CN110267677A - 使用与原m2巨噬细胞分子抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗癌症 - Google Patents

使用与原m2巨噬细胞分子抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗癌症 Download PDF

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Abstract

本发明提供了通过将包含与如本文所述的抗原结合的CAR的重组T细胞与例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂组合给予来治疗与抗原表达相关的疾病的组合物和方法，该抗原例如是实体瘤抗原或在与TAM和/或MDSC相关的肿瘤上表达的抗原。本发明还提供了本文所述的试剂盒和组合物。

Description

使用与原M2巨噬细胞分子抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗 癌症
相关申请
本申请要求2016年8月1日提交的美国序列号62/369589的优先权，将其内容通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且将该序列表通过引用以其整体特此并入。所述ASCII副本创建于2017年7月31日，名称为N2067-7113WO_SL.txt并且大小为1,549,304字节。
技术领域
本发明总体上涉及工程化为表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞例如与另一种药剂例如原M2巨噬细胞分子(pro-M2macrophage molecule)抑制剂组合用于治疗与癌抗原(例如实体瘤抗原或在与肿瘤相关巨噬细胞相关的癌细胞上的抗原)表达相关的疾病的用途，该抑制剂例如IL-13、IL-13Rα1、IL-4、IL-4Rα、IL-10或CSF-1的抑制剂。
背景技术
许多恶性肿瘤患者采用标准疗法无法治愈。此外，传统的治疗选择通常会产生严重的副作用。在癌症免疫疗法方面已经进行了尝试，然而，若干障碍使得这难以达到临床上的有效性目标。虽然已经鉴定了数百种所谓的肿瘤抗原，但这些抗原通常来自自身，因此免疫原性差。此外，肿瘤利用几种机制使其自身抵制免疫攻击的启动和传播。这些机制中的一些涉及可与肿瘤细胞相关的非肿瘤细胞例如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，其可具有抑制免疫应答的表型例如M2表型。
使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞(CART)疗法的最新发展依赖于将T细胞重定向至癌细胞如B细胞恶性肿瘤上的合适细胞表面分子，该最新发展在利用免疫系统治疗B细胞恶性肿瘤和其他癌症的能力方面显示出有希望的结果(参见例如，Sadelain等人,Cancer Discovery[癌症发现]3:388-398(2013))。鼠来源的CART19(即“CTL019”)的临床结果已显示出在患有CLL以及儿童ALL的患者中建立完全缓解的希望(参见例如，Kalos等人,Sci Transl Med[科学转化医学杂志]3:95ra73(2011)、Porter等人,NEJM 365:725-733(2011)、Grupp等人,NEJM 368:1509-1518(2013))。除了基因修饰的T细胞上的嵌合抗原受体识别和破坏靶细胞的能力之外，成功的治疗性T细胞疗法还需要具备随时间增殖和持续、在抑制其功能的环境中保持有效以及进一步监测恶性细胞逃逸的能力。T细胞的可变质量以及体内失能、抑制或耗尽将对CAR转化的T细胞的性能产生影响，此时技术实践人员对其具有有限的控制。虽然已经证明某些CAR转化的T细胞产物是有效的，但是需要具有增强功效的例如针对实体瘤及其相关免疫抑制性肿瘤微环境(TME)的增强功效的CAR转化的T细胞疗法。
发明内容
本披露的特征至少部分在于使用表达嵌合抗原受体(CAR)分子(例如结合肿瘤抗原的CAR，该肿瘤抗原例如是在实体瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤的表面上表达的抗原)的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)治疗障碍如癌症(例如实体瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤)的组合物和方法。这些组合物包括且这些方法包括组合给予表达靶向肿瘤的CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)与原M2巨噬细胞分子抑制剂(例如，以下项的抑制剂：集落刺激因子1(CSF-1)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素13(IL-13)、白细胞介素4(IL-4)、或存在于巨噬细胞细胞表面的针对IL-13或IL-4的受体(例如IL-13Rα1或IL-4Rα))。在一些实施例中，与单独的任何一种疗法相比，该组合保持或具有例如针对实体瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤的更好的临床有效性。不受理论束缚，本文显示使用原M2巨噬细胞分子抑制剂(例如，如本文所述)抑制巨噬细胞例如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)向M2表型的极化，或逆转M2巨噬细胞例如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的表型，从而去除对表达CAR的细胞例如表达CAR的T细胞的功能例如表达CAR的细胞的抗肿瘤或抗增殖活性的抑制源。本发明还涉及工程化细胞例如免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)与原M2巨噬细胞分子抑制剂(例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂)组合用于治疗与肿瘤抗原的表达相关的障碍(例如癌症)的用途，这些工程化细胞表达结合肿瘤抗原(例如实体瘤抗原或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤细胞上的抗原)的CAR分子，该肿瘤抗原例如是实体瘤抗原或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤上的抗原。
在第一方面，本发明提供了治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者(例如患有癌症(例如实体瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤)的受试者)的方法，其包括向受试者给予：(i)CAR疗法，其包括包含例如表达嵌合抗原受体(CAR)(例如，如本文所述)的细胞，例如免疫效应细胞群。CAR包含肿瘤抗原结合结构域(例如，CAR的肿瘤抗原结合结构域结合CD19或CD123)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(ii)原M2巨噬细胞分子抑制剂(例如，如本文所述)。
在另一方面，本发明提供了包括包含(例如表达)嵌合抗原受体(CAR)的细胞例如免疫效应细胞群的CAR疗法，该CAR疗法用于与原M2巨噬细胞分子抑制剂组合以治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者(例如，患有癌症(例如，实体瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤)的受试者)。CAR包含肿瘤抗原结合结构域(例如，CAR的肿瘤抗原结合结构域结合CD19或CD123)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
在实施例中，顺序给予CAR疗法和原M2巨噬细胞分子抑制剂。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，在CAR疗法之前给予原M2巨噬细胞分子抑制剂。在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，将原M2巨噬细胞分子抑制剂和CAR疗法同时或并行地给予。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，将CAR疗法以(a)单次输注或(b)多次输注(例如单剂量分成多次输注)给予，并且将原M2巨噬细胞分子抑制剂以(a)单剂量或(b)多剂量(例如第一和第二剂量以及任选地一个或多个后续剂量)给予。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，在给予原M2巨噬细胞分子抑制剂的第一剂量之后(例如，至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周或更长时间之后)，例如并且在给予该抑制剂的第二剂量之前给予CAR疗法的剂量。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，将CAR疗法的剂量与给予原M2巨噬细胞分子抑制剂的第一剂量并行地(例如，在给予该抑制剂的2天内(例如，在2天、1天、24小时、12小时、6小时、4小时、2小时或更短的时间内))给予。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，将原M2巨噬细胞分子抑制剂的一个或多个后续剂量在原M2巨噬细胞分子抑制剂的第二剂量之后给予。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，给予多于一个剂量的原M2巨噬细胞分子抑制剂，并且将这些剂量每天两次(BID)、每天一次、每周一次、每14天一次或每月一次给予。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂的给予包括多剂量，包括至少7天，例如至少7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或更长时间的持续时间。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，将CAR疗法以一定剂量给予，该剂量包含至少约5x 106、1x 107、1.5x 107、2x 107、2.5x 107、3x 107、3.5x 107、4x 107、5x107、1x 108、1.5x 108、2x 108、2.5x 108、3x 108、3.5x 108、4x 108、5x 108、1x 109、2x 109或5x 109个细胞，例如CAR阳性细胞。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含(i)细胞，例如免疫效应细胞群，其包含例如表达嵌合抗原受体(CAR)(例如，如本文所述)，其中该CAR包含肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(ii)原M2巨噬细胞分子抑制剂(例如，如本文所述)。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含(i)细胞，例如免疫效应细胞群，其包含例如表达嵌合抗原受体(CAR)(例如，本文所述)，其中该CAR包含肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(ii)原M2巨噬细胞分子抑制剂(例如，如本文所述)，以用于治疗本文所述的疾病或障碍。
在另一方面，本发明提供了一种刺激哺乳动物中T细胞介导的针对实体瘤细胞的免疫应答的方法，该方法包括向哺乳动物给予有效量的前述方面的组合物。
在另一方面，本发明提供了一种在哺乳动物中提供抗肿瘤例如抗实体瘤免疫的方法，其包括向哺乳动物给予有效量的该组合物。
在另一方面，本发明提供了治疗患有与肿瘤抗原例如实体瘤抗原的表达相关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括给予有效量的前述方面的组合物。
在实施例中，包括在任何上述方法实施例中，提供了细胞例如免疫效应细胞群和原M2巨噬细胞分子抑制剂用于单独给予(例如，在两个单独的组合物中)。在其他实施例中，包括在任何上述方法实施例中，提供了细胞例如免疫效应细胞群和原M2巨噬细胞分子抑制剂用于同时给予(例如，在一种组合物中)。
原M2巨噬细胞分子抑制剂的以下方面可以与任何前述方面和实施例一起使用。
在实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是IL-13抑制剂、IL-4抑制剂、IL-13Rα1抑制剂、IL-4Rα抑制剂、IL-10抑制剂、CSF-1抑制剂、TGFβ抑制剂或其组合，例如如本文所述。在实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是IL-13抑制剂、IL-4抑制剂、IL-13Rα1抑制剂、IL-4Rα抑制剂或其组合，例如如本文所述。在一些实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是小分子、抗体或其抗原结合片段、蛋白质(例如融合蛋白)、核酸(例如shRNA或siRNA)或基因编辑系统。在一些实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是IL-13抑制剂、IL-4抑制剂、IL-13Rα1抑制剂、IL-4Rα抑制剂、IL-10抑制剂、CSF-1抑制剂、TGFβ抑制剂、JAK2抑制剂、细胞表面分子、氧化铁、小分子抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、糖酵解途径抑制剂、线粒体靶向抗氧化剂或其组合，例如如本文所述。
在一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是IL-13抑制剂(例如，芬维A胺(4-HPR))。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是IL-4抑制剂(例如，4-HPR)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是IL-13Rα1抑制剂。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是IL-4Rα抑制剂。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是CSF-1抑制剂(例如，尼达尼布)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是TGFβ抑制剂。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是JAK2抑制剂(例如鲁索替尼)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是细胞表面分子(例如，二肽基肽酶4(DPP4)或CD26)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是氧化铁(例如，纳米氧化铁(ferumoxytol))。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是小分子抑制剂(例如，紫檀芪)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(例如，特那利司(tenalisib)(RP6530))。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是HDAC抑制剂(例如，SAHA)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是糖酵解途径抑制剂(例如，2-脱氧-d-葡萄糖(2-DG))。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是线粒体靶向抗氧化剂(例如，MitoQ)。
在另一方面，本发明提供了治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者(例如患有癌症(例如实体瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤)的受试者)的方法。该方法包括向受试者给予(i)包含细胞例如免疫效应细胞群的CAR疗法，该细胞包含(例如表达)嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含结合CD123的肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(ii)肿瘤靶向疗法。在一些实施例中，将CD123 CAR以足以导致抑制M2巨噬细胞活性的量和/或时间给予。在实施例中，抑制M2巨噬细胞活性包括抑制巨噬细胞向M2表型的极化和/或M2巨噬细胞表型的逆转。
在另一方面，本发明提供了包含细胞例如免疫效应细胞群的CAR疗法，该细胞包含(例如表达)嵌合抗原受体(CAR)，该CAR疗法用于与肿瘤靶向疗法组合使用以治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者(例如，患有癌症(例如，实体瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤)的受试者)。CAR包含结合CD123的肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，将CD123 CAR以足以导致抑制M2巨噬细胞活性的量和/或时间给予。在实施例中，抑制M2巨噬细胞活性包括抑制巨噬细胞向M2表型的极化和/或M2巨噬细胞表型的逆转。
用于本文所披露的用途的方法和CAR疗法的一些实施例中，肿瘤靶向疗法是包含细胞例如免疫效应细胞群的第二CAR疗法，该细胞包含(例如表达)CAR，该CAR包含结合除CD123之外的肿瘤抗原的肿瘤抗原结合结构域(例如，结合除CD123之外的实体瘤抗原或血液肿瘤抗原的CAR)。在一个实施例中，肿瘤抗原结合结构域结合CD19、间皮素或EGFRviii。
用于本文所披露的用途的方法和CAR疗法的一些实施例中，肿瘤靶向疗法是或包括CD19抑制或耗减疗法，例如包括CD19抑制剂的疗法。在一些实施例中，肿瘤靶向疗法包括表达CD19CAR的细胞(例如CD19CART细胞)，或抗CD19抗体(例如，抗CD19单或双特异性抗体)或其片段或缀合物。在一个实施例中，CD19抑制剂是CD19抗体例如CD19双特异性抗体(例如，靶向CD19的双特异性T细胞衔接器，例如博纳吐单抗)。
在其他实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，顺序给予CAR疗法和肿瘤靶向疗法。
在其他实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，在CAR疗法之前给予肿瘤靶向疗法。
在其他实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，在肿瘤靶向治疗之前给予CD123 CAR疗法。在一些实施例中，在给予肿瘤靶向疗法之前至少5天、至少7天、至少10天、至少15天、至少20天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月或至少10个月给予CD123 CAR疗法。
在其他实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，肿瘤靶向疗法和CAR疗法同时或并行地给予。
在其他实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，将CAR疗法以(a)单次输注或(b)多次输注(例如，单剂量分成多次输注)给予，并且将肿瘤靶向疗法以(a)单剂量或(b)多剂量(例如，第一和第二剂量以及任选一个或多个后续剂量)给予。
在其他实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，在给予肿瘤靶向疗法的第一剂量之后(例如，至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周或更长时间之后)，例如但在给予肿瘤靶向疗法的第二剂量之前给予CAR疗法的剂量。
在其他实施例中，将该CAR疗法的剂量与肿瘤靶向疗法的第一剂量并行地(例如，在给予该肿瘤靶向疗法的2天内(例如，在2天、1天、24小时、12小时、6小时、4小时、2小时或更短的时间内))给予。
在其他实施例中，在肿瘤靶向治疗的第二剂量之后给予肿瘤靶向疗法的一个或多个后续剂量。
在其他实施例中，给予多于一个剂量的肿瘤靶向疗法，并且给予这些剂量每天两次(BID)、每天一次、每周一次、每14天一次或每月一次。
在其他实施例中，肿瘤靶向疗法的给予包括多剂量，包括至少7天，例如至少7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或更长时间的持续时间。
在其他实施例中，CAR疗法或肿瘤靶向疗法以一定剂量给予，该剂量包含至少约5x106、1x 107、1.5x 107、2x 107、2.5x 107、3x 107、3.5x 107、4x 107、5x 107、1x 108、1.5x108、2x 108、2.5x 108、3x 108、3.5x 108、4x 108、5x 108、1x 109、2x 109或5x 109个细胞，例如CAR阳性细胞。
在一些实施例中，将CAR疗法和肿瘤靶向疗法配制在药物组合物(例如，包含药物赋形剂)中。
CAR和表达CAR的细胞例如免疫效应细胞群的以下方面可以与任何上述方面和实施例一起使用。
在一方面，CAR的肿瘤抗原结合结构域结合CD123。
在实施例中，CAR的肿瘤抗原结合结构域包含表16、表18、表20、表22、表24、表25、表26、表27或表28中列出的任何CD123重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及表17、表19、表21、表23、表24、表25、表26、表27或表28中列出的任何CD123轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。在实施例中，CD123结合结构域包含表26、表27或表28中列出的CD123结合结构域(例如scFv)氨基酸序列。在实施例中，CAR包含表26或表27中列出的CAR氨基酸序列(例如由其组成)。
在另一方面，CAR的肿瘤抗原结合结构域结合间皮素。在实施例中，CAR的肿瘤抗原结合结构域包含表2、表3或表11中列出的任何间皮素重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及表2、表4或表11中列出的任何间皮素轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。在实施例中，间皮素结合结构域包含表2或表11中列出的间皮素结合结构域(例如scFv)氨基酸序列。在实施例中，CAR包含表11中列出的CAR氨基酸序列(例如由其组成)。
在另一方面，CAR的肿瘤抗原结合结构域结合EGFRvIII。在实施例中，CAR的肿瘤抗原结合结构域包含表5中列出的任何EGFRvIII重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及表5中列出的任何EGFRvIII轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。在实施例中，EGFRvIII结合结构域包含表5中列出的EGFRvIII结合结构域(例如scFv)氨基酸序列。在实施例中，CAR包含表30中列出的CAR氨基酸序列(例如由其组成)。
在另一方面，CAR的肿瘤抗原结合结构域结合CD19。在一些实施例中，CAR的肿瘤抗原结合结构域包含表6、表7或表9中列出的任何CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及表6、表8或表9中列出的任何CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。在具体实施例中，CD19结合结构域包含表6或表9中列出的CD19结合结构域(例如scFv)氨基酸序列。在某些实施例中，CD19结合结构域包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQID NO:112。
在另一方面，CAR的肿瘤抗原结合结构域结合实体瘤抗原。在另一方面，CAR的肿瘤抗原结合结构域结合在与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和/或髓源性抑制细胞(MDSC)相关的肿瘤上表达的抗原。在实施例中，实体瘤抗原或在与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和/或髓源性抑制细胞(MDSC)相关的肿瘤上表达的抗原是CD123、EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈递的这些抗原的任一个的肽。
在另一方面，CAR的肿瘤抗原结合结构域结合血液癌，例如如本文所述。在一些实施例中，CAR的肿瘤抗原结合结构域结合CD19。任何上述结合CD19的CAR可用于治疗与CD19的表达相关的疾病，例如如本文所述的表达CD19的B细胞恶性肿瘤。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，细胞内信号传导结构域包括初级信号传导结构域，其包括CD3-ζ刺激结构域。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域，该共刺激结构域是选自下组的共刺激蛋白的细胞内结构域，该组由以下组成：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体。在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，共刺激结构域包括4-1BB的细胞内结构域。在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，共刺激结构域包括CD28的细胞内结构域。在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，细胞内信号传导结构域包括两个共刺激结构域，例如4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，与肿瘤抗原的表达相关的疾病是癌症。在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，癌症是霍奇金淋巴瘤。在癌症是霍奇金淋巴瘤的实施例中，CAR的抗原结合结构域结合CD19或CD123，例如结合CD123。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，癌症是实体癌。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，包含CAR的细胞包含编码CAR的核酸。在实施例中，编码CAR的核酸是慢病毒载体。在实施例中，通过慢病毒转导将编码CAR的核酸引入细胞中。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，编码CAR的核酸是RNA，例如体外转录的RNA。在实施例中，通过电穿孔将编码CAR的核酸引入细胞中。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，细胞是T细胞或NK细胞。在实施例中，T细胞是自体或同种异体T细胞。
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，受试者是哺乳动物，例如人。
标题、子标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等，仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求以字母顺序执行步骤或元素，或者不要求步骤或元素必须彼此分离。
本文所提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其整体并入。
本披露包括任何一个或多个前述方面和/或实施例的所有组合，以及在具体实施方式和实例中提出的任何一个或多个实施例的组合。
根据说明书和附图并且根据权利要求书，本发明的其他特征、目标和优点将是显而易见的。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施例。出于说明本发明的目的，在附图实施例中示出了目前优选的实施例。然而，应该理解，本发明不限于附图中所示的实施例的精确布置和手段。
图1A示出了针对CD30和CD123进行免疫组织化学染色的霍奇金淋巴瘤的初级样品。在HL Reed-sternberg细胞中发现CD123的表达，但也在肿瘤微环境中发现CD123的表达，与CD30仅在HRS上呈阳性相反。图1B示出了在4种标准HL细胞系(MOLM-14和A357用作阳性和阴性对照)中CD123的RNA表达。图1C示出了CD123也在HL细胞系的表面上表达(CD30用作HL的标准标记物)。
图2A示出了将由外周血单核细胞分化的人正常供体巨噬细胞与HDLM-2细胞或IL-4(M2阳性对照)或对照急性成淋巴细胞性白血病细胞系(NALM-6)共培养。在培养24小时后，HL淋巴瘤细胞(HDLM-2)可将巨噬细胞极化为M2表型(CD163+CD206+)。图2B示出了通过流式细胞术，M2极化的巨噬细胞(IL-4)是CD123+。图2C示出了M2极化的巨噬细胞(IL-4)可以抑制抗CD19嵌合抗原受体增殖，如CFSE稀释测定所示。图2D示出了HL极化的巨噬细胞强烈抑制CART19增殖，如在第5天通过CFSE稀释测定和绝对T细胞数(图2E)所示。图2F示出了在HL细胞(HDLM-2)与巨噬细胞的共培养物的上清液中存在的细胞因子的Luminex分析显示出与对照相比高水平的IL-13。图2G示出了用抗IL13抗体阻断IL-13逆转HL驱动的M2极化，如通过降低的PD-L1表达所示。
图3A示出了将HL细胞(HDLM-2)与CART123共培养4-6小时。CAR+而非CAR-T细胞表达高水平的脱粒标记物CD107A并产生细胞内细胞因子如IFNγ、IL-2和TNFα。图3B示出了CART123以剂量依赖性方式对HL细胞发挥有效的细胞毒性。图3C示出了将HL细胞(HDLM-2)与CART123或对照UTD长期共培养。在第20天，CART123而非UTD杀死HL细胞并增殖。图3D示出了将CART123或UTD与HL细胞系(或阳性和阴性对照)共培养5天。CART123而非UTD对照以绝对数量和CFSE稀释的形式显示出显著增殖(图3E)。图3F示出了HL细胞刺激CART123而非UTD细胞以释放多种细胞因子，包括GM-CSF、IFNγ、MIP1β和TNFα。在这些图中，E:T＝效应子:靶细胞比率。
图4A示出了针对HL测试CD123 CART的小鼠实验的实验方案。在NSG小鼠中静脉内注射2x 106个荧光素酶阳性HDLM-2细胞，并通过生物发光成像监测肿瘤移植。在第42天，将小鼠随机分组为不接受治疗、接受2x 106个对照未转导的T细胞(UTD)或2x 106个CART123。图4B示出了接受CART123而非对照的小鼠经历疾病长期缓解(>250天)的完全反应。图4C示出了CART123治疗的小鼠与对照相比具有显著更长的总体存活期。图4D示出了清除肿瘤后CAR123T细胞在外周血中移植、扩增和消失。CART123治疗的小鼠的PB中的T细胞是具有CAR高表达的CD8和CD4。
图5A示出了采用HL在小鼠中建立长期免疫记忆的实验方案：在第250天用HL细胞(HDLM-2)再次激发先前用CART123治疗并经历长期缓解的小鼠。作为对照，小鼠的肿瘤初试组也注射肿瘤。图5B示出了HL细胞仅在肿瘤初试小鼠中移植和生长，而长期存活的小鼠能够控制疾病生长。图5C示出了在先前用CART123治疗的小鼠中观察到的CART123细胞的再扩增。图5D示出了在先前暴露于CART123的小鼠中观察到的改善的总体存活期。
图6A示出了在5天CFSE增殖中，CART123对HL极化的巨噬细胞有完全抗性。图6B示出了CART123细胞快速(第1天)识别M2巨噬细胞，在它们周围聚集并在第5天前清除它们，分别如相差显微术(20X)和流式细胞术所示。图6C示出了与对照CART19细胞相反，CART123也能够在HL极化的M2巨噬细胞的存在下分泌细胞因子。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
术语“原M2巨噬细胞分子”是指单独地或与其他分子组合地促成巨噬细胞极化为M2表型的分子。原M2巨噬细胞分子的非限制性实例包括细胞因子IL-13(OMIM登录号147683；Entrez号3596；Swiss Prot.登录号P35225)、IL-4(OMIM登录号147780；EntrezNo.3565；Swiss Prot.登录号P05112)、CSF-1(Entrez号1435；Swiss Prot.登录号P09603)和/或IL-10(OMIM登录号124092；Entrez号3586；Swiss Prot.登录号P22301)。
术语“原M2巨噬细胞分子抑制剂”是指抑制原M2巨噬细胞分子的表达或功能例如受体结合功能的分子。原M2巨噬细胞分子抑制剂包括小分子、抗体分子、多肽(例如融合蛋白)、抑制性核酸(例如siRNA或shRNA)或基因编辑系统(例如CRISPR/Cas9系统)。原M2巨噬细胞分子抑制剂的实例包括IL-13抑制剂。原M2巨噬细胞分子抑制剂的另一个实例包括IL-4抑制剂。原M2巨噬细胞分子抑制剂的另一个实例包括IL-13Rα1抑制剂(Entrez号3597；Swiss Prot.登录号P78552)。原M2巨噬细胞分子抑制剂的另一个实例包括IL-10抑制剂。原M2巨噬细胞分子抑制剂的另一个实例包括CSF-1抑制剂。关于M2巨噬细胞分子抑制剂的其他细节提供如下。在实施例中，原M2巨噬细胞抑制剂抑制髓源性抑制细胞(MDSC)的功能，例如抑制功能。
术语“肿瘤相关巨噬细胞”或“TAM”是指典型地衍生自单核细胞或固有组织巨噬细胞的巨噬细胞谱系的细胞，其发现在肿瘤块附近或肿瘤块内，例如在肿瘤基质内。
术语“髓源性抑制细胞”或“MDSC”是指骨髓来源的细胞，其发现在肿瘤块附近或肿瘤块内，例如在肿瘤基质内。
术语“一个/种(a和an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
当指可测量的值如量、时距等时，术语“约”意在涵盖与规定值±20％、或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适于执行所披露的方法。
术语“嵌合抗原受体”或可替代地“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施例中典型地是两种多肽，当在免疫效应细胞中时，它为该细胞提供针对靶细胞(典型地针对癌细胞)的特异性，并且提供细胞内信号生成。在一些实施例中，CAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，该细胞质信号传导结构域包含衍生自如下定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些方面，该组多肽彼此邻接，例如在相同的多肽链(例如，包括嵌合融合蛋白)中。在一些实施例中，该组多肽彼此不邻接，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，该组多肽包括二聚化开关，其在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一方面，刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一方面，细胞质信号传导结构域还包含衍生自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一方面，共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28。在一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含衍生自共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含衍生自一种或多种共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含衍生自一种或多种共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)包含任选的前导序列。在一方面，CAR在细胞外抗原结合结构域的N-末端还包含前导序列，其中该前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜的过程中从抗原结合结构域(例如，scFv)切割。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能部分，其通过在细胞内传递信息来起作用，从而经由限定的信号传导途径通过生成第二信使或通过响应于这种信使而起到效应子的作用来调节细胞活性。
如本文所用，术语“IL-3受体的α亚基”、“IL3Rα”、“CD123”、“IL3Rα链”和“IL3Rα亚基”可互换地指已知在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人IL3Rα的氨基酸序列可以在登录号NP 002174下找到，且编码人IL3Rα的核苷酸序列可以在登录号NM 005191下找到。在一方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD123蛋白的细胞外结构域内的表位。在一方面，CD123蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD123”包括含有突变例如全长野生型CD123的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。
如本文所用，术语“CD19”是指分化簇19蛋白，其是在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD19的氨基酸序列可以在UniProt/Swiss-Prot登录号P15391下找到，且编码人CD19的核苷酸序列可以在登录号NM_001178098下找到。如本文所用，“CD19”包括含有突变例如全长野生型CD19的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。CD19在大多数B谱系癌症上表达，其包括例如急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。具有表达的CD19的其他细胞在下文“与CD19表达相关的疾病”的定义中提供。它也是B细胞祖细胞的早期标记物。参见例如，Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)。在一方面，CART的抗原结合部分识别并结合CD19蛋白的细胞外结构域内的抗原。在一方面，CD19蛋白在癌细胞上表达。
如本文所用，术语“CD20”是指已知在B细胞上可检测的抗原决定簇。人CD20也称为跨膜4结构域亚家族A成员1(MS4A1)。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD20的氨基酸序列可以在登录号NP_690605.1和NP_068769.2下找到，并且编码人CD20的转录物变体1和3的核苷酸序列可以分别在登录号NM_152866.2和NM_021950.3下找到。在一方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD20蛋白的细胞外结构域内的抗原。在一方面，CD20蛋白在癌细胞上表达。
如本文所用，术语“CD22”是指已知在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，同种型1-5人CD22的氨基酸序列可以分别在登录号NP 001762.2、NP 001172028.1、NP001172029.1、NP 001172030.1和NP 001265346.1下找到，并且编码人CD22的变体1-5的核苷酸序列可以分别在登录号NM 001771.3、NM 001185099.1、NM 001185100.1、NM001185101.1和NM 001278417.1下找到。在一方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD22蛋白的细胞外结构域内的抗原。在一方面，CD22蛋白在癌细胞上表达。
如本文所用，术语“ROR1”是指已知在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人ROR1的同种型1和2前体的氨基酸序列可分别在登录号NP_005003.2和NP_001077061.1下找到，并且编码它们的mRNA序列可分别在登录号NM_005012.3和NM_001083592.1下找到。在一方面，CAR的抗原结合部分识别并结合ROR1蛋白的细胞外结构域内的抗原。在一方面，ROR1蛋白在癌细胞上表达。
如本文所用，术语“CD33”是指分化33蛋白簇，其是在白血病细胞上以及髓系谱系的正常前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD33的氨基酸序列可以作为UniProt/Swiss-Prot登录号P20138下找到，并且编码人CD33的核苷酸序列可以在登录号NM_001772.3下找到。在一方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD33蛋白或其片段的细胞外结构域内的表位。在一方面，CD33蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD33”包括含有突变例如点突变的蛋白质，全长野生型CD33的片段、插入、缺失和剪接变体。
如本文所用，术语“BCMA”是指B细胞成熟抗原。BCMA(也称为TNFRSF17，BCM或CD269)是肿瘤坏死受体(TNFR)家族的成员，并且主要在终末分化的B细胞(例如记忆B细胞)和浆细胞上表达。其配体称为TNF家族(BAFF)的B细胞激活物和增殖诱导配体(APRIL)。BCMA参与介导浆细胞的存活以维持长期体液免疫。BCMA的基因在16号染色体上编码，产生长度为994个核苷酸的初级mRNA转录物(NCBI登录号NM_001192.2)，其编码184个氨基酸的蛋白质(NP_001183.2)。已经描述了衍生自BCMA基因座的第二反义转录物，其可以在调节BCMA表达中起作用。(Laabi Y.等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],1994,22:1147-1154)。已经描述了具有未知意义的其他转录物变体(Smirnova AS等人Mol Immunol.[分子免疫学],2008,45(4):1179-1183。已经鉴定了第二种同种型，也称为TV4(Uniprot标识符Q02223-2)。如本文所用，“BCMA”包括含有突变例如点突变的蛋白质，全长野生型BCMA的片段、插入、缺失和剪接变体。
如本文所用，术语“CLL-1”是指C型凝集素样分子-1，其是在白血病前体细胞和正常免疫细胞上可检测的抗原决定簇。C型凝集素样-1(CLL-1)也称为MICL、CLEC12A、CLEC-1、树突细胞相关凝集素1和DCAL-2。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CLL-1的氨基酸序列可以在UniProt/Swiss-Prot登录号Q5QGZ9下找到，并且编码人CLL-1的核苷酸序列可以在登录号NM 001207010.1、NM138337.5、NM 201623.3、和NM 201625.1下找到。在一个实施例中，CAR的抗原结合部分识别并结合CLL-1蛋白或其片段的细胞外结构域内的表位。在一个实施例中，CLL-1蛋白在癌细胞上表达。
术语“EGFR”是指任何哺乳动物成熟的全长表皮生长因子受体，包括人和非人形式。1186氨基酸人EGFR描述于Ullrich等人,Nature[自然]309:418-425(1984)和GenBank登录号AF125253和SwissProt登录号P00533-2。
术语“EGFRvIII”指表皮生长因子受体变体III。EGFRvIII是在人类肿瘤中观察到的最常见的EGFR变体，但在正常组织中很少观察到。该蛋白质来自：外显子2-7的框内缺失以及在EGFR的细胞外结构域内外显子1和8的连接处产生新的甘氨酸残基，从而产生肿瘤特异性表位。EGFRvIII在24％至67％的GBM中表达，但在正常组织中不表达。EGFRvIII也称为III型突变体、δ-EGFR、EGFRde2-7和ΔEGFR，并描述于美国专利号6,455,498、6,127,126、5,981,725、5,814,317、5,710,010、5,401,828和5,212,290中。EGFRvIII的表达可由染色体缺失引起，并且也可由异常的选择性剪接引起。参见Sugawa等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.[国家科学院院刊]87:8602-8606。
如本文所用，术语“间皮素”是指40-kDa蛋白质间皮素，其通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接和氨基末端31-kDa脱落片段(称为巨核细胞增强因子(MPF))锚定在细胞膜上。两个片段均含有N-糖基化位点。该术语还指40-kDa羧基末端片段(也称为“可溶性间皮素/MPF相关的”)的可溶性剪接变体。优选地，该术语是指GenBank登录号AAH03512.1的人间皮素及其天然切割部分，例如在细胞膜如癌细胞膜上表达的。
如本文所用，术语“抗体”是指衍生自与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指抗体的至少一部分，其保留与抗原表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段(例如包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体、和分离的CDR、或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、纳米抗体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见，例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段移植到基于多肽例如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“scFv”是指融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中该轻链可变区和重链可变区例如通过合成接头(例如短柔性多肽接头)是连续连接的并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了衍生出它的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以按任何顺序具有VL和VH可变区，例如关于多肽的N-末端和C-末端，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
包含抗体或其抗体片段的本发明CAR部分可以按多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，该连续多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999:Using Antibodies:ALaboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Harlow等人,1989:Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任何一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”[具有免疫学意义的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani等人,(1997)JMB273,927-948(“Chothia”编号方案)或其组合。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且该多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
包含抗体或其抗体片段的本发明CAR部分可以按多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，该连续多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体、或双特异性抗体(Harlow等人,1999:Using Antibodies:ALaboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Harlow等人,1989:Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。
术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型的多肽链中较大的一者，并且通常决定抗体所属的种类。
术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型的多肽链中较小的一者。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子(该DNA分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序列)产生的抗体，其中DNA或氨基酸序列是使用本领域可获得且熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。免疫应答可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当该术语在本文中使用时)。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫应答的多肽。另外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以衍生自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。
术语“抗癌作用”是指可以通过各种方式表明的生物学效应，包括但不限于例如肿瘤体积减少、癌细胞数量减少、转移瘤数量减少、预期寿命延长、癌细胞增殖减少、癌细胞存活降低、或与癌性病症相关的各种生理症状改善。“抗癌作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防癌症发生的能力来表明。术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种方式表现的生物学效应，包括但不限于例如肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少、或肿瘤细胞存活降低。
术语“自体的”是指衍生自同一个体与后来再将其引入该个体的任何材料。
术语“同种异体的”是指衍生自与引入材料的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，称两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。
术语“异种的”是指衍生自不同物种的动物的移植物。
术语“癌症”是指以异常细胞的不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语涵盖固体和液体，例如弥漫性或循环性肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。
短语“与CD19表达相关的疾病”包括但不限于与CD19表达相关的疾病或与表达或在任何时间表达CD19的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病(例如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达CD19的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑义，与CD19表达相关的疾病可包括与目前不表达CD19(例如，因为比如由于用靶向CD19的分子例如CD19 CAR进行治疗导致CD19表达已被下调)但曾经表达CD19的细胞相关的病症。在一方面，与CD19表达相关的癌症是血液癌。在一方面，血液癌是白血病或淋巴瘤。在一方面，与CD19表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于：例如一种或多种急性白血病，其包括但不限于例如B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，其包括但不限于例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。与CD19表达相关的其他癌症或血液病症包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和“白血病前期”(这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液病症的多样化集合)等。与CD19表达相关的其他疾病包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与CD19表达相关的增殖性疾病。与CD19表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫疾病(例如狼疮)、炎性障碍(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在实施例中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
短语“与B细胞抗原表达相关的疾病”包括但不限于与CD19、CD20、CD22或ROR1中的一种或多种的表达相关的疾病，或与表达或在任何时间表达CD19、CD20、CD22或ROR1中的一种或多种的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病(例如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达CD19、CD20、CD22或ROR1中的一种或多种的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑义，与B细胞抗原表达相关的疾病可包括与目前不表达B细胞抗原(例如，因为比如由于用靶向B细胞抗原的分子例如靶向B细胞的CAR进行治疗导致抗原表达已被下调)但曾经表达该抗原的细胞相关的病症。短语“与B细胞抗原表达相关的疾病”包括与CD19表达相关的疾病，如本文所述。
如本文所用，短语“与CD123表达相关的疾病”包括但不限于与CD123表达相关的疾病或与表达CD123(例如野生型或突变型CD123)的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病(例如癌症或恶性肿瘤)；癌前病症(例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD123(例如野生型或突变型CD123)的细胞相关的非癌症相关适应症。在一方面，与CD123(例如野生型或突变型CD123)表达相关的癌症是血液癌。在一方面，该疾病包括AML、ALL、毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、淋巴母细胞B细胞白血病(B细胞急性淋巴细胞白血病，BALL)、急性成淋巴细胞性T细胞白血病(T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)；骨髓增生异常综合征；骨髓增生性肿瘤；组织细胞性障碍(例如肥大细胞障碍或母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤)；肥大细胞障碍，例如系统性肥大细胞增多症或肥大细胞白血病等。与CD123表达相关的其他疾病包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与CD123表达相关的增殖性疾病。还可以包括与CD123表达相关的非癌症相关适应症。
如本文所用的短语“与CD33表达相关的疾病”包括但不限于与表达CD33(例如野生型或突变型CD33)的细胞相关的疾病或与表达CD33(例如野生型或突变型CD33)的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病(例如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达CD33(例如野生型或突变型CD33)的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑义，与CD33表达相关的疾病可包括与目前不表达CD33(例如，因为比如由于用靶向CD33的分子例如本文所述的CD33抑制剂进行治疗导致CD33表达已被下调)但曾经表达CD33的细胞相关的病症。在一方面，与CD33(例如野生型或突变型CD33)表达相关的癌症是血液癌。一方面，血液癌包括但不限于急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化和骨髓增生性肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病(CML)、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤等。与CD33(例如野生型或突变型CD33)表达相关的其他疾病包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与CD33(例如野生型或突变型CD33)表达相关的增殖性疾病。还可以包括与CD33(例如野生型或突变型CD33)表达相关的非癌症相关适应症。在实施例中，与CD33表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫疾病(例如狼疮)、炎性障碍(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在实施例中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
短语“与BCMA表达相关的疾病”包括但不限于与表达BCMA(例如野生型或突变型BCMA)的细胞相关的疾病或与表达BCMA(例如野生型或突变型BCMA)的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病(例如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达BCMA(例如野生型或突变型BCMA)的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑义，与BCMA表达相关的疾病可包括与目前不表达BCMA(例如，因为比如由于用靶向BCMA的分子例如本文所述的BCMA抑制剂进行治疗导致BCMA表达已被下调)但曾经表达BCMA的细胞相关的病症。在一方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症是血液癌。在一方面，血液癌是白血病或淋巴瘤。在一方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症是分化的血浆B细胞的恶性肿瘤。在一方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于：例如一种或多种急性白血病，其包括但不限于例如B细胞急性淋巴细胞白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，其包括但不限于例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的其他癌症或血液病症包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和“白血病前期”(这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液病症的多样化集合)等。在一些实施例中，癌症是多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或胶质母细胞瘤。在实施例中，与BCMA表达相关的疾病包括浆细胞增殖性障碍，例如无症状骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如恶性浆细胞病、单发性骨髓瘤、单发性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为Crow-Fukase综合征、Takatsuki病、和PEP综合征)。与BCMA表达相关的其他疾病(例如野生型或突变型BCMA)表达包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、与BCMA的表达相关的癌前病症或增殖性疾病(例如野生型或突变型BCMA)，例如本文所述的癌症，例如前列腺癌(例如去势抗性或治疗抗性前列腺癌或转移前列腺癌)、胰腺癌、或肺癌。
与BCMA相关的非癌症相关病症(例如野生型或突变型BCMA)包括病毒感染，例如HIV；真菌感染，例如新型隐球菌；自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE或狼疮)、寻常型天疱疮和干燥综合征(Sjogren’s syndrome)；炎症性肠病、溃疡性结肠炎；与粘膜免疫有关的移植相关的同种特异性免疫障碍；以及针对生物制剂(如因子VIII)而言不需要的免疫应答(其中体液免疫很重要)。在实施例中，与BCMA表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫疾病(例如狼疮)、炎性障碍(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在实施例中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
短语“与CLL-1表达相关的疾病”包括但不限于与表达CLL-1的细胞相关的疾病或与表达CLL-1的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病(例如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达CLL-1(例如野生型或突变型CLL-1)的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑义，与CLL-1表达相关的疾病可包括与目前不表达CLL-1(例如，因为比如由于用靶向CLL-1的分子例如本文所述的CLL-1抑制剂进行治疗导致CLL-1表达已被下调)但曾经表达CLL-1的细胞相关的病症。在一方面，与CLL-1表达相关的癌症是血液癌。一方面，血液癌包括但不限于白血病(如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和骨髓增生异常综合征)和恶性淋巴组织增生病(包括淋巴瘤(如多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、和小细胞和大细胞滤泡性淋巴瘤))。与CLL-1表达相关的其他疾病包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与CLL-1表达相关的增殖性疾病。还可以包括与CLL-1表达相关的非癌症相关适应症。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在实施例中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
本文所用的术语“与EGFRvIII表达相关的疾病”包括但不限于与EGFRvIII表达相关的疾病或与表达EGFRvIII的细胞相关的病症，这些细胞包括以下各种癌症的肿瘤细胞，例如像胶质母细胞瘤(包括胶质母细胞瘤干细胞)；乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌；头颈部鳞状细胞癌；成神经管细胞瘤、结直肠癌、前列腺癌和膀胱癌。不受特定理论或机制的束缚，认为通过引发针对EGFRvIII的抗原特异性应答，本文披露的CAR提供以下中的一个或多个：靶向和破坏表达EGFRvIII的肿瘤细胞、减少或消除肿瘤、促进免疫细胞向肿瘤部位的浸润、以及增强/扩展抗肿瘤应答。因为EGFRvIII在正常(即非癌)组织中不以可检测的水平表达，所以预期本发明的CAR有利地基本上避免靶向/破坏正常组织和细胞。
如本文所用的短语“与间皮素表达相关的疾病”包括但不限于与间皮素表达相关的疾病或与表达间皮素的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病(例如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(例如间皮细胞增生)；或与表达间皮素的细胞相关的非癌症相关适应症。表达间皮素的各种癌症的实例包括但不限于间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌等。
