KR20030061784A - 중합체-변형 합성 단백질 - Google Patents

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KR20030061784A
KR20030061784A KR10-2003-7002773A KR20037002773A KR20030061784A KR 20030061784 A KR20030061784 A KR 20030061784A KR 20037002773 A KR20037002773 A KR 20037002773A KR 20030061784 A KR20030061784 A KR 20030061784A
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거드 지. 코첸도에르페르
파올로 보티
제임즈 에이. 브래드번
시아-윤 첸
소냐 크레스맨
크리스티 엘. 헌터
스티븐 비. 에이치. 켄트
도날드 더블유. 로우
질 지. 윌켄
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그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 중합체, 특히 당-의태성 중합체로 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 변형시켜서, 그것들의 생물학적 활성 또는 약물동태학적 특성을 개선하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 더 이상으로, 본 발명은 그러한 중합체-변형 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 위한 방법 및 용도를 제공한다. 본 발명은 중합체-변형 합성 생물활성 단백질, 및 그러한 단백질을 함유하는 제약학적 조성물의 합성에 사용하기에 특히 적합하다.

Description

중합체-변형 합성 단백질{POLYMER-MODIFIED SYNTHETIC PROTEINS}
지난 30년 동안 의학적 주의는 질환 치료를 위한 치료약으로서 단백질의 사용 가능성에 대해 점점 집중되어 왔다(예를 들어, "치료 단백질 1999", 데이타모니터 피엘씨, 런던 1999). 대부분의 단백질 치료제는 천연 발생하는 동물 또는 사람 형태의 단백질(인슐린, 성장호르몬, 에리트로포에틴, 인터류킨-2 등과 같은)에 기초하며, 재조합 DNA 조작된 박테리아 또는 진핵 세포에서 생산된다. 불행하게도,E. coli와 같은 박테리아 세포에서 만들어진 재조합 단백질은 흔히, 이 단백질의 천연 생산된 형태에서 정상적으로 발견되는 전사-후 변형을 결여한다. 이런 변형의 결여는 사람에게 도입되었을 때 단백질의 제약학적 특성에 유의한 부정적인 영향을 줄 수 있다.
단백질에 복잡한 당사슬의 효소적 부착을 수반하는 당화가 진핵세포에서 통상적인 전사-후 변형의 한 예이다. 박테리아 발현 시스템에서 만들어진 재조합 단백질은 단백질을 당화하는 능력을 결여하고 있기 때문에, 당화된 형태 또는 "당단백질"이 필요할 때는 그것들을 대신하여 식물, 효모, 곤충 또는 포유류 세포와 같은 진핵 발현 시스템이 사용된다. 재조합 당단백질 제조에 있어서의 유의한 문제는 결과의 생성물이 전형적으로 상이한 '당형태들'의 복잡한 혼합물로 구성된다는 점이며, 이것은 생리학적 또는 약리학적 특성을 광범위하게 변화시킬 수 있다.
그럼에도 불구하고, 재조합 DNA 기술은 박테리아 및 다른 숙주 세포에서 다량으로 생산될 수 있기 때문에 많은 폴리펩티드 및 단백질의 상업적 생산을 위한 주된 방법이 되고 있다. 재조합 단백질 생산은, 원하는 외인성 단백질을 코드하는 DNA로 숙주 세포를 핵산전달감염 또는 형질전환시키고, 재조합 단백질의 발현을 선호하는 조건하에서 이 세포를 성장시키는 것을 포함한다.E. coli및 효모가 높은 역가로 재조합 단백질을 생산하도록 만들 수 있기 때문에 숙주로서 선호된다(미국 특허 5,756,672 참조).
수많은 미국 특허가 재조합-DNA-코드된 단백질의 일반적인 박테리아 발현에 관하여 간행되었다(예를 들어, 미국 특허 4,565,785; 4,673,641; 4,738,921; 4,795 ,706; 4,710,473 참조). 불행하게도, 재조합 DNA 기술의 사용은 보편적으로 성공적이지 못했다. 어떤 조건하에서, 박테리아 숙주로부터 다량으로 발현된 어떤 이종성 단백질은 조밀한 덩어리로 세포 내에 침전되며, 이것은 세포 인클로저 내에서 눈에 보이는 밝은 반점으로서 인식된다. 이들 침전된 단백질 덩어리는 "굴절반사소체"로서 언급되며, 총 세포 단백질 중 상당 부분을 구성할 수 있다(Brems 등, 생화학 (1985) 24:7662).
이들 소체로부터의 단백질 회수는, 세포 물질 및 그것을 숨기고 있는 단백질들로부터 세포 내에 있는 단백질을 어떻게 분리할 것인지, 봉입체 단백질을 생물학적 활성 형태로 어떻게 회수할 것인지와 같은 수많은 문제를 나타낸다. 굴절반사소체에 대한 일반적인 리뷰 논문은 Marston, 상동; Mitraki 및 King, 생물/기술, 7:690 (1989); Marston 및 Hartley, 효소학의 방법, 182:264-276 (1990); Wetzel, "생체내 단백질 응집: 박테리아 봉입체 및 포유류 아밀로이드", 단백질 제약의 안정성: 생체내 분해 경로 및 단백질 안정화 전략, Ahern 및 Manning (편저)(플레넘 프레스, 1991); 및 Wetzel, "시험관내 및 생체내에서 응집 억제에 의한 증진된 접힘 및 단백질 안정화", 단백질 조작--실용 접근법, Ree, A. R. 등 (편저)(옥스포드 대학 출판부의 IRL 프레스, 옥스포드, 1991)를 참조한다.
또한, 단백질은 총 화학 합성에 의해 연구 시약으로서 생산된다(예를 들어, Wilkin 등, Curr. Opinion Biotech. (1999) 9:412-426 참조). 이 과정은 개별 아미노산들의 단계적 커플링에 의한 단백질의 화학적 합성, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 단편의 개별적 합성 후에, 그러한 세그먼트들의 화학적 라이게이션을 포함한, 이 세그먼트들의 연결을 사용하는 수렴 전략을 포함하며, 이로써 전길이 생성물이 생성된다(예를 들어, Dawson 등, Ann. Rev. Biochem (2000) 69:923-960). 어떤 예에서, 화학적 합성은 간단한 저분자량 당으로 변형된 작은 당단백질을 만드는 것을 이용한다(Shin 등, J. Am. Chem. Soc. (1999) 121:11684-11689). 다른 예에서, 단백질은 검출 가능한 표지 등을 함유하도록 화학적으로 만들어진다(Bolin 등, FEBSLetters (1999) 451:125-131). 불행하게도, 그러한 표지된 단백질은 그것들의 재조합적으로 생산된 대응물에 비해 치료적 이점을 거의 제공하지 못한다. 그러나, 치료 잠재성을 나타내는 몇몇 단백질이, 표적 단백질의 소분자를 약물작용발생단으로 바꾸는 것에 의한, 효능의 개선에 중점을 둔 화학적 합성에 의해 만들어진다(미국 특허 6,168,784). 치료제를 만드는데 있어서 효능이 중요한 측면이지만, 단백질 치료제에서는 다른 요인들도 문제로 남아 있다.
치료적으로 이용가능한 단백질 약물을 개발하려는 노력은 생체내 투여시 잠정적 약물 후보의 바람직하지 못한 생물활성, 생체이용율 및 생물역동학(청소 시간 등과 같은)으로 인해 오랫동안 힘들었다. 단백질 및 폴리펩티드의 특히 치료제로서의 사용을 심하게 제한하는 주된 요인은 이들 화합물이 흔히 순환계통에서 면역 반응을 도출한다는 사실이다(미국 특허 4,179,337(Davis 등) 참조). 이 효과는 2가지의 이차적인 결과 중 어느 하나 또는 모두를 가진다. 첫째는 도출된 항체에 의한 폴리펩티드의 파괴이고, 둘째는 더욱 심각한 알러지 반응의 출현이다. 예를 들어, 인슐린의 항체-매개 파괴는 사람 순환계통에서 인슐린의 다소 낮은 체류 시간 때문인 것으로 여겨진다. 효소의 경우에는 폴리펩티드의 파괴 및 뒤이은 그것의 생리학적 활성의 거부 뿐만 아니라, 제일 바람직하지 못한 알러지 반응의 도출이라는 문제가 있다. 반대로, 응고인자, 성장인자 및 사이토카인 등과 같은 어떤 단백질은 생체내 투여시에 불리할 정도로 연장된 생물학적 반감기를 나타낼 수 있다.
치료제로서 사용되는 단백질을 개선하기 위한 한 접근법은 단백질을 수용성중합체 유도체로 만드는 것을 포함한다. 그러한 콘쥬게이션은 생체내 투여된 단백질의 혈중 수명, 수용해도 또는 항원성을 개선하기 위한 수단으로서 제안되었다(미국 특허 4,179,337(Davis 등) 참조). 많은 상이한 수용성 중합체 및 부착 화학이 이런 목표를 위해 사용되었으며, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥소란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/무수말레산의 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 랜덤 공중합체) 등이다. 폴리에틸렌 글리콜("PEG")이 치료적으로 이용 가능한 단백질을 얻고자 하는 노력에 사용되고 있는 그러한 화학적 부분이다(Zalipsky S., 바이오콘쥬게이트 화학 (1995) 6:150-165; Mehvar R. J., Pharm. Pharmaceut. Sci. (2000) 3(1):125-136). 폴리에틸렌 글리콜의 백본인 (CH2CH2O)n은 유연하고 호양성이고 프로테아제에 민감하지 않으며 비-면역원성이다. 또한, 단백질 가수분해에 대해 단백질을 보호하기 위한 PEG의 부착이 알려져 있다(Blomhoff, H. K. 등, Biochim Biophys Acta (1983) 757:202-208). 또한, 단백질의 다른 물리화학적 특성을 개선할 수도 있다.
예를 들어, PEG 중합체가 부착된 아데노신 디아미나제의 공식 명칭인 페가데마제 보빈(Adagen)은 심한 복합면역결핍질환(SCID)을 치료하기 위해 개발되었고; PEG 부분이 부착된 과산소 디스뮤타제는 머리 손상을 치료하기 위한 임상 시험 중이고; PEG 부분이 부착된 알파 인터페론은 간염을 치료하기 위해 시험되었다. 페길화된 IL-6이 설명되었다(EP 0 442 724 및 미국 특허 5,264,209 참조). EP 0 154316은 림포카인과 폴리에틸렌 글리콜의 알데히드를 반응시키는 것을 보고한다. 유럽 특허 공보 EP 0 401 384는 폴리에틸렌 글리콜 분자가 부착된 과립구 콜로니 자극인자("G-CSF")를 제조하기 위한 물질 및 방법을 설명한다. 변형된 G-CSF 및 그것의 유사체가 또한 EP 0 473 268에 보고되며, 이것은 다양한 G-CSF 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 입자 중합체에 공유적으로 콘쥬게이트된 유도체의 사용을 말하고 있다. 미국 특허 5,880,255는 PEG 사슬로 변형된 많은 단백질을 요약한다.
PEG와 같은 중합체 부분 및 관련 중합체를 단백질 상에서 발견되는 반응성 기에 부착하기 위해 여러 가지 수단이 사용되었다(미국 특허 4,179,337(Davis 등) 및 미국 특허 4,002,531(Royer) 참조). 리뷰로서 Abuchowski 등, "약물로서의 효소", J. S. Holerberg 및 J. Roberts 편저, pp. 367-383 (1981) 및 Zalipsky S. 바이오콘쥬게이트 화학 (1995) 6:150-165를 참조한다. 또한, 단백질 변형을 위한 PEG 및 다른 중합체의 사용이 Cheng, T. L. 등, 바이오콘쥬게이트 화학 (1999) 10: 520-528; Belcheva, N. 등, 바이오콘쥬게이트 화학 (1999) 10:932-937; Bettinger, T. 등, 바이오콘쥬게이트 화학 (1998) 9:842-846; Huang, S. Y. 등, 바이오콘쥬게이트 화학 (1998):612-617; Xu, B. 등, Langmuir (1997) 13:2447-2456; Schwarz J. B. 등, J. Amer. Chem. Soc. (1999) 121:2662-2673; Reuter J. D. 등, 바이오콘쥬게이트 화학 (1999) 10:271-278; Chan, T. H. 등, J. Org. Chem. (1997) 62:3500-3504에 논의된다. 단백질에서 전형적인 부착 부위는, 리신 잔기 상에 또는 N-말단에 있는 것들과 같은 1차 아미노기, 시스테인 측쇄 상에 있는 것들과 같은 티올기, 및 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기 상에 또는 C-말단에 있는 것들과 같은카르복실기를 포함한다. 가장 통상적인 부착 부위 중 일부는 당단백질의 당 잔기, 시스테인, 또는 표적 단백질의 N-말단 및 리신이다.
많은 상이한 접근법이 중합체와 단백질의 콘쥬게이션에 대해 설명되었지만 콘쥬게이션 과정은 복잡하지 않다. 콘쥬게이션 반응에 의해 야기되는 생물학적 활성의 손실을 제한하기 위해 주의해야 한다. 예를 들어, 접힌 또는 재-접힌 단백질이 부착 부위의 수를 최소화하기 위해 전형적으로 사용된다. 그러나, 활성화된 중합체가 표적 단백질 또는 폴리펩티드에 너무 많이 부착된다면, 생물학적 활성이 심하게 감소되거나 또는 손실될 수 있다. 마찬가지로, 중합체와 단백질의 잘못된 링커 연결이 사용되거나, 또는 불충분한 양의 중합체가 표적에 부착된다면, 결과의 콘쥬게이트의 치료적 가치가 제한될 수 있으며, 콘쥬게이트의 생물활성 손실을 보상할 만큼 충분한 혈중 수명 증가를 나타내지 못할 수 있다. 또한, 변형 중합체에 의한 단백질 활성 부위의 차단으로 인한 결과가 문제될 수 있다. 이 문제는 중합체와 단백질이 전형적으로 용액-기반 반응에서 연결되므로 피하기 어려울 수 있다. 피리독살 포스페이트와 같은 물질로 활성 부위를 미리 차단하는 것이 제안되었지만 결과는 일관적이지 않았다(미국 특허 4,179,337(Davis 등) 참조). 이들 문제는 생물활성에 관련되지 않은 소수의 부착 부위를 주로 갖는 저분자량 단백질 및 펩티드에 있어서 특히 중대하다.
예를 들어, 통상적인 기술은 표적 단백질에 있는 1차 아민(예를 들어, N-말단 아미노기 및 리신의 엡실론 아미노기)에 수용성 중합체를 부착하는 것이었다. 또한, 티올-반응성 중합체 콘쥬게이트가 시스테인의 티올 측쇄에 중합체를 부착하기 위해 사용되었다. 대부분의 단백질은 단백질의 활성, 접힘, 재-접힘 및 안정성을 규정하는데 중요한 역할을 하는 폴리펩티드 백본의 다양한 영역에 걸쳐 분포된 그러한 반응성 기의 다수 카피를 함유하기 때문에, 이 2가지 접근법은 유의한 문제를 나타낸다. 따라서, 광범위한 사용에도 불구하고, 그러한 접근법은 단백질의 다소 불완전한 생물활성 또는 생물활성의 원치 않는 감소를 겪으며, 보통 분리 및 특성화하기 어려운 복잡한 혼합물을 가져온다(Delgada 등, Pharmaceutical Sciences (1997) 3:59-66).
무작위 부착을 줄이기 위한 시도로서, 천연 리신을 제거함과 동시에 원하는 중합체 부착 부위에 리신을 부가한 단백질이 만들어졌다(미국 특허 4,904,584). 예를 들어, G-CSF 및 IL-2가 이 방식으로 변형되었다. 무작위 부착을 피하려는 다른 시도는 천연 시스테인을 제거함과 동시에 원하는 중합체 부착 부위에 시스테인을 부가하거나, 또는 천연 시스테인이 존재한다면 이것을 제거하지 않고 시스테인을 부가한 단백질을 만드는 것이었다(EP 0 668 353). 예를 들어, G-CSF, IL-3 및 EPO가 이 방식으로 만들어졌다. 그러한 시스테인 또는 리신 변이체는 이론적으로는 부위-특이적 중합체 부착을 허용하지만, 여전히 모든 선택된 부위가 제어된 방식으로 변형될 수 있다는 것을 장담하지 못한다.
동일한 또는 유사한 반응성 작용기를 지니는 측쇄를 갖는 다수의 아미노산을 함유하는 단백질을 부위-특이적으로 변형할 수 없다고 가정하면, 최근의 노력은 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단의 변형에 초점을 맞춘다. 아미노 또는 카르복시 말단의 변형은 이들 부위를 유일하게 변형시킬 수 있는 어떤 화학적 콘쥬게이션기술의 능력에 의존한다(WO 90/02136 및 WO 90/02135). 예를 들어, 이 기술은 G-CSG 및 케모카인 IL-8의 N-말단 잔기에 PEG 사슬을 부착하기 위해 이용되었다(Gae-rtner 등, Bioconjugate Chem. (1996) 7(1):38-44; 및 WO 96/41813). 그러나, N- 또는 C-말단의 변형은 전형적으로 단백질의 활성을 감소시킨다(예를 들어, G-CSF의 N-말단 및 리신 측쇄에 PEG의 부착을 논의하고 있는 미국 특허 5,985,265 참조). 수용성 중합체를 사용한 단백질 변형의 단점에도 불구하고, PEG화 및 단백질에 다른 수용성 중합체의 부착이 계속 수행되고 있다. 예를 들어, IF-알파에 있는 히스티딘에 PEG의 부착이 미국 특허 5,951,974 및 6,042,822에 설명되었다. 알파 인터페론에 있는 리신에 PEG의 부착은 미국 특허 5,595,732에 설명된다. 또한, 에리트로포에틴(EPO) 및 리신과 같은 내부 아미노산의 당사슬(EP 0 605 963 및 WO 00/327 72), 및 N-말단(미국 특허 6,077,939 및 WO 00/32772)에 PEG의 부착이 설명되었다.
다른 문제는 상기 논의된 중합체가 모두 매우 비-균질하여 중합체-변형 단백질의 혼합물의 분석적 특성화 및 정제를 어렵게 만든다는 것이다(Delgada 등, 제약 과학 (1997) 3:59-66). 예를 들어, PEG 또는 PEG-기초 사슬을 제조하는데 사용되는 기술은 심지어 3,400과 같이 꽤 적은 상대 분자 질량을 가진 것들 조차도 평균값 근처의 사슬 길이의 분포를 갖는 제조물을 가져오는 불량하게 제어된 중합 단계를 포함하는데, 즉 그것들은 (CH2CH2O)n의 중합체 제조물을 포함하며, 여기에서 n은 불연속적인 값을 갖는 것이 아니라 오히려 평균 근처의 값의 범위를 가진다. 유도된 단백질의 결과의 이질성은 흔히 훨씬 덜 개별적인 쉽게 확인할 수 없는 특성 범위에 관련된다. 폴리펩티드 애덕트의 사용이 원칙적으로 가능한 해결책을 제공하기 위해 고려될 수 있지만, 폴리펩티드의 사용은 그것들이 단백질 가수분해 절단에 민감하고 유도된 단백질을 면역원성으로 만들 수 있기 때문에 유리하지 않다.
그러나, 불행하게도, 적합한 중합체를 확인하고 사용하는 문제는 현재 치료용으로 사용되는 모든 단백질이 재조합 DNA 기술로부터 유래된다는 사실에 의해 악화된다. 재조합 DNA 기술의 사용은 성능-증진 부분과 재조합적으로 생산된 단백질 사이에 형성될 수 있는 결합의 종류 및 특이성에 대한 엄격한 제약을 낳는다. 이것은, 첫째 결합에 적합한 작용기의 수가 매우 제한되어 있고, 둘째 일반적으로 변형될 단백질에 반응성 작용기의 수개 카피가 있어서 변형의 어떤 특이성을 방해하기 때문이다. 예를 들어, PEG를 갖는 과산소 디스뮤타제의 비선택적 콘쥬게이션의 경우 변형된 효소의 몇몇 부분은 완전히 비활성이었다는 것이 알려졌다(P. McGoff 등, Chem. Pharm. Bull. (1988) 36:3079-3091). 또한, 그러한 부분이 상이한 수로 무작위적으로 부착된다면, 치료 단백질의 약물동태학을 정확하게 예측할 수 없어서 용량화에 큰 문제가 된다. 더욱이, 부착 제어의 결여는 (a) 효능 감소, (b) 유도체의 방대한 혼합물을 분리하기 위한 면밀한 정제 계획의 필요, 및 (c) 아마도 변형 부분의 불안정한 부착을 가져올 수 있다. 또한, 본 분야에 공지된 트레실클로라이트-기초 결합과 같은 몇몇 결합은 면역원성이라고 공지되어 있다.
따라서, 혈중 반감기를 개선하고, 단백질 가수분해 및 면역원성을 감소시키고, 생물학적으로 생산된 단백질의 다른 특성을 개선하기 위해서, PEG와 같은 수용성 중합체가 부착될 수 있지만, 제어된 방식으로 그리고 사용자-규정된 정확성으로그것들을 부착하는 것이 어렵다고 가정한다면, 혼합된 결과들이 있을 수 있다. 또한, 정확한 사용자-규정된 부위에 중합체를 부착하는데 있어서의 제한된 성공 때문에, 일반적인 단백질에 적용할 수 있는 바람직한 부착 부위에 대해서는 거의 알려지지 않고 있다. 게다가, 부착의 확률적인 성질, 및 그러한 목적으로 현재 사용되는 PEG 및 다른 수용성 중합체의 이종-분산성 때문에, PEG-단백질 콘쥬게이트의 정제 및 분석적 특성화가 어렵다. 따라서, 재생성 부착 전반의 불량한 제어와 중합체 이질성의 복합적 문제가 치료제로서 중합체-변형 단백질의 통상적인 승인을 심하게 방해한다(1970년대 초에 그것이 도입되었지만 지금까지 치료용으로 승인된 것은 단지 소수에 불과하다).
따라서, 재조합 DNA 기술과 구별되며, 중합체 변형가능한 단백질을 형성하는데 사용될 수 있는 생물활성 단백질을 형성하는 방법에 대한 필요성이 있다. 또한, 상이한 길이의 사슬들의 혼합물보다는 오히려 규정된 구조의 중합체 애덕트를 갖는 유도 단백질을 형성하는데 사용될 수 있는 바람직한 중합체에 대한 필요성이 있다. 또한, 천연 단백질의 바람직한 특성을 의태하도록 꼬리 달려질 수 있는 구조를 갖는 중합체 애덕트를 갖는 유도 단백질을 형성하는데 사용될 수 있는 중합체가 요구된다. 더욱이, 많은 단백질에 대해 일반적인 적용성을 갖는 단백질을 유도하기 위한 필요성이 있다.
본 발명은 중합체, 특히 당-의태성 중합체(glyco-mimetic polymer)로 생물학적으로 활성인 합성 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 변형시켜서, 그것들의 생물학적 활성 또는 약물동태학적 특성을 개선하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 더 이상으로, 본 발명은 그러한 중합체-변형 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 위한 방법 및 용도를 제공한다.
도 1A-1E는 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질 제조 프로세스의 개략도이다.
도 2A-2C는 본 발명의 합성 생물활성 단백질 제조 프로세스의 개략도이다.
도 3A-3B는 3개 이상의 비-중첩 펩티드 세그먼트들의 화학적 라이게이션을 포함하는 다수-세그먼트 라이게이션 프로세스의 개략도이며, 즉 적어도 1개 세그먼트는 최종 전길이 라이게이션 생성물에 해당하는 중간 세그먼트이다.
도 4A-4C는 결과의 측쇄 티올의 자생 화학적 라이게이션 및 화학적 변형을 예시한다.
도 5A-5B는 본 발명의 수용성 중합체 U-B-Polymer-J*의 분기 중심(B) 및 유일한 화학선택성 작용기(U)를 생성하기 위한 고체상 프로세스이다.
도 6A-6D는 U-B 중심에 이후의 부착을 위한, 본 발명의 바람직한 실질적으로 비-항원성인 수용성 폴리아미드 Polymer-J* 성분을 생성하기 위한 고체상 프로세스이다.
도 7은 U-B 성분과 Polymer-J* 성분을 커플링하여 식 U-B-Polymer-J*의 본 발명의 바람직한 합성 중합체 구성물을 생성하는 프로세스이다.
도 8은 라이게이션 및 본 발명의 생물활성 합성 단백질의 생성에 이용할 수 있는 펩티드 세그먼트에 수용성 중합체를 정확히 부착하기 위한 다른 경로를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 합성 생물활성 단백질을 제조하는 전체적인 프로세스를 예시한다.
도 10은 바람직한 형태의 합성 적혈구생성 자극 단백질의 기본 구조를 나타낸다. pPEG = "정확한 PEG"
도 11은 재배치된 아미노 및 카르복시 말단을 갖는 순환식 변경된 SEP 유사체의 일반 구조를 나타낸다.
도 12는 합성 생물활성 GCSF 단백질의 기본 구조를 나타낸다. 도면에서 "J"는 소수성 측쇄를 갖는 천연적으로 코드되지 않는 잔기를 표시한다.
도 13은 바람직한 합성 RANTES 유사체의 구조를 나타낸다. 도면에서, NNY = 노나노일, X = 소수성 측쇄를 갖는 천연적으로 코드되지 않는 아미노산, 및 FA = 지방산이다.
도 14는 바람직한 수용성 중합체, 및 그것의 다양한 선형 및 분기 구성물의 구조를 나타낸다.
도 15는 분기-사슬 pPEG 중합체의 형성을 도식적으로 나타낸다.
도 16은 실시예 2에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-L30으로 표시된 합성 사이토카인의 합성을 나타낸다.
도 17은 실시예 2에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-L30으로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.
도 18은 실시예 3에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-L26으로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.
도 19는 실시예 4에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B50으로 표시된 합성 사이토카인에 부착되는 바람직한 분기-사슬 수용성 중합체의 형성을 도식적으로 나타낸다.
도 20은 실시예 4에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B50으로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.
도 21은 실시예 5에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP3-L42로 표시된 합성 사이토카인의 합성을 나타낸다.
도 22는 실시예 5에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP3-L42로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.
도 23은 실시예 7에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B51로 표시된 합성 사이토카인에 부착하기 위한 바람직한 수용성 중합체의 합성을 나타낸다.
도 24는 실시예 7에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B51로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.
도 25는 실시예 8에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B52로 표시된 합성 사이토카인에 부착하기 위한 바람직한 수용성 중합체의 합성을 나타낸다.
도 26은 실시예 8에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B52로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.
도 27은 실시예 2 내지 5 및 7 내지 8에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체에 대한 대표적인 분석 데이타를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 대표적인 등전 포커싱 겔(IEF) 및 비-환원성 SDS-PAGE 겔은 접힌 정제된 SEP1-B51의 상대적 분자량을 나타낸다.
도 28은 SEP 화합물들인 SEP0, SEP1-L26, SEP1-L30, SEP1-B50, SEP1-B51 및 SEP3-L42의 인자-의존성 셀라인의 시험관내 활성을 나타낸다.
도 29는 수시간 내의 시간에 대한 SEP3-L42 및 SEP1-B50의 혈장 농도(ng/ml)를 비교하는 대표적인 약물동태학 프로파일을 나타낸다.
도 30은 SEP1-B51 및 저산소 래트 모델의 CHO-세포에서 생성된 재조합 당화된 사람 에리트로포에틴("rhEPO")에 대한 적혈구(RBC)-59Fe 흡수(용량 %로서)인, 72시간까지 측정된 생체내 활성의 선형 회귀 분석을 나타낸다.
도 31은 각 화합물에 대해 5㎍/kg의 단일 정맥내 용량 후, 수시간 내의 시간에 대한 SEP1-B51 및 rhEPO의 혈장 농도(ng/ml)를 비교하는, 래트에서의 청소에 대한 대표적인 약물동태학 프로파일을 나타낸다.
도 32는 실시예 18에 설명된 대로 제조된 RANTES의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, RANTES G1755-01로 표시된 합성 케모카인을 나타낸다.
도 33은 실시예 19에 설명된 대로 제조된 RANTES의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, RANTES G1755로 표시된 합성 케모카인을 나타낸다.
도 34는 실시예 20에 설명된 대로 제조된 RANTES의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, RANTES G1805로 표시된 합성 케모카인을 나타낸다.
도 35는 실시예 21에 설명된 대로 제조된 RANTES의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, RANTES G1806으로 표시된 합성 케모카인을 나타낸다.
도 36은 실시예 18 내지 21에서 제조된 합성 케모카인 유사체에 대한 대표적인 분석 데이타를 나타낸다. 나타낸 대로, 대표적인 SDS-PAGE 겔은 환원(R) 또는 비-환원(N) 조건하에서 야생형(Wt) RANTES과 합성 케모카인 유사체 RANTES G1806의 상대적 분자량을 비교한다.
도 37은 각 화합물에 대해 등몰랄 양/각 동물의 kg 중량의 단일 정맥내 용량 후, 수분내의 시간에 대한 합성 RANTES 유사체들인 G1755, G1806 및 G1805의 혈장 농도(pg/ml)를 비교하는, 래트에서의 청소에 대한 약물동태학 프로파일을 나타낸다.
도 38은 순환식 변경된 중합체-변형 SEP 구성물을 나타낸다.
바람직한 구체예의 설명
본 발명은 중합체-변형 합성 생물활성 단백질, 제조 방법 및 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당-의태성 수용성 폴리아미드 중합체에 관한 것이다.
I. 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질
중합체-변형 단백질은 이전에도 설명되었지만, 본 발명의 가능한 중합체-변형의 성질 및 방식은 그러한 선행 노력과는 현저히 다르다. 예를 들어, 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 완전히 화학적으로 합성된다. 게다가, 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 1개 이상의 특정한 사용자-선택되고 사용자-규정된 부위에서 수용성 중합체를 사용하여 변형된다.
더욱이, 본 발명에서 단백질의 합성 제조는, 그러한 변형이 제조 중인 모든 분자의 사용자-선택되고 사용자-규정된 부위들 각각에 존재하도록 확실히 하는 것을 허락한다. 이러한 합성의 균일성 및 제어는 본 발명과 선행 기술의 방법을 사용할 때의 무작위 변형을 현저하게 구분짓는다. 의미심장하게도 본 발명은, 어떤 불가결하지 않은 잔기가 중합체 애덕트를 함유하도록 유도될 수 있는 합성 단백질을 디자인하는 것을 허락한다. 더욱이, 각각의 그러한 사용자-선택되고 사용자-규정된 부위에 대해서, 사용자는 정확한 결합(아미드, 티오에스테르, 티오에테르, 옥심 등)을 규정할 수 있으며, 그러한 애덕트는 이 결합을 통해 폴리펩티드 또는 단백질 백본에 결합될 것이다. 추가하여, 특정 부위에 존재되는 것이 바람직한 특정한 중합체 애덕트는 변화될 수 있고 제어될 수 있으며, 이로써 존재하는 모든 단백질 또는 폴리펩티드가 정확하게 동일한 유도된 부위에 정확하게 동일한 유도된 애덕트를 함유하는 최종 제조물이 얻어진다. 따라서, 본 발명은 중합체-변형 폴리펩티드 및 단백질의 동종성 제조물의 형성을 허락한다.
수용성 중합체가 결합될 수 있는 부착 부위의 위치 및 수를 변화시키는 수단을 제공하는 것에 더하여, 본 발명은 결합된 중합체의 성질을 변화시키는 것을 허락한다. 어떤 특정한 사용자-선택되고 사용자-규정된 부위에 결합될 수 있는 중합체 애덕트는 어떤 규정된 길이를 가질 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 방법에 일관하여, 상이한 부위에 상이한 길이의 중합체를 사용하는 것이 가능하다. 따라서 한 구체예에서, 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 수용성 중합체 애덕트로 단일-변형, 또는 다중-변형된 것일 수 있다. 1개 이상의 중합체 애덕트가 특정한 폴리펩티드 또는 단백질에 도입된 경우, 사용된 중합체는 "단일-종분화된", "다중-종분화된", "균일하게-종분화된", 또는 "다양하게-종분화된" 것일 수 있다.본원에 사용된 용어 "단일-종분화된"은 단일 종의 중합체에 의해 변형된 폴리펩티드 또는 단백질로 간주된다. 반대로, 용어 "다중-종분화된"은 1개 이상의 중합체 종에 의해 변형된 폴리펩티드 또는 단백질로 간주된다. 그러한 다중-종분화된 폴리펩티드 또는 단백질은, 만일 폴리펩티드 또는 단백질의 각 변형된 부위에 동일한 단일 종의 중합체가 존재한다면 "균일하게-종분화된"이라고 말한다. 반대로, 만일 폴리펩티드 또는 단백질의 변형된 부위가 상이한 종의 중합체로 변형된다면, 다중-종분화된 폴리펩티드 또는 단백질은 "다양하게-종분화된"이라고 말한다.
더욱이, 사용자-선택되고 사용자-규정된 부위 각각에서 중합체 애덕트의 선형성 또는 분기성의 범위를 변화시키는 것이 가능하다. 따라서, 중합체 애덕트는 선형이거나, 분기되거나 또는 균일하게 분기될 수 있다. 용어 "균일하게 분기된"은 특정 부위에 있는 중합체의 모든 분기가 동일한 구조 및 길이를 가진다는 것을 의미한다. 우리가 인정하는 바와 같이, 본 발명은 어떤 개별 분기의 길이 뿐만 아니라, 그러한 분기 지점에 존재하는 중합체의 구조도 독립적으로 변화시키는 것을 허락한다.
요컨대, 본 발명은 폴리펩티드 또는 단백질 백본에서 중합체-변형된 사용자-선택되고 사용자-규정된 부위의 (1) 위치 및 (2) 빈도를 규정하는 것, 뿐만 아니라 각각의 그러한 부위에 존재하는 분기의 (3) 길이, (4) 종, 및 (5) 정도를 제어하는 것을 허락한다. 추가하여, 다수의 중합체 변형을 갖는 폴리펩티드 및 단백질에 관해서, 본 발명은 각 부위에 대해 상기-확인된 5가지 변수를 각각 독립적으로 규정하는 것을 허락한다. 더욱이, 분기된 중합체 변형을 갖는 폴리펩티드 및 단백질에관해서, 본 발명은 각 분기 지점에 대해 상기-확인된 5가지 변수를 각각 독립적으로 규정하는 것을 허락한다. 이것은 원치 않는 중합체 부착에 의해 방해받지 않고 존재하며 남겨진 어떤 또는 모든 20개의 유전적으로 코드된 아미노산 측쇄의 다수 카피를 갖는 정확한 중합체-변형 합성 생물활성 단백질의 동종성 조성물의 합성을 허용한다.
따라서, 본 발명은 중합체-변형 합성 생물활성 단백질, 특히 사이토카인, 성장인자 등에 대한 표적 수용체인 것들의 디자인, 합성 및 사용에 있어 상당한 융통성을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 합성 생물활성 단백질의 아미노산 서열은, 그것이 기초하고 있는 유전적으로 코드된 단백질의 아미노산 서열에 비해 1개 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 위아미노산 및/또는 비-천연 측쇄 등을 지니는 다른 아미노산, 예를 들어 그것에 수용성 중합체 애덕트를 부착하기 위한 유일한 화학선택성 작용기를 지니도록 변형된 것과 같은, 1개 이상의 변칙 아미노산으로 치환될 수 있다. 따라서, 수용성 중합체는 변칙 아미노산, 또는 유전적으로 코드된 아미노산을 통해 부착될 수 있다. 수용성 중합체는 선형이거나 또는 분기될 수 있으며, 그것은 카르복실산, 지방족, 아미드 또는 아민과 같은 화학적 부분을 포함하는 말단기를 가질 수 있다. 더욱이, 수용성 중합체는 단일-분산될 수 있는데, 즉 정확하게 규정된 구조 및 조성의 단일 분자 종을 포함하도록 만들어질 수 있다. 따라서, 수용성 중합체는 반감기, 면역원성, 효능, 저장 안정성, 투약, 전달성 및 그것으로 변형된 표적 단백질 등을 정확하게 조율하기 위한 특색들을 함유하도록 디자인될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 분자적으로 동종성 중합체-변형 합성 생물활성 단백질에 관한 것이다. 이들 단백질은 식
Protein-U n -s1-B-s2-Polymer-s3-J*
을 가지며,
여기에서, 단백질은 리보솜 특이 단백질의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 폴리펩티드 사슬은 1개 이상의 화학적 라이게이션 부위에 의해 공유 결합된 1개 이상의 비-중첩 펩티드 세그먼트를 포함한다.
"리보솜 특이 단백질"은 세포에서 리보솜적으로 생산된 단백질을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 중합체-변형 폴리펩티드 사슬은 천연 포유류 단백질(예를 들어, 사람, 유인원, 소, 뮤린, 돼지, 양, 또는 말, 조류, 또는 어류 단백질)과 같은 그러한 리보솜 특이 단백질에 관련된 생물활성을 의태하는 생물활성을 가진다. 더 바람직하게는, 단백질 수용체 또는 그것의 단편, 단백질 수용체 리간드 또는 그것의 단편, 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택된 리보솜 특이 단백질에 관련된 생물활성을 의태하는 생물활성이다. 리보솜 특이 단백질의 생물활성 폴리펩티드 사슬은 신규한 것들 뿐만 아니라, 다양한 유전자 또는 단백질 데이타베이스로부터 얻을 수 있는 것들을 포함한다. 그러한 데이타베이스의 예는 GeneBank(Benson 등, Necleic Acids Res (1998) 26(1):1-7; 미국 생물기술정보 국립센터, 국립의학도서관, 국립보건학회, 메릴랜드 베데스다, 미국), TIGR 데이타베이스(게놈연구학회, 메릴랜드 록크빌, 미국), 단백질 데이타뱅크(브룩하벤 국립연구소, 미국), 및ExPASy 및 스위스-단백질 데이타베이스(스위스 생물정보학회, 스위스 제네바)를 포함하지만 제한은 없다. 가장 바람직한 리보솜 특이 단백질은 사이토카인이며, 이것들의 폴리펩티드 사슬 및 그것들의 특이적 아미노산 서열은 잘 알려져 있다(예를 들어, "사이토카인 핸드북", 3판, 편저 A. Thomas, 어소시에이티드 프레스, 1998; "사이토카인", 편저 A. Mire-Sluis & R. Thorpe, 아카데믹 프레스, 1998; 및 "사이토카인 레퍼런스", 1권, 리간드, 사이토카인 개론 및 숙주 방어의 다른 매개인자, 편저 J. J. Oppendh-eim 및 M. Feldmann, 아카데믹 프레스, 2001 참조).
"화학적 라이게이션 부위"는 화학적 라이게이션에 의해 그 사이에서 비-가역적 공유 결합을 형성하거나 또는 형성할 수 있는 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 및 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드의 C-말단 아미노산을 의미한다. 본원에 설명된 "화학적 라이게이션"은 2개의 화학적 부분의 공유적 연결을 포함하는 화학선택성 반응으로 간주하며, 이 부분들은 각각 나머지 하나와 비-가역적 공유 결합을 유일하게 형성할 수 있는 상호 반응성 작용기를 지닌다. 화학적 라이게이션은 (1) 유일한 반응성 C-말단기를 지니는 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드와 (2) 유일한 반응성 N-말단기를 지니는 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드의 공유적 라이게이션을 포함하며, 여기에서 C-말단과 N-말단 반응성 기는 그 사이에서 비-가역적 공유 결합을 형성한다. 특히, 화학적 라이게이션은 보호되지 않은 펩티드 세그먼트들의 라이게이션에 적용될 수 있는 어떤 화학선택성 반응 화학을 포함한다.
U는 비-중첩 펩티드 세그먼트 중 1개 이상에 속한 1개 이상의 아미노산의 측쇄n의 상호 반응성인 유일 작용기에 공유 결합된 유일 작용기의 잔기이며, 여기에서n은 1 내지 6의 불연속 정수이다. 가장 바람직하게, 측쇄 n은 1 내지 4의 불연속 정수이다. 본원에 설명된 용어 "아미노산"은 20개의 유전적으로 코드된 아미노산, 천연에서 발견된 희귀하거나 드문 아미노산, 및 변칙 아미노산과 같은 비-천연 발생 아미노산 중 어느 것을 포함하며, 간혹 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 문맥에 있을 때는 아미노산 잔기로 간주된다. U 및 측쇄 n의 바람직한 구체예는 유일한 상호 반응성 기로부터 형성된 공유 결합이며, 여기에서 그러한 결합은 옥심, 아미드, 아민, 우레탄, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 히드라지드, 옥사졸리딘, 티아졸리딘, 티오에테르, 에테르, 및 에스테르로부터 선택된다. 가장 바람직한 U 및n결합은, U가 아미드, 옥심, 티오에스테르, 히드라존, 티아졸리딘, 및 옥사졸리딘으로 구성된 군으로부터 선택된 화학적 라이게이션에 의해 형성된 결합을 통해 측쇄n에 공유 결합된 경우이다.
B는 3개 이상의 팔을 갖는 분기 중심으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 존재할 수도 또는 부재할 수도 있다. B가 존재하며 3개 이상의 팔, 더욱 더 바람직하게 4개 이상의 팔을 포함하는 것이 가장 바람직하다. 특히, B의 한 팔은 U(선택적으로 스페이서 또는 링커 s1을 통해)에 연결되고, 두번째 팔은 Polymer(선택적으로 스페이서 또는 링커 s2를 통해)에 연결된다. 선호되는 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 B 부분의 분기한 팔 중 적어도 1개가 옥심, 아미드, 아민, 우레탄, 티오에테르, 에스테르, 히드라지드, 옥사졸리딘, 및 티아졸리딘으로 구성된 군으로부터 선택된 결합의 잔기를 포함하는 것이다. 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질의 바람직한 분기기 B는 아미노, 카르복실레이트 및 혼성 아미노-카르복실레이트로 구성된 군으로부터 선택된 분기 중심을 포함한다. 바람직한 아미노 분기 중심은 리신을 포함하고, 바람직한 카르복실레이트 분기 중심은 글루탐산 또는 아스파르트산을 포함하고, 바람직한 혼성 아미노-카르복실레이트 분기 중심은 감마-글루탐산, 또는 그것의 유도체를 포함한다.
Polymer 성분은 실질적으로 비-항원성인 수용성 중합체로, B가 존재하는 경우 동일하거나 또는 상이할 수 있다. "수용성 중합체"는 실질적으로 비-항원성인 중합체를 의미하며, 물에서 가용성이고 약 1,000 달톤 이상의 원자 분자량을 가진다. Polymer는 바람직하게 10,000Da 이상, 더 바람직하게 약 20,000 내지 500,000 Da, 가장 바람직하게 약 40,000 내지 300,000Da의 유효 유체역학 분자량을 가진다. "유효 유체역학 분자량"은 수성-기초 크기배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정된 중합체 사슬의 효과적인 수-용매화 크기를 의미한다. 수용성 중합체가 에틸렌 옥시드 반복 단위와 같은 폴리알킬렌 옥시드 반복 단위를 갖는 중합체 사슬을 함유할 때, 각 사슬은 약 200 내지 약 80,000Da, 바람직하게 약 1,500 내지 약 42,000Da의 원자 분자량을 갖는 것이 바람직하며, 2,000 내지 약 20,000Da가 가장 바람직하다. 구체적으로 언급되지 않는다면, 분자량은 원자 분자량으로 간주된다.
Polymer 성분은 넓은 범위의 분자량, 및 중합체 서브유닛을 가진다. 이들 서브유닛은 생물학적 중합체, 합성 중합체, 또는 그것들의 조합을 포함할 수 있다. 그러한 수용성 중합체의 예는, 덱스트란 술페이트, P-아미노 교차결합 덱스트린, 및 카르복시메틸 덱스트린을 포함한 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스를 포함한 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 녹말 및 덱스트린, 및 녹말 유도체 및 가수분해물, 폴리에틸렌 글리콜, 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체, 및 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기에서, 상기 동종중합체 및 공중합체는 치환되지 않거나 또는 한 단부에서 알킬기로 치환될 수 있다)를 포함한 폴리알킬렌 글리콜 및 그것의 유도체, 헤파린 및 헤파린 단편, 폴리비닐 알콜 및 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리비닐피롤리돈, 아스파르타미드, 및 데스트란 및 덱스트란 유도체, 덱스트린 및 덱스트린 유도체로 폴리옥시에틸화된 폴리올을 포함한다. 또한, 구체적으로 기술된 수용성 중합체의 다양한 유도체가 고려된다는 것이 인정될 것이다.
상술된 것들과 같은 수용성 중합체는 잘 알려져 있으며, 특히 폴리에틸렌 글리콜인 "PEG"와 같은 폴리알킬렌 옥시드-기재 중합체가 잘 알려져 있다(예를 들어, "폴리(에틸렌 글리콜) 화학: 생물기술 및 생물의학 응용", J. M. Harris 편저, 플레넘 프레스, 뉴욕 (1992); 및 "폴리(에틸렌 글리콜) 화학 및 생물학적 응용", J. M. Harris 및 S. Zalipsky 편저, ACS (1997); 및 국제 특허 출원: WO 90/13540, WO 92/00748, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28937, WO 95/11924, WO 96/00080, WO 96/23794, WO 98/07713, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/30727, WO 99/32134, WO 99/33483, WO 99/53951, WO 01/26692, WO 95/13312, WO 96/21469, WO 97/03106, WO 99/45964, 및 미국 특허 번호 4,179,337; 5,075,046; 5,089,261; 5,100,992; 5,134,192; 5,166,309; 5,171,264; 5,213,891; 5,219,564; 5,275,838; 5,281,698; 5,298,643; 5,312,808; 5,321,095; 5,324,844; 5,349,001; 5,352,756; 5,405,877; 5,455027; 5,446,090; 5,470,829; 5,478,805;5,567,422; 5,605,976; 5,612,460; 5,614549; 5, 618,528; 5,672,662; 5,637,749; 5,643,575; 5,650,388; 5,681,567; 5,686,110; 5,730,990; 5,739,208; 5,756,593; 5,808,096; 5,824,778; 5,824,784; 5,840,900; 5,874,500; 5,880,131; 5,900,461; 5,902,588; 5,919,442; 5,919,455; 5,932,462; 5,965,119; 5,965,566; 5,985,263; 5,990,237; 6,011,042; 6,013,283; 6,077,939; 6,113,906; 6,127355; 6,177,087; 6,180,095; 6,194,580; 6,214,966 참조).
더 바람직한 Polymer 성분은 폴리알킬렌 옥시드, 폴리아미드 알킬렌 옥시드, 또는 그것의 유도체를 포함한다. 더욱 더 바람직한 Polymer 성분은 식 -[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-의 약 1,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 폴리아미드이며, 여기에서 X 및 Y는 2가 라디칼로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 분기되거나 또는 선형일 수 있고, n은 2 내지 100의 불연속 정수이고, X 및 Y 중 어느 하나 또는 모두는 선형이거나 또는 분기될 수 있는 생체적합성이며 실질적으로 비-항원성인 수용성 반복 단위를 포함한다. 가장 바람직한 수용성 반복 단위는 식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(CH2-CH2-O)-의 에틸렌 옥시드를 포함한다. 그러한 수용성 반복 단위의 수는 유의하게 변할 수 있지만, 더 바람직하게 그러한 단위의 수는 2 내지 500, 2 내지 400, 2 내지 300, 2 내지 200, 2 내지 100이고, 가장 바람직하게는 2 내지 50이다. 더 바람직한 구체예의 예는, X 및 Y 중 어느 하나 또는 모두가 -((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)n1-)- 또는 -((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)-으로부터 선택되는 경우이며, 여기에서 n1은 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 가장 바람직하게 1 내지 3이고, n2는 2 내지 50, 2 내지 25, 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 8, 가장 바람직하게 2 내지 5이다. 매우 바람직한 구체예의 예는, X가 -(CH2-CH2)-이고, Y가 -(CH2-(CH2-CH2-0)3-CH2-CH2-CH2)- 또는 -(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2) -인 경우이다.
Polymer 성분 또는 1개 이상의 스페이서 또는 링커가 존재할 때, 이것은 생물안정성 또는 생분해성인 중합체 사슬 또는 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 반복 결합을 갖는 Polymer는 결합 불안정성에 따라 생리학적 조건하에서 안정성의 정도가 변화한다. 그러한 결합을 갖는 Polymer는 생리학적 조건하에서의 상대 가수분해 속도에 의해 분류될 수 있는데, 이것은 저분자량 유사체의 공지된 가수분해 속도를 기준으로 하며, 예를 들어 덜 안정한 것에서부터 더 안정한 순서로, 폴리카르보네이트(-O-C(O)-O-) > 폴리에스테르(-C(O)-O-) > 폴리우레탄(-NH-C(O)-O-) > 폴리오르토에스테르(-O-C((OR)(R'))-O-) > 폴리아미드(-C(O)-NH-)이다. 유사하게, 표적 분자에 수용성 중합체를 부착시키는 결합 시스템도 생물안정성 또는 생분해성일 수 있는데, 예를 들어 덜 안정한 것에서부터 더 안정한 순서로, 카르보네이트(-O-C(O)-O-) > 에스테르(-C(O)-O-) > 우레탄(-NH-C(O)-O-) > 오르토에스테르(-O-C((OR)(R'))-O-) > 아미드(-C(O)NH-)이다. 이들 결합은 단지 예일 뿐이며, 본 발명 수용성 중합체의 중합체 사슬 또는 결합 시스템에 사용할 수 있는 결합의 종류를 제한하지 않는다.
성분 J*는 음, 양 및 중성으로 구성된 군으로부터 선택된 생리학적 조건하에서의 순전하를 갖는 펜던트기의 잔기이다. 이것은 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아실, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 아미드, 아미노, 카르보닐기 등 뿐만 아니라, 그것들의 염을 포함한다. 중성기는 바람직하게 알킬 또는 알콕시기이며, 제한은 없지만 1 내지 18개의 탄소를 함유하는 부분을 포함할 수 있고, 선형이거나 또는 분기될 수 있다. J*가 하전된 기로서 제공될 때, 이것은 이온성 작용기를 포함한다. 작용기의 예는 카르복실산, 에스테르, 아미드, 니트릴, 티올 및 히드록실을 포함하지만 제한은 없다. 그러한 J* 기는 아미노산, 핵산, 지방산, 탄수화물, 및 그것들의 유도체, 및 키틴, 키토산, 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘트로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 및 데르마탄 술페이트, 시클로덱스트린, 덱스트란, 히알루론산, 인지질, 시알산 등과 같은 부분의 성분일 수 있다. 바람직하게, J*는 카르복실, 아미노, 티올, 히드록실, 포스포릴, 구아니디늄, 이미다졸 및 그것들의 염으로부터 선택된 이온성 부분을 포함한다. J*가 이온성 카르복실레이트 부분을 포함하고, 생리학적 조건하에서 순 음전하를 갖는 경우가 가장 바람직하다.
