CN110520524A - 靶向肿瘤微环境的嵌合抗原受体t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗癌症的方法和组合物，该癌症治疗可以有利地通过靶向肿瘤微环境来实现。

Description

靶向肿瘤微环境的嵌合抗原受体T细胞
技术领域
本文所述的技术涉及免疫疗法。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)提供了一种将细胞毒性T细胞应答指向表达所选靶抗原(最常见的是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原)的靶细胞的方法。CAR是对T细胞受体的适应，其中抗原结合结构域被特异性结合衍生的靶抗原的抗体的抗原结合结构域替代。通过在T细胞(“CAR T细胞”或“CAR-T”)上表达的CAR使靶抗原接合在靶细胞表面上促进杀死靶细胞。
发明内容
本发明提供了包括异源核酸分子的嵌合抗原受体(CAR)T细胞，其中该异源核酸分子包括：(a)编码CAR的第一多核苷酸，该第一多核苷酸包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(b)编码治疗剂的第二多核苷酸。任选地，该第一和第二多核苷酸包括在单个多核苷酸分子内。此外，在一些实施例中，CAR进一步包括一个或多个共刺激结构域(例如4-1BB；也参见下文)。
在各种实施例中，治疗剂是或包括抗体试剂(例如单链抗体、单结构域抗体(如骆驼科动物抗体)或双特异性抗体试剂(如双特异性T细胞接合子(BiTE))；也参见下文)。在其他实施例中，治疗剂是或包括细胞因子。
在各种实施例中，CAR和治疗剂以多蛋白的形式产生(并且因此可以在单个核酸分子中被编码)，该多蛋白被裂解以生成单独的CAR和治疗剂分子。在一些实施例中，该多蛋白包括在CAR与治疗剂之间的可裂解部分(例如2A肽，如P2A或T2A；也参见下文)。在一些实施例中，CAR和治疗剂各自组成性表达。在一些实施例中，CAR和治疗剂的表达受延伸因子-1α(EF1α)启动子驱动。在一些实施例中，治疗剂在诱导型启动子(例如，NFAT启动子)的控制下表达，该诱导型启动子任选地可被T细胞受体或CAR信号传导诱导。在一些实施例中，CAR在组成型启动子的控制下表达并且治疗剂在诱导型启动子(例如，NFAT启动子)的控制下表达，该诱导型启动子任选地可被T细胞受体或CAR信号传导诱导。
在各种实施例中，CAR的抗原结合结构域是或包括抗体、单链抗体、单结构域抗体(例如骆驼科动物抗体)或配体。
在各种实施例中，CAR的跨膜结构域包括CD8铰链/跨膜结构域，该CD8铰链/跨膜结构域任选地包括SEQ ID NO:4、10、16、22、28、37、46、58和66中任一项的序列，或其变体。
在各种实施例中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ细胞内信号传导结构域，该CD3ζ细胞内信号传导结构域任选地包括SEQ ID NO:6、12、18、24、30、39、48、60和68中任一项的序列，或其变体，或者由SEQ ID NO:6、12、18、24、30、39、48、60和68中任一项的序列，或其变体组成。
在各种实施例中，包括4-1BB共刺激结构域，该4-1BB共刺激结构域任选地包括SEQID NO:5、11、17、23、29、38、47、59和67中任一项的序列，或其变体，或者由SEQ ID NO:5、11、17、23、29、38、47、59和67中任一项的序列，或其变体组成。
在各种实施例中，当治疗剂是或包括抗体试剂时，CAR抗原结合结构域或治疗剂与肿瘤相关抗原结合(例如参见下文)。在各种实施例中，与CAR抗原结合结构域或治疗剂结合的肿瘤相关抗原是实体肿瘤相关抗原。在各种实施例中，与CAR抗原结合结构域或治疗剂结合的肿瘤相关抗原包括表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、EGFR、CD19、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或IL-13受体α2(IL-13Rα2)，并且任选地，CAR抗原结合结构域或治疗剂包括选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:21、27、33、36、42、45、51、55、57、63、65，及其变体。
在各种实施例中，当治疗剂是或包括抗体试剂时，CAR抗原结合结构域或治疗剂与Treg相关抗原结合。在各种实施例中，与CAR抗原结合结构域或治疗剂结合的Treg相关抗原选自下组，该组由以下组成：糖蛋白A主导重复序列(GARP)、潜在相关肽(LAP)、CD25和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)，并且任选地，CAR抗原结合结构域或治疗剂包括选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:3、9、15、25，及其变体。
本发明进一步提供了包括编码CAR的多核苷酸的CAR T细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域(例如CD8铰链/TM；参见例如下面的其他实例)和细胞内信号传导结构域(例如CD3z；如参见以下的其他实例)；并且该抗原结合结构域与Treg相关抗原结合。在各种实施例中，Treg相关抗原选自下组，该组由以下组成：GARP、LAP、CD25和CTLA-4。在各种实施例中，CAR进一步包括一个或多个共刺激结构域(例如4-1BB；关于其他实例，如参见下文)。在各种实例中，CAR的抗原结合结构域包括scFv或单结构域抗体，该scFv或单结构域抗体任选地包括选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:3、9、15、25，及其变体。
本发明进一步提供了包括编码氨基酸序列的异源核酸分子的CAR T细胞，该氨基酸序列与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:61、SEQID NO:19、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:13中的任一项的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或100％)序列同一性。
此外，本发明提供了编码如本文所述的(i)CAR多肽或(ii)包括CAR多肽和治疗剂的多蛋白的核酸分子。
本发明另外提供了如本文所述的(i)CAR多肽或(ii)包括CAR多肽和治疗剂的多蛋白。
本发明另外提供了药物组合物，其包括一种或多种如本文所述的CAR T细胞、核酸分子、CAR多肽或多蛋白。
本发明还包括治疗受试者的方法，该受试者包括患有疾病或病症(例如癌症(如成胶质细胞瘤)；也参见下文)的患者(例如人类患者)。这些方法包括向受试者施用包括一种或多种本文所述的CAR T细胞或药物组合物的药物组合物。在各种实施例中，这些方法针对肿瘤微环境，从而例如降低全身毒性。在各种实施例中，该癌症的特征在于存在一种或多种实体肿瘤。在各种实施例中，该癌症的特征在于肿瘤浸润性Treg。
本发明进一步提供了治疗患有癌症的受试者(例如患者，如人类患者)的方法。该方法包括向受试者施用经基因修饰以分泌肿瘤毒性抗体或细胞因子的CAR T细胞产物，其中通过将癌症毒性局部地指向肿瘤微环境来降低全身毒性。在各种实施例中，CAR T细胞经基因修饰以递送针对CTLA4、CD25、GARP、LAP、IL15、CSF1R或EGFR的抗体，或者针对肿瘤微环境的双特异性抗体(针对例如EGFR和CD3)。
本发明另外提供了将一种或多种治疗剂递送至患者的组织或器官以治疗疾病或病状的方法。该方法包括向患者施用经基因修饰以分泌治疗性抗体、毒素或药剂的CAR T细胞，其中该治疗性抗体、毒素或药剂本身将无法进入或渗透组织或器官。在各种实施例中，该组织或器官位于神经系统。在各种实施例中，该神经系统是中枢神经系统(例如大脑)。在各种实施例中，该疾病或病状是成胶质细胞瘤。在各种实施例中，该治疗性抗体是抗EGFR(抗表皮生长因子受体)或抗EGFRvIII。
本发明还包括CAR T细胞、多肽、核酸分子、药物组合物以及其他组合物和分子在预防或治疗本文所述的疾病或病症中的用途，或者在制备针对本文所述的疾病或病症的药物中的用途。
定义
为方便起见，下文提供说明书、实例和所附权利要求书中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或上下文中隐含的，否则以下术语和短语包括以下提供的含义。提供这些定义是为了帮助描述特定实施例，并且不旨在限制所要求保护的技术，因为本技术的范围仅由权利要求限制。除非另外定义，否则所有在此使用的技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。若本领域术语的使用与本文提供的定义之间存在明显差异，则以本说明书中提供的定义为准。
免疫学和分子生物学中常见术语的定义可以在The Merck Manual of Diagnosisand Therapy[默克诊断和疗法手册],第19版,Merck Sharp&Dohme Corp.[默沙东公司]出版,2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编),The Encyclopedia ofMolecular Cell Biology and Molecular Medicine[分子细胞生物学和分子医学百科全书],Blackwell Science Ltd.[布莱克威尔科学有限公司]出版,1999-2012(ISBN9783527600908)；及Robert A.Meyers(编),Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference[分子生物学和生物技术：全面的案头参考],VCHPublishers,Inc.[VCH出版社有限公司]出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)；WernerLuttmann,Immunology[免疫学],Elsevier[爱思唯尔]出版,2006；Janeway’sImmunobiology[免疫生物学],Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编),Taylor&Francis Limited(泰勒与弗朗西斯有限公司),2014(ISBN 0815345305,9780815345305)；Lewin,Genes XI[基因XI],Jones&Bartlett Publishers[琼斯和巴特利特出版社]出版,2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green和Joseph Sambrook,MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第4版,Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约州,美国(2012)(ISBN1936113414)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology[分子生物学的基本方法],Elsevier Science Publishing,Inc.[爱思唯尔科学出版有限公司],纽约,美国(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA[酶学的实验室方法：DNA],Jon Lorsch(编),Elsevier(爱思唯尔),2013(ISBN 0124199542)；CurrentProtocols in Molecular Biology(CPMB)[分子生物学实验指南(CPMB)],FrederickM.Ausubel(编),John Wiley and Sons[约翰·威利父子出版公司],2014(ISBN047150338X,9780471503385)，Current Protocols in Protein Science(CPPS)[蛋白质科学实验指南(CPPS)],John E.Coligan(编),John Wiley and Sons,Inc.[约翰·威利父子出版公司],2005；及Current Protocols in Immunology(CPI)[免疫学实验指南(CPI)](John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,WarrenStrobe,(编)John Wiley and Sons,Inc.[约翰·威利父子出版公司],2003(ISBN0471142735,9780471142737)中找到，各参考文献的内容通过引用以其全文并入本文。
术语“降低(decrease)”、“减少(reduced/reduction)”或“抑制(inhibit)”在本文中均用于表示降低统计学上显著的量。在一些实施例中，“减少(reduce/reduction)”或“降低(decrease)”或“抑制(inhibit)”典型地意指与参考水平(例如，不存在给定的治疗或药剂)相比降低至少10％并且可以包括，例如，降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“减少(reduction)”或“抑制(inhibition)”不包括与参考水平相比完全抑制或减少。“完全抑制”是与参考水平相比100％抑制。在适用的情况下，降低可以优选地降至未患给定障碍的个体的正常范围内而被接受的水平。
术语“增加(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”在本文中均用于表示增加统计学上显著的量。在一些实施例中，术语“增加的(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”可意指与参考水平相比增加至少10％，例如，增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达且包括100％的增加，或者与参考水平相比10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加，或2倍与10倍之间或更多的任何增加。在标记物或症状的背景下，“增加(increase)”是这种水平的统计学上的显著增加。
如本文所用，“受试者”意指人或动物。通常该动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物包括，例如黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括，例如小鼠、大鼠、土拨鼠、白鼬、兔子和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括，例如牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物(例如家猫)、犬科动物(例如狗)、狐狸、狼，鸟类(例如鸡、鸸、鸵鸟)以及鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施例中，该受试者是哺乳动物，例如灵长类动物(例如人)。本文中术语“个体”、“患者”和“受试者”可互换使用。
优选地，该受试者是哺乳动物。该哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病(例如癌症)的动物模型的受试者。受试者可以是雄性或雌性。
受试者可以是如下的受试者，其先前被诊断患有或被鉴定为遭受或患有需要治疗的病症(例如，成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病或其他类型的癌症等)或与这种病症相关的一种或多种并发症，并且任选地，已经进行了对该病症或与该病症有关的一种或多种并发症的治疗。可替代地，受试者也可以是先前未被诊断为患有这种病症或相关并发症的受试者。例如，受试者可以是展现出该病症一种或多种风险因素或与该病症相关的一种或多种并发症的受试者，或未展现出风险因素的受试者。
对特定病症的治疗“有需要的受试者”可以是患有该病症、被诊断为患有该病症或有患该病症的风险的受试者。
“疾病”是动物(例如，人)的如下健康状态，在这种状态中该动物不能维持体内平衡，并且在这种状态中如果疾病没有改善，则该动物的健康继续恶化。相反，动物中的“障碍”是如下健康状态，在这种状态中动物能够维持体内平衡，但在这种状态中动物的健康状况不如没有该障碍时的健康状态。如果不治疗，障碍不一定会导致动物的健康状态进一步降低。
如本文所用，术语“肿瘤抗原”和“癌抗原”可互换使用，是指由癌细胞差异化表达的抗原，并且从而可加以利用以靶向癌细胞。癌抗原是可以潜在地刺激明显肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些被正常细胞编码，但不一定被正常细胞表达。这些抗原可以表征为在正常细胞中通常沉默(即，不表达)的那些、仅在某些分化阶段表达的那些以及暂时表达的那些(如胚胎和胎儿抗原)。其他癌抗原由突变型细胞基因编码，如癌基因(例如，活化的ras癌基因)、抑制基因(例如，突变型p53)和由内部缺失或染色体易位导致的融合蛋白。仍其他的癌抗原可以由病毒基因编码，如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的基因。已经从多种实体肿瘤角度定义了许多肿瘤抗原：MAGE 1、2和3，按免疫力定义；MART-1/Melan-A、gp100、癌胚抗原(CEA)、HER2、粘蛋白(即，MUC-1)、前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)。此外，已经显示病毒蛋白(如乙型肝炎病毒(HBV)、埃巴病毒(EBV)和人乳头瘤病毒(HPV)编码的一些病毒蛋白)分别在肝细胞癌、淋巴瘤和宫颈癌的发展中是重要的。下文提供了肿瘤抗原的实例，并且包括例如EGFR、EGFRvIII、CD19、PSMA、BCMA、IL13Ra2等。
如本文所用，“Treg抗原”或“Treg相关抗原”可互换使用，是指由T调节(Treg)细胞表达的抗原。这些抗原可任选地被本发明的细胞和方法靶向。下文提供了Treg抗原的实例，并且包括例如GARP、LAP、CD25和CTLA4。
如本文所用，术语“嵌合”是指至少两种或更多种不同多核苷酸分子的部分融合的产物。在一个实施例中，术语“嵌合”是指通过操纵已知元件或其他多核苷酸分子产生的基因表达元件。
“双特异性T细胞接合子”、“BiTE抗体构建体”或“BiTE”是指各自包括串联连接的单链可变片段(scFv)的多肽。任选地，scFv通过接头(例如，富含甘氨酸的接头)连接。BiTE的一个scFv与T细胞受体(TCR)(例如，CD3ε亚基)结合，并且另一个与靶抗原(例如，肿瘤相关抗原)结合。
在一些实施例中，“活化”可以指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。在一些实施例中，活化可以指诱导的细胞因子产生。在其他实施例中，活化可以指可检测的效应子功能。至少，如本文所用的“活化的T细胞”是增殖性T细胞。
如本文所用，术语“特异性结合”(“specific binding”和“specifically bind”)是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的物理相互作用，其中第一个实体与第二个实体(即靶标)的结合比其与非靶标的第三个实体的结合具有更大的特异性和亲和力。在一些实施例中，特异性结合可以指第一个实体对第二个实体(即靶标)的亲和力，该亲和力超过在相同条件下与第三个实体(非靶标)的亲和力的至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多。给定靶标的特异性试剂是在所用测定条件下对该靶标展现出特异性结合的试剂。非限制性实例包括抗体或配体，其识别同源结合配偶体(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白质并与其结合。
如本文所用，“刺激配体”是指当存在于抗原呈递细胞(APC，例如，巨噬细胞、树突细胞、B细胞、人工APC等)上时可以与T细胞上的同源结合配偶体(在本文中称为“刺激分子”或“共刺激分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初次应答(包括但不限于增殖、活化、免疫应答的启动等)的配体。刺激配体是本领域熟知的，尤其包括载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超级激动剂抗CD28抗体和超级激动剂抗CD2抗体。
本文使用的术语“刺激分子”是指T细胞上与抗原呈递细胞上存在的同源刺激配体特异性结合的分子。
本文使用的术语“共刺激配体”包括APC上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合提供的原始信号之外的信号，并介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可包括但不限于4-1BBL、OX40L、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、与Toll样受体结合的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还可包括但不限于与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA、Toll样受体、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和CD83。
在一个实施例中，如本文所用的术语“工程化的”及其语法等同物可以指核酸(例如，生物体基因组内的核酸)的一种或多种人类设计的改变。在另一个实施例中，工程化可以指基因的改变、添加和/或缺失。“工程化的细胞”可以指具有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。如本文所用的术语“细胞”或“工程化的细胞”及其语法等同物可以指人或非人动物来源的细胞。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指第一多核苷酸分子，例如启动子，其与第二可转录的多核苷酸分子(如目的基因)连接，其中这些多核苷酸分子被安排以使第一多核苷酸分子影响第二多核苷酸分子的功能。这两个多核苷酸分子可以是或可以不是单个连续多核苷酸分子的一部分，并且可以相邻或不相邻。例如，如果一个启动子调节或介导细胞中目的基因的转录，则该启动子与目的基因可操作地连接。
在本文所述的各种实施例中，进一步预期涵盖任何所述特定多肽的变体(天然存在的或其他的)、等位基因、同源基因、保守修饰变体和/或保守的取代变体。关于氨基酸序列，普通技术人员将认识到改变编码序列中单个氨基酸或少量氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中这种改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代并保留所需的多肽活性。此类保守修饰的变体补充而不排除与本公开文本一致的多态变体、种间同源基因和等位基因。
一种给定的氨基酸可以被具有相似生理化学特征的残基替代，例如，用一个脂肪族残基取代另一个(如Ile、Val、Leu或Ala彼此)，或用一个极性残基取代另一个(如Lys和Arg之间；Glu和Asp之间；或Gln和Asn之间)。其他这样的保守取代，例如，具有相似疏水性特征的整个区域的取代，是众所周知的。可以在本文所述的任何一种测定中测试包含保守氨基酸取代的多肽，以确认保留了所需活性，例如，原生或参考多肽的配体介导的受体活性和特异性。
氨基酸可根据其侧链性质的相似性进行分组(参见A.L.Lehninger,Biochemistry[生物化学],第二版,第73-75页,Worth Publishers[沃思出版公司],纽约(1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。可替代地，基于共同的侧链特性可将天然存在的残基分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Gln；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守性取代将需要将这些类别之一的一个成员与另一个类别交换。特定的保守性取代包括，例如：Ala变为Gly或变为Ser；Arg变为Lys；Asn变为Gln或变为His；Asp变为Glu；Cys变为Ser；Gln变为Asn；Glu变为Asp；Gly变为Ala或变为Pro；His变为Asn或变为Gln；Ile变为Leu或变为Val；Leu变为Ile或变为Val；Lys变为Arg、变为Gln或变为Glu；Met变为Leu、变为Tyr或变为Ile；Phe变为Met、变为Leu或变为Tyr；Ser变为Thr；Thr变为Ser；Trp变为Tyr；Tyr变为Trp；和/或Phe变为Val、变为Ile或变为Leu。
在一些实施例中，本文所述的多肽(或编码这种多肽的核酸)可以是本文所述的氨基酸序列之一的功能片段。如本文所用，“功能片段”是肽的片段或部分，其根据本领域已知的或本文下文所述的测定保留野生型参考多肽的至少50％的活性。功能片段可包含本文披露的序列的保守取代。
在一些实施例中，本文所述的多肽可以是如本文所述的多肽或分子的变体。在一些实施例中，该变体是保守性修饰的变体。例如，可以通过原生核苷酸序列的突变获得保守取代变体。如本文所提及的“变体”是与原生或参考多肽基本上同源的多肽，但由于一个或多个缺失、插入或取代而具有与原生或参考多肽不同的氨基酸序列。编码变体多肽的DNA序列包括与原生或参考DNA序列相比包含核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代，但是编码保留非变体多肽活性的变体蛋白或其片段的序列。多种基于PCR的位点特异性诱变方法是本领域已知的，并且可由普通技术人员应用。
变体氨基酸或DNA序列可以与原生或参考序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高比例相同。可以确定原生序列和突变序列之间的同源性程度(同一性百分比)，例如，通过使用在万维网上通常用于此目的的可免费获取的计算机程序(例如，BLASTp或BLASTn，默认设置)比较这两个序列。
原生氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的许多技术中的任何一种来完成。例如，通过合成含有突变序列的寡核苷酸，可以在特定基因座处引入突变，所述突变序列的侧翼是允许连接原生序列的片段的限制性位点。连接后，得到的重构序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的类似物。可替代地，可以采用寡核苷酸指导的位点特异性诱变程序来提供改变的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根据所需的取代、缺失或插入而改变的特定密码子。用于进行这些改变的技术已经很成熟，并且包括，例如，Walder等人(Gene[基因]42:133,1986)；Bauer等人(Gene[基因]37:73,1985)；Craik(BioTechniques[生物技术],1985年1月,12-19)；Smith等人(Genetic Engineering:Principles andMethods[基因工程：原理与方法],Plenum Press[普莱纽姆出版社],1981)；以及美国专利号4,518,584和4,737,462中披露的那些，这些文献通过引用以其全文并入本文。任何不参与维持多肽的正确构象的半胱氨酸残基也可以被取代，通常被丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将一个或多个半胱氨酸键添加到多肽中以改善其稳定性或促进寡聚化。
