CZ2003678A3

CZ2003678A3 - Syntetické proteiny stimulující erytropoézu

Info

Publication number: CZ2003678A3
Application number: CZ2003678A
Authority: CZ
Inventors: Gerd G. Kochendoerfer; Paolo Botti; James A. Bradburne; Shiah-Yun Chen; Sonya Cressman; Christie L. Hunter; Stephen B. H. Kent; Donald W. Low
Original assignee: Gryphon Therapeutics, Inc.
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2001-07-12
Publication date: 2004-03-17
Also published as: NO20031048L; YU17603A; JP2004508338A; CA2412279A1; AU2001273385B2; WO2002020034A1; AU7338501A; KR20030046411A; AU7338801A; KR20030061784A; CN1454097A; JP2007269799A; JP2004518621A; EP1315513B1; RU2003109746A; NO20031049L; AU2001273388B2; EP1315513A4; NO20031047L; EP1315511A4

Description

Oblast techniky

Vynález erytropoézu, způsobem, a a jejich použití.

se týká syntetických které jsou polymerně dále se týká způsobů proteinů stimulujících modifikované definovaným přípravy těchto proteinů

Odkaz na související přihlášky:

Tato přihláška je pokračování patentových přihlášek Spojených Států č. 60/231 330 (podaná 8. září 2000) a 60/236 377 (podaná 29. září, 2000), které jsou obě v celistvosti zahrnuty v tomto textu formou odkazu.

Dosavadní stav techniky

Erytropoéza je proces tvorby červených krvinek, který nastává při regulaci obratu a ztráty červených krvinek.

(EPO) je proteinový hormon, který stimuluje se vyskytující humánní EPO je

Erytropoetin erytropoézu.

Pnrozene glykoprotein obsahující 165 aminokyselin, který je tvořen primárně v ledvinách, je sekretován do krevního oběhu a stimuluje produkci červených krvinek z prekurzorových buněk v kostní dřeni. Ačkoli gen kódující humánní EPO předurčuje molekulu se 166 aminokyselinovými zbytky, karboxy-koncový arginin je odstraněn při posttranslační modifikaci na zralou formu proteinu.

Glykosylovaný humánní EPO má tři N-vázané řetězce připojené v polohách 24, 38 a 83. Má

O-vazanou sacharidovou skuřinu ořítomnou v poloze sacharidové také jednu glykosylace jsou komplexní. Neglykosylovaný EPO je účinný in vitro. Nicméně studie prokázaly, že glykosylace je nutná pro plnou aktivitu in vivo. Studie také ukázaly, že variabilní typ glykosylace projevuje variabilní účinky. Například desialyzovaný EPO projevuje jak zesílenou aktivitu in vitro tak sníženou aktivitu in vivo, účinek přisuzovaný expozici galaktózových zbytků, které jsou rozpoznávány, vázány a odstraňovány hepatocyty. Bylo také ukázáno, že typ větvení plně sialyzovaného EPO způsobuje rozdíly v biologické aktivitě. Převážně čtyřnásobně rozvětvený EPO vykazuje aktivitu ekvivalentní standardnímu EPO, zatímco převážně dvojnásobně rozvětvený EPO vykazuje trojnásobně větší aktivitu in vitro, ale pouze 15% normální aktivity in vivo. Navíc různé studie prokázaly, že pro účinek EPO jsou důležité pouze N-vázané sacharidy a ne O-vázané sacharidy.

K dispozici je několik farmaceutických produktů obsahujících rekombinantně vytvořený . glykosylovaný EPO. Nicméně současně dostupné EPO farmaceutické výrobky jsou limitovány krátkým plazmatickým poločasem a citlivostí k degradaci proteázami. Obsahují také komplexní směsi různých glykoforem kvůli vysokému stupni heterogenity větvení a obsahu sialové kyseliny, který se vyskytuje v každém N-vázaném glykosylačním místě a mezi místy. Tyto nedostatky jim zabránily dosáhnout maximální klinické účinnosti.

Aby se zlepšil poločas cirkulace a jiné vlastnosti těchto EPO proteinů, byly připojovány polymery rozpustné ve vodě, jako je například PEG (polyethylenglykol) , ale s nestálými výsledky vzhledem k obtížím jejich připojování řízeným způsobem a s přesností definovanou uživatelem. Byla použita například celá řada prostředků pro připojení polymerových skupin, jako je například PEG a příbuzné polymery, k reaktivním skupinám zjištěným na proteinech (viz patent » ··«· ·· ···< • · · · • · · · · · · • · · · · «

Spojených Států 4 179 337 (Davis et al. ) a patent Spojených Států 4 002 531 (Royer) . Pro přehled viz Abuchowski et al. , v Enzymes as Drugs, (J. S. Holcerberg a J. Roberts, vyd., s. 367-383, 1981, a Zalipsky, S. (Bioconjugate Chemistry, 1995,

6, 150-165). Použití PEG a jiných polymerů pro modifikaci

proteinů je	také	diskutováno	autory	Cheng, T.-L.	Et	al. ,
Bioconj ugate	Chem.	, 1999, 10,	520-528	, Belcheva, N.	, et	al.,
Bioconj ugate	Chem.	, 1999, 10,	932-937,	Bettinger, T	. et	al. ,
Bioconj ugate	Chem.	1998, 9,	842-846,	Huang, S.-Y.	et	al. ,
Bioconj ugate	Chem.	, 1998, 9, 612-617,	Xu, B. et al.	Langmuir,

1997, 13, 2447-2456, Schwarz, J. B. et al., J.

D. et al.,

Amer. Chem. Bioconj ugate Org. Chem.,

Soc., 1999, 121, 2662-2673, Reuter, J.

Chem., 1999, 10, 271-278, Chán, T.-H. et al., J.

1997, 62, 3500-3504. Typická místa připojení v proteinech zahrnují primární aminoskupiny, jako jsou například skupiny na lysinových zbytcích nebo na N-konci, thiolové skupiny, jako jsou například skupiny na cysteinových postranních řetězcích a karboxylové skupiny, jako jsou například skupiny na glutamátových nebo aspartátových zbytcích nebo na C-konci. Některá nejčastější místa připojení jsou k sacharidovým zbytkům glykoproteinů, cysteinům nebo k N-konci a lysinům cílových proteinů.

Ačkoli pro kondenzaci polymerů k EPO bylo popsáno mnoho různých přístupů, postup kondenzace není bez komplikací. Musí být věnována péče omezení ztráty biologické aktivity způsobené kondenzační reakcí. Například pro minimalizaci počtu míst připojení jsou typicky používány svinuté nebo opětně svinuté proteiny. Nicméně jestliže je k cílovému proteinu nebo polypeptidu připojeno příliš mnoho aktivovaného polymeru, biologická aktivita mohou být závažně redukována nebo ztracena. Podobně, jestliže je použit špatný linker (spojovací úsek) spojující polymer k proteinu nebo jestliže je k cíli • · » · · · » · · · » · · · · připojeno nedostatečné množství polymeru, terapeutická hodnota výsledného konjugátu mohou být limitována a nemusí vykazovat dostatečné prodloužení cirkulujícího poločasu, aby se vynahradila ztráta jeho biologické aktivity. Problémy mohou také vyplývat z blokády aktivního místa proteinu modifikujícím polymerem. Tomuto problému mohou být obtížné zabránit, protože polymer a protein jsou typicky spojovány v reakcích probíhájících v roztoku. Bylo navrhováno zablokovat předem aktivní místa látkami, jako je například pyridoxalfosfát, ale výsledky byly rozporuplné (viz patent Spojených Států 4 179 337 (Davis et al.)). Tyto problémy jsou obzvláště naléhavé u proteinů a peptidů s nižší molekulovou hmotností, které často mají málo míst připojení, které nejsou asociovány s biologickou aktivitou.

Například běžná technika je připojení polymerů rozpustných ve vodě k primárním aminům v cílovém proteinu (např. N-koncová aminoskupina a epsilon aminoskupiny lysinu). K připojení polymerů k thiolovým postranním řetězcům cysteinů byly také použity thiol-reaktivní polymerové konjugáty. Oba přístupy představují významné problémy, protože většina proteinů obsahuje mnohonásobné kopie takových reaktivních skupiny rozprostřených přes různé úseky hlavního řetězce polypeptidu, které mají důležitou úlohu pro definici aktivity, svinutí, opětného svinutí a stabilitu proteinu. Takže i když jsou široce používány, trpí tyto přístupy více nebo méně neúplným nebo nežádoucím snížením biologické aktivity proteinu a obvykle vznikají komplexní směsi, které je obtížné separovat a charakterizovat 1997, 3, 59-66).

Uelgada et al

Pharmaceutical Sciences,

V pokusech redukovat náhodné připojení byly vyrobeny proteiny, ve kterých přírodní lysiny jsou odstraněny ve spojitosti s přidáním lysinů na požadovaná místa připojení • 4 ·· ·· * · · * · · · · «· Λ ··*··* • · · * » · · » * · · ♦ · » * · e.

• · · · ► <. _r ,. φ • · ·· * · ··· ·« ·· polymeru (patent Spojených Států č. 4 904 584). Tímto způsobem byly modifikovány například G-CSF a IL-2. V dalších pokusech zabránit náhodnému připojení byly vyráběny proteiny, ve kterých přírodní cysteiny jsou odstraněny ve spojitosti s přidáním cysteinů na požadovaná místa připojení polymeru nebo cysteiny jsou přidány bez odstranění přírodních cysteinů, jestliže jsou přítomny (EP 0 668 353). Například EPO byl vytvořen tímto způsobem. Zatímco takové varianty cysteinu nebo lysinu teoreticky umožňují místně specifické připojení polymeru, stále neexistuje záruka, že všechna vybraná místa mohou být modifikována řízeným způsobem.

Vzhledem k neschopnosti místně specificky modifikovat proteiny obsahující mnohonásobné aminokyseliny s postranními řetězci nesoucími stejné nebo podobné reaktivní funkční skupiny, nedávné úsilí bylo zaměřeno na modifikaci amino- nebo karboxy-konce proteinů. Modifikace amino- nebo karboxy-konce spoléhá na schopnost některých chemických kondenzačních technik tato místa unikátně modifikovat (WO 90/02136 a WO 90/02135). Tato technika byla například použita pro připojení PEG řetězců k N-koncovému zbytku G-CSF a chemokinu IL-8 (Gaertner et al., Bioconjug. Chem., 1996, 7(1), 38-44 a WO 96/41813). Nicméně modifikace N- nebo C-konců typicky redukuje aktivitu proteinu (viz např. patent Spojených Států 5 985 265 diskutující připojení PEG k N-konci a lysinovým postranním řetězcům G-CSF). Přes nedostatky modifikace proteinů polymery rozpustnými ve vodě pokračuje úsilí o PEGylaci (připojení PEG) a připojení dalších polymerů rozpustných ve vodě k proteinům. Bylo také popsáno například připojení PEG k sacharidovým řetězcům erytropoetinu (EPO) a vnitřním aminokyselinám, jako jsou například lysiny (EP 0 605 963 a WO 00/32772), a k N-konci (patent Spojených Států 6 077 939 a WO 00/32772). Bohužel, tyto PEGylované EPO mají za následek komplexní směsi, • · ·· ·· ···· · * · · «· Λ • · · · · * >- « .

« · · · · · · · · « • ····· » · « fc ί • · · · · · » ► · « • * ·· ·· ··· ·· · * které je obtížné separovat a charakterizovat.

Dalším problémem je, že výše diskutované polymery jsou velmi nehomogenní, což činí analytickou charakterizaci a purifikaci směsí polymerně modifikovaných proteinů obtížnou (Delgada et al. , Pharmaceutical Sciences, 1997, 3, 59-66).

Například techniky použité pro přípravu PEG řetězců nebo řetězců založených na PEG, dokonce i těch s docela nízkou relativní molekulovou hmotností, jako je například 3400, zahrnují chabě řízený krok polymerizace, který vede k preparátům majícím rozsah délek řetězců s průměrnou hodnotou, tj . zahrnují polymerové preparáty (CH2CH2O)_n, kde n nemá nespojitou hodnotu, ale spíše má rozsah hodnot přibližně průměru. Výsledná heterogenita derivatizovaných proteinů je často sdružena s řadou vlastností, které nelze samostatně snadno identifikovat.

Bohužel nicméně problém identifikace a použití vhodného polymeru je znovu oživen faktem, že všechny EPO proteiny nyní využívané pro terapeutické použití pocházejí z technologie rekombinantní DNA. Použití technologie rekombinantní DNA klade závažné omezení na typy a specifitu vazeb, které mohou být vytvořeny mezi skupinami zesilujícími účinnost a rekombinantně vytvořeným EPO proteinem. To je proto, že zaprvé existuje pouze velmi omezený počet funkčních skupin vhodných pro vazbu a zadruhé obecně je několik kopií reaktivních funkčních skupina v modifikovaném proteinu, což vylučuje některé specifity modifikace. Například bylo ukázáno, že v případě neselektivní kondenzace superoxiddismutázy s PEG bylo několik frakcí modifikovaného enzymu kompletně inaktivních (P. McGoff et al., Chem. Pharm. Bull., 1988, 36, 3079-3091). Také, jestliže je náhodně připojeno odlišné množství takových skupin, farmakokinetika terapeutického proteinu nemůže být přesně předvídatelná, což činí velký problém pro dávkování.

• · · · připojení může vést (a) k potřebě komplikovaných

Kromě toho nedostatek kontroly k redukované účinnosti, (b) purifikačních schémat pro separaci obrovské směsi derivátů a (c) je možné nestálé připojení modifikující skupiny. 0 několika vazbách v oboru známých, jako jsou například vazby založené na tresylchloridu, se také ví, že jsou imunogenní.

Aby se tedy zlepšil poločas cirkulace, snížila se proteolýza a imunogenicita a zlepšily se jiné vlastnosti biologicky vytvořených proteinů, mohou být připojeny polymery rozpustné ve vodě, jako je například PEG, ale s nestálými výsledky vzhledem k obtížím jejich připojování řízeným způsobem a s přesností definovanou uživatelem. Také díky omezeným úspěchům v připojování polymerů v přesných místech definovaných uživatelem je známo velmi málo o výhodných místech připojení, která by mohla být vhodná pro proteiny obecně. Kromě toho, kvůli stochastické povaze připojení a hetero-disperzní povaze PEG a dalších polymerů rozpustných ve vodě nyní používaných pro tyto účely, je obtížná purifikace a analytická charakterizace konjugátů PEG-protein. Tak problém špatné kontroly reprodukovatelného heterogenita polymeru závažně brání rutinnímu schválení polymerně modifikovaných proteinů jako léčiv (doposud bylo schváleno pouze několik pro terapeutické použití navzdory jejich zavedení v časných 70. létech).

V souladu s tím existuje potřeba způsobů produkce bioaktivních proteinů stimulujících erytropoézu, které se liší od technologie rekombinantní DNA a technologie polymerů používaných pro modifikaci přírodního a rekombinantně EPO. Jsou také potřebné proteiny stimulující kombinovaný připojení a vytvořeného erytropoézu^ k⁴ mai i zleršené klinické vlastnosti.

Předkládaný vynález uspokojuje tyto a jiné potřeby.

• · • · * · ···· ····» « • ·····«> p * « • · · · * «. , _w .

• · ·« · · ··* ·· »·

Podstata vynálezu.

Předkládaný vynález se týká syntetických proteinů stimulujících erytropoézu, způsobů jejich výroby a použití. Konkrétně se vynález týká syntetických proteinů stimulujících erytropoézu majících k sobě navázaný jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě. Jsou také poskytnuty farmaceutické přípravky obsahující syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle vynálezu.

Vynález se dále týká léčení savce syntetickými proteiny modifikovanými polymery stimulujícími erytropoézu podle vynálezu. Jedno provedení se týká způsobu zvyšování hematokritu u savce. Další provedení se týká způsobu zvyšování tvorby červených krvinek u savce. Další provedení se týká způsobu zvyšování hemoglobinu u savce. Další provedení se týká způsobu zvyšování množství retikulocytů u savce. Tyto způsoby zahrnují podávání účinného množství polymerně modifikovaného syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu podle vynálezu savci pro dosažení žádaného účinku.

Jsou také poskytnuty způsoby výroby syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle vynálezu, včetně výhodných polymerně modifikovaných forem a meziproduktů. Způsob obsahuje chemickou ligaci peptidových segmentů obsahujících nepřekrývající se aminokyselinové sekvence polypeptidového řetězce syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu, přičemž je vytvořen polypeptidový řetězec obsahující syntetický protein stimulující erytropoézu.

• · • · · · • » · · · · • · ···· · · ···»· · ··· *

Popis obrázků

Obrázky 1A-1E zobrazují schémata způsobů přípravy polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle vynálezu.

Obrázky syntetických vynálezu.

2A-2C zobrazují schémata způsobů přípravy proteinů stimulujících erytropoézu podle

Obrázky 3A-3B zobrazují schémata procesu multisegmentových ligací, který zahrnuje chemickou ligaci tří nebo více nepřekrývajících se peptidových segmentů, tj . alespoň jeden segment je prostřední segment odpovídající konečnému kompletnímu ligačnímu produktu.

Obrázky 4A-4C ilustrují nativní chemickou ligaci a chemickou modifikaci výsledného thiolového postranního řetězce.

Obrázky 5A-5B zobrazují postup tvorby na pevné fázi rozvětveného jádra (B) a unikátní chemoselektivní funkční skupiny (U) polymeru rozpustného ve vodě U-B-Polymer-J* podle vynálezu.

Obrázky 6A-6D zobrazují postup tvorby na pevné fázi výhodných v podstatě neantigenních ve vodě rozpustných polyamidových složek Polymeru-J* podle vynálezu pro následné připojení k U-B jádru.

Obrázek 7 ukazuje postup kondenzace U-B složky ke složce Polymer-J* za vzniku výhodných syntetických polymerových konstruktů podle vynálezu vzorce U-B-Polymer-J*.

Obrázek 8 ukazuje polymeru rozpustného ligaci alternativní způsob pro přesné ve vodě k peptidovému produkci syntetických připoj ení segmentu proteinů • · · · « · · · stimulujících erytropoézu podle vynálezu.

Obrázek 9 ukazuje celkový postup přípravy syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle předkládaného vynálezu.

Obrázek syntetických přesný PEG ukazuje základní strukturu výhodného typu proteinů stimulujících erytropoézu. pPEG

Obrázek 11 ukazuje obecnou strukturu cirkulárně permutovaných SEP analogů majících přesunuté amino- a karboxykonce.

Obrázek 12 ukazuje strukturu výhodného polymeru rozpustného ve vodě a jeho různých lineárních a rozvětvených konstruktů.

Obrázek 13 ukazuje schématicky tvorbu pPEG polymerů s rozvětveným řetězcem.

Obrázek 14 ukazuje syntézu syntetického cytokinu nazvaného SEP1-L30, který je přesný polymerně modifikovaný syntetický analog humánního EPO připravený, jak bylo popsáno v příkladu .

Obrázek 15 ukazuje syntetický cytokin nazvaný SEP1-L30, který je přesný polymerně modifikovaný syntetický analog humánního EPO připravený, jak bylo popsáno v příkladu 2.

Obrázek 16 ukazuje syntetický cytokin nazvaný SEP1-L26, který je přesný polymerně modifikovaný syntetický analog humánního EPO připravený, jak bylo popsáno v příkladu 3.

Obrázek 17 ukazuje schématicky tvorbu výhodného polymeru s rozvětveným řetězcem rozpustného ve vodě, který je připojen k syntetickému cytokinu nazvanému SEP1-B50, který je přesný polymerně modifikovaný syntetický analog humánního EPO připravený, jak bylo popsáno v příkladu 4.

• · ·· · · · · ·· ·· ··«« • » · · ··* ·· » • · t · · ···· » « e • ······ · ··· «

Obrázek 18 ukazuje syntetický cytokin nazvaný SEP1-B50, který je přesný polymerně modifikovaný syntetický analog humánního EPO připravený, jak bylo popsáno v příkladu 4.

Obrázek 19 ukazuje syntézu syntetického cytokinu nazvaného SEP3-L42, který je přesný polymerně modifikovaný syntetický analog humánního EPO připravený, jak bylo popsáno v příkladu

5.

Obrázek 20 ukazuje syntetický cytokin nazvaný SEP3-L42, který je přesný polymerně modifikovaný syntetický analog humánního EPO připravený, jak bylo popsáno v příkladu 5.

Obrázek 21 ukazuje syntézu výhodného polymeru rozpustného ve vodě pro připojení k syntetickému cytokinu nazvanému SEPlB51, který je přesný polymerně modifikovaný syntetický analog humánního EPO připravený, jak bylo popsáno v příkladu 7.

Obrázek 22 ukazuje syntetický cytokin nazvaný SEP1-B51, který je přesný polymerně modifikovaný syntetický analog humánního EPO připravený, jak bylo popsáno v příkladu 7.

Obrázek 23 ukazuje syntézu výhodného polymeru rozpustného ve vodě pro připojení k syntetickému cytokinu nazvanému SEP1B52, který je přesný polymerně modifikovaný syntetický analog humánního EPO připravený, jak bylo popsáno v příkladu 8.

Obrázek 24 ukazuje syntetický cytokin nazvaný SEP1-B52, který je přesný polymerně modifikovaný syntetický analog humánního EPO připravený, jak bylo popsáno v příkladu 8.

Obrázek 25 ukazuje reprezentativní analytická data pro přesné polymerně modifikované syntetické analogy humánního EPO připravené, jak bylo popsáno v příkladech 2-5 a 7-8. Jak je ukázáno, reprezentativní gel izoelektrického „zaostřování („isoelectric focusing, IEF) a neredukční SDS-PAGE gel demonstrují relativní monomerní molekulovou hmotnost svinutého purifokovaného SEPl-351.

• · «· ·· »··· * * *« * * • · · · · * '. ♦· « • · · « ·*··· • ······ « * · • · · ·· · to f * ·· · * ·· ··· ·· ·e

Obrázek 26 ukazuje in vitro aktivitu buněčné linie závislé na faktoru SEP sloučenin SEPO, SEP1-L26, SEP1-L30, SEP1-B50,

SEP1-B51 a SEP3-L42.

Obrázek 27 ukazuje reprezentativní farmakokinetický profil srovnáním plazmatické koncentrace v nanogramech na mililitr (ng/ml) SEP3-L42 a SEP1-B50 oproti času v hodinách.

Obrázek 28 ukazuje analýzu lineární regresí in vivo aktivity, jak byla měřena 72-hodinovým vychytáváním ⁵⁹Fe červenými krvinkami (RBC) (jako % dávky) pro SEP1-B51 a rekombinantní glykosylovaný humánní erytropoetin vytvořený v CHO buňkách (rhEPO) v hypoxickém modelu laboratorních potkanů.

Obrázek 29 ukazuje reprezentativní farmakokinetický profil pro clearance u laboratorních potkanů srovnáním plazmatické koncentrace v ng/ml SEP1-B51 a rhEPO proti času v hodinách po jedné i.v. dávce 5 μρ/kg pro každou sloučeninu.

Obrázek 30 ukazuje cirkulárně permutovaný, polymerně modifikovaný SEP konstrukt.

Popis výhodných provedení vynálezu

Předkládaný vynález se týká syntetických proteinů stimulujících erytropoézu, způsobů produkce a použití těchto proteinů.

Syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle vynálezu

Ve výhodném provedení se vynález týká syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu majícího k sobě připojený jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě k sobě. Termín protein stimulující erytropoézu znamená protein, který má in vitro biologickou aktivitu podporující růst buněčné linie • · ♦ · • · · · • · · · · · • · · · · · • · ····· · závislé na erytropoetinu. Ve výhodném provedení syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle vynálezu mají in vivo biologickou aktivitu podporující produkci červených krvinek. Erytropoézu stimulující aktivita proteinu může být určena kterýmkoliv z celé řady prostředků, jako je například sledování erytropoézy po in vivo podávání, testováním schopnosti proteinu zprostředkovat proliferaci buněčné linie závislé na erytropoetinu, apod.

Termín polymer rozpustný ve vodě znamená v podstatě neantigenní polymer, který je rozpustný ve vodě.

Jak se v tomto textu používá, protein je syntetický, jestliže byla použita nerekombinantní technologie k polymerizaci některých a nej výhodněji všech jeho aminokyselinových zbytků. Termín nerekombinantní technologie je zamýšlen pro rozlišování technologií, které zahrnují organickou chemii a jiné syntetické polymerizační přístupy, od technologií zahrnujících translaci RNA na'protein, buď in vivo nebo in vitro. Syntetické proteiny zahrnují úplně syntetické a polosyntetické proteiny, úplně syntetický protein je vytvořen, když všechny ligační složky jsou vytvořené chemickou syntézou, tj . syntézou bez účasti ribozomů. Polosyntetický protein je vytvořen, když alespoň část ligační složky je vytvořena biologickou syntézou, tj . pomocí ribozomů v buněčném nebo bezbuněčném translačním systému a další část je vytvořena chemickou syntézou.

Ve výhodném provedení syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle vynálezu obsahují polypeptidový řetězec mající aminokyselinovou sekvenci z ribozomálně specifikovaného erytropoetinu a jeden nebo více nepřekrývajících se peptidových segmentů kovalentně navázaných jedním nebo více místy chemické ligace. Nejvýhcdněji je erytropoetin savčího původu a výhodněji humánního původu nebo jeho deriváty.

• · · · «

I · · • · · « • ·

Například je známa aminokyselinová sekvence mnoha erytropoetinů a bylo vytvořeno mnoho účinných variant humánních erytropoetinů (viz např. patent Spojených Států č. 5 856 298, 5 955 422, 8 888 772, 5 858 347, 5 614 184, 5 457 089 a 6 077 939 a WOO/32772), a tak syntetický protein stimulující erytropoézu podle vynálezu může zahrnovat polypeptidový řetězec mající tyto aminokyselinové sekvence.

Ve výhodném provedení ribozomálně specifikovaný erytropoetin obsahuje jedno nebo více glykosylačních míst a polymer rozpustný ve vodě je řetězci syntetického proteinu připojen k polypeptidovému stimulujícímu erytropoézu v jednom nebo více místech odpovídajícím jednomu nebo více glykosylačním místům ribozomálně specifikovaného erytropoetinů. Ve výhodnějším provedení polymer rozpustný ve vodě je připojen k polypeptidovému řetězci výhradně v jednom nebo více místech odpovídajícím jednomu nebo více takovým glykosylačním místům, syntetické proteiny

Tento aspekt . vynálezu zahrnuje stimulující erytropoézu, kde je rekombinantně vytvořen ribozomálně specifikovaný erytropoetin. V souladu s tím, ribozomálně specifikovaný erytropoetin může být přírodní erytropoetin nebo „nepřírodní erytropoetin, druhý uvedený může dále zahrnovat jedno nebo více nepřírodních glykosylačních míst.

Termín „glykosylační místo znamená aminokyselinovou sekvenci proteinu, která kóduje enzymatické připojení oligosacharidového (sacharidového) řetězce k postrannímu řetězci aminokyselinového zbytku proteinu, příkladem jsou N-vázaná místa. Je nutné uznat, že erytropoetiny, které byly mutovány tak, aby se eliminovalo jedno nebo více takových glykosylačních míst, jsou zahrnuty do definice 'glykosylační m í sto' . oo t o ž e rezidua¹ ní r.5 stc no o modifikaci no 1 vme ru i e aminokyselinové sekvence a 0-vázaná glykosylační • · · · • · * · pozičně stejné. Termín přirozeně se vyskytující glykosylační místo znamená glykosylační místo erytropoetinového glykoproteinu nalézané v přírodě. Termín nepřirozeně se vyskytující glykosylační místo znamená glykosylační místo, které bylo geneticky vpraveno do erytropoetinu. Například rekombinantní humánní EPO byl geneticky upraven tímto způsobem (viz např. patent Spojených Států č. 5 856 298).

Toto provedení vynálezu je částečně založeno na zjištění, že když syntetický protein stimulující erytropoézu mající polypeptidový řetězec humánního erytropoetinu je modifikován v jeho jednom nebo více glykosylačních místech polymerem rozpustným ve vodě, jako jsou například polymery popsané v tomto textu, polymer rozpustný ve vodě může být použit pro využití jednoho nebo více biologických účinků přisuzovaných sacharidovému řetězci normálně nalézanému v této poloze přirozeně se vyskytujícím erytropoetinovém Tyto biologické účinky. zahrnují modulaci na proteázy, imunogenicitu, receptorovou v analogickém glykoproteinu. rezistence specificitu, specifickou aktivitu, účinnost a farmakokinetiku. Nicméně eliminací výskytu sacharidového řetězce a jeho nahrazením výhodným polymerem rozpustným ve vodě podle vynálezu, jsou získány významné výhody včetně zabránění enzymatickému rozpadu a clearance, jako například tehdy, když jsou odstraněny připojené zbytky sialové kyseliny sacharidového řetězce, nestabilita, omezený poločas v cirkulaci, distribuce, špatné manipulační vlastnosti apod. významně bylo také zjištěno, že takové polymerně modifikované syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle vynálezu si podrží tyto výhodné biologické vlastnosti při podstatné nepřítomnosti ztráty biologické aktivity ve srovnání s nemodifikovaným analogickým syntetickým proteinem, včetně zvýšené biologické aktivity, dokonce když monomerní molekulová • · · · • · · · ·« ···· · · * · · · • ·· · · · · · · · · « • ······ · · · · · · ·· · ·· · ···· ·· ·· ·· ··· ·· ·· hmotnost syntetického proteinu je větší než 25 kD.

V dalším výhodném provedení se tedy vynález týká syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu obsahujícího polypeptidový řetězec zahrnující aminokyselinovou sekvenci ribozomálně specifikovaného erytropoetinu, kde polypeptidový řetězec má k sobě připojen jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě a monomerní molekulovou hmotnost větší než 25 kD a kde syntetický protein stimulující erytropoézu zahrnuje biologickou aktivitu, která je stejná nebo lepší než odpovídajícího syntetického proteinu majícího polypeptidový řetězec, který postrádá polymer rozpustný ve vodě. Biologická aktivita může být in vitro, in vivo nebo obě. Ve výhodném provedení je biologická aktivita in vivo. V dalším výhodném provedení se vynález týká syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu obsahujícího polypeptidový řetězec zahrnující aminokyselinovou sekvenci ribozomálně specifikovaného erytropoetinu, kde polypeptidový řetězec, má k sobě připojen jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě a monomerní molekulovou hmotnost větší než 25 kD a kde syntetický protein stimulující erytropoézu zahrnuje biologickou aktivitu, která je stejná nebo lepší než ribozomálně specifikovaného erytropoetinu. Zde opět, biologická aktivita může být in vitro, in vivo nebo obě. Ve výhodném provedení je biologická aktivita in vivo. Nejvýhodněji mají takové polymerně modifikované syntetické proteiny stimulující erytropoézu k sobe připojeny individuální počet polymerů rozpustných ve vodě.

Termín místo chemické ligace znamená N-koncovou aminokyselinu prvního peptidu nebo polypeptidu a C-koncovou aminokyselinu druhého peptidu nebo polypeptidu, které tvoří nebo jsou schopné vytvořit ireverzibilní kovalentní vazbu mezi nimi chemickou ligací. Jak se v tomto textu používá, termín ·· ·· ·· ··»· «· ···* ···· ··« ·· · • ·· · · ···· · · · • ······ · * · · · · chemická ligace se týká chemoselektivní reakce zahrnující kovalentní spojení dvou chemických skupin, každá z těchto skupin nese vzájemně reaktivní funkční skupinu, která je unikátně schopná vytvoření ireverzibilní kovalentní vazbou s druhou skupinou. Chemická ligace zahrnuje kovalentní ligaci (1) prvního peptidu nebo polypeptidu nesoucího unikátně reaktivní C-koncovou skupinu s (2) druhým peptidem nebo polypeptidem nesoucím unikátně reaktivní N-koncovou skupinu, kde C-koncové a N-koncové reaktivní skupiny tvoří ireverzibilní kovalentní vazbu mezi nimi. Konkrétně chemická ligace zahrnuje kteroukoliv chemoselektivní reakční chemii, která může být aplikována na ligaci nechráněných peptidových segmentů.

Co se týká polymeru rozpustného ve vodě, výhodné polymery rozpustné ve vodě mohou být reprezentovány vzorcem:

UN-sl-B-s2-Polymer-s3-J*

U je zbytek unikátní funkční skupiny kovalentně spojené s polypeptidovým řetězcem syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu. Konkrétně U skupina je připojena k vzájemně reaktivní unikátní funkční skupině postranního řetězce n jedné nebo více aminokyselin jednoho nebo více nepřekrývajících se peptidových segmentů syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu a kde n je individuální celé číslo 1 až 6. Výhodněji postranní řetězec n je individuální celé číslo 1 až 4 a nej výhodněji 1 až 2. Jak se v tomto textu používá termín aminokyselina, je zamýšleno, že zahrnuje kódovaných aminokyselin, z neořirozeně aminokyselin, vzácných nebo který jsou nalézány v přírodě a se vyskytujících aminokyselin, geneticky neobvyklých kteroukoliv jako jsou například neobvyklé (neregulérní) aminokyseliny, někdy nazývané aminokyselinové zbytky v kontextu peptidu, polypeptidu nebo proteinu. Výhodná provedení U a postranního řetězce n jsou kovalentní vazby tvořené z unikátních vzájemně reaktivních skupin, kde jsou tyto vazby vybrány ze skupiny, kterou tvoří oxim, amid, amin, urethan, ether, thioether, ester, hydrazid, oxazolidin, thaizolidin, thioether, ether a ester. Nejvýhodnější U a n vazba je ta, kdy U je kovalentně navázán k postrannímu řetězci n vazbou vytvořenou chemickou ligací vybranou ze skupiny, kterou tvoří amid, oxim, thioester, hydrazon, thaizolidin, oxazolidin.

B je rozvětvené jádro mající tři nebo více větví, které mohou být stejné nebo různé a mohou být přítomny nebo chybějí. Nejvýhodněji B je přítomný a obsahuje tři nebo více větví a dokonce výhodněji čtyři nebo více větví. Konkrétně jedna větev B je spojena s U (volitelně přes spacer nebo linker sl) a druhá větev B je spojena s Polymerem (volitelně přes spacer nebo linker s2) . Zvýhodněný polymerně modifikovaný syntetický protein stimulující erytropoézu je ten, ve kterém alespoň jedna z rozvětvených ramen skupiny B obsahuje zbytek vazby vybrané ze skupiny, kterou tvoří oxim, amid, amin, urethan, thioether, ester, hydrazid, oxazolidin a thiazolidin. Výhodná rozvětvující skupina B polymerně modifikovaného syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu podle vynálezu obsahuje rozvětvené jádro vybrané ze skupiny, kterou tvoří amincskupina, karboxylát a smíšený amino-karboxylát. Výhodná jádro obsahuje lysin, výhodné jádro zahrnuje glutamovou nebo asparagovou kyselinu a výhodné smíšené amino-karboxylátové rozvětvené jádro obsahuje γ-glutamovou kyselinu nebo její deriváty.

aminoskupinové rozvětvené karboxylátové rozvětvené

Polymerní uoz.ta podstatě neantigenní polymer • · • · · · *· ·· •••••· ·· · • · · · ···· · · · ··»··· · «·· · · ·· ·· ··· ·· *« · rozpustný ve vodě, který může být stejný nebo různý, když je přítomný B. Termín polymer rozpustný ve vodě znamená v podstatě neantigenní polymer, který je rozpustný ve vodě a má molekulovou hmotnost větší než přibližně 1 000 daltonů.

Polymer výhodně má účinnou hydrodynamickou molekulovou hmotnost větší než 10 000 D a výhodněji přibližně 20 000 až 500 000 D a nejvýhodněji přibližně 40 000 až 300 000 D. Termín účinná hydrodynamická molekulová hmotnost znamená účinnou velikost řetězce polymeru jako solvátu ve vodě, jak je určena vylučovací chromatografií ve vodném prostředí (SEC). Když polymer rozpustný ve vodě obsahuje polymerové řetězce mající polyalkylenoxidové repetiční jednotky, jako jsou například ethylenoxidové repetiční jednotky, je výhodné, že každý řetězec má atomovou molekulovou hmotnost přibližně mezi 200 a přibližně 80 000 D a výhodně přibližně mezi 1 500 a přibližně 42 000 D, přičemž 2000 až přibližně 20 000 D je nejvýhodnější. Pakliže není specificky uvedeno, molekulová hmotnost odkazuje na atomovou molekulovou hmotnost.

Polymerní složka může mít široký rozsah molekulové hmotnosti a polymerových podjednotek. Tyto podjednotky mohou zahrnovat biologický polymer, syntetický polymer nebo jejich kombinaci. Příklady takových polymerů rozpustných ve vodě zahrnují: dextran a deriváty dextranu, včetně dextransulfátu, P-amino zesítěný dextrin a karboxymethyldextrin, celulózu a celulózové deriváty, včetně methylcelulózy a karboxymetnylceiulózy, škrob a dextriny a deriváty a hydroxylakáty škrobu, polyaikylenglykol a jeho deriváty, včetně polyethylenglykolu, methoxypolyethylenglykolu, homopolymerů polyethylenglykolu, homopolymery polypropylenglykolu, kopolymery ethylenglykolu s propylenglykolem, kde homopolymery a kopolymery jsou nesubstituovány nebo substituovány na jednom konci alkylovou skupinou, heparinem a ·· ·· ·> ··♦« t* »·0 * • · » » 9 · 9 * • · · · · · k · « ř « • ·«»··» · « · « · • · » * A · »«·«.

• · ·· ·· · · · ·. » · >

fragmenty heparinu, polyvinylalkoholem a polyvinylethylethery, polyvinylpyrolidonem, aspartamidem a polyoxyethylovanými polyoly, dextranem a deriváty dextranu, dextrinem a deriváty dextrinu. Je nutné uznat, že různé deriváty specificky uvedených polymerů rozpustných ve vodě jsou také zvažovány.

Polymery rozpustné ve vodě, jako jsou například ty popsané výše, jsou dobře známy, konkrétně polymery založené na polyalkylenoxidu, jako je například polyethylenglykol PEG (viz např. Póly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical a Biomedical Applications, J. M. Harris, vyd., Plenům Press, New York, NY, 1992, a Póly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, J. M. Harris a S. Zalipsky, vyd., ACS, 1997, a mezinárodní patentové přihlášky: WO 90/13540, WO 92/00748, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO

94/17039, WO 94/18247, WO 94/28937, WO 95/11924, WO 96/00080, WO 96/23794, WO 98/07713, WO 98/41562, WO 98/48837, WO

99/30727, WO 99/32134, WO 99/33483, WO 99/53951, WO 01/26692, WO 95/13312, WO 96/21469, WO 97/03106, WO 99/45964/ a patenty

Spoj ených	Států	č.	4 179	337, 5	075	046,	5 089 261,	5	100	992,
5 134 192,	5	166	309,	5 171	264,	5	213 891,	5	219	564,
5 275 838,	5	281	698,	5 298	643,	5	312 808,	5	321	095,
5 324 844,	5	349	001,	5 352	756,	5	405 877,	5	455	027,
5 446 090,	5	470	829,	5 478	805,	5	567 422,	5	605	976,
5 612 460,	5	614	549,	5 618	528,	5	672 662,	5	637	749,
5 643 575,	5	650	388,	5 681	567,	5	686 110,	5	730	990,
5 739 208,	5	7 5 6	K0 7 r	5 808	0 96,	5	824 778,	5	824	784,
5 840 900,	5	874	500,	5 880	131,	5	900 461,	5	902	588,
5 919 442,	5	919	455,	5 932	462,	5	965 119,	5	965	566,
5 985 263,	5	990	237,	6 011	042,	6	013 283,	6	077	939,
6 113 906,	6	127355,	6 177	087,	6	180 095,	6	194	580,

214 966) .

Výhodnější polymerní složka obsahuje polyalkylenoxid, •· ···* • 4 ·· ·♦»*·· « · · • · * · · · · · · « fc · • ···*·» « ··· « » ·· · > * * ···· • ·' · * · · «·· · k. ar polyamidalkylenoxid nebo jejich deriváty. Výhodnější polyalkylenoxid a polyamidalkylenoxid zahrnují ethylenoxidovou repetiční jednotku vzorce -(CH2-CH2-O)-. Ještě výhodnější Polymerní složka je polyamid mající molekulovou hmotnost větší než přibližně 1 000 D vzorce - [C (O)-X-C(O)-NH-Y-NH]N- nebo [NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]N-, kde X a Y jsou dvojmocný skupiny, který mohou být stejný nebo různý a mohou být rozvětvený nebo lineární a n je individuální celé číslo 2 až 100 a výhodněji 2 až 50 a kde jeden nebo oba X a Y obsahují biologicky kompatibilní v podstatě neantigenní repetiční jednotku rozpustnou ve vodě, která může být lineární nebo rozvětvená. Nej výhodnější repetiční jednotka rozpustná ve vodě obsahuje ethylenoxid vzorce - (CH2-CH2-O) - nebo - (CH2-CH2-O) -. Počet těchto repetičních jednotek rozpustných ve vodě se může významně měnit, ale výhodnější počet takových jednotek je 2 až 500, 2 až 400, 2 až 300, 2 až 200, 2 až 100 a nejvýhodněji 2 až 50. Příklad výhodnějšího provedení je když jeden nebo oba X a Y jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří: -((CH₂)_ni-(CH₂-CH₂O)_n2-(CH₂)ni-) - nebo - ( (CH₂) _ni-(O-CH₂-CH₂) _n2-(CH₂) ni) , kde nl je 1 až 6, 1 až 5, 1 až 4 a nejvýhodněji 1 až 3 a kde n2 je 2 až 50, 2 až 25, 2 až 15, 2 až 10, 2 až 8 a nejvýhodněji 2 až 5. Příklad vysoce výhodného provedení je, když X je -(CH₂-CH₂)- a když Y je - (CH₂- (CH₂-CH₂-O) ₃-CH₂-CH₂-CH₂) - nebo - (CH₂CH₂-CH₂-(0CH2-CH2) ₃-CH₂) -.

Polymerní složka nebo jeden či více spacerů nebo linkerů, když jsou přítomny, mohou zahrnovat polymerové řetězce nebo jednotky, které jsou biologicky stabilní nebo biologicky rozložitelné. Například Polymery s repetitivními vazbami mají kolísavý stupeň stability ve fyziologických podmínkách v závislosti na labilitě vazby. Polymery s takovými vazbami mohou být roztříděny podle jejich relativní rychlosti na základě na známé • Q • · · · • · · · • · · · · « • · · • · β · rychlosti hydrolýzy analogů s nízkou molekulovou hmotností, např. od méně stabilních k více stabilním, polykarbonáty (-0-C (O)-O-) > polyestery (-C (O)-O-) > polyurethany (-NH-C(0)-0-) > polyorthoestery (-0-C((OR)(R'))-0-) > polyamidy (-C(O)-NH-). Podobně vazebné systémy připojující polymer rozpustný ve vodě k cílové molekule může být biologicky stabilní nebo biologicky rozložitelný, např. od méně stabilních k více stabilním, karbonát (-O-C(O)-O-) > ester (-C(O)-O-) > urethan (-NH-C(O)0-) > orthoester (-0-C((OR)(R*))-0-) > amid (-C(O)NH-). Tyto vazby jsou poskytnuty jako příklad a nejsou zamýšleny limitovat typy vazeb použitelné v polymerových řetězcích nebo vazebných systémech polymerů rozpustných ve vodě podle vynálezu.

amidoskupina, které jsou jej ich skupina soli.

nebo

Složka J* je zbytek připojené skupiny mající čistý náboj ve fyziologických podmínkách vybraný ze skupiny, kterou tvoří negativní, pozitivní a neutrální. To je alkylová skupina, arylová skupina, heteroalkylová skupina, heteroarylová skupina, arylalkylová skupina, acylová skupina, alkoxyskupina, alkenylová skupina, alkynylová skupina, aminoskupina, karbonylová skupiny apod., substituované nebo nesubstituované, a také Neutrální skupiny jsou výhodně alkylová alkoxyskupina a mohou zahrnovat, ale bez omezení, skupiny obsahující 1 až 18 uhlíků a mohou být lineární nebo rozvětvené. Když je poskytnuta jako skupina s nábojem, J* zahrnuje ionizovatelnou funkční skupinu. Příklady funkčních skupin zahrnují, ale bez omezení, karboxylové kyseliny, estery, amidy, nitrily, thiolové skupiny a hydroxylové skupiny. Takové J* skupiny mohou být složkou aminokyselin, nukleových kyselin, mastných kyselin, sacharidů a jejich derivátů a skupiny, jako je například chitin, chitosan, heoarin, heparansulfát, chondroitin, chondroitinsulfát, • «' dermatan a dermatansulfát, cyklodextrin, dextran, hyaluronová kyselina, fosfolipid, sialová kyselina apod. J* výhodně obsahuje ionizovatelnou skupinu vybranou ze skupiny, kterou tvoří karboxylová skupina, aminoskupina, thiolová skupina, hydroxylová skupina, fosforylová skupina, guanidinium, imidazol a jejich solí. Nej výhodnější je, když J* obsahuje ionizovatelnou karboxylátovou skupinu a má čistý negativní náboj ve fyziologických podmínkách. Například výhodné polymerně modifikované syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle vynálezu mají izoelektrický bod mezi 3 a 7, a tak J* skupiny s negativními náboji mohou být využívány pro

jemné ladění pí.
Složky sl,	s2 a s3 jsou skupiny	spacerů	nebo linkerů,
které mohou být	stejné nebo různé a	mohou být	individuálně
přítomny nebo	nepřítomny. Výhodné	spacery	nebo linkery

zahrnují lineární nebo rozvětvené skupiny obsahující jednu nebo více repetičních jednotek použitých .v polymeru rozpustném ve vodě, jednotky diaminoskupin a nebo dvojsytných kyselin, přírodní nebo nepřirozené aminokyseliny nebo jejich deriváty, a také alifatické skupiny, včetně alkylové skupiny, arylové skupiny, heteroalkylové skupiny, heteroarylové skupiny, alkoxyskupiny, apod., který výhodně obsahují až 18 atomů uhlíku nebo dokonce další polymerový řetězec. Nejvýhodněji spacer nebo linker obsahuje polymerový řetězec.

