CN102574896B - 变异LovD多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了用于合成治疗上重要的他汀类化合物的酰基转移酶。
Description
1.相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年9月30日提交的美国临时申请61/247,253号和61/247,274号的权益,其所有内容通过引用以整体并入本文。
2.序列表引用
将根据37CFR§1.821以计算机可读形式(CRF)经由EFS-Web同时递交的文件名为CX2-022.txt的序列表通过引用并入本文。序列表的电子拷贝于2010年9月24日生成,其文件大小为52K字节。
3.背景
辛伐他汀(simvastatin)是可以从土曲霉(Aspergillus terreus)的发酵液分离的自然真菌聚酮(polyketide)洛伐他汀(lovastatin)的半合成类似物。辛伐他汀和洛伐他汀作为减少心脏病风险的降胆固醇药物:辛伐他汀作为而洛伐他汀作为均由Merck公司销售。
洛伐他汀(在图1中说明)是胆固醇生物合成途径中的限速酶羟甲基戊二酸辅酶A还原酶的强效抑制剂(Xie等人,2006,Chemistry & Biology13:1161-1169)。其类似物辛伐他汀(也在图1中说明)在高胆固醇血症治疗中更有效(Manzoni和Rollini,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.58:555-564;Istan和Diesenhofer,2001,Science 292:1160-1164)。用辛伐他汀中发现的α-二甲基丁酸侧链取代洛伐他汀的α-甲基丁酸侧链在降低不期望的副作用的同时显著地增加其抑制性质(Klotz,Ulrich,2003,Arzneimittel-Forschung 53:605-611)。
因为辛伐他汀的临床重要性,从洛伐他汀起始的不同的多步骤合成已经被描述(见,如WO 2005/066150;美国申请2005/0080275号;美国申请2004/0068123号;美国专利6,833,461号;WO 2005/040107;Hoffman等人,1986,J.Med.Chem.29:849-852;Schimmel等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:1307-1311)。
用于洛伐他汀生物合成的基因簇之前已经被描述(见,如美国专利6,391,583号;Kennedy等人,1999,Science 284:1368-1372;Hutchinson等人,2000,Antonie Van Leeuwenhoek 78:287-295)。在该基因簇中编码46kD酶LovD,其催化洛伐他汀生物合成的最后一步。
简言之,模拟洛伐他汀化合物的部分的十氢化萘核部分与HMG-CoA部分通过洛伐他汀九酮合酶(LNKS)和三种辅助酶体内合成。洛伐他汀的2-甲基丁酸侧链通过洛伐他汀二酮合酶(LDKS)体内合成,并经由硫酯键共价连接到LovF的酰基载体域。酰基转移酶LovD继而能够在单个步骤中使2-甲基丁酸基团从LDKS向莫纳可林J(monacolin J)的C8羟基基团选择性地转移以生产洛伐他汀(Xie等人,2006,Chemistry & Biology13:1161-1169)。
最近已发现LovD酰基转移酶对酰基载体、酰基底物和十氢化萘酰基受体具有广泛的底物特异性(Xie等人,2006,Chem.Biol.13:1161-1169)。例如,LovD可以有效地催化酰基从CoA硫酯或N-乙酰基半胱胺(“SNAC”)硫酯向莫纳可林J转移(同上)。显著地是,在α-二甲基丁酰-SNAC被用作酰基供体时,LovD能够使莫纳可林J和6-羟基-6-去甲基莫纳可林J分别转化为辛伐他汀和huvastatin(同上)。使用被工程化以过表达LovD的大肠杆菌(E.coli)菌株作为全细胞生物催化剂,制备量的辛伐他汀在单个发酵步骤(同上)中合成。
以上研究证明LovD酰基转移酶是用于诸如辛伐他汀的药学上重要的降低胆固醇药物的生物合成的有吸引力的酶。然而,在使用分离的LovD酶进行的随后的实验中,稳定性和反应速率被证实是有问题的(Xie和Tang,2007Appl.Environ.Microbiol.73:2054-2060)。具体来说,发现LovD在高蛋白浓度(~100μM)容易(以小时计)沉淀,而在较低浓度(~10μM)缓慢(以天计)沉淀(同上)。此外,发现非常期待的产物辛伐他汀竞争LovD酶,显著地阻碍酰化的总净速率(同上)。
LovD酶在大肠杆菌中过表达时也高度倾向于错误折叠和聚集,使得对于商品化生产来说即使是全细胞生物催化系统也不太理想(Xie等人,2009,Biotech.Bio Eng.102:20-28)。
在试图增加LovD的溶解性而不损失催化活性的努力中,野生型土曲霉LovD的突变体已被研究。用丙氨酸残基替换位置40和60的半胱氨酸残基(Cys40和Cys60)造成酶的溶解度和全细胞生物催化活性的改进(同上)。使这两个残基向小的或极性的氨基酸转化的进一步的诱变实验显示Cys40→Ala(“C40A”)和Cys60→Asn(“C60N”)突变最有益,分别造成全细胞生物催化活性27%和26%的增加(同上)。在组合时,这些突变证明是加性的,其中C40A/C60N双突变体表现出溶解度和全细胞生物催化活性近50%的增长。
除了其改进的性质,这些LovD突变体并不适于在无细胞系统中大规模生产辛伐他汀。与野生型和/或已知突变体相比,表现出改进的性质的野生型土曲霉LovD酶的额外变异体或突变体会是期待的。
4.概述
如以上讨论的,土曲霉的LovD基因编码酰基转移酶(在下文中称为“LovD多肽”、“LovD酶”、“LOvD酰基转移酶”或“LovD”),该酰基转移酶能够使天然产物洛伐他汀的水解产物莫纳可林J转化为辛伐他汀。本公开内容的发明人已发现包括在一定位置的突变的LovD多肽与土曲霉产生的野生型LovD多肽(SEQ ID NO:2)相比表现出改进的性质。
相应地,在一方面本公开内容提供变异LovD多肽,其与来自土曲霉的野生型LovD多肽(SEQ ID NO:2)相比具有一种或多种改进的性质。一般来说,LovD变异体包括在选定位置的一个或多个突变,其与一种或多种改进的性质,诸如增加的催化活性、增加的热稳定性、减少的聚集和/或增加的对细胞裂解条件的稳定性相关。变异LovD多肽可以包括一种或多种来自单一种类的突变(例如,增加催化活性的一种或多种突变),或者来自两种或多种不同种类的突变。通过选定与具体性质相关的突变,适合于在特定条件下使用的变异LovD多肽可以被容易地获得。
已被发现与一种或多种改进的性质诸如增加的催化活性相关的突变所在的野生型LovD多肽序列SEQ ID NO:2中的位置包括但不限于A123、M157、S164、S172、L174、A178、N191、L192、A247、R250、S256、A261、G275、Q297、L361、V370和N391。已被发现与一种或多种改进的性质诸如热稳定性相关的突变所在的额外的位置包括但不限于Q241、A261、Q295和Q412。已被发现与一种或多种改进的性质诸如减少的聚集相关的突变所在的又另一些位置包括但不限于N43、D96和H404。已被发现与一种或多种改进的性质诸如增加的稳定性相关的突变所在的位置包括但不限于C40、C60和D254。
不具有不利作用的突变所在的(或者改进LovD酶性质的突变所在的)野生型LovD多肽序列SEQ ID NO:2中的位置被发现包括但不限于I4、A9、K26、R28、I35、C40、S41、N43、C60、S109、S142、A184V、N191S、A261、L292、Q297、L335、A377、A383、N391和H404。具有改进的性质的特别的实施方案可以包括但不限于具有在位置L174和A178的突变以及任选地零至约30个额外突变的LovD多肽。在一种具体的实施方案中,额外突变处在选自以上鉴定的位置的位置。在一些实施方案中,具有改进的性质的LovD多肽包括在位置A123、L174、A178、N191、A247和L361的突变,以及零向上至约26个额外突变。在一种具体的实施方案中,额外突变处在选自以上鉴定的位置的位置。
与增加催化活性相关的SEQ ID NO:2的野生型LovD多肽的具体示例性的突变包括但不限于A123P、M157V、S164G、S172N、L174F、A178L、N191G、L192I、A247S、R250K、S256T、A261H、G275S、Q297G、L361M、V370I和N391S。
与增加热稳定性相关的SEQ ID NO:2的野生型LovD多肽的具体示例性的突变包括但不限于Q241M、A261H、Q295R和Q412R。
与减少聚集相关的SEQ ID NO:2的野生型LovD多肽的具体示例性的突变包括但不限于N43R、D96R和H404K。
与增加稳定性相关的SEQ ID NO:2的野生型LovD多肽的具体示例性的突变包括但不限于C40R、C60R和D254E。
除了以上公开的具体的、示例性的突变,已发现LovD多肽能够耐受没有不利作用的在其它位置的一定范围的额外的特定的突变。确实,在一些实例中,额外突变也赋予LovD多肽有益的或改进的性质。这些额外突变包括但不限于以下特定的和示例性的突变:I4N、A9V、K26E、R28K、R28S、I35L、C40A、C40V、C40F、S41R、N43Y、C60F、C60Y、C60N、C60H、S109C、S142N、A184T、A184V、N191S、A261T、A261E、A261V、L292R、Q297E、L335M、A377V、A383V、N391D和H404R。变异LovD多肽可以包括在这些额外位置的一个或多个突变。
在一些实施方案中,本文描述的变异LovD多肽包括以下两个突变:L174F和A178L,以及任选地零至约30个额外突变。在一种具体的实施方案中,任选的额外突变选自以上鉴定的不同的突变。
在一些实施方案中。本文描述的变异LovD多肽将至少包括以下突变:A123P、L174F、A178L、N191(S或G)、A247S和L361M,以及零到约26个选自以上鉴定的多种不同突变的额外突变。
一般而言,包括更大突变数的变异LovD多肽表现出更大的催化活性。例如,包括在两个残基位置(L174F和A178L)的突变的特定的变异体比野生型LovD表现出大近两倍的活性,包括在六个残基位置(SEQ IDNO:120)的突变的特定的变异体比野生型LovD表现出大近12倍的催化活性,一种包括28个突变的特定的变异体(SEQ ID NO:114),一种包括29个突变的特定的变异体(SEQ ID NO:116)和一种包括32个突变的特定的变异体(SEQ ID NO:118),各自比野生型LovD表现出大近1550倍的催化活性。表1公开了多种比SEQ ID NO:2的野生型LovD多肽表现出大约10至约1550倍的活性的变异LovD多肽。使用这些示例性的特定的变异LovD多肽,具有比SEQ ID NO:2的野生型LovD多肽大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700倍或者甚至更大的活性的额外LovD变异多肽可以容易地被获得。
表1的特定的变异LovD多肽也可以被用于容易地获得具有改进性质的特定组合的变异LovD多肽。
除以上描述的突变之外本文描述的不同的变异LovD多肽还可以任选地包括一种或多种保守突变。通常,这种任选的保守突变将构成总序列的不多于约20%、15%、10%、8%、5%、3%、2%或1%。不打算被任何特殊的操作理论约束,相信在位置76的氨基酸可能涉及催化。在该残基位置的突变应优选地被避免。也相信在位置79、148、188和/或363的氨基酸可能有助于催化。在一些实施方案中,包括任选的保守突变的变异LovD多肽将包含从1至20个这种突变。在又一些实施方案中,变异LovD多肽包括截短的多肽,其中1至15个氨基酸可以从N末端删去且1至6个氨基酸可以从C末端删去。