성분 s1, s2, 및 s3은 스페이서 또는 링커 부분으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 개별적으로 존재하거나 또는 부재할 수 있다. 바람직한 스페이서 또는 링커는 수용성 중합체에 사용된 1개 이상의 반복 단위를 포함하는 선형 또는 분기 부분, 디아미노 및/또는 2산 단위, 천연 또는 비-천연 아미노산 또는 그것의 유도체 뿐만 아니라, 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 알콕시 등을 포함한 지방족 부분을 포함하며, 바람직하게는 18개 이하의 탄소 원자나 심지어 추가의 중합체 사슬을 함유한다.
또는 달리, 상기 식 "Protein-U n -s1-B-s2-Polymer-s3-J*"는 "Protein-U n -B-Polymer-J*"로 표시될 수 있으며, 여기에서 s1, s2, 및 s3 기는 존재할 수도 또는 부재할 수도 있다. 수용성 중합체 U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*가 단계적 합성에 의해 전체로서 생산되는 경우의 Polymer 성분이 더 바람직하다. 이것은 이들 중합체가 정확한 분자량 및 규정된 구조를 가질 것이라는 의미이다. 반대로, 중합 과정인 보통의 중합체 합성은 상이한 길이를 갖는 사슬들의 혼합물을 가져오며, 그래서 비록 분리하는 것이 불가능하지 않다 해도, 그것을 어렵게 하는 분자량 및 크기의 분포가 있게 된다. 분자 순도를 제어하는 능력은, 그것에 부착된 수용성 중합체를 가지며 단일-분산된 합성 단백질이 구성될 수 있다는 점에서 유리하다. 이것은 이종성 화합물로 인한 가변적인 특성들을 피할 수 있고, 단지 가장 바람직한 특성을 갖는 화합물들 만이 제조되며, 비교적 용이하게 분리될 수 있다는 점에서 상당한 이점을 나타낸다.
또는 달리, 상기 식 "Protein-U n -s1-B-s2-Polymer-s3-J*"는 "Protein-U n -B-Polymer-J*"로 표시될 수 있으며, 여기에서 s1, s2, 및 s3 기는 존재할 수도 또는 부재할 수도 있다.
식 Protein-U n -s1-B-s2-Polymer-s3-J*의 더 바람직한 화합물은 리보솜 특이 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 가지며, 더욱 바람직하게는 폴리펩티드 사슬이 1개 이상의 변칙 아미노산을 갖는 경우이다. 본원에 사용된 "변칙 아미노산"은 비-유전적으로 코드된 측쇄, 비-유전적으로 코드된 백본, 비-유전적으로 코드된 치환 Nα 또는 αC(O) 부분, 또는 그것들의 조합을 갖는 아미노산, 즉 리보솜적으로 인스톨된 20개의 유전적으로 코드된 아미노산에 속한 것 이외의 다른 아미노산으로 간주한다. 바람직한 변칙 아미노산의 예는 유전적으로 코드된 작용기 이외의 다른 유일한 작용기를 지닌 측쇄를 갖는 아미노산, 뿐만 아니라 위아미노산 및 다양한 아미노산 변이체를 포함한다. 이 점에 있어서, 본 발명은 합성 생물활성 단백질의 디자인 및/또는 구성에 있어 폭넓은 선택성 및 융통성을 허락한다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 비-리보솜적으로 인스톨된 아미노산의 예는, D-아미노산, β-아미노산, 위-글루타메이트, γ-아미노부티레이트, 오르니틴, 호모시스테인, N-치환 아미노산(R. Simon 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89:9367-71; WO 91/19735(Bartlett 등), 미국 특허 5,646,285 (Baindur)), α-아미노메틸렌옥시 아세트산(아미노산-Gly-디펩티드 동배체) 및 α-아미노옥시 산, 및 비-유전적으로 비-코드된 측쇄 작용기를 갖는 다른 아미노산 유도체 등을 포함하지만 제한은 없다. 티오아미드, 비닐성 아미드, 히드라지노, 메틸렌옥시, 티오메틸렌, 포스폰아미드, 옥시아미드, 히드록시에틸렌, 환원 아미드 및 치환 환원 아민드 동배체, 및 β-술폰아미드(들)를 함유하는 펩티드 유사체가 사용될 수 있다. "위아미노산"은 유전적으로 코드된 아미노산과 동일한 백본 구조 및 측쇄기를 가지지만, 측쇄 원자의 원자 조성에 차이가 있는 아미노산을 의미한다.
바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 사슬의 변칙 아미노산에 부착된 수용성 중합체를 갖는 합성 생물활성 단백질이 제공된다. 그것에 수용성 중합체의 부착을 위한 가장 바람직한 변칙 아미노산은 유전적으로 코드된 작용기의 존재하에서 이것들과의 반응 없이 사용될 수 있는 화학선택성 라이게이션 화학을 사용한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 리보솜 특이 당단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 합성 생물활성 단백질에 관한 것이며, 여기에서 폴리펩티드 사슬은 그것에 부착된 1개 이상의 수용성 중합체를 가지고, 바람직하게는 25kDa 이상의 단량체 분자량을 가진다. 이것은 리보솜 특이 당단백질에 관련된 생물활성을 의태하는 생물활성을 갖는 합성 생물활성 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 "당단백질"은 당 잔기를 통해서 단백질의 아미노산 측쇄에 공유적으로 연결된 탄수화물 사슬을 함유하는 단백질로 간주하며, 간혹 당화된 단백질로 언급된다. 당단백질의 탄수화물은 단당, 이당(들), 올리고당(들), 다당(들), 또는 그것들의 유도체(예를 들어, 술포- 또는 포스포-치환)의 형태일 수 있다. 단백질에 부착된 1개 이상의 탄수화물을 갖는 당단백질을 포함하며, N-연결 및 O-연결 당화를 갖는 당당백질에 의해 예시된다. 천연 또는 비-천연 당당백질의 당화된 생물활성 도메인을 포함한다. 중합체 변형을 위한 잔여 부위는 위치상 동일할 것이므로, 1개 이상의 당화 부위를 제거하도록 돌연변이된 당단백질, 또는 단백질을 당화시키지 않는 세포(예를 들어,E. coli)에서 발현된 당단백질이 이 정의에 포함된다는 것이 인정될 것이다.
본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질의 바람직한 폴리펩티드 사슬은 사람 당단백질과 같은 리보솜 특이 포유류 당단백질의 아미노산 서열을 포함한다.더 바람직한 폴리펩티드 사슬은 사이토카인인 리보솜 특이 당단백질의 아미노산 서열을 포함하며, 이것에 속한 많은 폴리펩티드 사슬 및 그것들의 특이적 아미노산 서열, 그리고 관련된 생물학적 특성은 잘 알려져 있다(예를 들어, "사이토카인 핸드북", 3판, 편저 A. Thomas, 어소시에이티드 프레스, 1998; "사이토카인", 편저 A. Mire-Sluis & R. Thorpe, 아카데믹 프레스, 1998; 및 "사이토카인 레퍼런스", 1권, 리간드, 사이토카인 개론 및 숙주 방어의 다른 매개인자, 편저 J. J. Oppendh-eim 및 M. Feldmann, 아카데믹 프레스, 2001 참조). 바람직한 구체예에서, 리보솜 특이 당단백질은 1개 이상의 당화 부위를 포함하며, 수용성 중합체가 리보솜 특이 당단백질의 1개 이상의 당화 부위에 해당하는 1개 이상의 부위에서 합성 생물활성 단백질의 폴리펩티드 사슬에 부착된다. 더 바람직한 구체예에서, 수용성 중합체는 1개 이상의 그러한 당화 부위에 해당하는 1개 이상의 부위에서 배타적으로 폴리펩티드 사슬에 부착된다. 본 발명의 이런 측면은 리보솜 특이 당단백질이 재조합적으로 생산된 당단백질인 경우의 합성 생물활성 단백질을 포함하며, 이것은 천연 당단백질 또는 비-천연 당단백질일 수 있고, 후자의 경우 1개 이상의 비-천연 당화 부위를 더 포함할 수 있다. "당화 부위"는 단백질의 아미노산 서열에 속한 아미노산 잔기의 측쇄에 올리고당(탄수화물) 사슬의 효소적 부착을 코드하는 이 단백질의 아미노산 서열을 의미하며, N-연결 및 O-연결 당화 부위에 의해 예시된다. 중합체 변형을 위한 잔여 부위는 위치상 동일할 것이므로, 그러한 당화 부위 중 1개 이상의 당화 부위를 제거하도록 돌연변이된 당단백질이 '당화 부위'의 정의에 포함된다는 것이 인정될 것이다. "천연 발생 당화 부위"는 천연에서 발견된 당단백질의 당화 부위를 의미한다. "비-천연 발생 당화 부위"는 단백질로 조작된 당화 부위를 의미한다. 예를 들어, 재조합 사람 EPO 및 GCSF가 이 방식으로 조작되었다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,856,298 및 5,218,092 참조).
본 발명의 이 바람직한 구체예는, 당단백질의 폴리펩티드 사슬을 갖는 합성 단백질이 본원에 설명된 중합체와 같은 수용성 중합체로 그것의 1개 이상의 당화 부위에서 변형될 때, 이 수용성 중합체가 대응물인 천연 발생 당단백질, 추가의 당화 부위를 함유하도록 조작된 당단백질, 또는 당화되도록 조작된 비-당단백질에 있는 그 위치에서 정상적으로 발견되는 탄수화물 사슬로 인한 생물학적 효과 중 1가지 이상을 이용하는데 이용될 수 있다는 발견에 일부 기초한다. 그러한 생물학적 효과는 프로테아제 내성, 면역원성, 수용체-특이성, 특이적 활성, 효능 및 약물동태학의 조정을 포함한다. 그러나, 탄수화물 사슬을 제거하고, 그것을 본 발명의 바람직한 수용성 중합체로 대체함에 의해, 당 사슬의 펜던트 시알산 잔기가 제거될 때와 같은 효소적 분해 및 청소의 회피, 불안정성, 제한된 혈중 반감기, 분포, 나쁜 취급성 등을 포함하는 유의한 이익이 얻어진다. 유의하게는, 본 발명의 그러한 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은, 심지어 합성 단백질의 단량체 분자량이 25 kDa 이상인 때 조차도, 증가된 생물활성을 포함해서, 비-변형 대응물 단백질과 비교했을 때 생물학적 활성의 실질적인 손실 없이 그러한 유리한 생물학적 특성을 보유한다고 밝혀졌다.
따라서, 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 리보솜 특이 당단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 합성 생물활성 단백질에 관한것이며, 여기에서 폴리펩티드 사슬은 그것에 부착된 1개 이상의 수용성 중합체 및 25kDa 이상의 단량체 분자량을 가지고, 여기에서 이 합성 생물활성 단백질은 상기 수용성 중합체가 없는 폴리펩티드 사슬을 갖는 해당하는 합성 생물활성 단백질과 동일하거나 또는 이보다 좋은 생물활성을 포함한다. 생물활성은 시험관내, 생체내, 또는 이 2가지 모두일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 생물활성은 생체내이다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 리보솜 특이 당단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 합성 생물활성 단백질에 관한 것이며, 여기에서 폴리펩티드 사슬은 그것에 부착된 1개 이상의 수용성 중합체 및 25kDa 이상의 단량체 분자량을 가지고, 여기에서 이 합성 생물활성 단백질은 리보솜 특이 당단백질과 동일하거나 또는 이보다 좋은 생물활성을 포함한다. 여기서 다시, 생물활성은 시험관내, 생체내, 또는 이 2가지 모두일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 생물활성은 생체내이다. 가장 바람직하게, 그러한 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 불연속적 수의 그것에 부착된 수용성 중합체를 가질 것이다.
단백질의 비-천연 발생 당화 부위를 표적화하는 이익은, 천연에서 발견된 단백질이, 천연 당단백질이든지 아니든지 간에, 재조합 DNA 기술(예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 또는 지정 진화)을 사용하여, 면역원성 또는 프로테아제 민감성의 원인인 보호되지 않은 혼란된 또는 표면-노출된 영역들과 같은, 1개 이상의 부위 또는 영역에서 당화 부위를 함유하도록 변형될 수 있다는 점이다. 예를 들어, 비-천연 발생 당화 부위는 표적 폴리펩티드 서열의 잠재적 면역원성 또는 프로테아제 민감성에서 디자인되며, 생성에 대해 재조합 시스템(예를 들어, CHO 세포 및 효모세포 발현 시스템 등)에서 스크린되고, 관련된 원하는 생물활성에 대해 분석된다. 다음에, 당화될 수 있다고 밝혀진 새로운 부위들이, 이들 위치 중 1개 이상에 배타적으로 부착된 수용성 중합체를 갖는 본 발명의 합성 생물활성 단백질의 디자인 및 합성에 이용된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 단백질의 라이게이션 부위에 위아미노산, 및 선택적으로 단백질에 부착된 수용성 중합체를 포함하는 합성 생물활성 단백질에 관한 것이다. 이들 화합물은 시스테인과 같은 화학선택성 반응성 작용기를 포함하는 N-말단 아미노산을 갖는 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트와, α-카르복시 티오에스테르와 같은 화학적 라이게이션 양립성 C-말단 작용기를 갖는 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드를 라이게이션함에 의해 라이게이션 부위에 보호되지 않은 측쇄 작용기를 갖는 라이게이션 생성물을 형성하고, 라이게이션 부위에 있는 보호되지 않은 측쇄 작용기를 시스테인 티올 측쇄의 카르복시메틸화와 같이 위아미노산으로 화학적으로 전환하여 위-글루타메이트 아미노산을 형성함에 의해 생산된다. 자생 화학적 라이게이션 부위에서 시스테인의 전환에 의해 형성된 위아미노산은 본원에서 "위자생 화학적 라이게이션"으로 간주되며, 아래에 상세히 설명된다.
또한, 단백질의 라이게이션 부위에서 아미노산의 측쇄에 부착된 수용성 중합체를 포함하는 합성 생물활성 단백질이 제공된다. 이들 화합물은 시스테인과 같은 화학선택성 반응성 작용기를 포함하는 N-말단 아미노산을 갖는 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트와, α-카르복시 티오에스테르와 같은 라이게이션 양립성 C-말단 작용기를 갖는 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드를 라이게이션함에 의해 라이게이션부위에 보호되지 않은 측쇄 작용기를 갖는 라이게이션 생성물을 형성하고, 라이게이션 부위에 있는 보호되지 않은 측쇄 작용기에 수용성 중합체를 부착함에 의해 합성된다.
본 발명의 위아미노산 화학적 라이게이션 및 화학적 라이게이션 부위 중합체 변형 방법의 이용은 선행 기술에 비해 몇가지 이점을 제공하는데, 이들 이점은 적합한 라이게이션 부위가 없는 다른 상태에서도 합성 생물활성 단백질의 확실한 합성, 부위-특이적 중합체 변형이 루틴하고 비용-효과적인 방식으로 활용될 수 있는 부위들(및 부착 화학들)의 확장, 뿐만 아니라 그 중에서도 특히 실질적인 분자량의 합성 생물활성 단백질의 합성을 포함한다. 또한, 그것들은 수용성 중합체 부착을 위한 개별 또는 다수 부위를 스캐닝하는 것을 포함한, 원하는 생물학적 특성의 미세-조율을 위한 고처리량 아날로그화에 특히 적합하다.
상기 주지된 바와 같이, 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질의 생물학적 특성은, 분자량, 중합체 조성, 구조(예를 들어, 선형 대 분기, 또는 그것들의 혼합), 및 수용성 중합체의 펜던트기(예를 들어, 하전 대 비하전, 또는 그것들의 혼합)의 정확한 조절과 함께, 중합체 부착의 부위 및 결합 화학을 정확하게 조절함으로써 변형될 수 있다. 구체적으로, 반감기를 개선하기 위한 단백질의 분자량 증가, 및 분기 등에 더하여, 그것에 부착된 수용성 중합체는, 합성 단백질이 합성 생물활성 단백질의 아미노산 서열이 기초하고 있는 상응하는 생물학적으로 생산된 단백질의 전하와 대략 동일한, 등전점에 의해 측정된 정확한 전하를 가지도록 할 수 있다. 이것은 상응하는 리보솜 특이 단백질의 중성전하를 의태한다는 이점을 가진다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 상기 특징들이 합쳐진 합성 생물활성 단백질, 뿐만 아니라 그것을 위해 이용된 수용성 중합체, 특히 미리 선택된 위치에 부착될 수 있는 구조적으로 규정된 중합체 애덕트에 관한 것이다.
또한, 상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 약 25kDa 이상인 실질적인 총 분자량을 가질 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 분자량의 그러한 측정은 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동을 변성시킴으로서 만들어진다. 용어 "단량체 분자량"은 단백질 또는 폴리펩티드의 다수 카피를 가질 수 있는 합성 단백질과 구별되는, 단량체 합성 단백질의 분자량으로 간주한다. 용어 "단량체 폴리펩티드 분자량"은 그것에 부착된 중합체 및/또는 단백질 또는 폴리펩티드의 다수 카피를 가질 수 있는 합성 단백질과 구별되는, 단량체 폴리펩티드의 분자량으로 간주한다.
본원에 사용된 대로, 만일 단백질의 아미노산 잔기의 일부, 가장 바람직하게는 전부를 중합하는데 비-재조합 기술이 사용되었다면, 단백질은 "합성"이라고 말한다. 용어 "비-재조합 기술"은, 유기 화학 및 다른 합성 중합 접근법을 포함하는 기술과, 생체내 또는 시험관내에서 RNA를 단백질로 번역하는 것을 포함하는 기술을 구별하려는 의도이다. 합성 단백질은 총합성 및 반합성 단백질을 포함한다. 총합성 단백질은 모든 라이게이션 성분이 화학적 합성, 즉 리보솜 없는 합성에 의해 인공적으로 만들어진 경우에 생산된다. 반합성 단백질은 라이게이션 성분의 적어도 일부는 생물학적 합성에 의해, 즉 세포 또는 세포 없는 번역 시스템에서 만들어지고, 다른 일부는 화학적 합성에 의해 만들어진 경우에 생산된다.
본원에 사용된 대로, 만일 합성 단백질이 합성 단백질의 구조 또는 아미노산 서열에 좌우되는 식별 가능한 생물활성을 가지고, 그러한 구조 또는 서열에서의 그러한 변화가 단백질의 생물활성을 증진, 변형 또는 약화시킨다면, 합성 단백질은 "생물활성"이라고 말한다. 제한 없이, 그러한 "생물활성"은 촉매, 신호화 또는 유도 반응을 매개할 수 있는 단백질의 능력을 포함한다. 본원에 사용된 대로, 단백질은 그 자체가 소비되거나 또는 영구히 변형되는 일 없이 기질을 생성물로 전환시킴에 의해 "촉매 반응을 매개한다"고 말한다. 만일 단백질의 존재가 유기체, 또는 유기체의 조직 또는 세포로 하여금 유전자 발현, 세포 분화, 또는 세포 증식을 개시, 계속, 증진, 변형, 또는 약화시키게 한다면, 단백질은 "신호화 반응 또는 유도 반응을 매개한다"고 말한다. 그러한 신호화 또는 유도 반응의 예는, 사이토카인 발현 또는 사이토카인 발현에 대한 반응의 유도, 적혈구생성의 유도, 염증 및/또는 염증성 과정의 유도 또는 약화, 혈관형성 또는 혈관신생의 개시, 세포자살의 유도, 세포주기에의 영향 등을 포함한다.
따라서, 본원에 사용된 "중합체-변형 합성 생물활성 단백질"은 그것에 부착된 1개 이상의 수용성 중합체를 갖는 합성 생물활성 단백질로 간주한다. 또한, 본 발명의 합성 생물활성 단백질의 생물활성은 수용체, 리간드 또는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질의 능력을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "특이적" 결합은 호르몬과 그것의 수용체, 또는 항체와 항원 에피토프 사이에 존재하는 것과 같은, 구조-기반 결합 상호작용으로 간주하며, 전하, 용해성, 소수성 등을 기반으로 하는 "비-특이적" 결합과 구별된다.
본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 포유류(사람, 유인원, 소, 뮤린, 돼지, 양, 말 등을 포함하는), 조류, 또는 어류 단백질에 관련된 생물활성을 의태하는 생물활성을 가지도록 디자인될 수 있다. 본원에 사용된 대로, 만일 제 1 단백질이 제 2 단백질의 생물활성과 관련하여 변형, 증진, 또는 약화된 생물활성을 가진다면, 제 1 단백질은 제 2 단백질을 의태한다고 말한다. 만일 생물활성의 존재가 단백질의 아미노산 서열에 직접적으로 또는 간접적으로 좌우된다면, 생물활성은 단백질에 "관련된다"고 말한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 생물활성 단백질은 어떤 상응하는 천연 생물활성 대응물에 관계 없이 완전히 또는 부분적으로 조작될 수 있다.
본 발명의 바람직한 합성 생물활성 단백질은 수용체 이외의 다른 중합체-변형 단백질, 및 중합체-변형 가용성 수용체 도메인을 포함한다. 예를 들어, 중합체 -변형 가용성 수용체 도메인을 포함하는 합성 생물활성 단백질이 특히 바람직하다. 중합체 변형에 바람직한 가용성 수용체 도메인의 예가 PCT/US00/06297에 설명되며, 부신겉질자극호르몬 수용체 및 그것의 생물활성 단편, 안지오텐신 수용체, 심방 나트륨이뇨 수용체, 브라디키닌 수용체, 성장호르몬 수용체, 주화성 수용체, 디놀핀 수용체, 엔돌핀 수용체, β-리포트로핀 수용체 및 그것의 생물활성 단편, 엔케팔린 수용체, 효소억제제 수용체, 섬유결합소 수용체 및 그것의 생물활성 단편, 위장관- 및 성장호르몬-분비 펩티드 수용체, 황체형성호르몬 분비 펩티드 수용체, 멜라닌세포자극호르몬 수용체, 뉴로텐신 수용체, 오피오이드 수용체, 옥시토신 수용체, 바소프레신 수용체, 바소토신 수용체, 부갑상샘호르몬 수용체 및 단편, 단백질 키나제 수용체, 성장억제호르몬 수용체, 섭스턴스 P 수용체의 가용성 도메인들을 포함한다.
중합체-변형 합성 사이토카인이 본 발명의 특히 바람직한 구체예이다. 구체적으로, 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은, 생물학적 환경에서의 세포-세포 상호작용, 소통 및 다른 세포의 행동에 대한 특이적 효과를 매개하는, 합성 케모카인을 포함하는 합성 사이토카인을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "사이토카인"은 인터류킨("IL")(IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 등과 같은), 림포카인 및 신호화 분자, 예를 들어 적혈구생성 자극 단백질(예를 들어, 에리트로포에틴(EPO), 트롬보포에틴(TPO)), 종양 괴사인자(TNF), 인터페론 등, 성장인자, 예를 들어 전환 성장인자, 신경 성장인자, 뇌유래 성장인자, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 간세포 성장인자, T-세포 성장인자(TGF, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 등), 콜로니 자극인자(G-CSF, GM-CSF, M-CSF 등), 표피 성장인자(EGF, LIF, KGF, OSM, PDGF, IGF-I 등), 섬유모세포 성장인자(αFGF, βFGF 등), 및 호르몬, 특히 신호 펩티드 호르몬, 예를 들어 성장호르몬, 및 케모카인을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "케모카인"은 주화성 사이토카인으로 간주하며, 예를 들어 6Ckine, 9E3, ATAC, ABCD-1, ACT-2, ALP, AMAC-1, AMCF-1, AMCF-2, AIF, ANAP, Angie, 베타-R1, 베타-트롬보글루불린, BCA-1, BLC, blr-1 리간드, BRAK, C10, CCF18, Ck-베타-6, Ck-베타-8, Ck-베타-8-1, Ck-베타-10, Ck-베타-11, cCAF, CEF-4, CINC, C7, CKA-3, CRG-2, CRG-10, CTAP-3, DC-CK1, ELC, 에오타신, 에오타신-2, 엑소더스-1, 엑소더스-2, ECIP-1, ENA-78, EDNAP, ENAP, FIC,FDNCF, FINAP, 프락탈카인, G26, GDCF, GOS-19-1, GOS-19-2, GOS-19-3, GCF, GCP-2, GCP-2-유사형, GRO1, GRO2, CRO3, GRO-알파, GRO-베타, GRO-감마, H400, HC-11, HC-14, HC-21, HCC-1, HCC-2, HCC-3, HCC-4, H174, 헤파린 중화 단백질, Humig, I-309, ILINCK, I-TAC, Ifi10, IL8, IP-9, IP-10, IRH, JE, KC, 림포탁틴, L2G25B, LAG-1, LARC, LCC-1, LD78-알파, LD78-베타, LD78-감마, LDCF, LEC, Lkn-1, LMC, LAI, LCF, LA-PF4, LDGF, LDNAP, LIF, LIX, LUCT, 렁카인, LYNAP, 맨체스터억제제, MARC, MCAF, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MDC, MIP-1-알파, MIP-1-베타, MIP-1-감마, MIP-3, MIP-3-알파, MIP-3-베타, MIP-4, MIP-5, 모노탁틴-1, MPIF-1, MPIF-2, MRP-1, MRP-2, M119, MDNAP, MDNCF, 거대핵세포-자극성-인자, MGSA, Mig, MIP-2, mob-1, MOC, MONAP, NC28, NCC-1, NCC-2, NCC-3, NCC-4 N51, NAF, NAP-1, NAP-2, NAP-3, NAP-4, NAP S, NCF, NCP, 뉴로탁틴, 온코스타틴 A, P16, P500, PARC, pAT464, pAT744, PBP, PBP-유사형, PBSF, PF4, PF4-유사형, PF4-ALT, PF4V1, PLF, PPBP, RANTES, SCM-1-알파, SCI, SCY A26, SLC, SMC-CF, ST38, STCP-1, SDF-1-알파, SDF-1-베타, TARC, TCA-3, TCA-4, TDCF, TECK, TSG-8, TY5, TCF, TLSF-알파, TLSF-베타, TPAR-1, 및 TSG-1이다.
그러한 사이토카인, 및 그것들의 케모카인 아과와 그것들의 해당하는 폴리펩티드 사슬, 그리고 그것의 변이체 및 관련된 생물활성은 잘 공지되어 있으며, 많은 출처를 통해 공개적으로 이용할 수 있다(예를 들어, "사이토카인 핸드북", 3판, 편저 A. Thomas, 어소시에이티드 프레스, 1998; "사이토카인", 편저 A. Mire-Sluis & R. Thorpe, 아카데믹 프레스, 1998; 및 "사이토카인 레퍼런스", 1권, 리간드, 사이토카인 개론 및 숙주 방어의 다른 매개인자, 편저 J. J. Oppendheim 및 M. Feldma-nn, 아카데믹 프레스, 2001 참조).
II. 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질의 생산
본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질의 생산은 다음 단계들을 갖는 것으로서 계획될 수 있다: 디자인 단계, 펩티드 합성 단계, 펩티드 라이게이션 단계, 전길이 라이게이션 생성물을 접어서 단백질을 생성하는 단계, 및 단백질 생물활성의 평가 단계. 우리는 중합체 변형이 펩티드 합성 단계, 라이게이션 단계 또는 접힌 생성물 상태로 있는 단계 중 1단계 이상에서 수행될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 그러나, 접는 단계 전에 펩티드 또는 라이게이션 생성물에 중합체를 부착하는 것이 바람직하다. 이 방식으로 생산된, 원하는 생물활성을 나타내는 단백질이 선택되며, 본 발명의 합성 생물활성 단백질을 대표한다.
특히 바람직한 구체예에서는, 본 발명의 표적 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 폴리펩티드 사슬의 비-중첩 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 세그먼트들을 화학적으로 라이게이션하는 단계를 포함하는, 본 발명의 합성 생물활성 단백질을 생산하는 방법이 제공되며, 여기에서 라이게이션에 사용된 펩티드 세그먼트 중 1개 이상은 사용자-규정되고 사용자-선택된 부위에서 그것에 부착된 수용성 중합체를 가진다. 다음에, 중합체-변형 폴리펩티드 사슬을 접어서, 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명의 합성 생물활성 단백질을 생산하기 위한 다른 바람직한 방법은, 본 발명의 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 폴리펩티드 사슬의 비-중첩 아미노산서열을 포함하는 펩티드 세그먼트들을 화학적으로 라이게이션하는 단계, 및 1개 이상의 화학적 라이게이션 부위에 있는 아미노산의 측쇄에 1개 이상의 수용성 중합체를 부착하는 단계를 포함한다. 다음에, 중합체-변형 폴리펩티드 사슬을 접어서, 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 생산할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 합성 생물활성 단백질의 폴리펩티드 사슬의 비-중첩 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 세그먼트들을 화학적으로 라이게이션하여 합성 생물활성 단백질에 해당하는 전길이 폴리펩티드 사슬을 형성하며, 여기에서 적어도 1개의 펩티드 세그먼트는 제 1 화학선택성 작용기를 갖는 변칙 아미노산을 포함하는 단계, (2) 폴리펩티드 사슬을 접는 단계, 및 (3) 그것에 폴리펩티드 사슬에 제 1 화학선택성 기와 유일하게 상호 반응하는 제 2 화학선택성 기를 포함하는 수용성 중합체를 부착하는 단계를 포함하는, 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 포함되고, 실시예에 예시된 이들 다양한 프로세스는, 도면에 나타낸 바와 같이 설명될 수 있다. 예를 들어, 도 1A-1E는 라이게이션 전 또는 후에 부분적으로 또는 완전히 보호되지 않은 펩티드 세그먼트들에 수용성 중합체(본원에 정의된 U-B-Polymer-J*)의 부착을 포함하는 라이게이션 계획, 또는 그것들의 조합을 묘사한다. 도 1A 내지 1D에서, Yaa는 Yaa와 화학선택성 화학적 라이게이션할 수 있는 유일한 상호 반응성 N-말단 아미노산 Xaa(예를 들어, 아미노 말단 시스테인) 부분을 지니는 제 2 펩티드 세그먼트와의 화학적 라이게이션을 위한 유일한 화학선택성 부분(예를 들어, 알파-카르복실 티오에스테르를 지닌아미노산)을 지니는 제 1 펩티드 세그먼트 상의 C-말단 아미노산을 표시한다. Yaa와 Xaa 사이의 화학선택성 반응은 그 사이에 공유 결합을 생성한다(예를 들어, 아미노 결합). 따라서, Yaa 및 Xaa는 화학선택성 라이게이션 쌍을 형성한다. 도면에 나타낸 Un-은 아미노산 측쇄 상의 정확한 사용자-규정된 부위에 결합된 제 2의 유일한 화학선택성 부분을 표시하며, 수용성 중합체 U-B-Polymer-J*의 U- 기에 대해 화학선택성이고 상호 반응성이다. 예를 들어, Un이 케톤기를 지니도록 변형된 측쇄일 때, 수용성 중합체 U-Polymer-J*의 U-는 케톤과의 반응을 위한 화학선택성 기, 예를 들어 그 사이에서 옥심 결합을 생성하는 아미노옥시기이다. Un-의 하첨자 "u"는 화학선택성 기 U를 지니도록 디자인된 아미노산 및 그것의 측쇄의 수를 표시하며, 예를 들어 2개의 특이적인 사용자-규정된 부위가 중합체 변형되는 경우 n=2이며, 이것은 또한 U2또는 Un=2로 표시될 수 있다. 모든 경우에서 n은 디자인에 의해 정확하게 제어되는 양의 정수이다. 따라서, Un및 U는 Xaa 및 Yaa의 화학선택성 기와 양립할 수 있으며 비반응성인 제 2의 화학선택성 라이게이션 쌍을 표시한다. 도 1A 및 1B는 2가지의 상이한 가능한 반응을 예시한다. 처음에 묘사된 반응에서는, Un작용기를 지닌 폴리펩티드 사슬이 제 2 폴리펩티드와 라이게이션된 후, U-B-Polymer-J* 부분과 반응되어 중합체-변형 폴리펩티드를 얻는다. 두번째 묘사된 반응에서는, Un작용기를 지닌 폴리펩티드 사슬이 U-B-Polymer-J*와 반응되어 중합체-변형 폴리펩티드를 얻은 후, 제 2 폴리펩티드와 라이게이션되어 더 큰 중합체-변형폴리펩티드를 얻는다. 이 도면들은, 도 1A에서는 Xaa 잔기를 지닌 폴리펩티드가 중합체 변형을 수용하는 반면, 도 1B에서는 Yaa 잔기를 지닌 폴리펩티드가 중합체 변형을 수용한다는 점에서 다르다. 도 1C는 다수 폴리펩티드 사슬을 그것들의 라이게이션 전 또는 후에 변형시켜서 더 큰 폴리펩티드를 형성하는 본 발명의 능력을 예시한다. 도 1D에서,PG및PG'는 보호기를 표시하며, 여기에서PG'는 직교하는 보호기를 나타내는데, 즉PG및PG'는 상이한 조건하에서 제거할 수 있으며, 상이한 수용성 중합체가 동일한 화학에 의해 Un기들에 부착되는 경우, 또는 Un기가 중합체로 변형시키고 싶지 않은 측쇄 작용기(예를 들어, 반응성 -NH2또는 -SH를 지닌 측쇄, 이 경우 수용성 중합체의 U 기는 1차 아미노 또는 측쇄 티올에 배타적으로 반응하도록 디자인된다)를 표시하는 경우에 유용하다. 도 1D는 보호기가 본 발명의 방법에 따라서 라이게이션되는 폴리펩티드의 원하는 측쇄를 보호하기 위해서 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
도 1E는 도 1A 내지 1D에 따르는 라이게이션 및 중합체 변형에 사용된 펩티드 세그먼트에 존재할 수도 또는 부재할 수도 있는 기들의 다양성을 예시한다.
도 2A 내지 2C는 본 발명의 합성 생물활성 단백질을 제조하기 위한 프로세스의 추가 계획을 묘사한다. 구체적으로, 도 2A 내지 2B는 라이게이션 부위에 있는 아미노 말단기 Xaa의 측쇄(예를 들어, 시스테인의 측쇄 티올)에 수용성 중합체 U-B-Polymer-J*의 부착을 포함하는 라이게이션 계획을 묘사한다. 도 2C는 도 2A 내지 2B에 따르는 라이게이션 및 중합체 변형에 사용된 펩티드 세그먼트에 존재할 수도 또는 부재할 수도 있는 기들의 다양성을 예시한다.
도 3A 내지 3B는 3개 이상의 비-중첩 펩티드 세그먼트의 화학적 라이게이션을 포함하는 멀티-세그먼트 라이게이션을 달성하기 위한 프로세스의 추가 계획을 묘사하는데, 즉 적어도 1개 세그먼트는 최종 전길이 라이게이션 생성물에 해당하는 중간 세그먼트이다. 이 방식으로 제조된 펩티드는, 예를 들어 도 1A 내지 1E, 도 2A 내지 2C, 및 도 4A 내지 4C에 나타낸 다른 라이게이션 반응에 포함된 펩티드 세그먼트들을 제조하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 멀티-세그먼트 라이게이션에 대해서, 중간 세그먼트(들)은 사용된 라이게이션 화학에 따라서 그 펩티드의 고리화 또는 연쇄체 형성을 피하기 위해 보호된 Xaa 기 또는 보호된 Yaa 기를 가진다. 연속 또는 일련의 라이게이션에 대해서, 중간 세그먼트의 Xaa 기는 보호되는(예를 들어, Cys(Acm)) 반면, Yaa 기는 보호되지 않는다(예를 들어, Yaa-COSR, 여기에서 -COSR은 알파-카르복실 티오에스테르이다). 여기서, Yaa 기는 보호되지 않은 Xaa 기를 지닌 제 2 펩티드와 반응하는 것이 자유로우며, 이 경우 제 2 펩티드는 자유로운 Yaa 기가 없는 상태이다. 라이게이션 후, 보호기가 제거되어 다음 라이게이션 반응을 위해 Xaa 기를 재생성한다. 이 프로세스는 필요에 따라 계속될 수 있으며, 이로써 연장된 폴리펩티드 사슬을 생성한다. Yaa 기의 보호는 4개 이상의 세그먼트로 이루어진 최종 라이게이션 생성물의 생성을 포함하는 수렴 화학적 라이게이션에 특히 유용하다. 예를 들어, 4-세그먼트 라이게이션(즉, 3회 라이게이션 반응)으로부터 생성된 단백질 표적에 대해서, 단백질의 한 단부에 해당하는 2개 세그먼트 및 단백질의 나머지 단부에 해당하는 2개 세그먼트는 연속 라이게이션에 대립하는 것으로서 병행하여 라이게이션될 수 있고, 이 두 단부는 최종 라이게이션 생성물에서 연결된다. 또한, 그러한 수렴 화학적 라이게이션 계획은 직교 라이게이션 화학을 사용할 수 있다. 여기서 다시, 그러한 펩티드 세그먼트에 존재할 수도 또는 부재할 수도 있는 기들의 다양성이 도 1E, 2C 및 4C에 예시된다.
도 4A 내지 4C는 결과의 측쇄 티올의 자생 화학적 라이게이션 및 화학적 변형이 어떻게 본 발명의 원리에 따라서 달성될 수 있는지를 예시한다. 구체적으로, 도 4A 내지 4B는 티오알킬화에 의해 "위아미노산"(ψXaa로 표시)을 형성하기 위한 라이게이션 부위(들)에 있는 결과의 시스테인 측쇄 티올의 자생 화학적 라이게이션 및 화학적 변형, 및 티오에테르 결합을 포함하는 화학적으로 변형된 측쇄(ψ로 표시)의 생성을 묘사한다. 나타내지 않은 다른 구체예에서 측쇄 티올은 탈황 반응에서 알라닌으로 전환될 수 있다(Liang 등, J. Amer. Chem. Soc. (2001) 123(4):526-533). 두 반응의 중요한 측면은, 전환 또는 변형하고 싶지 않은 어떤 다른 측쇄 티올이 적합한 보호기(PG)로 보호된다는 점, 또는 멀티-세그먼트 라이게이션을 위해서는 직교하는 보호기(PG')로 보호되며, 이 경우에는 카르복시 말단 Yaa 기를 지닌 세그먼트가 도 4B에 예시된 방식에 의해 제공된 보호된 아미노 말단 Xaa 기, 즉PG-Xaa-펩티드를 포함한다는 점이다. 도 4C는 도 4A 내지 4B 뿐만 아니라, 도 1A 내지 도 1E, 도 2A 내지 2C, 및 도 3A 내지 3B에 따르는 라이게이션 및 중합체 변형에 사용된 펩티드 세그먼트에 존재할 수도 또는 부재할 수도 있는 기들의 다양성을 예시한다.
본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 디자인하는데 대해서, 표적단백질에 대한 초기 폴리펩티드 백본 아미노산 서열은, 전형적으로 유전자 및/또는 단백질 데이타베이스와 같은 데이타베이스를 포함하는 많은 다양한 공급원으로부터 얻어지거나, 또는 예를 들어 관심의 신규 단백질 표적의 프로테오믹 확인을 통해 새로 얻어진다. 상기 주지된 바와 같이, 그러한 데이타베이스의 예는 GeneBank (Benson 등, Necleic Acids Res (1998) 26(1):1-7; 미국 생물기술정보 국립센터, 국립의학도서관, 국립보건학회, 메릴랜드 베데스다, 미국), TIGR 데이타베이스(게놈연구학회, 메릴랜드 록크빌, 미국), 단백질 데이타뱅크(브룩하벤 국립연구소, 미국), 및 ExPASy 및 스위스-단백질 데이타베이스(스위스 생물정보학회, 스위스 제네바)를 포함하지만 제한은 없다. 또한, 공개적으로 이용할 수 있는 특허 데이타베이스가 이 목적에 사용될 수 있다. 디자인에 사용된 폴리펩티드 백본은 표적 서열의 일부(예를 들어, 도메인) 또는 전부(예를 들어, 성숙한 형태의 폴리펩티드 사슬)를 대표할 수 있다.
초기 폴리펩티드 백본 서열과 함께, 원하는 전길이 중합체-변형 폴리펩티드 구조가 주어진 표적 합성 단백질 또는 그것의 유사체의 패널에 대해 디자인된다. 이것은 폴리펩티드 백본의 디자인, 수용성 중합체(들)의 구조, 및 관심의 주어진 합성 단백질 구성물에 대한 라이게이션 및 수용성 중합체 부착 전략을 포함한다. 특히, 디자인의 기초가 되는 폴리펩티드 아미노산 서열은 1개 이상의 당화 부위, 1개 이상의 면역원성 부위, 또는 1개 이상의 프로테아제 민감성 부위에 대해 검토된다(즉, 헬릭스 또는 베타-시트 2차 구조가 실질적으로 없는 영역; 전형적으로 루프 및 턴 영역). 응집 부위 및 글리코사미노글리칸(GAG) 결합 부위를 포함하는 다른부위도 수집될 수 있으며, 이 중 후자는 모든 케모카인에 공통적이다. 더욱이, 많은 단백질의 3차원 구조가 알려져 있으며, 디자인을 돕기 위해 사용될 수 있다.
당화 부위는 N-연결 및 O-연결 당화 부위를 포함하며, 이것들은 전형적으로 루프 및 턴에서 발견된 혼란된 영역에서 생긴다. 면역원성 부위는 턴에 있는 친수성 부위로, 단백질의 표면에 있다. 관심의 프로테아제 민감성 부위는 프로테아제에 의해 인식되는 아미노산 서열을 포함하며, 단백질의 표면, 전형적으로 혼란된 영역에 있다. 많은 단백질의 응집 및 GAG 부위, 그리고 그것들의 확인 방법이, 특히 케모카인에 대해 잘 공지되어 있다(예를 들어, "사이토카인 핸드북", 3판, 편저 A. Thomas, 어소시에이티드 프레스, 1998; "사이토카인", 편저 A. Mire-Sluis & R. Thorpe, 아카데믹 프레스, 1998; 및 "사이토카인 레퍼런스", 1권, 리간드, 사이토카인 개론 및 숙주 방어의 다른 매개인자, 편저 J. J. Oppendheim 및 M. Feldmann, 아카데믹 프레스, 2001 참조).
예를 들어, 주어진 단백질 표적의 면역원성 또는 프로테아제 안정성은, 면역원성 에피토프 또는 프로테아제 인식 서열에 1개 이상의 중합체를 부위-특이적 부착함에 의해 감소 또는 제거될 수 있으며, 이로써 본 발명의 프로테아제 내성 또는 비-면역원성 수용성 중합체-변형 생물활성 단백질이 생성된다. 중합체가 부착될 수 있는 다른 부위는 주어진 단백질 표적의 아미노 및/또는 카르복시 말단을 포함한다.
천연적인 것 뿐만 아니라, 당화 부위를 함유하도록 조작된 부위를 포함해서, 당화 부위는 수용성 중합체의 부착에 특히 바람직한 부위이다. 이것은 수용성 중합체로 그러한 부위들 중 1개 이상에서 배타적으로 변형되어, 그 위치에 있는 천연 발생 당단백질의 탄수화물 측쇄 중 1개 이상의 긍정적인 생물학적 효과를 대체 및 의태할 수 있는, 합성 생물활성 단백질이 생산될 수 있다는 본 발명의 발견을 기초로 한다.
그러한 수용성 중합체 부착 부위는 모델링에 의해, 및/또는 생물학적 또는 화학적 분석 접근법을 사용하여 측정될 수 있다. 모델링은 표적 단백질의 주어진 핵산 또는 아미노산 서열의 부분들(최고 전부까지), 관심의 폴리펩티드에 대한 2차원 구조 정보, 및 관심의 단백질에 대한 3차원 구조 정보를 비교하거나, 또는 그것들을 조합하여 비교하는, 상동성 모델링 소프트웨어 알고리듬 또는 프로그램의 사용과 같은, 생물정보적 접근법을 포함한다. 많은 소프트웨어 프로그램 및 데이타베이스가 잘 공지되어 있으며, 이 목적에 이용할 수 있다(예를 들어, GeneBank(Be-nson 등, Necleic Acids Res (1998) 26(1):1-7; 미국 생물기술정보 국립센터, 국립의학도서관, 국립보건학회, 메릴랜드 베데스다, 미국), TIGR 데이타베이스(게놈연구학회, 메릴랜드 록크빌, 미국), 단백질 데이타뱅크(브룩하벤 국립연구소, 미국), 및 ExPASy 및 스위스-단백질 데이타베이스(스위스 생물정보학회, 스위스 제네바) 참조). 이들 방법을 통합한 소프트웨어 프로그램의 예가 "MAXVECTOR"(옥스포드 몰리큘라 그룹)이며, 이것은 2차 구조(Chou-Fasman 및 Robson-Garnier 법); 소수성 (FaucherePliska, Janin, Manavalan, Sweet-Eisenberg 법); 친수성(Hopp-Woods, Kyte-Doolittle, Goldman-Engelman-Steitz(GES), 및 von-Heijne 법); 항원성(Hopp-Woods, Parker, Protrusion Index(Thornton), Welling 법); 표면 확률(Karplus &Schultz's 법); 유연성(Janin 및 Emini 법); 양쪽성(Eisenberg 법); PROSITE 기초 하위서열 데이타베이스 및 사용자-규정 하위서열; 주문된 하위서열 세트; 및 프로테아제 부위 및 단백질 가수분해 절단을 예측하기 위한 많은 단백질 분석툴을 함유한다.
예를 들어, 1개 이상의 당화 부위의 존재에 대해 단백질 표적을 스캐닝하는 때, 자생 아미노산 서열의 일부 또는 전부는, 전형적으로 N-연결 당화 부위(이것은 전형적으로 루프 또는 턴 내의 Asn-Xaa-Thr 또는 Asn-Xaa-Ser 서열에서 생긴다) 및 O-연결 부위(이것은 전형적으로 루프 또는 턴 내의 Ser-Xaa-Xaa-Pro 또는 Thr-Xaa-Xaa-Pro 서열에서 생긴다)에 대해 검토된다. 다양한 알고리듬 및 모델링 프로그램이 이 목적에 적합하다(예를 들어, ExPASy 및 스위스-단백질 데이타베이스(스위스 생물정보학회, 스위스 제네바); Gupta 등, Glycobiology (1999) 9(10);1009-1022; "DICTYOGLYC", Hansen 등, Biochemical Journal (1995) 308:801-813; "O-GLYCBASE" Hansen 등, Nucleic Acids Research (1997) 25:278-282; "NETOGLYX", Hansen 등, Glycoconjugate J. (1998) 15:115-130 참조).
단백질에 있는 면역원성 부위를 예측하기 위해서 다음의 접근법이 사용될 수 있다. 2차 구조 예측이 단백질 서열 상에서 작업된다. Chou-Fasman 파라미터가 이 목적에 특히 유용하다(Chou 등, 고등 효소학 (1978) 47:45-418; Maclin 등, "지식-기반 신경망을 사용한 알고리듬 개량: 단백질 접힘에 대한 Chou-Fasman 알고리듬의 개선", 연구 논문 91-2, 위스콘신 메디슨 대학 컴퓨터과학부, 1991; 및 Qian 등, J. Molecular Biology (1988) 202:865-884; Genetics Computer Group, Inc.의"PEPEPLOT" 프로그램). 혼란된 영역, 특히 턴이 확인된다. 또한, 단백질 서열은, 전형적으로 표준 방법(예를 들어, Fauchere-Pliska 또는 Hopp-Woods 소수성 예측법 또는 Bull-Breese)에 따라서 6개 잔기의 작업 평균을 사용하여 소수성에 대해 스캔되며, 더욱 친수성인 영역은 턴 영역들에 특별히 주의하여 확인된다. 이와 함께, N-연결 부위 및 O-연결 부위를 포함하는 당화 부위가 확인된다. 단백질에서 가장 친수성인 부분은, 만일 그것이 턴 내에 있고 당화될 것으로 예측되지 않는다면, 그것은 면역원성일 확률이 높으며, 따라서 중합체 변형을 위한 부위로서 사용될 것이다. 동일한 기본 규칙이 중합체 변형을 위한 2차 부위를 확인하기 위해서 연속적으로 덜 친수성인 영역에 적용될 수 있다.
또한, 생물학적 및 화학적 분석이 본 발명의 합성 생물활성 단백질을 생성하는데 있어 중합체 부착에 대한 특이적 부위를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 합성 생물활성 단백질의 디자인 및 합성의 기초로 사용되는 분리된 당단백질은 효소 절단되고, 예를 들어 HPLC 펩티드 지도화 및 질량분광법에 의해 분석되어, O- 및 N-연결 당화의 부위가 실험적으로 확인될 수 있다. 면역원성 부위, 또는 프로테아제 민감성 부위를 확인하기 위해서, 그러한 영역들을 함유하는 단백질 분자 표면의 더욱 고도로 혼란된 '루프' 영역이 다수의 생물학적 또는 화학적 방식으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 합성 생물활성 단백질의 디자인 및 합성의 기초로 사용되는 분리된 단백질은 여러 가지 프로테아제로 제한된 단백질 가수분해 절단된 후, 이어서 결과의 펩티드 단편이 질량분광 분석되어, 표준 방법에 따라서 프로테아제에 대해 가장 감수성인 부위가 지도화될 수 있다(예를 들어, Coligen J. E., Dunn B. M., Ploegn H. L., Speicher D. W., Wingfield P. T. 편저, 단백질 구조에서의 현행 프로토콜, II권, 뉴욕: John Wiley & Sons, 1997; Chait B. T., 구조 (1994) 2:465-467; Kriwacki 등, J. Chromatogr. A. (1997) 777 :23-30; Hillenkamp 등, Anal Chem (1991) 63:A1193-1201; Fenn 등, Mass. Spectr. Rev. (1990) 9:37-70; 및 Siuzdak G. 생물기술을 위한 질량분광법. 샌디에고: 아카데믹 프레스, 1996 참조). 그리고, 그러한 목적에 통상 사용되는 많은 프로테아제가 있다(Konigsberg W. H., 효소학 방법 (1995) 262:331-346; Carry E. A., Creig-hton T. 편저, 단백질 구조, 실용 접근법. 뉴욕: IRL 프레스 (1989) pp:117-144; 및 Coligan J. E, Dunn B. M, Ploegh H. L., Speicher D. W., Wingfield P. T. 편저, 단백질 구조에서의 현행 프로토콜, II권, 뉴욕: John Wiley & Sons, 1997). 접힌 단백질의 폴리펩티드 사슬의 표면 루프 영역은 보통 단백질 가수분해 절단에 대한 감수성 증가에 관련된다. 또한, 제한된 '무작위' 화학적 변형과, 그 후의 절단 및 질량분광법에 의한 펩티드 지도화를 사용하는 유사한 접근법이 미지의 3차원 구조의 단백질의 노출된 표면 영역을 확인하는데 사용될 수 있다.
