TW202144418A - 唾液酸結合Ｉｇ樣凝集素結合的材料及方法 - Google Patents

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帕特里克 都南
拉庫瑪 甘尼桑
梅哈鮑 德雷比
薩耶德維 文卡塔拉瑪尼
桑賈亞 辛格
伊克巴爾 格魯瓦
卡爾拉 維哈根
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Abstract

本發明提供了結合骨髓細胞表面抗原CD33蛋白的抗原結合結構域，其包含結合CD33的抗原結合結構域、編碼它們的多核苷酸、載體、宿主細胞、其製備和使用方法。

Description

唾液酸結合Ig樣凝集素結合的材料及方法
本發明提供了結合骨髓細胞表面抗原CD33蛋白的抗原結合結構域，其包含結合CD33的抗原結合結構域、編碼它們的多核苷酸、載體、宿主細胞、其製備和使用方法。
骨髓細胞表面抗原CD33（也稱為唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素3（Siglec-3））係唾液酸結合蛋白家族的成員。CD33係I型單次跨膜蛋白，在其細胞外結構域（ECD）中具有N-末端唾液酸結合結構域，並且具有細胞內基於免疫受體酪胺酸的抑制模體（ITIM）模體（Uniprot.org）[4]。
在正常細胞中，CD33參與免疫細胞維持和細胞-細胞相互作用[5]。CD33蛋白至少在骨髓、肺、皮膚、闌尾、脾、淋巴結、和扁桃體中表現。在多種組織和器官中發現CD33 mRNA的表現，該等組織和器官包括但不限於骨髓、腦、眼睛、肺、內分泌組織、唾液腺、食道、胃、結腸、直腸、肝、膽囊、胰腺、腎臟、膀胱、男性和女性生殖組織、前列腺、乳腺、心臟、平滑肌、骨骼肌、脂肪組織、皮膚、胸腺、闌尾、脾、淋巴結、扁桃體、粒細胞、和血液（例如，PBMC、樹突狀細胞、和淋巴細胞）。參見，例如，www.proteinatlas.org/ENSG00000105383-CD33/tissue。
CD33在90%的AML患者中表現[6]，並且是AML免疫療法中探索最廣泛的表面抗原之一。已經探索了幾種靶向CD33的方法，包括抗體-藥物/抗體-毒素偶合物、嵌合抗原受體（CAR）和T細胞轉向器雙特異性抗體[7]。需要另外的CD33結合結構域，用於治療和診斷目的。
急性骨髓性白血病（AML）係一種以快速發展和進展為特徵的骨髓細胞系白血病[1]。AML係異質性疾病，其具有很大的分子變化差異同時具有不同的臨床結果。此外，AML之特徵在於AML母細胞或白血病細胞的自我更新、持續增殖並逃逸免疫系統的能力，導致疾病由次要選殖復發[2]。因此，AML歷來被認為具有最低的長期存活率之一，成人AML的總體5年存活率約為27%。存活率與年齡有很強的反比關係[3]。從歷史上看，主要的AML治療策略包括化學療法以及幹細胞移植。然而近年來，人們一直在積極努力開發用於探索關鍵表面抗原的AML免疫療法。AML細胞中高度表現的表面抗原之一係CD33。
在一方面，本揭露提供了結合CD33的分離的蛋白質、或其CD33結合片段，其中該分離的蛋白質包含： a) SEQ ID NO: 18的重鏈可變區（VH）之重鏈互補決定區（HCDR）1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 19的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 20的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 21的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 22的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 23的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 24的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 25的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 26的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 j) SEQ ID NO: 27的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 1、6和12； b) 分別是，SEQ ID NO: 2、7和13； c) 分別是，SEQ ID NO: 1、8和14； d) 分別是，SEQ ID NO: 3、9和13； e) 分別是，SEQ ID NO: 4、10和15； f) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或者 g) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係VHH。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係Fab。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係scFv。在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。
在另一方面，本揭露提供了結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VHH。
在另一方面，本揭露提供了結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含： a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； k) SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； l) SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36和45； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38和47； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39和48； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41和50； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42和51； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44和51； j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42和51； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256和259； l) 分別是，SEQ ID NO: 254、257和260；或者 m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258和261。
在另一方面，本揭露提供了結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； b) 分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； c)  分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； d) 分別是，SEQ ID NO: 253、256和259； e)  分別是，SEQ ID NO: 254、257和260；或者 f)  分別是，SEQ ID NO: 255、258和261。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 81的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 83的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 84的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 86的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 88的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； k) SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； l) SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80； j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269； l) 分別是，SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76；或者 m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係Fab。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係VHH。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係scFv。在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。
在一些實施方式中，L1包含 a) 約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c) 約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263、264、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382或382的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272,273、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397或398的VL。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含： a) SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c) SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f) SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i) SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j) SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL； m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL； n) SEQ ID NO: 291的VH和SEQ ID NO: 271的VL； o) SEQ ID NO: 292的VH和SEQ ID NO: 271的VL； p) SEQ ID NO: 293的VH和SEQ ID NO: 271的VL； q) SEQ ID NO: 294的VH和SEQ ID NO: 271的VL； r) SEQ ID NO: 295的VH和SEQ ID NO: 271的VL； s) SEQ ID NO: 296的VH和SEQ ID NO: 271的VL； t) SEQ ID NO: 297的VH和SEQ ID NO: 271的VL； u) SEQ ID NO: 298的VH和SEQ ID NO: 271的VL； v) SEQ ID NO: 299的VH和SEQ ID NO: 271的VL； w) SEQ ID NO: 300的VH和SEQ ID NO: 271的VL； x) SEQ ID NO: 301的VH和SEQ ID NO: 271的VL； y) SEQ ID NO: 302的VH和SEQ ID NO: 271的VL； z) SEQ ID NO: 303的VH和SEQ ID NO: 271的VL； aa) SEQ ID NO: 304的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ab) SEQ ID NO: 305的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ac) SEQ ID NO: 306的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ad) SEQ ID NO: 307的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ae) SEQ ID NO: 308的VH和SEQ ID NO: 271的VL； af) SEQ ID NO: 309的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ag) SEQ ID NO: 310的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ah) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 311的VL； ai) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 312的VL； aj) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 313的VL； ak) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 314的VL； al) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 315的VL； am) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 316的VL； an) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 317的VL； ao) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 318的VL； ap) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 319的VL； aq) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 320的VL； ar) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 321的VL； as) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 322的VL； at) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 323的VL； au) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 324的VL； av) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 325的VL； aw) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 326的VL； ax) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 327的VL； ay) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 328的VL； az) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 329的VL； ba) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 330的VL； bb) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 331的VL； bc) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 332的VL； bd) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 333的VL； be) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 334的VL； bf) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 335的VL； bg) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 336的VL； bh) SEQ ID NO: 337的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bi) SEQ ID NO: 338的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bj) SEQ ID NO: 339的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bk) SEQ ID NO: 340的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bl) SEQ ID NO: 341的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bm) SEQ ID NO: 342的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bn) SEQ ID NO: 343的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bo) SEQ ID NO: 344的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bp) SEQ ID NO: 345的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bq) SEQ ID NO: 346的VH和SEQ ID NO: 272的VL； br) SEQ ID NO: 347的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bs) SEQ ID NO: 348的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bt) SEQ ID NO: 349的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bu) SEQ ID NO: 350的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bv) SEQ ID NO: 351的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bw) SEQ ID NO: 352的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bx) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 353的VL； by) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 354的VL； bz) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 355的VL； ca) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 356的VL； cb) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 357的VL； cc) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 358的VL； cd) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 359的VL； ce) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 360的VL； cf) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 361的VL； cg) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 362的VL； ch) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 363的VL； ci) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 364的VL； cj) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 365的VL； ck) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 366的VL； cl) SEQ ID NO: 367的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cm) SEQ ID NO: 368的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cn) SEQ ID NO: 369的VH和SEQ ID NO: 85的VL； co) SEQ ID NO: 370的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cp) SEQ ID NO: 371的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cq) SEQ ID NO: 372的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cr) SEQ ID NO: 373的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cs) SEQ ID NO: 374的VH和SEQ ID NO: 85的VL； ct) SEQ ID NO: 375的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cu) SEQ ID NO: 376的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cv) SEQ ID NO: 377的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cw) SEQ ID NO: 378的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cx) SEQ ID NO: 379的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cy) SEQ ID NO: 380的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cz) SEQ ID NO: 381的VH和SEQ ID NO: 85的VL； da) SEQ ID NO: 382的VH和SEQ ID NO: 85的VL； db) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 383的VL； dc) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 384的VL； dd) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 385的VL； de) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 386的VL； df) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 387的VL； dg) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 388的VL； dh) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 389的VL； de) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 390的VL； df) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 391的VL； dg) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 392的VL； dh) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 393的VL； di) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 394的VL； dj) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 395的VL； dk) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 396的VL； dl) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 397的VL；或者 dm) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 398的VL。
在另一方面，本揭露提供了結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c) SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f) SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i) SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j) SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL； m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL； n) SEQ ID NO: 291的VH和SEQ ID NO: 271的VL； o) SEQ ID NO: 292的VH和SEQ ID NO: 271的VL； p) SEQ ID NO: 293的VH和SEQ ID NO: 271的VL； q) SEQ ID NO: 294的VH和SEQ ID NO: 271的VL； r) SEQ ID NO: 295的VH和SEQ ID NO: 271的VL； s) SEQ ID NO: 296的VH和SEQ ID NO: 271的VL； t) SEQ ID NO: 297的VH和SEQ ID NO: 271的VL； u) SEQ ID NO: 298的VH和SEQ ID NO: 271的VL； v) SEQ ID NO: 299的VH和SEQ ID NO: 271的VL； w) SEQ ID NO: 300的VH和SEQ ID NO: 271的VL； x) SEQ ID NO: 301的VH和SEQ ID NO: 271的VL； y) SEQ ID NO: 302的VH和SEQ ID NO: 271的VL； z) SEQ ID NO: 303的VH和SEQ ID NO: 271的VL； aa) SEQ ID NO: 304的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ab) SEQ ID NO: 305的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ac) SEQ ID NO: 306的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ad) SEQ ID NO: 307的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ae) SEQ ID NO: 308的VH和SEQ ID NO: 271的VL； af) SEQ ID NO: 309的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ag) SEQ ID NO: 310的VH和SEQ ID NO: 271的VL； ah) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 311的VL； ai) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 312的VL； aj) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 313的VL； ak) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 314的VL； al) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 315的VL； am) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 316的VL； an) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 317的VL； ao) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 318的VL； ap) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 319的VL； aq) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 320的VL； ar) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 321的VL； as) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 322的VL； at) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 323的VL； au) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 324的VL； av) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 325的VL； aw) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 326的VL； ax) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 327的VL； ay) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 328的VL； az) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 329的VL； ba) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 330的VL； bb) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 331的VL； bc) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 332的VL； bd) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 333的VL； be) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 334的VL； bf) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 335的VL； bg) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 336的VL； bh) SEQ ID NO: 337的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bi) SEQ ID NO: 338的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bj) SEQ ID NO: 339的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bk) SEQ ID NO: 340的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bl) SEQ ID NO: 341的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bm) SEQ ID NO: 342的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bn) SEQ ID NO: 343的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bo) SEQ ID NO: 344的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bp) SEQ ID NO: 345的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bq) SEQ ID NO: 346的VH和SEQ ID NO: 272的VL； br) SEQ ID NO: 347的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bs) SEQ ID NO: 348的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bt) SEQ ID NO: 349的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bu) SEQ ID NO: 350的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bv) SEQ ID NO: 351的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bw) SEQ ID NO: 352的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bx) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 353的VL； by) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 354的VL； bz) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 355的VL； ca) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 356的VL； cb) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 357的VL； cc) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 358的VL； cd) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 359的VL； ce) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 360的VL； cf) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 361的VL； cg) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 362的VL； ch) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 363的VL； ci) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 364的VL； cj) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 365的VL； ck) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 366的VL； cl) SEQ ID NO: 367的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cm) SEQ ID NO: 368的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cn) SEQ ID NO: 369的VH和SEQ ID NO: 85的VL； co) SEQ ID NO: 370的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cp) SEQ ID NO: 371的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cq) SEQ ID NO: 372的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cr) SEQ ID NO: 373的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cs) SEQ ID NO: 374的VH和SEQ ID NO: 85的VL； ct) SEQ ID NO: 375的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cu) SEQ ID NO: 376的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cv) SEQ ID NO: 377的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cw) SEQ ID NO: 378的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cx) SEQ ID NO: 379的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cy) SEQ ID NO: 380的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cz) SEQ ID NO: 381的VH和SEQ ID NO: 85的VL； da) SEQ ID NO: 382的VH和SEQ ID NO: 85的VL； db) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 383的VL； dc) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 384的VL； dd) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 385的VL； de) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 386的VL； df) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 387的VL； dg) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 388的VL； dh) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 389的VL； de) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 390的VL； df) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 391的VL； dg) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 392的VL； dh) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 393的VL； di) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 394的VL； dj) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 395的VL； dk) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 396的VL； dl) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 397的VL；或者 dm) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 398的VL。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係Fab。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係VHH。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係scFv。在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。
在一些實施方式中，L1包含 a) 約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c) 約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221 274、275或276中任一項的胺基酸序列。特別地，SEQ ID NO: 213、216、219、274、275或276的胺基酸序列。
在另一方面，本揭露提供了結合骨髓CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含： a) SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之重鏈互補決定區（HCDR）1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 i) SEQ ID NO: 196的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和92； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和93； c) 分別是，SEQ ID NO: 33、91和94； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168和169； e) 分別是，SEQ ID NO: 172、173和174； f) 分別是，SEQ ID NO: 176、177和178； g) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和180；或者 h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和93。
在另一方面，本揭露提供了如請求項32或33所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 105的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3； b) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 106的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； c) SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 107的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； d) SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 185的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； e) SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 188的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； f) SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 192的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； g) SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 196的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； h) SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 200的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者 i) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 202的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c) 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e) 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f) 分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199； i) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質係Fab。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質係VHH。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質係scFv。
在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。
在一些實施方式中，L1包含 a) 約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c) 約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。在一些實施方式中，該分離的蛋白質包含： a) SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c) SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e) SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f) SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
在另一方面，本揭露提供了結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含： a) SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c) SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e) SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f) SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
在一些實施方式中，該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係Fab。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係VHH。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係scFv。在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。在一些實施方式中，L1包含 a) 約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c) 約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。
本揭露提供了上述任何分離的蛋白質，其中該蛋白質與半衰期延長部分軛合。在一些實施方式中，該半衰期延長部分係免疫球蛋白（Ig）、該Ig的片段、Ig恒定區、該Ig恒定區的片段、Fc區、轉鐵蛋白、白蛋白、白蛋白結合結構域或聚乙二醇。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係單特異性蛋白質。在一些實施方式中，該分離的蛋白質係多特異性蛋白質。在一些實施方式中，該多特異性蛋白質係雙特異性蛋白質。在一些實施方式中，該多特異性蛋白質係三特異性蛋白質。在一些實施方式中，該多特異性蛋白質進一步包含免疫球蛋白（Ig）恒定區或其Ig恒定區的片段。在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含Fc區。在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含CH2結構域。在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含CH3結構域。在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含CH2結構域和CH3結構域。在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含鉸鏈的至少部分、CH2結構域和CH3結構域。在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域。在一些實施方式中，該分離的蛋白質與Ig恒定區的N末端或該Ig恒定區的片段軛合。在一些實施方式中，該分離的蛋白質與Ig恒定區的C末端或該Ig恒定區的片段軛合。在一些實施方式中，該分離的蛋白質經由第二連接子（L2）與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合。在一些實施方式中，L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。
在一些實施方式中，該多特異性蛋白質包含結合淋巴細胞上抗原的抗原結合結構域。在一些實施方式中，該淋巴細胞係T細胞。在一些實施方式中，該T細胞係CD8+ T細胞。在一些實施方式中，該淋巴細胞係自然殺手（NK）細胞。在一些實施方式中，該多特異性蛋白質包含結合CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C的抗原結合結構域。在一些實施方式中，該多特異性蛋白質包含結合CD3ε的抗原結合結構域。在一些實施方式中，結合CD3ε的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 141的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 142的HCDR2、SEQ ID NO: 143的HCDR3、SEQ ID NO: 144的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 145的LCDR2和SEQ ID NO: 146的LCDR3； b) SEQ ID NO: 147的VH和SEQ ID NO: 148的VL； c)  SEQ ID NO: 149的HCDR1、SEQ ID NO: 150的HCDR2、SEQ ID NO: 151的HCDR3、SEQ ID NO: 152的LCDR1、SEQ ID NO: 153的LCDR2和SEQ ID NO: 154的LCDR3；或者 d) SEQ ID NO: 155的VH和SEQ ID NO: 156的VL。
在一些實施方式中，該多特異性蛋白質包含結合TRGV9的抗原結合結構域。在一些實施方式中，結合TRGV9的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 238的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； b) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 242的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； c)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 243的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； d) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 244的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； e)  SEQ ID NO: 245的VH和SEQ ID NO: 249的VL； f)  SEQ ID NO: 246的VH和SEQ ID NO: 249的VL； g) SEQ ID NO: 247的VH和SEQ ID NO: 249的VL；或者 h) SEQ ID NO: 248的VH和SEQ ID NO: 249的VL。
在一些實施方式中，Ig恒定區或該Ig恒定區的片段係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。在一些實施方式中，Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合降低。在一些實施方式中，導致該蛋白質與FcγR的結合降低的該至少一個突變選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。在一些實施方式中，Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該蛋白質與FcγR的結合增強。在一些實施方式中，導致該蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。在一些實施方式中，FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII、或其任何組合。在一些實施方式中，Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節該蛋白質的半衰期。在一些實施方式中，調節該蛋白質的半衰期的該至少一個突變選自由以下組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中殘基根據EU索引編號。在一些實施方式中，該蛋白質包含Ig恒定區的CH3結構域中的至少一個突變。在一些實施方式中，Ig恒定區的CH3結構域中的該至少一個突變選自由以下組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基根據EU索引編號。
本揭露提供了上述任何分離的蛋白質，其中該蛋白質係嵌合抗原受體（CAR）。在一些實施方式中，該CAR包含 a)  包含上述分離的蛋白質中之任一種的細胞外結構域； b) 跨膜結構域；和 c)  視需要包含至少一個共刺激結構域的細胞內傳訊結構域。
在一些實施方式中，該CAR進一步包含CD8a鉸鏈區。在一些實施方式中， a)  該跨膜結構域包含CD8a跨膜區（CD8a-TM）多肽；並且 b) 該細胞內傳訊結構域包含共刺激結構域和初級傳訊結構域，該共刺激結構域包含TNF受體超家族成員9（CD137）組分，該初級傳訊結構域包含T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分。
在一些實施方式中， a)  該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 157的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列； b) 該跨膜結構域包含與SEQ ID NO: 162的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列；和/或 c)  該細胞內傳訊結構域包含具有與SEQ ID NO: 163的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之共刺激結構域和具有與SEQ ID NO: 164的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之初級傳訊結構域。
在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含選自由以下組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9（CD137）組分、T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分、分化簇（CD27）組分、分化簇超家族成員組分、或其任何組合。
在另一方面，本揭露提供了分離的多特異性蛋白質，該分離的多特異性蛋白質包含結合CD33的第一抗原結合結構域和結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域。在一些實施方式中，該淋巴細胞抗原係T細胞抗原。在一些實施方式中，該T細胞抗原係CD8+ T細胞抗原。在一些實施方式中，該淋巴細胞抗原係NK細胞抗原。在一些實施方式中，該淋巴細胞抗原係CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C。在某些實施方式中，該淋巴細胞抗原係CD3ε。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域和/或結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域和/或結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含Fab。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域和/或結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含VHH。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域和/或結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv。在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。在一些實施方式中，L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 1、2、3、4或5中任一項的HCDR1、SEQ ID NO: 6、7、8、9、10或11中任一項的HCDR2、和SEQ ID NO: 12、13、14、15、16或17中任一項的HCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 1、6和12； b) 分別是，SEQ ID NO: 2、7和13； c)  分別是，SEQ ID NO: 1、8和14； d) 分別是，SEQ ID NO: 3、9和13； e)  分別是，SEQ ID NO: 4、10和15； f)  分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或者 g) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34或35的HCDR1，SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、42、43或44的HCDR2，SEQ ID NO: 45、46、47、48、49、50或51的HCDR3，SEQ ID NO: 62、63、64、65、66、67或68的LCDR1，SEQ ID NO: 69、70、71、72、73或74的LCDR2，和SEQ ID NO: 75、76、77、78、79或80的LCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80； j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269； l)  分別是，SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76；或者 m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272或273的VL。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l)  SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 33、89、167、172或176的HCDR1，SEQ ID NO: 90、91、168、173或177的HCDR2，SEQ ID NO: 92、93、94、169、174、178或180的HCDR3，SEQ ID NO: 98、99、100、182、186、189、193、197或201的LCDR1，SEQ ID NO: 101、102、103、183、187、190、194或198的LCDR2，和SEQ ID NO: 104、184、191、195或199的LCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f)  分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199；或者 i)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
在一些實施方式中，結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 141的HCDR1、SEQ ID NO: 142的HCDR2、SEQ ID NO: 143的HCDR3、SEQ ID NO: 144的LCDR1、SEQ ID NO: 145的LCDR2和SEQ ID NO: 146的LCDR3； b) SEQ ID NO: 147的VH和SEQ ID NO: 148的VL； c)  SEQ ID NO: 149的HCDR1、SEQ ID NO: 150的HCDR2、SEQ ID NO: 151的HCDR3、SEQ ID NO: 152的LCDR1、SEQ ID NO: 153的LCDR2和SEQ ID NO: 154的LCDR3；或者 d) SEQ ID NO: 155的VH和SEQ ID NO: 156的VL。
在一些實施方式中，結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 238的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； b) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 242的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； c)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 243的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； d) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 244的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； e)  SEQ ID NO: 245的VH和SEQ ID NO: 249的VL； f)  SEQ ID NO: 246的VH和SEQ ID NO: 249的VL； g) SEQ ID NO: 247的VH和SEQ ID NO: 249的VL；或者 h) SEQ ID NO: 248的VH和SEQ ID NO: 249的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域與第一免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第一Ig恒定區的片段軛合，和/或結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與第二免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第二Ig恒定區的片段軛合。在某些實施方式中，多特異性蛋白質進一步包含第二連接子（L2），該第二連接子介於結合CD33的第一抗原結合結構域與第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段之間，以及介於結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段之間。在一些實施方式中，L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG1、IgG2、和IgG3或IgG4同種型。在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致多特異性蛋白質與FcγR的結合降低。在一些實施方式中，導致多特異性蛋白質與FcγR的結合降低的該至少一個突變選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致多特異性蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合增強。在一些實施方式中，導致多特異性蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。在一些實施方式中，FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII、或其任何組合。在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節多特異性蛋白質的半衰期。在一些實施方式中，調節多特異性蛋白質的半衰期的該至少一個突變選自由以下組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中殘基根據EU索引編號。在一些實施方式中，該分離的多特異性蛋白質包含第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變。在一些實施方式中，第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變選自由以下組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基根據EU索引編號。在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含以下突變： a)  該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W；或者 b) 該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V。
本揭露提供了包含上述分離的蛋白質中之任一種的免疫軛合物，該免疫軛合物與治療劑或顯像劑軛合。本揭露提供了藥物組成物，該藥物組成物包含上述分離的蛋白質中的任一種和藥學上可接受的載劑。
本揭露提供了編碼上述分離的蛋白質中之任一種的多核苷酸。本揭露還提供了載體，該載體包含編碼上述分離的蛋白質中之任一種的多核苷酸。本揭露還提供了包含載體的宿主細胞，該載體包含編碼上述分離的蛋白質中之任一種的多核苷酸。
在另一方面，本揭露提供了產生上述分離的蛋白質中的任一種之方法，該方法包括在表現該蛋白質的條件下培養宿主細胞，以及回收由該宿主細胞產生的蛋白質。在另一方面，本揭露提供了包含上述分離的多特異性蛋白質中之任一種的免疫軛合物，該免疫軛合物與治療劑或顯像劑軛合。
在另一方面，本揭露提供了產生上述分離的多特異性蛋白質中的任一種之方法，該方法包括在表現該多特異性蛋白質的條件下培養上述任何宿主細胞，以及回收由該宿主細胞產生的多特異性蛋白質。
在另一方面，本揭露提供了治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的上述分離的蛋白質中的任一種、上述分離的多特異性蛋白質中的任一種、上述免疫軛合物中的任一種、或上述藥物組成物中的任一種，持續足以治療表現CD33的癌症的時間。
在另一方面，本揭露提供了減少受試者中表現CD33的細胞的量之方法，該方法包括向該受試者投與上述分離的蛋白質中的任一種、上述分離的多特異性蛋白質中的任一種、上述免疫軛合物中的任一種、或上述藥物組成物中的任一種，持續足以減少表現CD33的細胞的量的時間。在一些實施方式中，該等表現CD33的細胞係癌細胞。在一些實施方式中，該等表現CD33的細胞不是癌細胞。
在另一方面，本揭露提供了預防受試者中表現CD33的癌症的建立之方法，該方法包括向該受試者投與上述分離的蛋白質中的任一種、上述分離的多特異性蛋白質中的任一種、上述免疫軛合物中的任一種、或上述藥物組成物中的任一種以預防該受試者中表現CD33的癌症的建立。
在另一方面，本揭露提供了治療有發展表現CD33的癌症風險的受試者中非癌病症之方法，該方法包括向該受試者向該受試者投與上述分離的蛋白質中的任一種、上述分離的多特異性蛋白質中的任一種、上述免疫軛合物中的任一種、或上述藥物組成物中的任一種以治療該非癌病症。
在上述三個方面的一些實施方式中，表現CD33的癌症係血液癌。在一些實施方式中，該血液癌係白血病、淋巴瘤、或多發性骨髓瘤。在一些實施方式中，該血液癌係急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴細胞白血病（ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓白血病（CML）或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。在一些實施方式中，將該分離的蛋白質或分離的多特異性蛋白質與第二治療劑組合投與。在一些實施方式中，該第二治療劑係手術、化學療法、或放射或其任何組合。本揭露還提供了檢測受試者中血液癌之存在的方法，該方法包括向懷疑患有該血液癌的受試者投與上述免疫軛合物中的任一種，以及視覺化該免疫軛合物所結合的生物學結構，從而檢測該血液癌的存在。
本揭露還提供了套組（kit），該套組包含上述分離的蛋白質中的任一種、上述分離的多特異性蛋白質中的任一種、上述免疫軛合物中的任一種或上述藥物組成物中的任一種。
本揭露還提供了抗遺傳型抗體，該抗遺傳型抗體與上述分離的蛋白質中的任一種結合。
本揭露還提供了嵌合抗原受體（CAR），該嵌合抗原受體包含： a) 包含結合CD33的抗原結合結構域之細胞外結構域； b) 跨膜結構域；和 c) 視需要包含至少一個共刺激結構域的細胞內傳訊結構域。
在一些實施方式中，該CAR進一步包含CD8a鉸鏈區。 a) 在一些實施方式中，該跨膜結構域包含CD8a跨膜區（CD8a-TM）多肽；並且 b) 該細胞內傳訊結構域包含共刺激結構域和初級傳訊結構域，該共刺激結構域包含TNF受體超家族成員9（CD137）組分，該初級傳訊結構域包含T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分。
在一些實施方式中， a) 該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 157的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列； b) 該跨膜結構域包含與SEQ ID NO: 162的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列；和/或 c) 該細胞內傳訊結構域包含具有與SEQ ID NO: 163的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之共刺激結構域和具有與SEQ ID NO: 164的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之初級傳訊結構域。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 1、2、3、4或5中任一項的HCDR1、SEQ ID NO: 6、7、8、9、10或11中任一項的HCDR2、和SEQ ID NO: 12、13、14、15、16或17中任一項的HCDR3。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 1、6和12； b) 分別是，SEQ ID NO: 2、7和13； c) 分別是，SEQ ID NO: 1、8和14； d) 分別是，SEQ ID NO: 3、9和13； e) 分別是，SEQ ID NO: 4、10和15； f) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或者 g) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34、35、253、254或255的HCDR1，SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、42、43、44、256、257或258的HCDR2，SEQ ID NO: 45、46、47、48、49、50、51、259、260或261的HCDR3，SEQ ID NO: 62、63、64、65、66、67、68、265或266的LCDR1，SEQ ID NO: 69、70、71、72、73、74、267或268的LCDR2，和SEQ ID NO: 75、76、77、78、79、80、269或270的LCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80； j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269； l)  分別是，SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76；或者 m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272、273的VL。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l)  SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 33、89、167、172或176的HCDR1，SEQ ID NO: 90、91、168、173或177的HCDR2，SEQ ID NO: 92、93、94、169、174、178或180的HCDR3，SEQ ID NO: 98、99、100、182、186、189、193、197或201的LCDR1，SEQ ID NO: 101、102、103、183、187、190、194或198的LCDR2，和SEQ ID NO: 104、184、191、195或199的LCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f)  分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199；或者 i)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係VHH。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。
在一些實施方式中，scFv包含介於VL與VH之間的第一連接子（L1）。
在某些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。
在一些實施方式中，包含結合CD33的抗原結合結構域之CAR的細胞外結構域進一步包含訊息多肽。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含選自由以下組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9（CD137）組分、T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分、分化簇（CD27）組分、分化簇超家族成員組分、及其組合。在一些實施方式中，該CD137組分包含SEQ ID NO: 163的胺基酸序列。在一些實施方式中，該CD3z組分包含SEQ ID NO: 164的胺基酸序列。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含SEQ ID NO: 165的胺基酸序列。在一些實施方式中，該CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO: 162的胺基酸序列。在一些實施方式中，該CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO: 157的胺基酸序列。
在一些實施方式中，CAR係多特異性蛋白質。在一些實施方式中，該多特異性蛋白質係雙特異性蛋白質。在一些實施方式中，該多特異性蛋白質係三特異性蛋白質。在一些實施方式中，該多特異性蛋白質包含結合淋巴細胞上抗原的抗原結合結構域。在一些實施方式中，該淋巴細胞係T細胞。在一些實施方式中，該T細胞係CD8+ T細胞。在一些實施方式中，該淋巴細胞係自然殺手（NK）細胞。在一些實施方式中，該多特異性蛋白質包含結合CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C的抗原結合結構域。在一些實施方式中，該多特異性蛋白質包含結合CD3ε的抗原結合結構域。在一些實施方式中，結合CD3ε的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 141的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 142的HCDR2、SEQ ID NO: 143的HCDR3、SEQ ID NO: 144的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 145的LCDR2和SEQ ID NO: 146的LCDR3； b) SEQ ID NO: 147的VH和SEQ ID NO: 148的VL； c)  SEQ ID NO: 149的HCDR1、SEQ ID NO: 150的HCDR2、SEQ ID NO: 151的HCDR3、SEQ ID NO: 152的LCDR1、SEQ ID NO: 153的LCDR2和SEQ ID NO: 154的LCDR3；或者 d) SEQ ID NO: 155的VH和SEQ ID NO: 156的VL。
在一些實施方式中，該多特異性蛋白質包含結合TRGV9的抗原結合結構域。在一些實施方式中，結合TRGV9的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 238的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； b) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 242的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； c)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 243的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； d) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 244的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； e)  SEQ ID NO: 245的VH和SEQ ID NO: 249的VL； f)  SEQ ID NO: 246的VH和SEQ ID NO: 249的VL； g) SEQ ID NO: 247的VH和SEQ ID NO: 249的VL；或者 h) SEQ ID NO: 248的VH和SEQ ID NO: 249的VL。
在另一方面，本揭露提供了表現上述CAR中之任一種的分離的淋巴細胞。在一些實施方式中，該淋巴細胞係T淋巴細胞。在一些實施方式中，該淋巴細胞係自然殺手（NK）細胞。在另一方面，本揭露提供了編碼上述CAR中之任一種的分離的多核苷酸。本揭露還提供了載體，該載體包含編碼上述CAR中之任一種的分離的多核苷酸。本揭露提供了包含該分離的多核苷酸或該載體的宿主細胞。本揭露還提供了藥物組成物，該藥物組成物包含上述淋巴細胞中的任一種和藥學上可接受的載劑。
在另一方面，本揭露提供了治療患有表現CD33的癌症的受試者之方法，該方法包括：向有需要的受試者投與治療有效量的上述淋巴細胞中的任一種，由此該淋巴細胞介導該受試者中表現CD33的癌症的殺傷。在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係血液癌。在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴細胞白血病（ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓白血病（CML）或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。
在另一方面提供了癌細胞的靶向殺傷之方法，該方法包括：將該癌細胞與上述淋巴細胞中的任一種接觸，由此該淋巴細胞誘導該癌細胞的靶向殺傷。在一些實施方式中，該癌細胞係血液癌。在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴細胞白血病（ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓白血病（CML）或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。
在另一方面提供了檢測受試者中癌症之存在的方法，該方法包括： a)  將獲得自該受試者的細胞樣本與如上述CAR中的任一種接觸，從而形成CAR-細胞複合物，以及 b) 檢測該CAR-細胞複合物，其中該CAR-細胞複合物的檢測指示該受試者中癌症的存在。
在一些實施方式中，該癌細胞係血液癌。在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴細胞白血病（ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓白血病（CML）或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。
在另一方面提供了包含上述分離的蛋白質中之任一種的免疫軛合物，該免疫軛合物與放射性藥劑軛合。在一些實施方式中，該放射性藥劑包含放射性金屬離子。在一些實施方式中，該放射性金屬離子係32 P、47 Sc、67 Cu、77 As、89 Sr、90 Y、99 Tc、105 Rh、109 Pd、111 Ag、131 I、153 Sm、159 Gd、165 Dy、166 Ho、169 Er、177 Lu、186 Re、188 Re、194 Ir、198 Au、199 Au、211 At、212 Pb、212 Bi、213 Bi、223 Ra、225 Ac、255 Fm、227 Th、62 Cu、64 Cu、67 Ga、68 Ga、86 Y、89 Zr或111 In。在某些實施方式中，該放射性金屬離子係225 Ac、111 In或89 Zr。在某些實施方式中，該放射性金屬離子係225 Ac。在一些實施方式中，該免疫軛合物的放射性金屬離子與螯合部分軛合。在一些實施方式中，該螯合部分包含具有式 (I) 之結構的大環：
Figure 02_image001
其中R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地是CHQCO2 X，其中 Q獨立地是氫、C1 -C4 烷基或(C1 -C2 烷基)苯基，並且 X獨立地是氫、苄基、C1 -C4 烷基；並且 Z係(CH2)n Y，其中 n係1-10，並且 Y係與第二點擊反應配偶體共價連接的親電子或親核部分； 可替代地，Z係氫；並且 R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地是CHQCO2 X，其中 Q獨立地是氫、C1 -C4 烷基或(C1 -C2 烷基)苯基，並且 X獨立地是氫、苄基、C1 -C4 烷基、或與第二點擊反應配偶體共價連接的親電子或親核部分； 可替代地，螯合劑包含開鏈配體。
在一些實施方式中，該螯合部分包含具有式 (II) 之結構：
Figure 02_image003
或式 (III) 之結構的大環：
Figure 02_image005
。
本揭露還提供了具有式 (IV) 之免疫軛合物，
Figure 02_image007
式 (IV) 其中該蛋白質係上述分離的蛋白質中的任一種。
本揭露還提供了具有式 (V) 之免疫軛合物，
Figure 02_image009
式 (V) 其中該蛋白質係上述分離的蛋白質中的任一種。
本揭露提供了藥物組成物，該藥物組成物包含用於治療受試者中表現CD33的癌症之手段。
本揭露提供了藥物組成物，該藥物組成物包含用於降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之手段。
本揭露提供了藥物組成物，該藥物組成物包含用於預防受試者中表現CD33的癌症的建立的手段。
本揭露提供了藥物組成物，該藥物組成物包含用於治療有發展表現CD33的癌症風險的受試者中非癌病症之手段。
本揭露提供了治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中表現CD33的癌細胞之手段。
本揭露提供了降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之方法，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中一或多種表現CD33的腫瘤細胞之手段。
本揭露提供了藥物組成物，該藥物組成物包含用於預防受試者中表現CD33的癌症的建立的手段，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中表現CD33的細胞之手段。
本揭露提供了藥物組成物，該藥物組成物包含用於治療有發展表現CD33的癌症風險的受試者中非癌病症的手段，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中表現CD33的細胞之手段。
藉由參考以下結合附圖進行的詳細說明（形成本揭露的一部分），可以更容易地理解所揭露的方法。應理解，所揭露的方法不限於本文所描述和/或顯示的具體方法，並且本文所使用的術語僅僅是出於藉由舉例來描述特別實施方式之目的並且不旨在限制所要求保護的方法。
本文引用的所有專利、公開的專利申請和出版物如同完全列出一樣藉由引用併入本文。
當呈現列表時，除非另有說明，否則應當理解，該清單的每個單獨元素以及該清單的每個組合是單獨的實施方式。例如，呈現為「A 、 B 、或 C 」的實施方式的列表應解釋為包括實施方式「A」、「B」、「C」、「A或B」、「A或C」、「B或C」或「A、B、或C」。
如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一個 /一種 （a/an）」以及「該 （the）」包括複數指示物，除非上下文另外清楚地指示。因此，例如，提到「一個細胞」包括兩個或更多個細胞的組合等。
過渡術語「包含 」、「基本上由 …… 組成 」和「由 …… 組成 」旨在暗示它們在專利白話中通常被接受的含義；即，(i) 「包含（comprising）」同義於「包括（including）」、「含有（containing）」或「以……為特徵的」係包括性的或是開放式的，並且不排除另外的未列舉的要素或方法步驟；(ii) 「由……組成」不包括未在請求項中指定的任何要素、步驟或成分；並且 (iii) 「基本上由……組成」將請求項的範圍限制為要求保護的發明的指定材料或步驟「以及不對一或多種基本和新穎特徵產生實質性影響的那些」。作為實施方式，用短語「包含」（或其等效物）描述的實施方式還提供了用「由……組成」和「基本上由……組成」獨立描述的那些。
「約 （about）」意指由熟悉該項技術者確定的特定值在可接受的誤差範圍之內，這將部分地取決於該值是怎樣測定或確定的，即，受到測量系統的限制。除非在實例中或本說明書的其他地方對特定的測定、結果或實施方式的背景下另外明確說明，「約」意指根據本領域的實踐在一個標準差之內，或在高達5%之範圍內，以較大者為準。
「激活 （activation，activated）」或「刺激 （stimulation，stimulated）」係指誘導細胞的生物學狀態的改變，導致激活標記物的表現、細胞介素產生、增殖，或介導靶細胞的細胞毒性。可以藉由初級刺激訊息激活細胞。共刺激訊息可以放大初級訊息的量級，並在初始刺激後抑制細胞死亡，導致更持久的激活狀態，從而具有更高的細胞毒性能力。「共刺激訊息 」係指與初級訊息（如TCR/CD3連接）組合導致T細胞和/或NK細胞增殖和/或關鍵分子的上調或下調的訊息。
「替代支架 」係指含有與高構象耐受性的可變結構域相關的結構核心的單鏈蛋白框架。可變結構域容忍在不損害支架完整性的情況下引入變異，因此可以對可變域進行工程化並選擇與特定抗原的結合。
「抗體依賴性細胞毒性」 、「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 」或「ADCC 」係指誘導細胞死亡的機制，該機制取決於抗體包被的靶細胞與具有裂解活性的效應細胞（如自然殺手細胞（NK）、單核細胞、巨噬細胞和嗜中性球）經由效應細胞上表現的Fc γ受體（FcγR）的相互作用。
「抗體依賴性細胞吞噬作用 」或「ADCP 」係指藉由吞噬細胞（如巨噬細胞或樹突狀細胞）藉由內化來消除抗體包被的靶細胞的機制。
「抗原 」係指能夠被能夠介導免疫反應的抗原結合結構域或T細胞受體結合的任何分子（例如，蛋白質、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸、其部分、或其組合）。示例性免疫反應包括抗體產生和免疫細胞（如T細胞、B細胞或NK細胞）的激活。抗原可由基因表現、合成或從生物樣本（如組織樣本、腫瘤樣本、細胞或具有其他生物組分、生物體、蛋白質/抗原的亞基的液體、殺傷或失活的全細胞或裂解物）中純化。
「抗原結合片段 」或「抗原結合結構域 」係指結合抗原的蛋白質的一部分。抗原結合片段可為合成的、酶促獲得的或基因工程改造的多肽，並且包括結合抗原的免疫球蛋白的部分，如VH、VL、VH和VL、Fab、Fab’、F(ab')2 、Fd和Fv片段、由一個VH結構域或一個VL結構域組成的結構域抗體（dAb）、鯊魚可變IgNAR結構域、駱駝化VH結構域、VHH結構域、由模擬抗體的CDR的胺基酸殘基組成的最小識別單元，如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和LCDR1、LCDR2和/或LCDR3、結合抗原的替代支架，和包含該抗原結合片段的多特異性蛋白質。抗原結合片段（如VH和VL）可以經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單個抗體設計，其中VH/VL結構域可以在分子內或在分子間配對（VH和VL結構域由分開的單鏈表現的那些情況下），以形成單價抗原結合結構域，如單鏈Fv（scFv）或雙抗體。抗原結合片段也可以與其他抗體、蛋白質、抗原結合片段或替代支架軛合，該等抗體、蛋白質、抗原結合片段或替代支架軛合可為單特異性或多特異性的，以對雙特異性和多特異性蛋白質進行工程化。
「抗體 」意指廣義的，並且包括免疫球蛋白分子，該等免疫球蛋白分子包括單株抗體（包括鼠、人、人源化和嵌合單株抗體），抗原結合片段，多特異性抗體（如雙特異性、三特異性、四特異性等），二聚、四聚或多聚抗體，單鏈抗體，結構域抗體以及包含所需特異性的抗原結合位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型。「全長抗體」由藉由二硫鍵相互連接的兩條重鏈（HC）和兩條輕鏈（LC）及其多聚體（例如IgM）組成。每條重鏈由重鏈可變區（VH）和重鏈恒定區（由結構域（CH1、鉸鏈、CH2和CH3）構成）構成。每條輕鏈由輕鏈可變區（VL）和輕鏈恒定區（CL）組成。VH和VL區可進一步細分為高變區（稱為互補決定區（CDR）），它們散佈有框架區（FR）。每個VH和VL從胺基到羧基末端由按以下順序排列的三個CDR和四個FR片段組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根據重鏈恒定結構域胺基酸序列，免疫球蛋白可以分為五大類（IgA、IgD、IgE、IgG和IgM）。IgA和IgG進一步細分為同種型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基於其恒定結構域的胺基酸序列，任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可以分為兩種明顯不同的類型中的一種，即κ（kappa）和λ（lambda）。
「雙特異性 」係指特異性結合兩個不同的抗原或同一抗原內的兩個不同的表位的分子（如抗體）。雙特異性分子可能與其他相關抗原（例如與來自其他物種（同源物），如人或猴，例如食蟹獼猴（Macaca cynomolgus ，cynomolgus，cyno）或黑猩猩（Pan troglodytes ）的相同抗原）具有交叉反應性，或可以結合兩個或更多個不同的抗原之間共用的表位。
「癌症 」係指一大組各種疾病，其特徵在於體內異常細胞的不受控制的生長。不受調控的細胞分裂和生長導致惡性腫瘤的形成，該等腫瘤侵襲鄰近的組織，還可能通過淋巴系統或血流轉移到身體的遠處。「癌症」或「癌組織」可包括腫瘤。
如本文所用，「嵌合抗原受體 」（CAR）定義為包含細胞外靶結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域的細胞表面受體，所有該等均為在單個蛋白質上不能天然地一起存在的組合。這包括其中細胞外結構域和細胞內傳訊結構域不能天然地一起存在於單個受體蛋白上的受體。CAR旨在主要用於淋巴細胞，如T細胞和自然殺手（NK）細胞。
「補體依賴性細胞毒性 」或」CDC 」係指誘導細胞死亡的機制，其中靶結合蛋白的Fc效應子結構域結合並激活補體組分C1q，這進而激活導致靶細胞死亡的補體級聯。補體的激活還可能導致補體組分在靶細胞表面上沈積，從而藉由結合白血球上的補體受體（例如，CR3）促進CDC。
「互補決定區 」（CDR）係結合抗原的抗體區。VH中有三個CDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3）並且VL中有三個CDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3）。可以使用各種描述定義CDR，如Kabat（Wu等人 (1970) J Exp Med [實驗醫學雜誌] 132: 211-50）；Kabat等人., Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學上感興趣的蛋白質序列], 第5版編輯. Public Health Service [公共衛生署], National Institutes of Health [國立衛生研究院], 貝塞斯達, 馬里蘭州, 1991）、Chothia（Chothia等人 (1987) J Mol Biol [分子生物學雜誌] 196: 901-17）、IMGT（Lefranc等人 (2003) Dev Comp Immunol [發展與比較免疫學] 27: 55-77）、AbM（Martin和Thornton J Bmol Biol [分子生物學雜誌] 263: 800-15, 1996）和Contact，其基於複雜晶體結構的分析（MacCallum, R. M., Martin, A. C. R.和Thornton, J. T. 「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography [抗體-抗原相互作用：接觸分析和結合位點圖形]」 J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 262: 732-745）。描述了各種描述和可變區編號之間的對應關係（參見例如 Lefranc等人 (2003) Dev Comp Immunol [發展與比較免疫學] 27: 55-77；Honegger和Pluckthun, J Mol Biol [分子生物學雜誌] (2001) 309:657-70；國際免疫遺傳學（IMGT）數據庫；網路資源，www.imgt.org）。可用程式如UCL Business PLC的abYsis可用於描繪CDR。如本文所用，術語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」和「LCDR3」包括藉由supra、Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact描述的方法中的任一種定義的CDR，除非說明書中另有明確說明。具有SEQ ID NO. 1至17、28至51、62至80、89至94、98至104、141至146、149至154、167至169、172至174、176至178、180、182至184、186、187、189至191、193至195、197至199、201、236至244、253至261和265至270序列的CDR根據Kabat定義。具有SEQ ID NO. 399至434序列的CDR根據AbM定義。具有SEQ ID NO. 435至470序列的CDR根據Chothia定義。具有SEQ ID NO. 471至506序列的CDR根據IMGT定義。具有SEQ ID NO. 507至542序列的CDR根據Contact定義。
「降低 （Decrease）」、「更低 （lower）」、「減少 （lessen、reduce或abate）」一般係指與對照或媒介物所介導的反應相比，測試分子介導反應減少（即下游效應）的能力。示例性反應係T細胞擴增、T細胞激活或T細胞介導的腫瘤細胞殺傷或蛋白質與其抗原或受體的結合、與Fcγ的結合增強或Fc效應子功能增強（如ADCC、CDC和/或ADCP增強）。降低可為測試分子與對照（或媒介物）之間的測量響應的統計學上的顯著差異，或測量響應的降低，如降低約1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或30倍或更多，如500、600、700、800、900或1000倍或更多（包括其間並且大於1的所有整數和小數點，例如1.5、1.6、1.7、1.8等）。
「分化 」係指降低細胞的效力或增殖或使細胞進入發育更受限的狀態的方法。
「編碼 （Encode或encoding）」係指多核苷酸（例如基因、cDNA或mRNA）中特定核苷酸序列的固有特性，以作為生物學過程中用於合成其他聚合物和大分子的模板，該模板具有定義的核苷酸序列（例如，rRNA、tRNA和mRNA）或定義的胺基酸序列以及由此產生的生物學特性。因此，如果對應於該基因的mRNA的轉錄和翻譯在細胞或其他生物系統中產生了蛋白質，則該基因、cDNA或RNA編碼蛋白質。編碼鏈（其核苷酸序列與mRNA序列相同）和非編碼鏈（作為基因或cDNA的轉錄模板）均可稱為編碼該基因或cDNA的蛋白質或其它產物。
「增強 （enhance）」、「促進 （promote）」、「增加 （increase）」、「擴增 （expand）」或「改善 （improve）」一般係指與對照或媒介物所介導的反應相比，測試分子介導更大的反應（即下游效應）的能力。示例性反應係T細胞擴增、T細胞激活或T細胞介導的腫瘤細胞殺傷或蛋白質與其抗原或受體的結合、與Fcγ的結合增強或Fc效應子功能增強（如ADCC、CDC和/或ADCP增強）。增強可為測試分子與對照（或媒介物）之間的測量響應的統計學上的顯著差異，或測量響應的增加，如增加約1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或30倍或更多，如500、600、700、800、900或1000倍或更多（包括其間並且大於1的所有整數和小數點，例如1.5、1.6、1.7、1.8等）。
「擴增 」係指細胞分裂和細胞死亡的結果。
「表現 （express、expression）」係指在細胞或體外發生的熟知的轉錄和翻譯。因此，表現產物（例如，蛋白質）由細胞或體外表現，並且可為細胞內、細胞外或跨膜蛋白。
「表現載體 」係指可在生物系統中或在重構的生物系統中利用以指導由表現載體中存在的多核苷酸序列編碼的多肽的翻譯的載體。
「dAb 」或「dAb 片段 」係指由VH結構域組成的抗體片段（Ward等人, Nature [自然] 341:544 546 (1989)）。
「Fab 」或「Fab 片段 」係指由VH、CH1、VL和CL結構域組成的抗體片段。
「F(ab')2 」或「F(ab')2 片段 」係指含有藉由二硫橋在鉸鏈區連接在一起的兩個Fab片段的抗體片段。
「Fd 」或「Fd 片段 」係指由VH和CH1結構域組成的抗體片段。
「Fv 」或「Fv 片段 」係指由來自抗體的單臂的VH和VL結構域組成的抗體片段。
「全長抗體 」由藉由二硫鍵相互連接的兩條重鏈（HC）和兩條輕鏈（LC）及其多聚體（例如IgM）組成。每條重鏈由重鏈可變結構域（VH）和重鏈恒定結構域組成，該重鏈恒定結構域由亞結構域CH1、鉸鏈、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變結構域（VL）和輕鏈恒定結構域（CL）組成。VH和VL可進一步細分為高變區（稱為互補決定區（CDR）），它們散佈有框架區（FR）。每個VH和VL從胺基到羧基末端由按以下順序排列的三個CDR和四個FR片段組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
「遺傳修飾 」係指將「外源」（即，外在或細胞外）基因、DNA或RNA序列引入宿主細胞，使得該宿主細胞表現所引入的基因或序列以產生所需物質（典型地由所引入的基因或序列編碼的蛋白質或酶）。引入的基因或序列也可稱為「選殖」或「外源」基因或序列，可包括與編碼嵌合抗原受體的多核苷酸可操作地連接的調節或控制序列，如起始、停止、啟動子、訊息、分泌或細胞的遺傳機器使用的其它序列。基因或序列可以包括無功能的序列或沒有已知功能的序列。接受和表現引入的DNA或RNA的宿主細胞已經被「基因工程改造」。引入宿主細胞的DNA或RNA可以來自任何來源，包括與該宿主細胞同屬或同物種的細胞，或來自不同屬或不同物種的細胞。
「異源 」係指不會以彼此間的相同關係天然地發現的兩個或更多個多核苷酸或兩個或更多個多肽。
「異源多核苷酸 」係指編碼如本文所述兩個或更多個新抗原的非天然存在的多核苷酸。
「異源多肽 」係指包含如本文所述兩個或更多個新抗原多肽的非天然存在的多肽。
「宿主細胞 」係指含有異源核酸的任何細胞。示例性異源核酸係載體（例如，表現載體）。