术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下项的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性的侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的CAR内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR。
术语“刺激”是指通过刺激分子(例如TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或CAR的情况下的肿瘤抗原)结合诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，例如但不限于，通过TCR/CD3复合物的信号转导或通过CAR的适当NK受体或信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达。
术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供以针对免疫细胞信号传导通路的至少一些方面的刺激方式调节免疫细胞激活的一个或多个细胞质信号传导序列。在一方面，信号是初级信号，其通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而启动，并且导致了介导T细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可含有信号传导基序，该信号传导基序称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。在本发明中特别有用的含有细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa，FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是提供为SEQ ID NO:17的序列，或来自非人物种的等同残基，例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是提供为SEQ ID NO:43的序列，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞，例如辅助细胞(例如B细胞、树突细胞等)，该免疫系统细胞在其表面上显示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将抗原呈递给T细胞。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生信号，该信号促进含有CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能。免疫效应子功能的实例，例如在CART细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。
在实施例中，细胞内信号传导结构域可以包括初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包括衍生自负责初级刺激或抗原依赖性模拟的分子的那些。在实施例中，细胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的细胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包括信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、Fcγ RIIa、FcRβ(Fcε R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或可替代地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”被定义为以GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等同残基，并且“ζ刺激结构域”或可替代地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”被定义为来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能衍生物，其足以在功能上传递T细胞激活所必需的初始信号。在一方面，ζ的细胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等同残基，它们是其功能性直系同源物。在一方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是提供为SEQ ID NO:17的序列。在一方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是提供为SEQ ID NO:43的序列。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其有助于高效的免疫应答。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、和特异性地结合CD83的配体。
共刺激细胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子可以在以下蛋白质家族中表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活型NK细胞受体。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、和特异性地结合CD83的配体等。
细胞内信号传导结构域可以包含衍生它的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段或衍生物。
术语“4-1BB”是指TNFR超家族的成员，其具有以GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等同残基。在一方面，“4-1BB共刺激结构域”是提供为SEQID NO:16的序列，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等同残基。
如本文所用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答例如促进免疫效应子应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓衍生的吞噬细胞。免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞，可以直接来源于受试者，或者可以从来自受试者的细胞分化(例如，可以从干细胞例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)分化)。
如本文所用的术语“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指增强或促进对靶细胞免疫攻击的(例如免疫效应细胞的)功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答是指促进靶细胞的杀伤或抑制生长或增殖的T或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。
术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。
除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文所述的化合物、制剂、材料或组合物的有效于实现特定的生物学结果的量。在一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指本文所述的化合物的以下量，当给予受试者时，该量有效地(1)至少部分地缓解、抑制、预防和/或改善病症，或(i)由BTK介导的或(ii)与BTK活性相关的或(iii)以BTK活性(正常或异常)为特征的障碍或疾病；或(2)降低或抑制BTK的活性；或(3)减少或抑制BTK的表达。在另一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指本文所述的化合物的以下量，当给予至细胞、或组织、或非细胞生物材料或介质时，该量可有效地至少部分降低或抑制BTK的活性；或部分或完全减少或抑制BTK的表达。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送该分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当解释为进一步包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列有效地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体中最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括自失活慢病毒载体，如Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453–1464(2009)中提供的。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自Oxford BioMedica的基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数目的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的具有所需特异性、亲和力和容量的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体/抗体片段可以包括既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有如下项：至少一个(典型地两个)可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，且FR区的所有或显著一部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。进一步的细节参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[当前结构生物学观点],2:593-596,1992。
“完全人”是指如下免疫球蛋白，例如抗体或抗体片段，其中整个分子是人起源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像，宿主细胞)中。
在本发明的上下文中，使用以下对常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
术语“有效地连接”或“转录控制”是指调节序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列有效地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列有效地连接。有效地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。
术语“肠胃外”给予免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，这些核酸具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子细胞探针]8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含由肽键共价连接地氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体，并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，存在有很多类型的蛋白质。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。
术语“启动子/调节序列”是指表达与启动子/调节序列有效地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调节元件。启动子/调节序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸有效地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸有效地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸有效地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
如在scFv的上下文中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起。在一个实施例中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:31)。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，以及n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，以及n＝10(SEQ ID NO:28)。在一个实施例中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。在另一个实施例中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:31)的多个重复。WO 2012/138475中描述的接头也被包括在本发明的范围内，将该文献通过引用并入本文。
如本文所用，5'帽(也称为RNA帽，RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是经修饰的鸟嘌呤核苷酸，在转录开始后不久其被添加至真核信使RNA的“前”端或5'端。5'帽由末端基团组成，该末端基团与第一个转录的核苷酸相连。它的存在对于被核糖体识别和被保护免于RNA酶至关重要。帽添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得每个都影响另一个。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。该酶促复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生物化学反应进行。可以修饰加帽部分以调节mRNA的功能，例如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“聚(A)”是通过聚腺苷酸化与mRNA连接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施例中，聚A为50个至5000个之间(SEQ ID NO:2589)，优选大于64个，更优选大于100个，最优选大于300个或400个。聚(A)序列可以被化学修饰或酶促修饰以调节mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其经修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加到前mRNA上的腺嘌呤核苷酸(通常数百个)的长序列。在高等真核生物中，将聚(A)尾添加到含有特定序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。聚(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、从细胞核输出mRNA以及翻译也是重要的。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在细胞核中发生，但另外也可稍后在细胞质中发生。转录终止后，通过与RNA聚合酶相关的内切核酸酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点通常被表征为切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，腺苷残基被添加到切割位点处的游离3'端上。
如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达，其中表达的时间段小于如果整合到基因组中或含有在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的基因的表达的时间段。
术语“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且传递信号跨过细胞膜的分子以及分子复合物。
术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人)。
术语“基本上纯化的”细胞是指本质上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下正常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同源的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。
如本文所用的术语“治疗剂”意指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
如本文所用的术语“预防”意指对疾病或疾病状态的预防或保护性治疗。
在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性障碍抗原”或“与过度增殖性障碍相关的抗原”是指特异性过度增殖性障碍常见的抗原。在某些方面，本发明的过度增殖性障碍抗原衍生自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌(例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等)。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经使用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主题细胞及其子代。
术语“特异性地结合”是指抗体或配体，其识别样品中存在的结合配偶体(例如刺激性肿瘤抗原)蛋白并与之结合，但该抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
如本文所用的术语“可调节的嵌合抗原受体(RCAR)”是指一组多肽，在最简单的实施例中典型地是两个多肽，当在RCARX细胞中时，其为RCARX细胞提供对靶细胞(典型地为癌细胞)的特异性以及可调节的细胞内信号产生或增殖，这可以优化RCARX细胞的免疫效应子特性。RCARX细胞至少部分地依赖于抗原结合结构域以向靶细胞提供特异性，该靶细胞包含被抗原结合结构域结合的抗原。在实施例中，RCAR包括二聚化开关，其在存在二聚化分子时可以将细胞内信号传导结构域偶联至抗原结合结构域。
如本文所用的术语“膜锚”或“膜束缚结构域”是指足以将细胞外或细胞内结构域锚定到质膜上的多肽或部分，例如肉豆蔻酰基。
如本文所用的术语“开关结构域”，例如，当提及RCAR时是指在二聚化分子的存在下与另一个开关结构域缔合的实体，典型地为基于多肽的实体。该缔合导致与第一开关结构域连接例如融合的第一实体和与第二开关结构域连接例如融合的第二实体的功能偶联。第一和第二开关结构域统称为二聚化开关。在实施例中，第一和第二开关结构域彼此相同，例如，它们是具有相同的一级氨基酸序列的多肽，并且统称为同源二聚化开关。在实施例中，第一和第二开关结构域彼此不同，例如，它们是具有不同一级氨基酸序列的多肽，并且统称为异源二聚化开关。在实施例中，开关是细胞内的。在实施例中，开关是细胞外的。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体，例如基于FKBP或FRB，并且二聚化分子是小分子，例如rapalogue。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体，例如结合myc肽的scFv，并且二聚化分子是多肽、其片段、或多肽的多聚体，例如与一种或多种myc scFv结合的myc配体或myc配体的多聚体。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体，例如myc受体，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如myc抗体。
如本文所用的术语“二聚化分子”，例如当提及RCAR时是指促进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的分子。在实施例中，二聚化分子在受试者中不天然存在，或者不会以导致显著二聚化的浓度发生。在实施例中，二聚化分子是小分子，例如雷帕霉素或rapalogue，例如RAD001。
如本文所用的“难治性”是指对治疗无反应的疾病，例如癌症。在实施例中，难治性癌症可以在治疗开始之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其他实施例中，难治性癌症在治疗期间可能变得难以治愈。
如本文所用的“完全反应者”是指患有疾病(例如癌症)的受试者，其对治疗展现出完全反应，例如完全缓解。可以例如使用如本文所述的Cheson标准来鉴定完全反应。
如本文所用的“部分反应者”是指患有疾病(例如癌症)的受试者，其对治疗展现出部分反应，例如部分缓解。可以例如使用Cheson标准来鉴定部分反应。
如本文所用的“无反应者”是指患有疾病(例如癌症)的受试者，其对治疗没有展现出反应，例如患者具有稳定的疾病或进行性疾病。可以例如使用如本文所述的Cheson标准来鉴定无反应者。
如本文所用的术语“复发”是指在反应(例如完全反应或部分反应)初始期后疾病(例如癌症)的再现。反应初始期可涉及癌细胞水平降低至低于某一阈值，例如低于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。再现可涉及癌细胞水平升高超过某一阈值，例如高于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。可以例如使用如本文所述的Cheson标准来鉴定复发。
范围：贯穿本披露，能以范围形式呈现本发明的各个方面。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个实例，范围如95％-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。
描述
本文提供了使用表达嵌合抗原受体(CAR)(例如靶向实体瘤上的抗原或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤上的抗原的CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)治疗例如癌症(例如实体瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤)等疾病的物质组合物和使用方法。该方法尤其包括将表达本文所述的CAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)与另一种药剂组合给予，该另一种药剂例如原M2巨噬细胞分子抑制剂，例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂，例如抗IL-13抗体、抗IL-4抗体或抗IL-13Rα1抗体。
本发明至少部分地提供了支持CAR疗法(例如，靶向实体瘤上的抗原或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤上的抗原的CAR)与原M2巨噬细胞分子抑制剂的组合的高功效的实验。相对于原M2巨噬细胞分子抑制剂或一个剂量的表达CAR的细胞的单一疗法或两者，原M2巨噬细胞分子抑制剂与CAR疗法的组合可以提高组合疗法的功效。例如，这些有益效果可以允许较低剂量的原M2巨噬细胞分子抑制剂或表达CAR的细胞或两者，同时保持功效。本文的结果适用于广泛的癌症，例如实体瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤。例如，已知淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤与MDSC或TAM相关，其可抑制表达CAR的免疫效应细胞(例如CD123 CAR)针对所述淋巴瘤的功能。表达CD123 CAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)，例如如本文所述，靶向具有CD123表面表达的癌症(例如霍奇金淋巴瘤)。可替代地或与CD123 CAR相组合，任何其他淋巴瘤靶向CAR可以用于本文所述的组合疗法中。因此，CAR疗法(例如一种或多种CD123 CAR或其他靶向淋巴瘤抗原的CDR)与原M2巨噬细胞分子抑制剂(例如如本文所述)的组合适合于治疗广泛淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤)。类似地，表达靶向实体瘤上的抗原(例如如本文所述，例如间皮素或EGFRvIII)的CAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)靶向具有抗原表面表达的癌症。因此，CAR疗法(例如一种或多种实体瘤靶向CAR，例如靶向间皮素或EGFRvIII的CAR，例如如本文所述)与原M2巨噬细胞分子抑制剂(例如如本文所述)的组合适合于治疗广泛实体瘤，例如与间皮素表达相关的疾病或与EGFRvIII表达相关的疾病。
根据本发明，原M2巨噬细胞分子抑制剂可以降低免疫效应细胞(例如如本文所述的表达CAR的肿瘤效应细胞)对癌症(例如实体瘤或与MDSC或TAM相关的肿瘤)的例如巨噬细胞介导的抑制。不希望受理论束缚，某些淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤)和实体瘤的特征在于与MDSC或TAM相关的癌细胞团块。表达CAR的免疫效应细胞有时难以穿透这些密集包裹的团块，并且它们的抗癌功能可能受到抑制性肿瘤微环境的损害，例如被MDSC或TAM抑制。因此，可以将原M2巨噬细胞分子抑制剂与表达CAR的细胞疗法组合给予，使得癌细胞更容易受到表达CAR的细胞的攻击。
在一方面，本发明提供了许多嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段被工程化为特异性地结合在实体瘤或与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原(例如在霍奇金淋巴瘤的情况下，抗原是例如CD123)。在一方面，本发明提供了被工程化为表达CAR的细胞(例如T细胞)，其中CAR T细胞(“CART”)展现出抗癌特性。在一方面，用CAR转化细胞，并在细胞表面上表达CAR。在一些实施例中，用编码CAR的病毒载体转导细胞(例如T细胞)。在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体。在一些此类实施例中，细胞可以稳定地表达CAR。在另一个实施例中，用编码CAR的核酸(例如mRNA、cDNA、DNA)转染细胞(例如T细胞)。在一些此类实施例中，细胞可以瞬时表达CAR。
在一方面，CAR的抗原结合部分是scFv抗体片段。在一方面，此类抗体片段具有功能性，因为它们保留等同的结合亲和力，例如，它们以与衍生出它们的IgG抗体相当的亲和力结合相同的抗原。在一方面，此类抗体片段是功能性的，因为它们提供生物学应答，其可包括但不限于免疫应答的激活、抑制起源于其靶抗原的信号转导、激酶活性的抑制等，如熟练技术人员所理解的那样。在一方面，CAR的抗原结合结构域是scFv抗体片段，其与衍生它的scFv的鼠序列相比是人源化的。在一些方面，将本发明的抗体掺入嵌合抗原受体(CAR)中。
在一方面，本发明的CAR或CAR的结合结构域(例如人源化scFv)部分由转基因编码，该转基因的序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一方面，本发明的整个CAR构建体由转基因编码，该转基因的整个序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指如下发现：在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中有偏差。这种密码子简并性允许相同的多肽由各种核苷酸序列编码。各种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括例如在至少美国专利号5,786,464和6,114,148中披露的方法。
在一方面，本发明的CAR将特异性抗体的抗原结合结构域与细胞内信号传导分子组合。例如，在一些方面，细胞内信号传导分子包括但不限于CD3-ζ链、4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。
此外，本发明提供了CAR组合物及其在药物或方法中的用途，这些药物或方法用于治疗癌症或任何涉及表达由CAR识别的靶抗原的细胞或组织的恶性肿瘤或自身免疫疾病等疾病。
在一方面，本发明的CAR可用于根除表达靶抗原的正常细胞，从而适用于在细胞移植之前用作细胞调理疗法。在一方面，表达靶抗原的正常细胞是表达CD19的正常干细胞，并且细胞移植是干细胞移植。
在一方面，本发明提供了被工程化为表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)，其中表达CAR的细胞例如CAR T细胞(“CART”)展现出抗癌特性。关于针对例如霍奇金淋巴瘤的抗癌特性，优选的抗原是CD123。在一方面，CAR的抗原结合结构域包含多个抗原结合片段。在一方面，CAR的抗原结合结构域包含含有scFv的多个抗体片段。
在一方面，CAR包含选自以下项的组的至少一个细胞内结构域：CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域及其任何组合。在一方面，CAR包含至少一个细胞内信号传导结构域，其来自除CD137(4-1BB)或CD28之外的一种或多种共刺激分子。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明涵盖包含编码CAR的序列的重组DNA构建体，其中CAR包含与抗原(例如在实体瘤或与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)特异性地结合的抗体或抗体片段，其中抗体片段的序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并在相同的阅读框中。细胞内信号传导结构域可以包括共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如ζ链。共刺激信号传导结构域是指CAR的如下部分：其包含共刺激分子的细胞内结构域的至少一部分。在一个实施例中，抗原结合结构域是本文所述的鼠抗体或抗体片段。在一个实施例中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段。
在一方面，示例性CAR构建体(例如如本文所述)包含任选的前导序列、细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域和细胞内刺激结构域。在一方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列、细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和细胞内刺激结构域。下文提供了含有本发明的鼠、完全人和/或人源化scFv结构域的特定CAR构建体。
示例性前导序列被提供为SEQ ID NO:2。示例性铰链/间隔子序列被提供为SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10。示例性跨膜结构域序列被提供为SEQID NO:12。4-1BB蛋白的细胞内信号传导结构域的示例性序列被提供为SEQ ID NO:14。CD27的细胞内信号传导结构域的示例性序列被提供为SEQ ID NO:16。示例性CD3ζ结构域序列被提供为SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20。
在一方面，本发明涵盖重组核酸构建体，其包含编码CAR的核酸分子，其中该核酸分子包含编码例如本文所述的抗原结合结构域的核酸序列，该核酸序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并在相同的阅读框中。在一方面，本发明涵盖重组核酸构建体，其包含编码CAR的转基因，其中该核酸分子包含编码本文所述的抗原结合结构域的核酸序列。可用于CAR的示例性细胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3-ζ、CD28、4-1BB等的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包括CD3-ζ、CD28、4-1BB等的任何组合。
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞中筛选文库，通过从已知含有该基因的载体中获得基因，或通过使用标准技术直接从包含该基因的细胞和组织分离。可替代地，感兴趣的核酸可以合成产生，而不是克隆。
本发明包括表达可以直接转导入细胞的CAR的逆转录病毒和慢病毒载体构建体。
本发明还包括可以直接转染到细胞中的RNA构建体。产生用于转染的mRNA的方法包括：用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，然后添加聚A以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸、和聚A尾的构建体，典型地长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:32)(例如SEQ ID NO:32-34或SEQ ID NO:37-38)。如此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个实施例中，模板包含针对CAR的序列。在实施例中，通过电穿孔将RNA CAR载体转导到T细胞中。
可以是本文所述CAR分子的一部分的各种组分的非限制性实例的序列列于表1中，其中“aa”代表氨基酸，并且“na”代表编码相应肽的核酸。
表1.CAR的各种组分的序列(aa-氨基酸，na-编码相应蛋白质的核酸)
抗原结合结构域和CAR
在一方面，本发明的CAR包含靶标特异性结合元件，否则称为抗原结合结构域。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标记物的配体。因此，可以充当本发明的CAR中的抗原结合结构域的配体的细胞表面标记物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
在一方面，通过将特异性地结合所需抗原的抗原结合结构域工程化到CAR中，可以将CAR介导的T细胞应答导向目标抗原。
在一方面，CAR包含靶向实体瘤抗原的抗原结合结构域。在一方面，CAR包含抗原结合结构域，其靶向在与MDSC或TAM相关的肿瘤(例如霍奇金淋巴瘤)上表达的肿瘤抗原。
抗原结合结构域可以是结合抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、鼠抗体、人抗体、人源化抗体及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体(例如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科动物衍生的纳米抗体的可变结构域(VHH))以及本领域已知的用作抗原结合结构域的替代支架(例如重组纤连蛋白结构域等)。
在实施例中，CAR的抗原结合结构域与人间皮素结合。在实施例中，抗原结合结构域是结合人间皮素的鼠scFv结构域，例如SS1或SEQ ID NO:46。在实施例中，抗原结合结构域是衍生自鼠SS1scFv的人源化抗体或抗体片段(例如scFv结构域)。在实施例中，抗原结合结构域是结合人间皮素的人抗体或抗体片段。表2中提供了结合间皮素的示例性人scFv结构域(及其序列)和鼠SS1scFv。CDR序列加下划线。表2中提供的scFv结构域序列包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH通过包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30)(例如，如SS1scFv结构域中所示)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:29)(例如，如在M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20、M21、M22、M23、或M24scFv结构域中所示)的接头附接。表2中列出的scFv结构域处于以下方向：VL-接头-VH。
表2.结合间皮素的抗原结合结构域的实例
表2中提供的间皮素抗原结合结构域的scFv结构域的CDR序列的序列示于表3(针对重链可变结构域)和表4中(针对轻链可变结构域)。
表3.人抗间皮素scFv的重链(HC)CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列
表4.人抗间皮素scFv的轻链(LC)CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列
来自例如已知抗体、双特异性分子或CAR的任何已知抗间皮素结合结构域可适合在本发明的CAR中使用。例如，针对间皮素的抗原结合结构域是或可以衍生自例如在PCT公开WO 2015/090230中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分(例如CDR或VH和VL)。在实施例中，针对间皮素的抗原结合结构域是或衍生自例如在PCT公开WO 1997/025068、WO 1999/028471、WO 2005/014652、WO 2006/099141、WO 2009/045957、WO 2009/068204、WO 2013/142034、WO 2013/040557或WO 2013/063419中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分(例如CDR或VH和VL)。
在一个实施例中，间皮素结合结构域包含本文描述的间皮素结合结构域(例如在表2或4中提供的)的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文描述的间皮素结合结构域(例如在表2或3中提供的)的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，间皮素结合结构域包含具有如表4中提供的任何氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部；以及具有如表3中提供的任何氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3全部中的一个、两个或三个。
在一个实施例中，间皮素抗原结合结构域包含：
(i)(a)SEQ ID NO:184的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:209的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:234的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:115的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:134的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:159的HC CDR3氨基酸序列；
(ii)(a)SEQ ID NO:190的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:215的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:240的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:121的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:141的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:165的HC CDR3氨基酸序列；
(iii)(a)SEQ ID NO:204的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:229的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:254的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:132的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:154的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:179的HC CDR3氨基酸序列；
(iv)(a)SEQ ID NO:180的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:205的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:230的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:113的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:133的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:155的HC CDR3氨基酸序列；
(v)(a)SEQ ID NO:181的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:206的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:231的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:113的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:134的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:156的HC CDR3氨基酸序列；
(vi)(a)SEQ ID NO:182的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:207的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:232的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:113的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:134的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:157的HC CDR3氨基酸序列；
(vii)(a)SEQ ID NO:183的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:208的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:233的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:114的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:135的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:158的HC CDR3氨基酸序列；
(viii)(a)SEQ ID NO:186的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:210的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:235的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:116的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:136的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:160的HC CDR3氨基酸序列；
(ix)(a)SEQ ID NO:186的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:211的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:236的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:117的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:137的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:161的HC CDR3氨基酸序列；
(x)(a)SEQ ID NO:187的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:212的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:237的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:118的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:138的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:162的HC CDR3氨基酸序列；
(xi)(a)SEQ ID NO:188的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:213的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:238的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:119的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:139的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:163的HC CDR3氨基酸序列；
(xii)(a)SEQ ID NO:189的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:214的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:239的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:120的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:140的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:164的HC CDR3氨基酸序列；
(xiii)(a)SEQ ID NO:191的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:216的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:241的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:121的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:142的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166的HC CDR3氨基酸序列；
(xiv)(a)SEQ ID NO:192的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:217的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:242的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:122的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:143的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:167的HC CDR3氨基酸序列；
(xv)(a)SEQ ID NO:193的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:218的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:243的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:123的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:144的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:168的HC CDR3氨基酸序列；
(xvi)(a)SEQ ID NO:194的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:219的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:244的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:124的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:145的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:169的HC CDR3氨基酸序列；
(xvii)(a)SEQ ID NO:195的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:220的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:245的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:124的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:146的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:170的HC CDR3氨基酸序列；
(xviii)(a)SEQ ID NO:196的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:221的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:246的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:124的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:146的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:171的HC CDR3氨基酸序列；
(xix)(a)SEQ ID NO:197的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:222的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:247的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:125的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:172的HC CDR3氨基酸序列；
(xx)(a)SEQ ID NO:198的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:223的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:248的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:126的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:148的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:173的HC CDR3氨基酸序列；
(xxi)(a)SEQ ID NO:199的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:224的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:249的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:127的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:149的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:174的HC CDR3氨基酸序列；
(xxii)(a)SEQ ID NO:200的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:225的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:250的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:128的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:175的HC CDR3氨基酸序列；
(xxiii)(a)SEQ ID NO:201的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:226的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:251的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:129的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:151的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:176的HC CDR3氨基酸序列；
(xxiv)(a)SEQ ID NO:202的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:227的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:252的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:130的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:152的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:177的HC CDR3氨基酸序列；
或者
(xxv)(a)SEQ ID NO:203的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:228的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:253的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:131的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:153的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:178的HC CDR3氨基酸序列。
在一个实施例中，间皮素结合结构域包含本文所述的轻链可变区(例如在表2中)和/或本文所述的重链可变区(例如在表2中)。在一个实施例中，间皮素结合结构域是scFv，其包含具有表2中列出的氨基酸序列的轻链和重链。在实施例中，间皮素结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含具有表2中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列，或与表2中提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表2中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列，或与表2中提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。
在一个实施例中，间皮素结合结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、和SEQ ID NO:70；或具有对任何上述序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列；或与任何上述序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，间皮素结合结构域是scFv，并且包含本文(例如在表2中)所述氨基酸序列的轻链可变区通过接头(例如本文所述的接头)附接至包含本文(例如在表2中)所述氨基酸序列的重链可变区。在一个实施例中，间皮素结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选4(SEQ ID NO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如处于以下方向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
例如，如本文所述，结合间皮素的此类抗原结合结构域可用于例如本发明的其中治疗与例如本文所述的间皮素表达相关的疾病的实施例中。
在实施例中，CAR(例如由本发明的细胞表达的CAR)的抗原结合结构域结合人EGFRvIII。在实施例中，抗原结合结构域是与人EGFRvIII结合的鼠scFv结构域，例如像mu310C。在实施例中，抗原结合结构域是衍生自鼠mu310C scFv的人源化抗体或抗体片段(例如scFv结构域)。表5中提供了与EGFRvIII结合的示例性人源化scFv结构域(及其序列)。
在实施例中，CAR(例如由本发明的细胞表达的CAR)的抗原结合结构域结合人紧密连接蛋白(claudin)6(CLDN6)。在实施例中，抗原结合结构域是结合人CLDN6的鼠scFv结构域。在实施例中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段。表5中提供了与CLDN6结合的示例性scFv结构域(及其序列)。表5中提供的scFv结构域序列包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH通过包含序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:29)的接头附接，例如，处于以下方向：VL-接头-VH。
表5.结合肿瘤抗原EGFRvIII或CLDN6的抗原结合结构域的实例(如所示)
在一个实施例中，EGFRvIII结合结构域包含本文描述的EGFRvIII结合结构域(例如在表5中提供的)的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文描述的EGFRvIII结合结构域(例如在表5中提供的)的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在一个实施例中，EGFRvIII结合结构域包含本文所述的轻链可变区(例如在表5中)和/或本文所述的重链可变区(例如在表5中)。在一个实施例中，EGFRvIII结合结构域是scFv，其包含具有表5中列出的氨基酸序列的轻链和重链。在实施例中，EGFRvIII结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含具有表5中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列，或与表5中提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表5中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列，或与表5中提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。
在一个实施例中，EGFRvIII结合结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、和SEQ ID NO:79；或具有对任何上述序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列；或与任何上述序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，EGFRvIII结合结构域是scFv，并且包含本文(例如在表5中)所述氨基酸序列的轻链可变区通过接头(例如本文所述的接头)附接至包含本文(例如在表5中)所述氨基酸序列的重链可变区。在一个实施例中，EGFRvIII结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选4(SEQ ID NO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如处于以下方向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个实施例中，紧密连接蛋白-6结合结构域包含本文描述的EGFRvIII结合结构域(例如在表5中提供的)的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文描述的紧密连接蛋白-6结合结构域(例如在表5中提供的)的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在一个实施例中，紧密连接蛋白-6结合结构域包含本文所述的轻链可变区(例如在表5中)和/或本文所述的重链可变区(例如在表5中)。在一个实施例中，紧密连接蛋白-6结合结构域是scFv，其包含具有表5中列出的氨基酸序列的轻链和重链。在实施例中，紧密连接蛋白-6结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含具有表5中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列，或与表5中提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表5中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列，或与表5中提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。
例如，如本文所述，结合EGFRvIII的此类抗原结合结构域可用于例如本发明的其中治疗与例如本文所述的EGFRvIII表达相关的疾病的实施例中。
