여준다, 도 96 A, B. GraphPadPrism5 를 사용하여 계산된 살해 검정과 관련된 EC50 값이 표 22 에 제공되어 있다.
표 22. hIgG1 DDKK TCB 항체에 의해 유도되는 MCSP-발현 종양 세포 (MV-3) 의 T-세포 매개되는 살해에 대한 EC50 값 (pM).
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SEQ ID NOs 1-266 은 첨부된 서열 목록에 제공되어 있다.
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전술한 발명은 이해의 명확성을 목적으로 설명 및 예시에 의해 다소 상세히 기재되었지만, 설명 및 예시는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되면 안된다. 본원에서 언급된 모든 특허의 공개 및 과학 문헌은 전문이 참조로 명백히 포함된다.
<110> Roche Glycart AG <120> Bispecific T cell activating antigen binding molecules <130> 31457 <160> 390 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 700 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V9 (scFab)-Fc(hole) P329G LALA <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val 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Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 4 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC007 (VH-CH1)-Fc(knob) P329G LALA <400> 4 gaggtccagc tgcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60 acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaagctgga atggatgggc tacataacct acgacggtag caataactac 180 aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240 ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagctacat attactgtgc ggactttgac 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc 360 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 420 gtcaaggact 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1440 tctgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa 1500 gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 1560 gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800 accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067 <210> 207 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 431/26(VH-CH1)-Fc(hole) P329G LALA <400> 207 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Gly 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ctgcctcgtg 480 aaggactact ttcccgagcc tgtgaccgtg tcctggaact ctggcgccct gacaagcggc 540 gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc agcggcctgt actctctgag cagcgtggtc 600 accgtgccta gcagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc 660 agcaacacca aagtggacaa gaaggtggag cccaagagct gtgatggcgg aggagggtcc 720 ggaggcggag gatccgaggt gcagctgctg gaatctggcg gcggactggt gcagcctggc 780 ggatctctga gactgagctg tgccgccagc ggcttcacct tcagcaccta cgccatgaac 840 tgggtgcgcc aggcccctgg caaaggcctg gaatgggtgt cccggatcag aagcaagtac 900 aacaactacg ccacctacta cgccgacagc gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac 960 gacagcaaga acaccctgta cctgcagatg aacagcctgc gggccgagga caccgccgtg 1020 tactattgtg tgcggcacgg caacttcggc aacagctatg tgtcttggtt tgcctactgg 1080 ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcaagc gctagcgtgg ccgctccctc cgtgtttatc 1140 tttcccccat ccgatgaaca gctgaaaagc ggcaccgcct ccgtcgtgtg tctgctgaac 1200 aatttttacc ctagggaagc taaagtgcag tggaaagtgg ataacgcact gcagtccggc 1260 aactcccagg aatctgtgac agaacaggac tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc 1320 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ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg 1140 tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380 aaatga 1386 <210> 374 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain humanized CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1) <400> 374 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60 gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120 tgtggcagtt ctacaggcgc 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<211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain humanized CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1) <400> 385 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60 gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120 tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180 cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240 gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300 ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360 ggaggcacca agctgacagt gctgagcagc gcttccacca aaggcccttc cgtgtttcct 420 ctggctccta gctccaagtc cacctctgga ggcaccgctg ctctcggatg cctcgtgaag 480 gattattttc ctgagcctgt gacagtgtcc tggaatagcg gagcactgac ctctggagtg 540 catactttcc ccgctgtgct gcagtcctct ggactgtaca gcctgagcag cgtggtgaca 600 gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 660 aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc aagtcttgtt ga 702 <210> 386 <211> 2124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DP47 GS (VH-CH1) - humanized CD3 CH2527 (Crossfab VH-Ck)-Fc(knob) P329GLALA <400> 386 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60 gtgcaattgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ccggattcac ctttagcagt tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aggcagcgga 360 tttgactact ggggccaagg aaccctggtc accgtctcga gtgctagcac aaagggcccc 420 agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc 480 tgcctcgtga aggactactt tcccgagcct gtgaccgtgt cctggaactc tggcgccctg 540 acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg ctgcagagca gcggcctgta ctctctgagc 600 agcgtggtca ccgtgcctag