「人抗體 」係指經優化以在投與於人受試者時具有最小的免疫響應的抗體。人抗體的可變區源自人免疫球蛋白序列。如果人抗體含有恒定區或恒定區的一部分，則該恒定區也源自人免疫球蛋白序列。如果人抗體的可變區是從使用人種系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系統獲得，則人抗體包含「源自」人源序列的重鏈和輕鏈可變區。此類示例性系統是在噬菌體上展示的人免疫球蛋白基因文庫，以及攜帶人免疫球蛋白基因座的轉基因非人動物，如小鼠或大鼠。由於獲得人抗體所使用的系統與人免疫球蛋白基因座之間的差異、體細胞突變的引入或有意將取代引入框架或CDR或兩者中，因此當與在人中表現的免疫球蛋白相比時，「人抗體」典型地含有胺基酸差異。典型地，「人抗體」的胺基酸序列與人種系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一些情況下，「人抗體」可以含有源自人框架序列分析的共有框架序列，例如如以下中所述之：Knappik等人 (2000) J Mol Biol [分子生物學雜誌] 296: 57-86），或併入噬菌體上顯示的人免疫球蛋白基因文庫的合成HCDR3，例如描述於以下：Shi等人 (2010) J Mol Biol [分子生物學雜誌] 397: 385-96和國際專利公開號WO 2009/085462。至少一個CDR源自非人物種的抗體不包括在「人抗體」的定義中。
「人源化抗體 」係指至少一個CDR源自非人物種並且至少一個框架源自人免疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體可以在框架中包括取代，使得框架可以不是表現的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白種系基因序列的精確拷貝。
「與 …… 組合 」意指將兩種或更多種治療劑同時作為單一試劑或以任何順序連續作為單一試劑在混合物中一起投與於受試者。
「細胞內傳訊結構域 」或「細胞質傳訊結構域 」係指分子的細胞內部分。蛋白質的功能性部分藉由以下起作用：藉由在細胞內傳遞資訊以藉由產生第二信使或藉由響應於此類信使而用作效應子，經由定義的傳訊途徑調控細胞活性。細胞內傳訊結構域產生促進含有CAR的細胞（例如，CAR-T細胞）的免疫效應子功能的信號。
「分離的 」係指已經基本從產生分子的系統（如重組細胞）的其他組分中分離和/或純化的分子的同質群體（如合成的多核苷酸或多肽），以及經過至少一個純化或分離步驟的蛋白質。「分離的」係指基本上不含其他細胞物質和/或化學物質的分子，並且涵蓋分離至較高純度（如至80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的純度）的分子。
「調節 」係指與對照或載體介導的反應相比，測試分子介導反應增強或降低（即，下游效應）的能力增強或減弱。
「單株抗體 」係指除可能的熟知的改變（如從抗體重鏈上去除C-末端離胺酸）或翻譯後修飾（如胺基酸異構化或去醯胺、甲硫胺酸氧化或天冬醯胺或麩醯胺酸去醯胺）外，從基本同質的抗體分子群體中獲得的抗體，即包含群體的單個抗體相同的。單株抗體典型地結合一個抗原表位。雙特異性單株抗體結合兩個不同的抗原表位。單株抗體可以在抗體群體內具有異質糖基化。單株抗體可為單特異性或多特異性（如雙特異性）、單價、二價或多價的。
「多特異性 」係指特異性結合兩個或更多個不同的抗原或同一抗原內的兩個或更多個不同的表位的分子（如抗體）。多特異性分子可能與其他相關抗原（例如與來自其他物種（同源物），如人或猴，例如食蟹獼猴（Macaca fascicularis ，cynomolgus，cyno）或黑猩猩（Pan troglodytes ）的相同抗原）具有交叉反應性，或可以結合兩個或更多個不同的抗原之間共用的表位。
「自然殺手細胞 」和「NK 細胞 」在本文中可互換並同義使用。NK細胞係指具有CD16+ CD56+ 和/或CD57+ TCR- 表型的分化的淋巴細胞。NK細胞之特徵在於藉由激活特定的細胞溶解酶結合並殺死不能表現「自身」MHC/HLA抗原的細胞的能力，殺傷腫瘤細胞或表現NK活化受體配體的其他患病細胞的能力，以及釋放稱為細胞介素的刺激或抑制免疫反應的蛋白質分子的能力。
當參考核酸或胺基酸使用時，「有效地連接 」和類似短語係指分別處於彼此的功能關係中的核酸序列或胺基酸序列的有效連接。例如，有效地連接的啟動子、增強子元件、開讀框、5'和3'UTR以及終止子序列導致核酸分子（例如，RNA）的精確產生，並且在一些情況下導致多肽的產生（即，開讀框的表現）。有效地連接的肽係指肽的功能結構域之間處於彼此適當的距離，以賦予每個結構域的預期功能的肽。
「藥物組合 」係指一起或分開投與的兩種或更多種活性成分的組合。
「藥物組成物 」係指由活性成分和藥學上可接受的載劑組合所產生的組成物。
「藥學上可接受的載劑 」或「賦形劑」係指藥物組成物中除活性成分以外的、對受試者無毒的成分。示例性藥學上可接受的載劑係緩衝液、穩定劑或防腐劑。
「多核苷酸 」或「核酸 」係指包含藉由糖-磷酸主鏈或其他等效共價化學共價連接的核苷酸鏈的合成分子。cDNA係多核苷酸的典型實例。多核苷酸可為DNA或RNA分子。
疾病或障礙的「預防 （Prevent，preventing，prevention，或prophylaxis）」意指預防受試者發生障礙。
「增殖 」係指細胞分裂的增加，係細胞的對稱或非對稱分裂。
「啟動子 」係指引發轉錄所需的最小序列。啟動子還可以包括分別增強或抑制轉錄的增強子或阻遏元件。
「蛋白質 」或「多肽 」在本文中可互換地使用，係指包含一或多個多肽的分子，每個多肽由藉由肽鍵連接的至少兩個胺基酸殘基組成。蛋白質可為單體，或者可為兩個或更多個亞基的蛋白質複合物，該等亞基係相同或不同的。少於50個胺基酸的小多肽可稱為「肽」。蛋白質可為異源融合蛋白、糖蛋白、或經翻譯後修飾（如磷酸化、乙醯化、豆蔻醯化、棕櫚醯化、糖基化、氧化、甲醯化、醯胺化、瓜胺酸化、聚麩胺醯化、ADP-核糖基化、聚乙二醇化或生物素化）所修飾的蛋白質。蛋白質可以重組表現。
「重組 」係指藉由重組方式製備、表現、產生或分離的多核苷酸、多肽、載體、病毒和其他大分子。
「調控元件 」係指控制核酸序列的表現的一些方面的任何順式或反式作用的遺傳元件。
「復發性 」係指在之前用治療劑治療後經過一段時間的改善後，疾病或疾病的症狀和體征的復發。
「難治性 」係指對治療沒有響應的疾病。難治性疾病可以在治療前或治療開始時對治療產生抗性，或者難治性疾病可以在治療過程中變得具有抗性。
「單鏈 Fv 」或「scFv 」係指包含含有輕鏈可變區（VL）的至少一個抗體片段和含有重鏈可變區（VH）的至少一個抗體片段的融合蛋白，其中該VL和VH經由多肽連接子連續連接，並且能夠表現為單鏈多肽。除非另有說明，否則如本文所用，scFv可具有任一種順序的VL和VH可變區，例如，相對於多肽的N末端和C末端，scFv可以包含VL-連接子-VH或可以包含VH-連接子-VL。
「特異性地結合 （specifically binds、specifically binding）」、「特異性結合 （specific binding）」或「結合 」係指蛋白質的分子與抗原或抗原內的表位結合的親和力大於對其他抗原的結合。典型地，蛋白質的分子以約1 x 10-7 M或更小，例如約5 x 10-8 M或更小、約1 x 10-8 M或更小、約1 x 10-9 M或更小、約1 x 10-10 M或更小、或約1 x 10-11 M或更小、或約1 x 10-12 M或更小的平衡解離常數（KD ），典型地，比其與非特異性抗原（例如，BSA，酪蛋白）結合的KD 小至少一百倍的KD 與抗原或抗原內的表位結合。
「受試者 」包括任何人或非人動物。「非人動物」包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、奶牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。術語「受試者」和「患者」在本文可互換地使用。
「T 細胞 」和「T 淋巴細胞 」在本文中可互換並同義使用。T細胞包括胸腺細胞、初始T淋巴細胞、記憶T細胞、未成熟T淋巴細胞、成熟T淋巴細胞、靜息T淋巴細胞或激活的T淋巴細胞。T細胞可為T輔助（Th）細胞，例如T輔助1（Th1）或T輔助2（Th2）細胞。該T細胞可為輔助T細胞（HTL；CD4+ T細胞）CD4+ T細胞、細胞毒性T細胞（CTL；CD8+ T細胞）、腫瘤浸潤性細胞毒性T細胞（TIL；CD8+ T細胞）、CD4+ CD8+ T細胞、或T細胞的任何其他亞組。還包括「NKT細胞」，其係指T細胞的特殊群體，該等NKT細胞表現半恒定型αβ T細胞受體，還表現典型的與NK細胞相關的各種分子標記，如NK1.1。NKT細胞包括NK1.1+ 和NK1.1- 、以及CD4+ 、CD4- 、CD8+ 和CD8- 細胞。NKT細胞上的TCR係獨特的，它能識別MHC I樣分子CD Id表示的糖脂抗原。NKT細胞由於能夠產生促進炎症或免疫耐受的細胞介素，所以可能具有保護或有害作用。還包括「γ-δ T細胞（γδ T細胞）」，其係指在T細胞表面具有不同TCR的T細胞的小的亞組的特殊群體，並且不像大多數T細胞（其中TCR由指定的α-和β-TCR鏈的兩條糖蛋白鏈組成），γδ T細胞中的TCR由γ鏈和δ鏈組成。γδ T細胞可以在免疫監視和免疫調節中起作用，並且發現該等γδ T細胞係IL-17的重要來源，並誘導強烈的CD8+ 細胞毒性T細胞響應。還包括「調節性T細胞」或「Treg」，其係指抑制異常或過度免疫反應並在免疫耐受中起作用的T細胞。Tregs係典型的轉錄因子Foxp3-陽性CD4+ T細胞，並且還可以包括轉錄因子Foxp3-陰性調節性T細胞（產生IL-10的CD4+ T細胞）。
在本文可互換使用的「治療有效量 」或「有效量 」係指以必要的劑量和在必要的時間段內有效實現所需治療結果的量。治療有效量可以根據如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重以及治療劑或治療劑的組合在個體中引起所需反應的能力等因素而變化。有效的治療劑或治療劑的組合的實例指標包括，例如，改善患者的健康、減少腫瘤負荷、阻止或減緩腫瘤的生長、和/或癌細胞未轉移到身體的其他位置。
「轉導 」係指使用病毒載體將外源核酸引入細胞中。
疾病或障礙（如癌症）的「治療 （Treat，treating或treatment）」係指完成以下一項或多項：減輕障礙的嚴重程度和/或減少持續時間、抑制所治療障礙的症狀特徵的惡化、限制或預防曾患該障礙的受試者中該障礙的復發、或限制或預防曾有該障礙的症狀的受試者中症狀的復發。
「腫瘤細胞 」或「癌細胞 」係指體內、離體或組織培養中具有自發或誘導表型改變的癌細胞、癌前期細胞或轉化細胞。該等改變不需要涉及新遺傳物質的攝取。儘管轉化可能是由於轉化病毒感染並引入新的基因組核酸、攝取外源核酸所致，但是轉化也可能自發地或者暴露於致癌物後發生，從而使內源性的基因發生突變。轉化/癌症以以下為例：形態變化、細胞永生化、生長控制異常、病灶形成、增殖、惡性腫瘤、腫瘤特異性標誌物水平的調控、侵襲、腫瘤在合適的動物宿主如裸鼠等體外、體內和離體生長。
「變體 」、「突變 」或「改變 」係指藉由一或多種修飾（例如一或多種取代、插入或缺失）而不同於參考多肽或參考多核苷酸的多肽或多核苷酸。
除非另有明確說明，否則貫穿本說明書的抗體恒定區中的胺基酸殘基編號是根據EU索引，如描述於Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學目的蛋白質序列]，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health [公共衛生服務，美國國立衛生研究院]，貝塞斯達，馬里蘭州，(1991) 中。
Ig恒定區中的突變稱為如下：L351Y_F405A_Y407V係指一個免疫球蛋白恒定區中的L351Y、F405A和Y407V突變。L351Y_F405A_Y407V/T394W係指第一Ig恒定區中的L351Y、F405A和Y407V突變、和第二Ig恒定區中的T394W突變，其存在於一個多聚蛋白中。物質的組成物 結合 CD33 的抗原結合結構域
本揭露提供了結合CD33的抗原結合結構域、包含結合CD33的抗原結合結構域之單特異性和多特異性蛋白質、包含結合CD33的抗原結合結構域之嵌合抗原受體（CAR）、編碼前述的多核苷酸、載體、宿主細胞以及製備和使用前述的方法。本文鑒定的結合CD33的抗原結合結構域在改善的熱穩定性方面表現出改善的特性。
本揭露提供了包含結合CD33的抗原結合結構域之分離的蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18的重鏈可變區（VH）之重鏈互補決定區（HCDR）1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 19的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 20的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 21的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 22的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 23的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 24的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 25的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 26的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 27的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
用於鑒定CDR（例如，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3）的方法和技術在本領域係已知的，並且該等方法和技術可用於鑒定本文揭露的重鏈可變區內的任一個和/或輕鏈可變區中的任一個內的CDR。可用於鑒定CDR邊界的慣例包括但不限於Kabat定義、Chothia定義、AbM定義、IMGT定義和Contact定義。不希望受理論的束縛，Kabat定義基於序列可變性，Chothia定義基於結構環區的位置，並且AbM定義是Chothia和Kabat方法之間的折中。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了分離的蛋白質，分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3：分別是，SEQ ID NO: 1、6和12；分別是，SEQ ID NO: 2、7和13；分別是，SEQ ID NO: 1、8和14；分別是，SEQ ID NO: 3、9和13；分別是，SEQ ID NO: 4、10和15；分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了包含結合骨髓細胞表面抗原CD33的抗原結合結構域之分離的蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； k) SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； l) SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
表4a、4b、4c、4d、4e和4f中描述了示例性HCDR序列。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272或273的VL。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 82的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 85的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 87的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 271的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 272的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272或273的VL。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36和45； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38和47； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39和48； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41和50； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42和51； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44和51；或者 j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42和51； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256和259； l) 分別是，SEQ ID NO; 254、257和260；或者 m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258和261。
在某些實施方式中，該分離的蛋白質分別包含SEQ ID NO: 29、37和46的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，該分離的蛋白質分別包含SEQ ID NO: 32、40和49的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，該分離的蛋白質分別包含SEQ ID NO: 34、43和51的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，該分離的蛋白質分別包含SEQ ID NO: 253、256和259的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，該分離的蛋白質分別包含SEQ ID NO: 254、257和260的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，該分離的蛋白質分別包含SEQ ID NO: 255、258和361的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272或273的VL。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 82的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 85的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 87的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 271的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 272的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272或273的VL。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了結合骨髓細胞表面抗原CD33的抗原結合結構域，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之重鏈互補決定區（HCDR）1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 81的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 83的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 84的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 86的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 88的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
表4a、4b、4c、4d、4e和4f中描述了示例性HCDR和LCDR序列。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了結合骨髓細胞表面抗原CD33的抗原結合結構域，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80； j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269； l) 分別是，SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76； m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含： a) SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c) SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f) SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i) SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j) SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了包含結合骨髓細胞表面抗原CD33的抗原結合結構域之分離的蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含 a) SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c) SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f) SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i) SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j) SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些實施方式中，該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。
在其他實施方式中，該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。
在其他實施方式中，該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。
在其他實施方式中，該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。
在其他實施方式中，該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。
在其他實施方式中，該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了包含結合骨髓細胞表面抗原CD33的抗原結合結構域之分離的蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了包含結合骨髓細胞表面抗原CD33的抗原結合結構域之分離的蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含以下：分別是，SEQ ID NO: 89、90和92的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 33、91和94的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 167、168和169的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 172、173和174的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 176、177和178的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和180的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了包含結合骨髓細胞表面抗原CD33的抗原結合結構域之分離的蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含 a) SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 105的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3；b) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 106的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；c) SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 107的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；d) SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 185的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；e) SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 188的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；f) SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 192的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；g) SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 196的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；h) SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和 SEQ ID NO: 200的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 i) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 202的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了包含結合骨髓細胞表面抗原CD33的抗原結合結構域之分離的蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3 a) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c) 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e) 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f) 分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199； i) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了包含結合骨髓細胞表面抗原CD33的抗原結合結構域之分離的蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL；SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL；SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL；SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL；SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL；SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL；SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL；SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。
本揭露還提供了包含結合骨髓細胞表面抗原CD33的抗原結合結構域之分離的蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL；SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL；SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL；SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL；SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL；SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL；SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL；SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係scFv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係(scFv)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fv。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fab。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係F(ab’)2 。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域係Fd。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係dAb。在一些實施方式中，CD33抗原結合結構域係VHH。結合 CD33 的 scFv
本文鑒定的結合CD33的VH和VL結構域中的任何一種可以以VH-連接子-VL或VL-連接子-VH方向工程化到scFv形式。本文鑒定的VH和VL結構域中的任何一種還可用於產生sc(Fv)2 結構，如VH-連接子-VL-連接子-VL-連接子-VH、VH-連接子-VL-連接子-VH-連接子-VL。VH-連接子-VH-連接子-VL-連接子-VL。VL-連接子-VH-連接子-VH-連接子-VL。VL-連接子-VH-連接子-VL-連接子-VH或VL-連接子-VL-連接子-VH-連接子-VH。
可以將本文鑒定的VH和VL結構域併入scFv形式中，並且可以使用已知方法評估所得scFv與CD33的結合和熱穩定性。可以使用熟悉該項技術者己知的ProteOn XPR36、Biacore 3000或KinExA儀器、ELISA或競爭結合測定法來評估結合。可以使用純的scFvs或大腸桿菌上清液或含有表現的scFv的裂解的細胞來評估結合。如果在不同條件（例如，莫耳滲透壓濃度、pH）下測量，測量的測試scFv對CD33的親和力可能變化。因此，親和力和其他結合參數（例如，KD 、Kon 、Koff ）的測量典型地用標準條件和標準化緩衝液進行。可以藉由將測試scFv在升高的溫度下（如在50°C、55°C或60°C下）加熱一段時間（如5分鐘（min）、10 min、15 min、20 min、25 min或30 min）並測量測試scFv與CD33的結合來評估熱穩定性。與未加熱的scFv樣本相比，保留與CD33相當的結合的scFv被稱為具有熱穩定性。
在重組表現系統中，連接子係肽連接子並且可以包括任何天然存在的胺基酸。可以包括在連接子中的示例性胺基酸係Gly、Ser Pro、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、His和The。連接子的長度應足以連接VH和VL，以使它們相對於彼此形成正確的構象，從而保留所需的活性，如與CD33結合。
連接子可以為約5-50個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為約10-40個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為約10-35個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為約10-30個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為約10-25個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為約10-20個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為約15-20個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為6個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為7個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為8個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為9個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為10個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為11個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為12個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為13個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為14個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為15個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為16個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為17個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為18個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為19個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為20個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為21個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為22個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為23個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為24個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為25個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為26個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為27個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為28個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為29個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為30個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為31個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為32個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為33個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為34個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為35個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為36個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為37個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為38個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為39個胺基酸長。在一些實施方式中，該連接子為40個胺基酸長。可以使用的示例性連接子係富含Gly的連接子、含有Gly和Ser的連接子、含有Gly和Ala的連接子、含有Ala和Ser的連接子、和其他柔性連接子。
其他連接子序列可以包括免疫球蛋白鉸鏈區域、源自任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈同種型的CL或CH1的部分。可替代地，各種非蛋白質聚合物（包括聚乙二醇（PEG）、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物）可用作連接子。可以使用的示例性連接子示於表1中。另外的連接子在例如國際專利公開案號WO2019/060695中描述，該專利公開藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）。
在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含VL、L1和VH（VL-L1-VH）。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 109的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 110的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 111的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 112的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 113的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 114的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 115的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 116的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 117的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 118的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 119的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 120的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 121的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 122的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 123的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 124的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 125的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 126的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 127的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 128的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 129的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 130的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 131的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 132的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 133的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 134的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 135的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 136的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 137的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 138的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 139的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 140的胺基酸序列。 [表 1 ].
連接子名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO:
連接子1 GGSEGKSSGSGSESKSTGGS 108
連接子2 GGGSGGGS 109
連接子3 GGGSGGGSGGGS 110
連接子4 GGGSGGGSGGGSGGGS 111
連接子5 GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS 112
連接子6 GGGGSGGGGSGGGGS 113
連接子7 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 114
連接子8 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 115
連接子9 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 116
連接子10 IRPRAIGGSKPRVA 117
連接子11 GKGGSGKGGSGKGGS 118
連接子12 GGKGSGGKGSGGKGS 119
連接子13 GGGKSGGGKSGGGKS 120
連接子14 GKGKSGKGKSGKGKS 121
連接子15 GGGKSGGKGSGKGGS 122
連接子16 GKPGSGKPGSGKPGS 123
連接子17 GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS 124
連接子18 GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS 125
連接子19 STAGDTHLGGEDFD 126
連接子20 GEGGSGEGGSGEGGS 127
連接子21 GGEGSGGEGSGGEGS 128
連接子22 GEGESGEGESGEGES 129
連接子23 GGGESGGEGSGEGGS 130
連接子24 GEGESGEGESGEGESGEGES 131
連接子25 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 132
連接子26 PRGASKSGSASQTGSAPGS 133
連接子27 GTAAAGAGAAGGAAAGAAG 134
連接子28 GTSGSSGSGSGGSGSGGGG 135
連接子29 GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS 136
連接子30 GSGS 137
連接子31 APAPAPAPAP 138
連接子32 APAPAPAPAPAPAPAPAPAP 139
連接子33 AEAAAKEAAAKEAAAAKEAAAAKEAAAAKAAA 140
在某些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列（例如，由SEQ ID NO: 108的胺基酸序列組成）。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 18的重鏈可變區（VH）之重鏈互補決定區（HCDR）1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 19的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 20的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 21的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 22的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 23的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 24的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 25的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 26的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 27的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。
在一些實施方式中，scFv包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：分別是，SEQ ID NO: 1、6和12；分別是，SEQ ID NO: 2、7和13；分別是，SEQ ID NO: 1、8和14；分別是，SEQ ID NO: 3、9和13；分別是，SEQ ID NO: 4、10和15；分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。
在一些實施方式中，scFv包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； k) SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； l) SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
表4a、4b、4c、4d、4e和4f中描述了示例性HCDR序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH。
在某些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 53的VH。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 56的VH。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 59的VH。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 262的VH。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 263的VH。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 264的VH。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272、或273的VL。
在某些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 82的VL。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 85的VL。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 87的VL。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 271的VL。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 272的VL。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272或273的VL。在一些實施方式中，scFv包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36和45； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38和47； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39和48； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41和50； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42和51； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44和51； j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42和51； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256和259； l) 分別是，SEQ ID NO; 254、257和260；或者 m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258和261。
在某些實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 29、37和46的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 32、40和49的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 34、43和51的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 253、256和259的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 254、257和260的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 255、258和261的HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 81的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 83的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 84的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 86的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 88的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
表4a、4b、4c、4d、4e和4f中描述了示例性HCDR和LCDR序列。
在一些實施方式中，scFv包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80；或者 j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269； l) 分別是，SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76； m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270。
在某些實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，scFv分別包含SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，scFv包含： a) SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c) SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f) SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i) SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j) SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。在某些此類實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列之連接子序列。因此，在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 53的VH、SEQ ID NO: 108的第一連接子（L1）和SEQ ID: 82的VL（VH-L1-VL）。在其他實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 82的VL、SEQ ID NO: 108的第一連接子和SEQ ID: 53的VL（VL-L1-VH）。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。在某些此類實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列之連接子序列。因此，在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 56的VH、SEQ ID NO: 108的第一連接子（L1）和SEQ ID: 85的VL（VH-L1-VL）。在其他實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 56的VL、SEQ ID NO: 108的第一連接子和SEQ ID: 85的VL（VL-L1-VH）。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。在某些此類實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列之連接子序列。因此，在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 59的VH、SEQ ID NO: 108的第一連接子（L1）和SEQ ID: 87的VL（VH-L1-VL）。在其他實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 59的VL、SEQ ID NO: 108的第一連接子和SEQ ID: 87的VL（VL-L1-VH）。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。在某些此類實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列之連接子序列。因此，在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 262的VH、SEQ ID NO: 108的第一連接子（L1）和SEQ ID: 271的VL（VH-L1-VL）。在其他實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 271的VL、SEQ ID NO: 108的第一連接子和SEQ ID: 262的VL（VL-L1-VH）。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。在某些此類實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列之連接子序列。因此，在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 263的VH、SEQ ID NO: 108的第一連接子（L1）和SEQ ID: 272的VL（VH-L1-VL）。在其他實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 272的VL、SEQ ID NO: 108的第一連接子和SEQ ID: 263的VL（VL-L1-VH）。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。在某些此類實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列之連接子序列。因此，在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 264的VH、SEQ ID NO: 108的第一連接子（L1）和SEQ ID: 273的VL（VH-L1-VL）。在其他實施方式中，scFv從N末端至C末端包含SEQ ID NO: 273的VL、SEQ ID NO: 108的第一連接子和SEQ ID: 264的VL（VL-L1-VH）。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，scFv包含以下：分別是，SEQ ID NO: 89、90和92的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 33、91和94的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 167、168和169的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 172、173和174的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 176、177和178的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和180的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 105的輕鏈可變區（VL）之LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 106的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 107的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 185的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 188的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 192的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 196的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 200的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 202的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，scFv包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c) 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e) 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f) 分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199； i) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL；SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL；SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL；SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL；SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL；SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL；SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL；SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 203的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 204的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 205的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 206的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 207的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 208的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 209的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 210的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 211的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 212的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 213的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 214的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 215的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 216的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 217的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 218的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 219的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 220的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 221的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列。
在某些實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 213的胺基酸序列。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 216的胺基酸序列。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 219的胺基酸序列。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列。
在其他實施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列。結合 CD33 的其他抗原結合結構域
本文鑒定的結合CD33的VH和VL結構域中的任何一種還可以工程化到Fab、F(ab’)2 、Fd或Fv形式，並且可以使用本文所述測定法來評估它們與CD33的結合和熱穩定性。在某些實施方式中，本文鑒定的VH和VL結構域工程化到Fab。
在一些實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 18的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 19的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 20的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 21的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 22的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 23的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 24的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 25的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 26的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 27的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。
在一些實施方式中，Fab包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：分別是，SEQ ID NO: 1、6和12；分別是，SEQ ID NO: 2、7和13；分別是，SEQ ID NO: 1、8和14；分別是，SEQ ID NO: 3、9和13；分別是，SEQ ID NO: 4、10和15；分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。
在一些實施方式中，Fab包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； k) SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； l) SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
表4a、4b、4c、4d、4e和4f中描述了示例性HCDR序列。
在一些實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH。在一些實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272、或273的VL。在一些實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、或88、271、272或273的VL。
在一些實施方式中，Fab包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36和45； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38和47； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39和48； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41和50； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42和51； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44和51；或者 j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42和51；或者 l) 分別是，SEQ ID NO: 253、256和259； m) 分別是，SEQ ID NO: 254、257和260； n) 分別是，SEQ ID NO: 255、258和261。
在一些實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 81的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 83的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 84的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 86的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 88的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
表4a、4b、4c、4d、4e和4f中描述了示例性HCDR和LCDR序列。
在某些實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，Fab包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80； j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269； l) 分別是，SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76；或者 m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270。
在一些實施方式中，Fab包含： a) SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c) SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f) SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i) SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j) SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，Fab包含以下：分別是，SEQ ID NO: 89、90和92的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 33、91和94的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 167、168和169的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 172、173和174的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 176、177和178的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和180的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 105的輕鏈可變區（VL）之LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 106的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 107的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 185的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 188的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 192的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 196的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 200的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 202的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，Fab包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c) 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e) 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f) 分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199； i) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。
在一些實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。在一些實施方式中，Fab包含SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL；SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL；SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL；SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL；SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL；SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL；SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL；SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
在其他實施方式中，本文鑒定的VH和VL結構域工程化到F(ab’)2 。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含SEQ ID NO: 18的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 19的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 20的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 21的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 22的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 23的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 24的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 25的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 26的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 27的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：分別是，SEQ ID NO: 1、6和12；分別是，SEQ ID NO: 2、7和13；分別是，SEQ ID NO: 1、8和14；分別是，SEQ ID NO: 3、9和13；分別是，SEQ ID NO: 4、10和15；分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； k) SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； l) SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH。在一些實施方式中，F(ab’)2 包含SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272、或273的VL。在一些實施方式中，F(ab’)2 包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272或273的VL。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36和45； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38和47； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39和48； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41和50； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42和51； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44和51； j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42和51； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256和259； l) 分別是，SEQ ID NO 254、257和260； m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258和261。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 81的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 83的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 84的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 86的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 88的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80； j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269； l) 分別是，SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76；或者 m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含： a) SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c) SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f) SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i) SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j) SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含以下：分別是，SEQ ID NO: 89、90和92的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 33、91和94的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 167、168和169的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 172、173和174的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 176、177和178的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和180的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 105的輕鏈可變區（VL）之LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 106的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 107的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 185的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 188的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 192的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 196的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 200的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 202的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c) 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e) 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f) 分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199； i) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。
在一些實施方式中，F(ab’)2 包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或196的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。在一些實施方式中，F(ab’)2 包含SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL；SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL；SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL；SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL；SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL；SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL；SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL；SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
在某些實施方式中，本文鑒定的VH和VL結構域工程化到Fv。
在一些實施方式中，該Fv包含SEQ ID NO: 18的重鏈可變區（VH）之重鏈互補決定區（HCDR）1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 19的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 20的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 21的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 22的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 23的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 24的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 25的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 26的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 27的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。
在一些實施方式中，Fv包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：分別是，SEQ ID NO: 1、6和12；分別是，SEQ ID NO: 2、7和13；分別是，SEQ ID NO: 1、8和14；分別是，SEQ ID NO: 3、9和13；分別是，SEQ ID NO: 4、10和15；分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。
在一些實施方式中，Fv包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； k) SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； l) SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH。在一些實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272、或273的VL。在一些實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、r 61、262、263或264的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272、273的VL。
在一些實施方式中，Fv包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36和45； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38和47； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39和48； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41和50； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42和51； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44和51； j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42和51； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256和259； l) 分別是，SEQ ID NO 254、257和260； m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258和261。
在一些實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 81的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 83的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 84的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 86的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 88的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，Fv包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80；或者 j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80。
在一些實施方式中，Fv包含： a) SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c) SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f) SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i) SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j) SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，Fv包含以下：分別是SEQ ID NO: 89、90和92的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 33、91和94的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 167、168和169的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 172、173和174的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 176、177和178的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和180的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，Fv包含SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 105的輕鏈可變區（VL）之LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 106的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 107的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 185的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 188的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 192的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 196的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 200的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 202的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些實施方式中，本文鑒定的VH和VL結構域工程化到Fd。
在一些實施方式中，該Fd包含SEQ ID NO: 18的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 19的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 20的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 21的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 22的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 23的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 24的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 25的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 26的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 27的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。
在一些實施方式中，Fd包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：分別是，SEQ ID NO: 1、6和12；分別是，SEQ ID NO: 2、7和13；分別是，SEQ ID NO: 1、8和14；分別是，SEQ ID NO: 3、9和13；分別是，SEQ ID NO: 4、10和15；分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。
在一些實施方式中，Fd包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； k) SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； l) SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在其他實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH。
在一些實施方式中，Fd包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a) 分別是，SEQ ID NO: 28、36和45； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； c) 分別是，SEQ ID NO: 30、38和47； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39和48； e) 分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； f) 分別是，SEQ ID NO: 33、41和50； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42和51； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； i) 分別是，SEQ ID NO: 34、44和51； j) 分別是，SEQ ID NO: 35、42和51； k) 分別是，SEQ ID NO: 253、256和259； l) 分別是，SEQ ID NO 254、257和260； m) 分別是，SEQ ID NO: 255、258和261。
在一些實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，Fd包含： a) SEQ ID NO: 52的VH； b) SEQ ID NO: 53的VH； c) SEQ ID NO: 54的VH； d) SEQ ID NO: 55的VH； e) SEQ ID NO: 56的VH； f) SEQ ID NO: 57的VH； g) SEQ ID NO: 58的VH； h) SEQ ID NO: 59的VH； i) SEQ ID NO: 60的VH； j) SEQ ID NO: 61的VH； k) SEQ ID NO: 262的VH； l) SEQ ID NO: 263的VH；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH。
在一些實施方式中，Fd包含SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，Fd包含以下：分別是，SEQ ID NO: 89、90和92的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 33、91和94的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 167、168和169的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 172、173和174的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 176、177和178的HCDR1、HCDR2和HCDR3；分別是，SEQ ID NO: 89、90和180的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或分別是，SEQ ID NO: 89、90和93的HCDR1、HCDR2和HCDR3。同源抗原結合結構域和具有保留取代的抗原結合結構域
結合CD33的抗原結合結構域之變體在本揭露之範圍內。例如，在結合CD33的抗原結合結構域中，變體可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個胺基酸取代，只要它們與親本抗原結合結構域相比時保留或具有改善的功能特性。例如，在一些實施方式中，當與相同測定中的親本抗原結合結構域相比時，結合CD33的變體抗原結合結構域具有改善的熱穩定性。在一些實施方式中，當與親本結合結構域相比時，結合CD33的變體抗原結合結構域具有降低的翻譯後修飾可能性。由於模體（如NG、DG或DP）的取代，可能發生翻譯後修飾的可能性降低。在一些實施方式中，與本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之序列同一性可以為約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些實施方式中，變異是在框架區中。在一些實施方式中，藉由保留取代產生變體。
例如，結合CD33的抗原結合結構域可以包含VH中的殘基位置P41、I49、M70和A88（殘基根據SEQ ID NO: 5的hu11B6_VH編號）處和VL中的S80、L82、A88和Y91（殘基根據SEQ ID NO: 2的hu11B6_VL編號）處的取代。可以在任何指示的位置上進行保留取代，並在本文所述之測定法中測試所得的結合CD33的變體抗原結合結構域的所需特徵。
還提供了包含VH的結合CD33的抗原結合結構域，該VH與以下具有至少80%同一性： SEQ ID NO: 18的VH； SEQ ID NO: 19的VH； SEQ ID NO: 20的VH； SEQ ID NO: 21的VH； SEQ ID NO: 22的VH； SEQ ID NO: 23的VH； SEQ ID NO: 24的VH； SEQ ID NO: 25的VH； SEQ ID NO: 26的VH； SEQ ID NO: 27的VH； SEQ ID NO: 52的VH； SEQ ID NO: 53的VH； SEQ ID NO: 54的VH； SEQ ID NO: 55的VH； SEQ ID NO: 56的VH； SEQ ID NO: 57的VH； SEQ ID NO: 58的VH； SEQ ID NO: 59的VH； SEQ ID NO: 60的VH； SEQ ID NO: 61的VH； SEQ ID NO: 95的VH； SEQ ID NO: 96的VH； SEQ ID NO: 97的VH； SEQ ID NO: 170的VH； SEQ ID NO: 171的VH； SEQ ID NO: 175的VH； SEQ ID NO: 179的VH； SEQ ID NO: 181的VH； SEQ ID NO: 96的VH； SEQ ID NO: 262的VH； SEQ ID NO: 263的VH；或者 SEQ ID NO: 264的VH。
在某些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH，該VH與SEQ ID NO: 53的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH，該VH與SEQ ID NO: 56的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH，該VH與SEQ ID NO: 59的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH，該VH與SEQ ID NO: 262的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH，該VH與SEQ ID NO: 263的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH，該VH與SEQ ID NO: 264的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在一些實施方式中，同一性為85%。在一些實施方式中，同一性為90%。在一些實施方式中，同一性為91%。在一些實施方式中，同一性為91%。在一些實施方式中，同一性為92%。在一些實施方式中，同一性為93%。在一些實施方式中，同一性為94%。在一些實施方式中，同一性為94%。在一些實施方式中，同一性為95%。在一些實施方式中，同一性為96%。在一些實施方式中，同一性為97%。在一些實施方式中，同一性為98%。在一些實施方式中，同一性為99%。