면역원성 부위, 프로테아제 민감성 부위 또는 중합체 변형에 적합한 다른 부위를 확인하기 위해서, 알라닌 스캐닝이 또한 수용성 중합체 부착 부위일 수 있는 폴리펩티드 백본의 특이적 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 이것은 생물학적 활성에 필요한 비-변형 잔기를 확인하는데, 그리고 수용성 중합체 부착 부위가 표적 분자의 면역원성 또는 프로테아제 민감성 부위에 위치할 때 특히 유용하다. 알라닌 스캐닝은 상술된 것과 같은 다른 단백질 분석툴과 함께 사용되었을 때 특히유용하다. 다른 접근법은, 각 분자의 폴리펩티드 사슬에서 상이한 부위에 위치되도록 수용성 중합체 부분을 변형시키면서, 관심의 합성 단백질의 라이브러리를 계통적으로 제조하는 것이다. 중합체-변형 폴리펩티드 사슬의 라이브러리를 접은 후, 예를 들어 접힌 분자와 접히지 않은 분자, 또는 수용체-결합 분자와 수용체-비결합 분자를 분리하기 위해서 기능적 선택/분석이 수행될 수 있다. 다음에, 중합체 변형 부위의 위치가 기능 분자에 대해 측정될 수 있다. 그러한 접근법은 '단백질 서명 분석' 방법의 원리의 사용이 중합체 변형의 비-방해 부위의 확인을 용이하게 하도록 만들 수 있다(Muir 등, Chemistry & Biology (1996) 3:817-825).
디자인과 함께, 폴리펩티드 백본을 합성하는데 이용된 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트들이 구성된다. 이것은 다양한 폴리펩티드 백본 세그먼트들을 회합시키기 위해 선택된 라이게이션 화학, 주어진 표적 단백질에 대해 선택된 중합체 부착 화학, 및 특정한 중합체 부착 부위를 기초로 하여 선택되는 적합한 라이게이션 부위의 선택을 포함한다. 자생 화학적 라이게이션이 사용될 때, 시스테인 라이게이션 부위는 적합한 천연 발생 시스테인 잔기에 대해 표적 폴리펩티드 백본 아미노산 서열을 스캐닝함으로써 결정된다. 본원에 설명된 "확장된 자생 화학적 라이게이션"이 사용될 때, 라이게이션 부위는Xaa-Gly 부위와 같은 확실한 라이게이션을 허락하는 적합한 천연 발생 라이게이션 부위 접합부에 대해 표적 폴리펩티드 백본 아미노산 서열을 스캐닝함으로써 선택될 수 있다. 확장된 자생 화학적 라이게이션이 시스테인 잔기에서의 라이게이션으로 제한되지 않기 때문에, 많은 잔기가 라이게이션 부위 접합부로서 사용될 수 있다. 어떤 경우에, 자생 및 확장된 자생 화학적 라이게이션의 조합이 디자인의 일부일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 전길이 폴리펩티드 사슬의 일부 또는 전부를 생성하기 위해서 자생 화학적 라이게이션이 사용된다. 합성 생물활성 단백질이 기초하는 천연 발생 단백질에 존재하는 시스테인이 화학적 라이게이션 부위로 사용될 수 있다. 그러나, 바람직한 라이게이션 접합부가 적합한 시스테인을 갖지 않은 경우, 그 위치에 있는 비-시스테인 아미노산이 시스테인으로 대체되어, 그 위치에서의 자생 화학적 라이게이션이 허락될 수 있다. 원한다면, 본원에 설명된 대로, 새로 도입된 시스테인이 그 위치에 있는 원래 아미노산에 상응하는 위아미노산 잔기로 전환된 수 있다. 또는 달리, 시스테인이 중합체 변형을 위한 부위에 도입될 때는, 측쇄 티올이 티올-반응성 수용성 중합체 구성물의 부착을 위해 활용될 수 있으며, 단 표적 폴리펩티드에 있는 변형하고 싶지 않은 모든 다른 시스테인은 보호된다.
다른 바람직한 구체예에서, 본원에 설명된 확장된 자생 화학적 라이게이션이 전길이 폴리펩티드의 일부 또는 전부를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 이 방법을 위해서, N-말단 Nα-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산이 사용될 수 있다. 그러한 잔기(라이게이션을 위해 사용된 펩티드 또는 폴리펩티드의 N-말단에 존재하는 경우)는, 본원에 설명된 확장된 자생 화학적 라이게이션 방법에 따라서, 그 폴리펩티드와 C-말단 α-카르복시 티오에스테르 부분을 갖는 폴리펩티드를 라이게이션하는데 유리하게 사용될 수 있다.
전형적으로, 펩티드 합성은, 표준 자동화 펩티드 합성기를 사용하는 단계적 표준 Boc 및/또는 Fmoc 고체상 펩티드 합성을 사용하거나, 또는 표준 프로토콜에따라 수동으로 합성되거나, 또는 상업적 판매자로부터 주문 및 구입된다("합성 펩티드, 사용자 가이드", G. A. Grant, 편저, W. H. Freeman & Company, 뉴욕, 1992; "펩티드 합성 원리, 2판", M. Bodanszky, 편저, Springer-Verlag, 1993; "펩티드 합성 연습, 2판", M. Bodanszky 및 A. Bodanszky, 편저, Springer-Verlag, 1994; 및 "보호기", P. J. Kocienski, 편저, Georg Thieme Verlag, 독일 스투트가르트, 1994; "Fmoc 고체상 펩티드 합성, 실용 접근법", 편저 W. C. Chan 및 P. D. White, 옥스포드 대학 출판부 2000). 자생 화학적 라이게이션에서와 같이, 티오에스테르-매개 라이게이션에 이용된 펩티드에 대해서, 그것들은 또한 표준 프로토콜에 따라서 만들어질 수 있다(예를 들어, Dawson 등, Sciecne (1994) 266:776-779; Canne 등, Tetrahedron Lett. (1995) 36:1217-1220; Kent 등, WO 96/34878; Kent 등, WO 98/28434; Ingenito 등, JACS (1999) 121(49):11369-11374; 및 Hackeng 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96:10068-10073); Amiato 등, 상동 참조).
수용성 중합체의 라이게이션 및 부위-특이적 부착에 대해서, 원치 않는 부착을 가져오는 부반응을 피하기 위해서 화학적 직교 접근법이 펩티드 합성에 사용된다(예를 들어, 도 1 내지 4, 및 실시예 참조). 예를 들어, 라이게이션 디자인 및 중합체 부착 접근법에 따라서, 여러 가지의 직교 합성 전략이 활용될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어 본 발명의 바람직한 당-의태성 중합체에 대해 하기 논의된 바와 같이, 부착될 수용성 중합체의 성질, 특히 그것을 폴리펩티드에 연결하기 위한 작용기가 고려된다.
구체적으로, 수용성 중합체는 라이게이션에 사용된 표적 펩티드, 전길이 물질 또는 심지어 접힌 폴리펩티드 상의 유일한 작용기와 선택적으로 반응하는 유일한 작용기 U를 포함하도록 만들어진다. 화학적 합성이 사용될 때, 펩티드는 정확한 사용자-규정된 부위에 상호 반응성인 화학선택성 기를 함유하도록 만들어진다. 본 발명의 이런 측면은 펩티드 합성(보호기 전략) 및 화학적 라이게이션(부분적 보호기 또는 비보호기 전략)의 원리를 포함한다. 보호기 전략에 대해서, 수용성 중합체 상의 원하는 작용기를 제외한 모든 잠재적 반응성 작용기 및 표적 분자 상에 존재하는 그것의 상호 반응성 작용기가 적합한 보호기로 차단된다. 많은 보호기가 공지되어 있으며, 이 목적에 적합하다(예를 들어, "유기 합성에서의 보호기", 3판, T. W. Greene 및 P. G. M. Wuts, 편저, John Wiley & Sons, Inc., 1999; 노바바이오켐 카탈로그 2000; "합성 펩티드, 사용자 가이드", G. A. Grant, 편저, W. H. Freeman & Company, 뉴욕, 1992; "어드밴스드 캠테크 조합 & 고체상 유기 화학 핸드북", W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, 및 H. H. Saneii, 편저, 어드밴스드 캠테크, 1998; "펩티드 합성 원리, 2판", M. Bodanszky, 편저, Springer-Verlag, 1993; "펩티드 합성 연습, 2판", M. Bodanszky 및 A. Bodanszky, 편저, Springer-Verlag, 1994; 및 "보호기", P. J. Kocienski, 편저, Georg Thieme Verlag, 독일 스투트가르트, 1994 참조).
따라서, 수용성 중합체는 상술된 것들과 같은 광범위한 작용기를 가지도록 만들어진다고 말할 수 있다. 부분적 보호기 또는 비보호기 전략에 대해서, 중합체 상의 작용기 및 표적 펩티드 또는 폴리펩티드 상에 존재하는 그것의 상호 반응성 작용기가 화학선택성 반응쌍으로 사용되며, 여기에서 이 반응 시스템에는 비반응성인 다른 작용기도 존재할 수 있다. 이것은 아민 포착 전략(예를 들어, 헤미아미날 형성, 이민 형성, 및 미카엘 부가에 의한 라이게이션), 티올 포착 전략(예를 들어, 메르캅티드 형성, 2황화물 교환에 의한 라이게이션), 자생 화학적 라이게이션 전략(예를 들어, 시스테인 또는 티올 함유 측쇄 아미노산 유도체를 포함하는 티오에스테르 교환에 의한 라이게이션), 및 직교 라이게이션 커플링 전략(예를 들어, 티아졸리딘 형성, 티오에스테르 교환, 티오에스테르 형성, 2황화물 교환, 및 아미드 형성에 의한 라이게이션)에 따르는 기들을 포함한다(예를 들어, Coltart D. M., Tetrahedron (2000) 56:3449-3491).
이 구체예에 바람직한 화학선택성 U 기는, 자생 화학적 라이게이션(Dawson 등, Science (1994) 266:776-779; Kent 등, WO 96/34878), 확장된 일반적 화학적 라이게이션(Kent 등, WO 98/28434), 옥심 형성 화학적 라이게이션(Rose 등, J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116:30-33), 티오에스테르 형성 라이게이션(Schnolzer 등, Science (1992) 256:221-225), 티오에테르 형성 라이게이션(Englebretsen 등, Tet. Letts. (1995) 36(48):8871-8874), 히드라존 형성 라이게이션(Gaertner 등 Bioconj. Chem. (1994) 5(4):333-338), 및 티아졸리딘 형성 라이게이션 및 옥사졸리딘 형성 라이게이션(Zhang, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95(16):9184-9189; Tam 등, WO 95/00846)과 같은, 또는 다른 방법(Yan, L. Z. 및 Dawson, P. E., "탈황 반응과 조합된 자생 화학적 라이게이션에 의한 시스테인 잔기를 사용하지 않는 펩티드 및 단백질의 합성", J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526-533, 본원에 참고자료로 수록됨; Gieselnan 등, Org. Lett. 2001 3(9):1331-1334; Saxon, E.등, 아미드 결합의 화학선택성 합성을 위한 "무추적자" 스타우딘저 라이게이션. Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143)에 의한, 수양립성 라이게이션 화학에 사용되는 유일한 작용기의 잔기를 포함할 것이다.
상술된 다양한 부착 화학이 주어진다면, 수용성 중합체와 표적 펩티드 또는 폴리펩티드 사이에 형성된 결합은 카르보네이트, 에스테르, 우레탄, 오르토에스테르, 아미드, 아민, 옥심, 이미드, 유레아, 티오유레아, 티오에테르, 티오우레탄, 티오에스테르, 에테르, 티아졸리딘, 히드라존, 옥사졸리딘 등으로부터 선택된 결합의 잔기를 포함할 수 있다. 가장 바람직한 결합은 옥심 및 아미드 결합이다.
예를 들어, 도 1 내지 4에 나타낸 바와 같은, 펩티드 라이게이션 단계는 고체 또는 용액상 라이게이션 전략을 사용할 수 있다. 도 8은 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질의 라이게이션 및 생산에 사용할 수 있는 펩티드 세그먼트에 수용성 중합체를 정확히 부착하는 다른 경로를 묘사한다. 제 1 단계는 고체상 펩티드 합성("SPPS")(예를 들어, Fmoc 또는 Boc SPPS)을 사용하며, 여기에서 중합체 부착에 대해 표적화된 아미노산 측쇄가 직교하는 보호기로 보호된다(예를 들어, Fmoc SPPS를 사용한다면 Boc 기가 중합체 부착 부위를 보호하기 위해 사용될 수 있고, 또는 Boc SPPS를 사용한다면 Fmoc 기가 직교하는 보호기로서 사용될 수 있다). 펩티드 합성 후, 직교하는 보호기는 나머지 펩티드가 보호된 채로 있는 동안 선택적으로 제거된다. 이것은 다음 단계 - 고체상 중합체 합성을 위한 단일 부착 부위를 제공한다. 일단 직교 보호기가 제거되면, 중합체 사슬이 선구물질로서 부착된다. 더 바람직하게는, 중합체 사슬이 도 6A 내지 6D에 묘사된 프로세스를 사용한중합체 합성의 연속 라운드를 통해 구성된다. 단일 중합체 부착 부위를 나타내지만, 1개 이상이 제공될 수도 있다.
상기 주지된 바와 같이, 화학적 라이게이션은 제 1 화학 성분과 제 2 화학 성분 사이의 선택적 공유 결합의 형성을 포함한다. 제 1 및 제 2 성분 상에 존재하는 유일한 상호 반응성인 작용기는 라이게이션 반응을 화학선택성으로 만들기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드와 폴리펩티드의 화학적 라이게이션은 양립 가능한 유일한 상호 반응성 C-말단 및 N-말단 아미노산 잔기를 지니는 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트들의 화학선택성 반응을 포함한다. 몇가지 상이한 화학이 이 목적에 이용되었는데, 이것의 예는 자생 화학적 라이게이션(Dawson 등, Science (1994) 266:776-779; Kent 등, WO 96/34878; Kent 등, WO 98/28434), 옥심 형성 화학적 라이게이션(Rose 등, J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116:30-33), 티오에스테르 형성 라이게이션(Schnolzer 등, Science (1992) 256:221-225), 티오에테르 형성 라이게이션 (Englebretsen 등, Tet. Letts. (1995) 36(48):8871-8874), 히드라존 형성 라이게이션(Gaertner 등 Bioconj. Chem. (1994) 5(4):333-338), 및 티아졸리딘 형성 라이게이션 및 옥사졸리딘 형성 라이게이션(Zhang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95(16):9184-9189; Tam 등, WO 95/00846; 미국 특허 번호 5,589,356); Gieselman 등, 셀레노시스테인-매개 자생 화학적 라이게이션(Org Lett (2001) 3(9):1331-1334); 및 스타우딘저 아미드 형성 화학적 라이게이션(Saxon 등, Org Lett (2000) 2:2141-2143)을 포함한다. 따라서, 인정되는 바와 같이, 그러한 목적을 위한 어떤 화학선택성 반응 화학이 보호되지 않은 펩티드 세그먼트들의 라이게이션에 적용될 수 있다.
주어진 라이게이션 화학의 반응 조건은 라이게이션에 사용된 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트들의 원하는 상호작용을 유지하도록 선택된다. 예를 들어, pH와 온도, 라이게이션 표지의 수용해성, 제 1 세그먼트 대 제 2 세그먼트의 비, 물함량, 및 반응 혼합물의 조성이 라이게이션의 최적화를 위해 변화될 수 있다. 더 나아가서, 상이한 정도로 라이게이션 세그먼트들을 용해시키는 시약의 첨가 또는 배제가, 원하는 라이게이션 반응의 특이성 및 속도를 제어하기 위해, 즉 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트들의 용해성을 조종함으로써 반응성 기의 노출 및 표출을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 반응 조건은 1개 이상의 내부 및/또는 외부 대조표준과 비교하여 원하는 화학선택성 반응 생성물을 분석함으로써 쉽게 결정된다.
라이게이션이 N-말단 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드의 연결을 포함하는 경우, 바람직하게 자생 화학적 라이게이션 과정이 사용된다(Kent 등, WO 96/34878; Kent 등, WO 98/28434; Dawson 등, Science (1994) 266:776-779). 이 방법은 라이게이션 부위에서 자생 아미드 결합을 생성하는 확실한 방법으로 판명되었다. 자생 화학적 라이게이션은 C-말단 α-카르복시티오에스테르 부분을 갖는 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트와 N-말단 시스테인 잔기를 갖는 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드 사이의 화학선택성 반응을 포함한다. 티올 교환 반응이 초기 티오에스테르-연결 중간체를 제공하며, 이것은 자발적으로 재배열되어 라이게이션 부위에 자생 아미드 결합을 제공함과 동시에 시스테인 측쇄 티올을 다시 생성한다. 많은 예에서, 천연 단백질의 서열은, N-말단 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드 단편이 합성되어 자생 화학적 라이게이션 반응에 사용될 수 있도록 적합하게 위치된 시스테인 잔기를 포함할 것이다. 다른 예에서, 펩티드 합성은 이런 목적으로 폴리펩티드에 시스테인 잔기를 도입하기 위해 수행될 수 있다. 따라서, 그것의 표준형에서, 자생 화학적 라이게이션은 표적 폴리펩티드 서열에 있는 시스테인 잔기에서의 티오에스테르-매개 화학선택성 반응을 포함하며, 펩티드 결합이 라이게이션 부위에 형성되고, Cys 측쇄가 자생 형태에서 다시 생성된다.
또는 달리, 본 발명의 단백질은 "위자생 화학적 라이게이션" 또는 "확장된 자생 화학적 라이게이션"의 사용을 통해 합성될 수 있다. 위-자생 화학적 라이게이션은 단백질 합성에 사용된 펩티드의 미리 선택된 위치에 있는 비-천연 발생 위아미노산 잔기의 사용을 포함한다(예를 들어, 도 4 참조). 그러한 위아미노산의 구조는 시스테인의 구조 및 합성될 단백질의 그러한 미리 선택된 위치에서 천연적으로 발견되는 아미노산의 구조를 모두 의태한다. 따라서, 위자생 화학적 라이게이션은 자생 화학적 라이게이션으로부터의 라이게이션 부위에서 생성된 시스테인 측쇄의 티오알킬화에 관련된다. 바람직한 양태는 시스테인 라이게이션 부위의 티오알킬화이며, 여기에서 적어도 1개 펩티드는 적합한 보호기로 보호된 티올 측쇄를 갖는 자생 시스테인을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 시스테인기의 티올 부분은 원하는 측쇄, 예를 들어 리보솜 특이 아미노산, 그러한 아미노산의 유사체, 또는 비-리보솜 특이 아미노산의 측쇄로 변형된다. 본원에 사용된 리보솜 특이 아미노산은 단백질 번역 과정에서 리보솜에 의해 인식되는 아미노산이며, 리보솜적으로 생산된 단백질에 결합될 수 있다. 많은 공개된 문헌이 시스테인 측쇄 티올 부분의 화학적 변형을 설명하고 있다(예를 들어, "단백질 과학에서의 현행 프로토콜", John E. Coligan 등 편저, John Wiley & Sons, 뉴욕 (2000)). Kaiser E. T.는 천연 발생 아미노산 측쇄의 화학적 특성을 의태하 위한 시스테인 잔기 측쇄의 전환을 설명했다(예를 들어, Kaiser E. T. 등, "효소 활성 부위의 화학적 돌연변이", Science 1984. 2. 11;226(4674):505-11). 추가하여, 펩티드 또는 단백질에 표지를 도입하기 위한 시스테인 측쇄의 사용이 설명되었다. 시스테인 측쇄 변형이 단백질 콘쥬게이션 및 교차결합 화학, S. S. Wong(1991, CRC Press); 단백질의 화학적 변형, Gary E. Means 등(1971, Holden-Day), 단백질의 화학적 변형: 선택적 방법 및 분석 과정, Glazer, A. N. 등(1975, Elsevier); 단백질 변형을 위한 화학 시약, R. L. Lundblad(1991, CRC Press)에서 검토된다. Tam 등(Biopolym-ers (1998) 46:319-327)은 비-cys 자생 화학적 라이게이션을 위한 호모시스테인(-CH2-CH2-SH)의 사용 후, 메틸 p-니트로벤젠술포네이트(메틸화 시약)를 사용한 티오알킬화에 의해, 이 호모시스테인 측쇄를 자생 메티오닌 측쇄(-CH2-CH2-S-CH3)로 전환시키는 것을 개시했다. 또한, 본 발명은 호모시스테인을 위아미노산, 즉 메티오닌 이외의 다른 아미노산으로 전환시키는데 사용될 수 있다. 그러나, 본원에 설명된 시스테인의 전환에 관해서, 본 발명에 따르면, 전환시키고 싶지 않은 적어도 1개의 자생 시스테인을 함유하는 펩티드에 대해서, 2황화물쌍에 포함된 자생 시스테인의 파괴를 피하기 위해 보호기를 사용할 필요가 있다. 적합한 보호기가 아래 설명된다.
위-자생 화학적 라이게이션의 방법은 어떤 리보솜 특이 아미노산의 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 및 프롤린의 측쇄)의 의태를 용이하게 하지는 않지만(그러나, 알라닌의 측쇄는 탈황 반응을 통해 형성될 수 있다, Liang Z. Y. 및 Dawson P. E. "탈황 반응과 조합된 자생 화학적 라이게이션에 의한 시스테인 잔기를 사용하지 않는 펩티드 및 단백질의 합성", J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526-533, 본원에 참고자료로 수록됨), 그것은 많은 리보솜적으로 특이화된 또는 비-코드된 아미노산을 의태하는 측쇄를 형성하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 위-자생 화학적 라이게이션 방법에 따라서 생산된 아미노산은 티오에테르 결합을 함유할 것이며, 베타-분기를 갖지 않을 것이다(그것들이 모두 베타 위치에 메틸기를 포함할 것이라는 점에서, 즉 aa-CH2-S-). 따라서, 베타-분기 아미노산의 위-아미노산 버전인 이소로이신 및 트레오닌이, 베타 기하구조 및 그것의 부수적인 콘스트레인트를 갖지 않으면서, 펜던트 측쇄 구조를 가지도록 만들어질 것이다.
유의하게도, 본 발명의 방법은 리보솜 특이 아미노산의 측쇄와 동일한, 또는 이러한 길이보다 더 길거나 짧은 아미노산 측쇄를 형성하는데 이용될 수 있다. 측쇄 길이의 이러한 변경은 3차원적 형태를 안정화(또는 불안정화)하여 단백질 안정성을 증가시키는데(또는 단백질의 입체구조를 변경함으로써, 천연 발생 단백질에 의해 용인되는 것에 비하여, 상이한 범위의 기질, 억제제, 수용체, 리간드 등을 받아들이는 단백질의 능력을 증진시키는데) 사용될 수 있다. 예를 들어, Cys-CH2-SH + Br-CH2-COOH는 Cys-CH2-S-CH2-COOH를 제공한다(이러한 "위-글루탐산"은 1개의 추가측쇄 원자, 즉 -S- 기를 갖는다; 또는 달리, 만일 아스파르트산 대신에 사용되었다면, 그것은 2개의 추가 측쇄 원자, 즉 -CH2-S- 기를 가질 것이다). 다른 측쇄는 측쇄에 동일한 수의 원자를 갖지만, 티오에테르 결합(-S-)의 포함에 의해 차이가 있다. 예를 들어, Cys-CH2-SH + Br-CH2-CH2-NH-PG에 이어서PG의 제거는 Cys-CH2-S-CH2-CH2-NH2를 제공한다. 결과의 구조는 측쇄에 추가 원자를 갖지 않지만, 1개의 -CH2- 기가 -S-로 대체된다. 여기서, 메티오닌이 또 다른 예이며, Cys-CH2-SH + I-CH2-CH3가 Cys-CH2-S-CH2-CH3를 제공한다(Met-CH2-CH2-S-CH3의 천연 met에 대해); 따라서, 티오에테르가 재배치된다. 아르기닌은 또한: Cys-CH2-SH + Br-CH2-NH-CH((-NH2)(=NH2 +))가 Cys-CH2-S-CH2-NH-CH((-NH2)(=NH2 +))를 제공한다. 바람직하게, 특히 위리신을 구성하는데 있어서 반응성 아미노기의 보호가 원치 않는 부반응을 피하기 위해 사용될 수 있다. 일단 티오알킬화 반응이 수행되면, 보호기가 제거될 수 있다.
일반적으로, 가능한 근접하게 천연 발생 단백질을 의태하는 것이 요구된다면, 단백질 내의 이러한 위치에 통상적으로 존재하는 리보솜 특이 아미노산의 측쇄 길이와 동일한 측쇄 길이를 갖는 위아미노산 분자를 채택하는 것이 가장 바람직하고; 리보솜 특이 아미노산의 측쇄보다 한 원자 더 긴 측쇄 길이를 갖는 위아미노산 분자를 채택하는 것은 덜 바람직하며, 리보솜 특이 아미노산의 측쇄보다 두 원자더 긴 측쇄 길이를 갖는 위아미노산 분자를 채택하는 것은 더욱 덜 바람직하다. 게다가, 한 위치에 있는 시스테인 라이게이션 부위를 선택하는 것이 바람직한데, 이 부위는 유전적 변화가 기능을 방해할 것으로 생각되지 않거나 관련된 단백질 내의 이 부위에서 아미노산이 보존되는 부위이다. 이러한 부위는 알라닌 스캐닝, 상동성 모델링 및 다른 방법에 의해 식별될 수 있다.
위자생 화학적 라이게이션에서, 아미노 말단 시스테인 잔기를 함유한 펩티드는, 자생 화학적 라이게이션과 같이 카르복시 말단 티오에스테르를 갖는 펩티드와 라이게이션된다. 시스테인의 티올 측쇄는 그 다음 식 Raa-X의 화합물과 반응하는데, 여기에서 X는 좋은 이탈기이고, Raa는 그 구조가 리보솜 특이 또는 합성 아미노산의 측쇄의 말단 부분을 의태하는 기이다.
중요하게도, 위자생 화학적 라이게이션의 반응은 시스테인 측쇄의 천연 L-배열, 또는 D-배열로 작용한다. C-배열의 사용은 이 라이게이션 부위에서 프로테아제 내성을 부여하므로, 단백질 가수분해에 대한 증가된 안정성이 요구될 때 바람직할 수 있다. 그러나, D-시스테인의 사용에 있어서, 이 부위에서 백본 구조는 변경될 것이다. 이러한 변경은, 프로테아제 내성 외에, 생물활성을 변경하는데 바람직할 수 있다. 그러나, 생물활성에 대한 충격을 최소화하기 위해서, 분자의 혼란된 말단 상의 결과의 접힌 분자의 표면에 위치할 혼란된 루프와 같은, 혼란된 영역과 같은, 높은 유연성의 부위에 D-시스테인을 위치시키는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 위자생 화학적 라이게이션의 반응이 합성된 분자의 표면에 거대하고 하전된 측쇄(예를 들어, Lys, Arg, Asp 또는 Glu의 측쇄)를 위치시키도록 이용될 수 있다.
적당한 좋은 이탈기인 X의 예는 할로겐, 특히 요오드 및 브롬을 포함한다. Raa기의 예는 PO4, COOH, COO, CONH2, 구아니디늄, 아민, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 이미다졸, 알킬화 이미다졸, 인돌, 또는 알킬화 인돌기를 포함한다.
어떤 Raa를 채택하는가에 대한 선택은 특정 위치에서 존재하기를 원하는 아미노산 측쇄에 의존할 수 있다. 그러므로, 예를 들어 원하는 폴리펩티드 또는 단백질은 아미노산 서열:
aaNH2-Q-aax-aay- W-aaCOOH
을 가지며,
여기에서, Q 및 W는 각각 추가 아미노산 잔기의 선택적 존재 또는 부재를 표시하고, aax및 aay는 내부 인접 잔기를 나타내며(각각 측쇄 x 및 y를 가짐), aaNH2및 aaCOOH는 각각 2개의 펩티드 단편
aaNH2-Q-aax-COSR 및 Cys-W-aaCOOH
을 제조함으로써 합성되는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노(N-) 말단 잔기 및 카르복시(C-) 말단 잔기를 표시하며,
여기에서 Cys는 aay의 시스테인으로의 대체를 표시하고, R은 티오에스테르기와 양립하는 어떤 기인데, 아릴, 벤질, 및 알킬기를 포함하지만 제한은 없다. R의 예는 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르, 벤질 에스테르, 및 메르캅토프로프리온산 로이신 에스테르를 포함한다(Dawson 등, Science (1994) 266:776-779; Canne등, Tetrahedron Lett. (1995) 36:1217-1220; Kent 등, WO 96/34878; Kent 등, WO 98/28434; Ingenito 등, JACS (1999) 121(49):11369-11374; 및 Hackeng 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96:10068-10073 참조). 다른 예는 디티오트레이톨 또는, 알킬 또는 아릴 티오에스테르를 포함하는데, 이는 또한 주지된 인테인-매개 생물학적 기술(Chong 등 Gene (1997) 192:277-281; Chong 등, Nucl. Acids Res. (1998) 26:5109-5115; Evans 등, Protein Science (1998) 7:2256-2264; 및 Cotton 등, Chemistry & Biology (1999) 6(9):247-256 참조)로 생산될 수 있고; 그 후 단편을 함께 라이게이션하여
aaNH2-Q-aax-Cys-W-aaCOOH.
을 형성한다.
라이게이션된 단편은 그 다음 Ry-X와 반응하는데, 여기에서 Ry는 y 측쇄의 구조를 의태하는 측기이다. 반응은 시스테인의 티올기가 "위-y" 측쇄로 전환되기에 충분한 조건하에서 수행된다. 예를 들어, Raa가 CH2-COOH 또는 (CH2)2-COOH로 되도록 선택된다면, 반응은 아스파르트산 또는 글루탐산의 기능 및 구조를 의태하는 아미노산 잔기(각각 "위-Asp", "위-Glu")의 형성을 일으킬 것이다. 상기 설명에 비추어 인정되는 바와 같이, 더욱 복잡한 합성은 2개 이상의 펩티드 단편을 채택하도록 수행될 수 있다.
이러한 접근법의 중요한 특징은, 반응 세그먼트에 있는 변형하고 싶지 않은 시스테인 잔기가, 예를 들어 Cys(Acm)과 같이 측쇄 보호되어 라이게이션 부위(들)이외의 다른 Cys 잔기의 화학적 변형을 방지하거나, 또는 반응 세그먼트에 있는 어떤 다른 Cys 잔기가 라이게이션 후 화학적 변형 반응에 의해 동일한 '위아미노산'의 동시 형성을 의도한다는 것이다.
여기서 사용될 때, 기호 φ는 벤질기를 표시하고;IM은 이미다졸기를 표시하고,IN은 인돌기를 표시하고;PG는 보호기를 표시한다. 본 발명에 따른 위아미노산 잔기를 포함한 펩티드를 합성하는데 사용될 수 있는 Raa 측기를 아래에 요약한다(여기에서, X는 할로겐(I, Br, Cl, F, 대부분 I 및 Br이 바람직하고, φ부착에 대해서는 F가 바람직하다)이다):
염기성 아미노산
Lys(가외 원자 없음)
-CH2-SH + X-CH2-CH2-NH-PG, 탈보호 후 -CH2-S-CH2-CH2-NH2를 제공
Arg(가외 원자 없음)
-CH2-SH +X-CH2-NH-C((NH2)(=NG2+))는 -CH2-S-CH2-NH-C((NH2)(=NH2+)를 제공
His(2개의 가외 원자)
-CH2-SH + X-CH2-IM은 -CH2-S-CH2-IM을 제공
산성 아미노산
Asp(2개의 가외 원자)
-CH2-SH + X-CH2-COOH는 -CH2-S-CH2-COOH를 제공
Glu(1개 가외 원자)
-CH2-SH + X-CH2-COOH는 -CH2-S-CH2-COOH를 제공
하전되지 않은 극성 아미노산
Tyr(가외 원자 없거나 또는 1개)
-CH2-SH + F-φ-pOH는 -CH2-S-φ-pOH를 제공(가외 원자 없음, 동일한 기하 구조)
-CH2-SH + Br/I-CH2-φpOH는 -CH2-S-CH2-φpOH를 제공(1개의 가외 원자)
Gln(1개의 가외 원자)
-CH2-SH + X-CH2-C(O)(NH2)는 -CH2-S-CH2-C(O)(NH2)를 제공
Asn(2개의 가외 원자)
-CH2-SH + X-CH2-C(O)(NH2)는 -CH2-S-CH2-C(O)(NH2)를 제공
Ser(2 또는 3개의 가외 원자)
-CH2-SH + X-CH2OH는 -CH2-S-CH2-OH를 제공(2개의 가외 원자)
-CH2-SH + X-CH2CH2OH는 -CH2-S-CH2-CH2OH를 제공(3개의 가외 원자)
Thr(2 또는 3개의 가외 원자, 베타 분기를 잃음)
-CH2-SH + X-CH((CH3)(O-PG)),PG제거 후 -CH2-S-CH((CH3)(OH))를 제공(2개의 가외 원자)
-CH2-SH + X-CH2-CH((CH3)(O-PG)),PG제거 후 -CH2-S-CH2-CH((CH3)(OH))를 제공(3개의 가외 원자)
비-극성 아미노산
Leu(1 또는 2개의 가외 원자)
-CH2-SH + X-CH((CH3)(CH3))는 -CH2-S-CH((CH3)(CH3))를 제공(1개의 가외 원자)
-CH2-SH + X-CH2-CH((CH3)(CH3))는 -CH2-S-CH2-CH((CH3)(CH3))를 제공(2개의 가외 원자)
Ile(2 또는 3개의 가외 원자, 베타 분기 잃음)
-CH2-SH + X-CH(CH3)-CH2-CH3은 -CH2-S-CH(CH3)-CH2-CH3을 제공(2개의 가외 원자)
-CH2-SH + X-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3은 -CH2-S-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3을 제공(3개의 가외 원자)
Phe(1 또는 2개의 가외 원자)
-CH2-SH + F-φ는 -CH2-S-φ를 제공(1개의 가외 원자)
-CH2-SH + Br/I-CH2-φ는 -CH2-S-CH2-φ를 제공(2개의 가외 원자)
Met(가외 원자 없음)
-CH2-SH + I-CH2-CH3은 -CH2-S-CH2-CH3을 제공
Trp(1개의 가외 원자)
-CH2-SH + F-IN은 -CH2-S-IN을 제공
그러나, 단백질 서열을 변형하여 라이게이션에 이용된 폴리펩티드의 주어진 N-말단에 시스테인 또는 호모시스테인 잔기를 도입하거나, 또는 라이게이션 부위에서 위아미노산을 이용하는 것이 편리하지 않거나 바람직하지 않은 경우, 자생 화학적 라이게이션 방법은, N-말단이 N-치환, 바람직하게는 Nα-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 함유하도록 변형된 폴리펩티드를 사용하여 확장될 수 있으며, 이로써 자생 화학적 라이게이션 원리를 시스테인 잔기를 결여하고 있는 폴리펩티드와 함께 사용할 수 있게 된다(미국 특허출원 일련번호 60/231,339, 본원에 참고자료로 수록됨).
"확장된 자생 화학적 라이게이션"의 방법은 카르복실 티오에스테르, 더욱 바람직하게는 α-카르복실 티오에스테르를 포함한 제 1 성분을, 산에 안정한 N-치환, 바람직하게는 Nα-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함한 제 2 성분에 라이게이션시키는 것을 포함한다. 제 1 성분의 카르복시티오에스테르와 제 2 성분의 N-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 티올간 화학선택적 반응은 티오에스테르-연결 중간체를 통해 진행되고, 초기 라이게이션 생성물로 분해된다. 보다 명확하게 말하자면, COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분간에 발생하는 티올 교환은 티오에스테르-연결 중간체 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 생성물은 자발적인 재배열 후 아미노 알킬 티올 성분이 식 I 또는 II 중 어떤 것을 갖느냐에 따라서 5-원 또는 6-원 고리 중간체를 통해아미드-연결 제 1 라이게이션 생성물을 생성한다:
J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 I
J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II
여기에서, J1은 하나 이상의 선택적으로 보호되는 아미노산 측쇄를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이거나, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드, 중합체, 염료, 적합하게 기능화된 표면, 링커 또는 검출가능한 마커이거나, 또는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 자생 화학적 라이게이션과 양립하는 어떤 다른 화학적 부분이고; R1, R2 및 R3은 독립적으로 H 또는 C1에 콘쥬게이트된 전자공여기이고; 단, R1, R2 및 R3 중 적어도 1개는 C1에 콘쥬게이트된 전자공여기이고; J2는 1개 이상의 선택적으로 보호되는 아미노산 측쇄를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이거나, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드, 중합체, 염료, 적합하게 기능화된 표면, 링커 또는 검출가능한 마커이거나; 또는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 자생 화학적 라이게이션과 양립하는 어떤 다른 화학적 부분이다.
라이게이션 부위에서 N-치환된 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-] 또는 [HS-(C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]은 생성물의 손성 없이 펩티드-양립성 조건하에서 제거되어, 라이게이션 부위에 자생 아미드 결합을 갖는 식 III의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다:
J1-C(O)-HN-J2 III
여기에서, J1, J2, R1, R2 및 R3은 상기 정의된 것과 같다.
R1, R2 및 R3 기는 펩티드-양립성 절단 조건하에서 N-C1 결합의 절단을 용이하게 하도록 선택된다. 예를 들어, 전자공여기는, 특히 C1에 콘쥬게이트되어 있다면 절단을 용이하게 하는 C1에서 공명 안정화된 양이온을 형성하는데 이용될 수 있다. 바람직하게, 화학적 라이게이션 반응은 첨가제로서 티올 촉매를 포함하며, 수성 또는 혼성 유기-수성 조건에서, 중성 pH 조건 근처에서 수행된다. 제 1 및 제 2 성분의 화학적 라이게이션은 5 또는 6 원 고리를 통해 진행될 수 있으며, 자발적으로 재배열되어 N-치환 아미노-연결 라이게이션 생성물을 제공한다. 제 1 및 제 2 성분이 펩티드 또는 폴리펩티드이면, N-치환 아미드-연결 라이게이션 생성물은 식 IV 또는 V를 가진다:
J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 IV
J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 V
여기에서, J1, J2 및 R1, R2, R3은 상기 정의된 것과 같다.
N-치환 아미드 결합 라이게이션 생성물의 콘쥬게이트된 전자공여기 R1, R2 또는 R3은, N-C1 결합의 절단 및 N-치환 아미드-연결 라이게이션 생성물로부터 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 제거를 용이하게 한다. 펩티드-양립성 절단 조건하에서 N의 알킬 또는 아릴 티올 사슬의 제거는 라이게이션 부위에 자생 아미드 결합을 갖는 라이게이션 생성물을 생성한다. 제 1 및 제 2 성분이 펩티드 또는 폴리펩티드이면, 라이게이션 생성물은 다음의 식을 가질 것이다:
J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2 X
식 I에 대한 대표적인 R1 치환기가 표 I에 보여진다.
식 II에 대한 대표적인 R1, R2 및 R3 치환기는 표 II에 보여진다.
N-치환 2개 탄소 사슬 화합물에 관하여, 오르토 또는 파라 위치에서 벤질 및피콜릴 전자공여 치환기 R1', R3' 및 R5'의 위치 결정은 라이게이션 후 Nα-결합의 확실한 절단을 위해 C1 탄소와의 전자적 콘쥬게이션을 유지시킬 필요가 있다. 그러나, R2 및 R3가 C2 및 C3과 벤질기를 형성할 때, R1' 및 R3' 중 적어도 1개는 강력한 전자공여기를 포함하는데, 여기서 R1' 또는 R3'은 메톡시(-OCH3), 티올(-SH), 히드록시(-OH), 및 티오메틸(-SCH3)로부터 선택된다. R2 및 R3이 수소인 N-치환 3개 탄소 사슬 티올에 대하여, R1은 R1', R3' 및 R5'가 강력한 또는 중간의 전자공여기, 또는 그들의 조합을 포함하는 벤질 또는 피콜릴기를 포함한다. N-치환 2개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올에 관하여, 강력한 전자공여기는 라이게이션 후 절단에 대한 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 민감성을 향상시킨다. 그러므로, 특별한 전자공여기 또는 그것의 조합은 그에 따라 선택될 수 있다.
N-치환 2개 탄소 사슬 화합물과 유사하게, 본 발명의 N-치환 3개 탄소 사슬 화합물은 관심 있는 구성물에서 치환에 대하여 이용가능할 때, R1' 및 R5' 위치에 R1'의 치환기로서 티올을 포함한다. 여기서 다시, 전자공여 티올기는 C1에 콘쥬게이션되고, 이 위치에서 그것의 도입은 화합물이 라이게이션 사건을 형성하는 6-원 고리에 대한 2개의 경로를 갖게 할 수 있다. 이는 또한, α-카르복시 티오에스테르와의 반응을 위한 이용가능한 티올의 국부적 농도를 증가시키고, 라이게이션을 개선할 수 있는 구조적 콘스트레인트에 관한 추가의 입체구조를 제공한다.
본 발명의 N-말단 N-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산의 합성은, 여기 설명된 것과 같이 수행될 수 있고(예를 들어, 반응식 I 및 반응식 II), 당업계에 공지된 표준 유기화학 기술에 따라서 수행될 수도 있다. 예를 들어, "고급 유기화학 메카니즘, 및 구조", 4판, J. March 편저, John Wiley & Sons, 뉴욕, 1992; "포괄적 유기 변형, 작용기 제조 가이드", R. Larock 편저, VCH 퍼블리셔, 뉴욕, 1989 참조. 이 아미노산은 용액 중에서, 중합체-지지 합성에 의해, 또는 그들의 조합에 의해 합성될 수 있다. 바람직한 접근법은 N 알파 보호 N 알킬화 S-보호 아미노 알킬- 또는 아릴- 티올 아미노산 전구물질을 채택한다. 합성에 이용되는 시약은 다수의 제조사로부터 얻을 수 있다. 또한, 출발 성분 및 개개의 아미노산 유도체와 같은, 다양한 중간체가 이후의 사용을 위해 저장될 수 있고, 키트 등으로 제공될 수 있다는 것이 잘 이해될 것이다.
본 발명의 N-말단 Nα-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산의 제조에 보호기 전략이 채택된다. 일반적으로, 다양한 합성 전략에 사용되는 바람직한 보호기(PG)는 고체상 펩티드 합성("SPPS")과 양립한다. 몇몇 예에서, 상이한 조건하에서 제거가능한 직교 보호기를 사용하는 것이 또한 필요하다. 많은 이러한 보호기는 공지되어 있으며, 본 목적에 적합하다(예를 들어, "유기합성에서의 보호기" 3판, T. W. Greene 및 P.G.M. Wuts 편저, John Wiley & Sons, Inc., 1999; 노바바이오켐 카탈로그 2000; "합성 펩티드, 사용자 가이드", G. A. Grant 편저, W. H. Freeman & Company, 뉴욕, 1992; "어드밴스드 켐테크 조합 및 고체상 유기화학 핸드북", W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, 및 H. H. Saneii 편저, 어드밴스드 켐테크, 1998; "펩티드 합성 원리, 2판", M. Bodanszky 편저, Springer-Verlag, 1993; "펩티드 합성 연습, 2판", M. Bodanszky 및 A. Bodanszky, 편저, Springer-Verlag, 1994; 및 "보호기", P. J. Kocienski 편저, Georg Thieme Verlag 독일 스투트가르트 1994, 참조). 예는 벤질옥시카르보닐(Z), Boc, Bpoc, Trt, Nps, FmocCl-Z, Br-Z; NSC; MSC, Dde 등을 포함한다. 황 부분에 대하여, 적당한 보호기의 예는 벤질, 4-메틸벤질, 4-메톡시벤질, 트리틸, ACM, TACAM, 크산틸, 이황화물 유도체, 피콜릴, 및 페나실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
더 구체적으로, Nα-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올은 반응식 I(Nα-치환 전구물질의 고체상 제조), 반응식 II(Nα-치환 전구물질의 용액상 제조)에 따라서 제조될 수 있다. 반응식 I에서, Nα-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올은 중합체-지지 유기합성의 표준 방법을 이용하여 고체상 위에서 직접 회합되는 반면, 반응식 II의 Nα-보호, N-알킬화, S-보호, 아미노 알킬 또는 아릴 티올 아미노산 전구물질은 표준 커플링 프로토콜을 이용하여 수지에 커플링된다. 라세미체 또는 부분입체이성질체 생성물이 생산되면, 확장된 자생 화학적 라이게이션에 사용하기에 앞서 표준 방법에 의해 이들을 분리할 필요가 있다.
α-카르복시티오에스테르는 실시예를 포함하여 여기 설명된 것과 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 따라서 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 생성될 수 있다. 화학적 합성을 위하여, α-카르복시티오에스테르 펩티드는 용액에서 또는 티오에스테르-생성 수지으로부터 합성될 수 있는데, 이 기술은 잘 공지되어 있다(예를 들어, Dawson 등, Science (1994) 266:776-779; Canne 등, Tetrahedron. Lett. (1995) 36:1217-1220; Kent 등, WO 96/34878; Kent 등, WO 98/28434; Ingenito 등, JACS (1999) 121(49):11369-11374; 및 Hackeng 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96: 10068-10073); Amiato 등, 상동, 참조). 예를 들어, 화학적으로 합성되는 티오에스테르 펩티드는 상응하는 펩티드 α-티오산으로부터 만들어질 수 있는데, 이는 차례로 티오에스테르-수지 상에서 또는 용액에서 합성될 수 있지만, 수지 접근법이 바람직하다. 펩티드-α-티오산은 상응하는 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르, 상응하는 벤질 에스테르, 또는 다양한 알킬 티오에스테르 중 어느 것으로 전환될 수 있다. 이 모든 티오에스테르는 라이게이션 반응을 위한 만족할 만한 이탈기를 제공하며, 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르는 상응하는 벤질 티오에스테르보다 다소 더 빠른 반응 속도를 나타내는데, 이것은 차례로 알킬 티오에스테르보다 더 반응성일 수 있다. 또 다른 예로서, 트리틸-결합 메르캅토프로프리온산 로이신 티오에스테르-생성 수지는 C-말단 티오에스테르를 구성하는데 사용될 수 있다(Hackeng 등, 상동). 또한, C-말단 티오에스테르 합성은 3-카르복시프로판술폰아미드 안전-캐치 링커를 이용하여, 디아조메탄 또는 요오드아세토니트릴로 활성화시킨 후 적합한 티올로 대체함으로써 달성될 수 있다(Ingenito 등, 상동; Ber-tozzi 등).
또한, C-말단 α-카르복시티오에스테르 펩티드가 인테인-매개 생물학적 기술과 같은 생물학적 프로세스를 사용하여 만들어질 수 있다(예를 들어, Chong 등, Gene (1997) 192:277-281; Chong 등, Nucl Acids Res. (1998) 26:5109-5115; Evans 등, Protein Science (1998) 7:2256-2264; 및 Cotton 등, Chemistry & Biology (1999) 6(9):247-256 참조). 예를 들어, 친화성 택과 같은 표지를 갖거나 또는 갖지 않은 인테인 발현 시스템을 이용하여, '인테인' 단백질-스플라이싱 요소의 유도성 자기-절단 활성을 활용하여, C-말단 디티오트레이톨(DTT) 에스테르 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트를 생성할 수 있다. 구체적으로, 인테인은 DTT, b-메르캅토에탄올 또는 시스테인과 같은 티올의 존재하에서 특이적 자기-절단을 겪으며, 이것은 C-말단 티오에스테르를 지닌 펩티드 세그먼트를 생성한다. 예를 들어, Chong 등, (1997) 상동; Chong 등, (1998) 상동; Evans 등, 상동; 및 Cotton 등, 상동, 참조. 그러나, 재조합적으로 생산된 세그먼트를 사용했을 때, 최종 구성물의 화학적으로 합성된 부분은 전형적으로, 포함되었을 경우 중합체 변형을 함유할 것이다.
제 1 카르복시티오에스테르 성분을 갖는 본 발명의 N-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 성분의 라이게이션은, 라이게이션 부위에 N-치환 아미드 결합을 갖는 라이게이션 생성물을 생성한다. 반응의 라이게이션 조건은 N-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 부분을 갖는 티오에스테르의 선택적 반응성을 유지하도록 선택된다. 바람직한 구체예에서, 라이게이션 반응은 pH 6 내지 8을 갖는 완충액에서 수행되며, 바람직한 pH 범위는 6.5 내지 7.5이다. 완충액은수성, 유기성 또는 그들의 혼합물이 될 수 있다. 또한, 라이게이션 반응은 1개 이상의 촉매 및/또는 1개 이상의 환원제, 지질, 세제, 다른 변성제 또는 용해제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 촉매의 예는 티올 및 포스핀으로, 이는 티오페놀, 벤질메르캅탄, TCEP 및 알킬 포스핀과 같은 부분을 함유한다. 변성제 및/또는 용해제의 예는 구아니디늄, 물 또는 TFE, HFIP, DMF, NMP와 같은 유기 용매에 용해된 유레아, 물과 혼합된 아세토니트릴, 또는 구아니디늄과 혼합된 아세토니트릴 및 물에 용해된 유레아를 포함한다. 또한, 온도가 라이게이션 반응의 속도를 조절하는데 이용될 수 있는데, 이것은 보통 5℃ 내지 55℃이며, 바람직한 온도는 15℃ 내지 40℃이다. 한 예에서, 라이게이션 반응은 6.8 내지 7.8의 pH에서, 6M 구아니디늄에 용해된 2% 티오페놀을 갖는 반응 시스템에서 잘 진행한다.
N-치환 2개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올에 대하여, 라이게이션 사건은 COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 사이에서 발생하는 티올 교환으로부터 일어난다. 교환은 티오에스테르-연결 중간체 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 생성물은 5-원 고리 중간체를 통한 자발적인 재배열 후, 식 J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2의 제 1 라이게이션 생성물을 생성하고, 이것은 라이게이션 부위에 제거가능한 N-치환 2개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]을 가지며, 여기에서 치환기는 상기 정의된 것과 같다. 라이게이션 부위에 있는 N-치환 2개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]은 펩티드-양립성 조건하에서 제거되어, 라이게이션 부위에 자생 아미드 결합을 갖는 식 J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다.
