EA047663B1 - Материалы и способы для связывания siglec-3/cd33 - Google Patents
Материалы и способы для связывания siglec-3/cd33 Download PDFInfo
- Publication number
- EA047663B1 EA047663B1 EA202391269 EA047663B1 EA 047663 B1 EA047663 B1 EA 047663B1 EA 202391269 EA202391269 EA 202391269 EA 047663 B1 EA047663 B1 EA 047663B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- under
- under seq
- hcdr3
- hcdr2
- Prior art date
Links
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 title claims description 608
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 title claims description 595
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- 108010029180 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 3 Proteins 0.000 title description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 title description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 710
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 710
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 676
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 676
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 676
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 273
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 259
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 245
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 claims description 221
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 claims description 221
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 153
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 134
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 84
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 78
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 61
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 56
- 101000680681 Homo sapiens T cell receptor gamma variable 9 Proteins 0.000 claims description 50
- 102100022393 T cell receptor gamma variable 9 Human genes 0.000 claims description 50
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 claims description 32
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 claims description 32
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 31
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 31
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 24
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 18
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 16
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 11
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 10
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 10
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 claims description 10
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 10
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 10
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 claims description 10
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 claims description 10
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 claims description 10
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 10
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 10
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 9
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 7
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 6
- 102100025430 Butyrophilin-like protein 3 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100025371 Butyrophilin-like protein 8 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100025618 C-X-C chemokine receptor type 6 Human genes 0.000 claims description 5
- 208000016778 CD4+/CD56+ hematodermic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 101000934741 Homo sapiens Butyrophilin-like protein 3 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000934742 Homo sapiens Butyrophilin-like protein 8 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000946926 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000856683 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 6 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101150074862 KLRC3 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150018199 KLRC4 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 5
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 5
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 5
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 5
- 102100022701 NKG2-E type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 5
- 102100022700 NKG2-F type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 5
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 213
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 90
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 80
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 71
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 54
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 49
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 31
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 26
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 25
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 13
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 13
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 12
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 11
- 101710147545 Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 11
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 9
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 description 8
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102220471155 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8_N97G_mutation Human genes 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 5
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 5
- 102220534604 Protein quaking_N97A_mutation Human genes 0.000 description 5
- 102000001555 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 3 Human genes 0.000 description 5
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 102200012486 rs111033669 Human genes 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- -1 213Bi Chemical compound 0.000 description 4
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 4
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102220579602 Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A_N99T_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102220520996 N-chimaerin_D54T_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102220485195 Testis-expressed protein 30_N99A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 102220424826 c.291C>G Human genes 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102220485771 Glycophorin-A_G98L_mutation Human genes 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 102220427461 c.289A>G Human genes 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 102220328047 rs1060502586 Human genes 0.000 description 3
- 102200012531 rs111033829 Human genes 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220485321 ATP-dependent DNA/RNA helicase DHX36_G55L_mutation Human genes 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102220479077 Cyclin-dependent kinase 5 activator 1_N99Q_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 102220627400 Ferric-chelate reductase 1_D54L_mutation Human genes 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 2
- 102220564972 Hexokinase HKDC1_D54G_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220637906 Histone chaperone ASF1B_N99I_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102220487447 Isoaspartyl peptidase/L-asparaginase_D54R_mutation Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102220520993 N-chimaerin_D54A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 102100037906 T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain Human genes 0.000 description 2
- 101710156660 T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 229940125666 actinium-225 Drugs 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 102220353096 c.163G>C Human genes 0.000 description 2
- 102220360679 c.164G>T Human genes 0.000 description 2
- 102220359611 c.55G>A Human genes 0.000 description 2
- 102220347737 c.98G>T Human genes 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 150000002678 macrocyclic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 208000037922 refractory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 102220212766 rs1060500017 Human genes 0.000 description 2
- 102220199908 rs150665982 Human genes 0.000 description 2
- 102220253757 rs1553178735 Human genes 0.000 description 2
- 102200080525 rs200322968 Human genes 0.000 description 2
- 102200068614 rs281865227 Human genes 0.000 description 2
- 102220061393 rs786203307 Human genes 0.000 description 2
- 102220171560 rs886048506 Human genes 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- XRASPMIURGNCCH-UHFFFAOYSA-N zoledronic acid Chemical compound OP(=O)(O)C(P(O)(O)=O)(O)CN1C=CN=C1 XRASPMIURGNCCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004276 zoledronic acid Drugs 0.000 description 2
- PMKKIDFHWBBGDA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)ethyl methanesulfonate Chemical compound CS(=O)(=O)OCCN1C(=O)C=CC1=O PMKKIDFHWBBGDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVAIXJRFHXIRRE-UHFFFAOYSA-N 2-henicosylpropanedioic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(C(O)=O)C(O)=O YVAIXJRFHXIRRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBJCTWMARHHQD-UHFFFAOYSA-N 2-heptadecylpropanedioic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(C(O)=O)C(O)=O BTBJCTWMARHHQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-M Arachidonate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC([O-])=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-M 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000633786 Homo sapiens SLAM family member 6 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 101710197063 Lectin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 102100029197 SLAM family member 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100027732 Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2 Human genes 0.000 description 1
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102220567080 UHRF1-binding protein 1_G98N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940114078 arachidonate Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000017047 asymmetric cell division Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940116224 behenate Drugs 0.000 description 1
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-M behenate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004611 cancer cell death Effects 0.000 description 1
- 230000005880 cancer cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000006329 citrullination Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- DGXRZJSPDXZJFG-UHFFFAOYSA-N docosanedicarboxylic acid Natural products OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O DGXRZJSPDXZJFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000004475 gamma-delta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 231100000405 induce cancer Toxicity 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000012004 kinetic exclusion assay Methods 0.000 description 1
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229950002950 lintuzumab Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- OHSVLFRHMCKCQY-NJFSPNSNSA-N lutetium-177 Chemical compound [177Lu] OHSVLFRHMCKCQY-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940105132 myristate Drugs 0.000 description 1
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 1
- 210000004296 naive t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000001884 polyglutamylation Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 102220026970 rs267607725 Human genes 0.000 description 1
- 102220080117 rs34015709 Human genes 0.000 description 1
- 102220085078 rs863225382 Human genes 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 102000036068 sialic acid binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000315 sialic acid binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000035087 single-pass transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005496 single-pass transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229940114926 stearate Drugs 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- HQHCYKULIHKCEB-UHFFFAOYSA-N tetradecanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCC(O)=O HQHCYKULIHKCEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка заявляет приоритет согласно предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/989093, поданной 13 марта 2020 года, предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/989071, поданной 13 марта 2020 года, предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/989120, поданной 13 марта 2020 года, предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/989187, поданной 13 марта 2020 года, и предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/989230, поданной 13 марта 2020 года.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим доменам, которые связывают белок CD33, являющийся поверхностным антигеном миелоидных клеток, предусматривающим антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, кодирующим их полинуклеотидам, векторам, клеткамхозяевам, способам получения и их применению.
Предпосылки изобретения
Поверхностный антиген миелоидных клеток CD33, также известный как связывающий сиаловую кислоту иммуноглобулин-подобный лектин 3 (Siglec-3), является представителем связывающего сиаловую кислоту семейства белков. CD33 представляет собой однопроходный трансмембранный белок типа I с N-концевым доменом связывания сиаловой кислоты в его внеклеточном домене (ECD) и внутриклеточным иммунорецепторным ингибирующим мотивом на основе тирозина (ITIM) (Uniprot.org) [4].
В нормальных клетках CD33 участвует в поддержании иммунных клеток и в межклеточных взаимодействиях [5]. Белок CD33 экспрессируется по меньшей мере в костном мозге, легком, коже, аппендиксе, селезенке, лимфатических узлах и миндалинах. Экспрессия mRNA CD33 обнаружена в самых разных тканях и органах, включая без ограничения костный мозг, головной мозг, глаз, легкое, эндокринные ткани, слюнные железы, пищевод, желудок, толстую кишку, прямую кишку, печень, желчный пузырь, поджелудочную железу, почку, мочевой пузырь, мужские и женские репродуктивные ткани, предстательную железу, молочную железу, сердце, гладкую мускулатуру, скелетную мускулатуру, жировую ткань, кожу, тимус, аппендикс, селезенку, лимфатические узлы, миндалину, гранулоциты и кровь (например, РВМС, дендритные клетки и лимфоциты).
См., например, www.proteinatlas.org/ENSG00000105383-CD33/tissue.
CD33 экспрессируется у 90% пациентов с AML [6] и является одним из наиболее широко изученных поверхностных антигенов для иммунотерапии AML. Было изучено несколько подходов для нацеливания на CD33, включая конъюгаты антитело-лекарственное средство/антитело-токсин, химерные антигенные рецепторы (CAR) и биспецифические антитела перенаправления Т-клеток [7]. Существует потребность в дополнительных связывающих CD33 доменах для терапевтических и диагностических целей.
Острый миелоидный лейкоз (AML) представляет собой тип лейкоза линии миелоидных клеток, характеризующийся быстрым развитием и прогрессированием [1]. AML является гетерогенным заболеванием с широко варьирующими молекулярными изменениями вместе с различными клиническими исходами. Более того, AML характеризуется способностью бластов AML, или лейкозных клеток, к самообновлению, непрерывной пролиферации и ускользанию от иммунной системы, что приводит к рецидиву заболевания из незначительных клонов [2]. Соответственно, исторически считается, что AML имеет один из самых низких показателей долгосрочной выживаемости, при этом общая 5-летняя выживаемость взрослых с AML составляет приблизительно 27%. Показатели выживаемости находятся в строгой обратной зависимости от возраста [3]. Исторически сложилось так, что основные стратегии лечения AML включают химиотерапию, а также трансплантацию стволовых клеток. Однако в последние годы предпринимают активные усилия по разработке иммунотерапии AML с использованием ключевых поверхностных антигенов. Одним из поверхностных антигенов, в высокой степени экспрессируемых в клетках, подверженных AML, является CD33.
Сущность изобретения
В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному белку, который связывает CD33, где выделенный белок содержит
a) определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 18;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 19;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 20;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 21;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 22;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 23;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 24;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 25;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 26; или
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 27, или его связывающему CD33 фрагменту.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3 под a) SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно;
- 1 047663
b) SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно;
c) SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно;
d) SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно;
e) SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно;
f) SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или
g) SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой VHH. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному белку, который связывает CD33, где выделенный белок содержит VHH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному белку, который связывает CD33, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60;
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61;
k) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262;
l) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263; или
m) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36 и 45 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38 и 47 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39 и 48 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41 и 50 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42 и 51 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44 и 51 соответственно;
j) SEQ ID NO: 35, 42 и 51 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257 и 260 соответственно; или
m) SEQ ID NO: 255, 258 и 261 соответственно.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному белку, который связывает CD33, где выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
b) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
c) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
d) SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно;
e) SEQ ID NO: 254, 257 и 260 соответственно; или
f) SEQ ID NO: 255, 258 и 261 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 81;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 83;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 84;
- 2 047663
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 86;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87;
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 88;
k) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271;
l) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272; или
m) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно; или
m) SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой VHH. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VLL1-VH).
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140. В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263, 264, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303,304,
305, 306, 307, 308, 309, 310, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351,352,
367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, или 382, и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272,273, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322,323,
324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360,361,
362, 363, 364, 365, 366, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397 или 398.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
- 3 047663
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87; h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87; i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271; l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273; n) VH под SEQ ID NO: 291 и VL под SEQ ID NO: 271; o) VH под SEQ ID NO: 292 и VL под SEQ ID NO: 271; p) VH под SEQ ID NO: 293 и VL под SEQ ID NO: 271; q) VH под SEQ ID NO: 294 и VL под SEQ ID NO: 271; r) VH под SEQ ID NO: 295 и VL под SEQ ID NO: 271; s) VH под SEQ ID NO: 296 и VL под SEQ ID NO: 271; t) VH под SEQ ID NO: 297 и VL под SEQ ID NO: 271;
u) VH под SEQ ID NO: 298 и VL под SEQ ID NO: 271; v) VH под SEQ ID NO: 299 и VL под SEQ ID NO: 271; w) VH под SEQ ID NO: 300 и VL под SEQ ID NO: 271; x) VH под SEQ ID NO: 301 и VL под SEQ ID NO: 271; y) VH под SEQ ID NO: 302 и VL под SEQ ID NO: 271; z) VH под SEQ ID NO: 303 и VL под SEQ ID NO: 271; aa) VH под SEQ ID NO: 304 и VL под SEQ ID NO: 271; ab) VH под SEQ ID NO: 305 и VL под SEQ ID NO: 271; ac) VH под SEQ ID NO: 306 и VL под SEQ ID NO: 271; ad) VH под SEQ ID NO: 307 и VL под SEQ ID NO: 271; ae) VH под SEQ ID NO: 308 и VL под SEQ ID NO: 271; af) VH под SEQ ID NO: 309 и VL под SEQ ID NO: 271; ag) VH под SEQ ID NO: 310 и VL под SEQ ID NO: 271; ah) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 311; ai) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 312; aj) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 313; ak) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 314; al) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 315; am) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 316; an) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 317; ao) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 318; ap) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 319; aq) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 320; ar) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 321; as) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 322; at) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 323; au) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 324; av) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 325; aw) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 326; ax) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 327; ay) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 328; az) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 329; ba) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 330; bb) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 331; bc) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 332; bd) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 333; be) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 334; bf) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 335; bg) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 336; bh) VH под SEQ ID NO: 337 и VL под SEQ ID NO: 272; bi) VH под SEQ ID NO: 338 и VL под SEQ ID NO: 272; bj) VH под SEQ ID NO: 339 и VL под SEQ ID NO: 272; bk) VH под SEQ ID NO: 340 и VL под SEQ ID NO: 272; bl) VH под SEQ ID NO: 341 и VL под SEQ ID NO: 272; bm) VH под SEQ ID NO: 342 и VL под SEQ ID NO: 272; bn) VH под SEQ ID NO: 343 и VL под SEQ ID NO: 272; bo) VH под SEQ ID NO: 344 и VL под SEQ ID NO: 272; bp) VH под SEQ ID NO: 345 и VL под SEQ ID NO: 272;
- 4 047663 bq) VH под SEQ ID NO: 346 и VL под SEQ ID NO: 272;
br) VH под SEQ ID NO: 347 и VL под SEQ ID NO: 272;
bs) VH под SEQ ID NO: 348 и VL под SEQ ID NO: 272;
bt) VH под SEQ ID NO: 349 и VL под SEQ ID NO: 272;
bu) VH под SEQ ID NO: 350 и VL под SEQ ID NO: 272;
bv) VH под SEQ ID NO: 351 и VL под SEQ ID NO: 272;
bw) VH под SEQ ID NO: 352 и VL под SEQ ID NO: 272;
bx) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 353;
by) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 354;
bz) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 355;
ca) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 356;
cb) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 357;
cc) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 358;
cd) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 359;
ce) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 360;
cf) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 361;
cg) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 362;
ch) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 363;
ci) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 364;
cj) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 365;
ck) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 366;
cl) VH под SEQ ID NO: 367 и VL под SEQ ID NO: 85;
cm) VH под SEQ ID NO: 368 и VL под SEQ ID NO: 85;
cn) VH под SEQ ID NO: 369 и VL под SEQ ID NO: 85;
со) VH под SEQ ID NO: 370 и VL под SEQ ID NO: 85;
cp) VH под SEQ ID NO: 371 и VL под SEQ ID NO: 85;
cq) VH под SEQ ID NO: 372 и VL под SEQ ID NO: 85;
cr) VH под SEQ ID NO: 373 и VL под SEQ ID NO: 85;
cs) VH под SEQ ID NO: 374 и VL под SEQ ID NO: 85;
ct) VH под SEQ ID NO: 375 и VL под SEQ ID NO: 85;
cu) VH под SEQ ID NO: 376 и VL под SEQ ID NO: 85;
cv) VH под SEQ ID NO: 377 и VL под SEQ ID NO: 85;
cw) VH под SEQ ID NO: 378 и VL под SEQ ID NO: 85;
cx) VH под SEQ ID NO: 379 и VL под SEQ ID NO: 85;
cy) VH под SEQ ID NO: 380 и VL под SEQ ID NO: 85;
cz) VH под SEQ ID NO: 381 и VL под SEQ ID NO: 85;
da) VH под SEQ ID NO: 382 и VL под SEQ ID NO: 85;
db) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 383;
dc) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 384;
dd) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 385;
de) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 386;
df) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 387;
dg) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 388;
dh) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 389;
de) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 390;
df) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 391;
dg) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 392;
dh) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 393;
di) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 394;
dj) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 395;
dk) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 396;
dl) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 397; или dm) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 398.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному белку, который связывает CD33, где выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
- 5 047663
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87; i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87; j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271; l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273; n) VH под SEQ ID NO: 291 и VL под SEQ ID NO: 271; o) VH под SEQ ID NO: 292 и VL под SEQ ID NO: 271; p) VH под SEQ ID NO: 293 и VL под SEQ ID NO: 271; q) VH под SEQ ID NO: 294 и VL под SEQ ID NO: 271; r) VH под SEQ ID NO: 295 и VL под SEQ ID NO: 271;
s) VH под SEQ ID NO: 296 и VL под SEQ ID NO: 271; t) VH под SEQ ID NO: 297 и VL под SEQ ID NO: 271; u) VH под SEQ ID NO: 298 и VL под SEQ ID NO: 271; v) VH под SEQ ID NO: 299 и VL под SEQ ID NO: 271; w) VH под SEQ ID NO: 300 и VL под SEQ ID NO: 271; x) VH под SEQ ID NO: 301 и VL под SEQ ID NO: 271; y) VH под SEQ ID NO: 302 и VL под SEQ ID NO: 271; z) VH под SEQ ID NO: 303 и VL под SEQ ID NO: 271; aa) VH под SEQ ID NO: 304 и VL под SEQ ID NO: 271; ab) VH под SEQ ID NO: 305 и VL под SEQ ID NO: 271; ac) VH под SEQ ID NO: 306 и VL под SEQ ID NO: 271; ad) VH под SEQ ID NO: 307 и VL под SEQ ID NO: 271; ae) VH под SEQ ID NO: 308 и VL под SEQ ID NO: 271; af) VH под SEQ ID NO: 309 и VL под SEQ ID NO: 271; ag) VH под SEQ ID NO: 310 и VL под SEQ ID NO: 271; ah) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 311; ai) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 312; aj) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 313; ak) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 314; al) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 315; am) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 316; an) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 317; ao) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 318; ap) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 319; aq) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 320; ar) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 321; as) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 322; at) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 323; au) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 324; av) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 325; aw) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 326; ax) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 327; ay) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 328; az) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 329; ba) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 330; bb) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 331; bc) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 332; bd) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 333; be) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 334; bf) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 335; bg) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 336; bh) VH под SEQ ID NO: 337 и VL под SEQ ID NO: 272; bi) VH под SEQ ID NO: 338 и VL под SEQ ID NO: 272; bj) VH под SEQ ID NO: 339 и VL под SEQ ID NO: 272; bk) VH под SEQ ID NO: 340 и VL под SEQ ID NO: 272; bl) VH под SEQ ID NO: 341 и VL под SEQ ID NO: 272; bm) VH под SEQ ID NO: 342 и VL под SEQ ID NO: 272; bn) VH под SEQ ID NO: 343 и VL под SEQ ID NO: 272; bo) VH под SEQ ID NO: 344 и VL под SEQ ID NO: 272; bp) VH под SEQ ID NO: 345 и VL под SEQ ID NO: 272; bq) VH под SEQ ID NO: 346 и VL под SEQ ID NO: 272;
- 6 047663 br) VH под SEQ ID NO: 347 и VL под SEQ ID NO: 272;
bs) VH под SEQ ID NO: 348 и VL под SEQ ID NO: 272;
bt) VH под SEQ ID NO: 349 и VL под SEQ ID NO: 272;
bu) VH под SEQ ID NO: 350 и VL под SEQ ID NO: 272;
bv) VH под SEQ ID NO: 351 и VL под SEQ ID NO: 272;
bw) VH под SEQ ID NO: 352 и VL под SEQ ID NO: 272;
bx) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 353;
by) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 354;
bz) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 355;
ca) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 356;
cb) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 357;
cc) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 358;
cd) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 359;
ce) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 360;
cf) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 361;
cg) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 362;
ch) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 363;
ci) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 364;
cj) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 365;
ck) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 366;
cl) VH под SEQ ID NO: 367 и VL под SEQ ID NO: 85;
cm) VH под SEQ ID NO: 368 и VL под SEQ ID NO: 85;
cn) VH под SEQ ID NO: 369 и VL под SEQ ID NO: 85;
со) VH под SEQ ID NO: 370 и VL под SEQ ID NO: 85;
cp) VH под SEQ ID NO: 371 и VL под SEQ ID NO: 85;
cq) VH под SEQ ID NO: 372 и VL под SEQ ID NO: 85;
cr) VH под SEQ ID NO: 373 и VL под SEQ ID NO: 85;
cs) VH под SEQ ID NO: 374 и VL под SEQ ID NO: 85;
ct) VH под SEQ ID NO: 375 и VL под SEQ ID NO: 85;
cu) VH под SEQ ID NO: 376 и VL под SEQ ID NO: 85;
cv) VH под SEQ ID NO: 377 и VL под SEQ ID NO: 85;
cw) VH под SEQ ID NO: 378 и VL под SEQ ID NO: 85;
cx) VH под SEQ ID NO: 379 и VL под SEQ ID NO: 85;
cy) VH под SEQ ID NO: 380 и VL под SEQ ID NO: 85;
cz) VH под SEQ ID NO: 381 и VL под SEQ ID NO: 85;
da) VH под SEQ ID NO: 382 и VL под SEQ ID NO: 85;
db) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 383;
dc) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 384;
dd) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 385;
de) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 386;
df) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 387;
dg) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 388;
dh) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 389;
de) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 390;
df) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 391;
dg) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 392;
dh) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 393;
di) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 394;
dj) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 395;
dk) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 396;
dl) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 397; или dm) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 398.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой VHH. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VLL1-VH).
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
- 7 047663
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140. В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 274, 275 или 276. В частности, аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213, 216, 219, 274, 275 или 276.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному белку, который связывает миелоидный CD33, где выделенный белок содержит
a) определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181; или
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 196.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90 и 92 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91 и 94 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно;
e) SEQ ID NO: 172, 173 и 174 соответственно;
f) SEQ ID NO: 176, 177 и 178 соответственно;
g) SEQ ID NO: 89, 90 и 180 соответственно; или
h) SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному белку по п.32 или 33, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 105;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 106;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 107;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 185;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 188;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 192;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 196;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 200; или
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно;
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
- 8 047663
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой Fab.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой VHH.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой scFv.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному белку, который связывает CD33, где выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой VHH. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VLL1-VH).
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140. В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
Настоящее изобретение относится к любому выделенному белку, описанному выше, где белок конъюгирован с удлиняющим период полужизни фрагментом. В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой иммуноглобулин (Ig), фрагмент Ig, константную область Ig, фрагмент константной области Ig, Fc-область, трансферрин, альбумин, альбуминсвязывающий домен или полиэтиленгликоль. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой моноспецифический белок. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок представляет собой мультиспецифический белок. В некоторых вариантах осуществления мультиспе
- 9 047663 цифический белок представляет собой биспецифический белок. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок представляет собой триспецифический белок. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок дополнительно содержит константную область иммуноглобулина (Ig) или фрагмент его константной области Ig. В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит Fc-область. В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит домен СН2. В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит домен CH3. В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит домен СН2 и домен CH3. В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере часть шарнира, домен СН2 и домен CH3. В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит шарнир, домен СН2 и домен CH3. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок конъюгирован с N-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок конъюгирован с С-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок конъюгирован с константной областью Ig или фрагментом константной области Ig через второй линкер (L2). В некоторых вариантах осуществления L2 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген на лимфоците. В некоторых вариантах осуществления лимфоцит представляет собой Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка представляет собой CD8+ Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления лимфоцит представляет собой естественную киллерную (NK) клетку. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3, CD3 эпсилон (CD3ε), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε, содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 141, HCDR2 под SEQ ID NO: 142, HCDR3 под SEQ ID NO: 143, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 144, LCDR2 под SEQ ID NO: 145 и LCDR3 под SEQ ID NO: 146;
b) VH под SEQ ID NO: 147 и VL под SEQ ID NO: 148;
c) HCDR1 под SEQ ID NO: 149, HCDR2 под SEQ ID NO: 150, HCDR3 под SEQ ID NO: 151, LCDR1 под SEQ ID NO: 152, LCDR2 под SEQ ID NO: 153 и LCDR3 под SEQ ID NO: 154; или
d) VH под SEQ ID NO: 155 и VL под SEQ ID NO: 156.
В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 238, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
b) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 242, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
c) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 243, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
d) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 244, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
e) VH под SEQ ID NO: 245 и VL под SEQ ID NO: 249;
f) VH под SEQ ID NO: 246 и VL под SEQ ID NO: 249;
g) VH под SEQ ID NO: 247 и VL под SEQ ID NO: 249; или
h) VH под SEQ ID NO: 248 и VL под SEQ ID NO: 249.
В некоторых вариантах осуществления константная область Ig или фрагмент константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления константная область Ig или фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению степени связывания белка с FcY-рецептором (FcyR). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация, которая приводит к снижению степени связывания белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S,
V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A,
- 10 047663
V234A/G237A, К214Т/Е233Р/Ь234У/Ь235А/делеции G236/A327G/P331A/D365E/L358M,
H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A,
L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S и
S228Р/F234А/L235А/делеции G236/G237A/P238S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU. В некоторых вариантах осуществления константная область Ig или фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к усилению связывания белка с FcyR. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация, которая приводит к усилению связывания белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и
G236A/S239D/I332E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU. В некоторых вариантах осуществления FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIII или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления константная область Ig фрагмента константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует период полужизни белка. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация, которая модулирует период полужизни белка, выбрана из группы, состоящей из Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H,
M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU. В некоторых вариантах осуществления белок содержит по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 константной области Ig. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация в домене CH3 константной области Ig выбрана из группы, состоящей из T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V,
L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F, L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V и
T350V/T366L/K392L/T394W, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
Настоящее изобретение относится к любому выделенному белку, описанному выше, где белок представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR содержит
a) внеклеточный домен, содержащий любой из выделенных белков, описанных выше;
b) трансмембранный домен и
c) домен внутриклеточной передачи сигнала, необязательно содержащий по меньшей мере один костимуляторный домен.
В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит CD8a-шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления
а) трансмембранный домен содержит полипептид трансмембранной области CD8a (CD8a-TM); и
b) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, содержащий компонент представителя 9 супер семейства рецепторов TNF (CD137), и домен передачи первичного сигнала, содержащий компонент дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z).
В некоторых вариантах осуществления
a) CD8а-шарнuрная область содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 157;
b) трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 162; и/или
c) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 163, и домен передачи первичного сигнала, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 164.
В некоторых вариантах осуществления домен внутриклеточной передачи сигнала содержит полипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из компонента представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), компонента дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z), компонента кластера дифференцировки (CD27), компонента представителя суперсемейства кластеров дифференцировки или любых их комбинаций.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному мультиспецифическому белку, содержащему первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита. В некоторых вариантах осуществления антиген лимфоцита представляет собой антиген Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген Тклетки представляет собой антиген CD8+ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген лимфоцита представляет собой антиген NK-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген лимфоцита представляет собой CD3, CD3 эпсилон (CD3s), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C. В определенных вариантах осуществления антиген лимфоцита представляет собой CD3ε. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает ан
- 11 047663 тиген лимфоцита, предусматривают scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, предусматривают Fab. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, предусматривают VHH. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, предусматривает scFv. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или
VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140. В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под любым из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 или 5, HCDR2 под любым из SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 или 11 и HCDR3 под любым из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 или 17.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно;
b) SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно;
c) SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно;
d) SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно;
e) SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно;
f) SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или
g) SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35, HCDR2 под SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, HCDR3 под SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51, LCDR1 под SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 67 или 68, LCDR2 под SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73 или 74 и LCDR3 под SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78, 79 или 80.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно; или
m) SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
- 12 047663
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 33, 89, 167, 172 или 176, HCDR2 под SEQ ID NO: 90, 91, 168, 173 или 177, HCDR3 под SEQ ID NO: 92, 93, 94, 169, 174, 178 или 180, LCDR1 под SEQ ID NO: 98, 99, 100, 182, 186, 189, 193, 197 или 201, LCDR2 под SEQ ID NO: 101, 102, 103, 183, 187, 190, 194 или 198 и LCDR3 под SEQ ID NO: 104, 184, 191, 195 или 199.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно; или
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержит
a) HCDR1 под SEQ ID NO: 141, HCDR2 под SEQ ID NO: 142, HCDR3 под SEQ ID NO: 143, LCDR1 под SEQ ID NO: 144, LCDR2 под SEQ ID NO: 145 и LCDR3 под SEQ ID NO: 146;
b) VH под SEQ ID NO: 147 и VL под SEQ ID NO: 148;
c) HCDR1 под SEQ ID NO: 149, HCDR2 под SEQ ID NO: 150, HCDR3 под SEQ ID NO: 151, LCDR1 под SEQ ID NO: 152, LCDR2 под SEQ ID NO: 153 и LCDR3 под SEQ ID NO: 154; или
d) VH под SEQ ID NO: 155 и VL под SEQ ID NO: 156.
В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 238, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
b) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 242, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
c) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 243, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
d) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 244, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
e) VH под SEQ ID NO: 245 и VL под SEQ ID NO: 249;
f) VH под SEQ ID NO: 246 и VL под SEQ ID NO: 249;
g) VH под SEQ ID NO: 247 и VL под SEQ ID NO: 249; или
- 13 047663
h) VH под SEQ ID NO: 248 и VL под SEQ ID NO: 249.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгирован с первой константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом первой константной области Ig и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, конъюгирован со второй константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом второй константной области Ig. В определенных вариантах осуществления мультиспецифический белок, дополнительно содержащий второй линкер (L2) между первым антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, и первой константной областью Ig или фрагментом первой константной области Ig и вторым антигенсвязывающим доменом, который связывает антиген лимфоцита, и второй константной областью Ig или фрагментом второй константной области Ig. В некоторых вариантах осуществления L2 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140. В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению степени связывания мультиспецифического белка с FcyR. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация, которая приводит к снижению степени связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A,
S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214Т/Е233Р/L234V/L235А/делеции
G236/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S и
S228Р/F234А/L235А/делеции G236/G237A/P238S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с Fcy рецептором (FcyR). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и G236A/S239D/I332E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU. В некоторых вариантах осуществления FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIII или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка, выбрана из группы, состоящей из Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU. В некоторых вариантах осуществления выделенный мультиспецифический белок содержит по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одна мутация в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig выбраны из группы, состоящей из T350V, L351Y, F405A,Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F, L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V и
T350V/T366L/K392L/T394W, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат следующие мутации:
a) L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V в первой константной области Ig и L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W во второй константной области Ig или
b) L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W в первой константной области Ig и L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V во второй константной области Ig.
Настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему любой из упомянутых выше выделенных белков, конъюгированный с терапевтическим средством или визуализирующим средством.
- 14 047663
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей любой из упомянутых выше выделенных белков и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему любой из упомянутых выше выделенных белков. Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий любой из упомянутых выше выделенных белков. Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий любой из упомянутых выше выделенных белков.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения любого из упомянутых выше выделенных белков, при этом способ включает культивирование клетки-хозяина в условиях, при которых экспрессируется белок, и извлечение белка, продуцируемого клеткой-хозяином. В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему любой из упомянутых выше выделенных мультиспецифических белков, конъюгированный с терапевтическим средством или визуализирующим средством.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения любого из упомянутых выше выделенных мультиспецифических белков, включающему культивирование любой клеткихозяина, описанной выше, в условиях, при которых экспрессируется мультиспецифический белок, и извлечение мультиспецифического белка, продуцируемого клеткой-хозяином.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества любого из упомянутых выше выделенных белков, любого из упомянутых выше выделенных мультиспецифических белков, любого из упомянутых выше иммуноконъюгатов или любой из упомянутых выше фармацевтических композиций субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения количества экспрессирующих CD33 клеток у субъекта, включающему введение любого из упомянутых выше выделенных белков, любого из упомянутых выше выделенных мультиспецифических белков, любого из упомянутых выше иммуноконъюгатов или любой из упомянутых выше фармацевтических композиций субъекту в течение времени, достаточного для снижения количества экспрессирующих CD33 клеток. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие CD33 клетки являются раковыми клетками. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие CD33 клетки не являются раковыми клетками.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающему введение любого из упомянутых выше выделенных белков, любого из упомянутых выше выделенных мультиспецифических белков, любого из упомянутых выше иммуноконъюгатов или любой из упомянутых выше фармацевтических композиций субъекту для предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения не являющегося раковым состояния у субъекта с риском развития рака с экспрессией CD33, включающему введение любого из упомянутых выше выделенных белков, любого из упомянутых выше выделенных мультиспецифических белков, любого из упомянутых выше иммуноконъюгатов или любой из упомянутых выше фармацевтических композиций субъекту для лечения не являющегося раковым состояния.
В некоторых вариантах осуществления упомянутых выше трех аспектов рак с экспрессией CD33 представляет собой гематологический рак. В некоторых вариантах осуществления гематологический рак представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления гематологический рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелоидный лейкоз (CML) или бластное плазмоцитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN). В некоторых вариантах осуществления выделенный белок или выделенный мультиспецифический белок вводят в комбинации со вторым терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой хирургическое вмешательство, химиотерапию или облучение, или любую их комбинацию. Настоящее изобретение также относится к способу выявления присутствия гематологического рака у субъекта, включающему введение любого из упомянутых выше иммуноконъюгатов субъекту с подозрением на гематологический рак и визуализацию биологических структур, с которыми связан иммуноконъюгат, с выявлением тем самым присутствия гематологического рака.
Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему любой из упомянутых выше выделенных белков, любой из упомянутых выше выделенных мультиспецифических белков, любой из упомянутых выше иммуноконъюгатов или любую из упомянутых выше фармацевтических композиций.
Настоящее изобретение также относится к антиидиотипическому антителу, связывающемуся с любым из упомянутых выше выделенных белков.
Настоящее изобретение также относится к химерному антигенному рецептору (CAR), содержащему a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33;
b) трансмембранный домен и
c) домен внутриклеточной передачи сигнала, необязательно содержащий по меньшей мере одни ко-
- 15 047663 стимуляторный домен.
В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит CD8a-шарнирную область.
а) В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит полипептид трансмембранной области CD8a (CD8a-TM); и
b) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, содержащий компонент представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), и домен передачи первичного сигнала, содержащий компонент дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z).
В некоторых вариантах осуществления
a) CD8а-шарнирнαя область содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 157;
b) трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 162; и/или
c) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 163, и домен передачи первичного сигнала, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 164.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под любым из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 или 5, HCDR2 под любым из SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 или 11 и HCDR3 под любым из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 или 17.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно;
b) SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно;
c) SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно;
d) SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно;
e) SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно;
f) SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или
g) SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 253, 254 или 255, HCDR2 под SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 256, 257 или 258, HCDR3 под SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 259, 260 или 261, LCDR1 под SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 265 или 266, LCDR2 под SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 267 или 268 и LCDR3 под SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78, 79, 80, 269 или 270.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно; или
m) SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272, 273.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
- 16 047663
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 33, 89, 167, 172 или 176, HCDR2 под SEQ ID NO: 90, 91, 168, 173 или 177, HCDR3 под SEQ ID NO: 92, 93, 94, 169, 174, 178 или 180, LCDR1 под SEQ ID NO: 98, 99, 100, 182, 186, 189, 193, 197 или 201, LCDR2 под SEQ ID NO: 101, 102, 103, 183, 187, 190, 194 или 198 и LCDR3 под SEQ ID NO: 104, 184, 191, 195 или 199.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно; или
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой VHH.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит первый линкер (L1) между VL и VH.
В определенных вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен CAR, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, дополнительно содержит сигнальный полипептид. В некоторых вариантах осуществления домен внутриклеточной передачи сигнала содержит полипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из компонента представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), компонента дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z), компонента кластера дифференцировки (CD27), компонента представителя суперсемейства кластеров дифференцировки и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления компонент CD137 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 163. В некоторых вариантах осуществления компонент CD3z содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 164. В некоторых вариантах осуществления домен внутриклеточной передачи сигнала содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 165. В некоторых вариантах осуществления полипептид CD8a-TM содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 162. В некоторых вариантах осуществления CD8а-шарнирная область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 157.
В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой мультиспецифический белок. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок представляет собой биспецифический
- 17 047663 белок. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок представляет собой триспецифический белок. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген на лимфоците. В некоторых вариантах осуществления лимфоцит представляет собой Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка представляет собой CD8+ Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления лимфоцит представляет собой естественную киллерную (NK) клетку. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3, CD3 эпсилон (CD3ε), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε, содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 141, HCDR2 под SEQ ID NO: 142, HCDR3 под SEQ ID NO: 143, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 144, LCDR2 под SEQ ID NO: 145 и LCDR3 под SEQ ID NO: 146;
b) VH под SEQ ID NO: 147 и VL под SEQ ID NO: 148;
c) HCDR1 под SEQ ID NO: 149, HCDR2 под SEQ ID NO: 150, HCDR3 под SEQ ID NO: 151, LCDR1 под SEQ ID NO: 152, LCDR2 под SEQ ID NO: 153 и LCDR3 под SEQ ID NO: 154; или
d) VH под SEQ ID NO: 155 и VL под SEQ ID NO: 156.
В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 238, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
b) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 242, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
c) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 243, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
d) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 244, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
e) VH под SEQ ID NO: 245 и VL под SEQ ID NO: 249;
f) VH под SEQ ID NO: 246 и VL под SEQ ID NO: 249;
g) VH под SEQ ID NO: 247 и VL под SEQ ID NO: 249; или
h) VH под SEQ ID NO: 248 и VL под SEQ ID NO: 249.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному лимфоциту, экспрессирующему любой из упомянутых выше CAR. В некоторых вариантах осуществления лимфоцит представляет собой Т-лимфоцит. В некоторых вариантах осуществления лимфоцит представляет собой естественную киллерную (NK) клетку. В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему любой из упомянутых выше CAR. Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему выделенный полинуклеотид, кодирующий любой из упомянутых выше CAR. Настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей выделенный полинуклеотид или вектор. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей любой из упомянутых выше лимфоцитов и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, имеющего рак с экспрессией CD33, при этом способ включает введение терапевтически эффективного количества любого из упомянутых выше лимфоцитов субъекту, нуждающемуся в этом, при этом лимфоцит опосредует уничтожение рака с экспрессией CD33 у субъекта. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой гематологический рак. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), диффузную Вкрупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелоидный лейкоз (CML) или бластное плазмоцитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN).
В другом аспекте представлен способ целевого уничтожения раковой клетки, при этом способ включает приведение раковой клетки в контакт с любым из упомянутых выше лимфоцитов, при этом лимфоцит индуцирует целевое уничтожение раковой клетки. В некоторых вариантах осуществления раковая клетка представляет собой гематологический рак. В некоторых вариантах осуществления рак с
- 18 047663 экспрессией CD33 представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), диффузную Вкрупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелоидный лейкоз (CML) или бластное плазмоцитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN).
В другом аспекте представлен способ выявления присутствия рака у субъекта, включающий
a) приведение клеточного образца, полученного от субъекта, в контакт с любым из упомянутых выше CAR, с образованием тем самым комплекса CAR-клетка, и
b) выявление комплекса CAR-клетка, где выявление комплекса CAR-клетка указывает на присутствие рака у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления раковая клетка представляет собой гематологический рак. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелоидный лейкоз (CML) или бластное плазмоцитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN).
В другом аспекте представлен иммуноконъюгат, содержащий любой из упомянутых выше выделенных белков, конъюгированный с радиоактивным средством. В некоторых вариантах осуществления радиоактивное средство содержит ион радиометалла. В некоторых вариантах осуществления ион радиометалла представляет собой 32Р, 47Sc, 67Cu, 77As, 89Sr, 90Y, 99Tc, 105Rh, 109Pd, mAg, 131I, 153Sm, 159Gd, 165Dy, i66Ho,^69Er,J77Lu, 186Re, 188Re, 194lr, 198Au, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 225Ac, 255Fm, 227Th, 62Cu, 64Cu, 7Ga, Ga, Y, Zr или In. В определенных вариантах осуществления ион радиометалла представляет собой 225Ac, 111In или 89Zr. В определенных вариантах осуществления ион радиометалла представляет собой 225Ас. В некоторых вариантах осуществления ион радиометалла иммуноконъюгата конъюгирован с хелатирующим фрагментом.
В некоторых вариантах осуществления хелатирующий фрагмент содержит макроцикл, имеющий структуру формулы (I):
формула (Γχ.
где каждый из R1, R2, R3 и R4 независимо представляет собой CHQCO2X, где
Q независимо представляет собой водород, ^-^-алкил или (С1-С2-алкил)фенил, и
X независимо представляет собой водород, бензил, ^-^-алкил; и
Z представляет собой (CH2)nY, при этом n равняется 1-10, и
Y представляет собой электрофильный или нуклеофильный фрагмент, ковалентно связанный со вторым партнером клик-реакции; в качестве альтернативы, Z представляет собой водород; и каждый из R1, R2, R3 и R4 независимо представляет собой CHQCO2X, где
Q независимо представляет собой водород, ^-^-алкил или (С1-С2-алкил)фенил, и
X независимо представляет собой водород, бензил, Ог^-алкил или электрофильный или нуклеофильный фрагмент, ковалентно связанный со вторым партнером клик-реакции;
в качестве альтернативы, хелант содержит открытоцепочечный лиганд.
В некоторых вариантах осуществления хелатирующий фрагмент содержит макроцикл, имеющий структуру формулы (II):
а, „Ой „да
-ча.. Sy
или структуру формулы (III):
- 19 047663
Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгату формулы (IV), .' СО.,Н •м
Ν'’ беяок формула (IV), где белок представляет собой любой из упомянутых выше выделенных белков. Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгату формулы (V),
где белок представляет собой любой из упомянутых выше выделенных белков.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей средство для лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей средство для снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей средство для предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей средство для лечения не являющегося раковым состояния у субъекта с риском развития рака с экспрессией CD33.
Настоящее изобретение относится к способу лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на экспрессирующую CD33 раковую клетку у субъекта.
Настоящее изобретение относится к способу снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на одну или несколько из экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей средство для предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на экспрессирующую CD33 клетку у субъекта.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей средство для лечения не являющегося раковым состояния у субъекта с риском развития рака с экспрессией CD33, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на экспрессирующую CD33 клетку у субъекта.
Краткое описание графических материалов
Файл настоящей заявки на патент содержит по меньшей мере одну фигуру, выполненную в цвете. Копии настоящей заявки на патент с цветной(-ыми) фигурой(-ами) будут предоставлены ведомством по запросу и после уплаты необходимой пошлины.
На фиг. 1 показаны репрезентативные сенсограммы BIAcore 8K взаимодействий антител vHH к CD33 с антигенами hu CD33 (FL ECD и домен IgC2).
На фиг. 2А и 2В показано связывание антител к CD33 с линиями клеток-мишеней. На графиках показаны профили нелинейной регрессии антител к CD33 человека при 4°C. Построены графики зависимости медианной интенсивности флуоресценции (MFI) от логарифмической концентрации антитела. Связывание проводили путем инкубирования клеток с серийными разбавлениями антитела при 4°C с последующим выявлением с помощью конъюгированного с РЕ козьего F(ab')2 к IgG человека - Fc-антитела.
- 20 047663
Верхний хит для каждой клеточной линии обозначен красным цветом, а связывание линтузумаба показано на синих кривых.
На фиг. 3 показано зависимое от времени и температуры связывание различных антител к CD33 с линиями клеток-мишеней. На графиках показаны профили нелинейной регрессии связывания антител к CD33 человека при 37°C и 4°C. Построены графики зависимости медианной интенсивности флуоресценции (MFI) от логарифмических концентраций антитела. Связывание проводили путем инкубирования клеток с серийными разбавлениями непосредственно конъюгированных антител при 37°C и 4°C.
На фиг. 4A-4D показана интернализация антител к CD33 на линиях клеток-мишеней с высокой, средней и низкой экспрессией. Клетки культивировали с серийными разбавлениями антител к CD33 вместе с белком A-MMAF в течение 96 ч. Через 96 ч к клеткам добавляли реагент CellTitre-Glo для измерения жизнеспособности клеток. Лунки только с белком A-MMAF считали на 100% жизнеспособными. Клетки HDLM-2 использовали в качестве клеточной линии без экспрессии. Снижение жизнеспособности клеток указывает на интернализацию антитела. На графиках показан нелинейный регрессионный анализ жизнеспособности клеток в зависимости от логарифмической концентрации антитела.
На фиг. 5 показана кинетика интернализации антитела к CD33. Антитела к CD33 метили красителями pHAb и инкубировали с клетками при концентрации 100 нМ при 37°C в течение указанных моментов времени, после чего клетки промывали и собирали на проточном цитометре. На графиках показаны значения MFI в указанные моменты времени.
На фиг. 6 показана экспрессия CD33 на линиях клеток-мишеней. Линии клеток с высокой, средней и низкой экспрессией CD33 идентифицировали с применением антитела к человеческому CD33 от Biolegend. Клетки MOLM-13, Kasumi-1, OCI-AML-3 и HDLM2 окрашивали антителом (оранжевые гистограммы) или изотипическим контролем IgG мыши (синие гистограммы) и рассчитывали кратность изменения по сравнению с изотипом для каждой линии клеток.
На фиг. 7 показана целостность антител и значения DAR после конъюгирования с красителями pHAb. Антитела метили красителями pHAb и анализировали на SDS-PAGE. Отношения лекарственного средства к антителу (DAR) рассчитывали путем измерения OD при 280 и 530 нм и поправки на поглощение красителя при 280 нм.
На фиг. 8А и 8В показана специфичность определения кинетики интернализации антител, опосредованной pHAb. На фиг. 8А антитела к CD33 метили красителями pHAb и инкубировали с клетками Kasumi-1 или OCI-AML-3 при концентрации 100 нМ при 4°C в течение указанных моментов времени, после чего клетки промывали и собирали на проточном цитометре. На графиках показаны значения MFI в указанные моменты времени. При 4°C интернализацию не наблюдали. На фиг. 8В показано, что антитела также инкубировали с клетками HDLM-2 при 37°C. Усиление MFI не наблюдали.
На фиг. 9 показана сводная таблица значений EC50 связывания антител к CD33 для линий клеток с высокой (MOLM-13), средней (Kasumi-1) и низкой (OCI-AML-3) плотностью рецепторов. Связывание осуществляли при 4°C с серийными разбавлениями антитела.
На фиг. 10 показана сводная таблица интернализации антитела к CD33 на различных линиях клеток-мишеней. Для MOLM-13 и OCI-AML-3 указаны значения ЕС50. Для Kasumi-1 показан % жизнеспособности при концентрации 100 нМ.
На фиг. 11 представлена схема, на которой продемонстрировано связывание биспецифического антитела к TRGV9/k CD33 для привлечения γδ Т-клеток к раковой клетке, которая является CD33+, и для индуцирования гибели раковой клетки.
На фиг. 12 показаны результаты анализа целостности биспецифического антитела VG4 с помощью геля SDS-PAGE (в невосстанавливающих условиях).
На фиг. 13-15 показаны результаты анализов связывания антитела к CD33 (клон С33В904) с панелью линий опухолевых клеток, измеренные с помощью FACS. EC50 для MOLM-13 (с высокой плотностью рецепторов) составляла 134,3 нМ, для Kasumi-1 (с умеренной плотностью) составляла 82,2 нМ и для OCI-AML-3 (с низкой поверхностной плотностью) составляла 16,4 нМ.
На фиг. 16-17 представлены результаты эксперимента, из которого видно, что биспецифическое антитело к TRGV9/k CD33 опосредует цитотоксичность γδ Т-клеток в отношении экспрессирующих CD33 клеток Kasumi-3 in vitro. В эксперименте обогащенные γδ Т-клетки (эффекторы), выделенные из РВМС, культивированных с золедроновой кислотой + IL-2 + IL-15 в течение 12 дней, совместно культивировали с меченными CFSE клетками Kasumi-3 (мишени) в отношениях 1:1 и 5:1 Е:Т в присутствии различных концентраций биспецифического антитела в течение 24 ч. На кривых зависимости ответа от дозы показано, что биспецифические антитела к TRGV9/k CD33 и к TRGV9/k NULL опосредуют цитотоксичность γδ Т-клеток в отношении экспрессирующих CD33 клеток kasumi-3 зависимым от дозы образом при отношениях 1:1 и 5:1 Е:Т. Представленные в данном документе значения цитотоксичности вычитали из исходного значения цитотоксичности, наблюдаемого в отсутствие биспецифического антитела. Значения EC50 рассчитывали, как описано в способах. Представленные в данном документе репрезентативные данные получены в одном эксперименте.
На фиг. 18 представлены результаты экспериментов, из которых видно, что биспецифическое анти
- 21 047663 тело к TRGV9/k CD33 опосредует цитотоксичность γδ Т-клеток в отношении экспрессирующих CD33 клеток Kasumi-3 in vitro. РВМС здоровых доноров (эффекторы), культивированные с золедроновой кислотой + IL-2 + IL-15 в течение 12 дней, совместно культивировали с меченными CFSE клетками Kasumi-3 (мишени) в отношениях 1:1 Е:Т в присутствии различных концентраций биспецифического антитела в течение 24 ч.
На фиг. 19 показан in silico анализ потенциального риска посттрансляционных модификаций (РТМ). Выделены некоторые потенциальные мотивы риска РТМ (DG, NG, DP).
На фиг. 20 показаны результаты анализов для оценки термостабильности scFv, полученных из библиотеки NNK на основе C33B1475 (SEQ ID NO: 274). Для оценки термостабильности каждого варианта проводили анализы ELISA. Надосадочные жидкости Е. coli подвергали тепловой обработке при 55°C, 60°C, 65°C и сигналы люминесценции нормализовали по отношению к необработанному находящемуся при комнатной температуре тому же клону.
На фиг. 21 показаны результаты анализа для оценки термостабильности scFv, полученного из библиотеки NNK на основе C33B1516 (SEQ ID NO: 275). Для оценки термостабильности каждого варианта проводили анализы ELISA. Надосадочные жидкости Е. coli подвергали тепловой обработке при 55°C, 60°C, 65°C и сигналы люминесценции нормализовали по отношению к необработанному находящемуся при комнатной температуре тому же клону.
На фиг. 22 показаны результаты анализа для оценки термостабильности scFv, полученного из библиотеки NNK на основе C33B1517 (SEQ ID NO: 216). Для оценки термостабильности каждого варианта проводили анализы ELISA. Надосадочные жидкости Е. coli подвергали тепловой обработке при 55°C, 60°C, 65°C и сигналы люминесценции нормализовали по отношению к необработанному находящемуся при комнатной температуре тому же клону.
На фиг. 23 показаны результаты анализа для оценки термостабильности scFv, полученного из библиотеки NNK на основе C33B1522 (SEQ ID NO: 213). Для оценки термостабильности каждого варианта проводили анализы ELISA. Надосадочные жидкости Е. coli подвергали тепловой обработке при 55°C, 60°C, 65°C и сигналы люминесценции нормализовали по отношению к необработанному находящемуся при комнатной температуре тому же клону.
На фиг. 24 показана таблица с перечнем вариантов последовательностей VH и VL, идентифицированных в ходе скрининга библиотеки NNK.
Подробное описание
Раскрываемые способы можно легче понять при обращении к следующему подробному описанию, рассматриваемому в сочетании с прилагаемыми графическими материалами, которые образуют часть настоящего раскрытия. Следует учитывать, что раскрытые способы не ограничиваются конкретными способами, описанными и/или показанными в данном документе, и что терминология, используемая в данном документе, представлена с целью описания конкретных вариантов осуществления исключительно в качестве примера и не предполагает ограничения заявленных способов.
Все патенты, опубликованные заявки на патент и публикации, цитируемые в данном документе, включены посредством ссылки, как если бы они были полностью изложены в данном документе.
При наличии перечня, если не указано иное, следует понимать, что каждый отдельный элемент из этого перечня и каждая комбинация из этого перечня представляет собой отдельный вариант осуществления. Например, перечень вариантов осуществления, представленный в виде А, В или С, следует интерпретировать как включающий варианты осуществления А, В, С, А или В, А или С, В или С или А, В или С.
Применяемая в данном описании и прилагаемой формуле изобретения форма единственного числа также предусматривает объекты во множественном числе, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, упоминание клетки включает комбинацию двух или более клеток и т.п.
Переходные термины содержащий, по сути состоящий из и состоящий из предназначены для обозначения их общепринятых значений в профессиональном языке патентов; то есть (i) термин содержащий, который является синонимом терминов включающий, включающий в себя или характеризующийся, является включающим или открытым и не исключает дополнительные, не упомянутые элементы или стадии способа; (ii) термин состоящий из исключает любые элемент, стадию или ингредиент, не указанные в пункте формулы изобретения; и (iii) термин по сути состоящий из ограничивает объем пункта формулы изобретения указанными материалами или стадиями и теми, которые существенно не влияют на основную(-ые) и новую(-ые) характеристику(-и) заявляемого изобретения. Также предусмотрены варианты осуществления, описанные посредством фразы содержащий (или ее эквивалентов), как и те варианты осуществления, которые независимо описаны посредством терминов состоящий из и по сути состоящий из.
Термин приблизительно означает в пределах приемлемого диапазона погрешности для конкретного значения, как определено специалистом в данной области, что будет частично зависеть от способа измерения или определения значения, т.е. от ограничений измерительной системы. Если явно не указано иное, то в разделе Примеры или в других местах в данном описании в контексте конкретного анализа, результата или варианта осуществления, термин приблизительно означает в пределах одного стандарт
- 22 047663 ного отклонения в соответствии с практикой в уровне техники, или в диапазоне до 5%, в зависимости от того, что больше.
Термины активация, или стимуляция, или активированный, или стимулированный относятся к индукции изменения биологического состояния клетки, приводящего к экспрессии маркеров активации, продуцированию цитокинов, пролиферации или опосредованию цитотоксичности в отношении клеток-мишеней. Клетки могут быть активированы первичными стимулирующими сигналами. Костимулирующие сигналы могут усиливать величину первичных сигналов и подавлять гибель клеток после первоначальной стимуляции, что приводит к более длительному состоянию активации и, следовательно, к более высокой цитотоксической способности. Термин костимулирующий сигнал относится к сигналу, который в комбинации с первичным сигналом, таким как лигирование TCR/CD3, приводит к пролиферации Т-клеток и/или NK-клеток и/или к повышающей регуляции или понижающей регуляции ключевых молекул.
Термин альтернативная каркасная структура относится к одноцепочечному белковому каркасу, который содержит структурированное ядро, связанное с вариабельными доменами с высокой конформационной толерантностью. Вариабельные домены допускают введение вариации без нарушения целостности каркасной структуры, и поэтому вариабельные домены могут быть сконструированы и отобраны для связывания с конкретным антигеном.
Термин антителозависимая клеточная цитотоксичность, антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность или ADCC относится к механизму индуцирования гибели клеток, который зависит от взаимодействия покрытых антителами клеток-мишеней с эффекторными клетками, обладающими литической активностью, такими как естественные киллерные (NK) клетки, моноциты, макрофаги и нейтрофилы через Fc гамма рецепторы (FcyR), экспрессированные на эффекторных клетках.
Термин антителозависимый клеточный фагоцитоз или ADCP относится к механизму устранения покрытых антителами клеток-мишеней путем интернализации фагоцитарными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки.
Термин антиген относится к любой молекуле (например, белку, пептиду, полисахариду, гликопротеину, гликолипиду, нуклеиновой кислоте, их частям или их комбинациям), способной связываться антигенсвязывающим доменом или Т-клеточным рецептором, что может вызывать иммунный ответ. Иллюстративные иммунные ответы включают продуцирование антител и активацию иммунных клеток, таких как Т-клетки, В-клетки или NK-клетки. Антигены могут быть экспрессированы генами, синтезированы или очищены из биологических образцов, таких как образец ткани, образец опухоли, клетка или жидкость с другими биологическими компонентами, организмами, субъединицами белков/антигенов, убитыми или инактивированными целыми клетками или лизатами.
Термин антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий домен относится к части белка, которая связывает антиген. Антигенсвязывающие фрагменты могут быть синтетическими, ферментативно получаемыми или генетически сконструированными полипептидами и включают части иммуноглобулина, которые связывают антиген, такие как VH, VL, VH и VL, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fd и Fv, доменные антитела (dAb), состоящие из одного домена VH или одного домена VL, акульи вариабельные домены IgNAR, верблюжьи домены VH, домены VHH, минимальные единицы распознавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют CDR антитела, такие как части FR3-CDR3-FR4, HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3 и LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, альтернативные каркасные структуры, которые связывают антиген, и мультиспецифические белки, содержащие антигенсвязывающие фрагменты. Антигенсвязывающие фрагменты (такие как VH и VL) могут быть соединены вместе с помощью синтетического линкера с образованием различных типов конструкций одиночных антител, где домены VH/VL могут спариваться внутримолекулярно или межмолекулярно в тех случаях, когда домены VH и VL экспрессируются отдельными одиночными цепями, с образованием одновалентного антигенсвязывающего домена, такого как одноцепочечный Fv (scFv) или диатело. Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть конъюгированы с другими антителами, белками, антигенсвязывающими фрагментами или альтернативными каркасными структурами, которые могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими, для конструирования биспецифических и мультиспецифических белков.
Термин антитела рассматривается в широком смысле и включает молекулы иммуноглобулина, в том числе моноклональные антитела, включая мышиные, человеческие, гуманизированные и химерные моноклональные антитела, антигенсвязывающие фрагменты, мультиспецифические антитела, такие как биспецифические, триспецифические, тетраспецифические и т.д., димерные, тетрамерные или мультимерные антитела, одноцепочечные антитела, доменные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которые содержат антигенсвязывающий сайт требуемой специфичности. Полноразмерные антитела состоят из двух тяжелых цепей (НС) и двух легких цепей (LC), связанных между собой дисульфидными связями, а также их мультимеров (например, IgM). Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (состоящей из доменов СН1, шарнирной области, СН2 и CH3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими ком
- 23 047663 плементарность областями (CDR), перемежающиеся каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех сегментов FR, организованных от амино- к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Иммуноглобулины можно отнести к пяти основным классам IgA, IgD, IgE, IgG и IgM в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи. IgA и IgG дополнительно подразделены на изотипы IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи антитела любого вида позвоночных животных можно отнести к одному из двух четко различающихся типов, а именно каппа (к) и лямбда (λ), исходя из аминокислотных последовательностей их константных доменов.
Термин биспецифическая относится к молекуле (такой как антитело), которая специфически связывает два разных антигена или два разных эпитопа в одном и том же антигене. Биспецифическая молекула может характеризоваться перекрестной реактивностью по отношению к другим родственным антигенам, например к тому же антигену других видов (гомологов), таких как человек или обезьяна, например, Масаса cynomolgus (яванский макак, cyno) или Pan troglodytes, или может связывать эпитоп, который является общим для двух или более различных антигенов.
Термин рак относится к широкой группе различных заболеваний, характеризующихся неконтролируемым ростом аномальных клеток в организме. В результате нерегулируемого деления и роста клеток образуются злокачественные опухоли, которые проникают в соседние ткани, а также могут метастазировать в отдаленные части тела через лимфатическую систему или кровоток. Термин рак или раковая ткань может включать опухоль.
Используемый в данном документе термин химерный антигенный рецептор (CAR) определяется как рецептор клеточной поверхности, включающий внеклеточный домен, связывающий мишень, трансмембранный домен и внутриклеточный домен передачи сигнала в комбинации, которая в природе не встречается вместе в одном белке. Сюда входят рецепторы, в которых внеклеточный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала не встречаются вместе на одном рецепторном белке. CAR предназначены в первую очередь для применения с лимфоцитами, такими как Т-клетки и естественные киллерные (NK) клетки.
Термин комплемент-зависимая цитотоксичность или CDC, относится к механизму индуцирования гибели клеток, при котором Fc эффекторный домен связанного с мишенью белка связывается и активирует компонент комплемента C1q, который в свою очередь активирует каскад комплемента, приводящий к гибели клеток-мишеней. Активация комплемента может также приводить к осаждению компонентов комплемента на поверхности клетки-мишени, что облегчает CDC за счет связывания рецепторов комплемента (например, CR3) на лейкоцитах.
Термин определяющие комплементарность области (CDR) означает области антитела, которые связывают антиген. В VH содержатся три CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3), и в VL содержатся три CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3). CDR могут быть определены с применением различных методик картирования, таких как картирование по Kabat (Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), Chothia (Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17), IMGT (Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77), AbM (Martin and Thornton J Bmol Biol 263: 800-15, 1996) и Contact, которые основаны на анализе доступных кристаллических структур комплекса (MacCallum, R. M., Martin, А. С. R. and Thornton, J. Т. Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography J. Mol. Biol. 262:732-745). Описано соответствие между различными методиками картирования и нумерацией вариабельной области (см., например, Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77; Honegger and Pluckthun, J Mol Biol (2001) 309:657-70; международная база данных ImMunoGeneTics (IMGT); веб-ресурс, www.imgt.org). Доступные программы, такие как abYsis от UCL Business PLC, можно применять для картирования CDR. Используемый в данном документе термин CDR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 включает CDR, определенные любым из способов, описанных выше, Kabat, Chothia, IMGT, AbM или Contact, если в данном описании явным образом не указано иное. CDR последовательностей под SEQ ID NO. 1-17, 28-51, 62-80, 89-94, 98-104, 141-146, 149-154, 167-169, 172-174, 176-178, 180, 182184, 186, 187, 189-191, 193-195, 197-199, 201, 236-244, 253-261 и 265-270 определены согласно Kabat. CDR последовательностей под SEQ ID NO: 399-434 определены согласно AbM. CDR последовательностей под SEQ ID NO: 435-470, определены согласно Chothia. CDR последовательностей под SEQ ID NO: 471-506 определены согласно IMGT. CDR последовательностей под SEQ ID NO: 507-542 определены согласно Contact.
Термины снижение, понижение, ослабление, уменьшение или устранение в целом относятся к способности тестируемой молекулы опосредовать уменьшенный ответ (т.е. эффект в направлении передачи сигнала) по сравнению с ответом, опосредованным контролем или средой-носителем. Примерами ответов являются экспансия Т-клеток, активация Т-клеток или опосредованное Т-клетками уничтожение опухолевых клеток или связывание белка с его антигеном или рецептором, усиленное связывание с Fcy или усиление эффекторных функций Fc, таких как усиление ADCC, CDC и/или ADCP. Снижение может представлять собой статистически значимую разницу в измеренном ответе между тес
- 24 047663 тируемой молекулой и контролем (или средой-носителем) или снижение измеренного ответа, например снижение в приблизительно 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 30 раз или больше, например в 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 раз или больше (включая все целые числа и десятичные дроби между и выше 1, например 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 и т.д.).
Термин дифференцировка относится к способу снижения действенности или пролиферации клетки или перевода клетки в более ограниченное в развитии состояние.
Термин кодировать или кодирующий относится к генетически детерминированному свойству определенных последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, cDNA или mRNA, служить матрицами для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих либо определенную последовательность нуклеотидов (например, rRNA, tRNA и mRNA), либо определенную последовательность аминокислот и вытекающие из этого биологические свойства. Таким образом, ген, cDNA или РНК кодирует белок, если транскрипция и трансляция mRNA, соответствующей этому гену, приводит к продуцированию белка в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая нить, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности mRNA, так и некодирующая нить, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или cDNA, могут называться кодирующими белок или другой продукт этого гена или cDNA.
Термины усиление, обеспечение, повышение, расширение или улучшение в целом относятся к способности тестируемой молекулы опосредовать более сильный ответ (т.е. эффект в направлении передачи сигнала) по сравнению с ответом, опосредованным контролем или средой-носителем. Примерами ответов являются экспансия Т-клеток, активация Т-клеток или опосредованное Т-клетками уничтожение опухолевых клеток или связывание белка с его антигеном или рецептором, усиленное связывание с Fcy или усиление эффекторных функций Fc, таких как усиление ADCC, CDC и/или ADCP. Усиление может представлять собой статистически значимую разницу в измеренном ответе между тестируемой молекулой и контролем (или средой-носителем) или усиление измеренного ответа, например усиление в приблизительно 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 30 раз или больше, например в 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 раз или больше (включая все целые числа и десятичные дроби между и выше 1, например 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 и т.д.).
Термин экспансия относится к результатам деления и гибели клеток.
Термины экспрессировать и экспрессия относятся к хорошо известной транскрипции и трансляции, происходящей в клетках или in vitro. Таким образом, продукт экспрессии, например белок, экспрессируется клеткой или in vitro и может быть внутриклеточным, внеклеточным или трансмембранным белком.
Термин вектор экспрессии относится к вектору, который может быть использован в биологической системе или в восстановленной биологической системе для направления трансляции полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью, присутствующей в векторе экспрессии.
Термин dAb или dAb-фрагмент относится к фрагменту антитела, состоящему из домена VH (Ward et al., Nature 341:544 546 (1989)).
Термин Fab или Fab-фрагмент относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VH, CH1, VL и CL.
Термин F(ab')2 или 'F(ab')2-фрагмент относится к фрагменту антитела, содержащему два Fabфрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области.
Термин Fd или Fd-фрагмент относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VH и СН1.
Термин Fv или Fv-фрагмент относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VH и VL из одного плеча антитела.
Полноразмерное антитело состоит из двух тяжелых цепей (НС) и двух легких цепей (LC), связанных между собой дисульфидными связями, а также их мультимеров (например, IgM). Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и константного домена тяжелой цепи, при этом константный домен тяжелой цепи состоит из субдоменов СН1, шарнира, СН2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного домена легкой цепи (VL) и константного домена легкой цепи (CL). VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех сегментов FR, организованных от амино- к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.
Термин генетическая модификация относится к введению чужеродного (т.е. внешнего или внеклеточного) гена, последовательности ДНК или РНК в клетку-хозяина, чтобы клетка-хозяин экспрессировала введенные ген или последовательность для продуцирования необходимого вещества, обычно белка или фермента, кодируемого введенным геном или последовательностью. Введенный ген или последовательность могут также называться клонированными или чужеродными геном или последовательностью, могут включать регуляторные или контрольные последовательности, функционально связанные с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, такие как старт-последовательность, стоп-последовательность, промоторные, сигнальные, секреторные или другие последовательности, ис
- 25 047663 пользуемые генетическим механизмом клетки. Ген или последовательность могут включать нефункциональные последовательности или последовательности с неизвестной функцией. Клетка-хозяин, которая получает и экспрессирует введенную ДНК или РНК, была генетически сконструирована. ДНК или РНК, вводимые в клетку-хозяина, могут происходить из любого источника, включая клетки одного и того же рода или вида, что и клетка-хозяин, или из другого рода или вида.
Термин гетерологичный относится к двум или более полинуклеотидам или двум или более полипептидам, которые не встречаются в одной и той же взаимосвязи друг с другом в природе.
Термин гетерологичный полинуклеотид относится к не встречающемуся в природе полинуклеотиду, который кодирует два или более неоантигенов, которые описаны в данном документе.
Термин гетерологичный полипептид относится к не встречающемуся в природе полипептиду, содержащему два или более неоантигенов, которые описаны в данном документе.
Термин клетка-хозяин относится к любой клетке, содержащей гетерологичную нуклеиновую кислоту. Примером гетерологичной нуклеиновой кислоты является вектор (например, вектор экспрессии).
Термин человеческое антитело относится к антителу, которое оптимизировано таким образом, что оно вызывает минимальный иммунный ответ при введении субъекту-человеку. Вариабельные области человеческого антитела получены из последовательностей человеческого иммуноглобулина. Если человеческое антитело содержит константную область или часть константной области, то константная область также получена из последовательностей человеческого иммуноглобулина. Человеческое антитело содержит вариабельные области тяжелых и легких цепей, которые получены из последовательностей человеческого происхождения, если вариабельные области человеческого антитела получены из системы, использующей человеческие иммуноглобулины зародышевой линии или перестроенные гены иммуноглобулинов. Такие иллюстративные системы представляют собой библиотеки генов человеческого иммуноглобулина, представленные на фаге, и трансгенных животных, отличных от человека, таких как мыши или крысы, несущие локусы человеческого иммуноглобулина. Человеческое антитело, как правило, содержит аминокислотные различия при сравнении с иммуноглобулинами, экспрессирующимися у людей, вследствие различий между системами, используемыми для получения человеческого антитела и локусов человеческого иммуноглобулина, введения соматических мутаций или преднамеренного введения замен в каркасную последовательность или CDR, или того и другого. Как правило, человеческое антитело на по меньшей мере приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентично по аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности, кодируемой человеческим иммуноглобулином зародышевой линии или перестроенными генами иммуноглобулина. В некоторых случаях человеческое антитело может содержать консенсусные каркасные последовательности, полученные в результате анализа человеческих каркасных последовательностей, например, которые описаны в Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296: 57-86, или синтетическую HCDR3, включенную в библиотеки генов человеческого иммуноглобулина, представленные на фаге, например, которая описана в Shi et al., (2010) J Mol Biol 397: 385-96, и публикации международной заявки на патент № WO2009/085462. Антитела, в которых по меньшей мере одна CDR получена от вида, отличного от человека, не включены в определение термина человеческое антитело.