如本文所用，术语“DNA”的定义为脱氧核糖核酸。术语“多核苷酸”在本文中与“核酸”可互换使用，指示核苷的聚合物。典型地，多核苷酸由天然存在于通过磷酸二酯键连接的DNA或RNA(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)中的核苷组成。然而，该术语包括含有核苷或核苷类似物的分子，所述核苷或核苷类似物含有化学或生物学修饰的碱基、修饰的主链等，无论是否存在于天然存在的核酸中，并且这些分子对于某些应用可能是优选的。在本申请涉及多核苷酸的情况下，应理解，提供DNA和RNA两者，并且在每种情况下均提供单链和双链形式(以及每个单链分子的互补物)。如本文所用的“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料本身和/或生物化学上表征特定核酸的序列信息(即，用作碱基缩写的一连串字母)。除非另有指示，否则本文给出的多核苷酸序列以5'至3'方向呈现。
如本文所用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。本文中术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。肽是相对较短的多肽，典型地长度为约2至60个氨基酸。本文使用的多肽典型地含有氨基酸，如蛋白质中最常见的20L-氨基酸。然而，可以使用本领域已知的其他氨基酸和/或氨基酸类似物。多肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如，通过添加化学实体，如碳水化合物基团，磷酸基团，脂肪酸基团，用于缀合、官能化等的接头。具有与其共价或非共价缔合的非多肽部分的多肽仍然被认为是“多肽”。示例性修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源纯化，使用重组DNA技术产生或通过化学方法(如常规固相肽合成等)合成。本文所用的术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指该多肽材料本身和/或生物化学上表征多肽的序列信息(即，用作氨基酸名称缩写的一连串字母或三个字母代码)。除非另有指示，否则本文给出的多肽序列以N端至C端方向呈现。
在一些实施例中，编码本文所述多肽的核酸(例如CAR多肽)由载体组成。在本文所述的一些方面中，编码如本文所述的给定多肽或其任何模块的核酸序列与载体可操作地连接。如本文所用，术语“载体”是指设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒的或非病毒的。术语“载体”包括当与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移到细胞的任何遗传元件。载体可包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、人工染色体、病毒、病毒粒子等。
如本文所用，术语“表达载体”是指指导RNA或多肽从与载体上的转录调节序列连接的序列表达的载体。表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可以包含其他元件，例如，该表达载体可以具有两个复制系统，从而允许其保持在两个生物体中，例如，在人细胞中用于表达，并且在原核宿主中用于克隆和扩增。术语“表达”是指参与产生RNA和蛋白质以及适当情况下分泌蛋白质的细胞过程，包括在适用的情况下，但不限于，例如，转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA，以及通过翻译从基因转录的mRNA获得的多肽。术语“基因”是指当与适当的调节序列可操作地连接时，在体外或体内转录(DNA)成RNA的核酸序列。该基因可以包括或不包括编码区之前和之后的区域，例如，5'非翻译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾随”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文所用，术语“病毒载体”是指核酸载体构建体，其包含至少一个病毒来源的元件并且具有包装入病毒载体颗粒的能力。该病毒载体可含有编码本文所述多肽(代替非必需病毒基因)的核酸。该载体和/或颗粒可用于在体外或体内将核酸转移到细胞中的目的。许多形式的病毒载体是本领域已知的。
“重组载体”是指包含能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应当理解，在一些实施例中，本文所述的载体可以与其他合适的组合物和疗法组合。在某些实施例中，该载体是附加型的。使用合适的附加型载体提供了维持受试者高拷贝数染色体外DNA中目的核苷酸的方法，从而消除了染色体整合的潜在影响。
如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“改善”是指疗法性治疗，其中目标是逆转、缓解、改善、抑制、减缓或阻止疾病或障碍相关的病症(例如，成胶质细胞瘤、胶质瘤、急性淋巴细胞白血病或其他癌症、疾病或障碍)的进展或严重性。术语“治疗”包括减少或缓解病症、疾病或障碍的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。可替代地，如果疾病的进展减慢或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括与没有治疗时的预期相比，症状进展或恶化的停止或至少是减缓。有益的或所希望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病的稳定化状态(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和、缓解(无论是部分还是全部)和/或降低的死亡率，无论是可检测的还是不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括减轻疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)。
如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与药学上可接受的载体(例如通常用于制药行业的载体)的组合。本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围，适合用于与人类和动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。在任何方面的一些实施例中，药学上可接受的载体可以是除水之外的载体。在任何方面的一些实施例中，药学上可接受的载体可以是乳膏、乳液、凝胶、脂质体、纳米颗粒和/或软膏。在任何方面的一些实施例中，药学上可接受的载体可以是人工或工程化的载体，例如，其中不会发现天然存在的活性成分的载体。
如本文所用，术语“施用”是指将本文所披露的治疗组合物或药物组合物通过使该药剂在所需部位至少部分递送的方法或途径置于受试者体内。包含本文所披露的药剂的药物组合物可以通过任何合适的途径施用，从而在受试者中产生有效的治疗。
术语“统计学上显著的”或“显著的”是指统计学显著性，并且通常表示两个标准偏差(2SD)或更大的差异。
除了在操作实例中或另有指示的情况，本文所用的表示成分量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”可以表示±1％。
如本文所用，术语“包含”是指除了所给出的限定元素之外还可以存在其他元素。“包含”的使用指示包括而不是限制。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其排除该实施例的说明中没有描述的任何元件。
如本文所用，术语“基本上由......组成”是指给定实施例所需的那些元件。该术语允许存在不会实质上影响本技术实施例的一个或多个基本和新颖或功能特征的附加元件。
除非上下文中另外明确指示，单数术语“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物。类似地，词语“或”旨在包括“和”(并且反之亦然)，除非上下文另外明确指示。尽管与本公开文本的实践或测试中可使用与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料，下文描述了适宜的方法和材料。缩写词“例如(e.g.)”衍生自拉丁语“exempli gratia”，并且在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
在任何方面的一些实施例中，本文所述的公开内容不涉及用于克隆人类的过程、用于修饰人类的种系遗传同一性的过程、人胚胎用于工业或商业目的的用途或用于修饰动物的遗传同一性的过程，这些过程可能导致它们对人或动物以及由这些过程产生的动物没有任何实质性医疗益处。
在如下所述技术的各个方面和实施例的描述中定义了其他术语。
本发明提供了几个优点。例如，本发明的CAR T细胞可用于递送治疗性分子用于癌症治疗。在一个实例中，本发明的CAR T细胞可用于将另外的毒性抗体(例如抗CTLA4或抗CD25(例如达克珠单抗)或其他分子(例如细胞因子)递送至肿瘤微环境，在这里它们可以有利地活化周围肿瘤浸润性淋巴细胞，提供检查点阻断，并耗尽调节性T细胞(Treg)。本发明的CAR T细胞可以进一步针对Treg抗原，以促进Treg细胞的寻靶。此外，本发明的某些CAR T细胞可用于将基因编码的分子(例如抗体或细胞因子)递送至这些分子以其他方式无法到达的身体区域(例如中枢神经系统，包括大脑)。在一个实例中，靶向EGFRvIII的CAR T细胞可用于靶向大脑肿瘤，并可向肿瘤递送抗体(例如，针对EGFR的抗体，如西妥昔单抗；也参见下文)。因此，本发明提供了在肿瘤微环境中寻靶的基因编码的Treg。另外，本发明提供了不能进入某些组织的抗体的基因编码形式的递送，并且可以通过扩大抗肿瘤靶标的特异性来增强T细胞疗法的效力。因此，本发明提供了针对癌症的基因修饰的T细胞疗法。
本发明的其他特征和优点从以下详细说明、附图、和权利要求书将是清楚的。
附图说明
图1是显示CART-EGFRvIII细胞对人胶质瘤靶细胞系U87vIII的杀伤作用随CART-EGFRvIII:U87vIII靶细胞的比率而变化的图。将未转导的细胞与靶细胞一起孵育作为阴性对照。
图2A和2B是一系列X射线叠加图，显示了在人胶质瘤的皮下模型中表达EGFRvIII的肿瘤(U87vIII)的位置。图2A显示了用未转导的细胞处理的小鼠，作为阴性对照。图2B显示了在植入后第4天用CART-EGFRvIII处理的小鼠(上排)，在第21天实现成功治疗(下排)。
图3A和3B是一系列X射线叠加图，显示了在人胶质瘤的颅内模型中表达EGFRvIII的肿瘤(U87vIII)的位置。图2A显示了在第5天(D5；上部)和D11(下部)，用未转导(UTD)细胞处理的小鼠，作为阴性对照。图2B显示了在D5(上排)和D21(下排)在植入后第2天用CART-EGFRvIII处理的小鼠。
图4A和4B是显微照片，显示了在输注CART-EGFRvIII五天后一名患者中肿瘤组织的免疫组织化学。图4A显示了针对CD3染色的T细胞。图4B显示了CD25+细胞。CD25是IL-2受体α链，其是活化的或调节性T细胞的标志物。
图5A-5C是定性证明在体外与人胶质瘤细胞(绿色)共孵育18小时后，Treg抑制CART细胞(红色)抗肿瘤活性的荧光显微照片。图5A显示了CART非特异性细胞与胶质瘤细胞的相对浓度。图5B显示了培养物中没有Treg的情况下CART-EGFRvIII细胞与胶质瘤细胞的相对浓度。图5C显示了培养物中包含Treg的情况下的CART-EGFRvIII细胞与胶质瘤细胞的相对浓度。
图5D是显示绿色物质汇合的定量读数的图，该读数作为随时间(至多48小时)变化的胶质瘤细胞生存力的量度。顶部线代表图5A中所示的结果(胶质瘤细胞生长)，底部线表示图5B中所示的结果(胶质瘤细胞杀死)，而中部线表示图5C中所示的结果(胶质瘤细胞对CART杀伤作用的抗性)。
图6A-6C是流式细胞术图，显示了在对照T细胞(图6A)、未活化的Treg(图6B)和活化的Treg(图6C)上LAP(x轴)和GARP(y轴)的表达。从CD4+CD25+CD127-上的leukopak分离Treg，并在IL-2存在下用CD3/CD28珠扩增7天。在第1天，将它们转导至表达的GFP。在第7天脱珠后，将扩增的Treg静置四天，然后冷冻。解冻后，在过夜静置(未活化)或用抗CD3和抗CD28过夜活化后，针对LAP和GARP表达对Treg进行染色。将来自同一供体的未转导的T细胞(CD4+和CD8+)用作表达的对照(图6A)。
图7A和7B是对应于图6A-6C中所示的结果的流式细胞术直方图，分别显示了LAP(图7A)和GARP(图7B)的表达。
图8A-8D是用于靶向Treg相关抗原的CAR构建体的示意图。图8A显示了具有抗LAPscFv(其轻链(L)和重链(H)分别沿5′至3′方向排列(CART-LAP-L-H))的靶向LAP的CAR构建体。图8B显示了具有抗LAP scFv(其重链(H)和轻链(L)分别沿5′至3′方向排列(CART-LAP-H-L))的靶向LAP的CAR构建体。图8C显示了具有抗GARP骆驼科动物抗体结合结构域(CART-GARP)的靶向GARP的CAR构建体。图8D显示了具有抗GARP骆驼科动物抗体的靶向EGFR的CAR构建体。
图9A和9B是显示靶Treg杀死随CAR T细胞与靶Treg细胞的比率而变化的图。用GFP转导Treg，并通过监测GFP表达来定量细胞毒性。图9A显示了杀死活化的Treg，而图9B显示了杀死未活化的Treg。与CART-LAP-L-H相比，CART-LAP-H-L在杀死未活化的Treg方面更有效。
图10A和10B是显示持续四天、以1:1的CAR T细胞比Treg的比率，不同抗Treg CART细胞(即CART-GARP、CART-LAP-H-L、CART-LAP-L-H或未转导的对照细胞)对靶Treg的杀伤作用的图。图10A和10B显示了在两个不同供体中进行的来自相同实验的结果。
图11A-11D是显示在共培养三天后，靶向LAP的CAR T细胞对靶Treg的杀伤作用随CAR T细胞与靶Treg细胞的比率而变化的图。图11A和11B显示了通过流式细胞术测量的共培养物中剩余的靶细胞的数量。虚线表示不含CAR细胞的对照样品中靶细胞的数量。图11A显示了未活化的Treg作为靶细胞，而图11B显示了活化的Treg作为靶细胞。图11C和11D显示了如通过靶细胞的荧光素酶表达所测量的细胞毒性百分比。图11C显示了未活化的Treg作为靶细胞，而图11D显示了活化的Treg作为靶细胞。在11A-11D中的每一个中，圆圈代表CART-LAP-H-L，正方形代表CART-LAP-L-H，并且三角形代表未转导的CAR细胞。
图12A和12B是流式细胞术直方图，显示了HUT78细胞中GARP(图12A)和LAP(图12B)的表达。
图13A和13B是显示在共培养三天后，靶向LAP的CAR T细胞对靶HUT78细胞的杀伤作用随CAR T细胞与靶细胞的比率而变化的图。图13A显示了三天后培养物中剩余的靶细胞的数量，如通过流式细胞术所测量的。虚线表示不含CAR细胞的对照样品中靶细胞的数量。图13B显示了如通过靶细胞的荧光素酶表达所测量的细胞毒性百分比。圆圈代表CART-LAP-H-L，正方形代表CART-LAP-L-H，并且三角形代表未转导的CAR细胞。
图14A和14B是流式细胞术直方图，显示了SeAx细胞中GARP(图14A)和LAP(图14B)的表达。
图15A和15B是显示在共培养24小时(图15A)和48小时(图15B)后，靶向GARP和LAP的CAR T细胞对靶SeAx细胞的杀伤作用随CAR T细胞与靶细胞的比率而变化的图，如通过靶细胞的荧光素酶表达所测量的。正方形代表CART-GARP，向上的三角形代表CART-LAP-H-L，向下的三角形代表CART-LAP-H-L细胞，以及菱形代表未转导的CAR细胞。
图16A-16C是蛋白质印迹的照片，其显示了从CART-EGFR-GARP T细胞培养物中获得的上清液的蛋白质组分的存在。图16A和16B示出了完整的凝胶，包括分子量参考梯状物。图16C是图16B所示的凝胶的底部区域的更长的曝光，其中用箭头标识出10至15kD之间的条带，表明存在骆驼科动物抗体。
图17是CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)的示意图，CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)是示例性的编码CAR和BiTE的核酸分子。
图18是具有来自西妥昔单抗的抗EGFR结构域和来自博纳吐单抗的抗CD3结构域的BiTE的示意图。
图19是显示证实在泳道2中存在BiTE的蛋白质印迹实验的一组照片。
图20A和20B是一组流式细胞术图，显示了由用CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)转导的HEK293细胞表达的BiTE与由K562细胞表达的EGFR(图20A)和由Jurkat细胞表达的CD3(图20B)的结合。
图21A和21B是一组流式细胞术图，显示了由用CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)转导的SupT1细胞表达的BiTE与由K562细胞表达的EGFR(图21A)和由表达CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)的SupT1细胞表达的CD3(图21B)的结合。
图22A和22B是一组流式细胞术图，显示了由用CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)转导的ND4细胞表达的BiTE与由K562细胞表达的EGFR(图21A)和由表达CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)的ND4细胞表达的CD3(图21B)的结合。
图23是显示ND4细胞对U87vIII细胞的杀伤作用随效应子(未转导的ND4)与靶(U87vIII)细胞的比率而变化的图，其中该ND4细胞与由用CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)转导的HEK293T细胞分泌的BiTE一起孵育。正方形代表实验组，其中上清液包含BiTE，并且圆圈代表不含BiTE的阴性对照。
图24是示例性核酸分子的图，该核酸分子编码在EF1α启动子的控制下的CAR和在NFAT启动子的控制下的GFP。
图25A和25B是一组流式细胞术图，显示了用图24的构建体转导的细胞的GFP表达。红色直方图显示了未刺激细胞中GFP的表达；蓝色直方图显示了PMA和离子霉素刺激的细胞中GFP的表达；以及橙色直方图显示了在被PEPvIII包被的细胞中GFP的表达。
图26A是GFP-CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)的示意图，GFP-CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)是示例性的编码CAR和组成性表达的BiTE的核酸分子。
图26B是GFP-CAR-EGFR-BiTE-(CD19-CD3)的示意图，GFP-CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)是示例性的编码CAR和组成性表达的BiTE的核酸分子。
图27A是BiTE-(CD19-CD3)-CAR-EGFR的示意图，BiTE-(CD19-CD3)-CAR-EGFR是示例性的编码CAR和可诱导表达的BiTE的核酸分子。
图27B是BiTE-(CD19-CD3)-CAR-EGFR的示意图，BiTE-(CD19-CD3)-CAR-EGFR是示例性的编码CAR和可诱导表达的BiTE的核酸分子。
具体实施方式
本发明提供了基于嵌合抗原受体T细胞(“CAR T细胞”)的疗法的改进方法。通常，这些改进涉及抗肿瘤疗法中寻靶的不同方面，例如靶向肿瘤微环境。
如下面进一步解释的，我们已经证明，在抑制受试者针对肿瘤的免疫应答中(例如，在肿瘤微环境中)起作用的调节性T细胞(本文也称为“Treg”)可以被CAR T细胞靶向。因此，本发明提供了CAR T细胞，其中CAR针对Treg抗原或标志物(例如，GARP、LAP、CTLA4或CD25；也参见下文)。在其他实例中，本发明提供了CAR T细胞，其分泌针对一种或多种Treg抗原或标志物(例如，GARP，LAP，CTLA4和CD25；也参见下文)的抗体(例如单链抗体、单结构域抗体(如骆驼科动物抗体)或双特异性抗体(如双特异性T细胞接合子)。除了靶向Treg，本发明还提供了CAR T细胞和用于将其他治疗剂(例如抗体和相关分子)递送至肿瘤的相关方法。在一个实例中，将具有对EGFRvIII具有特异性的CAR的CAR T细胞用于靶向大脑肿瘤(例如，成胶质细胞瘤)。此类CAR T细胞还可用于向这些肿瘤递送治疗性分子，如抗体试剂(例如单链抗体、单结构域抗体(如骆驼科动物抗体)或双特异性抗体(如双特异性T细胞接合子)。这些方法特别有利，因为尽管存在抗体通常不会通过的血脑屏障，但事实上这些方法能促进抗体向大脑的施用。这些方法以及相关的方法和组成将在下面进一步描述。
嵌合抗原受体
本文所述的技术提供用于免疫疗法的改善的CAR。以下讨论CAR和各种改善。
本文所用的术语“嵌合抗原受体”或一个或多个“CAR”是指工程化的T细胞受体，其将配体或抗原特异性移植到T细胞上(例如，幼稚T细胞、中枢记忆性T细胞、效应记忆性T细胞或其组合)。CAR也称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。
CAR放置嵌合细胞外靶标结合结构域，该结构域特异性结合在待靶向的细胞表面上表达的靶标(例如多肽)，以使T细胞应答到包含T细胞受体分子的跨膜结构域和一个或多个细胞内结构域的构建体上。在一个实施例中，该嵌合细胞外靶标结合结构域包含抗体的一个或多个抗原结合结构域，所述抗体与在待靶向的细胞上表达以产生T细胞应答的抗原特异性结合。CAR的一个或多个细胞内信号传导结构域的特性可以如本领域已知的和本文披露的那样变化，但是当该靶标/抗原结合结构域与靶标细胞表面上的靶标/抗原结合时，该嵌合靶标/抗原结合结构域使受体对信号传导活化敏感。
关于细胞内信号传导结构域，所谓的“第一代”CAR包括在抗原结合时仅提供CD3ζ(CD3zeta)信号的那些CAR。所谓的“第二代”CAR包括提供共刺激(例如，CD28或CD137)和活化(CD3ζ)结构域的那些CAR，并且所谓的“第三代”CAR包括提供多种共刺激(例如，CD28和CD137)结构域和活化结构域(例如，CD3ζ)的那些CAR。在各种实施例中，选择CAR以对靶标/抗原具有高亲和力或亲合力-例如，抗体衍生的靶标或抗原结合结构域通常对靶抗原具有比天然存在的T细胞受体更高的亲和力和/或亲合力。这一特性与可以选择的抗体的高特异性相结合，提供了CAR T细胞的高度特异性T细胞寻靶。
如本文所用，“CAR T细胞”或“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。当在T细胞中表达时，CAR具有以非MHC限制性方式利用单克隆抗体的抗原结合特性将T细胞特异性和反应性重定向到选定靶标的能力。非MHC限制性抗原识别使得表达CAR的T细胞能够识别独立于抗原加工的抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。
如本文所用，术语“细胞外靶标结合结构域”是指在细胞外部发现的足以促进与靶标结合的多肽。细胞外靶标结合结构域将特异性结合其结合配偶体，即靶标。作为非限制性实例，该细胞外靶结合结构域可包括抗体或抗体试剂或配体的抗原结合结构域，其识别并结合同源结合配偶体蛋白质。在本文中，配体是与蛋白质和/或受体的一部分特异性结合的分子。可用于本文所述方法和组合物的配体的同源结合配偶体通常可在细胞表面上找到。配体:同源配偶体结合可导致带有配体的受体的改变，或活化生理应答，例如，信号传导途径的活化。在一个实施例中，该配体可以是非基因组原生的。任选地，该配体在至少两个物种上具有保守的功能。
抗体试剂
在各种实施例中，本文所述的CAR包含抗体试剂或其抗原结合结构域作为细胞外靶结合结构域。
如本文所用，术语“抗体试剂”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列并且与给定抗原特异性结合的多肽。抗体试剂可包含抗体或含有抗体的抗原结合结构域的多肽。在任何方面的一些实施例中，抗体试剂可包含单克隆抗体或含有单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可包括重(H)链可变区(本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文中缩写为VL)。在另一个实例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”包括抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体，Fab和sFab片段，F(ab’)2，Fd片段，Fv片段，scFv，CDR和结构域抗体(dAb)片段(参见，例如,deWildt等人,Eur J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]26(3):629-639,1996；其通过引用以其全文并入本文)以及完整抗体。抗体可具有IgA、IgG、IgE、IgD或IgM的结构特征(以及亚型及其组合)。抗体可以来自任何来源，包括小鼠、兔、猪、大鼠和灵长类动物(人和非人灵长类动物)和灵长类化抗体。抗体还包括中间抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。可以使用本领域普通技术人员已知的方法从例如噬菌体展示文库中选择完全人抗体结合结构域。此外，抗体试剂包括单结构域抗体，如骆驼科动物抗体。
VH和VL区域可以进一步细分为具有高变性的区域，称为“互补决定区”(“CDR”)，散布有更保守的区域，称为“框架区”(“FR”)。已经精确定义了框架区和CDR的范围(参见，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质序列],第五版,U.S.Department of Health and Human Services[美国卫生与公众服务部],NIH公开号91-3242，及Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917,1987；各文献通过引用以其全文并入本文)。每个VH和VL典型地由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
在一个实施例中，该抗体或抗体试剂不是人抗体或抗体试剂(即，该抗体或抗体试剂是小鼠)，但已经人源化。“人源化抗体或抗体试剂”是指在蛋白质序列水平上被修饰以增加其与人类天然产生的抗体或抗体试剂变体的相似性的非人抗体或抗体试剂。人源化抗体的一种方法采用将鼠或其他非人CDR移植到人抗体框架上。
在一个实施例中，CAR的细胞外靶结合结构域包含通过柔性接头肽融合抗体(通常是单克隆抗体)的VH和VL结构域产生的单链Fv(scFv)片段，或基本上由其组成。在各种实施例中，该scFv与跨膜结构域和T细胞受体细胞内信号传导结构域融合，例如，本文所述的工程化细胞内信号传导结构域。在另一个实施例中，CAR的细胞外靶结合结构域包含骆驼科动物抗体。
