JP4187277B2 - グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、一般に、グリコシル化し得る抗原結合単鎖分子に関する。より具体的には、本発明は炭水化物部分に付着し得るAsn結合型グリコシル化部位を有する抗原結合タンパク質に関する。本発明はまた、グリコシル化し得る多価の抗原結合分子に関する。本発明はさらに、ポリアルキレンオキシド結合体化し得るグリコシル化抗原結合分子に関する。ポリアルキレンオキシドと結合体化し得るグリコシル化抗原結合タンパク質の組成物、このグリコシル化抗原結合タンパク質についての遺伝構築物、このグリコシル化抗原結合タンパク質の使用方法、および産生方法が開示される。本発明はまた、増加したグリコシル化を有するポリペプチドを産生するための方法および記載された方法により生成されるポリペプチドに関する。
背景技術の説明
抗体は、抗原と呼ばれる侵入する分子と複合体化し得る特定の分子を提供する免疫系により生成されるタンパク質である。天然の抗体は、2つの同一の抗原結合部位を有し、これら両方は特定の抗原に特異的である。抗体分子は、エピトープと呼ばれる抗原の領域とその抗原結合領域との複合体化により、抗原を「認識」する。エピトープは、抗体の抗原結合部位のコンフォメーション構造物に適合し、抗体が抗原に結合することが可能になる。
IgG抗体は、例えば、2つの同一のポリペプチド重鎖および軽鎖からなり、鎖間のジスルフィド結合によりともに保持される。抗体についてのこの議論の残りは、軽鎖/重鎖の一対にのみ言及する。なぜなら、それぞれの軽鎖/重鎖の対は同一であるからである。各個々の軽鎖および重鎖は、約110アミノ酸の領域に折畳まれ、保存された3次元コンホメーションをとる。軽鎖は、1つの可変領域(VL)および1つの定常領域(CL)を含むが、重鎖は1つの可変領域(VH)および3つの定常領域(CH1、CH2、およびCH3)を含む。領域の対が会合して、個別の構造を形成する。特に、軽鎖および重鎖の可変領域は会合して、抗原結合部位を含む「Fv」領域を形成する。
免疫生物学、組換えDNA技術およびコンピューターサイエンスにおける今日の進歩は、抗原に結合する単一のポリペプチド鎖分子の作成を可能にしてきた。これらの単一鎖の抗原結合分子(「SCA」)または抗体の単鎖可変フラグメント(「sFv」)は、リンカーポリペプチドを組み込んで個別の可変領域であるVLおよびVHを単一のポリペプチド鎖と架橋する。抗原結合単鎖タンパク質の理論および生成についての説明は、Ladnerら、米国特許第4,946,778号、同第5,260,203号、同第5,455,030号および同第5,518,889号に見い出される。上記の米国特許に記載されるプロセスにおいて生成される抗原結合単鎖タンパク質は、Fabフラグメントに対応する抗原結合単鎖タンパク質に実質的に類似する結合特異性および親和性を有する。リンカー設計についてのコンピューターが介助する方法は、Ladnerら、米国特許第4,704,692号および同第4,881,175号およびWO94/12520においてより詳細に記載される。
SCAポリペプチドのインビボ特性は、MAbおよび抗体フラグメントとは異なる。それらの小さなサイズに起因して、SCAポリペプチドは、血液からより迅速に消失し、そして組織へより迅速に浸透する(Milenic、D.E.ら、Cancer Reseach 51:6363-6371(1991);Colcherら、J.Natl.Cancer Inst.82:1191(1990);Yokotaら、Cancer Reseach 52:3402(1992))。定常領域の欠失に起因して、SCAポリペプチドは、肝臓および腎臓のような組織では保持されない。定常領域の迅速なクリアランスおよび欠失に起因して、SCAポリペプチドは、低い免疫原生を有する。従って、SCAポリペプチドは、癌の診断および治療における適用を有し、ここで、迅速な組織浸透性およびクリアランス、ならびに微生物生成の容易さが有利である。
多価抗原結合タンパク質は、1つより多くの抗原結合部位を有する。多価抗原結合タンパク質は、2つ以上の単鎖タンパク質分子を含む。増強された結合活性、2つ以上の特異的結合、および多価抗原結合タンパク質の他の新規の作用が実証されてきた。Whitlow,M.ら、Protein Engng.7:1017-1026(1994);Hoogenboom、H.R.Nature Biotech 15:125-126(1997);およびWO93/11161を参照のこと。
タンパク質の炭水化物修飾は3つの一般的なカテゴリーに分けられる:アスパラギンのN結合型(またはAsn結合型)修飾、セリンまたはトレオニンのO結合型修飾、ならびにC末端のカルボキシル基のグリコシル-ホスハチジルイノシトール誘導。それぞれのこれらの形質転換は、異なるペプチド配列要件および反応特異性を実証する1つ以上の酵素により触媒される。N結合型グリコシル化は、単一の酵素であるオリゴ糖トランスフェラーゼ(oligosaccharyl transferase)(OT)により触媒され、そして発生段階でのポリペプチド内部のアスパラギン側鎖への脂質結合型テトラ-デカ多糖類(GlcNAc2-Man9-Glc3)の同時翻訳転移を含む(Imperiali,B.およびHendrickson,T.L.,Bioorganic & Med.Chem.3:1565-1578(1995))。アスパラギン残基は、トリペプチドのN結合型グリコシル化コンセンサス配列Asn-Xaa-Thr/Ser(NXT/S)(ここで、Xaaはプロリンを除く20個の天然アミノ酸のいずれかであり得る)の内部に存在しなければならない。
アミノ酸18-20位(Kabatの番号付け)における天然のN結合型グリコシル化配列(Asn-Val-Thr)が、マウス抗B細胞リンパ腫抗体であるLL-2の軽鎖可変ドメインのフレームワーク1(FR-1)領域において同定された(Leung,S.-O.ら、J.Immunol.154:5919-5926(1995))。アルギニンからアスパラギンへの単一変異により、IL-2の配列と類似するN結合型グリコシル化配列は、非グリコシル化ヒト化抗癌胎児性Ag(CEA)AbのFR-1セグメント、MN-14に導入される(Leung、S.-O.ら、J.Immunol.154:5919-5926(1995)(これは本明細書において参考として援用される)。
システイン残基でのジスルフィド結合による架橋手段を有するC末端を有するsFvが報告されている(Hustonら、米国特許第5,534,254号)。モノクローナル抗体もまた、VL領域の約アミノ酸18位でのAsn結合型グリコシル化部位での炭水化物部分を介して、診断剤または治療剤と共有結合することが報告されている(Hansenら、米国特許第5,443,953号)。VH鎖でのAsn結合型グリコシル化される抗デキストラン抗体の結合についての研究が実施されており、これは、VH領域でのAsn結合型炭水化物部分の位置におけるわずかな変化が実質的に異なる抗原結合の効果を生じることを示す(Wrightら、EMBO J.10:2717-2723(1991))。sFvのVH領域内部の19位でのグリコシル化は、細胞内にsFvの全体の量の発現を増強し、その約半分はグリコシル化され(Greenman,Jら、J.Immunol.Methods 194:169-180(1996))、かつグリコシル化sFvの合成および分泌は非グリコシル化sFvを超えて増強された(Jost,C.R.ら、J.Biol.Chem.269:26267-26273(1994))ことも報告されている。Coら、米国特許第5,714,350号は、グリコシル化部位の除去による抗体の結合親和性の増加に関する。
ポリペプチド分子へのポリアルキレングリコールまたはポリアルキレンオキシドの鎖の共有結合は、Davisらの米国特許第4,179,337号、ならびにAbuchowskiおよびDavisの「Enzymes as Drugs」HolcenbergおよびRoberts編、367-383頁、John Wiley and Sons,New York(1981)、ならびにZalipskyら、WO92/16555に開示される。これらの参考文献は、ポリエチレングリコールにより修飾されたタンパク質および酵素が、元々の化合物と比較して、減少した免疫原性および抗原性を有し、そして血流中におけるより長い生存時間を有することを開示した。化学的に修飾された結合体の得られた有益な特性は、様々な治療的適用において非常に有用である。
ポリエチレングリコール(PEG)および類似のポリ(アルキレンオキシド)の分子への共有結合をもたらすために、ポリマーのヒドロキシル末端基が、最初に、反応性官能基へ変換されなければならない。このプロセスは、「活性化」と頻繁に言われ、そして生成物は「活性化PEG」と呼ばれる。
ヒドラジドは、アルデヒドおよびケトンの縮合により比較的安定なヒドラゾン結合体を容易に形成する(Andresz,H.ら、Makromol.Chem.179:301(1978))。この特性は、酸化オリゴ糖部分を介する糖タンパク質の修飾について広範に使用されてきた(Wilchek,M. & Bayer,E.A.,Meth.Enzymol.138:429(1987))。
活性化PEGヒドラジドは、アルデヒド基との反応を可能にする。アルデヒドはタンパク質のポリペプチド鎖には通常存在しない。しかし、タンパク質が炭水化物部分を含む場合、そのときは、炭水化物が活性化されて、マンノースのような糖環の酸化により反応性のアルデヒド基を提供し得る。免疫結合体の活性化の方法は、Selaら、Immunoconjugates,Vogel編、Oxford University Press(1987)に記載される。この方法では、PEGヒドラジドは炭水化物構造を介してタンパク質と共有結合され得る。Zalipsky,S.ら、WO92/16555では、ポリマーに結合されたヒドラジド官能基またはヒドラゾン官能基を含む結合による糖ポリペプチドの酸化炭水化物部分と共有結合されたPAOを記載する。炭水化物部分の酸化は反応性アルデヒドを生成する。ヒドラゾン結合は、ペプチド配列を含むポリマーのアシルヒドラジン誘導体をこれらのアルデヒド基と反応させることにより形成される。
先行技術は、塩化シアヌル酸とのPEGのヒドロキシル基の活性化し、次いで得られた化合物は、タンパク質と結合される(Abuchowskiら、J.Biol.Chem.252:3578(1977);Abuchowski & Davis、前出(1981)。しかし、この方法の使用においては欠点が存在する(例えば、塩化シアヌル酸の毒性およびアミンではない官能基(例えば、遊離型の必須システインまたはチロシン残基)を有するタンパク質についてのその非特異的反応性)。
これらおよび他の欠点を克服するために、別の活性化PEG(例えば、PEGのスクシンイミジルスクシネート誘導体(「SS-PEG」)が導入された(Abuchowskiら、Cancer Biochem.Biophys.7:175-186(1984))。これは、穏やかな条件下でタンパク質と迅速に反応し(30分)、さらに広範に修飾された結合体を得る。
Zalipskyは、米国特許第5,122,614号において、ポリ(エチレングリコール)−N-スクシンイミド炭酸塩およびその調製物を開示した。このポリマーの形態は、タンパク質のアミノ基、ならびに低分子量ペプチドおよび遊離のアミノ基を含む他の物質と容易に反応すると言われていた。
タンパク質のアミノ基とPEGの間の他の結合型(例えば、ウレタン結合型(Veroneseら、Appl.Biochem.Biotechnol.11:141-152(1985))、カルバメート結合型(Beauchampら、Analyt. Biochem.131:25-33(1983))など)もまた、当該分野で公知である。
sFvのポリアルキレンオキシド修飾は、米国仮特許出願第60/050,472号(1997年6月23日出願)に開示され、この開示は本明細書において参考として援用される。
活性化ポリマーはまた、付着部位として働く求核性官能基を有する治療剤と反応し得る。接着部位として一般に使用される1つの求核性官能基は、リジンの∈-アミノ基である。遊離カルボキシル酸基、適切には、活性化カルボニル基、酸化型炭水化物部分およびメルカプト基もまた、接着部位として使用されてきた。
ポリ(エチレングリコール)またはポリ(アルキレンオキシド)の有機低分子との結合は、Greenwald,R.B.,Exp.Opin.Ther.Patents 7:601-609(1997)、Enzon Inc.,WO95/11020およびEnzon Inc.,WO96/23794(これらの開示は、本明細書において参考としてすべてが援用される)に記載される。PEGバラストと劇薬との間の種々のリンカー基の使用に基づく組成物は、WO96/23794に記載される。
発明の要旨
本発明は、グリコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドに関し、このポリペプチドは、以下:
(a)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第一のポリペプチド;
(b)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第二のポリペプチド;ならびに
(c)第一のポリペプチド(a)および第二のポリペプチド(b)を連結して、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドにするペプチドリンカー、
を含み、ここで、抗原結合単鎖ポリペプチドは、Asn-Xaa-Yaa(ここで、Xaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンである)を含む少なくとも1つのトリペプチドのAsn結合型グリコシル化配列を有し、ここで、トリペプチドグルコシル化配列は、(i)軽鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14位、または15位;(ii)軽鎖可変領域のアミノ酸77位、78位、または79位;(iii)重鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14位、または15位;(iv)重鎖可変領域のアミノ酸82B位、82C位、または83位;(v)ペプチドリンカーの任意のアミノ酸位置;(vi)第二のポリペプチド(b)のC末端の近傍;ならびに(Vii)それらの組み合わせ、からなる群から選択される位置に位置するAsn残基で炭水化物部分と結合体化し得、ここで、グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドは、抗原と結合体化し得る。
本発明はさらに、グリコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、このポリペプチドは、以下:
(a)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第一のポリペプチド;
(b)抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第二のポリペプチド;ならびに
(c)第一のポリペプチド(a)および第二のポリペプチド(b)を連結して、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドにするペプチドリンカー、
を含み、ここで、抗原結合単鎖ポリペプチドは、少なくとも1つのAsn-Xaa-Yaa(ここで、Xaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンである)を含む少なくとも1つのトリペプチドのAsn結合型グリコシル化配列を有し、ここで、トリペプチドグルコシル化配列は、(i)軽鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14位、または15位;(ii)軽鎖可変領域のアミノ酸77位、78位、または79位;(iii)重鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14または15位;(iv)重鎖可変領域のアミノ酸82B位、82C位、または83位;(v)ペプチドリンカーの任意のアミノ酸位置;(vi)第二のポリペプチド(b)のC末端の近傍;および(vii)それらの組み合わせ、からなる群から選択される位置に位置するAsn残基で炭水化物部分と付着し得、ここで、グリコシル化抗原結合単鎖ポリペプチドは、抗原と結合体化し得る。
ポリヌクレオチドはDNAまたはRNAであり得る。
本発明は、上記のDNA配列を含む複製クローニングまたは発現ビヒクルに関する。本発明はまた、プラスミドのようなビヒクルに関する。本発明はさらに、上記のDNAで形質転換された宿主細胞に関する。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞もしくは他の真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞株であり得る。好ましい宿主はPichia pastorisである。
本発明は、グリコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドを生成する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:
(a)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを提供する工程;
(b)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを提供する工程;ならびに
(c)第一のポリヌクレオチド(a)および第二のポリヌクレオチド(b)を、ペプチドリンカーをコードする第3のポリヌクレオチドと連結して、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドをコードする第4のポリヌクレオチドにする、工程であって、ここで、抗原結合単鎖ポリペプチドは、Asn-Xaa-Yaa(ここで、Xaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンである)を含む少なくとも1つのトリペプチドのAsn結合型グリコシル化配列を有し、ここで、トリペプチドグルコシル化配列は、(i)軽鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14位、または15位;(ii)軽鎖可変領域のアミノ酸77位、78位、または79位;(iii)重鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14位、または15位;(iv)重鎖可変領域のアミノ酸82B位、82C位、または83位;(v)ペプチドリンカーの任意のアミノ酸部位;(vi)第二のポリペプチド(b)のC末端の近傍;および(vii)それらの組み合わせ、からなる群から選択される位置に位置するAsn残基で炭水化物部分と結合体化し得、ここで、グリコシル化抗原結合単鎖ポリペプチドは、抗原と結合体化し得る、工程;ならびに
(d)(c)の抗原結合単鎖ポリペプチドを宿主中で発現させ、それによりグリコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドを生成する、工程。
本発明に従う方法では、宿主細胞はグリコシル化を触媒し得る。宿主細胞は、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞もしくは他の真菌細胞、または昆虫細胞、または哺乳動物細胞株である。好ましい宿主細胞は、Pichia pastorisである。
本発明はさらに、多価抗原結合単鎖タンパク質に関し、これは2つ以上の抗原結合単鎖ポリペプチドを含み、各単鎖結合ポリペプチドは以下:
(a)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第一のポリペプチド
(b)抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第二のポリペプチド;ならびに
(c)第一のポリペプチド(a)および第二および(b)を連結して、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドにする、ペプチドリンカー、
を含み、ここで、抗原結合単鎖ポリペプチドは、Asn-Xaa-Yaa(ここで、Xaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンである)を含む少なくとも1つのトリペプチドのAsn結合型グリコシル化配列を有し、ここで、トリペプチドグルコシル化配列は、(i)軽鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14位、または15位;(ii)軽鎖可変領域のアミノ酸77位、78位、または79位;(iii)重鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14位または15位;(iv)重鎖可変領域のアミノ酸82B位、82C位、または83位;(v)ペプチドリンカーの任意のアミノ酸部位;(vi)第二のポリペプチド(b)のC末端の近傍;および(vii)それらの組み合わせ、からなる群から選択される位置に位置するAsn残基で炭水化物部分と付着し得、ここで、グリコシル化抗原結合単鎖ポリペプチドは、抗原と結合し得る。
本発明の上記の実施態様において、トリペプチドグリコシル化配列は、以下から選択される部位に位置するAsn残基での炭水化物部分を結合し得る:(i’)軽鎖可変領域のアミノ酸12位;(ii’)軽鎖可変領域のアミノ酸77位;(iii’)重鎖可変領域のアミノ酸13位;(iv’)重鎖可変領域のアミノ酸82B位;(v’)ペプチドリンカーのアミノ酸2位;(vi’)第二のポリペプチド(b)のC末端へ隣接した;ならびに(vii’)それらの組み合わせ、ここで、グリコシル化抗原結合単鎖ポリペプチドは、抗原に結合し得る。
本発明の上記の実施態様において、少なくとも1つの抗原結合単鎖ポリペプチドは、少なくとも2つのタンデムなトリペプチドグリコシル化配列を有し得、その結果、Asn残基は、2つのアミノ酸残基および/または少なくとも1セットの重複したトリペプチドグリコシル化配列により隔てられており、その結果、Asn残基が隣接する。少なくとも1つの抗原結合単鎖ポリペプチドは、3つのタンデムなトリペプチドグリコシル化配列を有し得る。少なくとも1つの抗原結合単鎖ポリペプチドは、少なくとも2セットの2つのタンデムなトリペプチドグリコシル化配列および少なくとも2セットの2つの重複したトリペプチドグリコシル化配列を有し得る。
本発明の上記の実施態様においてもまた、トリペプチドグリコシル化配列のAsn残基は、炭水化物部分と結合され得る。炭水化物部分は、ポリアルキレンオキシドとさらに結合体化され得る。炭水化物および/またはアルキレンオキシド部分は、1または複数のペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、付加されたホウ素または検出可能な標識分子と結合体化し得る。炭水化物および/またはポリアルキレン部分は、キャリアと結合した1または複数のペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、付加されたホウ素または検出可能な標識分子と結合体化し得る。
