JP2023548034A - デルタ様リガンド３（ｄｌｌ３）抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用 - Google Patents

デルタ様リガンド３（ｄｌｌ３）抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用 Download PDF

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マクデビット，テレサ
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エム． スミス，リャン
ズウォラック，アダム
ヴェンカタラマニ，サチャデヴィ
ディー． パワーズ，ゴードン
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Abstract

デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）に結合する抗体及び抗原結合領域が記載される。ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物、例えば二重特異性抗体も記載される。本出願はまた、抗ＤＬＬ３抗体、その抗原結合性断片、又は多重特異性抗原結合構築物を使用した治療又は検出の方法、並びに関連する分子、組成物、及び方法も記載する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年１０月２２日に出願された米国仮出願第６３／０９４，９３３号及び２０２０年１０月２２日に出願された米国仮出願第６３／０９４，９３４号に対する優先権を主張するものであり、これら各々の開示は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂにより電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、ファイル名が「ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ ＪＢＩ６４１１」であり、作成日が２０２１年１０月７日であり、２７５ＫＢのサイズを有する。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本出願は、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（Delta-like canonical Notch Ligand 3、ＤＬＬ３）に結合する抗原結合領域を含むタンパク質、並びに関連する組成物及び方法に関する。
前立腺がんは、診断頻度が２番目に高いがんであり、男性におけるがんの死因の６位であり、世界中の男性の全ての新たながん症例の１４％（９０３，５００）及び全てのがん死亡の６％（２５８，４００）を占める。転移性前立腺がんは、米国の男性におけるがん死の第２位の原因である。前立腺がんの診断から死亡までの過程は、疾患の程度、ホルモン状態、及び検出可能な転移の有無：限局性疾患、放射線療法又は手術後に検出可能な転移なく前立腺特異的抗原（prostate-specific antigen、ＰＳＡ）のレベルが上昇していること、並びに非去勢病期又は去勢病期における臨床的転移に基づいて、一連の臨床段階として最善に分類される。手術、放射線照射、又は両方の組み合わせは、限局性疾患の患者にとって治癒的なものになり得るが、これらの患者のうちのかなりの割合は、ＰＳＡレベルの上昇をエビデンスとする再発性疾患を有し、これはまた、特に高リスク群における転移形成、疾患の終末期への移行をもたらす場合がある。
アンドロゲン枯渇療法（androgen depletion therapy、ＡＤＴ）が標準的治療であり、全般的に予測可能な転帰は、ＰＳＡの低下、腫瘍が増殖しない安定期、続いて、ＰＳＡの上昇、及び去勢抵抗性疾患としての再成長である。長年にわたり、ＡＤＴは、転移性前立腺がんの患者のための標準治療であった。
しかしながら、最近の臨床データは、アンドロゲン枯渇療法が、細胞の分化転換のプロセスを介して神経内分泌前立腺がん（neuroendocrine prostate cancer、ＮＥＰＣ）として知られるアンドロゲン非依存性腫瘍表現型の出現をもたらし得ることを示唆している。デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＬＬ３）は、ＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方でＮＥＰＣ腫瘍において豊富に存在することが示されている。したがって、ＤＬＬ３を標的化するように設計された戦略は、ＮＥＰＣ／小細胞がん患者集団において臨床的な有用性を有し得る。
小細胞肺がんは、全ての肺がん発生率の約２０％を占める。小細胞肺がんは、多くの場合、診断時に既にリンパ節転移又は遠隔転移が生じているため、急速に進行し、外科的に除去することが困難である。このがんは、抗がん剤に対して早期に高い応答率を示す。したがって、化学療法は、がんを治療するための第１の選択肢と考えられる。しかしながら、がんは直ちに化学療法に耐性となり、再発し、３年生存率は５％以下となる。
したがって、ＮＥＰＣ、小細胞がん又は小細胞肺がんなどのがんを治療するための新しい療法が必要とされている。
正常細胞において、ＤＬＬ３は、細胞内でｎｏｔｃｈシグナル伝達を調節する。がん細胞では、ＤＬＬ３は細胞外に発現され、例えば、ヒトでは６１８アミノ酸及び６つのＥＧＦ様リピートを含む８つの細胞外ドメインを有する。ヒトＤＬＬ３は、カニクイザル及びマウス／ラットのものと高度に相同であり、それぞれ９６％及び８３％のアミノ酸配列同一性を共有するが、ＤＬＬ１及びＤＬＬ４とは約４０％未満の同一性しか有しない。ＤＬＬ３は、正常組織において低い発現から検出不能な発現を有するが、小細胞肺がん、前立腺、大細胞がん、及び膀胱を含む神経内分泌腫瘍の細胞表面上で高度に発現されており、神経内分泌がんの治療のためのＴ細胞リダイレクトにおける標的となっている。
一般的な一態様では、本開示は、デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域が、配列番号２６３に記載のヒトＤＬＬ３の残基４２９～６１８内のエピトープに結合する、単離されたタンパク質に関する。
いくつかの実施態様では、単離されたタンパク質は、ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨの重鎖相補性決定領域（heavy chain complementarity determining region、ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）、並びに配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬの軽鎖相補性決定領域（light chain variable region、ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）、ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有するＶＨ、並びに配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有するＶＬ、ｃ）配列番号５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有するＶＨ、並びに配列番号６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ｄ）配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ｅ）配列番号９のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１０のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ｆ）配列番号１１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又はｇ）配列番号１３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、参照抗体とＤＬＬ３への結合について競合する抗原結合領域を含む。任意選択で、参照抗体は、配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
任意選択で、単離されたタンパク質は、ａ）それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、ｂ）それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８、ｃ）それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０、ｄ）それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３、ｅ）それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、４６、ｆ）それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９、ｇ）それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、３５、ｈ）それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、３５、ｉ）それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、ｊ）それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、４０、ｋ）それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、ｌ）それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、４６、又はｍ）それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、４９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。任意選択で、単離されたタンパク質は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｆａｂである。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、ｓｃＦｖである。任意選択で、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。任意選択で、Ｌ１は、ａ）約５～５０個のアミノ酸、ｂ）約５～４０個のアミノ酸、ｃ）約１０～３０個のアミノ酸、ｄ）約１０～２０個のアミノ酸を含む。任意選択で、Ｌ１は、配列番号２７、７２、７３、７４、７５、７６、７９、８１、８２、８３、８８、９０、９１、９２、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、又は１３９のアミノ酸配列を含む。任意選択で、Ｌ１は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、配列番号１、３、５、７、９、１１、又は１３のＶＨ及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、又は１４のＶＬを含む、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を提供する。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、ａ）配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、ｂ）配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、ｃ）配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、ｄ）配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、ｅ）配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、ｆ）配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、並びに／又はｇ）配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＬを含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号６３又は６４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。
本開示は、単一特異性タンパク質又は多重特異性抗原結合構築物である単離されたタンパク質を提供する。任意選択で、単離されたタンパク質は、多重特異性抗原結合構築物である。任意選択で、多重特異性抗原結合構築物は、二重特異性タンパク質である。任意選択で、多重特異性抗原結合構築物は、三重特異性タンパク質である。任意選択で、多重特異性抗原結合構築物は、リンパ球上の抗原に結合する抗原結合領域を含む。任意選択で、リンパ球は、Ｔ細胞である。任意選択で、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。任意選択で、リンパ球は、ナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞である。任意選択で、多重特異性抗原結合構築物において、リンパ球上の抗原は、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（CD3 epsilon、ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃである。任意選択で、リンパ球上の抗原は、ＣＤ３εである。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ａ）配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３、ｂ）配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物において、ＣＤ３εに結合する抗原結合領域は、配列番号９８のＨＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物において、ＣＤ３εに結合する抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ａ）配列番号９５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３、又はｂ）配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、配列番号９５のＨＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１のＬＣＤＲ１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、配列番号７７のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＬを含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合領域を含む。
本開示はまた、デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）に結合する抗原結合領域を含む、単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、ａ）それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、ｂ）それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、及び３８、ｃ）それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、及び４０、ｄ）それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、及び４３、ｅ）それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、及び４６、ｆ）それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、及び４９、ｇ）それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、及び３５、ｈ）それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、及び３５、ｉ）それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、ｊ）それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、及び４０、ｋ）それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、ｌ）それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、及び４６、ｍ）それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、及び４９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ｎ）配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、ｏ）配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、ｐ）配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、ｑ）配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、ｒ）配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、ｓ）配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、又はｔ）配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む、多重特異性抗原結合構築物を提供する。任意選択で、多重特異性抗原結合構築物は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＤＬＬ３に結合する結合ドメインを含む。
特定の実施形態では、本開示は、デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）に結合する抗原結合領域を含む、単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号３の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
本開示はまた、デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）に結合する抗原結合領域を含む、単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号３の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号４の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
任意選択で、タンパク質は、単離された半減期延長部分（moiety）にコンジュゲートされる。任意選択で、半減期延長部分は、免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである。任意選択で、Ｉｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートされる。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートされる。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、第２のリンカー（Ｌ２）を介してＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる。任意選択で、Ｌ２は、配列番号２７、７２、７３、７４、７５、７６、７９、８１、８２、８３、８８、９０、９１、９２、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、又は１３９のアミノ酸配列を含む。任意選択で、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。任意選択で、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。任意選択で、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、タンパク質のＦｃγ受容体（Fcγ receptor、ＦｃγＲ）への低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。任意選択で、ＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けはＥＵインデックスに従う。任意選択で、ＦｃγＲへのタンパク質の結合の低減をもたらす変異は、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓである。
本開示は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域が、ａ）それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ｂ）配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、ｃ）配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、ｄ）配列番号６３のｓｃＦｖ、並びに／又はｅ）配列番号６４のｓｃＦｖを含む、単離されたタンパク質を提供する。任意選択で、単離されたタンパク質は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、ａ）それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びに／又はｂ）配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。任意選択で、単離されたタンパク質は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、ａ）それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ｂ）配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、並びに／又は配列番号６５のｓｃＦｖを含む。任意選択で、単離されたタンパク質は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、ａ）それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ｂ）配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、並びに／又は配列番号６６のｓｃＦｖを含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域は、ａ）それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ｂ）配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、並びに／又は配列番号６７のｓｃＦｖを含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域は、ａ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、４４、４５、４６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ｂ）配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、並びに／又は配列番号６８のｓｃＦｖを含む。任意選択で、単離されたタンパク質は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、ａ）それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ｂ）配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、並びに／又は配列番号６９のｓｃＦｖを含む。
任意選択で、単離されたタンパク質は、ＣＤ３εに結合する抗原結合領域を含む、多重特異性抗原結合構築物である。任意選択で、多重特異性抗原結合構築物は、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３、並びに／又はｂ）配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合領域を含む。任意選択で、多重特異性抗原結合構築物は、ａ）配列番号９５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３、並びに／又はｂ）配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合領域を含む。
本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質を提供する。任意選択で、リンパ球抗原は、Ｔ細胞抗原である。任意選択で、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原である。任意選択で、リンパ球抗原は、ＮＫ細胞抗原である。任意選択で、リンパ球抗原は、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃである。任意選択で、リンパ球抗原は、ＣＤ３εである。
任意選択で、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質において、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨを含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、Ｆａｂを含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、ｓｃＦｖを含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域はｓｃＦｖを含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域はＦａｂを含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域はＦａｂを含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域はｓｃＦｖを含む。任意選択的に、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。任意選択で、Ｌ１は、ａ）約５～５０個のアミノ酸、ｂ）約５～４０個のアミノ酸、ｃ）約１０～３０個のアミノ酸、ｄ）約１０～２０個のアミノ酸を含む。任意選択で、Ｌ１は、配列番号２７、７２、７３、７４、７５、７６、７９、８１、８２、８３、８８、９０、９１、９２、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、又は１３９のアミノ酸配列を含む。任意選択で、Ｌ１は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。
任意選択で、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質において、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号１５、１８、２１、２４、２７、３０、５０、５２、５３、５５、５７、５９、又は６１のＨＣＤＲ１、配列番号１６、１９、２２、２５、２８、３１、５１、５４、５６、５８、６０、又は６２のＨＣＤＲ２、配列番号１７、２０、２３、２６、２９、３２、１７、２０、２３、２６、２９、又は３２のＨＣＤＲ３、配列番号３３、３６、３９、４１、４４、又は４７のＬＣＤＲ１、配列番号３４、３７、４２、４５、又は４８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３５、３８、４０、４３、４６、又は４９のＬＣＤＲ３を含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、ａ．それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、ｂ．それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８、ｃ．それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０、ｄ．それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３、ｅ．それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、４６、ｆ．それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９、ｇ．それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、３５、ｈ．それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、３５、ｉ．それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、ｊ．それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、４０、ｋ．それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、ｌ．それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、４６、又はｍ．それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、４９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、ａ．配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、ｂ．配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、ｃ．配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、ｄ．配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、ｅ．配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、ｆ．配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、又はｇ．配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６３又は６４のアミノ酸配列を含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む。任意選択で、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＬを含む。任意選択で、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号９５又は９８のＨＣＤＲ１、配列番号９６又は９９のＨＣＤＲ２、配列番号９７又は１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０１又は１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０２又は１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４又は１０８のＬＣＤＲ３を含む。任意選択で、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号９５のＨＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１のＬＣＤＲ１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３を含む。任意選択で、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号９８のＨＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３を含む。任意選択で、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＬを含む。任意選択で、ＣＤ３に特異的結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む。任意選択で、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一であるＶＬを含む。任意選択で、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第１のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされ、かつ／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、第２の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第２のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる。任意選択で、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域と第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域との間、並びにリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域と第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片との間に、第２のリンカー（Ｌ２）を更に含む。任意選択で、Ｌ２は、配列番号２７、７２、７３、７４、７５、７６、７９、８１、８２、８３、８８、９０、９１、９２、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、又は１３８のアミノ酸配列を含む。任意選択で、Ｉｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。任意選択で、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。任意選択で、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。任意選択で、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＦｃγＲへの多重特異性抗原結合構築物の低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。任意選択で、ＦｃγＲへの多重特異性抗原結合構築物の低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けはＥＵインデックスに従う。任意選択で、ＦｃγＲへの多重特異性抗原結合構築物の結合の低減をもたらす変異は、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓである。任意選択で、タンパク質は、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む。任意選択で、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けはＥＵインデックスに従う。
一般的な一態様では、本出願は、
（１）ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域であって、第１の抗原結合領域が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有する第１のＶＨ、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する第１のＶＬを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、
（ａ）それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、
（ｂ）それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８、
（ｃ）それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０、
（ｄ）それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３、
（ｅ）それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、４６、
（ｆ）それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９、
（ｇ）それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、３５、
（ｈ）それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、３５、
（ｉ）それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、
（ｊ）それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、４０、
（ｋ）それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、
（ｌ）それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、４６、又は
（ｍ）それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、４９のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域。
（２）ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域であって、
（ａ）それぞれ配列番号９５、９６、及び９７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する第２のＶＨ、並びにそれぞれ配列番号１０１、１０２、及び１０４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を有する第２のＶＬ、又は
（ｂ）それぞれ配列番号９８、９９、及び１００のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する第２のＶＨ、並びにそれぞれ配列番号１０６、１０７、及び１０８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を有する第２のＶＬを含む、第２の抗原結合領域、を含む、二重特異性抗原結合構築物に関する。
二重特異性抗原結合構築物は、本明細書において「抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物」又は「抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３」と称される。
いくつかの実施態様では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含み、ａ）ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、リンパ球抗原に結合する第２のドメインは、それぞれ配列番号９５、９６、９７、１０１、１０２、１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又はｂ）ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含むＦａｂを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号１０５のｓｃＦｖを含み、かつ／又はｃ）単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、配列番号１０９のＨＣ１、配列番号１１０のＬＣ１、及び配列番号１１２のＨＣ１を含む。
いくつかの実施態様では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含み、ａ）ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、それぞれ配列番号９５、９６、９７、１０１、１０２、１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又はｂ）ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含むＦａｂを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号１１９のｓｃＦｖを含み、かつ／又はｃ）単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、配列番号１０９のＨＣ１、配列番号１１０のＬＣ１、及び配列番号１１３のＨＣ１を含む。
いくつかの実施態様では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含み、ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又はｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６３のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含むＦａｂを含み、かつ／又はｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、配列番号１１１のＨＣ１、配列番号１１６のＨＣ２、及び配列番号１１７のＬＣ２を含む。
いくつかの実施態様では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、それぞれ配列番号９５、９６、９７、１０１、１０２、１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又はｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６３のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含むＦａｂを含み、かつ／又はｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、配列番号１１１のＨＣ１、配列番号１１４のＨＣ２、及び配列番号１１５のＬＣ２を含む。
いくつかの実施態様では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又はｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含むＦａｂを含み、かつ／又はｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、配列番号７１のＨＣ１、配列番号１１８のＨＣ２、及び配列番号１１７のＬＣ２を含む。
いくつかの実施態様では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又はｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＬを含むＦａｂを含み、かつ／又はｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、配列番号７１のＨＣ１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ１、配列番号１１８のＨＣ２と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ２及び配列番号１１７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＬＣ２を含む。
いくつかの実施態様では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又はｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含むＦａｂを含み、かつ／又はｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、配列番号２２９のＨＣ１、配列番号２３０のＨＣ２、及び配列番号１１７のＬＣ２を含む。
いくつかの実施態様では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又はｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＬを含むＦａｂを含み、かつ／又はｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、配列番号２２９のＨＣ１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ１、配列番号２３０のＨＣ２と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ２及び配列番号１１７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＬＣ２を含む。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する単離された抗原結合領域を含む、免疫コンジュゲートを提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質を含む、免疫コンジュゲートを提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物を含む、免疫コンジュゲートを提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する単離された抗原結合領域を含む、医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質を含む、医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物を含む、医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する単離された抗原結合領域をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
また、本発明は、本開示のポリヌクレオチド又はベクターを含む、宿主細胞を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんを治療する方法であって、治療有効量の、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を、ＤＬＬ３発現がんを治療するのに十分な時間にわたって、それを必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間にわたって対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんの確立を予防する方法であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与して、対象におけるＤＬＬ３発現がんの確立を予防することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３発現がん性状態が発生するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与して、非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象における前立腺がんを治療する方法であって、治療有効量の、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を、前立腺がんを治療するのに十分な時間にわたって、それを必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象における小細胞肺がんを治療する方法であって、治療有効量の、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を、小細胞肺がんを治療するのに十分な時間にわたって、それを必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象における前立腺がん又は小細胞肺がんを検出する方法であって、本開示の免疫コンジュゲートを対象に投与することと、ＤＬＬ３への免疫コンジュゲートの結合を検出し、それによって、前立腺がん又は小細胞肺がんを検出することと、を含む、方法を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を含む、キットを提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域に結合する、抗イディオタイプ抗体を提供する。
実施例に示されるように、本明細書に開示される単離された多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞介在性細胞毒性を媒介し、Ｔ細胞の活性化及び増殖を促進し、Ｔ細胞サイトカイン放出を増加し、かつ／又は増加した抗腫瘍効力を示すのに特に有効であり得る。
前述のことは、添付の図面に示されているように、例示的な実施形態のより具体的な説明から明らかになるであろう。
ＤＳＬドメイン及び６つのＥＧＦドメインを含むＤＬＬ３細胞外ドメインの概略図を示す。示されるアミノ酸配列は、ＤＳＬドメインの残基１７６～２１５（配列番号２４６）、ＥＧＦ－１ドメインの残基２１６～２４９（配列番号２４７）、ＥＧＦ－２ドメインの残基２７４～３１０（配列番号２４８）、ＥＧＦ－３ドメインの残基３１２～３５１（配列番号２４９）、ＥＧＦ－４ドメインの残基３５３～３８９（配列番号２５０）、ＥＧＦ－５ドメインの残基３９１～４２７（配列番号２５１）、ＥＧＦ－６ドメインの残基４２９～４６５（配列番号２５２）、及びＥＧＦ－６ドメイン＋Ｃ末端ドメインの残基４２９～６１８（配列番号２６３）を表す。 ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す。図２Ａは、ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株であるＳＨＰ７７細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す。図２Ｂは、ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株であるＨＣＣ１８３３細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す。 ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す。図２Ａは、ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株であるＳＨＰ７７細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す。図２Ｂは、ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株であるＨＣＣ１８３３細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す。 ＦＡＣＳを使用したヒト汎Ｔ細胞に対する二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合を示す。 ＩｎｃｕＣｙｔｅベースの細胞傷害アッセイにおいて評価された、最適化された抗ＤＬＬ３配列を有する及び有さない抗ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性抗体の腫瘍溶解を示す。 標的細胞死を定量化するためにリアルタイムでのｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のインビトロでの標的細胞傷害を示す。図５Ａは、標的細胞死を定量化するためにリアルタイムでのｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された抗ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性分子のインビトロでの標的細胞傷害を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の存在下で１２０時間、ＤＬＬ３＋ＳＨＰ７７細胞と共インキュベートした。図５Ｂは、標的細胞死を定量化するためにリアルタイムでｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された抗ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性分子のインビトロでの標的細胞傷害を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の存在下で１２０時間、ＤＬＬ３－ＨＥＫ２９３細胞と共インキュベートした。 標的細胞死を定量化するためにリアルタイムでのｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のインビトロでの標的細胞傷害を示す。図５Ａは、標的細胞死を定量化するためにリアルタイムでのｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された抗ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性分子のインビトロでの標的細胞傷害を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の存在下で１２０時間、ＤＬＬ３＋ＳＨＰ７７細胞と共インキュベートした。図５Ｂは、標的細胞死を定量化するためにリアルタイムでｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された抗ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性分子のインビトロでの標的細胞傷害を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の存在下で１２０時間、ＤＬＬ３－ＨＥＫ２９３細胞と共インキュベートした。 単離された汎Ｔ細胞が二重特異性抗ＤＬＬ３／ＣＤ３抗体の存在下でＤＬＬ３＋ＳＨＰ７７細胞とともに１２０時間共インキュベートされたことを示す。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によるインビトロでのＴ細胞ＩＦＮ－γ放出を示す。ＩＦＮ－γ濃度を、示された時点で収集した上清から測定した。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示す。図８Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１０：１である。図８Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、５：１である。図８Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１：１である。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示す。図８Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１０：１である。図８Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、５：１である。図８Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１：１である。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示す。図８Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１０：１である。図８Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、５：１である。図８Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１：１である。 全ＰＢＭＣ細胞傷害アッセイにおける二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖を示す。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化を示す。図１０Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ２５＋細胞％を示す。図１０Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ６９＋細胞％を示す。図１０Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ７１＋細胞％を示す。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化を示す。図１０Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ２５＋細胞％を示す。図１０Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ６９＋細胞％を示す。図１０Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ７１＋細胞％を示す。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化を示す。図１０Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ２５＋細胞％を示す。図１０Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ６９＋細胞％を示す。図１０Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ７１＋細胞％を示す。 ４８時間でのＩＦＮγ濃度についての用量反応曲線を示す。 １２０時間でのＩＦＮγ濃度についての用量反応曲線を示す。 ４８時間での全ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージとしてのＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞についての用量反応曲線を示す。 １２０時間での全ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージとしてのＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞についての用量反応曲線を示す。 ７２時間でのＣＤ８＋Ｔ細胞増殖についての用量反応曲線を示す。 １２０時間でのＣＤ８＋Ｔ細胞増殖についての用量反応曲線を示す。
様々な刊行物、論文、特許、及び特許出願が、背景技術及び本明細書全体で引用又は説明され、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明の背景を与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によってあたかもその全体が本明細書に記載されているように組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
リストが提示される場合、特に指定されない限り、そのリストの各個々の要素及びそのリストの全ての組み合わせは別個の実施形態であることを、理解されたい。例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣ」として提示される実施形態のリストは、実施形態「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ又はＣ」、「Ｂ又はＣ」、又は「Ａ、Ｂ、又はＣ」を含むと解釈されるべきである。
特に断らない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、通常、記載される値の±１０％を含む。例えば、投薬量１０ｍｇは、９ｍｇ～１１ｍｇを含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、特に文脈上明示的に指定されていない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。
移行句「備える／含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「からなる（consisting of）」は、特許用語において一般的に受け入れられている意味を含意することを意図しており、すなわち、（ｉ）「備える／含む（comprising）」は、「含む」、「含有する」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非制限的なものであり、その他の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものではなく、（ｉｉ）「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲において特定されていない、あらゆる要素、工程、又は成分を除外し、並びに（ｉｉｉ）「から本質的になる」は、特定される材料又は工程、並びに、特許請求される発明の「基本的かつ新しい特徴に実質的に影響しないもの」に、特許請求の範囲を制限する。語句「備える／含む」（又はその同等語）を伴って記載される実施形態はまた、「からなる」及び「から本質的になる」を伴って独立して記載される実施形態として提供する。