抗体结合结构域及其选择和克隆方法是本领域普通技术人员所熟知的。在一个实施例中，该抗体试剂为抗GARP抗体试剂并且包含SEQ ID NO:3或25的序列，或包含与SEQ IDNO:3或25的序列的具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的序列。在另一个实施例中，该抗体试剂为抗LAP抗体试剂并且包含SEQ ID NO:9或15的序列，或包含与SEQ ID NO:9或15的序列的具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的序列。在另一个实施例中，该抗体试剂为抗EGFR或抗EGFRvIII抗体试剂并且包含SEQ ID NO:21、27、33、36、42、45、55、57、或65的序列，或包含与SEQ ID NO:21、27、33、36、42、45、55、57、或65的序列的具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的序列。在另一个实施例中，该抗体试剂为抗CD19抗体试剂并且包含SEQ ID NO:51或63的序列，或包含与SEQ ID NO:51或63的序列的具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的序列。在另一个实施例中，该抗体试剂为抗CD3抗体试剂并且包含SEQ ID NO:34、43、52、56或64的序列，或包含与SEQ ID NO:34、43、52、56或64的序列的具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的序列。在各种实例中，抗体可以选自C225、3C10、西妥昔单抗和2173。
在一个实施例中，可用于本文所述技术的CAR包含至少两个抗原特异性寻靶区域、一个细胞外结构域、一个跨膜结构域和一个细胞内信号传导结构域。在此类实施例中，该两个或更多个抗原特异性寻靶区域靶向至少两个不同的抗原，并且可以串联排列并通过接头序列分开。在另一个实施例中，该CAR是双特异性CAR。双特异性CAR对两种不同的抗原具有特异性。
靶标/抗原
任何细胞表面部分都可以被CAR靶向。通常，该靶标将是可以在希望靶向以产生T细胞应答的细胞上差异或优先表达的细胞表面多肽。为了靶向Treg，抗体试剂可以靶向例如糖蛋白A主导重复序列(GARP)、潜在相关肽(LAP)、CD25、CTLA-4、ICOS、TNFR2、GITR、OX40、4-1BB和LAG-3。如本文所述，为了靶向肿瘤或癌细胞，可以将抗体结构域靶向例如EGFR或EGFRvIII。靶向肿瘤抗原或肿瘤特异性的肿瘤相关抗原可以提供靶向肿瘤细胞的手段，同时避免或至少限制对非肿瘤细胞或组织的附带损伤。另外的肿瘤抗原、肿瘤相关抗原、或其他目的抗原的非限制性实例包括CD19、CD37、BCMA(肿瘤坏死因子受体超家族成员17(TNFRSF17)；NCBI基因ID：608；NCBI参考序列NP_001183.2)和mRNA(例如，NCBI参考序列NM_001192.2)、CEA、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、HPV E6和E7、BING-4、钙活化的氯化物通道2、细胞周期蛋白B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、her2/neu、端粒酶、mesotheliun、SAP-1、生存蛋白、BAGE家族、CAGE家族、GAGE家族、MAGE家族、SAGE家族、XAGE家族、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、gp100/pmel17、酪氨酸酶、TRP-1/-2、MC1R、BRCA1/2、CDK4、MART-2、p53、Ras、MUC1、TGF-βRII、IL-15、IL13Ra2、和CSF1R。
跨膜结构域
如本文所述的每个CAR包括将细胞外靶标结合结构域连接至细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。
如本文所用，“跨膜结构域”(TM结构域)是指CAR的通常疏水性的区域，其穿过细胞的质膜。该TM结构域可以是跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白或其他跨膜蛋白)的跨膜区域或其片段、人工疏水序列或其组合。虽然本文提供了具体实例并且在实施例中使用，但是其他跨膜结构域对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以与本技术的替代实施例结合使用。选择的跨膜区或其片段优选地不会干扰CAR的预期功能。如关于蛋白质或多肽的跨膜结构域所使用的，“其片段”是指足以将蛋白质锚定或附接于细胞表面的跨膜结构域的一部分。
在一个实施例中，CAR或其片段的跨膜结构域源自或包含CD8的跨膜结构域(例如，SEQ ID NO:4、10、16、22、28、37、46、58或66中的任何一个，或其变体)。在一个备选实施例中，本文所述CAR的跨膜结构域或其片段包含选自如下的跨膜结构域：T细胞受体，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、4-1BBL、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C的α、β或ζ链的跨膜结构域。
CD8是优先在细胞毒性T淋巴细胞的细胞表面上发现的抗原。CD8介导免疫系统内的细胞-细胞相互作用，并充当T细胞共同受体。CD8由α(CD8α)链和β(CD8β)链组成。CD8a序列对于许多物种是已知的，例如，人CD8a，(NCBI基因ID：925)多肽(例如，NCBI参考序列NP_001139345.1)和mRNA(例如NCBI参考序列NM_000002.12)。CD8可以指人CD8，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施例中，例如在兽医应用中，CD8可以指，例如狗、猫、牛、马、猪等的CD8。本领域技术人员可以容易地鉴定人CD8的同源物和/或直系同源物，例如，使用NCBI直系同源物搜索功能或搜索给定物种的与参考CD8序列相似的序列的可用序列数据。
4-1BBL是属于TNF超家族的2型跨膜糖蛋白。4-1BBL在活化的T淋巴细胞上表达。4-1BBL序列对于许多物种是已知的，例如人4-1BBL，也称为TNFSF9(NCBI基因ID：8744)多肽(例如，NCBI参考序列NP_003802.1)和mRNA(例如，NCBI参考序列NM_003811.3)。4-1BBL可以指人4-1BBL，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施例中，例如在兽医应用中，4-1BBL可以指，例如狗、猫、牛、马、猪等的4-1BBL。本领域技术人员可以容易地鉴定人4-1BBL的同源物和/或直系同源物，例如，使用NCBI直系同源物搜索功能或搜索给定物种的与参考4-1BBL序列相似的序列的可用序列数据。
共刺激结构域
本文所述的每种CAR任选地包含一种或多种共刺激分子的细胞内结构域，或者共刺激结构域。如本文所用，术语“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，其提供在与抗原结合后有效活化和T淋巴细胞功能所需的第二信号。在一个实例中，可使用4-1BB细胞内结构域(ICD)(参见，例如，下文和SEQ ID NO:5、11、17、23、29、38、47、59、67，或其变体)。这种共刺激分子的其他说明性实例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70。在一个实施例中，该细胞内结构域是4-1BB的细胞内结构域。4-1BB(CD137；TNFRS9)是活化诱导的共刺激分子，并且是免疫应答的重要调节剂。
细胞内信号传导结构域
如本文所述的CAR包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指CAR多肽的一部分，其参与将与靶抗原结合的有效CAR的信息转导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括细胞毒性因子释放到已与CAR结合的靶细胞，或抗原与细胞外CAR结构域结合后引发的其他细胞应答。在各种实例中，细胞内信号传导结构域来自CD3ζ(参见，例如，下文和SEQ ID NO:6、12、18、24、30、39、48、60、68，或其变体)。在该技术中特别使用的含有ITAM的细胞内信号传导结构域的其他非限制性实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3θ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
CD3是T细胞共同受体，其在同时参与适当的共刺激(例如，共刺激分子的结合)时促进T淋巴细胞活化。CD3复合物由4个不同的链组成；哺乳动物CD3由一个CD3γ链、一个CD3δ链和两个CD3ε链组成。这些链与被称为T细胞受体(TCR)的分子和CD3ζ结合，在T淋巴细胞中生成活化信号。完整的TCR复合物包含TCR、CD3ζ和完整的CD3复合物。
在任何方面的一些实施例中，本文所述的CAR多肽包含细胞内信号传导结构域，其包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序或来自CD3ζ(CD3 zeta)的ITAM。在任何方面的一些实施例中，该ITAM包括CD3ζ(ITAM3)的ITAM的三个基序。在任何方面的一些实施例中，该CD3ζ的ITAM的三个基序未突变，因此包括原生序列或野生型序列。在一些实施例中，CD3ζ序列包含本文提供的序列中列出的CD3ζ的序列。
如本领域技术人员可以确定的，如本文所述的单独的CAR和其他构建体组分可以与彼此一起使用，并且可以与本文所述的各种构建体换进换出。这些组分中的每一个可包含本文所述的任何相应序列或其变体，或者由本文所述的任何相应序列或其变体组成。
CAR和CAR T细胞的更详细描述可见于Maus等人,Blood[血液]123:2624-2635,2014；Reardon等人,Neuro-Oncology[神经肿瘤学]16:1441-1458,2014；Hoyos等人,Haematologica[血液病学]97:1622,2012；Byrd等人,J.Clin.Oncol.[临床肿瘤学杂志]32:3039-3047,2014；Maher等人,Cancer Res[癌症研究]69:4559-4562,2009；及Tamada等人,Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]18:6436-6445,2012；各文献通过引用以其全文并入本文。
在一个实施例中，该CAR还包含接头结构域。如本文所用，“接头结构域”是指长度为约2至100个氨基酸的寡肽或多肽区域，其将如本文所述的CAR的任何结构域/区域连接在一起。在一些实施例中，接头可包括或由柔性残基如甘氨酸和丝氨酸组成，以使相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。当希望确保两个相邻的结构域不在空间上彼此干扰时，可以使用更长的接头。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头的实例包括2A接头(例如T2A)、2A样接头或其功能等同物及其组合。在各种实例中，使用具有本文所述序列的接头或其变体。应该理解的是，特定接头在特定位置的构建体中的指示并不意味着仅可以在那里使用该接头。而是，如本领域技术人员所确定的，不同的接头序列(例如，P2A和T2A)可以彼此交换(例如，在本发明的构建体的情况下)。在一个实施例中，该接头区是衍生自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)的T2A。可用于本技术的接头的非限制性实例包括T2A、P2A、E2A、BmCPV2A、和BmIFV2A。诸如这些的接头可用于多蛋白的背景中，如下文所述的那些。例如，它们可用于将多蛋白的CAR组分与多蛋白的治疗剂(例如抗体，如scFv、单结构域抗体(如骆驼科动物抗体)或双特异性抗体(如BiTE))组分分离(见下文)。
在一些实施例中，如本文所述的CAR任选地还包含报告分子，例如，以允许非侵入性成像(例如，正电子发射断层摄影PET扫描)。在包含报告分子的双特异性CAR中，第一细胞外结合结构域和第二细胞外结合结构域可包括不同或相同的报告分子。在双特异性CAR T细胞中，第一CAR和第二CAR可以表达不同或相同的报告分子。在另一个实施例中，如本文所述的CAR还包含报告分子(例如潮霉素磷酸转移酶(hph))，其可以单独成像或与底物或化学物质(例如9-[4-[18F]氟-3-(羟甲基)丁基]鸟嘌呤([18F]FHBG))组合成像。在另一个实施例中，如本文所述的CAR还包含可以使用非侵入性技术(例如，用64Cu2+功能化的金纳米颗粒(GNP))容易地成像的纳米颗粒。用于非侵入性成像的CAR T细胞的标记的综述，例如Bhatnagar等人,Integr Biol.(Camb).[综合生物学(剑桥)]5(1):231-238,2013，以及Keu等人,Sci.Transl.Med.[科学转化医学]18；9(373),2017，这些文献通过引用以其全文并入本文。
GFP和mCherry在本文中被证明是可用于对在T细胞(例如，CAR T细胞)上表达的CAR进行成像的荧光标签。预期基本上本领域已知的任何荧光蛋白均可用作此目的的荧光标签。对于临床应用，该CAR不需要包括荧光标签或荧光蛋白。因此，在本文提供的特定构建体的每种情况下，可以除去存在于构建体中的任何标志物。本发明包括具有或不具有标志物的构建体。因此，当在本文中提及特定构建体时，可以认为其具有或不具有任何标记物或标签(包括例如组氨酸标签)被包括在本发明内。
在一个实施例中，该CAR多肽序列对应于，包含，或包含与选自SEQ ID NO:1、7或13的序列的具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的序列，或者SEQ IDNO:21-24、27-30、36-39、45-48、57-60、或65-68的组合。如本领域技术人员可以确定的，这些CAR的各种功能相似或等效的组分可以相互交换或替换，以及本领域已知或本文列出的其他类似或功能等效的组分。
CAR T细胞递送的抗体和相关分子
如上所述，本发明的CAR T细胞可任选地用于将抗体试剂(或其他治疗性分子，例如细胞因子)递送至肿瘤，如肿瘤微环境。在各种实施例中，抗体试剂由与CAR相同的核酸分子编码，从而促进细胞(例如T细胞)的转导以表达CAR和抗体试剂。在这样的实例中，抗体试剂可以被表达，例如，使得其通过可裂解的接头序列(例如，2A接头，如像P2A或T2A；参见上文)与CAR(和任选地其他蛋白质，例如标志物)分离。抗体试剂可以在与CAR相同的启动子的控制下表达(例如，通过EF1α启动子)，并且可以组成型表达。在其他实例中，抗体试剂在诱导型启动子例如在T细胞活化时表达的启动子(例如NFAT启动子)的控制下表达。可以使用这种诱导型启动子，例如，以确保仅在T细胞活化时才表达抗体，因此，仅当例如CAR T细胞在肿瘤微环境内时，限制抗体产生对于该场所可能是有利的。如本领域所理解的，在本发明内的各种载体设计中，CAR编码序列对于抗体试剂编码序列可以是5′或3′。
在各种实例中，在CAR T细胞内表达的抗体(例如，来自与CAR相同的核酸分子)是本文所述的单链抗体或单结构域抗体(scFV或骆驼科动物)。在单链抗体的情况下，链可以为L-H或H-L顺序，并且任选地可以通过接头(例如，基于甘氨酸的接头)彼此分开。
在各种实例中，抗体是双特异性抗体，包括例如双特异性T细胞结合子(BiTE)。此类分子可以靶向T细胞(例如，通过结合CD3)以及肿瘤抗原(例如，EGFR、EGFRvIII或CD19；也参见上文)，并且可以用于增强例如肿瘤微环境中的T细胞应答。BiTE的两种组分可以任选地通过接头(例如，基于甘氨酸的接头)彼此分开。
抗体试剂可以靶向例如肿瘤抗原或Treg抗原(如本文所述的那些)或其他抗原(例如EGFR、EGFRvIII、CD19、CTLA4、CD25、GARP、LAP、IL-15、IL13Ra2、CSF1R等)。
如本文所述，除了任选地递送抗体试剂之外，本发明的CAR T细胞还可用于递送其他治疗分子，包括例如细胞因子和毒素。
对于本领域技术人员将显而易见的是，可以选择本文所述的CAR和相关构建体(或其变体)的其他组分，如Igκ(例如SEQ ID NO:32、41、50、54、62或其变体)、CD8前导(例如SEQID NO:2、14、20或其变体)和相关序列，以用于制备本发明的构建体。
细胞和疗法
本文所述的技术的一个方面涉及包含本文所述的任何CAR多肽的哺乳动物细胞(可选地与另一种治疗分子，例如抗体试剂(如scFv、骆驼科动物抗体或BiTE)或细胞因子一起)；或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸(任选地与另一种治疗分子，例如抗体试剂(如scFv、骆驼科动物抗体或细胞因子)一起)。在一个实施例中，该哺乳动物细胞包含抗体，抗体试剂，其抗原结合部分，本文所述的任何CAR，或细胞因子，或编码这种抗体、抗体试剂、其抗原结合部分、本文所述的任何CAR、或细胞因子的核酸。该哺乳动物细胞或组织可以来源于人、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫，但也可以使用任何其他哺乳动物细胞。在任何方面的优选实施例中，该哺乳动物细胞是人。
在一个实施例中，该细胞是T细胞。在任何方面的备选实施例中，该细胞是免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞具有造血来源，并且包括淋巴细胞，如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一些实施例中，该细胞是T细胞；NK细胞；NKT细胞；淋巴细胞，如B细胞和T细胞；以及骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
在一个实施例中，该细胞是从患有或被诊断患有癌症、浆细胞障碍或自身免疫疾病的个体获得的。
如本文所用，“癌症”可指细胞的过度增殖，其独特性状、正常细胞控制的丧失导致不受调节的生长，缺乏分化，局部组织侵入和转移，并且可以是成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或实体瘤。白血病的非限制性实例包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一个实施例，该癌症是ALL或CLL。淋巴瘤的非限制性实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)以及T细胞淋巴瘤(例如，外周T细胞淋巴瘤(PTCL)，包括皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL))。在一个实施例中，该癌症是DLBCL或滤泡性淋巴瘤。实体肿瘤的非限制性实例包括肾上腺皮质瘤、腺泡状软组织肉瘤、上皮癌、软骨肉瘤、结直肠癌、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、内胚窦瘤、上皮样血管内皮瘤、尤文肉瘤、生殖细胞肿瘤(实体肿瘤)、骨和软组织巨细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(NRSTS)、骨肉瘤、椎旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和威尔姆斯瘤。实体肿瘤可以在骨骼、肌肉或器官中找到，并且可以是肉瘤或上皮癌。预期本文所述技术的任何方面均可用于治疗所有类型的癌症，包括本申请中未列出的癌症。如本文所用，术语“肿瘤”是指细胞或组织的异常生长，例如，恶性类型或良性类型。
如本文所用，“自身免疫疾病或障碍”的特征在于一个人的免疫系统不能区分外来细胞和健康细胞。这导致一个人的免疫系统靶向其健康细胞以造成程序性细胞死亡。自身免疫疾病或障碍的非限制性实例包括炎性关节炎、1型糖尿病、多发性硬化、牛皮癣、炎性肠病、SLE、以及血管炎、过敏性炎症(如过敏性哮喘、特应性皮炎和接触性超敏反应)。自身免疫相关疾病或障碍的其他实例包括，但不应被解释为限于，类风湿性关节炎、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮、格雷夫斯病(甲状腺功能亢进)、桥本氏甲状腺炎(甲状腺功能低下)、乳糜泻、克罗恩病和溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征、原发性胆道硬化/肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、雷诺氏现象、硬皮病、肖格伦综合征、古德帕斯彻氏综合征、韦格纳肉芽肿、风湿性多肌痛、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、慢性疲劳综合征(CFS)、银屑病、自身免疫性艾迪生病、强直性脊柱炎、急性播散性脑脊髓炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、眼球阵挛-肌阵挛综合征、视神经炎、奥德氏甲状腺炎、天疱疮、恶性贫血、狗多发性关节炎、赖特综合征、大动脉炎、温抗体型自身免疫性溶血性贫血和纤维肌痛(FM)。
在一个实施例中，该哺乳动物细胞是对患有免疫系统障碍的患者获得的，该免疫系统障碍导致免疫系统的异常低活性，或免疫缺陷障碍，其阻碍一个人抵抗外来物质(例如，病毒或细菌细胞)的能力。
浆细胞是由B淋巴细胞产生的白细胞，其功能是生成和释放抗感染所需的抗体。如本文所用，“浆细胞障碍或疾病”的特征在于浆细胞的异常增殖。异常的浆细胞能够“排挤”健康的浆细胞，这导致对抗外来物体(如病毒或细菌细胞)的能力降低。浆细胞障碍的非限制性实例包括淀粉样变性病、华氏巨球蛋白血症、骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合征)、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)和浆细胞骨髓瘤。
可以使用本领域已知的标准技术从受试者中获得T细胞。例如，可以从取自供体或患者的外周血中分离T细胞。T细胞可以从哺乳动物中分离。优选地，T细胞是从人体中分离的。
细胞，例如T细胞，可以被工程化为包含本文所述的任何CAR多肽(包括本文所述的与抗体试剂或细胞因子可裂解连接的CAR多肽)；或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸(以及任选地还包含基因编码的抗体试剂或细胞因子)。在一个实施例中，本文所述的任何CAR多肽(任选地与本文所述的抗体试剂或细胞因子一起)从慢病毒载体表达。使用感染标准技术将慢病毒载体用于在细胞中表达CAR多肽(以及任选地抗体试剂或细胞因子)。
逆转录病毒(如慢病毒)为递送编码基因或目的嵌合基因的核酸序列提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的核酸序列插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并将其递送至细胞，例如体外或离体递送。逆转录病毒系统在本领域中是熟知的，其描述于，例如，美国专利号5,219,740；Kurth和Bannert(2010)“Retroviruses:Molecular Biology,Genomics and Pathogenesis”[逆转录病毒：分子生物学、基因组学和发病学]Calster Academic Press[卡尔斯特学术出版社](ISBN:978-1-90455-55-4)；及Hu等人,Pharmacological Reviews[药理学综述]52:493-512,2000；这些文献各自通过引用以其全文并入本文。用于高效DNA递送的慢病毒系统可从傲锐基因(马里兰州罗克维尔市)购买。在替代实施例中，本文所述任何CARS的CAR多肽(以及任选地抗体试剂或细胞因子)通过包含编码该CAR的核酸的表达载体的转染或电穿孔在哺乳动物细胞中表达。转染或电穿孔方法是本领域中己知的。
可以使用检测编码该CAR(以及任选地抗体试剂或细胞因子)的核酸的mRNA、DNA或基因产物的标准测定来评估本文所述的任何多肽的CAR多肽(以及任选地抗体试剂或细胞因子)高效表达。例如，RT-PCR、FACS、RNA印迹、蛋白印迹、ELISA或免疫组织化学法。
在一个实施例中，本文所述的CAR多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)组成性表达。在一个实施例中，CAR多肽组成性表达并且任选的抗体试剂或细胞因子是可诱导表达的。在一个实施例中，本文所述的CAR多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)由重组核酸序列编码。
本文所述技术的一个方面涉及在有需要的受试者中治疗癌症、浆细胞障碍或自身免疫疾病的方法，该方法包括：工程化T细胞以在T细胞表面上包含本文所述的任何CAR多肽(以及任选地抗体试剂或细胞因子)；并将工程化的T细胞施用于受试者。在癌症的情况下，该方法可以用于治疗确诊的癌症、预防癌症的复发或用于辅助或新辅助设置中。
本文所述技术的一个方面涉及在有需要的受试者中治疗癌症、浆细胞障碍或自身免疫疾病的方法，该方法包括：施用包含本文所述的任何CAR多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)的任何哺乳动物细胞中的细胞。
簇分化(CD)分子是存在于白细胞上的细胞表面标志物。随着白细胞分化并成熟，其CD谱发生变化。在白细胞变成癌细胞(即淋巴瘤)的情况下，其CD谱在该疾病的诊断中是重要的。某些类型的癌症的治疗和预后依赖于确定癌细胞的CD谱。“CDX+”，其中“X”是CD标志物，指示CD标志物存在于癌细胞中，而“CDX-”指示该标志物不存在。本领域技术人员将能够使用标准技术评估存在于癌细胞上的CD分子，例如使用免疫荧光来检测市售的与CD分子结合的抗体。
在任何方面的一些实施例中，在施用于受试者之前刺激和/或活化工程化的CAR-T细胞。
施用
在一些实施例中，本文所述的方法涉及用包含本文所述的任何CAR多肽(以及任选地抗体试剂或细胞因子)、或编码本文所述任何CAR多肽(以及任选地抗体试剂或细胞因子)的核酸的哺乳动物细胞治疗患有或被诊断患有癌症、浆细胞病或障碍或自身免疫疾病或障碍的受试者。如本文所用，“如本文所述的CAR T细胞”是指哺乳动物细胞，其包含本文所述的任何CAR多肽(以及任选地抗体试剂或细胞因子)，或编码本文所述的任何CAR多肽(以及任选地抗体试剂或细胞因子)的核酸。如本文所用，“病症”是指癌症、浆细胞病或障碍、或自身免疫疾病或障碍。患有病症的受试者可以由医生使用现有诊断该病症的方法来鉴定。该病症的症状和/或并发症表征这些病症并有助于诊断，这些症状和/或并发症在本领域中是熟知的，包括但不限于疲劳、持续性感染和持续性出血。对于给定的病症，可帮助诊断(例如该病症)的测试包括但不限于血液筛查和骨髓测试，并且这些测试是本领域已知的。病症的家族史或暴露于病症的风险因素也可以帮助确定受试者是否可能患有该病症或帮助诊断该病症。
本文所述的组合物可以施用于患有或被诊断为患有病症的受试者。在一些实施例中，本文所述的方法包括向受试者施用有效量的本文所述的活化的CAR T细胞，以缓解该病症的症状。如本文所用，“缓解该病症的症状”是改善与该病症相关的任何病症或症状。与同等的未治疗的对照相比，用任何标准技术测量的这种减少为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更高。用于向受试者施用本文所述组合物的多种方法是本领域技术人员已知的。在一个实施例中，本文所述的组合物是全身或局部施用的。在优选的实施例中，本文所述的组合物是静脉内施用的。在另一个实施例中，本文所述的组合物在肿瘤部位施用。
如本文所用的术语“有效量”是指缓解疾病或障碍的至少一种或多种症状所需的活化CAR T细胞的量，并且涉及足以提供所需效果的细胞制剂或组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指当施用于典型受试者时足以提供特定抗病症效果的活化CAR T细胞的量。在各种情况下，本文所用的有效量还包括足以延迟疾病症状发展、改变症状疾病进程(例如但不限于减缓病症的进展)、或扭转病症症状的量。因此，通常不可能指定一个精确的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，一个适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅仅使用常规实验来确定。