在另一方面,本公开内容提供编码本文描述的变异LovD多肽的多核苷酸。在一些实施方案中,该编码多核苷酸是表达载体的一部分,该表达载体包括一个或多个适合于在宿主细胞中指导编码序列的表达的控制序列。在一些实施方案中,表达载体适合于在诸如但不限于大肠杆菌的细菌中表达变异LovD多肽,并且包括可操作地连接到编码序列的启动子序列,诸如lac启动子序列。在这种多核苷酸中,编码序列的密码子可以被优化以用于在感兴趣的特定的宿主细胞中表达。
在又另一方面,本公开内容提供包括编码变异LovD的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中,宿主细胞是细菌,诸如但不限于大肠杆菌。宿主细胞可以用于生产特定的变异LovD多肽的粗制备物或纯化制备物,或者可选地,宿主细胞可以被用作本文描述的方法中的全细胞制备物来生产辛伐他汀和huvastatin。
本文描述的变异LovD多肽使莫纳可林J的C8羟基基团在α-二甲基丁酰硫酯辅助底物存在条件下酯化以生产辛伐他汀。相应地,在另一方面,本公开内容提供了利用本文描述的变异LovD多肽生产辛伐他汀的方法。该方法大体包括在产生辛伐他汀的条件下使莫纳可林J与变异LovD多肽在α-二甲基丁酰硫酯辅助底物的存在下接触。在一些实施方案中,莫纳可林J的类似物可以被用作形成诸如但不限于huvastatin的其它他汀类的前体底物。
本文描述的变异LovD多肽识别多种不同的α-二甲基丁酰硫酯辅助底物,包括作为实例且不受限的α-二甲基丁酰-S-N-乙酰基半胱胺(“DMB-S-NAC”)、α-二甲基丁酰-S-甲硫乙酸酯(α-dimethylbutyryl-S-methylthioglycolate)(“DMB-S-MTG”)、α-二甲基丁酰-S-巯基丙酸甲酯(α-dimethylbutyryl-S-methyl mercaptopropionate)(“DMB-S-MMP”)、α-二甲基丁酰-S-巯基丙酸乙酯(α-dimethylbutyryl-S-ethyl mercaptoproprionate)(“DMB-S-EMP”)、α-二甲基丁酰-S-巯基丁酸甲酯(α-dimethylbutyryl-S-methyl mercaptobutyrate)(“DMB-S-MMB”)和α-二甲基丁酰-S-巯基丙酸(“DMB-S-MPA”)。这些硫酯辅助底物中任一种或这样的硫酯辅助底物的混合物能够在本文描述的方法中使用。
在一些实施方案中,该反应用分离的变异LovD多肽在体外进行,该分离的变异LovD多肽在使用前可以被纯化或不纯化。在一些实施方案中,酶标签可以被添加到LovD多肽的任一末端以使其能够结合到固体载体。在一些具体的实施方案中,变异LovD多肽在使用前被分离和纯化。在其它具体的实施方案中,变异LovD多肽作为被工程化以表达变异LovD多肽的宿主细胞的粗裂解产物供给,且需要或并不需要从细胞裂解产物去除细胞碎片。
莫纳可林J底物能够以纯化的形式被包括在反应混合物中,或者可选地它可以通过洛伐他汀的水解原位产生。相应地,在一些实施方案中,该反应在作为从洛伐他汀起始的两步处理在单锅(pot)中进行。
该方法可以在多种条件下进行,取决于所使用的特定的变异LovD多肽的活性和其它因素。典型的反应包括约1至250g/L、也可以是25至200g/L、并且经常是1至200g/L的莫纳可林J底物或其类似物,过量的硫酯辅助底物(例如,从约1.0至10.0当量、也可以是1.0至5.0当量、并且经常是1.0至4.0当量)以及约0.1至10g/L的LovD变异多肽。在一些实施方案中,典型的反应可以包括20至200g/L、50至200g/L、或50至150g/L的莫纳可林J底物或其类似物。在一些实施方案中,典型的反应可以包括从1.0至2.0、从1.0至1.5、或从1.1至1.3当量的硫酯辅助底物。在一些实施方案中,可以使用0.2至10g/L、0.5至10g/L、0.5至5g/L、0.75至2.5g/L、或0.75至1.5g/L的LovD变异多肽。反应混合物的pH、反应进行的温度和反应的持续时间将取决于所使用的特定的LovD变异多肽和其它因素。大多数反应能够在pH 7.5至pH 10.5、也可以是pH 8.0至pH10.0、并且经常是pH 8至pH 9.5的范围中的pH,和在约20至50℃、也可以是20至30℃、并且经常是20至40℃的范围中的温度,持续近2至54小时、5至48小时或10至48小时来进行。用包括与热稳定性增加相关的突变的变异LovD多肽进行的反应可以在更高温度进行,该温度通常在约30至40℃的范围中,取决于所使用的特定的变异体。
酰基转移反应的硫醇副产物可以抑制LovD多肽。相应地,在反应混合物中包括一种或多种清除剂是可取的,该清除剂可能通过去除或清除这些硫醇副产物来改进反应速率和/或产量。清除包括但不限于诸如通过氧化对硫醇副产物的化学修饰。适合的清除剂可以包括但不限于与硫醇副产物反应的化合物和能够螯合、吸附、吸收或去除硫醇副产物的试剂。在使用清除剂的一些实施方案中,清除剂可以是活性炭。在使用时,活性炭可以按从1至30g/L、2至20g/L、和5至15g/L范围的量被包括在反应混合物中。
莫纳可林J底物可以是盐的形式,诸如铵盐或钠盐。莫纳可林J底物诸如莫纳可林J的钠盐或铵盐的反应,可以任选地在诸如活性炭的清除剂的存在下运行。莫纳可林J也可以是铵盐的形式。在莫纳可林J的铵盐被转化为辛伐他汀的铵盐时,辛伐他汀的铵盐可以从反应介质例如从水沉淀。
根据以下详细的描述本公开内容的其它方面和优势将是明显的。
5.附图简述
图1提供了说明从洛伐他汀或莫纳可林J合成辛伐他汀的途径的图;
图2提供了已被进行密码子优化以用于在大肠杆菌中表达的编码来自土曲霉的野生型LovD酶的多核苷酸序列(SEQ ID NO:1);并且
图3提供了由图2的序列编码的多肽序列(SEQ ID NO:2)。
6.详细描述
在某些方面,本公开内容提供了如下LovD变异多肽:其能够将来自某些硫酯辅助底物的酰基基团向莫纳可林J及其类似物或衍生物转移以产生治疗上重要的他汀类化合物(statin compound),诸如但不限于辛伐他汀和huvastatin。LovD变异体与可从土曲霉获得的野生型LovD酰基转移酶(SEQ ID NO:2)相比具有改进的性质,并且能够在基于细胞或者无细胞的系统中使用以高效地并且经济有效地从容易得到的起始材料诸如洛伐他汀和莫纳可林J生产他汀类诸如辛伐他汀。
6.1缩写
出于本文描述的目的,遗传编码的氨基酸所使用的缩写是常规的并且如下:
氨基酸 | 三字母缩写 | 一字母缩写 |
丙氨酸 | Ala | A |
精氨酸 | Arg | R |
天冬酰胺 | Asn | N |
天冬氨酸 | Asp | D |
半胱氨酸 | Cys | C |
谷氨酸 | Glu | E |
谷氨酰胺 | Gln | Q |
甘氨酸 | Gly | G |
组氨酸 | His | H |
异亮氨酸 | Ile | I |
亮氨酸 | Leu | L |
赖氨酸 | Lys | K |
甲硫氨酸 | Met | M |
苯丙氨酸 | Phe | F |
脯氨酸 | Pro | P |
丝氨酸 | Ser | S |
苏氨酸 | Thr | T |
色氨酸 | Trp | W |
酪氨酸 | Tyr | Y |
缬氨酸 | Val | V |
在肽或多肽序列作为一串一字母或三字母缩写(或其混合)表示时,序列按普遍习惯以N→C方向表示。
6.2定义
除非以其它方式特别定义,否则本文描述中使用的技术术语和科学术语将具有本领域普通技术人员普遍理解的含义。相应地,以下术语意图具有以下含义。
“野生型LovD”、“野生型LovD酶”、“野生型LovD多肽”、和/或“野 生型LovD酰基转移酶”指可从土曲霉获得的由LovD基因编码的并具有对应于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酰基转移酶。该酶可以使用硫酯以区域专一的方式酰化莫纳可林J或6-羟基-6-去甲基莫纳可林J的C8羟基基团以便产生辛伐他汀或huvastatin。见如Xie等人,2006,“Biosynthesis ofLovastatin Analogs with a Broadly Specific Acyltransferase(使用广泛特异性酰基转移酶的洛伐他汀类似物的生物合成)”,Chem.Biol.13:1161-1169。
“编码序列”指核酸或多核苷酸(如,基因、mRNA、cDNA,等)编码肽或多肽的部分。
“自然存在”或“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如自然存在或野生型的多肽或多核苷酸序列是可以从自然中的来源分离并且未通过人的操纵来修饰的在生物体中存在的序列。
在用于指如细胞、核酸或多肽时,“重组”指已经以使得其在自然中存在方式修饰,或者与自然中存在的材料相同、但是从合成材料和/或由已经以某种方式操纵的天然材料生产或得到的材料或对应于该材料的自然或固有形式的材料。非限制性实例包括,被工程化以表达在固有(非重组)形式的细胞内未发现的核酸序列或者以不同于固有表达水平的水平表达非重组形式的细胞内发现的固有基因的细胞及其它。
“序列一致性百分率”、“百分比一致性”、和/或“百分比一致”在本文中使用指多核苷酸序列或多肽序列之间的比较,并且通过在比较窗比较两个最佳比对序列来确定,其中与参考序列相比,比较窗中多核苷酸或多肽序列的部分可以包括添加或缺失(即空位)以便实现最佳比对。通过比较窗中匹配部分的数目除以比较窗中位置的总数并乘以100计算百分率一致性。比较窗中匹配位置的数目是序列与参考多核苷酸或多肽相同的窗中的比较多核苷酸或多肽的位置的数目与同比较多核苷酸或多肽中的空位对齐的参考多核苷酸或多肽的位置的数目的和。最佳比对和百分比序列一致性使用BLAST和BLAST2.0算法(见,如Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402)实施。实施BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)网站公开地得到。
简单来说,BLAST分析涉及首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字来鉴定高分序列对(HSP),在与数据库序列中相同长度的字比对时所述短字匹配或满足某个正值域值得分T。T被称为相邻字得分阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul等人,1990,前述)。这些初始相邻字命中担当用于启始搜索的种子来寻找包含它们的更长的HSP。字命中继而沿着每个序列向两个方向延伸到累积比对得分不能够增加的程度。对于核苷酸序列,累积得分使用参数M(对于匹配残基对的奖励得分;永远>0)和N(对于错配残基对的惩罚得分;永远<0)计算。对于氨基酸序列,得分矩阵被用于计算累计得分。字命中每个方向的延伸在以下情况停止:累积比对得分从其最大取得值下降数量X;由于一个或多个负得分残基比对的积累,累积得分达到零或以下;或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M=5、N=-4以及两链的比较作为默认值。对于氨基酸序列,BLASTP程序使用字长(W)3、期望值(E)10以及BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff和Henikoff,1989,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 89:10915)作为默认值。在提供序列之间的百分率一致性上与BLAST功能相似的许多其它算法可用。