Alternativně výše uvedený vzorec UW-sl-B-s2-Polymer-s3-J* může být reprezentován jako UN-B-Polymer-J*, kde sl, s2 a s3 skupiny mohou být přítomny nebo chybějí.

Výhodnější Polymerní složka je ta, kde polymer rozpustný ve vodě U-sl-B-s2-Polymer-s3-u* je vytvořen jako celek stupňovitou syntézou. Toto umožní konstrukci polymerů majících přesnou molekulovou hmotnost a definovanou strukturu. Na rozdíl od toho normální syntéza polymeru, což je polymerizace, * · · · « · · · má za následek směs, ve které jsou řetězce odlišných délek, a tak existuje rozložení molekulových hmotností a velikostí, které je obtížné, ne-li nemožné separovat. Schopnost kontrolovat molekulární čistotu je výhodná v tom, že může být konstruován syntetický protein, který má k sobě připojen polymer rozpustný ve vodě a který je mono-disperzní. To představuje významnou výhodu v tom, že může být zabráněno variabilním vlastnostem, které jsou důsledkem heterogenních sloučenin a mohou být připraveny pouze sloučeniny s nejvýhodnějšími vlastnostmi a relativně snadno izolovány.

V dalším výhodném provedení syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle předkládaného vynálezu obsahují jednu nebo více neregulérních aminokyselin. Jak se v tomto textu používá, termín neregulérní aminokyselina se týká aminokyseliny mající negeneticky kódovaný postranní řetězec, negeneticky kódovaný hlavní řetězec, negeneticky kódovanou substituovanou Na nebo aC(O) skupinu nebo jejich kombinace, tj . jiné aminokyseliny než je jedna z ribozomálně inkorporovaných 20 aminokyselin kódovaných geneticky. Příklady výhodných neregulérních aminokyselin zahrnují aminokyseliny mající postranní řetězce nesoucí unikátní funkční skupinu jinou než geneticky kódovanou funkční skupinu, pseudoaminokyseliny a různé aminokyselinové deriváty ohledu předkládaný vynález umožňuje široký výběr a flexibilitu při navrhování a/nebo konstrukci syntetických proteinů stimulujících erytropoézu. Příklady neribczomálně inkorporovaných aminokyselin, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu zahrnují, ale bez omezení, β-aminokyseliny, a také

V tomto

D-aminokyseliny, γ-minobutyrát, ornitin, homocystein, pseudoglutamát, N-substituované d-iTilíiC KV3 i .ny i?ο ΙΓΓιΟΠ e _ di. .

Nati. Acad. Sex. t. S ,

Ά. , 1992, 89, 9367-71, WO 91/19735 (Bartlett et al.), patent • · * ·

Spojených Států č. 5 646 285 (Baindur) , ct-aminomethylenoxyoctové kyseliny (izoster dipeptidu aminokyselina-Gly) a α-aminooxy kyseliny a jiné aminokyselinové deriváty mající negeneticky kódované funkční skupiny postranního řetězce apod. Mohou být použity peptidové analogy obsahující thioamid, vinyloidní amid, hydrazin, methylenoxy, thiomethylen, fosfonamidy, oxyamid, hydroxyethylen, redukovaný amid a substituované redukované amidové izostery a β-sulfonamidy. Termín pseudoaminokyselina označuje aminokyselinu mající totožnou strukturu hlavního řetězce a skupinu postranního řetězce jako geneticky kódovaná aminokyselina, ale lišící se v atomovém složení atomů postranního řetězce.

Ve výhodném provedení jsou poskytnuty syntetické proteiny stimulující erytropoézu, které mají polymer rozpustný ve vodě připojený k nepravidelné aminokyselině polypeptidového řetězce. Výhodnější neregulérní aminokyseliny pro připojení polymeru rozpustného ve vodě používají chěmoselektivní ligační chemii, která může být použita v přítomnosti geneticky kódovaných funkčních skupin, aniž by s nimi probíhala reakce.

Jak je uvedeno výše, polymery rozpustné ve vodě, které sestavením, mohou být například výhodné jsou tvořeny celkově stupňovitým vytvořeny jako mono-disperzní, polyamidethylenoxidy podle vynálezu. Další výhodné provedení tedy je, kdy polymer rozpustný ve vodě je mono-disperzní (tj . molekulárně homogenní přípravek obsahující jeden a strukturálně definovaný požadovaný molekulární druh). Také, protože syntetické proteiny stimulující erytropoézu mohou být vyrobeny celkově chemickou syntézou, mohou být také vytvořeny mono-disperzní. Takové sloučeniny mají výhodu, že jsou velmi čisté a vyhnou se problémům charakterizace, jako když jsou purifikace a analytické použity hetero-disperzní polymery. Takové sloučeniny jsou také výhodné, co se týče • · · · • · · · · · • · · · « * · » » · • · · · · · « • · ., • · · · · · reprodukovatelného dávkování apod. (například jeden molekulární druh oproti směsím typickým pro glykoproteiny a PEGylované rekombinantně vytvořené proteiny).

Jak je uvedeno výše, syntetický protein stimulující erytropoézu podle vynálezu může mít monomerní molekulovou hmotnost větší než 25 kD. Pro účely předkládaného vynálezu, tato stanovení molekulové hmotnosti jsou prováděna elektroforézou na denaturujícím SDS-polyakrylamidovém gelu. Termín monomerní molekulová hmotnost odkazuje na molekulovou hmotnost monomeru syntetického proteinu, jak je odlišen od syntetických proteinů, které mohou mít mnohonásobné kopie proteinu nebo polypeptidu. Termín molekulová hmotnost monomeru polypeptidu odkazuje na molekulovou hmotnost monomeru polypeptidu, jak je odlišen od syntetických proteinů, které mohou mít k sobě připojené polymery a/nebo mnohonásobné kopie proteinu nebo polypeptidu. Výhodněji má syntetický protein stimulující erytropoézu podle, vynálezu monomerní molekulovou hmotnost nad 40 kD a výhodněji 50 kD a výše, přičemž nejvýhodnější je nad 60 až 70. ' Například výhodný syntetický protein stimulující erytropoézu podle vynálezu, nazvaný SEP1-B51 má monomerní molekulovou hmotnost přibližně 73 kD. Nicméně předpokládá se, že o hodně větší konstrukty jsou dobře v rozsahu předkládaného vynálezu.

V dalším provedení se vynález týká syntetického proteinu stimulující erytropoézu obsahující pseudoaminokyselinu v místě ligace proteinu a volitelně, polymer rozpustný ve vodě připojený k proteinu. Tyto sloučeniny jsou vytvářeny tvorbou ligačního produktu, který má nechráněnou funkční skupinu postranního řetězce v místě ligace, ligací prvního peptidu nebo polypeptidového segmentu majícího N-koncovou aminekvse1inu obsahující chemcselektivní reaktivní funkční skupinu, jako je například cystein, k druhému peptidu nebo • · • · · · • · · * · ····· · • · · · · • · V' · · polypeptidu majícímu C-koncovou funkční skupinu kompatibilní s chemickou ligací, jako je například α-karboxythioester, a chemickou konverzí nechráněné funkční skupiny postranního řetězce v místě ligace na pseudoaminokyselinu, jako je například karboxymethylace cysteinu thiolového postranního řetězce za vzniku aminokyseliny pseudoglutamátu. Konverze cysteinů v místech nativní chemické ligace vytvářející pseudoaminokyseliny je v tomto textu nazývána pseudo-nativní chemická ligace, která je popsaná podrobně níže.

Je také poskytnut syntetický protein stimulující erytropoézu obsahující polymer rozpustný ve vodě spojený s postranním řetězcem aminokyseliny v místě ligace proteinu. Tyto sloučeniny jsou syntetizovány vytvořením ligačního produktu majícího nechráněnou funkční skupinu postranního řetězce v místě ligace, ligací prvního peptidu nebo polypeptidového segmentu majícího N-koncovou aminokyselinu obsahující chemoselektivní reaktivní funkční skupinu, jako je například cystein, k druhému peptidu nebo polypeptidu majícímu C-koncovou funkční skupinu kompatibilní s chemickou ligací, jako je například α-karboxythioester, a připojením polymeru rozpustného ve vodě k nechráněné funkční skupině postranního řetězce v místě ligace.

Využití pseudoaminokyselinové chemické ligace a modifikace polymeru chemickou ligací, tj . způsoby podle vynálezu, poskytuje několik výhod oproti stavu techniky, včetně rozsáhlé syntézy pestré škály proteinů stimulujících erytropoézu, které jsou jinak bez vhodných míst ligace, expanze míst (a chemie připojování), kde mohou být požity místně specifické modifikace polymeru rutinně a ekonomicky, a také syntéza syntetických proteinů stimulujících erytropoézu značné molekulové hmotnosti. Jsou také konkrétně vhodné pro vysoký výkon a pro dolaďování požadovaných biologických vlastností, • · • · · · · • » · · · ·

I · « » · · · · ► · « ► · * • · · · · včetně skenování jednotlivých nebo mnohonásobných míst pro připojení polymeru rozpustného ve vodě.

Jak je uvedeno výše, biologické vlastnosti polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle vynálezu mohou být modifikovány přesným nastavením míst a vazebné chemie pro připojení polymeru v kombinaci s přesnou úpravou molekulové hmotnosti, složením polymeru, strukturou (např. lineární oproti rozvětvené nebo jejich směsi) a připojenou skupinou (např. s nábojem oproti bez náboje nebo jejich směsi) polymeru rozpustného ve vodě. Konkrétně kromě zvyšování molekulové hmotnosti proteinu pro zlepšení poločasu a rozvětvení apod., připojený polymer rozpustný ve vodě může propůjčit syntetickému proteinu stimulujícímu erytropoézu přesný náboj, jak měřeno izoelektrickým bodem, který se přibližně rovná náboji odpovídajícího biologicky vytvořeného proteinu, na kterém je založena aminokyselinová sekvence syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu. To má výhodu napodobování přírodního náboje odpovídajícího ribozomálně specifikovaného proteinu. Výhodné provedení vynálezu se tak týká syntetických proteinů stimulujících erytropoézu, které kombinují výše uvedené vlastnosti, a také použitých polymerů rozpustných ve vodě, konkrétně strukturálně definovaných adičních sloučenin polymerů, které jsou schopné připojení do preselektovaných poloh.

Konkrétně výhodné syntetické proteiny stimulující erytropoézu (SEP) podle předkládaného vynálezu jsou výhodně polymerně modifikované syntetický analogy humánního EPO z moči. Ve výhodném provedení obsahují jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě připojených k jednomu nebo více peptidovým zbytkům prostřednictvím thioetherové, oximové, amidové nebo jiné vazby. Ve vysoce výhodném provedení jsou takové vazby v jedné nebo více polohách, které jsou přirozeně * * glykosylované v humánním močovém EPO (tj. polohy 24, 38, 83 a 126). Nejvýhodněji molekuly SEP mají polymerové skupiny ve dvou nebo více takových polohách. V alternativním provedení další proteinové zbytky mohou být modifikovány skupinami polymeru. Polohy modifikace pro syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle předkládaného vynálezu zahrnují zbytky lokalizované v porušené kličce, úseku nebo domény proteinu nebo v místě či blízko místa potenciálního štěpení proteázou. Například polymerové modifikace mohou být zavedeny v jedné nebo více polohách 9, 69 a/nebo 125 EPO. Navíc, jestliže jedno nebo více přírodních glykosylačních míst je ponecháno bez modifikace polymerem, jedna nebo více aminokyselin v těchto oblastech může být konvertováno na jiné zbytky, je-li žádoucí, například lysiny, jestliže je žádoucí pozitivní náboj nebo asparagovou či glutamovou kyselinu, kde je žádoucí negativní náboj nebo alanin apod. Celková molekulová hmotnost SEP molekul podle předkládaného vynálezu se může měnit od přibližně 25 do přibližně 150 kD a výhodněji od přibližně 30 do přibližně 80 kD. Molekulová hmotnost může být řízena zvýšením nebo snížením množství polymeru a struktury polymeru rozpustného ve vodě použitého pro modifikaci daného analogu.

Například oximem spojené polymerové SEP analogy jsou výhodně konstruovány připojením aminooxyskupinou, ketonem nebo aldehydem funkcionalizovaného polymeru rozpustného ve vodě k SEP proteinu v nepřirozeně kódované aminokyselině nesoucí aminooxyskupinovou, ketonovou nebo aldehydovou funkční skupinu postranního řetězce. Například polohy 89 a 117 SEP-0 a 1 obsahují pseudoglutamáty (nepřirozeně kódovaná aminokyselina nesoucí postranní řetězec vzorce -CHa-CH₂-S-COOH (ve srovnání s glutamátovým postranním řetězcem -CHa-CHs-Cřb-CQOH)). SEP analogy používající thioetherové vazby jsou výhodně • · konstruovány tak, aby obsahovaly thiolovou funkční skupinu poskytovanou cysteinem nebo nepřirozenou aminokyselinou s postranním řetězcem nesoucím thiolovou skupinu. Obrázek 10 ukazuje základní strukturu jednoho typu výhodného syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu.

V alternativním provedení SEP molekuly podle předkládaného vynálezu mohou zahrnovat cirkulárně permutované EPO analogy, ve kterých byl přesunut přírodní amino- a karboxy-konec EPO. Nej výhodněji takový přesun přestěhuje amino- a karboxy-konce do poloh s nízkým strukturálním omezením, jako například do porušených kliček, apod. Porušená klička kolem poloh 125 a 126 (relativně k číslovacímu systému zbytku nativního EPO) je příklad takového místa přesunu. Nejvýhodněji, takové SEP jsou bez disulfidu a jsou chemicky modifikovány tak, aby obsahovaly polymerové skupiny v preselektovaných zbytkách.

Alternativně mohou mít SEP molekuly amino- a karboxy-konce přesunuté na přirozeně se vyskytující glykosylační místo nebo na jiná místa přístupná glykosylaci, jako například poloha 126 a 125. SEP molekuly mohou také zahrnovat modifikace amino- a karboxy-konců, aby se eliminoval nebo modifikoval náboj (jako například karboxyamidace apod.). Ve výhodném příkladu takových cirkulárně permutovaných molekul jsou poskytnuty nové N- a Ckonce polohami 126 a 125, v daném pořadí. Přírodní cysteiny tvořící disulfid v polohách 7, 29, 33 a 161 jsou výhodně nahrazeny nepřirozeně kódovanou aminokyselinou, L-a-N-máselnou kyselinou (Aba), která nemůže tvořit disulfidové můstky. Zbytky R166, E37 a V82 jsou výhodně nahrazeny alaniny pro zlepšení produkce. Také další cystein je výhodně vložen mezi polohy 1 a 166 relativně k číselnému schématu nativního EPO, který je číslován pod '0'. Výsledná molekula obsahuje čtyři cysteiny (v polohách 126, 0, 38 a 33 (jak čteno směru oa hk C-koncové části)), které jsou použity jako (1) místa ligace • · *999 · « · · · · * · · · · · ·

• «* a (2) místa připojení pPEG vytvořená thioetherem. Volitelně

cystein může	nahradit	A125 za	vzniku	dalšího pPEG	místa
připoj ení.
Celková	molekulová	hmotnost	těchto	SEP molekul	podle
předkládaného	vynálezu	se může	měnit	od přibližně	25 do

přibližně 150 kD a výhodněji od přibližně 30 do přibližně 80 kD. Molekulová hmotnost může být řízena zvýšením nebo snížením množství polymeru a struktury polymeru (jako například pPEG) použitého pro modifikaci daného analogu. PPEG zprostředkovaná hydrodynamická molekulová hmotnost (MW) pro větší konstrukty je větší než 100 kD. Volitelná místa připojení pPEG jsou lokalizována v polohách 125, 9 a 24 (jak čteno ve směru od N- k C-koncové části). Další návrhy SEP analogů mají alternativní N- a C-konce v úseku porušené kličky, a/nebo zkrácených zbytků z nových N- a/nebo C-konců. Základní struktura výhodných cirkulárně permutovaných molekul je ukázána na obrázku 11. Obrázek 12 ukazuje strukturu výhodného polymeru rozpustného ve vodě a různé lineární a rozvětvené konstrukty.

Například kromě specifických SEP konstruktů popsaných v příkladech v tomto textu byly navrženy sekvence cirkulárně permutované nativní sekvence humánního EPO následujícím způsobem: přírodní N-koncový Ala¹ a C-koncový Arg¹⁶⁶ byly spojeny dalším Cys zbytkem za vzniku polypeptidu ze 167 aminokyselin, nové N- a C-konce byly vytvořeny rozdělením řetězce ve zbytcích 125-126 nativní sekvence, všechny nativní Cys zbytky byly nahrazeny zbytky kyseliny L-^aamino-N-máselné a byly vytvořeny následující substituce: Glu37Ala, Asn38Cys, Val82AIa, Asn83Cys, SeR126Cys, Argl66Ala (všechna čísla zbytků založena na nativní sekvenci humánního EPO) . Společně tyto navržené prvky měly za následek aminokyselinovou sekvenci SEP5, jak je ukázáno. Protein SEP-5-L28 byl polymerně • · · · · modifikovaný v Cys zbytcích 126, 0, 24, 38 a 83 (číslování vychází z humánní EPO sekvence) maleimidem modifikovaným lineárním (TTD-Sukc)₆ karboxylátovým polymerovým konstruktem Michaelovou adiční reakcí. Tyto změny byly navrženy pro zlepšení syntézy a manipulace s SEP-5-L28 proteinem. Navržená sekvence byla vytvořena ze čtyř peptidových segmentů, každý s N-koncovým Cys zbytkem. Chemická ligační místa byly Cys°, Cys³⁸, Cys⁸³. Peptidy byly syntetizovány, kde C-koncový peptid byl α-karboxylát, další tři peptidy byly α-thioestery a N-koncové Cys zbytky byly tedy postranní řetězce chráněné Acm. Cys²⁴ byl nechráněný postranní řetězec. Segmenty byly připojeny postupně nativní chemickou ligací, počínaje dvěma C-koncovými segmenty. Po ligaci volný Cys postranní řetězec v místě ligace reagoval s maleimidem modifikovaným lineárním (TTD-Sukc)6 karboxylátovým polymerovým konstruktem Michaelovou adiční reakcí, pak byla odstraněna Acm chránící skupina Cys postranního řetězce a ligace dalšího segmentu a polymerní modifikace byla prováděna podobným způsobem. Po odstranění Acm skupiny byla prováděna ligace dalšího (čtvrtého) segmentu, konečná Acm skupina byla odstraněna a polymerní modifikace byla prováděna podobným způsobem za vzniku cirkulárně permutovaného, polymerně modifikovaného SEP konstruktu popsaného výše a ukázaného na obrázku 30. ^{II. * * * * * *}

II. Produkce syntetických proteinů stimulujících podle vynálezu erytropoézu

Ačkoli polymerně modifikované proteiny stimulující erytropoézu byly popsány dříve, předkládaný vynález se výrazně liší od dřívějších prací. Například syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle předkládaného vynálezu jsou syntetizovány chemicky, celkově nebo částečně. Kromě toho • · jsou modifikovány polymery rozpustnými ve vodě v jednom nebo více konkrétních, uživatelem vybraných a uživatelem definovaných místech.

Kromě toho syntetická produkce proteinů stimulujících erytropoézu podle předkládaného vynálezu umožní zajistit, že takové modifikace jsou přítomné v každém místě vybraném uživatelem a definovaném uživatelem každé molekuly v přípravku. Taková jednotnost a kontrola syntézy výrazně od náhodných způsobech stavu modifikací techniky.

odlišuje předkládaný vynález tolerovaných pro použití ve Předkládaný vynález význačně umožňuje navrhnout syntetický protein stimulující erytropoézu, ve kterém kterýkoliv nerozhodující zbytek může být derivatizován tak, aby obsahoval polymerovou adiční sloučeninu. Navíc pro každé takové místo vybrané uživatelem a definované uživatelem, může uživatel definovat přesnou vazbu (amid, thioester, thioether, oxim, apod.) jejíž prostřednictvím tyto adiční sloučeniny budou navázány k hlavnímu řetězci polypeptidu nebo proteinu. Dále konkrétní polymerní adiční sloučeniny, u kterých je žádoucí, aby byly přítomny v konkrétním místě mohou být změněny a řízeny tak, že je získán konečný preparát, ve kterém každý přítomný protein nebo polypeptid obsahuje přesně stejné derivatizované adiční sloučeniny v přesně stejných derivatizovaných místech. Předkládaný vynález tedy umožňují tvorbu homogenních preparátů polymerně modifikovaných polypeptidů a proteinů stimulujících erytropoézu.

Kromě poskytnutí prostředku pro změny polohy a počtu míst připojení, ke kterým může být vázán polymer rozpustný ve vodě, předkládaný vynález umožňuje měnit povahu vázaného polymeru. Polymerové adiční sloučeniny, které mohou být inkorporovány do kteréhokoli konkrétního místa vybraného uživatelem a definovaného uživatelem, mohou být kterékoliv definované • · • · · · • · · ·

délky. Podobně, souhlasně se způsoby podle předkládaného vynálezu, je možné používat polymery odlišných délek v různých místech. Tak v jednom provedení polymerně modifikované syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle předkládaného vynálezu mohou být buď mono-modifikované nebo poly-modifikované, s polymerovou adiční sloučeninou rozpustnou ve vodě. Kde je do konkrétního polypeptidu nebo proteinu zavedena více než jedna polymerová adiční sloučenina, použité polymery mohou být mono-druhové, poly-druhové, jednotného druhu nebo různého druhu. Jak se v tomto textu používá, termín mono-druhový odkazuje na polypeptid nebo protein, který byl modifikován jedním druhem polymeru. Na rozdíl od toho termín poly-druhový odkazuje na polypeptid nebo protein, který byl modifikován více než jedním druhem polymer. Tyto poly-druhové polypeptidy nebo proteiny jsou jednotného druhu, jestliže v každém modifikovaném místě polypeptidu nebo proteinu je přítomný jeden stejný druh polymeru. Na rozdíl od toho poly-druhový polypeptid nebo protein je různého druhu jestliže modifikovaná místa polypeptidu nebo proteinu jsou modifikována různými druhy polymeru.

Navíc je možné měnit rozsah linearity nebo rozvětvenosti polymerové adiční sloučeniny v každém místě vybraném uživatelem v místech definovaných uživatelem. Polymerové adiční sloučeniny mohou být tedy lineární, rozvětvené nebo jednotně rozvětvené. Termín jednotně rozvětvené znamená, že všechny větve polymeru v konkrétním místě mají stejnou strukturu a délku. Jak původci oceňují, předkládaný vynález umožňuje nezávisle měnit jak délku kterékoliv individuální větve, tak strukturu polymeru přítomného v takovém bodu větvení.

Souhrnem, předkládaný vynález umožňuje definovat (1) lokalizaci a (2) frekvenci polymerně modifikovaných míso • · · • » • · · ·

vybraných uživatelem a definovaných uživatelem v polypeptidu nebo hlavní řetězci proteinu, a také řídit (3) délku, (4) druh a (5) stupeň větvení přítomný v každém takovém místě. Dále, vzhledem k polypeptidům a proteinům majícím mnohonásobné polymerní modifikace, předkládaný vynález umožňuje samostatně definovat každou z výše uvedených pěti proměnných pro každé místo. Navíc, s ohledem na syntetické polypeptidy a proteiny stimulující erytropoézu mající modifikace rozvětveného polymeru, předkládaný vynález umožňuje samostatně definovat každou z výše uvedených pěti proměnných pro každý bod větvení. To umožňuje syntézu homogenních přípravků přesně polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulujících erytropoézu majících mnohonásobné kopie kterékoliv nebo všech přítomných 20 geneticky kódovaných aminokyselinových postranních řetězců a nezatížených nechtěným připojením polymeru.

Tak vynález umožňuje významnou flexibilitu navrhování, syntézy a použití polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulujících erytropoézu. Například aminokyselinová sekvence syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle vynálezu může zahrnovat jednu nebo více delecí, inzercí nebo substitucí relativně k aminokyselinové sekvenci geneticky kódovaného proteinu, na kterém je založena. Aminokyselinová sekvence může být substituována jednou nebo více neregulérními aminokyselinami, jako je například pseudoaminokyselina, a nebo jinou aminokyselinou nesoucí nepřirozený postranní řetězec, jako je například ten, který je modifikován tak, aby nesl unikátní chemoselektivní funkční skupinu pro připojení polymerové adiční sloučeniny rozpustné ve vodě. Tak, polymer rozpustný ve vodě může být připojen prostřednictvím neregulérní aminokyseliny nebo geneticky kódované aminokyseliny. Polymer rozpustný ve vodě může být lineární nebo rozvětvený a může mít koncovou skupinu obsahující • · · · chemickou skupinu, jako je například karboxylová kyselina, alifatická skupina, amid nebo amin. Navíc, polymer rozpustný ve vodě může být mono-disperzní, tj . může být vytvořen tak, aby zahrnoval jeden molekulární druh přesně definované struktury a složení. Tak, polymer rozpustný ve vodě může být navržen tak, aby obsahoval vlastnosti přesně vyladěného poločasu, imunogenicity, dávkování, aplikovatelnosti cílového proteinu.

účinnosti, skladovatelnosti, apod., takto modifikovaného

Konkrétně produkce polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle vynálezu může být předvídána takto: navržení, syntéza peptidů, ligace peptidu, svinutí kompletního ligačního produktu za vzniku proteinu a hodnocení biologické aktivity proteinu. Původci zjistili, že polymerní modifikace může být prováděna při jedné nebo více krocích syntézy peptidů, ligace nebo při svinutí produktu. Nicméně je výhodné připojit polymer k peptidům nebo k ligačnímu produktu před svinutím. Proteiny vytvářené tímto způsobem, které projevují požadovanou biologickou aktivitu, jsou vybrány a představují syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle vynálezu.

Ve výhodném způsobu polypeptidový řetězec obsahující syntetický protein stimulující erytropoézu je tvořen chemickou ligací peptidových segmentů obsahujících nepřekrývající se aminokyselinové sekvence polypeptidového řetězce syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu. Konkrétně, molekuly syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu podle vynálezu mohou být vyrobeny chemickou ligací peptidových segmentů obsahujících nepřekrývající se aminokyselinové sekvence polypeptidového řetězce požadovaných molekul syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu, kde jeden nebo více peptidových segmentů použitých pro ligaci mají k sobě připojený polymer rozpustný ve vodě v místě definovaném uživatelem a preselektovaném uživatelem. Polymerně modifikovaný polypeptidový řetězec může pak být svinut za vzniku polymerně modifikovaného syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu podle vynálezu.

Další výhodný způsob přípravy syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle vynálezu obsahuje chemickou ligaci peptidových segmentů obsahujících nepřekrývající se aminokyselinové sekvence polypeptidového řetězce syntetického polymerně modifikovaného proteinu stimulujícího erytropoézu podle vynálezu a připojení jednoho nebo více polymerů vodě k postrannímu řetězci aminokyseliny více míst chemické ligace. Polymerně modifikovaný polypeptidový řetězec může pak být svinut za vzniku polymerně modifikovaného syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu podle vynálezu.

rozpustných ve v jednom nebo

I když je to méně výhodné, syntetické- proteiny stimulující erytropoézu mohou být vyrobeny (1) chemickou ligaci peptidových segmentů obsahujících nepřekrývající se aminokyselinové sekvence polypeptidového řetězce syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu za vzniku kompletního polypeptidového řetězce odpovídajícího syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu, kde alespoň jeden peptidový segment obsahuje neregulérní aminokyselinu mající první chemoselektivní funkční skupinu, (2) svinutí polypeptidového řetězce a (3) připojení k sobě polymeru rozpustného ve vodě, který obsahuje druhou chemoselektivní skupinu, která je unikátně a vzájemně reaktivní s první chemoselektivní skupinou.

Konkrétně tyto různé způsoby prováděné ve vynálezu a ilustrovány v příkladech, mohou být znázorněny tak, jak je ukázáno na obrázcích obecně pro syntetické proteiny a X_aa tvoří je ukázáno na chemoselektivní

Yaa jak stimulující erytropoézu. Například obrázky 1A-1 E zobrazují ligační schémata zahrnující připojení polymeru rozpustného ve vodě (U-B-Polymer-J*, jak bylo definováno v tomto textu) k částečně nebo úplně nechráněným peptidovým segmentům (vvvwwvv') před nebo po ligaci nebo jejich kombinace. Na obrázcích 1A-1D, Y_aa představuje C-koncovou aminokyselinu na prvním peptidovém segmentu, která nese unikátní chemoselektivní skupinu (např. aminokyselina nesoucí α-karboxylthioester) pro chemickou ligaci ke druhému peptidovému segmentu nesoucímu unikátní a vzájemně reaktivní N-koncovou aminokyselinovou X_aa (např. amino-koncový cystein) skupinu, která je schopná chemoselektivní chemické ligace s Y_aa. Chemoselektivní reakce mezi Y_aa a X_aa tvoří kovalentní vazbu (např. amidovou vazbu). Tak chemoselektivní ligační dvojici. UN-, obrázcích, představuje druhou unikátní skupinu, která byla zavedena do přesného místa definovaného uživatelem na postranním řetězci aminokyseliny a je chemoselektivní a vzájemně reaktivní se skupinou U- polymeru rozpustného ve vodě U-B-Polymer-J*. Například, když U_n je postranní řetězec, který byl modifikován tak, aby nesl ketonovou skupinu, U- polymeru rozpustného ve vodě U-PolymerJ* je skupina chemoselektivní pro reakcí s ketonem, např. aminooxyskupina, která poskytuje oximovou vazbu mezi nimi. Index n ve výrazu U_n- představuje počet aminokyselin a jejich postranních řetězců navržených tak, aby nesly chemoselektivní skupiny, například, kde dvě specifická místa a místa definovaná uživatelem jsou polymerně modifikovaná, n = 2, což může také být vyjádřeno jako U2 nebo U_n=2· Ve všech případech n je pozitivní celé číslo, které je přesně řízeno návrhem. Tak U_na U představují druhou chemoselektivní ligační dvojici, která je kompatibilní a nereaktivní s chemoselektivními skupinami X_aa ·· * · • · * ·

• · a Y_aa. Obrázky 1A a 1B ilustrují dvě různé potenciální reakce. V první ukázané reakci je polypeptidový řetězec nesoucí U_nfunkční skupinu ligován ke druhému polypeptidu, a pak reaguje se skupinou U-B-Polymer-J*, aby se získal polymerně modifikovaný polypeptid. Ve druhé ukázané reakci polypeptidový řetězec nesoucí U_n funkční skupinu reaguje se skupinou U-BPolymer-J*, aby se získal polymerně modifikovaný polypeptid, a pak je ligován ke druhému polypeptidu za zisku většího polymerně modifikovaného polypeptidu. Obrázky se liší v tom, že na obrázku 1A, polypeptid nesoucí X_aa zbytek přijímá polymerní modifikaci, zatímco na obrázku 1B polymerní modifikaci přijímá polypeptid nesoucí Y_aa zbytek. Obrázek 1C ukazuje schopnost podle předkládaného vynálezu modifikovat mnohonásobný polypeptidové řetězce, buď před nebo po jejich ligaci za vzniku většího polypeptidu. Na obrázku ID, PG a PG’ představují chránící skupiny, přičemž PG' ukazuje ortogonální chránící skupinu, tj . PG a PG' jsou odstranitelné v různých podmínkách a jsou použitelné, kde různé polymery rozpustné ve vodě jsou připojeny prostřednictvím stejných chemických postupů k U_n skupinám nebo kde U_n skupiny představují funkční skupiny postranního řetězce, které není žádoucí modifikovat polymerem (např. postranní řetězce nesoucí reaktivní skupiny NH₂ nebo -SH, kde U skupina polymeru rozpustného ve vodě je navržena tak, aby reagovala výlučně s primární aminoskupinou nebo thiolovými skupinami postranního řetězce). Obrázek ID ukazuje, že mohou být použity chránící skupiny, aby chránily požadované postranní řetězce ligačních polypeptidů podle způsobů podle předkládaného vynálezu.

Obrázek 1E ukazuje heterogenitu skupin, který mohou být přítomny nebo chybět v peptidových segmentech použitých v ligaci a polymerní modifikaci podle obrázků 1A-1D.

Obrázky 2A-2C zobrazují další schémata způsobů přípravy .·· ·· »« ···· ·· ,,, ···· ... ., • ·· · · ···· « « _a• ·····» « ··» « syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle vynálezu. Konkrétně obrázky 2A-2B zobrazují ligační schéma zahrnující připojení polymeru rozpustného ve vodě U-B-PolymerJ* k postrannímu řetězci amino-koncové skupiny X_aa v místě ligace (např. thiolová skupina cysteinu postranního řetězce). Obrázek 2C ukazuje heterogenitu skupin, které mohou být přítomny nebo chybět v peptidových segmentech použitých v ligaci a polymerní modifikaci podle obrázků 2A-2B.

Obrázky 3A-3B zobrazují další schémata způsobů dosažení multi-segmentových ligací, které zahrnují chemickou ligaci tří nebo více nepřekrývajících se peptidových segmentů, tj . alespoň jeden segment je prostřední segment odpovídající konečnému kompletnímu ligačnímu produktu. Peptidy připravené tímto způsobem mohou být použity pro přípravu peptidových segmentů zapojených do další ligační reakce, například jak je ukázáno na obrázcích 1A-1E, obrázcích 2A-2C a obrázcích 4A-4C. Obecně pro multi-segmentové ligace, střední segment má buď chráněnou X_aa skupinu nebo chráněnou Y_aa skupinu, aby se zabránilo cyklizaci nebo tvorbě konkatemerů tohoto peptidu v závislosti na použité chemické ligaci. Pro následné nebo sériové ligace je chráněna X_aa skupina středního segmentu (např. Cys(Acm)), zatímco Y_aa skupina je nechráněná (např. Y_aa-COSB, kde -COSR je a-karboxylthioester) . Zde je Y_aa skupina volná pro reakci s druhým peptidem nesoucím nechráněnou X_aaskupinu, kde druhý peptid je bez volné Y_aa skupiny. Po ligaci je chránící skupina odstraněna pro regeneraci X_aa skupiny pro další ligační reakci. Tento postup může pokračovat, jak je potřebné pro tvorbu prodlouženého polypeptidového řetězce. Ochrana Y_aa skupiny je obzvláště užitečná pro konvergentní chemickou ligaci zahrnující produkci konečného ligačního produktu složeného ze čtyř nebo více segmentů. Například pro cílový protein vzniklý ze čtyřsegmentové ligace (tj. tři ·· ··♦· • i ♦ » · · • «fc · ligační reakce), dva segmenty odpovídající jednomu konci proteinu a dva segmenty odpovídající druhému konci proteinu mohou být ligovány souběžně, na rozdíl od postupné reakce, a dva konce spojeny v konečné ligační reakci. Taková schémata konvergentní chemické ligace také mohou používat ortogonální ligační chemické postupy. Zde opět heterogenita skupin, které mohou být přítomny nebo chybět v takových peptidových segmentech je znázorněna na obrázcích 1E, 2C a 4C.

Obrázky 4A-4C ilustrují, jak může být prováděna nativní chemická ligace a chemická modifikace výsledných thiolových skupin postranního řetězce podle principů předkládaného vynálezu. Konkrétně, obrázky 4A-4B zobrazují použití nativní chemická ligace a chemické modifikace výsledných thiolových skupin cysteinu postranního řetězce v místě ligace za vzniku pseudoaminokyseliny (zobrazeno ψΧ₃₃) prostřednictvím thioalkylace a vytvoření chemicky modifikovaného postranního řetězce (zobrazeno ψ) obsahujícího thioetherovou vazbu. V neukázaném alternativním provedení může být thiolová skupina postranního řetězce konvertována na alanin desulfurací (Liang et al, J. Amer. Chem. Soc., 2001, 123 (4): 525-533). Významný aspekt pro obě reakce je, že kterékoliv další thiolové skupiny postranního řetězce, které není žádoucí konvertovat nebo modifikovat, mohou být chráněny vhodnou chránící skupinou (PG) nebo pro multi-segmentové ligace a ortogonální chránící skupinou (PG'), kde segment nesoucí karboxy-koncovou Y_aaskupinu obsahuje chráněnou amino-koncovou X_aa skupinu, tj . PGX_aa-peptid, který je poskytnut jako příklad na obrázku 4B. Obrázek 4C ukazuje heterogenitu skupin, které mohou být přítomny nebo chybět v peptidových segmentech použitých v ligací a polymerní modifikaci podle obrázků 4A-4B, a také obrázků 1A-1E, obrázků 2A-2C a obrázků 3A-3B.

Podle návrhu jsou konstruovány peptidy nebo polypeptidové *» ··« k » ·» · · · *

♦ 1 · · ( » • » · » · « • » O » « « · ' • · » · » .

·’ »> ,» ··« segmenty použité pro syntézu polypeptidového hlavního řetězce. To zahrnuje selekci vhodných míst ligace, které jsou zvoleny na základě chemické ligace vybrané pro sestrojení různých segmentů polypeptidového hlavního řetězce, chemického postupu pro připojení polymeru zvoleného pro daný cílový protein a konkrétních míst připojení polymeru. Když je použita nativní chemická ligace, cysteinová místa ligace jsou určena skenováním aminokyselinové sekvence hlavního řetězce cílového polypeptidu na vhodný přirozeně se vyskytující cysteinový zbytek. Když je použita „prodloužená nativní chemická ligace, jak je popsaná v tomto textu, místa ligace mohou být vybrána skenováním aminokyselinové sekvence hlavního řetězce cílového polypeptidu na vhodná přirozeně se vyskytující místa ligace, která umožňuje masivní ligace, jako například místa X_aa-Gly. Protože prodloužená nativní chemická ligace není omezena na ligaci cysteinových zbytků, kterýkoliv počet zbytků může sloužit jako místa ligace. V některých příkladech může být součástí návrhu kombinace nativní a prodloužené nativní chemické ligace.

Ve výhodném provedení je použita nativní chemická ligace pro vytvoření části nebo celého kompletního polypeptidového řetězce. Cysteiny přítomné v přirozeně se vyskytujícím proteinu, na kterém je založen syntetický protein stimulující erytropoézu, mohou být použity jako místa chemické ligace. Nicméně, kde je výhodné spojení ligací bez vhodného cysteinu, aminokyselina, která není cystein v této poloze může být nahrazena cysteinem, aby se umožnila nativní chemická ligace v tomto místě. Je-li žádoucí, nově zavedený cystein může být konvertován na pseudoaminokyselinový zbytek odpovídající originální aminokyselině v této poloze, jak bylo popsáno v tomto textu. Alternativně, když cystein je zaveden do místa pro polymerní modifikaci, thiolová skupina postranního řetězce • · • · • · · · může být využita pro připojení thiol-reaktivního polymerového konstruktu rozpustného ve vodě za předpokladu, že všechny další cysteiny v cílovém polypeptidu, které není žádoucí modifikovat, jsou chráněny.

V dalším výhodném provedení může být použita prodloužená nativní chemická ligace, jak je popsána v tomto textu, pro vznik části nebo celého kompletního polypeptidu. V tomto způsobu může být použita aminokyselina N-koncově

Να-substituovaná alkylthiolovou skupinou nebo arylthiolovou skupinou s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky. Takové zbytky (když jsou přítomny na N-konci peptidu nebo polypeptidového segmentu použitého pro ligaci) tohoto polypeptidu a-karboxythioesterovou mohou být výhodně použity k ligaci k polypeptidu majícímu C-koncovou skupinu podle způsobu prodloužené nativní chemické ligace popsaného v tomto textu.

Typicky syntéza peptidů používá stupňovitou standardní syntézu peptidů na pevné fázi s Boc a/nebo Fmoc s použitím standardních automatizovaných peptidových syntetizátorů nebo ručně podle standardních protokolů nebo objednaných a zakoupených od komerčních prodejců. (Synthetic Peptides, A User's Guide, G. A. Grant, vyd., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992, „Principles of Peptide Synthesis, 2. vyd., M. Bodanszky, vyd., Springer-Verlag, 1993, „The Practice of Peptide Synthesis, 2. vyd., M. Bodanszky a A. Bodanszky, vyd., Springer-Verlag, 1994, a „Protecting Groups, P. J. Kocienski, vyd., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994, „Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, vyd. W. C. Chán a P. D. White, Oxford University Press, 2000) . Peptidy použité pro thioesterem zprostředkované ligace, jako například pro nativní chemickou ligaci, mohou být vytvořeny také podle standardních protokolů, (viz např. Dawson et al., Science, 1994, 266: 776-779, Canne et al. Tetrahedron • ·

Lett., 1995, 36, 1217-1220, Kent, et al. , WO 96/34878, Kent, et al., WO 98/28434, Ingenito et al., JACS, 1999, 121 (49): 11369-11374, a Hackeng et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 1999, 96, 10068-10073), Amiato et al., výše.).

Pro ligaci a místně specifické připojení polymerů rozpustných ve vodě, jsou v syntéze peptidů použity chemické ortogonální strategie (viz např. obrázky 1-4 a příklady), aby se zabránilo vedlejším reakcím, které mají za následek nechtěné připojení. Například v závislosti na navržení ligace a postupu připojení polymeru, může být použita celá řada ortogonálních strategií syntézy. Konkrétně je uvažována povaha připojovaného polymeru rozpustného ve vodě a konkrétní funkční skupina pro připojení k polypeptidu, například jak je diskutováno níže pro výhodné glykomimetické polymery podle vynálezu.

Konkrétně polymer rozpustný ve vodě je vytvořen tak, aby obsahoval unikátní funkční skupinu U, -která je selektivně reaktivní s unikátní funkční skupinou na cílovém peptidu používaném pro ligaci, kompletním materiálu nebo dokonce svinutém polypeptidu. Protože je použita chemická syntéza, peptid je vytvořen tak, aby obsahoval vzájemně reaktivní chemoselektivní skupinu v přesném místě definovaném uživatelem. Tento aspekt vynálezu ztělesní principy syntézy peptidů (strategie chránících skupin) a chemické ligace (strategie parciální nebo žádné chránící skupiny). Ve strategii chránících skupin jsou všechny potenciálně reaktivní charakteristické skupiny kromě požadované funkční skupiny na polymeru rozpustném ve vodě a jejich vzájemně reaktivní funkční skupina přítomná na cílové molekule blokovány vhodnými chránícími skupinami. Je znám mnoho chránících skupin vhodných pro tento účel (viz např. Protecting Groups in Organic Synthesis,,, 3. vyd. , T. W. Greene a P. G. M. Wuts, vyd., John • · · · · ·

Wiley & Sons, lne., 1999, NovaBiochem Catalog 2000, „Synthetic Peptides, A User's Guide, G. A. Grant, vyd., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992, „Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry, W. D. Bennet,

J. W. Christensen, 1. K. Hamaker, Μ. 1. Peterson, M. R. Rhodes, a Η. H. Saneii, vyd., Advanced Chemtech, 1998, „Principles of Peptide Synthesis, 2. vyd., M. Bodanszky, vyd., Springer-Verlag, 1993, „The Practice of Peptide Synthesis, 2. vyd., M. Bodanszky a A. Bodanszky, vyd., Springer-Verlag, 1994, a „Protecting Groups, P. J. Kocienski, vyd., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Německo, 1994).

Polymer rozpustný ve vodě může být tedy vytvořen tak, aby měl široký rozsah funkčních skupin, jako jsou například ty popsané výše. Co se týče strategie parciální nebo žádné chránící skupiny, funkční skupina na polymeru a jejich vzájemně reaktivní funkční skupina přítomná na cílovém peptidu nebo polypeptidu používá chemoselektivní reakční pár, kdy jiné funkční skupiny mohou být přítomny v reakčním systému, ale jsou nereaktivní. To zahrnuje skupiny přístupné strategiím zachycujícím aminoskupinu (např. ligace tvorbou hemiaminalu, tvorbou iminu a Michaelovou adicí), strategie zachycující thiolovou skupinu (např. ligace tvorbou merkaptidu, výměnou disulfidu), strategie nativní chemické ligace (např. ligace výměnou thioesteru zahrnující cystein nebo thiolovou skupinu obsaženou v postranním řetězci aminokyselinového derivátu) a strategie ortogonální ligační kondenzace (např. ligace tvorbou thiazolidinu, výměnou thioesteru, tvorbou thioesteru, výměnou disulfidu a tvorbou amidu) (viz např. Coltart, DM., Tecrahedron, 2003, 50, 3449-3491).