Термин гуманизированное антитело относится к антителу, в котором по меньшей мере одна CDR получена от вида, отличного от человека, и по меньшей мере одна каркасная последовательность получена из последовательностей человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело может содержать замены в каркасных последовательностях таким образом, что каркасные последовательности могут не являться точными копиями экспрессируемого человеческого иммуноглобулина или последовательностей гена человеческого иммуноглобулина зародышевой линии.
Термин в комбинации с означает, что два или более терапевтических средства вводят субъекту вместе в смеси, одновременно как отдельные средства или последовательно как отдельные средства в любом порядке.
Термин домен внутриклеточной передачи сигнала или цитоплазматический домен передачи сигнала относится к внутриклеточной части молекулы. Это функциональная часть белка, которая действует путем передачи информации внутри клетки для регулирования клеточной активности через определенные пути передачи сигнала путем генерирования вторых мессенджеров или функционирования в качестве эффекторов, отвечая на такие мессенджеры. Домен внутриклеточной передачи сигнала генерирует сигнал, который обеспечивает иммунную эффекторную функцию CAR-содержащей клетки, например CAR-T-клетки.
Термин выделенный относится к гомогенной популяции молекул (таких как синтетические полинуклеотиды или полипептиды), которая была по сути отделена и/или очищена от других компонентов системы, в которой получают молекулы, такой как рекомбинантная клетка, а также белку, который был подвергнут по меньшей мере одной стадии очистки или выделения. Термин выделенный относится к молекуле, которая по сути не содержит другого клеточного материала и/или химических веществ, и охватывает молекулы, которые выделены до более высокой чистоты, например до 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% чистоты.
- 26 047663
Термин модулировать относится к усиленной или пониженной способности тестируемой молекулы опосредовать усиленный или пониженный ответ (т.е. эффект в направлении передачи сигнала) по сравнению с ответом, опосредованным контролем или средой-носителем.
Термин моноклональное антитело относится к антителу, полученному из по сути гомогенной популяции молекул антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных хорошо известных изменений, таких как удаление С-концевого лизина из тяжелой цепи антитела или посттрансляционные модификации, такие как изомеризация или дезамидирование аминокислот, окисление метионина или дезамидирование аспарагина или глутамина. Моноклональные антитела обычно связывают один антигенный эпитоп. Биспецифическое моноклональное антитело связывает два разных антигенных эпитопа. Моноклональные антитела могут характеризоваться гетерогенным гликозилированием в пределах популяции антител. Моноклональное антитело может быть моноспецифическим или мультиспецифическим, как, например, биспецифическим, или моновалентным, бивалентным или поливалентным.
Термин мультиспецифическая относится к молекуле, такой как антитело, которая специфически связывает два или более разных антигена или два или более разных эпитопа в одном и том же антигене. Мультиспецифическая молекула может характеризоваться перекрестной реактивностью по отношению к другим родственным антигенам, например к тому же антигену других видов (гомологов), таких как человек или обезьяна, например Масаса fascicularis (яванский макак, супо) или Pan troglodytes, или может связывать эпитоп, который является общим для двух или более различных антигенов.
Термины естественная киллерная клетка и NK-клетка используют в данном документе взаимозаменяемо и синонимично. NK-клетка относится к дифференцированным лимфоцитам с фенотипом CD16' CD56+ и/или CD57' TCR-. NK-клетки характеризуются способностью связываться с клетками, не экспрессирующими собственные антигены MHC/HLA, и уничтожать их путем активации специфических цитолитических ферментов, способностью уничтожать опухолевые клетки или другие больные клетки, экспрессирующие лиганд для активирующих рецепторов NK, и способностью высвобождать белковые молекулы, называемые цитокинами, которые стимулируют или ингибируют иммунный ответ.
Термин функционально связанный и подобные фразы при использовании в отношении нуклеиновых кислот или аминокислот, относятся к функциональной связи последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей, соответственно, находящихся в функциональных взаимосвязях друг с другом. Например, функционально связанные промотор, энхансерные элементы, открытая рамка считывания, 5' и 3' UTR и терминаторные последовательности приводят к точному продуцированию молекулы нуклеиновой кислоты (например, РНК) и в некоторых случаях к продуцированию полипептида (т.е. экспрессии открытой рамки считывания). Функционально связанный пептид относится к пептиду, в котором функциональные домены пептида расположены на соответствующем расстоянии друг от друга для обеспечения предполагаемой функции каждого домена.
Термин фармацевтическая комбинация относится к комбинации двух или более активных ингредиентов, вводимых либо вместе, либо раздельно.
Термин фармацевтическая композиция относится к композиции, которая является результатом объединения активного ингредиента и фармацевтически приемлемого носителя.
Термин фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество относится к ингредиенту фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для субъекта. Иллюстративными фармацевтически приемлемыми носителями являются буфер, стабилизатор или консервант.
Термин полинуклеотид или нуклеиновая кислота относится к синтетической молекуле, содержащей цепь нуклеотидов, ковалентно связанных сахарно-фосфатным остовом или другим эквивалентным ковалентным химическим соединением. cDNA является типичным примером полинуклеотида. Полинуклеотид может представлять собой молекулу ДНК или РНК.
Термины предупреждать, предупреждающий, предупреждение или профилактика заболевания или нарушения означает предупреждение возникновения нарушения у субъекта.
Термин пролиферация относится к усилению деления клеток, либо симметричного, либо асимметричного деления клеток.
Термин промотор относится к минимальным последовательностям, необходимым для инициации транскрипции. Промотор может также включать энхансеры или репрессорные элементы, которые усиливают или подавляют транскрипцию, соответственно.
Термин белок или полипептид используют в данном документе взаимозаменяемо и относятся к молекуле, которая содержит один или несколько полипептидов, каждый из которых состоит по меньшей мере из двух аминокислотных остатков, соединенных пептидной связью. Белок может быть мономером или представлять собой белковый комплекс из двух или более субъединиц, при этом субъединицы являются одинаковыми или разными. Небольшие полипептиды, состоящие из менее чем 50 аминокислот, могут называться пептидами. Белок может представлять собой гетерологичный слитый белок, гликопротеин или белок, модифицированный посттрансляционными модификациями, такими как фосфорилирование, ацетилирование, миристоилирование, пальмитоилирование, гликозилирование, окисление,
- 27 047663 формилирование, амидирование, цитруллинирование, полиглутамилирование, АДФ-рибозилирование, пегилирование или биотинилирование. Белок может быть экспрессирован рекомбинантно.
Термин рекомбинантный относится к полинуклеотидам, полипептидам, векторам, вирусам и другим макромолекулам, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантным способом.
Термин регуляторный элемент относится к любому действующему в цис-или транс-положении генетическому элементу, который контролирует некоторые аспекты экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот.
Термин рецидивный относится к заболеванию или признакам и симптомам заболевания, которые возвращаются после периода улучшения после предшествующего лечения терапевтическим средством.
Термин рефрактерный относится к заболеванию, которое не отвечает на лечение. Рефрактерное заболевание может быть устойчивым к лечению до или в начале лечения, или рефрактерное заболевание может стать устойчивым во время лечения.
Термин одноцепочечный Fv или scFv относится к слитому белку, включающему по меньшей мере один фрагмент антитела, включающий вариабельную область легкой цепи (VL), и по меньшей мере один фрагмент антитела, включающий вариабельную область тяжелой цепи (VH), где VL и VH смежно связаны через полипептидный линкер, и способному экспрессироваться в виде одноцепочечного полипептида. Если не указано, то как используется в данном документе, scFv может иметь вариабельные области VL и VH в любом порядке, например по отношению к N-концу и С-концу полипептида, scFv может содержать VL-линкер-VH или может содержать VH-линкер-VL.
Термины специфически связывается, специфическое связывание, специфически связывающийся или связывает относятся к связыванию белковой молекулы с антигеном или эпитопом в антигене с большей аффинностью, чем с другими антигенами. Как правило, белковая молекула связывается с антигеном или эпитопом в антигене с равновесной константой диссоциации (KD), составляющей приблизительно 1х 10-7 М или меньше, например приблизительно 5х 10-S М или меньше, приблизительно 1 х 10-8 М или меньше, приблизительно 1х10-9 М или меньше, приблизительно 1/10-10 M или меньше, приблизительно 1х 10-11 M или меньше или приблизительно 1х10-12 M или меньше, как правило с KD, которая является в по меньшей мере сто раз меньшей, чем ее KD для связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеином).
Термин субъект включает любого человека или не являющего человеком животного. Термин не являющееся человеком животное включает всех позвоночных, например млекопитающих и не являющихся млекопитающими, таких как не являющиеся человеком приматы, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.д. Термины субъект и пациент могут быть использованы в данном документе взаимозаменяемо.
Термин Т-клетка и Т-лимфоцит являются взаимозаменяемыми и используются в данном документе как синонимы. Т-клетка включает тимоциты, наивные Т-лимфоциты, Т-клетки памяти, незрелые Т-лимфоциты, зрелые Т-лимфоциты, покоящиеся Т-лимфоциты или активированные Т-лимфоциты. Тклетка может представлять собой Т-хелперную (Th) клетку, например Т-хелперную клетку 1 (Th1) или Тхелперную клетку 2 (Th2). Т-клетка может представлять собой хелперную Т-клетку (HTL; CD4+ Тклетку) CD4' Т-клетку, цитотоксическую Т-клетку (CTL; CDS' Т-клетку), инфильтрующую опухоль цитотоксическую Т-клетку (TIL; CDS' Т-клетку), CD4+CD8+ Т-клетку или любую другую подгруппу Тклеток. Также включены NKT-клетки, которые относятся к специализированной популяции Т-клеток, экспрессирующих полуинвариантный αβ Т-клеточный рецептор, но также экспрессирующих ряд молекулярных маркеров, которые обычно ассоциируются с NK-клетками, такими как NK1.1. NKT-клетки включают NK1.1+ и NK1.1-, а также CD4', CD4-, CDS' и CD8- клетки. TCR на NKT-клетках уникален тем, что он распознает гликолипидные антигены, представленные МНС I-подобной молекулой CD Id. NKTклетки могут оказывать как защитное, так и вредное воздействие из-за своей способности продуцировать цитокины, способствующие либо воспалению, либо иммунной толерантности. Также включены гаммадельта Т-клетки (γδ Т-клетки), которые относятся к специализированной популяции, представляющей собой небольшую подгруппу Т-клеток, обладающих отдельным TCR на своей поверхности, и в отличие от большинства Т-клеток, в которых TCR состоит из двух гликопротеиновых цепей, обозначаемых как αи e-TCR-цепи, TCR в γδ Т-клетках состоит из γ-цепи и δ-цепи. γδ Т-клетки могут играть роль в иммунном надзоре и иммунной регуляции, и было обнаружено, что они являются важным источником IL-17 и вызывают устойчивый ответ CDS' цитотоксических Т-клеток. Также включены регуляторные Т-клетки или Treg, которые относятся к Т-клеткам, подавляющим аномальный или чрезмерный иммунный ответ и играющим роль в иммунной толерантности. Treg обычно представляют собой транскрипционный фактор ГохрЗ-положительные CD4+T-клетки и могут также включать транскрипционный фактор Foxp3отрицательные регуляторные Т-клетки, которые являются IL-10-продуцирующими CD4+Т-клетками.
Термины терапевтически эффективное количество или эффективное количество, используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к количеству, эффективному при дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения необходимого терапевтического результата. Терапевти
- 2S 047663 чески эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивидуума, а также способность терапевтического средства или комбинации терапевтических средств вызывать необходимый ответ у индивидуума. Иллюстративные показатели эффективного терапевтического средства или комбинации терапевтических средств включают, например, улучшение самочувствия пациента, уменьшение опухолевой нагрузки, остановку или замедление роста опухоли и/или отсутствие метастазирования раковых клеток в другие места в организме.
Термин трансдукция относится к введению чужеродной нуклеиновой кислоты в клетку с использованием вирусного вектора.
Термины лечить, лечащий или лечение заболевания или нарушения, такого как рак, относится к достижению одного или нескольких из следующего: уменьшение тяжести и/или продолжительности нарушения, ингибирование ухудшения симптомов, характерных для нарушения, которое лечат, ограничение или предупреждение рецидива нарушения у субъектов, которые ранее имели нарушение, или ограничение, или предупреждение рецидива симптомов у субъектов, которые ранее имели симптомы нарушения.
Термин опухолевая клетка или раковая клетка относится к раковой, предраковой или трансформированной клетке in vivo, ex vivo или в культуре ткани, которая имеет спонтанные или индуцированные фенотипические изменения. Эти изменения не обязательно связаны с поглощением нового генетического материала. Хотя трансформация может произойти в результате инфекции трансформирующим вирусом и включения новой геномной нуклеиновой кислоты, поглощения экзогенной нуклеиновой кислоты, она также может произойти спонтанно или после воздействия канцерогена, в результате чего мутирует эндогенный ген. Трансформация/рак проявляется морфологическими изменениями, иммортализацией клеток, аберрантным контролем роста, образованием очагов, пролиферацией, злокачественностью, модуляцией уровней опухолеспецифических маркеров, инвазивностью, ростом опухоли у подходящих животныххозяев, таких как бестимусные мыши, и т.п., in vitro, in vivo и ex vivo.
Термины вариант, мутант или измененный относятся к полипептиду или полинуклеотиду, который отличается от эталонного полипептида или эталонного полинуклеотида одной или несколькими модификациями, например одной или несколькими заменами, вставками или делециями.
Нумерация аминокислотных остатков в константной области антитела по всему настоящему описанию соответствует индексу ЕС, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), если явно не указано иное.
Мутации в константных областях Ig обозначаются следующим образом: L351Y_F405A_Y407V относится к мутациям L351Y, F405A и Y407V в одной константной области иммуноглобулина. L351Y_F405A_Y407V/T394W относится к мутациям L351Y, F405A и Y407V в первой константной области Ig и мутации T394W во второй константной области Ig, которые присутствуют в одном мультимерном белке.
Композиции веществ.
Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33.
Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим доменам, которые связывают CD33, моноспецифическим и мультиспецифическим белкам, включающим антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, химерным антигенным рецепторам (CAR), включающим антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, полинуклеотидам, кодирующим приведенные выше, векторам, клеткамхозяевам и способам получения и применения приведенного выше. Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, идентифицированные в данном документе, продемонстрировали улучшенные свойства в отношении улучшенной термостабильности.
Настоящее изобретение относится к выделенному белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 18; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 19;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 20; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO:21;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 22; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO:23;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 24; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO:25;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 26; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 27.
Способы и методики идентификации CDR (например, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3) известны в уровне техники и могут быть применены для идентификации CDR в любой из вариабельных областей тяжелой цепи и/или любой из вариабельных областей легкой цепи, раскрытых в данном документе. Правила, которые могут быть использованы для идентификации границ CDR, включают без ограничения определение по Kabat, определение по Chothia, определение по AbM, определение по IMGT и определение по Contact. Без ограничения конкретной теорией считается, что определение по Kabat основано на вариабельности последовательности, определение по Chothia основано на расположении областей структурных петель, а определение по AbM является компромиссом между подходами Chothia и Kabat.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, со
- 29 047663 держит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к выделенному белку, при этом выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3 под SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно; SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно; SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно; SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к выделенному белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает поверхностный антиген миелоидных клеток CD33, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60;
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61;
k) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262;
l) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263; или
m) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
Иллюстративные последовательности HCDR описаны в табл. 4а, 4b, 4c, 4d, 4е и 4f.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 53.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 56.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 59.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 262.
- 30 047663
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 263.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 264.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к выделенному белку, содержащему HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36 и 45 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38 и 47 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39 и 48 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33,41и50 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42 и 51 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44 и 51 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42 и 51 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257 и 260 соответственно; или
m) SEQ ID NO: 255, 258 и 261 соответственно.
В определенных вариантах осуществления выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно.
В других вариантах осуществления выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно.
- 31 047663
В других вариантах осуществления выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно.
В других вариантах осуществления выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно.
В других вариантах осуществления выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 254, 257 и 260 соответственно.
В других вариантах осуществления выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 255, 258 и 361 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 53.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 56.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 59.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 262.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 263.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 264.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающему домену, который связывает по- 32 047663 верхностный антиген миелоидных клеток CD33, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 81; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO:83;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO:84;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO:85;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO:86;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO:87;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO:87;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO:87;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO:88;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
Иллюстративные последовательности HCDR и LCDR описаны в табл. 4а, 4b, 4c, 4d, 4e и 4f.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающему домену, который связывает поверхностный антиген миелоидных клеток CD33, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно;
m) SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
- 33 047663
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к выделенному белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает поверхностный антиген миелоидных клеток CD33, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
- 34 047663
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к выделенному белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает поверхностный антиген миелоидных клеток CD33, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к выделенному белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает поверхностный антиген миелоидных клеток CD33, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 92 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 33, 91 и 94 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 172, 173 и 174 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 176, 177 и 178 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 180 соответственно; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой
- 35 047663
F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к выделенному белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает поверхностный антиген миелоидных клеток CD33, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 105; b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 106; с) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 107; d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 185; е) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 188; f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 192; g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 196; h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 200; или i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 202. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к выделенному белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает поверхностный антиген миелоидных клеток CD33, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно;
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к выделенному белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает поверхностный антиген миелоидных клеток CD33, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105; VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106; VH под SEQ ID NO: 97 и VL под
SEQ ID NO: 107; VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185; VH под SEQ ID NO: 171 и VL под
SEQ ID NO: 188; VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192; VH под SEQ ID NO: 179 и VL под
SEQ ID NO: 196; VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах
- 36 047663 осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к выделенному белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает поверхностный антиген миелоидных клеток CD33, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105; VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106; VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107; VH под
SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185; VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188; VH под
SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192; VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196; VH под
SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой (scFv)2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fab. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой Fd. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой dAb. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для CD33 представляет собой VHH.
Связывающие CD33 scFv.
Любой из идентифицированных в данном документе доменов VH и VL, которые связывают CD33, может быть сконструирован в формате scFv в ориентации либо VH-линкер-VL, либо Ук-линкер-УИ. Любой из идентифицированных в данном документе доменов VH и VL также может быть использован для создания структур sc(Fv)2, таких как VH-линкер-VL-линкер-VL-линкер-VH, VH-линкер-VL-линкерVH-линкер-VL, VH-линкер-VH-линкер-VL-линкер-VL, VL-линкер-VH-линкер-VH-линкер-VL, VLлинкер-VH-линкер-VL-линкер-VH или VL-линкер-VL-линкер-VH-линкер-VH.
Домены VH и VL, идентифицированные в данном документе, могут быть включены в формат scFv, а связывание и термостабильность полученного scFv с CD33 могут быть оценены с применением известных способов. Связывание может быть оценено с использованием приборов ProteOn XPR36, Biacore 3000 или KinExA, ELISA или конкурентных анализов связывания, известных специалистам в данной области. Связывание может быть оценено с использованием очищенных scFv, или надосадочных жидкостей Е. coli, или лизированных клеток, содержащих экспрессированный scFv. Измеренная аффинность тестируемого scFv по отношению к CD33 может варьировать при измерении в различных условиях (например, осмолярность, рН). Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания (например, KD, Kon, Koff) обычно проводят при стандартных условиях и в стандартных буферах. Термостабильность может быть оценена путем нагревания тестируемого scFv при повышенных температурах, например при 50°C, 55°C или 60°C, в течение определенного периода времени, например 5 мин (мин), 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин или 30 мин, и измерения связывания тестируемого scFv с CD33. ScFv, сохраняющие сравнимое связывание с CD33 по сравнению с ненагретым образцом scFv, называют термостабильными.
В рекомбинантных системах экспрессии линкер представляет собой пептидный линкер и может включать любую встречающуюся в природе аминокислоту. Иллюстративными аминокислотами, которые могут быть включены в линкер, являются Gly, Ser Pro, Thr, Glu, Lys, Arg, Ile, Leu, His и The. Линкер должен иметь длину, достаточную для соединения VH и VL таким образом, чтобы они образовывали правильную конформацию относительно друг друга, чтобы они сохраняли необходимую активность, как, например, связывание с CD33.
Линкер может иметь длину приблизительно 5-50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину приблизительно 10-40 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину приблизительно 10-35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину приблизительно 10-30 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину приблизительно 10-25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину приблизительно 10-20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину приблизительно 15-20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 6 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 7 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 8 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 9 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 11 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 12 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 13 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 14 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 15 аминокислот. В некоторых вариантах осу
- 37 047663 ществления линкер имеет длину 16 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 17 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 18 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 19 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 21 аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 22 аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 23 аминокислоты В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 24 аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 26 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 27 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 28 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 29 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 30 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 31 аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 32 аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 33 аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 34 аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 36 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 37 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 38 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 39 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 40 аминокислот. Иллюстративными линкерами, которые могут быть использованы, являются богатые Gly линкеры, содержащие Gly и Ser линкеры, содержащие Gly и Ala линкеры, содержащие Ala и Ser линкеры и другие гибкие линкеры.
Другие линкерные последовательности могут включать части шарнирной области иммуноглобулина, CL или СН1, полученные из любого изотипа тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина. В качестве альтернативы, в качестве линкеров могут найти применение различные небелковые полимеры, включая полиэтиленгликоль (PEG), полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля. Примерные линкеры, которые могут быть использованы, показаны в табл. 1. Дополнительные линкеры описаны, например, в международной патентной публикации № WO 2019/060695, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL).
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 109.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 110.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 111.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 112.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 113.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 114.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 115.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 116.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 117.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 118.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 119.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 120.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 121.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 122.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ
- 38 047663
ID NO: 123.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 124.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 125.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 126.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 127.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 128.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 129.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 130.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 131.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 132.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 133.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 134.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 135.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 136.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 137.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 138.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 139.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 140.
_______________________________________________________________Таблица 1
| Название линкера | Аминокислотная последовательность | SEQ ГО NO: |
| Линкер 1 | GGSEGKSSGSGSESKSTGGS | 108 |
| Линкер 2 | GGGSGGGS | 109 |
| Линкер 3 | GGGSGGGSGGGS | 110 |
| Линкер 4 | GGGSGGGSGGGSGGGS | 111 |
- 39 047663
| Линкер 5 | GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS | 112 |
| Линкер 6 | GGGGSGGGGSGGGGS | ИЗ |
| Линкер 7 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS | 114 |
| Линкер 8 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS | 115 |
| Линкер 9 | GSTSGSGKPGSGEGSTKG | 116 |
| Линкер 10 | IRPRAIGGSKPRVA | 117 |
| Линкер И | GKGGSGKGGSGKGGS | 118 |
| Линкер 12 | GGKGSGGKGSGGKGS | 119 |
| Линкер 13 | GGGKSGGGKSGGGKS | 120 |
| Линкер 14 | GKGKSGKGKSGKGKS | 121 |
| Линкер 15 | GGGKSGGKGSGKGGS | 122 |
| Линкер 16 | GKPGSGKPGSGKPGS | 123 |
| Линкер 17 | GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS | 124 |
| Линкер 18 | GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS | 125 |
| Линкер 19 | STAGDTHLGGEDFD | 126 |
| Линкер 20 | GEGGSGEGGSGEGGS | 127 |
| Линкер 21 | GGEGSGGEGSGGEGS | 128 |
| Линкер 22 | GEGESGEGESGEGES | 129 |
| Линкер 23 | GGGESGGEGSGEGGS | 130 |
| Линкер 24 | GEGESGEGESGEGESGEGES | 131 |
| Линкер 25 | GSTSGSGKPGSGEGSTKG | 132 |
| Линкер 26 | PRGASKSGSASQTGSAPGS | 133 |
| Линкер 27 | GTAAAGAGAAGGAAAGAAG | 134 |
| Линкер 28 | GTSGSSGSGSGGSGSGGGG | 135 |
| Линкер 29 | GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS | 136 |
| Линкер 30 | GSGS | 137 |
| Линкер 31 | АР АР АР АР АР | 138 |
| Линкер 32 | АР АР АР АР АР АР АР АРАР АР | 139 |
| Линкер 33 | АЕАААКЕАААКЕААААКЕААААКЕААААКААА | 140 |
В определенных вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108 (например, состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 108).
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 18; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 19; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 20;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 21; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO:22;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 23; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO:24;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 25; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO:26;
или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно; SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно; SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно; SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
- 40 047663
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60;
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61;
k) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262;
l) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263; или
m) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
В определенных вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
Иллюстративные последовательности HCDR описаны в табл. 4а, 4b, 4c, 4d, 4е и 4f.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264.
В определенных вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 53.
В других вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 56.
В других вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 59.
В других вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 262.
В других вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 263.
В других вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 264.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273.
В определенных вариантах осуществления scFv содержит VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления scFv содержит VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления scFv содержит VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления scFv содержит VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления scFv содержит VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления scFv содержит VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36 и 45 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38 и 47 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39 и 48 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33,41и50 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42 и 51 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44 и 51 соответственно;
j) SEQ ID NO: 35, 42 и 51 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257 и 260 соответственно; или
m) SEQ ID NO: 255, 258 и 261 соответственно.
В определенных вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 254,
- 41 047663
257 и 260 соответственно.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 255, 258, и 261 соответственно. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 81; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID
NO: 83; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID
NO: 84; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID
NO: 85; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID
NO: 86; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID
NO: 87; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID
NO: 87; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID
NO: 87; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID
NO: 88; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID
NO: 271; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
Иллюстративные последовательности HCDR и LCDR описаны в табл. 4а, 4b, 4c, 4d, 4e и 4f.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно;
m) SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
В определенных вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно.
В других вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
- 42 047663
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82. В определенных таких вариантах осуществления scFv содержит линкерную последовательность на основе аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 108. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH под SEQ ID NO: 53, первый линкер (L1) под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ГО: 82 (VH-L1-VL). В других вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VL под SEQ ID NO: 82, первый линкер под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ID NO: 53 (VLL1-VH).
В других вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85. В определенных таких вариантах осуществления scFv содержит линкерную последовательность на основе аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 108. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH под SEQ ID NO: 56, первый линкер (L1) под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ГО: 85 (VH-L1-VL). В других вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VL под SEQ ID NO: 56, первый линкер под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ID NO: 85 (VL-L1VH).
В других вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87. В определенных таких вариантах осуществления scFv содержит линкерную последовательность на основе аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 108. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH под SEQ ID NO: 59, первый линкер (L1) под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ГО: 87 (VH-L1-VL). В других вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VL под SEQ ID NO: 59, первый линкер под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ID NO: 87 (VL-L1VH).
В других вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271. В определенных таких вариантах осуществления scFv содержит линкерную последовательность на основе аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 108. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH под SEQ ID NO: 262, первый линкер (L1) под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ID: 271 (VH-L1-VL). В других вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VL под SEQ ID NO: 271, первый линкер под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ID NO: 262 (VL-L1-VH).
В других вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272. В определенных таких вариантах осуществления scFv содержит линкерную последовательность на основе аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 108. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH под SEQ ID NO: 263, первый линкер (L1) под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ID: 272 (VH-L1-VL). В других вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VL под SEQ ID NO: 272, первый линкер под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ID NO: 263 (VL-L1-VH).
В других вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273. В определенных таких вариантах осуществления scFv содержит линкерную последовательность на основе аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 108. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH под SEQ ID NO: 264, первый линкер (L1) под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ID: 273 (VH-L1-VL). В других вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VL под SEQ ID NO: 273, первый линкер под SEQ ID NO: 108 и VL под SEQ ID NO: 264 (VL-L1-VH).
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 92 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 33, 91 и 94 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 172, 173 и 174
- 43 047663 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 176, 177 и 178 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 180 соответственно; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 105; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 106; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 107; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 185; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 188; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 192; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 196; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 200; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно;
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105; VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106; VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107; VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185; VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188; VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192; VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196; VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 203.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 204.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 205.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 206.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 207.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 208.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 209.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 210.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 211.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 212.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 214.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 215.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 216.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 217.
- 44 047663
В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 218.
В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 219.
В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 220.
В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 221.
В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 274.
В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 275.
В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 276.
scFv содержит аминокислотную последовательность под scFv содержит аминокислотную последовательность под scFv содержит аминокислотную последовательность под scFv содержит аминокислотную последовательность под scFv содержит аминокислотную последовательность под scFv содержит аминокислотную последовательность под scFv содержит аминокислотную последовательность под
В определенных вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213.
В других вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 216.
В других вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 219.
В других вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 274.
В других вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 275.
В других вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 276.
Другие антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33.
Любой из идентифицированных в данном документе доменов VH и VL, которые связывают CD33, также могут быть сконструированы в формате Fab, F(ab')2, Fd или Fv, и их связывание с CD33 и термостабильность можно оценивать с использованием анализов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления домены VH и VL, идентифицированные в данном документе, сконструированы в Fab.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 18; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 19;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 20; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 21;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 22; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 23;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 24; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 25;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 26; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно; SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно; SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно; SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60;
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61;
k) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262;
l) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263; или
m) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
В определенных вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53.
В других вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56.
- 45 047663
В других вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59.
В других вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262.
В других вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263.
В других вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
Иллюстративные последовательности HCDR описаны в табл. 4а, 4b, 4c, 4d, 4е и 4f.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264. В некоторых вариантах осуществления Fab содержит VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273. В некоторых вариантах осуществления Fab содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 или 88, 271, 272 или 273.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36 и 45 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38 и 47 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39 и 48 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41 и 50 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42 и 51 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44 и 51 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42 и 51 соответственно; или
l) SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно;
m) SEQ ID NO: 254, 257 и 260 соответственно;
n) SEQ ID NO: 255, 258 и 261 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 81; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 83; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 84; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 86; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 88; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
Иллюстративные последовательности HCDR и LCDR описаны в табл. 4а, 4b, 4c, 4d, 4e и 4f.
В определенных вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
- 46 047663
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно; или
m) SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 92 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 33, 91 и 94 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 172, 173 и 174 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 176, 177 и 178 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 180 соответственно; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 105; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 106; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 107; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 185; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 188; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 192; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 196; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 200; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ IDN0: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно;
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления Fab содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202. В некоторых вариантах осуществления Fab содержит VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105; VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106; VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107; VH под SEQ ID NO: 170
- 47 047663 и VL под SEQ ID NO: 185; VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188; VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192; VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196; VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
В других вариантах осуществления домены VH и VL, идентифицированные в данном документе, сконструированы в F(ab')2.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 18; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 19; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 20; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 21;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 22; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 23;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 24; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 25;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 26; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO:
27. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно; SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно; SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно; SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60;
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61;
k) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262;
l) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263; или
m) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264. В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273. В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36 и 45 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38 и 47 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39 и 48 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41 и 50 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42 и 51 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44 и 51 соответственно;
j) SEQ ID NO: 35, 42 и 51 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257 и 260 соответственно;
m) SEQ ID NO: 255, 258 и 261 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 81; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 83; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 84; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 86; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 88 HCDR1,
- 48 047663
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно; или
m) SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 92 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 33, 91 и 94 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 172, 173 и 174 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 176, 177 и 178 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 180 соответственно; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 105; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 106; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 107; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170 и LCDR1, LCDR2 и
LCDR3 VL под SEQ ID NO: 185; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171 и LCDR1, LCDR2 и
LCDR3 VL под SEQ ID NO: 188; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175 и LCDR1, LCDR2 и
LCDR3 VL под SEQ ID NO: 192; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179 и LCDR1, LCDR2 и
LCDR3 VL под SEQ ID NO: 196; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181 и LCDR1, LCDR2 и
LCDR3 VL под SEQ ID NO: 200; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
- 49 047663
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно;
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 196 и VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202. В некоторых вариантах осуществления F(ab')2 содержит VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105; VH под
SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106; VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107; VH под
SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185; VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188; VH под
SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192; VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196; VH под
SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
В определенных вариантах осуществления домены VH и VL, идентифицированные в данном документе, сконструированы в Fv.
В некоторых вариантах осуществления Fv содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 18; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 19; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 20;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 21; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO:22;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 23; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO:24;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 25; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO:26;
или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
В некоторых вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно; SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно; SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно; SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления Fv содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60;
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61;
k) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262;
l) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263; или
m) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
В определенных вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53.
В других вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56.
В других вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59.
В других вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262.
В других вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263.
В других вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
В некоторых вариантах осуществления Fv содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264. В некоторых вариантах осуществления Fv содержит VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273. В некоторых вариантах осуществления Fv содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272, 273.
В некоторых вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36 и 45 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38 и 47 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39 и 48 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41 и 50 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42 и 51 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
- 50 047663
i) SEQ ID NO: 34, 44 и 51 соответственно;
j) SEQ ID NO: 35, 42 и 51 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257 и 260 соответственно;
m) SEQ ID NO: 255, 258 и 261 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 81; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 83; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 84; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 86; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 88; HCDR1,
HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления Fv содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175;
- 51 047663
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96.
В некоторых вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 92 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 33, 91 и 94 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 172, 173 и 174 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 176, 177 и 178 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 180 соответственно; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления Fv содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 105; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 106; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 107; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170 и LCDR1, LCDR2 и
LCDR3 VL под SEQ ID NO: 185; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171 и LCDR1, LCDR2и
LCDR3 VL под SEQ ID NO: 188; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175 и LCDR1, LCDR2и
LCDR3 VL под SEQ ID NO: 192; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179 и LCDR1, LCDR2и
LCDR3 VL под SEQ ID NO: 196; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181 и LCDR1, LCDR2и
LCDR3 VL под SEQ ID NO: 200; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 202.
В определенных вариантах осуществления домены VH и VL, идентифицированные в данном документе, сконструированы в Fd.
В некоторых вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 18; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 19; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 20; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 21; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 22; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 23; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 24; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 25; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 26; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26 или 27.
В некоторых вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно; SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно; SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно; SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно; SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления Fd содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60;
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61;
k) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262;
l) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263; или
m) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
В определенных вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53.
В других вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56.
В других вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59.
В других вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262.
В других вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263.
В других вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
В некоторых вариантах осуществления Fd содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264.
В некоторых вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36 и 45 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38 и 47 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39 и 48 соответственно;
- 52 047663
e) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41 и 50 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42 и 51 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44 и 51 соответственно;
j) SEQ ID NO: 35, 42 и 51 соответственно;
k) SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно;
l) SEQ ID NO: 254, 257 и 260 соответственно;
m) SEQ ID NO: 255, 258 и 261 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61;
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273. В некоторых вариантах осуществления Fd содержит a) VH под SEQ ID NO: 52; b) VH под SEQ ID NO: 53; с) VH под SEQ ID NO: 54; d) VH под SEQ ID NO: 55; e) VH под SEQ ID NO: 56; f) VH под SEQ ID NO: 57; g) VH под SEQ ID NO: 58; h) VH под SEQ ID NO: 59; i) VH под SEQ ID NO: 60; j) VH под SEQ ID NO: 61; k) VH под SEQ ID NO: 262; l) VH под SEQ ID NO: 263; или m) VH под SEQ ID NO: 264.
В некоторых вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96.
В некоторых вариантах осуществления Fd содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 92 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 33, 91 и 94 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 172, 173 и 174 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 176, 177 и 178 соответственно; HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 180 соответственно; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно.
Гомологичные антигенсвязывающие домены и антигенсвязывающие домены с консервативными заменами.
Варианты антигенсвязывающих доменов, которые связывают CD33, попадают в объем настоящего изобретения. Например, варианты могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 аминокислотных замен в антигенсвязывающем домене, связывающем CD33, при условии, что они сохраняют или улучшают функциональные свойства по сравнению с исходными антигенсвязывающими доменами. Например, в некоторых вариантах осуществления вариант антигенсвязывающего домена, который связывает CD33, характеризуется улучшенной термостабильностью по сравнению с исходным антигенсвязывающим доменом в одном и том же анализе. В некоторых вариантах осуществления вариант антигенсвязывающего домена, который связывает CD33, характеризуется пониженной вероятностью посттрансляционной модификации по сравнению с исходным связывающим доменом. Снижение вероятности посттрансляционной модификации может возникнуть из-за замены мотива, такого как NG, DG или DP. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательности может составлять приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,
- 53 047663
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% по отношению к антигенсвязывающим доменам, которые связывают CD33, по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления вариация находится в каркасных областях. В некоторых вариантах осуществления варианты образуются за счет консервативных замен.
Например, антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, могут содержать замены в положениях остатков Р41, I49, М70 и А88 в VH (нумерация остатков согласно hu11B6_VH под SEQ ID NO: 5) и S80, L82, А88 и Y91 в VL (нумерация остатков согласно hu11B6_VL под SEQ ID NO: 2). Консервативные замены могут быть осуществлены в любых указанных положениях, и полученные варианты антигенсвязывающих доменов, которые связывают CD33, тестируют в отношении необходимых характеристик в анализах, описанных в данном документе.
Также представлены антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, содержащие VH, которые на по меньшей мере 80% идентичны
V H под SEQ ID NO: 18;
V H под SEQ ID NO: 19;
V H под SEQ ID NO: 20;
V H под SEQ ID NO: 21;
V H под SEQ ID NO: 22;
V H под SEQ ID NO: 23;
V H под SEQ ID NO: 24;
V H под SEQ ID NO: 25;
V H под SEQ ID NO: 26;
V H под SEQ ID NO: 27;
V H под SEQ ID NO: 52;
V H под SEQ ID NO: 53;
V H под SEQ ID NO: 54;
V H под SEQ ID NO: 55;
V H под SEQ ID NO: 56;
V H под SEQ ID NO: 57;
V H под SEQ ID NO: 58;
V H под SEQ ID NO: 59;
V H под SEQ ID NO: 60;
V H под SEQ ID NO: 61;
V H под SEQ ID NO: 95;
V H под SEQ ID NO: 96;
V H под SEQ ID NO: 97;
V H под SEQ ID NO: 170;
V H под SEQ ID NO: 171;
V H под SEQ ID NO: 175;
V H под SEQ ID NO: 179;
V H под SEQ ID NO: 181;
V H под SEQ ID NO: 96;
V H под SEQ ID NO: 262;
V H под SEQ ID NO: 263; или
V H под SEQ ID NO: 264.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 53.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 56.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 59.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%,
- 54 047663 по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 262.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 263.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 264.
В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 85%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 90%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 91%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 91%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 92%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 93%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 94%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 94%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 95%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 96%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 97%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 98%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 99%.
Также представлены антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, содержащие VH и VL, которые на по меньшей мере 80% идентичны
V H под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
V H под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
V H под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
V H под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
V H под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
V H под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
V H под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
V H под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
V H под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
V H под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
V H под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
V H под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
V H под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
V H под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
V H под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200;
V H под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202;
VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH и VL, которые на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичны VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 53 и VL, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VL под SEQ ID NO: 82. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 82 и VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 53.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%,
- 55 047663 по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 56 и VL, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VL под SEQ ID NO: 85. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 85 и VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 56.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 59 и VL, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VL под SEQ ID NO: 87. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 87 и VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 59.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 262 и VL, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VL под SEQ ID NO: 271. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 271 и VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 262.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 263 и VL, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VL под SEQ ID NO: 272. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 272 и VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 263.
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 264 и VL, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VL под SEQ ID NO: 273. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 273 и VH, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей
- 56 047663 мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична VH под SEQ ID NO: 264.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что положения в доменах VH и/или VL могут быть подвергнуты мутации для удаления мотивов, которые подвержены посттрансляционной модификации. Посттрансляционная модификация может повышать вероятность, например, дезамидирования, изомеризации и/или фрагментации антигенсвязывающего домена, который связывается с CD33. Эти мутации могут также повышать термостабильность антигенсвязывающего домена, который связывается с CD33.
Примерами мотивов последовательности, которые подвержены посттрансляционной модификации являются, например, NG, DG и DP.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит домен VH и/или VL, содержащий одну или две аминокислотные замены в одном или нескольких мотивах NG. В некоторых вариантах осуществления заменяют остаток N в мотиве NG. В других вариантах осуществления заменяют остаток G в мотиве NG. В некоторых вариантах осуществления заменяют остатки N и G в мотиве NG. В определенных таких вариантах осуществления одна или две аминокислотные замены в одном или нескольких мотивах NG являются единственными заменами в домене VH и/или VL.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит домен VH и/или VL, содержащий одну или две аминокислотные замены в одном или нескольких мотивах DG. В некоторых вариантах осуществления заменяют остаток D в мотиве DG. В других вариантах осуществления заменяют остаток G в мотиве DG. В некоторых вариантах осуществления заменяют остатки D и G в мотиве DG. В определенных таких вариантах осуществления одна или две аминокислотные замены в одном или нескольких мотивах DG являются единственными заменами в домене VH и/или VL.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит домен VH и/или VL, содержащий одну или две аминокислотные замены в одном или нескольких мотивах DP. В некоторых вариантах осуществления заменяют остаток D в мотиве DP. В других вариантах осуществления заменяют остаток Р в мотиве DP. В некоторых вариантах осуществления заменяют остатки D и Р в мотиве DP. В определенных таких вариантах осуществления одна или две аминокислотные замены в одном или нескольких мотивах DP являются единственными заменами в домене VH и/или VL.
Иллюстративный антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, по настоящему изобретению представляет собой белок (например, scFv), содержащий VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что подвергание мутации мотива DG в VH под SEQ ID NO: 262 может снизить вероятность посттрансляционной модификации, сохраняя при этом свойства связывания CD33. Эти мутации также могут повышать термостабильность.
Антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, имеющий VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271, может быть подвергнут мутации с удалением мотива DG. VH под SEQ ID NO: 262 имеет мотив DG в положениях 54-55 (с использованием нумерации остатков согласно индексу EU).
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VH под SEQ ID NO: 262, в которой остаток D в положении 54 замещен (например, D54G, D54A, D54Y, D54P, D54N, D54S, D54R, D54L, D54V, D54T, D54F или D54W). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VH под SEQ ID NO: 262, в которой остаток G в положении 55 замещен (например, G55V, G55P, G55R, G55A, G55L, G55Q, G55T или G55H). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VH под SEQ ID NO: 262, в которой остаток D в положении 54 (например, D54G, D54A, D54Y, D54P, D54N, D54S, D54R, D54L, D54V, D54T, D54F или D54W) замещен, и остаток G в положении 55 замещен (например, G55V, G55P, G55R, G55A, G55L, G55Q, G55T или G55H). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VH под SEQ ID NO: 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 или 310.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит
V H под SEQ ID NO: 291 и VL под SEQ ID NO:271;
V H под SEQ ID NO: 292 и VL под SEQ ID NO:271;
V H под SEQ ID NO: 293 и VL под SEQ ID NO:271;
V H под SEQ ID NO: 294 и VL под SEQ ID NO:271;
V H под SEQ ID NO: 295 и VL под SEQ ID NO:271;
V H под SEQ ID NO: 296 и VL под SEQ ID NO:271;
V H под SEQ ID NO: 297 и VL под SEQ ID NO:271;
V H под SEQ ID NO: 298 и VL под SEQ ID NO:271;
V H под SEQ ID NO: 299 и VL под SEQ ID NO:271;
- 57 047663
V H под SEQ ID NO: 300 и VL под SEQ ID NO: 271;
V H под SEQ ID NO: 301 и VL под SEQ ID NO: 271;
V H под SEQ ID NO: 302 и VL под SEQ ID NO: 271;
V H под SEQ ID NO: 303 и VL под SEQ ID NO: 271;
V H под SEQ ID NO: 304 и VL под SEQ ID NO: 271;
V H под SEQ ID NO: 305 и VL под SEQ ID NO: 271;
V H под SEQ ID NO: 306 и VL под SEQ ID NO: 271;
V H под SEQ ID NO: 307 и VL под SEQ ID NO: 271;
VH под SEQ ID NO: 308 и VL под SEQ ID NO: 271;
VH под SEQ ID NO: 309 и VL под SEQ ID NO: 271; или
VH под SEQ ID NO: 310 и VL под SEQ ID NO: 271.
Другой иллюстративный антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, по настоящему изобретению представляет собой белок (например, scFv), содержащий VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что подвергание мутации одного или нескольких мотивов NG в VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272 может снизить вероятность посттрансляционной модификации, сохраняя при этом свойства связывания CD33. Эти мутации также могут повышать термостабильность.
Антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, имеющий VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272, может быть подвергнут мутации с удалением мотива NG. VH под SEQ ID NO: 263 имеет мотив NG в положениях 99-100 (с использованием нумерации остатков согласно индексу EU), a VL под SEQ ID NO: 272 имеет мотив NG в положениях 97-98 (с использованием нумерации остатков согласно индексу EU).
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VH под SEQ ID NO: 263, в которой остаток N в положении 99 замещен (например, N99V, N99S, N99E, N99H, N99A, N99G, N99K, N99T, N99F, N99V, N99R, N99L, N99H или N99I). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VH под SEQ ID NO: 263, в которой остаток G в положении 100 замещен (например, G100S, G100A). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VH под SEQ ID NO: 263, в которой остаток N в положении 99 замещен (например, N99V, N99S, N99E, N99H, N99A, N99G, N99K, N99T, N99F, N99V, N99R, N99L, N99H или N99I) и остаток G в положении 100 замещен (например, G100S, G100A). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351 или 352.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 272, в которой остаток N в положении 97 замещен (например, N97V, N97R, N97P, N97T, N97G, N97Q, N97S, N97A, N97L, N97Y, N97E, N97F, N97D, N97I или N97H). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 272, в которой остаток G в положении 98 замещен (например, G98V, G98P, G98R, G98D, G98E, G98W, G98Y, G98A, G98N, G98K, G98L). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 272, в которой остаток N в положении 97 замещен и остаток G в положении 98 замещен. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335 или 336.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 311;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 312;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 313;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 314;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 315;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 316;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 317;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 318;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 319;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 320;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 321;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 322;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 323;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 324;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 325;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 326;
- 58 047663
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 327;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 328;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 329;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 330;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 331;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 332;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 333;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 334;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 335;
V H под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 336;
V H под SEQ ID NO: 337 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 338 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 339 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 340 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 341 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 342 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 343 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 344 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 345 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 346 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 347 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 348 и VL под SEQ ID NO: 272;
V H под SEQ ID NO: 349 и VL под SEQ ID NO: 272;
VH под SEQ ID NO: 350 и VL под SEQ ID NO: 272;
VH под SEQ ID NO: 351 и VL под SEQ ID NO: 272; или
VH под SEQ ID NO: 352 и VL под SEQ ID NO: 272.
Другой иллюстративный антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, по настоящему изобретению представляет собой белок (например, scFv), содержащий VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что подвергание мутации одного или нескольких мотивов NG в VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85 может снизить вероятность посттрансляционной модификации, сохраняя при этом свойства связывания CD33. Эти мутации также могут повышать термостабильность.
Антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, имеющий VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85, может быть подвергнут мутации с удалением мотива NG. VH под SEQ ID NO: 56 имеет мотив NG в положениях 99-100 (с использованием нумерации остатков согласно индексу EU), a VL под SEQ ID NO: 85 имеет мотив NG в положениях 97-98 (с использованием нумерации остатков согласно индексу EU).
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VH под SEQ ID NO: 56, в которой остаток N в положении 99 замещен (например, N99R, N99P, N99G, N99V, N99L, N99D, N99E, N99A, N99Q или N99T). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VH под SEQ ID NO: 56, в которой остаток G в положении 100 замещен (например, G100S, G100A, G100L, G100P, G100T или G100Q). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VH под SEQ ID NO: 56, в которой остаток N в положении 99 замещен (например, N99R, N99P, N99G, N99V, N99L, N99D, N99E, N99A, N99Q или N99T) и остаток G в положении 100 замещен (например, G100S, G100A, G100L, G100P, G100T или G100Q). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VH под SEQ ID NO: 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 или 382.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 85, в которой остаток N в положении 97 замещен (например, N97G, N97D, N97P, N97K, N97E, N97A, N97R, N97Q, N97I, N97V, N97H, N97K, N97W или N97S). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 85, в которой остаток G в положении 98 замещен. В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 85, в которой остаток N в положении 97 замещен (например, N97G, N97D, N97P, N97K, N97E, N97A, N97R, N97Q, N97I, N97V, N97H, N97K, N97W или N97S) и остаток G в положении 98 замещен. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365 или 366.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит
- 59 047663
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 353;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 354;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 355;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 356;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 357;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 358;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 359;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 360;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 361;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 362;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 363;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 364;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 365;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 366;
V H под SEQ ID NO: 367 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 368 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 369 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 370 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 371 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 372 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 373 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 374 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 375 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 376 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 377 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 378 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 379 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 380 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 381 и VL под SEQ ID NO: 85; или
V H под SEQ ID NO: 382 и VL под SEQ ID NO: 85.
Другой иллюстративный антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, по настоящему изобретению представляет собой белок (например, scFv), содержащий VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что подвергание мутации мотива NG в VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82 может снизить вероятность посттрансляционной модификации, сохраняя при этом свойства связывания CD33. Эти мутации также могут повышать термостабильность.
Антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33, имеющий VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82, может быть подвергнут мутации до мотива NG. VL под SEQ ID NO: 82 имеет мотив NG в положениях 97-98 (с использованием нумерации остатков согласно индексу EU).
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 82, в которой остаток N в положении 97 замещен (например, N97S, N97Q, N97V, N97G, N97W, N97T, N97I, N97E, N97A, N97R или N97L). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 272, в которой остаток G в положении 98 замещен (например, G98V, G98A, G98P, G98L или G98T). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 82, в которой остаток N в положении 97 замещен (например, N97S, N97Q, N97V, N97G, N97W, N97T, N97I, N97E, N97A, N97R или N97L) и остаток G в положении 98 замещен (например, G98V, G98A, G98P, G98L или G98T). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит VL под SEQ ID NO: 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397 или 398.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 383;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 384;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 385;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 386;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 387;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 388;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 389;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 390;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 391;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 392;
- 60 047663
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO:393;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO:394;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO:395;
VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO:396;
VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 397; или
VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO:398.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит домен VH под SEQ ID NO: 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, или 382.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит домен VL под SEQ ID NO: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397 или 398.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с CD33 (например, scFv), содержит домен VH под SEQ ID NO: 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348,
349, 350, 351, 352, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, или 382 и домен VL под SEQ ID NO: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326,
327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364,
365, 366, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397 или 398.
В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 85%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 90%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 91%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 91%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 92%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 93%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 94%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 94%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 95%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 96%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 97%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 98%. В некоторых вариантах осуществления идентичность составляет 99%.
Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, разделяемых последовательностями (т.е. % идентичности = число идентичных положений/общее число положений х 100), с учетом количества числа гэпов и длины каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей.
Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с использованием алгоритма Е. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы весов замен остатков РАМ120, штрафа за длину гэпа 12 и штрафа за гэп 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с использованием алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)), который был включен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступном на www_gcg_com), с использованием либо матрицы Blossum 62, либо матрицы РАМ250, веса гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
В некоторых вариантах осуществления вариантные антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, содержат одну или две консервативные замены в любой из областей CDR при сохранении необходимых функциональных свойств исходных антигенсвязывающих фрагментов, которые связывают CD33.
Термин консервативные модификации относится к аминокислотным модификациям, которые не оказывают существенного влияния или не изменяют характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотные модификации. Консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислоту заменяют остатком аминокислоты с аналогичной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, хорошо определены и включают аминокислоты с кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин, триптофан), ароматическими боковыми цепями (например, фенилаланин, триптофан, гистидин, тирозин), алифатическими боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин), амидом (например, аспарагин, глутамин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и серосодержащими боковыми цепями (цистеин, метионин). Кроме того, любой нативный остаток в полипептиде может быть также заменен аланином, как было описано ранее для аланин
- 61 047663 сканирующего мутагенеза (MacLennan et al., (1988) Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67; Sasaki et al., (1988) Adv Biophys 35:1-24). Аминокислотные замены в антителах по настоящему изобретению могут быть сделаны известными способами, например путем мутагенеза ПЦР (патент США № 4683195). В качестве альтернативы, библиотеки вариантов могут быть созданы, например, с использованием случайных (NNK) или неслучайных кодонов, например, кодонов DVK, которые кодируют 11 аминокислот (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp). Полученные варианты могут быть тестированы по их характеристикам с использованием анализов, описанных в данном документе. Способы создания антигенсвязывающего фрагмента, который связывает CD33
Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, представленные в настоящем изобретении, могут быть созданы с использованием различных технологий. Например, гибридомный способ Келера и Милыптейна можно применять для идентификации пар VH/VL, которые связывают CD33. В гибридомном способе мышь или другого животного-хозяина, такого как хомяк, крыса или курица, иммунизируют антигенами CD33 человека и/или яванского макака с последующим слиянием клеток селезенки от иммунизированных животных с клетками миеломы с применением стандартных способов для образования гибридомных клеток. Колонии, образующиеся из одиночных иммортализованных гибридомных клеток, можно подвергать скринингу в отношении продуцирования антител, содержащих антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, с требуемыми свойствами, такими как специфичность связывания, перекрестная реактивность или ее отсутствие, аффинность в отношении антигена и любая требуемая функциональность.
Антигенсвязывающие домены, связывающие CD33, полученные путем иммунизации отличных от человека животных, могут быть гуманизированы. Иллюстративные методики гуманизации, в том числе отбор человеческих акцепторных каркасных последовательностей, включают прививку CDR (патент США № 5225539), прививку SDR (патент США № 6818749), изменение поверхности (Padlan, (1991) Mol Immunol 28:489-499), изменение поверхности остатков, определяющих специфичность (публикация заявки на патент США № 2010/0261620), адаптацию человеческой каркасной последовательности (патент США № 8748356) или супергуманизацию (патент США № 7709226). В данных способах CDR или подгруппу остатков CDR исходных антител переносят на человеческие каркасные последовательности, которые могут быть выбраны на основании их общей гомологии по отношению к исходным каркасным последовательностям, на основании схожести длины CDR или идентичности канонической структуры или их комбинации.
Гуманизированные антигенсвязывающие домены могут быть дополнительно оптимизированы для улучшения их селективности или аффинности в отношении требуемого антигена посредством включения измененных поддерживающих каркасную последовательность остатков для сохранения аффинности связывания (возвратных мутаций) посредством методик, как, например, таковые, описанные в публикациях международных заявок на патент №№ WO 1990/007861 и WO 1992/22653, или посредством введения вариации на уровне любой из CDR, например, для улучшения аффинности антигенсвязывающего домена.
Трансгенных животных, таких как мыши, крыса или курица, несущих локусы человеческого иммуноглобулина (Ig) в своем геноме, можно использовать для получения антигенсвязывающих фрагментов, которые связывают CD33, и описаны, например, в патенте США № 6150584, публикации международной заявки на патент № WO 1999/45962, публикациях международных заявок на патент №№ WO 2002/066630, WO 2002/43478, WO 2002/043478 и WO 1990/04036.
Эндогенные локусы иммуноглобулина у таких животных могут быть разрушены или удалены, и по меньшей мере один полный или частичный локус человеческого иммуноглобулина может быть вставлен в геном животного с применением гомологичной или негомологичной рекомбинации с применением трансхромосом или с применением минигенов. Компании, такие как Regeneron (www_regeneron_com), Harbour Antibodies (www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (www_omtinc_net), KyMab (www_kymab_com), Trianni (www.trianni_com) and Ablexis (www_ablexis_com), могут быть задействованы для обеспечения человеческих антител, направленных против выбранного антигена, с применением технологий, описанных выше.
Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, могут быть выбраны из библиотеки фагового дисплея, где фаг сконструирован для экспрессии человеческих иммуноглобулинов или их частей, таких как Fab, одноцепочечные антитела (scFv) или неспаренные или спаренные вариабельные области антитела. Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, могут быть выделены, например, из библиотеки фагового дисплея, экспрессирующей вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела в виде белков, слитых с белком оболочки бактериофага pIX, как описано в Shi et al., (2010) J Mol Biol 397: 385-96 и публикации международной заявки на патент № WO 09/085462). Библиотеки могут быть подвергнуты скринингу в отношении связывания фага с CD33 человека и/или макака-крабоеда, и полученные положительные клоны могут быть дополнительно охарактеризованы, Fab выделены из лизатов клона и преобразованы в scFv или другие конфигурации антигенсвязывающих фрагментов.
Подготовку иммуногенных антигенов, и экспрессию, и получение антигенсвязывающих доменов по настоящему изобретению можно осуществлять с применением любой подходящей методики, такой как получение рекомбинантного белка. Иммуногенные антигены можно вводить животному в форме очи
- 62 047663 щенного белка или белковых смесей, включающих цельные клетки или экстракты клеток или тканей, или антиген может образовываться в организме животного de novo из нуклеиновых кислот, кодирующих указанный антиген или его часть.
Конъюгирование с удлиняющими период полужизни фрагментами.
Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с удлиняющим период полужизни фрагментом. Иллюстративными удлиняющими период полужизни фрагментами являются альбумин, варианты альбумина, альбуминсвязывающие белки и/или домены, трансферрин и его фрагменты и аналоги, иммуноглобулины (Ig) или их фрагменты, такие как Fc-области. Известны аминокислотные последовательности упомянутых выше удлиняющих период полужизни фрагментов. Ig или его фрагменты включают все изотипы, т.е., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE.
Дополнительные удлиняющие период полужизни фрагменты, которые могут быть конъюгированы с антигенсвязывающими доменами, которые связывают CD33, по настоящему изобретению, включают молекулы полиэтиленгликоля (PEG), такие как PEG5000 или PEG20000, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот с различной длиной цепи, например лаурат, миристат, стеарат, арахидат, бегенат, олеат, арахидонат, октандикарбоновую кислоту, тетрадекандикарбоновую кислоту, октадекандикарбоновую кислоту, докозандикарбоновую кислоту и т.п., полилизин, октан, углеводы (декстран, целлюлозу, олиго- или полисахариды) для придания необходимых свойств. Эти молекулы могут быть прямым слиянием с антигенсвязывающими доменами, которые связывают CD33, по настоящему изобретению, и могут быть получены с помощью стандартных методик клонирования и экспрессии. В качестве альтернативы, хорошо известные способы химического соединения могут быть использованы для присоединения фрагментов к рекомбинантно полученным антигенсвязывающим доменам, которые связывают CD33, по настоящему изобретению.
Пегильный фрагмент может быть, например, конъюгирован с антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, по настоящему изобретению путем включения цистеинового остатка к С-концу антигенсвязывающего домена, который связывает CD33 по настоящему изобретению или встраивания путем генной инженерии цистеинов в положения остатков, которые обращены в сторону от сайта связывания CD33, и присоединения пегильной группы к цистеину с помощью хорошо известных способов.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент, который связывает CD33, конъюгирован с удлиняющим период полужизни фрагментом.
В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой иммуноглобулин (Ig), фрагмент Ig, константную область Ig, фрагмент константной области Ig, Fcобласть, трансферрин, альбумин, альбуминсвязывающий домен или полиэтиленгликоль. В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой константную область Ig.
В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой Ig.
В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой фрагмент Ig.
В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой константную область Ig.
В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой фрагмент константной области Ig.
В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой Fc-область.
В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой альбумин.
В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой альбуминсвязывающий домен.
В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой трансферрин.
В некоторых вариантах осуществления удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой полиэтиленгликоль.
Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, конъюгированные с удлиняющим период полужизни фрагментом, могут быть оценены по их фармакокинетическим свойствам с использованием известных моделей in vivo. Конъюгирование константных областей иммуноглобулина (Ig) или фрагментов константных областей Ig
Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с константной областью Ig или фрагментом константной области Ig для придания антителоподобных свойств, включая Fc-эффекторные функции связывания C1q, комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), связывание Fc рецептора, антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз или понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (напри
- 63 047663 мер, рецептора В-клеток; BCR). Константная область Ig или фрагмент константной области Ig также функционирует как удлиняющий период полужизни фрагмент, как описано в настоящем документе. Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, по настоящему изобретению могут быть сконструированы в обычные полноразмерные антитела с использованием стандартных способов. Полноразмерные антитела, включающие антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, могут быть далее сконструированы, как описано в данном документе.
Константная область тяжелой цепи иммуноглобулина состоит из субдоменов СН1, шарнира, СН2 и CH3. Домен СН1 охватывает остатки A118-V215, домен СН2 охватывает остатки А231-К34О, а домен CH3 охватывает остатки G341-K447 на тяжелой цепи, нумерация остатков соответствует индексу ЕС. В некоторых случаях G341 упомянут как остаток домена СН2. Термин шарнир обычно определяют как включающий Е216 и заканчивающийся на Р230 человеческого IgG1. Fc-область Ig содержит по меньшей мере домены СН2 и CH3 константной области Ig и, следовательно, содержит по меньшей мере область от приблизительно А231 до K447 константной области тяжелой цепи Ig.
Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающему домену, который связывает CD33, конъюгированному с константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом константной области Ig. В определенных таких вариантах осуществления константная область Ig или фрагмент константной области Ig получены из IgG1.
В некоторых вариантах осуществления константная область Ig представляет собой константную область тяжелой цепи. В определенных таких вариантах осуществления константная область Ig представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1.
В некоторых вариантах осуществления константная область Ig представляет собой константную область легкой цепи.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит Fc-область. В определенных таких вариантах осуществления константная область Ig содержит Fc-область IgG1. В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит домен СН2. В определенных таких вариантах осуществления константная область Ig содержит домен СН2 IgG1.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит домен CH3. В определенных таких вариантах осуществления константная область Ig содержит домен CH3 IgG1.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит домен СН2 и домен CH3. В определенных таких вариантах осуществления константная область Ig содержит домен СН2 и CH3 IgG1.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере часть шарнира, домен СН2 и домен CH3. В определенных таких вариантах осуществления по меньшей мере часть шарнира, домен СН2 и домен CH3 из IgG1. Часть шарнира относится к одному или нескольким аминокислотным остаткам шарнира Ig.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит шарнир, домен СН2 и домен CH3. В определенном таком варианте осуществления содержатся шарнир, домен СН2 и домен CH3 из IgG1.
В определенных вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 278.
Остаток цистеина в положении 220 тяжелой цепи может быть подвергнут мутации для предупреждения образования цистеинового мостика между константной областью и легкой цепью. Таким образом, в определенных вариантах осуществления константная область Ig содержит остаток, который не является цистеином в положении 220. В одном варианте осуществления константная область Ig содержит серин в положении 220.
В определенных вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 279.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгирован с N-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгирован с С-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгирован с константной областью Ig или фрагментом константной области Ig через второй линкер (L2).
В некоторых вариантах осуществления L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, по настоящему изобретению, конъюгированные с константной областью Ig или фрагментом константной области Ig, можно оценивать по их функциональности с использованием нескольких известных анализов. Связывание с CD33 можно оценивать с использованием способов, описанных в данном документе. Измененные свойства, обеспечиваемые константным доменом Ig или фрагментом константной области Ig, такими как Fc-область, могут быть
- 64 047663 оценены в анализах связывания с Fc-рецептором с использованием растворимых форм рецепторов, таких как рецепторы FcyRI, FcyRII, FcyRIII или FcRn, или с использованием клеточных анализов, измеряющих, например, AdCC, CDC или AdCp.
ADCC может быть оценена с помощью анализа in vitro с использованием экспрессирующих CD33 клеток в качестве клеток-мишеней и NK-клеток в качестве эффекторных клеток. Цитолиз может быть выявлен по высвобождению метки (например, радиоактивных субстратов, флуоресцентных красителей или природных внутриклеточных белков) из лизированных клеток. В иллюстративном анализе используют клетки-мишени в соотношении 1 клетка-мишень на 4 эффекторные клетки. Клетки-мишени предварительно метят BATDA и объединяют с эффекторными клетками и тестируемым антителом. Образцы инкубируют в течение 2 ч и измеряют лизис клеток путем измерения высвобожденного BATDA в надосадочной жидкости. Данные нормализовали по максимальной цитотоксичности с 0,67% Triton X-100 (Sigma Aldrich) и минимальному контролю, определяемому по спонтанному высвобождению BATDA из клеток-мишеней в отсутствие любого антитела.
ADCP можно оценить с использованием моноцитарных макрофагов в качестве эффекторных клеток и любых экспрессирующих CD33 клеток в качестве клеток-мишеней, которые сконструированы для экспрессии GFP или другой меченой молекулы. В иллюстративном анализе соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней может составлять, например, 4:1. Эффекторные клетки можно инкубировать с клетками-мишенями в течение 4 ч с антителом по настоящему изобретению или без него. После инкубации клетки могут быть отделены с использованием аккутазы. Макрофаги могут быть идентифицированы с помощью антител к CD11b и к CD14, соединенных с флуоресцентной меткой, и процент фагоцитоза может быть определен на основании % флуоресценции GFP в CD11+CD14+ макрофагах с использованием стандартных способов.
CDC клеток можно измерить, например, путем посева клеток Daudi в количестве 1х105 клеток/лунка (50 мкл/лунка) в RPMI-B (RPMI, дополненная 1% BSA), добавления в лунки 50 мкл тестируемого белка при конечной концентрации от 0 до 100 мкг/мл, инкубации реакционной смеси в течение 15 мин при комнатной температуре, добавления в лунки 11 мкл объединенной сыворотки крови человека и инкубирования реакционной смеси в течение 45 мин при 37°C. Процентная доля (%) лизированных клеток может быть определена как % окрашенных пропидия йодидом клеток в FACS-анализе с использованием стандартных способов.
Включающие антигенсвязывающие домены белки, которые связывают CD33 по настоящему изобретению.
Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, по настоящему изобретению могут быть сконструированы в моноспецифические или мультиспецифические белки различных конструкций с использованием стандартных способов.
Настоящее изобретение также относится к моноспецифическому белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления моноспецифический белок представляет собой антитело.
Настоящее изобретение также относится к мультиспецифическому белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок является биспецифическим.
В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок является триспецифическим.
В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок является тетраспецифическим.
В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок является моновалентным при связывании с CD33.
В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок является бивалентным при связывании с CD33.
Настоящее изобретение также относится к выделенному мультиспецифическому белку, содержащему первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита.
В некоторых вариантах осуществления антиген лимфоцита представляет собой антиген Т-клетки.
В некоторых вариантах осуществления антиген Т-клетки представляет собой антиген CD8+ Тклетки.
В некоторых вариантах осуществления антиген лимфоцита представляет собой антиген NK-клетки.
В некоторых вариантах осуществления антиген лимфоцита представляет собой CD3, CD3 эпсилон (CD3s), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C.
В некотором варианте осуществления мультиспецифический белок представляет собой биспецифический белок, содержащий первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и второй антигенсвязывающий домен, который связывается с TRGV9. TRGV9 также известен как Vy9 и экспрессируется на γδ Т-клетках. Используемый в данном документе термин TRGV9 относится к полипептиду, способному образовывать Т-клеточный рецептор при экспрессии на поверхности γδ Т-клеток. Экспрес
- 65 047663 сирующие TRGV9 γδ Т-клетки являются одними из первых Т-клеток, развивающихся у человеческого плода, и преобладающим подмножеством γδ Т-клеток в клетках периферической крови здоровых взрослых людей. Термин TRGV9 включает любой вариант TRGV9, изоформу и видовой гомолог, который естественным образом экспрессируется клетками (в том числе Т-клетками) или может быть экспрессирован на клетках, трансфицированных генами или cDNA, кодирующими полипептид. Если не указано, то предпочтительно TRGV9 является TRGV9 человека. Аминокислотная последовательность TRGV9 человека представлена под номером доступа GenBank NG_001336.2. Vγ9Vδ2 Т-лимфоциты, основное подмножество γ/δ Т-клеток у людей, могут распознавать фосфоантигены, некоторые опухолевые клетки и клетки, обработанные аминобисфосфонатами. Vγ9Vδ2 Т-лимфоциты могут проявлять цитолитическую активность в отношении различных опухолевых клеток. Рядовым специалистам в данной области понятно, что γ/δ TCR представляет собой гетеродимерный комплекс TCR, состоящий из ковалентно связанных γ и δ цепей, участвующих в распознавании антигена, и нековалентно связанных мономорфных белков CD3δ, γ, ε и ζ, цепей. TCR Vy9 представляет собой вариант γ-цепи TCR, экспрессируемой на подмножестве γ/δ Т-клеток.
