JP2023538115A - Ｃｅａｃａｍ陽性がんを治療するための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＣＥＡに特異的な第１の活性化因子受容体と、第２の抑制性受容体と、を含む、免疫細胞、並びにがんの治療のためにそれを作製及び使用する方法を提供する。【選択図】図１６

Description

関連出願
本出願は、２０２０年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／０６８，２４４号の優先権及び利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、養子細胞療法及びがん治療の分野に関する。
参照による配列表の組み込み
配列表の項目の出願は、ＥＦＳ－ＷＥＢを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出されている配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年８月１７日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、Ａ２ＢＩ＿０２２＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前であり、９１４ＫＢサイズである。
細胞療法は、様々な疾患、特にがんの治療のための強力なツールである。従来の養子細胞療法において、免疫細胞は、特異的受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作され、これにより、標的細胞によって発現されるリガンドとの受容体の相互作用を介して細胞標的に対する免疫細胞の活性化が誘導される。多くの標的が正常な組織で発現されるため、好適な標的分子の同定は依然として困難である。この発現は、移植された細胞が、標的分子を発現する正常な組織を標的とするときに毒性をもたらし得る。したがって、養子細胞療法による、疾患、特にがんの治療に有用な組成物及び方法が当該技術分野において必要とされている。
本開示は、養子細胞療法において使用される免疫細胞の特異性を増加させるための組成物及び方法を提供する。本開示は、標的抗原を発現する標的細胞に対する免疫細胞の特異性を増加させる２受容体系を含む、免疫細胞を提供する。免疫細胞は、標的抗原による第１の受容体の結合に応答して免疫細胞を活性化する第１の活性化因子受容体を含む。免疫細胞は、非標的抗原に特異的な第２の抑制性受容体を更に含む。この第２の受容体は、第２の受容体が非標的抗原によって結合されているとき、第１の受容体が標的抗原によって結合されているときであっても、免疫細胞の活性化を阻害する。
本開示は、免疫細胞であって、（ａ）ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体と、（ｂ）ＣＥＡ＋がん細胞において喪失した非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体と、を含み、第１の受容体が、ＣＥＡに応答する活性化因子受容体であり、第２の受容体が、非標的抗原に応答する抑制性受容体である、免疫細胞を提供する。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、非標的抗原は、ヘテロ接合性の喪失によってＣＥＡ＋がん細胞において喪失している。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質の対立遺伝子バリアントに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃタンパク質の対立遺伝子バリアントに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるような相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号１０３～１０８若しくは配列番号１０９～１１４の相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は配列番号１０３～１０８若しくは配列番号１０９～１１４のＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表５に開示されるポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列から選択されるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号９１～１０２のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第１の受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号５５～５８からなる群から選択される重鎖相補性決定領域（ＨＣ－ＣＤＲ）のセットを含む重鎖可変（ＶＨ）部分、及び配列番号５９～６３からなる群から選択される軽鎖相補性決定領域のセットを含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又は配列番号５５～５８若しくは配列番号５９～６３と比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号５５～５７を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣ－ＣＤＲ）のセットを含む重鎖可変（ＶＨ）部分、並びに配列番号５９、６１、及び６３を含む軽鎖相補性決定領域のセットを含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又は配列番号５５～５７若しくは配列番号５９、６１、及び６３と比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号１４４を含む重鎖可変（ＶＨ）部分、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列、及び配列番号１４８を含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又はそれと８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号６６～７０からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号６８のｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第１の受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号７１の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号７５の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１５８の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号５２の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第２の受容体は、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインは、配列番号１３１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントは、配列番号１３５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号１３４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、それらのうちのいずれかの機能的バリアント、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、及びＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号１３２、又は配列番号１３２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、若しくはそれと同一である配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第２の受容体は、配列番号１６４の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＣＥＡ＋がん細胞は、膵臓がん細胞、結腸直腸がん細胞、肺がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、頭頸部がん細胞、胆嚢がん細胞、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん細胞、又は急性骨髄性白血病がん細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ＋がん細胞は、肺がん細胞、結腸直腸がん細胞、又は膵臓がん細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ＋がん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現しないＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２の喪失をもたらす、ＨＬＡ－Ａにおけるヘテロ接合性の喪失によってＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋細胞から派生する。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体はともに、ヘテロ接合性の喪失を有するＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２ーがん細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体はともに、ヘテロ接合性の喪失によってＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失していないＣＥＡ＋細胞の存在下では免疫細胞を特異的に活性化しない。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現及び／又は機能は、低下又は除去されている。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、干渉ＲＮＡを含むポリヌクレオチドを更に含み、干渉ＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、表１１に示す配列の群から選択される配列、又はそれに対して最大で１、２、３、若しくは４個の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、（ａ）Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第１の配列と、（ｂ）第１の配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第２の配列と、を含み、第１の配列及び第２の配列が、ｓｈＲＮＡを形成する。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号１７９）若しくはＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号１８０）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む配列によってコードされる。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現及び／又は機能は、低下又は除去されている。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ２Ｍをコードする配列に対する１つ以上の修飾を更に含み、１つ以上の修飾が、Ｂ２Ｍの発現を低下させ、かつ／又は機能を除去する。いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は、Ｂ２Ｍをコードする内因性遺伝子の１つ以上の不活性化変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の不活性化変異は、欠失、挿入、置換、又はフレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の不活性化変異は、Ｂ２Ｍをコードする内因性遺伝子の配列を特異的に標的とする少なくとも１つのガイド核酸（ｇＮＡ）との複合体において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼとともに導入される。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、表１０に示す配列セットの群から選択される配列、又はそれに対して最大で１、２、３、若しくは４個の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現及び／又は機能は、低下又は除去されている。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む、干渉ＲＮＡを含むポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、（ａ）ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第１の配列と、（ｂ）第１の配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第２の配列と、を含み、第１の配列及び第２の配列が、ｓｈＲＮＡを形成する、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、表１２に記載の配列群から選択される配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現及び／又は機能は、低下又は除去されている。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする内因性遺伝子の配列に対する１つ以上の修飾を含み、１つ又は修飾が、ＨＬＡ－Ａ＊０２の発現を低下させ、かつ／又は機能を除去する。いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする内因性遺伝子の１つ以上の不活性化変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の不活性化変異は、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする内因性遺伝子の配列を特異的に標的とする少なくとも１つのガイド核酸（ｇＮＡ）との複合体において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼとともに導入される。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、表９に記載の配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号５２の配列を含み、第２の受容体は、配列番号１６４の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号１７９）を含む配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列によってコードされるｓｈＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体は、単一のポリヌクレオチドによってコードされ、第１及び第２の受容体をコードする配列は、自己切断ポリペプチドをコードする配列によって分離される。いくつかの実施形態において、自己切断ポリペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８１）の配列を含むＴ２Ａ自己切断ポリペプチドを含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己由来である。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、同種異系である。
本開示は、治療有効量の本開示の免疫細胞を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む。
本開示は、ＣＥＡ＋がんの治療における医薬として使用するための治療有効量の本開示の免疫細胞を含む、医薬組成物を提供する。
本開示は、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系であって、（ａ）ＣＥＡ細胞接着分子５陽性（ＣＥＡ）に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体と、（ｂ）ＣＥＡ＋がん細胞において喪失している非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体と、をコードするポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含み、第１の受容体が、ＣＥＡ＋がん細胞上のＣＥＡに応答する活性化因子受容体であり、第２の受容体が、非標的抗原に応答する抑制性受容体である、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系を提供する。
本開示のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、本開示の免疫細胞の生成に使用するための、第１の受容体及び第２の受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
本開示のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、Ｂ２Ｍに特異的なｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体、第２の受容体、及びＢ２Ｍに特異的なｓｈＲＮＡをコードする配列は、同じポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、（ａ）Ｂ２Ｍに特異的なｓｈＲＮＡをコードする配列は、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号１７９）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）第１の受容体をコードする配列は、配列番号１４３、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、（ｃ）第２の受容体をコードする配列は、配列番号１６５、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
本開示は、本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。
本開示は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を有するＣＥＡ＋がん細胞を死滅させる方法であって、有効量の本開示の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を有するＣＥＡ＋腫瘍を有する対象においてＣＥＡ＋がんを治療する方法であって、有効量の本開示の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示は、対象においてがんを治療する方法であって、（ａ）対象の正常細胞及び複数のがん細胞のＨＬＡ－Ａ遺伝子型又は発現を決定することと、（ｂ）任意選択で、対象の複数のがん細胞におけるＣＥＡの発現を決定することと、（ｃ）正常細胞がＨＬＡ－Ａ＊０２を発現し、複数のがん細胞がＨＬＡ－Ａ＊０２を発現せず、複数のがん細胞がＣＥＡ陽性である場合、有効量の本開示の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することと、を含む、方法を提供する。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、対象は、ＣＥＡ（ＣＥＡ＋）を発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した悪性腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２患者である。いくつかの実施形態において、対象は、ＣＥＡを発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した再発性切除不能又は転移性固形腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２患者である。いくつかの実施形態において、がんは、膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、胆嚢がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん、又は急性骨髄性白血病を含む。いくつかの実施形態において、がんは、肺がん、結腸直腸がん、又は膵臓がんを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、がん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現しないＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２がん細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２の喪失をもたらす、ＨＬＡ－Ａにおけるヘテロ接合性の喪失によってＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋細胞から派生する。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体はともに、ＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体はともに、ＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失していないＣＥＡ＋細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化しない。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象における腫瘍のサイズを縮小させる。いくつかの実施形態において、腫瘍は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％減少する。いくつかの実施形態において、腫瘍は、除去される。いくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象における腫瘍の増殖を阻止する。いくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象における腫瘍の数を減少させる。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象におけるがん細胞の選択的死滅をもたらすが、正常細胞の死滅をもたらさない。いくつかの実施形態において、死滅した細胞の少なくとも約６０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の少なくとも約６５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の少なくとも約７０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の少なくとも約７５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の少なくとも約８０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の少なくとも約８５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の少なくとも約９０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の少なくとも約９５％は、がん細胞であるか、又は死滅した細胞の約１００％は、がん細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象のがん細胞の少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は全ての死滅をもたらす。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、第１の活性化因子受容体を含むが、第２の抑制性受容体を含まない他の等価の免疫細胞の投与よりも、対象に対して少ない副作用をもたらす。
本開示は、複数の免疫細胞を作製する方法であって、（ａ）複数の免疫細胞を提供することと、（ｂ）本開示のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド系又はベクターで複数の免疫細胞を形質転換することと、を含む、方法を提供する。
本開示は、本開示の免疫細胞又は医薬組成物を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、使用説明書を更に含む。
バリアントＴＮＦＲＳＦ１１Ａエピトープが、タンパク質表面上にあり、おそらく抗体にアクセス可能であることを示す、ＴＮＦＲＳ１１（ＲＡＮＫＬ）に結合したＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）の結晶構造である。 ヒトインテグリンアルファ－Ｅ（ＩＴＧＡＥ）（配列番号１８２）と、ヒトインテグリンアルファ－Ｘ（ＩＴＧＡＸ、Ｐ２０７０２、ＩＴＡＸ＿ヒト）（配列番号１８３）とのアラインメントを示す。ＩＴＧＡＥ ｒｓ１７１６Ｒ９５０Ｗ（１０００ ＧｅｎｏｍｅｓプロジェクトからのＭＡＦ ０．２６５４）及びｒｓ２９７６２３０ Ｖ１０１９Ａ／Ｖ１０１９Ｇ（１０００ ＧｅｎｏｍｅｓプロジェクトからのＭＡＦ ０．２８２）におけるＳＮＰバリアントをボックスに示す。 同上。 ＩＴＧＡＥに対して２７％の同一性を有する、ＩＴＧＡＸの不活性立体構造の結晶構造である。ＩＴＧＡＥ ＳＮＰの位置は、標識されているように示される。 ＲＡＮＫ遮断因子受容体と組み合わせてＣＥＡ ＴＣＲにより治療することができる対処可能な結腸直腸がん（ＣＲＣ）患者集団が、どのＲＡＮＫバリアントが使用されるかに応じて、２，０００～５，０００人の患者と推定されることを示す表である。表では、上記の治療可能な患者の小計は、５，０００～１１，０００人であり、示したように、高ＣＥＡ＋患者のパーセンテージを含む。治療された患者は、以下のように計算される：ＨＬＡ－Ａ＊０２保持頻度（０．５）×ランダム喪失（０．５）×ＲＡＮＫバリアントｈｅｔ頻度（０．２～０．５）×がんＲＡＮＫ ＬＯＨ頻度＝［０．０５～０．１２５］×ＬＯＨ頻度 正常組織におけるＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）の発現を示す。 正常組織におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）の発現を示す。 全てのＴＣＧＡがんにわたるＣＥＡの発現を示す（腫瘍及び正常試料を用いた。略語：ＢＬＣＡ（膀胱がん）、ＢＲＣＡ（乳がん）、ＣＥＳＣ（子宮頸部扁平上皮がん及び子宮頸管腺がん）、ＣＨＯＬ 胆管がん）、ＣＯＡＤ（結腸腺がん）、ＥＳＣＡ（食道がん）、ＧＢＭ（多形膠芽腫）、ＨＮＳＣ（頭頸部扁平上皮がん）、ＫＩＣＨ（嫌色素性腎臓）、ＫＩＲＰ（腎臓乳頭状腎細胞がん）、ＬＩＨＣ（肝臓肝細胞がん）、ＬＵＡＤ（肺腺がん）、ＬＵＳＣ（肺扁平上皮がん）、ＰＡＡＤ（膵臓腺がん）、ＰＲＡＤ（前立腺腺がん）、ＰＣＰＧ（褐色細胞腫及び傍神経節腫）、ＲＥＡＤ（直腸腺がん）、ＳＡＲＣ（肉腫）、ＳＫＣＭ（皮膚黒色腫）、ＴＨＣＡ（甲状腺がん）、ＴＨＹＭ（胸腺腫）、ＳＴＡＤ（胃腺がん）、ＵＣＥＣ（子宮体子宮内膜がん）。 ＴＣＧＡがんにわたるＴＮＦＧＳＦ１１Ａの発現を示す（腫瘍及び正常試料を用いた）。 米国がん協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）から得た統計である、がん部位による米国における推定死亡者数を示す表である。 ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体が、ＣＥＡ ＣＡＲによるＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を遮断することができることを示す一連のプロットである。 潜在的な非標的抗原（遮断因子）候補遺伝子を同定するために使用されるバイオインフォマティクス検索プロセスを示す図である。 ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を使用して、腫瘍組織と正常組織との区別を示す一対の図である。操作された免疫細胞は、腫瘍を死滅させるが、正常細胞を温存する。例示的な実施形態の場合、免疫細胞はＣＥＡ ＣＡＲを発現し、活性化因子抗原はＣＥＡであり、遮断因子抗原はＨＬＡ－Ａ＊０２である。腫瘍におけるＨＬＡ－Ａ＊０２の生殖細胞系ヘテロ接合性及びＨＬＡ－Ａ＊０２のクローン性ＬＯＨを有する患者を選択する。 ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体を含む、本開示の例示的な二重受容体系の分子組成を示す図である。 ＨｅＬａ細胞におけるＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抗原の発現を示す。Ａ＊０２：ＨＬＡ－Ａ＊０２。 ＣＥＡ活性化因子及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体が、細胞傷害性についての標的として操作されたＨｅＬａ細胞を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞において機能することを示す。Ａ＊０２：ＨＬＡ－Ａ＊０２；Ｔｍｏｄ：細胞は、ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を発現する；ＣＡＲ：細胞は、ＣＥＡ ＣＡＲのみを発現する。 ＣＥＡ活性化因子及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体が、ＨｅＬａ細胞上の単一のドナー由来のドナーＴ細胞において機能することを示す。Ｔｍｏｄ：細胞は、ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を発現する；ＣＡＲ：細胞は、ＣＥＡ ＣＡＲのみを発現する。 ＣＥＡ活性化因子及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体が、ＨｅＬａ細胞上の４人のドナー由来のＴ細胞において機能すること示す。Ｔｍｏｄ：細胞は、ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を発現する；ＣＡＲ：細胞は、ＣＥＡ ＣＡＲのみを発現する。標的細胞は、ＣＥＡのみ又はＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａ＊０２を発現するＨｅＬａ細胞である。 ＨｅＬａ細胞におけるｍＲＮＡ滴定によるＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａ＊０２の細胞表面発現を示す。Ａ＊０２：ＨＬＡ－Ａ＊０２。 安定に発現されたＣＥＡ活性化因子及びＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子受容体を有するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を使用して、ＨｅＬａ細胞におけるＣＥＡ表面分子の数の関数として測定した、ＣＥＡ ＣＡＲ活性化因子及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＬＲＢ１遮断因子感受性を示す。 ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ（ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２並びにＬＩＬＲＢ１抑制性受容体の両方）、ＣＡＲのみ、及びＣＥＡ ＴＣＲを発現する初代Ｔ細胞の活性化因子及び遮断因子の感受性を示す。活性化因子についての用量応答曲線（右）は、ＣＥＡ ＣＡＲ、ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子（Ｔｍｏｄ）を有するＣＥＡ ＣＡＲ、及びＣＥＡ ＴＣＲについて示されているが、抑制性受容体（遮断因子）についての用量応答曲線は、ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子（Ｔｍｏｄ）を有するＣＥＡ ＣＡＲについてのみである。Ａ＊０２：ＨＬＡ－Ａ＊０２。 ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体の組み合わせが、正常な組織を保護しながら腫瘍を死滅させることが予測されることを示す。ＴＰＭ：１００万個当たりの転写産物；Ａ＊０２：ＨＬＡ－Ａ＊０２；ＬＯＨ：ヘテロ接合性の喪失。 分子／細胞をＴＰＭ値に変換するために使用される標準曲線を示す。ＣＥＡ標準曲線（左）のデータは、ＧＴＥｘデータベースからｍＲＮＡ（ＴＰＭ）に対してプロットされたＢａｃａｃ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２２，３２８６－３２９７からのＣＥＡ細胞表面発現を示す。ＴＰＭ：１００万個当たりの転写産物。 Ｈ５０８及びＳＷ１４６３細胞株上のＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａ＊０２の表面発現を示す。ＷＴ：野生型；ＫＯ：示された遺伝子がノックアウトされる。 標的として結腸直腸細胞株を用いてアッセイした、３つのＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナーに由来するＣＥＡ Ｔｍｏｄ発現細胞（ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ抑制性受容体の両方を発現する細胞）の細胞傷害性データを示す。Ａ＊０２：ＨＬＡ－Ａ＊０２。 ＣＥＡ ＴＣＲ又はＴｍｏｄ二重受容体系で形質導入したＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）ドナーＴ細胞を使用した、異なるＥ：Ｔ比での腫瘍及び正常細胞のＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ及びＴＣＲ Ｔ死滅の時間経過を示す。 ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ二重受容体系を発現するエフェクター細胞が、ＣＥＡ ＴＣＲを発現する細胞と同様に腫瘍細胞を死滅させるが、ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）正常Ｈ５０８標的細胞を死滅させる際に活性が約７０倍低いことを示す。腫瘍：ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）標的細胞；Ｂのみ：標的細胞はＨＬＡ－Ａ＊０２のみを発現する；正常：ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）標的細胞。 １：１の比で混合された腫瘍及び正常細胞培養物を提示した場合のＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ二重受容体を発現するエフェクター細胞の選択的細胞傷害性を示す。腫瘍細胞は、ＧＦＰ（緑色）を安定して発現したＨ５０８ ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）細胞であった。正常細胞は、ＲＦＰ（赤色）を安定して発現したＨ５０８ ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）細胞であった。Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）ドナーＤ１２３３３由来であった。スケールバーは５００ミクロンである。 １：１の腫瘍：正常な標的細胞の混合物中でＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体（Ｔｍｏｄ）を発現するエフェクター細胞の特異的死滅の概要を示す。Ｈ５０８標的細胞の遺伝子型は、図２６と同様であり、ＩＬ－２は添加されなかった。ドナーＴ細胞は、ドナー１８３５３４を除き、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）であった。 連続して共培養された標的細胞の画像を示す。細胞傷害性アッセイのために、Ｔ細胞を形質導入し、遮断因子抗原を濃縮し、１つの特定の種類の標的細胞から次の標的細胞に移した。正常細胞及び腫瘍細胞の両方が、ＧＦＰで標識されるが、赤色の疑似色は、腫瘍細胞を可視化するために使用され、緑色は、正常細胞に使用される。スケールバーは５００ミクロンを示す。 反復抗原チャレンジにおけるＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ発現細胞及びＣＥＡ ＣＡＲ発現細胞の時間経過を示す。水平矢印は、標的細胞の種類（腫瘍又は正常なＨ５０８）からの転移を示す。ＣＥＡ ＣＡＲ、又はＴｍｏｄ二重受容体で形質導入されたドナーＴ細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）（Ｄ１２３３３）であった。 可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ；１０ｕｇ／ｍＬ）の存在は、Ｈ５０８細胞におけるＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ細胞傷害性に有意に影響しないことを示す。腫瘍、正常、及びＢの遺伝子型は、以下の通りである：腫瘍：ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）標的細胞；正常：ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）標的細胞；Ｂ：ＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）標的細胞。 ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ二重受容体及びＣＥＡ（＋）標的細胞株を発現するエフェクターＴ細胞を用いた細胞傷害性アッセイを示す。Ｅ：Ｔは、標的細胞共培養物について３：１であり、Ｈ５０８標的細胞を使用した。Ｂは、ＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）標的細胞のみを指す。 ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ二重受容体及びＣＥＡ（＋）標的細胞株を発現するエフェクターＴ細胞を用いた細胞傷害性アッセイを示す。Ｅ：Ｔは、標的細胞共培養物について３：１であり、ＳＷ１４６３標的細胞を使用した。Ｂのみ、ＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）標的細胞。 ＣＥＡ Ｔｍｏｄ二重受容体を発現するエフェクターＴ細胞（細胞は、別個の活性化因子及び遮断因子レンチウイルスベクターを使用して形質導入された）が、結腸直腸がん細胞株Ｈ５０８における腫瘍細胞対正常細胞の選択的死滅を可能にすることを示す。Ｔｍｏｄ受容体を発現するＴ細胞は、ベンチマークＣＥＡ ＴＣＲよりも正常細胞に対して感受性が高かったが、より選択的であった。Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナー（Ｄ４８０９）に由来した。 ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナー細胞（Ｄ４８０９）における、ＣＥＡ Ｔｍｏｄ二重受容体（２つの別個のレンチウイルスベクターを介して送達された）を発現するエフェクターＴ細胞による可逆的細胞傷害性の定量化を示す。Ｔ細胞を、ラウンド１で最初に腫瘍又は正常細胞のいずれかに曝露し、次いで、それぞれ、ラウンド２で正常細胞又は腫瘍細胞に曝露し、選択的腫瘍対正常細胞死滅を測定した。ＷＴ：野生型；Ａ２ＫＯ：ＨＬＡ－Ａ＊０２ノックアウト。 ヒト成人組織遺伝子発現の９０％超を表すように選択された細胞株パネルを使用した、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ二重受容体オフターゲット選択性のＪｕｒｋａｔ細胞アッセイを示す。Ｔｍｏｄ受容体を発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、表２６に記載の個々の標的細胞株と共培養した。腫瘍細胞を表す陽性対照細胞株を、２ｕｇのＣＥＡ ｍＲＮＡ又は天然に発現したＣＥＡでトランスフェクトした。正常細胞は、ＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）である。水平破線は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔｍｏｄ受容体を発現する）のみからのデータの平均＋標準偏差（ＳＤ）の２倍に配置される。共培養物は、各ウェルにおける１０，０００（１０Ｋ）のＪｕｒｋａｔ細胞及び１０Ｋの標的細胞のものであった。左のバー：ＣＥＡ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）細胞を伴うＴｍｏｄ二重受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞；中央のバー：ＣＥＡ（－）標的細胞を伴うＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞；右のバー、ＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）標的細胞を伴う両方の受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞。陰性対照は、灰色のボックス内にある。 ３人のＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）ドナーに由来するＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ二重受容体を発現するエフェクターＴ細胞についての細胞傷害性データの概要を示す。ＵＴＤ、非形質導入。 初代Ｔエフェクター細胞を使用した選択性データの概要を示す。 ＣＥＡ ＣＡＲ又はＣＥＡ Ｔｍｏｄ二重受容体を発現するヒトＴ細胞を用いたマウス異種移植片研究の設計を示す。異種移植片の実験設計及び腫瘍体積対時間を示す。 マウス異種移植片研究においてキャリパーによって測定された腫瘍体積を示す。エラーバーはＳＥＭである。Ｎ＝７匹のマウス／群（生理食塩水及びＵＴＤ、又は非形質導入群では５匹）；異種移植片＝ホタルルシフェラーゼを発現するＨ５０８結腸がん細胞株；用量＝尾静脈注射による２Ｅ７ヒトＴ細胞／マウス。ＢＬＩ％変化＝１００×（ｔ日目のＢＬＩ－３５日目のＢＬＩ）／（３５日目のＢＬＩ）。右下のｙ軸上の－１００％は、生物発光シグナルがゼロであること、すなわち、あらゆる残存腫瘍細胞の証拠がないことを示す。マウス血中のヒトＴ細胞を、ｈＣＤ３ ｍＡｂで検出した。 生物発光（ルセリファーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆａｓｅ））を経時的に測定するために使用した、各群（図４０のそれらのサブセット）からの５匹のマウスの画像を示す。１匹のＴｍｏｄマウス（左から２番目、６４日目）は、誤ってＢＬＩ基質を受けなかった。 マウス当たり５Ｅ６のＴ細胞のＴ細胞用量についての異種移植片研究結果を示す。中央の一番下のパネルは、より高い解像度での腫瘍体積を示すために、上のパネルからの再プロットされたデータを示す。ＵＴＤ：非形質導入；ＣＡＲ、ＣＥＡ ＣＡＲのみで形質導入されたＴ細胞；Ｔｍｏｄ、ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体で形質導入されたＴ細胞。 マウス異種移植片研究からの個々の腫瘍データを示す。薄い灰色の細い線：個々のマウス；黒い太い線：平均；点線の垂線：Ｔ細胞注射日（３５日目）。ＵＴＤ、非形質導入Ｔ細胞；ＣＡＲ、ＣＥＡ ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞、Ｔｍｏｄ、ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ＳｃＦｖ ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体の両方で形質導入されたＴ細胞；生理食塩水、生理食塩水対照を注射されたマウス。 異種移植片研究の個々のマウスにおける生物発光（ＢＬＩ）を示す。ＢＬＩ％を、図４０に記載されるように決定した。ＵＴＤ、非形質導入Ｔ細胞；ＣＡＲ、ＣＥＡ ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞、Ｔｍｏｄ、ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ＳｃＦｖ ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体の両方で形質導入されたＴ細胞；生理食塩水、生理食塩水対照を注射されたマウス。 異種移植片研究からのマウスの脾臓からの細胞分析を示す。Ｔ細胞注射の３０日後に細胞を回収した。 ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原が、正常細胞に対するトランスでの遮断因子受容体結合／機能を妨げるために、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）Ｔ細胞におけるシスでのＨＬＡ－Ａ＊０２ Ｔｍｏｄ遮断因子受容体にどのように結合することができるかを示す図である。この効果は、標識されたＨＬＡ－Ａ＊０２四量体及び機能的アッセイによって検出することができる。 Ｂ２Ｍに対するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＢ２Ｍ ｓｈＲＮＡを使用したＣＲＩＳＰＲが、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）Ｔ細胞における細胞表面上のＨＬＡ発現を低下させ、遮断因子受容体の利用可能性を増加させることを示す。 ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖＬＩＬＲＢ１抑制性受容体（Ｔｍｏｄ）を発現する第１世代の自己Ｔ細胞へのシス結合に対するＢ２Ｍ ｓｈＲＮＡ構築物の効果を示す。 急性細胞傷害性アッセイにおけるサイトカイン分泌を示す。腫瘍細胞は、ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）Ｈ５０８細胞であり、正常細胞は、ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）Ｈ５０８細胞であった。Ｌ．Ｄ．、検出限界＝バックグラウンド＋各アッセイについての標準偏差の３倍。 ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体が、ＨｅＬａ標的細胞を使用してアッセイした場合、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）及びＨＬＡ－Ａ＊０２（－）Ｊｕｒｋａｔ細胞において同等に感受性であることを示す。 ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体を発現するＴ細胞におけるＢ２Ｍ ｓｈＲＮＡの同時発現が、初代Ｔ細胞上のプローブに結合するように受容体を解放させることを示す。 急性細胞傷害性アッセイにおけるサイトカイン分泌を示す。腫瘍、ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）Ｈ５０８細胞；正常なＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）Ｈ５０８細胞；Ｌ．Ｄ．、検出限界＝バックグラウンド＋各アッセイについての標準偏差の３倍。 本明細書に記載のいくつかの実施形態の二重受容体系の特性を要約した表である。
本明細書では、がんと正常な野生型細胞との間のリガンドの遺伝子発現の相違に応答する２つの受容体系を含む免疫細胞を使用してがんを治療するための組成物及び方法が提供される。これらの発現の相違は、がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失に起因し得る。代替的に、発現の相違は、遺伝子発現が、がん細胞において発現されないか、又は正常細胞よりも低いレベルでがん細胞において発現されるためであり得る。２受容体系は、免疫細胞、例えば、養子細胞療法において使用される免疫細胞において発現され、これらの免疫細胞の活性を、ヘテロ接合性の喪失又は発現の相違を示すがん細胞に標的化する。この２受容体系において、第１の受容体（活性化因子受容体、本明細書においてＡモジュールと称されることがある）は、免疫細胞を活性化するか、又はその活性化を促進するのに対して、第２の受容体（抑制性受容体、本明細書において遮断因子、又は抑制因子受容体、又はＢモジュールと称されることがある）は、第１の受容体による免疫細胞の活性化を阻害するように作用する。各受容体は、特異的リガンドに結合するリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含有する。リガンド結合時の２つの受容体からのシグナルは、免疫細胞によって統合される。例えば、がん細胞において抑制性リガンドをコードする遺伝子座のヘテロ接合性の喪失、又は転写レベルの相違による、がん細胞及び正常細胞における第１及び第２の受容体に対するリガンドの差次的発現は、第１の活性化因子リガンドを発現するが、第２の抑制性リガンドを発現しない標的がん細胞による免疫細胞の活性化を媒介する。
本明細書に提供される組成物及び方法の特定の実施形態において、本明細書に記載の２受容体系を含む免疫細胞は、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）陽性がんを治療するために使用される。これは、胃腸（ＧＩ）管のＣＥＡ陽性がんを含む。ＣＥＡ陽性がんの場合、活性化因子受容体の標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＣＥＡ又はそのペプチド抗原である。ＣＥＡは、膜から切断され、可溶性形態で放出され得る表面タンパク質として、ＧＩ組織において正常な成人で主に発現される。ＧＩ腫瘍におけるその選択的発現のために、これは、適切な治療薬でＣＥＡ陽性がん細胞を特異的に標的とすることができる場合、ＧＩ腫瘍の選択的死滅を媒介することができる、魅力的な腫瘍特異的抗原であると長らくみなされてきた。更に、ＣＥＡ遺伝子産物は、実質的に全ての結腸直腸腫瘍（及び他の固形腫瘍の多くのサブセット）におけるその高発現及び成人組織における限定的な発現のために、がんのための魅力的な標的である。しかしながら、非がん（非標的）細胞における正常なＣＥＡ発現は、養子細胞療法などの標的療法に対するＣＥＡの有効な使用を妨げている。ＣＥＡに対するいくつかの治療法は、臨床で試験されており、用量制限毒性（ＤＬＴ）として大腸炎を誘発することが見出された。２０１１年において、ＨＬＡ－Ａ＊０２と複合体化したＣＥＡペプチド（すなわち、ｐＭＨＣ）に対するマウスＴＣＲを用いた臨床試験は、結腸に対する局在的毒性のために、第１相試験（ｎ＝３）において中止された（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１１ １９（３）：Ｐ６２０－６２６、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９ Ｊａｎ １；１５（１）：１６９－１８０）。ＤＬＴは、２～４Ｅ８細胞／患者の著しく低い用量で生じた。
腫瘍のサブセットにおけるＨＬＡヘテロ接合型遺伝子喪失は、オンターゲット、オフ腫瘍毒性から患者を保護するために利用され得る。活性化因子受容体を抑制性受容体と対にすることにより、本明細書で提供される方法は、養子細胞療法の特異性を増加させ、用量制限毒性などの、これらの療法と関連する有害な作用を減少させる。ＣＥＡ活性化因子受容体及びＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抑制性受容体を含む免疫細胞は、インビトロ及びインビボでＡ＊０２（－）腫瘍細胞を選択的に死滅させた。これらの免疫細胞は、臨床的に活性なＣＥＡ ＴＣＲ－Ｔ細胞と同じくらい強力であったが、ＨＬＡ－Ａ＊０２を欠く腫瘍細胞に対しては非常に選択的であった。抑制性受容体と対にされたＣＥＡ ＣＡＲは、その活性が、正常な組織がＣＥＡ媒介性細胞傷害性から保護され得るように、腫瘍細胞内で欠失された遺伝子によって指示される固形腫瘍治療候補である。
いくつかの実施形態において、活性化因子に対するリガンドは、ＭＨＣクラスＩと複合体化されたＣＥＡペプチド、例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含むＭＨＣ複合体である。本明細書に記載される方法において、このＣＥＡ標的化活性化因子受容体は、抑制性受容体と対にされ、これにより、正常なＣＥＡ陽性組織に対するその細胞溶解作用を遮断することによって活性化因子の安全ウィンドウが増加する。理論に拘束されることを望まないが、これらの組織は主に胃腸管にあると考えられている。しかしながら、腫瘍細胞は、抑制因子、又は遮断因子、受容体に対するリガンドを発現しないため、活性化因子受容体は依然として、２受容体系を含む免疫細胞による腫瘍細胞の標的化死滅を誘導する。第２の抑制性受容体に対する標的は、胃腸（ＧＩ）組織によって発現されるが、がん細胞においては発現されず、抑制性受容体は、この「非標的抗原」を抑制刺激として認識する。第２の抑制性受容体に対する例示的な標的は、正常なＧＩ上皮細胞の表面上で発現され、ヘテロ接合性（ＬＯＨ）又は他の機構の喪失によりＧＩ腫瘍細胞から喪失され、抑制性受容体上の対立遺伝子特異的リガンド結合ドメインを介して他の対立遺伝子と区別することができるがん細胞内に単一の対立遺伝子形態を残す。抑制性受容体の例示的な標的には、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）などの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及び他のＨＬＡ。ＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０１．、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、及びその他などのバリアント遺伝子によってコードされ、これらは、ヘテロ接合性の喪失を通じてＣＥＡ陽性がん細胞から喪失され得る。代替的に、抑制性受容体の更なる例示的な標的には、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１１ａ（ＲＡＮＫとも呼ばれる、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、インテグリンサブユニットアルファＥ（ＩＴＧＡＥ）、コリン作動性受容体ニコチン性ベータ１サブユニット（ＡＣＨＲＢ、又はＣＨＲＮＢ）、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（ＴＲＰＶ１）、及びスカベンジャー受容体クラスＦメンバー１（ＳＲＥＣ、又はＳＣＡＲＦ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの各々は、抗体にアクセス可能なその細胞外ドメインにおけるアミノ酸変化を有する、共通の非同義バリアント形態を有し、これは、ＣＥＡ又はＣＥＡ ｐＭＨＣ応答性活性化因子受容体などの活性化因子受容体によって活性化された操作されたＴ細胞を用いてＧＩがん患者を安全に治療するように設計された細胞インテグレーターに対するＢモジュール標的として使用され得る。
本開示の組成物及び方法は、正常なＧＩ組織上のＣＥＡの発現によって引き起こされる用量制限毒性（ＤＬＴ）を減少又は除去することができる。理論に拘束されることを望まないが、ＣＥＡの発現は、限定されるが、臨床における養子細胞療法又は免疫療法に対する標的としてのＣＥＡの更なる進行を妨げた重症度の有害事象を誘発するのにＧＩ管において十分に高いと考えられる。本開示は、第２のリガンド（非標的抗原と呼ばれる、ＣＥＡ以外のリガンド又は代替として、遮断因子抗原）の存在下で養子免疫細胞の活性化を遮断する第２の抑制性受容体を付加することによって、養子細胞療法を使用してＣＥＡ陽性がんを治療するためにがん細胞におけるＣＥＡを標的化する方法を提供する。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、ＣＥＡを発現する腫瘍細胞は、これらの腫瘍細胞が、活性化因子リガンドであるＣＥＡのみを発現するため、２つの受容体を発現する養子免疫細胞によって攻撃される。対照的に、ＣＥＡと非標的抗原（代替的に「遮断因子抗原」と呼ばれる）を発現する正常な細胞は、養子免疫細胞から保護される。正常な細胞上の非標的抗原に対する抑制性受容体の応答により、ＣＥＡ標的化活性化因子受容体による免疫細胞の活性化を防止する。この二重標的化アプローチは、ＣＥＡ陽性のがん患者においてＣＥＡ指向性細胞療法を安全かつ効果的に投与することを可能にする治療ウィンドウを作り出す。
本開示は、オンターゲット毒性を誘導する強力なＣＥＡ ＣＡＲ及びＴＣＲの使用を可能にする方法及び組成物を提供し、これらのＣＥＡ標的化受容体を、それらの毒性を緩和することによって治療薬として有用にする。細胞及び大分子療法を含む、臨床で試験された既存の治療法のいずれも、正常なＣＥＡ陽性組織を保護する機構を提供しない。
変形例では、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、非標的抗原の発現が、非標的抗原をコードする配列における部分的遺伝子欠失、エピジェネティックサイレンシング、及び点変異又は短縮型変異を含むが、これらに限定されない、ヘテロ接合性の喪失以外の原因によって部分的又は完全に低下する、標的細胞を死滅させることができ、かつ／又は対象を治療することができる。
定義
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を提供することは、その定義を理解することに役立ち得る。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を特定の実施形態の実施又は試験に使用することができるが、組成物、方法及び材料の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。本開示の目的のために、以下の用語を以下に定義する。追加の定義は、本開示全体を通して記載されている。
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、基準量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％と同じ程度に変化する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さを指す。一実施形態において、「約」又は「およそ」という用語は、基準量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さについて±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さの範囲を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、その天然の状態で通常それに付随する成分を実質的又は本質的に含まない材料を意味する。特定の実施形態において、「得られた」又は「派生された」という用語は、単離されたと同義的に使用される。
「対象」、「患者」及び「個体」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書において互換的に使用される。インビボで得られた、又はインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞、及びそれらの子孫もまた包含される。本明細書で使用される場合、「対象」、「患者」又は「個体」は、本明細書で企図されるベクター、組成物、及び方法で治療され得る疼痛を示す任意の動物を含む。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、又はモルモットなど）、農場動物、及び家畜又はペット（ネコ又はイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、及び好ましくはヒト患者が含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」は、任意の有益又は望ましい効果を含み、症状の最小限の改善さえ含み得る。「治療」は、必ずしも、疾患若しくは状態、又はその関連する症状の完全な根絶又は治癒を示すとは限らない。
本明細書で使用される場合、「予防する」、及び「予防される」、「予防すること」などの類似の単語は、疾患の症状の可能性を予防、阻害、又は減少させるためのアプローチを示す。それはまた、疾患若しくは状態の発症若しくは再発を遅延させること、又は疾患の症状の発生若しくは再発を遅延させることを指す。本明細書で使用される場合、「予防」及び同様の単語はまた、発症又は再発前の疾患の強度、効果、症状及び／又は負荷を減少させることを含む。
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益又は所望の予防又は治療結果を達成するためのウイルスの「有効な量」又は「有効量」を指す。
ウイルス又は細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びにウイルス又は細胞が個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に応じて変化し得る。治療有効量はまた、ウイルス又は細胞のあらゆる毒性又は有害作用が、治療的に有益な効果により上回る量である。「治療有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効である量を含む。
生理学的応答、例えば、電気生理学的活性又は細胞活性の「増加した」又は「増大した」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、未処理の細胞における活性のレベルの１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上である（例えば、５００、１０００倍）（その間で１を超える全ての整数及び小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）増加を含み得る。
生理学的応答、例えば、電気生理学的活性又は細胞活性の「低減した」又は「減少した」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、未処理の細胞における活性のレベルの１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上である（例えば、５００、１０００倍）（その間で１を超える全ての整数及び小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）低減を含み得る。
「維持する」、又は「保存する」、又は「維持」、又は「変化なし」、又は「実質的な変化なし」、又は「実質的な低減なし」とは、一般に、ビヒクル、又は対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と同等の生理学的応答を指す。同等の応答は、参照応答とは著しく異なっていない、又は測定可能なほど異なっていないものである。