Výhodná chemoselektivní U skupina pro toto provedení zahrnuje zbytek unikátní funkční skupiny použité ve vodném kompatibilním ligačním chemickém postupu, jako je například • * · · · · nativní chemická ligace (Dawson, et al., Science, 1994, 266: 776-779, Kent, et al., WO 96/34878), prodloužená obecná chemická ligace (Kent, et al., WO 98/28434), chemická ligace tvořící oxim (Rose, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1994, 116, 30-33), ligace tvořící thioester (Schnólzer, et al., Science, 1992, 256: 221-225), ligace tvořící thioether (Englebretsen, et al., Tet. Letts., 1995, 36 (48): 8871-8874), ligace tvořící hydrazon (Gaertner, et al., Bioconj . Chem., 1994, 5 (4): 333338) a ligace tvořící thiazolidin a ligace tvořící oxazolidin (Zhang, et al. , Proč. Nati. Acad. Sci., 1998, 95 (16): 91849189, Tam, et al., WO 95/00846) nebo další metody (Yan, 1. Z. a Dawson, P. E., „Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization, J. Am. Chem. Soc. 2001,123, 526-533, herein incorporated by reference, Gieselnan et al., Org. Lett. 2001 3 (9): 13311334, Saxon, E. et al., „Traceless Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds. Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143).

Vzhledem k různým chemickým postupům připojení popisovaným výše, vazba vytvořená mezi polymerem rozpustným ve vodě a cílovým peptidem nebo polypeptidem může zahrnovat zbytek vazby vybrané ze skupiny, která zahrnuje karbonát, ester, urethan, orthoester, amid, amin, oxim, imid, močovinu, thiomočovinu, thioether, thiourethan, thioester, ether, thaizolidin, hydrazon, oxazolidin apod. nejvýhodnější vazby jsou oximové a amidové vazby.

Krok peptidové ligace, například jak je ukázán na obrázcích 1-4, může používat ligační strategie na pevné fázi nebo v roztoku. Obrázek 8 ukazuje další způsob přesného připojení polymeru rozpustného ve vodě k peptidovému segmentu použitelný pro ligaci a produkci polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle tttf »· »« • 4 » * t · · · > 4 » · · • · · » > * 1 f 1 » » « i · ·

-» · * » · · » > »· vynálezu. První krok používá syntézu peptidů na pevné fázi (SPPS) (např. Fmoc nebo Boc SPPS), ve které aminokyselinový postranní řetězec zacílený pro připojení polymeru je chráněn ortogonální chránící skupinou (např. jestliže se používá Fmoc SPPS, může být použita Boc skupina pro ochranu místa připojení polymeru nebo jestliže se používá Boc SPPS, může být použita Fmoc skupina jako ortogonální chránící skupina). Po syntéze peptidů je ortogonální chránící skupina selektivně odstraněna, zatímco zbytek peptidů zůstane chráněn. To umožní jedno místo připojení pro další krok - syntéza polymeru na pevné fázi. Jakmile je ortogonální chránící skupina odstraněna, polymerový řetězec je připojen jako prekurzor. Výhodněji, je polymerový řetězec tvořen postupnými cykly syntézy polymeru s použitím postupu ukázaného na obrázcích 6A-6D. Ačkoli je ukázáno jedno místo připojení polymeru, může být poskytnuto víc než jedno. Obrázek 9 ukazuje obecné reakční schéma.

Jak je uvedeno výše, chemická ligace zahrnuje tvorbu selektivní kovalentní vazba mezi první chemickou složkou a druhou chemickou složkou. Mohou být použity unikátní vzájemně reaktivní funkční skupiny přítomné na první a druhé složce, které učiní to, že ligační reakce je chemoselektivní. Například chemická ligace peptidů a polypeptidů zahrnuje chemoselektivní reakci peptidových nebo polypeptidových segmentů nesoucích kompatibilní unikátní vzájemně reaktivní C-koncové a N-koncové aminokyselinové zbytky. Za tímto účelem bylo použito několik různých chemických postupů, příklady zahrnují nativní chemickou ligaci (Dawson, et al., Science, 1994, 266: 776-779, Kent, et al., WO 96/34878, Kent, et al., WO 98/28434), chemickou ligaci tvořící oxim (Rose, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1994, 116, 30-34), ligaci tvořící thioester (Schnólzer, et al., Science, 1992, 256: 221-225), ligaci tvořící thioether (Englebretsen, et al., Tet. Letts., 1995, 36 • « (48): 8871-8874), ligaci tvořící hydrazon (Gaertner, et al., Bioconj. Chem., 1994, 5 (4): 333-338) a ligaci tvořící thiazolidin a ligaci tvořící oxazolidin (Zhang, et al., Proč. Nati. Acad. Sci. , 1998, 95 (16): 9184-9189, Tam, et al., WO 95/00846, patent Spojených Států č. 5,589,356), Gieselman et al., Selenocysteine-mediated native Chemical ligation (Org. Lett., 2001, 3 (9): 1331-1334) a chemickou ligaci tvořící Staudingerův amid (Saxon et al., Org. Lett., 2000, 2, 21412143) . Je tedy uznáváno, že kterýkoliv chemoselektivní reakční chemický postup, který může být aplikován na ligaci nechráněných peptidových segmentů, je modifikovatelný pro tento účel.

Reakční podmínky pro daný ligační chemický postup jsou vybrán tak, aby se udržovala požadovaná interakce peptidových nebo polypeptidových segmentů použitých pro ligaci. Například pH a teplota, rozpustnost ligační značky ve vodě, poměr prvního segmentu ke druhému segmentu, obsah vody a složení reakční směsi může být měněno tak, aby se ligace optimalizovala. Přidání nebo vyloučení činidel, která do různé míry solubilizují ligační segmenty může být dále použito pro kontrolu specifity a rychlosti požadované ligační reakce, tj . řízení expozice a prezentace reaktivních skupin manipulací rozpustnosti peptidových nebo polypeptidových segmentů. Reakční podmínky jsou snadno určeny testováním požadovaného chemoselektivního reakčního produktu ve srovnání s jednou nebo více vnitřními a/nebo vnějšími kontrolami.

Kde ligace zahrnuje připojení polypeptidu, který má N-koncový cysteinový zbytek, je výhodně použit postup nativní chemické ligace (Dawson, et al., Science, 1994, 266, 776-779, Kent, et al., WO 96/34878, Kent, et al., WO 98/28434)). Okázalo se, že tato metodologie je silná metoda pro tvorbu nativní amidové vazby v místě ligace. Nativní chemická ligace »· · · ·· · · · · ·· · · · · • * « · ··« < « · • ·· · · ···· · · · • ···«·· · · · ♦ · · • « · » · · ···· • · tf · ·· · · v ·· ·· zahrnuje chemoselektivní reakci mezi prvním peptidovým nebo polypeptidovým segmentem majícím C-koncovou a-karboxythioesterovou skupinu a druhým peptidem nebo polypeptidem majícím N-koncový cysteinový zbytek. Výměnná reakce thiolové skupiny poskytla výchozí meziprodukt spojený thioesterem, který se spontánně přeskupil za vzniku nativní amidové vazby v místě ligace, zatímco se regeneruje thiolová skupina cysteinu postranního řetězce. V mnoha případech sekvence přírodního proteinu zahrnuje vhodně umístěné cysteinové zbytky tak, že polypeptidové fragmenty mající N-koncový cysteinový zbytek mohou být syntetizovány a použity v nativní chemické ligační reakci. V jiných případech může být syntéza peptidů řízena tak, aby se za tímto účelem zavedly cysteinové zbytky do polypeptidu. Ve své standardní formě tedy nativní chemická ligace zahrnuje chemoselektivní reakci zprostředkovanou thioesterem v cysteinovém zbytku v cílové polypeptidové sekvenci, peptidová vazba je vytvořena v místě ligace a postranní řetězec Cys je regenerován v nativní formě.

Alternativně proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být syntetizovány použitím pseudonativní chemické ligace nebo prodloužené nativní chemické ligace. Pseudonativní chemická ligace zahrnuje použití nepřirozeně se vyskytujících pseudoaminokyselinových zbytků v preselektovaných polohách v peptidech použitých v syntéze proteinů (např. viz obrázek 4). Struktury těchto pseudoaminokyselin napodobují jak struktury cysteinu tak struktury aminokyselin, které jsou přirozeně nalézány v těchto preselektovaných polohách v proteinu, který je syntetizován. Pseudonativní chemická ligace tak směřuje k thioalkylaci cysteinových postranních řetězců tvořených v místech ligace z nativní chemické ligace. Výhodný aspekt je thioalkylace cysteinových míst ligace, kde alespoň jeden peptid obsahuje nativní cystein mající svůj tt · ·

9·* * * , · ···· » · ···· · ··· · « » · · * * thiolový postranní řetězec chráněný vhodnou chránící skupinou.

je thiolová skupina požadovaný postranní řetězec ribozomálně

Ve výhodném provedení vynálezu cysteinové skupiny modifikována na řetězec, například na postranní specifikované aminokyseliny, analog takové aminokyseliny nebo na neribozomálně specifikovanou aminokyselinu. Jak se v tomto textu používá, ribozomálně specifikovaná aminokyselina je aminokyselina, která je rozpoznávána ribozomy při translaci proteinu a může být inkorporována do ribozomálně vytvořeného proteinu. Existuje značné množství publikovaných článků popisujících chemické modifikace thiolové skupiny postranního řetězce cysteinu (viz např. Current Protocols in Protein Science, vyd: John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, NY (2000)). Kaiser, E. T. popsal konverzi postranních řetězců cysteinových zbytků napodobující chemické vlastnosti přirozeně se vyskytujícíco aminokyselinového postranního řetězce (viz např. Kaiser, E. T. et al., „Chemical. Mutation Of Enzyme Active Sites, Science. 1984 Nov 2, 226 (4674): 505-11). Dále bylo popsáno použití postranního řetězce cysteinu pro zavedení značky do peptidu nebo proteinu. Modifikace postranního řetězce cysteinu jsou uvedeny v přehledu v Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, S. S. Wong, (1991, CRC Press), Chemical Modification of Proteins, Gary E. Means et al., (1971, HoldeN-Day), Chemical Modification of Proteins: Selected methods and analytical procedures, Glazer, A. N. et al. (1975, Modification,

Elsevier), Chemical Reagents RL Lundblad (1991, CRC Press) for Protein Tam et al.

(Biopolymers, 1998, 46, 319-327) popsali použití homocysteinu (-CH₂-CH₂-SH) pro noN-cys nativní chemickou ligaci následovanou thioalkylací s použitím methyl-p-nitrobenzensulfonátu (methylační činidlo) pro konverzi homocysteinového postranního řetězce na nativní methioninový postranní řetězec (-CH₂-CH₂-S• ·

CH₃) . Předkládaný vynález může také být použit pro konverzi homocysteinů na pseudoaminokyseliny, tj. na aminokyseliny jiné než methionin. Nicméně, jako u konverze cysteinů popsané v tomto textu, podle předkládaného vynálezu je nutné použití chránících skupin, aby se zabránilo zničení nativních cysteinů zapojených do disulfidových dvojic peptidů, které obsahují alespoň jeden nativní cystein, který není žádoucí konvertovat. Vhodné chránící skupiny jsou popsány níže.

Zatímco způsob pseudonativní chemické ligace neusnadní napodobování postranních řetězců určitými ribozomálně specifikovanými aminokyseliny (např. postranní řetězce glycinu, alaninu, valinu a prolinu) (postranní řetězec alaninu může být nicméně vytvořen prostřednictvím desulfurace (Liang, Z. Y. a Dawson, P. E., „Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization, J. Am. Chem. Soc. 2001,123, 526-533, zahrnuto formou odkazu v tomto textu), může být použit pro vznik postranních řetězců, které napodobují mnoho ribozomálně specifikovaných nebo nekódovaných aminokyselin. Aminokyseliny vytvořené podle způsobu pseudonativní chemické ligace podle předkládaného vynálezu obsahují thioetherovou vazbu a nemají β-větvení (v tom, že všechny zahrnují methylová skupinu v β poloze, tj . aa-CH₂-S-) . Tak mohou být vytvořeny pseudoaminokyselinové verze β-větvených aminokyselin, izoleucinu a threoninu, mající připojenou strukturu postranního řetězce, bez β geometrie a s ní souvisejícími omezeními.

Významné je, že způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být použity ke tvorbě aminokyselinových postranních řetězců, které mají stejnou délku jako řetězce ribozomálně specifikovaných aminokyselin nebo jsou delší či kratší než • tpoužita ke stabilizaci (nebo destabilizaci) trojrozměrné konformace ke zvýšení proteinové stability (nebo k zesílení schopnosti proteinu změnit svou konformaci, a tím přijímat různou řadu substrátů, inhibitorů, receptorů, ligandů, apod. relativně k těm přijímaným přirozeně se vyskytujícím proteinem. Například Cys-CH₂-SH + Br-CH₂-COOH poskytuje CysCH₂-S-CH₂-COOH (taková pseudoglutamová kyselina má jeden další atom postranního řetězce, a to skupiny -S-, alternativně, jestliže je použita v místě asparagové kyseliny, bude mít dva další atomy postranního řetězce, a to skupiny -CH₂-S-). Jiné postranní řetězce mají stejný počet atomů v postranním řetězci, ale liší se zahrnutím thioetherové vazby (-S-) . Například Cys-CH₂-SH + Br-CH₂-CH₂-NH-AG, následované odstraněním PG poskytne Cys-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH₂. Výsledná struktura nemá žádné další atomy v postranním řetězci, ale jedna -CH₂- skupina je nahrazena -S-. Methionin je další příklad, Cys-CH₂-SH + I-CH₂-CH₃ poskytne Cys-CH₂-S-CH₂-CH₃(oproti nativní methioninové struktuře Met-CH₂-CH₂-S-CH₃) , je tedy přesunut thioether. Arginin také: Cys-CH₂-SH + Br-CH₂-NHCH ( (-NH₂) (=NH₂ ⁺) ) poskytne Cys-CH₂-S-CH₂-NH-CH ( (-NH₂) (=NH₂ ⁺) ) . Výhodně může být použita ochrana reaktivních aminoskupin, konkrétně pro konstrukci pseudolysinu, aby se zabránilo nechtěným vedlejším reakcím. Jak je thioalkylační reakce provedena, může být odstraněna chránící skupina.

Obecně, kde je žádoucí co nejvíce napodobit přirozeně se vyskytující protein, je nejvýhodnější používat molekulu pseudoaminokyseliny, která má délku postranního řetězce, která je stejná jako délka ribozomálně specifikované aminokyseliny normálně přítomné v této poloze v proteinu, je méně výhodné používat molekulu pseudoaminokyseliny, která má délku postranního řetězce, která je o jeden atom delší než délka ribozomálně specifikované aminokyseliny a ještě méně výhodné • · · · je používat molekulu pseudoaminokyseliny, která má délku postranního řetězce, která je o dva atomy delší než délka ribozomálně specifikované aminokyseliny. Navíc je výhodné vybrat cysteinové místo ligace, které je v lokalizaci, kde není pravděpodobné, že genetické změny poruší funkci nebo kde jsou aminokyseliny v tomto místě v příbuzných proteinech konzervativní. Taková místa mohou být identifikována skenováním alaninu, modelováním homologie a dalšími metodami.

V pseudonativní chemické ligací je peptid obsahující amino-koncový cysteinový zbytek ligován k peptidu majícímu karboxy-koncový thioester, jako v nativní chemické ligaci. Thiolový postranní řetězec cysteinu pak reaguje se sloučeninou vzorce R_aa-X, kde X je dobře odstupující skupina a R_aa je skupina, jejíž struktura napodobuje koncovou část postranního řetězce ribozomálně specifikované nebo syntetické aminokyseliny.

Je významné, že reakce pseudonativní chemické ligace fungují buď s přírodní L-konfigurací cysteinového postranního řetězce nebo s D-konfigurací. Použití D-konfigurace může poskytnout rezistenci na proteázy v tomto místu ligace, a tak může být žádoucí, když je požadovaná zvýšená stabilita k proteolýze. Nicméně při použití D-cysteinu bude struktura hlavního řetězce v tomto místě změněna. Taková změna, kromě rezistence k proteázám, může být požadována pro změnu biologické aktivity. Nicméně, aby se minimalizoval dopad na biologickou aktivitu, je výhodné lokalizovat D-cystein na místo s vysokou flexibilitou, jako je například porušený úsek, jako je například porušená klička, které bude lokalizováno na povrchu výsledné svinuté molekuly, na porušený konec molekuly. Je žádoucí, aby reakce pseudonativní chemické ligace byly použity pro umístění velkých, nabitých postranních řetězců (např. postranní řerězce Lys, Arg, Asp nebo Glu) na povrch • · syntetizované molekuly.

Příklady vhodných dobře odstupujících skupin, X, zahrnují halogeny, obzvláště jod a brom. Příklady R_aa skupin zahrnují P0₄, COOH, C00, CONH₂, guanidinium, amin, alkylovou skupinu, alkylovou skupinu, arylovou skupinu, substituovanou substituovanou arylovou skupinu, alkylovanou imidazolovou skupinu, alkylovanou indolovou skupinu.

imidazolovou skupinu, indolovou skupinu nebo

Selekce, kterou R_aa použít, závisí na požadovaném aminokyselinovém postranním řetězci, který má být přítomen v konkrétní poloze. Tak například požadovaný polypeptid nebo protein mající aminokyselinovou sekvenci:

aa_NH2^_Q^-aa_x-aa_y-W-aacooH kde Q a W každý označuje volitelnou přítomnost nebo nepřítomnost dalších aminokyselinových zbytků a aa_x a aa_yoznačují interní sousední zbytky (mající postranní řetězce x a y, v daném pořadí) a aa_NH2 a aa_CooH v daném pořadí označují amino-(N-)koncový zbytek a karboxy-(C-)koncový zbytek polypeptidu nebo proteinu, mohou být syntetizovány přípravou dvou peptidových fragmentů:

aa_NH2-Q-aa_x-COSR a Cys—W—aacooH kde Cys označuje nahrazení aa_y cysteinem a R je kterákoliv skupina kompatibilní s thioesterovou skupinou, včetně, ale bez omezení, arylové skupiny, benzylové skupiny a alkylové skupiny. Příklady R zahrnují 3-karboxy-4-nitrofenylthioestery, benzylestery a leucinylestery merkaptoproprionové kyseliny • · · · (viz např. Dawson et al., Science, 1994, 266: 776-779, Canne et al. Tetrahedron Lett., 1995, 36, 1217-1220, Kent, et al.,

WO 96/34878, Kent, et al., WO 98/28434, Ingenito et al., JACS, 1999, 121 (49): 11369-11374, a Hackeng et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 1999, 96, 10068-10073) . Další příklady zahrnují dithiothreitol nebo alkyl či arylthioestery, které mohou být vytvořeny biologickými technikami zprostředkovanými inteinem, které jsou také dobře známy (viz např. Chong et al., Gene, 1997, 192: 277-281, Chong et al., Nucl. Kyselins Res.,

1998, 26, 5109-5115, Evans et al., Protein Science, 1998, 7,

2256-2264, a Cotton et al., Chemistry & Biology, 1999, 6(9):

247-256), a pak ligací fragmentů dohromady za vzniku:

aa_NH2-Q-aa_x-Cys-W- aacooH

Ligační fragment pak reagoval s R_y-X, kde R_y je postranní skupina, která napodobuje strukturu y postranního řetězce). Reakce je prováděna v podmínkách postačujících pro konverzi thiolové skupiny cysteinu na pseudo-y postranní řetězec. Například, jestliže R_aa je vybrán a je CH2-COOH nebo (CH₂)2^_COOH, pak reakce povede k tvorbě aminokyselinového zbytku, který napodobuje strukturu a funkci asparagové kyseliny (pseudo-Asp) nebo glutamové kyseliny (pseudo-Glu). Jak se uznává, dle popisu uvedeného výše, může být prováděna komplikovanější syntéza s použitím více než dvou peptidových fragmentů.

Význačná vlastnost tohoto přístupu je, že cysteinové zbytky, které není žádoucí modifikovat v reagujících segmentech, postranní řetězce mohou být chráněny, např. jako Cys(Acm), pro prevenci chemické modifikace Cys zbytků jiných než je zbytek(zbytky) v místě(místech) ligace nebo kterýkoliv • · · · jiných Cys zbytků v reakčních segmentech určených pro současnou tvorbu totožných 'pseudoaminokyselin' chemickou modifikací po ligaci.

Jak se v tomto textu používá, symbol ψ označuje benzylovou skupinu, IM označuje imidazolovou skupinu a IN označuje indolovou skupinu, PG označuje chránící skupinu. Níže je shrnutí R_aa postranních skupin, které mohou být použity pro syntézu peptidů obsahujících pseudoaminokyselinové zbytky podle předkládaného vynálezu (kde X je atom halogenu (I, Br, Cl, F, přičemž I a Br jsou nejvýhodnější a F je výhodný pro ψ připojení):

Bazické aminokyseliny:

Lys (žádné zvláštní atomy)

-CH₂-SH + X-CH₂-CH₂-NH-PG, následuje odstranění chránící skupiny

Za vzniku -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH₂

Arg (žádné zvláštní atomy)

-CH₂-SH + X-CH₂-NH-C ( (NH₂) (=NH₂+) )

Za vzniku -CH₂-S-CH₂-NH-C ( (NH₂) (=NH₂+) )

His (2 zvláštní atomy)

-CH₂-SH + X-CH₂-/M za vzniku -CH₂-S-CH₂-/M

Kyselé aminokyseliny:

Asp (2 zvláštní atomy)

-CH₂-SH + X-CH₂-COOH za vzniku -CH₂-S-CH₂-COOH

Glu (1 zvláštní atom)

9 • ·

-CH₂-SH + X-CH₂-COOH za vzniku -CH₂-S-CH₂-COOH

Polární aminokyseliny bez náboje:

Tyr (žádný nebo 1 zvláštní atom)

-CH₂-SH + F-ψ-ρΟΗ za vzniku -CH₂-S-ý-pOH (žádné zvláštní atomy, stejná geometrie)

-CH₂-SH + Br/I-CH₂-Ů-pOH za vzniku -CH₂-S-CH₂-ů-pOH (1 zvláštní atom)

Gin (1 zvláštní atom)

-CH₂-SH + X-CH₂-C(O) (NH₂) za vzniku -CH₂-S-CH₂-C (0) (NH₂)

Asn (2 zvláštní atomy)

-CH₂-SH + X-CH₂-C(O) (NH₂) za vzniku -CH₂-S-CH₂-C (0) (NH₂)

Ser (2 nebo 3 zvláštní atomy)

-CH₂-SH + X-CH₂OH) za vzniku -CH₂-S-CH₂OH (2 zvláštní atomy)

- CH₂-SH + X-CH2-CH2-OH za vzniku -CH₂-S-CH₂-CH₂OH (3 zvláštní atomy)

Thr (2 nebo 3 zvláštní atomy, postrádá β rozvětvení)

-CH₂-SH + X-CH((CH₃) (O-PG) následuje odstraněním PG

Za vzniku -CH₂-S-CH((CH₃) (OH)) (2 zvláštní atomy)

-CH₂-SH + X-CH₂-CH ( (CH₃) (0-PG) ) následuje odstraněním PG

Za vzniku -CH₂-S-CH₂-CH((CH₃) (OH)) (3 zvláštní atomy)

Nepolární aminokyseliny:

Leu (1 nebo 2 zvláštní atomy)

-CH₂-SH + X-CH ( (CH₃) (CH₃) ) za vzniku -CH₂-S-CH ( (CH₃) (CH₃) ) (1 zvláštní atom) ·· · · · · ·» « · · · · • · · · · · · · ···· · ··· · x-ch₂-ch( (ch₃) (ch₃;

za vzniku

-CH2-S-CH2CH((CH₃) (CH₃) ) (2 zvláštní atomy)

Ile (2 nebo 3 zvláštní atomy, postrádá β rozvětvení)

-CH₂-SH + X-CH (CH₃) -CH2-CH3 za vzniku -CH₂-S-CH (CH₃) -CH₂-CH₃ (2 zvláštní atomy)

-CH₂-SH + X-CH₂-CH (CH₃) -CH2-CH3 za vzniku -CH₂-S-CH₂-CH (CH₃) -CH₂CH₃ (3 zvláštní atomy)

Phe (1 nebo 2 zvláštní atomy)

-CH₂-SH + F-ψ za vzniku -CH₂-S-ů (1 zvláštní atom)

-CH₂-SH + Br/l-CH₂-ú za vzniku -CH₂-S-CH₂-ú (2 zvláštní atomy)

Met (žádné zvláštní atomy)

-CH₂-SH + I-CH₂-CH₃ za vzniku -CH₂-S-CH₂-CH₃

Trp (1 zvláštní atom)

-CH₂-SH + F-/N za vzniku -CH₂-S-IN

Nicméně, kde je buď nevyhovující nebo nežádoucí modifikovat cysteinový polypeptidu proteinovou sekvenci tak, aby byl zaveden nebo homocysteinový zbytek do daného N-konce použitého pro ligaci nebo použít pseudoaminokyselinu v místě ligace, způsob nativní chemické ligace může být rozšířen s použitím polypeptidů, jejichž N-konec byl modifikován tak, aby obsahoval N-substituovanou a výhodně Να-substituovanou aminoalkylthiolovou skupinu nebo arylthiolovou skupinu s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky, a proto umožní, aby byly použity principy nativní chemické ligace s polypeptidy postrádajícími cysteinové zbytky (viz patentová přihláška Spojených Států č. 60/231 339, zahrnuta formou odkazu v tomto textu).

Zoůsob prodloužené nativní chemické ligace zahrnuj e • · ligaci první složky obsahující karboxylthioester a výhodněji, a-karboxylthioester

N-substituovanou a thiolovou skupinu obsahuj ící aminoalkyls druhou složkou výhodně Na-substituovanou stabilní v kyselém prostředí nebo arylthiolovou skupinu s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky. Chemoselektivní reakce mezi karboxylthioesterem první složky a thiolovou skupinou N-substituované alkylthiolové skupiny nebo arylthiolové skupiny s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky druhé složky pokračuje přes meziprodukt spojený thioesterem a rozloží se na výchozí ligační produkt. Konkrétněji, výměna thiolové skupiny nastávající mezi COSR thioesterovou složkou a aminoalkylthiolovou složkou vytváří meziproduktový ligační produkt spojený thioesterem, který po spontánním přeskupení vytváří amidem spojený první ligační produkt prostřednictvím kruhového meziproduktu s 5 členy nebo se 6 členy v závislosti na tom, zda aminoalkylthiolová složka má vzorec I nebo 11, v daném pořadí:

Jl-C(0)-N(Cl(Rl)-C2-SH)-J2

Jl-C(0)-N(Cl(Rl)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2

I

II kde JI je peptid nebo polypeptid mající jeden nebo více volitelně chráněných aminokyselinových postranních řetězců nebo skupina takového peptidu nebo polypeptidu, polymer, barvivo, vhodně funkcionalizovaný povrch, linker nebo detekovatelný markér nebo kterákoliv další chemická skupina kompatibilní s chemickou syntézou peptídů nebo prodlouženou nativní chemickou ligací, Rl, R2 a R3 jsou nezávisle atom H nebo skupina poskytující elektron kondenzovaná k Cl, s podmínkou, že alespoň jeden z Rl, R2 a R3 obsahuje skupinu poskytující elektron kondenzovanou k Cl a J2 je peptid nebo volitelně chráněných nebo skupina takového • · · · • · · · · · • · · • · · · polypeptid mající jeden nebo více aminokyselinových postranních řetězců peptidu nebo polypeptidu, polymer, barvivo, vhodně funkcionalizovaný povrch, linker nebo detekovatelný markér nebo kterákoliv další chemická skupina kompatibilní s chemickou syntézou peptidů nebo prodlouženou nativní chemickou ligaci.

N-substituovaná alkylthiolová skupina nebo arylthiolová skupina s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky [HS-C2-C1 (Rl)-] nebo [HS(C3(R3)-C2(R2)-Cl(Rl)-] v místě ligace je přístupná k tomu, aby byla odstraněna, v podmínkách kompatibilních pro peptid, bez poškození produktu, za vzniku konečného ligačního produktu vzorce III, mající nativní amidovou vazbu v místě ligace:

Jl-C(O)-HN-J2

III kde JI, J2, Rl, R2 a R3 jsou, jak bylo definováno výše.

stabilizovaného kationtu Chemická ligační reakce

Rl, R2 a R3 skupiny jsou vybrány, aby se usnadnilo štěpení N-Cl vazby v podmínkách kompatibilních pro štěpení peptidu. Například skupiny poskytující elektron, obzvláště když jsou kondenzovány k Cl, mohou být použity za vzniku rezonančně v Cl, který usnadňuje štěpení, výhodně zahrnuje jako excipient thiolový katalyzátor a je prováděna v podmínkách přibližně neutrálního pH ve vodném nebo smíšeném organickém-vodném prostředí. Chemická ligace první a druhé složky může pokračovat přes kruh s pěti nebo šesti členy, který podstoupí spontánně přeskupení za vzniku N-substituovaného amidem spojeného ligačního produktu. Když je první a druhá složka peptid nebo polypeptid, N-substituovaný amidem spojený ligační o Z^-’

IV nebo V;

• · • · • · ·· . · * ·· · ·

Jl-C(O)-N-a(Cl(Rl)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2

IV

Jl-C(O)-N-a(Cl(Rl)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 V kde JI, J2 a Rl, R2, R3 a Z2 jsou, jak bylo definováno výše.

Kondenzované skupiny poskytující elektron Rl, R2 nebo R3 N-substituovaného amidem spojeného ligačního produktu usnadňují štěpení N-Cl vazby a odstranění alkylthiolové skupiny nebo arylthiolové skupiny s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky z N-substituovaného amidem spojeného ligačního produktu. Odstranění alkylthiolového nebo arylthiolového řetězce z N v podmínkách kompatibilních pro štěpení peptidu tvoří ligační produkt mající nativní amidovou vazbu v místě ligace. Když první a druhá složka jsou peptidy nebo polypeptidy, ligační produkt má vzorec:

Jl-CONaH-CH(Z2)-C(0)-J2

Příklady Rl substituentů pro vzorec I jsou ukázány v tabulce 1.

Příklady Rl, R2 a R3 substituentů pro vzorec II jsou • · ukázány v tabulce 2.

Co se týče N-substituovaných sloučenin s řetězcem se 2 uhlíky, umístění benzylových a pikolylových substituentů poskytujících elektron Rl', R3' a R5' v ortho nebo para polohách je nutné pro udržení elektronové kondenzace k Cl uhlíku pro masivní štěpení Να-Cl vazby po ligaci. Nicméně když R2 a R3 tvoří benzylovou skupinu s C2 a C3, alespoň jeden z R1' a R3' obsahuje silnou skupinu poskytující elektron, kde R1' nebo R3' je vybrán ze skupiny, kterou tvoří methoxyskupina (-OCH3), thiolová skupina (-SH), hydroxylová skupina (-0H) a thiomethylová skupina (-SCH3) . Co se týče N-substituovaných thiolových skupin s řetězcem se 3 uhlíky, ve kterých R2 a R3 jsou atomy vodíku, Rl zahrnuje benzylovou skupinu nebo pikolylovou skupinu, ve které Rl' , R3' a R5' zahrnují buď • « • · silné nebo středně silné skupiny poskytující elektron nebo jejich kombinace. Co se týče N-substituovaných alkylthiolových skupin nebo arylthiolových skupin s řetězcem se 2 uhlíky, silné skupiny poskytující elektron zesilují senzitivitu alkylthiolové skupiny nebo arylthiolové skupiny s řetězcem se 3 uhlíky na štěpení po ligaci. Podle toho mohou být tedy vybrány konkrétní skupiny poskytující elektron nebo jejich kombinace.

Podobně jako N-substituované sloučeniny s řetězcem se 2 uhlíky, N-substituované sloučeniny s řetězcem se 3 uhlíky podle předkládaného vynálezu mohou zahrnovat thiolovou skupinu jako substituent Rl v polohách R1' a R5' , když jsou dostupné pro substituci v požadovaném konstruktu. Zde opět je thiolová skupina poskytující elektron kondenzovaná k Cl a její zavedení v těchto lokalizacích umožní to, že sloučeniny mají dva způsoby ligace tvořící kruh se 6 členy. To také zvyšuje lokální koncentraci dostupných thiolových skupin pro reakci s α-karboxythioesterem a poskytuje další konformace v termínech strukturálních omezení, která mohou zlepšit ligaci.

Syntéza N-koncově N-substituovaných alkylthiolových skupin nebo arylthiolových skupin s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky aminokyselin podle vynálezu může být prováděna tak, jak bylo popsáno v tomto textu, například ve schématu I a schématu II, a podle standardních technik organické chemie v oboru známých, (viz např. Advanced Organíc Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure, 4. vyd., J. March (vyd.), John Wiley & Sons, New York, NY, 1992, „Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, R. Larock (vyd.), VCH Publishers, New York, NY, 1989). Mohou být syntetizovány v roztoku, syntézou na polymerním nosiči nebo jejich kombinací. Výhodný přístup používá N a chráněné N alkylované »· ·* *· • · · · · • · · · ·

S-chráněný aminoalkylthiolové nebo arylthiolové aminokyselinové prekurzory. činidla použitá pro syntézu mohou být získána z kteréhokoliv komerčního zdroje. Také se rozumí, že výchozí složky a různé meziprodukty, jako například jednotlivé aminokyselinové deriváty mohou být uloženy pro pozdější použití, poskytnuty v soupravách apod.

Při přípravě N-koncově Να-substituovaných alkylthiolových skupin nebo arylthiolových skupin s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky aminokyselin podle vynálezu jsou použity strategie chránících skupin. Výhodný chránící skupiny (FG) použité v různých strategiích syntézy jsou obecně kompatibilní se syntézou peptidů na pevné fázi (SPPS). V některých případech je také nutné použít ortogonální chránící skupiny, který jsou odstranitelné v různých podmínkách. Mnoho takových chránících skupin je známých a vhodných pro tento účel (viz např. „Protecting Groups in Organic Synthesis, 3. vyd., T. W. Greene a P. G. M. Wuts, vyd., John Wiley. & Sons, lne., 1999, NovaBiochem Catalog 2000, „Synthetic Peptides, A User’s Guide, G. A. Grant, vyd., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992, „Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry, W. D. Bennet, J. W. Christensen, 1.

Peterson, M. R. Rhodes, a Η. H. Saneii, 1998, „Principles of Peptide

Synthesis, 2. vyd., M. Bodanszky, vyd., Springer-Verlag, 1993, „The Practice of Peptide Synthesis, 2. vyd., M. Bodanszky a A. Bodanszky, vyd., Springer-Verlag, 1994, a „Protecting Groups, P. J. Kocienski, vyd., Georg Thieme Německo, 1994). Příklady zahrnují skupinu (Z) , Boc, Bpoc, Trt, Nps,

FmocCI-Z, Br-Z, NSC, MSC, Dde, apod. Co se týče sírových skupin, příklady vhodných chránících skupin zahrnují, ale bez omezení, benzylovou skupinu, 4-methylbenzylovou skupinu, 4K. Hamaker, Μ. 1 vyd., Advanced Chemtech,

Verlag, Stuttgart, benzyloxykarbonylovou • · • · · methoxybenzylovou skupinu, tritylovou skupinu, ACM, TACAM, xanthylovou skupinu, disulfidové deriváty, pikolylovou skupinu a fenacylovou skupinu.

Konkrétně, Να-substituované alkylthiolové skupiny nebo arylthiolové skupiny s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky mohou být připraveny podle schématu I (příprava Ncc-substituovaného prekurzoru na pevné fázi) schématu

II (příprava

Να-substituovaného prekurzoru na pevné fázi). Ve schématu I Να-substituované alkylthiolové skupiny nebo arylthiolové skupiny s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky jsou skládány přímo na pevné fázi s použitím standardních metod organické syntézy na zatímco Να-chráněný, N-alkylovaný, arylthiolový je kondenzován nosném polymeru,

S-chráněný, aminoalkylthiolový nebo aminokyselinový prekurzor ze schématu II k pryskyřici s použitím standardních kondenzačních protokolů. Kde jsou vytvářeny racemické nebo diastereoizomerní produkty, může být nutné je separovat standardními metodami před použitím v prodloužené nativní chemické ligaci.

• · · *

Schéma I

X = atom halogenu • · · · • ·

A-karboxythioestery mohou být vytvářeny chemickými nebo biologickými metodami, které následují po standardních technikách v oboru známých, jako jsou například techniky popsané v tomto textu, včetně příkladů. Co se týče chemické syntézy, α-karboxythioesterové peptidy mohou být syntetizovány v roztoku nebo na pryskyřicích tvořících thioester, kteréžto techniky jsou dobře známy (viz např. Dawson et al., Science, 1994, 266: 776-779, Canne et al. Tetrahedron. Lett., 1995, 36, 1217-1220, Kent, et al., WO 96/34878, Kent, et al., WO 98/28434, Ingenito et al., JACS, 1999, 121 (49): 11369-11374, a Hackeng et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 1999, 96, 10068-10073), Amiato et al., výše.). Například chemicky ·· ··> ' ) · · » · » · · ♦ · , φ φ · · · <

. · ♦ · • · · · ·· · ·» z odpovídajících peptid-a-thiokyselin, které dále mohou být syntetizovány na thioesterové pryskyřici nebo v roztoku, ačkoli je výhodný postup s pryskyřicí. Peptid-a-thiokyseliny mohou být konvertovány na odpovídající 3-karboxy-4nitrofenylthioestery, na odpovídající benzylester nebo na kterýkoliv z celé řady alkylthioesterů. Všechny z těchto thíoesterů poskytují uspokojivě odstupující skupiny pro ligační reakce, přičemž 3-karboxy-4-nitrofenylthioestery demonstrují poněkud rychlejší rychlost reakce než odpovídající benzylthioestery, které dále mohou být reaktivnější než alkylthioestery. Jako další příklad, trityl-vázaná leucinylmerkaptoproprionová pryskyřice poskytující thioester může být použita pro konstrukci C-koncových thíoesterů (Hackeng et al., výše). Syntéza C-koncového thíoesterů může také být prováděna s použitím 3-karboxypropansulfonamidového „safety-catch linkeru aktivací diazomethanem nebo jodacetonitrilem následovanou nahrazením vhodnou thiolovou skupinou (Ingenito et al., výše, Bertozzi et al.).

Peptidy s C-koncovým α-karboxythioesterem také mohou být vytvářeny s použitím biologických způsobů, jako jsou například biologické techniky zprostředkované inteinem (viz např. Chong et al., Gene, 1997, 192: 277-281, Chong et al., Nucl. Kyselins Res., 1998, 26, 5109-5115, Evans et al., Protein Science,

1998, 7, 2256-2264, a Cotton et al., Chemistry & Biology,

1999, 6 (9) : 247-256) . Například inteinové expresní systémy, se značkami nebo bez nich, jako jsou například afinitní značky, mohou být použity pro využití indukovatelné samoštěpící aktivity 'intein' „protein-splicing prvku (prvku štěpícího protein) za vzniku C-koncového dithiothreitol(DTT) esteru peptidu nebo polypeptidového segmentu. Konkrétně, s sOecl.£^ cké v přítomnosti thiolů, jako je například DTT, β-merkaptoethanol • · * • Φ ·*

I Φ · * » φ φ * • φ ··· · • · · φφ φ nebo cystein, který tvoří peptidový segment nesoucí C-koncový thioester. (viz např. Chong et al., 1997, výše, Chong et al., 1998, výše, Evans et al., výše a Cotton et al., výše). Nicméně při použití rekombinantně vytvořeného segmentu chemicky syntetizovaná část konečného konstruktu typicky obsahuje polymerní modifikaci, kde byla zahrnuta.

Ligace N-substituovaných alkylthiolových skupin nebo arylthiolových skupin s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky složek podle vynálezu s první karboxythioesterovou složkou tvoří ligační produkt mající N-substituovanou amidovou vazbu v místě ligace. Ligační podmínky reakce jsou zvoleny tak, aby udržovaly selektivní reaktivitu thioesteru s N-substituovanou alkylthiolovou skupinou nebo arylthiolovou skupinou s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky. Ve výhodném provedení byla ligační reakce prováděna v pufrovacím roztoku majícím pH 6-8, s výhodným rozsahem pH 6,5-7,5. Pufrovací roztok může být vodný, organický nebo jejich směs. Ligační reakce také může zahrnovat jeden nebo více katalyzátorů a/nebo jedno nebo více redukčních činidel, lipidů, detergentů, jiných denaturačních činidel nebo solubilizačních činidel apod. Ppříklady výhodných katalyzátorů jsou thiol a fosfin obsahující skupiny, jako je například thiofenol, benzylmerkaptan, TCEP a alkylfosfiny. Příklady denaturačních a/nebo solubilizačních činidel zahrnují močovinu, ve vodě nebo organických jako je například TFE, HFIP, DMF, NMP, acetonitril smíchaný s vodou nebo s guanidiniem a močovinou ve vodě. Pro regulaci rychlosti ligační reakce může také být použita teplota, která je obvykle mezi 5 °C a 55 °C, přičemž výhodná teplota je mezi 15 °C a 40 °C. Jako příklad, ligační reakce dobře postupuje v reakčním systému, který má 2% thiofenol v 6M guanidiniu při pH mezi 6,8 a 7,8.

Co guanidinium, rozpouštědlech, týče N-substituovaných alkylthiolových skupin nebo « · • · • · · ·

Jl-HN-CH(Zl)-C(O)odstranitelnou nebo arylthiolovou arylthiolových skupin s řetězcem se 2 uhlíky, ligace je důsledkem výměny thiolové skupiny, která nastane mezi COSR thioesterovou složkou a aminoalkylthiolovou složkou. Výměna vytváří thioesterem spojený ligační meziprodukt, který po spontánním přeskupení přes meziprodukt s 5členným kruhem tvoří první ligační produkt vzorce

Na(Cl(Rl)-C2-SH)-CH(Z2)-J2 . mající

N-substituovanou alkylthiolovou skupinu skupinu s řetězcem se 2 uhlíky [HS-C2-C1(Rl)-] v místě ligace, kde substituenty jsou, jak bylo definováno výše.

N-substituovaná alkylthiolová skupina nebo arylthiolová skupina s řetězcem se 2 uhlíky [HS-C2-C1(Rl)-] v místě ligace je přístupná odstranění, v podmínkách kompatibilních pro peptid, za vzniku konečného ligačního produktu vzorce Jl-HN-CH(Zl)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2 majícího nativní amidovou vazbu v místě ligace.

Co se týče N-substituovaných arylthiolových skupin nebo alkylthiolových skupin s řetězcem se 3 uhlíky, výměna thiolové skupiny mezi COSR thioesterovou složkou a aminoalkylthiolovou složkou vytváří thioesterem spojený ligační meziprodukt, který po spontánním přeskupení přes kruhový meziprodukt se 6 členy tvoří první ligační produkt vzorce Jl-HN-CH(Zl)-C(O)-Na(ClC2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2 mající odstranitelnou N-substituovanou alkylthiolovou skupinu nebo arylthiolovou skupinu s řetězcem se 3 uhlíky [HS-C3(R3)-C2(R2)-Cl(Rl)-] v místě ligace. N-substituovaná arylthiolová skupina s řetězcem se 3 uhlíky [HS-C3(R3)-C2(R2)-Cl(Rl)-] vmiste ligace je přístupná odstranění, v podmínkách kompatibilních pro peptid, za vzniku konečného ligačního produktu vzorce Jl-HN-CH(Zl)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2 majícího nativní amidovou vazbu v místě ligace.

♦ · 9 ♦ * ♦

9 9

9 9 9 arylthiolové skupiny je výhodně prováděno v kyselých podmínkách, aby se usnadnilo štěpení N-Cl vazby, poskytující stabilizovanou nesubstituovanou amidovou vazbu v místě ligace. Termín podmínky kompatibilní pro štěpení peptidu označuje fyzikálněchemické podmínky kompatibilní pro peptidy a vhodné pro odštěpení alkylthiolové skupiny nebo arylthiolové skupiny z ligačního produktu. Obecně jsou podmínky kompatibilní pro štěpení peptidu vybrány v závislosti na použité α-substituované sloučenině, které mohou být snadno odvozeny rutinními a dobře známými přístupy (viz např. „Protecting Groups in Organic Synthesis, 3. vyd., T. W. Greene a P. G. M. Wuts, vyd., John Wiley & Sons, lne., 1999, NovaBiochem Catalog 2000, „Synthetic Peptides, A User's Guide, G. A. Grant, vyd., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992, „Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry, W. D. Bennet, J. W. Christensen, 1. K. Hamaker, M. l.Peterson, M. R. Rhodes, a Η. H. Saneii, vyd., Advanced Chemtech, 1998, „Principles of Peptide Synthesis, 2. vyd., M. Bodanszky, vyd., Springer-Verlag, 1993, „The Practice of Peptide Synthesis, 2. vyd., M. Bodanszky a A. Bodanszky, vyd., Springer-Verlag, 1994, a „Protecting Groups, P. J. Kocienski, vyd., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Německo, 1994) .