cagcagcctg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac 660 cacaagccca gcaacaccaa agtggacaag aaggtggagc ccaagagctg tgatggcgga 720 ggagggtccg gaggcggagg atccgaggtg cagctgctgg aatctggcgg cggactggtg 780 cagcctggcg gatctctgag actgagctgt gccgccagcg gcttcacctt cagcacctac 840 gccatgaact gggtgcgcca ggcccctggc aaaggcctgg aatgggtgtc ccggatcaga 900 agcaagtaca acaactacgc cacctactac gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc 960 agccgggacg acagcaagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac 1020 accgccgtgt actattgtgt gcggcacggc aacttcggca acagctatgt gtcttggttt 1080 gcctactggg gccagggcac cctcgtgacc gtgtcaagcg ctagcgtggc cgctccctcc 1140 gtgtttatct ttcccccatc cgatgaacag ctgaaaagcg gcaccgcctc cgtcgtgtgt 1200 ctgctgaaca atttttaccc tagggaagct aaagtgcagt ggaaagtgga taacgcactg 1260 cagtccggca actcccagga atctgtgaca gaacaggact ccaaggacag cacctactcc 1320 ctgtcctcca ccctgacact gtctaaggct gattatgaga aacacaaagt ctacgcctgc 1380 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 1440 gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgaag ctgctggcgg cccttctgtg 1500 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 1560 tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 1620 ggcgtggaag tgcacaacgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 1680 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1740 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1800 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 1860 aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1920 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1980 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 2040 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 2100 ctctccctgt ctccgggtaa atga 2124 <210> 387 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DP47 GS (VH-CH1)-Fc(hole) P329GLALA <400> 387 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60 gtgcaattgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ccggattcac ctttagcagt tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aggcagcgga 360 tttgactact ggggccaagg aaccctggtc accgtctcga gtgctagcac caagggcccc 420 tccgtgttcc ccctggcccc cagcagcaag agcaccagcg gcggcacagc cgctctgggc 480 tgcctggtca aggactactt ccccgagccc gtgaccgtgt cctggaacag cggagccctg 540 acctccggcg tgcacacctt ccccgccgtg ctgcagagtt ctggcctgta tagcctgagc 600 agcgtggtca ccgtgccttc tagcagcctg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac 660 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaggtggagc ccaagagctg cgacaaaact 720 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gctgcagggg gaccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag ccctcggcgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtgcac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctctcgt gcgcagtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctcg tgagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tctccgggta aatga 1395 <210> 388 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain humanized CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1) <400> 388 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60 gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120 tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180 cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240 gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300 ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360 ggaggcacca agctgacagt gctgagcagc gcttccacca aaggcccttc cgtgtttcct 420 ctggctccta gctccaagtc cacctctgga ggcaccgctg ctctcggatg cctcgtgaag 480 gattattttc ctgagcctgt gacagtgtcc tggaatagcg gagcactgac ctctggagtg 540 catactttcc ccgctgtgct gcagtcctct ggactgtaca gcctgagcag cgtggtgaca 600 gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 660 aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc aagtcttgtt ga 702 <210> 389 <211> 1836 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Darpin (HER2) - humanized CD3 CH2527 (VH-CK)-Fc(knob) P329GLALA <400> 389 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgat 60 ctgggcaaga agctgctgga agccgccaga gccggccagg acgacgaagt gcggatcctg 120 atggccaacg gcgccgacgt gaacgccaag gacgagtacg gcctgacccc tctgtatctg 180 gccacagccc acggccacct ggaaatcgtg gaggtgctgc tgaagaacgg ggccgatgtg 240 aacgccgtgg acgccatcgg cttcacacct ctgcacctgg ccgccttcat cggccacctc 300 gagattgccg aggtcctgct gaaacatggc gctgacgtga acgctcagga caagttcggc 360 aagaccgcct tcgacatcag catcggcaac ggcaacgagg acctggccga gatcctgcag 420 aagctgggcg gaggagggtc cggaggcgga ggatccgagg tgcagctgct ggaatctggc 480 ggcggactgg tgcagcctgg cggatctctg agactgagct gtgccgccag cggcttcacc 540 ttcagcacct acgccatgaa ctgggtgcgc caggcccctg gcaaaggcct ggaatgggtg 600 tcccggatca gaagcaagta caacaactac gccacctact acgccgacag cgtgaagggc 660 cggttcacca tcagccggga cgacagcaag aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg 720 cgggccgagg acaccgccgt gtactattgt gtgcggcacg gcaacttcgg caacagctat 780 gtgtcttggt ttgcctactg gggccagggc accctcgtga ccgtgtcaag cgctagcgtg 840 gccgctccct ccgtgtttat ctttccccca tccgatgaac agctgaaaag cggcaccgcc 900 tccgtcgtgt gtctgctgaa caatttttac cctagggaag ctaaagtgca gtggaaagtg 960 gataacgcac tgcagtccgg caactcccag gaatctgtga cagaacagga ctccaaggac 1020 agcacctact ccctgtcctc caccctgaca