可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序评价有效量、毒性和治疗功效。该剂量可以取决于所采用的剂型以及使用的施用途径而变化。毒性与治疗功效之间的剂量比为治疗指数，并且可以被表示为比率LD50/ED50。展现出大治疗指数的组合物和方法是优选的。最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。此外，可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养中或者在适当的动物模型测定的IC50(即，实现症状的半数最大抑制的活化CAR T细胞的浓度)。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱法。任何特定剂量的作用可以通过合适的生物测定来监测，例如，用于骨髓测试的测定等。剂量可由医生确定，并根据需要调整以适应观察到的治疗效果。
在本技术的一个方面，本文所述的技术涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的活化CAR T细胞，以及任选地药学上可接受的载体。该药物组合物的活性成分至少包含如本文所述的活化CAR T细胞。在一些实施例中，该药物组合物的活性成分基本上由如本文所述的活化CAR T细胞组成。在一些实施例中，药物组合物的活性成分由如本文所述的活化CAR T细胞组成。用于基于细胞的治疗配制品的药学上可接受的载体包括盐水和水性缓冲溶液、林格氏溶液和血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL。如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等术语在本文中可互换使用。
在一些实施例中，该包含如本文所述的活化CAR T细胞的药物组合物可以是肠胃外剂型。由于肠胃外剂型的施用典型地绕过患者对污染物的天然防御，因此除了CAR T细胞本身之外的组分优选地是无菌的或能够在施用于患者之前进行灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于即用型注射溶液、随时可溶解或悬浮在药学上可接受的注射用媒介物中的干燥产品，即用于注射的悬浮液和乳液。这些中的任何一种都可以在施用前添加到活化CAR T细胞制剂中。
可用于提供如本文所披露的活化CAR T细胞的肠胃外剂型的合适媒介物是本领域技术人员熟知的。实例包括但不限于：盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介物包括但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；可与水混溶的媒介物，如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性媒介物，如但不限于玉米油、棉花籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
剂量
本文使用的术语“单位剂型”是指适合一次施用的剂量。举例来说，单位剂型可以是布置在递送装置(例如，注射器或静脉内滴注袋)中的一定量的治疗剂。在一个实施例中，单位剂型以单次施用的形式施用。在另一个实施例中，可以同时施用多于一个单位剂型。
在一些实施例中，本文所述的活化CAR T细胞作为单一疗法施用，即，对该病症的另一种治疗不同时施用于受试者。
包含本文所述T细胞的药物组合物通常可以以104到109个细胞/kg体重的剂量施用，在一些情况下，105到106个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。如果需要，T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。这些细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用(参见，例如，Rosenberg等人,New Eng.J.Med.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。
在某些方面，可能需要将活化CAR T细胞施用于受试者，然后随后重新抽取血液(或进行单采术)，如本文所述从其中活化T细胞，并将这些活化和扩增的T细胞重新输注给患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，T细胞可以从10cc至400cc的抽血中活化。在某些方面，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中活化。
施用方式可包括，例如静脉内(i.v.)注射或输注。本文所述的组合物可通过经动脉、肿瘤内、结节内或髓内施用于患者。在一些实施例中，T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。在一个实施例中，将本文所述的组合物施用到体腔或体液(例如，腹水、胸膜液、腹膜液或脑脊髓液)中。
在一个特定的示例性方面，受试者可进行白细胞去除术，其中白细胞被离体收集、富集或耗尽以选择和/或分离目的细胞，例如，T细胞。可以通过与人工APC(例如，表达抗CD28和抗CD3 CDR的aAPC)接触而扩增这些T细胞分离物，并且进行处理以使得可以引入该技术的一种或多种CAR构建体，从而产生CAR T细胞。有需要的受试者随后可以进行高剂量化学疗法的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在移植之后或移植的同时，受试者可以接受扩增的CAR T细胞的输注。在一个实施例中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。
在一些实施例中，在施用如本文所述的一种或多种CAR T细胞之前，对受试者进行淋巴细胞清除。在此类实施例中，该淋巴细胞清除可包括施用美法仑、环磷酰胺、环磷酰胺和氟达拉滨中的一种或多种。
应施用于患者的上述治疗的剂量将因所治疗病症的确切性质和治疗的接受者而变化。可以根据本领域公认的实践来进行人类施用剂量的缩放。
在一些实施例中，需要单一治疗方案。在其他实施例中，可以进行一种或多种后续剂量或治疗方案的施用。例如，在每两周一次的治疗持续三个月后，可以按每个月一次重复治疗，持续六个月或一年或更长。在一些实施例中，在初始治疗后不施用另外的治疗。
如本文所述的组合物的剂量可由医生确定，并根据需要调整以适应观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生典型地会监测受试者以确定治疗何时提供治疗益处，并确定是否施用进一步的细胞、停止治疗、恢复治疗或对治疗方案做出其他改变。剂量不应大到引起不良副作用，如细胞因子释放综合征。通常情况下，剂量将随患者的年龄、病症和性别而不同，并且可由本领域技术人员确定。在任何并发症的事件下，也可以由个别医师调整剂量。
组合疗法
如本领域技术人员可以确定的，本文所述的活化的CAR T细胞可以任选地彼此组合以及与其他已知的试剂和疗法组合使用。在一个实例中，可以组合施用靶向不同Treg标志物(例如，GARP、LAP等)的两个或更多个CAR T细胞。在另一个实例中，组合施用靶向不同癌症抗原的两个或更多个CAR T细胞。在另外的实例中，组合施用靶向Treg标志物(例如，GARP、LAP等)的一种或多种CAR T细胞和靶向一种或多种肿瘤抗原的一种或多种CAR T细胞。
如本文所用，“组合”施用是指在受试者患有疾病的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在受试者被诊断出患有该障碍后并且在该障碍被治愈或消除之前或治疗因其他原因停止治疗之前递送两种或更多种治疗。在一些实施例中，当第二次治疗的递送开始时仍在进行一种治疗的递送，从而在治疗施用方面存在重叠。这有时在本文中称为“同时(simultaneous)”或“同时递送(concurrent delivery)”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施例中，治疗由于组合施用而更有效。例如，第二次治疗更有效，例如，与没有第一次治疗的情况下施用第二次治疗相比，更少的第二次治疗观察到等同的作用，或者第二次治疗在更大程度上减轻了症状，或者观察到与第一次治疗时类似的情况。在一些实施例中，递送使得症状减轻或与障碍相关的其他参数的减小大于在没有一种治疗时递送的另一种治疗所观察到的。这两种治疗的作用可以是部分相加、完全相加或大于相加的作用。该递送可以使得当递送第二次治疗时仍然可以检测到递送的第一次治疗的作用。本文所述的活化CAR T细胞和至少一种另外的治疗剂可以同时施用、在相同或分开的组合物中施用或顺序施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所述的CAR表达细胞，并且可以第二次施用另外的试剂，或者可以逆转施用顺序。CAR T疗法和/或其他治疗剂、程序或方式可以在活动性障碍期间或在缓解期或活动性较低的疾病期间施用。CAR T疗法可以在另一种治疗之前施用、与该治疗同时施用、治疗后施用或在障碍缓解期间施用。
当组合施用时，活化CAR T细胞和另外的药剂(例如，第二或第三种药剂)，或全部，可以以与每种药剂单独使用(例如，作为单一疗法)的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量施用。在某些实施例中，活化CAR T细胞、另外的药剂(例如，第二或第三种药剂)或全部的施用量或剂量低于(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)单独使用的每种药剂的量或剂量。在其他实施例中，导致所需效果(例如，癌症治疗)的活化CAR T细胞、另外的药剂(例如，第二或第三种药剂)或全部的量或剂量低于(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)实现相同治疗效果所需的单独的每种药剂的量或剂量。在进一步的实施例中，治疗方案中本文所述的活化CAR T细胞可以与外科手术、化疗、放射、mTOR途径抑制剂、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体、或其他免疫清除剂(如CAMPATH)、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子或肽疫苗(如Izumoto等人,J.Neurosurg[神经外科杂志]108:963-971，2008中描述的那些)一起使用。
在一个实施例中，本文所述的活化CAR T细胞可以与检查点抑制剂组合使用。示例性检查点抑制剂包括抗PD-1抑制剂(纳武单抗、MK-3475、派姆单抗、吡地利单抗、AMP-224、AMP-514)、抗CTLA4抑制剂(伊匹单抗和替西木单抗)、抗PDL1抑制剂(阿特珠单抗、阿威罗单抗(Avelomab)、MSB0010718C、MEDI4736和MPDL3280A)，以及抗TIM3抑制剂。
在一个实施例中，本文所述的活化CAR T细胞可以与化学治疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包括蒽环霉素(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷化剂(例如，环磷酰胺、氮烯咪胺、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)、抗代谢药(包括，例如，叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调节剂(如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺))。考虑用于组合疗法的一般化疗药物包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪放线菌素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西紫杉醇盐酸多柔比星依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎他滨、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲去甲氧柔红霉素异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶甲酰四氢叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌吉妥单抗、紫杉醇菲尼克斯(phoenix)(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、卡莫司汀聚苯丙生20植入片柠檬酸他莫西芬替尼泊苷6-硫代鸟嘌呤、噻替哌、替拉扎明注射用托泊替康盐酸盐长春碱长春新碱和长春瑞滨示例性的烷基化剂包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：乌拉莫司汀(Aminouracil Uracil nitrogen )、盐酸氮芥环磷酰胺( RevimmuneTM)、异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷三亚乙基三聚氰胺三亚乙基硫代磷胺、替莫唑胺噻替哌白消安卡莫司汀洛莫司汀链脲佐菌素和达卡巴嗪另外的示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(也称为放线菌素-D，)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶血素和苯丙氨酸氮芥、)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、)；卡莫司汀苯达莫司汀白消安(和)；卡铂洛莫司汀(也称为CCNU、)；顺铂(也称为CDDP、和)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、)；异环磷酰胺泼尼莫司汀；甲苄肼二氯甲基二乙胺(也称氮芥、芥酸和盐酸甲氯乙胺、)；链脲佐菌素噻替哌(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、)；环磷酰胺 和盐酸苯达莫司汀示例性的mTOR抑制剂包括，例如，替西罗莫司；地磷莫司(ridaforolimus，正式名称为deferolimus，(lR,2R,45)-4-[(2R)-2[(1R,95,125,15R,16E,18R,19R,21R,235,24E,26E,28Z,305,325,35R)-l,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-ll,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04'9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基亚膦酸盐，也称为AP23573和MK8669，并描述于PCT公开号WO 03/064383)；依维莫司或RADOOl)；雷帕霉素(AY22989，)；塞马莫德(CAS164301-51-3)；替西罗莫司，(5-{2,4-双[(35,)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-(i]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[iraw5,-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-JJ嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；和N2-[l,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-l-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰-L-a-天冬氨酰L-丝氨酸-内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)和XL765。示例性免疫调节剂包括，例如，阿伏珠单抗(可从获得)；培非格司亭来那度胺(CC-5013，)；沙利度胺阿替米德(actimid)(CC4047)；和IRX-2(人细胞因子的混合物，包括白细胞介素1、白细胞介素2和干扰素γ，CAS 951209-71-5，可从IRX治疗公司(IRX Therapeutics)获得)。示例性的蒽环霉素包括，例如，多柔比星(和)；博莱霉素柔红霉素(盐酸多柔比星、道诺霉素和盐酸鲁维多霉素，)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，)；米托蒽醌(DHAD，)；表柔比星(EllenceTM)；去甲氧柔红霉素(Idamycin)；丝裂霉素C格尔德霉素；除莠霉素；拉维霉素；和去乙酰基拉维霉素。示例性的长春花生物碱包括，例如，长春瑞滨酒石酸盐长春新碱和长春地辛)；长春碱(也称为长春碱硫酸盐、长春花碱和VLB，和)；和长春瑞滨示例性蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米卡非佐米(PX-171-007，(5)-4-甲基-N-((5)-l-(((5)-4-甲基-l-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-l-氧代戊-2-基)氨基)-l-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((5,)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；玛丽佐米(marizomib)(NPT0052)；柠檬酸艾沙佐米(MLN-9708)；地兰佐米(delanzomib)(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(llS')-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-l-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
本领域技术人员可以容易地鉴定使用的化学治疗剂(例如，参见Physicians’Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014[癌症化疗药物医生手册2014],Edward Chu,Vincent T.DeVita Jr.,Jones&Bartlett Learning[琼斯和巴特利特学习]；Principlesof Cancer Therapy[癌症治疗原理],Harrison,Principles of Internal Medicine[内科原理]第85章,第18版；Therapeutic Targeting of Cancer Cells:Era of MolecularlyTargeted Agents and Cancer Pharmacology[癌细胞治疗靶向：分子靶向药物和癌症药理学时代],Abeloff,Clinical Oncology[临床肿瘤学]第28-29章,2013Elsevier[爱思唯尔]；以及Fischer D.S.(编):The Cancer Chemotherapy Handbook[癌症化疗手册],第4版St.Louis,Mosby-Year Book[年鉴],2003)。
在一个实施例中，将本文所述的活化CAR T细胞与降低靶向GITR和/或调节GITR功能的分子的水平和/或活性的分子、降低Treg细胞群的分子、mTOR抑制剂、GITR激动剂、激酶抑制剂、非受体酪氨酸激酶抑制剂、CDK4抑制剂和/或BTK抑制剂组合施用于受试者。
功效
活化CAR T细胞的功效，例如在本文所述病症的治疗中的功效，或诱导如本文所述的应答的功效(例如，癌细胞的减少)，可由技术熟练的临床医生确定。然而，如本文所用的治疗被认为是“有效治疗”的术语，是指本文所述病症的一种或多种体征或症状以有益方式改变，其他临床上可接受的症状得到改善，或甚至是减轻，或者根据本文所述的方法治疗后诱导所需的应答，例如至少10％。例如，可以通过测量根据本文所述方法治疗的病症的标志物、指标、症状和/或发病率或任何其他适当的可测量参数来评估功效。根据本文所述的方法的治疗可以减少标志物的水平或病症的症状，例如，减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。
通过住院、或医学干预的需要评估的个体恶化失败(即，疾病的进展停止)也可以测量功效。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述的。
治疗包括对个体或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性实例包括人或动物)并且包括：(1)抑制疾病，例如,预防症状恶化(例如，疼痛或炎症)；或(2)缓解疾病的严重程度，例如，引起症状消退。用于治疗疾病的有效量是指当施用于有需要的受试者时足以导致对该疾病如本文所定义的有效治疗时的量。可以通过评估病症或所需的应答的物理指标来确定药剂的功效。通过测量任何一个此类参数或任何参数组合来监测施用和/或治疗的功效，这在本领域技术人员的能力范围之内。可以在本文所述病症的动物模型中评估给定方法的功效。当使用实验动物模型时，当观察到统计学上显著的标志物改变时治疗的效果得到证明。
所有专利和其他公开；包括参考文献、已授权的专利、已公布的专利申请和共同未决的专利申请；在整个本申请中引用的内容通过引用明确地并入本文，用于描述和披露，例如，在这些公开中描述的方法，其可以与本文所述的技术结合使用。只提供在本申请的申请日之前披露的这些出版物。在此方面的所有内容都不应当解释为承认本发明人由于在先有技术或任何其他原因而无权先于这类公开内容。关于日期或关于这些文件内容的表述的所有陈述均基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
本公开文本的实施例的描述并不旨在是穷尽性的或旨在将本发明局限于披露的精确形式。虽然本文中出于说明性目的描述了本公开文本的特定实施例和实例，但是正如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开内容的范围内可以进行各种等同性修改。例如，虽然以给定顺序呈现方法步骤或功能，但是替代实施例可以以不同顺序执行功能，或者可以基本上同时执行功能。本文提供的本公开文本的传授内容可以适当地应用于其他程序或方法。可以将本文所述的不同实施例组合以提供进一步的实施例。如有必要，可以修改本公开文本的各方面，以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开文本的再进一步的实施例。此外，由于生物功能等效性考虑，可以在蛋白质结构中进行一些改变而不影响种类或数量的生物或化学作用。可以根据具体实施方式对本公开内容作出这些以及其他改变。所有这类修改旨在包括在所附权利要求书的范围内。
任何前述实施例的具体元件可以进行组合或取代其他实施例中的元件。此外，虽然已经在这些实施例的上下文中描述了与本公开文本的某些实施例相关联的优势，但是其他实施例也可以展现出这样的优势，并且并非所有实施例都必须表现出这些优势方可落入本公开内容的范围内。
通过以下实例来进一步说明本文所述的技术，这些实例绝不应被解释为进一步的限制。
实例
实例1.靶向EGFRvIII的CAR T细胞
具有EGFRvIII抗原结合部分的CAR T细胞(例如CART-EGFRvIII细胞)代表了一种有前途的可将溶细胞性细胞特异性靶向肿瘤微环境的细胞疗法，部分原因是EGFRvIII在肿瘤组织上特异性表达，而在健康组织上通常不表达。在该实例中，在两个动物模型中体外和体内测试CART-EGFRvIII细胞。
以珠与细胞的比率为3:1用Dynabeads(人T激活剂CD3/CD28)刺激来自去识别的贡者的白细胞分离术产品的T细胞并在完全RPMI 1640培养基中培养。刺激和慢病毒转导后十天，将细胞冷冻并保存以用于功能测定。
在二十小时的基于萤光素酶的测定中，体外进行了初步测试，以表征CAR-EGFRvIII细胞相对于未转导的对照细胞优先杀死肿瘤细胞的能力，如图1所示。人胶质瘤细胞系U87vIII被用作靶细胞。体外表征表明，EGFRvIII CAR T细胞介导针对U87vIII细胞的显著的特异性细胞毒性(图1)。
对于体内实验，在对数生长期收集U87vIII肿瘤细胞，洗涤，并在人成胶质细胞瘤的异种移植模型中皮下施用(图2A和2B)或在人胶质瘤模型中颅内施用于小鼠(图3A和3B)。对于颅内施用，使用立体定向框架将50微升汉密尔顿(Hamilton)注射器的针头置于前囟右侧2mm，冠状缝颅骨表面下方4mm。为了进行治疗，通过尾静脉向小鼠注入CAR T细胞一次(每只小鼠1x 106个CAR转导的T细胞)。
体外观察到的有效抗肿瘤作用反映在人成胶质细胞瘤的体内皮下异种移植模型中(图2A和2B)。在该模型中，已成形的大块肿瘤(上排)对CART-EGFRvIII有应答(图2B)，而未转导的细胞并不能阻止肿瘤的生长(图2A)。在颅内人胶质瘤的小鼠模型中，相对于未转导的细胞(图3A)，EGFRvIII CAR T细胞减慢了肿瘤的生长并导致延长的存活期(图3B)。尽管肿瘤的生长被消除，但其效果却不如针对皮下肿瘤的效果明显。
用CART-EGFRvIII细胞处理后，在人类患者的肿瘤组织中观察到了调节性T细胞(Treg)的存在(图4A和4B)。为了确定大脑浸润性Treg是否在抑制CART-EGFRvIII细胞中具有功能性作用，进行体外Treg抑制测定，其中在Treg存在下将CART-EGFRvIII细胞(红色)和胶质瘤细胞(绿色)孵育18小时。如图5A-5C所示，通过IncyCyte活细胞分析获得结果。尽管非特异性CAR细胞允许胶质瘤细胞增殖(图5A和5D，顶部线)，但CART-EGFRvIII细胞杀死了胶质瘤细胞(图5B和5D，底部线)。然而，在共培养物中添加Treg显着降低了CART-EGFRvIII细胞杀死靶胶质瘤细胞的能力(图5C和5D，中部线)。
实例2.靶向Treg相关抗原的CAR T细胞的设计和表征
图6A-6C、7A和7B显示了实验的结果，在该实验中LAP和GARP被鉴定为人外周血细胞上的Treg相关标志物。特别地，在未被离体活化的人Treg中，大约27％的人表达了LAP，大约4％的人对LAP和GARP呈双重阳性(图6B)。一旦使用抗CD3、抗CD8和IL-2进行离体活化，大约30％的人表达LAP，并且LAP/GARP双重阳性Treg的数量会增加到12.3％(图6C)。
接下来，设计了编码靶向LAP和GARP的CAR的CAR构建体。这些构建体的示意图示于图8A-8D中。靶向Treg的构建体包括两个靶向LAP的CAR(CAR-LAP-L-H(图8A)和CAR-LAP-H-L(图8B)；其中每个抗LAP scFv在重链(H)和轻链(L)排列上包含反向链(reversal))，靶向GARP的CAR构建体(CAR-GARP；图8C)，以及进一步编码抗GARP骆驼科动物抗体的靶向EGFR的CAR构建体(CAR-EGFR-GARP；图8D)。使用流式细胞术通过测量mCherry阳性细胞的百分比来评估每个构建体的转导效率，并在下面提供。
靶向Treg的CAR构建体的转导效率
为了测试抗LAP CART细胞，将CAR T细胞与从相同供体扩增的分离的Treg共培养，并转导以表达GFP作为Treg标志物。在杀死测定之前，将Treg用抗CD3和抗CD28活化过夜(图9B)或静置过夜(图9A)。每孔接种62,500个Treg。以与Treg所指示的比率添加CAR。在300U/mL IL-2的存在下，将培养物孵育三天。在第3天通过每孔收集30,000个事件进行流式细胞术。将细胞毒性百分比计算为与含有Treg的未转导的T细胞培养物相比，GFP阳性细胞减少的百分比。与CART-LAP-L-H相比，CART-LAP-H-L在杀死未活化的Treg方面更有效。然后在持续四天的、以CAR T细胞与Treg的比率为1:1的涉及两个不同供体的类似Treg杀伤测定中，将靶向LAP的CAR T细胞与靶向GARP的CART细胞进行比较(图10A和10B)。图11A和11B通过三天共培养结束时剩余的靶Treg数量随CAR T细胞与Treg细胞的比率而变化来表征相对于未转导的对照，靶向LAP的CAR T细胞对非活化和活化Treg的杀伤作用。图11C和11D显示了来自同一供体的类似数据，其中通过荧光素酶表达测量细胞毒性。