Například, kde Rl, R2 nebo R3 substituenty obsahují methoxyskupínu, hydroxylovou skupinu, thiolovou skupinu nebo thiomethylovou skupinu, methylovou skupinu apod., univerzálnější způsob odstranění zahrnuje kyselé podmínky štěpení typické pro chemické postupy syntézy peptidů. To zahrnuje štěpení N-Cl vazby v silně kyselých podmínkách nebo vodných kyselých podmínkách, s redukčními činidly nebo bez nich a/nebo se systémy lapačů (např. kyselina jako je například bezvodý fluorovodík (HF), trifluoroctová kyselina • · • · · · • · • · · · ··· ·· · • ·· · · · · · · · « · • ······ · ··· · · • · «· · * ··· «4 · · (TFA) nebo trimethylsulfonylfluoroctová kyselina (TMSFA) apod.). Mohou být vybrány specifičtější systémy kyselého štěpení, aby se optimalizovalo štěpení Να-Cl vazby pro odstranění arylthiolové skupiny nebo alkylthiolové skupiny pro daný konstrukt. Takové podmínky jsou dobře známy a jsou kompatibilní s udržením integrity peptidů. Může být zahrnut lapač thiolové skupiny, konkrétně když jsou v peptidové nebo polypeptidové sekvenci přítomny tryptofany, aby se zabránilo reakci tryptofanového postranního řetězec s uvolněnou arylthiolovou skupinou nebo alkylthiolovou skupinou. Příklady lapačů thiolové skupiny zahrnují ethandiol, cystein, β-merkaptoethanol a thiokrezol.

Další specializované podmínky štěpení zahrnují světlo nebo podmínky redukčního štěpení, když je substituentem pikolylová skupina. Například, když Rl nebo R2 a R3 substituenty zahrnují pikolylovou skupinu, může být použita fotolýza (např. ultrafialové světlo), systé, zinek/octová kyselina nebo elektrolytická redukce pro štěpení podle standardních protokolů. Kde Rl N-substituovaná thiolová skupina s řetězcem se 2 uhlíky obsahuje thiomethan v Rl, může být použita rtuť nebo štěpení HF. štěpný systém může také být použit pro současné štěpení od pevné fáze a/nebo jako činidlo pro odstranění chránící skupiny, když první nebo druhá ligační složka zahrnuje další chránící skupiny.

V jednom provedení předkládaného vynálezu Να-substituované alkylthiolové skupiny nebo arylthiolové skupiny s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky jsou použity v syntéze peptidů (konkrétně v automatizované syntéze peptidů a strategiích ortogonální a konvergentní ligace) za vzniku vhodně

N-koncově derivatizovaných polypeptidů, které mohou být použity jako substráty pro prodlouženou chemickou syntetických proteinů stimulujících ligaci za erytropoézu.

vzniku

Tyto »» · · · · ·· · · · 4 • · » · I • · · · · · · • · · · · 4 sloučeniny zahrnují plně chráněnou, částečně chráněnou nebo plně nechráněnou v kyselém prostředí stabilní Nasubstituovanou aminoalkylthiolovou skupinu nebo arylthiolovou skupinu s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky vzorce (PG1)S-C2-C1(R1)Na(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2 nebo (PG1)S-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)Na(PG2)-CH(Z2)-C(0)-J2, které jsou ukázány níže v tabulce III a Tabulka IV. Konkrétně, jeden nebo více Rl, R2 a R3 obsahuje skupinu poskytující elektron kondenzovanou k Cl, která je po konverzi Να-substituované aminoalkylthiolové skupiny nebo arylthiolové skupiny na Να-substituovanou amidoalkylthiolovou skupinu nebo arylthiolovou skupinu schopná vytvořit rezonančně stabilizovaný kationt v Cl, který usnadní štěpení Να-Cl vazby v podmínkách kompatibilních pro štěpení peptidu. PG1 a PG2 jsou chránící skupiny, které jsou přítomné individuálně nebo v kombinaci nebo jsou nepřítomné a mohou být stejné nebo různé, kde Z2 je kterákoliv chemická skupina kompatibilní s chemickou syntézou peptidů nebo prodlouženou nativní chemickou ligaci a kde J2 je kterákoliv chemická skupina kompatibilní s chemickou syntézou peptidů nebo prodlouženou nativní chemickou ligaci. PG1 (nebo XI) je skupina chránící amin. PG2 (nebo X2) je skupina chránící thiolovou skupinu. Je známo mnoho takových chránících skupin vhodných pro tento účel (víz např. „Protecting Groups in Organic Synthesis, 3. vyd., T. W. Greene a P. G. M. Wuts, vyd., John Wiley & Sons, lne., 1999, NovaBiochem Catalog 2000, „Synthetic Peptides, A User's Guide, G. A. Grant, vyd., W. H, Freeman & Company, New York, NY, 1992, „Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry, W. D. Bennet, J. W. Christensen, 1.

K. Hamaker, Μ. 1. Peterson, M. R. Rhodes, a Η. H. Saneii, vyd., Advanced Chemtech, 1998, „ Pricipies of Peptide Synthesis, 2. vyd., M. Bodanszky, vyd., Springer-Verlag, 1993, „The Practice of Peptide Synthesis, 2. vyd., M.

• · • · · · · · · · · · 9 · · » · ···· · · · « ······ · ··· · ·

Bodanszky a A. Bodanszky, vyd., Springer-Verlag, 1994, a „Protecting Groups, P. J. Kocienski, vyd., Georg ThiemeVerlag, Stuttgart, Německo, 1994).

Tabulka III

Příklady výhodných chránících skupin pro PG1 a XI zahrnují, ale bez omezení, [Boc(t-butylkarbamát), Troc(2,2,2,trichlorethylkarbamát), Fmoc(9-fluorenylmethylkarbamát), Br-Z nebo Cl-Z(Br- nebo Cl-benzylkarbamát), Dde(4,4-dimethyl-2,6dioxocyklohex-l-yliden), MsZ(4-methylsulfinylbenzyl-karbamát), Msc(2-methylsulfoethylkarbamát), Nsc(4-nitrofenylethylsulfonyl-ethyloxykarbonylová skupina]. Výhodné PG1 a XI chránící skupiny jsou vybrány z Protective Groups in Organic Synthesis, Green a Wuts, 3. vyd., Wiley-lnterscience, 1999, přičemž nejvýhodnější jsou Fmoc a Nsc. Příklady výhodných chránících skupin pro PG2 zahrnují, ale bez omezení, [Acm(acetamidomethylová skupina), MeoBzl nebo Mob(pmethoxybenzyiová skupina), Meb(p-methylbenzylová skupina), • · · ·

• · · ♦ · · · · · · ·

Trt(tritylová skupina), Xan(xanthenylová skupina), tButhio(st-butylová skupina), Mmt(p-methoxytritylová skupina), 2 nebo 4 pikolylová skupina (2 nebo 4 pyridylová skupina)), Fm(9fluorenylmethylová skupina), tbut(t-butylová skupina), Tacam(trimethylacetamidomethylová skupina)]. Výhodné chránící skupiny PG2 a X2 jsou vybrány z Protective Groups in Organic Synthesis, Green a Wuts, 3. vyd., Wiley-Interscience, (1999), přičemž nejvýhodnější jsou Acm, Mob, MeB, pikolylová skupina.

Tabulka IV

Chráněné formy Να-substituovaných alkylthiolových skupin nebo arylthiolových skupin s řetězcem se 2 nebo 3 uhlíky podle vynálezu mohou být připraveny, jak je uvedeno ve schématech I a II výše.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být • · • 4 • 4 vytvářeny kterýmkoliv z celé řady prostředků, včetně aminoalkylace zprostředkované halogenem, redukční aminace a přípravou Να-chráněných, N-alkylovaných, S-chráněných, aminoalkylthiolových nebo arylthiolových aminokyselinových prekurzorů kompatibilních s metodami syntézy aminokyselin na pevné fázi. Je-li žádoucí, štěpení vytvořených racemátů nebo diastereoizomerů za vzniku sloučenin přijatelné chirální čistoty může být prováděno standardními metodami.

III. Syntéza a produkce výhodných polymerů rozpustných ve vodě podle vynálezu

Jak se v tomto textu používá, termín molekulární heterogenita odkazuje na variace počtu molekul polymeru připojených ke každému proteinu proteinového preparátu. Termín molekulární diverzita odkazuje (a) na změnu místa (míst) proteinu, které je polymerně modifikováno, (b) na změnu délky polymerových adičních sloučenin z různých míst stejného proteinu nebo stejného místa (míst) v různých proteinech proteinového preparátu nebo (c) na změnu rozsahu a/nebo povahy kteréhokoliv větvení polymerových adičních sloučenin z různých míst stejného proteinu nebo stejného místa (míst) v různých proteinech proteinového preparátu. Jak se v tomto textu používá, termín molekulárně homogenní odkazuje na proteinový preparát, ve kterém všechny proteinové molekuly obsahují aminokyselinovou sekvenci a stejné polymerní modifikace ve stejných polohách. Směs dvou nebo více molekulárně homogenních proteinových preparátů je v tomto textu nazývána molekulárně definovaný preparát.

Podle tohoto aspektu vynálezu řešení výše uvedených problémů heterogenity polymeru, diverzity a nevhodnosti zahrnuje produkci nové skupiny biologicky kompatibilních ·· ·· ·* «··· ·· ···· ···« ··· »« · • ·· · · · · · · · · · • ······ · ··· » · polymerů, které spojují výhody obou polypeptidů (přesnou délku, příhodnou syntézu) a pPEG (přesný PEG), flexibilního, amfifilního, neimunogenního polymeru, který není citlivý k proteázám) (Rose, K. Et al. (patentová přihláška Spojených Států č. 09/379 297, v tomto textu zahrnuta formou odkazu).Tato nová skupina biologicky kompatibilních polymerů má vzorec:

-[CO-X-CO-NH-Y-NH]_nkde n je celé číslo, výhodně od 1 do 100 a výhodněji od 2 do 100, kde X a Y jsou biologicky kompatibilní repetiční prvky přesné struktury spojené amidovou vazbou.

Výhodně jsou X a Y dvojmocné organické skupiny postrádající reaktivní funkční skupiny nebo jsou nepřítomny, a jsou stejné nebo různé a mohou se měnit nezávisle s každou repetiční jednotkou (n) . Výhodně, když n=2, je alespoň jeden z X nebo Y vybrán ze skupiny, kterou tvoří substituovaná, nesubstituovaná, rozvětvená a lineární alifatická a aromatická skupina. Výhodněji, jeden z X nebo Y je vybrán ze skupiny, kterou tvoří fenylová skupina, alkylenová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina obsahující heteroatom, alkylenová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku obsahující heteroatom, alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku obsahující heteroatom a jejich kombinace.

Obzvláště výhodné pPEG skupiny mají vzorce:

-(CO- (CH₂) 2-CO-NH- (CH₂) 3- (OCH₂CH₂) ₃-CH₂-NH}_nkde n se výhodně mění od 1 do 100 a výhodněji od 2 do 100

nebo

-{CO- (CH₂) 2-CO-NH- (CH₂) s-NH-CO- (CH₂) 2-CO-NH- (CH₂) 3(OCH₂CH₂) 3-CH2-NH-}_nkde n se výhodně mění od 1 do 50 a výhodněji od 2 do 50.

Takové pPEG skupiny mohou být syntetizovány kterýmkoliv z celé řady způsobů. Tyto skupiny jsou nicméně výhodně tvořeny spíše s použitím stupňovitého řetězového sestavení jednotek na pevné fázi než polymerizačním postupem. Použití takového sestavení umožňuje skupinám preparátu to, že mají definovanou a homogenní strukturu, pokud jde o jejich délku, povahu jejich X a Y substituentů, polohu (polohy) (jestliže vůbec) bodů větvení a délku, X a Y substituenty a polohu (polohy) každé větve.

Výhodně jsou tyto skupiny syntetizovány kroky, jako jsou například:

(a) acylace aminoskupiny nebo hydroxylové skupiny sloučeniny vzorce Z-Q-nosič molárním nadbytkem derivátu dvojsytné kyseliny mající vzorec HOOC-X-COOH, kde Z je H₂N- nebo HO, Q je linker nebo cílová molekula a nosič je pevná fáze, matrix nebo povrch, (b) aktivace volné karboxylové skupiny produktu z kroku (a) , (c) aminolýza produktu z kroku (b) s molárním nadbytkem diaminu majícího vzorec NH₂-Y-NH₂ a (d) volitelně opakování kroků (a)- (c) s použitím HOOC-X-COOH a NH₂-Y-NH₂, kde X a Y jsou dvojmocné organické skupiny nebo chybějí, a jsou stejné nebo různé a mohou se měnit nezávisle s každou z volitelně repetičních jednotek, a jsou stejné nebo různé oproti X a Y substituentům • · • · použitých ve kterémkoliv předchozím kroku acylace a aminolýzy.

Ve výhodném provedení jsou použity 6-mery, 12-mery, 18mery a 32-mery výše uvedené repetiční jednotky. Kde je žádoucí, může být repetiční jednotka použita například ve spojení s aminoskupinou lysinu za vzniku rozvětvené struktury pPEG. PPEG může být připojen k syntetickým proteinům podle předkládaného vynálezu celou řadou chemických postupů, včetně tvorby thioetherové, oximové a amidové vazby.

V jednom provedení stupňovité řetězové sestavení jednotek na pevné fázi obsahuje:

Krok 1: kondenzace chráněné nebo nechráněné dvojsytné kyseliny k aminoskupině na pryskyřici za vzniku amidové vazby ve vazebném místě (kde PG je chránící skupina, která je přítomná nebo chybí v závislosti na použité dvojsytné kyselině):

PG-OOC-X-COOH + NH₂-Y-NH-pryskyřice

Krok 2: odstranění chránící skupiny (PG) na pryskyřici, jestliže je přítomna

HOOC-X-CO-NH-Y-NH-pryskyřice

Krok 3: kondenzace chráněné nebo nechráněné diaminoskupiny ke karboxyskupině na pryskyřici za vzniku amidové vazby ve vazebném místě (kde PG je přítomná nebo chybí v závislosti na použité diaminoskupině)

PG-NH-Y-NH + HOOC-X-CO-NH-Y-NH-pryskyřice

Krok 4: odstranění chránící skupiny (PG) na pryskyřici, • · · · • · ·· • · · · • · · · jestliže je přítomna

-NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-pryskyřice

Krok 5: opakování kroků 1 až 4 'n' krát pro přidání 'n' jednotek, pak odštěpit od pryskyřice

-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH][CO-X-CO-NH-Y-NH]

Jak bylo diskutováno, lineární a rozvětvené pPEG konstrukty jsou výhodné polymery rozpustné ve vodě pro připojení k syntetickým molekulám stimulujícím erytropoézu podle vynálezu. Použité pPEG nesou připojené skupiny, které jsou nabité nebo neutrální ve fyziologických podmínkách a mohou být vytvořeny tak, aby se lišily v chemickém postupu použitém pro připojení, v délce, větvení a rozpustnosti v závislosti na použité pPEG struktuře. Jak je uvedeno výše, výhodné pPEG podle vynálezu zahrnují polyamid rozpustný ve vodě mající repetiční jednotku -CO-X-CO-NH-Y-NH-, kde jeden nebo oba X a Y obsahují repetiční jednotku rozpustnou ve vodě a nejvýhodněji repetiční jednotku založenou na 'PEG'. Ačkoli oligomočoviny jsou v principu dostupné s použitím jednoduchého dvoustupňového postupu na pevné fázi, jak je ukázáno níže pro případ amino-pryskyřice, NH2-pryskyřice, a symetrického diaminu, NH₂-Y-NH₂:

Aktivace karbonyldiimidazolem -» im-CO-NH-pryskyřice Aminolýza diaminem NH2-Y-NH2 -» NH2-Y-NH-CO- NH-pryskyřice

Kde tyto dva kroky mohou být opakovány nesčetněkrát za vzniku oligomočoviny s repetiční jednotkou NH-Y-NH-CO-, tento ·· ·« ·· ···· ·· ···· ···· ··· · · * • ·· · · ···· · · · • ·····» · · · · · · přístup je méně výhodný. To je proto, že výtěžky výše uvedených kroků nemusí být vysoké při teplotě místnosti, dokonce i při velmi vysokém nadbytku činidel a dlouhých reakčních časů. V souladu s tím je výhodné použít trojstupňový postup na pevné fázi, ukázaný níže pro případ použití aminopryskyřice, NH₂-pryskyřice, za vzniku polyamidu. Reagencie HO₂C-X-CO₂H a NH₂-Y-NH₂ by měly být symetrické, aby se zabránilo tvorbě izomerních produktů.

Acylace dvojsytnou kyselinou HO₂C-X-CO₂H -» HO-CO-X-CO-NHpryskyřice

Aktivace karbonyldiimidazolem -► im-CO-OCO-X-CO-NHpryskyřice

Aminolýza diaminem NH₂-Y-NH₂ -> NH₂-Y-NH-CO-X-CO-NHpryskyřice

Tyto tři kroky mohou být opakovány v sekvenci nesčetněkrát za vzniku polyamidu s repetiční jednotkou -NH-Y-NH-CO-X-CO-. Polymer obsahuje přesný počet monomerních jednotek, X a Y mohou být změněny samostatně v každém kroku a mohou být také koncové skupiny vybrány. Například při použití anhydridu kyseliny jantarové, sukcinátu (Suke) pro acylaci a 4,7,10trioxa-1,13-tridekandiaminu (také nazývaného EDA nebo TTD) pro aminolýzu, jsou tvořeny 'PEG'-založené polyamidy, kde X je -CH₂CH₂-, Y je -NH-CH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂) 3-CH2-NH- a repetiční jednotka je -NH-CH₂CH₂CH₂- (OCH₂CH₂) ₃-CH₂-NH-COCH₂CH₂CO-. Navzdory faktu, že postup zahrnuje dvojmocné reagencie činidla bez chránících skupin, zesítění není problém, když jsou použity standardní komerční pryskyřice pro syntézu peptidů (Rose et al., patentová přihláška Spojených Států č. 09/379 297) a Rose et al., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 7034), kromě toho, jak • · • ·ί • · · · · · je uvedeno níže v případě rozvětvených Lys jader pro výrobu rozvětvených konstruktů.

Například rozvětvené pPEG konstrukty mohou být tvořeny podobně pokud jde o konstrukty nazvané chemobody popsané v práci Rose et al. , (patentová přihláška Spojených Států č. 09/379 297) a Rose, K. A Vizzavona, J. (J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 7034). Mohou být tedy vytvořeny rozvětvené pPEG konstrukty, které mají rozvětvené jádro, jako je například rozvětvené jádro lysinu, které je kondenzováno přes oximové linkery na výhodný polyamid rozpustný ve vodě, jako je například - (COCH2CH2CO-NH-CH2CH2CH2- (OCH₂CH₂) ₃-CH₂-NH) _n-.

Například oximové vazby mohou být snadno vytvořeny mezi aminooxyacetylovou skupinou na Lys postranním řetězci na druhém konci polyamidu a glyoxylylovými skupinami na lysinovém jádru, například tetramerním jádru (O=CHCO) ₄Lys₂Lys-. Oximový linker z každého bodu rozvětvení lysinu může být připraven jako struktura -Lys (COCH₂ON=CHCO-) amid-. Alternativní konstrukce může umístit oximovou vazbu mezi polyamid a volnou připojenou skupinu polyamidu, výhodně s použitím monodiaminu a odstraněním chránící skupiny po polyamidu za vzniku čtyřmocného rozvětveného chráněného kondenzaci konstruktu uvedeného níže:

[O=CHCO- (NH-CH₂CH₂CH₂- [OCH₂CH₂] ₃-CH₂-NH-COCH₂CH₂CO-) _n] ₄Lys₂LysChemie oximů může být použita nejen pro přípravu dimerních a tetramerních rozvětvených konstrukty, ale je také vhodná ke spojování oktamerních rozvětvených konstruktů (Rose, K., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 30, Rose, K. et al., Bioconj .

Chem., 1996, 7, 552). Při použití těchto pPEG polyamidů je samozřejmě možné použít pro tyto účely jiné chemické postupy • · ·* « « «··· «· · · > · ···· »·» · · · • · · · · ···· · · · • ··»··· · · · · · · • · · ·· · ···· • · β« ·· ·«· · «V (viz např. obrázek 13). Navíc tvorba polyamidu může být zavedena do syntetického schématu pro syntézu peptidů zahrnující Boc nebo Fmoc chemické postupy, ale při vypracovávání takových schémat se musí mít na mysli, že aminolýza odstraní Fmoc skupinu a odstraní formylovou ochranu indolu, jestliže je použit Boc chemický postup.

V souladu s tím mohou být vytvořeny pPEG, které mají různá rozvětvená jádra (např. lysinové rozvětvené jádro apod.) spojené vazbou volby (např. amidovou, thioetherovou, oximovou apod.) k lineárnímu polyamidu rozpustnému ve vodě (např.,(Sukc-TTD)_n-, apod.), kde volný konec každého lineárního polyamidu rozpustného ve vodě může být opatřen požadovanou připojenou skupinou (např. karboxylát, aminoskupina, amidoskupina apod.) za vzniku požadovaného náboje. Navíc lineární a rozvětvené pPEG podle předkládaného vynálezu mohou být vytvořeny tak, aby zahrnovaly unikátní funkční skupinu pro připojení k syntetickému proteinu nesoucímu jednu nebo více unikátních a vzájemně reaktivních charakteristických skupin a připojené skupiny pPEG budou výhodně neantigenní (viz např. obrázek 13).

V obzvláště výhodném provedení syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle vynálezu jsou modifikovány molekulárně homogenními glykomimetickými polymery rozpustnými ve vodě vzorce:

U-sl-B-s2-Polymer-s3-J* kde U je zbytek unikátní funkční skupiny, B je rozvětvené jádro mající tři nebo více větví, které mohou být stejné nebo různé a mohou být přítomny nebo chybět, Polymer je polyamid mající molekulovou hmotnost větší než přibližně 5 000 D vzorce «· *··»

9 · *» · • 9 « > * · • · * * « ·»·»*

- [C(Ο)-X-C(Ο)-ΝΗ-Υ-ΝΗ]η- nebo - [NH-Y-NH-C (Ο)-X-C (0) ] η-, kde X a Υ jsou dvojmocné skupiny, které mohou být stejné nebo různé a mohou být rozvětvené nebo lineární a n je individuální celé číslo od 2 do 50, a kde každý nebo oba X a Y obsahují v podstatě neantigenní repetiční jednotku rozpustnou ve vodě, která může být lineární nebo rozvětvená, J* je zbytek v podstatě neantigenní připojené skupiny mající čistý náboj ve fyziologických podmínkách vybraný ze skupiny, kterou tvoří negativní, pozitivní a neutrální náboj, a kde sl, s2 a s3 jsou skupiny spacerů nebo linkerů, které mohou být stejné nebo různé, a mohou být individuálně přítomny nebo nepřítomny. Takové polymery zahrnují polymery popsané v patentové přihlášce Spojených Států č. 60/236 377, která je v celistvosti zahrnuta v tomto textu formou odkazu. Vzorec Usl-B-s2-Polymer-s3-J* také může být reprezentován vzorcem U-BPolymer-J*, kde skupiny spacerů nebo linkerů sl, s2, s3 mohou být přítomny nebo chybět.

Výhodný postup tvorby výhodných glykomimetických polymerů podle vynálezu je znázorněn na obrázcích 5 až 7. Obrázky 5A-5B zobrazují postup tvorby rozvětveného jádra (B) na pevné fázi a unikátní chemoselektivní funkční skupiny (U) polymeru rozpustného ve vodě U-B-Polymer-J* podle vynálezu. Postup může být prováděn v roztoku, ačkoli postup na pevné fázi je výhodný, jak ukázáno. Konkrétně, obrázek 5A ukazuje ortogonálně chráněnou U-B prekurzorovou skupinu s reaktivní skupinou skupinou ( ) a základní geometrická struktura takového konstruktu je zobrazena tečkami spojenými vazbou tato základní geometrická struktura není zamýšlena omezovat použité typy chemických vazeb nebo skupin, ale pouze znázorňuje relativní body geometrie pro budování struktur a body chemického zpracování vhodné k vytvoření U-B skupin podle vynálezu. Ortogonálně chráněný U-B prekurzor je kondenzován • * • · · · k polymernímu nosiči/pryskyřici obsahujícímu vhodný štěpitelný /' v linker a ko-reaktivní skupinu v J po aktivaci, která je schopná kovalentní vazby k U-B prekurzoru:

Polymerní

0—□—¹

I

Linker nosič

Tento systém využívá principy organické chemie používající polymerní nosič. Po kondenzaci je zpracováno rozvětvené jádro (je ukázán pouze první bod větvení a další body větvení mohou být přítomny nebo chybět) jak znázorněno, za vzniku rozvětveného jádra, které je vhodné pro následné připojení požadované Polymerní složky, neantigenní lineární polymer jako je například v podstatě rozpustný ve vodě. Je také ukázána U skupina, která může být poskytnuta na počátku syntézy jako část ortogonálně chráněného U-B prekurzoru nebo vypracována během vytvoření rozvětveného jádra B nebo po vytvoření jádra. Zatímco připojení Polymerní složky může být dosaženo na pryskyřici, tj . před odštěpením, výhodný způsob je odštěpení U-B skupiny od polymerního nosiče/pryskyřice tak, aby se vytvořilo U-B jádro, které může být purifikováno pro následné připojení Polymerní složky.

Jak znázorněno, připojené body větvení jádra skupiny B jsou sestaveny tak, aby zahrnovaly funkční skupinu (Punc), která může být stejná nebo různá a může být reverzibilně chráněna (PG, PG' nebo PG) nebo nechráněna. V každém případě konečný krok pro připojení Polymerní složky zahrnuje vytvoření funkční skupiny (Punc) v připojených bodech větvení a vytvoření skupiny U (viz obrázek 7) . Obrázek 5B ukazuje alternativní postup, ve kterém je chráněný U-B prekurzor použit v kombinaci s polymerním nosičem nesoucím linker, který • · • · · ·

4 4 » ·« · 4 4 4 ···· 4 4 4 4 9 · • ·· * 4 «444 4 4 4

44444« · 444 4 4

4 44 4 4444

44 4» 444 44 «4 po odštěpení vytvoří požadovanou chráněnou nebo nechráněnou U skupinu. Obrázek 5B také ukazuje připojení předem sestaveného rozvětveného jádra B k polymernímu nosiči a použití pryskyřice tvořící U skupinu, aby vznikla U-B skupina pro následné připojení Polymerní složky.

Obrázky 6A-6D zobrazují postup na pevné fázi tvorby výhodných v podstatě neantigenních ve vodě rozpustných polyamidových Polymer-J* složek podle vynálezu pro následné připojení k U-B jádru. Ačkoli je znázorněn postup na pevné fázi, což je výhodný postup, postup ve fázi roztoku může být upraven tak, aby se dosáhlo stejného konečného výsledku. Na obrázcích 6A a 6B jsou jednotky dvojsytné kyseliny a diaminoskupiny kondenzovány s použitím principů organické chemie na pevné fázi. Volitelně, chráněné jednotky amino-X'kyseliny a/nebo amino-Y'-kyseliny mohou být zavedeny pro další diverzitu skupin X a Y do konečného štěpného produktu majícího polyamidovou strukturu vzorce -[NH-Y-NHCO-X-CO]-. Obrázek 6A ukazuje syntézu ve směru od N-konce k C-konci, zatímco obrázek 6B ukazuje syntézu ve směru od C-konce k N-konci. Na obrázcích 60 a 6D jsou chráněné jednotky amino-X'-kyseliny a/nebo aminoY'-kyseliny kondenzovány s použitím principů organické chemie na pevné fázi. Obrázek 60 ukazuje syntézu ve směru od N-konce k C-konci, zatímco obrázek 6D ukazuje syntézu ve směru od Ckonce k N-konci. Jak je zjevné z obrázků 6A-6D, povaha konečných polyamidových produktů může být přesně řízena, což závisí na počtu cyklů, které se uskuteční v syntéze. Navíc připojená skupina J* může být vytvořena dle prakticky kteréhokoliv popisu definovaného uživatelem. Kde jsou použity mono-disperzní repetiční jednotky X, Y, X' a Y', může být přesně řízena přesná molekulární struktura konečného polyamidového produktu.

Výhodný postup kondenzace U-B složky k Polymer-J* složce • · · · ···· ··· « * · • ·· · · ···· < · · • ······ · · * · · 9 • « · · ·· · · · ·· · · za vzniku výhodných syntetických polymerních konstruktů podle vynálezu vzorce U-B-Polymer-J* je ukázán na obrázku 7. Jak znázorněno, mohou být poskytnuty různé chránící skupiny a jsou volitelné v závislosti na zamýšleném konečném použití daného konstruktu. Jsou také znázorněny různé způsoby vzniku požadovaných U-B-Polymer-J* konstruktů, včetně postupu na pevné fázi a postupu ve fázi roztoku.

Jak je uvedeno výše, výhodné ve vodě rozpustné repetiční jednotky zahrnují polyalkylenoxid, polyamidalkylenoxid nebo jejich deriváty. Nejvýhodnější repetiční jednotka ve vodě rozpustná obsahuje ethylenoxid vzorce - (CH2-CH2-O) - nebo -(CH2CH₂—0) —. Počet takových ve vodě rozpustných repetičních jednotek se může významně měnit, ale výhodnější počet takových jednotek je 2 až 500, 2 až 400, 2 až 300, 2 až 200, 2 až 100, 2 až 50 a výhodněji 2 až 32, přičemž 3 až 8 je nej výhodně j ší. Příklad výhodnějšího provedení je, když jeden nebo oba X a Y jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří: -((CH₂)_ni-(CH₂-CH₂-O)n2(CH₂)_nl-)-or-( (CH₂)ni-(O-CH2-CH₂)n2-(CH2)ni-) , kde nl je 1 až 6, 1 až 5, 1 až 4 a nejvýhodněji 1 až 3 a kde n2 je 2 až 50, 2 až 25, 2 až 15, 2 až 10, 2 až 8 a nejvýhodněji 2 až 5. Příklad vysoce výhodného provedení je, když X je -(CH₂-CH₂)- a když Y j e - (CH₂- (CH₂-CH₂-O) ₃-CH₂-CH₂CH₂) - nebo - (CH₂-CH₂-CH₂- (O-CH₂-CH₂) 3CH₂)-. Ještě výhodnější jsou mono-disperzní přípravky, kde každý n je nespojité celé číslo. Ve vysoce výhodném provedení X je -(CH₂-CH₂)~ a Y je - (CH₂-(CH₂-CH₂-O) 3-CH2-CH2-CH2) _n- nebo (CH₂-CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂) 3-CH2) _n-, kde n je 12 až 36.

Obzvláště výhodný Polymer, když jde o polymer rozpustný ve vodě obsahující polymerové řetězce mající polyalkylenoxidové repetiční jednotky, jako například ethylenoxidové repetiční jednotky, tak je výhodné, když každý řetězec má molekulovou hmotnost mezi přibližně 1 500 až přibližně 42 000 D a výhodně mezi přibližně 2 000 až přibližně 20 000 D, což je • · ·* ·· ···· · · • · · · v · · · · · • ·· · · · · · · · · · nejvýhodněj ší.

Výhodná U skupina obsahuje skupinu schopnou chemické ligace. Výhodné polymery jsou rozvětven, kde skupina B obsahuje tři nebo více větví. Výhodná složka J* obsahuje skupinu, která je ionizovatelná ve fyziologických podmínkách a nejvýhodněji jednu, který je záporně nabitá. Každá nebo obě U a J mohou obsahovat chránící skupinu, který je schopná být odstraněna bez poškození integrity konstruktu.

Výhodné spacery nebo linkery zahrnují lineární nebo rozvětvené skupiny obsahující jednu nebo více repetičních jednotek použitých v polymeru rozpustném ve vodě, diaminoskupiny a nebo jednotky dvojsytné kyseliny, přírodní nebo nepřirozené aminokyseliny nebo jejich deriváty, a také alifatické skupiny, včetně alkylové skupiny, arylové skupiny, heteroalkylové skupiny, heteroarylové skupiny, alkoxyskupiny, apod., které výhodně obsahují až 18 atomů uhlíku nebo dokonce další polymerový řetězec.

Jak je uvedeno výše, složka U je zbytek funkční skupiny, která je schopná být připojena nebo je připojena k cílové molekule, jako je například peptid nebo polypeptid nebo jiný požadovaný povrch. Když U je zbytek funkční skupiny pro kondenzaci k cílové molekule, obsahuje U nukleofilní skupinu nebo elektrofilní skupinu a cílová molekula obsahuje vzájemně reaktivní elektrofilní skupinu nebo nukleofilní skupinu, v daném pořadí.

Mnoho takový vzájemně reaktivních funkčních skupin je známo a jsou schopné připojení k funkčním skupinám postranního řetězce společným peptidům a polypeptidům nebo derivatizovaným funkčním skupinám postranního řetězce (Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry, 1995, 6, 150-165, „Perspectives in Bicconjugate Chemistry, C. F. Meares, vyd., ACS, 1993, „Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, S. S.

• · • * • · · *

Wong, vyd., CRC Press, lne. (1993)). Příklady funkčních skupiny zahrnují skupiny schopné reakce s aminoskupinou, jako jsou například (a) uhličitany, jako je například pnitrofenylová skupina nebo sukcinímidylová skupina, (b) karbonylimidazoly, (c) azlaktony, (d) cyklické imidthiony a (e) isokyanáty nebo isothiokyanáty. Příklady funkčních skupin schopných reakce se skupinami karboxylové kyseliny a reaktivními karbonylovými skupinami zahrnují (a) primární aminy nebo (b) hydrazinové a hydrazidové funkční skupiny, jako jsou například acylhydrazidy, karbazáty, semikarbamáty, thio karbazáty, aminooxyskupiny apod. Funkční skupiny schopné reakcí s merkaptoskupinami nebo sulfhydrylovými skupinami zahrnují fenylglyoxalové skupiny, maleimidy a halogeny. Příklady funkčních skupin schopných reakce s hydroxylovými skupinami, jako jsou například (karboxylové) kyseliny nebo jiné nukleofíly schopné reakce s elektrofilním centrem, zahrnují hydroxylovou skupinu, aminoskupinu, karboxylovou skupinu, thiolové skupiny, aktivní methylen apod.

Například výše uvedený polymer může být připraven tak, aby nesl složku U jako funkční skupinu pro připojení k cílové molekule, kde funkční skupina je akrylát, aldehyd, keton, aminooxyskupina, amin, karboxylové kyselina, ester, thioester, skupina, kyanoacetát, distearylfosfatidylazid, izokyanát, maleimid, atom halogenu, thiolová dipalmitoylfosfatidylethanolamin, ethanolamin, epoxid, hydrazid, methakrylát, nitrofenylkarbonát, orcnopyridyldisulfid, silan, sulfhydrylová skupina, vinylsulfony, sukcinimidylglutarát, sukcimidylsukcinát, jantarová kyselina, tresylát apod. U také může být poskytnuta v aktivovatelné formě, např. jako karboxylová kyselina, která může být konvertována na svůj účinný ester, který je schopný reakce s nuklecfilem, jako je například amin.

···· *· · · ·· ···· ··· ·· · • ·· · · ···· · · * • ······ · · · · · ·

Ve výhodném provedení U je zbytek unikátní funkční skupiny, která je selektivně reaktivní s unikátní funkční skupinou na cílové molekule. Tento aspekt vynálezu ztělesňuje principy syntézy peptidů (strategie chránících skupin) a chemické ligace (parciální nebo žádné strategie chránících skupin) jako projednáno výše v části II. Tak, U může představovat zbytek širokého rejstříku funkčních skupin, jako jsou například skupiny popsané výše. Výhodné U skupiny jsou přístupné strategiím zachycujícím amin (např. ligace tvorbou hemiaminalu, tvorbou iminu a Michaelovou adicí), strategie zachycující thiolovou skupinu (např. ligace tvorbou merkaptidu, výměnou disulfidu), strategie nativní chemické ligace (např. ligace výměnou thioesteru zahrnující cystein nebo thiolovou skupinu obsaženou v postranním řetězci aminokyselinového derivátu) a strategie ortogonální ligační kondenzace (např. ligace tvorbou thiazolidinu, výměnou thioesteru, tvorbou thioesteru, výměnou disulfidu a tvorbou amidu) (viz např. Coltart, DM., Tetrahedron, 2000, 56, 34493491). Konkrétně výhodný U obsahuje zbytek unikátní funkční skupiny použité v chemii vodné kompatibilní chemické ligace, jako je například popsána výše v části II. V souladu s tím, U může být funkční skupina schopná vytvoření vazby vybrané ze skupiny, kterou tvoří karbonát, ester, urethan, orthoester, amid, amin, oxim, ímid, močovina, thiomočovina, thioether, thiourethan, thioester, ether, thaizolídin, hydrazon, oxazolidin apod. Výhodné vazby jsou oximové a amidové vazby.

Jak je uvedeno výše, B je skupina rozvětveného jádra mající tři nebo více větve a může být přítomná nebo chybět. Když je B přítomná, jedna větev je připojena k U nebo ke spaceru či linkeru připojenému k U a každá další větev je připojena k Polymeru nebo ke spaceru či linkeru připojenému k Polymeru. Příklady rozvětvených jader 3 zahrnují, ale bez

• · · · · ♦ · omezení, aminoskupinu, amidoskupinu, karboxylovou skupinu a jejich kombinace. Ty zahrnují oligoamidy lysinu apod. nebo oligomery připravené z alkandiaminů a akrylové kyseliny (polyamidoaminy), druhé uvedené poskytují čistý pozitivní náboj v rozvětveném jádru, (viz např. Zeng et al., J. Pept. Sci., 1996, 2, 66-72, Rose et al., Bioconjugate Chem., 1996, 7 (5) : 552-556, NovoBiochem Catalog and Peptide Synthesis

Handbook, Laufelfingen, 2001, Wells et al., Biopolymers, 1998, 47, 381-396, Mahajan et al., 1999, 40, 4909-49-12, Judson et al., 1998, 39, 1299-1302, Swali et al., 1997, 62, 4902-4903, patenty Spojených Států č. 5 932 462, 5 919 455, 5 643 575, 5 681 567). Mnoho dalších různých rozvětvených jader může být jsou k tomuto účelu vhodné, včetně substituovaných substituovaných dvojsytných kyselin, alkylových kyselin, jako je například glycerol a dalších skupin majících tři nebo více funkčních nebo aktivovatelných skupin včetně multivalentní alkylové skupiny, arylové skupiny, heteroalkylové skupiny, heteroarylové skupiny a alkoxyskupin apod. a oligosacharidů (např. Nierengarten et al., Tetrahedron Lett., 1999, 40, 5681-5684, Matthews et al., Prog. Polym.

Sci., 1998, 1-56, Suner et al., Macromolecules, 2000, 33, 253, Fischer et al., Angew. Chem. Int. Ed. , 1999, 38, 884, Sunder et al., Adv. Mater., 2000, 12, 235, Mulders et al.,

Tetrahedron Lett., 1997, 38, 631-634,

1997, 38, 30-3088, a (1) : 70-74) . Nejvýhodnější rozvětvené jádro připojené k Polymerní složce je připojeno amidovými vazbami.

použito a diaminů,

Mulders et al., Turnbull et al.,

Tetrahedron Lett., Chembiochem, 2000,

Výhodná rozvětvená jádra vycházejí z aminoskupiny, karboxylových nebo smíšených amino- a karboxylových funkčních skupin. Příklady výhodných rozvětvených jader jsou jádra z aminoskupin lysinu, rozvětvená jádra z asparagové nebo glutamové kyseliny a rozvětvená jádra z γ-glutamové kyseliny, v daném pořadí. Navíc výhodné rozvětvené polymerní konstrukty jsou ty, ve kterých rozvětvení pochází z jednoho rozvětveného jádra, jako je například oligoamidové nebo polyamidoaminové jádro. Nicméně mohou být použity další skupiny rozvětvených konstruktů, jako například „červovité („worm-like) struktury, ve kterých rozvětvení vychází ze sekvence mnohonásobných rozvětvených jader distribuovaných podél hlavního řetězce polymeru (Schluter et al., Chem. Int. Ed., 2000, 39, 864). V závislosti na chemickém složení a/nebo objemnosti hlavního řetězce polymeru a repetičních jednotek mohou být výsledné „worm-like struktury navrženy tak, aby byly rozpustné ve vodě nebo náchylné k indukci kapalné krystalické organizace (Ouali et al., Macromolecules, 2000, 33, 6185), což může být výhodné pro aplikační použití, stabilitu a dobu působení. Jako další rozvětvené polymerní konstrukty podle vynálezu, „worm-like konstrukty jsou vytvořeny tak, aby obsahovaly připojenou funkční skupinu obsahující U.

Polymerní složka nebo jeden či více spacerů nebo linkerů mohou zahrnovat polymerové řetězce nebo vmezeřené linkery nebo vazby, které jsou biologicky stabilní nebo biologicky rozložitelné, například jak bylo diskutováno výše v části I. Jak je také poznamenáno výše v části I, složka J* je zbytek připojené skupiny mající čistý náboj ve fyziologických vybraný ze skupiny, kterou tvoří negativní, i neutrální náboj. Nejvýhodnější je, když J* obsahuje ionizovatelnou karboxylátovou skupinu a má čistý negativní náboj ve fyziologických podmínkách. Složky sl, s2 a s3 jsou skupiny spacerů nebo linkerů, které mohou být stejné nebo různé a mohou být individuálně přítomny nebo nepřítomny, jako jsou například skupiny diskutované v části I.

podmínkách pozitivní

•« ·· ·· ··· · · · ·

Nejvýhodněji spacer nebo linker obsahuje polymerový řetězec, kde spacer nebo linker obsahuje jednu nebo více repetičních jednotek vzorce - CO-NH-Y-NH] _nIV. Farmakologie

Polymerně modifikované syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle předkládaného vynálezu mohou být použity jako farmaceutické přípravky pro provádění léčby nemocí a chorobných stavů. V souladu s tím v dalším provedení se vynález týká farmaceutických přípravků obsahujících syntetický protein stimulující erytropoézu podle vynálezu nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí. Takové farmaceutické přípravky mohou obsahovat jeden nebo více excipientů. Výhodné excipienty jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří pufr, proteinový nosič, aminokyselina, detergent, lipid, polymer rozpustný ve vodě a konzervační činidlo. Farmaceutické přípravky také mohou kombinovat jednu nebo více přidaných účinných farmaceutických složek, jako například jeden nebo více dalších bioaktivních přípravků (např. malé organické molekuly, další proteinová léčiva apod.) kromě syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu. Takové farmaceutické přípravky mohou být použity ve výhodných způsobech podle vynálezu. Ty zahrnují způsob zvyšování tvorby červených krvinek u savce, hematokritu, hemoglobinu a množství retikulocytů. Tyto způsoby zahrnují podávání savci účinného množství syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu podle vynálezu tak, aby se sledoval požadovaný účinek.

Nejvýhodněji, při podávání pacientovi nebo jedinci, který tuto léčbu potřebuje v potřebě terapie, jsou tyto syntetické polypeptidy a/nebo proteiny stimulující erytropoézu podávány s použitím lékového aplikačního systému. Použití takového systému umožní, že lék je prezentovaný pacientovi způsobem,

I · · · · · · • · « « · • · · · · · · »· · · · · · · zvyšuj i ochranu zahrnují: suché virovými náplasti, který jej učiní pro pacienta přijatelný a zvýší účinnost požadované biologické aktivity. Pro účely předkládaného vynálezu výhodné lékové aplikační systémy zahrnují systémy schopné podávání polypeptidu nebo proteinů perorální, nazální nebo inhalační cestou nebo intramuskulárně, subkutánně, transdermálně, intravenózně, intraurálně nebo intraokulárně.

Takové lékové aplikační systémy mohou zahrnovat formulace, které poskytují místně specifické uvolňování nebo které intestinální sliznice. Vhodné formulace práškové formulace, aplikaci opouzdřením částicemi, opouzdření lipozomy, transdermální elektricky podporovaný transport (elektroporační terapie) a kondenzace polymer/niazon.

Ve výhodném provedení taková lékové aplikační systémy reagují na změny biologického prostředí a dodávají nebo přestávají dodávat léky na základě těchto změn. Celá řada látek byla použita pro kontrolu uvolňování léků a dalších účinných látek: póly(urethany), póly(siloxany), póly(methylmethakrylát), póly(vinylalkohol) pro hydrofilii a koncentraci, póly(ethylen), póly(vinylpyrolidon), póly(2hydroxyethylmethakrylát), póly(N-vinylpyrolidon), póly(methylmethakrylát), póly(vinylalkohol), póly(akrylová kyselina), polyakrylamid, póly(ethylen-ko-vinylacetát), póly(ethylenglykol), póly(methakrylová kyselina), apod. V dalším výhodném provedení biologicky odbouratelné polymery jsou použity pro usnadnění aplikace léku. Takové polymery zahrnují polylaktidy (PLA), polyglykolidy (PGA), poly(laktidko-glykolidy) (PLGA), polyanhydridy a polyorthoestery. Zařízení pro aplikaci léků a způsob popsány v patentech Spojených Států č 6 018 678, 6 017 318, 6 002 961,

792 451, 5 783 212, 5 766 633,

jej ich	použití	j sou
6 072 041, 6 041	253,
879 712,	5 849	331,
759 566,	5 690	954 ,

• · · · ·· ···· • 9 9 · · · · • ·· · · · · · · • ······ · 9

9 9 9 9 9 9 99

681 811, 4 659 558.