ctgtctaagg ctgattatga gaaacacaaa 1080 gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 1140 aggggagagt gtgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga agctgctggc 1200 ggcccttctg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1260 cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 1320 tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1380 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1440 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1500 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atgccgggat 1560 gagctgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1620 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1680 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1740 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1800 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1836 <210> 390 <211> 1110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Darpin (HER2) -Fc(hole) P329GLALA <400> 390 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgat 60 ctgggcaaga agctgctgga agccgccaga gccggccagg acgacgaagt gcggatcctg 120 atggccaacg gcgccgacgt gaacgccaag gacgagtacg gcctgacccc tctgtatctg 180 gccacagccc acggccacct ggaaatcgtg gaggtgctgc tgaagaacgg ggccgatgtg 240 aacgccgtgg acgccatcgg cttcacacct ctgcacctgg ccgccttcat cggccacctc 300 gagattgccg aggtcctgct gaaacatggc gctgacgtga acgctcagga caagttcggc 360 aagaccgcct tcgacatcag catcggcaac ggcaacgagg acctggccga gatcctgcag 420 aagctggaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 480 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 540 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 600 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 660 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 720 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 780 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tgcaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 840 accaagaacc aggtcagcct ctcgtgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 900 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 960 gactccgacg gctccttctt cctcgtgagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1020 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1080 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1110

Claims (68)

  1. 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분, 및 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    상기 하나의 항원 결합 부분은 Fab 분자이거나 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 다른 항원 결합 부분은 단일 도메인 항원 결합 분자를 포함하는,
    T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 단일 도메인 항원 결합 분자가 단일 도메인 가변 중쇄인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  3. 제 2 항에 있어서, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분은 단일 도메인 가변 중쇄로 이루어지는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  4. 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분, 및 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    상기 하나의 항원 결합 부분은 Fab 분자이거나 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 다른 항원 결합 부분은 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질인,
    T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  5. 제 4 항에 있어서, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 제 2 항원 결합 부분은 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 제 2 항원 부분은 2, 3, 4 또는 5 개의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인을 추가로 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 1 개 이하의 항원 결합 부분을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의로 펩티드 링커를 통해, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분이 서로 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 3 항원 결합 부분을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  12. 제 11 항에 있어서, 제 3 항원 결합 부분이 단일 도메인 항원 결합 분자인 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  13. 제 12 항에 있어서, 단일 도메인 항원 결합 분자가 단일 도메인 가변 중쇄인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  14. 제 13 항에 있어서, 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자:
    a) 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인;
    b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자를 포함하는 제 1 항원 결합 부분으로서, 크로스오버 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 1 항원 결합 부분;
    c) 단일 도메인 가변 중쇄를 포함하는 제 2 항원 결합 부분으로서, 단일 도메인 가변 중쇄가 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 2 항원 결합 부분; 및
    d) 단일 도메인 가변 중쇄를 포함하는 제 3 항원 결합 부분으로서, 단일 도메인 가변 중쇄가 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 제 3 항원 결합 부분.
  15. 제 11 항에 있어서, 제 3 항원 결합 부분이 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  16. 제 15 항에 있어서, 제 3 항원 결합 부분이 2, 3, 4 또는 5 개의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자:
    a) 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인;
    b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자를 포함하는 제 1 항원 결합 부분으로서, 크로스오버 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 1 항원 결합 부분;
    c) 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질을 포함하는 제 2 항원 결합 부분으로서, 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는 제 2 항원 결합 부분; 및
    d) 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질을 포함하는 제 3 항원 결합 부분으로서, 하나 이상의 안키린 반복 모티프를 포함하는 결합 단백질이 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 제 3 항원 결합 부분.