一般に、「配列同一性」又は「配列相同性」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。典型的には、配列同一性を決定するための技術は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定すること、及び／又はそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、並びにこれらの配列を第２のヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較することを含む。２つ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。核酸配列又はアミノ酸配列に関わらず、２つの配列のパーセント同一性は、２つのアラインメントされた配列間の正確な一致の数を、より短い配列の長さで除算し、１００を乗じたものである。パーセント同一性はまた、例えば、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から入手可能なバージョン２．２．９を含む、高度なＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによって決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）のアラインメント方法に基づき、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）、Ｋａｒｌｉｎ Ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）に考察さている。簡潔に述べると、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一性を、同一のアラインメントされた記号（一般に、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を２つの配列のうちの短い方の記号の総数で除算したものとして定義する。プログラムを使用して、比較されるタンパク質の全長にわたるパーセント同一性を決定することができる。デフォルトパラメータは、短いクエリ配列で、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムで検索を最適化するために提供される。このプログラムではまた、Ｗｏｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９－１６３（１９９３）のＳＥＧプログラムによって決定されるように、ＳＥＧフィルタを使用して、クエリ配列のセグメントをマスクオフ（ｍａｓｋ－ｏｆｆ）することができる。所望の配列同一性度の範囲は、およそ８０％～１００％、及びそれらの間の整数値である。典型的には、開示される配列と特許請求される配列との間のパーセント同一性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％である。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド系」とは、１つ以上のポリヌクレオチドを指す。１つ以上のポリヌクレオチドは、特定の用途のために連携して働くように、又は所望の形質転換細胞を産生するように設計され得る。
「外因性」という用語は、生物体外に由来する核酸、タンパク質又はペプチド、低分子化合物などを含む、任意の分子を指すために本明細書で使用される。対照的に、「内因性」という用語は、生物体内に由来する（すなわち、生物によって天然に産生される）任意の分子を指す。
「ＭＯＩ」という用語は、感染標的（例えば、細胞）に対する作用物質（例えば、ウイルス粒子）の比である、感染多重度を指すために本明細書で使用される。
本明細書では、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、又は整数範囲は、別段の指示がない限り、列挙した範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むと理解されるべきである。「約」という用語は、数字又は数値の直前にある場合、その数字又は数値が、プラス又はマイナス１０％までの範囲にあることを意味する。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」とは、養子細胞療法によって標的化される細胞を指す。例えば、標的細胞は、がん細胞であってもよく、これは、養子細胞療法の移植されたＴ細胞によって死滅させることができる。本開示の標的細胞は、本明細書に記載されるような標的抗原を発現し、非標的抗原を発現しない。
本明細書で使用される場合、「非標的細胞」とは、養子細胞療法によって標的化されない細胞を指す。例えば、がん細胞を標的とする養子細胞において、正常な、健常な、非がん性細胞は、非標的細胞である。対象におけるいくつかの、又は全ての非標的細胞は、標的抗原及び非標的抗原の両方を発現し得る。対象における非標的細胞は、これらの細胞が標的抗原も発現するか否かに関係なく、非標的抗原を発現し得る。
本明細書で使用される場合、「非標的対立遺伝子バリアント」とは、その産物が非標的細胞によって発現されるが、標的細胞によって発現されない遺伝子の対立遺伝子を指す。例えば、非標的対立遺伝子バリアントは、対象の正常な非がん細胞によって発現されるが、対象のがん細胞によって発現されない遺伝子の対立遺伝子である。非標的対立遺伝子バリアントの発現は、非標的対立遺伝子バリアントをコードする遺伝子のヘテロ接合性、変異、又はエピジェネティック修飾の喪失を含むが、これらに限定されない、任意の機構によって、がん細胞内で喪失され得る。
本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインなどのリガンド結合ドメインに関して使用される場合、「に特異的な」又は「に特異的に結合する」とは、名前を付けられた標的に対して高い特異性を有するリガンド結合ドメインを指す。抗体特異性は、リガンド結合ドメインと、対応するリガンドとの間の適合の良さ、又はリガンド結合ドメインが類似若しくは更に異なったリガンドを識別する能力の尺度とみなされ得る。特異性と比較して、親和性は、低親和性リガンド結合ドメインが弱く結合し、高親和性リガンド結合ドメインが強く結合するように、リガンド結合ドメインとリガンドとの間の結合の強度の尺度である。標的対立遺伝子に特異的であるリガンド結合ドメインは、遺伝子の異なる対立遺伝子を識別することができるものである。例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２に特異的であるリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１又はＨＬＡ－Ａ＊０３などの他のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子に結合しないか、又は弱く結合するだけである。当業者は、リガンド結合ドメインが特定の標的に特異的であると言うことができるが、本明細書に記載の受容体系におけるその機能に影響を与えない１つ以上の追加の標的への結合レベルが依然として低いことを理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「標的抗原」は、抗原という用語又は特定の抗原の名称を使用して参照されるかどうかに関わらず、がん細胞などの標的細胞によって発現される抗原を指す。標的抗原の発現は、標的細胞に限定されない。標的抗原は、対象において、がん細胞及び正常な非がん細胞の両方によって発現され得る。
本明細書で使用される場合、「非標的抗原」（又は「遮断因子抗原」）は、抗原という用語又は特定の抗原の名称を使用して参照されるかどうかに関わらず、正常な非がん細胞によって発現され、がん細胞において発現されない抗原を指す。この発現の相違により、抑制性受容体が、非標的細胞の存在下で免疫細胞の活性化を阻害することを可能にするが、標的細胞の存在下では可能にしない。
多型とは、集団におけるヌクレオチド配列の２つ以上のバリアントの存在を指す。多型は、１つ以上の塩基の変化、挿入、反復、又は欠失を含み得る。多型には、例えば、単純反復配列（ＳＳＲ）及び一塩基多型（ＳＮＰ）が含まれ、これは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）の単一ヌクレオチドが変化するときに生じる変異である。
本明細書で使用される場合、「親和性」とは、受容体上の単一のリガンド結合部位、例えば、本明細書に記載される受容体のいずれかの抗原結合ドメインに対する抗原へのリガンドの結合の強度を指す。リガンド結合ドメインは、それらのリガンドとのより弱い相互作用（低親和性）、又はより強い相互作用（高親和性）を有することができる。
Ｋｄ、又は解離定数は、例えば、受容体及びその同族リガンドを含む巨大分子複合体がリガンド及び受容体に分離する場合など、より大きな物体がより小さな成分に可逆的に分離する傾向を測定する一種の平衡定数である。Ｋｄが高い場合、受容体を占有するためには高濃度のリガンドが必要であり、リガンドに対する受容体の親和性が低いことを意味する。逆に、低いＫｄは、リガンドが受容体に対して高い親和性を有することを意味する。
本明細書で使用される場合、「応答する」又は「に応答する」受容体は、リガンド（すなわち、抗原）が結合すると、細胞内ドメインの既知の機能に対応するシグナルを生成する、細胞内ドメインを含む受容体を指す。標的抗原に結合した活性化因子受容体は、活性化因子受容体を発現する免疫細胞の活性化を引き起こすシグナルを生成することができる。非標的抗原に結合した抑制性受容体は、活性化因子受容体を発現する免疫細胞の活性化を防止又は減少させる抑制シグナルを生成することができる。受容体の応答性、及び受容体を発現する免疫細胞を活性化又は阻害するそれらの能力は、レポーターアッセイ及び細胞傷害性アッセイを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載される任意の手段によってアッセイされ得る。
本明細書で使用される場合、免疫細胞の「活性化」又は「活性化される」免疫細胞は、免疫応答に特徴的な１つ以上の機能を行うことができる免疫細胞である。これらの機能には、増殖、サイトカインの放出、及び細胞傷害性、すなわち標的細胞の死滅が含まれる。活性化された免疫細胞は、当業者に明白であるマーカーを発現する。例えば、活性化Ｔ細胞は、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ２５及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上を発現することができる。活性化因子受容体（例えば、ＣＥＡ ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、標的細胞によって発現される標的抗原（例えば、ＣＥＡ）への受容体の結合に応答するようになると、活性化因子受容体によって活性化され得る。「標的抗原」はまた、「活性化因子抗原」とも称され得、標的細胞によって単離又は発現され得る。抑制性受容体を発現する免疫細胞の活性化は、活性化因子受容体が標的活性化因子リガンドに結合している場合であっても、抑制性受容体が非標的抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２）の結合に応答するようになったときに防止され得る。「非標的抗原」はまた、「抑制性リガンド」又は「遮断因子」とも称され得、標的細胞によって単離又は発現され得る。
免疫細胞上での受容体発現は、本明細書に記載の活性化因子受容体及び抑制性受容体の存在を報告するアッセイによって検証され得る。例えば、免疫細胞の集団を、標識分子（例えば、フルオロフォア標識受容体特異的抗体又はフルオロフォア標識受容体特異的リガンド）で染色し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）フローサイトメトリーを使用して定量化することができる。この方法は、免疫細胞の集団における免疫細胞のパーセンテージを、活性化因子受容体、抑制性受容体、又は両方の受容体を発現するものとして特徴付けることを可能にする。本明細書に記載の免疫細胞によって発現される活性化因子受容体及び抑制性受容体の比は、例えば、デジタルドロップレットＰＣＲによって決定され得る。これらのアプローチを使用して、本明細書に記載の免疫細胞、医薬組成物、及びキットの産生及び製造のための細胞の集団を特徴付けることができる。本明細書に記載の免疫細胞、医薬組成物、及びキットについて、活性化因子受容体及び抑制性受容体の両方を発現する免疫細胞の好適なパーセンテージが、本明細書に記載の方法に対して特異的に決定されることを理解されたい。例えば、活性化因子受容体及び抑制性受容体の両方を発現する免疫細胞の好適なパーセンテージは、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％であり得る。例えば、活性化因子受容体及び抑制性受容体の両方を発現する免疫細胞の好適なパーセンテージは、最大で５０％、最大で５５％、最大で６０％、最大で６５％、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、又は最大で９５％であり得る。例えば、免疫細胞における活性化因子受容体及び抑制性受容体の好適な比は、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、又は約１：５であり得る。精製、濃縮、及び／又は枯渇ステップは、本明細書に記載の免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な値を満たすために、免疫細胞の集団に対して使用することができることを理解されたい。
本明細書に記載の免疫細胞によって発現される応答性受容体は、受容体の細胞内ドメインによって生成されると予想されるシグナルの生成を測定するアッセイによって検証され得る。Ｊｕｒｋａｔ－ルシフェラーゼＮＦＡＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）などのレポーター細胞株を使用して、応答性受容体を特徴付けることができる。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、Ｔ細胞に由来し、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）誘導性ルシフェラーゼレポーター系の安定に組み込まれた核因子を含む。ＮＦＡＴは、免疫細胞活性化に必要な転写因子のファミリーであり、その活性化は、Ｔ細胞活性化についてのシグナルマーカーとして使用され得る。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、本明細書に記載の活性化因子受容体及び／又は抑制性受容体で形質導入又はトランスフェクトされ得る。活性化因子受容体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞がルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する場合、リガンドの結合に応答し、応答性のレベルは、レポーター遺伝子発現のレベルによって決定され得る。ルシフェラーゼの存在は、ルシフェリンなどの任意の既知のルシフェラーゼ検出試薬を使用して決定され得る。抑制性受容体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞内の活性化因子受容体と共発現したときに、リガンドの結合に応答し、正常に応答する免疫細胞を活性化因子受容体に応答してルシフェラーゼを発現することを防止する。例えば、抑制性受容体の応答性は、活性化因子及び抑制因子の両方を発現するＪｕｒｋａｔ細胞において、以下を観察することによって決定及び定量化され得る：１）Ｊｕｒｋａｔ細胞が、活性化因子受容体リガンドの存在下及び抑制性受容体リガンドの不在下でルシフェラーゼを発現し、２）Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるルシフェラーゼの発現が、活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方の存在下で低下又は除去される。このアプローチを使用して、活性化因子受容体、並びに活性化因子受容体及び抑制性受容体の特定の対の感受性、効力、及び選択性を決定することができる。感受性、効力、及び選択性は、用量反応実験を使用してＥＣ５０又はＩＣ５０値によって定量化することができ、活性化因子受容体リガンド及び／又は抑制性受容体リガンドは、活性化因子受容体又は活性化因子受容体及び抑制性受容体の特定の対を発現するＪｕｒｋａｔ細胞の培養物中に滴定される。代替的に、ＥＣ５０及びＩＣ５０値は、活性化因子受容体、又は活性化因子受容体及び抑制性受容体の特定の対を発現する免疫細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞又は初代免疫細胞）と、増加した量の活性化因子リガンド又は抑制因子リガンドを発現する標的細胞との共培養において決定することができる。増加した量の活性化因子リガンド又は抑制因子リガンドは、例えば、標的細胞への、ｍＲＮＡをコードする活性化因子リガンド若しくは抑制因子リガンドの滴定、又は異なるレベルの標的リガンドを天然に発現する標的細胞の使用によって、標的細胞において達成され得る。様々な量の標的及び非標的リガンドを発現する使用した標的細胞を決定する場合の活性化因子受容体及び抑制性受容体についての例示的な好適なＥＣ５０及びＩＣ５０値には、活性化因子受容体について１００万個当たり２６０個以下の転写産物（ＴＰＭ）のＥＣ５０、例えば、１０～２６０個のＴＰＭのＥＣ５０、及び抑制性受容体について１０個のＴＰＭ以下のＩＣ５０、例えば、１～５個のＴＰＭのＩＣ５０が含まれる。
活性化因子受容体又は活性化因子受容体及び抑制性受容体の特定の対を発現する本明細書に記載の免疫細胞の活性化は、当該免疫細胞との共インキュベーション後の標的細胞の生存率を測定するアッセイによって更に決定され得る。エフェクター細胞と称されることがある免疫細胞は、活性化因子受容体リガンド、抑制性受容体リガンド、又は活性化因子受容体及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞と共インキュベートされる。共インキュベーション後、標的細胞の生存率は、細胞培養における生存率を測定する任意の方法を使用して測定される。例えば、生存率は、テトラゾリウム塩基質を使用して活性ミトコンドリア酵素を測定するミトコンドリア機能アッセイを使用して決定され得る。生存率は、イメージングに基づく方法を使用して決定することもできる。標的細胞は、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質を発現することができる。全細胞蛍光の減少は、標的細胞の生存率の減少を示す。活性化因子受容体又は活性化因子受容体及び抑制性受容体の特定の対を発現する免疫細胞とのインキュベーション後の標的細胞の生存率の減少は、免疫細胞の標的細胞媒介性活性化と解釈される。免疫細胞の選択性の尺度は、このアプローチを使用して決定することもできる。活性化因子受容体及び抑制性受容体の対を発現する免疫細胞は、以下が観察される場合、選択的である。１）活性化因子受容体リガンドを発現するが、抑制性受容体リガンドを発現しない標的細胞では生存率が減少し、２）活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞では生存率が減少しない。これらの測定値から、陰性対照（活性化因子受容体を発現しない免疫細胞）のパーセンテージとしての標的細胞の生存率の減少に基づいて免疫細胞活性化のパーセンテージを定量化する「特異的死滅」値を導出することができる。更に、これらの測定値から、抑制性受容体リガンドの不在下で活性化因子受容体リガンドを発現する標的細胞において観察される特異的死滅と、活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞において観察される特異的死滅との比を表す「選択性比」値を導出することができる。このアプローチを使用して、本明細書に記載の免疫細胞、医薬組成物、及びキットの産生及び製造のための細胞の集団を特徴付けることができる。
免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な特異的死滅値は、例えば、以下の基準であり得る：１）抑制性受容体リガンドの不在下で免疫細胞及び活性化因子受容体リガンドを発現する標的細胞の４８時間の共インキュベーション後の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の特異的死滅、並びに２）活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞の４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、又は１％以下の特異的死滅。
更なる例として、免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な特異的死滅値は、以下の基準であり得る。１）活性化因子リガンドを発現するが、抑制因子リガンドを発現しない標的細胞の３０％～９９％、４０％～９９％、５０％～９９％、５５％～９５％、６０％～９５％、６０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、又は５０％～６０％が死滅し、２）活性化因子リガンド及び抑制因子リガンドを発現する標的細胞の１％～４０％、３％～４０％、５％～４０％、５％～３０％、１０％～３０％、１５％～３０％、又は５％～２０％が死滅する。
なお更なる例として、免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な特異的死滅値は、例えば、以下の基準であり得る。１）抑制性受容体リガンドの不在下での、免疫細胞及び活性化因子受容体リガンドを発現する標的細胞の４８時間の共インキュベーション後の少なくとも５０％の特異的死滅、並びに２）活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞の２０％以下の特異的死滅。更なる例として、免疫細胞は、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、又は６０時間の時間にわたって、活性化因子リガンドを発現し、抑制因子リガンドを発現しない標的細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％を死滅させることができ、一方、同じ時間にわたって、活性化因子リガンド及び抑制因子リガンドを発現する標的細胞の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、又は１％未満を死滅させることができる。
免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、少なくとも約５０％～少なくとも約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、最大で約５０％、最大で約５５％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、又は最大で約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満であり得るあり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な特異的死滅値は、標的細胞との免疫細胞の共インキュベーションの約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約５４時間、約６０時間、約６６時間、又は約７２時間後に決定され得るされ得る。
免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、少なくとも約５０％～少なくとも約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、最大で約５０％、最大で約５５％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、又は最大で約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満であり得るあり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な特異的死滅値は、標的細胞との免疫細胞の共インキュベーションの約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約５４時間、約６０時間、約６６時間、又は約７２時間後に決定され得るされ得る。
本明細書で使用される場合、「機能的バリアント」という用語は、親タンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を有し、親タンパク質の１つ以上の所望の活性を保持するタンパク質を指す。機能的バリアントは、親タンパク質の１つ以上の所望の活性を保持するタンパク質の断片（すなわち、Ｎ末端及び／又はＣ末端欠失を有するバリアント）であり得る。
本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書におけるあらゆる定義を含む本出願が優先する。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、記事、出版物、特許、特許公開、及び特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成する、又は世界のどの国でも一般的な知識の一部を形成するという認識、又はいかなる形態の示唆ではなく、それらとみなされるべきではない。
活性化因子受容体
本開示は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、がん細胞特異的抗原、又はそのペプチド抗原を含む標的抗原に特異的な第１の細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体を提供する。第１の受容体は活性化因子受容体であり、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインによる標的抗原の結合時に、第１の受容体を発現する免疫細胞の活性化を媒介する。第１の受容体は、標的抗原（すなわち、活性化因子リガンド）に応答する。例えば、標的抗原が第１の受容体に結合又は接触するとき、第１の受容体は応答性であり、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインによる標的抗原の結合時に第１の受容体を発現する免疫細胞を活性化する。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
いくつかの実施形態において、第１の受容体はヒト化される。本明細書で使用される場合、「ヒト化」とは、非ヒト種から単離されているか、又は非ヒト種から派生されている導入遺伝子における配列又は部分配列を、相同、又は機能的に等価なヒト配列と置き換えることを指す。例えば、ヒト化抗体は、マウスＣＤＲをヒトフレームワーク配列に移植し、続いて起源抗体からの対応するマウス残基に対する特定のヒトフレームワーク残基の逆置換によって作り出すことができる。
活性化因子標的
いくつかの実施形態において、第１の受容体についての標的抗原は、がん細胞特異的抗原である。標的がん細胞によって発現される任意の細胞表面分子は、第１の受容体リガンド結合ドメインに好適な標的抗原であり得る。例えば、細胞接着分子、細胞間シグナル伝達分子、細胞外ドメイン、走化性に関与する分子、糖タンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、膜貫通、神経伝達物質のための受容体、又は電圧依存性イオンチャネルを、標的抗原として使用することができる。
いくつかの実施形態において、標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原のペプチド抗原である。標的がん細胞によって発現され、がん細胞表面上の主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）によってペプチド抗原（ｐＭＨＣ）として提示される任意の分子は、第１の受容体細胞外リガンド結合ドメインに好適な標的抗原であり得る。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）、又はそのペプチド抗原である。
主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）は、免疫系の細胞に対する抗原を示し、免疫応答を誘発するタンパク質複合体である。ＭＨＣ－Ｉに対応するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃである。
ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ又はＨＬＡ－Ｇのいずれかを含む、がん細胞特異的ｐＭＨＣ抗原は、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＨＬＡ－Ａを含む。ＨＬＡ－Ａ受容体は、重α鎖及びより小さいβ鎖を含むヘテロ二量体である。α鎖は、ＨＬＡ－Ａのバリアントによってコードされ、一方、β鎖（β２－マイクログロブリン）は、不変である。数千のバリアントＨＬＡ－Ａ遺伝子が存在し、これらの全ては、本開示の範囲内に入る。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ－Ｉは、ヒト白血球抗原Ａ＊０２対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ＊０２）を含む。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＨＬＡ－Ｂを含む。ＨＬＡ－Ｂ遺伝子の数百のバージョン（対立遺伝子）が知られており、それらの各々には、特定の数（ＨＬＡ－Ｂ２７など）が与えられる。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＨＬＡ－Ｃを含む。ＨＬＡ－Ｃは、ＨＬＡクラスＩ重鎖パラログに属する。このクラスＩ分子は、重鎖及び軽鎖（ベータ－２マイクログロブリン）からなるヘテロ二量体である。１００を超えるＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、結腸直腸がん抗原である。いくつかの実施形態において、結腸直腸がん抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＣＥＡ、又はそのペプチド抗原を含む。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）、又はそのペプチド抗原である。ＣＥＡは、様々ながん細胞によって発現される１８０ｋＤａの糖タンパク質腫瘍関連タンパク質である。ＣＥＡは、反復免疫グロブリンドメインからなるＧＰＩアンカー接着分子である。これは、結腸がんのバイオマーカーとして、診断及び治療反応の代理の両方として使用される。ＣＥＡを発現するがんには、腺がん、結腸直腸がん、及び結腸直腸腺がんを含む、選択されるその他の上皮がんが含まれる。しかしながら、ＣＥＡはまた、胃腸管全体にわたる様々な正常上皮細胞において、例えば、結腸クリプトの上位３分の１にある高度に分化した上皮細胞においても発現される（ＣＥＡ発現については図７を参照されたい）。
ＣＥＡの全てのアイソフォームは、本開示のがん細胞特異的抗原として想定される。ＣＥＡアイソフォーム１は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿００１２７８４１３．１に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＣＥＡは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023538115000002
 いくつかの実施形態において、ＣＥＡは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＣＥＡアイソフォーム２は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿００１２９５３２７．１に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＣＥＡは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023538115000003
 いくつかの実施形態において、ＣＥＡは、配列番号１５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＣＥＡに由来するペプチド抗原である。いくつかの実施形態において、ペプチド抗原は、配列番号１の部分配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチド抗原は、配列番号１の部分配列と同一の配列を含む。例示的なＣＥＡペプチド抗原は、配列番号１のアミノ酸６９１～６９９（ＩＭＩＧＶＬＶＧＶ）、配列番号１のアミノ酸６０５～６１３（ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ）、及び配列番号１のアミノ酸６９４～７０２（ＧＶＬＶＧＶＡＬＩ）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＡペプチド抗原は、配列番号１のアミノ酸６９１～６９９（ＩＭＩＧＶＬＶＧＶ）を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ペプチド抗原は、配列番号１５の部分配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチド抗原は、配列番号１５の部分配列と同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＡペプチド抗原は、ＭＨＣ－Ｉと複合体化される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ－Ｉは、ヒト白血球抗原Ａ＊０２対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ＊０２）を含む。
細胞外リガンド結合ドメイン
本開示は、標的抗原に特異的な第１の細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体を提供する。いくつかの実施形態において、標的抗原は、がん細胞特異的抗原を含む。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＣＥＡ又はＭＨＣ－Ｉと複合体化されたＣＥＡ由来ペプチド抗原であり、第１の受容体のリガンド結合ドメインは、ＣＥＡ抗原を認識し、それに結合する。
リガンド依存的な様式で受容体の活性を調節することができる任意の種類のリガンド結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、抗原結合ドメインである。例示的な抗原結合ドメインには、とりわけ、ｓｃＦｖ、ＳｄＡｂ、Ｖβのみのドメイン、並びにＴＣＲα及びβ鎖可変ドメインに由来するＴＣＲ抗原結合ドメインが含まれる。
任意の種類の抗原結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。
例えば、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、例えば、Ｖβのみのドメイン、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）又は重鎖抗体ＨＣＡｂ、マウス、ヒト化又はヒト抗体に由来する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む、連続ポリペプチド鎖の一部であり得る（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。いくつかの態様において、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、抗体断片を含む、抗原結合ドメインを含む。更なる態様において、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂを含む、抗体断片を含む。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン分子に由来するタンパク質、又はポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル起源のインタクトな免疫グロブリン、又はその断片であり得、天然又は組換え源に由来し得る。
「抗体断片」又は「抗体結合ドメイン」という用語は、抗原結合ドメイン、すなわち、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を含有する、抗体又はその組換えバリアントの少なくとも１つの部分を指し、これは、抗原及びその定義されたエピトープなどの標的に対する抗体断片の認識及び特異的結合を付与するのに十分である。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体断片、線状抗体、単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」と略記される）（ＶＬ又はＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片、及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含む融合タンパク質を指し、軽鎖及び重鎖可変領域は、短い可撓性ポリペプチドリンカーを介して連続して連結され、単一のポリペプチド鎖として発現することが可能であり、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。
抗体に関して「重鎖可変領域」又は「ＶＨ」（又は、単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディの場合、「ＶＨＨ」）は、フレームワーク領域として知られている隣接ストレッチ間に介在する３つのＣＤＲを含有する重鎖の断片を指し、これらのフレームワーク領域は、一般に、ＣＤＲよりも高度に保存され、ＣＤＲを支持するための足場を形成する。
本明細書で使用される場合、指定されない限り、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、いずれかの順序でＶＬ及びＶＨ可変領域を有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよく、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、活性化因子及び／又は抑制性受容体の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、リンカーによって結合されたＶＬ及びＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシンセリンリンカー、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１４６）を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖのＮ末端においてシグナル配列を更に含む。例示的なシグナル配列には、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号１８４）が含まれ、これは、ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴ（配列番号１８５）によってコードされる。
「抗体軽鎖」という用語は、抗体分子中に存在する２つの種類のポリペプチド鎖のうちの、それらの天然に存在する立体配座における、より小さいものを指す。カッパ（「Ｋ」）及びラムダ（「λ」）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
「組換え抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体、例えば、バクテリオファージ又は酵母発現系によって発現される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、ＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する抗体、又は抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、ＤＮＡ又はアミノ酸配列は、当該技術分野で利用可能であり、周知である組換えＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を使用して得られている。
「Ｖβドメイン」、「Ｖβのみのドメイン」、「β鎖可変ドメイン」又は「単一可変ドメインＴＣＲ（ｓｖｄ－ＴＣＲ）」という用語は、第２のＴＣＲ可変ドメインの不在下で抗原に特異的に結合する単一Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ可変ドメインから本質的になる抗原結合ドメインを指す。Ｖβのみのドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を使用して抗原に関与する。各Ｖβのみのドメインは、３つの相補体決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。追加のエレメントは、Ｖβドメインが、第２のＴＣＲ可変ドメインの不在下でエピトープに結合するように構成されることを条件に組み合わされてもよい。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、又はβ鎖可変ドメイン（Ｖβ）を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＥＡ抗原に結合するＴＣＲリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ抗原は、ＭＨＣ－Ｉと複合体化され、ＭＨＣ－Ｉは、ＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子を含む。ＣＥＡ ＭＨＣ－Ｉ ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原に結合し、それを認識する例示的なＴＣＲ抗原結合ドメインは、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１１ １９（３）：Ｐ６２０－６２６に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＭＨＣ－Ｉと複合体化された配列番号１（ＩＭＩＧＶＬＶＧＶ）のアミノ酸６９１～６９９を認識する例示的なＴＣＲ細胞外リガンド結合ドメインは、ＴＲＡＶ８－１＊０１及びＴＲＡＪ６＊０１のＴＣＲアルファドメイン、並びにＴＲＢＶ２６＊０１、ＴＲＢＤ１＊０１、ＴＲＢＪ２－７＊０１及びＴＲＢＣ２のＴＣＲベータドメインを含む。
ＩＭＩＧＶＬＶＧＶ（配列番号２）を含むＣＥＡ ＭＨＣ－Ｉ ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原を認識するための例示的なＣＤＲを以下の表１に示す。
Figure 2023538115000004
いくつかの実施形態において、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号３～１２、又はそれらと少なくとも８５％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体のリガンド結合ドメインは、ＴＣＲリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＴＳＩＴＡ（配列番号３）のＣＤＲ－１、ＩＲＳＮＥＲ（配列番号４）のＣＤＲ－２、及びＡＴＤＬＴＳＧＧＮＹＫ（配列番号５）、ＡＴＤＦＴＳＧＧＮＹＫ（配列番号６）、ＡＴＤＬＴＴＧＧＮＹＫ（配列番号７）又はＡＴＤＦＴＴＧＧＮＹＫ（配列番号８）を含むＣＤＲ－３を含み、ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＫＧＨＰＶ（配列番号９）のＣＤＲ－１、ＦＱＮＱＥＶ（配列番号１０）のＣＤＲ－２、及びＡＳＳＬＧＬＧＤＹＥＱ（配列番号１１）若しくはＡＳＳＬＧＴＧＤＹＥＱ（配列番号１２）のＣＤＲ－３、又はそれらと少なくとも８５％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲα鎖可変ドメインは、配列番号９のＣＤＲ－１、配列番号１０のＣＤＲ－２、及び配列番号１１又は配列番号１２のＣＤＲ－３を含み、ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、配列番号３のＣＤＲ－１、配列番号４のＣＤＲ－２、及び配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８を含むＣＤＲ－３、又はそれらと少なくとも８５％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
表１からのＣＤＲを含む例示的なＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖を以下の表２に示す。ＣＤＲは、表２の配列において下線が引かれている。表２において、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ鎖は、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８６））及びＧＳＧリンカーによって分離される。
Figure 2023538115000005
Figure 2023538115000006
Figure 2023538115000007
Figure 2023538115000008
Figure 2023538115000009
Figure 2023538115000010
Figure 2023538115000011
Figure 2023538115000012
Figure 2023538115000013
Figure 2023538115000014
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号１６～３１又は３６～５１のうちのいずれか１つの配列又は部分配列と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、又は少なくとも９９．５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号１６～３１又は３６～５１のうちのいずれか１つの配列又は部分配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号１６～３１のうちのいずれか１つのアミノ酸１～２７０、又はそれと少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、若しくは少なくとも９９．５％同一の配列を含むか、又はそれから本質的になるＴＣＲアルファ鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号１６～３１のうちのいずれか１つのアミノ酸１～２７０を含むか、又はそれから本質的になるＴＣＲアルファ鎖を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号１６～３１のうちのいずれか１つのアミノ酸２９３～５９８、又はそれと少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、若しくは少なくとも９９．５％同一の配列を含むか、又はそれから本質的になるＴＣＲベータ鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号１６～３１のうちのいずれか１つのアミノ酸２９３～５９８を含むか、又はそれから本質的になるＴＣＲベータ鎖を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号１６～３１のうちのいずれか１つのアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号１６～３１のうちのいずれか１つのアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号３６～５１のうちのいずれか１つのアミノ酸１～２６８、又はそれと少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、若しくは少なくとも９９．５％同一の配列を含むか、又はそれから本質的になるＴＣＲアルファ鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号３６～５１のうちのいずれか１つのアミノ酸１～２６８を含むか、又はそれから本質的になるＴＣＲアルファ鎖を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号３６～５１のうちのいずれか１つのアミノ酸２９１～５９６、又はそれと少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、若しくは少なくとも９９．５％同一の配列を含むか、又はそれから本質的になるＴＣＲベータ鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号３６～５１のうちのいずれか１つのアミノ酸２９１～５９６を含むか、又はそれから本質的になるＴＣＲベータ鎖を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号３６～５１のうちのいずれか１つのアミノ酸１～２６８を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号３６～５１のうちのいずれか１つのアミノ酸２９１～５９６を含むＴＣＲベータ鎖を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、ＣＥＡに結合する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＡＲのリガンド結合ドメインである。ＣＥＡ標的化ｓｃＦｖドメインを含む例示的なＣＡＲ配列を以下の表３に示す。表３において、ＣＤＲ配列には下線が引かれている。
Figure 2023538115000015
Figure 2023538115000016
Figure 2023538115000017
Figure 2023538115000018
Figure 2023538115000019
いくつかの実施形態において、ＣＥＡ ｓｃＦｖは、ＥＦＧＭＮ（配列番号５５）のＣＤＲ－Ｈ１、ＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧ（配列番号５６）のＣＤＲ－Ｈ２、ＷＤＦＡＹＹＶＥＡＭＤＹ（配列番号５７）若しくはＷＤＦＡＨＹＦＱＴＭＤＹ（配列番号５８）のＣＤＲ－Ｈ３、ＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ（配列番号５９）若しくはＫＡＳＡＡＶＧＴＹＶＡ（配列番号６０）のＣＤＲ－Ｌ１、ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号６１）若しくはＳＡＳＹＲＫＲ（配列番号６２）のＣＤＲ－Ｌ２、及びＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴ（配列番号６３）のＣＤＲ－Ｌ３、又はそれらと少なくとも８５％若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ ｓｃＦｖは、ＥＦＧＭＮ（配列番号５５）のＣＤＲ－Ｈ１、ＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧ（配列番号５６）のＣＤＲ－Ｈ２、ＷＤＦＡＹＹＶＥＡＭＤＹ（配列番号５７）若しくはＷＤＦＡＨＹＦＱＴＭＤＹ（配列番号５８）のＣＤＲ－Ｈ３、ＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ（配列番号５９）若しくはＫＡＳＡＡＶＧＴＹＶＡ（配列番号６０）のＣＤＲ－Ｌ１、ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号６１）若しくはＳＡＳＹＲＫＲ（配列番号６２）のＣＤＲ－Ｌ２、及びＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴ（配列番号６３）のＣＤＲ－Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ ｓｃＦｖは、ＥＦＧＭＮ（配列番号５５）のＣＤＲ－Ｈ１、ＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧ（配列番号５６）のＣＤＲ－Ｈ２、ＷＤＦＡＹＹＶＥＡＭＤＹ（配列番号５７）のＣＤＲ－Ｈ３、ＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ（配列番号５９）のＣＤＲ－Ｌ１、ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号６１）のＣＤＲ－Ｌ２、及びＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴ（配列番号６３）のＣＤＲ－Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ ｓｃＦｖは、ＥＦＧＭＮ（配列番号５５）のＣＤＲ－Ｈ１、ＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧ（配列番号５６）のＣＤＲ－Ｈ２、ＷＤＦＡＹＹＶＥＡＭＤＹ（配列番号５７）のＣＤＲ－Ｈ３、ＫＡＳＡＡＶＧＴＹＶＡ（配列番号６０）のＣＤＲ－Ｌ１、ＳＡＳＹＲＫＲ（配列番号６２）のＣＤＲ－Ｌ２、及びＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴ（配列番号６３）のＣＤＲ－Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ ｓｃＦｖは、ＥＦＧＭＮ（配列番号５６）のＣＤＲ－Ｈ１、ＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧ（配列番号５６）のＣＤＲ－Ｈ２、ＷＤＦＡＨＹＦＱＴＭＤＹ（配列番号５８）のＣＤＲ－Ｈ３、ＫＡＳＡＡＶＧＴＹＶＡ（配列番号６０）のＣＤＲ－Ｌ１、ＳＡＳＹＲＫＲ（配列番号６２）のＣＤＲ－Ｌ２、及びＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴ（配列番号６３）のＣＤＲ－Ｌ３を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号５５～５８からなる群から選択される重鎖相補性決定領域（ＨＣ－ＣＤＲ）のセットを含む重鎖可変（ＶＨ）部分、及び配列番号５９～６３からなる群から選択される軽鎖相補性決定領域のセットを含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又は配列番号５５～５８若しくは配列番号５９～６３と比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号５５～５７を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣ－ＣＤＲ）のセットを含む重鎖可変（ＶＨ）部分、並びに配列番号５９、６１、及び６３を含む軽鎖相補性決定領域のセットを含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又は配列番号５５～５７若しくは配列番号５９、６１、及び６３と比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号５５～５７を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣ－ＣＤＲ）のセットを含む重鎖可変（ＶＨ）部分、並びに配列番号５９、６１、及び６３を含む軽鎖相補性決定領域のセットを含む軽鎖可変（ＶＬ）部分を含む。
ＣＥＡを認識する例示的なｓｃＦｖドメインを以下の表４に示す。下線はＣＤＲ配列を示す。
Figure 2023538115000020
Figure 2023538115000021
Figure 2023538115000022
Figure 2023538115000023
Figure 2023538115000024
いくつかの実施形態において、ＣＥＡ ｓｃＦｖは、配列番号６４～７０からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ ｓｃＦｖは、配列番号６４～７０からなる群から選択される配列を含むか、又はそれから本質的になる。更なる例示的な抗ＣＥＡ抗体配列は、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４７：２９９－３０６（１９９９）、ＷＯ１９９９／０４３８１７Ａ１、ＵＳ２００２／００１８７５０Ａ１、ＵＳ２０１１／０１０４１４８Ａ１、ＵＳ２０１６／０１０８１３１Ａ１、ＵＳ２０１６／００７５７９５Ａ１、ＵＳ２０１９／０１８５５８３Ａ１、ＵＳ２０２０／０１２３２７０Ａ１、ＷＯ２０２０／２５９５５０Ａ１、ＷＯ２０２１／０５３５８７Ａ１、ＷＯ２０２１／１１０６４７Ａ１に提供されており、それらの内容は、抗ＣＥＡ ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ、及び／又はリガンド結合ドメイン配列を提供する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号１４４を含む重鎖可変（ＶＨ）部分、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列、及び配列番号１４８を含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又はそれと８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号１４４を含む重鎖可変（ＶＨ）部分、及び配列番号１４８を含む軽鎖可変（ＶＬ）部分を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＶＨ部分とＶＬ部分との間のリンカーを更に含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号６６～７０からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号６８のｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号６８のｓｃＦｖ配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗原結合ドメインのＣＤＲ中の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、又は６個）のアミノ酸残基は、別のアミノ酸で置換される。置換は、アミノ酸の同じファミリー内の置換であるという意味で「保存的」であり得る。天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分割され得、保存的置換はそれらのファミリー内で行われる。（１）塩基性側鎖を有するアミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（２）酸性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸；（３）非荷電極性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン；及び（４）非極性側鎖を有するアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を、アミノ酸の付加、欠失又は置換によって変化させることにより、標的抗原に対する結合親和性の増加などの様々な効果が得られ得る。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本開示は、第１の活性化因子受容体、及びそれを含む免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、キメラ抗原受容体である。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、Ｔ細胞受容体に由来する人工受容体を指すことができ、特定の免疫エフェクター細胞に人工特異性を移植する操作された受容体を包含する。ＣＡＲは、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性を付与するために用いられてもよく、それによって、例えば、養子細胞療法での使用のために、多数の特異的Ｔ細胞が生成されることが可能になる。特定の実施形態において、ＣＡＲは、例えば、腫瘍関連抗原に対する細胞の特異性を指示する。例示的なＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ヒンジドメインを更に含む。特定の態様において、ＣＡＲは、ＣＤ３膜貫通ドメイン及びエンドドメインに融合した、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合を含む。他のＣＡＲ設計の特異性は、受容体のリガンド（例えば、ペプチド）に由来し得る。ある特定の場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３、４－１ＢＢ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／又はＯＸ４０などの追加の共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。ある場合には、分子は、共刺激分子、イメージングのためのレポーター遺伝子、プロドラッグの添加時にＴ細胞を条件付きで除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体を含む、ＣＡＲと同時発現され得る。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される。
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲは、細胞外ヒンジ領域を含む。ヒンジ領域の組み込みは、ＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカイン産生に影響を及ぼし、インビボでのＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大を改善することができる。例示的なヒンジは、ＩｇＤ及びＣＤ８ドメイン、例えば、ＩｇＧ１から単離又は派生され得る。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号７１）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、配列番号７１を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、配列番号７１から本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、ＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴ（配列番号７２）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、配列番号７２によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、配列番号１５６の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αは、配列番号１５６によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、ＣＴＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号７３）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、配列番号７３を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、ＴＧＴＡＣＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣ（配列番号７４）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、配列番号７４によってコードされる。