還提供了包含VH和VL的結合CD33的抗原結合結構域，該VH和VL與以下具有至少80%同一性 SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL； SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL； SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL與SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH和VL，該VL與SEQ ID NO: 82的VL具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 82的VL和VH，該VH與SEQ ID NO: 53的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH和SEQ ID NO: 85的VL，該VH與SEQ ID NO: 56的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH和VL，該VL與SEQ ID NO: 85的VL具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 85的VL和VH，該VH與SEQ ID NO: 56的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH和SEQ ID NO: 87的VL，該VH與SEQ ID NO: 59的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH和VL，該VL與SEQ ID NO: 87的VL具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 87的VL和VH，該VH與SEQ ID NO: 59的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH和SEQ ID NO: 271的VL，該VH與SEQ ID NO: 262的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH和VL，該VL與SEQ ID NO: 271的VL具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 271的VL和VH，該VH與SEQ ID NO: 262的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH和SEQ ID NO: 272的VL，該VH與SEQ ID NO: 263的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH和VL，該VL與SEQ ID NO: 272的VL具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 272的VL和VH，該VH與SEQ ID NO: 263的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH和SEQ ID NO: 273的VL，該VH與SEQ ID NO: 264的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH和VL，該VL與SEQ ID NO: 273的VL具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。例如，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 273的VL和VH，該VH與SEQ ID NO: 264的VH具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
本發明人已經發現，VH和/或VL結構域中的位置可以發生突變以去除易於翻譯後修飾的模體。翻譯後修飾可以增加與CD33結合的抗原結合結構域之，例如，去醯胺、異構化和/或片段化的可能性。該等突變還可以增加與CD33結合的抗原結合結構域之熱穩定性。
易於翻譯後修飾的序列模體的實例，例如，NG、DG和DP。
因此，在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH和/或VL結構域，該VH和/或VL結構域包含一或多個NG模體中的一個或兩個胺基酸取代。在一些實施方式中，NG模體的N殘基被取代。在其他實施方式中，NG模體的G殘基被取代。在一些實施方式中，NG模體的N和G殘基被取代。在某些此類實施方式中，一或多個NG模體中的一個或兩個胺基酸取代係VH和/或VL結構域中的唯一取代。
在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH和/或VL結構域，該VH和/或VL結構域包含一或多個DG模體中的一個或兩個胺基酸取代。在一些實施方式中，DG模體的D殘基被取代。在其他實施方式中，DG模體的G殘基被取代。在一些實施方式中，DG模體的D和G殘基被取代。在某些此類實施方式中，一或多個DG模體中的一個或兩個胺基酸取代係VH和/或VL結構域中的唯一取代。
在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含VH和/或VL結構域，該VH和/或VL結構域包含一或多個DP模體中的一個或兩個胺基酸取代。在一些實施方式中，DP模體的D殘基被取代。在其他實施方式中，DP模體的P殘基被取代。在一些實施方式中，DP模體的D和P殘基被取代。在某些此類實施方式中，一或多個DP模體中的一個或兩個胺基酸取代係VH和/或VL結構域中的唯一取代。
與本發明之CD33結合的示例性抗原結合結構域（例如，scFv）係包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL的蛋白質。本發明人已經發現，使DG模體在SEQ ID NO: 262的VH中突變可以減少翻譯後修飾的可能性，同時維持CD33結合特性。該等突變還可以增加熱穩定性。
與CD33結合的抗原結合結構域（具有SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL）可以發生突變以去除DG模體。SEQ ID NO: 262的VH在位置54-55（使用根據EU索引編號的殘基）處具有DG模體。
因此，在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 262的VH，其中位置54處的D殘基被取代（例如，D54G、D54A、D54Y、D54P、D54N、D54S、D54R、D54L、D54V、D54T、D54F或D54W）。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 262的VH，其中位置55處的G殘基被取代（例如，G55V、G55P、G55R、G55A、G55L、G55Q、G55T或G55H）。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 262的VH，其中位置54處的D殘基被取代（例如，D54G、D54A、D54Y、D54P、D54N、D54S、D54R、D54L、D54V、D54T、D54F或D54W），以及位置55處的G殘基被取代（例如，G55V、G55P、G55R、G55A、G55L、G55Q、G55T或G55H）。在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如,scFv）包含SEQ ID NO: 291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309或310的VH。
在某些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含：SEQ ID NO: 291的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 292的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 293的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 294的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 295的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 296的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 297的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 298的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 299的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 300的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 301的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 302的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 303的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 304的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 305的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 306的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 307的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 308的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 309的VH和SEQ ID NO: 271的VL；或者 SEQ ID NO: 310的VH和SEQ ID NO: 271的VL。
與本發明之CD33結合的另一個示例性抗原結合結構域（例如，scFv）係包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL的蛋白質。本發明人已經發現，使一或多個NG模體在SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL中突變可以減少翻譯後修飾的可能性，同時維持CD33結合特性。該等突變還可以增加熱穩定性。
與CD33結合的抗原結合結構域（具有SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL）可以發生突變以去除NG模體。SEQ ID NO: 263的VH在位置99-100（使用根據EU索引編號的殘基）處具有NG模體，以及SEQ ID NO: 272的VL在位置97-98（使用根據EU索引編號的殘基）處具有NG模體。
因此，在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 263的VH，其中位置99處的N殘基被取代（例如，N99V、N99S、N99E、N99H、N99A、N99G、N99K、N99T、N99F、N99V、N99R、N99L、N99H或N99I）。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 263的VH，其中位置100處的G殘基被取代（例如，G100S、G100A）。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 263的VH，其中位置99處的N殘基被取代（例如，N99V、N99S、N99E、N99H、N99A、N99G、N99K、N99T、N99F、N99V、N99R、N99L、N99H或N99I），以及位置100處的G殘基被取代（例如，G100S、G100A）。在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351或352的VH。
在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 272的VL，其中位置97處的N殘基被取代（例如，N97V、N97R、N97P、N97T、N97G、N97Q、N97S、N97A、N97L、N97Y、N97E、N97F、N97D、N97I或N97H）。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 272的VL，其中位置98處的G殘基被取代（例如，G98V、G98P、G98R、G98D、G98E、G98W、G98Y、G98A、G98N、G98K、G98L）。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 272的VL，其中位置97處的N殘基被取代，以及位置98處的G殘基被取代。在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 311、312 313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335或336的VL。
在某些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含： SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 311的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 312的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 313的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 314的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 315的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 316的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 317的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 318的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 319的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 320的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 321的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 322的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 323的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 324的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 325的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 326的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 327的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 328的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 329的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 330的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 331的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 332的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 333的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 334的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 335的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 336的VL； SEQ ID NO: 337的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 338的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 339的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 340的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 341的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 342的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 343的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 344的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 345的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 346的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 347的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 348的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 349的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 350的VH和SEQ ID NO: 272的VL； SEQ ID NO: 351的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 SEQ ID NO: 352的VH和SEQ ID NO: 272的VL。
與本發明之CD33結合的另一個示例性抗原結合結構域（例如，scFv）係包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL的蛋白質。本發明人已經發現，使一或多個NG模體在SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL中突變可以減少翻譯後修飾的可能性，同時維持CD33結合特性。該等突變還可以增加熱穩定性。
與CD33結合的抗原結合結構域（具有SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL）可以發生突變以去除NG模體。SEQ ID NO: 56的VH在位置99-100（使用根據EU索引編號的殘基）處具有NG模體，以及SEQ ID NO: 85的VL在位置97-98（使用根據EU索引編號的殘基）處具有NG模體。
因此，在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 56的VH，其中位置99處的N殘基被取代（例如，N99R、N99P、N99G、N99V、N99L、N99D、N99E、N99A、N99Q或N99T）。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 56的VH，其中位置100處的G殘基被取代（例如，G100S、G100A、G100L、G100P、G100T或G100Q）。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 56的VH，其中位置99處的N殘基被取代（例如，N99R、N99P、N99G、N99V、N99L、N99D、N99E、N99A、N99Q或N99T），以及位置100處的G殘基被取代（例如，G100S、G100A、G100L、G100P、G100T或G100Q）。在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如,scFv）包含SEQ ID NO: 367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381或382的VH。
在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 85的VL，其中位置97處的N殘基被取代（例如，N97G、N97D、N97P、N97K、N97E、N97A、N97R、N97Q、N97I、N97V、N97H、N97K、N97W或N97S）。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 85的VL，其中位置98處的G殘基被取代。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 85的VL，其中位置97處的N殘基被取代（例如，N97G、N97D、N97P、N97K、N97E、N97A、N97R、N97Q、N97I、N97V、N97H、N97K、N97W或N97S），以及位置98處的G殘基被取代。在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如,scFv）包含SEQ ID NO: 353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365或366的VL。
在某些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含： SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 353的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 354的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 355的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 356的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 357的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 358的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 359的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 360的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 361的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 362的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 363的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 364的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 365的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 366的VL； SEQ ID NO: 367的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 368的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 369的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 370的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 371的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 372的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 373的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 374的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 375的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 376的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 377的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 378的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 379的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 380的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 381的VH和SEQ ID NO: 85的VL；或者 SEQ ID NO: 382的VH和SEQ ID NO: 85的VL。
與本發明之CD33結合的另一個示例性抗原結合結構域（例如，scFv）係包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL的蛋白質。本發明人已經發現，使NG模體在SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL中突變可以減少翻譯後修飾的可能性，同時維持CD33結合特性。該等突變還可以增加熱穩定性。
與CD33結合的抗原結合結構域（具有SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL）可以突變為NG模體。SEQ ID NO: 82的VL在位置97-98（使用根據EU索引編號的殘基）處具有NG模體。
在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 82的VL，其中位置97處的N殘基被取代（例如，N97S、N97Q、N97V、N97G、N97W、N97T、N97I、N97E、N97A、N97R或N97L）。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 272的VL，其中位置98處的G殘基被取代（例如，G98V、G98A、G98P、G98L或G98T）。在其他實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 82的VL，其中位置97處的N殘基被取代（例如，N97S、N97Q、N97V、N97G、N97W、N97T、N97I、N97E、N97A、N97R或N97L），以及位置98處的G殘基被取代（例如，G98V、G98A、G98P、G98L或G98T）。在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如,scFv）包含SEQ ID NO: 383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397或398的VL。
在某些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含： SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 383的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 384的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 385的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 386的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 387的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 388的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 389的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 390的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 391的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 392的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 393的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 394的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 395的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 396的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 397的VL；或者 SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 398的VL。
在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382或382的VH結構域。
在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397或398的VL結構域。
在一些實施方式中，與CD33結合的抗原結合結構域（例如，scFv）包含SEQ ID NO: 291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382或382的VH結構域，和SEQ ID NO: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397或398的VL結構域。
在一些實施方式中，同一性為85%。在一些實施方式中，同一性為90%。在一些實施方式中，同一性為91%。在一些實施方式中，同一性為91%。在一些實施方式中，同一性為92%。在一些實施方式中，同一性為93%。在一些實施方式中，同一性為94%。在一些實施方式中，同一性為94%。在一些實施方式中，同一性為95%。在一些實施方式中，同一性為96%。在一些實施方式中，同一性為97%。在一些實施方式中，同一性為98%。在一些實施方式中，同一性為99%。
兩個序列之間的同一性百分比是序列共用的相同位置數量的函數（即，%同一性 = 相同位置數量/位置總數 × 100），將缺口數量和每個缺口的長度考慮在內，需要引入它們以便最佳比對兩個序列。
兩個胺基酸序列之間的同一性百分比可以使用已併入ALIGN程式 (2.0版）中的E. Meyers和W. Miller（Comput. Appl. Biosci.[電腦應用生物科學], 4:11-17 (1988)）的演算法，利用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12、空位罰分4來確定。此外，兩個胺基酸序列之間的同一性百分比可以使用已經併入GCG套裝軟體中的GAP程式 (可從www_gcg_com獲得）中的Needleman和Wunsch, J. Mol, Biol.[分子生物學雜誌] 48:444-453, (1970)演算法，利用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來確定。
在一些實施方式中，結合CD33的變體抗原結合結構域包含CDR區的任一個中的一個或兩個保留取代，同時保留結合CD33的親本抗原結合片段的所需功能特性。
「保守修飾」係指未顯著影響或改變含有胺基酸修飾的抗體的結合特徵的胺基酸修飾。保守修飾包括胺基酸取代、添加和缺失。保守胺基酸取代係胺基酸被具有類似側鏈的胺基酸殘基所替代的那些。明確定義了具有類似側鏈的胺基酸殘基的家族，並且包括具有以下側鏈的胺基酸：酸性側鏈（例如，天冬胺酸、麩胺酸）、鹼性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、非極性側鏈（例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、不帶電荷的極性側鏈（例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸）、芳香族側鏈（例如，苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸、酪胺酸）、脂肪族側鏈（例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸）、醯胺（例如，天冬醯胺、麩醯胺酸）、β-分支側鏈（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）和含硫側鏈（半胱胺酸、甲硫胺酸）。此外，多肽中的任何天然殘基還可以用丙胺酸取代，如先前丙胺酸掃描誘變中所述（MacLennan等人，(1988)Acta Physiol Scand Suppl [斯堪的生理學學報增刊] 643:55-67；Sasaki等人, (1988)Adv Biophys [生物物理學進展] 35:1-24)。可以藉由已知方法，例如藉由PCR誘變（美國專利案號4,683,195）進行本發明之抗體的胺基酸取代。可替代地，可以例如使用編碼11個胺基酸（Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp）的隨機（NNK）或非隨機密碼子（例如DVK密碼子）產生變體文庫。可以使用本文所述之測定法來測試所得變體的特徵。產生結合 CD33 的抗原結合片段的方法
可以使用各種技術來產生本揭露提供的結合CD33的抗原結合結構域。例如，可以使用Kohler和Milstein的融合瘤方法來鑒定結合CD33的VH/VL對。在融合瘤方法中，用人和/或食蟹獼猴CD33對小鼠或其他宿主動物（如倉鼠、大鼠或雞）進行免疫，隨後使用標準方法融合來自免疫動物的脾細胞和骨髓瘤細胞以形成融合瘤細胞。可以針對含有結合CD33的抗原結合結構域、具有所需特性的抗體的產生篩選源自單一永生化融合瘤細胞的菌落，該等特性如結合的特異性、交叉反應性或其的缺乏、對抗原的親和力以及任何所需功能。
藉由免疫非人動物產生的結合CD33的抗原結合結構域可以被人源化。包括人受體框架的選擇的示例性人源化技術包括CDR移植（美國專利案號5,225,539）、SDR移植（美國專利案號6,818,749）、表面重修（Padlan, (1991)Mol Immunol [分子免疫學] 28:489-499）、特異性決定殘基表面重修（美國專利公開案號2010/0261620）、人框架適應（美國專利案號8,748,356）或超人源化（美國專利案號7,709,226）。在該等方法中，將親本抗體的CDR或CDR殘基的子集轉移到人框架，該等人框架可以基於其與親本框架的總體同源性、基於CDR長度的相似性、或規範結構同一性或其組合來選擇。
人源化抗原結合結構域可藉由如國際專利公開案號WO 1990/007861和WO 1992/22653中所述之技術，藉由結合改變的框架支持殘基以保持結合親和力（回復突變），或藉由在任何CDR上引入變異以例如改善抗原結合結構域的親和力來進一步優化以提高其對所需抗原的選擇性或親和力。
在其基因組中攜帶人免疫球蛋白（Ig）基因座的轉基因動物（如小鼠、大鼠或雞）可用於產生結合CD33的抗原結合片段，並且描述於例如美國專利案號6,150,584、國際專利公開案號WO 1999/45962、國際專利公開案號WO 2002/066630、WO 2002/43478、WO 2002/043478和WO 1990/04036中。可以破壞或缺失此類動物中的內源性免疫球蛋白基因座，並且可以使用同源或非同源重組、使用轉染色體或使用小基因將至少一個完整或部分人免疫球蛋白基因座插入動物的基因組中。如再生元公司（Regeneron）（www_regeneron_com）、Harbour Antibodies公司（www_harbourantibodies_com）、開放單選殖技術公司（Open Monoclonal Technology, Inc.）（OMT）（www_omtinc_net）、KyMab公司（www_kymab_com）、Trianni公司（www.trianni_com）和Ablexis公司（www_ablexis_com）可以參與使用如上所述之技術來提供針對選擇抗原的人抗體。
結合CD33的抗原結合結構域可以選自噬菌體展示文庫，其中將噬菌體工程化以表現人免疫球蛋白或其部分，如Fab、單鏈抗體（scFv）、或未配對或配對的抗體可變區。可以例如從噬菌體展示文庫中分離結合CD33的抗原結合結構域，該噬菌體展示文庫將抗體重鏈和輕鏈可變區表現為具有噬菌體pIX外殼蛋白的融合蛋白，如Shi等人, (2010)J Mol Biol [分子生物學雜誌] 397:385-96和國際專利公開案號WO 09/085462中所述。可以針對與人和/或食蟹獼猴CD33結合的噬菌體來篩選文庫，並且可以進一步表徵獲得的陽性選殖，將Fab從選殖裂解物中分離，並轉化為scFv或抗原結合片段的其他構型。
可以使用任何合適的技術，如重組蛋白生產來進行免疫性抗原的製備以及本揭露之抗原結合結構域的表現和產生。免疫性抗原可以以純化的蛋白或包括全細胞或者細胞或組織提取物的蛋白混合物的形式投與至動物，或者可以在動物體內由編碼所述抗原或其部分的核酸來重新形成抗原。與半衰期延長部分軛合
本揭露之結合CD33的抗原結合結構域可以與半衰期延長部分軛合。示例性半衰期延長部分係白蛋白、白蛋白變體、白蛋白-結合蛋白和/或結構域、轉鐵蛋白及其片段和類似物、免疫球蛋白（Ig）或其片段，如Fc區。上述半衰期延長部分的胺基酸序列係已知的。Ig或其片段包括所有同種型，即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE。
可以與本揭露之結合CD33的抗原結合結構域軛合的另外的半衰期延長部分包括用於所需特性的聚乙二醇（PEG）分子（如PEG5000或PEG20,000）、不同鏈長度的脂肪酸和脂肪酸酯（例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯（arachidate）、山崳酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等）、聚離胺酸、辛烷、糖類（葡聚糖、纖維素、寡糖或多糖）。該等部分可與本揭露之結合CD33的抗原結合結構域直接融合，並且可藉由標準的選殖和表現技術產生。可替代地，熟知的化學偶合方法可用於將該等部分附接至重組產生的本揭露之結合CD33的抗原結合結構域。
例如，可以藉由將半胱胺酸殘基併入本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之C末端，或將半胱胺酸工程化到背離CD33結合位點的殘基位置，並使用熟知的方法將peg基團附接到半胱胺酸上，從而將peg基部分與本揭露之結合CD33的抗原結合結構域軛合。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合片段與半衰期延長部分軛合。
在一些實施方式中，該半衰期延長部分係免疫球蛋白（Ig）、該Ig的片段、Ig恒定區、該Ig恒定區的片段、Fc區、轉鐵蛋白、白蛋白、白蛋白結合結構域或聚乙二醇。在一些實施方式中，半衰期延長部分係Ig恒定區。
在一些實施方式中，半衰期延長部分係Ig。
在一些實施方式中，半衰期延長部分係Ig的片段。
在一些實施方式中，半衰期延長部分係Ig恒定區。
在一些實施方式中，半衰期延長部分係Ig恒定區的片段。
在一些實施方式中，半衰期延長部分係Fc區。
在一些實施方式中，半衰期延長部分係白蛋白。
在一些實施方式中，半衰期延長部分係白蛋白結合結構域。
在一些實施方式中，半衰期延長部分係轉鐵蛋白。
在一些實施方式中，半衰期延長部分係聚乙二醇。
可以利用已知的體內模型評估與半衰期延長部分軛合的結合CD33的抗原結合結構域之藥物動力學特性。與免疫球蛋白（ Ig ）恒定區或該 Ig 恒定區的片段軛合
本揭露之結合CD33的抗原結合結構域可以與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合以賦予抗體樣特性，該抗體樣特性包括Fc效應子功能C1q結合、補體依賴性細胞毒性（CDC）、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）、吞噬作用或細胞表面受體（例如，B細胞受體；BCR）的下調。Ig恒定區或該Ig恒定區的片段還作用為如本文所討論的半衰期延長部分。可以使用標準方法將本揭露之結合CD33的抗原結合結構域工程化到常規的全長抗體。如本文所述，可以將包含結合CD33的抗原結合結構域之全長抗體進一步工程化。
免疫球蛋白重鏈恒定區由亞結構域CH1、鉸鏈、CH2和CH3組成。CH1結構域跨越重鏈上的殘基A118-V215、CH2結構域殘基A231-K340和CH3結構域殘基G341-K447，殘基根據EU索引編號。在一些情況下，G341被稱為CH2結構域殘基。「鉸鏈」通常定義為包括E216且在人IgG1的P230處終止。Ig Fc區包含Ig恒定區的至少CH2和CH3結構域，並且因此包含Ig重鏈恒定區的至少從約A231至K447的區。
本發明還提供了結合CD33的抗原結合結構域與免疫球蛋白（Ig）恒定區或該Ig恒定區的片段軛合。在某些此類實施方式中，Ig恒定區或該Ig恒定區的片段源自IgG1。
在一些實施方式中，Ig恒定區係重鏈恒定區。在某些此類實施方式中，Ig恒定區係IgG1重鏈恒定區。
在一些實施方式中，Ig恒定區係輕鏈恒定區。
在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含Fc區。在某些此類實施方式中，Ig恒定區包含IgG1 Fc區。在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含CH2結構域。在某些此類實施方式中，Ig恒定區包含IgG1 CH2結構域。
在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含CH3結構域。在某些此類實施方式中，Ig恒定區包含IgG1 CH3結構域。
在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含CH2結構域和CH3結構域。在某些此類實施方式中，Ig恒定區包含IgG1 CH2和CH3結構域。
在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含鉸鏈的至少部分、CH2結構域和CH3結構域。在某些此類實施方式中，鉸鏈的至少部分、CH2結構域和CH3結構域來自IgG1。鉸鏈的部分係指Ig鉸鏈的一或多個胺基酸殘基。
在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域。在某些此類實施方式中，鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域來自IgG1。
在某些實施方式中，Ig恒定區的片段包含SEQ ID NO: 278的胺基酸序列。
重鏈的位置220處的半胱胺酸殘基可以發生突變，以預防在恒定區和輕鏈之間形成半胱胺酸橋。因此，在某些實施方式中，Ig恒定區包含位置220處不是半胱胺酸的殘基。在一個實施方式中，Ig恒定區包含位置220處的絲胺酸。
在某些實施方式中，Ig恒定區的片段包含SEQ ID NO: 279的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域與Ig恒定區的N末端或該Ig恒定區的片段軛合。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域與Ig恒定區的C末端或該Ig恒定區的片段軛合。
在一些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域經由第二連接子（L2）與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合。
在一些實施方式中，L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140的胺基酸序列。
可以使用幾種已知的測定法評估與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之功能。可以使用本文所述之方法評估與CD33的結合。由Ig恒定結構域或該Ig恒定區的片段（如Fc區）賦予的改變的特性可在Fc受體結合測定中使用該等受體的可溶性形式（如FcγRI、FcγRII、FcγRIII或FcRn受體），或使用測量例如ADCC、CDC或ADCP的基於細胞的測定法來測定。
可以使用體外測定法評估ADCC，其中使用表現CD33的細胞作為靶細胞，並且使用NK細胞作為效應細胞。可以藉由標記（例如，放射性底物、螢光染料或天然細胞內蛋白）從裂解的細胞的釋放來檢測細胞溶解。在示例性測定中，以1個靶細胞對4個效應細胞的比率使用靶細胞。將靶細胞用BATDA預先標記，並與效應細胞和測試抗體組合。將樣本孵育2小時，並且藉由測量釋放到上清液中的BATDA來測量細胞裂解。用0.67% Triton X-100（西格瑪奧德里奇公司（Sigma Aldrich））將數據歸一化為最大細胞毒性，並藉由在不存在任何抗體的情況下從靶細胞自發釋放的BATDA來確定最小對照。
可以藉由使用單核細胞衍生的巨噬細胞作為效應細胞以及任何表現CD33的細胞作為靶細胞來評估ADCP，該等細胞經工程改造以表現GFP或其他經標記的分子。在示例性測定中，效應子 : 靶細胞的比例可為例如4 : 1。在有或沒有本發明之抗體的情況下，效應細胞可與靶細胞一起孵育4小時。孵育後，可以使用accutase將細胞脫離。可以用與螢光標記偶合的抗CD11b和抗CD14抗體鑒定巨噬細胞，並且可以使用標準方法基於CD11+ CD14+ 巨噬細胞中的GFP螢光百分比（%）確定吞噬作用百分比。
可以藉由以下方法測量細胞的CDC，例如將Daudi細胞以1×105 個細胞/孔（50 μL/孔）在RPMI-B（補充有1% BSA的RPMI）中鋪板，向孔中添加50 μL終濃度在0-100 μg/mL之間的測試蛋白，將反應在室溫下孵育15 min，向孔中添加11 μL的合併的人血清，並且在37°C下將反應孵育45 min。在使用標準方法的FACS測定中，可以將裂解的細胞百分比（%）檢測為碘化丙啶染色的細胞百分比（%）。包含本揭露之結合 CD33 的抗原結合結構域之蛋白質
可以使用標準方法將本揭露之結合CD33的抗原結合結構域工程化到各種設計的單特異性或多特異性蛋白質。
本揭露還提供了包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之單特異性蛋白質。
在一些實施方式中，該單特異性蛋白係抗體。
本揭露還提供了包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質。
在一些實施方式中，該多特異性蛋白質係雙特異性的。
在一些實施方式中，該多特異性蛋白質係三特異性的。
在一些實施方式中，該多特異性蛋白質係四特異性的。
在一些實施方式中，該多特異性蛋白質係單價的，用於與CD33結合。
在一些實施方式中，該多特異性蛋白質係二價的，用於與CD33結合。
本揭露還提供了分離的多特異性蛋白質，該分離的多特異性蛋白質包含結合CD33的第一抗原結合結構域和結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域。
在一些實施方式中，該淋巴細胞抗原係T細胞抗原。
在一些實施方式中，該T細胞抗原係CD8+ T細胞抗原。
在一些實施方式中，該淋巴細胞抗原係NK細胞抗原。
在一些實施方式中，該淋巴細胞抗原係CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C。
在某些實施方式中，該多特異性蛋白質係雙特異性蛋白質，該雙特異性蛋白質包含結合CD33的第一抗原結合結構域和結合TRGV9的第二抗原結合結構域。TRGV9也稱為Vγ9，並且在γδ T細胞上表現。如本文所用，術語「TRGV9」係指在γδ T細胞的表面上表現時能夠形成T細胞受體的多肽。表現TRGV9的γδ T細胞係人類胎兒中最早發育的T細胞之一，並且也是健康成人周邊血細胞中主要的γδ T細胞亞組。術語「TRGV9」包括任何TRGV9變體、同種型和物種同源物，該TRGV9由細胞（包括T細胞）天然表現，或可在用編碼多肽的基因或cDNA轉染的細胞上表現。除非說明，較佳的是，TRGV9係人TRGV9。人TRGV9胺基酸序列由GenBank登錄號NG_001336.2提供。Vγ9Vδ2 T淋巴細胞（人類主要的γ/δ T細胞亞組）能識別磷酸抗原、某些腫瘤細胞和經胺基雙膦酸鹽處理的細胞。Vγ9Vδ2 T淋巴細胞可表現出對各種腫瘤細胞的細胞溶解活性。普通技術者理解，γ/δ TCR是由參與抗原識別的共價結合的γ和δ鏈與非共價結合的單態蛋白CD3δ、γ、ε和ζ鏈組成的異二聚體TCR複合物。Vγ9 TCR是在γ/δ T細胞的亞組上表現的TCR γ鏈的變體。
不希望受理論的束縛，表現TRGV9抗原和CD33抗原的雙特異性抗體可以將γδ T細胞募集到表現CD33的癌細胞中。多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）可以將效應細胞（例如，γδ T細胞）和靶細胞橋接在一起，從而導致癌細胞殺傷。γδ T細胞可具有先天免疫。不希望受理論的束縛，γδ T細胞僅占外周CD3+ T細胞的小部分（約1%-5%），但在上皮組織中構成了T細胞的主要亞組（約20%-50%）。循環γδ T細胞主要表現Vγ9（TRGV9）和Vδ2（TRVD2）鏈的異二聚體，而組織γδ T細胞優先表現與不同Vγ鏈相關的Vδ1鏈。
在人類中，γδ T細胞被賦予了強有力的抗癌功能（高細胞毒性和干擾素γ分泌）。此外，γδ T細胞具有吞噬功能（先天髓系細胞先前所獨有的功能），並且充當αβ T細胞的有效抗原呈現細胞並誘導適應性免疫反應。γδ T細胞可以浸潤癌組織、腫瘤和癌細胞。表現TRGV9抗原和CD33抗原的雙特異性抗體可表現出較少或沒有顯著的T細胞重定向、較少的T細胞泛激活，並且經由γδ T細胞的選擇性招募而增加對強效的癌症裂解的誘導。因此，表現TRGV9抗原和CD33抗原的雙特異性抗體可能不會導致可能由細胞介素風暴誘導而引起的嚴重副作用。
在一些實施方式中，淋巴細胞抗原係CD3ε。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域和/或結合淋巴細胞抗原（例如，TRGV9）的第二抗原結合結構域包含scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域和/或結合淋巴細胞抗原（例如，TRGV9）的第二抗原結合結構域包含Fab。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域和/或結合淋巴細胞抗原（例如，TRGV9）的第二抗原結合結構域包含F(ab’)2 。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域和/或結合淋巴細胞抗原（例如，TRGV9）的第二抗原結合結構域包含VHH。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域和/或結合淋巴細胞抗原（例如，TRGV9）的第二抗原結合結構域包含Fv。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域和/或結合淋巴細胞抗原（例如，TRGV9）的第二抗原結合結構域包含Fd。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域和/或結合淋巴細胞抗原（例如，TRGV9）的第二抗原結合結構域包含scFv。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含scFv，以及結合淋巴細胞抗原（例如，TRGV9）的第二結合結構域包含VHH。
在一些實施方式中，scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。
在一些實施方式中，L1包含約5-50個胺基酸。
在一些實施方式中，L1包含約5-40個胺基酸。
在一些實施方式中，L1包含約10-30個胺基酸。
在一些實施方式中，L1包含約10-20個胺基酸。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 109的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 110的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 111的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 112的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 113的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 114的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 115的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 116的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 117的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 118的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 119的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 120的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 121的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 122的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 123的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 124的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 125的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 126的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 127的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 128的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 129的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 130的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 131的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 132的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 133的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 134的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 135的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 136的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 137的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 138的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 139的胺基酸序列。
在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 140的胺基酸序列。
在某些實施方式中，L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、28、29、30、31、32、33、34、35、89、167、172、176、253、254或255的HCDR1，SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、36、37、38、39、40、41、42、43、44、90、91、168、173、177、256、257或258的HCDR2，SEQ ID NO: 12、13、14、15、16、17、45、46、47、48、49、50、51、92、93、94、169、174、178、180、259、260或261的HCDR3，SEQ ID NO: 62、63、64、65、66、67、68、98、99、100、182、186、189、193、197、201、265或266的LCDR1，SEQ ID NO: 69、70、71、72、73、74、101、102、103、183、187、190、194、198、267或268的LCDR2，和SEQ ID NO: 75、76、77、78、79、80、104、184、191、195、199、269或270的LCDR3。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： 分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； 分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； 分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； 分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； 分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80； 分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80； 分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； 分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； 分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199； 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104； 分別是，SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269； 分別是，SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76； 分別是，SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270。
在某些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域分別包含SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在某些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv分別包含SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且第二抗原結合結構域與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv分別包含SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且第二抗原結合結構域與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv分別包含SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且第二抗原結合結構域與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv分別包含SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且第二抗原結合結構域與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv分別包含SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且第二抗原結合結構域與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，分別包含SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且第二抗原結合結構域與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。在某些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL，並且第二抗原結合結構域與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL，並且第二抗原結合結構域與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL，並且第二抗原結合與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL，並且第二抗原結合結構域與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL，並且第二抗原結合結構域與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL，並且第二抗原結合結構域與TRGV9結合（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272或273的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含： SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 19的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 20的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 21的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 22的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 23的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 24的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 25的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 26的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60 61、262、263或264的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 54的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 55的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 57的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 60的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 61的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的胺基酸序列。在某些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 96的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 97的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 170的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 171的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 175的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 179的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 181的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 96的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272或273的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 81的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 82的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 83的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 84的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 86的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 87的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 88的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 271的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 272的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 273的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 82的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 87的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 271的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 272的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 273的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，第一抗原結合結構域係scFv。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 105的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 106的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 107的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 185的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 188的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 192的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 196的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 200的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 202的胺基酸序列。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220 221、274、275或276的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 203的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 204的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 205的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 206的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 207的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 208的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 209的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 210的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 211的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 212的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 213的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 214的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 215的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 216的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 217的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 218的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 219的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 220的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 221的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 213的胺基酸序列。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 216的胺基酸序列。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 219的胺基酸序列。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 213的胺基酸序列和與TRGV9結合的第二抗原結合結構域（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 216的胺基酸序列和與TRGV9結合的第二抗原結合結構域（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 219的胺基酸序列和與TRGV9結合的第二抗原結合結構域（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列和與TRGV9結合的第二抗原結合結構域（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列和與TRGV9結合的第二抗原結合結構域（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。
在其他實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列和與TRGV9結合的第二抗原結合結構域（例如，其中該第二結合結構域係VHH）。在一些實施方式中，結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含 SEQ ID NO: 141的HCDR1、SEQ ID NO: 142的HCDR2、SEQ ID NO: 143的HCDR3、SEQ ID NO: 144的LCDR1、SEQ ID NO: 145的LCDR2和SEQ ID NO: 146的LCDR3； SEQ ID NO: 147的VH和SEQ ID NO: 148的VL； SEQ ID NO: 149的HCDR1、SEQ ID NO: 150的HCDR2、SEQ ID NO: 151的HCDR3、SEQ ID NO: 152的LCDR1、SEQ ID NO: 153的LCDR2和SEQ ID NO: 154的LCDR3；或者 SEQ ID NO: 155的VH和SEQ ID NO: 156的VL。
在一些實施方式中，結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含： SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 238的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 242的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 243的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 244的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； SEQ ID NO: 245的VH和SEQ ID NO: 249的VL； SEQ ID NO: 246的VH和SEQ ID NO: 249的VL； SEQ ID NO: 247的VH和SEQ ID NO: 249的VL；或者 SEQ ID NO: 248的VH和SEQ ID NO: 249的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域與第一免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第一Ig恒定區的片段軛合，和/或結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與第二免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第二Ig恒定區的片段軛合。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區的片段和/或第二Ig恒定區的片段包含Fc區。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區的片段和/或第二Ig恒定區的片段包含CH2結構域。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區的片段和/或第二Ig恒定區的片段包含CH3結構域。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區的片段和/或第二Ig恒定區的片段包含CH2結構域和CH3結構域。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區的片段和/或第二Ig恒定區的片段包含鉸鏈的至少部分、CH2結構域和CH3結構域。
在一些實施方式中，Ig恒定區的片段包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域。
在一些實施方式中，多特異性蛋白質進一步包含第二連接子（L2），該第二連接子介於結合CD33的第一抗原結合結構域與第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段之間，以及介於結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段之間。
在一些實施方式中，L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140的胺基酸序列。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG1、IgG2、和IgG3或IgG4同種型。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG1同種型。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG2同種型。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG3同種型。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG4同種型。
如本文所述，可以將第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段進一步工程化。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致多特異性蛋白質與FcγR的結合降低。在某些此類實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG1同種型。
在一些實施方式中，導致多特異性蛋白質與FcγR的結合降低的該至少一個突變選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。
在某些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含L234A/L235A/D265S突變，其中殘基根據EU索引編號。在某些此類實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG1同種型。在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致多特異性蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合增強。
在一些實施方式中，導致多特異性蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、M252Y/S254T/T256E和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。
在某些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含M252Y/S254T/T256E突變，其中殘基根據EU索引編號。在某些此類實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含L234A/L235A/D265S和M252Y/S254T/T256E突變，其中殘基根據EU索引編號。在某些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG1同種型。在一些實施方式中，FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII、或其任何組合。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節多特異性蛋白質的半衰期。
在一些實施方式中，調節多特異性蛋白質的半衰期的該至少一個突變選自由以下組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中殘基根據EU索引編號。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節與蛋白A的結合。此類修飾對於抗體生產過程中的純化目的可能是有利的。
在某些實施方式中，調節與蛋白A的結合的該至少一個突變係H435/Y436F，其中殘基根據EU索引編號。在某些此類實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含L234A/L235A/D265S、M252Y/S254T/T256E和H435/Y436F突變，其中殘基根據EU索引編號。在某些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG1同種型。在一些實施方式中，多特異性蛋白質包含第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變選自由以下組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基根據EU索引編號。
在一些實施方式中，第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含以下突變 該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W；或者 該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V。包含結合 CD33 的抗原結合片段的多特異性蛋白質的產生
可以將本揭露之結合CD33的抗原結合片段工程化到多特異性抗體，該等特異性抗體也涵蓋在本發明之範圍內。
可以將結合CD33的抗原結合片段工程化到全長多特異性抗體，該等全長多特異性抗體使用Fab臂交換產生，在Fab臂交換中將取代引入到Ig恒定區CH3結構域內的兩個單特異性二價抗體中，其促進體外Fab臂交換。在方法中，兩個單特異性二價抗體經工程以使其在CH3域有一定的取代，這促進異二聚體的穩定性；將抗體在足以使鉸鏈區中的半胱胺酸發生二硫鍵異構化的還原條件下一起孵育；從而藉由Fab臂交換產生雙特異性抗體。孵育條件最好可以恢復到非還原性。可以使用的示例性還原劑係2-巰基乙胺（2-MEA）、二硫蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇（DTE）、麩胱甘肽、三(2-羧乙基)膦（TCEP）、L-半胱胺酸和β-巰基乙醇，較佳的是還原劑選自由2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇和三(2-羧乙基)膦組成之群組。例如，在至少25 mM 2-MEA的存在下或在至少0.5 mM二硫蘇糖醇的存在下，在5-8的pH（例如可以使用在為7.0的pH或7.4的pH值）下，在至少20°C的溫度下孵育至少90 min。
可以使用的CH3突變包括以下技術，如杵臼結構（Knob-in-Hole）突變（基因泰克公司（Genentech））、靜電匹配突變（日本中外製藥株式會社（Chugai）、安進公司（Amgen）、諾和諾德公司（NovoNordisk）、Oncomed公司）、鏈交換工程化的結構域主體（SEEDbody）（默克雪蘭諾公司（EMD Serono））、Duobody®突變（Genmab公司）和其他非對稱突變（例如Zymeworks公司）。
杵臼結構突變例如在WO1996/027011中揭露，並且包括CH3區的介面上的突變，在CH3區中將具有小側鏈（臼（hole））的胺基酸引入第一CH3區並且將具有大側鏈（杵（knob））的胺基酸引入第二CH3區，這導致第一CH3區和第二CH3區之間的優先相互作用。形成杵和臼的示例性CH3區突變係T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
如US 2010/0015133、US 2009/0182127、US 2010/028637或US 2011/0123532中所述，可以藉由使用靜電相互作用（藉由取代第一CH3區上的帶正電荷的殘基和第二CH3區上的帶負電荷的殘基）促進重鏈異二聚體形成。
如US2012/0149876或US2013/0195849（Zymeworks公司）中所述，可用於促進重鏈異源二聚體化的其他非對稱突變係L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W。
如US 20070287170中所述，SEEDbody突變涉及用IgA殘基取代選擇的IgG殘基以促進重鏈異源二聚體化。
如WO2007/147901、WO 2011/143545、WO 2013157954、WO 2013096291和US 2018/0118849中所述，可以使用的其他示例性突變係R409D_K370E/D399K_E357K、S354C_T366W/Y349C_ T366S_L368A_Y407V、Y349C_T366W/S354C_T366S_L368A_Y407V、T366K/L351D、L351K/Y349E、L351K/Y349D、L351K/L368E、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、K392D/D399K、K392D/E356K、K253E_D282K_K322D/D239K_E240K_K292D、K392D_K409D/D356K_D399K。
Duobody®突變（Genmab公司）揭露於例如US9150663和US2014/0303356中並且包括突變F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH和Y407LWQ/K409AGRH。
可以將結合CD33的抗原結合結構域引入其中的另外的雙特異性或多特異性結構包括雙可變結構域免疫球蛋白（DVD）（國際專利公開案號WO2009/134776；DVD是含有具有VH1-連接子-VH2-CH結構的重鏈和具有VL1-連接子-VL2-CL結構的輕鏈的全長抗體；連接子係視需要的）、包括連接兩個具有不同特異性的抗體臂的各種二聚化結構域的結構，如白胺酸拉鍊或膠原二聚化結構域（國際專利公開案號WO 2012/022811、美國專利案號5,932,448；美國專利案號6,833,441）、兩個或更多個軛合在一起的結構域抗體（dAb）、雙抗體、僅重鏈抗體，如駱駝科（camelid）抗體和工程化的駱駝科抗體、雙重靶向（DT）-Ig（葛蘭素史克公司（GSK）/Domantis公司）、二合一抗體（基因泰克公司）、交聯Mab（卡門諾斯癌症中心（Karmanos Cancer Center））、mAb2（F-Star公司）和CovX體（CovX公司/輝瑞公司（Pfizer））、IgG樣雙特異性（InnClone公司/禮來公司（Eli Lilly））、Ts2Ab（醫學免疫公司（Medimmune）/阿斯利康（AZ））和BsAb（Zymogenetics公司）、HERCULES（百健艾迪（Biogen Idec））和TvAb（羅氏公司（Roche））、ScFv/Fc融合物（學術機構（Academic Institution））、SCORPION（Emergent BioSolutions公司/祖比仁藥物公司（Trubion）、Zymogenetics公司/百時美施貴寶公司（BMS））、雙親和力重靶向技術（Fc-DART）（宏基因公司（MacroGenics））和雙(ScFv)2 -Fab（國家抗體藥物研究中心--中國）、雙重作用雙Fab（基因泰克公司）、對接鎖定（Dock-and-Lock，DNL）（免疫醫療公司（Immunomedics））、二價雙特異性（Biotecnol公司）和Fab-Fv（優時比製藥公司（UCB-Celltech））。基於ScFv的雙抗體和結構域抗體包括但不限於雙特異性T細胞接合劑（BiTE）（Micromet公司）、串聯雙抗體（Tandab）（Affimed公司）、雙親和力重靶向技術（DART）（宏基因公司）、單鏈雙抗體（學術（Academic））、TCR樣抗體（AIT，ReceptorLogics公司）、人血清白蛋白ScFv融合物（梅裡馬克公司（Merrimack））和COMBODY（Epigen生物技術公司（Epigen Biotech））、雙重靶向奈米抗體（Ablynx公司）、雙重靶向僅重鏈結構域抗體。
還可以將本揭露之結合CD33的抗原結合結構域工程化到包含三條多肽鏈的多特異性蛋白質。在此類設計中，至少一個抗原結合結構域係scFv的形式。示例性設計包括（其中「1」表示第一抗原結合結構域，「2」表示第二抗原結合結構域以及「3」表示第三抗原結合結構域： 設計1：A鏈) scFv1-CH2-CH3；B鏈) VL2-CL；C鏈) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計2：A鏈) scFv1-鉸鏈-CH2-CH3；B鏈) VL2-CL；C鏈) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計3：A鏈) scFv1-CH1-鉸鏈-CH2-CH3；B鏈) VL2-CL；C鏈) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計4：A鏈) CH2-CH3-scFv1；B鏈) VL2-CL；C鏈) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3
如US 2012/0149876或US2013/0195849（Zymeworks公司）中所述，可以將工程化的CH3引入設計1-4，如突變L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W。同種型、同種異型和工程化的 Fc
存在於本揭露之蛋白質中的Ig恒定區或該Ig恒定區的片段（如Fc區）可為任何同種異型或同種型。
在一些實施方式中，Ig恒定區或該Ig恒定區的片段係IgG1同種型。
在一些實施方式中，Ig恒定區或該Ig恒定區的片段係IgG2同種型。
在一些實施方式中，Ig恒定區或該Ig恒定區的片段係IgG3同種型。
在一些實施方式中，Ig恒定區或該Ig恒定區的片段係IgG4同種型。
Ig恒定區或該Ig恒定區的片段可為任何同種異型。可以預期，同種異型對Ig恒定區的特性（如結合或Fc介導的效應子功能）沒有影響。包含其片段的Ig恒定區的治療性蛋白質的免疫性與輸注反應的風險增加和治療反應的持續時間降低有關（Baert等人，(2003)N Engl J Med [新英格蘭醫學雜誌] 348:602-08）。包含其片段的Ig恒定區的治療性蛋白質在宿主中誘導免疫反應的程度可以部分由Ig恒定區的同種異型確定（Stickler等人, (2011)Genes and Immunity [基因與免疫] 12:213-21）。Ig恒定區同種異型與抗體的恒定區序列中特定位置的胺基酸序列變異有關。表2示出了選擇的IgG1、IgG2和IgG4同種異型。 [表 2 ].
同種異型 多樣性位置處的胺基酸殘基（殘基編號：EU索引）
  IgG2 IgG4 IgG1
  189 282 309 422 214 356 358 431
G2m(n) T M            
G2m(n-) P V            
G2m(n)/(n-) T V            
nG4m(a)     L R        
G1m(17)         K E M A
G1m(17,1)         K D L A
可藉由血流中的內源性循環羧肽酶從Ig恒定區去除C末端離胺酸（CTL）（Cai等人, (2011)Biotechnol Bioeng [生物技術與生物工程] 108:404-412）。如美國專利公開案號US 20140273092中所述，在製造過程中，可以藉由控制細胞外Zn2+ 、EDTA或EDTA-Fe3+ 的濃度，將CTL的去除控制在最大水平以下。可以使用已知方法測定蛋白質的CTL含量。
在一些實施方式中，與Ig恒定區軛合的結合CD33的抗原結合片段具有從約10%至約90%的C末端離胺酸含量。在一些實施方式中，C末端離胺酸含量為從約20%至約80%。在一些實施方式中，C末端離胺酸含量為從約40%至約70%。在一些實施方式中，C末端離胺酸含量為從約55%至約70%。在一些實施方式中，C末端離胺酸含量為約60%。
可以對與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域進行Fc區突變以調節其效應子功能，如ADCC、ADCP和/或ADCP和/或藥物動力學特性。這可以藉由將一或多個突變引入Fc來實現，該一或多個突變調節突變的Fc與激活FcγR（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII）、抑制性FcγRIIb和/或FcRn的結合。
在一些實施方式中，與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域包含Ig恒定區或該Ig恒定區的片段中的至少一個突變。
在一些實施方式中，該至少一個突變係在Fc區。
在一些實施方式中，與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域包含Fc區中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個或十五個突變。
在一些實施方式中，與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域包含Fc區中的至少一個突變，該至少一個突變調節抗體與FcRn的結合。
可以發生突變以調節半衰期（例如，與FcRn結合）的Fc位置包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可以單獨或組合進行的示例性突變係突變T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R。可以增加半衰期的示例性單獨或組合突變係突變M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A和T307A/E380A/N434A。可以減少半衰期的示例性單獨或組合突變係突變H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R。
在一些實施方式中，與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域包含M252Y/S254T/T256E突變。
在一些實施方式中，與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域包含Fc區中的至少一個突變，該至少一個突變降低蛋白質與激活Fcγ受體（FcγR）的結合和/或降低Fc效應子功能，如C1q結合、補體依賴性細胞毒性（CDC）、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）或吞噬作用（ADCP）。
可以發生突變以降低蛋白質與激活FcγR的結合隨後降低效應子功能的Fc位置包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331和365。可以單獨或組合進行的示例性突變IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的突變K214T、E233P、L234V、L234A、G236的缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S。導致蛋白質ADCC降低的示例性組合突變係以下突變：IgG1上的L234A/L235A、IgG1上的L234A/L235A/D265S、IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上的F234A/L235A、IgG4上的S228P/F234A/L235A、所有Ig同種型上的N297A、IgG2上的V234A/G237A、IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上的S267E/L328F、IgG1上的L234F/L235E/D265A、IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、和IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S。還可以使用雜合IgG2/4 Fc結構域，如具有來自IgG2的殘基117-260和來自IgG4的殘基261-447的Fc。
導致蛋白質CDC降低的示例性突變係K322A突變。
可以在IgG4中進行熟知的S228P突變以增強IgG4穩定性。
在一些實施方式中，與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域包含選自由以下組成之群組的至少一個突變：K214T、E233P、L234V、L234A、G236的缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、K322、A330S和P331S。
在一些實施方式中，與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域包含L234A/L235A/D265S突變。
在一些實施方式中，與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域包含L234A/L235A突變。
在一些實施方式中，與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域包含Fc區中的至少一個突變，該至少一個突變增強蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合和/或增強Fc效應子功能，如C1q結合、補體依賴性細胞毒性（CDC）、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）和/或吞噬作用（ADCP）。
可以發生突變以增加蛋白質與激活FcγR的結合和/或增強效應子功能的Fc位置包括位置236、239、243、256、290、292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396或430（殘基根據EU索引編號）。可以單獨或組合進行的示例性突變係G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E333A、K334A、A339T和P396L。導致蛋白質ADCC或ADCP增加的示例性組合突變係S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E。
可以發生突變以增強CDC的Fc位置包括位置267、268、324、326、333、345和430。可以單獨或組合進行的示例性突變係S267E、F1268F、S324T、K326A、K326W、E333A、E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430S、E430F或E430T。導致蛋白質CDC增加的示例性組合突變係K326A/E333A、K326W/E333A、H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T和S267E/H268F/S324T。
當與分別為SEQ ID NO：222、223和224的IgG1、IgG2和IgG4野生型胺基酸序列相比時，本文所述之特異性突變係突變。 SEQ ID NO: 222，野生型IgG1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 223；野生型IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 224；野生型IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
可以使用流動式細胞分析術在工程化以表現每種受體的細胞上評估抗體與FcγR或FcRn的結合。在示例性結合測定中，以2 x 105 個細胞/孔接種在96孔板中，並且在BSA染色緩衝液（美國聖約瑟的BD生物科學公司（BD Biosciences，San Jose，USA））中在4°C下封閉30 min。將細胞與測試抗體在冰上在4°C下孵育1.5小時。用BSA染色緩衝液洗滌兩次後，將細胞與R-PE標記的抗人IgG第二抗體（傑克遜免疫研究實驗室公司（Jackson ImmunoResearch Laboratories））在4°C下一起孵育45 min。將細胞在染色緩衝液中洗滌兩次，然後重懸於150 μL的含有1 : 200稀釋的DRAQ7活/死（live/dead）染色劑（美國丹弗斯的細胞傳訊技術公司（Cell Signaling Technology，Danvers，USA））的染色緩衝液中。分別使用B2和B4通道，藉由Miltenyi MACSQuant流式細胞儀（美國奧本的美天旎生物技術公司（Miltenyi Biotec，Auburn，USA））檢測染色細胞的PE和DRAQ7信號。將活細胞在DRAQ7排除上進行門控，並確定收集到的至少10,000個活事件的幾何平均螢光信號。使用FlowJo軟體（樹星公司（Tree Star））進行分析。將數據繪製為抗體濃度對平均螢光信號的對數。進行非線性回歸分析。糖改造
可以藉由工程化Ig恒定區或該Ig恒定區的片段寡糖組分增強與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合以介導ADCC的結合CD33的抗原結合結構域之能力。人IgG1或IgG3在Asn297處被N-糖基化，其中大多數聚糖以熟知的二天線型G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式存在。含Ig恒定區的蛋白質可由非工程化CHO細胞產生，該等CHO細胞典型地具有約85%的聚糖岩藻糖含量。從附接到與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域之二天線型複合物型寡糖中去除核心岩藻糖，經由改善FcγRIIIa結合增強了蛋白質的ADCC，而不改變抗原結合或CDC活性。可以使用報導的不同方法來獲得此類蛋白，該等方法可導致相對較高的去岩藻糖基化免疫球蛋白的成功表現，該等去岩藻糖基化免疫球蛋白帶有Fc寡糖的二天線型複合物型，如控制培養物滲透莫耳量（Konno等人, Cytotechnology [細胞技術] 64(:249-65, 2012)）、變體CHO系Lec13作為宿主細胞系的應用（Shields等人，J Biol Chem [生物化學雜誌] 277:26733-26740, 2002）、變體CHO系EB66作為宿主細胞系的應用（Olivier等人, MAbs [單株抗體];2(4): 405-415, 2010; PMID:20562582）、大鼠融合瘤細胞系YB2/0作為宿主細胞系的應用（Shinkawa等人, J Biol Chem [生物化學雜誌] 278:3466-3473, 2003）、針對1,6-岩藻糖基轉移酶（FUT8 ）基因的小干擾RNA特異性的引入（Mori等人, Biotechnol Bioeng [生物技術與生物工程] 88:901-908, 2004）、或β-1,4-N -乙醯葡萄胺糖轉移酶III和Golgi α-甘露糖苷酶II或有效的α-甘露糖苷酶I抑制劑、幾夫鹼（kifunensine）的共表現（Ferrara等人, J Biol Chem [生物化學雜誌] 281:5032-5036, 2006，Ferrara等人, Biotechnol Bioeng [生物技術與生物工程] 93:851-861, 2006；Xhou等, Biotechnol Bioeng [生物技術與生物工程] 99:652-65, 2008）。