Без ограничения конкретной теорией считается, что биспецифическое антитело, экспрессирующее и антиген TRGV9, и антиген CD33, может рекрутировать γδ Т-клетки к раковым клеткам, экспрессирующим CD33. Мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело) может соединять мостиком эффекторную клетку (например, γδ Т-клетку) и клетки-мишени вместе, что приводит к уничтожению раковых клеток, γδ Т-клетки могут обладать врожденным иммунитетом. Без ограничения конкретной теорией считается, что γδ Т-клетки представляют собой лишь незначительную часть периферических CD3' Т-клеток (приблизительно 1-5%), но составляют основное подмножество (приблизительно 20-50%) Т-клеток в эпителиальных тканях. Циркулирующие γδ Т-клетки в основном экспрессируют гетеродимеры цепей Vy9 (TRGV9) и Vδ2 (TRVD2), тогда как тканевые γδ Т-клетки преимущественно экспрессируют цепи Vδ1, связанные с различными цепями Υγ.
У человека γδ Т-клетки обладают мощными противораковыми функциями (высокой цитотоксичностью и секрецией интерферона γ). Более того, γδ Т-клетки способны к фагоцитозу, функции, ранее присущей исключительно врожденным клеткам миелоидной линии дифференцировки, ведут себя как эффективные антигенпрезентирующие клетки для αβ Т-клеток и индуцируют адаптивный иммунный ответ. γδ Т-клетки могут проникать в раковые ткани, опухоли и раковые клетки. Биспецифическое антитело, экспрессирующее как антиген TRGV9, так и антиген CD33, может проявлять меньшую или незначительную перенаправленность Т-клеток, меньшую пан-активацию Т-клеток и повышенную индукцию мощного лизиса раковых клеток посредством селективного рекрутинга γδ Т-клеток. Соответственно, биспецифическое антитело, экспрессирующее как антиген TRGV9, так и антиген CD33, может не приводить к тяжелым побочным эффектам, которые могут возникать при индукции цитокинового шторма.
В некоторых вариантах осуществления антиген лимфоцита представляет собой CD3ε.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита (например, TRGV9), содержат scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита (например, TRGV9), содержат Fab.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита (например, TRGV9), содержат F(ab')2.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита (например, TRGV9), содержат VHH.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита (например, TRGV9), содержат Fv.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита (например, TRGV9), содержат Fd.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита (например, TRGV9), содержат scFv.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит scFv, и второй связывающий домен, который связывает антиген лимфоцита (например, TRGV9), содержит VFH.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и
- 66 047663
VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит приблизительно 5-50 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит приблизительно 5-40 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит приблизительно 10-30 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит приблизительно 10-20 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117,
118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 109.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 110.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 111.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 112.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 113.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 114.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 115.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 116.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 117.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 118.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 119.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 120.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 121.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 122.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 123.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 124.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 125.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 126.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 127.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 128.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 129.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 130.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 131.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 132.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 133.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ
- 67 047663
ID NO: 134.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 135.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 136.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 137.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 138.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 139.
В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 140.
В определенных вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 89, 167, 172, 176, 253, 254 или 255, HCDR2 под SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 90, 91, 168, 173, 177, 256, 257 или 258 HCDR3 под SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 92, 93, 94, 169, 174, 178, 180, 259, 260 или 261, LCDR1 под SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 98, 99, 100, 182, 186, 189, 193, 197, 201, 265 или 266, LCDR2 под SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 101, 102, 103, 183, 187, 190, 194, 198, 267 или 268 и LCDR3 под SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78, 79, 80, 104, 184, 191, 195, 199, 269 или 270.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно;
SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно;
SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно;
SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно;
SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий до
- 68 047663 мен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и
270 соответственно. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает
CD33, представляет собой scFv, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно, и второй антигенсвязывающий домен связывается с
TRGV9 (например, при этом второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID
NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно, и второй антигенсвязывающий домен связывается с TRGV9 (например, при этом второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно, и второй антигенсвязывающий домен связывается с TRGV9 (например, при этом второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно, и второй антигенсвязывающий домен связывается с TRGV9 (например, где второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно, и второй антигенсвязывающий домен связывается с TRGV9 (например, где второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv и содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно, и второй антигенсвязывающий домен связывается с TRGV9 (например, где второй связывающий домен представляет собой VHH).
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает
- 69 047663
CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает который связывает который связывает который связывает который связывает который связывает
CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv. В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82, и второй антигенсвязывающий домен связывается с TRGV9 (например, где второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85, и второй антигенсвязывающий домен связывается с TRGV9 (например, где второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87, и второй антигенсвязывающий связывается с TRGV9 (например, где второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271, и второй антигенсвязывающий домен связывается с TRGV9 (например, где второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272, и второй антигенсвязывающий домен связывается с TRGV9 (например, где второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273, и второй антигенсвязывающий домен связывается с TRGV9 (например, где второй связывающий домен представляет собой VHH).
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
- 70 047663
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
V H под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
V H под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
V H под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
V H под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
V H под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
V H под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 52.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 53.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 54.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 55.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 57.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 58.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 59.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 60.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 61.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 262.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 263.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает
- 71 047663
CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 264. В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 53. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 59. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 262. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 263. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 264. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 95.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 96.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 97.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 170.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 171.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 175.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 179.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 181.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 96.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 81.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 82.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 83.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 84.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 85.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 86.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 87.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 88.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 271.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает
- 72 047663
CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 272.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 82. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 85. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 87. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 271. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 272. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 273. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 105.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 106.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 107.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 185.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 188.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 192.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 196.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 200.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 202. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220 221, 274, 275 или 276.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 203.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 204.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 205.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 206.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 207.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 208.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 209.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 210.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает
- 73 047663
CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 211.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 212.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 214.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 215.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 216.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 217.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 218.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 219.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 220.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 221.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 274.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 275.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 276.
который который который который который который который который который который который который который связывает связывает связывает связывает связывает связывает связывает связывает связывает связывает связывает связывает связывает
В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 216.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 219.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 274.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 275.
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 276.
В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213, и второй антигенсвязывающий домен, который связывается с TRGV9 (например, при этом второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 216, и второй антигенсвязывающий домен, который связывается с TRGV9 (например, при этом второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 219, и второй антигенсвязывающий домен, который связывается с TRGV9 (например, при этом второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 274, и второй антигенсвязывающий домен, который связывается с TRGV9 (например, при этом второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 275, и второй антигенсвязывающий домен, который связывается с TRGV9 (например, при этом второй связывающий домен представляет собой VHH).
В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 276, и второй антигенсвязывающий домен, который связывается с TRGV9 (например, гдепри этом второй связы
- 74 047663 вающий домен представляет собой VHH). В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержит
HCDR1 под SEQ ID NO: 141, HCDR2 под SEQ ID NO: 142, HCDR3 под SEQ ID NO: 143, LCDR1 под SEQ ID NO: 144, LCDR2 под SEQ ID NO: 145 и LCDR3 под SEQ ID NO: 146;
VH под SEQ ID NO: 147 и VL под SEQ ID NO: 148;
HCDR1 под SEQ ID NO: 149, HCDR2 под SEQ ID NO: 150, HCDR3 под SEQ ID NO: 151, LCDR1 под SEQ ID NO: 152, LCDR2 под SEQ ID NO: 153 и LCDR3 под SEQ ID NO: 154; или
VH под SEQ ID NO: 155 и VL под SEQ ID NO: 156.
В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержит определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 238, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 242, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 243, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 244, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
VH под SEQ ID NO: 245 и VL под SEQ ID NO: 249;
VH под SEQ ID NO: 246 и VL под SEQ ID NO: 249;
VH под SEQ ID NO: 247 и VL под SEQ ID NO: 249; или
VH под SEQ ID NO: 248 и VL под SEQ ID NO: 249.
В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгирован с первой константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом первой константной области Ig и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, конъюгирован со второй константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом второй константной области Ig.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент первой константной области Ig и/или фрагмент второй константной области Ig содержит Fc-область.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент первой константной области Ig и/или фрагмент второй константной области Ig содержит домен СН2.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент первой константной области Ig и/или фрагмент второй константной области Ig содержит домен CH3.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент первой константной области Ig и/или фрагмент второй константной области Ig содержит домен СН2 и домен CH3.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент первой константной области Ig и/или фрагмент второй константной области Ig содержит по меньшей мере часть шарнира, домен СН2 и домен CH3.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент константной области Ig содержит шарнир, домен СН2 и домен CH3.
В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок дополнительно содержит второй линкер (L2) между первым антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, и первой константной областью Ig или фрагментом первой константной области Ig и вторым антигенсвязывающим доменом, который связывает антиген лимфоцита, и второй константной областью Ig или фрагментом второй константной области Ig.
В некоторых вариантах осуществления L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG1.
В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG2.
В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig отно
- 75 047663 сятся к изотипу IgG3.
В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG4.
Первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig могут быть дополнительно сконструированы, как описано в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению степени связывания мультиспецифического белка с FcyR. В определенных таких вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG1.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация, которая приводит к снижению степени связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214Т/Е233Р/L234V/L235А/делеции G236/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S и
S228Р/F234А/L235А/делеции G236/G237A/P238S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
В определенных вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат мутации L234A/L235A/D265S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU. В определенных таких вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG1. B некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с Fcy рецептором (FcyR).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, M252Y/S254T/T256E и G236A/S239D/I332E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
В определенных вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат мутации M252Y/S254T/T256E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU. В определенных таких вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат мутации L234A/L235A/D265S и M252Y/S254T/T256E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU. В определенных вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG1. В некоторых вариантах осуществления FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIII или любую их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка, выбрана из группы, состоящей из Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует связывание с белком А. Такие модификации могут быть благоприятны для целей очистки в ходе получения антитела.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация, которая модулирует связывание с белком А, представляет собой H435/Y436F, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU. В определенных таких вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат мутации L234A/L235A/D265S, M252Y/S254T/T256E и H435/Y436F, при этом нуме
- 76 047663 рация остатков соответствует индексу EU. В определенных вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG1. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок содержит по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одна мутация в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig выбраны из группы, состоящей из T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F, L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V и T350V/T366L/K392L/T394W, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
В некоторых вариантах осуществления первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат следующие мутации:
L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V в первой константной области Ig и
L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W во второй константной области Ig; или
L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W в первой константной области Ig и
L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V во второй константной области Ig.
Создание мультиспецифических белков, содержащих антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают CD33.
Антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают CD33, по настоящему изобретению могут быть сконструированы в мультиспецифические антитела, которые также попадают в объем настоящего изобретения.
Антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают CD33, могут быть сконструированы в полноразмерные мультиспецифические антитела, которые создают с использованием обмена Fab-плечами, при котором в два моноспецифических бивалентных антитела вводят замены в домене CH3 константной области Ig, способствующие обмену Fab-плеча in vitro. В способах два моноспецифических бивалентных антитела конструируют с определенными заменами в домене СНЗ, которые способствуют стабильности гетеродимера; антитела инкубируют вместе в восстановительных условиях, достаточных для того, чтобы остатки цистеина в шарнирной области подверглись изомеризации дисульфидной связи; с созданием тем самым биспецифического антитела путем обмена Fab-плечами. Оптимально условия инкубации могут быть восстановлены до невосстановительных. Иллюстративными восстановителями, которые могут быть использованы, являются 2-меркаптоэтиламин (2-МЕА), дитиотреитол (DTT), дитиоэритрит (DTE), глутатион, трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), L-цистеин и бета-меркаптоэтанол, предпочтительно восстановитель, выбранный из группы, состоящей из 2-меркаптоэтиламина, дитиотреитола и трис(2карбоксиэтил)фосфина. Например, можно использовать инкубацию в течение по меньшей мере 90 мин при температуре по меньшей мере 20°C в присутствии по меньшей мере 25 мМ 2-МЕА или в присутствии по меньшей мере 0,5 мМ дитиотреитола при рН от 5-8, например при рН 7,0 или при рН 7,4.
Мутации CH3, которые могут быть использованы, включают такие технологии, как мутации выступы-во-впадины (Genentech), мутации электростатического совпадения (Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), тело со сконструированным доменом с обменом нитей (SEEDbody) (EMD Serono), мутации Duobody® (Genmab) и другие асимметричные мутации (например, Zymeworks).
Мутации выступы-во-впадины раскрыты, например, в WO1996/027011 и включают мутации на границе области CH3, при которых аминокислоту с малой боковой цепью (впадина) вводят в первую область CH3, а аминокислоту с большой боковой цепью (выступ) вводят во вторую область CH3, что приводит к преимущественному взаимодействию между первой областью CH3 и второй областью CH3. Иллюстративными мутациями области CH3, образующими выступ и впадину, являются T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S и T366W/T366S_L368A_Y407V.
Образование гетеродимера тяжелой цепи можно обеспечивать с использованием электростатических взаимодействий путем замены положительно заряженных остатков в первой области CH3 и отрицательно заряженных остатков во второй области CH3, как описано в US2010/0015133, US2009/0182127, US2010/028637 или US2011/0123532.
Другими асимметричными мутациями, которые могут быть использованы для обеспечения гетеродимеризации тяжелой цепи, являются L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F,
Y407A/T366A_K409F или T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, как описано в US2012/0149876 или US2013/0195849 (Zymeworks).
- 77 047663
Мутации SEEDbody включают замену выбранных остатков IgG на остатки IgA для обеспечения гетеродимеризации тяжелой цепи, как описано в US20070287170.
Другими иллюстративными мутациями, которые могут быть использованы, являются R409D_K370E/D399K_E357K, S354C_T366W/Y349C_T366S_L368A_Y407V,
Y349C_T366W/S354C_T366S_L368A_Y407V, T366K/L351D, L351K/Y349E, L351K/Y349D,
L351K/L368E, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, K392D/D399K,
K392D/E356K, K253E_D282K_K322D/D239K_E240K_K292D, K392D_K409D/D356K_D399K, как описано в WO2007/147901, WO 2011/143545, WO2013157954, WO2013096291 и US2018/0118849.
Мутации Duobody® (Genmab) раскрыты, например, в US9150663 и US2014/0303356 и включают мутации F405L/K409R, дикий тип/F405L_R409K, T350I_K370T_F405L/K409R, K370W/K409R, D399AFGHILMNRSTVWY/K409R, T366ADEFGHILMQVY/K4O9R, L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH, D399FHKRQ/K409AGRH, F405IKLSTVW/K409AGRH и Y407LWQ/K409AGRH.
Дополнительные биспецифические или мультиспецифические структуры, в которые могут быть включены антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, включают иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом (DVD) (публикация международной патентной заявки № WO2009/134776; DVD представляют собой полноразмерные антитела, содержащие тяжелую цепь, имеющую структуру VH1-линкер-VH2-CH, и легкую цепь, имеющую структуру ’7Ъ1-линкер-7Ъ2-^; линкер необязателен), структуры, включающие различные домены димеризации для соединения двух плечей антител с различной специфичностью, таких как лейциновая молния или домены димеризации коллагена (публикация международной патентной заявки № WO2012/022811, патент США № 5932448; патент США № 6833441), два или более доменных антитела (dAb), конъюгированные вместе, диатела, антитела только с тяжелой цепью, такие как верблюжьи антитела и сконструированные верблюжьи антитела, Ig с двойным нацеливанием (DT-Ig) (GSK/Domantis), антитело два в одном (Genentech), сшитые Mab (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star) и CovX-тело (CovX/Pfizer), IgG-подобные биспецифические (InnClone/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) и BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) и TvAb (Roche), слияния ScFv/Fc (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), созданное технологией переориентирования с двойной аффинностью (Fc-DART) (MacroGenics) и двой^и^Ет^^Ь (National Research Center for Antibody Medicine, Китай), двойного действия или бис-Fab (Genentech), полученные по способу Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics), бивалентное биспецифическое (Biotecnol) и Fab-Fv (UCB-Celltech). ScFv-антитела, диатела и доменные антитела включают без ограничения биспецифический рекрутер Т-клеток (BiTE) (Micromet), тандемное диатело (Tandab) (Affimed), созданное технологией переориентирования с двойной аффинностью (DART) (MacroGenics), одноцепочечное диатело (Academic), TCR-подобные антитела (AIT, ReceptorLogics), слияние человеческого сывороточного альбумина и ScFv (Merrimack) и COMBODY (Epigen Biotech), нанотела с двойным нацеливанием (Ablynx), антитела с двойным нацеливанием только домена тяжелой цепи.
Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, по настоящему изобретению также могут быть сконструированы в мультиспецифические белки, которые содержат три полипептидных цепи. В таких конструкциях по меньшей мере один антигенсвязывающий домен находится в форме scFv. Иллюстративные конструкции включают приведенное ниже (при этом 1 указывает на первый антигенсвязывающий домен, 2 указывает на второй антигенсвязывающий домен, и 3 указывает на третий антигенсвязывающий домен).
Конструкция 1: цепь A) scFv1-CH2-CH3; цепь В) VL2-CL; цепь С) VH2-CH1-шарнир-СН2-CH3.
Конструкция 2: цепь А) scFv1-шарнир-CH2-CH3; цепь В) VL2-CL; цепь С) \Н2-СН1-шарнир-СН2CH3.
Конструкция 3: цепь A) scFv1-CH1-шарнир-CH2-CH3; цепь В) VL2-CL; цепь С) VH2-CH1-шарнирСН2-СНЗ.
Конструкция 4: цепь A) CH2-CH3-scFv1; цепь В) VL2-CL; цепь С) VH2-CH1-шарнир-СН2-CH3.
Конструирование CH3 может быть включено в конструкции 1-4, например, мутации L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V,
T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F,
Y407A/T366A_K409F или T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, как описано в US2012/0149876 или US2013/0195849 (Zymeworks).
Изотипы, аллотипы и конструирование Fc.
Константная область Ig или фрагмент константной области Ig, например Fc-область, присутствующие в белках по настоящему изобретению, могут быть любого аллотипа или изотипа.
В некоторых вариантах осуществления константная область Ig или фрагмент константной области Ig относятся к изотипу IgG1.
В некоторых вариантах осуществления константная область Ig или фрагмент константной области Ig относятся к изотипу IgG2.
В некоторых вариантах осуществления константная область Ig или фрагмент константной области Ig относятся к изотипу IgG3.
- 78 047663
В некоторых вариантах осуществления константная область Ig или фрагмент константной области Ig относятся к изотипу IgG4.
Константная область Ig или фрагмент константной области Ig могут быть любого аллотипа. Предполагается, что аллотип не влияет на свойства константной области Ig, такие как связывание или Fcопосредованные эффекторные функции. Иммуногенность терапевтических белков, содержащих константные области Ig или их фрагменты, связана с повышенным риском реакций на инфузию и уменьшением продолжительности терапевтического ответа (Baert et al., (2003) N Engl J Med 348:602-08). Степень, в которой терапевтические белки, содержащие константные области Ig или их фрагменты, индуцируют иммунный ответ у хозяина, может частично определяться аллотипом константной области Ig (Stickler et al., (2011) Genes and Immunity 12:213-21). Аллотип константной области Ig связан с вариациями аминокислотной последовательности в определенных местах последовательностей константной области антитела. В табл. 2 показаны выбранные аллотипы IgG1, IgG2 и IgG4.
Таблица 2
| Аллотип | Аминокислотный остаток в положении разнообразия (нумерация остатков: индекс EU) | |||||||
| IgG2 | IgG4 | IgGl | ||||||
| 189 | 282 | 309 | 422 | 214 | 356 | 358 | 431 | |
| G2m(n) | Т | М | ||||||
| G2m(n-) | Р | V | ||||||
| G2m(n)/(n | т | V | ||||||
| nG4m(a) | L | R | ||||||
| Glm(17) | К | Е | М | А | ||||
| Glm(17,l | К | D | L | А |
С-концевой лизин (CTL) может быть удален из константной области Ig с помощью эндогенных циркулирующих карбоксипептидаз в кровотоке (Cai et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108:404-412). В ходе изготовления удаление CTL можно контролировать до уровня ниже максимального путем регулирования концентрации внеклеточного Zn2+, EDTA или EDTA - Fe3+, как описано в публикации патентного документа США № US20140273092. Содержание CTL в белках можно измерять с использованием известных способов.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig, характеризуется содержанием С-концевого лизина от приблизительно 10% до приблизительно 90%. В некоторых вариантах осуществления содержание Сконцевого лизина составляет от приблизительно 20% до приблизительно 80%. В некоторых вариантах осуществления содержание С-концевого лизина составляет от приблизительно 40% до приблизительно 70%. В некоторых вариантах осуществления содержание С-концевого лизина составляет от приблизительно 55% до приблизительно 70%. В некоторых вариантах осуществления содержание С-концевого лизина составляет приблизительно 60%.
Мутации Fc-области могут быть внесены в антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, конъюгированные с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, чтобы модулировать их эффекторные функции, такие как ADCC, ADCP и/или ADCP и/или фармакокинетические свойства. Это может быть достигнуто путем введения мутации(ий) в Fc, которая(ые) модулируют связывание мутированного Fc с активирующими FcyR (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIII), ингибирующими FcyRIIb и/или с FcRn.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или фрагментом константной области Ig, содержит по меньшей мере одну мутацию в константной области Ig или во фрагменте константной области Ig.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация находится в Fc-области.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать мутаций в Fc-области.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, содержит по меньшей мере одну мутацию в Fc-области, которая модулирует связывание антитела с FcRn.
Положения Fc, которые могут быть подвергнуты мутации для модулирования периода полужизни (например, связывания с FcRn), включают положения 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434 и 435. Иллюстративными мутациями, которые могут быть выполнены по отдельности или в комбинации, являются мутации T250Q, M252Y, I253A, S254T, Т256Е, P257I, Т307А, D376V, Е380А, M428L, Н433К, N434S, N434A, N434H, N434F, Н435А и H435R. Иллюстративными одиночными или комбинированными мутациями, которые могут быть осуществлены для увеличения периода полужизни, являются мутации
- 79 047663
M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A и T307A/E380A/N434A. Иллюстративными одиночными или комбинированными мутациями, которые могут быть осуществлены для уменьшения периода полужизни, являются мутации Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H,
M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, содержит мутацию M252Y/S254T/T256E.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, содержит по меньшей мере одну мутацию в Fc-области, которая снижает связывание белка с активирующим Fcy рецептором (FcyR) и/или снижает эффекторные функции Fc, такие как связывание C1q, комплементзависимая цитотоксичность (CDC), антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) или фагоцитоз (ADCP).
Положения Fc, которые могут быть мутированы для снижения связывания белка с активирующим FcyR и последующего снижения эффекторной функции, включают положения 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331 и 365. Иллюстративными мутациями, которые могут быть выполнены по отдельности или в комбинации, являются мутации К214Т, Е233Р, L234V, L234A, делеция G236, V234A, F234A, L235A, G237A, Р238А, P238S, D265A, S267E, Н268А, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, Р329А, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S и P331S в IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Иллюстративными комбинированными мутациями, которые приводят к белкам с пониженной ADCC, являются мутации L234A/L235A в IgG1, L234A/L235A/D265S в IgG1, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S в IgG2, F234A/L235A в IgG4, S228P/F234A/L235A в IgG4, N297A во всех изотипах Ig, V234A/G237A в IgG2, К214Т/Е233РО34УО35Аделеция G236/A327G/P331A/D365E/L358M в IgG1, H268Q/V309L/A330S/P331S в IgG2, S267E/L328F в IgG1, L234F/L235E/D265A в IgG1, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S в IgG1, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S в IgG4 и S228Р/F234А/L235А/делеция G236/G237A/P238S в IgG4. Также могут быть использованы гибридные домены Fc IgG2/4, например Fc с остатками 117-260 из IgG2 и остатками 261-447 из IgG4.
Иллюстративной мутацией, приводящей к белкам с пониженной CDC, является мутация К322А.
Хорошо известная мутация S228P может быть осуществлена в IgG4 для повышения стабильности IgG4.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из К214Т, Е233Р, L234V, L234A, делеции G236, V234A, F234A, L235A, G237A, Р238А, P238S, D265A, S267E, Н268А, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, Р329А, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, K322, A330S и P331S.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, содержит мутацию L234A/L235A/D265S.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, содержит мутацию L234A/L235A.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, содержит по меньшей мере одну мутацию в Fc-области, которая усиливает связывание белка с Fcy рецептором (FcyR) и/или усиливает эффекторные функции Fc, такие как связывание C1q, комплементзависимая цитотоксичность (CDC), антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) или фагоцитоз (ADCP).
Положения Fc, которые могут быть подвергнуты мутации для усиления связывания белка с активирующим FcyR и/или усиления эффекторных функций Fc, включают положения 236, 239, 243, 256, 290, 292, 298, 300, 305, 312, 326, 330, 332, 333, 334, 345, 360, 339, 378, 396 или 430 (нумерация остатков согласно индексу EU). Иллюстративными мутациями, которые могут быть выполнены по отдельности или в комбинации, являются мутации G236A, S239D, F243L, Т256А, К290А, R292P, S298A, Y300L, V305L, К326А, A330K, I332E, Е333А, К334А, А339Т и P396L. Иллюстративными комбинированными мутациями, приводящими к белкам с усиленной ADCC или ADCP, являются S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и
G236A/S239D/I332E.
Положения Fc, которые могут быть подвергнуты мутации для усиления CDC, включают положения 267, 268, 324, 326, 333, 345 и 430. Иллюстративными мутациями, которые могут быть выполнены по отдельности или в комбинации, являются S267E, F1268F, S324T, К326А, K326W, Е333А, Е345К, E345Q, E345R, E345Y, E430S, E430F и Е430Т. Иллюстративными комбинированными мутациями, приводящими
- 80 047663 к белкам с усиленной CDC являются К326А/Е333А, K326W/E333A, H268F/S324T, S267E/H268F, S267E/S324T и S267E/H268F/S324T.
Специфическими мутациями, описанными в данном документе, являются мутации по сравнению с аминокислотными последовательностями IgG1, IgG2 и IgG4 дикого типа под SEQ ID NO: 222, 223 и 224 соответственно.
SEQ Ш NO: 222, IgGl дикого типа
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP АР ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ Ш NO: 223; IgG2 дикого типа
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
S SGLYSLS S VVTVPS SNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCP АРР VA GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ Ш NO: 224; IgG4 дикого типа
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ S SGLYSLS SVVTVP S S SLGTKT YTCNVDHKP SNTKVDKRVESK YGPPCP SCP APEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Связывание антитела с FcyR или FcRn может быть оценено на клетках, сконструированных для экспрессии каждого рецептора, с использованием проточной цитометрии. В иллюстративном анализе связывания высевают 2х105 клеток на лунку в 96-луночный планшет и блокируют в буфере для окрашивания BSA (BD Biosciences, Сан-Хосе, США) в течение 30 мин при 4°C. Клетки инкубируют с тестируемым антителом на льду в течение 1,5 ч при 4°C. После двукратного промывания буфером для окрашивания BSA клетки инкубируют с R-PE меченым вторичным антителом к человеческому IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories) в течение 45 мин при 4°C. Клетки дважды промывают в буфере для окрашивания, а затем повторно суспендируют в 150 мкл буфера для окрашивания, содержащего разбавленный 1:200 краситель для выявления присутствия живых/мертвых клеток DRAQ7 (Cell Signaling Technology, Данверс, США). Сигналы РЕ и DRAQ7 окрашенных клеток выявляют на проточном цитометре Miltenyi MACSQuant (Miltenyi Biotec, Оберн, США) с использованием каналов В2 и В4, соответственно. Живые клетки гейтируют по исключению DRAQ7, и среднее геометрическое сигналов флуоресценции определяют по меньшей мере для 10000 собранных живых событий. Для анализа используют программное обеспечение FlowJo (Tree Star). Данные наносят на график в виде логарифма концентрации антитела в зависимости от среднего сигналов флуоресценции. Выполняют нелинейный регрессионный анализ.
Г ликоинженерия.
Способность антигенсвязывающего домена, который связывает CD33, конъюгированного с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, опосредовать ADCC может быть усилена путем конструирования олигосахаридного компонента константной области Ig или фрагмента константной области Ig. Человеческие IgG1 или IgG3 N-гликозилируют по Asn297 с большинством гликанов в хорошо известных биантенарных формах G0, G0F, G1, G1F, G2 или G2F. Содержащие константную область Ig белки могут быть получены с помощью неподвергнутых инженерии клеток СНО, которые, как правило, характеризуются содержанием фукозы гликанов по меньшей мере 85%. Удаление коровой фукозы из биантеннарных олигосахаридов комплексного типа, присоединенных к антигенсвязывающему домену, который связывает CD33, конъюгированному с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, повышает ADCC белка за счет улучшения связывания FcyRIIIa без изменения степени связывания антигена или активности CDC.
Такие белки могут быть получены с использованием различных способов, которые, как сообщается,
- 81 047663 приводят к успешной экспрессии относительно высокодефукозилированных иммуноглобулинов, несущих биантеннарный комплекс типа Fc-олигосахаридов, как, например, контроль осмоляльности культуры (Konno et al., Cytotechnology 64(:249-65, 2012), применение варианта линии Lec13 CHO в качестве линии клеток-хозяев (Shields et al., J Biol Chem 277: 26733-26740, 2002), применение варианта линии ЕВ66 CHO в качестве линии клеток-хозяев (Olivier et al., MAbs;2(4): 405-415, 2010; PMID:20562582), применение линии клеток гибридомы YB2/0 крысы в качестве линии клеток-хозяев (Shinkawa et al., J Biol Chem 278: 3466-3473, 2003), введение малой интерферирующей РНК, специфически направленной против гена а-1,6-фукозилтрасферазы (FUT8) (Mori et al., Biotechnol Bioeng 88:901-908, 2004), или коэкспрессия в-1,4-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазы III и α-маннозидазы II Гольджи или эффективного ингибитора альфа-маннозидазы I кифунензина (Ferrara et al., J Biol Chem 281:5032-5036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008).
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig по настоящему изобретению, имеет биантеннарную структуру гликана с содержанием фукозы от приблизительно 1% до приблизительно 15%, например приблизительно 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, имеет структуру гликана с содержанием фукозы приблизительно 50%, 40%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, или 20%.
Термин содержание фукозы означает количество моносахарида фукозы в сахарной цепи по Asn297. Относительное количество фукозы представляет собой процентную долю фукозосодержащих структур по отношению ко всем гликоструктурам. Они могут быть охарактеризованы и количественно определены несколькими способами, например 1) с помощью MALDI-TOF образца, обработанного Nгликозидазой F (например, комплексные, гибридные и олиго- и высокоманнозные структуры), как описано в международной публикации патентной заявки № WO2008/077546 2); 2) путем ферментативного высвобождения гликанов Asn297 с последующей дериватизацией и выявлением/количественным определением с помощью HPLC (UPLC) с выявлением флуоресценции и/или HPLC-MS (UPLC-MS); 3) анализом интактного белка нативного или восстановленного mAb с обработкой или без обработки гликанов Asn297 с помощью Endo S или другого фермента, который расщепляет между первым и вторым моносахаридом GlcNAc, оставляя фукозу, присоединенную к первому GlcNAc; 4) расщеплением mAb до составных пептидов с помощью ферментативного расщепления (например, трипсином или эндопептидазой Lys-C) и последующим разделением, выявлением и количественным определением с помощью HPLCMS (UPLC-MS); 5) отделением олигосахаридов mAb от белка mAb путем специфического ферментативного дегликозилирования с помощью PNGase F по Asn 297. Высвобожденные таким образом олигосахариды могут быть мечены флуорофором, разделены и идентифицированы с помощью различных дополнительных методик, которые позволяют тонкую характеристику гликановых структур с помощью массспектрометрии с лазерной десорбцией-ионизацией в присутствии матрицы (MALDI) путем сравнения экспериментальных масс с теоретическими массами, определения степени сиалилирования путем ионообменной HPLC (GlycoSep С), разделения и количественного определения форм олигосахаридов в соответствии с критериями гидрофильности с помощью нормально-фазовой HPLC (GlycoSep N), а также разделения и количественного определения олигосахаридов с помощью высокоэффективного капиллярного электрофореза-лазерной индуцированной флуоресценции (HPCE-LIF).
Используемый в данном документе термин низкая фукоза или низкое содержание фукозы относится к антигенсвязывающему домену, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, с содержанием фукозы от приблизительно 1% до 15%.
Используемый в данном документе термин нормальная фукоза или нормальное содержание фукозы относится к антигенсвязывающему домену, который связывает CD33, конъюгированный с константной областью Ig или с фрагментом константной области Ig, с содержанием фукозы более приблизительно 50%, как правило, более приблизительно 80% или более 85%.
Антиидиотипические антитела.
Антиидиотипические антитела представляют собой антитела, которые специфически связываются с антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также относится к антиидиотипическому антителу, которое специфически связывается с антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также относится к антиидиотипическому антителу, которое специфически связывается с антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, содержащему
V H под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
V H под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
V H под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
- 82 047663
V H под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
V H под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
V H под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
V H под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
V H под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
V H под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
V H под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
V H под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
V H под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
V H под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
V H под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
V H под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200;
V H под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202;
VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело специфически связывается с антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, содержащим VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления антиидиотипическое антитело специфически связывается с антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, содержащим VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления антиидиотипическое антитело специфически связывается с антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, содержащим VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления антиидиотипическое антитело специфически связывается с антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, содержащим VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления антиидиотипическое антитело специфически связывается с антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, содержащим VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления антиидиотипическое антитело специфически связывается с антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, содержащим VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
Антиидиотипическое (Id) антитело представляет собой антитело, которое распознает антигенные детерминанты (например, паратоп или CDR) антитела. Id антитело может быть антигенблокирующим или неблокирующим. Антигенблокирующее Id может быть использовано для выявления свободного антигенсвязывающего домена в образце (например, антигенсвязывающего домена, который связывает CD33, по настоящему изобретению). Неблокирующее Id может быть использовано для обнаружения общего антитела (свободного, частично связанного с антигеном или полностью связанного с антигеном) в образце. Id антитело может быть получено путем иммунизации животного антителом, к которому получают Id антитело.
Антитело к Id антителу также может быть использовано в качестве иммуногена для индуцирования иммунного ответа у другого животного с получением так называемого антитела к антителу к Id антителу. Антитело к антителу к Id может быть эпитопически идентичным оригинальному антигенсвязывающему домену, который индуцировал антитело к Id. Таким образом, используя антитела к идиотипическим детерминантам антигенсвязывающего домена, можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антигенсвязывающие домены с идентичной специфичностью. Антитела к Id можно варьировать (таким образом, получая варианты антител к Id) и/или дериватизировать с помощью любой подходящей методики, как, например, описанная в данном документе.
Иммуноконъюгаты.
Антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, по настоящему изобретению, белки, содержащие антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, или мультиспецифические белки, которые содержат антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33 (совместно называемые в данном документе связывающими CD33 белками), могут быть конъюгированы с гетерологичной молекулой. Связывающий CD33 белок также включает химерные антигенные рецепторы (CAR), которые содержат антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления гетерологичная молекула представляет собой выявляемую метку или цитотоксическое средство.
Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающему домену, который связывает CD33, конъюгированному с выявляемой меткой.
Настоящее изобретение также относится к белку, содержащему антигенсвязывающий домен, кото
- 83 047663 рый связывает CD33, конъюгированный с выявляемой меткой.
Настоящее изобретение также относится к мультиспецифическому белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с выявляемой меткой.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с выявляемой меткой.
Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающему домену, который связывает CD33, конъюгированному с цитотоксическим средством.
Настоящее изобретение также относится к белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с цитотоксическим средством.
Настоящее изобретение также относится к мультиспецифическому белку, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с цитотоксическим средством.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с цитотоксическим средством.
Связывающие CD33 белки по настоящему изобретению могут быть использованы для направления терапевтических средств на экспрессирующие CD33 клетки, такие как клетки миелоидной линии. В качестве альтернативы, экспрессирующие CD33 клетки могут быть нацелены на связывающий CD33 белок по настоящему изобретению, соединенный с терапевтическим средством, предназначенным для модификации функции клетки после интернализации.
В некоторых вариантах осуществления выявляемая метка также представляет собой цитотоксическое средство.
Связывающие CD33 белки по настоящему изобретению, конъюгированные с выявляемой меткой, могут быть использованы для оценки экспрессии CD33 в различных образцах.
Выявляемая метка включает композиции, которые при конъюгировании со связывающими CD33 белками по настоящему изобретению делают последние выявляемыми с помощью спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических или химических средств.
Иллюстративные выявляемые метки включают радиоактивные изотопы, магнитные гранулы, металлические гранулы, коллоидные частицы, флуоресцентные красители, электронно-плотные реагенты, ферменты (например, обычно используемые в ELISA), биотин, дигоксигенин, гаптены, люминесцентные молекулы, хемилюминесцентные молекулы, флуорохромы, флуорофоры, гасители флуоресценции, цветные молекулы, радиоактивные изотопы, сцинтилляты, авидин, стрептавидин, белок А, белок G, антитела или их фрагменты, полигистидин, Ni2+, метки Flag, метки myc, тяжелые металлы, ферменты, щелочную фосфатазу, пероксидазу, люциферазу, доноры/акцепторы электронов, сложные эфиры акридиния и колориметрические субстраты.
Можно применять любую из меток, раскрытых в международной патентной публикации № WO2019/125982, включенной в данный документ посредством ссылки.
Выявляемая метка может испускать сигнал спонтанно, как, например, когда выявляемая метка представляет собой радиоактивный изотоп. В других случаях выявляемая метка испускает сигнал в результате стимуляции внешним полем.
Иллюстративные радиоактивные изотопы могут быть γ-излучающими, оже-излучающими, βизлучающими, альфа-излучающими или позитрон-излучающими радиоактивными изотопами. Иллюстративные радиоактивные изотопы включают 3Н, 11C, 13C, 15N, 18F, 19F, 55Co, 57Co, 60Co, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 72As, 75Br, 86Y, 89Zr, 90Sr, 94mTc, 99mTc, 115In, 123I, 124I, 125I, 131I, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 226Ra, 225Ac и 227Ас.
В некоторых вариантах осуществления радиоактивный изотоп используют в терапевтических целях, например для усиления гибели клеток. Радиоактивные изотопы, используемые для усиления гибели клеток, включают без ограничения 32Р, 47Sc, 67Cu, 77As, 89Sr, 90Y, 99Тс, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 131I, 153Sm, 159Gd, 165Dy, 166Ho, 169Er, 186Re, 188Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 255Fm и 227Th. Без ограничения конкретной теорией считается, что связывающие CD33 белки, содержащие радиоизотоп, используемый в терапевтических целях, могут быть интернализованы клеткой-мишенью и уничтожены клеткоймишенью.
Радиоиммунотерапия с использованием связывающего CD33 белка, конъюгированного с радиоактивным изотопом, может быть полезной для лечения локальных или диффузных опухолей. В некоторых вариантах осуществления субъект получает лечение путем введения радиомеченых моноклональных антител, направленных специфически против опухоль-ассоциированных антигенов или против микроокружения опухоли. Радиомеченная (например, Ас225) терапия может быть высокоэффективной, требуя низких доз для уничтожения клеток, как, например, в контексте лечения гематологических злокачественных опухолей с клетками, экспрессирующими CD33.
В некоторых вариантах осуществления радиоактивный изотоп используют для усиления визуализации, как, например, для тестирования, чтобы показать, нацелен ли связывающий CD33 белок на представляющие интерес ткани. Иллюстративные изотопы, используемые для улучшения визуализации включают, без ограничения 62Cu, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr и 111In.
Иллюстративные атомы металлов представляют собой металлы с атомным номером более 20, такие
- 84 047663 как атомы кальция, атомы скандия, атомы титана, атомы ванадия, атомы хрома, атомы марганца, атомы железа, атомы кобальта, атомы никеля, атомы меди, атомы цинка, атомы галлия, атомы германия, атомы мышьяка, атомы селена, атомы брома, атомы криптона, атомы рубидия, атомы стронция, атомы иттрия, атомы циркония, атомы ниобия, атомы молибдена, атомы технеция, атомы рутения, атомы родия, атомы палладия, атомы серебра, атомы кадмия, атомы индия, атомы олова, атомы сурьмы, атомы теллура, атомы йода, атомы ксенона, атомы цезия, атомы бария, атомы лантана, атомы гафния, атомы тантала, атомы вольфрама, атомы рения, атомы осмия, атомы иридия, атомы платины, атомы золота, атомы ртути, атомы таллия, атомы свинца, атомы висмута, атомы франция, атомы радия, атомы актиния, атомы церия, атомы празеодима, атомы неодима, атомы прометия, атомы самария, атомы европия, атомы гадолиния, атомы тербия, атомы диспрозия, атомы гольмия, атомы эрбия, атомы тулия, атомы иттербия, атомы лютеция, атомы тория, атомы протактиния, атомы урана, атомы нептуния, атомы плутония, атомы америция, атомы кюрия, атомы беркелия, атомы калифорния, атомы эйнштейния, атомы фермия, атомы менделевия, атомы нобелия или атомы лоуренция.
В некоторых вариантах осуществления атомы металла могут быть щелочноземельными металлами с атомным номером более двадцати.
В некоторых вариантах осуществления атомы металла могут быть лантаноидами.
В некоторых вариантах осуществления атомы металла могут быть актинидами.
В некоторых вариантах осуществления атомы металла могут быть переходными металлами.
В некоторых вариантах осуществления атомы металла могут быть легкими металлами.
В некоторых вариантах осуществления атомы металла могут быть атомами золота, атомами висмута, атомами тантала и атомами гадолиния.
В некоторых вариантах осуществления атомы металла могут быть металлами с атомным номером от 53 (т.е. йод) до 83 (т.е. висмут).
В некоторых вариантах осуществления атомы металла могут быть атомами, подходящими для магнитно-резонансной визуализации.
Атомы металла могут быть ионами металла в форме +1, +2 или +3 состояния окисления, такими как Ва2+, Bi3+, Cs+, Ca2+, Cr2+, Cr3+, Cr6+, Co2+, Co3+, Cu+, Cu2+, Cu3+, Ga3+, Gd3+, Au+, Au3+, Fe2+, Fe3+, F3+, Pb2+, Mn2+, Mn3+, Mn4+, Mn7+, Hg2+, Ni2+, Ni3+, Ag+, Sr2+, Sn2+, Sn4+ и Zn2+. Атомы металла могут входить в состав оксида металла, такого как оксид железа, оксид марганца или оксид гадолиния.
Подходящие красители включают любые коммерчески доступные красители, такие как, например, 5(6)-карбоксифлуоресцеин, малеимид IRDye 680RD или IRDye 800CW, рутений-полипиридиловые красители и т.п.
Подходящими флуорофорами являются изотиоцианат флуоресцеина (FITC), тиосемикарбазид флуоресцеина, родамин, техасский красный, CyDyes (например, Су3, Су5, Су5.5), Alexa Fluors (например, Alexa488, Alexa555, Alexa594; Alexa647), флуоресцентные красители ближнего инфракрасного диапазона (NIR) (700-900 нм), а также карбоцианиновые и аминостириловые красители.
Антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с выявляемой меткой, может быть использован в качестве визуализирующего средства.
Белок, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с выявляемой меткой, может быть использован в качестве визуализирующего средства.
Мультиспецифический белок, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с выявляемой меткой, может быть использован в качестве визуализирующего средства.
CAR, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгированный с выявляемой меткой, может быть использован в качестве визуализирующего средства.
В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство, лекарственное средство, ингибирующее рост средство, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат).
В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое средство представляет собой дауномицин, доксорубицин, метотрексат, виндезин, бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, рицин, гелданамицин, майтансиноиды или калихеамицин. Цитотоксическое средство может вызывать цитотоксические и цитостатические действия посредством механизмов, включающих связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы.
В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое средство представляет собой ферментативно активный токсин, такой как дифтерийная цепь А, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модецина, альфа-сарцин, белки Aleuritesfordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены.
В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое средство представляет собой радионуклид, такой как Bi, 1311,131In, 90Y и 186Re.
В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое средство представляет собой доластатин
- 85 047663 или пептидные аналоги и производные долостатина, ауристатин или монометил фенилаланин ауристатина. Иллюстративные молекулы раскрыты в патентах США №№ 5635483 и 5780588. Было показано, что доластатины и ауристатины вмешиваются в динамику микротрубочек, гидролиз GTP и ядерное и клеточное деление (Woyke et al. (2001) Antimicrob Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) и обладают противораковой и противогрибковой активностью. Лекарственный фрагмент доластатин или ауристатин может быть присоединен к антителу по настоящему изобретению через Мамино)-конец или С (карбоксильный) конец пептидного лекарственного фрагмента (WO02/088172) или через любой цистеин, встроенный в антитело.
Связывающие CD33 белки по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с выявляемой меткой с помощью известных способов.
В некоторых вариантах осуществления выявляемая метка образует комплекс с хелатирующим средством.
В некоторых вариантах осуществления выявляемая метка конъюгирована со связывающими CD33 белками по настоящему изобретению через линкер.
Выявляемая метка или цитотоксический фрагмент могут быть связаны непосредственно или опосредованно со связывающими CD33 белками по настоящему изобретению с помощью известных способов. Подходящие линкеры известны в уровне техники и включают, например, простетические группы, нефенольные линкеры (производные N-сукцимидилбензоатов; додекаборат), хелатирующие фрагменты как макроциклических, так и ациклических хелаторов, такие как производные 1,4,7,10тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA), производные диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), производные S-2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7-триазациклононан-1,4,7триуксусной кислоты (NOTA) и производные 1,4,8,11-тетраазациклодоцедан-1,4,8,11-тетрауксусной кислоты (ТЕТА), И-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)-пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (например, диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), бис-диазониевые производные (такие как бис-(пдиазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат), бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол) и другие хелатирующие фрагменты. Подходящие пептидные линкеры хорошо известны.
В некоторых вариантах осуществления связывающие CD33 белки по настоящему изобретению удаляются из крови через почечный клиренс.
Наборы.
Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему любой из антигенсвязывающих доменов, которые связывают CD33, описанных в данном документе.
Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему белок, содержащий любой из антигенсвязывающих доменов, которые связывают CD33, описанных в данном документе.
Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему любой из мультиспецифических белков, описанных в данном документе, которые содержат антигенсвязывающий домен, который связывает CD33.
Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему CAR, содержащий любой из антигенсвязывающих доменов, описанных в данном документе, которые связывают CD33.
Набор может быть использован для терапевтических применений и в качестве диагностических наборов.
Набор может быть использован для обнаружения присутствия CD33 в образце.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит связывающий CD33 белок по настоящему изобретению и реагенты для выявления связывающего CD33 белка. Набор может включать один или несколько других элементов, в том числе инструкции по применению; другие реагенты, например метку, терапевтическое средство или средство, применимое для хелатирования или иного присоединения антитела к метке или терапевтическому средству, или радиозащитную композицию; устройства или другие материалы для получения антитела для введения; фармацевтически приемлемые носители и устройства или другие материалы для введения субъекту.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, в контейнере и инструкции по применению набора.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит белок, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, в контейнере и инструкции по применению набора.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит мультиспецифический белок, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, в контейнере и инструкции по применению набора.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, в наборе меченый.
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, в наборе меченый.
В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок, содержащий антигенсвязы
- 86 047663 вающий домен, который связывает CD33, в наборе меченый.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен (например, scFv), который связывает CD33, содержащий
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен (например, scFv), который связывает CD33, содержащий VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен (например, scFv), который связывает CD33, содержащий VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен (например, scFv), который связывает CD33, содержащий VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен (например, scFv), который связывает CD33, содержащий VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен (например, scFv), который связывает CD33, содержащий VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен (например, scFv), который связывает CD33, содержащий VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий
a) VH под SEQ ID NO: 18;
b) VH под SEQ ID NO: 19;
с) VH под SEQ ID NO: 20;
d) VH под SEQ ID NO: 21;
е) VH под SEQ ID NO: 22;
f) VH под SEQ ID NO: 23;
g) VH под SEQ ID NO: 24;
h) VH под SEQ ID NO: 25; или
i) VH под SEQ ID NO: 26; или
j) VH под SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27. В некоторых вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263 или 264. В некоторых вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272 или 273. В некоторых вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96. В некоторых вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216,
- 87 047663
217, 218, 219, 220 221, 274, 275 или 276.
В определенных вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 213.
В других вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 216.
В других вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 219.
В других вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 274.
В других вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 275.
В других вариантах осуществления набор содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержащий SEQ ID NO: 276.
Способы выявления CD33.
Настоящее изобретение также относится к способу выявления CD33 в образце, включающему получение образца, приведение образца в контакт с антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, по настоящему изобретению и выявление связанного CD33 в образце.
В некоторых вариантах осуществления образец может быть получен из мочи, крови, сыворотки крови, плазмы, слюны, асцитов, циркулирующих клеток, синовиальной жидкости, циркулирующих клеток, клеток, которые не связаны с тканями (т.е. свободных клеток), тканей (например, хирургически резецированной ткани, биоптатов, включая тонкоигольную аспирацию), гистологических препаратов и т.п.
Антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению может быть обнаружен с помощью известных способов. Иллюстративные способы включают прямое мечение антител с использованием флуоресцентных или хемилюминесцентных меток или радиометок или присоединение к антителам по настоящему изобретению легко выявляемых фрагментов, таких как биотин, ферменты или эпитопные метки. Иллюстративными метками и фрагментами являются рутений, 111In-DOTA, ^Ш-диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и бетагалактозидаза, полигистидин (метка HIS), акридиновые красители, цианиновые красители, флуороновые красители, оксазиновые красители, фенантридиновые красители, родаминовые красители и красители Alexafluor®.
Антитела могут быть непосредственно мечены любыми из радиометок и радиоактивных средств, раскрытых в международной патентной публикации № WO2019/125982, включенной в данный документ посредством ссылки.
Антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению может быть использован в различных анализах для выявления CD33 в образце. Иллюстративными анализами являются вестерн-блот анализ, радиоиммуноанализ, поверхностный плазмонный резонанс, иммунопреципитация, равновесный диализ, иммунодиффузия, иммунохимический анализ с электрохемилюминесценцией (ECL), иммуногистохимия, сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS) или анализ ELISA. Химерные антигенные рецепторы (CAR), содержащие антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, по настоящему изобретению.
Любой из антигенсвязывающих доменов, которые связывают CD33, идентифицированных в данном документе, могут быть сконструированы в химерный антигенный рецептор (CAR) для получения CAR, которые связывают CD33. Настоящее изобретение относится к CAR, которые нацеливаются на CD33, к клеткам, содержащим такие CAR, и к способам лечения рака с продуцированием CD33, такого как гематологический рак, с использованием CAR, описанных в данном документе.
CAR по настоящему изобретению обладают антигенной специфичностью в отношении CD33. Фразы обладают антигенной специфичностью и вызывают антиген-специфический ответ, используемые в данном документе, означают, что CAR может специфически связываться с антигеном и иммунологически распознавать его, так что связывание CAR с антигеном CD33 вызывает иммунный ответ. Способы тестирования CAR в отношении антигенной специфичности и способности распознавать клетки-мишени известны в уровне техники.
Настоящее изобретение относится к применению Т-клеток, которые были генетически модифицированы для стабильной экспрессии необходимого химерного антигенного рецептора. Химерный антигенный рецептор (CAR) представляет собой искусственно сконструированный гетерологичный белок или полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен антитела (например, scFv), соединенный с доменом передачи сигнала Т-клетки. Характеристики CAR включают их способность перенаправлять специфичность и реактивность Т-клеток на выбранную мишень без ограничения по МНС с использованием антигенсвязывающих свойств моноклональных антител. Распознавание антигена без ограничения по МНС дает Т-клеткам, экспрессирующим CAR, способность распознавать антигены независимо от обработки антигена, тем самым обходя основной механизм уклонения опухоли от иммунологического ответа. Более того, когда CAR экспрессируются в Т-клетках, CAR предпочтительно не димеризуются с эндогенными альфа- и бета-цепями Т-клеточных рецепторов (TCR).
- 88 047663
CAR, описанные в данном документе, представляют собой рекомбинантные полипептидные конструкции, включающие по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала (также упоминаемый в данном документе как цитоплазматический домен передачи сигнала), содержащий функциональный домен передачи сигнала, полученный из стимуляторной молекулы, как описано в данном документе. Т-клетки, экспрессирующие CAR, в данном документе называют Т-клетками с CAR, CAR-T-клетками или CAR-модифицированными Тклетками, и эти термины используют в данном документе взаимозаменяемо. Клетка может быть генетически модифицирована для стабильной экспрессии антителосвязывающего домена на своей поверхности, что придает новую антигенную специфичность, не зависящую от МНС.
В некоторых случаях Т-клетка генетически модифицирована для стабильной экспрессии CAR, который объединяет антигенраспознающий домен антитела с внутриклеточным доменом дзета-цепи CD3 или белка FcyRI в единый химерный белок. В одном варианте осуществления стимуляторная молекула представляет собой дзета-цепь, связанную с комплексом Т-клеточного рецептора.
Термин домен внутриклеточной передачи сигнала относится к внутриклеточной части молекулы. Это функциональная часть белка, которая действует путем передачи информации внутри клетки для регулирования клеточной активности через определенные пути передачи сигнала путем генерирования вторых мессенджеров или функционирования в качестве эффекторов, отвечая на такие мессенджеры. Домен внутриклеточной передачи сигнала генерирует сигнал, который обеспечивает иммунную эффекторную функцию CAR-содержащей клетки, например CAR-T-клетки. Примеры иммунной эффекторной функции, например, в CAR-T-клетке, включают цитолитическую активность и хелперную активность, включая секрецию цитокинов.
В одном варианте осуществления домен внутриклеточной передачи сигнала содержит первичный домен внутриклеточной передачи сигнала. Иллюстративные первичные домены внутриклеточной передачи сигнала включают домены, полученные из молекул, ответственных за первичную стимуляцию или антигензависимую стимуляцию. В одном варианте осуществления домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный внутриклеточный домен. Иллюстративные костимуляторные домены внутриклеточной передачи сигнала включают домены, полученные от молекул, ответственных за костимуляторные сигналы или антигеннезависимую стимуляцию. Например, в случае CAR-T первичный домен внутриклеточной передачи сигнала содержит цитоплазматическую последовательность рецептора Т-клеток, а костимуляторный домен внутриклеточной передачи сигнала содержит цитоплазматическую последовательность из корецептора или костимуляторной молекулы.
Первичный домен внутриклеточной передачи сигнала содержит мотив передачи сигнала, который известен как активирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина или ITAM. Иллюстративные ITAM, содержащие первичные цитоплазматические последовательности передачи сигнала, включают те, которые получены из CD3-дзета, FcRy, FcR бета, CD3y, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, DAP10 и DAP12.
Термин дзета или альтернативно дзета-цепь, CD3-дзета или TCR-дзета определяют как белок, представленный в GenBank под № доступа BAG36664.1, или эквивалентные остатки от отличного от человека вида, например мыши, кролика, примата, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т.п., а стимуляторный домен дзета или альтернативно стимуляторный домен CD3-дзета или стимуляторный домен TCR-дзета определяют как аминокислотные остатки из цитоплазматического домена дзета-цепи, которых достаточно для функциональной передачи начального сигнала, необходимого для активации Т-клетки. В одном аспекте цитоплазматический домен дзета включает остатки с 52 по 164 в GenBank под № доступа BAG36664.1 или эквивалентные остатки от отличного от человека вида, например мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т.п., которые являются их функциональными ортологами. В одном аспекте дзета-стимуляторный домен или CD3-дзета-стимуляторный домен представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 28, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 164.
SEQ Ш NO: 164, CD3-дзета стимуляторный домен
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ
EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP
PR
Термин костимуляторная молекула относится к когнатному партнеру по связыванию на Т-клетке, который специфически связывается с костимуляторным лигандом, тем самым опосредуя костимуляторный ответ Т-клетки, такой как без ограничения пролиферация. Костимуляторные молекулы представляют собой молекулы клеточной поверхности, отличные от антигенных рецепторов или их лигандов, которые необходимы для эффективного иммунного ответа. Костимуляторные молекулы включают без огра
- 89 047663 ничения молекулу МНС класса 1, BTLA и лигандный Toll рецептор, а также ОХ40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) и 4-1BB (CD137).
Костимуляторный домен внутриклеточной передачи сигнала может быть внутриклеточной частью костимуляторной молекулы. Костимуляторная молекула может быть представлена в следующих семействах белков: белки рецепторов TNF, иммуноглобулиноподобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM) и активирующие рецепторы NK-клеток. Иллюстративные такие молекулы включают CD27, CD28, 4-1ВВ (CD137), ОХ40, GITR, CD30, MyD88, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, лимфоцитарный функционально-ассоциированный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, В7-Н3, лиганд, специфически связывающийся с CD83, и т.п.
Домен внутриклеточной передачи сигнала может включать всю внутриклеточную часть или весь нативный домен внутриклеточной передачи сигнала молекулы, из которой он получен, или его функциональный фрагмент.
Термин 4-1ВВ или альтернативно CD137 относится к представителю суперсемейства TNFR с аминокислотной последовательностью, представленной в GenBank под номером доступа ААА62478.2, или эквивалентные остатки из отличного от человека вида, например мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т.п.; и костимуляторный домен 4-1ВВ определяют как аминокислотные остатки 214-255 из GenBank под номером доступа ААА62478.2 или эквивалентные остатки из отличного от человека вида, например мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т.п. В одном аспекте костимуляторный домен 4-1ВВ или костимуляторный домен CD137 представляет собой последовательность, представленную под
SEQ ID NO: 163 (KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL; SEQ ID NO: 163), или эквивалентные остатки из отличного от человека вида, например мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т.п., или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 163.
В одном варианте осуществления используют трансмембранный домен, который естественным образом связан с одним из других доменов в CAR. В другом варианте осуществления трансмембранный домен может быть выбран или модифицирован путем аминокислотной замены, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами одного и того же или разных поверхностных мембранных белков для минимизации взаимодействий с другими представителями рецепторного комплекса. В одном варианте осуществления трансмембранный домен содержит шарнирный домен CD8a.
В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический домен передачи сигнала дополнительно содержит один или несколько функциональных доменов передачи сигнала, полученных от по меньшей мере одной костимуляторной молекулы, которая определена в данном документе. В одном варианте осуществления костимуляторная молекула выбрана из 4-1ВВ (т.е. CD137), CD27, CD3-дзета и/или CD28. CD28 является маркером Т-клеток, важным для костимуляции Т-клеток. CD27 является представителем суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли и действует как костимуляторная молекула иммунной контрольной точки. 4-1ВВ передает мощный костимуляторный сигнал Т-клеткам, способствуя дифференцировке и повышая долгосрочное выживание Т-лимфоцитов. CD3-дзетa связывается с TCR для получения сигнала и содержит активирующие мотивы иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). В другом варианте осуществления костимуляторной молекулой является MyD88 или CD40.
В одном варианте осуществления CAR содержит внутриклеточный шарнирный домен, содержащий CD8, и домен внутриклеточной передачи сигнала рецептора Т-клеток, содержащий CD28, 4-1ВВ и CD3дзета. В другом варианте осуществления CAR содержит внутриклеточный шарнирный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала рецептора Т-клеток, содержащий CD28, 4-1ВВ и CD3-дзета, где шарнирный домен содержит всю внеклеточную область CD8, CD4 или CD28 или ее часть; всю константную область антитела или ее часть; весь рецептор FcyRIIIA, шарнир IgG, шарнир IgM, шарнир IgA, шарнир IgD, шарнир IgE или шарнир Ig или их часть. Шарнир IgG может быть из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1, IgA2, IgD, IgE или их химеры.
CAR, описанные в данном документе, представляют собой рекомбинантные полипептидные конструкции, содержащие по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала (также упоминаемый в данном документе как цитоплазматический домен передачи сигнала), содержащий, например, функциональный домен передачи сигнала, полученный из стимуляторной молекулы, которая определена ниже.
В одном варианте осуществления CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, включающий функциональный домен передачи сигнала, полученный из стимуляторной молекулы. В одном варианте осуществления CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, со
- 90 047663 держащий функциональный домен передачи сигнала, полученный из костимуляторной молекулы, и функциональный домен передачи сигнала, полученный из стимуляторной молекулы. В одном варианте осуществления CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, содержащий по меньшей мере два функциональных домена передачи сигнала, полученных из одной или нескольких костимуляторных молекул, и функциональный домен передачи сигнала, полученный из стимуляторной молекулы.
CAR по настоящему изобретению могут быть сконструированы с содержанием домена передачи сигнала CD28 и/или 4-1ВВ сами по себе или могут быть объединены с любым другим необходимым(и) цитоплазматическим(и) доменом(ами), применимым(и) в контексте CAR по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления цитоплазматический домен CAR может дополнительно включать домен передачи сигнала CD3-дзета. Например, цитоплазматический домен CAR может включать без ограничения модули передачи сигнала CD3-дзета, 4-1ВВ и CD28 и их комбинации. Соответственно, настоящее изобретение относится к Т-клеткам с CAR и способам их применения для адоптивной терапии.
Далее в настоящем изобретении представлены варианты, например, функциональные варианты CAR. Используемый в данном документе термин функциональный вариант относится к CAR, имеющему существенную или значительную идентичность последовательности или сходство с исходным CAR, функциональный вариант которого сохраняет биологическую активность CAR, в отношении которого он является вариантом. Функциональные варианты охватывают, например, те варианты CAR, которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени в подобной степени, в такой же степени или в большей степени, чем исходный CAR. По отношению к исходному CAR функциональный вариант может, например, быть на по меньшей мере приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более идентичным по аминокислотной последовательности исходному CAR.
Функциональный вариант может, например, включать аминокислотную последовательность исходного CAR с по меньшей мере одной консервативной аминокислотной заменой. В одном варианте осуществления функциональный вариант включает аминокислотную последовательность исходного CAR с по меньшей мере одной неконсервативной аминокислотной заменой. В этом случае неконсервативная аминокислотная замена может не взаимодействовать или ингибировать биологическую активность функционального варианта. Неконсервативная аминокислотная замена может усиливать биологическую активность функционального варианта таким образом, что биологическая активность функционального варианта повышается по сравнению с исходным CAR.
Консервативные аминокислотные замены известны в уровне техники и описаны в данном документе.
CAR по настоящему изобретению может состоять по сути из указанной аминокислотной последовательности или последовательностей, описанных в данном документе, так что другие компоненты, например другие аминокислоты, существенно не изменяют биологическую активность функционального варианта.
CAR по настоящему изобретению (включая функциональные части и функциональные варианты) могут быть любой длины, т.е. могут включать любое количество аминокислот, при условии, что CAR (или их функциональные части или функциональные варианты) сохраняют свою биологическую активность, например способность специфически связываться с антигеном, обнаруживать больные клетки (например, раковые клетки) у хозяина, лечить или предупреждать заболевание у хозяина и т.д. Например, CAR могут иметь длину от приблизительно 50 до приблизительно 5000 аминокислот, например приблизительно 50, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 100, приблизительно 125, приблизительно 150, приблизительно 175, приблизительно 200, приблизительно 225, приблизительно 250, приблизительно 275, приблизительно 300, приблизительно 325, приблизительно 350, приблизительно 375, приблизительно 400, приблизительно 425, приблизительно 450, приблизительно 475, приблизительно 500, приблизительно 525, приблизительно 550, приблизительно 575, приблизительно 600, приблизительно 625, приблизительно 650, приблизительно 675, приблизительно 700, приблизительно 725, приблизительно 750, приблизительно 775, приблизительно 800, приблизительно 825, приблизительно 850, приблизительно 875, приблизительно 900, приблизительно 925, приблизительно 950, приблизительно 975, приблизительно 1000 или более аминокислот в длину.
CAR по настоящему изобретению (включая функциональные части и функциональные варианты по настоящему изобретению) могут содержать синтетические аминокислоты вместо одной или нескольких аминокислот природного происхождения. Такие синтетические аминокислоты известны в уровне техники и включают, например, аминоциклогексанкарбоновую кислоту, норлейцин, α-амино-n-декановую кислоту, гомосерин, S-ацетиламинометил-цистеин, транс-3- и транс-4-гидроксипролин, 4аминофенилаланин, 4-нитрофенилаланин, а-(2-амино-2-норборнан)-карбоновую кислоту, α,γдиаминомасляную кислоту, α,β-диаминопропионовую кислоту, гомофенилаланин, 4-хлорфенилаланин, 4-карбоксифенилаланин, β-фенилсерин, β-гидроксифенилаланин, фенилглицин, α-нафтилаланин, цикло
- 91 047663 гексилаланин, циклогексилглицин, Н'-бензил-Н'-метил-лизин, Ν',Ν'-дибензил-лизин, 6-гидроксилизин, орнитин, α-аминоциклопентанкарбоновую кислоту, α-аминоциклогексанкарбоновую кислоту, αаминоциклогептанкарбоновую кислоту, индолин-2-карбоновую кислоту, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин3-карбоновую кислоту, аминомалоновую кислоту, моноамид аминомалоновой кислоты и α-третбутилглицин.
CAR по настоящему изобретению (включая функциональные части и функциональные варианты) могут подвергаться посттрансляционным модификациям. Они могут быть гликозилированы, этерифицированы, N-ацилированы, амидированы, карбоксилированы, фосфорилированы, эстерифицированы, циклизованы, например через дисульфидный мостик, или превращены в соль присоединения кислоты. В некоторых вариантах осуществления они димеризованы, полимеризованы или конъюгированы.
CAR по настоящему изобретению (включая функциональные части и их функциональные варианты) могут быть получены способами, известными в уровне техники. Подходящие способы синтеза полипептидов и белков de novo описаны в ссылках, таких как Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; и Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001. Также CAR могут быть получены рекомбинантно с использованием нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, с использованием стандартных рекомбинантных способов. Кроме того, некоторые CAR (включая функциональные части и их функциональные варианты) могут быть выделены и/или очищены из источника, такого как растение, бактерия, насекомое, млекопитающее и т.д. Способы выделения и очистки известны в уровне техники. В качестве альтернативы, CAR, по настоящему изобретению (включая их функциональные части и функциональные варианты) могут быть коммерчески синтезированы. В этом отношении CAR, полипептиды и белки могут быть синтетическими, рекомбинантными, выделенными и/или очищенными.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с эпитопом CAR по настоящему изобретению. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут иметь любой уровень аффинности или авидности по отношению к функциональной части CAR. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связывать CD33 с диапазоном значений аффинности (KD). В одном варианте осуществления антитело связывается с CD33 с KD, равным или меньшим, чем приблизительно 10-7 М, как, например, без ограничения 1-9,9 (или любой диапазон или значение в нем, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9)х10-8 М, 10-9 М, 10-10 М, 10-11 М, 10-12 М, 10-13 М, 10-14 М, 10-15 М или любой диапазон или значение в нем, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса или способа Kinexa, что практикуют специалисты в данной области. Одно иллюстративное значение аффинности равно или меньше 1 х 10-8 М. Другое иллюстративное значение аффинности равно или меньше 1х 10-9 М.
Способы тестирования антител в отношении их способности связываться с любой функциональной частью CAR по настоящему изобретению известны в уровне техники и включают любой анализ связывания антитело-антиген, такой как, например, радиоиммуноанализ (RIA), вестернблоттинг, ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), иммунопреципитация и анализ конкурентного ингибирования.
Часть CAR, содержащая антитело или его фрагмент, может существовать в различных формах, где антигенсвязывающий домен экспрессируется как часть непрерывной полипептидной цепи, включая, например, однодоменный фрагмент антитела (sdAb), scFv и человеческое химерное или гуманизированное антитело (Harlow et al., 1999, в: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; Harlow et al., 1989, в: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242: 423-426). В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR по настоящему изобретению содержит фрагмент антитела. В одном варианте осуществления CAR по настоящему изобретению содержит фрагмент антитела, который содержит scFv.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен связывает CD33.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33;
трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, необязательно содержащий по меньшей мере один костимуляторный домен.
В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит CD8a-шарнирную область.
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит полипептид трансмембранной области CD8a (CD8a-TM) и домен внутриклеточной передачи сигнала, содержащий костимуляторный домен, содержащий компонент представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137) и домен передачи первичного сигнала, содержащий компонент дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z).
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит
- 92 047663
CD8а-шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична SEQ ID NO: 157;
трансмембранный домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична SEQ ID NO: 162; и/или домен внутриклеточной передачи сигнала, содержащий костимуляторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична SEQ ID NO: 163, и домен передачи первичного сигнала, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична SEQ ID NO: 164.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен связывает CD33 и содержит
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 81 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 52;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 83 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 84 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 86 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 88 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 105 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 95;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 106 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 107 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 185 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 188 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 192 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 196 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 200 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 202 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262;
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263; или
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
В определенных вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен связывает CD33 и содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53.
В определенных вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен связывает CD33 и содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85 и
- 93 047663
HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56.
В определенных вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен связывает CD33 и содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59.
В определенных вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен связывает CD33 и содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262.
В определенных вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен связывает CD33 и содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263.
В определенных вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен связывает CD33 и содержит LCDR1, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273 и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
Иллюстративные последовательности HCDR и LCDR описаны в табл. 4а, 4b, 4c, 4d, 4e и 4f.
В некоторых вариантах осуществления CDR определяют согласно Kabat.
В некоторых вариантах осуществления CDR определяют согласно Chothia.