654 000, 5 641 511, 5 438 040, 4 810 499 a stimulující farmaceuticky nebo bází, kyselin,

V souladu s tím se další aspekt vynálezu týká farmaceutických přípravků a způsobů léčení savce, který to potřebuje, podáváním terapeuticky účinného množství sloučenin obsahujících polymerně modifikované syntetické proteiny erytropoézu podle vynálezu nebo jejich přijatelné soli. Termín farmaceuticky přijatelná sůl znamená sůl, která si podrží biologickou účinnost a vlastnosti polypeptidů podle vynálezu a která není biologicky či jinak nežádoucí. Soli mohou pocházet z kyselin Kyselé adiční soli pocházejí z anorganických jako je například chlorovodíková kyselina, bromovodíková kyselina, sírová kyselina (za vzniku sulfátových a bisulfátových solí) , dusičná kyselina, fosforečná kyselina apod. a organických kyselin, jako je například octová kyselina, propionová kyselina, glykolová kyselina, pyrohroznová kyselina, oxalová kyselina, jablečná kyselina, malonová kyselina, jantarová kyselina, maleinová kyselina, kyselina, vinná kyselina, citrónová kyselina, kyselina, skořicová kyselina, mandlová kyselina, methansulfonová kyselina, ethansulfonová kyselina, salicylová kyselina, p-toluensulfonová kyselina, apod. Bazické adiční soli mohou pocházet z anorganických bází a zahrnují sodné, draselné, lithné, amonné, vápenaté, horečnaté soli, apod. Soli pocházející z organických bází zahrnují sekundárních fumarová benzoová z primárních, substituovaných substituovaných isopropylaminu, tripropylaminu, aminů včetně aminů a soli tvorene a terciárních aminů, přirozeně se vyskytujících cyklických aminů, včetně trimethylaminu, dietylaminu, triethylaminu, ethanolaminu, 2-dimethylaminoethanolu, tromethaminu, lysinu, argininu, histidinu, kofeinu, procainu, • · • · « · « · • · · · hydrabaminu, cholinu, betainu, ethylendiaminu, glukózaminu, N-alkylglukaminů, theobromu, purinů, piperazinu, piperidinu, N-ethylpiperidinu, apod. Výhodné organické báze jsou isopropylamin, dietylamin, ethanolamin, piperidin, tromethamin a cholin.

Termín léčení, jak se v tomto textu používá, pokrývá každé léčení nemoci nebo chorobného stavu (např. anémie) u savce, obzvláště člověka, a zahrnuje: (i) prevenci nemoci nebo chorobného stavu, aby nenastal u pacienta, který může být k nemoci náchylný, ale u nějž ještě nebyla diagnostikována, (ii) inhibici nemoci nebo chorobného stavu, tj. zastavení jejího rozvoje nebo (iii) úlevu od nemoci nebo chorobného stavu, tj . vyvolání její regrese nebo zlepšení jejích symptomů.

Termín chorobný stav u savců, kterému je zabráněno nebo je zmírněn působením proteinu stimulujícího erytropoézu, jak se v tomto textu používá, je zamýšlen pro pokrytí všech chorobných stavů, u kterých se v oboru obecně připouští, že jsou užitečně léčeny proteiny stimulujícími erytropoézu obecně, a těch chorobných stavů, u kterých bylo zjištěno, že je jim možné zabránit nebo je zmírnit léčením specifickými sloučeninami podle vynálezu. Ty zahrnují, jako příklad bez omezení, anémii, β-thalasémii, perniciózní anémii, srpkovitou anémii, chronickou bakteriální endokarditidu, osteomyelitidu, juvenilní revmatoidní artritidu, revmatickou horečku, Crohnovu nemoc, ulcerativní kolitidu, apod.

Jak se v tomto textu používá, termín terapeuticky účinné množství se týká takového množství polymerně modifikovaného syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu, které, když je podáváno savci, který to potřebuje, je dostatečné pro uskutečnění léčby (jak byla definována výše), například jako induktor produkce červených krvinek, antianemický přípravek, • · ··· · · · · uskutečnění syntetických apod. Množství, které tvoří terapeuticky účinné množství se bude měnit v závislosti na proteinovém derivátu, chorobném stavu nebo nemoci a jejich závažnosti a na ošetřeném savci, jeho hmotnosti, věku, apod., ale může být určeno rutinně odborníkem s ohledem na současné znalosti a tento popis. Jak se v tomto textu používá, termín q. S. znamená přidání množství dostatečného pro dosažení řečené funkce, např. doplnit roztok na požadovaný objem (např. 100 ml).

Polymerně modifikované syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle tohoto vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelné soli, tj. účinná složka, jsou podávány v terapeuticky účinné dávce, tj. takovém množství, které, když je podáváno savci, který to potřebuje, je postačující pro léčby, jak bylo popsáno výše. Podávání proteinů stimulujících erytropoézu popsaných v tomto textu může být prostřednictvím kterýchkoliv přijímaných způsobů podávání pro přípravky, které slouží podobnému použití. Jak se v tomto textu používá, termíny polymerně modifikované syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle tohoto vynálezu, [farmaceuticky přijatelné soli] polypeptidů podle vynálezu a účinná složka jsou používány zaměnitelně.

Hladina polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulujících erytropoézu se ve formulaci může měnit v plném rozsahu používaném odborníky, např. přibližně od 0,01 hmotnostního procenta (% hmotnosti) do přibližně 99,99 hmotnostních procent proteinového antagonisty nebo agonisty na základě celkové formulace a přibližně 0,01 hmotnostního procenta až 99,99 hmotnostních procent excipientu. Typičtěji, polymerně modifikované syntetické proteiny stimulující erytropoézu budou přítomny v hladině přibližně 0,5 hmotnostního procenta až přibližně 80 hmotnostních procent.

* »*» · • · «· »9 *999 · · * « · · • ·· · 4 · · · 9 9 · · • ······ · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

1· ·· · * ··· 9 9 9 9

Zatímco humánní hladiny dávky ještě musí být pro polymerně modifikované syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle vynálezu optimalizovány, obecně je množství podávané sloučeniny samozřejmě závislé na pacientovi a chorobném stavu cíleném pro prevenci nebo úlevu, povaze nebo závažnosti utrpení, způsobu a schématu podávání a úsudku předepisujícího lékaře. Taková optimalizace použití je v oblasti schopností odborníka.

Podávání může být prostřednictvím kteréhokoliv přijatého systémového nebo lokálního způsobu, například parenterálním, perorálním (konkrétně pro formulace určené pro malé děti), intravenózním, nazálním způsobem, bronchiální inhalací (tj. aerosolová formulace), transdermálním nebo topickým způsobem, ve formě pevné, polotuhé nebo tekuté nebo aerosolové lékové formy, jako jsou například tablety, pilulky, tobolky, prášky, kapaliny, roztoky, emulze, přípravky pro injekce, suspenze, čípky, aerosoly apod. Polymerně modifikované syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle vynálezu mohou také být podávány v lékových formách s prodlouženým uvolňováním nebo s řízeným uvolňováním lékové formy, včetně depótních injekcí, osmotických pump, pilulek, transdermálních (včetně elektrotransportu) náplastí, apod., pro prodloužené podávání polypeptidů předurčenou rychlostí, výhodně v jednotkových lékových formách vhodných pro jedno podávání přesných dávek. Přípravky zahrnují obvyklý farmaceutický nosič nebo excipient a antagonistu nebo agonistu proteinu podle vynálezu a kromě toho mohou zahrnovat další léčivé přípravky, farmaceutické přípravky, nosiče, adjuvancia, apod. Nosiče mohou být vybrány z různých olejů, včetně minerálního (ropného), zvířecího, rostlinného nebo syntetického původu, například arašídový olej, sojový olej, minerální olej, sezamový olej apod. Voda, fyziologický roztok, vodná dextróza a glykolv jsou výhodné

Af »4A · >*· 44 *4 44*4 *»44 44« <4 « • 4 4 · 4 444» 4 · 4 «44444 r 444 4 4 • 4 · 44 4 4444

4· 44 494 4 4 4 4 tekuté nosiče, konkrétně pro injekční roztoky. Vhodné farmaceutické nosiče zahrnují škrob, celulózu, talek, glukózu, laktózu, sacharózu, želatinu, slad, rýži, mouku, křídu, silikagel, stearát horečnatý, stearát sodný, glycerol monostearát, chlorid sodný, sušené odtučněné mléko, glycerol, propylenglykol, vodu, ethanol, apod. Další vhodné farmaceutický nosiče a jejich formulace jsou popsány v Remington's Pharmaceutical Sciences od autora E. W. Martin.

Je-li žádoucí, podávaný farmaceutický přípravek může také obsahovat menší množství netoxických pomocných látek, jako jsou například smáčedla nebo emulgátory, pH pufrovací činidla apod., jako je například acetát sodný, sorbitan monolaurát, triethanolaminoleát, apod.

Ačkoli může být požadováno více účinné složky, může být použito perorální podávání pro aplikaci polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle vynálezu s použitím příhodného denního dávkovacího schématu, které může být upraveno podle požadovaného stupně prevence nebo pro zmírnění utrpení. Pro takové perorální podávání je farmaceuticky přijatelný netoxický přípravek vytvořen inkorporací kteréhokoliv z normálně používaných excipientů, jako je například farmaceutického stupně čistoty mannitol, laktóza, škrob, povidon, stearát hořečnatý, sacharín sodný, talek, celulóza, kroskarmelóza sodná, glukóza, želatina, sacharóza, uhličitan hořečnatý, apod. Takové přípravky mají formu roztoků, suspenzí, dispergovatelných tablet, pilulek, tobolek, prášků, s formulací prodlouženým uvolňováním apod. Perorální formulace jsou obzvláště vhodné pro léčbu gastrointestinálních chorobných stavů. Perorální biologická dostupnost pro obecné systémové účely může být upravena s využitím excipientů, který zlepší vychytávání do • · • · · « · β · · · · • · ····· ·

100 systémové cirkulace, jako například formulace obsahující acetylované aminokyseliny. (Viz např. patent Spojených Států 5 935 601 a patent Spojených Států 5 629 020).

Přípravky mohou mít formu tobolky, pilulky nebo tablety, a tak přípravek obsahuje spolu s účinnou složkou ředidlo, jako je například laktóza, sacharóza, fosfát vápenatý, apod., rozvolňovadlo, jako je například kroskarmelóza sodná, škrob nebo jejich deriváty, lubrikant, jako je například stearát hořečnatý apod., a pojivo, jako je například škrob, polyvinylpyrolidon, arabská guma, želatina, celulóza a jejich deriváty, apod.

Kapalné farmaceuticky aplikovatelné přípravky mohou být například připraveny rozpuštěním, disperzí, apod. polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle vynálezu (přibližně 0,5% až přibližně 20%) a volitelných farmaceutických adjuvancií v nosiči, jako je například voda, fyziologický roztok, vodná dextróza, ' glycerol, glykoly, ethanol, konzervační činidla apod., a tím vytvoří roztok nebo suspenzi. Je-li žádoucí, podávaný farmaceutický přípravek může také obsahovat menší množství netoxických pomocných látek, jako jsou například smáčedla, suspendující činidla, emulgátory nebo solubilizační činidla, pH pufry apod., například acetát sodný, citrát sodný, cyklodextrinové deriváty, polyoxyethylen, sorbitan monolaurát nebo stearát, apod. Účinné způsoby přípravy takových lékových forem jsou odborníkům známy nebo jsou jim zjevné, například viz Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensylvánie. Podávaný přípravek nebo formulace bude při každé příležitosti obsahovat množství účinné složky v množství účinném pro prevenci nebo zmírnění symptomů léčeného pacienta. Pro perorální podávání dětem je výhodná kapalná formulace (jako je například sirup nebo suspenze).

• · · · • · · ·

4» · · · ··· * · · • ·· · » · · · * · · * t ······ · · · « · * • · ··· .··♦· « « » · · · · » · · · · »

101

Pro pevnou lékovou formu obsahující kapalinu, roztok nebo suspenzi, například propylenkarbonát, rostlinné oleje nebo triglyceridy, je výhodné opouzdření v želatinové tobolce. Pro kapalnou lékovou formu roztok, např. polyethylenglykolu, může být naředěn dostatečným množstvím farmaceuticky přijatelného tekutého nosiče, např. vody, který snadno měřitelný pro podávání.

Alternativně, kapalné nebo polotuhé perorální formulace mohou být připraveny rozpuštěním nebo disperzí účinné složky v rostlinných olejích, glykolech, triglyceridech, propylenglykolesterech (např. propylenkarbonát) apod. a opouzdřením těchto roztoků nebo suspenzí v tvrdých nebo měkkých želatinových tobolkách.

Při použití polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle tohoto vynálezu k léčbě výše uvedených chorobných stavů, jsou účinné složky popsané v tomto textu výhodně podávány parenterálně. Parěnterální podávání je obecně charakterizováno injekcí, buď subkutánně, intramuskulárně nebo intravenózně a může zahrnovat intradermální nebo intraperitoneální injekce, a také injekce do sterna nebo infúzní techniky. Přípravky pro injekce mohou být připraveny v obvyklý formách, buď jako kapalné roztoky nebo suspenze, pevné formy vhodné pro vytvoření roztoku nebo suspenze v kapalině před injekcí, jako emulze nebo v biologicky kompatibilních na polymeru založených mikrosférách (např. lípozomy, deriváty polyethylenglykolu, polv(D,C)laktid apod.). Vhodné excipienty jsou například voda, fyziologický roztok, dextróza, glvcerol, ethanol apod. Kromě toho, je-lí žádoucí, podávané farmaceutické přípravky mohou také obsahovat menší množství netoxických pomocných látek, jako jsou například smáčedla nebo emulgátcry, pH pufry, zesilovače rozpustnosti, proteinové nosiče apod., jako je • · • · · · • · · ·

102 například acetát sodný, polyoxyethylen, sorbitan monolaurát, triethanolaminoleát, cyklodextriny, sérový albumin apod.

Polymerně modifikované syntetické proteiny stimulující erytropoézu podle předkládaného vynálezu mohou být podávány parenterálně, například rozpuštěním sloučeniny ve vhodném rozpouštědle (jako je například voda nebo fyziologický roztok) nebo inkorporací v lipozomální formulaci následované disperzí do přijatelné infúzní tekutiny. Typická denní dávka polypeptidu podle vynálezu může být podávána jednou infúzí nebo sérií infúzí proloženou periodickými intervaly. Pro parenterální podávání jsou obzvláště vhodné vodné roztoky účinné složky ve formě rozpustné ve vodě, například ve formě soli rozpustné ve vodě nebo vodných injekčních suspenzí, které obsahují látky zvyšující viskozitu, například karboxymethylcelulózu sodnou, sorbitol a/nebo dextran, a, jeli žádoucí, stabilizátory. Účinná složka, volitelně spolu s excipienty, může také být ve formě lyofilizátu a mohou být přetvořena do roztoku před parenterálním podáváním přidáním vhodných rozpouštědel.

Nověji vymyšlený přístup parenterálního podávání používá implantací systému s pomalým uvolňováním nebo s prodlouženým uvolňováním tak, že je udržována konstantní hladina dávky. (Viz např. patent Spojených Států 3 710 795, patent Spojených Států 5 714 166 a patent Spojených Států 5 041 292, které jsou tímto zahrnuty formou odkazu).

Procento účinné složky obsažené v takových parentálních přípravcích je velmi závislé na jejich specifické povaze, a také na aktivitě polypeptidu a potřebách pacienta. Nicméně jsou použitelná procento účinné složky od 0,01% do 10% v roztoku a bude vyšší, jestliže je přípravek pevná látka, která bude následovně naředěna na výše uvedená procenta. Výhodně ořípravek zahrnuje 0,02 až 8% účinné složky v roztoku.

• · • · ···· · · · « • · · · · · • · · · · ···· · · • ······ · ··· ·

103

Další způsob podávání polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulující erytropoézu podle vynálezu používá injekce bolusu a kontinuální infúzi.

Podávání aerosolu je účinný prostředek pro aplikaci polymerně modifikovaných syntetických proteinů stimulujících erytropoézu podle vynálezu přímo do respiračního traktu. Některé výhody tohoto způsobu jsou: 1) obchází působení enzymatické degradace, špatnou absorpci z gastrointestinálního traktu nebo ztrátu terapeutického přípravku po prvním průchodu játry, 2) podává účinné složky, které by jinak selhaly při dosažení svých cílových míst v respiračním traktu pro svou molekulární velikost, náboj nebo afinitu k extrapulmonárním místům, 3) poskytuje rychlou prostřednictvím plicních alveolů dalších orgánových systémů účinné složce, což je důležité, kde by expozice mohla způsobit nežádoucí vedlejší účinky. Z těchto důvodů je podávání aerosolu obzvláště - výhodné pro léčení astmatu, lokálních plicních infekcí a ostatních chorob nebo chorobných stavů plic a respiračního traktu.

absorpci do organismu a 4) zabrání vystavení

Existují tři typy farmaceutických inhalačních zařízení, nebulizační inhalátory, inhalátory s odměřenými dávkami a inhalátory suchého prášku. Nebulizační zařízení produkují proud vzduchu o vysoké rychlosti, který způsobí, že proteinový derivát (který byl formulován v kapalné formě) je rozstřikován jako mlha, která je nesena do pacientova respiračního traktu. Inhalátory s odměřenými dávkami typicky mají formulaci balenou se stlačeným plynem a při uvedení do chodu vypustí odměřené množství polypeptidu stlačeným plynem, a tím umožní spolehlivý způsob podávání nastaveného množství přípravku. Inhalátory suchého prášku podávají polypeptid ve formě volně plynoucího prášku, který může být zařízením dispergován do pacientových dýchacích cest během dýchání. Aby se dosáhlo volně plynoucího • · ···· ··· · * · • ·· · · · · · · · · » • ♦····· · · · · · « • · · · · · · · · · • · ·· ·· «·· ·· ·»

104 prášku, proteinový derivát je formulován s excipientem, jako je například laktóza. Odměřené množství proteinového derivátu je uloženo v tobolkové formě a je dávkováno pacientovi při každém uvedení do chodu. Všechny výše uvedené metody mohou být použity pro podávání podle předkládaného vynálezu.

Farmaceutické formulace založené na lipozomech jsou také vhodné pro použití s polymerně modifikovanými syntetickými proteiny stimulujícími erytropoézu podle tohoto vynálezu. (Viz např. patent Spojených Států č. 5 631 018, patenty Spojených Států č. 5 723 147 a 5 766 627) . Má se za to, že výhody lipozomů jsou ve vztahu k výhodným změnám v tkáňové distribuci a farmakokinetických parametrech, které vyplývají z lipozomového zachycování léků a mohou být aplikovány na polypeptidy podle předkládaného vynálezu odborníky. Mohou také být použity lipozomové kapalné farmaceutické formulace pro injekci nebo perorální podávání s řízeným uvolňováním.

Pro systémové podávání čípky, tradiční pojivá a nosiče zahrnují například polyethylenglykoly nebo triglyceridy, například PEG 1000 (96%) a PEG 4000 (4%). Tyto čípky mohou být vytvořeny ze směsí obsahujících účinnou složku v rozsahu přibližně od 0,5 hmotnostního procenta do přibližně 10 hmotnostních procent, výhodně přibližně od 1 hmotnostního procenta do přibližně 2 hmotnostních procent.

Všechny publikace a patentové přihlášky citované v tomto popisu jsou v tomto textu zahrnuty formou odkazu ve stejném rozsahu, jako by každá individuální publikace nebo patentová přihláška byla specificky a individuálně zahrnuta formou odkazu. Nyní po obecně popsaném vynálezu následují pro lepší porozumění příklady, které jsou ilustrativní a nejsou míněny jako omezení předkládaného vynálezu.

• · • · • · · · • · · · ··· · · * • ·· · · ···· · · · • ······ · · · · · · • · · · · ····· • · · · ·· · · · ·· · ·

105

Příklady provedení vynálezu

Zkratky používané v příkladech

Acm = acetamidomethylthiolová chránící skupina [ t j .-CH₂NHCOCH₃] AoA = aminooxyacetylová skupina

Arg (Tos) = L-arginin (postranní řetězec chráněný N^Gtoluensulfonylovou skupinou)

ART = absolutní množství retikulocytů

Asp(cHex) = L-asparagová kyselina (postranní řetězec chráněný cyklohexylesterem)

AUC = oblast pod křivkou

Boc = terč. Butoxykarbonylová skupina

CD = cirkulární dichroismus

CDI = karbonyldiimidiazol

CHO = vaječníky čínského křečka

CL = clearance (ml/h/kg)

Cmax = maximální koncentrace

Cys(4MeBzl) = L-cystein (postranní řetězec chráněný (4methyl)benzylovou skupinou)

Cys(Acm) = L-cystein (postranní řetězec chráněný acetamidomethylovou skupinou [t j .-CH₂NHCOCH₃]-)

DCM = dichlormethan

DIC - diisopropylkarbodiimid

DIEA = diisopropylethylamin

DMF = dimethylformamid

DMSO - dimethylsulfoxid

DPC = dodecylfosfocholin

Dpr = L-l,2-diaminopropionová kyselina

ED50 = účinný dávka vyžadovaná pro dosažení 50 % maximálního účinku

EDA =

ELISA

EPO =

ES-MS (4,7,10)-trioxatridekan-1,13diamin - enzymová imunoanalýza s vázaným enzymem erytropoetin = elektrosprejová ionizační hmotová spektr;

• ·

106

FBS = fetální bovinní sérum

Glu(cHex) = L-glutamová kyselina (postranní řetězec chráněný cyklohexylesterem)

GM-CSF = faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů

HATU = O-(7-azabenzotriazol-l-yl)-1,1,3,3tetramethylamoniumhexafluorfosfát HCT = hematokrit

HGB = hemoglobin

His(Dnp) = L-histidin (postranní řetězec chráněný N^lmdinitrofenylovou skupinou)

HOBT = N-hydroxybenzotriazol HPLC = vysokotlaká kapalinová chromatografie IMDM = Dulbeccovo médium modifikované Iscovem IPA - isopropanol

Lev = levulová kyselina

Lys(CIZ) = L-lysin (postranní řetězec chráněný 2chlorbenzyloxykarbonylovou skupinou)

MBHA = 4-methylbenzhydrylamin MRT = průměrná doba zdržení MTT = 4-methylTrityl

MTT = thiazolylová modř

NHS = N-hydroxysukcinimid

-OCH2~Pam-pryskyřice = -O-CH2-BZ-CH2CONHCH2 (kopolystyrendivinylbenzen)-pryskyřice

Pbo = 4-(CH₃S (O)-)benzylová skupina

PBS = fyziologický roztok pufrovaný fosfáty

PCV = kompaktní buněčný objem

RBC = červená krvinka

RET = retikulocyt

RhEPO = rekombinantní humánní EPO

RSA = sérový albumin laboratorního potkana

SDS = dodecylsulfát sodný

SDS-PAGE = elektroforéza v SDS-polyakrylamidovém gelu

SEP = syntetický protein erytropoézy

Ser (Bzl) = L-serin (postranní řetězec chráněný benzylovou skupinou)

107

Příklad 1

Syntéza syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu SEP-0

Byl syntetizován syntetický protein stimulující erytropoézu (SEP). Sekvence kompletního syntetizovaného

proteinu (nazvaného SEP-0	(1-166)) je:
APPRLICDSR	VLERYLLEAK	EAEKITTGCA	EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA	WKRMEVGQQA	VEVWQGLALL	SEAVLRGQAL
LVKSSQPWjíP	LQLHVDKAVS	GLRSLTTLLR	ALGAQKiJjAIS
PPDAASAAPL	RTITADTFRK	LFRVYSNFLR	GKLKLYTGEA

CRTGDR (sekv. id. č.: 1) kde ψ označuje nepřirozený aminokyselinový zbytek, který tvoří cystein, který je karboxymethylován v sulfhydrylové skupině. Protein SEP-0 byl syntetizován v roztoku ze čtyř polypeptidových segmentů:

Segment SEP-0:1 (GRFN 1711, skládá se ze zbytků 1-32 sekv. id.

č.: 1) :

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-thioester

Segment SEP-0:2 (GRFN 1712, skládá se ze zbytků 33-88 sekv. id. č. : 1): CSLNEKITVP DTKVNFYAWK RMEVGQQAVE

VWQGLALLSE AVLRGQALLV KSSQPW-thioester (kde Cys³³ je chráněný Acm)

Segment SEP-0:3 (GRFN 1713, skládá se ze zbytků 89-116 sekv. id. č. : 1): CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK-thioester (kde Cys je chráněný Acm)

Segment SEP-0:4 (GRFN 1714, skládá se ze zbytků 117-166 sekv. id. č. : 1): CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS

NFLRGKLKLY TGEACRTGDR-karboxylát (kde C-koncový cystein • · · · • · · · · • · · · · • · Λ · · · · • · · I

108

J. Pept. Prot. automatizovaném

Met, Asn,

Segment SEP-0.-4

Thr(Bzl), Gin byly byl

Peptidy SEP-O:1 a SEP-0.-2 a SEP-0:3 byly syntetizovány na pryskyřici vytvářející thioester podle in sítu neutralizačního protokolu pro Boc (terc-butoxykarbonylová skupina) chemický postup a stupňovitou syntézu peptidu na pevné fázi (SPPS) s použitím zavedených strategií SPPS, ochrany postranního řetězce a thioesterové pryskyřice (Hackeng, et al., PNAS, 1999, 96, 10068-10073 a Schnólzer, et al., Int

Res., 1992, 40, 180-193)) na AB1433A peptidovém syntetizátoru nebo ručním sestavením řetězce nebo byly objednány a zakoupeny od komerčních prodejců. Například byl použit standardní soubor Boc SPPS chránících skupin, zejména: Arg(Tos), Asp(cHex), Cys(4MeBzl) & Cys(Acm),

Glu(cHex), His(DNP), Lys(CIZ), Ser(Bzl),

Trp(formylová skupina), Tyr(BrZ), s nechráněnými postranními řetězci, syntetizován analogicky na -OCH2-Pam-pryskyřici. Peptidy byly zbaveny chránících skupin a současně odštěpeny z pryskyřice s použitím HF/p-krezoiu podle standardního Boc chemického postupu, nicméně u peptidů obsahujících chránící skupiny, které nebyly odstraněny v HF/p-krezolu, byly chránící skupiny udrženy. Peptidy byly purifikovány preparativní C4 vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) s převráceným poměrem fází. Frakce obsahující čistý peptid byly identifikovány s použitím ES-MS (elektrosprejová ionizační hmotová spektrometrie), sloučeny a lyofilízovány pro následnou ligaci.

Krok 1: Ligace č. 1

Segment SEP-0:4 a segment SEP-0:3 byly rozpuštěny v TFE v 15mM koncentraci. Byl přidán saturovaný fosfátový pufr (pH 7,9) obsahující 6 M guanidiniumchlorid a 1% thiofenol za vzniku čirého roztoku peptidových segmentů. Po ligaci byla • · · •· ·· ···· ·· • « · · · · · · « · · · · ···· · • ······ · · · · • · · · * · · • · ·· ····· ··

109 ligační směs přidána k roztoku 2 ml TFE (trifluorethanol), 6 ml 6M guanidiniumchloriduu, lOOmM fosfátu obsahujícího 25% βmerkaptoethanol a inkubována po dobu 20 minut. Roztok byl kyselinifikován roztokem 15 mg/ml TCEP (tris (2karboxyethyl)fosfin.HCl) v ledové octové kyselině a nanesen na preparativní C4 kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází (průměr 2,54 cm, 1 palec). Peptidy pak byly purifikovány preparativním gradientem HPLC s převráceným poměrem fází. Frakce obsahující požadovaný ligační produkt SEP-0:Acm+SEP0:3+SEP-0:4 byly identifikovány ES-MS a sloučeny.

Krok 2: Odstranění Acm č. 1

Pro odstranění Acm vodný roztok acetonitrilu obsahující sloučené frakce SEP-0:Acm+SEP-0:3+SEP-0: 4 byl naředěn lx vodou v kvalitě pro HPLC a pevná močovina byla přidána do konečné koncentrace 2M. Byl přidán trojnásobný molární nadbytek (relativní k celkové očekávané koncentraci cysteinu) 30 mg/ml roztoku Hg(acetát)2 ve 3% vodné kyselině octové a roztok byl míchán po dobu jedné hodiny. Roztok pak byl naředěn na 20% βmerkaptoethanolem, nanesen na semipreparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován stupňovým gradientem. Frakce obsahující požadovaný produkt SEP-0:3+SEP-O:4 byly identifikovány ES-MS a lyofilizovány přes noc.

Krok 3: Ligace č. 2

Stejná množství SEP-0:3+SEP-O:4 a SEP-0:2 byla společně rozpuštěna v čistém TFE v 15mM koncentraci. 250mM fosfátový pufr (pH 7,5) obsahující 6 M guanidiniumchlorid a 1% thiofenol byl přidán za vzniku čirého roztoku peptidových segmentů. Po jednom dni ligace, byla ligační směs přidána k roztoku 10 ml TFE, 10 ml β-merkaptoethanolu, 10 ml piperidinu a 20 ml ?M • · · · ·· ·· ♦···· ·· ··

110 guanidiniumchloridu, pH 4, a inkubována po dobu 20 minut, aby se odstranily každé zbylé chránící skupiny. Roztok byl kyselinifikován roztokem 15 mg/ml TCEP ve 20% vodné kyselině octové, nanesen na preparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován lineárním gradientem. Frakce obsahující požadovaný ligační produkt SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP0:3+SEP-0:4 byly identifikovány ES-MS a lyofilizovány přes noc.

Krok 4: Karboxymethylace

SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-O:3+SEP-O:4 byl rozpuštěn v TFE v 15mM koncentraci. Dvojnásobný nadbytek (objem/objem) 200mM fosfátového pufru (pH 7,9) obsahujícího 6M guanidiniumchlorid byl přidán za vzniku čirého roztoku peptidového segmentu. Byl přidán 2pětinásobný nadbytek bromoctové kyseliny rozpuštěné v minimálním množství methanolu a roztok byl ponechán reagovat po dobu dvou hodin. Roztok byl kyselinifikován roztokem 15 mg/ml TCEP ve 20% vodné kyselině octové, nanesen na preparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován stupňovým gradientem. Frakce obsahující požadovaný karboxymethylovaný produkt SEPO:Acm+SEP-0:2+SEP-O:3+SEP-O:4+Et byly identifikovány ES-MS a sloučeny.

Krok 5: Odstranění pikolylové skupiny

Zinkový prach byl aktivován v 2M HC1 po dobu 30 minut. Peptid SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-O:3+SEP-O:4+Et byl rozpuštěn v čistém TFE v přibližně 10 mg/ml koncentraci. Roztok byl naředěn 4x (objem/objem relativně k TFE) 6M guanidiniumchloridem, lOOmM acetátem, pH 4, obsahujícím (čerstvě přidaný) 35 mg/ml L-methioninu a 35 mg/ml dodecylsarkosinu (tj. N-dodekanoylsarkosin sodný). Roztok byl • · • · · · • ·· · · ···· · · · • ······ · · · · · · ·· · · · · ···· ·· ·· ·· ··· · · · ·

111 přidán k aktivovanému Zn prášku. Reakce byla monitorována v intervalech ~1 hodiny a byla kompletní po pěti hodinách. Po ukončení byl supernatant odstraněn a zbývající Zn prášek byl dvakrát promyt po dobu pěti minut 6M guanidiniumchloridem, pH 4, lOOmM acetátem obsahujícím 35 mg/ml L-methioninu a 35 mg/ml dodecylsarkosinu obsahujícího 20% TFE, a také jednou stejným roztokem obsahujícím 20% β-merkaptoethanol. Spojené produkty byly kyselinif ikovány roztokem 15 mg/ml TCEP ve 20% vodné kyselině octové, naneseny na preparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikovány stupňovým gradientem. Frakce obsahující požadovaný modifikovaný produkt SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-O:3+SEP-O:4+Et-Piko byly identifikovány ES-MS a sloučeny.

Krok 6: Odstranění Acm č. 2

Sloučený roztok SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEPO: 3+SEP-O:4+Et-Piko byl naředěn 3x vodou v kvalitě pro HPLC a pevná močovina byla přidána do konečné koncentrace 2M. Byl přidán trojnásobný molární nadbytek (relativní k celkové očekávané koncentraci cysteinu) 30 mg/ml roztoku Hg(acetát)₂ ve 3% vodné kyselině octové a roztok byl míchán po dobu jedné hodiny. Roztok pak byl naředěn na 20% β-merkaptoethanolem, nanesen na semipreparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován stupňovým gradientem. Frakce obsahující požadovaný produkt SEP0: 2+SEP-O:3+SEP-O:4+Et-Piko byly identifikovány ES-MS, naředěny 2x (objem/objem) vodou obsahující 2x (hmotnost/hmotnost relativně k peptidové hmotě) DPC (dodecylfosfocholin) a lyofilizovány přes noc.

Krok 7: Ligace č. 3

Steíná množství SEP-0:2+SEP-O:3+SEP-O:4+Et-Piko a SEP-O:1 • · • · • · · · • · « « · · · ···· · · · * · * • ·· · · · · · · · · · • ······ · · · · · · ·· · ·· · · · · · • · ·· ·· ··· · · · ·

112 byla společně rozpuštěna v čistém TFE v 15mM koncentraci a 250mM fosfátový pufr (pH 7,5) obsahující 6M guanidiniumchlorid byl přidán. K roztoku byl přidán 1% thiofenol. Po jednom dni ligace byla ligační směs přidána k roztoku 10 ml TFE, 10 ml βmerkaptoethanolu, 10 ml piperidinu a 20 ml 6M guanidiniumchloridu, pH 4, a inkubována po dobu 20 minut, aby se odstranily každé zbylé chránící skupiny. Roztok byl kyselinifikován roztokem 15 mg/ml TCEP ve 20% vodné kyselině octové, nanesen na preparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován lineárním gradientem. Frakce obsahující požadovaný ligační produkt SEP-0 (1-166): (sekv. id. č. : 1) byly identifikovány elektrosprejovou hmotovou spektrometrií, naředěny 2x (objem/objem) vodou obsahující 2x (hmotnost/hmotnost relativně k peptidové hmotě) dodecylsarkosinu a lyofilizovány.

Krok 8 Svinutí

Kompletní ligovaný peptid SEP-0 (1-166) byl rozpuštěn ve 200mM Tris pufru (pH 8,7) obsahujícím 6M guanidiniumchlorid a 20% TFE a desateronásobný molární nadbytek (relativní k Cys zbytkům v proteinu) cysteinu. Tento roztok byl dialyzován přes noc proti roztoku 200mM Tris pufru (pH 8,7) obsahujícímu 3M guanidiniumchlorid při teplotě místnosti. Roztok pak byl dialyzován proti roztoku 200mM Tris pufru (pH 8. 7) obsahujícímu IM guanidiniumchlorid při teplotě místnosti po dobu 4 hodin ve 4 °C a konečně proti lOmM fosfátovému pufru (pH 7,0) po dobu 4 hodin ve 4 °C za vzniku konečného svinutého produktu. Svinutí bylo ověřeno elektrosprejovou ES-MS a CD (cirkulární dichroismus) spektrometrií.

• · · · • · · ·

113 • · ·· • » · · · • · · · · • · · · · · ·

Krok 9 Purifikace

Svinutý polypeptid byl koncentrován 5x v lahvičkách koncentrátoru centricon a nanesen na Kolon s měničem kationtů Resource S ekvilibrovanou lOmM fosfátem, pH 7,0. Svinutý protein byl eluován v lineárním solném gradientu do 500mM NaCl během 10 minut. Frakce obsahující požadovaný svinutý produkt SEP-0 (1-166) byly identifikovány elektroforézou v SDSpolyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a zmraženy a uloženy v -80 °C. Chromatogram z analytické HPLC s převráceným poměrem fází a ES-MS spektrum svinutého proteinového produktu, a také CD spektrum demonstrovalo přítomnost svinutého proteinu.

Příklad 2

Syntéza syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu SEP-1L30

Druhý syntetický protein stimulující erytropoézu (nazvaný SEP-1-L30) byl syntetizován tak, aby obsahoval skupiny tvořící oxim v polohách 24 a 126 SEP-0. Tyto skupiny pak byly použity pro vytvoření SEP-1-L30, ve kterém lineární (EDA-Sukc-) χ₈karboxylát (EDA = (4,7,10)-trioxatridekan-1,13-diamin, také nazývaný TTD, Suke = -COCH₂CH₂CO-) polymery byly připojeny k hlavnímu řetězci proteinu. Sekvence kompletního SEP-1 (1166) je:

APPRLICDSR	VLERYLLEAK	EAEK^OXITTGCA	EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA	WKRMEVGQQA	VEVWQGLALL	SEAVLRGQAL
LVKSSQPWŮP	LQLHVDKAVS	GLRSLTTLLR	ALGAQKij/AIS
PPDAAK^0XAAPL	RTITADTFRK	LFRVYSNFLR	GKLKLYTGEA
CRTGDR (sekv.	id. č.: 2)

114 ·· *· r · · · » · · · » · · ·« « » · · • · « * kde ψ označuje nepřirozený aminokyselinový zbytek skládající se z cysteinu, který je karboxymethylován v sulfhydrylové skupině a kde K^ox označuje nepřirozený lysin, který je chemicky modifikován v epsilon-aminoskupině oximovým linkerem kondenzovaným k určenému polymeru rozpustnému ve vodě oximovou vazbou. Struktura SEP-1-L30 je také ukázána na obrázku 15.

Schématické zobrazení chemické syntézy SEP1-L30 popsané níže, je ukázáno na obrázku 14. Ve stručnosti, na obrázcích 14 (A) a 14 (B) , polymer rozpustný ve vodě GRFN32 (GP32) je připojen k peptidům SEP-1:1 a SEP-1:4 chemickou ligační reakcí tvořící oximovou vazbu. Jak je ukázáno, peptid SEP-1:1 nese C-koncovou Y_aa skupinu v poloze 32 obsahující a-karboxylthioester histidinu pro následnou nativní chemickou ligaci a nepřirozený lysinový zbytek v poloze 24 (glykosylační místo přírodního humánního EPO), jehož postranní řetězec byl chemicky modifikován tak, aby nesl U_n=i skupinu obsahující aminooxyacylovou skupinu. N-koncový alanin odpovídající poloze 1 konečného kompletního produktu je ukázán jako referenční příklad. Peptid SEP-1:4 má nechráněnou N-koncovou X_aa skupinu v poloze 117 obsahující cystein, U_n=l skupinu obsahující aminooxyacylovou skupinou modifikovaný Lysin v poloze 126 (glykosylační místo přírodního humánního EPO) a cystein v poloze 161 (cystein tvořící disulfid), který má svou thiolovou skupinu postranního řetězce chráněnou pikolylovou skupinou. Cys^lsl je chráněn, aby se zabránilo jeho thioalkylaci v následné konverzi cysteinů zavedených pro místa nativní chemické ligace (viz obrázek 14(D)), je také použita pikolylová chránící skupina, protože její odstranění je ortogonální pro podmínky vyžadované pro odstranění Acm (acetamidomethylová skupina) chráněného cysteinu v první nativní chemické ligační reakce (viz obrázek 14 (C)) . Místně τ« ··»« • · 4 *

115 ·« ·· » r · * · k » · · » · · · 4 · · specifické a exkluzivní připojení GP32 polymerových konstruktů v polohách 24 a 126 je dosaženo chemickou ligaci tvořící oxim za vzniku přesných polymerně modifikovaných peptidů SEP1:1+GP32 a SEP-1:4+GP32. Obrázek 14(C) ukazuje nativní chemickou ligaci SEP-1:4+GP32 ke střednímu peptidovému segmentu SEP-1:3 a vytvoření SEP-1:3-SEP+l:4+GP32, jehož místo ligace je v Lys

116

Cys

117

Jak je ukázáno, peptid SEP-1:3 obsahuje N-koncovou X_aa skupinu v poloze 89 obsahující Acm chráněný cystein a C-koncovou Y_aa skupinu v poloze 116 obsahující α-karboxylthioester lysinu. Po nativní chemické ligaci byla Acm chránící skupina odstraněna, aby se tento ligační produkt připravil pro příští ligační reakci. Obrázek 14(D) ukazuje nativní chemickou ligaci SEP-1:3+SEP-l:4+GP32 ke střednímu peptidovému segmentu SEP-1:2 a vytvoření SEP1:2+SEP-l:3+SEP-l:4+GP32, jehož místo ligace je v Trp⁸⁸ a Cys⁸⁹. Jak je ukázáno, peptid SEP-1:2 obsahuje N-koncovou X_aa skupinu v poloze 33 obsahující Acm cystein a C-koncovou Y_aa skupinu v poloze 89 obsahující α-karboxylthioester tryptofanu. Po nativní chemické ligaci byl ligační produkt exponován bromoctové kyselině pro karboxymethylaci thiolových skupin postranního řetězce z místa ligace cysteinů 89 a 117, a tak jejich konverzi na pseudoglutamové kyseliny. Po karboxymethylaci byly Acm a pikolylové chránící skupiny odstraněny, aby se připravil tento nechráněný polymerně modifikovaný ligační produkt pro příští ligační reakci. Obrázek 14 (E) ukazuje nativní chemickou ligaci SEP-1:3-SEP1:4+GP32 k peptidovému segmentu SEP-1:1+GP32 (odpovídajícímu N-koncovému segmentu kompletního produktu) a vytvoření kompletního SEP-1-L30 produktu SEP-1:1+GP32+SEP1:2+SEP1:3+SEP-l:4+GP32, jehož konečné místo ligace je v His a Cys . Jak je ukázáno, kompletní SEP-1-L30 produkt obsahuje dva polymery rozpustné ve vodě (G32) připojené výhradně mrstecn dermovanýcn u:

grykosylacnuch • 4 • · · · • · «4 4 · 4 4 4 4

4 4 4 · · · ·· · * 4« 4 4 4444 4 4 * • 444444 · 444 4 4

44 4 · » 4 · 49 94

116 odpovídajících poloze 24 a poloze 126 přírodního humánního EPO. Detaily syntézy jsou popsány níže.

A. Oximace GRFN1776 a GRFN1711 s GRFNP32

Byl připravován oxim, aby se připojily polymery rozpustné ve vodě nesoucí aminooxyacetylovou skupinu k peptidům nesoucím ketonkarbonylovou skupinu. Aby se toho dosáhlo, byly syntetizovány následující peptidové segmenty:

Segment SEP-1:4 (GRFN 1776, skládá se ze zbytků 117-166 sekv. id. č.: 2) :

CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY

TGEACRTGDR-karboxylát (kde Lys¹²⁶ je modifikovaný zbytkem levulové kyseliny v epsilon-aminoskupině a kde Cys¹¹⁷ je chráněn Acm)

Segment SEP-1:1 (GRFN 1711, skládá se ze zbytků 1-32 sekv. id. č.: 2) :

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-thioester (kde Lys²⁴ je modifikovaný zbytkem levulové kyseliny)

Segment SEP-1:1 (GRFN 1711) byl syntetizován na pryskyřici vytvářející thioester a segment SEP-1:4 (GRFN 1776) na -OCH₂Pam-pryskyřici, jako v příkladu 1. Lysiny 24 a 126 těchto dvou peptidových segmentů byly zpočátku chráněny Fmoc skupinou v epsilon-aminoskupině. Poté, co bylo dokončeno sestavení řetězce, Fmoc-nesoucí aminoskupiny byly zbaveny chránící skupiny po standardních postupech Fmoc odstranění chránící skupiny a modifikovány připojením levulové kyseliny ke každé peptidové pryskyřici, v daném pořadí. Peptidy pak byly zbaveny chránící skupiny a současně odštěpeny od nosné pryskyřice, jak bylo popsáno v příkladu 1. Peptidy byly purifikovány preparativní C4 HPLC s převráceným poměrem fází. Frakce • · • · · ·

117 • · ·· ·· ··· * · · « obsahující čistý peptid byly identifikovány s použitím ES-MS, sloučeny a lyofilizovány pro následnou ligaci. GRFNP32 [-(EDASukc) igkarboxylát] byl sestaven na Sasrin pryskyřici poskytující karboxylovou vazbu podle standardních protokolů (Rose, K. Et al., patentová přihláška Spojených Států č. 09/379 297, Rose, et al., J Am Chem Soc., 1999, 121, 7034). Aminooxyacetylová (AoA) skupina byla připojena k N-koncové aminoskupině polymeru kondenzací pětinásobného nadbytku aktivované Boc-aminooxyoctové kyseliny. Polymerový řetězec byl odštěpen od nosné pryskyřice s použitím klasických Fmoc chemických postupů. Polymerový řetězec byl purifikován preparativní C4 HPLC s převráceným poměrem fází. Frakce obsahující čistý polymer byly identifikovány s použitím ES-MS, sloučeny a lyofilizovány pro následnou ligaci.