在一些實施方式中，本揭露之與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域具有二天線型聚糖結構，該二天線型聚糖結構的岩藻糖含量為約1%與約15%之間，例如約15%、14%、13%、12%、11% 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在一些實施方式中，與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域具有聚糖結構，該聚糖結構的岩藻糖含量為約50%、40%、45%、40%、35%、30%、25%或20%。
「岩藻糖含量」意指Asn297處糖鏈內岩藻糖單糖的量。岩藻糖的相對量係含褐藻糖的結構占所有糖結構的百分比。該等可以藉由多種方法表徵和量化，例如：1) 使用如國際專利公開案號WO2008/077546中所述之N-糖苷酶F的MALDI-TOF處理過的樣本（例如複合物，雜合物以及寡甘露糖和高甘露糖結構）；2) 藉由酶促釋放Asn297聚糖，隨後進行衍生化，並藉由具有螢光檢測的HPLC（UPLC）和/或HPLC-MS（UPLC-MS）進行檢測/定量；3) 用或不用Endo S或在第一GlcNAc單糖和第二GlcNAc單糖之間裂解的其他酶處理Asn297聚糖，對天然或還原的mAb的完整的蛋白進行分析，使岩藻糖附接在第一GlcNAc上；4) 藉由酶消化（例如，胰蛋白酶或內肽酶Lys-C）將mAb消化成組成肽，隨後藉由HPLC-MS（UPLC-MS）進行分離、檢測和定量；5) 藉由用Asn 297 PNG酶F進行特異性酶去糖基化，將mAb寡糖從mAb蛋白中分離出來。這樣釋放出來的寡糖可以用螢光團進行標記，藉由各種互補技術進行分離和鑒定，該等技術允許：藉由基質輔助雷射解吸電離（MALDI）質譜法，將實驗品質和理論品質進行對比，對聚糖結構進行精細表徵；藉由離子交換HPLC（GlycoSep C）確定唾液酸化程度；藉由正相HPLC（GlycoSep N）根據親水性標準對寡糖形式進行分離和定量；藉由高效毛細管電泳-雷射誘導螢光（HPCE-LIF）對寡糖進行分離和定量。
如本文所用，「低岩藻糖」或「低岩藻糖含量」係指與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域，其岩藻糖含量為約1%-15%之間。
如本文所用，「正常岩藻糖」或「正常岩藻糖含量」係指與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合的結合CD33的抗原結合結構域之岩藻糖含量為約大於50%，典型地約大於80%或大於85%。抗遺傳型抗體
抗遺傳型抗體是與本揭露之結合CD33的抗原結合結構域特異性結合的抗體。
本發明還提供了抗遺傳型抗體，該抗遺傳型抗體與本揭露之結合CD33的抗原結合結構域特異性結合。
本發明還提供了與結合CD33的抗原結合結構域特異性結合的抗遺傳型抗體，該抗遺傳型抗體包含 SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL； SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL； SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些實施方式中，與結合CD33的抗原結合結構域特異性結合的抗遺傳型抗體包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。
在其他實施方式中，與結合CD33的抗原結合結構域特異性結合的抗遺傳型抗體包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。
在其他實施方式中，與結合CD33的抗原結合結構域特異性結合的抗遺傳型抗體包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。
在其他實施方式中，與結合CD33的抗原結合結構域特異性結合的抗遺傳型抗體包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。
在其他實施方式中，與結合CD33的抗原結合結構域特異性結合的抗遺傳型抗體包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。
在其他實施方式中，與結合CD33的抗原結合結構域特異性結合的抗遺傳型抗體包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
抗遺傳型（Id）抗體係識別抗體的表位（例如，互補位或CDR）的抗體。Id抗體可為抗原阻斷性的或非阻斷性的。抗原阻斷性的Id可用於檢測樣本中的游離抗原結合結構域（例如，本揭露之結合CD33的抗原結合結構域）。非阻斷性的Id可用於檢測樣本中的總抗體（游離、與抗原部分結合或與抗原完全結合）。可藉由用製備了抗Id的抗體免疫動物來製備Id抗體。
抗Id抗體也可以用作免疫原以在另外一種動物中誘導免疫反應，從而產生所謂的抗抗Id抗體。抗抗Id可能與誘導抗Id的原始抗原結合結構域表位相同。因此，藉由使用針對抗原結合結構域的獨特型決定簇的抗體，可以鑒定表現相同特異性的抗原結合結構域之其他選殖。可以藉由任何合適的技術來改變（從而產生抗Id抗體變體）和/或衍生抗Id抗體，如本文其他地方描述的那些。免疫軛合物
本揭露之結合CD33的抗原結合結構域、包含結合CD33的抗原結合結構域之蛋白質、或包含結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質（本文統稱為CD33結合蛋白）可以與異源分子軛合。CD33結合蛋白還包括包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之嵌合抗原受體（CAR）。
在一些實施方式中，異源分子係可檢測標記或細胞毒性劑。
本發明還提供了與可檢測標記軛合的結合CD33的抗原結合結構域。
本發明還提供了包含與可檢測標記軛合的結合CD33的抗原結合結構域之蛋白質。
本發明還提供了包含與可檢測標記軛合的結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質。
本發明還提供了包含與可檢測標記軛合的結合CD33的抗原結合結構域之CAR。
本發明還提供了與細胞毒性劑軛合的結合CD33的抗原結合結構域。
本發明還提供了包含與細胞毒性劑軛合的結合CD33的抗原結合結構域之蛋白質。
本發明還提供了包含與細胞毒性劑軛合的結合CD33的抗原結合結構域之多特異蛋白質。
本發明還提供了包含與細胞毒性劑軛合的結合CD33的抗原結合結構域之CAR。
本揭露之CD33結合蛋白可用於將治療劑引導至表現CD33的細胞，如髓系的細胞。可替代地，可以用本揭露之CD33結合蛋白靶向表現CD33的細胞，該CD33結合蛋白與旨在被內化後即修飾細胞功能的治療劑偶合。
在一些實施方式中，可檢測標記也是細胞毒性劑。
與可檢測標記軛合的本揭露之CD33結合蛋白可用於評估CD33在各種樣本上的表現。
可檢測標記包括當與本揭露之CD33結合蛋白軛合時，使後者變成經由光譜、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段可檢測的組成物。
示例性可檢測標記包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠粒、螢光染料、電子緻密試劑、酶（例如，如ELISA中通常所用的）、生物素、地高辛、半抗原、發光分子、化學發光分子、螢光染料、螢光團、螢光淬滅劑、著色分子、放射性同位素、閃爍體、抗生物素蛋白、鏈黴親和素、蛋白A、蛋白G、抗體或其片段、聚組胺酸、Ni2+ 、Flag標籤、myc標籤、重金屬、酶、鹼性磷酸酶、過氧化物酶、螢光素酶、電子供體/受體、吖啶酯和比色底物。
可以使用藉由引用併入本文的國際專利公開案號WO2019/125982中揭露的任何標籤。
可檢測標記可以自發發出信號，如當可檢測標記係放射性同位素時。在其他情況下，可檢測標記由於受到外磁場的刺激而發出信號。
示例性放射性同位素可為發射γ、發射俄歇（Auger-emitting）、發射β、發射α或發射正電子的放射性同位素。示例性放射性同位素包括3 H、11 C、13 C、15 N、18 F、19 F、55 Co、57 Co、60 Co、61 Cu、62 Cu、64 Cu、67 Cu、68 Ga、72 As、75 Br、86 Y、89 Zr、90 Sr、94m Tc、99m Tc、115 In、123 1、124 1、125 I、131 1、211 At、212 Bi、213 Bi、223 Ra、226 Ra、225 Ac和227 Ac。
在一些實施方式中，放射性同位素用於治療目的，如藉由增強細胞殺傷。用於增強細胞殺傷的放射性同位素包括但不限於32 P、47 Sc、67 Cu、77 As、89 Sr、90 Y、99 Tc、105 Rh、109 Pd、111 Ag、131 I、153 Sm、159 Gd、165 Dy、166 Ho、169 Er、186 Re、188 Re、194 Ir、198 Au、199 Au、211 At、212 Pb、212 Bi、213 Bi、223 Ra、255 Fm和227 Th。不希望受理論的束縛，包含用於治療目的的放射性同位素的CD33結合蛋白可以藉由靶細胞內化並藉由靶細胞殺傷。
使用與放射性同位素軛合的CD33結合蛋白的放射免疫療法可有益於治療局部或彌漫性腫瘤。在一些實施方式中，藉由投與放射性標記的單株抗體治療受試者，該放射性標記的單株抗體特異性針對腫瘤相關抗原或針對腫瘤微環境。放射標記（例如Ac225）療法可為高效的，其對於細胞殺傷需要低劑量，如在治療具有表現CD33的細胞的血液惡性腫瘤的背景下。
在一些實施方式中，放射性同位素用於增強成像，如用於測試以指示CD33結合蛋白係否靶向目標群組織。用於增強成像的示例性同位素包括但不限於62 Cu、64 Cu、67 Ga、68 Ga、86 Y、89 Zr和111 In。
示例性金屬原子係原子數大於20的金屬，如鈣原子、鈧原子、鈦原子、釩原子、鉻原子、錳原子、鐵原子、鈷原子、鎳原子、銅原子、鋅原子、鎵原子、鍺原子、砷原子、硒原子、溴原子、氪原子、銣原子、鍶原子、釔原子、鋯原子、鈮原子、鉬原子、鍀原子、釕原子、銠原子、鈀原子、銀原子、鎘原子、銦原子、錫原子、銻原子、碲原子、碘原子、氙原子、銫原子、鋇原子、鑭原子、鉿原子、鉭原子、鎢原子、錸原子、鋨原子、銥原子、鉑原子、金原子、汞原子、鉈原子、鉛原子、鉍原子、鈁原子、鐳原子、錒原子、鈰原子、鐠原子、釹原子、鉕原子、釤原子、銪原子、釓原子、鋱原子、鏑原子、鈥原子、鉺原子、銩原子、鐿原子、鑥原子、釷原子、鏷原子、鈾原子、錼原子、鈈原子、鋂原子、鋦原子、錇原子、鉲原子、鎄原子、鐨原子、鍆原子、鍩原子鐒原子。
在一些實施方式中，金屬原子可為鹼土金屬，其原子數大於二十。
在一些實施方式中，金屬原子可為鑭系元素。
在一些實施方式中，金屬原子可為錒系元素。
在一些實施方式中，金屬原子可為過渡金屬。
在一些實施方式中，金屬原子可為貧金屬。
在一些實施方式中，金屬原子可為金原子、鉍原子、鉭原子和釓原子。
在一些實施方式中，金屬原子可為原子數為53（即碘）至83（即鉍）的金屬。
在一些實施方式中，金屬原子可為適合於磁共振成像的原子。
金屬原子可為+1、+2或+3氧化態的金屬離子，如Ba2+ 、Bi3+ 、Cs+ 、Ca2+ 、Cr2+ 、Cr3+ 、Cr6+ 、Co2+ 、Co3+ 、Cu+ 、Cu2+ 、Cu3+ 、Ga3+ 、Gd3+ 、Au+ 、Au3+ 、Fe2+ 、Fe3+ 、F3+ 、Pb2+ 、Mn2+ 、Mn3+ 、Mn4+ 、Mn7+ 、Hg2+ 、Ni2+ 、Ni3+ 、Ag+ 、Sr2+ 、Sn2+ 、Sn4+ 和Zn2+ 。金屬原子可以包含金屬氧化物，如氧化鐵、氧化錳或氧化釓。
合適的染料包括任何可商購的染料，例如像，5(6)-羧基螢光素、IRDye 680RD馬來醯亞胺或IRDye 800CW、聚吡啶釕染料等。
合適的螢光團是異硫氰酸螢光素（FITC）、螢光素硫代胺基脲、羅丹明（rhodamine）、德克薩斯紅（Texas Red）、CyDyes（例如，Cy3、Cy5、Cy5.5）、Alexa Fluors（例如，Alexa488、Alexa555、Alexa594；Alexa647）、近紅外（NIR）（700-900 nm）螢光染料、以及羰花菁（carbocyanine）和胺基苯乙烯染料。
與可檢測標記軛合的結合CD33的抗原結合結構域可用作顯像劑。
包含與可檢測標記軛合的結合CD33的抗原結合結構域之蛋白質可用作顯像劑。
包含與可檢測標記軛合的結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質可用作顯像劑。
包含與可檢測標記軛合的結合CD33的抗原結合結構域之CAR可用作顯像劑。
在一些實施方式中，細胞毒性劑係化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素（例如，細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段）或放射性同位素（即放射性偶合物）。
在一些實施方式中，細胞毒性劑係道諾黴素、阿黴素、甲胺蝶呤、長春地辛、細菌毒素（如白喉毒素、蓖麻毒素、格爾德黴素（geldanamycin）、美登木素生物鹼（maytansinoids）或加利車黴素（calicheamicin））。細胞毒性劑可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制的機制引發它們的細胞毒性和細胞抑制作用。
在一些實施方式中，細胞毒性劑係酶活性毒素如白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈（來自銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒蛋白A鏈、α-帚曲毒蛋白、油桐（Aleurites fordii ）蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸（Phytolaca americana ）蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜（momordica charantia ）抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草（sapaonaria officinalis ）抑制劑、多花白樹毒蛋白、絲林黴素（mitogellin）、局限麴菌素（restrictocin）、釀黴素（phenomycin）、依諾黴素（enomycin）和單端抱菌素（tricothecenes）。
在一些實施方式中，細胞毒性劑係放射性核素，如212 Bi、131 I、131 In、90 Y和186 Re。
在一些實施方式中，細胞毒性劑係朵拉司他汀（dolastatin）或多洛他汀（dolostatin）肽類似物和衍生物，瑞奧西汀（auristatin）或單甲基瑞奧西汀苯丙胺酸。示例性分子描述於美國專利案號5,635,483和5,780,588中。已經顯示朵拉司他汀和瑞奧西汀干擾微管動力學、GTP水解以及核和細胞分裂（Woyke等人 (2001) Antimicrob Agents and Chemother [抗微生物劑和化學療法]. 45(12):3580-3584），並且具有抗癌和抗真菌活性。朵拉司他汀或瑞奧西汀藥物部分可以通過肽藥物部分的N（胺基）末端或C（羧基）末端（WO 02/088172）、或經由工程化到抗體中的任何半胱胺酸與本發明之抗體附接。
可以使用已知方法將本揭露之CD33結合蛋白與可檢測標記軛合。
在一些實施方式中，可檢測標記與螯合劑複合。
在一些實施方式中，可檢測標記經連接子與本揭露之CD33結合蛋白軛合。
可以使用已知方法將可檢測標記或細胞毒性部分直接或間接連接至本揭露之CD33結合蛋白。合適的連接子在本領域係已知的並且包括，例如，輔基、非酚類連接子（N-琥珀醯亞胺-苯甲酸鹽的衍生物；十二硼酸鹽）、大環和非環狀螯合劑的螯合部分，如1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10,四乙酸（DOTA）的衍生物、二伸乙基三胺五乙酸（DTPA）的衍生物、S-2-(4-異硫氰酸根苄基)-1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）的衍生物和1,4,8,11-四氮雜環十二烷-1,4,8,11-四乙酸（TETA）的衍生物、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸鹽（SPDP）、亞胺基硫烷(IT)、亞胺酸酯的雙功能衍生物（如二甲基己二亞胺酸酯HCl）、活性酯（如辛二酸二琥珀醯亞胺酯）、醛類（如戊二醛）、雙疊氮化合物（如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺）、雙重氮衍生物（如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺）、二異氰酸酯（如甲苯2,6-二異氰酸酯）、和雙活性氟化合物（如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）和其他螯合部分。合適的肽連接子係熟知的。
在一些實施方式中，本揭露之CD33結合蛋白經腎臟清除從血液中去除。套組
本發明還提供了套組，該套組包含本文所述之結合CD33的抗原結合結構域中的任一個。
本發明還提供了套組，該套組包含含有本文所述之結合CD33的抗原結合結構域中的任一個的蛋白質。
本發明還提供了套組，該套組包含含有結合CD33的抗原結合結構域之本文所述之多特異性蛋白質中的任一個。
本發明還提供了套組，該套組包含含有結合CD33的本文所述之抗原結合結構域中的任一個的CAR。
套組可用於治療用途並用作診斷套組。
套組可用於檢測樣本中CD33的存在。
在一些實施方式中，套組包含本揭露之CD33結合蛋白和用於檢測該CD33結合蛋白的試劑。套組可以包括一或多種其他元件，該等元件包括：使用說明書；其他試劑，例如，標記、治療劑或可用於使抗體與標記或治療劑螯合或以其他方式偶合的藥劑，或輻射防護組成物；用於製備用於投與的抗體的裝置或其他材料；藥學上可接受的載劑；以及用於向受試者投與的裝置或其他材料。
在一些實施方式中，套組包含在容器中的結合CD33的抗原結合結構域和該套組的使用說明。
在一些實施方式中，套組包含在容器中的含有結合CD33的抗原結合結構域之蛋白質和該套組的使用說明。
在一些實施方式中，套組包含在容器中的含有結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質和該套組的使用說明。
在一些實施方式中，在套組中的結合CD33的抗原結合結構域被標記。
在一些實施方式中，蛋白質包含在套組中的被標記的結合CD33的抗原結合結構域。
在一些實施方式中，多特異性蛋白質包含在套組中的被標記的結合CD33的抗原結合結構域。
在一些實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域（例如，scFv），該結合CD33的抗原結合結構域包含 a) SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c) SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f) SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i) SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j) SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域（例如，scFv），該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。
在其他實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域（例如，scFv），該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。
在其他實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域（例如，scFv），該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。
在其他實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域（例如，scFv），該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。
在其他實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域（例如，scFv），該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。
在其他實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域（例如，scFv），該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含 a) SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c) SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e) SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f) SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
在一些實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含 a) SEQ ID NO: 18的VH； b) SEQ ID NO: 19的VH； c) SEQ ID NO: 20的VH； d) SEQ ID NO: 21的VH； e) SEQ ID NO: 22的VH； f) SEQ ID NO: 23的VH； g) SEQ ID NO: 24的VH； h) SEQ ID NO: 25的VH；或者 i) SEQ ID NO: 26的VH；或者 j) SEQ ID NO: 27的VH。
在一些實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27。在一些實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52，53，54、55、56、57、58、59、60、61、262、263或264。在一些實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272或273。在一些實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96。在一些實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202。
在一些實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220 221、274、275或276。
在某些實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 213。
在其他實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 216。
在其他實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 219。
在其他實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 274。
在其他實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 275。
在其他實施方式中，套組包含結合CD33的抗原結合結構域，該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 276。檢測 CD33 的方法
本發明還提供了檢測樣本中CD33之方法，該方法包括獲得樣本，將該樣本與本揭露之結合CD33的抗原結合結構域接觸，以及檢測樣本中結合的CD33。
在一些實施方式中，樣本可以源自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、滑液、循環細胞、與組織無關的細胞（即，游離細胞）、組織（例如，手術切除的組織、活檢組織，包括細針抽吸）、組織學製劑等。
可以使用已知方法檢測本揭露之結合CD33的抗原結合結構域。示例性方法包括使用螢光或化學發光標記或放射性標記直接標記抗體，或將易於檢測的部分（例如生物素、酶或表位標籤）附接至本發明之抗體。示例性標記和部分係釕、111 In-DOTA、111 In-二伸乙基三胺五乙酸（DTPA）、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚組胺酸（HIS標籤）、吖啶染料、菁染料、螢光酮染料、㗁𠯤染料、菲啶染料、羅丹明染料和Alexafluor®染料。
可以用藉由引用併入本文的國際專利公開案號WO 2019/125982中揭露的放射性標記和放射性藥劑中的任何一種直接標記抗體。
本揭露之結合CD33的抗原結合結構域可用於各種測定中以檢測樣本中的CD33。示例性測定係蛋白質印跡分析、放射免疫測定、表面等離子共振、免疫沈澱、平衡透析、免疫擴散、電化學發光（ECL）免疫測定、免疫組織化學、螢光激活細胞分選（FACS）或ELISA測定。包含本揭露之結合 CD33 的抗原結合結構域之嵌合抗原受體（ CAR ）
可以將本文所鑒定的結合CD33的抗原結合結構域中的任何一種工程化到嵌合抗原受體（CAR）以提供結合CD33的CAR。本揭露提供了靶向CD33的CAR、包含該等CAR的細胞、和使用本文所述之CAR治療產生CD33的癌症（如血液癌）之方法。
本發明之CAR具有CD33的抗原特異性。如本文所用，短語「具有抗原特異性」和「引起抗原特異性響應」意指，CAR可以特異性結合抗原並免疫學地識別抗原，使得CAR與CD33抗原的結合引起免疫反應。測試CAR的抗原特異性和識別靶細胞的能力的方法係本領域已知的。
本揭露關於經遺傳修飾以穩定表現所需嵌合抗原受體的T細胞之用途。嵌合抗原受體（CAR）係人工構建的異源蛋白或多肽，該異源蛋白或多肽含有與T細胞傳訊結構域連接的抗體（如scFv）的抗原結合結構域。CAR的特徵包括以非MHC限制的方式將T細胞特異性和反應性重定向至選擇的靶標的能力（利用單株抗體的抗原結合特性）。非MHC限制性抗原識別賦予表現CAR的T細胞識別獨立於抗原加工的抗原的能力，因此繞開了腫瘤逃逸的主要機制。此外，當在T細胞中表現時，CAR不會有利地與內源性T細胞受體（TCR）α和β鏈二聚。
本文所述之CAR提供了包含至少細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域（本文也稱為細胞質傳訊結構域）的重組多肽構建體，該細胞內傳訊結構域包含源自本文所述刺激性分子的功能性傳訊結構域。表現CAR的T細胞在本文中稱為CAR T細胞、CAR-T細胞或CAR修飾的T細胞，並且該等術語在本文中可互換地使用。該等細胞可以經遺傳修飾以穩定表現其表面上的抗體結合結構域，賦予MHC獨立的新型抗原特異性。
在一些情況下，將T細胞進行基因修飾以穩定表現CAR，該CAR將抗體的抗原識別結構域與CD3-ζ鏈或FcγRI蛋白的細胞內結構域組合成單個的嵌合蛋白。在一個實施方式中，刺激性分子係與T細胞受體複合物有關的ζ鏈。
「細胞內傳訊結構域 」係指分子的細胞內部分。蛋白質的功能性部分藉由以下起作用：藉由在細胞內傳遞資訊以藉由產生第二信使或藉由響應於此類信使而用作效應子，經由定義的傳訊途徑調控細胞活性。細胞內傳訊結構域產生促進含有CAR的細胞（例如，CAR-T細胞）的免疫效應子功能的訊息。免疫效應子功能的實例，例如，在CAR-T細胞中，包括細胞溶解活性和輔助活性（包括細胞介素的分泌）。
在一個實施方式中，細胞內傳訊結構域包含初級細胞內傳訊結構域。示例性初級細胞內傳訊結構域包含源自負責初級刺激、或抗原依賴性模擬的分子的那些。在一個實施方式中，細胞內傳訊結構域包含共刺激細胞內結構域。示例性共刺激細胞內傳訊結構域包括源自負責共刺激訊息或抗原依賴性刺激的分子的那些。例如，在CAR-T的情況下，初級細胞內傳訊結構域包含T細胞受體的細胞質序列，並且共刺激細胞內傳訊結構域包含來自共受體或共刺激分子的細胞質序列。
初級細胞內傳訊結構域包含傳訊模體，該信號模體被稱為基於免疫受體酪胺酸的激活模體或ITAM。含有初級細胞質傳訊序列的示例性ITAM包括源自CD3-ζ、FcRγ、FcR β、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、DAP10和DAP12的那些。
術語「ζ」或可替代地「ζ鏈」、「CD3-ζ」或「TCR-ζ」定義為由GenBank登錄號BAG36664.1提供的蛋白質，或來自非人物種，例如，鼠、兔、靈長類動物、小鼠、齧齒動物、猴、猿等的相當的殘基，以及「ζ刺激性結構域」或可替代地「CD3-ζ刺激性結構域」或「TCR-ζ刺激性結構域」定義為來自ζ鏈的細胞質結構域的胺基酸殘基，該等胺基酸殘基足以在功能上傳遞T細胞激活所必需的初始訊息。在一方面，ζ的細胞質結構域包含GenBank登錄號BAG36664.1的殘基52至164或來自其功能同源物的非人物種（例如，小鼠、齧齒動物、猴，猿等）的相當的殘基。在一方面，「ζ刺激性結構域」或「CD3-ζ刺激性結構域」是由SEQ ID NO: 28提供的序列，或與SEQ ID NO: 164具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。 SEQ ID NO: 164 CD3-ζ刺激性結構域 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
術語「共刺激分子」係指與共刺激配體特異性結合的T細胞上的同源結合配偶體，從而介導T細胞的共刺激響應，如但不限於增殖。共刺激分子係除有效免疫反應所需的抗原受體或其配體以外的細胞表面分子。共刺激分子包括但不限於MHC 1類分子、BTLA和Toll配體受體、以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）和4-1BB（CD137）。
共刺激細胞內傳訊結構域可為共刺激分子的細胞內部分。共刺激分子可以以下蛋白家族表示：TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、傳訊淋巴細胞激活分子（SLAM蛋白）和激活NK細胞受體。示例性此類分子包括CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40、GITR、CD30、MyD88、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、和與CD83特異性結合的配體等。
細胞內傳訊結構域可以包含其源自分子的整個細胞內部分、或整個天然細胞內傳訊結構域、或其功能片段。
術語「4-1BB」或可替代地「CD137」係指具有由GenBank登錄號AAA62478.2提供的胺基酸序列之TNFR超家族的成員，或來自非人物種，例如，小鼠、齧齒動物、猴、猿等的相當的殘基；並且「4-1BB共刺激結構域」定義為GenBank登錄號AAA62478.2的胺基酸殘基214-255，或來自非人物種，例如，小鼠、齧齒動物、猴、猿等的相當的殘基。在一方面，「4-1BB共刺激結構域」或「CD137共刺激結構域」是由SEQ ID NO: 163 （KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；SEQ ID NO: 163 ）提供的序列或來自非人物種，例如，小鼠、齧齒動物、猴、猿等的相當的殘基，或與SEQ ID NO: 163具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。
在一個實施方式中，使用與CAR中的其他結構域之一天然相關的跨膜結構域。在另一個實施方式中，可以藉由胺基酸取代來選擇或修飾跨膜結構域，以避免該等結構域與相同或不同表面膜蛋白的跨膜結構域的結合，以最小化與受體複合物的其他成員的相互作用。在一個實施方式中，跨膜結構域包含CD8α鉸鏈結構域。
在一些實施方式中，細胞質傳訊結構域進一步包含源自至少一個本文所定義的共刺激分子的一或多個功能傳訊結構域。在一個實施方式中，共刺激分子選自4-1BB（即，CD137）、CD27、CD3-ζ和/或CD28。CD28在T細胞共刺激中是重要的T細胞標記。CD27係腫瘤壞死因子受體超家族的成員，並用作共刺激免疫檢查點分子。4-1BB向T細胞傳遞強效的共刺激訊息，促進T淋巴細胞的分化，並增強T淋巴細胞的長期存活。CD3-ζ與TCR相關聯以產生訊息，並含有基於免疫受體酪胺酸的激活模體（ITAM）。在另一個實施方式中，共刺激分子係MyD88或CD40。
在一個實施方式中，CAR包含細胞內鉸鏈結構域，該細胞內鉸鏈結構域包含CD8和包含CD28、4-1BB和CD3-ζ的細胞內T細胞受體傳訊結構域。在另一個實施方式中，CAR包含細胞內鉸鏈結構域和包含CD28、4-1BB和CD3-ζ的細胞內T細胞受體傳訊結構域，其中該鉸鏈結構域包含CD8、CD4或CD28的細胞外區的全部或部分；抗體恒定區的全部或部分；FcγRIIIA受體、IgG鉸鏈、IgM鉸鏈、IgA鉸鏈、IgD鉸鏈、IgE鉸鏈或Ig鉸鏈的全部或部分。IgG鉸鏈可以來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1、IgA2、IgD、IgE或其嵌合體。
本文所述之CAR提供了包含至少細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域（本文也稱為細胞質傳訊結構域）的重組多肽構建體，該細胞內傳訊結構域包含例如，源自以下所定義的刺激性分子的功能性傳訊結構域。
在一個實施方式中，CAR包含嵌合融合蛋白，該嵌合融合蛋白包含細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含源自刺激性分子的功能性傳訊結構域。在一個實施方式中，CAR包含嵌合融合蛋白，該嵌合融合蛋白包含細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含源自共刺激分子的功能性傳訊結構域和源自刺激性分子的功能性傳訊結構域。在一個實施方式中，CAR包含嵌合融合蛋白，該嵌合融合蛋白包含細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含源自一或多個共刺激分子的至少兩個功能性傳訊結構域和源自刺激性分子的功能性傳訊結構域。
可將本揭露之CAR設計為本身包含CD28和/或4-1BB傳訊結構域，或與可用於本發明之CAR的背景下任何其他所需的一或多個細胞質結構域組合。在一個實施方式中，CAR的細胞質結構域可以進一步包含CD3-ζ的傳訊結構域。例如，CAR的細胞質結構域可以包括但不限於CD3-ζ、4-1BB和CD28傳訊模組及其組合。因此，本發明提供了CAR T細胞和其用於過繼性治療之方法。
本揭露進一步提供了變體，例如，CAR的功能性變體。如本文所用，術語「功能性變體」係指與親本CAR具有實質或顯著的序列同一性或相似性的CAR，該功能性變體保留了其作為變體的CAR的生物活性。功能性變體涵蓋，例如，CAR的那些保留與親本CAR相似程度、相同程度或更高程度地識別靶細胞的能力的變體。關於親本CAR，功能性變體可以，例如，在胺基酸序列方面與親本CAR具有至少約30%、約40%、約50%、約60%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多同一性。
功能性變體可以，例如，包含具有至少一個保守胺基酸取代的親本CAR的胺基酸序列。在一個實施方式中，功能性變體包含具有至少一個非保守胺基酸取代的親本CAR的胺基酸序列。在這種情況下，非保守胺基酸取代可能不會干擾或抑制功能性變體的生物活性。非保守胺基酸取代可以增強功能性變體的生物活性，使得該功能性變體的生物活性相比於親本CAR增加。
保守胺基酸取代在本領域係已知的，並且本文在此描述。
本揭露之CAR可以基本上由本文所述之一或多個特定的胺基酸序列組成，使得其他組分（例如，其他胺基酸）不會實質性改變功能性變體的生物活性。
本揭露之CAR（包括功能性部分和功能性變體）可為任何長度，即，可以包含任何數目的胺基酸，其條件是CAR（或其功能部分或功能性變體）保留它們的生物活性，例如，與抗原特異性結合、檢測宿主中的患病細胞（例如，癌細胞）、或治療或預防宿主疾病等的能力。例如，CAR可以為約50至約5000個胺基酸長，如約50、約70、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約225、約250、約275、約300、約325、約350、約375、約400、約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、約625、約650、約675、約700、約725、約750、約775、約800、約825、約850、約875、約900、約925、約950、約975、約1000和或更多個胺基酸長度。
本揭露之CAR（包括本發明之功能性部分和功能性變體）可以包含合成的胺基酸，代替一或多種天然存在的胺基酸。此類合成的胺基酸在本領域係已知的，並且包括，例如，胺基環己烷羧酸、正白胺酸、α-胺基正癸酸、高絲胺酸、S-乙醯基胺基甲基-半胱胺酸、反式-3-和反式-4-羥脯胺酸、4-胺基苯丙胺酸、4-硝基苯丙胺酸、α-(2-胺基-2-降莰烷)-甲酸、α,γ-二胺基丁酸、α,β-二胺基丙酸、高苯丙胺酸、4-氯苯基丙胺酸、4-羧基苯基丙胺酸、β-苯基絲胺酸 β-羥基苯基丙胺酸、苯基甘胺酸、α-萘基丙胺酸、環己基丙胺酸、環己基甘胺酸、N′-苄基-N′-甲基-離胺酸、N′,N′-二苄基-離胺酸、6-羥離胺酸、鳥胺酸、α-胺基環戊烷羧酸、α-胺基環己烷羧酸、α-胺基環庚烷羧酸、吲哚啉-2-甲酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、和α-三級丁基甘胺酸。
本揭露之CAR（包括功能性部分和功能性變體）可以進行翻譯後修飾。它們可以經由例如，二硫橋被糖基化、酯化、N-醯化、醯胺化、羧化、磷酸化、酯化、環化，或轉化為酸加成鹽。在一些實施方式中，它們被二聚化或聚合、或軛合。
可以藉由本領域已知的方法獲得本揭露之CAR（包括其功能性部分和功能性變體）。從頭合成多肽和蛋白質的合適方法描述於參考文獻中，如Chan等人,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis [Fmoc固相肽合成], Oxford University Press [牛津大學出版社], 牛津, 英國, 2000；Peptide and Protein Drug Analysis [肽和蛋白質藥物分析], Reid, R.編輯, 馬塞爾德克爾公司（Marcel Dekker，Inc.）,2000；和Epitope Mapping [表位作圖], Westwood等人編輯, Oxford University Press [牛津大學出版社], 牛津, 英國, 2001。此外，可以使用標準重組方法，使用本文所述之核酸來重組產生CAR。此外，一些CAR（包括其功能性部分和功能性變體）可以從如植物、細菌、昆蟲、哺乳動物等來源分離和/或純化。分離和純化的方法在本領域係已知的。可替代地，本揭露之CAR（包括其功能性部分和功能性變體）可以商業合成。在這方面，CAR、多肽和蛋白質可以合成、重組、分離、和/或純化。
本揭露還提供了與本揭露之CAR的表位結合的抗體或其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段可以對CAR的功能性部分具有任何水平的親和力（affinity、avidity）。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段可以以一定範圍的親和力（KD ）結合CD33。在一個實施方式中，與CD33結合的抗體具有KD 等於或小於約10− 7 M，如但不限於1-9.9（或其中的任何範圍或值，如1、2、3、4、5、6、7、8或9）× 10− 8 M、10− 9 M、10− 10 M、10− 11 M、10− 12 M、10− 13 M、10− 14 M、10− 15 M或其中的任何範圍或值，如藉由熟悉該項技術者所實踐的藉由表面等離子共振或Kinexa方法所確定的。一個示例性親和力為等於或小於1 × 10− 8 M。另一個示例性親和力為等於或小於1 × 10− 9 M。
測試抗體與本揭露之CAR的任何功能性部分結合的能力的方法在本領域係已知的，並且包括任何抗體-抗原結合測定法，例如像，放射免疫測定（RIA）、蛋白質印跡、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、免疫沈澱和競爭性抑制測定。
包含抗體或其抗體片段的CAR的部分可以以各種形式存在，其中抗原結合結構域表現為連續多肽鏈的一部分，該連續多肽鏈包括，例如，單結構域抗體片段（sdAb）、scFv和人嵌合或人源化抗體（Harlow等人, 1999,In: Using Antibodies: A Laboratory Manual [使用抗體：實驗室手冊], Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], 紐約；Harlow等人, 1989,In: Antibodies: A Laboratory Manual [抗體：實驗室手冊], Cold Spring Harbor [冷泉港實驗室出版社], 紐約；Houston等人, 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 85:5879-5883；Bird等人, 1988,Science [科學] 242:423-426）。在一方面，本揭露之CAR的抗原結合結構域包含抗體片段。在一個實施方式中，本揭露之CAR包含含有scFv的抗體片段。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該細胞外抗原結合結構域結合CD33。
本揭露還提供了CAR,該CAR包含 含有結合CD33的抗原結合結構域之細胞外結構域； 跨膜結構域；以及 視需要包含至少一個共刺激結構域的細胞內傳訊結構域。
在一些實施方式中，CAR進一步包含CD8a鉸鏈區。
在一些實施方式中，CAR包含CD8a跨膜區（CD8a-TM）多肽和細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含共刺激結構域和初級傳訊結構域，該共刺激結構域包含TNF受體超家族成員9（CD137）組分，該初級傳訊結構域包含T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分。
在一些實施方式中，該CAR包含 CD8a鉸鏈區，該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 157具有至少90%同一性的胺基酸序列； 跨膜結構域，該跨膜結構域包含與SEQ ID NO: 162具有至少90%同一性的胺基酸序列；和/或 細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含具有與SEQ ID NO: 163具有至少90%同一性的胺基酸序列之共刺激結構域和具有與SEQ ID NO: 164具有至少90%同一性的胺基酸序列之初級傳訊結構域。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該細胞外抗原結合結構域結合CD33並且包含： SEQ ID NO: 81的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 52的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 83的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 84的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 86的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 88的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 105的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 95的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 106的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 107的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 185的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 188的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 192的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 196的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 200的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 202的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些實施方式中，CAR包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該細胞外抗原結合結構域結合CD33並且包含SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些實施方式中，CAR包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該細胞外抗原結合結構域結合CD33並且包含SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些實施方式中，CAR包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該細胞外抗原結合結構域結合CD33並且包含SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些實施方式中，CAR包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該細胞外抗原結合結構域結合CD33並且包含SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些實施方式中，CAR包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該細胞外抗原結合結構域結合CD33並且包含SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些實施方式中，CAR包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該細胞外抗原結合結構域結合CD33並且包含SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR1、LCDR2和LCDR3，和SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
表4a、4b、4c、4d、4e和4f中描述了示例性HCDR和LCDR序列。
在一些實施方式中，CDR根據Kabat定義。
在一些實施方式中，CDR根據Chothia定義。
在一些實施方式中，CDR根據IMGT定義。
在一些實施方式中，CDR根據AbM定義。
在一些實施方式中，CDR根據Contact定義。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34、35、253、254或255的HCDR1，SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、42、43、44、256、257或258的HCDR2，SEQ ID NO: 45、46、47、48、49、50、51、259、260或261的HCDR3，SEQ ID NO: 62、63、64、65、66、67、68、265或266的LCDR1，SEQ ID NO: 69、70、71、72、73、74、267或268的LCDR2，和SEQ ID NO: 75、76、77、78、79、80、269或270的LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 33、89、167、172或176的HCDR1，SEQ ID NO: 90、91、168、173或177的HCDR2，SEQ ID NO: 92、93、94、169、174、178或180的HCDR3，SEQ ID NO: 98、99、100、182、186、189、193、197或201的LCDR1，SEQ ID NO: 101、102、103、183、187、190、194或198的LCDR2，和SEQ ID NO: 104、184、191、195或199的LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34、35、253、254或255的HCDR1、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 33、89、167、172或176的HCDR1、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、42、43、44、256、257或258的HCDR2、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 90、91、168、173或177的HCDR2、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 45、46、47、48、49、50、51、259、260或261的HCDR3、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 92、93、94、169、174、178或180的HCDR3、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 62、63、64、65、66、67、68、265或266的LCDR1、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 98、99、100、182、186、189、193、197或201的LCDR1、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 69、70、71、72、73、74、267或268的LCDR2、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 101、102、103、183、187、190、194或198的LCDR2、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 71或146的LCDR3、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 75、76、77、78、79、80、269或270的LCDR3、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 104、184、191、195或199的LCDR3、或其保留取代。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含分別是SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87或88的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含 a) SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c) SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f) SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i) SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j) SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l) SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL；
在某些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。
在其他實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含 a) SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c) SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e) SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f) SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
細胞外抗原結合結構域也可為CD33結合結構域的變體，如其他地方所述（例如，實例19-20中所述之變體結構域）。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 52的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 81的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 53的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 82的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 54的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 83的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 55的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 84的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 56的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 85的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 57的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 86的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 58的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 87的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 59的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 87的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 60的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 87的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 61的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 88的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 95的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 105的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 96的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 106的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 97的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 107的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 170的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 185的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 171的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 188的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 175的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 192的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 179的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 196的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 181的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 200的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 96的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 202的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 262的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 271的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 263的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 272的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，細胞外抗原結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 264的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VH，和含有與SEQ ID NO: 273的多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列之VL。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含scFv。在一些實施方式中，scFv包含介於VL與VH之間的連接子多肽。
在一些實施方式中，連接子多肽包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列。在一些實施方式中，連接子多肽包含與SEQ ID NO: 108具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，連接子多肽包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列（例如，其中該連接子多肽由SEQ ID NO: 108的胺基酸序列組成）。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、274、275和276。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 203的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 204的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 205的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 206的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 207的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 208的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 209的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 210的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 211的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 212的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 213的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 214的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 215的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 216的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 217的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 218的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 219的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 220的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 221的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 213的胺基酸序列。
在其他實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 216的胺基酸序列。
在其他實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 219的胺基酸序列。
在其他實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列。
在其他實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列。
在其他實施方式中，結合CD33的細胞外抗原結合結構域係scFv，該scFv包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 203的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 204的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 205的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 206的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 207的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 208的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 209的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 210的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 211的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 212的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 213的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 214的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 215的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 216的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 217的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 218的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 219的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 220的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 221的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 274的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 275的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、274、275或276。
在某些實施方式中，CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 213、216、219、274、275或276。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 18的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 19的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 19的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 20的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 21的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 21的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 22的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 22的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 23的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 23的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 24的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 24的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 25的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 25的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 26的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 26的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 27的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 203的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 203的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 204的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 204的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 205的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 205的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 206的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 206的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 207的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 207的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 208的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 208的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 209的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 209的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 210的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 210的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 211的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 211的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 212的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 212的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 213的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 213的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 214的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 214的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 215的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 215的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 216的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 216的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 217的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 217的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 218的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 218的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 219的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 219的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 220的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 220的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 221的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 221的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 274的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 275的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列。
本揭露提供了CAR，該CAR包含細胞外抗原結合結構域，該細胞外抗原結合結構域包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
本揭露還提供了CAR，該CAR包含結合CD33的細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中結合CD33的細胞外抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列。
在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含選自由以下組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9（CD137）組分、T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分、分化簇（CD27）組分、分化簇超家族成員（例如像，CD28或可誘導的T細胞共刺激分子（ICOS））組分、及其組合。
在一些實施方式中，該CD137組分包含SEQ ID NO: 163的胺基酸序列。在一些實施方式中，CD137組分包含與SEQ ID NO: 163的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，該CD3z組分包含SEQ ID NO: 164的胺基酸序列。在一些實施方式中，CD3z組分包含與SEQ ID NO: 164的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含SEQ ID NO: 165的胺基酸序列。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含與SEQ ID NO: 165的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98或至少99%同一性的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 165 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一些實施方式中，跨膜結構域包含CD8a跨膜區（CD8a-TM）多肽。在一些實施方式中，該CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO: 162 的胺基酸序列。（IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；SEQ ID NO: 162 ）。
在一些實施方式中，CD8a-TM多肽包含與SEQ ID NO: 26的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，跨膜結構域包含至少T細胞受體、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD40、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的α、β或ζ鏈的一或多個跨膜區。在一些實施方式中，跨膜結構域包含至少ζ、η或FcεR1γ和-β、MB1（Igα）、B29或CD3-γ、ζ或η的跨膜結構域。在一些實施方式中，跨膜結構域係合成的，例如，主要包含疏水殘基（如白胺酸和纈胺酸、苯丙胺酸的三聯體、或色胺酸）。
在一些實施方式中，CAR進一步包含將跨膜結構域與結合CD33的細胞外抗原結合結構域連接的鉸鏈區。在一些實施方式中，該鉸鏈區是CD8a鉸鏈區。在一些實施方式中，CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO: 157 的胺基酸序列（ TSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；SEQ ID NO: 157）。
在一些實施方式中，CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 157 的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，鉸鏈區包含胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP（SEQ ID NO: 158），或包含與EPKSCDKTHTCPPCP（SEQ ID NO: 158）具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，鉸鏈區包含序列ERKCCVECPPCP（SEQ ID NO: 159），或包含與ERKCCVECPPCP（SEQ ID NO: 159）具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，鉸鏈區包含序列ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3 （SEQ ID NO: 160），或包含與ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3 （SEQ ID NO: 160）具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，鉸鏈區包含序列ESKYGPPCPSCP（SEQ ID NO: 161），或包含與ESKYGPPCPSCP（SEQ ID NO: 161）具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。CAR 構建體和表現 CAR 的免疫反應細胞
本揭露還提供了編碼本文所述之CAR的分離的多核苷酸。
除非另外說明，否則「編碼胺基酸序列的多核苷酸」包括彼此呈簡並形式且編碼相同胺基酸序列的所有多核苷酸序列。編碼蛋白質或RNA的短語多核苷酸也可包括內含子，就此來說編碼該蛋白質的多核苷酸在一些變體中可以含有一或多個內含子，該內含子被剪接至表現的蛋白質中。
本揭露還提供了包含編碼本揭露之CAR的核酸分子的表現載體。
術語「表現載體」係指包含重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸包含有效地連接至待表現的核苷酸序列的表現控制序列。表現載體包含足夠的用於表現的順式作用元件；用於表現的其他元件可以由宿主細胞或在體外表現系統中提供。表現載體包括本領域已知的所有載體，包括併入重組多核苷酸的黏粒、質體（例如，裸的或包含在脂質體中的）和病毒（例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒）。
本揭露還提供了包含本揭露之CAR的分離的免疫反應細胞。在一些實施方式中，用CAR轉導分離的免疫反應細胞，例如，CAR在免疫反應細胞的表面上組成型表現。在某些實施方式中，用至少一個共刺激配體進一步轉導分離的免疫反應細胞，使得該免疫反應細胞表現至少一個共刺激配體。在某些實施方式中，該至少一個共刺激配體選自由以下組成之群組：4-1BBL、CD48、CD70、CD80、CD86、OX40L、TNFRSF14及其組合。在某些實施方式中，用至少一個細胞介素進一步轉導分離的免疫反應細胞，使得該免疫反應細胞分泌至少一個細胞介素。在某些實施方式中，該至少細胞介素選自由以下組成之群組：IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21及其組合。在一些實施方式中，分離的免疫反應細胞選自由以下組成之群組：T淋巴細胞（T細胞）、自然殺手（NK）細胞、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）、調節性T細胞（Treg）、人胚胎幹細胞、淋巴先驅細胞、T細胞前體細胞和可從中分化出淋巴細胞的多能幹細胞。
在一些實施方式中，分離的免疫反應細胞係T細胞。
出於本文之目的，T細胞可為任何T細胞，如培養的T細胞，例如，原代T細胞或來自培養的T細胞系的T細胞，例如，Jurkat、SupT1等、或獲得自哺乳動物的T細胞。如果獲得自哺乳動物，則T細胞可獲得自大量來源，包括但不限於骨髓、血液、淋巴結、胸腺或其他組織或液體。T細胞還可以被富集或純化。該T細胞可為人T細胞。該T細胞可以為從人分離的T細胞。該T細胞可為任何類型的T細胞並且可以處於任何發展階段，包括但不限於，CD4+ /CD8+ 雙陽性T細胞、CD8+ T細胞（例如，細胞毒性T細胞）、CD4+ 輔助T細胞，例如，Th1和Th2細胞、周邊血單核細胞（PBMC）、周邊血白血球（PBL）、腫瘤浸潤性細胞、記憶T細胞、初始T細胞等。該T細胞可為CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。
在一些實施方式中，分離的免疫反應細胞係NK細胞。
在一些實施方式中，分離的免疫反應細胞係CTL。
在一些實施方式中，分離的免疫反應細胞係Treg。
在一些實施方式中，分離的免疫反應細胞係人胚胎幹細胞。
在一些實施方式中，分離的免疫反應細胞係淋巴先驅細胞。
在一些實施方式中，分離的免疫反應細胞係多能幹細胞。
在一個實施方式中，可以藉由向細胞中引入慢病毒載體來產生本揭露之CAR T細胞，該慢病毒載體包含所需的CAR，例如，包含細胞外結構域的CAR，該細胞外結構域包含結合CD33的抗原結合結構域、CD8α鉸鏈和跨膜結構域、以及人4-1BB和CD3-ζ傳訊結構域。本揭露之CAR T細胞能夠在體內複製，導致長期的持久性，這可以導致持續的腫瘤控制。
本發明之實施方式進一步提供了包含本文所述之重組表現載體中的任何一種的宿主細胞。如本文所用，術語「宿主細胞」係指可以含有重組表現載體的任何類型的細胞。宿主細胞可為真核細胞，例如，植物、動物、或藻類、真菌，或者可為原核細胞，例如，細菌或原生動物。宿主細胞可為培養的細胞或原代細胞，即，直接從生物體（例如，人）分離的細胞。宿主細胞可為貼壁細胞或懸浮細胞，即，生長在懸浮液中的細胞。合適的宿主細胞在本領域係已知的並且包括，例如，DH5α 大腸桿菌細胞、中國倉鼠卵巢細胞、猴VERO細胞、COS細胞、HEK293細胞等。為了擴增或複製重組表現載體，宿主細胞可為原核細胞，例如，DH5α細胞。為了產生重組CAR、多肽、或蛋白質，宿主細胞可為哺乳動物細胞。宿主細胞可為人細胞。儘管宿主細胞可為任何細胞類型，可以來源於任何類型的組織，並且可以處於任何發育階段，但是宿主細胞也可為周邊血淋巴細胞（PBL）。宿主細胞可為T細胞。
還提供了包含本文所述之至少一個宿主細胞的細胞群體。該細胞群體可為包含宿主細胞的異源群體，除至少一種其他細胞（例如，宿主細胞（例如，T細胞））外，該宿主細胞還包含所述重組表現載體中的任何一種，該宿主細胞不包含以下重組表現載體中的任何一種，或除T細胞外的細胞，例如，B細胞、巨噬細胞、紅血球、嗜中性球、肝細胞、內皮細胞、上皮細胞、肌細胞、腦細胞等。可替代地，該細胞群體可為基本上同質的群體，其中該群體主要包含含有重組表現載體的宿主細胞（例如，基本上由其組成）。該群體還可為細胞的選殖群體，其中該群體的所有細胞均為含有重組表現載體的單個宿主細胞的選殖，從而該群體的所有細胞都包含該重組表現載體。在一個實施方式中，該細胞群體係包含宿主細胞的選殖群體，該等宿主細胞包含本文所述之重組表現載體。多核苷酸、宿主細胞和載體
本揭露還提供了編碼本揭露之CD33結合蛋白中任何一種的分離的多核苷酸。CD33結合蛋白包括結合CD33的抗原結合結構域、包含結合CD33的抗原結合結構域之蛋白質、包含結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質、和包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之嵌合抗原受體（CAR）。
本發明還提供了編碼CD33結合蛋白或其片段中的任何一種的分離的多核苷酸。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263、264、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382或382的VH。
在某些實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 53的VH。
在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 56的VH。
在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 59的VH。
在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 262的VH。
在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 263的VH。
在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 264的VH。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87,88、271、272、273、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397或398的VL。
在某些實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 82的VL。
在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 85的VL。
在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 87的VL。
在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 271的VL。
在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 272的VL。
在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 273的VL。    本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27的VH。
在一些實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263、264、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382或382的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272、273、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397或398的VL。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼 a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l)  SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL或 m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼 a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220 221、274、275或276的多肽。本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 18的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 19的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 20的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 21的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 22的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 23的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 24的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 25的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 26的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 27的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 203的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 204的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 205的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 206的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 207的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 208的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 209的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 210的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 211的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 212的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 213的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 214的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 215的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 216的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 217的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 218的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 219的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 220的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 221的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 274的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 275的多肽。
本發明還提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 276的多肽。
在某些實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 213的多肽。在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 216的多肽。在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 219的多肽。在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 274的多肽。在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 275的多肽。在其他實施方式中，分離的多核苷酸編碼SEQ ID NO: 276的多肽。
本揭露還提供了分離或純化的多核苷酸，該分離或純化的多核苷酸編碼本揭露之CAR中的任何一種、或其功能性部分或功能性變體。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220 ，221、274、275或276的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 18的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 19的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 20的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 21的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 22的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 23的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 24的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 25的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 26的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 203的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 204的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 205的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 206的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 207的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 208的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 209的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 210的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 211的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 212的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 213的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 214的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 215的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 216的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 217的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 218的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 219的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 220的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 221的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼CAR的分離的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列。
本揭露之一些實施方式還提供了分離或純化的核酸，該分離或純化的核酸包含與編碼本揭露之CD33結合蛋白的多核苷酸互補的多核苷酸、或在嚴格條件下與編碼本揭露之CD33結合蛋白的多核苷酸雜交的多核苷酸。
在嚴格條件下雜交的多核苷酸可以在高嚴格條件下雜交。「高嚴格條件」意指多核苷酸以與非特異性雜交相比可檢測地更強的量與靶序列（本文所述之核酸中的任何一種的核苷酸序列）特異性雜交。高嚴格條件包括將具有完全互補序列的多核苷酸，或僅含有少量分散錯配的多核苷酸與偶然有幾個小區域（例如，3-12個鹼基）與核苷酸序列相匹配的隨機序列區分開的條件。這種互補小區域比14-17個或更多鹼基的全長補體更容易融化，並且高嚴格雜交使它們易於區分。相對高嚴格條件可以包括，例如，低鹽和/或高溫度條件，如在約50°C-70°C的溫度下，由約0.02-0.1 M NaCl或等價物提供的條件。此類高嚴格條件容忍很少的核苷酸序列與模板或靶標鏈之間的錯配（如果存在任何錯配），並且特別適合於檢測本文所述之CAR中的任何一種的表現。通常應理解，藉由添加增加數量的甲醯胺可以使條件更加嚴格。
本揭露之多核苷酸序列可以可操作地連接至一或多個調控元件，如啟動子或增強子，以允許核苷酸序列在預期的宿主細胞中表現。該多核苷酸可為cDNA。該啟動子可為強、弱、組織特異性、可誘導的或發育特異性的啟動子。可以使用的示例性啟動子係次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HPRT）、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅素、人肌肉肌酸等。此外，許多病毒啟動子在真核細胞中具有組成型功能，並且適合與所述實施方式一起使用。此類病毒啟動子包括巨細胞病毒（CMV）立即早期啟動子、SV40的早期和晚期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）啟動子、莫洛尼（Maloney）白血病毒的長末端重複序列（LTR）、人類免疫缺陷病毒（HIV）、愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr Virus，EBV）、勞氏肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus，RSV）、和其他反轉錄病毒、以及單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子。也可以使用可誘導的啟動子如金屬硫蛋白啟動子、四環素誘導的啟動子、強力黴素誘導的啟動子、含有一或多個干擾素刺激的響應元件（ISRE）（如蛋白激酶R 2',5'-寡腺苷酸合成酶）的啟動子，Mx基因、ADAR1等。
本發明還提供了包含本發明之多核苷酸的載體。本揭露還提供了包含本發明之多核苷酸的表現載體。此類載體可為質體載體、病毒載體、用於桿狀病毒表現的載體、基於轉座子的載體或任何其他適於藉由任何手段將本發明之合成多核甘酸引入給定生物體或遺傳背景的載體。編碼本揭露之CD33結合蛋白的多核苷酸可以可操作地連接至一或多種表現載體中的控制序列，以確保CD33結合蛋白的表現。此類調控元件可以包括轉錄啟動子、編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列、和控制轉錄和翻譯的終止的序列。表現載體還可以包括一或多種非轉錄元件（如複製起點）、連接至待表現的基因上的合適的啟動子和增強子、其他5’或3’側翼非轉錄序列、5’或3’非翻譯序列（如必要的核糖體結合位點）、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點或轉錄終止序列。也可以併入賦予在宿主中進行複製的能力的複製起點。
表現載體可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸間鍵聯、或兩種類型的鍵聯。非天然存在的或改變的核苷酸或核苷酸間鍵聯不妨礙載體的轉錄或複製。
一且載體己經併入到適當的宿主中，則宿主在適合於高水平表現由併入的多核苷酸編碼的本揭露之CD33結合蛋白的條件下維持。用於轉化脊椎動物細胞的表現載體中的轉錄和翻譯控制序列可由病毒源提供。示例性載體可以如Okayama和Berg, 3Mol. Cell. Biol . [分子細胞生物學] 280 (1983)所述構建。
本揭露之載體還可以含有一或多個內部核糖體進入位點（IRES）。將IRES序列包含在融合載體中可能有利於增強某些蛋白質的表現。在一些實施方式中，載體系統將包括一或多個聚腺苷酸化位點（例如，SV40），該等聚腺苷酸化位點可以在上述核酸序列中的任一個的上游或下游。載體組分可以以提供表現基因產物的最佳間隔的方式（即，藉由在ORF之間引入「間隔子」核苷酸）連續連接或排列，或以另一種方式定位。調控元件（如IRES模體）也可以排列以提供最佳表現間隔。
本揭露之載體可為環形的或線性的。它們可以被製備成含有在原核或真核宿主細胞中起作用的複製系統。複製系統可源自，例如，ColE1、SV40、2μ質體、λ、牛乳頭瘤病毒等。
重組表現載體可以設計用於暫態表現、穩定表現或兩者。同樣，可以製備重組表現載體用於組成型表現或用於誘導的表現。
此外，可以製備重組表現載體以包括自殺基因。如本文所用，術語「自殺基因」係指導致表現自殺基因的細胞死亡的基因。自殺基因可為賦予該基因所表現的細胞對藥劑（例如藥物）的敏感性，並在細胞接觸或暴露於該藥劑時導致細胞死亡的基因。自殺基因在本領域係已知的並且包括，例如，單純皰疹病毒（HSV）胸苷激酶（TK）基因、胞嘧啶去胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基還原酶。
載體還可以包含本領域熟知的選擇標記。選擇標記包括陽性和陰性選擇標記。標記基因包括殺生物劑抗性，例如，對抗生素、重金屬等的抗性，在營養缺陷宿主中的互補以提供原營養等。示例性標記基因包括抗生素抗性基因（例如，新黴素抗性基因、潮黴素抗性基因、康黴素抗性基因、四環素抗性基因、青黴素抗性基因、組胺醇抗性基因、組胺醇x抗性基因）、麩醯胺酸合酶基因、用於更昔洛韋（ganciclovir）選擇的HSV-TK、HSV-TK衍生物、或用於6-甲基嘌呤選擇的細菌嘌呤核苷磷酸化酶基因（Gadi等人, 7Gene Ther [基因治療].1738-1743 (2000)）。編碼選擇標記或選殖位點的核酸序列可也以在編碼目的多肽或選殖位點的核酸序列的上游或下游。