本発明の上記の実施態様おいて、第二のポリペプチド(b)のC末端は、第二のポリペプチド(b)のネイティブなC末端であり得る。あるいは、第二のポリペプチド(b)のC末端は、1または複数のアミノ酸残基の欠失を含み得、その結果、第二のポリペプチドの残りのN-末端アミノ酸残基は、抗原と結合し得るグリコシル化ポリペプチドについて十分である。あるいは、第二のポリペプチドのC末端は、1または複数のアミノ酸残基の付加を含み得、その結果、グリコシル化ポリペプチドは抗原と結合し得る。1つの実施態様において、グリコシル化配列のAsn残基は、任意の上記の言及された第二のポリペプチドのC末端を局所的に隣接し得、そしてグリコシル化配列が、少なくとも1個のアミノ酸残基に続き得る。あるいは、グリコシル化配列は、2個、3個、4個、または5個のアミノ酸残基に続き得る。
本発明の好ましい実施態様において、第一のポリペプチドは、(a)抗体軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含み得、そして第二のポリペプチドは、(b)抗体重鎖の可変領域の抗原結合部分を含む。
本発明はまた、試料中にあると予想される抗原を検出する方法に関し、以下の工程を包含する:
(a)試料を本発明のグリコシル化ポリペプチドまたは多価タンパク質と接触させる工程であって、ここで、炭水化物部分は1または複数の検出可能な標識分子と結合されるか、またはキャリアと結合した1または複数の検出可能な分子を有するキャリアと結合される、工程;ならびに
(b)グリコシル化抗原結合単鎖ポリペプチドが抗原と結合するか否かを検出する工程。
本発明はさらに、動物の内部構造を画像化する方法に関し、有効量の本発明のグリコシル化ポリペプチドまたは多価タンパク質を投与する工程を包含し、ここで、炭水化物部分は、1または複数の検出可能な標識もしくはキレート分子と結合体化されているか、またはキャリアと結合した1または複数の検出可能な標識またはキレート分子と結合体化されており、そして、動物に関連する検出可能な放射線を測定する工程を包含する。動物は、ヒトおよび非ヒトを含む。
本発明はまた、標的化された疾患を処置するための方法に関し、この方法は、本発明のグリコシル化されたポリペプチドまたは多価タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアビヒクルを含む組成物の有効量を投与する工程を包含し、ここで、炭水化物部分は、1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、ホウ素付加物(addend)または放射性同位体分子)に結合体化されているか、またはキャリアに結合体化されており、このキャリアは、このキャリアに結合した、1または複数の、薬物、毒素、ホウ素付加物または放射性同位体分子を有する。
上記の方法は、1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識化分子にもまた結合体化され得る、ポリアルキレンオキシドに結合体化した本発明のグリコシル化ポリペプチドまたは多価タンパク質を用いて容易にされ得る。
本発明はまた、(1)増大したグリコシル化を有するポリペプチドを産生する方法であって、(a)そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも2つのトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、ここで、各トリペプチドグリコシル化配列は、Asn-Xaa-Yaaを含み、ここで、Xaaは、プロリン以外のアミノ酸であり、Yaaは、トレオニンまたはセリンであり、そしてここで、トリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデムになっている、工程;ならびに(b)Asn残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞において、上記ポリヌクレオチドを発現する工程、を包含する方法、ならびに(2)記載したプロセスによって産生される増大したグリコシル化を有するポリペプチドに関する。
本発明はさらに、(1)増大したグリコシル化を有するポリペプチドを産生する方法であって、(a)そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも1セットの2つのトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、そしてここで各トリペプチドグリコシル化配列が、Asn-Xaa-Yaaを含み、ここでXaaは、プロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaは、トレオニンまたはセリンであり、ここでこの2つのトリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が隣接するように重複する、工程;ならびに(b)Asn残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞において、上記ポリヌクレオチドを発現する工程、を包含する方法、ならびに(2)記載したプロセスによって産生される増大したグリコシル化を有するポリペプチドに関する。
本発明はまた、(1)増大したグリコシル化を有するポリペプチドを産生する方法であって、(a)そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも2つのトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、ここで各トリペプチドグリコシル化配列は、Asn-Xaa-Yaaを含み、ここでXaaは、プロリン以外のアミノ酸であり、Yaaは、トレオニンまたはセリンであり、ここでこのトリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるようにタンデムになっている、工程;(b)そのポリヌクレオチドに、少なくとも1セットの2つのトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、ここで、この2つのトリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が隣接するように重複する、工程;および(c)Asn残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞において、上記ポリペプチドを発現する工程、を包含する方法、ならびに(2)記載したプロセスによって産生される増大したグリコシル化を有するポリペプチドに関する。
【図面の簡単な説明】
図1.操作されたN連結グリコシル化部位を有する、CC49/218 SCAのDNA配列(配列番号1)および翻訳されたタンパク質配列(配列番号2)。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)を示す。制限部位に下線を付し、そして名前を付す。CDR配列には、二重下線を付してある。218リンカーに下線を付し、名前を付す。提案されたトリペプチドN連結グリコシル化部位に下線を付してある。N連結グリコシル化部位を生成するように作製された変異を、提案されたグリコシル化部位の下に括弧内に示し、そしてオリゴ糖結合の部位を、変異した配列の下に*によって示し、そして番号を付す。グリコシル化のためのC末端の延長を括弧内に示す。
図2.ELISAにおける、E.coli GX9251(A)またはP.pastoris EN225(B)から得られた親CC49/218 SCAの連続希釈物の、固定されたウシ下顎ムチンへの結合。E.coli(100μg/ml)からの精製されたCC49/218 SCAおよびP.pastoris EN225(約50μg/ml SCA)からの精製されていない培養上清を、材料および方法に記載されるように、抗原の直接結合についてアッセイした。405nmでの吸光度(A405)を、PNPP基質の、アルカリホスファターゼ結合体化ウサギ抗マウス抗体とのインキュベーションの10分後に測定した。2つのコントロールを右側に示す。C1は、固定化したブタ下顎ムチンを用いてアッセイしたCC49/218(3.3倍希釈)の吸光度を記録する。C2は、ウシ下顎ムチンに固定化された誘導されたP.pastoris宿主GS115(3.3倍希釈)のバックグランド結合を示す。
図3.Nアセチルグルコサミン特異的エンドグリコシダーゼでの酵素的処置の前および後のCC49/218SCAおよびグリコSCAのウエスタンブロット分析。EN225、EN235、およびEN236の培養上清由来の精製されていないCC49/218 SCAを、ペプチドNグリコシダーゼFまたはエンドグリコシダーゼHで消化した。サンプル(1レーンあたり約1μg)を、4〜20%SDS-PAGEスラブゲル上で泳動し、そしてウサギ抗CC49/218 SCAポリクローナル抗体を使用するウエスタン分析のためにニトロセルロース膜に移した。レーン1〜3、EN236;レーン4〜6、EN235;レーン7〜9、EN225。レーン1、4、および7、エンドグリコシダーゼH処置;レーン2、5、および8、ペプチドNグリコシダーゼF処置;レーン3、6、および9、非処置。隣接するレーン10(示さず)は、分子量マーカーを含み、そして抗体に対して交差反応性を示さなかった。
図4.EN235の培養上清由来のCC49/218 SCAのアフィニティークロマトグラフィー。SDS-PAGE分析を、実施例1の「材料および方法」の節に記載したように、ムチンSepharoseカラム上でのクロマトグラフィーの後に、修飾していないSCAおよびグリコSCAの混合物に由来するEN235上で行った。クーマシーブルー染色ゲルを、Molecular Dynamics Laser Scanner Model PD-SIを使用してスキャンし、そして面積定量化を、精製されたサンプル(A)および出発上清(B)について表示する。グリコシル化SCA(ピーク1)の修飾していないSCA(ピーク2)に対する比は、1.2(A)および1.1(B)である。
図5.Con A Sepharoseによる修飾していないSCAからのグリコSCAのレクチン特異的分離。EN235培養上清からのCC49/218 SCAを、モル過剰のCon A Sepharose樹脂(Pharmacia Biotech)とともにインキュベートした。結合していない上清の画分を除去し、そして結合した画分をα-D-メチルマンノシドで溶出した。SDS-PAGE分析を、4〜20%スラブゲル(レーンあたり約1μg)上で行った。クーマシーブルーで染色したゲルを、Aに示す:レーンa、結合画分;レーンb、非結合画分;レーンc、非処置培養上清。ゲルを、図4に示すようにスキャンし、そして結果をBに示す。ここで、ピーク1および2は、それぞれバンド1および2に対応する。
図6.操作されたグリコシル化部位を有するKabatコンセンサスVκI/218/VHIII SCA。218リンカーによって連繋されたVLドメイン(ヒトκ軽鎖サブグループIコンセンサス配列由来)およびVHドメイン(ヒト重鎖サブグループIIIコンセンサス配列由来)を含むコンセンサスヒトSCAタンパク質についてのアミノ酸配列(配列番号3)および操作されたN連結グリコシル化部位。アミノ酸の割り当ては、Kabaら、Sequences of Proteins of Immunological Interest,108および331頁、第5版、U.S.Dept.Health and Human Services,Bethesda,MD(1991)に従った。ここで、ある位置に割り当てられたアミノ酸残基は、その位置で最も一般的に生じるアミノ酸である。アミノ酸は、標準的な1文字コドンに従って列挙され、そしてXは、任意のアミノ酸を示す。CDR配列に、二重下線を付す。218リンカーに上線を付し、そして名前を付す。提案されたトリペプチドN連結グリコシル化部位に下線を付し、そしてオリゴ糖結合の部位を*で示す。N連結グリコシル化部位を生成する提案された残基変化を、下に括弧内に示す。グリコシル化のためのC末端延長を、括弧内に示す。3つの共通でないVκICDR1位置、27D、27E、および27Fは、示されていない。VHIII末端部位113は、任意であり、そして代替のSCAは、112位で終結し得る。+3位のトリペプチド配列に隣接するプロリン残基は、Gavel,Y.,およびvon Heijne,G.,Protein Engng.3:433-442(1990)の編集物によって推奨されるように、アラニンに変化している。
図7.操作されたグリコシル化部位を有するC6.5/218 SCA。218リンカーによって連繋されたVLドメイン(ヒトλ鎖サブグループ1セグメントに由来)およびVHドメイン(ヒト重鎖サブグループ5セグメントに由来)を含むヒトC6.5 SCAタンパク質についてのアミノ酸配列(配列番号4)および操作されたN連結グリコシル化部位。野生型C6.5可変ドメインのアミノ酸の割り当ては、Schier,R.ら、J.Mol.Biol.255:28-43(1996)に従った。CDR配列に二重下線を付す。218リンカーに、上線を付し、そして名前を付す。提案されたトリペプチドN連結グリコシル化部位に、下線を付し、そしてオリゴ糖結合の部位を、*によって示す。生成されたN連結グリコシル化部位を生成するための提案された残基変化を、下に括弧内に示す。グリコシル化のためのC末端延長は、括弧内に示す。VH末端位置113は、任意であり、そして代替のSCAは、112位で終結し得る。+3位のトリペプチド配列に隣接するプロリン残基は、Gavel,Y.およびvon Heijne,G.,Protein Engng.3:433-442(1990)の編集物によって推奨されるように、アラニンに変化している。
図8.操作されたグリコシル化部位を有するA33/218 SCA。218リンカーによって連繋されたマウスVLドメインおよびマウスVHドメインを含有するpGX9451のマウスA33 SCAタンパク質についてのアミノ酸配列(配列番号5)および操作されたN連結グリコシル化部位。アミノ酸割り当ては、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版、U.S.Dept.Health and Services,Bethesda,MD(1991)の番号付けシステムに従う。CDR配列に二重下線を付す。218リンカーに上線を付し、そして名前を付す。提案されたトリペプチドN連結グリコシル化部位に、下線を付し、そしてオリゴ糖結合の部位を、*によって示す。N連結したグリコシル化部位を生成するための提案された残基変化を、下に括弧内に示す。グリコシル化のためのC末端延長を、括弧内に示す。
図9.エンドグリコシダーゼHでの処置の前および後の、1、2、または3つのグリコシル化部位を有するCC49/218 SCAおよびグリコCC49/218 SCAのウエスタンブロット分析。条件は上記した。レーン1、コントロールP.pastoris宿主GS115;レーン2、CC49/218 SCA;レーン3および4、グリコCC49/218 SCA EN236(1つのグリコシル化部位);レーン5および6、グリコCC49/218 SCA EN279(2つのグリコシル化部位);レーン7および8、グリコCC49/218 SCA EN280(3つのグリコシル化部位)。レーン4、6、および8、エンドグリコシダーゼHで処置した。
図10.修飾していないCC49 SCA(E.coli CC49およびP.pastoris EN225)、ならびに1つ(EN 236)、2つ(EN279)、または3つ(EN280)のグリコシル化部位を有するCC49によるムチン結合活性のELISA定量化。2つのコントロール、BSAおよびGS115(P.pastoris宿主)は、非常に少ないムチン結合活性を示した。(切貼)=BSA;(切貼)=E.coli CC49;(切貼)=GS115;(切貼)=EN225;(切貼)=EN236;(切貼)=EN279;および(切貼)=EN280。
図11.A.グリコシル化CC49および2つのタンデムグリコシル化部位を有するPEG修飾CC49のSECクロマトグラフィー。グリコCC49/2(EN279)を、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって精製した。グリコシル化CC49/2のPEG化(PEG修飾)のための条件は、実施例4に記載したとおりであった。反応混合物のSECクロマトグラフィーは、PEG化前の唯一のピークであった低分子量非グリコシル化ピークに加えて、高分子量ピークの出現を示した。B.反応混合物のSDS-PAGE分析は、グリコシル化CC49/2およびPEG化CC49/2が、すべて高分子量種に変換されたことを示した(レーン2)。レーン2および3は、グリコシル化、およびPEGヒドラジド修飾されていない非グリコシル化CC49の50/50混合物を含んでいた。非グリコシル化CC49/2(レーン3)は、非修飾種に対応する位置に残った。これは、反応が、炭水化物部分に特異的であり、そして炭水化物を含まないSCAに影響を与えなかったことを示した。レーン1および4は、分子量標準を含んでいた。
図12.グリコCC49/2(EN279)のPEG化の後のサイズ排除クロマトグラフィーからの画分のSDS-PAGE分析。レーン1、分子量マーカー;レーン2、天然の非PEG化gCC49/2(非グリコシル化およびグリコシル化画分);レーン3、低分子量画分(非グリコシル化SCA);レーン4、高分子量画分(PEG化およびグリコシル化された単鎖gCC49/2)。
図13.gCC49/3(グリコ-CC49/3重部位)(EN280)およびPEG化gCC49/3のSDS-PAGE分析。グリコシル化されたCC49/3のPEG化のための条件を、実施例5に記載したとおりであった。レーン1、天然の非PEG化グリコシル化CC49/3;レーン2、gCC49/3-HZ5,000-PEG(高度にPEG化された画分);レーン3、gCC49/3-HZ5,000-PEG(低度にPEG化された画分);レーン4、分子量マーカー(116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、26.5(CC29/218天然)、21.5、14.4、6kDa)。PEG化およびグリコシル化されたCC49/3の高度にPEG化された画分およびより低度にPEG化された画分の両方が、非PEG化グリコシル化CC49/3の分子量よりもかなり高い分子量を有していた。
図14.グリコ-SCAおよびPEG-グリコ-SCAの循環寿命。(切貼)=gCC49/3(EN280);(切貼)=PEG5-gCC49/3。詳細を、実施例6に記載する。
図15.SCAおよびPEG-SCAの血漿保持の薬物動力学。(切貼)=CC49;および(切貼)=PEG20-CC49。詳細を実施例7に記載する。
図16.SCAのウエスタンブロット:レーン1および10、分子量マーカー;レーン2、EN293;レーン3、EN280;レーン4、EN294;レーン5、EN279;レーン6、EN292;レーン7、EN236;レーン8、E.coli CC49;レーン9、GS115。
図17.EN290(リンカー領域の3つのグリコシル化配列)およびEN225(CC49親)のウエスタンブロット。分子量マーカー(27kDa、30kDa、および43kDa)を示した。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、グリコシル化抗原結合単鎖分子(「SCA」)または抗体の単鎖可変フラグメント(「sFv」)が、非グリコシル化抗原結合単鎖タンパク質の有用性を超える有意な有用性を有するという発見に関する。抗原結合部位を維持することに加えて、グリコシル化SCAタンパク質は、第二の生物学的エフェクターとして作用する炭水化物部分を有する。オリゴ糖機能には、細胞および組織標的化、血清タンパク質との特異的結合および相互作用、細胞レセプター、細胞マトリックスおよび細胞内タンパク質との特異的結合および相互作用が含まれ得る。従って、本発明は、グリコシル化が可能な1価および多価SCAタンパク質、1価および多価のグリコシル化SCAタンパク質の組成物、1価および多価のグリコシル化SCAタンパク質を作製および精製する方法、ならびにグリコシル化SCAタンパク質のための使用に関する。本発明はまた、Asn結合型炭水化物部分に共有結合した診断的または治療的薬剤を有するグリコシル化SCAタンパク質に関する。
用語「抗原結合単鎖分子」(SCA)または「単鎖Fv」(sFv)は、本明細書中で互換的に使用される。これらは、抗体の可変領域VH(または、VL)由来の第二のポリペプチド結合部分に結合された、抗体の可変領域VL(または、VH)由来の第一のポリペプチド結合部分(その2つのポリペプチドは、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドを1本のポリペプチド鎖に連結させるペプチドリンカーにより結合されている)を含むものとして構造的に定義され、その結果、第一のポリペプチドはリンカーに対してN末端側であり、そして第二のポリペプチドは、第一のポリペプチドおよびリンカーに対してC末端側である。従って、1本のポリペプチド鎖は、ポリペプチドリンカーにより結合された可変領域の対を含む。領域が、適切に対になった相補性決定領域(CDR)を有する軽鎖可変領域と重鎖可変領域との対を含む場合と同様に、その領域は、機能的な抗原結合部位を形成するために結合され得る。この場合、単鎖タンパク質は、「抗原結合単鎖タンパク質」または「抗原結合単鎖分子」と呼ばれる。
単鎖Fvは、いくつかの方法において構築され得、そして構築されている。VLが、リンカーおよびVHの続くN末端ドメイン(VL-リンカー-VH構築物)であるか、またはVHが、リンカーおよびVLの続くN末端ドメイン(VH-リンカー-VL構築物)であるかのいずれかである。好ましい実施態様は、N末端ドメインにVLを含む(Anand,N.N.ら、J.Biol.Chem.266:21874-21879(1991)を参照のこと)。あるいは、多価リンカーもまた使用されている。いくつかのタイプのsFv(SCA)タンパク質は、首尾良く構築され、精製されており、そして結合親和性およびそれらが由来した抗体と同様の特異性が示されている。
抗原結合単鎖タンパク質の理論および生成の記載は、Ladnerら、米国特許第4,946,778号、同第5,260,203号、同第5,455,030号、および同第5,518,889号に、ならびにHustonら、米国特許第5,091,513号(「生合成抗体結合部位」(BABS))において見出され、全てが本明細書に参考として援用されている。上記の特許に記載されたプロセス下で生成された抗原結合単鎖タンパク質は、結合特異性および対応するFabフラグメントの親和性と実質的に同様の親和性を有する。