在一个实施例中，紧密连接蛋白-6结合结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、和SEQ ID NO:100；或具有对任何上述序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列；或与任何上述序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，紧密连接蛋白-6结合结构域是scFv，并且包含本文(例如在表5中)所述氨基酸序列的轻链可变区通过接头(例如本文所述的接头)附接至包含本文(例如在表5中)所述氨基酸序列的重链可变区。在一个实施例中，紧密连接蛋白-6结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选4(SEQ ID NO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如处于以下方向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Mujoo等人,Cancer Res[癌症研究]47(4):1098-1104(1987)；Cheung等人,Cancer Res[癌症研究]45(6):2642-2649(1985)，Cheung等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]5(9):1430-1440(1987)，Cheung等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]16(9):3053-3060(1998)，Handgretinger等人,Cancer Immunol Immunother[癌症免疫学和免疫疗法]35(3):199-204(1992)。在一些实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是选自以下项的抗体的抗原结合部分：mAb 14.18、14G2a、ch14.18、hu14.18、3F8、hu3F8、3G6、8B6、60C3、10B8、ME36.1、和8H9，参见例如WO 2012033885、WO 2013040371、WO 2013192294、WO2013061273、WO 2013123061、WO 2013074916、和WO 201385552。在一些实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是美国公开号20100150910或PCT公开号WO 2011160119中描述的抗体的抗原结合部分。
在一个实施例中，针对Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽抗原或sTn-O-糖肽抗原的抗原结合结构域是描述于例如US 2014/0178365、US8,440,798、EP 2083868A2、Brooks等人,PNAS 107(22):10056-10061(2010)和Stone等人,OncoImmunology[肿瘤免疫学]1(6):863-873(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对PSMA的抗原结合结构域是描述于例如Parker等人,ProteinExpr Purif[蛋白质表达与纯化]89(2):136-145(2013)、US 20110268656(J591ScFv)、Frigerio等人,European J Cancer[欧洲癌症杂志]49(9):2223-2232(2013)(scFvD2B)、WO2006125481(mAb 3/A12、3/E7和3/F11)中的抗体和单链抗体片段(scFv A5和D7)中的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对CD97的抗原结合结构域是描述于例如US 6,846,911、deGroot等人,J Immunol[免疫学杂志]183(6):4127-4134(2009)中的抗体或来自R&D:MAB3734的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对TAG72的抗原结合结构域是描述于例如Hombach等人,Gastroenterology[肠胃病学]113(4):1163-1170(1997)中的抗体以及Abcam ab691的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对CD44v6的抗原结合结构域是描述于例如Casucci等人,Blood[血液]122(20):3461-3472(2013)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对CEA的抗原结合结构域是描述于例如Chmielewski等人,Gastoenterology[肠胃病学]143(4):1095-1107(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对EPCAM的抗原结合结构域是选自以下的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：MT110、EpCAM-CD3双特异性Ab(参见例如clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596)；依决洛单抗；3622W94；ING-1；和阿德木单抗(MT201)。
在一个实施例中，针对KIT的抗原结合结构域是描述于例如US 7915391、US20120288506中的抗体和几种商业目录抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对IL-13Ra2的抗原结合结构域是描述于例如WO 2008/146911、WO 2004087758中的抗体、几种商业目录抗体和WO 2004087758中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对CD171的抗原结合结构域是描述于例如Hong等人,JImmunother[免疫疗法杂志]37(2):93-104(2014)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对PSCA的抗原结合结构域是描述于例如Morgenroth等人,Prostate[前列腺]67(10):1121-1131(2007)(scFv 7F5)、Nejatollahi等人,J ofOncology[肿瘤学杂志]2013(2013),文章ID 839831(scFv C5-II)、和美国专利公开号20090311181中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对MAD-CT-2的抗原结合结构域是描述于例如PMID:2450952、US 7635753中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对叶酸受体α的抗原结合结构域是抗体IMGN853或描述于US20120009181、US 4851332、LK26:US 5952484中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对ERBB2(Her2/neu)的抗原结合结构域是抗体曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对MUC1的抗原结合结构域是抗体SAR566658的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对EGFR的抗原结合结构域是抗体西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗或马妥珠单抗的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对NCAM的抗原结合结构域是抗体克隆2-2B：MAB5324(EMD密理博公司(EMD Millipore))的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对CAIX的抗原结合结构域是抗体克隆303123(R&D Systems公司)的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对Fos相关抗原1的抗原结合结构域是抗体12F9(NovusBiologicals公司)的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对SSEA-4的抗原结合结构域是抗体MC813(Cell Signaling公司)或其他市售抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对PDGFR-β的抗原结合结构域是抗体Abcamab32570的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对ALK的抗原结合结构域是描述于例如Mino-Kenudson等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]16(5):1561-1571(2010)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对多唾液酸的抗原结合结构域是描述于例如Nagae等人,JBiol Chem[生物化学杂志]288(47):33784-33796(2013)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对PLAC1的抗原结合结构域是描述于例如Ghods等人,Biotechnol Appl Biochem[生物化学生物技术应用]2013doi:10.1002/bab.1177中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对GloboH的抗原结合结构域是抗体VK9或描述于例如Kudryashov V等人,Glycoconj J.[糖缀合物杂志]15(3):243-9(1998)、Lou等人,ProcNatl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]111(7):2482-2487(2014)、MBr1:Bremer E-G等人J Biol Chem[生物化学杂志]259:14773–14777(1984)中的抗体的抗原结合部分。
在一个实施例中，针对NY-BR-1的抗原结合结构域是描述于例如Jager等人,ApplImmunohistochem Mol Morphol[应用免疫组织化学分子形态学]15(1):77-83(2007)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对精子蛋白17的抗原结合结构域是描述于例如Song等人,Target Oncol[靶标肿瘤学]2013年8月14日(PMID:23943313)、Song等人,Med Oncol[医学肿瘤学]29(4):2923-2931(2012)中的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施例中，针对TRP-2的抗原结合结构域是描述于例如Wang等人,J ExpMed.[实验医学杂志]184(6):2207-16(1996)中的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施例中，针对CYP1B1的抗原结合结构域是描述于例如Maecker等人,Blood[血液]102(9):3287-3294(2003)中的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施例中，针对RAGE-1的抗原结合结构域是抗体MAB5328(EMD Millipore)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施例中，针对人端粒酶逆转录酶的抗原结合结构域是抗体目录号LS-B95-100(Lifespan Biosciences)的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施例中，针对肠羧基酯酶的抗原结合结构域是抗体4F12：目录号LS-B6190-50(Lifespan Biosciences)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施例中，针对mut hsp70-2的抗原结合结构域是抗体LifespanBiosciences：单克隆：目录号LS-C133261-100(Lifespan Biosciences公司)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施例中，针对MAD-CT-2的抗原结合结构域是描述于例如PMID:2450952、US 7635753中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或来自与上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一个实施例中，抗原结合结构域包含上文列出的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一个实施例中，可以选择CAR(例如由本发明的细胞表达的CAR)的抗原结合结构域，使得髓系肿瘤群被靶向。可替代地，当需要靶向多于一种类型的髓系肿瘤时，可以选择靶向由多于一种例如所有待靶向的髓系肿瘤表达的髓系肿瘤抗原的抗原结合结构域。
在一方面，CAR的抗原结合结构域，例如由本发明的细胞表达的CAR，结合CD123，例如人CD123。任何已知的CD123结合结构域均可用于本发明。在一个实施例中，针对CD123的抗原结合结构域是描述于例如PCT公开WO 2014/130635中的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如CDR或VH和VL。在一个实施例中，针对CD123的抗原结合结构域是描述于例如PCT公开WO 2016/028896中的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如CDR或VH和VL。在一个实施例中，针对CD123的抗原结合结构域是描述于例如PCT公开WO 1997/024373、WO 2008/127735(例如26292、32701、37716或32703的CD123结合结构域)、WO 2014/138805(例如CSL362的CD123结合结构域)、WO 2014/138819、WO 2013/173820、WO 2014/144622、WO2001/66139、WO 2010/126066(例如Old4、Old5、Old17、Old19、New102、或Old6中的任一个的CD123结合结构域)、WO 2014/144622、或US 2009/0252742中的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如CDR。在实施例中，抗原结合结构域是或衍生自鼠抗人CD123结合结构域。在实施例中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段(例如scFv结构域)。在实施例中，抗原结合结构域是结合人CD123的人抗体或抗体片段。在实施例中，抗原结合结构域是scFv结构域，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH可以通过本文所述的接头(例如包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30))附接，并且可以处于任何方向，例如VL-接头-VH或VH-接头-VL。
在一个实施例中，人CD123结合结构域包含本文所述的人CD123结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文所述的人CD123结合结构域(例如包含一个或多个例如全部三个LC CDR以及一个或多个例如全部三个HC CDR的人CD123结合结构域)的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，人CD123结合结构域包含本文所述的人CD123结合结构域(例如该人CD123结合结构域具有两个可变重链区，每个包含本文所述的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，人CD123结合结构域包含本文所述的人轻链可变区(例如在表26或28中)和/或本文所述的人重链可变区(例如在表26或28中)。在一个实施例中，人CD123结合结构域包含本文所述的人重链可变区(例如在表26或28中)，例如本文所述的至少两个人重链可变区(例如在表26或28中)。在一个实施例中，CD123结合结构域是scFv，其包含具有表26或28中的氨基酸序列的轻链和重链。在实施例中，CD123结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含具有表26或28中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，或与表26的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如95％-99％同一性)的序列；和/或重链可变区，其包含具有表26或28中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，或与表26或28中的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如95％-99％同一性)的序列。在一个实施例中，人CD123结合结构域包含选自由SEQ ID NO:2157-2160、2478、2480、2483、和2485组成的组的序列，或与其具有至少95％同一性(例如95％-99％同一性)的序列。在一个实施例中，人CD123结合结构域是scFv，并且包含本文(例如在表26或28中)所述氨基酸序列的轻链可变区通过接头(例如本文所述的接头)附接至包含本文(例如在表26中)所述氨基酸序列的重链可变区。在一个实施例中，人CD123结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选3或4(SEQ ID NO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如处于以下方向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与在人中天然产生的抗体或其片段的相似度。因此，在一方面，抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一个实施例中，人源化CD123结合结构域包含本文所述的人源化CD123结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文所述的人源化CD123结合结构域(例如包含一个或多个例如全部三个LC CDR以及一个或多个例如全部三个HC CDR的人源化CD123结合结构域)的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，人源化CD123结合结构域包含本文所述的人源化CD123结合结构域(例如该人源化CD123结合结构域具有两个可变重链区，每个包含本文所述的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，人源化CD123结合结构域包含本文所述的人源化轻链可变区(例如在表27中)和/或本文所述的人源化重链可变区(例如在表27中)。在一个实施例中，人源化CD123结合结构域包含本文所述的人源化重链可变区(例如在表27中)，例如本文所述的至少两个人源化重链可变区(例如在表27中)。在一个实施例中，CD123结合结构域是scFv，其包含具有表27中的氨基酸序列的轻链和重链。在实施例中，CD123结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含具有表27中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，或与表27的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如95％-99％同一性)的序列；和/或重链可变区，其包含具有表27中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，或与表27中的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如95％-99％同一性)的序列。在一个实施例中，人源化CD123结合结构域包含选自由SEQ ID NO:2184-2215和2302-2333组成的组的序列，或与其具有至少95％同一性(例如95％-99％同一性)的序列。在一个实施例中，人源化CD123结合结构域是scFv，并且包含本文(例如在表27中)所述氨基酸序列的轻链可变区通过接头(例如本文所述的接头)附接至包含本文(例如在表27中)所述氨基酸序列的重链可变区。在一个实施例中，人源化CD123结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选3或4(SEQ ID NO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如处于以下方向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在本文中披露的示例性CD123 CAR构建体包含scFv(例如，如本文表26、27和28中披露的人scFv)，任选地在其前面为任选的前导序列(例如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，分别为示例性前导氨基酸和核苷酸序列)。本文在表26中提供了人scFv片段的序列(SEQ IDNO:2157-2160的氨基酸序列)。不含前导序列的人scFv片段的序列在本文表28中提供(核苷酸序列为SEQ ID NO:2479、2481、2482和2484，氨基酸序列为SEQ ID NO:2478、2480、2483、和2485)。CD123 CAR构建体可以进一步包括任选的铰链结构域，例如CD8铰链结构域(例如包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由SEQ ID NO:5的核酸序列编码)；跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域(例如包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的核苷酸序列编码)；细胞内结构域，例如4-1BB细胞内结构域(例如包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ IDNO:15的核苷酸序列编码)；和功能性信号传导结构域，例如CD3ζ结构域(例如包括SEQ IDNO:18或20的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:19或21的核苷酸序列编码)。在某些实施例中，这些结构域是相邻的且处于同一阅读框，以形成单一融合蛋白。在其他实施例中，结构域是单独的多肽，例如在如本文所述的RCAR分子中。
在某些实施例中，全长CD123 CAR分子包括表26、27或28中提供的CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31、或hzCD123-32的氨基酸序列或由以上各项的核苷酸序列编码，或者包括与这些氨基酸序列或核苷酸序列基本相同的(例如具有至少95％同一性，例如95％-99％同一性)序列。
在某些实施例中，CD123 CAR分子或CD123抗原结合结构域包括表26、27或28中提供的CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31、或hzCD123-32的scFv氨基酸序列；或包括CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31、或hzCD123-32的scFv氨基酸序列或由以上各项的核苷酸序列编码，或者包括与任一前述序列基本上相同的(例如具有至少95％同一性，例如95％-99％同一性，或高达20、15、10、8、6、5、4、3、2、或1个氨基酸改变)序列。
在某些实施例中，CD123 CAR分子或CD123抗原结合结构域包括表26或27中提供的CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31、或hzCD123-32的重链可变区和/或轻链可变区，或与任一前述序列基本上相同的(例如具有至少95％同一性，例如95％-99％同一性，或高达20、15、10、8、6、5、4、3、2、或1个氨基酸改变)序列。
在某些实施例中，CD123 CAR分子或CD123抗原结合结构域包括在表16或18中提供的来自重链可变区的一个、两个或三个CDR(例如HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)；和/或在表17或19中提供的来自CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31、或hzCD123-32的轻链可变区的一个、两个或三个CDR(例如LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)；或者与任一前述序列基本上相同的(例如，至少95％相同，例如95％-99％相同，或至多5、4、3、2或1个氨基酸变化)序列。
在某些实施例中，CD123 CAR分子或CD123抗原结合结构域包括在表20中提供的来自重链可变区的一个、两个或三个CDR(例如HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)；和/或在表21中提供的来自CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31、或hzCD123-32的轻链可变区的一个、两个或三个CDR(例如LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)；或者与任一前述序列基本上相同的(例如，至少95％相同，例如95％-99％相同，或至多5、4、3、2或1个氨基酸变化)序列。
在某些实施例中，CD123分子或CD123抗原结合结构域包括在表22中提供的来自重链可变区的一个、两个或三个CDR(例如HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)；和/或在表23中提供的来自CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31、或hzCD123-32的轻链可变区的一个、两个或三个CDR(例如LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)；或者与任一前述序列基本上相同的(例如，至少95％相同，例如95％-99％相同，或至多5、4、3、2或1个氨基酸变化)序列。
scFv结构域的CDR序列的序列，针对重链可变结构域的示于表16、18、20和22中，而针对轻链可变结构域的示于表17、19、21和23中。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。
表16、17、18和19中提供的CDR是根据Kabat和Chothia编号方案的组合。
表16.重链可变结构域CDR
表17.轻链可变结构域CDR
表18.重链可变结构域CDR
表19.轻链可变结构域CDR
表20.根据Kabat编号方案的重链可变结构域CDR(Kabat等人(1991),“Sequencesof Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列],”第5版Public Health Service[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州)
表21.根据Kabat编号方案的轻链可变结构域CDR(Kabat等人(1991),“Sequencesof Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列],”第5版Public Health Service[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州)
表22.根据Chothia编号方案的重链可变结构域CDR(Al-Lazikani等人,(1997)JMB273,927-948)
表23.根据Chothia编号方案的轻链可变结构域CDR(Al-Lazikani等人,(1997)JMB273,927-948)
在实施例中，产生CD123单链可变片段并将其克隆到具有细胞内CD3ζ结构域和4-1BB的细胞内共刺激结构域的慢病毒CAR表达载体中。表24中描绘了示例性完全人CD123scFv的名称。表25中描绘了示例性人源化CD123 scFv的名称。
表24：CAR-CD123构建体
构建体ID CAR别称
EBB-C1357-F11 CAR123-1
EBB-C1358-B10 CAR123-2
EBB-C1358-D5 CAR123-3
EBB-C1357-C4 CAR123-4
表25：CAR-CD123构建体
在实施例中，其中VL和VH结构域出现在scFv中的顺序是变化的(即，VL-VH或VH-VL方向)，并且其中三个(SEQ ID NO:30)或四个(SEQ ID NO:29)“G4S”(SEQ ID NO:22)亚基拷贝连接可变结构域以产生scFv结构域的全部，其中每个亚基包含序列GGGGS(SEQ ID NO:22)(例如(G4S)3(SEQ ID NO:30)或(G4S)4(SEQ ID NO:29))，如表26、表27和表28中所示。
表26、表27和表28中提供了CD123 scFv结构域和CD123 CAR分子的氨基酸和核酸序列。表26和表27中还提供了每种scFv的可变重链和可变轻链的氨基酸序列。应注意具有前导序列(例如SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸序列)和没有前导序列(SEQ ID NO:2478、2480、2483、2485和2556-2587)的scFv片段(SEQ ID NO:2157-2160和2184-2215)也被涵盖在本发明中。
在实施例中，表26和27中的这些克隆均含有在衍生自CD3ζ链的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
表26.示例性CD123 CAR序列
表27：人源化CD123 CAR序列
在实施例中，本文所述的CAR分子包含特异性地结合CD123的scFv，并且不含有前导序列，例如氨基酸序列SEQ ID NO:2。下表28提供了不含有前导序列SEQ ID NO:2的CD123scFv序列的氨基酸和核苷酸序列。
表28.CD123 CAR scFv序列
在一方面，CAR的抗原结合结构域，例如由本发明的细胞表达的CAR，结合CD33，例如人CD33。任何已知的CD33结合结构域均可用于本发明。在一个实施例中，针对CD33的抗原结合结构域是抗体的抗原结合部分(例如CDR或VH和VL)、抗原结合片段或描述于例如PCT公开WO 2016/014576中的CAR，将该公开的内容以其整体并入本文。在一个实施例中，针对CD33的抗原结合结构域是吉妥珠单抗奥唑米星的抗原结合部分或衍生自吉妥珠单抗奥唑米星的抗原结合部分(例如，包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包括：吉妥珠单抗奥唑米星(之前作为Mylotarg销售)的scFv序列的重链可变结构域的一个或多个例如一个、两个或三个CDR，和/或轻链可变结构域的一个或多个例如一个、两个或三个CDR，或VH或VL，或scFv序列)，例如Bross等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]7(6):1490-1496(2001)(吉妥珠单抗奥唑米星，hP67.6)。在一个实施例中，针对CD33的抗原结合结构域是由GenBank参考号AM402974.1编码的scFv序列的抗原结合部分或衍生自该scFv序列的抗原结合部分(例如，包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包括：重链可变结构域的一个或多个例如一个、两个或三个CDR，和/或轻链可变结构域的一个或多个例如一个、两个或三个CDR，或VH或VL，或scFv序列)(参见Wang等人,Mol.Ther.[分子疗法],第23卷:1,第184-191页(2015)，特此将其通过引用并入。在一个实施例中，针对CD33的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Caron等人,Cancer Res[癌症研究]52(24):6761-6767(1992)(林妥珠单抗，HuM195)，Lapusan等人,Invest New Drugs[新药物研究]30(3):1121-1131(2012)(AVE9633)，Aigner等人,Leukemia[白血病]27(5):1107-1115(2013)(AMG330，CD33BiTE)，Dutour等人,Advhematol[血液学进展]2012:683065(2012)，以及Pizzitola等人,Leukemia[白血病]doi:10.1038/Lue.2014.62(2014)。在实施例中，抗原结合结构域是或衍生自鼠抗人CD33结合结构域。在实施例中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段(例如scFv结构域)。在实施例中，抗原结合结构域是结合人CD33的人抗体或抗体片段。在实施例中，抗原结合结构域是scFv结构域，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH可以通过本文所述的接头(例如包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30))附接，并且可以处于任何方向，例如VL-接头-VH或VH-接头-VL。
在一方面，CAR(例如由本发明的细胞表达的CAR)的抗原结合结构域结合CLL-1，例如人CLL-1。任何已知的CLL-1结合结构域均可用于本发明。在一个实施例中，针对CLL-1的抗原结合结构域是抗体的抗原结合部分(例如CDR或VH和VL)、抗原结合片段或描述于例如PCT公开WO 2016/014535中的CAR，将该公开的内容以其整体并入本文。在一个实施例中，针对CLL-1的抗原结合结构域是可从R&D公司、ebiosciences公司、Abcam公司获得的抗体的抗原结合部分(例如CDR)，该抗体例如PE-CLL1-hu目录号353604(BioLegend公司)；和PE-CLL1(CLEC12A)目录号562566(BD)。在实施例中，抗原结合结构域是或衍生自鼠抗人CLL-1结合结构域。在实施例中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段(例如scFv结构域)。在实施例中，抗原结合结构域是结合人CLL-1的人抗体或抗体片段。在实施例中，抗原结合结构域是scFv结构域，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH可以通过本文所述的接头(例如包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30))附接，并且可以处于任何方向，例如VL-接头-VH或VH-接头-VL。
在一方面，CAR(例如由本发明的细胞表达的CAR)的抗原结合结构域结合B细胞抗原，例如人B细胞抗原。任何已知的B细胞抗原结合结构域均可用于本发明。
在实施例中，B细胞抗原是优先或特异性地表达在B细胞表面上的抗原。抗原可以在以下类型B细胞的任一种的表面上表达：祖细胞B细胞(例如前B细胞或祖B细胞)、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞(例如初试B细胞)、成熟B细胞、浆B细胞、浆母细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、生发中心B细胞或调节性B细胞(Breg)。
本披露提供了可以靶向以下B细胞抗原的CAR：CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD37、CD38、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、ROR1、BCMA、CD86、和CD179b。可以被本文所述的CAR靶向的其他B细胞抗原包括：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD5、CD6、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD17、CD18、CD26、CD27、CD29、CD30、CD31、CD32a、CD32b、CD35、CD38、CD39、CD40、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD49d、CD50、CD52、CD54、CD55、CD58、CD60a、CD62L、CD63、CD63、CD68CD69、CD70、CD85E、CD85I、CD85J、CD92、CD95、CD97、CD98、CD99、CD100、CD102、CD108、CD119、CD120a、CD120b、CD121b、CD122、CD124、CD125、CD126、CD130、CD132、CD137、CD138、CD139、CD147、CD148、CD150、CD152、CD162、CD164、CD166、CD167a、CD170、CD175、CD175s、CD180、CD184、CD185、CD192、CD196、CD197、CD200、CD205、CD210a、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD224、CD225、CD226、CD227、CD229、CD230、CD232、CD252、CD253、CD257、CD258、CD261、CD262、CD263、CD264、CD267、CD268、CD269、CD270、CD272、CD274、CD275、CD277、CD279、CD283、CD289、CD290、CD295、CD298、CD300a、CD300c、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD314、CD315、CD316、CD317、CD319、CD321、CD327、CD328、CD329、CD338、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362、和CD363。
在另一个实施例中，由CAR靶向的B细胞抗原选自CD19、BCMA、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、CS-1和CD138。在实施例中，由CAR靶向的B细胞抗原是CD19。在实施例中，由CAR靶向的B细胞抗原是CD20。在实施例中，由CAR靶向的B细胞抗原是CD22。在实施例中，由CAR靶向的B细胞抗原是BCMA。在实施例中，由CAR靶向的B细胞抗原是FcRn5。在实施例中，由CAR靶向的B细胞抗原是FcRn2。在实施例中，由CAR靶向的B细胞抗原是CS-1。在实施例中，由CAR靶向的B细胞抗原是CD138。
在一个实施例中，可以将CAR(例如由本发明的细胞表达的CAR)的抗原结合结构域选择为使得靶向优选的B细胞群。例如，在需要靶向B调节性细胞的实施例中，选择靶向B细胞抗原的抗原结合结构域，该B细胞抗原在调节性B细胞上而不是在其他B细胞群(例如浆B细胞和记忆B细胞)上表达。在调节性B细胞上表达的细胞表面标记物包括：CD19、CD24、CD25、CD38或CD86，或He等人,2014,J Immunology Research[免疫学研究杂志],文章ID215471中描述的标记物。当需要靶向多于一种类型的B细胞时，可以选择靶向由待靶向的所有B细胞表达的B细胞抗原的抗原结合结构域。
在实施例中，CAR(例如由本发明的细胞表达的CAR)的抗原结合结构域结合CD19。在从前/祖B细胞阶段直到终末分化的浆细胞阶段的整个谱系分化中，在B细胞上发现CD19。在实施例中，抗原结合结构域是结合人CD19的鼠scFv结构域，例如CTL019(例如SEQ ID NO:95)。在实施例中，抗原结合结构域是衍生自鼠CTL019scFv的人源化抗体或抗体片段(例如scFv结构域)。在实施例中，抗原结合结构域是结合人CD19的人抗体或抗体片段。表6中提供了结合CD19的示例性scFv结构域(及其序列，例如CDR、VL和VH序列)。表6中提供的scFv结构域序列包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH通过包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30)的接头附接，例如，处于以下方向：VL-接头-VH。
表6.结合B细胞抗原CD19的抗原结合结构域
表6中提供的CD19抗原结合结构域的scFv结构域的CDR序列的序列示于表7(针对重链可变结构域)和表8中(针对轻链可变结构域)。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。
表7.重链可变结构域CDR
表8.轻链可变结构域CDR
在实施例中，抗原结合结构域包含抗CD19抗体或其片段(例如scFv)。例如，抗原结合结构域包含表9中列出的可变重链和可变轻链。连接可变重链和可变轻链的接头序列可以是本文所述的接头序列中的任一个，或者可替代地可以是GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ IDNO:81)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如处于以下方向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
表9.另外的抗CD19抗体结合结构域
在一个实施例中，CD19结合结构域包含本文描述的CD19结合结构域(例如在表6或7中提供的)的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文描述的CD19结合结构域(例如在表6或8中提供的)的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，CD19结合结构域包含具有如表8中提供的任何氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部，将所述氨基酸序列通过引用并入本文；以及具有如表7中提供的任何氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。
在一个实施例中，CD19抗原结合结构域包含：
(i)(a)SEQ ID NO:261的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:262的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:263的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:255的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:256的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:260的HC CDR3氨基酸序列
(ii)(a)SEQ ID NO:261的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:262的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:263的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:255的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:257的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:260的HC CDR3氨基酸序列；
(iii)(a)SEQ ID NO:261的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:262的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:263的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:255的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:258的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:260的HC CDR3氨基酸序列；
或者
(iv)(a)SEQ ID NO:261的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:262的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:263的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:255的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:259的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:260的HC CDR3氨基酸序列。
在一个实施例中，CD19结合结构域包含本文所述的轻链可变区(例如在表6或9中)和/或本文所述的重链可变区(例如在表6或9中)。在一个实施例中，CD19结合结构域是scFv，其包含具有表6或9中列出的氨基酸序列的轻链和重链。在实施例中，CD19结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含具有表6或9中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列，或与表6或9中提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表6或9中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列，或与表6或9中提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。
在一个实施例中，CD19结合结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQID NO:95和SEQ ID NO:112；或具有对任何上述序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列；或与任何上述序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，CD19结合结构域是scFv，并且包含本文(例如在表6或9中)所述氨基酸序列的轻链可变区通过接头(例如本文所述的接头)附接至包含本文(例如在表6或9中)所述氨基酸序列的重链可变区。在一个实施例中，CD19结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选4(SEQIDNO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如处于以下方向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
可以根据本发明使用本领域中任何已知的CD19CAR，例如任何已知CD19CAR的CD19抗原结合结构域来构建CAR。例如，CD19CAR描述于以下中：美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood[血液],118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；和16th Annu Meet Am Soc GenCell Ther[第16次美国基因细胞疗法学会会议](ASGCT)(5月15日-18日，盐湖城)2013年，摘要10，将这些文献中的每个均通过引用以其整体并入本文。在一个实施例中，针对CD19的抗原结合结构域是描述于例如以下中的CAR、抗体或其抗原结合片段的抗原结合部分(例如CDR)：PCT公开WO2012/079000；PCT公开WO 2014/153270；Kochenderfer,J.N.等人,J.Immunother.[免疫疗法杂志]32(7),689-702(2009)；Kochenderfer,J.N.,等人,Blood[血液],116(20),4099-4102(2010)；PCT公开WO2014/031687；Bejcek,Cancer Research[癌症研究],55,2346-2351,1995；或美国专利号7,446,190，将这些文献中的每一个均通过引用以其整体并入本文。
在实施例中，CAR(例如由本发明的细胞表达的CAR)的抗原结合结构域结合BCMA。发现BCMA优先在成熟B淋巴细胞中表达。在实施例中，抗原结合结构域是结合人BCMA的鼠scFv结构域。在实施例中，抗原结合结构域是结合人BCMA的人源化抗体或抗体片段(例如scFv结构域)。在实施例中，抗原结合结构域是结合人BCMA的人抗体或抗体片段。表12、表13、表14和表15中提供了结合BCMA的示例性scFv结构域(及其序列，例如CDR、VL和VH序列)。表12和表13中提供的scFv结构域序列包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH通过接头附接，例如，处于以下方向：VH-接头-VL。
表12.结合B细胞抗原BCMA的抗原结合结构域
还提供了每个scFv的氨基酸序列可变重链和可变轻链序列。
在实施例中，使用来自PCT公开WO 2012/0163805(将该公开的内容通过引用以其整体特此并入)的VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。在实施例中，使用来自PCT公开WO 2016/014565(将该公开的内容通过引用以其整体特此并入)的VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。在实施例中，使用来自PCT公开WO 2014/122144(将该公开的内容通过引用以其整体特此并入)的VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。在实施例中，使用来自PCT公开WO 2016/014789(将该公开的内容通过引用以其整体特此并入)的CAR分子和/或VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。在实施例中，使用来自PCT公开WO 2014/089335(将该公开的内容通过引用以其整体特此并入)的CAR分子和/或VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。在实施例中，使用来自PCT公开WO 2014/140248(将该公开的内容通过引用以其整体特此并入)的CAR分子和/或VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。
在实施例中，还可以使用表13中找到的VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。包含VH和VL结构域和接头序列的示例性scFv结构域和全长CAR的氨基酸序列也可在表13中找到。
表13.另外的示例性BCMA结合结构域序列
scFv结构域的人CDR序列的序列示于表14(针对重链可变结构域)和表15(针对轻链可变结构域)中。“ID”代表每个CDR的相应SEQ IDNO。根据Kabat定义示出CDR，然而，基于上述VH和VL序列，可以容易地推断出在其他惯例(例如Chothia或组合的Kabat/Chothia定义)下的CDR。
表14：根据Kabat编号方案的重链可变结构域CDR(Kabat等人(1991),“Sequencesof Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列],”第5版Public Health Service[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州)
表15：根据Kabat编号方案的轻链可变结构域CDR(Kabat等人(1991),“Sequencesof Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列],”第5版Public Health Service[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州)
在一个实施例中，BCMA结合结构域包含本文描述的BCMA结合结构域(例如在表12、13或15中提供的)的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文描述的BCMA结合结构域(例如在表12、13或14中提供的)的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，BCMA结合结构域包含具有如表12中提供的任何氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3中的一个、两个或全部，将所述氨基酸序列通过引用并入本文；以及具有如表12中提供的任何氨基酸序列的HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。
在一个实施例中，BCMA抗原结合结构域包含：
(v)(a)SEQ ID NO:814的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:854的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:894的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:694的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:734的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:774的HC CDR3氨基酸序列
(vi)(a)SEQ ID NO:804的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:844的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:884的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:684的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:724的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:764的HC CDR3氨基酸序列
(vii)(a)SEQ ID NO:805的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:845的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:885的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:685的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:725的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:765的HC CDR3氨基酸序列
(viii)(a)SEQ ID NO:806的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:846的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:886的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:686的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:726的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:766的HC CDR3氨基酸序列
(ix)(a)SEQ ID NO:807的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:847的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:887的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:687的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:727的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:767的HC CDR3氨基酸序列
(x)(a)SEQ ID NO:808的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:848的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:888的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:688的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:728的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:768的HC CDR3氨基酸序列
(xi)(a)SEQ ID NO:809的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:849的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:889的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:689的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:729的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:769的HC CDR3氨基酸序列
(xii)(a)SEQ ID NO:810的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:850的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:890的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:690的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:730的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:770的HC CDR3氨基酸序列
(xiii)(a)SEQ ID NO:811的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:851的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:891的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:691的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:731的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:771的HC CDR3氨基酸序列
(xiv)(a)SEQ ID NO:812的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:852的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:892的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:692的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:732的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:772的HC CDR3氨基酸序列
(xv)(a)SEQ ID NO:813的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:853的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:893的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:693的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:733的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:773的HC CDR3氨基酸序列
(xvi)(a)SEQ ID NO:815的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:855的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:895的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:695的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:735的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:775的HC CDR3氨基酸序列
(xvii)(a)SEQ ID NO:816的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:856的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:896的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:696的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:736的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:776的HC CDR3氨基酸序列
(xviii)(a)SEQ ID NO:817的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:857的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:897的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:697的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:737的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:777的HC CDR3氨基酸序列
(xix)(a)SEQ ID NO:818的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:858的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:898的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:698的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:738的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:778的HC CDR3氨基酸序列
(xx)(a)SEQ ID NO:819的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:859的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:899的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:699的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:739的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:779的HC CDR3氨基酸序列
(xxi)(a)SEQ ID NO:820的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:860的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:900的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:700的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:740的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:780的HC CDR3氨基酸序列