为了进一步表征抗原表达对靶向LAP和GARP的CAR T细胞功能的影响，针对LAP和GARP抗原的表达对永生细胞系进行了筛选，并评估了每个CAR T细胞的细胞毒性作用。首先，对HUT78细胞，即表达IL-2的人皮肤CD4 T细胞淋巴细胞来源的细胞系，针对GARP和LAP进行染色(分别为图12A和12B)，并确认了HUT78细胞的LAP表达。接下来，通过细胞毒性测定，确定CART-LAP-H-L和CART-LAP-L-H细胞介导的对HUT78细胞的细胞毒性(图13A和13B)。接下来，对SeAx(IL-2依赖性人Sezary综合征来源的细胞)针对GARP和LAP进行染色(分别为图14A和14B)，并确认了两种抗原的表达。将SeAx细胞与CART-GARP细胞、CART-LAP-H-L细胞、CART-LAP-L-L细胞和未转导细胞共培养，以定量在24小时(图15A)和48小时(图15B)CART细胞介导的杀伤作用。每个CAR T在24小时时均表现出优异的SeAx靶细胞杀伤力作用，在48小时时效果更明显。CART-GARP和CART-LAP-H-L杀死靶SeAx细胞的效率比CART-LAP-L-H细胞高48小时。
接下来，通过蛋白质印迹来表征CART-EGFR-GARP细胞的抗GARP骆驼科动物抗体分泌(图16A-16C)。从含有CART-EGFR-GARP细胞的培养物中收集上清液，在还原和非还原条件下进行处理，并在含有非还原样品的泳道中观察到10至15kD的条带存在(图16C)，从而证实了骆驼科动物抗体的存在。
实例3.BiTE分泌性CAR T细胞的设计和表征
本文提供的增强肿瘤微环境内CAR T细胞活性功效(例如，以克服Treg的免疫调节作用)的另一机制是通过分泌免疫调节抗体如BiTE的CAR T细胞。不希望受理论的束缚，本发明人发现，从还编码CAR的构建体表达免疫调节抗体(例如BiTE)可以进一步放大抗肿瘤作用。
一种示例性核酸构建体，CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)，如图17所示，包括与BiTE编码多核苷酸5’可操作地连接的CAR编码多核苷酸。CAR具有与EGFRvIII结合的肿瘤抗原结合结构域，其可将CAR T细胞指向EGFRvIII阳性肿瘤的微环境。如图18所示，BiTE在一个结构域上与EGFR结合，在另一结构域上与CD3结合，这能够(a)进一步增强宿主CAR T细胞与肿瘤细胞的结合亲和力或(b)使邻近的(例如内源性)T细胞抵御肿瘤。BiTE的侧翼是可裂解的接头P2A和T2A，以使BiTE单独分泌，而CAR靶向细胞表面。在图26A和26B中描绘了其他示例性的BiTE编码CAR构建体(例如，编码靶向CD19的BiTE)。
通过以下确认CART-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)细胞的BiTE分泌：从含有经CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)转导的SupT1细胞的培养物中分离上清液，基于OD450计算上清液中BiTE浓度，并进行蛋白质印迹分析。上清液中BiTE的浓度为0.604ng/mL。蛋白质印迹实验的结果如图19所示。在第二泳道中观察到约50-60kD的条带，表明上清液中存在BiTE分子。
接下来，通过流式细胞术评估BiTE分子的结合。用CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)转导HEK293T细胞，并收集含有分泌的BiTE的上清液，并与K562细胞(图20A)和Jurkat细胞(图20B)一起孵育。如图20A所示，BiTE结合表达EGFR的K562细胞，但不结合表达CD19的K562细胞，证实了BiTE的EGFR结合结构域的功能。如图20B中所示，在与来自未转导的HEK293T细胞的上清液一起孵育后的针对BiTE的染色比较，在与来自表达CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)的HEK293T细胞的上清液一起孵育后，表达CD3的Jurkat细胞显示针对BiTE的染色更强，表明BiTE也功能性结合CD3。
使用SupT1细胞作为CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)的转导宿主，进行了类似的实验。图21A显示BiTE结合表达EGFR的K562细胞，但不结合表达CD19的K562细胞，证实了由转导的SupT1细胞表达的BiTE的EGFR结合结构域的功能。为了确认BiTE与宿主SupT1细胞表面表达的CD3结合，对转导的SupT1细胞针对BiTE进行染色。结果如图21B所示，证实转导的SupT1细胞针对BiTE染色阳性。还评估了ND4细胞在用CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)转导后分泌功能性BiTE的能力。图22A显示了由转导的ND4细胞分泌的BiTE结合表达EGFR的K562细胞并且不结合表达CD19的K562细胞。如图22B所示，BiTE与CD3结合，该CD3在从分泌其的转导ND4细胞上表达。
接下来，在体外表征从转导的CAR T细胞分泌BiTE的能力。将含有从用CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3)转导的HEK293T细胞分泌的BiTE的上清液与未转导的ND4细胞和U87vIII靶细胞的共培养物以不同比率一起孵育。如图23所示，ND4细胞以剂量依赖性方式与BiTE一起孵育，表明BiTE与表达ND4的CD3和表达U87vIII的EGFR二者结合的程度足以诱导ND4细胞的杀伤作用。
为了在T细胞活化时能够诱导表达BiTE，设计并合成了包含NFAT启动子的构建体。如图24中所示，NFAT启动子在编码GFP的多核苷酸之前，并且该构建体进一步包括由组成型启动子EF1α驱动的下游CAR编码多核苷酸。为了证实GFP的诱导型表达，响应于PMA/离子霉素引起的TCR刺激，通过FACS评估了GFP的表达。如在图25A和25B中，刺激触发了GFP的表达。通过与PEPvIII一起孵育抑制了这种诱导型表达。如图27A和27B所示，通过将BiTE定位在诱导型启动子(如NFAT启动子)的下游来设计编码CAR的诱导型BiTE构建体。
实例4.序列信息
抗GARP CAR-pMGH 97：CD8前导-抗GARP-CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(SEQ ID NO:1)，包含CD8前导序列(SEQ ID NO:1的氨基酸1-21；SEQ ID NO:2)；抗GARP骆驼科动物(SEQ IDNO:1的氨基酸22-128；SEQ ID NO:3)；CD8铰链/TM结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸129-197；SEQ ID NO:4)；4-1BB ICD(SEQ ID NO:1的氨基酸198-239；SEQ ID NO:5)；和CD3ζ(SEQ IDNO:1的氨基酸240-351；SEQ ID NO:6)。
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCQASQSISSYLAWYQQKPGQAPNILIYGASRLKTGVPSRFSGSGSGTSFTLTISGLEAEDAGTYYCQQYASVPVTFGQGTKVELKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:1)
CD8前导序列(SEQ ID NO:1的氨基酸1-21；SEQ ID NO:2)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
抗GARP骆驼科动物(SEQ ID NO:1的氨基酸22-128；SEQ ID NO:3)
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCQASQSISSYLAWYQQKPGQAPNILIYGASRLKTGVPSRFSGSGSGTSFTLTISGLEAEDAGTYYCQQYASVPVTFGQGTKVELK
CD8铰链/TM结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸129-197；SEQ ID NO:4)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
4-1BB ICD(SEQ ID NO:1的氨基酸198-239；SEQ ID NO:5)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3ζ(SEQ ID NO:1的氨基酸240-351；SEQ ID NO:6)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
抗LAP CAR(H-L)-pMGH 99：CD8前导-抗LAP-CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(SEQ ID NO:7)，包含CD8前导序列(SEQ ID NO:7的氨基酸1-21；SEQ ID NO:8)、抗LAP scFv(H-L)(SEQID NO:7的氨基酸22-307；SEQ ID NO:9)、CD8铰链/TM结构域(SEQ ID NO:7的氨基酸308-376；SEQ ID NO:10)、4-1BB ICD(SEQ ID NO:7的氨基酸377-418；SEQ ID NO:11)和CD3ζ(SEQ ID NO:7的氨基酸419-530；SEQ ID NO:12)。
MALPVTALLLPLALLLHAARPMKLWLNWIFLVTLLNDIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKPNGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNVLRAEDSATYYCARYTGGGYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRLTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQADIATYFCQQGDTLPWTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:7)
CD8前导序列(SEQ ID NO:7的氨基酸1-21；SEQ ID NO:8)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
抗LAP scFv(H-L)(SEQ ID NO:7的氨基酸22-307；SEQ ID NO:9)
MKLWLNWIFLVTLLNDIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKPNGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNVLRAEDSATYYCARYTGGGYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRLTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQADIATYFCQQGDTLPWTFGGGTKLEIK
CD8铰链/TM结构域(SEQ ID NO:7的氨基酸308-376；SEQ ID NO:10)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGT CGVLLLSLVITLYC
4-1BB ICD(SEQ ID NO:7的氨基酸377-418；SEQ ID NO:11)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3ζ(SEQ ID NO:7的氨基酸419-530；SEQ ID NO:12)。
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
抗LAP CAR(L-H)-pMGH 100：CD8前导-抗LAP-CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(SEQ IDNO:13)，包含CD8前导(SEQ ID NO:13的氨基酸1-21；SEQ ID NO:14)、抗LAP scFv(L-H)(SEQID NO:13的氨基酸22-307；SEQ ID NO:15)、CD8铰链/TM(SEQ ID NO:13的氨基酸308-376；SEQ ID NO:16)、4-1BB ICD(SEQ ID NO:13的氨基酸377-418；SEQ ID NO:17)和CD3z(SEQID NO:13的氨基酸419-530；SEQ ID NO:18)。
MALPVTALLLPLALLLHAARPMMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRLTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQADIATYFCQQGDTLPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMKLWLNWIFLVTLLNDIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKPNGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNVLRAEDSATYYCARYTGGGYFDYWGQGTTLTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:13)
CD8前导(SEQ ID NO:13的氨基酸1-21；SEQ ID NO:14)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
抗LAP scFv(L-H)(SEQ ID NO:13的氨基酸22-307；SEQ ID NO:15)
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRLTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQADIATYFCQQGDTLPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMKLWLNWIFLVTLLNDIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKPNGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNVLRAEDSATYYCARYTGGGYFDYWGQGTTLTVSS
CD8铰链/TM(SEQ ID NO:13的氨基酸308-376；SEQ ID NO:16)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
4-1BB ICD(SEQ ID NO:13的氨基酸377-418；SEQ ID NO:17)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3z(SEQ ID NO:13的氨基酸419-530；SEQ ID NO:18)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
抗EGFR CAR分泌性GARP骆驼科动物-pMGH 105：CD8前导-抗EGFR-CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z-抗GARP骆驼科动物(SEQ ID NO:19)，包含CD8前导(SEQ ID NO:19的氨基酸1-21；SEQ ID NO:20)、抗EGFR scFv(SEQ ID NO:19的氨基酸22-267；SEQ ID NO:21)、CD8铰链/TM(SEQ ID NO:19的氨基酸268-336；SEQ ID NO:22)、4-1BB(SEQ ID NO:19的氨基酸337-378；SEQ ID NO:23)、CD3z(SEQ ID NO:19的氨基酸379-490；SEQ ID NO:24)、2A裂解序列(SEQID NO:19的氨基酸494-515；SEQ ID NO:31)、IgK前导(SEQ ID NO:19的氨基酸519-539；SEQID NO:32)和抗GARP骆驼科动物(SEQ ID NO:19的氨基酸540-646；SEQ ID NO:25)。
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRPGSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRTAMETDTLLLWVLLLWVPGSTGDDIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCQASQSISSYLAWYQQKPGQAPNILIYGASRLKTGVPSRFSGSGSGTSFTLTISGLEAEDAGTYYCQQYASVPVTFGQGTKVELKHHHHHHSG(SEQ ID NO:19)
CD8前导(SEQ ID NO:19的氨基酸1-21；SEQ ID NO:20)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
抗EGFR scFv(SEQ ID NO:19的氨基酸22-267；SEQ ID NO:21)
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK
CD8铰链/TM(SEQ ID NO:19的氨基酸268-336；SEQ ID NO:22)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
4-1BB(SEQ ID NO:19的氨基酸337-378；SEQ ID NO:23)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3z(SEQ ID NO:19的氨基酸379-490；SEQ ID NO:24)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
2A裂解序列(SEQ ID NO:19的氨基酸494-515；SEQ ID NO:31)
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
IgK前导(SEQ ID NO:19的氨基酸519-539；SEQ ID NO:32)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD
抗GARP骆驼科动物(SEQ ID NO:19的氨基酸540-646；SEQ ID NO:25)。
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCQASQSISSYLAWYQQKPGQAPNILIYGASRLKTGVPSRFSGSGSGTSFTLTISGLEAEDAGTYYCQQYASVPVTFGQGTKVELK
pMGH113-3C10 scFv-CD8铰链/TM-4-1BB ICD-CD3z-P2A-IgK前导-西妥昔单抗scFv-CD3 scFv-His标签(SEQ ID NO:26)，包含3C10 scFv(SEQ ID NO:26的氨基酸1-243；SEQ ID NO:27)、CD8铰链/TM(SEQ ID NO:26的氨基酸244-312；SEQ ID NO:28)、4-1BB ICD(SEQ ID NO:26的氨基酸313-354；SEQ ID NO:29)、CD3z(SEQ ID NO:26的氨基酸355-466；SEQ ID NO:30)、P2A(SEQ ID NO:26的氨基酸467-488；SEQ ID NO:31)、IgK前导(SEQ IDNO:26的氨基酸491-511；SEQ ID NO:32)、西妥昔单抗scFv(SEQ ID NO:26的氨基酸512-752；SEQ ID NO:33)、CD3 scFv(SEQ ID NO:26的氨基酸758-1000；SEQ ID NO:34)。
EIQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIEDYYIHWVKQRTEQGLEWIGRIDPENDETKYGPIFQGRATITADTSSNTVYLQLSSLTSEDTAVYYCAFRGGVYWGPGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSHMDVVMTQSPLTLSVAIGQSASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPGTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPPRMETDTLLLWVLLLWVPGSTGDDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID NO:26)
3C10 scFv(SEQ ID NO:26的氨基酸1-243；SEQ ID NO:27)
EIQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIEDYYIHWVKQRTEQGLEWIGRIDPENDETKYGPIFQGRATITADTSSNTVYLQLSSLTSEDTAVYYCAFRGGVYWGPGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSHMDVVMTQSPLTLSVAIGQSASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPGTFGGGTKLEIK
CD8铰链/TM(SEQ ID NO:26的氨基酸244-312；SEQ ID NO:28)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
4-1BB ICD(SEQ ID NO:26的氨基酸313-354；SEQ ID NO:29)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3z(SEQ ID NO:26的氨基酸355-466；SEQ ID NO:30)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
P2A(SEQ ID NO:26的氨基酸467-488；SEQ ID NO:31)
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
IgK前导(SEQ ID NO:26的氨基酸491-511；SEQ ID NO:32)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD
西妥昔单抗scFv(SEQ ID NO:26的氨基酸512-752；SEQ ID NO:33)
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA
CD3 scFv(SEQ ID NO:26的氨基酸758-1000；SEQ ID NO:34)
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
pMGH133-2173scFv-CD8铰链/TM-4-1BB ICD-CD3z-P2A-IgK前导-西妥昔单抗scFv-CD3 scFv-His标签(SEQ ID NO:35)，包含2173scFv(SEQ ID NO:35的氨基酸1-246；SEQ ID NO:36)、CD8铰链/TM(SEQ ID NO:35的氨基酸247-315；SEQ ID NO:37)、4-1BB ICD(SEQ ID NO:36的氨基酸316-357；SEQ ID NO:38)、CD3z(SEQ ID NO:35的氨基酸358-469；SEQ ID NO:39)、P2A(SEQ ID NO:35的氨基酸470-491；SEQ ID NO:40)、IgK前导(SEQ IDNO:35的氨基酸494-514；SEQ ID NO:41)、西妥昔单抗scFv(SEQ ID NO:35的氨基酸515-755；SEQ ID NO:42)和CD3 scFv(SEQ ID NO:35的氨基酸761-1003；SEQ ID NO:43)。
EIQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGFNIEDYYIHWVRQMPGKGLEWMGRIDPENDETKYGPIFQGHVTISADTSINTVYLQWSSLKASDTAMYYCAFRGGVYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQKPGQPPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGTHFPGTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPPRMETDTLLLWVLLLWVPGSTGDDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID NO:35)
2173scFv(SEQ ID NO:35的氨基酸1-246；SEQ ID NO:36)
EIQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGFNIEDYYIHWVRQMPGKGLEWMGRIDPENDETKYGPIFQGHVTISADTSINTVYLQWSSLKASDTAMYYCAFRGGVYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQKPGQPPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGTHFPGTFGGGTKVEIK
CD8铰链/TM(SEQ ID NO:35的氨基酸247-315；SEQ ID NO:37)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
4-1BB ICD(SEQ ID NO:35的氨基酸316-357；SEQ ID NO:38)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3z(SEQ ID NO:35的氨基酸358-469；SEQ ID NO:39)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
P2A(SEQ ID NO:35的氨基酸470-491；SEQ ID NO:40)
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
IgK前导(SEQ ID NO:35的氨基酸494-514；SEQ ID NO:41)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD
西妥昔单抗scFv(SEQ ID NO:35的氨基酸515-755；SEQ ID NO:42)
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA
CD3 scFv(SEQ ID NO:35的氨基酸761-1003；SEQ ID NO:43)
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
pMGH134-2173scFv-CD8铰链/TM-4-1BB ICD-CD3z-P2A-IgK前导-CD19 scFv-CD3scFv-His标签(SEQ ID NO:44)，包含2173scFv(SEQ ID NO:44的氨基酸1-246；SEQ ID NO:45)、CD8铰链/TM(SEQ ID NO:44的氨基酸247-315；SEQ ID NO:46)、4-1BB ICD(SEQ ID NO:44的氨基酸316-357；SEQ ID NO:47)、CD3z(SEQ ID NO:44的氨基酸358-469；SEQ ID NO:48)、P2A(SEQ ID NO:44的氨基酸470-491；SEQ ID NO:49)、IgK前导(SEQ ID NO:44的氨基酸494-514；SEQ ID NO:50)、CD19 scFv(SEQ ID NO:44的氨基酸515-764；SEQ ID NO:51)、CD3 scFv(SEQ ID NO:44的氨基酸770-1012；SEQ ID NO:52)。
EIQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGFNIEDYYIHWVRQMPGKGLEWMGRIDPENDETKYGPIFQGHVTISADTSINTVYLQWSSLKASDTAMYYCAFRGGVYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQKPGQPPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGTHFPGTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPPRMETDTLLLWVLLLWVPGSTGDDIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID NO:44)
2173scFv(SEQ ID NO:44的氨基酸1-246；SEQ ID NO:45)
EIQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGFNIEDYYIHWVRQMPGKGLEWMGRIDPENDETKYGPIFQGHVTISADTSINTVYLQWSSLKASDTAMYYCAFRGGVYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQKPGQPPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGTHFPGTFGGGTKVEIK
CD8铰链/TM(SEQ ID NO:44的氨基酸247-315；SEQ ID NO:46)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
4-1BB ICD(SEQ ID NO:44的氨基酸316-357；SEQ ID NO:47)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3z(SEQ ID NO:44的氨基酸358-469；SEQ ID NO:48)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
P2A(SEQ ID NO:44的氨基酸470-491；SEQ ID NO:49)
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
IgK前导(SEQ ID NO:44的氨基酸494-514；SEQ ID NO:50)
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CD19 scFv(SEQ ID NO:44的氨基酸515-764；SEQ ID NO:51)
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pMGH135-(NFAT应答元件)-IgK前导-西妥昔单抗scFv-CD3scFv-His标签-(EF1a启动子)-2173scFv-CD8铰链/TM-4-1BB ICD-CD3z(SEQ ID NO:53)，包含IgK前导(SEQ ID NO:53的氨基酸1-21；SEQ ID NO:54)、西妥昔单抗scFv(SEQ ID NO:53的氨基酸22-262；SEQ IDNO:55)、CD3 scFv(SEQ ID NO:53的氨基酸268-510；SEQ ID NO:56)、2173scFv(SEQ ID NO:53的氨基酸517-762；SEQ ID NO:57)、CD8铰链/TM(SEQ ID NO:53的氨基酸763-831；SEQ IDNO:58)、4-1BB ICD(SEQ ID NO:53的氨基酸832-873；SEQ ID NO:59)、CD3z(SEQ ID NO:53的氨基酸874-985；SEQ ID NO:60)。
(NFAT应答元件)
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(EF1a启动子)
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IgK前导(SEQ ID NO:53的氨基酸1-21；SEQ ID NO:54)
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西妥昔单抗scFv(SEQ ID NO:53的氨基酸22-262；SEQ ID NO:55)
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pMGH136-(NFAT应答元件)-IgK前导-CD19 scFv-CD3 scFv-His标签-(EF1a启动子)-2173scFv-CD8铰链/TM-4-1BB ICD-CD3z(SEQ ID NO:61)，包含(NFAT应答元件)、IgK前导(SEQ ID NO:61的氨基酸1-21；SEQ ID NO:62)、CD19 scFv(SEQ ID NO:61的氨基酸22-271；SEQ ID NO:63)、CD3 scFv(SEQ ID NO:61的氨基酸277-519；SEQ ID NO:64)、2173scFv(SEQ ID NO:61的氨基酸526-771；SEQ ID NO:65)、CD8铰链/TM(SEQ ID NO:61的氨基酸772-840；SEQ ID NO:66)、4-1BB ICD(SEQ ID NO:61的氨基酸841-882；SEQ ID NO:67)、CD3z(SEQ ID NO:61的氨基酸883-994；SEQ ID NO:68)。
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(EF1a启动子)
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IgK前导(SEQ ID NO:61的氨基酸1-21；SEQ ID NO:62)
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CD3 scFv(SEQ ID NO:61的氨基酸277-519；SEQ ID NO:64)
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2173scFv(SEQ ID NO:61的氨基酸526-771；SEQ ID NO:65)
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CD8铰链/TM(SEQ ID NO:61的氨基酸772-840；SEQ ID NO:66)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
4-1BB ICD(SEQ ID NO:61的氨基酸841-882；SEQ ID NO:67)
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CD3z(SEQ ID NO:61的氨基酸883-994；SEQ ID NO:68)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
本发明的其他方面在以下编号的段落的范围内。
1.一种包含异源核酸分子的嵌合抗原受体(CAR)T细胞，其中该异源核酸分子包含：
(a)编码CAR的第一多核苷酸，该第一多核苷酸包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及
(b)编码治疗剂的第二多核苷酸。
2.如段落1所述的CAR T细胞，其中该治疗剂包含抗体试剂。
3.如段落2所述的CAR T细胞，其中该抗体试剂包含单链抗体或单结构域抗体。
4.如段落2或3所述的CAR T细胞，其中该抗体试剂包含双特异性抗体试剂。
5.如段落4所述的CAR T细胞，其中该双特异性抗体试剂包含双特异性T细胞接合子(BiTE)。
6.如段落3所述的CAR T细胞，其中该单结构域抗体包含骆驼科动物抗体。
7.如段落1所述的CAR T细胞，其中该治疗剂包含细胞因子。
8.如段落1至7中任一项所述的CAR T细胞，其中该CAR和该治疗剂以多蛋白的形式产生，该多蛋白被裂解以生成单独的CAR和治疗剂分子。
9.如段落8所述的CAR T细胞，其中该多蛋白包含在该CAR和该治疗剂之间的可裂解部分。
10.如段落9所述的CAR T细胞，其中该可裂解部分包含2A肽。
11.如段落10所述的CAR T细胞，其中该2A肽包含P2A或T2A。
12.如段落1至11中任一项所述的CAR T细胞，其中该CAR和该治疗剂各自组成性表达。
13.如段落1至12中任一项所述的CAR T细胞，其中该CAR和该治疗剂的表达受延伸因子-1α(EF1α)启动子驱动。
14.如段落1至11中任一项所述的CAR T细胞，其中该治疗剂在诱导型启动子的控制下表达，该诱导型启动子任选地可被T细胞受体或CAR信号传导诱导。
15.如段落14所述的CAR T细胞，其中该诱导型启动子包含NFAT启动子。
16.如段落1至11中任一项所述的CAR T细胞，其中该CAR在组成型启动子的控制下表达并且该治疗剂在诱导型启动子的控制下表达，该诱导型启动子任选地可被T细胞受体或CAR信号传导诱导。
17.如段落1至16中任一项所述的CAR T细胞，其中该CAR进一步包含一个或多个共刺激结构域。
18.如段落1至17中任一项所述的CAR T细胞，其中该CAR的抗原结合结构域包含抗体、单链抗体、单结构域抗体或配体。
19.如段落1至18中任一项所述的CAR T细胞，其中该CAR的跨膜结构域包含CD8铰链/跨膜结构域，该CD8铰链/跨膜结构域任选地包含SEQ ID NO:4、10、16、22、28、37、46、58和66中任一项的序列，或其变体。
20.如段落1至19中任一项所述的CAR T细胞，其中该细胞内信号传导结构域包含CD3ζ细胞内信号传导结构域，该CD3ζ细胞内信号传导结构域任选地包含SEQ ID NO:6、12、18、24、30、39、48、60和68中任一项的序列，或其变体。
21.如段落1至20中任一项所述的CAR T细胞，该CAR T细胞包含4-1BB共刺激结构域，该4-1BB共刺激结构域任选地包含SEQ ID NO:5、11、17、23、29、38、47、59和67中任一项的序列，或其变体。
22.如段落1至21中任一项所述的CAR T细胞，其中当该治疗剂包含抗体试剂时，该CAR抗原结合结构域或该治疗剂与肿瘤相关抗原结合。
23.如段落22所述的CAR T细胞，其中与该CAR抗原结合结构域或该治疗剂结合的该肿瘤相关抗原是实体肿瘤相关抗原。
24.如段落22或23所述的CAR T细胞，其中与该CAR抗原结合结构域或该治疗剂结合的该肿瘤相关抗原包含表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、EGFR、CD19、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或IL-13受体α2(IL-13Rα2)，并且任选地，该CAR抗原结合结构域或该治疗剂包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:21、27、33、36、42、45、51、55、57、63、65，及其变体。
25.如段落1至21中任一项所述的CAR T细胞，其中当该治疗剂包含抗体试剂时，该CAR抗原结合结构域或该治疗剂与Treg相关抗原结合。
26.如段落25所述的CAR T细胞，其中与该CAR抗原结合结构域或该治疗剂结合的该Treg相关抗原选自下组，该组由以下组成：糖蛋白A主导重复序列(GARP)、潜在相关肽(LAP)、CD25和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)，并且任选地，该CAR抗原结合结构域或该治疗剂包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:3、9、15、25，及其变体。
27.一种包含编码CAR的多核苷酸的CAR T细胞，其中该CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；并且该抗原结合结构域与Treg相关抗原结合。
28.如段落27所述的CAR T细胞，其中该Treg相关抗原选自下组，该组由以下组成：GARP、LAP、CD25和CTLA-4。
29.如段落27至28中任一项所述的CAR T细胞，其中该CAR进一步包含一个或多个共刺激结构域。
30.如段落27至29中任一项所述的CAR T细胞，其中该CAR的抗原结合结构域包含scFv或单结构域抗体，该scFv或单结构域抗体任选地包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:3、9、15、25，及其变体。
31.一种包含编码氨基酸序列的异源核酸分子的CAR T细胞，该氨基酸序列与SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:13中的任一项的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
32.如段落31所述的CAR T细胞，其包含编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:13中的任一项的氨基酸序列的异源核酸分子。
33.一种核酸分子，其编码如段落1至32中任一项所述的(i)CAR多肽，或(ii)包含CAR多肽和治疗剂的多蛋白。
34.如段落1至32中任一项所述的CAR多肽，或包含CAR多肽和治疗剂的多蛋白。
35.一种药物组合物，其包含一种或多种如段落1至34中任一项所述的CAR T细胞、核酸分子、CAR多肽或多蛋白。
36.一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括向该患者施用包含一种或多种如段落1至32中任一项所述的CAR T细胞或如段落35所述的药物组合物。
37.如段落36所述的方法，其中通过靶向肿瘤微环境，降低全身毒性。
38.如段落36或37所述的方法，其中该癌症的特征在于存在一种或多种实体肿瘤。
39.如段落36至38中任一项所述的方法，其中该癌症的特征在于肿瘤浸润性Treg。
40.如段落36至39中任一项所述的方法，其中该癌症是成胶质细胞瘤。
41.一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括向该患者施用经基因修饰以分泌肿瘤毒性抗体或细胞因子的CAR T细胞产物，其中通过将该癌症毒性局部地指向该肿瘤微环境来降低全身毒性。
42.如段落41所述的方法，其中该CAR T细胞经基因修饰以递送针对CTLA4、CD25、GARP、LAP、IL15、CSF1R或EGFR的抗体，或者针对该肿瘤微环境的双特异性抗体。
43.如段落42所述的方法，其中该双特异性抗体针对EGFR和CD3。
44.一种向患者的组织或器官递送治疗剂以治疗疾病或病状的方法，该方法包括向所述患者施用经基因修饰以分泌治疗性抗体、毒素或药剂的CAR T细胞，其中该治疗性抗体、毒素或药剂本身将无法进入或渗透该组织或器官。
45.如段落44所述的方法，其中该组织或器官位于神经系统。
46.如段落45所述的方法，其中该神经系统是中枢神经系统。
47.如段落46所述的方法，其中该中枢神经系统是大脑。
48.如段落44至47中任一项所述的方法，其中该疾病或病状是成胶质细胞瘤。
49.如段落44所述的方法，其中该治疗性抗体是抗EGFR(抗表皮生长因子受体)或抗EGFRvIII。
以下权利要求书仅是代表性的，并不限制所公开发明的范围。在至少一个方面，我们要求保护：
序列表
<110> 综合医院公司（The General Hospital Corporation）
<120> 靶向肿瘤微环境的嵌合抗原受体T细胞
<130> 51295-006WO3
<150> US 62/629,593
<151> 2018-02-12
<150> US 62/485,670
<151> 2017-04-14
<160> 68
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Asn Ile Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Lys Thr Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Glu Ala Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
100 105 110
Ala Ser Val Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
115 120 125
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
130 135 140
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
145 150 155 160
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
165 170 175
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
180 185 190
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
195 200 205
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210 215 220
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
225 230 235 240
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
245 250 255
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
260 265 270
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
275 280 285
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
290 295 300
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
305 310 315 320
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
325 330 335
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345 350
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Asn Ile Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Ser Val Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
100 105
<210> 4
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 5
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
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100 105 110
<210> 7
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val
20 25 30
Thr Leu Leu Asn Asp Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly
35 40 45
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala
50 55 60
Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro
65 70 75 80
Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Pro Asn
85 90 95
Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
100 105 110
Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Val Leu
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Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Thr Gly Gly
130 135 140
Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu
180 185 190
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210 215 220
Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
225 230 235 240
Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
245 250 255
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
260 265 270
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275 280 285
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Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
325 330 335
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
340 345 350
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
355 360 365
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
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Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
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420 425 430
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
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450 455 460
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530
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
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1 5 10 15
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20
<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
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1 5 10 15
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275 280 285
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
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530
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 15
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
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1 5 10 15
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<211> 69
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
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<210> 17
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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275 280 285
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435 440 445
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485 490 495
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
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His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 21
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
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Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu
180 185 190
Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp
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Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Leu Lys
245
<210> 22
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
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Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
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<210> 23
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
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<210> 24
<211> 112
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
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<210> 26
<211> 1006
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser His Met Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val
130 135 140
Ala Ile Gly Gln Ser Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
145 150 155 160
Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
180 185 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys
210 215 220
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
290 295 300
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
305 310 315 320
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
325 330 335
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
340 345 350
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
355 360 365
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
370 375 380
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
385 390 395 400
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
420 425 430
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
435 440 445
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
450 455 460
Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly
465 470 475 480
Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Pro Arg Met Glu Thr Asp Thr Leu
485 490 495
Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Asp
500 505 510
Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu
515 520 525
Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile
530 535 540
His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys
545 550 555 560
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
565 570 575
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu
580 585 590
Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr
595 600 605
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
610 615 620
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser
625 630 635 640
Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr
645 650 655
Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln
660 665 670
Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly
675 680 685
Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys
690 695 700
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser
705 710 715 720
Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp
725 730 735
Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
740 745 750
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
755 760 765
Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr
770 775 780
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
785 790 795 800
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
805 810 815
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser
820 825 830
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
835 840 845
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850 855 860
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly
865 870 875 880
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile
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Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp
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Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr
930 935 940
Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
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Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala
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980 985 990
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His
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<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr
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Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser His Met Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val
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Ala Ile Gly Gln Ser Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
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Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
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Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys
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Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
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Glu Ile Lys
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<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
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<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 33
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
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50 55 60
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
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Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg
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Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
165 170 175
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn
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Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr
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Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Ala
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<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
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Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
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65 70 75 80
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Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys
<210> 35
<211> 1009
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe
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Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
245 250 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
260 265 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
275 280 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
290 295 300
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
305 310 315 320
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
325 330 335
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
340 345 350
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
355 360 365
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
370 375 380
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
385 390 395 400
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
420 425 430
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
435 440 445
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
450 455 460
Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
465 470 475 480
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Pro Arg Met Glu Thr
485 490 495
Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr
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Gly Asp Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser
515 520 525
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Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu
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Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe
565 570 575
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val
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595 600 605
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
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Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp
660 665 670
Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
675 680 685
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705 710 715 720
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725 730 735
Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
740 745 750
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755 760 765
Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr
770 775 780
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg
785 790 795 800
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Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr
820 825 830
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
835 840 845
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His
995 1000 1005
His
<210> 36
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
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Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
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Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
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245
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
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Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
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Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
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<211> 42
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
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85 90 95
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 41
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
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1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
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100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
165 170 175
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr
210 215 220
Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ala
<210> 43
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys
<210> 44
<211> 1018
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
245 250 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
260 265 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
275 280 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
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Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
305 310 315 320
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
325 330 335
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
340 345 350
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
355 360 365
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
370 375 380
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
385 390 395 400
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
420 425 430
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
435 440 445
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
450 455 460
Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
465 470 475 480
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Pro Arg Met Glu Thr
485 490 495
Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr
500 505 510
Gly Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser
515 520 525
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
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Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
725 730 735
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<210> 45
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
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Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
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Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
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Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
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Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
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245
<210> 46
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
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Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 48
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1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 51
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
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Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met