用于比较的最佳的序列比对可以如通过Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法,通过Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法,通过Pearson和Lipman,1988,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法,通过这些算法的计算机化实现方式(GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA),或通过目测(大体上见,Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术),F.M.Ausubel等人,编,Current Protocols,Greene Publishing Associates,Inc.与John Wiley & Sons,Inc.的合资企业,1995附录)来执行。
此外,序列比对和百分比序列一致性的测定可以使用GCG Wisconsin软件包(Accelrys,Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序,使用所提供的默认参数。
“参考序列”指与另一序列相比较的指定的序列。参考序列可以是较大序列的子集,例如,全长基因或多肽序列的片段。一般来说,参考序列是至少20个核苷酸或氨基酸残基的长度,至少25个残基的长度,至少50个残基的长度,或者核酸或多肽的全长。因为两个多核苷酸或多肽可以各自(1)包括这两条序列之间相似的序列(即,完整序列的一部分),并且(2)还可以包括这两条序列之间相异的序列,两个(或多个)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过在比较窗比较两个多核苷酸的序列来实施以鉴定和比较序列相似性的局部区域。
术语“参考序列”并非意图限于野生型序列,而是可以包括工程化的、变异的和/或改变的序列。
“比较窗”指至少约20个相邻核苷酸位置或者氨基酸残基的概念性片段,其中序列可以与至少20个相邻核苷酸或氨基酸的参考序列相比较,并且其中比较窗中的序列的部分可以包括与参考序列(其不包括添加或缺失)相比20%或更少的添加或缺失(即,空位),用于两序列的最佳比对。比较窗可以长于20个相邻残基,并且包括任选地30、40、50、100或更长的窗。
“实质一致性(substantial identity)”指具有与参考序列至少约80%序列一致性的多核苷酸或多肽序列。在很多实施方案中,共享“序列一致性”的序列将与参考序列至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、或者甚至99%一致。在对给定的氨基酸序列或多核苷酸序列编号的背景下使用时,词语“对 应于”、“参考”、“相对于”指在给定的氨基酸序列或多核苷酸序列与特定的参考序列比较时对特定的参考序列的残基编号。换言之,给定聚合物的残基编号或残基位置相对于参考序列指定,而非按照给定氨基酸或多核苷酸序列内的该残基的实际数字位置指定。例如,给定的氨基酸序列,诸如变异LovD多肽的氨基酸序列,能够通过引入空位与参考序列比对来优化这两条序列之间的残基匹配。在这些情况下,虽然存在空位,但是给定氨基酸或多核苷酸序列中的残基编号相对于已与其比对的参考序列制定。
在本文描述的变异LovD多肽的背景下使用时,“增加的催化活性”指如在体外或体内试验中所测量的与参考LovD多肽相比,表现出使底物(例如莫纳可林J或其盐)向产物(例如辛伐他汀或其盐)转化增加的LovD多肽。催化活性的增加起点并不关键。因此该增加可能是由于Km、Vmax或Kcat中的一个或多个的改变或者由于底物抑制的降低。在一些实施方案中,出于比较的目的,催化活性能够被方便地用特定时间段中每单位酶使转化为产物的底物百分率表示。与相同条件下试验的参考酶相比在每单位每时间段将更大百分率底物转化为产物的酶相比于参考酶具有增加的催化活性。
用于测量酶的催化活性的方法和试验是本领域充分已知的。用于LovD多肽的具体实例在实施例部分中提供。对于用粗细胞裂解产物进行的比较试验,应使用相同的宿主细胞和表达系统。此外,每个制备中的细胞数和LovD多肽量应该如本领域已知地被测量。
在LovD多肽背景下的“热稳定(thermostable)”或“热稳定的(thermal stable)”指与变异LovD多肽在相同反应条件下在25℃表现出的催化活性相比,当暴露于30℃的温度3小时时间时该变异LovD多肽保留其催化活性的至少约50%。
“残基”在多肽背景下使用时指氨基酸,而在多核苷酸背景下使用时指核苷酸。
“亲水性氨基酸或残基”指根据Eisenberg等人,1984,J.Mol.Biol.179:125-142的标准化共有疏水性等级具有表现出小于零的疏水性的侧链的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸包括Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)和Arg(R)。
“酸性氨基酸或残基”指在氨基酸被包括在肽或多肽中时具有表现出小于约6的pKa值的侧链的亲水性氨基酸。由于失去氢离子,酸性氨基酸在生理pH下通常具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括Glu(E)和Asp(D)。
“碱性氨基酸或残基”指在氨基酸被包括在肽或多肽中时具有表现出大于约6的pKa值的侧链的亲水性氨基酸或残基。由于缔合氢离子,碱性氨基酸在生理pH下通常具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括Arg(R)、His(H)和Lys(K)。
“极性氨基酸或残基”指在具有在生理pH下不带电荷但是具有至少一个如下键的侧链的亲水性氨基酸,在该键中由两个原子共同分享的电子对被两原子中的一个更接近地持有。遗传编码的极性氨基酸包括Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。
“疏水性氨基酸或残基”指根据Eisenberg等人,1984,J.Mol.Biol.179:125-142的标准化共有疏水性等级具有表现出大于零的疏水性的侧链的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸包括Pro(P)、Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)和Tyr(Y)。
“芳香族氨基酸或残基”指具有包括至少一个芳环或杂芳环的侧链的亲水性或疏水性氨基酸。遗传编码的芳香族氨基酸包括Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。由于His(H)杂芳环氮的pKa,本文将His(H)分类为疏水或碱性残基。His(H)由于杂芳侧链又被归类为芳香族残基。
“约束性氨基酸或残基(constrained amino acid or residue)”指具有受约束的几何构型的氨基酸。在本文中,约束性残基包括Pro(P)。
“非极性氨基酸或残基”指在具有在生理pH下不带电荷并且具有如下的键的侧链的疏水性氨基酸,在所述键中由两个原子共同分享的电子对大体由这两个原子中的每个相等地持有(即,侧链是非极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包括Gly(G)、Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)和Ala(A)。
“脂肪族氨基酸或残基”指具有脂肪烃侧链的疏水性氨基酸或残基。遗传编码的脂肪族氨基酸包括Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。
半胱氨酸的不寻常在于其可以与其它Cys残基或其它含硫烷基(sulfanyl)或含巯基的氨基酸形成二硫键。“半胱氨酸样残基”包括半胱氨酸和其它包含可用于形成二硫键的巯基部分的氨基酸。Cys(和其它具有含-SH侧链的氨基酸)以还原的游离-SH或氧化的二硫键形式存在于多肽中的能力影响其是否为多肽贡献净疏水或净亲水特性。尽管根据Eisenberg标准化共有等级(Eisenberg等人,1984,前述)Cys表现出0.29的疏水性,应理解出于本公开内容的目的,Cys按自成一组归类。
“小氨基酸或残基”指具有由总共三个或更少的碳和/或杂原子(不包括α-碳和氢)组成的侧链的氨基酸,根据上述定义小氨基酸或残基可能会进一步归类为脂肪族、非极性、极性或酸性小氨基酸或残基。遗传编码的小氨基酸包括Ala(A)、Val(V)、Cys(C)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)和Asp(D)。
“含羟基的氨基酸或残基”指包含羟基(-OH)部分的氨基酸。遗传编码的含羟基的氨基酸包括Ser(S)、Thr(T)和Tyr(Y)。
“保守”氨基酸取代或突变指在其中参考多肽的氨基酸残基被具有相似理化性质的氨基酸残基替换的那些取代和突变。被认为是保守的取代和突变是本领域中充分已知的。在一些实施方案中,保守的取代和突变是其中特定类型的氨基酸被相同类型内的另一氨基酸替换(例如,脂肪族→脂肪族)的那些。示例性的保守取代在以下提供:
“分离的”指已从自然发生的来源取出的物质。物质不需要为分离而被纯化。例如,宿主细胞中重组生产的变异LovD多肽在从细胞取出或释放时被认为是分离的。出于本公开内容的目的,在粗细胞裂解产物成分内包含的变异LovD多肽被认为是“分离的”。
“纯化的”指已经使其至少部分地不含污染物和通常伴随着它的其它材料的物质。物质可以被纯化到不同程度。在物质的制剂或组成包含小于约1%的污染物时,物质是“实质纯”的。在物质的制剂或组成包含小于约5%的污染物时,物质是“基本纯”的。在物质的制剂或组成包含小于约2%的污染物时,物质是“纯”的。对于“纯化到均一”的物质,污染物不能用常规分析方法检出。
6.3LovD变异多肽
如背景部分的所讨论的,土曲霉的lovD基因编码的多肽是催化洛伐他汀生物合成最后一步的酰基转移酶。该LovD酰基转移酶具有对酰基载体、酰基底物和十氢化萘受体的广泛的底物特异性(见,如Xie等人,2006,Chem.Biol.12:1161-1169),使得该酶可以用来使酰基基团从硫酯辅助底物向诸如莫纳可林J和6-羟基-6-去甲基莫纳可林J的十氢化萘转移以生产治疗上重要的他汀类化合物。示例性反应在图1(加框区域)中说明。如该图1中所说明的,LovD酰基转移酶将硫酯(14)的α二甲基丁酰基团催化地转移到莫纳可林J(12)以产生辛伐他汀(16),使其成为用于制备该药学重要的他汀类的有吸引力的靶标。
尽管土曲霉LovD酰基转移酶具有有吸引力的催化性质,使用分离的土曲霉LovD酰基转移酶及其某些突变在体外生产辛伐他汀的尝试尚不非常成功。稳定性、溶解度、错误折叠、聚集和反应速率都被证实是有问题的(见,如Xie和Tang,2007,Appln.Environ.Microbiol.73:2054-2060;Xie等人,2009,Biotech.Bio.Eng.102:20-28)。
本公开内容提供了变异LovD多肽,其类似于来自土曲霉的野生型LovD酰基转移酶(SEQ ID NO:2),使来自硫酯辅助底物的酰基基团向莫纳可林J(或其类似物或衍生物)催化地转移以产生辛伐他汀。该变异体与野生型LovD和SEQ ID NO:2的转移酶相比包括在特定位置的突变并且表现出一个或多个改进的性质。
技术人员将领会洛伐他汀、莫纳可林J和辛伐他汀以及其类似物和衍生物可能以包括酸、酯、酰胺和内酯形式的多种形式存在。酸、酯、酰胺和内酯形式也可以是盐的形式。这些化合物的酸(R=-OH),酯(R=-O(烃基),R=-O(alkyl)),酰胺(R=-N(烃基)2)及内酯形式如下所示。除非另外规定,如本文所使用的“洛伐他汀”包括酸、酯、酰胺、内酯和盐的形式,如本文所使用的“莫纳可林J”包括酸、酯、酰胺、内酯和盐的形式,并且如本文所使用的“辛伐他汀”包括酸、酯、酰胺、内酯和盐形式。这些形式可以在本文描述的方法中使用。