(xxii)(a)SEQ ID NO:821的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:861的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:901的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:701的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:741的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:781的HC CDR3氨基酸序列
(xxiii)(a)SEQ ID NO:822的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:862的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:902的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:702的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:742的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:782的HC CDR3氨基酸序列
(xxiv)(a)SEQ ID NO:823的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:863的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:903的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:703的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:743的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:783的HC CDR3氨基酸序列
(xxv)(a)SEQ ID NO:824的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:864的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:904的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:704的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:744的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:784的HC CDR3氨基酸序列
(xxvi)(a)SEQ ID NO:825的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:865的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:905的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:705的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:745的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:785的HC CDR3氨基酸序列，
或
(xxvii)(a)SEQ ID NO:826的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:866的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:906的LC CDR3氨基酸序列；
以及
(b)SEQ ID NO:706的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:746的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:786的HC CDR3氨基酸序列。
在一个实施例中，BCMA结合结构域包含本文所述的轻链可变区(例如在表12或13中)和/或本文所述的重链可变区(例如在表12或13中)。在一个实施例中，BCMA结合结构域是scFv，其包含具有表12或13中列出的氨基酸序列的轻链和重链。在实施例中，BCMA结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含具有表12或13中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列，或与表12或13中提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表12或13中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列，或与表12或13中提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。
在一个实施例中，BCMA结合结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:349、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345、SEQ ID NO:346、SEQ ID NO:347、SEQ ID NO:348、SEQID NO:350、SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:352、SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:430、SEQ ID NO:431、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:433、SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:435、SEQID NO:436、SEQ ID NO:437、SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:439、SEQ ID NO:440、SEQ ID NO:441、SEQ ID NO:442、SEQ ID NO:443、SEQ ID NO:444、SEQ ID NO:445、SEQ ID NO:446、SEQID NO:447、SEQ ID NO:448、SEQ ID NO:449、SEQ ID NO:563、SEQ ID NO:564、SEQ ID NO:565和SEQ ID NO:566；或具有对任何上述序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列；或与任何上述序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，BCMA结合结构域是scFv，并且包含本文(例如在表12或13中)所述氨基酸序列的轻链可变区通过接头(例如本文所述的接头)附接至包含本文(例如在表12或13中)所述氨基酸序列的重链可变区。在一个实施例中，BCMA结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选4(SEQ ID NO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如处于以下方向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
可以根据本发明使用本领域中任何已知的BCMA CAR，例如任何已知BCMA CAR的BCMA抗原结合结构域来构建CAR。例如，本文描述的那些。
在一个实施例中，针对ROR1的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Hudecek等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]19(12):3153-3164(2013)；WO 2011159847；和US 20130101607。
在一个实施例中，针对CD22的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Haso等人,Blood[血液],121(7):1165-1174(2013)；Wayne等人,ClinCancer Res[临床癌症研究]16(6):1894-1903(2010)；Kato等人,Leuk Res[白血病研究]37(1):83-88(2013)；Creative BioMart(creativebiomart.net):MOM-18047-S(P)。
在一个实施例中，针对CD20的抗原结合结构域是抗体利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗或GA101或其衍生物的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3)，和/或来自与上文列出的肿瘤抗原或B细胞抗原结合的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一个实施例中，抗原结合结构域包含与上文列出的肿瘤抗原或B细胞抗原结合的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
可以使用本领域已知的多种技术产生人源化抗体，这些技术包括但不限于CDR-移植(参见例如欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，将其每一个通过引用以其整体并入本文)、饰面或表面重修(参见例如欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology[分子免疫学],28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering[蛋白质工程],7(6):805-814；以及Roguska等人,1994,PNAS,91:969-973，将其每一个通过引用以其整体并入本文)、链改组(参见例如美国专利号5,565,332，将其通过引用以其整体并入本文)、和披露于例如以下中的技术：美国专利申请公开号US 2005/0042664，美国专利申请公开号US2005/0048617，美国专利号6,407,213，美国专利号5,766,886，国际公开号WO 9317105，Tan等人,J.Immunol.[免疫学杂志],169:1119-25(2002)，Caldas等人,Protein Eng.[蛋白质工程],13(5):353-60(2000)，Morea等人,Methods[方法],20(3):267-79(2000)，Baca等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],272(16):10678-84(1997)，Roguska等人,Protein Eng.[蛋白质工程],9(10):895-904(1996)，Couto等人,Cancer Res.[癌症研究],55(23增补):5973s-5977s(1995)，Couto等人,Cancer Res.[癌症研究],55(8):1717-22(1995)，SandhuJ S,Gene[基因],150(2):409-10(1994)，以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],235(3):959-73(1994)，将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变例如改善抗原结合。这些框架取代是通过本领域熟知的方法来鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合和序列比较而言重要的框架残基，以鉴定特定位置处的异常框架残基。(参见例如Queen等人,美国专利号5,585,089；以及Riechmann等人,1988,Nature[自然],332:323，将其通过引用以其全文并入本文。)
实体瘤相关抗原(即实体瘤抗原)的实例包括但不限于：EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPVE6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和MHC上呈递的这些抗原的任一个的肽。
在一方面，CAR包含结合B细胞抗原的抗原结合结构域。在一个实施例中，CAR包含CD19抗原结合结构域(例如特异性地结合CD19的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域)。
本文描述的示例性CAR分子在表10中提供。表10中的CAR分子包含CD19抗原结合结构域，例如表6中提供的任何CD19抗原结合结构域的氨基酸序列。
表10.示例性CD19 CAR分子
在一个实施例中，CAR分子包含如表10或2014年3月15日提交的国际公开号WO2014/153270的表3中提供的氨基酸序列(例如由其组成)；将该文献通过引用并入本文。在一个实施例中，CAR分子包含(例如由以下组成)SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ IDNO:271、SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:276、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:280、或SEQ ID NO:281的氨基酸序列；或具有SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:272、SEQ IDNO:273、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:276、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:280、或SEQ ID NO:281的氨基酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、10个、15个、20个或30个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过60个、50个或40个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:275、SEQ IDNO:276、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:280、或SEQ ID NO:281的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一方面，CAR包含结合B细胞抗原的抗原结合结构域。在一个实施例中，CAR包含BCMA抗原结合结构域(例如特异性地结合BCMA如人BCMA的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域)。
本文所述的示例性CAR分子在表29或WO 2016/014565的表1中提供，或者如本文中另外所述。表29中的CAR分子包含BCMA抗原结合结构域，例如表12或13中提供的任何BCMA抗原结合结构域的氨基酸序列。
表29.示例性BCMA CAR分子。序列设有前导序列。
在一个实施例中，CAR分子包含表29或WO 2016/014565的表1中提供的氨基酸序列，或如本文中另外描述的(例如由其组成)。在一个实施例中，CAR分子包含(例如由以下组成)SEQ ID NO:949、SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:951、SEQ ID NO:952、SEQ ID NO:953、SEQID NO:954、SEQ ID NO:955、SEQ ID NO:956、SEQ ID NO:957、SEQ ID NO:958、SEQ ID NO:959、SEQ ID NO:960、SEQ ID NO:961、SEQ ID NO:962、SEQ ID NO:963、SEQ ID NO:979、SEQID NO:980、SEQ ID NO:981、SEQ ID NO:982、SEQ ID NO:983、SEQ ID NO:984、SEQ ID NO:985、SEQ ID NO:986、SEQ ID NO:987、SEQ ID NO:988、SEQ ID NO:989、SEQ ID NO:990、SEQID NO:991、SEQ ID NO:992、SEQ ID NO:993、SEQ ID NO:994、SEQ ID NO:995、SEQ ID NO:996、SEQ ID NO:997、SEQ ID NO:998、或SEQ ID NO:999的氨基酸序列；或具有SEQ ID NO:949、SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:951、SEQ ID NO:952、SEQ ID NO:953、SEQ ID NO:954、SEQID NO:955、SEQ ID NO:956、SEQ ID NO:957、SEQ ID NO:958、SEQ ID NO:959、SEQ ID NO:960、SEQ ID NO:961、SEQ ID NO:962、SEQ ID NO:963、SEQ ID NO:979、SEQ ID NO:980、SEQID NO:981、SEQ ID NO:982、SEQ ID NO:983、SEQ ID NO:984、SEQ ID NO:985、SEQ ID NO:986、SEQ ID NO:987、SEQ ID NO:988、SEQ ID NO:989、SEQ ID NO:990、SEQ ID NO:991、SEQID NO:992、SEQ ID NO:993、SEQ ID NO:994、SEQ ID NO:995、SEQ ID NO:996、SEQ ID NO:997、SEQ ID NO:998、或SEQ ID NO:999的氨基酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、10个、15个、20个或30个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过60个、50个或40个修饰(例如取代，例如保守取代)；或与SEQ ID NO:949、SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:951、SEQ ID NO:952、SEQ ID NO:953、SEQ ID NO:954、SEQ ID NO:955、SEQ ID NO:956、SEQ ID NO:957、SEQID NO:958、SEQ ID NO:959、SEQ ID NO:960、SEQ ID NO:961、SEQ ID NO:962、SEQ ID NO:963、SEQ ID NO:979、SEQ ID NO:980、SEQ ID NO:981、SEQ ID NO:982、SEQ ID NO:983、SEQID NO:984、SEQ ID NO:985、SEQ ID NO:986、SEQ ID NO:987、SEQ ID NO:988、SEQ ID NO:989、SEQ ID NO:990、SEQ ID NO:991、SEQ ID NO:992、SEQ ID NO:993、SEQ ID NO:994、SEQID NO:995、SEQ ID NO:996、SEQ ID NO:997、SEQ ID NO:998、或SEQ ID NO:999的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
本文描述了靶向间皮素的示例性CAR分子，并且在表11中提供。表11中的CAR分子包含间皮素抗原结合结构域，例如表2中提供的任何间皮素抗原结合结构域的氨基酸序列。前导序列以粗体加下划线表示，CDR加下划线，并且抗原结合区的重链与轻链之间的接头序列以灰色阴影显示。
表11.示例性间皮素CAR分子
在一个实施例中，本发明的细胞包含CAR分子，该CAR分子结合间皮素并且包含如表11中和2014年12月19日提交的国际公开号WO 2015/090230的表2中提供的氨基酸序列(例如由其组成)；将该文献通过引用并入本文。在一个实施例中，CAR分子包含(例如由以下组成)SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ IDNO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:296、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQ IDNO:303、SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:305、或SEQ ID NO:306的氨基酸序列；或具有SEQ IDNO:282、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ IDNO:293、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:296、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:303、SEQ IDNO:304、SEQ ID NO:305、或SEQ ID NO:306的氨基酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、10个、15个、20个或30个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过60个、50个或40个修饰的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:296、SEQID NO:297、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:305、或SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一方面，本发明的细胞包含CAR分子，该CAR分子包含结合肿瘤抗原的抗原结合结构域。在一个实施例中，CAR包含EGFRvIII抗原结合结构域(例如特异性地结合间皮素的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域)。
靶向EGFRvIII的示例性CAR分子在本文中描述，并且在表30或WO/2014/130657的表2中提供或如在WO 2016/014789中所述。
表30.人源化EGFRvIII CAR构建体。序列设有前导序列，并且CDR加下划线。Nt代表核酸，且aa代表氨基酸
在一个实施例中，本发明的细胞包含结合EGFRvIII的CAR分子，该CAR分子包含表30中提供的氨基酸序列(例如由其组成)。在一个实施例中，结合EGFRvIII的CAR包含(例如由以下组成)SEQ ID NO:1043、SEQ ID NO:1049、SEQ ID NO:1055、SEQ ID NO:1061、SEQ IDNO:1067、SEQ ID NO:1073、SEQ ID NO:1079、SEQ ID NO:1085、SEQ ID NO:1090、或SEQ IDNO:1096的氨基酸序列；或具有SEQ ID NO:1043、SEQ ID NO:1049、SEQ ID NO:1055、SEQ IDNO:1061、SEQ ID NO:1067、SEQ ID NO:1073、SEQ ID NO:1079、SEQ ID NO:1085、SEQ IDNO:1090、或SEQ ID NO:1096的氨基酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、10个、15个、20个或30个修饰(例如取代，例如保守取代)但不超过60个、50个或40个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:1043、SEQ ID NO:1049、SEQ ID NO:1055、SEQID NO:1061、SEQ ID NO:1067、SEQ ID NO:1073、SEQ ID NO:1079、SEQ ID NO:1085、SEQ IDNO:1090、或SEQ ID NO:1096的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一方面，本发明的细胞包含CAR分子，该CAR分子包含结合肿瘤抗原的抗原结合结构域。在一个实施例中，CAR包括CAR分子，该CAR分子包含CD123抗原结合结构域(例如特异性地结合间皮素的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域)。
本文(例如表26或表27)描述了靶向CD123的示例性CAR分子，并且在WO 2016/028896的表2、6和9中提供。在WO/2014/130635(例如WO/2014/130635的表1)中描述了靶向CD123的其他示例性CAR分子。在WO/2014/144622中描述了靶向CD123的其他示例性CAR分子。
在一方面，本发明的细胞包含CAR分子，该CAR分子包含结合肿瘤抗原的抗原结合结构域。在一个实施例中，CAR包含CD33抗原结合结构域(例如特异性地结合CD33的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域)。本文描述了靶向CD33的示例性CAR分子，并且在WO 2016/014576中提供，例如在WO 2016/014576的表2中提供。
在一方面，本发明的细胞包含CAR分子，该CAR分子包含结合肿瘤抗原的抗原结合结构域。在一个实施例中，CAR包含CLL-1抗原结合结构域(例如特异性地结合CLL-1的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域)。本文描述了靶向CLL-1的示例性CAR分子，并且在WO/2016/014535中提供，例如在WO 2016/014535的表2中提供。
在一个实施例中，本文描述的CAR的抗原结合结构域是scFv抗体片段。在一方面，此类抗体片段具有功能性，因为它们保留等同的结合亲和力，例如，它们以与衍生出它们的IgG抗体相当的效力结合相同的抗原。在其他实施例中，抗体片段具有较低的结合亲和力，例如，它与抗原结合的结合亲和力低于衍生出它的抗体与相同的抗原结合的结合亲和力，但其功能在于它提供了本文所述的生物学反应。在一个实施例中，CAR分子包含如下抗体片段，该抗体片段与靶抗原的结合亲和力KD为10-4M至10-8M，例如10-5M至10-7M，例如10-6M或10-7M。在一个实施例中，抗体片段的结合亲和力比参考抗体(例如本文所述的抗体)的结合亲和力低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。
在一个实施例中，抗原结合结构域包含非人抗体或抗体片段，例如小鼠抗体或抗体片段。
在另一个实施例中，抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与在人中天然产生的抗体或其片段的相似度。在一方面，与衍生出抗原结合结构域的抗体或抗体片段(例如scFv)的鼠序列相比，该抗原结合结构域是人源化的。
可以使用本领域已知的多种技术产生人源化抗体，这些技术包括但不限于CDR-移植(参见例如欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，将其每一个通过引用以其整体并入本文)、饰面或表面重修(参见例如欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology[分子免疫学],28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering[蛋白质工程],7(6):805-814；以及Roguska等人,1994,PNAS,91:969-973，将其每一个通过引用以其整体并入本文)、链改组(参见例如美国专利号5,565,332，将其通过引用以其整体并入本文)、和披露于例如以下中的技术：美国专利申请公开号US 2005/0042664，美国专利申请公开号US2005/0048617，美国专利号6,407,213，美国专利号5,766,886，国际公开号WO 9317105，Tan等人,J.Immunol.[免疫学杂志],169:1119-25(2002)，Caldas等人,Protein Eng.[蛋白质工程],13(5):353-60(2000)，Morea等人,Methods[方法],20(3):267-79(2000)，Baca等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],272(16):10678-84(1997)，Roguska等人,Protein Eng.[蛋白质工程],9(10):895-904(1996)，Couto等人,Cancer Res.[癌症研究],55(23增补):5973s-5977s(1995)，Couto等人,Cancer Res.[癌症研究],55(8):1717-22(1995)，SandhuJ S,Gene[基因],150(2):409-10(1994)，以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],235(3):959-73(1994)，将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变例如改善抗原结合。这些框架取代是通过本领域熟知的方法来鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合和序列比较而言重要的框架残基，以鉴定特定位置处的异常框架残基。(参见例如Queen等人,美国专利号5,585,089；以及Riechmann等人,1988,Nature[自然],332:323，将其通过引用以其全文并入本文。)
人源化抗体或抗体片段具有保留于其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。如本文提供的，人源化抗体或抗体片段包含来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和框架区，其中构成框架的氨基酸残基完全或大部分衍生自人种系。用于将抗体或抗体片段人源化的多种技术是本领域熟知的，并且本质上可以按照Winter和同事的方法进行(Jones等人,Nature[自然],321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature[自然],332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science[科学],239:1534-1536(1988))，该方法是通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列，即CDR-移植(EP 239,400；PCT公开号WO91/09967；和美国专利号4,816,567、6,331,415、5,225,539、5,530,101、5,585,089、6,548,640，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在此类人源化抗体和抗体片段中，基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。抗体和抗体片段的人源化也可以通过饰面或表面重修来实现(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology[分子免疫学],28(4/5):489-498；Studnicka等人,ProteinEngineering[蛋白质工程],7(6):805-814(1994)；和Roguska等人,PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择是降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后将最接近于啮齿动物序列的人类序列接受为用于人源化抗体的人类框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.[免疫学杂志]151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901(1987)，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文)。另一种方法采用衍生自具有特定亚组轻链或重链的全部人类抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(参见例如Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.[免疫学杂志],151:2623(1993)，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，重链可变区的框架区(例如所有四个框架区)衍生自VH4_4-59种系序列。在一个实施例中，框架区可以包括一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如来自相应鼠序列处的氨基酸的取代。在一个实施例中，框架区(例如轻链可变区的所有四个框架区)衍生自VK3_1.25种系序列。在一个实施例中，框架区可以包括一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如来自相应鼠序列处的氨基酸的取代。
在一些方面，本发明的CAR的包含抗体片段的部分是人源化的，其保留对靶抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法制备人源化抗体和抗体片段。三维免疫球蛋白模型通常是可用的并且是本领域技术人员所熟悉的。计算机程序可用于说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基，从而实现所需的抗体或抗体片段特征，例如对靶抗原的增加的亲和力。通常，CDR残基直接且最基本地参与影响抗原结合。
人源化抗体或抗体片段可保留与原始抗体相似的抗原特异性，例如，在本披露中结合如本文所述的人肿瘤抗原的能力。在一些实施例中，人源化抗体或抗体片段可具有改善的与本文所述的肿瘤抗原或如本文所述的B细胞抗原结合的亲和力和/或特异性。在一些实施例中，人源化抗体或抗体片段可具有对如本文所述的肿瘤抗原或如本文所述的B细胞抗原的较低亲和力和/或特异性。
在一方面，本发明的抗原结合结构域的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或特性。例如，在一方面，本发明的CAR的包含抗原结合结构域的部分特异性地结合如本文所述的肿瘤抗原。
在一方面，抗原结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一方面，如本文所述的抗肿瘤抗原结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。在一方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合如本文所述的肿瘤抗原蛋白。
在一些情况下，scFv可以根据本领域已知的方法制备(参见例如Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。ScFv分子可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生。scFv分子包括具有优化长度和/或氨基酸组成的接头(例如Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果使用短多肽接头(例如5-10个之间的氨基酸)，则可防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区放在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如Hollinger等人1993ProcNatl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448、美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794和PCT公开号WO 2006/020258和WO 2007/024715，将这些文献通过引用并入本文。
scFv可以在其VL和VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复序列，例如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:22)。在一个实施例中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
在另一方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)、工程化TCR或其片段(例如单链TCR(scTCR))。制备此类TCR的方法是本领域已知的。参见例如Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]7:1369–1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]11:487–496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]19(4):365-74(2012)(将参考文献以其整体并入本文)。例如，scTCR可以工程化为含有来自通过接头(例如柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和Vβ基因。此途径对于本身在细胞内的与癌症相关的靶标非常有用，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
在一方面，CAR的抗原结合结构域包含与本文所述的抗原结合结构域氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且抗原结合结构域保留了本文所述的抗原结合结构域的所需功能特性。
在一个具体方面，本发明的CAR组成包含抗体片段。在另一方面，抗体片段包含scFv。在另一方面，抗体片段仅包含可变重链(VH)。
在各个方面，CAR的抗原结合结构域是通过以下方式被工程化：对在一个或两个可变区(例如VH和/或VL)内，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个框架区内的一个或多个氨基酸进行修饰。在一个具体方面，本发明的CAR组成包含抗体片段。在另一方面，抗体片段包含scFv。
本领域普通技术人员将理解，可以进一步修饰本发明的抗体或抗体片段，使得它们的氨基酸序列(例如来自野生型)不同，但所需的活性不变。例如，可以对蛋白质进行额外的核苷酸取代，其导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代。例如，分子中的非必需氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代。在另一个实施例中，一串氨基酸可被一串结构相似的、在侧链家族成员的顺序和/或组成方面不同的氨基酸替代，例如可以产生保守取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。
本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，这些侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下的同一性百分比是指代两个或更多个相同的序列。如使用下文序列比较算法之一或通过手动对齐和可视化检查测量的，如果两个序列具有相同氨基酸残基或核苷酸的指定百分比(例如，在指定区域上有60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，或者如果未指定，则是在整个序列上有如上同一性)，两个序列是“基本相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，测试序列与该参考序列比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过如下方法进行：例如，通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970),J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988),Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444的寻找相似性方法，通过这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group[威斯康辛遗传学软件包，遗传学计算机组],575Science[科学]Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手动比对和目视检查(参见例如Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology[当前分子生物学方案])。
适用于确定序列同一性和序列相似度百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用E.Meyers和W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用]4:11-17的算法确定，该算法已并入使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分的ALIGN程序(2.0版)中。另外，可以使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:444-453算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6、或4的空位权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已经并入GCG软件包(在www.gcg.com可获得)中的GAP程序中。
在一方面，本披露考虑了产生功能等同分子的起始抗体或片段(例如scFv)氨基酸序列的修饰。例如，可以修饰针对本文所述的-a肿瘤抗原的包含在CAR中的抗原结合结构域(例如scFv)的VH或VL，以保留与针对本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域(例如scFv)的起始VH或VL框架区至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。本披露考虑了整个CAR构建体的修饰，例如CAR构建体的各种结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以产生功能等同的分子。可以修饰CAR构建体以保留与起始CAR构建体至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
双特异性CAR
在实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在实施例中，第一和第二表位在相同的抗原(例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基))上。在实施例中，第一和第二表位重叠。在实施例中，第一和第二表位不重叠。在实施例中，第一和第二表位在不同的抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些实施例中，抗体分子是多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异源二聚体抗体分子的方案是本领域已知的；这些方案包括但不限于：“球状突起于孔中(knob in a hole)”途径，例如在US 5731168中所述；静电导向Fc配对，如例如在WO 09/089004、WO 06/106905和WO 2010/129304中所述；链交换工程化结构域(SEED)异源二聚体形成，如例如在WO 07/110205中所述；Fab臂交换，如例如在WO 08/119353、WO 2011/131746和WO 2013/060867中所述；双抗体缀合物，例如使用具有胺反应性基团和巯基反应性基团的异双官能试剂，通过抗体交联以产生双特异性结构，如例如在US4433059中所述；通过对两条重链之间的二硫键进行还原和氧化的循环，通过重组来自不同抗体的半抗体(重-轻链对或Fab)产生的双特异性抗体决定簇，如例如在US 4444878中所述；三功能抗体，例如通过巯基反应性基团交联的三个Fab'片段，如例如在US 5273743中所述；生物合成结合蛋白，例如通过C-末端尾优选通过二硫键或胺反应性化学交联作用交联的scFv对，如例如在US 5534254中所述；双功能抗体，例如具有不同结合特异性的Fab片段，其通过已经替代恒定结构域的亮氨酸拉链(例如c-fos和c-jun)二聚化，如例如在US5582996中所述；双特异性和寡特异性单价和寡价受体，例如两个抗体(两个Fab片段)的VH-CH1区，其通过在一个抗体的CH1区与另一个抗体的VH区(典型地具有相关联的轻链)之间的多肽间隔子连接，如例如在US 5591828中所述；双特异性DNA-抗体缀合物，例如抗体或Fab片段通过DNA的双链段交联，如例如在US 5635602中所述；双特异性融合蛋白，例如含有两个scFv(它们之间具有亲水性螺旋肽接头)和一个完全恒定区的表达构建体，如例如在US5637481中所述；多价和多特异性结合蛋白，例如具有Ig重链可变区结合区的第一结构域和Ig轻链可变区结合区的第二结构域的多肽二聚体，通常称为双体抗体(也涵盖更高级结构，产生双特异性、三特异性或四特异性分子)，如例如在US 5837242中所述；具有连接的VL和VH链(它们进一步用肽间隔区连接至抗体铰链区和CH3区)的微型抗体构建体，其可以二聚化形成双特异性/多价分子，如例如在US5837821所述；与短肽接头(例如5或10个氨基酸)连接的或在任一方向上完全没有接头连接的VH和VL结构域，其可以形成二聚体以形成双特异性双体抗体；三聚体和四聚体，如例如在US 5844094中所述；VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的串，其通过肽键与C-末端的可交联基团连接，这些可交联基团进一步与VL结构域相关联以形成一系列FV(或scFv)，如例如在US 5864019中所述；具有经肽接头连接的VH和VL结构域二者的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合成多价结构，以使用scFV或双体抗体类型形式形成例如同二价、异二价、三价和四价结构，如例如在US 5869620中所述。在例如以下文献中发现另外的示例性多特异性和双特异性分子和制造它们的方法：US5910573、US 5932448、US 5959083、US 5989830、US 6005079、US 6239259、US 6294353、US6333396、US 6476198、US 6511663、US 6670453、US 6743896、US 6809185、US 6833441、US7129330、US 7183076、US 7521056、US 7527787、US 7534866、US 7612181、US 2002004587A1、US 2002076406 A1、US 2002103345 A1、US 2003207346 A1、US 2003211078 A1、US2004219643 A1、US 2004220388 A1、US 2004242847 A1、US 2005003403 A1、US2005004352 A1、US 2005069552 A1、US 2005079170 A1、US 2005100543 A1、US2005136049 A1、US 2005136051 A1、US 2005163782 A1、US 2005266425 A1、US2006083747 A1、US 2006120960 A1、US 2006204493 A1、US 2006263367 A1、US2007004909 A1、US 2007087381 A1、US 2007128150 A1、US 2007141049 A1、US2007154901 A1、US 2007274985 A1、US 2008050370 A1、US 2008069820 A1、US2008152645 A1、US 2008171855 A1、US 2008241884 A1、US 2008254512 A1、US2008260738 A1、US 2009130106 A1、US 2009148905 A1、US 2009155275 A1、US2009162359 A1、US 2009162360 A1、US 2009175851 A1、US 2009175867 A1、US2009232811 A1、US 2009234105 A1、US 2009263392 A1、US 2009274649 A1、EP 346087A2、WO 0006605 A2、WO 02072635 A2、WO 04081051 A1、WO 06020258 A2、WO 2007044887A2、WO 2007095338 A2、WO 2007137760 A2、WO 2008119353 A1、WO 2009021754 A2、WO2009068630 A1、WO 9103493 A1、WO 9323537 A1、WO 9409131 A1、WO 9412625 A2、WO9509917 A1、WO 9637621 A2、WO 9964460 A1。将上述申请的内容通过引用以其整体并入本文。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。在一些实施例中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)与其VL(VL1)上游的VH(VH1)一起排列，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)与其VH(VH2)的VL(VL2)上游一起排列，使得整个双特异性抗体分子具有VH1-VL1-VL2-VH2的排列。在其他实施例中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)与其VH(VH1)上游的VL(VL1)一起排列，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)与其VL(VL2)的VH(VH2)上游一起排列，使得整个双特异性抗体分子具有VL1-VH1-VH2-VL2的排列。任选地，在两个抗体或抗体片段(例如scFv)之间布置接头，例如如果构建体排列为VH1-VL1-VL2-VH2，则在VL1和VL2之间布置接头，或者如果构建体排列为VL1-VH1-VH2-VL2，则在VH1和VH2之间布置接头。接头可以是如本文所述的接头，例如(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5、或6，优选4(SEQ ID NO:80)。通常，两个scFv之间的接头应足够长以避免两个scFv的结构域之间的错配。任选地，接头布置于第一scFv的VL和VH之间。任选地，接头布置于第二scFv的VL和VH之间。在具有多个接头的构建体中，任何两个或更多个接头可以相同或不同。因此，在一些实施例中，双特异性CAR在如本文所述的排列中包含VL、VH和任选的一个或多个接头。
在一方面，本发明提供了嵌合抗原受体，其包含双特异性抗原结合结构域、跨膜结构域(例如如本文所述)和细胞内信号传导结构域(例如如本文所述)。在另一方面，本发明提供了细胞(例如细胞群)，例如免疫效应细胞，例如如本文所述的T细胞或NK细胞，其被工程化以表达(例如包含)如本文所述的双特异性CAR。不受任何理论的束缚，认为表达此类双特异性CAR的细胞可用于本文所述的方法和组合物中。
嵌合TCR
在一方面，可以将本文所述的抗原结合结构域(例如本文表中提供的抗体和抗体片段)移植到T细胞受体(“TCR”)链(例如TCRα或TCRβ链)的一个或多个恒定结构域，以产生与肿瘤抗原(例如本文所述的实体瘤抗原或在与TAM相关的肿瘤上表达的抗原)特异性地结合的嵌合TCR。不受理论束缚，认为嵌合TCR在抗原结合后将通过TCR复合物传导信号。例如，如本文所披露的间皮素或CD19 scFv或其片段(例如VL结构域或VH结构域)可以移植到TCR链(例如TCRα链和/或TCRβ链)的恒定结构域(例如细胞外恒定结构域的至少一部分)、跨膜结构域和细胞质结构域。作为另一个实例，可以将抗体或抗体片段的CDR(例如如本文提供的表中所述的抗体或抗体片段的CDR)移植到TCRα和/或β链中以产生特异性地结合至本文所述的肿瘤抗原的嵌合TCR，该肿瘤抗原例如是实体瘤抗原或在与TAM相关的肿瘤上表达的抗原。例如，可以将本文披露的LCDR移植到TCRα链的可变结构域中，并且可以将本文披露的HCDR移植到TCRβ链的可变结构域中，反之亦然。此类嵌合TCR可以通过本领域已知的方法产生(例如，Willemsen RA等人,Gene Therapy[基因疗法]2000；7:1369–1377；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]2004；11:487–496；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]2012年4月；19(4):365-74)。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，在各种实施例中，CAR可以被设计为包括附接至CAR的细胞外结构域(例如抗原结合结构域)的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区域相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与衍生出跨膜蛋白的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10乃至15个氨基酸)和/或与衍生出跨膜蛋白的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10乃至15个氨基酸)。在一方面，跨膜结构域是与CAR的其他结构域之一相关的结构域，例如，跨膜结构域来自与细胞内信号传导结构域(例如共刺激结构域)相同的蛋白质。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一种CAR进行同源二聚化。在不同的方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便最小化与存在于相同表达CAR的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以衍生自天然来源或重组来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。在一方面，每当CAR结合靶标时，跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的一个或多个跨膜区。在一些实施例中，跨膜结构域可至少包括例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C的一个或多个跨膜区。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)附接至CAR的细胞外区域，例如CAR的抗原结合结构域。例如，在一个实施例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链)或CD8a铰链。在一个实施例中，铰链或间隔子包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(例如由其组成)。在一方面，跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的跨膜结构域(例如由其组成)。
在一方面，铰链或间隔子包含IgG4铰链。例如，在一个实施例中，铰链或间隔子包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔子包含由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的铰链。在一方面，铰链或间隔子包含IgD铰链。例如，在一个实施例中，铰链或间隔子包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔子包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的铰链。
在一方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下，它主要包括疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一方面，可以在重组跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度在2和10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以形成跨膜结构域和CAR的细胞质区域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。例如，在一方面，接头包含GGGGSGGGGS的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。在一些实施例中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:11)的核苷酸序列编码。
在一方面，铰链或间隔子包含KIR2DS2铰链。
细胞质结构域
CAR的细胞质结构域或区域包括细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责激活已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括分泌细胞因子)。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的部分。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用这种截短部分代替完整链，只要截短部分可转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于在本发明的CAR中使用的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)以及这些序列的任何衍生物或变体和任何具有相同功能能力的重组序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要二次和/或共刺激信号。因此，可认为T细胞激活是由两种不同类别的细胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
含有ITAM的在本发明中具有特别用途的初级细胞内信号传导结构域的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d的那些。在一个实施例中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ(例如本文所述的CD3-ζ序列)的初级信号传导结构域。
在一个实施例中，初级信号传导结构域包括修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如增加或减少的)活性的突变ITAM结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包括修饰的含有ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如优化的和/或截短的含有ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在实施例中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者它可以与在本发明的CAR的背景中使用的任何其他所需细胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR的包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，是淋巴细胞对抗原的有效应答所必需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性地结合CD83的配体等。例如，已证明CD27共刺激可增强体外人CART细胞的扩增、效应子功能和存活，并增强体内人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3):696-706)。此类共刺激分子的其他实例包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、以及特异性地结合CD83的配体。
本发明的CAR的细胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)，可以形成细胞内信号传导序列之间的连接。在一个实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可用作合适的接头。在一个实施例中，单个氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的接头。
在一方面，细胞内信号传导结构域被设计为包括两个或更多个例如2、3、4、5或更多个共刺激信号传导结构域。在实施例中，两个或更多个例如2、3、4、5或更多个共刺激信号传导结构域被接头分子(例如本文所述的接头分子)分开。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。
在一方面，细胞内信号传导结构域被设计为包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一方面，细胞内信号传导结构域被设计为包括CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:14的信号传导结构域。在一方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:18的信号传导结构域。
在一方面，细胞内信号传导结构域被设计为包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一方面，CD27的信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一方面，CD27的信号传导结构域由SEQ ID NO:17的核酸序列编码。
在一方面，细胞内被设计为包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一方面，CD28的信号传导结构域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一方面，CD28的信号传导结构域由SEQ ID NO:45的核酸序列编码。
在一方面，细胞内被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。在一方面，ICOS的信号传导结构域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一方面，ICOS的信号传导结构域由SEQ ID NO:43的核酸序列编码。
在一方面，本发明的细胞，例如本文所述的细胞，例如表达本文所述的CAR的细胞，包含CAR，该CAR包含结合本文所述的靶标肿瘤抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)的抗原结合结构域、跨膜结构域、初级信号传导结构域和一个或多个(例如一个)共刺激信号传导结构域。
在一个实施例中，表达CAR的细胞可以进一步包括抑制性CAR。在一个实施例中，抑制性CAR包含与在正常细胞(例如也表达由CAR靶向的肿瘤抗原的正常细胞)而非癌细胞上发现的抗原结合的抗原结合结构域。在一个实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ的细胞内结构域。
在一个实施例中，CAR的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域彼此不相互作用。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域(例如作为片段，例如scFv)，其不与第二CAR的抗原结合结构域形成缔合，例如第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子，包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。实例包括但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、衍生自常规4-链抗体的单结构域、工程化结构域、和除抗体衍生的那些之外的单结构域支架。SDAB分子可以是任何现有技术，或任何未来的单结构域分子。SDAB分子可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。该术语还包括来自除骆驼科和鲨鱼外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一方面，SDAB分子可以衍生自在鱼中发现的免疫球蛋白的可变区，例如衍生自在鲨鱼血清中发现的称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型的可变区。WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.[蛋白质科学]14:2901-2909中描述了产生衍生自NAR可变区的单结构域分子(“IgNAR”)的方法。