В некоторых вариантах осуществления CDR определяют согласно IMGT.
В некоторых вариантах осуществления CDR определяют согласно AbM.
В некотором варианте осуществления CDR определяют согласно Contact.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 253, 254 или 255, HCDR2 под SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 256, 257 или 258, HCDR3 под SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 259, 260 или 261, LCDR1 под SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 265 или 266, LCDR2 под SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 267 или 268 и LCDR3 под SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78, 79, 80, 269 или 270.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 33, 89, 167, 172 или 176, HCDR2 под SEQ ID NO: 90, 91, 168, 173 или 177, HCDR3 под SEQ ID NO: 92, 93, 94, 169, 174, 178 или 180, LCDR1 под SEQ ID NO: 98, 99, 100, 182, 186, 189, 193, 197 или 201, LCDR2 под SEQ ID NO: 101, 102, 103, 183, 187, 190, 194 или 198 и LCDR3 под SEQ ID NO: 104, 184, 191, 195 или 199.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 253, 254 или 255 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 33, 89, 167, 172 или 176 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR2 под SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 256, 257 или 258 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR2 под SEQ ID NO: 90, 91, 168, 173 или 177 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR3 под SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 259, 260 или 261 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR3 под SEQ ID NO: 92, 93, 94, 169, 174, 178 или 180 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий
- 94 047663 домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 265 или 266 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 98, 99, 100, 182, 186, 189, 193, 197 или 201 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит LCDR2 под SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 267 или 268 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит LCDR2 под SEQ ID NO: 101, 102, 103, 183, 187, 190, 194 или 198 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит LCDR3 под SEQ ID NO: 71 или 146 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит LCDR3 под SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78, 79, 80, 269 или 270 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит LCDR3 под SEQ ID NO: 104, 184, 191, 195 или 199 или таковыми с консервативными заменами.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2,
- 95 047663
HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 или 88.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
- 96 047663
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271. В других вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272. В других вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
Внеклеточный антигенсвязывающий домен также может представлять собой вариант связывающих CD33 доменов, который описан в данном документе (например, вариант домена, который описан в примерах 19-20).
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 52, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 81.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 53, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 82.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 54, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 83.
- 97 047663
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 55, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 84.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 56, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 85.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 57, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 86.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 58, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 87.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 59, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 87.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 60, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 87.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 61, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%
- 98 047663 или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 88.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 95, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 105.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 96, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 106.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 97, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 107.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 170, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 185.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 171, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 188.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 175, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 192.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 179, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей
- 99 047663 мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 196.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 181, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 200.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 96, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 262, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 271.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 263, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 272.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 264, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична полипептиду под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит scFv. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит линкерный полипептид между VL и VH.
В некоторых вариантах осуществления линкерный полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления линкерный полипептид содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 108.
В некоторых вариантах осуществления линкерный полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108 (например где линкерный полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 108).
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215,
- 100 047663
216, 217, 218, 219, 220, 221, 274, 275 и 276.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 203.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 204.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 205.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 206.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 207.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 208.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 209.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 210.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 211.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 212.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 214.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 215.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 216.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 217.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 218.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 219.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 220.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 221.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 274.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связы
- 101 047663 вает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 275.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 276.
В определенных вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213.
В других вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 216.
В других вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 219.
В других вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 274.
В других вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 275.
В других вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, который содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 276.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 203.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 204.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 205.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 206.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 207.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 208.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 209.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокис
- 102 047663 лотной последовательности под SEQ ID NO: 210.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 211.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 212.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 213.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 214.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 215.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 216.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 217.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 218.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 219.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 220.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 221.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 274.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, кото
- 103 047663 рая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 275.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 276.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 274, 275 или 276.
В определенных вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 213, 216, 219, 274, 275 или 276.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 18.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 19.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 20.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 21.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%,
- 104 047663 по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 22.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 23.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 24.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 25.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 26.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 27.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 203.
- 105 047663
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 203.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 204.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 204.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 205.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 205.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 206.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 206.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 207.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 207.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 208.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 208.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 209.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала,
- 106 047663 где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 209.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 210.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 210.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 211.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 211.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 212.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 212.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 213.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 214.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 214.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 215.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 215.
- 107 047663
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 216.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 216.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 217.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 217.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 218.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 218.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 219.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 219.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 220.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 220.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 221.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 221.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по
- 108 047663 меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 274.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 274.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 275.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 275.
Настоящее изобретение относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 276.
Настоящее изобретение также относится к CAR, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, трансмембранный домен и домен внутриклеточной передачи сигнала, где внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 276.
В некоторых вариантах осуществления домен внутриклеточной передачи сигнала содержит полипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из компонента представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD 13 7), компонента дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z), компонента кластера дифференцировки (CD27), компонента представителя суперсемейства кластеров дифференцировки (таких как, например, CD28 или индуцибельный Т-клеточный костимулятор (ICOS)) и их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления компонент CD137 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 163. В некоторых вариантах осуществления компонент CD137 содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 163.
В некоторых вариантах осуществления компонент CD3z содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 164. В некоторых вариантах осуществления компонент CD3z содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 164.
В некоторых вариантах осуществления домен внутриклеточной передачи сигнала содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 165. В некоторых вариантах осуществления домен внутриклеточной передачи сигнала содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 165.
SEP ID NO: 165,
KRGRKKLLYIFKQPFMRP VQTTQEEDGC SCRFPEEEEGGCELRVKF SRS ADAPAYKQ
GQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAE
AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит полипептид трансмембранной области CD8a (CD8a-TM). В некоторых вариантах осуществления полипептид CD8a-TM содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 162. (IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC; SEQ
- 109 047663
ID NO: 162).
В некоторых вариантах осуществления полипептид CD8a-TM содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит по меньшей мере трансмембранную(ые) область(и) α-, β- или ζ-цепи рецептора Т-клеток, CD28, CD3 эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD40, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит по меньшей мере трансмембранный домен ζ, η или FcεR1γ и -β, МВ1 (Iga.), B29 или CD3-Y, -ζ или -η. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен является синтетическим, например содержащим преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин, триплет фенилаланина или триптофан.
В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит шарнирную область, соединяющую трансмембранный домен с внеклеточным антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область представляет собой CD8а-шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления CD8а-шарнирная область содержит аминокислотную последовательность под
SEQ ID NO: 157 (TSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD; SEQ ID NO: 157).
В некоторых вариантах осуществления CD8a-шарнирная область содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 157. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит аминокислотную последовательность EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 158) или содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью аминокислотной последовательности с EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 158). В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит последовательность ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 159) или содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 159). В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит последовательность ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3, (SEQ ID NO: 160) или содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3 (SEQ ID NO: 160). В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит последовательность ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 161) или содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 161). Конструкции CAR и иммунореактивные клетки, экспрессирующие CAR Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим CAR, описанные в данном документе.
Если не указано иное, то фраза полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность включает все полинуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза полинуклеотид, который кодирует белок или РНК может также включать интроны в той мере, в какой полинуклеотид, кодирующий белок, может в некоторых вариантах содержать интрон(ы), который(ые) встраивается(ются) в экспрессируемый белок.
Настоящее изобретение также относится к вектору экспрессии, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR по настоящему изобретению.
Термин вектор экспрессии относится к вектору, включающему рекомбинантный полинуклеотид, содержащий последовательности контроля экспрессии, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, подлежащей экспрессии. Вектор экспрессии содержит достаточное количество дей
- 110 047663 ствующих в цис-положении элементов для экспрессии; другие элементы для экспрессии могут быть обеспечены клеткой-хозяином или в системе экспрессии in vitro. Векторы экспрессии включают все известные в уровне техники, в том числе космиды, плазмиды (например, голые или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы), которые включают рекомбинантный полинуклеотид.
Настоящее изобретение также относится к выделенным иммунореактивным клеткам, содержащим CAR по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления выделенная иммунореактивная клетка трансдуцирована CAR, например CAR конститутивно экспрессируется на поверхности иммунореактивной клетки. В определенных вариантах осуществления выделенная иммунореактивная клетка дополнительно трансдуцирована по меньшей мере одним костимуляторным лигандом таким образом, что иммунореактивная клетка экспрессирует по меньшей мере один костимуляторный лиганд. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один костимуляторный лиганд выбран из группы, состоящей из 4-1BBL, CD48, CD70, CD80, CD86, OX40L, TNFRSF14 и их комбинаций. В определенных вариантах осуществления выделенную иммунореактивную клетку дополнительно трансдуцируют по меньшей мере одним цитокином таким образом, что иммунореактивная клетка секретирует по меньшей мере один цитокин. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере цитокин выбран из группы, состоящей из IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21 и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления выделенная иммунореактивная клетка выбрана из группы, состоящей из Т-лимфоцита (Т-клетки), естественной киллерной (NK) клетки, цитотоксического Т-лимфоцита (CTL), регуляторной Т-клетки (Treg), эмбриональной стволовой клетки человека, лимфоидной клеткипредшественницы, клетки-предшественницы Т-клетки и плюрипотентной стволовой клетки, из которой могут дифференцироваться лимфоидные клетки.
В некоторых вариантах осуществления выделенная иммунореактивная клетка представляет собой Т-клетку.
Для целей данного документа Т-клеткой может быть любая Т-клетка, такая как культивируемая Тклетка, например первичная Т-клетка или Т-клетка из культивируемой Т-клеточной линии, например Jurkat, SupT1 и т.д., или Т-клетка, полученная от млекопитающего. Если получена от млекопитающего, то Т-клетка может быть получена из многочисленных источников, включая без ограничения костный мозг, кровь, лимфатический узел, тимус или другие ткани или жидкости. Т-клетки также могут быть обогащены или очищены. Т-клетка может быть человеческой Т-клеткой. Т-клетка может быть Т-клеткой, выделенной из человека. Т-клетка может быть любым типом Т-клетки и может быть любой стадии развития, включая без ограничения CD47CD8' дважды положительные Т-клетки, CD8' Т-клетки (например, цитотоксические Т-клетки), CD4+ хелперные Т-клетки, например Th1 и Th2 клетки, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), лейкоциты периферической крови (PBL), инфильтрирующие опухоль клетки, Т-клетки памяти, наивные Т-клетки и т.п. Т-клетка может быть CD8+ Т-клеткой или CD4+ Т-клеткой.
В некоторых вариантах осуществления выделенная иммунореактивная клетка представляет собой NK-клетку.
В некоторых вариантах осуществления выделенная иммунореактивная клетка представляет собой CTL.
В некоторых вариантах осуществления выделенная иммунореактивная клетка представляет собой Treg.
В некоторых вариантах осуществления выделенная иммунореактивная клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку человека.
В некоторых вариантах осуществления выделенная иммунореактивная клетка представляет собой лимфоидную клетку-предшественницу.
В некоторых вариантах осуществления выделенная иммунореактивная клетка представляет собой плюрипотентную стволовую клетку.
В одном варианте осуществления Т-клетки с CAR по настоящему изобретению могут быть созданы путем введения в клетки лентивирусного вектора, включающего необходимый CAR, например CAR, включающий внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, CD8α-шарнирный и трансмембранный домен, а также человеческие домены передачи сигнала 4-1ВВ и CD3-дзета. Т-Клетки с CAR по настоящему изобретению способны реплицироваться in vivo, что приводит к длительной персистенции, которая может привести к устойчивому контролю опухоли.
Варианты осуществления настоящего изобретения также представляют клетки-хозяева, содержащие любой из рекомбинантных векторов экспрессии, описанных в данном документе. Используемый в данном документе термин клетка-хозяин относится к любому типу клеток, которые могут содержать рекомбинантный вектор экспрессии. Клетка-хозяин может быть эукариотической клеткой, например клеткой растения, животного или водоросли, гриба, или может быть прокариотической клеткой, например бактериальной клеткой или клеткой простейшего. Клетка-хозяин может быть культивированной клеткой или первичной клеткой, т.е. выделенной непосредственно из организма, например человека. Клетка-хозяин может быть адгезивной клеткой или суспензионной клеткой, т.е. клеткой, растущей в сус- 111 047663 пензии. Подходящие клетки-хозяева известны в уровне техники и включают, например, клетки DH5a E.coli, клетки яичника китайского хомячка, клетки VERO обезьяны, клетки COS, клетки HEK293 и т.п. Для целей амплификации или репликации рекомбинантного вектора экспрессии клетка-хозяин может быть прокариотической клеткой, например клеткой DH5a. Для целей получения рекомбинантного CAR, полипептида или белка клетка-хозяин может быть клеткой млекопитающего. Клетка-хозяин может быть клеткой человека. Хотя клетка-хозяин может принадлежать любому типу клеток, может происходить из любого типа ткани и может находиться на любой стадии развития, клетка-хозяин может быть лимфоцитом периферической крови (PBL). Клетка-хозяин может быть Т-клеткой.
Также представлена популяция клеток, содержащая по меньшей мере одну клетку-хозяина, описанную в данном документе. Популяция клеток может быть гетерогенной популяцией, содержащей клеткухозяина, содержащую любой из описанных рекомбинантных векторов экспрессии, в дополнение к по меньшей мере одной другой клетке, например клетке-хозяину (например, Т-клетке), которая не включает ни один из рекомбинантных векторов экспрессии, или клетке, отличной от Т-клетки, например В-клетке, макрофагу, эритроциту, нейтрофилу, гепатоциту, эндотелиальной клеткае, эпителиальной клетке, мышечной клетке, клетке мозга и т.д. В качестве альтернативы, популяция клеток может быть по сути однородной популяцией, при этом популяция содержит в основном клетки-хозяева, (например, состоящие по сути из) включающие рекомбинантный вектор экспрессии. Популяция также может быть клональной популяцией клеток, в которой все клетки популяции являются клонами одной клетки-хозяина, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии, так что все клетки популяции содержат рекомбинантный вектор экспрессии. В одном варианте осуществления популяция клеток представляет собой клональную популяцию, содержащую клетки-хозяева, содержащие рекомбинантный вектор экспрессии, который описан в данном документе.
Полинуклеотиды, клетки-хозяева и векторы.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему любой из связывающих CD33 белков по настоящему изобретению. Связывающий CD33 белок включает антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, белки, содержащие антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, мультиспецифические белки, которые содержат антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, и химерные антигенные рецепторы (CAR), содержащие антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему любой из связывающих CD33 белков или их фрагментов.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263, 264, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, или 382.
В определенных вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 53.
В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 56.
В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 59.
В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 262. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 263. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 264. Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,88, 271, 272, 273, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397 или 398.
В определенных вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VL под SEQ ID NO: 82.
В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VL под SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VL под SEQ ID NO: 87.
В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VL под SEQ ID NO: 271.
В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VL под SEQ ID NO: 272.
В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VL под SEQ ID NO: 273. Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему VH под SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
- 112 047663
В некоторых вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263, 264, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350,
351, 352, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, или 382 и a VL под
SEQ ID NOs: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272, 273, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320,
321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 353, 354, 355, 356, 357, 358,
359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396,
397 или 398.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220 221, 274, 275 или 276. Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 18.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 19.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 20.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 21.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 22.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 23.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 24.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 25.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 26.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 27.
- 113 047663
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 203.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 204.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 205.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 206.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 207.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 208.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 209.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 210.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 211.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 212.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 213.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 214.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 215.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 216.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 217.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 218.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 219.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 220.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 221.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 274.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 275.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид под SEQ ID NO: 276.
В определенных вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует полипептид под SEQ ID NO: 213. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует полипептид под SEQ ID NO: 216. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует полипептид под SEQ ID NO: 219. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует полипептид под SEQ ID NO: 274. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует полипептид под SEQ ID NO: 275. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует полипептид под SEQ ID NO: 276.
Настоящее изобретение также относится к выделенному или очищенному полинуклеотиду, который кодирует любой из CAR по настоящему изобретению или его функциональные части или функциональные варианты.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 274, 275 или 276.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, со
- 114 047663 держащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 203.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 204.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 205.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 206.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 207.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 208.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 209.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 210.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 211.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 212.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 214.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 215.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 216.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 217.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 218.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 219.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 220.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 221.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 274.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 275.
Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 276.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также предоставлена выделенная или очищенная нуклеиновая кислота, содержащая полинуклеотид, который комплементарен полинуклеотидам, кодирующим связывающие CD33 белки по настоящему изобретению, или полинуклеотидам,
- 115 047663 которые гибридизируются в жестких условиях с полинуклеотидами, кодирующими связывающие CD33 белки по настоящему изобретению.
Полинуклеотиды, которые гибридизируются в жестких условиях, могут гибридизироваться в условиях высокой жесткости. Под условиями высокой жесткости подразумевается, что полинуклеотид специфически гибридизуется с целевой последовательностью (нуклеотидной последовательностью любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе) в количестве, которое выявляется сильнее, чем неспецифическая гибридизация. Условия высокой жесткости включают условия, которые позволяют отличить полинуклеотид с точной комплементарной последовательностью или полинуклеотид, содержащий только несколько разрозненных ошибочных спариваний от случайной последовательности, в которой оказалось несколько небольших областей (например, 3-12 оснований), совпадающих с нуклеотидной последовательностью. Такие небольшие области комплементарности плавятся легче, чем полноразмерная комплементарная последовательность из 14-17 или более оснований, а гибридизация высокой жесткости делает их легко различимыми. Условия относительно высокой жесткости могут включать, например, условия с низким содержанием соли и/или высокой температурой, такие как обеспечиваемые приблизительно 0,02-0,1 M NaCl или эквивалента, при температурах приблизительно 50-70°C. Такие условия высокой жесткости допускают незначительное количество, если вообще имеется, ошибочных спариваний между нуклеотидной последовательностью и матричной или целевой нитью, и особенно подходят для выявления экспрессии любого из CAR, описанных в данном документе. Обычно считается, что условия можно сделать более жесткими путем добавления увеличивающихся количеств формамида.
Полинуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут быть функционально связаны с одним или несколькими регуляторными элементами, такими как промотор или энхансер, которые обеспечивают экспрессию нуклеотидной последовательности в предполагаемой клетке-хозяине. Полинуклеотид может представлять собой cDNA. Промотор может быть сильным, слабым, тканеспецифическим, индуцибельным или специфическим в отношении стадии развития промотором. Иллюстративными промоторами, которые могут быть использованы, являются гипоксантинфосфорибозилтрансфераза (HPRT), аденозиндезаминаза, пируваткиназа, бета-актин, миозин человека, гемоглобин человека, креатин мышц человека и другие. Кроме того, многие вирусные промоторы функционируют конститутивно в эукариотических клетках и подходят для применения в описанных вариантах осуществления. Такие вирусные промоторы включают немедленный ранний промотор цитомегаловируса (CMV), ранний и поздний промоторы SV40, промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), длинные терминальные повторы (LTR) вируса лейкоза Малони, вируса иммунодефицита человека (HIV), вируса ЭпштейнаБарра (EBV), вируса саркомы Рауса (RSV) и других ретровирусов, а также промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса. Также могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как промотор металлотионеина, тетрациклин-индуцибельный промотор, доксициклин-индуцибельный промотор, промоторы, содержащие один или несколько элементов интерферон-стимулированного ответа (ISRE), такие как протеинкиназа R, 2',5'-олигоаденилатсинтетазы, гены Мх, ADAR1 и т.п.
Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему полинуклеотид по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к вектору экспрессии, содержащему полинуклеотид по настоящему изобретению. Такие векторы могут быть плазмидными векторами, вирусными векторами, векторами для экспрессии бакуловируса, векторами на основе транспозонов или любыми другими векторами, подходящими для введения синтетического полинуклеотида по настоящему изобретению в данный организм или генетический фон любыми способами. Полинуклеотиды, кодирующие связывающие CD33 белки по настоящему изобретению, могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в векторе(ах) экспрессии, который(е) обеспечивает(ют) экспрессию связывающих CD33 белков. Такие регуляторные элементы могут включать транскрипционный промотор, последовательности, кодирующие подходящие сайты связывания рибосомы mRNA, и последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции. Векторы экспрессии могут также включать один или несколько нетранскрибируемых элементов, таких как точка начала репликации, подходящие промотор и энхансер, связанные с геном, подлежащим экспрессии, другие 5'- или 3'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, 5'- или 3'-нетранслируемые последовательности (как, например, необходимые сайты связывания рибосомы), сайт полиаденилирования, сайты донора и акцептора сплайсинга или последовательности терминации транскрипции. Также может быть включена точка начала репликации, которая придает способность реплицироваться в хозяине.
Векторы экспрессии могут включать межнуклеотидные связи, встречающиеся в природе или не встречающиеся в природе, или оба типа связей. Не встречающиеся в природе или измененные нуклеотиды или межнуклеотидные связи не препятствуют транскрипции или репликации вектора.
После включения вектора в соответствующего хозяина, хозяина поддерживают в условиях, подходящих для высокого уровня экспрессии связывающих CD33 белков по настоящему изобретению, кодируемых включенными полинуклеотидами. Транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности в векторах экспрессии, используемых для трансформации клеток позвоночных, могут быть получены из вирусных источников. Иллюстративные векторы могут быть сконструированы, как описано у Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983).
- 116 047663
Векторы по настоящему изобретению могут также содержать один или несколько сайтов внутренней посадки рибосомы (IRES). Включение последовательности IRES в слитые векторы может быть полезным для усиления экспрессии некоторых белков. В некоторых вариантах осуществления векторная система будет включать один или несколько сайтов полиаденилирования (например, SV40), которые могут находиться выше или ниже любой из вышеупомянутых последовательностей нуклеиновых кислот. Компоненты вектора могут быть смежно связаны или расположены таким образом, чтобы обеспечить оптимальное расстояние для экспрессии генных продуктов (т.е. путем введения спейсерных нуклеотидов между ORF), или расположены другим образом. Регуляторные элементы, такие как мотив IRES, также могут быть расположены таким образом, чтобы обеспечить оптимальное расстояние для экспрессии.
Векторы по настоящему изобретению могут быть кольцевыми или линейными. Они могут быть получены таким образом, чтобы содержать систему репликации, функционирующую в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине. Системы репликации могут быть получены, например, из ColE1, SV40, плазмиды 2μ, λ, вируса папилломы крупного рогатого скота и т.п.
Рекомбинантные векторы экспрессии могут быть предназначены для временной экспрессии, для стабильной экспрессии или для обеих. Также рекомбинантные векторы экспрессии могут быть созданы для конститутивной экспрессии или для индуцибельной экспрессии.
Кроме того, рекомбинантные векторы экспрессии могут включать ген самоубийства. Используемый в данном документе термин ген самоубийства относится к гену, который вызывает гибель клетки, экспрессирующей ген самоубийства. Ген самоубийства может быть геном, который придает чувствительность к средству, например лекарственному средству, клетке, в которой экспрессируется ген, и вызывает гибель клетки при контакте клетки со средством или при воздействии средства. Гены самоубийства известны в уровне техники и включают, например, ген тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса (HSV), цитозиндезаминазы, фосфорилазы пуриновых нуклеозидов и нитроредуктазы.
Векторы могут также включать маркеры отбора, которые хорошо известны в уровне техники. Маркеры отбора включают маркеры положительного и отрицательного отбора. Маркерные гены включают устойчивость к биоцидам, например устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т.д., комплементацию в ауксотрофном хозяине для обеспечения прототрофии и т.п. Иллюстративные маркерные гены включают гены устойчивости к антибиотикам (например, ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к гигромицину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к пенициллину, ген устойчивости к гистидинолу, ген устойчивости к гистидинолу х), гены глутаминсинтазы, HSV-TK, производные HSV-TK для отбора по ганцикловиру или ген бактериальной пуриновой нуклеозидфосфорилазы для отбора по 6-метилпурину (Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая маркер отбора или сайт клонирования, может находиться выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид или сайт клонирования.
Иллюстративными векторами, которые могут быть использованы, являются бактериальные: рВ, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pB KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, Ла-Хойя, штат Калифорния, США); рТгс99А, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 и pRIT5 (Pharmacia, Уппсала, Швеция); эукариотические: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL (Pharmacia), pEE6.4 (Lonza) и рЕЕ12.4 (Lonza). Дополнительные векторы включают серию pUC (Fermentas Life Sciences, Глен Берни, штат Мэриленд, США), серию pBluescript (Stratagene, Ла-Хойя, штат Калифорния, США), серию рЕТ (Novagen, Мэдисон, штат Висконсин, США), серию pGEX (Pharmacia Biotech, Уппсала, Швеция) и серию рЕХ (Clontech, Пало Альто, штат Калифорния, США). Можно использовать векторы бактериофагов, такие как λGT10, λGT11, λEMBL4 и λΚ^^, λZapII (Stratagene). Иллюстративные растительные векторы экспрессии включают pBI01, pBI01.2, pBI121, pBI101.3 и pBIN19 (Clontech). Иллюстративные векторы экспрессии животных включают pEUK-Cl, рМАМ и pMAMneo (Clontech). Вектор экспрессии может быть вирусным вектором, например ретровирусным вектором, например гамма-ретровирусным вектором.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263, 264, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, или 382.
В определенных вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 53. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 56. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 59. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 262. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 263. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 264.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272, 273, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322,
- 117 047663
323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397 или 398.
В определенных вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VL под SEQ ID NO: 82. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VL под SEQ ID NO: 85. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VL под SEQ ID NO: 87. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VL под SEQ ID NO: 271. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VL под SEQ ID NO: 272. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 262, 263, 264, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348,
349, 350, 351, 352, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, или 382 и
VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 271, 272, 273, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 353, 354, 355, 356, 357,
358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395,
396, 397 или 398.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий выделенный полинуклеотид, кодирующий
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
k) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272;
m) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272. В других вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий выделенный полинуклеотид, кодирующий
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид под SEQ ID NO: SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 274, 275 или 276.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид под SEQ ID NO: 18.
- 118 047663
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 203.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 204.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 205.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 206.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 207.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 208.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 209.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 210.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 211.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 212.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 213.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 214.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 215.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 216.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 217.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 218.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 219.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 220.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 221.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 274.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 275.
В некоторых вариантах осуществления вектор под SEQ ID NO: 276.
содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид
- 119 047663
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий любой из CAR по настоящему изобретению или его функциональные части или функциональные варианты.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 274, 275 или 276.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 203.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 204.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 205.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 206.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 207.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 208.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 209.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 210.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 211.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 212.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 214.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 215.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 216.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 217.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 218.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 219.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 220.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содер
- 120 047663 жащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 221.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 274.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 275.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 276.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей один или несколько векторов по настоящему изобретению. Клетка-хозяин относится к клетке, в которую был введен вектор. Подразумевается, что термин клетка-хозяин относится не только к конкретной клетке-субъекту, но и к потомству такой клетки, а также к стабильной клеточной линии, полученной из конкретной клеткисубъекта. Поскольку вследствие мутации либо влияний окружающей среды в последующих поколениях могут происходить определенные модификации, то такое потомство может не быть идентичным исходной клетке, но все еще быть включенным в объем термина хозяин, используемого в данном документе. Такие клетки-хозяева могут быть эукариотическими клетками, прокариотическими клетками, клетками растений или архей. Escherichia coli, бациллы, такие как Bacillus subtilis, и другие энтеробактерии, такие как Salmonella, Serratia и различные виды Pseudomonas, являются примерами прокариотических клетокхозяев. Другие микробы, такие как дрожжи, также применимы для экспрессии. Saccharomyces (например, S. cerevisiae) и Pichia являются примерами подходящих клеток-хозяев дрожжей. Иллюстративные эукариотические клетки могут происходить от млекопитающих, насекомых, птиц или других животных. Эукариотические клетки млекопитающих включают иммортализованные клеточные линии, такие как гибридомы или линии клеток миеломы, такие как линии мышиных клеток SP2/0 (Американская коллекция типовых культур (АТСС), Манассас, штат Вирджиния, США, CRL-1581), NS0 (Европейская коллекция клеточных культур (ЕСАСС), Солсбери, Уилтшир, Великобритания, ЕСАСС № 85110503), FO (АТСС CRL-1646) и Ag653 (АТСС CRL-1580). Иллюстративной клеточной линией миеломы человека является U266 (АТТС CRL-TIB-196). Другие применимые клеточные линии включают линии, полученные из клеток яичника китайского хомячка (СНО), такие как CHO-K1SV (Lonza Biologics, Уолкерсвилл, штат Мэриленд, США), СНО-Ki (АТСС CRL-61) или DG44.
Настоящее изобретение также относится к способу получения связывающего CD33 белка по настоящему изобретению, включающему культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях экспрессии связывающего K2 белка и извлечения связывающего CD33 белка, продуцируемого клеткой-хозяином. Известны способы получения белков и их очистки. После синтеза (химического или рекомбинантного) связывающие CD33 белки могут быть очищены в соответствии со стандартными процедурами, включая осаждение сульфатом аммония, аффинные колонки, колоночную хроматографию, очистку высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC), гель-электрофорез и т.п. (см. в целом Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Белок-субъект может быть по сути чистым, например на по меньшей мере от приблизительно 80% до 85% чистым, по меньшей мере от приблизительно 85% до 90% чистым, по меньшей мере от приблизительно 90% до 95% чистым или по меньшей мере от приблизительно 98% до 99% или более чистым, например свободным от загрязняющих веществ, таких как остатки клеток, макромолекулы и т.д., отличные от белка-субъекта.
Полинуклеотиды, кодирующие связывающие CD33 белки по настоящему изобретению, могут быть включены в векторы с использованием стандартных способов молекулярной биологии. Трансформацию клеток-хозяев, культивирование, экспрессию и очистку антител проводят с использованием хорошо известных способов.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу получения полипептида, включающему экспрессию нуклеотида по настоящему изобретению, который кодирует полипептид по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82. В других вариантах осуществления полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85. В других вариантах осуществления полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87. В других вариантах осуществления полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 82. В других вариантах осуществления полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82. В других вариантах осуществления полинуклеотид кодирует VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82.
В определенных вариантах осуществления данного способа полинуклеотид кодирует полипептид, содержащий VH под SEQ ID NO: 53, и полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 82. В других вариантах осуществления полинуклеотид кодирует полипептид, содержащий VH под SEQ ID NO: 56, и полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 85. В других вариантах осуществления полинуклеотид кодирует полипептид, содержащий VH под SEQ ID NO: 59, и полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 87. В других вариантах осуществления полинуклеотид кодирует полипептид, содержащий VH под SEQ ID NO: 262, и полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 271. В других вариантах осуществления полинуклеотид кодирует полипептид, содержащий VH под SEQ ID NO: 263, и полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 272. В других вариантах осуществления полинуклеотид кодирует полипептид, содер
- 121 047663 жащий VH под SEQ ID NO: 264, и полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 273.
Если полипептид образуется из отдельных цепей, которые кодируются разными нуклеиновыми кислотами, то настоящее изобретение относится к способу получения полипептида, включающему экспрессию нуклеотидов по настоящему изобретению, которые кодируют полипептид по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления первый полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VH под SEQ ID NO: 53, и второй полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 82. В других вариантах осуществления первый полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VH под SEQ ID NO: 56, и второй полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 85. В других вариантах осуществления первый полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VH под SEQ ID NO: 59, и второй полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 87. В других вариантах осуществления первый полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VH под SEQ ID NO: 262, и второй полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 271. В других вариантах осуществления первый полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VH под SEQ ID NO: 263, и второй полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 272. В других вариантах осуществления первый полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VH под SEQ ID NO: 264, и второй полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий VL под SEQ ID NO: 273.
Модифицированные нуклеотиды могут быть использованы для получения полинуклеотидов по настоящему изобретению. Иллюстративными модифицированными нуклеотидами являются 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-йодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5(карбоксигидроксиметил)урацил, карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, ^-замещенный аденин, 7-метилгуанин, 5метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-О-маннозилкеозин, 5''метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-Нб-изопентениладенин, урацил-5оксиуксусная кислота (v), вибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, бета-Э-галактозилкеозин, инозин, N6изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5метилурацил, сложный метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, 3-(3-амино-3-Ы-2карбоксипропил)урацил и 2,6-диаминопурин.
Фармацевтические композиции/введение.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей связывающий CD33 белок по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей белок, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей мультиспецифический белок, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей CAR, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Для терапевтического применения, связывающий CD33 белок по настоящему изобретению можно получать в виде фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество антитела в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному средству или среденосителю, с которыми вводят антитело по настоящему изобретению. Такие среды-носители могут представлять собой жидкости, такие как вода и масла, включая масла, полученные из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Например, можно использовать 0,4% солевой раствор и 0,3% глицин. Эти растворы являются стерильными и, как правило, не содержат твердых частиц. Они могут быть стерилизованы с помощью обычных, хорошо известных методик стерилизации (например, фильтрации). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые необходимы для приблизительного соответствия физиологическим условиям, как, например, для доведения рН и буферные средства, стабилизирующие, загущающие, смазывающие и красящие средства и т.д. Концентрация антител по настоящему изобретению в таком фармацевтическом составе может варьировать от менее чем приблизительно 0,5%, обычно от по меньшей мере приблизительно 1% вплоть до 15 или 20% по весу, и при этом она будет выбрана, в первую очередь, исходя из требуемой дозы, объемов жидкости, вяз
- 122 047663 костей и т.д., в зависимости от конкретного выбранного способа введения. Подходящие среды-носители и составы, включающие другие человеческие белки, например сывороточный альбумин человека, описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, особенно см. стр. 958-989.
Способ введения связывающего CD33 белка по настоящему изобретению может быть любым подходящим путем, таким как парентеральное введение, например внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное или подкожное, трансмукозальное (пероральное, интраназальное, интравагинальное, ректальное), или другими способами, известными специалисту и хорошо известными в уровне техники.
Связывающий CD33 белок по настоящему изобретению также может быть введен профилактически для снижения риска развития такого заболевания, как рак.
Таким образом, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению для внутримышечной инъекции можно получать с содержанием 1 мл стерильной забуференной воды и от приблизительно 1 нг до приблизительно 100 мг/кг, например от приблизительно 50 нг до приблизительно 30 мг/кг, или более предпочтительно от приблизительно 5 мг до приблизительно 25 мг/кг, связывающего CD33 белка по настоящему изобретению.
В вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессирующие CAR клетки могут быть обеспечены в композициях, например в подходящей(их) фармацевтической(их) композиции(иях), содержащей(их) экспрессирующие CAR клетки и фармацевтически приемлемый носитель. В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим эффективное количество лимфоцита, экспрессирующего один или несколько описанных CAR, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать экспрессирующую CAR клетку, например множество экспрессирующих CAR клеток, которые описаны в данном документе, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или разбавителями. Фармацевтически приемлемый носитель может быть ингредиентом фармацевтической композиции, отличным от активного ингредиента, который нетоксичен для субъекта.
Фармацевтически приемлемый носитель может включать буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант. Примерами фармацевтически приемлемых носителей являются растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и задерживающие всасывание средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми, такими как соли, буферы, антиоксиданты, сахариды, водные или неводные носители, консерванты, смачивающие средства, поверхностно-активные вещества или эмульгаторы или их комбинации. Количества фармацевтически приемлемого(ых) носителя(ей) в фармацевтических композициях можно определять экспериментально на основании видов активности носителя(ей) и требуемых характеристик состава, таких как стабильность и/или минимальное окисление.
Фармацевтические композиции могут включать буферы, такие как уксусная кислота, лимонная кислота, муравьиная кислота, янтарная кислота, фосфорная кислота, угольная кислота, яблочная кислота, аспарагиновая кислота, гистидин, борная кислота, Tris-буферы, HEPPSO, HEPES, нейтральный забуференный солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатирующие средства, такие как EDTA или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия); антибактериальные и противогрибковые средства и консерванты.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть составлены для различных способов парентерального или непарентерального введения. В одном варианте осуществления композиции могут быть составлены для инфузии или внутривенного введения. Фармацевтические композиции, раскрытые в данном документе, могут быть представлены, например, в виде стерильных жидких препаратов, например изотонических водных растворов, эмульсий, суспензий, дисперсий или вязких композиций, которые могут быть забуферены до необходимого рН. Составы, пригодные для перорального введения, могут включать жидкие растворы, капсулы, саше, таблетки, пастилки и троше, порошки, жидкие суспензии в соответствующей жидкости и эмульсии.
Термин фармацевтически приемлемый, используемый в настоящем документе в отношении фармацевтических композиций, означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или включенный в Фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею для применения животным и/или людям.
Способы лечения и применения.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего домена, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом, в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта,
- 123 047663 включающему введение терапевтически эффективного количества белка, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающего введение терапевтически эффективного количества мультиспецифического белка, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению, субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33.
В определенных вариантах осуществления способ включает введение терапевтически эффективного количества мультиспецифического белка (например, биспецифического белка), содержащего первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению и второй антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33. В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, и необязательно второй связывающий домен, который связывает TRGV9, представляет собой VHH.
В некоторых вариантах осуществления способ включает введение терапевтически эффективного количества мультиспецифического белка (например, биспецифического белка), содержащего первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, и необязательно второй связывающий домен, который связывает TRGV9, представляет собой VHH.
В некоторых вариантах осуществления способ включает введение терапевтически эффективного количества мультиспецифического белка (например, биспецифического белка), содержащего первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213, 216, 219, 274, 275 или 276. В определенных таких вариантах осуществления второй связывающий домен, который связывает TRGV9, представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества CAR, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению, субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающего введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению, субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33. В определенных таких вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит мультиспецифический белок (например, биспецифический белок), содержащий первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению и второй антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9. В некоторых таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, и необязательно второй связывающий домен, который связывает TRGV9, представляет собой VHH.
В некоторых вариантах осуществления способ включает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей мультиспецифический белок (например, биспецифический белок), где мультиспецифический белок содержит первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
- 124 047663
VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, и необязательно второй связывающий домен, который связывает TRGV9, представляет собой VHH.
В некоторых вариантах осуществления способ включает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей мультиспецифический белок (например, биспецифический белок), где мультиспецифический белок содержит первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213, 216, 219, 274, 275 или 276. В определенных таких вариантах осуществления второй связывающий домен, который связывает TRGV9, представляет собой VHH.
Настоящее изобретение также относится к способу введения генетически модифицированной Тклетки, экспрессирующей CAR, для лечения субъекта, имеющего рак или подверженного риску заболевания раком, с использованием инфузии лимфоцитов.
По меньшей мере в одном варианте осуществления для лечения применяют инфузию аутологичных лимфоцитов. Аутологичные РВМС собирают у субъекта, нуждающегося в лечении, и Т-клетки активируют и размножают с использованием способов, описанных в данном документе и известных в уровне техники, а затем вводят обратно субъекту.
В одном аспекте настоящее изобретение в целом относится к лечению субъекта, подверженного риску развития рака. Настоящее изобретение также включает лечение злокачественной опухоли или аутоиммунного заболевания, при котором химиотерапия и/или иммунотерапия приводит к значительной иммуносупрессии у субъекта, тем самым повышая риск развития рака у субъекта.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения не являющегося раковым состояния у субъекта, подверженного риску развития ракового состояния, включающему введение антигенсвязывающего домена, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту для лечения не являющегося раковым состояния.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения не являющегося раковым состояния у субъекта, подверженного риску развития ракового состояния, включающему введение белка, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту для лечения не являющегося раковым состояния.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения не являющегося раковым состояния у субъекта, подверженного риску развития ракового состояния, включающему введение мультиспецифического белка, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту для лечения не являющегося раковым состояния.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения не являющегося раковым состояния у субъекта, подверженного риску развития ракового состояния, включающему введение иммуноконъюгата по настоящему изобретению субъекту для лечения не являющегося раковым состояния.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения не являющегося раковым состояния у субъекта, подверженного риску развития ракового состояния, включающему введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению субъекту для лечения не являющегося раковым состояния.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения не являющегося раковым состояния у субъекта, подверженного риску развития ракового состояния, включающему введение CAR по настоящему изобретению субъекту для лечения не являющегося раковым состояния.
Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества любого антигенсвязывающего домена, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для предупреждения рака с экспрессией CD33.
Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества белка, содержащего любой антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению, субъекту в течение времени, достаточного для предупреждения рака с экспрессией CD33.
Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающего введение терапевтически эффективного количества мультиспецифического белка, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению, субъекту в течение времени, достаточного для предупреждения рака с экспрессией CD33.
Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества CAR, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для предупреждения рака с экспрессией CD33.
- 125 047663
Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для предупреждения рака с экспрессией CD33.
Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей любой антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для предупреждения рака с экспрессией CD33.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта, включающему введение любого антигенсвязывающего домена, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта, включающему введение белка, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта, включающему введение мультиспецифического белка, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения количества экспрессирующих CD33 раковых клеток у субъекта, включающему введение CAR, который содержит любой антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта, включающему введение иммуноконъюгата по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта, включающему введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению субъекту в течение времени, достаточного для снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток.
В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой гематологический рак.
В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой лейкоз.
В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой лимфому.
В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой множественную миелому.
В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML).
В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой миелодиспластический синдром (MDS).
В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой острый лимфоцитарный лейкоз (ALL).
В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой диффузную Вкрупноклеточную лимфому (DLBCL).
В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой хронический миелоидный лейкоз (CML).
В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой бластное плазмацитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN).
В определенных вариантах осуществления рак с экспрессией CD33 представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML).
В некоторых вариантах осуществления рак является рецидивным, рефрактерным, злокачественным или любой их комбинацией.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения гематологического рака (например, лейкоза (в частности, AML), лимфомы или множественной миеломы) у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества мультиспецифического белка, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, субъекту в течение времени, достаточного для лечения гематологического рака, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
V H под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
V H под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
V H под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
- 126 047663
V H под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
V H под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
V H под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
V H под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
V H под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
V H под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87;
V H под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88;
VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272; или
VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82. В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85. В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87. В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271. В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272. В других вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения гематологического рака (например, лейкоза (в частности, AML), лимфомы или множественной миеломы) у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества мультиспецифического белка, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, субъекту в течение времени, достаточного для лечения гематологического рака, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
V H под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
V H под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
V H под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
V H под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
V H под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
V H под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
V H под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
V H под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения гематологического рака (например, лейкоза (в частности, AML), лимфомы или множественной миеломы) у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества мультиспецифического белка, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, субъекту в течение времени, достаточного для лечения гематологического рака, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
V H под SEQ ID NO: 18;
V H под SEQ ID NO: 19;
V H под SEQ ID NO: 20;
V H под SEQ ID NO: 21;
V H под SEQ ID NO: 22;
V H под SEQ ID NO: 23;
V H под SEQ ID NO: 24;
V H под SEQ ID NO: 25;
V H под SEQ ID NO: 26; или
V H под SEQ ID NO: 27.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения гематологического рака (например, лейкоза (в частности, AML), лимфомы или множественной миеломы) у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества мультиспецифического белка, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, субъекту в течение времени, достаточного для лечения гематологического рака, где антигенсвязывающий домен, которые связывают CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 274, 275 или 276.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213, 216, 219, 274, 275 или 276.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам предупреждения рака, при этом способы включают введение количества лимфоцита, экспрессирующего один или несколько из описанных CAR, субъекту, нуждающемуся в этом.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения субъекта, имеющего рак, при этом способы включают введение терапевтически эффективного количества лимфоцита, экспресси
- 127 047663 рующего один или несколько из описанных CAR, субъекту, нуждающемуся в этом, с индуцированием или модулированием при этом лимфоцитом уничтожения раковых клеток у субъекта.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам снижения опухолевой нагрузки у субъекта, имеющего рак, при этом способы включают введение терапевтически эффективного количества лимфоцита, экспрессирующего один или несколько из описанных CAR, субъекту, нуждающемуся в этом, с индуцирование при этом лимфоцитом уничтожения гематологических раковых клеток у субъекта. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам повышения выживаемости субъекта, имеющего рак, при этом способы включают введение терапевтически эффективного количества лимфоцита, экспрессирующего один или несколько из описанных CAR, субъекту, нуждающемуся в этом, с продлением тем самым срока выживаемости субъекта. В целом, лимфоциты, экспрессирующие CAR, индуцируют уничтожение гематологических раковых клеток у субъекта и приводят к уменьшению или уничтожению гематологических опухолей/раковых клеток у субъекта. Неограничивающий перечень гематологических раковых заболеваний, включая метастатические поражения, которые могут быть мишенью, включает лейкоз, лимфому, множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления гематологический рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелоидный лейкоз (CML) или бластное плазмоцитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN).
В одном аспекте представлены способы лечения субъекта, имеющего рак, которые включают введение терапевтически эффективного количества лимфоцита, экспрессирующего CAR, имеющий внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывает антиген CD33, субъекту, нуждающемуся в этом, с индуцированием при этом лимфоцитом уничтожения раковых клеток у субъекта.
В одном аспекте раскрыт способ целевого уничтожения раковой клетки, при этом способ включает приведение раковой клетки в контакт с лимфоцитом, экспрессирующим один или несколько из описанных CAR, с индуцированием при этом лимфоцитом уничтожения раковой клетки. Неограничивающий перечень раковых клеток, включая гематологические раковые клетки, которые могут быть мишенью, включает клетки лейкоза, лимфомы, множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления гематологический рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелоидный лейкоз (CML) или бластное плазмоцитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN).
Когда указано терапевтически эффективное количество, тогда точное количество CAR или CAR-Tклеток по настоящему изобретению, подлежащих введению, может быть определено врачом с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе, размере опухоли, степени инфекции или метастазирования и состояния субъекта. В целом можно утверждать, что фармацевтическая композиция, содержащая Тклетки, описанные в данном документе, может быть введена при дозе от приблизительно 104 до приблизительно 1010 клеток/кг массы тела, в некоторых случаях от приблизительно 105 до приблизительно 106 клеток/кг массы тела, включая все целые значения в этих диапазонах. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая Т-клетки, описанные в данном документе, может быть введена при дозе, составляющей приблизительно 10 клеток/кг массы тела. Композиции Т-клеток также можно вводить многократно в таких дозах. Клетки можно вводить с использованием инфузионных методик, которые обычно известны в иммунотерапии (см., например, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).
Системы доставки, пригодные в контексте CAR-T-клеток по настоящему изобретению, могут включать системы доставки высвобождением по времени, с замедленным высвобождением и пролонгированным высвобождением, так что доставка композиций Т-клеток происходит до и в течение времени, достаточного, чтобы вызвать сенсибилизацию участка, подлежащего лечению. Композиция может быть использована в сочетании с другими терапевтическими средствами или способами терапии. Такие системы позволяют избежать повторных введений композиции, тем самым повышая удобство для субъекта и врача, и могут быть особенно подходящими для определенных вариантов осуществления композиции по настоящему изобретению.
Многие типы систем доставки с высвобождением доступны и известны специалистам в данной области. Они включают полимерные базовые системы, такие как поли(лактид-гликолид), сополиоксалаты, сложные полиэфирамиды, сложные полиортоэфиры, поликапролактоны, полигидроксимасляная кислота и полиангидриды. Микрокапсулы из вышеперечисленных полимеров, содержащие лекарственные средства, описаны, например, в патенте США № 5075109. Системы доставки также включают неполимерные системы, которые представляют собой липиды, включая стерины, такие как холестерин, сложные эфиры холестерина и жирные кислоты, или нейтральные жиры, такие как моно-, ди- и триглицериды; силастиковые системы; системы на основе пептидов; гидрогелевые системы высвобождения; восковые покрытия; прессованные таблетки с использованием традиционных связующих и вспомогательных веществ; частично слитые имплантаты и т.п. Конкретные примеры включают без ограничения: (а) эрозионные системы, в которых активная композиция содержится в форме внутри матрицы, например описанные в
- 128 047663 патентах США №№ 4452775, 4667014, 4748034 и 5239660, и (b) диффузионные системы, в которых активный компонент проникает с контролируемой скоростью из полимера, например описанные в патентах США №№ 3854480 и 3832253. Кроме того, могут использоваться аппаратные системы доставки на основе насосов, некоторые из которых приспособлены для имплантации.
В определенных аспектах может быть необходимым введение активированных Т-клеток субъекту, а затем последующий забор крови (или проведение афереза), активация Т-клеток по настоящему изобретению и повторное введение субъекту этих активированных и размноженных Т-клеток. Этот процесс может проводиться несколько раз каждые несколько недель. В определенных аспектах Т-клетки могут быть активированы при заборе крови объемом от 10 см3 до 400 см3. В определенных аспектах Т-клетки активируют при заборе крови объемом 20 см3, 30 см3, 40 см3, 50 см3, 60 см3, 70 см3, 80 см3, 90 см3 или 100 см3.
Введение CAR-T-клеток и композиций можно осуществлять любым способом, например путем парентерального или не парентерального введения, в том числе путем ингаляции аэрозоля, инъекции, инфузий, приема внутрь, переливания, имплантации или трансплантации. Например, CAR-T-клетки и композиции, описанные в данном документе, могут быть введены пациенту трансартериально, внутрикожно, подкожно, интратуморально, интрамедуллярно, интранодально, внутримышечно, путем внутривенной (i.v.) инъекции или внутрибрюшинно. В одном аспекте композиции по настоящему изобретению вводят путем i.v. инъекции. В одном аспекте композиции по настоящему изобретению вводят субъекту путем внутрикожной или подкожной инъекции. Композиции Т-клеток могут быть инъецированы, например, непосредственно в опухоль, лимфатический узел, ткань, орган или участок инфекции.
Введение может быть аутологичным или неаутологичным. Например, иммунореактивные клетки, экспрессирующие CD33-специфический CAR, могут быть получены от одного субъекта и введены тому же субъекту или другому, совместимому субъекту. Полученные из периферической крови Т-клетки по настоящему изобретению или размноженные Т-клетки (например, полученные in vivo, ex vivo или in vitro) можно вводить, например, путем внутривенной инъекции, локализованной инъекции, системной инъекции, катетерного введения или парентерального введения.
В конкретных вариантах осуществления субъектов можно подвергать лейкаферезу, при котором лейкоциты собирают, обогащают или истощают ex vivo для отбора и/или выделения представляющих интерес клеток, например Т-клеток. Эти изоляты Т-клеток могут быть размножены способами, известными в уровне техники, и обработаны таким образом, чтобы ввести одну или несколько конструкций CAR по настоящему изобретению с созданием тем самым CAR-T-клеток. Субъекты, нуждающиеся в этом, могут впоследствии пройти стандартное лечение химиотерапией при высокой дозе с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В определенных аспектах после трансплантации или одновременно с ней субъекты получают инфузию размноженных CAR-T-клеток. В одном аспекте размноженные клетки вводят до или после хирургического вмешательства.
Доза, вводимая пациенту, имеющему злокачественную опухоль, достаточна для облегчения или по меньшей мере частичной остановки заболевания, подлежащего лечению (терапевтически эффективное количество). Доза вышеуказанных средств лечения для введения субъекту будет варьироваться в зависимости от точной природы состояния, подлежащего лечению, и от реципиента лечения. Масштабирование доз для введения человеку может быть выполнено в соответствии с общепринятой в данной области практикой.
Т-Клетки с CAR по настоящему изобретению можно подвергать экспансии Т-клеток in vivo и можно образовывать CD33-специфические клетки памяти, которые сохраняются на высоких уровнях в течение длительного времени в крови и костном мозге. В некоторых случаях Т-клетки с CAR по настоящему изобретению, вводимые инфузией субъекту, могут уничтожать раковые клетки, например гематологические раковые клетки, in vivo у субъектов с запущенным раком, устойчивым к химиотерапии.
В одном варианте осуществления CAR по настоящему изобретению вводят в Т-клетки, например с применением in vitro транскрипции, и субъект (например, человек) получает начальное введение CAR-Tклеток по настоящему изобретению и одно или несколько последующих введений CAR-T-клеток, где одно или несколько последующих введений вводят менее чем через 15 дней, например 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 дня, после предыдущего введения. В одном варианте осуществления субъекту (например, человеку) вводят более одного введения CAR-T-клеток в неделю, например 2, 3 или 4 введения CAR-T-клеток в неделю. В одном варианте осуществления субъект получает более одного введения CAR-T-клеток в неделю (например, 2, 3 или 4 введения в неделю) (также упоминается в данном документе как цикл), после чего следует неделя без введений CAR-T-клеток, а затем субъекту вводят одно или несколько дополнительных введений CAR-T-клеток (например, более одного введения CAR-Tклеток в неделю). В другом варианте осуществления субъект получает более одного цикла CAR-Tклеток, и время между каждым циклом составляет менее 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 дней. В одном варианте осуществления CAR-T-клетки вводят через день по 3 введения в неделю. В одном варианте осуществления CAR-T-клетки вводят в течение по меньшей мере двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или более недель.
В одном варианте осуществления введение можно повторять через один день, два дня, три дня, четыре дня, пять дней, шесть дней, одну неделю, две недели, три недели, один месяц, пять недель, шесть
- 129 047663 недель, семь недель, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев и более. Возможны повторные курсы лечения, а также постоянное введение. Повторное введение может осуществляться при той же дозе или при другой дозе.
CAR-T-Клетки можно вводить в способах по настоящему изобретению посредством поддерживающей терапии, такой как, например, один раз в неделю на протяжении периода 6 месяцев или больше.
В одном варианте осуществления CAR-T-клетки создают с использованием лентивирусных вирусных векторов, таких как лентивирус. CAR-T-Клетки, созданные с помощью таких вирусных векторов, обычно характеризуются стабильной экспрессией CAR.
В одном варианте осуществления CAR-T-клетки временно экспрессируют векторы CAR в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 дней после трансдукции. На временную экспрессию CAR может влиять доставка вектора РНК CAR. В одном варианте осуществления РНК CAR трансдуцируют в Т-клетку путем электропорации.
Если пациент подвержен высокому риску развития ответа антител к CAR во время транзиторной терапии с помощью CAR (например, в результате трансдукции РНК), то перерывы в инфузии CAR-Tклеток не должны длиться более десяти-четырнадцати дней.
Виды комбинированной терапии.
Связывающие CD33 белки по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим средством.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство представляет собой хирургическое вмешательство, химиотерапию или облучение или любую их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления доставка одного средства лечения все еще продолжается, когда начинается доставка второго, так что в плане введения происходит перекрывание. В данном документе это иногда называют одновременной или параллельной доставкой. В других вариантах осуществления доставка одного средства лечения заканчивается до начала введения другого средства лечения. В некоторых вариантах осуществления в любом случае лечение является более эффективным благодаря комбинированному введению. Например, второе средство лечения более эффективно, например эквивалентный эффект наблюдается при меньшем количестве второго средства лечения, или второе средство лечения уменьшает симптомы в большей степени, чем если бы второе средство лечения вводили в отсутствие первого средства лечения, или наблюдается ситуация, аналогичная первому средству лечения. В некоторых вариантах осуществления доставка осуществляется таким образом, что уменьшение симптома или другого параметра, связанного с нарушением, больше, чем наблюдалось бы при применении одного средства лечения в отсутствие другого. Эффект от двух видов лечения может быть частично аддитивным, полностью аддитивным или более чем аддитивным. Доставка может быть такой, что эффект от первого средства лечения все еще можно обнаружить при доставке второго.
В одном варианте осуществления другие терапевтические средства, такие как факторы, можно вводить до, после или в одно и то же время (одновременно) со связывающими CD33 белками, например, CAR-T-клетками, включая без ограничения интерлейкины, а также колониестимулирующие факторы, такие как G-, М- и GM-CSF, а также интерфероны.
Связывающие CD33 белки, такие как CAR-экспрессирующие клетки, описанные в данном документе, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство можно вводить одновременно, в одной и той же или в отдельных композициях, или последовательно. При последовательном введении связывающие CD33 белки, такие как CAR-экспрессирующие клетки, описанные в данном документе, могут быть введены первыми, а дополнительное средство может быть введено вторым, или порядок введения может быть обратным.
В дальнейших вариантах осуществления связывающие CD33 белки, такие как CARэкспрессирующие клетки, описанные в данном документе, можно применять в схеме лечения в комбинации с хирургическим вмешательством, облучением, химиотерапией, иммуносупрессивными средствами, антителами или другими иммунодеструктивными средствами. В одном варианте осуществления субъекту может быть введено средство, которое усиливает активность CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном варианте осуществления средство может представлять собой средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу.
Следующие примеры приведены для дальнейшего описания некоторых вариантов осуществления, раскрытых в данном документе. Примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения раскрытых вариантов осуществления.
Примеры
Настоящее изобретение также описано и продемонстрировано с помощью следующих примеров. Однако применение этих и других примеров в любом месте описания является исключительно иллюстративным и никоим образом не ограничивает объем и суть настоящего изобретения или любого приведенного в качестве примера термина. Подобным образом, настоящее изобретение не ограничено какимилибо конкретными предпочтительными вариантами осуществления, описанными в данном документе. Действительно, многие модификации и вариации по настоящему изобретению могут быть очевидны
- 130 047663 специалистам в данной области после прочтения настоящего описания, и такие вариации могут быть сделаны без отклонения от сути или объема настоящего изобретения. Поэтому настоящее изобретение подлежит ограничению только терминами прилагаемой формулы изобретения, а также полным объемом эквивалентов, применимых к такой формуле изобретения.
Пример 1. Создание антигена.
Конструкции экспрессии, кодирующие внеклеточный домен (ECD) CD33 человека или его субдомены, конструировали на основе последовательности поверхностного антигена миелоидных клеток CD33 (Uniprot, № доступа Р20138) и аннотации его домена с последовательностью либо 6Х His-метка, либо в виде слитого белка с вариантом C34S сывороточного альбумина человека (HSA) с последовательностью 6Х His-метки на С-конце. Аналогичные конструкции экспрессии, кодирующие CD33 (ECD) или его субдомены от яванского макака (Масаса fascicularis), конструировали на основе NCBI № доступа ХР_005590138.1. Аминокислотные последовательности созданных антигенов представлены в табл. 3. Конструкции экспрессии полноразмерного ECD или субдомена CD33 человека и яванского макака временно трансфицировали в полученные из клеток HEK293, Expi293 (Gibco/Thermo Fisher Scientific) с использованием Expifectamine согласно протоколу производителя. Перед сбором клетки инкубировали 5 дней при 37°C с 8% CO2 на орбитальном шейкере. Экспрессированные клетки удаляли центрифугированием, а растворимые белки CD33 с his-метками очищали от среды с применением аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов на смоле Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare), а затем меняли буфер на 1X фосфатно-солевой буфер Дубелько рН 7,2 без кальция или магния с использованием колонок Zeba™ Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 10 мл; ThermoScientific, номер по каталогу 89893 в соответствии со описаниями производителя.
Таблица 3
Аминокислотные последовательности антигенов CD33
| ID белка AA | Описание | Аминокислотная последовательность |
| C33W1 | HSA N-концевое слияние; CynoCD33ECDHSA(C34S)6xHis | DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRN SPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQG RFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGS TKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKN LTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSV LIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSY ASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGSGSGSENLYFQG VRS S SDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAF AQ YL QQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSL HTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNEC FLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLK KYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAA DKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFG |
- 131 047663
| ERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVH TECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKEC CEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKD VCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLR LAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEE PQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYL SVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFS ALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKK QTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCC KADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHH HH (SEQ Ш NO: 225) | ||
| C33W2 | HSA N-концевое слияние; человеческий CD33ECD-TevHSA(C34S)6xHis | DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKN SPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGR FRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGST KYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLT CSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIIT PRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVP QNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSGSGSENLYFQ GVRS S SD AHKSE VAHRFKDLGEENFK AL VLIAF AQ YLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERN ECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETF LI<I<YLYEIARRHPYFYAPELLFFAI<RYI<AAFTECCQ AADK AACLLPKLDELRDEGK AS S AKQRLKC ASLQK FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLK ECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVES |
- 132 047663
| KDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLL LRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLV EEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQ VSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDY LSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCF SALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKK QTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCC KADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHH НН (SEQ Ш NO: 226) | ||
| C33W3 | HSA N-концевое слияние; hCD33 Ig-подобный домен V-типа (Uniprot P20138, V136-H259), слитый c HSA и 6xHi s-меткой на С-конце | DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKN SPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGR FRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGST KYSYKSPQLSVHVTDLTHRDAHKSEVAHRFKDLGE ENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKT CVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEM ADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDV MCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFA KRYKAAFTECCQ AADKAACLLPKLDELRDEGKAS S AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMP ADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY ARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHEC YAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKH PEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTK CCTESLVNRRPCF S ALEVDET YVPKEFNAETFTFHA DICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAV |
- 133 047663
| MDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQA ALGLHHHHHH (SEQ Ш NO: 227) | ||
| C33W4 | HSA N-концевое слияние; Igподобный домен С2-типа hCD33 (Uniprot Р20138, V136-H259), слитый с HSA и 6xHi s-меткой на С-конце | VHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQ GTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTN LTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPG DGSGKQETRAGVVHDAHKSEVAHRFKDLGEENFK ALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVA DESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADC CAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCT AFHDNEETFLI<I<YLYEIARRHPYFYAPELLFFAI<RY KAAFTECCQ AADKAACLLPKLDELRDEGK AS S AKQ RLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEV SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICE NQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADL PSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARR HPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAK VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALL VRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEA KRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCT ESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICT LSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL НННННН (SEQ Ш NO: 228) |
| C33W8 | hCD33_Igподобный домен V-типа | DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKN SPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGR FRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGST |
- 134 047663
| KYSYKSPQLSVHVTDLTHRGSHHHHHH (SEQ ID NO: 229) | ||
| C33W9 | Ig-подобный домен С2-типа hCD33 | VHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQ GTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTN LTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPG DGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH (SEQ ID NO: 230) |
| C33W1 0 | MuIgV Hu IgC2 химера CD336xHis_vl | QDLEFQLVAPESVTVEEGLCVHVPCSVFYPSIKLTL GPVTGSWLRKGVSLHEDSPVATSDPRQLVQKATQG RFQLLGDPQKHDCSLFIRDAQKNDTGMYFFRVVRE PFVRYSYKKSQLSLHVTSLSRTPKILIPGTLEPGHSK NLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSV LIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVT YVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH (SEQ ID NO: 231) |
| C33W1 2 | MuIgV_cyno IgC2 химера CD33-6xHis_vl | QDLEFQLVAPESVTVEEGLCVHVPCSVFYPSIKLTL GPVTGSWLRKGVSLHEDSPVATSDPRQLVQKATQG RFQLLGDPQKHDCSLFIRDAQKNDTGMYFFRVVRE PFVRYSYKKSQLSLHVTSLSRTPQILIPGALDPDHSK NLTCS VPW ACEQGTPPIF SWMS AAPTSLGLRTTHS S VLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVS YASQNPRTDIFLGDGSGRKARKQGVVQGSHHHHH H (SEQ ID NO: 232) |
| C33W4 9 | CD33 человека ECD (D18-H259) | DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKN SPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGR |
- 135 047663
| из Uniprot Р20138сСконцевой меткой 6xHis | FRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGST KYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLT С S VSW ACEQGTPPIF S WLS AAPTSLGPRTTHS S VLIIT PRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVP QNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH (SEQ Ш NO: 233) | |
| C33W5 0 | Cyno CD33 ECD (D37-Q274) из ХР_005590138.1 с С-концевой меткой 6xHis | DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRN SPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQG RFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGS TKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKN LTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSV LIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSY ASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGSHHHHHH (SEQ Ш NO: 234) |
| C33W5 1 | CD33 человека ECD (D18-G241) из Uniprot Р20138 с меткой 6xHis | DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKN SPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGR FRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGST KYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLT CSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIIT PRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVP QNPTTGHHHHHH (SEQIDNO: 235) |
Пример 2. Создание антител к CD33.
Антитела создавали с помощью технологии Open Monoclonal Technologies (ОМТ) или технологий Ablexis с использованием трансгенных мышей следующим образом. Трансгенных мышей AlivaMab и ОМТ создавали способами генной инженерии для получения иммуноглобулинов человека/мыши. Трансгенных мышей AlivaMab или ОМТ иммунизировали рекомбинантным человеческим белком CD33 (выбор антигенов из табл. 1). Лимфоциты экстрагировали из вторичных лимфоидных органов и либо сливали с клеточной линией миеломы мыши FO для получения гибридомы, либо подвергали сортингу отдельных клеток с помощью FACS. Надосадочные жидкости гибридомы подвергали скриннингу с помощью электрохемилюминесценции MSD в отношении связывания с надэкспрессирующими ECD CD33 человека клетками НЕК. Образцы, идентифицированные в результате скрининга, далее анализировали с помощью FACS в отношении связывания с надэкспрессирующими ECD CD33 человека клетками HEK (положительный сигнал) по сравнению с исходными клетками HEK (отрицательный сигнал). Подтвержденные клеточные связывания подвергали изотипированию по легкой цепи с применением ELISA. Надосадочные жидкости для сортинга отдельных клеток подвергали скриннингу с помощью электрохемилюминесценции MSD в отношении связывания с рекомбинантным человеческим белком CD33. Отбирали и секвенировали несколько хитов с необходимым профилем связывания.
Клонирование V области проводили следующим образом. Как РНК, очищенную с помощью набора Qiagen® RNeasy Plus Mini Kit, так и лизат В-клеток использовали для выполнения синтеза cDNA с использованием набора для синтеза cDNA Smarter (Clontech, Маунтин-Вью, штат Калифорния, США). Для облегчения синтеза cDNA использовали oligodT для первичной обратной транскрипции всех мессенджерных РНК с последующим 5'-кэппингом с олигонуклеотидом Smarter IIA. Последующую амплификацию фрагментов VH и VL проводили с использованием 2-стадийной ПЦР-амплификации с использованием 5'-праймеров, нацеленных на кэп Smarter IIA, и 3'-праймеров, нацеленных на консенсусные области в СН1. Вкратце, каждая реакционная смесь для ПЦР объемом 50 мкл состоит из 20 мкМ смесей прямых и обратных праймеров, 25 мкл премикса ДНК-полимеразы PrimeStar Max (Clontech), 2 мкл неочищенной cDNA и 21 мкл дважды дистиллированной Н2О. Программу циклирования начинают при
- 136 047663
94°C в течение 3 мин, затем 35 циклов (94°C в течение 30 с, 55°C в течение 1 мин, 68°C в течение 1 мин) и заканчивают при 72°C в течение 7 мин. Второй раунд ПЦР проводили с использованием праймеров второго раунда VL и VH, содержащих 15 п. н. комплементарных удлинений, которые перекрывают соответствующие области в соответствующем ему материнском векторе Lonza (VH и VL). ПЦР второго раунда проводили по следующей программе: 94°C в течение 3 мин; 35 циклов (94°C в течение 30 с, 55°C в течение 1 мин, 68°C в течение 1 мин) и завершение при 72°C в течение 7 мин. Для направленного клонирования гена VL в вектор Lonza huIgK или Lambda и гена VH в вектор Lonza huIgG1 использовали набор In-Fusion® HD Cloning Kit (Clonetech, США). Для облегчения клонирования In-Fusion® HD продукты ПЦР обрабатывали Cloning Enhancer перед проведением клонирования In-Fusion® HD. Клонирование и трансформацию проводили в соответствии с протоколом производителя (Clonetech, США). ДНК, полученную с помощью набора mini-prep, подвергали секвенированию по Сэнгеру для подтверждения получения полных фрагментов V-гена.
В табл. 4 приведены аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей каждого из антител, полученных вышеуказанными способами.