N-치환 3개 탄소 사슬 아릴 또는 알킬 티올에 대하여, COSR 티오에스테르 성분과 아미노 알킬 티올 성분간 티올 교환은 6-원 고리 중간물을 통한 자발적인 재배열 후 티올에스테르-연결 중간체 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 생성물은 식 J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R1)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2의 제 1 라이게이션 생성물을 생성하고, 이것은 라이게이션 부위에 제거가능한 N-치환 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]을 가진다. 라이게이션 부위에 있는 N-치환 3개 탄소 사슬 아릴 티올 [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]은 펩티드-양립성 조건하에서 제거되어, 라이게이션 부위에 자생 아미드 결합을 갖는 J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다.
N-치환 알킬 또는 아릴 티올기의 제거는, 바람직하게 N-C1 결합의 절단을 용이하게 하기 위해 산성 조건에서 수행되어, 라이게이션 부위에 안정화되고, 치환되지 않은 아미드 결합을 제공한다. "펩티드-양립성 절단 조건"은, 펩티드와 양립하며, 라이게이션 생성물로부터 알킬 또는 아릴 티올 부분의 절단에 적합한 물리화학적 조건을 의미한다. 일반적으로, 펩티드-양립성 절단 조건은 사용된 α-치환 화합물에 따라서 선택되는데, 이 조건은 루틴하며 공지된 접근법을 통해 쉽게 추론될 수 있다(예를 들어, "유기합성에서의 보호기" 3판, T. W. Greene 및 P. G. M. Wuts 편저, John Wiley & Sons, Inc., 1999; 노바바이오켐 카탈로그 2000; "합성 펩티드, 사용자 가이드", G. A. Grant 편저, W. H. Freeman & Company, 뉴욕, 1992; "어드벤스드 켐테크 조합 및 고체상 유기화학 핸드북", W. D. Bennet, J. W. Chris-tensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, 및 H. H. Saneii 편저, 어드밴스드 켐테크, 1998; "펩티드 합성 원리, 2판", M. Bodanszky 편저, Springer-Verlag, 1993; "펩티드 합성 연습, 2판", M. Bodanszky 및 A. Bodanszky 편저, Springer-Verlag, 1994; 및 "보호기", P. J. Kocienski 편저, Georg Thieme Verlag 독일 스투트가르트, 1994, 참조).
예를 들어, R1, R2 또는 R3 치환기가 메톡시, 히드록시, 티올 또는 티오메틸, 메틸 등을 포함할 때, 제거를 위한 더욱 보편적인 방법은 펩티드 합성 화학에 대한 전형적인 산성 절단 조건을 포함한다. 이것은 강한 산성 조건 또는 물-산성 조건 하에서, 환원제 및/또는 스캐빈져 시스템(예를 들어, 무수 불화수소(HF), 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 트리메틸술포닐 플루오르아세트산(TMSFA) 등과 같은 산)을 갖거나 갖지 않고, N-C1 결합의 절단을 포함한다. 더 특이적인 산성 절단 시스템은 주어진 구조에 대한 아릴 또는 알킬 티오 부분을 제거하기 위해 Nα-C1 결합을 최적화하도록 선택될 수 있다. 이러한 조건은 공지되어 있으며, 펩티드의 완정성을 유지하는데 적합하다. 특히 자유 아릴 또는 알킬 티올 부분과 트립토판 측쇄의 반응을 피하기 위해서, 트립토판이 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 존재할 때는 티올 스캐빈져가 포함될 수 있다. 티올 스캐빈져의 예는 에탄디올, 시스테인, 베타-메르캅토에탄올 및 티오크레졸을 포함한다.
다른 명시된 절단 조건은 피콜릴기가 치환기일 때의 광 또는 환원-절단 조건을 포함한다. 예로서, R1, R2 및 R3 치환기가 피콜릴 부분을 포함할 때, 광분해(예를 들어, 자외선광), 아연/아세트산 또는 전기분해적 환원이 표준 프로토콜에 따라서 절단에 이용될 수 있다. N-치환 2개 탄소 사슬 티올의 R1이, R1에 티오메탄을 포함하면, 수은 또는 HF 절단이 이용될 수 있다. 또한, 절단 시스템은 제 1 또는 제 2 라이게이션 성분이 다른 보호기를 포함할 때, 고체 지지물로부터의 동시 절단 및/또는 탈보호제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, Nα-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올이 펩티드 합성 단계(특히, 자동 펩티드 합성, 및 직교 및 수렴 라이게이션 전략)에 채택되어, 합성 생물활성 단백질을 얻기 위한 확장된 화학적 라이게이션에 기질로서 사용될 수 있는 적절하게 N-말단 유래된 폴리펩티드를 얻는다. 이러한 화합물은 식 (PG1)S-C2-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2 또는 (PG1)S-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2의 완전히 보호된, 부분적으로 보호된, 또는 완전히 보호되지 않은 산에 안정한 Nα-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함하는데, 이것이 아래 표 III 및 표 IV에 보여진다. 특히, R1, R2 및 R3 중 1개 이상은 C1에 콘쥬게이트된 전자공여기를 포함하는데, 이것은 Nα-치환 아미노 알킬 또는 아릴 티올이 Nα-치환 아미드 알킬 또는 아릴 티올로 전환된 후, C1에서 공명 안정화된 양이온을 형성할 수 있으며, 이로써 펩티드-양립성 절단 조건하에서 Nα-C1 결합의 절단이 용이하게 된다. PG1 및 PG2는 개별적으로 또는 조합하여 존재하거나 또는 부재할 수 있으며, 동일하거나 또는 상이할 수 있는 결합기인데, 여기에서 Z2는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 자생 화학적 라이게이션과 양립하는 어떤 화학적 부분이고, J2는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 자생 화학적 라이게이션과 양립하는 어떤 화학적 부부분이다. PG1(또는 X1)은 아민을 보호하기 위한 기이다. PG2(또는 X2)는 티올을 보호하기 위한 기이다. 많은이러한 보호기가 공지되어 있으며, 본 목적에 적합하다(예를 들어, "유기합성에서의 보호기" 3판, T. W. Greene 및 P. G. M. Wuts 편저, John Wiley & Sons, Inc., 1999; 노바바이오켐 카탈로그 2000; "합성 펩티드, 사용자 가이드", G. A. Grant 편저, W. H. Freeman & Company, 뉴욕, 1992; "어드벤스드 켐테크 조합 및 고체상 유기화학 핸드북", W. D. Bennet, J. W. Chris-tensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, 및 H. H. Saneii 편저, 어드밴스드 켐테크, 1998; "펩티드 합성 원리, 2판", M. Bodanszky 편저, Springer-Verlag, 1993; "펩티드 합성 연습, 2판", M. Bodanszky 및 A. Bodanszky 편저, Springer-Verlag, 1994; 및 "보호기", P. J. Kocienski 편저, Georg Thieme Verlag 독일 스투트가르트, 1994, 참조).
PG1 및 X1에 대한 바람직한 보호기의 예는 [Boc(t-부틸카르바메이트), Troc (2,2,2-트리클로로에틸카르바메이트), Fmoc(9-플루오렌일메틸카르바메이트), Br-Z 또는 Cl-Z(Br- 또는 Cl-벤질카르바메이트), Dde(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로에틸-일리덴), MsZ(4-메틸술피닐벤질카르바메이트), Msc(2-메틸술포에틸카르바메이트), Nsc(4-니트로페닐에틸술포닐-에틸옥시-카르보닐)]을 포함하지만 제한은 없다. 바람직한 PG1 및 X1 보호기는 "Protecting Groups in Organic Synthesis"(Greene 및 Wuts, 3판, Wiley-Interscience, (1999))로부터 선택되며, Fmoc 및 Nsc가 가장 바람직하다. PG2에 대한 바람직한 보호기의 예는 [Acm(아세트아미도메틸), MeoBzl 또는 Mob(p-메톡시벤질), Meb(p-메틸벤질), Trt(트리틸), Xan(크산테닐), tBu티오 (s-t-부틸), Mmt(p-메톡시트리틸), 2 또는 4 피콜릴(2 또는 4 피리딜), Fm(9-플루오렌일-메틸), tbut(t-부틸), Tacam(트리메틸아세트아미도메틸)]을 포함하지만 제한은 없다. PG2 및 X2에 대한 바람직한 보호기는 "Protective Groups in Organic Synthesis"(Green 및 Wuts, 3판, Wiley-Interscience, 1999)로부터 선택되며, Acm, Mob, MeB, 피콜릴이 가장 바람직하다.
본 발명의 Nα-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 보호 형태는 상기 반응식 I 및 II에서와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물은, 할로겐-매개 아미노 알킬화, 환원성 아민화를 포함하는 어떤 다양한 수단, 및 고체상 아미노산 합성 방법과 양립하는 Nα-보호, N-알킬화, S-보호, 아미노 알킬- 또는 아릴-티올 아미노산 전구물질에 의해 생산될 수 있다. 바람직하다면, 허용되는 키랄 순도의 화합물을 얻기 위해서, 생산된 라세미체 또는 부분입체이성질체의 분해가 표준 방법에 의해 수행될 수 있다.
III. 바람직한 본 발명의 수용성 중합체 및 제조
여기에서 사용될 때, 용어 "분자 이종성"은 단백질 제조물의 각 단백질에 부착된 중합체 분자수의 변화를 지칭하도록 의도된다. 용어 "분자 다양성"은 (a) 중합체에 의해 변형되는 단백질 부위의 변화, (b) 동일한 단백질의 상이한 부위, 또는 단백질 제조물의 상이한 단백질에 있는 동일한 부위(들)의, 중합체 애덕트 길이의 변화, (c) 동일한 단백질의 상이한 부위의, 또는 단백질 제조물의 상이한 단백질에 있는 동일한 부위(들)의 중합체 애덕트의 어떤 분기 형성 정도 및/또는 특성의 변화를 지칭하도록 의도된다. 여기에서 사용될 때, 용어 "분자적으로 동종성"은 모든 단백질 분자가 동일한 위치에 동일한 아미노산 서열 및 동일한 중합체 변형을 함유하는, 단백질의 제조물을 지칭하도록 의도된다. 2개 이상의 "분자적으로 동종성"인 단백질 제조물의 혼합물은 여기에서 "분자적으로 규정된" 제조물로서 지칭된다.
본 발명의 이런 측면에 따라서, 중합체 이종성, 다양성, 및 부적합성에 대한 상기-확인된 문제의 해결책은 폴리펩티드(정확한 길이, 편리한 합성) 및 "pPEG"("정확한 PEG"; 유동성, 양쪽성, 비-면역원성인, 프로테아제에 민감하지 않은 중합체: Rose, K. 등, 미국 특허 출원 제 09/379,297, 참고자료로 본원에 수록됨)의 장점을 조합한 새로운 분류의 생체적합성 중합체의 제조를 포함한다. 이 새로운 분류의 생체적합성 중합체는 다음의 식:
-[CO-X-CO-NH-Y-NH]n-
을 가지며,
여기에서, n은 바람직하게 1 내지 100, 더 바람직하게 2 내지 100의 정수이고, X 및 Y는 아미드 결합에 의해 연결된 정확한 구조의 생체적합성 반복 요소이다. 바람직하게, X 및 Y는 반응성 작용기를 갖지 않는 2가 유기 라디칼이거나 또는 부재하며, 동일하거나 또는 상이할 수 있고, 각 반복 단위(n)에 독립적으로 변화할 수 있다. 바람직하게, n=2일 때, X 또는 Y 중 적어도 1개는 치환, 비치환, 분기 및 선형 지방족 및 방향족으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게, X 또는 Y 중 적어도 1개는 페닐, C1-C10알킬렌 부분, C1-C10알킬기, 헤테로원자-함유 페닐, 헤테로원자-함유 C1-C10알킬렌 부분, 헤테로원자-함유 C1-C10알킬기, 및 그것의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 것이다.
특히 바람직한 pPEG 부분은 식:
-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-}n-
(여기에서, n은 바람직하게 1에서 100까지, 더욱 바람직하게 2에서 100까지 변한다); 또는
-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-}n-
(여기에서, n은 바람직하게 1에서 50까지, 더욱 바람직하게 2에서 50까지 변한다)
를 가진다.
이러한 pPEG 부분은 여러 가지 방식 중 어느 것에 의해 합성될 수 있다. 그러나, 이러한 부분은 바람직하게, 중합 프로세스보다는 오히려 단위들의 고체상 단계식 사슬 회합을 이용하여 생산된다. 이러한 회합 프로세스의 이용은 제조물의 부분들이, 그것들의 길이, 그것들의 X 및 Y 치환기의 특성, (만약 있다면) 분기 지점의 위치, 및 길이, X 및 Y 치환기, 및 어떤 분기(들)의 위치에 관하여, 규정되고 동종성인 구조를 가지도록 허용한다.
바람직하게, 그러한 부분들은 다음의 단계에 의해서 합성될 것이다:
(a) 식 HOOC-X-COOH를 갖는 2산 유도체의 몰 과량을 사용하여, 식 Z-Q-지지체 화합물의 아미노 또는 히드록시 기를 아실화하는 단계(여기에서, Z는 H2N- 또는 HO-이고; Q는 링커 또는 표적 분자이고; 지지체는 고체상, 매트릭스 또는 표면이다);
(b) 단계 (a)의 생성물의 자유 카르복실기를 활성화하는 단계;
(c) 식 NH2-Y-NH2를 갖는 디아민의 몰 과량을 사용하여, 단계 (b)의 생성물을 아미노 분해하는 단계; 및
(d) HOOC-X-COOH 및 NH2-Y-NH2를 이용하여, 단계 (a) 내지 (c)를 선택적으로반복하는 단계(여기에서, 상기 X 및 Y는 2가 유기 라디칼이거나 또는 부재하며, 동일하거나 또는 상이하고, 상기 선택적으로 반복된 단위 각각에 독립적으로 변화할 수 있고, 선행한 아실화 및 아미노 분해 단계 중 어느 단계에서 사용된 X 및 Y 치환기와 동일하거나 또는 상이하다)
바람직한 구체예에서, 6-원소체, 12-원소체, 18-원소체 및 32-원소체의 상기 반복 단위가 채택된다. 원한다면, 분기된 pPEG 구조를 형성하기 위해서 반복 단위는, 예를 들어 리신의 아미노기와 함께 사용될 수 있다. pPEG는 티오에테르, 옥심 및 아미드 결합 형성을 포함하는 다양한 화학에 의해, 본 발명의 합성 단백질에 부착될 수 있다.
한 구체예에서, 단위의 고체상 단계적 사슬 회합은 다음의 단계를 포함한다:
단계 1: 보호 또는 보호되지 않은 2산을 수지 상의 아미노에 커플링하여 결합 부이에 아미드 결합을 생성하는 단계(여기에서,PG는 사용된 2산에 따라서 존재 또는 부재하는 보호기이다)
PG-OOC-X-COOH + NH2-Y-NH-수지
단계 2: 만일 수지 상에 보호기(PG)가 존재한다면 이것을 제거하는 단계
HOOC-X-CO-NH-Y-NH-수지
단계 3: 보호 또는 보호되지 않은 2산을 수지 상의 카르복시에 커플링하여 결합 부위에 아미드 결합을 생성하는 단계(여기에서,PG는 사용된 2산에 따라서 존재 또는 부재하는 보호기이다)
PG-NH-Y-NH + HOOC-X-CO-NH-Y-NH-수지
단계 4: 만일 수지 상에 보호기(PG)가 존재한다면 이것을 제거하는 단계
-NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-수지
단계 5: 단계 1 내지 4를 'n'회 반복하여 'n' 개의 단위를 부가한 후 수지로부터 절단하는 단계
-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-
논의된 바와 같이, 선형 및 분기 pPEG 구성물이 본 발명의 합성 생물활성 분자에 부착되기 위한 바람직한 수용성 중합체이다. 사용된 pPEG는 생리학적 조건하에서 하전되거나 또는 중성인 펜던트기를 지니며, 사용하는 pPEG 구조에 따라서 부착 화학, 길이, 분기 및 용해성이 변화하도록 만들 수 있다. 상기 주지된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 pPEG는 반복 단위 -CO-X-CO-NH-Y-NH-를 갖는 수용성 폴리아미드를 포함하는데, 여기에서 X 및 Y 중 하나 또는 모두는 수용성 반복 단위, 가장 바람직하게 'PEG'-기초 반복 단위를 포함한다. 올리고유레아는 간단한 2-단계 고체상 과정을 사용하여 원칙적으로 얻을 수 있지만, 아래 나타낸 바와 같이, 아미노 수지, NH2-수지, 및 대칭성 디아민 NH2-Y-NH2의 경우에 대해서는:
카르보닐디이미다졸으로 활성화 → im-CO-NH-수지
NH2-Y-NH2디아민으로 아미노 분해 → NH2-Y-NH-CO-NH-수지
로서, 여기에서는 이 두 단계가 수회 반복되어 반복 단위 -NH-Y-NH-CO-를 갖는 올리고유레아를 얻을 수 있는데, 이 접근법은 덜 바람직하다. 이것은 상기 단계의 수율이, 심지어 매우 큰 과량의 시약 및 오랜 반응 시간을 사용할 때 조차도, 상온에서 비-정량적일 수 있기 때문이다. 따라서, 아미노 수지, NH2-수지의 경우에 대해서는 아래 나타낸 3-단계 고체상 과정을 사용하여 폴리아미드를 형성하는 것이 바람직하다. 시약 HO2C-X-CO2H 및 NH2-Y-NH2는 이성질체 생성물을 피하기 위해 대칭이어야 한다.
2산 HO2C-X-CO2H으로 아실화 → HO-CO-X-CO-NH-수지
카르보닐디이미다졸으로 활성화 → im-CO-OCO-X-CO-NH-수지
디아민 NH2-Y-NH2으로 아미노 분해 → NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-수지
이 세 단계를 차례대로 수회 반복하여 반복 단위 -NH-Y-NH-CO-X-CO-를 갖는 폴리아미드를 얻을 수 있다. 중합체는 정확한 수의 단량체 단위를 함유하고, X 및 Y는 각 단계에서 독립적으로 변화될 수 있으며, 말단-기는 마음대로 선택될 수 있다. 예를 들어, 아실화 단계에서 무수 숙신산("Succ")을, 아미노 분해 단계에서 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민("EDA" 또는 "TTD"라고도 함)을 사용함에 의해, X가 -CH2CH2-이고, Y가 -NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-이고, 반복 단위가 -NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-COCH2CH2CO-인 "PEG"-기초 폴리아미드가 형성된다. 이 과정이 보호기를 갖지 않는 2가 시약을 포함한다는 사실에도 불구하고, 아래에 언급된 분기 구성물을 만들기 위한 분기 Lys 중심의 경우를 제외하고는, 표준의 상업적 펩티드 합성 수지를 사용하면 교차결합은 문제되지 않는다(Rose 등(미국 특허출원 09/379,297); 및 Rose 등, J. Am. Chem. Soc. (1999) 121: 7034).
예를 들어, 분기된 pPEG 구성물은 Rose 등(미국 특허 출원 09/379,297) 및 Rose, K. 및 Vizzavona, J., J. Am. Chem. Soc. (1999) 121:7034)에 설명된 "케모바디(chemobody)"와 유사한 수단으로 만들어 질 수 있다. 그러므로, 분기된 pPEG 구성물은 리신 분기 중심과 분기 중심을 가지도록 만들어 질 수 있는데, 이 리신 중심은 옥심 링커를 통해 -(COCH2CH2CO-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH)n-과 같은 바람직한 수용성 폴리아미드에 커플링된다. 예를 들어, 폴리아미드의 다른 말단에 있는 Lys 측쇄 상의 아미노옥시아세틸기와, 4량체 중심인 (O=CHCO)4Lys2Lys-과 같은 리신 중심 상의 글리옥실일기 간에, 옥심 결합이 손쉽게 형성된다. 따라서, 각 리신 분기 지점으로부터 나온 옥심 링커는 구조 -Lys(COCH2ON=CHCO-)아미드-로서 제조될 수 있다. 다른 구성물은, 바람직하게 단일-보호 디아민 및 폴리아미드 커플링 후의 탈보호를 사용하여 폴리아미드와 폴리아미드의 자유 펜던트기 사이에 옥심 결합을 위치시켜서, 아래에 나타낸 4가 분기 구성물을 생성할 수 있다:
[O=CHCO-(NH-CH2CH2CH2-[OCH2CH2]3-CH2-NH-COCH2CH2CO-)n]4Lys2Lys-
옥심 화학은 이량체 및 4량체 분기 구성물을 만드는데 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 8량체 분기 구성물의 회합에도 적합할 수 있다(Rose K., J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:30; Rose K. 등, Bioconj. Chem. (1996) 7:552). 이러한 pPEG 폴리아미드를 사용할 때, 이러한 목적을 위해 다른 화학을 이용하는 것도 물론 가능하다(도 15 참조). 더욱이, 폴리아미드 형성은 Bco 또는 Fmoc 화학을 포함하는 펩티드 합성을 위한 합성 계획에 통합될 수 있으나, 이러한 계획을 고안할 때에 아미노 분해 단계가 Fmoc기를 제거할 수 있고, 만약 Bco 화학을 사용하려 한다면 이 단계가 인돌의 포르밀 보호를 제거할 수 있어야 한다는 것을 명심하여야 한다.
따라서, 이러한 pPEG는 선택된 결합(예를 들어, 아미드, 티오에테르, 옥심 등)을 통해 선형 수용성 폴리아미드(예를 들어, -(Succ-TTD)n- 등)에 연결된 다양한 분기 중심(예를 들어, 리신 분기 중심 등)을 가지도록 만들어질 수 있는데, 여기에서 각 선형 수용성 폴리아미드의 자유 말단은 원하는 전하를 제공하기 위해 원하는 펜던트기(예를 들어, 카르복실레이트, 아미노, 아미드 등)로 각각 모자화될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 선형 및 분기 pPEG는 1개 이상의 유일하며 상호 반응성인 작용기를 지닌 합성 단백질에 부착하기 위한 유일 작용기를 포함하도록 만들어질 수 있으며, pPEG의 펜던트기는 바람직하게 비-면역원성일 것이다(예를 들어, 도 15 참조).
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 식
U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*
의 분자적으로 동종성인 당-의태성 수용성 중합체에 관한 것이며,
여기에서, U는 유일 작용기의 잔기이고, B는 3개 이상의 팔을 갖는 분기 중심으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 존재할 수도 또는 부재할 수도 있고, Polymer는 약 5,000Da 이상의 분자량을 갖는 식 -[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-의 폴리아미드이며, 여기에서 X 및 Y는 2가 라디칼로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 분기되거나 또는 선형일 수 있고, n은 2 내지 50의 불연속 정수이고, X 및 Y 중 어느 하나 또는 모두는 선형이거나 또는 분기될 수 있는 실질적으로 비-항원성인 수용성 반복 단위를 포함하고, J*는 음, 양 및 중성으로 구성되는 군으로부터 선택된 생리학적 조건하에서의 순전하를 갖는 실질적으로 비-항원성인 펜던트기의 잔기이고, s1, s2, 및 s3는 스페이스 또는 링커로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 개별적으로 존재하거나 또는 부재할 수 있다. 그러한 중합체는 본원에 참고자료로 포함된 미국 특허출원 일련번호 60/236,377에 설명된 것들을 포함한다. 또한, 식 U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*는 식 U-B-Polymer-J*으로 나타낼 수 있으며, 여기에서 스페이서 또는 링커기 s1, s2, s3은 존재할 수도 또는 부재할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 당-의태성 중합체를 형성하는 바람직한 프로세스가 도 5 내지 7에 보여진다. 도 5A 내지 5B는 본 발명의 수용성 중합체 U-B-Polymer-J*의 분기 중심(B) 및 유일 화학선택적 작용기(U)를 생성하기 위한 고체상 프로세스를 나타낸다. 나타낸 바와 같은 고체상 접근법이 바람직하지만, 이 프로세스는 용액에서 수행될 수도 있다. 구체적으로, 도 5A는 반응성 기를 갖는 직교하여 보호된 U-B 선구물질 부분을 나타내는데, 그러한 구성물의 기본적 기하 구조는 결합으로 연결된 점들에 의해 묘사된다. 이 기본적 기하 구조는 사용된 화학적 결합 또는 기들의 종류를 제한하지 않으며, 단지 본 발명의 U-B 부분의 생성에 적합한 빌딩 구조 및 화학 합성점에 대한 기하구조의 상대적 지점을 예시한다. 직교하여 보호된 U-B 선구물질은, U-B 선구물질에 공유 결합할 수 있는 활성화 후의 적합한 절단가능한 링커 및 공통-반응성 기를 포함하는 중합체 지지체/수지에 커플링된다.
이 시스템은 중합체-지지 유기화학 원리를 이용한다. 커플링 후, 분기 중심이 예시된 대로 면밀히 제조되어(제 1 분기 지점만을 나타냄, 추가 분기 지점을 존재할 수도 또는 부재할 수도 있음), 실질적으로 비-항원성인 수용성 선형 중합체와 같은, 원하는 Polymer 성분의 연속 부착에 적합한 분기 중심을 생성한다. 또한, U가 보여지는데, 이것은 직교하여 보호된 U-B 선구물질의 부분으로서 합성을 개시할 때 제공되거나, 또는 분기 중심 B의 면밀한 제조 동안 또는 후에 면밀히 제조될 수 있다. Polymer 성분의 부착은 수지 상에서, 즉 절단 전에 달성될 수 있지만, 바람직한 경로는 중합체 지지체/수지로부터 U-B 부분을 절단하여 U-B 중심을 생성하는 것이며, 이것은 이후의 Polymer 성분의 부착을 위해 정제될 수 있다.
예시된 대로, 중심기 B의 펜던트 분기 지점은 작용기(Func)를 포함하도록 구성되며, 이것은 동일하거나 또는 상이할 수 있고, 가역적으로 보호되거나(PG,PG'또는PG'') 또는 보호되지 않을 수 있다. 이러한 경우에, Polymer 성분의 부착을 위한 최종 단계는 펜던트 분기 지점에서 작용기(Func)의 생성, 및 U 기의 생성을 포함한다(도 7 참조). 도 5B는 보호된 U-B 선구물질이 링커를 지닌 중합체 지지체와 조합하여 사용된 다른 프로세스를 나타내며, 이것은 절단시 원하는 보호된 또는 보호되지 않은 U 기를 생성한다. 또한, 도 5B는 미리 회합된 분기 중심 B의 부착,및 이후의 Polymer 성분의 부착을 위한 U-B 부분을 제조하기 위한 U 기 생성 수지의 사용을 나타낸다.
도 6A 내지 6D는 이후의 U-B 중심에의 부착을 위한 본 발명의 바람직한 실질적으로 비-항원성인 수용성 폴리아미드 Polymer-J* 성분을 생성하기 위한 고체상 프로세스를 나타낸다. 고체상 프로세스가 예시된 바람직한 방법이지만, 용액상 프로세스가 동일한 최종 결과를 달성하기 위해 적합하게 될 수도 있다. 도 6A 및 6B에서, 2산과 디아미노 단위가 고체상 유기화학 원리를 사용하여 커플링된다. 선택적으로, 식 -[NH-Y-NHCO-X-CO]-의 폴리아미드 구조를 갖는 최종 절단 생성물에 있는 X 및 Y 기의 추가의 다양성을 위해, 보호된 아미노-X'-산 및/또는 아미노-Y'-산 단위가 포함될 수 있다. 도 6A는 N-에서 C-말단 방향으로의 합성을 나타내며, 도 6B는 C-에서 N-말단 방향으로의 합성을 나타낸다. 도 6C 및 6D에서, 보호된 아미노-X'-산 및/또는 아미노-Y'-산 단위가 고체상 유기화학 원리를 사용하여 커플링된다. 도 6C는 N-에서 C-말단 방향으로의 합성을 나타내며, 도 6D는 C-에서 N-말단 방향으로의 합성을 나타낸다. 도 6A 내지 6D로부터 명백한 대로, 최종 폴리아미드 생성물의 성질은 정확하게 제어될 수 있으며, 이것은 합성을 위해 수행하는 사이클의 수에 좌우된다. 게다가, 펜던트기 J*는 사실상 어떤 사용자-규정된 설계대로 만들어질 수 있다. 단일-분산 반복 단위 X, Y, X' 및 Y'가 사용되는 경우, 최종 폴리아미드 생성물의 정확한 분자 구조가 정확하게 제어될 수 있다.
식 U-B-Polymer-J*의 본 발명의 바람직한 합성 중합체 구성물을 생성하기 위한, U-B 성분과 Polymer-J* 성분을 커플링하는 바람직한 프로세스가 도 7에 보여진다. 나타낸 바와 같이, 다양한 보호기가 제공될 수 있으며, 선택적으로 주어진 구성물의 예정된 최종 사용에 좌우된다. 또한, 고체상 접근법 및 용액상 접근법을 포함하여, 원하는 U-B-Polymer-J* 구성물을 제조하기 위한 다른 경로가 예시된다.
주지된 바와 같이, 바람직한 수용성 반복 단위는 폴리알킬렌 옥시드, 폴리아미드 알킬렌 옥시드, 또는 그것들의 유도체를 포함한다. 가장 바람직한 수용성 반복 단위는 식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(CH2-CH2-0)-의 에틸렌 옥시드를 포함한다. 그러한 수용성 반복 단위의 수는 유의하게 변할 수 있지만, 그러한 단위의 더욱 바람직한 수는 2 내지 500, 2 내지 400, 2 내지 300, 2 내지 200, 2 내지 100, 2 내지 50, 더 바람직하게는 2 내지 32이고, 가장 바람직한 것은 3 내지 8이다. 더욱 바람직한 구체예의 예는, X 및 Y 중 어느 하나 또는 모두가 -((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)n1-)- 또는 -((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)로부터 선택되는 경우이며, 여기에서 n1은 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 가장 바람직하게 1 내지 3이고, n2는 2 내지 50, 2 내지 25, 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 8, 가장 바람직하게 2 내지 5이다. 매우 바람직한 구체예의 예는, X가 -(CH2-CH2)-이고, Y가 -(CH2-(CH2-CH2-0)3-CH2-CH2CH2)- 또는 -(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-인 경우이다. 더욱 더 바람직한 것은 각 n이 불연속 정수인 단일-분산 조성물이다. 매우 바람직한 구체예에서, X는 -(CH2-CH2)-이고, Y는 -(CH2-(CH2-CH2-0)3-CH2-CH2-CH2)n- 또는 -(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)n-이며, 여기에서 n은 12 내지 36이다.
구체적으로, Polymer는 바람직하게, 에틸렌 옥시드 반복 단위와 같은 폴리알킬렌 옥시드 반복 단위를 갖는 중합체 사슬을 함유하는 수용성 중합체를 가질 것이며, 각 사슬은 약 1,500 내지 약 42,000Da의 분자량을 갖는 것이 바람직하며, 바람직하게는 약 2,000 내지 약 20,000Da이 가장 바람직하다.
바람직한 U 기는 화학적 라이게이션을 할 수 있는 부분을 포함한다. 바람직한 중합체는 B 기가 3개 이상의 팔을 포함하는 경우 분기된다. 바람직한 J* 성분은 생리학적인 조건하에서 이온성인 기를 포함하며, 음으로 하전된 것이 가장 바람직하다. U 및 J 중 어느 하나 또는 모두는 구성물의 완전성을 손상시키지 않고 제거될 수 있는 보호기를 포함할 수 있다.
바람직한 스페이서 또는 링커는 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 알콕시 등을 포함하는 지방족 부분들 뿐만 아니라, 수용성 중합체에 사용된 1개 이상의 반복 단위, 디아미노 및/또는 2산 단위, 천연 또는 비-천연 아미노산 또는 그것들의 유도체를 포함하는 선형 또는 분기 부분을 포함하며, 바람직하게는 18개 이하의 탄소 원자 또는 심지어 추가의 중합체 사슬을 함유한다.
주지된 바와 같이, 성분 U는 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은, 표적 분자 또는 관심의 다른 표면에 부착되어 있거나 또는 부착될 수 있는 작용기의 잔기이다. U가 표적 분자에 결합하기 위한 잔기일 때, U는 친핵성기 또는 친전자성기를 포함하고, 표적 분자는 상호 반응성인 친핵성기 또는 친전자성기를 각각 포함한다.
많은 그러한 상호 반응성인 작용기는 공지되어 있으며, 펩티드 및 폴리펩티드에 공통적인 측쇄 작용기, 또는 유도된 측쇄 작용기에 부착할 수 있다(Zalipsky 등, Bioconjugate Chemistry (1995) 6:150-165; "Perspectives in Bioconjugate Chemistry", C. F. Meares 편저, ACS, 1993; "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking", S. S. Wong 편저, CRC Press, Inc. (1993)). 작용기의 아미노기와 반응할 수 있는 기들을 포함하며, 예를 들어 (a) p-니트로페닐과 같은 카르보네이트, 또는 숙신이미딜; (b) 카르보닐 이미다졸; (c) 아즈락톤; (d) 환상 이미드 티온; 및 (e) 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트가 있다. 카르복실산기 및 반응성 카르보닐기와 반응할 수 있는 작용기의 예는 (a) 1차 아민; 또는 (b) 아실 히드라지드, 카르바제이트, 세미카르바메이트, 티오카르바제이트, 아미노옥시 등과 같은 히드라진 및 히드라지드 작용기를 포함한다. 메르캅토 또는 술프히드릴기와 반응할 수 있는 작용기는 페닐 글리옥살, 말레이미드 및 할로겐을 포함한다. (카르복실)산과 같은 히드록실기와 반응할 수 있는 작용기, 또는 친전자성 중심부와 반응할 수 있는 다른 친핵체의 예는 히드록실, 아미노, 카르복실, 티올기, 활성 메틸렌 등을 포함한다.
예를 들어, 상기 중합체는 표적 분자에의 부착을 위한 작용기로서 성분 U를 지니도록 제조될 수 있으며, 여기에서 작용기는 아크릴레이트, 알데히드, 케톤, 아미노옥시, 아민, 카르복실산, 에스테르, 티오에스테르, 할로겐, 티올, 시아노아세테이트, 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, 에폭시드, 히드라지드, 아지드, 이소시아네이트, 말레이미드, 메타크릴레이트, 니트로페닐 카르보네이트, 오르토피리딜 디술파이드, 실란, 술프히드릴, 비닐 술폰, 숙신이미딜 글루타레이트, 숙시미딜 숙시네이트, 숙신산, 트레실레이트 등이다. 또한, U는 활성화가능한 형태, 예를 들어 아민과 같은 친핵체와 반응할 수 있는 활성 에스테르로 전환될 수 있는 카르복실산의 형태로 제공될 수 있다.
바람직한 구체예에서, U는 표적 분자 상의 유일 작용기와 선택적으로 반응하는 유일 작용기의 잔기이다. 본 발명의 이런 측면은, 섹션 II에서 논의된 바와 같이, 펩티드 합성(보호기 전략) 및 화학적 라이게이션(부분적 보호기 또는 보호기 없는 전략)의 원리를 포함한다. 따라서, U는 상술된 것들과 같은 광범위한 범위의 작용기의 잔기를 나타낼 수 있다. 바람직한 U 기는 아민 포착 전략(예를 들어, 헤미아미날 형성, 이민 형성, 미카엘 부가에 의한 라이게이션), 티올 포착 전략(예를 들어, 메르캅티드 형성, 이황화물 교환에 의한 라이게이션), 자생 화학적 라이게이션 전략(예를 들어, 시스테인 또는 티올을 포함하는 티오에스테르 교환에 의한 라이게이션은 측쇄 아미노산 유도체를 함유한다) 및 직교 라이게이션 커플링 전략(예를 들어, 티아졸리딘 형성, 티오에스테르 교환, 이황화물 교환, 아미드 형성에 의한 라이게이션)에 따른다(예를 들어, Coltart D. M., tetrahedron (2000) 56:3449-3491). 특히 바람직한 U는 섹션 II에 설명된 것들과 같은 수-양립성 화학적 라이게이션 화학에 사용된 유일 작용기의 잔기를 포함한다. 따라서, U는 카르보네이트, 에스테르, 우레탄, 오트로에스테르, 아미드, 아민, 옥심, 이미드, 유레아, 티오유레아, 티오에테르, 티오우레탄, 티오에스테르, 에테르, 티아졸리딘, 히드라존, 옥사졸리딘 등으로 구성되는 군으로부터 선택된 결합을 형성할 수 있는 작용기일수 있다. 바람직한 결합은 옥심 및 아미드 결합이다.
주지된 바와 같이, B는 3개 이상의 팔을 갖는 분기 중심 부분이며, 존재할 수도 또는 부재할 수도 있다. B가 존재할 때, 한 팔은 U 또는 U에 부착된 스페이서 또는 링커에 연결되고, 각 다른 팔은 Polymer 또는 Polymer에 부착된 스페이서 또는 링커에 연결된다. 분기 중심 B의 예는 아미노, 아미드, 카르복실 및 그것들의 조합을 포함하지만 제한은 없다. 이것들은 리신 등의 올리고아미드, 또는 알칸디아민 및 아크릴산("폴리아미도아민")으로부터 제조된 올리고머를 포함하며, 후자의 올리고머는 분기 중심에 순 양전하를 제공한다(예를 들어, Zeng 등, J. Pept. Sci. (1996) 2:66-72; Rose 등, Bioconjugate Chem., (1996) 7(5):552-556; Novo-Biochem 카탈로그 및 Peptide Synthesis Handbook, Laufelfingen, 2001; Wells 등, Biopolymers (1998) 47:381-396; Mahajan 등, (1999) 40:4909-49-12; Judson 등, (1998) 39:1299-1302; Swali 등, (1997) 62:4902-4903; 미국 특허 번호 5,932,462, 5,919,455, 5,643,575, 5,681,567 참조). 많은 다른 분기 중심이 사용될 수 있고, 이 목적에 적합하며, 치환 디아민, 치환 2산, 글리세롤과 같은 알킬산 및 다가 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 및 알콕시 부분 등을 포함하는 3개 이상의 작용기 또는 활성화가능한 기를 갖는 다른 부분, 및 다당류를 포함한다(예를 들어, Nierengarten 등, tetrahedron Lett. (1999) 40:5681-5684; Matthews 등, Prog. Polym. Sci. (1998) 1-56; Suner 등, Macromolecules (2000) 33:253; Fischer 등, Angew. Chem. Int. Ed. (1999) 38:884; Sunder 등, Adv. Mater. (2000) 12:235; Mulders 등 tetrahedron Lett. (1997) 38:631-634; Mulders 등, tetrahedron Lett.(1997) 38:30-3088; 및 Turnbull 등, Chembiocehm (2000) 1(1):70-74). Polymer 성분에 연결된 가장 바람직한 분기 중심은 아미드 결합에 의해 연결된다.
바람직한 분기 중심은 아미노, 카르복실 또는 혼성 아미도 및 카르복실 작용기로부터 나온다. 바람직한 분기 중심의 예는, 각각 리신 아미노 중심, 아스파르트산 또는 글루탐산 분기 중심, 및 감마-글루탐산 분기 중심이다. 더욱이, 바람직한 분기 중합체 구성물은, 분기가 올리고아미드 또는 폴리아미도아민 중심과 같은 단일 분기 중심으로부터 나오는 것들이다. 그러나, 다른 부류의 분기 구성물이 사용될 수 있는데, 예를 들어 분기가 중합체 백본을 따라서 분포된 다수 분기 중심의 서열로부터 나오는 웜-형(worm-like) 구조가 있다(Schluter 등, Chem. Int. Ed. (2000) 39:864). 화학적 조성 및/또는 중합체 백본 및 반복 단위의 벌키함에 따라서, 결과의 웜-형 구조는 수용성이거나, 또는 액상 결정질 조직을 유발하는 경향이 있도록 디자인될 수 있으며(Ouali 등, Macromolecules (2000) 33:6185), 이것은 전달, 안정성 및 작용 지속기간에 유리할 수 있다. 본 발명의 나머지 분기 중합체 구성물에 관해서, 웜-형 구성물은 U를 포함하는 펜던트 작용기를 함유하도록 만들어진다.
Polymer 성분, 또는 스페이서 또는 링커 중 1개 이상은, 예를 들어 섹션 I에서 논의된 바와 같이, 생물안정성 또는 생분해성인 중합체 사슬 또는 공간 사이의 링커 또는 결합을 포함할 수 있다. 또한, 섹션 I에서 주지된 바와 같이, 성분 J*는 음, 양 및 중성으로 구성된 군으로부터 선택된 생리학적 조건하에서의 순전하를 갖는 펜던트기의 잔기이다. 가장 바람직하게, J*는 이온성 카르복실레이트 부분을포함하며, 생리학적 조건하에서 순 음전하를 가진다. 섹션 I에서 논의된 것과 같이, 성분 s1, s2, 및 s3는 스페이서 또는 링커로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 개별적으로 존재하거나 또는 부재할 수 있다. 가장 바람직하게, 스페이서 또는 링커는 중합체 사슬을 포함하며, 여기에서 스페이서 또는 링커는 식 -[CO-NH-X-NH]n-의 하나 이상의 반복 단위를 포함한다.
IV. 본 발명의 바람직한 중합체-변형 합성 생물활성 단백질
상기 주지된 바와 같이, 중합체-변형 합성 사이토카인 및 주화성 사이토카인이 본 발명의 특히 바람직한 예들이다. 더 바람직한 사이토카인은 당단백질이다. 많은 그러한 사이토카인은 당단백질이며, 예를 들어 대부분의 인터류킨, 인터페론, 성장인자, 케모카인 등을 포함한다. 예로서, EPO, TPO, GCSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IFα-II, IF-γ, LIL, IF-베타, 신경성장인자, 및 RANTES 및 많은 다른 케모카인과 같은 사이토카인이 당단백질이며, 이들 및 다른 그러한 단백질의 당화 부위가 공지되어 있다.
EPO가, 그것의 아미노산 서열이 적혈구생성-자극 활성을 갖는 중합체-변형 합성 생물활성 단백질의 디자인을 돕는데 사용될 수 있는 단백질의 특히 바람직한 예이다. 또한, 콜로니-자극인자 및 RNATES가, 그것의 아미노산 서열이 본 발명 범위 내의 합성 생물활성 단백질의 디자인을 돕는데 사용될 수 있는 단백질의 특히 바람직한 예이다.
EPO는 항정-상태 동안 적혈구 생산을 조절하고, 출혈 후 적혈구 질량의 회복을 가속시키는 주요 인자이다(Jelkmann W. (1992) Physiol Reviews 72:449; Krantz S. B. (1991) Blood 77:419; Porter D. L. 및 M. A. Goldberg (1993) Exp Hematol. 21:399; Nissenson A. R. (1994) Blood Purif. 12:6). 사람 EPO의 혈중 형태는 분자량이 대략 30,000인 165개 아미노산(aa) 당단백질이다(Sawyer S. T. 등 (1994) Hematol. Oncol. Clinics N. A. 8:895; Jacobs K. J. 등, Nature (1985) 313:806; Lin F. K. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1985) 82:7580). EPO의 cDNA는 166개 아미노산 잔기를 갖는 분자라고 예측되지만, 카르복시-말단 아르기닌이 번역 후 변형에서 제거된다. N-연결 당화를 위한 3개의 가능한 부위가 있으며 모두 채워진다. 또한, 1개의 O-연결 탄수화물 부분이 존재한다. 당화의 효과는 복잡하다. 당화되지 않은E. coli-유래 EPO는 시험관내에서 충분한 생물학적 활성을 나타내지만, 생체내에서의 충분한 활성을 위해서는 당화가 분명히 필수적이다. 따라서,E. coli-생산되고 탈당화된 천연 유래의 EPO는 동물 연구에서 매우 낮은 활성을 나타낸다(Krantz S. B. (1991) Blood 77:419; Sasaki H. 등 (1987) J. Biol. Chem. 262:12059; Lowy P. H. 등 (1960) Nature 185:102; Wojchowski D. M. 등, Biochem Biophys Acta 910:224; Dordal M. S. 등 (1985) Endocrinology 116:2293).
상기와 일관하여, 가변적인 당화 패턴은 가변적인 효과를 나타낸다. 예를 들어, 탈시알화된 EPO는 간세포에 의해 인식, 결합, 및 청소되는 갈락토스 잔기의 노출로 인한 효과로서, 시험관내에서 증진된 활성과 생체내에서 감소된 활성을 모두 나타낸다(Spivak J. L. 및 B. B. Hogans (1989) Blood 73v:90; Goldwasser E.등 (1974) J. Biol. Chem. 249:4202). 또한, 완전히 시알화된 EPO의 분기 패턴이 생물학적 활성의 차이를 만든다. 4중-촉각 모양이 우세하게 분기된 EPO는 "표준" EPO와 동등한 활성을 나타내는 반면, 2중-촉각 모양이 우세하게 분기된 EPO는 시험관내에서는 3배 이상의 활성을 나타내지만, 생체내에서는 정상 활성의 단지 15% 만을 나타낸다(Takeuchi M. 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7819). 연구들은 N-연결 당 만이 EPO 기능화에서 중요하며, O-연결 당은 중요하지 않다는 것을 나타냈다(Higuchi M. 등 (1992) J. Biol. Chem. 267:770319).
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 합성 생물활성 단배질은 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 적혈구생성 자극 단백질은 적혈구의 생산을 매개하는 단백질이다. 단백질의 적혈구생성 자극 생물활성은, 생체내 투여 후 적혈구생성의 추적, EPO-의존성 셀라인의 증식을 매개하는 단백질 능력의 분석 등에 의해서와 같은, 여러 가지 수단 중 어느 것에 의해 측정될 수 있다.
바람직한 적혈구생성 자극 단백질은 포유류, 가장 바람직하게 사람의 EPO 및 그것의 유사체이다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,856,298; 5,955,422; 8,888,772; 5,858,347; 5,614,184; 5,457,089; 및 6,077,939; 및 WO 99/32772 참조). 에리트로포에틴은 신장의 세뇨관 및 세뇨관부근 모세관 내피 및 사이질 세포에 의해 우세하게 합성 및 분비된다. 만성 신장 질환은 신장에서 EPO-생성 세포의 파괴를 일으킨다. 결과의 EPO의 부족은 주로 빈혈을 유발한다. 그러므로, EPO의 주된 임상적 용도는, 심한 신부전증(0.3 이하의 적혈구용적율)을 가지며 보통 수혈을 또한 받은환자의 치료 뿐만 아니라, 화학요법 후의 빈혈 환자의 치료이다. 전형적으로, EPO는 임상적 용도를 위해 햄스터 난소 세포에서 재조합적으로 합성된다. EPO는 그것의 성숙한 형태로서 165개 아미노산 잔기의 비교적 열- 및 pH-안정한 산성(pI=4.5) 단백질이다. EPO의 분자 질량 중 대략 40%는 그것의 당화 때문이다. 당화는 생체내에서 EPO의 약물동태학적 행동을 결정하는 중요한 요인이다. 비-당화된 EPO는 극도로 짧은 생물학적 반감기를 가진다. 그것은 여전히 그것의 수용체와 결합하고 있으며, 심지어 시험관내에서 더 높은 특이적 활성을 가질 수 있다. 그러나, 최근의 실험은 EPO의 PEG화가 그것의 수명을 유의하게 증진시키지만, 세포-기초 분석 시스템에서 EPO 활성을 유의하게 감소시킨다는 것을 나타냈다.
본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질("SEP")은 바람직하게 인뇨의 EPO의 중합체-변형 합성 유사체이다. 바람직한 구체예에서, 그것들은 티오에테르, 옥심, 아미드 또는 다른 결합을 통해 1개 이상의 펩티드 잔기(들)에 부착된 1개 이상의 중합체 부분(가장 바람직하게는 pPEG 부분)을 함유한다. 매우 바람직한 구체예에서, 그러한 결합은 인뇨의 EPO의 천연적으로 당화되는 위치(즉, 위치 24, 38, 83 및 126) 중 1개 이상에 있을 것이다. 가장 바람직하게, SEP 분자는 그러한 위치 중 2개 이상에서 pPEG 부분을 가질 것이다. 다른 구체예에서, 다른 단백질 잔기가 중합체 부분에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 합성 생물활성 단백질을 위한 변형 위치는 혼란된 루프, 이 단백질의 영역 또는 도메인, 또는 가능한 프로테아제 절단 부위 또는 그 근처에 위치된 잔기를 포함한다. 예를 들어, 중합체 변형은 EPO의 9, 69 및/또는 125 중 1개 이상의 위치에 도입될 수 있다. 본 발명의 SEP분자의 총 분자량은 약 25에서 약 150kDa까지, 더 바람직하게 약 30에서 약 80kDa까지 변할 수 있다. 분자량은 주어진 유사체의 변형에 이용된 중합체(pPEG와 같은)의 수 및 구조를 증가 또는 감소시킴으로써 제어될 수 있다. 더 큰 구성물에 대한 pPEG 매개 유체역학적 분자량은 약 100kDa 이상이다. 시험관내 분석은 사람 EPO 수용체를 발현하는 세포에서 본 발명의 SEP가 재조합적으로 생산된 당화된 사람 EPO의 ED50과 동등한 ED50을 가진다는 것을 나타낸다.
옥심-연결 pPEG 유사체는 바람직하게, 측쇄 아미노옥시, 케톤 또는 알데히드 작용성을 지닌 비-천연 코드된 아미노산에서 SEP 단백질에 pPEG로 작용기화된 아미노옥시, 케톤 또는 알데히드를 부착시킴으로써 구성된다. 예를 들어, SEP-0 및 1의 위치 89 및 117은 위글루타메이트(식 CHα-CH2-S-COOH(글루타메이트 측쇄 -CHα-CH2-CH2-COOH와 비교)의 측쇄를 지닌 비-천연 코드된 아미노산)를 함유한다. 티오에테르 결합을 이용하는 SEP 유사체는 바람직하게, 시스테인 또는 티올을 지닌 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산에 의해 제공된 티올 작용성을 함유하도록 구성된다. 도 10은 바람직한 합성 적혈구생성 자극 단백질의 한 종류의 기본적 구조를 나타낸다.