根据另一方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称为缺乏轻链的重链。在例如WO 9404678和Hamers-Casterman,C.等人(1993)Nature[自然]363:446-448中披露了此类单结构域分子。出于清楚的原因，衍生自天然缺乏轻链的重链分子的这种可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这种VHH分子可以衍生自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼。除骆驼科外的其他物种可产生天然缺乏轻链的重链分子；此类VHH在本发明的范围内。
SDAB分子可以是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示选择的)。
还发现，具有多个嵌合膜嵌入受体(这些嵌合膜嵌入受体包含抗原结合结构域，受体的抗原结合结构域之间具有相互作用)的细胞可能是不希望的，例如，因为它抑制一个或多个抗原结合结构域结合其同源抗原的能力。因此，本文披露了具有第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的细胞，该嵌合膜嵌入受体包含使此类相互作用最小化的抗原结合结构域。本文还披露了编码第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体(该嵌合膜嵌入受体包含使此类相互作用最小化的抗原结合结构域)的核酸以及制备和使用此类细胞和核酸的方法。在实施例中，所述第一、所述第二非天然存在的嵌合膜包埋受体之一的抗原结合结构域包含scFv，而另一个包含单个VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域或衍生自人或小鼠序列的单个VH结构域。
在一些实施例中，要求保护的本发明包括第一和第二CAR，其中第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域不包括可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施例中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域是scFv，而另一个不是scFv。在一些实施例中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含单个VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域或衍生自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施例中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施例中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施例中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，而另一个包含单个VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域或衍生自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施例中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，而另一个包含纳米抗体。在一些实施例中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，而另一个包含骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合基本上不会因第二CAR的存在而降低。在一些实施例中，在第二CAR的存在下，第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合是在不存在第二CAR的情况下第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，第一CAR和第二CAR的抗原结合结构域彼此的缔合少于二者都是scFv抗原结合结构域的情况下的缔合。在一些实施例中，所述第一CAR、所述第二CAR的抗原结合结构域彼此的缔合比二者都是scFv抗原结合结构域的情况下的缔合少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在另一方面，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步表达另一种药剂，例如增强表达CAR的细胞活性的药剂。例如，在一个实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。在一些实施例中，抑制性分子(例如PD1)可降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ。
在一个实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂例如是本文所述的分子，例如包含第一多肽(例如抑制性分子)的药剂，该第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽例如本文所述的细胞内信号传导结构域相关联。在一个实施例中，该药剂包含例如抑制性分子的第一多肽和第二多肽，该抑制性分子例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ或这些中的任一个的片段(例如这些中的任一个的细胞外结构域的至少一部分)，该第二多肽是本文所述的细胞内信号传导结构域(例如其包括共刺激结构域(例如41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ信号传导结构域))。在一个实施例中，该药剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如PD1的细胞外结构域的至少一部分)和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD1是受体的CD28家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在激活的B细胞、T细胞和髓系细胞上表达(Agata等人1996Int.Immunol[国际免疫学]8:765-75)。已经显示PD1的两种配体PD-L1和PD-L2在与PD1结合后下调T细胞激活(Freeman等人2000J Exp Med[实验医学杂志]192:1027-34；Latchman等人2001Nat Immunol[自然免疫学]2:261-8；Carter等人2002Eur JImmunol[欧洲免疫学杂志]32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong等人2003J MolMed[分子医学杂志]81:281-7；Blank等人2005Cancer Immunol.Immunother[癌症免疫学和免疫疗法]54:307-314；Konishi等人2004Clin Cancer Res[临床癌症研究]10:5094)。通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。
在一个实施例中，该药剂包含抑制性分子例如程序性死亡蛋白1(PD1)的细胞外结构域(ECD)，该细胞外结构域融合至跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如41BB和CD3ζ)(本文中也称为PD1 CAR)。在一个实施例中，PD1CAR与本文所述的XCAR组合使用时，改善了T细胞的持久性。在一个实施例中，CAR是PD1 CAR，其包含PD1的细胞外结构域，如SEQ IDNO:26中加下划线所指示的。在一个实施例中，PD1CAR包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一个实施例中，PD1CAR包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在一个实施例中，该药剂包含编码PD1CAR(例如本文所述的PD1 CAR)的核酸序列。在一个实施例中，PD1 CAR的核酸序列如表1中的SEQ ID NO:27所示，其中PD1 ECD的序列加下划线。
在另一方面，本披露提供了表达CAR的细胞群。在一些实施例中，表达CAR的细胞群包含表达不同CAR的细胞混合物。例如，在一个实施例中，CART细胞群可包括表达CAR(该CAR具有针对本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域)的第一细胞和表达具有不同抗原结合结构域的CAR的第二细胞，该不同抗原结合结构域例如是针对本文所述的不同肿瘤抗原的抗原结合结构域，例如针对不同于由第一细胞表达的CAR的抗原结合结构域所结合的肿瘤抗原的本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域。作为另一个实例，表达CAR的细胞群可包括表达CAR(该CAR包括针对本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域)的第一细胞和表达CAR(该CAR包括针对除如本文所述的肿瘤抗原以外的靶标的抗原结合结构域)的第二细胞。在一个实施例中，表达CAR的细胞群包括例如表达CAR(该CAR包括初级细胞内信号传导结构域)的第一细胞和表达CAR(该CAR包括次级信号传导结构域)的第二细胞。
在另一方面，本披露提供了细胞群体，其中群体中的至少一种细胞表达具有针对本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域的CAR，第二细胞表达另一种药剂，例如增强表达CAR的细胞的活性的药剂。例如，在一个实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。在一些实施例中，抑制性分子(例如PD-1)可降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ。在一个实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂例如是本文所述的分子，例如包含第一多肽(例如抑制性分子)的药剂，该第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽例如本文所述的细胞内信号传导结构域相关联。在一个实施例中，该药剂包含例如抑制性分子的第一多肽和第二多肽，该抑制性分子例如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ或这些中的任一个的片段，该第二多肽是本文所述的细胞内信号传导结构域(例如其包括共刺激结构域(例如41BB、CD27、OX40或CD28，例如如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ信号传导结构域))。在一个实施例中，该药剂包含PD-1的第一多肽或其片段和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在一方面，本披露提供了方法，这些方法包括与另一种药剂(例如激酶抑制剂，例如本文所述的激酶抑制剂)组合给予表达CAR的细胞群，例如表达不同CAR的细胞混合物。在另一方面，本披露提供了包括与另外的药剂(例如激酶抑制剂，例如本文所述的激酶抑制剂)组合给予细胞群的方法，其中群体中的至少一种细胞表达具有本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域的CAR，第二细胞表达另一种药剂(例如增强表达CAR的细胞的活性的药剂)。
自然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在实施例中，本文所述的CAR分子，例如靶向肿瘤抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)的CAR分子包含自然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自任一以下自然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或细胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A、LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可以与衔接子分子或细胞内信号传导结构域(例如DAP12)相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述于国际公开号WO 2014/145252中，将其内容通过引用特此并入。
分离的CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞使用分离的CAR。分离的CAR途径在公开WO 2014/055442和WO 2014/055657中更详细地描述，将其通过引用并入本文。简而言之，分离的CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且该细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活，并且细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被激活并且细胞杀伤活性开始。因此，表达CAR的细胞在两种抗原均存在的情况下才能完全被激活。在实施例中，第一抗原结合结构域识别本文所述的肿瘤抗原或B细胞抗原，例如包含本文所述的抗原结合结构域，并且第二抗原结合结构域识别第二抗原，例如本文所述的第二肿瘤抗原或第二B细胞抗原。
调节嵌合抗原受体的策略
可以通过多种方式调节CAR活性。在一些实施例中，需要CAR活性可控制的可调节CAR(RCAR)以优化CAR疗法的安全性和功效。例如，使用例如与二聚化结构域融合的半胱天冬酶诱导细胞凋亡(参见例如Di等人,N Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011年11月3日；365(18):1673-1683)可用作本发明CAR疗法中的安全性开关。在另一个实例中，表达CAR的细胞还可以表达诱导型半胱天冬酶-9(iCaspase-9)分子，其在给予二聚物药物(例如利米度塞(rimiducid)(也称为AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))时导致激活细胞的半胱天冬酶-9和细胞凋亡。诱导型半胱天冬酶-9分子含有二聚化化学诱导物(CID)结合结构域，其在CID的存在下介导二聚化。这导致表达CAR的细胞的诱导性和选择性耗减。在一些情况下，诱导型半胱天冬酶-9分子由与一种或多种CAR编码载体分开的核酸分子编码。在一些情况下，诱导型半胱天冬酶-9分子由与CAR编码载体相同的核酸分子编码。诱导型半胱天冬酶-9可以提供安全性开关，以避免表达CAR的细胞的任何毒性。参见例如Song等人Cancer Gene Ther.[癌症基因疗法]2008；15(10):667-75；临床试验Id号NCT02107963；以及Di Stasi等人N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011；365:1673-83。
用于调节本发明的CAR疗法的可替代策略包括利用使CAR活性失活或关闭的小分子或抗体，例如通过使表达CAR的细胞缺失，例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的受体。此类受体的实例包括EpCAM、VEGFR、整合素(例如整合素αvβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD1 1、CD1 1a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如保留一个或多个细胞外表位但缺少在细胞质结构域内的一个或多个区域的形式)。
例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，其缺乏信号传导能力但保留了由能够诱导ADCC的分子例如西妥昔单抗识别的表位，使得给予西妥昔单抗诱导ADCC并随后耗减表达CAR的细胞(参见例如WO 2011/056894，和Jonnalagadda等人,Gene Ther.[基因疗法]2013；20(8)853-860)。另一种策略包括表达高度紧密的标记基因/自杀基因，其组合了来自本文所述的表达CAR的细胞中的CD32和CD20抗原二者的靶表位(其结合利妥昔单抗)，导致例如通过ADCC选择性地耗减表达CAR的细胞(参见例如Philip等人,Blood[血液].2014；124(8)1277-1287)。用于耗减本文所述的表达CAR的细胞的其他方法包括给予CAMPATH，它是一种单克隆抗CD52抗体，其选择性地结合并靶向成熟淋巴细胞，例如表达CAR的细胞，以便例如通过诱导ADCC进行破坏。在其他实施例中，可以使用CAR配体(例如抗独特型抗体)选择性地靶向表达CAR的细胞。在一些实施例中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性，从而减少表达CAR的细胞的数量。在其他实施例中，CAR配体，例如抗独特型抗体，可以与诱导细胞杀伤的药剂(例如毒素)偶联，从而减少表达CAR的细胞的数量。可替代地，CAR分子本身可以被配置成使得活性可以被调节，例如打开和关闭，如下所述。
在其他实施例中，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达由T细胞耗减剂识别的靶蛋白。在一个实施例中，靶蛋白是CD20，并且T细胞耗减剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。在这种实施例中，一旦需要减少或消除表达CAR的细胞，就给予T细胞耗减剂，例如以减轻CAR诱导的毒性。在其他实施例中，T细胞耗减剂是抗CD52抗体，例如阿仑单抗。
在其他实施例中，RCAR包含一组多肽，典型地在最简单的实施例中有两个，其中本文所述的标准CAR的组分(例如抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域)在单独的多肽或成员上分配。在一些实施例中，该组多肽包括二聚化开关，其在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。本文和国际公开号WO 2015/090229中提供了此类可调节性CAR的另外的描述和示例性构型，将该文献通过引用以其整体特此并入。
CAR与趋化因子受体的共表达
在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞还包含趋化因子受体分子。T细胞中趋化因子受体CCR2b或CXCR2的转基因表达增强了分泌CCL2或CXCL1的实体瘤(包括黑素瘤和神经母细胞瘤)的运输，(Craddock等人,J Immunother.[免疫疗法杂志]2010年10月；33(8):780-8和Kershaw等人,Hum Gene Ther.[人类基因疗法]2002年11月1日；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论束缚，认为在表达CAR的细胞中表达的趋化因子受体(识别由肿瘤例如实体瘤分泌的趋化因子)可以改善表达CAR的细胞到肿瘤的归巢，促进表达CAR的细胞到肿瘤的渗透，并增强表达CAR的细胞的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子可以包括天然存在的或重组的趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适于在本文所述的表达CAR的细胞中表达的趋化因子受体分子包括CXC趋化因子受体(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6或CXCR7)、CC趋化因子受体(例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、或CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1)、XC趋化因子受体(例如XCR1)、或其趋化因子结合片段。在一个实施例中，基于肿瘤分泌的一种或多种趋化因子选择与本文所述的CAR一起表达的趋化因子受体分子。在一个实施例中，本文所述的表达CAR的细胞还包含例如表达CCR2b受体或CXCR2受体。在实施例中，本文所述的CAR和趋化因子受体分子在相同的载体上或在两个不同的载体上。在其中本文所述的CAR和趋化因子受体分子在同一载体上的实施例中，CAR和趋化因子受体分子各自处于两种不同启动子的控制下或处于相同启动子的控制下。
编码CAR的核酸构建体
本披露还提供了对靶向本文所述的肿瘤抗原和/或B细胞抗原的一种或多种CAR构建体进行编码的核酸分子。在一方面，核酸分子作为信使RNA转录物被提供。在一方面，核酸分子作为DNA构建体被提供。
因此，在一方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中CAR包含结合肿瘤抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)的抗原结合结构域、跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如本文所述的细胞内信号传导结构域)，该细胞内信号传导结构域包含刺激结构域(例如共刺激信号传导结构域，例如本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的初级信号传导结构域，例如本文所述的ζ链)。在一个实施例中，跨膜结构域是选自下组的蛋白质的跨膜结构域，该组由以下组成：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154。在一些实施例中，跨膜结构域可至少包括例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、和NKG2C的一个或多个跨膜区。
在一个实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的序列，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，抗原结合结构域通过铰链区(例如本文所述的铰链)与跨膜结构域连接。在一个实施例中，铰链区包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，分离的核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施例中，共刺激结构域是选自下组的蛋白质的功能性信号传导结构域，该组由以下组成：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKG2D、和NKG2C。在一个实施例中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的序列，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16、42或44的序列或与其具有95％-99％同一性的序列，和SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列或与其具有95％-99％同一性的序列，其中构成细胞内信号传导结构域的序列在相同的框架中且作为单一多肽链表达。
在另一方面，本发明涉及编码CAR构建体的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:2的前导序列、如本文所述的scFv结构域、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或SEQID NO:10(或与其具有95％-99％同一性的序列)的铰链区、具有SEQ ID NO:12的序列(或与其具有95％-99％同一性的序列)的跨膜结构域、具有SEQ ID NO:14的序列的4-1BB共刺激结构域、具有SEQ ID NO:16的序列(或与其具有95％-99％同一性的序列)的CD27共刺激结构域、具有SEQ ID NO:42的序列(或其具有95％-99％同一性的序列)的ICOS共刺激结构域、或具有SEQ ID NO:44的序列的CD28共刺激结构域、以及具有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列(或与其具有95％-99％同一性的序列)的CD3ζ刺激结构域。
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞中筛选文库，通过从已知包含该基因的载体中获得基因，或通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织分离。可替代地，感兴趣的基因可以合成产生，而不是克隆。
本披露还提供了插入本披露的核酸的载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。
在另一个实施例中，包含编码本发明所需CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施例中，编码CAR的核酸的表达可以使用转座子完成，例如睡美人系统(sleeping beauty)、crisper、CAS9和锌指核酸酶。见下文June等人2009Nature ReviewsImmunology[自然免疫学综述]9.10:704-716，将其通过引用并入本文。
简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达典型地是通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接、并将构建体并入表达载体中来实现。载体可适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所需核酸序列表达的启动子。
使用标准基因递送方案，本披露的表达构建体也可用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，将其通过引用以其整体并入本文。在另一个实施例中，本发明提供了一种基因治疗载体。
可以将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如描述于Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社],纽约中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有复制功能的起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标记物(例如WO01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用了腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，因此当元件相对于彼此反转或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到相隔50bp。取决于启动子，显现单独的元件可以协同或独立地起作用以激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR编码核酸分子的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，该复合物负责将氨酰tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒，并且已经显示出可有效地从克隆到慢病毒载体中的核酸分子驱动CAR表达。参见例如Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453–1464(2009)。在一方面，EF1a启动子包含如SEQ ID NO:1提供的序列。
启动子的另一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子(例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够当需要该启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施例中，可能需要截短的PGK启动子(例如，与野生型PGK启动子序列相比，具有一个或多个例如1、2、5、10、100、200、300、或400个核苷酸缺失的PGK启动子)。以下提供了示例性PGK启动子的核苷酸序列。
WT PGK启动子
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(SEQID NO:101)
示例性截短的PGK启动子：
PGK100：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(SEQ ID NO:102)
PGK200：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(SEQ ID NO:103)
PGK300：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(SEQ ID NO:104)
PGK400：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG(SEQ ID NO:105)
载体还可包括例如促进分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或博莱霉素标记物)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还可含有选择标记基因或报告基因或两者，以便于从旨在通过病毒载体被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择标记物可以在单独的DNA片段上携带并用于共转染程序。选择标记物和报告基因二者都可以侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标记物包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。
报告基因用于鉴定可能经转染的细胞和用于评价调节序列的功能。通常，报告基因是如下基因，其不存在于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽，该多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如酶活性)表现出来。在将DNA引入受体细胞后的适当时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei等人,2000FEBS快报479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，显示报告基因的最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些实施例中，包含编码本文所述CAR分子的核酸序列的载体可以进一步包含编码多肽(例如增加CAR分子活性的药剂)的第二核酸序列。在其他实施例中，所述两个或更多个核酸序列由相同框架中的单个核酸分子编码，并呈单个多肽链。在这方面，两种或更多种CAR可以例如被一个或多个肽切割位点分开。(例如，细胞内蛋白酶的自动切割位点或底物)。肽切割位点的实例包括以下，其中GSG残基是任选的：
T2A：(GSG)E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO:106)
P2A：(GSG)A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO:107)
E2A：(GSG)Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:108)
F2A：(GSG)V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:109)
将基因引入细胞并将其在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的背景下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆:实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社],纽约)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染或电穿孔。
用于将目标多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒、和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内的递送运载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人造膜囊泡)。可获得现有技术的靶向递送核酸(例如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸)的其他方法。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送运载体是脂质体。考虑使用脂质制剂以将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质关联。与脂质相关的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸二者相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，被含有作为在脂质中的悬浮液，含有胶束或与胶束复合，或以其他方式与脂质关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关联的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从密苏里州圣路易斯的西格玛公司获得；磷酸二鲸蜡脂(“DCP”)可以从K&K实验室(平景(Plainview)，纽约)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从阿凡提极地脂质公司(Avanti Polar LipidsInc.)(伯明翰(Birmingham)，阿拉巴马州)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质运载体。脂质体可以表征为具有囊泡结构，其具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。它们是在磷脂悬浮在过量的水溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology[糖生物学]5:505-10)。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式将细胞暴露于本披露的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中存在重组DNA序列，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如DNA和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定以鉴定落入本发明范围内的药剂。
本披露还提供了包含CAR编码核酸分子的载体。在一个实施例中，载体包含CAR编码核酸分子，例如如本文所述。在一方面，可以将一种或多种CAR载体直接转导入细胞，例如T细胞或NK细胞。在一方面，载体是克隆或表达载体，例如载体，包括但不限于一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、微环、微型载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一方面，载体能够在哺乳动物免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)中表达CAR构建体。
在需要稳定表达CAR的一个实施例中，将包含CAR编码核酸分子的载体转导到免疫效应细胞中。例如，可以使用慢病毒载体产生具有CAR的稳定表达的免疫效应细胞。表现出CAR稳定表达的细胞在转导后表达CAR持续至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、3个月、6个月、9个月或12个月。
在需要瞬时表达CAR的一个实施例中，将CAR编码核酸分子转染到免疫效应细胞中。CAR编码核酸分子可以是包含CAR编码核酸分子的载体或编码CAR的体外转录RNA。下文进一步描述了体外转录的RNA CAR和用于转染到免疫效应细胞中的方法。展现出CAR瞬时表达的细胞在转染后表达CAR持续4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。
RNA转染
本文披露了用于产生体外转录的RNA CAR(例如体外转录的RNACAR)的方法。本披露还包括CAR编码RNA构建体，其可以直接转染到细胞中。产生用于转染的mRNA的方法可以包括：用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，然后添加聚A以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸、和聚A尾的构建体，典型地长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:32)。如此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一方面，模板包括CAR的序列。
在一方面，本披露的CAR由信使RNA(mRNA)编码。在一方面，将编码本文所述CAR的mRNA引入T细胞或NK细胞中以产生表达CAR的细胞。
在一个实施例中，体外转录的RNA CAR可以作为瞬时转染的形式引入细胞。使用聚合酶链反应(PCR)产生的模板通过体外转录产生RNA。可以使用适当的引物和RNA聚合酶将来自任何来源的目的DNA直接通过PCR转化为用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。用于体外转录的所需模板是本文所述的CAR。例如，RNA CAR的模板包含：细胞外区域，该细胞外区域包含针对肿瘤抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)的抗体的单链可变结构域；铰链区(例如本文所述的铰链区；跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域，例如CD8a的跨膜结构域)；以及细胞质区域，其包括细胞内信号传导结构域，例如本文所述的细胞内信号传导结构域，例如包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施例中，有待用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以来自生物基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施例中，核酸可包括5'和/或3'非翻译区(UTR)中的一些或全部。核酸可包括外显子和内含子。在一个实施例中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施例中，用于PCR的DNA是包含5'和3'UTR的人核酸序列。可替代地，DNA可以是通常不在天然存在的生物体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因部分的序列，这些基因部分连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个的生物体。
使用PCR以产生用于体外转录mRNA的模板，该mRNA用于转染。进行PCR的方法是本领域熟知的。用于PCR的引物被设计成具有与有待用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸序列，其中引物序列中的大多数或所有碱基是互补的，或者一个或多个碱基是非互补的或错配的。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶标退火或杂交。可以将引物设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以设计引物以扩增通常在细胞中转录的核酸部分(开放阅读框)，包括5'和3'UTR。还可以设计引物以扩增编码特定目标结构域的核酸的一部分。在一个实施例中，引物被设计为扩增人cDNA的编码区，包括5'和3’UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是含有核苷酸区域的引物，这些核苷酸与DNA模板上的位于待扩增DNA序列上游的核苷酸基本上互补。“上游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的5’位置。“反向引物”是含有核苷酸区域的引物，该核苷酸区域与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补。“下游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的3'位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶均可用于本文披露的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。RNA优选具有5'和3'UTR。在一个实施例中，5'UTR的长度在一个和3000个核苷酸之间。待添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，这些方法包括但不限于设计与UTR的不同区域退火的PCR引物。使用该途径，本领域普通技术人员可以改变所需的5'和3'UTR长度，以在经转录RNA的转染后实现最佳翻译效率。
5'和3'UTR可以是目标核酸的天然存在的内源5'和3'UTR。可替代地，可以通过将UTR序列掺入正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加对目标核酸不是内源的UTR序列。使用对目标核酸而言不是内源的UTR序列可用于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3'UTR，以基于本领域熟知的UTR的特性来增加经转录的RNA的稳定性。
在一个实施例中，5'UTR可含有内源核酸的Kozak序列。可替代地，当如上所述通过PCR添加对目标核酸而言不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但显现并不是所有RNA实现高效翻译所需要的。对许多mRNA的Kozak序列的要求是本领域已知的。在其他实施例中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，该RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施例中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了在无需基因克隆的情况下实现从DNA模板合成RNA，转录启动子应附接到待转录序列上游的DNA模板上。当将用作RNA聚合酶启动子的序列添加到正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子被掺入待转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个优选的实施例中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在优选的实施例中，mRNA在5'末端具有帽和3’poly(A)尾，它们决定在细胞中核糖体结合、翻译起始和mRNA稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生长的多联产物，其不适于在真核细胞中表达。在3’UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，即使它在转录后进行了多腺苷酸化，但在真核转染中无效。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以使转录物的3'末端延伸超出模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.[核酸研究],13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],270:1485-65(2003))。
将聚A/T延展段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚A/T序列可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费力且耗时，而且通常不可靠。这就是为什么特别需要允许在不进行克隆的情况下构建具有聚A/T 3'伸展段的DNA模板的方法。
转录DNA模板的聚A/T区段可以在PCR期间通过使用含有polyT尾(例如100T尾)(SEQ ID NO:35)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO:2588))的反向引物产生，或在PCR后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)产生。poly(A)尾也为RNA提供稳定性并降低其降解。通常，poly(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性呈正相关。在一个实施例中，poly(A)尾在100和5000个腺苷之间(例如SEQ ID NO:34)。
在使用聚(A)聚合酶(例如大肠杆菌聚A聚合酶(E-PAP))进行体外转录后，可以进一步延伸RNA的poly(A)尾。在一个实施例中，将poly(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300到400个核苷酸(SEQ ID NO:38)，导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，不同化学基团与3'末端的附接可以增加mRNA稳定性。这种附接可包含修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可以使用poly(A)聚合酶将ATP类似物掺入poly(A)尾中。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在优选的实施例中，通过本文披露的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的和本文描述的技术提供5'帽(Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.[生物化学科学趋势],29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理研究通讯],330:958-966(2005))。
通过本文披露的方法产生的RNA还可含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，其启动与帽无关的核糖体与mRNA的结合并促进翻译的起始。可以包括适用于细胞电穿孔的任何溶质，这些溶质可以含有促进细胞渗透性和活力的因子，例如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用许多不同方法中的任一种将RNA引入靶细胞，这些不同方法例如可商购的方法，包括但不限于：电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，科隆，德国))，(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments，波士顿，马萨诸塞州)或Gene Pulser II(伯乐公司(BioRad)，丹佛，科罗拉多州)，多功能细胞电穿孔仪(Multiporator)(Eppendort，汉堡(Hamburg)，德国)；阳离子脂质体介导的转染(使用脂质转染)；聚合物包封；肽介导的转染；或生物射弹颗粒递送系统如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa等人Hum Gene Ther.[人类基因疗法],12(8):861-70(2001))。
非病毒递送方法
在一些方面，非病毒方法可用于将编码本文所述CAR的核酸递送至细胞或组织或受试者中。
在一些实施例中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。在一些实施例中，转座子是可以将自身插入基因组中一位置的一条DNA，例如，能够自我复制并将其拷贝插入基因组的一条DNA，或者是可以从较长的核酸中剪接出并插入基因组中的另一个位置的一条DNA。例如，转座子包含由侧接基因的用于转座的反向重复序列构成的DNA序列。
使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。参见例如Aronovich等人Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]20.R1(2011):R14-20；Singh等人Cancer Res.[癌症研究]15(2008):2961–2971；Huang等人Mol.Ther.[分子疗法]16(2008):580–589；Grabundzija等人Mol.Ther.[分子疗法]18(2010):1200–1209；Kebriaei等人Blood.[血液]122.21(2013):166；Williams.MolecularTherapy[分子疗法]16.9(2008):1515–16；Bell等人Nat.Protoc.[自然方案]2.12(2007):3153-65；以及Ding等人Cell.[细胞]122.3(2005):473-83，将所有这些文献通过引用并入本文。
SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶的来源。转座酶可以将转座子从载体质粒(或其他供体DNA)转移到靶标DNA，例如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与载体质粒/供体DNA结合，从质粒中切出转座子(包括一个或多个转基因)，并将其插入宿主细胞的基因组中。参见例如Aronovich等人，见上文。
示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见，例如，Grabundzija等人NucleicAcids Res.[核酸研究]41.3(2013):1829-47；和Singh等人Cancer Res.[癌症研究]68.8(2008):2961-2971，将所有这些通过引用并入本文。示例性的转座酶包括Tc1/海员型转座酶(mariner-type transposase)，例如SB10转座酶或SB11转座酶(可以例如从巨细胞病毒启动子表达的过度活跃的转座酶)。参见例如Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人，将所有这些文献通过引用并入本文。
SBTS的使用允许转基因(例如编码本文所述CAR的核酸)的高效整合和表达。本文提供了产生细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法，该细胞例如使用转座子系统(例如SBTS)稳定地表达本文所述的CAR。
根据本文所述的方法，在一些实施例中，将含有SBTS组分的一种或多种核酸(例如质粒)递送至细胞(例如T或NK细胞)。例如，通过核酸(例如质粒DNA)递送的标准方法递送一种或多种核酸，这些标准方法例如本文所述的方法，例如电穿孔、转染或脂质转染。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如编码本文所述CAR的核酸)的转座子。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如编码本文所述CAR的核酸)以及编码转座酶的核酸序列的转座子。在其他实施例中，提供了具有两种核酸的系统，例如双质粒系统，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子，而第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一和第二核酸共同递送到宿主细胞中。
在一些实施例中，通过使用基因插入(使用SBTS)和基因编辑(使用核酸酶(例如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、或工程化大范围核酸酶重新工程化的归巢内切核酸酶))的组合产生表达本文所述CAR的细胞，例如T或NK细胞。
在一些实施例中，使用非病毒递送方法允许细胞例如T或NK细胞的重编程，并将这些细胞直接输注到受试者体内。非病毒载体的优点包括但不限于容易产生满足患者群体所需的足够量、储存期间的稳定性和缺乏免疫原性且成本相对低。
细胞来源
在扩增和基因修饰之前，例如为了表达本文所述的CAR，可以从受试者获得细胞来源，例如T细胞或NK细胞。术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、和肿瘤。在本披露的某些方面，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。在本披露的某些方面，可以使用熟练技术人员已知的任何数量的技术，例如FicollTM分离，从采集自受试者的血液单位获得T细胞。在一个优选的方面，来自个体循环血液的细胞是通过单采血液成分术获得。单采血液成分术产物典型地含有淋巴细胞(包括T细胞)、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一方面，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆部分，并将细胞置于合适的缓冲液或介质中以用于后续处理步骤。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在可替代的方面，洗涤溶液缺乏钙并且可缺乏镁，或者可缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。在没有钙的情况下的初始激活步骤可以导致激活放大。如本领域普通技术人员易于理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如通过根据制造商的说明书使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液(例如无Ca、无Mg的PBS，PlasmaLyte A，或具有或不具有缓冲液的其他盐溶液)中。可替代地，可以除去单采血液成分术的样品中不需要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
应当认识到，本申请的方法可利用包含5％或更少(例如2％)的人AB血清的培养基条件，并使用已知的培养基条件和组合物，例如Smith等人,“Ex vivo expansion of humanT cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune CellSerum Replacement[使用新型无异物CTS免疫细胞血清替换来离体扩增人T细胞以用于过继性免疫疗法]”Clinical&Translational Immunology[临床和转化免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中描述的那些。
在一方面，通过裂解红细胞和耗减单核细胞(例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过对流离心淘洗)从外周血淋巴细胞分离T细胞。例如，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和CD45RO+T细胞。例如，在一方面，通过将T细胞与抗-CD3/抗-CD28(例如3x28)缀合的珠粒(例如M-450CD3/CD28T)一起孵育来分离这些T细胞，孵育持续足以对期望的T细胞进行阳性选择的时间段。在一方面，该时间段是约30分钟。在另一方面，该时间段的范围为30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另一方面，该时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在又另一个优选的方面，该时间段是10至24小时。在一方面，孵育时间段是24小时。与其他细胞类型相比，在存在较少T细胞的任何情况下，例如在从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)中可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+T细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠粒结合的时间和/或通过增加或降低珠粒与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养开始时或在过程的其他时间点优先选择或不选择T细胞亚群。另外，通过增加或降低珠粒或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养起始时或在其他所需时间点优先选择或不选择T细胞亚群。熟练技术人员将认识到在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。在某些方面，可能需要执行选择程序并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以经受另外多轮选择。
通过阴性选择富集T细胞群可以用针对阴性选择的细胞特有的表面标记物的抗体组合完成。一种方法是例如使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体混合物，通过负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些方面，可能需要富集或正选择典型地表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。可替代地，在某些方面，T调节性细胞被抗C25缀合的珠粒或其他类似的选择方法耗减。
本文描述的方法可以包括例如：使用例如负选择技术(例如本文所述的)选择特定的免疫效应细胞亚群(例如T细胞)，其是T调节性细胞耗减的群体，CD25+耗减的细胞。优选地，T调节性耗减细胞群含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一个实施例中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体IL-2从群体中除去T调节性细胞，例如CD25+T细胞。在一个实施例中，抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体与底物(例如珠粒)缀合，或者以其他方式包被在底物例如珠粒上。在一个实施例中，抗CD25抗体或其片段与如本文所述的底物缀合。
在一个实施例中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗减试剂从群体中除去T调节性细胞，例如CD25+T细胞。在一个实施例中，细胞与CD25耗减试剂的比率是1e7个细胞比20uL，或1e7个细胞比15uL，或1e7个细胞比10uL，或1e7个细胞比5uL，或1e7个细胞比2.5uL，或1e7个细胞比1.25uL。在一个实施例中，例如对于T调节性细胞，例如CD25+耗减，使用大于5亿个细胞/ml。在另一方面，使用6亿、7亿、8亿或9亿个细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施例中，待耗减的免疫效应细胞群包括约6x 109个CD25+T细胞。在其他方面，待耗减的免疫效应细胞群包括约1x 109至1x 1010个CD25+T细胞，以及其间的任何整数值。在一个实施例中，由此产生的T调节性耗减细胞群具有2x 109个T调节性细胞(例如CD25+细胞)或更少(例如1x 109、5x 108、1x 108、5x 107、1x 107或更少的CD25+细胞)。
在一个实施例中，使用具有耗减管件组的CliniMAC系统(例如管件162-01)从群体中去除T调节性细胞，例如CD25+细胞。在一个实施例中，CliniMAC系统在耗减设置例如DEPLETION2.1上运行。
不希望受特定理论的束缚，在单采血液成分术之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中的免疫细胞的负调节物的水平(例如减少不需要的免疫细胞例如TREG细胞的数量)可以降低受试者复发的风险。例如，耗减TREG细胞的方法是本领域已知的。降低TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗减及其组合。
在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前减少(例如耗减)TREG细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如单采血液成分术样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段，或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减TREG细胞。
在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物生产的细胞之前，用一种或多种减少TREG细胞的疗法预处理受试者，从而针对表达CAR的细胞治疗降低受试者复发的风险。在实施例中，降低TREG细胞的方法包括但不限于向受试者给予环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减或其组合中的一种或多种。给予环磷酰胺、抗GITR抗体，CD25耗减或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间或之后发生。
在实施例中，在收集细胞用于制造表达CAR的细胞产物之前，将受试者用环磷酰胺预治疗，从而降低受试者复发至表达CAR的细胞治疗的风险。在实施例中，在收集细胞用于制造表达CAR的细胞产物之前，将受试者用抗GITR抗体预处理，从而降低受试者复发至表达CAR的细胞治疗的风险。
在一个实施例中，待去除的细胞群既不是调节性T细胞也不是肿瘤细胞，而是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞，例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标记物的细胞。在一个实施例中，设想将此类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行去除，或者在所述耗减后去除，或者按另一个顺序去除。
本文描述的方法可包括多于一个选择步骤，例如多于一个耗减步骤。通过阴性选择富集T细胞群可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标记物的抗体组合完成。一种方法是例如使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体混合物，通过负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
本文描述的方法可以进一步包括从表达肿瘤抗原的群体中去除细胞，该肿瘤抗原例如不包括CD25的肿瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b，从而提供T调节耗减例如CD25+耗减的以及肿瘤抗原耗减的细胞群体(其适于表达CAR，例如本文所述的CAR)。在一个实施例中，将肿瘤抗原表达细胞与T调节性例如CD25+细胞同时去除。例如，抗CD25抗体或其片段以及抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至相同的底物(例如珠粒)，其可以用于去除细胞；或者抗CD25抗体或其片段或抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至分开的珠粒上，其混合物可用于去除细胞。在其他实施例中，T调节性细胞(例如CD25+细胞)的去除和肿瘤抗原表达细胞的去除是顺序的，并且可以例如按任一顺序发生。