Таблица 4
| Название антитела | Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей (CDR согласно системе Kabat выделены жирным шрифтом и подчеркнуты) |
| СЗЗВ1474 | VH: OVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKG LEWVANIKRDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMSSLRA EDT AVYYC VRD YGYFDFWGOGTL УТ VS S (SEQIDNO: 52) VL: DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCOASOAISNYLNWYOOKPGKAPK LLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLOPEDFSTYFCQHYD NLPYTFGOGTKLEIK (SEQ Ш NO: 81) |
| СЗЗВ1522 | VH: OVOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIROPPGKGL EWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNOFSLKLSSVTAADT AVYYCARMWEILGFDPWGOGTLVTVS (SEQ Ш NO: 53) VL: |
- 137 047663
| OSVLTOPPSASGTPGORVTISCSGSSSNIGSNPVNWYOQLPGTAPK LLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAA WDDSLNGPVFGGGTKLTVL (SEQ Ш NO: 82) | |
| C33B1607 | VH: EVOLOQSGPELVKPGSSVKISCKASGYTFTDYNINWVKOSHGKN LEWIGTINPNNGVTFYNQRFKGQ ATLTVDKS S STAYMELRSLTS EDSAVYYCSRDGYDTYYAMDYWGOGTTLTVSS (SEQ ID NO: 54) VL: DIVMTOSHKFMSTSVGDRVSITCKASODVRTAEAWYOQKPGOSP KLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVOAEDLAVYYCQ OYYTTPRTFGGGTKLEIK (SEQ Ш NO: 83) |
| C33B1601 | VH: EVQLVESGGGLVRPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVROTPEKR LEWVAGISNSGYSLYYPDTLKGRFTISRDNARNTLYLQMISLRSE DTAMYYCARDGGSYPYAMDYWGHGTSVTVSS (SEQ Ш NO: 55) VL: DIVMTOSOKFMSTSVGDRVSVTCKASONVGTYVAWYOQKPGHS PKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVOSEDLADYFCO QYKSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 84) |
| C33B1517 | VH: OVOLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIROTAGKGL EWLGHIYSTGNIHYNPSLKSRVTMSVDTSNNOFSLKLRSVTAAD TAVYYCARDNGAALFDYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 56) |
- 138 047663
| VL: OSVLTOPPSASGTPGORVTISCSGSSSNIGSNIVNWYOQFPGTAPK LLIYSNNORPSGVPDRVSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAA WDDSLNGPVFGPGTKVTVL (SEQ ID NO: 85) | |
| C33B1495 | VH: EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSYWMSWVROAPGKG LDWVANIKRDGSEKHYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLR AEDSAVYYCTRDYGYFDYWGOGTLVTVSS (SEQ Ш NO: 57) VL: DIOLTOSPSFLSASVGDRVTITCRASOGISSYLAWYOQKPGKAPK VLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLOPEDFATYFCOOL NSYPVTFGGGTKVEIK (SEQ Ш NO: 86) |
| C33B1478 | VH: EVOLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVROASGKG LEWIGRIRSKGNSYATAYDVSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSL KTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGOGTTVTVSS (SEQ Ш NO: 58) VL: DIVMTOSPLSLPVTPGEPASISCKSSOSLLFSNGYKFLDWYLQRP GOSPOLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLY YCMQALQTPPTFGGGTKVEIK (SEQ Ш NO: 87) |
| C33B1477 | VH: EVOLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVROASGKG LEWIGRIRSKGNSYATAYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSL KTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGOGTTVTVSS (SEQ Ш |
- 139 047663
| NO: 59) VL: DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLFSNGYKFLDWYLQRP GOSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLY YCMQALQTPPTFGGGTKVEIK (SEQ Ш NO: 87) | |
| C33B1476 | VH: EVOLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVROASGKG LEWIGRIRSKGNSYATAYNVSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSL KTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGOGTTVTVSS (SEQ Ш NO: 60) VL: DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLFSNGYKFLDWYLQRP GOSPOLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLY YCMQALQTPPTFGGGTKVEIK (SEQ Ш NO: 87) |
| C33B1484 | VH: EVOLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVFAIHWVROASGKG LEWIGRIRSKGNSYATAYDVSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSL KTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGOGTTVTVSS (SEQ Ш NO: 61) VL: DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLFSNGYKFLDWYLQRP GOSPOLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLY YCMQALQTPPTFGOGTKVEIK (SEQ Ш NO: 88) |
- 140 047663
| C33B933 | VH: OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROSPGK GLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMNSLR AEDTAVYYCAKDFRSLDWLPPDSTSYDGMDVWGOGTTVTVSS (SEQ ID NO: 95) VL: SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGHKLGDKYASWYQQKPGQSPVV VIYKDSKRPSGIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAW DSSTVVFGGGTKLTVL (SEQ Ш NO: 105) |
| C33B919 | VH: OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROAPGK GLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSTSYYGMDVWGOGTTVTVSS (SEQ ID NO: 96) VL: SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVSWYQQKPGQSPVV VIHQDRKRPSGIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAW DSSTVVFGGGTKLTVL (SEQ Ш NO: 106) |
| C33B931 | VH: EVOLVESGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVROAPGK GLEWVANIKQHGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSL RAEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 97) |
- 141 047663
| VL: SYELTOPPSVSVSPGOTASITCSGDKLGSKFASWYOQKPGOSPVL VIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTOAMDEADYYCOAW DSSTVVFGGGTKLTVL (SEQ Ш NO: 107) | |
| C33B836 | VH: OVOLVQSGSELRKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVROAPGO GLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVF SLDT S VS S AYLQIS SLK AEDT AMYYC ATP RDRGTD YWGOGTL VT VSS (SEQ Ш NO: 170) VL: OSALTOPASVSGSPGOSITISCTGTSSDVGDYNYVSWYOQHPGKV PKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSMSGNTASLTISGLQAEDEADYYC SSYSSSSALEVFGGGTKLTVL (SEQ Ш NO: 185) |
| C33B782 | VH: EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVROAPGK GLEWVANIKQHGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSL RAEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 171) VL: SYELTOPPSVSVSPGOTASITCSGNKLGAKFASWYOQKPGOSPVL VIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTOAVDEADYYCOAW DSSTVVFGGGTKLTVL (SEQ Ш NO: 188) |
| C33B806 | VH: OLOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIROPPGKG |
- 142 047663
| LDWIGSINYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLRSVTAADT AVYYCARLDGYESPFDYWGOGTLVTVSS (SEQ Ш NO: 175) VL: DIOMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYOQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOO ANSFPFTFGPGTKVDIK (SEQ Ш NO: 192) | |
| C33B904 | VH: EVOLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVROAPGK GLEWVSGIGWSGGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLR AEDTALYYCAKDSPYGDFFDYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 179) VL: DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOTVFYSSNNKNYLAWYOQ KPGOPPKLLISWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAEDV AVYYCQHYYSTPYTFGOGTKLEIK (SEQ Ш NO: 196) |
| C33B937 | VH: OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVROAPGK GLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEGTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSASYHGMDVWGOGTTVTVSS (SEQ Ш NO: 181) VL: SYELTQPPSVSVSPGOTASITCSGDKLGDKYASWYOQKPGOSPVL VIYQDGKRPSGIPERFSGSNFGNKATLTISGTOAMDEADYYCOA WDRNTVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 200) |
- 143 047663
| C33B125 | VH: OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGK GLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSTSYYGMDVWGOGTTVTVSS (SEQ Ш NO: 96) VL: SYELTOPPSVSVSPGOTASITCSGDKLGDKYVCWYOQKPGOSPV VVIHODRKRPSGIPERFSGSNFGNTATLTISGTOAMDEADYYCOA WDSSTVVFGGGTKLTVL (SEQ Ш NO: 202) |
| C33B1475 | VH: EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVROAPGK GLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDSAKNSLYLOMNSL RAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGOGTLVTVSS (SEQ Ш NO: 262) VL: DIVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSSOSLLHSDGYNYLDWYLQKS GOSPOLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIY YCMQVLQTPWTFGOGTKVEIK (SEQ ID NO: 271) |
| C33B1516 | VH: OVOLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIROSAGKEL EWFGHIFSTGHINYDSSLKSRVTMSVDTSNNOFSLKLRSVTAAD TAVYYCARDNGAALFDFWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 263) |
- 144 047663
| VL: OSVLTOPPSASGTPGORVTISCSGSSSNIGSNIVNWYOQFPGTAPK LLLYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAA WDDSLNGPVFGTGTKVTVL (SEQ Ш NO: 272) | |
| C33B1481 | VH: OVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSNYWMSWVROAPGK GLEWVASIKRDGSDKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLSLQMHSLR AEDTAVYYCAKGEFDYWGOGTLVTVSS (SEQ Ш NO: 264) VL: DVVMTOSPLSLPVTLGOPASISCRSSOSLVYSDGNTYLNWFOQRP GOSPRRLIYKVSTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVAV YYCLQGTHWPWTFGOGTKVEIK (SEQ Ш NO: 273) |
В табл. 4а показаны аминокислотные последовательности последовательностей CDR антитела С33В1522 (антитела с VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82), определяемые согласно системам AbM, Kabat, Chothia, IMGT и Contact.
- 145 047663
Таблица 4 а
| HC1 | HC2 | HC3 | LC1 | LC2 | LC3 | |
| AbM | GGSISSY YWG (SEQ ID NO: 399) | YIYYSGST N (SEQ Ш NO: 405) | MWEIL GFDP (SEQ ID NO: 411) | SGSSSNIGS NPVN (SEQ ID NO: 417) | SNNQRP S (SEQ Ш NO: 423) | AAW DDSL NGPV (SEQ ID NO: 429) |
| Kabat | SYYWG (SEQ ID NO: 29) | YIYYSGST NYNPSLKS (SEQ Ш NO: 37) | MWEIL GFDP (SEQ ID NO: 46) | SGSSSNIGS NPVN (SEQ ID NO: 63) | SNNQRP S (SEQ Ш NO: 70) | AAW DDSL NGPV (SEQ ID NO: 76) |
| Chothi a | GGSISSY (SEQ ID NO: 435) | YYSGS (SEQ Ш NO: 441) | MWEIL GFD (SEQ ID NO: 447) | SSSNIGSNP (SEQ Ш NO: 453) | SNN (SEQ ID NO: 459) | WDDS LNGP (SEQ ID NO: 465) |
| IMGT | GGSISSY Y (SEQ Ш NO: 471) | IYYSGST (SEQ Ш NO: 477) | ARMWE ILGFDP (SEQ ID NO: 483) | SSNIGSNP (SEQ Ш NO: 489) | SNN (SEQ ID NO: 495) | AAW DDSL NGPV (SEQ ID NO: 501) |
| Conta Ct | SSYYWG (SEQ ID NO: 507) | WIGYIYYS GSTN (SEQ ID NO: 513) | ARMWE ILGFD (SEQ ID NO: 519) | IGSNPVNW Y (SEQ Ш NO: 525) | LLIYSN NQRP (SEQ ID NO: 531) | AAW DDSL NGP (SEQ ID NO: 537) |
В табл. 4b показаны аминокислотные последовательности последовательностей CDR антитела С33В1477 (антитела с VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87), определяемые согласно системам AbM, Kabat, Chothia, IMGT и Contact.
- 146 047663
Таблица 4b
| HC1 | HC2 | HC3 | LC1 | LC2 | LC3 | |
| AbM | GFTFSV SAIH | RIRSKGNS YATA (SEQ | HNDKWN YYGLDV | KSSQSLL FSNGYKF | LGSYRAS (SEQ ID | MQAL QTPPT |
| (SEQ ID NO: 400) | ID NO: 406) | (SEQ ID NO: 412) | LD (SEQ ID NO: 418) | NO: 424) | (SEQ ID NO: 430) | |
| Kabat | VSAIH (SEQ ID NO: 34) | RIRSKGNS YATAYAAS VKG (SEQ ID NO: 43) | HNDKWN YYGLDV (SEQ ID NO: 51) | KSSQSLL FSNGYKF LD (SEQ ID NO: 68) | LGSYRAS (SEQ ID NO: 74) | MQAL QTPPT (SEQ ID NO: 80) |
| Choth ia | GFTFSV S (SEQ ID NO: 436) | RSKGNSYA (SEQ ID NO: 442) | HNDKWN YYGLD (SEQ ID NO: 448) | SQSLLFS NGYKF (SEQ ID NO: 454) | LGS (SEQ ID NO: 460) | ALQTP P (SEQ ID NO: 466) |
| IMGT | GFTFSV SA (SEQ ID NO: 472) | IRSKGNSY AT (SEQ ID NO: 478) | TRHNDK WNYYGL DV (SEQ ID NO: 484) | QSLLFSN GYKF (SEQ ID NO: 490) | LGS (SEQ ID NO: 496) | MQAL QTPPT (SEQ ID NO: 502) |
| Conta Ct | SVSAIH (SEQ ID NO: 508) | WIGRIRSK GNSYATA (SEQ ID NO: 514) | TRHNDK WNYYGL D (SEQ ID NO: 520) | LFSNGYK FLDWY (SEQ ID NO: 526) | LLIYLGS YRA (SEQ ID NO: 532) | MQAL QTPP (SEQ ID NO: 538) |
В табл. 4с показаны аминокислотные последовательности последовательностей CDR антитела С33В1475 (антитела с VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271), определяемые согласно системам AbM, Kabat, Chothia, IMGT и Contact.
- 147 047663
Таблица 4с
| HC1 | HC2 | HC3 | LC1 | LC2 | LC3 | |
| AbM | GFTFSS YWMT (SEQ ID NO: 401) | NIKQDGSE RY (SEQ ID NO: 407) | EVGYNW NQGGYF DY (SEQ ID NO: 413) | RSSQSLLH SDGYNYLD (SEQ ID NO: 419) | LGSYR AS (SEQ ID NO: 425) | MQVL QTPWT (SEQ ID NO: 431) |
| Kabat | SYWMT (SEQ ID NO: 253) | NIKQDGSE RYYVDSV KG (SEQ ID NO: 256) | EVGYNW NQGGYF DY (SEQ ID NO: 259) | RSSQSLLH SDGYNYLD (SEQ ID NO: 265) | LGSYR AS (SEQ ID NO: 74) | MQVL QTPWT (SEQ ID NO: 269) |
| Choth ia | GFTFSS Y (SEQ ID NO: 437) | KQDGSE (SEQ ID NO: 443) | EVGYNW NQGGYF D (SEQ ID NO: 449) | SQSLLHSD GYNY (SEQ ID NO: 455) | LGS (SEQ ID NO: 461) | VLQTP W (SEQ ID NO: 467) |
| IMGT | GFTFSS YW (SEQ ID NO: 473) | IKQDGSER (SEQ ID NO: 479) | AREVGY NWNQGG YFDY (SEQ ID NO: 485) | QSLLHSDG YNY (SEQ ID NO: 491) | LGS (SEQ ID NO: 497) | MQVL QTPWT (SEQ ID NO: 503) |
| Conta Ct | SSYWM T(SEQ ID NO: 509) | WVANIKQ DGSERY (SEQ ID NO: 515) | AREVGY NWNQGG YFD (SEQ ID NO: 521) | LHSDGYNY LDWY (SEQ ID NO: 527) | LLIYL GSYRA (SEQ ID NO: 533) | MQVL QTPW (SEQ ID NO: 539) |
В табл. 4d показаны аминокислотные последовательности последовательностей CDR антитела С33В1517 (антитела с VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85), определяемые согласно системам AbM, Kabat, Chothia, IMGT и Contact.
- 148 047663
Таблица 4d
| HC1 | HC2 | HC3 | LC1 | LC2 | LC3 | |
| AbM | GASIR NYYW S (SEQ ID NO: 402) | HIYSTGNIH (SEQ Ш NO: 408) | DNGAAL FDY (SEQ ID NO: 414) | SGSSSNIGS NIVN (SEQ Ш NO: 420) | SNNQRP S (SEQ ID NO: 426) | AAWDD SLNGPV (SEQ ID NO: 432) |
| Kabat | NYYW S (SEQ ID NO: 32) | HIYSTGNIH YNPSLKS (SEQ Ш NO: 40) | DNGAAL FDY (SEQ Ш NO: 49) | SGSSSNIGS NIVN (SEQ Ш NO: 66) | SNNQRP S (SEQ ID NO: 70) | AAWDD SLNGPV (SEQ ID NO: 76) |
| Chothi a | GASIR NY (SEQ ID NO: 438) | YSTGN (SEQ Ш NO: 444) | DNGAAL FD (SEQ ID NO: 450) | SSSNIGSNI (SEQ ID NO: 456) | SNN (SEQ ID NO: 462) | WDDSL NGP (SEQ ID NO: 468) |
| IMGT | GASIR NYY (SEQ ID NO: 474) | IYSTGNI (SEQ Ш NO: 480) | ARDNGA ALFDY (SEQ ID NO: 486) | SSNIGSNI (SEQ ID NO: 492) | SNN (SEQ ID NO: 498) | AAWDD SLNGPV (SEQ ID NO: 504) |
| Conta Ct | RNYY WS (SEQ ID NO: 510) | WLGHIYST GNIH (SEQ ID NO: 516) | ARDNGA ALFD (SEQ ID NO: 522) | IGSNIVNW Y (SEQ Ш NO: 528) | LLIYSN NQRP (SEQ ID NO: 534) | AAWDD SLNGP (SEQ ID NO: 540) |
В табл. 4е показаны аминокислотные последовательности последовательностей CDR антитела С33В1516 (антитела с VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272), определяемые согласно системам AbM, Kabat, Chothia, IMGT и Contact.
- 149 047663
Таблица 4е
| HC1 | HC2 | HC3 | LC1 | LC2 | LC3 | |
| AbM | GGSIR | HIFSTGHIN | DNGAAL | SGSSSNIG | SDNQRP | AAWDD |
| NYYW S (SEQ ID NO: 403) | (SEQ ID NO: 409) | FDF (SEQ ID NO: 415) | SNIVN (SEQ ID NO: 421) | S (SEQ ID NO: 427) | SLNGP V(SEQ ID NO: 433) | |
| Kabat | NYYW S (SEQ ID NO: 254) | HIFSTGHIN YDSSLKS (SEQ ID NO: 257) | DNGAAL FDF (SEQ ID NO: 260) | SGSSSNIG SNIVN (SEQ ID NO: 66) | SDNQRP S (SEQ ID NO: 267) | AAWDD SLNGP V (SEQ ID NO: 76) |
| Chothi a | GGSIR NY (SEQ ID NO: 439) | FSTGH (SEQ ID NO: 445 ) | DNGAAL FD (SEQ ID NO: 451) | SSSNIGSNI (SEQ ID NO: 457) | SDN (SEQ ID NO: 463) | WDDSL NGP (SEQ ID NO: 469) |
| IMGT | GGSIR NYY (SEQ ID NO: 475) | IFSTGHI (SEQ ID NO: 481) | ARDNGA ALFDF (SEQ ID NO: 487) | SSNIGSNI (SEQ ID NO: 493) | SDN (SEQ ID NO: 499) | AAWDD SLNGP V (SEQ ID NO: 505) |
| Conta Ct | RNYY WS (SEQ ID NO: 511) | WFGHIFST GHIN (SEQ ID NO: 517) | ARDNGA ALFD (SEQ ID NO: 523) | IGSNIVNW Y (SEQ ID NO: 529) | LLLYSD NQRP (SEQ ID NO: 535) | AAWDD SLNGP (SEQ ID NO: 541) |
В табл. 4f показаны аминокислотные последовательности последовательностей CDR антитела С33В1481 (антитела с VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273), определяемые согласно системам AbM, Kabat, Chothia, IMGT и Contact.
- 150 047663
Таблица 4f
| HC1 | HC2 | HC3 | LC1 | LC2 | LC3 | |
| АЬМ | GITFS NYW MS (SEQ ID NO: 404) | SIKRDGSDK Y (SEQ Ш NO: 410) | GEFDY (SEQ ID NO: 416) | RSSQSLVYS DGNTYLN(S EQ Ш NO: 422) | KVSTRD S (SEQ ID NO: 428) | LQGTH WPWT (SEQ ID NO: 434) |
| Kabat | NYW MS (SEQ ID NO: 255) | SIKRDGSDK YYVDSVKG (SEQ Ш NO: 258) | GEFDY (SEQ ID NO: 261) | RSSQSLVYS DGNTYLN (SEQ Ш NO: 266) | KVSTRD S (SEQ ID NO: 268) | LQGTH WPWT (SEQ ID NO: 270) |
| Chothi а | GITFS NY (SEQ ID NO: 440) | KRDGSD (SEQ Ш NO: 446) | GEFD (SEQ ID NO: 452) | SQSLVYSDG NTY (SEQ Ш NO: 458) | KVS (SEQ ID NO: 464) | GTHW PW (SEQ ID NO: 470) |
| IMGT | GITFS NYW (SEQ ID NO: 476) | IKRDGSDK (SEQ Ш NO: 482) | AKGEF DY (SEQ ID NO: 488) | QSLVYSDGN TY (SEQ Ш NO: 494) | KVS (SEQ ID NO: 500) | LQGTH WPWT( SEQ ID NO: 506) |
| Conta Ct | SNYW MS (SEQ ID NO: 512) | WVASIKRDG SDKY (SEQ ID NO: 518) | AKGEF D(SEQ ID NO: 524) | VYSDGNTY LNWF (SEQ ID NO: 530) | RLIYKV STRD (SEQ ID NO: 536) | LQGTH WPW (SEQ ID NO: 542) |
Антитела создавали у лам следующим образом. Трем ламам подкожно инъецировали антиген hCD33-IgC2 из табл. 3 тремя инъекциями (дни 0, 14 и 28), при этом первую инъекцию проводили в полном адъюванте Фрейнда, а последующие проводили в неполном адъюванте Фрейнда). За первой инъекцией следовали три инъекции антигена ECD hCD33-FL из табл. 3 (дни 61, 76 и 91). РВМС для сортинга по отдельным В-клеткам получали в дни 14, 35 и 86 и замораживали. Замороженные РВМС размораживали и окрашивали рекомбинантными антигенными приманками, либо биотинилированными, либо конъюгированными с Alexa Fluor 647. Антигенные приманки представляли собой рекомбинантный человеческий CD33-ECD и рекомбинантный человеческий домен CD33-IgC. Биотинилированную приманку выявляли с помощью стрептавидина (SA), меченного РЕ. Антиген-специфические клетки (положительные для обеих антигенных приманок) сортировали объемом непосредственно в буфер для лизиса RLT (Qiagen) с использованием устройства для сортинга BD FACSAria Fusion. Лизат клеток замораживали при -80°C и отправляли в Genewiz для дальнейшей обработки.
Клонирование V-области vHH ламы и конструирование конструкции моно-Fc слияния проводили следующим образом. В-клетки лизировали в буфере для лизиса RealTime Ready (Roche). Затем РНК очищали с помощью набора RNeasy Plus® Mini Kit (Qiagen 74134). Свежую РНК использовали непосредственно для синтеза cDNA с использованием набора Superscript® cDNA (Invitrogen 18091-050). Для облегчения синтеза cDNA использовали oligodT для первичной обратной транскрипции всех мессенджерных РНК. Последующую амплификацию фрагментов VHH проводили с применением 2-стадийной ПЦР-амплификации с использованием SP ламы и 3'-праймеров, нацеленных на консенсусные области в СН2. Вкратце, каждая реакционная смесь для ПЦР объемом 50 мкл состояла из 20 мкМ смесей прямых и обратных праймеров, 25 мкл премикса ДНК-полимеразы PrimeStar Max (Clontech), 2 мкл неочищенной cDNA и 21 мкл дважды дистиллированной H2O. Программу циклирования начинали при 94°C в течение 3 мин, затем следовало 35 циклов (94°C в течение 30 с, 55°C в течение 1 мин, 68°C в течение 1 мин) и
- 151 047663 заканчивали при 72°C в течение 7 мин.
ДНК VHH из первого раунда ПЦР очищали в геле. Второй раунд ПЦР VHH проводили с праймерами второго раунда, содержащими 15 п. н. комплементарных удлинений, которые перекрывают соответствующие области в соответствующем ему материнском векторе Lonza. ПЦР второго раунда проводили по следующей программе: 94°C в течение 3 мин; 35 циклов (94°C в течение 30 с, 55°C в течение 1 мин, 68°C в течение 1 мин) и завершение при 72°C в течение 7 мин. Для направленного клонирования гена VHH в вектор Lonza с moho-Fc использовали набор In-Fusion® HD Cloning Kit (Clonetech, США). Для облегчения клонирования In-Fusion® HD продукты ПЦР обрабатывали Cloning Enhancer перед проведением клонирования In-Fusion HD.
Клонирование и трансформацию проводили в соответствии с протоколом производителя (Clonetech, США). ДНК, полученную с помощью набора mini-prep, подвергали секвенированию по Сэнгеру для подтверждения получения полных фрагментов V-гена.
В табл. 5 приведены аминокислотные последовательности тяжелой цепи антител ламы, полученных вышеописанным способом.
Таблица 5
| Название антитела | Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (последовательности CDR выделены жирным шрифтом) |
| СЗЗВ1785 | VH: OVOLVESGGGSVOPGGSLRLSCAVFGFSLSDYAIGWFRQAPG KEREKVSCISESDGRTYLSDSVKSRFTISRDNGKNTVYLQMN NLKPDDTGVYYCATVDQAISESSYHCEKGFGSWGOGTOVT VSS (SEQIDNO: 18) |
| СЗЗВ1784 | VH: EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRTFSTYVMGWFRQAP GOERELVAAIVSGRNPTYADSVKSRFTISRDNAKNTIYLHMN SLOPEDTAVYYCHMYHYSSQYWGOGTOVTVSS (SEQ ГО NO: 19) |
| СЗЗВ1787 | VH: EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGFTFDDYAIGWFRQAP GKEREGVSCISSSDGSTYYVDSVKGRFTIS SDNAKNT VYLQM NSLKPEDTAVYYCTALIIMYGSGSERAAAACRYKYEYWGO GTQVTVSS (SEQ ГО NO: 20) |
- 152 047663
| C33B1786 | VH: EVOVVESGGGVVOSGGSLTLSCEASESILSFSTMDWFRQAPG KEREGVSCIRPRYSTTTHADSIKGRFKMYSDNAKNTIYLHM NSLOPEDTAVYYCHMYHYSSQYWGOGTOVTVSS (SEQ Ш NO: 21) |
| C33B1781 | VH: EVOVVESGGGLVQGGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYHOAP GKQRELVARITGGGATDYVDSVKGRFTISLDSAKSTVYLQM NSLKPEDTAVYHCYADLVTRVGSDLLYDDYWGOGTQVTVS S (SEQ ID NO: 22) |
| C33B1780 | VH: EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAVFGFSLSDYAIGWFRQAPG KEREKVSCISESDGRTYLSDSVKSRFTISRDNGKNTVYLQMN NLKPDDTGVYYCATVDQAISESSYHCEKGFGSWGOGTOVT VSS (SEQ ID NO: 23) |
| C33B1783 | VH: EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGFTFDDYAVGWFRQVP GKEREGVSCISSSDGATYYADSVKGRFTIS SDNAKNT VYLQ MNSLKPEDTAVYYCTAIIVRGSGWERAAAACRYEYSYWGO GTQVTVSS (SEQ ID NO: 24) |
- 153 047663
| СЗЗВ1782 | VH: EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGFTFDDYAVGWFRQAP GKEREGISCISSSDGATYYADSVKGRFTISTDNAKNTAFLQM NSLKPEDTAVYYCTAVIVRGTGWERAAAACRYEYAYWGO GTQVTVSS (SEQ Ш NO: 25) |
| СЗЗВ1789 | VH: OVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAVFGFSLSDYAIGWFRQAP GKEREKVSCISESDGRTYLSDSVKSRFTISRDNGKNTVYLQM NNLKPDDTGVYYCATVDQAISESSYHCEKGFGSWGOGTOV TVSS (SEQ Ш NO: 26) |
| СЗЗВ1788 | VH: OVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAVFGFSLSDYAIGWFRQAPG KEREKVSCISESDGRTYLSDSVKSRFTISRDNGKNTVYLQMN NLKPDDTGVYYCATVDQAISESSYHCEKGFGSWGOGTOVT VSS (SEQ ID NO: 27) |
Антитела к CD33 и слитые белки VHH-MOHO-FC экспрессировались в клетках ExpiCHO-S™ (ThermoFisher Scientific; Уолтем, штат Массачусетс, США, № по каталогу А29127) путем временной трансфекции очищенной плазмидной ДНК, кодирующей белки, в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, клетки ExpiCHO-S™ поддерживали в суспензии в среде для экспрессии ExpiCHO™ (ThermoFisher Scientific, № по каталогу А29100) в инкубаторе с орбитальным встряхиванием, установленном при 37°C, 8% CO2 и 125 оборотов в минуту. Клетки высевали и разбавляли перед трансфекцией до 6,0х106 клеток на мл, поддерживая жизнеспособность клеток при 99,0% или выше. Временные трансфекции проводили с использованием набора для трансфекции ExpiFectamine™ CHO (ThermoFisher Scientific, № по каталогу А29131). На каждый мл разбавленных клеток, подлежащих трансфекции, использовали 0,5 микрограмма кодирующей ДНК слияния scFv-Fc и 0,5 микрограмма ДНК pAdVAntage (Promega, № по каталогу Е1711) и разбавляли средой для комплексообразования OptiPRO™ SFM. Использовали реагент ExpiFectamine™ CHO при соотношении 1:4 (об./об., ДНК:реагент) и разбавляли OptiPRO™. Разбавленную ДНК и трансфекционный реагент объединяли в течение одной минуты, что обеспечивало образование комплекса ДНК/липид, а затем добавляли в клетки. После инкубации на протяжении ночи к клеткам добавляли подпитку ExpiCHO™ и энхансеры ExpiFectamine™ CHO в соответствии со стандартным протоколом производителя. Клетки инкубировали с орбитальным встряхиванием (125 об/мин) при 37°C в течение семи дней до сбора культурального бульона. Культуральную надосадочную жидкость из временно трансфицированных клеток ExpiCHO-S™ осветляли центрифугированием (30 мин, 3000 rcf) с последующей фильтрацией (0,2 мкм PES мембрана, Corning; Корнинг, штат Нью-Йорк, США).
Очистку белков проводили следующим образом. Отфильтрованную надосадочную жидкость клеточной культуры загружали на предварительно уравновешенную (1xDPBS, pH 7,2) колонку MabSelect Sure Protein A (GE Healthcare) с использованием хроматографической системы AKTAXpress. После загрузки колонку промывали 10 объемами колонки 1xDPBS, pH7,2. Белок элюировали 10 объемами колонки 0,1 М ацетата натрия (Na), pH 3,5. Белковые фракции немедленно нейтрализовали путем добавления 2,5 М Tris HCl, pH 7,5, до 20% (об./об.) от объема элюирующей фракции. Пиковые фракции объединяли и фильтровали (0,2 мкм). Качество очищенного белка оценивали с помощью аналитической HPLC с исключением размера (система HPLC Agilent).
Пример 3. Характеристика антител к CD33 и vHH ламы с помощью поверхностного плазменного резонанса (SPR; Biacore).
Значения аффинности (KD) в отношении взаимодействия антител к CD33 человека (полноразмер- 154 047663 ный ECD и домен IgC2) получали с помощью SPR. Антитела к CD33 захватывали с использованием антитела к Fc человека и в раствор вводили антигены. Данные представлены в табл. 6 ниже.
Таблица 6
| № Ш белка | Xd связывания с hu CD33 (FL ECD) (нМ) | Κχ) связывания с hu CD33 (IgC2) (нМ) |
| СЗЗВ1474 | 2,47 | 3,99 |
| СЗЗВ1517 | 4,44 | связывание отсутствует |
| СЗЗВ919 | 0,5 | связывание отсутствует |
| СЗЗВ1522 | >10 | связывание отсутствует |
| СЗЗВ1607 | 1,49 | связывание отсутствует |
| C33B933 | 0,5 | Не измеряли |
| СЗЗВ125 | ο,ι | >10 |
| C33B931 | 0,4 | Не измеряли |
| C33B937 | о,з | 56 |
| СЗЗВ1601 | 1,1 | 6,8 |
Аффинность связывания антител к CD33 и vHH ламы с рекомбинантным человеческим CD33 (FL ECD или домен IgC2) определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием прибора Biacore 8K. Fc-слитые scFv или моно-Ес-слитые vHH захватывали с использованием козьего антитела к Fc, модифицированного GLC-чипом, и титровали 5-кратными серийными разбавлениями антигена CD33 с концентрацией 40-1,6 нМ. Ассоциацию и диссоциацию отслеживали в течение 2 и 30 мин, соответственно, при скорости потока 50 мкл/минута. Необработанные данные по связыванию относили путем вычитания сигналов связывания аналита из контрольных образцов и анализировали с использованием модели связывания Ленгмюра 1:1 с использованием программного обеспечения Biacore для получения кинетических показателей, которые использовали для расчета аффинности связывания.
Аффинности (KD) в отношении взаимодействия vHH ламы к CD33 с CD33 человека (FL ECD или домен IgC2). vHH ламы к CD33 на остове моно-Fc захватывали с использованием антитела к Fc человека и в раствор вводили антигены. Данные представлены в табл. 7 ниже. Репрезентативные сенсограммы Biacore 8K взаимодействий антител vFIH к CD33 против антигенов hu CD33 (FL ECD и домен IgC2) также показаны на фиг. 1.
- 155 047663
Таблица 7
| ID белка vHH | KD (М) связывания с hu CD33 (FL ECD) | KD (М) связывания с hu CD33 (IgC2) |
| C33B1783 | 8,59E-11 | отсутствие связывания/низкое связывание |
| СЗЗВ1782 | 2,06E-10 | отсутствие связывания/низкое связывание |
| СЗЗВ1786 | 3,57E-10 | отсутствие связывания/низкое связывание |
| СЗЗВ1785 | 6,61E-10 | 3,31Е-09 |
| СЗЗВ1789 | 6,70E-10 | 3,03Е-09 |
| СЗЗВ1788 | 7,07E-10 | 4,34Е-09 |
| СЗЗВ1787 | 7,92E-10 | отсутствие связывания/низкое связывание |
| СЗЗВ1780 | 8,47E-10 | 3,38Е-09 |
| СЗЗВ1781 | 2,21E-09 | 5,59Е-11 |
| СЗЗВ1784 | связующее с низким значением, нМ; низкий ответ при этой концентрации | отсутствие связывания/низкое связывание |
Термостабильность слитых антител scFv-Fc к CD33 и VHH ламы определяли с помощью nanoDSF на приборе Prometheus® NT.Plex (NanoTemper Technologies). Измерения проводили путем загрузки образцов в стандартные капилляры (NanoTemper Technologies) из 384-луночного планшета для образцов. Выполняли двойные или тройные повторности. Термическое разворачивание отслеживали при скорости изменения температуры ^^/минута от 20°C до 95°C. Температуры термического перегиба (средняя точка Tm) и температуру начала агрегации (Tagg) определяли автоматически с помощью PR. ThermControl Software (NanoTemper Technologies) и далее анализировали с использованием программного обеспечения PR. Stability Analysis Software (NanoTemper Technologies). Данные представлены в табл. 8 ниже.
Таблица 8
Данные по термостабильности для антител scFv и vHH к CD33 (vHH ламы на основе моно-Fc), полученные с использованием прибора nanoDSF
П)белка villi Tin 1 (ί ) Τηι2(ί ) Τηι3(ί )
| СЗЗВ1780 | 50,2 | : 72,1 | |
| СЗЗВ1781 | | 52,6 | 53 | |
| СЗЗВ1782 | | 50,3 | 66,5 | |
| C33B1783 | | 51,4 | 64,7 | |
| СЗЗВ1784 | | 48,4 | 58,5 | |
| СЗЗВ1785 | | 49,9 | 63 | |
| СЗЗВ1786 | | 48,0 | 63,6 | |
| СЗЗВ1787 | | 50,4 | 59,3 | |
| СЗЗВ1788 | | 50,2 | 63,5 | 75,7 |
| СЗЗВ1789 | | 50,2 | 63,8 | 81,5 |
- 156 047663
Таблица 8А
Данные по термостабильности для антител scFv и vHH к CD33, полученные с использованием прибора для nanoDSF. Использовали остов Fc IgG1 под SEQ ID NO: 277. scFv присоединяли непосредственно к этому остову IgG1 без применения линкерной последовательности scFv на остове Fc IgG1 человека
| ID | ||||||||
| сл | ||||||||
| ИТ | ||||||||
| ого | ||||||||
| бел | ||||||||
| ка | ID | Обозн | Исх | Среднее | Среднее | Среднее | ||
| scF | кло | ачени | одно | значение | Среднее | Среднее | значение | значение |
| V- | на | е | е | Тш1—ScFv | значение | значение | Tagg | начала |
| Fc | scFv | белка | шАЬ | ((°C) | Тш2 (°C) | ТшЗ (°C) | (°C) | (°C) |
| СЗ | сззв | |||||||
| ЗВ | сзз | 1617 | СЗЗ | |||||
| 58 | 67,7 | 80,6 | 71,8 | 53,6 | ||||
| 16 | В16 | LHF | В93 | |||||
| 89 | 17 | с | 7 | |||||
| СЗ | СЗЗВ | |||||||
| ЗВ | СЗЗ | 1617 | СЗЗ | |||||
| 56,4 | 67,8 | 80,7 | 77,9 | 51,7 | ||||
| 16 | В16 | HLF | В93 | |||||
| 99 | 17 | с | 7 |
- 157 047663
| сз ЗВ 16 90 | сзз В16 18 | сззв 1618_ LHF с | сзз В93 3 | 63,1 | 80,7 | 77,7 | 52,5 | |
| СЗ ЗВ 17 00 | СЗЗ В16 18 | СЗЗВ 1618_ HLF с | сзз В93 3 | 63,7 | 80,5 | 79,6 | 52,2 | |
| СЗ ЗВ 16 91 | СЗЗ В16 19 | СЗЗВ 1619_ LHF с | сзз В93 1 | 61,2 | 68,3 | 80,1 | 78,5 | 56,6 |
| СЗ ЗВ 17 01 | СЗЗ В16 19 | СЗЗВ 1619_ HLF с | СЗЗ В93 1 | 61,6 | 68,4 | 80,6 | 78,7 | 56,5 |
| СЗ ЗВ 16 98 | СЗЗ В16 20 | СЗЗВ 1620_ LHF с | СЗЗ В91 9 | 63,5 | 68,8 | 81,3 | 77,6 | 59,2 |
| СЗ ЗВ 17 02 | СЗЗ В16 20 | СЗЗВ 1620_ HLF с | СЗЗ В91 9 | 64,9 | 80,4 | 79,2 | 55,5 | |
| СЗ ЗВ 16 93 | СЗЗ В16 46 | СЗЗВ 1646_ LHF с | СЗЗ В16 07 | 66,5 | 81,2 | 66,2 | 60,5 | |
| СЗ ЗВ 17 03 | СЗЗ В16 46 | СЗЗВ 1646_ HLF с | СЗЗ В16 07 | 64,7 | 81 | 64,1 | 58,9 | |
| СЗ | СЗЗ | СЗЗВ | СЗЗ | 65,2 | 81,2 | 63,4 | 56,9 |
- 158 047663
| ЗВ 16 94 | В16 51 | 1651_ LHF с | В16 01 | |||||
| сз | сззв | |||||||
| ЗВ | сзз | 1651 | СЗЗ | |||||
| 64,6 | 81,6 | 70,7 | 56,2 | |||||
| 17 | В16 | HLF | В16 | |||||
| 04 | 51 | с | 01 | |||||
| СЗ | СЗЗВ | |||||||
| ЗВ | СЗЗ | 1659 | сзз | |||||
| 68,1 | 81,1 | 76,3 | 56,1 | |||||
| 16 | В16 | LHF | В15 | |||||
| 96 | 59 | с | 17 | |||||
| СЗ | СЗЗВ | |||||||
| ЗВ | СЗЗ | 1659 | СЗЗ | |||||
| 68,1 | 80,9 | 79,8 | 60,7 | |||||
| 17 | В16 | HLF | В15 | |||||
| 06 | 59 | с | 17 | |||||
| СЗ | СЗЗВ | |||||||
| ЗВ | СЗЗ | 1680 | СЗЗ | |||||
| 56,7 | 67,1 | 80,6 | 69 | 48,2 | ||||
| 16 | В16 | LHF | В14 | |||||
| 97 | 80 | с | 74 | |||||
| СЗ | СЗЗВ | |||||||
| ЗВ | СЗЗ | 1680 | СЗЗ | |||||
| 54,6 | 67,2 | 80,2 | 78,7 | 46,2 | ||||
| 17 | В16 | HLF | В14 | |||||
| 07 | 80 | с | 74 | |||||
| СЗ | СЗЗВ | |||||||
| ЗВ | СЗЗ | 1682 | СЗЗ | |||||
| 65 | 81 | 77,7 | 55,4 | |||||
| 16 | В16 | LHF | В12 | |||||
| 92 | 82 | с | 5 | |||||
| СЗ | СЗЗВ | |||||||
| ЗВ | СЗЗ | 1682 | СЗЗ | |||||
| 63,9 | 80,2 | 80,5 | 58,8 | |||||
| 17 | В16 | HLF | В12 | |||||
| 08 | 82 | с | 5 |
Пример 4. Конструирование и экспрессия CAR scFv к CD33.
Конструировали конструкции CAR к CD33, включающие следующие последовательности scFv.
- 159 047663
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGDYNYVSWYQQHPGKVPKLMIYDVSNRP SGVSNRFSGSMSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSSSSALEVFGGGTKLTVLGGS EGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVQSGSELRKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVR QAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSSAYLQISSLKAEDTAM YYC ATDRDRGTD YWGQGTL VT VS S (SEQ Ш NO: 203)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGNKLGAKFASWYQQKPGQSPVLVIYQDNKRPSGI PERFSGSNSGNTATLTISGTQAVDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKS SGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGK GLEWVANIKQHGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRDLGYFD YWGQGTL VT VS S (SEQ Ш NO: 204)
DIQMTQ SP S S VS AS VGDRVTITCRASQGIS SWL AW YQQKPGK APKLLIY AAS SLQ SG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIKGGSEGKSS GSGSESKSTGGSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKG LDWIGSINYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLRSVTAADTAVYYCARLDGY ESPFD YWGQGTL VT VS S (SEQ Ш NO: 205)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVFYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLISW ASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAEDVAVYYCQHYYSTPYTFGQGTKLEIK GGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW VRQAPGKGLEWVSGIGWSGGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT AL YYC AKD SPYGDFFD YWGQGTL VT VS S (SEQ Ш NO: 206)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGHKLGDKYASWYQQKPGQSPVVVIYKDSKRPSGI
- 160 047663
PERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKS SGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQSPGK GLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DFRSLDWLPPDSTSYDGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ Ш NO: 207)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDGKRPSGI PERFSGSNFGNKATLTISGTQAMDEADYYCQAWDRNTVVFGGGTKLTVLGGSEGK SSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPG KGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEGTAVYYCA KDFRSFDWLPPDSASYHGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ Ш NO: 208)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVSWYQQKPGQSPVVVIHQDRKRPSGI PERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKS SGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPG KGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA KDFRSFDWLPPDSTSYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ Ш NO: 209)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSPVVVIHQDRKRPSGI PERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKS SGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPG KGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA KDFRSFDWLPPDSTSYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ Ш NO: 210)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGSKFASWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIP ERF SGSNSGNT ATLTISGTQAMDEAD YYCQ AWDS STVVFGGGTKLTVLGGSEGKS S GSGSESKSTGGSEVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGK GLEW VANIK QHGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR DRDLGYFD YWGQGTL VT VS S (SEQ Ш NO: 211)
- 161 047663
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQAISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFSTYFCQHYDNLPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSS GSGSESKSTGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKG LEWVANIKRDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMSSLRAEDTAVYYCVRD YGYFDFWGQGTL VT VS S (SEQ Ш NO: 212)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSG VPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGGSE GKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIRQPP GKGLEWIGYIYYS GSTNYNPSLKSRVTIS VDTSKNQF SLKLS S VTAADT AVYYC AR MWEILGFDPWGQGTLVTVS (SEQ Ш NO: 213)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVRTAEAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYT GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQYYTTPRTFGGGTKLEIKGGSEGK SSGSGSESKSTGGSEVQLQQSGPELVKPGSSVKISCKASGYTFTDYNINWVKQSHGK NLEWIGTINPNNGVTF YNQRFKGQ ATLTVDKS S ST AYMELRSLTSEDS AVYYC SRD GYDT YYAMD YWGQGTTLT VS S (SEQ Ш NO: 214)
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTYVAWYQQKPGHSPKALIYSASYRY SGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYKSYPLTFGAGTKLELKGGSEG KSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVRPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTP EKRLEWVAGISNSGYSLYYPDTLKGRFTISRDNARNTLYLQMISLRSEDTAMYYCA RDGGSYPYAMDYWGHGTSVTVSS (SEQ Ш NO: 215)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSG VPDRVSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGPGTKVTVLGGSE GKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTA GKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAR
- 162 047663
DNGAALFDYWGQGTLVTVSS (SEQ Ш NO: 216)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKVLIYAASTLQSG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQLNSYPVTFGGGTKVEIKGGSEGKSS GSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSYWMSWVRQAPGKG LDWVANIKRDGSEKHYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDSAVYYCTRD YGYFD YWGQGTL VT VS S (SEQ Ш NO: 217)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLFSNGYKFLDWYLQRPGQSPQLLIYLGSY RASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQALQTPPTFGGGTKVEIKGGS EGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVRQA SGKGLEWIGRIRSKGNSYATAYDVSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVY YCTRHNDKWNYYGLD VWGQGTT VT VS S (SEQ Ш NO: 218)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLFSNGYKFLDWYLQRPGQSPQLLIYLGSY RASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQALQTPPTFGGGTKVEIKGGS EGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVRQA SGKGLEWIGRIRSKGNSYATAYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVY YCTRHNDKWNYYGLD VWGQGTT VT VS S (SEQ Ш NO: 219)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLFSNGYKFLDWYLQRPGQSPQLLIYLGSY RASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQALQTPPTFGGGTKVEIKGGS EGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVRQA SGKGLEWIGRIRSKGNSYATAYNVSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVY YCTRHNDKWNYYGLD VWGQGTT VT VS S (SEQ Ш NO: 220)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLFSNGYKFLDWYLQRPGQSPQLLIYLGSY
RASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQALQTPPTFGQGTKVEIKGGS
- 163 047663
EGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVFAIHWVRQA SGKGLEWIGRIRSKGNSYATAYDVSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVY YCTRHNDKWNYYGLD VWGQGTT VT VS S (SEQ Ш NO: 221)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGYNYLDWYLQKSGQSPQLLIYLGSY RASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQVLQTPWTFGQGTKVEIKGG SEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVR QAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAV YYC ARE VGYNWNQGGYFD YWGQGTL VT VS S (SEQ Ш NO: 274)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSG VPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGTGTKVTVLGGSE GKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRQSA GKELEWFGHIFSTGHINYDSSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAR DNGAALFDFWGQGTLVT VS S (SEQ Ш NO: 275)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVS TRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVAVYYCLQGTHWPWTFGQGTKVEIKG GSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSNYWMSWV RQAPGKGLEWVASIKRDGSDKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLSLQMHSLRAEDTA VYYC AKGEFD YWGQGTL VT VS S (SEQ Ш NO: 276)
Стимулированные Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28 Т-клетки подвергали электропорации, затем трижды промывали с помощью OPTI-MEM (Invitrogen) и ресуспендировали в OPTI-MEM при конечной концентрации 50Е6/мл. Затем 0,1 мл клеток (5Е6) смешивали с 10 мкг РНК, кодирующей CAR IVT, и подвергали электрофорезу в 2-мм кювете Gap (Harvard Apparatus BTX, Холлистон, штат Массачусетс, США) с использованием BTX ECM830 (Harvard Apparatus BTX, Холлистон, штат Массачусетс, США) путем однократного нажатия кнопки импульс.
(Настройки: 500 вольт, длина импульса 750 мкс и одиночный (1) импульс, интервал 100 мкс). После электропорации Т-клетки переносили в 6-луночный планшет и немедленно помещали обратно в инкубатор при 37°C. Первичные Т-клетки человека подвергали электрофорезу без mRNA (MOCK) или с 10 мкг mRNA, экспрессирующей либо CAR scFv к CD33, либо нерелевантный контрольный CAR. Через 24 ч после электропорации измеряли экспрессию CAR поверхности с помощью проточной цитометрии после окрашивания с помощью 2 мкг/мл биотинилированного белка L и стрептавидин-конъюгированного РЕ, или биотинилированного CD33 (1 мкг/мл) и стрептавидин-конъюгированного РЕ.
Через двадцать четыре часа после электропорации подсчитывали Т-клетки. Для каждого подсчета собирали 1Е5 Т-клеток. Клетки дважды промывали буфером FACS с использованием 200 мкл/лунка буфера FACS для микротитровальных планшетов, надосадочную жидкость отбрасывали. Все лунки окрашивали с помощью 100 мкл буфера для окрашивания, содержащего белок L (Genscript, № по каталогу М000971:500; 2 мкг/мл), и инкубировали в течение по меньшей мере 30 мин при 4°C в защищенном от света месте. Клетки дважды промывали путем добавления буфера FACS с использованием 150 мкл/лунка буфера FACS для микротитровальных планшетов. Центрифугирование выполняли при 400xg в течение 4 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость затем отбрасывали. Все лунки окрашивали 100 мкл стрептавидин^-фикоэритрина (SA-PE; 1:250) и красителем Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain (1:1000), инкубировали в течение по меньшей мере 30 мин при 4°C при защите от света. После этого клетки готовы для анализа с помощью итометрии.
Наблюдали окрашивание белка L для CAR к CD33, в то время как в контрольных Т-клетках, представлявших собой Т-клетки без электропорации mRNA, наблюдали только фоновое окрашивание (~5,5%). Экспрессия CAR на первичных человеческих Т-клетках также может быть выявлена с помощью внутреннего биотин-меченого рекомбинантного белка KLK2 компании J&J с последующим SA-PE. Как
- 164 047663 показано, Т-клетки эффективно экспрессируют CAR к CD33, как измерено проточной цитометрией, тогда как в контрольных Т-клетках, представляющих собой Т-клетки без электропорации mRNA или нераскрытый контрольный CAR (неспецифический по отношению к CD33), наблюдали только фоновое окрашивание.
Пример 5. Уничтожение опухолевых клеток с помощью CAR-T-клеток к CD33.
Совместное культивирование для анализа цитотоксичности на основе CellTrace Violet (CTV, Thermo Fisher Scientific, номер по каталогу С34557) с использованием проточного цитометра проводили следующим образом.
Т-клетки получали следующим образом. Через двадцать четыре часа после ЕР Т-клетки подсчитывали и ресуспендировали при концентрации, необходимой для получения наиболее концентрированного/необходимого Е:Т. Т-клетки добавляли при 100 мкл/лунка анализа (2х 106 клеток/мл; высевали 100 мкл в лунку при соотношении 10:1 Е:Т, т.е. 2Е5 Т-клеток на 2Е4 клеток-мишеней). Получали исходный раствор с концентрацией 10:1 Е:Т, с двукратными серийными разбавлениями полной средой для Т-клеток (Optimizer w/CTS, 5% человеческой сыворотки, 1% GlutaMax) до 0,3125:1. Т-клетки высевали (100 мкл/лунка) в трех повторностях с использованием 96-луночного круглодонного планшета для обработки культуры ткани.
Меченные CTV клетки-мишени получали следующим образом. 20 мкл DMSO добавляли во флакон с окрашивающим раствором CTV. Этот исходный раствор разбавляли в 20 мл PBS (подогретого до 37°C) для получения 5 мкМ окрашивающего раствора. 10Е6 опухолевых клеток собирали, дважды промывали с помощью PBS и ресуспендировали в 4Е6/мл (2,5 мл). Добавляли равный объем (2,5 мл) окрашивающего раствора CTV. Клетки инкубировали в течение 20 минут в инкубаторе при 37°C. К клеткам добавляли 40 мл PRMI + 20% FBS для поглощения несвязавшегося красителя. Клетки инкубировали в течение 5 мин. Клетки повторно центрифугировали в течение 5 мин при 400xg. Клеточный осадок ресуспендировали в предварительно прогретой среде RPMI + 10% FBS. Тем временем, Т-клетки высевали при необходимом соотношении Е/Т, описанном выше. Линии опухолевых CD33+ клеток и линии опухолевых CD33клеток пересчитывали, а затем клетки ресуспендировали в 2Е5/мл и 100 мкл в двух повторностях. Клетки инкубировали совместно с линиями меченых опухолевых клеток в плоскодонном 96-луночном планшете.
Анализ цитотоксичности проводили следующим образом с использованием проточного цитометра. После 20 ч совместного культивирования все клетки переносили в 96-луночный планшет с U-образным дном и промывали. После 20 ч совместного культивирования все клетки собирали из плоскодонного 96луночного планшета и переносили в 96-луночный планшет с U-образным дном, а затем промывали. Во все лунки добавляли 30 мкл 0,25% трипсина и инкубировали в течение 5 мин в инкубаторе при 37°C. Через 5 мин все опухолевые клетки собирали в 96-луночный планшет с U-образным дном. Клетки центрифугировали и промывали в течение 5 мин при 400xg дважды. Затем клеточный осадок ресуспендировали в разбавленном (1:1000) красителе LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR (100 мкл). Клетки инкубировали в течение 30 мин при 4°C и дважды промывали буфером FACS с помощью центрифугирования в течение 5 мин при 400xg. После промывки все клетки фиксировали в течение 10 мин с использованием 100 мкл буфера для фиксации BD Cytofix™ (50 мкл буфера FACS + 50 мкл буфера для фиксации). Клетки центрифугировали и промывали в течение 5 мин при 400xg один раз. Клеточный осадок ресуспендировали в буфере FACS. После окончания инкубационного периода окрашенные образцы анализировали с помощью многоцветной проточной цитометрии. Процентную долю цитотоксической активности рассчитывали с использованием следующего уравнения:
% специфической гибели = % Near IR+CTV+ (мертвых) клеток - % спонтанных Near IR+CTV+/(100% - % спонтанных Near IR+CTV+ (мертвых) клеток) x 100%.
Через двадцать четыре часа после временной трансфекции клетки-мишени (CD33-положительные клетки Vcap и CD33-отрицательные клетки DU145) метили флуоресцентным красителем Cell Trace Violet (CTV), а затем совместно культивировали с CAR-T-клетками к CD33. Имитационные Т-клетки служили в качестве отрицательного эффекторного контроля. Клетки совместно культивировали в течение 20 ч при соотношениях эффекторных и клеток-мишеней (Е/Т) от 0,3125:1 до 10:1. Процентное уничтожение измеряли как соотношение абсолютного числа живых (отрицательных по красителю на жизнеспособность) клеток-мишеней (CTV положительных), оставшихся в совместной культуре, и числа живых клетокмишеней, культивированных без CAR-T-клеток. Как показано, CAR-T-клетки к CD33 специфически и эффективно лизируют линии раковых CD33(+) клеток человека, но не CD33(-) клетки, при соотношениях Е/Т от 10:1 до 0,3125:1, тогда как у Т-клеток, которые были имитационными или обработанными CAR к CD33, наблюдали только фоновую цитотоксичность.
CAR-T-Клетки к CD33 также тестировали в отношении цитотоксичности в режиме реального времени с использованием системы анализа клеток в режиме реального времени xCELLigence в качестве анализа эффективности для опосредованного иммунными клетками цитолиза клеток-мишеней.
В каждую лунку 96-луночного планшета E-Plates (ACEA Biosciences) добавляли 50 мкл среды для культивирования раковых клеток-мишеней, измеряли фоновый импеданс и отображали его в виде клеточного индекса. Затем адгезивные CD33(+) и CD33(-) клетки-мишени диссоциировали, высевали с
- 165 047663 плотностью 5Е4 (VCap), 5E3 клеток/лунка E-Plate в объеме 100 мкл и обеспечивали их пассивное прилипание к поверхности электрода. После посева E-Plate выдерживали при температуре окружающей среды в вытяжном шкафу с ламинарным потоком в течение 30 мин, а затем переносили в прибор RTCA МР в инкубаторе для клеточных культур. Регистрацию данных начинали немедленно с 15-минутными интервалами в течение всего времени (96 ч) эксперимента.
В момент начала обработки (через 24 ч после посева раковых клеток) сбор данных приостанавливали, из каждой лунки удаляли 50 мкл среды и добавляли эффекторные CAR-T-клетки при различных соотношениях эффектора и мишени (Е:Т) в объеме 50 мкл. CAR-T к CD33(+) и нераскрытые контрольные CAR (неспецифические по отношению к CD33) Т-клетки ресуспендировали. Затем осуществляли двукратные разбавления в двух повторностях в 96-луночном планшете (соотношения Е/Т от 5:1 до 0,156:1). К клеткам-мишеням также добавляли контрольные мишени плюс эффекторы (Т-клетки без электропорации РНК).
CD33(+) и CD33(-) клетки-мишени инкубировали с имитацией, 10 мкг mRNA электропорировали (через 24 ч после трансфекции) в CD33(+) и CD33(-) CAR-T-клетки при различных соотношениях Е/Т в течение приблизительно 72 ч. Строили графики нормализованного клеточного индекса (CI) для CD33(+) и CD33(-). При одиночном посеве клетки-мишени прилипали к планшету и пролиферировали, повышая показания CI.
Пример 6. Продуцирование цитокина CAR-T-клетками к CD33.
IFN-γ, продуцируемый цитотоксическими Т-клетками, позволяет осуществлять иммунный надзор за опухолями, который может непосредственно ингибировать пролиферацию и индуцировать апоптоз некоторых злокачественных опухолей in vivo и in vitro. Чтобы определить, способны ли CAR-T-клетки к CD33 распознавать и активироваться опухолевыми CD33 (+) клетками, собирали надосадочную жидкость при анализе уничтожения на основе xCELLigence, как описано в примере 5. Через приблизительно 70 ч совместного культивирования надосадочную жидкость собирали и анализировали с помощью ELISA в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору ELISA (Human IFN-γ ELISA MAX™ Deluxe, BioLegend, № по каталогу 430106).
Происходило продуцирование IFN-γ антиген-стимулированными CAR-T-клетками. CAR к CD33 и контрольные CAR-T-клетки секретировали IFN-γ во время совместного культивирования с экспрессирующими CD33 клетками в зависимости от соотношения Е:Т, но не во время совместного культивирования с отрицательными по CD33 клетками. Нераскрытые контрольные CAR секретировали гораздо большее количество IFN-γ из-за гораздо более высокого уровня экспрессии антигена, чем CD33.
Пример 7. Уничтожение опухолевых клеток с помощью CAR-T-клеток к CD33.
CAR-T-Клетки к CD33 оценивали в режиме реального времени в анализе уничтожения опухоли IncuCyte в отношении антиген-зависимой цитотоксичности. CAR-T-Клетки к CD33 инкубировали совместно с клетками-мишенями в течение 88 ч при соотношении эффектор:мишень 1:1 или 0,5:1, что было рассчитано на основании данных по экспрессии CAR. Идентифицировали клетки-мишени, которые стабильно экспрессируют красный ядерный краситель, что измеряли системой визуализации IncuCyte в режиме реального времени. Выполняли следующий расчет: ингибирование роста опухолевых клеток (%) = (исходное количество жизнеспособных клеток-мишеней текущее количество жизнеспособных клеток-мишеней)/исходное количество жизнеспособных клеток х 100 (%).
Пример 8. Продуцирование цитокина CAR-T-клетками к CD33.
Надосадочную жидкость собирали из ночной (около 20 ч) совместной культуры CAR-T-клеток к CD33 с клетками при соотношении Е/Т 1:1 и анализировали с использованием 13-плексного набора Milliplex Human High Sensitivity T cell (HSTCMAG28SPMX13). CAR-модифицированные Т-клетки к CD33 секретировали цитокины во время совместного культивирования с экспрессирующими CD33 клетками, но минимально для нетрансдуцированных Т-клеток (UTD).
Надосадочную жидкость собирали из ночной (около 20 ч) совместной культуры CAR-T-клеток к CD33 с клетками при соотношении Е/Т 1:1. CAR-T-клетки к CD33 секретировали IFN-γ во время совместного культивирования с экспрессирующими CD33 клетками, но не во время совместного культивирования с отрицательными по CD33 клетками. В качестве положительных и отрицательных контролей использовали стимулированные CD3/28 гранулами Т-клетки и только Т-клетки, соответственно. Высвобождение IFN-γ CAR-T-клетками к CD33. Показана средняя концентрация IFN-γ ± SD (пг/мл) из культур в двух повторностях. Различные термически стабилизированные CAR-T-клетки продуцировали разное количество IFN-у при совместном культивировании с CD33 (+) клетками.
Пример 9. Пролиферация CAR-T-клеток к CD33.
CAR-T-Клетки к CD33 оценивали в анализе пролиферации. Пролиферация Т-клеток является важным in vitro параметром иммунной функции in vivo. Для дальнейшей оценки функции CAR-T-клеток к CD33 метили CAR-T-клетки к CD33 с помощью CTV для оценки пролиферации Т-клеток.
CAR-T-Клетки к CD33 и нетрансдуцированные (UTD) Т-клетки метили CellTrace Violet (CTV; 5 мкМ) и совместно культивировали с CD33 (+) и CD33 (-) клетками. Через пять дней после совместного культи
- 166 047663 вирования клетки собирали и окрашивали с помощью CD3, CD25, NearIR Live/dead Dye и CAR к CD33. Анализ проточной цитометрии проводили на проточном цитометре Fortessa с программным обеспечением Flowjo. Лимфоциты идентифицировали по CD3 в живых клетках, определяли частоты CAR-T-клеток с разбавлением красителя CTV и маркера активации CD25. При гейтировании по CAR+ Т-клеткам к CD33, как показано, CD33 (+) клетки, но не CD33 (-) клетки, стимулировали все конструкции CAR. В качестве положительных и отрицательных контролей используют стимулированные CD3/28 гранулами Т-клетки и только Т-клетки, соответственно. Только Т-клетки без какой-либо стимуляции не пролиферировали, а Тклетки, стимулированные CD3/28-гранулами, демонстрировали эквивалентный паттерн пролиферации. CAR-T-Клетки к CD33 пролиферировали более интенсивно, чем обработанный CD3/28-гранулами положительный контроль, после 5 дней совместного культивирования с клетками. Различные Т-клетки, сконструированные с помощью конструкций CAR, обладают различной пролиферативной активностью и демонстрируют различные количества CAR-T-клеток. Количества CAR-T-клеток основаны на среднем абсолютном количестве клеток +/- SEM из трех технических повторностей.
Протокол выполняли следующим образом. Опухолевые клетки собирали, дважды промывали с помощью PBS и ресуспендировали в 10Е6/мл в PBS, содержащем 100 мкг/мл митомицина С (ММС), в течение 1,5 ч в инкубаторе при 37°C, чтобы блокировать пролиферацию опухолевых клеток. 20 мкл DMSO добавляли во флакон с окрашивающим раствором CTV. 5 мкл раствора разбавляли с помощью 5 мл (1:1000) PBS (подогретого до 37°C) с получением 5 мкМ окрашивающего раствора. Подсчитывали 2Е6 Т-клеток, дважды промывали с помощью PBS и ресуспендировали в 4Е6/мл (0,5 мл). Добавляли равный объем (0,5 мл) окрашивающего раствора CTV. Клетки инкубировали в течение 20 мин при 37°C. Затем к клеткам добавляли 4 мл PRMI + 20% FBS для поглощения какого-либо несвязавшегося красителя. Клетки инкубировали в течение 5 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 400xg. Клеточный осадок ресуспендировали в предварительно прогретой среде RPMI + 10% FBS. Т-клетки подсчитывали и высевали 1Е5 клеток (100 мкл) в 96-луночные планшеты с плоским дном.
Тем временем опухолевые клетки, обработанные ММС, собирали и подсчитывали через 1,5 ч, а затем ресуспендировали при 1Е6/мл. 1Е5 клеток (100 мкл) культивировали совместно с Т-клетками в 96луночном планшете. Т-клетки отдельно и Т-клетки с добавленными в соотношении 3:1 CD3/28гранулами использовали в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно.
После 5 дней совместного культивирования все клетки собирали из каждой лунки. Клетки центрифугировали и промывали в течение 5 мин при 400xg дважды, затем окрашивали с помощью CAR к CD33, CD3, CD8 и CD25, Live/dead (Near-IR) в 96-луночном планшете с U-образным дном. После промывки все клетки фиксировали в течение 10 мин с использованием 100 мкл BD Cytofix™ Fixation Buffer (50 мкл буфера FACS +50 мкл буфера для фиксации). После окончания инкубационного периода окрашенные образцы анализировали с помощью многоцветной проточной цитометрии.
Анализ данных проводили следующим образом. Получали гистограмму CTV. Гейт по неразбавленному CTV устанавливали таким образом, чтобы охватить крайний правый пик (CTV яркий) Т-клеток, культивируемых отдельно, а гейт по разбавленному CTV устанавливали, чтобы охватить остальную популяцию. Это применяли ко всем образцам.
Пример 10. Характеристика CAR-T-клеток, трансдуцированных CAR17, CAR18, CAR19 или CAR20.
Созданные CAR-T клетки оценивали в репортерном анализе JNL в отношении антиген-зависимой активности. Вкратце, клетки Jurkat, содержащие ген люциферазы, управляемый сигнальнореспонсивным промотором NFAT (называемые клетками JNL), трансдуцируют конструкциями CAR17 (KL2B413_HL), CAR18 (KL2B413_LH), CAR19 (KL2B359_HL) или CAR20 (KL2B359_LH). Экспрессию каждого CAR определяли с помощью биотинилированного CD33, а затем стрептавидинконъюгированного РЕ.
Связывание между конструкцией CAR к CD33 и ее когнатным клеточным антигеном (CD33 на клетках-мишенях) приводило к экспрессии люциферазы в клетках JNL. Для этого клетки JNL, трансдуцированные тестируемыми конструкциями CAR, или нетрансдуцированные клетки JNL (UTD) культивировали совместно с линиями опухолевых клеток-мишеней и измеряли активность люциферазы как интенсивность люминесценции. Конструкции считали активными, если интенсивность люминесценции превышала в 1,5 раза уровень клеток UTD в присутствии клеток, экспрессирующих антиген. Антигензависимую активацию для тестированных конструкций CAR не обнаруживали.
CAR-T клетки опосредуют уничтожение опухолевых клеток антиген-зависимым образом.
CAR-T-клетки, трансдуцированные CAR17, CAR18, CAR19 и CAR20, инкубировали совместно с CD33-πоложительными и CD33-отрицательными клетками в течение 96 ч при соотношении эффекторов и мишеней (ЕТ) 1:1 или 0,5:1, что рассчитывали на основании экспрессии CAR на Т-клетках. Клеткимишени стабильно экспрессировали красный ядерный краситель, что измеряли системой визуализации IncuCyte в режиме реального времени. Ингибирование роста опухолевых клеток (TGI) (%) = (исходное количество жизнеспособных клеток-мишеней - текущее количество жизнеспособных клетокмишеней)/исходное количество жизнеспособных клеток x 100 (%). Тестируемые CAR-T-клетки достига
- 167 047663 ли приблизительно 100% TGI, тогда как нетрансдуцированный контроль не продемонстрировал TGI. У тестируемых CAR-T-клеток в отрицательных по CD33 клетках TGI не наблюдали. CAR-T-клетки продуцируют цитокины при стимуляции антигеном IFN-γ, продуцируемый цитотоксическими Т-клетками, важен для осуществления иммунного надзора за опухолями, который может непосредственно ингибировать пролиферацию и индуцировать апоптоз некоторых злокачественных опухолей in vivo и in vitro. Чтобы определить, способны ли CAR-модифицированные человеческие Т-клетки к CD33 распознавать и активироваться положительными по CD33 опухолевыми клетками, первичные Т-клетки, трансдуцированные указанными клонами CAR, и контрольные нетрансдуцированные Т-клетки (UTD) совместно культивировали с линиями клеток-мишеней и собирали надосадочную жидкость для измерения концентрации IFN-γ. CAR-T-клетки, трансдуцированные CAR-клетками к CD33, секретировали IFN-γ при совместном культивировании с клетками LNCaP, рекомбинантно экспрессирующими CD33, а также при совместном культивировании с клетками, экспрессирующими CD33 на очень низком уровне, но не с отрицательными по CD33 клетками.
CAR-T-клетки активируются и активируют маркеры дегрануляции антиген-зависимым образом.
Опухолевые клетки могут быть распознаны и уничтожены цитотоксическими лимфоцитами, такими как CD8+ Т-лимфоциты и естественные киллерные (NK) клетки, главным образом посредством иммунной секреции литических гранул, которые убивают опухолевые клетки-мишени. Этот процесс включает слияние мембраны гранулы с цитоплазматической мембраной иммунной эффекторной клетки, что приводит к обнажению поверхности лизосомально-ассоциированных белков, которые обычно присутствуют на липидном бислое, окружающем литические гранулы, таких как CD107а. Поэтому мембранная экспрессия CD107а является маркером активации иммунных клеток и цитотоксической дегрануляции.
Анализ дегрануляции проводили, как описано ниже. Клетки-мишени (5х 104) совместно культивировали с равным количеством эффекторных клеток в 0,1 мл на лунку в 96-луночном планшете. Контрольные лунки содержали только Т-клетки. Антитело к CD107а (5 мкл на лунку) добавляли в дополнение к 1 мкл/образец моненсина (BD Biosciences) и инкубировали в течение 4 ч при 37°C. Клетки промывали два раза с помощью PBS, окрашивали в отношении экспрессии CAR к CD33, CD3 и CD8 и анализировали на проточном цитометре BD Fortessa.
CAR-T-Клетки к CD33 пролиферируют антиген-зависимым образом.
CAR-T-клетки оценивали по их пролиферации с использованием протокола анализа пролиферации Т-клеток, описанного в примере 9. CAR-T-Клетки к CD33 и нетрансдуцированные (UTD) Т-клетки метили CellTrace Violet (CTV; 5 мкМ) и совместно культивировали с положительными по CD33 и отрицательными по CD33 клетками. Через пять дней после совместного культивирования клетки собирали и окрашивали с помощью CD3, CD25, NearIR Live/dead Dye и CAR к CD33. Анализ проточной цитометрии проводили на проточном цитометре Fortessa с программным обеспечением Flowjo. Лимфоциты идентифицировали по CD3 в живых клетках, определяли частоты CAR-T-клеток с разбавлением красителя CTV и маркера активации CD25. При гейтировании по CD3+ Т-клеткам положительные по CD33 клетки, но не отрицательные по CD33 клетки, способствовали пролиферации каждой тестируемой линии CAR-Tклеток. Только Т-клетки без какой-либо стимуляции не пролиферировали, а Т-клетки, стимулированные CD3/28-гранулами, демонстрировали эквивалентный паттерн пролиферации. CAR+ Т-клетки к CD33 пролиферировали более интенсивно, чем обработанный CD3/28-гранулами положительный контроль, после 5 дней совместного культивирования с клетками. Различные тестируемые CAR-Т-клетки обладали различной пролиферативной активностью и демонстрировали различные количества CAR-T-клеток. Процентная доля пролиферирующих Т-клеток и Т-клеток, экспрессирующих CD25, была основана на среднем абсолютном количестве клеток +/- SEM из двух повторностей.