本開示のＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計され得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと自然に会合する膜貫通ドメインが使用される。例えば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むＣＡＲはまた、ＣＤ２８膜貫通ドメインを使用してもよい。いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避け、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。
膜貫通ドメインは、天然又は合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータ、若しくはゼータ鎖、又はＩｇＧ４などの免疫グロブリンから単離されてもよいか、又は派生されてもよい（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含む）。代替的に、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性残基を含む。いくつかの実施形態において、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。任意選択で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に結合を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
本開示のＣＡＲのいくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号７５）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号７５を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧ（配列番号７６）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号７６によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１５７の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１５７によってコードされる。
本開示のＣＡＲのいくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、ＩＰＷＬＧＨＬＬＶＧＬＳＧＡＦＧＦＩＩＬＶＹＬＬＩ（配列番号７７）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、配列番号７７を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、
Figure 2023538115000025
 （配列番号７８）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、配列番号７８によってコードされる。
本開示のＣＡＲの細胞質ドメイン、又はそうでなければ、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に特殊化された機能を実行させるタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される範囲で、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、インタクトな鎖の代わりに使用されてもよい。ある場合には、複数の細胞内ドメインを組み合わせて、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞の所望の機能を達成することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
本開示のＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列、及び抗原受容体関与後のシグナル伝達を開始するために協調的に作用する共受容体、並びにこれらの配列の任意の誘導体又はバリアント、及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。
したがって、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つの細胞質活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内活性化ドメインは、ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能を活性化するのに必要なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達が存在することを確実にする。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞質活性化は、ＣＤ２４７分子（ＣＤ３ζ）活性化ドメイン、刺激性キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ＫＩＲ２ＤＳ２活性化ドメイン、又は１２ｋＤａ（ＤＡＰ１２）活性化ドメインのＤＮＡＸ活性化タンパク質である。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号７９）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号７９を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ（配列番号８０）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号８０によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号１６３の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号１６３によってコードされる。
ＴＣＲのみを通じて生成されるシグナルは、多くの場合、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次又は共刺激シグナルもまた必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列である、ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、及び二次又は共刺激シグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的な方式、又は抑制的な方式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的な様式で作用する一次細胞質シグナル配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有し得る。いくつかの実施形態において、ＩＴＡＭは、任意の２つの他のアミノ酸（ＹｘｘＬ／Ｉ（配列番号９８３）によってロイシン又はイソロイシンから分離されたチロシンを含有する。いくつかの実施形態において、細胞質ドメインは、１、２、３、４、又は５個のＩＴＡＭを含有する。例示的なＩＴＡＭ含有細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメインである。本開示のＣＡＲに使用され得る一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの更なる例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
いくつかの実施形態において、単一のＩＴＡＭを含むＣＤ３ζ活性化ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号８１）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号８１を含む。いくつかの実施形態において、単一のＩＴＡＭを含むＣＤ３ζ活性化ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号８１）のアミノ酸配列から本質的になる。いくつかの実施形態において、単一のＩＴＡＭを含むＣＤ３ζ活性化ドメインは、
Figure 2023538115000026
 （配列番号８２）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号８２によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞質ドメインは、それ自体でＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むか、又は本開示のＣＡＲの文脈において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせるように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分及び共刺激ドメインを含むことができる。共刺激ドメインとは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、共刺激ドメインが挙げられ、その共刺激ドメインは、ＩＬ－２Ｒβ、Ｆｃ受容体ガンマ（ＦｃＲγ）、Ｆｃ受容体ベータ（ＦｃＲβ）、ＣＤ３ｇ分子ガンマ（ＣＤ３γ）、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５分子（ＣＤ５）、ＣＤ２２分子（ＣＤ２２）、ＣＤ７９ａ分子（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９ｂ分子（ＣＤ７９ｂ）、がん胎児抗原関連細胞接着分子３（ＣＤ６６ｄ）、ＣＤ２７分子（ＣＤ２７）、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー８（ＣＤ３０）、ＣＤ４０分子（ＣＤ４０）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２分子（ＣＤ２）、ＣＤ７分子（ＣＤ７）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１４（ＬＩＧＨＴ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｃ２（ＮＫＧ２Ｃ）、及びＣＤ２７６分子（Ｂ７－Ｈ３）ｃ－刺激ドメイン、又はそれらの機能的バリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号８３）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号８３を含むか、又はそれから本質的になる）。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、ＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＧＧＡＧＣ（配列番号８４）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号８４によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１６０の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１６０によってコードされる。
いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、４－１ＢＢから単離されるか、又は派生される。いくつかの実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１６１）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１６１）を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、ＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧ（配列番号１６２）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１５８）の配列、又はそれと少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１５９、又はそれと少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有する配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１５９によってコードされる。
本開示のＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質ドメインは、ランダム又は指定された順序で互いに連結され得る。任意選択で、例えば、２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーが、連結を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、好適なリンカーの一例を提供する。例示的なリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１４６）の配列を含む。
本開示のＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質ドメインは、ランダム又は指定された順序で互いに連結され得る。任意選択で、例えば、２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーが、連結を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、好適なリンカーの一例を提供する。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本開示は、第１の活性化因子受容体、及びそれを含む免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
本開示で使用するための細胞内ドメインを含む例示的なＴＣＲは、２０２０年９月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４５２５０に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ複合体」又は「ＴＣＲ／ＣＤ３複合体」と呼ばれることもある「ＴＣＲ」は、サブユニットと称されることもある、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、及びインバリアントＣＤ３鎖（ゼータ、ガンマ、デルタ、及びイプシロン）のうちの１つ以上を含むタンパク質複合体を指す。ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合するヘテロ二量体として機能するようにジスルフィド結合され得る。ＴＣＲアルファ／ベータヘテロ二量体がペプチド－ＭＨＣに関与すると、関連するインバリアントＣＤ３サブユニット内のＴＣＲ複合体における立体構造変化が誘導され、これが、それらのリン酸化及び下流タンパク質との会合をもたらし、それによって一次刺激シグナルを形質導入する。例示的なＴＣＲ複合体では、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータポリペプチドは、ヘテロ二量体を形成し、ＣＤ３イプシロン及びＣＤ３デルタは、ヘテロ二量体を形成し、ヘテロ二量体のためのＣＤ３イプシロン及びＣＤ３ガンマ、並びに２つのＣＤ３ゼータは、ホモ二量体を形成する。
任意の好適なリガンド結合ドメインは、本明細書に記載のＴＣＲの細胞外ドメイン、ヒンジドメイン又は膜貫通に融合され得る。例えば、リガンド結合ドメインは、抗体若しくはＴＣＲの抗原結合ドメインであってもよく、又は抗体断片、Ｖβのみのドメイン、直鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、若しくは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、１つ以上のＴＣＲサブユニットの１つ以上の細胞外ドメイン又は膜貫通ドメインに融合される。ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ又はＣＤ３ゼータであってもよい。例えば、リガンド結合ドメインは、ＴＣＲアルファ、若しくはＴＣＲベータに融合され得るか、又はリガンド結合の部分は、２つのサブユニットに融合され得、例えば、リガンド結合ドメインの部分は、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータの両方に融合され得る。
ＴＣＲサブユニットには、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３イプシロンが含まれる。ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、若しくはＣＤ３ゼータ、又はそれらの断片若しくは誘導体のうちのいずれか１つ以上は、本開示の刺激シグナルを提供することができる１つ以上のドメインに融合され得、それによって、ＴＣＲ機能及び活性が増強される。
任意の供給源から単離又は派生されるＴＣＲ膜貫通ドメインは、本開示の範囲内として想定される。膜貫通ドメインは、天然又は組換え源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲ複合体が標的に結合しているときはいつでも、細胞内ドメインにシグナル伝達することができる。特定の使用の膜貫通ドメインは、例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ガンマ、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータ、又はゼータ鎖の膜貫通領域を少なくとも含み得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して、ＴＣＲのポリペプチドの細胞外領域、例えば、ＴＣＲアルファ又はベータ鎖の抗原結合ドメインに結合することができる。例えば、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、又はＣＤ８ａヒンジであってもよい。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、ＴＣＲの１つ以上の膜貫通ドメインに結合される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメイン、ＴＣＲベータ膜貫通ドメイン、又はその両方を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通は、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを含む。
膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域と会合する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は最大１５個のアミノ酸）、及び／又は膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と会合する１つ以上の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は最大１５個のアミノ酸）を含み得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避け、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。
存在する場合、膜貫通ドメインは、天然ＴＣＲ膜貫通ドメイン、異種膜タンパク質由来の天然膜貫通ドメイン、又は人工膜貫通ドメインであってもよい。膜貫通ドメインは、膜アンカードメインであってもよい。限定されないが、天然又は人工膜貫通ドメインは、多くの場合、膜貫通セグメントに隣接する正電荷を有する、約２０個のアミノ酸の疎水性ａ－ヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、１つの膜貫通セグメント又は１つを超える膜貫通セグメントを有し得る。膜貫通ドメイン／セグメントの予測は、公開されている予測ツールを使用して作製され得る（例えば、ＴＭＨＭＭ，Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００１；３０５（３）：５６７－５８０、又はＴＭｐｒｅｄ，Ｈｏｆｍａｎｎ ＆ Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ－Ｓｅｙｌｅｒ １９９３；３４７：１６６）。膜アンカー系の非限定的な例としては、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通ドメイン、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー（シグナル配列に翻訳後付加される）などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、ＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷ（配列番号８５）の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、配列番号８５を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、ＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧ（配列番号８６）の配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、ＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬ（配列番号８７）の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、配列番号８７を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、ＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧ（配列番号８８）の配列によってコードされる。
本開示のＴＣＲは、１つ以上の細胞内ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、膜貫通ドメインに刺激シグナルを提供することができる１つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、刺激シグナルを提供することができる第１の細胞内ドメイン、及び刺激シグナルを提供することができる第２の細胞内ドメインを含む。他の実施形態において、細胞内ドメインは、刺激シグナルを提供することができる第１、第２及び第３の細胞内ドメインを含む。刺激シグナルを提供することができる細胞内ドメインは、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）ドメイン、ＬＣＫがん原遺伝子、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）ドメイン、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）ドメイン、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＧＩＴＲ）ドメイン、ＣＤ４分子（ＣＤ４）ドメイン、ＣＤ８ａ分子（ＣＤ８ａ）ドメイン、ＦＹＮがん原遺伝子、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｆｙｎ）ドメイン、Ｔ細胞受容体関連タンパク質キナーゼ７０（ＺＡＰ７０）ドメインのゼータ鎖、Ｔ細胞（ＬＡＴ）ドメインの活性化のためのリンカー、リンパ球細胞質タンパク質２（ＳＬＰ７６）ドメイン、（ＴＣＲ）アルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３イプシロン細胞内ドメインからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、機能細胞、例えば、ＴＣＲ含有細胞、例えば、ＴＣＲ発現Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。いくつかの実施形態において、本開示の第１の受容体の細胞内ドメインは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例えば、ＣＤ３ガンマ、デルタ、又はイプシロンの細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、同じタンパク質、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ゼータから単離されるか、又はそれらから派生される。
本開示の活性化因子受容体において使用するための細胞内ドメインの例としては、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３ゼータ、及び４－１ＢＢの細胞質配列、並びに抗原受容体関与後のシグナル伝達を開始するために協調して作用する細胞内シグナル伝達共受容体、並びにこれらの配列の任意の誘導体又はバリアント、及び同じ機能的能力を有する任意の組換え配列が挙げられる。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激、又は抗原依存性刺激を担うタンパク質に由来するものが含まれる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３デルタ細胞内ドメイン、ＣＤ３イプシロン細胞内ドメイン、ＣＤ３ガンマ細胞内ドメイン、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン、ＴＣＲアルファ細胞内ドメイン、又はＴＣＲベータ細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインは、Ｓｅｒ－Ｓｅｒを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインは、ＴＣＣＡＧＣの配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＴＣＲベータ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、ＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲ（配列番号８９）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、配列番号８９を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、ＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡ（配列番号９０）の配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの刺激性細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３イプシロン細胞内ドメインなどの一次細胞内シグナル伝達ドメイン、並びに１つの追加の刺激性細胞内ドメイン、例えば、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３イプシロン細胞内ドメインなどの一次細胞内シグナル伝達ドメイン、並びに２つの追加の刺激性細胞内ドメインを含む。
例示的な共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激性シグナル、又は抗原非依存性刺激を担うタンパク質に由来するものが含まれる。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、並びにＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９）、及びＣＤ２８分子（ＣＤ２８）が含まれるが、これらに限定されない。共刺激タンパク質は、以下のタンパク質ファミリーに表され得る。ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及びＮＫ細胞活性化受容体。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３、ＣＤ４と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。共刺激ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、若しくは天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はそれらの機能的バリアントを含むことができる。
いくつかの実施形態において、刺激ドメインは、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。ＣＤ２８及び４－１ＢＢは、完全なＴ細胞活性化に必要な十分に特徴付けられた共刺激分子であり、Ｔ細胞エフェクター機能を増強することが知られている。例えば、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインのみを含有する第１世代のＣＡＲにわたるサイトカインの放出、細胞溶解機能、及び持続性を強化するために、ＣＤ２８及び４－１ＢＢがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）において利用されている。同様に、ＴＣＲに共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８及び４－１ＢＢドメインを含めることにより、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させることができ、典型的には、腫瘍細胞の表面上で下方制御される共刺激リガンドの不在下での共刺激を特異的に可能にすることができる。いくつかの実施形態において、刺激ドメインは、ＣＤ２８細胞内ドメイン又は４－１ＢＢ細胞内ドメインを含む。
抑制性受容体
本開示は、がん細胞、例えば、遺伝子の対立遺伝子バリアントにおいて喪失している非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体を提供する。非標的対立遺伝子バリアントは、限定されないが、非標的対立遺伝子バリアントの発現に影響を及ぼすエピジェネティック変化、非標的対立遺伝子バリアントをコードする遺伝子に対する変異、非標的対立遺伝子バリアントの発現を調節する細胞シグナル伝達の破壊、染色体消失、ゲノム遺伝子座の部分的若しくは完全な欠失、核酸若しくはヘテロクロマチンの修飾による遺伝子サイレンシング、又は他の機構による発現の喪失などの任意の機構を通してがん細胞内で喪失され得る。本明細書に開示される組成物及び方法の変形例において、処理された細胞又は対象は、非遺伝的変化のために非標的対立遺伝子バリアントの発現の喪失を示し得る。したがって、本開示は、ヘテロ接合性の喪失を含むが、これに限定されない任意の原因からの非標的抗原の発現を欠く細胞を死滅させる、かつ／又は対象を治療するための組成物及び方法を提供する。
非標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるタンパク質、又はその抗原ペプチドであってもよく、非標的抗原は多型を含む。非標的抗原は多型であるため、がん細胞内のヘテロ接合性の喪失によって生じ得る、非標的抗原をコードする遺伝子の単一コピーの喪失は、遺伝子の他の多型バリアントを保持するが、非標的抗原を喪失したがん細胞を生じる。例えば、ＨＬＡ遺伝子座にＨＬＡ－Ａ＊０２及びＨＬＡ－Ａ＊０１対立遺伝子を有する対象は、ＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子のみが喪失されるがんを有し得る。このような対象において、ＨＬＡ－Ａ＊０１タンパク質は依然として存在するが、抑制因子受容体が、ＨＬＡ－Ａ＊０２（又は他の非標的抗原）に特異的であるように設計されているため、がん細胞に遭遇する免疫細胞の抑制性受容体によって認識されない。正常な非悪性細胞において、ＨＬＡ－Ａ＊０２（又は他の非標的抗原）が存在し、操作された免疫細胞の活性化を阻害する。ヘテロ接合性の喪失を有するがん細胞において、ＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子バリアント（又は他の非標的抗原）が喪失される。抑制性受容体は、がん細胞には存在しないＨＬＡ－Ａ＊０２（又は他の非標的抗原）にのみ応答するため、抑制性受容体を発現するように操作された免疫細胞は、抑制性受容体から抑制シグナルを受け取らない。この機構によって、免疫細胞は、選択的に活性化され、ＣＥＡを発現するが、ヘテロ接合性の喪失によりＨＬＡ－Ａ＊０２（又は別の非標的抗原）を喪失しているがん細胞を選択的に死滅させる。本明細書では、ＨＬＡ－Ａを例として使用する。同様の多型変異は、他のＭＨＣ遺伝子の集団においても、また他の非ＭＨＣ遺伝子においても生じる。したがって、本開示は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、及びＳＲＥＣ、又はそれらの抗原ペプチドから選択される非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体であって、非標的抗原が、多型を含む、第２の受容体と、それを含む免疫細胞と、を提供する。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、抑制性キメラ抗原受容体（抑制性受容体）である。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、抑制性受容体である。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、ヒト化される。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、配列番号１６４、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、１７４又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の同一性を共有する配列。
本開示は、非標的抗原の単一アミノ酸バリアント対立遺伝子を区別することができる細胞外リガンド結合を含む、抑制性受容体である、第２の受容体を提供する。非標的抗原の対立遺伝子バリアントを区別するこの能力は、第２の受容体が、リガンド結合ドメインによって認識される対立遺伝子を発現する非標的細胞の存在下で、第２の受容体を含む免疫細胞の活性化を抑制することを可能にする。しかしながら、免疫細胞の活性化は、対立遺伝子を喪失した標的細胞、例えば、ヘテロ接合性の喪失により遺伝子の１つの対立遺伝子を喪失したがん細胞の存在下では抑制されない。
本開示は、非標的抗原の異なるレベルの発現を区別することができる細胞外リガンド結合を含む、抑制性受容体である、第２の受容体を提供する。これにより、第２の受容体が、第２の受容体に対するリガンドを発現する非標的細胞の存在下で第２の受容体を含む免疫細胞の活性化を抑制することを可能にするが、第２の受容体に対するリガンドの低いレベルを発現するか、又は発現しないがん細胞の存在下での免疫細胞の活性化を可能にする。
抑制因子リガンド
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、標的細胞によって発現されず、非標的細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、健常な細胞、すなわち、がん細胞ではない細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を通じて非標的抗原の発現を喪失した複数のがん細胞である。いくつかの実施形態において、非標的細胞は、標的及び非標的抗原の両方を発現する、複数の健常な細胞（すなわち、非がん細胞、正常細胞、又は健常な細胞）である。
標的細胞によって発現されない、非標的細胞によって発現される任意の細胞表面分子は、第２の受容体細胞外リガンド結合ドメインに好適な非標的抗原であり得る。例えば、細胞接着分子、細胞間シグナル伝達分子、細胞外ドメイン、走化性に関与する分子、糖タンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、膜貫通、神経伝達物質のための受容体、又は電圧依存性イオンチャネルを、非標的抗原として使用することができる。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、及びＳＲＥＣの多型バリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、又はＳＲＥＣの多型残基を含む抗原ペプチドである。
いくつかの実施形態において、標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原のペプチド抗原である。
ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はＨＬＡ－Ｅのいずれかを含む非標的ＭＨＣ－１（ｐＭＨＣ）抗原は、本開示の範囲内であると想定される。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣはＭＨＣクラスＩである。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はＨＬＡ－Ｅからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩタンパク質の対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、又はＨＬＡ－Ａ＊１１を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａの対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａの対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、又はＨＬＡ－Ａ＊１１を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊６９を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、対立遺伝子ＨＬＡ－Ｂを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂの対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１１を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃの対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、及びＳＲＥＣからなる群から選択される。ＣＥＡ及びＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）は、Ｔ細胞において低い／不在であり、したがって、他のリガンドのシスでのチャレンジを回避する。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ遺伝子座についてのＬＯＨ頻度は、非常に高い（直腸がんでは約９０％）。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ａ又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＴＮＦＲＳＦ１１Ａは、Ｃｈｒ１８ｑ：３５，２３７，５９３～３７，２０８，５４１に位置し、結腸直腸がん細胞においてＬＯＨを介して頻繁に喪失される。
野生型ヒトＴＮＦＲＳＦ１１Ａアイソフォーム１は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿００３８３０．１に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａは、
Figure 2023538115000027
 のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａは、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型残基は、配列番号１３に太字としてマークされ、下線が引かれている。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型残基を含むＴＮＦＲＳＦ１１Ａに由来するペプチドを含む。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型残基は、配列番号１３のアミノ酸残基１４１及び１９２を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３のアミノ酸１４１（ｒｓ３５２１１４９６、Ｈ１４１Ｙ）又は１９２（ｒｓ１８０５０３４、Ｖ１９２Ａ）を含むＴＮＦＲＳＦ１１Ａのペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型は、ＴＮＦＲＳＦ１１ＡのＨ１４１／Ａ１９２Ｖ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型は、
Figure 2023538115000028
 （多型アミノ酸は太字であり、下線が引かれている）（配列番号２２９）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型は、ＴＮＦＲＳＦ１１ＡのＨ１４１Ｙ／Ａ１９２対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型は、
Figure 2023538115000029
 （多型アミノ酸は太字であり、下線が引かれている）（配列番号２３０）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型は、ＴＮＦＲＳＦ１１ＡのＨ１４１Ｙ／Ａ１９２Ｖ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型は、
Figure 2023538115000030
 （多型アミノ酸は太字であり、下線が引かれている）（配列番号２３１）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３の１９２位にＡを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａ多型を含み、第２の受容体は、配列番号１３の１９２位にＶを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対してよりも、配列番号１３の１９２位にＡを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３の１９２位にＶを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａ多型を含み、第２の受容体は、配列番号１３の１９２位にＡを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対してよりも、配列番号１３の１９２位にＶを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３の１４１位にＨを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａ多型を含み、第２の受容体は、配列番号１３の１４１位にＹを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対してよりも、配列番号１３の１４１位にＨを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３の１４１位にＹを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａ多型を含み、第２の受容体は、配列番号１３の１４１位にＨを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対してよりも、配列番号１３の１４１位にＹを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。
マウスＴＮＦＲＳＦ１１Ａアイソフォーム１は、ＮＣＢＩ記録番号ＡＨ１９１８５．１に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａは、
Figure 2023538115000031
 のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａは、配列番号３２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型残基は、配列番号３２に太字としてマークされ、下線が引かれている。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型を含む。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの多型残基は、配列番号３２の１４２位及び１９３位を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３２のアミノ酸１４２又は１９３を含むＴＮＦＲＳＦ１１Ａのペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体におけるインテグリンアルファ－Ｅ（ＩＴＧＡＥ）又はその抗原ペプチドを含む。ＩＴＧＡＥは、細胞外ドメインにおける２つの多型を含む：０．２６５４のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するＲ９５０Ｗ（ｒｓ１７１６）及び０．２８２のＭＡＦを有するＶ１０１９Ａ／Ｖ１０１９Ｇ（ｒｓ２９７６２３０）。
ヒトＩＴＧＡＥ（Ｒ９５０／Ｖ１０１０９）は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿００２１９９．３に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023538115000032
 いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥは、配列番号１４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＩＴＧＡＥの多型残基は、配列番号１４に太字としてマークされ、下線が引かれている。
いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、ＩＴＧＡＥのＲ９５０Ｗ／Ｖ１０１９対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、
Figure 2023538115000033
 （多型アミノ酸は太字であり、下線が引かれている）（配列番号２３２）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、ＩＴＧＡＥのＲ９５０／Ｖ１０１９Ａ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、
Figure 2023538115000034
 （多型アミノ酸は太字であり、下線が引かれている）（配列番号２３３）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、ＩＴＧＡＥのＲ９５０／Ｖ１０１９Ｇ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、
Figure 2023538115000035
 （多型アミノ酸は太字であり、下線が引かれている）（配列番号２３４）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、ＩＴＧＡＥのＲ９５０Ｗ／Ｖ１０１９対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、
Figure 2023538115000036
 （多型アミノ酸は太字であり、下線が引かれている）（配列番号２３５）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、ＩＴＧＡＥのＲ９５０Ｗ／Ｖ１０１９Ａ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、
Figure 2023538115000037
 （多型アミノ酸は太字であり、下線が引かれている）（配列番号２３６）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、ＩＴＧＡＥのＲ９５０Ｗ／Ｖ１０１９Ｇ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＧＡＥの多型は、
Figure 2023538115000038
 （多型アミノ酸は太字であり、下線が引かれている）（配列番号２３７）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＩＴＧＡＥの多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＩＴＧＡＥの多型残基を含むＩＴＧＡＥに由来するペプチドを含む。ＩＴＧＡＥの多型残基は、配列番号１４のアミノ酸９５０及び１０１９を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１４のアミノ酸９５０又は１０１９を含むＩＴＧＡＥのペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１４の９５０位にＲを有するＩＴＧＡＥ多型を含み、第２の受容体は、配列番号１４の９５０位にＷを有するＩＴＧＡＥリガンドに対してよりも、配列番号１４の９５０位にＲを有するＩＴＧＡＥリガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１４の９５０位にＷを有するＩＴＧＡＥ多型を含み、第２の受容体は、配列番号１４の９５０位にＲを有するＩＴＧＡＥリガンドに対してよりも、配列番号１４の９５０位にＷを有するＩＴＧＡＥリガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１４の１０１９位にＶを有するＩＴＧＡＥ多型を含み、第２の受容体は、配列番号１４の１０１９位にＡ又はＧを有するＩＴＧＡＥリガンドに対してよりも、配列番号１４の１０１９位にＶを有するＩＴＧＡＥリガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１４の１０１９位にＡを有するＩＴＧＡＥ多型を含み、第２の受容体は、配列番号１４の１０１９位にＶ又はＧを有するＩＴＧＡＥリガンドに対してよりも、配列番号１４の１０１９位にＡを有するＩＴＧＡＥリガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１４の１０１９位にＧを有するＩＴＧＡＥ多型を含み、第２の受容体は、配列番号１４の１０１９位にＶ又はＡを有するＩＴＧＡＥリガンドに対してよりも、配列番号１４の１０１９位にＧを有するＩＴＧＡＥリガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体においてＡＣＨＲＢ（ＣＨＲＮＢ、又はＣＨＲＮＢ１とも呼ばれる）、又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＡＣＨＲＢは、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿０００７３８．２に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＡＣＨＲＢは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023538115000039
 いくつかの実施形態において、ＡＣＨＲＢは、配列番号３３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＡＣＨＲＢの多型残基は、配列番号３３に太字としてマークされ、下線が引かれている。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＡＣＨＲＢの多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＡＣＨＲＢの多型残基を含むＡＣＨＲＢに由来するペプチドを含む。ＡＣＨＲＢの多型残基は、配列番号３３の３２を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３３のアミノ酸３２を含む、ＡＣＨＲＢのペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３３のアミノ酸３２にＥを含む、ＡＣＨＲＢのペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３３のアミノ酸３２にＧを含む、ＡＣＨＲＢのペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体におけるＴＲＰＶ１又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＴＲＰＶ１は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿５４２４３５．２に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＶ１は、
Figure 2023538115000040
 （配列番号３４）のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＲＰＶ１は、配列番号３４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＴＲＰＶ１の多型残基は、配列番号３４に太字としてマークされ、下線が引かれている。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＴＲＰＶ１の多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＴＲＰＶ１の多型残基を含むＴＲＰＶ１に由来するペプチドを含む。ＴＲＰＶ１の多型残基は、配列番号３４の５８５位、４５９位及び４６９位を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３４のアミノ酸５８５、４５９又は４６９を含むＴＲＰＶ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３４のアミノ酸５８５におけるＩを含む、ＴＲＰＶ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３４のアミノ酸５８５におけるＶを含む、ＴＲＰＶ１のペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体におけるＳＲＥＣ又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＳＲＥＣアイソフォーム１は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿００３６８４．２に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＳＲＥＣは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023538115000041
 いくつかの実施形態において、ＳＲＥＣは、配列番号３５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＳＲＥＣの多型残基は、配列番号３５に太字としてマークされ、下線が引かれている。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＳＲＥＣの多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＳＲＥＣの多型残基を含むＳＲＥＣに由来するペプチドを含む。ＳＲＥＣの多型残基は、配列番号３５の３３９位及び４２５位を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３５のアミノ酸３３９又は４２５を含むＳＲＥＣのペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３５のアミノ酸４２５にＡを含む、ＳＲＥＣのペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号３５のアミノ酸４２５にＶを含む、ＳＲＥＣのペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体においてＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＣＸＣＬ１６前駆体は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿００１０９４２８２．１に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ１６は、
Figure 2023538115000042
 のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＣＸＣＬ１６の多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＣＸＣＬ１６の多型残基を含むＣＸＣＬ１６に由来するペプチドを含む。ＣＸＣＬ１６の多型残基は、配列番号１３６の１４２位及び２００位を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３６のアミノ酸１４２又は２００を含むＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３６のアミノ酸２００におけるＡを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３６のアミノ酸２００におけるＶを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３６のアミノ酸１４２におけるＩを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３６のアミノ酸１４２におけるＴを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体においてコレクチンサブファミリーメンバー１２（ＣＯＬＥＣ１２）又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＣＯＬＥＣ１２は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿５６９０５７．２に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＣＯＬＥＣ１２は、
Figure 2023538115000043
 のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＯＬＥＣ１２は、配列番号１３７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＣＯＬＥＣ１２の多型残基は、配列番号１３７に太字としてマークされ、下線が引かれている。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＣＯＬＥＣ１２の多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＣＯＬＥＣ１２の多型残基を含むＣＯＬＥＣ１２に由来するペプチドを含む。ＣＯＬＥＣ１２の多型残基は、配列番号１３７の５２２位を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３７のアミノ酸５２２を含む、ＣＯＬＥＣ１２のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３７のアミノ酸５２２におけるＳを含む、ＣＯＬＥＣ１２のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３７のアミノ酸５２２におけるＰを含む、ＣＯＬＥＣ１２のペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体においてＡＰＣ下方制御１（ＡＰＣＤＤ１）又はその抗原ペプチドを含む。例示的なヒトＡＰＣＤＤ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ記録番号Ｑ８Ｊ０２５に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＡＰＣＤＤ１は、
Figure 2023538115000044
 のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＡＰＣＤＤ１の多型を含む。ＡＰＣＤＤ１の例示的な多型には、配列番号１３８の１５０位におけるＶ、Ｉ又はＬであり得る、ｒｓ３７４８４１５が含まれる。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３８のアミノ酸１５０を含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３８のアミノ酸１５０におけるＶを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３８のアミノ酸１５０におけるＩを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３８のアミノ酸１５０におけるＬを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。
更なる例示的なヒトＡＰＣＤＤ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ記録番号Ｖ９ＧＹ８２に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＡＰＣＤＤ１は、
Figure 2023538115000045
 のアミノ酸配列を含む。
ＡＰＣＤＤ１の例示的な多型には、ｒｓ１７８６６８３が含まれ、これは、配列番号１３９の１６５位におけるＹ又はＳであり得る。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３９のアミノ酸１６５を含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３９のアミノ酸１６５におけるＹを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１３９のアミノ酸１６５におけるＳを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。
更なる例示的なヒトＡＰＣＤＤ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ記録番号Ｊ３ＱＳＥ３に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＡＰＣＤＤ１は、
Figure 2023538115000046
 のアミノ酸配列を含む。