还提供了包括从表达检查点抑制剂(例如本文所述的检查点抑制剂)的群体中去除细胞(例如PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞)的方法，从而提供T调节性耗减例如CD25+耗减的细胞以及检查点抑制剂耗减的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)群体。示例性检查点抑制剂包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一个实施例中，将检查点抑制剂表达细胞与T调节性例如CD25+细胞同时去除。例如，抗CD25抗体或其片段以及抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于去除细胞的相同珠粒；或者抗CD25抗体或其片段和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至分开的珠粒上，其混合物可用于去除细胞。在其他实施例中，T调节性细胞(例如CD25+细胞)的去除和检查点抑制剂表达细胞的去除是顺序的，并且可以例如按任一顺序发生。
在一个实施例中，可以选择表达以下中的一者或多者的T细胞群：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B、和穿孔素、或其他适当的分子(例如其他细胞因子)。针对细胞表达进行筛选的方法可以通过例如PCT公开号WO 2013/126712中描述的方法测定。
为了通过阳性或阴性选择来分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如珠粒等颗粒)的浓度。在某些方面，可能需要显著降低珠粒和细胞混合在一起的体积(例如增加细胞浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，在一方面，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一方面，使用大于1亿个细胞/ml。在另一方面，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在一个方面，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞激活和细胞扩增的增加。此外，使用高细胞浓度可以更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或者来自于存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关方面，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面的混合物(例如珠粒等颗粒)，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量所需抗原的细胞以与颗粒结合。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更高效地被捕获。在一方面，所用细胞的浓度为5X 106/ml。在其他方面，使用的浓度可以是约1X 105/ml至1X 106/ml，以及其间的任何整数值。
在其他方面，可以将细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞提供更均匀的产物。在用以去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在这种背景下是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或者31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白、和7.5％DMSO的培养基，或其他合适的细胞冷冻培养基(例如Hespan和PlasmaLyte A)，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻的方法。
在某些方面，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在使用本披露的方法激活之前使其在室温下静置一小时。
在本发明的背景中还考虑在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离和冷冻所需的细胞(例如T细胞)以便后续用于T细胞疗法中，以用于将受益于T细胞疗法的任何数量的疾病或病症，例如本文所述的那些。在一方面，血液样品或单采血液成分术取自总体健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采血液成分术取自总体健康的受试者，该受试者有患病的风险但尚未患病，并且感兴趣的细胞被分离并冷冻供以后使用。在某些方面，可以将T细胞扩增、冷冻、并在以后使用。在某些方面，在诊断如本文所述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样品。在另一方面，在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分术中分离细胞，这些相关治疗方式包括但不限于用例如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化疗、辐射、免疫抑制剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消除剂(例如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、和辐照)等药剂治疗。
在本披露的另一方面，T细胞是在治疗后直接从患者获得的，该治疗使受试者具有功能性T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗后，具体而言在用破坏免疫系统的药物治疗后，就在治疗后不久，在患者正常从治疗中恢复的时期期间，获得的T细胞质量可以是最佳的或因其离体扩增能力而得到改善。同样地，在使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可以处于优选的状态以增强移植和体内扩增。因此，在本披露的背景下，考虑在该恢复阶段期间收集血液细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和调节方案可用于在受试者中产生病症，其中具体细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增是有利的，尤其是在治疗后限定的时间窗口期间有利。示例性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞和其他细胞。
在一个实施例中，T细胞群是二酰基甘油激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质、或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传途径产生，例如给予RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或防止DGK表达。可替代地，可通过用本文所述的DGK抑制剂处理来产生DGK缺陷型细胞。
在一个实施例中，T细胞群是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达IkarosRNA或蛋白质或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可通过遗传途径产生，例如给予RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或防止Ikaros表达。可替代地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如来那度胺)处理来产生Ikaros缺陷型细胞。
在实施例中，T细胞群是DGK缺陷型及Ikaros缺陷型，例如不表达DGK和Ikaros，或者具有降低或抑制的DGK和Ikaros活性。此类DGK和Ikaros缺陷型细胞可以通过本文描述的任何方法产生。
在实施例中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest)。
同种异体CAR免疫效应细胞
在本文所述的实施例中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如缺乏功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可以例如被工程化为使其表面上不表达任何功能性TCR，被工程化为使其不表达包括功能性TCR的一个或多个亚基，或者被工程化为使其表面上产生非常少的功能性TCR。可替代地，T细胞可以表达基本上受损的TCR，例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式。术语“基本上受损的TCR”意指该TCR不会在宿主中引发不利的免疫反应。
本文描述的T细胞可以例如被工程化为使其表面上不表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以被工程化为使得细胞表面HLA(例如HLA I类和/或HLA II类)的表达被下调。
在一些实施例中，T细胞可缺乏功能性TCR和功能性HLA，例如HLA I类和/或HLA II类。
缺乏功能性TCR和/或HLA表达的经修饰的T细胞可通过任何合适的手段获得，包括敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、或锌指内切核酸酶(ZFN)造成的TCR和/或HLA敲低。
在一些实施例中，同种异体细胞可以是例如通过本文描述的任何方法不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞。例如，细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如该抑制性分子可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ。抑制性分子的抑制，例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制，可以优化表达CAR的细胞的性能。在实施例中，可以使用抑制性核酸(例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)、规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、或锌指内切核酸酶(ZFN)，例如如本文所述。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在一些实施例中，可以用靶向编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA来抑制在细胞例如T细胞中的TCR表达和/或HLA表达、和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)。
siRNA和shRNA的表达系统以及示例性shRNA描述于例如2015年3月13日提交的国际公开WO 2015/142675的第649和650段中，将其通过引用以其整体并入。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文所用，“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组规律间隔成簇短回文重复序列，或包含这组重复序列的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。
“CRISPR/Cas”系统是指衍生自CRISPR和Cas的系统，其可用于沉默或突变在细胞例如T细胞中的TCR和/或HLA基因、和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHCI类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)。
CRISPR/Cas系统及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际公开WO 2015/142675的第651-658段中，将其通过引用以其整体并入。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录激活因子样效应子核酸酶，其为人工核酸酶，可用于编辑在细胞例如T细胞中的HLA和/或TCR基因、和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)。
TALEN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际公开WO 2015/142675的第659-665段中，将其通过引用以其整体并入。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，其为人工核酸酶，可用于编辑在细胞例如T细胞中的HLA和/或TCR基因、和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)。
ZFN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的第666-671段中，将其通过引用以其整体并入。
端粒酶表达
虽然不希望受任何特定理论的束缚，但在一些实施例中，由于T细胞中的端粒缩短，治疗性T细胞在患者中具有短期持久性；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善患者体内T细胞的持久性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancerin the clinic[临床上用于癌症的过继性T细胞疗法]”,Journal of ClinicalInvestigation[临床研究杂志],117:1466-1476(2007)。因此，在实施例中，免疫效应细胞，例如T细胞，异位表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基(例如TERT，例如hTERT)。在一些方面，本披露提供了产生表达CAR的细胞的方法，包括使细胞与编码端粒酶亚基例如端粒酶的催化亚基(例如TERT，例如hTERT)的核酸接触。可以在细胞与编码CAR的构建体接触之前、同时或之后使细胞与核酸接触。
在一方面，本披露的特征在于制备免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)群的方法。在实施例中，该方法包括：提供免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)群，使免疫效应细胞群与编码CAR的核酸接触；并且在允许CAR和端粒酶表达的条件下，使免疫效应细胞群与编码端粒酶亚基(例如hTERT)的核酸接触。
在实施例中，编码端粒酶亚基的核酸是DNA。在实施例中，编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基表达的启动子。
在实施例中，hTERT具有GenBank蛋白ID AAC51724.1的氨基酸序列(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[推定的人端粒酶催化亚基基因hEST2在肿瘤细胞中且在永生化期间上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)如下：
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD(SEQ ID NO:110)
在实施例中，hTERT具有与SEQ ID NO:110的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在实施例中，hTERT具有SEQ ID NO:110的序列。在实施例中，hTERT在N末端、C末端或两者处包含缺失(例如不超过5、10、15、20或30个氨基酸的缺失)。在实施例中，hTERT在N末端、C末端或两者处包含转基因氨基酸序列(例如不超过5、10、15、20或30个氨基酸的转基因氨基酸序列)。
在实施例中，hTERT由GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulatedin Tumor Cells and during Immortalization[推定的人端粒酶催化亚基基因hEST2在肿瘤细胞中且在永生化期间上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)如下：
在实施例中，hTERT由具有与SEQ ID NO: 111的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的核酸编码。在实施例中，hTERT由SEQ ID NO:111的核酸编码。
免疫效应细胞(例如T细胞)的激活和扩增
免疫效应细胞，例如T细胞，通常可以使用如描述于例如以下中的方法进行激活和扩增：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。
通常，免疫效应细胞(例如T细胞)群可以通过与附着有药剂和配体的表面接触来扩增，该药剂刺激CD3/TCR复合物相关的信号，该配体刺激免疫效应细胞(例如T细胞)表面上的共刺激分子。具体而言，可以如本文所述刺激T细胞群，例如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或通过与和钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，可以使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，法国)，可以如本领域公知的其他方法来使用(Berg等人,Transplant Proc.[移植进展]30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.[免疫学方法杂志]227(1-2):53-63,1999)。
在某些方面，可以通过不同方案提供用于T细胞的初级刺激信号和共刺激信号。例如，提供每个信号的药剂可以处于溶液中或偶联至表面。当与表面偶联时，药剂可以偶联至相同的表面(即“顺式”形成)或分开的表面(即“反式”形成)。可替代地，可以将一种药剂偶联至表面而使另一种药剂处于溶液中。在一方面，提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且提供初级激活信号的药剂处于溶液中或偶联至表面。在某些方面，两种药剂均可以处于溶液中。在一方面，这些药剂可以是可溶形式，然后交联至表面，例如表达与这些药剂结合的Fc受体或抗体或其他结合剂的细胞。就此而言，针对预期用于激活和扩增本披露中的T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810。
在一方面，将两种药剂固定在珠粒上，固定在相同的珠粒上(即“顺式”)或者固定至分开的珠粒(即“反式”)。例如，提供初级激活信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种药剂以相等的分子量共同固定在相同的珠粒上。在一方面，使用与珠粒结合的1:1比率的每种抗体以用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本披露的某些方面，使用与珠粒结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个具体方面，与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到约1倍至约3倍的增加。在一方面，与珠粒结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1至1:100，以及其间的所有整数值。在本披露的一方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于1。在本发明的某些方面，结合珠粒的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个具体方面，使用与珠粒结合的抗体的1:100CD3:CD28比率。在一方面，使用与珠粒结合的抗体的1:75CD3:CD28比率。在另一方面，使用与珠粒结合的抗体的1:50CD3:CD28比率。在一方面，使用与珠粒结合的抗体的1:30CD3:CD28比率。在一个优选的方面，使用与珠粒结合的抗体的1:10CD3:CD28比率。在一方面，使用与珠粒结合的抗体的1:3CD3:CD28比率。在又一方面，使用与珠粒结合的抗体的3:1CD3:CD28比率。
颗粒与细胞1:500至500:1以及其间的任何整数值的比率可用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。例如，小尺寸的珠粒只能结合几个细胞，而较大的珠粒可以结合许多细胞。在某些方面，细胞与颗粒的比率范围为1:100至100:1以及其间的任何整数值，以及在另外方面，该比率包括1:9至9:1以及其间的任何整数值，也可以刺激T细胞。如上所述，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比率可以变化，但是某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、以及15:1，其中一个优选的比率是至少1:1的颗粒/T细胞。在一方面，使用的颗粒与细胞的比率为1:1或更小。在一个具体方面，优选的颗粒:细胞比率为1:5。在其他方面，颗粒与细胞的比率可以根据刺激当天而变化。例如，在一方面，颗粒与细胞的比率在第一天为1:1至10:1，并且之后将另外的颗粒每天或每隔一天添加至细胞中持续长达10天，最终比率从1:1到1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个具体方面，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天是1:1，并且在刺激的第三天和第五天调整至1:5。在一方面，每天或每隔一天添加颗粒，在第一天最终比率达1:1，并且在刺激的第三天和第五天达1:5。在一方面，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天是2:1，并且在刺激的第三天和第五天调整至1:10。在一方面，每天或每隔一天添加颗粒，在第一天最终比率达1:1，并且在刺激的第三天和第五天达1:10。本领域技术人员将理解，各种其他比率可适用于本披露。具体而言，比率将根据颗粒大小以及细胞大小和类型而变化。在一方面，最典型的使用比率在第一天接近1:1、2:1和3:1。
在本披露的其他方面，将细胞如T细胞与药剂包被的珠粒组合，随后分离珠粒和细胞，然后培养细胞。在替代方面，在培养之前，药剂包被的珠粒和细胞不是分开的，而是一起培养的。在另一方面，首先通过施加力(例如磁力)浓缩珠粒和细胞，导致细胞表面标记物的结合增加，从而诱导细胞刺激。
举例来说，可以通过允许附着抗CD3和抗CD28的顺磁珠粒(3x 28个珠粒)与T细胞接触来结合细胞表面蛋白。在一方面，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠粒(例如，比率为1:1的M-450CD3/CD28T顺磁珠粒)组合于缓冲液中，例如PBS(不含二价阳离子如钙和镁)。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解可以使用任何细胞浓度。例如，在样品中的靶细胞可以非常少并且仅占样品的0.01％，或整个样品(即100％)可包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量均在本披露的背景中。在某些方面，可能需要显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一方面，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一方面，使用大于1亿个细胞/ml。在另一方面，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在一个方面，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞激活和细胞扩增的增加。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞。在某些方面，这样的细胞群可具有治疗价值并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施例中，将用编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸转导的细胞例如通过本文所述的方法扩增。在一个实施例中，将细胞在培养物中扩增数小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的时间段。在一个实施例中，将细胞扩增4至9天的时间段。在一个实施例中，将细胞扩增8天或更短例如7天、6天或5天的时间段。在一个实施例中，将细胞(例如本文所述的表达CAR的细胞)在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以通过例如各种T细胞功能来定义，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、激活、迁移或其组合。在一个实施例中，在相同培养条件下，与在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如，本文所述的表达CAR的细胞)显示抗原刺激后细胞倍增方面至少一倍、两倍、三倍或四倍的增加。在一个实施例中，将细胞(例如本文所述的表达CAR的细胞)在培养物中扩增5天，并且在相同培养条件下，所得细胞与在培养物中扩增9天的相同细胞相比，展现出更高的促炎性细胞因子产生，例如IFN-γ和/或GM-CSF水平。在一个实施例中，在相同培养条件下，与在培养物中扩增9天的相同细胞相比，细胞(例如，本文所述的表达CAR的细胞)扩增5天显示出以pg/ml计的促炎性细胞因子产生(例如IFN-γ和/或GM-CSF水平)方面至少一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多的增加。
在本披露的一方面，可以将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在一方面，可以将混合物培养21天。在本发明的一方面，将珠粒和T细胞一起培养约八天。在一方面，将珠粒和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适合T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，极限必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(瑞士龙沙集团(Lonza))，其可含有增殖和生存力所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或熟练技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、血浆制品(plasmanate)和还原剂(例如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、和X-Vivo 20、Optimizer，添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充适当量的血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量的一种或多种细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞保持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)。
在一个实施例中，将细胞在适当的培养基(例如，本文所述的培养基)中扩增，所述培养基包括一种或多种白细胞介素，其在14天扩增时期中产生至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)的细胞增加，例如如通过本文所述的方法如流式细胞术测量。在一个实施例中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如IL-15和IL-7)的存在下扩增。
在实施例中，本文所述的方法，例如表达CAR的细胞制造方法，包括例如使用抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体、IL-2从细胞群去除T调节性细胞例如CD25+T细胞。本文描述了从细胞群去除T调节性细胞(例如CD25+T细胞)的方法。在实施例中，方法，例如制造方法，还包括使细胞群(例如，其中T调节性细胞例如CD25+T细胞已经耗减的细胞群；或先前已接触抗CD25抗体、其片段、或CD25结合配体的细胞群)与IL-15和/或IL-7接触。例如，将细胞群(例如，其先前已接触抗CD25抗体、其片段或CD25结合配体)在IL-15和/或IL-7的存在下扩增。
在一些实施例中，在(例如离体)制造表达CAR的细胞期间，使本文所述的表达CAR的细胞与包含白细胞介素-15(IL-15)多肽、白细胞介素-15受体α(IL-15Ra)多肽、或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如hetIL-15)二者的组合的组合物接触。在实施例中，在(例如离体)制造表达CAR的细胞期间，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在实施例中，在(例如离体)制造表达CAR的细胞期间，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽二者的组合的组合物接触。在实施例中，在(例如离体)制造表达CAR的细胞期间，使本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。
在一个实施例中，使本文所述的表达CAR的细胞在离体扩增期间与包含hetIL-15的组合物接触。在实施例中，使本文所述的表达CAR的细胞在离体扩增期间与包含IL-15多肽的组合物接触。在实施例中，使本文所述的表达CAR的细胞在离体扩增期间与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽二者的组合物接触。在一个实施例中，接触导致淋巴细胞亚群(例如CD8+T细胞)的存活和增殖。
在一个实施例中，将细胞在包含血清的培养基中培养(例如扩增、模拟和/或转导)。血清可以是例如人AB血清(hAB)。在一些实施例中，hAB血清以约2％、约5％、约2％-3％、约3％-4％、约4％-5％或约2％-5％存在。2％和5％血清是各自适合允许T细胞多倍扩增的水平。此外，如Smith等人“Ex vivo expansion of human T cells for adoptiveimmunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无异源物的CTS免疫细胞血清替代进行人T细胞的离体扩增以用于过继性免疫疗法]”Clinical&Translational Immunology[临床转化免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31所示，含有2％人AB血清的培养基适合于T细胞的离体扩增。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可展现出不同的特征。例如，典型的血液或单采血液成分术处理的外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8+)更大的辅助性T细胞群(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体，离体扩增T细胞产生了T细胞群，该T细胞群在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，T细胞群包含越来越大的TC细胞群。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群可能是有利的。类似地，如果已经分离了TC细胞的抗原特异性子集，则将该子集扩增到更大程度可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8标记物之外，其他表型标记物显著变化，但在很大程度上，在细胞扩增过程中可重复。因此，这种再现性实现针对特定目的定制激活的T细胞产物的能力。
在一些实施例中，可以基于例如CCL20、GM-CSF、IFNγ、IL-10、IL-13、IL-17a、IL-2、IL-21、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、TNFα和/或其组合中的一种或多种的蛋白质表达水平，选择用编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸转导的细胞用于给药。在一些实施例中，可以基于例如CCL20、IL-17a、IL-6及其组合的蛋白质表达水平，选择用编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸转导的细胞用于给予。
一旦构建CAR，可以使用各种测定来评价分子活性，例如但不限于：在抗原刺激后扩增T细胞、在没有再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。用以评价CAR或表达CAR的细胞(例如，本发明的细胞)的作用的测定进一步详细描述于2015年3月13日提交的国际公开WO 2015/142675的第695-703段，将其通过引用以其整体并入。
用以评价CAR或表达CAR的细胞(例如，本发明的细胞)的作用的测定进一步详细描述于下文。
例如，可以改变上述细胞毒性测定以评价体外表达CAR的细胞的细胞毒性活性。可以将本发明的细胞与靶细胞(例如，表达由CAR靶向的抗原的细胞)以不同的效应子与靶标(E:T)的比率混合。在充分孵育以允许细胞介导的细胞溶解后，收获来自每种比率样品的上清液，然后测量释放的51Cr。为了监测细胞介导的持久性或增殖，可以通过例如流式细胞术监测本发明的细胞。
此外，可以向类似于上述模型的动物模型给予本发明的细胞，以评价细胞的能力。
其他测定，包括本文实施例部分中描述的那些测定以及本领域已知的那些测定也可用于评价本发明的CAR构建体和方法。
治疗应用
根据本文所述的任何方法，在实施例中，受试者患有癌症，例如实体瘤或与MDSC或TAM相关的肿瘤。在实施例中，本文描述的组合物可用于治疗本文所述的癌症。在实施例中，将例如如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂(例如抗IL-13抗体、抗IL-4抗体或抗IL-13Rα1抗体)和表达CAR的细胞(例如表达CD123 CAR的细胞)组合使用以治疗癌症，例如霍奇金淋巴瘤。
除其他之外，本发明提供了用于治疗与抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)表达相关的疾病或与表达抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)的细胞相关的病症或者与表达抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)的细胞相关的非癌症相关适应症的组合物和方法，该疾病或病症包括例如增殖性疾病，例如癌症或恶性肿瘤或癌前病症(例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)。在一方面，与抗原表达相关的癌症是血液癌。在一方面，血液癌包括但不限于AML、骨髓增生异常综合征、ALL、慢性髓性白血病、原始浆细胞样树突细胞肿瘤(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm)、骨髓增生性肿瘤、霍奇金淋巴瘤等。在实施例中，与CD123表达相关的疾病包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与CD123表达相关的增殖性疾病。还可以包括与抗原(例如CD123)表达相关的非癌症相关适应症。在一些实施例中，该障碍是与CD19表达相关的疾病，例如，如本文所述的表达CD19的B细胞恶性肿瘤。
在一方面，本发明提供了治疗与抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)表达相关的疾病的方法。在一方面，本发明提供了治疗疾病的方法，其中部分肿瘤针对抗原(例如，实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)是阴性的，并且部分肿瘤针对抗原(例如，实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)是阳性的。例如，本文描述的CAR可用于治疗已经历过与抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)表达升高相关的疾病的治疗的受试者，其中经历过针对抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)水平升高的治疗的受试者展现出与抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)水平升高相关的疾病。在实施例中，CAR可用于治疗已经历过与抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)表达相关的疾病的治疗的受试者，其中经历过与抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)表达相关的治疗的受试者展现出与抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)表达相关的疾病。
在一方面，本文提供了抑制表达抗原的肿瘤细胞(例如实体瘤或与MDSC或TAM相关的肿瘤)生长的方法，包括使肿瘤细胞与表达CAR的细胞(例如，如本文所述)接触，使得表达CAR的细胞响应于抗原而被激活并靶向癌细胞，其中肿瘤的生长受到抑制。该方法可以包括给予例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂。
在一方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法。该方法包括向受试者给予本文所述的表达CAR的细胞，从而治疗受试者的癌症。组合提供细胞疗法与例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂。
本披露包括一种细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，并将表达CAR的细胞输注给有此需要的受体。输注的细胞能够杀灭受体中的肿瘤细胞。组合提供细胞疗法与例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂。与抗体疗法不同，CAR-修饰的免疫效应细胞(例如CAR-修饰的T细胞或CAR-修饰的NK细胞)能够在体内复制，导致长期持久性，其可导致持续的肿瘤控制。在不同方面，在向患者给予免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)后，向患者给予的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)或其后代在患者中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年、或五年。
本发明还包括一种细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)例如通过体外转录的RNA被修饰，以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)，并且将表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或CAR NK细胞)输注给有此需要的受体。组合提供细胞疗法与例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂。输注的细胞能够杀灭受体中的肿瘤细胞。因此，在不同方面，在向患者给予免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)之后，向患者给予的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)存在少于一个月，例如三周、两周、一周。
不希望受任何具体理论的束缚，由CAR修饰的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答，或可替代地可以是由于直接与间接免疫应答。在一方面，CAR转导的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)展现出响应于表达靶抗原的人癌细胞的特异性促炎性细胞因子分泌和有力细胞溶解活性，抵抗可溶性靶抗原抑制，介导旁观者(bystander)杀伤并介导已建立的人类肿瘤的消退。例如，表达抗原的肿瘤的异质区域内的无抗原肿瘤细胞可能易受抗原重定向免疫效应细胞(例如先前已经针对邻近的抗原阳性癌细胞反应的T细胞或NK细胞)的间接破坏。
在一方面，本发明的完全人CAR修饰的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)可以是用于哺乳动物离体免疫和/或体内治疗的一类疫苗。在一方面，哺乳动物是人。
关于离体免疫，在将细胞(例如T细胞或NK细胞)给予至哺乳动物之前，以下中的至少一者在体外发生：I)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞或iii)冷冻保存细胞。
离体程序是本领域熟知的，并在下文更全面地讨论。简而言之，从哺乳动物(例如人)分离细胞，并用表达本文披露的CAR的载体进行遗传修饰(即体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞给予至哺乳动物受体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，并且CAR修饰的细胞可以相对于受体是自体的。可替代地，相对于受体，细胞可以是同种异体的、同基因的或异种异体的。
造血干细胞和祖细胞的离体扩增程序描述于美国专利号5,199,942(将其通过引用并入本文)中，可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于离体扩增细胞的任何具体方法。简而言之，T细胞的离体培养和扩增包括：(1)从哺乳动物外周血收获物或骨髓外植体收集CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)离体扩增此类细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子，其他因子例如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体也可以用于培养和扩增细胞。
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供了用于体内免疫以引发针对患者中的抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述激活和扩增的细胞可用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。具体而言，本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)用于治疗本文所述的疾病、障碍和病症，例如与本文所述抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)表达相关的障碍或病症。在某些方面，本发明的细胞用于治疗处于发展本文所述疾病、障碍和病症风险的患者，所述疾病、障碍和病症例如是与本文所述抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)表达相关的障碍或病症。因此，本发明提供了治疗或预防本文所述疾病、障碍和病症的方法，所述疾病、障碍和病症例如是与本文所述抗原(例如实体瘤抗原或在与MDSC或TAM相关的肿瘤上表达的抗原)表达相关的障碍或病症，这些方法包括向有需要的受试者给予与例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂相组合的治疗有效量的本文所述的CAR-修饰的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)。
在一方面，本发明的表达CAR的细胞(CART细胞或表达CAR的NK细胞)可用于治疗增殖性疾病，例如癌症或恶性肿瘤、或是癌前病症(例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)。在一方面，癌症是血液癌白血病前期、过度增殖性障碍、增生或发育不良，其特征在于细胞的异常生长。
在一方面，本发明的表达CAR的细胞(CART细胞或表达CAR的NK细胞)用于治疗癌症，其中癌症是血液癌。血液癌病症是多种癌症类型，例如影响血液、骨髓和淋巴系统的白血病和恶性淋巴组织增生病。
在一方面，本发明的组合物和表达CAR的细胞(CART细胞或表达CAR的NK细胞)特别可用于治疗实体瘤，例如各种器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤、腺癌和癌，例如影响胰腺、肝、肺、乳腺、卵巢、淋巴、胃肠(例如结肠)、泌尿生殖道(例如肾、尿路上皮细胞)、前列腺和咽的那些恶性肿瘤。在一方面，本发明的组合物和表达CAR的细胞(CART细胞或表达CAR的NK细胞)特别适用于治疗霍奇金淋巴瘤。
本文还提供了抑制表达抗原的细胞群(例如实体瘤细胞群或与MDSC或TAM相关的肿瘤细胞群)的增殖或减少所述表达抗原的细胞群的方法，该方法包括使包含表达抗原的细胞的细胞群与结合表达抗原的细胞的、表达CAR的细胞接触。在一个具体方面，本发明提供了抑制表达抗原的癌细胞群的增殖或减少所述癌细胞群的方法，该方法包括使表达抗原的癌细胞群与结合表达抗原的细胞的、表达CAR的细胞和例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂的组合接触。在一方面，本发明提供了抑制表达抗原的癌细胞群的增殖或减少所述癌细胞群的方法，该方法包括使表达抗原的癌细胞群与结合表达抗原的细胞的、表达CAR的细胞和例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂的组合接触。在某些方面，相对于阴性对照或相对于单独的任一单一疗法，当与例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂组合给予时，表达CAR的细胞将患有霍奇金淋巴瘤或与抗原表达细胞相关的其他癌症的受试者或针对所述霍奇金淋巴瘤或其他癌症的动物模型中的细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一方面，受试者是人。
本发明还提供了预防、治疗和/或管理与抗原表达细胞相关的疾病(例如实体瘤或与MDSC或TAM相关的肿瘤，例如霍奇金淋巴瘤)的方法，这些方法包括向有需要的受试者给予结合表达抗原的细胞的、表达CAR的细胞与例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂的组合。在一方面，受试者是人。
本发明还提供了预防、治疗和/或管理与抗原表达细胞相关的疾病的方法，这些方法包括向有需要的受试者给予结合表达抗原的细胞的、表达CAR的细胞与例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂的组合。在一方面，受试者是人。
本发明提供了预防与表达抗原的细胞相关的癌症复发的方法，这些方法包括向有需要的受试者给予结合抗原表达细胞的表达CAR的细胞与例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂的组合。在一方面，这些方法包括向有需要的受试者给予有效量的本文所述的结合抗原表达细胞的表达CAR的细胞与有效量的另一种疗法(例如，如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂)的组合。
在另一方面，本发明提供了治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者(例如患有癌症(例如实体瘤或与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤)的受试者)的方法。该方法包括向受试者给予(i)包含细胞例如免疫效应细胞群的CAR疗法，该细胞包含(例如表达)嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含结合CD123的肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(ii)肿瘤靶向疗法。在一些实施例中，将CD123 CAR以足以导致抑制M2巨噬细胞活性的量和/或时间给予。在实施例中，抑制M2巨噬细胞活性包括抑制巨噬细胞向M2表型的极化和/或M2巨噬细胞表型的逆转。
在其他实施例中，肿瘤靶向疗法是或包括CD19抑制或耗减疗法，例如包括CD19抑制剂的疗法。在一些实施例中，CD19抑制剂是CD19抗体，例如CD19双特异性抗体(例如，靶向CD19的双特异性T细胞衔接器，例如博纳吐单抗)。在一些实施例中，双特异性T细胞衔接器抗体分子是以下中描述的抗体分子：Bargou等人,“Tumor regression in cancerpatients by very low doses of a T cell-engaging antibody[通过非常低剂量的T细胞接合抗体在癌症患者中消退肿瘤].”Science[科学].2008年8月15日；321(5891):974-7.doi:10.1126/science.1158545。
在一些实施例中，肿瘤靶向疗法包括表达CD19CAR的细胞(例如CD19CART细胞)，或抗CD19抗体(例如，抗CD19单或双特异性抗体)或其片段或缀合物。在一个实施例中，抗CD19抗体是如WO 2014/153270中所述的人源化抗原结合结构域(例如，WO 2014/153270的表3)(将该文献通过引用并入本文)或其缀合物。其他示例性抗CD19抗体或其片段或缀合物包括但不限于博纳吐单抗、SAR3419(赛诺菲)、MEDI-551(米迪缪尼有限公司)、Combotox、DT2219ARL(共济会癌症中心(Masonic Cancer Center))、MOR-208(也称为XmAb-5574；莫弗西斯(MorphoSys))、XmAb-5871(Xencor)、MDX-1342(Bristol-Myers Squibb)、SGN-CD19A(西雅图遗传学公司(Seattle Genetics))和AFM11(Affimed Therapeutics)。参见例如Hammer.MAbs.4.5(2012):571-77。博纳吐单抗是一种双特异性抗体，由两个scFv构成，一个与CD19结合，一个与CD3结合。博纳吐单抗引导T细胞攻击癌细胞。参见例如Hammer等人；临床试验标识号NCT00274742和NCT01209286。MEDI-551是具有Fc的人源化抗CD19抗体，其被工程化为具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT01957579。Combotox是与CD19和CD22结合的免疫毒素的混合物。免疫毒素由与去糖基化的蓖麻毒蛋白A链融合的scFv抗体片段组成。参见例如Hammer等人；和Herrera等人J.Pediatr.Hematol.Oncol.[儿科血液肿瘤学杂志]31.12(2009):936-41；Schindler等人Br.J.Haematol.[英国血液病学杂志]154.4(2011):471-6。DT2219ARL是靶向CD19和CD22的双特异性免疫毒素，包含两种scFv和截短的白喉毒素。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT00889408。SGN-CD19A是抗体-药物缀合物(ADC)，其由与合成的细胞毒性细胞杀伤剂单甲基奥瑞西汀(auristatin)F(MMAF)连接的抗CD19人源化单克隆抗体构成。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT01786096和NCT01786135。SAR3419是抗CD19抗体-药物缀合物(ADC)，其包含通过可切割接头与美登素衍生物缀合的抗CD19人源化单克隆抗体。参见例如Younes等人J.Clin.Oncol.[临床肿瘤学杂志]30.2(2012):2776-82；Hammer等人；临床试验标识号NCT00549185；和Blanc等人Clin Cancer Res.[临床癌症研究]2011；17:6448-58。XmAb-5871是Fc-工程化人源化抗CD19抗体。参见例如Hammer等人。MDX-1342是具有增强的ADCC的人Fc-工程化抗CD19抗体。参见例如Hammer等人。在实施例中，抗体分子是双特异性抗CD19和抗CD3分子。例如，AFM11是靶向CD19和CD3的双特异性抗体。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT02106091。在一些实施例中，本文所述的抗CD19抗体与治疗剂缀合或以其他方式结合，该治疗剂例如化学治疗剂、肽疫苗(例如Izumoto等人2008J Neurosurg[神经外科杂志]108:963-971中所述)、免疫抑制剂、或免疫消除剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、FK506、CAMPATH、抗CD3抗体、细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228或细胞因子)。
血液癌
血液癌病症是多种癌症类型，例如影响血液、骨髓和淋巴系统的白血病、淋巴瘤和恶性淋巴组织增生病。
在一个实施例中，血液癌是白血病。在一个实施例中，癌症选自下组，该组由以下组成：一种或多种急性白血病，其包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，其包括但不限于慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其他血液癌或血液病，其包括但不限于套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和“白血病前期”(这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液病症的多样化集合)。
在实施例中，癌症是霍奇金淋巴瘤。在实施例中，CAR是例如本文所述的CD123CAR。
白血病可分为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可进一步分类为急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性骨髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。其他相关病症包括骨髓增生异常综合征(MDS，以前称为“白血病前期”)，这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液病症的多样化集合，具有转化为AML的风险。
淋巴瘤是一组从淋巴细胞发展而来的血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在实施例中，癌症是霍奇金淋巴瘤。在实施例中，CAR是例如本文所述的CD123 CAR。
在一方面，本发明涉及治疗患有血液癌的哺乳动物的方法，该方法包括向哺乳动物给予有效量的表达CAR分子的细胞和本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂。
实体癌
特别优选的是，本发明的方法和组合物用于治疗实体癌和实体瘤。示例性实体癌包括但不限于：子宫癌、结肠癌、卵巢癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、小肠癌、睾丸癌、肛门区癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、食管癌、黑素瘤、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、脑癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、肾上腺癌、骨癌、胰腺癌、头颈癌、表皮样癌、子宫内膜癌、阴道癌、宫颈癌、肉瘤、子宫癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、肝癌、前列腺癌、宫颈鳞状细胞癌、输卵管癌、软组织肉瘤、尿道癌、外阴癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、脊柱轴肿瘤、阴茎癌、膀胱癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、所述癌症的转移性病变、和/或其组合。
在一个实施例中，本披露提供了本文所述的疗法，其中给予本发明的细胞或组合物以治疗实体瘤，例如以抑制实体瘤的生长。在实施例中，细胞包括是CAR分子，该CAR分子靶向例如结合存在于实体瘤细胞或细胞群上的肿瘤抗原。可用本文披露的方法治疗的实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤、腺癌和癌，例如影响胰腺、肝、肺、乳腺、卵巢、淋巴、胃肠的那些(例如结肠)、泌尿生殖道(如肾、尿路上皮细胞)、前列腺和咽的那些恶性肿瘤。腺癌包括恶性肿瘤，例如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食管癌。在一个实施例中，实体瘤是间皮瘤。使用本发明的方法和组合物也可以治疗或预防上述癌症的转移性病变。