145 150 155 160
Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln
165 170 175
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
210 215 220
Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
<210> 52
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys
<210> 53
<211> 985
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu
20 25 30
Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser
50 55 60
Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile
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Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn
100 105 110
Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly
165 170 175
Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser
195 200 205
Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg
225 230 235 240
Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln
260 265 270
Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser
275 280 285
Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val
290 295 300
Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro
305 310 315 320
Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr
325 330 335
Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser
340 345 350
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp
355 360 365
Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
370 375 380
Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser
405 410 415
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser
420 425 430
Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys
435 440 445
Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg
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Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser
465 470 475 480
Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser
485 490 495
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530 535 540
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580 585 590
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
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Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln
645 650 655
Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn
660 665 670
Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu
675 680 685
Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser
690 695 700
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
705 710 715 720
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu
725 730 735
Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr
740 745 750
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro
755 760 765
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
770 775 780
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
785 790 795 800
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
805 810 815
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
820 825 830
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
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Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
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Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
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Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
915 920 925
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
930 935 940
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
945 950 955 960
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
965 970 975
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 54
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 55
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
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180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr
210 215 220
Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ala
<210> 56
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys
<210> 57
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 58
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 59
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 60
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 61
<211> 994
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu
20 25 30
Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val
65 70 75 80
Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His
100 105 110
Cys Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
145 150 155 160
Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
165 170 175
Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn
195 200 205
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser
210 215 220
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val
225 230 235 240
Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr
245 250 255
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala
275 280 285
Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr
290 295 300
Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly
305 310 315 320
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
325 330 335
Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser
340 345 350
Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
355 360 365
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
370 375 380
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln
405 410 415
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val
420 425 430
Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
435 440 445
Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
450 455 460
Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
465 470 475 480
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala
485 490 495
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala
500 505 510
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His Glu Ile Gln
515 520 525
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg
530 535 540
Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His
545 550 555 560
Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile
565 570 575
Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe Gln Gly His
580 585 590
Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp
595 600 605
Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg
610 615 620
Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
625 630 635 640
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
645 650 655
Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val
660 665 670
Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
675 680 685
Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro
690 695 700
Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
705 710 715 720
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
725 730 735
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
740 745 750
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
755 760 765
Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
770 775 780
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
785 790 795 800
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
805 810 815
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
820 825 830
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
835 840 845
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
850 855 860
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
865 870 875 880
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
885 890 895
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
900 905 910
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
915 920 925
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
930 935 940
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
945 950 955 960
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
965 970 975
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
980 985 990
Pro Arg
<210> 62
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 63
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met
145 150 155 160
Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln
165 170 175
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
210 215 220
Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 64
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys
<210> 65
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 66
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 67
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110

Claims (49)

1.一种包含异源核酸分子的嵌合抗原受体(CAR)T细胞，其中该异源核酸分子包含：
(a)编码CAR的第一多核苷酸，该第一多核苷酸包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及
(b)编码治疗剂的第二多核苷酸。
2.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中该治疗剂包含抗体试剂。
3.如权利要求2所述的CAR T细胞，其中该抗体试剂包含单链抗体或单结构域抗体。
4.如权利要求2所述的CAR T细胞，其中该抗体试剂包含双特异性抗体试剂。
5.如权利要求4所述的CAR T细胞，其中该双特异性抗体试剂包含双特异性T细胞接合子(BiTE)。
6.如权利要求3所述的CAR T细胞，其中该单结构域抗体包含骆驼科动物抗体。
7.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中该治疗剂包含细胞因子。
8.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中该CAR和该治疗剂以多蛋白的形式产生，该多蛋白被裂解以生成单独的CAR和治疗剂分子。
9.如权利要求8所述的CAR T细胞，其中该多蛋白包含在该CAR和该治疗剂之间的可裂解部分。
10.如权利要求9所述的CAR T细胞，其中该可裂解部分包含2A肽。
11.如权利要求10所述的CAR T细胞，其中该2A肽包含P2A或T2A。
12.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中该CAR和该治疗剂各自组成性表达。
13.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中该CAR和该治疗剂的表达受延伸因子-1α(EF1α)启动子驱动。
14.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中该治疗剂在诱导型启动子的控制下表达，该诱导型启动子任选地可被T细胞受体或CAR信号传导诱导。
15.如权利要求14所述的CAR T细胞，其中该诱导型启动子包含NFAT启动子。
16.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中该CAR在组成型启动子的控制下表达并且该治疗剂在诱导型启动子的控制下表达，该诱导型启动子任选地可被T细胞受体或CAR信号传导诱导。
17.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中该CAR进一步包含一个或多个共刺激结构域。
18.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中该CAR的抗原结合结构域包含抗体、单链抗体、单结构域抗体或配体。
19.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中该CAR的跨膜结构域包含CD8铰链/跨膜结构域，该CD8铰链/跨膜结构域任选地包含SEQ ID NO:4、10、16、22、28、37、46、58和66中任一项的序列，或其变体。
20.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中该细胞内信号传导结构域包含CD3ζ细胞内信号传导结构域，该CD3ζ细胞内信号传导结构域任选地包含SEQ ID NO:6、12、18、24、30、39、48、60和68中任一项的序列，或其变体。
21.如权利要求1所述的CAR T细胞，其包含4-1BB共刺激结构域，该4-1BB共刺激结构域任选地包含SEQ ID NO:5、11、17、23、29、38、47、59和67中任一项的序列，或其变体。
22.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中当该治疗剂包含抗体试剂时，该CAR抗原结合结构域或该治疗剂与肿瘤相关抗原结合。
23.如权利要求22所述的CAR T细胞，其中与该CAR抗原结合结构域或该治疗剂结合的该肿瘤相关抗原是实体肿瘤相关抗原。
24.如权利要求22所述的CAR T细胞，其中与该CAR抗原结合结构域或该治疗剂结合的该肿瘤相关抗原包含表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、EGFR、CD19、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或IL-13受体α2(IL-13Rα2)，并且任选地，该CAR抗原结合结构域或该治疗剂包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:21、27、33、36、42、45、51、55、57、63、65，及其变体。
25.如权利要求1所述的CAR T细胞，其中当该治疗剂包含抗体试剂时，该CAR抗原结合结构域或该治疗剂与Treg相关抗原结合。
26.如权利要求25所述的CAR T细胞，其中与该CAR抗原结合结构域或该治疗剂结合的该Treg相关抗原选自下组，该组由以下组成：糖蛋白A主导重复序列(GARP)、潜在相关肽(LAP)、CD25和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)，并且任选地，该CAR抗原结合结构域或该治疗剂包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:3、9、15、25，及其变体。
27.一种包含编码CAR的多核苷酸的CAR T细胞，其中该CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；并且该抗原结合结构域与Treg相关抗原结合。
28.如权利要求27所述的CAR T细胞，其中该Treg相关抗原选自下组，该组由以下组成：GARP、LAP、CD25和CTLA-4。
29.如权利要求27所述的CAR T细胞，其中该CAR进一步包含一个或多个共刺激结构域。
30.如权利要求27所述的CAR T细胞，其中该CAR的抗原结合结构域包含scFv或单结构域抗体，该scFv或单结构域抗体任选地包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:3、9、15、25，及其变体。
31.一种包含编码氨基酸序列的异源核酸分子的CAR T细胞，该氨基酸序列与SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:13中的任一项的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
32.如权利要求31所述的CAR T细胞，其包含编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:13中的任一项的氨基酸序列的异源核酸分子。
33.一种核酸分子，其编码如权利要求1所述的(i)CAR多肽，或(ii)包含CAR多肽和治疗剂的多蛋白。
34.如权利要求1所述的CAR多肽，或包含CAR多肽和治疗剂的多蛋白。
35.一种药物组合物，其包含一种或多种如权利要求1所述的CAR T细胞、核酸分子、CAR多肽或多蛋白。
36.一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括向该患者施用包含一种或多种如权利要求1所述的CAR T细胞或其核酸分子、CAR多肽或多蛋白的药物组合物。
37.如权利要求36所述的方法，其中通过靶向肿瘤微环境，降低全身毒性。
38.如权利要求36所述的方法，其中该癌症的特征在于存在一种或多种实体肿瘤。
39.如权利要求36所述的方法，其中该癌症的特征在于肿瘤浸润性Treg。
40.如权利要求36所述的方法，其中该癌症是成胶质细胞瘤。
41.一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括向该患者施用经基因修饰以分泌肿瘤毒性抗体或细胞因子的CAR T细胞产物，其中通过将该癌症毒性局部地指向该肿瘤微环境来降低全身毒性。
42.如权利要求41所述的方法，其中该CAR T细胞经基因修饰以递送针对CTLA4、CD25、GARP、LAP、IL15、CSF1R或EGFR的抗体，或者针对该肿瘤微环境的双特异性抗体。
43.如权利要求42所述的方法，其中该双特异性抗体针对EGFR和CD3。
44.一种向患者的组织或器官递送治疗剂以治疗疾病或病状的方法，该方法包括向所述患者施用经基因修饰以分泌治疗性抗体、毒素或药剂的CAR T细胞，其中该治疗性抗体、毒素或药剂本身将无法进入或渗透该组织或器官。
45.如权利要求44所述的方法，其中该组织或器官位于神经系统。
46.如权利要求45所述的方法，其中该神经系统是中枢神经系统。
47.如权利要求46所述的方法，其中该中枢神经系统是大脑。
48.如权利要求44所述的方法，其中该疾病或病状是成胶质细胞瘤。
49.如权利要求44所述的方法，其中该治疗性抗体是抗EGFR(抗表皮生长因子受体)或抗EGFRvIII。
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