ＡＰＣＤＤ１の例示的な多型には、配列番号１４０の２８位におけるＱ又はＲであり得る、ｒｓ９９５２５９８が含まれる。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１４０のアミノ酸２８を含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１４０のアミノ酸２８におけるＱを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号１４０のアミノ酸２８におけるＲを含む、ＡＰＣＤＤ１のペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＡＰＣＤＤ１は、配列番号１３８～１４０のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＡＰＣＤＤ１の多型残基は、配列番号１３８～１４０に太字としてマークされ、下線が引かれている。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７を含む。本明細書に記載の実施形態で使用するために、特定のＨＬＡ対立遺伝子に結合するか、又はそれらを認識する様々な単一可変ドメインを表５に記載する。このようなｓｃＦｖとしては、例えば、以下の表５（相補性決定領域には下線が引かれている）に示されるペプチド非依存的な方式でＨＬＡ対立遺伝子に結合する、以下のマウス及びヒト化ｓｃＦｖ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2023538115000047
Figure 2023538115000048
Figure 2023538115000049
Figure 2023538115000050
Figure 2023538115000051
Figure 2023538115000052
Figure 2023538115000053
Figure 2023538115000054
Figure 2023538115000055
Figure 2023538115000056
Figure 2023538115000057
Figure 2023538115000058
Figure 2023538115000059
Figure 2023538115000060
Figure 2023538115000061
Figure 2023538115000062
Figure 2023538115000063
Figure 2023538115000064
Figure 2023538115000065
Figure 2023538115000066
Figure 2023538115000067
Figure 2023538115000068
Figure 2023538115000069
Figure 2023538115000070
Figure 2023538115000071
Figure 2023538115000072
Figure 2023538115000073
Figure 2023538115000074
Figure 2023538115000075
Figure 2023538115000076
Figure 2023538115000077
Figure 2023538115000078
Figure 2023538115000079
Figure 2023538115000080
Figure 2023538115000081
Figure 2023538115000082
Figure 2023538115000083
Figure 2023538115000084
いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体のリガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７に結合し、配列番号９１～１０２、２５０～２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、及び２７８～３４５、若しくは表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７に結合し、表５に記載の配列群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０１を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列番号３３７～３４５を含むＨＬＡ－Ａ＊０１ ｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列番号９１～１０２を含むＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０３を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列番号３２３～３３６を含むＨＬＡ－Ａ＊０３ ｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列番号２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４若しくは２７６、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＨＬＡ－Ａ＊１１ ｓｃＦｖ配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列番号２５０～２５９、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＨＬＡ－Ｂ＊０７ ｓｃＦｖ配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列番号２７８～３２２、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＨＬＡ－Ｃ＊０７ ｓｃＦｖ配列を含む。
ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、及びＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインについての例示的な重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３、又はＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）を以下の表６に示す。
Figure 2023538115000085
Figure 2023538115000086
Figure 2023538115000087
Figure 2023538115000088
Figure 2023538115000089
Figure 2023538115000090
Figure 2023538115000091
Figure 2023538115000092
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体のリガンド結合ドメインは、表６に記載のＣＤＲ配列を含む、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、又はＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体のリガンド結合ドメインは、表６に記載のＣＤＲ配列を含むＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体のリガンド結合ドメインは、表６に記載のＣＤＲ配列を含むＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃタンパク質の対立遺伝子バリアントに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるようなＨＬＡ－Ａ＊０１相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＨＬＡ－Ａ＊０１ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるようなＨＬＡ－Ａ＊０２相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＨＬＡ－Ａ＊０２ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号１０３～１０８若しくは配列番号１０９～１１４の相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は配列番号１０３～１０８若しくは配列番号１０９～１１４のＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０３に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるようなＨＬＡ－Ａ＊０３相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＨＬＡ－Ａ＊０３ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊１１に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるようなＨＬＡ－Ａ＊１１相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＨＬＡ－Ａ＊１１ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるようなＨＬＡ－Ｂ＊０７相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＨＬＡ－Ｂ＊０７ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるようなＨＬＡ－Ｃ＊０７相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＨＬＡ－Ｃ＊０７ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
リガンド結合ドメインのいずれかの更なる実施形態において、各ＣＤＲ配列は、１、２、３個以上の置換、挿入、又は欠失を有し得る。ＣＤＲ配列は、置換、欠失、又は挿入を許容し得る。配列アラインメントツール、日常的な実験、及び既知のアッセイを使用して、当業者は、過度の実験なしに、ＣＤＲ配列において、１、２、３個以上の置換、挿入、又は欠失を有するバリアント配列を生成及び試験することができる。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含む非標的抗原、及び第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ａ＊０２に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインは、配列番号９１～１０２のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインは、配列番号９１～１０２のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖは、配列番号１０３～１１４のうちのいずれか１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号１０３～１１４のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号１０３～１１４のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインの重鎖は、配列番号１０３～１１４のうちのいずれか１つの重鎖ＣＤＲを含み、抗原結合ドメインの軽鎖は、配列番号１０３～１１４のうちのいずれか１つの軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原結合ドメインは、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号１０６～１０８及び１１２～１４から選択されるＣＤＲを含み、軽鎖は、配列番号１０３～１５及び１０９～１１１から選択されるＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原結合ドメインは、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号９１～１０２のうちのいずれか１つの重鎖部分と少なくとも９５％同一の配列を含み、軽鎖は、配列番号９１～１０２のうちのいずれか１つの軽鎖部分と少なくとも９５％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号９１～１０２のうちのいずれか１つの重鎖部分と同一の配列を含み、軽鎖は、配列番号９１～１０２のうちのいずれか１つの軽鎖部分と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖは、配列番号９１～１０２のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖは、配列番号９１～１０２のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０１を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を含むｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０１ ｓｃＦｖは、表６に記載のＨＬＡ－Ａ＊１ ＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０３を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を含むｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３ ｓｃＦｖは、表６に記載のＨＬＡ－Ａ＊０３ ＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１１を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を含むｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１ ｓｃＦｖは、表６に記載のＨＬＡ－Ａ＊１１ ＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を含むｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７ ｓｃＦｖは、表６に記載のＨＬＡ－Ｂ＊０７ ＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を含むｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７ ｓｃＦｖは、表６に記載のＨＬＡ－Ｃ＊０７ ＣＤＲ配列を含む。
抑制性受容体
本開示は、抑制性キメラ抗原受容体である第２の受容体を提供する。抑制性受容体は、ＭＨＣ－Ｉ複合体における非標的抗原又はそのペプチド誘導体に結合し、それを認識する細胞外リガンド結合ドメインを含んでもよい。
例示的な抑制性受容体は、２０２０年９月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４５２２８、２０２０年１２月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６４６０７、２０２１年４月２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２９９０７、及び２０２０年１１月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５９８５６に記載されており、これらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「抑制性受容体」という用語は、免疫細胞の免疫活性を阻害又は抑制する抑制シグナルを形質導入することができる細胞内シグナル伝達ドメインに融合されるリガンド結合ドメインを指す。抑制性受容体は、免疫細胞抑制性の潜在能力を有し、免疫細胞活性化の潜在能力を有する受容体であるＣＡＲとは異なり、区別可能である。例えば、ＣＡＲは、細胞内刺激ドメイン及び／又は共刺激ドメインを含むので、受容体を活性化している。抑制性受容体は、細胞内阻害ドメインを含有する抑制性受容体である。
本明細書で使用される場合、「抑制シグナル」とは、免疫応答の抑制（例えば、サイトカイン産生の減少又は免疫細胞活性化の減少）をもたらす免疫細胞におけるシグナル伝達又はタンパク質発現の変化を指す。免疫細胞の阻害又は抑制は、選択的及び／若しくは可逆的であり得るか、又は選択的及び／若しくは可逆的ではない。抑制性受容体は、非標的抗原に応答する（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２）。例えば、非標的抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２）が、抑制性受容体に結合又は接触する場合、抑制性受容体は応答性であり、抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインによる非標的抗原の結合時に抑制性受容体を発現する免疫細胞における抑制シグナルを活性化する。
本開示の抑制性受容体は、細胞外リガンド結合ドメインを含み得る。リガンド依存的な様式で受容体の活性を調節することができる任意の種類のリガンド結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、抗原結合ドメインである。例示的な抗原結合ドメインには、とりわけ、ｓｃＦｖ、ＳｄＡｂ、Ｖβのみのドメイン、並びにＴＣＲα及びβ鎖可変ドメインに由来するＴＣＲ抗原結合ドメインが含まれる。
任意の種類の抗原結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、抑制性ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される。
いくつかの実施形態において、本開示の抑制性受容体は、細胞外ヒンジ領域を含む。例示的なヒンジは、ＩｇＤ及びＣＤ８ドメイン、例えば、ＩｇＧ１から単離又は派生され得る。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。
本開示の抑制性受容体は、抑制性受容体の細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避け、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。
膜貫通ドメインは、天然又は合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータ、若しくはゼータ鎖、又はＩｇＧ４などの免疫グロブリンから単離されてもよいか、又は派生されてもよい（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含む）。代替的に、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性残基を含む。いくつかの実施形態において、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。任意選択で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーは、膜貫通ドメインと抑制性受容体の細胞内ドメインとの間の結合を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
本開示は、細胞内ドメインを含む抑制性受容体を提供する。本開示の抑制性受容体の細胞内ドメインは、他の場合に第１の受容体による活性化シグナルに応答して活性化されるであろう、抑制性受容体を含む免疫細胞の活性化を抑制することを担う。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＩＭを含む抑制性細胞内ドメインは、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１などの免疫チェックポイント阻害剤から単離され得るか、又は派生され得る。ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１は、Ｔ細胞の表面上に発現する免疫抑制性受容体であり、Ｔ細胞応答の減衰又は終結において重要な役割を果たす。
いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体及びＣＤ２００受容体１から単離される。いくつかの実施形態において、ＴＲＡＩＬ受容体は、ＴＲ１０Ａ、ＴＲ１０Ｂ又はＴＲ１０Ｄを含む。
いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、グリコスフィンゴ脂質マイクロドメイン１（ＰＡＧ１）を有するリンタンパク質膜アンカーから単離される。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１（ＬＩＬＲＢ１）から単離される。
いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、ヒトタンパク質、例えば、ヒトＴＲＡＩＬ受容体、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＡＧ１、又はＬＩＬＲＢ１タンパク質から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、細胞内ドメイン、膜貫通、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、又はそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部３（ＫＩＲ３ＤＬ３）、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１（ＬＩＲ－１及びＬＩＬＲＢ１とも呼ばれる、ＬＩＲ１）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＢ（ＦｃｇＲＩＩＢ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｋ１（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＴＬＡ－４、合成コンセンサスＩＴＩＭを含有するドメイン、ＺＡＰ７０ ＳＨ２ドメイン（例えば、Ｎ及びＣ末端ＳＨ２ドメインの１つ又は両方）、又はＺＡＰ７０ ＫＩ＿Ｋ３６９Ａ（キナーゼ不活性ＺＡＰ７０）から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、ヒトタンパク質から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、抑制性細胞内ドメイン及び／又は抑制性膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、抑制性受容体の細胞内ドメインに融合される。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、抑制性受容体の膜貫通ドメインに融合される。
いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、同じタンパク質、例えば、ＩＴＩＭ含有タンパク質から単離されるか、又は派生される、単離されるか、又は派生される、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメイン又はそれらの一部分を含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、細胞内ドメイン及び／又は膜貫通ドメインと同じタンパク質、例えば、ＩＴＩＭ含有タンパク質から単離されるか、又は派生される、単離されるか、又は派生されるヒンジ領域を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、阻害ドメインを含むＴＣＲ（抑制性ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、抑制性ＴＣＲは、抑制性細胞内ドメイン及び／又は抑制性膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ若しくはＣＤ３イプシロンの細胞内ドメイン、又はそれらの一部分のＴＣＲに融合される。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ又はＣＤ３イプシロンの膜貫通ドメインに融合される。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、阻害ドメインを含むＴＣＲ（抑制性ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、ＬＩＬＲＢ１から単離されるか、又は派生される。
ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体
本開示は、ＬＩＬＲＢ１阻害ドメイン、並びに任意選択で、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び／若しくはヒンジドメイン、又はその機能的バリアントを含む、第２の抑制性受容体を提供する。ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び／又はＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインを抑制性受容体に含めることにより、別の膜貫通ドメイン又は別のヒンジドメインを有する参照抑制性受容体と比較して、抑制性受容体によって生成される抑制シグナルが増加し得る。ＬＩＬＲＢ１阻害ドメインを含む第２の抑制性受容体は、本明細書に記載されるようなＣＡＲ又はＴＣＲであってもよい。本明細書に記載されるような任意の好適なリガンド結合ドメインは、ＬＩＬＲＢ１ベースの第２の抑制性受容体に融合され得る。
白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１としても知られている、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１）、並びにＩＬＴ２、ＬＩＲ１、ＭＩＲ７、ＰＩＲＢ、ＣＤ８５Ｊ、ＩＬＴ－２ ＬＩＲ－１、ＭＩＲ－７、及びＰＩＲ－Ｂは、白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＲ）ファミリーのメンバーである。ＬＩＬＲＢ１タンパク質は、ＬＩＲ受容体のサブファミリーＢクラスに属する。これらの受容体は、２～４個の細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び２～４個の細胞質免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。ＬＩＬＲＢ１受容体は、免疫細胞上で発現され、それは、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩ分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを形質導入する。ＬＩＬＲＢ１は、炎症反応、及び細胞傷害性を調節し、自己反応性を制限する際に役割を果たすと考えられている。ＬＩＬＲＢ１の異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが存在し、これらの全ては、本開示の範囲内であると企図される。
本明細書に記載される抑制性受容体のいくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１から単離されるか、又は派生される１つ以上のドメインを含む。ＬＩＬＲＢ１から単離されるか、又は派生される１つ以上のドメインを有する受容体のいくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号１１５の配列又は部分配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号１１５の配列又は部分配列と同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号１１５の配列又は部分配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一であるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号１１５の配列又は部分配列と同一であるアミノ酸配列からなる。
ＬＩＬＲＢ１から単離されるか、又は派生される１つ以上のドメインを有する受容体のいくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号１１６の配列又は部分配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインを有する受容体のいくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号１１６の配列又は部分配列と同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
様々な実施形態において、ポリペプチドを含む抑制性受容体が提供され、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的バリアント、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアント、及びＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又は少なくとも１つ、若しくは少なくとも２つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインのうちの１つ以上を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）から選択される。
本明細書で使用される場合、「免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ」又は「ＩＴＩＭ」とは、免疫系の多くの抑制性受容体の細胞質尾部に見出される、Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ（配列番号９８４）などのコンセンサス配列を有するアミノ酸の保存配列を指す。ＩＴＩＭ保有抑制性受容体が、それらのリガンドと相互作用した後、ＩＴＩＭモチーフがリン酸化され、抑制性受容体が、他の酵素、例えば、ホスホチロシンホスファターゼＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２、又はＳＨＩＰと呼ばれるイノシトール－ホスファターゼを動員することが可能になる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）、少なくとも２つのＩＴＩＭ、少なくとも３つのＩＴＩＭ、少なくとも４つのＩＴＩＭ、少なくとも５つのＩＴＩＭ、又は少なくとも６つのＩＴＩＭを含む、細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、１、２、３、４、５、又は６つのＩＴＩＭを有する。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）からなるＩＴＩＭの群から選択される少なくとも１つのＩＴＩＭを含む、細胞内ドメインを含む。
更なる特定の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも２つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）から選択される。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）及びＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）の両方を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２１と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２１と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）及びＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）の両方を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２２と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２２と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）の両方を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２３と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２３と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、及びＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２４と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２４と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２５と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２５と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）を含む。実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２６と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号１２６と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン（配列番号１３１）と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン（配列番号１３１）と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
本開示のＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、又は少なくとも８つのＩＴＩＭを有することができる。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントは、２、３、４、５、又は６つのＩＴＩＭを有する。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、２、３、４、５、又は６つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、少なくとも３つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、３つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、４つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、５つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、６つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、少なくとも７つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）から選択される。
ＬＩＬＲＢ１タンパク質は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４と呼ばれる４つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインは、配列番号１２７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインは、配列番号１２７を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的バリアントを含む。実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的バリアントは、配列番号１３４、配列番号１２７、又は配列番号１２８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれらと同一である配列を含む。実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的バリアントは、配列番号１３４、配列番号１２７、又は配列番号１２８と少なくとも９５％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号１３４、配列番号１２７、又は配列番号１２８と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号１３４、配列番号１２７、又は配列番号１２８と同一の配列から本質的になる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントである。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントは、配列番号１３５と少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントは、配列番号１３５と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号１３５と同一の配列を含む。実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号１３５と同一の配列から本質的になる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して、第２の抑制性受容体、例えば、抗原結合ドメイン又はリガンド結合ドメインの細胞外領域に結合することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ａヒンジ、又はＬＩＬＲＢ１ヒンジであり得る。
いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、抑制性細胞内ドメイン及び／又は抑制性膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、ＬＩＬＲ１Ｂから単離されるか、又は派生される。
ＬＩＬＲＢ１ドメインの組み合わせを含む抑制性受容体
いくつかの実施形態において、本開示のＬＩＬＲＢ１ベースの抑制性受容体は、１つを超えるＬＩＬＲＢ１ドメイン又はその機能的等価物を含む。例えば、いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン、又はＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
特定の実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的断片、及びＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン、又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１２９と少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１２９と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１２９と同一の配列を含む。
更なる実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアント、並びにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及び／又は少なくとも１つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインを含み、ＩＴＩＭは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）から選択される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアント、並びにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及び／又は少なくとも２つのＩＴＩＭを含む細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１２０）から選択される。
いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３０と同一の配列を含む。
好ましい実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的バリアント、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン、又はその機能的バリアント、並びにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及び／又は少なくとも２つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、ＬＹＡＡＶ（配列番号１１７）、ＶＴＹＡＥ（配列番号１１８）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号１１９）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号１１）から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、配列番号１３２若しくは配列番号１３３と少なくとも９５％同一、又は配列番号１３２若しくは配列番号１３３と少なくとも９９％同一、又は配列番号１３２若しくは配列番号１３３と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１２９と少なくとも９９％同一、又は配列番号１２９と少なくとも９９％同一、又は配列番号１２９と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも９９％同一、又は配列番号１３０と少なくとも９９％同一、又は配列番号１３０と同一の配列を含む。
Figure 2023538115000093
Figure 2023538115000094
Figure 2023538115000095
Figure 2023538115000096
ポリヌクレオチド及びベクター
本開示は、本開示の第１及び第２の受容体の配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド及びベクターを含む、免疫細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２の受容体の配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、第１の受容体をコードする配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され、第２の受容体をコードする配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結される。
本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、第１のベクターによってコードされ、第２の受容体は、第２のベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、両方の受容体は、単一のベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のベクターは、ｓｈＲＮＡ、例えば、Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、両方の受容体は、単一のベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｓｈＲＮＡ、例えば、Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、第１及び第２の受容体は、単一のベクターによってコードされる。単一のベクターを使用して複数のポリペプチドをコードする方法は、当業者に既知であり、とりわけ、異なるプロモーターの制御下で複数のポリペプチドをコードすること、又は単一のプロモーターを使用して複数のポリペプチドの転写を制御する場合、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及び／若しくは自己切断ペプチドをコードする配列の使用を含むであろう。例示的な自己切断ペプチドには、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ及びＦ２Ａ自己切断ペプチドが含まれる。いくつかの実施形態において、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号４８９）の配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８６）の配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ａ自己切断ペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号４９０）の配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ２Ａ自己切断ペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号４９１）の配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号４８９）の配列を含む。前述のうちのいずれも、またＮ末端ＧＳＧリンカーを含むこともできる。例えば、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドは、ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣ（配列番号４９２）の配列によってコードされ得る、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８１）の配列も含むことができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクター、すなわち、好適な細胞における第１及び／又は第２の受容体の発現のためのものである。
レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定的な組み込み、及び娘細胞におけるその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子移入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターよりも追加の利点を有する。これらはまた、低免疫原性という追加の利点も有する。
受容体をコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には、受容体又はその部分をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物の複製及び組み込みに好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。
受容体をコードするポリヌクレオチドは、いくつかの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むが、これらに限定されない、ベクターにクローニングすることができる。特に目的のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが含まれる。
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で、免疫細胞などの細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能なマーカー（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号）を含有する。
哺乳動物細胞への遺伝子移入のために、多くのウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための簡便なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該技術分野で既知の技術を使用して、ベクター内に挿入され、レトロウイルス粒子内にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスを単離し、対象の細胞にインビボ又はエクスビボのいずれかで送達することができる。多くのレトロウイルスシステムが、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが、当該技術分野で既知である。一実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
追加のプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の上流の領域３０～１１０塩基対（ｂｐ）に位置するが、多くのプロモーターが、最近、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟性があり、その結果、エレメントが互いに対して反転又は移動するときに、プロモーター機能が保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐ離して増加させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協調的又は独立してのいずれかで機能して、転写を活性化することができるように見える。
好適なプロモーターの一例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することが可能な強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスプロモーター、Ｕ６プロモーター、並びに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターを含む、他の構成的プロモーター配列も使用され得る。更に、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本開示の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が所望される場合に、作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができるか、又は発現が所望されない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、限定されないが、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
受容体の発現を評価するために、細胞内に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又は両方を含有することができる。他の態様において、選択可能なマーカーは、別個のＤＮＡ片上に担持されてもよく、同時トランスフェクション手順で使用されてもよい。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の両方に、適切な調節配列を隣接させて、宿主細胞での発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーには、例えば、ネオ（ｎｅｏ）などの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクト又は形質導入された細胞を同定し、調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物若しくは組織内に存在しないか、又はそれによって発現されない遺伝子であり、その発現が、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって現れるポリペプチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡがレシピエント細胞内に導入された後の好適な時間に、レポーター遺伝子の発現をアッセイする。好適なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。好適な発現系は周知であり、既知の技術を使用して調製することができるか、又は商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結されてもよく、プロモーターにより駆動される転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用されてもよい。
遺伝子を細胞内に導入及び発現する方法は、当該技術分野で既知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞内に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞内に移入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための１つの方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、及び特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞内に遺伝子を挿入するために最も広範に使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照のこと。
ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、並びに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む、脂質ベースの系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
宿主細胞内に外因性核酸を導入するために使用される方法に関わらず、又はそうでなければ本開示の抑制因子に細胞を曝露するために使用される方法に関わらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、本開示の範囲内に含まれる作用物質を同定するために免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によって、又は本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの存在又は不在を検出することなどの「生化学的」アッセイが含まれる。
免疫細胞
本開示は、本明細書に記載の受容体、ベクター及びポリヌクレオチドを含む、免疫細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、（ａ）（ｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原、若しくはそのペプチド抗原、又は（ｉｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）、若しくはそのペプチド抗原から選択される標的抗原に特異的な第１の細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体と、（ｂ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ＴＮＦＲＳＦ１１、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、及びＳＲＥＣ、又はそれらの抗原ペプチドから選択される非標的抗原に特異的な第２の細胞外リガンド結合を含む、第２の受容体と、を含み、非標的抗原は、多型を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、ＣＡＲ又はＴＣＲである。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、抑制性キメラ抗原受容体又はＴＣＲなどの抑制性受容体である。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、先天性又は適応性（後天性）免疫系に関与する細胞を指す。例示的な先天性免疫細胞には、好中球、単球及びマクロファージなどの食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球好酸球及び好塩基球などの多形核白血球、並びに単球、マクロファージ及び肥満細胞などの単核細胞が含まれる。後天性免疫において役割を有する免疫細胞には、Ｔ細胞及びＢ細胞などのリンパ球が含まれる。
本開示は、配列番号５２の配列を含む第１の受容体と、配列番号１６４の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む第２の受容体と、を含む、免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号１７９）を含む配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列によってコードされるｓｈＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、配列番号５２の配列を含む第１の受容体、配列番号１６４の配列を含む第２の受容体、及び配列番号１７９の配列を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体は、単一のポリヌクレオチドによってコードされ、第１及び第２の受容体をコードする配列は、自己切断ポリペプチドをコードする配列によって分離される。いくつかの実施形態において、自己切断ポリペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８１）の配列を含むＴ２Ａ自己切断ポリペプチドを含む。
本開示は、配列番号１４１の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１４１を含む。
本開示は、配列番号１４２の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを含む、免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４２を含む。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」とは、胸腺において発生する骨髄前駆体に由来するリンパ球の種類を指す。ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、調節ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び幹記憶Ｔ細胞を含む、胸腺への移行時に発生する、いくつかの異なる種類のＴ細胞が存在する。異なるタイプのＴ細胞は、それらのマーカーの発現に基づいて、当業者によって区別することができる。Ｔ細胞の種類を区別する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。
いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体はともに、標的細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、インバリアントＴ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８－である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８＋である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４－である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８－／ＣＤ４＋である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、非天然である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、単離される。
本開示のベクターを用いて、Ｔ細胞などの免疫細胞の集団を形質転換する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、製造業者の指示に従って、ＣＤ３＋Ｔ細胞陰性単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＭＣから単離することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ３／２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１：１の細胞対ビーズ比）及び３００ユニット／ｍＬのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の存在下で、５％のヒトＡ／Ｂ血清及び１％のＰｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したＸ－Ｖｉｖｏ１５培地中で１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で培養することができる。２日後、Ｔ細胞を、当該技術分野で既知の方法を使用して、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターで形質導入することができる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入される。次いで、細胞は、濃縮の前に更に５日間、ＩＬ－２又はＩＬ－７／１５／２１の組み合わせなどの他のサイトカイン中で培養することができる。Ｂ細胞などの免疫細胞の他の集団、又はＴ細胞の他の集団を単離及び培養する方法は、当業者には容易に明らかであろう。この方法は、潜在的なアプローチを概説しているが、これらの方法論は、急速に進化していることに留意すべきである。例えば、末梢血単核細胞の優れたウイルス形質導入は、５日間の増殖後に達成して、９９％超のＣＤ３＋が高度に形質導入された細胞集団を生成することができる。
ＴＣＲ、ＣＡＲ、抑制性受容体の受容体又はそれらをコードするベクターを含むＴ細胞の集団を活性化及び培養する方法は、当業者には容易に明らかであろう。
ＴＣＲを発現するためのＴ細胞の遺伝子修飾の前又は後に関わらず、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、同第１００４０８４６号、及び米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に一般的に記載されている方法を使用して活性化及び増殖することができる。