可以使用的示例性載體係細菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（斯曲傑公司（Stratagene），拉荷亞（La Jolla），加利福尼亞州，美國）；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5（法瑪西亞公司（Pharmacia），烏普薩拉（Uppsala），瑞典）。真核的：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG（斯曲傑公司）pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL（法瑪西亞公司）、pEE6.4（龍沙集團（Lonza））和pEE12.4（龍沙集團）。另外的載體包括pUC系列（富酶泰斯生命科學公司，葛籣伯尼，馬里蘭州）、pBluescript系列（斯曲傑公司、拉荷亞，加利福尼亞州）、pET系列（諾瓦基公司（Novagen），麥迪森，威斯康辛州）、pGEX系列（瑪西亞生物技術公司（Pharmacia Biotech），烏普薩拉（Uppsala），瑞典）和pEX系列（Clontech公司，帕洛阿爾托（Palo Alto），加利福尼亞州）。噬菌體載體可以使用，如λGT10、λGT11、λEMBL4和λNM1149、λZapII（斯曲傑公司）。示例性植物表現載體包括pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3和pBIN19（Clontech公司）。示例性動物表現載體包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo（Clontech公司）。表現載體可為病毒載體，例如，反轉錄病毒載體，例如，γ反轉錄病毒載體。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263、264、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382或382的VH。
在某些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 53的VH。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 56的VH。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 59的VH。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 262的VH。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 263的VH。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 264的VH。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272、273、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397或398的VL。
在某些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 82的VL。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 85的VL。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 87的VL。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 271的VL。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 272的VL。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27的VH。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、262、263、264、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382或382的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87、88、271、272、273、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397或398的VL。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼 a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； k) SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l)  SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL； m) SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。在其他實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼 a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、274、275或276的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 18的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 19的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 20的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 21的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 22的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 23的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 24的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 25的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 26的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 27的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 203的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 204的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 205的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 206的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 207的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 208的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 209的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 210的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 211的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 212的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 213的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 214的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 215的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 216的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 217的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 218的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 219的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 220的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 221的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 274的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 275的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 276的多肽。
在一些實施方式中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼本揭露之CAR中的任何一種、或其功能性部分或功能性變體。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、274、275或276的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 18的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 19的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 20的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 21的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 22的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 23的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 24的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 25的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 26的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 203的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 204的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 205的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 206的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 207的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 208的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 209的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 210的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 211的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 212的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 213的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 214的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 215的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 216的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 217的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 218的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 219的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 220的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 221的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列。
在一些實施方式中，載體包含編碼CAR的多核苷酸，該CAR包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列。
本發明還提供了宿主細胞，該宿主細胞包含本發明之一或多種載體。「宿主細胞」係指已向其中引入了載體的細胞。可以理解的是，術語宿主細胞不僅旨在指特定的主題細胞，而且指這種細胞的子代，還指由特定的主題細胞產生的穩定的細胞系。由於突變或環境影響而在後續世代中可能發生一些修飾，這樣的子代可能與親代細胞不同，但是仍然包括在如本文所用的術語「宿主細胞」之範圍內。這種宿主細胞可為真核細胞、原核細胞、植物細胞或古細菌細胞。大腸桿菌（Escherichia coli ）、桿菌（如枯草芽孢桿菌、和其他腸桿菌，如沙門氏菌、沙雷氏菌（Serratia））、和各種假單胞菌物種是原核宿主細胞的實例。其他微生物（例如酵母）也可用於表現。酵母屬（例如，釀酒酵母（S. cerevisiae））和畢赤酵母屬係合適的酵母宿主細胞的實例。示例性真核細胞可為哺乳動物、昆蟲、禽或其它動物來源。哺乳動物真核細胞包括永生化細胞系，如融合瘤或骨髓瘤細胞系如SP2/0（美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），馬納薩斯，維吉尼亞州，CRL-1581）、NS0（歐洲細胞培養物保藏中心（European Collection of Cell Cultures，ECACC），索爾茲伯里（Salisbury），威爾特郡，英國，ECACC號85110503）、FO（ATCC CRL-1646）和Ag653（ATCC CRL-1580）鼠細胞系。示例性人骨髓瘤細胞系係U266（ATTC CRL-TIB-196）。其它有用的細胞系包括源自中國倉鼠卵巢（CHO）細胞的那些，如CHO-K1SV（龍沙生物醫藥股份有限公司（Lonza Biologics），沃克斯維爾，馬里蘭州）、CHO-K1（ATCC CRL-61）或DG44。
本揭露還提供了產生本揭露之CD33結合蛋白之方法，該方法包括在表現K2結合蛋白的條件下培養本揭露之宿主細胞，以及回收由該宿主細胞產生的CD33結合蛋白。製備蛋白質和純化它們的方法係已知的。一經合成（化學或重組），則可以根據標準程式純化CD33結合蛋白，該等標準程序包括硫酸銨沈澱、親和柱、柱層析法、高效液相層析法（HPLC）純化、凝膠電泳等（一般參見Scopes, Protein Purification [蛋白質純化]（Springer-Verlag [柏林斯普林格出版社], 紐約,（1982)）。主題蛋白可為基本上純的，例如，至少約80%至85%純度、至少約85%至90%純度、至少約90%至95%純度、或至少約98%至99%、或更大純度，例如，不含除主題蛋白以外的污染物如細胞碎片、大分子等。
可以使用標準分子生物學方法將編碼本揭露之CD33結合蛋白的多核苷酸併入載體。使用熟知的方法進行宿主細胞轉化、培養、抗體表現和純化。
因此，本發明提供了產生包含表現本發明之核苷酸的多肽的方法，該核苷酸編碼本發明之多肽。在某些實施方式中，多核苷酸編碼SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。在其他實施方式中，多核苷酸編碼SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。在其他實施方式中，多核苷酸編碼SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。在其他實施方式中，多核苷酸編碼SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 82的VL。在其他實施方式中，多核苷酸編碼SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。在其他實施方式中，多核苷酸編碼SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。
在本方法的某些實施方式中，多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 53的VH之多肽，和編碼包含SEQ ID NO: 82的VL的多肽。在其他實施方式中，多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 56的VH之多肽，和編碼包含SEQ ID NO: 85的VL的多肽。在其他實施方式中，多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 59的VH之多肽，和編碼包含SEQ ID NO: 87的VL的多肽。在其他實施方式中，多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 262的VH之多肽，和編碼包含SEQ ID NO: 271的VL的多肽。在其他實施方式中，多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 263的VH之多肽，和編碼包含SEQ ID NO: 272的VL的多肽。在其他實施方式中，多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 264的VH之多肽，和編碼包含SEQ ID NO: 273的VL的多肽。
當多肽由藉由不同核酸編碼的分離的鏈形成時，本發明提供了產生多肽的方法，該多肽包含表現本發明之核苷酸，該等核苷酸編碼本發明之多肽。在某些實施方式中，本發明之第一多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 53的VH之多肽，並且本發明之第二多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 82的VL的多肽。在其他實施方式中，本發明之第一多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 56的VH之多肽，並且本發明之第二多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 85的VL的多肽。在其他實施方式中，本發明之第一多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 59的VH之多肽，並且本發明之第二多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 87的VL的多肽。在其他實施方式中，本發明之第一多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 262的VH之多肽，並且本發明之第二多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 271的VL的多肽。在其他實施方式中，本發明之第一多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 263的VH之多肽，並且本發明之第二多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 272的VL的多肽。在其他實施方式中，本發明之第一多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 264的VH之多肽，並且本發明之第二多核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 273的VL的多肽。
修飾的核苷酸可用於產生本揭露之多核苷酸。示例性修飾的核苷酸係5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、羧甲基胺甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、N6 -取代的腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷、5″-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6 -異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、懷丁苷（wybutoxosine）、假尿嘧啶、辮苷（queuosine）、β-D-半乳糖基辮苷、肌苷、N6 -異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、和2,6-二胺基嘌呤。藥物組成物 / 投與
本揭露還提供了藥物組成物，該藥物組成物包含本揭露之CD33結合蛋白和藥學上可接受的載劑。
本揭露還提供了藥物組成物，該藥物組成物包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域和藥學上可接受的載劑。
本揭露還提供了藥物組成物，該藥物組成物包含含有本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之蛋白質和藥學上可接受的載劑。
本揭露還提供了藥物組成物，該藥物組成物包含含有本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質和藥學上可接受的載劑。
本揭露還提供了藥物組成物，該藥物組成物包含含有本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之CAR和藥學上可接受的載劑。
對於治療用途，本揭露之CD33結合蛋白可以製備為藥物組成物，該藥物組成物含有有效量的抗體作為藥學上可接受的載劑中的活性成分。「載劑」係指與本發明之抗體一起投與的稀釋劑、輔助劑、賦形劑或媒介物。此類媒介物可為液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成起源的那些油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。例如，可以使用0.4%鹽水和0.3%甘胺酸。該等溶液係無菌的，通常不含顆粒物質。它們可藉由常規的熟知滅菌技術（例如過濾）進行滅菌。該等組成物可以含有接近生理條件所需的藥學上可接受的輔助物質，如pH調節劑和緩衝劑、穩定劑、增稠劑、潤滑劑以及著色劑等。本發明之抗體在這種藥物配製物中的濃度可以變化，按重量計從小於約0.5%、通常為或至少約1%到多達15%或20%，並且將根據選擇的投與方式主要基於所需的劑量、流體體積、黏性等進行選擇。包含其它人蛋白如人血清白蛋白在內的合適的媒介物和配製物描述在例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓：藥學科學與實踐], 第21版, 特洛伊, D.B.編輯, Lipincott Williams和Wilkins, 費城, 賓夕法尼亞州（PA）2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing [部分5，藥物製造] 第691-1092頁, 尤其參見第958-989頁。
本揭露之CD33結合蛋白的投與方式可為任何合適途徑，如腸胃外投與，例如，皮內、肌內、腹膜內、靜脈內或皮下、經黏膜（口服、鼻內、陰道內、直腸內）或熟悉該項技術者可理解的本領域熟知的其他方式。
本發明揭露的CD33結合蛋白也可以預防性地投與，以降低發生如癌症等疾病的風險。
因此，用於肌內注射的本發明之藥物組成物可以被製備成含有1 ml無菌緩衝水以及約1 ng至約100 mg/kg，例如約50 ng至約30 mg/kg或更較佳的是約5 mg至約25 mg/kg之間的本發明揭露的CD33結合蛋白。
在本揭露之實施方式中，可在組成物中提供表現CAR的細胞，例如，包含表現CAR的細胞和藥學上可接受的載劑的一或多種合適的藥物組成物。在一方面，本揭露提供了藥物組成物，該等藥物組成物包含有效量的表現一或多種所述之CAR的淋巴細胞和藥學上可接受的賦形劑。本揭露之藥物組成物可以包含與一或多種藥學上或生理學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑組合的表現CAR的細胞，例如，本文所述之多種表現CAR的細胞。藥學上可接受的載劑可為藥物組成物中除活性成分以外的對受試者無毒的成分。
藥學上可接受的載劑可以包括緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。藥學上可接受的載劑的實例係生理學上相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等（如鹽、緩衝液、抗氧化劑、糖類、水性或非水性載劑）、防腐劑、潤濕劑、界面活性劑或乳化劑、或其組合。可以基於一或多種載劑的活性和配製物的所需特性（如穩定性和/或最小氧化）來實驗確定藥物組成物中一或多種藥學上可接受的載劑的量。
藥物組成物可以包含緩衝液，如乙酸、檸檬酸、甲酸、琥珀酸、磷酸、碳酸、蘋果酸、天冬胺酸、組胺酸、硼酸、Tris緩衝液、HEPPSO、HEPES、中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等；糖類，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，如EDTA或麩胱甘肽；輔助劑（例如，氫氧化鋁）；抗細菌和抗真菌劑；和防腐劑。
本揭露之藥物組成物可以配製成腸胃外或非腸胃外投與的多種方式。在一個實施方式中，該等組成物可以配製用於輸注或靜脈內投與。本文揭露的藥物組成物可以例如以無菌液體製劑（例如，等滲水溶液、乳劑、懸浮液、分散劑或黏性組成物（可以緩衝至所需的pH））的形式提供。適於口服投與的配製物可以包括液體溶液、膠囊、小袋、片劑、錠劑（lozenges、troches）、粉末、在適當液體中的液體懸浮液和乳劑。
如本文所用，關於藥物組成物的術語「藥學上可接受的」意指由聯邦或州政府的管理機構批准的或者在美國藥典或其他普遍認可的藥典中列出的，用於在動物體內和/或在人體內使用。治療方法和用途
本揭露還提供了治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該有需要的受試者投與治療有效量的本揭露之結合CD33的抗原結合結構域，持續足以治療表現CD33的癌症的時間。
本揭露還提供了治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之蛋白質，持續足以治療表現CD33的癌症的時間。
本揭露還提供了治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質，持續足以治療表現CD33的癌症的時間。
在某些實施方式中，該方法包括向受試者投與治療有效量的多特異性蛋白質（例如，雙特異性蛋白質），該多特異性蛋白質包含本揭露之結合CD33的第一抗原結合結構域和結合TRGV9的第二抗原結合結構域，持續足以治療表現CD33的癌症的時間。在某些此類實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，以及視需要，結合TRGV9的第二結合結構域係VHH。
在一些實施方式中，該方法包括向受試者投與治療有效量的多特異性蛋白質（例如，雙特異性蛋白質），該多特異性蛋白質包含結合CD33的第一抗原結合結構域和結合TRGV9的第二抗原結合結構域，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中結合CD33的第一抗原結合結構域包含： SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些此類實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，以及視需要，結合TRGV9的第二結合結構域係VHH。
在一些實施方式中，該方法包括向受試者投與治療有效量的多特異性蛋白質（例如，雙特異性蛋白質），該多特異性蛋白質包含結合CD33的第一抗原結合結構域和結合TRGV9的第二抗原結合結構域，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 213、216、219、274、275或276的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，結合TRGV9的第二結合結構域係VHH。
本揭露還提供了治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之CAR，持續足以治療表現CD33的癌症的時間。
本揭露還提供了治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之免疫軛合物，持續足以治療表現CD33的癌症的時間。
本揭露還提供了治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之藥物組成物，持續足以治療表現CD33的癌症的時間。在某些此類實施方式中，藥物組成物包含多特異性蛋白質（例如，雙特異性蛋白質），該多特異性蛋白質包含本揭露之結合CD33的第一抗原結合結構域和結合TRGV9的第二抗原結合結構域。在一些實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，以及視需要，結合TRGV9的第二結合結構域係VHH。
在一些實施方式中，該方法包括向受試者投與治療有效量的藥物組成物，該藥物組成物包含多特異性蛋白質（例如，雙特異性蛋白質），其中該多特異性蛋白質包含結合CD33的第一抗原結合結構域和結合TRGV9的第二抗原結合結構域，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中結合CD33的第一抗原結合結構域包含： SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些此類實施方式中，結合CD33的第一抗原結合結構域係scFv，以及視需要，結合TRGV9的第二結合結構域係VHH。
在一些實施方式中，該方法包括向受試者投與治療有效量的藥物組成物，該藥物組成物包含多特異性蛋白質（例如，雙特異性蛋白質），其中該多特異性蛋白質包含結合CD33的第一抗原結合結構域和結合TRGV9的第二抗原結合結構域，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 213、216、219、274、275或276的胺基酸序列。在某些此類實施方式中，結合TRGV9的第二結合結構域係VHH。
本揭露還提供了使用淋巴細胞輸注投與表現CAR的基因修飾的T細胞用於治療患有癌症或有發展癌症的風險的受試者之方法。
在至少一個實施方式中，在治療中使用自體淋巴細胞輸注。從需要治療的受試者中收集自體PBMC，並使用本文所述和本領域已知的方法激活和擴增T細胞，然後將其再回注到該受試者體內。
在一方面，本揭露總體上關於治療有發展癌症的風險的受試者。本發明還包括治療惡性腫瘤或自體免疫性疾病，其中化學療法和/或免疫療法導致受試者出現明顯的免疫抑制，從而增加該受試者患癌症的風險。
本揭露還提供了治療有發展癌病症的風險的受試者中非癌病症之方法，該方法包括向該受試者投與本揭露之結合CD33的抗原結合結構域以治療該非癌病症。
本揭露還提供了治療有發展癌病症的風險的受試者中非癌病症之方法，該方法包括向該受試者投與包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之蛋白質以治療該非癌病症。
本揭露還提供了治療有發展癌病症的風險的受試者中非癌病症之方法，該方法包括向該受試者投與包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質以治療該非癌病症。
本揭露還提供了治療有發展癌病症的風險的受試者中非癌病症之方法，該方法包括向該受試者投與本揭露之免疫軛合物以治療該非癌病症。
本揭露還提供了治療有發展癌病症的風險的受試者中非癌病症之方法，該方法包括向該受試者投與本揭露之藥物組成物以治療該非癌病症。
本揭露還提供了治療有發展癌病症的風險的受試者中非癌病症之方法，該方法包括向該受試者投與本揭露之CAR以治療該非癌病症。
本揭露還提供了預防受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的任何本揭露之結合CD33的抗原結合結構域，持續足以預防表現CD33的癌症的時間。
本揭露還提供了預防受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含任何本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之蛋白質，持續足以預防表現CD33的癌症的時間
本揭露還提供了預防受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質，持續足以預防表現CD33的癌症的時間。
本揭露還提供了預防受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之CAR，持續足以預防表現CD33的癌症的時間。
本揭露還提供了預防受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之免疫軛合物，持續足以預防表現CD33的癌症的時間。
本揭露還提供了預防受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含任何本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之藥物組成物，持續足以預防表現CD33的癌症的時間。
本揭露還提供了降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之方法，該方法包括向該受試者投與任何本揭露之結合CD33的抗原結合結構域，持續足以降低表現CD33的腫瘤細胞的量的時間。
本揭露還提供了降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之方法，該方法包括向該受試者投與包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之蛋白質，持續足以降低表現CD33的腫瘤細胞的量的時間。
本揭露還提供了降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之方法，該方法包括向該受試者投與包含本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質，持續足以降低表現CD33的腫瘤細胞的量的時間。
本揭露還提供了降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之方法，該方法包括向該受試者投與包含任何本揭露之結合CD33的抗原結合結構域之CAR，持續足以降低表現CD33的腫瘤細胞的量的時間。
本揭露還提供了降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之方法，該方法包括向該受試者投與本揭露之免疫軛合物，持續足以降低表現CD33的腫瘤細胞的量的時間。
本揭露還提供了降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之方法，該方法包括向該受試者投與本揭露之藥物組成物，持續足以降低表現CD33的腫瘤細胞的量的時間。
在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係血液癌。
在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係白血病。
在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係淋巴瘤。
在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係多發性骨髓瘤。
在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係急性骨髓性白血病（AML）。
在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係骨髓發育不良症候群（MDS）。
在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係急性淋巴細胞白血病（ALL）。
在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）。
在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係慢性骨髓白血病（CML）。
在一些實施方式中，該表現CD33的癌症係母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。
在某些實施方式中，該表現CD33的癌症係急性骨髓性白血病（AML）。
在一些實施方式中，該癌症係復發性的、難治性的、惡性的或其任何組合。
本揭露還提供了治療受試者中血液癌（例如，白血病（特別是AML）、淋巴瘤或多發性骨髓瘤）之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質，持續足以治療該血液癌的時間，其中結合CD33的抗原結合結構域包含： SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL； SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL； SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL；或者 SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL。在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL。在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL。在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL。在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL。在其他實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL。
本揭露還提供了治療受試者中血液癌（例如，白血病（特別是AML）、淋巴瘤或多發性骨髓瘤）之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質，持續足以治療該血液癌的時間，其中結合CD33的抗原結合結構域包含： SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。
本揭露還提供了治療受試者中血液癌（例如，白血病（特別是AML）、淋巴瘤或多發性骨髓瘤）之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質，持續足以治療該血液癌的時間，其中結合CD33的抗原結合結構域包含： SEQ ID NO: 18的VH； SEQ ID NO: 19的VH； SEQ ID NO: 20的VH； SEQ ID NO: 21的VH； SEQ ID NO: 22的VH； SEQ ID NO: 23的VH； SEQ ID NO: 24的VH； SEQ ID NO: 25的VH； SEQ ID NO: 26的VH；或者 SEQ ID NO: 27的VH。
本揭露還提供了治療受試者中血液癌（例如，白血病（特別是AML）、淋巴瘤或多發性骨髓瘤）之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的包含結合CD33的抗原結合結構域之多特異性蛋白質，持續足以治療該血液癌的時間，其中結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、274、275或276的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 213、216、219、274、275或276的胺基酸序列。
在一方面，本揭露提供了預防癌症之方法，該方法包括向有需要的受試者投與一定量的表現所述之一或多種CAR的淋巴細胞。
在一方面，本揭露提供了治療患有癌症的受試者之方法，該方法包括向有需要的受試者投與治療有效量的表現所述之一或多種CAR的淋巴細胞，由此該淋巴細胞誘導或調節受試者中癌細胞的殺傷。
在另一方面，本揭露提供了降低患有癌症的受試者中腫瘤負荷之方法，該方法包括向有需要的受試者投與治療有效量的表現本文所述之一或多種CAR的淋巴細胞，由此該淋巴細胞誘導受試者中血液癌細胞的殺傷。在另一方面，本揭露提供了增加患有癌症的受試者的存活之方法，該方法包括向有需要的受試者投與治療有效量的表現所述之一或多種CAR的淋巴細胞，由此該受試者的存活延長。通常，表現一或多種CAR的淋巴細胞在受試者中誘導血液癌細胞的殺傷並導致該受試者中血液腫瘤/癌細胞的減少或消除。可以靶向的包括轉移病灶在內的血液癌症的非限制性列表包括白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤。在一些實施方式中，該血液癌係急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴細胞白血病（ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓白血病（CML）或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。
在一方面，提供的治療患有癌症的受試者之方法包括向有需要的受試者投與治療有效量的表現CAR的淋巴細胞，該CAR具有結合CD33抗原的細胞外抗原結合結構域，由此該淋巴細胞誘導受試者中癌細胞的殺傷。
在一方面，揭露了癌細胞的靶向殺傷之方法，該方法包括將癌細胞與表現所述之一或多種CAR的淋巴細胞接觸，由此該淋巴細胞誘導癌細胞的殺傷。可以靶向的包括血液癌細胞在內的癌細胞非限制性列表包括白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤。在一些實施方式中，該血液癌係急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴細胞白血病（ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓白血病（CML）或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。
當指示治療有效量時，醫生可以考慮年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移的程度和受試者的狀況的個體差異來確定待投與的本揭露之CAR或CAR-T的精確量。通常可以說，可以將本文所述之包含T細胞的藥物組成物以以下劑量投與：約104 至約1010 個細胞/kg體重，在一些情況下為約105 至約106 個細胞/kg體重，包括在那些範圍內的所有整數值。在一些實施方式中，可以以約106 個細胞/kg體重的劑量投與本文所述之包含T細胞的藥物組成物。還可以將T細胞組成物以該等劑量多次投與。可以使用免疫療法中公知的融合技術投與細胞（參見例如，Rosenberg等人,New Eng. J. of Med. [新英格蘭醫學雜誌] 319:1676, 1988）。
本發明之CAR-T的背景下有用的遞送系統可以包括隨時間釋放的、延遲釋放的和持續釋放的遞送系統以便使T細胞組成物的遞送在足夠的時間之前或伴隨足夠的時間發生，以導致待治療的部位的敏化。該組成物可與其他治療劑或治療協同使用。這種系統可避免組成物的重複投與，從而增加受試者和醫生的方便性，並且尤其適用於本發明之某些組成物實施方式。
許多類型的釋放遞送系統係可獲得的並且係本領域的那些普通技術者已知的。它們包括基於聚合物的系統如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚酯醯胺、聚原酸酯、聚己內酯、聚羥基丁酸和聚酐。含有藥物的上述聚合物的微膠囊描述於，例如，美國專利案號5,075,109。遞送系統還包括非聚合物系統，該等非聚合物系統係脂質，包括甾醇，如膽固醇、膽固醇酯和脂肪酸或中性脂肪如單-雙和三-甘油酯；矽橡膠（sylastic）系統；基於肽的系統；水凝膠釋放系統；蠟包衣；使用傳統結合劑和賦形劑的壓縮的片劑；部分融合植入物等。特定的實例包括但不限於：(a) 侵蝕系統，其中以在基質中的形式含有活性組成物，如美國專利案號第4,452,775；4,667,014；4,748,034；和5,239,660中描述的那些，以及 (b) 擴散系統，其中活性組分以可控制的速率從聚合物中滲出，如美國專利案號3,854,480和3,832,253中所描述的。此外，可使用基於泵的硬體遞送系統，其中一些係適於植入的。
在某些方面，可能需要向受試者投與活化的T細胞，隨後再抽取血液（或進行單采血液成分術），根據本揭露激活T細胞，並向受試者重新灌注該等活化的和擴增的T細胞。此過程可以每幾週進行多次。在某些方面，可以從10 cc到400 cc的抽血中激活T細胞。在某些方面，從20 cc，30 cc，40 cc，50 cc，60 cc，70 cc，80 cc，90 cc或100 cc的抽血中激活T細胞。
可以以任何方式進行CAR-T細胞和組成物的投與，例如藉由腸胃外或非腸胃外投與，包括藉由霧化吸入、注射、輸注、攝取、輸血、植入或移植。例如，本文所述之CAR-T細胞和組成物可以經動脈內、皮內、皮下、瘤內、髓內、結節內、肌內、藉由靜脈內（i.v.）注射或腹膜內向患者投與。在一方面，本揭露之組成物藉由i.v.注射投與。在一方面，本揭露之組成物藉由皮內或皮下注射向受試者投與。T細胞的組成物可以注射，例如，直接注射到腫瘤、淋巴結、組織、器官或感染的部位。
投與可為自體的或非自體的。例如，表現CD33特異性CAR的免疫反應細胞可從一個受試者獲得，並將其投與於相同受試者或不同的相容受試者。本揭露之周邊血來源的T細胞或擴增的T細胞（例如，體內、離體或體外來源）可以經由例如靜脈內注射、局部注射、全身注射、導管投與或腸胃外投與來投與。
在特定的實施方式中，受試者可以經歷白血球去除術，其中白血球被離體收集、富集或耗盡，以選擇和/或分離目的細胞，例如，T細胞。該等T細胞分離物可以藉由本領域已知的方法擴增並處理，使得可以引入本揭露之一或多種CAR構建體，從而產生CAR-T細胞。有需要的受試者隨後可經受高劑量化學療法的標準治療，然後進行周邊血幹細胞移植。在某些方面，在移植後或與移植同時，受試者接受擴增的CAR-T細胞的輸注。在一方面，在手術之前或之後投與擴增的細胞。
向患有惡性腫瘤的患者投與的劑量足以緩解或至少部分阻止所治療的疾病（「治療有效量」）。向受試者投與進行上述治療的劑量將因所治療的病症的確切性質和接受治療者的不同而不同。人體投與劑量的調整可以根據本領域普遍接受的做法進行。
本發明之CAR T細胞可以經受體內T細胞擴增並且可以建立CD33特異性記憶細胞，該等CD33特異性記憶細胞在血液和骨髓中以高水平持續存在。在一些情況下，輸注到受試者中的本發明之CAR T細胞可以在患有晚期化學療法抗性癌症的受試者體內消除癌細胞，例如血液癌細胞。
在一個實施方式中，例如，使用體外轉錄將本揭露之CAR引入T細胞，並且受試者（例如，人類）接收本揭露之CAR-T細胞的初始投與和CAR-T細胞的一次或多次後續投與，其中該一次或多次後續投與在前一次投與後少於15天（例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天）投與。在一個實施方式中，每週向受試者（例如，人類）投與超過一次的CAR-T細胞的投與，例如每週投與2、3或4次CAR-T細胞的投與。在一個實施方案中，受試者每週接受超過一次的CAR-T細胞投與（例如，每週2、3或4次投與）（在本文中也稱為週期），隨後是一週沒有CAR-T細胞投與，然後向該受試者投與一次或多次額外的CAR-T細胞投與（例如，每週超過一次的CAR-T細胞投與）。在另一個實施方式中，受試者接受超過一個週期的CAR-T細胞，並且每個週期之間的時間小於10、9、8、7、6、5、4或3天。在一個實施方式中，每隔一天投與一次CAR-T細胞，每週投與3次。在一個實施方式中，CAR-T細胞投與持續至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或更多週。
在一個實施方式中，可在一天、兩天、三天、四天、五天、六天、一週、兩週、三週、一個月、五週、六週、七週、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或更長時間後重複投與。重複的療程也是可能的，長期投與也是如此。重複投與可以以相同劑量或不同劑量。
在本發明之方法中，CAR-T細胞可以藉由維持療法（例如，每週一次，持續6個月或更長時間）進行投與。
在一個實施方式中，使用慢病毒病毒載體（如慢病毒）產生CAR-T細胞。用這種病毒載體產生的CAR-T細胞通常會具有穩定的CAR表現。
在一個實施方式中，CAR-T細胞在轉導後4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天暫態表現CAR載體。CAR的暫態表現可以受RNA CAR載體傳遞的影響。在一個實施方式中，藉由電穿孔將CAR RNA轉導到T細胞中。
如果患者在暫態CAR治療（如由RNA轉導產生的抗體）過程中產生抗CAR抗體反應的風險很高，則CAR-T輸液中斷時間不應持續超過十至十四天。組合療法
本揭露之CD33結合蛋白可以與至少一種另外的療法組合投與。
在一些實施方式中，該至少一種另外的療法是手術、化學療法、或放射或其任何組合。
在一些實施方式中，一種治療的遞送在第二治療的遞送開始時仍然發生，這樣就給藥而言存在著重疊。這在本文中有時被稱為「同時遞送」或「並行遞送」。在其他實施方式中，一種治療的遞送在另一種治療的遞送開始前結束。在任一情況的一些實施方式中，這種治療由於組合投與變得更加有效。例如，與不存在第一治療的條件下投與第二治療所觀察到的結果相比，第二治療更有效，例如使用更少的第二治療觀察到等效的作用，或者第二治療將症狀減少更大的程度，或者觀察到對第一治療而言類似的情況。在一些實施方式中，與不存在另一種治療的條件下遞送一種治療所觀察到的結果相比，遞送使得症狀或與該障礙相關的其他參數減少更多。兩種治療的效果可以部分累加、完全累加或大於累加。這種遞送可為使得所遞送的第一治療的作用在遞送該第二治療時仍然是可以檢測的。
在一個實施方式中，其他治療劑如因子可在CD33結合蛋白（如CAR-T細胞）之前、之後或同時（same time、simultaneous with））投與，該等CD33結合蛋白包括但不限於白血球介素、以及集落刺激因子，如G-、M-和GM-CSF、和干擾素。
本文所述之CD33結合蛋白（如表現CAR的細胞）和至少一種另外的治療劑可以同時投與，以相同或單獨的組成物，或按順序投與。對於順序投與，可以首先投與本文所述之CD33結合蛋白（如表現CAR的細胞），然後可以投與另外的試劑，或者可以顛倒投與順序。
在另一個實施方式中，本文所述之CD33結合蛋白（如表現CAR的細胞）可在治療方案中與手術、放射、化學療法、免疫抑制劑、抗體或其他免疫清除劑組合使用。在一個實施方式中，可以向受試者投與增強表現CAR的細胞活性的藥劑。例如，在一個實施方式中，該藥劑可為抑制抑制分子的藥劑。
提供以下實例以進一步描述本文揭露的一些實施方式。該等實例旨在說明但不限制揭露的實施方式。實例
還藉由以下實例來描述和證實本發明。然而，該等和在本說明書中任何地方的其他實例的用途僅是用於說明而絕非限制本發明或任何例證術語的範圍和意義。同樣地，本發明不限於本文所述之任何特定的較佳的實施方式。事實上，本發明之許多修飾和變異對於熟悉該項技術者在閱讀本說明書時係顯而易見的，並且可以在不脫離本發明之精神或範圍的情況下進行這種變異。本發明因此僅由所附請求項連同該等請求項所權要求的等同物的全部範圍來限定。實例 1 ：抗原產生
編碼人CD33細胞外結構域（ECD）或其子結構域的表現構建體係基於骨髓細胞表面抗原CD33（Uniprot登錄號P20138）的序列及其結構域注釋設計的，該結構域注釋具有6X His標籤序列或作為與人血清白蛋白（HSA）（C端具有6X His標籤序列）的C34S變體的融合蛋白。基於NCBI登錄號XP_005590138.1，設計了編碼來自食蟹獼猴（cynomolgus monkey，Macaca fascicularis ）的CD33（ECD）或其子結構域的相似表現構建體。產生的抗原的胺基酸序列顯示在表3中。
根據製造商的方案，使用Expifectamine將人和食蟹獼猴CD33全長ECD或子結構域表現構建體暫態轉染到HEK293衍生細胞Expi293（博科公司（Gibco）/賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific））中。在收穫前，將細胞在定軌振盪器上以8% CO2 在37°C下孵育5天。藉由離心去除表現的細胞，並使用固定化金屬親和層析法，使用Ni瓊脂糖6快速（Sepharose 6 Fast Flow）樹脂（GE醫療公司（GE Healthcare））從培養基中純化帶有his標籤的可溶性CD33蛋白，隨後使用Zeba™ Spin Desalting柱（7K MWCO，10 mL；賽默科技公司，目錄號：89893），按照製造商的說明，將緩衝液交換到1X 杜氏磷酸鹽水（Dubelcco’s Phosphate Saline）緩衝液（pH 7.2，無鈣或鎂）中。 [表 3 ]. CD33抗原的胺基酸序列。
蛋白AA ID 描述 胺基酸序列
C33W1 HSA N末端融合；食蟹獼猴CD33ECD-HSA(C34S)-6xHis DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGSGSGSENLYFQGVRSSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHHHH （SEQ ID NO: 225）
C33W2 HSA N末端融合；人CD33ECD-Tev-HSA(C34S)-6xHis DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSGSGSENLYFQGVRSSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHHHH （SEQ ID NO: 226）
C33W3 HSA N末端融合；hCD33 Ig樣V型結構域（Uniprot P20138，V136-H259）在C末端與HSA和6xHis標籤融合 DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH （SEQ ID NO: 227）
C33W4 HSA N末端融合；hCD33 Ig樣C2型結構域（Uniprot P20138，V136-H259）在C末端與HSA和6xHis標籤融合 VHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH （SEQ ID NO: 228）
C33W8 hCD33_Ig樣V型結構域 DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRGSHHHHHH （SEQ ID NO: 229）
C33W9 hCD33 Ig樣C2型結構域 VHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH （SEQ ID NO: 230）
C33W10 MuIgV_人IgC2嵌合體 CD33-6xHis_v1 QDLEFQLVAPESVTVEEGLCVHVPCSVFYPSIKLTLGPVTGSWLRKGVSLHEDSPVATSDPRQLVQKATQGRFQLLGDPQKHDCSLFIRDAQKNDTGMYFFRVVREPFVRYSYKKSQLSLHVTSLSRTPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH （SEQ ID NO: 231）
C33W12 MuIgV_食蟹獼猴IgC2嵌合體 CD33-6xHis_v1 QDLEFQLVAPESVTVEEGLCVHVPCSVFYPSIKLTLGPVTGSWLRKGVSLHEDSPVATSDPRQLVQKATQGRFQLLGDPQKHDCSLFIRDAQKNDTGMYFFRVVREPFVRYSYKKSQLSLHVTSLSRTPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGRKARKQGVVQGSHHHHHH （SEQ ID NO: 232）
C33W49 來自具有C末端6xHis標籤的Uniprot P20138的人CD33 ECD（D18-H259） DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH （SEQ ID NO: 233）
C33W50 來自具有C末端6xHis標籤的XP_005590138.1的食蟹獼猴CD33 ECD（D37-Q274） DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGSHHHHHH （SEQ ID NO: 234）
C33W51 來自具6xHis標籤的Uniprot P20138的人CD33 ECD（D18-G241） DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGHHHHHH （SEQ ID NO: 235）
實例 2. 抗 CD33 抗體的產生
如下使用開放單選殖技術（OMT）或Ablexis轉基因小鼠技術產生抗體。AlivaMab和OMT轉基因小鼠均經工程化以產生人/小鼠免疫球蛋白。用重組人CD33蛋白（從表1中選擇的抗原）免疫AlivaMab或OMT轉基因小鼠。從次級淋巴器官中提取淋巴細胞，並與FO小鼠骨髓瘤細胞系融合以產生融合瘤，或經由FACS進行單細胞分選。藉由MSD電化學發光法篩選融合瘤上清液與過表現人CD33 ECD HEK細胞的結合。與親本HEK細胞（陰性信號）相比，用FACS進一步分析從篩選中鑒定出的樣本與過表現人CD33 ECD HEK細胞（陽性信號）的結合。使用ELISA對確認的細胞結合劑進行輕鏈同種型。藉由MSD電化學發光法篩選單細胞分選上清液與重組人CD33蛋白的結合。選擇了幾個具有所需結合特徵的命中，並進行了定序。
如下進行V區選殖。使用Smarter cDNA合成套組（Clontech公司，芒廷維尤（Mountain View），加利福尼亞州），將藉由Qiagen® RNeasy Plus Mini套組純化的RNA和B細胞裂解物用於進行cDNA合成。為了促進cDNA的合成，使用oligodT激活所有信使RNA的逆轉錄，然後用Smarter IIA寡核苷酸進行「5'加帽」。隨後的VH和VL片段的擴增是使用靶向Smarter IIA帽的5'引物和靶向CH1中的共識區的3'引物，使用2步PCR擴增進行的。簡而言之，每個50 μl PCR反應由20 µM的正向和反向引物混合物、25 μl的PrimeStar Max DNA聚合酶預混合物（Clontech公司）、2 μl的未純化的cDNA、以及21 μl的雙蒸餾H2O組成。循環程序在94°C下開始，持續3分鐘，然後進行35次循環（94°C下持續30秒，55°C下持續1 min，68°C下持續1 min），並在72°C下持續7 min結束。使用VL和VH第二輪引物進行第二輪PCR，該等第二輪引物含有15 bp的互補延伸，該等互補延伸與它們各自的Lonza母體載體（VH和VL）中的各自區域「重疊」。第二輪PCR以以下程序進行：94°C持續3 min；35次循環（94°C下持續30秒，55°C下持續1 min，68°C下持續1 min），並在72°C下經7 min結束。使用In-Fusion®HD選殖套組（Clontech公司，美國）將VL基因定向選殖到Lonza人IgK或λ載體中，並將VH基因選殖到Lonza 人IgG1載體中。為了便於In-Fusion® HD選殖，在進行In-Fusion® HD選殖之前，用選殖增強子處理PCR產物。選殖和轉化按照製造商的方案進行（Clonetech公司，美國）。對迷你製備型DNA進行Sanger定序，以確認獲得了完整的V基因片段。
表4示出了藉由上述方法產生的每種抗體的重鏈和輕鏈的胺基酸序列。 [表 4 ].
抗體名稱 重鏈和輕鏈的胺基酸序列（根據Kabat系統的CDR，用黑體和下劃線表示）
C33B1474 VH：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SFGMS WVRQAPGKGLEWVA NIKRDGSEKYYVDSVKG RFTISRDNAKNSLFLQMSSLRAEDTAVYYCVR DYGYFDF WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 52）   VL： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC QASQAISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY DASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFSTYFC QHYDNLPYT FGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 81）  
C33B1522 VH： QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS SYYWG WIRQPPGKGLEWIG YIYYSGSTNYNPSLKS RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR MWEILGFDP WGQGTLVTVS（SEQ ID NO: 53）   VL： QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGSNPVN WYQQLPGTAPKLLIY SNNQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFC AAWDDSLNGPV FGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 82）  
C33B1607 VH： EVQLQQSGPELVKPGSSVKISCKASGYTFT DYNIN WVKQSHGKNLEWIG TINPNNGVTFYNQRFKG QATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCSR DGYDTYYAMDY WGQGTTLTVSS（SEQ ID NO: 54）   VL： DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVRTAEA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYT GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC QQYYTTPRT FGGGTKLEIK（SEQ ID NO: 83）  
C33B1601 VH： EVQLVESGGGLVRPGGSLKLSCAASGFTFS NYAMS WVRQTPEKRLEWVA GISNSGYSLYYPDTLKG RFTISRDNARNTLYLQMISLRSEDTAMYYCAR DGGSYPYAMDY WGHGTSVTVSS（SEQ ID NO: 55）   VL： DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC KASQNVGTYVA WYQQKPGHSPKALIY SASYRYS GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFC QQYKSYPLT FGAGTKLELK（SEQ ID NO: 84）  
C33B1517 VH： QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIR NYYWS WIRQTAGKGLEWLG HIYSTGNIHYNPSLKS RVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAR DNGAALFDY WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 56）   VL： QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGSNIVN WYQQFPGTAPKLLIY SNNQRPS GVPDRVSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC AAWDDSLNGPV FGPGTKVTVL（SEQ ID NO: 85）  
C33B1495 VH： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFS SYWMS WVRQAPGKGLDWVA NIKRDGSEKHYVDSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDSAVYYCTR DYGYFDY WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 57）   VL： DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC RASQGISSYLA WYQQKPGKAPKVLIY AASTLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFC QQLNSYPVT FGGGTKVEIK（SEQ ID NO: 86）  
C33B1478 VH： EVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFS VSAIH WVRQASGKGLEWIG RIRSKGNSYATAYDVSVKG RFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTR HNDKWNYYGLDV WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 58）   VL： DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC KSSQSLLFSNGYKFLD WYLQRPGQSPQLLIY LGSYRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYC MQALQTPPT FGGGTKVEIK（SEQ ID NO: 87）  
C33B1477 VH： EVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFS VSAIH WVRQASGKGLEWIG RIRSKGNSYATAYAASVKG RFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTR HNDKWNYYGLDV WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 59）   VL： DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC KSSQSLLFSNGYKFLD WYLQRPGQSPQLLIY LGSYRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYC MQALQTPPT FGGGTKVEIK（SEQ ID NO: 87）  
C33B1476 VH： EVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFS VSAIH WVRQASGKGLEWIG RIRSKGNSYATAYNVSVKG RFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTR HNDKWNYYGLDV WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 60）   VL： DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC KSSQSLLFSNGYKFLD WYLQRPGQSPQLLIY LGSYRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYC MQALQTPPT FGGGTKVEIK（SEQ ID NO: 87）  
C33B1484 VH： EVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFS VFAIH WVRQASGKGLEWIG RIRSKGNSYATAYDVSVKG RFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTR HNDKWNYYGLDV WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 61）   VL： DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC KSSQSLLFSNGYKFLD WYLQRPGQSPQLLIY LGSYRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYC MQALQTPPT FGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 88）  
C33B933 VH： QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQSPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DFRSLDWLPPDSTSYDGMDV WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 95）   VL： SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGHKLGDKYASWYQQKPGQSPVVVIYKDSKRPSGIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 105）  
C33B919 VH： QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DFRSFDWLPPDSTSYYGMDV WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 96）   VL： SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVSWYQQKPGQSPVVVIHQDRKRPSGIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 106）  
C33B931 VH： EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYWMS WVRQAPGKGLEWVA NIKQHGSEKYYVDSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRDLGYFDY WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 97）   VL： SYELTQPPSVSVSPGQTASITC SGDKLGSKFAS WYQQKPGQSPVLVIY QDSKRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWDSSTVV FGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 107）  
C33B836 VH： QVQLVQSGSELRKPGASVKVSCKASGYTFT NYAMN WVRQAPGQGLEWMG WINTNTGNPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSSAYLQISSLKAEDTAMYYCAT DRDRGTDY WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 170）   VL： QSALTQPASVSGSPGQSITISC TGTSSDVGDYNYVS WYQQHPGKVPKLMIY DVSNRPS GVSNRFSGSMSGNTASLTISGLQAEDEADYYC SSYSSSSALEV FGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 185）  
C33B782 VH： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYWMS WVRQAPGKGLEWVA NIKQHGSEKYYVDSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRDLGYFDY WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 171）   VL： SYELTQPPSVSVSPGQTASITC SGNKLGAKFAS WYQQKPGQSPVLVIY QDNKRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAVDEADYYC QAWDSSTVV FGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 188）  
C33B806 VH： QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS SSSYYWG WIRQPPGKGLDWIG SINYSGSTYYNPSLKS RVTISVDTSKIQFSLKLRSVTAADTAVYYCAR LDGYESPFDY WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 175）   VL： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLA WYQQKPGKAPKLLIY AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQANSFPFT FGPGTKVDIK（SEQ ID NO: 192）  
C33B904 VH： EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD DYAMH WVRQAPGKGLEWVS GIGWSGGSIVYADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK DSPYGDFFDY WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 179）   VL： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQTVFYSSNNKNYLA WYQQKPGQPPKLLIS WASTRKS GVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAEDVAVYYC QHYYSTPYT FGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 196）  
C33B937 VH： QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEGTAVYYCAK DFRSFDWLPPDSASYHGMDV WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 181）   VL： SYELTQPPSVSVSPGQTASITC SGDKLGDKYAS WYQQKPGQSPVLVIY QDGKRPS GIPERFSGSNFGNKATLTISGTQAMDEADYYC QAWDRNTVV FGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 200）  
C33B125 VH： QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DFRSFDWLPPDSTSYYGMDV WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 96）   VL： SYELTQPPSVSVSPGQTASITC SGDKLGDKYVC WYQQKPGQSPVVVIH QDRKRPS GIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWDSSTVV FGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 202）  
C33B1475 VH： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMT WVRQAPGKGLEWVA NIKQDGSERY YVDSVKG RFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EVGYNWNQGGYFDY WGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 262）   VL： DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSLLHSDGYNYLD WYLQKSGQSPQLLIY LGSYRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQVLQTPWT FGQGTKVEIK （SEQ ID NO: 271）  
C33B1516 VH： QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWS WIRQSAGKELEWFG HIFSTGHIN YDSSLKS RVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAR DNGAALFDF WGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 263）   VL： QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGSNIVN WYQQFPGTAPKLLLY SDNQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC AAWDDSLNGPV FGTGTKVTVL （SEQ ID NO: 272）  
C33B1481 VH： QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSNYWMS WVRQAPGKGLEWVA SIKRDGSDKY YVDSVKG RFTISRDNAKNSLSLQMHSLRAEDTAVYYCAK GEFDY WGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 264）   VL： DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC RSSQSLVYSDGNTYLN WFQQRPGQSPRRLIY KVSTRDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVAVYYC LQGTHWPWT FGQGTKVEIK （SEQ ID NO: 273）  
表4a示出了根據AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系統定義的C33B1522抗體（具有SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL的抗體）的CDR序列的胺基酸序列。 [表 4a ].
  HC1 HC2 HC3 LC1 LC2 LC3
AbM GGSISSYYWG （ SEQ ID NO: 399） YIYYSGSTN （SEQ ID NO: 405） MWEILGFDP （SEQ ID NO: 411） SGSSSNIGSNPVN （SEQ ID NO: 417） SNNQRPS （SEQ ID NO: 423） AAWDDSLNGPV （SEQ ID NO: 429）
Kabat SYYWG （SEQ ID NO: 29） YIYYSGSTNYNPSLKS （SEQ ID NO: 37） MWEILGFDP （SEQ ID NO: 46） SGSSSNIGSNPVN （SEQ ID NO: 63） SNNQRPS （SEQ ID NO: 70） AAWDDSLNGPV （SEQ ID NO: 76）
Chothia GGSISSY （SEQ ID NO: 435） YYSGS （SEQ ID NO: 441） MWEILGFD （SEQ ID NO: 447） SSSNIGSNP （SEQ ID NO: 453） SNN （SEQ ID NO: 459） WDDSLNGP （SEQ ID NO: 465）
IMGT GGSISSYY （SEQ ID NO: 471） IYYSGST （SEQ ID NO: 477） ARMWEILGFDP （SEQ ID NO: 483） SSNIGSNP （SEQ ID NO: 489） SNN （SEQ ID NO: 495） AAWDDSLNGPV （SEQ ID NO: 501）
Contact SSYYWG （SEQ ID NO: 507） WIGYIYYSGSTN （SEQ ID NO: 513） ARMWEILGFD （SEQ ID NO: 519） IGSNPVNWY （SEQ ID NO: 525） LLIYSNNQRP （SEQ ID NO: 531） AAWDDSLNGP （SEQ ID NO: 537）
表4b示出了根據AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系統定義的C33B1477抗體（具有SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL的抗體）的CDR序列的胺基酸序列。 [表 4b ].
HC1 HC2 HC3 LC1 LC2 LC3
AbM GFTFSVSAIH （SEQ ID NO: 400） RIRSKGNSYATA （SEQ ID NO: 406） HNDKWNYYGLDV （SEQ ID NO: 412） KSSQSLLFSNGYKFLD （SEQ ID NO: 418） LGSYRAS （SEQ ID NO: 424） MQALQTPPT （SEQ ID NO: 430）
Kabat VSAIH （ SEQ ID NO: 34） RIRSKGNSYATAYAASVKG （ SEQ ID NO: 43） HNDKWNYYGLDV （ SEQ ID NO: 51） KSSQSLLFSNGYKFLD （ SEQ ID NO: 68） LGSYRAS （ SEQ ID NO: 74） MQALQTPP T（SEQ ID NO: 80）
Chothia GFTFSVS （ SEQ ID NO: 436） RSKGNSYA （ SEQ ID NO: 442） HNDKWNYYGLD （ SEQ ID NO: 448） SQSLLFSNGYKF （ SEQ ID NO: 454） LGS （ SEQ ID NO: 460） ALQTPP （ SEQ ID NO: 466）
IMGT GFTFSVSA （ SEQ ID NO: 472） IRSKGNSYAT （ SEQ ID NO: 478） TRHNDKWNYYGLDV （ SEQ ID NO: 484） QSLLFSNGYKF （ SEQ ID NO: 490） LGS （ SEQ ID NO: 496） MQALQTPPT （ SEQ ID NO: 502）
Contact SVSAIH （ SEQ ID NO: 508） WIGRIRSKGNSYATA （ SEQ ID NO: 514） TRHNDKWNYYGLD （ SEQ ID NO: 520） LFSNGYKFLDWY （ SEQ ID NO: 526） LLIYLGSYRA （ SEQ ID NO: 532） MQALQTPP （ SEQ ID NO: 538）
表4c示出了根據AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系統定義的C33B1475抗體（具有SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL的抗體）的CDR序列的胺基酸序列。 [表 4c ].
HC1 HC2 HC3 LC1 LC2 LC3
AbM GFTFSSYWMT （ SEQ ID NO: 401） NIKQDGSERY （ SEQ ID NO: 407） EVGYNWNQGGYFDY （ SEQ ID NO: 413） RSSQSLLHSDGYNYLD （ SEQ ID NO: 419） LGSYRAS （ SEQ ID NO: 425） MQVLQTPWT （ SEQ ID NO: 431）
Kabat SYWMT （ SEQ ID NO: 253） NIKQDGSERYYVDSVKG （ SEQ ID NO: 256） EVGYNWNQGGYFDY （ SEQ ID NO: 259） RSSQSLLHSDGYNYLD （ SEQ ID NO: 265） LGSYRAS （ SEQ ID NO: 74） MQVLQTPWT （ SEQ ID NO: 269）
Chothia GFTFSSY （ SEQ ID NO: 437） KQDGSE （ SEQ ID NO: 443） EVGYNWNQGGYFD （ SEQ ID NO: 449） SQSLLHSDGYNY （ SEQ ID NO: 455） LGS （ SEQ ID NO: 461） VLQTPW （ SEQ ID NO: 467）
IMGT GFTFSSYW （ SEQ ID NO: 473） IKQDGSER （ SEQ ID NO: 479） AREVGYNWNQGGYFDY （ SEQ ID NO: 485） QSLLHSDGYNY （ SEQ ID NO: 491） LGS （ SEQ ID NO: 497） MQVLQTPWT （ SEQ ID NO: 503）
Contact SSYWMT （ SEQ ID NO: 509） WVANIKQDGSERY （ SEQ ID NO: 515） AREVGYNWNQGGYFD （ SEQ ID NO: 521） LHSDGYNYLDWY （ SEQ ID NO: 527） LLIYLGSYRA （ SEQ ID NO: 533） MQVLQTPW （ SEQ ID NO: 539）
表4d示出了根據AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系統定義的C33B1517抗體（具有SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL的抗體）的CDR序列的胺基酸序列。 [表 4d ].
HC1 HC2 HC3 LC1 LC2 LC3
AbM GASIRNYYWS （ SEQ ID NO: 402） HIYSTGNIH （ SEQ ID NO: 408） DNGAALFDY （ SEQ ID NO: 414） SGSSSNIGSNIVN （ SEQ ID NO: 420） SNNQRPS （ SEQ ID NO: 426） AAWDDSLNGPV （ SEQ ID NO: 432）
Kabat NYYWS （ SEQ ID NO: 32） HIYSTGNIHYNPSLKS （ SEQ ID NO: 40） DNGAALFDY （ SEQ ID NO: 49） SGSSSNIGSNIVN （ SEQ ID NO: 66） SNNQRPS （ SEQ ID NO: 70） AAWDDSLNGPV （ SEQ ID NO: 76）
Chothia GASIRNY （ SEQ ID NO: 438） YSTGN （ SEQ ID NO: 444） DNGAALFD （ SEQ ID NO: 450） SSSNIGSNI （ SEQ ID NO: 456） SNN （ SEQ ID NO: 462） WDDSLNGP （ SEQ ID NO: 468）
IMGT GASIRNYY （ SEQ ID NO: 474） IYSTGNI （ SEQ ID NO: 480） ARDNGAALFDY （ SEQ ID NO: 486） SSNIGSNI （ SEQ ID NO: 492） SNN （ SEQ ID NO: 498） AAWDDSLNGPV （ SEQ ID NO: 504）
Contact RNYYWS （ SEQ ID NO: 510） WLGHIYSTGNIH （ SEQ ID NO: 516） ARDNGAALFD （ SEQ ID NO: 522） IGSNIVNWY （ SEQ ID NO: 528） LLIYSNNQRP （ SEQ ID NO: 534） AAWDDSLNGP （ SEQ ID NO: 540）
表4e示出了根據AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系統定義的C33B1516抗體（具有SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL的抗體）的CDR序列的胺基酸序列。 [表 4e ].
HC1 HC2 HC3 LC1 LC2 LC3
AbM GGSIRNYYWS （ SEQ ID NO: 403） HIFSTGHIN （ SEQ ID NO: 409） DNGAALFDF （ SEQ ID NO: 415） SGSSSNIGSNIVN （ SEQ ID NO: 421） SDNQRPS （ SEQ ID NO: 427） AAWDDSLNGPV （SEQ ID NO: 433）
Kabat NYYWS （ SEQ ID NO: 254） HIFSTGHINYDSSLKS （ SEQ ID NO: 257） DNGAALFDF （ SEQ ID NO: 260） SGSSSNIGSNIVN （ SEQ ID NO: 66） SDNQRPS （ SEQ ID NO: 267） AAWDDSLNGPV （ SEQ ID NO: 76）
Chothia GGSIRNY （ SEQ ID NO: 439） FSTGH （ SEQ ID NO:445） DNGAALFD （ SEQ ID NO: 451） SSSNIGSNI （ SEQ ID NO: 457） SDN （ SEQ ID NO: 463） WDDSLNGP （ SEQ ID NO: 469）
IMGT GGSIRNYY （ SEQ ID NO: 475） IFSTGHI （ SEQ ID NO: 481） ARDNGAALFDF （ SEQ ID NO: 487） SSNIGSNI （ SEQ ID NO: 493） SDN （ SEQ ID NO: 499） AAWDDSLNGPV （ SEQ ID NO: 505）
Contact RNYYWS （ SEQ ID NO: 511） WFGHIFSTGHIN （ SEQ ID NO: 517） ARDNGAALFD （ SEQ ID NO: 523） IGSNIVNWY （ SEQ ID NO: 529） LLLYSDNQRP （ SEQ ID NO: 535） AAWDDSLNGP （ SEQ ID NO: 541）
表4f示出了根據AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系統定義的C33B1481抗體（具有SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL的抗體）的CDR序列的胺基酸序列。 [表 4f ].
HC1 HC2 HC3 LC1 LC2 LC3
AbM GITFSNYWMS （ SEQ ID NO: 404） SIKRDGSDKY （ SEQ ID NO: 410） GEFDY （ SEQ ID NO: 416） RSSQSLVYSDGNTYLN （SEQ ID NO: 422） KVSTRDS （ SEQ ID NO: 428） LQGTHWPWT （ SEQ ID NO: 434）
Kabat NYWMS （ SEQ ID NO: 255） SIKRDGSDKYYVDSVKG （ SEQ ID NO: 258） GEFDY （ SEQ ID NO: 261） RSSQSLVYSDGNTYLN （ SEQ ID NO: 266） KVSTRDS （ SEQ ID NO: 268） LQGTHWPWT （ SEQ ID NO: 270）
Chothia GITFSNY （ SEQ ID NO: 440） KRDGSD （ SEQ ID NO: 446） GEFD （ SEQ ID NO: 452） SQSLVYSDGNTY （ SEQ ID NO: 458） KVS （ SEQ ID NO: 464） GTHWPW （ SEQ ID NO: 470）
IMGT GITFSNYW （ SEQ ID NO: 476） IKRDGSDK （ SEQ ID NO: 482） AKGEFDY （ SEQ ID NO: 488） QSLVYSDGNTY （ SEQ ID NO: 494） KVS （ SEQ ID NO: 500） LQGTHWPWT （SEQ ID NO: 506）
Contact SNYWMS （ SEQ ID NO: 512） WVASIKRDGSDKY （ SEQ ID NO: 518） AKGEFD （ SEQ ID NO: 524） VYSDGNTYLNWF （ SEQ ID NO: 530） RLIYKVSTRD （ SEQ ID NO: 536） LQGTHWPW （ SEQ ID NO: 542）
如下在美洲駝中產生抗體。向三隻美洲駝皮下注射表3中的hCD33-IgC2抗原，進行三次注射（第0、14和28天），第一次注射完全弗氏佐劑，隨後注射不完全弗氏佐劑。第一次注射後，又注射了三次表3中的hCD33-FL ECD抗原（第61、76和91天）。於第14、35和86天獲得單個B細胞分選的PBMC並冷凍。將冷凍的PBMC解凍並用重組抗原誘餌染色，該等誘餌係生物素化的或與Alexa Fluor 647軛合。抗原誘餌為重組人CD33-ECD和重組人CD33-IgC結構域。使用PE標記的鏈黴親和素（SA）檢測生物素化的誘餌。使用BD FACSAria融合分選儀將抗原特異性細胞（對兩種抗原誘餌均為陽性）直接批量分揀到RLT裂解緩衝液（凱傑公司（Qiagen））中。將細胞裂解物在-80°C冷凍，並運送到Genewiz用於進一步處理。
如下進行了美洲駝vHH V區選殖和單Fc融合構建體設計。將B細胞在RealTime Ready細胞裂解緩衝液（羅氏公司）中裂解。然後將RNA用RNeasy Plus® Mini套組（Qiagen 74134）純化。使用SuperScript® cDNA套組（Invitrogen 18091-050）將新鮮RNA直接用於cDNA合成。為了促進cDNA的合成，使用oligodT激活所有信使RNA的逆轉錄。隨後的VHH片段的擴增是使用美洲駝SP和靶向CH2中的共識區的3'引物使用2步PCR擴增進行的。簡而言之，每個50 μl PCR反應由20 µM的正向和反向引物混合物、25 μl的PrimeStar Max DNA聚合酶預混合物（Clontech公司）、2 μl的未純化的cDNA、以及21 μl的雙蒸餾H2 O組成。循環程序在94°C下開始，持續3分鐘，然後進行35次循環（94°C下持續30秒，55°C下持續1 min，68°C下持續1 min），並在72°C下持續7 min結束。
對來自第一輪PCR的VHH DNA進行凝膠純化。使用第二輪引物進行第二輪VHH PCR，該等第二輪引物含有15 bp的互補延伸，該等互補延伸在它們各自的Lonza母體載體中的各自區域「重疊」。第二輪PCR以以下程序進行：94°C持續3 min；35次循環（94°C下持續30秒，55°C下持續1 min，68°C下持續1 min），並在72°C下經7 min結束。使用In-Fusion® HD選殖套組（Clontech公司，美國）將VHH基因定向選殖到具有單Fc的Lonza載體中。為了便於In-Fusion® HD選殖，在In-Fusion HD選殖之前，用選殖增強子處理PCR產物。選殖和轉化按照製造商的方案進行（Clonetech公司，美國）。對迷你製備型DNA進行Sanger定序，以確認獲得了完整的V基因片段。
表5示出了藉由上述方法產生的美洲駝抗體的重鏈的胺基酸序列。 [表 5 ].
抗體名稱 重鏈的胺基酸序列（CDR序列帶粗體下劃線）
C33B1785 VH：QVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAVFGFSLS DYAIG WFRQAPGKEREKVS CISESDGRTYLSDSVKS RFTISRDNGKNTVYLQMNNLKPDDTGVYYCAT VDQAISESSYHCEKGFGS WGQGTQVTVSS（SEQ ID NO: 18）  
C33B1784 VH： EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFS TYVMG WFRQAPGQERELVA AIVSGRNPTYADSVKS RFTISRDNAKNTIYLHMNSLQPEDTAVYYCHM YHYSSQY WGQGTQVTVSS（SEQ ID NO: 19）  
C33B1787 VH：EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFD DYAIG WFRQAPGKEREGVS CISSSDGSTYYVDSVKG RFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTA LIIMYGSGSERAAAACRYKYEY WGQGTQVTVSS（SEQ ID NO: 20）  
C33B1786 VH：EVQVVESGGGVVQSGGSLTLSCEASESILS FSTMD WFRQAPGKEREGVS CIRPRYSTTTHADSIKG RFKMYSDNAKNTIYLHMNSLQPEDTAVYYCHM YHYSSQY WGQGTQVTVSS（SEQ ID NO: 21）  
C33B1781 VH： EVQVVESGGGLVQGGGSLRLSCAASGSIFS INAMG WYHQAPGKQRELVA RITGGGATDYVDSVKG RFTISLDSAKSTVYLQMNSLKPEDTAVYHCYA DLVTRVGSDLLYDDY WGQGTQVTVSS（SEQ ID NO: 22）  
C33B1780 VH：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVFGFSLS DYAIG WFRQAPGKEREKVS CISESDGRTYLSDSVKS RFTISRDNGKNTVYLQMNNLKPDDTGVYYCAT VDQAISESSYHCEKGFGS WGQGTQVTVSS（SEQ ID NO: 23）  
C33B1783 VH： EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFD DYAVG WFRQVPGKEREGVS CISSSDGATYYADSVKG RFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTA IIVRGSGWERAAAACRYEYSY WGQGTQVTVSS（SEQ ID NO: 24）  
C33B1782 VH：EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFD DYAVG WFRQAPGKEREGIS CISSSDGATYYADSVKG RFTISTDNAKNTAFLQMNSLKPEDTAVYYCTA VIVRGTGWERAAAACRYEYAY WGQGTQVTVSS（SEQ ID NO: 25）  
C33B1789 VH： QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVFGFSLS DYAIG WFRQAPGKEREKVS CISESDGRTYLSDSVKS RFTISRDNGKNTVYLQMNNLKPDDTGVYYCAT VDQAISESSYHCEKGFGS WGQGTQVTVSS（SEQ ID NO: 26）  
C33B1788 VH：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVFGFSLS DYAIG WFRQAPGKEREKVS CISESDGRTYLSDSVKS RFTISRDNGKNTVYLQMNNLKPDDTGVYYCAT VDQAISESSYHCEKGFGS WGQGTQVTVSS（SEQ ID NO: 27）  
按照製造商的建議，藉由用編碼蛋白質的純化質體DNA暫態轉染，在ExpiCHO-S™細胞（賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher Scientific）；沃爾瑟姆，麻塞諸塞州，目錄號A29127）中表現抗CD33抗體和vHH-單Fc融合蛋白。簡而言之，將ExpiCHO-S™細胞懸浮在ExpiCHO™表現培養基（賽默飛世爾科技公司，目錄號A29100）中，並置於設定在37°C，8% CO2 和125 RPM的定軌振盪培養箱中。在轉染前將細胞傳代並稀釋到6.0 x 106 個細胞/ml，保持細胞活力在99.0%或更高。使用ExpiFectamine™ CHO轉染套組（賽默飛世爾科技公司，目錄號A29131）進行暫態轉染。對於每ml要轉染的稀釋細胞，使用0.5微克的編碼DNA的scFv Fc融合物和0.5微克的pAdVAntage DNA（普洛麥格公司（Promega），目錄號E1711），並稀釋到OptiPRO™ SFM複合培養基中。將ExpiFectamine™ CHO試劑以1 : 4的比率（v/v，DNA : 試劑）使用，並稀釋到OptiPRO™中。將稀釋的DNA和轉染試劑結合一分鐘，允許DNA/脂質複合物形成，然後將其添加到細胞中。過夜孵育後，按照製造商的標準方案，將ExpiCHO™飼料和ExpiFectamine™ CHO增強子添加至細胞。在收穫培養液之前，將細胞在37°C的定軌振盪下（125 rpm）孵育七天。將暫態轉染的ExpiCHO-S™細胞的培養上清液藉由離心（30 min，3000 rcf）澄清，然後過濾（0.2 µm PES膜，康寧；康寧公司（Corning），紐約）。
如下進行蛋白質純化。使用AKTAXpress層析系統，將過濾的細胞培養上清液載入到預先平衡的（1xDPBS，pH 7.2）MabSelect Sure蛋白A柱（GE醫療公司）上。上樣後，用10倍柱體積的1xDPBS（pH 7.2）洗滌柱。將蛋白質用10倍柱體積的0.1 M乙酸鈉（Na）（pH 3.5）洗脫。藉由添加2.5 M Tris HCl（pH 7.5）至洗脫級分體積的20%（v/v）來立即中和蛋白質級分。將峰級分合併並過濾（0.2 μm）。藉由分析型粒徑排阻HPLC（Agilent HPLC系統）評估純化的蛋白質的品質。實例 3. 藉由表面等離子共振（ SPR ； Biacore ）表徵抗 CD33 抗體和美洲駝 vHH
藉由SPR獲得抗CD33抗體與人CD33（全長ECD和IgC2結構域）相互作用的親和力（KD ）。使用抗人Fc抗體捕獲抗CD33抗體，並將抗原注射到溶液中。數據顯示於下表6中。 [表 6 ].