用野生型土曲霉LovD酰基转移酶进行的突变实验揭示在特定位置的突变与催化活性、热稳定性、细胞裂解条件下的稳定性和聚集性质相关。还发现一定范围的突变可以在一定的位置被纳入,在不提供可鉴定的改进的性质的同时,并不有害地影响多肽的整体性质。所有这些不同的突变以及额外的任选的保守突变可以被单独使用和/或组合使用以产生具有特定性质的LovD变异多肽。值得注意的是,不同于野生型土曲霉LovD酰基转移酶,本文描述的变异LovD多肽可以被分离并在体外反应系统中使用以生产治疗上重要的他汀类化合物。
已发现与增加催化活性相关的SEQ ID NO:2的野生型土曲霉LovD酰基转移酶的突变包括但不限于A123P、M157V、S164V、S172N、L174F、A178L、N191G、L192I、A247S、R250K、S256T、A261H、G275S、Q297G、L361M、V370I和N391S。
已发现与增加热稳定性相关的SEQ ID NO:2的野生型土曲霉LovD酰基转移酶的突变包括但不限于Q241M、A261H、Q295R和Q412R。
已发现与减少聚集相关的SEQ ID NO:2的野生型土曲霉LovD酰基转移酶的突变包括但不限于N43R,D96R和H404K。
已发现与细胞裂解条件下酶的稳定性增加相关的SEQ ID NO:2的野生型土曲霉LovD酰基转移酶的突变包括但不限于C40R、C60R和D245E。
在SEQ ID NO:2的野生型土曲霉LovD酰基转移酶内可以被突变而没有有害作用的位置包括但不限于I4N、A9V、K26E、R28K、R28S、I35L、C40A、C40V、C40F、S41R、N43Y、C60F、C60Y、C60N、C60H、S109C、S142N、A184T、A184V、N191S、A261T、A261E、A261V、L292R、Q297E、L355M、A377V、A383V、N391D和H404R。
变异LovD多肽的一种重要类型包括与SEQ ID NO:2的野生型土曲霉LovD酰基转移酶相比表现出增加的催化活性的LovD多肽。已发现包括更大数目的突变会增加LovD多肽的催化活性。如通过下文表1中提供的变异LovD多肽的示例性实施方案所说明的,来自以上鉴定的突变的组合可以被选定以获得具有特定的催化性质和其它性质的变异LovD多肽。在表1中,指出的突变是相对于SEQ ID NO:2并且相对活性是相对于来自土曲霉的野生型LovD酰基转移酶的活性。用于活性试验的条件在实施例部分中提供。
在表1中,具有相对活性“+”的变异体表现出比野生型大约10至50倍的活性;具有相对活性“++”的变异体表现出比野生型大约50至100倍的活性;具有相对活性“+++”的变异体表现出比野生型大约100至500倍的活性;并且具有相对活性“++++”的变异体表现出比野生型大约500至2000倍的活性。
在一些实施方案中,突变选自以上鉴定的产生表现出比野生型土曲霉LovD大至少两倍的催化活性的变异LovD多肽的突变。这种变异LovD多肽具有如下氨基酸序列:对应于SEQ ID NO:2,但包括至少以下两个突变:L174F和A178L,以及任选地选自以上鉴定的多种突变的1至约30个额外突变,以及任选地约1至20个额外的保守突变。
在一些实施方案中,突变选自以上鉴定的产生表现出比野生型土曲霉LovD大至少约10倍的催化活性的变异LovD多肽的突变。这种变异LovD多肽具有如下氨基酸序列:对应于SEQ ID NO:2,但包括至少以下突变:A123P、L174F、A178F、N191(S或G)、A247S和L361M,并来选自以上鉴定的多种突变的0至约26个额外突变,以及任选地约1至约20个额外的保守突变。具体的示例性变异LovD多肽在表1中提供。
在一些实施方案中,变异LovD多肽具有对应于表1的变异LovD多肽并且通常在与SEQ ID NO:2相比没有突变的残基位置包括一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中,选定保守氨基酸取代数使得特定的变异LovD多肽的序列保留与特定的参考变异LovD多肽至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性。
以上鉴定的突变,伴随表1中提供的具体的示例性变异LovD多肽能够被用于生成具有特定性质的变异LovD多肽。例如,具有比SEQ ID NO:2的野生型土曲霉酰基转移酶更大的热稳定性的变异LovD多肽可以通过包括以上鉴定的与增加热稳定性相关的突变中的一个或多个来获得。通过“混合和匹配”来自不同类别的突变,具有一种或多种不同性质的改进的变异LovD多肽可以容易地被获得。
在一些实施方案中,突变被选定使得变异LovD多肽是热稳定的。
在一些实施方案中,突变被选定使得变异LovD多肽比SEQ ID NO:2的野生型土曲霉酰基转移酶对细胞裂解的条件更稳定。对细胞裂解的增加的稳定性可以通过在升高的温度(例如35至45℃)下预孵育裂解产物并确定残余活性来测量。
在一些实施方案中,突变被选定使得变异LovD多肽比SEQ ID NO:2的野生型土曲霉酰基转移酶表现出更少的聚集,如在例如pH 8至9和温度25℃下的100mM三乙醇胺缓冲液中测定的。
技术人员应领会在许多情况下,全长变异LovD多肽对于保持酶的催化活性并不是必需的。相应地,应考虑变异LovD多肽的截短的类似物和有催化活性的片段。例如,在一些实施方案中,1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸可以被删去。在另外的实施方案中,变异LovD多肽包括如下截短的多肽:其中从N-末端可以删去从1到15个氨基酸而从C-末端可以删去从1至6个氨基酸。任何特定的截短的类似物或片段可以利用实施例部分中提供的试验来评估催化活性。
同样的,额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不有害地影响催化活性。因此,虽然许多本文描述的变异LovD多肽的示例性实施方案包含413个氨基酸残基,也应考虑在一个或两个末端包括从约1至约434个额外氨基酸的类似物。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如,额外序列可以被设计来帮助纯化,担当标记,或执行一些其它的功能。因此,本公开内容的变异LovD多肽可以是融合多肽的形式,其中变异LovD多肽(或其片段)诸如通过抗体标签(如,myc表位)、纯化序列(如,结合金属的His标签)和细胞定位信号(如,分泌信号)的实例而非限制的方式被融合到其它多肽。
变异LovD多肽可以通过常规方法获得,包括化学合成和重组表达。用于重组表达的多核苷酸和宿主细胞如下所述。如本领域已知,通过合成方法获得的变异LovD多肽可以包括非遗传编码的氨基酸。通常遇到的可以被包括在合成变异LovD多肽中的非编码氨基酸包括但不限于:2,3-二氨基丙酸(Dpr);α-氨基异丁酸(Aib);ε-氨基己酸(Aha);δ-氨基戊酸(Ava);N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly或Sar);鸟氨酸(Orn);瓜氨酸(Cit);叔丁基丙氨酸(Bua);叔丁基甘氨酸(Bug);N-甲基异亮氨酸(MeIle);苯基甘氨酸(Phg);环己基丙氨酸(Cha);正亮氨酸(Nle);萘基丙氨酸(Nal);2-氯苯丙氨酸(Ocf);3-氯苯丙氨酸(Mcf);4-氯苯丙氨酸(Pcf);2-氟苯丙氨酸(Off);3-氟苯丙氨酸(Mff);4-氟苯丙氨酸(Pff);2-溴苯丙氨酸(Obf);3-溴苯丙氨酸(Mbf);4-溴苯丙氨酸(Pbf);2-甲基苯丙氨酸(Omf);3-甲基苯丙氨酸(Mmf);4-甲基苯丙氨酸(Pmf);2-硝基苯丙氨酸(Onf);3-硝基苯丙氨酸(Mnf);4-硝基苯丙氨酸(Pnf);2-氰基苯丙氨酸(Ocf);3-氰基苯丙氨酸(Mcf);4-氰基苯丙氨酸(Pcf);2-三氟甲基苯丙氨酸(Otf);3-三氟甲基苯丙氨酸(Mtf);4-三氟甲基苯丙氨酸(Ptf);4-氨基苯丙氨酸(Paf);4-碘苯丙氨酸(Pif);4-氨甲基苯丙氨酸(Pamf);2,4-二氯苯丙氨酸(Opef);3,4-二氯苯丙氨酸(Mpcf);2,4-二氟苯丙氨酸(Opff);3,4-二氟苯丙氨酸(Mpff);吡啶-2-基丙氨酸(2pAla);吡啶-3-基丙氨酸(3pAla);吡啶-4-基丙氨酸(4pAla);萘-1-基丙氨酸(1nAla);萘-2-基丙氨酸(2nAla);噻唑丙氨酸(taAla);苯并噻吩丙氨酸(bAla);噻吩丙氨酸(tAla);呋喃丙氨酸(fAla);高苯丙氨酸(hPhe);高酪氨酸(hTyr);高色氨酸(hTrp);五氟苯丙氨酸(5ff);苯乙烯丙氨酸(sAla);蒽基丙氨酸(aAla);3,3-二苯基丙氨酸(Dfa);3-氨基-5-苯基戊酸(Afp);青霉胺(Pen);1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic);β-2-噻吩丙氨酸(Thi);甲硫氨酸亚砜(Mso);N(w)-硝基精氨酸(nArg);高赖氨酸(hLys);磷甲基苯丙氨酸(pmPhe);磷酸丝氨酸(pSer);磷酸苏氨酸(pThr);高天冬氨酸(hAsp);高谷氨酸(hGlu);1-氨基环戊-(2或3)-烯-4羧酸;2-哌啶酸(PA),氮杂环丁烷-3-羧酸(ACA);1-氨基环戊烷-3-羧酸;烯丙基甘氨酸(aOly);炔丙基甘氨酸(pgGly);高丙氨酸(hAla);正缬氨酸(nVal);高亮氨酸(hLeu);高缬氨酸(hVal);高异亮氨酸(hIle);高精氨酸(hArg);N-乙酰基赖氨酸(AcLys);2,4-二氨基丁酸(Dbu);2,3-二氨基丁酸(Dab);N-甲基缬氨酸(MeVal);高半胱氨酸(hCys);高丝氨酸(hSer);羟基脯氨酸(Hyp)和高脯氨酸(hPro)。可以被本文描述的多肽包括的额外的非编码氨基酸对本领域技术人员将是明显的(见,如在Fasman,1989,CRC Practical Handbook of Biochemistry and MolecularBiology(CRC生物化学与分子生物学实践手册),CRC Press,Boca Raton,FL,pp.3-70和其中引用的参考文献中提供的不同的氨基酸,所有这些文献均通过引用并入)。这些氨基酸可以处于或L或D的构型并且优选处于L构型。
在使用时,一般选定这种非编码的氨基酸使得它们与参考序列相比是保守取代。非编码氨基酸能够赋予变异LovD多肽改进的性质,诸如例如在所期望的溶剂中的溶解度增加、对蛋白酶的稳定性增加等。这种非编码氨基酸通常将仅在一些残基位置被包括,例如使得大于98%或99%的变异LovD多肽包括遗传编码的氨基酸。
6.4核酸
在另一方面,本公开内容提供了编码变异LovD多肽的多核苷酸。该多核苷酸可以被可操作地连接到到控制基因表达的一个或多个调节序列以生成能够表达变异LovD多肽的重组多核苷酸。包括编码变异LovD多肽的多核苷酸序列的表达构建体能够被引入到适当的宿主细胞中以表达相应的变异LovD多肽。
由于已知的遗传密码,多肽序列的可用性提供了能够编码该多肽的所有多核苷酸的描述。遗传密码的简并性造成极大数量编码特定的变异LovD多肽的核苷酸。因此,如果鉴定特定的多肽序列,本领域技术人员能够通过以不改变编码序列的方式简单地修改一个或多个密码子的序列制造任何数量的编码该多肽序列的不同的核酸。在这方面,本公开内容具体地考虑编码特定的多肽序列的每个和各个可能的个体多核苷酸,并且所有这种个体核酸应被认为是确切公开的以用于本文公开的任何变异LovD多肽。
在一些实施方案中,多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏倚是充分已知的,因为其是用于在这些微生物的每一个中表达特定的氨基酸的优化的密码子。(见,如Andersson,S G和C G Kurland,1990,Microbiol.Mol.Biol.Rev.54(2):198-210;Ermolaeva,M D.,2001,Current Issues in MolecularBiology 3(4):91-97)。