代表的に、Fvドメインは、以下の文献において、その略名(26-10、MOPC 315、741F8、520C9、McPC 603、D1.3、マウスphOx、ヒトphOx、RFL3.8sTCR、1A6、Se155-4、18-2-3、4-4-20、7A4-1、B6.2、CC49、3C2、2c、MA-15C5/K12G0、Oxなど)により公知のモノクローナル抗体の群から選択されている。Huston J.S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988);Huston J.S.ら、SIM News 38(4)(補遺):11(1988);McCartney,J.ら、ICSU Short Reports 10:114(1990);McCartney,J.E.ら、未公開結果(1990);Nedelman,M.A.ら、J.Nuclear Med.32(補遺):1005(1991);Huston J.S.ら、「Molecular Design and Modeling Concepts and Applications」,B部,J.J.Langone編,Methods in Enzymology 203:46-88(1991);Huston,J.S.ら、Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology,Epenetos,A.A.(編),London,Chapman & Hall(1993);Bird,R.E.ら、Science 242:423-426(1988);Bedzyk,W.D.ら、J.Biol.Chem.265:18615-18620(1990);Colcher D.ら、J.Nat.Cancer Inst.82:1191-1197(1990);Gibbs R.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4001-4004(1991);Milenic,D.E.ら、Cancer Research 51:6363-6371(1991);Pantoliano,M.W.ら、Biochemistry 30:10117-10125(1991);Chaudhary,V.K.ら、Nature 339:394-397(1989);Chaudhary,V.K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1066-1070(1990);Batra,J.K.ら、Biochem.Biophys.Res.Comm.171:1-6(1990);Batra,J.K.ら、J.Biol.Chem.265:15198-15202(1990);Chaudhary,V.K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9491-9494(1990);Batra,J.K.ら、Mol.Cell.Biol.11:2200-2205(1991);Brinkmann,U.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8616-8620(1991);Seetharam,S.ら、J.Biol.Chem.266:17376-17381(1991);Brinkmann,U.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3075-3079(1992);Glockshuber,R.ら、Biochemistry 29:1362-1367(1990);Skerra,Aら、Bio/Technol.9:273-278(1991);Pack,P.ら、Biochemistry 31:1579-1534(1992);Clackson,T.ら、Nature 352:624-628(1991);Marks,J.D.ら、J.Mol.Biol.222:581-597(1991);Iverson,B.L.ら、Science 249:659-662(1990);Roberts,V.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6654-6658(1990);Condra,J.H.ら、J.Biol.Chem.265:2292-2295(1990);Laroche,Y.ら、J.Biol.Chem.266:16343-16349(1991);Holvoet,P.ら、J.Biol.Chem.266:19717-19724(1991);Anand,N.N.ら、J.Biol.Chem.266:21874-21879(1991);Fuchs,P.ら、Bio/Technol.9:1369-1372(1991);Breitling,F.ら、Gene 104:104-153(1991);Seehaus,T.ら、Gene 114:235-237(1992);Takkinen,K.ら、Protein Engng 4:837-841(1991);Dreher,M.L.ら、J.Immunol.Methods 139:197-205(1991);Mottez,E.ら、Eur.J.Immunol.21:467-471(1991);Traunecker,A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8646-8650(1991);Traunecker,A.ら、EMBO J.10:3655-3659(1991);Hoo,W.F.S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4759-4763(1993)を参照のこと。
SCAポリペプチドを構築するために使用される本発明のリンカーは、VLのC末端(または、その近傍部位)とVHのN末端(または、その近傍部位)とにわたるように、すなわちVHのC末端とVLのN末端との間を架橋するために設計される。ペプチドリンカーの好ましい長さは、2〜約50アミノ酸であるべきである。それぞれの特定の場合において、好ましい長さは、連結されるポリペプチドの性質、および連結により生じる連結された融合ポリペプチドの所望の活性に依存する。一般的に、リンカーは、得られる連結された融合ポリペプチドを、所望の生物学的活性を提供する立体配座に適切に折りたたむことを可能にするのに十分長いべきである。立体配座の情報が利用可能な場合、以下に議論されるSCAポリペプチドの場合のように、適切なリンカーの長さは、置換ポリペプチドの3次元立体配座および得られる連結された融合ポリペプチドの所望の立体配座を考慮することにより推定され得る。このような情報が利用可能でない場合、適切なリンカーの長さは、種々の長さのリンカーを有する一連の連結された融合ポリペプチドを所望の生物学的活性について試験することにより、経験的に決定され得る。このようなリンカーは、WO 94/12520において詳細に記載され、これは本明細書に参考として援用される。
SCAポリペプチドを構築するために使用される好ましいリンカーは、10と30の間のアミノ酸残基を有する。このリンカーは、フレキシブルとなるよう設計されており、そしてGlyとSer残基が交互の基礎配列が使用されることが推奨されている。リンカーおよびその結合単鎖Fvタンパク質の溶解性を増強するために、3つの荷電した残基(2つの正に荷電したリジン残基(K)および1つの負に荷電したグルタミン酸残基(E))が含まれ得る。好ましくは、リンカーとVHとのペプチド結合を形成する場合に失われた正荷電を置換するために、リジン残基の1つが、VHのN末端に近接して配置される。
さらに、18残基に等しいかまたはより長いリンカーの長さは、凝集を減少させることが見出されている。これは、高濃度において、凝集が明らかになる傾向にある場合、重要になる。従って、18〜30残基を有するリンカーは、1価のコンホメーションにおけるSCAポリペプチドのために最も好ましい。10残基より短いリンカーの長さは、多価コンホメーションにおけるSCAにとって有利である。
SCAポリペプチドまたは任意の他の連結した融合ポリペプチドを操作するのに重要な別の特性は、タンパク質分解に対する安定性である。212リンカー(Pantolianoら、Biochemistry 30:10117(1991))は、ズブチリシンBPN’によるタンパク質溶解性に対して感受性である。212リンカーにおけるタンパク質溶解性クリップは、リンカーのLys8とSer9との間で生じる(表1を参照のこと)。プロリンをタンパク質分解性クリップ部位に配置することによって、リンカーを保護し得る。
表1は、例示のために種々のリンカーを示す。Whitlow,M.ら、Protein Engng.7:1017-1026(1994)もまた参照のこと。それぞれ、217リンカーは、リジン-プロリン対を6位および7位に含み;218リンカーは、リジン-プロリン対を8位および9位に含み、従って、リンカーはタンパク質分解をより受けにくくされる。218リンカーは、より少ない凝集、より大きなタンパク質分解安定性、および必要な可撓性および可溶性を実証してSCAタンパク質についての機能的リンカーをもたらす。
リンカー設計における第二のガイド考慮は、リンカーが減少した凝集を有することが好ましいことである。上記の通り、18残基の216リンカーは、14残基の212リンカーと比較して減少した凝集を示す。216リンカーの最初の11個の残基は、212リンカーと同一であり、タンパク質分解に感受性のペプチド結合をLys8とSer9との間に含む。従って、過剰の4つの残基が、減少した凝集に寄与すると考えられる。従って、18個以上の残基を有するリンカーが最も好ましい。
上記を考慮に入れて、18残基の216リンカーにおけるLys8の後でプロリンで9位のセリンを置換したリンカーを設計した。このリンカーを218と称する(表1を参照のこと)。WO 94/12520(その開示は本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。
タンパク質分解を阻害するためにプロリンをリンカー配列中の適切な位置に配置することは、感受性配列におけるタンパク質分解性攻撃の点を決定することにより達成される。当業者は、この点を決定する方法が分かる。1つの方法において、ズブチリシンBPN’のようなプロテアーゼを候補リンカーと接触させる。次いで、得られるペプチドを配列決定することにより切断が決定され得、これは存在するならば、切断点をもまた明らかにする。任意のプロテアーゼを用い得、そして選択はリンカーが実際の使用に遭遇する環境を考慮することにより導かれる。
SCAについての必要要件は、リンカーが12アミノ酸よりも長いことである。SCAにおけるリンカーの好ましい長さは、上記のように凝集を減少させるためには18残基よりも長い。
多価SCAについては、2つ以上のSCAの結合がその形成に必要である。多価SCAは、25残基と同じくらいの長さのリンカーを用いてSCAから生成され得るが、それらは不安定である傾向がある。Holliger,P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)は、最近、0から15残基長のリンカーが2価のFvsの形成を容易にすることを示した。Whitlow,M.ら、Protein Engng.7:1017-1026(1994);Hoogenboom,H.R.,Nature Biotech.15:125-126(1997);およびWO 93/11161を参照のこと。
本発明の目的は、Asn結合型グリコシル化部位(グリコシル化配列内のアスパラギン残基)が炭水化物部分に付着し得る、そしてグリコシル化ポリペプチドが抗原を結合し得る(すなわち、グリコシル化されたポリペプチドが抗原に結合する能力は破壊されない)ように、1以上(または少なくとも1)のAsn結合型グリコシル化配列を有するSCAを生成することである。例えば、SCAは、1、2、3、5、7、または10個のN結合型グリコシル化配列を有し得るが、記載された数には制限されない。Asn結合型グリコシル化(N結合型グリコシル化とも呼ばれる)は、糖残基がアスパラギン残基のアミド窒素を介して結合する場合に生じる。Asn結合型オリゴ糖の細胞内生合成は、小胞体の内腔およびゴルジ装置へのタンパク質の輸送に続いての両方で生じる。Asn結合型グリコシル化は、以下のトリペプチドグリコシル化コンセンサス配列で生じる:Asn-Xaa-Yaa(Asn-Xaa-Thr/Ser;NXT/S)、ここで、Xaaはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得、そしてYaaはセリンまたはトレオニンである。
全てのAsn結合型オリゴ糖は、共通の生合成中間体に由来する共通の五糖コア(Man3GlcNAc2)を有する。これらは、分枝の数および末端糖(例えば、フコースおよびシアル酸)の存在が異なる。これらは、それらの分枝構成成分に従って分類され得る。分枝構成成分は、マンノースのみ(高マンノース型Nグリカン);種々の糖配列で終結し、そして分枝するFucおよびコアGlcNAcの鎖内置換の可能性を有する交互のGlcNAc残基およびGal残基(複合型Nグリカン);または高マンノースおよび複合鎖の両方の寄与(ハイブリッド型Nグリカン)から構成され得る。Hounsell,E.F.編、「Glycoprotein Analysis in Biomedicine」,Methods in Molecular Biology 14:298(1993)を参照のこと。
本発明のさらなる目的は、1つ以上のAsn結合型グリコシル化配列を有する一価および多価のSCAを生成することである。多価のSCAについては、2つ以上のSCAの会合が、その形成のために必要である。例えば、多価SCAは、2つのSCAをC末端システイン残基と化学的に架橋することにより(Cumberら、J.Immunol.149:120-126(1992))、および2つのSCAを第3のポリペプチドリンカーと連結して二量体Fvを形成することにより(Georgeら、J.Cell.Biochem.15E:127(1991))、生成され得る。凝集により多価のSCAを生成することについての詳細は、Whitlow,M.ら、Protein Engng.7:1017-1026(1994)において記載されている。本発明の多価の抗原結合融合タンパク質は、任意のプロセスにより作製され得るが、好ましくは、その開示が本明細書に参考として援用されるWO 93/11161に示されている多価の抗原結合タンパク質の作製プロセスに従って作製され得る。
本発明のなおさらなる目的は、Asn残基が2つのアミノ酸残基で隔てられるように、少なくとも2つのトリペプチドグリコシル化配列をタンデムで有する、上記の通りの一価または多価のSCAを生成することである。本発明の別の目的は、Asn残基が隣接するように、少なくとも1セットの2つの重複するトリペプチドグリコシル化配列を有する、上記の通りの一価または多価のSCAを生成することである。本発明の別の目的は、ポリアルキレンオキシドに結合体化した、上記の通りの一価または多価のグリコシル化SCAを生成することである。
N結合型グリコシル化配列の同定および合成
本発明では、トリペプチドグリコシル化コンセンサス配列内のN結合型グリコシル化部位は、VLおよびVH領域、第二のポリペプチドのC末端(VL、VH、またはその隣接部位)、第一のポリペプチドのN末端(VL、VH、またはその隣接部位)、第一のポリペプチド領域と第二のポリペプチド領域との間のリンカー領域で生じ得るか、またはこれらの領域の組み合わせにおいて生じ得る。タンパク質における炭水化物部位の設計は、タンパク質および抗原結合に関与するそのタンパク質における残基について公知の構造情報を調べることを含む。炭水化物部位は、その抗原結合部位の破壊を防止するために可能な限りこれらの残基から遠くになるように選択される。Asn結合型グリコシル化の合成およびプロセシングの総説についてはHubbard,S.C.およびIvatt,R.J.,Ann.Rev.Biochem.50:555-583(1981)を参照のこと。
グリコシル化配列は、以下に隣接して生じ得る:(1)VL(またはVH)のネイティブなC末端残基、(2)VL(またはVH)のC末端(ここでこのC末端は1または複数のアミノ酸残基の欠失を有し、その結果、そのペプチドの残りのN末端アミノ酸残基は、グリコシル化されたポリペプチドが抗原に結合し得るのに十分である)、または(3)VL(またはVH)のC末端(ここでこのC末端残基は1または複数のアミノ酸残基の付加を有し、その結果、グリコシル化ポリペプチドは抗原に結合し得る)。「ネイティブ」によって、天然に存在する免疫グロブリン(第二のポリペプチド)のC末端が意図される。「C末端」によって、ポリペプチドの最初のN末端アミノ酸残基を除く、ポリペプチドのアミノ酸残基の全てに至るまで含み得る、ポリペプチドのC末端アミノ酸残基またはC末端領域が意図されるものとして、当該分野において十分に理解される。しかし、本発明において、「C末端」は、他に示されるか、または意図されない限り、上記の3つのタイプのC末端(1、2、または3)のC末端アミノ酸残基として意図される。
グリコシル化配列は、抗原結合部位に対して正反対であるSCA領域におけるループ部位内の残基で同定され、そして操作された。グリコシル化の好ましい部位として選択された5つのループ領域およびC末端伸長は、結合部位から空間的に離れた最も遠い領域にある。
抗原結合部位から最も遠い6つのSCA部分は、以下の通りである:
1)軽鎖における残基11〜15で構成されるループ;
2)軽鎖における残基77〜79で構成されるループ;
3)リンカーのN末端;
4)重鎖における残基11〜15で構成されるループ;
5)重鎖における残基82B、82C、および83で構成されるループ;および
6)SCAのC末端。
残基は、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interst,第5版,US.Dept.Health and Human Services,Bethesda,MD(1991)によるように同定される。これらの可能なグリコシル化部位は、4-4-20マウスFab構造を調べることにより決定された(その開示が参考として本明細書に援用される、Whitlow,M.ら、Protein Engng.8:749-761(1995)を参照のこと)。
抗原結合部位から最も遠いループを同定した後、それぞれのループの核酸配列およびアミノ酸配列が、ループ領域へと操作され得る可能なN結合型グリコシル化配列について調べられる。最良の部位は、Asn-Xaa-Thr/Serグリコシル化配列を生成するために最少数のアミノ酸変化を要する部位である(その開示が本明細書中で参考として援用されるGavel,Y.およびvon Heijne,G.,Protein Engng.3:433-442(1990)によれば、Thrは、Serの約2倍の頻度で好結果のグリコシル化トリペプチド配列中に生じる)。これは、手動で、またはIntelligenetics,Inc.(Mountain View,CA)からの「GeneWorks」プログラムのような配列相同性規則を用いるコンピュータープログラムを用いて実施され得る。しかし、これらの6個の同定された領域のいずこかにおけるN−X−S/T配列のNの操作された配置は、SCAグリコシル化に好ましい部位を生成し得る。
上記の設計アプローチは、CC49/218 SCAに使用されている。図1は、以下の生成設計物を示す:CC49/218 SCAの軽鎖において設計されたグリコシル化部位番号1および2;CC49/218 SCAのリンカーのN末端において設計されたグリコシル化部位番号3;CC49/218 SCAの重鎖において設計されたグリコシル化部位番号4および5;CC49/218 SCAのC末端に隣接して設計されたグリコシル化部位番号6。これらの6個の部位の任意の組合せが用いられ得る。設計アプローチは、他のSCCA(例えば、それぞれ図6〜8に示されるような、KabatコンセンサスVκI/218/VHIII、C6.5/218、およびA33/218)に用いられ得る。
Asn結合型グリコシル化配列を、種々の位置に導入するために使用される特定のヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列に依存する。最も好ましい部位は、Asn結合型グリコシル化配列の生成のために最小数のアミノ酸変化を要する部位である。例えば、図1におけるグリコシル化配列番号1は、アミノ酸12であるPro(CCT)をAsn(ACC)に変異させて、Asn-Val-SerというAsn結合型グリコシル化配列を生じることにより生成された。同様に、他のAsn結合型配列が生成され得る。もちろん、遺伝コードの重複性に基づいて、特定のアミノ酸は複数のヌクレオチド配列によりコードされ得る。
部位特異的変異誘発が、ネイティブのタンパク質配列を、N結合型グリコシル化のために設計された部位を組み込む配列に変化させるために使用される。変異タンパク質の遺伝子は、タンパク質をグリコシル化し得る発現系(例えば、細菌細胞、酵母細胞、もしくは他の真菌細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞)に配置される。変異体糖タンパク質を均質にグリコシル化する系を見出すことが重要であり得る。変異体糖タンパク質は、標準的な精製方法により精製され得る。
Asn結合型グリコシル化配列を生成するためのオリゴヌクレオチド特異的変異誘発法、およびクローン化されたDNAの変異誘発のための関連技術は、当該分野で周知である。Sambrookら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Ausubelら(編)、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley and Sons(1987)(各々の開示は、本明細書に参考として援用される)を参照のこと。本発明のための好ましいオリゴヌクレオチド特異的変異誘発法は、Hoら、Gene 77:51-59(1989)に従っており、この開示は本明細書に参考として援用される。タンデムなおよび/または重複するグリコシル化配列を生成するために用いられるプライマー配列は、下記の実施例1、材料および方法の節に開示される。
タンデムおよび重複するグリコシル化配列の合成
グリコシル化のために利用可能な遺伝的配列(ポリヌクレオチド)を有する抗原結合単鎖分子(例えば、CC49)は、真核生物細胞(例えば、酵母Pichia)において利用可能な翻訳後プロセスにより炭水化物部分を含むようにされ得る。
gCC49は、グリコシル化遺伝配列を取り込むことにより、最初のクローンCC49/218から誘導された。いくつかのクローンを作製した。
プラスミドpEN270を、Pichia中に形質転換して、gCC49/2と称されるグリコシル化されたCC49タンパク質を分泌するクローンEN279を得た。このクローンは、2つのグリコシル化配列を含んでいた。酵母により生成される遺伝子産物は、50%を超える、発現された全ての抗原結合単鎖分子をグリコシル化形態で有した。
プラスミドpEN271を、Pichia中に形質転換して、gCC49/3と称されるグリコシル化されたCC49タンパク質を分泌するクローンEN280を得た。このクローンは、3つのグリコシル化配列を含んでいた。酵母により生成される遺伝子産物は、90%を超える抗原結合単鎖タンパク質をグリコシル化形態で有した。
C末端に隣接する例示的な1、2、または3個のグリコシル化配列(太字)を有するCC49を以下に提供する。
1個のグリコシル化配列を有するCC49のC末端:
3個のグリコシル化配列を有するCC49のC末端:
C末端に隣接する1個のグリコシル化配列を有するCC49は、グリコシル化配列N−K−T(太字で示したアミノ酸は、グリコシル化部位に必要なアミノ酸である)を含む。C末端に隣接する2個のタンデムなグリコシル化配列を有するCC49もまた示す:N−K−T-N−A−T(配列番号17)。さらに、C末端に隣接する3個の重複しかつタンデムなグリコシル化配列を有するCC49を示す:N−K−T-N−N−T−T(配列番号18)。もちろん、SCAは、3、5、7、もしくは10個のような2個以上(もしくは少なくとも2個)の例えばN結合型グリコシル化配列をタンデムで、または3、5、7、もしくは10個のセットのような1個以上(もしくは少なくとも1個)のセットの、例えば、2つのタンデムな配列を有し得る。SCAは、2、3、5、7、もしくは10個のセットのような1個以上(少なくとも1個)のセットの2つの重複配列を有し得る。