Segmenty SEP-1:4 a GRFNP32 byly společně rozpuštěny v ekvimolárním poměru v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA. Roztok pak byl lyofilizován.. Usušený prášek byl rozpuštěn a polymerně modifikovaný peptid byl oddělen od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polymeru preparativní gradientovou C4 HPLC s převráceným poměrem fází. Frakce obsahující požadovaný oximovaný produkt SEP-1:4 + GP32 byly identifikovány ES-MS a sloučeny a lyofilizovány.

Segmenty SEP-1:1 a GRFNP32 byly společně rozpuštěny v ekvimolárním poměru v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA. Roztok pak byl lyofilizován. Usušený prášek byl rozpuštěn a polymerně modifikovaný peptid oddělen od nezreagovaného polymeru preparativní gradientovou C4 HPLC s převráceným poměrem fází. Frakce obsahující požadovaný oximovaný produkt SEP-1:1 + GP32 byly identifikovány ES-MS a sloučeny a lyofilizovány.

• · · ·

118

B. Syntéza syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu SEP-1-L30

SEP-1-L30 byl syntetizován v roztoku ze čtyř polypeptidových segmentů:

Segment SEP-1:1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32, odpovídající zbytkům 1-32 sekv. id. č.: 2) :

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^OXITTGCA EH-thioester (kde Lys²⁴ je modifikovaný v epsilon-aminoskupině oximovým linkerem levulové kyseliny, která je kondenzována k GRFNP32 kyselina levulová-aminooxycetyl(Lev-AoA)-oximovou vazbou označovanou K^ox)

Segment SEP-1:2 (GRFN 1712, odpovídající zbytkům 33-88 sekv. id. č.: 2) :

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-thioester (kde Cys³³ je chráněn Acm)

Segment SEP-1:3 (GRFN 1713, odpovídající zbytkům 89-116 sekv. id. č.: 2):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-thioester (kde Cys⁸⁹je chráněn Acm) + GRFNP32, odpovídající

LFRVYSNFLR ,126

Segment SEP:1:4+GP32 (GRFN 1776 zbytkům 117-166 sekv. id. č.: 2):

CAIS PPDAAK^0XAAPL RTITADTFRK CRTGDR-karbcxylát (kde Lys“·“ je v epsilon-aminoskupině oximovým linkerem levulové kyseliny, která je kondenzována k GRFNP32 kyselina levulováaminooxycetyl (Lev-AoA)-oximovou vazbou označovanou K^ox a kde Ckoncový cystein nese pikolylovou (piko) chránící skupinu)

GKLKLYTGEA modifikovaný

Syntéza dalších deprotekční reakce, bylo popsáno v příki peptidů, ligační reakce, karboxymethylace, svinutí a purifikace byly prováděny, jak idu 1 za vzniku kompletního svinutého SEP• · · · • · · · · · · * ♦ · · · · · · · • · ····· · • * ·» # · · · 4·

119

1-L30. Chromatogram z analytické HPLC s převráceným poměrem fází a ES-MS spektrum svinutého proteinového produktu, a také CD spektrum demonstrovalo přítomnost svinutého proteinu.

Příklad 3

Syntéza syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu SEP-1L2 6

Třetí syntetický protein stimulující erytropoézu (nazvaný SEP-1-L26) byl syntetizován tak, aby obsahoval skupiny tvořící oxim v polohách 24 a 126 SEP-0. Tyto skupiny pak byly použity pro vytvoření SEP-1-L26, ve kterém lineární polymery (EDASukc) i₈-karboxylát a (EDA-Sukc) ₆-amid byly spojeny s hlavním řetězcem proteinu přes oximovými vazbami v polohách 24 a 126,

v daném pořadí	. Sekvence	kompletního SEP-1	(1-166) je:
APPRLICDSR	VLERYLLEAK	EAEK^OXITTGCA '	EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA	WKRMEVGQQA	VEVWQGLALL	SEAVLRGQAL
LVKSSQPWÚP	LQLHVDKAVS	GLRSLTTLLR	ALGAQKÚAIS
PPDAAK^0XAAPL	RTITADTFRK	LFRVYSNFLR	GKLKLYTGEA
CRTGDR (sekv.	id. č.: 2) ,
kde ψ	označuj e	nepřirozený aminokyselinový

skládající se z cysteinu, který je karboxymethylován v sulfhydrylové skupině a kde K^ox označuje nepřirozený lysin, který je chemicky modifikován v epsilon-aminoskupině oximovým linkerem kondenzovaným k určenému polymeru rozpustnému ve vodě oximovou vazbou.

Na rozdíl od SEP-1-L30, SEP-1-L26 konstrukt byl navržen tak, aby nesl menší polymer rozpustný ve vodě bez náboje připojený v poloze 126. Polymer připojený v poloze 24 byl • · • · φ · φφφφ φ φ ···· • · · ·«* φ φ φ • · φ · «φφφ φ φ · •φφφφ· · φφφ φ φ • · φ«· «φφφ* • · φ· φφ φφφ φφ φφ

120 stejný jako v SEP-1-L30. Sestavení kompletního produktu bylo stejné, jak bylo popsáno v příkladu 2. Struktura SEP-1-L26 je ukázána na obrázku 16.

A. Oximace GRFN1776 s GRFNP6 a oximace GRFN1711 s GRFNP32

Byl připraven oxim, aby se připojily polymery rozpustné ve vodě nesoucí aminooxyacetylovou skupinu k peptidům nesoucím ketonkarbonylovou skupinu. Aby se toho dosáhlo, byly syntetizovány následující peptidové segmenty:

Segment SEP-1:4 (GRFN 1776, skládá se ze zbytků 117-166 sekv. id. č.: 2) :

CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY

Segment SEP-1:1 (GRFN 1711, skládá se ze zbytků 1-32 sekv. id. č.: 2) :

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-thioester (kde Lys je modifikovaný zbytkem levulové kyseliny)

Segment SEP-l.-l (GRFN 1711) byl syntetizován na pryskyřicí vytvářející thioester a segment SEP-1:4 (GRFN 1776) na -OCH₂Pam-pryskyřici, jako v příkladu 1. Lysiny 24 a 126 těchto dvou peptidových segmentů byly zpočátku chráněny Fmoc skupinou v epsilon-aminoskupině. Poté, co bylo dokončeno sestavení řetězce, Fmoc nesoucí aminoskupiny byly zbaveny chránící skupiny podle standardních Fmoc deprotekčních postupů a modifikovány připojením levulové kyseliny ke každé peptidové pryskyřici, v daném pořadí, podle standardních kondenzačních protokolů. Peptidy pak byly zbaveny chránící skupiny a současně odštěpeny od nosné pryskyřice podle standardních Boc

121 chemických postupů, jako v příkladu 1. Peptídy byly samostatně purifikovány preparativní C4 HPLC s převráceným poměrem fázi. Pro každý peptid byly frakce obsahující čistý peptid identifikovány s použitím ES-MS, sloučeny a lyofilizovány pro následnou ligaci.

Ve vodě rozpustný polymer (EDA-Sukc) ig-karboxylátu (GRFNP32) byl sestaven na Sasrin pryskyřici tvořící karboxylovou vazbu podle standardních protokolů (Rose, K. et al., patentová přihláška Spojených Států č. 09/379 297, Rose, et al., J Am Chem Soc., 1999, 121, 7034). Polymer rozpustný ve vodě (EDA-Sukc)6-amid (GRFNP6) byl sestaven na Sieber pryskyřici tvořící amidovou vazbu podle standardních protokolů (Rose, K. Et al., patentová přihláška Spojených Států č. 09/379, 297, Rose, et al., J Am Chem Soc., 1999, 121, 7034).

Aminooxyacetylová (AoA) skupina byla připojena k N-koncové aminoskupině každého polymeru kondenzací pětinásobného

Boc-aminooxyoctové kyseliny. Dva polymerové řetězce byly odděleně odštěpeny od příslušné nosné pryskyřice s použitím klasických Fmoc chemických postupů. Každý polymerový řetězec byl purifikován preparativní HPLC s převráceným poměrem fází. Pro každý polymer byly frakce obsahující čistý polymer identifikovány s použitím ES-MS, sloučeny a lyofilizovány pro následnou ligaci.

navázaného na nadbytku pryskyřici aktivované

Segmenty SEP-1:4 a GRFNP6 byly společně rozpuštěny v ekvimolárním poměru v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA. Roztok pak byl lyofilizován. Usušený prášek byl rozpuštěn a polymerně modifikovaný peptid byl oddělen od nemodifikovaného peptidů a nezreagovaného polymeru preparativní gradientovou C4 HPLC s převráceným poměrem fází. Frakce obsahující požadovaný oximovaný produkt SEP-1:4 + GP6 byly identifikovány ES-MS a sloučeny a lyofilizovány.

122

B. Syntéza syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu SEP-1-L26

SEP-1-L26 byl syntetizován v roztoku ze čtyř polypeptidových segmentů:

Segment SEP-1:1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32, odpovídající zbytkům 1-32 sekv. id. č.: 2):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^0XITTGCA - EH-thioester (kde Lys²⁴ je modifikovaný v epsilon-aminoskupině oximovým linkerem levulové kyseliny, která je kondenzována k GRFNP32 kyselina levulová-aminooxycetyl(Lev-AoA)-oximovou vazbou označovanou K^ox)

Segment SEP-1:2 (GRFN 1712, odpovídající zbytkům 33-88 sekv. id. č.: 2):

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-thioester (kde Cys je chráněn Acm)

Segment SEP-1:3 (GRFN 1713, odpovídající zbytkům 89-116 sekv. id. č.: 2):

CP LQLHVDKAVS je chráněn Acm)

Lí í\ ó xj i i j_í a τ y.... - z- — i t J_l Cí A.)* Iv L. i 1 -u o o c i (kde Cys⁸⁹

Segment SEP-1: 4+GP6 (GRFN 1776 + GRFNP6, odpovídající zbytkům

117-166 sekv. id. č.: 2) • · · ·

123

LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA je modifikovaný v epsilonRTITADTFRK ,126

CAIS PPDAAK^OXAAPL

CRTGDR-karboxylát (kde Lys aminoskupině oximovým linkerem levulové kyseliny, která je kondenzována k GRFNP6 kyselina levulová-aminooxycetyl(LevAoA)-oximovou vazbou označovanou K^ox a kde C-koncový cystein [tj . Cys¹⁶¹] nese pikolylovou (piko) chránící skupinu)

Syntéza dalších peptidů, ligační reakce, karboxymethylace, deprotekční reakce, svinutí a purifikace byly prováděny, jak bylo popsáno v příkladech 1 a 2 za vzniku kompletního svinutého SEP-1-L26. s převráceným poměrem proteinového produktu,

Chromatogram z analytické C4 HPLC fází a ES-MS spektrum svinutého a také CD spektrum demonstrovalo přítomnost svinutého proteinu.

Příklad 4

Syntéza syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu SEP-1B50

Čtvrtý syntetický protein stimulující erytropoézu (nazvaný SEP-1-B50) byl syntetizován. Aminokyselinová sekvence kompletního SEP-1-B50 je stejná jako sekvence SEP-1-L30:

APPRLICDSR

VPDTKVNFYA

LVKSSQPWŮP

PPDxAAK^0XAAPL

CRTGDR (sekv.

kde ψ

VLERYLLEAK

WKRMEVGQQA

LQLHVDKAVS

RTITADTFRK

EAEK^OXITTGCA

VEVWQGLALL

GLRSLTTLLR

LFRVYSNFLR

EHCSLNEKIT

SEAVLRGQAL

ALGAQKýAIS

GKLKLYTGEA id. č.: 2) označuje nepřirozený aminokyselinový zbytek skládáj ící se z cysteinu, který je karboxymethylován v sulfhydrylové skupině a kde K^ox označuje nepřirozený lysin, • · • · · · ···· ·· • · · ··· * « ·· · · · · · · * · • ······ · »·· « • · · · · · · · • · · · ·· ··· ·«

124 který je chemicky modifikován v epsilon-aminoskupině oximovým linkerem kondenzovaným k určenému polymeru rozpustnému ve vodě oximovou vazbou.

Nicméně protein byl derivatizován raději rozvětveným polymerním konstruktem majícím čtyři lineární (Sukc-EDA)i2 skupiny než lineárním (Sukc-EDA)ig polymerem SEP-1-L30. Derivatizace byla uskutečněna oximovou vazbou.

Obrázek 17 je schématické zobrazení chemické syntézy rozvětveného polymeru rozpustného ve vodě GRFNP29 (GP29), který byl připojen k SEP-1-B50 ligací tvořící oxim, jak popsáno podrobně níže. Jak je ukázáno na obrázku 17, ortogonálně chráněný prekurzor lysinu U-B byl použit pro vytvoření U-B složky GRFN17 (GP17) nesoucí aminooxyacylovou skupina jako U skupinu a mající 3x lysinové rozvětvené jádro B nesoucí čtyři připojené thiolové skupiny pro následnou kondenzaci thioetherovými vazbami k lineárnímu rozpustnému polyamidovému ethylenoxidovému připojený karboxylát darovaný Sestavení kompletního produktu bylo stejné, jak bylo popsáno v příkladu 2. Struktura SEP-1B50 je ukázána na obrázku 18.

ve vodě konstruktu nazvanému GP29, který nese zbytkem jantarové kyseliny.

A. Syntéza templátu GRFNP17 nesoucího mnohonásobné thiolové skupiny

Templát GRFNP17 byl syntetizován ručně na (4-methyl)benzhydrylaminové (MBHA)-pryskyřici tvořící amid v 0,4mmol měřítku. Fmoc-Lys(Boc)-OH byl kondenzován s použitím standardních kondenzačních protokolů (Schnólzer, M., Int J Pept Protein Res., 1992, 40, 180-93). Bylo použito 2,1 mmol aminokyseliny, 10% DIEA ve 3,8 ml 0,5M HBTU, tj . pětinásobný nadbytek aminokyseliny. Po odstranění Fmoc chránící skupiny, • · · · • · · · ···· ·· • · * · · · · e _a • · · · ···· · · · ······ · ··· · ·

125

Fmoc-Lys(Fmoc)-OH byl kondenzován s použitím standardních protokolů kondenzace aminokyselin (2,1 mmol aminokyseliny, 10% DIEA ve 3,8 ml 0,5M HBTU, t j. pětinásobný nadbytek aminokyseliny). Po druhém kroku odstranění Fmoc byl FmocLys (Fmoc) -OH kondenzován s použitím standardních protokolů kondenzace aminokyselin (4,2 mmol aminokyseliny, 10% DIEA v 7,6 ml 0,5M HBTU, tj . 5 pětinásobný nadbytek aminokyseliny relativně k volnému aminu). Po konečném kroku odstranění Fmoc chránící skupiny byl pětinásobný nadbytek (relativně k volným aminům) pentafluorfenylesteru S-acetylthioglykolové kyseliny (SAMA-oPfp) v DMF kondenzován po dobu 30 minut. Boc chránící skupina postranního řetězec C-koncového lysylového zbytku byla odstraněna dvěma jednominutovými promytími čistým TFA, pak následovala neutralizace pryskyřice promytím 10% DIEA v DMF. 2 mmol Boc-aminooxyoctové kyseliny a 2 mmol N-hydroxysukcinimidu (NHS) byly rozpuštěny ve 3 ml DMF. Po přidání 2 mmol DIC (diisopropylkarbodiimidu) kyselina byla aktivována po dobu 30 až 60 minut. Roztok byl přidán k neutralizované pryskyřici a kondenzován 1 hodinu. Nakonec byly S-spojené acetylové skupiny odstraněny 20% piperidinem v DMF po dobu 30 minut. Templát byl zbaven chránící skupiny a současně odštěpen od nosné pryskyřice s použitím HF/p-krezolu podle standardních Boc chemických postupů v přítomnosti cysteinu jako lapače volného aldehydu (Schnólzer, M., Int J Pept Protein Res., 1992, 40, 180-93). Získaný polyamid v 50% B [tj . 50% vodný acetonitril obsahující 0,1% TFA] (bez aldehydu) byl zmražen a lyofilizován. Pro purifikaci byl templátový surový produkt rozpuštěn ve 2 ml 50% B a 100 ml 100% A [tj. 0,1% TFA ve vodě] bylo přidáno pro naředění vzorku (zabránit přidání guanidiniumchloridu nebo acetátu, protože přidání aldehydu bylo zabezpečeno). Templát byl nanesen na C4 preparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází ekvilibrovanou při teplotě T = 40 °C ve 3% B. Soli byly eluovány izokraticky a • 4 4 4

4 4 4 4 • 444 · • · · · 4 4 · •4 4 4

4 4 4

126 požadovaný templát, GRFNP17, byl purifikován lineárním gradientem. Frakce obsahující požadovaný produkt byly identifikovány ES-MS, sloučeny a lyofilizovány.

B. Syntéza rozvětveného ve vodě rozpustného polymeru GRNP29

GRFNP29, rozvětvený (EDA-Sukc) ₇₂ polymer o molekulové hmotnosti 15 kD byl syntetizován ligací tvořící thioether purifikovaného thiolovou skupinu obsahujícího templátu GRFNP17 a lineárního polymeru GRFNP31, Br-acetyl-(EDA-Sukc) _i2karboxylátu, kde GRFNP31 byl syntetizován na Sasrin pryskyřici tvořící karboxylovou vazbu podle standardních protokolů (Rose, K. et al., patentová přihláška Spojených Států č. 09/379 297, Rose, et al., J Am Chem Soc, 1999, 121, 7034).

l,3x molární nadbytek (proti celkovým thiolovým skupinám) purifikovaného GRFNP31, Br-acetylovaný (EDA-Sukc) _i2 a purifikovaný thiol-obsahující templát GRFNP17 byly společně rozpuštěny v 0,1 M Tris-HCl/6M guanidiniumchloridu, pH 8,7 v ~10mM koncentraci. Po rozpuštění byl roztok naředěn trojnásobným objemem (objem/objem) pufru O,1M Tris-HCl, pH 8,7. Ligační směs byla míchána při teplotě místnosti a reakce byla monitorována HPLC s převráceným poměrem fází a ES/MS. Další reaktant GRFNP31 byl přidán dle potřeby, dokud hlavním produktem nebyl požadovaný reakční produkt. Pro zpracování byl přidán 3x (objem/objem k ligační směsi) objem O,1M acetátu/6M guanidiniumchloridu, pH 4, a roztok byl nanesen na preparativní C4 kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován lineárním gradientem. Frakce obsahující čistý GRFNP29 konstrukt byly identifikovány s použitím ES-MS, sloučeny a lyofilizovány.

127

C. Oximace GRFN1776 a GRFN1711 s GRFNP29

Segmenty SEP-1:4 a segment SEP-1:1 byly syntetizovány tak, jak bylo popsáno v příkladu 2. Segmenty SEP-1-.4 a GRFNP29 byly společně rozpuštěny v ekvimolárním poměru v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA. Roztok byl lyofilizován. Usušený prášek byl nanesen na preparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází (průměr 2,54 cm, 1 palec). Polymerně modifikovaný peptid byl oddělen od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polymeru preparativní gradientovou C4 HPLC s převráceným poměrem fází. Frakce obsahující požadovaný oximovaný produkt SEP: 1: 4+GP29 byly identifikovány ES-MS a sloučeny.

Segmenty SEP-1:1 a GRFNP29 byly společně rozpuštěny v ekvimolárním poměru v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1 % TFA. Roztok byl zmražen a lyofilizován. Usušený prášek byl rozpuštěn v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA a nanesen na preparativní GPC (gelová chromatografie) kolonu (průměr 2,54 cm, 1 palec). Polymerně modifikovaný peptid byl oddělen od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polymeru izokratickou elucí. Frakce obsahující požadovaný oximovaný produkt SEP-1:1+GP29 byly identifikovány ES-MS a sloučeny.

D. Syntéza syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu SEP-1-B50

SEP-1-B50 (sekv. id. č.: 2) byl syntetizován v roztoku ze čtyř polypeptidových segmentů:

Segment SEP-1:1+GP29 (GRFN 1711 + GRFNP29, odpovídající zbytkům 1-32 sekv. id. č.: 2):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^0XITTGCA EH-thioester (kde Lys²⁴ je modifikovaný v epsilon-aminoskupině oximovým linkerem Isvulové kyseliny, která je kondenzována k GRFNP29 kyselina

• ·

128 levulová-aminooxycetyl(Lev-AoA)-oximovou vazbou označovanou _K°X)

Segment SEP-1:2 (GRFN 1712, odpovídající zbytkům 33-88 sekv. id. č. : 2) :

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-thioester (kde Cys³³ je chráněn Acm)

Segment SEP-1:3 (GRFN 1713, odpovídající zbytkům 89-116 sekv. id. č.: 2) :

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-thíoester (kde Cys je chráněn Acm)

Segment SÉPII: 4+GP29 (GRFN 1776 + GRFNP29, odpovídající zbytkům 117-166 sekv. id. č.: 2) :

CAIS PPDAAK^0XAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR-karboxylát (kde Lys¹²⁶ je modifikovaný v epsilon-aminoskupině oximovým linkerem levulové kyseliny, která je kondenzována k GRFNP29 kyselina levulováaminooxycetyl (Lev-AoA) -oximovou vazbou označovanou K^ox a kde Ckoncový cystein nese pikolylovou (piko) chránící skupinu)

Syntéza dalších peptidů, ligační reakce, karboxymethylace, deprotekční reakce, svinutí a purifikace byly prováděny, jak bylo popsáno v příkladech 1 a 2, kromě toho, že purifikace byla prováděna na koloně Resource Q, za vzniku kompletního svinutého SEP-1-B50 (sekv. id. č.: 2). Chromatogram z analytické C4 HPLC s převráceným poměrem fází a ES-MS spektrum svinutého proteinového produktu SEP-1-B50, a také CD spektrum demonstrovalo přítomnost svinutého proteinu.

• · ·· · tt ««·« • · · · · * · • · · · · ···· • ······ · · • · · · · · • · ·· ·· ··· • · · · · » • · · • · · • · · • · · ·

129

Příklad 5

Syntéza syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu SEP-3L42

Pátý syntetický protein stimulující erytropoézu (nazvaný SEP-3-L42) byl syntetizován. Aminokyselinová sekvence

kompletního	SEP-3 proteinu	je:
APPRLICDSR	VLERYLLEAK	EAECITTGCA	EHCSLNECIT
VPDTKVNFYA	WKRMEVGQQA	VEVWQGLALL	SEAVLRGQAL
LACSSQPWEP	LQLHVDKAVS	GLRSLTTLLR	ALGAQKEAIS
PPDAACAAPL	RTITADTFRK	LFRVYSNFLR	GKLKLYTGEA
CRTGDR (sekv	. id. č. 3)
Cysteinové zbytky v	polohách: 24,	38, 83 a :

126 byly modifikovány maleimidem-funkcionalizovanými (EDA-Sukc)18 (GRFNP32) polymerními jednotkami (prostřednictvím Michaelovy adice) za vzniku SEP-3-L42. Struktura SEP-3-L42 je ukázána na obrázku 20.

Schématické zobrazení chemické syntézy SEP-3-L42 popsané níže je ukázáno na obrázku 19. Ve stručnosti, obrázky 19(A) a 19(B) ukazují nativní chemickou ligaci čtyř SEP-3-L42 peptidových segmentů SEP-3:1 přes SEP-3:4, která tvoří cysteiny v místech ligace odpovídajícím všem čtyřem nativním glykosylačním místům v humánním EPO. Konkrétně obrázek 19 (B) ukazuje kompletní polypeptid, který má všechny cysteiny tvořící disulfid chráněné, což umožňuje místně specifické připojení čtyř nabitých lineárních ve polymerů (nazvaný GRFN32-maleimid v cysteinových ligačních místech prostřednictvím Michaelovy adice. Obrázek 19(B) také ukazuje konečný deprotekční krok cysteinů tvořících disulfid a vytvoření kompletního polymerně vodě rozpustných (GP32-maleimid)) • · · · · • · · · · ♦ · · · 1 · · • ······ · ··· · · ►··· v « ·«·· » · · • · · * ·· · ·«

130 modifikovaného produktu.

Podrobněji, SEP-3 byl syntetizován v roztoku ze čtyř polypeptidových segmentů:

Segment SEP-3:1 (GRFN 1747, odpovídající zbytkům 1-37 sekv. id. č.: 3):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE-thioester (kde Cys7, Cys²⁹ a Cys³³ jsou chráněny Acm)

Segment SEP-3:2 (GRFN 1774, odpovídající zbytkům 38-82 sekv. id. č.: 3) :

CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LA-thioester (kde Cys³⁸ je postranní řetězec chráněný skupinou Acm)

Segment SEP-3:3 (GRFN 1749, odpovídající zbytkům 83-125 sekv. id. č.: 3) :

CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR . ALGAQKEAIS

PPDAA-thioester (kde Cys⁸³ je postranní řetězec chráněný skupinou Acm)

Segment SEP-3:4 (GRFN 1750, odpovídající zbytkům 126-166 sekv. id. č.: 3) :

CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR-karboxylát (kde Cys¹⁵¹ je chráněný Pbo [tj . 4-(CH3S (O))benzylová skupina-])

Syntéza peptidů

Peptídy SEP-3:1 a SEP-3:2 a SEP-3:3 byly syntetizovány na pryskyřici vytvářející thioester in šitu neutralizačním protokolem pro Boc chemický posrup SPFS, s použitím zavedených ochranných strategií pro postranní řetězec, jak bylo popsáno «· • · · « < · · • · · · * « • · · • · · ·

131 v příkladu 1, se změnami ve strategii chránících skupin, jak bylo poznamenáno pro specifické peptidy výše. Segment SEP-3:4 byl syntetizován analogicky na -0CH2-Pam-pryskyřici. Peptidy byly zbaveny chránící skupiny a současně odštěpeny z nosné pryskyřice tak, jak bylo popsáno v příkladu 1. Výsledné peptidy popsané výše byly purifikovány preparativní RP-HPLC. Frakce obsahující čistý peptid byly identifikovány s použitím ES-MS, sloučeny a lyofilizovány pro následnou ligaci.

Krok 1: Ligace č. 1.

Segment SEP-3:4 a segment SEP-3:3 byly rozpuštěny v TFE v 15mM koncentraci. Saturovaný fosfátový pufr (pH 7,5) obsahující 6M guanidiniumchlorid a 1 % thiofenol byl přidán za vzniku čirého roztoku peptidových segmentů. Po ligaci byla ligační směs (definovaná jako 1 objem) přidána ke 2 objemům roztoku {2 ml TFE, 6 ml 6M guanidiniumchloridu, lOOmM fosfát obsahující 25% β-merkaptoethanol} a inkubována po dobu 20 minut. Roztok byl kyselinifikován roztokem 15 mg/ml TCEP v ledové kyselině octové, nanesen na preparativní C4 kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován lineárním gradientem. Frakce obsahující požadovaný ligační produkt SEP3:Acm+SEP-3:3+SEP-3:4 byly identifikovány ES-MS a sloučeny.

Krok 2: odstranění Acm č. 1

Pro odstranění Acm byl vodný roztok acetonitrilu obsahující sloučené frakce SEP-3:Acm+SEP-3:3+SEP-3: 4 naředěn lx vodou v kvalitě pro HPLC a pevná močovina byla přidána do konečné koncentrace 2M. Byl přidán trojnásobný molární nadbytek (relativní k celkové očekávané koncentraci cysteinu) 30 mg/ml roztoku Hg(acetát)₂ ve 3% vodné kyselině octové a roztok byl míchán po dobu jedné hodiny. Roztok pak byl naředěn »· ·· » » · <

« ·· «·4· «* * * *·«

132 na 20% v β-merkaptoethanolu, nanesen na semipreparativní C4 kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován stupňovým gradientem. Frakce obsahující požadovaný ligační produkt SEP-3:3+SEP-3:4 byly identifikovány ES-MS a lyofilizovány přes noc.

Krok 3: Ligace č. 2

Stejná množství SEP-3:3+SEP-3:4 a SEP-3,2 byla společně rozpuštěna v čistém TFE trifluorethanolu v 15mM koncentraci. 250mM fosfátový pufr (pH 7,5) obsahující 6M guanidinium a 1% thiofenoi byl přidán za vzniku čirého roztoku peptidových segmentů. Po jednom dni ligace byla ligační směs (definovaná jako 1 objem) přidána ke 2 objemům roztoku 10 ml TFE, 10 ml βmerkaptoethanolu, 10 ml piperidinu a 20 ml 6M guanidinia, pH 4, a inkubována po dobu 20 minut, aby se odstranily každé zbylé chránící skupiny. Roztok byl kyselinifikován roztokem 15 mg/ml TCEP ve 20% vodné kyselině octové, nanesen na preparativní C4 kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován lineárním gradientem. Frakce obsahující požadovaný ligační produkt SEP-3:Acm+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP3: 4 byly identifikovány ES-MS a lyofilizovány přes noc.

Krok 4: odstranění Acm

Pro odstranění Acm byl vodný roztok acetonitrilu obsahující sloučené frakce SEP-3:Acm+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4 naředěn lx vodou v kvalitě pro HPLC a pevná močovina byla přidána do konečné koncentrace 2M. Byl přidán trojnásobný molární nadbytek (relativní k celkové očekávané koncentraci cysteinu) 30 mg/ml roztoku Hg(acetát)2 ve 3% vodné kyselině octové a roztok byl míchán po dobu jedné hodiny. Roztok pak byl naředěn na 20% v β-merkaotoethanolu, nanesen na C4 • · • · · · • · · · ··· · · · • ·· · · ···· · · · • ······ « ··» · · • · ·· · ···· • · ·· · · ··· · · · ·

133 semipreparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován stupňovým gradientem. Frakce obsahující požadovaný ligační produkt SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4 byly identifikovány ES-MS a lyofilizovány přes noc.

Krok 5: Ligace č. 3

Stejná množství SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3: 4 a SEP-3:1 byla společně rozpuštěna v čistém TFE v 15mM koncentraci. 250mM fosfátový pufr (pH 7,5) obsahující 6M guanidinium a 1% thíofenol byl přidán za vzniku čirého roztoku peptidových segmentů. Po jednom dni ligace byla ligační směs (definovaná jako 1 objem) přidána ke 2 objemům roztoku 10 ml TFE, 10 ml βmerkaptoethanolu, 10 ml piperidinu a 20 ml 6M guanidinia, pH 4, a inkubována po dobu 20 minut, aby se odstranily každé zbylé chránící skupiny. Roztok byl kyselinifikován roztokem 15 mg/ml TCEP ve 20% vodné kyselině octové, nanesen na preparativní C4 kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován lineárním gradientem. Frakce obsahující požadovaný ligační produkt SEP-3:l+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4 byly identifikovány ES-MS a lyofilizovány přes noc.

Krok 6: Připojení Polymeru GRFNP32

Maleimidem-funkcionalizovaný lineární (EDA-Sukc)ig polymer nazvaný GRFNP32-maleimid byl připraven funkcionalizací GRFNP32 s BMPS (NHS ester 3-maleimidopropionové kyseliny, Pierce, USA) podle protokolů výrobce za vzniku maleimidemfunkcionalizovaného (EDA-Sukc)ig polymeru [t j . maleimid-(EDASukc)₁₃]. SEP-3:l+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4 byl rozpuštěn v minimálním vyžadovaném množství TFE. Trojnásobný nadbytek GRFNP32-maleimidu byl rozpuštěn v 6M guanidiníumchloridu, lOOmM fosfátu, pH 7,5, a přidán k TFE roztoku. Postup • · • · · ·

134

Michaelovy adiční reakce byl sledován analytickou HPLC s převráceným poměrem fází. Poté, co byla reakce ukončena, byl roztok nanesen na preparativní C4 kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován lineárním gradientem. Frakce obsahující požadovaný polymerně modifikovaný produkt SEP3:Acm+SEP-3:l+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+pPEG [tj. ligovaný kompletní polypeptidový řetězec se 166 zbytky se čtyřmi kopiemi GRFNP32 připojenými k thiolovým skupinám postranního řetězce Cys²⁴, Cys³⁸, Cys⁸³ a Cys¹²⁶' a tedy nazvaný také

SEP3:Acm+SEP-3:l+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32] identifikovány ES-MS a lyofilizovány přes noc.

byly

Krok 7: Pbo odstranění

Pro redukci Pbo, lyofilizovaný prášek SEP3:Acm+SEP3:l+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32 byl rozpuštěn v čistém TFA obsahujícím 5% ethandithiol. Pbo skupina pak byla odštěpena přidáním 10% thioanizolu a 15% bromtrimethylsilanu po dobu 30 minut. Roztok byl usušen v rotační odparce a nabrán do vodného acetonitrilu obsahujícího 0,1% TFA. Výsledný roztok byl nanesen na semipreparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován stupňovým gradientem. Frakce obsahující požadovaný Cys^161_produkt zbavený chránící skupiny SEP3:Acm+SEP-3:l+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32-Pbo byly identifikovány ES-MS a lyofilizovány přes noc.

Krok 8: odstranění Acm

Pro konečné odstranění Acm z postranních řetězců Cys⁷, Cys²⁹ a Cys³³ byl vodný roztok acetonitrilu obsahující sloučené frakce SEP3: Acm+SEP-3:l+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32-Pbo naředěn lx vodou v kvalitě pro HPLC a pevná močovina byla přidána do konečné koncentrace 2M. Trojnásobný molární • · · · • · · ·

135 nadbytek (relativní k celkové očekávané koncentraci cysteinu) 30 mg/ml roztoku Hg(acetát)₂ ve 3% vodné kyselině octové byl přidán a roztok byl míchán po dobu jedné hodiny. Roztok pak byl naředěn na 20% v β-merkaptoethanolu, nanesen na semipreparativní C4 kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a purifikován stupňovým gradientem. Frakce obsahující požadovaný ligovaný polymerně modifikovaný produkt SEP-3 (1166) byly identifikovány ES-MS a lyofilizovány přes noc.

Krok 9: Svinutí

Kompletní ligovaný polymerně modifikovaný peptid SEP-3 (1166) byl rozpuštěn ve 200mM Tris pufru (pH 8,7) obsahujícím 6M guanidiniumchlorid a 20% TFE a desateronásobný molární nadbytek (relativní k Cys zbytkům v SEP-3) cysteinu. Tento roztok byl dialyzován přes noc proti roztoku 200mM Tris pufru (pH 8,7) obsahujícímu 3M guanidiniumchlorid při teplotě místnosti. Roztok pak byl dialyzován proti roztoku 200mM Tris pufru (pH 8,7) obsahujícímu 1M guanidiniumchlorid po dobu 4 hodin ve 4 °C a konečně proti lOmM fosfátovému pufru (pH 7,0) po dobu 4 hodin ve 4 °C za vzniku konečného svinutého produktu. Svinutí bylo ověřeno elektrosprejovou ES-MS a CD spektrometrií.

Krok 10: Purifikace

Svinutý polypeptid byl koncentrován 5x v kyvetách koncentrátoru Centricon a nanesen na kolonu s měničem kationtů Resource S ekvilibrovanou lOmM fosfátem, pH 7,0. Svinutý protein byl eluován v lineárním solném gradientu do 500mM NaCl během 10 minut. Frakce obsahující požadovaný svinutý produkt SEP-3-L42 byly identifikovány SDS-PAGE a zmraženy a uloženy v -80 °C.

• · · ·

136

Příklad 6

Test biologické aktivity syntetických proteinů stimulujících erytropoézu

Biologická aktivita svinutých syntetických proteinů stimulujících erytropoézu, SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1B50 a SEP-3-L42 byla určena s použitím buněčných linií UT/7 a 32D 103197, v testech proliferace buněčné linie závislé na faktoru s použitím komerčního rekombinantního erytropoetinu jako kontrolního standardu. UT-7 je humánní buněčná linie megakaryoblastové leukémie s absolutní závislostí na jednom faktoru z interleukinu-3, faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF) nebo erytropoetinu (EPO) pro růst a přežití (Miura Y, et al., Acta Haematol, 1998, 99, 180184, Komatsu N, et al., Cancer Res., 1991, 51, 341-8). 32D

103197 je myší hemopoetická buněčná linie (Metcalf, D. Int J Cell Cloning, 1992, 10, 116-25).

Zásobní roztoky SEP konstruktů byly tvořeny v Dulbeccově médiu modifikovaném podle Iscoveho (IMDM), 10% FBS (fetální bovinní sérum), glutaminu a Penstrepu a sériová 2x ředění těchto zásobních roztoků byla přidána do jamek mikrotitrační destičky, ke kterým byly přidány humánní buňky UT/7 EPO v koncentraci 5 000 buněk/50 μί. Destičky byly inkubovány ve 37 °C v přítomnosti 5% CO2 a růst byl denně monitorován. Po čtyřech dnech bylo přidáno 20 μΐ 2,5 mg/ml MTT (methylthiazoltetrazolium) v PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosfáty) a destičky byly inkubovány po dobu čtyř hodin. Bylo přidáno 150 μΐ IPA a absorbance každé jamky byla odečítána v 562 nm. Byly určeny hodnoty ED50 (účinná dávka pro dosažení 50% maximálního účinku) pro SEP sloučeniny a byly srovnány s hodnotami pro rhEPO (rekombinantní humánní • · · ·

137 erytropoetin) tvořený CHO buňkami (buňky vaječníků čínského křečka). Výsledky z těchto experimentů demonstrovaly, že všechny syntetické proteiny stimulující erytropoézu projevovaly biologickou aktivitu. Výsledky ED50 pro SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30 a SEP-1-B50 jsou ukázány v tabulce VI.

Tabulka VI

Protein stimulující erytropoézu	Hodnoty ED50 in vitro (pM)
Buňky UT-7 (humánní) 1,570	Buňky 32D 103197 (myší) 863
SEP-0
SEP-1-L26	46.5	100.8
SEP-1-L30	71.5	182.5
SEP-1-B50	182 '	6200
rh EPO	32.5	136.3

Další výsledky z těchto experimentů po normalizaci na obsah peptidu pouze s použitím extinkčního koeficientu pro výpočet koncentrace proteinu absorbancí pro polymerně modifikovaný SEP-1-L30 jsou ukázány v tabulce VII a obrázku 26 pro SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, SEP-3-L42 a SEP-1B51 (syntéza SEP-1-B51 sloučeniny je popsána v příkladu 7 níže). Souborně tyto in vitro testy prokázaly rozdílný účinek měnících se polymerních struktur a míst připojení na in vitro biologickou aktivitu, kdy tyto sloučeniny měly následující relativní pořadí účinnosti, když byly testovány (1) na aktivitu receptoru humánního EPO (od nejúčinnější k nejméně účinné sloučenině): SEP-1-L26 * SEP-1-L30 > SEP-1-B50 « SEP-1B51 > SEP-3-L42 > SEP- 0 a (2) na aktivitu receptoru myšího EPO (od nejúčinnější k nejméně účinné sloučenině): SEP-1-L26 > SEP-1-L30 > SEP-0 > SEP-3-L42 > SEP-1-B50 * SEP-1-B51.

• · • · • · · · • · · ·

138

Tabulka VII

Protein stimulující erytropoézu	Hodnoty ED50 in vitro (ng/ml) —
Buňky UT-7 (humánní EPO R) Π	Buňky 32D 103197 (myší EPO R) 20
SEP-0
SEP-1-L26	0.8	1
SEP-1-L30	0.8	4 '
SEP-3-L42	7	70
SEP-1-B50	2.5	125
SEP-1-B51 .	2	125

Výsledky v tabulce VII a obrázek 26 také ukazují významný rozdíl v preferenci receptoru pro polymerně modifikované SEP konstrukty ve srovnání s nepolymerně modifikovaným konstruktem SEP-0. Konkrétně, SEP-1-L26 byl modifikován různými lineárními polymery připojenými v odpovídající poloze 24 glykosylačního místa humánního EPO (lineární polymer o velikosti 5,5 kD s připojeným negativním nábojem připojený k tomuto místu) a poloze 126 (lineární polymer o velikosti' 1,8 kD s připojeným neutrálním nábojem připojený k tomuto místu), tento konstrukt měl podobnou aktivitu jak proti humánním tak proti myším receptorům. SEP-1-L30 je modifikován lineárním polymerem o velikosti 5,5 kD, který má připojený negativní náboj v odpovídájících polohách 24 a 126 glykosylačních míst humánního EPO, tento konstrukt byl přibližně 5x účinnější než humánní receptor ve srovnání s myším receptorem. SEP-3-L42, který je modifikován lineárním polymerem o velikosti 5,5 kD majícím připojený negativní náboj v odpovídajících polohách 24, 38, 83 a 126 glykosylačních míst humánního EPO, byl přibližně lOx účinnější než humánní receptor ve srovnání s myším receptorem. Největší rozdíl byl pozorován pro SEP-1B50 a SEP-1-B51, které jsou modifikovány rozvětvenými záporně nabitými polymery o velikosti 15 kD připojenými v odpovídajících polohách 24 a 126 glykosylačních míst • · · ·

139 humánního EPO a mající pl přibližně 5 (podobně humánnímu EPO), tyto dva konstrukty byly ~ 60x účinnější než humánní receptor ve srovnání s myším receptorem.

Protože myší EPO postrádá glykosylační místo v poloze odpovídající poloze 126 humánního EPO (myší EPO má neglykosylovaný prolin místo O-glykosylovaný šeřinu nalezeného v humánním EPO), změněná receptorová aktivita může být způsobena částečně tímto rozdílem, a tedy preferencí myšího receptoru pro EPO, který postrádá O-vázanou glykosylaci v odpovídající poloze 126. To je v souladu se srovnáním SEP-1L26 a SEP-1-L30 k SEP-1-B50 a SEP-1-B52. Například SEP-1-L26 má polymer bez náboje o velikosti 1,8 kD v poloze 126, zatímco SEP-1-L30 má záporně nabitý polymer o velikosti 5,5 kD v poloze 126. Ačkoli proti humánnímu EPO receptoru byla pozorována totožná aktivita, proti myšímu EPO receptoru byl zjištěn čtyřnásobný rozdíl. Největší rozdíl byl pozorován pro konstrukty SEP-1-B50 a SEP-1-B51 se záporně nabitými polymery o velikosti 15 kD připojenými v odpovídající poloze 126 glykosylačního místa humánního EPO. Přidání záporně nabitých polymerů o velikosti 5,5 kD v místech odpovídajících všem čtyřem nativním glykosylačním polohám v humánním EPO, t j. 24, 38, 83 a 126 jako u konstruktu SEP-3-L42 snížilo preferenci pro myší receptor ještě více, ale méně než u konstruktů SEP-1B50 a SEP-1 B51. Tyto výsledky demonstrují, že receptorová specificita může být modulována přesnou modifikací míst odpovídajících glykosylačním místům v biologicky vytvořeném, glykosylovaném proteinu a upravením velikosti, povahy větvení a náboje polymeru.

• · · ·

140

Příklad 7

Syntéza syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu SEP-1B51

A. Přípravek SEP-1-B51

Šestý syntetický protein stimulující erytropoézu (nazvaný SEP-1-B51) byl syntetizován. Aminokyselinová sekvence kompletního SEP-1-B51 je stejná jako sekvence SEP-1-B50:

APPRLICDSR

VPDTKVNFYA

LVKSSQPWiJjP

PPDAAK^OXAAPL

CRTGDR (sekv

VLERYLLEAK

WKRMEVGQQA

LQLHVDKAVS

RTITADTFRK id. č.: 2)

EAEK^0XITTGCA

VEVWQGLALL

GLRSLTTLLR

LFRVYSNFLR

EHCSLNEKIT

SEAVLRGQAL

ALGAQKiJjAIS

GKLKLYTGEA

Kde ψ označuje nepřirozený aminokyselinový zbytek skládající se z cysteinu, který je karboxymethylbván v sulfhydrylové skupině, a kde K^ox označuje nepřirozený lysin, který je chemicky modifikován v epsilon-aminoskupině oximovým linkerem kondenzovaným k určenému polymeru rozpustnému ve vodě oximovou vazbou.

Nicméně, na rozdíl od SEP-1-B50, protein byl derivatizován rozvětveným polymerním konstruktem majícím čtyři lineární (Sukc-TTD)12-Sukc-Alanin-OH [tj. (Sukc-TTD)12-Sukc-Ala-OH nebo (Sukc-TTD)12-Sukc-Ala] polymery kondenzované amidovou vazbou k lysinovému rozvětvenému jádru. Kondenzace lineárních polymerů k rozvětvenému jádru prostřednictvím amidových vazeb byla navržena pro zlepšení stability, čtyři lineární polymery jsou také navrženy tak, aby nesly alaninovou skupinu a negativní náboje, sialové kyseliny a přičemž negativní náboje alanin hydrofobní charakter pnpojene napodobuj í oodobnv připojeným sacharidovým skupinám sacharidových

• · * · · · • · · • · · · · • · · · . · · · • · · · · · ·

141 řetězců. Rozvětvené polymery také byly navrženy tak, aby měly ve vodě rozpustný spacer mezi rozvětveným jádrem a místem připojení hlavního řetězce proteinu pro zlepšení syntézy a manipulačních vlastností rozvětveného templátu jádra a aby napodobovaly rozestupy nalézané v přírodních sacharidových řetězcích mezi místem připojení sacharidu k hlavnímu řetězci proteinu a prvním bodem větvení sacharidu.