在一些实施方案中,编码变异LovD多肽的多核苷酸可以作为表达载体而提供,在那里存在一个或多个控制序列来调节多核苷酸的表达。取决于表达载体,在分离的多核苷酸插入载体之前对分离的多核苷酸的操作可能是期望的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术在本领域中充分已知。在Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(分子克隆实验手册),第三版,Cold Spring HarborLaboratory Press;和Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术),Ausubel.F.编,Greene Pub.Associates,1998更新至2006中提供指导。
在一些实施方案中,控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对于细菌宿主细胞,指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trp操纵子、噬菌体λ、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl Acad.Sci.USA 75:3727-3731)获得的启动子以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl Acad.Sci.USA 80:21-25)。
对于丝状真菌宿主细胞,适合的启动子包括但不限于从米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(见,如WO 96/00787,在此其通过引用并入本文)的基因获得的启动子,以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂合体)及其突变、截短及杂合的启动子。
在酵母宿主中,有用的启动子可以是来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。用于酵母宿主细胞的其它有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast 8:423-488描述。
控制序列也可以是适合的转录终止子序列,即,由宿主细胞识别来终止转录的序列。终止子序列被可操作地连接到编码多肽的核酸序列的3′末端。可以使用在所选择的宿主细胞中有功能性的任何终止子。
例如,丝状真菌宿主细胞的示例性转录终止子可以从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得。
酵母宿主细胞的示例性终止子可以从酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。用于酵母宿主细胞的其它有用的启动子由Romanos等人,1992前述描述。
控制序列也可以是适合的前导序列,前导序列是对宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列可操作地连接到编码多肽的核酸序列的5′末端。可以使用在所选择的宿主细胞中有功能性的任何前导序列。丝状真菌宿主细胞的示例性前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得。酵母宿主细胞的适合的前导序列从酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶,酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得。
控制序列也可以是多腺苷酸化序列,多腺苷酸化序列是可操作地连接到核酸序列的3′末端的序列,并且其在转录时,作为向转录的mRNA添加多腺苷残基的信号由宿主细胞识别。可以使用在所选择的宿主细胞中有功能性的任何多腺苷酸化序列。用于丝状真菌宿主细胞的示例性多腺苷酸化序列可以来自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。对酵母宿主细胞有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellBio.15:5983-5990描述。
控制序列也可以是信号肽编码区,其编码连接到多肽氨基末端的氨基酸序列并使编码的多肽定向到细胞的分泌途径中。核酸序列的编码序列的5′末端可以固有地包含信号肽编码区,其在翻译阅读框中与编码分泌多肽的编码区片段天然地连接。可选地,编码序列的5′末端可以包含对编码序列而言外来的信号肽编码区。在编码序列不天然包含信号肽编码区的情况下可能需要外来的信号肽编码区。
细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从芽孢杆菌NClB 11837生麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码区。又一些信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiol.Rev.57:109-137描述。
丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区可以是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶和绵毛状腐质菌(Humicolalanuginosa)脂肪酶的基因获得的信号肽编码区。
有用的酵母宿主细胞信号肽可以来自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其它有用的信号肽编码区由前述Romanos等人,1992描述。
控制序列也可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。产生的多肽被称为原酶或者多肽原(或在某些情况下称为酶原)。多肽原一般是钝性的并且可以通过催化裂解或自动催化裂解来自多肽原的前肽而被转换为成熟的活性多肽。前肽编码区可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)乳糖酶(见,如WO95/33836)的基因获得。
在多肽的氨基末端存在信号肽和前肽区的情况下,前肽区被定位在多肽的氨基末端旁边且信号肽区被定位在前肽区的氨基末端旁边。
包括允许调节与宿主细胞的生长相关的多肽的表达的调节序列也可以是期望的。调节系统的实例是促使基因的表达被开启或关闭以响应于化学或物理刺激的那些,所述化学或物理刺激包括调节性化合物的存在。在原核宿主细胞中,适合的调节序列包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母宿主细胞中,适合的调节系统包括作为实例的ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中,适合的调节序列包括TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。
调节序列的其它实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中,这些实例包括在甲氨蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和随重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下,编码本发明的转氨酶多肽的核酸序列将可操作地与调节序列连接。
因此,在另一实施方案中,本公开内容还涉及重组表达载体,其包括编码变异LovD多肽或其有催化活性的片段的多核苷酸,以及一个或多个表达调节区诸如启动子和终止子、复制原点等,这取决于引入表达调节区的宿主的类型。以上描述的不同核酸和控制序列可以接合在一起来产生表达载体,表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许编码多肽的核酸序列在这些位点的插入或取代。可选地,本公开内容的核酸序列可以通过使核酸序列或包括该序列的核酸构建体插入到适当的表达载体中来表达。在生成表达载体的过程中,编码序列位于载体之内使得编码序列与用于表达的适当的控制序列可操作地连接。
表达载体可以是任何载体(如质粒或病毒),其可以方便地经历DNA重组过程并能够引起多核苷酸序列的表达。载体的选择通常将取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状的质粒。
表达载体可以是自主复制的载体,即作为染色体外的实体而存在的载体,它的复制独立于染色体的复制,如质粒、染色体外的元件、微小染色体、或人工染色体。载体可以包含用于保证自我复制的任何工具(means)。可选地,载体可以是在被引入到宿主细胞中时整合到基因组中并且与其所整合到的染色体一起复制的载体。而且,可以使用单一载体或质粒或者一起包含待引入到宿主细胞基因组中的总DNA的两种或多种载体或质粒,或者转座子。
表达载体可以包含一个或多个选择性标记,其允许转化细胞的选择容易。选择性标记是如下基因,其产物提供杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属的抗性、原养型的营养缺陷型,及类似的特点。细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或赋予抗生素抗性诸如氨比西林、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。酵母宿主细胞的适合的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。
在丝状真菌的宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(草胺磷乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)、和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等同物。在曲霉细胞中使用的实施方案包括构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
表达变异LovD多肽的表达载体可以包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。为整合到宿主细胞基因组中,载体可以依赖编码多肽的核酸序列或通过同源重组或者非同源重组使载体整合到基因组中的载体的任何其它元件。
任选地,表达载体可以包含用于指导通过同源重组整合到宿主细胞的基因组中的额外核酸序列。额外核酸序列使载体能够在染色体中的精确位置被整合到宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置的整合的可能性,整合元件应优选地包含充足数量的核酸,诸如100至10,000个碱基对,优选的是400至10,000个碱基对,且最优选的是800至10,000个碱基对,其可以与相应的靶标序列高度同源以提高同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。而且,整合元件可以是非编码或编码的核酸序列。另一方面,载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。
为了自主复制,载体还可以包括使载体能够在讨论中的宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的P15A ori(如图5的质粒中所示)或者质粒pBR322、pUC19、pACYCl77(该质粒具有P15A ori)、或者pACYC184的复制起点,以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060或pAMβ1的复制起点。在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4,ARS1和CEN3的组合,以及ARS4和CEN6的组合。复制起点可以是具有使得在宿主细胞中温度敏感地发挥功能的突变的复制起点。(见,如Ehrlich,1978,Proc Natl Acad Sci.USA 75:1433)。