グリコシル化CC49を、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの組合せにより精製した。炭水化物を含まないタンパク質画分を、サイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。
他のタンパク質はまた、タンデムまたは重複するグリコシル化配列の付加により修飾され得る。このようなタンパク質は、ジスルフィドにより安定化されたFvフラグメント(Reiter,Y.ら,Nature Biotech.14:1239-1245(1996)、ラクダ免疫グロブリン(Muyldermans,S.ら,Protein Engng.7:1129-1135(1994))、ガンウイルス、セレクチンのような細胞接着タンパク質、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー(IgG、IgM、IgE、IgD、およびIgAを含む)、ならびに他の免疫グロブリンファミリータンパク質)を含むがこれらに限定されない。治療用酵素(例えば、DNase、RNase、および代謝酵素)、サイトカイン、ホルモン、ならびに増殖因子(例えば、エリトロポイエチン、GCSF(顆粒細胞コロニー刺激因子)、GMCSF(顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子))もまた含まれる。インターロイキン-2、α-インターフェロン、インスリン、ヒト成長ホルモン、および他の血液タンパク質(例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーターならびに第VIII因子および第XI因子)もまた含まれる。さらに、これらの方法は、ワクチン(例えば、B型肝炎ワクチン、AIDSワクチン、ライム病ワクチン、および他の感染性疾患のワクチン)に適用され得る。この技術の使用はまた、このような操作されたN結合型糖タンパク質を含む遺伝子治療ベクター(ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、および細胞性ベクターを含む)の選択的N結合型修飾を含む。
複数のタンデムなおよび/または重複するグリコシル化配列を含有するSCAが、立体障害に遭遇すると予測される互いに近接するかまたは隣接するAsn残基において単一のグリコシル化配列を炭水化物接着物として含有するSCAよりも完全にグリコシル化されることは驚くべきことである。特に、約35〜50%が修飾された単一部位バージョンと比較して、2個の配列バージョンは、50%を超えて修飾され、そして3個の配列バージョンは95%を超えて修飾された。さらに、三重配列バージョンでは、より長いオリゴ糖鎖が存在することが明らかである。従って、本発明は、以下に関する:(1)増加したグリコシル化を有するポリペプチドを生成する方法であって、(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも2個のトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、ここで各トリペプチドグリコシル化配列はAsn-Xaa-Yaaを含み、ここでXaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり、そしてここでトリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が2つのアミノ酸残基により隔てられるようにタンデムである、工程;および(b)ポリヌクレオチドを、Asn残基において炭水化物部分を付着させ得る宿主細胞において発現する工程、を含む方法、ならびに(2)記載されるプロセスにより生成される、増加したグリコシル化部位を有するポリペプチド。
本発明はさらに、以下に関する:(1)増加したグリコシル化を有するポリペプチドを生成する方法であって、(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも1セットの2個のトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、ここで各トリペプチドグリコシル化配列はAsn-Xaa-Yaaを含み、ここでXaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり、そしてここで2個のトリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が隣接するように重複している、工程;および(b)ポリヌクレオチドを、Asn残基において炭水化物部分を付着させ得る宿主細胞において発現する工程、を含む方法、ならびに(2)記載されるプロセスにより生成される、増加したグリコシル化部位を有するポリペプチド。
本発明はまた、以下に関する:(1)増加したグリコシル化を有するポリペプチドを生成する方法であって、(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも2個のトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、ここで各トリペプチドグリコシル化配列はAsn-Xaa-Yaaを含み、ここでXaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり、そしてここで2個のトリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が2個のアミノ酸残基により隔てられるようにタンデムである、工程;(b)このポリヌクレオチドに、少なくとも1セットの2個のトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、ここで2個のトリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が隣接するように重複している、工程;および(c)このポリヌクレオチドを、Asn残基において炭水化物部分を付着させ得る宿主細胞において発現する工程、を含む方法、ならびに(2)記載されるプロセスにより生成される、増加したグリコシル化部位を有するポリペプチド。
宿主およびベクター
「ポリヌクレオチド」により、DNA、RNA、または遺伝的配列が意図される。SCAのヌクレオチド配列を変異させた後、変異型DNAは、さらなる分析のため(例えば、DNA配列の確認のため)にクローニングベクターに挿入され得る。変異型DNA配列によってコードされるポリペプチドを発現させるため、DNA配列は、転写発現を制御する調節配列に作動可能に連結され、そして原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞のいずれかに導入される。
SCAは、代表的には原核生物宿主細胞によって産生されるが、真核生物宿主細胞は好ましい宿主細胞である。好ましい宿主細胞は、植物細胞、酵母もしくは他の真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を含む。標準的なタンパク質精製法は、これらの変異タンパク質を精製するために使用され得る。ネイティブのタンパク質精製スキームにほんのわずかの改変が必要とされ得る。
また、本発明によって、N結合型グリコシル化をし得る操作された配列を有する本発明のSCAをコードするDNA分子(例えば、精製された遺伝的配列またはプラスミドもしくはベクター)が提供される。グリコシル化SCAポリペプチドについてのDNA配列は、植物細胞、原核生物、酵母もしくは他の真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞のような生物体における産生を最適化するために選択され得る。
Asn結合型グリコシル化配列を有するSCAをコードするDNA分子は、その細胞によるグリコシル化SCAタンパク質の発現を可能にするために、発現ベクターに作動可能に連結され、そして宿主細胞に導入され得る。Asn結合型グリコシル化配列を有するSCAをコードするDNA配列は、従来技術に従ってベクターDNAと組換えられ得る。
本発明の単鎖タンパク質を産生するための、組換え宿主およびそれを使用する方法もまた、本明細書中に提供される。
本発明のそのようなSCAタンパク質の発現は、原核生物細胞において達成され得る。好ましい原核生物宿主は、グリコシル化し得る組換え異種酵素を発現する、Neisseria、Mycobacteria、Streptococci、Chlamydia、およびE.coliのような細菌を含むが、これらに限定されない。
本発明のそのようなSCAタンパク質のクローニングおよび発現のための真核生物宿主は、インビボまたは組織培養のいずれかにおいて、昆虫細胞、酵母、真菌、および哺乳動物細胞(例えば、ヒトまたは霊長類細胞)を含む。本発明に好ましい宿主は、Pichia pastorisである。
一価、多価、および融合形態タンパク質(特に、SCAポリペプチド)の、産生、単離、および精製の、適切なDNA分子、宿主、方法は、先行技術に十分に記載されている(例えば、米国特許第4,946,778号、これは、本明細書中において参考として援用される)。
Asn結合型グリコシル化配列および作動可能に連結されたプロモーターを有するSCAコード配列は、非複製DNA(またはRNA)分子(線状分子、またはより好ましくは共有結合閉環分子のいずれかであり得る)のいずれかとしてレシピエント原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。そのような分子は、自律的複製をし得ないので、所望のSCAタンパク質の発現は、導入された配列の一過性発現を介して生じ得る。あるいは、恒久的な発現は、導入されたSCA配列の、宿主染色体への組込みを介して生じ得る。
1つの実施態様において、SCA配列は、宿主細胞染色体へ組み込まれ得る。導入DNAをそれらの染色体に安定に組み込んだ細胞は、SCA配列およびマーカーを含む宿主細胞の選択を可能にする、1つ以上のマーカーを導入することによってもまた選択され得る。マーカーは、宿主における栄養要求性(例えば、his4、leu2、またはura3、これらは、共通の酵母栄養要求性マーカーである)、生物致死耐性(例えば、抗生物質)、または重金属(例えば、銅)に対する耐性などを補充し得る。選択マーカー遺伝子は、発現されるべきSCA DNA配列に直接連結されるか、または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入されるかのいずれかであり得る。
別の実施態様において、導入された配列は、レシピエント宿主細胞において自律的複製をし得るプラスミドベクターに取り込まれる。広範な種々の任意のベクターは、この目的のために使用され得る。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際に重要な因子は、以下を含む:ベクターを含むレシピエント細胞が認識され得、そしてベクターを含まないそれらのレシピエント細胞から選択され得る容易さ;特定の宿主において所望されるベクターのコピー数;および異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」し得ることが望ましいか否か。
任意の一連の酵母ベクター系が利用され得る。そのような発現ベクターの例は、酵母2μ環、発現プラスミドYEP13、YCP、およびYRPなど、またはそれらの誘導体を含む。そのようなプラスミドは、当該分野において周知である(Botsteinら、Miami Wntr.Symp.19:265-274(1982);Broach,J.R.,The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces:Life Cycle and Inheritance,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,445-470頁(1981);Broach,J.R.,Cell 28:203-204(1982))。
哺乳動物宿主について、いくつかの可能なベクター系が発現のために利用可能である。1つのクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、またはSV40ウイルスのような動物のウイルス由来の、自律的複製染色体外プラスミドを提供するDNAエレメントを利用する。第2のクラスのベクターは、宿主染色体への所望の遺伝子配列の組込みに依存する。導入されたDNAをそれらの染色体へ安定に組み込んだ細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする1つ以上のマーカーを導入することによってもまた選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、生物致死性耐性(例えば、抗生物質)、または重金属(例えば、銅)に対する耐性などを提供し得る。選択マーカー遺伝子は、発現されるべきDNA配列に直接的に連結され得るか、または同時形質転換によって同じ細胞に導入され得る。さらなるエレメントはまた、mRNAの最適な合成に必要とされ得る。これらのエレメントは、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含み得る。そのようなエレメントを取り込むcDNA発現ベクターは、Okayama,H.,Mol.Cell.Biol.3:280(1983)などによって記載されるものを含む。
細菌における使用のために好ましいベクターには、pQE70、pQE60、およびpQE-9(Qiagenから入手可能);pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratageneから入手可能);およびptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmaciaから入手可能)が挙げられる。好ましい真核生物ベクターには、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、およびpSG(Stratageneから入手可能);およびpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL(Phamaciaから入手可能)がある。Pichiaにおける発現のために好ましいベクターは、pHIL-S1(Invitrogen Corp.)およびpPIC9(Invitrogen Corp.)である。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
一旦、構築物を含むベクターまたはDNA配列が発現のために調製されると、DNA構築物は、適切な宿主に導入または形質転換され得る。種々の技術(例えば、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション、または他の従来技術)が使用され得る。細胞が、組換えDNA(またはRNA)分子で形質転換された後、細胞は、培地において増殖され、そして適切な活性についてスクリーニングされる。配列の発現は、本発明のグリコシル化SCAの産生を生じる。
代替的なアプローチにおいて、N結合型グリコシル化は、インビトロで、本明細書に記載される変異SCAポリペプチドを精製されたN結合型グリコシル化酵素と反応させ、そしてさらに、このようなグリコシル化されたSCAを他の炭水化物修飾酵素と反応させることにより、達成され得る。
ポリ(アルキレン)−グリコール修飾
本発明の実施において使用される直鎖ポリアルキレングリコールは、以下の構造式のものである:
ここで、Rは、水素、低級アルキル、およびその混合物からなる群から選択され、R1は、水素および低級アルキルからなる群から選択され、そしてnは、正の整数である。「低級アルキル」は、1〜4つの炭素原子を有するアルキル基(すなわち、メチル、エチル、プロピル、ブチル)、および前述の異性体を意味する。Rは、好ましくは、水素、メチル、およびそれらの混合物からなる群から選択され、R1は、好ましくは水素およびメチルからなる群から選択され、そしてnは、好ましくは500以下の正の整数である。Rは、最も好ましくは水素であり、R1は、最も好ましくはメチルであり、そしてnは最も好ましくは7〜150の整数である。本発明の実施において使用される好ましいポリ(アルキレングリコール)が、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)、それらの混合物、およびポリ(エチレングリコール)およびポリ(プロピレングリコール)のコポリマーであり、ここでポリマーの末端のヒドロキシル基の一方が、低級アルキル基で置換され得ることは、当業者には容易に明らかである。本発明における使用のために好ましいポリアルキレングリコールは、ポリ(エチレングリコール)−ヒドラジドである。
簡便のために、本発明の実施において使用されるポリアルキレングリコールは、PAGと命名され、その用語は、R1が水素である化合物、およびR1がアルキルである化合物の両方を含むことが意図される。PEGとは、ポリ(エチレングリコール)をいい、そしてmPEGとはメトキシポリ(エチレングリコール)をいう。
PAGは、特定の分子量である必要はないが、好ましくは分子量は約500〜約40,000の間であり;より好ましくは約2,000〜約20,000の間である。PAGの分子量の選択は、使用される特定のポリペプチドの性質(例えば、修飾のためにポリペプチド上で利用可能なアミノ基または他の基の数)に基づいてなされる。約10,000および約20,000の分子量が最も好ましい。
Zalipskyら、Eur.Pol.J.19(12):1177-1183(1983)は、とりわけ、メトキシポリ(エチレングリコール)と無水コハク酸との反応を記載している:
塩基(例えば、第3級ブタノール中のK第三級ブトキシド、テトラヒドロフラン中のNaナフタレン、またはベンゼン中のブチルリチウム)の存在下で、mPEGをエチルブロモアセテートでアルキル化することもまた公知である:
PEGの末端ヒドロキシル基は、アミン基、カルボキシル基、またはヘキサメチルイソシアネート基に転換され得る。例えば、Zalipskyら、1983、前出を参照のこと。カルボキシル化mPEGの混合無水物誘導体は、トリエチルアミンの存在化で調製され、次いでタンパク質と反応され得る:
カルボキシル化mPEGはまた、タンパク質との反応のためのジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジメチルホルムアミドの存在下で、ヒドロキシスクシンイミドと反応され得る:
KingおよびWeiner(Int.J.Peptide Protein Res.16:147(1980))は、mPEGのジチオカーボネートを記載している:
Beauchampら、Analytical Biochem.131:25-33(1983)は、1,1’-カルボニルジイミダゾールでのPEGの活性化を記載している。ペプチドとのこの誘導体の反応は、カルバメート結合を生じる:
Veroneseら、Appl.Biochem. & Biotechnol.11:141-152(1985)は、フェニルクロロホルメート(例えば、2,4,5,-トリクロロフェニルクロロホルメートまたはp-ニトロフェニルクロロホルメート)でのメトキシポリ(エチレングリコール)の活性化を記載している。これらの誘導体は、ウレタン結合によってペプチドに結合される:
Uenoら(欧州特許出願第87103259.5号)は、脱水低級アルコールの存在下での乾燥塩化水素との反応によって、対応するニトリルからmPEGイミドエステルを形成している。
Abuchowskiら、Cancer Biochem.Biophys.7:175-186(1984)は、上記のようにmPEGスクシネートを形成し、次いでジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下でのヒドロキシスクシンイミドとの反応によってメトキシポリエチレングリコリルスクシンイミジルスクシネート(「SS-PEG」)を形成することを記載している。
Sanoら(欧州特許出願番号89107960.0)は、ペプチドにおけるグアニジノ基を修飾し得る、メトキシポリ(エチレングリコール)のフェニルグリオキサル誘導体を開示している:
Zalipsky(米国特許第5,122,614号)は、そのN-スクシンイミドカーボネート誘導体(「SC-PEG」)への変換によるPEGの活性化を記載している:
Zalipskyら、J.Macromol.Sci.Chem.A21:839は、メトキシポリ(エチレングリコール)のアミノ酸エステル誘導体を開示している:
Davisら(米国特許第4,179,337号)は、アルデヒドおよびケトンならびに他の官能基を修飾し得る、メトキシポリ(エチレングリコール)のヒドラジド誘導体を開示している:
PEGの二官能誘導体(すなわち、ポリエチレングリコール-ビス-スクシニジル(succinidyl)カーボネート(「BSC-PEG」))が類似の手段によって調製され得ることが、さらに開示されている。次いで、SC-PEGおよびBSC-PEG化合物は、タンパク質中のアミン基と反応され、そしてウレタン(カルバメート)結合を介して結合される。
他の活性化PAGもまた、本発明の実施において使用され得ることは、当業者に容易に明らかである。本発明の実施における使用のために好ましい活性化PAGは、PEG-ヒドラジドである。
分岐ポリマー
本発明は、以下の式に対応するSCAタンパク質のPEG化について実質的に非抗原性の分岐ポリマーの使用をさらに提供する:
(R)nL-A (II)
ここで(R)は、水溶性非抗原性ポリマーを含む;
(n)=2または3;
(L)は、それぞれの(R)に共有結合した脂肪族の結合部分である;そして
(A)は、求核置換を起こし得る活性化官能基を表す。例えば、(A)は、生物学的に活性な求核剤を結合できる基であり得、または同じ事を行い得る部分で有り得る。
本発明の特に好ましい局面において、(R)は、ポリ(エチレングリコール)PRGまたはmPEGのようなポリ(アルキレンオキシド)PAOを含む。それぞれの鎖は、約200ダルトンと約12,000ダルトンとの間の分子量を有することが好ましく、そして好ましくは、約1,000ダルトンと約10,000ダルトンとの間の分子量を有する。分子量約5,000ダルトンが、最も好ましい。
式IIに示すように、本明細書において(R)と命名した2または3のポリマー鎖は、脂肪族の結合部分(L)に結合している。適切な脂肪族は、置換アルキルジアミンおよびトリアミン、リジンエステルおよびマロン酸エステル誘導体を含む。結合部分は、好ましくは非平面であり、故にポリマー鎖は、強固に固定されていない。結合部分(L)はまた、複数のポリマー鎖、すなわち「分岐」を(A)に結合するための手段であり、この部分を介してポリマーが、SCAタンパク質に結合する。