Пример 11. Создание биспецифических антител к CD33xCD3.
Области VH/VL антител к CD33, полученных в вышеприведенных примерах, и области VH/VL антител к CD3 CD3B219 и CD3B376 конструировали в биспецифическом формате, и они экспрессировались в виде IgG1. CD3B219 и CD3B376 конструировали как Fab, а области VH/VL CD33 конструировали как scFv в обеих ориентациях в биспецифические антитела, что давало связывающее CD33 плечо в формате scFv-шарнир-CH2-CH3 и связывающее CD3 плечо в формате тяжелой цепи: УИ-СН1-линкер-СН2CH3 и легкая цепь: VL-CL. В качестве альтернативы, области VH/VL антител к CD3 конструировали как scFv, а области VH/VL антител к CD33 конструировали как Fab. Линкер, который использовали в scFv, представлял собой линкер под SEQ ID NO: 7. CD3B219 был описан в патенте США № 9850310.
Мутации T350V_L351Y_F405A_Y407V CH3 конструировали в одну тяжелую цепь, а мутации T350V_T366L_K392L_T394W CH3 конструировали в другую тяжелую цепь. Кроме того, оба связывающих плеча CD33 и CD3 сконструированы с содержанием мутаций сайленсинга Fc-эффектора L235A_L235A_D265S.
Сконструированные цепи экспрессировали и полученные биспецифические антитела очищали стандартными способами. Биспецифические антитела характеризуются связыванием с CD33 и CD3, а также цитотоксичностью in vitro и in vivo, как описано в данном документе. В табл. 10 показаны аминокислотные последовательности антител к CD3 CD3B219 и CD3B376.
- 168 047663
Таблица 10
| Антите ЛО | Область | Аминокислотная последовательность | SEQ ГО NO: |
| CD3B2 19 | HCDR1 | TYAMN | 108 |
| HCDR2 | RIRSKYNNYATYYAASVKG | 109 | |
| HCDR3 | HGNFGNSYVSWFAY | 110 | |
| LICDR1 | RSSTGAVTTSNYAN | 111 | |
| LCDR2 | GTNKRAP | 112 | |
| LCDR3 | ALWYSNLWV | ИЗ | |
| VH (CD3B219VH) | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARI RSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDS KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHG NFGNS YVS WF AYWGQGTL VT VS S | 114 | |
| VL (CD3B219VL) | QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTG AVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGG TNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLS GVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVL | 115 | |
| CD3B3 76 | HCDR1 | NNNAAWS | 116 |
| HCDR2 | RTYYRSKWLYDYAVSVKS | 117 | |
| HCDR3 | GYSSSFDY | 118 | |
| LICDR1 | TGTSSNIGTYKFVS | 119 | |
| LCDR2 | EVSKRPS | 120 | |
| LCDR3 | VSYAGSGTLL | 121 | |
| VH(CD3H219) | QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGD SVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRT YYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSR NQFTLQLNS VTPEDT AL Y YC ARGYS S SFD YWGQGTL VT VS S | 122 | |
| VL(CD3L150) | QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSN IGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVS KRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQ AEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTK | 123 | |
| LTVL |
Пример 12. Созданные биспецифические антитела к CD33xCD3 являются цитотоксическими in vitro.
Анализ Т-клеточно-опосредованной цитотоксичности использовали для оценки потенциала цитотоксичности созданных биспецифических антител in vitro, с использованием визуализации в режиме реального времени на платформе Incucyte. Биспецифические антитела тестировали на клетках положительной по CD33 клеточной линии в присутствии выделенных человеческих CD3+ Т-клеток от здоровых доноров при соотношении (эффектор:мишень) эффектор:мишень (соотношение Е:Т) 3:1. Гибель клеток в результате апоптоза отслеживали путем измерения сигнала флуоресценции от красителя, который стабильно экспрессируется клетками-мишенями. Биспецифические антитела способствуют зависимому от дозы уменьшению количества жизнеспособных клеток с увеличением времени и, следовательно, индуцируют опосредованную Т-клетками гибель опухолевых клеток. Процент ингибирования опухолевых клеток % = (количество первоначально высеянных опухолевых клеток - текущее количество жизнеспо
- 169 047663 собных опухолевых клеток)/(количество первоначально высеянных опухолевых клеток) х 100%.
Пример 13. Получение и характеристика ADC.
Антитела или антигенсвязывающие домены, которые связывают CD33, метили различными радиометаллами, такими как In-111, Zr-89, Lu-177 или Ас-225, и проводили оценку биораспределения или эффективности в опухоли in vivo в установленных подкожных (SC) моделях предстательной железы человека, включая LNCaP, VCaP или С4-2В у самцов NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ (NSG, The Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн, США) или у мышей Balb-c или SHO Nude. Различные дозы антител или антигенсвязывающих доменов, которые связывают CD33, или изотипных контрольных антител метили различными количествами радиоактивности (10-1000 нКи) и измеряли поглощение опухолью или эффективность.
Пример 14. Тестирование антител к CD33, конъюгированных с лекарственными средствами, в отношении интернализации.
Следующие тесты проводили для характеристики степени интернализации антител к CD33 и определения терапевтического эффекта антител к CD33, конъюгированных с лекарственными средствами. Без ограничения конкретной теорией считается, что интернализация антител к CD33 свидетельствует об увеличении терапевтической пользы антител к CD33 при конъюгировании с радиоактивным изотопом, например In-111, Zr-89, Lu-177 или Ас-225.
Материалы и способы.
Культивирование клеток проводили следующим образом. Клетки MOLM-13, Kasumi-1, OCI-AML-3 и HDLM2 культивировали в среде RPMI1640 (Gibco) с 10% FBS (HiMedia). Клетки окрашивали антителом к CD33 (клон WM53, Biolegend) в насыщающей концентрации для определения плотности рецепторов на каждой линии клеток. Плотность рецепторов определяли с помощью РЕ-гранул BD Quantibrite (BD Biosciences).
Клетки MOLM-13, Kasumi-1, OCI-AML-3 и HDLM-2 окрашивали на жизнеспособность с помощью фиксируемого фиолетового красителя мертвых клеток (L34955, ThermoFisher) в соответствии с протоколом производителя. Клетки собирали, промывали один раз PBS и затем окрашивали фиксируемым красителем в отношении жизнеспособности при комнатной температуре в течение 30 мин. После инкубации клетки дважды промывали буфером FACS (PBS + 2% FBS). Затем клетки использовали для анализа связывания с тестируемыми антителами. 100000 клеток окрашивали тестируемыми антителами в объеме окрашивания 100 мкл. Антитела для окрашивания разбавляли буфером FACS и инкубировали с клетками в течение 40 мин на льду, затем промывали 2Х буфером FACS. Затем тестируемые антитела выявляли с использованием конъюгированного с РЕ козьего F(ab')2 к IgG человека - Fc (ab98596; Abcam) в течение 40 мин на льду. После промывки данные получали на проточном цитометре Novocyte (ACEA). Клетки гейтировали на FSC/SSC, затем проводили гейтирование живых клеток и дискриминацию дублетов. Данные анализировали с использованием Flow Jo (BD).
Медианные значения интенсивности флуоресценции использовали для построения 4параметрической кривой нелинейного регрессионного анализа после вычитания MFI только вторичного образца.
Для исследований кинетических показателей связывания при 37°C клетки обрабатывали, как указано выше, для окрашивания тестируемыми антителами. Тестируемые антитела конъюгировали с красителем Alexa Fluor 647 (AF647) с использованием набора для мечения AF647 (А20186, ThermoFisher) с использованием протокола производителя. После добавления антител клетки инкубировали при 37°C в термомиксере (Eppendorf) в течение указанных моментов времени. Затем образцы фиксировали с использованием Cytofix (BD Biosciences) и регистрировали на Novocyte (ACEA Biosciences). Данные анализировали, как указано выше.
Анализы интернализации антител проводили следующим образом.
Анализ белка A-MMAF проводили следующим образом. Белок A-MMAF приобретали у компании Levena Biopharma. Клетки MOLM-13, Kasumi-1, 0CI-AML3 и HDLM2 высевали по 4000 клеток в лунку 96-луночного темного планшета с плоским и прозрачным дном (Corning) в объеме 50 мкл. Исходные растворы антител готовили в 4Х концентрации (400 нМ) и серийно разбавляли. 25 мкл каждого разбавления антител добавляли в клетки. Исходный раствор белка A-MMAF также готовили в 4Х концентрации (400 нМ) и 25 мкл добавляли в каждую лунку. Лунки с клетками и белком A-MMAF, но без антител, рассматривали как 100% жизнеспособные клетки. Клетки инкубировали с антителами и белком AMMAF в течение 96 ч. В конце инкубационного периода к клеткам добавляли 100 мкл CellTitre-Glo (Promega) и считывали люминесценцию на устройстве для считывания планшетов Tecan. % жизнеспособности рассчитывали как показано ниже и использовали для построения 4-параметрической кривой нелинейной регрессии с использованием Graph Pad Prism.
% жизнеспособности = клетки + MMAF +Ab X100 клетки + MMAF.
Анализ интернализации на основе красителя pHAb проводили следующим образом. Аминореактивные красители pHAb приобретали у компании Promega. 400 мкг каждого тестируемого антитела конъюгировали с красителями pHAb. Вкратце, амино-реактивный краситель pHAb (Promega, № G9845) восстанавливали в 12,5 мкл DMSO + 12,5 мкл воды (общий объем 25 л) для конечной концентрации 10
- 170 047663 мг/мл (11,3 мМ). Реакции конъюгации проводили при 10-кратном молярном избытке красителя. Реакционная смесь содержала антитело (500 мкг в объеме 250 мкл + 3 мкл красителя pHAb + 30 мкл 0,5 М буфера на основе бората натрия + вода, чтобы конечный реакционный объем составлял 300 мкл. Реакционные смеси инкубировали при 37°C в течение 2 ч при перемешивании с последующим гашением путем добавления 1 М Трис, рН 7,5 до конечной концентрации 10 мМ. Меченные красителем образцы заменяли на PBS с помощью колонок Zeba - 2 мл, отсечение 40 кДа (Thermo 87768). Концентрацию антител и значения DAR рассчитывали следующим образом.
Измерение концентраций с помощью NanoDrop.
Концентрация pHAb (мкМ) = (поглощение/(ЕС_pHAb * длина пути)) х 106, где поглощение = А532,
ЕС_РНАЬ = 75000.
Концентрация Ab (мкМ) = (поглощение/(ЕС-Ab * длина пути)) х 106, где поглощение = А280-(0,256*А532),
0,256 представляет собой поправочный коэффициент для остаточного поглощения pHAb при А280, ЕС_АЬ = 210000.
Краситель:Ab = конц. pHAb (мкМ)/конц. Ab (мкМ).
Для анализа кинетических показателей меченных красителем pHAb антител к CD33 клетки MOLM13, Kasumi-1, OCI-AML-3 и HDLM2 инкубировали с 100 нМ конъюгированного с pHAb тестируемого антитела в течение 45 мин на льду. Разбавления антител получали в буфере FACS. После мечения клетки промывали охлажденным буфером FACS и инкубировали при 37°C в течение указанных моментов времени. В конце инкубационного периода клетки получали на проточном цитометре Novocyte. В каждый момент времени включали неокрашенный образец для учета фоновой флуоресценции.
Результаты.
Связывание проводили путем инкубирования клеток с серийными разбавлениями антитела к CD33 при 4°C с последующим выявлением с помощью РЕ конъюгированного козьего F(ab')2 к IgG человека Fc антитела. Данные, показывающие связывание антител к CD33 с линиями клеток-мишеней, представлены на фиг. 2А и 2В в виде графиков, на которых видны профили нелинейной регрессии антител к CD33 человека при 4°C. Строили графики зависимости медианной интенсивности флуоресценции (MFI) от логарифма концентрации антитела. Верхний хит для каждой клеточной линии обозначен красным цветом, а связывание линтузумаба показано на синих кривых.
Проводили оценку связывания антител к CD33 с линиями клеток-мишеней в зависимости от времени и температуры. Связывание проводили путем инкубирования клеток с серийными разбавлениями непосредственно конъюгированных антител при 37°C и 4°C. Данные представлены на фиг. 3А и 3В. На графиках и данных фигурах показаны профили нелинейной регрессии связывания антител к CD33 человека при 37°C и 4°C. Построены графики зависимости медианной интенсивности флуоресценции (MFI) от логарифмических концентраций антитела.
Анализировали интернализацию антител к CD33 на линиях клеток-мишеней с высокой, средней и низкой экспрессией. Клетки культивировали с серийными разбавлениями антител к CD33 вместе с белком A-MMAF в течение 96 ч. Через 96 ч к клеткам добавляли реагент CellTitre-Glo для измерения жизнеспособности клеток. Лунки только с белком A-MMAF считали на 100% жизнеспособными. Клетки HDLM-2 использовали в качестве клеточной линии без экспрессии. Результаты показаны на фиг. 4A-4D. Снижение жизнеспособности клеток указывает на интернализацию антитела. На графиках показан нелинейный регрессионный анализ жизнеспособности клеток в зависимости от логарифмической концентрации антитела.
Оценивали кинетические показатели интернализации антител к CD33. Антитела к CD33 метили красителями pHAb и инкубировали с клетками при концентрации 100 нМ при 37°C в течение указанных моментов времени, после чего клетки промывали и собирали на проточном цитометре. Результаты показаны на фиг. 5, где на графиках представлены значения MFI в указанные моменты времени.
Анализировали экспрессию CD33 на линиях клеток-мишеней. Линии клеток с высокой, средней и низкой экспрессией CD33 идентифицировали с применением антитела к человеческому CD33 от Biolegend. Клетки MOLM-13, Kasumi-1, OCI-AML-3 и HDLM2 окрашивали антителом (оранжевые гистограммы) или изотипическим контролем IgG мыши (синие гистограммы) и рассчитывали кратность изменения по сравнению с изотипом для каждой линии клеток. Данные показаны на фиг. 6.
Оценивали целостность антител и значения DAR после конъюгирования с красителями pHAb. Антитела метили красителями pHAb и анализировали на SDS-PAGE. Отношения лекарственного средства к антителу (DAR) рассчитывали путем измерения OD при 280 и 530 нм и поправки на поглощение красителя при 280 нм. Данные показаны на фиг. 7.
Определяли специфичность кинетических показателей опосредованной pHAb интернализации антител. Антитела к CD33 метили красителями pHAb и инкубировали с клетками Kasumi-1 или OCI-AML-3 при концентрации 100 нМ при 4°C в течение указанных моментов времени, после чего клетки промывали и обрабатывали на проточном цитометре. Данные показаны на фиг. 8А. На графиках показаны значе
- 171 047663 ния MFI в указанные моменты времени. При 4°C интернализацию не наблюдали. Антитела также инкубировали с клетками HDLM-2 при 37°C. Данные показаны на фиг. 8В. Увеличения MFI не наблюдали.
Анализировали значения ЕС50 связывания антител к CD33 для линий клеток с высокой (MOLM-13), средней (Kasumi-1) и низкой (OCI-AML-3) плотностью рецепторов. Связывание осуществляли при 4°C с серийными разбавлениями антитела. Данные показаны на фиг. 9.
Анализировали интернализацию антитела к CD33 на различных линиях клеток-мишенях, при этом данные показаны на фиг. 10. Для MOLM-13 и OCI-AML-3 указаны значения EC50. Для Kasumi-1 показан % жизнеспособности при концентрации 100 нМ.
Пример 15. Эффект антител к CD33 в отношении уровней CD33 на клеточной поверхности.
Проводили анализ для тестирования эффекта антител к CD33 и биспецифических антител к CD33 в отношении уровня CD33 на клеточной поверхности моноцитов, макрофагов, дендритных клеток, нейтрофилов, Т-клеток и/или микроглии. В анализе антитела к CD33 оценивали по их способности снижать уровни CD33 на клеточной поверхности линии гистиоцитарных лимфомных клеток U937, а также экспрессирующих CD33 клеток СНО, первичных моноцитов человека, первичных макрофагов человека, полученных из моноцитов периферической крови, первичных дендритных клеток человека, полученных из моноцитов периферической крови, микроглиальных клеток человека, полученных из моноцитов периферической крови, и первичных Т-клеток человека.
Микроглиальные клетки человека получали из моноцитов периферической крови с помощью клеточной культуры. Моноциты из образцов периферической крови человека выделяют с использованием антител для выделения моноцитов, дифференцируют в дендритные клетки и культивируют в течение пяти дней. Клетки культивировали в среде, содержащей 10% фетального телячьего рубца при 37°C в 5% CO2. Неприлипшие клетки собирали и использовали для экспериментов по фагоцитозу. Для получения макрофагов человека моноциты из образцов периферической крови человека выделяли, и их дифференцировали в макрофаги или в дендритные клетки.
Образцы клеток помещают в 200000 клеток на мл в 2 мл RPMI, дополненной 10% Hyclone FBS, 2 мМ глутамина, пенициллином, стрептомицином и незаменимыми аминокислотами. Антитела к CD33 или контрольные изотипы добавляли при 1,0 мкг/мл и инкубировали в течение 24 ч при 37°C с 5% CO2.
Для оценки динамики рецептора обеспечивали связывание антител с клетками в течение часа, а затем промывали. Уровни CD33 на поверхности определяли по меньшей мере через 24 ч. Экспрессию рецепторов на поверхности клеток определяли с помощью анализа FACS. Клетки инкубировали с антителом к CD33, конъюгированным с FITC, и с контрольным поверхностным маркером. Клетки промывали 2х в буфере FACS (PBS + 2% FBS, 2 мМ EDTA) и проводили проточную цитометрию. Для анализа данные рассчитывали как процент экспрессии рецептора в отсутствие антитела с использованием значений WI для соответствующих флуорофоров.
Пример 16. Анализ антител к CD33 и биспецифических антител к CD33 в отношении индукции или ингибирования фосфорилирования сигнальных молекул.
Различные клетки (например, клетки J774, RAW 264.7, ВММ, первичные моноциты человека, макрофаги, дендритные клетки, Т-клетки, микроглия или остеокласты) культивировали по отдельности. Клетки удаляли из культуральных чашек и подсчитывали. Затем клетки инкубировали с (i) антителом к CD33, (ii) биспецифическим антителом CD33 или (iii) изотипно совпадающим контрольным антителом. Затем клетки лизировали и центрифугировали для удаления нерастворимых материалов. В каждой надосадочной жидкости проводили реакцию иммунопреципитации с одним или несколькими различными антителами к каждому из DAP12, ERK, AKT, белка А-агарозы и белка G-агарозы. Гранулы интенсивно промывали буфером RIPA. Белки разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (SDS-PAGE), а затем переносили на нитроцеллюлозные мембраны с помощью вестернблоттинга. Затем гранулы инкубировали с антителами, специфически распознающими фосфорилированный тирозин или фосфорилированную форму DAP12, ERK, Syk, LCK, FYN, C-Cbl, VAV или AKT. Гранулы визуализировали с помощью системы усиленной хемилюминесценции (ECL) для количественной оценки степени фосфорилирования DAP12, ERK, Syk, LCK, FYN, C-Cbl, VAV и AKT.
Пример 17. In vivo анализ противоракового эффекта антител и/или биспецифических антител к CD33.
Группам из 10 мышей в возрасте 8 недель (+1-2 недели), либо обычным мышам, либо мышам, надэкспрессирующим ген CD33 человека, подкожно вводили опухолевые клетки (например, от 1х105 до 1х106 клеток МС38, Lewis Lung или В16), суспендированные в 1,00 мкл PBS. Перед имплантацией мышей анестезировали изофлураном. Начиная с дня 2, группам мышей инъецировали i.p. каждые 3 дня всего 4 дозы по 200 мкг каждого из антагонистических антител к CD33. Рост опухоли отслеживали с помощью штангенциркуля раз в две недели для измерения роста опухоли, начиная с дня 4. Конечной точкой эксперимента являлся объем опухоли 2000 мм или 60 дней. Рост опухоли и % выживаемости являются показателями результата. Если антитело к CD33 обладало противораковым эффектом, то наблюдали одно или несколько из следующих явлений: уменьшение объема и скорости роста опухоли, уменьшение количества инфильтрирующих опухоль иммунных макрофагов-супрессоров и увеличение притока эф
- 172 047663 фекторных Т-клеток в опухоль.
Пример 18. Антитело к TRGV9 и биспецифические антитела к CD33.
Проводили стимуляцию и экспансию γ/δ Т-клеток. Экспансию Vγ9-Vδ2 T-клеток проводили путем обработки РВМС в полной среде RPMI, содержащей rhIL-2 (1000 МЕ/мл), rhIL-15 (10 нг/мл) и золедроновую кислоту (5 мкМ) в течение 14 дней.
De novo секвенирование моноклональных антител к V','9 проводили следующим образом. Мышиный IgG1 к человеческому рецептору Т-клеток клон 7А5 к TRGV9 получали от Abcam (№ по каталогу ab171109). Получение образцов и LC-MS/MS анализ были выполнены компанией Lake Pharma (СанКарлос, штат Калифорния, США). Образец восстанавливали и алкилировали, делили на семь аликвот и протеолитически расщепляли с помощью ферментов трипсин/LysC, химотрипсин, LysC, пепсин, AspN, эластаза и протеиназа K. Полученные пептиды обессоливали с использованием ZipTip C18 Pipette Tips и разделяли в режиме on-line с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Масс-спектрометрию проводили на спектрометре Thermo Q-Exactive с использованием HCD-фрагментации. Наборы данных MS анализировали с использованием программного обеспечения PEAKS путем сопоставления меток последовательности de novo с базой данных последовательностей антител на основе IMGT. Гэпы в последовательности назначали с помощью сборки последовательности Contig из пептидов, идентифицированных de novo. Все CDR и гипермутации подтверждали путем проверки спектров MS/MS.
Последовательности четырех моноклональных антител, созданных в соответствии с вышеизложенным, а также их последовательности CDR представлены в табл. 11-15 ниже.
Таблица 11
Последовательности CDR mAb к TRGV9 (LP7A5_1)
| Антите ЛО | HCDR1 | SE 2 ID NO | HCDR2 | SE 2 ID NO | HCDR3 | SE 2 ID NO |
| LP7A5_ 1 | DHYIN | 236 | QIYPGDGNTYYNQ KFKG | 237 | NYGDYTI DF | 238 |
| Антите ЛО | LCDR1 | SE 2 ID NO | LCDR2 | SE 2 ID NO | LCDR3 | SE 2 ID NO |
| LP7A5_ 1 | KSSQSLLYSSNQKN YLA | 239 | WASTRES | 240 | QQYYRY HT | 241 |
- 173 047663
Таблица 12
Последовательности CDR mAb к TRGV9
| Антите ЛО | HCDR1 | SE 2 ID NO | HCDR2 | SE 2 ID NO | HCDR3 | SE 2 ID NO |
| LP7A5_ 2 | DHYIN | 236 | QIYPGDGNTYYNQ KFKG | 237 | NMGMYTI DF | 242 |
| Антите ЛО | LCDR1 | SE 2 ID NO | LCDR2 | SE 2 ID NO | LCDR3 | SE 2 ID NO |
| LP7A5_ 2 | KSSQSLLYSSNQKN YLA | 239 | WASTRES | 240 | QQYYRYH T | 241 |
Таблица 13
Последовательности CDR mAb к TRGV9
| Антите ЛО | HCDR1 | SE £ ID NO | HCDR2 | SE 2 ID NO | HCDR3 | SE 2 ID NO |
| LP7A5_ 3 | DHYIN | 236 | QIYPGDGNTYYNQ KFKG | 237 | NMGMYT LDF | 243 |
| Антите ЛО | LCDR1 | SE 2 ID NO | LCDR2 | SE 2 ID NO | LCDR3 | SE 2 ID NO |
| LP7A5_ 3 | KSSOSLLYSSNOK NYLA | 239 | WASTRES | 240 | QQYYRYH T | 241 |
- 174 047663
Таблица 14
Последовательности CDR mAb к TRGV9
| Антите ЛО | HCDR1 | SE Q ID NO | HCDR2 | SE Q ID NO | HCDR3 | SE Q ID NO |
| LP7A5_ 4 | DHYIN | 236 | QIYPGDGNTYYNQ KFKG | 237 | NYGDYTL DF | 244 |
| Антите ЛО | LCDR1 | SE Q ID NO | LCDR2 | SE Q ID NO | LCDR3 | SE Q ID NO |
| LP7A5_ | KSSQSLLYSSNQK | 239 | WASTRES | 240 | QQYYRY | 241 |
| Антите ЛО | HCDR1 | SE Q ID NO | HCDR2 | SE Q ID NO | HCDR3 | SE Q ID NO |
| 4 | NYLA | HT |
- 175 047663
Таблица 15
Последовательности тяжелой цепи и легкой цепи mAb к TRGV9
| mAb | Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (последовательности CDR выделены жирным шрифтом и подчеркнуты) | SE Q ID NO |
| LP7A5 _1 | EVQLOOSGAELARPGASVKLSCKASGFTFTDHYINWVKQRTG OGLEWIGQIYPGDGNTYYNQKFKGKATLT ADKS S STAYMQLS SLTSED SAVYFCAPNYGDYTIDFWGOGT S VT VS S | 245 |
| LP7A5 _2 | EVOLOQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFTDHYINWVKORTG OGLEWIGQIYPGDGNTYYNQKFKGKATLT ADKS S STAYMQLS SLTSED S A VYFC APNMGMYTIDFWGQGT S VT VS S | 246 |
| LP7A5 _3 | EVOLOQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFTDHYINWVKORTG OGLEWIGQIYPGDGNTYYNQKFKGKATLT ADKS S STAYMQLS SLTSED S A VYFC APNMGMYTLDFWGQGT S VT VS S | 247 |
| LP7A5 _4 | EVOLOQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFTDHYINWVKORTG OGLEWIGQIYPGDGNTYYNQKFKGKATLT ADKS S STAYMQLS SLTSED SAVYFCAPNYGDYTLDFWGOGTSVTVS S | 248 |
| Аминокислотная последовательность легкой цепи | SE Q ID | |
| NO | ||
| LP7A5 _1 | DIVMSQ SPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWY QQKPGOSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKA EDLAVYYCQQYYRYHTFGTGTKLEIK | 249 |
Получение биспецифического антитела к Vy9 x CD33 выполняли следующим образом. Последовательность вариабельной области 7А5 (антитела к TRGV9) и С33В904 (антитела к CD33) использовали для создания биспецифического антитела, подлежащего тестированию в отношении перенаправленного уничтожения Т-клетками клеток острого миелоидного лейкоза (AML). Биспецифические антитела VG4 (антитело к TRGV9 х CD33) и VG3 (антитело к TRGV9 х Null) получали как полноразмерные антитела в формате выступы-во-впадины как IgG4 человека. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие вариабельные области, субклонировали в специально созданные векторы экспрессии млекопитающих, содержащие константную область кассет экспрессии IgG4 человека, с использованием стандартных методик клонирования на основе стандартных ферментов рестрикции при ПЦР и подтверждали секвенированием. Биспецифические антитела экспрессировали путем временной трансфекции в линии клеток яичника китайского хомячка (СНО). Последовательности биспецифических антител, экспрессированных в клетках СНО, представлены в табл. 16 ниже.
- 176 047663
Таблица 16
Последовательности антител, экспрессированных в клетках СНО
| ID inAb | Аминокислотная последовательность плеча выступа и плеча впадины | SEQ ID NO: |
| анти тело к TRG V9 (иле чо впа дины ) | MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSC KSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVP DRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYRYHTFGTGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSEGKSSGSGSESKSTE GKSSGSGSESKSTGGSEVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGF TFTDHYINWVKQRTGQGLEWIGQIYPGDGNTYYNQKFKGKAT LTADKS S STAYMQLS SLTSEDS AVYFC APNYGD YTIDFWGQGT SVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VS WNSGALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S S SLGTKT Y TCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSLGK | 250 |
| анти тело к CD3 3 (иле чо выс тупа ) | MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQTVFYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRKSGVP DRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAEDVAVYYCQHYYSTPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSEGKSSGSGSESKST EGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASG FTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGIGWSGGSIVYADSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSPYGDFFDYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFP | 251 |
- 177 047663
| ЕР VT VS WNSGALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS S V VT VP S S SLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK | ||
| анти тело к RSV (пле чо выс тупа ) | MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR ASQS VS S S YLAWYQQKPGQAPRLLIYGAS SRATGIPDRFSGSGS GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGECGGSEGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGS ESKSTGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIS WVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIST AYLQWS SLKASDTAMYYC ARGDGSTDLD YWGQGTLVT VS S А STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP SNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK | 252 |
Антитела изначально очищали с помощью колонки Mab Select SuRe Protein A (GE Healthcare). Колонку уравновешивали с помощью PBS, рН 7,2 и загружали ферментационной надосадочной жидкостью со скоростью потока 2 мл/мин. После загрузки колонку промывали 4 объемами колонки PBS с последующим элюированием в 30 мМ ацетате натрия, рН 3,5. Фракции, содержащие белковые пики, отслеживаемые по поглощению при 280 нм, объединяли и нейтрализовали до рН 5,0 добавлением 1% 3 М ацетата натрия рН 9,0. Биспецифические mAb далее очищали на препаративной колонке Superdex 200 10/300 GL (GE healthcare) для эксклюзионной хроматографии (SEC), уравновешенной буфером PBS. Целостность образца оценивали путем измерения содержания эндотоксина и SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Репрезентативный гель для VG68 показан на фиг. 12. Конечные концентрации белка составляли 1,0 мг/мл для антител к TRGV9/антител к CD33 и 1,0 мг/мл для антител к TRGV9/Null. Конечные уровни EU для антител к TRGV9/антител к CD33 и антител к TRGV9/Null на их основе составляли <3,0 EU/мг.
Оценивали связывающую активность антитела к CD33 на линиях клеток-мишеней. Связывание клона С33В904 антитела к CD33 с панелью линий CD33+ клеток измеряли с помощью FACS. EC50 и ЕС90 рассчитывали для MOLM-13 (фиг. 13), Kasumi-1 (фиг. 14) и OCI-AML-3 (фиг. 16).
Характеристику Vy9+ (γδ) Т-клеток и всех Т-клеток проводили следующим образом. Золедроновую кислоту использовали для селективного размножения Υγ9' γδ Т-клеток из цельных РВМС. РВМС выделяли из цельных свежих РВМС с использованием набора для выделения человеческих γδ Т-клеток EasySep™ (Stem cell Technologies; Ванкувер, Канада) в соответствии с инструкциями производителя. Выделенные РВМС культивировали в среде RPMI-10 (RPMI, дополненной 10% FBS, 1х пенициллином/стрептомицином) с рекомбинантным человеческим IL-2 (rhIL-2) в конечной концентрации 1000 международных ед./мл, рекомбинантным человеческим IL-15 (rhIL-15) в конечной концентрации 10 нг/мл и золедроновой кислотой в конечной концентрации 5 мкМ в течение 14 дней.
Оценку связывания и цитотоксических свойств биспецифического антитела к TRGV9/k CD33 с ис
- 178 047663 пользованием клеток Kasumi-3 и человеческих γδ Т-клеток проводили следующим образом. Обогащенные γδ Т-клетки (эффекторы), выделенные из РВМС, культивированные с золедроновой кислотой + IL-2 + IL-15 в течение 12 дней, совместно культивировали с меченными CFSE клетками Kasumi-3 (мишени) в соотношениях 1:1 и 5:1 Е:Т в присутствии различных концентраций биспецифического антитела в течение 24 ч. Кривые зависимости ответа от дозы показывают опосредованную биспецифическими антителами к TRGV9/k CD33 и к TRGV9/k NULL цитотоксичность γδ Т-клеток против экспрессирующих CD33 клеток kasumi-3 зависимым от дозы образом при соотношениях 1:1 (фиг. 6) и 5:1 (фиг. 7) Е:Т.
Представленные в данном документе значения цитотоксичности вычитали из исходного значения цитотоксичности, наблюдаемого в отсутствие биспецифического антитела. Значения EC50 рассчитывали, как описано в способах. Репрезентативные данные одного эксперимента представлены на фиг. 16-17, из которых видно, что биспецифическое антитело к TRGV9/k CD33 опосредует цитотоксичность γδ Тклеток против экспрессирующих CD33 клеток Kasumi-3 in vitro.
РВМС здоровых доноров (эффекторы), культивированные с золедроновой кислотой + IL-2 + IL-15 в течение 12 дней, совместно культивировали с меченными CFSE клетками MOLM-13 (мишени) в отношениях 1:1 Е:Т в присутствии различных концентраций биспецифического антитела в течение 24 ч. На фиг. 18 показано, что биспецифическое антитело к TRGV9/k CD33 опосредует цитотоксичность γδ Тклеток (из цельных РВМС) против экспрессирующих CD33 клеток MOLM-13 in vitro. Из кривых зависимости ответа от дозы на фиг. 18 видно, что биспецифические антитела к TRGV9/k CD33 и к TRGV9/k NULL опосредуют цитотоксичность γδ Т-клеток против экспрессирующих CD33 клеток kasumi-3 зависимым от дозы образом. Представленные в данном документе значения цитотоксичности вычитали из исходного значения цитотоксичности, наблюдаемого в отсутствие биспецифического антитела. Значения ЕС50 рассчитывали, как описано в способах. Представленные в данном документе репрезентативные данные получены в одном эксперименте.
Пример 19. In silico анализ и конструирование библиотеки NKK.
In silico анализ доменов VH и VL, идентифицированных в данном документе, проводили для оценки потенциала этих доменов VH и VL подвергаться посттрансляционным модификациям (РТМ). Создавали библиотеку NNK в определенных сайтах РТМ и подвергали скриннингу для определения эффектов мутации аминокислот в потенциальной РТМ.
Потенциальные риски РТМ определяли с использованием инструмента анализа внутренней последовательности, сфокусированного на идентификации мотивов, включая NG, DG и DP. Для первого и второго положений каждого мотива конструировали библиотеки насыщающего мутагенеза NNK. В библиотеке NNK использовали кодоны (N=A, G, С, Т; K=G, T) таким образом, чтобы все 20 аминокислот были представлены в библиотеке. Библиотеки клонировали в плазмиду экспрессии Е. coli путем инфузионного клонирования. Библиотеки высевали и выделяли колонии, представляющие подвергнутые мутации РТМ. На фиг. 19 показан in silico анализ РТМ, при этом РТМ, отобранные для библиотеки NNK, показаны в рамках.
Пример 20. Тестирование термостабильности вариантов scFv, полученных из библиотеки NNK.
Оценивали термостабильности исходных и подверженных мутации клонов scFv, полученных в примере 19. Культуры исходных клонов и библиотек мутагенеза инокулировали и выращивали в течение ночи. Экспрессию индуцировали и надосадочные жидкости анализировали с помощью ELISA. CD33 высевали на 96-луночные планшеты и проводили ELISA связывания. Надосадочные жидкости разделяли на 4 отдельных планшета для нагревания. Для оценки термостабильности анализ проводили при отсутствии обработки, комнатная температура, 55°C, 60°C, 65°C. Сигналы люминесценции нормализовали по необработанному находящемуся при комнатной температуре тому же клону.
На фиг. 20 показана термостабильность scFv, полученных из библиотеки NNK на основе С33В1475 (SEQ ID NO: 277). На фиг. 21 показана термостабильность scFv, полученного из библиотеки NNK на основе С33В1516 (SEQ ID NO: 278). На фиг. 22 показана термостабильность scFv, полученных из библиотеки NNK на основе C33B1517SEQ (SEQ ID NO: 216). На фиг. 23 показана термостабильность scFv, полученного из библиотеки NNK на основе С33В1522 (SEQ ID NO: 213). На фиг. 24 показана таблица с предпочтительными остатками, идентифицированными в ходе скрининга библиотеки NNK.
Эти данные показывают, что удаление потенциальных сайтов РТМ путем мутации не ухудшает связывание с CD33 или не снижает термостабильность. Неожиданные улучшения стабильности наблюдали в нескольких клонах scFv.
Пронумерованные варианты осуществления.
Настоящее изобретение также представлено следующими пронумерованными вариантами осуществления.
Перечень пронумерованных вариантов осуществления (А).
1) Выделенный белок, который связывает CD33, при этом выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 18;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 19;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 20;
- 179 047663
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 21;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 22;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 23;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 24;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 25;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 26; или
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 27, или его связывающий CD33 фрагмент.
2) Выделенный белок по варианту осуществления 1, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно;
b) SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно;
c) SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно;
d) SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно;
e) SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно;
f) SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или
g) SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
3) Выделенный белок по вариантам осуществления 1 или 2, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
4) Выделенный белок по варианту осуществления 3, где выделенный белок представляет собой VHH.
5) Выделенный белок по варианту осуществления 3, где выделенный белок представляет собой Fab.
6) Выделенный белок по варианту осуществления 3, где выделенный белок представляет собой scFv.
7) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 1-6, где выделенный белок содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
8) Выделенный белок, который связывает CD33, где выделенный белок содержит VHH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27, или его связывающий CD33 фрагмент.
9) Выделенный белок, который связывает CD33, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60; или
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61.
10) Выделенный белок по варианту осуществления 9, содержащий HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36 и 45 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38 и 47 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39 и 48 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41 и 50 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42 и 51 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44 и 51 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42 и 51 соответственно.
11) Выделенный белок по варианту осуществления 9 или 10, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 81;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 83;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 84;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL VL под SEQ ID NO: 86;
- 180 047663
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; или
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 88.
12) Выделенный белок по варианту осуществления 11, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
13) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 9-12, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
14) Выделенный белок по варианту осуществления 13, где выделенный белок представляет собой Fab.
15) Выделенный белок по варианту осуществления 13, где выделенный белок представляет собой VHH.
16) Выделенный белок по варианту осуществления 13, где выделенный белок представляет собой scFv.
17) Выделенный белок по варианту осуществления 16, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
18) Выделенный белок по варианту осуществления 17, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
19) Выделенный белок по варианту осуществления 18, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
20) Выделенный белок по варианту осуществления 19, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
21) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 9-20, где выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или 61 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 или 88.
22) Выделенный белок по варианту осуществления 21, где выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87; или
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88.
23) Выделенный белок, который связывает CD33, где выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQIDNO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
- 181 047663
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87; или
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88.
24) Выделенный белок по варианту осуществления 23, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
25) Выделенный белок по варианту осуществления 24, где выделенный белок представляет собой Fab.
26) Выделенный белок по варианту осуществления 24, где выделенный белок представляет собой VHH.
27) Выделенный белок по варианту осуществления 24, где выделенный белок представляет собой scFv.
28) Выделенный белок по варианту осуществления 27, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
29) Выделенный белок по варианту осуществления 28, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
30) Выделенный белок по варианту осуществления 29, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
31) Выделенный белок по варианту осуществления 30, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
32) Выделенный белок, который связывает CD33, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96.
33) Выделенный белок по варианту осуществления 32, содержащий HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90 и 92 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91 и 94 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно;
e) SEQ ID NO: 172, 173 и 174 соответственно;
f) SEQ ID NO: 176, 177 и 178 соответственно;
g) SEQ ID NO: 89, 90 и 180 соответственно; или
h) SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно.
34) Выделенный белок по варианту осуществления 32 или 33, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 105;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 106;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 107;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 185;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 188;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 192;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 196;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 200; или
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 202.
- 182 047663
35) Выделенный белок по варианту осуществления 34, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно;
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
36) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 32-35, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
37) Выделенный белок по варианту осуществления 36, где выделенный белок представляет собой Fab.
38) Выделенный белок по варианту осуществления 36, где выделенный белок представляет собой VHH.
39) Выделенный белок по варианту осуществления 36, где выделенный белок представляет собой scFv.
40) Выделенный белок по варианту осуществления 39, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
41) Выделенный белок по варианту осуществления 40, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
42) Выделенный белок по варианту осуществления 41, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
43) Выделенный белок по варианту осуществления 42, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
44) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 32-43, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
45) Выделенный белок по варианту осуществления 44, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
46) Выделенный белок, который связывает CD33, где выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
47) Выделенный белок по варианту осуществления 46, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
48) Выделенный белок по варианту осуществления 47, где выделенный белок представляет собой Fab.
49) Выделенный белок по варианту осуществления 47, где выделенный белок представляет собой VHH.
50) Выделенный белок по варианту осуществления 47, где выделенный белок представляет собой
- 183 047663 scFv.
51) Выделенный белок по варианту осуществления 50, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
52) Выделенный белок по варианту осуществления 51, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
53) Выделенный белок по варианту осуществления 52, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
54) Выделенный белок по варианту осуществления 53, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
55) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 1-54, где белок конъюгирован с удлиняющим период полужизни фрагментом.
56) Выделенный белок по варианту осуществления 55, где удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой иммуноглобулин (Ig), фрагмент Ig, константную область Ig, фрагмент константной области Ig, Fc-область, трансферрин, альбумин, альбуминсвязывающий домен или полиэтиленгликоль.
57) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 1-56, где выделенный белок представляет собой моноспецифический белок.
58) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 1-57, где выделенный белок представляет собой мультиспецифический белок.
59) Выделенный белок по варианту осуществления 58, где мультиспецифический белок представляет собой биспецифический белок.
60) Выделенный белок по варианту осуществления 59, где мультиспецифический белок представляет собой триспецифический белок.
61) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 1-60, дополнительно содержащий константную область иммуноглобулина (Ig) или фрагмент его константной области Ig.
62) Выделенный белок по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит Fc-область.
63) Выделенный белок по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит домен СН2.
64) Выделенный белок по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит домен CH3.
65) Выделенный белок по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит домен СН2 и домен CH3.
66) Выделенный белок по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере часть шарнира, домен СН2 и домен CH3.
67) Выделенный белок по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит шарнир, домен СН2 и домен CH3.
68) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 61-67, содержащий связывающий CD33 антигенсвязывающий домен, который конъюгирован с N-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig.
69) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 61-67, содержащий связывающий CD33 антигенсвязывающий домен, который конъюгирован с С-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig.
70) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 61-69, содержащий связывающий CD33 антигенсвязывающий домен, который конъюгирован с константной областью Ig или фрагментом константной области Ig через второй линкер (L2).
71) Выделенный белок по варианту осуществления 70, где L2 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
72) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 58-71, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген на лимфоците.
73) Выделенный белок по варианту осуществления 72, где лимфоцит представляет собой Т-клетку.
74) Выделенный белок по варианту осуществления 72, где Т-клетка представляет собой CD8+ Тклетку.
75) Выделенный белок по варианту осуществления 72, где лимфоцит представляет собой естественную киллерную (NK) клетку.
76) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 58-75, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3, CD3 эпсилон (CD3ε), CD8, KI2L4,
- 184 047663
NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C.
77) Выделенный белок по варианту осуществления 76, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε.
78) Выделенный белок по варианту осуществления 77, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε, содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 141, HCDR2 под SEQ ID NO: 142, HCDR3 под SEQ ID NO: 143, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 144, LCDR2 под SEQ ID NO: 145 и LCDR3 под SEQ ID NO: 146;
b) VH под SEQ ID NO: 147 и VL под SEQ ID NO: 148;
c) HCDR1 под SEQ ID NO: 149, HCDR2 под SEQ ID NO: 150, HCDR3 под SEQ ID NO: 151, LCDR1 под SEQ ID NO: 152, LCDR2 под SEQ ID NO: 153 и LCDR3 под SEQ ID NO: 154; или
d) VH под SEQ ID NO: 155 и VL под SEQ ID NO: 156.
79) Выделенный белок по варианту осуществления 76, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9.
80) Выделенный белок по варианту осуществления 79, где антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 238, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
b) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 242, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
c) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 243, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
d) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 244, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
e) VH под SEQ ID NO: 245 и VL под SEQ ID NO: 249;
f) VH под SEQ ID NO: 246 и VL под SEQ ID NO: 249;
g) VH под SEQ ID NO: 247 и VL под SEQ ID NO: 249; или
h) VH под SEQ ID NO: 248 и VL под SEQ ID NO: 249.
81) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 61-80, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
82) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 61-81, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению степени связывания белка с Fcy рецептором (FcyR).
83) Выделенный белок по варианту осуществления 82, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к снижению степени связывания белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, Н214Т/Е233РА234^235Аделеции
G236/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S и
S228Р/F234А/L235А/делеции G236/G237A/P238S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
84) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 61-81, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к усилению связывания белка с FcyR.
85) Выделенный белок по варианту осуществления 84, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к усилению связывания белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и G236A/S239D/I332E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
86) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 82-85, где FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIII или любую их комбинацию.
87) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 61-86, где константная область Ig фрагмента константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует период полужизни белка.
88) Выделенный белок по варианту осуществления 87, где по меньшей мере одна мутация, которая модулирует период полужизни белка, выбрана из группы, состоящей из Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
- 185 047663
89) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 61-88, где белок содержит по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 константной области Ig.
90) Выделенный белок по варианту осуществления 89, где по меньшей мере одна мутация в домене CH3 константной области Ig выбрана из группы, состоящей из T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F,
L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V и T350V/T366L/K392L/T394W, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
91) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 1-54, где белок представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
92) Выделенный белок по варианту осуществления 91, где CAR содержит
a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по любому из вариантов осуществления 1-54;
b) трансмембранный домен и
c) домен внутриклеточной передачи сигнала, необязательно содержащий по меньшей мере один костимуляторный домен.
93) Выделенный белок по варианту осуществления 91 или 92, где CAR дополнительно содержит CD8а-шарнирную область.
94) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 91-93, где
a) трансмембранный домен содержит полипептид трансмембранной области CD8a (CD8a-TM); и
b) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, содержащий компонент представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), и домен передачи первичного сигнала, содержащий компонент дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z).
95) Выделенный белок по любому из вариантов осуществления 91-93, где
a) CD8а-шарнирная область содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 157;
b) трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 162; и/или
c) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 163, и домен передачи первичного сигнала, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 164.
96) Выделенный белок по варианту осуществления 95, где домен внутриклеточной передачи сигнала содержит полипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из компонента представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), компонента дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z), компонента кластера дифференцировки (CD27), компонента представителя суперсемейства кластеров дифференцировки или любых их комбинаций.
97) Фармацевтическая композиция, содержащая выделенный белок по любому из вариантов осуществления 1-96 и фармацевтически приемлемый носитель.
98) Полинуклеотид, кодирующий выделенный белок по любому из вариантов осуществления 1-96.
99) Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 98.
100) Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту осуществления 99.
101) Способ получения выделенного белка по любому из вариантов осуществления 1-96, включающий культивирование клетки-хозяина по варианту осуществления 100 в условиях, при которых экспрессируется белок, и извлечение белка, продуцируемого клеткой-хозяином.
102) Антиидиотипическое антитело, связывающееся с выделенным белком по любому из вариантов осуществления 1-96.
103) Набор, содержащий выделенный белок по любому из вариантов осуществления 1-96.
104) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта.
105) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта.
106) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта.
107) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для лечения не являющегося раковым состояния у субъекта с риском развития рака с экспрессией CD33.
Перечень пронумерованных вариантов осуществления (В).
1) Выделенный мультиспецифический белок, содержащий первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита.
2) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 1, где антиген лимфоцита представляет собой антиген Т-клетки.
- 186 047663
3) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 1, где антиген Т-клетки представляет собой антиген CD8+ Т-клетки.
4) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 1, где антиген лимфоцита представляет собой антиген NK-клетки.
5) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-4, где антиген лимфоцита представляет собой CD3, CD3 эпсилон (CD3ε), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C.
6) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 5, где антиген лимфоцита представляет собой CD3ε.
7) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-6, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
8) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 7, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат Fab.
9) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 7, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат VHH.
10) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 7, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат scFv.
11) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 10, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
12) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 11, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
13) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 12, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
14) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 13, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
15) Выделенный мультиспецифический по любому из вариантов осуществления 1-14, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под любым из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 или 5, HCDR2 под любым из SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 или 11 и HCDR3 под любым из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 или 17.
16) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-15, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно;
b) SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно;
c) SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно;
d) SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно;
e) SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно;
f) SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или
g) SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно, или его связывающий CD33 фрагмент.
17) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-16, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
18) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-14, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35, HCDR2 под SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, HCDR3 под SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51, LCDR1 под SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 67 или 68, LCDR2 под SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73 или 74 и LCDR3 под SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78, 79 или 80.
19) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-14 и 18, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
- 187 047663
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
20) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-14, 18 и 19, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или 61 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 или 88.
21) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-14 и 18-20, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87; или
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88.
22) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-14, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 33, 89, 167, 172 или 176, HCDR2 под SEQ ID NO: 90, 91, 168, 173 или 177, HCDR3 под SEQ ID NO: 92, 93, 94, 169, 174, 178 или 180, LCDR1 под SEQ ID NO: 98, 99, 100, 182, 186, 189, 193, 197 или 201, LCDR2 под SEQ ID NO: 101, 102, 103, 183, 187, 190, 194 или 198 и LCDR3 под SEQ ID NO: 104, 184, 191, 195 или 199.
23) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-14 и 22, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно; или
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
24) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-14, 22 и 23, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
25) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-14 и 22-24, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
26) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-25, где второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержит
a) HCDR1 под SEQ ID NO: 141, HCDR2 под SEQ ID NO: 142, HCDR3 под SEQ ID NO: 143, LCDR1 под SEQ ID NO: 144, LCDR2 под SEQ ID NO: 145 и LCDR3 под SEQ ID NO: 146;
b) VH под SEQ ID NO: 147 и VL под SEQ ID NO: 148;
c) HCDR1 под SEQ ID NO: 149, HCDR2 под SEQ ID NO: 150, HCDR3 под SEQ ID NO: 151, LCDR1 под SEQ ID NO: 152, LCDR2 под SEQ ID NO: 153 и LCDR3 под SEQ ID NO: 154; или
d) VH под SEQ ID NO: 155 и VL под SEQ ID NO: 156.
- 188 047663
27) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-25, где второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 238, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
b) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 242, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
c) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 243, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
d) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 244, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
e) VH под SEQ ID NO: 245 и VL под SEQ ID NO: 249;
f) VH под SEQ ID NO: 246 и VL под SEQ ID NO: 249;
g) VH под SEQ ID NO: 247 и VL под SEQ ID NO: 249; или
h) VH под SEQ ID NO: 248 и VL под SEQ ID NO: 249.
28) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-27, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгирован с первой константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом первой константной области Ig, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, конъюгирован со второй константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом второй константной области Ig.
29) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 28, дополнительно содержащий второй линкер (L2) между первым антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, и первой константной областью Ig или фрагментом первой константной области Ig и вторым антигенсвязывающим доменом, который связывает антиген лимфоцита, и второй константной областью Ig или фрагментом второй константной области Ig.
30) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 29, где L2 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, ПО, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
31) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 27-29, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
32) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 28-31, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению степени связывания мультиспецифического белка с FcyR.
33) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 32, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к снижению связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S,
V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A,
V234A/G237A, K214Т/Е233Р/L234V/L235А/делеции G236/A327G/P331A/D365E/L358M,
H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A,
L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S и
S228Р/F234А/L235А/делеции G236/G237A/P238S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
34) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 28-31, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с Fcy рецептором (FcyR).
35) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 34, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L,
F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и G236A/S239D/I332E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
36) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 32-35, где FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIII или любую их комбинацию.
37) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 28-36, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная об
- 189 047663 ласть Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка.
38) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 37, где по меньшей мере одна мутация, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка, выбрана из группы, состоящей из Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
39) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 28-38, содержащий по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig.
40) Выделенный мультиспецифический белок по варианту осуществления 39, где по меньшей мере одна мутация в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одна мутация в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig выбрана из группы, состоящей из T350V, L351Y, F405A,Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F, L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V и
T350V/T366L/K392L/T394W, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
41) Выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 28-40, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат следующие мутации:
a) L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V в первой константной области Ig и L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W во второй константной области Ig или
b) L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W в первой константной области Ig и L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V во второй константной области Ig.
41) Набор, содержащий выделенный мультиспецифический белок по любому из вариантов осуществления 1-41.
42) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта.
43) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта.
44) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта.
45) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для лечения не являющегося раковым состояния у субъекта с риском развития рака с экспрессией CD33.
Перечень пронумерованных вариантов осуществления (С).
1) Иммуноконъюгат, содержащий выделенный белок, конъюгированный со средством, где выделенный белок связывает CD33, при этом выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 18;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 19;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 20;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 21;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 22;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 23;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 24;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 25;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 26; или
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 27, или его связывающий CD33 фрагмент.
2) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 1, где выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно;
b) SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно;
c) SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно;
d) SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно;
e) SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно;
f) SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или
g) SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
3) Иммуноконъюгат по вариантам осуществления 1 или 2, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
4) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 3, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой VHH.
5) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 3, где антигенсвязывающий домен, который свя
- 190 047663 зывает CD33, представляет собой Fab.
6) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 3, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv.
7) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-6, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
8) Иммуноконъюгат, содержащий выделенный белок, конъюгированный со средством, где выделенный белок связывает CD33, при этом выделенный белок содержит VHH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
9) Иммуноконъюгат, содержащий выделенный белок, конъюгированный со средством, где выделенный белок связывает CD33, и при этом выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60; или
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61.
10) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 9, где выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36 и 45 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38 и 47 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39 и 48 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41 и 50 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42 и 51 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44 и 51 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42 и 51 соответственно.
11) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 9 или 10, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 81;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 83;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 84;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 86;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; или
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 88.
12) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 11, где выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
- 191 047663
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
13) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 9-12, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
14) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 13, где выделенный белок представляет собой Fab.
15) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 13, где выделенный белок представляет собой VHH.
16) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 13, где выделенный белок представляет собой scFv.
17) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 16, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
18) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 17, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
19) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 18, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
20) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 19, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
21) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 9-20, где выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или 61 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 или 88.
22) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 21, где выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87; или
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88.
23) Иммуноконъюгат, содержащий выделенный белок, конъюгированный со средством, где выделенный белок связывает CD33, и при этом выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87; или
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88.
24) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 23, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
25) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 24, где выделенный белок представляет собой Fab.
26) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 24, где выделенный белок представляет собой VHH.
27) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 24, где выделенный белок представляет собой scFv.
28) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 27, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
29) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 28, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
- 192 047663
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
30) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 29, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
31) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 30, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
32) Иммуноконъюгат, содержащий выделенный белок, конъюгированный со средством, где выделенный белок связывает CD33, и при этом выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96.
33) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 32, содержащий HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90 и 92 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91 и 94 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно;
e) SEQ ID NO: 172, 173 и 174 соответственно;
f) SEQ ID NO: 176, 177 и 178 соответственно;
g) SEQ ID NO: 89, 90 и 180 соответственно; или
h) SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно.
34) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 32 или 33, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 105;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 106;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 107;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 185;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 188;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 192;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 196;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 200; или
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 202.
35) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 34, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно;
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
36) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 32-35, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
37) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 36, где выделенный белок представляет собой
- 193 047663
Fab. 38) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 36, где выделенный белок представляет собой VHH.
39) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 36, где выделенный белок представляет собой scFv.
40) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 39, где scFv содержит от N- до С-конца VH, пер вый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
41) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 40, где L1 содержит a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
42) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 41, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,
122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
43) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 42, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
44) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 32-43, где выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
45) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 44, где выделенный белок содержит a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
46) Иммуноконъюгат, содержащий выделенный белок, конъюгированный со средством, где выделенный белок связывает CD33, и при этом выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
47) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 46, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
48) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 47, где выделенный белок представляет собой Fab.
49) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 47, где выделенный белок представляет собой VHH.
50) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 47, где выделенный белок представляет собой scFv.
51) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 50, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
52) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 51, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
53) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 52, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
54) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 53, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
55) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-54, где выделенный белок конъюгирован с удлиняющим период полужизни фрагментом.
- 194 047663
56) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 55, где удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой иммуноглобулин (Ig), фрагмент Ig, константную область Ig, фрагмент константной области Ig, Fc-область, трансферрин, альбумин, альбуминсвязывающий домен или полиэтиленгликоль.
57) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-56, где выделенный белок пред ставляет собой моноспецифический белок.
58) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-57, где выделенный белок представляет собой мультиспецифический белок.
59) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 58, где мультиспецифический белок представляет собой биспецифический белок.
60) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 59, где мультиспецифический белок представляет собой триспецифический белок.
61) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-60, дополнительно содержащий константную область иммуноглобулина (Ig) или фрагмент его константной области Ig.
62) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит Fc-область.
63) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит домен СН2.
64) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит домен CH3.
65) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит домен СН2 и домен CH3.
66) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере часть шарнира, домен СН2 и домен CH3.
67) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит шарнир, домен СН2 и домен CH3.
68) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 61-67, где выделенный белок конъюгирован с N-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig.
69) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 61-67, где выделенный белок конъюгирован с С-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig.
70) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 61-69, где выделенный белок конъюгирован с константной областью Ig или фрагментом константной области Ig через второй линкер (L2).
71) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 70, где L2 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
72) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 58-71, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген на лимфоците.
73) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 72, где лимфоцит представляет собой Т-клетку.
74) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 72, где Т-клетка представляет собой CD8+ Т клетку.
75) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 72, где лимфоцит представляет собой естественную киллерную (NK) клетку.
76) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 58-75, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3, CD3 эпсилон (CD3ε), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C.
77) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 76, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε.
78) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 77, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε, содержит
а) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 141, HCDR2 под SEQ ID NO: 142, HCDR3 под SEQ ID NO: 143, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 144, LCDR2 под SEQ ID NO: 145 и LCDR3 под SEQ ID NO: 146;
b) VH под SEQ ID NO: 147 и VL под SEQ ID NO: 148;
c) HCDR1 под SEQ ID NO: 149, HCDR2 под SEQ ID NO: 150, HCDR3 под SEQ ID NO: 151, LCDR1 под SEQ ID NO: 152, LCDR2 под SEQ ID NO: 153 и LCDR3 под SEQ ID NO: 154; или
d) VH под SEQ ID NO: 155 и VL под SEQ ID NO: 156.
79) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 76, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9.
80) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 77, где антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9 содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 238, определяющую комплементарность область 1
- 195 047663 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
b) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 242, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
c) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 243, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
d) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 244, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
e) VH под SEQ ID NO: 245 и VL под SEQ ID NO: 249;
f) VH под SEQ ID NO: 246 и VL под SEQ ID NO: 249;
g) VH под SEQ ID NO: 247 и VL под SEQ ID NO: 249; или h) VH под SEQ ID NO: 248 и VL под SEQ ID NO: 249.
81) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 61-80, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
82) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 61-81, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению степени связывания белка с Fcy рецептором (FcyR).
83) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 82, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к снижению степени связывания белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214Т/Е233Р/L234V/L235А/делеции
G236/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S и
S228Р/F234А/L235А/делеции G236/G237A/P238S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
84) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 61-81, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к усилению связывания белка с FcyR.
85) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 84, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к усилению связывания белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L,
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и G236A/S239D/I332E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
86) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 80-85, где FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIII или любую их комбинацию.
87) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 61-86, где константная область Ig фрагмента константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует период полужизни белка.
88) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 87, где по меньшей мере одна мутация, которая модулирует период полужизни белка, выбрана из группы, состоящей из Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
89) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 61-88, где выделенный белок содержит по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 константной области Ig.
90) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 89, где по меньшей мере одна мутация в домене CH3 константной области Ig выбрана из группы, состоящей из T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F,
L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V и T350V/T366L/K392L/T394W, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
91) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-54, где выделенный белок представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
92) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 91, где CAR содержит
a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, определяемый в любом из вариантов осуществления 1-54;
b) трансмембранный домен и
c) домен внутриклеточной передачи сигнала, необязательно содержащий по меньшей мере один костимуляторный домен.
93) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 91 или 92, где CAR дополнительно содержит
- 196 047663
CD8а-шарнирную область.
94) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 91-93, где
а) трансмембранный домен содержит полипептид трансмембранной области CD8a (CD8a-TM); и
b) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, содержащий компонент представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), и домен передачи первичного сигнала, содержащий компонент дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z).
95) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 91-93, где
а) CD8a-шарнирная область содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 157;
b) трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 162; и/или
c) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 163, и домен передачи первичного сигнала, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 164.
96) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 95, где домен внутриклеточной передачи сигнала содержит полипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из компонента представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), компонента дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Тклетки (CD3z), компонента кластера дифференцировки (CD27), компонента представителя суперсемейства кластеров дифференцировки или любых их комбинаций.
97) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-96, где средство представляет собой терапевтическое средство или визуализирующее средство.
98) Фармацевтическая композиция, содержащая иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-96 и фармацевтически приемлемый носитель.
99) Полинуклеотид, кодирующий выделенный белок иммуноконъюгата по любому из вариантов осуществления 1-96.
100) Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 99.
101) Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту осуществления 100.
102) Способ получения иммуноконъюгата по любому из вариантов осуществления 1-96, включающий культивирование клетки-хозяина по варианту осуществления 101 в условиях, при которых экспрессируется белок, извлечение белка, продуцируемого клеткой-хозяином, и конъюгирование белка, продуцируемого клеткой-хозяином, со средством.
103) Иммуноконъюгат, содержащий выделенный мультиспецифический белок, конъюгированный с средством, где выделенный мультиспецифический белок содержит первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита.
104) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 103, где антиген лимфоцита представляет собой антиген Т-клетки.
105) Иммуноконъюгированный белок по варианту осуществления 103, где антиген Т-клетки представляет собой антиген CD8+ Т-клетки.
106) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 103, где антиген лимфоцита представляет собой антиген NK-клетки.
107) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-106, где антиген лимфоцита представляет собой CD3, CD3 эпсилон (CD3s), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C.
108) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 107, где антиген лимфоцита представляет собой CD3s.
109) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-108, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
110) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 109, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат Fab.
111) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 109, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат VHH.
112) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 110, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат scFv.
113) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 112, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
114) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 113, где L1 содержит
- 197 047663
а) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
115) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 114, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
116) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 115, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
117) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-116, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под любым из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 или 5, HCDR2 под любым из SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 или 11 и HCDR3 под любым из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 или 17.
118) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-117, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR1, HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно;
b) SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно;
c) SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно;
d) SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно;
e) SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно;
f) SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или
g) SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
119) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-118, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
120) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-116, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35, HCDR2 под SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, HCDR3 под SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51, LCDR1 под SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 67 или 68, LCDR2 под SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73 или 74 и LCDR3 под SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78, 79 или 80.
121) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-116 и 120, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
122) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-116, 120 и 121, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или 61 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 или 88.
123) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-116 и 120-122, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87; или
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88.
124) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-116, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 33, 89, 167, 172 или 176, HCDR2 под SEQ ID NO: 90, 91, 168, 173 или 177, HCDR3 под SEQ ID NO: 92, 93, 94, 169, 174, 178 или 180, LCDR1 под SEQ ID NO: 98, 99, 100, 182, 186, 189, 193, 197 или 201, LCDR2 под SEQ ID NO: 101,
- 198 047663
102, 103, 183, 187, 190, 194 или 198 и LCDR3 под SEQ ID NO: 104, 184, 191, 195 или 199.
125) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-116 и 124, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно; или
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
126) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-116, 124 и 125, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175 или 179 и VL под SEQ ID NO 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
127) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-116 и 124-126, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
128) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-127, где второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержит
a) HCDR1 под SEQ ID NO: 141, HCDR2 под SEQ ID NO: 142, HCDR3 под SEQ ID NO: 143, LCDR1 под SEQ ID NO: 144, LCDR2 под SEQ ID NO: 145 и LCDR3 под SEQ ID NO: 146;
b) VH под SEQ ID NO: 147 и VL под SEQ ID NO: 148;
c) HCDR1 под SEQ ID NO: 149, HCDR2 под SEQ ID NO: 150, HCDR3 под SEQ ID NO: 151, LCDR1 под SEQ ID NO: 152, LCDR2 под SEQ ID NO: 153 и LCDR3 под SEQ ID NO: 154; или
d) VH под SEQ ID NO: 155 и VL под SEQ ID NO: 156.
129) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 101-128, где второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержит
а) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 238, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
b) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 242, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
c) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 243, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
d) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 244, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
e) VH под SEQ ID NO: 245 и VL под SEQ ID NO: 249;
f) VH под SEQ ID NO: 246 и VL под SEQ ID NO: 249;
g) VH под SEQ ID NO: 247 и VL под SEQ ID NO: 249; или
h) VH под SEQ ID NO: 248 и VL под SEQ ID NO: 249.
130) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-129, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгирован с первой константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом первой константной области Ig, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, конъюгирован со второй константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом второй константной области Ig.
131) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 130, дополнительно содержащий второй линкер (L2) между первым антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, и первой константной областью Ig или фрагментом первой константной области Ig и вторым антигенсвязывающим доменом, который связывает антиген лимфоцита, и второй константной областью Ig или фрагментом второй кон
- 199 047663 стантной области Ig.
132) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 131, где L2 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
133) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 130-132, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
134) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 130-133, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению степени связывания мультиспецифического белка с FcyR.
135) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 134, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к снижению степени связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S,
V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A,
V234A/G237A, K214Т/Е233Р/L234V/L235А/делеции G236/A327G/P331A/D365E/L358M,
H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A,
L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S и
S228Р/F234А/L235А/делеции G236/G237A/P238S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
136) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 130-133, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с Fcy рецептором (FcyR).
137) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 136, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L,
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и G236A/S239D/I332E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
138) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 134-137, где FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIII или любую их комбинацию.
139) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 130-138, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка.
140) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 139, где по меньшей мере одна мутация, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка, выбрана из группы, состоящей из Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
141) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 130-140, где белок содержит по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig.
142) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 141, где по меньшей мере одна мутация в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одна мутация в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig выбрана из группы, состоящей из T350V, L351Y, F405A,Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F, L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V и
T350V/T366L/K392L/T394W, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
143) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 130-142, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат следующие мутации:
a) L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V в первой константной области Ig и L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W во второй константной области Ig или
b) L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W в первой константной области Ig и L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V во второй константной области Ig.
144) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 103-143, где средство представляет собой терапевтическое средство или визуализирующее средство.
145) Фармацевтическая композиция, содержащая иммуноконъюгат по любому из вариантов осуще
- 200 047663 ствления 103-143 и фармацевтически приемлемый носитель.
146) Полинуклеотид, кодирующий выделенный мультиспецифический белок иммуноконъюгата по любому из вариантов осуществления 103-143.
147) Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 146.
148) Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту осуществления 147.
149) Способ получения иммуноконъюгата по любому из вариантов осуществления 103-143, включающий культивирование клетки-хозяина по варианту осуществления 148 в условиях, при которых экспрессируется мультиспецифический белок, извлечение мультиспецифического белка, продуцируемого клеткой-хозяином, и конъюгирование мультиспецифического белка со средством.
150) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-96 и 103-143, где средство представляет собой радиоактивное средство.
151) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 150, где радиоактивное средство содержит ион радиометалла.
152) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 151, где ион радиометалла представляет собой 32Р, 47Sc, 67Cu, 77As, 89Sr, 90Y, 99Tc, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 131I, 153Sm, 159Gd, 165Dy, 166Ho, 169Er, 177Lu, 186Re, 188Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 225Ac, 255Fm, 227Th, 62Cu, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr или 111In.
153) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 151, где ион радиометалла представляет собой 225Ас, 111In или 89Zr.
154) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 151, где ион радиометалла представляет собой 225Ас.
155) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 151-154, где ион радиометалла конъюгирован с хелатирующим фрагментом.
156) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 155, где хелатирующий фрагмент содержит макроцикл, имеющий структуру формулы (I):
где каждый из R1, R2, R3 и R4 независимо представляет собой CHQCO2X, где
Q независимо представляет собой водород, С1-С4-алкил или (С1-С2-алкил)фенил, и
X независимо представляет собой водород, бензил, С1-С4-алкил; и
Z представляет собой (CH2)nY, при этом n равняется 1-10, и
Y представляет собой электрофильный или нуклеофильный фрагмент, ковалентно связанный со вторым партнером клик-реакции;
в качестве альтернативы, Z представляет собой водород; и каждый из R1, R2, R3 и R4 независимо представляет собой CHQCO2X, где
Q независимо представляет собой водород, С1-С4-алкил или (С1-С2-алкил)фенил, и
X независимо представляет собой водород, бензил, С1-С4-алкил или электрофильный или нуклеофильный фрагмент, ковалентно связанный со вторым партнером клик-реакции;
в качестве альтернативы, хелант содержит открытоцепочечный лиганд.
157) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 155, где хелатирующий фрагмент содержит макроцикл, имеющий структуру формулы (II):
или структуру формулы (III):
- 201 047663
158) Иммуноконъюгат формулы (IV),
4 йежж формула (IV), где белок представляет собой выделенный белок, определяемый в любом из вариантов осуществления 1-96.
159) Иммуноконъюгат формулы (V),
NH 54 формула (V), где белок представляет собой выделенный белок, определяемый в любом из вариантов осуществления 1-96.
160) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта.
161) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта.
162) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта.
163) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для лечения не являющегося раковым состояния у субъекта с риском развития рака с экспрессией CD33.
Перечень пронумерованных вариантов осуществления (D).
1) Способ лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного белка субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где выделенный белок связывает CD33, и при этом выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 18;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 19;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 20;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 21;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 22;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 23;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 24;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 25;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 26; или
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 27, или его связывающий CD33 фрагмент.
2) Способ по варианту осуществления 1, где выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно;
b) SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно;
c) SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно;
d) SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно;
e) SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно;
f) SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или
g) SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
3) Способ по вариантам осуществления 1 или 2, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
4) Способ по варианту осуществления 3, где выделенный белок представляет собой VHH.
5) Способ по варианту осуществления 3, где выделенный белок представляет собой Fab.
6) Способ по варианту осуществления 3, где выделенный белок представляет собой scFv.
7) Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, где выделенный белок содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
- 202 047663
8) Способ лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного белка субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где выделенный белок связывает CD33, и при этом выделенный белок содержит VHH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
9) Способ лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного белка субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где выделенный белок связывает CD33, при этом антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60; или
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61, или его связывающий CD33 фрагмент.
10) Способ по варианту осуществления 9, где выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36 и 45 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38 и 47 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39 и 48 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41 и 50 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42 и 51 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44 и 51, соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42 и 51 соответственно.
11) Способ по варианту осуществления 9 или 10, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 52 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 81;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 54 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 83;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 55 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 84;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 57 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL VL под SEQ ID NO: 86;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 58 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 60 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87; или
j) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 61 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 88.
12) Способ по варианту осуществления 11, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
- 203 047663
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
13) Способ по любому из вариантов осуществления 9-12, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
14) Способ по варианту осуществления 13, где выделенный белок представляет собой Fab.
15) Способ по варианту осуществления 13, где выделенный белок представляет собой VHH.
16) Способ по варианту осуществления 13, где выделенный белок представляет собой scFv.
17) Способ по варианту осуществления 16, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
18) Способ по варианту осуществления 17, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
19) Способ по варианту осуществления 18, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
20) Способ по варианту осуществления 19, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
21) Способ по любому из вариантов осуществления 9-20, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, или 61 и VL под SeQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, или 88.
22) Способ по варианту осуществления 21, где выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87; или
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88.
23) Способ лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного белка субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где выделенный белок связывает CD33, и при этом выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87; или
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88.
24) Способ по варианту осуществления 23, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
25) Способ по варианту осуществления 24, где выделенный белок представляет собой Fab.
26) Способ по варианту осуществления 24, где выделенный белок представляет собой VHH.
27) Способ по варианту осуществления 24, где выделенный белок представляет собой scFv.
28) Способ по варианту осуществления 27, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
29) Способ по варианту осуществления 28, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
30) Способ по варианту осуществления 29, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
31) Способ по варианту осуществления 30, где L1 содержит аминокислотную последовательность
- 204 047663 под SEQ ID NO: 108.
32) Способ лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного белка субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где выделенный белок связывает CD33, и при этом выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181;
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96.
33) Способ по варианту осуществления 32, содержащий HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90 и 92 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91 и 94 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно;
e) SEQ ID NO: 172, 173 и 174 соответственно;
f) SEQ ID NO: 176, 177 и 178 соответственно;
g) SEQ ID NO: 89, 90 и 180 соответственно; или
h) SEQ ID NO: 89, 90 и 93 соответственно.
34) Способ по варианту осуществления 32 или 33, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 95 и определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) под SEQ ID NO: 105;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 106;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 97 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 107;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 170 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 185;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 171 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 188;
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 175 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 192;
g) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 179 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 196;
h) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 181 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 200; или
i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 96 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 202.
35) Способ по варианту осуществления 34, где выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно;
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
36) Способ по любому из вариантов осуществления 32-35, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
37) Способ по варианту осуществления 36, где выделенный белок представляет собой Fab.
38) Способ по варианту осуществления 36, где выделенный белок представляет собой VHH.
39) Способ по варианту осуществления 36, где выделенный белок представляет собой scFv.
40) Способ по варианту осуществления 39, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
41) Способ по варианту осуществления 40, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
- 205 047663
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
42) Способ по варианту осуществления 41, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
43) Способ по варианту осуществления 42, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
44) Способ по любому из вариантов осуществления 32-43, где выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO: 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
45) Способ по варианту осуществления 44, где выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
46) Способ лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного белка субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где выделенный белок связывает CD33, при этом выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
47) Способ по варианту осуществления 46, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
48) Способ по варианту осуществления 47, где выделенный белок представляет собой Fab.
49) Способ по варианту осуществления 47, где выделенный белок представляет собой VHH.
50) Способ по варианту осуществления 47, где выделенный белок представляет собой scFv.
51) Способ по варианту осуществления 50, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
52) Способ по варианту осуществления 51, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
53) Способ по варианту осуществления 52, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
54) Способ по варианту осуществления 53, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
55) Способ по любому из вариантов осуществления 1-54, где выделенный белок конъюгирован с удлиняющим период полужизни фрагментом.
56) Способ по варианту осуществления 55, где удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой иммуноглобулин (Ig), фрагмент Ig, константную область Ig, фрагмент константной области Ig, Fc-область, трансферрин, альбумин, альбуминсвязывающий домен или полиэтиленгликоль.
57) Способ по любому из вариантов осуществления 1-56, где выделенный белок представляет собой моноспецифический белок.
58) Способ по любому из вариантов осуществления 1-57, где выделенный белок представляет собой мультиспецифический белок.
59) Способ по варианту осуществления 58, где мультиспецифический белок представляет собой биспецифический белок.
60) Способ по варианту осуществления 59, где мультиспецифический белок представляет собой
- 206 047663 триспецифический белок.
61) Способ по любому из вариантов осуществления 1-60, дополнительно содержащий константную область иммуноглобулина (Ig) или фрагмент его константной области Ig.
62) Способ по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит Fcобласть.
63) Способ по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит домен СН2.
64) Способ по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит домен CH3.
65) Способ по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит домен СН2 и домен CH3.
66) Способ по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере часть шарнира, домен СН2 и домен CH3.
67) Способ по варианту осуществления 61, где фрагмент константной области Ig содержит шарнир, домен СН2 и домен CH3.
68) Способ по любому из вариантов осуществления 61-67, где выделенный белок конъюгирован с N-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig.
69) Способ по любому из вариантов осуществления 61-67, где выделенный белок конъюгирован с С-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig.
70) Способ по любому из вариантов осуществления 61-69, где выделенный белок конъюгирован с константной областью Ig или фрагментом константной области Ig через второй линкер (L2).
71) Способ по варианту осуществления 70, где L2 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
72) Способ по любому из вариантов осуществления 58-71, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген на лимфоците.
73) Способ по варианту осуществления 72, где лимфоцит представляет собой Т-клетку.
74) Способ по варианту осуществления 72, где Т-клетка представляет собой CD8 Т-клетку.
75) Способ по варианту осуществления 72, где лимфоцит представляет собой естественную киллерную (NK) клетку.
76) Способ по любому из вариантов осуществления 58-75, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3, CD3 эпсилон (CD3ε), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C.
77) Способ по варианту осуществления 76, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε.
78) Способ по варианту осуществления 77, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε, содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 141, HCDR2 под SEQ ID NO: 142, HCDR3 под SEQ ID NO: 143, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 144, LCDR2 под SEQ ID NO: 145 и LCDR3 под SEQ ID NO: 146;
b) VH под SEQ ID NO: 147 и VL под SEQ ID NO: 148;
c) HCDR1 под SEQ ID NO: 149, HCDR2 под SEQ ID NO: 150, HCDR3 под SEQ ID NO: 151, LCDR1 под SEQ ID NO: 152, LCDR2 под SEQ ID NO: 153 и LCDR3 под SEQ ID NO: 154; или
d) VH под SEQ ID NO: 155 и VL под SEQ ID NO: 156.
79) Выделенный белок по варианту осуществления 76, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9.
80) Выделенный белок по варианту осуществления 79, где антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, содержит
а) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 238, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
b) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 242, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
c) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 243, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
d) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 244, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
e) VH под SEQ ID NO: 245 и VL под SEQ ID NO: 249;
- 207 047663
f) VH под SEQ ID NO: 246 и VL под SEQ ID NO: 249;
g) VH под SEQ ID NO: 247 и VL под SEQ ID NO: 249; или h) VH под SEQ ID NO: 248 и VL под SEQ ID NO: 249.
81) Способ по любому из вариантов осуществления 61-80, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
82) Способ по любому из вариантов осуществления 61-81, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению степени связывания белка с Fcy рецептором (FcyR).
83) Способ по варианту осуществления 82, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к снижению степени связывания белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214Т/Е233Р/L234V/L235А/делеции
G236/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S и
S228Р/F234А/L235А/делеции G236/G237A/P238S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
84) Способ по любому из вариантов осуществления 61-81, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к усилению связывания белка с FcyR.
85) Способ по варианту осуществления 84, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к усилению связывания белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L,
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и G236A/S239D/I332E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
86) Способ по любому из вариантов осуществления 82-85, где FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIII или любую их комбинацию.
87) Способ по любому из вариантов осуществления 61-86, где константная область Ig фрагмента константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует период полужизни белка.
88) Способ по варианту осуществления 87, где по меньшей мере одна мутация, которая модулирует период полужизни белка, выбрана из группы, состоящей из Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
89) Способ по любому из вариантов осуществления 61-88, где выделенный белок содержит по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 константной области Ig.
90) Способ по варианту осуществления 89, где по меньшей мере одна мутация в домене CH3 константной области Ig выбрана из группы, состоящей из T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V,
T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F,
L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V и T350V/T366L/K392L/T394W, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
91) Способ по любому из вариантов осуществления 1-54, где выделенный белок представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
92) Способ по варианту осуществления 91, где CAR содержит
a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, определяемый в любом из вариантов осуществления 1-54;
b) трансмембранный домен и
c) домен внутриклеточной передачи сигнала, необязательно содержащий по меньшей мере один костимуляторный домен.
93) Способ по варианту осуществления 91 или 92, где CAR дополнительно содержит CD8ашарнирную область.
94) Способ по любому из вариантов осуществления 91-93, где
a) трансмембранный домен содержит полипептид трансмембранной области CD8a (CD8a-TM); и
b) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, содержащий компонент представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), и домен передачи первичного сигнала, содержащий компонент дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z).
95) Способ по любому из вариантов осуществления 91-93, где
a) CD8а-шарнирная область содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 157;
b) трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 162; и/или
- 208 047663
c) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 163, и домен передачи первичного сигнала, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 164.
96) Способ по варианту осуществления 95, где домен внутриклеточной передачи сигнала содержит полипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из компонента представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), компонента дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z), компонента кластера дифференцировки (CD27), компонента представителя суперсемейства кластеров дифференцировки или любых их комбинаций.
97) Способ лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного мультиспецифического белка субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где выделенный мультиспецифический белок содержит первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита.
98) Способ по варианту осуществления 97, где антиген лимфоцита представляет собой антиген Тклетки.
99) Способ по варианту осуществления 97, где антиген Т-клетки представляет собой антиген CD8+ Т-клетки.
100) Способ по варианту осуществления 97, где антиген лимфоцита представляет собой антиген NK-клетки.
101) Способ по любому из вариантов осуществления 97-100, где антиген лимфоцита представляет собой CD3, CD3 эпсилон (CD3s), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C.
102) Способ по варианту осуществления 101, где антиген лимфоцита представляет собой CD3ε.
103) Способ по любому из вариантов осуществления 97-102, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
104) Способ по варианту осуществления 103, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат Fab.
105) Способ по варианту осуществления 103, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат VHH.
106) Способ по варианту осуществления 103, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат scFv.
107) Способ по варианту осуществления 106, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
108) Способ по варианту осуществления 107, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
109) Способ по варианту осуществления 108, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
110) Способ по варианту осуществления 109, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
111) Способ по любому из вариантов осуществления 97-110, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под любым из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 или 5, HCDR2 под любым из SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 или 11 и HCDR3 под любым из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 или 17.
112) Способ по любому из вариантов осуществления 97-111, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно;
b) SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно;
c) SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно;
d) SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно;
e) SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно;
f) SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или
g) SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
- 209 047663
113) Способ по любому из вариантов осуществления 97-112, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
114) Способ по любому из вариантов осуществления 97-110, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35, HCDR2 под SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, HCDR3 под SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51, LCDR1 под SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 67 или 68, LCDR2 под SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73 или 74 и LCDR3 под SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78, 79 или 80.
115) Способ по любому из вариантов осуществления 97-110 и 114, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31, 39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
116) Способ по любому из вариантов осуществления 97-110, 114 и 115, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или 61 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 или 88.
117) Способ по любому из вариантов осуществления 97-110 и 114-116, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87; или
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88.
118) Способ по любому из вариантов осуществления 97-110, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 33, 89, 167, 172 или 176, HCDR2 под SEQ ID NO: 90, 91, 168, 173 или 177, HCDR3 под SEQ ID NO: 92, 93, 94, 169, 174, 178 или 180, LCDR1 под SEQ ID NO: 98, 99, 100, 182, 186, 189, 193, 197 или 201, LCDR2 под SEQ ID NO: 101, 102, 103, 183, 187, 190, 194 или 198 и LCDR3 под SEQ ID NO: 104, 184, 191, 195 или 199.
119) Способ по любому из вариантов осуществления 97-110 и 118, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно; или
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
120) Способ по любому из вариантов осуществления 97-110, 118 и 119, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179, 181 или 96 и VL под SEQ ID NO 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
121) Способ по любому из вариантов осуществления 97-110 и 118-120, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
- 210 047663
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
122) Способ по любому из вариантов осуществления 97-121, где второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержит
a) HCDR1 под SEQ ID NO: 141, HCDR2 под SEQ ID NO: 142, HCDR3 под SEQ ID NO: 143, LCDR1 под SEQ ID NO: 144, LCDR2 под SEQ ID NO: 145 и LCDR3 под SEQ ID NO: 146;
b) VH под SEQ ID NO: 147 и VL под SEQ ID NO: 148;
c) HCDR1 под SEQ ID NO: 149, HCDR2 под SEQ ID NO: 150, HCDR3 под SEQ ID NO: 151, LCDR1 под SEQ ID NO: 152, LCDR2 под SEQ ID NO: 153 и LCDR3 под SEQ ID NO: 154; или
d) VH под SEQ ID NO: 155 и VL под SEQ ID NO: 156.
123) Способ по любому из вариантов осуществления 95-119, где антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, содержит
а) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 238, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
b) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 242, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
c) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 243, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
d) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 244, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
e) VH под SEQ ID NO: 245 и VL под SEQ ID NO: 249;
f) VH под SEQ ID NO: 246 и VL под SEQ ID NO: 249;
g) VH под SEQ ID NO: 247 и VL под SEQ ID NO: 249; или
h) VH под SEQ ID NO: 248 и VL под SEQ ID NO: 249.
124) Способ по любому из вариантов осуществления 97-123, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгирован с первой константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом первой константной области Ig, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, конъюгирован со второй константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом второй константной области Ig.
125) Способ по варианту осуществления 124, дополнительно включающий второй линкер (L2) между первым антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, и первой константной областью Ig или фрагментом первой константной области Ig и вторым антигенсвязывающим доменом, который связывает антиген лимфоцита, и второй константной областью Ig или фрагментом второй константной области Ig.
126) Способ по варианту осуществления 125, где L2 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
127) Способ по любому из вариантов осуществления 124-136, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
128) Способ по любому из вариантов осуществления 124-127, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению степени связывания мультиспецифического белка с FcyR.
129) Способ по варианту осуществления 128, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к снижению степени связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214Т/Е233Р/L234V/L235А/делеции G236/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S и
S228Р/F234А/L235А/делеции G236/G237A/P238S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
130) Способ по любому из вариантов осуществления 124-127, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с Fcy рецептором (FcyR).
- 211 047663
131) Способ по варианту осуществления 130, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L,
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и G236A/S239D/I332E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
132) Способ по любому из вариантов осуществления 128-131, где FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIII или любую их комбинацию.
133) Способ по любому из вариантов осуществления 124-132, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка.
134) Способ по варианту осуществления 133, где по меньшей мере одна мутация, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка, выбрана из группы, состоящей из Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
135) Способ по любому из вариантов осуществления 124-134, включающий по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig.
136) Способ по варианту осуществления 135, где по меньшей мере одна мутация в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одна мутация в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig выбраны из группы, состоящей из T350V, L351Y, F405A,Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F,
L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V и T350V/T366L/K392L/T394W, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
137) Способ по любому из вариантов осуществления 124-136, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат следующие мутации:
a) L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V в первой константной области Ig и
L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W во второй константной области Ig или
b) L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W в первой константной области Ig и
L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V во второй константной области Ig.
138) Способ лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества иммуноконъюгата субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33, где иммуноконъюгат содержит выделенный белок, определяемый в любом из вариантов осуществления 1-137, конъюгированный со средством.
139) Способ по варианту осуществления 138, где средство представляет собой радиоактивное средство.
140) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 139, где радиоактивное средство содержит ион радиометалла.
141) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 140, где ион радиометалла представляет собой 32Р, 47Sc, 67Cu, 77As, 89Sr, 90Y, 99Tc, 105Rh, 109Pd, mAg, 131I, 153Sm, 159Gd, 165Dy, 166Ho, 169Er, 177Lu, 186Re, 188Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 225Ac, 255Fm, 227Th, 62Cu, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr или 111In.
142) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 140, где ион радиометалла представляет собой 225Ас, 111In или 89Zr.
143) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 140, где ион радиометалла представляет собой 225Ас.
144) Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 140-143, где ион радиометалла конъюгирован с хелатирующим фрагментом.
145) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 144, где хелатирующий фрагмент содержит макроцикл, имеющий структуру формулы (I):
формула (I), где каждый из R1, R2, R3 и R4 независимо представляет собой CHQCO2X, где
- 212 047663
Q независимо представляет собой водород, С1-С4-алкил или (С1-С2-алкил)фенил, и
X независимо представляет собой водород, бензил, С1-С4-алкил; и
Z представляет собой (CH2)nY, при этом n равняется 1-10, и
Y представляет собой электрофильный или нуклеофильный фрагмент, ковалентно связанный со вторым партнером клик-реакции;
в качестве альтернативы, Z представляет собой водород; и каждый из R1, R2, R3 и R4 независимо представляет собой CHQCO2X, где
Q независимо представляет собой водород, С1-С4-алкил или (С1-С2-алкил)фенил, и
X независимо представляет собой водород, бензил, С1-С4-алкил или электрофильный или нуклеофильный фрагмент, ковалентно связанный со вторым партнером клик-реакции;
в качестве альтернативы, хелант содержит открытоцепочечный лиганд.
146) Иммуноконъюгат по варианту осуществления 144, где хелатирующий фрагмент содержит макроцикл, имеющий структуру формулы (II):
или структуру формулы (III):
147) Иммуноконъюгат формулы (IV),
где белок представляет собой выделенный белок, определяемый в любом из вариантов осуществления 1-96.
148) Иммуноконъюгат формулы (V),
где белок представляет собой выделенный белок, определяемый в любом из вариантов осуществления 1-96.
149) Способ по любому из вариантов осуществления 1-148, где способ является эффективным для снижения количества экспрессирующих CD33 клеток у субъекта, при этом экспрессирующие CD33 клетки являются раковыми клетками, или при этом экспрессирующие CD33 клетки являются нераковыми клетками.
150) Способ по любому из вариантов осуществления 1-149, где способ является эффективным для предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта.
151) Способ по любому из вариантов осуществления 148-150, где рак с экспрессией CD33 пред
- 213 047663 ставляет собой гематологический рак.
152) Способ по варианту осуществления 151, где гематологический рак представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому.
153) Способ по варианту осуществления 151, где гематологический рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелоидный лейкоз (CML) или бластное плазмоцитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN).
154) Способ по любому из вариантов осуществления 148-153, где выделенный белок или выделенный мультиспецифический белок вводят в комбинации со вторым терапевтическим средством.
155) Способ по варианту осуществления 154, где второе терапевтическое средство представляет собой хирургическое вмешательство, химиотерапию, андрогендепривационную терапию или облучение или любую их комбинацию.
156) Способ лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на экспрессирующую CD33 раковую клетку у субъекта.
157) Способ снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на одну или несколько из экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта.
158) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на экспрессирующую CD33 клетку у субъекта.
159) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для лечения не являющегося раковым состояния у субъекта с риском развития рака с экспрессией CD33, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на экспрессирующую CD33 клетку у субъекта.
Перечень пронумерованных вариантов осуществления (Е).
1) Химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий
a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33;
b) трансмембранный домен и
c) домен внутриклеточной передачи сигнала, необязательно содержащий по меньшей мере одни костимуляторный домен.
2) CAR по варианту осуществления 1, дополнительно содержащий CDSa-шарнирную область.
3) CAR по варианту осуществления 1 или 2, где
a) трансмембранный домен содержит полипептид трансмембранной области CD8a (CD8a-TM); и
b) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, содержащий компонент представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), и домен передачи первичного сигнала, содержащий компонент дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z).
4) CAR по варианту осуществления 2 или 3, где
а) CD8а-шарнирная область содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 157;
b) трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 162; и/или
c) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 163, и домен передачи первичного сигнала, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 164.
5) CAR по любому из вариантов осуществления 1-4, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под любым из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 или 5, HCDR2 под любым из SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 или 11 и HCDR3 под любым из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 или 17.
6) CAR по любому из вариантов осуществления 1-5, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR1, HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 1, 6 и 12 соответственно;
b) SEQ ID NO: 2, 7 и 13 соответственно;
c) SEQ ID NO: 1, 8 и 14 соответственно;
d) SEQ ID NO: 3, 9 и 13 соответственно;
e) SEQ ID NO: 4, 10 и 15 соответственно;
f) SEQ ID NO: 5, 11 и 16 соответственно; или
g) SEQ ID NO: 5, 11 и 17 соответственно.
7) CAR по любому из вариантов осуществления 1-6, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под любым из SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27.
8) CAR по любому из вариантов осуществления 1-4, где антигенсвязывающий домен, который свя
- 214 047663 зывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35, HCDR2 под SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, HCDR3 под SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51, LCDR1 под SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 67 или 68, LCDR2 под SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73 или 74 и LCDR3 под SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78, 79 или 80.
9) CAR по любому из вариантов осуществления 1-4 и 8, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 28, 36, 45, 62, 69 и 75 соответственно;
b) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 30, 38, 47, 64, 71 и 77 соответственно;
d) SEQ ID NO: 31,39, 48, 65, 72 и 78 соответственно;
e) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
f) SEQ ID NO: 33, 41, 50, 67, 73 и 79 соответственно;
g) SEQ ID NO: 34, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
h) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
i) SEQ ID NO: 34, 44, 51, 68, 74 и 80 соответственно; или
j) SEQ ID NO: 35, 42, 51, 68, 74 и 80 соответственно.
10) CAR по любому из вариантов осуществления 1-4, 8 и 9, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или 61 и VL под SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 или 88.
11) CAR по любому из вариантов осуществления 1-4 и 8-10, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 52 и VL под SEQ ID NO: 81;
b) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
c) VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 83;
d) VH под SEQ ID NO: 55 и VL под SEQ ID NO: 84;
e) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
f) VH под SEQ ID NO: 57 и VL под SEQ ID NO: 86;
g) VH под SEQ ID NO: 58 и VL под SEQ ID NO: 87;
h) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
i) VH под SEQ ID NO: 60 и VL под SEQ ID NO: 87; или
j) VH под SEQ ID NO: 61 и VL под SEQ ID NO: 88.
12) CAR по любому из вариантов осуществления 1-4, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 33, 89, 167, 172 или 176, HCDR2 под SEQ ID NO: 90, 91, 168, 173 или 177, HCDR3 под SEQ ID NO: 92, 93, 94, 169, 174, 178 или 180, LCDR1 под SEQ ID NO: 98, 99, 100, 182, 186, 189, 193, 197, LCDR2 под SEQ ID NO: 101, 102, 103, 183, 187, 190, 194 или 198 и LCDR3 под SEQ ID NO: 104, 184, 191, 195 или 199.
13) CAR по любому из вариантов осуществления 1-4 и 12, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 89, 90, 92, 98, 101 и 104 соответственно;
b) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 99, 102 и 104 соответственно;
c) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 100, 103 и 104 соответственно;
d) SEQ ID NO: 167, 168, 169, 182, 183 и 184 соответственно;
e) SEQ ID NO: 33, 91, 94, 186, 187 и 104 соответственно;
f) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 189, 190 и 191 соответственно;
g) SEQ ID NO: 176, 177, 178, 193, 194 и 195 соответственно;
h) SEQ ID NO: 89, 90, 180, 197, 198 и 199 соответственно; или
i) SEQ ID NO: 89, 90, 93, 201, 102 и 104 соответственно.
14) CAR по любому из вариантов осуществления 1-4, 12 и 13, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит VH под SEQ ID NO: 95, 96, 97, 170, 171, 175, 179 или 181 и VL под SEQ ID NO 105, 106, 107, 185, 188, 192, 196, 200 или 202.
15) CAR по любому из вариантов осуществления 1-4 и 12-14, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит
a) VH под SEQ ID NO: 95 и VL под SEQ ID NO: 105;
b) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 106;
c) VH под SEQ ID NO: 97 и VL под SEQ ID NO: 107;
d) VH под SEQ ID NO: 170 и VL под SEQ ID NO: 185;
e) VH под SEQ ID NO: 171 и VL под SEQ ID NO: 188;
f) VH под SEQ ID NO: 175 и VL под SEQ ID NO: 192;
g) VH под SEQ ID NO: 179 и VL под SEQ ID NO: 196;
h) VH под SEQ ID NO: 181 и VL под SEQ ID NO: 200; или
i) VH под SEQ ID NO: 96 и VL под SEQ ID NO: 202.
16) CAR по любому из вариантов осуществления 1-15, где антигенсвязывающий домен, который
- 215 047663 связывает CD33, представляет собой VHH.
17) CAR по любому из вариантов осуществления 1-16, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, представляет собой scFv.
18) CAR по варианту осуществления 17, где scFv содержит первый линкер (L1) между VL и VH.
19) CAR по варианту осуществления 18, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
20) CAR по варианту осуществления 19, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
21) CAR по любому из вариантов осуществления 1-20, где внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, дополнительно содержит сигнальный полипептид.
22) CAR по варианту осуществления 21, где сигнальный полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 166.
23) CAR по любому из вариантов осуществления 1-22, где домен внутриклеточной передачи сигнала содержит полипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из компонента представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), компонента дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z), компонента кластера дифференцировки (CD27), компонента представителя суперсемейства кластеров дифференцировки и их комбинации.
24) CAR по любому из вариантов осуществления 3-23, где компонент CD137 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 163.
25) CAR по любому из вариантов осуществления 3-24, где компонент CD3z содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 164.
26) CAR по любому из вариантов осуществления 3-25, где домен внутриклеточной передачи сигнала содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 165.
27) CAR по любому из вариантов осуществления 3-26, где полипептид CD8a-TM содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 162.
28) CAR по любому из вариантов осуществления 3-27, где CD8а-шарнирная область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 157.
29) CAR по любому из вариантов осуществления 1-28, где CAR представляет собой мультиспецифический белок.
30) CAR по варианту осуществления 29, где мультиспецифический белок представляет собой биспецифический белок.
31) CAR по варианту осуществления 30, где мультиспецифический белок представляет собой триспецифический белок.
32) CAR по любому из вариантов осуществления 29-31, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген на лимфоците.
33) CAR по варианту осуществления 32, где лимфоцит представляет собой Т-клетку.
34) CAR по варианту осуществления 32, где Т-клетка представляет собой CD8+ T-клетку.
35) CAR по варианту осуществления 32, где лимфоцит представляет собой естественную киллерную (NK) клетку.
36) CAR по любому из вариантов осуществления 29-35, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3, CD3 эпсилон (CD3ε), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C.
37) CAR по варианту осуществления 36, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε.
38) CAR по варианту осуществления 37, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε, содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 141, HCDR2 под SEQ ID NO: 142, HCDR3 под SEQ ID NO: 143, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 144, LCDR2 под SEQ ID NO: 145 и LCDR3 под SEQ ID NO: 146;
b) VH под SEQ ID NO: 147 и VL под SEQ ID NO: 148;
c) HCDR1 под SEQ ID NO: 149, HCDR2 под SEQ ID NO: 150, HCDR3 под SEQ ID NO: 151, LCDR1 под SEQ ID NO: 152, LCDR2 под SEQ ID NO: 153 и LCDR3 под SEQ ID NO: 154; или
d) VH под SEQ ID NO: 155 и VL под SEQ ID NO: 156.
39) CAR по варианту осуществления 36, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9.
40) CAR по варианту осуществления 39, где антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, содержит
a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 238, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
- 216 047663
b) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 242, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
c) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 243, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
d) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 236, HCDR2 под SEQ ID NO: 237, HCDR3 под SEQ ID NO: 244, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 239, LCDR2 под SEQ ID NO: 240 и LCDR3 под SEQ ID NO: 241;
e) VH под SEQ ID NO: 245 и VL под SEQ ID NO: 249;
f) VH под SEQ ID NO: 246 и VL под SEQ ID NO: 249;
g) VH под SEQ ID NO: 247 и VL под SEQ ID NO: 249; или h) VH под SEQ ID NO: 248 и VL под SEQ ID NO: 249.
41) Выделенный лимфоцит, экспрессирующий CAR по любому из вариантов осуществления 1-40.
42) Выделенный лимфоцит по варианту осуществления 41, где лимфоцит представляет собой Тлимфоцит.
43) Выделенный лимфоцит по варианту осуществления 41, где лимфоцит представляет собой естественную киллерную (NK) клетку.
44) Выделенный полинуклеотид, кодирующий CAR по любому из вариантов осуществления 1-40.
45) Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 44.
46) Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по варианту осуществления 44 или вектор по варианту осуществления 45.
47) Фармацевтическая композиция, содержащий лимфоцит по любому из вариантов осуществления 41-43 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
48) Способ лечения субъекта, имеющего рак с экспрессией CD33, при этом способ включает введение терапевтически эффективного количества лимфоцита по любому из вариантов осуществления 41-43 субъекту, нуждающемуся в этом, при этом лимфоцит опосредует уничтожение рака с экспрессией CD33 у субъекта.
49) Способ по варианту осуществления 48, где рак с экспрессией CD33 представляет собой гематологический рак.
50) Способ по варианту осуществления 49, где рак с экспрессией CD33 представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому.
51) Способ по варианту осуществления 50, где рак с экспрессией CD33 представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелоидный лейкоз (CML) или бластное плазмоцитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN).
52) Способ целевого уничтожения раковой клетки, при этом способ включает приведение раковой клетки в контакт с лимфоцитом по любому из вариантов осуществления 41-43, при этом лимфоцит индуцирует целевое уничтожение раковой клетки.
53) Способ по варианту осуществления 52, где раковая клетка представляет собой гематологический рак.
54) Способ по варианту осуществления 53, где рак с экспрессией CD33 представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому.
55) Способ по варианту осуществления 54, где рак с экспрессией CD33 представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелоидный лейкоз (CML) или бластное плазмоцитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN).
56) Способ выявления присутствия рака у субъекта, включающий
a) приведение клеточного образца, полученного от субъекта, в контакт с CAR по любому из вариантов осуществления 1-40, с образованием тем самым комплекса CAR-клетка, и
b) выявление комплекса CAR-клетка, где выявление комплекса CAR-клетка указывает на присутствие рака у субъекта.
57) Способ по варианту осуществления 56, где раковая клетка представляет собой гематологический рак.
58) Способ по варианту осуществления 57, где рак с экспрессией CD33 представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому.
59) Способ по варианту осуществления 58, где рак с экспрессией CD33 представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелоидный лейкоз (CML) или бластное плазмоцитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN).
60) Набор, содержащий CAR по любому из вариантов осуществления 1-40.
61) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для лечения рака с экспрессией CD33 у
- 217 047663 субъекта.
62) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта.
63) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта.
64) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для лечения не являющегося раковым состояния у субъекта с риском развития рака с экспрессией CD33.
65) Способ лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на экспрессирующую CD33 раковую клетку у субъекта.
66) Способ снижения количества экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на одну или несколько из экспрессирующих CD33 опухолевых клеток у субъекта.
67) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на экспрессирующую CD33 клетку у субъекта.
68) Фармацевтическая композиция, содержащая средство для лечения не являющегося раковым состояния у субъекта с риском развития рака с экспрессией CD33, при этом способ включает введение субъекту средства для нацеливания терапевтического средства на экспрессирующую CD33 клетку у субъекта.
Перечень пронумерованных вариантов осуществления (F).
1) Выделенный белок, который связывает CD33, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 53;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263; или
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264.
2) Выделенный белок по п.1, содержащий HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
b) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
c) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
d) SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно;
e) SEQ ID NO: 254, 257 и 260 соответственно; или
f) SEQ ID NO: 255, 258 и 261 соответственно.
3) Выделенный белок, который связывает CD33, где выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под
a) SEQ ID NO: 29, 37 и 46 соответственно;
b) SEQ ID NO: 32, 40 и 49 соответственно;
c) SEQ ID NO: 34, 43 и 51 соответственно;
d) SEQ ID NO: 253, 256 и 259 соответственно;
e) SEQ ID NO: 254, 257 и 260 соответственно; или
f) SEQ ID NO: 255, 258 и 261 соответственно.
4) Выделенный белок по п. 1 или 2, где выделенный белок содержит
a) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 53 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 82;
b) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 56 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 85;
c) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 59 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 87;
d) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 262 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 271;
e) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 263 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 272; или
f) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 VH под SEQ ID NO: 264 и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 VL под SEQ ID NO: 273.
5) Выделенный белок по п.3 или 4, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под
a) SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76 соответственно;
b) SEQ ID NO: 32, 40, 49, 66, 70 и 76 соответственно;
c) SEQ ID NO: 34, 43, 51, 68, 74 и 80 соответственно;
d) SEQ ID NO: 253, 256, 259, 265, 74 и 269 соответственно
- 218 047663
e) SEQ ID NO: 254, 257, 260, 66, 267 и 76 соответственно; или
f) SEQ ID NO: 255, 258, 261, 266, 268 и 270 соответственно.
6) Выделенный белок по любому из пп.1-5, где выделенный белок содержит VH под SEQ ID NO: 53, 56, 59, 262, 263, 264, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 367, 368, 369,
370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, или 382, и VL под SEQ ID NO: 82, 85, 87,
271, 272, 273, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329,
330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 383,
384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397 или 398.
7) Выделенный белок по п.6, где выделенный белок содержит
a) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
b) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
c) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
d) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
e) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272;
f) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273;
g) VH под SEQ ID NO: 291 и VL под SEQ ID NO: 271;
h) VH под SEQ ID NO: 292 и VL под SEQ ID NO: 271;
i) VH под SEQ ID NO: 293 и VL под SEQ ID NO: 271;
j) VH под SEQ ID NO: 294 и VL под SEQ ID NO: 271;
k) VH под SEQ ID NO: 295 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 296 и VL под SEQ ID NO: 271;
m) VH под SEQ ID NO: 297 и VL под SEQ ID NO: 271;
n) VH под SEQ ID NO: 298 и VL под SEQ ID NO: 271;
o) VH под SEQ ID NO: 299 и VL под SEQ ID NO: 271;
p) VH под SEQ ID NO: 300 и VL под SEQ ID NO: 271;
q) VH под SEQ ID NO: 301 и VL под SEQ ID NO: 271;
r) VH под SEQ ID NO: 302 и VL под SEQ ID NO: 271;
s) VH под SEQ ID NO: 303 и VL под SEQ ID NO: 271;
t) VH под SEQ ID NO: 304 и VL под SEQ ID NO: 271;
u) VH под SEQ ID NO: 305 и VL под SEQ ID NO: 271;
v) VH под SEQ ID NO: 306 и VL под SEQ ID NO: 271;
w) VH под SEQ ID NO: 307 и VL под SEQ ID NO: 271;
x) VH под SEQ ID NO: 308 и VL под SEQ ID NO: 271;
y) VH под SEQ ID NO: 309 и VL под SEQ ID NO: 271;
z) VH под SEQ ID NO: 310 и VL под SEQ ID NO: 271;
aa) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 311;
ab) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 312;
ac) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 313;
ad) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 314;
ae) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 315;
af) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 316;
ag) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 317;
ah) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 318;
ai) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 319;
aj) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 320;
ak) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 321;
al) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 322;
am) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 323;
an) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 324;
ao) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 325;
ap) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 326;
aq) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 327;
ar) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 328;
as) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 329;
at) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 330;
au) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 331;
av) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 332;
aw) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 333;
ax) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 334;
ay) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 335;
az) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 336;
- 219 047663 ba) VH под SEQ ID NO: 337 и VL под SEQ ID NO: 272; bb) VH под SEQ ID NO: 338 и VL под SEQ ID NO: 272; bc) VH под SEQ ID NO: 339 и VL под SEQ ID NO: 272; bd) VH под SEQ ID NO: 340 и VL под SEQ ID NO: 272; be) VH под SEQ ID NO: 341 и VL под SEQ ID NO: 272; bf) VH под SEQ ID NO: 342 и VL под SEQ ID NO: 272; bg) VH под SEQ ID NO: 343 и VL под SEQ ID NO: 272; bh) VH под SEQ ID NO: 344 и VL под SEQ ID NO: 272; bi) VH под SEQ ID NO: 345 и VL под SEQ ID NO: 272; bj) VH под SEQ ID NO: 346 и VL под SEQ ID NO: 272; bk) VH под SEQ ID NO: 347 и VL под SEQ ID NO: 272; bl) VH под SEQ ID NO: 348 и VL под SEQ ID NO: 272; bm) VH под SEQ ID NO: 349 и VL под SEQ ID NO: 272; bn) VH под SEQ ID NO: 350 и VL под SEQ ID NO: 272; bo) VH под SEQ ID NO: 351 и VL под SEQ ID NO: 272; bp) VH под SEQ ID NO: 352 и VL под SEQ ID NO: 272; bq) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 353; br) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 354; bs) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 355; bt) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 356; bu) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 357; bv) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 358; bw) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 359; bx) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 360; by) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 361; bz) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 362; ca) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 363; cb) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 364; cc) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 365; cd) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 366; ce) VH под SEQ ID NO: 367 и VL под SEQ ID NO: 85; cf) VH под SEQ ID NO: 368 и VL под SEQ ID NO: 85; cg) VH под SEQ ID NO: 369 и VL под SEQ ID NO: 85; ch) VH под SEQ ID NO: 370 и VL под SEQ ID NO: 85; ci) VH под SEQ ID NO: 371 и VL под SEQ ID NO: 85; cj) VH под SEQ ID NO: 372 и VL под SEQ ID NO: 85; ck) VH под SEQ ID NO: 373 и VL под SEQ ID NO: 85; cl) VH под SEQ ID NO: 374 и VL под SEQ ID NO: 85; cm) VH под SEQ ID NO: 375 и VL под SEQ ID NO: 85; cn) VH под SEQ ID NO: 376 и VL под SEQ ID NO: 85; со) VH под SEQ ID NO: 377 и VL под SEQ ID NO: 85; cp) VH под SEQ ID NO: 378 и VL под SEQ ID NO: 85; cq) VH под SEQ ID NO: 379 и VL под SEQ ID NO: 85; cr) VH под SEQ ID NO: 380 и VL под SEQ ID NO: 85; cs) VH под SEQ ID NO: 381 и VL под SEQ ID NO: 85; ct) VH под SEQ ID NO: 382 и VL под SEQ ID NO: 85; cu) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 383; cv) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 384; cw) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 385; cx) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 386; cy) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 387; cz) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 388; da) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 389; db) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 390; dc) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 391; dd) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 392; de) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 393; df) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 394; dg) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 395; dh) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 396;
di) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 397; или dj) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 398.
- 220 047663
8) Выделенный белок, который связывает CD33, где выделенный белок содержит a) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 82;
b) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 85;
c) VH под SEQ ID NO: 59 и VL под SEQ ID NO: 87;
d) VH под SEQ ID NO: 262 и VL под SEQ ID NO: 271;
e) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 272;
f) VH под SEQ ID NO: 264 и VL под SEQ ID NO: 273;
g) VH под SEQ ID NO: 291 и VL под SEQ ID NO: 271;
h) VH под SEQ ID NO: 292 и VL под SEQ ID NO: 271;
i) VH под SEQ ID NO: 293 и VL под SEQ ID NO: 271;
j) VH под SEQ ID NO: 294 и VL под SEQ ID NO: 271;
k) VH под SEQ ID NO: 295 и VL под SEQ ID NO: 271;
l) VH под SEQ ID NO: 296 и VL под SEQ ID NO: 271;
m) VH под SEQ ID NO: 297 и VL под SEQ ID NO: 271;
n) VH под SEQ ID NO: 298 и VL под SEQ ID NO: 271;
o) VH под SEQ ID NO: 299 и VL под SEQ ID NO: 271;
p) VH под SEQ ID NO: 300 и VL под SEQ ID NO: 271;
q) VH под SEQ ID NO: 301 и VL под SEQ ID NO: 271;
r) VH под SEQ ID NO: 302 и VL под SEQ ID NO: 271;
s) VH под SEQ ID NO: 303 и VL под SEQ ID NO: 271;
t) VH под SEQ ID NO: 304 и VL под SEQ ID NO: 271;
u) VH под SEQ ID NO: 305 и VL под SEQ ID NO: 271;
v) VH под SEQ ID NO: 306 и VL под SEQ ID NO: 271;
w) VH под SEQ ID NO: 307 и VL под SEQ ID NO: 271;
x) VH под SEQ ID NO: 308 и VL под SEQ ID NO: 271;
y) VH под SEQ ID NO: 309 и VL под SEQ ID NO: 271;
z) VH под SEQ ID NO: 310 и VL под SEQ ID NO: 271;
aa) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 311;
ab) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 312;
ac) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 313;
ad) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 314;
ae) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 315;
af) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 316;
ag) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 317;
ah) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 318;
ai) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 319;
aj) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 320;
ak) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 321;
al) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 322;
am) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 323;
an) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 324;
ao) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 325;
ap) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 326;
aq) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 327;
ar) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 328;
as) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 329;
at) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 330;
au) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 331;
av) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 332;
aw) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 333;
ax) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 334;
ay) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 335;
az) VH под SEQ ID NO: 263 и VL под SEQ ID NO: 336;
ba) VH под SEQ ID NO: 337 и VL под SEQ ID NO: 272;
bb) VH под SEQ ID NO: 338 и VL под SEQ ID NO: 272;
bc) VH под SEQ ID NO: 339 и VL под SEQ ID NO: 272;
bd) VH под SEQ ID NO: 340 и VL под SEQ ID NO: 272;
be) VH под SEQ ID NO: 341 и VL под SEQ ID NO: 272;
bf) VH под SEQ ID NO: 342 и VL под SEQ ID NO: 272;
bg) VH под SEQ ID NO: 343 и VL под SEQ ID NO: 272;
bh) VH под SEQ ID NO: 344 и VL под SEQ ID NO: 272;
bi) VH под SEQ ID NO: 345 и VL под SEQ ID NO: 272;
- 221 047663 bj) VH под SEQ ID NO: 346 и VL под SEQ ID NO: 272;
bk) VH под SEQ ID NO: 347 и VL под SEQ ID NO: 272;
bl) VH под SEQ ID NO: 348 и VL под SEQ ID NO: 272;
bm) VH под SEQ ID NO: 349 и VL под SEQ ID NO: 272;
bn) VH под SEQ ID NO: 350 и VL под SEQ ID NO: 272;
bo) VH под SEQ ID NO: 351 и VL под SEQ ID NO: 272;
bp) VH под SEQ ID NO: 352 и VL под SEQ ID NO: 272;
bq) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 353;
br) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 354;
bs) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 355;
bt) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 356;
bu) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 357;
bv) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 358;
bw) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 359;
bx) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 360;
by) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 361;
bz) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 362;
ca) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 363;
cb) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 364;
cc) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 365;
cd) VH под SEQ ID NO: 56 и VL под SEQ ID NO: 366;
ce) VH под SEQ ID NO: 367 и VL под SEQ ID NO: 85;
cf) VH под SEQ ID NO: 368 и VL под SEQ ID NO: 85;
cg) VH под SEQ ID NO: 369 и VL под SEQ ID NO: 85;
ch) VH под SEQ ID NO: 370 и VL под SEQ ID NO: 85;
ci) VH под SEQ ID NO: 371 и VL под SEQ ID NO: 85;
cj) VH под SEQ ID NO: 372 и VL под SEQ ID NO: 85;
ck) VH под SEQ ID NO: 373 и VL под SEQ ID NO: 85;
cl) VH под SEQ ID NO: 374 и VL под SEQ ID NO: 85;
cm) VH под SEQ ID NO: 375 и VL под SEQ ID NO: 85;
cn) VH под SEQ ID NO: 376 и VL под SEQ ID NO: 85;
со) VH под SEQ ID NO: 377 и VL под SEQ ID NO: 85;
cp) VH под SEQ ID NO: 378 и VL под SEQ ID NO: 85;
cq) VH под SEQ ID NO: 379 и VL под SEQ ID NO: 85;
cr) VH под SEQ ID NO: 380 и VL под SEQ ID NO: 85;
cs) VH под SEQ ID NO: 381 и VL под SEQ ID NO: 85;
ct) VH под SEQ ID NO: 382 и VL под SEQ ID NO: 85;
cu) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 383;
cv) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 384;
cw) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 385;
cx) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 386;
cy) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 387;
cz) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 388;
da) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 389;
db) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 390;
dc) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 391;
dd) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 392;
de) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 393;
df) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 394;
dg) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 395;
dh) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 396;
di) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 397; или dj) VH под SEQ ID NO: 53 и VL под SEQ ID NO: 398.
9) Выделенный белок по любому из пп.1-8, где выделенный белок представляет собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
10) Выделенный белок по п.9, где выделенный белок представляет собой Fab.
11) Выделенный белок по п.9, где выделенный белок представляет собой scFv.
12) Выделенный белок по п.11, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
13) Выделенный белок по п. 12, где L1 содержит
a) приблизительно 5-50 аминокислот;
b) приблизительно 5-40 аминокислот;
- 222 047663
c) приблизительно 10-30 аминокислот или
d) приблизительно 10-20 аминокислот.
14) Выделенный белок по п.13, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
15) Выделенный белок по п.14, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
16) Выделенный белок по п.15, где выделенный белок содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 213, 216, 219, 274, 275 или 276.
17) Выделенный белок по любому из пп.1-16, где белок конъюгирован с удлиняющим период полужизни фрагментом.
18) Выделенный белок по п.17, где удлиняющий период полужизни фрагмент представляет собой иммуноглобулин (Ig), фрагмент Ig, константную область Ig, фрагмент константной области Ig, Fcобласть, трансферрин, альбумин, альбуминсвязывающий домен или полиэтиленгликоль.
19) Выделенный белок по любому из пп.1-18, где выделенный белок представляет собой моноспецифический белок.
20) Выделенный белок по любому из пп.1-19, где выделенный белок представляет собой мультиспецифический белок.
21) Выделенный белок по п.20, где мультиспецифический белок представляет собой биспецифический белок.
22) Выделенный белок по п.20, где мультиспецифический белок представляет собой триспецифический белок.
23) Выделенный белок по любому из пп.1-22, дополнительно содержащий константную область иммуноглобулина (Ig) или фрагмент его константной области Ig.
24) Выделенный белок по п.23, где фрагмент константной области Ig содержит Fc-область.
25) Выделенный белок по п.23, где фрагмент константной области Ig содержит домен СН2.
26) Выделенный белок по п.23, где фрагмент константной области Ig содержит домен CH3.
27) Выделенный белок по п.23, где фрагмент константной области Ig содержит домен СН2 и домен CH3.
28) Выделенный белок по п.23, где фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере часть шарнира, домен СН2 и домен CH3.
29) Выделенный белок по п.23, где фрагмент константной области Ig содержит шарнир, домен СН2 и домен CH3.
30) Выделенный белок по любому из пп.23-29, содержащий связывающий CD33 антигенсвязывающий домен, который конъюгирован с N-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig.
31) Выделенный белок по любому из пп.23-29, содержащий связывающий CD33 антигенсвязывающий домен, который конъюгирован с С-концом константной области Ig или фрагмента константной области Ig.
32) Выделенный белок по любому из пунктов 23-31, содержащий связывающий CD33 антигенсвязывающий домен, который конъюгирован с константной областью Ig или фрагментом константной области Ig через второй линкер (L2).
33) Выделенный белок по п.32, где L2 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
34) Выделенный белок по любому из пп.20-33, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген на лимфоците.
35) Выделенный белок по п.34, где лимфоцит представляет собой Т-клетку.
36) Выделенный белок по п.35, где Т-клетка представляет собой CD8+ Т-клетку.
37) Выделенный белок по п.34, где лимфоцит представляет собой естественную киллерную (NK) клетку.
38) Выделенный белок по любому из пп.20-37, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3, CD3эпсилон (CD3ε), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C.
39) Выделенный белок по п.38, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD3ε.
40) Выделенный белок по п.38, где мультиспецифический белок содержит антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9.
41) Выделенный белок по любому из пп.34-40, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
- 223 047663
42) Выделенный белок по п.41, где
а) первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат Fab;
b) первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат VHH;
c) первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат scFv; или
d) первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит scFv, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержит VHH.
43) Выделенный белок по любому из пп.23-42, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, где необязательно константная область Ig или фрагмент константной области Ig представляет собой IgG1.
44) Выделенный белок по п.43, где фрагмент константной области Ig имеет последовательность под SEQ ID NO: 277 или 278.
45) Выделенный белок по любому из пп.23-43, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению степени связывания белка с Fcy рецептором (FcyR).
46) Выделенный белок по п.45, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к снижению степени связывания белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A,
S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214Т/Е233Р/L234V/L235А/делеции
G236/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S и
S228Р/F234А/L235А/делеции G236/G237A/P238S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
47) Выделенный белок по любому из пп.23-43, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к усилению связывания белка с FcyR.
48) Выделенный белок по п.47, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к усилению связывания белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и
G236A/S239D/I332E, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
49) Выделенный белок по любому из пп.45-48, где FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIII или любую их комбинацию.
50) Выделенный белок по любому из пп.23-49, где константная область Ig фрагмента константной области Ig содержит по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует период полужизни белка.
51) Выделенный белок по п.50, где по меньшей мере одна мутация, которая модулирует период полужизни белка, выбрана из группы, состоящей из Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
52) Выделенный белок по любому из пп.23-51, где белок содержит по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 константной области Ig.
53) Выделенный белок по п.52, где по меньшей мере одна мутация в домене CH3 константной области Ig выбрана из группы, состоящей из T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F, L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V и T350V/T366L/K392L/T394W, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
54) Выделенный мультиспецифический белок, содержащий первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит связывающий домен, определяемый в любом из пп.1-16.
55) Выделенный мультиспецифический белок по п.54, где антиген лимфоцита представляет собой антиген Т-клетки.
56) Выделенный мультиспецифический белок по п.55, где антиген Т-клетки представляет собой антиген CD8+ Т-клетки.
57) Выделенный мультиспецифический белок по п.54, где антиген лимфоцита представляет собой антиген NK-клетки.
58) Выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.54-57, где антиген лимфоцита представляет собой CD3, CD3 эпсилон (CD3s), CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195, TRGV9 или NKG2C.
- 224 047663
59) Выделенный мультиспецифический белок по п.58, где антиген лимфоцита представляет собой CD3s.
60) Выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.54-59, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат scFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
61) Выделенный мультиспецифический белок по п.60, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат Fab.
62) Выделенный мультиспецифический белок по п.60, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат VHH.
63) Выделенный мультиспецифический белок по п.60, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат scFv.
64) Выделенный мультиспецифический белок по п.60 или п.63, где scFv содержит от N- до С-конца VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или VL, L1 и VH (VL-L1-VH).
65) Выделенный мультиспецифический белок по п.64, где L1 содержит приблизительно 5-50 аминокислот; приблизительно 5-40 аминокислот; приблизительно 10-30 аминокислот или приблизительно 10-20 аминокислот.
66) Выделенный мультиспецифический белок по п.65, где L1 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
67) Выделенный мультиспецифический белок по п.66, где L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
68) Выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.54-67, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, конъюгирован с первой константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом первой константной области Ig, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, конъюгирован со второй константной областью иммуноглобулина (Ig) или фрагментом второй константной области Ig.
69) Выделенный мультиспецифический белок по п.68, дополнительно содержащий второй линкер (L2) между первым антигенсвязывающим доменом, который связывает CD33, и первой константной областью Ig или фрагментом первой константной области Ig и вторым антигенсвязывающим доменом, который связывает антиген лимфоцита, и второй константной областью Ig или фрагментом второй константной области Ig.
70) Выделенный мультиспецифический белок по п.69 где L2 содержит аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, или 140.
71) Выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.68-70, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
72) Выделенный мультиспецифический белок по пп.68-71, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению степени связывания мультиспецифического белка с FcyR.
73) Выделенный мультиспецифический белок по п.72, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к снижению степени связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S,
V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A,
V234A/G237A, K214Т/Е233Р/L234V/L235А/делеции G236/A327G/P331A/D365E/L358M,
H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A,
L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S и
S228Р/F234А/L235А/делеции G236/G237A/P238S, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
74) Выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.68-71, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с Fcy рецептором (FcyR).
75) Выделенный мультиспецифический белок по п.74, где по меньшей мере одна мутация, которая приводит к усилению связывания мультиспецифического белка с FcyR, выбрана из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L,
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и G236A/S239D/I332E, при этом нумерация остатков соответствует
- 225 047663 индексу EU.
76) Выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.72-75, где FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIII или любую их комбинацию.
77) Выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.67-76, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат по меньшей мере одну мутацию, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка.
78) Выделенный мультиспецифический белок по п.77, где по меньшей мере одна мутация, которая модулирует период полужизни мультиспецифического белка, выбрана из группы, состоящей из Н435А, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
79) Выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.68-78, содержащий по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одну мутацию в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig.
80) Выделенный мультиспецифический белок по п.79, где по меньшей мере одна мутация в домене CH3 первой константной области Ig или в домене CH3 фрагмента первой константной области Ig и/или по меньшей мере одна мутация в домене CH3 второй константной области Ig или в домене CH3 фрагмента второй константной области Ig выбрана из группы, состоящей из T350V, L351Y, F405A,Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F,
L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V и T350V/T366L/K392L/T394W, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
81) Выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.68-80, где первая константная область Ig или фрагмент первой константной области Ig и вторая константная область Ig или фрагмент второй константной области Ig содержат следующие мутации:
L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V в первой константной области Ig и
L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W во второй константной области Ig; или
L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W в первой константной области Ig и
L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V во второй константной области Ig.
82) Выделенный белок по любому из пп.1-16, где белок представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
83) Выделенный белок по п.82, где CAR содержит
а) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, по любому из пп.1-16;
b) трансмембранный домен и
c) домен внутриклеточной передачи сигнала, необязательно содержащий по меньшей мере один костимуляторный домен.
84) Выделенный белок по п.82 или 83, где CAR дополнительно содержит CD8a-шарнирную область.
85) Выделенный белок по любому из пп.82-84, где
a) трансмембранный домен содержит полипептид трансмембранной области CD8a (CD8a-TM); и
b) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, содержащий компонент представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), и домен передачи первичного сигнала, содержащий компонент дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z).
86) Выделенный белок по любому из пп.82-84, где
а) CD8а-шарнирная область содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 157;
b) трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 162; и/или
c) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 163, и домен передачи первичного сигнала, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 164.
87) Выделенный белок по п.86, где домен внутриклеточной передачи сигнала содержит полипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из компонента представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), компонента дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z), компонента кластера дифференцировки (CD27), компонента представителя суперсемейства кластеров дифференцировки или любых их комбинаций.
88) Химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий
- 226 047663
а) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33;
b) трансмембранный домен и
c) домен внутриклеточной передачи сигнала, необязательно содержащий по меньшей мере один костимуляторный домен, где антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит связывающий домен, определяемый в любом из пп.1-16, 20-22 или 34-40.
89) CAR по п.88, дополнительно содержащий CD8а-шарнирную область.
90) CAR по п.88 или 89, где
a) трансмембранный домен содержит полипептид трансмембранной области CD8a (CD8a-TM); и
b) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, содержащий компонент представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), и домен передачи первичного сигнала, содержащий компонент дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z).
91) CAR по п.89 или 90, где
d) CD8а-шарнирная область содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 157;
e) трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 162; и/или
f) домен внутриклеточной передачи сигнала содержит костимуляторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 163, и домен передачи первичного сигнала, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 164.
92) CAR по любому из пп.88-91, где внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, дополнительно содержит сигнальный полипептид.
93) CAR по п.92, где сигнальный полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 166.
94) CAR по любому из пп.88-93, где домен внутриклеточной передачи сигнала содержит полипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из компонента представителя 9 суперсемейства рецепторов TNF (CD137), компонента дзета-цепи CD3 поверхностного гликопротеина Т-клетки (CD3z), компонента кластера дифференцировки (CD27), компонента представителя суперсемейства кластеров дифференцировки и их комбинации.
95) CAR по любому из пп.90-94, где компонент CD137 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 163.
96) CAR по любому из пп.90-95, где компонент CD3z содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 164.
97) CAR по любому из пп.90-96, где домен внутриклеточной передачи сигнала содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 165.
98) CAR по любому из пп.90-97, где полипептид CD8a-TM содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 162.
99) CAR по любому из пп.90-98, где CD8а-шарнирная область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 157.
100) Выделенный лимфоцит, экспрессирующий CAR по любому из пунктов 90-99.
101) Выделенный лимфоцит по п.100, где лимфоцит представляет собой Т-лимфоцит.
102) Выделенный лимфоцит по п.100, где лимфоцит представляет собой естественную киллерную (NK) клетку.
103) Иммуноконъюгат, содержащий выделенный белок по любому из пп.1-53 или выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.54-81, конъюгированный со средством.
104) Иммуноконъюгат по п.103, где средство представляет собой терапевтическое средство или визуализирующее средство.
105) Иммуноконъюгат по п. 103, где средство представляет собой радиоактивное средство.
106) Иммуноконъюгат по п. 105, где радиоактивное средство содержит ион радиометалла.
107) Иммуноконъюгат по п.106, где ион радиометалла представляет собой 32Р, 47Sc, 67Cu, 77As, 89Sr, 90Y, 99Тс, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 131I, 153Sm, 159Gd, 165Dy, 166Ho, 169Er, 177Lu, 186Re, 188Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 225Ac, 255Fm, 227Th, 62Cu, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr или 111In.
108) Иммуноконъюгат по п. 107, где ион радиометалла представляет собой 225Ас, 'Inили89Zr.
109) Иммуноконъюгат по п. 107, где ион радиометалла представляет собой 225Ас.
110) Иммуноконъюгат по любому из пп.106-109, где ион радиометалла конъюгирован с хелатирующим фрагментом.
111) Иммуноконъюгат по п.110, где хелатирующий фрагмент содержит макроцикл, имеющий структуру формулы (I):
- 227 047663
где каждый из R1, R2, R3 и R4 независимо представляет собой CHQCO2X, где
Q независимо представляет собой водород, С1-С4-алкил или (С1-С2-алкил)фенил, и
X независимо представляет собой водород, бензил, С1-С4-алкил; и
Z представляет собой (CH2)nY, при этом n равняется 1-10, и
Y представляет собой электрофильный или нуклеофильный фрагмент, ковалентно связанный со вторым партнером клик-реакции;
в качестве альтернативы, Z представляет собой водород; и каждый из R1, R2, R3 и R4 независимо представляет собой CHQCO2X, где
Q независимо представляет собой водород, С1-С4-алкил или (С1-С2-алкил)фенил, и
X независимо представляет собой водород, бензил, С1-С4-алкил или электрофильный или нуклеофильный фрагмент, ковалентно связанный со вторым партнером клик-реакции;
в качестве альтернативы, хелант содержит открытоцепочечный лиганд.
112) Иммуноконъюгат по п.110, где хелатирующий фрагмент содержит макроцикл, имеющий структуру формулы (II):
или структуру формулы (III):
113) Иммуноконъюгат формулы (IV),
где белок представляет собой выделенный белок, определяемый в любом из пп.1-53, 82-87, или выделенный мультиспецифический белок, определяемый в любом из пп.54-81.
114) Иммуноконъюгат формулы (V),
- 228 047663 где белок представляет собой выделенный белок, определяемый в любом из пп.1-53, 82-87, или выделенный мультиспецифический белок, определяемый в любом из пп.54-81.
115) Фармацевтическая композиция, содержащая выделенный белок по любому из пп.1-53, 82-87, выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.54-81, CAR по любому из пп.88-99, лимфоцит по любому из пп.100-102 или иммуноконъюгат по любому из пп.103-114 и фармацевтически приемлемый носитель.
116) Полинуклеотид, кодирующий выделенный белок по любому из пп.1-53, 82-87, выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.54-81, CAR по любому из пп.88-99 или иммуноконъюгат по любому из пп.103-114.
117) Вектор, содержащий полинуклеотид по п. 116.
118) Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.117 или полинуклеотид по п.116.
119) Способ получения выделенного белка по любому из пп.1-53, 82-87 или выделенного мультиспецифического белка по любому из пп.54-81, включающий культивирование клетки-хозяина по п.118 в условиях, при которых экспрессируется белок, и извлечение белка, продуцируемого клеткой-хозяином.
120) Способ получения иммуноконъюгата по любому из пп.103-114, включающий культивирование клетки-хозяина по п.118 в условиях, при которых экспрессируется белок, извлечение белка, продуцируемого клеткой-хозяином, и конъюгирование белка, продуцируемого клеткой-хозяином, со средством.
121) Антиидиотипическое антитело, связывающееся с выделенным белком по любому из пп.1-53 или 82-87.
122) Набор, содержащий выделенный белок по любому из пп.1-53, 82-87 или выделенный мультиспецифический белок по любому из пп.54-81 или CAR по любому из пп.88-99.
123) Способ лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного белка по любому из пп.1-53, 82-87, выделенного мультиспецифического белка по любому из пп.54-81 или иммуноконъюгата по любому из пп.103-114 субъекту в течение времени, достаточного для лечения рака с экспрессией CD33.
124) Способ по п.123, где способ является эффективным для снижения количества экспрессирующих CD33 клеток у субъекта, при этом экспрессирующие CD33 клетки являются раковыми клетками, или при этом экспрессирующие CD33 клетки являются нераковыми клетками.
125) Способ по п. 123 или 124, где способ является эффективным для предупреждения развития рака с экспрессией CD33 у субъекта.
126) Способ лечения субъекта, имеющего рак с экспрессией CD33, при этом способ включает введение терапевтически эффективного количества лимфоцита по любому из пп.100-102 субъекту, нуждающемуся в этом, при этом лимфоцит опосредует уничтожение рака с экспрессией CD33 у субъекта.
127) Способ целевого уничтожения раковой клетки, при этом способ включает приведение раковой клетки в контакт с лимфоцитом по любому из пп.100-102, при этом лимфоцит индуцирует целевое уничтожение раковой клетки.
128) Способ выявления присутствия рака у субъекта, включающий
a) приведение клеточного образца, полученного от субъекта, в контакт с CAR по любому из пп.8899 с образованием тем самым комплекса CAR-клетка, и
b) выявление комплекса CAR-клетка, где выявление комплекса CAR-клетка указывает на присутствие рака у субъекта.
129) Способ по любому из пп.123-128, где рак с экспрессией CD33 представляет собой гематологический рак.
130) Способ по п.129, где гематологический рак представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому.
131) Способ по п.130, где гематологический рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), диффузную Вкрупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелоидный лейкоз (CML) или бластное плазмоцитоидное дендритноклеточное новообразование (DPDCN).
132) Способ по п.131, где гематологический рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML).
133) Способ по любому из пп.123-132, где выделенный белок, выделенный мультиспецифический белок или иммуноконъюгат вводят в комбинации со вторым терапевтическим средством.
134) Способ по п.133, где второе терапевтическое средство представляет собой хирургическое вмешательство, химиотерапию, андрогендепривационную терапию или облучение или любую их комбинацию.