编码变异LovD的核酸的多于一个的拷贝可以被插入到宿主细胞中以增加基因产物的产生。核酸序列的拷贝数的增加可以如下获得:通过使该序列的至少一个额外拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过使该核酸序列包括可扩增的选择性标记基因,其中包括选择性标记基因的扩增的拷贝以及由此包括该核酸序列的额外拷贝的细胞能够通过在适当可选试剂的存在下培养细胞来选定。
用于表达变异LovD多肽的许多载体是市场上可以买到的。适合的商业表达载体包括来自Sigma-Aldrich Chemicals,St.Louis MO.的p3xFLAGTMTM表达载体,其包括CMV启动子和用于在哺乳动物宿主细胞中表达的hGH多腺苷酸化位点和pBR322复制起点,以及用于在大肠杆菌中扩增的氨比西林抗性标记。其它适合的表达载体有可以从Stratagene,LaJolla CA商业化购买的pBluescriptII SK(-)和pBK-CMV,以及衍生自pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pREP4、pCEP4(Invitrogen)或pPoly(Lathe等人,1987,Gene 57:193-201)的质粒。
6.5生产LovD的变异多肽和核酸的方法
变异LovD多肽和编码这种多肽的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。
具体公开的变异体的变异体可以通过使编码该变异体的多核苷酸经历诱变和/或定向进化方法获得。示例性定向进化技术是如Stemmer,1994,Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751;WO 95/22625;WO 97/0078;WO97/35966;WO 98/27230;WO 00/42651;WO 01/75767和美国专利6,537,746(在此其各自通过引用并入本文)中描述的诱变和/或DNA改组。
可以使用的其它定向进化程序包括交错延伸过程(StEP)、体外重组(Zhao等人,1998,Nat.Biotechnol.16:258-261)、诱变PCR(Caldwell等人,1994,PCR Methods Appl.3:S136-S140)、盒式诱变(Black等,1996,Proc NatlAcad Sci USA 93:3525-3529)等。用于获得额外变异体的诱变和定向进化技术也在以下参考文献中描述:Ling等人,1997,“Approaches to DNAmutagenesis:an overview(DNA诱变的手段:综述),”Anal.Biochem.254(2):157-78;Dale等人,1996,“Oligonucleotide-directed randommutagenesis using the phosphorothioate method(使用硫代磷酸酯方法的寡核苷酸定向随机诱变),”Methods Mol.Biol.57:369-74;Smith,1985,“In vitromutagenesis(体外诱变),”Ann.Rev.Genet.19:423-462;Botstein等人,1985,“Strategies and applications of in vitro mutagenesis(体外诱变的策略和应用),”Science 229:1193-1201;Carter,1986,“Site-directed mutagenesis(位点定向诱变),”Biochem.J.237:1-7;Kramer等人,1984,“Point MismatchRepair(点错配修复),”Cell 38:879-887;Wells等人,1985,“Cassettemutagenesis:an efficient method for generation of multiple mutations atdefined sites(盒式诱变:用于在限定位点产生多重突变的有效方法),”Gene34:315-323;Minshull等人,1999,“Protein evolution by molecular breeding(借助分子育种的蛋白进化),”Curr Opin Chem Biol 3:284-290;Christians等人,1999,“Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation usingDNA family shuffling(使用DNA家族改组定向进化用于AZT磷酸化的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶),”Nature Biotech 17:259-264;Crameri等人,1998,“DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directedevolution(来自不同物种的基因家族的DNA改组加速定向进化),”Nature391:288-291;Crameri等人,1997,“Molecular evolution of an arsenatedetoxification pathway by DNA shuffling(通过DNA改组的砷酸解毒途径的分子进化),”Nature Biotech 15:436-438;Zhang等人,1997,“Directedevolution of an effective fructosidase from a galactosidase by DNA shufflingand screening(通过DNA改组和筛选的来自半乳糖苷酶的高效果糖苷酶的定向进化),”Proc Natl Acad Sci USA 94:45-4-4509;Crameri等人,1996,“Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNAshuffling(通过使用DNA改组的分子进化的改进的绿色荧光蛋白),”NatureBiotech 14:315-319;Stemmer,1994,“Rapid evolution of a protein in vitro byDNA shuffling(通过DNA改组的体外蛋白的快速进化),”Nature370:389-391;美国专利6,117,679号(Stemmer,2000年9月12日);美国专利6,376,246号(Crameri等人,2002年4月23日);美国专利6,586,182号(Patten等人,2003年7月1日);美国专利申请2008/0220990号(Fox,2008年9月11日);和美国专利申请2009/0312196号(Colbeck等人,2009年12月17日)。
变异LovD多肽可以如以上描述的经宿主细胞中的重组表达获得。表达的变异LovD多肽可以使用用于蛋白纯化的任何一种或多种充分已知的技术从细胞和或培养基回收,包括溶菌酶处理、超声处理、过滤、盐析、超离心、和色谱等。用于裂解和从诸如大肠杆菌的细菌高效提取蛋白的适合的试剂,可以作为St.Louis MO的Sigma-Aldrich的商标名CelLytic BTM从市场获得。
用于变异LovD多肽的分离和/或纯化的色谱技术包括反相色谱、高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和亲和色谱等。纯化特定酶的条件将部分地取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性、分子量、分子形状等因素,并且对本领域技术人员将是明显的。在一些实施方案,工程化的转氨酶能够作为具有纯化标签的融合蛋白来表达,该标签诸如具有金属亲和性的His标签、或结合抗体的抗体标签,如myc表位标签。
在一些实施方案中,亲和技术可用于分离和/或纯化变异LovD多肽。对于亲和色谱纯化,可以使用特异地结合变异LovD多肽的任何抗体。对于抗体的生产,不同的宿主动物,包括但不限于兔、小鼠、大鼠等,可以通过注射工程化的多肽被免疫。多肽可以借助侧链官能团或连接到侧链官能团的接头与适合的载体诸如BSA连接。取决于宿主物种,不同佐剂可以被用来增加免疫学反应,包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全),诸如氢氧化铝的矿物质凝胶,诸如溶血卵磷脂的表面活性物质、普卢兰尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、乳化油、钥孔戚血蓝蛋白、二硝基酚,和可能有用的人类佐剂,诸如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
6.6宿主细胞
在另一个方面,本公开内容提供了包括编码变异LovD多肽的多核苷酸的宿主细胞,该多核苷酸可操作地连接到一个或多个用于在宿主细胞中表达变异LovD的控制序列。表达本文描述的变异LovD多肽所使用的宿主细胞是本领域充分已知的,并且包括但不限于诸如大肠杆菌、乳杆菌(Lactobacillus)、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)细胞的细菌细胞;诸如酵母细胞,(如,酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(ATCC登录号201178)或丝状真菌细胞(如曲霉、木霉(Trichoderma)、腐质酶(Humicola)、或金孢子菌(Chrysosporium))的真菌细胞;诸如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞的昆虫细胞;诸如CHO、COS、BHK、293和Bowes黑色素瘤细胞的动物细胞;以及植物细胞。以上描述的宿主细胞的适当的培养基和生长条件在本领域中是充分已知的。
表达变异LovD多肽的多核苷酸可以通过本领域中已知的不同方法引入到细胞中。技术包括电穿孔、基因枪粒子轰击、脂质体介导转染、氯化钙转染、以及原生质体融合等。使多核苷酸引入到细胞中的各种方法对本领域的技术人员将是明显的。
适合在大肠杆菌宿主细胞中表达LovD多肽的表达载体的制备在实施例部分中描述。这种表达载体可用于在大肠杆菌细菌宿主细胞的多种不同菌株中表达变异LovD多肽。特别适合的大肠杆菌宿主细胞是BL21和W3110 bioH-敲除。(见,如Xie,Xinkai和Yi Tang,2007,Applied andEnvironmental Microbiology 73(7):2054-2060;Xie等人,2006,Chemistry &Biology 13(11):1161-1169;和Xie等人,Metabolic Engineering 9(4):379-386)。
6.7用途
本文描述的变异LovD多肽催化酰基基团从硫酯辅助底物到莫纳可林J及其类似物或衍生物的转移以产生治疗上重要的他汀类化合物。使莫纳可林J转化为辛伐他汀的该反应的具体实施方案在图1的框区中说明。由于其催化性质和其它性质,本文描述的变异LovD多肽可以用于从莫纳可林J和/或其C8酯前体以高产量生产大量的治疗上重要的他汀类诸如辛伐他汀。在莫纳可林J被用来作为起始材料时,辛伐他汀可以在单一步骤中获得。使该方法与目前利用的获得辛伐他汀的半合成的方法(在图1中用虚线箭头说明)对比。
相应地,本公开内容还提供了利用本文描述的变异LovD多肽生产辛伐他汀的方法。根据该方法并参考图1,在变异LovD多肽使α-二甲基丁酰基团向莫纳可林J的C8位置转移的条件下,莫纳可林J底物(或其盐诸如钠盐或铵盐)(12)在α-二甲基丁酰硫酯辅助底物(14)的存在下与变异LovD多肽接触以产生辛伐他汀(16)。