蛋白質ID號 與人CD33結合（FL ECD） K D （ nM ） 與人CD33結合（IgC2） K D （ nM ）
C33B1474 2.47 3.99
C33B1517 4.44 沒有結合
C33B919 0.5 沒有結合
C33B1522 ＞ 10 沒有結合
C33B1607 1.49 沒有結合
C33B933 0.5 未測量
C33B125 0.1 ＞ 10
C33B931 0.4 未測量
C33B937 0.3 56
C33B1601 1.1 6.8
使用Biacore 8K儀器藉由表面等離子共振（SPR）確定抗CD33抗體和美洲駝vHH與重組人CD33（FL-ECD或IgC2結構域）的結合親和力。使用山羊抗Fc抗體修飾的GLC晶片捕獲Fc融合的scFv或單Fc融合的vHH，並用40 nM-1.6 nM的濃度跨度的CD33抗原的5倍連續稀釋液進行滴定。使用50 μL/ min的流速分別監測2分鐘和30分鐘的締合和解離。原始結合數據藉由減去空白的分析物結合信號來參考，並使用Biacore軟體使用1 : 1 Langmuir結合模型進行分析，以獲得用於計算結合親和力的動力學。
抗CD33美洲駝vHH與人CD33（FL-ECD或IgC2結構域）的相互作用的親和力（KD ）。使用抗人Fc抗體捕獲單Fc骨架上的抗CD33美洲駝vHH，並將抗原注射到溶液中。數據示於下表7中。針對人CD33抗原（FL ECD和IgC2結構域）的抗CD33 vHH相互作用的代表性Biacore 8K傳感圖也示於圖 1 中。 [表 7 ].
vHH 蛋白 ID 與人CD33結合（FL ECD）KD （M ） 與人CD33結合（IgC2）KD （ M ）
C33B1783 8.59E-11 無/低結合
C33B1782 2.06E-10 無/低結合
C33B1786 3.57E-10 無/低結合
C33B1785 6.61E-10 3.31E-09
C33B1789 6.70E-10 3.03E-09
C33B1788 7.07E-10 4.34E-09
C33B1787 7.92E-10 無/低結合
C33B1780 8.47E-10 3.38E-09
C33B1781 2.21E-09 5.59E-11
C33B1784 低nM結合物；在此濃度下響應低 無/低結合
藉由在Prometheus® NT.Plex儀器（諾坦普科技有限公司（NanoTemper Technologies））上的nanoDSF確定抗CD33 scFv-Fc融合抗體和美洲駝VHH的熱穩定性。測量係藉由將來自384孔樣本板的樣本載入到標準毛細管（諾坦普科技有限公司）進行的。重複兩次或三次運行。在1.0°C/分鐘的熱升溫中，從20°C到95°C監測熱去折疊。熱變形溫度（中點溫度Tm）和聚集溫度的開始（Tagg）由PR自動確定。ThermControl軟體（諾坦普科技有限公司）並使用PR.Stability分析軟體（諾坦普科技有限公司）進行進一步分析。數據示於下表8中。 [表 8 ]. 使用 nanoDSF 儀器獲得的抗 CD33 scFv 和 vHH 抗體（單 Fc 骨架上的美洲駝 vHH ）的熱穩定性數據
vHH 蛋白 ID Tm1 （ °C ） Tm2 （ °C ） Tm3 （ °C ）
C33B1780 50.2 72.1
C33B1781 52.6 53
C33B1782 50.3 66.5
C33B1783 51.4 64.7
C33B1784 48.4 58.5
C33B1785 49.9 63
C33B1786 48.0 63.6
C33B1787 50.4 59.3
C33B1788 50.2 63.5 75.7
C33B1789 50.2 63.8 81.5
[表 8a ]： 使用nanoDSF儀器獲得的抗CD33 scFv和vHH抗體的熱穩定性數據。使用了SEQ ID NO: 277的IgG1 Fc骨架。scFv直接附接至該IgG1骨架，而無需使用連接子序列。人 IgG1 Fc 骨架上的 scFv
scFv-Fc融合蛋白ID scFv選殖ID 蛋白質描述 親本mAb 平均Tm1—ScFv（°C） 平均Tm2（°C） 平均Tm3（°C） 平均Tagg（°C） 平均開始（°C）
C33B1689 C33B1617 C33B1617_LH_Fc C33B937 58 67.7 80.6 71.8 53.6
C33B1699 C33B1617 C33B1617_HL_Fc C33B937 56.4 67.8 80.7 77.9 51.7
C33B1690 C33B1618 C33B1618_LH_Fc C33B933 63.1 80.7 77.7 52.5
C33B1700 C33B1618 C33B1618_HL_Fc C33B933 63.7 80.5 79.6 52.2
C33B1691 C33B1619 C33B1619_LH_Fc C33B931 61.2 68.3 80.1 78.5 56.6
C33B1701 C33B1619 C33B1619_HL_Fc C33B931 61.6 68.4 80.6 78.7 56.5
C33B1698 C33B1620 C33B1620_LH_Fc C33B919 63.5 68.8 81.3 77.6 59.2
C33B1702 C33B1620 C33B1620_HL_Fc C33B919 64.9 80.4 79.2 55.5
C33B1693 C33B1646 C33B1646_LH_Fc C33B1607 66.5 81.2 66.2 60.5
C33B1703 C33B1646 C33B1646_HL_Fc C33B1607 64.7 81 64.1 58.9
C33B1694 C33B1651 C33B1651_LH_Fc C33B1601 65.2 81.2 63.4 56.9
C33B1704 C33B1651 C33B1651_HL_Fc C33B1601 64.6 81.6 70.7 56.2
C33B1696 C33B1659 C33B1659_LH_Fc C33B1517 68.1 81.1 76.3 56.1
C33B1706 C33B1659 C33B1659_HL_Fc C33B1517 68.1 80.9 79.8 60.7
C33B1697 C33B1680 C33B1680_LH_Fc C33B1474 56.7 67.1 80.6 69 48.2
C33B1707 C33B1680 C33B1680_HL_Fc C33B1474 54.6 67.2 80.2 78.7 46.2
C33B1692 C33B1682 C33B1682_LH_Fc C33B125 65 81 77.7 55.4
C33B1708 C33B1682 C33B1682_HL_Fc C33B125 63.9 80.2 80.5 58.8
實例 4 ： CD33 scFv CAR 的構建和表現 構建包含以下scFv序列的CD33 CAR構建體：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGDYNYVSWYQQHPGKVPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSMSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSSSSALEVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVQSGSELRKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSSAYLQISSLKAEDTAMYYCATDRDRGTDYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 203）  
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGNKLGAKFASWYQQKPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAVDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQHGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 204）  
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLDWIGSINYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLRSVTAADTAVYYCARLDGYESPFDYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 205）  
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVFYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAEDVAVYYCQHYYSTPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGIGWSGGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSPYGDFFDYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 206）  
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGHKLGDKYASWYQQKPGQSPVVVIYKDSKRPSGIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQSPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFRSLDWLPPDSTSYDGMDVWGQGTTVTVSS （SEQ ID NO: 207）  
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDGKRPSGIPERFSGSNFGNKATLTISGTQAMDEADYYCQAWDRNTVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEGTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSASYHGMDVWGQGTTVTVSS （SEQ ID NO: 208）  
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SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSPVVVIHQDRKRPSGIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSTSYYGMDVWGQGTTVTVSS （SEQ ID NO: 210）  
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGSKFASWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQHGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 211）  
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQAISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFSTYFCQHYDNLPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVANIKRDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMSSLRAEDTAVYYCVRDYGYFDFWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 212）  
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARMWEILGFDPWGQGTLVTVS （SEQ ID NO: 213）  
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QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGTGTKVTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRQSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDFWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 275）  
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVAVYYCLQGTHWPWTFGQGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVASIKRDGSDKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLSLQMHSLRAEDTAVYYCAKGEFDYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 276）  
將Dynabeads人T-Expander CD3/CD28刺激的T細胞進行電穿孔，然後用OPTI-MEM（英傑公司（Invitrogen））洗滌三次，並且以50E6/ml的最終濃度重懸於OPTI-MEM中。隨後，使用BTX ECM830（BTX哈佛裝置公司（BTX Harvard Apparatus），霍利斯頓，麻塞諸塞州，美國）將0.1 ml的細胞（5E6）與10 ug編碼RNA的IVT CAR混合，並藉由按一次「脈衝」按鈕在2-mm間隙試管（BTX哈佛裝置公司，霍利斯頓，麻塞諸塞州，美國）中電穿孔。（設置：500伏，750微秒脈衝長度和單（1）脈衝，100毫秒間隔。）電穿孔後，將T細胞轉移至6孔板中，然後立即放回37°C的培養箱中。對原代人T細胞進行電穿孔，不使用任何表現CD33 scFv CAR或無關對照CAR的mRNA（MOCK）或10 µg的mRNA。電穿孔後24小時，在用2 μg/ml生物素化的L蛋白和鏈黴親和素軛合的PE、或生物素化的CD33（1 μg/ml）和鏈黴親和素軛合的PE染色後，藉由流動式細胞分析術測量CAR表面的表現。
電穿孔後二十四小時，對T細胞進行計數。每種收集1E5個T細胞。將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，使用200 µL/孔的FACS緩衝液用於微量滴定板，棄去上清液。將所有孔用含有蛋白質L（金斯瑞公司（GenScript），目錄號M000971:500；2 ug/ml）的100 μl染色緩衝液染色，並在4°C下保存至少30分鐘，同時避光。將細胞藉由添加FACS緩衝液兩次洗滌，使用150 µL/孔用於具有FACS緩衝液的微量滴定板。在室溫下以400x g離心4分鐘。然後將上清液棄去。所有孔用100 μl鏈黴親和素-R-藻紅素（SA-PE；1 : 250）和活/死可固定近IR死細胞染色染料（Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain dye）（1 : 1000）染色，在4°C下培養至少30分鐘，同時避光。然後準備細胞用於流式細胞儀分析。
對於CD33 CAR觀察到蛋白L染色，而在沒有mRNA電穿孔的T細胞的對照T細胞中僅觀察到背景染色（約5.5%）。人原代T細胞上CAR的表現也可以經由J&J體內生物素標記的重組KLK2蛋白、然後是SA-PE檢測。如圖所示，藉由流式細胞儀測量，T細胞有效地表現了CD33 CAR，而在沒有mRNA電穿孔的T細胞或未揭露的對照CAR（非CD33特異性）的對照T細胞中只看到背景染色。實例 5 ：藉由 CD33 CAR-T 細胞殺傷腫瘤細胞
使用流式細胞儀如下進行基於CellTrace Violet（CTV，賽默飛世爾科技公司，目錄號：C34557）的細胞毒性分析的共培養。
如下製備T細胞。EP後二十四小時，將T細胞計數並以最濃的/所需的E:T需要的濃度重新懸浮。以100 μl/孔的測定添加T細胞（2 x 106 個細胞/ml；以10 : 1 E : T比率鋪板100 μl，即每2E4個靶細胞2E5個T細胞）。製備10 : 1 E : T濃度的儲備液，用完整的T細胞培養基（Optimizer w/CTS、5%人血清、1%麩醯胺酸）連續稀釋兩倍至0.3125 : 1。使用96孔圓底組織培養物處理的板將T細胞一式三份鋪板（100 ul/孔）。
如下製備CTV標記的靶細胞。向一小瓶CTV染色溶液中添加20 µL DMSO。將該儲備液稀釋到20 mL的PBS（溫熱至37°C）中，得到5 µM染色溶液。收集10E6腫瘤細胞，將其用PBS洗滌兩次並重懸於4E6/ml（2.5ml）中。添加等量（2.5 ml）的CTV染色溶液。將細胞在37°C培養箱中孵育20分鐘。向細胞中添加40 ml PRMI + 20% FBS以吸收任何未結合的染料。將細胞孵育5分鐘。將細胞在400 x g下離心5分鐘。將細胞沈澱重懸於預熱的RPMI + 10%FBS培養基中。同時，以上述所需的E/T比率接種T細胞。將CD33+腫瘤細胞系和CD33腫瘤細胞系重新計數，然後將細胞以2E5/ml和100 ul的濃度重懸。將細胞與標記的腫瘤細胞系在平底96孔板中共同孵育。
如下使用流式細胞儀進行細胞毒性測定。共培養20小時後，將所有細胞轉移至U型底96孔板中並洗滌。共培養20小時後，從平底96孔板收集所有細胞，並轉移至U型底96孔板，然後洗滌。向所有孔中添加30 μl的0.25%胰蛋白酶，並在37°C培養箱中孵育5分鐘。5分鐘後，將所有腫瘤細胞收集至U型底96孔板中。將細胞在400 x g下離心5分鐘並洗滌兩次。然後將細胞沈澱重懸於稀釋的（1 : 1000）LIVE/DEAD™可固定近IR染色染料（100 μl）中。將細胞在4°C孵育30分鐘，並將細胞以400 x g離心5分鐘，用FACS緩衝液洗滌兩次。洗滌後，使用100 μl的BD Cytofix™固定緩衝液將所有細胞固定10分鐘（50 ul FACS緩衝液+50 ul固定緩衝液）。將細胞在400 x g下離心5分鐘並洗滌一次。將細胞沈澱重懸於FACS緩衝液中。孵育期結束後，藉由多色流動式細胞分析術分析染色的樣本。使用以下公式計算細胞毒性活性的百分比： %特異性死亡 = %近IR + CTV +（死）細胞 - % 自發近IR + CTV+/（100% - %自發近IR + CTV +（死）細胞) x 100%。
暫態轉染後二十四小時，將靶細胞（CD33陽性Vcap和CD33陰性DU145細胞）用細胞示蹤紫（CTV）螢光染料標記，然後與CD33 CAR-T細胞共培養。模擬T細胞作為陰性效應對照。將細胞以效應子與靶細胞（E/T）的比率為0.3125 : 1至10 : 1的範圍共培養20小時。殺傷百分比測量為共培養中剩餘的活（活性染料陰性）靶細胞（CTV陽性）的絕對數量與不含CAR-T細胞培養的活靶細胞數量的比值。如圖所示，CD33 CAR T細胞在E/T比為10 : 1至0.3125 : 1時，能特異性地並有效裂解CD33(+)人癌細胞系，但不能裂解CD33(-)細胞，而在Mock或CD33 CAR的T細胞中只看到背景細胞毒性。
使用xCELLigence作為即時細胞分析系統，對CD33 CAR-T細胞進行即時細胞毒性測試，作為免疫細胞介導的靶細胞的細胞溶解的效力測試。
向96孔E板（ACEA生物科學公司）的每個孔中添加50 μL靶標癌細胞培養基，測量背景阻抗並顯示為細胞指數。然後，將黏附的靶細胞CD33（+）和CD33（-）分離並以5E4（VCap）、5E3個細胞/孔的密度（體積為100 μL）接種在E板上，並使其被動黏附在電極表面。接種後，將E板在層流罩內的環境溫度下保持30分鐘，然後轉移到細胞培養箱內的RTCA MP儀器中。在整個實驗期間（96小時），每隔15分鐘立即開始數據記錄。
在應用治療時（癌細胞接種後24小時），暫停數據獲取，從每個孔中取出50 μL的培養基，並以50 μL的體積以不同的效應子與靶標（E:T）的比率添加效應子CAR-T細胞。將CD33（+）CAR-T和未揭露的對照CAR（非CD33特異性）T細胞再懸浮。然後在96孔板中一式兩份進行兩倍稀釋（E/T比率從5 : 1到0.156 : 1）。將靶加模擬效應子對照物（無RNA電穿孔T細胞）也添加到靶細胞中。
將靶細胞CD33(+)和CD33(-)與模擬10 µg mRNA電穿孔（轉染後24小時）孵育為CD33(+)和CD33(-)CAR-T細胞（以不同的E/T比率），持續約72小時。產生CD33(+)和CD33(-)的歸一化細胞指數（CI）圖。當單獨接種時，靶細胞黏附在板上並增殖，增加了CI讀數。實例 6 ：藉由 CD33 CAR-T 細胞產生細胞介素
細胞毒性T細胞產生的IFN-γ可以對腫瘤進行免疫監視，這在體內和體外可以直接抑制一些惡性腫瘤的增殖並誘導其凋亡。為了確定CD33 CAR-T細胞係否能夠識別CD33(+)腫瘤細胞並被其激活，如實例5所述，從基於xCELLigence的殺傷測定中收集上清液。共培養約70小時後，收集上清液，並根據ELISA套組（IFN-γ ELISA MAX™ Deluxe，百進生技公司，目錄號430106）提供的說明進行ELISA分析。
發生抗原刺激的CAR-T細胞的IFN-γ產生。CD33 CAR和對照CAR-T細胞在與表現CD33的細胞共培養時（以E : T比例依賴的方式）分泌IFN-γ，但在與CD33陰性細胞共培養時不分泌。由於抗原表現水平比CD33高得多，未揭露的對照CAR分泌的IFN-γ的數量也高得多。實例 7 ：藉由 CD33 CAR-T 細胞殺傷腫瘤細胞
在即時IncuCyte腫瘤殺傷測定中評估CD33 CAR-T細胞，用於抗原依賴的細胞毒性。將CD33 CAR-T細胞與靶細胞以1 : 1或0.5 : 1的效應子/靶標比率（這是根據CAR表現數據計算的）共同孵育88小時。根據IncuCyte成像系統的即時測量，靶細胞被鑒定為穩定表現紅色核染料。進行以下計算：腫瘤細胞生長抑制（%）=（初始存活靶細胞數-當前存活靶細胞數）/初始存活細胞數*100（%）。實例 8 ：藉由 CD33 CAR-T 細胞產生細胞介素
從以1 : 1的E/T比率的CD33 CAR-T細胞比細胞的過夜共培養（約20小時）收集上清液，並使用13-plex Milliplex人高靈敏度T細胞套組（HSTCMAG28SPMX13）進行分析。CD33 CAR修飾的T細胞在與表現CD33的細胞共培養時分泌細胞介素，但未轉染的T細胞（UTD）分泌的細胞介素卻很少。
從以1 : 1的E/T比率的CD33 CAR-T細胞比細胞的過夜共培養（約20小時）收集上清液。CD33 CAR-T細胞在與表現CD33的細胞共培養時分泌IFN-γ，但在與CD33陰性細胞共培養時不分泌。將CD3/28珠刺激的T細胞和僅T細胞分別作為陽性和陰性對照。藉由CD33 CAR-T細胞釋放IFN-γ。顯示了來自重複培養的平均IFN-γ濃度 ± SD（pg/ml）。不同熱穩定的CAR-T細胞與CD33（+）細胞共培養時產生不同量的IFN-γ。實例 9 ： CD33 CAR-T 細胞的增殖
在增殖測定中評估CD33 CAR-T細胞。T細胞增殖係體內免疫功能的重要體外參數。為了進一步評估CD33 CAR-T細胞的功能，用CTV標記CD33 CAR-T細胞以評估T細胞增殖。
用CellTrace Violet（CTV；5 µM）標記CD33 CAR-T和未轉導（UTD）T細胞，並與CD33（+）和CD33（-）細胞共培養。共培養後五天，收穫細胞並用CD3、CD25、NearIR活/死染料和CD33 CAR進行染色。用Flowjo軟體在Fortessa流式細胞儀上進行流動式細胞分析術分析。藉由活的CD3鑒定淋巴細胞，並確定具有CTV染料稀釋和激活標記CD25的CAR-T細胞的頻率。如圖所示，藉由對CD33-CAR+ T細胞進行門控，CD33（+）細胞而不是CD33（-）細胞促進所有CAR結構。將CD3/28珠刺激的T細胞和僅T細胞分別作為陽性和陰性對照。沒有任何刺激的T細胞不會增殖，而CD3/28珠刺激的T細胞顯示出同等的增殖模式。與細胞共培養5天後，CD33 CAR-T細胞的增殖比CD3/28珠陽性對照更強。不同的CAR構建體工程化的T細胞具有不同的增殖活性，並且顯示出不同的CAR-T細胞計數。CAR-T細胞計數係基於三個技術複製的平均絕對細胞數 +/- SEM。
如下進行該方案。收集腫瘤細胞，用PBS洗滌兩次，並在37°C培養箱中以10E6/ml重懸於含有100 ug/ml的Mitomycin C（MMC）的PBS中1.5小時，以便阻斷腫瘤細胞增殖。向一小瓶CTV染色溶液中添加20 µL的DMSO。將5 µl的溶液稀釋到5 mL（1 : 1000）PBS（溫熱至37°C）中以提供5 µM染色溶液。將2E6 T細胞計數、收集、用PBS洗滌兩次並重懸於4E6/ml（0.5 ml）中。添加等量（0.5 ml）的CTV染色溶液。將細胞在37°C下孵育20分鐘。然後，向細胞中添加4 ml PRMI + 20% FBS以吸收任何未結合的染料。將細胞孵育5分鐘，並且在400 x g下離心5分鐘。將細胞沈澱重懸於預熱的RPMI + 10%FBS培養基中。對T細胞進行計數，並將1E5細胞（100 ul）接種在96孔平底板中。
同時，1.5小時後收集經MMC處理的腫瘤細胞並進行計數，然後以1E6/ml的濃度重懸。將1E5的細胞（100 μl）與T細胞在96孔板中進行共培養。單獨的T細胞和添加3 : 1 CD3/28 珠/細胞比例的T細胞分別用作陰性和陽性對照。
共培養5天後，從每個孔中收集所有的細胞。將細胞在400 x g下離心並洗滌5分鐘（兩次），然後在96孔U型底板上進行CD33 CAR、CD3、CD8和CD25、活/死（Near-IR）染色。洗滌後，使用100 μl BD Cytofix™固定緩衝液將所有細胞固定10分鐘（50 ul FACS緩衝液 + 50 ul固定緩衝液）。孵育期結束後，藉由多色流動式細胞分析術分析染色的樣本。
如下進行數據分析。繪製了CTV長條圖。CTV未稀釋門控被設置為涵蓋單獨培養的T細胞的最右邊的峰（CTV亮），CTV稀釋的門控被設置為捕獲其餘的人群。這適用於所有樣本。實例 10 ： CAR17 、 CAR18 、 CAR19 或 CAR20 轉導的 CAR-T 細胞的表徵。
在JNL報告測定中評估產生的CAR-T細胞的抗原依賴性活性。簡而言之，用CAR17（KL2B413_HL）、CAR18（KL2B413_LH）、CAR19（KL2B359_HL）或CAR20（KL2B359_LH）構建體轉導含有由訊息反應型NFAT啟動子驅動的螢光素酶基因的Jurkat細胞（稱為JNL細胞）。每個CAR的表現是藉由生物素化的CD33，然後是鏈黴親和素軛合的PE來確定的。
CD33 CAR構建體與其同源細胞抗原（靶細胞上的CD33）之間的結合導致JNL細胞中螢光素酶的表現。為此，用測試CAR構建體轉導的JNL細胞或未轉導的JNL細胞（UTD）與靶標腫瘤細胞系共培養，並且以發光強度測量螢光素酶活性。當發光強度超過UTD細胞在表現抗原細胞存在下的1.5倍時，認為該構建體具有活性。測試的CAR構建體沒有發現抗原依賴性的激活。CAR-T 細胞以抗原依賴的方式介導腫瘤細胞殺傷
將用CAR17、CAR18、CAR19和CAR20轉導的CAR-T細胞與CD33陽性細胞和CD33陰性細胞共同孵育96小時，效應子與靶標（ET）的比率為1 : 1或0.5 : 1，這是根據T細胞上的CAR表現計算的。藉由IncuCyte成像系統的即時測量，靶細胞被測定為穩定表現紅色核染料。腫瘤細胞生長抑制（TGI）（%）=（初始存活靶細胞數-當前存活靶細胞數）/初始存活細胞數*100（%）。經測試的CAR-T細胞實現了大約100%的TGI，而未轉化的對照組沒有顯示任何TGI。CD33陰性細胞中的經測試的CAR-T細胞未觀察到TGI。抗原刺激後 CAR-T 細胞產生細胞介素
細胞毒性T細胞產生的IFN-γ對於腫瘤進行免疫監視至關重要，這在體內和體外可以直接抑制一些惡性腫瘤的增殖並誘導其凋亡。為了確定CD33 CAR修飾的人T細胞係否能夠識別並被CD33陽性腫瘤細胞激活，將用指定的CAR選殖轉導的原代T細胞和未轉導的對照T細胞（UTD）與靶細胞系共培養，收集上清液進行IFN-γ濃度測量。用CD33 CAR細胞轉導的CAR-T細胞在與重組表現CD33細胞的LNCaP細胞共培養時分泌IFN-γ，並且在與極低的表現CD33的細胞共培養時也分泌IFN-γ，但沒有CD33陰性細胞。CAR-T 細胞被激活並以抗原依賴性方式上調去顆粒標記物
腫瘤細胞可以被細胞毒性淋巴細胞，如CD8+ T淋巴細胞和自然殺手細胞（NK）識別並殺傷，主要是藉由免疫分泌的殺死靶標腫瘤細胞的溶解性顆粒。這一過程涉及顆粒膜與免疫效應細胞的細胞質膜融合，這導致溶酶體相關蛋白的表面暴露，該等蛋白典型地存在於圍繞溶解性顆粒（如CD107a）的脂質雙分子層上。因此，CD107a的膜表現構成免疫細胞激活和細胞毒性去顆粒的標誌。
如上所述進行去顆粒測定。將靶細胞（5 × 104 ）與等量的效應細胞在0.1 ml/孔的96孔板中共培養。對照孔僅含有T細胞。除了1 μl/樣本的莫能黴素（monensin）（BD生物科學公司）外，添加抗CD107a（5 μl/孔），並在37°C下孵育4小時。將細胞用PBS洗滌兩次，對CD33 CAR、CD3和CD8的表現進行染色，並在流式細胞儀BD Fortessa上進行分析。CD33 CAR-T 細胞以抗原依賴性方式增殖
使用實例9中所述之T細胞增殖測定方案評估CAR-T細胞的增殖。用CellTrace Violet（CTV；5 μM）標記CD33 CAR-T和未轉導（UTD）T細胞，並與CD33陽性和CD33陰性細胞共培養。共培養後五天，收穫細胞並用CD3、CD25、NearIR活/死染料和CD33 CAR進行染色。使用Flowjo軟體在Fortessa流式細胞儀上進行流動式細胞分析術分析。藉由活的CD3鑒定淋巴細胞，並確定具有CTV染料稀釋和激活標記CD25的CAR-T細胞的頻率。藉由對CD3+ T細胞進行門控，CD33陽性細胞而不是CD33陰性細胞促進每個測試的CAR-T細胞系的增殖。沒有任何刺激的T細胞不會增殖，而CD3/28珠刺激的T細胞顯示出同等的增殖模式。與細胞共培養5天後，CD33 CAR+ T細胞的增殖比CD3/28珠陽性對照更強。不同的測試的CAR-T細胞具有不同的增殖活性，並且顯示出不同的CAR-T細胞計數。增殖的T細胞和表現CD25的T細胞的百分比基於來自重複的平均絕對細胞計數+/- SEM。實例 11 ：雙特異性 CD33xCD3 抗體的產生
將上述實例中產生的抗CD33抗體的VH/VL區和抗CD3抗體CD3B219和CD3B376的VH/VL區工程化為雙特異性格式並表現為IgG1。CD3B219和CD3B376被工程化為Fab，並且CD33 VH/VL區域被工程化為scFv，在兩個方向進入雙特異性抗體，產生scFv-鉸鏈-CH2-CH3格式的CD33結合臂和重鏈（VH-CH1-連接子-CH2-CH3）和輕鏈（VL-CL）格式的CD3結合臂。可替代地，將抗CD3抗體的VH/VL區工程化為scFv，並且將抗CD33抗體的VH/VL區工程化為Fab。scFv中使用的連接子係SEQ ID NO: 7 的連接子。CD3B219已在美國專利案號9,850,310中描述。
T350V_L351Y_F405A_Y407V CH3突變被工程化為一條重鏈，而T350V_T366L_K392L_T394W CH3突變被工程化為另一條重鏈。另外，CD33和CD3結合臂均經工程化以含有Fc效應子緘默突變L235A_L235A_D265S。
表現工程化的鏈並使用標準方法將產生的雙特異性抗體純化。如本文所述，雙特異性抗體的特點係它們與CD33和CD3的結合，以及它們的體外和體內的細胞毒性。表 10 示出抗CD3抗體CD3B219和CD3B376的胺基酸序列。 [表 10 ].
抗體 區域 胺基酸序列 SEQ ID NO:
CD3B219 HCDR1 TYAMN 108
HCDR2 RIRSKYNNYATYYAASVKG 109
HCDR3 HGNFGNSYVSWFAY 110
LICDR1 RSSTGAVTTSNYAN 111
LCDR2 GTNKRAP 112
LCDR3 ALWYSNLWV 113
VH（CD3B219VH） EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 114
VL（CD3B219VL） QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 115
CD3B376 HCDR1 NNNAAWS 116
HCDR2 RTYYRSKWLYDYAVSVKS 117
HCDR3 GYSSSFDY 118
LICDR1 TGTSSNIGTYKFVS 119
LCDR2 EVSKRPS 120
LCDR3 VSYAGSGTLL 121
VH（CD3H219） QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSS 122
VL（CD3L150） QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVL 123
實例 12 ：產生的雙特異性 CD33xCD3 抗體在體外具有細胞毒性
T細胞介導的細胞毒性測定係用來評估在體外產生的雙特異性抗體的細胞毒性潛力，在Incucyte平臺上使用即時成像。在來自健康供體的分離的泛人CD3+ T細胞存在的情況下，以（效應子 : 靶標）效應子 : 靶標比率（E : T比率）為3 : 1在CD33陽性細胞系細胞中測試雙特異性抗體。藉由測量由靶細胞穩定表現的染料的螢光信號來監測細胞凋亡引起的細胞死亡。雙特異性抗體隨著時間的增加，促進存活細胞的劑量依賴性減少，從而誘導T細胞介導的腫瘤細胞的死亡。腫瘤細胞抑制百分比% =（初始鋪板的腫瘤細胞的數量-當前存活的腫瘤細胞數量）/（初始鋪板的腫瘤細胞數量）*100%。實例 13 ： ADC 的產生和特徵
結合CD33的抗體或抗原結合域將被各種放射性物質（如In-111、Zr-89、Lu-177或Ac-225）標記，並在已建立的皮下（SC）人前列腺模型（包括雄性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ的LNCaP、VCaP或C4-2B（NSG，傑克遜實驗室（Jackson Laboratory）, 巴爾港，緬因州）或Balb-c或SHO裸小鼠）中評估體內腫瘤的生物分佈或腫瘤療效。用不同數目的放射性（10-1000 nCi）標記各種劑量的結合CD33的抗體或抗原結合結構域或者同型對照抗體，並測量腫瘤的攝取或療效。實例 14 ：測試與藥物軛合的抗 CD33 抗體的內化
進行以下測試以表徵抗CD33抗體的內化程度並且以確定與藥物軛合的抗CD33抗體的治療效果。不希望受理論的束縛，當抗CD33抗體與放射性同位素（例如In-111、Zr-89、Lu-177或Ac-225）軛合時，抗CD33抗體的內化表明其治療效果增加。材料及方法
如下進行細胞培養。MOLM-13、Kasumi-1、OCI-AML-3和HDLM2細胞在具有10% FBS（HiMedia）的RPMI 1640（博科公司）培養基中培養。用飽和濃度的抗CD33抗體（選殖WM53，百進生技公司）對細胞進行染色，以確定每個細胞系的受體密度。使用BD Quantibrite PE珠（BD生物科學公司）測定受體密度。
根據製造商的方案，藉由可固定的紫羅蘭死細胞染色劑（L34955，賽默飛世爾公司（ThermoFisher））對MOLM-13、Kasumi-1、OCI-AML-3和HDLM-2細胞染色用於活力測量。收穫細胞，將其用PBS洗滌一次，然後在室溫下用可固定的活力染料染色30 min。孵育後，將細胞用FACS緩衝液（PBS + 2% FBS）洗滌兩次。然後將細胞用於與測試抗體的結合測定。將100,000個細胞用100 ul染色體積的測試抗體染色。將用於染色的抗體在FACS緩衝液中稀釋，並在冰上與細胞一起孵育40分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌2X。然後使用PE軛合的山羊F(ab')2抗人IgG-Fc（ab98596；艾博抗公司（Abcam））在冰上測試抗體40分鐘。洗滌後，在Novocyte流式細胞儀（ACEA）上獲得數據。將細胞在FSC/SSC上進行門控，然後進行活細胞門控和雙重識別。使用Flow Jo（BD公司）分析數據。
在減去僅有的第二樣本的MFI後，平均螢光強度值用於繪製4參數非線性回歸分析曲線。
在37°C的動力學結合研究中，將細胞按上述方法處理，用於用測試抗體染色。使用製造商的方案，使用AF647標記套組（A20186，賽默飛世爾公司），將測試抗體與Alexa Fluor 647（AF647）染料軛合。添加抗體後，將細胞在恒溫混勻儀（艾本德（Eppendorf））中在37°C下孵育指定的時間點。然後將樣本使用Cytofix（BD生物科學公司）固定，並在Novocyte（ACEA生物科學公司）上獲取。如上所述分析數據。
如下進行抗體內化測定：
如下進行蛋白A-MMAF測定。蛋白A-MMAF購自聯寧生物製藥公司（Levena Biopharma）。將MOLM-13、Kasumi-1、OCI-AML3和HDLM2細胞以4000個細胞/孔接種到體積為50 ul的具有透明底部的96孔平底暗孔板（康寧公司）中。將抗體儲備液製備為4X濃度（400 nM）並連續稀釋。將25 μl各種抗體稀釋液添加至細胞中。蛋白A-MMAF儲備液也以4X濃度（400 nM）製備，並向每個孔中添加25 μl。具有細胞蛋白A-MMAF，但無抗體的孔被認為100%存活的細胞。將細胞與抗體和蛋白A-MMAF一起孵育96小時。在孵育期結束時向細胞中添加將100 ul的CellTitre-Glo（普洛麥格公司），並在Tecan讀板器中讀取發光。如下計算%活力，並使用Graph Pad Prism繪製4參數非線性回歸曲線。
%活力 = 細胞 + MMAF +Ab    X100
  細胞 + MMAF  
如下進行基於pHAb染料的內化測定。pHAb胺活性染料購自普洛麥格公司。將400 ug的每種測試抗體與pHAb染料軛合。將胺活性pHAb染料（普洛麥格公司，#G9845）在12.5 uL DMSO + 12.5 uL水（總體積25 uL）中短暫重組，最終濃度為10 mg/mL（11.3 mM）。軛合反應在10倍莫耳過量的染料中進行的。
反應混合物含有抗體（250 ul體積中500 ug + 3 ul pHAb染料+30 ul 0.5 M硼酸鈉緩衝液+水，以使最終反應體積為300 ul。將反應伴隨攪拌在37C下孵育2小時，隨後藉由添加1 M Tris（pH 7.5）至終濃度為10 mM淬滅。將染料標記的樣本用Zeba柱（2 mL，40 kDa截留值）交換到PBS中（Thermo 87768）。如下計算抗體濃度和DAR值： 藉由NanoDrop測量濃度 ●  pHAb濃度（uM）=（吸光度/（EC_pHAb * 路徑長度)) x 106 ，其中： o      吸光度 = A532 o      EC_pHAb = 75,000 ●  Ab濃度（uM）=（吸光度/（EC-Ab * 路徑長度)) x 106 ，其中： o      吸光度 = A280-(0.256*A532) ■   0.256係A280處殘留pHAb吸光度的校正因子 o      EC_Ab = 210,000 ●  染料：Ab = 濃pHAb（uM）/濃Ab（uM）
為了分析pHAb染料標記的CD33抗體的動力學，將MOLM-13、Kasumi-1、OCI-AML-3和HDLM2細胞與100 nM的pHAb軛合的測試抗體在冰上一起孵育45分鐘。在FACS緩衝液中製備抗體稀釋液。標記後，將細胞用冷凍的FACS緩衝液洗滌，並在37°C下孵育指定的時間點。孵育期結束後，在Novocyte流式細胞儀上獲取細胞。每次都包括一個未染色的樣本，以說明背景螢光。結果
藉由在4℃下用CD33抗體的連續稀釋液孵育細胞，然後用軛合山羊F(ab')2抗人IgG-Fc抗體的PE檢測來進行結合。顯示CD33抗體與靶細胞系的結合的數據示於呈圖表形式的圖 2A 和2B 中，圖 2A 和2B 示出了抗人CD33抗體在4°C下的非線性回歸曲線。繪製了平均螢光強度（MFI）相較於抗體的對數濃度的圖。每個細胞系的最高命中以紅色表示，並且林妥珠單抗（Lintuzumab）結合以藍色曲線顯示。
測定了CD33抗體與靶細胞系的時間和溫度依賴性結合。藉由在37°C和4°C下用直接軛合的抗體的連續稀釋液孵育細胞來進行結合。數據示於圖 3A 和 3B 中。該等圖中的圖表示出了在37°C和4°C下抗人CD33抗體的結合的非線性回歸曲線。繪製了平均螢光強度（MFI）相較於抗體的對數濃度的圖。
測定了CD33抗體在高、中、低表現靶細胞系上的內化。將細胞用CD33抗體的連續稀釋液連同蛋白A-MMAF培養96小時。96小時後，將CellTitre-Glo試劑添加至細胞中以測量細胞活力。單獨具有蛋白A-MMAF的孔被認為100%存活。將HDLM-2細胞用作無表現細胞系。結果示於圖 4A-4D 中。細胞活力的降低表示抗體內化。圖表表示針對抗體的對數濃度的細胞活力的非線性回歸分析。
評估了CD33抗體內化的動力學。將CD33抗體用pHAb染料標記，並在37°C下以100 nM的濃度與細胞一起孵育指定的時間點，然後洗滌細胞並在流式細胞儀上獲取。結果示於圖 5 ，其中圖表示出了指定的時間點的MFI值。
測定了靶細胞系上的CD33表現。使用來自百進生技公司（Biolegend）的抗人CD33抗體鑒定了高、中和低CD33表現細胞系。用抗體（橙色長條圖）或小鼠IgG同種型對照（藍色長條圖）對MOLM-13、Kasumi-1、OCI-AML-3和HDLM2細胞染色，並計算各細胞系同種型的倍數變化。數據示於圖 6 中。
評估了與pHAb染料軛合後抗體完整性和DAR值。將抗體用pHAb染料標記並在SDS-PAGE上分析。藉由在280和530 nm處測量OD並在280 nm處校正染料吸光度來計算藥物與抗體比率（DAR）。數據示於圖 7 中。
確定了pHAb介導的抗體內化動力學測定的特異性。將CD33抗體用pHAb染料標記，並在4°C下以100 nM的濃度與Kasumi-1或OCI-AML-3細胞一起孵育指定的時間點，然後洗滌細胞並在流式細胞儀上獲取。數據示於圖 8A 中。圖表示出了指定的時間點的MFI值。在4°C下未觀察到內化。也將抗體在37°C下與HDLM-2細胞一起孵育。數據示於圖 8B 中。未觀察到MFI的增加。
測定了CD33抗體與高（MOLM-13）、中（Kasumi-1）和低（OCI-AML-3）細胞系的結合EC50 值。在4°C下用該抗體的連續稀釋液進行結合。數據示於圖 9 中。
測定了各種靶細胞系上的CD33抗體內化，其數據示於圖 10 中。對於MOLM-13和OCI-AML-3，指示了EC50 值。對於Kasumi-1，指示了在100 nM濃度下的%活力。實例 15 ： CD33 抗體對 CD33 細胞表面水平的影響
進行測定以測試抗CD33和CD33雙特異性抗體對單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜中性球、T細胞和/或小膠質細胞上CD33的細胞表面水平的影響。在測定中，評估了抗CD33抗體降低組織細胞性淋巴瘤細胞系U937以及表現CD33的CHO細胞、人原代單核細胞、衍生自周邊血單核細胞的人原代巨噬細胞、源自周邊血單核細胞的人原代樹突狀細胞、源自周邊血單核細胞的人小膠質細胞和人原代T細胞的CD33細胞表面水平的能力。
藉由細胞培養從周邊血單核細胞中製備人小膠質細胞。使用單核細胞分離抗體分離來自人周邊血樣本的單核細胞，分化成樹突狀細胞，並培養五天。將細胞在37°C下在5% CO2 中，在含油10%胎牛血清的培養基中培養。收集非貼壁細胞並用於吞噬作用實驗。為了產生人巨噬細胞，從人周邊血樣本中分離單核細胞並將其分化為巨噬細胞或樹突狀細胞。
將細胞樣本以200,000個細胞/ml鋪板在2 ml的補充有10% Hyclone FBS、2 mM麩醯胺酸、青黴素、鏈黴素和非必需胺基酸的RPMI中。以1.0 μg/ml添加CD33抗體或對照同種型，並且在37°C下與5% CO2 孵育24小時。
為了評估受體的動力學，允許抗體與細胞結合一小時，然後再洗掉。至少24小時後測定CD33的表面水平。藉由FACS分析檢測細胞表面受體表現。將細胞與軛合有FITC的抗CD33抗體和對照表面標記物一起孵育。將細胞在FACS緩衝液（PBS + 2% FBS，2 mM EDTA）中洗滌2×，並且進行流動式細胞分析術。為了進行分析，使用各自螢光團的WI值，數據被計算為在沒有抗體的情況下受體表現的百分比。實例 16 ：用於誘導或抑制傳訊分子磷酸化的抗 CD33 抗體和 CD33 雙特異性抗體的測定
分別培養各種細胞（例如，J774、RAW 264.7、BMM細胞、人原代單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞、小膠質細胞或破骨細胞）。從培養皿中取出細胞並計數。然後將細胞與以下抗體一起孵育：(i) 抗CD33抗體，(ii) 抗CD33雙特異性抗體，或（iii) 同種型匹配對照抗體。然後對細胞進行裂解和離心，以去除任何不溶解的物質。用一或多種針對DAP12、ERK、AKT、蛋白A-瓊脂糖和蛋白G-瓊脂糖的不同抗體對每種上清液進行免疫沈澱反應。將珠用RIPA緩衝液充分洗滌。將蛋白質藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然後藉由蛋白質印跡轉移到硝酸纖維素膜上。然後將珠與特異性識別磷酸化酪胺酸或磷酸化形式的DAP12、ERK、Syk、LCK、FYN、C-Cbl、VAV或AKT的抗體一起孵育。用增強的化學發光（ECL）系統對珠進行視覺化，以便量化DAP12、ERK、Syk、LCK、FYN、C-Cbl、VAV和AKT的磷酸化程度。實例 17 ： CD33 抗體和 / 或雙特異性抗體的抗癌作用的體內分析
將10隻8週（+/- 2週）齡的小鼠（無論是普通小鼠還是過表現人CD33基因的小鼠），用懸浮在1.00 μl PBS中的腫瘤細胞（例如，1 × 105 至1 × 106 MC38，路易士肺（Lewis Lung），或B16細胞）皮下挑戰。植入前將小鼠用異氟醚麻醉。從第2天開始，每3天向各組小鼠i.p.注射4劑，每次200 μg的拮抗CD33抗體。從第4天開始，每兩週用卡尺監測一次腫瘤生長，以測量腫瘤生長。實驗的終點是腫瘤體積為2000 mm3 或60天。腫瘤生長和%存活係結果測量指標。如果抗CD33具有抗癌作用，則可觀察到以下一或多種情況：減少腫瘤的攝取和生長速度、減少腫瘤浸潤性免疫抑制巨噬細胞的數量、以及增加效應性T細胞流入腫瘤。實例 18 ：抗 TRGV9 和抗 CD33 雙特異性抗體
進行γ/δ T細胞刺激和擴增。藉由在含有rhIL-2（1000 IU/mL）、rhIL-15（10 ng/mL）和唑來膦酸（5 µM）的完全RPMI培養基中處理PBMC持續14天，進行Vγ9-Vδ2 T細胞的擴增。
如下進行抗Vγ9單株抗體的從頭定序。從艾博抗公司獲得小鼠IgG1抗人T細胞受體抗TRGV9選殖7A5（目錄號ab171109）。藉由Lake Pharma（聖卡洛斯，加利福尼亞州）進行樣本製備和LC-MS/MS分析。將樣本還原並烷基化，分成七個等分試樣，並用胰蛋白酶/LysC、胰凝乳蛋白酶、LysC、胃蛋白酶和AspN、彈性蛋白酶和蛋白酶K酶進行蛋白水解。使用ZipTip C18移液管吸頭對所得肽去鹽，並使用逆相層析線上分離。使用HCD片段化在Thermo Q-Exactive光譜儀上進行質譜分析。藉由將從頭序列標籤與基於IMGT的抗體序列數據庫匹配，使用PEAKS軟體分析MS數據集。使用從頭鑒定的肽的Contig序列組裝指定序列中的空位。藉由檢查MS/MS譜圖確認了所有CDR和超突變。
根據以上產生的四種單株抗體的序列及其CDR序列示於下表11-15中。 [表 11 ]：抗 TRGV9 mAb 的 CDR 序列（ LP7A5_1 ）
抗體 HCDR1 SEQ ID NO: HCDR2 SEQ ID NO: HCDR3 SEQ ID NO:
LP7A5_1 DHYIN   236 QIYPGDGNTYYNQKFKG   237 NYGDYTIDF 238
抗體 LCDR1 SEQ ID NO: LCDR2 SEQ ID NO: LCDR3 SEQ ID NO:
LP7A5_1 KSSQSLLYSSNQKNYLA   239 WASTRES 240 QQYYRYHT 241
[表 12 ]：抗 TRGV9 mAb 的 CDR 序列。
抗體 HCDR1 SEQ ID NO: HCDR2 SEQ ID NO: HCDR3 SEQ ID NO:
LP7A5_2 DHYIN   236 QIYPGDGNTYYNQKFKG 237 NMGMYTIDF 242
抗體 LCDR1 SEQ ID NO: LCDR2 SEQ ID NO: LCDR3 SEQ ID NO:
LP7A5_2 KSSQSLLYSSNQKNYLA   239 WASTRES 240 QQYYRYHT 241
[表 13 ]：抗 TRGV9 mAb 的 CDR 序列。
抗體 HCDR1 SEQ ID NO: HCDR2 SEQ ID NO: HCDR3 SEQ ID NO:
LP7A5_3 DHYIN   236 QIYPGDGNTYYNQKFKG 237 NMGMYTLDF 243
抗體 LCDR1 SEQ ID NO: LCDR2 SEQ ID NO: LCDR3 SEQ ID NO:
LP7A5_3 KSSQSLLYSSNQKNYLA   239 WASTRES 240 QQYYRYHT 241
[表 14 ]：抗 TRGV9 mAb 的 CDR 序列。
抗體 HCDR1 SEQ ID NO: HCDR2 SEQ ID NO: HCDR3 SEQ ID NO:
LP7A5_4 DHYIN   236 QIYPGDGNTYYNQKFKG 237 NYGDYTLDF 244
抗體 LCDR1 SEQ ID NO: LCDR2 SEQ ID NO: LCDR3 SEQ ID NO:
LP7A5_4 KSSQSLLYSSNQKNYLA   239 WASTRES 240 QQYYRYHT 241
[表 15 ]：抗 TRGV9 mAb 的重鏈和輕鏈序列
mAb 重鏈胺基酸序列（CDR 序列用黑體和下劃線表示） SEQ ID NO:
LP7A5_1 EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFT DHYIN WVKQRTGQGLEWIG QIYPGDGNTYYNQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAP NYGDYTIDF WGQGTSVTVSS   245
LP7A5_2 EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFT DHYIN WVKQRTGQGLEWIG QIYPGDGNTYYNQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAP NMGMYTIDF WGQGTSVTVSS   246
LP7A5_3 EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFT DHYIN WVKQRTGQGLEWIG QIYPGDGNTYYNQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAP NMGMYTLDF WGQGTSVTVSS   247
LP7A5_4 EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFT DHYIN WVKQRTGQGLEWIG QIYPGDGNTYYNQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAP NYGDYTLDF WGQGTSVTVSS   248
  輕鏈胺基酸序列 SEQ ID NO:
LP7A5_1 DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSC KSSQSLLYSSNQKNYLA WYQQKPGQSPKLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYC QQYYRYHT FGTGTKLEIK   249
如下進行Vγ9 x CD33雙特異性抗體的製備。7A5（抗TRGV9）和C33B904（抗CD33抗體）的可變區序列被用來產生雙特異性抗體，以測試T細胞對急性髓系白血病（AML）細胞的再定向殺傷。雙特異性抗體VG4（抗TRGV9 x CD33）和VG3（抗TRGV9 x 無）以全長抗體的形式產生，與人IgG4一樣呈杵臼結構形式。使用基於標準PCR限制酶的標準選殖技術，將編碼可變區域的核酸序列亞選殖到含有人IgG4表現盒的恒定區的慣用哺乳動物表現載體中，並進行定序驗證。藉由在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系中暫態轉染來表現雙特異性抗體。在CHO細胞中表現的雙特異性抗體的序列顯示在下表16中。 [表 16 ]：在 CHO 細胞中表現抗體的序列
mAb ID 「杵」臂和「臼」臂胺基酸序列 SEQ ID NO:
抗TRGV9 （「臼狀結構」臂） MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYRYHTFGTGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSEGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFTDHYINWVKQRTGQGLEWIGQIYPGDGNTYYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAPNYGDYTIDFWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSLGK   250
抗CD33（「杵」臂） MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVFYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAEDVAVYYCQHYYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSEGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGIGWSGGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSPYGDFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK   251
抗RSV（「杵」臂） MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSEGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK   252
抗體最初藉由Mab Select SuRe蛋白A柱（GE醫療公司）純化。將柱用PBS（pH 7.2）平衡，並以2 mL/min的流速載入發酵上清液。上樣後，用4倍柱體積的PBS洗滌柱，隨後在30 mM乙酸鈉（pH 3.5）中洗脫。將藉由280 nm吸光度監測到的含有蛋白質峰的級分合併，並且藉由添加1% 3 M乙酸鈉將pH 9.0中和到pH 5.0。將雙特異性mAb在用PBS緩衝液平衡的製備型Superdex 200 10/300 GL（GE醫療公司）粒徑排阻層析（SEC）柱上進一步純化。在還原和非還原條件下，藉由內毒素測量和SDS-PAGE評估樣本的完整性。VG68的代表性凝膠示於圖12中。抗TRGV9/抗CD33的最終蛋白濃度為1.0 mg/ml，並且抗TRGV9/無效最終蛋白濃度為1.0 mg/mL。基於該等，抗TRGV9/抗CD33和抗TRGV9/無效的最終EU水平為 ＜ 3.0 EU/mg。
評估了抗CD33抗體對靶細胞系的結合活性。藉由FACS測量抗CD33選殖C33B904與一組CD33+細胞系的結合。計算了MOLM-13（圖13）、Kasumi-1（圖14）和OCI-AML-3（圖16）的EC50和EC90。
如下進行了Vγ9+ (γδ) T細胞和泛T細胞的表徵。唑來膦酸用於從整個PBMC中選擇性擴增Vγ9+ γδ T細胞。根據製造商的說明，使用EasySepTM 人γδ T細胞分離套組（幹細胞技術公司（Stem cell Technologies）；溫哥華，加拿大）從整個新鮮PBMC中分離PBMC。分離的PBMC在具有重組人IL-2（rhIL-2）的RPMI-10（補充有10%FBS，1x Pen/Strep的RPMI）培養基中培養至終濃度為1000 IU/mL，重組人IL-15（rhIL-15）中至終濃度為10 ng/mL，並且唑來膦酸中至終濃度為5 μM，持續14天。
如下使用Kasumi-3細胞和人γδ T細胞對抗TRGV9/抗CD33雙特異性抗體的結合和細胞毒特性進行了評估。將從用唑來膦酸 + IL-2 + IL-15培養12天的PBMC中分離的富集的γδ T細胞（效應子）與CFSE標記的Kasumi-3細胞（靶標）在各種濃度的雙特異性抗體的存在下以1 : 1和5 : 1的E : T比率共培養24小時。劑量響應曲線示出了以劑量依賴性方式在1 : 1（圖6）和5 : 1的（圖7）E : T比率下，抗TRGV9/抗CD33和抗TRGV9/抗無效NULL雙特異性介導的γδ T細胞針對表現CD33的kasumi-3細胞的細胞毒性。將在此表示的細胞毒性值減去在沒有雙特異性抗體時觀察到的基礎細胞毒性值。如方法中所述之計算EC50 值。圖 16-17 提供了單個實驗的代表性數據，其顯示抗TRGV9/抗CD33雙特異性抗體在體外介導γδ T細胞針對表現CD33的Kasumi-3細胞的細胞毒性。
將健康供者來源的PBMC（效應子）（用唑來膦酸 + IL-2 + IL-15培養12天）與CFSE標記的MOLM-13細胞（靶標）在各種濃度的雙特異性抗體的存在下以1 : 1的E : T比率共培養24小時。圖 18 示出了抗TRGV9/抗CD33雙特異性抗體在體外介導γδ T細胞針對表現CD33的MOLM-13細胞的細胞毒性（從整個PBMC）。圖 18 中的劑量響應曲線示出了以劑量依賴性方式，抗TRGV9/抗CD33和抗TRGV9/抗無效NULL雙特異性介導的γδ T細胞針對表現CD33的kasumi-3細胞的細胞毒性。將在此表示的細胞毒性值減去在沒有雙特異性抗體時觀察到的基礎細胞毒性值。如方法中所述之計算EC50 值。在此示出的代表性數據來自單個實驗。實例 19 ：電腦模擬分析和 NKK 文庫設計
對本文鑒定的VH和VL結構域進行了電腦模擬分析，以評估該等VH和VL結構域進行翻譯後修飾（PTM）的潛力。在某些PTM位點產生了NNK文庫，並進行篩選以確定潛在PTM中胺基酸突變的影響。
使用內部序列分析工具鑒定潛在的PTM風險，其重點是鑒定包括NG、DG和DP的模體。為每個模體的第一個和第二個位置設計了NNK飽和誘變文庫。NNK文庫利用了密碼子（N = A、G、C、T；K = G、T），使得全部20個胺基酸都表現在文庫中。藉由輸注選殖將文庫選殖到大腸桿菌表現質體中。將文庫鋪板，並且分離菌落以代表突變的PTM。圖 19 示出了PTM的電腦模擬分析，為NNK文庫選擇的PTM在框中。實例 20 ：測試由 NNK 文庫生成的 scFv 變體的熱穩定性
評估了實例19中產生的親本和變異的scFv選殖的熱穩定性。將親本選殖和誘變文庫的培養物接種並生長過夜。誘導表現並藉由ELISA分析上清液。將CD33鋪在96孔板上，並進行結合ELISA。將上清液分到4個獨立的板用於加熱。在未處理的RT、55°C、60°C、65°C下進行測定，以評估熱穩定性。將發光信號歸一化為相同選殖的未處理的室溫。
圖 20 示出了從基於C33B1475（SEQ ID NO: 277）的NNK文庫中產生的scFv的熱穩定性。圖 21 示出了從基於C33B1516（SEQ ID NO: 278）的NNK文庫中產生的scFv的熱穩定性。圖 22 示出了從基於C33B1517SEQ（SEQ ID NO: 216）的NNK文庫中產生的scFv的熱穩定性。圖 23 示出了從基於C33B1522（SEQ ID NO: 213）的NNK文庫中產生的scFv的熱穩定性。圖 24 是在NNK文庫的文庫篩選期間鑒定出的較佳的殘基的表。
該等圖說明，藉由突變去除潛在的PTM位點並不削弱與CD33的結合或降低熱穩定性。在幾種scFv選殖中發現了意想不到的穩定性改善。編號的實施方式
本發明還提供了以下編號的實施方式： 編號的實施方式列表（A） 1) 一種結合CD33的分離的蛋白質、或其CD33結合片段，該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 18的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 19的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 20的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 21的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 22的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 23的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 24的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 25的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 26的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 j) SEQ ID NO: 27的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。 2) 如實施方式1所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 1、6和12； b) 分別是，SEQ ID NO: 2、7和13； c)  分別是，SEQ ID NO: 1、8和14； d) 分別是，SEQ ID NO: 3、9和13； e)  分別是，SEQ ID NO: 4、10和15； f)  分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或者 g) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。 3) 如實施方式1或2所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 4) 如實施方式3所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係VHH。 5) 如實施方式3所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係Fab。 6) 如實施方式3所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv。 7) 如實施方式1-6中任一項所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。 8) 一種結合CD33的分離的蛋白質、或其CD33結合片段，其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VHH。 9) 一種結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。 10)      如實施方式9所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36和45； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38和47； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39和48； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41和50； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42和51； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44和51；或者 j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42和51。 11)      如實施方式9或10所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 81的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 83的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 84的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 86的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者 j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 88的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 12)      如實施方式11所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80；或者 j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80。 13)      如實施方式9-12中任一項所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 14)      如實施方式13所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係Fab。 15)      如實施方式13所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係VHH。 16)      如實施方式13所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv。 17)      如實施方式16所述之分離的蛋白質，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 18)      如實施方式17所述之分離的蛋白質，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 19)      如實施方式18所述之分離的蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 20)      如實施方式19所述之分離的蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 21)      如實施方式9-20中任一項所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60或61的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87或88的VL。 22)      如實施方式21所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含： a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL；或者 j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL。 23)      一種結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含 a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL；或者 j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL。 24)      如實施方式23所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 25)      如實施方式24所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係Fab。 26)      如實施方式24所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係VHH。 27)      如實施方式24所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv。 28)      如實施方式27所述之分離的蛋白質，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 29)      如實施方式28所述之分離的蛋白質，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 30)      如實施方式29所述之分離的蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 31)      如實施方式30所述之分離的蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 32)      一種結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。 33)      如實施方式32所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90和92； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和93； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91和94； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168和169； e)  分別是，SEQ ID NO: 172、173和174； f)  分別是，SEQ ID NO: 176、177和178； g) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和180；或者 h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和93。 34)      如實施方式32或33所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 105的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3； b) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 106的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； c) SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 107的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； d) SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 185的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； e) SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 188的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； f) SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 192的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； g) SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 196的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； h) SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 200的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者 i) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 202的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 35)      如實施方式34所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f)  分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199； i)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。 36)      如實施方式32-35中任一項所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 37)      如實施方式36所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係Fab。 38)      如實施方式36所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係VHH。 39)      如實施方式36所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv。 40)      如實施方式39所述之分離的蛋白質，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 41)      如實施方式40所述之分離的蛋白質，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 42)      如實施方式41所述之分離的蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 43)      如實施方式42所述之分離的蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 44)      如實施方式32-43中任一項所述之分離的蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO :105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。 45)      如實施方式44所述之分離的蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。 46)      一種結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含 a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。 47)      如實施方式46所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 48)      如實施方式47所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係Fab。 49)      如實施方式47所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係VHH。 50)      如實施方式47所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv。 51)      如實施方式50所述之分離的蛋白質，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 52)      如實施方式51所述之分離的蛋白質，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 53)      如實施方式52所述之分離的蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 54)      如實施方式53所述之分離的蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 55)      如實施方式1-54中任一項所述之分離的蛋白質，其中該蛋白質與半衰期延長部分軛合。 56)      如實施方式55所述之分離的蛋白質，其中該半衰期延長部分係免疫球蛋白（Ig）、該Ig的片段、Ig恒定區、該Ig恒定區的片段、Fc區、轉鐵蛋白、白蛋白、白蛋白結合結構域或聚乙二醇。 57)      如實施方式1-56中任一項所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係單特異性蛋白質。 58)      如實施方式1-57中任一項所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係多特異性蛋白質。 59)      如實施方式58所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白係雙特異性蛋白質。 60)      如實施方式59所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白係三特異性蛋白質。 61)      如實施方式1-60中任一項所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質進一步包含免疫球蛋白（Ig）恒定區或其Ig恒定區的片段。 62)      如實施方式61所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含Fc區。 63)      如實施方式61所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含CH2結構域。 64)      如實施方式61所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含CH3結構域。 65)      如實施方式61所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含CH2結構域和CH3結構域。 66)      如實施方式61所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含鉸鏈的至少部分、CH2結構域和CH3結構域。 67)      如實施方式61所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域。 68)      如實施方式61-67中任一項所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含結合CD33的抗原結合結構域，該抗原結合結構域與Ig恒定區的N末端或該Ig恒定區的片段軛合。 69)      如實施方式61-67中任一項所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含結合CD33的抗原結合結構域，該抗原結合結構域與Ig恒定區的C末端或該Ig恒定區的片段軛合。 70)      如實施方式61-69中任一項所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含結合CD33的抗原結合結構域，該抗原結合結構域經由第二連接子（L2）與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合。 71)      如實施方式70所述之分離的蛋白質，其中該L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 72)      如實施方式58-71中任一項所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白質包含結合淋巴細胞上抗原的抗原結合結構域。 73)      如實施方式72所述之分離的蛋白質，其中該淋巴細胞係T細胞。 74)      如實施方式72所述之分離的蛋白質，其中該T細胞係CD8+ T細胞。 75)      如實施方式72所述之分離的蛋白質，其中該淋巴細胞係自然殺手（NK）細胞。 76)      如實施方式58-75中任一項所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白質包含結合CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C的抗原結合結構域。 77)      如實施方式76所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白質包含結合CD3ε的抗原結合結構域。 78)      如實施方式77所述之分離的蛋白質，其中結合CD3ε的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 141的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 142的HCDR2、SEQ ID NO: 143的HCDR3、SEQ ID NO: 144的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 145的LCDR2和SEQ ID NO: 146的LCDR3； b) SEQ ID NO: 147的VH和SEQ ID NO: 148的VL； c)  SEQ ID NO: 149的HCDR1、SEQ ID NO: 150的HCDR2、SEQ ID NO: 151的HCDR3、SEQ ID NO: 152的LCDR1、SEQ ID NO: 153的LCDR2和SEQ ID NO: 154的LCDR3；或者 d) SEQ ID NO: 155的VH和SEQ ID NO: 156的VL。 79)      如實施方式76所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白質包含結合TRGV9的抗原結合結構域。 80)      如實施方式79所述之分離的蛋白質，其中結合TRGV9的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 238的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； b) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 242的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； c)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 243的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； d) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 244的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； e)  SEQ ID NO: 245的VH和SEQ ID NO: 249的VL； f)  SEQ ID NO: 246的VH和SEQ ID NO: 249的VL； g) SEQ ID NO: 247的VH和SEQ ID NO: 249的VL；或者 h) SEQ ID NO: 248的VH和SEQ ID NO: 249的VL。 81)      如實施方式61-80中任一項所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。 82)      如實施方式61-81中任一項所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合降低。 83)      如實施方式82所述之分離的蛋白質，其中導致該蛋白質與FcγR的結合降低的該至少一個突變選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。 84)      如實施方式61-81中任一項所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該蛋白質與FcγR的結合增強。 85)      如實施方式84所述之分離的蛋白質，其中導致該蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。 86)      如實施方式82-85中任一項所述之分離的蛋白質，其中該FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII、或其任何組合。 87)      如實施方式61-86中任一項所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節該蛋白質的半衰期。 88)      如實施方式87所述之分離的蛋白質，其中調節該蛋白質的半衰期的該至少一個突變選自由以下組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中殘基根據EU索引編號。 89)      如實施方式61-88中任一項所述之分離的蛋白質，其中該蛋白質包含Ig恒定區的CH3結構域中的至少一個突變。 90)      如實施方式89所述之分離的蛋白質，其中Ig恒定區的CH3結構域中的該至少一個突變選自由以下組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基根據EU索引編號。 91)      如實施方式1-54中任一項所述之分離的蛋白質，其中該蛋白質係嵌合抗原受體（CAR）。 92)      如實施方式91所述之分離的蛋白質，其中該CAR包含 a)  包含結合如實施方式1-54中任一項所述之CD33的抗原結合結構域之細胞外結構域； b) 跨膜結構域；以及 c)  視需要包含至少一個共刺激結構域的細胞內傳訊結構域。 93)      如實施方式91或92所述之分離的蛋白質，其中該CAR進一步包含CD8a鉸鏈區。 94)      如實施方式91-93中任一項所述之分離的蛋白質，其中 a)  該跨膜結構域包含CD8a跨膜區（CD8a-TM）多肽；並且 b) 該細胞內傳訊結構域包含共刺激結構域和初級傳訊結構域，該共刺激結構域包含TNF受體超家族成員9（CD137）組分，該初級傳訊結構域包含T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分。 95)      如實施方式91-93中任一項所述之分離的蛋白質，其中 a)  該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 157的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列； b) 該跨膜結構域包含與SEQ ID NO: 162的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列；和/或 c)  該細胞內傳訊結構域包含具有與SEQ ID NO: 163的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之共刺激結構域和具有與SEQ ID NO: 164的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之初級傳訊結構域。 96)      如實施方式95所述之分離的蛋白質，其中該細胞內傳訊結構域包含選自由以下組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9（CD137）組分、T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分、分化簇（CD27）組分、分化簇超家族成員組分、或其任何組合。 97)      一種藥物組成物，其包含如實施方式1-96中任一項所述之分離的蛋白質和藥學上可接受的載劑。 98)      一種多核苷酸，其編碼如實施方式1-96中任一項所述之分離的蛋白質。 99)      一種載體，其包含如實施方式98所述之多核苷酸。 100)    一種宿主細胞，其包含如實施方式99所述之載體。 101)    一種產生如實施方式1-96中任一項所述之分離的蛋白質之方法，該方法包括在表現該蛋白質的條件下培養如實施方式100所述之宿主細胞，以及回收由該宿主細胞產生的蛋白質。 102)    一種抗遺傳型抗體，其與如實施方式1-96中任一項所述之分離的蛋白質結合。 103)    一種套組，其包含如實施方式1-96中任一項所述之分離的蛋白質。 104)    一種藥物組成物，其包含用於治療受試者中表現CD33的癌症之手段。 105)    一種藥物組成物，其包含用於降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之手段。 106)    一種藥物組成物，其包含用於預防受試者中表現CD33的癌症的建立的手段。 107)    一種藥物組成物，其包含用於治療有發展表現CD33的癌症風險的受試者中非癌病症之手段。 編號的實施方式列表（B） 1) 一種分離的多特異性蛋白質，其包含結合CD33的第一抗原結合結構域和結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域。 2) 如實施方式1所述之分離的多特異性蛋白質，其中該淋巴細胞抗原係T細胞抗原。 3) 如實施方式1所述之分離的多特異性蛋白質，其中該T細胞抗原係CD8+ T細胞抗原。 4) 如實施方式1所述之分離的多特異性蛋白質，其中該淋巴細胞抗原係NK細胞抗原。 5) 如實施方式1-4中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該淋巴細胞抗原係CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C。 6) 如實施方式5所述之分離的多特異性蛋白質，其中該淋巴細胞抗原係CD3ε。 7) 如實施方式1-6任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab’)2、Fd、dAb或VHH。 8) 如實施方式7所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含Fab。 9) 如實施方式7所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含VHH。 10)      如實施方式7所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv。 11)      如實施方式10所述之分離的多特異性蛋白質，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 12)      如實施方式11所述之分離的多特異性蛋白質，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 13)      如實施方式12所述之分離的多特異性蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 14)      如實施方式13所述之分離的多特異性蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 15)      如實施方式1-14中任一項所述之分離的多特異性，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 1、2、3、4或5中任一項的HCDR1，SEQ ID NO: 6、7、8、9、10或11中任一項的HCDR2，和SEQ ID NO: 12、13、14、15、16或17中任一項的HCDR3。 16)      如1-15中任一項所述之分離的多特異性蛋白質或其CD33結合片段，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 1、6和12； b) 分別是，SEQ ID NO: 2、7和13； c)  分別是，SEQ ID NO: 1、8和14； d) 分別是，SEQ ID NO: 3、9和13； e)  分別是，SEQ ID NO: 4、10和15； f)  分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或者 g) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。 17)      如實施方式1-16中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。 18)      如實施方式1-14中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34或35的HCDR1，SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、42、43或44的HCDR2，SEQ ID NO: 45、46、47、48、49、50或51的HCDR3，SEQ ID NO: 62、63、64、65、66、67或68的LCDR1，SEQ ID NO: 69、70、71、72、73或74的LCDR2，和SEQ ID NO: 75、76、77、78、79或80的LCDR3。 19)      如實施方式1-14和18中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80；或者 j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80。 20)      如實施方式1-14、18和19中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60或61的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87或88的VL。 21)      如實施方式1-14和18-20中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL；或者 j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL。 22)      如實施方式1-14中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 33、89、167、172或176的HCDR1，SEQ ID NO: 90、91、168、173或177的HCDR2，SEQ ID NO: 92、93、94、169、174、178或180的HCDR3，SEQ ID NO: 98、99、100、182、186、189、193、197或201的LCDR1，SEQ ID NO: 101、102、103、183、187、190、194或198的LCDR2，和SEQ ID NO: 104、184、191、195或199的LCDR3。 23)      如實施方式1-14和22中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f)  分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199；或者 i)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。 24)      如實施方式1-14、22和23中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。 25)      如實施方式1-14和22-24中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。 26)      如實施方式1-25中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 141的HCDR1、SEQ ID NO: 142的HCDR2、SEQ ID NO: 143的HCDR3、SEQ ID NO: 144的LCDR1、SEQ ID NO: 145的LCDR2和SEQ ID NO: 146的LCDR3； b) SEQ ID NO: 147的VH和SEQ ID NO: 148的VL； c)  SEQ ID NO: 149的HCDR1、SEQ ID NO: 150的HCDR2、SEQ ID NO: 151的HCDR3、SEQ ID NO: 152的LCDR1、SEQ ID NO: 153的LCDR2和SEQ ID NO: 154的LCDR3；或者 d) SEQ ID NO: 155的VH和SEQ ID NO: 156的VL。 27)      如實施方式1-25中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 238的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； b) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 242的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； c)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 243的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； d) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 244的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； e)  SEQ ID NO: 245的VH和SEQ ID NO: 249的VL； f)  SEQ ID NO: 246的VH和SEQ ID NO: 249的VL； g) SEQ ID NO: 247的VH和SEQ ID NO: 249的VL；或者 h) SEQ ID NO: 248的VH和SEQ ID NO: 249的VL。 28)      如實施方式1-27中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域與第一免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第一Ig恒定區的片段軛合，和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與第二免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第二Ig恒定區的片段軛合。 