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、インビトロで増殖及び活性化される。一般に、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを、それに付着させた表面との接触によってインビトロで増殖される。特に、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体との接触によって本明細書に記載されるように刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野で一般的に知られている他の方法として使用することができる（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，１９９８、Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９、Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，１９９９）。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞についての一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液中にあってもよいか、又は表面に結合していてもよい。表面に結合されたとき、作用物質は、同じ表面に結合されてもよく（すなわち、「シス」形成において）、又は別々の表面に結合されてもよい（すなわち、「トランス」形成において）。代替的に、一方の作用物質は表面に結合してもよく、他方の作用物質は溶液中にあってもよい。いくつかの実施形態において、共刺激シグナルを提供する作用物質は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する作用物質は溶液中にあるか、又は表面に結合している。ある特定の実施形態において、両方の作用物質は、溶液中にあってもよい。別の実施形態において、作用物質は、可溶性形態であってもよく、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞、又は作用物質に結合する抗体若しくは他の結合剤などの表面に架橋されてもよい。これに関して、例えば、本開示におけるＴ細胞の活性化及び増殖に使用するために企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、米国特許出願公開第２００４／０１０１５１９号及び同第２００６／００３４８１０号を参照されたい。
いくつかの実施形態において、２つの作用物質は、同じビーズ上に固定化されるか、すなわち「シス」、又は別個のビーズに固定化される、すなわち「トランス」のいずれかで、ビーズ上に固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合断片であり、両方の作用物質は、同等の分子量で同じビーズに共固定化される。一実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞拡大及びＴ細胞増殖のためのビーズに結合した各抗体の１：１の比が使用される。いくつかの実施形態において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１～１：１００及びその間にある全ての整数値の範囲である。本開示の一態様において、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合し、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比が１未満である。本開示のある特定の実施形態において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は、２：１を超える。
Ｔ細胞又は他の標的細胞を刺激するために、１：５００～５００：１及びそれらの間の任意の整数値の粒子対細胞の比が使用され得る。当業者であれば容易に理解することができるように、粒子対細胞の比は、標的細胞に対する粒径に依存し得る。例えば、小さなサイズのビーズは、少しの細胞にのみ結合することができ、一方、より大きなビーズは、多くの細胞に結合することができる。ある特定の実施形態において、細胞対粒子の比は、１：１００～１００：１及びそれらの間の任意の整数値の範囲であり、更なる実施形態において、その比は、１：９～９：１及びそれらの間の任意の整数値を含み、また、Ｔ細胞を刺激するために使用することもできる。いくつかの実施形態において、１：１の細胞対ビーズの比が使用される。当業者は、様々な他の比が、本開示での使用に好適であり得ることを理解するであろう。特に、比は、粒径、並びに細胞のサイズ及び種類に応じて変動することになる。
本開示の更なる実施形態において、Ｔ細胞などの細胞を、作用物質をコーティングしたビーズと合わせ、続いてビーズ及び細胞を分離し、次いで細胞を培養する。代替的な実施形態において、培養前に、作用物質をコーティングしたビーズ及び細胞を分離しないが、一緒に培養する。更なる実施形態において、ビーズ及び細胞を、最初に、磁力などの力を加えることによって濃縮し、その結果、細胞表面マーカーのライゲーションが増加し、それによって細胞刺激が誘導される。
例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合してＴ細胞に接触する、常磁性ビーズを可能にすることによってライゲーションされ得る。一実施形態において、細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）及びビーズ（例えば、１：１の比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ常磁性ビーズ）を緩衝液中に合わせる。ここでも、当業者は、任意の細胞濃度が使用され得ることを容易に理解することができる。ある特定の実施形態において、粒子及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましく、細胞及び粒子の最大限の接触を確保することができる。例えば、一実施形態において、約２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。別の実施形態において、１億個を超える細胞／ｍｌが使用される。更なる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、又は５０００万個の細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。更に別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、又は１億個の細胞／ｍｌからの細胞の濃度が使用される。更なる実施形態において、１億２５００万個又は１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。いくつかの実施形態において、１×１０６個の細胞／ｍＬの密度で培養される細胞が使用される。
いくつかの実施形態において、混合物は、数時間（約３時間）～約１４日間、又はその間の任意の時間単位の整数値で培養されてもよい。別の実施形態において、ビーズ及びＴ細胞は、２～３日間一緒に培養される。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシ胎仔又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ－α、又は当業者に既知の細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はＸ－ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、並びに還元剤、例えば、Ｎ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールが含まれるが、これらに限定されない。培地には、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、及びＸ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが含まれてもよく、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加されており、血清を含まないか、あるいは適切な量の血清（若しくは血漿）若しくは規定のセットのホルモン、並びに／又はＴ細胞の増殖及び拡大に十分な量のサイトカインが補充されている。いくつかの実施形態において、培地は、５％のヒトＡ／Ｂ血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）及び３００ユニット／ｍｌのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ－１５培地を含む。
Ｔ細胞は、増殖を支持するために必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ２）で維持される。
いくつかの実施形態において、本開示のＴＣＲ、ＣＡＲ、及び抑制性受容体を含むＴ細胞は、自己由来である。拡大及び遺伝子修飾の前に、Ｔ細胞の供給源が対象から得られる。Ｔ細胞などの免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。本開示のある特定の実施形態において、当該技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株が使用され得る。本開示のある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に既知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。
いくつかの実施形態において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む、リンパ球を含有する。いくつかの実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液又は培地中に入れてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替的な実施形態において、洗浄液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてもよいか、又は全てではないが多くの二価カチオンを欠いてもよい。当業者であれば容易に理解するであろうが、洗浄ステップは、製造業者の指示に従って、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用することなどによって、当業者に既知の方法によって達成され得る。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋非含有ＰＢＳ、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａなど、又は緩衝液を伴うか、若しくは伴わない他の生理食塩水中で再懸濁され得る。代替的に、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁させてもよい。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞などの免疫細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離によって、又は向流遠心分離によって、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はＣＤ４＋Ｔ細胞などの免疫細胞の特定の亜集団は、陽性又は陰性選択技術によって更に単離され得る。例えば、一実施形態において、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間、抗ＣＤ４コンジュゲートビーズとのインキュベーションによって単離される。
陰性選択によるＴ細胞集団などの免疫細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを対象とする抗体の組み合わせによって達成され得る。１つの方法は、陰性磁気免疫接着又はフローサイトメトリーによる細胞の選別及び／又は選択であり、これは、陰性に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを対象とするモノクローナル抗体のカクテルを使用する。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。
陽性又は陰性選択による免疫細胞の所望の集団の単離のために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。ある特定の実施形態において、ビーズ及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましく、細胞及びビーズの最大限の接触を確保することができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、２～１０℃又は室温のいずれかで様々な速度で、様々な長さの時間、回転子上でインキュベートされてもよい。
刺激用Ｔ細胞、又はＴ細胞などの免疫細胞が単離されるＰＢＭＣも、洗浄ステップ後に凍結することができる。理論に拘束されることを望まないが、凍結及びその後の解凍ステップは、細胞集団における顆粒球、及びある程度は単球を除去することによって、より均一な生成物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞を凍結溶液中に懸濁させることができる。多くの凍結溶液及びパラメータが当該技術分野で既知であり、この文脈において有用であるが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、あるいは１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン及び７．５％のＤＭＳＯ、若しくは３１．２５％のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、及び７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、又は例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地を使用することを含み、次いで、細胞は、毎分１°の速度で－８０℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相に保存される。制御凍結の他の方法、及び－２０℃又は液体窒素中での制御されていない即座の凍結を使用してもよい。
本開示は、本明細書に記載の活性化因子及び／又は遮断因子受容体を発現する免疫細胞を提供し、免疫細胞は、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ複合体の発現及び／又は機能を低下させる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己由来である。例えば、免疫細胞は、治療レジメンの一部として細胞を受容する同じ対象から単離されるか、又は派生される。遮断因子受容体によるＭＨＣクラスＩの発現及び／又は機能を低下させるように自己免疫細胞を修飾することは、ＭＨＣクラスＩ抗原に特異的であることが有利であり得る。理論に拘束されることを望まないが、ＭＨＣクラスＩの発現及び／又は機能が低下するように自己免疫細胞を修飾することは、シス又はトランスのいずれかにおいて、免疫細胞によって発現されるＭＨＣクラスＩによる遮断因子受容体の結合を低下させる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、全て同種異系である。同種免疫細胞は、免疫細胞が投与される対象以外のドナーに由来し得る。同種異系細胞は、様々な遺伝子型の対象に使用するために調製及び貯蔵される可能性があるため、同種免疫細胞は、細胞療法において「既製の」又は「普遍的な」と一般的に称されている。
ＭＨＣクラスＩ複合体の発現及び／又は機能を低下させる任意の好適な方法は、本開示の範囲内であると想定され、とりわけ、ＭＨＣクラスＩ構成要素をコードする１つ以上のＲＮＡをノックダウンする干渉ＲＮＡの発現、又はＭＨＣクラスＩ構成要素をコードする遺伝子の修飾を含む。本明細書に記載のＭＨＣクラスＩ複合体の発現及び／又は機能を低下させる方法は、同種異系及び自己免疫細胞の両方での使用に好適である。
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、適応免疫系に必要なポリペプチドのセットをコードする脊椎動物ゲノム上の遺伝子座である。これらの中には、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ、並びにそれらの対立遺伝子を含む、ＭＨＣクラスＩポリペプチドがある。ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子は、高度に多型であり、全ての有核細胞において発現される。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＣによってコードされるＭＨＣクラスＩポリペプチド及びそれらの対立遺伝子は、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とヘテロ二量体を形成し、細胞の表面上の抗原と複合体で存在する。本明細書で言及されるように、ＭＨＣクラスＩ遺伝子又はポリペプチドは、ＭＨＣ又は該ポリペプチドをコードする対応する遺伝子に見出される任意のポリペプチドを指してもよい。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ、並びにそれらの対立遺伝子を含む、抑制因子リガンドによって不活性化される。ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、例えば、限定されないが、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１、及び／又はＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質と同一若しくは類似のタンパク質をコードする任意の遺伝子であり得る。したがって、本明細書に記載の自己分泌シグナル伝達／結合を防止するために、免疫細胞内のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃによってコードされるポリペプチド、並びにそれらの対立遺伝子の発現を除去又は低下させることが望ましい。
ＭＨＣクラスＩポリペプチド発現が低下した免疫細胞
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の免疫細胞は、内因性ＭＨＣクラスＩポリペプチドの対立遺伝子をコードする内因性遺伝子の発現又は機能を不活性化するか、又は低下若しくは除去するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及び／又はＨＬＡ－Ｃである。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子座によってコードされる。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃの各々は、多くのバリアント対立遺伝子を含み、これらの全ては、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａである。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子産物の発現を低下又は除去するように修飾される。ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ、すなわち、ＭＨＣ－Ｉ複合体と会合するタンパク質をコードする。ＭＨＣ－Ｉ複合体は、細胞表面上の抗原の提示に必要とされる。ＭＨＣ－Ｉ複合体は、Ｂ２Ｍが欠失されると破壊され、機能しない（Ｗａｎｇ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．４：１２３４－１２４５（２０１５））。更に、Ｂ２Ｍ遺伝子は、当該技術分野で既知の遺伝子編集技術を使用して、高効率で破壊することができる（Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２３：２２５５－２２６６（２０１７））。Ｂ２Ｍを低下又は除去することは、免疫細胞の表面上の機能的ＭＨＣ Ｉを低下又は除去することができる。
本開示は、免疫細胞における内因性標的遺伝子を編集するための遺伝子編集システムを提供する。本開示は、標的遺伝子の配列に特異的な干渉ＲＮＡを提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ及び亜鉛フィンガーなどの遺伝子編集システムを使用して、二本鎖切断を生成することができ、これは、相同性指向修復又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの遺伝子修復機構を通じて、変異を導入するために使用され得る。破壊した末端の切除後のＮＨＥＪ、又は不適切な末端結合は、欠失を導入するために使用され得る。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＭＨＣ－Ｉ複合体のサブユニットをコードする遺伝子を含む。
標的遺伝子配列には、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、イントロン／エクソンジャンクション、転写産物（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びスプライスバリアント）、並びに／又は３’及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が含まれるが、これらに限定されない。任意の遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントの組み合わせは、本明細書に記載される免疫細胞における遺伝子編集の目的のために標的化され得る。標的遺伝子に対する修飾は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、標的遺伝子又は遺伝子産物の発現又は機能の変化又は破壊をもたらす標的遺伝子を編集することによって達成することができる。
いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子を修飾することは、遺伝子の全て又は一部分を欠失させることを含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子を修飾することは、遺伝子に変異を導入することを含む。いくつかの実施形態において、変異は、欠失、挿入、置換、又はフレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子を修飾することは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼを使用することを含む。
本明細書に記載される標的遺伝子についての遺伝子配列は、当該技術分野で既知である。配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ又はＮＣＢＩヌクレオチドデータベースなどの公開データベースに見出すことができる。配列は、遺伝子識別子を使用して見出すことができ、例えば、ＨＬＡ－Ａ遺伝子が、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３１０５を有し、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子が、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３１０６を有し、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子が、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３１０７を有し、Ｂ２Ｍ遺伝子が、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５６７及びＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１５．１０を有する。遺伝子配列は、キーワードを使用して公開データベースを検索することによっても見出すことができる。例えば、ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、キーワード「ＨＬＡ－Ａ＊０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１」、又は「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１」を検索することによって、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース中に見出すことができる。これらの配列は、当該技術分野で既知の様々な遺伝子編集技術における標的化に使用することができる。表８は、本明細書に記載の修飾のために標的化されたＨＬＡ－Ａ対立遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子配列の非限定的な例示的配列を提供する。
Figure 2023538115000097
当業者は、ＴがＵに置換されて、ＲＮＡ配列をＤＮＡ配列に変換することができ、逆もまた同様であることを理解し、両方とも本開示の標的遺伝子配列として想定される。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、核酸誘導型エンドヌクレアーゼを使用して、本明細書に記載の免疫細胞内で編集される。例示的な核酸誘導型エンドヌクレアーゼには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのクラスＩＩエンドヌクレアーゼが含まれる。
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」又は「ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集」とは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのセット、又はそのようなリピートのセットを含むシステムを指す。「Ｃａｓ」は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系とは、標的遺伝子をサイレンシングするか、ノックアウトするか、又は変異させるために使用することができる、ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓに由来する系を指す。この系は、プラスミド及びファージなどの外来遺伝子エレメントに耐性を付与し、後天性免疫の一形態を提供する原核生物免疫系の一種である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子編集に使用するために修飾されている。これは、真核生物細胞内に、１つ以上の特異的に設計されたガイド核酸（ｇＮＡ）、典型的にはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及びｇＮＡとリボヌクレオタンパク質複合体を形成する適切なＣａｓエンドヌクレアーゼを導入することによって達成される。ｇＮＡは、ｇＮＡ－エンドヌクレアーゼタンパク質複合体を標的ゲノム位置に誘導し、エンドヌクレアーゼは標的ゲノム位置に鎖切断を導入する。この鎖切断は、非相同末端結合（欠失につながる）又は相同修復（挿入を生成することができる）などの細胞機構によって修復することができ、それによって宿主細胞ゲノム内に遺伝子修飾を導入することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、クラス別及び種類別に分類される。クラス２系は、現在、３つの異なる種類（ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型）に分類される単一の干渉タンパク質を表す。遺伝子編集に好適な任意のクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、例えば、ＩＩ型、Ｖ型又はＶＩ型系は、本開示の範囲内として想定される。例示的なクラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系には、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、及びＣａｓ４が含まれる。例示的なクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ系には、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ及びＣａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）が含まれる。例示的なクラス２のＶＩ型系には、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ及びＣａｓ１３ｄが含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と呼ばれることもある、ＣＲＩＳＰＲ配列は、交互にリピート及びスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常、プラスミド又はファージ配列などの細菌に対して外来の配列を含む。本明細書に記載されるように、スペーサー配列はまた、「標的化配列」と称されてもよい。遺伝子操作のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーは、標的遺伝子配列（ｇＮＡ）に由来する。
例示的なクラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、タンパク質Ｃａｓ９に依存し、これは、二重らせんの各鎖に対して１つである、２つの活性切断部位を有するヌクレアーゼである。Ｃａｓ９及び修飾ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座ＲＮＡを組み合わせることは、遺伝子編集のための系において使用され得る。Ｐｅｎｎｉｓｉ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：８３３－８３６。いくつかの実施形態において、免疫細胞を修飾するために使用されるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、塩基対を付加若しくは欠失することによって、又は早期停止を導入し、それによって標的の発現を低下させることによって、本明細書に記載の免疫細胞における編集のために標的化された遺伝子などの標的遺伝子を編集するために使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、代替的に、可逆的に標的遺伝子をオフにするＲＮＡ干渉のように使用され得る。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を標的遺伝子プロモーターに誘導し、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断することができる。
Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌又は古細菌Ｃａｓタンパク質に由来し得る。任意の好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、本開示の範囲内として想定される。他の態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、それらのホモログ、又はそれらの修飾型のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、又はこれらの組み合わせ若しくは複合体である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
当該技術分野において既知である技術、例えば、米国公開第２０１４／００６８７９７号及びＣｏｎｇ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３に記載されているものを使用して、標的遺伝子を阻害する、人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を生成することができる。例えば、Ｔｓａｉ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：６ ５６９－５７６、米国特許第８，８７１，４４５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，７９５，９６５号、同第８，７７１，９４５号、及び同第８，６９７，３５９号に記載されているものの、標的遺伝子を阻害する、当該技術分野において既知の他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系もまた、生成され得る。特定のＣａｓタンパク質に好適なｇＮＡを設計する方法は、当業者に知られているであろう。
本開示は、関連するポリペプチド（例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼ）の活性を、標的核酸ゲノム内の特定の標的遺伝子配列に導くことができる遺伝子標的化ガイド核酸（ｇＮＡ）を提供する。ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書において「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列にハイブリダイズする標的化配列、及びＣＲＩＳＰＲリピート配列を少なくとも含むことができる。いくつかのＩＩ型系において、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡを含み、本明細書において「足場」配列とも称される。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び足場配列は、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ｃｒＲＮＡは、二本鎖を形成する。両方の系において、二本鎖は、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドが複合体を形成するように、部位特異的ポリペプチドに結合することができる。遺伝子標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドとの関連性により、複合体に標的特異性を提供することができる。したがって、遺伝子標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を導くことができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、標的化配列及びガイドＲＮＡ足場配列を含むガイドＲＮＡを提供し、標的化配列は、標的遺伝子の配列に相補的である。
例示的なガイドＲＮＡには、約１５～２０塩基の標的化配列が含まれる。当業者に理解されるように、各ｇＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的な標的化配列を含むように設計することができる。例えば、標的化配列の各々、例えば、表９に示されるＤＮＡ配列のＲＮＡ型から、そのＰＡＭ部位を表す３つの３’ヌクレオチドを引いたものを、単一のＲＮＡキメラ又はｃｒＲＮＡに入れることができる。
核酸を標的とする遺伝子は、二分子ガイドＲＮＡであってもよい。核酸を標的とする遺伝子は、単一分子ガイドＲＮＡであってもよい。遺伝子標的化核酸は、例えば、対合ｇＲＮＡを含む、当該技術分野で既知のガイドＲＮＡの任意の既知の構成、又は単一のステップで使用される複数のｇＲＮＡであり得る。コード配列及びスプライスジャンクションが存在するゲノム配列から明らかであるが、遺伝子発現に必要な他の特徴は特異的であり、不明確であり得る。
二分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２本鎖を含むことができる。第１の鎖は、５’から３’方向の配列、任意選択のスペーサー伸長配列、標的化配列、及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含むことができる。
ＩＩ型系における単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、標的化配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含むことができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡへの追加の機能性（例えば、安定性）に寄与するエレメントを含むことができる。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成することができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つ以上のヘアピンを含むことができる。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ又は単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、標的化配列及び足場配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、足場配列は、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態において、足場配列は、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号４９７）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、足場配列は、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号４９７）を含むＤＮＡ配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、Ｃａｓ９系であるそれらの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドの標的化配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド未満の標的化配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０を超えるヌクレオチド標的化配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０ヌクレオチドを有する可変長標的化配列を含むことができる。
好適な足場配列、及び足場標的配列の配置は、エンドヌクレアーゼの選択に依存し、当業者に知られているであろう。
ＩＩ型系における単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、例えば、Ｃａｓ９は、５’から３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び標的化配列を含むことができる。
例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系において使用されるガイドＲＮＡ、又は他のより小さなＲＮＡは、以下に例示され、当該技術分野で説明されているように、化学的手段によって容易に合成され得る。化学的合成手順が継続的に拡大している一方で、ポリヌクレオチド長が、１００ヌクレオチド程度を超えて著しく増加するにつれて、高速液体クロマトグラフィー（ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避するＨＰＬＣ）などの手順によるこのようなＲＮＡの精製は、より困難になる傾向がある。より長いＲＮＡを生成するために使用される１つのアプローチは、一緒にライゲーションされる２つ以上の分子を産生することである。Ｃａｓ９又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものなどの、はるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。様々な種類のＲＮＡ修飾は、ＲＮＡの化学的合成及び／又は酵素的生成の間又は後に導入することができ、例えば、当該技術分野で説明されているように、安定性を向上させ、先天性免疫応答の可能性若しくは程度を低減し、かつ／又は他の属性を向上させる修飾を導入することができる。
ｇＲＮＡの標的化配列は、目的の標的核酸中の配列にハイブリダイズする。ゲノム標的化核酸の標的化配列は、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的な様式で標的核酸と相互作用することができる。標的化配列のヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変化し得る。
本明細書に記載のＣａｓ９系において、標的化配列は、系で使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの逆相補体の５’に位置する標的核酸にハイブリダイズするように設計することができる。標的化配列は、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、標的ＤＮＡにおいて認識される、特定の方向及び位置における特定のＰＡＭ配列を有してもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’を含むＰＡＭを認識し、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、標的化配列によって標的とされる標的核酸配列のすぐ３’である。適切なＰＡＭ配列の選択は、当業者には明白であろう。
標的配列は、ｇＲＮＡの標的化配列に相補的であり、それとハイブリダイズする。標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを含むことができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満を含むことができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド超を含むことができる。標的核酸は、少なくとも、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、Ｃａｓ９系であるそれらの実施形態において、標的核酸配列は、ＰＡＭ配列の逆相補体の第１のヌクレオチドのすぐ５’の２０ヌクレオチドを含むことができる。この標的核酸配列は、多くの場合、ＰＡＭ鎖又は標的鎖と称され、相補的核酸配列は、多くの場合、非ＰＡＭ鎖又は非標的鎖と称される。当業者は、標的化配列が、標的核酸の非ＰＡＭ鎖にハイブリダイズすることを認識するであろう。例えば、ＵＳ２０１９／０１８５８４９Ａ１を参照されたい。
いくつかの例において、標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％である。いくつかの例において、標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、最大で約３０％、最大で約４０％、最大で約５０％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、最大で約９５％、最大で約９７％、最大で約９８％、最大で約９９％、又は１００％である。いくつかの例において、標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の６つの連続した最も５’側のヌクレオチドにわたって１００％である。標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、約２０個の連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。標的化配列及び標的核酸の長さは、１つのバルジ又は複数のバルジと考えられ得る、１～６ヌクレオチドによって異なり得る。
標的化配列は、当業者に既知のコンピュータプログラムを使用して設計又は選択することができる。コンピュータプログラムは、予測される融解温度、二次構造形成、予測されるアニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノム発生頻度（例えば、同一であるか、又は類似しているが、ミスマッチ、挿入、又は欠失の結果として１つ以上のスポットで変化する配列の）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用することができる。利用可能なコンピュータプログラムは、入力として、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ、公式の遺伝子記号、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤ、ゲノム座標、又はＤＮＡ配列を取得し、入力として指定された適切なゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡを含む出力ファイルを作成することができる。コンピュータプログラムはまた、標的遺伝子についてのｓｇＲＮＡのオンターゲット及びオフターゲット結合を示す統計及びスコアの要約を提供することができる（Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：１８４－１９１（２０１６））。本開示は、標的化配列を含むガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ足場配列を更に含む。いくつかの実施形態において、標的化配列は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、又はそれらの対立遺伝子からなる群から選択される標的遺伝子の配列に相補的である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、標的化配列は、表８に開示される配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を共有するか、又はそれと同一である配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、内因性ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の配列を特異的に標的とするｇＮＡは、表９に開示される配列から選択される配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の配列を特異的に標的とするｇＮＡは、表９に開示される配列から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。例えば、ｇＲＮＡは、全てのＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子によって共有される配列を特異的に標的とし、それとハイブリダイズするが、ＨＬＡ－Ａ＊０２及びＨＬＡ－Ａ＊０３対立遺伝子によって共有されない。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２のコードＤＮＡ配列を特異的に標的とする。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、１０００を超えるＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子によって共有されるコードＤＮＡ配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、１０００を超えるＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子におけるコードＤＮＡ配列を特異的に標的とするｇＮＡは、配列番号４００～４６５から選択される配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を共有するか、又はそれと同一である配列を含む。
表９～１２の配列をＤＮＡ配列として提示する。当業者は、対応するＲＮＡ配列に到達するために、表９～１２に記載のものを含む任意のＤＮＡ配列において、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置き換えられ得ることを理解するであろう。
Figure 2023538115000098
Figure 2023538115000099
表９に開示される配列は、ＰＡＭ配列を含む、対応するゲノム配列を含む。当業者は、ｇＲＮＡの標的化配列が、ｇＲＮＡについての対応するＰＡＭ部位を表す、表９の配列の３つの３’末端ヌクレオチドを含まないことを理解するであろう。
本開示は、Ｂ２Ｍ遺伝子に特異的な標的化配列を含むｇＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子プロモーター配列を標的とする配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、標的化配列及びｇＮＡ足場配列を含む。いくつかの実施形態において、標的化配列は、表１０に示される配列、又はそれと約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、標的化配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子の配列に相補的である。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍ遺伝子は、表８に示されるＢ２Ｍ配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を共有する配列を含む。
Figure 2023538115000100
Figure 2023538115000101
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の免疫細胞は、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を使用して編集される。
「ＴＡＬＥＮ」又は「ＴＡＬＥＮ遺伝子編集」とは、標的遺伝子を編集するために使用される人工ヌクレアーゼである、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって人工的に産生される。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌に由来する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を操作して、ＴＣＲサブユニット、ＭＨＣクラスＩ複合体成分、又はＣＤ５２などの標的遺伝子の一部分を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合させることができる。操作されたＴＡＬＥをＤＮＡ切断ドメインと合わせることにより、標的遺伝子配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的である制限酵素を産生することができる。次いで、これらを細胞内に導入することができ、それらをゲノム編集に使用することができる。
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質は、野生型又は変異Ｆｏｌｄエンドヌクレアーゼである、ヌクレアーゼ（Ｎ）に融合される。ＦｏｋＩに対するいくつかの変異は、そのＴＡＬＥＮでの使用のために作製されており、これらは、例えば、切断特異性又は活性を改善する。
ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な配向及び間隔を有する標的ゲノム内の部位に対して独自のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、ＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数、及び２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基の数の両方は、高レベルの活性を達成するための重要なパラメータであるように見える。
標的遺伝子内の配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュール成分を使用する様々なスキームを含む、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して構築することができる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＺＦＮ遺伝子編集を使用して、本明細書に記載の免疫細胞において編集される。
「ＺＦＮ」又は「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ遺伝子編集」とは、標的遺伝子を編集するために使用され得る人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを指す。
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｌｄヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上の亜鉛フィンガーを含む。
亜鉛フィンガーは、１つ以上の亜鉛イオンによって安定化された小さなタンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことができ、およそ３ｂｐ配列を認識することができる。既知の特異性の様々な亜鉛フィンガーを組み合わせて、約６、９、１２、１５、又は１８ｂｐ配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを産生することができる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッド及びツーハイブリッドシステム、並びに哺乳動物細胞を含む、特定の配列を認識する亜鉛フィンガー（及びそれらの組み合わせ）を生成するために、様々な選択及びモジュラーアセンブリ技術が利用可能である。
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡを切断するために二量体化しなければならない。したがって、一対のＺＦＮは、非回文ＤＮＡ部位を標的とするために必要である。２つの個々のＺＦＮは、それらのヌクレアーゼが適切に離間した状態で、ＤＮＡの反対側の鎖に結合しなければならない。
また、ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ内に二本鎖切断を作り出すことができ、これは、不適切に修復された場合にフレームシフト変異を作り出すことができ、細胞における標的遺伝子又は遺伝子産物の発現及び量の減少をもたらす。ＺＦＮは、標的遺伝子内で変異するために相同組換えとともに使用することもできる。
標的遺伝子内の配列に特異的なＺＦＮは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して構築することができる。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＭＣＨ－Ｉ成分の発現及び機能は、ＲＮＡ干渉を使用して低減される。「ＲＮＡｉ」又は「ＲＮＡ干渉」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）、ｄｄＲＮＡ（ＤＮＡ指向性ＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ）、又はｒａｓｉＲＮＡ（リピート関連ｓｉＲＮＡ）などの二本鎖ＲＮＡ、及びそれらの修飾形態は全て、ＲＮＡ干渉を媒介することができる。これらのｄｓＲＮＡ分子は、商業的に利用可能であり得るか、又は既知の配列情報に基づいて設計及び調製され得る。これらの分子のアンチセンス鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、又はそれらの組み合わせを含むことができる。ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドには、標的遺伝子の発現を阻害するＤＮＡ及びＲＮＡからなる二本鎖ポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ｄｓＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、１つ以上の修飾ヌクレオチドも含むことができ、これらは、いずれか又は両方の鎖に組み込むことができる。
ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシング又はノックダウンにおいて、標的遺伝子の一部分に相補的である第１の（アンチセンス）鎖、及び第１のアンチセンス鎖に完全に又は部分的に相補的である第２の（センス）鎖を含むｄｓＲＮＡを生物に導入する。生物に導入した後、標的遺伝子特異的ｄｓＲＮＡは、比較的小さな断片（ｓｉＲＮＡ）に処理され、その後、生物全体に分布し、標的遺伝子のメッセンジャーＲＮＡを減少させ、標的遺伝子の完全又は部分的な欠失から生じる表現型に非常に似ているようになり得る表現型をもたらすことができる。
細胞内のある特定のｄｓＲＮＡは、リボヌクレアーゼＩＩＩ酵素である、Ｄｉｃｅｒ酵素の作用を受けることができる。Ｄｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡを、ｄｓＲＮＡのより短い部分、すなわち、ｓｉＲＮＡに処理することができる。ＲＮＡｉはまた、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているエンドヌクレアーゼ複合体も含む。Ｄｉｃｅｒによる切断後、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡ標的のＲＩＳＣ複合体及び直接切断に入る。ｓｉＲＮＡの他方の鎖は、パッセンジャー鎖である。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で行われる。したがって、ｓｉＲＮＡは、配列特異的な様式でＲＮＡ干渉を媒介することによって、遺伝子発現を下方制御又はノックダウンすることができる。
ＲＮＡ干渉に関して本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」又は「標的配列」とは、対応するＲＮＡが、本明細書に記載されるように、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを使用してＲＮＡｉ経路を介して分解するために標的化される遺伝子又は遺伝子配列を指す。例示的な標的遺伝子配列を表８に示す。例えば、ｓｉＲＮＡを使用して遺伝子を標的化するために、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子又は配列の少なくとも一部分に相補的、又は実質的に相補的なアンチセンス領域、及びアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含む。一旦細胞内に導入されると、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ複合体に、標的配列を含むＲＮＡを切断するように指示し、それによってＲＮＡを分解する。本開示は、干渉ＲＮＡを提供する。本開示の二本鎖ＲＮＡ分子は、当該技術分野で既知の任意の種類のＲＮＡ干渉分子の形態であってもよい。いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、細胞内で処理されてｓｉＲＮＡを産生するＤｉｃｅｒ基質である。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ前駆体分子の一部である。
いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ基質として好適な長さであり、ＲＩＳＣ活性ｓｉＲＮＡ分子を産生するように処理され得る。例えば、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２００５／０２４４８５８を参照されたい。
Ｄｉｃｅｒ基質二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、活性ｓｉＲＮＡを産生するためにＤｉｃｅｒによって処理されるのに十分な長さのものであり得、以下の特性のうちの１つ以上を更に含み得る。（ｉ）Ｄｉｃｅｒ基質ｓｈＲＮＡは、例えば、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを有する非対称であってもよく、（ｉｉ）Ｄｉｃｅｒ基質ｓｈＲＮＡは、活性ｓｉＲＮＡへのＤｉｃｅｒ結合及びｄｓＲＮＡのプロセシングの配向、例えば、１つ以上のＤＮＡヌクレオチドの組み込みを指示するために、センス鎖上に修飾された３’末端を有してもよく、（ｉｉｉ）Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡの第１及び第２の鎖は、２１～３０ｂｐの長さであってもよい。。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ配列は、非翻訳領域を含む。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、非翻訳領域を含む。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡに相補的な配列を５’から３’末端に有する第１の配列と、第１の配列に相補的な配列を５’から３’末端に有する第２の配列と、を含み、第１の配列及び第２の配列は、ｓｈＲＮＡを形成する。
いくつかの実施形態において、第１の配列は、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表１１及び１２に示される配列から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、２５％以上及び６０％未満のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表１１及び１２に示される配列から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、同じ塩基の４つのヌクレオチド、又は７つのＣ若しくはＧヌクレオチド塩基のランを含まない。いくつかの実施形態において、第１の配列は、２１ヌクレオチドである。
第１の配列に相補的な例示的な標的Ｂ２Ｍ配列を表１１に示す。
ある場合には、第１の配列は、標的核酸配列と１００％の同一性、すなわち、完全な同一性、相同性、相補性を有し得る。他の場合には、第１の配列と標的核酸配列との間に１つ以上のミスマッチが存在し得る。例えば、センス領域と標的核酸配列との間に１、２、３、４、５、６、又は７個のミスマッチがあり得る。
表１１に示す配列をＤＮＡ配列として提示する。表１１に示す全ての配列において、チミン（Ｔ）は、標的ｍＲＮＡ配列の配列に到達するためにウラシル（Ｕ）によって置き換えられ得る。
Figure 2023538115000102
Figure 2023538115000103
Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡをコードする例示的な配列は、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号１７９）の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡをコードする更なる例示的な配列は、ＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号１８０）の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、非翻訳領域を含む。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡに相補的な配列を５’から３’末端に有する第１の配列と、第１の配列に相補的な配列を５’から３’末端に有する第２の配列と、を含み、第１の配列及び第２の配列は、ｓｈＲＮＡを形成する
第１の配列に相補的な例示的な標的ＨＬＡ配列を表１２に示す。
Figure 2023538115000104
Figure 2023538115000105
いくつかの実施形態において、第１の配列及び第２の配列は、ループと称されることもある、リンカーによって分離される。いくつかの実施形態において、第１の配列及び第２の配列の両方は、１つの一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ループは、第１の配列と第２の配列との間にある。これらの実施形態において、第１の配列及び第２の配列は、ハイブリダイズして二本鎖領域を形成する。第１の配列及び第２の配列は、リンカー配列によって連結され、「ヘアピン」又は「ステムループ」構造を形成する。ｓｈＲＮＡは、一本鎖分子の対向する末端に相補的な第１の配列及び第２の配列を有することができ、その結果、分子は、相補的な配列部分と二本鎖領域を形成することができ、鎖は、リンカー（すなわちループ配列）によって二本鎖領域の一端で連結される。リンカー、又はループ配列は、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーのいずれかであり得る。リンカーは、共有結合又は非共有結合相互作用を介して、第１の配列、及び任意選択で、第２の配列と相互作用することができる。