(L)は、好ましくは、18まで、そしてより好ましくは1〜10炭素原子を含む多官能基化されたアルキル基を含む。窒素、酸素、イオウのようなヘテロ原子は、アルキル鎖中に含まれ得る。アルキル鎖はまた、炭素原子または窒素原子で分岐され得る。本発明の別の局面において、(L)は、単一の窒素原子である。
(L)および(R)を、好ましくは、(R)および(L)の両方の求核官能基間の反応によって結合する。それぞれの(R)は、(L)と求核置換および結合を起こすために適切に官能基化される。このようなポリマーの官能基化は、当業者において容易に明らかである。
広範囲で種々の(R)と(L)との結合が、意図される。ウレタン(カルバメート)結合が好ましい。結合は、例えば、米国特許第5,122,614号に記載されるようにメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルカーボネートで1,3-ジアミノ-2-プロパノールのようなアミノ基を反応させることによって形成し得る。アミド結合、これは塩化アシル官能基でメトキシポリエチレングリコールアミン(mPEGアミン)のようなアミノ末端化非抗原性ポリマーを反応させることによって形成し得る。他のこのような結合の例は、エーテル、アミン、尿素、ならびにそれらのチオおよびチオールアナログならび上記に記載されるにウレタンおよびアミド結合のチオおよびチオールアナログを含む。
式IIの部分(A)は、生物学的に活性な物質との結合体化のために本発明の分岐ポリマーを「活性化する」基を示す。(A)は、以下から選択される部分であり得る:
1.以下のようなアミノ基と反応し得る官能基:
a)p-ニトロフェニルまたはスクシンイミジルのようなカーボネート;
b)カルボニルイミダゾール;
c)アズラクトン;
d)環状イミドチオン;または
e)イソシアネートもしくはイソチオシアネート。
2.カルボン酸基と反応し得、そして以下のようなカルボニル基と反応性である官能基:
a)一級アミン;または
b)アシルヒドラジド、カルバゼート、セミカルバメート、チオカルバゼートなどのようなヒドラジンおよびヒドラジド官能基。
3.フェニルグリオキサールのようなメルカプトまたはスルフヒドリル基と反応し得る官能基;例えば、米国特許第5,093,531号を参照のこと。
4.求電子性中心と反応し得る他の求核基。非限定的なリストは、例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、活性メチレンなどを含む。
部分(A)はまた、脂肪族結合部分(L)に近位に位置するスペーサー部分を含み得る。スペーサー部分は、18炭素原子まで、またはさらなるポリマー鎖でさえも含む、ヘテロアルキル、アルコキシル、アルキルであり得る。スペーサー部分は、標準的な合成技術を使用して付加し得る。
分岐ポリマー、一般的にU-PAOポリマーまたはU-PEGポリマーは、当業者に公知の通常の反応技術を使用して形成される。
本発明のこれらの傘状に分岐したポリマー(U-PAOポリマーまたはU-PEGポリマー)は、生物学的に活性な求核基と反応させての結合体を形成する。ポリマーの結合点は、官能基(A)に依存する。例えば、(A)は、スクシンイミジルスクシネートまたはカーボネートであり得、そしてε-アミノリジンと反応し得る。分岐ポリマーはまた、生物学的に活性なポリペプチドに見られる任意の一級または二級のアミノ基、メルカプト基、カルボン酸基、反応性カルボニル基などと連結するために活性化され得る。他の基は、当業者にとって明白である。
分岐ポリマーの使用の主な利点の1つは、分岐が、結合する物質に対して傘様の三次元の保護カバーを与えることである。これは、上記に議論した直鎖ポリマーの列様の構造と対照的である。分岐ポリマーのさらなる利点は、ポリマーのいくつかの鎖をSCAタンパク質または炭水化物部分に結合することに関連する利点を提供するが、実質的により少ない結合部位を必要とすることである。PEG化の所望の特性を、実現し、そして生物活性の欠失が最小化される。
1つ以上の活性化分岐ポリマーは、標準的な化学反応により、SCAタンパク質のような生物学的に活性な求核剤と結合し得る。その結合体は、以下の式によって表される:
[(R)nL-A1]2-(求核基) (III)
ここで(R)は、水溶性の実質的に非抗原性のポリマーである;n=2または3;(L)は、脂肪族の結合部分である;(A1)は、(L)と求核基との間の結合を表し、そして(z)は、>1の整数であり、これは生物学的に活性な求核基と結合したポリマーの数を表す。(z)についての上限を、利用可能な求核基結合部位の数および当業者によって探求されるポリマー結合の程度によって決定する。結合の程度は、周知の技術を使用して、反応化学量論を変えることによって改変し得る。求核基に結合した1つより多くのポリマーは、求核基で活性化ポリマーの化学量論的な過剰量と反応することによって得られ得る。
Seaら、Immunoconjugates,Vogel,C.編,Oxford University Press,189頁(1987)(この開示は、本明細書に参考として援用される)に一般的に記載される方法を用いて、活性化PAOは、炭水化物部分に結合され得る。簡潔には、グリコシル化SCAは、過ヨウ素酸ナトリウム(PAOが結合し得るアルデヒド基を提供する)を用いて酸化される。この反応は、ホウ素化水素ナトリウムにより安定化される。ポリペプチドまたはグリコポリペプチドへのPAO結合もまた、例えば、Zalipsky,S.ら、WO92/16555(この開示は、本明細書中に参考として援用される)に記載されている。
結合体
本発明のグリコシル化SCAの生成において、グリコシル化SCAは、SCAの炭水化物部分に診断剤または治療剤を結合することによってさらに修飾され得る。本発明による抗体結合体を調製する一般的な方法は、Shih,L.B.ら、Cancer Res.51:4192(1991);Shih,L.B.,およびD.M.Goldenberg,Cancer Immunol.Immunother.31:197(1990);Shih,L.B.ら、Intl.J.Cancer 46:1101(1990);Shih,L.B.ら、Intl.J.Cancer 41:832(1988)(これらの開示は、全ては本明細書に参考として援用される)に記載される。間接的な方法は、抗体(またはSCA)(それらの炭水化物部分は酸化されている)と、1または複数のペプチド(例えば、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子)を充填したキャリアポリマーとの反応を包含する。
あるいは、グリコシル化SCAは、直接的に診断剤または治療剤に結合し得る。一般的な手順は、診断剤または治療剤が、直接的に酸化型sFv成分に結合することを除いて、間接的な結合体化の方法と類似している。Hansenら、米国特許第5,443,953号(この開示は、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。
グリコシル化SCAは、充填される、特定の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物(addend)または標識の活性形態の誘導体、好ましくは、カルボキシル活性化誘導体(これは、従来の手段、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)またはその水溶性の改変体を用いて調製される)と結合されて、中間体付加物を形成させ得る。
上記に挙げた特定の例に加えて、ヒトに感染し得、そして病巣を生じさせ得る腫瘍細胞または微生物に対する細胞傷害効果を有する多くの薬物および毒素が、公知である。これらは、Merck Indexなどのような薬物および毒素の大要に見い出される。任意のこのような薬物は、当該分野で周知な従来の方法により、キャリアに充填され得るかまたはSCAの炭水化物部分に直接に充填され得、そして上記に記載されるのと同様に、例示され得る。
放射性金属または磁性共鳴エンハンサーについてのキレート剤はまた、当該分野で周知である。エチレンジアミン四酢酸(EDTA)およびジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)の誘導体が代表的である。これらは、代表的に、キレート剤がキャリアに、またはSCAの炭水化物部分に直接結合され得る基を側鎖に有する。このような基には、例えば、ベンジルイソチオシアネートが挙げられ、これによって、DTPAまたはEDTAは、SCAの反応基へと結合され得る。
放射性同位体、酵素、蛍光化合物、電子伝達因子などのような標識はまた、キャリアに、またはSCAの炭水化物部分に直接、当該分野で周知の従来方法によって連結され得る。これらの標識およびそれらから調製されたSCA結合体は、SCAへの標識の直接結合によって調製されたSCA結合体と同様に、免疫アッセイおよび免疫組織学のために使用され得る。しかし、本発明に従う結合体の複数の標識での充填は、アッセイの感度または組織学的手順を増加し得、ここで、標的抗原へのSCAの結合は低い程度しか達成されない。
ホウ素付加物は、例えば、カルボランは、抗原結合単鎖分子に結合され、そして損傷に対して標的化される場合、熱中性子照射によって活性化され得、そして放射性原子へと変換され得、これは、α放射によって崩壊して高度に細胞傷害性の短期の効果を生じ得る。ホウ素付加物および磁性共鳴増強イオンの高度の充填は、これらの効果を強化するのに非常に重要である。カルボランは、当該分野で周知なように、付属の側鎖においてカルボキシル官能基とともに作製され得る。
キャリアへの薬物の充填は、薬物の効力、SCA標的化の効率、および結合体が一旦その標的に達した場合の結合体の効力に依存する。ほとんどの場合、少なくとも20、好ましくは50、およびしばしば100以上の薬物分子がキャリアへ充填されることが望ましい。薬物が循環している間に、結合体としての薬物を本発明に従って部分的または完全に無毒化する能力は、結合体化していない薬物の全身投与が受容されない場合に、薬物の全身性副作用を低減させ得、そしてその使用を可能にさせ得る。本発明に従い、より多くの薬物分子(ただし、キャリア上でSCAと結合体化されている)の投与は、全身毒性を緩和しながら治療を可能にする。
毒素はしばしば、薬物より少ない密度で充填されるが、少なくとも5、好ましくは10、およびいくつかの場合には20以上の毒素分子が、キャリアに充填され、そして標的化送達のためには、少なくとも1つのキャリア鎖がSCAに充填されることがなお有利である。
診断剤または治療剤の上記の結合体はまた、グリコシル化SCAを用いて、ポリアルキレンオキシドと、炭水化物部分および/またはポリマー部分でさらに結合体化されることが意図される。ポリ(エチレングリコール)またはポリ(アルキレンオキシド)の有機低分子との結合体化は、Greenwald、R.B.、Exp.Opin.Ther.Patents 7:601−609(1997)、Enzon Inc.、WO95/11020、およびEnzon Inc.WO96/23794に記載されており、これらの開示はすべて、本明細書において参考として援用される。PEGバラストと活性薬物との間の種々のリンカー基の使用に基づく組成物は、WO96/23794に記載されている。
用途
グリコシル化SCAの主要な有用性の一つは、その二官能性(または、三官能性、四官能性などを含む多官能性)であり、ここで、1つの特異性は、1つのハプテン型または抗原型に対してであり、そして第二の特異性は、第二の分子またはレセプターに対してである。2つの異なる結合特異性を有するグリコシル化SCA分子は、多くの潜在的な用途を有する。例えば、炭水化物部分は、標的細胞(例えば、腫瘍細胞または他の所望されない細胞)の細胞表面エピトープに対して特異的であり得る。抗原結合部位は、エフェクター細胞(例えば、細胞傷害性T細胞のCD3タンパク質)の細胞表面エピトープに対して特異的であり得る。このようにして、グリコシル化SCAタンパク質は、優先的に攻撃されるべき特定のクラスの細胞へと細胞傷害性細胞を導き得る。あるいは、両方とも標的である抗原および炭水化物レセプターは、同一の細胞上に存在し得、その結果、一方の標的が結合特異性を調節し、そして他方の標的が、取り込みまたはインターナリゼーションに影響を与える。
マンノース特異的なレクチンがE.coli、Salmonella、およびPseudomonasのような腸内細菌種の表面線毛上に産生されることが報告されている。このような細菌は、グリコSCAのオリゴ糖に(徹底的に)結合され得る一方で、SCA特異性は、免疫細胞に指向されるか、またはそうでなければ、微生物の除去を促進する。同様に、腫瘍細胞上のマンノース特異的レセプターは、同様の適用を有し得る。細菌レクチンはまた、宿主に対する細胞接着および感染において重要であると考えられており、このことは、別の適用を示唆する。
細胞、ウイルス、または粒子表面上の炭水化物部分は、それらの同一性の主要な決定因子である。細胞、ウイルス、または粒子表面へ結合するSCA特異性を用いること、およびオリゴ炭水化物部分を突出させることは、この分子(entity)に、他の細胞、ウイルス、およびタンパク質との相互作用について新たな性質(identity)を与え得る。
診断剤または治療剤は、抗体に結合体化され、そして診断のためおよび治療のために有用である分子または原子である。この抗体の免疫反応性は保持される。診断剤または治療剤は、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素化合物および検出可能な標識を含む。さらに詳細には前述の「結合体」の節を参照のこと。
診断剤または治療剤は、核酸、化合物、タンパク質、元素、脂質、抗体、糖類、同位元素、炭水化物、造影剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、検出可能プローブ、および抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの任意の組合せから選択される少なくとも1つであり得るが、それらに限定されず、それらは、本明細書に記載のように、抗体を標識するためと同様に検出可能に標識され得る。このような標識は、酵素的標識、放射性同位体または放射性化合物または元素、蛍光化合物もしくは金属、化学発光化合物および生物発光化合物を含むが、それらに限定されない。あるいは、任意の他の公知の診断剤または治療剤が、本発明の方法において使用され得る。
本発明において使用される治療剤は、標的細胞に対する治療効果を有し得、この効果は、欠損遺伝子またはタンパク質の修正、薬物作用、毒性効果、成長刺激効果、成長阻害効果、代謝効果、異化効果、同化効果、抗ウイルス効果、抗菌効果、ホルモン効果、神経液性効果、細胞分化刺激効果、細胞分化阻害効果、神経調節効果、抗新生物効果、抗腫瘍効果、インスリン刺激効果または阻害効果、骨髄刺激効果、多能性幹細胞刺激効果、免疫系刺激効果、および本発明による送達系を介して細胞に送達される治療剤によって提供され得る任意の他の公知の治療効果から選択されるがそれらに限定されない。
SCA結合体は、感染または疾患の防御、抑制または処置のために使用され得る。本明細書に使用されるような、用語、感染または疾患からの「防御」は、「予防」、「抑制」または「処置」を意図する。「予防」は、疾患の誘発の前のグリコシル化SCA結合体の投与を含む。「抑制」は、疾患の臨床的な出現の前の組成物の投与を含む。
「処置」は、疾患の出現後の防御組成物の投与を含む。医学および獣医学においては、「予防」と「抑制」との間を区別することが常に可能であるわけではないことが理解される。なぜなら、最終的な誘発事象が、未知であり、不顕性であるか、または患者が、その事象の出現の十分後になるまで確認されないためである。それ故に、本明細書に定義するように「予防」および「抑制」の両方を包含するために、「処置」とは異なるような用語「予防(prophylaxis)」を使用することが一般的である。本明細書に使用される用語「防御」は、「予防」を含むことが意味される。
本発明の治療剤または組成物をさらに含み得るこのようなさらなる治療剤は、抗生物質、ステロイド、細胞傷害性薬剤、血管作用性薬物、抗体および他の治療様式を含む公知および新規な化合物および組成物から選択され得るが、それらに限定されない。このような薬剤の非限定な例は、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ナフシリン、非経口セファロスポリンなどのような、細菌ショックの処置において使用される抗生物質を含み;メチルプレドニゾロンのような、副腎性コルチコステロイドおよびそのアナログは、内毒素によって生じる細胞傷害を和らげ;αレセプター遮断剤(例えば、フェノキシベンザミン)、βレセプターアゴニスト(例えばイソプロテレノール)、およびドパミンのような血管作用性薬物は、敗血性ショックを処置するために適切な薬剤である。
本発明のグリコシル化SCAはまた、疾患の診断のため、および治療応答をモニターするために使用され得る。グリコシル化SCAタンパク質の他の用途は、腫瘍細胞および酵素に対する特異性を有する二重特異的分子による、腫瘍細胞へのプロドラック活性化酵素の特異的標的化である。グリコシル化SCAは、腫瘍のようなインビボ標的への薬物の特異的な送達、腫瘍放射免疫診断または放射免疫治療のための放射性金属の送達(Goldenberg,D.M.,Am J.Med.94:297(1993))、ホウ素/ウラン中性子捕獲治療(Ranadive,G.N.ら、Nucl.Med.Biol.20:1(1993);Barth,R.F.ら、Bioconjug.Chem.5:58(1994))のような適用における非放射性金属の送達、および核磁気共鳴画像診断(Sieving,P.F.ら、Bioconjug.Chem.1:65(1990))に使用し得る。この列挙は、ただの例示であり、そしてオリゴ糖特異性が適切である任意の用途が本発明の範囲内に含まれる。
本発明はまた、精製およびバイオセンサーにおけるグリコシル化SCAタンパク質のための使用にまで拡張される。アフィニティー精製は、支持体にグリコシル化SCAタンパク質を添加することによって可能にされ、リガンド分子に曝露され、これと接触した抗原結合部位が分離され、従って精製される。バイオセンサーは、抗原結合分子への特異的抗原の結合の際に検出可能なシグナルを生成し、続いてそのシグナルを処理する。グリコシル化SCAタンパク質は、バイオセンサーにおいて抗原結合分子として使用する場合、結合の際にコンフォメーションを変化させ得、従って検出され得るシグナルを生成し得る。
本発明はまた、その炭水化物部分によって標識化されているグリコシル化SCAとサンプルとを接触させることによって、サンプル中に存在すると推測される抗原を検出する方法に関する。1つのサンプルは、少なくとも1つの化合物、混合物、表面、溶液、乳濁液、懸濁液、混合物、細胞培養物、発酵培養物、細胞、組織、分泌物および/またはそれらの誘導物または抽出物を含み得る。
このようなサンプルはまた、例えば、動物組織(例えば、血液、リンパ液、脳脊髄液(CNS)、骨髄、胃腸内容物、ならびに、皮膚、心臓、肺および呼吸系、肝臓、脾臓、腎臓、膵臓、胆嚢、胃腸管、平滑筋、骨格筋または心筋、循環系、生殖器官、聴覚系、自律神経系および中枢神経系の部分、細胞または内分泌物および外分泌物)およびそれらの抽出物または細胞培養物を含み得る。このようなサンプルは、インビトロ、インビボ、およびインサイチュにおいて、本発明の方法を使用して測定され得る。
このようなサンプルはまた、土壌、大気または水のサンプルのような環境サンプル、ならびに、化合物、混合物、表面、水性化学溶液、乳濁液、懸濁液または混合物のような産業的または商業的サンプルを含み得る。
さらに、本発明の方法において使用され得るサンプルは、細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞および昆虫細胞のような、原核生物または真核生物の細胞および/または組織の増殖のために使用される細胞培養培地および発酵培地を含む。
モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはそれらのフラグメントが先行技術によって想起される用途の本質的に全てが、本発明のグリコシル化SCAタンパク質によって取り組まれ得る。これらの用途は、グリコシル化SCAタンパク質の検出可能な標識化形態を含む。標識の型は、当業者に周知である。それらは、放射標識化、化学発光標識化、蛍光色素標識化、および発色団標識化を含む。他の用途は、グリコシル化SCAタンパク質の標識化形態の有効量を投与すること、およびその動物に付随する検出可能放射能を測定することによって、動物(ヒトを含む)の内部構造を造影することを含む。それらはまた、標識化抗体が本発明のグリコシル化SCAタンパク質によって置き換えられ得る、サンドイッチ免疫アッセイ、競合免疫アッセイ、および他の免疫アッセイを含む、改良された免疫アッセイを含む。例えば、Kohlerら、Nature 256:495(1975);Kohlerら、Eur.J.Immunol.6:511(1976);Kohlerら、Eur.J.Immunol.6:292(1976);Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,563-681頁,Elsevier,N(1981);Sambrookら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)を参照のこと。
上記に記載した用途はまた、特に例えば、血流における免疫原性および抗原性の低減ならびにより長期の寿命のために、ポリアルキレンオキシドと結合体化したグリコシル化SCAを用いることも意図される。
投与
インビボ診断および治療適用のための本発明のグリコシル化SCA結合体の投与は、同一または同様の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識の結合体と類似の方法によってであり、ここで、診断または治療成分(principle)が抗体に直接連結されるか、または充填されたキャリアが非部位特異的様式でSCAのアミノ酸残基上のアミン基またはカルボキシル基にランダムに結合することによって連結される。
本発明の結合体(免疫結合体)は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って(例えば、薬学的に受容可能なキャリアビヒクルとの混合によって)処方され得る。適切なビヒクルおよびそれらの処方物は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版、Osol,A.編、Mack,Easton PA(1990)に記載される。有効な投与のために適切な薬学的に受容可能な組成物を形成するために、このような組成物は、単独でまたは適切な量のキャリアビヒクルと共にのいずれかで、治療的有効量の免疫結合体を含む。