Obrázek 21 je schématické zobrazení chemické syntézy rozvětveného ve vodě rozpustného polymeru GRFNP41 (GP41), který byl připojen k SEP-1-B51 ligaci tvořící oxim, jak je popsáno níže. Sestavení kompletního produktu bylo stejné, jak bylo popsáno v příkladu 2. Struktura SEP-1-B51 je ukázána na obrázku 22.

B. Syntéza (Sukc-TTD) i₂-Sukc-AlaOtBu (GRFNP39) pro kondenzaci k rozvětvenému templátu (GRFNP40).

Lineární polymer (Sukc-TTD) i₂-Sukc-AlaOtBu (GRFNP39) byl syntetizován v 0,5 mol měřítku na Sasrin pryskyřici, labilní v kyselině, tvořící karboxylovou kyselinu. 0,5mmol (~0,5 g) Sasrin polystyrénové pryskyřice, labilní v kyselině, tvořící karboxylovou kyselinu (substituce hydroxylové skupiny 1,02 nunol/g) , byla ponechána bobtnat v DMF po dobu 15 minut, a pak byla vysušena. K této hydroxyl-funkcionalizované pryskyřici bylo přidáno 450 mg (4,5 mmol) anhydridu kyseliny jantarové a 488 mg (4 mmol) 4-(dimethylamino) pyridinu rozpuštěného v 8 ml DMF obsahujících 500 μΐ (3,9 mmol) DIEA (diisopropylethylamin) a ponecháno reagovat po dobu 30 minut s třepáním na vortexu a vysušeno. Kondenzace byla opakována a nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty byly odstraněny 1 minutou třepání na vortexu, průrokovým promytím DMF (~50 ml), a pak usušeny. HOOC-CH₂CH₂CO-O-pryskyřice (0,5 mmol) byla aktivována přidáním • · · · • · · · · ·

142 ml čerstvého 1,OM (8 mmol) CDI (karbonyldiimidazol) roztoku v DMF a ponechána reagovat po dobu 40 minut, a pak usušena. Nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty byly odstraněny 1 minutou třepání na vortexu, průtokovým promytím DMF (~50 ml) , a pak usušeny. Byly přidány 4 ml (4 gramy, 18,2 mmol) (4,7,10)-trioxatridekan-1,13-diaminu (TTD) rozpuštěné ve 4 ml 0,5M (2 mmol) HOBT roztoku v DMF a ponechány reagovat za třepání na vortexu po dobu 30 minut, a pak usušeny. Nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty byly odstraněny 1 minutou třepání na vortexu, průtokovým promytím DMF (—50 ml), a pak usušeny. 450 mg (4,5 mmol) anhydridu kyseliny jantarové rozpuštěných v 8 ml 0,5M (4 mmol) HOBT (N-hydroxybenzotriazol) roztoku obsahujícím 500 μΐ (3,9 mmol) DIEA bylo přidáno k pryskyřici a ponecháno reagovat za třepání na vortexu po dobu 15 minut, a pak usušeno. Tyto tři kroky (CDI aktivace, TTD kondenzace, reakce anhydridu kyseliny jantarové) byly opakovány jedenáctkrát [tj. celkem dvanáctkrát]. Nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty byly odstraněny 1 minutou třepání na vortexu, průtokovým promytím DMF (~50 ml) a usušeny. HOOC-CH₂CH₂CO (TTD-Sukcinyl) ₁₂-O-pryskyřice (0,5 mmol) byla aktivována 8 ml čerstvého l,0M (8 mmol) CDI roztoku v DMF a ponechána reagovat po dobu 40 minut, a pak usušena. Nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty byly odstraněny 1 minutou třepání na vortexu, průtokovým promytím DMF (—50 ml), a pak usušeny. 2,5 mmol H-AlaOtBu. HC1 bylo rozpuštěno ve 4,75 ml 0,5M (2,375 mmol) HOBT v DMF obsahujícího 150 μΐ (111 mg, 0,825 mmol) DIEA a ponecháno reagovat s CDI-aktivovanou HOOCCH₂CH₂CO (TTD-Sukcinyl) i₂-O-pryskyřicí (0,5 mmol) po dobu 1 hodiny za třepání na vortexu, a pak usušeno. Nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty byly odszraněny 1 minutou třepání na vortexu, průtokovým promytím DMF (-50 ml), a pak usušeny. Produkt tercBuOOC-CH (CH₃)-NH-OC-CH₂CH₂CO (TTDSukcinyl) ₁₂-O-pryskyřice promyt důkladně • · >

143 (dichlormethan), usušen, a pak pryskyřice byla usušena ve vakuu do konstantní hmotnosti. Typická hmotnost produktupryskyřice byla kolem 2 gramů.

Lineární (Sukc-TTD) i₂Sukc-AlaOtBu polymer byl odštěpen od nosné pryskyřice podle standardních Fmoc chemických postupů s použitím 4% TFA v DCM. Precipitovaný surový produkt byl rozpuštěn v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA a lyofilizován. Lyofilizovány polymer byl rozpuštěn v malém množství 50% vodného acetonitrilu obsahujícího 0,1% TFA a naředěn tak, aby se snížila koncentrace organických látek pod 1%. Surový produkt byl nanesen na C4 preparativní kolonu pro chromatografii s převráceným poměrem fází ekvilibrovanou při teplotě T = 40 °C v 3% B. Soli byly eluovány izokraticky a požadovaný templát byl purifikován lineárním gradientem 20-35 % pufru B (acetonitril obsahující 0,1% TFA) proti 0,1% vodné TFA po dobu 60 minut. Frakce obsahující požadovaný (SukcTTD) 12-Sukc-AlaOtBu materiál (GRFNP39) byly identifikovány ESMS, zmraženy a lyofilizovány.

C. Syntéza templátu nesoucího mnohonásobné aminové skupiny pro rozvětvení a chráněnou aminooxyskupinu pro (pozdější) připojení k proteinu (GRFNP40)

Templát GRFNP40 byl syntetizován ručně na Sieber pryskyřici tvořící amidovou vazbu v 0,4 mmol měřítku. Byl prováděn jednominutový krok průtokového promytí DMF mezi každým krokem kondenzace, odstranění chránící skupiny a aktivace. 2 mmol N^a-Fmoc-N^p (Boc-aminooxyacetyl)-L-diaminopropionové kyseliny byly kondenzovány k pryskyřici s použitím 30 minutové NHS-ester preaktivace 2 mmol DIC a 2 mmol NHS v DCM/DMF (dimethylformamid), po dobu 1 hodiny. Po odstranění Fmoc chránící skupiny (2x3 minuty 20% objem/objem piperidinu ··4 · »·· · ’ · · < ·* ··

144 v DMF) a promytí, byly 4 mmol anhydridu kyseliny jantarové rozpuštěné v 8 ml 0,5M HOBT (N-hydroxybenzotriazol) roztoku obsahujícím 2,2 mmol D1EA kondenzovány k pryskyřici po dobu 10 minut. Po tomto kroku byla karboxylová skupina aktivována 8 ml čerstvého 0,5M (4 mmol) CDI roztoku v DMF. 4 ml (18,2 mmol) TTD byly přidány ve 4 ml 0,5M HOBT roztoku v DMF a kondenzovány po dobu 30 minut.

mmol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH byly kondenzovány k výsledné amino-TTD-Sukc-Dpr(BocAoA)-pryskyřici (kde Dpr = diaminopropionová kyselina) s použitím 30 minut preaktivace 2 mmol DIC a 2 mmol NHS v DMF a kondenzace po dobu 1 hodiny. Tato kondenzace byla jednou opakována. Po kroku Fmoc odstranění (2x3 minuty 20% objem/objem piperidinu v DMF), 4 mmol FmocLys (Fmoc) -OH byly kondenzovány tak, jak bylo popsáno výše, včetně opětovné kondenzace. Po konečném Fmoc ochranném kroku (2x3 minuty 20% objem/objem piperidinu v DMF) byl templát odštěpen od nosné pryskyřice podle, standardních Fmoc chemických postupů s použitím 4% TFA v DCM. Precipitovaný produkt byl rozpuštěn v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA a lyofilizován. Lyofilizovaný surový produkt byl vodného tak, aby acetonitrilu se snížila

Templát byl nanesen na rozpuštěn v malém množství 50% obsahujícího 0,1% TFA a naředěn koncentrace organických látek pod 1%

C4 preparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází ekvilibrovanou při teplotě T = 40 °C ve 3% pufru B (0,1 % TFA v acetonitrilu). Soli a další neamidový materiál byly eluovány izokraticky a požadovaný templát byl purifikován lineárním gradientem 5-12 % pufru B (acetonitril obsahující 0,1 % TFA) proti 0,1% vodné TFA po dobu 60 minut. Frakce obsahující požadovanou látku Lys-Lys(Lys)-TTD-Sukc-Dpr (BocAOA).amid (GRFNP40) byly identifikovány ES-MS, zmraženy a lyofilizovány.

• · · ·

145

D. Sestavení a odstranění chránící skupiny z amidem kondenzovaného rozvětveného polymeru (GRFNP41)

GRFNP41, rozvětvený (TTD-Sukc) 49-polymer o molekulové hmotnosti 16kD byl syntetizován kondenzací GRFNP39 [(SukcTTD) i₂-Sukc-AlaOtBu] k purifikovanému templátu GRFNP40. Purifíkovaný (Sukc-TTD) i₂-Sukc-AlaOtBu (GRFNP39) (1,0 mmol) rozpuštěný v DMSO (dimethylsulfoxid) v 60 °C na koncentraci 20 mg/ml byl aktivován 0,95 mol HATU {C-(7-azabenzotriazol-l-yl)1,1, 3, 3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát} v DMSO v koncentraci 10 mg/ml v přítomnosti dvacetinásobného (molárního) nadbytku DIEA. Bezprostředně byl přidán purifíkovaný templát GRFNP40 (0,24 mol) rozpuštěný v DMSO v koncentraci 3,9 mg/ml. Postup reakce byl monitorován C4 analytickou HPLC s převráceným poměrem fází a ES-MS. Typicky, kondenzace byla ukončena během minut. Pro zpracování byly přidány 4 objemy (relativně k ligační směsi) 0,lM acetátu sodného/6M guanidiniumchloridu, pH 4, a roztok byl nanesen na preparativní (C4) kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází. Soli a další látky neobsahující amid byly eluovány izokraticky a požadovaný rozvětvený polymerní produkt byl purifikován lineárním gradientem 20-35 % pufru B (acetonitril obsahující 0,1% TFA) proti 0,1% vodné TFA po dobu 80 minut. Frakce obsahující požadovanou látku byly identifikovány ES-MS, zmraženy a lyofilizovány.

Výsledný purifíkovaný polymer byl rozpuštěn v čisté TFA v koncentraci 1 mg/ml po dobu 1 hodiny, aby se odstranila Boc skupina z aminooxyacetylové skupiny a aby se odstranily skupiny terc-butylesteru z -Ala-OtBu skupin. Roztok byl rotován do sucha na rotační odparce a usušený polymer byl rozpuštěn v 50% pufru B (acetonitril obsahující 0,1% TFA). Aminooxyoctová kyselina (také 'karboxymetnoxylamin') byla přidána do konečné koncentrace 0,5M, aby byly odstraněny • · · · • · • · · ·

146 nečistoty tvořící adiční sloučeniny. Po 20 minutách byl roztok naředěn 3,3 objemy pufru A (0,1% TFA ve vodě) a nanesen na preparativní C4 kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a čerpán do 10% pufru B dokud nebyla odstraněn veškerá aminooxyoctová kyselina, pak byl polymer purifikován stupňovým gradientem 15% až 45% pufru B proti 0,1% vodné TFA po dobu 80 minut. Sloučené frakce obsahující požadovanou rozvětvenou polymerní látku (GRFNP41) byly zmraženy a lyofilizovány.

E. Ligace tvořící oxim (oximace) peptidových segmentů GRFN1776 a GRFN1711 s rozvětveným polymerem GRFNP41

Segment SEP-1:4 (GRFN1776, skládá se ze zbytků 117-166 sekv. id. č.: 2) a segment SEP-1:1 (GRFN1711, skládá se ze zbytků 1-32 sekv. id. č.: 2) byly syntetizovány tak, jak bylo s použitím standardní in šitu SPPS. Peptid GRFN1776 byl popsáno výše neutralizační syntetizován v příkladu 1 Boc chemie na -OCH₂-Pam-pryskyřici podle standardních protokolů, jak bylo také popsáno výše. Peptid GRFN1711 byl syntetizován na pryskyřici standardních protokolů, jak vytvářející thioester podle bylo popsáno výše. Segment

GRFN1776 obsahující acylovou skupinu levulové kyseliny na Lys¹²⁶ a AoA-obsahující GRFNP41 byly společné rozpuštěny v ekvimolárním poměru v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1 % TFA. Roztok byl lyofilizován. Usušený práškový surový produkt byl opět rozpuštěn v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA a nanesen na preparativní kolonu (C4) pro HPLC s převráceným poměrem fází. Polymerně modifikovaný peptid byl oddělen od nemodifikovaného peptidů a nezreagovaného polymeru preparativní gradientovou HPLC s převráceným poměrem fází. Frakce obsahující požadovaný produkt spojený s oximem (oximovaný) SEP-1:4+GP41 byly identifikovány ES-MS a sloučeny a lyofilizovány.

• · • · · · • · · ·

147

Segment GRFN1711 obsahující acylovou skupinu levulové kyseliny na Lys²⁴ a AoA-obsahující GRFNP41 byly společně rozpuštěny v ekvimolárním poměru v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA. Roztok byl zmražen a lyofilizován. Usušený prášek byl rozpuštěn v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA a nanesen na C4 preparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází. Polymerně modifikovaný peptid byl oddělen od nemodifikovaného peptidů a nezreagovaného polymeru preparativní gradientovou elucí C4 HPLC s převráceným poměrem fází. Frakce obsahující požadovaný produkt spojený s oximem (oximovaný) SEP-1:1 +GP41 byly identifikovány ES-MS a sloučeny a lyofilizovány.

F. Syntéza syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu

SEP-1-B51

SEP-1-B51 (mající sekv. id. č.: 2) byl syntetizován v roztoku ze čtyř polypeptidových segmentů:

Segment SEP-1:1+GP41 (GRFN 1711+GRFNP41, odpovídající zbytkům 1-32 sekv. id. č.: 2):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^OXITTGCA EH-thioester (kde Lys²⁴ má připojenou acylovou skupinu levulové kyseliny spojenou oximem k rozvětvenému polymeru GRFNP41, jak označeno K^ox a kde His³² je chráněn Dnp)

Segment SEP-1:2 (GRFN 1712, odpovídající zbytkům 33-88 sekv. id. č.: 2) :

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-thioester (kde Cys³³ je chráněn Acm a kde tři Trp zbytky jsou chráněny formylovou skupinou)

Segment SEP-1:3 (GRFN 1713, odpovídající zbytkům 89-116 sekv. id, č.: 2) :

• · · · ► · · 1 • · ·*

148

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-thioester (kde Cys je chráněn Acm a kde His94 je chráněn Dnp)

Segment SEP-1:4+GP41 (GRFN 1776+GRFNP41, odpovídající zbytkům 117-166 sekv. id. č.: 2).

CAIS PPDAAK^OXAAPL

RTITADTFRK

LFRVYSNFLR

GKLKLYTGEA CRTGDR-karboxylát (kde C-koncový cystein (tj .

Cys¹⁶¹) nese pikolylovou (piko) chránící skupinu a kde Lys

126 ma připojenou acylovou skupinu levulové kyseliny spojenou oximem k rozvětvenému polymeru GRFNP41, jak označeno K^ox)

Syntéza dalších peptidů, ligační reakce, karboxymethylace, deprotekční reakce, svinutí a purifikace za vzniku kompletního svinutého SEP-1-B51 (sekv. id. č.: 2) byly prováděny, jak bylo popsáno v příkladech 1 až 4, s následujícími modifikacemi:

Krok 1: Ligace č. 1

Segment SEP-1:4+GP41 byl rozpuštěn v TFE (1 objem) ve 3mM koncentraci. Segment SEP-1:3 byl rozpuštěn ve 2 objemech 300mM

Na fosfátového puf ru (pH

7,9) obsahuj ícím

6M guanidiniumchlorid v koncentraci 2,25mM. Tyto dva roztoky byly míchány za vzniku konečné koncentrace segmentu lmM SEP1:4+GP41 a l,5mM SEP-1:3 a 1% thiofenol byl přidán za vzniku roztoku ('3 objemy') peptidových segmentů v pH 6,8-7,2. Reakce byla ponechána pokračovat přes noc při teplotě místnosti. Po ligaci byl k ligační směsi přidán β-merkaptoethanol (3 objemy), následovaly 3 objemy 300mM pufru fosfátu sodného, pH 7,9, obsahujícího 6M guanidiniumchlorid a byl přidán TCEP (0,25 hmotnosti celkové hmotnosti peptidových segmentů) a roztok byl míchán po dobu 20 minut. Roztok byl acidífikován na hodnotu pH 4,0 +/- 0,1 se 0,6 objemy ledové kyseliny octové za vzniku čirého roztoku, ke kterému bylo přidáno 30 objemů pH 4,0, lOOmM ředicího pufru acetátu sodného, 6M guanidiniumchloridu.

• · · • · · ·

149

Výsledný roztok byl nanesen na preparativní kolonu (C4) pro HPLC s převráceným poměrem fází. Pufr byl čerpán do 5% B [tedy zbytek je 95% pufru A (0,1% TFA ve vodě)] dokud nebyly z kolony eluovány všechny nepeptidové látky, pak byl ligační produkt purifikován gradientem 25-45 % pufru B po dobu 80 minut. Frakce obsahující požadovaný ligační produkt (Cys⁸⁹ (Acm) ) {SEP-1:3+SEP-l:4+GP41} byly identifikovány elektrosprejovou hmotovou spektrometrií a sloučeny.

Krok 2: odstranění Acm č. 1

Pro odstranění Acm vodný roztok acetonitrilu obsahující sloučené frakce (Cys⁸⁹ (Acm)){SEP-1: 3+SEP-l: 4+GP41} byl naředěn lx vodou v kvalitě pro HPLC a pevná močovina byla přidána do konečné koncentrace 2M. Byl přidán trojnásobný molární nadbytek (relativní k celkové koncentraci cysteinu) 30 mg/ml roztoku Hg(acetát)2 ve 3% vodné kyselině octové a roztok byl míchán po dobu jedné hodiny. Roztok pak byl naředěn na 20% βmerkaptoethanolem, nanesen na semipreparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází a čerpán do 25% pufru B, dokud nebyly všechny nepeptidové látky eluovány a produkt pak byl purifikován stupňovým gradientem do 50% pufru B. Frakce obsahující požadovaný ligační produkt {SEP-1:3+SEP-l:4+GP41} byly identifikovány elektrosprejovou hmotovou spektrometrií, sloučeny a lyofilizovány.

Krok 3: Ligace č. 2

Produkt {SEP-1:3+SEP-l:4+GP41} [tj . 1713-1776-GP41] z kroku 2 byl rozpuštěn v TFE (1 objem) ve 3mM koncentraci. Segment SEP-1:2 (segment GRFN1712) byl rozpuštěn ve 2 objemech 300mM Na fosfátového pufru (pH 7,9) obsahujícím 6M guanidiniumchlorid v koncentraci 2,25mM. Tyto dva roztoky byly • · • · • · • · · ·

150 míchány za vzniku konečné koncentrace segmentu lmM {SEP1:3+SEP-l:4+GP41} a l,5mM SEP-1:2 a byl přidán 1% thiofenol za vzniku roztoku ('3 objemy') peptidových segmentů v pH 6,8-7,2. Reakce byla ponechána pokračovat přes noc při teplotě místnosti. Pak byla ligační směs naředěna 3 objemy (tj. relativně k objemu TFE použitém výše) ředicího pufru: lOOmM acetát sodný, pH 4,0, obsahující 6M guanidiniumchlorid, a pak byla přidána k roztoku, ochlazenému na 4 °C, který tvořily 3 objemy TFE, 3 objemy β-merkaptoethanolu, 3 objemy piperidinu a 6 objemů 6M guanidiniumchloridu, lOOmM acetát sodný, pH 4,0, a byla míchána po dobu 20 minut při teplotě místnosti, aby se odstranily každé zbylé chránící skupiny. Roztok byl acidifikován 1,8 objemy zmražené ledové kyseliny octové za vzniku čirého roztoku, ke kterému byl přidán TCEP (0,25 hmotnosti celkové hmotnosti peptidových segmentů) a roztok byl inkubován po dobu 20 minut. Pak bylo přidáno 30 objemů ředicího pufru lOOmM acetátu sodného, pH 4,0, 6M guanidiniumchloridu, a roztok byl míchán. Výsledný roztok byl nanesen na preparativní kolonu (C4) pro HPLC s převráceným poměrem fází. Pufr byl čerpán do 30% C (Pufr C: 0,1% TFA ve směsi 60% isopropanol/30% acetonitril/10% voda) dokud nebyly z kolony eluovány všechny nepeptidové látky, pak byl ligační produkt purifikován gradientem 37-57% pufru C po dobu 80 minut. Frakce obsahující požadovaný ligační produkt (Cys³³ (Acm)){SEP-1:2 + SEP-l:3 + SEP-l:4+GP41} byly identifikovány ES-MS a sloučeny a lyofilizovány.

Krok 4: Karboxymethylace zbytků Cys⁸⁹ a Cys¹¹⁷ (Cys³³ (Acm) ) {SEP-1:2 + SEP-l:3 + SEP-l:4+GP41} [tj.

(Cys³³ (Acm))-1712-1713-1776-GP41] byl rozpuštěn v TFE v lmM koncentraci. Bylo přidáno 10 objemů pufru 300mM fosfátu sodného (pH 7,9) obsahujícího 6M guanidiniumchlorid. Byl • · · · ·· ·· • · ·

151 přidán 25-násobný nadbytek (co se týče sulfhydrylových skupin) bromoctové kyseliny rozpuštěné v methanolu v koncentraci 75 mg/ml a roztok byl ponechán reagovat za míchání po dobu dvou hodin při teplotě místnosti. Reakční směs pak byla naředěna 11 objemy lOOmM acetátu sodného, pH 4,0, 6M guanidiniumchloridu, a nanesena na preparativní kolonu (C4) pro HPLC s převráceným poměrem fází a čerpána do 20% pufru C, dokud nebyly eluovány všechny nepeptidové složky, pak byl ligační produkt purifikován stupňovým gradientem do 55% pufru C. Frakce obsahující požadovaný modifikovaný produkt (Cys³³ (Acm), Ψ^89,117) {SEP-1:2+SEP-l:3+SEP-l:4+GP41} byly identifikovány ES-MS a sloučeny a lyofilizovány.

Krok 5: Odstranění pikolylové skupiny

Zinkový prach (71 miligramů na miligram peptidu) byl aktivován ve 2M HC1 po dobu 5 minut, aktivace byla jednou opakována, pak byl zinek promyt po dobu 10 minut 6M guanidiniumchloridem, 50mM glycinem, pH 2,2, obsahujícím (čerstvě přidaný) 35 mg/ml L-methioninu a 35 mg/ml dodekanoylsarkosinu sodného a 10% (objem/objem) TFE. Nadbytek kyseliny byl odstraněn. Promytí bylo jednou opakováno. Cys¹⁶¹ (Piko)-obsahuj ící peptid (Cys³³ (Acm), Ψ⁸⁹'¹¹⁷){3ΕΡ-1:2+3ΕΡ1:3+SEP-l:4+GP41} byl rozpuštěn v čistém TFE v přibližně 30 mg/ml koncentraci. Roztok byl naředěn 4 objemy (relativně k TFE) 6M guanidiniumchloridu, 50mM glycinu, pH 2,2, obsahujícím (čerstvě přidaný) 35 mg/ml L-methioninu a 35 mg/ml dodekanoylsarkosinu sodného a 10% (objem/objem) TFE. Roztok byl přidán k aktivovanému zinkovému prášku a míchán po dobu 50 minut při teplotě místnosti. Reakce byla monitorována analytickou C4 HPLC s převráceným poměrem fází alikvotů (podrobených působení stejným objemem β-merkaptoethanolu a několika zrnek TCEP, pak neředěných 2 objemy 6M • · • · · · • · · · • · ·

152 guanidiniumchloridu, lOOmM acetátu sodného, pH 4,0, pro analýzu) v ~1 hodinových intervalech a reakce byla kompletní po 2 až 5 hodinách. Poté, co bylo odstranění pikolylové skupiny ukončeno, jak ukázáno ES-MS analýzou vrcholů analytické HPLC (tj. ztráta hmoty o velikosti 91 D), supernatant byl odstraněn filtrací a zbývající Zn prášek byl promyt 3 krát 6M guanidiniumchloridem, pH 4, lOOmM acetátem obsahujícím 35 mg/ml L-methioninu a 35 mg/ml dodecylsarkosinu obsahujícího 20% TFE. Perličky BioRad SM-2 (přibližně jedna třetina objemu roztoku) byly přidány ke sloučenému supernatantu a promývacím pufrům a míchány při teplotě místnosti po dobu 30 minut, pak filtrovány. Byl přidán βmerkaptoethanol do 10% (objem/objem), pak bylo přidáno 0,25x (spojená hmotnost peptidů) TCEP a roztok byl míchán po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Roztok byl naředěn 1:1 stejným objemem lOOmM acetátu sodného, pH 4,0, 6M guanidiniumchloridu, a nanesen na preparativní kolonu (C4) HPLC s převráceným poměrem fází a 35% pufru C byl čerpán, dokud nebyly eluovány všechny nepeptidové látky a požadovaný produkt byl purifikován stupňovým gradientem do 55% pufru C. Frakce obsahující požadovaný Cys¹⁶¹-odchránšný produkt (Cys³³ (Acm), Ψ⁸⁹'¹¹⁷) {SEP1:2+SEP-l:3+SEP-l:4+GP41-Piko} byly identifikovány elektrosprejovou hmotovou spektrometrií a sloučeny.

Krok 6: odstranění Acm č. 2

Sloučený roztok (Cys³³ (Acm), Ψ⁸⁹'¹¹⁷) {SEP-1:2+SEP-l:3+SEP1:4+GP41-Piko} [t j . (Cys³³ (Acm), Ψ⁸⁹'¹¹⁷) -1712-1713-1776-GP41] byl naředěn 3x vodou v kvalitě pro HPLC a pevná močovina byla přidána do konečné koncentrace 2M. Byl přidán trojnásobný molární poměr (relativní k celkové koncentraci cysteinu) 30 mg/ml roztoku Hg(acetát)₂ ve 3% vodné kyselině octové a roztok

153 byl míchán po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Roztok pak byl naředěn na 20% β-merkaptoethanolem a byl nanesen na semipreparativní kolonu (C4) HPLC s převráceným poměrem fází. Pufr C (20%) byl čerpán, dokud nebyly eluovány všechny nepeptidové látky, a pak byl požadovaný produkt purifikován stupňovým gradientem do 55% pufru C. Frakce obsahující požadovaný produkt (Cys³³, Ψ⁸⁹'¹¹⁷) { SEP-1: 2+SEP-l: 3+SEP-l: 4+GP41Piko} byly identifikovány ES-MS, naředěny 2x (objem/objem) vodou obsahující 2x (hmotnost/hmotnost relativně k peptidové hmotě) DPC (dodecylfosfocholin) a byly lyofilizovány přes noc.

Krok 7: Ligace č. 3 (Cys³³, Ψ⁸⁹'¹¹⁷) {SEP-1:2+SEP-l:3+SEP-l:4+GP41-Piko} [tj

Ligační směs byla míchána K roztoku byly přidány 3 (Cys³³, ψ⁸⁹'¹¹⁷) -1712-1713-1776-GP41] byl rozpuštěn v čistém TFE (1 objem) ve 3mM koncentraci. SEP-1:1 [tj. 1711-GP41] byl rozpuštěn ve 2 objemech pufru 300mM fosfátu sodném (pH 7,9) obsahujícím 6M guanidiniumchlorid. Roztoky byly spojeny a byl přidán 1% (objem/objem) thíofenol, přes noc při teplotě místnosti, objemy (relativní k TFE objemu výše) β-merkaptoethanolu a 9 objemů ligačního pufru (300mM pufr fosfát sodný, pH 7,9, obsahující 6M guanidiniumchlorid). K roztoku bylo přidáno 0,25x (spojené hmotnosti peptidů) TCEP a roztok byl míchán při teplotě místnosti po dobu 20 minut. Bylo přidáno 0,6 objemu ledové octové kyseliny pro okysličení roztoku na pH 4,0 a roztok pak byl naředěn 30 objemy lOOmM acetátu sodného, pH 4,0, obsahujícího 6M guanidiniumchlorid a byl nanesen na preparativní kolonu (C4) HPLC s převráceným poměrem fází. Pufr C (25%) byl čerpán, dokud nebyly eluovány všechny nepeptidové látky, pak byl ligační produkt purifikován lineárním gradientem pufru C od 35 do 55% po dobu 80 minut. Frakce »·· · t

► · ·

154 obsahující požadovaný ligační produkt SEP-1, (1-166, ψ89,ιπ) {sep-1: i (+GP41)+SEP-1:2+SEP-l:3+SEP-l:4+GP41}: (sekv. id. č. : 2) byly identifikovány elektrosprejovou hmotovou spektrometrií a sloučeny.

Krok 8 Svinutí:

Ke spojeným frakcím obsahujícím kompletní ligovaný peptid SEP-1 (1-166) (Ψ^89,117) { SEP-1:1 (+GP41)+SEP-1: 2 + SEP-l: 3 + SEP1:4+GP41} [tj . 1711(GP41)-1712-1713-1776-GP41] byl přidán pevný guanidiniumchlorid, 1M Tris pufr (pH 8,7) a destilovaná voda za vzniku konečného roztoku 0,1 mg/ml ligovaného peptidu SEP-1 (1-166), 6M guanidiniumchloridu, lOOmM Tris. Tento roztok ligovaného peptidu ('proteinu') byl nanesen do 15 ml dialyzačních kazet a dialyzován přes noc ve 4 °C proti roztoku lOOmM Tris pufru (pH 8,5) obsahujícímu 3M guanidiniumchlorid, 5μΜ cystein a 2μΜ cystin. Proteinový roztok pak byl dialyzován proti roztoku lOOmM Tris pufru (pH 8,5) obsahujícímu 1M guanidiniumchlorid po dobu 8 hodin ve 4 °C a konečně byl dialyzován proti lOmM Tris pufru (pH 7,0) po dobu 14 hodin ve 4 °C za vzniku konečného svinutého produktu. Svinuté roztoky obsahující protein z dialyzačních kazet byly spojeny. Svinutí bylo ověřeno ES-MS, analytickou RP-HPLC a CD spektrometrií.

Krok 9 Purifikace:

Roztok obsahující svinutý protein byl nanesen na iontoměničovou kolonu Q-Sepharose ekvilibrovanou lOmM Tris, pH 7,0. Svinutý protein byl eluován s použitím lineárního solného gradientu do 125mM NaCl. Frakce obsahující požadovaný svinutý produkt SEP-1-B51 byly identifikovány neredukční SDS-PAGE a sloučeny. Spojené frakce byly koncentrovány ultrafiltrací na koncentraci přibližně 2 mg/ml, pak byl roztok proteinu nanesen • · · ·

155 na 2,6 x 100 cm S-300 gelovou filtrační kolonu. Purifikovaný SEP-1-B51 byl eluován lOmM Tris pH 7,0, 137mM chloridem sodným. Frakce obsahující SEP-1-B51 o vysoké čistotě byly identifikovány neredukční SDS-PAGE a byly sloučeny, zmraženy a uloženy v -80 °C. Konečný, purifikovaný svinutý protein SEP-1B51 byl charakterizován analytickou (C4) HPLC s převráceným poměrem fází, ES-MS, neredukční SDS-PAGE a CD spektrometrií. Obrázek 25 ukazuje reprezentativní gel izoelektrické fokusace (IEF) a gel z neredukční SDS-PAGE ukazující relativní molekulovou hmotnost svinutého purifikovaného SEP1-B51. Standardy molekulové hmotnosti puštěné na stejných gelech jsou ukázány pro srovnání. Jak je ukázáno, relativní molekulová hmotnost SEP1-B51 určena neredukční SDS-PAGE je přibližně 73kD. Relativní pl je přibližně 5,0. Je také ukázán reprezentativní chromatogram RP-HPLC svinutého purifikovaného SEP-1-B51 produktu. To ukazuje čistotu a zvýšenou relativní molekulovou hmotnost přesných polymerně modifikovaných proteinů podle předkládaného vynálezu.

Příklad 8

Syntéza syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu SEP-1B52

A. Přípravek SEP-1-B52

Sedmý syntetický protein stimulující erytropoézu (nazvaný SEP-1-B52) byl syntetizován. Aminokyselinová sekvence kompletního SEP-1-B52 je stejná jako sekvence SEP-1-B51:

APPRLICDSR	VLERYLLEAK	EAEK^OXITTGCA	EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA	WKRMEVGQQA	VEVWQGLALL	SEAVLRGQAL
LVKSSQPWTP	LQLHVDKAVS	GLRSLTTLLR	ALGAQKTAIS

• · • · · · • · · · · « • · · • · · · · • · ·

156

PPDAAK^OXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR (sekv. id. č.: 2) kde Ψ označuje nepřirozený aminokyselinový zbytek skládající se z cysteinu, který je karboxymethylován v sulfhydrylové skupině a kde K^ox označuje nepřirozený lysin, který je chemicky modifikován v epsilon-aminoskupině oximovým linkerem kondenzovaným k určenému polymeru rozpustnému ve vodě oximovou vazbou.

SEP-1-B52 protein byl derivatizován ve zbytcích 24 a 126 rozvětveným (Sukc-TTD) 12-Sukc-Ala polymerním konstruktem podobným SEP-1-B51, ale u tohoto analogu byl polymer připojen prostřednictvím oximové vazby mezi pyrohroznovou kyselinou a aminooxyoctovou kyselinou. Navíc, epsilon-aminoskupina lysinových zbytků 24 a 126 byla modifikována tak, aby nesla aminooxyacetylovou funkční skupinu místo acylové skupiny levulové kyseliny a rozvětvený (Sukc-TTD) 12-Sukc-Ala polymerní konstrukt byl vytvořen tak, aby nesl připojenou acylovou skupinu pyrohroznové kyseliny. Tyto změny byly navrženy pro zlepšení syntézy a manipulace a další zvýšení stability oximových vazeb.

Obrázek 23 je schématické zobrazení chemické syntézy rozvětveného polymeru rozpustného ve vodě GRFNP43 (GP43), který byl připojen k SEP-1-B52 ligací tvořící oxim, jak je popsáno níže. Sestavení kompletního produktu bylo stejné, jak bylo popsáno v příkladu 2. Struktura SEP-1-B52 je ukázána na obrázku 24.

B. Syntéza (Sukc-TTD) ₁₂-Sukc-AlaOtBu (GRFNP39) pro kondenzaci k rozvětvenému templátu (GRFNP42) (Sukc-TTD) 12-Sukc-AlaOtBu (GRFNP39) byl syntetizován • · • · · ·

157 pryskyřice, labilní v kyselém prostředí, tvořící karboxylovou kyselinu (substituce hydroxylové skupiny 1,02 mmol/g) bylo ponecháno bobtnat v DMF po dobu 15 minut, a pak usušeno. K této hydroxyl-funkcionalizované pryskyřici bylo přidáno 450 mg (4,5 mmol) anhydridu kyseliny jantarové a 488 mg (4 mmol) 4-(dimethylamino)pyridinu rozpuštěného v 8 ml DMF obsahujících 500 μΐ (3,9 mmol) DIEA (diisopropylethylamin) a ponecháno reagovat po dobu 30 minut za třepání na vortexu, a pak usušeno. Kondenzace byla opakována a nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty byly odstraněny 1 minutou třepání na vortexu, průtokovým promytím DMF (-50 ml) , a pak usušeny. 0,5 mmol HOOC-CH₂CH₂CO-O-pryskyřice bylo aktivováno přidáním 8 ml čerstvého l,0M (8 mmol) CDI roztoku v DMF a ponecháno reagovat po dobu 40 minut, a pak usušeno. Nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty byly odstraněny 1 minutou třepání na vortexu, průtokovým promytím DMF (-50 ml) a usušeny. Byly přidány 4 ml (4 g, 18,2 mmol) TTD rozpuštěné ve 4 ml 0,5M (2 mmol) HOBT roztoku v DMF a ponechány reagovat za třepání na vortexu po dobu 30 minut a usušeny. Nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty byly odstraněny 1 minutou třepání na vortexu, průtokovým promytím DMF (-50 ml) a usušeny. 450 mg (4,5 mmol) anhydridu kyseliny jantarové rozpuštěných v 8 ml 0,5M (4 mmol) HOBT (N-hydroxybenzotriazol) roztoku obsahujícím 500 μΐ (3,9 mmol) DIEA bylo přidáno k pryskyřici a ponecháno reagovat za třepání na vortexu po dobu 15 minut, a pak usušeno. Tyto tři kroky (CDI aktivace, TTD kondenzace, reakce anhydridu kyseliny jantarové) byly opakovány jedenáctkrát [tj . celkem dvanáctkrát]. Nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty byly odstraněny 1 minutou třepání na vortexu, průtokovým promytím DMF (-50 ml) a usušeny. 0,5 mmol HOOC-CH₂CH₂CO (TTDsukcinyl) i2-O-pryskyřice bylo aktivováno 8 ml čerstvého l,0M (8 mmol) CDI roztoku v DMF, ponecháno reagovat po dobu 40 minut a usušeno. Nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty • · · · ·· · · » · · « ·· ·«

158 byly odstraněny 1 minutou třepání na vortexu, průtokovým promytím DMF (~50 ml) a usušeny. 2,5 mmol H-AlaOtBu. HC1 bylo rozpuštěno ve 4,75 ml 0,5M (2,37 5 mmol) HOBT v DMF obsahujícího 150 μΐ (111 mg, 0,825 mmol) DIEA a ponecháno reagovat s CDI-aktivovanou HOOC-CH₂CH₂CO(TTD-sukcinyl) i₂-Opryskyřicí (0,5 mmol) po dobu 1 hodiny za třepání na vortexu, a pak usušeno. Nadbytek reaktantů a rozpustné koprodukty byly odstraněny 1 minutou třepání na vortexu, průtokovým promytím DMF (~50 ml), a pak usušeno. Produkt tercBuOOC-CH (CH₃) -NH-OCCH₂CH₂CO (TTD-sukcinyl) 12-O-pryskyřice byl promyt důkladně DCM, usušen, a pak pryskyřice byla usušena ve vakuu do konstantní hmotnosti. Typická hmotnost produktu-pryskyřice byla kolem 2 gramů.

Lineární GRFNP39 byl odštěpen od nosné pryskyřice podle standardních Fmoc chemických postupů s použitím 4% TFA v DCM. Precipitovaný surový produkt byl rozpuštěn acetonitrilu obsahujícím 0,1 % TFA a

Lyofilizovány polymer byl rozpuštěn v malém množství 50% vodného acetonitrilu obsahujícího 0,1% TFA a naředěn tak, aby se snížila koncentrace organických látek pod 1%. Surový produkt byl nanesen na C4 preparativní kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází ekvilibrovanou při teplotě T = 40 °C v 3% B. Soli byly eluovány izokraticky a požadovaný templát byl purifikován lineárním gradientem 20-35% pufru B (acetonitril obsahující 0,1% TFA) proti 0,1% vodné TFA po dobu 60 minut. Frakce obsahující požadovaný (Sukc-TTD) i₂-SukcAlaOtBu materiál (GRFNP39) byly identifikovány ES-MS, zmraženy a lyofilizovány.

v 50% vodném lyofilizován.

C. Syntéza templátu nesoucího mnohonásobné aminové skupiny pro rozvětvení a připojenou acylovou skupinu pyrohroznové kyseliny clo (pozdější) ccicojeni- k cLOteicc ÍGRFNP42) ·« · «

159

Templát byl syntetizován ručně na Boc-Leu-0CH2-Pampryskyřici v 0,4 mmol měřítku. Byl prováděn jednominutový krok průtokového promytí DMF mezi každým krokem kondenzace, odstranění chránící skupiny a aktivace. Boc skupina byla odstraněna působením čisté (tj. 100%) TFA. Po DMF promytí byly 2 mmol Fmoc-(Rinkova spojka)-OH kondenzovány k pryskyřici po aktivaci 1,8 mmol HBTU ve 3,8 ml DMF obsahujícím 1 ml DIEA. Po odstranění Fmoc chránící skupiny (2x3 minuty 20% piperidinu v DMF), 2 mmol Fmoc-Lys (MTT)-OH [MTT = 4-methyltritylová skupina] byly kondenzovány k pryskyřici s použitím NHS-ester aktivace 2 mmol DIC a 2 mmol NHS v DMF. Po odstranění Fmoc chránící skupiny (2x1 minuta 0,5% DBU v DMF), byly 4 mmol anhydridu kyseliny jantarové rozpuštěné v 8 ml z 0,5M HOBT roztoku obsahujícím 2,2 mmol DIEA kondenzovány k pryskyřici po dobu 10 minut. Po tomto kroku byla karboxylová skupina navázaná na pryskyřici aktivována 8 ml čerstvého 0,5M CDI roztoku v DMF. 4 ml TTD byly přidány ve 4 ml 0,5M HOBT roztoku a kondenzovány po dobu 30 minut.

mmol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH byly kondenzovány k pryskyřici s použitím NHS-ester aktivace 2 mmol DIC a 2 mmol NHS v DMF. Po kroku Fmoc odstranění (2x1 minuta 0,5% DBU v DMF), 4 mmol Boc-Lys (Boc)-NHS byly kondenzovány ve 3 ml DMF.

MTT chránící skupina byla odstraněna mnohonásobným promytím 2% TFA v DCM. Odstranění chránící skupiny bylo kompletní, když supernatant ztratil svou žlutou barvu. Pryskyřice byla neutralizována 10% DIEA v DMF po dobu jedné minuty. 2 mmol kyseliny pyrohroznové byly kondenzovány k pryskyřici s použitím NHS-ester aktivace 2 mmol DIC a 2 mmol NHS v DMF po dobu 45 minut. Templát byl zbaven chránící skupiny a odštěpen od nosné pryskyřice s použitím čisté TFA obsahující 5 % vody. štěpený roztok byl evaporován do sucha v rotační odpare. Zbytek byl rozpuštěn v 50% vodném • ·«*· • » >

» » · # · • » · · ·· ·»*· a lyofilizován. malém množství 50% ·· >„ • ♦ · · • · · 9 • * » » » Λ • · · *« >·

160 acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA Lyofilizovány templát byl rozpuštěn v vodného acetonitrilu obsahujícího 0,1% TFA a naředěn tak, aby se snížila koncentrace organických látek pod 1 %. Templát obsahující pyruvát byl nanesen na C4 Prep kolonu ekvilibrovanou při teplotě T = 40 °C v 0 % pufru B [tj. 100% pufr A = 0,1 % TFA ve vodě]. Soli byly eluovány izokraticky a požadovaný templát byl purifikován lineárním gradientem 5-12 % pufru B proti 0,1% vodné TFA během 60 minut. Frakce obsahující požadovanou látku (GRFNP42) byly identifikovány ESI-MS, zmraženy a lyofilizovány.

D. Sestavení a odstranění chránící skupiny z amidem kondenzovaného rozvětveného polymeru (GRFNP43)

GRFNP43, rozvětvený (TTD-Sukc) 49-polymer o molekulové hmotnosti 16kD byl syntetizován kondenzací GRFNP39 k purifikovanému templátu GRFNP42. 1,0 mmol purifikovaného (Sukc-TTD)12-Sukc-AlaOtBu (GRFNP39) rozpuštěného v DMSO v 60 °C v koncentraci 20 mg/ml byl aktivován 0,95 mol HATU v DMSO v koncentrací 10 mg/ml v přítomnosti dvacetinásobného (molárního) nadbytku DIEA. Bezprostředně bylo přidáno 0,24 mol purifikovaného templátu GRFNP42 rozpuštěného v DMSO v koncentraci 3,9 mg/ml. Postup reakce byl monitorován analytickou C4 HPLC s převráceným poměrem fází a ES-MS. Typicky, kondenzace byla ukončena během minut. Pro zpracování byly přidány 4 objemy (relativně k ligační směsi) 0,lM acetátu/6M guanidiniumchloridu, pH 4, a roztok byl nanesen na preparativní kolonu (C4) HPLC s převráceným poměrem fází. Solí a další látky neobsahující amid byly eluovány izokraticky a požadovaný rozvětvený polymerní produkt byl purifikován lineárním gradientem 20-35 % pufru B (acetonitril obsahující 0,1% TFA) proti 0,1% vodné TFA po dobu 80 minut. Frakce • · • · · * • · · · • · · · « · · · a * * · · · · ···· · · « • ······ · «·· · 4

	• · « · 161	• · · · 4» »6
obsahuj ící	požadovanou látku byly	identifikovány
zmraženy a	lyofilizovány.