「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるのか、すなわち、測定システムの制限に部分的に依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において、実施例又は明細書の他の箇所に別途明示的に記載されない限り、「約」は、当該技術分野の実施につき１つの標準偏差、又は５％までの範囲のうちのいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
「活性化」又は「刺激」又は「活性化された」又は「刺激された」とは、活性化マーカーの発現、サイトカイン産生、又は標的細胞の増殖若しくは細胞傷害性の媒介をもたらす、細胞の生物学的状態の変化の誘導を指す。細胞は、一次刺激シグナルによって活性化され得る。
「代替スカフォールド」は、立体構造の許容度が高い可変ドメインに会合する構造化コアを含有する単鎖タンパク質フレームワークを指す。可変ドメインは、スカフォールドの完全性を損なうことなく導入される多型を許容するため、可変ドメインは、特異的抗原に結合するように遺伝子操作及び選択され得る。
「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」、又は「ＡＤＣＣ」とは、抗体でコーティングされた標的細胞と、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、単球、マクロファージ、及び好中球などの溶解活性を有するエフェクター細胞との、エフェクター細胞上で発現するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を介した相互作用に依存する細胞死を誘導する機序を指す。
「抗体依存性細胞食作用」又は「ＡＤＣＰ」とは、マクロファージ又は樹状細胞などの食細胞による取り込みによって抗体被覆標的細胞を排除する機構を指す。
「抗原」は、免疫応答を媒介することができる抗原結合領域又はＴ細胞受容体によって結合され得る任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸、それらの一部、又はそれらの組み合わせ）を指す。免疫応答の例には、抗体の生成及びＴ細胞、Ｂ細胞、又はＮＫ細胞などの免疫細胞の活性化が含まれる。抗原は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、又は他の生物学的成分を有する流体、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、死滅若しくは不活性化された全細胞又は溶解物などの生体サンプルからの遺伝子によって発現し得る、当該サンプルから合成され得る、又は当該サンプルから精製され得る。
「抗原結合領域」又は「抗原結合断片」又は「抗原結合ドメイン」はそれぞれ、抗原に結合する全長抗体の部分を指す。抗原結合領域は、合成ポリペプチド、酵素的に得られるポリペプチド、又は遺伝子操作されたポリペプチドであり得る。抗原結合領域は、典型的には、少なくともＶＨ領域の１つ又は２つ以上の部分を含む。抗原結合性断片は、抗体の１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の抗原結合部分と、単鎖構成体とを含む多価分子であり、ＶＬ及びＶＨ領域、又はその選択された部分が、合成リンカーによって又は遺伝子組換え法によって接合されて機能性の抗原結合分子を形成する。抗原結合断片はまた、単一の単量体可変抗体ドメイン（ＶＨＨ）からなる抗体断片である、ナノボディとしても知られる単一ドメイン抗体（single-domain antibody、ｓｄＡｂ）であり得る。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８；２４２：４２３－４２６及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １９８８；８５：５８７９－５８８３を参照されたい）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（典型的にはＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、及びｄＡｂ（典型的にはＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、及びＶ－ＮＡＲドメイン；単一のＶＨ鎖及び単一のＶＬ鎖を含む一価分子；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９７；１０：９４９－５７を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；並びに１つ又は２つ以上の単離されたＣＤＲ又は機能性パラトープが挙げられ、単離されたＣＤＲ又は抗原結合残基若しくはポリペプチドは、機能性の抗体断片、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの抗体のＣＤＲを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及び／又はＬＣＤＲ３、抗原に結合する代替的な足場、並びに抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物を形成するために、会合又は一緒に連結させることができる。様々な種類の抗体断片が、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３：１１２６－１１３６、国際公開第２００５０４０２１９号、並びに公開された米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号及び同第２００２０１６１２０１号に記載又は総説されている。抗体断片は、従来の組換え又はタンパク質工学的手法を用いて得ることができ、この断片は、無傷の抗体と同様にして抗原結合又は他の機能に関してスクリーニングすることができる。抗体断片の作製のために様々な手法が開発されている。慣例的に、これらの断片は、全長抗体のタンパク分解消化から得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：１０７－１１７（１９９２）、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）に記載されている。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接に作製され得る。代替的に、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収でき、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３－１６７（１９９２））。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。他の実施形態において、選ばれる抗体は単鎖Ｆｖ断片（single-chain Fv fragment、ｓｃＦｖ）である。国際公開第１９９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号、及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号において記述されるように「直鎖抗体」であってもよい。このような直鎖抗体断片は、単一特異性又は二重特異性であってもよい。抗原結合領域（（ＶＨ及びＶＬなど）は、合成リンカーを介して一緒に連結させて、様々な種類の一本鎖抗体設計を形成することができ、ここで、ＶＨ／ＶＬドメインは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが別々の一本鎖で発現される場合には分子内で又は分子間で対形成して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はダイアボディなどの一価の抗原結合領域を形成し得る。抗原結合領域はまた、二重特異性及び多重特異性抗原結合構築物を遺伝子操作するために単一特異性又は多重特異性であり得る、他の抗体、タンパク質、抗原結合断片、又は代替的な足場にコンジュゲートされ得る。
「抗体」は、広義の意味を意味し、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化、キメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合領域、二重特異性、三重特異性、四特異性などの多重特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chain、ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、及び重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（light chain constant region、ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）が散在している、相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラスである、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。抗体分子構造の一般的原理及び抗体の生成に関する様々な技法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）に提供されている。
本出願の単離されたタンパク質又は構築物はまた、抗体の誘導体を含み得る。本明細書で使用される「抗体誘導体」という用語は、完全長抗体又はその抗原結合断片を含む分子であって、１つ又は２つ以上のアミノ酸が化学的に修飾又は置換されている、分子を指す。抗体の誘導体において使用することができる化学修飾としては、例えば、抗体を第２の分子に連結するための、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成などが挙げられる。例示的な修飾としては、ＰＥＧ化（例えば、システインＰＥＧ化）、ビオチン化、放射性標識、第２の試薬（例えば、細胞毒性剤）との結合が挙げられる。
本明細書中の抗体は、変更された抗原結合又は生物学的活性を有する「アミノ酸配列バリアント」を含む。そのようなアミノ酸変更の例としては、抗体に対する親和性が増強された抗体（例えば、「親和性成熟」抗体）、及びＦｃ領域が変更された抗体（存在する場合）、例えば、抗体依存性細胞傷害（antibody dependent cellular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）が変更された（増加又は減少した）抗体（例えば、国際公開第００／４２０７２号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）及び国際公開第９９／５１６４２号（Ｉｄｕｏｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ）を参照されたい）。並びに／又は血清半減期が増加若しくは減少した抗体（例えば、国際公開第００／４２０７２号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．を参照されたい）が挙げられる。
「二重特異性抗原結合構築物」又は「二重特異性構築物」は、２つの異なる抗原又は同じ抗原内の２つの異なるエピトープに特異的に結合する構築物を指す。二重特異性抗原結合構築物は、タンパク質、タンパク質複合体、又は抗体であり得る。二重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（Macaca cynomolgus）（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｃｙｎｏ）又はチンパンジー（Pan troglodytes）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有することができ、あるいは２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。
「二重特異性抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３抗体」、「抗ＤＬＬ３×ＣＤ３」、「ＤＬＬ３／ＣＤ３抗体」、「ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体」「抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質」などは、ＤＬＬ３及びＣＤ３に結合し、かつＤＬＬ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、を含む、構築物又は抗体を指す。ＤＬＬ３及びＣＤ３に特異的に結合するドメインは、典型的にはＶＨ／ＶＬ対である。二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体は、ＤＬＬ３又はＣＤ３のいずれかへの結合に関して一価であり得る。
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用するとき、抗原結合を担当する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）；（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）、及び／又は「超可変ループ」由来の残基（軽鎖可変ドメイン中の残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）及び９１～９６（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３））；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６：９０１－９１７）を含む。典型的に、この領域のアミノ酸残基の番号付けは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に記述されている方法により実施される。本明細書における「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基番号付け」及び「Ｋａｂａｔによる」などの表現は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対するこの番号付けシステムを指す。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを用いて、ペプチドの実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮化又はこれらへの挿入に対応する、より少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）と、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）とを含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体に対して、その抗体の配列と「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列とを相同領域でアライメントすることにより、決定することができる。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％又はそれ以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を５０％又はそれ以上遮断する。
本発明の方法に関して「投与」という用語は、本発明の複合体、又はその形成物、組成物、若しくは薬剤を使用することにより、本明細書に記載の症候群、障害、又は疾患を、治療学的又は予防学的に、予防する、治療する、又は寛解させる方法を意味する。このような方法には、有効量の上記抗体、その抗原結合断片、あるいはそれらのコンジュゲート、又は形成物、組成物、若しくは薬剤を、治療過程中の異なる時点で、又は組み合わせ形式で同時に、投与することを含む。本発明の方法は、既知の治療的処置レジメンを全て包含するものとして理解されるものである。
標的抗体が天然標的リガンドへの標的分子の結合を「遮断する」能力とは、抗体が、可溶性又は細胞表面に結合した標的及びリガンド分子を使用するアッセイにおいて、用量依存な様式で標的分子のリガンドへの結合を検出可能に減少させ、標的分子は、抗体の非存在下でリガンドに検出可能に結合することを意味する。
「がん」は、身体における異常細胞の制御されていない成長を特徴とする様々な疾患の広範な群を指す。制御されていない細胞分裂及び成長は、隣接組織を浸潤する悪性腫瘍の形成をもたらし、リンパ系又は血流を介して身体の遠位部分にも転移し得る。「がん」又は「がん組織」は、腫瘍を含み得る。
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、標的に結合したタンパク質のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合し、これを活性化し、次に、補体カスケードを活性化して標的細胞死をもたらす、細胞死を誘導する機序を指す。補体の活性化はまた、標的細胞表面上に補体成分の沈着を生じさせ得、それは、白血球への補体受容体（例えば、ＣＲ３）の結合によって、ＣＤＣを容易にする。
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、抗原に結合する抗体の領域である。ＶＨには３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、ＶＬには３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲは、以下のものなどの様々な記述を用いて定義することができる：Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－５０、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７）、及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ Ｊ Ｂｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００－１５，１９９６）などの様々な描写を用いて定義することができる。様々な記述と可変領域の付番との間の対応関係が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９：６５７－７０；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（International ImMunoGeneTics、ＩＭＧＴ）データベース、ウェブリソース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇを参照されたい）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを描写することができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、明細書で別途明示的に記載のない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。例えば、Ｋａｂａｔ番号付け及びＩＭＧＴ固有の番号付けシステムを含む番号付けシステム間の対応関係は、当業者に周知である（例えば、上記のＫａｂａｔ、上記のＣｈｏｔｈｉａ、上記のＭａｒｔｉｎ、上記のＬｅｆｒａｎｃらを参照されたい）。
Figure 2023548034000002
「ＣＤ３」は、多分子Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）複合体の一部としてＴ細胞上で発現され、２つ又は４つの受容体鎖：ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ゼータ、及びＣＤ３ガンマの会合から形成されたホモ二量体又はヘテロ二量体からなる抗原を指す。ヒトＣＤ３イプシロンは、配列番号２５３のアミノ酸配列を含む。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片に対する全ての言及は、非ヒト種由来のものであると明示的に指定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質断片のヒトバージョンを指すことを意図する。したがって、「ＣＤ３」は、非ヒト種、例えば、「マウスＣＤ３」「サルＣＤ３」などからのものとして指定されない限り、ヒトＣＤ３を意味する。
本明細書全体を通して、「ＣＤ３特異的」又は「ＣＤ３に特異的に結合する」又は「抗ＣＤ３抗体」は、ＣＤ３－ε細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）（配列番号２５４）に特異的に結合する抗体を含む、ＣＤ３－εポリペプチド（配列番号２５３）に特異的に結合する抗体を指す。ＣＤ３－εは、ＣＤ３－γ、－δ、及び－ζ、並びにＴ細胞受容体α／β及びγ／δヘテロ二量体と一緒に、Ｔ細胞受容体－ＣＤ３複合体を形成する。この複合体は、いくつかの細胞内シグナル伝達経路を認識する抗原結合において重要な役割を果たす。ＣＤ３複合体はシグナル伝達を媒介し、Ｔ細胞の活性化及び増殖をもたらす。ＣＤ３は、免疫応答に必要である。
本明細書で使用される「コンジュゲート」は、治療用ペプチド若しくはタンパク質、抗体、標識、又は神経障害薬を含むがこれらに限定されない、１つ又は２つ以上の異種分子に共有結合したタンパク質を指す。１つのタンパク質が別のタンパク質にコンジュゲートされる場合、それはまた、２つのタンパク質が一緒に融合されるとも称される。非限定的な例として、本出願の抗体又は抗原結合断片を別のポリペプチドにコンジュゲートして、融合タンパク質を形成することができる。ある特定の実施形態では、本出願の抗体又は抗原結合性断片をリンカーを介して別のポリペプチドに融合又はコンジュゲートすることができる。
「減少する」、「低下する」、「低くする」、「低減する」、又は「軽減する」は、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合に、試験分子が低減された応答（すなわち、下流効果）を媒介する能力を指す。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、増強されたＦｃγへの結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。減少は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍、若しくはそれ以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍、若しくはそれ以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）の増加などの、測定された応答の増加であってもよい。
「デルタ様タンパク質３」又は「ＤＬＬ３」は、デルタ様３、デルタ３、又はショウジョウバエデルタホモログ３とも称される、知られているタンパク質を指す。特定されない限り、本明細書で使用される場合、ＤＬＬ３は、ヒトＤＬＬ３を指す。全てのＤＬＬ３アイソフォーム及びバリアントが、「ＤＬＬ３」に包含される。様々なアイソフォームのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０５８６３７．１（アイソフォーム１前駆体、６１８アミノ酸）及びＮＰ＿９８２３５３．１（アイソフォーム２前駆体、５８７アミノ酸）などのデータベースから取得可能である。完全長ヒトＤＬＬ３のアミノ酸配列を配列番号２５５に示す。ＤＬＬ３の配列は、ＤＳＬドメイン（残基１７６～２１５）、ＥＧＦ－１ドメイン（残基２１６～２４９）、ＥＧＦ－２ドメイン（残基２７４～３１０）、ＥＧＦ－３ドメイン（残基３１２～３５１）、ＥＧＦ－４ドメイン（残基３５３～３８９）、ＥＧＦ－５ドメイン（残基３９１～４２７）、ＥＧＦ－６ドメイン（残基４２９～４６５）、及びＣ末端ドメイン（残基４６６～６１８）を含む（図１）。ＤＬＬ３ ＤＳＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号２４６に示される。ＤＬＬ３ ＥＧＦ－１ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２４７に示される。ＤＬＬ３ ＥＧＦ－２ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２４８に示される。ＤＬＬ３ ＥＧＦ－３ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２４９に示される。ＤＬＬ３ ＥＧＦ－４ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２５０に示される。ＤＬＬ３ ＥＧＦ－５ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２５１に示される。ＤＬＬ３ ＥＧＦ－６ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２５２に示される。ＤＬＬ３ ＥＧＦ－６＋Ｃ末端ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２６３に示される。
「分化」は、細胞の能力若しくは増殖を減少させるか、又は細胞をより発達的に制限された状態に移動させる方法を指す。
「コードする」又は「コードすること」は、定義されたヌクレオチドの配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）か、又は定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異性配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、細胞又は他の生物系において、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳がタンパク質を産生する場合、その遺伝子、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡは、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖とはいずれも、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードするとして言及され得る。
「増強する（enhance）」、「促進する（promote）」、「増加させる（increase）」、「拡大する（expand）」、又は「改善する（improve）」という用語は、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合、試験分子がより大きな応答（すなわち下流効果）を媒介する能力をいう。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、増強されたＦｃγへの結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。増強は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍、若しくはそれ以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍、若しくはそれ以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）の増加などの、測定された応答の増加であってもよい。
「エピトープ」とは、抗体、又はその抗体結合部分が特異的に結合する抗原の一部分を指す。エピトープは、典型的には、化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）部分の表面集団、例えばアミノ酸又は多糖側鎖からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、高次構造的空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続なアミノ酸で構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分からのアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。抗体「エピトープ」は、エピトープを識別するために使用する方法論によって異なる。
「拡大」は、細胞分裂及び細胞死の結果を指す。
「発現する」及び「発現」は、細胞内又はインビトロで起こる周知の転写及び翻訳を指す。したがって、発現産物、例えば、タンパク質は、細胞によって又はインビトロで発現し、細胞内、細胞外、又は膜貫通タンパク質であってもよい。
「発現ベクター」とは、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成された生物系において利用することができるベクターを指す。
「ｄＡｂ」又は「ｄＡｂ断片」は、ＶＨドメインで構成される抗体断片を指す（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４ ５４６）。
「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ断片」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬドメインで構成される抗体断片を指す。
「Ｆ（ａｂ’）２」又は「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域内のジスルフィド架橋によって接続された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。
「Ｆｄ」又は「Ｆｄ断片」は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指す。
「Ｆｖ」又は「Ｆｖ断片」は、抗体の単一のアーム由来のＶＨドメイン及びＶＬドメインで構成される抗体断片を指す。Ｆｖ断片は、Ｆａｂ（ＣＨ１及びＣＬ）領域の定常領域を欠いている。Ｆｖ断片におけるＶＨ及びＶＬは、非共有結合性相互作用によって一緒に保持される。
「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書において定義されるＣＤＲ以外のこれらのＶＨ又はＶＬ残基である。
「完全長抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続された、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）で構成される。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメインで構成され、重鎖定常ドメインは、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）で構成される。ＶＨ及びＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
「遺伝子修飾」は、宿主細胞が、導入された遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生するように、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを指す。導入された遺伝子又は配列はまた、「クローニングされた」又は「外来」遺伝子又は配列と呼ばれる場合もあり、開始、終止、プロモータ、シグナル、分泌、又は細胞の遺伝機序によって使用される他の配列などのキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結した調節配列又は制御配列を含んでいてよい。遺伝子又は配列は、既知の機能を有さない非機能的配列を含んでいてよい。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取って発現する宿主細胞は、「遺伝的に操作されている」。宿主細胞に導入されたＤＮＡ又はＲＮＡは、宿主細胞と同じ属若しくは種の細胞を含む任意の起源、又は異なる属若しくは種に由来し得る。
「異種」とは、自然界では互いに対して同じ関係で見出されることのない、２つ若しくは３つ以上のポリヌクレオチド又は２つ若しくは３つ以上のポリペプチドを指す。
「異種ポリヌクレオチド」とは、本明細書に記載の２つ又は３つ以上のネオ抗原をコードする、天然には存在しないポリヌクレオチドを指す。
「異種ポリペプチド」とは、本明細書に記載の２つ又は３つ以上のネオ抗原ポリペプチドを含む、天然には存在しないポリペプチドを指す。
「宿主細胞」は、異種核酸を含有する任意の細胞を指す。例示的な異種核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）である。
「ヒト抗体」は、ヒト対象に投与されるときに、最小の免疫応答を有するように最適化された抗体を意味する。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、その定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットである。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、又はこれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載されるヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を意味する。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
「～と組み合わせて」は、２つ又は３つ以上の治療剤を、混合物の状態で一緒に、単剤として同時に、又は単剤として任意の順序で順次、対象に投与することを意味する。
「単離／単離された」とは、組換え細胞などにおける分子が産生される系の他の成分から離して実質的に分離及び／又は精製された分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又はポリペプチド）、並びに少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離／単離された」とは、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された分子を包含する。「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（isoelectric focusing、ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィ（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
本明細書で使用される「リンカー」は、２つの異なる実体を共有結合的に連結する化学リンカー又は単鎖ペプチドリンカーを指す。リンカーは、本発明の抗体又はその又はその断片、融合タンパク質及びコンジュゲートのいずれか２つを連結することができる。リンカーは、例えば、ｓｃＦｖ中のＶＨ及びＶＬ又はモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を第２の抗体などの治療用分子と連結することができる。ペプチド結合によって連結された１～２５個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のアミノ酸から構成される単鎖ペプチドリンカーを使用することができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、２０種の天然アミノ酸から選択される。ある特定の他の実施形態では、１つ又は２つ以上のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択される。炭化水素リンカー、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）リンカー、ポリプロピレングリコール（polypropylene glycol、ＰＰＧ）リンカー、多糖リンカー、ポリエステルリンカー、ＰＥＧと埋め込まれた複素環とからなるハイブリッドリンカー、及び炭化水素鎖などの化学リンカーも使用することができる。
「調節する」は、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較したときに、より多い又はより少ない応答を媒介する（すなわち、下流効果）試験分子の増強された又は低減された能力のいずれかを指す。
「モノクローナル抗体」とは、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去する、又はアミノ酸の異性化若しくは脱アミド、メチオニンの酸化、又はアスパラギン若しくはグルタミンの脱アミドなどの翻訳後修飾といった、可能な周知の変更を除いて同一である、抗体分子の実質的に均質な母集団から得られた抗体、すなわち、集団を構成する個別の抗体を意味する。二重特異性モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であってよく、又は、二重特異性などの多重特異性であってよく、一価、二価、又は多価であってもよい。
「多重特異性抗原結合構築物」又は「多重特異性分子」は、２つ以上の異なる抗原又は同じ抗原内の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する構築物を指す。多重特異性抗原結合構築物は、タンパク質、タンパク質複合体、又は抗体であり得る。これは、少なくとも１つの他の機能性分子（例えば、別の抗体又は受容体に対するリガンドなどの、別のペプチド又はタンパク質）に会合又は結合し、これによって少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する分子を形成する、抗体又はその抗原結合性断片を含む。多重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（Macaca fascicularis）（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｃｙｎｏ）又はチンパンジー（Pan troglodytes）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合もあり、２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合する場合もある。例示的な多重特異性分子としては、三重特異性又は二重特異性抗体、及び可溶性受容体断片又はリガンドに連結された抗体が挙げられる。
「ナチュラルキラー細胞」及び「ＮＫ細胞」は、本明細書では互換的かつ同義的に使用される。本明細書で使用するとき、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋ ＣＤ５６＋及び／又はＣＤ５７＋ＴＣＲ－表現型を有する分化リンパ球を指す。ＮＫ細胞は、特定の細胞溶解性酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合し、死滅させる能力、腫瘍細胞又はＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する他の疾患細胞を死滅させる能力、及び免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。
「動作可能に連結された」及び類似の語句は、核酸又はアミノ酸に関して使用される場合、それぞれ、互いに機能的な関係で配置された核酸配列又はアミノ酸配列の動作上の連結を指す。例えば、動作可能に連結されたプロモータ、エンハンサエレメント、オープンリーディングフレーム、５’及び３’ＵＴＲ、並びにターミネータ配列は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の正確な産生をもたらし、場合によっては、ポリペプチドの産生（すなわち、オープンリーディングフレームの発現）をもたらす。動作可能に連結されたペプチドは、ペプチドの機能ドメインが互いに適切な距離で配置されて、各ドメインの意図された機能を付与するペプチドを指す。
「パラトープ」という用語は、抗原の結合に関与し、抗原と相互作用する残基を含む抗体分子の区域又は領域を指す。パラトープは、高次構造的空間単位を形成する連続的及び／又は不連続なアミノ酸で構成され得る。所与の抗体のパラトープは、様々な実験及び計算方法を使用して、様々なレベルで詳細に定義及び特性評価することができる。実験方法は、水素／重水素交換質量分析（hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry、ＨＸ－ＭＳ）を含む。パラトープは、用いられるマッピング方法に応じて異なって定義される。パラトープは、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基（このいくつかは典型的にＣＤＲ内にある）と、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に結合した抗原により効果的に遮断されるアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基が、特異的に結合した抗原の「溶媒除外表面」及び／又はフットプリント内にある）とを含んでもよい。
「医薬的組み合わせ」は、一緒に又は別々に投与される２つ又は３つ以上の活性成分の組み合わせを指す。
「医薬組成物」は、活性成分と医薬的に許容される担体とを組み合わせて得られる組成物を指す。
「医薬的に許容される担体」又は「賦形剤」は、対象に対して毒性のない、活性成分以外の医薬組成物中の成分を指す。例示的な医薬的に許容される担体は、バッファ、安定剤、又は防腐剤である。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、糖－リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学によって共有結合されたヌクレオチド鎖を含む、合成分子を指す。ｃＤＮＡは、ポリヌクレオチドの典型例である。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る。
疾患又は障害を「予防する」、「予防すること」、「予防」、又は「予防法」は、対象において障害が発生するのを防ぐことを意味する。
「増殖」は、細胞の対称的又は非対称的な分裂のいずれかである細胞分裂の増加を指す。
「プロモータ」は、転写を開始させるために必要な最小配列を指す。プロモータはまた、それぞれ転写を増強又は抑制するエンハンサ又はリプレッサエレメントを含み得る。
本明細書では互換的に使用される「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、各々がペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸残基で構成されている１つ又は２つ以上のポリペプチドを含む分子を指す。タンパク質は、モノマーであってもよく、又は同一若しくは異なる２つ若しくは３つ以上のサブユニットのタンパク質複合体であってもよい。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。タンパク質は、異種融合タンパク質、糖タンパク質、又はリン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、シトルリン化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ペグ化又はビオチン化などの翻訳後改変によって修飾されたタンパク質であり得る。タンパク質は、組換え発現し得る。
「組換え体」とは、組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、ウイルス、及び他の巨大分子を指す。
「調節エレメント」は、核酸配列の発現のある側面を制御する任意のシス又はトランス作用性遺伝要素を指す。
「再発性」とは、治療薬による前治療後の改善期間後に疾患又は疾患の徴候及び症状が再開することを指す。
「難治性」とは、治療に応答しない疾患を指す。難治性疾患は、治療前若しくは治療開始時に治療に抵抗性であり得るか、又は難治性疾患は、治療中に抵抗性疾患となり得る。
アミノ酸配列に関して使用するとき、「配列同一性」又は「配列同一性パーセント（％）」又は「同一性％」という語句は、アミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較した、２つ又は３つ以上のアラインされたアミノ酸配列の同一のアミノ酸の一致数（「ヒット」）を記載する。２つ又は３つ以上の配列についてアライメントを使用した他の用語において、配列が、当該技術分野で既知の配列比較アルゴリズムを使用して測定した場合の、又は手動でアライン及び目視検査したときの、最大一致性について比較及びアラインされたとき、同じであるアミノ酸残基のパーセンテージ（例えば、アミノ酸配列の全長にわたって９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性）が判定され得る。したがって、配列同一性を判定するために比較される配列は、アミノ酸の置換、付加、又は欠失によって異なり得る。タンパク質配列をアラインするための好適なプログラムは、当業者に既知である。タンパク質配列の配列同一性のパーセンテージは、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡ、又はＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して判定され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗体断片及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含む少なくとも１つの抗体断片を含む融合タンパク質であって、ＶＬ及びＶＨが、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができる、融合タンパク質を指す。特に指定されない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域をいずれの順序で有していてもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでいてもよく、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでいてもよい。
「（ｓｃＦｖ）２」又は「タンデムｓｃＦｖ」又は「ビス－ｓｃＦｖ」断片とは、２つの軽鎖可変領域（ＶＬ）と、２つの重鎖可変領域（ＶＨ）と、を含む融合タンパク質を指し、２つのＶＬ及び２つのＶＨは、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができる。２つのＶＬ及び２つのＶＨは、ペプチドリンカーによって融合されて、二価分子ＶＬＡ－リンカー－ＶＨＡ－リンカー－ＶＬＢ－リンカー－ＶＨＢを形成して、２つの異なる抗原又はエピトープに同時に結合することができる２つの結合部位を形成する。
「特異的に結合する」、「特異的結合」、「特異的に結合している」、又は「結合する」とは、タンパク質性分子が、抗原又は当該抗原内のエピトープに、他の抗原に対する親和性よりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、タンパク質性分子は、約１×１０－７Ｍ以下、例えば約５×１０－８Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原又は抗原内のエピトープに結合し、典型的には、ＫＤは、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのＫＤよりも少なくとも１００倍小さい。
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」としては、あらゆる脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳類及び非哺乳類が挙げられる。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」は互換的であり、本明細書において同義的に使用される。Ｔ細胞には、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、メモリＴ細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（T helper、Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。また、「ＮＫＴ細胞」も含まれ、これは、半不変αβＴ細胞受容体を発現するだけでなく、ＮＫ１．１などの典型的にはＮＫ細胞に関連する様々な分子マーカーも発現する、Ｔ細胞の特殊な集団を指す。ＮＫＴ細胞には、ＮＫ１．１＋及びＮＫ１．１－、並びにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、及びＣＤ８－細胞が含まれる。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉ様分子ＣＤ Ｉｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生する能力により、保護効果又は有害効果のいずれかを有し得る。また、「ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）」も含まれ、これは、それらの表面に異なるＴＣＲを有するＴ細胞の小さなサブセットの特殊な集団を指し、ＴＣＲがα及びβ－ＴＣＲ鎖と表記される２つの糖タンパク質鎖から構成されるＴ細胞の大部分とは異なり、γδＴ細胞におけるＴＣＲは、γ鎖及びδ鎖から構成される。γδＴ細胞は、免疫監視及び免疫調節において役割を果たすことができ、ＩＬ－１７の重要な供給源であること、及び強固なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することが見出された。また、「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」も含まれ、これは、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容における役割を果たす、Ｔ細胞を指す。Ｔｒｅｇは、典型的には、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞であり、かつ、ＩＬ－１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞である転写因子Ｆｏｘｐ３陰性調節性Ｔ細胞も含み得る。
本明細書において互換的に使用される「治療有効量」又は「有効量」は、必要な投薬量及び期間で、所望される治療結果を得るのに有効な量を指す。治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を引き出す治療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々であってよい。有効な治療薬又は治療薬の組み合わせの例示的な指標としては、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍量の低減、腫瘍の成長の停止若しくは減速、及び／又は体内の他の箇所へのがん細胞の転移の不在が含まれる。
「形質導入」は、ウイルスベクターを使用する、外来核酸の細胞への導入を指す。
がんなどの疾患若しくは障害を「治療する」、「治療すること」、又は「治療」とは、以下、障害の重篤度及び／若しくは期間を低減する、治療される障害に特徴的な症状の悪化を抑制する、以前に障害を有していた対象における障害の再発を制限若しくは予防する、又は障害について以前に症候性であった対象における症状の再発を制限若しくは予防する、のうちの１つ又は２つ以上を達成することを指す。
「腫瘍細胞」又は「がん細胞」とは、インビボ、エクスビボ、又は組織培養のいずれかにおいて、自然発生的な又は誘発された表現型の変化を有するがん性、前がん性、又は形質転換細胞を指す。これらの変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の組み込み、外因性核酸の取り込みにより発生させることもでき、自然発生的に又は発がん物質に曝露した後に発生し、それによって内因性の遺伝子が変異する場合もある。形質転換／がんは、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍の増殖などによって例示される。
「バリアント」、「変異体」又は「変化した」とは、１つ又は２つ以上の改変、例えば、１つ又は２つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
本明細書全体を通して、抗体定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、本明細書に別途明示的に記載のない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
「ＶＨＨ」は、重鎖の抗原結合領域で専ら構成される単一ドメイン抗体又はナノボディを指す。ＶＨＨ単一ドメイン抗体は、従来のＦａｂ領域の軽鎖及び重鎖のＣＨ１ドメインを欠いている。
物質の組成
ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域
本開示は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単一特異性及び多重特異性抗原結合構築物、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。本明細書で同定されたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、改善された熱安定性の観点で改善された特性を示した。本明細書に開示される多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を媒介し、Ｔ細胞の活性化及び増殖を促進し、Ｔ細胞サイトカイン放出を増加させ、かつ／又は抗腫瘍効果の増加を示すのに特に有効であり得る。
本開示は、デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号２６３に示されるＤＬＬ３のＥＧＦ－６＋Ｃ末端ドメイン内のエピトープ（ＤＬＬ３の残基４２９～６１８）に結合する、単離されたタンパク質を提供する。実施例に示されるように、ＥＧＦ－６ドメイン内の又はＤＬＬ３のＣ末端により近いエピトープを標的化する多重特異性抗原結合構築物は、強力なレベルの抗腫瘍細胞傷害性を達成した。
本開示を考慮して、当該技術分野で任意の既知の方法を使用して、本出願の抗体が結合するＤＬＬ３内の領域を同定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体が結合するＤＬＬ３内のドメインを同定することができる。ドメインマッピングＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Ｎ末端ＤＳＬ融合ドメイン（ＤＬ３Ｗ４４、配列番号１８９）、ＥＧＦ－１＋２融合体（ＤＬ３Ｗ４２、配列番号１８７）、ＥＧＦ－２（ＤＬ３Ｗ４１、配列番号１８６）、ＥＧＦ－３（ＤＬ３Ｗ４０、配列番号１８５）、ＥＧＦ－４（ＤＬ３Ｗ３９、配列番号１８４）、ＥＧＦ－５（ＤＬ３Ｗ３８、配列番号１８３）、ＥＧＦ－６（ＤＬ３Ｗ３７、配列番号１８２）、及びＥＧＦ－６＋Ｃ末端ドメイン融合体（ＤＬ３Ｗ３６、配列番号１８１）にわたる組換えＤＬＬ３ドメイン抗原への結合について、抗ＤＬＬ３抗体を評価した。ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ高結合プレートを、２０ｎＭ抗原で４℃で一晩コーティングした。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで洗浄し、次いでＳｔａｒｔｉｎｇ ｂｌｏｃｋ溶液で３０分間ブロッキングした。抗体を添加し、周囲温度で６０分間インキュベートし、次いで過剰の抗体をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１４１９０－１３６）で３回洗浄することによって除去した。抗原結合抗体を、スルホタグ化抗ヒト抗体（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒ３２ＡＪ）を用いて周囲温度で６０分間検出し、続いて別のＰＢＳ洗浄を行った。シグナル取得は、１×ＭＳＤリードバッファＴ（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ９２ＴＣ－１）の存在下、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ６００イメージャー上で適切なプレート設定で行った。優先的なドメイン結合を示す、ドメイン当たりの最も高い結合シグナルについてデータを分析した。
Ｈ／Ｄ交換アッセイを使用して、抗体が結合するＤＬＬ３内の残基を決定することができる。Ｈ／Ｄ交換アッセイでは、組換え的に発現させた可溶性ＤＬＬ３を、抗体の存在又は非存在下、重水素化水中で、所定の時間にわたってインキュベートすると、抗体によって保護されていない交換可能な水素原子で重水素の組み込みが生じ、続いて、タンパク質のプロテアーゼ消化及びＬＣ－ＭＳを使用するペプチド断片の分析を行う。Ｈ／Ｄ交換アッセイは、既知のプロトコルを使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、クエンチングバッファ（例えば、８Ｍ尿素、１Ｍ ＴＣＥＰ、ｐＨ３．０）の添加によってＨ／Ｄ交換混合物をクエンチした後、室温で、平衡化された固定化ペプシン／ＦＰＸＩＩＩカラムに通す（例えば、６００μＬ／分）。次いで、消化性断片を逆相トラップカラムに充填し（例えば、６００μＬ／分）し、脱塩し（例えば、６００μＬで１分間）し、分離し（例えば、Ｃ１８カラム）、質量分析によって分析する（例えば、キャピラリー温度２７５℃、分解能１５０，０００、及び質量範囲（ｍ／ｚ）３００～１，８００で、ＬＴＱ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる）。
いくつかの実施態様では、本出願は、抗原結合領域を含む、抗体などの単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、ＤＬＬ３への結合について本明細書に開示される参照抗体と競合する、単離されたタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、参照抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有するＶＨ、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有するＶＬを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、
ａ．配列番号１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｃ．配列番号５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｄ．配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｅ．配列番号９のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１０のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｆ．配列番号１１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｇ．配列番号１３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３である。
ある特定のこのような実施形態では、参照抗体は、配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
可溶性ＤＬＬ３の配列番号２６３に結合する試験抗体と本出願の参照抗体との結合についての競合は、本開示を考慮して周知の方法を使用してインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識参照抗体の存在下での、ＤＬＬ３、例えば、ＤＬＬ３の膜近位領域への標識抗体の結合は、ＥＬＩＳＡによって評価することができる。Ｂｉｏａｃｏｒｅ分析又はフローサイトメトリーを使用して、競合を示すことができる。試験抗体が可溶性ＤＬＬ３への参照抗体の結合を８５％又はそれ以上、例えば、９０％又はそれ以上、又は９５％又はそれ以上阻害するとき、試験抗体はＤＬＬ３への結合について参照抗体と競合する。
いくつかの実施態様では、本出願は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む、抗体などの単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有するＶＨ、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有するＶＬを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号９のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１０のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号１１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号１３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３である、単離されたタンパク質を提供する。特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、本出願は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む、抗体などの単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、
それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、
それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８、
それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０、
それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３、
それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、４６、
それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９、
それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、３５、
それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、３５、
それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、
それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、４０、
それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、
それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、４６、又は
それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、４９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３である、単離されたタンパク質を提供する。
別の実施形態では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５の配列番号のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離されたタンパク質を提供する。
別の実施形態では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号１、３、５、７、９、１１、又は１３のアミノ酸配列を有するＶＨを及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、又は１４のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、単離されたタンパク質を提供する。
本開示は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、
配列番号１のアミノ酸配列のＶＨ及び配列番号２のアミノ酸配列のＶＬ（配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬとも称される）、
配列番号１のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号１のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号１のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号１のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号１のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、又は
配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む、単離されたタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む、単離されたタンパク質を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む、単離されたタンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、例えば、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、例えば、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む。
本開示は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号６３のアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号６４のアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、（ｓｃＦｖ）２である。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｆｖである。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｆａｂである。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｆ（ａｂ’）２である。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｆｄである。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、ｄＡｂである。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、ＶＨＨである。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、ｓｃＦｖである。
ＤＬＬ３結合ｓｃＦｖ
ＤＬＬ３に結合する本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメイン又はそれらの構成成分のいずれも、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれのｓｃＦｖフォーマットへと遺伝子操作することができる。本明細書において同定されるＶＨ及びＶＬのいずれも、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ、ＶＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＬ、ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ、ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、又はＶＬ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＨなどのｓｃ（Ｆｖ）２構造を生成するために使用することができる。
本明細書で同定されたＶＨ及びＶＬ又はそれらの構成成分は、ｓｃＦｖフォーマットに組み込むことができ、ＤＬＬ３への得られたｓｃＦｖの結合及び熱安定性は、本開示を考慮して既知の方法を使用して評価することができる。結合は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、若しくはＫｉｎＥｘＡ機器、ＥＬＩＳＡ、又は当業者に既知の競合的結合アッセイを使用して評価することができる。結合は、精製されたｓｃＦｖ又は発現したｓｃＦｖを含むＥ．ｃｏｌｉ上清又は溶解細胞を使用して評価することができる。ＤＬＬ３に対する試験ｓｃＦｖの親和性の測定値は、異なる条件（例えば、モル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定した場合に異なり得る。したがって、親和性及び他の結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、典型的には、標準化条件及び標準化緩衝液を用いて行われる。熱安定性は、５０℃、５５℃、又は６０℃などの高温で、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、又は３０分などの期間、試験ｓｃＦｖを加熱し、ＤＬＬ３への試験ｓｃＦｖの結合を測定することによって評価し得る。非加熱ｓｃＦｖサンプルと比較したときに、ＤＬＬ３と同等の結合を保持しているｓｃＦｖが、熱安定性であると称される。
組換え発現系にて、リンカーはペプチドリンカーであり、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。リンカーに含まれ得る例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＴｈｅである。リンカーは、ＤＬＬ３への結合などの所望の活性を保持するように、互いに対して正確な高次構造を形成するような方法でＶＨ及びＶＬを連結させるのに適切な長さを有している必要がある。
リンカーは、約５～５０個のアミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～４０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１５～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、４０個のアミノ酸長である。使用され得る例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、Ｇｌｙ及びＳｅｒ含有リンカー、Ｇｌｙ及びＡｌａ含有リンカー、Ａｌａ及びＳｅｒ含有リンカー、並びに他の柔軟なリンカーである。
他のリンカー配列は、任意の免疫グロブリン重鎖又は軽鎖アイソタイプに由来する免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＬ又はＣＨ１の部分を含み得る。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含む様々な非タンパク質性ポリマーは、リンカーとしての使用が見出され得る。使用され得る例示的なリンカーを表２に示す。追加のリンカーは、例えば、国際公開第２０１９／０６０６９５号に記載されている。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１２０、配列番号２７、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、又は配列番号１３９のアミノ酸配列を含む。
Figure 2023548034000003
特定の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号９のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１０のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号１１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号１３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有するＶＨ、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有するＶＬを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、
それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、
それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８、
それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０、
それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３、
それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、４６、
それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９、
それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、３５、
それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、３５、
それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、
それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、４０、
それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、
それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、４６、又は
それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、４９のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号２のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号６のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号８のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号１０のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号１２のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号１４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。
ＤＬＬ３に結合する他の抗原結合領域
ＤＬＬ３に結合する本明細書で同定されたＶＨ及びＶＬ又はその構成成分のいずれも、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖフォーマットへと遺伝子操作することができ、それらのＤＬＬ３への結合及び熱安定性は、本明細書に記載されるアッセイを使用して評価することができる。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有するＶＨ、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有するＶＬを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号９のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１０のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号１１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は配列番号１３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、
それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５、
それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、及び４０、
それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、及び４３、
それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、及び４９、
それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、及び３５、
それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、及び３５、
それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、及び４０、
それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、及び４３、
それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、及び４６、又は
それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、及び４９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号５のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号７のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号９のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１１のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号１０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号１２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
特定の実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号２のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号２のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号２のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号２のＶＬと少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号１のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号２のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む。
特定の実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖは、配列番号３のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む。
ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むＦａｂのＶＨ及びＶＬは、それぞれＦａｂ－Ｆｃ ＨＣ（ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）及びＦａｂ－Ｆｃ ＬＣ（ＶＬ－ＣＬ）形式へと遺伝子操作することができる。ある特定のこのような実施形態では、Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣは、配列番号１０９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣは、配列番号１０９と同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ－Ｆｃ ＬＣは、配列番号１１０と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｆａｂ－Ｆｃ ＬＣは、配列番号１１０と同一であるアミノ酸配列を含む。
実施例に示されるように、多重特異性構築物に組み込むためのＤＬＬ３に結合する特に好適な抗原結合領域は、配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＦａｂ－Ｆｃ ＨＣ及び配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＦａｂ－Ｆｃ ＬＣを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。
相同な抗原結合領域及び保存的置換を有する抗原結合領域
ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域のバリアントは、本開示の範囲内である。例えば、バリアントは、親抗原結合領域と比較したときに改善された機能的性質を保持するか又は有する限り、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９個のアミノ酸置換を含んでもよい。いくつかの実施形態では、配列同一性は、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であってもよい。いくつかの実施形態では、多様性はフレームワーク領域に存在する。いくつかの実施形態では、バリアントは、保存的置換により生成される。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質は、本明細書に開示されるＤＬＬ３に結合する抗原結合領域のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含む。
また、
配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、又は
配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬと少なくとも８０％同一であるＶＨ及びＶＬを含む、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域も提供される。
いくつかの実施形態では、同一性は、８５％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９０％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９１％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９１％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９２％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９３％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９４％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９４％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９５％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９６％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９７％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９８％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９９％である。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号１のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号２のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号５のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号６のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号７のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号８のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号９のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号１０のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号１１のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号１２のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号１３のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号１４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも８５％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９０％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９１％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９２％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９３％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９４％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９６％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９７％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９８％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８５％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９０％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９１％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９２％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９３％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９４％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９６％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９７％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９８％同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ４：１１－１７（１９８８））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ＿／／＿ｗｗｗ＿ｇｃｇ＿ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４４－４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかと、ギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、及び長さ重み付け１、２、３、４、５、又は６を使用して決定することもできる。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域のバリアントは、ＤＬＬ３に結合する親抗原結合断片の所望の機能的特性を保持しながら、ＣＤＲ領域のいずれかに１つ又は２つの保存的置換を含む。
「保存的改変」は、アミノ酸修飾を含む抗体の結合特性に著しく影響を与えることも変化させることもないアミノ酸修飾を指す。保存的改変は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、ポリペプチド中の任意の天然残基はまた、アラニンスキャニング変異誘発（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６４３：５５－６７；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５：１－２４）について以前に記載されているように、アラニンで置換され得る。本出願の抗体に対するアミノ酸置換は、既知の方法、例えばＰＣＲ変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）により行うことができる。代替的に、バリアントのライブラリは、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン（例えば、１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコドン）を用いて生成することもできる。得られるバリアントは、本明細書に記載のアッセイを用いて、その特徴について試験することができる。
ＤＬＬ３に結合する抗原結合断片を作製する方法
本開示で提供されるＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、様々な技術を使用して作製し得る。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法を使用して、ＤＬＬ３に結合するＶＨ／ＶＬ対を同定することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えば、ハムスター、ラット、若しくはニワトリを、ヒト及び／又はカニクイザルＤＬＬ３で免疫し、続いて、標準的な方法を用いて骨髄腫細胞で免疫した動物の脾臓細胞を融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から生じたコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、抗原に対する親和性、及び任意の所望の機能性などの所望の特性を有するＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む抗体の生成についてスクリーニングし得る。
非ヒト動物を免疫することによって生成されたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域をヒト化し得る。ヒトアクセプタフレームワークの選択を含む例示的なヒト化技術としては、ＣＤＲ移植（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲ移植（米国特許第６，８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ，（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：４８９－４９９）、特異性決定残基リサーフェシング（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適合（米国特許第８，７４８，３５６号）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）が挙げられる。これらの方法では、ＣＤＲの長さの類似性若しくはカノニカル構造の同一性、又はそれらの組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づき選択され得るヒトフレームワークに、親抗体のＣＤＲ又はＣＤＲ残基のサブセットを移植する。
ヒト化抗原結合領域は、国際公開第１０９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号に記載されているものなどの技術により、変化させたフレームワーク支持残基を組み込んで結合親和性を保持することによって（復帰変異）、又はＣＤＲのいずれかに多様性を導入して、例えば抗原結合領域の親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択性又は親和性を改善するように更に最適化し得る。
自身のゲノムにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を保有するマウス、ラット、又はニワトリなどのトランスジェニック動物を使用して、ＤＬＬ３に結合する抗原結合断片を作製することができ、これらは例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第１９９９／４５９６２号、同第２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８号、及び同第１９９０／０４０３６号に記載されている。このような動物の内因的な免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組換えを使用して、導入染色体（transchromosome）を使用して、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を使用して、選択抗原を標的としたヒト抗体を提供するべく取り組んでいる場合がある。いくつかの実施形態では、Ａｂｌｅｘｉｓマウスを可溶性全長ＤＬＬ３タンパク質で免疫化した。
ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、ヒト免疫グロブリン又はその一部、例えばＦａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は不対若しくは対合抗体可変領域を発現するようにファージが遺伝子操作されているファージディスプレイライブラリから選択することができる。ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６、及び国際公開第０９／０８５４６２号）に記載されるバクテリオファージｐＩＸ被覆タンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリから単離され得る。ライブラリを、ヒト及び／又はカニクイザルＤＬＬ３へのファージ結合についてスクリーニングしてよく、得られた陽性クローンを更に特性評価し、クローン溶解物からＦａｂを単離し、ｓｃＦｖ又は抗原結合断片の他の構成に変換してよい。
免疫原性抗原の調製並びに本開示の抗原結合領域の発現及び生成は、組換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を用いて行うことができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あるいは全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、あるいは、抗原は、当該抗原又はその一部分をコードする核酸から動物の体内で新規に（de novo）形成されてもよい。
半減期延長部分への融合又はコンジュゲーション
本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を半減期延長部分に融合又はコンジュゲートさせることができる。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミンバリアント、アルブミン結合タンパク質及び／又はドメイン、トランスフェリン並びにその断片及び類似体、免疫グロブリン（Ｉｇ）又はその断片、例えばＦｃ領域である。前述の半減期延長部分のアミノ酸配列は公知である。Ｉｇ又はその断片は、全てのアイソタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む。
本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域にコンジュゲートされ得る追加の半減期延長部分としては、所望の特性のための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えば、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００、異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖又は多糖類）が挙げられる。これら部分は、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域と直接融合させ、標準的なクローニング及び発現技術によって作製し得る。代替的に、周知の化学的カップリング方法を用いて、組換えで生成された本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域にその部分を結合し得る。
例えば、システイン残基を本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域のＣ末端に組み込むか、又は遺伝子操作してシステインをＤＬＬ３結合部位から離れる方向に面する残基位置にし、周知の方法を用いてペギル基をシステインに結合させることによって、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域にペギル（pegyl）部分をコンジュゲートさせることができる。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合断片は、半減期延長部分に融合又はコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域である。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇである。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇの断片である。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域である。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域の断片である。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｆｃ領域である。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、アルブミンである。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、アルブミン結合ドメインである。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、トランスフェリンである。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコールである。
既知のインビボモデルを利用し、本開示を考慮して、半減期延長部分に融合又はコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域をその薬物動態特性について評価することができる。
免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域の断片への融合
本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域をＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートして、Ｆｃエフェクター機能Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ））のダウンレギュレーションを含む、抗体様特性を付与することができる。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片はまた、本明細書で論じられるように、半減期延長部分としても機能する。本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、標準的な方法を使用して遺伝子操作して従来の完全長抗体にすることができる。ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む完全長抗体は、本明細書に記載のとおり、更に遺伝子操作され得る。
免疫グロブリン重鎖定常領域は、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。ＥＵインデックスに従う残基番号付けで、重鎖においてＣＨ１ドメインは残基Ａ１１８～Ｖ２１５に及び、ＣＨ２ドメイン残基はＡ２３１～Ｋ３４０に及び、ＣＨ３ドメイン残基Ｇ３４１～Ｋ４４７に及ぶ。いくつかの例では、Ｇ３４１は、ＣＨ２ドメイン残基と称される。ヒンジは、概して、Ｅ２１６を含み、ヒトＩｇＧ１のＰ２３０で終結すると定義される。Ｉｇ Ｆｃ領域は、Ｉｇ定常領域の少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、したがって、Ｉｇ重鎖定常領域の少なくともおよそＡ２３１からＫ４４７までの領域を含む。
本出願はまた、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を提供する。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域は、重鎖定常領域である。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域は、軽鎖定常領域である。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。ヒンジの一部分は、Ｉｇヒンジの１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を指す。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
特定の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、第２のリンカー（Ｌ２）を介してＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２７、７２、７３、７４、７５、７６、７９、８１、８２、８３、８８、９０、９１、９２、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、又は１３９のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、いくつかの既知のアッセイを使用してその機能性について評価することができる。ＤＬＬ３への結合は、本明細書に記載の方法を使用して評価することができる。Ｉｇ定常ドメイン又はＩｇ定常領域の断片、例えばＦｃ領域によって付与される変化した特性は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、若しくはＦｃＲｎ受容体などの受容体の可溶性形態を使用するＦｃ受容体結合アッセイにおいて、又は例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ、若しくはＡＤＣＰを測定する細胞ベースのアッセイを使用して、アッセイすることができる。
ＡＤＣＣは、ＤＬＬ３発現細胞を標的細胞として、及び、ＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用するインビトロアッセイを使用して評価することができる。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光色素、又は天然細胞内タンパク質）の放出によって検出することができる。例示的なアッセイでは、標的細胞を、１つの標的細胞の、４つのエフェクター細胞に対する比で使用する。標的細胞はＢＡＴＤＡで予め標識し、エフェクター細胞及び試験抗体と組み合わせる。サンプルを２時間インキュベートし、上清に放出したＢＡＴＤＡを測定することにより、細胞溶解を測定する。０．６７％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による最大の細胞傷害に対してデータを正規化し、また任意の抗体の非存在下における標的細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出によって最小対照を求める。
ＡＤＣＰは、単球由来マクロファージをエフェクター細胞として、及び、ＧＦＰ又は他の標識分子を発現するように遺伝子操作された任意のＤＬＬ３発現細胞を標的細胞として使用することによって評価することができる。例示的なアッセイでは、エフェクター：標的細胞比は、例えば４：１とすることができる。エフェクター細胞は、本出願の抗体を添加して、又は添加せずに、標的細胞とともに４時間インキュベートしてよい。インキュベーション後、細胞は、アクターゼを用いて剥離できる。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び抗ＣＤ１４抗体を用いて特定することができ、貪食作用の割合は、標準的な方法を用いて、ＣＤ１１＋ＣＤ１４＋マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光％に基づいて求めることができる。
細胞のＣＤＣは、例えば、Ｄａｕｄｉ細胞を、ＲＰＭＩ－Ｂ（１％のＢＳＡを補給したＲＰＭＩ）に１×１０５個の細胞／ウェル（５０μＬ／ウェル）で播種し、５０μＬの試験タンパク質を０～１００μｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに添加し、反応物を室温で１５分間インキュベートし、１１μＬのプールヒト血清をウェルに添加し、反応物を３７℃で４５分間インキュベートすることによって測定され得る。溶解した細胞の割合（％）は、標準法を使用して、ＦＡＣＳアッセイにおけるヨウ化プロピジウム染色細胞の％として検出され得る。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第１のＩｇ定常領域の断片に融合され、かつ／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、第２の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第２のＩｇ定常領域の断片に融合される。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域と第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片との間、及びリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域と第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片との間に、第２のリンカー（Ｌ２）を更に含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２７、７２、７３、７４、７５、７６、７９、８１、８２、８３、８８、９０、９１、９２、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、又は１３９のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
特定の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、本明細書に記載のとおり更に遺伝子操作されてもよい。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＦｃγＲへの多重特異性抗原結合構築物の低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、ＦｃγＲへの多重特異性抗原結合構築物の低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けはＥＵインデックスに従う。特定の実施形態では、第１のＩｇ定常領域若しくは第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域若しくは第２のＩｇ定常領域の断片は、以下の変異：Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓを含む。
いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性抗原結合構築物の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異及び／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異、及び／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載されるＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異、及び／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異は、国際公開第１９９６／０２７０１１号に記載されるＴ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本出願のタンパク質又は多重特異性抗原結合構築物は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣなどのエフェクター機能を低減又は排除する１つ又は２つ以上のアミノ酸改変、例えば、Ｆｃγ受容体への結合を低減又は消失させる変異を含み得る。そのような変異は、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓの１つ、２つ、又は３つの変異であり得、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従う。
本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質
本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、標準的な方法を使用して、様々な設計の単一特異性又は多重特異性抗原結合構築物へと遺伝子操作することができる。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単一特異性タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、単一特異性タンパク質は、抗体である。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、二重特異性である。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、三重特異性である。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は四重特異性である。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３への結合について一価である。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３への結合に関して二価である。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（ＣＤ３など）に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原は、Ｔ細胞抗原である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原である。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原は、ＮＫ細胞抗原である。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原は、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃである。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原は、ＣＤ３εである。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、Ｆａｂを含む。
他の実施態様では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、Ｆ（ａｂ’）２を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、ＶＨＨを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、Ｆｖを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、Ｆｄを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、ｓｃＦｖを含む。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は二重特異性であり、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域はｓｃＦｖを含み、リンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域はＦａｂを含む。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は二重特異性であり、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域はＦａｂを含み、リンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域はｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約５～５０個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約５～４０個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約１０～３０個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約１０～２０個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２７、７２、７３、７４、７５、７６、７９、８１、８２、８３、８８、９０、９１、９２、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、又は１３９のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する細胞外抗原結合領域は、
配列番号１５、１８、２１、２４、１８、３０、５０、５２、５３、５５、５７、５９、又は６１のＨＣＤＲ１、配列番号１６、１９、２２、２５、２８、３１、５１、５４、５６、５８、６０、又は６２のＨＣＤＲ２、配列番号１７、２０、２３、２６、２９、３２、１７、２０、２３、２６、２９、又は３２のＨＣＤＲ３、配列番号３３、３６、３９、４１、４４、又は４７のＬＣＤＲ１、配列番号３４、３７、４２、４５、又は４８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３５、３８、４０、４３、４６、又は４９のＬＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞介在性細胞毒性を媒介し、Ｔ細胞活性化及び増殖を促進し、Ｔ細胞サイトカイン放出を増加させ、及び／又は増加した抗腫瘍効力を示す。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を強力に媒介する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１発現を上方制御する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、増加した腫瘍死滅を示す。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びに任意選択で、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃ、例えばＣＤ３であるリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、例えば、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬ、並びに任意選択で、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃ、例えばＣＤ３であるリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞介在細胞毒性を媒介し、Ｔ細胞活性化及び増殖を促進し、Ｔ細胞サイトカイン放出を増加させ、及び／又は増加した抗腫瘍効果を示す。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を強力に媒介する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１発現を上方制御する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、増加した腫瘍死滅を示す。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞細胞傷害性アッセイにおいて、５日までに９０％超（例えば、９５％）の腫瘍溶解を達成する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬ、並びに任意選択で、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃ、例えばＣＤ３であるリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬ、並びに任意選択で、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃ、例えばＣＤ３であるリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離された多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞介在性細胞毒性を媒介し、Ｔ細胞活性化及び増殖を促進し、Ｔ細胞サイトカイン放出を増加させ、及び／又は増加した抗腫瘍効力を示すのに特に有効であり得る。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、並びに任意選択で、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃ、例えばＣＤ３であるリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域を含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を媒介する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を強力に媒介する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１発現を上方制御する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、増加した腫瘍死滅を示す。いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞細胞傷害性アッセイにおいて、５日までに９０％超（例えば、９５％）の腫瘍溶解を達成する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６３のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６４のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６６のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６８のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６３又は６４のアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、リンパ球抗原（ＣＤ３など）に結合する第２の抗原結合領域であって、リンパ球に結合する抗原結合領域が、配列番号７７の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号８０の軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む、第２の抗原結合領域を提供する。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原（ＣＤ３など）に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。
特定の実施形態では、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原（ＣＤ３など）に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。
特定の実施形態では、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、
配列番号９５のＨＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１のＬＣＤＲ１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３、又は配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、
配列番号９８のＨＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３、又は配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む。
特定の実施形態では、リンパ球抗原（ＣＤ３など）に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号９５のＨＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１のＬＣＤＲ１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、リンパ球抗原（ＣＤ３など）に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号９５のＨＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１のＬＣＤＲ１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、リンパ球抗原（ＣＤ３など）に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号９８のＨＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を媒介する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を強力に媒介する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１発現を上方制御する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、増加した腫瘍死滅を示す。いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞細胞傷害性アッセイにおいて５日までに９０％超（例えば、９５％）の腫瘍溶解を達成する。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、リンパ球抗原（ＣＤ３など）に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を媒介し、Ｔ細胞活性化、増殖（proliferation）、及び増殖（expansion）を促進し、Ｔ細胞サイトカイン放出を増加させ、かつ／又は増加した抗腫瘍有効性を示す。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を強力に媒介する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１発現を上方制御する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、増加した腫瘍死滅を示す。いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３は、Ｔ細胞障害活性アッセイにおいて、５日までに９０％超（例えば、９５％）の腫瘍溶解を達成する。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含み、リンパ球抗原（ＣＤ３など）に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号９５のＨＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１のＬＣＤＲ１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む。
ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物の作製
本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合断片は、多重特異性抗体へと遺伝子操作してもよく、当該抗体も本出願の範囲内に包含される。
ＤＬＬ３に結合する抗原結合断片は、Ｆａｂアーム交換を使用して作製される完全長多重特異性抗体へと遺伝子操作してもよく、ここでは、置換が、インビトロでＦａｂアーム交換を促進するＩｇ定常領域ＣＨ３ドメイン内の２つの単一特異性二価抗体に導入される。この方法では、ヘテロ二量体の安定性を促進する特定の置換をＣＨ３ドメインに有するように、２つの単一特異性二価抗体を遺伝子操作する。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下においてともにインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る代表的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine、２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（dithioerythritol、ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（tris(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びβ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
使用され得るＣＨ３変異としては、ノブインホール変異（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、静電マッチ変異（Ｃｈｕｇａｉ、Ａｍｇｅｎ、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｏｎｃｏｍｅｄ）、鎖交換遺伝子操作ドメインボディ（Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ、ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）、及び他の非対称変異（例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）などの技術が挙げられる。
ノブインホール変異は、例えば、国際公開第１９９６／０２７０１１号に開示されており、小さい側鎖（ホール）を有するアミノ酸が第１のＣＨ３領域に導入され、大きな側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が第２のＣＨ３領域に導入され、第１のＣＨ３領域と第２のＣＨ３領域との間に優先的な相互作用をもたらす、ＣＨ３領域の界面上の変異が含まれる。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３領域変異は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである。
重鎖ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、同第２００９／０１８２１２７号、同第２０１０／０２８６３７号、又は同第２０１１／０１２３５３２号に記載のように、第１のＣＨ３領域上の正に荷電した残基及び第２のＣＨ３領域上の負に荷電した残基を置換することにより、静電相互作用を使用することによって促進され得る。
重鎖ヘテロ二量体化を促進するために使用することができる他の非対称変異は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は同第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗである。
ＳＥＥＤボディ変異は、米国特許出願公開第２００７０２８７１７０号に記載のように、選択されたＩｇＧ残基をＩｇＡ残基と置換して、重鎖ヘテロ二量体化を促進することを伴う。
使用され得る他の例示的な変異は、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号、及び米国特許出願公開第２０１８／０１１８８４９号に記載のＲ４０９Ｄ＿Ｋ３７０Ｅ／Ｄ３９９Ｋ＿Ｅ３５７Ｋ、Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｋ／Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｅ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ３５６Ｋ、Ｋ２５３Ｅ＿Ｄ２８２Ｋ＿Ｋ３２２Ｄ／Ｄ２３９Ｋ＿Ｅ２４０Ｋ＿Ｋ２９２Ｄ、Ｋ３９２Ｄ＿Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３５６Ｋ＿Ｄ３９９Ｋである。
Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）は、例えば、米国特許第９，１５０，６６３号及び米国特許出願公開第２０１４／０３０３３５６号に開示されており、Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、野生型／Ｆ４０５Ｌ＿Ｒ４０９Ｋ、Ｔ３５０Ｉ＿Ｋ３７０Ｔ＿Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、Ｋ３７０Ｗ／Ｋ４０９Ｒ、Ｄ３９９ＡＦＧＨＩＬＭＮＲＳＴＶＷＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｔ３６６ＡＤＥＦＧＨＩＬＭＱＶＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８ＡＤＥＧＨＮＲＳＴＶＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｄ３９９ＦＨＫＲＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｆ４０５ＩＫＬＳＴＶＷ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、及びＹ４０７ＬＷＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨの変異が挙げられる。
ＤＬＬ３に結合する抗原結合断片を組み込むことができる追加の二重特異性又は多重特異性構造としては、二重可変ドメイン免疫グロブリン（Dual Variable Domain Immunoglobuliｎ、ＤＶＤ）（国際公開第２００９／１３４７７６号；ＤＶＤは、ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２－ＣＨ構造を有する重鎖と、ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２－ＣＬ構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意選択である）、異なる特異性を有する２つの抗体アームを結合するための様々な二量化ドメインを含む構造、例えば、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量化ドメイン（国際公開第２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）、一緒にコンジュゲートされた２つ又は３つ以上のドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、ダイアボディ、ラクダ科抗体及び遺伝子操作されたラクダ科抗体などの重鎖のみ抗体、Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩｇＧ－ｌｉｋｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、ＳｃＦｖ／Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ））、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ又はＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）並びにＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ抗体、ダイアボディに基づく抗体、及びドメイン抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（Bispecific T Cell Engager、ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Tandem Diabody、Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的技術（Dual Affinity Retargeting Technology、ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的重鎖のみドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。
本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域はまた、３本のポリペプチド鎖を含む多重特異性抗原結合構築物へと遺伝子操作してもよい。このような設計では、少なくとも１つの抗原結合領域は、ｓｃＦｖの形態である。例示的な設計としては、以下が挙げられる（「１」が第１の抗原結合領域を示し、「２」が第２の抗原結合領域を示し、「３」が第３の抗原結合領域を示す）：
設計１：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計２：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計３：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計４：鎖Ａ）ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖ１、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
ＣＨ３操作は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗの変異など、設計１～４に組み込まれ得る。
特定の実施形態では、設計は、以下である、鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３。
いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（ＣＤ３など）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号１５、１８、２１、２４、１８、３０、５０、５２、５３、５５、５７、５９、又は６１のＨＣＤＲ１、配列番号１６、１９、２２、２５、２８、３１、５１、５４、５６、５８、６０、又は６２のＨＣＤＲ２、配列番号１７、２０、２３、２６、２９、３２、１７、２０、２３、２６、２９、又は３２のＨＣＤＲ３、配列番号３３、３６、３９、４１、４４、又は４７のＬＣＤＲ１、配列番号３４、３７、４２、４５、又は４８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３５、３８、４０、４３、４６、又は４９のＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（ＣＤ３など）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、
それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、
それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８、
それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０、
それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３、
それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、４６、
それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９、
それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、３５、
それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、３５、
それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、
それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、４０、
それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、
それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、４６、又は
それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、４９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３である、単離されたタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域と、リンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域とを含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞介在細胞毒性を媒介し、Ｔ細胞活性化及び増殖を促進し、Ｔ細胞サイトカイン放出を増加させ、及び／又は増加した抗腫瘍効果を示す。いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を強力に媒介する。いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１発現を上方制御する。いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、増加した腫瘍死滅を示す。いくつかの実施態様では、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞細胞傷害性アッセイにおいて５日までに９０％超（例えば、９５％）の腫瘍溶解を達成する。
いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、
配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号１のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号１のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号１のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号１のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号１のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号１３のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、又は
配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む。
特定の実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
特定の実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離された多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞介在性細胞毒性を媒介し、Ｔ細胞活性化及び増殖を促進し、Ｔ細胞サイトカイン放出を増加させ、及び／又は増加した抗腫瘍効力を表すのに特に有効であり得る。特定の実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
特定の実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
特定の実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。
特定の実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるＶＬを含む。いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を媒介する。いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を強力に媒介する。いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１発現を上方制御する。いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、増加した腫瘍死滅を示す。いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞細胞傷害性アッセイにおいて、５日までに９０％超（例えば、９５％）の腫瘍溶解を達成する。
特定の実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６３又は６４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６３又は６４のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号９５又は９８のＨＣＤＲ１、配列番号９６又は９９のＨＣＤＲ２、配列番号９７又は１００のＨＣＤＲ３、又は配列番号１０１又は１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０２又は１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０３、１０４、又は１０８のＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、
配列番号９５のＨＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１のＬＣＤＲ１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３、又は
配列番号９８のＨＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域を含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号９５のＨＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、又は配列番号１０１のＬＣＤＲ１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域を含み、リンパ球抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域を含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域は、
配列番号９８のＨＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３、又は配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、それぞれ配列番号９５、９６、９７、１０１、１０２、１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号１０５のｓｃＦｖを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号１０９のＨＣ１、配列番号１１０のＬＣ１、及び配列番号１１２のＨＣ１を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、それぞれ配列番号９５、９６、９７、１０１、１０２、１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号１１９のｓｃＦｖを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号１０９のＨＣ１、配列番号１１０のＬＣ１、及び配列番号１１３のＨＣ１を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、並びに／及び
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６３のｓｃＦｖを含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号１１１のＨＣ１、配列番号１１６のＨＣ２、及び配列番号１１７のＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９５、９６、９７、１０１、１０２、１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６３のｓｃＦｖを含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含み、かつ／又は任意選択で、
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号１１１のＨＣ１、配列番号１１４のＨＣ２、及び配列番号１１５のＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号７１のＨＣ１、配列番号１１８のＨＣ２、及び配列番号１１７のＬＣ２を含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、及び１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号２２９のＨＣ１、配列番号２３０のＨＣ２、及び配列番号１１７のＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、及び１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるＶＬを含むＦａｂを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号７１のＨＣ１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ１、配列番号１１８のＨＣ２と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ２及び配列番号１１７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質を提供する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、及び１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるＶＬを含むＦａｂを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号２２９のＨＣ１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ１、配列番号２３０のＨＣ２と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ２及び配列番号１１７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された多重特異性抗原結合構築物であって、
ａ）ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、及び１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ）ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を媒介する。いくつかの実施態様では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を強力に媒介する。いくつかの実施態様では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１発現を上方制御する。いくつかの実施形態では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、増加した腫瘍死滅を示す。いくつかの実施形態では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、Ｔ細胞細胞毒性アッセイにおいて５日までに９０％超（例えば、９５％）の腫瘍溶解を達成する。
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、及び１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるＶＬを含むＦａｂを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号２２９のＨＣ１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ１、配列番号２３０のＨＣ２と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ２及び配列番号１１７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質を提供する。
いくつかの実施態様では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を媒介する。いくつかの実施態様では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を強力に媒介する。いくつかの実施態様では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１発現を上方制御する。いくつかの実施態様では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、増加した腫瘍死滅を示す。いくつかの実施態様では、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質は、Ｔ細胞傷害性アッセイにおいて５日までに９０％超（例えば、９５％）の腫瘍溶解を達成する。
特定の実施形態では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された多重特異性抗原結合構築物であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、及び１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬ含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施形態では、単離された多重特異性抗原結合構築物は、両方のＦｃドメイン（すなわち、ＨＣ１及びＨＣ２ドメイン）のＣ末端にリジン（例えば、Ｋ４７７）を含む。追加のリジンは、コンストラクトの発現を増強し得る。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも８０％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨと少なくとも８０％同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも８０％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも８５％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨと少なくとも８５％同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも８５％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域は、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９０％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域は、配列番号７７のＶＨと少なくとも９０％同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも９０％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９５％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９９％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも９９％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９５％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９９％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも９９％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９５％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９９％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも８０％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも８５％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも８５％同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８５％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９０％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも９０％同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも９０％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９５％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９９％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも９９％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９５％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９９％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも９９％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９５％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも９９％同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも９９％同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも９５％同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも９５％同一であるＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
特定の実施態様では、本開示は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された多重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む、単離された多重特異性抗原結合構築物を提供する。
実施例に示されるように、本明細書に開示される単離された多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞介在性細胞毒性を媒介し、Ｔ細胞の活性化及び増殖を促進し、Ｔ細胞サイトカイン放出を増加させ、及び／又は増加した抗腫瘍効力を示すのに特に有効であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離された多重特異性抗原結合構築物は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を媒介する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離された多重特異性抗原結合構築物は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を強力に媒介する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離された多重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１の発現を上方制御する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離された多重特異性抗原結合構築物は、増加した腫瘍死滅を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞細胞毒性アッセイにおいて５日までに９０％超（例えば、９５％）の腫瘍溶解を達成する。特に驚くべきことは、最大の腫瘍死滅を示す多重特異性抗原結合構築物が、免疫シナプスを達成するために腫瘍細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞を最適に配置する多重特異性抗体の能力を損なうと考えられる位置である、細胞膜に最も近接したＤＬＬ３上のエピトープに結合するという事実である。
アイソタイプ、アロタイプ、及びＦｃ遺伝子操作
本開示のタンパク質中に存在するＩｇ定常領域又はＦｃ領域などのＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプ又はアイソタイプのものであってよい。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプであり得る。アロタイプは結合又はＦｃ媒介性エフェクター機能などのＩｇ定常領域の特性に影響を与えないことが予想される。断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質の免疫原性は、輸注反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮に関連している（Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：６０２－０８）。断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質が宿主において免疫応答を誘導する程度は、Ｉｇ定常領域のアロタイプによってある程度決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３－２１）。Ｉｇ定常領域のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の変異に関連する。表３は、選択されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アロタイプを示す。
Figure 2023548034000004
特定の実施形態では、Ｉｇ定常領域のアロタイプは、ｈｕＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）である。
Ｃ末端リジン（C-terminal lysine、ＣＴＬ）は、Ｉｇ定常領域から、血流中の内因性循環カルボキシペプチダーゼによって除去され得る（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０８：４０４－４１２）。製造中、米国特許出願公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、又はＥＤＴＡ－Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御することができる。タンパク質のＣＴＬ含量を、既知の方法を使用して測定することができる。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域にコンジュゲートした、ＤＬＬ３に結合する抗原結合断片は、約１０％～約９０％のＣ末端リジン含有量を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約２０％～約８０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約４０％～約７０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約５５％～約７０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約６０％である。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域に対してＦｃ領域変異を行って、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／若しくはＡＤＣＰなどのエフェクター機能、並びに／又は薬物動態特性を調節し得る。これは、変異したＦｃの活性化ＦｃγＲｓ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃγＲＩＩｂ、及び／又はＦｃＲｎへの結合を制御する変異をＦｃに導入することによって達成可能である。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｆｃ領域にある。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｆｃ領域に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、抗体のＦｃＲｎへの結合を調節するＦｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
半減期（例えば、ＦｃＲｎへの結合）を調節するために変異させることができるＦｃの位置としては、位置２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、及び４３５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、変異Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒである。抗体の半減期を増加させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａである。半減期を低減させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒである。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）へのタンパク質の結合を増強し、かつ／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び／若しくは貪食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低減する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
活性化ＦｃγＲへのタンパク質の結合を低減させ、続いて、エフェクター機能を低減させるために変異させ得るＦｃ位置としては、位置２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、及び３６５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで加えることができる例示的な変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４における、変異Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓである。ＡＤＣＣが低減したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及び、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓの変異である。また、ＩｇＧ２由来の残基１１７～２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１～４４７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４ Ｆｃドメインを使用してもよい。
ＣＤＣが低減したタンパク質をもたらす例示的な変異は、Ｋ３２２Ａ変異である。
周知のＳ２２８Ｐ変異をＩｇＧ４抗体に加えて、ＩｇＧ４の安定性を増強することができる。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ｋ３２２、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される、少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ変異を含む。特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ変異を含むＩｇＧ１定常領域又はＩｇＧ１定常領域の断片にコンジュゲートさせる。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）へのタンパク質の結合を増強し、かつ／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び／若しくは貪食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を増強する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
活性化ＦｃγＲへのタンパク質の結合を増加させる、かつ／又はＦｃエフェクター機能を増強するために変異させ得るＦｃ位置としては、位置２３６、２３９、２４３、２５６，２９０，２９２、２９８、３００、３０５、３１２、３２６、３３０、３３２、３３３、３３４、３４５、３６０、３３９、３７８、３９６、又は４３０（ＥＵインデックスに従う残基番号付け）が挙げられる。単一で又は組み合わせて行われ得る例示的な変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３３０Ｋ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ及びＰ３９６Ｌである。ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰが増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅである。
ＣＤＣを増強するように変異させ得るＦｃ位置としては、位置２６７、２６８、３２４、３２６、３３３、３４５及び４３０が挙げられる。単一で又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｆ１２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ及びＥ４３０Ｔである。ＣＤＣが増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ、及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔである。
本明細書に記載の特異性変異は、配列番号２５７、２５８、及び２５９それぞれのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４野生型アミノ酸配列と比較した場合の変異である。
ＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの抗体の結合は、フローサイトメトリーを用いて、各受容体を発現するように遺伝子操作された細胞で評価することができる。例示的な結合アッセイでは、９６ウェルプレートに２×１０５個／ウェルの細胞を播種し、ＢＳＡ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）中にて４℃で３０分間ブロッキングする。細胞を、氷上で、４℃で１．５時間、試験抗体とともにインキュベートする。ＢＳＡ染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、Ｒ－ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに４℃で４５分間、インキュベートする。細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、次いで、１：２００希釈したＤＲＡＱ７生／死細胞染色試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含有する１５０μＬのＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁する。染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ７シグナルを、それぞれＢ２及びＢ４チャネルを使用してＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によって検出する。生細胞をＤＲＡＱ７除外でゲートし、収集された少なくとも１０，０００生細胞イベントについて、幾何平均蛍光シグナルを決定する。分析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用する。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対数としてプロットする。非線形回帰分析を実行する。
糖鎖遺伝子操作
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域のＡＤＣＣを媒介する能力は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のオリゴ糖成分を遺伝子操作することによって増強することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ－グリコシル化される。ここで、グリカンの大部分は、既知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。操作されていないＣＨＯ細胞により産生され得るＩｇ定常領域含有タンパク質は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域に結合した二分岐複合体型オリゴ糖からコアフコースを除去すると、抗原結合もＣＤＣ活性も変化させることなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を介してタンパク質のＡＤＣＣが増強される。このようなタンパク質は、二分岐の複合型のＦｃオリゴ糖を有する比較的高い脱フコシル化免疫グロブリンの発現の成功に導くと報告された異なる方法を使用して達成することができ、以下が含まれる：培養物の浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４（：２４９－６５，２０１２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０，２００２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４）：４０５－４１５，２０１０；ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３，２００３）、１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８，２００４）、又はβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩ若しくは強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害物質であるキフネンシンの共発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２－５０３６，２００６、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９３：８５１－８６１，２００６；Ｘｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９：６５２－６５，２００８）。
いくつかの実施形態では、本開示のＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、約１％～約１５％、例えば、約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％のフコース含有量を有する二分岐グリカン構造を有する。いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、又は２０％のフコース含有量を有するグリカン構造を有する。
「フコース含量」は、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖類の量を意味する。フコースの相対量は、フコース含有構造の全糖構造に対する割合である。これらの糖構造は、複数の方法、例えば、１）国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されるような、Ｎ－グリコシダーゼＦ処理サンプル（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ－並びに高マンノース構造）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの使用、２）Ａｓｎ２９７グリカンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／又はＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに付加されたままにさせる、Ｅｎｄｏ Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴うか又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ－Ｃ）によるｍＡｂの構成ペプチドへの消化、その後のＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による分離、検出及び定量、５）Ａｓｎ ２９７にＰＮＧａｓｅ Ｆを有する特異的な酵素脱グリコシル化により、ｍＡｂタンパク質からｍＡｂオリゴ糖を分離すること、により特性評価及び定量化され得る。このように放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識し、実測された質量の理論上の質量との比較によるマトリクス支援レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionization、ＭＡＬＤＩ）質量分析によるグリカン構造の細かな特性評価、イオン交換ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｃ）によるシアル化の程度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｎ）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量、並びに高性能キャピラリー電気泳動－レーザー誘起蛍光（high performance capillary electrophoresis-laser induced fluorescence、ＨＰＣＥ－ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量、を可能にする様々な補足的技術によって分離及び特定することができる。
「低フコース」又は「低フコース含有量」は、本明細書で使用するとき、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、約１％～１５％のフコース含有量を有することを指す。
「正常フコース」又は「正常フコース含有量」は、本明細書で使用するとき、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、約５０％超、典型的には８０％超又は８５％超のフコース含有量を有することを指す。
抗イディオタイプ抗体
抗イディオタイプ抗体は、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域に特異的に結合する抗体である。
本出願はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
抗イディオタイプ（idiotypic、Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原決定基（例えば、パラトープ又はＣＤＲ）を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗原をブロッキングするものであっても、しないものであってもよい。抗原ブロッキングＩｄは、サンプル中の遊離抗原結合領域（例えば、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域）を検出するために使用し得る。ブロッキングしないＩｄを使用して、サンプル中の全抗体（遊離しているもの、抗原に一部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの）を検出することができる。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されている抗体で動物を免疫することによって調製し得る。
また、更に別の動物で免疫応答を誘導する免疫原として抗Ｉｄ抗体を使用して、いわゆる抗－抗Ｉｄ抗体を生成することもできる。抗－抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元の抗原結合領域とエピトープが同一であり得る。したがって、抗原結合領域のイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗原結合領域を発現する他のクローンを同定することが可能である。抗Ｉｄ抗体は、本明細書の他の箇所に記載のものなどの任意の好適な技術によって変動（それにより、抗Ｉｄ抗体バリアントを産生する）、及び／又は誘導し得る。
免疫コンジュゲート（Immunoconjugates）
本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質、又はＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物（本明細書ではまとめてＤＬＬ３結合タンパク質と呼ぶ）は、異種分子にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、異種分子は、検出可能な標識又は細胞傷害性剤である。
本出願はまた、検出可能な標識にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合断片を提供する。
本出願はまた、検出可能な標識にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合断片を含む、タンパク質を提供する。
本出願はまた、検出可能な標識にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合断片を含む、多重特異性抗原結合構築物を提供する。
本出願はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する、抗原結合断片を提供する。
本出願はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合断片を含む、タンパク質を提供する。
本出願はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合断片を含む、多重特異性抗原結合構築物を提供する。
本開示のＤＬＬ３結合タンパク質を使用して、ＤＬＬ３発現細胞、例えばＤＬＬ３発現前立腺がん細胞又は小細胞肺がん細胞に対する治療薬を指向し得る。代替的に、内在化してから細胞機能を修飾することを意図する治療薬に結合させた本開示のＤＬＬ３結合タンパク質を用いて、ＤＬＬ３発現細胞を標的化し得る。
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は細胞毒性剤でもある。
検出可能な標識にコンジュゲートした本開示のＤＬＬ３結合タンパク質は、様々なサンプルでＤＬＬ３の発現を評価するために使用することができる。
検出可能な標識は、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質にコンジュゲートさせたとき、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段を介して後者を検出可能なものにする組成物を含む。
例示的な検出可能な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えば、一般的にＥＬＩＳＡにおいて使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンチレート（scintillates）、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体又はその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、及び比色基質が挙げられる。
検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識が放射性同位体であるときなど、自発的にシグナルを発し得る。他の場合、検出可能な標識は、外部場によって刺激された結果として、シグナルを発する。
例示的な放射性同位体は、γ放出、オージェ放出、β放出、α放出、又はポジトロン放出性の放射性同位体であり得る。例示的な放射性同位体としては、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１５Ｉｎ、１２３１、１２４１、１２５Ｉ、１３１１、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２６Ｒａ、２２５Ａｃ、及び２２７Ａｃが挙げられる。
例示的な金属原子は、２０超の原子番号を有する金属、例えば、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユウロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バーケリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はローレンシウム原子である。
いくつかの実施形態では、金属原子は、２０超の原子番号を有するアルカリ土類金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、ランタニドであり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、アクチニドであり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、遷移金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、卑金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、及びガドリニウム原子であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、５３（すなわち、ヨウ素）～８３（すなわち、ビスマス）の原子番号を有する金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、磁気共鳴映像法に好適な原子であり得る。
金属原子は、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、及びＺｎ２＋などの＋１、＋２、又は＋３酸化状態の形態の金属イオンであり得る。金属原子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄、酸化マンガン、又は酸化ガドリニウムを含み得る。
好適な色素としては、例えば、５（６）－カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤマレイミド、又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などの任意の市販の色素が挙げられる。
好適なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyante、ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、テキサスレッド、ＣｙＤｙｅ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（near infrared、ＮＩＲ）（７００～９００ｎｍ）蛍光染料、並びにカルボシアニン及びアミノスチリル染料である。
検出可能な標識にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、造影剤として使用することができる。