다른 구체예에서, 본 발명의 SEP 분자는, EPO의 천연 아미노 및 카르복시 말단이 재배치된, "순환식 변경된" EPO 유사체를 포함할 수 있다. 더 바람직하게, 그러한 재배치는 아미노 및 카르복시 말단을 혼란된 루프 등과 같은 구조적 콘스트레인트가 적은 위치로 이동시킬 것이다. 위치 125 및 126(자생 EPO 잔기의 넘버링시스템에 호응함) 주위의 혼란된 루프가 그러한 재배치 부위의 예이다. 가장 바람직하게, 그러한 SEP는 2황화물을 함유하지 않을 것이며, 미리 선택된 잔기에 중합체 부분을 함유하도록 화학적으로 변형될 것이다.
또는 달리, SEP 분자는 천연 발생 당화 부위, 또는 위치 126 및 125와 같은 당화될 수 있는 다른 부위로 재배치된 아미노 및 카르복시 말단을 가질 수 있다. 또한, SEP 분자는 전하를 제거 또는 변형하기 위한 아미노 및 카르복시 말단의 변형을 포함할 수 있다(카르복시 아미드화 등에 의해서와 같이). 그러한 순환식 변경된 분자의 바람직한 예에서, 새로운 N- 및 C-말단이 위치 126 및 125에 의해 각각 제공된다. 위치 7, 29, 33 및 161에 있는 천연 2황화물-형성 시스테인은 바람직하게, 2황화물 다리를 형성할 수 없는 비-천연 코드된 아미노산인 L-α-L-부티르산(Aba)에 의해 대체된다. 잔기 R166, E37 및 V82는 바람직하게 알라닌으로 대체되어 생산성을 개선시킨다. 또한, 바람직하게, 추가의 시스테인이 아래에 '0'으로 넘버링된 자생 EPO의 번호 계획에 호응하는 위치 1과 166 사이에 삽입된다. 결과의 분자는 4개의 시스테인(위치 126, 0, 38, 및 83에(N-에서 C-말단 방향으로 판독됨))을 함유하며, 이것은 (1) 라이게이션 부위 및 (2) 티오에테르-형성 pPEG 부착 부위로서 이용된다. 선택적으로, 시스테인은 A125를 제자리로 되돌려서 추가의 pPEG 부착 부위를 제공할 수 있다.
본 발명의 그러한 SEP 분자의 총 분자량은 약 25에서 약 150kDa, 더 바람직하게 약 30에서 약 80kDa까지 변할 수 있다. 분자량은 주어진 유사체의 변형에 이용된 중합체(pPEG와 같은)의 수 및 구조를 증가 또는 감소시킴으로써 제어될 수 있다. 더 큰 구성물에 대한 pPEG 매개 유체역학적 분자량은 약 100kDa 이상이다. 선택적인 pPEG 부착 부위는 위치 125, 9, 및 24(N-에서 C-말단 방향으로 판독됨)에 위치된다. 추가의 SEP 유사체 디자인은 혼란된 루프 영역 내에 다른 N- 및 C-말단, 및/또는 이 새로운 N- 및/또는 C-말단으로부터의 끝이 잘려진 잔기를 가진다. 바람직한 순환식 변경된 분자의 기본 구조가 도 11에 보여진다.
예를 들어, 다음 방식으로 사람 EPO의 자생 서열을 순환식 변경함으로써 서열이 디자인되었다: 천연 N-말단 Ala1및 C-말단 Arg166을 추가 Cys 잔기로 연결하여 167개 아미노산의 폴리펩티드를 얻었다; 자생 서열의 잔기 125-126에서 사슬을 끊어서 새로운 N- 및 C-말단을 만들었다; 모든 자생 Cys 잔기를 L-□아미노-n-부티르산 잔기로 대체했다; 그리고, 다음 치환 Glu37Ala; Asn38Cys; Val82Ala; Asn83Cys; Ser126Cys; Arg166Ala(모든 잔기 번호는 사람 EPO의 자생 서열을 기초로 했다)을 만들었다. 함께, 이들 디자인 요소는 나타낸 SEP-5의 아미노산 서열을 가져온다. SEP-5-L28 단백질은 Cys 잔기 126, 0, 24, 38, 및 83(넘버링은 사람 EPO 서열을 기초로 했다)에서 미카엘 부가 반응에 의해 말레이미드-변형 선형 (TTD-Succ)6카르복실레이트 중합체 구성물로 중합체-변형되었다. 이들 변화는 SEP-5-L28 단백질의 합성 및 취급을 개선하도록 디자인되었다. 디자인된 서열은 각각 N-말단 Cys 잔기를 갖는 4개의 펩티드 세그먼트로부터 만들어졌다. 화학적 라이게이션 부위는 Cys0, Cys38, Cys83이었다. C-말단 펩티드가 □-카르복실레이트이고; 나머지 3개의펩티드가 □-티오에스테르여서, N-말단 Cys 잔기가 Acm 보호된 측쇄였던 경우에 펩티드가 합성되었다. Cys24는 보호되지 않은 측쇄였다. 세그먼트들은 C-말단의 2개 세그먼트에서 시작하여 자생 화학적 라이게이션에 의해 연속적으로 연결되었다. 라이게이션 후, 라이게이션 부위에 있는 자유로운 Cys 측쇄가 미카엘 부가 반응에 의해 말레이미드-변형 선형 (TTD-Succ)6카르복실레이트 중합체 구성물과 반응되며, 다음에 Cys 측쇄 Acm 보호기가 제거되고, 다음 세그먼트의 라이게이션 및 중합체 변형이 유사한 방식으로 수행되었다. Acm 기의 제거 후 다음(4번째) 세그먼트의 라이게이션이 수행되고, 마지막 Acm 기가 제거되고, 중합체 변형이 유사한 방식으로 수행되어, 상술된 도 38에 나타낸 순환식 변경된 중합체-변형 SEP 구성물을 제공했다.
다른 구체예에서, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 포유류, 더 바람직하게 사람 C-GSF이다. G-CSF는 혈류에서 호중성 과립구의 빠른 증식 및 방출을 유도함으로써 호전적인 감염에서 치료 효과를 제공한다. 사람 G-CSF 단백질은 174개 아미노산 길이(특허: EP 0459630(Camble, R 등)이며, 그것의 서열 변이체가 분리되었다(미국 특허 번호 6,004,548; 4,810,643; 5,218,092; 5,214,132; 5,416,195; 및 5,580,755 참조). 이 단백질은 4개의 시스테인 잔기 및 트레오닌 위치 133에 O-당화 부위를 가진다.
그러한 합성 G-CSF 분자의 한 구체예에서, 자생 G-CSF의 서열에 호응하여, 위치 1, 2 또는 3 중 1개 이상에 천연, 또는 더 바람직하게는 비-천연 코드된 소수성 잔기를 함유하도록 분자의 아미노산 서열이 변경될 수 있다. 선택적으로, 그러한 분자는 G-CSG의 위치 5, 및/또는 위치 173 및/또는 174에 추가의 천연, 또는 더 바람직하게는 비-천연 코드된 소수성 잔기 함유하도록 더 변형될 것이다.
더 이상의 바람직한 구체예에서, 합성 G-CSF 분자는 위치 63, 64 및/또는 133 중 1개 이상에서, 및/또는 위치 1 및 174 중 1개 이상에서 중합체-변형(바람직하게 pPEG)될 것이다. pPEG 중합체는 선형 또는 분기이거나, 하전되거나, 하전되지 않거나, 또는 혼성일 수 있으며; 변형에 이용된 pPEG의 수 및 구조에 따라서, 약 5 내지 약 80kDa, 더 바람직하게 약 40 내지 약 70kDa pPEG 총 분자량 공헌의 분자량 범위를 가질 수 있다. 유체역학적 반경은 생체내에서 더 큰 분자량 효과를 나타낸다(예를 들어, 10kDa의 분기 pPEG는 약 55kDa의 유효 분자량을 나타낸다). 추정된 pPEG 매개 유체역학적 분자량은 100kDa 이상이다.
옥심 결합을 이용한 유사체에 대해서, pPEG는 바람직하게 측쇄 아미노옥시, 케톤 또는 알데히드 작용성을 지닌 비-천연 코드된 잔기에 부착된다. 티오에테르 결합을 이용한 유사체에 대해서, pPEG는 바람직하게 시스테인 또는 티올을 지닌 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산에 부착된다. 아미드 결합을 이용한 유사체에 대해서, pPEG는 반응성 측쇄 아민을 지닌 천연 또는 비-천연 아미노산에 부착된다.
합성 생물활성 G-CSF 단백질의 기본적 구조가 도 12에 보여진다. 이 도면에서, "J"는 소수성 측쇄를 갖는 비-천연 코드된 잔기를 표시한다.
그러한 중합체-변형 합성 생물활성 G-CSF 단백질의 생물활성은 종래의 수단에 의해서 분석될 수 있는데, 예를 들어 인자-의존성 사람 또는 마우스 셀라인(예를 들어, NFS60 셀라인)의 증식을 매개하는 단백질의 능력을 분석함에 의해, 또는 생체내에서의 호중구 자극, 반감기 및 면역원성을 측정함에 의해 분석된다(20일 미만의 반감기/분비를 목표로 하는 전달 시스템을 사용하여 또는 사용하지 않고).
다른 구체예에서, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 포유류, 가장 바람직하게 사람 케모카인 RANTES이다. RANTES는 1차 수용체 CCR5를 통한 M-향성 HIV 균주의 진입을 차단하며, 또한 천식, 이식거부 및 상처치유에 연루된 염증 경로를 하향조정한다(Kalinkovich A. 등, Immunol Lett. (1999) 68:281-287). 바람직하게, 본 발명의 합성 RANTES 분자는 (1) RANTES 1-68의 위치 1에서 발견된 N-말단 세린이 n-노나노일("NNY")기로 치환되고; (2) 위치 3에 있는 티로신이 소수성 측쇄를 갖는 비-천연 코드된 아미노산으로 치환되도록 화학적으로 변형된다는 점에서 RANTES 케모카인과 차이가 있다. 그러한 화합물은 대단히 효능 있는 것으로 밝혀졌으며, 재조합 "Met-RANTES 1-68"에 대한 mM 범위와 비교하여 pM 범위의 ED50을 가진다.
위치 2에 있는 프롤린을 소수성 측쇄를 갖는 비-천연 코드된 아미노산으로 대체하는 것과 같은, 그리고 분자의 C-말단에 지방산을 부착함에 의한, 상기 주지된 것들에 대한 1가지 이상의 추가 변화를 갖는 효능 있는 RANTES 유사체가 만들어졌다. RANTES 잔기 12-20에 해당하는 N-루프 영역에 대한 변형에 의한 효능과 조합하여 수용체 특이성이 개선되었다. 더 이상의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 합성 RANTES 분자는 그것들의 N- 또는 C-말단에서 중합체 부분(pPEG와 같은), 또는 노나노일("NNY") 또는 Y3X와 결합하여, 그 중에서도 특히 생체내에서의 반감기를개선시킨다. 바람직하게, pPEG 부분은 옥심 결합을 통해 위치 66, 67, 68에 도입된 비-천연 코드된 아미노산 또는 위치 68, 더 바람직하게는 응집 영역을 초래하는 영역인 위치 67에 있는 링커에 부착된다. 바람직하게, 지방산은 옥심 결합(바람직하게는 링커)를 통해 잔기 68, 예를 들어 아미노-옥시-변형 아미노산 디- 또는 트리-펩티드 링커에 부착된다. 다른 부착 화학이 대신 사용될 수 있다. 이러한 합성 RANTES 유사체의 더 큰 구성물의 분자량은 pPEG 부착의 성질 및 구조에 따라서 약 25kDa 내지 약 45kDa의 범위이며, pPEG 매개 유체역학적 분자량을 갖는 더 큰 구성물에 대해서는 60kDa 이상이다. 바람직한 합성 RANTES 유사체의 구조가 도 13에 보여진다.
V. 제약학
본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 질환 및 상태의 치료를 행하기 위한 제약학적 제제로서 사용될 수 있다. 더 바람직하게, 치료법이 필요한 환자 또는 개체에 투여될 때, 그러한 합성 생물활성 폴리펩티드 및/또는 단백질은 약물 전달 시스템을 사용하여 투여될 것이다. 그러한 시스템의 사용은, 약물을 허용 가능하게 만들고, 원하는 생물활성의 유효성을 증진시키는 방식으로 약물이 환자에게 존재하도록 한다. 본 발명의 목적을 위해서, 바람직한 약물 전달 시스템은 폴리펩티드 또는 단백질을 경구, 비강, 또는 흡입 경로에 의해, 또는 근육내, 피하내, 경피내, 정맥내, 귀내 또는 안내로 투여할 수 있는 시스템을 포함한다.
그러한 약물 전달 시스템은 부위-특이적 방출을 제공하거나, 또는 장점막에 대한 보호를 증진시키는 제제를 포함할 수 있다. 적합한 제제는 건조 분말 제제,바이러스 입자 캡슐화에 의한 전달, 리포솜 캡슐화, 경피 패치, 전기적으로 보조된 운반(전기충격 요법), 및 중합체/니아존 콘쥬게이션을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 그러한 약물 전달 장치는 생물학적 환경 변화에 반응할 것이며, 이들 변화에 기초하여 약물을 전달-또는 전달을 중단-할 것이다. 물질의 범위는 약물 및 다른 활성제의 방출을 제어하도록 채택된다: 폴리(우레탄), 폴리(실록산), 폴리(메틸메타크릴레이트), 친수성 및 강도를 위한 폴리(비닐알콜), 폴리(에틸렌), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(n-비닐피롤리돈), 폴리(메틸메타크릴레이트), 폴리(비닐알콜), 폴리(아크릴산), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌-코-비닐아세테이트), 폴리(에틸렌클리콜), 폴리(메타크릴산) 등. 더 바람직한 구체예에서, 생분해성 중합체가 약물 전달을 용이하게 하기 위해 사용될 것이다. 그러한 중합체는 폴리락티드(PLA), 폴리클리콜리드(PGA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA), 폴리무수물, 및 폴리오르토에스테르를 포함한다. 약물 전달 장치 및 그것들의 사용 방법이 미국 특허; 6,072,041; 6,041,253; 6,018,678; 6,017,318; 6,002,961; 5,879,712; 5,849,331; 5,792,451; 5,783,212; 5,766,633; 5,759,566; 5,690,954; 5,681,811; 5,654,000; 5,641,511; 5,438,040; 4,810,499; 및 4,659,558에 설명되어 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 포함하는 화합물, 또는 제약학적으로 허용되는 그것의 염을 치료적 유효량으로 투여함에 의해, 치료가 필요한 포유류를 치료하는 제약학적 조성물 및 방법에 관한 것이다. "제약학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적유효성 및 특성들을 보유하며, 생물학적으로 또는 다른 식으로도 바람직하지 않지 않은 염을 의미한다. 염은 산 또는 염기로부터 유도될 수 있다. 산 부가염은 염산, 브롬화수소산, 황산(술페이트 및 비술페이트 염을 제공함), 질산, 인산 등과 같은 무기산, 및 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 살리실산, p-톨루엔술폰산 등과 같은 유기산으로부터 유도된다. 염기 부가염은 무기염기로부터 유도될 수 있으며, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘염 등을 포함한다. 유기염기로부터 유도된 염은 1차, 2차 및 3차 아민, 천연적으로 발생하는 치환 아민을 포함하는 치환 아민 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘 등을 포함하여, 환상 아민으로부터 형성된 것들을 포함한다. 바람직한 유기염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 피페리딘, 트로메타민 및 콜린이다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 포유류, 특히 사람에서의 모든 질환 치료를 망라하며, (i) 질환에 걸릴 소인이 있지만 아직 질환을 가진다고 진단되지 않은 피험자에서 질환 발생의 예방; (ii) 질환의 억제, 즉 질환의 발달을 저지; 또는 (iii) 질환의 경감, 즉 질환의 퇴행을 일으키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단백질 길항제 또는 작용제를 사용한 치료에 의해 예방또는 완화되는 포유류의 질환 상태"는, 일반적으로 단백질 억제제로 유용하게 치료된다고 본 분야에 일반적으로 알려진 모든 질환 상태, 및 본 발명의 특이적 화합물을 사용한 치료에 의해 유용하게 예방 또는 완화된다고 밝혀진 질환 상태들을 망라한다. 예시의 방식으로 제한 없이, 이것들은 천식, 알레르기 비염, 아토피 피부염, 바이러스 질환, 죽종/죽상경화증, 류마티스성 관절염 및 기관 이식조직 거부를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 필요한 포유류에게 투여되었을 때, 예를 들어 항염증제, 항천식제, 면역억제제 또는 항자가면역질환제로서 치료(상기 정의된)를 행하여 포유류에서 바이러스 감염을 억제하기에 충분한, 중합체-변형 합성 생물활성 단백질의 양으로 간주한다. "치료적 유효량"을 구성하는 양은 단백질 유도체, 상태 또는 질환 및 그것의 심함, 및 치료될 포유류, 그것의 체중, 나이 등에 따라 변할 것이지만, 당대의 지식 및 본 명세서를 고려하여 당업자에 의해 루틴하게 결정될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "q. s."는 정해진 기능을 달성하는데, 예를 들어 용액을 원하는 부피(예를 들어, 100ml)로 만드는데 충분한 양을 첨가한다는 의미이다.
본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질 및 제약학적으로 허용되는 그것의 염, 즉 활성 성분은 치료적 유효량, 즉 필요한 포유류에게 투여되었을 때, 상술된 치료를 행하기에 충분한 양으로 투여된다. 본원에 설명된 합성 생물활성 단백질의 투여는 유사한 유용성을 제공하는 승인된 제제 투여 방식 중 어느 것에 의할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질","본 발명의 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염", 및 "활성 성분"은 상호교환하여 사용된다.
제제에 있는 중합체-변형 합성 생물활성 단백질의 수준은 당업자에 의해 채택된 모든 범위 내에서, 예를 들어 총 제제를 기준으로 하여 약 0.01%중량(%w) 내지 약 99.99%w의 단백질 길항제 또는 작용제, 및 약 0.01%w 내지 99.99%w 부형제 범위 내에서 변할 수 있다. 더욱 전형적으로, 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 약 0.5%w 내지 약 80%w의 수준으로 존재할 것이다.
아직 사람 투약 수준이 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질에 대해 최적화되지 않았지만, 일반적으로 투여되는 화합물의 양은, 물론 예방 또는 완화를 목표로 하는 피험자 및 질환 상태, 고통의 성질 및 심함, 투여 방식 및 시간표, 및 주치의의 판단에 좌우될 것이다. 그러한 사용 최적화는 당업계의 기술 범위 내이다.
투여는 어떤 허용된 전신 또는 국부 경로에 의해, 예를 들어 비경구, 경구(특히 유아용 제제에 대해), 정맥내, 비강, 기관지 흡입(즉, 에어로졸 제제), 경피 또는 국소적 경로에 의해, 고체, 반고체 또는 액체 형태, 또는 에어로졸 투약 형태로, 예를 들어 정제, 알약, 캡슐, 분말, 액체, 용액, 에멀젼, 주사가능 물질, 현탁액, 좌약, 에어로졸 등으로 행해질 수 있다. 또한, 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은, 정해진 속도의 연장된 폴리펩티드의 투여를 위해서 저장 주사, 삼투 펌프, 알약, 경피(전기수송을 포함) 패치 등을 포함한, 지속- 또는 제어-방출 투약 형태로, 바람직하게는 정확한 투약의 단일 투여에 적합한 단위 투약 형태로투여될 수 있다. 조성물은 종래의 제약학적 담체 또는 부형제, 및 본 발명의 단백질 길항제 또는 작용제를 포함할 것이며, 여기에 더하여 다른 의약 제제, 제약학적 제제, 담체, 보조제 등을 포함할 수 있다. 담체는 석유, 동물, 야체 또는 합성 기원의 기름을 포함하는 여러 가지 기름, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 미네랄오닐, 참깨유 등으로부터 선택될 수 있다. 물, 살린, 수성 덱스트로스, 및 글리세롤이 주사가능한 용액에 특히 바람직한 액체 담체이다. 적합한 제약학적 담체는 녹말, 셀룰로스, 활석, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 호분, 실리카겔, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 건조 탈지우유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 다른 적합한 제약학적 담체 및 그것들의 제제는 E. W. Martin의 "레밍턴 제약 과학"에 설명된다.
원한다면, 투여될 제약학적 조성물은 또한 소량의 비독성 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 포함할 수 있다.
더 이상의 활성 성분이 필요할 수 있지만, 경구 투여가 편리한 일일 투약 섭생을 사용하여 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 전달하기 위해 사용될 수 있으며, 이것은 원하는 예방의 정도 또는 고통의 완화에 따라서 조정될 수 있다. 그러한 경구 투여에 대해서, 제약학적으로 허용되는 비독성 조성물은 보통 사용되는 부형제, 예를 들어 제약학적 등급의 만니톨, 락토스, 녹말, 포비돈, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 크로스카멜로스 나트륨, 글루코스, 젤라틴, 수크로스, 마그네슘 카르보네이트 등 중 어느 것의 혼합에 의해 형성된다. 그러한 조성물은 용액, 현탁액, 분산성 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속-방출 제제 등의 형태를 취한다. 경구 제제는 위장 질환의 치료에 특히 적합하다. 일반적인 전신 목적을 위한 경구 생체이용율은, 아세틸화 아미노산을 포함하는 제제과 같은, 전신 순환에서 흡수를 개선하는 부형제를 이용함으로써 조정될 수 있다. 예를 들어, US 5,935,601 및 US 5,629,020 참조.
조성물은 캡슐, 알약 또는 정제의 형태를 취할 수 있으며, 따라서 조성물은 활성 성분과 함께, 락토스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 등과 같은 희석제; 크로스카멜로스 나트륨, 녹말 또는 그것의 유도체와 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 등과 같은 윤활제; 녹말, 폴리비닐피롤리돈, 검 아카시아, 젤라틴, 셀룰로스 및 그것의 유도체 등과 같은 바인더를 함유할 것이다.
제약학적으로 투여가능한 액체 조성물은, 예를 들어 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질(약 0.5% 내지 약 20%) 및 선택적으로 제약학적 애쥬번트를, 예를 들어 물, 살린, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올, 보존제 등과 같은 담체에 용해, 분산 등하여, 용액 또는 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 원한다면, 투여될 제약학적 조성물은 또한, 습윤제, 현탁제, 유화제 또는 용해제, pH 완충제 등과 같은 비독성 보조 물질, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트, 시클로덱스트린 유도체, 폴리옥시에틸렌, 소르비탄 모노라우레이트 또는 스테아레이트 등을 소량 함유할 수 있다. 그러한 투약 형태를 제조하는 실제 방법은 공지되어 있거나, 또는 당업자에게 분명할 것이다. 예를 들어, 레밍턴 제약 과학(Mack Publishing Company, 펜실베니아 이스톤) 참조. 어쨌든 투여될 조성물 또는 제제는 치료될 피험자의 증상을 예방 또는 완화하는데 효과적인 양으로 활성 성분을 함유한다. 유아에게 경구 투여하기 위해서는 액체 제제(시럽 또는 현탁액과 같은)이 바람직하다.
액체를 함유하는 고체 투약 형태에 대해서, 예를 들어 프로필렌 카르보네이트, 식물유 또는 트리글리세라이드 중의 용액 또는 현탁액이 바람직하게 젤라틴 캡슐에 넣어진다. 액체 투약 형태에 대해서, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 중의 용액이 투여를 위해서 쉽게 측정되는 충분한 양의 제약학적으로 허용되는 액체 담체, 예를 들어 물과 함께 희석될 수 있다.
또는 달리, 액체 또는 반고체 경구 제제가 활성 성분을 식물유, 글리콜, 트리글리세라이드, 프로필렌 글리콜 에스테르(예를 들어, 프로필렌 카르보네이트) 등에 용해 또는 분산시시키고, 이들 용액 또는 현탁액을 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐 껍질에 넣음으로써 제조될 수 있다.
상기 상태의 치료에 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 적용하는데 있어서, 본원에 설명된 활성 성분의 투여는 바람직하게 비경구적으로 투여된다. 비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 특징지어지며, 피내 또는 복강내 주사 뿐만 아니라, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함할 수 있다. 주사가능 물질은 종래의 형태로서, 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체에 용해하여 용액 또는 현탁액을 만들기에 적합한 고체 형태, 에멀전 또는 생체적합성 중합체-기재 미세구(예를 들어, 리포솜, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 폴리(D,C) 락타이드 등)로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 살린, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 여기에 더하여, 원한다면 투여될 제학학적 조성물은 또한, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 용해성 증진제, 단백질 캐리어 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 폴리옥시에틸렌, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 시클로덱스트린, 혈청 알부민 등과 같은 비독성 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.
본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은, 예를 들어 화합물을 적합한 용매(물 또는 살린과 같은)에 용해시키거나, 또는 리포솜 제제에 혼합한 후 허용되는 주입 유체로 분산시킴에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 전형적인 일일 용량은 1회 주입, 또는 주기적인 간격에 걸쳐 사이를 둔 일련의 주입에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여에 대해서, 수용성 형태, 예를 들어 수용성 염의 형태인 활성 성분의 수용액, 또는 점도-증가 물질, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란, 및 원한다면 안정제를 함유하는 수성 주사 현탁액이 특히 적합하다. 또한, 활성 성분은 선택적으로 부형제와 함께 동결건조물의 형태일 수 있으며, 적합한 용매를 첨가함으로써 비경구 투여 전에 용액으로 만들어질 수 있다.
비경구 투여에 대한 더욱 최근에 고안된 접근법은 느린-방출 또는 지속-방출 시스템의 이식을 사용하며, 이로써 일정한 투약 수준이 유지된다. 예를 들어, 본원에 참고자료로 수록된 US 3,710,795, US 5,714,166 및 US 5,041,292를 참조한다.
그러한 비경구 조성물에 함유된 활성 성분의 퍼센트는, 그것의 특이적 성질뿐만 아니라, 폴리펩티드의 활성 및 피험자의 필요에 매우 좌우된다. 그러나, 용액 중에서 0.01% 내지 10%의 활성 성분 퍼센트가 사용 가능하며, 만일 조성물이 이후에 상기 퍼센트로 희석될 고체라면 퍼센트는 더 높을 것이다. 바람직하게, 조성물은 용액 중에 0.02% 내지 8%의 활성 성분을 포함할 것이다.
본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 투여하는 다른 방법은 거환 주사 및 연속 주입을 이용한다.
에어로졸 투여가 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 기도로 직접 전달하는 효과적인 수단이다. 이 방법의 일부 이점은 1) 효소 분해의 효과, 위장관에서의 불량한 흡수, 또는 간 일차-통과 효과로 인한 치료제의 손실을 피하고; 2) 활성 성분의 분자 크기, 전하 또는 폐-외 부위에 대한 친화성으로 인해 다른 식으로는 기도에 있는 그것들의 표적 부위에 도달할 수 없는 활성 성분을 투여하고; 3) 허파꽈리를 통해 신체로의 빠른 흡수를 제공하고; 4) 노출이 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수 있는 경우 중요한, 활성 성분에 다른 기관계통이 노출되는 것을 피한다는 점이다. 이들 이유 때문에, 에어로졸 투여는 천식, 폐의 국부 감염, 및 폐 및 기도의 다른 질환 또는 질환 상태의 치료에 특히 유리하다.
3가지 종류의 제약학적 흡입 장치가 있는데, 분무 흡입기, 계량 흡입기 및 건조 분말 흡입기이다. 분무기 장치는 고속의 공기 흐름을 야기하며, 이로써 단백질 유도체(이것은 액체 형태로 조제되었다)가 안개로서 분무되어 환자의 기도로 운반되게 된다. 계량 흡입기는 전형적으로 압축 기체와 함께 패키지된 제제를 가지며, 작동시 압축 기체에 의해 측정된 양의 폴리펩티드를 배출함으로써, 한 세트의제제의 양을 투여하는 믿을 수 있는 방법을 제공한다. 건조 분말 흡입기는 이 장치에 의해 숨쉬는 동안 환자의 공기-흐름 내로 분산될 수 있는 자유롭게 흐르는 분말의 형태로 폴리펩티드를 투여한다. 자유롭게 흐르는 분말을 달성하기 위해서, 단백질 유도체는 락토스와 같은 부형제와 함께 조제된다. 측정된 양의 단백질 유도체는 캡슐 형태로 저장되고, 각 작동에 대해 환자에게 분배된다. 상기 방법은 모두 본 발명을 투여하는데 사용될 수 있다.
또한, 리포솜에 기초한 제약학적 제제가 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질과 함께 사용하는데 적합하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,631,018, US 5,723,147, 및 5,766,627 참조. 리포솜의 이익은 약물의 리포솜 포착으로 인한 조직 분포 및 약물동태학 파라미터에서의 유리한 변화와 관련된다고 여겨지며, 당업자에 의해 본 발명의 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 또한, 주사 또는 경구 투여용의 제어-방출 리포솜 액체 제약학적 제제가 사용될 수 있다.
좌약에 의한 전신 투여에 대해서, 통상의 바인더 및 캐리어는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 트리글리세라이드, 예를 들어 PEG 1000(96%)과 PEG 4000(4%)를 포함한다. 그러한 좌약은 약 0.5w/w% 내지 약 10w/w%, 바람직하게 약 1w/w% 내지 약 2w/w% 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허 출원은, 개개의 공보 또는 특허 출원이 참고문헌으로서 수록되도록 구체적이고도 개별적으로 지시되었던 것과 동일한 규모로 본원에 참고자료로서 수록된다. 본 발명의 배경에 대한 논의가 본 발명의 배경을 설명하기 위해 본원에 포함된다. 이것이 언급된 물질 중 어느 것이 공개되거나, 공지되거나, 또는 청구항 중 어느 것의 우선일을 가지는 전세계 어느 곳에서든지의 선행기술 또는 통상의 일반적 지식의 일부라는 것을 승인하는 것은 아니다. 이제 본 발명을 일반적으로 설명하였으며, 그것이 다음에 실시예를 참고하여 더 쉽게 이해될 것이다. 실시예는 예로서 제공되며, 명시되지 않는다면 본 발명을 제한하지 않는다.
발명의 개요
본 발명은 중합체-변형 합성 생물활성 단백질, 그것을 함유하는 제약학적 조성물 및 그것의 제조 방법 및 사용에 관한 것이다. 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 전체적으로 또는 부분적으로 화학적 합성에 의해 생산되며, 따라서 생물학적으로 제조된 단백질과 현저하게 차이가 있다.
상세하게, 본 발명은 약 25 킬로달톤("kDa") 이상의 단량체 분자량을 갖는 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 제공한다. 더 이상으로, 본 발명은 1개 이상의 변칙 아미노산 잔기를 갖는 중합체-변형 생물활성 단백질을 제공한다. 본 발명은 특히, 천연 포유류 단백질(예를 들어, 사람, 유인원, 소, 뮤린, 돼지, 양, 또는 말, 조류, 또는 어류 단백질)과 같은 리보솜 특이(ribosomally specified) 단백질에 관련된 생물활성을 의태하는 생물활성을 갖는 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 제공한다. 본 발명은 더욱 특히, 단백질 수용체 또는 그것의 단편, 단백질 수용체 리간드 또는 그것의 단편, 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택된 리보솜 특이 단백질에 관련된 생물활성을 의태하는 생물활성을 갖는 그러한 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 식
Protein-U n -s1-B-s2-Polymer-s3-J*
의 분자적으로 동종성인 중합체-변형 합성 생물활성 단백질에 관한 것이며,
여기에서, Protein은 리보솜 특이 단백질의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 여기에서 폴리펩티드 사슬은 1개 이상의 화학적 라이게이션 부위에 의해 공유 결합된 1개 이상의 비-중첩 펩티드 세그먼트를 포함하고, U는 비-중첩 펩티드 세그먼트 중1개 이상에 속한 1개 이상의 아미노산의 측쇄n의 상호 반응성인 유일 작용기에 공유 결합된 유일 작용기의 잔기이며, 여기에서n은 1 내지 6의 불연속 정수이고, B는 3개 이상의 팔을 갖는 분기 중심(branching core)으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 존재할 수도 또는 부재할 수도 있고, Polymer는 실질적으로 비-항원성인 수용성 중합체로, B가 존재하는 경우 동일하거나 또는 상이할 수 있고, J*는 음, 양 및 중성으로 구성된 군으로부터 선택된 생리학적 조건하에서의 순전하를 갖는 펜던트기의 잔기이고, s1, s2 및 s3은 스페이서 또는 링커 부분으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 개별적으로 존재하거나 또는 부재할 수 있이다. 본 발명의 바람직한 분자적으로 동종성인 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 25kDa 이상의 단량체 분자량을 갖는 단일-분산된 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 리보솜 특이 당단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 갖는 중합체-변형 합성 생물활성 단백질에 관한 것이며, 여기에서 폴리펩티드 사슬은 그것에 부착된 1개 이상의 수용성 중합체를 가진다. 더 바람직한 구체예에서, 수용성 중합체 중 1개 이상은 리보솜 특이 당단백질의 당화 부위에 해당하는 폴리펩티드 사슬의 1개 이상의 부위에 공유적으로 부착된다. 바람직한 수용성 중합체는 당-의태성 수용성 중합체인 폴리알킬렌 옥시드, 폴리아미드 알킬렌 옥시드 및 그것들의 유도체이다. 가장 바람직한 것은 사이토카인 당단백질의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 중합체-변형 합성 단백질이다.
더 이상으로, 본 발명은 본 발명의 그러한 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 더 이상으로, 본 발명은 사람의질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 그러한 치료가 필요한 개체에게 본 발명의 그러한 제약학적 조성물 중 1가지 이상을 포함하는 제약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 합성 생물활성 단백질을 제조하기 위한 바람직한 방법은 중합체-변형 합성 단백질의 폴리펩티드 사슬의 비-중첩 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 세그먼트들을 화학적으로 라이게이션하는 단계를 포함하며, 여기에서 라이게이션에 사용된 펩티드 세그먼트 중 1개 이상은 사용자-규정된 미리 선택된 부위에서 그것에 부착된 수용성 중합체를 가진다. 다음에, 중합체-변형 폴리펩티드 사슬을 접어서 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 제조할 수 있다.
본 발명의 합성 생물활성 단백질을 생산하기 위한 다른 바람직한 방법은 본 발명의 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 폴리펩티드 사슬의 비-중첩 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 세그먼트들을 화학적으로 라이게이션하는 단계, 및 그것의 1개 이상의 화학적 라이게이션 부위에 있는 아미노산의 측쇄에 1개 이상의 수용성 중합체를 부착하는 단계를 포함한다. 다음에, 중합체-변형 폴리펩티드 사슬을 접어서 본 발명의 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 합성 생물활성 단백질의 폴리펩티드 사슬의 비-중첩 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 세그먼트들을 화학적으로 라이게이션하여 합성 생물활성 단백질에 해당하는 전길이 폴리펩티드 사슬을 형성하며, 여기에서 적어도 1개의 펩티드 세그먼트는 제 1 화학선택성 작용기를 갖는 변칙 아미노산을 포함하는 단계, (2) 폴리펩티드 사슬을 접는 단계, 및 (3) 폴리펩티드 사슬에 제 1 화학선택성 기와 유일하게 상호 반응하는 제 2 화학선택성 기를 포함하는 수용성 중합체를 부착하는 단계를 포함하는, 중합체-변형 합성 생물활성 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체예는 식
U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*
의 분자적으로 동종성인 당-의태성 수용성 중합체에 관한 것이며,
여기에서, U는 유일한 작용기의 잔기이고, B는 3개 이상의 팔을 갖는 분기 중심으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 존재할 수도 또는 부재할 수도 있고, Polymer는 식 -[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-의 약 5,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 폴리아미드이며, 여기에서 X 및 Y는 2가 라디칼로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 분기되거나 또는 선형일 수 있고, n은 2 내지 50의 불연속 정수이고, X 및 Y 중 어느 하나 또는 모두는, 선형이거나 또는 분기될 수 있는 실질적으로 비-항원성인 수용성 반복 단위를 포함하고, J*는 음, 양 및 중성으로 구성된 군으로부터 선택된 생리학적 조건하에서의 순전하를 갖는 실질적으로 비-항원성인 펜던트기의 잔기이고, s1, s2 및 s3은 스페이서 또는 링커 부분으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 개별적으로 존재하거나 또는 부재할 수 있다.
더 이상으로, 본 발명은 식
U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*
의 분자적으로 동종성인 수용성 중합체에 관한 것이며,
여기에서, U는 유일한 작용기의 잔기이고, B는 3개 이상의 팔을 갖는 분기 중심으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 존재할 수도 또는 부재할 수도 있고, Polymer는 식 -[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-의 약 5,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 폴리아미드이며, 여기에서 X 및 Y는 2가 라디칼로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 분기되거나 또는 선형일 수 있고, n은 2 내지 50의 불연속 정수이고, X 및 Y 중 어느 하나 또는 모두는, 선형이거나 또는 분기될 수 있는 실질적으로 비-항원성인 수용성 반복 단위를 포함하고, J*는 음, 양 및 중성으로 구성된 군으로부터 선택된 생리학적 조건하에서의 순전하를 갖는 실질적으로 비-항원성인 펜던트기의 잔기이고, s1, s2 및 s3은 스페이서 또는 링커 부분으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있고, 개별적으로 존재하거나 또는 부재할 수 있으며, 만일 존재한다면 바람직하게 1 내지 18개 탄소를 포함한다.
본 발명은 특히 그러한 분자적으로 동종성인 수용성 중합체에 관한 것이며, 여기에서 U는 아크릴레이트, 알데히드, 케톤, 아미노옥시, 아민, 카르복실산, 에스테르, 티오에스테르, 할로겐, 티올, 시아노아세테이트, 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, 에폭시드, 히드라지드, 아지드, 이소시아네이트, 말레이미드, 메타크릴레이트, 니트로페닐 카르보네이트, 오르토피리딜디술파이드, 실란, 술프히드릴, 비닐 술폰, 숙신이미딜 글루타레이트, 숙시미딜 숙시네이트, 숙신산, 트레실레이트 및 활성화가능한 작용기로 구성된 군으로부터 선택된 작용기의 잔기이다.
더 이상으로, 본 발명은 그러한 분자적으로 동종성인 수용성 중합체, 및 특히 U가 보호된 그러한 중합체에 관한 것이며, 여기에서 U는 카르보네이트, 에스테르, 우레탄, 오르토에스테르, 아미드, 아민, 옥심, 이미드, 유레아, 티오유레아, 티오에테르, 티오우레탄, 티오에스테르, 에테르, 티아졸리딘, 히드라존, 및 옥사졸리딘으로 구성된 군으로부터 선택된 결합을 형성할 수 있는 작용기의 잔기이다.
더 이상으로, 본 발명은 그러한 분자적으로 동종성인 수용성 중합체에 관한 것이며, 여기에서 중합체는 약 10,000Da 이상, 더 바람직하게 15,000Da 이상의 분자량을 가진다.
더 이상으로, 본 발명은 그러한 분자적으로 동종성인 수용성 중합체에 관한 것이며, 여기에서 B는 4개 이상의 팔을 포함하고, 및/또는 B는 1개 이상의 아미드 결합을 통해 s2 또는 Polymer에 연결된 분기 중심을 포함하고, 및/또는 B는 아미드 결합을 통해 Polymer에 연결된 분기 중심을 포함한다.
더 이상으로, 본 발명은 그러한 분자적으로 동종성인 수용성 중합체에 관한 것이며, 여기에서 반복 단위는 식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(CH2-CH2-O)-의 에틸렌 옥시드를 포함하고; 및/또는 X, Y, 또는 X 및 Y는 -((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)n1-)- 또는 -((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)으로부터 선택되며, 여기에서 n1은 1 내지 6의불연속 정수, n2는 2 내지 50의 불연속 정수이고; 및/또는 X 또는 Y 중 1개는 페닐, C1-C10알킬렌 부분, C1-C10알킬기, 헤테로원자-함유 페닐, 헤테로원자-함유 C1-C10알킬렌 부분, 헤테로원자-함유 C1-C10알킬기, 및 그것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 특히 그러한 분자적으로 동종성인 수용성 중합체에 관한 것이며, 여기에서 X는 -(CH2-CH2)-, 또는 -X'-NH- 또는 -NH-X'-이다.
본 발명은 특히 그러한 분자적으로 동종성인 수용성 중합체에 관한 것이며, 여기에서 Y는 -(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)n- 또는 -(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)n-이며, 여기에서 n은 6 내지 36이거나; 또는 -Y'-NH- 또는 -NH-Y'-이며, 특히 여기에서 X' 및 Y' 중 적어도 1개는 식 (-CH2-CH2-O-)n또는 (O-CH2-CH2-)n의 폴리에틸렌 옥시드를 포함하고, n은 2 내지 50이다.
본 발명은 특히 그러한 분자적으로 동종성인 수용성 중합체에 관한 것이며, 여기에서 J*는 보호되거나, 또는 (i) 생리학적 조건하에서 순 중성전하를 갖는 비-이온성 기, 또는 (ii) 생리학적 조건하에서 순 양전하를 포함하는 이온성 기, 또는 (iii) 생리학적 조건하에서 순 음전하를 포함하는 이온성 기를 포함한다.
본 발명은 특히 그러한 분자적으로 동종성인 수용성 중합체에 관한 것이며, 여기에서 수용성 중합체는 단일-분산된다.
약어
Acm = 아세트아미도메틸 티올-보호기[즉, -CH2NHCOCH3]
AoA = 아미노옥시아세틸
Arg(Tos) = L-아르기닌(측쇄 NG톨루엔술포닐-보호)
ART = 절대 세망세포수
Asp(cHex) = L-아스파르트산(측쇄 시클로헥실 에스테르-보호)
AUC = 곡선하 면적
Boc = tert-부톡시카르보닐
CD = 환상 이색성
CDI = 카르보닐디이미디아졸
CHO = 중국 햄스터 난소
CL = 청소(ml/시간/kg)
Cmax = 최대 농도
Cys(4MeBzl) = L-시스테인(측쇄 (4-메틸)벤질-보호)
Cys(Acm) = L-시스테인(측쇄 아세트아미도메틸[즉, -CH2NHCOCH3]-보호)
DCM = 디클로로메탄
DIC = 디이소프로필카르보디이미드
DIEA = 디이소프로필에틸아민
DMF = 디메틸포름아미드
DMSO = 디메틸술폭시드
DPC = 도데실포스포콜린
Dpr = L-1,2-디아미노프로피온산
ED50 = 50% 최대 효과에 도달하는데 필요한 유효 용량
EDA = (4,7,10)-트리옥사트리데칸-1,13-디아민
ELISA = 효소-연결 면역분석
EPO = 에리트로포에틴
ES-MS = 전기분사 이온화 질량분광법
FBS = 소태아 혈청
Glu(cHex) = L-글루탐산(측쇄 시클로헥실 에스테르-보호)
GM-CSF = 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자
HATU = 0-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸암모늄 헥사플루오로포스페이트
HCT = 적혈구용적율
HGB = 헤모글로빈
His(Dnp) = L-히스티딘(측쇄 NIm디니트로페닐-보호)
HOBT = N-히드록시벤조트리아졸
HPLC = 고압 액체 크로마토그래피
IMDM = 이스코베스 변형 둘베코스 배지
IPA = 이소프로판올
Lev = 레불린산
Lys(ClZ) = L-리신(측쇄 2-클로로벤질옥시카르보닐)-보호
MBHA = 4-메틸벤즈히드릴아민
MRT = 평균 체류 시간
MTT = 4-메틸 트리틸
MTT = 티아졸릴 블루
NHS = N-히드록시숙신이미드
-OCH2-Pam-수지 = -O-CH2-Bz-CH2CONHCH2(코폴리스티렌-디비닐벤젠)-수지
Pbo = 4-(CH3S(O)-)벤질
PBS = 인산 완충 살린
PCV = 채워진 세포 부피
RBC = 적혈구
RET = 세망세포
rhEPO = 재조합 사람 EPO
RSA = 래트 혈청 알부민
SDS = 나트륨 도데실 술페이트
SDS-PAGE = SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동
Ser(Bzl) = L-세린(측쇄 벤질-보호)
아미노산의 1문자 코드: A = 알라닌; C = 시스테인; D = 아스파르트산; E = 글루탐산; F = 페닐알라닌; G = 글리신; H = 히스티딘; I = 이소로이신; K = 리신; L = 로이신; M = 메티오닌; N = 아스파라긴; P = 프롤린; Q = 글루타민; R = 아르기닌; S = 세린; T = 트레오닌; V = 발린; W = 트립토판; Y = 티로신
SPPS = 단계적 고체상 펩티드 합성
Succ = 숙신일[즉, -COCH2CH2CO-]
TCEP = 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염
TFE = 2,2,2-트리플루오로에탄올
Thr(Bzyl) = L-트레오닌(측쇄 벤질-보호)
아미노산의 3문자 코드: Ala = 알라닌; Arg = 아르기닌; Asn = 아스파라긴; Asp = 아스파르트산; Chg = 시클로헥실글리신; Cys = 시스테인; Gln = 글루타민; Glu = 글루탐산; Gly = 글리신; His = 히스티딘; Ile = 이소로이신; Leu =로이신; Lys = 리신; Met = 메티오닌; Phe = 페닐알라닌; Pro = 프롤린; Ser = 세린; Thr =트레오닌; Thz = 4-티오프롤린; Trp = 트립토판; Tyr = 티로신; Val = 발린
Trp(포르밀) = L-트립토판(측쇄 NIn포르밀-보호)
TTD = (4,7,10)-트리옥사트리데칸-1,13-디아민
Tyr(BrZ) = L-티로신(측쇄 2-브로모벤질옥시카르보닐-보호)
Vc = 중심 구획의 분포 부피
실시예 1
합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-0의 합성
합성 적혈구생성 자극 단백질(SEP)을 합성하였다. 전길이 합성 단백질의 서열(SEP-0(1-166)으로 표시)은 다음과 같다:
여기에서, ψ는 술프히드릴기에서 카르복시메틸화된 시스테인으로 구성된 비-자생 아미노산 잔기를 나타낸다. SEP-0 단백질은 다음의 4개 폴리펩티드 단편으로부터 용액 중에서 합성하였다:
단편 SEP-0:1 (GRFN 1711; SEQ ID NO:1의 잔기 1에서 32로 구성됨)
단편 SEP-0:2 (GRFN 1712, SEQ ID NO:1의 잔기 33에서 38로 구성됨)
여기에서, Cys33은 Acm 보호된다.
단편 SEP-0:3 (GRFN 1713, SEQ ID NO:1의 잔기 89에서 116으로 구성됨)
여기에서, Cys89는 Acm 보호된다.
단편 SEP-0:4 (GRFN 1714, SEQ ID NO:1의 잔기 117에서 166으로 구성됨)
여기에서, C-말단 시스테인(Cys161)은 피콜릴(피코) 보호기를 지닌다.
펩티드 SEP-0:1, SEP-0:2 및 SEP-0:3은 ABI433A 자동 펩티드 합성기에서 티오에스테르-생성 수지에 결합하여 Boc(tert-부톡시카르보닐) 화학 및 확립된 SPPS, 측쇄 보호 및 티오에스테르-수지 전략(Hackeng 등, PNAS (1999) 96:10068-10073; Schnolzer 등, Int. J. Pept. Prot. Res. (1992) 40:180-193))을 이용한 단계적 고체상 펩티드 합성(SPPS)을 위한 인시투 중성화 프로토콜에 의해, 또는 수동 사슬회합에 의해 합성하거나, 상업적 공급원으로부터 주문 공급받았다. 예를 들어, Boc SPPS 보호기의 표준 세트를 사용하였다: 즉, Arg(Tos); Asp(cHex); Cys(4MeBzl) 및 Cys(Acm); Glu(cHex); His(DNP); Lys(ClZ); Ser(Bzl); Thr(Bzl); Trp(포르밀); Try(BrZ); Met, Asn, Gln을 측쇄 비-보호하였다. 단편 SEP-0:4는 -OCH2-Pam-수지 상에서 유사하게 합성하였다. 표준 Boc 화학법에 따라서, HF/p-크레졸을 이용하여 펩티드를 탈보호하고 수지 지지체로부터 동시에 절단하였다. 그러나, HF/p-크레졸에서 제거되지 않은 보호기를 함유한 펩티드를 위해 보호기를 유지하였다. 예비 C4 역상-고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 펩티드를 정제하였다. ES-MS(전자분무 이온화 질량분석법)을 이용하여 순수한 펩티드를 함유한 부분을 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다.
단계 1: 라이게이션 #1
단편 SEP-0:4 및 단편 SEP-0:3을 15mM 농도로 TFE에 용해하였다. 6M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 표준 인산 완충액(pH 7.9)을 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻었다. 라이게이션 후, 라이게이션 혼합물을 2ml TFE(트리플루오로에탄올), 6ml 6M 구아니디늄 클로라이드, 25% β-메르캅토에탄올을 함유한 100mM 인산 용액에 첨가하고, 20분 동안 인큐베이션 하였다. 빙초산에 용해된 15mg/ml TCEP(트리(2-카르복시에틸)포스핀.HCl) 용액으로 용액을 산성화하고, 예비 C4 역상 HPLC 컬럼(지름 1인치) 상에 로딩하였다. 다음에, 예비 구배 역상 HPLC로 펩티드를 정제하였다. 원하는 라이게이션 생성물인 SEP-0:Acm+SEP-0:3+SEP-0:4를 함유한 부분을 ES-MS로써 식별한 후 모았다.
단계 2: Acm-제거 #1
Acm 제거를 위하여, SEP-0:Acm+SEP-0:3+SEP-0:4의 모아진 부분을 함유한 액체 아세토니트릴 용액을 HPLC 등급수로 1x로 희석하고, 최종 농도 2몰이 되도록 고체 유레아를 첨가하였다. 3% 수성 아세트산에 용해된(총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 2배 몰 과량의 30mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 다음에, β-메르캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계적 구배로 정제하였다. 원하는 생성물인 SEP-0:3+SEP-0:4를 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하룻밤 동안 동결건조하였다.
단계 3: 라이게이션 #2
순 TFE에 같은 양의 SEP-0:3+SEP-0:4 및 SEP-0:2를 15mM 농도에서 공동으로 용해하였다. 6M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 250mM 인산 완충액(pH 7.5)을 첨가하여, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻는다. 하루 동안 라이게이션한 후, 10ml TFE, 10ml β-메르캅토에탄올, 10ml 피페리딘 및 20ml 6M 구아니디늄 클로라이드의 pH4 용액에 라이게이션 혼합물을 첨가하고, 남아 있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산에 용해된 15mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상으로 로딩하고 선형 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 생성물인 SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4를 ES-MS로 식별하고 하룻밤 동안 동결건조하였다.