Výsledný purifikovaný rozvětvený polymerní konstrukt GRFNP43 byl rozpuštěn v čisté TFA v koncentraci 1 mg/ml po dobu 1 hodiny, aby se odstranila Ala-OtBu tercbutylesterová chránící skupina. Roztok byl evaporován do sucha v rotační odparce a usušený polymer byl rozpuštěn v 50% pufru B (acetonitril obsahující 0,1% TFA). Polymer byl odsolen preparativní HPLC s převráceným poměrem fází stupňovým gradientem 15% až 45% pufru B proti 0,1% vodné TFA po dobu 80 minut. Sloučené frakce obsahující požadovanou látku (GRFNP43) byly zmraženy a lyofilizovány a usušený prášek byl použit pro ligační krok tvořící oximaci.

E. Ligace tvořící oxim (oximace) GRFN1776 a GRFN1711 s rozvětveným polymerem GRFNP43

Segmenty SEP-1:4 a segment SEP-1:1 byly syntetizovány tak, jak bylo popsáno výše v příkladech 2, 3, 4 a 7, s tím, že místo levulové kyseliny byla aminooxyacetylová (AoA) skupina připojena k Lys²⁴ a Lys¹²⁶ v příslušných peptidových segmentech podle standardních kondenzačních protokolů. Tak, po sestavení peptidové pryskyřice, Fmoc skupina postranního řetězce byla odstraněna z každé peptidové pryskyřice a 2 mmol Boc-aminooxyoctové kyseliny byly přidány k pryskyřici s použitím NHS-ester aktivace 2 mmol DIC a 2 mmol NHS v DMF. Tyto dva peptidy byly zbaveny chránící skupiny a odštěpeny od pryskyřice HF a purifikovaný C4 HPLC s převráceným poměrem fází. Byla učiněna vhodná opatření, aby se zabránilo expozicí karbonylovým sloučeninám. Segment SEP-1:4 a GRFNP43 byly společně rozpuštěny v ekvimolárním poměru v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA (trifluoroctová kyselina).

• 9 • f • · · · • · · · « · · · · ···· · * · • «····· · ··· · · • β · ·· · ···· • W · · ····· * · > ·

162 v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA a nanesen na preparativní C4 kolonu pro HPLC s převráceným poměrem fází. Polymerně modifikovaný peptid byl oddělen od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polymeru preparativní gradientovou HPLC s převráceným poměrem fází. Frakce obsahující požadovaný oximovaný produkt SEP-1:4+GP43 byly identifikovány ES-MS a sloučeny.

Segmenty SEP-1:1 a GRFNP43 byly společně rozpuštěny v ekvimolárním poměru v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1 % TFA. Roztok byl zmražen a lyofilizován. Usušený prášek byl rozpuštěn v 50% vodném acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA a nanesen na preparativní gradientovou kolonu C4 HPLC s převráceným poměrem fází. Polymerně modifikovaný peptid byl oddělen od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polymeru preparativní gradientovou elucí s převráceným poměrem fází. Frakce obsahující požadovaný oximovaný produkt SEP-1:1+GP43 byly identifikovány ES-MS a sloučeny.

F. Příprava syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu SEP-1-B52

SEP-1-B52 (sekv. id. č. : 2) byl syntetizován v roztoku ze čtyř polypeptidových segmentů:

Segment SEP-1:1+GP43 (GRFN 1711+GRFNP43, odpovídající zbytkům 1-32 sekv. id. č.: 2):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^OXITTGCA EH-thioester (kde

Lys²⁴ má připojenou skupinu AoA spojenou oximem k rozvětvenému polymeru GRFNP43, jak označeno K^ox a kde His32 je chráněn Dnp)

Segment SEP-1:2 (GRFN 1712, odpovídající zbytkům 33-88 sekv. id. č.: 2) :

CSLNEKIT VPDTKVNFYA

WKRMEVGQQA

VEVWQGLALL • · • · · · ··· · · β • · · · · ···· · · · • ·♦···· · # · · · · • · · ·· · ···· • · ·« ·· ··· ·« ··

163

Segment SEP-1:3 (GRFN 1713, odpovídající zbytkům 89-116 sekv. id. č. : 2):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-thioester (kde Cys³⁹je chráněn Acm a kde His⁹⁴ je chráněn Dnp)

Segment SEP-1:4+GP43 (GRFN 1776+GRFNP43, odpovídající zbytkům 117-166 sekv. id. č.: 2):

CAIS PPDAAK^OXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR

GKLKLYTGEA CRTGDR-karboxylát (kde C-koncový cystein (tj. Cys¹⁶¹) nese pikolylovou (piko) chránící skupinu a kde Lys^q126 má připojenou skupinu AoA spojenou oximem k rozvětvenému polymeru GRFNP43, jak označeno K^ox) .

Syntéza dalších peptidů, ligační reakce, karboxymethylace, deprotekční reakce, svinutí a purifikace jsou prováděny tak, jak bylo popsáno výše v příkladech 1, 2, 3, 4 a 7, za vzniku kompletního svinutého SEP-1-B52 (sekv. id. č. : 2), který byl charakterizován analytickou (C4) HPLC s převráceným poměrem fází, ES-MS a neredukční SDS-PAGE. Biologické testy jsou prováděny tak, jak bylo popsáno pro jiné SEP konstrukty.

Příklad 9

Studie účinnosti SEP-3-L42

SEP-3-L42 byl reformulován v citrátovém pufru (20mM citrát sodný + lOOmM chlorid sodný) plus 0,25% sérový albumin laboratorního potkana (RSA) a byl podáván intravenózně normálním samcům laboratorního potkana (5 laboratorních potkanů ve skupině) v dávkách 0, 1, 5 nebo 10 μg/kg, tiw, ve • · • · · · • » · · · · · · • * · « · * k ·· « • · · · · · · · · · · · • ······ · · · · · · • · · ·· · ·<·· • · «· · t * · · # · ·<

164 dnech 1, 3 a 6. Vzorky krve byly odebírány 4 dny po poslední injekci (den 9) a analyzovány na hematologické parametry. Nebyly žádné statisticky významné rozdíly v hodnotách množství červených krvinek(RBC), hemoglobinu (HGB), hematokritu (HCT) a retikulocytů (RET) 4 dny po poslední injekci SEP-3-L42 v těchto dávkách ve srovnání s hodnotami kontrolní skupiny.

Příklad 10

Farmakokinetické studie SEP-3-L42

SEP-3-L42 byl reformulován v citrátovém pufru (20mM citrát sodný + lOOmM chlorid sodný) plus 0,25% RSA, pH6,9, a byl podáván intravenózně jako jedna dávka normálním samcům laboratorního potkana v dávkové hladině 5 μg/kg. Vzorky krve byly odebírány 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 hodin po podání dávky. Plazmatická koncentrace SEP-3-L42 byla určena pomocí soupravy ELISA anti-EPO (R & D Systems, Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00) podle instrukcí výrobce. Výsledky jsou ukázány na obrázku 27.

Jak je ukázáno na obrázku 27, SEP-1-B50 projevoval o něco pomalejší clearance ve srovnání se SEP3-L42. Navzdory svému poločasu v cirkulaci, SEP3-L42 nedokázal projevit statisticky významné rozdíly při podporování produkce červených krvinek v testovaných dávkách. Na rozdíl od toho, SEP-1-B50 ve stejných dávkách produkci červených krvinek stimuloval. To ukazuje, že polymerní struktura může být využívána pro ladění in vivo biologických vlastností, včetně farmakokinetického režimu a účinnosti.

# · ·· ·· · · · * · · ·

165

Příklad 11

Studie účinnosti SEP-1-L30

SEP-1-L30 byl reformulován v citrátovém pufru (20mM citrát sodný + lOOmM chlorid sodný) plus 0,25% RSA a byl podáván intravenózně normálním samcům laboratorního potkana (5 laboratorních potkanů ve skupině) v dávkách 0, 1, 5, 25 nebo 50 pg/kg, tiw, ve dnech 1, 3 a 5. Vzorky krve byly odebírány 4 a 8 dnů po poslední injekci (dny 9 a 13) a analyzovány na hematologické parametry. Nebyly žádné statisticky významné rozdíly v hodnotách RBC, HGB a HCT, kdykoliv po léčbě SEP-1-L30, ve srovnání s hodnotami kontrolní skupiny. Množství retikulocytů bylo vyšší 4 dny po poslední injekci (den 9) u laboratorních potkanů léčených 25 a 50 μς/kg (statisticky významný rozdíl ve srovnání s hodnotami kontrolní skupiny). žádné jiné rozdíly v hematologických parametrech nebyly pozorovány ani v den 9 ani v den 13 pro kterékoliv ze zvířat léčených SEP-1-L30. [Data nejsou ukázána]

Příklad 12

Farmakokinetické studie SEP-1-L30

SEP-1-L30 byl reformulován v citrátovém pufru (20mM citrát sodný + lOOmM chlorid sodný) plus 0,25% RSA, pH 6,9, a byl podáván intravenózně normálním samcům laboratorního potkana jako jedna dávka v dávkové hladině 5 nebo 25 μς/^. Vzorky krve byly odebírány 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 a 168 hodin po podání dávky. Plazmatická koncentrace SEP-1-L30 byla určena soupravou ELISA (R & D Systems, Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00) podle • ·· · · · · · · · · · • ·····« · · » · · · • · · ·· » · · · · • · ·· · · · · · ·· ··

166 instrukcí výrobce. SEP-1-L30 nebyl zjistitelný v kterémkoliv časovém bodu v podávaných dávkách.

Příklad 13

Studie účinnosti SEP-1-B50

SEP-1-B50 byl reformulován ve sterilním PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosfáty) plus 0,25% RSA a byl podáván intravenózně normálním samcům laboratorního potkana (5 laboratorních potkanů ve skupině) v dávkách 0, 1, 5, 25 nebo 125 pg/kg, tiw, ve dnech 1, 3 a 6. Vzorky krve byly odebírány 4, 9 a 14 dnů po poslední injekci (dny 10, 15 a 20) a analyzovány na hematologické parametry. Data jsou ukázána v tabulce VIII níže. Zvýšení RBC, HGB, HCT a RET jako reakce závislá na dávce bylo pozorováno 4 dny po poslední injekci (den 10) u zvířat dostávajících 5, 25 a 125 μ/kg SEP-1-B50 (statisticky významný rozdíl ve srovnání s hodnotami kontrolní

skupiny).	RBC, HGB	a HCT	u	těchto zvířaty zůstaly	vyšší	než
kontrolní	hodnoty	v den	15	a setrvávaly významně	vyšší	než
kontrolní	hodnoty	v den	20	(14 dnů po poslední	injekci)	u

zvířat léčených dávkou 125 μg/kg. Produkce RET byla snížena po dni 10, s významně nižšími počty ve dnech 15 a 20 u zvířat s dávkou 25 a 125 μ5^ς.

• · · * · · ···· ···« «·« ·· » • 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9 · • ······ · · · · » » · · · · · « · · · · «·

167

Tabulka VIII

Hematologické nálezy po mnohonásobných dávkách SEP-1-B50
RBC	Den 10	Den 15	Den 20
Kontrola	7.01+0.301	6.86 + 0.391	6.96 + 0.178
1 gg/kg	7.07 + 0.452	6.85 + 0.446	7.00 + 0.315
5 gg/kg	7.16 + 0.402	7.27 + 0.229	6.92 + 0.238
25 gg/kg	7.98 + 0.484**	773 + 0.448*	7.20. + 0.331
125 gg/kg	8.71 +0.512**	8.89 + 0.598**	8.25 + 0.641**
·.^: ’, Λ··'.		.-·/*- ' ·Ρ?·,Ρ ; pj	<pípppppp.p,.p
HGB	Den 10	Den 15	Den 20
Kontrola	14.2 + 0.49	14.0 + 0.61	13.9 + 0.36
1 gg/kg	14.4 + 1.18	14.2 + 0.44	14.1+0.30
5 gg/kg	15.6 + 0.43*	15.3 + 0.33*	14.4 + 0.30 '
25 gg/kg	16.1+0.49**	15.1 + 0.57	13.8 + 0.22
125 gg/kg	16.9 + 0.82**	16.4 + 0.32**	15.0 + 1.07*


HCT	I Den 10	Den 15	Den 20
Kontrola	41.1 +1.39	40.5 + 0.93	40.9 + 1.33
1 gg/kg	42.6 + 1.82	40.6 + 1.83	41.2 + 1.13
5 gg/kg	44.7 + 1.69*	44.1+1.27	41.5 + 0.90
25 gg/kg	46.6 + 1.50**	43.6 + 1.61	40.3 + 1.05
125 gg/kg	49.8 + 2.13** .	48,4 + 3.95**	44.3 + 3.39*
1 Pp <P		' Plp-P_:p:P.z.P	-.··<·.'.· '· Pí'·· P
RET	Den 10	Den 15	Den 20
Kontrola	2.4 + 1.14	2.5 + 1.10	0.9 + 0.13
1 gg/kg	3.8 + 1.14	2.3 + 0.46	1.3 + 0.41
5 gg/kg	6.6 + 3.60*	1.8 + 0.48	0.8 + 0.26
25 gg/kg	6.2 + 1.12* P	1.1 +0.24*	0.2 + 0.21**
125 gg/kg	8.4 + 1.60**	0.9 + 0.50**	0.3 + 0.36**

*Významný rozdíl proti kontrolám, p < 0,05 **Významný rozdíl proti kontrolám, p < 0,01 • · • · • · · « • ·

168

Příklad 14

Farmakokinetické studie SEP-1-B50

SEP-1-B50 byl reformulován v citrátovém pufru (20mM citrát sodný + lOOmM chlorid sodný) plus 0,25% RSA, pH 6,9, a byl podáván intravenózně normálním samcům laboratorního potkana jako jedna dávka v dávkové hladině 5 nebo 25 μρ/kg. Vzorky krve byly odebírány 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144,

168 hodin po podání dávky. Plazmatická koncentrace SEP-1-B50 byla určena soupravou ELISA (R & D Systems, Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00) podle instrukcí výrobce. Eliminační poločasy byly určeny 9,7 a 9,9 hodiny pro dávku 5 a 25 μς/kg, v daném pořadí. Pozorovaná MRT (průměrná doba cirkulace) byla 13,9 a 14,4 hodiny pro dávku 5 a 25 μg/kg, v daném pořadí. Reprezentativní farmakokinetický profil pro SEP-1-B50 je ukázán na obrázku.27.

Příklad 15

Studie účinnosti SEP-1-B51

SEP-1-B51 byl podáván intravenózně normálním samcům laboratorního potkana ve dvou experimentech.

Experiment 1

SEP-1-B51 byl reformulován v citrátovém pufru (20mM citrát sodný + lOOmM chlorid sodný) plus 0,25% RSA a byl podáván intravenózně samcům laboratorního potkana (5 laboratorních potkanů ve skupině) v dávkách 0, 1, 5 nebo 25 μg/kg, tiw, ve dnech 1, 3 a 6 a vzorky krve byly odebírány 4, 9 a 14 dnů po • » • · · ·

169 poslední injekci (dny 10, 15 a 20) pro analýzu hematologických parametrů. Data jsou ukázána v tabulce IX níže. čtyři dny po třetí a poslední intravenózní injekci SEP-1-B51 (den 10), statisticky významné zvýšení RBC, HGB, HCT a absolutní množství retikulocytů (ART) bylo pozorováno pro zvířata dostávající dávku 25 μρ/kg SEP-1-B51, ve srovnání s hodnotami kontrolní skupiny. Hodnota RBC pro tyto zvířata zůstala vyšší než kontrolní hodnota v den 15 a byla srovnatelná s kontrolní hodnotou v den 20. Produkce retikulocytů byla snížena po dni 10, přičemž významně nižší počty byly pozorovány u zvířat dostávájících dávky 5 a 25 pg/kg v den 15.

Tabulka IX

Hematologické nálezy po mnohonásobných dávkách SEP-1-B51

RBC	Den 10	Den 15	Den 20
Kontrola	5.66 + 0.497	5.62 + 0.385	5.90 + 0.286
1 ug/kg	5.32 + 0.275	5.23 + 0.470	5.77 + 0.200
5 ug/kg	6.22 + 0.377	6.18 + 0.298	6 39 + 0.369
25 ug/kg	6.70 + 0.257**	6.25 + 0.348*	5.94 + 0.294
		^; «	.Λ
HGB	Den 10	Den 15	Den 20
' Kontrola	14.3 + 1.10	14.2 + 0.88	14.8 + 0.72
1 ug/kg	13.3 + 0.41	13.2 + 0.93	14.3 + 0.37
5 ug/kg	15.1 +0.53	14.8 + 0.30	15.4 + 0.25
25 ug/kg	16.5 + 0.52**	15.0 + 0.91	14.3 + 0.64

• ·

170

” ....... ‘ —---—---—-;-
HCT	Den 10	Den 15	Den 20
Kontrola	36.8 + 3.08	36.2 + 2.59	37.9 + 1.93
1 ug/kg	34.5 + 1.21	33.4 + 2.56	37.1 +0.82
5 ug/kg	39.9 + 1.51	38.6 + 0.91	40.2 + 1.36
25 ug/kg	43.8 + 1.83**	39.3 + 2.77	37.2 + 1.60
WuW-V:			BíOii
ART	Den 10	Den 15	Den 20
Kontrola	0.29 + 0.089	0.28 + 0,086	0.21 + 0.034
1 ug/kg.	0.34 + 0.50	0.23+ 0-.055	0.19 + 0.075
5 ug/kg	0.28 + 0.059	0.11 +0.021**	0.20 + 0.081
25 ug/kg	0.48 + 0.121* .	0.06 + 0.054**.	1.45 + 3.100

★★ Významný rozdíl proti kontrolám p < 0,01 * Významný rozdíl proti kontrolám p < 0,05

Experiment 2

SEP-1-B51 byl reformulován v citrátovém pufru (20mM citrát sodný + lOOmM chlorid sodný) plus 0,25% humánní sérový albumin a byl podáván intravenózně samcům laboratorního potkana (5 laboratorních potkanů ve skupině) v dávkách 0, 1, 5 nebo 25 μς/kg, tiw, ve dnech 1, 3 a 5 a vzorky krve byly odebírány 2, 4 a 6 dnů po poslední injekci (dny 7, 9 a 11) pro analýzu hematologických parametrů. Kromě toho vzorky krve pro měření pouze hematokritu [jako kompaktní objem buňky (PCV)] byly odebírány denně ve zbývajících dnech studie (dny 2, 3, 4, 5,

6, 8, 10, 12 a 13). Data jsou ukázána v tabulce X níže. Hodnoty HCT (PCV nebo vypočtené) byly významně zvýšeny u zvířat dostávajících 5 a 25 μρ/kg počínaje 2 dny po první injekci (den 3) a setrvávaly po 6 dnů po třetí a poslední injekci (den 11) . RBC a HGB byly také významně zvýšeny ve ·

171 dnech, kdy byly měřeny (2, 4 a 6 dnů po poslední dávce, dny 7, 9 a 11) u zvířat dostávajících 5 a 25 μς/kg. ART byl významně zvýšen pouze u skupiny s dávkou 25 μg/kg ve dnech 2 a 4 po poslední dávce (dny 7 a 9).

Tabulka X

Hematologické nálezy po mnohonásobných dávkách* SEP-1-B51

RBC	Den 7	Den 9	Den 11
Kontrola \	5.61 + 0.679	5.23 + 0.467	5.34 + 0.405
1 ug/kg	6.08 + 0.141	5.70 + 0.300	5.67 + 0.547
5 ug/kg	6.29 + 0.459	6.07 + 0.308**	6.11 +0.248*
25 ug/kg	6.61 + 0.295**	6.24 + 0.268**	6.38 + 0.173**
’ ·· ’· '•• v'	·· ·.·. ’·'		•
HGB .	Den 7	Den 9	Den 11
(Kontrola	13.7 + 1.07	12.9 + 0.79	13.3 + 0.93
1 ug/kg	14.6 + 0.27	13.9 + 0.19	13.9 + 0.90
5 ug/kg	15.8 + 0.50**	14.9 + 0.53**	14.8 + 0.18*
25 ug/kg	16.7 + 0.86**	15.1+0.66**	14.6 + 0.69*

HCT	» Den 7	Den 9	Den 11
> Kontrola	35.6 + 3.61	33.2 + 2.39	34.5 + 3.19
1 ug/kg	38.9 + 0.82	35.9+0.94	35.9 + 2.43
5 ug/kg	41.3 + 1.92**·	39.1+ 1.01**	39.2 + 0.7S*
25 ug/kg	44.4 + 2.08**	39.7 + 2,23**	39.6 + 2.32**
' < ^;	7/·.’	.. -in..·... 'g »; ' *	·' Γ' ·'··:' tyů /'·.// ;··'^:ύ''·;Λ
ART	^Γ Den 7	Den 9	Den 11
Kontrola	0.50 + 0.158	0.36 + 0.093	0.34 + 0.079
1 ug/kg	0.30 + 0.044*	0.30 + 0.026	0.25 + 0.054
5 ug/kg	0.45 + 0.125	0.36 + 0.056	0.25 + 0.045
25 ug/kg	0.78 + 0.117**	0.71+ 0.152*	0.32 + 0.099

• · • · · · • · • · · ·

• · ··· · · · ·

172 *Významný rozdíl proti kontrolám, p < 0,05 **Významný rozdíl proti kontrolám, p < 0,01 ^poznámka: den 7 (2 dny po 3. dávce), den 9 (4 dny po 3.

dávce), den 11 (6 dnů po 3. dávce)

Další skupiny laboratorních potkanů byly léčeny jednou intravenózní dávkou SEP-1-B51 v dávce 25 μρ/kg a vzorky krve byly odebírány 48 hodin po injekci pro analýzu hematologických parametrů. Vzorky krve pro měření pouze hematokritu (jako kompaktní objem buňky) byly odebírány 8, 24 a 72 hodin a 7 dnů po injekci (dny 1, 2, 4 a 8). Hodnoty HCT, HGB a ART u laboratorních potkanů léčených intravenózně SEP-1-B51 byly vyšší než hodnoty u kontrolních zvířat (statisticky významně) v den 3 (2 dny po injekci) a u těchto zvířat byl také významně zvýšen HCT v den 4.

Příklad 16

Studie účinnosti SEP-1-B51 v polycytemickém a hypoxickém modelu

Skupiny po 10 normálních myších (kontrolní skupina s vehikulem, rekombinantní glykosylovaný humánní erytropoetin tvořený v buňkách CHO (rhEPO) ve 4 dávkových hladinách a SEP-1-B51 ve 4 dávkových hladinách: 0,32, 1, 5, 25 gg/kg/dávka s předpokladem 100 mU/ng) byly exponovány 18 hodin denně atmosférickému vzduchu udržovanému při tlaku 50,65 kPa (506,5 mb) v komoře se simulovaným vysokým podtlakem po dobu 20 dnů. Intravenózně (i.v.) byl injikován rhEPO nebo SEP-1-B51, formulovaný v citrátovém pufru plus 0,25% humánní sérum albumin, v objemu 200 μΐ 4. Den po hypoxii. Dva dny později • · ·« · · ···· ·· · · · » * · · · · · · ·· · • ·· · · · · · · · · · • ······ · ··· · *

173 byla každá myš injikována intraperitoneálně (i.p.) 0,2 μθί ⁵⁹Fe. Vychytávání radioaktivního železa RBC bylo zjišťováno o 3 dny později měřením množství radioaktivity přítomného v 500 μΐ krve odebírané srdeční punkcí.

72-hodinové vychytávání ⁵⁹Fe RBC (% dávky) pro SEP-1-B51 a rhEPO ukázalo jasnou závislost reakce na dávce zvýšeným vychytáváním ⁵⁹Fe při zvyšování dávky až do 5 μς/kg, nad touto dávkou reakce tvořila plateau (25 μg/kg). Tři nejnižší dávky byly proto použity pro výpočet lineární regrese. Lineární regresní analýzy pro SEP-1-B51 a rhEPO jsou prezentovány na obrázku 28. Reakce SEP-1-B51 a rhEPO byly v podstatě stejné. Poměr účinnosti SEP-1-B51 k rhEPO byl 1,0035 (95% interval spolehlivosti 0,6947 až 1,4498) a účinnost SEP-1-B51 určená v tomto testu byla 100 mU/ng (95% interval spolehlivosti 69 až 145) .

SEP-1-B51 projevoval in vivo aktivitu podobnou aktivitě rhEPO a působí způsobem závislým na dávce, včetně plateau reakce ve vyšších dávkách kvůli indukci mechanismu negativní zpětné vazby, což je typické pro rhEPO v tomto modelu. To ukazuje, že polymerní struktury připojené v přesných glykosylačních místech definovaných uživatelem v molekule SEP1-B51 napodobují in vivo aktivitu připisovanou sacharidovým řetězcům rhEPO.

Příklad 17

Farmakokinetické studie SEP-1-B51

Skupinám normálních samců laboratorních potkanů byly podávány dávky intravenózně v jedné dávce 5 μg/kg SEP-1-B51, formulovaného v citrátovém pufru plus 0,25% humánní sérový • · • · · · • · • · · ·

174 albumin, nebo rhEPO (ekvivalent 500 U/kg) a krev byly odebírána v 5, 30, 60 minutách, 2, 4, 8 a 24 hodinách a 2, 3, 4, 5, 6 a 7 dnech po dávce. Koncentrace SEP-1-B51 nebo rhEPO v plazmatických vzorcích byla určena testy ELISA s použitím soupravy anti-EPO ELISA od firmy R & D Systems (R & D Systems, Human Erythropoietin Quantíkine IVD Immunoassay Kit #DEP00) podle instrukcí výrobce.

Byla prováděna analýza nejmenších čtverců logaritmů koncentrací poskytující farmakokinetické parametry vypsané v tabulce XI níže. Změna plazmatické koncentrace SEP-1-B51 v čase u samců laboratorních potkanů dostávajících jednu intravenózní dávku 5 μρ/kg může být popsána mono-exponenciální farmakokinetickou dispoziční funkcí s poločasem 10,5 ± 0,5 hodiny. Objem distribuce centrálního kompartmentu (Vc) pro SEP-1-B51 byl 32,5 ± 2,0 ml/kg. Clearance (CL) byla 2,15 ml/h/kg, s průměrnou dobou cirkulace (MRT) 15,1 ± 0,7 hodiny. Ve srovnání změna plazmatické koncentrace rhEPO u samců laboratorních potkanů dostávajících intravenózní dávku 5 μg/kg byla nejlépe popsána s použitím bi-exponenciální farmakokinetickou dispoziční funkcí s a poločasem 1,24 ± 0,22 hodiny a β poločasem 5,51 ± 0,40 hodiny. Vc pro rhEPO byla 57,0 ± 3,2 ml/kg. CL byla 16,0 ± 0,5 ml/h/kg, přibližně 8 krát větší než CL SEP-1-B51. Průměrná doba cirkulace (MRT) z rhEPO byla 5,73 ± 0,17 hodiny, přibližně 3 krát kratší než MRT SEP1-B51.

• · • · · • · · · · * • · · · · ···· • ·····« · · ·

175

Tabulka XI

Farmakokinetické parametry pro SEP-1-B51 ve srovnání s rhEPO

Křivka	AUC (ng/ml-h)	Cmax (ng/ml)	Vc (ml/kg)	CL (ml/h/kg)
SEP-1-B51	2326 ±121	154 ±9	32.5 ± 2.0	2.15 ± 0.11
rhEPO	312 ±9	87.9 ±5.0	57.0 ± 3.2	16.0 ±0.5

Křivka	MRT (hodiny)	T1/2a (hodiny)	Τ1/2β (hodiny)
SEP-1-B51	15.1 ±0.7	10.5 ±0.5	N/A
rhEPO	5.73 ±0.17	1.24 ±0.22	5.51 ± 0.40

Diagram SEP-1-B51 a rhEPO plazmatické clearance je uveden na obrázku 29. Tato data ilustrují významné zvýšení poločasu cirkulace pro SEP-1-B51 oproti glykosylovanému rekombinantnímu humánnímu EPO a že toto zvýšení je díky polymerním strukturám připojeným v místech molekuly přesně definovaných uživatelem.

I když byl vynález popsán v souvislosti se svými specifickými provedeními, rozumí se, že je schopný být dále modifikován a tato přihláška zamýšlí pokrýt všechny variace, použití nebo úpravy vynálezu podle obecných principů vynálezu a zahrnuje takové odchylky od předkládaného popisu, které spadají do známé nebo obvyklé praxe v oboru, kterého se vynález týká a které mohou být aplikovány na důležité rysy uvedené výše v tomto textu.

• 9

ΦΦΦΦ • 9

99 9 9 ΦΦΦΦ 9 · · • ······ · «φφ « Φ

176

Seznam sekvencí
<210>	1
<211>	166
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	1

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr

Leu

T_

5

10

15

Leu

Glu

Ala

Lys

Glu

Ala

Glu

Lys

Ile

Thr

Gly

Cys

Ala

Glu

His

20

25

30

Cys

Ser

Leu

Asn

Glu

Lys

Ile

Thr

Val

Pro

Asp

Thr

Lys

Val

Asn

Phe

35

40

45

Tyr

Ala

Trp

Lys

Arg

Met

Glu

Val

Gly

Gin

Ala

Val

Glu

Val

Trp

50

55

60

Gin

Gly

Leu

Ala

Leu

Ser

Glu

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu

65

70

75

80

Leu

Val

Lys

Ser

Gin

Pro

Trp

Cys

Pro

Leu

Gin

Leu

His

Val

Asp

85

90

95

Lys

Ala

Val

Ser

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Leu

Arg

Ala

Leu

100

105

110

Gly

Ala

Gin

Lys

Cys

Ala

Ile

Ser

Pro

Asp

Ala

Ser

Ala

115

120

125

Pro

Leu

Arg

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

130

135

140

Tyr

Ser

Asn

Phe

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala

145

150

155

160

Cys

Arg

Thr

Gly

Asp

Arg

165

<210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Pro Pro Arg 1	Leu 5	Ile	Cys	Asp	Ser	Arg Val 10	Leu	Glu	Arg	Tyr 15	Leu
Leu Glu Ala Lys 20	Glu	Ala	Glu	Lys	Ile 25	Thr Thr	Gly	Cys	Ala 3 0	Glu	His

·· ·· ·· ···· ·· ·*·> 4 · * · » » · ·· · • 4 1 « 4 ···« 4 4 · • ······ » ♦ · · 4 · • · · · · · · · · · •· ·« ····· ·4 ··

177

Cys

Ser

Leu 35

Asn

Glu

Lys

Ile

Thr Val 40

Pro

Asp

Thr

Lys 45

Val

Asn

Phe

Tyr

Ala

Trp

Lys

Arg

Met

Glu

Val

Gly

Gin

Ala

Val

Glu

Val

Trp

50

55

60

Gin

Gly

Leu

Ala

Leu

Ser

Glu

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu

65

70

75

80

Leu

Val

Lys

Ser

Gin

Pro

Trp

Cys

Pro

Leu

Gin

Leu

His

Val

Asp

85

90

95

Lys

Ala

Val

Ser

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Leu

Arg

Ala

Leu

100

105

110

Gly

Ala

Gin

Lys

Cys

Ala

Ile

Ser

Pro

Asp

Ala

Lys

Ala

115

120

125

Pro

Leu

Arg

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

130

135

140

Tyr

Ser

Asn

Phe

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala

145

150

155

160

Cys

Arg

Thr

Gly

Asp

Arg

165 <210> 3 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Ala 1

Pro

Arg

Leu 5

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg 10

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr 15

Leu

Glu

Ala

Lys

Glu

Ala

Glu

Cys

Ile

Thr

Gly

Cys

Ala

Glu

His

20

25

30

Cys

Ser

Leu

Asn

Glu

Cys

Ile

Thr

Val

Pro

Asp

Thr

Lys

Val

Asn

Phe

35

40

45

Tyr

Ala

Trp

Lys

Arg

Met

Glu

Val

Gly

Gin

Ala

Val

Glu

Val

Trp

50

55

60

Gin

Gly

Leu

Ala

Leu

Ser

Glu

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu

65

70

75

80

Leu

Ala

Cys

Ser

Gin

Pro

Trp

Glu

Pro

Leu

Gin

Leu

His

Val

Asp

85

90

95

Lys

Ala

Val

Ser

Gly

Leu

A.rg

Ser

Leu

Thr

Leu

Arg

Ala

Leu

100

105

110

Gly Ala Gin Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Cys Ala Ala ·· ·» • · · * • · · · • · « ·» τ • · · • * ·· ··»·

• « « • « * * 9 · « ·· ··

178

Pro

Leu 130

Arg Thr

Ile

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys

Leu

Phe

Arg

Val

135

140

Tyr

Ser

Asn

Phe

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala

145

150

155

160

Cys

Arg

Thr

Gly

Asp

Arg

165

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Syntetický protein stimulující erytropoézu mající k sobě připojený jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě.
2. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1 mající in vivo biologickou aktivitu zvyšování tvorby červených krvinek.
3. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde protein obsahuje polypeptidový řetězec mající aminokyselinovou sekvenci z ribozomálně specifikovaného erytropoetinu a jeden nebo více nepřekrývajících se peptidových segmentů kovalentně navázaných jedním nebo více místy chemické ligace.
4. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 3, kde jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě je připojen k polypeptidovému řetězci v místě odpovídajícím glykosylačnímu místu ribozomálně specifikovaného erytropoetinu.
5. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 3, kde ribozomálně specifikovaný erytropoetin je humánního původu.
6. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 3, kde ribozomálně specifikovaný erytropoetinový glykoprotein je nepřirozený.
7. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 6, kde nepřirozený ribozomálně specifikovaný erytropoetin má jeden nebo více nepřirozených glykosylačních míst.

• · • · · · • · · · · · ·· • · · · · • · · · · · · • · · · · · ·

180
8. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 2, kde polymer rozpustný ve vodě je připojen výlučně k polypeptidovému řetězci v jednom nebo více místech odpovídajícím glykosylačnímu místu ribozomálně specifikovaného erytropoetinu.
9. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě obsahuje repetiční jednotku obsahující polyalkylenoxid, polyamidalkylenoxid nebo jejich deriváty.
10. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 9, kde polyalkylenoxid a polyamidalkylenoxid obsahují ethylenoxidovou repetiční jednotku vzorce - (CH2-CH2-O) -.
11. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě je rozvětvených.
12. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě nese ve fyziologických podmínkách čistý náboj, který je negativní.
13. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde syntetický protein stimulující erytropoézu má izoelektrický bod mezi 3 a 7.
14. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde polymer rozpustný ve vodě je mono-disperzní.
15. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde syntetický protein stimulující erytropoézu je mono181 disperzní .
16. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde syntetický protein stimulující erytropoézu má monomerní molekulovou hmotnost větší než 25 kD.
17. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde syntetický protein stimulující erytropoézu má monomerní molekulovou hmotnost větší než 40 kD.
18. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde syntetický protein stimulující erytropoézu má monomerní molekulovou hmotnost větší než 50 kD.
19. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde syntetický protein stimulující erytropoézu má monomerní molekulovou hmotnost větší než 60 kD.
20. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde syntetický protein stimulující erytropoézu má monomerní molekulovou hmotnost větší než 70 kD.
21. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde polypeptidový řetězec obsahuje jednu nebo více neregulérních aminokyselin.
22. Syntetický protein 21, kde neregulérní postranní řetězec.

stimulující erytropoézu podle nároku aminokyselina obsahuje nepřirozený
23.

21,

Syntetický kde pseudoaminokyselinu.

protein stimulující erytropoézu neregulérní aminokyselina podle nároku obsahuj e

182
24. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 23, kde pseudoaminokyselina je pseudoglutamát.
25. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 22, kde nepřirozený postranní řetězec je kovalentně navázán k polymeru rozpustnému ve vodě.
26. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku

25, kde polymer rozpustný ve vodě je kovalentně navázán k postrannímu řetězci prostřednictvím vazby vytvořené chemickou ligací.
27. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku

26, kde vazba vytvořená chemickou ligací je vybrána ze skupiny, kterou tvoří amidová, oximová, hydrazonová, thaizolidinová, oxazolidinová a thioesterová vazba.
28. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 3, kde jedno nebo více míst chemické ligace obsahuje amidovou vazbu.
29. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, kde polymer rozpustný ve vodě je připojen k polypeptidovému řetězci prostřednictvím postranního řetězce aminokyseliny v místě chemické ligace polypeptidového řetězce.
30. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu vybranou ze skupiny, kterou tvoří SEP-1 a SEP-3.

• · • ···· ·· · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · · ·

183
31. Syntetický protein stimulující erytropoézu vybraný ze skupiny, kterou tvoří SEP-0, SEP-1 a SEP-3 a jejích analogy.
32. Syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 31, kde analogy jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří SEP-1L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, SEP-1-B51 a SEP-1-B52.
33. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje syntetický protein stimulující erytropoézu podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.
34. Farmaceutický přípravek podle nároku 33 vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více excipientů vybraných ze skupiny, kterou tvoří pufr, nosič proteinu, aminokyselina, detergent, lipid, polymer rozpustný ve vodě a konzervační činidlo.
35. Farmaceutický přípravek podle nároku 33 vyznačující se tím, že obsahuje jedno nebo více dalších bioaktivních činidel kromě syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu.
36. Způsob zvyšování hematokritu u se tím, že zahrnuje podávání syntetického proteinu stimulujícího 1, čímž je hematokrit savce zvýšen.

savce vyznačuj ící savci účinného množství erytropoézu podle nároku
37. Způsob zvyšování tvorby červených krvinek u savce vyznačující se tím, že zahrnuje podávání savci účinného množství polymerně modifikovaného syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu podle nároku 1, čímž je tvorba červených krvinek u savce zvýšena.

z ws ován tvcrbv hemoglobinu u savce • · ·· ·· · · · · · • · · · · · · • · · · · ···· • · ····· ·

184 vyznačující se tím, že zahrnuje podávání savci účinného množství polymerně modifikovaného syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu podle nároku 1, čímž je tvorba hemoglobinu u savce zvýšena.
39. Způsob zvyšování množství vyznačující se tím, že účinného množství syntetického erytropoézu podle nároku 1, čímž je savce zvýšeno.

retikulocytů u savce zahrnuje podávání savci proteinu stimulujícího množství retikulocytů u
40. Způsob přípravy polypeptidového řetězce obsahujícího syntetický protein stimulující erytropoézu vyznačuj ící se tím, že zahrnuje krok chemické ligace peptidových segmentů obsahujících nepřekrývající se aminokyselinové sekvence polypeptidového řetězce syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu, přičemž je vytvořen polypeptidový řetězec obsahující syntetický protein stimulující erytropoézu.
41. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok svinutí polypeptidového řetězce, přičemž je vytvořen bioaktivní syntetický protein stimulující erytropoézu.
42. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že jeden nebo více peptidových segmentů jsou částečně chráněny.
43. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že jeden nebo více peptidových segmentů jsou nechráněny.
44. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že jeden nebo více peptidových segmentů obsahuje k sobě připojený ocl'/mer rozoustr.v ve vodě.

• · • · · · • ·

185
45. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že krok chemické ligace zahrnuje chemoselektivní ligační chemické postupy vybrané z postupů nativní chemické ligace, rozšířené nativní chemické ligace, pseudonativní chemické ligace, chemické ligace tvořící oxim, chemické ligace tvořící hydrazon, chemické ligace tvořící oxazolidin, chemické ligace tvořící thaizolidin a chemické ligace tvořící thioester.
46. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že polypeptidový řetězec obsahuje k sobě připojený jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě.
47. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že polypeptidový řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci ribozomálně specifikovaného erytropoetinu.
48. Způsob podle jeden nebo více k polypeptidovému místu ribozomálně se tím, že je připojeno glykosylačnímu nároku 46 vyznačující polymerů rozpustných ve vodě řetězci v místě odpovídajícím specifikovaného erytropoetinu.
49. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že ribozomálně specifikovaný erytropoetinový glykoprotein je vytvořen rekombinantně.
50. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že ribozomálně specifikovaný erytropoetinový glykoprotein je nepřirozený.
51. Způsob podle nároku 50 vyznačující se tím, že nepřirozený ribozomálně specifikovaný erytropoetinový clvkcorotein má ίδώΐο nebo více necřirozenvch clykosvláčcích • · • · · · • · ·

186 míst.
52. Způsob podle nároku 47 vyznačující se tím, že ribozomálně specifikovaný erytropoetin je humánního původu.
53. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že polymer rozpustný ve vodě je připojen výlučně k polypeptidovému řetězci v místě odpovídajícím glykosylačnímu místu ribozomálně specifikovaného erytropoetinu.
54. Způsob podle nároku 46 vyznačující se tím, že jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě obsahuje repetiční jednotku obsahující polyalkylenoxid, polyamidalkylenoxid nebo jejich deriváty.
55. Způsob podle nároku 54 vyznačující se tím, že polyalkylenoxid a polyamidalkylenoxid obsahují ethylenoxidovou repetiční jednotku vzorce -(CH₂-CH₂-0)-.
56. Způsob podle nároku 46 vyznačující se tím, že jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě je rozvětvených.
57. Způsob podle nároku 46 vyznačující se tím, že jeden nebo více polymerů rozpustných ve vodě ve fyziologických podmínkách nese čistý náboj, který je negativní.
58. Způsob podle nároku 41 vyznačující se tím, že syntetický protein stimulující erytropoézu má izoelektrický bod mezi 3 a 7.
59. Způsob podle nároku 46 vyznačující polymer rozpustný ve vodě je mono-disperzní.

se tím, že • · · · • · ·» ·· · > · · · · ···· ··» · · · • ·· · · · · · · · · · • ······ · ··· · · ·· · ·· · ···· • · · · ·· · ·· ·· · ·

187
60. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že syntetický protein stimulující erytropoézu je mono-disperzní.
61. Způsob podle nároku 46 vyznačující se syntetický protein stimulující erytropoézu tvoří molekulovou hmotnost větší než 25 kD.
62. Způsob podle nároku 46 vyznačující se syntetický protein stimulující erytropoézu má molekulovou hmotnost větší než 40 kD.
63. Způsob podle nároku 46 vyznačující se syntetický protein stimulující erytropoézu má molekulovou hmotnost větší než 50 kD.
64. Způsob podle nároku 46 vyznačující se syntetický protein stimulující erytropoézu má molekulovou hmotnost větší než 60 kD.
65. Způsob podle nároku 46 vyznačující se syntetický protein stimulující erytropoézu má molekulovou hmotnost větší než 70 kD.

tím, že monomerní tím, že monomerní tím, že monomerní tím, že monomerní tím, že monomerní
66. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že polypeptidový řetězec obsahuje jeden nebo více neregulérních aminokyselin.
67. Způsob podle nároku 66 vyznačující se neregulérní aminokyselina obsahuje nepřirozený řetězec.

tím, že postranní
68. Způsob podle nároku 67 vyznačující se tím, neregulérní aminokyselina obsahuje pseudoaminokyselinu.

• v • · · > · · ·· · · > · ···· · · » · · · • ·· · · · · · * · · · • ······ · ··· · · • · · ·· · ···· ·· · · ·· ··· · · ··

188
69. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že polypeptidový řetězec obsahuje místo chemické ligace mající vazbu vybranou ze skupiny, kterou tvoří amidová, oximová, hydrazonová, thaizolidinová, oxazolidinová a thioesterová vazba.
70. Způsob podle nároku 46 vyznačující se tím, že polymer rozpustný ve vodě je připojen k aminokyselině polypeptidového řetězce majícího nepřirozený postranní řetězec.
71. Způsob podle nároku 46 vyznačující se tím, že polymer rozpustný ve vodě je kovalentně navázán k postrannímu řetězci prostřednictvím vazby vytvořené chemickou ligaci.
72. Způsob podle nároku 71 vyznačující se tím, že vazba vytvořená chemickou ligaci je vybrána ze skupiny, kterou tvoří amidová, oximová, hydrazonová, thaizolidinová, oxazolidinová a thioesterová vazba.
73. Způsob podle nároku 46 vyznačující se tím, že polymer rozpustný ve vodě je připojen k polypeptidovému řetězci prostřednictvím postranního řetězce aminokyseliny v místě chemické ligace polypeptidového řetězce.
74. Způsob podle nároku 41 vyznačující se tím, že bioaktivní syntetický protein stimulující erytropoézu má in vivo biologickou aktivitu zvyšování tvorby červených krvinek.
75. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že polypeptidový řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci » · ·« 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 999999 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

189 syntetického proteinu stimulujícího erytropoézu vybranou ze skupiny, kterou tvoří SEP-1 a SEP-3.
76. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že syntetický protein stimulující erytropoézu je vybraný ze skupiny, kterou tvoří SEP-0, SEP-1 a SEP-3 a jejich analogy.
77. Způsob podle nároku 76 vyznačující se tím, že analogy jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří SEP-1-L26, SEP1-L30, SEP-1-B50, SEP-1-B51 a SEP-1-B52.