さらなる薬学的方法を使用して、作用の持続時間を制御し得る。制御された放出調製物は、本発明の免疫結合体を複合体化または吸着するためのポリマーの使用によって達成され得る。制御された送達は、適切な高分子(例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタミン)を選択することによって行われ得る。薬物放出の速度はまた、このような高分子の濃度を変化させることによって制御され得る。作用の持続を制御するための別の可能性のある方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ(乳酸)またはエチレンビニルアセテート共重合体のような重合体物質の粒子への治療剤の組み込みを含む。あるいは、例えば、コロイド脱混合現象技術、または界面重合(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルもしくはポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルの使用によって)によって調製されたマイクロカプセルにおいて、またはコロイドドラッグデリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル、または巨大エマルジョンにおいて)において、本発明の免疫結合体を包括することは可能である。このような教示は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol,A.編、Mack,Easton PA(1990)に開示される。
免疫結合体は、当該分野で周知の手段によって患者に提供され得る。このような導入の手段は、経口手段、経鼻手段、皮下手段、筋肉内手段、静脈内手段、動脈内手段、または非経口的手段を含む。静脈内投与、動脈内投与、または胸膜内投与は、通常、肺腫瘍、乳房腫瘍、および白血病性腫瘍に対して使用される。腹腔内投与は、卵巣腫瘍に勧められる。くも膜下腔内投与は、脳腫瘍および白血病に勧められる。皮下投与は、ホジキン病、リンパ腫および乳癌に対して勧められる。カテーテル灌流は、転移性肺、乳房または肝臓の胚細胞癌のために有用である。病巣内投与は、肺および乳房病巣のために有用である。
治療的または診断的適用のために、本発明による組成物は、従来の注射用液体キャリア(例えば、滅菌無発熱物質(sterile pyrogen-free)水、滅菌無ペルオキシド(sterile peroxidase-free)オレイン酸エチル、無水アルコール、またはプロピレングリコール)と組み合わせて非経口的に投与され得る。安定化剤、可溶化剤および緩衝液(例えば、エタノール、エチレンジアミン四酢酸のような錯体形成剤、酒石酸およびクエン酸緩衝液)ならびに粘性調節のためのポリエチレンオキシドのような高分子量ポリマーのような注射溶液用の従来の薬学的アジュバントが添加され得る。このような組成物は、筋肉内、腹腔内、または静脈内に注射され得る。
キャリアおよび希釈物のさらなる非制限的な例は、アルブミンおよび/または他の血漿タンパク質成分(例えば、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質およびこれらの血清タンパク質と結合する脂質)を含む。これらの脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、および中性脂質(例えば、トリグリセリド)を含む。脂質キャリアはまた、トコフェロールを含むがこれに限定されない。
本発明による治療剤に連結された少なくとも1つのグリコシル化結合SCAは、これらの意図される目的、例えば種々の症状(例えば、細胞炎症、アレルギー、組織損傷または他の関連する症状)を処置することを達成する任意の手段によって投与され得る。
種々の症状を予防、抑制、または処置するための代表的な投与計画は、1日または数日の間(1週間までおよび1週間と約24ヶ月との間を含む)にわたって投与された、有効な量のSCA結合体の投与を含む。
インビボまたはインビトロで投与された本発明の投薬量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、および体重、併用処置の種類、もしあるなら処置の程度、および所望される効果の性質に依存することが理解される。以下に提供される有効用量の範囲が、本発明を制限することは意図されず、そして好ましい用量範囲を代表する。しかし、最も好ましい投薬量は、過度の実験なく当業者によって理解されそして決定され得るように、個々の被検体に合わせて変更される。例えば、Berkowら編、Merck Manual,第16版、Merck and Co.、Rahway,N.J.(1992);Goodmanら編、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics、第8版、Pergamon Press,Inc.,Elmsford,N.Y.(1990);Avery’s Drug Treatment:Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics,第3版、ADIS Press,LTD.、WilliamsおよびWilkins,Baltimore,MD.(1987),Ebadi,Pharmacology,Little,Brown and Co.,Boston(1985),Katzung,Basic and Clinical Phamacology,Appleton and Lange,Norwalk,Conn.(1992)(これらの参考文献および本明細書中で引用される参考文献は、本明細書中で参考として全体的に援用される)を参照のこと。
各処置に必要な総用量が、複数回用量によってまたは単回用量で投与され得る。本発明の診断的/薬学的化合物または組成物の有効な量は、約0.001μg〜約100mg/kg体重であり、2時間〜5年の期間の間、4〜72時間の間隔で投与されるか、またはその中の任意の範囲または値(例えば、0.01〜1.0、1.0〜10、10〜50および50〜100mg/kgを、1〜4、6〜12、12〜24および24〜72時間の間隔で、0.5、1.0〜2.0、2.0〜4.0および4.0〜7.0日または1、1〜2、2〜4、4〜52もしくはそれより長いの週、または1、2、3〜10、10〜20、20〜60年もしくはそれより長い期間、あるいはそれらの中の任意の範囲または値で投与される)である。
非経口的投与のための調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む(これらは、当該分野で公知である補助薬剤または賦形剤を含み得る)。錠剤およびカプセルのような薬学的組成物はまた、日常的な方法によって調製され得る。例えば、Berker(前出)、Goodman(前出)、Avery(前出)およびEbadi(前出)(これらの開示は、その全体(そこに引用された全ての文献を含む)が本明細書において参考として援用される)を参照のこと。
本発明のSCA結合体の少なくとも1つの型、または本発明のSCA結合体の1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型または10型を含む薬学的組成物は、その意図される目的を達成するために有効な量で含まれ得る。少なくとも1つのSCA結合体に加えて、薬学的組成物は、適切な薬学的に受容可能なキャリア(例えば、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物の加工を容易にする賦形剤、キャリアおよび/または補助剤)を含み得る。
薬学的組成物はまた、静脈内投与、皮下投与、経皮投与、経口投与、粘膜投与、または直腸投与のために適切な溶液を含み得、そして賦形剤と共に、約0.01〜99%、好ましくは約20〜75%の活性成分(すなわちSCA)を含み得る。経口投与のための薬学的組成物は、錠剤およびカプセルを含む。直腸的に投与され得る組成物は座剤を含む。例えば、Berker(前出)、Goodman(前出)、Avery(前出)、およびEbadi(前出)を参照のこと。本明細書中に含まれ得るさらなる脂質およびリポタンパク質ドラッグデリバリーシステムは、Annals N.Y.Acad.Sci.507:775-88、98-103、および252-271(この開示は本明細書中で参考として援用される)でより十分に記載される。
組成物はまた、1つ以上の生理学的に適合性のキャリアまたは賦形剤を含む経口投与可能な組成物へと処方され得、そして固体形態または液体形態であり得る。これらの組成物は、所望される場合、結合剤(例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントまたはポリビニルピロリドン);賦形剤(例えば、ラクトース、マンニトール、デンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール、シクロデキストラン、またはメチルセルロース);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコールのような高分子量ポリマー、ステアリン酸のような高分子量脂肪酸、またはシリカ);デンプンのような崩壊剤;例えばラウリル硫酸ナトリウムのような受容可能な湿潤剤)のような従来の成分を含み得る。
経口組成物は、任意の従来の形態(例えば、錠剤、カプセル、トローチ剤(lozenge)、水性または油性懸濁液、エマルジョン、あるいは使用前に水または他の液体媒体と再構成するために適切な乾燥産物)を想定し得る。当然、液体経口形態は、香料、甘味料、p−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはp−ヒドロキシ安息香酸プロピルのような防腐剤;ソルビトール、グルコースまたは他の糖シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースあるいはゼラチンのような懸濁剤;レシチンまたはソルビタンモノオレエートのような乳化剤、あるいは増粘剤(thickening agent)を含む。非水溶性組成物もまた処方され得、これは例えば、魚肝臓または植物油のような食用油を含む。これらの液体組成物は、例えば単位投薬量でゼラチンカプセルに都合良く封入され得る。
本発明による薬学的組成物はまた、適切な場合、エアロゾルとして、またはクリームまたは軟膏のような従来の基剤で処方されるかのいずれかで局所的に投与され得る。
本発明の薬学的組成物はまた、リポソームのようなコロイド性キャリアに活性成分を組み込むことによって投与され得る。リポソーム技術は当該分野で周知であり、Allisonら、Nature 252:252-254(1974)、およびDancyら、J.Immunol.120:1109-1113(1978)によって記載されている。
上記に記載された組成物の投与はまた、ポリアルキレンオキシドと結合体化したグリコシル化SCAを含む。
本発明を一般的に記載したので、本発明は、以下の実施例を参照すれば、より容易に理解される。実施例は、例示の目的で提供され、限定することは意図しない。
実施例
実施例1.CC49/218におけるAsn結合グリコシル化配列の合成およびグリコシル化SCAの発現
CC49モノクローナル抗体は、National Cancer Instituteの腫瘍免疫学および生物学研究室で、Jeffrey Schlom博士のグループによって開発された。これは、膵臓ガン腫抗原TAG-72に特異的に結合する(Muraro,R.ら、Cancer Res.48:4588-4596(1988))。CC49のSCA遺伝子バージョンは、Milenicら、Cancer Res.51:6363-6371(1991)によって記載されている。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を、図1において示されるDNA配列において示されるように、CC49/218(218リンカーは、前出の「好ましい実施態様の詳細な説明」の節において記載される)において、Asn結合グリコシル化配列を作製するために用いた(すなわち、(1)2つのVL変化;(2)2つのVH変化;(3)1つのリンカー変化;(4)1つのC末端変化)。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発をまた、CC49/218において、2つもしくは3つのタンデムなまたは重複するグリコシル化部位を作製するために用いた。さらに、6つの全ての変化を有する変異体遺伝子、C末端変化以外の5つの変化を有する変異体遺伝子、およびC末端+リンカー変化を有する変異体遺伝子を作製した。これらの変異体CC49遺伝子および変異されていないCC49 SCA遺伝子を、Pichia移入プラスミドpHIL-S1(Invitrogen Corp.)に個々にライゲーションし、そして酵母Pichia pastorisに形質転換した。これらの手順についての詳細なプロトコルは、Invitrogen CorporationからのPichia発現キット使用説明書マニュアルカタログ番号X1710-01(1994)において示される。CC49遺伝子改変体を、これらの構築において酵母シグナル配列の後ろに配置し、そして酵母形質転換体中に取込まれたSCA遺伝子を、SCAタンパク質または糖タンパク質産物の分泌について試験した。発現の評価を、SDS-PAGEゲルのクマシーブルー染色によって行った。
修飾していないCC49/218 SCA(約27kDa)を、組換えPichiaにおいて高レベルで発現(分泌)させた(取込まれる遺伝子のコピー数に依存して約20〜100mg/l)。上記の変異体遺伝子の全ては、約27〜35kDaの範囲におけるタンパク質バンドによって観察されるように、分泌されたグリコ-SCA+グリコシル化されていないSCAの検出可能な(しかし、減少した)発現を与えた。各グリコシル化事象は、Pichiaが、約8〜14残基のオリゴマンノース鎖を、コアN-アセチルグルコサミンに付加することが報告されているので(Cregg,J.M.ら、Bio/Technol.11:905-910(1993))、約2〜3kDaの質量を付加することが予測される。C末端変異体は、発現(分泌)の最も高いレベル、ならびにほぼ等しい割合で約27kDaおよび約30kDaの2つの顕著なバンドを与えた。変異体による分泌されたグリコ-SCAの発現を、表2にまとめる。
これらの結果は、全ての変異体SCAタンパク質のいくつかのグリコシル化が存在し、そしてC末端変異体が、グリコ-SCAの最も高い発現(分泌)を与えたことを示す。この変異体を、より詳細な研究のために選択した。
E.coli GX9251からの精製されたCC49/218 SCAおよびP.pastoris EN225からの未精製の培養上清を、抗原の、ウシ下顎部ムチンへの直接結合について、ELISAによりアッセイした。図2に示すように、E.coliおよびPichiaの両方からの親CC49/218 SCA産物は、ELISAによって、ウシ下顎部ムチンを結合するにおいて活性であることが示された。このことは、Pichiaにおいて産生されるCC49/218 SCAが、活性であることを示す。
C末端+リンカー二重変異体(EN236)CC49/218 SCAを、SDS-PAGEゲルにおいて泳動した(図3)。製造業者によって記載されるように、ダブレットの上部のバンドを、Oxford GlycoSystemsからのGlyco Track炭水化物キットK-050を使用することによって、選択的に染色した。より低い約27kDa(修飾されていない)のバンドは染色されず、約30kDaのバンドが、糖タンパク質であったことを示した。
さらに、C末端変異体(EN235)およびC末端+リンカー二重変異体(EN236)CC49/218 SCAを、ポリペプチド鎖からのアスパラギン結合(N結合型)炭水化物を選択的に切断するペプチド-N-グリコシダーゼ(PNGアーゼ)Fまたはエンド-グリコシダーゼH(Oxford Glycosystems)で消化した。PNGアーゼFまたはエンド-グリコシダーゼH処理後、サンプルを、SDS-PAGEによって分析し、これは、以前のダブレット(約27および約30kDa)が、単一の約27kDaバンドに変換されたことを、クマシー染色によって示した。図3に示されるように、抗CC49 SCAウサギ血清抗体(HRP Inc.)を使用するウエスタン分析によって、C末端変異体、およびC末端+リンカー二重変異体から発現されるタンパク質ダブレットの両方のバンドは、このCC49特異的抗体と反応することが確認された。
C末端変異体CC49/218 SCAダブレットタンパク質を、ウシ下顎部ムチン−Sepharoseアフィニティーカラムに結合し、そして尿素濃度を増加することによって溶出した。図4に示されるように、結合し、溶出したダブレットは、開始サンプルにおけるように、等しい化学量論であるようであり、グリコ-SCAは、ムチン結合特異性を維持することを示す。
EN235培養上清からのCC49/218 SCAを、モル過剰のConA Sepharose樹脂(Pharmacia Biotech)とともにインキュベートした。未結合の上清画分を除去し、そして結合画分を、α-D-メチルマンノシドで溶出した。図5に示されるように、グリコシル化された結合画分は、約30kDaであったが、グリコシル化されていない未結合の画分は、約27kDaであった。
C末端において1つ、2つ、または3つのグリコシル化配列を有するCC49 SCAを、図9において示す。C末端に近接する1つのグリコシル化部位を有するCC49 SCAのウェスタンブロット分析(図9、レーン3および4)は、これが、修飾されたポリペプチド(約30kDaバンド)および修飾されていないポリペプチド(約27kDa)の混合物であることを示す。2つのグリコシル化部位を有するCC49 SCA(図9、レーン5および6)は、より少ない割合の修飾していないポリペプチドを有し、1つおよび2つのグリコシル化部位の種、ならびに高グリコシル化(hyperglycosylated)種(約43kDaバンド)の混合物を有した。3つのグリコシル化部位を有するCC49(図9、レーン7および8)は、事実上、修飾されていないポリペプチドを有さず、2つのグリコシル化部位種および高グリコシル化種の混合物を有した。
3つのグリコシル化配列を含有するSCA(図9、レーン7およびレーン8)は、主に、2つの付着されたオリゴ糖または高グリコシル化種を有した(および事実上、修飾されていないタンパク質を有さなかった)。より高分子量の高グリコシル化種は、3つの部位の付着および/または1つ以上のグリコシル化の部位でのより広範なより長い鎖のオリゴ糖付着の両方を含み得る。
修飾されていないCC49 SCA(E.coli CC49およびP.pastoris EN225)、EN236(1つのC末端グリコシル化配列)、EN279(2つのグリコシル化配列)、ならびにEN280(3つのグリコシル化配列)を、ELISAによって、抗原であるウシ下顎ムチンへの直接的な結合について、アッセイした(図10)。2つのコントロールのBSAおよびGS115(P.pastoris宿主)は、ムチン結合活性をほとんど示さなかった。
材料および方法
材料。CC49/218 SCAの遺伝子を、プラスミドpGX5608(Enzon,Inc.)から得た。CC49/218 SCAの完全なDNA配列は、報告されている(Filpula,D.ら、「1本鎖Fvモノマーおよびマルチマーの生成:Antibody Engineering:A Practical Approach(J.McCafferty,H.HoogenboomおよびD.J.Chiswell編、Oxford University Press,Oxford、UK)、253-268頁(1996))。オリゴヌクレオチドを、Millipore Cyclone DNA Synthesizerを使用して合成した。GlycoTrack炭水化物検出キットK-050、エンドグリコシダーゼH、およびペプチド-N-グリコシダーゼFを、Oxford GlycoSystems(Rosedale、NY)から購入した。予め成形されたポリアクリルアミドスラブゲル(4〜20%)を、Novex Corporation(San Diego,CA)から得た。ウシ下顎部ムチンI型、ブタ下顎部ムチンIII型、およびCNBr-活性化Sepharose 4Bを、Sigma Inc.(St.Louis,MO)から購入した。ConA Sepharoseを、Pharmacia Biotech(Piscataway、NJ)から得た。E.coli GX9251に由来する精製されたCC49/218 SCAタンパク質を、Enzon,Inc.から得た。ウサギ抗CC49/218 SCAポリクローナル抗体を、HRP Inc.から得た(Denver,PA)。マウス抗CC49/218ポリクローナル抗体を、Enzon,Inc.から得た。
SCA遺伝子構築。プラスミドpGX5608からのCC49/218 SCA遺伝子を、Hoら、Gene 77:51-59(1989)の手順を使用して、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって修飾した。N結合型グリコシル化についての6つの指定された変化(N-X-T/S)を、図1において示す。T7 Sequenase version 2.0(Amersham Corporation,Arlington Heights,IL)を使用するDNA配列解析を、製造業者の指示に従って行って、正確な構築を確認した。EcoRI-BamHIフラグメントとして、P.pastorisベクターpHIL-SIに連結可能であるEN235 SCA遺伝子の最終的な構築のために、プライマー対5’-CGGAATTCGACGTCGTGATGTCACAG-3’(配列番号19)および5’-CCAGGATCCTATTAACTGGTCTTGTTGGAGACGGTGACTGA-3’(配列番号20)を、PCR反応において使用した。
2つおよび3つのタンデムなまたは重複するN結合型グリコシル化部位についての指定される変化は、以下のように提供される:
二重のグリコシル化部位を有するCC49のC末端:
三重のグリコシル化部位を有するCC49のC末端:
これらの例示的な部位の構築のために、PCR反応において使用されるプライマー対は、以下のように提供される。
オリゴヌクレオチド5228:ベクターPhilS1のBamHI部位に、CC49のC末端の2つのN結合型グリコシル化部位をクローニングするための3’PCRプライマー:
オリゴヌクレオチド5229:ベクターPhilS1のBamHI部位に、CC49のC末端の3つのN結合型グリコシル化部位を配置するための3’PCRプライマー:
オリゴヌクレオチド5230:ベクターpPic9のEcoRI部位に、CC49のC末端の2つのN結合型グリコシル化を配置するための3’PCRプライマー:
Pichia pastorisにおけるSCAの発現。Pichia発現ベクターpHIL-S1(Invitrogen Corporation)を、修飾されていないSCAおよびグリコシル化されたSCAの両方の発現のために使用した。このベクターは、酵母遺伝子PHO1に由来するシグナル配列を提供し、これは目的の遺伝子に融合される。融合点は、EcoRI部位でである。シグナルプロセシング後、SCAタンパク質の予測されるN末端配列はREFDであり−正常なN末端D(斜字体)は、3つのアミノ酸によって先行される。PhchiaにおけるSCAの生成のための、全てのクローニングおよび発現手順は、Invitrogen Corporation,San Diego,CA(カタログ番号K1710-01;1994)からの「Pichia発現キット使用説明書」において記載されるように行った。pHIL-S1/SCAベクターを用いるP.pastorisGS115の形質転換を、スフェロプラスト形質転換手順によって行い、続いて、His+およびMut-表現型を単離した。BMGYおよびBMMYにおける増殖プロトコルをまた、Invitrogenのマニュアルにおいて記載されるように行った。BMMY培地における、30℃での増殖の48時間後、誘導された培養上清を、遠心分離後に回収した。