단계 4: 카르복시메틸화
SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4를 15mM 농도에서 TFE에 용해하였다. 6M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 2배 과량(v/v)의 200mM 인산 완충액(pH 7.9)을 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻었다. 최소량의 메탄올에 용해된 25배 과량의 브로모-아세트산을 첨가하고, 용액을 2시간 동안 반응하게 하였다. 20% 수성 아세트산에 용해된 15mg/ml TCEP의 용액으로 용액을 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 단계적 구배로 정제하였다. 원하는 카르복시메틸화된 생성물SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et를 ES-MS로 식별하고 모았다.
단계 5: 피콜릴 제거
아연 가루를 2M HCl에서 30분 동안 활성화하였다. 펩티드 SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et를 약 10mg/ml 농도에서 순 TFE에 용해하였다. (새로 첨가된) 35mg/ml L-메티오닌 및 35mg/ml 도데실사르코신(즉, 나트륨 N-도데카노일사르코신)을 함유한, 4x(v/v; TFE에 대해) 6M 구아니디늄 클로라이드, pH 4의 100mM 아세테이트로 용액을 희석하였다. 용액을 활성화된 Zn 분말에 첨가하였다. 1시간 간격으로 반응을 모니터링하고 5시간 후 완료하였다. 완료 후, 상청액을 제거하고 남아 있는 Zn 분말은 20% TFE를 함유하는 35mg/ml L-메티오닌 및 35mg/ml 도데실사르코신을 함유한 6M 구아니디늄 클로라이드, pH 4, 100 mM 아세테이트로 5분 동안 2회 세척하고, 20% β-메르캅토에탄올을 함유한 동일한 용액으로 1회 세척하였다. 결합된 생성물은 20% 수성 아세트산에 용해된 15mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 단계적 구배로 정제하였다. 원하는 변형된 생성물 SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-피코를 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 모았다.
단계 6: Acm-제거 #2
SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-피코의 모아진 용액은 HPLC 등급수로써 3x로 희석하고, 고체 유레아를 첨가하여 최종 농도를 2몰로 하였다. 3% 수성 아세트산에 용해된(총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 3배 몰 과량의 30mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 다음에, β-메르캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계적 구배로 정제하였다. 원하는 생성물 SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-피코를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후, 2x(w/w; 펩티드 양에 대해) DPC(도데실포스포콜린)를 함유한 물로 2x(v/v) 희석하고 하룻밤 동안 동결건조하였다.
단계 7: 라이게이션 #3
순 TFE에 같은 양의 SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-피코 및 SEP-0:1을 15mM 농도에서 공동으로 용해하고, 6M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 250mM 인산 완충액 (pH 7.5)을 첨가한다. 이 용액에 1% 티오페놀을 첨가하였다. 하루 동안 라이게이션한 후, 10ml TFE, 10ml β-메르캅토에탄올, 10ml 피페리딘 및 20ml 6M 구아니디늄 클로라이드의 pH 4 용액에 라이게이션 혼합물을 첨가하고, 남아 있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산에 용해된 15mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 선형 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 생성물 SEP-0(1-166):(SEQ ID NO:1)을 함유한 부분을 전자분무 질량분석법으로 식별한 후, 2x(w/w; 펩티드 양에 대해) 도데실사르코신을 함유한 물로 2x(v/v) 희석하고 동결건조하였다.
단계 8 접기:
전길이 라이게이션 펩티드 SEP-0(1-166)을 6M 구아니디늄 클로라이드 및 20% TFE 및 10배 과량(단백질 내 Cys 잔기에 대해)의 시스테인을 함유한 200mM 트리스완충액(pH 8.7)에 용해시켰다. 3M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200mM 트리스 완충액(pH 8.7)에 대하여 이 용액을 실온에서 하룻밤 동안 투석하였다. 다음에, 1M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200 mM 트리스 완충액(pH 8.7)에 대하여 용액을 4℃에서 4시간 동안 투석하고, 최종적으로 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 4℃에서 4시간 동안 투석하여 최종 접힌 생성물을 수득하였다. 전자분무 ES-MS 및 CD(원편광 2색성) 분석법으로 확인하였다.
단계 9 정제:
접힌 폴리펩티드를 센트리콘 농축기 바이알에서 5x로 농축하고, 10mM 인산, pH 7.0로 평형화된 Resource S 양이온 교환 컬럼 상에 로딩하였다. 접힌 단백질을 선형 염 구배로 500mM NaCl로 10분 동안 용리하였다. 원하는 접힌 생성물인 SEP-0(1-166)을 함유한 부분을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)으로 식별한 후, 냉동하여 -80℃에 저장하였다. 접힌 단백질 생성물의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고, CD 분광분석법 역시 접힌 단백질의 존재를 예증하였다.
실시예 2
합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L30의 합성
두번째 합성 적혈구생성 자극 단백질(SEP-1-L30으로 표시)을 SEP-0의 위치 24 및 126에 옥심-형성기를 함유하도록 합성하였다. 다음에, 이 기를 SEP-1-L30을 형성하는데 사용하였는데, 여기에서 선형 (EDA-Succ)18카르복실레이트(EDA = (4,7,10)-트리옥사트리데칸-1,3-디아민(TTD라고도 함); Succ = -CO-CH2-CH2CO-) 중합체는 단백질 백본에 결합되어 있다. 전길이 SEP-1(1-166)의 서열은 다음과 같다:
여기에서, ψ는 술프히드릴기에서 카르복실메틸화된 시스테인으로 구성된 비-자생 아미노산 잔기를 표시하고, KOX는 옥심 결합을 통해 명시된 수용성 중합체와 커플링된 옥심 링커기로 ε-아미노기에서 화학적으로 변형된 비-자생 리신을 표시한다. 또한, SEP-1-L30의 구조를 도 17에 나타낸다.
아래 설명된 SEP-1-L30의 화학적 합성을 예시하는 도면이 도 16에 보여진다. 간단히, 도 16A 및 16B에서 수용성 중합체 GRFN32(GP32)가 옥심 결합-형성 화학적 라이게이션 반응을 통해 펩티드 SEP-1:1 및 SEP-1:4에 부착된다. 나타낸 대로, 펩티드 SEP-1:1은 위치 32에 이후의 자생 화학적 라이게이션을 위한 히스티딘 알파-카르복실 티오에스테르를 포함하는 C-말단Yaa기, 및 위치 24(자생 사람 EPO의 당화 부위)에 아미노옥시 아실 부분을 포함하는 Un=1기를 지니도록 측쇄를 화학적으로 변형한 비-자생 리신 잔기를 지닌다. 최종 전길이 생성물의 위치 1에 해당하는 N-말단 알라닌을 참고적으로 나타낸다. 펩티드 SEP-1:4는 위치 117에 시스테인을 포함하는 비보호 N-말단Xaa기, 위치 126(자생 사람 EPO의 당화 부위)에 아미노옥시 아실을 포함하는 Un=1기로 변형된 리신, 및 위치 161(이황화물 형성 시스테인)에 피콜릴기로 보호된 측쇄 티올을 갖는 시스테인을 가진다. Cys161은 자생 화학적 라이게이션 부위를 위해 도입된 시스테인의 이후의 전환에서 티오알킬화를 방지하기 위해 보호되고(도 16 참조); 또한, 피콜릴 보호기는 제 1 자생 화학적 라이게이션 반응에서 그것의 제거가 Acm(아세트아미도메틸) 보호 시스테인을 제거하는데 필요한 상태에 직교하기 때문에 사용된다(도 16C 참조). 위치 24 및 126에서 GP32 중합체 구성물의 부위-특이적이고 배타적인 부착은 옥심-형성 화학적 라이게이션을 통해 달성되며, 이로써 정확한 중합체-변형 펩티드 SEP-1:1+GP32 및 SEP-1:4+GP32가 생산된다. 도 16C는 SEP-1:4+GP32와 중간 펩티드 세그먼트 SEP-1:3의 자생 화학적 라이게이션 및 Lys116및 Cys117에 라이게이션 부위가 있는 SEP-1:3-SEP-1:4+GP32의 생성을 나타내며, 이것의 있다. 나타낸 대로, 펩티드 SEP-1:3은 위치 89에 Acm 보호 시스테인을 포함하는 N-말단Xaa기, 및 위치 116에 리신 알파-카르복실 티오에스테르를 포함하는 C-말단Yaa기를 포함한다. 자생 화학적 라이게이션 후, 이 라이게이션 생성물을 다음 라이게이션 반응을 위해 준비시키기 위해 Acm 보호기가 제거된다. 도 16D는 SEP-1:3+SEP-1:4GP32와 중간 펩티드 세그먼트 SEP-1:2의 자생 화학적 라이게이션 및 Trp88및 Cys89에 라이게이션 부위가 있는 SEP-1:2-SEP-1:3-SEP-1:4+GP32의 생성을 나타낸다. 나타낸 대로, 펩티드 SEP-1:2는 위치 33에 Acm 시스테인을 포함하는 N-말단Xaa기, 및 위치 89에 트립토판 알파-카르복실 티오에스테르를 포함하는 C-말단Yaa기를 포함한다. 자생 화학적 라이게이션 후, 라이게이션 생성물은 라이게이션 부위 시스테인 89 및 117의 측쇄 티올의 카르복시메틸화를 위해 브로모아세트산에 노출되며, 이로써 그것들이 위글루탐산으로 전환된다. 카르복시메틸화 후, 이 보호되지 않은 중합체-변형 라이게이션 생성물을 다음 라이게이션 반응을 위해 준비시키기 위해 Acm 및 피콜릴 보호기가 제거된다. 도 16E는 SEP-1:3-SEP-1:4+GP32와 펩티드 세그먼트 SEP-1:1+GP32(전길이 생성물의 N-말단 세그먼트에 해당)의 자생 화학적 라이게이션 및 His32 및 Cys33에 최종 라이게이션 부위가 있는 전길이 SEP-1-L30 생성물 SEP-1:1+GP32+SEP-1:2+SEP-1:3+SEP-1:4+GP32의 생성을 나타낸다. 나타낸 대로, 전길이 SEP-1-L30 생성물은 사용자-규정된 부위, 즉 자생 사람 EPO의 위치 24 및 위치 126에 해당하는 당화 부위에 배타적으로 부착된 2개의 수용성 중합체(G32)를 포함한다. 상세한 합성을 아래 설명한다.
A. GRFNP32로 GRFN1776 및 GRFN1711의 옥심화
옥심 형성은 케톤 카르보닐기를 갖는 펩티드에 아미노옥시아세틸기를 갖는 수용성 중합체가 부착하도록 수행하였다. 이를 성취하기 위해, 다음의 펩티드 단편을 합성하였다:
단편 SEP-1:4 (GRFN 1776; SEQ ID NO:2의 잔기 117에서 166으로 구성됨)
여기에서, Lys126은 ε-아미노기에서 레불린산으로 변형되고, Cys117은 Acm 보호된다.
단편 SEP-1:1 (GRFN 1711, SEQ ID NO:2의 잔기 1에서 32로 구성됨)
여기에서, Lys24는 레불린산 잔기로 변형된다.
실시예 1에서와 같이 단편 SEP-1:1(GRFN 1711)은 티오에스테르-생성 수지 상에서, 단편 SEP-1:4(GRFN 1776)는 -OCH2-Pam-수지 상에서 합성하였다. 이들 두 펩티드 단편의 리신 24 및 126은 ε-아미노기 부위에서 Fmoc기로 처음에 보호하였다. 사슬 회합의 완료 후, 표준 Fmoc 탈보호 방법에 따라 Fmoc-보유 아미노기를 탈보호하고, 각 펩티드 수지에 레불린산을 각각 부착함으로써 변형하였다. 다음에, 실시예 1에서 설명한 것과 같이 펩티드를 탈보호하고, 동시에 수지 지지체로부터 절단하였다. 예비 C4 역상 HPLC로 펩티드를 정제하였다. 순수한 펩티드를 함유한 부분을 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다. GRFNP32[-(EDA-Succ)18카르복실레이트]를 표준 프로토콜(Rose K. 등,미국 특허 출원 09/379,297; Rose 등, J Am Chem Soc. (1999) 121:7034)에 따라 Sasrin 카르복실-생성 수지 상에서 회합시켰다. 아미노옥시아세틸(AoA) 부분은 5배 과량의 활성화된 Boc-아미노옥시아세트산을 커플링함으로써 중합체의 N-말단 아미노기에 부착하였다. 전통적 Fmoc-화학법을 이용하여 수지 지지체로부터 중합체 사슬을 절단하였다. 중합체 사슬은 예비 C4 역상 HPLC로 정제하였다. 순수한 중합체를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위하여 모아서 동결건조하였다.
0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:4 및 GRFNP32를 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비-변형된 펩티드 및 비-반응된 중합체로부터 중합체-변형된 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화 생성물 SEP-1:4+GP32를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.
0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:1 및 GRFNP32를 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비-반응된 중합체로부터 중합체-변형 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화 생성물 SEP-1:1+GP32를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.
B. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L30의 합성
SEP-1-L30은 용액 중에서 다음 4개의 폴리펩티드 단편으로 합성하였다:
단편 SEP-1:1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32, SEQ ID NO:2의 잔기 1에서 32에 해당):
여기에서, Lys24는 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸(Lev-AoA) 옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변형된다.
단편 SEP-1:2 (GRFN 1712, SEQ ID NO:2의 잔기 33에서 88에 해당):
여기에서, Cys33은 Acm 보호된다.
단편 SEP-1:3 (GRFN 1713, SEQ ID NO:2의 잔기 89 내지 116에 해당):
여기에서, Cys89는 Acm 보호된다.
단편 SEP-1:4+GP32 (GRFN 1776 + GRFNP32, SEQ ID NO:2의 잔기 117에서 166에 해당):
여기에서, Lys126은 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸(Lev-AoA) 옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변형되고, C-말단 시스테인은 피콜릴(피코) 보호기를 갖는다.
추가적인 펩티드의 합성, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 접기 및 정제는 실시예 1에서 설명된 것과 같이 수행하여 전길이의 접힌 SEP-1-L30을 수득하였다. 접힌 단백질 생성물의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고 CD 분광분석법 역시 접힌 단백질의 존재를 예증하였다.
실시예 3
합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L26의 합성
제 3의 합성 적혈구생성 자극 단백질(SEP-1-L26으로 나타냄)을 SEP-0의 위치 24 및 126에 옥심-형성기를 함유하도록 합성하였다. 이 기를 SEP-1-L26을 형성하는데 사용하였는데, 여기에서 선형 중합체 (EDA-Succ)18카르복실레이트 및 (EDA-Succ)6-아미드는 옥심 연결을 통해 각각 위치 24 및 126에서 단백질 백본에 결합되어 있다. 전길이 SEP-1(1-166)의 서열은 다음과 같다:
여기에서, ψ는 술프히드릴기에서 카르복실메틸화된 시스테인으로 구성된 비-자생 아미노산 잔기를 표시하고, KOX는 옥심 결합을 통해 명시된 수용성 중합체와 커플링된 옥심 링커기로 ε-아미노기에서 화학적으로 변형된 비-자생 리신을 표시한다.
SEP-1-L30과는 반대로, SEP-1-L26 구성물은 위치 126에 부착된 더 작고 비-하전된 수용성 중합체를 갖도록 디자인한다. 위치 24에 부착된 중합체는 SEP-1L30에서와 동일하다. 전길이 생성물의 집합은 실시예 2에 설명된 것과 같다. SEP-1-L26의 구조를 도 18에 나타낸다.
A. GRFNP6으로 GRFN1776의 옥심화 및 GRFNP32로 GRFN1711의 옥심화
옥심 형성은 케톤 카르보닐기를 갖는 펩티드에 아미노옥시아세틸기를 갖는 수용성 중합체가 부착하도록 수행하였다. 이를 성취하기 위해, 다음의 펩티드 단편을 합성하였다:
단편 SEP-1:4 (GRFN 1776; SEQ ID NO:2의 잔기 117에서 166으로 구성됨)
여기에서, Lys126은 ε-아미노기에서 레불린산으로 변형되고, Cys117은 Acm 보호된다.
단편 SEP-1:1 (GRFN 1711, SEQ ID NO:2의 잔기 1에서 32로 구성됨)
여기에서, Lys24는 레불린산 잔기로 변형된다.
실시예 1에서와 같이 단편 SEP-1:1(GRFN 1711)은 티오에스테르-생성 수지 상에서, 단편 SEP-1:4 (GRFN 1776)는 -OCH2-Pam-수지 상에서 합성하였다. 이들 두 펩티드 단편의 리신 24 및 126은 ε-아미노기 부위에서 Fmoc기로 처음에 보호하였다. 사슬 회합의 완료 후, 표준 Fmoc 탈보호 방법에 따라 Fmoc-보유 아미노기를 탈보호하고, 표준 커플링 프로토콜에 따라 각 펩티드 수지에 레불린산을 각각 부착함으로써 변형하였다. 그 다음 실시예 1에서 설명한 것과 같이 Boc-화학법에 따라 펩티드를 탈보호하고 동시에 수지 지지체로부터 절단하였다. 예비 C4 역상 HPLC로 펩티드를 정제하였다. 각 펩티드에 대하여, 순수한 펩티드를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다.
수용성 중합체 (EDA-Succ)18카르복실레이트(GRFNP32)는 Sasrin 카르복시-생성 수지 상에서 표준 프로토콜(Rose, K. 등, 미국 특허 출원 09/379,297; Rose 등, J Am Chem Soc. (1999) 121:7034)에 따라 회합시켰다. 수용성 중합체 (EDA-Succ)6-아미드(GRFNP6)는 Sieber 아미드-생성 수지 상에서 표준 프로토콜(Rose, K. 등, 미국 특허 출원 09/379,297; Rose 등, J Am Chem Soc. (1999) 121:7034)에 따라 회합시켰다. 아미노옥시아세틸(AoA) 부분은 5배 과량의 활성화된 Boc-아미노옥시아세트산을 커플링함으로써 각 수지-결합 중합체의 N-말단 아미노기에 부착하였다. 두 중합체 사슬은 전통적 Fmoc-화학법을 이용하여 각 수지 지지체로부터 분리되도록 절단하였다. 각 중합체 사슬은 예비 역상 HPLC로 정제하였다. 각 중합체에 대하여, 순수한 중합체를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다.
0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:4 및 GRFNP6을 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비-변형된 펩티드 및 비-반응된 중합체로부터 중합체-변형된 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화 생성물 SEP-1:4+GP6을 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.
0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:1 및 GRFNP32를 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비-반응된 중합체로부터 중합체-변형 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화 생성물 SEP-1:1+GP32를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.
B. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L26의 합성
SEP-1-L26은 용액 내에서 다음 4개의 폴리펩티드 단편으로 합성하였다:
단편 SEP-1:1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32, SEQ ID NO:2의 잔기 1에서 32에해당):
여기에서, Lys24는 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸(Lev-AoA) 옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변형된다.
단편 SEP-1:2 (GRFN 1712, SEQ ID NO:2의 잔기 33에서 88에 해당):
여기에서, Cys33은 Acm 보호된다.
단편 SEP-1:3 (GRFN 1713, SEQ ID NO:2의 잔기 89에서 116에 해당):
여기에서, Cys89는 Acm 보호된다.
단편 SEP-1:4+GP32 (GRFN 1776 + GRFNP32, SEQ ID NO:2의 잔기 117에서 166에 해당):
여기에서, Lys126은 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸(Lev-AoA) 옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변형되고, C-말단 시스테인은 피콜릴(피코) 보호기를 갖는다.
추가적인 펩티드의 합성, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 접기 및 정제는 실시예 1에서 설명된 것과 같이 수행하여 전길이의 접힌 SEP-1-L26을 수득하였다. 접힌 단백질 생성물의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고 CD 분광분석법 역시 접힌 단백질의 존재를 예증하였다.
실시예 4
합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-B50의 합성
제 4의 합성 적혈구생성 자극 단백질(SEP-1-B50으로 나타냄)을 합성하였다. 전길이 SEP-1-B50의 아미노산 서열은 SEP-1-L50의 그것과 동일하다:
여기에서, ψ는 술프히드릴기에서 카르복실메틸화된 시스테인으로 구성된 비-자생 아미노산 잔기를 표시하고, KOX는 옥심 결합을 통해 명시된 수용성 중합체와 커플링된 옥심 링커기로 ε-아미노기에서 화학적으로 변형된 비-자생 리신을 표시한다.
그러나, SEP-1-L30의 선형 (Succ-EDA)18중합체를 갖기 보다는 오히려 4개의 선형 (Succ-EDA)12부분을 갖는 분기된 중합체 구성물로 단백질을 유도하였다. 옥심 연결을 통해 유도를 성취하였다.
도 19는 아래 상세히 설명된 옥심 형성 라이게이션을 통해 SEP-1-B50에 연결된 분기 수용성 중합체 GRFNP29(GP29)의 화학적 합성을 예시하는 도면이다. 도 19에 나타낸 대로, 직교하여 보호된 리신 U-B 선구물질을 사용하여 U 기로서 아미노옥시 아실을 지닌 U-B 성분 GRFN17(GP17)을 생성했으며, 이것은 숙신산 잔기에 의해 제공된 펜던트 카르복실레이트를 지니는 GP29로 표시된 선형 수용성 폴리아미드 에틸렌 옥시드 구성물에 티오에테르 결합을 통한 이후의 커플링을 위해 4개의 펜던트 티올기를 지닌 3X 리신 분기 중심 B를 가진다. 전길이 생성물의 회합을 실시예 2에 설명했다. SEP-1-B50의 구조를 도 20에 나타낸다.
A. 다수의 티올기를 갖는 주형 GRFNP17의 합성
주형 GRFNP17은 0.4mmol 규모로 아미드 생성 (4-메틸)벤즈히드릴아민(MBHA)-수지 상에서 수공으로 합성하였다. Fmoc-Lys(Boc)-OH는 표준 커플링 프로토콜(Sch-nolzer, M., Int J Pept Protein Res. (1992) 40:180-93)을 이용하여 커플링하였다. 2.1mmol 아미노산, 즉 5배 과량의 아미노산, 3.8ml 0.5M HBTU 중 10% DIEA를 사용하였다. Fmoc 보호기의 제거 후, Fmoc-Lys(Fmoc)-OH는 표준 아미노산 커플링 프로토콜을 이용하여 커플링하였다(2.1mmol 아미노산, 즉 5배 과량의 아미노산, 3.8ml 0.5M HBTU 중 10% DIEA). 제 2 Fmoc 제거 단계 후, Fmoc-Lys(Fmoc)-OH는 표준 아미노산 커플링 프로토콜을 이용하여 커플링하였다(4.2mmol 아미노산, 즉 자유 아민에 대해 5배 과량의 아미노산, 3.8ml 0.5M HBTU 중 10% DIEA). 최종 Fmoc 탈보호 단계 후, DMF 중(자유 아민에 대해) 5배 과량의 S-아세틸 티오글리콜산 펜타플루오로페닐 에스테르(SAMA-oPfp)를 30분 동안 커플링하였다. 순 TFA로 1분간 2회 세척하여 C-말단 리신 잔기 측쇄의 Boc 보호기를 제거한 후, DMF 중 10% DIEA로 세척하여 수지를 중화하였다. 2mmol Boc-아미노옥시아세트산 및 2mmol N-히드록시숙신이미드(NHS)를 3ml DMF에 용해하였다. 2mmol DIC(디이소프로필카르보디이미드)의 첨가 후, 30 내지 60분 동안 산을 활성화하였다. 중화된 수지에 용액을 첨가하고 1시간 동안 커플링하였다. 최종적으로, S-연결 아세틸기는 DMF 중 20% 피페리딘으로 30분 동안 제거하였다. 자유 알데히드에 대한 스캐빈져로서 시스테인이 존재하는 표준 Boc-화학법에 따라서 HF/p-크레졸을 이용하여 주형을 탈보호하고 동시에 수지 지지체로부터 절단하였다(Schnolzer, M., Int J Pept Protein Res. (1992) 40:180-93). 50% B[즉, 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴] 중 회수된 폴리아미드(알데히드 없음)를 냉동시키고 동결건조하였다. 정제를 위하여, 주형 조생성물을 2ml 50% B에 용해하고, 100ml 100% A[즉, 물 중 0.1% TFA]를 첨가하여 샘플을 희석하였다(알데히드의 첨가가 보증되기 때문에, 구아니디늄 클로라이드 및 아세테이트의 첨가는 피한다). 주형은 T=40℃, 3% B에서 평형화된 C4 예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하였다. 염을 등용매로 용리하고, 원하는 주형 GRFNP17을 선형 구배로 정제하였다. 원하는 생성물을 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후, 모아서 동결건조하였다.
B. 분기된 수용성 중합체 GRFNP29의 합성
15 kDa 분자량의 분기된 (EDA-Succ)12중합체인 GRFNP29를 정제된 티올-함유 주형인 GRFNP17 및 선형 중합체 GRFNP31, Br-아세틸-(EDA-Succ)12의 티오에스테르-생성 라이게이션으로써 합성하였다(Rose K. 등, 미국 특허 출원 09/379,297; Rose, 등, J Am Chem Soc. (1999) 121:7034).
(총 티올의) 1.3x 몰 과량의 정제된 GRFNP31, Br-아세틸화 (EDA-Succ)12, 및 정제된 티올-함유 주형 GRFNP17을 ~10mM 농도에서 pH8.7의 0.1M 트리스-HCl/6M 구아니디늄 클로라이드에 공동으로 용해시켰다. 용해 후, 0.1 M 트리스-HCl, pH 8.7 완충액으로 3배(v/v) 희석하였다. 실온에서 라이게이션 혼합물을 교반하고 역상 HPLC 및 ES-MS로 반응을 모니터링하였다. 원하는 반응 생성물이 주된 생성물일 때까지 추가적인 GRFNP31 반응물을 필요 기준만큼 첨가하였다. 정밀검사를 위해, pH 4인 3x(v/v, 라이게이션 혼합물에 대해) 0.1M 아세테이트/6M 구아니디늄 클로라이드를 첨가하고, 용액을 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고, 선형 구배로 정제하였다. 순수한 GRFNP29 구성물을 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 모아서 동결건조하였다.
C. GRFNP29로 GRFN1776 및 GRFN1711의 옥심화
단편 SEP-1:4 및 단편 SEP-1:1은 실시예 2에서 설명된 것과 같이 합성하였다. 단편 SEP-1:4 및 GRFNP29는 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 동분자 비율로 공동으로 용해시켰다. 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말은 예비 역상 HPLC 컬럼(지름 1 인치)상에 로딩하였다. 중합체-변형 펩티드는 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비-변형 펩티드 및 비-반응 중합체로부터 분리하였다. 원하는 옥심화 생성물 SEP-1:4+GP29를 함유한 부분은 ES-MS로 식별하여 모았다.
단편 SEP-1:1 및 GRFNP29는 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 용액을 냉동하고 동결건조하였다. 건조된 분말을 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 예비 GPC(겔 침투 크로마토그래피) 컬럼(지름 1인치)상에 로딩하였다. 등용매 용리로서 비-변형 펩티드 및 비-반응된 중합체로부터 중합체-변형 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화 생성물 SEP-1:1+GP29를 함유한 부분은 ES-MS로 식별하여 모았다.
D. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-B50의 합성
SEP-1-B50(SEQ ID NO:2)은 다음 4개의 폴리펩티드 단편으로 용액 중에서 합성하였다.
단편 SEP-1:1+GP29 (GRFN 1711 + GRFNP29, SEQ ID NO:2의 잔기 1에서 32에 해당):
여기에서, Lys24는 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸(Lev-AoA) 옥심 결합을 통해 GRFNP29에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변형된다.
단편 SEP-1:2 (GRFN 1712, SEQ ID NO:2의 잔기 33에서 88에 해당):
여기에서, Cys33은 Acm 보호된다.
단편 SEP-1:3 (GRFN 1713, SEQ ID NO:2의 잔기 89에서 116에 해당):
여기에서, Cys89는 Acm 보호된다.
단편 SEP-1:4+GP29 (GRFN 1776 + GRFNP29, SEQ ID NO:2의 잔기 117에서 166에 해당):
여기에서, Lys126은 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸(Lev-AoA) 옥심 결합을 통해 GRFNP29에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변형되고, C-말단 시스테인은 피콜릴(피코) 보호기를 갖는다.
추가적인 펩티드의 합성, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 접기 및 정제는, 정제를 Resource Q 컬럼상에서 한 것을 제외하고는, 실시예 1 및 2에서 설명된 것과 같이 수행하여 전길이의 접힌 SEP-1-B50(SEQ ID NO:2)을 수득하였다. 접힌 단백질 생성물 SEP-1-B50의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고 CD 분광분석법 역시 접힌 단백질의 존재를 예증하였다.
실시예 5
합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-3-L42의 합성
제 5 합성 적혈구생성 자극 단백질(SEP-3-L42로 표시)을 합성하였다. 전길이 SEP-3 단백질의 아미노산 서열은 다음과 같다:
위치: 24, 38, 83 및 126에 있는 시스테인 잔기는 SEP-3-L42를 형성하도록(미카엘 부가 반응을 통하여) 말레이미드-기능화된 (EDA-Succ)18(GRFNP32) 중합체 단위로써 변형하였다. SEP-3-L42의 구조를 도 22에 나타낸다.
아래 설명된 SEP-3-L42의 화학적 합성을 예시하는 도면을 도 21에 나타낸다. 간단히, 도 21A 및 21B는 SEP-3:4를 통한 4개의 SEP-3-L42 펩티드 세그먼트 SEP-3:1의 자생 화학적 라이게이션을 나타내며, 이것은 사람 EPO의 모든 4개 자생 당화 부위에 해당하는 라이게이션 부위에서 시스테인을 생성한다. 특히, 도 21B는 미카엘 부가 반응을 통한 시스테인 라이게이션 부위에서 4개의 하전된 선형 수용성 중합체(GRFN32-말레이미드(GP32-말레이미드)로 표시)의 부위-특이적 부착을 허락하는, 보호된 모든 이황화물-형성 시스테인을 갖는 전길이 폴리펩티드를 나타낸다. 또한, 도 21B는 이황화물-형성 시스테인의 최종 탈보호 단계, 및 전길이 중합체-변형 생성물의 생성을 나타낸다.
상세히 말해서, SEP-3은 다음 4개의 폴리펩티드 단편으로 용액 중에서 합성하였다:
단편 SEP-3:1 (GRFN 1747, SEQ ID NO:3의 잔기 1에서 37에 해당)
여기에서, Cys7, Cys29및 Cys33은 Acm 보호된다.
단편 SEP-3:2 (GRFN 1774, SEQ ID NO:3의 잔기 38에서 82에 해당)
여기에서, Cys38은 Acm기로 보호된 측쇄이다.
단편 SEP-3:3 (GRFN 1749, SEQ ID NO:3의 잔기 83에서 125에 해당)
여기에서, Cys83은 Acm기로 보호된 측쇄이다.
단편 SEP-3:4 (GRFN 1750, SEQ ID NO:3의 잔기 126에서 166에 해당)
여기에서, Cys161은 Pbo[즉, 4-(CH3S(O)-)벤질-] 보호된다.
펩티드 합성
펩티드 SEP-3:1 및 SEP-3:2 및 SEP-3:3은 실시예 1에서 설명된 것과 같이 확립된 측쇄 보호 전략을 이용하여, 위의 특정 펩티드에서 언급된 것과 같이 보호기에 변화를 주어, Boc 화학 SPPS를 위한 인시투 중성화 프로토콜로써 티오에스테르-생성 수지 상에서 합성하였다. 단편 SEP-3:4는 -OCH2-Pam-수지 상에서 유사하게 합성하였다. 실시예 1에서 설명된 것과 같이 펩티드를 탈보호하고 동시에 수지 지지체로부터 절단하였다. 위에 설명된 결과적 펩티드는 예비 RP-HPLC로 정제하였다. 순수한 펩티드를 함유한 부분은 ES-MS를 사용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위하여 모아서 동결건조하였다.
단계 1: 라이게이션 #1
단편 SEP-3:4 및 단편 SEP-3:3을 15mM 농도로 TFE에 용해하였다. 6M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 표준 인산 완충액(pH 7.5)을 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻었다. 라이게이션 후, 라이게이션 혼합물(1 부피로 정의)을 {2ml TFE, 6ml 6M 구아니디늄 클로라이드 및 25% β-메르캅토에탄올을 함유한 100mM 인산}의 용액 2 부피에 첨가하고, 20분 동안 인큐베이션 하였다. 빙초산에 용해된 15mg/ml TCEP의 용액으로 용액을 산성화한 후, 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고, 선형 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 생성물 SEP-3:Acm+SEP-3:3+SEP-3:4를 함유한 부분을 ES-MS로써 식별한 후 모았다.
단계 2: Acm-제거 #1
Acm 제거를 위하여, SEP-3:Acm+SEP-3:3+SEP-3:4의 모아진 부분을 함유한 액체 아세토니트릴 용액을 HPLC 등급수로 1x로 희석하고, 최종 농도 2몰이 되도록 고체 유레아를 첨가하였다. 3% 수성 아세트산에 용해된(총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 3배 몰 과량의 30mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고, 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-메르캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계적 구배로 정제하였다. 원하는 생성물 SEP-3:3+SEP-3:4를 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하룻밤 동안 동결건조하였다.
단계 3: 라이게이션 #2
순 TFE에 같은 양의 SEP-3:3+SEP-3:4 및 SEP-3:2를 15mM 농도에서 공동으로 용해하였다. 6M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 250mM 인산 완충액(pH 7.5)을 첨가하여, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻는다. 하루 동안 라이게이션한 후, 라이게이션 혼합물(1 부피로 정의)을 10ml TFE, 10ml β-메르캅토에탄올, 10ml 피페리딘 및 20ml 6M 구아니디늄의 pH 4 용액 2 부피에 첨가하고, 남아 있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산에 용해된 15mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 선형 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 생성물 SEP-3:Acm+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4를 ES-MS로 식별하고 하룻밤 동안 동결건조하였다.
단계 4: Acm 제거
Acm 제거를 위하여, SEP-3:Acm+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4의 모아진 부분을 함유한 수성 아세토니트릴 용액은 HPLC 등급수로써 1x로 희석하고, 고체 유레아를 첨가하여 최종 농도를 2몰로 하였다. 3% 수성 아세트산에 용해된(총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 3배 몰 과량의 30mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-메르캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계적 구배로 정제하였다. 원하는 생성물 SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-피코를 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하룻밤 동안 동결건조하였다.
단계 5: 라이게이션 #3
순 TFE에 같은 양의 SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4 및 SEP-0:1을 15mM 농도에서 공동으로 용해하였다. 6M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 250mM인산 완충액(pH 7.5)을 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻는다. 하루 동안 라이게이션한 후, 라이게이션 혼합물(1 부피로 정의)을 10ml TFE, 10ml β-메르캅토에탄올, 10ml 피페리딘 및 20ml 6M 구아니디늄 클로라이드의 pH 4 용액 2 부피에 첨가하고, 남아 있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산에 용해된 15mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 선형 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 생성물 SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4을 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하룻밤 동안 동결건조하였다.
단계 6: 중합체 GRFNP32의 부착
GRFNP32-말레이미드라 불리우는 말레이미드-기능화된 선형 (EDA-Succ)18중합체를 제조자의 프로토콜에 따라서 BMPS(3-말레이미도 프로피온산 NHS 에스테르, Pierce, 미국A)로 GRFNP32를 기능화시킴으로써 말레이미드-기능화된 (EDA-Succ)18중합체(즉, 말레이미드-(EDA-Succ)18)를 형성하도록 제조하였다. 필요한 TFE의 최소량에 SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4를 용해하였다. 3배 과량의 GRFNP32-말레이미드를 6M 구아니디늄 클로라이드, 100mM 인산, pH 7.5에 용해시키고 TFE 용액에 첨가하였다. 미카엘 부가 반응 과정 후, 분석적 역상 HPLC를 행하였다. 반응을 완료한 후, 용액을 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 선형 구배로 정제하였다. 원하는 중합체-변형 생성물 SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+pPEG [즉, Cys24, Cys38, Cys83및 Cys126의 측쇄 티올에 부착된 GRFNP32의 4개의 카피를 갖는 라이게이션된 전길이 166개 잔기 폴리펩티드 사슬, 그러므로 SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32라고도 함]를 ES-MS로 식별하고 하룻밤 동안 동결건조하였다.
단계 7: Pbo 제거
Pbo 제거를 위하여, SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32의 동결건조된 분말을 5% 에탄디티올을 함유한 순 TFA에 용해하였다. 그 다음 Pbo기는 30분 동안 10% 티오아니졸 및 15% 브로모트리메틸실레인을 첨가함으로써 절단하였다. 용액을 회전-증발기에서 건조시키고 0.1% TFA를 함유한 수성 아세토니트릴에 녹였다. 결과 용액은 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 단계적 구배로 정제하였다. 원하는 Cys161-탈보호 생성물인 SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32-Pbo를 함유한 부분은 ES-MS로 식별하고 하룻밤 동안 동결건조하였다.
단계 8: Acm 제거
Cys7, Cys29 및 Cys33의 측쇄로부터 최종 Acm의 제거를 위하여, SEP-3:Acm+ SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32의 모아진 부분을 함유한 수성 아세토니트릴 용액을 HPLC 등급수로써 1x로 희석하고, 고체 유레아를 첨가하여 최종 농도가 2몰이 되게 하였다. 3% 수성 아세트산에 용해된(총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 3배 몰 과량의 30mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-메르캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 중합체-변형 생성물 SEP-3(1-166)을 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하룻밤 동안 동결건조하였다.
단계 9: 접기
전길이 라이게이션 중합체-변형 펩티드 SEP-3(1-166)은 6M 구아니디늄 클로라이드 및 20% TFE 및 10배 과량(SEP-3 내 Cys 잔기에 대해)의 시스테인을 함유한 200mM 트리스 완충액(pH 8.7)에 용해시켰다. 3M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200mM 트리스 완충액(pH 8.7)에 대하여 이 용액을 실온에서 하룻밤 동안 투석하였다. 그 다음 1M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200mM 트리스 완충액(pH 8.7)에 대하여 용액을 4℃에서 4시간 동안 투석하고, 최종적으로 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 4℃에서 4시간 동안 투석하여 최종 접힌 생성물을 수득하였다. 전자분무 ES-MS 및 CD 분광분석법으로 확인하였다.
단계 9: 정제
접힌 폴리펩티드를 센트리콘 농축기 바이알에서 5x로 농축하고 10mM 인산, pH 7.0로 평형화된 Resource S 양이온 교환 컬럼 상에 로딩하였다. 접힌 단백질을 선형 염 구배에서 500mM NaCl로 10분 동안 용리하였다. 원하는 접힌 생성물 SEP-3-L42(1-166)를 함유한 부분을 SDS-PAGE로 식별한 후, 냉동하여 -80℃에 저장하였다.
실시예 6
합성 적혈구생성 자극 단백질의 생물활성 분석
접힌 합성 적혈구생성 자극 단백질, SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, 및 SEP-3-L42의 생물활성은 대조표준으로서 시중 재조합 에리트로포에틴을 사용한 인자-의존 세포주 증식 분석에서, UT/7 및 32D 103197 세포주를 이용하여 측정하였다. UT/7은 성장 및 생존을 위해 인터류킨-3, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 또는 에리트로포에틴에 절대적인 의존성을 갖는 사람 거대핵모세포성 백혈병 세포주이다(Miura Y, 등, Acta Haematol (1998) 99:180-184; Komatsu N, 등, Cancer Res. (1991) 51:341-8). 32D 103197는 쥐의 조혈 세포주이다(Metcalf, D. Int J Cell Cloning (1992) 10:116-25).
SEP 구성물의 원액은 Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM), 10% FBS(소태아 혈청), 글루타민 및 Penstrep으로 제조하였고, 이 원액의 연속된 2x 희석액을 사람 UT/7 EPO 세포가 5000 세포/50㎕의 농도로 첨가된 멀티-웰 플레이트에 첨가하였다. 5% CO2존재하에 37℃에서 플레이트를 인큐베이션하고 성장에 대해 매일 모니터링 하였다. 4일 후, PBS (인산 완충 살린) 중 20㎕ 2.5mg/ml MTT(메틸티아졸 테트라졸륨)을 첨가하고, 4시간 동안 플레이트를 인큐베이션하였다. 150㎕ IPA를 첨가하고 562nm에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다. SEP 화합물에 대한 ED50(최대 효과의 50%에 도달하기 위한 효과량) 수치를 측정하고, CHO(중국 햄스터 난소)-세포 생산된 rhEPO(재조합 사람 에리트로포에틴)의 그것과 비교하였다. 이 실험으로부터 나온 결과는 모든 합성 적혈구생성 자극 단백질이 생물활성을 나타낸다는 것을 예시하였다. SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30 및 SEP-1-B50에 대한 ED50 결과는 표 VI에 나타난다.
중합체-변형 SEP-1-L30에 대한 흡수에 의한 단백질 농도를 계산하기 위한 소멸 계수만을 사용하는 펩티드 함량에 대해 정상화(표준화)될때, 이들 실험으로부터의 추가적인 결과가 표 VII 및 SEP-0, SEP1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, SEP-3-L42, 및 SEP-1-B51(SEP-1 B51 화합물의 합성은 하기 실시예 7에 기술되어 있다)에 대한 도 28에 나와있다. 집합적으로, 시험관내 분석에서 이들은 시험관내 생물활성에서 중합체 구조와 부착의 위치를 바꾸는 차별적인 효과를 나타내고, 여기서 이들 화합물은 하기의 효능의 상대 순서를 가진다: (1) 사람 EPO 수용체 활성(가장 유력한 것에서부터 가장 적게 유력한 것까지)에 대해 실험할때: SEP-1-L26 SEP-1-L30 > SEP-1-B50 SEP-1-B51 > SEP-3-L42 > SEP- 0; (2) 마우스 EPO 수용체 활성(가장 유력한 것에서부터 가장 적게 유력한 것까지)에 대해서: SEP-1-L26 > SEP-1-L30 > SEP-0 > SEP-3-L42 > SEP-1-B50 ~ SEP-1-B51.
표 VIl 및 도 28 에서의 결과는 또한 비-중합체-변형 구조 SEP-0와 비교하여 중합체-변형 SEP 구조에 대한 수용체 선호에 있어서, 상당한 차이를 나타낸다. 특히, SEP-1-L26은 대응하는 사람 EPO 당화 부위 위치 24(이 부위에 부착된 펜던트 음전하를 갖는 5.5kDa 선형 중합체) 및 위치 126(이 부위에 부착된 펜던트 중성전하를 갖는 1.8kDa 선형 중합체)에 부착된 다른 선형 중합체로 변형된다; 이 구조는 사람과 마우스 수용체 모두에 대해 유사한 활성을 가졌다. SEP-1-L30는 대응하는 사람 EPO 당화 부위 위치 24와 126에서 펜던트 음전하를 갖는 5.5kDa 선형 중합체로 변형된다; 이 구조는 사람 수용체에 대해 마우스 수용체와 비교하여 약 5X 보다 활성이었다.
대응하는 사람 EPO 당화 부위 위치 24, 38, 83 및 126에서 펜던트 음전하를 갖는 5.5kDa 선형 중합체로 변형된 SEP-3-L42는 마우스 수용체와 비교하여 사람 수용체에 대해 약 10X 더 활성이다. 가장 큰 차이는 SEP-1-B50 및 SEP-1-B51에서 관찰되었고, 그것은 대응하는 사람 EPO 당화 부위 위치 24 및 126에 부착된 분기상 음으로 하전된 15kDa 중합체로 변형되고, 대략 5(사람 EPO에 유사)의 pl을 가진다; 이들 두 구조는 마우스 수용체에 비하여 사람 수용체에 대해 60X 보다 활성이었다.
마우스 EPO가 사람 EPO 위치 126에 대응하는 위치에서 당화 부위를 잃고 있기 때문에(마우스 EPO는 사람 EPO에서 발견된 O-당화 세린을 대신하여 비-당화 프롤린을 가진다), 변형된 수용체 활성은 부분적으로 이 차이 때문일 수 있고, 따라서 EPO에 대한 마우스 수용체의 선호는 대응하는 위치 126에서 O-결합된 당화를 잃고 있다. 이것은 SEP-1-L26 및 SEP-1-L30을 SEP-1-B50 및 SEP-1-B52에 비교하는 것과 함께 일치한다. 예를 들어, SEP-1-L30는 위치 126에서 5.5kDa 음으로 하전된 중합체를 가지는 반면, SEP-1-L26는 위치 126에서 1.8kDa 하전되지 않은 중합체를 가진다. 비록 등가의 활성이 사람 EPO 수용체에 대해 관찰되었지만, 마우스 EPO 수용체에 대해 4배 차이가 발견되었다. 가장 큰 차이가 대응하는 사람 EPO 당화 부위 위치 126에 부착된 음으로 하전된 15kDa 중합체와 함께, SEP-1-B50 및 SEP-1-B51 구조에 대해 발견되었다. 사람 EPO에서 모든 4개 음 당화 위치에 대응하는 5.5kDa 음으로 하전된 중합체의 첨가는, 즉 SEP-3-L42 구조를 갖는 24, 38, 83 및 126에서와 같이 마우스에 대한 감소된 선호를 보다 더욱 감소시켰지만, SEP-1-B50 및 SEP-1 B51 구조 미만이었다. 이들 결과는 수용체-특이성이 생물학적으로 제조된 당화 부위에 대응하는 부위의 정확한 변형, 당화 단백질에 의해 그리고 크기, 분기의 성질 및 중합체의 전하에 의해 조절될 수 있다.
실시예 7
적혈구생성 자극 단백질 SEP-1 B51의 합성
A. SEP-1-B51의 조성물
6번째 합성 적혈구생성 자극 단백질(SEP-1-B51 명시)이 합성되었다. 전길이SEP-1-B51의 아미노산 서열이 SEP-1-B50의 것과 동일하다:
여기서, ψ는 술프히드릴 기에서 카르복실메틸화 되는 시스테인으로 구성되는 비-자생 아미노산 잔기를 나타내고, Kox는 옥심 결합을 통해 명시된 수용성 중합체에 결합된 옥심 링커기로 ε-아미노기에서 화학적으로 변형되는 비-자생 리신을 나타낸다.
그러나, SEP-1-B50에 대조적으로, 단백질은 리신 분기 중심에 대한 아미드 결합을 통해 커플링된 단백질을 4개 선형 (Succ-TTD)12-Succ-알라닌-OH[즉, (Succ-TTD)12-Succ-Ala-OH, 또는 (Succ-TTD)12-Succ-Ala] 중합체를 갖는 분기상 중합체 구조로 유도되었다. 아미노 결합을 통한 분기 중심으로 선형 중합체의 커플링은 안정성을 향상하도록 설계되었다. 4개의 선형 중합체는 또한 살리실산을 의태하는 음전하 및 아닐린과 카르보히드레이트 사슬의 펜던트 당부분과 유사한 소수성 특성과 함께, 아닐린 부분 및 펜던트 음전하를 운반하도록 설계된다. 분기상 중합체는 또한 분기 중심 주형의 합성 및 취급 특성을 개선하기 위해 그리고 단백질 백본에 대한 당 부착 부위와 카르보히드레이트의 첫번째 분기 포인트 사이에 자생의 카르보히드레이트 사슬에서 발견된 스페이서를 의태하기 위해, 분기 중심과 단백질 백본 부착 부위 사이에 수용성 스페이서를 갖도록 설계되었다.
도 23은 하기한 바와 같이 SEP-1-B51에 결합되었던 화학적 합성의 분기 수용성 중합체 GRFNP41(GP41)의 화학적 합성을 나타내는 도면이다. 전길이 생성물의 회합은 실시예 2에서 기술한 바와 같았다. SEP-1-B51의 구조는 도 24에 나와있다.
B. 분기 주형(GRFNP40)에 결합시키기 위한 (Succ-TTD) 12 Succ-AlaOtBu(GRFNP 39)의 합성
선형 중합체 (Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)는 Sasrin 산 라빌레, 카르복실산-생성 수지에서 0.5몰 규모로 합성되었다. 0.5몰(-0.5g) Sasrin 산 불안정, 카르복실산-생성 폴리스티렌 수지(히드록실 치환 1.02몰/g)을 15분 동안 DMF에서 팽창시켰고, 그 후 배출시켰다. 이 히드록실-기능화 수지에, 500마이크로리터 (3.9몰) DIEA(디이소프로필에틸아민)를 함유한 8ml의 DMF에 용해된 450mg(4.5mmol) 무수 숙신산 및 488mg(4mmol) 4-(디메틸아미노)피리딘을 첨가하고, 소용돌이 교반으로 30분 동안 반응시키고 배출시켰다. 커플링은 반복되었고, 과잉의 반응물과 가용성 공생성물을 DMF(~50ml)로 1분간 소용돌이 흐름 세척으로 제거하였고, 그 후 배출시켰다. HOOC-CH2CH2CO-O-수지(0.5mmol)는 DMF 중의 8ml의 신선한 1.0M(8mmol) CDI(카르보닐디이미다졸) 용액을 첨가함으로써 활성화되었고, 40분간 반응시켰고, 그 후 배출되었다. 과잉의 반응물 및 가용성 공생성물을 DMF(-50ml)으로 1분간 소용돌이 흐름 세척으로 제거하고 그 후 배출하였다. DMF에 용해된 4ml 0.5M(2mmol) HOBT 용액 중의 4ml(4g, 18.2mmole) (4,7,10)-트리옥사트리데칸-1,13-디아민(TTD)을 첨가하고 30분 동안 소용돌이 교반으로 반응시키고, 그 후 배출하였다. DMF(-50ml)으로 1분간 소용돌이 흐름 세척에 의해 과잉의 반응물 및 가용성 공생성물을 제거하고, 그 후 배출하였다. 500마이크로리터(3.9mmole) DIEA를 함유하는 8ml의 0.5M(4mmole) HOBT(N-히드록시벤조트리아졸) 용액에 용해된 무수 숙신산(450mg, 4.5mmole)를 수지에 첨가하고 15분 동안 소용돌이 교반으로 반응시키고, 그 후 배출하였다. 이 3개 단계(CDI 활성화; TTD 커플링; 숙신 안히드리드 반응)를 11회 반복하였다[즉, 총 12회]. 과잉의 반응물 및 가용성 공생성물을 DMF(-50ml)으로 1분간 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거하였고, 배출하였다. HOOC-CH2CH2CO(TTD-숙시닐)12-O-수지(0.5 mmole)을 DMF 중의 8ml의 신선한 1.0M(8 mmole) CDI 용액으로 활성화시키고 40분 동안 반응시켰고 그 후 배출하였다. 과잉의 반응물 및 가용성 공생성물은 DMF(-50ml)으로 1분의 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거되었고, 그 후 배출시켰다. 2.5mmole H-AlaOtBu.HCl을 150마이크로리터(111mg, 0.825mmole) DIEA를 함유하는 DMF 중의 4.75ml 0.5M(2.375mmole) HOBT에 용해시키고, 소용돌이 교반하면서 1시간 동안 CDI-활성화된 HOOCCH2CH2CO(TTD-숙시닐)12-0-수지(0.5 mmole)로 반응시키고 그 후 배출하였다. 과잉의 반응물 및 가용성 공생성물을 DMF(-50ml)으로 1분간 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거하고, 그 후 배출하였다. 생성물인 tert-BuOOC-CH(CH3)-NH-OC-CH2CH2CO(TTD-숙시닐)12-O-수지를 DCM(디클로로메탄)으로 광범위하게 세척하고 배출시키고, 그 후 수지를 진공하에서 일정한 중량으로 건조시켰다. 전형적인 생성물-수지의 중량은 약 2g이었다.