検出可能な標識にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質は、造影剤として使用することができる。
検出可能な標識にコンジュゲートされたＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物は、造影剤として使用することができる。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素的に活性のある毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）である。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、マイタンシノイド、又はカリケアマイシンである。細胞傷害性剤は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってその細胞傷害性又は細胞増殖抑制作用を誘発し得る。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の未結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（Pseudomonas aeruginosa）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボン草（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、並びにトリコテセン（tricothecenes）などの酵素活性毒素である。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅなどの放射性核種である。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、ドラスタチン又はドロスタチンのペプチド類似体及び誘導体、アウリスタチン又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。例示的な分子は、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号に開示されている。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰの加水分解、並びに核及び細胞の分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０～３５８４）、抗がん及び抗真菌活性を有することが示されている。ドラスタチン及びアウリスタチン薬剤部位は、ペプチド薬剤部位のＮ（アミノ）末端若しくはＣ（カルボキシル）末端を介して（国際公開第０２／０８８１７２号）、又は抗体内に遺伝子操作された任意のシステインを介して、本出願の抗体に結合し得る。
本開示のＤＬＬ３結合タンパク質は、既知の方法を使用して検出可能な標識にコンジュゲートさせることができる。
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、キレート剤と複合体を形成している。
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介して本開示のＤＬＬ３結合タンパク質にコンジュゲートされる。
検出可能な標識又は細胞傷害性部分は、既知の方法を用いて、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質に直接又は間接的に連結させることができる。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ－スクシミジル－ベンゾエートの誘導体、ドデカボラート）、大環状及び非環式の両キレート剤のキレート部分、例えば、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（diethylenetriaminepentaacetic avid、ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアナート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）、並びに他のキレート部分が挙げられる。好適なペプチドリンカーは周知である。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質は、腎クリアランスを介して血液から除去される。
キット
本出願はまた、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むキットを提供する。
本出願はまた、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質を含むキットを提供する。
本出願はまた、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物を含むキットを提供する。
キットは、治療的使用のために、及び診断キットとして使用することができる。
キットを使用して、サンプル中のＤＬＬ３の存在を検出することができる。
いくつかの実施形態では、キットは、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質と、ＤＬＬ３結合タンパク質を検出するための試薬とを含む。キットは、使用説明書；他の試薬、例えば、標識、治療剤、又はキレート化若しくは別の方法のカップリングに有用な薬剤、標識若しくは治療剤に対する抗体、又は放射線防護組成物；投与するために抗体を調製するためのデバイス又は他の材料；医薬的に許容される担体、及び対象に投与するためのデバイス又は他の材料を含む、１つ又は２つ以上の他の要素を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、容器中のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域と、キットの使用説明書とを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、容器中のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質と、キットの使用説明書とを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、容器中のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物と、キットの使用説明書とを含む。
いくつかの実施形態では、キット中のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、標識される。
いくつかの実施形態では、キット中のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質は、標識される。
いくつかの実施形態では、キット中のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物は、標識される。
ＤＬＬ３を検出する方法
本出願はまた、サンプル中のＤＬＬ３を検出する方法であって、サンプルを入手することと、サンプルを本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域と接触させることと、サンプル中の結合したＤＬＬ３を検出することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、滑液、循環細胞、組織に会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科的に切除された組織、穿刺吸引を含む生検材料）、組織プレパラートなどに由来し得る。
本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、既知の方法を使用して検出し得る。例示的な方法としては、蛍光若しくは化学発光標識、又は放射線標識を使用して抗体を直接標識すること、又は本発明の抗体に、ビオチン、酵素、又はエピトープタグなどの容易に検出可能な部分を結合させることが挙げられる。例示的な標識及び部分は、ルテニウム、１１１Ｉｎ－ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びベータガラクトシダーゼ、ポリ－ヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料である。
本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、サンプル中のＤＬＬ３を検出するための様々なアッセイで使用し得る。例示的なアッセイは、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化学発光（electrochemiluminescence、ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）、又はＥＬＩＳＡアッセイである。
ポリヌクレオチド、宿主細胞、及びベクター
本開示はまた、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質、ＤＬＬ３を結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物のいずれかをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、本出願は、本明細書に開示されるＤＬＬ３結合タンパク質又はその断片のいずれかをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号１、３、５、７、９、１１、又は１３のＶＨをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、又は１４のＶＬをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態では、本出願は、
配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、又は
配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本出願はまた、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７７、７８、８０、８４、８５、１０５、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、２２９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２３０、又は１９６のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本出願はまた、配列番号８６、８７、８９、９３、９４、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、２０２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２５６、２６０、２６１、２６２、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、又は２７０のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号７１、１１８、及び１１７のポリヌクレオチド配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号２２９、２３０、及び１１７のポリヌクレオチド配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号２６６のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であり、配列番号２３５のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であり、配列番号２３６のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一である、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号２６６のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％、又は１００％）同一である、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号２３５のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％、又は１００％）同一である、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号２３６のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％、又は１００％）同一である、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号２３９のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であり、配列番号２３７のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であり、配列番号２３８のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一である、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号２３７のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％、又は１００％）同一である、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号２３８のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％、又は１００％）同一である、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号２３９のポリヌクレオチドと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％、又は１００％）同一である、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号６４、８４、及び８５のポリヌクレオチド配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。本開示のいくつかの実施形態はまた、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は本開示のＤＬＬ３結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む、単離又は精製核酸を提供する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシー条件」は、ポリヌクレオチドが、非特異的なハイブリダイゼーションよりも強い検出可能な量で標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件は、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド又は点在するミスマッチをほんのわずかに含むポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列とマッチしたいくつかの小領域（例えば、３～１２塩基）を有することになったランダム配列と識別する条件を含む。そのような相補的な小領域は、１４～１７又はそれ以上の塩基の完全長相補体よりも容易に融解され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションにより、それらが容易に識別可能となる。比較的高ストリンジェンシーな条件は、例えば、約５０～７０℃の温度で約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌ又は等価物によって提供されるものなど、低塩及び／又は高温条件を含む。このような高ストリンジェンシー条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間の不一致を、たとえあったとしても、ほとんど許容しない。条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントになり得ることが、概ね理解される。
本開示のポリヌクレオチド配列は、意図とする宿主細胞においてヌクレオチド配列を発現させる１つ又は２つ以上の制御エレメント（例えば、プロモータ又はエンハンサ）に動作可能に連結し得る。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってもよい。プロモータは、強い、弱い、組織特異的、誘導性、又は発生段階特異的なプロモータであってよい。使用され得る例示的なプロモータは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxanthine phosphoribosyl transferase、ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンなどである。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載される実施形態での使用に好適である。このようなウイルスプロモータとしては、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus、ＣＭＶ）最初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス（Mouse Mammary Tumor Virus、ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus、ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられる。メタロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、ドキシサイクリン誘導性プロモータ、タンパク質キナーゼＲ２’，５’－オリゴアデニル酸合成酵素、Ｍｘ遺伝子、ＡＤＡＲ１などの１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（interferon-stimulated response element、ＩＳＲＥ）を含むプロモータなどの誘導性プロモータを使用し得る。
本出願はまた、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本開示はまた、本出願のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。このようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝的バックグラウンドに本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってよい。本開示のＤＬＬ３結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＤＬＬ３結合タンパク質の発現を確実にする発現ベクター中の制御配列に動作可能に連結され得る。そのような調節エレメントとしては、転写プロモータ、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクターはまた、１つ又は２つ以上の非転写エレメント、例えば、複製起点、発現する遺伝子に連結された好適なプロモータ及びエンハンサ、他の５’又は３’隣接非転写配列、５’又は３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプタ部位、又は転写終結配列を含んでいてもよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた、組み込まれ得る。
発現ベクターは、天然に存在する若しくは天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方の種類の結合を含み得る。天然に存在しない又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間連結は、ベクターの転写又は複製を阻害しない。
ベクターを適切な宿主に組み込んだら、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされる本開示のＤＬＬ３結合タンパク質を高レベルで発現させるのに好適な条件下で宿主を維持する。脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳制御配列は、ウイルス源により提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，３ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）によって記載されるように構築され得る。
本開示のベクターはまた、１つ又は２つ以上の内部リボソーム侵入部位（Internal Ribosome Entry Site、ＩＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列を融合ベクターに含めることは、一部のタンパク質の発現を増強させるのに有益であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含み、その部位は、前述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターの成分は、近接して連結されてもよいか、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（すなわち、ＯＲＦ間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよいか、又は別の方法で位置付けられてもよい。また、調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフが、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
本開示のベクターは、環状であっても線形であってもよい。これらは、原核生物又は真核生物の宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、２μプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどに由来していてよい。
組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のためのいずれか、又はその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために作製され得る。
更に、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に対し薬剤（例えば、薬物）に対する感受性を付与し、細胞が薬剤と接触したとき又は薬剤に曝露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野において既知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（Herpes Simplex Virus、ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼが挙げられる。
ベクターはまた、当技術分野において周知の選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーは、陽性及び陰性選択マーカーを含む。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性）、栄養要求性宿主における原栄養を提供するための補完などを含む。例示的なマーカー遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ペニシリン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、ヒスチジノール×耐性遺伝子）、グルタミン合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ－ＴＫ、ＨＳＶ－ＴＫ誘導体、又は６－メチルプリン選択用の細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子が挙げられる（Ｇａｄｉ ｅｔ ａｌ．，７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７３８－１７４３（２０００））が開発され、広く採用されている。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
使用され得る例示的なベクターは、細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）である。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ）並びにｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）である。追加のベクターとしては、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのバクテリオファージベクターを使用することができる。例示的な植物発現ベクターとしては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。例示的な動物発現ベクターとしては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであり得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１、３、５、７、９、１１、又は１３のＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、又は１４のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
本出願はまた、本出願の１つ又は２つ以上のベクターを含む宿主細胞を提供する。「宿主細胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細胞株も指すことを意図すると理解される。変異又は環境の影響のいずれかに起因して、後続世代においてある特定の修飾が生じ得るために、そのような後代は、親細胞に同一ではない場合があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってもよい。原核宿主細胞の例は、大腸菌、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）などの桿菌（bacilli）、及びサルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、及び様々なシュードモナス種（Pseudomonas species）などの他の腸内細菌科である。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス（Saccharomyces）（例えば、Ｓ．セレビジアエ（S.cerevisiae））及びピキア（Pichia）である。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞は、ハイブリドーマなどの不死化細胞株、又はＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ－１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）、及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）マウス細胞株などの骨髄腫の細胞株を含む。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（Chinese Hamster Ovary、ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
別の態様では、本出願は、本明細書に開示されるベクターで形質転換された宿主細胞に関する。一実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉである。別の実施形態では、宿主は、真核細胞、例えば、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、ＰＥＲ．Ｃ６を含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの真菌細胞、又はＳｆ９などの昆虫細胞である。
本出願のタンパク質、抗体若しくはその抗原結合断片、コンジュゲート、多重特異性抗体／構築物又は融合構築物は、本開示を考慮して当該技術分野で既知の多くの技術のいずれかによって作製し得る。例えば、それは、組換え宿主細胞から発現することができ、融合構築物又は多重特異性抗体／構築物の重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターが、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。宿主細胞は、原核又は真核宿主細胞であり得る。
例示的なシステムでは、本出願の融合構築物のヘテロ二量体の２つの重鎖及び軽鎖をコードする１つ又は２つ以上の組換え発現ベクターが、トランスフェクション又はエレクトロポレーションによって宿主細胞に導入される。選択された形質転換宿主細胞を培養して、融合構築物を産生するのに十分な条件下で重鎖及び軽鎖の発現を可能にし、融合構築物を培養培地から回収する。標準的な分子生物学技術を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地からタンパク質構築物を回収する。
本開示はまた、ＤＬＬ３結合タンパク質が発現する条件下で本開示の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって生成されたＤＬＬ３結合タンパク質を回収することと、を含む、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質の生成方法も提供する。タンパク質を作製し、それを精製する方法は既知である。（化学的に又は組換えによって）合成されてから、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（high performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動などを含む標準的な手順に従ってＤＬＬ３結合タンパク質を精製することができる（全般的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照されたい）。対象タンパク質は、実質的に純粋、例えば、純度が少なくとも約８０％～８５％、純度が少なくとも約８５％～９０％、純度が少なくとも約９０％～９５％、又は純度が少なくとも約９８％～９９％、若しくはそれ以上であってよく、例えば、細胞残屑、対象タンパク質以外の巨大分子などの夾雑物を含んでいなくてよい。
本開示のＤＬＬ３結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、標準的な分子生物学的方法を用いてベクターに組み込むことができる。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を使用して行われる。
修飾ヌクレオチドを使用して、本開示のポリヌクレオチドを生成することができる。例示的な修飾ヌクレオチドは、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５″－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンである。
医薬組成物／投与
本発明はまた、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
治療用途では、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」は、本出願の抗体と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってもよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いてよい。これらの溶液は滅菌され、概して粒子状物質を含まない。これらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含み得る。そのような医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１－１０９２に記載されており、特にｐｐ．９５８－９８９を参照されたい。
医薬的に許容される担体としては、バッファ、賦形剤、安定剤、又は防腐剤を挙げることができる。医薬的に許容される担体の例は、生理学的に適合性の溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などであり、例えば、塩、緩衝液、抗酸化剤、糖類、水性若しくは非水性担体、防腐剤、湿潤剤、界面活性剤、若しくは乳化剤、又はこれらの組み合わせである。医薬組成物中の医薬的に許容される担体の量は、担体の活性及び製剤の所望の特性、例えば安定性及び／又は最小酸化に基づいて実験的に決定され得る。
医薬組成物は、酢酸、クエン酸、ギ酸、コハク酸、リン酸、炭酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、ホウ酸、トリス緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチド又はアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；補助剤（例えば、水酸化アルミニウム）；抗菌剤及び抗真菌剤；並びに防腐剤を含み得る。
本開示の医薬組成物は、非経口投与又は経口投与の様々な手段のために製剤化することができる。一実施形態では、組成物は、注入又は静脈内投与向けに製剤化され得る。本明細書に開示される医薬組成物は、例えば、無菌液体調製物、例えば、等張水溶液、エマルション、懸濁液、分散液、又は粘性組成物として提供することができ、これらは、所望のｐＨに緩衝され得る。経口投与に好適な製剤としては、液体溶液、カプセル剤、サッシェ剤、タブレット剤、ドロップ剤、及びトローチ剤、適切な液体及び乳剤中の粉末液体懸濁液を挙げることができる。
医薬組成物に関して本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される」という用語は、動物及び／又はヒトにおける使用について、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。
治療及び使用方法
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんを治療する方法であって、治療有効量の本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を、ＤＬＬ３発現がんを治療するのに十分な時間にわたって、それを必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんを治療する方法であって、治療有効量の本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を、ＤＬＬ３発現がんを治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんを治療する方法であって、治療有効量の本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物を、ＤＬＬ３発現がんを治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんを治療する方法であって、治療有効量の本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを含む免疫コンジュゲートを、ＤＬＬ３発現がんを治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんを治療する方法であって、治療有効量の本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを含む医薬組成物を、ＤＬＬ３発現がんを治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
一態様では、本開示は、全般的には、がんを発症するリスクのある対象の治療に関する。本出願はまた、化学療法及び／又は免疫療法により、対象において著しく免疫が抑制され、それによって対象のがんを発症するリスクを増加させる、悪性腫瘍又は自己免疫疾患を治療することを含む。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を対象に投与して非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含むタンパク質を対象に投与して非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物を対象に投与して非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示の免疫コンジュゲートを対象に投与して当該非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示の医薬組成物を対象に投与して当該非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、がん性状態を発症するリスクを有する対象は、前立腺肥大を有する。
いくつかの実施形態では、がん性状態を発症するリスクを有する対象は、良性前立腺過形成（benign prostate hyperplasia、ＢＰＨ）を有する。
いくつかの実施形態では、がん性状態を発症するリスクを有する対象は、診断された前立腺がんの非存在下で高ＰＳＡレベルを有する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんを予防する方法であって、治療有効量の本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを、ＤＬＬ３発現がんを予防するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんを予防する方法であって、治療有効量の本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を、ＤＬＬ３発現がんを予防するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんを予防する方法であって、治療有効量の本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物を、ＤＬＬ３発現がんを予防するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんを予防する方法であって、治療有効量の本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを含む免疫コンジュゲートを、ＤＬＬ３発現がんを予防するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現がんを予防する方法であって、治療有効量の本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを含む医薬組成物を、ＤＬＬ３発現がんを予防するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、本開示のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物を、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、本開示の免疫コンジュゲートを、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、本開示の医薬組成物を、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３発現がんは、前立腺がんである。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３発現がんは、神経内分泌前立腺がんである。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３発現がんは、前立腺由来がんである。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３発現がんは、骨に転移している。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３発現がんは、肺がんである。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３発現がんは、小細胞肺がんである。
いくつかの実施形態では、前立腺がんは、再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性の前立腺がん、又はそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、肺がんは、再発性、難治性又は悪性の肺がん、又はそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、神経内分泌前立腺がんは、再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性の前立腺がん、又はそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、小細胞肺がんは、再発性、難治性、若しくは悪性の肺がん、又はそれらの任意の組み合わせである。
本開示はまた、対象における前立腺がんを治療する方法であって、治療有効量の、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む本出願の実施形態による多重特異性抗原結合構築物を、前立腺がんを治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む方法を提供する。
本開示はまた、対象における前立腺がんの治療のための医薬の製造における、本出願の一実施形態による多重特異性抗体の使用を提供する。
本開示はまた、対象における前立腺がんを治療する方法であって、治療有効量の、本出願の一実施形態による多重特異性抗原結合構築物を、前立腺がんを治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象における前立腺がんを治療する方法は、治療有効量の、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のアミノ酸配列を含むＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物を投与することを含む。
本開示はまた、対象における前立腺がんの治療のための医薬の製造における、本出願の一実施形態による多重特異性抗体の使用を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域は、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、対象における小細胞肺がんを治療する方法であって、治療有効量の本出願の一実施形態による多重特異性抗原結合構築物を、小細胞肺がんを治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象における小細胞肺がんの治療のための医薬の製造における、本出願の一実施形態による多重特異性抗体の使用を提供する。
本開示はまた、対象における小細胞肺がんを治療する方法であって、治療有効量のＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む多重特異性抗原結合構築物を、小細胞肺がんを治療するのに十分な期間にわたって、対象に投与することを含み、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のアミノ酸配列を含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象における小細胞肺がんの治療のための医薬の製造における、本出願の一実施形態による多重特異性抗体の使用を提供する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のアミノ酸配列を有するＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む。
組み合わせ療法
本開示のＤＬＬ３結合タンパク質は、少なくとも１つの追加の療法と組み合わせて投与してもよい。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の療法は、手術、化学療法、アンドロゲン枯渇療法、若しくは放射線、又はこれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、１つの治療の送達は、第２の送達が開始されるときにも依然として起こるため、投与に関して重複がある。これは、本明細書において「同時」又は「同時送達」と称されることがある。他の実施形態では、１つの治療の送達は、もう１つの治療の送達が開始される前に終了する。いずれかの場合のいくつかの実施形態では、組み合わせた投与であることから、治療はより効果的である。例えば、第２の治療はより効果的であり、例えば、同等の効果が、第２の治療を少なくして見られ、又は第２の治療が、第１の治療なく第２の治療が施される場合に見られるよりも、症状を大幅に軽減し、又は第１の治療と同様の状況が見られる。いくつかの実施形態では、送達は、障害に関連する症状又は他のパラメータの軽減が、他の治療なしで送達される１つの治療で観察される軽減よりも大きくなるようなものである。２つの治療の効果は、部分的に相加的であるか、全体的に相加的であるか、又は相加的を超えるものであり得る。送達は、送達された第１の治療の効果が、第２の送達時に依然として検出可能であるようなものであり得る。
本明細書において開示した実施形態のいくつかを更に説明するために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、例示を目的とするものであって、本開示の実施形態を制限するものではない。
番号付き実施形態
本開示はまた、以下の番号付きの実施形態を提供する。
１．デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域が、配列番号２６３に示されるヒトＤＬＬ３の残基４２９～６１８内のエピトープに結合する、単離されたタンパク質。
２．抗原結合領域が、ＤＬＬ３への結合について、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む参照抗体と競合し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、
ａ．配列番号１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｃ．配列番号５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｄ．配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｅ．配列番号９のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１０のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｆ．配列番号１１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｇ．配列番号１３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する、実施形態１に記載の単離されたタンパク質。
３．参照抗体が、配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態２に記載の単離されたタンパク質。
４．
ａ．それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、
ｂ．それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８、
ｃ．それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０、
ｄ．それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３、
ｅ．それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、４６、
ｆ．それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９、
ｇ．それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、３５、
ｈ．それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、３５、
ｉ．それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、
ｊ．それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、４０、
ｋ．それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、
ｌ．それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、４６、又は
ｍ．それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、４９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
５．それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態４に記載の単離されたタンパク質。
６．抗原結合領域が、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである、実施形態１～５のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
７．抗原結合領域が、Ｆａｂである、実施形態６に記載の単離されたタンパク質。
８．抗原結合領域が、ＶＨＨである、実施形態６に記載の単離されたタンパク質。
９．抗原結合領域が、ｓｃＦｖである、実施形態６に記載の単離されたタンパク質。
１０．ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、実施形態９に記載の単離されたタンパク質。
１１．Ｌ１が、
ａ．約５～５０個のアミノ酸、
ｂ．約５～４０個のアミノ酸、
ｃ．約１０～３０個のアミノ酸、又は
ｄ．約１０～２０個のアミノ酸、を含む、実施形態１０に記載の単離されたタンパク質。
１２．Ｌ１が、配列番号２７、７２、７３、７４、７５、７６、７９、８１、８２、８３、８８、９０、９１、９２、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、又は１３９のアミノ酸配列を含む、実施形態１１に記載の単離されたタンパク質。
１３．Ｌ１が、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む、実施形態１２に記載の単離されたタンパク質。
１４．抗原結合領域が、配列番号１、３、５、７、９、１１、又は１３のＶＨ及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、又は１４のＶＬを含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
１５．抗原結合領域が、
ａ．配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
ｂ．配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
ｃ．配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
ｄ．配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
ｅ．配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
ｆ．配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、又は
ｇ．配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む、実施形態１４に記載の単離されたタンパク質。
１６．抗原結合領域が、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＬを含む、実施形態１４に記載の単離されたタンパク質。
１７．抗原結合領域が、配列番号６３又は６４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
１８．単離されたタンパク質が、単一特異性タンパク質である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
１９．実施形態１～１７のいずれか１つに記載のタンパク質を含む、多重特異性抗原結合構築物。
２０．二重特異性抗原結合構築物である、実施形態１９に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２１．三重特異性抗原結合構築物である、実施形態１９に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２２．リンパ球上の抗原に結合する第２の抗原結合領域を更に含む、実施形態２０又は２１に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２３．リンパ球が、Ｔリンパ球である、実施形態２２に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２４．Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態２３に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２５．リンパ球が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態２２に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２６．リンパ球上の抗原が、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃである、実施形態２２に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２７．第２の抗原結合領域が、ＣＤ３εに結合する、実施形態２６に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２８．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、
ａ）配列番号９８の重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６の軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３、又は
ｂ）配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む、実施形態２７に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２９．第２の抗原結合領域が、配列番号９８のＨＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３を含む、実施形態２８に記載の多重特異性抗原結合構築物。
３０．第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＬとを含む、実施形態２８又は２９に記載の多重特異性抗原結合構築物。
３１．第２の抗原結合領域が、
ａ）配列番号９５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３、又は
ｂ）配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む、実施形態２７に記載の多重特異性抗原結合構築物。
３２．第２の抗原結合領域が、配列番号９５のＨＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１のＬＣＤＲ１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３を含む、実施形態３１に記載の多重特異性抗原結合構築物。
３３．第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＬを含む、実施形態３１又は３２に記載の多重特異性抗原結合構築物。
３４．それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する、ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域、並びにそれぞれ配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０６、配列番号１０７、及び配列番号１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する、ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域を含む、実施形態３３に記載の多重特異性抗原結合構築物。
３５．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬを含み、ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む、実施形態３４に記載の多重特異性抗原結合構築物。
３６．実施形態１～８のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質又は実施形態１９～３５のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物に融合又は共有結合された半減期延長部分を含む、融合体又はコンジュゲート。
３７．半減期延長部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである、実施形態３６に記載の融合体又はコンジュゲート。
３８．Ｉｇ定常領域の断片が、Ｆｃ領域を含む、実施形態３７に記載の融合体又はコンジュゲート。
３９．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートされている、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載の融合体又はコンジュゲート。
４０．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートされている、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載の融合体又はコンジュゲート。
４１．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、第２のリンカー（Ｌ２）を介してＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされている、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載の融合体又はコンジュゲート。
４２．Ｌ２が、配列番号２７、７２、７３、７４、７５、７６、７９、８１、８２、８３、８８、９０、９１、９２、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、又は１３９のアミノ酸配列を含む、実施形態４１に記載の融合体又はコンジュゲート。
４３．Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態３７～４２のいずれか１つに記載の融合体又はコンジュゲート。
４４．Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、ＩｇＧ１アイソタイプである、実施形態４３に記載の融合体又はコンジュゲート。
４５．Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）へのタンパク質の低減された結合もたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態３７～４４のいずれか１つに記載の融合体又はコンジュゲート。
４６．ＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異が、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けがＥＵインデックスに従う、実施形態４５に記載の融合体又はコンジュゲート。
４７．ＦｃγＲへのタンパク質の結合の減少をもたらす変異が、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓである、実施形態４６に記載の融合体又はコンジュゲート。
４８．Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、実施形態３７～４４のいずれか１つに記載の融合体又はコンジュゲート。
４９．Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けがＥＵインデックスに従う、実施形態４８に記載の融合体又はコンジュゲート。
５０．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域が、
ａ．それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
ｃ．配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
ｄ．配列番号６３のｓｃＦｖ、並びに／又は
配列番号６４のｓｃＦｖを含む、単離されたタンパク質。
５１．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域が、
ａ．それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含む、単離されたタンパク質。
５２．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域が、