SDS-PAGE。SDSの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動を、製造業者の指示に従って、Novex Corporation(San Diego、CA)からの予め成形された4〜20%スラブゲルを使用して行った。タンパク質バンドを、クマシーブルーで染色することによって可視化した。染色したバンドの面積定量を、Molecular Dynamics PD-SIレーザースキャナを使用して行った。
ウェスタン分析。セミ-ドライ法によるゲルからニトロセルロースメンブレンへのタンパク質のトランスファーについてのイムノブロッティング手順を、Harlowら,E. & Lane,D.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,(1998)において記載されるように行った。ブロット発色をまた、このマニュアルにおける手順に従って行った。簡潔には、ブロットされたメンブレンを、室温で、2時間、PBS中の1% BSAブロッキング試薬中でブロックし;PBSで3回洗浄し;そして1:1,000希釈のウサギ抗CC49/218 SCA抗体を含有する、PBS中の3% BSAとともに、4℃で一晩インキュベートした。次に、1:1000希釈の、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGを含有するPBS中の3% BSA溶液を、室温で1時間のインキュベーションにおいて使用した。PBSによる洗浄後、メンブレンを、TMBM-500(MOSS,Inc.)で、室温にて1分間、発色させた。
ムチン−Sepharoseクロマトグラフィー。抗原結合シアノゲンブロミド活性化ビーズの調製のためのプロトコルは、Harlowら,E.およびLane,D.、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、(1988)において記載される。CNBr活性化Sepharose4B(Sigma Corporation、カタログ番号C9412)を、ウシ下顎部ムチン(Sigma、カタログ番号M4503)に結合した。5mgのムチンを、1mlの0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3中に溶解した。CNBr活性化樹脂の2.5gアリコートを、1mM HCl中で膨潤させた。次に、ムチン溶液を、樹脂とともに、1時間、22℃で穏やかに混合した。25mlの上記の結合溶液で未結合のムチンを洗浄した後、Sepharose 4Bムチンを、0.1M Tris-HCl、pH8.0に移した。樹脂を、0.1M 酢酸ナトリウム、pH4.0、0.5M NaCl;および0.1M Tris-HCl、pH8.0、0.5M NaClで、交互に、3サイクル洗浄した。ゲルを、10mlカラムに注ぎ、そして25mlの0.1M Tris-HCl、pH8.0、0.1M NaClで洗浄した。EN235 Pichia培養上清を、4℃で一晩、0.1M Tris-HCl、pH7.4、0.1M NaClに対して透析し、次いで、ムチン-Sepharoseカラム上にロードした。カラムを、0.1M Tris-HCl、pH8.0、0.1M NaClで、OD280=0になるまで洗浄した(約50ml)。結合されたSCAタンパク質の溶出を、10mlの溶出液1(0.1Mクエン酸ナトリウム、pH4.0)、続いて、10mlの溶出液2(8M尿素、0.1M Tris-HCl、pH7.4)を使用することによって行った。結合したSCAは溶出液2中に溶出した。
エンドグリコシダーゼ消化。ペプチド-N-グリコシダーゼFおよびエンド-グリコシダーゼHを、Oxford GlycoSystems(Rosedale,NY)から入手し、そして添付の製品文献に従って、使用した。
糖タンパク質染色。GlycoTrackTM炭水化物検出キット(カタログ番号K-050)をOxford GlycoSystems(Rosedale、NY)から購入し、そして製造業者の使用説明書に従って使用した。
ConA Sepharoseへのグリコ-SCAの結合。ConA Sepharoseを、Pharmacia Biotech(カタログ番号17-0440-03)から入手し、そして製造業者の使用説明書に従って使用した。結合緩衝液(20mM Tris-HCl、pH7.4、0.5M NaCl)中の1mlの樹脂を、50μlの透析したEN235培養上清とともに、30分間、22℃でインキュベートした。ビーズをマイクロ遠心分離によってペレット化し、そして上清を除去した。結合したグリコ-SCAの溶出を、0.2M α-D-メチルマンノシドを含有する結合緩衝液で、樹脂を洗浄することによって、行った。
SCA結合活性についてのELISA。イムノアッセイ手順を、Harlow,E.およびLane,D.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,(1988)からのプロトコルの改変を使用して行った。直接的な結合アッセイを行い、そして用量応答曲線を構築した。ウシ下顎部ムチン(100μlウェル当たり250ng)抗原を使用して、マイクロタイタープレートウェル(MaxiSorp、Nunc、VWR Scientific、Boston、MA)をコートした。EN225または精製したCC49/218 SCAタンパク質を、1% BSAを含有するPBS中で連続的に希釈し、そして22℃で1時間、コートしたウェルにおいてインキュベートした。0.05% Tween 20を含有するPBS(PBS-T)で、プレートを洗浄した後、結合したSCAを、二次抗体(マウス抗CC49/218)とともに1時間インキュベーションし、続いてPBS-Tで洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗マウスIgG抗体とともに1時間インキュベートすることによって、検出した。(図10について、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGを使用した)。シグナル生成を、HarlowおよびLane(597頁)において記載されるように、PNPPを使用して行った。プレートを、Molecular Devices(Sunnyvale、CA)プレート読み取り器を使用して、405nmで読み取った。
実施例2.他のSCAにおけるAsn結合グリコシル化配列の合成
実施例1において記載される方法を使用して、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いて、それぞれ、図6〜8において示されるように、KabatコンセンサスVkI/218/VHIIISCA、C6.5/218 SCA、およびA33/218 SCAの同定されたループ領域における、Asn結合グリコシル化コンセンサス配列を作製する(すなわち、(1)2つのVL変化;(2)2つのVH変化;(3)1つのリンカー変化;(4)1つのC末端変化;または(5)その組合わせ)。VkI/218/VHIIISCAおよびC6.5/218 SCAにおいて、Gavel,Y.およびvon Heijne,G.、Protein Engng.3:433-442(1990)の編集によって推奨されるように、+3位においてトリペプチド配列に隣接するプロリン残基を、アラニンに変化した。KabatコンセンサスVkI/218/VHIIISCAおよびA33/218 SCAのアミノ酸割当ては、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、108および331頁、第5版、U.S.Dept.Health and Human Services、Bethesda、MD(1991)に従い、ここである位置で割当てられたアミノ酸残基は、その位置で最も一般に生じるアミノ酸である。野生型C6.5可変ドメインのアミノ酸割当ては、Schier,R.ら、J.Mol.Biol.255:28-43(1996)に従う。
実施例1の「材料および方法」の節において記載されるように、変異されたSCAを、Pichia移入プラスミドpHIL-S1(Invitrogen Corp.)に、個々に連結し、そしてPichia pastorisに形質転換した。これらの手順についての詳細なプロトコルは、Invitrogen CorporationからのPichia発現キット使用説明書マニュアルカタログ番号X1710-01(1994)において示される。SCA改変体を、これらの構築において酵母シグナル配列の後ろに配置し、そして酵母形質転換体中に取込まれたSCAを、SCAタンパク質または糖タンパク質産物の分泌について試験する。発現の評価を、SDS-PAGEゲルのクマシーブルー染色によって行う。さらなる試験が、実施例1において記載されるように、グリコシル化SCAの発現を確認するためになされ得る。
実施例3.グリコ-CC49の精製
Pichia細胞を、発酵器から採集し、そして5000rpmで40分間、遠心分離した。澄明化された培地を、回収し、そして0.22μmフィルターを通して濾過した。サンプルを、3500の分子量カットオフのメンブレンを用いて、1mS未満の最終伝導率になるまで水に対して透析した。カチオン交換カラム(Poros-HS)を、pH6.15の、15mM Tris-酢酸で平衡化した。サンプルを、pH6.2に調整し、そしてカラム上にロードした。次いで、グリコ-CC49を、Tris-酢酸緩衝液pH7.4中の0.15M NaClの塩濃度で溶出した。次いで、これを、0.15M NaCl、Tris-酢酸緩衝液pH7.4で平衡化したPoros-HQカラムを通過させた。次いで、素通りした物質を、サイズ排除カラム(Pharmacia、Superdex-75)上でプロセスした。25〜35kDaの分子量に対応する画分を、回収した。
実施例4.PEG-ヒドラジドによる、二つの部位−1本鎖gCC49/2の部位特異的PEG化
精製したgCC/2(EN279)を、Tris-HCl、pH7、0.1M NaCl中に2mg/mlに濃縮し、次いで、PEGYLATION緩衝液(0.1M酢酸、pH5.5)中でサイズ排除カラム(Superd-ex-75)を通過させた。過ヨウ素酸ナトリウムを、最終濃度が10mMになるように添加した。サンプルを、室温で、暗所において、1時間、酸化した。反応の終わりに、グリセロールを、5%の最終濃度となるように添加し、そしてサンプルを、サイズ排除カラム上にロードして、未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。次いで、タンパク質を、2mg/mlに濃縮した。
同じ緩衝液中に溶解されたPEG-ヒドラジド(5000分子量)(Shearwater)を、PEG:タンパク質=100:1のモル比で、タンパク質に添加した。反応を、37℃で、振盪しながら、2.5時間、進行させた。
PBS(リン酸緩衝化生理食塩水)中で作製されたホウ化水素ナトリウムを、10mMの最終濃度となるように、反応混合物に添加した。次いで、10分間、室温で、攪拌した。
次いで、反応産物を、SDS-ポリアクリルアミドゲルおよびサイズ排除クロマトグラフィー分析で分析した。反応混合物のSECクロマトグラフィー分析は、低分子量のグリコシル化されていないピーク(これは、PEGYLATIONの前の唯一のピークであった)に加えて、高分子量ピークの出現を示した(図11(a))。図11(b)および12は、PEGYLATION反応は炭水化物部分に特異的であり、そして炭水化物を含有しない1本鎖抗原結合分子に影響しないことを示す。
実施例5.PEG-ヒドラジドによる、3つの部位−1本鎖gCC49/3の部位特異的PEG化
精製したgCC/3(EN280)を、10mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH7中で、2mg/mlに濃縮した。PEGYLATION反応の直前に、1/10容量の1M酢酸ナトリウムpH5.5を添加することによって、pHを5.5に調整した。次いで、酢酸緩衝液pH5.5中に調製された新鮮な過ヨウ素酸ナトリウムを、最終濃度10mMに添加した。次いで、タンパク質を1時間、暗所において、室温で酸化した。反応の終わりに、サンプルをサイズ排除カラムにロードして、未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。次いで、タンパク質を、2.5mg/mlに濃縮した。
タンパク質のモル数よりも140倍モル過剰で、同じ緩衝液中に作製されたPEG-ヒドラジド(5000分子量)(Shearwater)を、タンパク質に添加した。反応は、2.5時間、振盪しながら、室温(25℃)で進行させた。
PBS中のホウ化水素ナトリウムを、反応混合液に10mMの最終濃度で添加し、そして混合物を、10分間、室温で攪拌した。
反応産物を、サイズ排除カラムにおいて分画した。次いで、精製した産物を、SDS-PAGEによって分析した(図13)。修飾されていないかまたはPEGで修飾されたかのいずれかであった、グリコシル化CC49/3のSDS-PAGE分析は、PEG修飾された、グリコシル化CC49/3が、修飾されていない種よりも非常に高い分子量を有することを示す。このことは、グリコシル化CC49/3がまた、PEG化され得ることを示す。
実施例6.グリコ-SCAおよびPEG-グリコ-SCAの循環寿命
Pichia pastoris株EN280から精製された60μgのグルコシル化SCA、または60μgのPEG修飾されたこのグリコ-SCAを、ICR(CD-1)雌性マウス(Harlan約25g、7〜8週齢)に、0時間で静脈内に注射した。マウスを図14において示される時点で採血した。血漿中の保持パーセントをELISA法によって定量した。PEG修飾された結合体について、グリコ-CC49/218 SCAを、分子質量5,000のPEG-ヒドラジドに結合した(プロトコルは、Zalipsky,S.ら、PCT WO 92/16555において記載され、この開示は本明細書中に参考として援用される)。試験したPEG-グリコ-SCA結合体における平均のPEG:SCAのモル比は、約4:1であった。
実施例7.SCAおよびPEG-SCAの血漿保持の薬物動態学
60μgのCC49/218 SCAタンパク質、または60μgのPEG修飾されたSCAタンパク質を、ICR(CD-1)雌性マウス(Harlan約25g、7〜8週齢)に、0時間で静脈内に注射した。マウスを、図15において示される時点で、採血した。血漿中の保持パーセントを、ELISA法によって定量した。PEG修飾された結合体について、CC49/218 SCAを、分子質量20,000のSC-PEGに結合した(プロトコルは、米国特許第5,122,614号において記載され、この開示は本明細書中に参考として援用される)。試験したPEG-SCA結合体における平均のPEG:SCAのモル比は、約1:1であった。
実施例8.グリコシル化およびPEG化CC49 SCAの親和定数(Kd)測定
ビオチン化CC49 SCAを使用して、HarlowおよびLaneによるように、競合ELISA法を行い、親和定数(Kd)を測定した。結果を以下の表3において提供する。
非PEG化CC49 SCA(ネイティブ-CC49)、ビオチン化CC49 SCA(Bio-CC49)、および三重部位グリコシル化CC49 SCA(ネイティブGC;EN280)は、全て、それぞれ、3.6nM、6.2nM、および7.34nMの非常に類似のKd値を有する。三重部位グリコ-SCAのPEG化バージョンは、減少されたが、実質的なムチン結合親和性を示した。SCA(EN280)当たり約3つのPEGポリマーを有するP1B調製物は、48.37nMのKdを有する。約4〜7のPEG/SCA(EN280)モル比を有するP1A調製物は、51.54のKdを示す。8を超えるPEG/SCA(EN280)モル比を有するZ919調製物は、341nMのKdを与える。
実施例9.C末端のN結合型グリコシル化配列の後ろに5残基の付加を有するSCA
本発明者らはすでに、第二のポリペプチドのC末端に近接する、その後ろにただ1つのさらなる残基が続く単一のトリペプチドN結合型グリコシル化配列が、十分なグリコシル化を与えることを確立した。SCAの約50%がグリコシル化される。文献は、C末端のN結合型修飾が稀であることを示すので、本発明者らは、以前に記載される方法(以下)を使用して、5つの後に続く残基の付加が、ただ1つよりもむしろ、より効率的な全体のコアグリコシル化を促進するか否かを調査した。この改変体についてのウェスタンブロットの結果(図16、EN292)は、SCAの90%以上が、見かけ上のコアグリコシル化で修飾され、高グリコシル化の証拠を伴わないことを示す。このことは、N結合型コアグリコシル化を有するグリコ-SCAの生成の改善を提供する。この改変体について使用される遺伝子の配列は、以下のようである。
合計5つアミノ酸が、下線を付す最初のN結合型トリペプチドグリコシル化配列に続く。修飾されていないCC49 SCAの最後の5つの残基を、太字で示す。
実施例10.C末端に近接する3つのタンデムなN結合型グリコシル化配列を有するSCA
本発明者らはすでに、C末端に近接する三重配列改変体(2つのタンデムな部位および1つの重複する部位を含む)が、優勢な高グリコシル化を伴って、ほぼ完全な全体のグリコシル化を生成することを示した。本発明者らは、純粋な3つのタンデムな部位バージョンが、同様な結果を生じるか否かを次に調査することを望んだ。ウェスタンブロット(図16、EN293)において示されるように、3つのタンデムな配列バージョンは、完全な修飾を生成し、これはもっぱら高グリコシル化のカテゴリー内に存在する。これは、ウェスタンにより、以前の三重部位バージョンよりも均一な産物であるようである。しかし、本発明者らの最初の結果は、全体の発現が減少されることを示す。それゆえ、これは、発現が改善され得る場合、三重配列アプローチにおける潜在的な改善であり得る。この改変体の遺伝子配列は、実施例9におけるような表記法を伴って、以下に示される。
実施例11.C末端に近接する2つの重複するグリコシル化配列を有するSCA
本発明者らはすでに、第二のポリペプチドのC末端に近接する2つのタンデムなN結合型トリペプチド配列を有するSCAが、2つの部位のコアグリコシル化および存在するいくつかの高グリコシル化の両方を伴う合計約70〜90%の修飾を生成することを示した。さらに、小量の修飾されていないSCAが観察される。次に、本発明者らはここで、タンデムな配列ではなく重複するトリペプチド配列を有する、C末端に近接する2つのトリペプチド配列バージョンを調査する。ウェスタンブロット(図16、EN294)において見られるように、この改変体は、修飾されていないSCAを生成しなかったが、ウェスタンブロットについて使用されたSDS-PAGEゲルにおけるこれらの産物の分子量によって判断されるように、いくつかの見かけ上の2つの部位のコア修飾を有する高グリコシル化されたSCAを、優勢に生成した。この結果は、Pichiaにおける「高グリコシル化」の現象が、C末端からのただ1つの残基に配置される、最小の重複する2つの部位の配列Asn-Asn-Thr-Thrによって効率的にPichiaにおいて誘導され得ることを示す。対照的に、類似の単一配列バージョンは、相対的により少ない全体の修飾を示し、本質的に検出可能な高グリコシル化を示さなかった。この改変体についての遺伝子配列は、実施例9におけるような表記法を伴って、以下に示される。
実施例12.リンカー領域において3つのN結合型グリコシル化配列を有するSCA
本発明者らは以前に、CC49/218 SCAの218リンカー中に操作された単一のN結合型トリペプチド配列における効率の悪いグリコシル化の証拠を見出した。本発明者らはさらに、218リンカーのSmaI部位に挿入される三重トリペプチド配列のグリコシル化を調査した。ウェスタンブロット(図17、EN290)は、修飾されていないSCA、コア修飾されたSCA、および高グリコシル化されたSCAの不均一な混合物が観察されることを示した。予備的なELISAは、ムチン結合活性の保持を確認する。それゆえ、この結果は、活性なグリコ-SCAは、リンカーにおけるN結合部位を有する、Pichiaから生成され得ることを示す。しかし、本発明者らのC末端データは、全体により完全であるようである。この改変体の遺伝子配列は、以下のようであり、SmaI部位で開かれる隣接する218リンカー配列を、太字で示す。
実施例13.リンカー領域において6つのN結合型グリコシル化配列を有するSCA
本発明者らはまた、218リンカーのSmaI部位に、6つのN結合型配列を挿入した。ウェスタンブロットは、発現は不十分であったが、全体のグリコシル化は完全であると思われる(ほとんどコアI部位であるが)ことを示した。それゆえ、この改変体は、発現レベルが改善され得る場合、価値があり得る。さらにまた、C末端バージョンは、それを用いて研究するのにより容易であり得るようである。この改変体の遺伝子配列は、以下のようであり、SmaI部位で開かれる隣接する218リンカー配列を、太字で示す。
ELISA結果は、上記の実施例9〜13における改変体のそれぞれが、ムチン結合特異性を維持することを示す。ウェスタンブロットのために使用されるクマシー染色したSDS-PAGEゲルをまた、相対的な発現量について調べた。PichiaベクターpHIL-S1を、この研究について以前に記載されるように使用した。
本発明は、本発明またはその任意の実施態様の精神および範囲から逸脱することなく、組成物、濃度、投与の態様、および条件の等価なパラメーターの広範な範囲内で行われ得ることが、当業者によって理解される。
全ての文献(例えば、本明細書中に引用される科学文献、特許、および特許文献)は、各個々の文献が、具体的におよび個々に、その全体が参考として援用されることが示されるのと同じ程度に、その全体が本明細書中に参考として援用される。
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:エンゾン,インコーポレイテッド
キングスブリッジ ロード 20
ピスカタウェイ,ニュージャージー 08854-3963
アメリカ合衆国
(ii)発明の名称:グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用
(iii)配列数:33
(iv)連絡住所:
(A)名称:スターン,ケスラー,ゴールドスタイン アンド フォックス ピー.エル.エル.シー.
(B)番地:ニューヨーク アベニュー 1100,ニューヨーク,スイート 600
(C)市:ワシントン
(D)州:ディーシー
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:20005
(v)コンピューター読み出し形態:
(A)媒体型:フロッピー ディスク
(B)コンピューター:IBM PC 互換用
(C)OS:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:パテントイン リリース #1.0,バージョン #1.30
(vi)現在の出願データ:
(A)出願番号:PCT/US98/08662
(B)出願日:1998年4月30日
(vii)先願データ:
(A)出願番号:US 60/067,341
(B)出願日:1997年12月2日
(vii)先願データ:
(A)出願番号:US 60/063,074
(B)出願日:1997年10月27日
(vii)先願データ:
(A)出願番号:US 60/050,472
(B)出願日:1997年6月23日
(vii)先願データ:
(A)出願番号:US 60/044,449
(B)出願日:1997年4月30日
(viii)代理人/事務所情報:
(A)氏名:ゴールドスタイン,ジョージ エイ.