29)      如實施方式28所述之分離的多特異性蛋白質，該分離的多特異性蛋白質進一步包含第二連接子（L2），該第二連接子介於結合CD33的第一抗原結合結構域與第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段之間，以及介於結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段之間。 30)      如實施方式29所述之分離的多特異性蛋白質，其中該L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 31)      如實施方式27-29中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG1、IgG2、和IgG3或IgG4同種型。 32)      如實施方式28-31中所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合降低。 33)      如實施方式32所述之分離的多特異性蛋白質，其中導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合降低的該至少一個突變選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。 34)      如實施方式28-31中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該多特異性蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合增強。 35)      如實施方式34所述之分離的多特異性蛋白質，其中導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。 36)      如實施方式32-35中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII、或其任何組合。 37)      如實施方式28-36中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節該多特異性蛋白質的半衰期。 38)      如實施方式37所述之分離的多特異性蛋白質，其中調節該多特異性蛋白質的半衰期的該至少一個突變選自由以下組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中殘基根據EU索引編號。 39)      如實施方式28-38中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，該分離的多特異性蛋白質包含該第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或該第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變。 40)      如實施方式39所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或該第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變選自由以下組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基根據EU索引編號。 41)      如實施方式28-40中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含以下突變： a)  該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W；或者 b) 該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V。 41)      一種套組，其包含如實施方式1-41中任一項所述之分離的多特異性蛋白質。 42)      一種藥物組成物，其包含用於治療受試者中表現CD33的癌症之手段。 43)      一種藥物組成物，其包含用於降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之手段。 44)      一種藥物組成物，其包含用於預防受試者中表現CD33的癌症的建立的手段。 45)      一種藥物組成物，其包含用於治療有發展表現CD33的癌症風險的受試者中非癌病症之手段。 編號的實施方式列表（C）： 1) 一種免疫軛合物，其包含與藥劑軛合的分離的蛋白質、或其CD33結合片段，其中該分離的蛋白質結合CD33，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 18的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 19的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 20的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 21的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 22的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 23的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 24的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 25的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 26的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 j) SEQ ID NO: 27的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。 2) 如實施方式1所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 1、6和12； b) 分別是，SEQ ID NO: 2、7和13； c)  分別是，SEQ ID NO: 1、8和14； d) 分別是，SEQ ID NO: 3、9和13； e)  分別是，SEQ ID NO: 4、10和15； f)  分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或者 g) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。 3) 如實施方式1或2所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的抗原結合結構域係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 4) 如實施方式3所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的抗原結合結構域係VHH。 5) 如實施方式3所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的抗原結合結構域係Fab。 6) 如實施方式3所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的抗原結合結構域係scFv。 7) 如實施方式1-6中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。 8) 一種免疫軛合物，其包含與藥劑軛合的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質結合CD33，其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VHH。 9) 一種免疫軛合物，其包含與藥劑軛合的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質結合CD33，並且其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。 10)      如實施方式9所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36和45； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38和47； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39和48； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41和50； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42和51； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44和51；或者 j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42和51。 11)      如實施方式9或10所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 81的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 83的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 84的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 86的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者 j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 88的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 12)      如實施方式11所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80；或者 j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80。 13)      如實施方式9-12中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 14)      如實施方式13所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係Fab。 15)      如實施方式13所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係VHH。 16)      如實施方式13所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係scFv。 17)      如實施方式16所述之免疫軛合物，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 18)      如實施方式17所述之免疫軛合物，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 19)      如實施方式18所述之免疫軛合物，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 20)      如實施方式19所述之免疫軛合物，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 21)      如實施方式9-20中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60或61的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87或88的VL。 22)      如實施方式21所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質包含： a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL；或者 j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL。 23)      一種免疫軛合物，其包含與藥劑軛合的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質結合CD33，並且其中該分離的蛋白質包含 a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL；或者 j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL。 24)      如實施方式23所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 25)      如實施方式24所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係Fab。 26)      如實施方式24所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係VHH。 27)      如實施方式24所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係scFv。 28)      如實施方式27所述之免疫軛合物，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 29)      如實施方式28所述之免疫軛合物，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 30)      如實施方式29所述之免疫軛合物，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 31)      如實施方式30所述之免疫軛合物，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 32)      一種免疫軛合物，其包含與藥劑軛合的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質結合CD33，並且其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。 33)      如實施方式32所述之免疫軛合物，該免疫軛合物包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90和92； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和93； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91和94； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168和169； e)  分別是，SEQ ID NO: 172、173和174； f)  分別是，SEQ ID NO: 176、177和178； g) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和180；或者 h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和93。 34)      如實施方式32或33所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 105的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3； b) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 106的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； c) SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 107的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； d) SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 185的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； e) SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 188的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； f) SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 192的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； g) SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 196的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； h) SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 200的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者 i) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 202的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 35)      如實施方式34所述之免疫軛合物，該免疫軛合物包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f)  分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199； i)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。 36)      如實施方式32-35中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 37)      如實施方式36所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係Fab。 38)      如實施方式36所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係VHH。 39)      如實施方式36所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係scFv。 40)      如實施方式39所述之免疫軛合物，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 41)      如實施方式40所述之免疫軛合物，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 42)      如實施方式41所述之免疫軛合物，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 43)      如實施方式42所述之免疫軛合物，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 44)      如實施方式32-43中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。 45)      如實施方式44所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質包含： a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。 46)      一種免疫軛合物，其包含與藥劑軛合的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質結合CD33，並且其中該分離的蛋白質包含 a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。 47)      如實施方式46所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 48)      如實施方式47所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係Fab。 49)      如實施方式47所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係VHH。 50)      如實施方式47所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係scFv。 51)      如實施方式50所述之免疫軛合物，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 52)      如實施方式51所述之免疫軛合物，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 53)      如實施方式52所述之免疫軛合物，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 54)      如實施方式53所述之免疫軛合物，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 55)      如實施方式1-54中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質與半衰期延長部分軛合。 56)      如實施方式55所述之免疫軛合物，其中該半衰期延長部分係免疫球蛋白（Ig）、該Ig的片段、Ig恒定區、該Ig恒定區的片段、Fc區、轉鐵蛋白、白蛋白、白蛋白結合結構域或聚乙二醇。 57)      如實施方式1-56中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係單特異性蛋白質。 58)      如實施方式1-57中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係多特異性蛋白質。 59)      如實施方式58所述之免疫軛合物，其中該多特異性蛋白係雙特異性蛋白質。 60)      如實施方式59所述之免疫軛合物，其中該多特異性蛋白係三特異性蛋白質。 61)      如實施方式1-60中任一項所述之免疫軛合物，該免疫軛合物進一步包含免疫球蛋白（Ig）恒定區或其Ig恒定區的片段。 62)      如實施方式61所述之免疫軛合物，其中該Ig恒定區的片段包含Fc區。 63)      如實施方式61所述之免疫軛合物，其中該Ig恒定區的片段包含CH2結構域。 64)      如實施方式61所述之免疫軛合物，其中該Ig恒定區的片段包含CH3結構域。 65)      如實施方式61所述之免疫軛合物，其中該Ig恒定區的片段包含CH2結構域和CH3結構域。 66)      如實施方式61所述之免疫軛合物，其中該Ig恒定區的片段包含鉸鏈的至少部分、CH2結構域和CH3結構域。 67)      如實施方式61所述之免疫軛合物，其中該Ig恒定區的片段包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域。 68)      如實施方式61-67中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質與Ig恒定區的N末端或該Ig恒定區的片段軛合。 69)      如實施方式61-67中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質與Ig恒定區的C末端或該Ig恒定區的片段軛合。 70)      如實施方式61-69中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質經由第二連接子（L2）與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合。 71)      如實施方式70所述之免疫軛合物，其中該L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 72)      如實施方式58-71中任一項所述之免疫軛合物，其中該多特異性蛋白質包含結合淋巴細胞上抗原的抗原結合結構域。 73)      如實施方式72所述之免疫軛合物，其中該淋巴細胞係T細胞。 74)      如實施方式72所述之免疫軛合物，其中該T細胞係CD8+ T細胞。 75)      如實施方式72所述之免疫軛合物，其中該淋巴細胞係自然殺手（NK）細胞。 76)      如實施方式58-75中任一項所述之免疫軛合物，其中該多特異性蛋白質包含結合CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C的抗原結合結構域。 77)      如實施方式76所述之免疫軛合物，其中該多特異性蛋白質包含結合CD3ε的抗原結合結構域。 78)      如實施方式77所述之免疫軛合物，其中該結合CD3ε的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 141的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 142的HCDR2、SEQ ID NO: 143的HCDR3、SEQ ID NO: 144的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 145的LCDR2和SEQ ID NO: 146的LCDR3； b) SEQ ID NO: 147的VH和SEQ ID NO: 148的VL； c)  SEQ ID NO: 149的HCDR1、SEQ ID NO: 150的HCDR2、SEQ ID NO: 151的HCDR3、SEQ ID NO: 152的LCDR1、SEQ ID NO: 153的LCDR2和SEQ ID NO: 154的LCDR3；或者 d) SEQ ID NO: 155的VH和SEQ ID NO: 156的VL。 79)      如實施方式76所述之免疫軛合物，其中該多特異性蛋白質包含結合TRGV9的抗原結合結構域。 80)      如實施方式77所述之免疫軛合物，其中該結合TRGV9的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 238的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； b) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 242的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； c)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 243的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； d) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 244的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； e)  SEQ ID NO: 245的VH和SEQ ID NO: 249的VL； f)  SEQ ID NO: 246的VH和SEQ ID NO: 249的VL； g) SEQ ID NO: 247的VH和SEQ ID NO: 249的VL；或者 h) SEQ ID NO: 248的VH和SEQ ID NO: 249的VL。 81)      如實施方式61-80中任一項所述之免疫軛合物，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。 82)      如實施方式61-81中任一項所述之免疫軛合物，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合降低。 83)      如實施方式82所述之免疫軛合物，其中導致該蛋白質與FcγR的結合降低的該至少一個突變選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。 84)      如實施方式61-81中任一項所述之免疫軛合物，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該蛋白質與FcγR的結合增強。 85)      如實施方式84所述之免疫軛合物，其中導致該蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。 86)      如實施方式80-85中任一項所述之免疫軛合物，其中該FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII、或其任何組合。 87)      如實施方式61-86中任一項所述之免疫軛合物，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節該蛋白質的半衰期。 88)      如實施方式87所述之免疫軛合物，其中調節該蛋白質的半衰期的該至少一個突變選自由以下組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中殘基根據EU索引編號。 89)      如實施方式61-88中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質包含Ig恒定區的CH3結構域中的至少一個突變。 90)      如實施方式89所述之免疫軛合物，其中Ig恒定區的CH3結構域中的該至少一個突變選自由以下組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基根據EU索引編號。 91)      如實施方式1-54中任一項所述之免疫軛合物，其中該分離的蛋白質係嵌合抗原受體（CAR）。 92)      如實施方式91所述之免疫軛合物，其中該CAR包含 a)  包含結合如實施方式1-54中任一項所定義的CD33的抗原結合結構域之細胞外結構域； b) 跨膜結構域；以及 c)  視需要包含至少一個共刺激結構域的細胞內傳訊結構域。 93)      如實施方式91或92所述之免疫軛合物，其中該CAR進一步包含CD8a鉸鏈區。 94)      如實施方式91-93中任一項所述之免疫軛合物，其中 a)  該跨膜結構域包含CD8a跨膜區（CD8a-TM）多肽；以及 b) 該細胞內傳訊結構域包含共刺激結構域和初級傳訊結構域，該共刺激結構域包含TNF受體超家族成員9（CD137）組分，該初級傳訊結構域包含T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分。 95)      如實施方式91-93中任一項所述之免疫軛合物，其中 a)  該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 157的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列； b) 該跨膜結構域包含與SEQ ID NO: 162的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列；和/或 c)  該細胞內傳訊結構域包含具有與SEQ ID NO: 163的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之共刺激結構域和具有與SEQ ID NO: 164的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之初級傳訊結構域。 96)      如實施方式95所述之免疫軛合物，其中該細胞內傳訊結構域包含選自由以下組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9（CD137）組分、T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分、分化簇（CD27）組分、分化簇超家族成員組分、或其任何組合。 97)      如實施方式1-96中任一項所述之免疫軛合物，其中該藥劑係治療劑或顯像劑。 98)      一種藥物組成物，其包含如實施方式1-96中任一項所述之免疫軛合物和藥學上可接受的載劑。 99)      一種多核苷酸，其編碼如實施方式1-96中任一項所述之免疫軛合物的分離的蛋白質。 100)    一種載體，其包含如實施方式99所述之多核苷酸。 101)    一種宿主細胞，其包含如實施方式100所述之載體。 102)    一種產生如實施方式1-96中任一項所述之免疫軛合物之方法，該方法包括在表現蛋白質的條件下培養如實施方式101所述之宿主細胞，回收由該宿主細胞產生的蛋白質，以及將該宿主細胞產生的蛋白質與藥劑軛合。 103)    一種免疫軛合物，其包含與藥劑軛合的分離的多特異性蛋白質，其中該分離的多特異性蛋白質包含結合CD33的第一抗原結合結構域和結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域。 104)    如實施方式103所述之免疫軛合物，其中該淋巴細胞抗原係T細胞抗原。 105)    如實施方式103所述之免疫軛合物蛋白質，其中該T細胞係CD8+ T細胞抗原。 106)    如實施方式103所述之免疫軛合物，其中該淋巴細胞抗原係NK細胞抗原。 107)    如實施方式103-106中任一項所述之免疫軛合物，其中該淋巴細胞抗原係CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C。 108)    如實施方式107所述之免疫軛合物，其中該淋巴細胞抗原係CD3ε。 109)    如實施方式103-108任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab’)2、Fd、dAb或VHH。 110)    如實施方式109所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含Fab。 111)    如實施方式109所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含VHH。 112)    如實施方式110所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv。 113)    如實施方式112所述之免疫軛合物，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 114)    如實施方式113所述之免疫軛合物，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 115)    如實施方式114所述之免疫軛合物，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 116) 如實施方式115所述之免疫軛合物，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 117) 如實施方式103-116中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 1、2、3、4或5中任一項的HCDR1、SEQ ID NO: 6、7、8、9、10或11中任一項的HCDR2、和SEQ ID NO: 12、13、14、15、16或17中任一項的HCDR3。 118) 如103-117中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR1、HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 1、6和12； b) 分別是，SEQ ID NO: 2、7和13； c)  分別是，SEQ ID NO: 1、8和14； d) 分別是，SEQ ID NO: 3、9和13； e)  分別是，SEQ ID NO: 4、10和15； f)  分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或者 g) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。 119) 如實施方式103-118中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。 120) 如實施方式103-116中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34或35的HCDR1，SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、42、43或44的HCDR2，SEQ ID NO: 45、46、47、48、49、50或51的HCDR3，SEQ ID NO: 62、63、64、65、66、67或68的LCDR1，SEQ ID NO: 69、70、71、72、73或74的LCDR2，和SEQ ID NO: 75、76、77、78、79或80的LCDR3。 121) 如實施方式103-116和120中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80；或者 j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80。 122) 如實施方式103-116、120和121中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60或61的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87或88的VL。 123) 如實施方式103-116和120-122中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL；或者 j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL。 124) 如實施方式103-116中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 33、89、167、172或176的HCDR1，SEQ ID NO: 90、91、168、173或177的HCDR2，SEQ ID NO: 92、93、94、169、174、178或180的HCDR3，SEQ ID NO: 98、99、100、182、186、189、193、197或201的LCDR1，SEQ ID NO: 101、102、103、183、187、190、194或198的LCDR2，SEQ ID NO: 104、184、191、195或199的LCDR3。 125) 如實施方式103-116和124中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f)  分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199；或者 i)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。 126) 如實施方式103-116、124和125中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175或179的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。 127) 如實施方式103-116和124-126中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。 128) 如實施方式103-127中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 141的HCDR1、SEQ ID NO: 142的HCDR2、SEQ ID NO: 143的HCDR3、SEQ ID NO: 144的LCDR1、SEQ ID NO: 145的LCDR2和SEQ ID NO: 146的LCDR3； b) SEQ ID NO: 147的VH和SEQ ID NO: 148的VL； c)  SEQ ID NO: 149的HCDR1、SEQ ID NO: 150的HCDR2、SEQ ID NO: 151的HCDR3、SEQ ID NO: 152的LCDR1、SEQ ID NO: 153的LCDR2和SEQ ID NO: 154的LCDR3；或者 d) SEQ ID NO: 155的VH和SEQ ID NO: 156的VL。 129) 如實施方式101-128中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 238的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； b) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 242的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； c)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 243的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； d) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 244的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； e)  SEQ ID NO: 245的VH和SEQ ID NO: 249的VL； f)  SEQ ID NO: 246的VH和SEQ ID NO: 249的VL； g) SEQ ID NO: 247的VH和SEQ ID NO: 249的VL；或者 h) SEQ ID NO: 248的VH和SEQ ID NO: 249的VL。 130) 如實施方式103-129中任一項所述之免疫軛合物，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域與第一免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第一Ig恒定區的片段軛合，和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與第二免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第二Ig恒定區的片段軛合。 131) 如實施方式130所述之免疫軛合物，該免疫軛合物進一步包含第二連接子（L2），該第二連接子介於該結合CD33的第一抗原結合結構域與第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段之間，以及介於該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段之間。 132) 如實施方式131所述之免疫軛合物，其中該L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 133) 如實施方式130-132中任一項所述之免疫軛合物，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG1、IgG2、和IgG3或IgG4同種型。 134) 如實施方式130-133中任一項所述之免疫軛合物，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合降低。 135) 如實施方式134所述之免疫軛合物，其中導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合降低的該至少一個突變選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。 136) 如實施方式130-133中任一項所述之免疫軛合物，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該多特異性蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合增強。 137) 如實施方式136所述之免疫軛合物，其中導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。 138) 如實施方式134-137中任一項所述之免疫軛合物，其中該FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII、或其任何組合。 139) 如實施方式130-138中任一項所述之免疫軛合物，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節該多特異性蛋白質的半衰期。 140) 如實施方式139所述之免疫軛合物，其中調節該多特異性蛋白質的半衰期的該至少一個突變選自由以下組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中殘基根據EU索引編號。 141) 如實施方式130-140中任一項所述之免疫軛合物，其中該蛋白質包含該第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或該第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變。 142) 如實施方式141所述之免疫軛合物，其中該第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或該第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變選自由以下組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基根據EU索引編號。 143) 如實施方式130-142中任一項所述之免疫軛合物，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含以下突變： a)  該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W；或者 b) 該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V。 144) 如實施方式103-143中任一項所述之免疫軛合物，其中該藥劑係治療劑或顯像劑。 145) 一種藥物組成物，其包含如實施方式103-143中任一項所述之免疫軛合物和藥學上可接受的載劑。 146) 一種多核苷酸，其編碼如實施方式103-143中任一項所述之免疫軛合物的分離的多特異性蛋白質。 147) 一種載體，其包含如實施方式146所述之多核苷酸。 148) 一種宿主細胞，其包含如實施方式147所述之載體。 149) 一種產生如實施方式103-143中任一項所述之免疫軛合物之方法，該方法包括在表現多特異性蛋白質的條件下培養如實施方式148所述之宿主細胞，回收由該宿主細胞產生的多特異性蛋白質，並且將該多特異性蛋白質與藥劑軛合。 150) 如實施方式1-96和103-143中任一項所述之免疫軛合物，其中該藥劑係放射性藥劑。 151) 如實施方式150所述之免疫軛合物，其中該放射性藥劑包含放射性金屬離子。 152) 如實施方式151所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子係32 P、47 Sc、67 Cu、77 As、89 Sr、90 Y、99 Tc、105 Rh、109 Pd、111 Ag、131 I、153 Sm、159 Gd、165 Dy、166 Ho、169 Er、177 Lu、186 Re、188 Re、194 Ir、198 Au、199 Au、211 At、212 Pb、212 Bi、213 Bi、223 Ra、225 Ac、255 Fm、227 Th、62 Cu、64 Cu、67 Ga、68 Ga、86 Y、89 Zr或111 In。 153) 如實施方式151所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子係225 Ac、111 In或89 Zr。 154) 如實施方式151所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子係225 Ac。 155) 如實施方式151至154中任一項所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子與螯合部分軛合。 156) 如實施方式155所述之免疫軛合物，其中該螯合部分包含具有式 (I) 之結構的大環：
Figure 02_image011
其中R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地是CHQCO2 X，其中 Q獨立地是氫、C1 -C4 烷基或(C1 -C2 烷基)苯基，並且 X獨立地是氫、苄基、C1 -C4 烷基；以及 Z係(CH2)n Y，其中 n係1-10，並且 Y係與第二點擊反應配偶體共價連接的親電子或親核部分； 可替代地，Z係氫；以及 R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地是CHQCO2 X，其中 Q獨立地是氫、C1 -C4 烷基或(C1 -C2 烷基)苯基，並且 X獨立地是氫、苄基、C1 -C4 烷基、或與第二點擊反應配偶體共價連接的親電子或親核部分； 可替代地，螯合劑包含開鏈配體。 157) 如實施方式155所述之免疫軛合物，其中該螯合部分包含具有式 (II) 之結構：
Figure 02_image003
或式 (III) 之結構的大環：
Figure 02_image005
。 158) 一種具有式 (IV)的免疫軛合物，
Figure 02_image014
式 (IV) 其中該蛋白質係如實施方式1-96中任一項所定義的分離的蛋白質。 159) 一種具有式 (V) 之免疫軛合物，
Figure 02_image016
式 (V) 其中該蛋白質係如實施方式1-96中任一項所定義的分離的蛋白質。 160) 一種藥物組成物，其包含用於治療受試者中表現CD33的癌症之手段。 161) 一種藥物組成物，其包含用於降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之手段。 162) 一種藥物組成物，其包含用於預防受試者中表現CD33的癌症的建立的手段。 163) 一種藥物組成物，其包含用於治療有發展表現CD33的癌症風險的受試者中非癌病症之手段。 編號的實施方式列表（D）： 1) 一種治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的分離的蛋白質或其CD33結合片段，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中該分離的蛋白質結合CD33，並且其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 18的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 19的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 20的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 21的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 22的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 23的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 24的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 25的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 26的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 j) SEQ ID NO: 27的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。 2) 如實施方式1所述之方法，其中該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 1、6和12； b) 分別是，SEQ ID NO: 2、7和13； c)  分別是，SEQ ID NO: 1、8和14； d) 分別是，SEQ ID NO: 3、9和13； e)  分別是，SEQ ID NO: 4、10和15； f)  分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或者 g) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。 3) 如實施方式1或2所述之方法，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 4) 如實施方式3所述之方法，其中該分離的蛋白質係VHH。 5) 如實施方式3所述之方法，其中該分離的蛋白質係Fab。 6) 如實施方式3所述之方法，其中該分離的蛋白質係scFv。 7) 如實施方式1-6中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。 8) 一種治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的分離的蛋白質，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中該分離的蛋白質結合CD33，並且其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VHH。 9) 一種治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的分離的蛋白質或其CD33結合片段，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中該分離的蛋白質結合CD33，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。 10)      如實施方式9所述之方法，其中該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36和45； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38和47； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39和48； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41和50； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42和51； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44和51；或者 j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42和51。 11)      如實施方式9或10所述之方法，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 52的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 81的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3； b) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； c) SEQ ID NO: 54的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 83的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； d) SEQ ID NO: 55的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 84的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； e) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； f) SEQ ID NO: 57的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 86的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； g) SEQ ID NO: 58的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； h) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； i) SEQ ID NO: 60的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者 j) SEQ ID NO: 61的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 88的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 12)      如實施方式11所述之方法，該方法包括以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80；或者 j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80。 13)      如實施方式9-12中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 14)      如實施方式13所述之方法，其中該分離的蛋白質係Fab。 15)      如實施方式13所述之方法，其中該分離的蛋白質係VHH。 16)      如實施方式13所述之方法，其中該分離的蛋白質係scFv。 17)      如實施方式16所述之方法，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 18)      如實施方式17所述之方法，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 19)      如實施方式18所述之方法，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 20)      如實施方式19所述之方法，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 21)      如實施方式9-20中任一項所述之方法，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60或61的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87或88的VL。 22)      如實施方式21所述之方法，其中該分離的蛋白質包含： a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL；或者 j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL。 23)      一種治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的分離的蛋白質，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中該分離的蛋白質結合CD33，並且其中該分離的蛋白質包含 a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL；或者 j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL。 24)      如實施方式23所述之方法，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 25)      如實施方式24所述之方法，其中該分離的蛋白質係Fab。 26)      如實施方式24所述之方法，其中該分離的蛋白質係VHH。 27)      如實施方式24所述之方法，其中該分離的蛋白質係scFv。 28)      如實施方式27所述之方法，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 29)      如實施方式28所述之方法，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 30)      如實施方式29所述之方法，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 31)      如實施方式30所述之方法，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 32)      一種治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的分離的蛋白質，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中該分離的蛋白質結合CD33，並且其中分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； f) SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； g) SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； h) SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； i) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。 33)      如實施方式32所述之方法，該方法包括以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90和92； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和93； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91和94； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168和169； e)  分別是，SEQ ID NO: 172、173和174； f)  分別是，SEQ ID NO: 176、177和178； g) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和180；或者 h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90和93。 34)      如實施方式32或33所述之方法，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 95的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 105的輕鏈可變區（VL）之輕鏈互補決定區（LCDR）1、LCDR2和LCDR3； b) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 106的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； c) SEQ ID NO: 97的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 107的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； d) SEQ ID NO: 170的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 185的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； e) SEQ ID NO: 171的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 188的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； f) SEQ ID NO: 175的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 192的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； g) SEQ ID NO: 179的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 196的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； h) SEQ ID NO: 181的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 200的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者 i) SEQ ID NO: 96的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 202的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 35)      如實施方式34所述之方法，其中該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f)  分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199； i)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。 36)      如實施方式32-35中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 37)      如實施方式36所述之方法，其中該分離的蛋白質係Fab。 38)      如實施方式36所述之方法，其中該分離的蛋白質係VHH。 39)      如實施方式36所述之方法，其中該分離的蛋白質係scFv。 40)      如實施方式39所述之方法，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 41)      如實施方式40所述之方法，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 42)      如實施方式41所述之方法，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 43)      如實施方式42所述之方法，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 44)      如實施方式32-43中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。 45)      如實施方式44所述之方法，其中該分離的蛋白質包含： a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。 46)      一種治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的分離的蛋白質，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中該分離的蛋白質結合CD33，其中該分離的蛋白質包含 a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。 47)      如實施方式46所述之方法，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。 48)      如實施方式47所述之方法，其中該分離的蛋白質係Fab。 49)      如實施方式47所述之方法，其中該分離的蛋白質係VHH。 50)      如實施方式47所述之方法，其中該分離的蛋白質係scFv。 51)      如實施方式50所述之方法，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 52)      如實施方式51所述之方法，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 53)      如實施方式52所述之方法，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 54)      如實施方式53所述之方法，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 55)      如實施方式1-54中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質與半衰期延長部分軛合。 56)      如實施方式55所述之方法，其中該半衰期延長部分係免疫球蛋白（Ig）、該Ig的片段、Ig恒定區、該Ig恒定區的片段、Fc區、轉鐵蛋白、白蛋白、白蛋白結合結構域或聚乙二醇。 57)      如實施方式1-56中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質係單特異性蛋白質。 58)      如實施方式1-57中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質係多特異性蛋白質。 59)      如實施方式58所述之方法，其中該多特異性蛋白係雙特異性蛋白質。 60)      如實施方式59所述之方法，其中該多特異性蛋白係三特異性蛋白質。 61)      如實施方式1-60中任一項所述之方法，該方法進一步包括免疫球蛋白（Ig）恒定區或其Ig恒定區的片段。 62)      如實施方式61所述之方法，其中該Ig恒定區的片段包含Fc區。 63)      如實施方式61所述之方法，其中該Ig恒定區的片段包含CH2結構域。 64)      如實施方式61所述之方法，其中該Ig恒定區的片段包含CH3結構域。 65)      如實施方式61所述之方法，其中該Ig恒定區的片段包含CH2結構域和CH3結構域。 66)      如實施方式61所述之方法，其中該Ig恒定區的片段包含鉸鏈的至少部分、CH2結構域和CH3結構域。 67)      如實施方式61所述之方法，其中該Ig恒定區的片段包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域。 68)      如實施方式61-67中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質與Ig恒定區的N末端或該Ig恒定區的片段軛合。 69)      如實施方式61-67中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質與Ig恒定區的C末端或該Ig恒定區的片段軛合。 70)      如實施方式61-69中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質經由第二連接子（L2）與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合。 71)      如實施方式70所述之方法，其中該L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 72)      如實施方式58-71中任一項所述之方法，其中該多特異性蛋白質包含結合淋巴細胞上抗原的抗原結合結構域。 73)      如實施方式72所述之方法，其中該淋巴細胞係T細胞。 74)      如實施方式72所述之方法，其中該T細胞係CD8+ T細胞。 75)      如實施方式72所述之方法，其中該淋巴細胞係自然殺手（NK）細胞。 76)      如實施方式58-75中任一項所述之方法，其中該多特異性蛋白質包含結合CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C的抗原結合結構域。 77)      如實施方式76所述之方法，其中該多特異性蛋白質包含結合CD3ε的抗原結合結構域。 78)      如實施方式77所述之方法，其中結合CD3ε的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 141的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 142的HCDR2、SEQ ID NO: 143的HCDR3、SEQ ID NO: 144的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 145的LCDR2和SEQ ID NO: 146的LCDR3； b) SEQ ID NO: 147的VH和SEQ ID NO: 148的VL； c)  SEQ ID NO: 149的HCDR1、SEQ ID NO: 150的HCDR2、SEQ ID NO: 151的HCDR3、SEQ ID NO: 152的LCDR1、SEQ ID NO: 153的LCDR2和SEQ ID NO: 154的LCDR3；或者 d) SEQ ID NO: 155的VH和SEQ ID NO: 156的VL。 79)      如實施方式76所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白質包含結合TRGV9的抗原結合結構域。 80)      如實施方式79所述之分離的蛋白質，其中結合TRGV9的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 238的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； b) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 242的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； c)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 243的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； d) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 244的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； e)  SEQ ID NO: 245的VH和SEQ ID NO: 249的VL； f)  SEQ ID NO: 246的VH和SEQ ID NO: 249的VL； g) SEQ ID NO: 247的VH和SEQ ID NO: 249的VL；或者 h) SEQ ID NO: 248的VH和SEQ ID NO: 249的VL。 81)      如實施方式61-80中任一項所述之方法，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。 82)      如實施方式61-81中任一項所述之方法，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合降低。 83)      如實施方式82所述之方法，其中導致該蛋白質與FcγR的結合降低的該至少一個突變選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。 84)      如實施方式61-81中任一項所述之方法，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該蛋白質與FcγR的結合增強。 85)      如實施方式84所述之方法，其中導致該蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。 86)      如實施方式82-85中任一項所述之方法，其中該FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII、或其任何組合。 87)      如實施方式61-86中任一項所述之方法，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節該蛋白質的半衰期。 88)      如實施方式87所述之方法，其中調節該蛋白質的半衰期的該至少一個突變選自由以下組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中殘基根據EU索引編號。 89)      如實施方式61-88中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質包含Ig恒定區的CH3結構域中的至少一個突變。 90)      如實施方式89所述之方法，其中Ig恒定區的CH3結構域中的該至少一個突變選自由以下組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基根據EU索引編號。 91)      如實施方式1-54中任一項所述之方法，其中該分離的蛋白質係嵌合抗原受體（CAR）。 92)      如實施方式91所述之方法，其中該CAR包含 a)  包含結合如實施方式1-54中任一項所定義的CD33的抗原結合結構域之細胞外結構域； b) 跨膜結構域；以及 c)  視需要包含至少一個共刺激結構域的細胞內傳訊結構域。 93)      如實施方式91或92所述之方法，其中該CAR進一步包含CD8a鉸鏈區。 94)      如實施方式91-93中任一項所述之方法，其中 a)  該跨膜結構域包含CD8a跨膜區（CD8a-TM）多肽；以及 b) 該細胞內傳訊結構域包含共刺激結構域和初級傳訊結構域，該共刺激結構域包含TNF受體超家族成員9（CD137）組分，該初級傳訊結構域包含T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分。 95)      如實施方式91-93中任一項所述之方法，其中 a)  該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 157的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列； b) 該跨膜結構域包含與SEQ ID NO: 162的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列；和/或 c)  該細胞內傳訊結構域包含具有與SEQ ID NO: 163的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之共刺激結構域和具有與SEQ ID NO: 164的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之初級傳訊結構域。 96)      如實施方式95所述之方法，其中該細胞內傳訊結構域包含選自由以下組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9（CD137）組分、T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分、分化簇（CD27）組分、分化簇超家族成員組分、或其任何組合。 97)      一種治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的分離的多特異性蛋白質，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中該分離的多特異性包含該結合CD33的第一抗原結合結構域和該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域。 98)      如實施方式97所述之方法，其中該淋巴細胞抗原係T細胞抗原。 99)      如實施方式97所述之方法，其中該T細胞係CD8+ T細胞抗原。 100)    如實施方式97所述之方法，其中該淋巴細胞抗原係NK細胞抗原。 101)    如實施方式97-100中任一項所述之方法，其中該淋巴細胞抗原係CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C。 102)    如實施方式101所述之方法，其中該淋巴細胞抗原係CD3ε。 103)    如實施方式97-102任一項所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab’)2、Fd、dAb或VHH。 104)    如實施方式103所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含Fab。 105)    如實施方式103所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含VHH。 106)    如實施方式103所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv。 107)    如實施方式106所述之方法，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。 108)    如實施方式107所述之方法，其中該L1包含 a)  約5-50個胺基酸； b) 約5-40個胺基酸； c)  約10-30個胺基酸；或者 d) 約10-20個胺基酸。 109)    如實施方式108所述之方法，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 110)    如實施方式109所述之方法，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 111)    如實施方式97-110中任一項所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 1、2、3、4或5中任一項的HCDR1、SEQ ID NO: 6、7、8、9、10或11中任一項的HCDR2、和SEQ ID NO: 12、13、14、15、16或17中任一項的HCDR3。 112)    如97-111中任一項所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 1、6和12； b) 分別是，SEQ ID NO: 2、7和13； c)  分別是，SEQ ID NO: 1、8和14； d) 分別是，SEQ ID NO: 3、9和13； e)  分別是，SEQ ID NO: 4、10和15； f)  分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或者 g) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。 113)    如實施方式97-112中任一項所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。 114)    如實施方式97-110中任一項所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34或35的HCDR1，SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、42、43或44的HCDR2，SEQ ID NO: 45、46、47、48、49、50或51的HCDR3，SEQ ID NO: 62、63、64、65、66、67或68的LCDR1，SEQ ID NO: 69、70、71、72、73或74的LCDR2，和SEQ ID NO: 75、76、77、78、79或80的LCDR3。 115)    如實施方式97-110和114中任一項所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80；或者 j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80。 116)    如實施方式97-110、114和115中任一項所述之方法，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60或61的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87或88的VL。 117)    如實施方式97-110和114-116中任一項所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL；或者 j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL。 118)    如實施方式97-110中任一項所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 33、89、167、172或176的HCDR1，SEQ ID NO: 90、91、168、173或177的HCDR2，SEQ ID NO: 92、93、94、169、174、178或180的HCDR3，SEQ ID NO: 98、99、100、182、186、189、193、197或201的LCDR1，SEQ ID NO: 101、102、103、183、187、190、194或198的LCDR2，和SEQ ID NO: 104、184、191、195或199的LCDR3。 119)    如實施方式97-110和118中任一項所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f)  分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199；或者 i)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。 120)    如實施方式97-110、118和119中任一項所述之方法，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179、181或96的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。 121)    如實施方式97-110和118-120中任一項所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。 122)    如實施方式97-121中任一項所述之方法，其中該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 141的HCDR1、SEQ ID NO: 142的HCDR2、SEQ ID NO: 143的HCDR3、SEQ ID NO: 144的LCDR1、SEQ ID NO: 145的LCDR2和SEQ ID NO: 146的LCDR3； b) SEQ ID NO: 147的VH和SEQ ID NO: 148的VL； c)  SEQ ID NO: 149的HCDR1、SEQ ID NO: 150的HCDR2、SEQ ID NO: 151的HCDR3、SEQ ID NO: 152的LCDR1、SEQ ID NO: 153的LCDR2和SEQ ID NO: 154的LCDR3；或者 d) SEQ ID NO: 155的VH和SEQ ID NO: 156的VL。 123)    如實施方式95-119中任一項所述之方法，其中該結合TRGV9的第一抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 238的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； b) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 242的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； c)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 243的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； d) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 244的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； e)  SEQ ID NO: 245的VH和SEQ ID NO: 249的VL； f)  SEQ ID NO: 246的VH和SEQ ID NO: 249的VL； g) SEQ ID NO: 247的VH和SEQ ID NO: 249的VL；或者 h) SEQ ID NO: 248的VH和SEQ ID NO: 249的VL。 124)    如實施方式97-123中任一項所述之方法，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域與第一免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第一Ig恒定區的片段軛合，和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與第二免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第二Ig恒定區的片段軛合。 125)    如實施方式124所述之方法，該方法進一步包含第二連接子（L2），該第二連接子介於該結合CD33的第一抗原結合結構域與第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段之間，以及介於該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段之間。 126)    如實施方式125所述之方法，其中該L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 127)    如實施方式124-136中任一項所述之方法，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG1、IgG2、和IgG3或IgG4同種型。 128)    如實施方式124-127中任一項所述之方法，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合降低。 129)    如實施方式128所述之方法，其中導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合降低的該至少一個突變選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。 130)    如實施方式124-127中任一項所述之方法，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該多特異性蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合增強。 131)    如實施方式130所述之方法，其中導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。 132)    如實施方式128-131中任一項所述之方法，其中該FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII、或其任何組合。 133)    如實施方式124-132中任一項所述之方法，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節該多特異性蛋白質的半衰期。 134)    如實施方式133所述之方法，其中調節該多特異性蛋白質的半衰期的該至少一個突變選自由以下組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中殘基根據EU索引編號。 135)    如實施方式124-134中任一項所述之方法，該方法包括該第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或該第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變。 136)    如實施方式135所述之方法，其中該第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或該第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變選自由以下組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基根據EU索引編號。 137)    如實施方式124-136中任一項所述之方法，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含以下突變： a)  該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W；或者 b) 該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V。 138)    一種治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的分離的免疫軛合物，持續足以治療表現CD33的癌症的時間，其中該免疫軛合物包含如實施方式1-137中任一項所定義的分離的蛋白質，該分離的蛋白質與藥劑軛合。 139)    如實施方式138所述之方法，其中該藥劑係放射性藥劑。 140) 如實施方式139所述之免疫軛合物，其中該放射性藥劑包含放射性金屬離子。 141) 如實施方式140所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子係32 P、47 Sc、67 Cu、77 As、89 Sr、90 Y、99 Tc、105 Rh、109 Pd、111 Ag、131 I、153 Sm、159 Gd、165 Dy、166 Ho、169 Er、177 Lu、186 Re、188 Re、194 Ir、198 Au、199 Au、211 At、212 Pb、212 Bi、213 Bi、223 Ra、225 Ac、255 Fm、227 Th、62 Cu、64 Cu、67 Ga、68 Ga、86 Y、89 Zr或111 In。 142) 如實施方式140所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子係225 Ac、111 In或89 Zr。 143) 如實施方式140所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子係225 Ac。 144) 如實施方式140至143中任一項所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子與螯合部分軛合。 145) 如實施方式144所述之免疫軛合物，其中該螯合部分包含具有式 (I) 之結構的大環：
Figure 02_image018
其中R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地是CHQCO2 X，其中 Q獨立地是氫、C1 -C4 烷基或(C1 -C2 烷基)苯基，並且 X獨立地是氫、苄基、C1 -C4 烷基；以及 Z係(CH2)n Y，其中 n係1-10，並且 Y係與第二點擊反應配偶體共價連接的親電子或親核部分； 可替代地，Z係氫；以及 R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地是CHQCO2 X，其中 Q獨立地是氫、C1 -C4 烷基或(C1 -C2 烷基)苯基，並且 X獨立地是氫、苄基、C1 -C4 烷基、或與第二點擊反應配偶體共價連接的親電子或親核部分； 可替代地，螯合劑包含開鏈配體。 146) 如實施方式144所述之免疫軛合物，其中該螯合部分包含具有式 (II) 之結構：
Figure 02_image003
或式 (III) 之結構的大環：
Figure 02_image005
。 147) 一種具有式 (IV) 的免疫軛合物，
Figure 02_image022
式 (IV) 其中該蛋白質係如實施方式1-96中任一項所定義的分離的蛋白質。 148) 一種具有式 (V) 之免疫軛合物，
Figure 02_image024