α-二甲基丁酰硫酯辅助底物的身份并不关键。变异LovD多肽接受多种硫酯辅助底物。用于生产辛伐他汀的适合的α-二甲基丁酰硫酯辅助底物包括但不限于,α-二甲基丁酰-S-N-乙酰基半胱胺(“DMB-S-NAC”)、α-二甲基丁酰-S-甲硫乙酸酯(“DMB-S-MTG”)、α-二甲基丁酰-S-巯基丙酸甲酯(“DMB-S-MMP”)、α-二甲基丁酰-S-巯基丙酸乙酯(“DMB-S-EMP”)、α-二甲基丁酰-S-巯基丁酸甲酯(“DMB-S-MMB”)和α-二甲基丁酰-S-巯基丙酸(“DMB-S-MPA”),并且任选地取代的S-烃基或者任选地取代的S-芳基/杂芳基硫酯。任何这些硫酯辅助底物或这样的硫酯辅助底物的混合物能够在本文描述的方法中使用。
α-二甲基丁酰底物可以使用市售的起始材料使用常规方法制备。制备DMB-S-MMP的示例性反应如下所示:
简言之,在N,N-二异丙胺(DIEA)的存在下用2,2-二甲基丁酰氯(4)酰化甲基-3-巯基丙酸酯(2)以生成DMB-S-MMP(6)。具体的示例性反应条件在实施例7中提供。其它α-二甲基丁酰硫酯辅助底物可以通过这些方法的常规修改来制备。
该方法可以用纯化的变异LovD多肽来进行,或者可选地LovD多肽可以以粗细胞裂解产物或半纯化细胞裂解产物部分的形式添加到反应混合物中。使变异LovD多肽纯化到适合在大规模反应中使用的纯度水平的方法在实施例3中提供。
莫纳可林J底物(或其盐)能够以纯化的形式添加到反应混合物中,或者可选地,其可以通过洛伐他汀的水解原位生成。获得洛伐他汀和/或莫纳可林J的方法是充分已知的。例如,洛伐他汀可以经充分已知的方法(见,如Endo,A.,1980,The Journal of Antibiotics 33(3):334-336;Hendrickson等人,1999,Chemistry & Biology 6(7):429-439;Kennedy等人,1999,Science284(5418):1368-1372;和Manzoni等人,2002,Applied Microbiology andBiotechnology 58(5):555-564.)从土曲霉分离。它也可以在市场上买到。
莫纳可林J(及其盐)可以使用常规方法经过洛伐他汀的碱性水解获得。具体示例性反应在实施例6中提供。
反应可以各种不同的反应条件下进行。通常反应作为包含约0.2至10g/L、通常0.25至5g/L的变异LovD多肽,从约1至250g/L、通常50至150g/L的莫纳可林J底物(或其盐),和从约1至10当量、通常1至2当量的α-二甲基丁酰硫酯辅助底物的浆液进行。反应通常在具有pH 7.5至pH 10.5、通常pH 8.5至pH 9.5的范围的pH的含水缓冲液(0至300mM)中进行。缓冲液的身份并不关键。适合的缓冲液包括但不限于三乙醇胺(TEA)、磷酸钾,或可能不使用缓冲液。反应的温度是从20至50℃,通常20至40℃。
也可以使用含水共溶剂体系。这种共溶剂将通常包括从约1至10%的极性有机共溶剂。适合的极性有机共溶剂包括但不限于乙腈(MeCN)、二甲基亚砜(DMSO)、异丙醇(IPA)、二噁烷、四氢呋喃(THF)、丙酮和甲醇(MeOH)。
已发现反应产生的硫醇副产物(图1中的18)可以抑制变异LovD多肽。相应地,在反应混合物中包括硫醇清除剂可能是期望的。适合的硫醇清除剂及其使用方法在2009年9月30日提交的题为“Improved Lov-DAcyltransferase Mediated Acylation(改进的Lov-D酰基转移酶介导的酰化)”的61/247,242号申请和具有相同名称的同时提交的律师代理申请案编号为376247-044US(105192){CX2-032}的_____________号申请中描述,其公开内容通过引用并入本文。优选的硫醇清除剂是活性炭。在使用时它能以范围在从约2至20g/L的量被包括在反应混合物中。可选地,该产品可作为盐被沉淀,例如,作为铵盐或钠盐。
适合用于本文描述的变异LovD的多肽的反应条件如下:1至250g/L、也可以是25至200g/L、且通常为50至150g/L的莫纳可林J钠盐底物;1至10当量、也可以是1至5当量、且通常为1至2当量的DMB-S-MMP辅助底物;0.2至10g/L、通常为0.25至5g/L的变异LovD多肽(如实施例3中所述制备);2至20g/L的活性炭(任选);和0至300mM的TEA缓冲液,pH7.5至10.5、也可以是pH 8.0至10.0、而且通常为pH 8.5至9.5。
反应在约20至50℃、也可以是20至30℃、而且通常20至40℃的范围的温度下进行,其取决于所使用的变异LovD多肽的热稳定性,并且搅动或搅拌的持续时间是约18至48小时。反应的进程可以通过经实施例部分中描述的HPLC色谱分析等分试样来监测。
按照该反应,辛伐他汀可以从反应混合物中分离并且使用标准程序转化为药学上有用的盐类,诸如铵盐。
简言之,在保持温度近17℃的同时,副产物和过剩的底物用MTBE(2X)提取,合并水相,并且用5M HCl将pH调至pH 5.3-5.4。加入乙酸乙酯(EtOAc)(13vol)并用平叶片叶轮(345rpm,17℃)使混合物搅动10分钟。EtOAc洗涤过程再重复两次并且合并三次EtOAc提取物。EtOAc提取物通过Celite垫减压过滤,滤饼用EtOAc洗涤。在减压条件下滤液和洗液被合并与浓缩以生产辛伐他汀羟酸。
该羟酸可以使用标准技术转化为铵盐。具体的示例性条件在实施例8中提供。可选地,反应可以使用莫纳可林J的铵盐运行,并且由此产生的辛伐他汀铵盐可以通过过滤从反应介质直接分离。该过程在实施例9中示例。
7.实施例
实施例1:LovD基因和表达载体的构建
使用标准密码子优化设计来自野生型土曲霉的酰基转移酶编码基因lovD(SEQ ID NO:1)以用于在大肠杆菌中表达(对密码子优化软件的最近的综述,见Puigbò等人,Jul 2007,“OPTIMIZER:A Web Server forOptimizing the usage of DNA Sequences(OPTIMIZER::优化DNA序列的使用的网络服务器),”Nucleic Acids Res.200735(网络服务器特刊):W126-31)。基因用包括42个核苷酸的寡核苷酸来合成,并且克隆到pCK110900表达载体中lac启动子的控制下,其在美国专利申请公布2006/0195947号的图3中描述,该申请公布通过引用并入本文。表达载体还包含P15a复制起点和氯霉素抗性基因。所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌W3110或大肠杆菌BL21中。
编码在前述表1中公开的本公开内容的变异LovD多肽的示例性实施方案的多核苷酸也被克隆到pCK110900载体用于在大肠杆菌W3110或大肠杆菌BL21中表达。
实施例2:用于生产LovD多肽的摇瓶程序
包含编码感兴趣的变异LovD多肽的质粒的大肠杆菌的单微生物菌落被接种到包含30μg/ml氯霉素和1%葡萄糖的50mL2×YT肉汤(1×强度,16g/L酪蛋白胰腺消化物(胰蛋白胨)、10g/L酵母提取物、5g/L氯化钠)中。细胞在30℃培养箱中以250rpm振动过夜(至少16小时)生长。培养物被稀释到1升烧瓶中的包含30μg/ml氯霉素的250ml 2×YT肉汤中达到600nm处的光密度(OD600)0.2,并且被允许在25-30℃生长。lovD基因的表达通过在培养物的OD600为0.6至0.8时添加异丙基βD-硫代半乳糖苷至终浓度为1mM来诱导,并且培养继而继续过夜(至少16小时)。
通过离心(2400g、15min、4℃)收获细胞并弃去上清。细胞团(cellpellet)用等体积的冷的(4℃)50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.5)再悬浮并通过如上的离心收获。洗涤过的细胞在两倍体积的冷磷酸盐缓冲液中再悬浮并通过弗氏压碎器(French Press)(18,000psi,4℃)。细胞碎片通过离心(7700g、30min、4℃)去除。收集澄清的裂解产物上清液并储存在-20℃。冷冻的澄清裂解产物的冻干提供了粗LovD多肽的干燥摇瓶粉末。可选地,细胞团(在洗涤前或洗涤后)可以被储存在4℃或-80℃。
实施例3:用于生产LovD多肽的发酵程序
实验室规模发酵在37℃在充气搅动的15L发酵罐中使用6.0L培养基(0.88g/L硫酸铵、0.98g/L二水柠檬酸三钠、12.5g/L三水磷酸氢二钾、6.25g/L磷酸二氢钾、3.33g/L Tastone-154酵母提取物、10mg/L生物素、0.083g/L的柠檬酸铁铵,和8.3ml/L微量元素溶液,微量元素溶液包含2g/L二水氯化钙、2.2g/L七水硫酸锌、0.5g/L一水硫酸锰、1g/L五水硫酸亚铜、0.1g/L四水钼酸铵和0.02g/L四硼酸钠)开始。发酵罐接种包含编码感兴趣的变异lovD基因的质粒的大肠杆菌W3110或大肠杆菌BL21的晚期指数期培养物(在如实施例2中描述的摇瓶中生长)达到起始OD600为0.5至2.0。发酵罐用以500-1500rpm搅动,以2.0-30.0L/min将空气供给到发酵容器,以保持至少55%的溶解氧水平。培养物的pH通过28%(v/v)氢氧化铵水溶液的添加保持在7.0。通过进料液(高达4L)的添加保持培养物的生长,该进料液包含500g/L葡萄糖、12g/L氯化铵、10mg/L生物素和5g/L的七水硫酸镁。在向发酵罐添加1L进料量之后,在培养物OD600近50时,lovD基因的表达通过加入IPTG至终浓度为1mM来诱导,并且发酵在30℃继续另18小时。培养物继而冷却到4-8℃并保持在该温度直到收获。细胞通过离心(7300g、30min、4-8℃)收获。收获的细胞在以下描述的回收过程中直接使用或者在-20℃冷冻直到被这样使用。
对每体积的湿细胞体(cell paste),细胞团在4℃在2体积100mM三乙醇胺(氯化物)缓冲液(pH 8.5)中被再悬浮并使pH调至8.5。通过使用12000psi的压力使悬浮液通过装有两阶段均质阀组件的均质机使细胞内的LovD多肽从细胞释放。细胞匀浆在破裂之后立即被冷却至4℃,pH调至8.5,并且继而将pH 7.2的11%(w/v)聚乙烯亚胺溶液添加到裂解产物达到终浓度0.35-0.5%(w/v)并且在25-30℃的室温在600rpm搅拌30分钟。所得悬浮液通过离心(7300g、60min、4-8℃)澄清。将澄清的上清倾倒出,将其pH调到8.5并使用纤维素超滤膜(截留分子量30kDa)在20℃浓缩8至10倍。最终浓缩物被分配到到培养皿或浅的容器中,在-20℃冷冻并冻干48至72小时,并伴随温度从-20到15℃缓慢升温,以产生粗LovD多肽的干燥粉末。粗粉末被转移到聚乙烯袋并储存在-20℃。
实施例4:测定莫纳可林J钠盐向辛伐他汀钠盐转化的高通量HPLC方法使用配备C18柱(4.6×50mm)的Agilent HPLC 1200测定莫纳可林J钠盐向辛伐他汀钠盐转化的程度。对该试验,10μL样品用包含0.1%三氟乙酸(TFA)的52%(v/v)乙腈水溶液以1.5mL/min的流速和30℃的温度洗脱。洗脱液在238nm处监测。在这些条件下,莫纳可林J酸钠盐、二甲基丁酰-S-巯基丙酸甲酯(DMB-S-MMP)和辛伐他汀钠盐的保留时间分别近0.8、2.9和3.9min。莫纳可林J钠盐向辛伐他汀钠盐的转化程度可以使用曲线下面积分析来测定。
实施例5:测定莫纳可林J钠盐向辛伐他汀钠盐转化的高分辨率HPLC方法
取5μL反应混合物并溶解于1.0mL的MeCN∶水(95∶5)混合物中。样品继而被离心(300g、5min、25℃)以去除沉淀的酶并且上清液用HPLC分析。莫纳可林J钠盐向辛伐他汀羟酸钠盐的转化使用配备Zorbax EclipseC18柱(150×4.6mm,5μm)的Agilent HPLC 1200以及H2O+0.1%TFA(A)和乙腈+0.1%TFA(B)作为洗脱液以2.0mL/min的流速在30℃和238nm测定。分析在具有以下时间和组成的梯度方法下运行:0-1min,40%B;1-9min,90%B;9-9.5min,90%B;9.5-10.0min,40%B;10.0-10.5min,40%B。莫纳可林J羟酸、莫纳可林J、α-二甲基丁酰-S-巯基丙酸甲酯(DMB-S-MMP)、辛伐他汀羟酸和辛伐他汀的保留时间分别为近2.0、3.2、5.9、6.4和7.7分钟。