- 229 047663
Последовательности
SEQ ID NO: 1, CDR1 (C33B1785; C33B1787; C33B1780; C33B1789; C33B1788)
DYAIG
SEO ID NO: 2, CDR1 (C33B1784)
TYVMG
SEQ ID NO: 3, CDR1 (C33B1786)
FSTMD
SEQ ID NO: 4, CDR1 (C33B1781)
INAMG
SEQ ID NO: 5, CDR1 (C33B1783; C33B1782)
DYAVG
SEQ ID NO: 6, CDR2 (C33B1785; C33B1780; C33B1789; C33B1788)
CISESDGRTYLSDSVKS
SEQ ID NO: 7, CDR2 (C33B1784)
AIVSGRNPTYADSVKS
SEQ ID NO: 8, CDR2 (C33B1787)
CISSSDGSTYYVDSVKG
SEQ ID NO: 9, CDR2 (C33B1786)
CIRPRYSTTTHADSIKG
SEQ ID NO: 10, CDR2 (C33B1781)
RITGGGATDYVDSVKG
SEQ ID NO: 11. CDR2 (C33B1783; C33B1782)
CISSSDGATYYADSVKG
SEQ ID NO: 12, CDR3 (C33B1785; C33B1780; C33B1789; C33B1788)
VDpAISESSYHCEKGFGS
- 230 047663
SEQ ID NO: 13, CDR3 (C33B1784; C33B1786)
YHYSSQY
SEQ ID NO: 14, CDR3 (C33B1787)
LIIMYGSGSERAAAACRYKYEY
SEO ID NO: 15, CDR3 (C33B178D
DLVTRVGSDLLYDDY
SEO ID NO: 16, CDR3 (C33B1783)
IIVRGSGWERAAAACRYEYSY
SEO ID NO: 17, CDR3 (C33B1782)
VIVRGTGWERAAAACRYEYAY
SEQ ID NO: 18, последовательность VHH (C33B1785) pVpLVESGGGSVpPGGSLRLSCAVFGFSLSDYAIGWFRpAPGKEREKVSCISESDGRTYLSDS VKSRFTISRDNGKNTVYLpMNNLKPDDTGVYYCATVDpAISESSYHCEKGFGSWGpGTpVT vss
SEQ ID NO: 19, последовательность VHH (C33B1784)
EVpLVESGGGLVpAGGSLRLSCAASGRTFSTYVMGWFRpAPGpERELVAAIVSGRNPTYAD SVKSRFTISRDNAKNTIYLHMNSLpPEDTAVYYCHMYHYSSpYWGpGTpVTVSS
SEO ID NO: 20, последовательность VHH (C33B1787)
EVpLVESGGGLVpAGGSLRLSCAASGFTFDDYAIGWFRpAPGKEREGVSCISSSDGSTYYVD SVKGRFTISSDNAKNTVYLpMNSLKPEDTAVYYCTALIIMYGSGSERAAAACRYKYEYWGp GTpVTVSS
SEO ID NO: 21, последовательность VHH (C33B1786)
EVpVVESGGGVVpSGGSLTLSCEASESILSFSTMDWFRpAPGKEREGVSCIRPRYSTTTHADS IKGRFKMYSDNAKNTIYLHMNSLpPEDTAVYYCHMYHYSSpYWGpGTpVTVSS
SEO ID NO: 22, последовательность VHH (C33B1781)
- 231 047663
EVQVVESGGGLVQGGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYHQAPGKQRELVARITGGGATDYVD SVKGRFTISLDSAKSTVYLQMNSLKPEDTAVYHCYADLVTRVGSDLLYDDYWGQGTQVTVS S
SEQ ID NO: 23, последовательность VHH (C33B1780)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVFGFSLSDYAIGWFRQAPGKEREKVSCISESDGRTYLSDS VKSRFTISRDNGKNTVYLQMNNLKPDDTGVYYCATVDQAISESSYHCEKGFGSWGQGTQVT VSS
SEO ID NO: 24, последовательность VHH (C33B1783)
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYAVGWFRQVPGKEREGVSCISSSDGATYYA DSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTAIIVRGSGWERAAAACRYEYSYWGQ GTQVTVSS
SEQ ID NO: 25, последовательность VHH (C33B1782)
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYAVGWFRQAPGKEREGISCISSSDGATYYAD SVKGRFTISTDNAKNTAFLQMNSLKPEDTAVYYCTAVIVRGTGWERAAAACRYEYAYWGQ GTQVTVSS
SEQ ID NO: 26, последовательность VHH (C33B1789)
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVFGFSLSDYAIGWFRQAPGKEREKVSCISESDGRTYLSD SVKSRFTISRDNGKNTVYLQMNNLKPDDTGVYYCATVDQAISESSYHCEKGFGSWGQGTQV TVSS
SEQ ID NO: 27, последовательность VHH (C33B1788)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVFGFSLSDYAIGWFRQAPGKEREKVSCISESDGRTYLSDS VKSRFTISRDNGKNTVYLQMNNLKPDDTGVYYCATVDQAISESSYHCEKGFGSWGQGTQVT VSS
SEQ ID NO: 28, CDR1 VH (C33B1474)
SFGMS
SEQ ID NO: 29, CDR1 VH (C33B1522)
SYYWG
SEQ ID NO: 30, CDR1 VH (C33B1607)
DYNIN
- 232 047663
SEQ ID NO: 31.CDR1 VH (C33B1601)
NYAMS
SEQ ID NO: 32, CDR1 VH (C33B1517)
NYYWS
SEO ID NO: 33, CDR1 VH (C33B1495; C33B931; C33B782)
SYWMS
SEO ID NO: 34, CDR1 VH (C33B1478; C33B1477; C33B1476)
VSAIH
SEO ID NO: 35, CDR1 VH (C33B1484)
VFAIH
SEQ ID NO: 36, CDR2 VH (C33B1474)
NIKRDGSEKYYVDSVKG
SEQ ID NO: 37, CDR2 VH (C33B1522)
YIYYSGSTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 38, CDR2 VH (C33B1607)
TINPNNGVTFYNpRFKG
SEO ID NO: 39, CDR2 VH (C33B1601)
GISNSGYSLYYPDTLKG
SEO ID NO: 40, CDR2 VH (C33B1517)
HIYSTGNIHYNPSLKS
SEO ID NO: 41. CDR2 VH (C33B1495)
NIKRDGSEKHYVDSVKG
SEO ID NO: 42, CDR2 VH (C33B1478; C33B1484)
RIRSKGNSYATAYDVSVKG
- 233 047663
SEO ID NO: 43, CDR2 VH (C33B1477)
RIRSKGNSYATAYAASVKG
SEQ ID NO: 44, CDR2 VH (C33B1476)
RIRSKGNSYATAYNVSVKG
SEO ID NO: 45, CDR3 VH (C33B1474)
DYGYFDF
SEO ID NO: 46, CDR3 VH (C33B1522)
MWEILGFDP
SEO ID NO: 47, CDR3 VH (C33B1607)
DGYDTYYAMDY
SEQ ID NO: 48, CDR3 VH (C33B1601)
DGGSYPYAMDY
SEQ ID NO: 49, CDR3 VH (C33B1517)
DNGAALFDY
SEQ ID NO: 50, CDR3 VH (C33B1495)
DYGYFDY
SEO ID NO: 51, CDR3 VH (C33B1478; C33B1477; C33B1476; C33B1484)
HNDKWNYYGLDV
SEO ID NO: 52, последовательность VH (C33B1474)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVANIKRDGSEKYYV
DSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMSSLRAEDTAVYYCVRDYGYFDFWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 53, последовательность VH (C33B1522)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSL
KSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARMWEILGFDPWGQGTLVTVS
SEO ID NO: 54, последовательность VH (C33B1607)
- 234 047663
EVQLQQSGPELVKPGSSVKISCKASGYTFTDYNINWVKQSHGKNLEWIGTINPNNGVTFYNQ RFKGQATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCSRDGYDTYYAMDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO: 55, последовательность VH (C33B1607)
EVQLVESGGGLVRPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVAGISNSGYSLYYP DTLKGRFTISRDNARNTLYLQMISLRSEDTAMYYCARDGGSYPYAMDYWGHGTSVTVSS
SEO ID NO: 56, последовательность VH (C33B1517)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDYWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 57, последовательность VH (C33B1495)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLDWVANIKRDGSEKHY
VDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDSAVYYCTRDYGYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 58, последовательность VH (C33B1478)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVRQASGKGLEWIGRIRSKGNSYATAY DVSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGQGTTVTVS S
SEQ ID NO: 59, последовательность VH (C33B1477)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVRQASGKGLEWIGRIRSKGNSYATAY AASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGQGTTVTVS S
SEO ID NO: 60, последовательность VH (C33B1476)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVRQASGKGLEWIGRIRSKGNSYATAY NVSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGQGTTVTVS S
SEO ID NO: 61, последовательность VH (C33B1484)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVFAIHWVRQASGKGLEWIGRIRSKGNSYATAY DVSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGQGTTVTVS S
SEO ID NO: 62, CDR1 VL (C33B1474)
QASQAISNYLN
- 235 047663
SEQ ID NO: 63, CDR1 VL (C33B1522)
SGSSSNIGSNPVN
SEQ ID NO: 64, CDR1 VL (C33B1607)
KASpDVRTAEA
SEO ID NO: 65, CDR1 VL (C33B1601)
KASpNVGTYVA
SEO ID NO: 66, CDR1 VL (C33B1517; C33B1516)
SGSSSNIGSNIVN
SEO ID NO: 67, CDR1 VL (C33B1495)
RASpGISSYLA
SEQ ID NO: 68, CDR1 VL (C33B1478; C33B1477; C33B1476; C33B1484)
KSSpSLLFSNGYKFLD
SEQ ID NO: 69, CDR2 VL (C33B1474)
DASNLET
SEQ ID NO: 70, CDR2 VL (C33B1522; C33B1517)
SNNpRPS
SEO ID NO: 71, CDR2 VL (C33B1607)
SASNRYT
SEO ID NO: 72, CDR2 VL (C33B1601)
SASYRYS
SEO ID NO: 73, CDR2 VL (C33B1495)
AASTLpS
SEO ID NO: 74, CDR2 VL (C33B1478; C33B1477; C33B1476; C33B1484; C33B1475)
LGSYRAS
- 236 047663
SEQ ID NO: 75, CDR3 VL (C33B1474)
QHYDNLPYT
SEQ ID NO: 76, CDR3 VL (C33B1522; C33B1517; C33B1516)
AAWDDSLNGPV
SEO ID NO: 77, CDR3 VL (C33B1607)
QQYYTTPRT
SEO ID NO: 78, CDR3 VL (C33B1601)
QQYKSYPLT
SEO ID NO: 79, CDR3 VL (C33B1495)
QQLNSYPVT
SEQ ID NO: 80, CDR3 VL (C33B1478; C33B1477; C33B1476; C33B1484)
MQALQTPPT
SEQ ID NO: 81, последовательность VL (C33B1474)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQAISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFS GSGSGTDFTFTISSLQPEDFSIYFCQHYDNLPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 82, последовательность VL (C33B1522)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 83, последовательность VL (C33B1607)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVRTAEAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRF TGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQYYTTPRTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 84, последовательность VL (C33B1601)
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTYVAWYQQKPGHSPKALIYSASYRYSGVPDR FTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYKSYPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO: 85, последовательность VL (C33B1517)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGPGTKVTVL
- 237 047663
SEQ ID NO: 86, последовательность VL (СЗЗВ 1495)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKVLIYAASTLQSGVPSRFSG SGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQLNSYPVTFGGGTKVEIK
SEO ID NO: 87, последовательность VL (СЗЗВ 1478; СЗЗВ 1477; СЗЗВ 1476)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLFSNGYKFLDWYLQRPGQSPQLLIYLGSYRASGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQALQTPPTFGGGTKVEIK
SEO ID NO: 88, последовательность VL (СЗЗВ 1484)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLFSNGYKFLDWYLQRPGQSPQLLIYLGSYRASGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQALQTPPTFGQGTKVEIK
SEO ID NO: 89, CDR1 VH (C33B933; C33B919; C33B937; СЗЗВ 125)
SYGMH
SEQ ID NO: 90, CDR2 VH (C33B933; C33B919; C33B937; C33B125)
VISYDGSNKYYADSVKG
SEQ ID NO: 91, CDR2 VH (C33B931; C33B782)
NIKpHGSEKYYVDSVKG
SEQ ID NO: 92, CDR3 VH (C33B933)
DFRSLDWLPPDSTSYDGMDV
SEO ID NO: 93, CDR3 VH (C33B933)
DFRSFDWLPPDSTSYYGMDV
SEO ID NO: 94, CDR3 VH (C33B931)
DRDLGYFDY
SEO ID NO: 95, последовательность VH (C33B933) pVpLVESGGGVVpPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRpSPGKGLEWVAVISYDGSNKYY ADSVKGRFTISRDNSKSTLYLpMNSLRAEDTAVYYCAKDFRSLDWLPPDSTSYDGMDVWG pGTTVTVSS
SEO ID NO: 96, последовательность VH (C33B919; C33B125)
- 238 047663
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSTSYYGMDVWG QGTTVTVSS
SEQ ID NO: 97, последовательность VH (C33B931)
EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQHGSEKYY VDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 98, CDR1 VL (C33B933)
SGHKLGDKYAS
SEO ID NO: 99, CDR1 VL (C33B919)
SGDKLGDKYVS
SEQ ID NO: 100, CDR1 VL (C33B931)
SGDKLGSKFAS
SEQ ID NO: 101. CDR2 VL (C33B933)
KDSKRPS
SEQ ID NO: 102, CDR2 VL (C33B919; C33B125) pDRKRPS
SEO ID NO: 103, CDR2 VL (C33B93D pDSKRPS
SEO ID NO: 104, CDR3 VL (C33B933; C33B919; C33B931; C33B782; C33B125) pAWDSSTVV
SEO ID NO: 105, последовательность VL (C33B933)
SYELTPPPSVSVSPGPTASITCSGHKLGDKYASWYPPKPGPSPVVVIYKDSKRPSGIPERFSGS NFGNTATLTISGTpAMDEADYYCpAWDSSTVVFGGGTKLTVL
SEO ID NO: 106, последовательность VL (C33B919)
SYELTpPPSVSVSPGpTASITCSGDKLGDKYVSWYppKPGpSPVVVIHpDRKRPSGIPERFSG SNFGNTATLTISGTpAMDEADYYCpAWDSSTVVFGGGTKLTVL
- 239 047663
SEQ ID NO: 107, последовательность VL (C33B931)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGSKFASWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGS
NSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 108, линкерная последовательность
GGSEGKSSGSGSESKSTGGS
SEO ID NO: 109, линкерная последовательность
GGGSGGGS
SEO ID NO: ПО, линкерная последовательность
GGGSGGGSGGGS
SEO ID NO: 111, линкерная последовательность
GGGSGGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO: 112, линкерная последовательность
GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO: 113, линкерная последовательность
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 114, линкерная последовательность
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEO ID NO: 115, линкерная последовательность
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEO ID NO: 116, линкерная последовательность
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
SEO ID NO: 117, линкерная последовательность
IRPRAIGGSKPRVA
SEO ID NO: 118, линкерная последовательность
GKGGSGKGGSGKGGS
- 240 047663
SEQ ID NO: 119, линкерная последовательность
GGKGSGGKGSGGKGS
SEQ ID NO: 120, линкерная последовательность
GGGKSGGGKSGGGKS
SEO ID NO: 121, линкерная последовательность
GKGKSGKGKSGKGKS
SEO ID NO: 122, линкерная последовательность
GGGKSGGKGSGKGGS
SEO ID NO: 123, линкерная последовательность
GKPGSGKPGSGKPGS
SEQ ID NO: 124, линкерная последовательность
GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS
SEQ ID NO: 125, линкерная последовательность
GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS
SEQ ID NO: 126, линкерная последовательность
STAGDTHLGGEDFD
SEO ID NO: 127, линкерная последовательность
GEGGSGEGGSGEGGS
SEO ID NO: 128, линкерная последовательность
GGEGSGGEGSGGEGS
SEO ID NO: 129, линкерная последовательность
GEGESGEGESGEGES
SEO ID NO: 130, линкерная последовательность
GGGESGGEGSGEGGS
SEO ID NO: 131, линкерная последовательность
- 241 047663
GEGESGEGESGEGESGEGES
SEQ ID NO: 132, линкерная последовательность
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
SEO ID NO: 133, линкерная последовательность
PRGASKSGSASQTGSAPGS
SEQ ID NO: 134, линкерная последовательность
GTAAAGAGAAGGAAAGAAG
SEQ ID NO: 135, линкерная последовательность
GTSGSSGSGSGGSGSGGGG
SEQ ID NO: 136, линкерная последовательность
GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS
SEQ ID NO: 137, линкерная последовательность
GSGS
SEQ ID NO: 138, линкерная последовательность
АР АРАР АРАР
SEQ ID NO: 139, линкерная последовательность
АР АРАР АРАР АРАР АР АР АР
SEQ ID NO: 140, линкерная последовательность
АЕАААКЕАААКЕААААКЕААААКЕААААКААА
SEQ ID NO: 141, HCDR1 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B219) ΊΎΑΜΝ
SEQ ID NO: 142, HCDR2 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B219) RIRSKYNNYATYYAASVKG
SEQ ID NO: 143. HCDR3 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B219)
- 242 047663
HGNFGNSYVSWFAY
SEQ ID NO: 144, LCDR1 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B219) RSSTGAVTTSNYAN
SEQ ID NO: 145, LCDR2 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B219) GTNKRAP
SEQ ID NO: 146, LCDR3 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B219) ALWYSNLWV
SEQ ID NO: 147, УН антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B219) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNIYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYAT YYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTL VTVSS
SEQ ID NO: 148, VL антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B219)
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPA RFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 149, HCDR1 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B376) NNNAAWS
SEQ ID NO: 150, HCDR2 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B376) RTYYRSKWLYDYAVSVKS
SEQ ID NO: 151, HCDR3 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B376) GYSSSFDY
SEQ ID NO: 152, LCDR1 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B376) TGTSSNIGTYKFVS
SEQ ID NO: 153, LCDR2 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B376) EVSKRPS
SEQ ID NO: 154, LCDR3 антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B376)
- 243 047663
VSYAGSGTLL
SEQ ID NO: 155, VH антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B376)
QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLY DYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 156, VL антигенсвязывающего домена, который связывает СРЗг (CD3B376)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGVSSRF SGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 157, СР8а-шарнирная область CAR, содержащего антигенсвязывающий домен.
который связывает CD33
TSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO: 158, шарнирная область CAR содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33
EPKSCDKTHTCPPCP
SEQ ID NO: 159, шарнирная область CAR содержащая антигенсвязывающий домен, который связывает CD33
ERKCCVECPPCP
SEQ ID NO: 160, шарнирная область CAR содержащая антигенсвязывающий домен, который связывает CD33
ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3
SEQ ID NO: 161, шарнирная область CAR содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33
ESKYGPPCPSCP
SEQ ID NO: 162. CD8a трансмембранная область CAR, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO: 163. CD 137 костимуляторный домен CAR содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает CD33
- 244 047663
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO: 164, CD 137 костимуляторный домен CAR, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает СР 33
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYN ELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 165, домен внутриклеточной передачи сигнала CAR, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает СР 33
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEPGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAPAPAYKQGQNQL YNELNLGRREEYPVLPKRRGRPPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKPKMAEAYSEIGMKGER RRGKGHPGLYQGLSTATKPTYPALHMQALPPR
SEQ IP NO: 166, шарнирная область CAR, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает СРЗЗ
ESKYGPPCPSCP
SEQ IP NO: 167, CPR1 VH (C33B836)
NYAMN
SEQ IP NO: 168, CPR2 VH (C33B836)
WINTNTGNPTYAQGFTG
SEO IP NO: 169, CPR3 VH (C33B836)
DRORGTDY
SEO IP NO: 170, последовательность VH (C33B836)
QVQLVQSGSELRKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPT YAQGFTGRFVFSLOTSVSSAYLQISSLKAEOTAMYYCATORPRGTPYWGQGTLVTVSS
SEO IP NO: 171, последовательность VH (C33B782)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQHGSEKYY VDSVKGRFTISRPNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARORPLGYFDYWGQGTLVTVSS
SEO IP NO: 172, CPR1 VH (C33B806)
SSSYYWG
- 245 047663
SEQ ID NO: 173, CDR2 VH (C33B806)
SINYSGSTYYNPSLKS
SEQ ID NO: 174, CDR3 VH (C33B806)
LDGYESPFDY
SEO ID NO: 175, последовательность VH (C33B806) pLpLpESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRpPPGKGLDWIGSINYSGSTYYNPS LKSRVTISVDTSKIpFSLKLRSVTAADTAVYYCARLDGYESPFDYWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 176, CDR1 VH (C33B904)
DYAMH
SEO ID NO: 177, CDR2 VH (C33B904)
GIGWSGGSIVYADSVKG
SEQ ID NO: 178, CDR3 VH (C33B904)
DSPYGDFFDY
SEQ ID NO: 179, последовательность VH (C33B904)
EVpLVESGGGLVpPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRpAPGKGLEWVSGIGWSGGSIVY ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLpMNSLRAEDTALYYCAKDSPYGDFFDYWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 180, CDR3 VH (C33B937)
DFRSFDWLPPDSASYHGMDV
SEO ID NO: 181, последовательность VH (C33B937) pVpLVESGGGVVpPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRpAPGKGLEWVAVISYDGSNKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLpMNSLRAEGTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSASYHGMDVWG pGTTVTVSS
SEO ID NO: 182, CDR1 VL (C33B836)
TGTSSDVGDYNYVS
SEO ID NO: 183, CDR2 VL (C33B836)
DVSNRPS
- 246 047663
SEQ ID NO: 184, CDR3 VL (C33B836)
SSYSSSSALEV
SEQ ID NO: 185, последовательность VL (C33B836)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGDYNYVSWYQQHPGKVPKLMIYDVSNRPSGVSN
RFSGSMSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSSSSALEVFGGGTKLTVL
SEO ID NO: 186, CDR1 VL (C33B782)
SGNKLGAKFAS
SEO ID NO: 187, CDR2 VL (C33B782)
QDNKRPS
SEO ID NO: 188, последовательность VL (C33B782)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGNKLGAKFASWYQQKPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGS
NSGNTATLTISGTQAVDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 189, CDR1 VL (C33B806)
RASpGISSWLA
SEQ ID NO: 190, CDR2 VL (C33B806)
AASSLpS
SEO ID NO: 191, CDR3 VL (C33B806) ppANSFPFT
SEO ID NO: 192, последовательность VL (C33B806)
DIpMTpSPSSVSASVGDRVTITCRASpGISSWLAWYppKPGKAPKLLIYAASSLpSGVPSRFS
GSGSGTDFTLTISSLpPEDFAIYYCppANSFPFTFGPGTKVDIK
SEO ID NO: 193, CDR1 VL (C33B904)
KSSpTVFYSSNNKNYLA
SEO ID NO: 194, CDR2 VL (C33B904)
WASTRKS
SEO ID NO: 195, CDR3 VL (C33B904)
- 247 047663
QHYYSTPYT
SEQ ID NO: 196, последовательность VL (C33B904)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVFYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRKS GVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAEDVAVYYCQHYYSTPYTFGQGTKLEIK
SEO ID NO: 197, CDR1 VL (C33B937)
SGDKLGDKYAS
SEO ID NO: 198, CDR2 VL (C33B937)
QDGKRPS
SEO ID NO: 199, CDR3 VL (C33B937)
QAWDRNTW
SEQ ID NO: 200, последовательность VL (C33B937)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDGKRPSGIPERFSG SNFGNKATLTISGTQAMDEADYYCQAWDRNTVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 201, CDR1 VL (C33B125)
SGDKLGDKYVC
SEQ ID NO: 202, последовательность VL (C33B125)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSPVVVIHQDRKRPSGIPERFSG SNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
SEO ID NO: 203, scFv (C33B836)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGDYNYVSWYQQHPGKVPKLMIYDVSNRPSGVSN RFSGSMSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSSSSALEVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSES KSTGGSQVQLVQSGSELRKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINT NTGNPIYAQGFTGRFVFSLDTSVSSAYLQISSLKAEDTAMYYCATDRDRGTDYWGQGTLVT VSS
SEO ID NO: 204, scFv (C33B782)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGNKLGAKFASWYQQKPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGS NSGNTATLTISGTQAVDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGS
- 248 047663
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQHGSEKYY VDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 205, scFv (C33B806)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGS QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLDWIGSINYSGSIYYNPS LKSRVTISVDTSKIQFSLKLRSVTAADTAVYYCARLDGYESPFDYWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 206, scFv (C33B904)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVFYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRKS GVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAEDVAVYYCQHYYSTPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGS ESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGIG WSGGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSPYGDFFDYWGQGT LVTVSS
SEQ ID NO: 207, scFv (C33B933)
SYELTpPPSVSVSPGpTASITCSGHKLGDKYASWYppKPGpSPVVVIYKDSKRPSGIPERFSGS NFGNTATLTISGTpAMDEADYYCpAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGS pVpLVESGGGVVpPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRpSPGKGLEWVAVISYDGSNKYY ADSVKGRFTISRDNSKSTLYLpMNSLRAEDTAVYYCAKDFRSLDWLPPDSTSYDGMDVWG pGTTVTVSS
SEO ID NO: 208, scFv (C33B937)
SYELTpPPSVSVSPGpTASITCSGDKLGDKYASWYppKPGpSPVLVIYpDGKRPSGIPERFSG SNFGNKATLTISGTpAMDEADYYCpAWDRNTVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTG GSpVpLVESGGGVVpPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRpAPGKGLEWVAVISYDGSNK YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLpMNSLRAEGTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSASYHGMDV WGpGTTVTVSS
SEO ID NO: 209, scFv (C33B919)
SYELTPPPSVSVSPGPTASITCSGDKLGDKYVSWYPPKPGPSPVVVIHPDRKRPSGIPERFSG SNFGNTATLTISGTpAMDEADYYCpAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGG SpVQLVESGGGVVpPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRpAPGKGLEWVAVISYDGSNKY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLpMNSLRAEDTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSTSYYGMDVW GpGTTVTVSS
- 249 047663
SEQ ID NO: 210, scFv (C33B125)
SYELTpPPSVSVSPGpTASITCSGDKLGDKYVCWYppKPGpSPVVVIHpDRKRPSGIPERFSG SNFGNTATLTISGTpAMDEADYYCpAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGG SpVpLVESGGGVVpPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRpAPGKGLEWVAVISYDGSNKY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLpMNSLRAEDTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSTSYYGMDVW GpGTTVTVSS
SEO ID NO: 21E scFv (C33B93D
SYELTpPPSVSVSPGpTASITCSGDKLGSKFASWYppKPGpSPVLVIYpDSKRPSGIPERFSGS NSGNTATLTISGTpAMDEADYYCpAWDSSTVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGS EVpLVESGGGFVpPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRpAPGKGLEWVANIKpHGSEKYY VDSVKGRFTISRDNAKNSLYLpMNSLRAEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 212, scFv (C33B1474)
DIpMTpSPSSLSASVGDRVTITCpASpAISNYLNWYppKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFS GSGSGTDFTFTISSLpPEDFSTYFCpHYDNLPYTFGpGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGS pVpLVESGGGLVpPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRpAPGKGLEWVANIKRDGSEKYYV DSVKGRFTISRDNAKNSLFLpMSSLRAEDTAVYYCVRDYGYFDFWGpGTLVTVSS
SEQ ID NO: 213, scFv (C33B1522) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYppLPGTAPKLLIYSNNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYFCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKST GGSpVpLpESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIRpPPGKGLEWIGYIYYSGSINYN PSLKSRVTISVDTSKNpFSLKLSSVTAADTAVYYCARMWEILGFDPWGpGTLVTVS
SEO ID NO: 214, scFv (C33B1607)
DIVMTpSHKFMSTSVGDRVSITCKASpDVRTAEAWYppKPGpSPKLLIYSASNRYTGVPDRF TGSGSGTDFTFTISSVpAEDLAVYYCppYYTTPRTFGGGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTG GSEVpLppSGPELVKPGSSVKISCKASGYTFTDYNINWVKpSHGKNLEWIGTINPNNGVTFY NpRFKGpATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCSRDGYDTYYAMDYWGpGTTLTVSS
SEO ID NO: 215, scFv (C33B1601)
DIVMTpSpKFMSTSVGDRVSVTCKASpNVGTYVAWYppKPGHSPKALIYSASYRYSGVPDR FTGSGSGTDFTLTISNVpSEDLADYFCpQYKSYPLTFGAGTKLELKGGSEGKSSGSGSESKST GGSEVpLVESGGGLVRPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRpTPEKRLEWVAGISNSGYSL YYPDTLKGRFTISRDNARNTLYLpMISLRSEDTAMYYCARDGGSYPYAMDYWGHGTSVTVS S
- 250 047663
SEQ ID NO: 216, scFv (C33B1517)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGPGTKVTVLGGSEGKSSGSGSESKS TGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAGKGLEWLGHIYSTGNIH YNPSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDYWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 217, scFv (C33B1495)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKVLIYAASTLQSGVPSRFSG SGSGTEFTLTISSLQPEDFAIYFCQQLNSYPVTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSE VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLDWVANIKRDGSEKHYV DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDSAVYYCTRDYGYFDYWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 218, scFv (C33B1478)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLFSNGYKFLDWYLQRPGQSPQLLIYLGSYRASGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQALQTPPTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESK STGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVRQASGKGLEWIGRIRSKGNS YATAYDVSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGQG TTVTVSS
SEQ ID NO: 219, scFv (C33B1477)
DIVMTpSPLSLPVTPGEPASISCKSSpSLLFSNGYKFLDWYLQRPGpSPpLLIYLGSYRASGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMpALpTPPTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESK STGGSEVpLVESGGGLVpPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVRpASGKGLEWIGRIRSKGNS YATAYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLpMDSLKTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGpG TTVTVSS
SEO ID NO: 220, scFv (C33B1476)
DIVMTpSPLSLPVTPGEPASISCKSSpSLLFSNGYKFLDWYLQRPGpSPpLLIYLGSYRASGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMpALpTPPTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESK STGGSEVpLVESGGGLVpPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVRpASGKGLEWIGRIRSKGNS YATAYNVSVKGRFTISRDDSKNTAYLpMDSLKTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGpG TTVTVSS
SEO ID NO: 221, scFv (C33B1484)
DIVMTpSPLSLPVTPGEPASISCKSSpSLLFSNGYKFLDWYLQRPGpSPpLLIYLGSYRASGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMpALpTPPTFGpGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESK
- 251 047663
STGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVFAIHWVRQASGKGLEWIGRIRSKGNS YATAYDVSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGQG TTVTVSS
SEO ID NO: 222. IgGl дикого типа
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEO ID NO: 223, IgG2 дикого типа
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTV VHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 224, IgG4 дикого типа
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK
SEO ID NO: 225, антиген CD33: HSAN-концевое слияние; CynoCD33ECD-HSA(C34S)-6xHis DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLD QEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDL THRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDH GTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGSGSGSENLYFQG VRSSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADE
SAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRP EVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKV
- 252 047663
HTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAA DPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEV SRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPC FSALEVDETYVPI<EFNAETFTFHADICTLSEI<ERQII<I<QTALVELVI<HI<PI<ATI<EQLI<AVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHHHH
SEQ ID NO: 226, антиген CD33: HSAN-концевое слияние; человеческий CD33ECD-TevHSA(C34S)-6xHis
DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLD QEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDL THRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDH GTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSGSGSENL YFQGVRSSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPR LVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKA ACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVT DLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEM PADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEK CCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTP TLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLV NRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLK AVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHHHH
SEQ ID NO: 227, антиген CD33: HSA N-концевое слияние; hCD33 Ig-подобный домен У-типа (Uniprot P20138, V136-H259), слитый c HSA и 6хН18-меткой на С-конце
DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLD QEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDL THRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPE VDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKV HTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAA DPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEV SRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPC
- 253 047663
FSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO: 228, антиген CD33: HSA N-концевое слияние; Ig-подобный домен С2-типа hCD33 (Uniprot P20138, V136-H259), слитый c HSA и бхЕНз-меткой на С-конце
VHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIIT PRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHDAH KSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKS LHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDE GKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGD LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVES KDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAK VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVG SKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDET YVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKC CKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO: 229, антиген CD33: hCD33 Ig-подобный домен У-типа
DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLD QEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDL THRGSHHHHHH
SEQ ID NO: 230, антиген CD33: Ig-подобный домен С2-типа hCD33
VHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIIT PRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSH HHHHH
SEQ ID NO: 231, антиген CD33: MuIgV Hu IgC2 химера CD33-6xHis vl
QDLEFQLVAPESVTVEEGLCVHVPCSVFYPSIKLTLGPVTGSWLRKGVSLHEDSPVATSDPRQ LVQKATQGRFQLLGDPQKHDCSLFIRDAQKNDTGMYFFRVVREPFVRYSYKKSQLSLHVTSL SRTPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHG TNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH
SEQ ID NO: 232, антиген CD33: MuIgV cyno IgC2 химера CD33-6xHis vl
QDLEFQLVAPESVTVEEGLCVHVPCSVFYPSIKLTLGPVTGSWLRKGVSLHEDSPVATSDPRQ LVQKATQGRFQLLGDPQKHDCSLFIRDAQKNDTGMYFFRVVREPFVRYSYKKSQLSLHVTSL
- 254 047663
SRTPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDH GTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGRKARKQGVVQGSHHHHHH
SEQ ID NO: 233, антиген CD33: CD33 человека ECD (D18-H259) из Uniprot P20138 с Cконцевой меткой 6xHis
DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLD QEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDL THRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDH GTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH
SEO ID NO: 234, антиген CD33: Cyno CD33 ECD (D37-Q274) из ХР 005590138,1 с С-концевой меткой 6xHis
DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLD QEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDL THRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDH GTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGSHHHHHH
SEQ ID NO: 235, антиген CD33: CD33 человека ECD (D18-G241) из Uniprot P20138 с меткой 6xHis
DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLD QEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDL THRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDH GTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGHHHHHH
SEQ ID NO: 236, последовательность HCDR1 mAb к TRGV9 LP7A5 1, LP7A5 2, LP7A5 3,
LP7A5 4
DHYIN
SEQ ID NO: 237, последовательность HCDR2 mAb к TRGV9 LP7A5 1, LP7A5 2, LP7A5 3,
LP7A5 4
QIYPGDGNTYYNQKFKG
SEO ID NO: 238, последовательность HCDR3 mAb к TRGV9 LP7A51
NYGDYTIDF
SEQ ID NO: 239, последовательность LCDR1 mAb к TRGV9 LP7A51, LP7A5 2, LP7A5 3,
LP7A54
KSSQSLLYSSNQKNYLA
- 255 047663
SEQ ID NO: 240, последовательность LCDR2 mAb к TRGV9 LP7A5 1, LP7A5 2, LP7A5 3,
LP7A5 4
WASTRES
SEP ID NO: 241. последовательность LCDR3 mAb к TRGV9 LP7A5 1, LP7A5 2, LP7A5 3,
LP7A5 4
QQYYRYHT
SEQ ID NO: 242, последовательность HCDR3 mAb к TRGV9 LP7A5 2
NMGMYTIDF
SEQ ID NO: 243, последовательность HCDR3 mAb к TRGV9 LP7A5 3
NMGMYTLDF
SEO ID NO: 244, последовательность HCDR3 mAb к TRGV9 LP7A5 4
NYGDYTLDF
SEO ID NO: 245, последовательность тяжелой цепи LP7A51
EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFTDHYINWVKQRTGQGLEWIGQIYPGDGNTYYN QKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAPNYGDYTIDFWGQGTSVTVSS
SEO ID NO: 246, последовательность тяжелой цепи LP7A52
EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFTDHYINWVKQRTGQGLEWIGQIYPGDGNTYYN QKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAPNMGMYTIDFWGQGTSVTVSS
SEO ID NO: 247, последовательность тяжелой цепи LP7A53
EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFTDHYINWVKQRTGQGLEWIGQIYPGDGNTYYN QKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAPNMGMYTLDFWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO: 248, последовательность тяжелой цепи LP7A5 4
EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFTDHYINWVKQRTGQGLEWIGQIYPGDGNTYYN QKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAPNMGMYTLDFWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO: 249, последовательность легкой цепи LP7A5 1
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQOKPGQSPKLLIYWASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYRYHTFGTGTKLEIK
SEO ID NO: 250, последовательность формирующего впадину плеча антитела к TRGV9
- 256 047663
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAW YQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYRYHTF GTGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSEGKSS GSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFTDHYINWV KQRTGQGLEWIGQIYPGDGNTYYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAP NYGDYTIDFWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPP CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSLGK
SEO ID NO: 251, последовательность формирующего выступ плеча антитела к CD33
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVFYSSNNKNYLAWY QQKPGQPPKLLISWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAEDVAVYYCQHYYSTPYTF GQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSEGKSS GSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW VRQAPGKGLEWVSGIGWSGGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCA KDSPYGDFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKY GPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO: 252, последовательность формирующего выступ плеча антитела к RSV
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQ APRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSEGKSSGSGSESKST EGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVRQMPGKGL EWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF
- 257 047663
NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO: 253, CDR1 VH (C33B1475)
SYWMT
SEO ID NO: 254, CDR1 VH (C33B1516)
NYYWS
SEO ID NO: 255, CDR1 VH (C33B1481)
NYWMS
SEO ID NO: 256, CDR2 VH (C33B1475)
NIKQDGSERYYVDSVKG
SEQ ID NO: 257, CDR2 VH (C33B1516)
HIFSTGHINYDSSLKS
SEQ ID NO: 258, CDR2 VH (C33B1481)
SIKRDGSDKYYVDSVKG
SEQ ID NO: 259, CDR3 VH (C33B1475)
EVGYNWNOGGYFDY
SEO ID NO: 260, CDR3 VH (C33B1516)
DNGAALFDF
SEO ID NO: 261, CDR3 VH (C33B148D
GEFDY
SEO ID NO: 262, последовательность VH (C33B1475)
EVpLVESGGGLVpPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRpAPGKGLEWVANIKpDGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLpMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNpGGYFDYWGpGTLVT VSS
SEO ID NO: 263, последовательность VH (C33B1516)
- 258 047663
QVOLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIROSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL
KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDFWGOGTLVTVSS
SEQ ID NO: 264, последовательность VH (C33B1481)
OVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSNYWMSWVROAPGKGLEWVASIKRDGSDKYY
VDSVKGRFTISRDNAKNSLSLQMHSLRAEDTAVYYCAKGEFDYWGOGTLVTVSS
SEQ ID NO: 265, CDR1 VL (C33B1475)
RSSOSLLHSDGYNYLD
SEO ID NO: 266, CDR1 VL (C33B148D
RSSOSLVYSDGNTYLN
SEO ID NO: 267, CDR2 VL (C33B1516)
SDNORPS
SEQ ID NO: 268, CDR2 VL (C33B1481)
KVSTRDS
SEQ ID NO: 269, CDR3 VL (C33B1475)
MQVLQTPWT
SEQ ID NO: 270, CDR3 VL (C33B1481)
LQGTHWPWT
SEQ ID NO: 271, последовательность VL (C33B1475)
DIVMTpSPLSLPVTPGEPASISCRSSpSLLHSDGYNYLDWYLpKSGpSPpLLIYLGSYRASGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMpVLpTPWTFGpGTKVEIK
SEQ ID NO: 272, последовательность VL (C33B1516)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO: 273, последовательность VL (C33B1481)
DVVMTOSPLSLPVTLGOPASISCRSSOSLVYSDGNTYLNWFOQRPGOSPRRLIYKVSTRDSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVAVYYCLQGTHWPWTFGOGTKVEIK
- 259 047663
SEQ ID NO: 274, scFv (C33B1475)
DIVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSSOSLLHSDGYNYLDWYLOKSGOSPOLLIYLGSYRASGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMOVLQTPWTFGOGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESK STGGSEVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVROAPGKGLEWVANIKQDGS ERYYVDSVKGRFTISRDSAKNSLYLOMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNOGGYFDYWGO GTLVTVSS
SEO ID NO: 275, scFv (C33B1516)
OSVLTOPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYOOFPGTAPKLLLYSDNORPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGTGTKVTVLGGSEGKSSGSGSESKS TGGSOVOLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIROSAGKELEWFGHIFSTGHINY DSSLKSRVTMSVDTSNNOFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDFWGOGTLVTVSS
SEQ ID NO: 276, scFv (C33B1481)
DVVMTOSPLSLPVTLGOPASISCRSSOSLVYSDGNIYLNWFOQRPGOSPRRLIYKVSTRDSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVAVYYCLQGTHWPWTFGOGTKVEIKGGSEGKSSGSGSE SKSTGGSOVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSNYWMSWVROAPGKGLEWVASIKRD GSDKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLSLQMHSLRAEDTAVYYCAKGEFDYWGOGTLVTVSS
SEQ ID NO: 277. huIgGl О1ш(17)-шарнир-ЕС C220S|IgGl| (C33B1475; C33B1516; C33B1481;
C33B1477; C33B1517; C33B1522)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEOYNSIYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEO ID NO; 278, huIgGl Gimli7)
EPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEpYNSTYRVVSVLTVLHpDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEO ID NO: 279, Fab НС (C33B1475)
OVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSNYWMSWVROAPGKGLEWVASIKRDGSDKYY VDSVKGRFTISRDNAKNSLSLQMHSLRAEDTAVYYCAKGEFDYWGOGTLVTVSSASTKGPS
- 260 047663
VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
SEQ ID NO: 280, FabHC (C33B1516)
OVOLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIROSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL KSRVTMSVDTSNNOFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDFWGOGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
SEQ ID NO: 281. Fab НС (C33B148D
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVASIKRDGSDKYY VDSVKGRFTISRDNAKNSLSLQMHSLRAEDTAVYYCAKGEFDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
SEQ ID NO: 282, Fab НС (C33B1477)
EVOLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVROASGKGLEWIGRIRSKGNSYATAY AASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGOGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
SEQ ID NO: 283, FabHC (C33B1517)
OVOLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIROTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
SEQ ID NO: 284, Fab НС (C33B1522)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARMWEILGFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
SEQ ID NO: 285, Fab LC (C33B1475)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGYNYLDWYLQKSGQSPQLLIYLGSYRASGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQVLQTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE
- 261 047663
QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 286, Fab LC (C33B1516)
QSVLTOPPSASGTPGORVTISCSGSSSNIGSNIVNWYOOFPGTAPKLLLYSDNORPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLOSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELOANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKOSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCOVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEO ID NO: 287, Fab LC (C33B148D
DVVMTOSPLSLPVTLGOPASISCRSSOSLVYSDGNIYLNWFOORPGQSPRRLIYKVSTRDSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVAVYYCLOGTHWPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEOLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALOSGNSOESVTEODSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 288, Fab LC (C33B1477)
DIVMTOSPLSLPVTPGEPASISCKSSOSLLFSNGYKFLDWYLORPGOSPOLLIYLGSYRASGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMOALOTPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALOSGNSOESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 289, Fab LC (C33B1517)
OSVLTQPPSASGTPGORVTISCSGSSSNIGSNIVNWYOOFPGTAPKLLIYSNNORPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGPGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCOVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 290, Fab LC (C33B1522)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCOVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 291, (C33B1475VH1-2)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQGGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT VSS
- 262 047663
SEQ ID NO: 292, (C33B1475VH1-3)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQAGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT vss
SEO ID NO: 293, (C33B1475VH1-5)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQYGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT
VSS
SEO ID NO: 294. (C33B1475VH1-12)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQPGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT
VSS
SEO ID NO: 295, (C33B1475VH1-14)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQNGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT VSS
SEO ID NO: 296, (C33B1475VH1-22)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQSGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT VSS
SEO ID NO: 297, (C33B1475VH1-27)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQRGSERYY
VDS
VKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 298, (C33B1475VH1-32)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQLGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT VSS
SEO ID NO: 299, (C33B1475VH1-36)
- 263 047663
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQVGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT VSS
SEO ID NO: 300, (C33B1475VH1-46)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQTGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT VSS
SEO ID NO: 301, (C33B1475VH1-63)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQFGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT
VSS
SEO ID NO: 302, (C33B1475VH1-89)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQWGSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT
VSS
SEO ID NO: 303, (C33B1475VH2-12)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDVSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT
VSS
SEO ID NO: 304, (C33B1475VH2-16)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDPSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT
VSS
SEO ID NO: 305, (C33B1475VH2-20)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDRSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT
VSS
SEO ID NO: 306, (C33B1475VH2-22)
- 264 047663
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDASERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT vss
SEO ID NO: 307, (C33B1475VH2-24)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDLSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT VSS
SEO ID NO: 308, (C33B1475VH2-35)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDQSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT VSS
SEO ID NO: 309, (C33B1475VH2-58)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDTSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT VSS
SEO ID NO: 310, (C33B1475VH2-86)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDHSERYY VDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVT VSS
SEO ID NO: 311, (C33B1516 VL1-1)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLVGPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 312, (C33B1516 VL1-2)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLRGPVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO: 313, (C33B1516 VL1-4) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLPGPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 314, (C33B1516 VL1-10)
- 265 047663
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLTGPVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO: 315. (C33B1516 VL1-11)
QSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLGGPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 316, (C33B1516 VL1-14)
QSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLpGPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 317, (C33B1516 VL1-16)
QSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLSGPVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO: 328, (СЗЗВ 1516 VL1-20)
QSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLAGPVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO: 319, (C33B1516 VL1-22)
QSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLLGPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 320, (СЗЗВ 1516 VL1-23)
QSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLYGPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 321. (C33B1516 VL1-30)
QSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLEGPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 322, (C33В1516VL 1-39)
QSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLFGPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 323, (C33В1516VL 1-41)
- 266 047663
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLDGPVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO: 324, (C33B1516VL1 -63) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLIGPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 325, (C33B1516VL1 -90) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLHGPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 326, (C33B1516 VL2-3) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLNVPVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO: 327, (C33B1516 VL2-4) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLNPPVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO: 328, (C33B1516 VL2-7) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLNRPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 329, (C33B1516 VL2-8) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLNDPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 330, (C33B1516 VL2-10) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLNEPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 331. (C33B1516 VL2-11) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLNWPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 332, (C33B1516 VL2-29)
- 267 047663
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNYPVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO: 333, (C33B1516 VL2-35) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLNAPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 334, (C33B1516VL2-37) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLNNPVFGTGTKVTVL
SEO ID NO: 335, (C33B1516VL2-38) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLNKPVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO: 336, (C33B1516VL2-90) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLLYSDNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLNLPVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO: 337, (C33В1516VH 1 -1) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDVGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 338, (C33B1516VH1-3) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDSGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 339, (C33В1516VH 1 -4) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDEGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 340, (C33В1516VH 1 -6) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDHGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 341, (C33В1516VH 1 -7)
- 268 047663
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRQSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL
KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDAGAALFDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 342, (C33В1516VH 1-8) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDGGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 343, (C33В1516VH 1-10) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDKGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 344, (C33B1516VH1-13) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDTGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEQ ID NO: 345, (C33В1516VH 1-17) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDFGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEQ ID NO: 346, (C33В1516VH 1-20) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDVGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 347, (C33В1516VH 1-21) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDRGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 348, (C33В1516VH 1-27) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDLGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 349, (C33B1516VH1-38) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRpSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDHGAALFDFWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 350, (C33В1516VH 1-56)
- 269 047663
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRQSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDIGAALFDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 351. (C33B1516VH2-8)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRQSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNSAALFDFWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 352, (C33B1516VH2-9)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRQSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSL KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNAAALFDFWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 353, (C33В1517VL 1 -1)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLGGPVFGPGTKVTVL
SEQ ID NO: 354, (C33B1517VL1 -7)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLDGPVFGPGTKVTVL
SEQ ID NO: 355, (C33B1517VL1 -8)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLPGPVFGPGTKVTVL
SEO ID NO: 356, (C33В1517VL 1-12)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLKGPVFGPGTKVTVL
SEO ID NO: 357, (C33B1517VL1-13)
OSVLTpPPSASGTPGORVTISCSGSSSNIGSNIVNWYOQFPGTAPKLLIYSNNORPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLEGPVFGPGTKVTVL
SEO ID NO: 358, (C33В1517VL 1-16)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLAGPVFGPGTKVTVL
SEO ID NO: 359, (C33B1517VL1 -22)
- 270 047663
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLRGPVFGPGTKVTVL
SEQ ID NO: 360, (C33B1517VL1 -24) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLIYSNNpRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLpGPVFGPGTKVTVL
SEO ID NO: 361, (C33B1517VL1 -27) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLIYSNNpRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLIGPVFGPGTKVTVL
SEO ID NO: 362, (C33B1517VL1-35) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLIYSNNpRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLVGPVFGPGTKVTVL
SEQ ID NO: 363, (C33B1517VL1 -49) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLIYSNNpRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLHGPVFGPGTKVTVL
SEQ ID NO: 364, (C33B1517VL1 -66) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLIYSNNpRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLKGPVFGPGTKVTVL
SEO ID NO: 365, (C33B1517VL1 -69) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLIYSNNpRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLWGPVFGPGTKVTVL
SEO ID NO: 366, (C33В1517VL 1-71) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYppFPGTAPKLLIYSNNpRPSGVPDRVS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYYCAAWDDSLSGPVFGPGTKVTVL
SEO ID NO: 367, (C33В1517VH 1 -1) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRpTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDRGAALFDYWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 368, (C33B1517VH1-3)
- 271 047663
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL
KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDPGAALFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 369, (C33В1517VH 1 -4) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRpTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDGGAALFDYWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 370, (C33В1517VH 1 -6) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRpTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDVGAALFDYWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 371. (C33В1517VH 1-8) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRpTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDLGAALFDYWGpGTLVTVSS
SEQ ID NO: 372, (C33В1517VH 1 -11) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRpTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDDGAALFDYWGpGTLVTVSS
SEQ ID NO: 373, (C33В1517VH 1-17) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRpTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDEGAALFDYWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 374, (C33B1517VH1-33) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRpTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDAGAALFDYWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 375, (C33В1517VH 1-60) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRpTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDpGAALFDYWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 376, (C33В1517VH 1-71) pVpLpESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRpTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL
KSRVTMSVDTSNNpFSLKLRSVTAADTAVYYCARDTGAALFDYWGpGTLVTVSS
SEO ID NO: 377, (C33B1517VH2-7)
- 272 047663
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNSAALFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 378, (C33B1517VH2-30)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNAAALFDYWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 379, (C33B1517VH2-31)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNLAALFDYWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 380, (C33B1517VH2-60)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNPAALFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 381, (C33B1517VH2-68)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNTAALFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 382, (C33B1517VH2-76)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSL KSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNQAALFDYWGQGTLVTVSS
SEO ID NO: 383, (C33B1522VL1 -2)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLSGPVFGGGTKLTVL
SEO ID NO: 384, (C33B1522VL1 -3)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLQGPVFGGGTKLTVL
SEO ID NO: 385, (C33B1522VL1 -4)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLVGPVFGGGTKLTVL
SEO ID NO: 386, (C33B1522VL1 -5)
- 273 047663
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLGGPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 387, (C33B1522VL1-7)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLWGPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 388, (C33В1522VL 1-12)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLTGPVFGGGTKLTVL
SEO ID NO: 389, (C33B1522VL1-15)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLIGPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 390, (C33B1522VL1 -27) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYppLPGTAPKLLIYSNNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYFCAAWDDSLEGPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 391, (C33B1522VL1 -29) pSVLTpPPSASGTPGpRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYppLPGTAPKLLIYSNNpRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLpSEDEADYFCAAWDDSLAGPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 392, (C33B1522VL1 -32)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLRGPVFGGGTKLTVL
SEO ID NO: 393, (C33B1522VL1 -47)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLLGPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 394, (C33B1522VL2-82)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNVPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 395, (C33B1522VL2-D
- 274 047663
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNAPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 396, (C33B1522VL2-2)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNPPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 397, (C33B1522VL2-8)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNLPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 398, (C33B1522VL2-17)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNTPVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 399, HC AbM CDR1 (C33B1522)
GGSISSYYWG
SEQ ID NO: 400, HC AbM CDR1 (C33B1477)
GFTFSVSAIH
SEQ ID NO: 401, HC AbM CDR1 (C33B1475)
GFTFSSYWMT
SEQ ID NO: 402, HC AbM CDR1 (C33B1517)
GASIRNYYWS
SEQ ID NO: 403, HC AbM CDR1 (C33B1516)
GGSIRNYYWS
SEQ ID NO: 404, HC AbM CDR1 (C33B148D
GITFSNYWMS
SEQ ID NO: 405, HC AbM CDR2 (C33B1522)
YIYYSGSTN
SEQ ID NO: 406, HC AbM CDR2 (C33B1477)
- 275 047663
RIRSKGNSYATA
SEQ ID NO: 407, HC AbM CDR2 (СЗЗВ 1475)
NIKQDGSERY
SEO ID NO: 408, HC AbM CDR2 (СЗЗВ 1517)
HIYSTGNIH
SEO ID NO: 409, HC AbM CDR2 (СЗЗВ 1516)
HIFSTGHIN
SEO ID NO: 410, HC AbM CDR2 (СЗЗВ 1481)
SIKRDGSDKY
SEQ ID NO: 411, HC AbM CDR3 (C33B1522)
MWEILGFDP
SEQ ID NO: 412, HC AbM CDR3 (СЗЗВ 1477)
HNDKWNYYGLDV
SEQ ID NO: 413, HC AbM CDR3 (C33B1475)
EVGYNWNQGGYFDY
SEO ID NO: 414, HCAbM CDR3 (C33B1517)
DNGAALFDY
SEO ID NO: 415, HCAbM CDR3 (C33B1516)
DNGAALFDF
SEO ID NO: 416, HC AbM CDR3 (СЗЗВ 1481)
GEFDY
SEQ ID NO: 417, LC AbM CDR1 (C33B1522)
SGSSSNIGSNPVN
SEO ID NO: 418, LC AbM CDR1 (СЗЗВ 1477)
KSSOSLLFSNGYKFLD
- 276 047663
SEQ ID NO: 419, LC AbM CDR1 (C33B1475)
RSSQSLLHSDGYNYLD
SEQ ID NO: 420, LC AbM CDR1 (C33B1517)
SGSSSNIGSNIVN
SEO ID NO: 421, LC AbM CDR1 (C33B1516)
SGSSSNIGSNIVN
SEO ID NO: 422, LC AbM CDR1 (C33B1481)
RSSOSLVYSDGNTYLN
SEO ID NO: 423, LC AbM CDR2 (C33B1522) SNNQRPS
SEQ ID NO: 424, LC AbM CDR2 (C33B1477) LGSYRAS
SEQ ID NO: 425, LC AbM CDR2 (C33B1475)
LGSYRAS
SEQ ID NO: 426, LC AbM CDR2 (C33B1517) SNNQRPS
SEQ ID NO: 427, LC AbM CDR2 (C33B1516)
SDNQRPS
SEQ ID NO: 428, LC AbM CDR2 (C33B148D
KVSTRDS
SEQ ID NO: 429, LC AbM CDR3 (C33B1522)
AAWDDSLNGPV
SEQ ID NO: 430, LC AbM CDR3 (C33B1477)
MQALQTPPT
- 277 047663
SEO ID NO: 431, LC AbM CDR3 (C33B1475)
MQVLQTPWT
SEQ ID NO: 432, LC AbM CDR3 (C33B1517)
AAWDDSLNGPV
SEO ID NO: 433, LC AbM CDR3 (C33B1516)
AAWDDSLNGPV
SEO ID NO: 434, LC AbM CDR3 (C33B1481)
LQGTHWPWT
SEO ID NO: 435, HC CHOTHIA CDR1 (C33B1522) GGSISSY
SEQ ID NO: 436, HC CHOTHIA CDR1 (C33B1477) GFTFSVS
SEQ ID NO: 437, HC CHOTHIA CDR1 (C33B1475) GFTFSSY
SEQ ID NO: 438, HC CHOTHIA CDR1 (C33B1517) GASIRNY
SEO ID NO: 439, HC CHOTHIA CDR1 (C33B1516)
GGSIRNY
SEO ID NO: 440, HC CHOTHIA CDR1 (C33B1481) GITFSNY
SEO ID NO: 441, HC CHOTHIA CDR2 (C33B1522) YYSGS
SEO ID NO: 442, HC CHOTHIA CDR2 (C33B1477) RSKGNSYA
SEO ID NO: 443, HC CHOTHIA CDR2 (C33B1475)
- 278 047663
KQDGSE
SEQ ID NO: 444, HC CHOTHIA CDR2 (C33B1517) YSTGN
SEO ID NO: 445, HC CHOTHIA CDR2 (C33B1516) FSTGH
SEO ID NO: 446, HC CHOTHIA CDR2 (C33B1481)
KRDGSD
SEO ID NO: 447, HC CHOTHIA CDR3 (C33B1522) MWEILGFD
SEQ ID NO: 448, HC CHOTHIA CDR3 (C33B1477)
HNDKWNYYGLD
SEQ ID NO: 449, HC CHOTHIA CDR3 (C33B1475)
EVGYNWNQGGYFD
SEQ ID NO: 450, HC CHOTHIA CDR3 (C33B1517) DNGAALFD
SEO ID NO: 451, HC CHOTHIA CDR3 (C33B1516) DNGAALFD
SEO ID NO: 452, HC CHOTHIA CDR3 (C33B1481) GEFD
SEO ID NO: 453, LC CHOTHIA CDR1 (C33B1522) SSSNIGSNP
SEQ ID NO: 454, LC CHOTHIA CDR1 (C33B1477) SOSLLFSNGYKF
SEO ID NO: 455, LC CHOTHIA CDR1 (C33B1475)
SOSLLHSDGYNY
- 279 047663
SEO ID NO: 456, LC CHOTHIA CDR1 (C33B1517) SSSNIGSNI
SEQ ID NO: 457, LC CHOTHIA CDR1 (C33B1516) SSSNIGSNI
SEO ID NO: 458, LC CHOTHIA CDR1 (C33B1481) SOSLVYSDGNTY
SEO ID NO: 459, LC CHOTHIA CDR2 (C33B1522) SNN
SEO ID NO: 460, LC CHOTHIA CDR2 (C33B1477) LGS
SEQ ID NO: 461, LC CHOTHIA CDR2 (C33B1475) LGS
SEQ ID NO: 462, LC CHOTHIA CDR2 (C33B1517) SNN
SEQ ID NO: 463, LC CHOTHIA CDR2 (C33B1516) SDN
SEO ID NO: 464, LC CHOTHIA CDR2 (C33B1481) KVS
SEO ID NO: 465, LC CHOTHIA CDR3 (C33B1522)
WDDSLNGP
SEO ID NO: 466, LC CHOTHIA CDR3 (C33B1477) ALQTPP
SEO ID NO: 467, LC CHOTHIA CDR3 (C33B1475)
VLOTPW
- 280 047663
SEQ ID NO: 468, LC CHOTHIA CDR3 (C33B1517)
WDDSLNGP
SEQ ID NO: 469, LC CHOTHIA CDR3 (C33B1516) WDDSLNGP
SEO ID NO: 470, LC CHOTHIA CDR3 (C33B148D
GTHWPW
SEO ID NO: 471, HC IMGT CDR1 (C33B1522)
GGSISSYY
SEO ID NO: 472, HC IMGT CDR1 (C33B1477) GFTFSVSA
SEQ ID NO: 473, HC IMGT CDR1 (C33B1475)
GFTFSSYW
SEQ ID NO: 474, HC IMGT CDR1 (C33B1517) GASIRNYY
SEQ ID NO: 475, HC IMGT CDR1 (C33B1516)
GGSIRNYY
SEO ID NO: 476, HC IMGT CDR1 (C33B148D GITFSNYW
SEO ID NO: 477, HC IMGT CDR2 (C33B1522)
IYYSGST
SEO ID NO: 478, HC IMGT CDR2 (C33B1477)
IRSKGNSYAT
SEO ID NO: 479, HC IMGT CDR2 (C33B1475) IKODGSER
SEO ID NO: 480, HC IMGT CDR2 (C33B1517)
- 281 047663
IYSTGNI
SEQ ID NO: 481. HC IMGT CDR2 (C33B1516)
IFSTGHI
SEO ID NO: 482, HC IMGT CDR2 (C33B148D IKRDGSDK
SEO ID NO: 483, HC IMGT CDR3 (C33B1522) ARMWEILGFDP
SEO ID NO: 484, HC IMGT CDR3 (C33B1477)
TRHNDKWNYYGLDV
SEQ ID NO: 485, HC IMGT CDR3 (C33B1475)
AREVGYNWNQGGYFDY
SEQ ID NO: 486, HC IMGT CDR3 (C33B1517)
ARDNGAALFDY
SEQ ID NO: 487, HC IMGT CDR3 (C33B1516)
ARDNGAALFDF
SEO ID NO: 488, HC IMGT CDR3 (C33B148 D AKGEFDY
SEO ID NO: 489, LC IMGT CDR1 (C33B1522) SSNIGSNP
SEO ID NO: 490, LC IMGT CDR1 (C33B1477) OSLLFSNGYKF
SEQ ID NO: 491, LC IMGT CDR1 (C33B1475) OSLLHSDGYNY
SEO ID NO: 492, LC IMGT CDR1 (C33B1517)
SSNIGSNI
- 282 047663
SEQ ID NO: 493, LC IMGT CDR1 (C33B1516) SSNIGSNI
SEQ ID NO: 494, LC IMGT CDR1 (C33B1481) OSLVYSDGNTY
SEQ ID NO: 495. LC IMGT CDR2 (C33B1522)
SNN
SEO ID NO: 496, LC IMGT CDR2 (C33B1477)
LGS
SEO ID NO: 497, LC IMGT CDR2 (C33B1475)
LGS
SEQ ID NO: 498, LC IMGT CDR2 (C33B1517)
SNN
SEQ ID NO: 499, LC IMGT CDR2 (C33B1516)
SDN
SEQ ID NO: 500, LC IMGT CDR2 (C33B1481) KVS
SEO ID NO: 501, LC IMGT CDR3 (C33B1522) AAWDDSLNGPV
SEO ID NO: 502, LC IMGT CDR3 (C33B1477) MOALOTPPT
SEO ID NO: 503, LC IMGT CDR3 (C33B1475) MQVLQTPWT
SEO ID NO: 504, LC IMGT CDR3 (C33B1517)
AAWDDSLNGPV
SEO ID NO: 505, LC IMGT CDR3 (C33B1516)
- 283 047663
AAWDDSLNGPV
SEQ ID NO: 506, LC IMGT CDR3 (СЗЗВ 1481) LQGTHWPWT
SEO ID NO: 507, HC CONTACT CDR1 (C33B1522) SSYYWG
SEO ID NO: 508, HC CONTACT CDR1 (СЗЗВ 1477) SVSAIH
SEO ID NO: 509, HC CONTACT CDR1 (СЗЗВ 1475) SSYWMT
SEQ ID NO: 510, HC CONTACT CDR1 (C33B1517) RNYYWS
SEQ ID NO: 511, HC CONTACT CDR1 (C33B1516) RNYYWS
SEQ ID NO: 512, HC CONTACT CDR1 (СЗЗВ 1481) SNYWMS
SEO ID NO: 513, HC CONTACT CDR2 (C33B1522)
WIGYIYYSGSTN
SEO ID NO: 514, HC CONTACT CDR2 (СЗЗВ 1477)
WIGRIRSKGNSYATA
SEO ID NO: 515, HC CONTACT CDR2 (C33B1475) WVANIKODGSERY
SEQ ID NO: 516, HC CONTACT CDR2 (СЗЗВ 1517)
WLGHIYSTGNIH
SEO ID NO: 517, HC CONTACT CDR2 (C33B1516)
WFGHIFSTGHIN
- 284 047663
SEO ID NO: 518, HC CONTACT CDR2 (C33B1481)
WVASIKRDGSDKY
SEQ ID NO: 519, HC CONTACT CDR3 (C33B1522) ARMWEILGFD
SEO ID NO: 520, HC CONTACT CDR3 (C33B1477)
TRHNDKWNYYGLD
SEO ID NO: 521, HC CONTACT CDR3 (C33B1475)
AREVGYNWNOGGYFD
SEO ID NO: 522, HC CONTACT CDR3 (C33B1517)
ARDNGAALFD
SEQ ID NO: 523, HC CONTACT CDR3 (C33B1516)
ARDNGAALFD
SEQ ID NO: 524, HC CONTACT CDR3 (C33B1481) AKGEFD
SEQ ID NO: 525, LC CONTACT CDR1 (C33B1522) IGSNPVNWY
SEO ID NO: 526, LC CONTACT CDR1 (C33B1477) LFSNGYKFLDWY
SEO ID NO: 527, LC CONTACT CDR1 (C33B1475) LHSDGYNYLDWY
SEO ID NO: 528, LC CONTACT CDR1 (C33B1517) IGSNIVNWY
SEQ ID NO: 529. LC CONTACT CDR1 (C33B1516)
IGSNIVNWY
- 285 047663
SEO ID NO: 530, LC CONTACT CDR1 (СЗЗВ 1481)
VYSDGNTYLNWF
SEQ ID NO: 531, LC CONTACT CDR2 (C33B1522) LLIYSNNQRP
SEO ID NO: 532, LC CONTACT CDR2 (СЗЗВ 1477) LLIYLGSYRA
SEO ID NO: 533, LC CONTACT CDR2 (СЗЗВ 1475) LLIYLGSYRA
SEO ID NO: 534, LC CONTACT CDR2 (СЗЗВ 1517) LLIYSNNQRP
SEQ ID NO: 535, LC CONTACT CDR2 (СЗЗВ 1516) LLLYSDNQRP
SEQ ID NO: 536, LC CONTACT CDR2 (СЗЗВ 1481)
RLIYKVSTRD
SEQ ID NO: 537, LC CONTACT CDR3 (C33B1522) AAWDDSLNGP
SEQ ID NO: 538, LC CONTACT CDR3 (C33B1477) MQALQTPP
SEQ ID NO: 539, LC CONTACT CDR3 (СЗЗВ 1475) MQVLQTPW
SEQ ID NO: 540, LC CONTACT CDR3 (C33B1517) AAWDDSLNGP
SEQ ID NO: 541, LC CONTACT CDR3 (СЗЗВ 1516)
AAWDDSLNGP
SEQ ID NO: 542, LC CONTACT CDR3 (СЗЗВ 1481)
LQGTHWPW
- 286 047663
Ссылочные материалы:
1. www_lls_org/sites/default/files/file_assets/PS32_AML_Booklet_2019_FINAL.pdf
2. D Н Wiseman, В F Greystoke & T С P Somervaille, The variety of leukemic stem cells in myeloid malignancy,, Oncogene volume 33, pages3091-3098(2014)
3. American Cancer Society: Cancer Facts and Figures 2014. Atlanta, Ga: American
Cancer Society, 2014. Available onlineExit Disclaimer
4. www.uniprot.org/uniprot/P20138
5. Engagement of p75/AIRMl or CD33 inhibits the proliferation of normal or leukemic myeloid cells, Vitale C., Romagnani C., Falco M., Ponte M., Vitale M., Moretta A., Bacigalupo A., Moretta L., Mingari M.C., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:1509115096(1999)
6. Ehninger A. Et al (2015) Blood Cancer Journal (2014) 4, e218
7. Felix S. Lichtenegger, et al., Recent developments in immunotherapy of acute myeloid leukemia, JHematol Oncol. 2017; 10: 142.
***
Объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе. Следует отметить, что различные модификации настоящего изобретения в дополнение к описанным в данном документе станут очевидными специалистам в данной области из вышеуказанного описания и прилагаемых графических материалов. Такие модификации предполагаются как находящиеся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, следует учитывать, что все значения являются приблизительными и представлены для описания.
По всей настоящей заявке цитируются патенты, заявки на патенты, публикации, описания продуктов и протоколы, описания которых включены в данный документ посредством ссылки в полном своем объеме для всех целей.
Claims (15)
1. Выделенный белок, который связывает CD33, где выделенный белок содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 29, 37, 46, 63, 70 и 76, соответственно.
2. Выделенный белок по п.1, где выделенный белок содержит VH SEQ ID NO: 53 и VL SEQ ID NO: 82.
3. Выделенный белок по п.1 или 2, где выделенный белок представляет собой Fab, scFv, (scFv)2, Fv, F(ab')2, Fd, dAb или VHH.
4. Выделенный белок по п.3, где выделенный белок представляет собой scFv, содержащий от N- до С-конца (i) VH, первый линкер (L1) и VL (VH-L1-VL) или (ii) VL, L1 и VH (VL-L1-VH); и где необязательно L1 содержит:
a) любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140; и/или
b) приблизительно 5-50 аминокислот; приблизительно 5-40 аминокислот; приблизительно 10-30 аминокислот или приблизительно 10-20 аминокислот.
5. Выделенный белок по п.4, где выделенный белок представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 213.
6. Выделенный белок по любому из пп.1-4, где белок конъюгирован с удлиняющим или модулирующим период полужизни фрагментом, выбранным из иммуноглобулина (Ig); фрагмента Ig; константной области Ig; фрагмента константной области Ig; Fc-области; фрагмента константной области Ig, содержащего Fc-область; фрагмента константной области Ig, содержащего домен СН2; фрагмента константной области Ig, содержащего домен CH3; фрагмента константной области Ig, содержащего домен СН2 и домен CH3; фрагмента константной области Ig, содержащего по меньшей мере часть шарнира, домена СН2 и домена CH3; фрагмента константной области Ig, содержащего шарнир, домен СН2 и домен CH3; трансферрина; альбумина; альбуминсвязывающего домена или полиэтиленгликоля.
7. Выделенный белок по п.6, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, где
а) указанный антигенсвязывающий домен конъюгирован с N-концом константной области Ig или фрагментом константной области Ig;
b) указанный антигенсвязывающий домен конъюгирован с С-концом константной области Ig или фрагментом константной области Ig; или
- 287 047663
c) указанный антигенсвязывающий домен конъюгирован с константной областью Ig или фрагментом константной области Ig через второй линкер (L2), содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
8. Выделенный белок по любому из пп.1-7, где выделенный белок представляет собой моноспецифический белок, мультиспецифический белок, биспецифический белок или триспецифический белок; где необязательно мультиспецифический белок, биспецифический белок или триспецифический белок независимо содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген на лимфоците, Т-клетке, CD8+ Т-клетке или естественной киллерной (NK) клетке; где необязательно мультиспецифический белок, биспецифический белок или триспецифический белок независимо содержит антигенсвязывающий домен, который связывает TRGV9, CD3 эпсилон (CD3e), CD3, CD8, KI2L4, NKG2E, NKG2D, NKG2F, BTNL3, CD186, BTNL8, PD-1, CD195 или NKG2C.
9. Выделенный белок по п.8, где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и/или второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержат Fab, scFv, VHH, (scFv)2, Fv, F(ab')2, Fd или dAb; или где первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, содержит scFv, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген лимфоцита, содержит VHH.
10. Выделенный белок по любому из пп.6-9, где константная область Ig или фрагмент константной области Ig относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, где необязательно константная область Ig или фрагмент константной области Ig относятся к IgG1; где необязательно фрагмент константной области Ig имеет последовательность SEQ ID NO: 277 или 278.
11. Фармацевтическая композиция, содержащая выделенный белок по любому из пп.1-10 и фармацевтически приемлемый носитель.
12. Полинуклеотид, кодирующий выделенный белок по любому из пп.1-10.
13. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.12.
14. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.13 или полинуклеотид по п.12.
15. Применение выделенного белка по любому из пп.1-10 в способе лечения рака с экспрессией CD33 у субъекта, где экспрессирующий CD33 рак является гематологическим раком, выбранным из лейкоза, лимфомы, множественной миеломы, острого миелоидного лейкоза (AML), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL), диффузной В-крупноклеточной лимфомы (DLBCL), хронического миелоидного лейкоза (CML) или бластного плазмоцитоидного дендритноклеточного новообразования (DPDCN).
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/989,120 | 2020-03-13 | ||
| US62/989,071 | 2020-03-13 | ||
| US62/989,230 | 2020-03-13 | ||
| US62/989,187 | 2020-03-13 | ||
| US62/989,093 | 2020-03-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA047663B1 true EA047663B1 (ru) | 2024-08-22 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240124583A1 (en) | Proteins Comprising Kallikrein Related Paptidase 2 Antigen Binding Domains And Their Uses | |
| US11827708B2 (en) | Proteins comprising HLA-G antigen binding domains and their uses | |
| US20220411504A1 (en) | Proteins comprising cd3 antigen binding domains and uses thereof | |
| US20230365683A1 (en) | Materials And Methods For Binding Siglec-3/CD33 | |
| US12084501B2 (en) | Proteins comprising CD3 antigen binding domains and uses thereof | |
| EA047663B1 (ru) | Материалы и способы для связывания siglec-3/cd33 | |
| EA047121B1 (ru) | Материалы и способы для связывания siglec-3/cd33 | |
| EP4405392A1 (en) | Proteins comprising cd20 binding domains, and uses thereof | |
| EP4304649A1 (en) | Uses of cd79b antibodies for autoimmune therapeutic applications |