式 (V) 其中該蛋白質係如實施方式1-96中任一項所定義的分離的蛋白質。 149)    如實施方式1至148中任一項所述之方法，其中該方法有效減少受試者中表現CD33的細胞的量，其中該等表現CD33的細胞係癌細胞或其中該等表現CD33的細胞係非癌細胞。 150)    如實施方式1至149中任一項所述之方法，其中該方法有效預防該受試者中表現CD33的癌症的建立。 151) 如實施方式148-150中任一項所述之方法，其中該表現CD33的癌症係血液癌。 152) 如實施方式151所示的方法，其中該血液癌係白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。 153) 如實施方式151所示的方法，其中該血液癌係急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴細胞白血病（ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓白血病（CML）或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。 154) 如實施方式148-153中任一項所述之方法，其中將該分離的蛋白質或分離的多特異性蛋白質與第二治療劑組合投與。 155) 如實施方式154所述之方法，其中該第二治療劑係手術、化學療法、雄激素剝奪療法或放射或其任何組合。 156) 一種治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中表現CD33的癌細胞之手段。 157) 一種降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之方法，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中一或多種表現CD33的腫瘤細胞之手段。 158) 一種藥物組成物，其包含用於預防受試者中表現CD33的癌症的建立的手段，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中表現CD33的細胞之手段。 159) 一種藥物組成物，其包含用於治療有發展表現CD33的癌症風險的受試者中非癌病症的手段，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中表現CD33的細胞之手段。 編號的實施方式列表（E）： 1) 一種嵌合抗原受體（CAR），其包含： a)  含有結合CD33的抗原結合結構域之細胞外結構域； b) 跨膜結構域；以及 c)  視需要包含至少一個共刺激結構域的細胞內傳訊結構域。 2) 如實施方式1所述之CAR，該CAR進一步包含CD8a鉸鏈區。 3) 如實施方式1或2所述之CAR，其中 a)  該跨膜結構域包含CD8a跨膜區（CD8a-TM）多肽；以及 b) 該細胞內傳訊結構域包含共刺激結構域和初級傳訊結構域，該共刺激結構域包含TNF受體超家族成員9（CD137）組分，該初級傳訊結構域包含T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分。 4) 如實施方式2或3所述之CAR，其中 a)  該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 157的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列； b) 該跨膜結構域包含與SEQ ID NO: 162的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列；和/或 c)  該細胞內傳訊結構域包含具有與SEQ ID NO: 163的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之共刺激結構域、和具有與SEQ ID NO: 164的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之初級傳訊結構域。 5) 如實施方式1-4中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 1、2、3、4或5中任一項的HCDR1、SEQ ID NO: 6、7、8、9、10或11中任一項的HCDR2、和SEQ ID NO: 12、13、14、15、16或17中任一項的HCDR3。 6) 如1-5中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR1、HCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 1、6和12； b) 分別是，SEQ ID NO: 2、7和13； c)  分別是，SEQ ID NO: 1、8和14； d) 分別是，SEQ ID NO: 3、9和13； e)  分別是，SEQ ID NO: 4、10和15； f)  分別是，SEQ ID NO: 5、11和16；或者 g) 分別是，SEQ ID NO: 5、11和17。 7) 如實施方式1-6中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一項的VH。 8) 如實施方式1-4中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34或35的HCDR1，SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、42、43或44的HCDR2，SEQ ID NO: 45、46、47、48、49、50或51的HCDR3，SEQ ID NO: 62、63、64、65、66、67或68的LCDR1，SEQ ID NO: 69、70、71、72、73或74的LCDR2，和SEQ ID NO: 75、76、77、78、79或80的LCDR3。 9) 如實施方式1-4和8中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 28、36、45、62、69和75； b) 分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； c)  分別是，SEQ ID NO: 30、38、47、64、71和77； d) 分別是，SEQ ID NO: 31、39、48、65、72和78； e)  分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； f)  分別是，SEQ ID NO: 33、41、50、67、73和79； g) 分別是，SEQ ID NO: 34、42、51、68、74和80； h) 分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； i)  分別是，SEQ ID NO: 34、44、51、68、74和80；或者 j)  分別是，SEQ ID NO: 35、42、51、68、74和80。 10) 如實施方式1-4、8和9中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57、58、59、60或61的VH，和SEQ ID NO: 81、82、83、84、85、86、87或88的VL。 11) 如實施方式1-4和8-10中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 52的VH和SEQ ID NO: 81的VL； b) SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； c)  SEQ ID NO: 54的VH和SEQ ID NO: 83的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 84的VL； e)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； f)  SEQ ID NO: 57的VH和SEQ ID NO: 86的VL； g) SEQ ID NO: 58的VH和SEQ ID NO: 87的VL； h) SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； i)  SEQ ID NO: 60的VH和SEQ ID NO: 87的VL；或者 j)  SEQ ID NO: 61的VH和SEQ ID NO: 88的VL。 12) 如實施方式1-4中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 33、89、167、172或176的HCDR1，SEQ ID NO: 90、91、168、173或177的HCDR2，SEQ ID NO: 92、93、94、169、174、178或180的HCDR3，SEQ ID NO: 98、99、100、182、186、189、193、197的LCDR1，SEQ ID NO: 101、102、103、183、187、190、194或198的LCDR2，SEQ ID NO: 104、184、191、195或199的LCDR3。 13) 如實施方式1-4和12中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、92、98、101和104； b) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、99、102和104； c)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、100、103和104； d) 分別是，SEQ ID NO: 167、168、169、182、183和184； e)  分別是，SEQ ID NO: 33、91、94、186、187和104； f)  分別是，SEQ ID NO: 172、173、174、189、190和191； g) 分別是，SEQ ID NO: 176、177、178、193、194和195； h) 分別是，SEQ ID NO: 89、90、180、197、198和199；或者 i)  分別是，SEQ ID NO: 89、90、93、201、102和104。 14) 如實施方式1-4、12和13中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含SEQ ID NO: 95、96、97、170、171、175、179或181的VH，和SEQ ID NO: 105、106、107、185、188、192、196、200或202的VL。 15) 如實施方式1-4和12-14中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域包含 a)  SEQ ID NO: 95的VH和SEQ ID NO: 105的VL； b) SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 106的VL； c)  SEQ ID NO: 97的VH和SEQ ID NO: 107的VL； d) SEQ ID NO: 170的VH和SEQ ID NO: 185的VL； e)  SEQ ID NO: 171的VH和SEQ ID NO: 188的VL； f)  SEQ ID NO: 175的VH和SEQ ID NO: 192的VL； g) SEQ ID NO: 179的VH和SEQ ID NO: 196的VL； h) SEQ ID NO: 181的VH和SEQ ID NO: 200的VL；或者 i)  SEQ ID NO: 96的VH和SEQ ID NO: 202的VL。 16) 如實施方式1-15中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域係VHH。 17) 如實施方式1-16中任一項所述之CAR，其中該結合CD33的抗原結合結構域係scFv。 18) 如實施方式17所述之CAR，其中該scFv包含介於VL與VH之間的第一連接子（L1）。 19) 如實施方式18所述之CAR，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。 20) 如實施方式19所述之CAR，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。 21) 如實施方式1-20中任一項所述之CAR，其中包含結合CD33的抗原結合結構域之細胞外結構域進一步包含訊息多肽。 22) 如實施方式21所述之CAR，其中該訊息多肽包含SEQ ID NO: 166的胺基酸序列。 23) 如實施方式1-22中任一項所述之CAR，其中該細胞內傳訊結構域包含選自由以下組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9（CD137）組分、T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分、分化簇（CD27）組分、分化簇超家族成員組分、及其組合。 24) 如實施方式3-23中任一項所述之CAR，其中該CD137組分包含SEQ ID NO: 163的胺基酸序列。 25) 如實施方式3-24中任一項所述之CAR，其中該CD3z組分包含SEQ ID NO: 164的胺基酸序列。 26) 如實施方式3-25中任一項所述之CAR，其中該細胞內傳訊結構域包含SEQ ID NO: 165的胺基酸序列。 27) 如實施方式3-26中任一項所述之CAR，其中該CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO: 162的胺基酸序列。 28) 如實施方式3-27中任一項所述之CAR，其中該CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO: 157的胺基酸序列。 29)      如實施方式1-28中任一項所述之CAR，其中該CAR係多特異性蛋白質。 30)      如實施方式29所述之CAR，其中該多特異性蛋白係雙特異性蛋白質。 31)      如實施方式30所述之CAR，其中該多特異性蛋白係三特異性蛋白質。 32)      如實施方式29-31中任一項所述之CAR，其中該多特異性蛋白質包含結合淋巴細胞上抗原的抗原結合結構域。 33)      如實施方式32所述之CAR，其中該淋巴細胞係T細胞。 34)      如實施方式32所述之CAR，其中該T細胞係CD8+ T細胞。 35)      如實施方式32所述之CAR，其中該淋巴細胞係自然殺手（NK）細胞。 36)      如實施方式29-35中任一項所述之CAR，其中該多特異性蛋白質包含結合CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C的抗原結合結構域。 37)      如實施方式36所述之CAR，其中該多特異性蛋白質包含結合CD3ε的抗原結合結構域。 38)      如實施方式37所述之CAR，其中該結合CD3ε的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 141的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 142的HCDR2、SEQ ID NO: 143的HCDR3、SEQ ID NO: 144的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 145的LCDR2和SEQ ID NO: 146的LCDR3； b) SEQ ID NO: 147的VH和SEQ ID NO: 148的VL； c)  SEQ ID NO: 149的HCDR1、SEQ ID NO: 150的HCDR2、SEQ ID NO: 151的HCDR3、SEQ ID NO: 152的LCDR1、SEQ ID NO: 153的LCDR2和SEQ ID NO: 154的LCDR3；或者 d) SEQ ID NO: 155的VH和SEQ ID NO: 156的VL。 39)      如實施方式36所述之CAR，其中該多特異性蛋白質包含結合TRGV9的抗原結合結構域。 40)      如實施方式39所述之CAR，其中該結合TRGV9的抗原結合結構域包含： a)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 238的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； b) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 242的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； c)  SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 243的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； d) SEQ ID NO: 236的重鏈互補決定區1（HCDR1）、SEQ ID NO: 237的HCDR2、SEQ ID NO: 244的HCDR3、SEQ ID NO: 239的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、SEQ ID NO: 240的LCDR2和SEQ ID NO: 241的LCDR3； e)  SEQ ID NO: 245的VH和SEQ ID NO: 249的VL； f)  SEQ ID NO: 246的VH和SEQ ID NO: 249的VL； g) SEQ ID NO: 247的VH和SEQ ID NO: 249的VL；或者 h) SEQ ID NO: 248的VH和SEQ ID NO: 249的VL。 41) 一種分離的淋巴細胞，其表現如實施方式1-40中任一項所述之CAR。 42) 如實施方式41所述之分離的淋巴細胞，其中該淋巴細胞係T淋巴細胞。 43) 如實施方式41所述之分離的淋巴細胞，其中該淋巴細胞係自然殺手（NK）細胞。 44) 一種分離的多核苷酸，其編碼如實施方式1-40中任一項所述之CAR。 45) 一種載體，其包含如實施方式44所述之多核苷酸。 46)一種宿主細胞，其包含如實施方式44所述之多核苷酸或如實施方式45所述之載體。 47) 一種藥物組成物，其包含如實施方式41-43中任一項所述之淋巴細胞和藥學上可接受的賦形劑。 48) 一種治療患有表現CD33的癌症的受試者之方法，該方法包括：向有需要的受試者投與治療有效量的如實施方式41-43中任一項所述之淋巴細胞，由此該淋巴細胞介導該受試者中表現CD33的癌症的殺傷。 49) 如實施方式48所述之方法，其中該表現CD33的癌症係血液癌。 50) 如實施方式49所示的方法，其中該表現CD33的癌症係白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。 51) 如實施方式50所示的方法，其中該表現CD33的癌症係急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴細胞白血病（ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓白血病（CML）或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。 52) 一種癌細胞的靶向殺傷之方法，該方法包括：將該癌細胞與如實施方式41-43中任一項所述之淋巴細胞接觸，由此該淋巴細胞誘導該癌細胞的靶向殺傷。 53) 如實施方式52所述之方法，其中該癌細胞係血液癌。 54) 如實施方式53所示的方法，其中該表現CD33的癌症係白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。 55) 如實施方式54所示的方法，其中該表現CD33的癌症係急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴細胞白血病（ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓白血病（CML）或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。 56) 一種檢測受試者中癌症之存在的方法，該方法包括： a)  將獲得自該受試者的細胞樣本與如實施方式1-40中任一項所述之CAR接觸，從而形成CAR-細胞複合物，以及 b) 檢測該CAR-細胞複合物，其中該CAR-細胞複合物的檢測指示該受試者中癌症的存在。 57) 如實施方式56所述之方法，其中該癌細胞係血液癌。 58) 如實施方式57所示的方法，其中該表現CD33的癌症係白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。 59) 如實施方式58所示的方法，其中該表現CD33的癌症係急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴細胞白血病（ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓白血病（CML）或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。 60) 一種套組，其包含如實施方式1-40中任一項所述之CAR。 61) 一種藥物組成物，其包含用於治療受試者中表現CD33的癌症之手段。 62) 一種藥物組成物，其包含用於降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之手段。 63) 一種藥物組成物，其包含用於預防受試者中表現CD33的癌症的建立的手段。 64) 一種藥物組成物，其包含用於治療有發展表現CD33的癌症風險的受試者中非癌病症之手段。 65) 一種治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中表現CD33的癌細胞之手段。 66) 一種降低受試者中表現CD33的腫瘤細胞的量之方法，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中一或多種表現CD33的腫瘤細胞之手段。 67) 一種藥物組成物，其包含用於預防受試者中表現CD33的癌症的建立的手段，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中表現CD33的細胞之手段。 68) 一種藥物組成物，其包含用於治療有發展表現CD33的癌症風險的受試者中非癌病症的手段，該方法包括向該受試者投與用於將治療劑靶向該受試者中表現CD33的細胞之手段。序列 SEQ ID NO: 1  CDR1 （ C33B1785 ； C33B1787 ； C33B1780 ； C33B1789 ； C33B1788 ） DYAIGSEQ ID NO: 2  CDR1 （ C33B1784 ） TYVMGSEQ ID NO: 3  CDR1 （ C33B1786 ） FSTMDSEQ ID NO: 4  CDR1 （ C33B1781 ） INAMGSEQ ID NO: 5  CDR1 （ C33B1783 ； C33B1782 ） DYAVGSEQ ID NO: 6  CDR2 （ C33B1785 ； C33B1780 ； C33B1789 ； C33B1788 ） CISESDGRTYLSDSVKSSEQ ID NO: 7  CDR2 （ C33B1784 ） AIVSGRNPTYADSVKSSEQ ID NO: 8  CDR2 （ C33B1787 ） CISSSDGSTYYVDSVKGSEQ ID NO: 9  CDR2 （ C33B1786 ） CIRPRYSTTTHADSIKGSEQ ID NO: 10  CDR2 （ C33B1781 ） RITGGGATDYVDSVKGSEQ ID NO: 11  CDR2 （ C33B1783 ； C33B1782 ） CISSSDGATYYADSVKGSEQ ID NO: 12  CDR3 （ C33B1785 ； C33B1780 ； C33B1789 ； C33B1788 ） VDQAISESSYHCEKGFGSSEQ ID NO: 13  CDR3 （ C33B1784 ； C33B1786 ） YHYSSQYSEQ ID NO: 14  CDR3 （ C33B1787 ） LIIMYGSGSERAAAACRYKYEYSEQ ID NO: 15  CDR3 （ C33B1781 ） DLVTRVGSDLLYDDYSEQ ID NO: 16  CDR3 （ C33B1783 ） IIVRGSGWERAAAACRYEYSYSEQ ID NO: 17  CDR3 （ C33B1782 ） VIVRGTGWERAAAACRYEYAYSEQ ID NO: 18  VHH 序列（ C33B1785 ） 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本發明不被本文所述之特定實施方式限於一定的範圍。確實，根據以上說明書和附圖，除了在本文所述之內容以外，本發明的不同修改方案對於本領域的普通技術者而言都將變得很清楚。這類修飾旨在落入所附申請專利範圍之範圍內。應當進一步理解的是，所有的值均為近似值，僅為了描述之目的而提供。
貫穿本申請，引用了專利、專利申請、出版物、產品描述、和實驗方案，出於所有目的，將其揭露內容以其整體藉由引用結合在此。
無
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[圖 1 ]示出了針對人CD33抗原（FL ECD和IgC2結構域）的抗CD33 vHH相互作用的代表性BIAcore 8K傳感圖。
[圖 2A 和2B ]示出了CD33抗體與靶細胞系的結合。圖表示出了在4°C下抗人CD33抗體的非線性回歸曲線。繪製了平均螢光強度（MFI）相較於抗體的對數濃度的圖。藉由在4℃下用抗體的連續稀釋液孵育細胞，然後用軛合山羊F(ab')2抗人IgG-Fc抗體的PE檢測來進行結合。每個細胞系的最高命中以紅色表示，並且林妥珠單抗（Lintuzumab）結合以藍色曲線顯示。
[圖 3A 和3B ]示出了CD33抗體與靶細胞系的時間和溫度依賴性結合。圖表示出了在37°C和4°C下抗人CD33抗體的結合的非線性回歸曲線。繪製了平均螢光強度（MFI）相較於抗體的對數濃度的圖。藉由在37°C和4°C下用直接軛合的抗體的連續稀釋液孵育細胞來進行結合。
[圖 4A-4D ]示出了CD33抗體在高、中、低表現靶細胞系上的內化。將細胞用CD33抗體的連續稀釋液連同蛋白A-MMAF培養96小時。96小時後，將CellTitre-Glo試劑添加至細胞中以測量細胞活力。單獨具有蛋白A-MMAF的孔被認為100%存活。將HDLM-2細胞用作無表現細胞系。細胞活力的降低表示抗體內化。圖表表示針對抗體的對數濃度的細胞活力的非線性回歸分析。
[圖 5 ]示出了CD33抗體內化的動力學。將CD33抗體用pHAb染料標記，並在37°C下以100 nM的濃度與細胞一起孵育指定的時間點，然後洗滌細胞並在流式細胞儀上獲取。圖表示出了指定的時間點的MFI值。
[圖 6 ]示出了靶細胞系上的CD33表現。使用來自百進生技公司（Biolegend）的抗人CD33抗體鑒定了高、中和低CD33表現細胞系。用抗體（橙色長條圖）或小鼠IgG同種型對照（藍色長條圖）對MOLM-13、Kasumi-1、OCI-AML-3和HDLM2細胞染色，並計算各細胞系同種型的倍數變化。
[圖 7 ]示出了與pHAb染料軛合後抗體完整性和DAR值。將抗體用pHAb染料標記並在SDS-PAGE上分析。藉由在280和530 nm處測量OD並在280 nm處校正染料吸光度來計算藥物與抗體比率（DAR）。
[圖 8A 和 8B ]示出了pHAb介導的抗體內化動力學確定的特異性。圖8A中，將CD33抗體用pHAb染料標記，並在4°C下以100 nM的濃度與Kasumi-1或OCI-AML-3細胞一起孵育指定的時間點，然後洗滌細胞並在流式細胞儀上獲取。圖表示出了指定的時間點的MFI值。在4C下未觀察到內化。圖8B中，也將抗體在37°C下與HDLM-2細胞一起孵育。未觀察到MFI的增加。
[圖 9 ]示出了CD33抗體與高（MOLM-13）、中（Kasumi-1）和低（OCI-AML-3）細胞系的結合EC50 值的總結。在4°C下用該抗體的連續稀釋液進行結合。
[圖 10 ]示出了各種靶細胞系上的CD33抗體內化的總結。對於MOLM-13和OCI-AML-3，指示了EC50 值。對於Kasumi-1，在100 nM濃度下的%活力。
[圖 11 ]示出了展示抗TRGV9/抗CD33雙特異性抗體的結合，以招募γδ T細胞至CD33+癌細胞上並誘導癌細胞死亡的示意圖。
[圖 12 ]示出了藉由SDS-PAGE（非還原性）凝膠對VG4雙特異性抗體的完整性的測定結果。
[圖 13 -15 ]示出了藉由FACS測量的抗CD33抗體（選殖C33B904）與一組腫瘤細胞系的結合的測定結果。MOLM-13（高受體密度）的EC50為134.3 nM，Kasumi-1（中等密度）為82.2 nM並且OCI-AML-3（低表面密度）為16.4 nM。
[圖 16-17 ]示出了實驗結果，該實驗結果展示了抗TRGV9/抗CD33雙特異性抗體在體外介導γδ T細胞針對表現CD33的Kasumi-3細胞的細胞毒性。在實驗中，將從用唑來膦酸（Zoledronic acid）+ IL-2 + IL-15培養12天的PBMC中分離的富集的γδ T細胞（效應子）與CFSE標記的Kasumi-3細胞（靶標）在各種濃度的雙特異性抗體的存在下以1 : 1和5 : 1的E : T比率共培養24小時。劑量響應曲線示出了以劑量依賴性方式在1 : 1和5 : 1的E : T比率下，抗TRGV9/抗CD33和抗TRGV9/抗無效NULL雙特異性抗體介導的γδ T細胞針對表現CD33的kasumi-3細胞的細胞毒性。將在此表示的細胞毒性值減去在沒有雙特異性抗體時觀察到的基礎細胞毒性值。如方法中所述之計算EC50 值。在此示出的代表性數據來自單個實驗。
[圖 18 ]示出了實驗結果，該實驗結果展示了抗TRGV9/抗CD33雙特異性抗體在體外介導γδ T細胞針對表現CD33的Kasumi-3細胞的細胞毒性。將健康供者來源的PBMC（效應子）（用唑來膦酸 + IL-2 + IL-15培養12天）與CFSE標記的Kasumi-3細胞（靶標）在各種濃度的雙特異性抗體的存在下以1:1的E:T比率共培養24小時。
[圖 19 ]示出了電腦模擬分析的潛在的翻譯後修飾（PTM）風險。突出顯示了一些潛在的PTM風險模體（DG、NG、DP）。
[圖 20 ]示出了測定結果以評估從基於C33B1475（SEQ ID NO: 274）的NNK文庫中產生的scFv的熱穩定性。為了評估熱穩定性，對每個變體進行ELISA。將大腸桿菌上清液在55C、60C、65C下熱處理，並將發光信號歸一化為相同選殖的未處理的室溫。
[圖 21 ]示出了測定結果以評估從基於C33B1516（SEQ ID NO: 275）的NNK文庫中產生的scFv的熱穩定性。為了評估熱穩定性，對每個變體進行ELISA。將大腸桿菌上清液在55C、60C、65C下熱處理，並將發光信號歸一化為相同選殖的未處理的室溫。
[圖 22 ]示出了測定結果以評估從基於C33B1517（SEQ ID NO: 216）的NNK文庫中產生的scFv的熱穩定性。為了評估熱穩定性，對每個變體進行ELISA。將大腸桿菌上清液在55C、60C、65C下熱處理，並將發光信號歸一化為相同選殖的未處理的室溫。
[圖 23 ]示出了測定結果以評估從基於C33B1522（SEQ ID NO: 213）的NNK文庫中產生的scFv的熱穩定性。為了評估熱穩定性，對每個變體進行ELISA。將大腸桿菌上清液在55C、60C、65C下熱處理，並將發光信號歸一化為相同選殖的未處理的室溫。
[圖 24 ]係列出在NNK庫的文庫篩選過程中鑒定的變體VH和VL序列的表。
無
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Claims (134)

  1. 一種結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 53的重鏈可變區（VH）之HCDR1、HCDR2和HCDR3； b) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； c) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； d) SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3； e) SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者 f) SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3。
  2. 如請求項1所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a)     分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； b)    分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； c)     分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； d)    分別是，SEQ ID NO: 253、256和259； e)     分別是，SEQ ID NO: 254、257和260；或者 f)     分別是，SEQ ID NO: 255、258和261。
  3. 一種結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3： a)     分別是，SEQ ID NO: 29、37和46； b)    分別是，SEQ ID NO: 32、40和49； c)     分別是，SEQ ID NO: 34、43和51； d)    分別是，SEQ ID NO: 253、256和259； e)     分別是，SEQ ID NO: 254、257和260；或者 f)     分別是，SEQ ID NO: 255、258和261。
  4. 如請求項1或2所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含 a) SEQ ID NO: 53的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 82的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； b) SEQ ID NO: 56的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 85的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； c) SEQ ID NO: 59的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 87的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； d) SEQ ID NO: 262的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 271的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； e) SEQ ID NO: 263的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 272的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者 f) SEQ ID NO: 264的VH之HCDR1、HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO: 273的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  5. 如請求項3或4所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)     分別是，SEQ ID NO: 29、37、46、63、70和76； b)    分別是，SEQ ID NO: 32、40、49、66、70和76； c)     分別是，SEQ ID NO: 34、43、51、68、74和80； d)    分別是，SEQ ID NO: 253、256、259、265、74和269； e)     分別是，SEQ ID NO: 254、257、260、66、267和76；或者 f)     分別是，SEQ ID NO: 255、258、261、266、268和270。
  6. 如請求項1-5中任一項所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 53、56、59、262、263、264、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382或382的VH，和SEQ ID NO: 82、85、87、271、272、273、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397或398的VL。
  7. 如請求項6所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含： a)     SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； b)    SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； c)     SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； d)    SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； e)     SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL； f)     SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL； g)    SEQ ID NO: 291的VH和SEQ ID NO: 271的VL； h)    SEQ ID NO: 292的VH和SEQ ID NO: 271的VL； i)     SEQ ID NO: 293的VH和SEQ ID NO: 271的VL； j)     SEQ ID NO: 294的VH和SEQ ID NO: 271的VL； k)    SEQ ID NO: 295的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l)     SEQ ID NO: 296的VH和SEQ ID NO: 271的VL； m)   SEQ ID NO: 297的VH和SEQ ID NO: 271的VL； n)    SEQ ID NO: 298的VH和SEQ ID NO: 271的VL； o)    SEQ ID NO: 299的VH和SEQ ID NO: 271的VL； p)    SEQ ID NO: 300的VH和SEQ ID NO: 271的VL； q)    SEQ ID NO: 301的VH和SEQ ID NO: 271的VL； r)     SEQ ID NO: 302的VH和SEQ ID NO: 271的VL； s)     SEQ ID NO: 303的VH和SEQ ID NO: 271的VL； t)     SEQ ID NO: 304的VH和SEQ ID NO: 271的VL； u)    SEQ ID NO: 305的VH和SEQ ID NO: 271的VL； v)    SEQ ID NO: 306的VH和SEQ ID NO: 271的VL； w)   SEQ ID NO: 307的VH和SEQ ID NO: 271的VL； x)    SEQ ID NO: 308的VH和SEQ ID NO: 271的VL； y)    SEQ ID NO: 309的VH和SEQ ID NO: 271的VL； z)     SEQ ID NO: 310的VH和SEQ ID NO: 271的VL； aa)SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 311的VL； ab)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 312的VL； ac)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 313的VL； ad)SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 314的VL； ae)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 315的VL； af)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 316的VL； ag)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 317的VL； ah)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 318的VL； ai)    SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 319的VL； aj)    SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 320的VL； ak)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 321的VL； al)    SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 322的VL； am)  SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 323的VL； an)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 324的VL； ao)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 325的VL； ap)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 326的VL； aq)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 327的VL； ar)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 328的VL； as)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 329的VL； at)    SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 330的VL； au)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 331的VL； av)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 332的VL； aw)  SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 333的VL； ax)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 334的VL； ay)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 335的VL； az)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 336的VL； ba)   SEQ ID NO: 337的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bb)  SEQ ID NO: 338的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bc)   SEQ ID NO: 339的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bd)  SEQ ID NO: 340的VH和SEQ ID NO: 272的VL； be)   SEQ ID NO: 341的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bf)   SEQ ID NO: 342的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bg)  SEQ ID NO: 343的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bh)  SEQ ID NO: 344的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bi)   SEQ ID NO: 345的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bj)   SEQ ID NO: 346的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bk)  SEQ ID NO: 347的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bl)   SEQ ID NO: 348的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bm) SEQ ID NO: 349的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bn)  SEQ ID NO: 350的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bo)  SEQ ID NO: 351的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bp)SEQ ID NO: 352的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bq)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 353的VL； br)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 354的VL； bs)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 355的VL； bt)SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 356的VL； bu)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 357的VL； bv)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 358的VL； bw) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 359的VL； bx)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 360的VL； by)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 361的VL； bz)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 362的VL； ca)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 363的VL； cb)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 364的VL； cc)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 365的VL； cd)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 366的VL； ce)   SEQ ID NO: 367的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cf)   SEQ ID NO: 368的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cg)   SEQ ID NO: 369的VH和SEQ ID NO: 85的VL； ch)   SEQ ID NO: 370的VH和SEQ ID NO: 85的VL； ci)    SEQ ID NO: 371的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cj)    SEQ ID NO: 372的VH和SEQ ID NO: 85的VL； ck)   SEQ ID NO: 373的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cl)    SEQ ID NO: 374的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cm)  SEQ ID NO: 375的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cn)   SEQ ID NO: 376的VH和SEQ ID NO: 85的VL； co)   SEQ ID NO: 377的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cp)   SEQ ID NO: 378的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cq)   SEQ ID NO: 379的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cr)   SEQ ID NO: 380的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cs)   SEQ ID NO: 381的VH和SEQ ID NO: 85的VL； ct)    SEQ ID NO: 382的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cu)SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 383的VL； cv)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 384的VL； cw)  SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 385的VL； cx)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 386的VL； cy)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 387的VL； cz)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 388的VL； da)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 389的VL； db)  SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 390的VL； dc)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 391的VL； dd)  SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 392的VL； de)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 393的VL； df)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 394的VL； dg)  SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 395的VL； dh)  SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 396的VL； di)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 397的VL；或者 dj)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 398的VL。
  8. 一種結合CD33的分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含 a)     SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 82的VL； b)    SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 85的VL； c)     SEQ ID NO: 59的VH和SEQ ID NO: 87的VL； d)    SEQ ID NO: 262的VH和SEQ ID NO: 271的VL； e)     SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 272的VL； f)     SEQ ID NO: 264的VH和SEQ ID NO: 273的VL； g)    SEQ ID NO: 291的VH和SEQ ID NO: 271的VL； h)    SEQ ID NO: 292的VH和SEQ ID NO: 271的VL； i)     SEQ ID NO: 293的VH和SEQ ID NO: 271的VL； j)     SEQ ID NO: 294的VH和SEQ ID NO: 271的VL； k)    SEQ ID NO: 295的VH和SEQ ID NO: 271的VL； l)     SEQ ID NO: 296的VH和SEQ ID NO: 271的VL； m)   SEQ ID NO: 297的VH和SEQ ID NO: 271的VL； n)    SEQ ID NO: 298的VH和SEQ ID NO: 271的VL； o)    SEQ ID NO: 299的VH和SEQ ID NO: 271的VL； p)    SEQ ID NO: 300的VH和SEQ ID NO: 271的VL； q)    SEQ ID NO: 301的VH和SEQ ID NO: 271的VL； r)     SEQ ID NO: 302的VH和SEQ ID NO: 271的VL； s)     SEQ ID NO: 303的VH和SEQ ID NO: 271的VL； t)     SEQ ID NO: 304的VH和SEQ ID NO: 271的VL； u)    SEQ ID NO: 305的VH和SEQ ID NO: 271的VL； v)    SEQ ID NO: 306的VH和SEQ ID NO: 271的VL； w)   SEQ ID NO: 307的VH和SEQ ID NO: 271的VL； x)    SEQ ID NO: 308的VH和SEQ ID NO: 271的VL； y)    SEQ ID NO: 309的VH和SEQ ID NO: 271的VL； z)     SEQ ID NO: 310的VH和SEQ ID NO: 271的VL； aa)SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 311的VL； ab)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 312的VL； ac)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 313的VL； ad)SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 314的VL； ae)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 315的VL； af)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 316的VL； ag)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 317的VL； ah)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 318的VL； ai)    SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 319的VL； aj)    SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 320的VL； ak)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 321的VL； al)    SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 322的VL； am)  SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 323的VL； an)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 324的VL； ao)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 325的VL； ap)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 326的VL； aq)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 327的VL； ar)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 328的VL； as)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 329的VL； at)    SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 330的VL； au)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 331的VL； av)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 332的VL； aw)  SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 333的VL； ax)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 334的VL； ay)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 335的VL； az)   SEQ ID NO: 263的VH和SEQ ID NO: 336的VL； ba)   SEQ ID NO: 337的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bb)  SEQ ID NO: 338的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bc)   SEQ ID NO: 339的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bd)  SEQ ID NO: 340的VH和SEQ ID NO: 272的VL； be)   SEQ ID NO: 341的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bf)   SEQ ID NO: 342的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bg)  SEQ ID NO: 343的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bh)  SEQ ID NO: 344的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bi)   SEQ ID NO: 345的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bj)   SEQ ID NO: 346的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bk)  SEQ ID NO: 347的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bl)   SEQ ID NO: 348的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bm) SEQ ID NO: 349的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bn)  SEQ ID NO: 350的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bo)  SEQ ID NO: 351的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bp)  SEQ ID NO: 352的VH和SEQ ID NO: 272的VL； bq)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 353的VL； br)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 354的VL； bs)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 355的VL； bt)SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 356的VL； bu)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 357的VL； bv)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 358的VL； bw) SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 359的VL； bx)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 360的VL； by)  SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 361的VL； bz)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 362的VL； ca)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 363的VL； cb)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 364的VL； cc)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 365的VL； cd)   SEQ ID NO: 56的VH和SEQ ID NO: 366的VL； ce)   SEQ ID NO: 367的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cf)   SEQ ID NO: 368的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cg)   SEQ ID NO: 369的VH和SEQ ID NO: 85的VL； ch)   SEQ ID NO: 370的VH和SEQ ID NO: 85的VL； ci)    SEQ ID NO: 371的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cj)    SEQ ID NO: 372的VH和SEQ ID NO: 85的VL； ck)   SEQ ID NO: 373的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cl)    SEQ ID NO: 374的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cm)  SEQ ID NO: 375的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cn)   SEQ ID NO: 376的VH和SEQ ID NO: 85的VL； co)   SEQ ID NO: 377的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cp)   SEQ ID NO: 378的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cq)   SEQ ID NO: 379的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cr)   SEQ ID NO: 380的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cs)   SEQ ID NO: 381的VH和SEQ ID NO: 85的VL； ct)    SEQ ID NO: 382的VH和SEQ ID NO: 85的VL； cu)SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 383的VL； cv)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 384的VL； cw)  SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 385的VL； cx)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 386的VL； cy)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 387的VL； cz)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 388的VL； da)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 389的VL； db)  SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 390的VL； dc)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 391的VL； dd)  SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 392的VL； de)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 393的VL； df)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 394的VL； dg)  SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 395的VL； dh)  SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 396的VL； di)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 397的VL；或者 dj)   SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 398的VL。
  9. 如請求項1-8中任一項所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv、(scFv)2 、Fv、Fab、F(ab’)2 、Fd、dAb或VHH。
  10. 如請求項9所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係Fab。
  11. 如請求項9所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係scFv。
  12. 如請求項11所述之分離的蛋白質，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。
  13. 如請求項12所述之分離的蛋白質，其中該L1包含 a)     約5-50個胺基酸； b)    約5-40個胺基酸； c)     約10-30個胺基酸；或者 d)    約10-20個胺基酸。
  14. 如請求項13所述之分離的蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。
  15. 如請求項14所述之分離的蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。
  16. 如請求項15所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質包含SEQ ID NO: 213、216、219、274、275或276的胺基酸序列。
  17. 如請求項1-16中任一項所述之分離的蛋白質，其中該蛋白質與半衰期延長部分軛合。
  18. 如請求項17所述之分離的蛋白質，其中該半衰期延長部分係免疫球蛋白（Ig）、該Ig的片段、Ig恒定區、該Ig恒定區的片段、Fc區、轉鐵蛋白、白蛋白、白蛋白結合結構域或聚乙二醇。
  19. 如請求項1-18中任一項所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係單特異性蛋白質。
  20. 如請求項1-19中任一項所述之分離的蛋白質，其中該分離的蛋白質係多特異性蛋白質。
  21. 如請求項20所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白質係雙特異性蛋白質。
  22. 如請求項20所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白質係三特異性蛋白質。
  23. 如請求項1-22中任一項所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質進一步包含免疫球蛋白（Ig）恒定區或其Ig恒定區的片段。
  24. 如請求項23所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含Fc區。
  25. 如請求項23所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含CH2結構域。
  26. 如請求項23所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含CH3結構域。
  27. 如請求項23所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含CH2結構域和CH3結構域。
  28. 如請求項23所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含鉸鏈的至少部分、CH2結構域和CH3結構域。
  29. 如請求項23所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域。
  30. 如請求項23-29中任一項所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含結合CD33的抗原結合結構域，該抗原結合結構域與Ig恒定區的N末端或該Ig恒定區的片段軛合。
  31. 如請求項23-29中任一項所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含結合CD33的抗原結合結構域，該抗原結合結構域與Ig恒定區的C末端或該Ig恒定區的片段軛合。
  32. 如請求項23-31中任一項所述之分離的蛋白質，該分離的蛋白質包含結合CD33的抗原結合結構域，該抗原結合結構域經由第二連接子（L2）與Ig恒定區或該Ig恒定區的片段軛合。
  33. 如請求項32所述之分離的蛋白質，其中該L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。
  34. 如請求項20-33中任一項所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白質包含結合淋巴細胞上抗原的抗原結合結構域。
  35. 如請求項34所述之分離的蛋白質，其中該淋巴細胞係T細胞。
  36. 如請求項35所述之分離的蛋白質，其中該T細胞係CD8+ T細胞。
  37. 如請求項34所述之分離的蛋白質，其中該淋巴細胞係自然殺手（NK）細胞。
  38. 如請求項20-37中任一項所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白質包含結合 CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C的抗原結合結構域。
  39. 如請求項38所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白質包含結合CD3ε的抗原結合結構域。
  40. 如請求項38所述之分離的蛋白質，其中該多特異性蛋白質包含結合TRGV9的抗原結合結構域。
  41. 如請求項34-40中任一項所述之分離的蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab’)2、Fd、dAb或VHH。
  42. 如請求項41所述之分離的蛋白質，其中 a) 該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含Fab； b) 該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含VHH； c) 該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv；或者 d) 該結合CD33的第一抗原結合結構域包含scFv並且該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含VHH。
  43. 如請求項23-42中任一項所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型，其中視需要該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段係IgG1。
  44. 如請求項43所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區的片段具有SEQ ID NO: 277或278的序列。
  45. 如請求項23-43中任一項所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合降低。
  46. 如請求項45所述之分離的蛋白質，其中導致該蛋白質與FcγR的結合降低的該至少一個突變選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。
  47. 如請求項23-43中任一項所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該蛋白質與FcγR的結合增強。
  48. 如請求項47所述之分離的蛋白質，其中導致該蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。
  49. 如請求項45-48中任一項所述之分離的蛋白質，其中該FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII、或其任何組合。
  50. 如請求項23-49中任一項所述之分離的蛋白質，其中該Ig恒定區或該Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節該蛋白質的半衰期。
  51. 如請求項50所述之分離的蛋白質，其中調節該蛋白質的半衰期的該至少一個突變選自由以下組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中殘基根據EU索引編號。
  52. 如請求項23-51中任一項所述之分離的蛋白質，其中該蛋白質包含Ig恒定區的CH3結構域中的至少一個突變。
  53. 如請求項52所述之分離的蛋白質，其中Ig恒定區的CH3結構域中的該至少一個突變選自由以下組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基根據EU索引編號。
  54. 一種分離的多特異性蛋白質，其包含結合CD33的第一抗原結合結構域和結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域包含如請求項1-16中任一項所定義的結合結構域。
  55. 如請求項54所述之分離的多特異性蛋白質，其中該淋巴細胞抗原係T細胞抗原。
  56. 如請求項55所述之分離的多特異性蛋白質，其中該T細胞抗原係CD8+ T細胞抗原。
  57. 如請求項54所述之分離的多特異性蛋白質，其中該淋巴細胞抗原係NK細胞抗原。
  58. 如請求項54-57中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該淋巴細胞抗原係CD3、CD3ε（CD3 epsilon）、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、TRGV9、或NKG2C的抗原結合結構域。
  59. 如請求項58所述之分離的多特異性蛋白質，其中該淋巴細胞抗原係CD3ε。
  60. 如請求項54-59中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab’)2、Fd、dAb或VHH。
  61. 如請求項60所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含Fab。
  62. 如請求項60所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含VHH。
  63. 如請求項60所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域包含scFv。
  64. 如請求項60或63所述之分離的多特異性蛋白質，其中該scFv從N末端至C末端包含VH、第一連接子（L1）和VL（VH-L1-VL）或VL、L1和VH（VL-L1-VH）。
  65. 如請求項64所述之分離的多特異性蛋白質，其中該L1包含 約5-50個胺基酸； 約5-40個胺基酸； 約10-30個胺基酸；或者 約10-20個胺基酸。
  66. 如請求項65所述之分離的多特異性蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。
  67. 如請求項66所述之分離的多特異性蛋白質，其中該L1包含SEQ ID NO: 108的胺基酸序列。
  68. 如請求項54-67中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該結合CD33的第一抗原結合結構域與第一免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第一Ig恒定區的片段軛合，和/或該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與第二免疫球蛋白（Ig）恒定區或該第二Ig恒定區的片段軛合。
  69. 如請求項68所述之分離的多特異性蛋白質，該分離的多特異性蛋白質進一步包含第二連接子（L2），該第二連接子介於該結合CD33的第一抗原結合結構域與該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段之間，以及介於該結合淋巴細胞抗原的第二抗原結合結構域與該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段之間。
  70. 如請求項69所述之分離的多特異性蛋白質其中該L2包含SEQ ID NO: 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140中任一項的胺基酸序列。
  71. 如請求項68-70中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段係IgG1、IgG2、和IgG3或IgG4同種型。
  72. 如請求項68-71中所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合降低。
  73. 如請求項72所述之分離的多特異性蛋白質，其中該導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合降低的該至少一個突變選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。
  74. 如請求項68-71中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變導致該多特異性蛋白質與Fcγ受體（FcγR）的結合增強。
  75. 如請求項74所述之分離的多特異性蛋白質，其中該導致該多特異性蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。
  76. 如請求項72-75中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII、或其任何組合。
  77. 如請求項67-76中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含至少一個突變，該突變調節該多特異性蛋白質的半衰期。
  78. 如請求項77所述之分離的多特異性蛋白質，其中調節該多特異性蛋白質的半衰期的該至少一個突變選自由以下組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中殘基根據EU索引編號。
  79. 如請求項68-78中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，該分離的多特異性蛋白質包含該第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或該第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變。
  80. 如請求項79所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區的CH3結構域中或該第一Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變，和/或該第二Ig恒定區的CH3結構域中或該第二Ig恒定區的片段的CH3結構域中的至少一個突變選自由以下組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基根據EU索引編號。
  81. 如請求項68-80中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，其中該第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區的片段和該第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區的片段包含以下突變： 該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W；或者 該第一Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W和該第二Ig恒定區中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V。
  82. 如請求項1-16中任一項所述之分離的蛋白質，其中該蛋白質係嵌合抗原受體（CAR）。
  83. 如請求項82所述之分離的蛋白質，其中該CAR包含 a)     包含結合如請求項1-16中任一項所述之CD33的抗原結合結構域之細胞外結構域； b)    跨膜結構域；和 c)     視需要包含至少一個共刺激結構域的細胞內傳訊結構域。
  84. 如請求項82或83所述之分離的蛋白質，其中該CAR進一步包含CD8a鉸鏈區。
  85. 如請求項82-84中任一項所述之分離的蛋白質，其中 a)     該跨膜結構域包含CD8a跨膜區（CD8a-TM）多肽；並且 b)    該細胞內傳訊結構域包含共刺激結構域和初級傳訊結構域，該共刺激結構域包含TNF受體超家族成員9（CD137）組分，該初級傳訊結構域包含T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分。
  86. 如請求項82-84中任一項所述之分離的蛋白質，其中 a)     該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 157的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列； b)    該跨膜結構域包含與SEQ ID NO: 162的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列；和/或 c)     該細胞內傳訊結構域包含具有與SEQ ID NO: 163的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之共刺激結構域和具有與SEQ ID NO: 164的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之初級傳訊結構域。
  87. 如請求項86所述之分離的蛋白質，其中該細胞內傳訊結構域包含選自由以下組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9（CD137）組分、T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分、分化簇（CD27）組分、分化簇超家族成員組分、或其任何組合。
  88. 一種嵌合抗原受體（CAR），其包含： a)     含有結合CD33的抗原結合結構域之細胞外結構域； b)    跨膜結構域；和 c)     視需要包含至少一個共刺激結構域的細胞內傳訊結構域， 其中該結合CD33的抗原結合結構域包含如請求項1-16、20-22或34-40中任一項所定義的結合結構域。
  89. 如請求項88所述之CAR，該CAR進一步包含CD8a鉸鏈區。
  90. 如請求項88或89所述之CAR，其中 a)     該跨膜結構域包含CD8a跨膜區（CD8a-TM）多肽；並且 b)    該細胞內傳訊結構域包含共刺激結構域和初級傳訊結構域，該共刺激結構域包含TNF受體超家族成員9（CD137）組分，該初級傳訊結構域包含T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分。
  91. 如請求項89或90所述之CAR，其中 d)    該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 157的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列； e)     該跨膜結構域包含與SEQ ID NO: 162的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列；和/或 f)     該細胞內傳訊結構域包含具有與SEQ ID NO: 163的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之共刺激結構域、和具有與SEQ ID NO: 164的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列之初級傳訊結構域。
  92. 如請求項88-91中任一項所述之CAR，其中該包含結合CD33的抗原結合結構域之細胞外結構域進一步包含訊息多肽。
  93. 如請求項92所述之CAR，其中該訊息多肽包含SEQ ID NO: 166的胺基酸序列。
  94. 如請求項88-93中任一項所述之CAR，其中該細胞內傳訊結構域包含選自由以下組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9（CD137）組分、T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈（CD3z）組分、分化簇（CD27）組分、分化簇超家族成員組分、及其組合。
  95. 如請求項90-94中任一項所述之CAR，其中該CD137組分包含SEQ ID NO: 163的胺基酸序列。
  96. 如請求項90-95中任一項所述之CAR，其中該CD3z組分包含SEQ ID NO: 164的胺基酸序列。
  97. 如請求項90-96中任一項所述之CAR，其中該細胞內傳訊結構域包含SEQ ID NO: 165的胺基酸序列。
  98. 如請求項90-97中任一項所述之CAR，其中該CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO: 162的胺基酸序列。
  99. 如請求項90-98中任一項所述之CAR，其中該CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO: 157的胺基酸序列。
  100. 一種分離的淋巴細胞，其表現如請求項90-99中任一項所述之CAR。
  101. 如請求項100所述之分離的淋巴細胞，其中該淋巴細胞係T淋巴細胞。
  102. 如請求項100所述之分離的淋巴細胞，其中該淋巴細胞係自然殺手（NK）細胞。
  103. 一種免疫軛合物，其包含如請求項1-53中任一項所述之分離的蛋白質、或如請求項54-81中任一項所述之分離的多特異性蛋白質，該免疫軛合物與藥劑軛合。
  104. 如請求項103所述之免疫軛合物，其中該藥劑係治療劑或顯像劑。
  105. 如請求項103所述之免疫軛合物，其中該藥劑係放射性藥劑。
  106. 如請求項105所述之免疫軛合物，其中該放射性藥劑包含放射性金屬離子。
  107. 如請求項106所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子係32 P、47 Sc、67 Cu、77 As、89 Sr、90 Y、99 Tc、105 Rh、109 Pd、111 Ag、131 I、153 Sm、159 Gd、165 Dy、166 Ho、169 Er、177 Lu、186 Re、188 Re、194 Ir、198 Au、199 Au、211 At、212 Pb、212 Bi、213 Bi、223 Ra、225 Ac、255 Fm、227 Th、62 Cu、64 Cu、67 Ga、68 Ga、86 Y、89 Zr或111 In。
  108. 如請求項107所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子係225 Ac、111 In或89 Zr。
  109. 如請求項107所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子係225 Ac。
  110. 如請求項106至109中任一項所述之免疫軛合物，其中該放射性金屬離子與螯合部分軛合。
  111. 如請求項110所述之免疫軛合物，其中該螯合部分包含具有式 (I) 之結構的大環：
    Figure 03_image026
    其中R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地是CHQCO2 X，其中 Q獨立地是氫、C1 -C4 烷基或(C1 -C2 烷基)苯基，並且 X獨立地是氫、苄基、C1 -C4 烷基；以及 Z係(CH2)n Y，其中 n係1-10，並且 Y係與第二點擊反應配偶體共價連接的親電子或親核部分； 可替代地，Z係氫；以及 R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地是CHQCO2 X，其中 Q獨立地是氫、C1 -C4 烷基或(C1 -C2 烷基)苯基，並且 X獨立地是氫、苄基、C1 -C4 烷基、或與第二點擊反應配偶體共價連接的親電子或親核部分； 可替代地，螯合劑包含開鏈配體。
  112. 如請求項110所述之免疫軛合物，其中該螯合部分包含具有式 (II) 之結構：
    Figure 03_image003
    或式 (III) 之結構的大環：
    Figure 03_image005
    。
  113. 一種具有式 (IV) 的免疫軛合物，
    Figure 03_image028
    式 (IV) 其中該蛋白質係如請求項1-53、82-87中任一項所定義的分離的蛋白質或如請求項54-81中任一項所定義的分離的多特異性蛋白質。
  114. 一種具有式 (V) 之免疫軛合物，
    Figure 03_image030
    式 (V) 其中該蛋白質係如請求項1-53、82-87中任一項所定義的分離的蛋白質或如請求項54-81中任一項所定義的分離的多特異性蛋白質。
  115. 一種藥物組成物，其包含如請求項1-53、82-87中任一項所述之分離的蛋白質、如請求項54-81中任一項所述之分離的多特異性蛋白質、如請求項88-99中任一項所述之CAR、如請求項100-102中任一項所述之淋巴細胞或如請求項103-114中任一項所述之免疫軛合物、和藥學上可接受的載劑。
  116. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1-53、82-87中任一項所述之分離的蛋白質、如請求項54-81中任一項所述之分離的多特異性蛋白質、如請求項88-99中任一項所述之CAR、或如請求項103-114中任一項所述之免疫軛合物。
  117. 一種載體，其包含如請求項116所述之多核苷酸。
  118. 一種宿主細胞，其包含如請求項117所述之載體或如請求項116所述之多核苷酸。
  119. 一種產生如請求項1-53、82-87中任一項所述之分離的蛋白質，或如請求項54-81中任一項所述之分離的多特異性蛋白質之方法，該方法包括在表現蛋白質的條件下培養如請求項118所述之宿主細胞，以及回收由該宿主細胞產生的蛋白質。
  120. 一種產生如請求項103-114中任一項所述之免疫軛合物之方法，該方法包括在表現蛋白質的條件下培養如請求項118所述之宿主細胞，回收由該宿主細胞產生的蛋白質，以及將該宿主細胞產生的蛋白質與藥劑軛合。
  121. 一種抗遺傳型抗體，其與如請求項1-53或82-87中任一項所述之分離的蛋白質結合。
  122. 一種套組，其包含如請求項1-53、82-87中任一項所述之分離的蛋白質，或如請求項54-81中任一項所述之分離的多特異性蛋白質或者如請求項88-99中任一項所述之CAR。
  123. 一種治療受試者中表現CD33的癌症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的如請求項1-53、82-87中任一項所述之分離的蛋白質，如請求項54-81中任一項所述之分離的多特異性蛋白質或如請求項103-114中任一項所述之免疫軛合物，持續足以治療表現CD33的癌症的時間。
  124. 如請求項123所述之方法，其中該方法有效減少受試者中表現CD33的細胞的量，其中該等表現CD33的細胞係癌細胞或其中該等表現CD33的細胞係非癌細胞。
  125. 如請求項123或124所述之方法，其中該方法有效預防該受試者中表現CD33的癌症的建立。
  126. 一種治療患有表現CD33的癌症的受試者之方法，該方法包括：向有需要的受試者投與治療有效量的如請求項100-102中任一項所述之淋巴細胞，由此該淋巴細胞介導該受試者中表現CD33的癌症的殺傷。
  127. 一種癌細胞的靶向殺傷之方法，該方法包括：將該癌細胞與如請求項100-102中任一項所述之淋巴細胞接觸，由此該淋巴細胞誘導該癌細胞的靶向殺傷。
  128. 一種檢測受試者中癌症之存在的方法，該方法包括： a)     將獲得自該受試者的細胞樣本與如請求項88-99中任一項所述之CAR接觸，從而形成CAR-細胞複合物，以及 b)    檢測該CAR-細胞複合物，其中該CAR-細胞複合物的檢測指示該受試者中癌症的存在。
  129. 如請求項123-128中任一項所述之方法，其中該表現CD33的癌症係血液癌。
  130. 如請求項129所述之方法，其中該血液癌係白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
  131. 如請求項130所述之方法，其中該血液癌係急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴細胞白血病（ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓白血病（CML）或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（DPDCN）。
  132. 如請求項131所述之方法，其中該血液癌係急性骨髓性白血病（AML）。
  133. 如請求項123-132中任一項所述之方法，其中將該分離的蛋白質、分離的多特異性蛋白質或該免疫軛合物與第二治療劑組合投與。
  134. 如請求項133所述之方法，其中該第二治療劑係手術、化學療法、雄激素剝奪療法或放射或其任何組合。
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