선형 (Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu 중합체는 DCM 중의 4% TFA를 사용하여 Fmoc-화학 과정에 따라 수지 지지체로부터 절단되었다. 침전된 미정제 생성물은 50% 수성 아세토니트릴 중에 용해되었다. 동결건조된 중합체는 0.1% TFA를 함유하는 소량의 50% 수성 아세토니트릴에 용해되었고, 희석시켜 유기물의 농도를 1% 미만으로 낮췄다. 미정제 생성물은 3% B에서 T=40℃에서 평형화된 C4 예비 역상 칼럼 상에 로딩하였다. 염은 등용매적으로 용출되었고, 원하는 주형을 60분에 걸쳐서 20-35% 완충액 B(0.1% TFA을 함유하는 아세토니트릴) 대 0.1% 수성 TFA의 선형 구배로 정제하였다. 원하는 (Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu 물질(GRFNP39)을 함유하는 분율을 ES-MS에 의해 확인하였고, 냉동 및 동결건조되었다.
C. 분기화를 위한 다중 아민기를 운반하는 주형과 합성 단백질(GRFNP40)에 (나중) 부착을 위한 보호된 아미노옥시기의 합성
주형 GRFNP40을 상호적으로 0.4mmol 규모로 Sieber 아미드-생성 수지에서 합성하였다. 모든 커플링 사이에 DMF로 1분 흐름 세척 단계, 탈보호 및 활성화 단계가 있었다. 2mmol N-Fmoc-N(Boc-아미노옥시아세틸)-L-디아미노프로피온산을 30 분 NHS-에스테르 전-활성화를 사용하여, DCM/DMF(디메틸포름아미드) 중의 2mmol DIC 및 2mmol NHS로 1시간 동안 수지에 커플링시켰다. Fmoc 보호기의 제거(2x3분, DMF 중의 20%v/v 피페리딘)와 세척 후에, 2.2mmol DlEA를 함유하는 8ml의 0.5M HOBT(N-히드록시벤조트리아졸) 용액에 용해된 4mmol 무수 숙신산을 수지에 10분 동안 커플링시켰다. 이 단계 후, 카르복실기는 DMF 중의 8ml의 신선한 0.5M(4mmole)CDI 용액으로 활성화하였다. 4ml(18.2mmole) TTD를 DMF 중의 4ml 0.5M HOBT 용액에 첨가하고 30분 동안 커플링하였다.
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(2mmol)를 생성된 아미노-TTD-Succ-Dpr(BocAoA)-수지(여기서, Dpr=디아미노프로피온산)에 DMF 중의 2mmol DIC 및 2mmol NHS로 30분의 전-활성화 및 1시간 동안의 커플링을 사용하여 커플링하였다. 이러한 커플링은 1회 반복되었다. Fmoc 제거 단계 후(2x3분, 20%v/v DMF 중의 피페리딘), 4mmol Fmoc-Lys (Fmoc)-OH를 상기한 바와 같이 재커플링을 포함하여, 커플링하였다. 최종 Fmoc 보호 단계 후(2x3분, 20%v/v DMF 중의 피페리딘), 주형을 DCM 중의 4% TFA를 사용하여 표준 Fmoc-화학 과정에 따라 수지 지지체로부터 절단하였다. 침전된 생성물을 0.1% TFA을 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 동결건조시켰다. 동결건조된 미정제 생성물은 0.1% TFA를 함유하는 소량의 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고, 희석시켜 유기물의 농도를 1% 미만으로 낮췄다. 주형은 3% B에서(아세토니트릴 중의 0.1% TFA) T=40℃에서 평형화된 C4 예비 역상 칼럼 상에 로딩하였다. 염과 다른 비아미드 물질은 등용매로 용출되었고, 원하는 주형은 60분에 걸쳐서 5-12% 완충액 B(0.1% TFA을 함유하는 아세토니트릴) 대 0.1% 수성 TFA의 선형 구배로 정제하였다. 원하는 Lys-Lys(Lys)-TTD-Succ-Dpr(BocAOA).아미드 물질(GRFNP 40)을 함유하는 분율은 ES-MS에 의해 확인되었고, 냉동 및 동결건조되었다.
D. 아미드-커플링된 분기상 중합체(GRFNP41)의 회합 및 탈보호
GRFNP41인 분기 (TTD-Succ)49-16kD 분자량의 중합체는 GRFNP39[(Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu]를 정제된 주형 GRFNP40에 커플링함으로써 합성되었다. 60℃에서 20mg/ml의 농도로 DMSO(디메틸술폭시드)에 용해된 정제된 (Succ-TTD)12-Succ-AlaOt-Bu(GRFNP39)(1.0mmole)는 20배(몰) 과량의 DIEA의 존재하에서 0.95mole의 DMSO 중의 HATU{0-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트}로 10mg/ml의 농도에서 활성화되었다. 3.9mg/ml의 농도에서 DMSO에 용해시킨 정제된 주형 GRFNP40(0.24mole)을 즉시 첨가하였다. 반응 과정은 C4 분석 역상 HPLC 및 ES-MS에 의해 모니터링되었다. 전형적으로, 커플링은 몇분내에 완료되었다. 마무리를 위해, 4 부피(라이게이션 혼합에 비례하여)의 0.1M 나트륨 아세테이트/6M 구아니디늄 클로라이드, pH 4를 첨가하고, 용액을 예비 (C4) 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하였다. 염과 다른 비아미드 함유 물질은 등용매로 용출되었고, 원하는 분기상 중합체 생성물은 80분 내에에 20-35% 완충액 B(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴) 대 0.1% 수성 TFA의 선형 구배로 정제하였다. 원하는 물질을 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고, 냉동 및 동결건조되었다.
생성된 정제된 중합체는 순수한 TFA 1mg/ml의 농도에서 1시간 동안 용해되어 아미노옥시아세틸 부분으로부터 Boc 기를 제거하고, -Ala-OtBu 부분으로부터 tert-Butyl 에스테르 기를 제거하였다. 용액을 회전 증발기에서 회전시켜 건조하고, 건조한 중합체를 50% 완충액 B(0.1% TFA을 함유하는 아세토니트릴)에 용해하였다. 아미노옥시아세트산(a.k.a. '카르복시메톡실아민')을 0.5M의 최종 농도로 첨가하여 애덕트-형성 불순물을 소기하였다. 20분 후에, 용액을 3.3 부피의 완충액 A(물 중의 0.1% TFA)로 희석하고, 예비 C4 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하고, 모든 아미노옥시아세트산이 제거될 때까지 10% 완충액 B에서 펌핑하였고, 그 후 중합체는 80분에 걸쳐 15% 내지 45% 완충액 B 대 0.1% 수성 TFA의 단계적 구배로 정제되었다. 원하는 분기된 중합체 물질(GRFNP41)을 함유하는 모아진 부분은 냉동되고 동결건조되었다.
E. 분기된 중합체 GRFNP41으로 펩티드 단편 GRFN1776 및 GRFN1711의 옥심 형성 라이게이션(옥심화)
실시예 1에서 상기한 바와 같이 표준 인시투 중화 Boc 화학 SPPS를 사용하여 세그먼트 SEP-1:4(GRFN1776, SEQ ID NO:2의 잔기 117-166와 세그먼트 SEP-1:1으로 구성됨) 및 SEQ ID NO:2의 잔기 1-32로 구성된 GRFN1711을 합성하였다. 펩티드 GRFN1776를 또한 상기한 바와 같은 표준 프로토콜을 따라 OCH2-Pam-수지에서 합성하였다. 펩티드 GRFN1711를 상기한 바와 같은 표준 프로토콜을 따라 티오에스테르-생성 수지에서 합성하였다. Lys126에서 레불린(레불린) 아실 부분을 함유하는 세그먼트 GRFN1776 및 AoA-함유 GRFNP41는 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에서 같은 분자 비율로 함께 용해되었다. 용액은 동결건조하였다. 건조된 분말 미정제 생성물은 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에서 재용해시키고 예비 역상 (C4) HPLC 칼럼 상에 로딩하였다. 중합체-변형 펩티드는 예비 구배 역상 HPLC에 의해 변형되지 않은 펩티드와 반응하지 않은 중합체로부터 분리되었다. 원하는 옥심-연결(옥심화) 생성물 SEP-1:4+GP41을 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고 모아지고 동결건조하였다.
Lys24에서 레불린 아실 부분을 함유하는 세그먼트 GRFN1711 및 AoA-함유 GRFNP41를 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에 함께 동일한 몰비율로 용해하였다. 용액을 냉동시키고 동결건조시켰다. 건조된 분말을 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에서 재용해시키고 C4 예비 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하였다. 중합체-변형 펩티드는 예비 구배 역상 HPLC에 의해 변형되지 않은 펩티드와 반응하지 않은 중합체로부터 분리되었다. 원하는 옥심-연결(옥심화) 생성물 SEP-1:4+GP41을 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고 모아지고 동결건조하였다.
F. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1 B51의 합성
SEQ ID NO : 2을 갖는 SEP-1-B51를 4개의 폴리펩티드 단편으로부터 용액 중에서 합성하였다:
단편 SEP-1:1+GP41 (GRFN 1711+GRFNP41; SEQ ID NO:2의 잔기 1에서 32에 해당):
여기서, Kox로 나타낸 Lys24은 레불린 아실 펜던트 부분 옥심-중합체 GRFNP41에 연결되고, His32은 Dnp 보호된다.
세그먼트 SEP-1:2 (GRFN 1712; SEQ ID NO:2의 잔기 33에서 88에 해당):
여기서, Cys33은 Acm 보호되고, 3개 Trp 잔기는 포르밀 보호된다.
세그먼트 SEP-1:3 (GRFN 1713; SEQ ID NO:2의 잔기 89에서 116에 해당):
여기서, Cys89는 Acm 보호되고, His94은 Dnp 보호된다.
세그먼트 SEP-1:4+GP41 (GRFN 1776+GRFNP41; SEQ ID NO:2의 잔기 117에서 166에 해당):
여기서, C-말단 시스테인(즉 Cys61) 피콜일(피코)는 보호기를 지니고, Kox에 의해 나타낸 Lys126은 분기된 중합체 GRFNP41에 연결된-레불린 아실 펜던트 부분 옥심을 가진다.
하기의 변형과 함께, 실시예 1-4에서 기술된 바와 같이, 추가 펩티드의 합성, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 접기 및 전체 길이, 접힌 SEP-1-B51(SEQ NO:2)를 얻는 정제가 수행되었다.
단계 1: 라이게이션 #1
세그먼트 SEP-1:4+GP41를 3mM 농도로 TFE(1 부피)에 용해하였다. 세그먼트 SEP-1:3을 6M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 2 부피의 300mM Na 인산 완충액(pH 7.9)에 2.25mM의 농도로 용해하였다. 2개의 용액을 혼합하여, 1mM의 최종 단편 농도의 SEP-1:4+GP41 및 1.5mM SEP-1:3를 얻었고, 1% 티오페놀을 첨가하였고, 6.8-7.2의 pH에서 펩티드 단편의 용액을 생성하였다('3 부피'). 반응을 실온에서 하룻밤 진행시켰다. 라이게이션 후에, 교반 혼합물에 β-메르캅토에탄올(3 부피)을 첨가하고, 이어서 3 부피의 6M 구아니디늄 클로라이드 300mM Na 포스페이트 pH 7 트리스 완충액, 및 TCEP을 첨가하고(펩티드 단편의 총 중량의 0.25중량), 용액을 20분 동안 교반하였다. 용액을 0.6 부피의 차가운 아세트산으로 pH 4.0±0.1까지 산성화시켜 깨끗한 용액을 얻었고, 거기에 구아니디늄 클로라이드 중의 6M 30 부피의 pH 4.0, 100mM Na 아세테이트 희석 완충액을 첨가하였다. 생성된 용액을 예비 역상 (C4) HPLC 칼럼 상에 펌핑하였다. 완충액은 5% B[따라서, 남은 부분은 물 중의 95% 완충액 A(물 중의 0.1% TFA)이다]에서 모든 비-펩티드 물질이 칼럼으로부터 용출할 때까지 펌핑하였고, 그 후 라이게이션 생성물을 80분에 걸쳐 25-45% 완충액 B의 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 생성물을 함유하는 부분(Cys89(Acm)) {SEP1:3+SEP-1:4+GP41}은 전기분무 질량분석법에 의해 확인되고 모아졌다.
단계 2: Acm-제거 #1
Acm 제거를 위해, (Cys89(Acm)){SEP-1:3+SEP-1:4+GP41}의 모아진 부분을 함유하는 수성 아세토니트릴 용액을 HPLC 등급수로 1x 희석하였고, 고체 요소를 2M의 최종 농도에 대해 첨가하였다. 3배 몰농도 과량(총 시스테인 농도에 비례하여)의 3% 수성 아세트산 중의 30mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고, 용액을 1시간 동안 교반하였다. 용액을 그 후 3-메르캅토에탄올 중에서 20%로 만들고, 반-예비 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하고, 모든 비-펩티드 물질이 용출할 때까지 25% 완충액 B에서 펌핑하고, 생성물을 그 후 50% 완충액 B로의 단계 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 생성물{SEP-1:3+SEP1:4+GP41}을 함유하는 부분은 전자분무 질량분석법에 의해 확인되었고, 모아지고 동결건조되었다.
단계 3: 라이게이션 #2
단계 2로부터의 {SEP-1:3+SEP-1:4+GP41} 생성물[즉, 1713-1776GP41]을 3mM 농도에서 TFE(1 부피)에 용해하였다. 세그먼트 SEP-1:2(세그먼트 GRFN1712)를 6M 구아니디늄 클로라이드를 함유하는 2 부피의 300mM Na 인산 완충액(pH 7.9)에 2.25 mM의 농도로 용해하였다. 2가지 용액을 혼합하여, 최종 단편 농도의 1mM{SEP-1:3+SEP1:4+GP41} 및 1.5mM SEP-1:2을 얻고, 1% 티오페놀을 첨가하였고, 6.8-7.2의 pH에서 펩티드 단편의 용액('3 부피')을 얻었다. 반응을 하룻밤 실온에서 진행시켰다. 그 후 라이게이션 혼합물을 6M 구아니디늄 클로라이드을 함유하는 희석 완충액:100mM 나트륨 아세테이트 pH 4.0의 3 부피(즉, 위에서 사용된 TFE의 체적에 비례함)으로 희석하고, 그 후 4℃로 냉각하고, 3 부피 TFE, 3 부피 (3-메르캅토에탄올, 3 부피 피페리딘 및 6 부피의 6M 구아니디늄 클로라이드, 100mM Na 아세테이트 pH 4.0으로 구성된 용액에 첨가하고 20분 동안 실온에서 교반하여, 어떠한 남은 보호기를 제거하였다. 용액을 1.8 부피의 냉동된 차가운 아세트산으로 산성화하여 깨끗한 용액을 얻고, TCEP(펩티드 단편의 총 중량의 0.25 중량)를 첨가하고, 용액을 20분 동안 배양하였다. 그 후 30 부피의 구아니디늄 클로라이드 중의 pH 4.0, 100mM Na 아세테이트 희석 완충액 6M를 첨가하고 용액을 혼합하였다. 생성된 용액을 예비 역상 (C4) HPLC 칼럼 상에 펌핑하였다. 완충액을 모든 비-펩티드 물질이칼럼으로부터 용출할 때까지, 30% C(완충액 C: 60% 이소프로판올 중의 0.1% TFA/ 30% 아세토니트릴/10% 물)에서 펌핑하고, 그 후 라이게이션 생성물을 80분에 걸쳐 37-57% 완충액 C의 구배에 의해 정제하였다. (Cys33(Acm)){SEP-1:2+SEP-1:3+SEP-1:4+GP41}을 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고 모아지고 동결건조되었다.
단계 4: 잔기 Cys 89 및 Cys 117 의 카르복시메틸화
(Cys33(Acm)){SEP-1:2+SEP-1:3+SEP-1:4+GP41}[즉, (Cys33(Acm))-1712-1713-1776-GP41}을 1mM 농도에서 TFE에 용해하였다. 6M 구아니디늄 클로라이드를 함유하는 10 부피의 300mM Na 인산 완충액(pH 7.9)을 첨가하였다. 메탄올에 용해된 브로모아세트산의 25배 과량(술프히드릴기 보다)을 75mg/ml에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 그 후 11 부피의 100mM Na 아세테이트 pH4.0, 6M 구아니디늄 클로라이드로 희석하고, 예비 역상 (C4) HPLC 칼럼 상에 로딩하고 모든 비-펩티드 성분이 용출할 때까지 20% 완충액 C에서 펌핑하고, 그 후 라이게이션 생성물을 55% 완충액 C로의 단계적 구배로 정제하였다. 원하는 변형된 생성물을 함유하는 부분(Cys33(Acm );ψ89,1l7){SEP-1:2+SEP1:3+SEP-1:4+GP41}은 ES-MS에 의해 확인되었고 모아지고 동결건조되었다.
단계 5: 피콜릴 제거
5분 동안 2M HCl에서 아연 더스트(펩티드의 mg 당 7mg)를 활성화하였고, 활성화를 1회 반복한 후, 아연은 10분 동안 6M 구아니디늄 클로라이드, 35mg/ml L-메티오닌 및 35mg/ml Na 도데카노일사르코신을 함유하는 50mM 글리신 pH 2.2(새롭게 추가된) 및 10%v/v TFE으로 세척하여 과잉의 산을 제거하였다. 세척은 1회 반복하였다. Cys161(피코) 함유 펩티드(Cys33(Acm);Ψ89,117){SEP-1:2+SEP-1:3+SEP-1:4+GP41}을 순수한 TFE에 용해하였다. 용액을 4 부피(TFE에 비례하여) 6M 구아니디늄 클로라이드, (새롭게 추가된) 35mg/ml L-메티오닌 및 35mg/ml Na 도데카노이사르코신을 함유하는 50mM 글리신 pH 2.2 및 10%v/v TFE으로 희석하였다. 용액을 활성화된 아연 분말에 첨가하고 실온에서 50분 동안 교반하였다. 반응을 분석 C4 역상 HPLC의 알리쿼트(동일한 부피의 3-메르캅토에탄올 및 약간의 과립 TCEP으로 처리한 후, 그 후 분석을 위해 2 부피의 6M 구아니디늄 클로라이드, 100mM Na 아세테이트 pH 4.0로 희석하였다)에 의해 1시간 간격으로 모니터하고, 2 내지 5시간 후에 완료하였다. 피콜릴기 제거가 완료된 후에, 분석 HPLC 피크의 ES-MS 분석(즉, 91Da 질량의 손실)에 의해 나타낸 바와 같이, 상청액을 여과에 의해 제거하고, 남아 있는 Zn 분말을 6M 구아니디늄 클로라이드, pH 4, 35mg/ml L-메티오닌을 함유하는 100mM 아세테이트 및 20% TFE을 함유한 35mg/ml 도데실사르코신으로 3회 세척하였다. BioRad SM-2 비드(용액 부피의 대략 1/3)를 조합된 상청액과 워시에 첨가하고 실온에서 30분동안 교반하고, 그 후 여과하였다. p-메르캅토에탄올을 10%v/v에 첨가하고, 그 후 0.25x(펩티드의 조합된 중량)의 TCEP를 첨가하고 용액을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 용액은 동일한 부피의 100mM Na 아세테이트 pH4.0, 6M 구아니디늄 클로라이드로 1:1 희석하였고, 예비 (C4) 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하였고, 모든 비-펩티드 물질이 용출될 때까지 35% 완충액 C를 펌핑하고, 원하는 생성물을 55% 완충액 C까지의 단계적 구배로 정제하였다. 원하는 Cys161-탈보호 생성물(Cys33(Acm);ψ89, 117){SEP-1:2+SEP-1:3+SEP-1:4+GP41-피코}을 함유하는 부분을 전자분무 질량분석법에 의해 확인하고 모았다.
단계 6: Acm-제거 #2
(Cys33(Acm);Ψ89,117){SEP-1:2+SEP-1:3+SEP-1:4+GP41-피코}[즉, (Cys33(Acm);Ψ89,117)-1712-1713-1776-GP41]의 모아진 용액을 HPLC 등급수로 3x 희석하였고, 최종 농도의 2M를 위해 고체 요소를 첨가하였다. 3% 수성 아세트산중의 3배 몰비(총 시스테인 농도에 비례하여)의 30mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고 용액을 1시간동안 실온에서 교반하였다. 용액을 그 후 β-메르캅토에탄올 중에 20%로 만들고, 반-예비 (C4) 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하였다. 완충액 C(20%)를 모든 비-아미드 물질이 용출될 때까지 펌핑하였고, 그 후 원하는 생성물을 55% 완충액 C로의 단계적 구배로 정제하였다. (Cys33;Ψ89,117){SEP-1:2+SEP-1:3+SEP1:4+GP41-피코}을 ES-MS에 의해 확인하고, 2x(w/w 펩티드 질량에 비례함) DPC(도데실포스포콜린)를 함유하는 물로 2x(v/v) 희석하고 하룻밤 동결건조시켰다.
단계 7: 라이게이션 #3
(Cys33;Ψ89,117){SEP-1:2+SEP-1:3+SEP-1:4+GP41-피코}[즉, (Cys33;Ψ89,117)-1712-1713-1776-GP41]을 순수한 TFE(1 부피)에서 3mM 농도로 용해하였다. SEP-1:1[즉 1711-GP41]를 6M 구아니디늄 클로라이드를 함유하는 2 부피의 300mM Na 포스페이트에(pH 7.9) 용해시켰다. 용액을 조합하고, 1%v/v 티오페놀을 첨가했다. 라이게이션 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 용액에 3 부피(상기 TFE 부피에 비례)의 β-메르캅토에탄올, 및 9 부피의 라이게이션 완충액(300mM Na 인산 완충액 pH 7.9, 6M 구아니디늄 클로라이드를 함유)를 첨가하였다. 용액에 0.25x (펩티드의 조합된 중량) TCEP을 첨가하고 용액을 실온에서 20분간 교반하였다. 차가운 아세트산(0.6 부피)을 첨가하여 용액을 pH 4.0로 산성화하고, 용액을 그 후 6M 구아니디늄 클로라이드을 함유하는 30 부피의 100mM Na 아세테이트 pH 4.0로 희석하고, 예비 (C4) 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하였다. 모든 비-아미드 물질이 용출될 때까지 완충액 C(25%)를 펌핑하고, 그 후 교반 생성물을 80분에 걸쳐 35-55%으로부터의 선형 구배의 완충액 C로 정제하였다. 원하는 라이게이션 생성물 SEP-1(1166)(Ψ89, 117){SEP-1:1(+GP41)+SEP-1:2+SEP-1:3+SEP-1:4+GP41}:(SEQ ID NO:2)을 전자분무 질량 분석에 의해 확인하고 모았다.
단계 8: 접기
전길이 라이게이션 펩티드를 함유하는 SEP-1(1-166)(Ψ89,117){SEP-1:1(+GP41) +SEP-1:2+SEP-1:3+SEP-1:4+GP41}[즉, 1711(GP41)-1712-1713-1776-GP41]에 고체 구아니디늄 클로라이드, 1M 트리스 완충액(pH 8.7) 및 증류수를 첨가하여 최종 용액을 ml 라이게이션 펩티드 SEP-1(1-166), 6M 구아니디늄 클로라이드, 100mM 트리스당 0.1mg으로 만들고, 이러한 라이게이션 펩티드('단백질') 용액을 15ml 투석 카세트 상에 로딩하고, 하룻밤 4℃에서 3M 구아니디늄 클로라이드, 5마이크로몰 시스테인 및 2마이크로몰 시스테인을 함유하는 100mM 트리스 완충액(pH 8.5) 용액에 대해 투석시켰다. 단백질 용액은 그 후 1M 구아니디늄 클로라이드을 함유하는 100mM 트리스 완충액(pH 8.5)의 용액에 대해 8시간 동안 4℃에서 투석시키고, 마지막으로 4℃에서 14시간 동안 10mM 트리스 완충액(pH 7.0)에 대해 투석시켜 최종 접힌 생성물을 얻었다. 투석 카세트로부터 접힌 단백질-함유 용액을 조합하였다. 접힘을 ES-MS, 분석 RP-HPLC, 및 CD 분광분석법에 의해 확인하였다.
단계 9: 정제
접힌 단백질-함유 용액을 10mM 트리스, pH 7.0로 평형화시킨 Q-Sepharaose 이온 교환 칼럼 상에 로딩하였다. 125 mM NaCl로의 선형 염 구배를 사용하여 접힌 단백질을 용출시켰다. 원하는 접힌 생성물 SEP-1-B51을 함유하는 부분은 비-환원 SDS-PAGE에 의해 확인되고 모아졌다. 조합된 부분은 한외여과에 의해 대략 ml 당 2mg의 농도로 농축되고, 그 후 단백질 용액을 2.6x100cm S-300 겔 여과 칼럼 상에 로딩하였다. 정제된 SEP-1-B51을 10mM 트리스 pH 7.0, 137mM 나트륨 클로라이드로 용출시켰다. 고순도 SEP-1-B51를 함유하는 부분을 비환원 SDS-PAGE에 의해 확인하고 모으고 동결시키고 -80℃에서 저장하였다. 최종 정제된 접힌 단백질 SEP-1-B51은 분석적 (C4) 역상 HPLC, ES-MS, 비환원 SDS-PAGE, 및 CD 분광분석법에 의해 특징지어 진다.
도 27는 접힌 정제된 SEP1-B51의 상대적인 분자량을 나타내는 대표적인 등전포커싱 겔(IEF) 및 비환원 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 동일한 겔에서 작동되는 분자량 표준이 비교를 위해 나와있다. 나타낸 바와 같이, 비환원 SDS PAGE에 의해 결정된 SEP1-B51의 상대 분자량은 약 73kDa이다. 상대 pl은 대략 5.0이다. 또한, 접힌 정제된 SEP-1-B51 생성물의 대표적 RP-HPLC 크로마토그램이 나와있다. 이것은 본 발명의 정확한 중합체-변형 단백질의 순도 및 증가된 상대 분자량을 예증한다.
실시예 8
합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-B52의 합성
A. SEP-1-B52의 조성물
7번째 합성 적혈구생성 자극 단백질(SEP-1-B52으로 지정됨)을 합성하였다. 전길이 SEP-1-B52의 아미노산 서열은 SEP-1-B51의 것과 동일하다:
여기서, Ψ는 술프히드릴기에서 카르보메틸화된 시스테인으로 구성되는 비-자생 아미노산 잔기를 나타내고, Kox는 옥심 결합을 통해 지정된 수용성 중합체에 커플링된 옥심 링커와 함께 ε-아미노기에서 화학적으로 변형된 비-자생 리신을 나타낸다.
SEP-1-B52 단백질은 SEP-1-B5와 유사한 분기상 (Succ-TTD)12-Succ-Ala 중합체구조를 갖는 잔기 24와 126에서 유도되었지만, 이러한 유사체에 대한 중합체는 피루브산 및 아미노옥시아세트산 사이의 옥심 결합을 통해 부착되었다. 게다가, 리신 잔기 24와 126의 ε-아미노기는 레불린 아실 부분을 대신하여 아미노옥시아세틸 작용기를 갖도록 변형되었다. 분기상 (Succ-TTD)12-Succ-Ala 중합체 구조는 펜던트 피루브 아실 부분을 갖도록 만들어졌다. 이들 전하는 합성과 취급을 향상시키고, 옥심 결합의 안정성을 더욱 증가시키도록 설계되었다.
도 25은 옥심-형성 라이게이션을 통해 SEP-1-B52에 결합된 분기상 수용성 GRFNP43(GP43)의 화학적 합성을 설명하는 도면이다. 전길이 생성물의 회합은 실시예 2에서 기술된 바와 같았다. SEP-1-B52의 구조는 도 26에 나타난다.
B. 분기 주형(GRFNP42)에 커플링하기 위한 (Succ-TTD) 12 -Succ-AlaOtBu(GRFN P39)의 합성
(Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu(GRFNP39)을 0.5mmol 규모로 합성했다. 0.5mmole (~0.5g) Sasrin 산불안정, 카르복실산-생성 폴리스티렌 수지(히드록실 치환 1.02 mmole/g)을 15분 동안 DMF에 팽창시키고 그 후 배출하였다. 이 히드록실-기능화 수지에 500마이크로리터(3.9mmole) DIEA(디이소프로필에틸아민)을 함유하는 8ml의 DMF에 용해된 450mg(4.5 mmole) 무수 숙신산 및 488mg(4mmole) 4-(디메틸아미노) 피리딘을 첨가하고 소용돌이 교반과 함께 30분 동안 반응시키고, 그 후 배출시켰다. 커플링을 반복하고 과잉의 반응물과 가용성 공생성물을 DMF(~50mol)으로 1분 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거하고 그 후 배출하였다. HOOC-CH2CH2CO-O-수지(0.5mmole)을 DMF 중의 8ml의 신선한 1.0M(8 mmole) CDI 용액을 첨가함으로써 활성화하고 40분 동안 반응시키고 배출하였다. 과잉의 반응물과 가용성 공생성물은 DMF (~50ml)로 1분 소용돌이 흐름 세척함으로써 제거되었고 배출되었다. DMF 중의 4ml 0.5M(2 mmole) HOBT 용액에 용해된 4ml(4g, 18.2mmole) TTD을 첨가하고 30분 동안 소용돌이 교반으로 반응시키고 배출시켰다. 과잉의 반응물과 가용성 공생성물을 DMF(~50mol)로 1분 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거하고 배출하였다. 500마이크로리터(3.9mmole) DIEA을 함유하는 8ml의 0.5M(4mmole) HOBT(N-히드록시벤조트리아졸) 용액에 용해된 무수 숙신산(450mg, 4.5mmole)를 수지에 첨가하고 15분 동안 소용돌이 교반으로 반응시키고, 그 후 배출하였다. 3단계(GDI 활성화; TTD 커플링; 무수 숙신산 반응)를 11회 반복하였다[즉, 총 12회]. 과잉의 반응물과 가용성 공생성물을 DMF(-50ml)으로 1분 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거하였고 배출하였다. HOOC-CH2CH2CO(TTD-숙시닐)12-O-수지(0.5mmole)를 활성화하였다. DMF 중의 8ml의 신선한 1.0M(8mmole) CDI 용액으로 활성화하고 40분 동안 반응시키고 배출시켰다. 과잉의 반응물과 가용성 공생성물을 DMF(-50ml)로 1분 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거하고 배출하였다. 2.5mmole HAlaOtBu.HCl을 150마이크로리터(111mg, 0.825mmo le) DIEA을 함유하는 DMF 중의 4.75ml 0.5M(2.375mmole) HOBT에 용해시키고, CDI-활성화 HOOC-CH2CH2CO(TTD-숙시닐)12-O-수지(0.5mmole)로 1시간 동안 소용돌이 교반으로 반응시킨 후 배출시켰다. 과잉의 반응물 및 가용성 공생성물을 DMF(~50ml)로 1-분 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거한 후 배출시켰다. 생성물 tert-BuOOC-CH(CH3)-NH-OC-CH2CH2CO(TTD-숙시닐)12-O-수지를 DCM로 광범위하게 세척하고 배출시킨 후, 수지를 일정한 중량으로 진공하에서 건조시켰다. 생성물-수지의 전형적인 중량은 약 2g이었다.
DCM 중의 4% TFA를 사용하여 표준 Fmoc-화학 과정에 따라 수지 지지체로부터 선형 GRFNP39를 절단하였다. 침전된 미정제 생성물은 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 동결건조하였다. 동결건조한 중합체를 0.1% TFA를 함유하는 소량의 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 희석시켜서 유기물의 농도를 1% 미만으로 줄였다. 미정제 생성물을 3% B에서 T=40℃에 눈금보정된 C4 예비 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하였다. 염을 등용매로 용출하고, 60분에 걸쳐 원하는 주형을 20-35% 완충액 B(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴) 대 0.1% 수성 TFA 의 선형 구배로 정제하였다. 원하는 (Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu 물질(GRFNP39)을 함유하는 부분을 ES-MS에 의해 확인하고, 냉동하고 동결건조시켰다.
C. 분기를 위한 다중 아민기를 지니 주형 및 단백질에 대한 (이후의) 부착을 위한 펜던트 피루브 아실 부분의 합성
주형은 0.4mmol 규모로 Boc-Leu-OCH2-Pam-수지에서 수동식으로 합성되었다. DMF로 1분 흐름-세척 단계를 모든 커플링, 탈보호 및 활성화 단계 사이에 사용하였다. Boc 기를 순수한(즉 100%) TFA로 처리함으로써 제거하였다. DMF 세척 후에, 1ml DIEA를 함유하는 3.8ml DMF 중의 1.8mmol HBTU으로 활성화한 후에, 2mmol Fmoc-(Rink-링커)-OH를 수지에 커플링하였다. Fmoc 보호기(2x3분, 20% DMF 중의피페리딘)를 제거한 후에, DMF 중의 2mmol DIC 및 2mmol NHS으로 NHS-에스테르 활성화를 사용하여, 2mmol Fmoc-Lys(MTT)-OH[MTT=4-메틸트리틸]를 수지에 커플링하였다. Fmoc 보호기(2x1분, DMF 중의 0.5% DBU)의 제거 후에, 2.2mmol DIEA를 함유하는 8ml의 0.5M HOBT 용액 중에 용해된 4mmol 숙신산 무수물을 수지에 10분 동안 커플링하였다. 이 단계 후, 수지-결합된 카르복실기는 DMF 중의 8ml의 신선한 0.5M CDI 용액으로 활성화시켰다. 4ml TTD를 4ml 0.5M HOBT 용액에 첨가하고 30분 동안 커플링하였다.
DMF에 용해된 2mmol DIC 및 2mmol NHS으로 NHS-에스테르 활성화를 사용하여 2mmol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH를 수지에 커플링하였다. Fmoc 제거 단계(2x1분 0.5% DMF 중의 DBU) 후, 4mmol Boc-Lys(Boc)-NHS는 3ml DMF 중에서 커플링한다.
MTT 보호기는 DCM 중의 2% TFA으로 다중 세척에 의해 제거되었다. 탈보호는 상청액이 그것의 황색이 없어질 때 완료되었다. 수지를 DMF 중의 10% DIEA으로 1분 동안 중화하였다. 45분 동안 DMF 중의 2mmol DIC 및 2mmol NHS로 NHS-에스테르 활성화함으로써 2mmol 피루브산을 수지에 커플링하였다. 주형을 탈보호시키고 5% 물을 함유하는 순수한 TFA를 사용하여 수지 지지체로부터 절단하였다. 분할 용액은 회전 증발기에서 건조하게 증발시켰다. 잔기를 0.1% TFA을 함유하는 50% 수성 아세토니트릴중에 용해시키고 동결건조시켰다. 동결건조된 주형을 0.1% TFA을 함유하는 소량의 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 희석시켜 유기물의 농도를 1% 미만으로 줄였다. 피루베이트-함유 주형을 0% 완충액 B에서 T=40℃에서 평형을 이룬 C4 Prep 칼럼 상에 로딩하였다[즉, 물 중의 100% 완충액 A=0.1% TFA]. 염을 등용매로 용출시키고, 원하는 주형을 60분에서 5-12%의 완충액 B 대 0.1% 수성 TFA의 선형 구배로 정제하였다. 원하는 물질(GRFNP42)을 함유하는 부분은 ESI-MS에 의해 확인되고, 냉동되고 동결건조되었다.
D. 아미드-커플링된 분기 중합체(GRFNP43)의 회합 및 탈보호
GRFNP43, 분기 (TTD-Succ)49-16kDa 분자량의 중합체는 GRFNP39를 정제된 주형 GRFNP42에 커플링함으로써 합성되었다. 60℃에서 20mg/ml의 농도로 DMSO에 용해된 정제된 (Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu(GRFNP39)(1.Ommole)은 12배(몰) 과량의 DIEA 존재하에서 10mg/ml의 농도에서 DMSO에 용해된 0.95mole의 HATU으로 활성화되었다. 3.9mg/ml의 농도로 DMSO에 용해된 정제된 주형(0.24mole) GRFNP42을 즉시 첨가하였다. 반응의 과정을 분석 C4 역상 HPLC 및 ES-MS에 의해 모니터링하였다. 전형적으로, 커플링은 몇분 내에 완료되었다. 마무리를 위해, 4 부피(라이게이션 혼합물에 비례하여) 0.1M 아세테이트/6M 구아니디늄 클로라이드, pH 4를 첨가하고, 용액을 예비 (C4) 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하였다. 물질을 함유하는 염과 다른 비-아미드를 등용매로 용출하였고, 원하는 생성물 분기 중합체는 80분에 걸쳐서 20-35% 완충액 B(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴) 대 0.1% 수성 TFA의 선형 구배로 정제되었다. 원하는 물질을 함유하는 부분을 ES-MS에 의해 확인하고, 냉동시키고 동결건조시켰다.
생성된 정제된 분기상 중합체 구조 GRFNP43를 1시간 동안 1mg/ml의 농도로 순수한 TFA에 용해시켰다. Ala-OtBu tert-부틸 에스테르 보호를 제거하였다. 용액을 회전 증발기에서 건조 상태로 증발시켰다. 건조시킨 중합체를 TFA에서 80분 동안 15% 내지 45% 완충액 B 대 0.1% 수성 TFA의 단계 구배로 예비 역상 HLPC 상에서 염분제거하였다. 원하는 물질(GRFNP43)을 함유하는 모아진 분율은 냉동되고 동결건조되고, 옥심 형성 라이게이션 단계를 위해 사용된 분말을 건조시켰다.
E. 분기 중합체 GRFNP43로 GRFN1776 및 GRFN1711의 옥심-형성 라이게이션(옥심화)
상기 실시예 2, 3, 4 및 7에서 기술된 바와 같이 세그먼트 SEP-1:4, 및 세그먼트 SEP-1:1를 합성하였다. 오직 레불린 산을 대신하여 아미노옥시아세틸(AoA) 부분을 표준 커플링 프로토콜을 따라 각각의 펩티드 단편에서 Lys24및 Lys126에 추가되었다. 따라서, 펩티드 수지의 회합 후에, 측쇄 Fmoc 기를 각각의 펩티드-수지로부터 제거하였다. DMF 중의 2mmol DIC 및 2mmol NHS로 NHS-에스테르 활성화를 사용하여 2mmol Boc-아미노옥시아세트산을 수지에 첨가하였다. 2개의 펩티드는 탈보호되고, HF으로 수지로부터 절단하고, C4 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 예방 조치를 취해 카르보닐 화합물에 노출되는 것을 피했다. 세그먼트 SEP-1:4 및 GRFNP43을 공동으로 동일 몰비에서 0.1% TFA(트리플루오로아세트산)을 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에서 용해시켰다. 용액을 동결건조시켰다. 건조된 분말을 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에 재용해하였고, 예비 C4 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하였다. 중합체-변형 펩티드는 변형되지 않은 펩티드 및 반응하지 않은 중합체로부터 예비 구배 역상 HPLC으로부터 분리시켰다. 원하는 옥심화 생성물 SEP-1:4+GP43을 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고 모아졌다.
세그먼트 SEP-1:1 및 GRFNP43을 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에서 동일 몰비에서 함께 용해하였다. 용액을 냉동시키고 동결건조하였다. 건조된 분말을 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하였다. 중합체-변형 펩티드는 예비 역상 구배에 의해 변형되지 않은 펩티드와 반응하지 않은 중합체로부터 분리되었다. 원하는 옥심화 생성물 SEP-1:1+GP43을 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고 모아졌다.
F. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-B52의 합성
SEP-1-B52(SEQ ID NO:2)는 다음과 같은 4개의 폴리펩티드 단편으로부터 용액 중에서 합성되었다:
세그먼트 SEP:1:1+GP43 (GRFN 1711+GRFNP43; SEQ ID NO:2의 잔기 1에서 32에 해당):
여기서, Kox에 의해 나타낸 Lys24은 분기상 중합체 GRFNP43에 옥심-연결된 AoA 펜던트 부분을 가지고, His32는 Dnp 보호된다.
세그먼트 SEP-1:2 (GRFN 1712; SEQ ID NO:2의 잔기 33에서 88에 해당):
여기서, Cys33는 Acm 보호되고, 3개 Trp 잔기는 포르밀 보호된다.
세그먼트 SEP-1:3 (GRFN 1713, SEQ ID NO:2의 잔기 89에서 116에 해당):
여기서, Cys39는 Acm 보호되고, His94는 Dnp 보호된다.
세그먼트 SEP-1:4+GP43 (GRFN 1776+GRFNP43; SEQ ID NO:2의 잔기 117에서 166에 해당):
여기서, C-말단 시스테인(즉, Cys161)은 피콜릴(피코) 보호기를 지니고, Kox에 의해 나타낸 Lys126은 분기상 중합체 GRFNP43에 옥심-연결된 AoA 펜던트 부분을 가진다.
추가적인 펩티드, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 접기 및 정제가 상기 실시예 1, 2, 3, 4 및 7에서 기술된 바와 같이 수행되어 전길이 접힌 SEP-1-B52(SEQ ID NO:2)를 수득하고, 그것은 분석 (C4) 역상 HPLC, ES-MS, 및 비환원 SDS-PAGE에 의해 특성화되었다. 다른 SEP 구조에 대해 설명된 바와 같이 생물분석을 수행한다.
실시예 9
SEP-3-L42에 대한 유효성 연구
SEP-3-L42를 시트레이트 완충액(20mM 나트륨 시트레이트+100mM 나트륨 클로라이드)+0.25% 래트 혈청알부민(RSA)에서 다시 조제하고, 0, 1, 5, 또는 10μg/kg의 2회 투여량으로(군당 5 래트) 1, 3, 및 6일째에 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여되었다. 혈액 샘플을 마지막 투여 후 4일째(9일째)에 수집하였고 혈액학적 파라미터에 대해 분석하였다. 대조군의 것들과 비교 했을때, 이들 투여량에서 SEP-3-L42으로 마지막 주사한 후 4일째에 적혈구(RBC), 헤모글로빈(HGB), 적혈구용적율 (HCT), 및 세망세포수(RET) 값에서의 통계학적으로 중요한 어떠한 차이가 없었다.
실시예 10
SEP-3-L42에 대한 약물동태학 연구
SEP-3-L42를 시트레이트 완충액(20mM 나트륨 시트레이트+100mM 나트륨 클로라이드)+0.25% RSA, pH6.9에서 다시 조제되고, 5ug/kg의 투여 수준에서 단일 투여량으로 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여되었다. 혈액 샘플을 투여 후에 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 및 168 시간에서 수집하였다. 제조자의 지시에 따라 항-EPO ELISA 키트(R & D Systems, 사람 에리트로포에틴 Quantikine IVD 면역분석 키트 #DEP00)에 의해 SEP-3-L42 농도를 측정하였다. 결과는 도 29에 나타나 있다.
도 29에 나타낸 바와 같이, SEP-1-B50는 SEP3-L42에 비해 약간 더 낮은 제거를 나타내었다. 그것의 혈중 반감기에도 불구하고, SEP3-L42는 통계학적으로 유의한 차이를 나타내는데 실패하였다. 대조적으로, SEP-1-B50는 실험한 투여량에서 적혈구 제조를 촉진하였다. 이것은 중합체 구조가 약물동태학 거동 및 효능을 포함하는, 생체내 생물학적 특성에서 미세-조율에 이용될 수 있다는 것을 예증한다.
실시예 11
SEP-1-L30에 대한 유효성 연구
SEP-1-L30을 시트레이트 완충액(20mM 나트륨 시트레이트+100mM 나트륨 클로라이드)+ 0.25% RSA에서 다시 조제하고, 0, 1, 5, 25 또는 50μg/kg의 2회 투여량으로 (군당 5 래트) 1, 3, 및 5일째에 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여하였다. 혈액 샘플을 마지막 투여 후 4일과 8일째(9일과 13일째)에 수집하였고 혈액학적 파라미터에 대해 분석하였다. 대조군의 것들과 비교했을때, SEP-1-L30으로 치료한 후에 어떠한 간격에서 RBC, HGB, 및 HCT 값에서의 통계학적으로 중요한 어떠한 차이는 없었다. 세망세포수는 25 및 50μg/kg로 처리된 래트에 대해서 마지막 투여 후 4일째(9일째)에 더 높았다(대조군의 것들과 비교했을때 통계학적으로 유의한 차이). 혈액학 파라미터에서의 어떠한 다른 차이는 SEP-1-L30로 처리된 어떤 동물에 대해 9일 또는 13일에 관찰되지 않았다[데이타 나타내지 않음].
실시예 12
SEP-1-L30에 대한 약물동태학 연구
SEP-1-L30을 시트레이트 완충액(20mM 나트륨 시트레이트+100mM 나트륨 클로라이드)+0.25% RSA, pH 6.9에서 다시 조제하고, 5 또는 25ug/kg의 투여 수준에서 단일 투여량으로 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여되었다. 혈액 샘플을 투여 후에 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 및 168 시간에서 수집하였다. 제조자의 지시에 따라 SEP-1-L30 혈장 농도는 ELISA 키트(R & D Systems, 사람 에리트로포에틴 Quantikine IVD 면역분석 키트 #DEP00)에 의해 측정되었다. 어떠한 SEP-1-L30은 주어진 투여량에서 어떠한 시점에서 검출되지 않았다.
실시예 13
SEP-1-B50에 대한 유효성 연구
SEP-1-B50을 무균 PBS (포스페이트 완충처리한 살린) 플러스 0.25% RSA에서 다시 조제하고, 1, 3 및 6일째에 정상 수컷 래트(그룹당 5 래트)에게 0, 1, 5, 25 또는 125μg/kg, 2회의 투여량으로 정맥내 투여하였다. 혈액 샘플을 마지막 투여후 4, 9 및 14일째(10, 15 및 20일째)에 수집하고 혈액학 파라미터에 대해 분석하였다. 데이타는 하기 표 VIII에 나타나있다. 5, 25 및 125μg/kg SEP-1-B50을 받은 동물에 대해 마지막 투여후 4일째(10일째)에서 증가된 RBC, HGB, HCT, 및 RET에 있어서의 투여량 관련 반응이 관찰되었다(대조군의 값과 비교할때 통계학적으로 유의한 차이). 이들 동물에 대한 RBC, HGB, 및 HCT은 15일째에 대조 값보다 더 높게 남아 있었고, 125μg/kg로 처리된 동물에 대해 20일(마지막 투여후 14일) 동안 내내 계속 대조 값보다 상당히 더 높았다. 25 및 125μg/kg 동물에 대해, 15일과 20일째에 상당히 더 낮은 수와 함께, 10일째 후에는 RET 제조가 감소되었다.
실시예 14
SEP-1-B50에 대한 약물동태학 연구
SEP-1-B50을 시트레이트 완충액(20mM 나트륨 시트레이트+100mM 나트륨 클로라이드)+0.25% RSA, pH 6.9에서 다시 조제하고, 단일 투여량으로서 5 또는 25ug/kg의 투여 수준으로 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여하였다. 투여 후 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 시간에 혈액 샘플을 수집하였다. SEP-1-B50의 혈장 농도는 제조자의 지시에 따라 ELISA 키트(R & D Systems, 사람 에리트로포에틴 Quantikine IVD 면역분석 키트 #DEP00)에 의해 측정되었다. 제거 반감기를 5 및 25ug/kg 투여량에 대해, 각각 9.7 및 9.9 시간으로 결정하였다. 관찰된 MRT(평균 체류 시간)은 5 및 25ug/kg 투여량에 대해 각각, 13.9 및 14.4 시간이었다. SEP-1-B50에 대한 대표적인 약물동태학 프로파일은 도 29에 나타난다.
실시예 15
SEP-1-B51을 위한 유효성 연구
SEP-1-B51은 2가지 실험에서 정상 수컷 래트로 정맥내 투여되었다.
실험 1: SEP-1-B50을 시트레이트 완충액(20mM 나트륨 시트레이트+100mM 나트륨 클로라이드)+0.25% RSA에서 다시 조제하고, 0, 1, 5 또는 25μg/kg, 2회의 투여량으로(군당 5 래트) 1, 3 및 6 일째에 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여되었고 혈액 샘플을 혈액학적 파라미터의 분석을 위해 마지막 투여 후 4, 9 및 14일째(10일, 15일 및 20일)에 수집하였다. 데이타는 표 IX에 나와있다. SEP-1-B51으로 세번째 및 마지막 정맥내 투여 4일 후(10일째)에, 대조군의 값과 비교할 때, RBC, HGB, HCT 및 절대 세망세포수(ART)에서의 통계학적으로 상당한 증가가 25μg/kg SEP-1-B51을 받은 동물에 대해 관찰되었다. 이들 동물들에 대한 RBC 값은 15일째에 대조값보다 더 높게 남아 있었고, 20일째에 대조값과 비교할만 하였다. 15일째에 5 및 25μg/kg 동물들에 대해 관찰된 상당히 더 낮은 수와 함께, 10일째 후에 망상 적혈구 제조가 감소되었다.