在一个实施例中，给予本文所述的组合疗法以治疗CD19阴性癌症。CD19阴性癌症可以表征为CD19缺失(例如，抗原缺失突变)或降低CD19水平的其他CD19改变(例如，由CD19阴性克隆的克隆选择引起)。应当理解，CD19阴性癌症不需要100％的CD19缺失，而可以保留一些部分的CD19表达(例如，保留一些表达CD19的癌细胞)。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达CD123 CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CD123。在一个实施例中，待治疗的癌症是霍奇金淋巴瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达EGFRvIIICAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达EGFRvIII。在一个实施例中，待治疗的癌症是胶质母细胞瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达间皮素CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达间皮素。在一个实施例中，待治疗的癌症是间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、或大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺转移性癌症、食道腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌和膀胱癌、或其任何组合。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达GD2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达GD2。在一个实施例中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达TnCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达Tn抗原。在一个实施例中，待治疗的癌症是卵巢癌、结肠癌、乳腺癌或胰腺癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达sTnCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达sTn抗原。在一个实施例中，待治疗的癌症是卵巢癌、结肠癌、乳腺癌或胰腺癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达PSMACAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达PSMA。在一个实施例中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达TAG72CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达TAG72。在一个实施例中，待治疗的癌症是胃肠癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达CD44v6CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CD44v6。在一个实施例中，待治疗的癌症是宫颈癌、AML或MM。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达EPCAMCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达EPCAM。在一个实施例中，待治疗的癌症是胃肠癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达KITCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达KIT。在一个实施例中，待治疗的癌症是胃肠癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达IL-13Ra2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达IL-13Ra2。在一个实施例中，待治疗的癌症是胶质母细胞瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达CD171CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CD171。在一个实施例中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌或NSCLC(非小细胞肺癌)。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达PSCACAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达PSCA。在一个实施例中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达LewisYCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达LewisY。在一个实施例中，待治疗的癌症是卵巢癌或AML。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达PDGFR-βCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达PDGFR-β。在一个实施例中，待治疗的癌症是乳腺癌、前列腺癌症、GIST(胃肠道间质瘤)、CML、DFSP(隆突性皮肤纤维肉瘤)、或神经胶质瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达SSEA-4CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达SSEA-4。在一个实施例中，待治疗的癌症是胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌或干细胞癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达叶酸受体αCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达叶酸受体α。在一个实施例中，待治疗的癌症是卵巢癌、NSCLC、子宫内膜癌、肾癌或其他实体瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达ERBB2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ERBB2(Her2/neu)。在一个实施例中，待治疗的癌症是乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肺癌或其他实体瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达MUC1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达MUC1。在一个实施例中，待治疗的癌症是乳腺癌、肺癌或其他实体瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达EGFRCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达EGFR。在一个实施例中，待治疗的癌症是胶质母细胞瘤、SCLC(小细胞肺癌)、SCCHN(头颈部鳞状细胞癌)、NSCLC或其他实体瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达NCAMCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达NCAM。在一个实施例中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤或其他实体瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达CAIXCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CAIX。在一个实施例中，待治疗的癌症是肾癌、CRC、宫颈癌或其他实体瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达HMWMAACAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达HMWMAA。在一个实施例中，待治疗的癌症是黑素瘤、胶质母细胞瘤或乳腺癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达o-乙酰基-GD2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达o-乙酰基-GD2。在一个实施例中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤或黑素瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达CLDN6CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CLDN6。在一个实施例中，待治疗的癌症是卵巢癌、肺癌或乳腺癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达TSHRCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达TSHR。在一个实施例中，待治疗的癌症是甲状腺癌、或多发性骨髓瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达CD97CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CD97。在一个实施例中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤、胃癌、胰腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌或结直肠癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达多唾液酸CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达多唾液酸。在一个实施例中，待治疗的癌症是小细胞肺癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达PLAC1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达PLAC1。在一个实施例中，待治疗的癌症是HCC(肝细胞癌)。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达GloboHCAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达GloboH。在一个实施例中，待治疗的癌症是卵巢癌、胃癌、前列腺癌症、肺癌、乳腺癌或胰腺癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达NY-BR-1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达NY-BR-1。在一个实施例中，待治疗的癌症是乳腺癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达MAD-CT-1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达MAD-CT-1。在一个实施例中，待治疗的癌症是前列腺癌或黑素瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达MAD-CT-2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达MAD-CT-2。在一个实施例中，待治疗的癌症是前列腺癌、黑素瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达Fos相关抗原1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达Fos相关抗原1。在一个实施例中，待治疗的癌症是神经胶质瘤、鳞状细胞癌或胰腺癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达ML-IAP CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ML-IAP。在一个实施例中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达NA17CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达NA17。在一个实施例中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达TRP-2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达TRP-2。在一个实施例中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达CYP1B1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CYP1B1。在一个实施例中，要治疗的癌症是乳腺癌、结肠癌、肺癌、食管癌、皮肤癌、淋巴结癌、脑癌或睾丸癌。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达RAGE-1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达RAGE-1。在一个实施例中，待治疗的癌症是RCC(肾细胞癌)或其他实体瘤
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达人端粒酶逆转录酶CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达人端粒酶逆转录酶。在一个实施例中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达肠羧基酯酶CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达肠羧基酯酶。在一个实施例中，待治疗的癌症是甲状腺癌症、RCC、CRC(结直肠癌)、乳腺癌或其他实体瘤。
在一方面，本披露提供了通过向有需要的受试者提供被工程化为表达mut hsp70-2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达mut hsp70-2。在一个实施例中，待治疗的癌症是黑素瘤。
组合疗法
本文所述的表达CAR的细胞可以与例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂组合使用。表达CAR的细胞与原M2巨噬细胞分子抑制剂的组合可以进一步与其他已知的药剂和疗法(另外的治疗剂)组合使用。如本文所用，“组合”给予意指在受试者患障碍的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如在受试者被诊断为患有障碍之后或在障碍已治愈或消除或治疗已出于其他原因停止之前递送两种或更多种治疗。在一些实施例中，当第二次开始递送时一个治疗递送仍然在发生，因此在给药方面存在重叠。这有时在本文中称为“同时”或“并行递送”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗递送开始之前结束。在任一种情况的实施例中，由于组合给药，治疗更有效。例如，第二治疗更有效，例如，用较少的第二治疗可观察到等同效果，或第二治疗在更大程度上减轻症状(这是与如果第二治疗是在没有第一治疗的情况下给予时会观察到的相比)，或观察到与第一治疗类似的情形。在一些实施例中，递送使得症状或与障碍相关的其他参数的减轻大于在没有另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的。两种治疗的效果可以是部分加和的、完全加和的或大于加和的。递送可以使得在递送第二治疗时仍然可以检测到递送的第一治疗的效果。
可以将本文所述的表达CAR的细胞和至少一种另外的治疗剂同时、以相同或分开的组合物、或顺序给予。对于顺序给予，可以首先给予本文所述的表达CAR的细胞并且可以其次给予另外的药剂，或者可以颠倒给予顺序。可以将原M2巨噬细胞分子抑制剂在表达CAR的细胞或另外的药剂之前、并行或之后给予。
可以将CAR疗法和/或其他治疗剂、程序或方式在活性障碍期间，或在缓解期或活性较低的疾病期间给予。可以将CAR疗法在其他治疗之前、与治疗并行、治疗后或在障碍缓解期给予。
当组合给予时，可以将CAR疗法和另外的药剂(例如第二或第三试剂)或全部以比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量给予。在某些实施例中，CAR疗法、另外的药剂(例如第二或第三药剂)、或全部的给予量或剂量比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量低(例如至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。在其他实施例中，CAR疗法、另外的药剂(例如第二或第三药剂)、或全部的导致期望效果(例如治疗癌症)的量或剂量比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂实现相同治疗效果所需的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。
原M2巨噬细胞分子抑制剂
已知具有M2表型的巨噬细胞在抑制T细胞功能(包括细胞毒性功能)中起作用。已知某些细胞因子例如IL-13、IL-4、IL-10、CSF-1、TGF-β和GM-CSF将巨噬细胞极化为M2表型，例如(在IL-13和/或IL-4的情况下)通过与巨噬细胞上表达的IL-13Rα1链和/或IL-4Rα链相互作用实现。阻断此类分子的分子可用于本文所述的方法和组合物中。原M2巨噬细胞分子的优选抑制剂包括IL-13抑制剂、IL-4抑制剂、IL-13Rα1抑制剂和/或IL-4Rα抑制剂，例如如本文所述。
原M2巨噬细胞分子抑制剂包括例如小分子。可以与表达CAR的细胞一起给予的小分子抑制剂的实例是紫檀芪(参见例如Huang等人,Oncotarget.[肿瘤靶标]2016年6月28日；7(26):39363–39375)，将其通过引用以其整体并入本文。
原M2巨噬细胞分子抑制剂包括例如抗体分子、多肽(例如融合蛋白)、或抑制性核酸(例如siRNA或shRNA)、或结合MDSC或TAM上的一种或多种表面抗原的表达CAR的细胞。
在一方面，原M2巨噬细胞分子抑制剂是抗IL-13抗体。可以通过本领域已知的方法进行此类抗体的产生。抗IL-13抗体的实例包括例如lebrikizumab(参见CAS号953400-68-5)。抗IL-13抗体的另一个实例是例如tralokinumab(CAS号1044515-88-9)。抗IL-13抗体的另一个实例是或包含GSK2434735的抗IL-13结合结构域。抗IL-13抗体的另一个实例是QAX576(参见例如Rothenberg等人,J.Allergy Clin.Immunol.[过敏临床免疫学杂志],2015,135(2),第500-507页)。
在另一方面，原M2巨噬细胞分子抑制剂是抗IL-4抗体或抗IL-4Rα抗体。可以通过本领域已知的方法进行此类抗体的产生。抗IL-4抗体的实例包括例如GSK2434735的抗IL-4结合结构域。抗IL-4抗体的另一个实例是例如dupilumab(参见CAS号1190264-60-8)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞抑制剂是IL-13和/或IL-4抑制剂。可以与表达CAR的细胞一起给予的IL-13和IL-4抑制剂的实例是维生素A衍生物芬维A胺((例如4-HPR)，参见例如Dong等人CancerLetters.[癌症快报]2017年3月1日第388卷,第43-53页，将其通过引用以其整体特此并入)。
在另一方面，原M2巨噬细胞分子抑制剂是抗CSF-1抗体或CSF-1小分子抑制剂。可以通过本领域已知的方法进行此类抗体的产生。抗CSF-1抗体的一个实例是emactuzumab。CSF-1抑制剂的另一个实例是BLZ945(参见例如Strachan,DC等人,Oncoimmunology[肿瘤免疫学],2013年12月1日,2(12):e26968)。可以与表达CAR的细胞一起给予的CSF-1抑制剂的另一个实例是尼达尼布(参见例如Tandon等人American Journal of Respiratory andCritical Care Medicine[美国呼吸与危重病学杂志]2017；195:A2397，将其通过引用以其整体特此并入)。
在另一方面，原M2巨噬细胞分子抑制剂是表达CAR的细胞，该表达CAR的细胞结合在MDSC或TAM(即TAM抗原)表面上表达的抗原，例如相对于其他巨噬细胞在MDSC或TAM表面上调的抗原。在实施例中，与MDSC或TAM抗原结合的表达CAR的细胞结合CD123(例如，是如本文所述的CD123 CAR)。在实施例中，与MDSC或TAM抗原结合的表达CAR的细胞结合CSF1R。在实施例中，与MDSC或TAM抗原结合的表达CAR的细胞结合CD68。在实施例中，与MDSC或TAM抗原结合的表达CAR的细胞结合CD206。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞抑制剂是JAK2抑制剂。可以与表达CAR的细胞一起给予的JAK2抑制剂的实例是鲁索替尼(参见例如Chen等人Clinical Lymphoma,Myelomaand Leukemia[临床淋巴瘤、骨髓瘤和白血病],第17卷,第1期,e93,2017，将其通过引用以其整体特此并入)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是细胞表面分子。可与表达CAR的细胞一起给予的细胞表面分子的实例是二肽基肽酶4(DPP-4)或CD26(参见例如Zhuge等人Diabetes[糖尿病]2016年10月；65(10):2966-2979，将其通过引用以其整体特此并入)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是HDAC抑制剂。可与表达CAR的细胞一起给予的HDAC抑制剂的实例是suberanilohydroxamic acid(SAHA)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是糖酵解途径抑制剂。可以与表达CAR的细胞一起给予的糖酵解途径抑制剂的实例是2-脱氧-d-葡萄糖((2-DG)，参见例如Zanganeh,Nat Nanotechnol.[自然纳米技术]2016年11月；11(11):986-994，将其通过引用以其整体特此并入)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是线粒体靶向抗氧化剂。可以与表达CAR的细胞一起给予的线粒体靶向抗氧化剂的实例是MitoQ(Formentini等人,CellReports[细胞报告],第19卷,第6期,2017年5月9日,第1202-1213页，将其通过引用以其整体特此并入)。
在另一个实施例中，原M2巨噬细胞分子抑制剂是氧化铁。可以与表达CAR的细胞一起给予的氧化铁的实例是纳米氧化铁(参见例如Zanganeh,Nat Nanotechnol.[自然纳米技术]2016年11月；11(11):986–994，将其通过引用以其整体特此并入)。
在实施例中，本发明包括组合物，该组合物包含原M2巨噬细胞分子抑制剂和药学上可接受的载体。
另外的联合疗法
在另外的方面，本文所述的表达CAR的细胞可以用于与以下项组合的治疗方案中：手术、细胞因子、辐射或化疗(例如环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰化酶抑制剂、去甲基化剂或肽疫苗)，例如在Izumoto等人2008J Neurosurg[神经外科杂志]108:963-971中所述。
在某些情况下，将本发明化合物与其他治疗剂组合，例如其他抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或抗呕剂)、镇痛药、细胞保护剂及其组合。
在一个实施例中，表达CAR的细胞和/或例如本文所述的原M2巨噬细胞分子抑制剂可以进一步与化学治疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包括蒽环霉素(例如多柔比星(例如脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷化剂(例如环磷酰胺、达卡巴嗪(decarbazine)、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、托西莫单抗、布仑妥昔单抗)、抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调节剂(例如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如来那度胺)。
考虑用于组合疗法的一般化学治疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西他赛盐酸多柔比星 依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌麦罗塔、紫杉醇phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、具有卡莫司汀植入物的polifeprosan 20枸橼酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫代鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明注射用盐酸盐托泊替康长春碱长春新碱和长春瑞滨
用于本文披露的组合的特别感兴趣的抗癌剂包括：蒽环霉素；烷化剂；抗代谢物；抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶或p70S6激酶FK506)或抑制p70S6激酶的药物；mTOR抑制剂；免疫调节剂；蒽环霉素；长春花生物碱；蛋白酶体抑制剂；GITR激动剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；CDK4激酶抑制剂；BTK抑制剂；MKN激酶抑制剂；DGK激酶抑制剂；或溶瘤病毒。
示例性抗代谢物包括而不限于嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂：甲氨蝶呤5-氟尿嘧啶 氟尿苷阿糖胞苷(TarabinePFS)、6-巯基嘌呤6-硫代鸟嘌呤(硫代鸟嘌呤)、磷酸氟达拉滨喷司他丁培美曲塞雷替曲塞克拉屈滨氯法拉滨阿扎胞苷地西他滨和吉西他滨优选的抗代谢物包括阿糖胞苷、氯法拉滨和氟达拉滨。
示例性的烷化剂包括而不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：乌拉莫司汀(Aminouracil
)、氮芥(chlormethine)环磷酰胺( RevimmuneTM)、异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷三乙烯蜜胺三乙烯硫代磷酰胺、替莫唑胺噻替派白消安 卡莫司汀洛莫司汀链脲佐菌素和达卡巴嗪另外的示例性烷化剂包括而不限于奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(也称为放线菌素-D、)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素和苯丙氨酸氮芥、)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、)；卡莫司汀苯达莫司汀白消安(和)；卡铂洛莫司汀(也称为CCNU、)；顺铂(也称为CDDP、和)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、)；异环磷酰胺Prednumustine；丙卡巴肼二氯甲基二乙胺(也称为氮芥、盐酸氮芥和盐酸二氯甲基二乙胺、)；链脲佐菌素噻替派(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、)；环磷酰胺 和盐酸苯达莫司汀
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞(任选地与原M2巨噬细胞分子抑制剂相组合)与BTK抑制剂组合给予至受试者。BTK抑制剂包括小分子、抗体分子、多肽(例如融合蛋白)、或抑制性核酸(例如siRNA或shRNA)。
在一个实施例中，激酶抑制剂是选自以下项的BTK抑制剂：依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在优选的实施例中，BTK抑制剂不降低或抑制白细胞介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在一个实施例中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如依鲁替尼(PCI-32765)。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与BTK抑制剂(例如依鲁替尼)组合给予至受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与依鲁替尼(也称为PCI-32765)组合给予至受试者。依鲁替尼的化学名称如下：1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)。
在一些实施例中，BTK抑制剂是国际申请WO/2015/079417中描述的BTK抑制剂，将该文献通过引用以其整体并入本文。
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞(任选地与原M2巨噬细胞分子抑制剂相组合)与磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(例如本文所述的PI3K抑制剂，例如艾拉利司(idelalisib)或度维利司(duvelisib))和/或利妥昔单抗组合给予至受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与艾拉利司和利妥昔单抗组合给予至受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与度维利司和利妥昔单抗组合给予至受试者。艾拉利司(也称为GS-1101或CAL-101；Gilead)是一种阻断PI3K的δ同种型的小分子。艾拉利司的化学名称是5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮。
度维利司是一种阻断PI3K-δ,γ的小分子。度维利司的化学名称是8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-1(2H)-异喹啉酮)。
在一些实施例中，将表达CAR的细胞与磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂组合给予至受试者。在某些实施例中，PI3K抑制剂是特那利司(RP6530)，参见例如Locatell等人,Blood[血液].2016年7月07日；128(1)，将其通过引用以其整体并入本文。
在实施例中，受试者患有CLL。在实施例中，受试者患有复发的CLL，例如先前已经向受试者给予过癌症疗法(例如先前给予过抗CD20抗体或先前给予过依鲁替尼)。例如，受试者在染色体17的短臂中具有缺失(del(17p)，例如在白血病细胞中)。在其他实例中，受试者没有del(17p)。在实施例中，受试者包含白血病细胞，其包含免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中的突变。在其他实施例中，受试者不包括含有免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中的突变的白血病细胞。在实施例中，受试者在染色体11的长臂中具有缺失(del(11q))。在其他实施例中，受试者没有del(11q)。在实施例中，将艾拉利司以约100-400mg(例如100-125、125-150、150-175、175-200、200-225、225-250、250-275、275-300、325-350、350-375或375-400mg)的剂量例如以BID给予。在实施例中，将度维利司以约15-100mg(例如约15-25、25-50、50-75或75-100mg)的剂量例如每天两次给予。在实施例中，将利妥昔单抗以约350-550mg/m2(例如350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)的剂量例如静脉给予。
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞(任选地与原M2巨噬细胞分子抑制剂相组合)与间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂组合给予至受试者。示例性ALK激酶抑制剂包括但不限于克唑替尼(辉瑞)、色瑞替尼(诺华)、艾乐替尼(Chugai)、布加替尼(也称为AP26113；Ariad)、恩曲替尼(Ignyta)、PF-06463922(辉瑞)、TSR-011(Tesaro)(参见例如临床试验标识号NCT02048488)、CEP-37440(Teva)和X-396(Xcovery)。在一些实施例中，受试者患有实体癌，例如本文所述的实体癌，例如肺癌。
克唑替尼的化学名称是3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。色瑞替尼的化学名称是5-氯-N2-[2-异丙氧基-5-甲基-4-(4-哌啶基)苯基]-N4-[2-(异丙基磺酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。艾乐替尼的化学名称是9-乙基-6,6-二甲基-8-(4-吗啉代哌啶-1-基)-11-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[b]咔唑-3-腈。布加替尼的化学名称是5-氯-N2-{4-[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]-2-甲氧基苯基}-N4-[2-(二甲基磷酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。恩曲替尼的化学名称是N-(5-(3,5-二氟苄基)-1H-吲唑-3-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)苯甲酰胺。PF-06463922的化学名称是(10R)-7-氨基-12-氟-2,10,16-三甲基-15-氧代-10,15,16,17-四氢-2H-8,4-(甲桥)吡唑并[4,3-h][2,5,11]-苯并氧杂二氮杂环四癸炔-3-腈。CEP-37440的化学结构是(S)-2-((5-氯-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-1-甲氧基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-2-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-N-甲基苯甲酰胺。X-396的化学名称是(R)-6-氨基-5-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)哒嗪-3-甲酰胺。
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞(任选地与原M2巨噬细胞分子抑制剂相组合)与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂组合给予至受试者。IDO是催化氨基酸L-色氨酸降解为犬尿氨酸的酶。许多癌症过度表达IDO，例如前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌和肺癌。pDC、巨噬细胞和树突细胞(DC)可以表达IDO。不受理论束缚，认为L-色氨酸的减少(例如，由IDO催化)通过诱导T细胞无反应性和细胞凋亡导致免疫抑制环境。因此，不受理论束缚，认为IDO抑制剂可以例如通过降低表达CAR的免疫细胞的抑制或死亡来增强本文所述的表达CAR的细胞的功效。在实施例中，受试者患有实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌或肺癌。IDO的示例性抑制剂包括但不限于1-甲基-色氨酸、吲哚莫德(NewLink Genetics)(参见例如临床试验标识号NCT01191216；NCT01792050)和INCB024360(Incyte集团(Incyte Corp.)(参见例如临床试验标识号NCT01604889；NCT01685255)。
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞(任选地与具有原M2巨噬细胞分子抑制剂相组合)与髓源性抑制细胞(MDSC)调节剂组合给予至受试者。MDSC在许多实体瘤的外周和肿瘤部位积聚。这些细胞抑制T细胞应答，从而阻碍表达CAR的细胞疗法的功效。不受理论束缚，认为MDSC调节剂的给予增强了本文所述的表达CAR的细胞的功效。在实施例中，受试者患有实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如胶质母细胞瘤。MDSC的示例性调节剂包括但不限于MCS110和BLZ945。MCS110是针对巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的单克隆抗体(mAb)。参见例如临床试验标识号NCT00757757和WO 2005/068503。BLZ945是集落刺激因子1受体(CSF1R)的小分子抑制剂。参见例如Pyonteck等人Nat.Med.[自然医学]19(2013):1264-72。在实施例中，CAR靶向间皮素，例如包含本文所述的间皮素结合结构域，例如是表11的CAR，例如是M5。在实施例中，CAR靶向EGFRvIII，例如包含本文所述的EGFRvIII结合结构域，例如是表30的CAR。BLZ945的结构如下所示。
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞(任选地与原M2巨噬细胞分子抑制剂相组合)与白细胞介素-15(IL-15)多肽、白细胞介素-15受体α(IL-15Ra)多肽、或IL-15多肽和IL-15Ra多肽例如hetIL-15(Admune疗法有限公司(Admune Therapeutics,LLC))二者的组合相组合来给予至受试者。hetIL-15是IL-15和IL-15Ra的异源二聚体非共价复合物。hetIL-15描述于例如U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413、和U.S.2011/0081311中，将这些文献通过引用并入本文。在实施例中，皮下给予het-IL-15。在实施例中，受试者患有癌症，例如实体癌，例如黑素瘤或结肠癌。在实施例中，受试者患有转移性癌症。
在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞(任选地与原M2巨噬细胞分子抑制剂相组合)与溶瘤病毒组合给予至受试者。在实施例中，溶瘤病毒是Talimogenelaherparepvec。在实施例中，溶瘤病毒被工程化为分泌一种或多种细胞因子，例如在实施例中，该溶瘤病毒是Ad5-CMV-TNFα；在实施例中，溶瘤病毒是Ad5-CMV-IL2；在实施例中，溶瘤病毒是Ad5-CMV-IFNg；在实施例中，溶瘤病毒是Ad5-CMV-IFNb；或其组合。在实施例中，溶瘤病毒如WO 2014/170389中所述(将其通过引用以其整体并入本文)，并且与表达CAR的细胞例如本文所述的表达CAR的细胞(例如如本文所述的表达mesoCAR的细胞)组合使用。在实施例中，溶瘤病毒描述于US 2010/0178684A1中，将其通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，重组溶瘤病毒包含编码免疫反应或炎性反应抑制剂的核酸序列(例如异源核酸序列)，例如如US2010/0178684A1中所述，将该文献通过引用以其整体并入本文。在实施例中，重组溶瘤病毒，例如溶瘤性NDV，包含促凋亡蛋白(例如凋亡蛋白)、细胞因子(例如GM-CSF、干扰素-γ、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α)、免疫球蛋白(例如针对ED-Bfirbonectin的抗体)、肿瘤相关抗原、双特异性衔接蛋白(例如针对NDV HN蛋白的双特异性抗体或抗体片段和T细胞共刺激受体(例如CD3或CD28)；或人IL-2与针对NDV HN蛋白的单链抗体之间的融合蛋白)。参见例如Zamarin等人Future Microbiol.[未来微生物学]7.3(2012):347-67，将其通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，溶瘤病毒是US8591881B2、US2012/0122185A1、或US 2014/0271677A1中描述的嵌合溶瘤性NDV，将这些文献各自通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，溶瘤病毒包含条件复制型腺病毒(CRAd)，其被设计为仅在癌细胞中复制。参见例如Alemany等人Nature Biotechnol.[自然生物技术]18(2000):723-27。在一些实施例中，溶瘤腺病毒包含Alemany等人的第725页的表1中所述的一种，将该文献通过引用以其整体并入本文。
示例性溶瘤病毒包括但不限于以下：
B组溶瘤腺病毒(ColoAd1)(PsiOxus Therapeutics Ltd.)(参见例如临床试验标识符：NCT02053220)；
ONCOS-102(以前称为CGTG-102)，其是包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(Oncos Therapeutics)的腺病毒(参见，例如，临床试验标识符：NCT01598129)；
VCN-01，其是基因修饰的溶瘤人腺病毒，编码人PH20透明质酸酶(VCNBiosciences，S.L.)(参见例如临床试验标识符：NCT02045602和NCT02045589)；
条件复制型腺病毒ICOVIR-5，是来源于野生型人腺病毒血清型5(Had5)的病毒，其经过修饰以在癌细胞中选择性地复制，并具有解除调节的视网膜母细胞瘤/E2F途径(Institut Català d'Oncologia)(参见例如临床试验标识符：NCT01864759)；
Celyvir，其包含用ICOVIR5感染的骨髓衍生的自体间充质干细胞(MSC)，是一种溶瘤腺病毒(Hospital Infantil Universitario Jesús,马德里,西班牙/RamonAlemany)(参见例如临床试验标识符：NCT01844661)；
CG0070，其是条件性复制型溶瘤血清型5腺病毒(Ad5)，其中人E2F-1启动子驱动必需的E1a病毒基因的表达，从而限制病毒复制和对Rb途径缺陷型肿瘤细胞的细胞毒性(ColdGenesys公司)(参见例如临床试验标识符：NCT02143804)；或者
DNX-2401(以前命名为δ-24-RGD)，是腺病毒，其被工程化为在视网膜母细胞瘤(Rb)途径缺陷型细胞中选择性地复制并感染更高效地表达某些RGD结合整合素的细胞(Clinica Universidad de Navarra,纳瓦拉大学(Universidad de Navarra)/DNAtrix公司)(参见例如临床试验标识符：NCT01956734)。在任何并入溶瘤病毒的实施例中，在一个方面，CAR靶向间皮素，例如包含本文所述的间皮素结合结构域，例如是表11的CAR，例如是M5。在任何并入溶瘤病毒的实施例中，在一个方面，CAR靶向EGFRvIII，例如包含本文所述的EGFRvIII结合结构域，例如是表30的CAR。
在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞(任选地与原M2巨噬细胞分子抑制剂相组合)与人透明质酸酶例如重组人透明质酸酶(例如PEGPH20)组合给予至受试者。参见例如临床试验标识符：NCT02715804。在实施例中，CAR靶向间皮素，例如包含本文所述的间皮素结合结构域，例如是表11的CAR，例如是M5。在实施例中，CAR靶向EGFRvIII，例如包含本文所述的EGFRvIII结合结构域，例如是表30的CAR。
药物组合物和治疗
本发明的药物组合物可以包含如本文所述的表达CAR的细胞(例如多个表达CAR的细胞)与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。在一方面，本发明的组合物被配制用于静脉内给予。
本发明的药物组合物能以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式给予。给予的数量和频率将由例如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素来确定，然而适当的剂量可以通过临床试验来确定。
在一个实施例中，药物组合物基本上不含，例如没有可检测水平的污染物，该污染物例如选自下组，该组由以下组成：内毒素、支原体、有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠粒、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施例中，细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待给予的本发明组合物的精确量。通常可以说，可以将包含本文所述T细胞的药物组合物按以下剂量给予：104至109个细胞/kg体重，在一些情况下为105至106个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。还可以将T细胞组合物以这些剂量多次给予。
在一些实施例中，CAR细胞的剂量包括约104至约109个细胞/kg，例如约104至约105个细胞/kg、约105至约106个细胞/kg、约106至约107个细胞/kg、约107至约108个细胞/kg、或约108至约109个细胞/kg。在实施例中，CAR细胞的剂量包括约0.6x 106个细胞/kg至约2x107个细胞/kg。在具体实施例中，CAR细胞的剂量包括约2x 105、1x 106、1.1x106、2x 106、3x106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、3x 108、或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞的剂量包括至少约1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、3x 108、或5x 108个细胞/kg。
在一些实施例中，CAR细胞的剂量包括约1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞的剂量包括至少约1x106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞的剂量包括多达约1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞的剂量包括约1.1x 106–1.8x 107个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞的剂量包括约1x 107、2x 107、5x 107、1x108、2x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞的剂量包括至少约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞的剂量包括至多约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x109、2x 109、或5x 109个细胞。
可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来给予细胞(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。
在某些方面，可能需要将激活的T细胞给予至受试者，然后随后重新抽取血液(或进行单采血液成分术)，根据本发明激活来自血液的T细胞，并用这些激活和扩增的T细胞重新输注入患者。此过程可以每几周进行多次。在某些方面，可以将来自10cc至400cc抽血的T细胞激活。在某些方面，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的T细胞激活。
能以任何常规方式给予主题组合物，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内给予本文所述的组合物。在一方面，通过皮内或皮下注射将本发明的表达CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)组合物给予至患者。在一方面，通过静脉内注射来给予本发明的表达CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)组合物。可以将表达CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
在具体的示例性方面，受试者可经历白细胞析离法，其中离体收集、富集或耗减白细胞以选择和/或分离感兴趣的细胞，例如免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)。可以将这些免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)分离物通过本领域已知的方法扩增，并进行处理，使得可以引入本发明的一种或多种CAR构建体，从而产生本发明的表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)。有需要的受试者随后可以接受高剂量化疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植后或与移植同时，受试者接受本发明的经扩增的表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)的输注。在另一方面，在手术之前或之后给予扩增的细胞。
有待向患者给予的以上治疗的剂量将随着所治疗病症的确切性质和该治疗的受者而变化。可以根据本领域接受的做法来调整人类给予剂量。例如，对于成年患者，CAMPATH的剂量通常在1至约100mg的范围内，通常每天给予持续1天和30天之间的时间。优选的日剂量为每天1至10mg，但在一些情况下，可以使用每天多达40mg的较大剂量(描述于美国专利号6,120,766中)。
在一个实施例中，例如使用体外转录将CAR引入免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)，并且受试者(例如人)接收表达CAR的细胞(例如本发明的CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)的初始给予以及本发明的表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)的一次或多次后续给予，其中将该一种或多种后续给予在先前的给予之后少于15天，例如在14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2天进行给予。在一个实施例中，将本发明的表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)的多于一次给予每周给予至受试者(例如人)，例如每周给予本发明的表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)的2、3、或4次给予。在一个实施例中，受试者(例如人受试者)每周接受多于一次表达CAR的细胞(例如CART细胞或表达CAR的NK细胞)的给予(例如每周2、3或4次给予)(在本文中也称为循环)，随后一周未给予表达CAR的细胞(例如CART细胞或表达CAR的NK细胞)，然后将表达CAR的细胞(例如CART细胞或表达CAR的NK细胞)的一次或多次另外的给予(例如，每周表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)的多于一次的给予)给予至受试者。在另一个实施例中，受试者(例如人受试者)接受表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)的多于一次的循环，并且每个循环之间的时间小于10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一个实施例中，每隔一天给予(每周3次给予)表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)。在一个实施例中，给予本发明的表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)持续至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
在一方面，使用慢病毒病毒载体(例如慢病毒)产生表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)(例如表达CD123 CAR的细胞)。以这种方式产生的表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)将具有稳定的CAR表达。
在一方面，使用病毒载体例如γ逆转录病毒载体(例如本文所述的γ逆转录病毒载体)产生表达CAR的细胞，例如CART或表达CAR的NK细胞。使用这些载体产生的表达CAR的细胞(例如CART或表达CAR的NK细胞)可以具有稳定的CAR表达。
在一方面，转导后，表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)瞬时表达CAR载体持续4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。CAR的瞬时表达可以通过RNA CAR载体递送来实现。在一方面，通过电穿孔将CAR RNA转导到细胞(例如T细胞或NK细胞)中。
在使用瞬时表达CAR细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)(特别是采用携带CAR的鼠scFv时)治疗的患者中可能出现的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。
不受该理论的束缚，认为这种过敏反应可能是由患者发展体液抗CAR应答，即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体引起的。认为，当在暴露于抗原方面中断十至十四天时，患者的抗体产生细胞经历从IgG同种型(不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。
如果患者在短暂CAR治疗过程中(例如由RNA转导产生的那些)处于产生抗CAR抗体应答的高风险，则表达CAR的细胞(例如CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)输注中断时间不应超过十至十四天。
实例
通过参考以下实验实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不应旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的传授而变得明显的任何和所有变化。
无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实例制备和利用本发明的化合物并实践所要求保护的方法。以下工作实例具体指出了本发明的不同方面，并且不应被解释为以任何方式限制本披露的其余部分。
实例1：使用嵌合抗原受体T细胞克服霍奇金淋巴瘤的免疫抑制性肿瘤微环境
尽管采用了现代治疗方案，患有霍奇金淋巴瘤(HL)的患者子集仍然受制于这种疾病。具体而言，10％-15％的初始患有局部疾病的患者以及20％-40％的初始患有晚期疾病的患者最终会复发。Josting A,Franklin J,May M,Koch P,Beykirch MK,Heinz J,等人New prognostic score based on treatment outcome of patients with relapsedHodgkin's lymphoma registered in the database of the German Hodgkin'slymphoma study group[基于在德国霍奇金淋巴瘤研究小组数据库中登记的复发霍奇金淋巴瘤患者的治疗结果的新预测得分].Am J Clin Oncol.[美国临床肿瘤学杂志]2002；20:221-30。此外，10％-15％的患者患有一线治疗难治的疾病。Santoro A,Bonadonna G,Valagussa P,Zucali R,Viviani S,Villani F,等人Long-term results of combinedchemotherapy-radiotherapy approach in Hodgkin's disease:superiority of ABVDplus radiotherapy versus MOPP plus radiotherapy[组合化疗-放疗途径在霍奇金病中的长期结果：ABVD加放疗相对于MOPP加放疗的优越性].J Clin Oncol.[临床肿瘤学杂志]1987；5:27-37。在一线治疗之后大约一半的复发患者或一线治疗难治的大约一半的患者(r/r HL)可以通过化疗然后进行自体干细胞移植(SCT)成功挽救。然而，在挽救化疗后未能实现PET阴性状态的患者预后特别差，并且可以预期患有原发性难治性疾病的患者的总体存活率低于50％。Josting A,Franklin J,May M,Koch P,Beykirch MK,Heinz J,等人Newprognostic score based on treatment outcome of patients with relapsedHodgkin's lymphoma registered in the database of the German Hodgkin'slymphoma study group[基于在德国霍奇金淋巴瘤研究小组数据库中登记的复发霍奇金淋巴瘤患者的治疗结果的新预测得分].J Clin Oncol.[临床肿瘤学杂志]2002；20:221-30；Josting A,Rueffer U,Franklin J,Sieber M,Diehl V,Engert A.Prognostic factorsand treatment outcome in primary progressive Hodgkin lymphoma:a report fromthe German Hodgkin Lymphoma Study Group[在原发性进展型霍奇金淋巴瘤中的预后因子和治疗结果：来自德国霍奇金淋巴瘤研究小组的报告].Blood[血液].2000；96:1280-6。r/r HL的生物疗法的最近发展包括抗CD30抗体-药物缀合物维汀-布仑妥昔单抗(brentuximab vedotin，BV)。尽管BV在75％的在自体SCT后的RR-HL患者中诱导了客观反应，但反应并不持久，且中位无进展生存期为5.6个月。Younes A,Gopal AK,Smith SE,Ansell SM,Rosenblatt JD,Savage KJ,等人Results of a pivotal phase II study ofbrentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin'slymphoma[维汀-布仑妥昔单抗针对复发性或难治性霍奇金淋巴瘤患者的关键II期研究结果].J Clin Oncol.[临床肿瘤学杂志]2012；30:2183-9。这些患者通常年轻并且急需替代的积极疗法。
正如HL患者子集中同种异体移植的活性所证明的，以及最近通过输注EBV特异性T细胞的有前景的临床结果所证明的，HL是免疫应答疾病。Bollard CM,Gottschalk S,Torrano V,Diouf O,Ku S,Hazrat Y,等人Sustained complete responses in patientswith lymphoma receiving autologous cytotoxic T lymphocytes targeting Epstein-Barr virus latent membrane proteins[在接受靶向Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白的自体细胞毒性T淋巴细胞的淋巴瘤患者中的持续完全反应].J Clin Oncol.[临床肿瘤学杂志]2014；32:798-808.然而，同种异体移植具有治疗相关的高死亡率并且仅约30％-40％的HL表达EBV抗原。Staal SP,Ambinder R,Beschorner WE,Hayward GS,Mann R.A survey ofEpstein-Barr virus DNA in lymphoid tissue.Frequent detection in Hodgkin'sdisease[在淋巴组织中Epstein-Barr病毒DNA的研究.在霍奇金病中频繁检测].Americanjournal of clinical pathology[美国临床病理学杂志].1989；91:1-5；Weiss LM,Movahed LA,Warnke RA,Sklar J.Detection of Epstein-Barr viral genomes in Reed-Sternberg cells of Hodgkin's disease[在霍奇金病的Reed-Sternberg细胞中检测Epstein-Barr病毒基因组].The New England journal of medicine[新英格兰医学杂志].1989；320:502-6。最近的临床试验指示，在r/HL中抑制PD1-PDL1轴时的反应率高，导致FDA批准纳武单抗用于此适应症。Ansell SM,Lesokhin AM,Borrello I,Halwani A,ScottEC,Gutierrez M,等人PD-1blockade with nivolumab in relapsed or refractoryHodgkin's lymphoma[在复发性或难治性霍奇金淋巴瘤中用纳武单抗阻断PD-1].The NewEngland journal of medicine[新英格兰医学杂志].2015；372:311-9；Moskowitz CH,Ribrag V,Michot J-M,Martinelli G,Zinzani PL,Gutierrez M,等人PD-1Blockade withthe Monoclonal Antibody Pembrolizumab(MK-3475)in Patients with ClassicalHodgkin Lymphoma after Brentuximab Vedotin Failure:Preliminary Results from aPhase 1b Study[在经典霍奇金淋巴瘤患者中在维汀-布仑妥昔单抗失败之后用单克隆抗体派姆单抗(MK-3475)阻断PD-1：来自1b期研究的初步结果](KEYNOTE-013).Blood[血液].2014；124:290。因此，基于T细胞的治疗剂在HL中具有重要且不断提高的作用。嵌合抗原受体T细胞(CART)代表了癌症免疫疗法中令人振奋的最新发展。Ruella M,Kalos M.Adoptiveimmunotherapy for cancer[癌症的过继性免疫疗法].Immunological reviews[免疫学综述].2014；257:14-38。我们小组和其他人已证明抗CD19嵌合抗原受体重定向T细胞(CART19，CTL019)对难治性B细胞恶性肿瘤的临床功效。Kalos M,Levine BL,Porter DL,Katz S,Grupp SA,Bagg A,等人T cells with chimeric antigen receptors havepotent antitumor effects and can establish memory in patients with advancedleukemia[具有嵌合抗原受体的T细胞在晚期白血病患者中具有有力的抗肿瘤作用并可建立记忆].Science translational medicine[科学转化医学].2011；3:95ra73；Maude SL,Frey N,Shaw PA,Aplenc R,Barrett DM,Bunin NJ,等人Chimeric antigen receptor Tcells for sustained remissions in leukemia[用于白血病持续缓解的嵌合抗原受体T细胞].The New England journal of medicine[新英格兰医学杂志].2014；371:1507-17；Davila ML,Riviere I,Wang X,Bartido S,Park J,Curran K,等人Efficacy andToxicity Management of 19-28z CAR T Cell Therapy in B Cell AcuteLymphoblastic Leukemia[在B细胞急性成淋巴细胞性白血病中的CAR T细胞疗法].Science translational medicine[科学转化医学].2014；6:224ra25；Turtle CJ,HanafiLA,Berger C,Gooley TA,Cherian S,Hudecek M,等人CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+composition in adult B cell ALL patients[在成年B细胞ALL患者中具有限定的CD4+:CD8+组成的CD19 CAR-T细胞].The Journal of clinical investigation[临床研究杂志].2016；Lee DW,Kochenderfer JN,Stetler-Stevenson M,Cui YK,Delbrook C,Feldman SA,等人T cells expressing CD19chimeric antigen receptors for acutelymphoblastic leukaemia in children and young adults:a phase 1 dose-escalation trial[表达CD19嵌合抗原受体的T细胞用于儿童和年轻成人的急性成淋巴细胞性白血病：1期剂量递增试验].Lancet[柳叶刀].2015；385:517-28。然而，不管Hodgkin(霍奇金)Reed-Sternberg(HRS)细胞的B细胞起源如何，包括CD19的B细胞抗原很少在HL中表达。Herbst H,Tippelmann G,Anagnostopoulos I,Gerdes J,Schwarting R,Boehm T,等人Immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements in Hodgkin's diseaseand Ki-1-positive anaplastic large cell lymphoma:dissociation betweenphenotype and genotype[在霍奇金病和Ki-1阳性间变性大细胞淋巴瘤中的免疫球蛋白和T细胞受体基因重排：在表型与基因型之间的离解].Leukemia research[白血病研究].1989；13:103-16。虽然已知CD30抗原通常在HRS细胞上表达，但用抗CD30CART治疗的患者的结果令人失望，其中在r/r HL患者中有1/8完全反应(CR)和4/8稳定疾病(SD)和3/8进展性疾病(PD)。Savoldo B,Rooney CM,Di Stasi A,Abken H,Hombach A,Foster AE,等人Epstein Barr virus specific cytotoxic T lymphocytes expressing the anti-CD30zeta artificial chimeric T-cell receptor for immunotherapy of Hodgkindisease[表达抗CD30ζ人工嵌合T细胞受体的Epstein Barr病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞用于霍奇金病的免疫疗法].Blood[血液].2007；110:2620-30；Di Stasi A,De Angelis B,Rooney CM,Zhang L,Mahendravada A,Foster AE,等人T lymphocytes coexpressingCCR4and a chimeric antigen receptor targeting CD30have improved homing andantitumor activity in a Hodgkin tumor model[共表达CCR4和靶向CD30的嵌合抗原受体的T淋巴细胞具有在霍奇金肿瘤模型中改善的归巢和抗肿瘤活性].Blood[血液].2009；113:6392-402；Ramos CA,Ballard B,Liu E,Dakhova O,Mei Z,Liu H,等人Chimeric TCells for Therapy of CD30+Hodgkin and Non-Hodgkin Lymphomas[嵌合T细胞用于CD30+霍奇金和非霍奇金淋巴瘤的疗法].Blood[血液].2015；126:185-。在HL中，恶性细胞仅占细胞的约1％-2％，其中大部分由浸润性免疫细胞(巨噬细胞和髓源性抑制细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、B和T淋巴细胞、基质细胞和成纤维细胞)构成。TME以及特别是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和/或髓源性抑制细胞(MDSC)在促进肿瘤生长同时还抑制抗肿瘤免疫应答中具有关键作用。Steidl C,Connors JM,Gascoyne RD.Molecularpathogenesis of Hodgkin's lymphoma:increasing evidence of the importance ofthe microenvironment[霍奇金淋巴瘤的分子发病机理：渐增的关于微环境重要性的证据].J Clin Oncol.[临床肿瘤学杂志]2011；29:1812-26；Steidl C,Lee T,Shah SP,Farinha P,Han G,Nayar T,等人Tumor-associated macrophages and survival inclassic Hodgkin's lymphoma[在经典霍奇金淋巴瘤中的肿瘤相关巨噬细胞和存活].TheNew England journal of medicine[新英格兰医学杂志].2010；362:875-85；Sanchez-Aguilera A,Montalban C,de la Cueva P,Sanchez-Verde L,Morente MM,Garcia-CosioM,等人Tumor microenvironment and mitotic checkpoint are key factors in theoutcome of classic Hodgkin lymphoma[肿瘤微环境和有丝分裂检查点是经典霍奇金淋巴瘤的结果中的关键因子].Blood[血液].2006；108:662-8；Devilard E,Bertucci F,Trempat P,Bouabdallah R,Loriod B,Giaconia A,等人Gene expression profilingdefines molecular subtypes of classical Hodgkin's disease[基因表达谱定义了经典霍奇金病的分子亚型].Oncogene[致癌基因].2002；21:3095-102；Mizuno H,NakayamaT,Miyata Y,Saito S,Nishiwaki S,Nakao N,等人Mast cells promote the growth ofHodgkin's lymphoma cell tumor by modifying the tumor microenvironment thatcan be perturbed by bortezomib[肥大细胞通过改变可被硼替佐米扰动的肿瘤微环境促进霍奇金淋巴瘤细胞肿瘤的生长].Leukemia[白血病].2012；26:2269-76；Huber S,Hoffmann R,Muskens F,Voehringer D.Alternatively activated macrophages inhibitT-cell proliferation by Stat6-dependent expression of PD-L2[可选激活的巨噬细胞通过Stat6依赖性表达PD-L2来抑制T细胞增殖].Blood[血液].2010；116:3311-20。因此，HL代表了研究TME对免疫疗法影响的独特机会。通过提供对CAR T细胞的稳固刺激同时避免T细胞抑制，开发可以靶向恶性细胞以及支持性TME的途径可能代表CART免疫疗法领域的重要进展。在这种背景下，我们研究了CD123，即白细胞介素-3(IL-3)受体的α链，其表达先前已在Hodgkin(霍奇金)Reed 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因此，此实例的目的是开发抗HL CAR T细胞免疫疗法，其也能够克服HL微环境的免疫抑制。我们证实了CD123在HRS细胞上的存在，并发现HL TME(具体而言免疫抑制性M2型肿瘤相关巨噬细胞)中的许多免疫细胞表达CD123。我们先前开发了用于治疗AML的抗CD123CAR T细胞(Gill S,Tasian SK,Ruella M,Shestova O,Li Y,Porter DL,等人Preclinical targeting of human acute myeloid leukemia and myeloablation usingchimeric antigen receptor-modified T cells[人急性髓性白血病的初步靶向和使用嵌合抗原受体修饰的T细胞进行的骨髓肃清].Blood[血液].2014；123:2343-54)，并且我们现在发现CART123细胞可以消除播散性HL肿瘤异种移植物，导致持久的缓解和免疫记忆的形成。此外，通过共靶向表达免疫抑制性CD123的肿瘤相关巨噬细胞，CART123(不同于CART19)对微环境免疫抑制具有抗性。