ａ．それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、及び３８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、並びに／又は
配列番号６５のｓｃＦｖを含む、単離されたタンパク質。
５３．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域が、
ａ．それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、及び４０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、並びに／又は
ｃ．配列番号６６のｓｃＦｖを含む、単離されたタンパク質。
５４．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域が、
ａ．それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、及び４３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、並びに／又は
配列番号６７のｓｃＦｖを含む、単離されたタンパク質。
５５．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域が、
ａ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、４４、４５、及び４６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、並びに／又は
配列番号６８のｓｃＦｖを含む、単離されたタンパク質。
５６．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、抗原結合領域が、
ａ．それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、及び４９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ、並びに／又は
配列番号６９のｓｃＦｖを含む、単離されたタンパク質。
５７．実施形態５０～５６のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質及びＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域を含む、多重特異性抗原結合構築物。
５８．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、
ａ．配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む、実施形態５７に記載の多重特異性抗原結合構築物。
５９．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、
ａ．配列番号９５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む、実施形態５７に記載の多重特異性抗原結合構築物。
６０．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域を含む、単離された二重特異性抗原結合構築物。
６１．リンパ球抗原が、Ｔ細胞抗原である、実施形態６０に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
６２．Ｔ細胞抗原が、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原である、実施形態６１に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
６３．リンパ球抗原が、ＮＫ細胞抗原である、実施形態６２に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
６４．リンパ球抗原が、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃである、実施形態６０～６３のいずれか１つに記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
６５．リンパ球抗原が、ＣＤ３εである、実施形態６４に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
６６．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨを含む、実施形態６０～６５のいずれか１つに記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
６７．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、Ｆａｂを含む、実施形態６６に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
６８．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、ｓｃＦｖを含む、実施形態６６に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
６９．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、ＶＨＨを含む、実施形態６６に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
７０．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、ｓｃＦｖを含む、実施形態６４に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
７１．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、Ｆａｂを含む、実施形態６６に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
７２．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、ｓｃＦｖを含む、実施形態６６に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
７３．ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、実施形態６６～７２のいずれか１つに記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
７４．Ｌ１が、
ａ．約５～５０個のアミノ酸、
ｂ．約５～４０個のアミノ酸、
ｃ．約１０～３０個のアミノ酸、又は
ｄ．約１０～２０個のアミノ酸を含む、実施形態７３に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
７５．Ｌ１が、配列番号２７、７２、７３、７４、７５、７６、７９、８１、８２、８３、８８、９０、９１、９２、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、又は１３９のアミノ酸配列を含む、実施形態７４に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
７６．Ｌ１が、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む、実施形態７５に記載の単離された二重特異性抗原結合構築物。
７７．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物である、実施形態６０～７６のいずれか１つに記載の単離された二重特異性抗原結合構築物であって、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号１５、１８、２１、２４、２７、３０、５０、５２、５３、５５、５７、５９、又は６１のＨＣＤＲ１、配列番号１６、１９、２２、２５、２８、３１、５１、５４、５６、５８、６０、又は６２のＨＣＤＲ２、配列番号１７、２０、２３、２６、２９、３２、１７、２０、２３、２６、２９、又は３２のＨＣＤＲ３、配列番号３３、３６、３９、４１、４４、又は４７のＬＣＤＲ１、配列番号３４、３７、４２、４５、又は４８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３５、３８、４０、４３、４６、又は４９のＬＣＤＲ３を含む、単離された二重特異性抗原結合構築物。
７８．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、
ａ．それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、
ｂ．それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８、
ｃ．それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０、
ｄ．それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３、
ｅ．それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、４６、
ｆ．それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９、
ｇ．それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、３５、
ｈ．それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、３５、
ｉ．それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、
ｊ．それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、４０、
ｋ．それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、
ｌ．それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、４６、又は
それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、４９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態７７に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
７９．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態７８に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
８０．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、
ａ．配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
ｂ．配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
ｃ．配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
ｄ．配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
ｅ．配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
ｆ．配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、又は
ｇ．配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含む、実施形態７７に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
８１．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６３又は６４のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む、実施形態８０に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
８２．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態８０に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
８３．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＨ及び配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＬを含む、実施形態７７～７９のいずれか１つに記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
８４．ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号９５又は９８のＨＣＤＲ１、配列番号９６又は９９のＨＣＤＲ２、配列番号９７又は１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０１又は１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０２又は１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４又は１０８のＬＣＤＲ３を含む、実施形態６０～８３のいずれか１つに記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
８５．ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号９５のＨＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１のＬＣＤＲ１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３を含む、実施形態８４に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
８６．ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号９８のＨＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３を含む、実施形態８４に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
８７．ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８０のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＬを含む、実施形態８５に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
８８．ＣＤ３に特異的結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む、実施形態８７に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
８９．ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＶＬを含む、実施形態８６に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
９０．ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む、実施形態８９に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
９１．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第１のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされ、かつ／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、第２の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第２のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる、実施形態５９～９０のいずれか１つに記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
９２．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域と第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片との間、及びリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域と第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片との間に、第２のリンカー（Ｌ２）を更に含む、実施形態９１に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
９３．Ｌ２が、配列番号２７、７２、７３、７４、７５、７６、７９、８１、８２、８３、８８、９０、９１、９２、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、又は１３９のアミノ酸配列を含む、実施形態９２に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
９４．Ｉｇ定常領域の断片が、Ｆｃ領域を含む、実施形態９１～９３のいずれか１つに記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
９５．第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態９４に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
９６．第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片が、ＩｇＧ１である、実施形態９５に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
９７．第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片が、ＦｃγＲへの構築物の低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態９６に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
９８．ＦｃγＲへの構築物の低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異が、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けがＥＵインデックスに従う、実施形態９７に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
９９．ＦｃγＲへの構築物の結合の低減をもたらす変異が、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓである、実施形態９８に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
１００．構築物が、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、実施形態９１～９６のいずれか１つに記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
１０１．Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けがＥＵインデックスに従う、実施形態１００に記載の単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
１０２．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、それぞれ配列番号９５、９６、９７、１０１、１０２、１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号１０５のｓｃＦｖを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物が、配列番号１０９の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号１１０の軽鎖（ＬＣ１）、及び配列番号１１２の第２の重鎖（ＨＣ２）を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
１０３．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、それぞれ配列番号９５、９６、９７、１０１、１０２、１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号１１９のｓｃＦｖを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物が、配列番号１０９のＨＣ１、配列番号１１０のＬＣ１、及び配列番号１１３のＨＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
１０４．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６３のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号１１１のＨＣ１、配列番号１１６のＨＣ２、及び配列番号１１７のＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
１０５．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、リンパ球抗原に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９５、９６、９７、１０１、１０２、１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号１１１のＨＣ１、配列番号１１４のＨＣ２、及び配列番号１１５のＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
１０６．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号７１のＨＣ１、配列番号１１８のＨＣ２、及び配列番号１１７のＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
１０７．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるＶＬを含むＦａｂを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号７１のＨＣ１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ１、配列番号１１８のＨＣ２と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ２及び配列番号１１７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質。
１０８．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、及び１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号２２９のＨＣ１、配列番号２３０のＨＣ２、及び配列番号１１７のＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質。
１０９．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、及び１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％若しくは１００％）同一であるＶＬを含むＦａｂを含み、かつ／又は
ｃ．単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質が、配列番号２２９のＨＣ１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ１、配列番号２３０のＨＣ２と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣ２及び配列番号１１７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＬＣ２を含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質を提供する。
１１０．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域を含む単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物であって、
ａ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤ３に結合する第２のドメインが、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、及び１０８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ／又は
ｂ．ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域が、配列番号６４のｓｃＦｖを含み、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む、単離された抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物。
１１１．治療剤又は造影剤にコンジュゲートされた実施形態１～５９のいずれかに１つに記載の単離されたタンパク質を含む、免疫コンジュゲート。
１１２．実施形態１～５９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
１１３．実施形態１～５９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質又は多重特異性抗原結合構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
１１４．
ａ．実施形態１～５９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質又は多重特異性抗原結合構築物をコードする、及び／又は
ｂ．配列番号８６、８７、８９、９０、９３、９４、１１２、１１３、１１４、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、２０２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２５５、２５６、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、若しくは２７０のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
１１５．
ａ．実施形態１～５９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質又は多重特異性抗原結合構築物と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一である単離されたタンパク質をコードする、
ｂ．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７７、７８、８０、８４、８５、１０５、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、２２９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２３０、若しくは１９６のポリペプチドをコードする、及び／又は
ｃ．配列番号８６、８７、８９、９３、９４、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、２０２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２５６、２６０、２６１、２６２、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、又は２７０のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％）同一であるポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
１１６．請求項１１３～１１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
１１７．実施形態１１６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
１１８．実施形態１～５９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質又は多重特異性抗原結合構築物を産生する方法であって、タンパク質又は多重特異性抗原結合構築物が発現される条件下で実施形態１１７に記載の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生されたタンパク質又は多重特異性抗原結合構築物を回収することと、を含む、方法。
１１９．治療剤又は造影剤にコンジュゲートされた実施形態６０～１１０のいずれかに１つに記載の単離された多重特異性抗原結合構築物を含む、免疫コンジュゲート。
１２０．実施形態６０～１１０のいずれか１つに記載の単離された二重特異性構築物又は実施形態１２０の免疫コンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
１２１．
ａ．実施形態６０～１１０のいずれか１つに記載の単離された二重特異性構築物をコードする、又は
配列番号８６、８７、８９、９３、９４、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、２０２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２５６、２６０、２６１、２６２、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、若しくは２７０のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
１２２．
ａ．実施形態６０～１１０のいずれか１つに記載の単離された二重特異性構築物と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一である単離された二重特異性構築物をコードする、又は
ｂ．配列番号８６、８７、８９、９３、９４、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、２０２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２５６、２６０、２６１、２６２、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、又は２７０のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％）同一であるポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
１２３．実施形態１２１又は１２２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
１２４．実施形態１２３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
１２５．実施形態６０～１１０のいずれか１つに記載の単離された二重特異性構築物を産生する方法であって、二重特異性構築物が発現する条件で実施形態１２４に記載の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生された二重特異性構築物を収集することと、を含む、方法。
１２６．対象におけるＤＬＬ３発現がんを治療する方法であって、治療有効量の、実施形態１～５９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質若しくは多重特異性抗原結合構築物、実施形態６０～１１０のいずれか１つに記載の単離された二重特異性抗原結合構築物、実施形態１１１若しくは１１９に記載の免疫コンジュゲート、又は実施形態１１２若しくは１２０に記載の医薬組成物を、ＤＬＬ３発現がんを治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法。
１２７．対象におけるＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減させる方法であって、治療有効量の、実施形態１～５９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質若しくは多重特異性抗原結合構築物、実施形態６０～１１０のいずれか１つに記載の単離された二重特異性抗原結合構築物、実施形態１１１若しくは１１９に記載の免疫コンジュゲート、又は実施形態１１２若しくは１２０に記載の医薬組成物を、ＤＬＬ３発現がんを治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法。
１２８．対象におけるＤＬＬ３発現がんの確立を防止する方法であって、治療有効量の、実施形態１～５９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質若しくは多重特異性抗原結合構築物、実施形態６０～１１０のいずれか１つに記載の単離された二重特異性抗原結合構築物、実施形態１１１若しくは１１９に記載の免疫コンジュゲート、又は実施形態１１２若しくは１２０に記載の医薬組成物を、ＤＬＬ３発現がんの確立を防止するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法。
１２９．ＤＬＬ３発現がんを発症するリスクのある対象における非がん性状態を治療する方法であって、治療有効量の、実施形態１～５９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質若しくは多重特異性抗原結合構築物、実施形態６０～１１０のいずれか１つに記載の単離された二重特異性抗原結合構築物、実施形態１１１若しくは１１９に記載の免疫コンジュゲート、又は実施形態１１１若しくは１１９に記載の医薬組成物を対象に投与して、非がん性状態を治療することを含む、方法。
１３０．ＤＬＬ３発現がんが、肺がん、前立腺がん、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、神経内分泌膵臓がん、肝芽腫、及び肝細胞がんからなる群から選択される、実施形態１２６～１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３１．ＤＬＬ３発現がんが、非小細胞肺がんである、請求項１３０に記載の方法。
１３２．ＤＬＬ３発現がんが、小細胞肺がんである、請求項１３０に記載の方法。
１３３．ＤＬＬ３発現がんが、再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺がん、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１３０に記載の方法。
１３４．非がん性状態が、前立腺肥大、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、又は診断された前立腺がんの非存在下で高い前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルを有する状態である、実施形態１２９に記載の方法。
１３５．単離されたタンパク質又は単離された多重特異性抗原結合構築物が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、実施形態１２６～１３４のいずれか１つに記載の方法。
１３６．第２の治療剤が、手術、化学療法、アンドロゲン遮断療法、若しくは放射線、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態１３５に記載の方法。
１３７．対象における神経内分泌前立腺がん又は小細胞肺がんの存在を検出する方法であって、実施形態１１１又は１１９の免疫コンジュゲートを、前立腺がん又は小細胞肺がんを有する疑いのある対象に投与することと、免疫コンジュゲートが結合している生物学的構造を視覚化し、それによって前立腺がん又は小細胞肺がんの存在を検出することと、を含む、方法。
１３８．実施形態１～５９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質若しくは多重特異性抗原結合構築物、実施形態６０～１１０のいずれか１つに記載の単離された二重特異性抗原結合構築物、実施形態１１２若しくは１２０に記載の免疫コンジュゲート、又は実施形態１１３若しくは１２１に記載の医薬組成物を含む、キット。
１３９．実施形態１～５９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質又は多重特異性抗原結合構築物に結合する、抗イディオタイプ抗体。
１４０．少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、及び少なくとも９０％の細胞死滅効果を有する抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３構築物である、実施形態６０～１１０のいずれか１つに記載の単離された二重特異性構築物。
本開示は、以下の番号付きの実施形態を更に提供する。
１．デルタ様リガンド３（ＤＬＬ３）に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、当該抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離されたタンパク質。
２．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号３のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％）同一であるＶＨを含む、実施形態１に記載の単離されたタンパク質。
３．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号３のＶＨを含む、実施形態２に記載の単離されたタンパク質。
４．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号４のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％）同一であるＶＬを含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
５．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号４のＶＬを含む、実施形態４に記載の単離されたタンパク質。
６．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、ｓｃＦｖである、実施形態１～５のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
７．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号６３又は６４のｓｃＦｖと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるｓｃＦｖを含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
８．タンパク質が、半減期延長部分にコンジュゲートされ、半減期延長部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、又はＩｇ定常領域の断片である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
９．Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、Ｆｃγ受容体へのタンパク質の結合の低減をもたらす少なくとも１つの変異を含み、任意選択で、ＦｃγＲへのタンパク質の結合の低減をもたらす変異が、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓである、実施形態８に記載の単離されたタンパク質。
１０．単離されたタンパク質が、配列番号２２９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
１１．単離されたタンパク質が、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む、実施形態１０に記載の多重特異性抗原結合構築物。
１２．単離されたタンパク質が、配列番号７１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
１３．単離されたタンパク質が、配列番号７１のアミノ酸配列を含む、実施形態１２に記載の多重特異性抗原結合構築物。
１４．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のタンパク質を含む、多重特異性抗原結合構築物。
１５．二重特異性構築物である、実施形態１４に記載の多重特異性抗原結合構築物。
１６．リンパ球上の抗原に結合する第２の抗原結合領域を更に含む、実施形態１４又は１５に記載の多重特異性抗原結合構築物。
１７．リンパ球が、Ｔリンパ球である、実施形態１６に記載の単離されたタンパク質。
１８．Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態１７に記載の単離されたタンパク質。
１９．リンパ球が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態１６に記載の単離したリンパ球。
２０．リンパ球抗原が、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃである、実施形態１６～１９のいずれ１つに記載の単離された多重特異性抗原結合構築物。
２１．リンパ球上の抗原が、ＣＤ３εである、実施形態２０に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２２．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、
ａ．配列番号９５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３、並びに／又は
ｂ．配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬを含む、実施形態２１に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２３．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、
ｂ．配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３、並びに／又は
ｃ．配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬを含む、実施形態２１に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２４．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号９５のＨＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣＤＲ２、配列番号９７のＨＣＤＲ３、配列番号１０１のＬＣＤＲ１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４のＬＣＤＲ３を含む、実施形態１４～２３のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物。
２５．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号９８のＨＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、配列番号１００のＨＣＤＲ３、配列番号１０６のＬＣＤＲ１、配列番号１０７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＬＣＤＲ３を含む、実施形態１４～２３のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物。
２６．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％）同一であるＶＨを含む、実施形態２４に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２７．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号７７のＶＨを含む、実施形態２４又は２６に記載の多重特異性抗原結合構築物。
２８．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８０のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％）同一であるＶＬを含む、実施形態２４、２６及び２７のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
２９．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８０のＶＬを含む、実施形態２８に記載の多重特異性抗原結合構築物。
３０．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％）同一であるＶＨを含む、実施形態２５に記載の多重特異性抗原結合構築物。
３１．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８４のＶＨを含む、実施形態３０に記載の多重特異性抗原結合構築物。
３２．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８５のＶＬと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％）同一であるＶＬを含む、実施形態２５、３０及び３１のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
３３．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号８５のＶＬを含む、実施形態２８に記載の多重特異性抗原結合構築物。
３４．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、Ｆａｂである、実施形態２６～３３のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
３５．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号２３０と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣを含む、実施形態１４～３４のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
３６．ＨＣが、配列番号２３０のアミノ酸配列を含む、実施形態３５に記載の単離された多重特異性抗原結合構築物。
３７．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号１１７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＬＣを含む、実施形態１４～３６のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
３８．ＬＣが、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む、実施形態３７に記載の単離された多重特異性抗原結合構築物。
３９．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号２２９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む、実施形態１４～３８のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物。
４０．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号２２９のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む、実施形態３９に記載の多重特異性抗原結合構築物。
４１．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号１１８と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＨＣを含む、実施形態１４～３４のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。
４２．ＨＣが、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む、実施形態４１に記載の単離された多重特異性抗原結合構築物。
４３．ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域が、配列番号１１７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるＬＣを含む、実施形態１４～３４、４１、及び４２いずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物。
４４．ＬＣが、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む、実施形態４３に記載の単離された多重特異性抗原結合構築物。
４５．ＤＬＬ３に結合する抗原結合領域が、配列番号７１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む、実施形態４１～４４のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物。
４６．ｓｃＦｖが、配列番号７１のアミノ酸配列を含む、実施形態４５に記載の単離された多重特異性抗原結合構築物。
４７．リンパ球上の抗原に結合する抗原結合領域が、半減期延長部分にコンジュゲートされ、半減期延長部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、又はＩｇ定常領域の断片である、実施形態１４～４６のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物。
４８．Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減する少なくとも１つの変異を含み、任意選択で、タンパク質のＦｃγＲへの結合を低減する変異が、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓである、実施形態４７に記載の多重特異性抗原結合構築物。
４９．二重特異性抗原結合構築物であって、
（１）ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域であって、第１の抗原結合領域が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有する第１のＶＨ並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する第１のＶＬを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、
（ａ）それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、
（ｂ）それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８、
（ｃ）それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０、
（ｄ）それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３、
（ｅ）それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、４６、
（ｆ）それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９、
（ｇ）それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、３５、
（ｈ）それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、３５、
（ｉ）それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、
（ｊ）それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、４０、
（ｋ）それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、
（ｌ）それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、４６、又は
（ｍ）それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、４９のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域。
（２）ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域であって、
（ａ）それぞれ配列番号９５、９６、及び９７のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有する第２のＶＨ並びに配列番号１０１、１０２、及び１０４のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する第２のＶＬ、又は
（ｂ）それぞれ配列番号９８、９９、及び１００のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有する第２のＶＨ、並びにそれぞれ配列番号１０６、１０７、及び１０８のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する第２のＶＬを含む、第２の抗原結合領域を含む、二重特異性抗原結合構築物。
５０．
ａ．第１のＶＨ及び第１のＶＬが、
ｉ．それぞれ配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
ｉｉ．それぞれ配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
ｉｉｉ．それぞれ配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
ｉｖ．それぞれ配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
ｖ．それぞれ配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
ｖｉ．それぞれ配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、又は
ｖｉｉ．それぞれ配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を有し、
ｂ．第２のＶＨ及び第２のＶＬが、
ｉ．配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬ、又は
ｉｉ．配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を有する、実施形態４９に記載の二重特異性抗原結合構築物。
５１．第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態４９又は５０に記載の二重特異性抗原結合構築物。
５２．第１のＶＨが、配列番号３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、第１のＶＬが、配列番号４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む、実施形態５１に記載の二重特異性抗原結合構築物。
５３．第１の抗原結合領域が、第１のＶＨ及び第１のＶＬを含む第１のｓｃＦｖ又は第１のＦａｂを含み、第２の抗原結合領域が、第２のＶＨ及び第２のＶＬを含む第２のＦａｂ又は第２のｓｃＦｖを含む、実施形態４９～５２のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合構築物。
５４ａ．第１の抗原結合領域が第１のｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合領域が第２のＦａｂを含む、実施形態５３に記載の二重特異性抗原結合構築物。
５４ｂ．第１の抗原結合領域が第１のＦａｂを含み、第２の抗原結合領域が第２のｓｃＦｖを含む、実施形態５３に記載の二重特異性抗原結合構築物。
５５．第１の重鎖及び第２の重鎖を含む二重特異性抗体である、実施形態４９～５４ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合構築物であって、第１の重鎖が第１のＶＨを含み、任意選択で、第１のＶＬを更に含み、第２の重鎖が第２のＶＨを含み、任意選択で、第２のＶＬを更に含み、第１及び第２の重鎖の各々が、１つ又は２つ以上のヘテロ二量体変異を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域を更に含む、二重特異性抗原結合構築物。
５６．
（１）配列番号１０９、１０９、１１１、１１１、７１、及び２２９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
（２）それぞれ配列番号１１０、１１０、１１７、１１５、１１７、及び１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖、及び
（３）それぞれ配列番号１１２、１１３、１１６、１１４、１１８、及び２３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する第２の重鎖を含む、実施形態５５に記載の二重特異性抗原結合構築物。
５７．それぞれ配列番号１１１、１１７、及び１１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する第１の重鎖、軽鎖、及び第２の重鎖を含む、実施形態５５に記載の二重特異性抗原結合構築物。
５８．それぞれ配列番号１１１、１１５、及び１１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する第１の重鎖、軽鎖、及び第２の重鎖を含む、実施形態５５に記載の二重特異性抗原結合構築物。
５９．それぞれ配列番号７１、１１７、及び１１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する第１の重鎖、軽鎖、及び第２の重鎖を含む、実施形態５５に記載の二重特異性抗原結合構築物。
６０．それぞれ配列番号２２９、１１７、及び２３０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する第１の重鎖、軽鎖、及び第２の重鎖を含む、実施形態５５に記載の二重特異性抗原結合構築物。
６０ａ．それぞれ配列番号１０９、１１０、及び１１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する第１の重鎖、軽鎖、及び第２の重鎖を含む、実施形態５５に記載の二重特異性抗原結合構築物。
６０ｂ．それぞれ配列番号１０９、１１０、及び１１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する第１の重鎖、軽鎖、及び第２の重鎖を含む、実施形態５５に記載の二重特異性抗原結合構築物。
６１．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のタンパク質、又は実施形態８～４８のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物、又は実施形態４９～６０ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合構築物をコードする、単離された核酸。
６２．実施形態６１に記載の核酸を含む、ベクター。
６３．請求項６１に記載の核酸又は請求項６２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
６４．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のタンパク質、又は実施形態８～４８のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物、又は実施形態４９～６０ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合構築物を産生する方法であって、タンパク質、多重特異性抗原結合構築物、融合体若しくはコンジュゲート、又は二重特異性抗原結合構築物を産生する条件下で、実施形態２６に記載の宿主細胞を培養することと、細胞又は細胞培養物からそれを回収することとを含む、方法。
６５．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のタンパク質、又は実施形態８～４８のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物、又は実施形態４９～６０ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合構築物、実施形態６１に記載の核酸、実施形態６２に記載のベクター、又は実施形態６３に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
６６．治療有効量の実施形態６５に記載の医薬組成物を、好ましくはＤＬＬ３発現がんを治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてＤＬＬ３発現がんを治療する方法。