실험 2: SEP-1-B51을 시트레이트 완충액(20mM 나트륨 시트레이트+100mM 나트륨 클로라이드)+0.25% 사람 혈청 알부민에서 다시 조제하고, 1, 3 및 5일째에 0, 1, 5 또는 25μg/kg, 2회의 투여량에서 수컷 래트에게(군당 5마리 래트) 정맥내 투여하고, 혈액학 파라미터의 분석을 위해 혈액 샘플을 마지막 투여 후 2, 4,및 6일째(7, 9, 및 11일째)에 수집하였다. 게다가, 오직 적혈구용적율만의 측정을 위한 혈액 샘플은 [밀집된 세포 부피(PCV)으로서] 남아 있는 연구 일수에 날마다 수집되었다(2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 및 13일째). 데이타는 하기 표 X에 나타낸다. HCT(PCV 또는 계산된) 값은 첫번째 투여 후 2일째(3일째)에 시작하여 5 및 25pg/kg을 받은 동물들에 대해 상당히 증가되었고, 3번째와 마지막 주사 후 6일 동안 내내계속되었다(11일째). RBC 및 HGB은 또한 5 및 25μg/kg을 받은 동물에 대해 그들이 측정된 날(마지막 투여 후 2, 4 및 6일; 7, 9 및 11일째)에 상당히 증가되었다. ART는 마지막 투여 후 2 및 4일째(7일과 9일째)에 오직 25μg/kg 군에 대해서만 상당히 증가되었다.
래트의 추가 그룹을 25μg/kg에서 SEP-1 B51의 단일 정맥내 투여로 처리하였고, 적혈구용적율 만의 측정을 위한 혈액 샘플을 투여 후 8, 24 및 72 시간과 7일째(1, 2, 4 및 8일째)에 수집하였다. SEP-1-B51으로 정맥내 처리된 래트에 대한 HCT, HGB, 및 ART 값은 3일째(주사 후 2일째)에 대조 동물의 값보다 더 높았고(통계학적으로 유의함), HCT은 또한 이들 동물에 있어서 4일째에 상당히 증가되었다.
실시예 16
SEP-1-B51에 대한 폴리시테믹 및 저산소증 Model에서의 유효성 연구
4 투여량에서 10 각각의 정상 마우스의 군(매개물 제어, 4개 투여 수준에서 CHO-세포("rhEPO")에서 제조된 재조합 당화 사람 에리트로포에틴, 및 4개 투여 수준에서 SEP-1-B51:100mU/ng을 가정하는 0.32, 1, 5, 25ug/kg/투여량)은 20일 동안 시뮬레이티된 높은 고도 챔버에서 506.5mb로 유지된 대기 공기로 하루에 18시간 노출되었다. 시트레이트 완충액+0.25% 사람 혈정 알부민에 다시 조제된, rhEPO 또는 SEP-1-B51을 4th후-저산소증 일수에서 200μL-부피에서 정맥내(IV) 주사하였다. 2일 후에, 각각의 마우스는 0.2μCi의59Fe로 복강내 주입하였다. RBC-방사성철 흡수는 심장 천자에 의해 흡수된 500μL의 혈액에 존재하는 방사능의 양을 측정함으로써 3일 후에 추정되었다.
SEP-1-B51 및 rhEPO에 대한 72-시간 RBC-59Fe 흡수(투여량의 %)는 반응 접시 (25 μg/kg) 위에, 투여량을 5 μg/kg 까지 증가하면서, 증가된59Fe 흡수에서의 정확한 투여량 관련 반응을 나타내었다. 3개 가장 낮은 투여량 수준은 따라서 선형 후퇴를 계산하는데 사용되었다. SEP-1-B51 및 rhEPO의 선형 후퇴 분석이 도 30에 나타난다. SEP-1-B51 및 rhEPO의 반응은 본질적으로 동일하였다. rhEPO에 대한 SEP-1-B51의 "효능 비"가 1.0035 였고(0.6947 내지 1.4498의 95% 신뢰 간격) 이 평가에서 결정된 SEP-1-B51의 효능이 100 mU/ng 였다(69-145의 95% 신뢰 간격).
SEP-1-B51은 rhEPO의 것과 유사한 생체내 활성을 나타내고, 이 모델에서 rhEPO에 대해 전형적인 음 피드백 메카니즘의 유도로 인한 더 높은 투여량에서의 반응 접시를 포함하여, 투여량 의존 방식으로 작용한다. 이것은 SEP-1-B51 분자에서 정확한 사용자-정의된 당화 부위에 부착된 중합체 구조는 rhEPO의 당 사슬에 의해 공헌된 생체내 활성을 흉내낸다.
실시예 17
SEP-1-B51의 약물동태학 연구
정상 수컷 래트의 그룹은 시트레이트 완충액+0.25% 사람 혈청 알부민, 또는 rhEPO(500U/kg와 등가임)에서 조제된, 5ug/kg SEP-1-B51의 단일 투여량으로 정맥내 투여되고, 투여후 5, 30, 60분, 2, 4, 8 및 24시간, 2, 3, 4, 5, 6, 및 7일째에 출혈하였다. 혈장 샘플에서 SEP-1-B51 또는 rhEPO 농도는 제조업체의 지시에 따라 R & D Systems 항-EPO ELISA 키트(R & D Systems, 사람 에리트로포에틴 Quantikine IVD 면역분석 키트 #DEPOO)를 사용하여 ELISA 분석에 의해 측정되었다.
농도의 로그의 최소 좌승 분석이 수행되었고, 하기 표 XI에 나열된 약물동태학 파라미터를 산출해냈다. 혈장 농도의 변화는 5μg/kg의 단일 정맥내 투여량을 수용하는 수컷 래트에서 시간에 따른 SEP-1-B51의 혈장 농도에서의 변화는 10.5±0.5 시간의 반감기를 갖는 단일-지수 약물동태학 성질 기능에 의해 설명될 수 있다. 중앙 구획(Vc)의 분포의 부피는 32.5±2.0 mL/kg였다. 제거(CL)는 15.1±0.7 시간의 평균 체류 시간과 함께, 2.15mL/hr/kg이었다. 비교에 의해, 5μg/kg의 정맥내 투여량을 수용하는 수컷 래트에서의 rhEPO의 혈장 농도에서의 변화는 1.24±0.22 시간의 α반감기 및 5.51±0.40 시간의 β반감기를 갖는, 2-지수 약물 생체 반응 성질 기능에 의해 가장 잘 설명되었다. rhEPO에 대한 Vc는 57.0±3.2mL/kg였다. CL은 16.0±0.5 mL/hr/kg였고, SEP-1-B51의 그것보다 약 8배 더 크다. rhEPO의 평균 체류 시간(MRT)은 5.73±0.17 시간이었고, SEP-1-B51의 것보다 약 3배 더 짧다.
SEP-1-B51 및 rhEPO 혈장 제거를 그래픽으로 나타낸 것이 도 31에 나와있다. 이들 데이타는 당화 재조합 사람 EPO을 넘는 SEP-1B51에 대한 순환 반감기에서의 상당한 증가를 설명하며, 이러한 증가는 분자에서 정확한 사용자-정의된 부위에 부착된 중합체 구조 때문이다.
실시예 18
중합체-변형 합성 RANTES 단백질의 합성
본 발명의 중합체-변형 단백질을 더 예시하기 위해서, RANTES 2-68에 대한 2개의 중합체-변형 유도체(RANTES G1755-01; 도 32 및 RANTES G1755; 도 33), 및RANTES 4-66에 대한 2개의 중합체-변형 유도체(RANTES G1805; 도 34 및 RANTES G1806; 도 35)를 제조했다. 이들 중합체-변형 단백질의 구조를 도 32 내지 35에 나타낸다.
RANTES 유사체 G1755-01의 제조
도 32에 묘사된 RANTES 유사체 G1755-01를 다음과 같이 합성했다.
1. AOP-[RANTES(2-33)]-티오에스테르의 제조
N-말단 아미노옥시페탄-글리옥살릴 옥심 부분(AOP)를 함유하는 N-말단 펩티드 세그먼트 AOP-[RANTES(2-33)]-α티오에스테르(티오에스테르는 -C(O)SR로도 나타낸다)를 티오에스테르-생성 수지 상에서 RANTES(2-33) 서열을 회합시켜 합성한 후 (Haceng 등, PNAS (1999) 96:10068-10073), 표준 프로토콜에 따라서 아미노옥시펜탄-글리옥살릴 옥심 부분[즉, CH3(CH2)4-O-N=CHCOOH]와 수지를 직접 커플링하여 n-말단에서 변형시켰다(Wilken 등, Chemistry & Biology (1999) 6(1):43-51). 펩티드-수지를 불화수소로 절단하고, 역상 HPLC로 정제하여 α-카르복시 티오에스테르 펩티드 AOP-RANTES(2-33)-티오에스테르를 얻었다. 관찰 질량 = 4179.6Da; 이론 질량 = 4178.6Da (평균 동위원소 조성).
2. [RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70의 제조
여기에서 GP6은 Lys69의 Nε에 결합된다:
a. 고체상 펩티드 및 {펩티드-수지} 상에서의 수용성 중합체 합성
C-말단 펩티드 세그먼트 [RANTES(34-68)]-Lys69(Fmoc)-Leu70을 Schnolzer 등 Int. J. Pep. Protein Res. (1992) 40:180-193에 설명된 Boc 화학 SPPS에 대한 인시투 중화/HBTU 활성화 프로토콜을 사용하여, Boc-Leu-OCH2-Pam-수지 상에서 종래의 SPPS에 의해 합성했다.
사슬 회합의 완료 후, Lys69의 엡실론 질소 상의 Fmoc 기를 DMF 처리중에 20% 피페리딘을 사용하여 보호된 펩티드-수지로부터 제거했다. 다음에, 무수 숙신산을 DIEA를 함유하는 DMF에 용해된 HOBT 용액 중에서 Lys69 상의 엡실론 질소와 커플링시켰다. 세척 후 수지-결합 숙신산의 자유 카르복실기를 DMF에 용해된 CDI를 첨가하여 활성화시켰다. 또 다른 세척 사이클 후, DMF에 용해된 0.5M HOBT 중의 50% TTD를 첨가했다. 세척 후 수지-결합 중합체를 다음 사이클의 무수 숙신산 커플링/CDI 활성화/TTD 커플링에 대해 준비했다. 6회의 사이클 후, 무수 숙신산을 HOBT/DMF + DIEA 용액 중에서 마지막 TTD와 커플링시켰다.
펩티드/선형 수용성 중합체 수지를 불화수소를 사용하여 수지로부터 절단하고, 생성물을 역상 예비 HPLC로 정제하여 [RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70을 얻었다. 관찰 질량 = 6253Da; 이론 질량 = 6252Da (평균 동위원소 조성).
3. G1755-01의 제조
상술된 N-말단 및 C-말단 펩티드 세그먼트를 Dawson 등, Science 266:776-779 (1994)에 설명된 자생 화학적 라이게이션에 의해 함께 연결했다. 환원된 형태의 전길이 폴리펩티드 생성물을, 아세토니트릴 대 0.1% 트리플루오로아세트산 함유 물을 선형 구배로 사용하는 역상 HPLC로 정제했다. 관찰된 질량 = 10,060Da.
GP6이 부착된 전길이 폴리펩티드를 시스테인-시스틴 산화환원 커플을 함유하는 수성 완충액 중에서 2개의 2황화물 결합을 형성시키면서 접었고, 표준 프로토콜에 따라서 역상 HPLC로 정제했다(Wilken 등, Chemistry & Biology (1999) 6(1):43-51). 접힌 생성물은 HPLC 상에서 균질했다. 관찰 질량 = 10,056Da; 이론 질량 = 10,058Da (평균 동위원소 조성).
실시예 19
RANTES 유사체 G1755의 제조
도 33에 묘사된 G1755 화합물을 다음과 같이 합성했다.
1. n-노나노일-RANTES(2-33)의 제조
n-노나노일-RANTES(2-33)을 실시예 18에서 설명된 대로 티오에스테르-생성 수지 상에서 합성한 후, n-노나노산과 수지를 직접 커플링하여 n-말단에서 변형시켰다. 펩티드 수지를 불화수소로 절단하고, 역상 HPLC로 정제하여 n-노나노일-RANTES(2-33)을 얻었다. 관찰 질량 = 4177.0Da; 이론 질량 = 4177.6Da (평균 동위원소 조성).
2. [RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70의 제조
a. 고체상 펩티드 및 {펩티드-수지} 상에서의 수용성 중합체 합성
[RANTES(34-68)]-Lys69(Fmoc)-Leu70을 실시예 18에 설명된 대로 Boc 화학 고체상 펩티드 합성에 대한 인시투 중화/HBTU 활성화 프로토콜을 사용하여, Boc-Leu-OCH2-Pam-수지 상에서 종래의 고체상 펩티드 합성에 의해 합성했다.
사슬 회합의 완료 후, Lys69의 엡실론 질소 상의 Fmoc 기를 보호된 펩티드 수지로부터 제거하고, GP6 구성물을 실시예 18에 설명된 대로 펩티드 수지 상에서 합성했다. 펩티드/선형 수용성 중합체 수지를 불화수소로 절단하고, 생성물을 역상 예비 HPLC로 정제하여 [RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70을 얻었다. 관찰 질량 = 6252.9Da; 이론 질량 = 6252.2Da (평균 동위원소 조성).
3. G1755의 제조
a. 자생 화학적 라이게이션에 의한 전길이 폴리펩티드의 회합
N-말단 및 C-말단 펩티드 세그먼트를 실시예 18에 설명된 대로 자생 화학적 라이게이션에 의해 함께 연결했다. 환원된 형태의 전길이 폴리펩티드를, 아세토니트릴 대 0.1% 트리플루오로아세트산 함유 물을 선형 구배로 사용하는 역상 HPLC로정제했다. 관찰 질량 = 10,060.7Da; 이론 질량 = 10,058.7Da (평균 동위원소 조성).
b. 수용성 중합체로 변형된 폴리펩티드 접기 및 정제
GP6이 부착된 전길이 폴리펩티드를 시스테인-시스틴 산화환원 커플을 함유하는 수성 완충액 중에서 2개의 2황화물 결합을 형성시키면서 접었고, 실시예 18에 설명된 대로 역상 HPLC로 정제했다. 접힌 생성물은 HPLC 상에서 균질했다. 관찰 질량 = 10,057.4Da; 이론 질량 = 10,054.7Da (평균 동위원소 조성).
실시예 20
RANTES 유사체 G1805의 제조
도 34에 묘사된 G1805 화합물을 다음과 같이 합성했다.
1. n-노나노일-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-티오에스테르의 제조
여기에서 X = L-시클로헥실글리신(Chg)
n-노나노일-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)를 실시예 18에서 설명된 대로 티오에스테르-생성 수지 상에서 합성한 후, n-노나노산과 수지를 직접 커플링하여 n-말단에서 변형시켰다. 펩티드 수지를 불화수소로 절단하고, 역상 HPLC로 정제하여 n-노나노일-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)를 얻었다. 관찰질량 = 41512.0Da; 이론질량 = 4152.6Da (평균 동위원소 조성).
2. [RANTES(34-68)](Met67Lys(Lev))-Lys69-Leu70의 제조
[RANTES(34-68)](Met67Lys)-Lys69(Fmoc)-Leu70을 실시예 18에 설명된 대로 Boc 화학 SPPS에 대한 인시투 중화/HBTU 활성화 프로토콜을 사용하여, Boc-Leu-OCH2-Pam-수지 상에서 종래의 SPPS에 의해 합성했다.
사슬 회합의 완료 후, Lys67의 엡실론 질소 상의 Fmoc 기를 DMF 처리중에 20% 피페리딘을 사용하여 보호된 펩티드-수지로부터 제거했다. 레불린산을 1,3-디이소프로필카르보디-이미드를 갖는 대칭 무수물로서 활성화시키고, Lys67의 엡실론 질소와 커플링시켰다. 펩티드-수지를 불화수소로 절단하고, 생성물을 역상 예비 HPLC로 정제하여 [RANTES(34-68)](Met67Lys(Lev))-Lys69(GP6)-Leu70을 얻었다. 관찰 질량 = 4433.2Da; 이론 질량 = 4434.2Da (평균 동위원소 조성).
3. G1805의 제조
여기에서 X = L-시클로헥실글리신(Chg), GP29 = 실시예 4에 설명된 대로 제조된 도 34에 묘사된 분기 옥심-연결 수용성 중합체 구성물.
a. 자생 화학적 라이게이션에 의한 전길이 폴리펩티드의 회합
N-말단 및 C-말단 펩티드 세그먼트를 실시예 18에 설명된 대로 자생 화학적 라이게이션에 의해 함께 연결했다. 환원된 형태의 전길이 폴리펩티드를, 아세토니트릴 대 0.1% 트리플루오로아세트산 함유 물을 선형 구배로 사용하는 역상 HPLC로정제했다. 관찰 질량 = 8213.6Da; 이론 질량 = 8216.6Da (평균 동위원소 조성).
b. 라이게이션된 전길이 폴리펩티드에 GP29의 부착
동결건조된 전길이 폴리펩티드를 용해시키고, 아미노옥시아세틸(AoA)-함유 분기 수용성 중합체 구성물 GP29의 등몰량과 함께 동결건조시켰다. 건조된 분말을 용해시키고 역상 HPLC로 정제하여, 옥심 결합에 의해 위치 67에 있는 리신의 변형된 측쇄 상의 케토 작용기에 GP29가 공유적으로 부착된 전길이 폴리펩티드를 얻었다. 관찰 질량 = 23,836Da; 이론 질량 = 23,845Da (평균 동위원소 조성). 또는 달리, 폴리펩티드를 접은 후에 GP29를 공유적으로 부착시켰지만, 이것은 더 낮은 수율로 얻어진 것이 관찰되었다.
c. 폴리펩티드 함유 옥심-연결 GP29의 접기 및 정제
GP29가 부착된 전길이 폴리펩티드를 시스테인-시스틴 산화환원 커플을 함유하는 수성 완충액 중에서 2개의 2황화물 결합을 형성시키면서 접었고, 실시예 18에 설명된 대로 역상 HPLC로 정제했다. 접힌 생성물은 HPLC 상에서 균질했다. 관찰 질량 = 23,832Da; 이론 질량 = 23,840Da (평균 동위원소 조성).
실시예 21
RANTES 유사체 G1806의 제조
도 35에 묘사된 RANTES 유사체 G1806을 다음과 같이 합성했다.
1. n-노나노일-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-티오에스테르의 제조
여기에서 X = L-시클로헥실글리신(Chg)
펩티드 세그먼트 n-노나노일-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-티오에스테르(티오에스테르는 -COSR로도 나타냄, 여기에서 R은 알킬기)를 실시예 18에서 설명된 대로 티오에스테르-생성 수지 상에서 합성한 후, n-노나노산과 수지를 직접 커플링하여 n-말단에서 변형시켰다. 펩티드 수지를 불화수소로 절단하고, 역상 HPLC로 정제하여 n-노나노일-RANTES(2-33)Tyr3Chg를 얻었다. 관찰 질량 = 4152.0Da; 이론 질량 = 4152.6Da (평균 동위원소 조성).
2. [RANTES(34-68)](Met67Lys(Lev))-Lys69(Palm)-Leu70의 제조
여기에서 K(lev)는 야생형 RANTES로부터 Met67Lys 변화를 가진 Lys67의 레불린산-변형 엡실론 질소이고, K(Palm)은 구조:
를 가진 아미노-옥타노 부분을 통해 부착된 Lys69의 팔미테이트-변형 엡실론 질소이다.
[RANTES(34-68)](Met67Lys)-Lys69(Palm)-Leu70을 실시예 18에 설명된 대로 Boc 화학 고체상 펩티드 합성에 대한 인시투 중화/HBTU 활성화 프로토콜을 사용하여, Boc-Leu-OCH2-Pam-수지 상에서 종래의 SPPS에 의해 합성했다. 위치 69에서 Boc-Lys(Fmoc)-OH를 커플링한 후, Fmoc 기를 DMF에 용해된 20% 피페리딘을 사용하여 제거했다. Fmoc-8-아미노-옥타노산을 HBTU/DIEA로 활성화시키고, Lys69의 엡실론 질소와 커플링시켰다. Fmoc 기의 제거 후, 팔미트산을 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HATU) 및 1,3-디-이소프로필카르보디-이미드로 활성화시키고, 수지와 커플링시켰다. 다음에, 사슬 회합을 실시예 18에 설명된 대로 표준 Boc 화학 SPPS 과정을 사용하여 완료했다. 사슬 회합의 완료 후, Lys67의 엡실론 질소 상의 Fmoc 기를 DMF 처리중에 20% 피페리딘을 사용하여 제거했다. 레불린산을 1,3-디-이소프로필카르보디-이미드를 갖는 대칭 무수물로서 활성화시키고, Lys67의 엡실론 질소와 커플링시켰다. 펩티드 수지를 불화수소로 절단하고, 생성물을 역상 예비 HPLC로 정제하여 [RANTES(34-68)](Met67Lys(Lev))-Lys69(팔미테이트)-Leu70을 얻었다. 관찰 질량 = 4813.7Da; 이론 질량 = 4813.8Da (평균 동위원소 조성).
3. G1806의 제조
여기에서 X = L-시클로헥실글리신(Chg)이고, 팔미테이트("Palm") 지방산 부착은 아미노-옥타노 부분:
를 통한다.
a. 자생 화학적 라이게이션에 의한 지방산 변형 전길이 폴리펩티드의 회합
N-말단 및 C-말단 펩티드 세그먼트를 실시예 18에 설명된 대로 자생 화학적 라이게이션에 의해 함께 연결했다. 환원된 형태의 전길이 폴리펩티드를, 아세토니트릴 대 0.1% 트리플루오로아세트산 함유 물을 선형 구배로 사용하는 역상 HPLC로정제했다. 관찰 질량 = 8598.2Da; 이론 질량 = 8596.3Da (평균 동위원소 조성).
b. 라이게이션된 지방산 변형 전길이 폴리펩티드에 수용성 중합체 GP29의 부착
동결건조된 전길이 폴리펩티드를 용해시키고, AoA-함유 중합체 GP29의 등몰량과 함께 동결건조시켰다. 건조된 분말을 용해시키고 역상 HPLC로 정제하여, 옥심 결합에 의해 위치 67에 있는 리신의 변형된 측쇄 상의 케토 작용기에 GP29가 공유적으로 부착된 전길이 폴리펩티드를 얻었다. 관찰 질량 = 24,217Da; 이론 질량 = 24.224Da (평균 동위원소 조성). 또는 달리, 폴리펩티드를 접은 후에 GP29를 공유적으로 부착시켰지만, 이것은 더 낮은 수율로 얻어진 것이 관찰되었다.
c. 폴리펩티드 함유 옥심-연결 GP29 및 지방산의 접기 및 정제
GP29가 부착된 전길이 폴리펩티드를 시스테인-시스틴 산화환원 커플을 함유하는 수성 완충액 중에서 2개의 2황화물 결합을 형성시키면서 접었고, 실시예 18에 설명된 대로 역상 HPLC로 정제했다. 접힌 생성물은 HPLC 상에서 균질했다. 관찰 질량 = 24,210Da; 이론 질량 = 24.220Da (평균 동위원소 조성).
도 36은 최종 접힌 정제된 합성 RANTES 유사체의 대표적인 분석 데이타를 나타낸다. 구체적으로, 환원(R) 및 비-환원(N) 조건하에서 야생형(Wt) RANTES와 합성 케모카인 유사체 RANTES G1806의 상대적 분자량을 비교하는 대표적인 SDS-PAGE 겔을 도 36에 나타낸다. 상대 분자량은 각 겔의 좌측에 묘사되며, 이것은 동일한 겔 상에서 전개된 분자량 표준에 상응한다(나타내지 않음). 또한, 접힌 정제된 G1806 생성물의 대표적인 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 이것은 야생형 자생RANTES와 비교하여 정확한 중합체-변형 구성물의 순도 및 증가된 상대 분자량을 예시한다.
실시예 22
G1755-01, G1755, G1805 및 G1806에 대한 세포 융합 분석
다양한 중합체-변형 RANTES 유사체의 항-HIV 활성을 시험하기 위해 세포 융합 분석을 수행했다. CCR5-의존성 세포 융합을 억제하는 주어진 패널의 화합물의 능력을 CD4 및 CCR5를 지니고 수용체 시스템을 함유하는 세포와 융합된 바이러스막 단백질을 함유하도록 조작된 세포를 사용하여 측정했다. CCR5-매개 바이러스막-매개 세포 융합 분석은 본질적으로 Simmons 등(Science (1997) 276:276-279)에 설명된 대로, 셀라인 HeLa-P5L 및 HeLa-Env-ADA를 사용하여 수행했으며, 이 셀라인은 모두 M. Alizon(파리)의 연구소에 의해 친절하게 제공되었다. 간단히, HeLa-P5L 세포를 96-웰플레이트에 접종했다(100㎕의 웰 당 104세포). 24시간 후 배지를 제거하고, 웰 당 104HeLa-Env-ADA 세포를 함유하는 배지 + 케모카인을 첨가했다(최종 부피 200㎕). 24시간이 더 지난 후, 세포를 PBS 중에서 세척하고, 실온에서 15분간 50㎕ PBS/0.5% NP-40에 용해시켰다. 50㎕ 2x CPRG 기질(16mM 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노시드; 120mM Na2HPO4, 80mM NaH2PO4, 20mM KCl, 20mM MgSO4, 및 10mM β-메르캅토에탄올)을 첨가한 후, 실온의 암소에서 1-2시간 동안 인큐베이션함에 의해, β-갈락토시다제 활성에 대해 용해액을 분석했다. 다음에, 575nm에서의 흡광도를 랩시스템스 마이크로플레이트 리더 상에서 읽었다. 이들 값으로부터각 억제제 농도에서의 억제 % [100 x (OD(시험)- OD(음성 대조표준)/OD(양성 대조표준)- OD(음성 대조표준)를 계산했다. 억제제 농도에 대한 융합 억제 퍼센트 곡선으로부터 각 화합물에 대한 IC50값을 계산했다.
대표적인 결과를 아래 표 XII에 나타낸다.
이들 결과는 선형 또는 분기 수용성 중합체 구성물로 부위-특이적 변형한 후 항-융합 활성의 실질적 보유를 증명한다. 이 결과는 지방산과 같은 소수성 부분이 C-말단에 부착되었을 때 다양한 RANTES 유사체의 활성의 증가가 관찰된다는 점에서 놀라우며, 이것은 일반적으로 RANTES 유사체의 소수성 성질이 증가하면 항-융합 활성도 증가한다는 가설을 지지한다. 반면, 변형에 사용된 수용성 중합체, 특히 분기 수용성 중합체는 꽤 친수성이고 음으로 하전되었지만, 활성에 있어 최저의 감소만이 관찰되었고, 이것은 생체내 활성에 대해 추구된 목표 효능 범위 내였다. 심지어 더욱 예상치 못한 것은, 더 작은 선형 수용성 중합체 구성물과 비교하여, 더 큰 음으로 하전된 분기 수용성 중합체 구성물로 변형된 RNATES 유사체의 활성의 상대적 보유였으며, 작은 선형 중합체 및 큰 분기 중합체로 변형된 유사체가 활성에 대해 실질적으로 동일한 효과를 가졌다는 것이었다. 이 나중의 관찰은, 수용성 중합체 변형이 응집 영역에 있는 야생형 RANTES의 펜던트 C-말단 잔기에 내부적으로 만들어질 때의 항-응집 특성, 및/또는 수용성 중합체의 국부화된 항-융합 특성에 일부 원인이 있는 것으로 여겨진다.
AOP-RANTES 및 NNY-RANTES에 대하여, 추가의 효능-증가 변화가 수용성 중합체의 부착으로 인한 최저 활성 손실을 보상했다. 이들 변화는 N-말단에 1개 이상의 소수성 아미노산 유도체의 도입, 및 C-말단에 소수성 지방산 부분의 첨가를 포함했다. 이들 결과는 단일분산 폴리아미드 에틸렌 중합체(또는 다른 수용성 중합체)와 조합된 추가의 변화가, N-말단에 대한 Pro2Thz와 Tyr3Chg 변화 및/또는 C-말단에 지질 부분의 첨가가 조합된, AOP- 또는 NNY-RANTES와 같은, NNY- 및 AOP-형 변형된 케모카인 분자의 전체적인 효능을 개선시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 23
G1755, G1805, 및 G1806의 약물동태학 연구
중합체-변형 RANTES 유사체의 약물동태학 연구를 다음과 같이 수컷 Sprague-Dawley 래트에서 수행했다. 상술된 대로 제조된 RANTES 유사체 G1755, G1805, 및 G1806(대조표준으로서 AOP-RANTES와 함께)을 pH 7.0의 인산 완충 살린에 용해된 동결건조된 단백질 스톡으로부터 주사하기 바로 전에 정맥내(IV) 주사용으로 조제했다. 각 시험 동물에 RANTES 유사체를 등몰 용량으로 제공하도록 제제를 제조했다 [400㎍/kg(AOP-RANTES); 510㎍/kg(G1755); 1210㎍/kg(G1805); 및 1225㎍/kg(G1806)(㎍ 유사체/kg 동물)]. 각 동물에 대해 1ml/kg의 총 용량 부피를 제공할 필요가 있는 경우 최종 농도를 조정했다(즉, 용량 부피를 일정하게 유지했다). 각 조제된 유사체를 실험 1일째에 래트의 꼬리를 통해 정맥내 투여했으며, 각 동물은 단일 용량을 받았다.
표준 프로토콜 및 국립보건학회의 동물 관리 가이드라인 및 추천된 시험 과정에 따라서, 주사 후 대략 0.25ml의 혈액을 실험 과정 동안에 각 샘플 수집 시간점에서 꼬리 정맥/동맥으로부터 수집했고, 혈장 또는 혈청 샘플을 항응고제로서 EDTA를 사용하여 제조했다. 3주 이내에 어느 동물로부터 14회 이상의 0.25ml 샘플의 수집을 피하기 위해서 초기 데이타 수집을 기초로 샘플 수집 시간을 조정했다(국립보건학회의 동물 관리 가이드라인에 의해 확립). 검출 가능한 혈액 수준이 초기 샘플을 지나서 지속되었을 경우, 주간격으로 추가의 샘플을 수집했다. 각 시간점에서 각 RANTES 유사체의 혈장 농도를 제조자의 지시에 따라서 QuantikineElisa, 사람 RANTES 면역분석(R&D Systems 카탈로그 번호 DRN00)을 사용하여 측정했다. 체중, 식이습관, 성질, 외모 등을 포함한 동물의 전반적인 건강을 실험 과정 동안에 모니터했으며, 분명한 부작용은 관찰되지 않았다. 대표적인 결과를 도 37에 나타낸다.
이들 결과는 다양한 선구물질 RANTES 유사체에 수용성 중합체의 부착에 의해 제공된 혈중 반감기의 실질적인 증가를 증명하며, G1805 > G1806 > G1755 > AOP-RANTES 순으로 반감기의 분명한 증가를 가진다. AOP-RANTES에 비해, G1805는 약 40배, G1806은 약 20배, 그리고 G1755는 약 10배 증가했다. 총괄하여, 중합체-변형 RANTES 유사체에 대한 높은 효능 보유 및 혈중 반감기의 상당한 개선의 균형은 생체내 환경에서 이들 화합물의 치료 효능을 증진시키고, 치료에 필요한 용량의 수와 양을 감소시킬 것으로 예상된다.
본 발명이 특정한 구체예와 관련하여 설명되었지만 더 이상의 변형이 가능하다는 것이 이해될 것이며, 본 발명이 속하는 기술 범위 내의 공지된 또는 통상의 실시 범위 내이며, 상기 설명된 본질적인 특징들에 적용될 수 있기 때문에, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따르며, 본 명세서로부터의 그러한 벗어남을 포함하는, 본 발명의 어떤 변형, 사용, 또는 개조를 포함하도록 의도된다.

Claims (109)

  1. 식 Protein-U n -B-Polymer-J*를 갖는 분리된 합성 생물활성 단백질로서, 여기에서 Protein은 리보솜 특이 단백질의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 상기 폴리펩티드 사슬은 1개 이상의 화학적 라이게이션 부위에 의해 공유 결합된 1개 이상의 비-중첩 펩티드 세그먼트를 포함하고, U는 상기 비-중첩 펩티드 세그먼트 중 1개 이상에 속한 1개 이상의 아미노산의 측쇄n의 상호 반응성인 유일 작용기에 공유 결합된 유일 작용기의 잔기이며, 여기에서n은 1 내지 6으로부터 선택된 불연속 정수이고, B는 3개 이상의 팔을 갖는 분기 중심으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 존재할 수도 또는 부재할 수도 있고, Polymer는 실질적으로 비-항원성인 수용성 중합체이고, J*는 음, 중성 및 양으로 구성된 군으로부터 선택된 생리학적 조건하에서의 순전하를 갖는 펜던트기인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 합성 생물활성 단백질은 25,000 달톤 이상의 단량체 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 합성 생물활성 단백질은 상기 리보솜 특이 단백질에 관련된 생물활성을 의태하는 생물활성을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 리보솜 특이 단백질은 포유류 단백질인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 포유류 단백질은 사이토카인인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 사이토카인은 인터류킨, 적혈구생성 자극 단백질, 인터페론, 림포카인, 케모카인, 성장인자, 콜로니 자극인자, 및 신호 펩티드 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 포유류 단백질은 사람 단백질인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 리보솜 특이 단백질은 리보솜 특이 당화 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  9. 제 8 항에 있어서, U는 리보솜 특이 당화 부위에 해당하는 상기 폴리펩티드 사슬의 부위에서 상기 측쇄n에 공유 결합된 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  10. 제 9 항에 있어서, U는 상기 리보솜 특이 당화 부위에 해당하는 부위에서 배타적으로 상기 측쇄n에 공유 결합된 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 리보솜 특이 단백질은 재조합적으로 생산된 단백질인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 재조합적으로 생산된 단백질은 비-천연 단백질인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 비-천연 단백질은 1개 이상의 비-천연 리보솜 특이 당화 부위를 갖는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬은 1개 이상의 변칙 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 변칙 아미노산은 20개의 유전적으로 코드된 아미노산에 속한 것 이외의 다른 측쇄를 갖는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 변칙 아미노산은 위아미노산 및 소수성 아미노산유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 화학적 라이게이션 부위는 아미드, 옥심, 히드라존, 티오에스테르, 티아졸리딘, 옥사졸리딘 및 티오에테르로 구성된 군으로부터 선택된 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 측쇄n은 비-천연 측쇄인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  19. 제 1 항에 있어서, U는 화학적 라이게이션에 의해 형성된 결합을 통해 상기 측쇄n에 공유 결합된 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  20. 제 19 항에 있어서, 화학적 라이게이션에 의해 형성된 상기 결합은 아미드, 옥심, 히드라존, 티오에스테르, 티아졸리딘, 및 옥사졸리딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  21. 제 1 항에 있어서, U, B, Polymer 및 J* 중 1개 이상은 스페이서 또는 링커에 의해 분리되고, 식 U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*를 가지며, 여기에서 s1, s2 및 s3은 스페이서 또는 링커 부분으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 개별적으로 존재하거나 또는 부재할 수 있는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  22. 제 1 항에 있어서, U는 옥심, 아미드, 아민, 우레탄, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 티오에스테르, 히드라지드, 옥사졸리딘, 및 티아졸리딘으로부터 선택된 결합의 잔기인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  23. 제 1 항에 있어서, B의 한 팔은 U에 연결되고, B의 두번째 팔은 Polymer에 연결된 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  24. 제 1 항에 있어서, B는 4개 이상의 팔을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  25. 제 1 항에 있어서, 상기 팔 중 적어도 1개는 옥심, 아미드, 아민, 우레탄, 티오에테르, 에스테르, 티오에스테르, 히드라지드, 옥사졸리딘, 및 티아졸리딘으로 구성된 군으로부터 선택된 결합의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  26. 제 1 항에 있어서, B는 아미노, 카르복실레이트 및 혼성 아미노-카르복실레이트로 구성된 군으로부터 선택된 분기 중심을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 아미노 분기 중심은 리신을 포함하고, 상기 카르복실레이트 분기 중심은 글루탐산 또는 아스파르트산을 포함하고, 상기 혼성 아미노-카르복실레이트 분기 중심은 감마-글루탐산을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  28. 제 1 항에 있어서, Polymer는 폴리알킬렌 옥시드, 폴리아미드 알킬렌 옥시드 및 그것들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  29. 제 1 항에 있어서, 상기 측쇄n은 상기 폴리펩티드 사슬의 화학적 라이게이션 부위에 있는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  30. 제 1 항에 있어서, B-Polymer-J*는 1,500 내지 80,000 달톤의 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  31. 제 1 항에 있어서, 측쇄 n은 2개 이상이고, B-Polymer-J* 중 1개 이상은 상이한 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  32. 제 1 항에 있어서, B-Polymer-J*는 음, 중성 및 양으로 구성된 군으로부터 선택된 생리학적 조건하에서의 순전하를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  33. 제 1 항에 있어서, B-Polymer-J*는 단일-분산된 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  34. 제 1 항에 있어서, 상기 합성 생물활성 단백질은 단일-분산된 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  35. 제 1 항에 있어서, Polymer는 식 -[C(O)-X-C(O)NH-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-의 폴리아미드이며, 여기에서 X 및 Y는 2가 라디칼로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 분기되거나 또는 선형일 수 있고, n은 2 내지 100의 정수이고, X 및 Y 중 어느 하나 또는 모두는 선형이거나 또는 분기될 수 있는 수용성 반복 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 X는 식 -NH-X'- 또는 -X'-NH-의 2가 라디칼이며, 여기에서 X'는 선형이거나 또는 분기될 수 있는 수용성 반복 단위를 포함하는 2가 라디칼인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  37. 제 35 항에 있어서, 상기 Y는 식 -CO-Y'- 또는 -Y'-CO-의 2가 라디칼이며,여기에서 Y'는 2가 라디칼인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  38. 제 35 항에 있어서, n은 2 내지 50의 불연속 정수인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  39. 제 35 항에 있어서, 상기 수용성 반복 단위는 식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥시드 반복 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 에틸렌 옥시드 반복 단위는 식 -(CH2-CH2-O-)n- 또는 -(O-CH2-CH2)n-을 가지며, 여기에서 n은 2 내지 50의 불연속 정수인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  41. 제 1 항에 있어서, J는 음 및 양으로 구성된 군으로부터 선택된 생리학적 조건하에서의 순전하를 갖는 이온성 기인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 이온성 기는 카르복실, 아민, 및 히드록실로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  43. 제 1 항에 있어서, J는 생리학적 조건하에서 순 중성전하를 갖는 비-이온성 기인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  44. 제 35 항에 있어서, 포유류에서 상기 수용성 중합체가 없는 상응하는 합성 생물활성 단백질에 비하여 더 큰 증가된 혈중 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  45. 리보솜 특이 당단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 상기 폴리펩티드 사슬은 그것에 부착된 1개 이상의 수용성 중합체 및 25kDa 이상의 단량체 분자량을 갖는 합성 생물활성 단백질.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 합성 생물활성 단백질은 상기 리보솜 특이 당단백질에 관련된 생물활성을 의태하는 생물활성을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 리보솜 특이 당단백질은 사이토카인인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 사이토카인은 적혈구생성 자극 단백질, RANTES, 및 과립구 콜로니 자극인자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성생물활성 단백질.
  49. 제 45 항에 있어서, 상기 리보솜 특이 당단백질은 1개 이상의 당화 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 상기 1개 이상의 당화 부위에 해당하는 1개 이상의 부위에서 상기 폴리펩티드 사슬에 부착된 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 상기 1개 이상의 당화 부위에 해당하는 1개 이상의 부위에서 배타적으로 상기 폴리펩티드 사슬에 부착된 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  52. 제 45 항에 있어서, 상기 리보솜 특이 당단백질은 재조합적으로 생산된 당단백질인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 재조합적으로 생산된 당단백질은 비-천연 당단백질인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 비-천연 당단백질은 1개 이상의 비-천연 당화 부위를 갖는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  55. 제 45 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬은 1개 이상의 변칙 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  56. 제 45 항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 1,500 내지 80,000 달톤의 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  57. 제 45 항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 음, 중성 및 양으로 구성된 군으로부터 선택된 생리학적 조건하에서의 순전하를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  58. 제 45 항에 있어서, Polymer는 폴리알킬렌 옥시드, 폴리아미드 알킬렌 옥시드 및 그것들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  59. 제 45 항에 있어서, Polymer는 식 -[C(O)-X-C(O)NH-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-의 폴리아미드이며, 여기에서 X 및 Y는 2가 라디칼로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 분기되거나 또는 선형일 수 있고, n은 2 내지 100의 정수이고, X 및 Y 중 어느 하나 또는 모두는 선형이거나 또는 분기될 수 있는 수용성 반복 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  60. 제 59 항에 있어서, n은 2 내지 50의 불연속 정수인 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  61. 제 59 항에 있어서, 상기 수용성 반복 단위는 식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥시드 반복 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물활성 단백질.
  62. 제 1 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 따르는 합성 생물활성 단백질, 또는 제약학적으로 허용되는 그것의 염을 포함하는 제약학적 조성물.
  63. 제 62 항에 있어서, 완충액, 캐리어 단백질, 아미노산, 세제, 지질, 수용성 중합체, 및 보존제로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  64. 제 63 항에 있어서, 상기 합성 생물활성 단백질 이외의 다른 1개 이상의 추가 생물활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  65. 약 25kDa 이상의 단량체 분자량을 가지며, 천연 사람 단백질 수용체 또는 그것의 단편, 단백질 수용체 리간드 또는 그것의 단편, 또는 사이토카인에 관련된 생물활성을 의태하는 생물활성을 갖는 중합체-변형 합성 생물활성 단백질의 1개 이상의 분자적으로 동종성인 제약학적 조성물을 포함하는 제약학적 조성물의 유효량을 그러한 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 사람의 질환 또는 상태를 치료하는 방법.
  66. 제 65 항에 있어서, 상기 합성 생물활성 단백질은 사이토카인의 생물활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 66 항에 있어서, 상기 사이토카인을 인터류킨, 적혈구생성 자극 단백질, 인터페론, 림포카인, 케모카인, 성장인자, 콜로니 자극인자, 및 신호 펩티드 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 62 항에 있어서, 천연 사람 단백질 수용체 또는 그것의 단편, 단백질 수용체 리간드 또는 그것의 단편, 또는 사이토카인의 생물활성 또는 생물활성의 결여에 관련된 사람의 질환 또는 상태를 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  69. 제 68 항에 있어서, 상기 중합체-변형 합성 생물활성 단백질은 사이토카인의 생물활성을 갖는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  70. 제 69 항에 있어서, 상기 사이토카인은 인터류킨, 적혈구생성 자극 단백질, 인터페론, 림포카인, 케모카인, 성장인자, 콜로니 자극인자, 및 신호 펩티드 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  71. 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 중합체-변형 폴리펩티드 사슬을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 폴리펩티드 사슬의 비-중첩 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 세그먼트들을 화학적으로 라이게이션함하여 상기 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 중합체-변형 폴리펩티드 사슬을 제조하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 펩티드 세그먼트 중 1개 이상은 그것에 부착된 수용성 중합체를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬은 리보솜 특이 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 72 항에 있어서, 상기 리보솜 특이 단백질은 포유류 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 73 항에 있어서, 상기 포유류 단백질은 사이토카인인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 74 항에 있어서, 상기 사이토카인을 인터류킨, 적혈구생성 자극 단백질, 인터페론, 림포카인, 케모카인, 성장인자, 콜로니 자극인자, 및 신호 펩티드 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 71 항에 있어서, 상기 중합체-변형 폴리펩티드 사슬을 접어서 합성 생물활성 중합체-변형 단백질을 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 71 항에 있어서, 상기 펩티드 세그먼트 중 1개 이상을 부분적으로 보호하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 71 항에 있어서, 상기 펩티드 세그먼트 중 1개 이상을 보호하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 71 항에 있어서, 상기 펩티드 세그먼트 중 1개 이상은 1개 이상의 변칙 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 71 항에 있어서, 상기 화학적으로 라이게이션하는 단계는 자생 화학적 라이게이션, 확장된 자생 화학적 라이게이션 및 위자생 화학적 라이게이션으로부터 선택된 화학선택성 라이게이션 화학을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 71 항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 1,500 내지 80,000 달톤의 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 중합체-변형 폴리펩티드 사슬을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    a. 상기 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 비-중첩 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 세그먼트들을 화학적으로 라이게이션하여 상기 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 아미노산 서열에 해당하는 전길이 폴리펩티드 사슬을 형성하며, 여기에서 상기 펩티드 세그먼트 중 1개 이상은 제 1 유일 화학선택성 기를 포함하는 단계; 및
    b. 수용성 중합체와 상기 전길이 폴리펩티드 사슬을 화학적으로 라이게이션하여 상기 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 중합체-변형 폴리펩티드 사슬을 제조하며, 상기 수용성 중합체는 상기 제 1 유일 화학선택성 기와 상호적으로 유일하게 반응하는 제 2 화학선택성 기를 포함하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 82 항에 있어서, 상기 중합체-변형 폴리펩티드 사슬을 접어서 합성 생물활성 중합체-변형 단백질을 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 합성 생물활성 중합체-변형 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    a. 상기 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 비-중첩 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 세그먼트들을 화학적으로 라이게이션하여 상기 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 아미노산 서열에 해당하는 전길이 폴리펩티드 사슬을 형성하며, 여기에서 상기 펩티드 세그먼트 중 1개 이상은 유전적으로 코드된 아미노산의 아미노산 측쇄 작용기와 반응하지 않는 제 1 유일 화학선택성 기를 포함하는 비-자생 측쇄를 포함하는 단계;
    b. 상기 전길이 폴리펩티드 사슬을 접어서 접힌 폴리펩티드 사슬을 형성하는 단계; 및
    c. 수용성 중합체와 상기 접힌 폴리펩티드 사슬을 화학적으로 라이게이션하여 상기 합성 생물활성 중합체-변형 단백질의 중합체-변형 폴리펩티드 사슬을 제조하며, 상기 수용성 중합체는 상기 제 1 유일 화학선택성 기와 상호적으로 유일하게 반응하는 제 2 화학선택성 기를 포함하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 식 U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*의 분자적으로 동종성인 수용성 중합체로서, 여기에서 U는 유일 작용기의 잔기이고, B는 3개 이상의 팔을 갖는 분기 중심으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 존재할 수도 또는 부재할 수도 있고, Polymer는 식 -[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-의 약 5,000Da 이상의 분자량을 갖는 폴리아미드이며, 여기에서 X 및 Y는 2가 라디칼로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 분기되거나 또는 선형일 수 있고, n은 2 내지 50의 불연속 정수이고, X 및 Y 중 어느 하나 또는 모두는 선형이거나 또는 분기될 수 있는 실질적으로 비-항원성인 수용성 반복 단위를 포함하고, J*는 음, 양 및 중성으로 구성된 군으로부터 선택된 생리학적 조건하에서의 순전하를 갖는 실질적으로 비-항원성인 펜던트기의 잔기이고, s1, s2 및 s3은 스페이서 또는 링커 부분으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 개별적으로 존재하거나 또는 부재할 수 있는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  86. 제 85 항에 있어서, U는 아크릴레이트, 알데히드, 케톤, 아미노옥시, 아민, 카르복실산, 에스테르, 티오에스테르, 할로겐, 티올, 시아노아세테이트, 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, 에폭시드, 히드라지드, 아지드, 이소시아네이트, 말레이미드, 메타크릴레이트, 니트로페닐 카르보네이트, 오르토피리딜 디술파이드, 실란, 술프히드릴, 비닐 술폰, 숙신이미딜 글루타레이트, 숙시미딜 숙시네이트, 숙신산, 트레실레이트 및 활성화가능한 작용기로 구성된 군으로부터 선택된 작용기의 잔기인 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  87. 제 85 항에 있어서, U는 카르보네이트, 에스테르, 우레탄, 오르토에스테르, 아미드, 아민, 옥심, 이미드, 유레아, 티오유레아, 티오에테르, 티오우레탄, 티오에스테르, 에테르, 티아졸리딘, 히드라존, 및 옥사졸리딘으로 구성된 군으로부터 선택된 결합을 형성할 수 있는 작용기의 잔기인 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  88. 제 85 항에 있어서, U는 보호된 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  89. 제 85 항에 있어서, s1, s2, 및 s3 중 1개 이상이 존재하며 선택되고, 1 내지 18개 탄소를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  90. 제 85 항에 있어서, s1, s2, 및 s3 중 1개 이상이 존재하며 선택되고, Polymer를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  91. 제 85 항에 있어서, s1은 Polymer를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  92. 제 85 항에 있어서, B는 4개 이상의 팔을 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  93. 제 85 항에 있어서, 상기 분자량은 약 10,000Da 이상인 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  94. 제 93 항에 있어서, 상기 분자량은 약 15,000Da 이상인 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  95. 제 85 항에 있어서, B는 1개 이상의 아미드 결합을 통해 s2 또는 Polymer에 연결된 분기 중심을 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  96. 제 85 항에 있어서, B는 아미드 결합을 통해 Polymer에 연결된 분기 중심을 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  97. 제 85 항에 있어서, 상기 반복 단위는 식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(CH2-CH2-O)-의 에틸렌 옥시드를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  98. 제 85 항에 있어서, X, Y, 또는 X 및 Y는 -((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)n1-)- 또는 -((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)으로부터 선택되며, 여기에서 n1은 1 내지 6의 불연속 정수이고, n2는 2 내지 50의 불연속 정수인 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  99. 제 85 항에 있어서, X 또는 Y 중 1개는 페닐, C1-C10알킬렌 부분, C1-C10알킬기, 헤테로원자-함유 페닐, 헤테로원자-함유 C1-C10알킬렌 부분, 헤테로원자-함유 C1-C10알킬기, 및 그것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  100. 제 96 항에 있어서, X는 -(CH2-CH2)-인 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  101. 제 100 항에 있어서, Y는 -(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)n- 또는 -(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)n-이며, 여기에서 n은 6 내지 36인 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  102. 제 85 항에 있어서, J*는 보호된 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  103. 제 85 항에 있어서, J*는 생리학적 조건하에서 순 중성전하를 갖는 비-이온성 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  104. 제 85 항에 있어서, J*는 생리학적 조건하에서 순 양전하를 포함하는 이온성 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  105. 제 85 항에 있어서, J*는 생리학적 조건하에서 순 음전하를 포함하는 이온성 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  106. 제 85 항에 있어서, X는 -X'-NH- 또는 -NH-X'-인 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  107. 제 85 항에 있어서, Y는 -Y'-NH- 또는 -NH-Y'-인 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  108. 제 107 항에 있어서, X' 및 Y' 중 적어도 1개는 식 (-CH2-CH2-O-)n또는 (O-CH2-CH2-)n의 폴리에틸렌 옥시드를 포함하며, 여기에서 n은 2 내지 50인 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
  109. 제 85 항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 단일-분산된 것을 특징으로 하는 수용성 중합체.
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