任意の好適なヌクレオチドループ配列は、本開示の範囲内として想定される。本開示のｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡの第１の配列を、ｓｈＲＮＡの第２の配列に結合するヌクレオチド、非ヌクレオチド、又は混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを含んでもよい。ヌクレオチドループ配列は、長さが、２ヌクレオチド以上、例えば、長さが、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドであり得る。例示的なループ配列は、表１４に開示されている。
いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、５’隣接配列及び３’隣接配列を更に含む。いくつかの実施形態において、５’隣接配列は、第１の配列の５’末端に連結され、３’隣接配列は、第２の配列の３’末端に連結される。
理論に拘束されることを望まないが、マイクロＲＮＡで見出されるものと同様の５’及び３’配列を有するｓｈＲＮＡステムループ配列を隣接させることで、内因性マイクロＲＮＡプロセシング機構によるプロセシングのためにｓｈＲＮＡを標的とすることができ、ｓｈＲＮＡプロセシングの有効性を高めることができると考えられる。代替的に、又は加えて、隣接配列は、ポリメラーゼＩＩ又はポリメラーゼＩＩＩプロモーターとのｓｈＲＮＡ適合性を増加させ、ｓｈＲＮＡ発現のより効果的な調節をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、５’隣接配列は、表１３に示される配列から選択される。例示的な隣接配列を表１３に示す。
Figure 2023538115000106
いくつかの実施形態において、第１及び第２の配列は、一本鎖ポリヌクレオチド上に存在し、第１の配列及び第２の配列は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドによって分離され、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ内のループ領域を形成する。いくつかの実施形態において、ループ領域は、表１４に示される配列から選択される配列を含む。
Figure 2023538115000107
本開示のｓｈＲＮＡは、化学合成によって、インビトロ転写によって、又はＤｉｃｅｒ若しくは同様の活性を有する別の適切なヌクレアーゼによる、より長い二本鎖ＲＮＡの切断によって外因的に生成され得る。従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトから産生される化学合成されたｓｉＲＮＡは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．）、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、又はＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）などの商業的供給源から得ることができる。ｓｉＲＮＡは、例えば、溶媒若しくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせによって精製することができる。代替的に、ｓｉＲＮＡは、試料処理による損失を回避するために、ほとんど精製せずに使用してもよい。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｈＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡをコードする核酸が、例えば、好適なプロモーターの制御下でクローニングされている発現ベクターを使用して産生され得る。
医薬組成物
本開示は、本開示の第１及び第２の受容体、並びに薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤を含む免疫細胞を含む、医薬組成物を提供する。
このような組成物は、中性緩衝食塩水、ホスフェート緩衝食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤、及び防腐剤を含み得る。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、第１の受容体及び第２の受容体の両方を発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞の少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％は、第１の受容体及び第２の受容体の両方を発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞の少なくとも９０％は、第１の受容体及び第２の受容体の両方を発現する。
がんの治療
対象において複数のがん細胞を死滅させるか、又はがんを治療する方法であって、治療有効量の本開示の第１及び第２の受容体を含む免疫細胞を含む組成物を対象に投与することを含む、方法が、本明細書に提供される。免疫細胞は、同じ細胞内で両方の受容体を発現する。
がんは、異常な細胞が制御できずに分裂し、近くの組織に広がる疾患である。いくつかの実施形態において、がんは、液体腫瘍又は固形腫瘍を含む。例示的な液体腫瘍には、白血病及びリンパ腫が含まれる。がんは、上皮組織を含む、事実上体内の臓器で生じ得る。複数のがん細胞が、第１の活性化因子リガンドを発現し、第２の抑制因子リガンドを発現しない、任意のがんは、本開示の範囲内であると想定される。例えば、本明細書に記載の方法を使用して治療することができるＣＥＡ陽性がんには、結腸直腸がん、膵臓がん、食道がん、胃がん、肺腺がん、頭頸部がん、胆嚢がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん又は急性骨髄性白血病がんが含まれる。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、標的抗原を発現する。いくつかの実施形態において、対象の複数のがん細胞は、ＣＥＡを発現する。細胞がＣＥＡを発現する、すなわち、ＣＥＡ陽性である、いずれのがんも、本開示の範囲内として想定される。例示的なＣＥＡ陽性がんには、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、甲状腺がん、胃腸がん、乳がん、及び肝がんが含まれるが、これらに限定されない。更なるＣＥＡ陽性がんには、結腸直腸がん、膵臓がん、食道がん、胃がん、肺がん、頭頸部がん、胆嚢がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん、又は急性骨髄性白血病がんが含まれる。いくつかの実施形態において、がんは、結腸がん、肺がん、又は膵臓がんを含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ陽性がんは、肺がん、結腸直腸がんを含む。いくつかの実施形態において、肺がんは、肺腺がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、又は非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む。いくつかの実施形態において、肺がんは、肺腺がんを含む。本明細書における組成物及び方法の開示を使用して、再発性、難治性及び／又は転移性であるＣＥＡ陽性がんを治療することができる。
ＣＥＡ＋腫瘍を有する対象においてＣＥＡ＋がんを治療する方法であって、腫瘍が、ＭＨＣクラスＩ遺伝子座においてヘテロ接合性の喪失を有する、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象の正常細胞及び複数のがん細胞のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子型又は発現を決定することと、（ｂ）対象の複数のがん細胞におけるＣＥＡの発現を決定することと、（ｃ）正常細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ非標的抗原２を発現し、複数のがん細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ非標的抗原を発現せず、また、複数のがん細胞がＣＥＡ陽性である場合、有効量の本開示の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、例えば、がんが、ＣＥＡ＋であることが知られているそれらの実施形態において、方法は、（ａ）対象の正常細胞及び複数のがん細胞のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子型又は発現を決定することと、（ｂ）正常細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ非標的抗原を発現し、複数のがん細胞が、非標的抗原を発現しない場合、有効量の本開示の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７を含む。
本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象における腫瘍のサイズを減少させることができる。いくつかの実施形態において、腫瘍のサイズは、免疫細胞又は医薬組成物の投与前の腫瘍のサイズと比較して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％減少する。いくつかの実施形態において、腫瘍は、除去される。
本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象における腫瘍の増殖を阻止することができる。例えば、免疫細胞又は医薬組成物は、腫瘍細胞を死滅させることができるため、腫瘍は成長を停止するか、又はサイズが縮小される。ある場合には、免疫細胞又は医薬組成物は、対象における更なる腫瘍の形成を防止することができるか、又は腫瘍の総数を減少させることができる。
本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象において、野生型細胞ではなく、がん細胞の選択的死滅をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、死滅した細胞の約６０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約６５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約７０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約７５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約８０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約８５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約９０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約９５％は、がん細胞であるか、又は死滅した細胞の約１００％は、がん細胞である。
本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象のがん細胞の約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は全ての死滅をもたらし得る。
本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物の投与は、第１の活性化因子受容体を含むが、第２の抑制性受容体を含まない、他の等価の免疫細胞の投与よりも、対象に対して少ない副作用をもたらすことができる。例えば、本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物を投与することは、第２の抑制性受容体を用いずに投与するＣＥＡ ＣＡＲ、又はＣＥＡ ＴＣＲと比較して、用量制限毒性を低減させることができる。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ＴＮＦＲＳＦ１１、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、又はＳＲＥＣの多型対立遺伝子を発現しない。例えば、がん細胞は、その遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を通じて、ＴＮＦＲＳＦ１１、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、又はＳＲＥＣの対立遺伝子を喪失している。
本開示は、対象においてがんを治療する方法であって、（ａ）ｒｓ１７１６（ＩＴＧＡＥ Ｒ９５０Ｗ）、ｒｓ２９７６２３０（ＩＴＧＡＥ Ｖ１０１９Ａ／Ｖ１０１９Ｇ）、ｒｓ１８０５０３４（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ Ｖ１９２Ａ）及びｒｓ３５２１１４９６（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ Ｈ１４１Ｙ）からなる群から選択される多型遺伝子座において、対象の正常細胞及び複数のがん細胞の遺伝子型を決定することと、（ｂ）複数のがん細胞におけるＣＥＡの発現を決定することと、（ｃ）野生型細胞が多型遺伝子座に対してヘテロ接合性であり、複数のがん細胞が多型遺伝子座に対して半接合性であり、複数のがん細胞がＣＥＡ陽性である場合、複数の免疫細胞を対象に投与することと、を含み、複数の免疫細胞が、（ｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体においてＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）、又はそのペプチド抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｉｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体においてＴＮＦＲＳＦ１１、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、及びＳＲＥＣ、又はそれらの抗原ペプチドから選択される非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合を含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性受容体と、を含み、非標的抗原が、多型を含む、方法を提供する。
ＳＮＰの存在又は不在のために、対象に由来するがん細胞及び正常細胞の遺伝子型を決定する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。ＳＮＰ遺伝子型決定方法には、とりわけ、デュアルプローブＴａｑＭａｎアッセイなどのＰＣＲベースの方法、アレイベースのハイブリダイゼーション方法、及び配列決定が含まれる。
対象に由来するがん又は野生型細胞における標的抗原の発現を測定する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。これらには、とりわけ、ＲＮＡ配列決定及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）などのＲＮＡ発現を測定する方法、並びに免疫組織化学に基づく方法などのタンパク質発現を測定する方法が含まれる。複数のがん細胞におけるヘテロ接合性の喪失を測定する方法には、とりわけ、当該技術分野で既知の方法を使用してがん細胞から抽出されるゲノムＤＮＡのハイスループット配列決定が含まれる。
いくつかの実施形態において、第１のリガンドは、ＩＭＩＧＶＬＶＧＶ（配列番号２）を含む。いくつかの実施形態において、第１のリガンドは、ヒト白血球抗原Ａ＊０２対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ＊０２）を含む主要組織適合性複合体と複合体化される。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ｒｓ１８０５０３４におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ａ １９２Ａ対立遺伝子を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、配列番号１３の１９２位にＡを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対してよりも、配列番号１３の１９２位にＶを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対して高い親和性を有する。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ｒｓ１８０５０３４におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ａ １９２Ｖ対立遺伝子を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、配列番号１３の１９２位にＶを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対してよりも、配列番号１３の１９２位にＡを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対して高い親和性を有する。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ｒｓ３５２１１４９６におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ａ １４１Ｈ対立遺伝子を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、配列番号１３の１４１位にＨを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対してよりも、配列番号１３の１４１位にＹを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対して高い親和性を有する。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ｒｓ３５２１１４９６におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ａ １４１Ｙ対立遺伝子を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、配列番号１３の１４１位にＹを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対してよりも、配列番号１３の１４１位にＨを有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａリガンドに対して高い親和性を有する。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ｒｓ１７１６におけるＩＴＧＡＥ ９５０Ｒ対立遺伝子を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、配列番号１４の９５０位にＲを有するＩＴＧＡＥリガンドに対してよりも、配列番号１４の９５０位にＷを有するＩＴＧＡＥリガンドに対して高い親和性を有する。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ｒｓ１７１６におけるＩＴＧＡＥ ９５０Ｗを含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、配列番号１４の９５０位にＷを有するＩＴＧＡＥリガンドに対してよりも、配列番号１４の９５０位にＲを有するＩＴＧＡＥリガンドに対して高い親和性を有する。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ｒｓ２９７６２３０におけるＩＴＧＡＥ １０１９Ｖ対立遺伝子を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、配列番号１４の１０１９位にＷを有するＩＴＧＡＥリガンドに対してよりも、配列番号１４の１０１９位にＡ又はＧを有するＩＴＧＡＥリガンドに対して高い親和性を有する。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ｒｓ２９７６２３０におけるＩＴＧＡＥ １０１９Ａ対立遺伝子を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、配列番号１４の１０１９位にＡを有するＩＴＧＡＥリガンドに対してよりも、配列番号１４の１０１９位にＶ又はＧを有するＩＴＧＡＥリガンドに対して高い親和性を有する。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ｒｓ２９７６２３０におけるＩＴＧＡＥ １０１９Ｇ対立遺伝子を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、配列番号１４の１０１９位にＧを有するＩＴＧＡＥリガンドに対してよりも、配列番号１４の１０１９位にＶ又はＡを有するＩＴＧＡＥリガンドに対して高い親和性を有する。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、同種異系又は自己由来である。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、第１の受容体を発現するが、第２の受容体を発現しない免疫細胞と比較して、ＣＥＡ陽性がん細胞に対する免疫細胞の特異性を増加させる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、第１の受容体を発現するが、第２の受容体を発現しない免疫細胞と比較して、減少した副作用を有する。
がんの治療は、腫瘍のサイズの縮小をもたらし得る。腫瘍のサイズの縮小は、「腫瘍退縮」と称されることもある。好ましくは、治療後、腫瘍サイズは、治療前のサイズと比較して５％以上減少し、より好ましくは、腫瘍サイズは、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、及び最も好ましくは、７５％以上減少する。腫瘍のサイズは、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍のサイズは、腫瘍の直径として測定され得る。
がんの治療は、腫瘍体積の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、腫瘍体積は、治療前のサイズと比較して５％以上減少し、より好ましくは、腫瘍体積は、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、及び最も好ましくは、７５％以上減少する。腫瘍体積は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。
がんの治療は、腫瘍の数の減少をもたらす。好ましくは、治療後、腫瘍数は、治療前の数と比較して５％以上減少し、より好ましくは、腫瘍数は、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、及び最も好ましくは、７５％以上減少する。腫瘍の数は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍の数は、肉眼で見える腫瘍を数えることによって、又は指定された倍率で測定され得る。好ましくは、指定された倍率は、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又は５０倍である。
がんの治療は、原発腫瘍部位から離れた他の組織又は臓器における転移性病変の数の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、転移性病変の数は、治療前の数と比較して５％以上減少し、より好ましくは、転移性病変の数は、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、及び最も好ましくは、７５％以上減少する。転移性病変の数は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。転移性病変の数は、肉眼で見える転移性病変を数えることによって、又は指定された倍率で測定され得る。好ましくは、指定された倍率は、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又は５０倍である。
がんの治療は、担体のみを受容する集団と比較して、治療対象の集団の平均生存時間の増加をもたらし得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日超、より好ましくは６０日超、より好ましくは９０日超、及び最も好ましくは１２０日超増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。
がんの治療は、治療されていない対象の集団と比較して、治療対象の集団の平均生存時間の増加をもたらし得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日超、より好ましくは６０日超、より好ましくは９０日超、及び最も好ましくは１２０日超増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。
がんの治療は、本開示の化合物ではない薬物、又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、アナログ若しくは誘導体による単剤療法を受ける集団と比較して、治療対象の集団の平均生存時間の増加をもたらし得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日超、より好ましくは６０日超、より好ましくは９０日超、及び最も好ましくは１２０日超増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。
がんの治療は、担体のみを受容する集団と比較して、治療対象の集団の死亡率の低下をもたらし得る。がんの治療は、未治療の集団と比較して、治療対象の集団の死亡率の低下をもたらし得る。がんの治療は、本開示の化合物ではない薬物、又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、アナログ若しくは誘導体による単剤療法を受ける集団と比較して、治療対象の集団の死亡率の低下をもたらし得る。好ましくは、死亡率は、２％超、より好ましくは５％超、より好ましくは１０％超、及び最も好ましくは２５％超低下する。治療対象の集団の死亡率の低下は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の死亡率の低下は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の単位時間当たりの疾患関連死の平均数を計算することによって測定され得る。集団の死亡率の低下は、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の単位時間当たりの疾患関連死の平均数を計算することによっても測定され得る。
がんの治療は、腫瘍増殖速度の低下をもたらし得る。好ましくは、治療後、腫瘍増殖速度は、治療前の数値と比較して少なくとも５％減少し、より好ましくは、腫瘍増殖速度は、少なくとも１０％減少し、より好ましくは、少なくとも２０％減少し、より好ましくは、少なくとも３０％減少し、より好ましくは、少なくとも４０％減少し、より好ましくは、少なくとも５０％減少し、更により好ましくは、少なくとも５０％減少し、及び最も好ましくは、少なくとも７５％減少する。腫瘍増殖速度は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍増殖速度は、単位時間当たりの腫瘍直径の変化に応じて測定され得る。
がんの治療は、腫瘍再増殖の低下をもたらし得る。好ましくは、治療後、腫瘍再増殖は、５％未満であり、より好ましくは、腫瘍再増殖は、１０％未満であり、より好ましくは、２０％未満であり、より好ましくは、３０％未満であり、より好ましくは、４０％未満であり、より好ましくは、５０％未満であり、更により好ましくは、５０％未満であり、及び最も好ましくは、７５％未満である。腫瘍再増殖は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍再増殖は、例えば、治療後の以前の腫瘍縮小後の腫瘍の直径の増加を測定することによって測定される。腫瘍再増殖の減少は、治療が停止した後に腫瘍が再発しないことによって示される。
がんの治療又は予防は、細胞増殖速度の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、細胞増殖速度は、少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも５０％、及び最も好ましくは少なくとも７５％減少する。細胞増殖の速度は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。細胞増殖速度は、例えば、単位時間当たりの組織試料中の分裂細胞の数を測定することによって測定される。
がんの治療又は予防は、増殖細胞の割合の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、増殖細胞の割合は、少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも５０％、及び最も好ましくは少なくとも７５％減少する。増殖細胞の割合は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。好ましくは、増殖細胞の割合は、例えば、組織試料中の非分裂細胞の数に対する分裂細胞の数を定量化することによって測定される。増殖細胞の割合は、分裂指数と同等であり得る。
がんの治療又は予防は、細胞増殖の領域又はゾーンのサイズの減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、治療前のサイズと比較して少なくとも５％減少し、より好ましくは少なくとも１０％減少し、より好ましくは少なくとも２０％減少し、より好ましくは少なくとも３０％減少し、より好ましくは少なくとも４０％減少し、より好ましくは少なくとも５０％減少し、更により好ましくは少なくとも５０％減少し、及び最も好ましくは少なくとも７５％減少する。細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、細胞増殖の領域又はゾーンの直径又は幅として測定され得る。
がんの治療又は予防は、異常な外観又は形態を有する細胞の数又は割合の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、異常な形態を有する細胞の数は、治療前のサイズと比較して少なくとも５％減少し、より好ましくは少なくとも１０％減少し、より好ましくは少なくとも２０％減少し、より好ましくは少なくとも３０％減少し、より好ましくは少なくとも４０％減少し、より好ましくは少なくとも５０％減少し、更により好ましくは少なくとも５０％減少し、及び最も好ましくは少なくとも７５％減少する。異常な細胞の外観又は形態は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。異常な細胞の形態は、例えば、倒立組織培養顕微鏡を使用して、顕微鏡法によって測定され得る。異常な細胞の形態は、核多型の形態をとり得る。
投与量及び投与
本開示の免疫細胞及びは、局所治療又は全身治療が所望されるかどうかに応じて、いくつかの方式で投与され得る。
一般に、投与は非経口であってもよい。
養子細胞療法のための細胞の投与方法は既知であり、提供される方法及び組成物に関連して使用することができる。例えば、養子Ｔ細胞療法の方法は、例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号、及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号に記載されている。
本開示の組成物は、非経口投与に好適である。本明細書で使用される場合、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織の物理的破壊を特徴とする任意の投与経路、及び組織内の破壊を通じた医薬組成物の投与を含み、したがって、一般に、血流内、筋肉内、又は内臓内への直接投与をもたらす。したがって、非経口投与には、組成物の注射による医薬組成物の投与、外科的切開による組成物の適用、組織透過性非外科的創傷による組成物の適用などが含まれるが、これらに限定されない。特に、非経口投与には、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、腫瘍内、滑液内注射又は注入、及び腎臓透析的注入技術が含まれることが企図されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示の組成物の非経口投与は、静脈内又は動脈内投与を含む。
本開示は、本開示の複数の免疫細胞、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
非経口投与に好適な医薬組成物の製剤は、典型的には、通常、滅菌水又は滅菌等張食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わせた免疫細胞からなる。このような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に好適な形態で調製、包装、又は販売されてもよい。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプル又は防腐剤を含有する複数回用量容器中で調製、包装、又は販売されてもよい。非経口投与用の製剤には、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルション、ペーストなどが含まれるが、これらに限定されない。このような製剤は、限定されないが、懸濁化剤、安定化剤、又は分散剤を含む、１つ以上の追加の成分を更に含んでもよい。非経口製剤には、塩、炭水化物、及び緩衝剤などの賦形剤を含有し得る水溶液も含まれる。例示的な非経口投与形態には、滅菌水溶液、例えば、プロピレングリコール水溶液又はデキストロース溶液中の溶液又は懸濁液が含まれる。このような剤形は、所望の場合、好適には、緩衝され得る。非経口投与のための製剤は、即時及び／又は放出調節であるように製剤化され得る。放出調節製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出及びプログラム放出が含まれる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞を含む製剤化された組成物は、注射による投与に好適である。いくつかの実施形態において、免疫細胞を含む製剤化された組成物は、注入による投与に好適である。
本開示の医薬組成物は、単位剤形で好都合に提示することができ、製薬業界で周知の従来の技術に従って調製することができる。そのような技術には、免疫細胞を、薬学的担体又は賦形剤、例えば、液体担体と会合させるステップが含まれる。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質を更に含有し得る。懸濁液はまた、安定剤を含有してもよい。
本開示の組成物は、追加的に、医薬組成物に従来見出される他の補助成分を含有してもよい。したがって、例えば、組成物は、例えば、かゆみ止め剤、収れん剤、局所麻酔剤若しくは抗炎症剤などの追加の、適合性の薬学的に活性な材料を含有してもよいか、又は染料、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、及び安定剤などの、本開示の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な追加の材料を含有してもよい。しかしながら、このような材料は、添加されるとき、本開示の組成物の免疫細胞の生物学的活性を不当に妨げるべきではない。
製剤又は組成物はまた、免疫細胞で治療されている特定の適応症、疾患、又は状態に有用な１つを超える活性成分を含有してもよく、それぞれの活性は互いに悪影響を及ぼさない。このような活性成分は、好適には、意図する目的に効果的である量で組み合わせて存在する。したがって、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、化学療法剤などの他の薬学的に活性な薬剤又は薬物を更に含む。
いくつかの態様における医薬組成物は、組成物の送達が、治療される部位の感作の前に、かつ治療される部位の感作を引き起こすのに十分な時間で生じるように、時間放出、遅延放出、及び持続放出送達系を用いることができる。多くの種類の放出送達系が利用可能であり、既知である。このような系は、組成物の反復投与を回避することができ、それによって、対象及び医師への利便性を増大させる。
投与は、治療過程を通じて連続的に又は断続的に、１回の用量で行うことができる。単回又は複数回の投与を、治療する医師によって選択される用量レベル及びパターンを用いて実施することができる。
いくつかの実施形態における医薬組成物は、がんを治療又は予防するのに有効な量、例えば、治療有効量又は予防有効量で免疫細胞を含有する。いくつかの実施形態において、治療的又は予防的有効性は、治療された対象の定期的評価によって監視される。数日、数週間又は数ヶ月にわたる反復投与については、状態に応じて、がんの徴候又は症状の所望の抑制が生じるまで治療を繰り返すことができる。しかしながら、他の投与レジメンが有用であり得、決定することができる。所望の用量は、組成物の単回ボーラス投与若しくは注入によって、又は組成物の複数回ボーラス投与若しくは注入によって送達することができる。
細胞又は細胞集団は、１回以上の用量で投与することができる。いくつかの実施形態において、有効量の細胞は、単回用量として投与され得る。いくつかの実施形態において、有効量の細胞は、ある期間にわたって１回を超える用量として投与され得る。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。
細胞又は細胞集団は、血液バンク若しくはドナー、又は患者自身などの任意の供給源から得られてもよい。
有効量とは、治療的又は予防的利益をもたらす量を意味する。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康及び体重、同時治療の種類（もしあれば）、治療の頻度及び所望の効果の性質に依存するであろう。いくつかの実施形態において、有効量の細胞又はそれらの細胞を含む組成物は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態において、投与は、静脈内投与であり得る。いくつかの実施形態において、投与は、腫瘍内への注射によって直接行うことができる。
本開示の目的のために、例えば、所与の用量のこのような免疫細胞を哺乳動物に投与する際に、各々が異なる用量の免疫細胞を与えられる一組の哺乳動物の間で、標的細胞が溶解されるか、又は１つ以上のサイトカインが受容体を発現する免疫細胞によって分泌される程度を比較することを含むアッセイを使用して、哺乳動物に投与される開始用量を決定することができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、抗体又は操作された細胞又は受容体又は薬剤、例えば、細胞傷害性剤若しくは治療剤などの別の治療介入と同時に、又は任意の順序で連続的になどで、併用療法の一部として投与される。本開示の免疫細胞は、いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療剤とともに、又は別の治療介入に関連して、同時に若しくは任意の順序で連続的にのいずれかで同時投与される。いくつかの文脈では、免疫細胞集団が１つ以上の追加の治療剤の効果を増強するように、又はその逆であるように、免疫細胞が、十分に時間的に近い別の治療法とともに同時投与される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、１つ以上の追加の治療剤の前に投与される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、１つ以上の追加の治療剤の後に投与される。
実施形態において、リンパ枯渇化学療法は、養子免疫細胞の投与（例えば、注入）の前に、同時に、又はその後に、対象に投与される。一例において、リンパ枯渇化学療法は、免疫細胞の投与前に対象に投与される。例えば、リンパ枯渇化学療法は、養子細胞注入の１～４日前（例えば、１、２、３、又は４日）に終了する。実施形態において、複数回用量の養子細胞は、例えば、本明細書に記載されるように投与される。実施形態において、リンパ枯渇化学療法は、本明細書に記載の免疫細胞の投与（例えば、注入）の前に、同時に、又は後に、対象に投与される。リンパ枯渇の例としては、非骨髄性リンパ枯渇化学療法、骨髄性リンパ枯渇化学療法、全身照射などが挙げられるが、これらに限定され得ない。リンパ枯渇剤の例としては、抗胸腺細胞グロブリン、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ２抗体、ＴＣＲαβ遮断因子、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、ボルテゾミブ、リツキシマブ、抗ＣＤ１５４抗体、ラパマイシン、ＣＤ３免疫毒素、フルダラビン、シクロホスファミド、ブスルファン、メルファラン、マブセラ、タクロリムス、アレファセプト、アレムツズマブ、ＯＫＴ３、ＯＫＴ４、ＯＫＴ８、ＯＫＴ１１、フィンゴリモド、抗ＣＤ４０抗体、抗ＢＲ３抗体、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ、抗ＣＤ２５抗体、カルシニューリン阻害剤、ミコフェノール酸、及びステロイドが挙げられるが、これらに限定されず、これらは単独で、又は組み合わせて使用され得る。更なる例として、リンパ枯渇レジメンは、アレムツズマブ、シクロホスファミド、ベンドゥアムスチン（ｂｅｎｄｕａｍｕｓｔｉｎ）、リツキシマブ、ペントスタチン、及び／又はフルダラビンの投与を含むことができる。リンパ枯渇レジメンは、循環免疫細胞の減少の所望の転帰まで、１つ以上のサイクルで投与することができる。いくつかの実施形態において、リンパ枯渇は、対象におけるＣＤ５２＋細胞を特異的に標的とし、低減又は除去する薬剤を投与することを含み、免疫細胞は、ＣＤ５２発現を低減又は除去するように改変される。
いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、養子免疫細胞の投与前、投与と同時に、又は投与後（例えば、注入）に対象に投与される。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、恒常性サイトカインを含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、免疫刺激分子を含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－９、又はそれらの機能的断片を含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－９、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、ＩＬ－２、又はその機能的断片を含む。
自己細胞を使用する養子細胞療法のための方法は、免疫細胞を患者の血液から単離することと、細胞を、本明細書に記載の二重受容体系をコードする１つ以上のベクターで形質導入することを含む、単離された細胞に対して一連の修飾を実施することと、細胞を患者に投与することと、を含む。がん若しくは血液悪性腫瘍に罹患しているか、又はがん若しくは血液悪性腫瘍のリスクがある対象からの免疫細胞を提供することは、患者の血液からの免疫細胞の単離を必要とし、当該技術分野で既知の方法、例えば、白血球除去によって達成することができる。白血球除去中、対象からの血液が抽出され、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が分離され、血液の残りが対象の循環に戻される。ＰＢＭＣは、免疫細胞の試料として凍結、又は凍結保存のいずれかで貯蔵され、例えば、本明細書に記載の修飾などの更なる処理ステップのために提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の対象を治療する方法は、濃縮及び／又は枯渇、活性化、遺伝子修飾、拡大、製剤化、並びに凍結保存を含む、一連の修飾を含む、対象からの免疫細胞に対する修飾を含む。
本開示は、例えば、下流の手順、例えば、本明細書に記載の修飾のための対象ＰＢＭＣの調製のための当該技術分野で既知の洗浄及び分画方法であり得る濃縮及び／又は枯渇ステップを提供する。例えば、限定されないが、方法は、総赤血球及び血小板汚染物質を除去するためのデバイス、単球の枯渇及びリンパ球の単離のためのサイズベースの細胞分画のためのシステム、並びに／又は例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２５＋、若しくはＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞などの、Ｔ細胞の特定のサブセットの濃縮を可能にするシステムを含み得る。濃縮ステップに続いて、更なる処理のために、対象のＰＭＢＣから免疫細胞の標的サブ集団を単離する。当業者は、本明細書で提供される濃縮ステップが、任意の新たに発見される方法、デバイス、試薬、又はそれらの組み合わせも包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、免疫細胞、例えば、それらのエクスビボ拡大に必要なＴ細胞の活性化を誘導するための当該技術分野で既知の任意の方法であり得る活性化ステップを提供する。免疫細胞活性化は、例えば、対象の免疫細胞を、樹状細胞の存在下で培養すること、対象の免疫細胞を、人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）の存在下で培養すること、又は照射されたＫ５６２由来のＡＡＰＣの存在下で免疫細胞を培養することによって達成することができる。対象免疫細胞を活性化するための他の方法は、例えば、単離された活性化要素及び組成物、例えば、ビーズ、表面、又は活性化要素で官能化された粒子の存在下で免疫細胞を培養することであり得る。活性化要素には、例えば、抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体が含まれ得る。活性化要素はまた、例えば、サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－２又はＩＬ－２１であってもよい。活性化要素はまた、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲＬ、及びＣＤ１３４Ｌなどの共刺激分子であってもよい。当業者は、本明細書に提供される活性化要素が、免疫細胞を活性化することができる任意の新たに発見される活性化要素、試薬、組成物、又はそれらの組み合わせも包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、対象の免疫細胞を修飾するための遺伝子修飾ステップを提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、Ｂ２Ｍ又はＨＬＡ－Ａに相補的な本明細書に記載されるｓｈＲＮＡを含むベクターを用いて免疫細胞を形質導入することを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム操作を使用してＢ２Ｍ又はＨＬＡ－Ａにおける変異を誘導するように免疫細胞のゲノムを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、免疫細胞を、活性化因子及び抑制性受容体をコードする１つ以上のベクターで形質導入することを含み、それによって活性化因子及び抑制性受容体を発現する免疫細胞を産生する。
本開示は、遺伝子修飾された対象免疫細胞のための拡大ステップを提供する。遺伝子修飾された対象免疫細胞は、投与のための免疫細胞の治療用量を生成するために、当該技術分野で既知の任意の免疫細胞拡大システムで拡大することができる。例えば、コントローラポンプを含むシステムに使用するためのバイオリアクターバッグ、並びに自動供給及び廃棄物除去を可能にするプローブを、免疫細胞拡大に使用することができる。基部にガス透過性膜を有する細胞培養フラスコが、免疫細胞の拡大のために使用され得る。臨床用途のための免疫細胞の拡大を可能にする当該技術分野で既知の任意のそのようなシステムは、本明細書に提供される拡大ステップに包含される。免疫細胞は、拡大のために特異的に製剤化された培地中の培養系において拡大される。拡大はまた、本明細書に記載の活性化要素の存在下で本開示の免疫細胞を培養することによって促進され得る。当業者は、本明細書で提供される拡大ステップが、免疫細胞を拡大するために使用することができる任意の新たに発見される培養系、培地、又は活性化要素も包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、拡大した遺伝子修飾された対象免疫細胞のための製剤化及び凍結保存ステップを提供する。提供される製剤化ステップは、例えば、本明細書に記載の治療方法の免疫細胞の調製及び拡大に使用される過剰な成分を洗い流すことを含む。当該技術分野で既知の免疫細胞と適合する任意の薬学的に許容される製剤培地又は洗浄緩衝液を使用して、免疫細胞を洗浄し、希釈／濃縮し、投与用の用量を調製することができる。製剤培地は、例えば、静脈内注入のための晶質液などの免疫細胞の投与のために許容され得る。
任意選択で、凍結保存を使用して、免疫細胞を長期間貯蔵することができる。凍結保存は、例えば、細胞を、凍結保存成分を含有する凍結保存培地中に貯蔵することを含む、当該技術分野で既知の方法を使用して達成することができる。凍結保存成分は、例えば、ジメチルスルホキシド又はグリセロールを含むことができる。凍結保存培地中に貯蔵された免疫細胞は、貯蔵温度を－８０℃～－１９６℃まで低下させることにより凍結保存することができる。
いくつかの実施形態において、治療方法は、対象のＨＬＡ生殖細胞型を決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ生殖細胞型は、骨髄において決定される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、ＣＥＡの発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＡの発現レベルは、対象に由来する腫瘍組織試料中で決定される。いくつかの実施形態において、ＣＥＡの発現レベルは、次世代配列決定を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＣＥＡの発現レベルは、ＲＮＡ配列決定を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＣＥＡのレベルは、免疫組織化学を使用して決定される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０２ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０１抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０１ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０１を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０３を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０３ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０７抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０７ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０７を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ｃ＊０７抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ｃ＊０７ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ｂ＊０７抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ｂ＊０７ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を喪失したがん細胞を有することが決定される。
様々な実施形態において、本開示は、ＣＥＡを発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した悪性腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２患者の治療方法、及び／又はＣＥＡを発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した再発性切除不能若しくは転移性固形腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２成人患者の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態において、治療有効量の本明細書に記載の免疫細胞が投与される。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、腹腔内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞、約１×１０６個の細胞、約２×１０６個の細胞、約３×１０６個の細胞、４×１０６個の細胞、約５×１０６個の細胞、約６×１０６個の細胞、約７×１０６個の細胞、約８×１０６個の細胞、約９×１０６個の細胞、約１×１０７個、約２×１０７個、約３×１０７個、約４×１０７個、約５×１０７個、約６×１０７個、約７×１０７個、約８×１０７個、約９×１０７個、約１×１０８個の細胞、約２×１０８個の細胞、約３×１０８個の細胞、約４×１０８個の細胞、約５×１０８個の細胞、約６×１０８個の細胞、約７×１０８個の細胞、約８×１０８個の細胞、約９×１０８個の細胞、約１×１０９個の細胞、約２×１０９個の細胞、約３×１０９個の細胞、約３×１０９個の細胞、約４×１０９個の細胞、約５×１０９個の細胞、約５×１０９個の細胞、約６×１０９個の細胞、約７×１０９個の細胞、約８×１０９個の細胞、約９×１０９個の細胞、約１×１０１０個の細胞、約２×１０１０個の細胞、約３×１０１０個の細胞、約４×１０１０個の細胞、約５×１０１０個の細胞、約６×１０１０個の細胞、約７×１０１０個の細胞、約８×１０１０個の細胞、又は約９×１０１０個の細胞を含む。
いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約９×１０１０個の細胞、約１×１０６個の細胞～約５×１０１０個の細胞、約２×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約３×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約４×１０６個の細胞～約３×１０９個の細胞、約５×１０６個の細胞～約２×１０９個の細胞、約６×１０６個の細胞～約１×１０９個の細胞、０．５×１０６個の細胞～約６×１０９個の細胞、約１×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約２×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約３×１０６個の細胞～約４×１０９個の細胞、約４×１０６個の細胞～約３×１０９個の細胞、約５×１０６個の細胞～約２×１０９個の細胞、約６×１０６個の細胞～約１×１０９個の細胞、０．５×１０６個の細胞～約６×１０８個の細胞、約１×１０６個の細胞～約５×１０８個の細胞、約２×１０６個の細胞～約５×１０８個の細胞、約３×１０６個の細胞～約４×１０８個の細胞、約４×１０６個の細胞～約３×１０８個の細胞、約５×１０６個の細胞～約２×１０８個の細胞、約６×１０６個の細胞～約１×１０８個の細胞、約７×１０６個の細胞～約９×１０８個の細胞、約８×１０６個の細胞～約８×１０８個の細胞、約９×１０６個の細胞～約７×１０８個の細胞、約１×１０７個の細胞～約６×１０８個の細胞、約２×１０７個の細胞～約５×１０８個の細胞、約７×１０６個の細胞～約９×１０７個の細胞、約８×１０６個の細胞～約８×１０７個の細胞、約９×１０６個の細胞～約７×１０７個の細胞、約１×１０７個の細胞～約６×１０７個の細胞、又は約２×１０７個の細胞～約５×１０７個の細胞を含む。
いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０５個の細胞～約９×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約１×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約１×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約６×１０８個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約９×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約１×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約１×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約６×１０８個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約９×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約１×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約１×１０９個の細胞を含む。治療用量で言及される場合、「約」という用語は、例えば、±０．５×１０６個の細胞、±０．５×１０７個の細胞、又は±０．５×１０８個の細胞であり得る。
キット及び製品
本開示は、本明細書に記載の受容体をコードするポリヌクレオチド及びベクター、並びに本明細書に記載の受容体を含む免疫細胞を含む、キット及び製品を提供する。いくつかの実施形態において、キットは、バイアル、シリンジ、及び使用説明書などの物品を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本開示の１つ以上の受容体をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド又はベクターを含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の第１及び第２の受容体を含む、複数の免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、複数の免疫細胞は、複数のＴ細胞を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、使用説明書を更に含む。
実施形態の列挙
本開示は、以下の例示的な列挙された実施形態を参照して理解することができる。
１．がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失に応答する免疫細胞であって、（ａ）第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、（ｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原、若しくはそのペプチド抗原、又は（ｉｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）、若しくはそのペプチド抗原から選択される標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｂ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、ＳＲＥＣ、ＣＸＣＬ１６、ＣＯＬＥＣ１２及びＡＰＣＤＤ１、又はそれらの抗原ペプチドから選択される非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性受容体と、を含み、非標的抗原が、多型を含む、免疫細胞。
２．標的抗原が、がん細胞特異的抗原である、実施形態１に記載の免疫細胞。
３．標的抗原が、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原のペプチド抗原である、実施形態１に記載の免疫細胞。
４．がん細胞が、結腸直腸がん細胞である、実施形態２又は実施形態３に記載の免疫細胞。
５．がん細胞が、膵臓がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、肺腺がん細胞、頭頸部がん細胞、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん細胞、又は急性骨髄性白血病がん細胞である、実施形態２又は実施形態３に記載の免疫細胞。
６．がん細胞が、ＣＥＡを発現する、実施形態１に記載の免疫細胞。
７．標的抗原が、ＣＥＡである、実施形態６に記載の免疫細胞。
８．標的抗原が、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＣＥＡのペプチド抗原である、実施形態１に記載の免疫細胞。
９．標的抗原が、標的細胞によって発現される、実施形態１～８のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１０．非標的抗原が、標的細胞によって発現されない、実施形態１～９のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１１．非標的抗原が、健常な細胞によって発現される、実施形態１～９のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１２．健常な細胞が、標的抗原及び非標的抗原の両方を発現する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１３．第１の受容体及び第２の受容体がともに、標的細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１４．免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態１３に記載の免疫細胞。
１５．Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である、実施形態１４に記載の免疫細胞。
１６．標的細胞が、結腸直腸がん細胞、膵臓がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、肺腺がん細胞、頭頸部がん細胞、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん細胞又は急性骨髄性白血病がん細胞を含む、実施形態９～１５のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１７．ＣＥＡが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１８．ＣＥＡのペプチド抗原が、ＩＭＩＧＶＬＶＧＶ（配列番号２）である、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１９．ＭＨＣ－Ｉが、ヒト白血球抗原Ａ＊０２対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ＊０２）を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の免疫細胞。