６７．がんが、肺がん、前立腺がん、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、神経内分泌膵臓がん、肝芽腫、及び肝細胞がんからなる群から選択される、実施形態６６に記載の方法。
６８．対象におけるＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、治療有効量の実施形態６５に記載の医薬組成物を、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞を治療するのに十分な時間にわたって対象に投与することを含む、方法。
６９．がんが、肺がん（小細胞肺がんなど）、前立腺がん（神経内分泌前立腺がん、又は再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺がんなど）、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、神経内分泌膵臓がん、肝芽腫、及び肝細胞がん、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態６８に記載の方法。
７０．ＤＬＬ３発現がんを発症するリスクがある対象における非がん性状態を治療する方法であって、治療有効量の実施形態６５に記載の医薬組成物を対象に投与して、非がん性状態を治療することを含む、方法。
７１．非がん性状態が、前立腺肥大、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、又は診断された前立腺がんの非存在下で高い前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルを有する状態である、実施形態７０に記載の方法。
７２．対象における神経内分泌前立腺がん又は小細胞肺がんの存在を検出する方法であって、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のタンパク質、又は実施形態８～４８のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物、又は実施形態４９～６０ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合構築物にコンジュゲートされた治療剤又は造影剤を含む免疫コンジュゲートを、前立腺がん又は小細胞肺がんを有することが疑われる対象に投与し、免疫コンジュゲートが結合している生物学的構造を可視化し、それによって前立腺がん又は小細胞肺がんの存在を検出することを含む、方法。
７３．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のタンパク質、又は実施形態８～４８のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物、又は実施形態４９～６０ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合構築物、又はタンパク質、多重特異性抗原結合構築物若しくは二重特異性抗原結合構築物にコンジュゲートされた治療剤若しくは造影剤を含む免疫コンジュゲート、実施形態６１に記載の核酸、実施形態６２に記載のベクター、又は実施形態６３に記載の宿主細胞を含む、キット。
７４．がんの治療に使用するための、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のタンパク、又は実施形態８～４８のいずれか１つに記載の多重特異的抗原結合構築物、又は実施形態４９～６０ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合構築物、又はタンパク、多重特異的抗原結合構築物若しくは二重特異性抗原結合構築物、実施形態６１に記載の核酸、実施形態６２に記載のベクター、又は実施形態６３に記載の宿主。好ましくは、がんは、肺のがん（小細胞肺がんなど）、前立腺のがん（神経内分泌前立腺のがん、又は再発性、難治性、悪性若しくは去勢抵抗性前立腺のがんなど）、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、神経内分泌膵臓のがん、肝芽腫、及び肝細胞のがん、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
７５．がんを治療する方法であって、治療有効量の実施形態１～１３のいずれか１つに記載のタンパク、又は実施形態８～４８のいずれか１つに記載の多重特異的抗原結合構築物、又は実施形態４９～６０ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合構築物、又はタンパク、多重特異的抗原結合構築物、若しくは二重特異性抗原結合構築物にコンジュゲートされた治療剤を含む免疫コンジュゲート、実施形態６１に記載の核酸、請求項６２に記載のベクター、実施形態６３に記載の宿主細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、好ましくは、がんは、肺がん（小細胞肺がんなど）、前立腺がん（神経内分泌前立腺がん、又は再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺がんなど）、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、神経内分泌膵臓がん、肝芽腫、及び肝細胞がん、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、方法。
７６．がんを治療するための医薬の製造における、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のタンパク、又は実施形態８～４８のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合構築物、又は実施形態４９～６０ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合構築物、又はタンパク、多重特異性抗原結合構築物、若しくは二重特異性抗原結合構築物にコンジュゲートされた治療剤を含む免疫コンジュゲート、実施形態６１に記載の核酸、請求項６２に記載のベクター、実施形態６３に記載の宿主細胞の使用であって、好ましくは、がんは、肺がん（小細胞肺がんなど）、前立腺がん（神経内分泌前立腺がん、又は再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺がんなど）、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、神経内分泌膵臓のがん、肝芽腫、及び肝細胞がん、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、使用。
以下の本発明の実施例は、本発明の本質を更に説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項によって定められる点を理解されたい。
実施例１。抗原の生成
免疫化のために使用されるＤＬＬ３構築物は、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグ及びリンカーに連結されたヒトＤＬＬ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む（構築物ＤＬ３Ｗ３５、配列番号１８０）。ヒトＤＬＬ３ ＥＣＤのサブドメインをコードする発現構築物を、ヒト血清アルブミンのＣ３４Ｓバリアント（ＨＳＡ、（ＤＬ３Ｗ３６ＤＬ３Ｗ４４、配列番号１８１～１８９）を使用して融合タンパク質として設計した。具体的には、構築物は、ヒトＤＬＬ３ ＥＧＦ６ドメイン＋Ｃ末端ＥＣＤ配列、ＨＳＡ融合体、及びＣ末端６Ｈｉｓタグ（ＤＬ３Ｗ３６、配列番号１８１）、ヒトＤＬＬ３ ＥＧＦ６ドメイン、ＨＳＡ融合体、及びＣ末端６Ｈｉｓタグ（ＤＬ３Ｗ３７、配列番号１８２）、ヒトＤＬＬ３ ＥＧＦ５ドメイン、ＨＳＡ融合体、及びＣ末端６Ｈｉｓタグ（ＤＬ３Ｗ３８、配列番号１８３）、ヒトＤＬＬ３ ＥＧＦ４ドメイン、ＨＳＡ融合体、及びＣ末端６ Ｈｉｓタグ（ＤＬ３Ｗ３９、配列番号１８４）、ヒトＤＬＬ３ ＥＧＦ３ドメイン、ＨＳＡ融合体、及びＣ末端６Ｈｉｓタグ（ＤＬ３Ｗ４０、配列番号１８５）、ヒトＤＬＬ ＥＧＦ２ドメイン、ＨＳＡ融合体、及びＣ末端６Ｈｉｓタグ（ＤＬ３Ｗ４１、配列番号１８６）、ヒトＤＬＬ３ ＥＧＦ１＋２ドメイン、ＨＳＡ融合体、及びＣ末端６Ｈｉｓタグ（ＤＬ３Ｗ４２、配列番号１８７）、ヒトＤＬＬ３ ＥＧＦ－１ドメイン、ＨＳＡ融合体、及びＣ末端６Ｈｉｓタグ（ＤＬ３Ｗ４３、配列番号１８８）、ヒトＤＬＬ３ Ｎ末端＋ＤＳＬドメインＨＳＡ融合体、及びＣ末端６Ｈｉｓタグ（ＤＬ３Ｗ４４、配列番号１８９）の構築物を含む。ＨＳＡをヒトＤＬＬ３ ＥＣＤサブドメインのＣ末端に融合させた。６×ＨｉｓタグもＣ末端に付加した。構築物は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＹＪ７及びそのドメインアノテーションに基づいた。Ｎ末端及びＤＳＬドメイン、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ１及びＥＧＦ２ドメイン、ＥＧＦ２ドメイン、ＥＧＦ３ドメイン、ＥＧＦ４ドメイン、ＥＧＦ５ドメイン、ＥＧＦ６ドメイン及びＥＧＦ６、並びにＣ末端ドメインのいずれかを含む９つの構築物を作製した。サブドメインをコードする構築物をドメインのマッピングに使用した。
製造元のプロトコルに従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、構築物をＨＥＫ２９３由来細胞Ｅｘｐｉ２９３（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に一過的にトランスフェクトした。細胞を採取前にオービタルシェーカー上で、８％ＣＯ２、３７℃で５日間インキュベートした。発現した細胞を遠心分離により除去し、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する固定化金属アフィニティクロマトグラフィ、続いて、ダルッベッコリン酸生理食塩水バッファｐＨ７．２（１×ＤＰＢＳ）中におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００分取サイズ排除クロマトグラフィ（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｈｉｓタグを有する可溶性ＤＬＬ３タンパク質を培地から精製した。
実施例２。抗ＤＬＬ３抗体の生成
トランスジェニックマウス（Ａｂｌｅｘｉｓ（登録商標））を用いた抗体生成
抗ＤＬＬ３抗体をＡｂｌｅｘｉｓマウスにおいて生成した。Ａｂｌｅｘｉｓ（登録商標）マウスは、ヒトＣＨ１及びＣＬドメインに連結されたヒト可変ドメイン、キメラヒト／マウスヒンジ領域、及びマウスＦｃ領域を有するヒト／マウスキメラ抗体を生成する。Ａｂｌｅｘｉｓカッパマウスによって生成された抗体は、マウスＶＨ、ＤＨ、及びＪＨエクソン、並びにマウスＶκ、Ｊκ、及びＣκエクソンに由来する配列を欠く。内因性マウスＩｇλは、カッパマウスにおいて活性である。ヒトＩｇκ鎖は、約９０～９５％のナイーブレパートリを含み、マウスＩｇλ鎖は、この系統において約５～１０％のナイーブレパートリを含む。Ａｂｌｅｘｉｓラムダマウスによって生成された抗体は、マウスＶＨ、ＤＨ、及びＪＨエクソン、並びにマウスＶλ、Ｊλ、及びＣλエクソンに由来する配列を欠く。内因性マウスＩｇκは、ラムダマウスにおいて活性である。ヒトＩｇλ鎖は、約４０％のナイーブレパートリを含み、マウスＩｇκ鎖は、約６０％のナイーブレパートリを含む。Ａｂｌｅｘｉｓ（登録商標）の調製及び使用、並びにこのようなマウスが有するゲノム改変は、国際公開第１１／１２３７０８号に記載されている。
Ａｂｌｅｘｉｓマウスを組換えヒトＤＬＬ３ ＥＣＤタンパク質（ＤＬ３Ｗ３５、配列番号１８０）で免疫化した。リンパ球を二次リンパ器官から抽出し、ハイブリドーマ生成のためにＦＯマウス骨髄腫細胞株と融合させたか、又は蛍光活性化セルソーティング（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）を介して単一細胞選別に供した。ヒトＤＬＬ３ ＥＣＤを過剰発現するＨＥＫ細胞への結合について、メソスケールディスカバリ（Meso Scale Discovery、ＭＳＤ）電気化学発光により、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。同定されたサンプルを、ヒトＤＬＬ３ ＥＣＤを過剰発現するＨＥＫ細胞（陽性シグナル）及び親ＤＬＬ３陰性ＨＥＫ細胞（陰性シグナル）への結合について、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって更にアッセイした。加えて、組換えヒトＤＬＬ３タンパク質への結合について、ＭＳＤ電気化学発光により、単一細胞選別の上清をスクリーニングした。約３００個超のサンプルがＤＬＬ３結合剤であると同定された。ヒトＤＬＬ３タンパク質への結合について、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ ＳＰＲによる単一サイクル動態法により、３００個の抗ｈＤＬＬ３上清サンプルの結合を更に評価した。
６つのＤＬＬ３陽性結合剤を選択し、Ｖ領域クローニングへと進めた。
Ｖ領域クローニング
ヒトＤＬＬ３に対する陽性結合剤を含有するハイブリドーマ上清からの重鎖と軽鎖のＶ領域をクローニングし、配列決定した。ｍＲＮＡをハイブリドーマサンプルから単離した。Ｑｉａｇｅｎキット（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）によって精製したＲＮＡ、及びＢ細胞溶解物の両方を、Ｓｍａｒｔｅｒ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用するｃＤＮＡ合成用に使用した。ｃＤＮＡ合成を容易にするために、ｏｌｉｇｏｄＴを使用して、全てのメッセンジャーＲＮＡの逆転写をプライムし、続いて、Ｓｍａｒｔｅｒ ＩＩＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを用いた「５’キャッピング」を行った。ＶＨ及びＶＬ断片の後続の増幅を、Ｓｍａｒｔｅｒ ＩＩＡキャップを標的とする５’プライマー及びＣＨ１内のコンセンサス領域を標的とする３’プライマーを使用して、２段階ＰＣＲ増幅により実施した。簡単に説明すると、各５０μｌのＰＣＲ反応物は、２０μＭのフォワープライマ及びリバースプライマーの混合物、２５μｌのＰｒｉｍｅＳｔａｒ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ予備混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２μｌの未精製ｃＤＮＡ、並びに、２１μｌの再蒸留Ｈ２Ｏからなった。サイクリングプログラムは、９４℃で３分間で開始し、続いて３５サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、６８℃で１分間）であり、７２℃で７分間で終了した。第２ラウンドのＰＣＲは、それぞれのＬｏｎｚａマザーベクター（ＶＨ及びＶＬ）中のそれぞれの領域と「重複する」１５ｂｐの相補的伸長を含む、ＶＬ及びＶＨ第２ラウンドプライマーを用いて行った。第２ラウンドのＰＣＲを次のプログラムで行った：９４℃で３分間、３５サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、６８℃で１分間）、７２℃で７分間で終了。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を、Ｌｏｎｚａ ｈｕＩｇＫ又はＬａｍｂｄａベクターへのＶＬ遺伝子、及びＬｏｎｚａ ｈｕＩｇＧ１へのＶＨ遺伝子の指向性クローニングのために使用した。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇを容易にするために、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇの前に、Ｃｌｏｎｉｎｇ ＥｎｈａｎｃｅｒでＰＣＲ生成物を処理した。クローニング及び形質転換を製造元のプロトコル（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に従って行った。ミニプレップ（Ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐ）ＤＮＡをサンガーシーケンシングに供して、完全なＶ遺伝子断片が得られたことを確認した。
Ｆａｂ、ｍＡｂ、ｓｃＦｖ、及びｓｃＦｖ－Ｆｃの形成
回収したｖ領域のアミノ酸配列をコドン最適化し、ＩｇＧ１定常領域を有する発現ベクターにクローニングした。
抗体は、Ｆａｂフォーマット、モノクローナルＡｂフォーマット、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向のｓｃＦｖフォーマット、又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のｓｃＦｖフォーマットのいずれかで発現させた。配列番号１２０のリンカー配列（ＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳ）を使用して、ＶＨ／ＶＬ領域をコンジュゲートさせた。
抗ＤＬＬ３抗体のＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）トランスフェクション及び精製
タンパク質発現及び細胞培養
免疫化キャンペーンから同定された抗体をクローニングし、ＩｇＧ１－ＡＡＳ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）として２ｍｌスケールで発現させ、精製した。抗体を、製造元の推奨に従って、タンパク質をコードする精製プラスミドＤＮＡでの一過性トランスフェクションにより、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において発現させた。簡潔に述べると、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞は、３７℃、８％ＣＯ２、１２５ＲＰＭに設定されたオービタル振盪インキュベータ中でＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に懸濁させて維持した。細胞を継代し、トランスフェクションの前に、６．０×１０６個の細胞／ｍｌに希釈し、細胞生存率を９９．０％以上で維持した。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１３１）を使用して行った。トランスフェクトされるべき各ｍｌの希釈細胞について、０．５マイクログラムのＤＮＡをコードするｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物、及び０．５マイクログラムのｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１７１１）を使用して、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ複合体化培地中に希釈した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を、１：４比（ｖ／ｖ、ＤＮＡ：試薬）で使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）に希釈した。希釈したＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を１分間組み合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成させ、次いで細胞に添加した。一晩インキュベートした後、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィード及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサを、製造業者の標準プロトコルのとおり、細胞に添加した。細胞を軌道振盪（１２５ｒｐｍ）しながら、３７℃で７日間インキュベートした後、培養ブロスを採取した。一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞からの培養上清を、遠心分離（３０分、３０００ｒｃｆ）、続いて濾過（０．２μｍのＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）によって浄化した。
タンパク質の精製
濾過した細胞培養上清を、ＡＫＴＡＸｐｒｅｓｓクロマトグラフィシステムを使用して、予め平衡化した（１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。装填後、カラムを１０カラム体積の１×ＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。タンパク質を、１０カラム体積の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出した。タンパク質画分を、２．５ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を溶出分画量の２０％（ｖ／ｖ）まで添加することによって完全に中和した。ピーク画分をプールし、濾過した（０．２μｍ）。精製したタンパク質の量を、分析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステム）によって評価した。移動相としてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、及び１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．２を使用する予備サイズ排除クロマトグラフィによって、タンパク質を更に精製した。単量体タンパク質のみを含有するピーク画分をプールし、濾過した（０．２μｍ）。
実施例３。抗ＤＬＬ３抗体の生物物理学的特性評価
ＤＬＬ３抗体の可変領域を、配列番号１２０のリンカーを使用してＶＨ－リンカー－ＶＬ配向のｓｃＦｖ－Ｆｃとしてフォーマット化し、組換えＤＬＬ３への結合及び熱安定性について評価した。配列番号１２０を有する野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖに融合させて、ｓｃＦｖ－Ｆｃ分子を作製した。これらの構築物を使用して、抗体の熱安定性を評価した。
抗ＤＬＬ３抗体の結合親和性。
組換えヒトＤＬＬ３に対する抗ＤＬＬ３抗体の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ機器を使用した表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）によって測定した。ＳＰＲは、複合体の形成及び解離時の質量の変化を測定することによって、２つの結合パートナー間の相互作用の強度を試験するための無標識技術である。抗体を抗Ｆｃ抗体でコーティングしたセンサチップ上に捕捉し、１００ｎＭ～６．２５ｎＭ又は６．２５ｎＭ～０．３９ｎＭの濃度にわたるＤＬＬ３抗原（ＤＬ３Ｗ３５、配列番号１８０）の２倍連続希釈で用量設定した。
抗体をまた、１００ｎＭ及び１０００ｎＭの濃度で、以下に記載されるＤＬＬ１（ＤＬ３Ｗ３３、組換えヒトＤＬＬ１ ＥＣＤ（Ｓｅｒ２２－Ｇｌｙ５４０）、－ＤＩ－Ｃ－６×Ｈｉｓ、ＴＰＰ００００４９４６５、（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号１８１８－ＤＬ）、配列番号１７８）、及びＤＬＬ４（ＤＬ３Ｗ３４、ヒトＤＬＬ４ ＥＣＤ（Ｓｅｒ２７－Ｐｒｏ５２４）、Ｃ－１０×Ｈｉｓ、ＴＰＰ００００４９４６６、配列番号１７９）への結合について試験した。
５０μＬ／分の流速を用いて、会合及び解離をそれぞれ５分間及び３０分間モニタリングした。センサグラムを１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させることによって、速度論情報（オンレート及びオフレート定数）を得た。結合親和性（ＫＤ）を速度定数の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として報告する。選択した抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖのＫＤ値を表４に示す。表４に示すように、抗体は、約７０ｐｍ～約２．４ｎＭの範囲の高親和性でヒトＤＬＬ３に結合するが、相同タンパク質ＤＬＬ１及びＤＬＬ４への結合は観察されない。
Figure 2023548034000005
抗ＤＬＬ３抗体の熱安定性
自動Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ装置を使用した示差走査蛍光定量法（ＮａｎｏＤＳＦ）により、抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合抗体の熱安定性を測定した。様々なドメインを含む抗体などのタンパク質は、典型的には、これらのドメインに対応する異なる転移を示す。第１の転移又は融解温度（Ｔｍ１）は、生理学的条件下及び保存時の試験タンパク質の安定性を示すために使用される。タンパク質の蛍光変化はまた、温度の上昇に伴う凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を反映する。ＮａｎｏＤＳＦを使用して、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中０．５ｍｇ／ｍｌの濃度の分子のＴｍを測定した。サンプルを、３８４ウェルサンプルプレートから２４ウェルキャピラリーに装填することによって測定を行った。各サンプルについて、２回測定を行った。熱走査スキャンは、１．０℃／分の加熱速度で、２０℃～９５℃に及ぶ。固有のトリプトファン及びチロシンの蛍光を３３０ｎｍ及び３５０ｎｍの発光波長でモニタリングし、Ｆ３５０／Ｆ３３０ｎｍ比を温度に対してプロットして、アンフォールディング曲線を作成した。測定されたＴｍ及びＴａｇｇ値を表５に列挙する。
表５に示されるように、全ての抗ＤＬＬ３分子は、５６．５ｏ℃よりも高い第１の転移（Ｔｍ１）を有する。ＤＬ３Ｂ５７０を除く全ての試験したｓｃＦｖ－Ｆｃ融合抗体は低い凝集傾向を有し、Ｔａｇｇ値は７０℃より高く、それらのＴｍ１値よりも５℃以上高い。
Figure 2023548034000006
実施例４。抗ＤＬＬ３抗体のドメインマッピング及びパラトープマッピング
抗ＤＬＬ３抗体のエピトープマッピング
以下の各組換えＤＬＬ３ドメインへの結合について、選択した抗ＤＬＬ３抗体を評価した：Ｎ末端及びＤＳＬ融合ドメイン（ＤＬ３Ｗ４４、配列番号１８９）、ＥＧＦ－１＋２融合ドメイン（ＤＬ３Ｗ４２、配列番号１８７）、ＥＧＦ－２（ＤＬ３Ｗ４１、配列番号１８６）、ＥＧＦ－３（ＤＬ３Ｗ４０、配列番号１８５）、ＥＧＦ－４（ＤＬ３Ｗ３９、配列番号１８４）、ＥＧＦ－５（ＤＬ３Ｗ３８、配列番号１８３）、ＥＧＦ－６（ＤＬ３Ｗ３７、配列番号１８２）、並びにＥＧＦ－６及びＣ末端融合ドメイン（ＤＬ３Ｗ３６、配列番号１８１）。これらの構築物の発現及び精製を実施例１に記載する。
ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ高結合プレートを、２０ｎＭ抗原で４℃で一晩コーティングした。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで洗浄し、次いでＳｔａｒｔｉｎｇ ｂｌｏｃｋ溶液で３０分間ブロッキングした。ＤＬＬ３抗体を添加し、周囲温度で６０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１４１９０－１３６）で３回洗浄することによって過剰な抗体を除去した。抗原結合抗体を、スルホタグ化抗ヒト抗体（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒ３２ＡＪ）を用いて周囲温度で６０分間検出し、続いて別のＰＢＳ洗浄を行った。シグナル取得は、１×ＭＳＤリードバッファＴ（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ９２ＴＣ－１）の存在下、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ６００イメージャー上で適切なプレート設定で行った。優先的なドメイン結合を示す、ドメイン当たりの最も高い結合シグナルについてデータを分析した。試験した各抗体の結合ドメインを表６に列挙する。
Figure 2023548034000007
 ＤＬ３Ｂ５６９、ＤＬ３Ｂ５７０、及びＤＬ３Ｂ５７１は、ＥＧＦ６ドメインに結合することが見出されたが、ＤＬ３Ｂ６７２、ＤＬ３Ｂ５７４、及びＤＬ３Ｂ５７５は、ＥＧＦ６及びＣ末端ドメインに結合することが見出された。
抗ＤＬＬ３抗体のエピトープマッピング
選択した抗ＤＬＬ３抗体のエピトープ及びパラトープを水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によって決定した。簡単に述べると、抗体サンプルを、わずかに過剰な結合タンパク質について、９：１０のモル比で、非結合状態（抗体単独）及び結合状態（ｈｕＤＬＬ３（ＤＬ３Ｗ３５）とともにインキュベートした抗体）で比較した。これらのサンプルを０℃で保存した。サンプルをＤ２Ｏで３０、１００、１０００、及び１００００秒間標識した。１００番目の標識を２つ組で行った。各標識時間及びサンプルについて、５μＬのサンプルを５０μＬのＤ２Ｏ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）と２３℃で混合した。５０μＬのこの混合物を、予め冷却したクエンチ緩衝液（４Ｍ尿素、０．４Ｍ ＴＣＥＰ ＨＣｌ）６０μＬに０℃で移した。混合物を０℃で２分間保持した。１００μＬの混合物を０℃でＬＥＡＰ冷却バルブボックスに注入した。ＦｌｅｘＬＣイソクラティックフローを使用して、インラインペプシンプロテアーゼ１３コンボカラム（室温で、冷却したボックスの外側）を通してサンプルを押し出し、インライントラップカラムを通してサンプルを３分間脱塩した。次いで、サンプルをトラップカラムから溶出させ、Ｈｏｒｉｚｏｎポンプ勾配を用いて分析カラム上で分離した。サンプルをまた、ペプチド及び保持時間を同定するために、Ｄ２Ｏの代わりにＨ２Ｏ並びにＣＩＤ、ＨＣＤ、及びＥＴｈｃＤ ＭＳ／ＭＳ断片化を使用して実施した。ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ残基プロットからの重水素取り込みの有意差に基づいて、パラトープを同定した。
抗ＤＬＬ３抗体、ＤＬ３Ｂ５６９、ＤＬ３Ｂ５７０、ＤＬ３Ｂ５７１、ＤＬ３Ｂ５７４、及びＤＬ３Ｂ５７５を可溶性ＤＬＬ３とインキュベートすることにより、異なるパターンの水素交換及び抗体に対する全体的な保護が得られた。ＤＬＬ３の存在下での抗体上の保護されたセグメントを表７に示す。
Figure 2023548034000008
実施例５。ＤＬＬ３抗体の構造的特性評価
インビトロアッセイにおいて最も高い性能を示すＤＬＬ３抗体可変ドメイン及びｓｃＦｖ抗体断片の配列を本明細書に提供する。可変ドメインを、実施例２に記載するように配列番号１２０のリンカーを使用して、Ｆａｂフォーマット、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向のｓｃＦｖフォーマット、又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のｓｃＦｖフォーマットで発現させた。
抗体の翻訳後修飾（Post-translational modification、ＰＴＭ）は、抗体の親和性、安定性、効力、及び均一性に影響を及ぼす可能性を有する。加えて、トランスジェニック動物から得られた抗体配列は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域に体細胞超変異を含み得る。体細胞超変異は、ヒトフレームワーク領域において異常な又は低頻度の残基をもたらし、生物学的治療薬の安定性及び免疫原性に影響を与える可能性がある。ＤＬ３Ｂ２７９ｍＡｂでの特徴である親抗ＤＬＬ３可変領域には、生殖細胞変異に起因する配列欠陥が含まれていた。具体的には、可変重ドメインは２７位にアスパラギンを含み、チロシン残基は、通常、ＩＧＨＶ１－４６＊０３生殖細胞系列において見出される。この残基はＣＤＲの近くにあったため、この位置での極性の非荷電アミノ酸の存在を保存するために、代わりにグルタミン残基（Ｎ２７Ｑ）に変異させた。更に、酸化を避けるために、隣接領域におけるＭｅｔ１０５をＴｈｒ（Ｍ１０５Ｔ）に変異させた。ＤＬ３Ｂ２７９由来の軽鎖ｖ領域はまた、Ｇｌｙ（Ａ９９Ｇ）に再び変異させたＡ９９での生殖細胞変異を特徴とする。合わせて、可変重ドメインにおけるＮ２７Ｑ及びＭ１０５Ｔの変異並びに可変軽ドメインにおけるＡ９９Ｇ変異により、ＤＬ３Ｂ２７９バリアントと命名した最適化可変領域が得られた。最適化したＤＬ３Ｂ２７９バリアントを、上記のＶＬ－リンカー－ＶＨ配向の一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）としてフォーマット化した。
可変ドメインＶＨ、ＶＬ、及びＣＤＲ
表８は、選択された抗ＤＬＬ３抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。表９は、選択された抗ＤＬＬ３抗体のＫａｂａｔ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表１０は、選択された抗ＤＬＬ３抗体のＫａｂａｔ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表１１は、選択された抗ＤＬＬ３抗体のＡｂＭ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表１２は、選択された抗ＤＬＬ３抗体のＡｂＭ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表１３は、選択された抗ＤＬＬ３抗体のＣｈｏｔｉａ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表１４は、選択された抗ＤＬＬ３抗体のＣｈｏｔｉａ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表１５は、選択された抗ＤＬＬ３抗体のＩＭＴＧ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表１６は、選択された抗ＤＬＬ３抗体のＩＭＴＧ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表１７は、選択されたＤＬＬ３抗体の可変ドメイン配列及び配列番号をまとめる。表１８は、ＶＨ及びＶＬ領域のタンパク質及びＤＮＡの配列番号を示す。
Figure 2023548034000009
Figure 2023548034000010
Figure 2023548034000011
Figure 2023548034000012
Figure 2023548034000013
Figure 2023548034000014
Figure 2023548034000015
Figure 2023548034000016
Figure 2023548034000017
Figure 2023548034000018
Figure 2023548034000019
Figure 2023548034000020
Ｆａｂ－Ｆｃ及びｓｃＦｖ
ＤＬＬ３特異的ＶＨ／ＶＬ領域を、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジＣＨ２－ＣＨ３及びＶＬ－ＣＬフォーマットのＦａｂ－Ｆｃとして操作し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４として発現させた。ＤＬＬ３特異的ＶＨ／ＶＬもまた、実施例２及び表２に記載されるように配列番号１２０のリンカー（リンカー１）を使用して、ＶＨ－リンカー－ＶＬ（ｓｃＦｖ－ＬＨ）又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向（ｓｃＦｖ－ＬＨ）のいずれかでｓｃＦｖとして操作した（表１９）。これらのｓｃＦｖを使用して、二重特異性抗体を生成した。
Figure 2023548034000021
ＶＬ－リンカー－ＶＨ（ＬＨ）フォーマットの選択された抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖ抗体の可変ドメインのＤＮＡ配列を以下に記載する：ＤＬ３Ｂ２７９－ｓｃＦｖ－ＬＨ ＤＮＡ（配列番号２６０）；ＤＬ３Ｂ２７９－ｓｃＦｖ－ＬＨバリアントＤＮＡ（配列番号２６１）；ＤＬ３Ｂ３３２－ｓｃＦｖ－ＬＨ ＤＮＡ（配列番号２６２）；ＤＬ３Ｂ３５８－ｓｃＦｖ－ＬＨ ＤＮＡ（配列番号２３３）；ＤＬ３Ｂ４０９－ｓｃＦｖ－ＬＨ ＤＮＡ（配列番号２３４）；ＤＬ３Ｂ４５０－ｓｃＦｖ－ＬＨ ＤＮＡ（配列番号２３５）；ＤＬ３Ｂ４６１－ｓｃＦｖ－ＬＨ ＤＮＡ（配列番号２３６）。
実施例６：抗ＣＤ３抗体の作製
免疫
抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６の生成は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開第２０２０００４８３４９号に記載されている。Ｋａｂａｔ記述を使用して、ＣＤ３Ｂ３７６は、アミノ酸ＮＮＮＡＡＷＳ（配列番号９８）のＨＣＤＲ１、アミノ酸ＲＴＹＹＲＳＫＷＬＹＤＹＡＹＳＹＫＳ（配列番号９９）のＨＣＤＲ２、及びアミノ酸ＧＹＳＳＳＦＤＹ（配列番号１００）のＨＣＤＲ３、並びにアミノ酸ＴＧＴＳＳＮＩＧＴＹＫＦＶＳ（配列番号１０６）のＬＣＤＲ１、アミノ酸ＥＶＳＫＲＰＳ（配列番号１０７）のＬＣＤＲ２、及びアミノ酸ＶＳＹＡＧＳＧＴＬＬ（配列番号１０８）のＬＣＤＲ３を含む。ＣＤ３Ｂ３７６のＶＨ及びＶＬ配列は、配列番号８４、ＣＤ３Ｂ３７６ ＦａｂのＶＨアミノ酸配列；配列番号８５、ＣＤ３Ｂ３７６ ＦａｂのＶＬアミノ酸配列；配列番号９３、ＣＤ３Ｂ３７６ ＦａｂのＶＨ核酸配列；及び配列番号９４、ＣＤ３Ｂ３７６ ＦａｂのＶＬ核酸配列である。
代替的に、Ａｂｌｅｘｉｓトランスジェニックマウスプラットフォームを使用して抗ＣＤ３抗体を生成した。１３匹のカッパマウス及び１２匹のラムダマウスを含む、ＡｂｌｅｘｉｓマウスをＴＲＣＷ５（配列番号１９７）で免疫した。ＴＲＣＷ５は、２６個のアミノ酸のリンカーでＣＤ３εの細胞外領域に融合されたＣＤ３δの細胞外領域から構成される。部位特異的ビオチン化のために、Ｃ末端Ａｖｉタグを有するヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインをＣ末端に付加した。
マウスを週２回、７週間にわたって免疫した。４２日目に、６箇所の皮下及び２箇所の皮内注射を含む８部位に広げて５０μｇのＴＲＣＷ５及び５０μｇのＣＤ４０ｍＡｂを投与することによって、マウスをハイブリドーマ融合のためにブーストした。最終的なブーストについては、マウスに、４．７４×１０７細胞／ｍＬで、ＣＤ３εを含むＴ細胞受容体複合体を内因的に発現するＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞を２０μＬ注射した（（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９（５）：６２１－６）。
リンパ節及び脾臓をマウスから摘出し、コホートごとに融合を実施した。リンパ節細胞をカウントし、ＦＯ骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１６４６））と１：１の比で合わせ、３７℃で１０日間インキュベートした後、抗体スクリーニングを行った。次いで、製造指示書に従って、プレート（ＥＬＩＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３４０２２）上に非特異的に固定化されたＴＲＣＷ５を使用するか、又はビオチン化ＴＲＣＷ５（ＳＰＡＲＣＬ ＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｇｅｎ）へのストレプトアビジンコンジュゲーションによって固定化することによって、ハイブリドーマ融合細胞からの上清を、ＴＲＣＷ５への結合についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。ＥＬＩＳＡアッセイは、０．５ｕｇ／ｍＬのＴＲＣＷ５及び０．５ｕｇ／ｍＬのＨＶＥＭ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄカタログ番号３６５－ＨＶ）でプレートをコーティングすることによって、４℃で一晩行った。４℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline、ＰＢＳ）中０．４％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin、ＢＳＡ）を添加することによって、プレートをブロッキングした。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を補充した１×ＰＢＳでプレートを洗浄した。各ウェルに対し、５０ｕＬのハイブリドーマ上清を適用し、室温で１時間インキュベートした。結合した抗体は、ブロッキング緩衝液で１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１１５－０３６－０７１）の添加、続いて室温での３０分間インキュベートによって検出した。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（tetramethylbenzidine、ＴＭＢ）基質緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３４０２２）を２５ｕＬ／ウェルで添加し、暗所で１０分間インキュベートした。２５ｕＬ／ウェルの４ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって、反応を停止させた。ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈ２マイクロプレートリーダーを使用して、発光を４５０ｎｍで発光を読み取った。バックグラウンドよりも少なくとも３倍高いシグナルを有するヒットを選択した。
２つのアッセイフォーマットの結果、４２６ヒット（ＥＬＩＳＡから２６４ヒット、ＳＰＡＲＣＬ ＥＬＩＳＡから１９４、７０ヒットは両方のアッセイで同定された）が得られた。これら４２６個の初期ヒットのうち、４９個のＥＬＩＳＡ、及び３２個のＳＰＡＲＣＬ ＥＬＩＳＡヒットを確認した。陽性結合剤に対応するハイブリドーマ融合体を再度供給し、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ３を内因的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞に結合する能力を試験した。クローン００３＿Ｆ１２、クローン０３６＿Ｅ１０、及びクローン０６５＿Ｄ０３を含む３つの抗体は、平均蛍光指数（ＭＦＩ）に基づいて、ＣＤ３を内因的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞への有意な結合を示した（表２０）。クローン００３＿Ｆ１２及び０３６＿Ｅ１０（ヒトカッパマウスから）は、ＥＬＩＳＡによってヒトカッパ軽鎖について陽性であることが確認されたが、クローン０６５＿Ｄ０３（ヒトラムダマウスから）は、ヒトラムダについて陰性であった。これら３つのクローンの可変遺伝子を配列決定した。
Figure 2023548034000022
次に、これら３つのクローンを、初代ヒト及びカニクイザルＴ細胞に結合する能力についてスクリーニングした。簡潔に述べると、初代ヒト及びカニクイザル汎Ｔ細胞をフロー染色緩衝液中１×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁させ、細胞を５０，０００個の細胞／ウェルで播種した。各ウェルに、５０ｕＬのハイブリドーマ上清を添加し、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、２００μＬの染色バッファを添加し、３００×Ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。Ａｌｅｘａ－６４７にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧを、５０μＬの総体積で染色バッファ中２μｇ／ｍＬで添加し、氷上で３０分間インキュベートした。１５０μＬの染色バッファを添加し、３００×Ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。細胞を、１：１，０００希釈したＳｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎを含有するランニングバッファ３０μＬに再懸濁させ、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒで実験した。細胞をＦＣＳ対ＳＣＳでゲーティングして、残屑を除去した。シングレットをＳＣＳ－Ａ対ＳＣＳ－Ｈでゲーティングし、シングレット集団から、Ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎによる低－陰性についてＢＬ１チャネルを用いて生細胞を選択した。ＲＬ１（Ａｌｅｘａ－６４７）幾何平均により試験物質を陰性対照と比較することによって、ＣＤ３結合を評価した。このアッセイでは、クローン０６５＿Ｄ０３が最も高い細胞結合シグナルを示した。
次いで、クローン０６５＿Ｄ０３の可変領域をＩｇＧ１骨格にクローニングして、ＣＤ３Ｂ８１５と称される抗体を得た（配列を表２１に示す）。Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合についてＣＤ３Ｂ８１５を再度スクリーニングしたところ、Ｊｕｒｋａｔ細胞への陽性結合を示した。
Figure 2023548034000023
ＣＤ３結合ドメインのヒト化及びｓｃＦｖフォーマット化
ＣＤ３Ｂ８１５のｖ領域の軽鎖（ＬＣ）を、ｓｃＦｖフォーマットでヒト化した。簡潔に述べると、ＣＤ３Ｂ８１５からのＬＣをヒトＩＧＫＶ１－３９＊０１－ＩＧＫＪ２＊０１生殖細胞系列に移植し、Ｙ４９Ｋ位をヒトからマウスへの復帰変異として同定した。ＣＤ３Ｂ８１５のＬＣはまた、９２～９３位にＮＳ（Ａｓｎ－Ｓｅｒ）モチーフを含み、これはこの部位での脱アミド化のリスクを提示する。ＩＧＫＶ１Ｄ－３９＊０１へのＣＤ３Ｂ８１５ ＣＤＲのグラフト並びにＬＣ変異Ｙ４９Ｋ及びＮ９２Ｇの導入により、以下に示すＶＨ及びＶＬ配列を有するＣＤ３Ｗ２４５抗体が得られた。
表２２は、選択された抗ＣＤ３抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。表２３は、選択された抗ＣＤ３抗体のＶＨ及びＶＬ ＤＮＡ配列を示す。
表２４は、ＣＤ３ｓｃＦｖアミノ酸配列を示す。表２５は、選択された抗ＣＤ３抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列をＫａｂａｔ記述で示す。表２６は、選択された抗ＣＤ３抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列をＫａｂａｔ記述で示す。表２７は、選択されたＣＤ３抗体のＣＤＲ、ＶＨ、及びＶＬ配列をまとめる。
Figure 2023548034000024
Figure 2023548034000025
Figure 2023548034000026
Figure 2023548034000027
Figure 2023548034000028
ＣＤ３Ｗ２４５のＶＨ及びＶＬ配列もまた、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向（ｓｃＦｖ－ＨＬ）又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向（ＳｃＦｖ－ＬＨ）のｓｃＦｖフォーマットで発現させた。配列番号１２０のリンカー配列（ＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳ）を使用して、ＶＨ／ＶＬ領域をコンジュゲートさせた。ＣＤ３Ｗ２４５ ｓｃＦｖ ＬＨ及びＣＤ３Ｗ２４５ ｓｃＦｖ ＨＬの配列を表２７に示す。
Figure 2023548034000029
熱ショック後のヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖバリアントのＣＤ３への結合。
Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために、リンカーＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号１３９）を使用して、ＣＤ３Ｗ２４５の可変領域もＶＨ－リンカー－ＶＬ配向のｓｃＦｖとしてフォーマット化した。６×ｈｉｓタグをＣ末端で操作した。この構築物を使用して、組換えＣＤ３（ホモ二量体ＣＤ３εγ－Ｆｃ、ＣＤ３Ｗ１４７、配列番号２００）への結合及びＴ細胞への結合を試験した。Ｅ．ｃｏｌｉで発現したＣＤ３Ｗ１４７及びＣＤ３Ｗ２４５ ｓｃＦｖ ＨＬの配列は、 配列番号２００に示され、ＣＤ３Ｗ１４７の配列は配列番号２０６に示され、ＣＤ３Ｗ２４５－ＨＬ－Ｅ．ｃ．はＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された。
簡潔に述べると、ｓｃＦｖをコードしている配列を、分泌のためにＰｅｌＢリーダー配列を有するｐＡＤＬ（商標）－２２ｃベクターにクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をプラスミドで形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充した２×ＹＴ微生物成長培地において３７℃で一晩成長させた。１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによってタンパク質発現を誘導し、培養物を一晩成長させた。発現後、２，２００×ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってビオチン化ＣＤ３Ｗ１４７への結合について直接試験した。
ＣＤ３Ｗ１４７への抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３Ｗ２４５ ｓｃＦｖ－ＨＬ）の結合をＥＬＩＳＡによって測定した。ビオチン化されたＣＤ３Ｗ１４７を２倍希釈で０．０３９μｇ／ｍＬ～２．５μｇ／ｍＬの範囲の濃度でプレート上に固定化し、続いて、室温で４５分間インキュベートした。結合したｓｃＦｖをニワトリ抗ＨＡ西洋ワサビペルオキシダーゼを使用して検出し、次いで化学発光基質を用いて検出した。ＣＤ３Ｗ２４５は、ＣＤ３Ｗ１４７への結合を示した（データは示さず）。
次いで、フローサイトメトリーを使用して、Ｔ細胞結合能力について、ＣＤ３Ｗ２４５ ｓｃＦｖ－ＨＬを試験した。簡潔に述べると、ヒトＴ細胞を解凍し、１×１０＾６細胞／ｍＬでフロー染色バッファに再懸濁させ、５０，０００細胞／ウェルで播種した。陽性対照であるＣＤ３Ｗ３６は、ｓｃＦｖ－ＬＨとしてフォーマット化された抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４で構成されており、呼吸器合胞体ウイルスからのＦ－糖タンパク質を標的とするｓｃＦｖである陰性対照Ｂ２３を比較のために使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ上清発現ＣＤ３Ｗ２４５ ｓｃＦｖ－ＨＬを１５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを染色緩衝液で洗浄し、染色緩衝液中のＡｌｅｘａ－６４７にコンジュゲートした抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した。インキュベーション後、２００μＬのＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔランニングバッファを混合物に添加し、細胞を１：１，０００ Ｓｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎを含有するランニングバッファ３０μＬ中に再懸濁させ、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。上記のとおり、ゲーティング及び分析を行った。ＣＤ３Ｗ２４５ ｓｃＦｖ－ＨＬは、Ｔ細胞結合と一致する平均蛍光指数を示した（表２８）。
Figure 2023548034000030
実施例７。二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３媒介性細胞傷害に対するＤＬＬ３エピトープの効果
ＤＬＬ３＋標的細胞に対する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３媒介性死滅に対するＤＬＬ３エピトープの効果を決定するために、エフェクターとしてヒト汎Ｔ細胞及び標的としてＳＨＰ－７７細胞を３：１の比で使用して、７２時間、Ｔ細胞再指向を実施した。細胞毒性に対するドメイン結合の効果を研究するために、個々のＤＬＬ３サブドメインに結合することができるＤＬＬ３抗体を使用して、様々なＤＬＬ３×ＣＤ３抗体を生成した。様々なＤＬＬ３サブドメインに結合するＤＬＬ３抗体を、３つの異なるＣＤ３アーム、実施例５に記載されるＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｗ２４５並びに米国特許出願公開第２０２０００４８３４９号に記載されるＣＤ３Ｂ２１９と組み合わせて、本研究で使用される二重特異性抗体を生成した。
ＤＬＬ３×ＣＤ３介在性死滅実験は、最終容量２００ｕＬのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ中で１５０，０００個の汎Ｔ細胞と混合した５０，０００個のＣＳＦＥ標識ＳＨＰ－７７細胞に３７℃で７２時間添加した、２０ｎＭからの１／２対数希釈（１０ｎＭで最終開始）における等容量（１００ｕｌ）の２×試験サンプルで行われた。７２時間後、プレートをＰＢＳで１回洗浄し、染色緩衝液中で近赤外Ｌ／Ｄ染色剤及びＢＶ４２１標識抗ＣＤ２５抗体とともに２０分間インキュベートした。細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、２５ｕｌのＡｃｃｕｔａｓｅ中に１０分間再懸濁し、次いで２５ｕｌのＱＳｏｌ緩衝液を添加した。プレートをＩＱｕｅ ｐｌｕｓで読み取り、細胞をＣＳＦＥ陽性集団（腫瘍細胞）及びＣＳＦＥ陰性細胞（Ｔ細胞）でゲーティングし、続いて両方の集団を生／死染色でゲーティングした。生存Ｔ細胞を更にＣＤ２５染色でゲーティングした。算出された出力は、腫瘍死滅％、ＣＤ２５ Ｔ細胞活性化％、及びＴ細胞生存率であった。ルビーレッド染色対照（偽１００％死亡）及びＴ細胞のみ／ＳＨＰ－７７のみを使用して、デブリからの細胞を含有する核、次いで個々の細胞集団をゲーティングした。データを、ＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｒにおいて、４つのパラメータ曲線フィットを使用して分析した。
表３１～３３は、様々なＣＤ３アームと対になった各ＤＬＬ３結合剤について、７２時間の終了時に観察されたＳＨＰ－７７細胞の最大溶解パーセントを示す。本発明者らは、予想外にも、ＤＬＬ３内の結合ドメインが一次配列のＣ末端に向かって、又は腫瘍膜の近位に移動するにつれて、各ドメインにおける最大死滅が増加するという興味深い傾向が現れることを発見した。結果は、腫瘍死滅％がＤＬＬ３上の結合エピトープに依存し、抗体が膜から更に離れたＤＬＬ３サブドメインに結合するに従って細胞溶解が減少することを示した（表２９～３１）。ＤＬＬ３結合エピトープがより膜近位になるにつれて、腫瘍死滅％は、改善された。この傾向は比較的一貫しており、ＣＤ３アームとは無関係である。
具体的には、ＤＬＬ３－ＣＤ３二重特異性抗体がＤＬＬ３のＥＧＦ２～ＥＧＦ６サブドメインに結合する場合、最大死滅効率が向上し、試験した対象の抗体がＥＧＦ－６ドメイン又はＣ末端近くに結合する場合に最も高いパーセンテージに達する。
Figure 2023548034000031
Figure 2023548034000032
Figure 2023548034000033
実施例８二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３の生成
ＤＬ３Ｂ２７９及びＤＬ３Ｂ２７９バリアント（ＤＬ３Ｂ２７９－ＶＬ－Ａ９９Ｇ－ＶＨ－Ｎ２７Ｑ＿Ｍ１０５Ｔ－ＬＨ－ｓｃＦｖ）を、ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性の生成のために選択した。抗ＤＬＬ３抗体のＶＨ／ＶＬ領域並びに抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｗ２４５のＶＨ／ＶＬ領域を二重特異性フォーマットに操作し、ＩｇＧ１として発現させた。
二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３生成のためのＣＤ３及びＤＬＬ３ ｓｃＦｖの遺伝子操作
ＣＤ３ ＶＨ／ＶＬ領域を、配列番号１２０のリンカーを使用して、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖとして操作した（表２）。ＣＤ３に結合するＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨのｓｃＦｖ分子を、Ｆｃサイレンシング変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）、及び二量化変異を含むｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットに、ＩｇＧ１として更に遺伝子操作し、ＤＬＬ３及びＣＤ３重鎖のヘテロ二量体を可能にした。
ＤＬＬ３ ＶＨ／ＶＬ領域を、配列番号１２０の上記のＣＤ３ ｓｃＦｖ生成と同じリンカーを使用して、ＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のｓｃＦｖとして遺伝子操作した（表２）。ＤＬＬ３に結合するＶＬ－リンカー－ＶＨ ｓｃＦｖ分子を、Ｆｃサイレンシング変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）を含むｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットに、ＩｇＧ１として更に遺伝子操作した。Ｆｃドメインの選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計された変異もまた、Ｆｃドメインにおいて遺伝子操作した。
ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性生成のためのＣＤ３及びＤＬＬ３ Ｆａｂの遺伝子操作
ＣＤ３及びＤＬＬ３特異的ＶＨ及びＶＬ領域もまた、それぞれＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３及びＶＬ－ＣＬフォーマットに遺伝子操作し、ＩｇＧ１として発現させた。Ｆｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５ＳをＦｃ領域に導入した。Ｆｃドメインの選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計された変異もまた、Ｆｃドメインにおいて遺伝子操作した。
二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の発現
二重特異性抗体を、製造業者の推奨に従って精製プラスミドＤＮＡでの一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞において発現させた。簡潔に述べると、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を、３７℃、８％ＣＯ２、及び１２５ＲＰＭに設定された軌道振動インキュベータ内で、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１００）中に懸濁させて維持した。細胞を継代し、トランスフェクションの前に、６．０×１０６個の細胞／ｍｌに希釈し、細胞生存率を９９．０％以上で維持した。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１３１）を使用して行った。トランスフェクトされる希釈された細胞１ｍｌごとに、ＨＣ１：ＬＣ１：ＨＣ２＝１：２：２の比での０．５マイクログラムの各二重特異性抗体をコードするＤＮＡ、及び０．５マイクログラムのｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１７１１）を使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ複合体形成培地中に希釈した。細胞１リットルごとに、２．５６ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を８ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ（商標）に希釈した。希釈したＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を１分間組み合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成させ、次いで細胞に添加した。一晩インキュベートした後、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィード及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサを、製造業者の標準プロトコルのとおり、細胞に添加した。細胞を軌道振盪（１２５ｒｐｍ）しながら、３７℃で７日間インキュベートした後、培養ブロスを採取した。一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞からの培養上清を、遠心分離（３０分、３０００ｒｃｆ）、続いて濾過（０．２μｍのＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）によって浄化した。
二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３の精製
濾過した細胞培養上清を、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０クロマトグラフィシステムを使用して、予め平衡化した（１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に装填した。装填後、カラムを５カラム体積の１×ＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。タンパク質を、８カラム体積の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出した。タンパク質画分を、２．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．２を最終体積の１５％（ｖ／ｖ）まで添加することによって完全に中和し、シリンジ濾過した（０．２μｍ）。中和されたタンパク質溶液を、２×５ｍＬのプレパックされたＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ－ＣＨ１ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に装填した。カラムを１０カラム体積の１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄した。タンパク質を、１０カラム体積の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出した。タンパク質画分を、２．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．２を最終体積の１５％（ｖ／ｖ）まで添加することによって完全に中和した。主要なピーク画分をプールし、１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２中に透析し、合計３回透析交換し、濾過した（０．２μｍ）。
ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性抗体の構造特性評価
表３２は、選択されたＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＨＣ及びＬＣアミノ酸配列番号を記載する。表３３は、選択されたＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を示す。表３４は、選択されたＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＫａｂａｔ ＣＤＲ配列番号を記載した。表３５は、選択されたＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＨＣ及びＬＣヌクレオチド配列番号を記載する。
Figure 2023548034000034
Figure 2023548034000035
Figure 2023548034000036
Figure 2023548034000037
具体的には、ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＨＣ及びＬＣ ＤＮＡ配列は、例えば、配列番号２６７（ＤＬ３Ｂ５８２及びＤＬ３Ｂ５８３におけるＤＬ３Ｂ２７９－Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣ１ ｃＤＮＡ）、配列番号２６８（ＤＬ３Ｂ５８２及びＤＬ３Ｂ５８３におけるＤＬ３Ｂ２７９－Ｆａｂ－Ｆｃ ＬＣ１ ｃＤＮＡ）、配列番号２６５（ＤＬ３Ｂ５８５及びＤＬ３Ｂ５８７におけるＤＬ３Ｂ２７９ ＬＨ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｃＤＮＡ）、配列番号２６６（ＤＬ３Ｂ２７９ ＬＨ ｓｃＦｖバリアント－Ｆｃ ｃＤＮＡ）、配列番号２３９（ＤＬ３Ｂ２７９ ｓｃＦｖ－ＦｃバリアントＫＩＨ ｃＤＮＡ）、配列番号２６９（ＣＤ３Ｗ２４５ ＬＨ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｃＤＮＡ）、配列番号２７０（ＣＤ３Ｗ２４５ ＨＬ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｃＤＮＡ）、配列番号１７７（ＣＤ３Ｗ２４５ Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣ２ ｃＤＮＡ）、配列番号２０２（ＣＤ３Ｗ２４５ Ｆａｂ－Ｆｃ ＬＣ２ ｃＤＮＡ）、配列番号２５６（ＣＤ３Ｂ３７６ Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣ２ ｃＤＮＡ）、配列番号２６４（ＣＤ３Ｂ３７６ Ｆａｂ－Ｆｃ ＬＣ２ ｃＤＮＡ）、配列番号２３７（ＣＤ３Ｂ３７６ Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣ２ ＫＩＨ ｃＤＮＡ）、及び配列番号２３８（ＣＤ３Ｂ３７６ Ｆａｂ－Ｆｃ ＬＣ ＫＩＨ ｃＤＮＡ）を含む。
実施例９二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の特性評価
ＤＬＬ３に対する二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合親和性
組換えヒトＤＬＬ３に対する抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。抗体をヤギ抗Ｆｃ抗体修飾Ｃ１チップ上に捕捉し、９０ｎＭ～１．１ｎＭの濃度に及ぶＤＬＬ３抗原の３倍連続希釈で滴定した。１００μＬ／分の流速を使用して、会合を２分間、解離を５又は６０分間、監視した。生の結合データを、ブランクから分析物結合シグナルを差し引くことによって参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアを使用する１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して分析して、結合親和性を計算するために使用される動態を得た。組換えヒトＤＬＬ３に対する抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合親和性を表３６にまとめる。
Figure 2023548034000038
実施例５に記載されるように、ＤＬ３Ｂ２７９バリアントのＨＣＤＲ１領域（又は使用される記述によってはＨＣＤＲ１領域付近）におけるＮからＱへの変異がＤＬＬ３への結合の変化をもたらさなかったことを保証するために、組換えヒトＤＬＬ３に対するＤＬ３Ｂ２７９バリアントの結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定し、親ＤＬ３Ｂ２７９と比較した。結果（表３７）は、ＤＬ３Ｂ２７９バリアント（ＤＬ３Ｂ２７９－ＶＬ－Ａ９９Ｇ－ＶＨ－Ｎ２７Ｑ＿Ｍ１０５Ｔ－ＬＨ－ｓｃＦＶ）を含むＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性（Ｄ３Ｃ３Ｂ８０）の結合親和性が、元のＤＬ３Ｂ５８５－ＬＨ－ｓｃＦＶ分子（ＤＬ３Ｂ２７９：２４ｐＭ）を含む元のＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性（ＤＬ３Ｂ５８５）の結合親和性と同等であることを示した。
Figure 2023548034000039
二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の熱安定性
熱安定性（立体配座安定性）二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体を、自動化Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ機器を使用してＮａｎｏＤＳＦ法によって決定した。サンプルを、３８４ウェルサンプルプレートから２４ウェルキャピラリーに装填することによって測定を行った。二重の実行を行った。熱走査スキャンは、１．０℃／分の加熱速度で、２０℃～９５℃に及ぶ。データを処理して、３３０ｎｍ、３５０ｎｍ、比３３０／３５０、並びに熱転移、アンフォールディングの開始、Ｔｍ、及びＴａｇｇが得られた散乱データについて積分データ及び一次微分解析を得た。
結果は、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体が５９℃より高い第１の転移（Ｔｍ１）を有することを示す。結果はまた、ＤＬ３Ｂ５８５を除くほとんどのタンパク質が、Ｔａｇｇが７０℃超であり、Ｔｍ１より５度以上高く、低い凝集能力を有することを示す（表３８）。
Figure 2023548034000040
ＤＬ３Ｂ２７９バリアント（Ｄ３Ｃ３Ｂ８０）を含む二重特異性抗ＤＬＬ３ ＣＤ３抗体の熱安定性も決定した。結果（表３９）は、ＤＬ３Ｂ２７９－ＶＬ－Ａ９９Ｇ－ＶＨ－Ｎ２７Ｑ＿Ｍ１０５Ｔ－ＬＨ－ｓｃＦＶバリアント（Ｄ３Ｃ３Ｂ８０）を有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の熱安定性が、元のＤＬ３Ｂ２７９－ＬＨ－ｓｃＦｖ配列を有する元の二重特異性分子における熱安定性と同等であることを示した（表３９に示されるＤＬ３Ｂ５８５：Ｔａｇｇ＝６２．７、Ｔｍ１＝６０．８）。
Figure 2023548034000041
ＤＬＬ３＋腫瘍細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合
ＤＬＬ３＋ヒト腫瘍細胞株（ＨＣＣ１８３３及びＳＨＰ－７７）に対する抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合プロファイルも決定した。接着性ＳＣＬＣ ＨＣＣ１８３３細胞をＤＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンを添加して、細胞を剥離させた。培地を添加して、トリプシンを中和し、細胞を１５ｍＬのコニカルチューブに移した。懸濁ＳＣＬＣ ＳＨＰ７７細胞を１５ｍＬのコニカルチューブに移し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。培地を吸引し、細胞をＤＰＢＳでもう一度洗浄した。Ｖｉ－ｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率アナライザーを使用して細胞を計数し、１００ｕＬのＤＰＢＳ中に１００Ｋ／ウェルで播種した。プレートを１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＶｉｏｌｅｔ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、暗所にて室温で２５分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で２回洗浄した。
試験抗体をＦＡＣＳ染色緩衝液中で１００ｎＭの最終出発濃度に希釈し、合計１０個の希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００μＬ／ウェル）を細胞に添加し、３７°で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートロバ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、細胞とともに４°で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａ上で泳動させ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。図２Ａ及び図２Ｂに示されるように、ＤＬＬ３－Ｆａｂアーム（ＤＬ３Ｂ５８２及びＤＬ３Ｂ５８３）とＤＬＬ３－ｓｃＦｖアーム（ＤＬ３Ｂ５８５及びＤＬ３Ｂ５８７）との間の結合プロファイルは、中程度に異なる。
汎Ｔ細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合
正常ヒトＴ細胞に対する二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合プロファイルも評価した。ヒト汎Ｔ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）を解凍し、ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸生理食塩水緩衝液）を含む１５ｍＬのコニカルに移した。細胞を１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＤＰＢＳを吸引し、細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁した。Ｖｉ－ｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率アナライザーを使用して細胞を計数し、１００μＬのＤＰＢＳ中に１００Ｋ／ウェルで播種した。プレートを１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＶｉｏｌｅｔ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、暗所にて室温で２５分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で２回洗浄した。試験抗体をＦＡＣＳ染色緩衝液中で１００ｎＭの最終出発濃度に希釈し、合計１０個の希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００ｕＬ／ウェル）を細胞に添加し、３７°で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートロバ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、細胞とともに４°で３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａ上で泳動させ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。図３に示されるように、細胞結合プロファイルは、様々なＣＤ３アームにわたって異なる。
正常ヒトＴ細胞に対するＤＬ３Ｂ２７９バリアント（ＤＬ３Ｂ２７９－ＶＬ－Ａ９９Ｇ－ＶＨ－Ｎ２７Ｑ＿Ｍ１０５Ｔ－ＬＨ－ｓｃＦＶ）を含む抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合プロファイルも評価し、元のＤＬ３Ｂ５８５－ＬＨ－ｓｃＦＶ分子を含む元のＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性（ＤＬ３Ｂ２７９）と比較した。図４に示されるように、ＤＬ３Ｂ２７９－ＶＬ－Ａ９９Ｇ－ＶＨ－Ｎ２７Ｑ＿Ｍ１０５Ｔ－ＬＨ－ｓｃＦＶバリアントを有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体（Ｄ３Ｃ３Ｂ８０）は、元のＤＬ３Ｂ２７９－ＬＨ－ｓｃＦｖ配列を有する元の二重特異性分子（ＤＬ３Ｂ５８５）と同等のＴ細胞への結合を有する。
汎Ｔ細胞におけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３媒介性細胞傷害
ＤＬＬ３＋及びＤＬＬ３－細胞株における二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のＴ細胞媒介性死滅能も評価した。赤色核色素を安定的に発現するＤＬＬ３＋ＳＨＰ７７及びＤＬＬ３－ＨＥＫ２９３を生成して、ＩｎｃｕＣｙｔｅベースの細胞傷害アッセイにおいて使用した。健康なドナーＴ細胞の凍結バイアル（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）を３７℃の水浴中で解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、５ｍＬのフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ／１０％ＨＩ ＦＢＳ培地で１回洗浄した。Ｖｉａｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存アナライザーを使用して細胞を計数し、Ｔ細胞を、５：１の最終のエフェクターＴ細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞と合わせた。Ｔ）比５：１でインキュベートした。細胞混合物（１００ｕＬ／ウェル）を５０ｍＬのコニカルチューブ中で合わせ、透明な９６ウェル平底プレートに添加した。次いで、試験抗体を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ／１０％ＨＩ ＦＢＳ培地中で６０ｎＭの最終出発濃度に希釈し、合計１１個の希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００ｕＬ／ウェル）を合わせた細胞に添加した。プレートを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｚｏｏｍ又はＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ）のいずれかの中に、３７℃、５％ＣＯ２で１２０時間置いた。標的細胞株は、標的細胞溶解の動態を追跡するために使用された赤色核色素を安定的に発現する。細胞成長阻害（％）＝（初期生存標的細胞数－現時点の生存標的細胞数）／初期生存細胞数×１００％。図５Ａ及び図５Ｂに示されるように、Ｔ細胞細胞傷害性アッセイの結果は、全ての二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体が５日までに９５％超の腫瘍溶解を達成することができることを実証する。
ＤＬ３Ｂ２７９バリアント（ＤＬ３Ｂ２７９－ＶＬ－Ａ９９Ｇ－ＶＨ－Ｎ２７Ｑ＿Ｍ１０５Ｔ－ＬＨ－ｓｃＦＶ）を含む抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のＴ細胞媒介性死滅能も評価し、元のＤＬ３Ｂ２７９－ＬＨ－ｓｃＦＶ分子を含む元のＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性（ＤＬ３Ｂ５８５）と比較した。図６に示すように、ＤＬ３Ｂ２７９－ＶＬ－Ａ９９Ｇ－ＶＨ－Ｎ２７Ｑ＿Ｍ１０５Ｔ－ＬＨ－ｓｃＦＶバリアントを有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体（Ｄ３Ｃ３Ｂ８０）は、元のＤＬ３Ｂ２７９－ＬＨ－ｓｃＦｖ配列を有する元の二重特異性分子（ＤＬ３Ｂ５８５）と同等の細胞増殖阻害を有する。
汎Ｔ細胞における二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介されるサイトカイン誘導
二重特異性抗ＤＬＬ３ ｘＣＤ３抗体のサイトカイン放出プロファイルを、ＤＬＬ３＋ヒト腫瘍細胞株で評価した。上清を、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ Ｉ組織培養キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して分析し、湿った氷上で解凍し、１，５００ｒｐｍで５分間、４℃で回転させ、次いで氷上に置いた。ＭＵＬＴ－ＳＰＯＴアッセイプレートを製造業者のプロトコルに従って予め洗浄した。標準曲線を、ＭＳＤ希釈剤１中の提供された較正物質の連続希釈によって調製した。標準及び試験抗体サンプル（２５ｕＬ／ウェル）を予め洗浄したプレートに添加した。ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００でアッセイプレートを読み取った。図７に示されるように、サイトカインプロファイリング実験の結果は、ＩＦＮ－γ産生が二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のＣＤ３親和性と相関することを実証する。
ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３媒介性細胞傷害
様々なレベルの抗原発現を有するＤＬＬ３＋標的細胞に対する二重特異性の有効性を試験するために、ＤＬＬ３高発現細胞株（ＳＨＰ－７７及びＨＣＣ１８３３）及びＤＬＬ３低発現細胞株（Ｇ３６１）を細胞傷害アッセイで試験した。ＳＨＰ－７７及びＨＣＣ１８３３は、それぞれ肺上皮細胞株及び肺腺がん細胞株である。Ｇ３６１細胞は、悪性皮膚黒色腫に由来する。核制限されたＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（ＮＬＲ）タンパク質を安定的に発現するＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７細胞株を、細胞毒性アッセイで使用した。アッセイ当日、ＳＨＰ－７７－ＮＬＲ細胞を５０ｍｌのファルコンチューブに収集し、１３００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。次いで、細胞ペレットを修飾ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＢＳ（完全培地）に再懸濁し、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して細胞数を推定した。次いで、ＳＨＰ－７７－ＮＬＲ細胞を、コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート上に、１０，０００細胞／ウェル／９０μｌの完全培地で播種した。細胞を穏やかに撹拌することによって均一に分布させ、５％ＣＯ２インキュベータ中で１時間静置した。ＨＣＣ１８３３及びＧ３６１標的細胞株の場合、ＰＢＭＣ添加の１日前に、３０００個の細胞／ウェル／９０μｌの完全培地を９６ウェル平底組織培養プレートに播種した。
健康なドナーから凍結したＰＢＭＣのバイアル（Ｃｌｉｎｉｇｅｎｅ）を３７℃の水浴中で急速に解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、１０ｍＬの完全培地で１回洗浄した。細胞を抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメータによって分析して、ＰＢＭＣ内のＣＤ３％を決定した。各ドナーからのＰＢＭＣを、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して計数し、必要とされるエフェクター対標的（effector to target、ＥＴ）比（ＣＤ３：標的細胞）を得るために必要なＰＢＭＣの数を、９０μｌの完全培地中の藩種された標的細胞に添加した。次いで、試験抗体を完全培地中の１０×ストックとして調製し、３倍連続希釈物を調製した。抗体の最終濃度が１×になるように、連続希釈した試験抗体をＰＢＭＣ－腫瘍共培養物に２０μｌ／ウェルで添加した。抗体を含まないウェル（ＮＢＳ）を基底細胞毒性の対照として使用した。プレートを、５％ＣＯ２、３７℃でＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）中に５日間置いた。赤色シグナルの増加は、標的細胞増殖に対応し、シグナルの減少は、標的細胞死に対応する。結果を表４０にまとめる。溶解％を、＝｛１００－（抗体を用いた特定の時点での赤色シグナル強度／ＮＢＳウェルにおけるその時点での赤色シグナル強度）＊１００｝として計算した。
Figure 2023548034000042
強力な腫瘍細胞溶解が、異なる起源及び抗原密度の細胞株にわたって二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体で観察された。高親和性ＣＤ３二重特異性抗体（ＤＬ３Ｂ５８３）の有効性を低親和性ＣＤ３二重特異性抗体（ＤＬ３Ｂ５８５）と比較するために、ＤＬＬ３高発現ＳＨＰ－７７細胞に対する細胞傷害を様々なＥＴ比で試験した。３人のドナーからの全ＰＢＭＣを、ＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７－ＮＬＲ細胞とともに、示されたＥＴ比（ＣＤ３：ＳＨＰ－７７）で、二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の存在下で培養した。ＰＢＭＣ及び標的細胞を含むが抗体を含まないウェルを、基底細胞傷害の対照として使用した。プレートを、５％ＣＯ２インキュベータを用いて３７℃でＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）中で最大１２０時間走査した。溶解％を、＝｛１００－（抗体を用いた特定の時点での赤色シグナル強度／ＮＢＳウェルにおけるその時点での赤色シグナル強度）＊１００｝として計算した。グラフ上の各点は、３人のドナーの平均を表す。図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃに示されるように、高親和性ＣＤ３（ＤＬ３Ｂ５８３）及び低親和性ＣＤ３（ＤＬ３Ｂ５８５）アームの両方を有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体は、ＳＨＰ－７７細胞に対して強固な細胞傷害を示した。９０ｎＭ及び３０ｎＭの抗体濃度での標的細胞溶解は、１０：１のＥＴ比については、高親和性ＣＤ３抗体と低親和性ＣＤ３抗体との間で同様であった。
全ＰＢＭＣ細胞傷害アッセイにおける二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖
ＣＤ８＋Ｔ細胞への二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び拡大を誘導し得るかどうかを試験するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の経時変化分析を行った。ＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７細胞をアッセイに使用した。アッセイ当日、ＳＨＰ－７７細胞を５０ｍｌファルコンチューブに収集し、１３００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。次いで、細胞ペレットを１ｍｌの修飾ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＢＳ（完全培地）に再懸濁し、トリパンブルー生死マーカーを用いて血球計数器で細胞数を推定した。次に、ＳＨＰ７７細胞をＵ底９６ウェルプレートに１０，０００個の細胞／ウェル／９０μｌの完全培地で播種した。
健康なドナーから凍結したＰＢＭＣのバイアル（Ｃｌｉｎｉｇｅｎｅ）を３７℃の水浴中で急速に解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、１０ｍＬの完全培地で１回洗浄した。細胞を抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメータによって分析して、ＰＢＭＣ内のＣＤ３％を決定した。ＰＢＭＣをＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素（Ｃ３４５７１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。各ドナーからのＰＢＭＣを、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して計数し、１０：１（ＣＤ３：標的細胞）のエフェクター対標的（ＥＴ）比を得るために必要なＰＢＭＣの数を、９０μｌの完全培地中の播種された標的細胞に添加した。
次いで、試験抗体を完全培地中の１０×ストックとして調製し、合計３つの希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。抗体の最終濃度が１×になるように、連続希釈した試験抗体をＰＢＭＣ－腫瘍共培養物に２０μｌ／ウェルで添加した。抗体を含まないウェル（ＮＢＳ）を基底細胞毒性の対照として使用した。プレートを、指示された期間、５％ＣＯ２のインキュベータ内でインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞懸濁液をｖ底プレートに移し、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。ペレットを１００μｌのＤＰＢＳに再懸濁した。１０μｌの細胞懸濁液を採取し、血球計数器とともにトリパンブルーを使用して各抗体濃度での総細胞数を決定した。細胞懸濁液の残りを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｌ１０１１９）に供し、氷上で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を使用して生存染色剤を不活性化し、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。細胞をＢＤ Ｆｃブロック（５６４２２０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で１０分間染色した後、ＣＤ３抗体及びＣＤ８抗体で染色し、フローサイトメータで取得した。ＣＤ８ Ｔ細胞に対するゲーティングを実施して、ＣＤ３ Ｔ細胞内での細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞集団の拡大を推定した。図９に示されるように、二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のＴ細胞への結合は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の拡大を強力に媒介する。
全ＰＢＭＣアッセイにおける二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によるＣＤ８ Ｔ細胞の活性化プロファイル
ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性の結合に応答した細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞集団の活性化状態を調べるために、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１マーカーの動態分析を行った。ＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７細胞をアッセイに使用した。ＳＨＰ－７７細胞を５０ｍｌのファルコンチューブに収集し、１３００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。次いで、細胞ペレットを１ｍｌの修飾ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＢＳ（完全培地）に再懸濁し、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して細胞数を推定した。次に、ＳＨＰ－７７細胞をＵ底９６ウェルプレートに１０，０００個の細胞／ウェル／９０μｌの完全培地で播種した。
健康なドナーから凍結したＰＢＭＣのバイアル（Ｃｌｉｎｉｇｅｎｅ）を３７℃の水浴中で急速に解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、１０ｍＬの完全培地で１回洗浄した。細胞を抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメータによって分析して、ＰＢＭＣ内のＣＤ３％を決定した。各ドナーからのＰＢＭＣを、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して計数し、１０：１（ＣＤ３：標的細胞）のエフェクター対標的（ＥＴ）比を得るために必要なＰＢＭＣの数を、９０μｌの完全培地中の播種された標的細胞に添加した。
試験抗体を完全培地中の１０×ストックとして調製し、合計３つの希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。抗体の最終濃度が１×になるように、連続希釈した試験抗体をＰＢＭＣ－腫瘍共培養物に２０μｌ／ウェルで添加した。抗体を含まないウェル（ＮＢＳ）を基底細胞毒性の対照として使用した。プレートを、示された期間、５％ＣＯ２のインキュベータ内でインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞懸濁液をｖ底プレートに移し、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。ペレットを１００μｌのＤＰＢＳに再懸濁した。１０μｌの細胞懸濁液を採取し、血球計数器とともにトリパンブルーを使用して各抗体濃度での総細胞数を決定した。
細胞懸濁液の残りを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｌ１０１１９）に供し、氷上で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を使用して生存染色剤を不活化し、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。細胞をＢＤ Ｆｃブロック（５６４２２０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で１０分間染色した後、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１抗体で染色し、フローサイトメータで取得した。図１０Ａ、図１０Ｂ、及び図１０Ｃに示されるように、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の強力な活性化は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１発現の上方制御によって示されるように、二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体で見られた。
ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、ＤＬＬ３＋細胞との共培養においてＴ細胞に対する活性を誘導した。
ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性抗体の細胞毒性効果を、ＳＨＰ－７７（ＤＬＬ３を発現する小細胞肺がん細胞株）に対して、３人のＰＡＮ－Ｔドナーに対する反復実験において、５：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で試験した。実験の０日目に、アッセイプレートに、ウェル当たり２０，０００個のＳＨＰ－７７（０．４ｅ６細胞／ｍＬのうち５０ｕＬ）細胞、５０ｕＬの増殖培地、及び１００，０００個のＰＡＮ ＣＤ３＋Ｔ細胞（５０ｕＬの２ｅ６細胞／ｍＬ）を播種した。Ｔ細胞を増殖測定のために事前にＥｎｃｏｄｅｒ Ｄｙｅ Ｂ／Ｇｒｅｅｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で染色し、適切に希釈したＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性抗体５０ｕＬを適切なウェルに２つ組で添加する。ＤＬＬ３×ヌルを陰性対照として用いた。最終抗体濃度は、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７０ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．４１ｎＭ、０．１４ｎＭ、０．０４６ｎＭ、０．０１５ｎＭ、及び０ｎＭであった。次いで、プレートを４８、７２、及び１２０時間インキュベートした。その後の各時点の後、上清（サイトカイン計数のため）及びＴ細胞（増殖及び活性化のため）を回収した。サイトカインを含む上清をＩＦＮγＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２５について分析し、Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ及びＣｙｔｏｋｉｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓカタログ番号９０５６１）を使用して、Ｔ細胞を増殖について分析した。
ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＴ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ及びＣｙｔｏｋｉｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｋｉｔから調製した標準を使用して、ＩＦＮγサイトカインを４８時間及び１２０時間で測定した。３つの別個のＰＡＮ ＣＤ３＋Ｔドナー実験（２つ組のウェル）からの結果をｎ＝６について平均した。４８時間及び１２０時間で、ＤＬＬ３×ヌルと比較してＤＬＬ３×ＣＤ３の方がより高濃度でＩＦＮγが用量依存的に放出されることが観察された（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。
ＣＤ３＋集団内のＣＤ８＋及びＣＤ２５＋マーカーをゲーティングすることにより、Ｔ細胞活性化を測定した。３つの汎Ｔドナー実験結果（２つ組）の結果をｎ＝６で平均した。ＤＬＬ３×ヌルと比較して、ＤＬＬ３×ＣＤ３は、４８時間及び１２０時間の両方で用量依存的にＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のより大きな活性化を誘導した（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を７２時間及び１２０時間で測定した。７２時間から１２０時間まで、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＤＬＬ３×ＣＤ３増殖は、ＤＬＬ３×ヌルと比較して用量依存的に増加した（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。
全ＰＢＭＣアッセイにおける二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介されるサイトカイン誘導
Ｔ細胞再指向二重特異性抗体は、サイトカイン放出症候群の誘導のために毒性を引き起こし得る。これらのサイトカインは、Ｔ細胞自体又は骨髄細胞によって産生され得、より多くのサイトカイン産生のフィードバックループをもたらす。ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性の添加によるＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＧＭＣＳＦ、及び他のＴ細胞サイトカインなどのサイトカインの放出を理解するために、細胞傷害アッセイからの培養上清をこれらのサイトカインのレベルについて試験した。ＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７細胞をアッセイに使用した。ＳＨＰ－７７細胞を５０ｍｌのファルコンチューブに収集し、１３００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。次いで、細胞ペレットを１ｍｌの修飾ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＢＳ（完全培地）に再懸濁し、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して細胞数を推定した。次いで、ＳＨＰ－７７細胞を、１０，０００個の細胞／ウェル／９０μｌの完全培地でＵ底９６ウェルプレートに播種した。
健康なドナーから凍結したＰＢＭＣのバイアル（Ｃｌｉｎｉｇｅｎｅ）を３７℃の水浴中で急速に解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、１０ｍＬの完全培地で１回洗浄した。細胞を抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメータによって分析して、ＰＢＭＣ内のＣＤ３％を決定した。各ドナーからのＰＢＭＣを、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して計数し、１０：１（ＣＤ３：標的細胞）のエフェクター対標的（ＥＴ）比を得るために必要なＰＢＭＣの数を、９０μｌの完全培地中の播種された標的細胞に添加した。
試験抗体を完全培地中の１０×ストックとして調製し、抗体の最終濃度が１×になるように、２０μｌ／ウェルでＰＢＭＣ－腫瘍共培養物に添加した。抗体を含まないウェル（ＮＢＳ）を基底細胞毒性の対照として使用した。プレートを、示された期間、５％ＣＯ２のインキュベータ内でインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞懸濁液をｖ底プレートに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心沈殿させた。上清を収集し、－２０℃で保存し、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ ＭＡＰ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ Ｐａｎｅｌ（ＨＣＤ８ＭＡＧ－１５Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＬｕｍｉｎｅｘを行った。ｅＸＰＯＮＥＮＴソフトウェアを備えたＭＡＧＰＩＸを使用してプレートを分析した。結果を表４１にまとめる。
Figure 2023548034000043
より高い親和性のＣＤ３アームを有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体（ＤＬ３Ｂ５８２及びＤＬ３Ｂ５８３）、具体的には、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－２及びＩＬ－４と比較して、より低い親和性のＣＤ３を有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体（ＤＬ３Ｂ５８５）では、低レベルのサイトカイン放出が観察されたが、これらの二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３の細胞傷害性効力は同等であった。
本実施例は、本明細書に開示される単離された多重特異性抗原結合構築物が、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を媒介し、Ｔ細胞の活性化及び増殖を促進し、Ｔ細胞サイトカイン放出を増加させ、かつ／又は抗腫瘍効果の増加を示すのに特に有効であることを示している。これらの活性は、標的細胞のＤＬＬ３及びＴ細胞上のＣＤ３を標的化する抗原結合領域の組み合わせの反映である。当業者であれば、そのような活性は、二重特異性抗体が組み立てられる機構に関係なく、結合ドメインを二重特異性抗体に組み立てることから予想されることを理解するであろう。
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の趣旨及び範囲内の修正をも包含することを意図するものと理解される。

Claims (32)

  1. デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）に結合する抗原結合領域を含む単離されたタンパク質であって、前記抗原結合領域が、配列番号２６３のアミノ酸配列内のエピトープに結合する、単離されたタンパク質。
  2. 前記抗原結合領域が、ＤＬＬ３への結合について、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、参照抗体と競合し、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、
    ａ．配列番号１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
    ｂ．配列番号３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
    ｃ．配列番号５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
    ｄ．配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
    ｅ．配列番号９のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１０のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
    ｆ．配列番号１１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
    ｇ．配列番号１３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号１４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３
    のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
  3. 前記抗原結合領域が、
    ａ．それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、
    ｂ．それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８、
    ｃ．それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０、
    ｄ．それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３、
    ｅ．それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、４６、
    ｆ．それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９、
    ｇ．それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、３５、
    ｈ．それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、３５、
    ｉ．それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、
    ｊ．それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、４０、
    ｋ．それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、
    ｌ．それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、４６、又は
    ｍ．それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、４９
    のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１又は２に記載の単離されたタンパク質。
  4. 前記抗原結合領域が、それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、又は１３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、又は１４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有するＶＬを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
  5. 前記抗原結合領域が、
    ａ．配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
    ｂ．配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
    ｃ．配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
    ｄ．配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
    ｅ．配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
    ｆ．配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、又は
    ｇ．配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ
    を含む、請求項４に記載の単離されたタンパク質。
  6. 前記抗原結合領域が、配列番号６３又は６４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
  7. 治療剤又は造影剤にコンジュゲートされた請求項１～６のいずれかに一項に記載の単離されたタンパク質を含む、免疫コンジュゲート。
  8. 請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、多重特異性抗原結合構築物。
  9. Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球上の抗原に結合する第２の抗原結合領域を更に含む、請求項８に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  10. 前記リンパ球上の前記抗原が、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃである、請求項９に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  11. 前記第２の抗原結合領域が、ＣＤ３εに結合し、かつＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有するＶＨ、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有するＶＬを含み、前記第２の抗原結合領域の前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、
    ａ．それぞれ配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、及び１０８、又は
    ｂ．それぞれ配列番号９５、９６、９７、１０１、１０２、及び１０４
    のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  12. 前記第２の抗原結合領域が、
    ａ．配列番号８４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有するＶＬ、好ましくは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む前記ＶＨ、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含む前記ＶＬ、又は
    ｂ．配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有するＶＬ、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＶＬ
    を含む、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  13. ＤＬＬ３に結合する前記抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、及び３５のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有し、好ましくは、ＤＬＬ３に結合する前記抗原結合領域が、配列番号３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  14. 請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質又は請求項８～１３のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合構築物に融合された半減期延長部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む、融合体又はコンジュゲートであって、前記半減期延長部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）、前記Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、前記Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである、融合体又はコンジュゲート。
  15. 前記半減期延長部分が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ、及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、Ｉｇ定常領域などの、前記Ｉｇ定常領域の断片を含み、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項１４に記載の融合体又はコンジュゲート。
  16. 二重特異性抗原結合性構築物であって、
    （１）ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合領域であって、前記第１の抗原結合領域が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有する第１のＶＨ、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する第１のＶＬを含み、前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３が、
    （ａ）それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５、
    （ｂ）それぞれ配列番号１８、１９、２０、３６、３７、３８、
    （ｃ）それぞれ配列番号２１、２２、２３、３９、３７、４０、
    （ｄ）それぞれ配列番号２４、２５、２６、４１、４２、４３、
    （ｅ）それぞれ配列番号１８、２８、２９、４４、４５、４６、
    （ｆ）それぞれ配列番号３０、３１、３２、４７、４８、４９、
    （ｇ）それぞれ配列番号５０、５１、１７、３３、３４、３５、
    （ｈ）それぞれ配列番号５２、５１、１７、３３、３４、３５、
    （ｉ）それぞれ配列番号５３、５４、２０、３６、３７、３８、
    （ｊ）それぞれ配列番号５５、５６、２３、３９、３７、４０、
    （ｋ）それぞれ配列番号５７、５８、２６、４１、４２、４３、
    （ｌ）それぞれ配列番号５９、６０、２９、４４、４５、４６、又は
    （ｍ）それぞれ配列番号６１、６２、３２、４７、４８、４９
    のアミノ酸配列を含む、第１の抗原結合領域、
    （２）ＣＤ３εに結合する第２の抗原結合領域であって、
    （ａ）それぞれ配列番号９５、９６、及び９７のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有する第２のＶＨ、並びにそれぞれ配列番号１０１、１０２、及び１０４の配列のアミノ酸のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する第２のＶＬ、又は
    （ｂ）それぞれ配列番号９８、９９、及び１００のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有する第２のＶＨ、並びにそれぞれ配列番号１０６、１０７、及び１０８のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する第２のＶＬ
    を含む、第２の抗原結合領域
    を含む、二重特異性抗原結合性構築物。
  17. ａ．前記第１のＶＨ及び前記第１のＶＬが、
    ｉ．それぞれ配列番号１のＶＨ及び配列番号２のＶＬ、
    ｉｉ．それぞれ配列番号３のＶＨ及び配列番号４のＶＬ、
    ｉｉｉ．それぞれ配列番号５のＶＨ及び配列番号６のＶＬ、
    ｉｖ．それぞれ配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、
    ｖ．それぞれ配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ、
    ｖｉ．それぞれ配列番号１１のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ、又は
    ｖｉｉ．配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬ
    と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有し、
    ｂ．前記第２のＶＨ及び前記第２のＶＬが、
    ｉ．それぞれ配列番号７７のＶＨ及び配列番号８０のＶＬ、又は
    ｉｉ．それぞれ配列番号８４のＶＨ及び配列番号８５のＶＬ
    と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の二重特異性抗原結合構築物。
  18. 前記第１の抗原結合領域が、それぞれ配列番号１５、１６、１７、３３、３４、３５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１６又は１７に記載の二重特異性抗原結合構築物。
  19. 前記第１のＶＨが、配列番号３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含み、前記第１のＶＬが、配列番号４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の二重特異性抗原結合構築物。
  20. 前記第１の抗原結合領域が、前記第１のＶＨ及び前記第１のＶＬを含む第１のｓｃＦｖ又は第１のＦａｂを含み、前記第２の抗原結合領域が、前記第２のＶＨ及び前記第２のＶＬを含む第２のＦａｂ又は第２のｓｃＦｖを含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合構築物。
  21. 前記第１の抗原結合領域が、前記第１のｓｃＦｖを含み、前記第２の抗原結合領域が、前記第２のＦａｂを含む、請求項２０に記載の二重特異性抗原結合構築物。
  22. 第１の重鎖及び第２の重鎖を含む二重特異性抗体であり、前記第１の重鎖が、前記第１のＶＨを含み、任意選択で前記第１のＶＬを更に含み、前記第２の重鎖が、前記第２のＶＨを含み、任意選択で前記第２のＶＬを更に含み、前記第１及び第２の重鎖の各々が、１つ又は２つ以上のヘテロ二量体変異を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域を更に含む、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性構築物。
  23. （４）配列番号１１１、１１１、７１、及び２２９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
    （５）それぞれ配列番号１１７、１１５、１１７、及び１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖、並びに
    （６）それぞれ配列番号１１６、１１４、１１８、及び２３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する第２の重鎖を含む、請求項２２に記載の二重特異性抗原結合構築物。
  24. 請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項８～１３のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合構築物、請求項１４若しくは１５に記載の融合体若しくはコンジュゲート、又は請求項１６～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合構築物をコードする、単離された核酸。
  25. 請求項２４に記載の核酸を含む、ベクター。
  26. 請求項２４に記載の核酸又は請求項２５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  27. 請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項８～１３のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合構築物、請求項１４～２５のいずれか一項に記載の融合体若しくはコンジュゲート、又は請求項１６～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合構築物を産生する方法であって、前記タンパク質、前記多重特異性抗原結合構築物、前記融合体若しくはコンジュゲート、又は前記二重特異性抗原結合構築物を産生する条件下で請求項２６に記載の宿主細胞を培養することと、前記細胞又は細胞培養物からそれを回収することと、を含む、方法。
  28. 請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項７に記載の免疫コンジュゲート、請求項８～１３のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合構築物、請求項１４～２５のいずれか一項に記載の融合体若しくはコンジュゲート、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合構築物、請求項２４に記載の核酸、請求項２５に記載のベクター、又は請求項２６に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  29. ＤＬＬ３発現がんの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、治療有効量の請求項２８に記載の医薬組成物を、前記ＤＬＬ３発現がんを治療するのに十分な時間にわたって前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記がんが、肺がん（小細胞肺がんなど）、前立腺がん（神経内分泌前立腺がん、又は再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺がんなど）、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、神経内分泌膵臓がん、肝芽腫、及び肝細胞がん、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、方法。
  30. 対象におけるＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を減少させる方法であって、治療有効量の請求項２８に記載の医薬組成物を、前記ＤＬＬ３発現腫瘍細胞の量を減少させるのに十分な時間にわたって前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記対象が、肺がん（小細胞肺がんなど）、前立腺がん（神経内分泌前立腺がん、又は再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺がんなど）、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、神経内分泌膵臓がん、肝芽腫、及び肝細胞がん、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがんの治療を必要とする、方法。
  31. ＤＬＬ３発現がんを発症するリスクのある対象における非がん性状態を治療する方法であって、治療有効量の請求項２８に記載の医薬組成物を前記対象に投与して、前記非がん性状態を治療することを含み、好ましくは、前記非がん性状態が、前立腺肥大、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、又は診断された前立腺がんの非存在下で高い前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルを有する状態である、方法。
  32. 対象における神経内分泌前立腺がん又は小細胞肺がんの存在を検出する方法であって、請求項７に記載の免疫コンジュゲートを、前立腺がん又は小細胞肺がんを有することが疑われる対象に投与することと、前記免疫コンジュゲートが結合している生物学的構造を可視化し、それによって前立腺がん又は小細胞肺がんの存在を検出することと、を含む、方法。
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