  18. 제 14 항 또는 제 17 항에 있어서, 제 1 항원 결합 부분은 활성화 T 세포 항원에 결합하고, 제 2 및 제 3 항원 결합 부분은 동일한 표적 세포 항원에 결합하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  19. 제 7 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 IgG, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4, Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  20. 제 19 항에 있어서, Fc 도메인이 인간 Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  21. 제 7 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 연합을 촉진하는 수식을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  22. 제 21 항에 있어서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내에 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 공동에 위치가능한 융기를 생성하고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내에 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 융기가 내부에 위치가능한 공동을 생성하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  23. 제 7 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  24. 제 7 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  25. 제 24 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 L234, L235, 및 P329 의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  26. 제 25 항에 있어서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛이 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3 개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환이 L234A, L235A 및 P329G 인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  27. 제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 수용체가 Fcγ 수용체인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  28. 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 기능이 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  29. 하기를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자:
    제 1 및 제 2 항원 결합 부분으로서, 그 중 하나는 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 분자이고, 다른 하나는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 분자이고,
    제 1 항원 결합 부분은
    (a) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 펩티드 링커에 의해 연결되어 있는 단일 사슬 Fab 분자, 또는
    (b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자인
    제 1 및 제 2 항원 결합 부분; 및
    안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 Fc 도메인으로서,
    제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛이 이종이합체 형성에 정전기적으로 유리한 하나 이상의 하전된 아미노산을 포함하도록 수식된 Fc 도메인.
  30. 제 29 항에 있어서, 제 1 서브유닛은 아미노산 돌연변이 E356K, E357K 및 D399K 를 포함하고, 제 2 서브유닛은 아미노산 돌연변이 K370E, K409E 및 K439E 를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  31. 제 29 항에 있어서, 제 1 서브유닛은 아미노산 돌연변이 K392D, K409D 를 포함하고, 제 2 서브유닛은 아미노산 돌연변이 E356K, D399K (DDKK) 를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  32. 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 T 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 1 개 이하의 항원 결합 부분을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  33. 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의로 펩티드 링커를 통해, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분이 서로 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  34. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  35. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서, 제 1 항원 결합 부분이 크로스오버 Fab 분자이고, 임의로 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄 및 제 2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄가 서로 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  37. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제 2 항원 결합 부분이 Fab 경쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  38. 제 29 항 내지 제 33 항, 제 35 항 또는 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제 2 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  39. 제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  40. 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분이 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  41. 제 29 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 부분을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  42. 제 41 항에 있어서, 제 3 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, 제 2 및 제 3 항원 결합 부분이 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  44. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, 제 1 및 제 3 항원 결합 부분이 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되어 있고, 제 2 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  45. 제 43 항에 있어서, 제 2 및 제 3 항원 결합 부분 및 Fc 도메인이 면역글로불린 분자, 특히 IgG 클래스 면역글로불린의 일부인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  46. 제 29 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 IgG, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4, Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  47. 제 29 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 인간 Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  48. 제 29 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  49. 제 29 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  50. 제 49 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 L234, L235, 및 P329 의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  51. 제 50 항에 있어서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛이 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3 개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G 인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  52. 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 T 세포 항원이 CD3 인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  53. 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포 항원이 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), CD19, CD20, CD33, 암배아 항원 (CEA) 및 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  54. 제 1 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 조각을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  55. 제 54 항의 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드.
  56. 제 54 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
  57. 제 54 항의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 제 56 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  58. 제 1 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 생산 방법으로서, a) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 제 57 항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 b) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  59. 제 58 항의 방법에 의해 생산된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  60. 제 1 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  61. 제 1 항 내지 제 53 항 또는 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학적 조성물.
  62. 제 1 항 내지 제 53 항 또는 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 그것을 필요로 하는 개체에서의 질환의 치료에서 사용하기 위한, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학적 조성물.
  63. 제 62 항에 있어서, 질환이 암인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학적 조성물.
  64. 그것을 필요로 하는 개체에서의 질환의 치료를 위한 의약을 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도.
  65. 개체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 개체에게 약학적으로 허용가능한 형태의 제 1 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  66. 제 64 항 또는 제 65 항에 있어서, 질환이 암인, 용도 또는 방법.
  67. 표적 세포를 T 세포의 존재 하에 제 1 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 세포의 용해의 유도 방법.
  68. 위에 기재된 바와 같은 발명.
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