２０．第１の受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の免疫細胞。
２１．第１の受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の免疫細胞。
２２．第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、又はβ鎖可変ドメイン（Ｖβ）を含む、実施形態２０又は２１に記載の免疫細胞。
２３．第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含む、実施形態２０又は２１に記載の免疫細胞。
２４．第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号３～１２から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、実施形態２２又は２３に記載の免疫細胞。
２５．（ａ）ＴＣＲα鎖可変ドメインが、ＴＳＩＴＡ（配列番号３）のＣＤＲ－１、ＩＲＳＮＥＲ（配列番号４）のＣＤＲ－２、及びＡＴＤＬＴＳＧＧＮＹＫ（配列番号５）、ＡＴＤＦＴＳＧＧＮＹＫ（配列番号６）、ＡＴＤＬＴＴＧＧＮＹＫ（配列番号７）又はＡＴＤＦＴＴＧＧＮＹＫ（配列番号８）を含むＣＤＲ－３を含み、（ｂ）ＴＣＲβ鎖可変ドメインが、ＫＧＨＰＶ（配列番号９）のＣＤＲ－１、ＦＱＮＱＥＶ（配列番号１０）のＣＤＲ－２、及びＡＳＳＬＧＬＧＤＹＥＱ（配列番号１１）又はＡＳＳＬＧＴＧＤＹＥＱ（配列番号１２）のＣＤＲ－３を含む、実施形態２３に記載の免疫細胞。
（ａ）ＴＣＲα鎖可変ドメインが、配列番号９のＣＤＲ－１、配列番号１０のＣＤＲ－２、及び配列番号１１又は配列番号１２のＣＤＲ－３を含み、（ｂ）ＴＣＲβ鎖可変ドメインが、配列番号３のＣＤＲ－１、配列番号４のＣＤＲ－２、及び配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８を含むＣＤＲ－３を含む、実施形態２３に記載の免疫細胞。
非標的抗原が、配列番号１３と少なくとも９５％の同一性を共有するＴＮＦＲＳＦ１１Ａ抗原であり、多型が、（ａ）配列番号１３の１９２位におけるＡ若しくはＶ、又は（ｂ）配列番号１３の１４１位におけるＨ若しくはＹから選択される、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の免疫細胞。
非標的抗原が、配列番号１４と少なくとも９５％の同一性を共有するＩＴＧＡＥ抗原であり、多型が、（ａ）配列番号１４の９５０位におけるＲ若しくはＷ、又は（ｂ）配列番号１４の１０１９位におけるＶ、Ａ、若しくはＧから選択される、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の免疫細胞。
２９．がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失に応答する免疫細胞であって、（ａ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）、又はそのペプチド抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｂ）非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性受容体と、を含み、非標的抗原が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含む、免疫細胞。
３０．第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含むＭＨＣ－Ｉ複合体におけるＣＥＡペプチド抗原を認識しない、実施形態２９に記載の免疫細胞。
３１．第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、β鎖可変ドメイン（Ｖβ）、又はＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含む、実施形態２９又は３０に記載の免疫細胞。
３２．第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、実施形態２９又は３０に記載の免疫細胞。
３３．ｓｃＦｖが、配列番号６４～７０のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態３２に記載の免疫細胞。
３４．ｓｃＦｖが、配列番号６４～７０のいずれか１つの配列を含む、実施形態３２に記載の免疫細胞。
３５．第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号５５～６３からなる群から選択されるＣＤＲを含む、実施形態２９～３３に記載の免疫細胞。
３６．第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、β鎖可変ドメイン（Ｖβ）、又はＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含む、実施形態２９～３５のいずれか１つに記載の免疫細胞。
３７．第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、実施形態２９～３５のいずれか１つに記載の免疫細胞。
３８．ｓｃＦｖが、配列番号９１～１０２のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態３７に記載の免疫細胞。
３９．ｓｃＦｖが、配列番号９１～１０２のいずれか１つの配列を含む、実施形態３７に記載の免疫細胞。
４０．第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号１０３～１１４からなる群から選択されるＣＤＲを含む、実施形態２９～３９のいずれか１つに記載の免疫細胞。
４１．第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントを含む、実施形態２９～４０のいずれか１つに記載の免疫細胞。
４２．ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインが、配列番号１２６と少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態４１に記載の免疫細胞。
４３．第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントを含む、実施形態２９～４２のいずれか１つに記載の免疫細胞。
４４．ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントが、配列番号１３５と少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態４３に記載の免疫細胞。
４５．第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的バリアントを含む、実施形態２９～４４のいずれか１つに記載の免疫細胞。
４６．ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインが、配列番号１３４、配列番号１２７又は配列番号１２８と少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態４５に記載の免疫細胞。
４７．第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及びＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン、又はその機能的バリアントを含む、実施形態２９～４６のいずれか１つに記載の免疫細胞。
４８．ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及びＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインが、配列番号１３０、又は配列番号１３０と少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態４７に記載の免疫細胞。
４９．がん細胞が、結腸直腸がん細胞である、実施形態２９～４８のいずれか１つに記載の免疫細胞。
５０．がん細胞が、膵臓がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、肺腺がん細胞、頭頸部がん細胞、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん細胞、又は急性骨髄性白血病がん細胞である、実施形態２９～４８のいずれか１つに記載の免疫細胞。
５１．標的抗原が、標的細胞によって発現される、実施形態２９～５０のいずれか１つに記載の免疫細胞。
５２．非標的抗原が、標的細胞によって発現されない、実施形態２９～５１のいずれか１つに記載の免疫細胞。
５３．標的細胞が、結腸直腸がん細胞、膵臓がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、肺腺がん細胞、頭頸部がん細胞、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん細胞、又は急性骨髄性白血病がん細胞である、実施形態５１又は５２に記載の免疫細胞。
５４．非標的抗原が、健常な細胞によって発現される、実施形態２９～５３のいずれか１つに記載の免疫細胞。
５５．健常な細胞が、標的抗原及び非標的抗原の両方を発現する、実施形態２９～５４のいずれか１つに記載の免疫細胞。
５６．第１の受容体及び第２の受容体がともに、標的細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する、実施形態２９～５５のいずれか１つに記載の免疫細胞。
５７．免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態５６に記載の免疫細胞。
５８．Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である、実施形態５７に記載の免疫細胞。
５９．ＣＥＡが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態２９～５８のいずれか１つに記載の免疫細胞。
６０．第２９の受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態１～５９のいずれか１つに記載の免疫細胞。
６１．治療有効量の実施形態１～６０のいずれか１つに記載の免疫細胞を含む、医薬組成物。
６２．薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む、実施形態６１に記載の医薬組成物。
６３．がんの治療において医薬として使用するための、実施形態６１又は６２に記載の医薬組成物。
６４．ポリヌクレオチド系であって、（ａ）第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、（ｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原、若しくはそのペプチド抗原、又は（ｉｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）、若しくはそのペプチド抗原から選択される標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｂ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、ＳＲＥＣ、ＣＸＣＬ１６、ＣＯＬＥＣ１２及びＡＰＣＤＤ１、又はそれらの抗原ペプチドから選択される非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性受容体とをコードするポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含み、非標的抗原が、多型を含む、ポリヌクレオチド系。
６５．ポリヌクレオチド系であって、（ａ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）、又はそのペプチド抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｂ）非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性受容体とをコードするポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含み、非標的抗原が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含む、ポリヌクレオチド系。
６６．実施形態６４又は６５に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
６７．対象において複数のがん細胞を死滅させる、かつ／又はがんを治療する方法であって、有効量の実施形態１～６０のいずれか１つに記載の免疫細胞、又は実施形態６１～６３のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
６８．複数のがん細胞が、標的抗原を発現する、実施形態６７に記載の方法。
６９．複数のがん細胞が、非標的抗原を発現しない、実施形態６７又は６８に記載の方法。
７０．複数のがん細胞が、ヘテロ接合性（ＬＯＨ）の喪失に起因して、非標的抗原を喪失している、実施形態６９に記載の方法。
７１．対象においてがんを治療する方法であって、（ａ）ｒｓ１７１６（ＩＴＧＡＥ Ｒ９５０Ｗ）、ｒｓ２９７６２３０（ＩＴＧＡＥ Ｖ１０１９Ａ／Ｖ１０１９Ｇ）、ｒｓ１８０５０３４（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ Ｖ１９２Ａ）及びｒｓ３５２１１４９６（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ Ｈ１４１Ｙ）からなる群から選択される多型遺伝子座において、対象の正常細胞及び複数のがん細胞の遺伝子型を決定することと、（ｂ）複数のがん細胞におけるＣＥＡＣＡＭ５の発現を決定することと、（ｃ）正常細胞が多型遺伝子座に対してヘテロ接合性であり、複数のがん細胞が多型遺伝子座に対して半接合性であり、複数のがん細胞がＣＥＡ陽性である場合、複数の免疫細胞を対象に投与することと、を含み、複数の免疫細胞が、（ｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体においてＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）、又はそのペプチド抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｉｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体においてＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、及びＳＲＥＣ、又はそれらの抗原ペプチドから選択される非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合を含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性受容体と、を含み、非標的抗原が、多型を含む、方法。
７２．対象においてがんを治療する方法であって、（ａ）対象の正常細胞及び複数のがん細胞についてのＨＬＡ－Ａ遺伝子型又は発現を決定することと、（ｂ）複数のがん細胞におけるＣＥＡの発現を決定することと、（ｃ）正常細胞がＨＬＡ－Ａ＊０２を発現し、複数のがん細胞がＨＬＡ－Ａ＊０２を発現せず、複数のがん細胞がＣＥＡ陽性である場合、複数の免疫細胞を対象に投与することと、を含み、複数の免疫細胞が、（ｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）、又はそのペプチド抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｉｉ）非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性受容体と、を含み、非標的抗原が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含む、方法。
７３．複数の免疫細胞を作製する方法であって、（ａ）複数の免疫細胞を提供することと、（ｂ）実施形態６４若しくは６５に記載のポリヌクレオチド系、又は実施形態６６に記載のベクターで複数の免疫細胞を形質転換することと、を含む、方法。
７４．実施形態１～６０のいずれか１つに記載の免疫細胞、又は実施形態６１～６３のいずれか１つに記載の医薬組成物を含む、キット。
７５．使用説明書を更に含む、実施形態７４に記載のキット。
７６．（１）配列番号１６～３１のうちのいずれか１つのアミノ酸１～２７０、若しくはそれと少なくとも９５％同一の配列を含むか、又は本質的にそれからなるＴＣＲアルファ鎖と、（２）配列番号１６～３１のうちのいずれか１つのアミノ酸２９３～５９８、若しくはそれと少なくとも９５％同一の配列を含むか、又は本質的にそれからなるＴＣＲベータ鎖と、を含む、ＴＣＲ。
７７．（ａ）配列番号１６のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号１６のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｂ）配列番号１７のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号１７のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｃ）配列番号１８のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号１８のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｄ）配列番号１９のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号１９のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｅ）配列番号２０のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号２０のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｆ）配列番号２１のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号２１のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｇ）配列番号２２のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号２２のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｈ）配列番号２３のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号２３のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｉ）配列番号２４のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号２４のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｊ）配列番号２５のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号２５のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｋ）配列番号２６のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号２６のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｌ）配列番号２７のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号２７のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｍ）配列番号２８のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｎ）配列番号２９のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号２９のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、（ｏ）配列番号３０のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号３０のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖、又は（ｐ）配列番号３１のアミノ酸１～２７０を含むＴＣＲアルファ鎖、及び配列番号３１のアミノ酸２９３～５９８を含むＴＣＲベータ鎖を含む、ＴＣＲ。
７８．実施形態７６又は７７に記載のＴＣＲを含む、免疫細胞。
７９．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＡＣＨＲＢ、ＩＴＧＡＥ、ＴＲＰＶ１、ＳＲＥＣ、ＣＸＣＬ１６、ＣＯＬＥＣ１２及びＡＰＣＤＤ１、又はそれらの抗原ペプチドから選択される非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性受容体を更に含み、非標的抗原が、多型を含む、実施形態７８に記載の免疫細胞。
以下の実施例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲を限定するものではない。実施例を通して、「遮断因子抗原」という用語は、非標的抗原の実施形態を説明するために使用される。
実施例１：遮断因子としてのＴＮＦＲＳ１１Ａの同定
ＧＩＳＴＩＣ ＴＣＧＡデータベースを検索して、結腸直腸がんにおけるヘテロ接合性の喪失により喪失した領域を同定した。Ｃｈｒ１８ｑ：３５，２３７，５９３～３７，２０８，５４を、結腸直腸がんにおけるヘテロ接合性の喪失により最も頻繁に喪失した領域として同定した。Ｃｈｒ．１８ｑ上でコードされる表面タンパク質を、正常な結腸細胞によって発現されたタンパク質についてフィルタリングした。
これらの表面タンパク質を、以下のプロセスを使用して、タンパク質の細胞外ドメイン内の非同義ＳＮＰについて検索した：
－ 一般的なバリアントについてのＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰデータベースをダウンロードした（ＮＣＢＩの場合、「一般的な」カテゴリーは、生殖細胞起源、及び少なくとも２つの無関係な個体がマイナー対立遺伝子を有する、少なくとも１つの主要集団における０．０１以上のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）に基づいていることに留意されたい）
－ このデータベースは、１８番染色体及び１７番染色体におけるバリアントのみを分析した
－ ＭＡＦ＜０．１であるバリアントを除去した
－ ＶＥＰ（バリアント効果予測因子）を実行し、タンパク質コード領域にあるミスセンスバリアントのみを保持した
－ 以下の遺伝子を除去した：
○膜貫通ドメインを有しない遺伝子
○ゴルジ、ＥＲ、ミトコンドリア、エンドソーム、核膜に位置する遺伝子
○結腸において高度に発現されない遺伝子（ＧＴＥｘ発現レベル＜５ＴＰＭ）
○欠失とは対照的に増幅される遺伝子
－ ＴＣＧＡ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｐｏｒｔａｌにおいて、候補遺伝子のヘテロ接合性の喪失を確認した
－ 候補遺伝子を、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒにおける他のバリアントについて確認した
○バリアントが存在する場合、バリアントの位置を確認した（それは細胞外ドメインにあるか？）
フィルタリングパイプラインの概要を以下の表１５に示す。
Figure 2023538115000108
５つの候補遺伝子が、全てのフィルタを通過した。これらの５つの遺伝子の概要を以下の表１６～１９に示す。
Figure 2023538115000109
Figure 2023538115000110
Figure 2023538115000111
Figure 2023538115000112
表１８の結果は、ＴＣＧＡ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｐｏｒｔａｌからのものである。
結晶構造を調べて、抗体への細胞外ドメインＳＮＰの利用可能性を検証した。
これらの方法を使用して、ＴＮＦＲＳ１１Ａ（ＲＡＮＫ）を、ＣＥＡ ＴＣＲ又はＣＡＲ活性化因子と対合する遮断因子受容体に対する標的として同定した。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）受容体は、腸を含む、広範囲の正常組織において発現される。腸発現は、結腸における発現を含み、正常なＴＮＦＲＳＦ１１Ａ結腸発現の中央値は、２３個の転写産物／細胞である。結腸における最大ＣＲＣ ＣＥＡ発現は、８，７８０個の転写産物／細胞である。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａはまた、食道においても発現される。正常な食道ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ発現の中央値は、２個の転写産物／細胞である。食道における最大ＥｓＣａ ＣＥＡ発現は、６，２０８個の転写産物／細胞である。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａは、ＲＡＮＫＬ（デノスマブの標的）に結合する６１６残基のタンパク質をコードする。これは、２８個のアミノ酸シグナルペプチド、１８４個のアミノ酸細胞外ドメイン、２１個のアミノ酸膜貫通ドメイン、及び３８３個のアミノ酸細胞内ドメインを含む。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａは、２つの一般的な非同義バリアント、０．４のＭＡＦを有するｒｓ１８０５０３４（Ｖ１９２Ａ）、及び約０．２のＭＡＦを有するｒｓ３５２１１４９６（Ｈ１４１Ｙ）を含有する。
実施例２：ＣＥＡ ＣＡＲにより媒介されるＪｕｒｋａｔ細胞の活性化は、ＨＬＡ－Ａ＊２抑制性受容体によって遮断される
細胞培養
ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターをコードするＪｕｒｋａｔ細胞を、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。培養において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８／ジェネテシンを補充したＲＰＭＩ培地中に維持した。ＨｅＬａ細胞を、ＡＴＣＣによって示唆されるように維持した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞トランスフェクション
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、Ｊｕｒｋａｔ細胞についての設定を使用して、製造業者のプロトコルに従って、１００ｕＬフォーマットの４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ）により一過性にトランスフェクトした。同時トランスフェクションを、１ｅ６細胞当たり１～３ｕｇの活性化因子構築物、及び１～３ｕｇの遮断因子構築物又は空のベクターで実施し、２０％の熱不活性化ＦＢＳ及び０．１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地中で回収した。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ活性化研究
ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＣＥＡ、又はその両方を発現するＨｅＬａ細胞を、Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養し、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター系を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化をアッセイした。ＨＬＡ－Ａ－Ａ＊０２抗原結合ドメイン及びＬＩＲ－１ ＩＣＤ（Ｃ１７６５）を有する遮断因子受容体が、ＣＥＡ ｓｃＦｖ（ＣＴ６１８）を有する活性化因子ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を遮断する能力をアッセイした。ＨｅＬａ細胞を、ＨＬＡ－Ａ＊０２＋及び／又はＣＥＡ＋をコードするポリヌクレオチドで形質導入し、ＨＬＡ－Ａ＊０２＋／ＣＥＡ－ＨｅＬａ細胞、ＨＬＡ－Ａ＊０２－／ＣＥＡ＋ＨｅＬａ細胞、及びＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＨｅＬａ細胞を生成して、Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化アッセイのための標的細胞として使用した。これらのＨｅＬａ細胞を、Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養し、ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター系を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化をアッセイした。結果を図１０に示す。図１０に見ることができるように、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ１遮断因子は、Ｊｕｒｋａｔ細胞が、ＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋標的細胞と培養されるとき、ＣＥＡ ｓｃＦｖ ＣＡＲによるＪｕｒｋａｔ細胞活性化を阻害することができる。
実施例３：追加の遮断因子標的抗原の同定
実施例１のＴＮＦＲＳＦ１１Ａを同定するために使用されるものと同様のバイオインフォマティクスパイプラインを使用して、追加の候補の遮断因子標的を同定した。ヒト遺伝子のセットを、結腸直腸がんにおけるヘテロ接合性の高い喪失（０．５超）を有する細胞外ドメインにおける一般的な非同義バリアントを有する遺伝子について探索した。非同義バリアントを有する遺伝子を、公開、集団頻度、分子結果、及びゲノムマッピング情報とともに小規模の挿入及び欠失も含む、一塩基多型のデータベースであるｄｂＳＮＰ内で検索した。一般的なバリエーションは、少なくとも１つの主要集団において０．０１以上のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有し、ＮＣＢＩにおいてマイナー対立遺伝子を有する少なくとも２つの無関係な個体を有すると定義された。一般的なバリエーションについての基準として０．１以上のＭＡＦ。染色体は結腸直腸がんにおいて高いＬＯＨを有するため、１７番染色体及び１８番染色体に焦点が当てられた。上記のように、細胞外ドメインにおける膜タンパク質、結腸発現、及び一般的な非同義バリアントについて遺伝子をフィルタリングした。検索プロセスの概要を図１１に示す。
この分析で使用される追加のデータベースには、以下が含まれる。Ｕｎｉｐｒｏｔ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩ、ＳＩＢ、及びＰＩＲによってホストされるタンパク質配列及び注釈データについてのリソースを使用した。ＧＴＥｘ（Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、組織特異的な遺伝子発現及び調節についての公的リソースとして使用した。これは、約１０００人の個体にわたる５４の非疾患組織部位からの試料を含有する。ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）を、２０，０００を超える原発性がんについてのリソースとして使用し、３３種類のがんにわたる正常な試料を一致させた。ＴＣＧＡ－ＣＯＡＤＲＥＡＤデータセットは、結腸腺がん及び直腸腺がんデータセットである。ＣＣＬＥ（Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ）は、５７の結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞株に関する情報を含む。
ＲＮＡＳｅｑＤＢは、同じパイプラインを使用してＧＴＥｘ及びＴＣＧＡからの処理データのデータベースであり、これは、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒからの比較研究を可能にする。ＧＴＥｘから３７２個のＴＣＧＡ－ＣＯＡＤＲＥＡＤ試料及び３３９個の正常な結腸試料を分析した。
ＣＯＬＥＣ１２、ＣＸＣＬ１６及びＡＰＣＤＤ１を、潜在的な遮断因子標的としてこれらの方法を使用して同定した。表１９は、結腸直腸がんにおけるこれらの遺伝子についての発現データをまとめたものである。ＵＣＳＣ Ｘｅｎａブラウザ（ＴＣＧＡ用）及びＣＣＬＥ試料からの発現データ。
Figure 2023538115000113
表２０は、バリアント及びマイナー対立遺伝子頻度をまとめたものである。
Figure 2023538115000114
Figure 2023538115000115
Figure 2023538115000116
実施例４：遮断因子標的抗原に特異的な抗原結合ドメインの同定
ＣＤＲ配列が未知である場合、候補の遮断因子抗原に対する公的に入手可能な抗体が配列決定される。候補の遮断因子標的に対する抗体が利用可能でない場合、これらの抗体は、精製されたタンパク質（例えば、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＸＣＬ１６、ＴＮＦＲＳ１１Ａ及び実施例に記載の他の標的）を用いたマウス、ラット、又はウサギの免疫化によって生成される。免疫化動物からの血清を使用して、ｍＡｂが遮断因子標的に結合するかどうかをスクリーニングする。遮断因子標的に対する抗体もまた、ｈｕＴＡＲＧ系を使用して生成される。次いで、所望の特異性を有する抗体を単離し、配列決定して、ＣＤＲ配列を決定する。
抗体から遮断因子標的までのＣＤＲ配列を使用して、標準的な分子生物学的技術を使用してｓｃＦｖを生成する。候補のｓｃＦｖは、抑制性受容体ヒンジ又は膜貫通ドメインに融合され、標準的な分子生物学的技術を使用して抑制性受容体を生成する。候補のｓｃＦｖはまた、活性化因子受容体ヒンジ又は膜貫通ドメイン（例えば、ＣＡＲ）に融合され、標的抗原に結合するｓｃＦｖについての陽性対照として使用するための全長活性化因子受容体を生成する。抑制性受容体の状況において作用する候補ｓｃＦｖの能力を、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用してＪｕｒｋａｔ細胞においてアッセイする。
実施例５：実施例６～１１についての方法
細胞株生成
標的細胞株を、供給業者の指示に従って増殖させた。表２５に示すようにＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）細胞株を構築するための遺伝子修飾は、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９を使用した。ガイドＲＮＡは、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ及び／又はＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入し、標的化配列を表２２に列挙する。ＲＮＰ複合体を形成するために、Ｓ．ｐ．ＨｉＦｉ Ｃａｓ９タンパク質（ＩＤＴ）を、１：３のモル比でｓｇＲＮＡと混合した後、４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して各細胞株に合わせた設定を行ってエレクトロポレーションした。
ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）及びＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ＨｅＬａ細胞株を生成するために、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードするプラスミドを有する、又は有しないＣＥＡをコードするｐＬｅｎｔｉプラスミドを、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ＣＥＡ及び／又はＨＬＡ－Ａ＊０２を発現する安定なプールを、ＦＡＣＳによって濃縮し、その後拡大した。
ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）Ｋ５６２及びＣｏｌｏ６６８株を確立するために、ＨＬＡ－Ａ＊０２重鎖をコードするレンチウイルスを形質導入して、安定なプールを作製した。ＣＥＡ（＋）標的細胞を生成するために、Ｃｏｌｏ６６８及びＨ５０８を除く、全てのＣＥＡ（－）標的細胞を、４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用してＣＥＡ ｍＲＮＡ（以下を参照されたい）でトランスフェクトし、トランスフェクション後１～３日以内にアッセイした。ウミシイタケルシフェラーゼ及びＲＦＰ（シスで）をコードするレンチウイルスを、Ｂｉｏｓｅｔｔｉａから購入し、形質導入して、ＲＦＰを発現する標的細胞の安定なプールを確立した。標的ノックアウト又は過剰発現細胞株を、ＨＬＡ－Ａ＊０２抗体（ＢＶ４２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃３４３３２６）、又はＣＥＡ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ４１２８１）を使用して、ＦＡＣＳによって標的陰性又は陽性プールについて濃縮した。標的細胞株のＲＦＰ発現プールを、ＦＡＣＳによって選択した。
Ａ＊０２遮断因子を有する、又は有しないＣＥＡ ＣＡＲを、レンチウイルス形質導入によってルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞内で安定に発現させた。
ｍＲＮＡのインビトロ転写
ｍＲＮＡを、４０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭのジチオスレイトール、２ｍＭのスペルミジン、０．００２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、２７ｍＭの酢酸マグネシウム、５ｍＭのＣｌｅａｎＣａｐ Ｃａｐ １ ＡＧ三量体（ＴｒｉＬｉｎｋ）、並びに各々５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びシュードウリジントリホスフェート（ＮＥＢ）を含有する２５ｕｌの１×反応緩衝液中で合成した。反応は、８Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０４６０Ｔ）、０．００２Ｕ／μＬの無機ピロホスファターゼ（ＮＥＢ、Ｍ２４０３Ｌ）、１Ｕ／μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ、Ｍ０３１４Ｌ）、及び０．０２５μｇ／μＬの線形化Ｔ７鋳型の最終濃度で、３７℃で２時間進行させた。０．４Ｕ／μＬのＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、Ｍ０３０３Ｌ）を、１×ＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液中に３７℃で１５分間の反応の終わりに添加して、鋳型を除去した。ＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）テーリングを、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｏｌｙ（Ａ）ポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７６）を用いて製造業者のプロトコルに従って実施し、ＲＮＡを、供給業者のクリーンアップキット（ＮＥＢ、Ｔ２０４０Ｌ）によって精製した。ＲＮＡを、１×Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ緩衝液中の０．２Ｕ／μｇのＡｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２８９Ｌ）で１時間処理し、（ＮＥＢ、Ｔ２０４０Ｌ）によって再精製した。ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって測定し、１％アガロースゲル上で調べた。
プローブ結合及び受容体発現のためのフローサイトメトリー
ＣＡＲ及びＴＣＲの発現を、ビオチン化プロテインＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃２９９９７）、続いて蛍光標識ストレプトアビジン（ＣＡＲ用）、又は蛍光標識抗マウスＴＲＢＶ抗体（ＴＣＲ用；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃｌ：Ｈ５７－５９７）を使用してフローサイトメトリーによって評価した。Ｔｍｏｄを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、ビオチン化ｐＭＨＣプローブで染色し、四量体化し、適切な蛍光色素（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）にコンジュゲートしたストレプトアビジンで前標識することによって、遮断因子－抗原結合を決定した。４℃で染色した後、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を決定した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞機能アッセイ
この研究では、ｍＲＮＡトランスフェクションによって、天然、組換え、又は一過性に活性化因子及び遮断因子抗原を発現する標的細胞を使用した。ｍＲＮＡトランスフェクションを使用した場合、９倍希釈系列における２μｇのｍＲＮＡから合計６～１６点で開始する、可変量のＣＥＡ ｍＲＮＡとともに４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、標的細胞の各対（ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）及びＨＬＡ－Ａ＊０２（＋））をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞又は標的抗原を天然／安定的に発現する細胞を播種し、１０，０００個の細胞／ウェルの密度で３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３５７０）中で１８～２０時間、正常な組織培養条件下で増殖させた。野生型又はＣＥＡ ＣＡＲ若しくはＣＥＡ Ｔｍｏｄ構築物を発現する１２，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を、標的細胞ウェルに添加し、ルシフェリン基質を添加する前に６時間共培養して、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００を使用してルシフェラーゼシグナルを測定した。
ＣＥＡ発現を定量化するために、各ＣＥＡ ｍＲＮＡ滴定点からの標的細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３６１０）に播種し、細胞収集前に１８～２０時間増殖させた。ＣＥＡ発現を、ＣＥＡ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ４１２８１）及びＱＩＦＩＫＩＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｋ００７８１１－８）を使用して、製造業者のプロトコルに従って定量化して、表面ＣＥＡ分子数を決定した。細胞表面数対ｍＲＮＡについて標準曲線を生成した（以下を参照されたい）。
ＥＣ５０及びＩＣ５０分子／細胞値のＴＰＭへの変換
タンパク質分子／細胞対ＴＰＭ標準曲線を生成するために、複数の細胞株上のＣＥＡ又はＨＬＡ－Ａ＊０２の表面発現を、上記のように社内で決定するか、又は以前に公表された結果から取得した。ＴＰＭ値は、ＤｅｐＭａｐポータル（ｄｅｐｍａｐ．ｏｒｇ／ｐｏｒｔａｌ／）から得た。勾配（ｋ）を、分子／細胞＝ｋ＊ＴＰＭを適合することによって決定し、組織及び細胞株抗原発現値と比較するために、分子／細胞におけるＥＣ５０及びＩＣ５０をＴＰＭに変換するために使用した。
初代Ｔ細胞の生成及び特性評価
初代Ｔ細胞及びドナー収集プロトコルについてのインフォームドコンセントは、Ａｌｌｃｅｌｌｓ（登録商標）の施設内審査委員会（ＩＲＢ）によって承認された。Ａｌｌｃｅｌｌｓ（登録商標）は、ＨＩＰＡＡコンプライアンス及び承認されたプロトコル（ｗｗｗ．ａｌｌｃｅｌｌｓ．ｃｏｍ／ｃｅｌｌ－ｔｉｓｓｕｅ－ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ／ｄｏｎｏｒ－ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ／）に従った。ＰＢＭＣを、Ａｌｌｃｅｌｌｓ（登録商標）から購入したＬｅｕｋｏｐａｋｓから精製した。ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）培地（Ｔａｋａｒａ ＷＫ５５２）に、別段の記載がない限り、１％のヒトＡＢ血清（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ １００－５１２）を補充した。ヒトＰＢＭＣを、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）内で増殖させ、製造業者のガイドライン（１：１００希釈）に従って２４時間、ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－１１１－１６０）を補充した後、ＣＥＡ ＣＡＲのみ及びＣＥＡ Ｔｍｏｄをコードするレンチウイルスで形質導入した。形質導入細胞への形質導入の２４時間後に、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）を補充した追加のＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）を添加し、これを３日間培養した後、２４ウェルのＧ－Ｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ ８０１９２Ｍ）に移した。新鮮なＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）を、４８時間ごとに添加し、Ｇ－Ｒｅｘプレート中での拡大の間に７日ごとに培地を交換した。初代Ｔ細胞における形質導入ＣＡＲ又はＴｍｏｄ成分の発現及び抗原結合を、上記のようにフローサイトメトリーによって確認した。
インビボ研究のために、ＣＥＡ ＣＡＲ及びＣＥＡ Ｔｍｏｄを、３日目から開始する大量の細胞を収容するために、Ｇ－Ｒｅｘ１０（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ ８００４０Ｓ）又はＧ－Ｒｅｘ１００（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ ８０５００）を使用して上記のように生成した。Ｔ細胞をカウントし、３日目から開始して１日おきに培地を交換した。ＣＡＲ及びＴｍｏｄ発現細胞の濃縮を９日目に行った。
ＣＡＲ又はＴｍｏｄ二重受容体発現集団を濃縮するために、製造業者のプロトコルに従って、細胞を、プロテインＬ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃２９９９７）ストレプトアビジン－ＰＥ又はプローブ－ビオチン／ストレプトアビジン－ＰＥで標識し、続いて、抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－０４８－８０１）で標識し、その後、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して濃縮した。濃縮した細胞を、Ｇ－Ｒｅｘプレート中で、収集前と同様に増殖させた。
初代Ｔ細胞の機能アッセイ（急性）
ＧＦＰ又はＲＦＰのいずれかを発現する標的細胞株対（ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）及びＨＬＡ－Ａ＊０２（＋））を、４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して記載した量でＣＥＡ ｍＲＮＡとともにエレクトロポレーションし、３８４ウェルＰＤＬコーティングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｃａｔ＃７８１０９１）を、細胞撮像のために使用したことを除いて、上記のように培養した。必要に応じて、細胞密度決定のために、同一の細胞数を、別の３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３５７０）に並行して播種した。翌日、標的細胞播種密度を、製造業者の指示に従って、セルタイターグロウ（ｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７０）によって測定した。ＣＥＡ ＣＡＲ陽性及びＣＥＡ ＣＡＲ／Ａ＊０２遮断因子二重陽性Ｔ細胞の割合を、共培養前のフローサイトメトリーによって測定した。必要に応じて、非形質導入Ｔ細胞を、ＣＥＡ ＣＡＲ陽性プールと混合して、陽性ＣＥＡ ＣＡＲ細胞の割合を二重陽性集団と一致させた。標的細胞及びＴ細胞を、最大４８時間共培養した。全ウェル蛍光シグナルを、共培養中に４倍の対物レンズを備えるＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３又はＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｎｆｏｃａｌイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｄｅｖｉｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でモニタリングし、全蛍光面積又は強度を経時的に記録した。Ｔ細胞を含まないか、又は非形質導入Ｔ細胞と共培養したウェルと比較した、ＣＡＲ又はＴｍｏｄ共培養物における蛍光シグナルの低減により、ＣＥＡ活性化因子及びＣＥＡ Ｔｍｏｄ構築物の細胞傷害性の比較が可能になった。標的細胞上のＣＥＡ発現を、上記のようにＱＩＦＩＫＩＴを使用して決定した。
混合した標的細胞を使用した場合、ＧＦＰ－ウミシイタケルシフェラーゼを有する正常なＣＥＡ（＋）Ａ＊０２（＋）標的細胞、及びＲＦＰ－ホタルルシフェラーゼで操作された腫瘍ＣＥＡ（＋）Ａ＊０２（－）標的細胞を、１：１の比で混合し、上記のように濃縮された初代Ｔ細胞と共培養した。細胞傷害性は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３でのＧＦＰ及びＲＦＰシグナル喪失をモニタリングすることによって決定した。
可逆性細胞傷害性アッセイ
標的細胞株を、ＬｙｍｐｈｏｎｅＯＮＥ（商標）に加えて、１％のヒト血清及び１倍のＰ／Ｓ中でＴ細胞と共培養した。簡潔に述べると、標的細胞を、連続移入実験を目的としたバルク共培養のための６ウェルプレート中で５００，０００個の細胞／ウェルでプレーティングした。３８４ウェルイメージングプレートにおいて、標的細胞を、５，０００個の細胞／ウェルで播種し、一晩インキュベートした。翌日、Ｔ細胞を、３：１の公称エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で共培養ウェルに添加した（６ウェルフォーマットで１，５００，０００個の細胞／ウェル；３８４ウェルフォーマットで１５，０００個の細胞／ウェル）。インキュベーション／イメージングを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３プラットフォーム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上で、イメージングを２時間ごとに４８時間で行い（連続共培養の各ラウンドに及ぶ）、６ウェルプレートを、３７℃でオフラインでインキュベートした。各４８時間サイクルの終わりに、Ｔ細胞を標的細胞から分離し、６ウェル共培養物から収集し、これらのＴ細胞をカウントし、新鮮な培地中で均一な密度で再懸濁して、（ｉ）示されたシリーズの次の共培養のためのバルク標的細胞の新しいウェル、及び（ｉｉ）シリーズの次の共培養のためのデータを収集するための新しいイメージングウェルのセット（３８４ウェルフォーマット）に移した。第２のラウンドでは、７５０，０００個のＴ細胞及び２５０，０００個の標的細胞を含有するバルク共培養のために、１２ウェルプレートを使用した（Ｅ：Ｔ比は、シリーズを通して一定のままであり、イメージングプレート共培養物は、３８４ウェルフォーマット中で、公称１５，０００：５，０００のＥ：Ｔ比で、この研究を通して使用した）。その結果、一連の共培養が得られ、濃縮された初代Ｔ細胞を、正常な（ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋））、次いで腫瘍（ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－））標的細胞と交互に培養したか、又はその逆を行った。データを特異的死滅（％）として提示し、これは、ドナーと一致した非形質導入Ｔ細胞と比較して形質導入集団における標的細胞ＧＦＰシグナルの喪失のパーセントを反映した。
異種移植片研究
インビボ実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルの下でＥｘｐｌｏｒａ ＢｉｏＬａｂｓによって実施された。５～６週齢の雌のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）、ＪＡＸストック番号００５５５７マウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。研究開始前に、動物を、少なくとも３日間住居環境に順応させた。
住居環境に順応した後、適切な細胞数を確立したパイロット研究で決定されたように、動物に腫瘍細胞を注射した。ホタルルシフェラーゼレポーターで操作された野生型又はアイソジェニックＨＬＡ－Ａ＊０２（－）細胞株を使用して、Ｈ５０８異種移植モデルを確立した（上記を参照されたい）。５０％の２Ｅ７ Ｈ５０８細胞を、ＮＳＧマウスの脇腹に皮下注射した。「正常」細胞を右脇腹に皮下注射し、腫瘍細胞を各マウスの左脇腹に注射した。腫瘍増殖を、キャリパー測定によってモニタリングした。腫瘍が、約１００～２００ｍｍ３の平均サイズに達したとき、動物を、複数の群にランダム化し、尾静脈を介してＴ細胞を投与した。Ｔ細胞注射後、マウスの総腫瘍負荷が、２，０００ｍｍ３に達するまで、腫瘍測定を週に３回行った。生物発光定量化を、７つの各コホートからの５匹のマウスのサブセットで行った。簡潔に述べると、各マウスに、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－ルシフェリンカリウム塩（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ １２２７９９）を１００ｕｌ皮下注射し、次いで、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、１５分後に背側で撮像した。研究を通して定期的に臨床観察及び体重への影響を介して、動物の一般的な健康状態をモニタリングした。
Ｔ細胞注射後、－１、２、９、１６、３０日目及び研究終了時に血液及び血清を採取した。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩでの赤血球溶解後に、血液及び脾臓中のＴ細胞の染色を行った。マウスＣＤ４５及びＴｅｒ１１９に対する抗体で染色することによって、マウス細胞を除外した。ヒトＴ細胞を、ヒトＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８に対する抗体で染色した。全ての抗体の供給源を、補足表２３に列挙する。
Figure 2023538115000117
Figure 2023538115000118
Figure 2023538115000119
実施例６：ＣＥＡキメラ抗原受容体及びＬＩＬＲＢ１抑制性受容体対の設計及び活性
膜近位ＣＥＡ Ｂ３ドメインにおける細胞外エピトープに結合するマウスｍＡｂに基づくヒト化ｓｃＦｖを生成した。元のｍＡｂは、タンパク質の脱落（ｓｈｅｄ）形態に存在しないエピトープに結合し、それによって、可溶性ＣＥＡによる受容体阻害のリスクを回避すると考えられた。ＣＥＡ ｓｃＦｖを、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及び４－１ＢＢ、並びにＣＤ３ζ細胞内ドメインを含んだ、第３世代ＣＡＲに融合させた（図１３）。配列を以下の表２４に示す。
ＣＡＲ活性化因子のみの活性を確認した後、ＣＥＡ ＣＡＲを、ＬＩＬＲＢ１遺伝子産物（ＬＩＲ－１）のヒンジ、膜貫通及びシグナル伝達ドメインに融合したＨＬＡ－Ａ＊０２特異的ｓｃＦｖを含有する構築物である、ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体と同時発現させた。ＬＩＲ－１は、免疫抑制性受容体ファミリーのメンバーであり、そのシグナル伝達ドメインに４つのＩＴＩＭを含有する。ＣＡＲ及びＬＩＲ－１抑制性受容体は、Ｊｕｒｋａｔ及び初代Ｔ細胞の表面上で良好に発現し、両方の受容体は、ＣＥＡ、ＨＬＡ－Ａ＊０２、又は両方を発現するように操作されたＨｅＬａ標的細胞を使用して、大部分がリガンド依存的な様式で機能した（図１４～図１７）。ＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａ＊０２を、ＨｅＬａ細胞において安定に発現させ、それを、標識されたｍＡｂで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。各抗原の表面抗原密度を、ＱＩＦＩＫＩＴを使用して決定した（図１４）。トランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞及び形質導入した初代Ｔエフェクター細胞における両方の受容体の発現及び濃縮を、蛍光活性化フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用して確認した。
特記される場合を除き、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）発現を低下させるために、切断可能なＴ２Ａリンカー及びｓｈＲＮＡ発現カセットを含有する単一の融合遺伝子によってコードされる両方の受容体モジュールを有する単一のベクター構築物を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞をトランスフェクトしたか、又は初代エフェクターＴ細胞を形質導入した
図１５において、ＣＥＡ ＣＡＲは、ＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａ＊０２の両方を発現するＨｅＬａ標的細胞と共培養したＪｕｒｋａｔ細胞において特異的に遮断される。ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターを含有するＪｕｒｋａｔ細胞を、２つの別個の構築物から活性化因子及び遮断因子を安定に発現するように操作した。
図１６及び図１７において、２つの受容体を発現する初代Ｔ細胞における細胞傷害性を、操作されたＨｅＬａ細胞標的でアッセイした。図１６において、両方の受容体をコードする単一のレンチウイルスベクターを、アッセイの前に遮断因子陽性細胞に対して濃縮された、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）ドナーＴ細胞の形質導入のために使用した。１人のドナー（ＨＬ－Ａ＊０２（＋）であった）を図１６に示し、一方、４人のドナーを図１７に示す。
追加のドナーからのＴ細胞の結果を図１７に示す。操作されたＨｅＬａ細胞を、細胞傷害性に対する標的として再度使用し、初代Ｔ細胞を、両方の受容体をコードする単一のレンチウイルスベクターで形質導入した。アッセイの前に、遮断因子リガンド（ＨＬＡＡ＊０２ ｐＭＨＣ）及びプロテインＬを使用して濃縮を行った。ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）であったＤ１８３５３４を除いて、ドナーは、Ａ＊０２（＋）であった。
Figure 2023538115000120
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実施例７：ＣＥＡ ＣＡＲ及びＬＩＬＲＢ１抑制性受容体対の感受性及び選択性
ＣＥＡ活性化因子のＥＣ５０及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＬＲＢ１遮断因子受容体のＩＣ５０を定量化した。これらの値は、ヒト腫瘍及び正常組織の標的抗原発現値と比較することができる。
合成ｍＲＮＡは、Ｊｕｒｋａｔ細胞における機能的測定と組み合わせて、ＨｅＬａ標的細胞及びバリアント上のＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抗原の表面レベルを制御することであった（図１８～図１９）。初代Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイを使用した同様の実験を実施し、比較のためにＨＬＡ－Ａ＊０２制限ＣＥＡ ＴＣＲを含めた（図２０）。ＣＥＡ ＴＣＲは、ＣＥＡ ＴＣＲに記載されており、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５，１６９－１８０に記載されている。このＴＣＲは、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及びその同僚らによって、臨床において活性であることが示されたが、大腸炎のために終了した（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９，６２０－６２６）。
図２０において、両方の受容体を有するＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）ドナーＴ細胞を、ＨｅＬａ標的細胞と共培養した。ＥＣ５０推定のために、異なる量のＣＥＡ ｍＲＮＡを、共培養前にＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）又はＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。適合した代用「正常」細胞を作製するために、１μｇのＡ＊０２ ｍＲＮＡを共トランスフェクトした。ＣＥＡ ｍＲＮＡ量に対して最大死滅（Ｋｍａｘ；総標的細胞数に正規化）をプロットした。ｍＲＮＡ量及び分子／細胞として計算したＥＣ５０を表２５に列挙する。ＴＣＲ ＥＣ５０は、ＣＥＡ表面抗原／細胞で与えられるが、実際の標的は、ＣＥＡ ｐＭＨＣである。ＩＣ５０については、異なる量のＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡを、共培養前に１２５ｎｇのＣＥＡ ｍＲＮＡとともに細胞に共トランスフェクトした。死滅を４８時間モニタリングした。Ｋｍａｘに正規化した死滅の減少を、Ａ＊０２ ｍＲＮＡ量に対してプロットした。ＣＥＡ Ｔｍｏｄを遮断するＨＬＡ－Ａ＊０２のＩＣ５０は、図２２の標準曲線を使用して、約６．８ｎｇのｍＲＮＡ及び約１００Ｋの分子／細胞である。標準曲線を使用して、ｍＲＮＡレベル（図１８を参照）を表面タンパク質分子に関連付け、結果を図１９に示す。これらの実験は、Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイにおいて測定したＥＣ５０及びＩＣ５０が、Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイから導出された同等の感受性パラメータに匹敵することを実証した。