材料与方法
细胞系和原代样品。细胞系最初从ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚州)(K-562)或DSMZ(布伦瑞克，德国)(MOLM-14和NALM-6)获得。测试所有细胞系中支原体污染的存在(MycoAlertTM支原体检测试剂盒，LT07-318，瑞士龙沙集团(Lonza)，巴塞尔，瑞士)。对于一些实验，用荧光素酶(叩头虫绿)或eGFP转导细胞系，然后分选以获得>99％阳性群体。如相关图中所指示，使用MOLM-14和K562作为对照。将细胞系保持在培养物中，采用补充有10％胎牛血清(FBS，Gemini公司，100-106，西萨克拉门托，加利福尼亚州)和50UI/ml青霉素/链霉素(Gibco公司，生命技术公司(LifeTechnologies)，15070-063)的RPMI培养基1640(Gibco公司，11875-085，生命技术公司(LifeTechnologies)，格兰德岛(Grand Island)，纽约州(NY))。对于所有功能研究，在实验前至少12小时解冻原代细胞并在37℃下静置。根据机构审查委员会(IRB)协议，从宾夕法尼亚大学/费城儿童医院的临床实践中获得去标识的经福尔马林固定的原代人HL样本。
免疫组织化学和免疫荧光。对于福尔马林固定的经石蜡包埋的组织，使用BondPolymer Refine检测系统在Leica Bond-III仪器(Leica Biosystems，布法罗格罗夫，伊利诺伊州，美国)上进行免疫组织化学(IHC)染色。将针对CD30、CD123的抗体未经稀释使用。用ER2溶液(Leica Microsystems，AR9640)进行热诱导的表位修复持续20分钟。使用AperioScanScopeTM(Leica Biosystems)数字化地采集图像。
RT-PCR。通过RT-PCR分析针对CD123(AB，Hs0060814)mRNA表达来筛选HL和对照细胞系。用RNAqueos-4PCR试剂盒(Ambion，生命技术公司(LifeTechnologies)，AM-1914)提取RNA，并用用于RT-qPCR的iScript Reverse Transcription Supermix(伯乐公司(BioRad)，170-8841)合成cDNA。通过相对qPCR(qPCR)用ABI TaqMan特异性引物和探针组定量相对靶cDNA拷贝；使用TaqMan GUSB引物(AB，Hs00939627)和探针组以便归一化。
多参数流式细胞术。如前所述进行流式细胞术。Kenderian SS,Ruella M,Shestova O,Klichinsky M,Aikawa V,Morrissette JJ,等人CD33Specific ChimericAntigen Receptor T Cells Exhibit Potent Preclinical Activity against HumanAcute Myeloid Leukemia[CD33特异性嵌合抗原受体T细胞展现出针对人急性髓性白血病有力的临床前活性].Leukemia[白血病].2015。抗人抗体购买自Biolegend公司、eBioscience公司或Becton Dickinson公司。对于细胞数量定量，根据制造商的说明使用Countbright(英杰公司(Invitrogen))珠粒。在所有分析中，基于前向与侧向散射特征对感兴趣的群体进行门控，然后是单峰门控，并且使用Live Dead Fixable Aqua(英杰公司)对活细胞进行门控。包括时间门控以便质量控制。使用山羊抗小鼠抗体(杰克逊实验室(Jackson Laboratories))或CD123-Fc/His(Sino Biologicals公司)和抗His-APC(R&D公司)或PE(AbCam公司)或直接PE缀合的CD123蛋白进行CAR123的检测。在四激光Fortessa-LSR II细胞计数器(Becton-Dickinson)上进行流式细胞术，并用FlowJo X 10.0.7r2(TreeStar)分析。
人类巨噬细胞分化。通过在补充有5％GemCell人血清AB(Gemini BioProducts)、1x Glutamax(Gibco公司)和青霉素/链霉素(瑞士龙沙集团(Lonza))的X-VIVO 10(瑞士龙沙集团(Lonza))中使阳性选择的CD14+正常供体单核细胞(人CD14MicroBeads，MiltenyiBiotec)分化7天来产生人巨噬细胞(M0)。通过向分化培养基中添加20ng/mL人IFNγ(Peprotech)和100ng/mL LPS(LPS-EK，InvivoGen)持续另外24小时，将巨噬细胞极化为M1。通过向分化培养基中添加20ng/mL人IL-4、IL-10或IL-13(Peprotech)持续另外24小时，将巨噬细胞极化为M2。霍奇金淋巴瘤细胞对巨噬细胞表型的影响是通过在补充有10％胎牛血清(FBS，Gemini公司，100-106，西萨克拉门托，加利福尼亚州)和50Ui/ml青霉素/链霉素(Gibco公司，生命技术公司(LifeTechnologies)，15070-063)的RPMI培养基1640(Gibco公司，11875-085，生命技术公司(LifeTechnologies)，格兰德岛，纽约州)中以1:1效应子与靶标比率共培养M0人巨噬细胞和HDLM-2细胞持续5天来评估。
CAR构建体和CAR T细胞的产生。第二代抗CD123嵌合抗原受体(CAR123)的特征在于抗CD123 scFv(克隆32716)、CD8铰链、4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ信号传导结构域。GillS,Tasian SK,Ruella M,Shestova O,Li Y,Porter DL,等人Preclinical targeting ofhuman acute myeloid leukemia and myeloablation using chimeric antigenreceptor-modified T cells[使用嵌合抗原受体修饰的T细胞进行临床前靶向人急性髓性白血病和骨髓肃清].Blood[血液].2014；123:2343-54。此构建体目前在宾夕法尼亚大学(NCT02623582)用于急性髓性白血病的临床试验中。如前所述产生鼠抗CD19嵌合抗原受体(CD8铰链、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域)。Milone MC,Fish JD,CarpenitoC,Carroll RG,Binder GK,Teachey D,等人Chimeric receptors containingCD137signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells andincreased antileukemic efficacy in vivo[含有CD137信号转导结构域的嵌合受体介导增强的T细胞存活和增加的体内抗白血病功效].Molecular therapy:the journal of theAmerican Society of Gene Therapy[分子疗法：美国基因疗法学会杂志].2009；17:1453-64；Imai C,Mihara K,Andreansky M,Nicholson IC,Pui CH,Geiger TL,等人Chimericreceptors with 4-1BB signaling capacity provoke potent cytotoxicity againstacute lymphoblastic leukemia[具有4-1BB信号传导能力的嵌合受体引起有力的针对急性成淋巴细胞性白血病的细胞毒性].Leukemia[白血病].2004；18:676-84。这与目前宾夕法尼亚大学CTL019临床试验中使用的构建体相同。如前所述产生表达CAR的T细胞。Gill S,Tasian SK,Ruella M,Shestova O,Li Y,Porter DL,等人Preclinical targeting ofhuman acute myeloid leukemia and myeloablation using chimeric antigenreceptor-modified T cells[使用嵌合抗原受体修饰的T细胞进行临床前靶向人急性髓性白血病和骨髓肃清].Blood[血液].2014；123:2343-54。正常的供体CD4和CD8T细胞或PB单核细胞(PBMC)获得自宾夕法尼亚大学的人类免疫学核心。在所有实验之前，将T细胞解冻并在37℃下静置过夜。
体外T细胞效应子功能测定。如前所述进行脱粒、CFSE增殖、细胞毒性测定和细胞因子测量。Kalos M,Levine BL,Porter DL,Katz S,Grupp SA,Bagg A,等人T cells withchimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establishmemory in patients with advanced leukemia[在晚期白血病患者中具有嵌合抗原受体的T细胞具有有力的抗肿瘤作用并可建立记忆].Science translational medicine[科学转化医学].2011；3:95ra73；Gill S,Tasian SK,Ruella M,Shestova O,Li Y,Porter DL,等人Preclinical targeting of human acute myeloid leukemia and myeloablationusing chimeric antigen receptor-modified T cells[使用嵌合抗原受体修饰的T细胞进行临床前靶向人急性髓性白血病和骨髓肃清].Blood[血液].2014；123:2343-54；RuellaM,Kenderian SS,Shestova O,Fraietta JA,Qayyum S,Zhang Q,等人The Addition ofthe BTK inhibitor Ibrutinib to Anti-CD19Chimeric Antigen Receptor T Cells(CART19)Improves Responses against Mantle Cell Lymphoma[将BTK抑制剂依鲁替尼添加至抗CD19嵌合抗原受体T细胞(CART19)改进针对套细胞淋巴瘤的反应].Clinicalcancer research:an official journal of the American Association for CancerResearch[临床癌症研究：美国癌症研究协会官方杂志].2016。在Nikon Eclipse Ti-S显微镜(尼康仪器公司(Nikon Instruments,Inc.))上使用20x透镜产生人巨噬细胞和T细胞共培养物(24小时)的相差图像。
动物实验。如前所述进行体内实验。Kenderian SS,Ruella M,Shestova O,Klichinsky M,Aikawa V,Morrissette JJ,等人CD33Specific Chimeric AntigenReceptor T Cells Exhibit Potent Preclinical Activity against Human AcuteMyeloid Leukemia[CD33特异性嵌合抗原受体T细胞展现出针对人急性髓性白血病有力的临床前活性].Leukemia[白血病].2015.在相关图中详细讨论了所用异种移植模型的模式。最初从杰克逊实验室(Jackson Laboratories)获得的NOD-SCIDγ链缺陷型(NSG)小鼠购自宾夕法尼亚大学的干细胞和异种移植核心。将细胞(HL细胞系或T细胞)在100-200ul的PBS中以指定浓度注射到小鼠的尾静脉中。使用Xenogen IVIS-200Spectrum相机进行生物发光成像，并用LivingImage软件v.4.3.1(Caliper LifeSciencies)分析。在实验结束时或当动物根据IACUC方案满足预先指定的终点时对动物实施安乐死。研究批准。根据由机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准的方案(#803230)进行动物实验，该方案遵守NIH实验动物护理和使用指南。
统计学分析。如使用用于Windows的GraphPad Prism 6版本6.05(拉荷亚(LaJolla)，加利福尼亚州)所示进行所有统计。学生t检验用于比较两个组；在比较多组的分析中，进行单因素方差分析(ANOVA)，其中用Holm-Sidak校正以便多重比较。当比较在多个时间点/比率下的多个组时，针对每个时间点/比率使用学生t检验或ANOVA。使用对数秩检验比较存活曲线。在图中，星号用于表示p值(*＝<0.05，**＝<0.01，***＝<0.001，****＝<0.0001)，并且“ns”表示“不显著”(p>0.05)。
结果
IL-3受体α(CD123)在霍奇金淋巴瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞中表达
我们试图定义在HRS中但也在微环境上表达的肿瘤相关抗原。为此目的，我们评价了来自HL患者的组织学样本上的CD123(IL-3受体α)的表达。正如预期的那样，在10/10患者中，HRS细胞是针对HL的标志(即CD30)呈阳性的；在5/10名患者中，我们还在HRS细胞上发现了CD123。尽管CD30稀疏地分布在浸润性免疫细胞上，但CD123在TME上高度表达，具体而言我们发现TAM表达CD123，如双色免疫荧光所示(图1A)。为了限定适当的人类肿瘤模型以便进一步研究，我们评估了四种HL细胞系(HDLM-2、KM-H2、SUP-HD1和L-428)，并发现mRNA和蛋白水平的高水平表达(图1B和图1C)。
HL细胞将正常巨噬细胞极化为M2样表型并通过IL-13起作用
由于TAM在HL发病机理和预后中具有相关作用(Steidl C,Lee T,Shah SP,Farinha P,Han G,Nayar T,等人Tumor-associated macrophages and survival inclassic Hodgkin's lymphoma[在经典霍奇金淋巴瘤中的肿瘤相关巨噬细胞和存活].TheNew England journal of medicine[新英格兰医学杂志].2010；362:875-85)，我们试图寻求HL细胞是否可以直接介导单核细胞向免疫抑制表型的转化。将由外周血单核细胞分化的人正常供体巨噬细胞与HDLM-2细胞或IL-4(M2阳性对照)或对照急性成淋巴细胞性白血病细胞系(NALM-6)共培养。共培养24小时后，通过流式细胞术分析巨噬细胞表型。如图2A所示，HDLM-2引发的巨噬细胞示出M2样表型，其中CD206和CD163的表达类似于IL4引发的巨噬细胞的这些表达。Gordon S.Alternative activation of macrophages[巨噬细胞的可选激活].Nat Rev Immunol.[自然免疫学综述]2003；3:23-35；Murray PJ,Allen JE,BiswasSK,Fisher EA,Gilroy DW,Goerdt S,等人Macrophage activation and polarization:nomenclature and experimental guidelines[巨噬细胞激活和极化：术语和实验指南].Immunity[免疫力].2014；41:14-20；Qian BZ,Pollard JW.Macrophage diversityenhances tumor progression and metastasis[巨噬细胞多样性增强肿瘤进展和转移].Cell[细胞].2010；141:39-51；Roszer T.Understanding the Mysterious M2Macrophagethrough Activation Markers and Effector Mechanisms[通过激活标记物和效应子机制理解神秘的M2巨噬细胞].Mediators of inflammation[炎症介导物].2015；2015:816460；Georgoudaki AM,Prokopec KE,Boura VF,Hellqvist E,Sohn S,Ostling J,等人Reprogramming Tumor-Associated Macrophages by Antibody Targeting InhibitsCancer Progression and Metastasis[通过抗体靶向重编程肿瘤相关巨噬细胞抑制癌症进展和转移].Cell reports[细胞报告].2016；15:2000-11。作为对照，与非HL细胞系NALM-6共培养的巨噬细胞显示出非M2样表型。重要的是，在M2和HL极化的两种巨噬细胞中CD123表达均较高(图2B)。
为了测试表型定义的免疫抑制性巨噬细胞的功能，我们使用了一种模型，其中将人CAR T细胞在M0(人血清，GM-或M-CSF)、M1(IFNγ/LPS)或M2(IL-4)极化条件下或与HL极化的巨噬细胞(作为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的模型)共培养。在此实验中，我们使用金标准抗CD19CAR T细胞作为“应答器”细胞，并且使用CD19+B白血病细胞系NALM-6作为“刺激器”细胞。Milone MC,Fish JD,Carpenito C,Carroll RG,Binder GK,Teachey D,等人Chimeric receptors containing CD137signal transduction domains mediateenhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo[含有CD137信号转导结构域的嵌合受体介导增强的T细胞存活和增加的体内抗白血病功效].Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy[分子疗法：美国基因疗法学会杂志].2009；17:1453-64。如所预期的，CART19在靶细胞系的存在下强烈地增殖，但是在M2巨噬细胞或HL-极化巨噬细胞的存在下这种增殖受到抑制(图2C-图2E)。为了探索HL细胞极化巨噬细胞的机制，我们收集了HDLM-2(或对照非HL细胞系，K562)的上清液，与人巨噬细胞共培养，并通过Luminex测定分析了30种不同细胞因子的存在。IL-13是过表达最多的细胞因子(图2F)。通过使用特异性抗体阻断IL-13信号传导，我们发现HL-引发的巨噬细胞的免疫抑制功能的部分逆转(图2G)和抑制性受体配体PDL-1的表达的降低。(图2H)。
抗CD123嵌合抗原受体T细胞在体外和体内杀灭HL细胞
已证实在HRS细胞中存在CD123，我们试图证明抗CD123 CAR T细胞(CART123)可识别HL细胞的程度，如通过抗原依赖性CART增殖、细胞因子产生和特异性肿瘤溶解所测量的。在不可能在培养物中繁殖原代HL的情况下并且由于缺乏可靠的原代HL异种移植模型，我们使用HDLM2细胞系作为模型。在这些实验中使用表达CD123的AML作为阳性对照，因为我们之前已经证明其对CART123的敏感性。在体外，CART123当与HL细胞共培养4-6小时时，表现出特异性CD107a脱粒和细胞内细胞因子(IFNγ、IL-2、TNFα)的产生(图3A)。在24小时时，CART123对HL细胞产生有力的细胞毒性，但未转导的T细胞(UTD)对照未产生有力的细胞毒性(图3B)，并且在第4天完全根除HL细胞与大量T细胞增殖(第20天)相关(图3C)。CART123当与HL细胞(HDLM-2或KM-H2)共培养时增殖，如5天后的绝对T细胞数(图3D)和CFSE稀释(图3E)所证明。重要的是，CART123细胞在HL细胞的存在下分泌效应细胞因子如GM-CSF、IFNg、MIP1b和TNFα(图3F)。总之，尽管存在HRS和TAM二者均表达PDL1并通过HRS产生免疫抑制细胞因子的事实，但CART123细胞在体外对恶性HRS细胞具有极好的响应性。
然后，我们通过在第0天在NSG小鼠中静脉注射1x 106个荧光素酶+HDLM-2细胞，开发出系统上先进的HL模型的新型严格异种移植模型(图4A)。连续生物发光成像(BLI)在第7天显示肿瘤移植，随后经约6周逐渐增加肿瘤负荷，再现人类疾病的缓慢进展性质。在第42天，当肿瘤负荷比基线高20倍时，用1.5x 106个CART123细胞或对照T细胞处理小鼠。CART123在14天内诱导完全和持久地根除播散性肿瘤，导致在6个月时100％无复发和100％总体存活率(图4B和图4C)。对小鼠进行随访近1年，并且在CART123处理的小鼠中未观察到复发，而用对照T细胞处理的小鼠的中位存活期为128天(p＝0.009)。如在抗CD19CAR T细胞的临床研究中所见，肿瘤消除与外周血中广泛的CAR T细胞扩增相关，包括通过流式细胞术在连续外周血分析中检测到的CD8+和CD4+细胞二者(图4D)。
CART123在HL小鼠中建立长期免疫记忆
长期持续存在和T细胞记忆在免疫监视和预防复发中发挥重要作用。为了证明免疫记忆的形成，在长的随访时间处(第250天)，用HDLM-2HL细胞再次激发经CART123治疗的小鼠(参见实验方案图5A)。有趣的是，在先前经CART123治疗的小鼠中，肿瘤被排斥(图5B)，与外周血中先前不可检测的CART123细胞的再扩增相关(T细胞注射后约10个月)(图5C)。相反，在对照小鼠中，移植HL细胞并导致这些小鼠死亡(图5D)。
CART123对M2-巨噬细胞的抑制具有抗性
最后，当我们证明CAR T细胞可以被M2和HL极化巨噬细胞抑制并且这些巨噬细胞呈CD123阳性时，我们试图了解CART123是否也对巨噬细胞抑制敏感，或者相反，由于CD123在HL-巨噬细胞中的表达，它们会受到另外的刺激。
我们使用IL-4或暴露于HDLM-2细胞产生免疫抑制性M2巨噬细胞。在B-急性成淋巴细胞性白血病中使用CART19模型的预先建立的模型，我们表明M2TAM在第5天CAR刺激后可有力地抑制CART19增殖，但与之形成鲜明对比的是，CART123未受影响(图6A)。重要的是，CART123在早期时间点(24小时)主动识别M2巨噬细胞并在它们周围形成聚集体，并在第5天对TAM发挥显著的细胞毒性，从而克服TAM介导的抑制(图6B)。HL-巨噬细胞能够通过CART19而不是通过CART123抑制细胞因子产生(图6C)。
讨论
我们先前已经描述了CART123在人急性髓性白血病中的活性。Gill S,Tasian SK,Ruella M,Shestova O,Li Y,Porter DL,等人Preclinical targeting of human acutemyeloid leukemia and myeloablation using chimeric antigen receptor-modified Tcells[使用嵌合抗原受体修饰的T细胞进行临床前靶向人急性髓性白血病和骨髓肃清].Blood[血液].2014；123:2343-54。在这里，我们证实以前的发现-HRS细胞和HL细胞系表达CD123(Fromm JR.Flow cytometric analysis of CD123is useful forimmunophenotyping classical Hodgkin lymphoma[CD123的流式细胞术分析可用于对经典霍奇金淋巴瘤进行免疫表型分型].Cytometry B Clin Cytom.[细胞计数B部分-临床细胞计数]2011；80:91-9；Aldinucci D,Poletto D,Gloghini A,Nanni P,Degan M,Perin T,等人Expression of functional interleukin-3receptors on Hodgkin and Reed-Sternberg cells[功能性白细胞介素-3受体在霍奇金和Reed-Sternberg细胞上的表达].The American journal of pathology[美国病理学杂志].2002；160:585-96)并且示出CART123在体外特异性地脱粒、增殖、产生细胞因子并杀灭HL细胞在体内，我们表明人CD123重定向的T细胞显示出针对播散性HL的有力的治疗活性，在根除疾病后长期存在并且能够对肿瘤激发产生稳固的回忆应答。据我们所知，这是播散性霍奇金淋巴瘤的第一个异种移植模型，以及临床疾病的一些方面的节点定位和缓慢进展重演。然而，异种移植系统不允许评价肿瘤微环境(TME)的作用，因为鼠NSG受体缺乏淋巴细胞并且没有人免疫细胞与HL细胞系一起被转移。因此，为了研究TME在针对CAR T细胞的抗性中的作用，我们转向体外系统。
我们表明HL细胞系产生了几种免疫抑制细胞因子，其中白细胞介素-13增加最高。先前已报道IL-13在HRS细胞的自分泌生长刺激中起作用(Trieu Y,Wen XY,Skinnider BF,Bray MR,Li Z,Claudio JO,等人Soluble interleukin-13Ralpha2decoy receptorinhibits Hodgkin's lymphoma growth in vitro and in vivo[可溶性白细胞介素-13Rα2诱饵受体在体外和体内抑制霍奇金淋巴瘤生长].Cancer research[癌症研究].2004；64:3271-5；Skinnider BF,Kapp U,Mak TW.The role of interleukin 13 in classicalHodgkin lymphoma[白细胞介素13在经典霍奇金淋巴瘤中的作用].Leukemia&lymphoma[白血病与淋巴瘤].2002；43:1203-10)，并且预想可介导免疫细胞到HL TME的募集。我们表明暴露于HL使巨噬细胞朝向可选激活的“M2”表型极化，其中PD-L1上调并因此对T细胞(特别是CAR T细胞)具有免疫抑制作用。这种作用表现为T细胞增殖和细胞因子产生的减少。我们使用由ALL细胞系NALM-6刺激的抗CD19CAR T细胞(CART19)作为“金标准”。Milone MC,FishJD,Carpenito C,Carroll RG,Binder GK,Teachey D,等人Chimeric receptorscontaining CD137signal transduction domains mediate enhanced survival of Tcells and increased antileukemic efficacy in vivo[含有CD137信号转导结构域的嵌合受体介导增强的T细胞存活和增加的体内抗白血病功效].Molecular therapy:thejournal of the American Society of Gene Therapy[分子疗法：美国基因疗法学会杂志].2009；17:1453-64；Brentjens RJ,Latouche JB,Santos E,Marti F,Gong MC,LyddaneC,等人Eradication of systemic B-cell tumors by genetically targeted human Tlymphocytes co-stimulated by CD80and interleukin-15[通过由CD80和白细胞介素-15共刺激的基因靶向的人T淋巴细胞根除全身B细胞肿瘤].Nature medicine[自然医学].2003；9:279-86。我们发现暴露于HL的巨噬细胞(作为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的模型)能够抑制CART19。虽然CD19不在HL上表达，并且未预期CART19疗法在HL中具有活性，有关于HL中克隆型CD19+B细胞的文献，并且一些小组(包括我们在内)已经尝试用B细胞定向的药剂作为用于HL的疗法(Younes A,Oki Y,McLaughlin P,Copeland AR,Goy A,Pro B,等人Phase 2study of rituximab plus ABVD in patients with newly diagnosedclassical Hodgkin lymphoma[利妥昔单抗加ABVD在新诊断为经典霍奇金淋巴瘤的患者中的2期研究].Blood[血液].2012；119:4123-8；Kasamon YL,Jacene HA,Gocke CD,SwinnenLJ,Gladstone DE,Perkins B,等人Phase 2study of rituximab-ABVD in classicalHodgkin lymphoma[利妥昔单抗在经典霍奇金淋巴瘤中的2期研究].Blood[血液].2012；119:4129-32)，并且在我们的机构运行的试验评估了用于HL的针对CD19的CAR T细胞(NCT02277522)。更重要的是，如果我们的发现可推广到其他恶性肿瘤中的TAM，那么TAM可能对真实的表达骨髓CD19的B细胞恶性肿瘤中的CART19具有相似的作用。
在这种背景下，我们寻求为HL开发相关的CART细胞模式。最广泛表达的HL抗原CD30不在TME中的大多数其他细胞上表达，并且特别是在TAM上不表达。在报道CD123在HRS细胞上表达后，我们分析了来自宾夕法尼亚大学病理学系的一系列临床样本，并观察到大约50％的患者中的HRS细胞上存在CD123。同样重要的是，我们注意到存在于TAM上的CD123。由于HL患者的诊断样本中CD68+巨噬细胞数量的增加给出了不利的预后，我们假设能够消融TAM和HRS两种细胞的模式将代表在渐增的针对HL的医疗设备中的显著进步。Steidl C,Lee T,Shah SP,Farinha P,Han G,Nayar T,等人Tumor-associated macrophages andsurvival in classic Hodgkin's lymphoma[经典霍奇金淋巴瘤中的肿瘤相关巨噬细胞和存活].The New England journal of medicine[新英格兰医学杂志].2010；362:875-85。值得注意的是，HL治疗的最新进展包括PD1拮抗剂纳武单抗，并且尽管推测的作用机制是从HRS细胞上表达的PD-L1逆转抑制性信号传导，但是响应于纳武单抗在TAM上表达PD-L1的重要性尚未根据我们的知识进行研究。TAM表达CD123并且可被CART123靶向的发现加到了渐增的关于使用针对CSF1R的单克隆抗体耗减TAM的文献主体中。Pyonteck SM,Akkari L,Schuhmacher AJ,Bowman RL,Sevenich L,Quail DF,等人CSF-1R inhibition altersmacrophage polarization and blocks glioma progression[CSF-1R抑制改变巨噬细胞极化并阻断神经胶质瘤进展].Nature medicine[自然医学].2013；19:1264-72。
因此，在这项工作中，我们强调淋巴瘤-巨噬细胞-T细胞轴可能特别容易受到抗CD123 CAR T细胞的影响。我们之前关于抗CD123 CAR T细胞(CART123)的抗白血病功效的出版物也强调了由于靶向正常造血前体上的CD123导致的骨髓肃清的可能性。因此，我们目前的临床试验使用短效mRNA电穿孔的CAR T细胞而不是永久性修饰的慢病毒转导的CAR T细胞。(NCT02623582)。值得注意的是，目前有13项试验使用CAR T细胞、双特异性抗体、单克隆抗体或抗体-药物缀合物研究CD123作为血液癌的靶标。例如，Liu K,Zhu M,Huang Y,WeiS,Xie J,Xiao Y.CD123and its potential clinical application in leukemias[CD123及其在白血病中的潜在临床应用].Life sciences[生命科学].2015；122:59-64；Gill S,Tasian SK,Ruella M,Shestova O,Li Y,Porter DL,等人Preclinical targeting ofhuman acute myeloid leukemia and myeloablation using chimeric antigenreceptor-modified T cells[使用嵌合抗原受体修饰的T细胞进行临床前靶向人急性髓性白血病和骨髓肃清].Blood[血液].2014；123:2343-54；Angelot-Delettre F,Roggy A,Frankel AE,Lamarthee B,Seilles E,Biichle S,等人In vivo and in vitrosensitivity of blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm to SL-401,aninterleukin-3receptor targeted biologic agent[母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤对白细胞介素-3受体SL-401靶向的生物剂的体内和体外敏感性].Haematologica[血液病学].2015；100:223-30；Cohen KA,Liu TF,Cline JM,Wagner JD,Hall PD,FrankelAE.Safety evaluation of DT388IL3,a diphtheria toxin/interleukin 3fusionprotein,in the cynomolgus monkey[在食蟹猴中白喉毒素/白细胞介素3融合蛋白DT388IL3的安全性评价].Cancer immunology,immunotherapy:CII.[癌症免疫学、免疫疗法：CII.]2005；54:799-806；He SZ,Busfield S,Ritchie DS,Hertzberg MS,Durrant S,Lewis ID,等人A Phase 1study of the safety,pharmacokinetics and anti-leukemicactivity of the anti-CD123monoclonal antibody CSL360in relapsed,refractory orhigh-risk acute myeloid leukemia[抗CD123单克隆抗体CSL360在复发性、难治性或高风险急性髓性白血病中的安全性、药代动力学和抗白血病活性的1期研究].Leukemia&lymphoma[白血病与淋巴瘤].2014:1-10；Zereshkian A,Leyton JV,Cai Z,Bergstrom D,Weinfeld M,Reilly RM.The human polynucleotide kinase/phosphatase (hPNKP)inhibitor A12B4C3radiosensitizes human myeloid leukemia cells to Augerelectron-emitting anti-CD123(1)(1)(1)In-NLS-7G3 radioimmunoconjugates[人类多核苷酸激酶/磷酸酶(hPNKP)抑制剂A12B4C3使人类髓性白血病细胞针对俄歇电子发射性抗CD123(1)(1)(1)In-NLS-7G3放射免疫缀合物放射致敏].Nuclear medicine and biology[核医学和生物学].2014；41:377-83；Kuo SR,Wong L,Liu JS.Engineering aCD123xCD3bispecific scFv immunofusion for the treatment of leukemia andelimination of leukemia stem cells[工程化CD123xCD3双特异性scFv免疫融合以治疗白血病和消除白血病干细胞].Protein engineering,design&selection:PEDS[蛋白质工程化、设计和选择：PEDS].2012；25:561-9；Chichili GR,Huang L,Li H,Burke S,He L,Tang Q,等人A CD3xCD123bispecific DART for redirecting host T cells tomyelogenous leukemia:Preclinical activity and safety in nonhuman primates[用于将宿主T细胞重定向至骨髓性白血病的CD3xCD123双特异性DART：非人灵长类动物中的临床前活性和安全性].Science translational medicine[科学转化医学].2015；7:289ra82；Fan D,Li Z,Zhang X,Yang Y,Yuan X,Zhang X,等人AntiCD3Fv fused to humaninterleukin-3deletion variant redirected T cells against human acute myeloidleukemic stem cells[与人白细胞介素-3缺失变体融合的抗CD3Fv将T细胞针对人急性髓性白血病干细胞重定向].Journal of hematology&oncology[血液学与肿瘤学杂志].2015；8:18；Mardiros A,Dos Santos C,McDonald T,Brown CE,Wang X,Budde LE,等人Tcells expressing CD123-specific chimeric antigen receptors exhibit specificcytolytic effector functions and antitumor effects against human acutemyeloid leukemia[表达CD123特异性嵌合抗原受体的T细胞展现出特异性细胞溶解效应子功能和针对人急性髓性白血病的抗肿瘤作用].Blood[血液].2013；122:3138-48；Tettamanti S,Magnani CF,Biondi A,Biagi E.Acute myeloid leukemia and novelbiological treatments:monoclonal antibodies and cell-based gene-modifiedimmune effectors[急性髓性白血病和新型生物治疗：单克隆抗体和基于细胞的基因修饰的免疫效应子].Immunology letters[免疫学通报].2013；155:43-6。最新的案例报告描述了一名用慢病毒转导的CART123治疗的患者，示出这种途径的可行性，其通过来自其他CD123靶向剂的初步结果证实。Luo Y,Chang L-J,Hu Y,Dong L,Wei G,Huang H.First-in-Man CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells for theTreatment of Refractory Acute Myeloid Leukemia[第一次作用于人体的CD123-特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞用于治疗难治性急性髓性白血病].Blood[血液].2015；126:3778-；Frankel AE,Woo JH,Ahn C,Pemmaraju N,Medeiros BC,Carraway HE,等人Activity of SL-401,a targeted therapy directed to interleukin-3receptor,inblastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm patients[被定向至白细胞介素-3受体的靶向疗法SL-401在母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤患者中的活性].Blood[血液].2014；124:385-92；He SZ,Busfield S,Ritchie DS,Hertzberg MS,Durrant S,Lewis ID,等人A Phase 1study of the safety,pharmacokinetics and anti-leukemic activityof the anti-CD123monoclonal antibody CSL360in relapsed,refractory or high-risk acute myeloid leukemia[抗CD123单克隆抗体CSL360在复发性、难治性或高风险急性髓性白血病中的安全性、药代动力学和抗白血病活性的1期研究].Leukemia&lymphoma[白血病与淋巴瘤].2015；56:1406-15。
总之，我们表明人CD123重定向的T细胞显示出对播散性HL的有力治疗活性。重要的是CART123可以靶向HRS和TAM二者。CART123在临床前模型中导致骨髓抑制的观察结果表明，我们的发现可以转化为用组合的“短效”RNA-CAR123或用可耗减的CART123T细胞、然后自体骨髓移植挽救来治疗难治性HL患者。同样，此实例证明了IL-13抑制剂连同CART细胞疗法(例如靶向实体瘤的CART细胞)的组合疗法是治疗实体瘤的可行策略。
等效形式
将本文所引用的每个专利、专利申请和出版物的披露特此通过引用以其整体并入本文。虽然已经参照具体方面披露了本发明，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本发明的真实精神以及范围的情况下设想本发明的其他方面以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类方面以及等效变化。

Claims (67)

1.一种CAR疗法，该CAR疗法包含细胞例如免疫效应细胞群，该细胞包含例如表达嵌合抗原受体(CAR)，该CAR疗法用于与原M2巨噬细胞分子抑制剂组合使用以治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者，其中该CAR包含肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
2.一种治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予：
(i)CAR疗法，该CAR疗法包含细胞例如免疫效应细胞群，该细胞包含例如表达嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及
(ii)原M2巨噬细胞分子抑制剂。
3.如权利要求1或2所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中顺序给予该CAR疗法和该原M2巨噬细胞分子抑制剂。
4.如权利要求1-3中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在该CAR疗法之前给予该原M2巨噬细胞分子抑制剂。
5.如权利要求1-4中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中将该原M2巨噬细胞分子抑制剂和该CAR疗法同时或并行地给予。
6.如权利要求1-5中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中将该CAR疗法以(a)单次输注或(b)多次输注(例如单剂量分成多次输注)给予，并且其中将该原M2巨噬细胞分子抑制剂以(a)单剂量或(b)多剂量(例如第一和第二剂量以及任选地一个或多个后续剂量)给予。
7.如权利要求1-6中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在给予该原M2巨噬细胞分子抑制剂的第一剂量之后(例如，至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周或更长时间之后)，例如但在给予该抑制剂的第二剂量之前给予该CAR疗法的剂量。
8.如权利要求1或5所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中将该CAR疗法的剂量与给予该原M2巨噬细胞分子抑制剂的第一剂量并行地(例如，在给予该抑制剂的2天内(例如，在2天、1天、24小时、12小时、6小时、4小时、2小时或更短的时间内))给予。
9.如权利要求6-8中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中将该原M2巨噬细胞分子抑制剂的一个或多个后续剂量在该原M2巨噬细胞分子抑制剂的第二剂量之后给予。
10.如权利要求1-9中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中给予多于一个剂量的该原M2巨噬细胞分子抑制剂，并且将这些剂量每天两次(BID)、每天一次、每周一次、每14天一次或每月一次给予。
11.如权利要求1-10中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该原M2巨噬细胞分子抑制剂的给予包括多剂量，包括至少7天，例如至少7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或更长时间的持续时间。
12.如权利要求1-11中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中将该CAR疗法以一定剂量给予，该剂量包含至少约5 x 106、1 x 107、1.5 x 107、2 x 107、2.5 x 107、3 x107、3.5 x 107、4 x 107、5 x 107、1 x 108、1.5 x 108、2 x 108、2.5 x 108、3 x 108、3.5 x108、4 x 108、5 x 108、1 x 109、2 x 109、或5 x 109个细胞，例如CAR阳性细胞。
13.如权利要求1-12中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该原M2巨噬细胞分子抑制剂是IL-13抑制剂、IL-4抑制剂、IL-13Rα1抑制剂、IL-4Rα抑制剂、IL-10抑制剂、CSF-1抑制剂、TGFβ抑制剂、JAK2抑制剂、细胞表面分子、氧化铁、小分子抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、糖酵解途径抑制剂、线粒体靶向抗氧化剂或其组合。
14.如权利要求13所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该原M2巨噬细胞分子抑制剂是小分子、抗体或其抗原结合片段、蛋白质(例如融合蛋白)、核酸(例如shRNA或siRNA)或基因编辑系统。
15.如权利要求13所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该原M2巨噬细胞分子抑制剂是抗体或其抗原结合片段。
16.如权利要求1-15中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR的该肿瘤抗原结合结构域结合CD123。
17.一种CAR疗法，该CAR疗法包含细胞例如免疫效应细胞群，该细胞包含例如表达嵌合抗原受体(CAR)，该CAR疗法用于与肿瘤靶向疗法组合使用以治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者，其中：
(i)该CAR包含结合CD123(CD123CAR)的肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；并且
(ii)该肿瘤靶向疗法包括第二CAR疗法，该第二CAR疗法包含细胞例如免疫效应细胞群，该细胞包含例如表达CAR，该CAR包含结合除CD123之外的肿瘤抗原的肿瘤抗原结合结构域(例如，结合除CD123之外的实体瘤抗原或血液肿瘤抗原的CAR)，
其中将该CD123CAR以足以导致抑制M2巨噬细胞活性的量和/或时间给予。
18.一种治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予：
(i)CAR疗法，该CAR疗法包含细胞例如免疫效应细胞群，该细胞包含例如表达嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含结合CD123(CD123CAR)的肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及
(ii)肿瘤靶向疗法，其中该肿瘤靶向疗法包括第二CAR疗法，该第二CAR疗法包含细胞例如免疫效应细胞群，该细胞包含例如表达CAR，该CAR包含结合除CD123之外的肿瘤抗原的肿瘤抗原结合结构域(例如，结合除CD123之外的实体瘤抗原或血液肿瘤抗原的CAR)，
其中将该CD123CAR以足以导致抑制M2巨噬细胞活性的量和/或时间给予。
19.如权利要求17或18所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中抑制该M2巨噬细胞活性包括抑制巨噬细胞向M2表型的极化和/或M2巨噬细胞表型的逆转。
20.如权利要求17-19中任一项所述使用的CAR疗法，其中该第二CAR疗法的该肿瘤抗原结合结构域结合CD19、间皮素或EGFRviii。
21.如权利要求16-20中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中结合CD123的该CAR的该肿瘤抗原结合结构域包含表16、表18、表20、表22、表24、表25、表26、表27或表28中列出的任何CD123重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及
表17、表19、表21、表23、表24、表25、表26、表27或表28中列出的任何CD123轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
22.如权利要求16-21中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD123结合结构域包含表26、表27或表28中列出的CD123结合结构域(例如scFv)氨基酸序列。
23.如权利要求16-22中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR包含表26或表27中列出的CAR氨基酸序列(例如由其组成)。
24.如权利要求1-15、17或18中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR的该肿瘤抗原结合结构域结合间皮素。
25.如权利要求24所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR的该肿瘤抗原结合结构域包含表2、表3或表11中列出的任何间皮素重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及
表2、表4或表11中列出的任何间皮素轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
26.如权利要求24或25所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该间皮素结合结构域包含表2或表11中列出的间皮素结合结构域(例如scFv)氨基酸序列。
27.如权利要求24-26中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR包含表11中列出的CAR氨基酸序列(例如由其组成)。
28.如权利要求1-15、17或18中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR的该肿瘤抗原结合结构域结合EGFRvIII。
29.如权利要求28所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR的该肿瘤抗原结合结构域包含表5中列出的任何EGFRvIII重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及
表5中列出的任何EGFRvIII轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
30.如权利要求28或29所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该EGFRvIII结合结构域包含表5中列出的EGFRvIII结合结构域(例如scFv)氨基酸序列。
31.如权利要求28-30中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR包含表30中列出的CAR氨基酸序列(例如由其组成)。
32.如权利要求1-15、17或18所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR的该肿瘤抗原结合结构域结合CD19。
33.如权利要求32所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR的该肿瘤抗原结合结构域包含表6、表7或表9中列出的任何CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及
表6、表8或表9中列出的任何CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
34.如权利要求32或33所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD19结合结构域包含表6或表9中列出的CD19结合结构域(例如scFv)氨基酸序列。
35.如权利要求32-34中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD19结合结构域包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:112。
36.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR的该肿瘤抗原结合结构域结合实体瘤抗原。
37.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR的该肿瘤抗原结合结构域结合在与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和/或髓源性抑制细胞(MDSC)相关的肿瘤上表达的抗原。
38.如权利要求36或37所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该实体瘤抗原或在与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和/或髓源性抑制细胞(MDSC)相关的肿瘤上表达的该抗原是CD123、EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈递的这些抗原的任一个的肽。
39.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该细胞内信号传导结构域包括含有CD3-ζ刺激结构域的初级信号传导结构域。
40.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该细胞内信号传导结构域包含共刺激结构域，该共刺激结构域是选自下组的共刺激蛋白的细胞内结构域，该组由以下组成：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体。
41.如权利要求40所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该共刺激结构域包含4-1BB的细胞内结构域。
42.如权利要求40所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该共刺激结构域包含CD28的细胞内结构域。
43.如权利要求40-42中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该细胞内信号传导结构域包含两个共刺激结构域，例如4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。
44.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中与肿瘤抗原表达相关的该疾病是癌症。
45.如权利要求44所述的方法，其中该癌症是霍奇金淋巴瘤。
46.如权利要求44所述的方法，其中该癌症是实体癌。
47.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中包含CAR的该细胞包含编码该CAR的核酸。
48.如权利要求47所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中编码该CAR的该核酸是慢病毒载体。
49.如权利要求47或48所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中通过慢病毒转导将编码该CAR的该核酸引入这些细胞中。
50.如权利要求47-49中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中编码该CAR的该核酸是RNA，例如体外转录的RNA。
51.如权利要求47-50中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中通过电穿孔将编码该CAR的该核酸引入这些细胞中。
52.如权利要求1-51中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该细胞是T细胞或NK细胞。
53.如权利要求52所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。
54.如权利要求1-53中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该受试者是哺乳动物，例如人。
55.如权利要求17-54所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中将该CD123CAR疗法和该肿瘤靶向疗法顺序、同时或并行地给予。
56.如权利要求17-55所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在该肿瘤靶向疗法之前给予该CD123CAR疗法。
57.如权利要求56所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在给予该肿瘤靶向疗法之前至少5天、至少7天、至少10天、至少15天、至少20天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月或至少10个月给予该CD123CAR疗法。
58.如权利要求17-57所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中将该CD123CAR疗法以(a)单次输注或(b)多次输注(例如单剂量分成多次输注)给予，并且其中将该肿瘤靶向疗法以(a)单剂量或(b)多剂量(例如第一和第二剂量以及任选地一个或多个后续剂量)给予。
59.如权利要求17-58所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中将该CAR疗法或该肿瘤靶向疗法以一定剂量给予，该剂量包含至少约5 x 106、1 x 107、1.5 x 107、2 x 107、2.5 x107、3 x 107、3.5 x 107、4 x 107、5 x 107、1 x 108、1.5 x 108、2 x 108、2.5 x 108、3 x108、3.5 x 108、4 x 108、5 x 108、1 x 109、2 x 109、或5 x 109个细胞，例如CAR阳性细胞。
60.如权利要求17-60所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中将该CAR疗法和该肿瘤靶向疗法配制于药物组合物中。
61.一种药物组合物，该药物组合物包含(i)细胞，例如免疫效应细胞群，该细胞包含例如表达嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(ii)原M2巨噬细胞分子抑制剂。
62.一种药物组合物，该药物组合物包含(i)细胞，例如免疫效应细胞群，该细胞包含例如表达嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(ii)原M2巨噬细胞分子抑制剂，该药物组合物用于在治疗疾病或障碍中使用。
63.一种刺激哺乳动物中T细胞介导的针对实体瘤细胞的免疫应答的方法，该方法包括向哺乳动物给予有效量的如权利要求61所述的组合物。
64.一种在哺乳动物中提供抗实体瘤免疫力的方法，该方法包括向该哺乳动物给予有效量的如权利要求61所述的组合物。
65.一种治疗患有与实体瘤抗原表达相关的疾病的哺乳动物的方法，该方法包括给予有效量的如权利要求61所述的组合物。
66.如权利要求63-65中任一项所述的方法，其中提供该细胞例如该免疫效应细胞群和该原M2巨噬细胞分子抑制剂以用于单独给予(例如在两个单独的组合物中)。
67.如权利要求63-65中任一项所述的方法，其中提供该细胞例如该免疫效应细胞群和该原M2巨噬细胞分子抑制剂以用于同时给予(例如在一个组合物中)。
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RUELLA M等: "Smart CARS: optimized development of a chimeric antigen receptor (CAR) T cell targeting epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) for glioblastoma", 《ANN TRANSL MED》 *
RUELLA M等: "Smart CARS: optimized development of a chimeric antigen receptor (CAR) T cell targeting epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) for glioblastoma", 《ANN TRANSL MED》, vol. 04, no. 01, 31 January 2016 (2016-01-31), pages 13, XP055357095, DOI: 10.3978/j.issn.2305-5839.2015.10.11 *
朱童等: "嵌合抗原受体修饰T细胞在实体肿瘤中应用的研究进展", 《临床肿瘤学杂志》 *
朱童等: "嵌合抗原受体修饰T细胞在实体肿瘤中应用的研究进展", 《临床肿瘤学杂志》, vol. 20, no. 04, 15 April 2015 (2015-04-15), pages 367 - 370 *
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