(B)登録番号:29,021
(C)照会/記録番号:0977.228PC03
(ix)電話回線情報:
(A)電話:(202)371-2600
(B)テレファックス:(202)371-2540
(2)配列番号1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:758塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:両形態
(D)トポロジー:両形態
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..747
(xi)配列:配列番号1:
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:249アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号2:
(2)配列番号3の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:263アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:関連なし
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号3:
(2)配列番号4の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:262アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:関連なし
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号4:
(2)配列番号5の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:245アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
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(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号5:
(2)配列番号6の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:12アミノ酸
(B)型:アミノ酸
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(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号6:
(2)配列番号7の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:14アミノ酸
(B)型:アミノ酸
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(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号7:
(2)配列番号8の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18アミノ酸
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(ii)配列の種類:ペプチド
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(2)配列番号9の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:12アミノ酸
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(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号9:
(2)配列番号10の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18アミノ酸
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(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号10:
(2)配列番号11の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
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(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..27
(xi)配列:配列番号11:
(2)配列番号12の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
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(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号12:
(2)配列番号13の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:47塩基対
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(D)トポロジー:両形態
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..36
(xi)配列:配列番号13:
(2)配列番号14の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:12アミノ酸
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(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号14:
(2)配列番号15の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:48塩基対
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(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..39
(xi)配列:配列番号15:
(2)配列番号16の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:13アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号16:
(2)配列番号17の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:6アミノ酸
(B)型:アミノ酸
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(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号17:
(2)配列番号18の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:7アミノ酸
(B)型:アミノ酸
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(D)トポロジー:関連なし
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号18:
(2)配列番号19の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:26塩基対
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(ii)配列の種類:cDNA
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(2)配列番号20の情報:
(i)配列の特徴:
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(ii)配列の種類:cDNA
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(2)配列番号21の情報:
(i)配列の特徴:
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(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号21:
(2)配列番号22の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:46塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:両形態
(D)トポロジー:両形態
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号22:
(2)配列番号23の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:45塩基対
(B)型:核酸
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(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号23:
(2)配列番号24の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:両形態
(D)トポロジー:両形態
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..39
(xi)配列:配列番号24:
(2)配列番号25の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:13アミノ酸
(B)型:アミノ酸
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(ii)配列の種類:タンパク質
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(2)配列番号26の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:48塩基対
(B)型:核酸
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(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..45
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(2)配列番号27の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:15アミノ酸
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(ii)配列の種類:タンパク質
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(2)配列番号28の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:両形態
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(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
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(xi)配列:配列番号28:
(2)配列番号29の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:13アミノ酸
(B)型:アミノ酸
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(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号29:
(2)配列番号30の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:27塩基対
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(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..27
(xi)配列:配列番号30:
(2)配列番号31の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号31:
(2)配列番号32の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:48塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:両形態
(D)トポロジー:両形態
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
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(xi)配列:配列番号32:
(2)配列番号33の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:16アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号33:
Claims (94)
- 抗原結合単鎖ポリペプチドであって、以下:
(a)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む、第一のポリペプチドであって、該第一のポリペプチドは、該抗原結合単鎖ポリペプチドのN末端に配置される、第一のポリペプチド;
(b)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む、第二のポリペプチドであって、該第二のポリペプチドは、該抗原結合単鎖ポリペプチドのC末端に配置される、第二のポリペプチド;ならびに
(c)該第一のポリペプチド(a)および該第二のポリペプチド(b)を連結して、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドにするペプチドリンカー
を含み、
ここで、該抗原結合単鎖ポリペプチドは、Asn−Xaa−Yaaを含む少なくとも3つのトリペプチドAsn結合型グリコシル化アミノ酸残基を有し、ここでXaaはプロリン以外のアミノ酸であり、Yaaはトレオニンまたはセリンであり、該Asn残基は、該第二のポリペプチド(b)のC末端アミノ酸残基に隣接するアミノ酸配列中のアミノ酸位置に存在する、
ポリペプチド。 - 前記Asn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデムな少なくとも2つの前記トリペプチドグリコシル化アミノ酸残基を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記Asn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデムな3つの前記トリペプチドグリコシル化アミノ酸残基を有する、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記Asn残基が隣接するように、少なくとも1セットの2つの重複する前記トリペプチドグリコシル化アミノ酸残基を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- (A)前記Asn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデムな少なくとも2つの前記トリペプチドグリコシル化アミノ酸残基、および(B)該Asn残基が隣接するように、少なくとも1セットの2つの重複する該トリペプチドグリコシル化アミノ酸残基を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 少なくとも2セットの2つのタンデムな前記トリペプチドグリコシル化アミノ酸残基、および少なくとも2セットの2つの重複する該トリペプチドグリコシル化アミノ酸残基を有する、請求項5に記載のポリペプチド。
- 前記第一のポリペプチド(a)が抗体軽鎖の可変領域の抗体結合部分を含み、そして前記第二のポリペプチド(b)が抗体重鎖の可変領域の抗原結合部分を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記第二のポリペプチド(b)のC末端が、該第二のポリペプチド(b)のネイティブなC末端である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記第二のポリペプチド(b)のC末端は、該第二のポリペプチドの残りのN末端アミノ酸残基が、前記グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドが抗原を結合し得るのに十分であるように、該第二のポリペプチド(b)のネイティブなC末端に由来する1または複数のアミノ酸残基の欠失を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記第二のポリペプチド(b)のC末端は、前記グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドが抗原を結合し得るように、該第二のポリペプチド(b)のネイティブなC末端に1または複数のアミノ酸残基の付加を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記グリコシル化アミノ酸残基の前記少なくとも3つのAsn残基が前記第二のポリペプチド(b)のC末端の近傍に位置し、そして該グリコシル化アミノ酸残基には少なくとも1つのアミノ酸残基が続く、請求項9に記載のポリペプチド。
- 前記グリコシル化配列には5つのアミノ酸残基が続く、請求項11に記載のポリペプチド。
- 前記トリペプチドグリコシル化アミノ酸残基の前記少なくとも3つのAsn残基が、炭水化物部分に結合される、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記炭水化物部分が、
(a)1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子に結合体化されているか、あるいは
(b)キャリアに結合体化されており、該キャリアが、該キャリアに結合した、1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子を有する、
請求項13に記載のポリペプチド。 - 前記炭水化物部分がポリアルキレンオキシド部分と結合体化されている、請求項13に記載のポリペプチド。
- 前記ポリアルキレンオキシド部分が、
(a)1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子と結合体化されているか、あるいは
(b)キャリアに結合体化されており、該キャリアが、該キャリアに結合した、1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子を有する、
請求項15に記載のポリペプチド。 - 前記グリコシル化アミノ酸残基の前記少なくとも3つのAsn残基が前記第二のポリペプチド(b)のC末端に隣接して位置し、そして該グリコシル化アミノ酸残基には少なくとも1つのアミノ酸残基が続く、請求項9または10に記載のポリペプチド。
- 前記グリコシル化アミノ酸残基には5つのアミノ酸残基が続く、請求項17に記載のポリペプチド。
- サンプル中に存在すると疑われる抗原を検出する方法であって、以下の工程:
(a)該サンプルと請求項13に記載のポリペプチドとを接触させる工程であって、ここで前記炭水化物部分が、1または複数の検出可能な標識分子と結合体化されているか、またはキャリアと結合体化されており、該キャリアは、該キャリアに結合した1または複数の検出可能な標識分子を有する、工程;ならびに
(b)前記グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドまたはタンパク質が該抗原と結合したかどうかを検出する工程、
を包含する、方法。 - 診断を補助するために動物の内部構造を画像化するための組成物であって、該組成物は、請求項13に記載のポリペプチドの有効量を含み、ここで、前記炭水化物部分が、1または複数の検出可能な標識分子またはキレート剤分子と結合体化されているか、またはキャリアと結合体化されており、該キャリアは該キャリアに結合した1または複数の検出可能な標識分子またはキレート剤分子を有し;ここで該動物に関連する検出可能な放射線が測定されることが可能となる、組成物。
- 前記動物がヒトを含む、請求項20に記載の組成物。
- 標的化された疾患を処置するための、請求項13に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアビヒクルを含む組成物であって、ここで前記炭水化物部分が、1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、ホウ素付加物、または放射性同位体分子と結合体化されているか、またはキャリアに結合体化されており、該キャリアが、該キャリアに結合した、1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、ホウ素付加物、または放射性同位体分子を有する、組成物。
- 抗原結合単鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下
(a)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む、第一のポリペプチドであって、該第一のポリペプチドは、該抗原結合単鎖ポリペプチドのN末端に配置される、第一のポリペプチド;
(b)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む、第二のポリペプチドであって、該第二のポリペプチドは、該抗原結合単鎖ポリペプチドのC末端に配置される、第二のポリペプチド;ならびに
(c)該第一のポリペプチド(a)および該第二のポリペプチド(b)を連結して、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドにするペプチドリンカー
を含み、
ここで、該コードされる抗原結合単鎖ポリペプチドが、Asn−Xaa−Yaaを含む、少なくとも3つのトリペプチドを含み、ここで、Xaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり、該トリペプチドのAsn残基は、該第二のポリペプチド(b)のC末端に隣接するアミノ酸位置に位置し、
ここで、該コードされる抗原結合単鎖ポリペプチドは、適切な宿主細胞により発現される場合、該トリペプチドのAsn残基においてグリコシル化される、
ポリヌクレオチド。 - 前記コードされる抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記トリペプチドのそれぞれのAsn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデムな少なくとも2つのトリペプチドを含む、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- 前記コードされる抗原結合単鎖ポリペプチドが、タンデムな3つの前記トリペプチドを有する、請求項24に記載のポリヌクレオチド。
- 前記コードされる抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記トリペプチドのそれぞれのAsn残基が隣接するように、少なくとも1セットの2つの重複する前記トリペプチドを含む、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- 前記コードされる抗原結合単鎖ポリペプチドが、
(A)前記それぞれのトリペプチドの各Asn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデムな少なくとも2つの前記トリペプチド、および
(B)該それぞれのトリペプチドの各Asn残基が隣接するように、少なくとも1セットの2つの重複する該トリペプチド、
を含む、請求項23に記載のポリヌクレオチド。 - 前記コードされる抗原結合単鎖ポリペプチドが、少なくとも2セットの2つのタンデムな前記トリペプチド、および少なくとも2セットの2つの重複する該トリペプチドを有する、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- 前記コードされる抗原結合単鎖ポリペプチドの第二のポリペプチドは、該第二のポリペプチドのネイティブなC末端である、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第二のポリペプチドのC末端は、前記コードされた抗原結合単鎖ポリペプチドがグリコシル化される場合、該第二のポリペプチドの残りのN末端アミノ酸残基が、該抗原結合単鎖ポリペプチドが抗原を結合し得るのに十分であるように、1または複数のアミノ酸残基の欠失を含む、請求項29に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第二のポリペプチドのC末端は、前記コードされた抗原結合単鎖ポリペプチドがグリコシル化される場合、該抗原結合単鎖ポリペプチドが抗原を結合し得るように、1または複数のアミノ酸残基の付加を含む、請求項29に記載のポリヌクレオチド。
- 前記少なくとも2つのAsn残基の一つが前記第二のポリペプチドのC末端に隣接して位置し、そして該C末端トリペプチドには少なくとも1つのさらなるアミノ酸残基が続く、請求項29、30、または31に記載のポリヌクレオチド。
- 前記C末端トリペプチドには5つのアミノ酸残基が続く、請求項32に記載のポリヌクレオチド。
- DNAまたはRNAである、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項23に記載のポリヌクレオチドを含む、複製可能なクローニングまたは発現ベクター。
- プラスミドである、請求項35に記載のベクター。
- 請求項35に記載のベクターで形質転換した、単離された宿主細胞。
- 植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞株の細胞からなる群より選択される、請求項35に記載のベクターで形質転換した、宿主細胞。
- 酵母細胞である、請求項38に記載の宿主細胞。
- グリコシル化される抗原結合単鎖ポリペプチドを産生する方法であって、請求項35に記載のベクターを含む宿主細胞を培養して、該グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドを産生する工程を包含する、方法。
- 前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記それぞれのトリペプチドのAsn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデムな少なくとも2つの前記トリペプチドグリコシル化配列を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記それぞれのトリペプチドのAsn残基が隣接するように、少なくとも1セットの2つの重複する前記トリペプチドグリコシル化配列を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、
(A)前記それぞれのトリペプチドのAsn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデムな少なくとも2つの前記トリペプチドグリコシル化配列、および
(B)該それぞれのトリペプチドのAsn残基が隣接するように、少なくとも1セットの2つの重複する該トリペプチドグリコシル化配列、
を含む、請求項40に記載の方法。 - 前記宿主細胞がグリコシル化を触媒し得る、請求項40に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞株の細胞からなる群より選択される、請求項44に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、Pichia pastorisである、請求項45に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドによってコードされる第一のポリペプチドが、抗体の軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含み、そして前記ポリヌクレオチドによってコードされる第二のポリペプチドが、抗体の重鎖の可変領域の抗原結合部分を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記第二のポリペプチドは、該第二のペプチドのネイティブなC末端である、請求項40に記載の方法。
- 前記第二のポリペプチドは、該第二のポリペプチドの残りのN末端アミノ酸残基が、前記グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドが抗原を結合し得るのに十分であるように、1または複数のアミノ酸残基の欠失を含むC末端を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記第二のポリペプチドが、前記グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドが抗原を結合し得るように、1または複数のアミノ酸残基の付加を含むC末端を含む、請求項40に記載の方法。
- グリコシル化を増大したポリペプチドを産生する方法であって、
以下:
(a)請求項23に記載のポリヌクレオチドを提供する工程であって、ここでコードされるポリペプチドは、Asn−Xaa−Yaaを含む少なくとも3つのトリペプチドを含み、ここで、Xaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり、該トリペプチドは、各それぞれのトリペプチドのAsn残基が隣接するように、2つのトリペプチドが重複する、工程;
(b)前記Asn残基における炭水化物部分を結合し得る宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現する工程を包含し、該Asn残基は、該ポリペプチドのC末端アミノ酸残基に隣接するアミノ酸配列のアミノ酸位置に配置される、方法。 - 増加したグリコシル化を有するポリペプチドを産生する方法であって、以下:
(a)請求項23に記載のポリヌクレオチドを提供する工程であって、ここでコードされるポリペプチドは、Asn−Xaa−Yaaを含む、少なくとも2セットの2つのトリペプチドを含み、ここでXaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり、そしてここで2つのトリペプチドは、該それぞれのトリペプチドのAsn残基が隣接するように重複する、工程、および
(b)該Asn残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞中で該ポリヌクレオチドを発現させる工程、
を包含し、該Asn残基は、該ポリペプチドのC末端アミノ酸残基に隣接するアミノ酸配列のアミノ酸位置に配置される、方法。 - 増加したグリコシル化を有するポリペプチドを産生する方法であって、以下の工程:
(a)請求項23に記載のポリヌクレオチドを提供する工程であって、該コードされるポリペプチドは、Asn−Xaa−Yaaを含む、少なくとも2つのトリペプチドを含み、ここでXaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり、そしてここで該トリペプチドは、該それぞれのトリペプチドのAsn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるようにタンデムである、工程;および
(b)少なくとも1セットの2つのトリペプチドグリコシル化配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する工程であって、ここで該2つのトリペプチドグリコシル化配列は、該それぞれのトリペプチドのAsn残基が隣接するように重複する、工程;および
(c)該Asn残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞中で該ポリヌクレオチドを発現させる工程を包含し、
該Asn残基は、該ポリペプチドのC末端アミノ酸残基に隣接するアミノ酸配列のアミノ酸位置に配置される、方法。 - 前記ペプチドリンカーは、長さが2〜50個のアミノ酸残基の範囲である、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ペプチドリンカーは、長さが10〜30個のアミノ酸残基の範囲である、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ペプチドリンカーは、長さが10個未満のアミノ酸残基である、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- Pichia pastorisである、請求項39に記載の宿主細胞。
- 植物細胞または真菌細胞である、請求項38に記載の宿主細胞。
- Neisseria、Mycobacteria、Streptococci、Chlamydia、およびEscherichiacoliからなる群より選択される細菌細胞である、請求項38に記載の宿主細胞。
- Escherichia coliである、請求項38に記載の宿主細胞。
- Escherichia coli株GX9251またはP.pastoris EN225である、請求項38に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が植物細胞または真菌細胞である、請求項45に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、Neisseria、Mycobacteria、Streptococci、Chlamydia、およびEscherichiacoliからなる群より選択される細菌である、請求項45に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、Escherichia coliである、請求項45に記載の方法。
- 酵母2μ環、発現プラスミドYEP13、YCP、およびYRPからなる群より選択される、請求項35に記載の複製可能なクローニングまたは発現ベクター。
- PQE70、PQE60およびPQE-9、pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptre99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5からなる群より選択される、請求項35に記載の複製可能なクローニングまたは発現ベクター。
- pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLからなる群より選択される真核生物ベクターである、請求項35に記載の複製可能なクローニングまたは発現ベクター。
- pHIL-S1およびpPIC9からなる群より選択される、請求項35に記載の複製可能なクローニングまたは発現ベクター。
- 前記宿主細胞は、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞株の細胞からなる群より選択される、請求項51、52および53に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、P.pastorisまたはEscherichia coliである、請求項51、52および53に記載の方法。
- 2つ以上の抗原結合単鎖ポリペプチドを含む多価抗原結合単鎖タンパク質であって、各抗原結合単鎖ポリペプチドは以下:
(a)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第一のポリペプチドであって、該第一のポリペプチドは、該抗原結合単鎖ポリペプチドのN末端に配置される、第一のポリペプチド;
(b)抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第二のポリペプチドであって、該第二のポリペプチドは、該抗原結合単鎖ポリペプチドのC末端に配置される、第二のポリペプチド;ならびに
(c)該第一のポリペプチド(a)および該第二のポリペプチド(b)を連結して、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドにするペプチドリンカー
を含み、
ここで、該抗原結合単鎖ポリペプチドは、Asn−Xaa−Yaaを含む少なくとも3つのトリペプチドを含み、ここで、Xaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり;該トリペプチドのAsn残基は、該第二のポリペプチドのC末端に隣接するアミノ酸位置に位置し、そして
ここで、該抗原結合単鎖ポリペプチドのうちの少なくとも1つは、該ポリペプチドが適切な宿主細胞によって発現される場合に、該トリペプチドのAsn残基でグリコシル化され得る、
多価タンパク質。 - 少なくとも1つの前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記トリペプチドのそれぞれのAsn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデムな少なくとも2つの前記トリペプチドを含む、請求項71に記載の多価タンパク質。
- 少なくとも1つの前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記トリペプチドのそれぞれのAsn残基が隣接するように、少なくとも1セットの2つの重複する前記トリペプチドを含む、請求項71に記載の多価タンパク質。
- 少なくとも1つの前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、
(A)前記Asn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられる、タンデムな少なくとも2つの前記トリペプチド、および
(B)該トリペプチドのそれぞれのAsn残基が隣接するように、少なくとも1セットの2つの重複する該トリペプチド、
を有する、請求項71に記載の多価タンパク質。 - 前記第一のポリペプチドが抗体軽鎖の可変領域の抗体結合部分を含み、そして前記第二のポリペプチドが抗体重鎖の可変領域の抗原結合部分を含む、請求項71に記載の多価タンパク質。
- 少なくとも1つの抗原結合単鎖ポリペプチドが前記第二のポリペプチドのネイティブなC末端を含む、請求項71に記載の多価タンパク質。
- 前記第二のポリペプチドのC末端は、前記それぞれの抗原結合単鎖ポリペプチドがグリコシル化される場合、該第二のポリペプチドの残りのN末端アミノ酸残基が、前記グリコシル化された多価タンパク質が抗原を結合し得るのに十分であるように、1または複数のアミノ酸残基の欠失を含む、請求項76に記載の多価タンパク質。
- 前記第二のポリペプチドに対してネイティブなC末端は、それぞれの抗原結合単鎖ポリペプチドがグリコシル化される場合、前記グリコシル化された多価タンパク質が抗原を結合し得るように、1または複数のアミノ酸残基の付加を含む、請求項76に記載の多価タンパク質。
- 少なくとも1つの前記トリペプチドの前記Asn残基が、ポリアルキレンオキシド結合体化し得る炭水化物部分に結合される、請求項71に記載の多価タンパク質。
- 前記炭水化物部分が:
(a)1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子に結合体化されている;または
(b)キャリアに結合体化されており、該キャリアが、該キャリアに結合した、1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子を有する、
請求項79に記載の多価タンパク質。 - 前記炭水化物部分がポリアルキレンオキシド部分と結合体化されて、多価タンパク質−ポリアルキレンオキシド結合体を形成する、請求項79に記載の多価タンパク質。
- 前記ポリアルキレンオキシド部分が、1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子と結合体化されている、請求項81に記載の多価タンパク質。
- 前記ポリアルキレンオキシド部分が、キャリアに結合体化されており、該キャリアが、該キャリアに結合した、1または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子を有する、請求項81に記載の多価タンパク質。
- 以下の工程:
(a)請求項23に記載のポリヌクレオチドを提供する工程であって、ここでコードされるポリペプチドは、Asn−Xaa−Yaaを含む、少なくとも2セットの2つのトリペプチドを含み、ここでXaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり、そしてここで該トリペプチドは、該それぞれのトリペプチドのAsn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるようにタンデムである、工程;
(b)該トリペプチドAsn残基で炭水化物部分に結合し得る宿主細胞を、該ポリヌクレオチドで形質転換する工程;および
(c)該宿主細胞を該ポリペプチドを発現するに有効な条件下で培養する工程を包含し、該Asn残基は、該ポリペプチドのC末端アミノ酸残基に隣接するアミノ酸配列のアミノ酸位置に配置される、方法によって産生される増加したグリコシル化を有するポリペプチド。 - 以下の工程:
(a)請求項23に記載のポリヌクレオチドを提供する工程であって、ここでコードされるポリペプチドは、Asn−Xaa−Yaaを含む、少なくとも2セットの2つのトリペプチドを含み、ここでXaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり、そしてここで該2つのトリペプチドは、該それぞれのトリペプチドのAsn残基が隣接するように重複する工程;
(b)該トリペプチドAsn残基で炭水化物部分に結合し得る宿主細胞を、該ポリヌクレオチドで形質転換する工程;および
(c)該宿主細胞を該ポリペプチドを発現するに有効な条件下で培養する工程
を包含し、該Asn残基は、該ポリペプチドのC末端アミノ酸残基に隣接するアミノ酸配列のアミノ酸位置に配置される、方法によって産生される増加したグリコシル化を有するポリペプチド。 - 以下の工程:
(a)請求項23に記載のポリヌクレオチドを提供する工程であって、ここでコードされるポリペプチドは、Asn−Xaa−Yaaを含む、少なくとも3つのトリペプチドを含み、ここでXaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり、そしてここで該2つのトリペプチドは、該それぞれのトリペプチドのAsn残基が2つのアミノ酸残基によって隔てられるようにタンデムである、工程;
(b)少なくともさらに1セットの2つのトリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する工程であって、ここで該2つのさらなるトリペプチドは、該それぞれのトリペプチドのAsn残基が隣接するように重複する、工程;
(c)該トリペプチドAsn残基で炭水化物部分に結合し得る宿主細胞を、該ポリヌクレオチドで形質転換する工程;および
(d)該宿主細胞を該ポリペプチドを発現するに有効な条件下で培養する工程
を包含し、該Asn残基は、該ポリペプチドのC末端アミノ酸残基に隣接するアミノ酸配列のアミノ酸位置に配置される、方法によって産生される増加したグリコシル化を有するポリペプチド。 - 前記ポリアルキレンオキシドは、500〜約40,000kDaのサイズ範囲である、請求項81に記載の多価タンパク質−ポリアルキレンオキシド結合体。
- 前記ポリアルキレンオキンドは、2,000〜約20,000kDaのサイズ範囲である、請求項81に記載の多価タンパク質。
- 前記ポリアルキレンオキシドはポリエチレングリコールである、請求項81に記載の多価タンパク質。
- 前記ポリアルキレンオキシドは分枝状である、請求項81に記載の多価タンパク質。
- 2つの分枝を有するポリアルキレンオキシドポリマーを含む、請求項90に記載の多価タンパク質。
- 前記ペプチドリンカーは、長さが2〜50個のアミノ酸残基の範囲である、請求項71に記載の多価抗原結合タンパク質。
- 前記ペプチドリンカーは、長さが10〜30個のアミノ酸残基の範囲である、請求項71に記載の多価抗原結合タンパク質。
- 前記ペプチドリンカーは、長さが10個未満のアミノ酸残基である、請求項71に記載の多価抗原結合タンパク質。
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