図２１は、ＣＥＡ及びＡ＊０２抗原についての腫瘍及び正常発現値を有するグラフ上のＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体ＥＣ５０及びＩＣ５０を示す。図２１では、ＣＥＡ標準曲線のデータを、Ｂａｃａｃ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２２，３２８６－３２９７から再プロットした。ＥＣ５０及びＩＣ５０値を決定した。腫瘍の種類は、ＬＯＨによるＨＬＡ－Ａ＊０２（－）腫瘍の選択を考慮するために、ＨＬＡ－Ａ発現を０ＴＰＭに設定した。腫瘍データは、ＴＣＧＡデータベースからであり、正常組織データは、ＧＴＥｘデータベースからであった。
ほとんどの正常組織は、２つの受容体の組み合わせのＥＣ５０をはるかに下回るＣＥＡを発現する。例外は、結腸及び食道であり、これらは、図２１のＣＥＡ ＥＣ５０の上方の象限内にある。しかしながら、結腸及び食道を含む、全ての正常組織は、遮断因子受容体ＩＣ５０をはるかに上回るＨＬ－Ａ＊０２の発現レベルを有し、受容体の組み合わせを発現する免疫細胞によるＣＥＡ指向性死から安全であると考えられる。多くの固形腫瘍、特に結腸直腸、膵臓、及び肺は、ＥＣ５０を上回るＣＥＡレベルを発現する。これらの悪性組織は、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現の不在下（すなわち、ＬＯＨに対して選択された場合）、２つの受容体を発現する免疫細胞においてＣＥＡ ＣＡＲを活性化することが予想される。
様々な結腸がん細胞株を特徴付けて、正常結腸における抗原発現の天然レベルを表す株を同定した。結腸がん株Ｈ５０８及びＳＷ１４６３を選択した（表２６）。両方とも、ＨＬＡ－Ａ＊０２のためのヘテロ接合型であり、ＣＥＡを発現する。ＲＮＡ－Ｓｅｑデータセットの比較は、これらの株が、正常結腸におけるこれらの遺伝子の発現を反映するレベルでＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａを発現することを示した。標的関連対照として使用する標的細胞株を作製するために、ＨＬＡ－Ａ＊０２又はＣＥＡ発現のいずれかを欠くＨ５０８及びＳＷ１４６３の遺伝子ノックアウトバージョンを生成した（図２３）。図２３に示すように、遺伝子操作前のＨ５０８及びＳＷ１４６３株は、正常結腸組織と同様の抗原数及びＨＬＡ－Ａ＊０２：ＣＥＡ発現比を有する。試験のためのバリアントを作製するために、ＨＬＡ－Ａ＊０２欠損細胞の安定なプールを、ＣＲＩＳＰＲノックアウトから導出し、ＣＥＡ又はＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＡｂで染色した後、ここでフローサイトメトリーによって分析した。全ての細胞株は、初期通過バイアルの新鮮な解凍物由来であった。
内因性抗原発現を有するＨ５０８及びＳＷ１４６３結腸直腸がん株に対するＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ細胞（二重ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体系を発現する細胞）の選択的応答を、初代Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイにおいて確認した（図２４）。図２４では、バックグラウンド減算なしで生データをプロットした。バックグラウンド（三角形でのＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）細胞）を使用した時間経過も実施した。右側の凡例に示されるように、腫瘍及び正常な標的細胞は、遺伝子修飾を伴った、又は伴わない、Ｈ５０８及びＳＷ１４６３であった。２つの別個のベクター（１つは活性化因子受容体用、及び１つは遮断因子受容体用）を使用して、Ｂ２ＭをノックダウンするためのｓｈＲＮＡを用いずに、ドナーＴ細胞を形質導入した。全てのドナーは、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）であった。
図２４は、Ｔｍｏｄ二重受容体系が、Ｈ５０８標的細胞の選択的死滅をどのように可能にするかの例を示す。図２４において、３つのＮＣＩ－Ｈ５０８－ＲＦＰ標的細胞株を使用した。ＣＥＡ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）（正常、塗りつぶした円）、ＣＥＡ－ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）（正常、三角形）及びＣＥＡ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）（腫瘍、正方形）。細胞傷害性アッセイを、３：１のエフェクター対標的比で行った。形質導入Ｔ細胞共培養物中に存在するＲＦＰ又はＧＦＰシグナルの総ピクセル面積に基づいて、特異的死滅を決定し、非形質導入Ｔ細胞共培養対照に対するパーセントとして表した。
ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ発現細胞及びベンチマークＴＣＲの両方が、低いＥ：Ｔ比で同等の標的選択的細胞傷害性を示した（図２５）。図２５において、ＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）標的細胞のバックグラウンド死滅を、特異的死滅から差し引いた。機能的ＨＬＡ－Ａ＊０２遺伝子が存在しない場合、ＴＣＲは、Ｅ：Ｔ＝９：１であっても不活性であった。この比では、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ発現細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）標的細胞に対する選択性の低下を示した。Ｔｍｏｄ発現細胞とＴＣＲ発現細胞との間のこの差異は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナーには見られなかったので（図３２～図３４）、ドナーハプロタイプ及び／又はそれらのそれぞれの標的：ＴＣＲに対するｐＭＨＣ及びＣＥＡ ＣＡＲ構築物に対するＣＥＡ表面抗原の絶対抗原レベルにおける極端な差異に部分的に関連し得る。
ＴＣＲ発現細胞とは異なり、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ発現細胞は、遮断因子抗原の発現のみに基づいて、ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）腫瘍細胞を、ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）正常細胞から区別することができ、応答対Ｅ：Ｔ比で約７０倍のシフトを示した（図２６）。対照的に、ＴＣＲは、その臨床プロファイルと一致して、正常細胞に対して非選択的であった。
Figure 2023538115000134
表２５において、Ｈ５０８及びＳＷ１４６３は、天然ＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａ＊０２発現を伴う結腸直腸がん細胞株である。ＨｅＬａは、ＣＥＡ（－）及びＨＬＡ－Ａ＊０２（－）である子宮頸がん細胞株である。ＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａ＊０２を発現するようにＨｅＬａ細胞を遺伝子操作した。細胞を染色し、分子／細胞を上記のように計算した。ＴＰＭは、ＨＬＡ－Ａに対してである。ＭＦＩ、蛍光強度中央値；ＴＰＭ、１００万個当たりの転写産物；ＮＡ：該当なし；ＮＤ、未実施。
Figure 2023538115000135
遺伝子発現情報をＤｅｐＭａｐから得た。１４個の細胞株を市販の供給源から得た。ＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）及びＣＥＡ（－）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）アイソジェニック細胞株を、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を使用してＣＥＡ及び／又はＨＬ－Ａ＊０２のノックアウト（ＫＯ）によって生成し、Ａ＊０２を欠く細胞株において、細胞を、Ａ＊０２を発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。
実施例８：混合及び連続培養物における腫瘍識別及び可逆的活性化
より困難なインビトロ機能アッセイにおいて、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ二重受容体系（ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体）を発現する細胞の機能を試験するための一連の実験。最初に、２つの受容体を発現する細胞が、混合細胞培養物中の正常細胞から腫瘍を識別する能力を試験した。野生型Ｈ５０８細胞を、ＲＦＰで標識して正常細胞を模倣し、ＨＬＡ－Ａ＊０２ノックアウト（ＫＯ）アイソジェニック細胞をＧＦＰで標識し、腫瘍細胞を模倣するために使用した。着色されたタンパク質は、インビトロでの細胞生存のための便利な読み出しを提供した。２つの標識した細胞株を１：１の比で混合し、２つのＴｍｏｄ受容体を発現するエフェクターＴ細胞と共培養した。その後、標的細胞を顕微鏡によって可視化した。ＣＥＡ ＣＡＲのみを発現するＴ細胞は、腫瘍及び正常株の両方を完全に死滅させたが、ＣＥＡ ＣＡＲ及び抑制性受容体を発現するＴ細胞は、腫瘍細胞のみを死滅させた（図２７～図２８）。
次に、固形腫瘍細胞療法の別の特性である、可逆的活性化を媒介するＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ二重受容体の能力をアッセイした。ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ受容体を発現するエフェクターＴ細胞を、異種環境を通って移動する体内のＴ細胞の経験を模倣するために、異なる標的細胞の存在下、すなわち、腫瘍から正常に、又は正常から腫瘍に連続的に培養した。Ｔｍｏｄ二重受容体を発現するエフェクターＴ細胞は、両方向で活性化（ＯＮ）状態と遮断（ＯＦＦ）状態とを連続して切り替えることができた（図２９～図３０、図３５）。
最後に、２つの受容体を発現するエフェクターＴ細胞の感受性は、患者の血液中で検出された最高レベルであっても、外因性可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）によって影響されなかった（図３１）。１つのＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）ドナー（Ｄ１２３３３）からの代表的なデータを図３１に示し、４人のドナーからのＴ細胞を試験した。ｓＣＥＡは、より長い時点で、４人全てのドナーからのＴ細胞におけるＣＥＡ ＣＡＲを活性化した。ｓＣＥＡ（１０ｕｇ／ｍＬ）の存在は、複数のドナーにわたって両方のＴｍｏｄ受容体を発現するエフェクターＴ細胞の細胞傷害性に有意に影響しなかった。興味深いことに、ＣＥＡ ＣＡＲは、より長い時点でｓＣＥＡに反応するように見えた。細胞表面上に凝集したＣＥＡに由来する可能性のあるこの活性化は、両方のＴｍｏｄ受容体を発現する細胞において検出されなかった。
実施例９：ＣＥＡを発現しない細胞株に対するオフターゲット反応性
この１つを含む、全ての細胞治療薬についての１つの考慮事項は、オフターゲット反応性である。したがって、活性化因子及び遮断因子抗原発現から生じる標的特異的細胞選択性を超える機能的オフターゲット反応性を試験するプロセスが確立された。本明細書に記載の二重受容体系について、臨床的オンターゲット安全性（腫瘍対正常細胞）は、主に、活性化因子受容体によってではなく、その同種の遮断因子抗原の存在又は不在に応答する遮断因子受容体によって達成されることは注目に値する。遮断因子抗原、ＨＬＡ－Ａ＊０２を遍在的に発現する正常細胞は、細胞傷害性から保護され、オンターゲット、オフ腫瘍リのスクを低減する。この安全機構はまた、オフターゲット反応から患者を保護する。活性化因子受容体とオフターゲット分子との任意の潜在的な関与による活性化は、遮断因子受容体と関与するＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質の遍在的な存在によって阻害されることになる。
ヒト細胞株を、体内の正常組織についての代用として使用し、０．５超の転写産物／細胞のレベルで成人遺伝子発現の約９０％を表す多様な細胞株パネルを組み立てた（表２６）。トランスジェニック株及び遺伝子ノックアウト株の組み合わせを使用して、陽性対照及び陰性対照の両方を生成した。ＣＥＡ－であった標的細胞株のいずれも、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞においてバックグラウンドレベルを上回る有意な応答を誘発しなかった（ｈａｔは、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ受容体構築物を発現した（図３６）。ＣＯＬＯ ６６８細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞を発現するＣＥＡ ＣＡＲにおいて応答を刺激したが、両方の受容体を発現するＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ Ｊｕｒｋａｔ細胞においては応答を刺激しなかった。しかしながら、この応答は、初代Ｔ細胞において、ＣＡＲのみ、又は抑制性受容体と組み合わせたＣＡＲのいずれにおいても観察されなかった。これらの知見は、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ発現細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイに基づくオフターゲット機能活性の可能性が低いことを示唆する。
同じアプローチを使用して、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ受容体を発現する初代Ｔ細胞の細胞傷害性を試験した。ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ発現細胞が、ＣＥＡ ｍＲＮＡトランスフェクト陽性対照細胞株の約５０％を死滅させた時点を選択した（Ｋ５０；図３７～図３８）。図３７において、Ｔ細胞を、表２６に記載される細胞株パネルに対して試験した。１つのＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナーを、Ａ３７５及びＭＳ７５１細胞上で試験した。使用したＥ：Ｔ比は３：１であった。Ｔｍｏｄ二重受容体発現細胞が、腫瘍細胞上で５０％以上の死滅に達した時間（ｔＫ５０）を、ＣＥＡ ＣＡＲのみ、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ受容体、及び非形質導入Ｔ細胞の両方を発現するＴ細胞による死滅％を比較するために選択した。陰性対照として、ＣＥＡ（－）細胞株を、非形質導入Ｔ細胞と共培養した。標的として腫瘍細胞、すなわち、ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）標的細胞を用いた、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ二重受容体を発現するＴ細胞の平均５０％標的細胞死滅（Ｋ５０）は、非形質導入Ｔ細胞共培養物のバックグラウンド平均よりも約６倍高かった。
図３８において、全ての死滅（％）を、標的細胞のみ（Ｔ細胞なし）の増殖に対して正規化した。１つの細胞株（Ａ３７５）からの動態データの例を左に示す。細胞株を、１ｕｇのＣＥＡ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。全てのデータは、Ｅ：Ｔ ３：１実験からのものである。Ｔｍｏｄ細胞が、腫瘍細胞上で５０％以上の死滅に達した時間を、ＣＥＡ ＣＡＲ、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ及び非形質導入Ｔ細胞による死滅％を比較するために選択した。１２の異なる標的細胞株上の全てのドナー測定（３～４人のドナー）を、右のグラフのためにプールした。Ｋ５０の腫瘍標的細胞［ＣＥＡ（＋）Ａ＊０２（－）］を用いたＴｍｏｄ Ｔ細胞におけるダイナミックレンジ（陽性対照）の上限を、最も高いトランスフェクトＣＡＲ ｍＲＮＡレベルを使用して推定した。バックグラウンドは、ＣＥＡ（－）標的細胞を用いて非形質導入Ｔ細胞から推定した。Ｔｍｏｄ及びＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞からの個々の細胞株平均から、標的細胞（試験群）との交差反応性を推定した。
野生型ＣＥＡ（＋）Ｈ５０８は、ＣＥＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞からの強い応答を誘発した。ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ細胞及びＣＥＡ（－）標的細胞で有意なオフターゲット応答は検出されなかった。したがって、初代Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイでは、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ構築物によるオフターゲット活性化の証拠は得られなかった。特に、Ｊｕｒｋａｔ及び初代Ｔ細胞アッセイの両方は、Ｈ５０８細胞及び正常な結腸上皮の表面上に存在すると推定されるＣＥＡよりも少なくとも１，０００倍低い、１００未満の分子／細胞レベルで機能的標的相互作用を検出することができる。
実施例１０：マウスモデルにおける腫瘍特異的有効性
インビボ実験を使用して、マウス異種移植片におけるＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ二重受容体を発現するＴ細胞の機能を確認した（図３９）。ＣＥＡ ＣＡＲ、又は二重受容体系のいずれかをコードする単一のレンチウイルスベクターを使用して、Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡを用いずに、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナーからＴ細胞を形質導入した。ドナーＴ細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）（Ｄ４８０９）であった。ＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａ＊０２の正常な発現レベルを反映するために、細胞株Ｈ５０８を、異種移植片研究のために選択した。２つの用量レベルのＣＥＡ ＣＡＲ Ｔ又はＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ細胞（ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナー由来）を使用した：マウス当たり５Ｅ６及び２Ｅ７細胞。ＩＬ－２でＴ細胞産生をスケールアップした後、濃縮したレンチウイルス形質導入初代Ｔ細胞を、２つの種類のＨ５０８腫瘍を保有するマウスの尾静脈を介して、各脇腹に１つで注入した。１つは、ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）正常細胞から正常結腸上皮をモデル化するものであり、１つはＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）細胞から腫瘍をモデル化するものである。
５Ｅ６用量は、ＣＡＲ及びＴｍｏｄ構築物に対して小規模で一貫性のない効果を示した（図４２）。しかしながら、２Ｅ７用量は、劇的な差異を示した（図４０～図４１）。図４０において、７匹のマウス／群を使用した（５匹が生理食塩水及びＵＴＤ、又は非形質導入群であったことを除く）。異種移植片は、ホタルルシフェラーゼを発現するように操作されたＨ５０８結腸がん細胞株由来であった。マウスに、尾静脈注射を介して、マウス当たり２Ｅ７のヒトＴ細胞の用量で、ＣＥＡ ＣＡＲ又はＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ二重受容体発現細胞を注射した。図４０のデータ点は、コホート内の個々のマウスが、大きな腫瘍体積（合計体積２０００ｍｍ３超）を有した時点までの各コホートについて示される。込み合いを避けるために、一部の曲線には一方向エラーバーが使用される。エラーバーは、平均の標準誤差である。Ｔｍｏｄ二重受容体を発現するＴ細胞を注射したコホート内の全てのマウスは、更に約２０日間にわたって腫瘍増殖を示さず、治癒効果を示唆した。ＣＡＲ／正常移植片コホートにおける１匹のマウスが免れて成長し、平均が増加する原因となった。
個々の腫瘍データについての図４２～図４３。図４３に見られるように、１つのＣＡＲ－Ｔ処置動物において、腫瘍は応答したが、その後、増殖を再開した。これは、Ｔ細胞注入時のその動物におけるより大きな腫瘍体積に起因する可能性がある。正常な移植片は、腫瘍移植片よりも平均してわずかに大きく、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍を完全に根絶しなかった。ＣＥＡ ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体（Ｔｍｏｄ細胞）と組み合わせてＣＥＡ ＣＡＲを発現する細胞で処置した両方の動物は、ＣＤ３＋Ｔ細胞の減少を示した。しかしながら、Ｔｍｏｄ細胞で処置した動物は、より早い時点でＣＤ３＋Ｔ細胞のレベルを減少させ始めた。Ｔｍｏｄ二重受容体を発現するＴ細胞を注射したコホートにおけるアッセイの終わりでのＴ細胞カウントの減少は、一方の脇腹上の腫瘍の完全な除去及び他方の脇腹上の移植片による抗原の効果的な遮断に起因し、有効な活性化因子シグナル伝達の停止をもたらす可能性が高い。
ＣＥＡ ＣＡＲのみを発現する細胞が、腫瘍及び正常な移植片の両方を死滅させたのに対して、Ｔｍｏｄ操作Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）腫瘍のみを死滅させた。生理食塩水処置対照と同様に、マウスにおいて正常なＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）Ｈ５０８細胞が増殖した。腫瘍サイズのキャリパー測定は、生物発光によって確認され、腫瘍を保有していたＴｍｏｄ処置マウスの脇腹にはシグナルは検出されなかった（図４０～図４１）。原因不明のため、右脇腹上の異種移植片は、左脇腹上の腫瘍よりも平均してわずかに大きかった。これにより、ＣＥＡ ＣＡＲを発現するＴ細胞、及びＴｍｏｄ二重受容体を発現するＴ細胞によって処置された腫瘍及び正常なＨ５０８細胞の間に、わずかに明らかな有効性の差異が生じた。ＣＡＲ及びＴｍｏｄ処置マウスは、左脇腹上に非常に類似した活性を示した。Ｔｍｏｄ Ｔ細胞処置コホートは、腫瘍を含まないように見えたが、ＣＡＲ－Ｔコホートは、正常な移植片を保有する右脇腹上に残存する平均腫瘍体積を有し、これには、最初に応答し、次いで増殖を再開した１つのエスケーパーが含まれた（図４３～図４４）。Ｔｍｏｄ Ｔｃｅｌｌ注射コホートにおける１つの腫瘍は、コホートにおける他の腫瘍と同様に除去される前にほぼ１ｃｃであった。これらの結果は、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ Ｔ細胞が、インビボにおいて、インビトロと同じ強力な、腫瘍選択的様式で機能することを示唆する。
注入したＴ細胞の血球数を含む、様々な他のパラメータも測定した。注入の２日後、全てのコホート由来のＴ細胞は、それらが生存し、血液中に残留した場合に予想される濃度の１／１０，０００レベルで存在した（図４０）。しかしながら、ＣＥＡ ＣＡＲ及びＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ Ｔ細胞で処置したコホートにおいて、Ｔ細胞計数は、経時的に増加した。最終的に、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ Ｔ細胞は、腫瘍除去と、並行して減少した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原刺激を提供するために残留ＣＥＡ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）移植片細胞が存在したために、より長く残ったと推定される。注入後３０日までに、それらはベースラインまで低下した。Ｔｍｏｄ Ｔ細胞コホートにおいて、異種移植片は、マウスの右脇腹上で増殖し続けたが、これらは、ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子抗原を発現し、Ｔｍｏｄ細胞の活性化因子－抗原刺激を効果的に防止した。マウスの細胞、組織、及び臓器について、他のいくつかの分析を行った（図４５）。図４５は、大多数のマウスが、ＣＤ８カウントよりも高いＣＤ４カウントを有していたことを示す。ＣＤ３（＋）ヒトＴ細胞の存在は、ＣＥＡ Ｔｍｏｄ群の２匹のマウスの脾臓において、Ｔ細胞注射の３０日後に観察された。マウスは概して健康であり、生理食塩水及び対照非形質導入Ｔ細胞群の体重と同様の体重を維持した。
実施例１１：ＨＬＡ－Ａ＊０２シス結合及び自己治療
ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子受容体は、原則として、自己Ｔ細胞における内因性Ａ＊０２によってシスで影響を受ける可能性があった（図４６）。したがって、親Ｊｕｒｋａｔ細胞における応答を、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ株と比較した。遮断因子受容体表面発現レベルに見られた少しの差異が、野生型ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）親株と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）トランスジェニックＪｕｒｋａｔ株の間で検出された（図５０）。遮断因子のＩＣ５０は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）及びＨＬＡ－Ａ＊０２（－）Ｊｕｒｋａｔ細胞においても同様であった。
しかしながら、結果は、初代Ｔ細胞において異なっていた。ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）ドナー由来のＴ細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナーと比較して、それらの表面上でより少ない遮断因子受容体を発現した（図４７）。この差異に対処するために、Ｂ２Ｍを標的とするｓｈＲＮＡモジュールが開発された。Ｂ２Ｍは、ＨＬＡクラスＩ分子の共通の軽鎖であり、細胞表面上のそれらの発現に必要とされる。ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ受容体で形質導入されたＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）及びＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナー細胞の間のＨＬＡ－Ａ＊０２四量体結合の差異は実質的に減少し、結合レベルは、ＣＲＩＳＰＲ処置Ｔ細胞で見られるものに近かった（図４７及び図５１）。図４７に見られるように、Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡは、プローブ結合を部分的に回復させた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＢ２Ｍノックアウトは、同様に、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）細胞に見られるものと同じレベルにプローブ結合を回復させた。ｐａｎ ＨＬＡ－Ｉ ｍＡｂ Ｗ６／３２によってＨＬＡクラスＩを検出し、遮断因子受容体の発現を、Ａ＊０２四量体によって検出した。図４７の個々のドットは、異なるドナーを表す。合計８人のドナーを使用した：６人のドナーは、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）であり、２人のドナーは、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）であった。全てを３連で試験し、平均を単一のドットとしてプロットした。Ｔｍｏｄ＿Ａ２ ｎｅｇと標識された群は、３つの条件／構築物を有する２人のＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナーからのデータをそのすぐ左側に含む（Ｔｍｏｄのみ、Ｔｍｏｄ＋ＣＲＩＳＰＲ、Ｔｍｏｄ＋ｓｈＲＮＡを一緒にプロットした）。この実験からの１つのＴ細胞集団が死滅し、ここで、及び図４８において除外された。
３人のドナーからのＴ細胞におけるＢ２Ｍのレベルを以下の表２７に示す。非形質導入Ｔ細胞及びＴｍｏｄ形質導入Ｔ細胞（Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡを含む）の３人のドナーからの全ＲＮＡを抽出し、相補ＤＮＡに逆転写した。非形質導入Ｔ細胞及びＡ２Ｂ５３０におけるＢ２Ｍ発現レベルを評価するために、ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応の反応を設定した。Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ発現レベルを、ベータアクチン遺伝子発現に正規化した。
Figure 2023538115000136
Ｈ５０８標的細胞を使用した細胞傷害性アッセイにおいて、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ構築物は、Ａ＊０２（－）ドナー（ｎ＝２）と同様に、Ａ＊０２（＋）ドナー（ｎ＝６）において効果的に死滅させ、遮断した（図４８）。これらのデータは、サイトカイン放出と相関していた（図４９及び図５２）。したがって、Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡモジュールを含有するＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ構築物は、腫瘍がＨＬＡ－Ａ ＬＯＨを含有するＡ＊０２ヘテロ接合型固形腫瘍患者のサブセットについての自己Ｔ細胞療法として好適であり得る。
図４８において、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）ドナーにおけるＢ２Ｍ ｓｈＲＮＡモジュールを有するＴｍｏｄの機能は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナーにおけるその機能と区別できない。正常は、天然ＣＥＡ及びＨＬＡ－Ａ＊０２発現を有するＨ５０８標的細胞を示し、一方、腫瘍は、ＨＬＡ－Ａ＊０２が欠失したＨ５０８標的細胞を示す。アッセイを、３：１のＥ：Ｔで４８時間後に実施した。右側のグラフには、左側のグラフの破線ボックスから再プロットされた正常標的細胞データのみが含まれる。
図４９において、ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ発現細胞からのサイトカイン発現を、ＣＥＡ ＣＡＲ発現細胞及びベンチマークＴＣＲを発現する細胞と比較した。ドナーＤ１２３３３３及びＤ２０５５８６は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）であったが、ドナーＤ４８０９は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）であった。このデータセットには、Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡを有する、及び有しない、ＣＥＡ Ｔｍｏｄ受容体の試験が含まれた。ＩＦＮ－ｇアッセイは、１０Ｋ ｐｇ／ｍＬで飽和した。
追加のサイトカインを図５２に示す。ＣＥＡ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ受容体を発現する細胞を、ＣＥＡ ＣＡＲ発現細胞及びベンチマークＴＣＲを発現する細胞と比較した。ドナー１及び２は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）であり、ドナー３は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）であった。データには、Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡを有しないＣＥＡ Ｔｍｏｄ受容体の試験が含まれる。

Claims (99)

  1. 免疫細胞であって、
    ａ．ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡ）に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体と、
    ｂ．ＣＥＡ＋がん細胞において喪失した非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体と、を含み、
    前記第１の受容体が、ＣＥＡに応答する活性化因子受容体であり、前記第２の受容体が、前記非標的抗原に応答する抑制性受容体である、免疫細胞。
  2. 前記非標的抗原の発現が、前記ＣＥＡ＋がん細胞において喪失している、請求項１に記載の免疫細胞。
  3. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質の対立遺伝子バリアントに特異的に結合する、請求項１又は２に記載の免疫細胞。
  4. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃタンパク質の対立遺伝子バリアントに特異的に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  5. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７に特異的に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  6. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、ＨＬＡ－Ａ＊０２に特異的に結合する、請求項５に記載の免疫細胞。
  7. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、表６に開示されるような相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６の前記ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  8. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号１０３～１０８若しくは配列番号１０９～１１４の相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は配列番号１０３～１０８若しくは配列番号１０９～１１４の前記ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  9. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、表５に開示されるポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  10. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号９１～１０２のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  11. 前記第１の受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  12. 前記第１の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号５５～５８からなる群から選択される重鎖相補性決定領域（ＨＣ－ＣＤＲ）のセットを含む重鎖可変（ＶＨ）部分、及び配列番号５９～６３からなる群から選択される軽鎖相補性決定領域のセットを含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又は配列番号５５～５８若しくは配列番号５９～６３と比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  13. 前記第１の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号５５～５７を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣ－ＣＤＲ）のセットを含む重鎖可変（ＶＨ）部分、並びに配列番号５９、６１、及び６３を含む軽鎖相補性決定領域のセットを含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又は配列番号５５～５７若しくは配列番号５９、６１、及び６３と比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  14. 前記第１の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号１４４を含む重鎖可変（ＶＨ）部分、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列、及び配列番号１４８を含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又はそれと８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  15. 前記第１の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号６６～７０からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  16. 前記第１の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号６８のｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  17. 前記第１の受容体が、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  18. 前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αヒンジドメインを含む、請求項１７に記載の免疫細胞。
  19. 前記ＣＤ８αヒンジドメインが、配列番号７１の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１８に記載の免疫細胞。
  20. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項１１～１９のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  21. 前記ＣＤ２８膜貫通ドメインが、配列番号７５の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項２０に記載の免疫細胞。
  22. 前記細胞内ドメインが、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ活性化ドメインを含む、請求項１１～２１０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  23. 前記細胞内ドメインが、配列番号１５８の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項２２に記載の免疫細胞。
  24. 前記第１の受容体が、配列番号５２の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  25. 前記第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  26. 前記ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインが、配列番号１３１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む、請求項２５に記載の免疫細胞。
  27. 前記第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  28. 前記ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントが、配列番号１３５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む、請求項２７に記載の免疫細胞。
  29. 前記第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的バリアントを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  30. 前記ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインが、配列番号１３４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む、請求項２９に記載の免疫細胞。
  31. 前記第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、それらのうちのいずれかの機能的バリアント、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  32. 前記ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及びＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインが、配列番号１３２、又は配列番号１３２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、若しくはそれと同一である配列を含む、請求項３１に記載の免疫細胞。
  33. 前記第２の受容体が、配列番号１６４の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  34. 前記ＣＥＡ＋がん細胞が、膵臓がん細胞、結腸直腸がん細胞、肺がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、頭頸部がん細胞、胆嚢がん細胞、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん細胞、又は急性骨髄性白血病がん細胞である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  35. 前記ＣＥＡ＋がん細胞が、肺がん細胞、結腸直腸がん細胞、又は膵臓がん細胞である、請求項３４に記載の免疫細胞。
  36. 前記ＣＥＡ＋がん細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現しないＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  37. 前記ＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２の喪失をもたらす、ＨＬＡ－Ａにおけるヘテロ接合性の喪失によってＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋細胞から派生する、請求項３６に記載の免疫細胞。
  38. 前記第１の受容体及び前記第２の受容体がともに、ヘテロ接合性の喪失を有する前記ＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞の存在下で前記免疫細胞を特異的に活性化する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  39. 前記第１の受容体及び前記第２の受容体がともに、ヘテロ接合性の喪失によってＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失していないＣＥＡ＋細胞の存在下で前記免疫細胞を特異的に活性化しない、請求項１～３８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  40. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージである、請求項１～３９のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  41. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である、請求項４０に記載の免疫細胞。
  42. ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現及び／又は機能が、低下又は除去されている、請求項１～４１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  43. 前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子が、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）である、請求項４２に記載の免疫細胞。
  44. 干渉ＲＮＡを含むポリヌクレオチドを更に含み、前記干渉ＲＮＡが、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む、請求項４３に記載の免疫細胞。
  45. 前記干渉ＲＮＡが、表１１に記載の配列の群から選択される配列、又はそれと比較して最大で１、２、３、若しくは４個の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む、請求項４４に記載の免疫細胞。
  46. 前記干渉ＲＮＡが、前記Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる、請求項４４又は４５に記載の免疫細胞。
  47. 前記干渉ＲＮＡが、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項４６に記載の免疫細胞。
  48. 前記ｓｈＲＮＡが、
    ａ．前記Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第１の配列と、
    ｂ．前記第１の配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第２の配列と、を含み、
    前記第１の配列及び前記第２の配列が、前記ｓｈＲＮＡを形成する、請求項４７に記載の免疫細胞。
  49. 前記ｓｈＲＮＡが、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号１７９）若しくはＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号１８０）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、配列によってコードされる、請求項４７又は４８に記載の免疫細胞。
  50. Ｂ２Ｍをコードする配列に対する１つ以上の修飾を含み、前記１つ以上の修飾が、Ｂ２Ｍの発現を低下させ、かつ／又は機能を除去する、請求項４３に記載の免疫細胞。
  51. 前記１つ以上の修飾が、Ｂ２Ｍをコードする内因性遺伝子の１つ以上の不活性化変異を含む、請求項５０に記載の免疫細胞。
  52. 前記１つ以上の不活性化変異が、欠失、挿入、置換、又はフレームシフト変異を含む、請求項５１に記載の免疫細胞。
  53. 前記１つ以上の不活性化変異が、Ｂ２Ｍをコードする前記内因性遺伝子の配列を特異的に標的とする少なくとも１つのガイド核酸（ｇＮＡ）との複合体において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼとともに導入される、請求項５１又は５２に記載の免疫細胞。
  54. 前記ｇＮＡが、表１０に記載の配列の群から選択される配列、又はそれと比較して最大で１、２、３、若しくは４個の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む、請求項５３に記載の免疫細胞。
  55. 前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ＊０２である、請求項４２に記載の免疫細胞。
  56. ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む、干渉ＲＮＡを含むポリヌクレオチドを更に含む、請求項５５に記載の免疫細胞。
  57. 前記干渉ＲＮＡが、前記ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介性分解を誘導することができる、請求項５６に記載の免疫細胞。
  58. 前記干渉ＲＮＡが、
    ａ．前記ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第１の配列と、
    ｂ．前記第１の配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第２の配列と、を含む、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、
    前記第１の配列及び前記第２の配列が、前記ｓｈＲＮＡを形成する、請求項５７に記載の免疫細胞。
  59. ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする内因性遺伝子の配列に対する１つ以上の修飾を含み、前記１つ又は修飾が、ＨＬＡ－Ａ＊０２の発現を低下させ、かつ／又は機能を除去する、請求項５５に記載の免疫細胞。
  60. 前記１つ以上の修飾が、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする前記内因性遺伝子の１つ以上の不活性化変異を含む、請求項５９に記載の免疫細胞。
  61. 前記１つ以上の不活性化変異が、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする前記内因性遺伝子の配列を特異的に標的とする少なくとも１つのガイド核酸（ｇＮＡ）との複合体において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼとともに導入される、請求項５９又は６０に記載の免疫細胞。
  62. 前記第１の受容体が、配列番号５２の配列を含み、前記第２の受容体が、配列番号１６４の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  63. ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号１７９）を含む配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列によってコードされるｓｈＲＮＡを含む、請求項６２に記載の免疫細胞。
  64. 前記第１の受容体及び第２の受容体が、単一のポリヌクレオチドによってコードされ、前記第１及び第２の受容体をコードする配列が、自己切断ポリペプチドをコードする配列によって分離される、請求項６２又は６３に記載の免疫細胞。
  65. 前記自己切断ポリペプチドが、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８１）の配列を含むＴ２Ａ自己切断ポリペプチドを含む、請求項６３に記載の免疫細胞。
  66. 前記免疫細胞が、自己由来である、請求項１～６５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  67. 前記免疫細胞が、同種異系である、請求項１～６５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  68. 治療有効量の請求項１～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞を含む、医薬組成物。
  69. 薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む、請求項６８に記載の医薬組成物。
  70. ＣＥＡ＋がんの治療において医薬として使用するための、請求項６８又は６９に記載の医薬組成物。
  71. ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系であって、
    ａ．ＣＥＡ細胞接着分子５陽性（ＣＥＡ）に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体と、
    ｂ．前記ＣＥＡ＋がん細胞において喪失している非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体と、をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含み、
    前記第１の受容体が、前記ＣＥＡ＋がん細胞上のＣＥＡに応答する活性化因子受容体であり、前記第２の受容体が、前記非標的抗原に応答する抑制性受容体である、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系。
  72. ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系であって、請求項１～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞の生成に使用するための、前記第１の受容体及び前記第２の受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系。
  73. Ｂ２Ｍに特異的なｓｈＲＮＡをコードする配列を含む、請求項７１又は７２に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系。
  74. 前記第１の受容体、前記第２の受容体、及びＢ２Ｍに特異的な前記ｓｈＲＮＡをコードする配列が、同じポリヌクレオチドによってコードされる、請求項７３に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系。
  75. ａ．Ｂ２Ｍに特異的な前記ｓｈＲＮＡをコードする配列が、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号１７９）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、
    ｂ．前記第１の受容体をコードする配列が、配列番号１４３、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、
    ｃ．前記第２の受容体をコードする配列が、配列番号１６５、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項７３又は７４に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系。
  76. 請求項７１～７５のいずれか一項に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  77. ＭＨＣクラスＩ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を有するＣＥＡ＋がん細胞を死滅させる方法であって、有効量の請求項１～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞又は請求項６８～７０のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
  78. ＭＨＣクラスＩ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を有するＣＥＡ＋腫瘍を有する対象においてＣＥＡ＋がんを治療する方法であって、有効量の請求項１～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞又は請求項６８～７０のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  79. 対象においてがんを治療する方法であって、
    ａ．前記対象の正常細胞及び複数のがん細胞のＨＬＡ－Ａ遺伝子型又は発現を決定することと、
    ｂ．任意選択で、前記対象の複数のがん細胞におけるＣＥＡの発現を決定することと、
    ｃ．前記正常細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現し、前記複数のがん細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現せず、前記複数のがん細胞が、ＣＥＡ陽性である場合、有効量の請求項１～６５のいずれか一項に記載の免疫細胞、又は請求項６６～６８のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することと、を含む、方法。
  80. 前記対象が、ＣＥＡ（ＣＥＡ＋）を発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した悪性腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２患者である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記対象が、ＣＥＡを発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した再発性切除不能又は転移性固形腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２患者である、請求項７９に記載の方法。
  82. 前記がんが、膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、食道がん、胃がん、胆嚢がん、頭頸部がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん、又は急性骨髄性白血病を含む、請求項７９～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記がんが、肺がん、結腸直腸がん、又は膵臓がんを含む、請求項７９～８１のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記がん細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現しないＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞を含む、請求項７９～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記ＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２の喪失をもたらす、ＨＬＡ－Ａにおけるヘテロ接合性の喪失によってＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋細胞から派生する、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記第１の受容体及び前記第２の受容体がともに、前記ＣＥＡ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞の存在下で前記免疫細胞を特異的に活性化する、請求項７９～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記第１の受容体及び前記第２の受容体がともに、ＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失していないＣＥＡ＋細胞の存在下で前記免疫細胞を特異的に活性化しない、請求項７９～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 請求項１～５８のいずれか一項に記載の免疫細胞、又は請求項５９～６１のいずれか一項に記載の医薬組成物の投与が、前記対象における腫瘍のサイズを減少させる、請求項７９～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記腫瘍が、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％減少する、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記腫瘍が、除去される、請求項８８に記載の方法。
  91. 前記免疫細胞又は前記医薬組成物の投与が、前記対象における腫瘍の増殖を阻止する、請求項８８又は８９に記載の方法。
  92. 前記免疫細胞又は前記医薬組成物の投与が、前記対象における腫瘍の数を減少させる、請求項７９～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記免疫細胞又は前記医薬組成物の投与が、前記対象におけるがん細胞の選択的死滅をもたらすが、正常細胞の死滅をもたらさない、請求項７９～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 死滅した前記細胞の少なくとも約６０％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約６５％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約７０％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約７５％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約８０％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約８５％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約９０％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約９５％が、がん細胞であるか、又は死滅した前記細胞の約１００％が、がん細胞である、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記免疫細胞又は医薬組成物の投与が、前記対象の前記がん細胞の少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は全ての前記死滅をもたらす、請求項９３に記載の方法。
  96. 前記免疫細胞又は前記医薬組成物の投与が、第１の活性化因子受容体を含むが、第２の抑制性受容体を含まない他の等価の免疫細胞の投与よりも、前記対象に対して少ない副作用をもたらす、請求項７９～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 複数の免疫細胞を作製する方法であって、
    ａ．複数の免疫細胞を提供することと、
    ｂ．請求項７１～７５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド系、又は請求項７６に記載のベクターで前記複数の免疫細胞を形質転換することと、を含む、方法。
  98. 請求項１～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞、又は請求項６８～７０８のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、キット。
  99. 使用説明書を更に含む、請求項９８に記載のキット。
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