实施例6:从洛伐他汀制备莫纳可林J
向装有冷凝器的3颈圆底烧瓶(RBF)中的洛伐他汀(30g、0.074mol)加入异丙醇(IPA,250mL)。氢氧化钾颗粒(33.2g,0.593mol)和水(3mL,0.1vol)继而被加入到搅拌的悬浮液。反应在80℃(内部温度)搅拌7h。反应继而被冷却到约50℃并且在减压(35℃,50mbar)条件下去除IPA直到最终体积为约100毫升(3.3vol)。水(110mL,3.7vol)被添加到残留物并且溶液在冰水浴中被冷却到约10℃。在使内部温度保持在12-17℃之间的同时,6M HCl(92mL,3.0vol)被滴加到溶液。溶液的pH被调整到3和4之间的最终pH。混合物继而在冰浴中搅拌2h。得到的固体被过滤掉并且用水(60-90mL,2-3vol)洗涤,并且继而用庚烷(60mL,2vol)洗涤。滤饼在25℃真空干燥24h以产生经HPLC分析具有>99%纯度的白色固体(22.4g,产率90%)。
实施例7:DMB-S-MMP的制备
乙酸异丙酯(i-PrOAc,100mL)中的N,N-二异丙基乙胺(19.9mL,120mmol)和3-巯基丙酸甲酯(7.21,60mmol)的溶液被冷却到2℃的内部温度。经10分钟向这种用力搅拌的溶液滴加2,2-二甲基丁酰氯(8.1g,60mmol)。所得悬浮液在25℃搅拌2h。反应通过使用硅胶板上的薄层色谱(TLC)检查3-巯基丙酸甲酯的消失来监测。斑点用碘染色(洗脱液:5%EtOAc/庚烷;3-巯基丙酸甲酯的Rf:0.20)。反应通过加入饱和氯化铵(100mL)随后加入i-PrOAc(100mL)来猝灭,并且搅拌所得混合物直到所有固体溶解。各相被分开并且有机相接续用1%盐酸水溶液(100mL)和随后用水(2×50mL)洗涤。有机相继而在硫酸钠上干燥,过滤,并在减压下(45℃水浴,50mm Hg)浓缩,从而获得作为淡黄色液体的粗混合物。粗混合物使用庚烷到2%乙酸乙酯∶庚烷的梯度进行硅胶柱色谱。包括纯产物的级分(fraction)被合并且被浓缩以获得10.5g(80%)的3-(2,2-二甲基硫代丁酰)丙酸甲酯(methyl 3-(2,2-dimethylbutanoylthio)propionate)(DMB-S-MMP)。
实施例8:莫纳可林J钠盐向辛伐他汀钠盐的转化,辛伐他汀羟酸的纯化、分离和辛伐他汀羟酸向辛伐他汀羟酸铵盐的转化
对如实施例3中描述所制备的变异酰基转移酶在莫纳可林J钠盐向辛伐他汀钠盐的制备规模的转化中的使用分析如下。250mL的3颈圆底烧瓶(RBF)装有顶置式搅拌器、平叶片叶轮和内部温度计。反应容器装载莫纳可林J羟酸(5g,14.79mmol)。随后加入1M NaOH溶液(16.3mL)和去离子水(8.6mL)。在加入缓冲液之前搅动混合物直到所有固体溶解(约5min)。TEA缓冲溶液(33.3mL,400mM,pH=8.5)被加入并且在酶加入之前所得混合物的pH用5M HCl(0.15mL)调整到9.4至9.0。变异LovD酶(0.05g)作为粉末被装载到搅拌的混合物中。混合物在350rpm在25℃搅拌5分钟以获得均匀性。DMB-S-MMP(3.55mL,16.27mmol,1.1当量)被加入来起始酶促反应。所得二相混合物在25℃(内部温度)以350rpm搅拌。如实施例5中描述的HPLC分析在定期采集的样品上实施。近92%的转化在72h之后获得。当在DMB-S-MMP之前加入活性炭(10g/L)(来清除副产物3-巯基丙酸甲酯)时,95-99%的转化可在40-48小时后获得。在一种实施方案中,具有SEQ ID NO:116中描述的突变的变异体根据以上条件提供了良好的结果。包括底物或酶的装载量的反应条件可能需要按其它变异体的反应状况进行优化。
辛伐他汀羟酸钠盐从以上反应纯化如下。在进程中的分析指示出最大转化之后,反应混合物的pH使用10M NaOH溶液(0.55mL)从8.2调到9.0。如果添加了活性炭,反应混合物在减压下通过标准的G4烧结玻璃漏斗中的Celite(1.5g)垫过滤以去除活性炭。250mL 3颈RBF用去离子水(5mL)冲洗,其也通过同一Celite垫过滤,并且继而与滤液合并。滤饼用水(5mL)洗涤,并且洗液被收集并与滤液合并。MTBE(60mL;12vol)被装载到反应中并且混合物在450rpm搅动10分钟。两相继而被分开并且使用分液漏斗分别收集。水相被重新装载到250mL 3颈RBF中并且用MTBE(30mL;6vol)再次萃取。各相被分开并分别收集。
辛伐他汀羟酸钠盐向辛伐他汀羟酸的转化继而进行如下。EtOAc(65mL;13vol)被装载到水相。混合物的pH使用5M HCl溶液(0.52mL)调整到5.3-5.4,并以450rpm在23-25℃搅动10分钟。允许各相在分液漏斗中分开。如果形成乳状液,则加入盐水以促进两相的分离。含水层被去除而EtOAc相被单独收集。含水层被再次装载到250ml的3颈RBF并且再次用EtOAc(65mL;13vol)萃取。两相混合物以450rpm在23℃搅动10分钟并且继而各相被允许在分液漏斗中分开并分别收集。用EtOAc(5mL)冲洗分液漏斗,其继而与第一次和第二次的EtOAc萃取物合并。合并的EtOAc萃取物在减压下通过在标准G4烧结玻璃漏斗中的Celite(1g)垫过滤以使萃取物澄清。滤饼用EtOAc(10mL)洗涤,并且洗液与滤液合并。滤液在减压下从145mL浓缩到65mL。
辛伐他汀羟酸向辛伐他汀羟酸铵盐的转化进行如下。包含辛伐他汀羟酸的乙酸乙酯溶液中被装载到250mL 3颈RBF并且反应混合物以250rpm在20-22℃搅拌。将氢氧化铵(2.5mL)和MeOH(2.5mL)的1∶1(v/v)混合物继而经10min滴加到反应混合物,使内部温度保持在20-22℃。在氢氧化铵和MeOH混合物完全加入之后,所得混合物在20-22℃以260rpm搅拌1h。浆液进一步在0-5℃搅动1h。白色固体继而在真空下通过标准的G4烧结玻璃漏斗过滤并且反应容器用6.5mL冷的EtOAc冲洗。冲洗液过滤通过同一Celite垫并且与滤液合并。滤饼继而用冷的EtOAc(6.5mL;1.3vol)洗涤。白色固体继而在25℃的真空炉(2mm Hg)中干燥24h,以获得近4.3-5.0g(65-75%的分离产率)的辛伐他汀羟酸铵盐,为具有化学纯度94-97%(AUC,238nm)的白色固体。
实施例9:莫纳可林J羟酸铵盐向辛伐他汀羟酸铵盐的转化和辛伐他汀羟酸铵盐的分离
对如实施例3中所述制备的变异酰基转移酶在莫纳可林J铵盐向辛伐他汀铵盐的制备规模的转化中的使用分析如下。250mL的3颈圆底烧瓶(RBF)装有顶置式搅动器、平叶片叶轮和内部温度计。反应容器装载莫纳可林J羟酸(10g,29.58mmol)。随后加入去离子水(112.0mL)和NH4OH(4.2mL)。在pH调整之前混合物被搅拌直到所有固体溶解(约2分钟)。在酶加入之前,用5M HCl(1.5mL)使所得混合物的pH从9.2调整到9.0。变异LovD酶(0.10g)作为粉末被装载到搅拌的混合物中。混合物以350rpm在25℃搅拌5分钟以获得均匀性。DMB-S-MMP(7.1mL,32.54mmol,1.1当量)被加入来起始酶促反应。所得二相混合物以300rpm在25℃(内部温度)搅拌。反应的pH通过恒pH法(pH stat)和25%NH4OH的滴定被控制在9.0。如实施例5中描述的HPLC分析在定期采集的样品上实施。近97%的转化在48h之后获得。在一种实施方案中,具有SEQ ID NO:116中描述的突变的变异体根据以上条件提供了良好的结果。包括底物或酶的装载量的反应条件可能需要按其它变异体的反应状况进行优化。
辛伐他汀羟酸铵盐从以上反应分离如下。在进程中的分析指示出最大转化之后,反应混合物在减压下过滤通过标准G4烧结玻璃漏斗。250mL 3颈RBF用冷却的去离子水(10mL)冲洗并且浆液过滤通过同一烧结玻璃漏斗。滤饼用冷却的去离子水(20mL)洗涤两次,并且继而用MTBE(40mL)洗涤三次。白色固体在25℃的真空炉(2mm Hg)中干燥24h以获得约11.4至11.7g(85至87%,分离产率)辛伐他汀羟酸铵盐,为具有化学纯度约97至98%的白色固体(AUC,238nm)。
本申请中引用的所有公布、专利、专利申请和其它文档出于所有目的在此通过引用以整体并入,其程度如同将各单个公布、专利、专利申请或其它文档被分别指出出于所有目的通过引用并入。
尽管已说明和描述不同具体实施方案,应领会可以做出不同变化而不背离本发明的精神和范围。
Claims (22)
1.一种变异LovD多肽,所述变异LovD多肽具有比SEQ IDNO:2的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶大至少两倍的催化活性,其中所述变异LovD多肽与SEQ ID NO:2相比至少具有两种突变:L174F和A178L,并且所述变异LovD多肽由选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118和120的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的变异LovD多肽,所述变异LovD多肽具有比SEQ ID NO:2的野生型土曲霉酰基转移酶大至少10倍的催化活性。
3.一种多核苷酸,所述多核苷酸编码根据权利要求1-2的任一项所述的变异LovD多肽。
4.如权利要求3所述的多核苷酸,所述多核苷酸是适于在宿主细胞中表达所述变异LovD多肽的表达载体。
5.如权利要求3或权利要求4所述的多核苷酸,在所述多核苷酸中编码序列利用为在宿主细胞中表达而优化的密码子。
6.一种宿主细胞,所述宿主细胞包括编码根据权利要求1-2的任一项所述的变异LovD多肽的多核苷酸。
7.一种生产变异LovD多肽的方法,包括在所述变异LovD多肽被表达的条件下培养根据权利要求6的宿主细胞,并且任选地回收所述变异LovD多肽。
8.一种生产辛伐他汀的方法,包括在α-二甲基丁酰硫酯辅助底物的存在下并在使莫纳可林J转化为辛伐他汀的条件下使所述莫纳可林J底物与根据权利要求1-2的任一项的变异LovD多肽接触。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述莫纳可林J是钠盐。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法,其中所述莫纳可林J是钠盐并且加入活性炭。
11.如权利要求8所述的方法,其中所述莫纳可林J是铵盐。
12.如权利要求8-9和11的任一项所述的方法,其中加入用于沉淀辛伐他汀的试剂。
13.如权利要求10所述的方法,其中加入用于沉淀辛伐他汀的试剂。
14.如权利要求12所述的方法,其中所述试剂是氢氧化铵。
15.如权利要求13所述的方法,其中所述试剂是氢氧化铵。
16.一种生产辛伐他汀的方法,包括在α-二甲基丁酰硫酯辅助底物的存在下并在使洛伐他汀底物转化为辛伐他汀的条件下使所述洛伐他汀底物与根据权利要求1-2的任一项的变异LovD多肽接触。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述洛伐他汀底物、所述变异LovD多肽、和所述α-二甲基丁酰硫酯在实质相同的时间被装载到容器中。
18.如权利要求16或权利要求17所述的方法,其中所述洛伐他汀底物和所述变异LovD多肽首先被装载到容器中并且继而所述α-二甲基丁酰硫酯被装载到所述容器中。
19.如权利要求16-17的任一项所述的方法,其中加入用于沉淀辛伐他汀的试剂。
20.如权利要求18所述的方法,其中加入用于沉淀辛伐他汀的试剂。
21.如权利要求19所述的方法,其中所述试剂是氢氧化铵。
22.如权利要求20所述的方法,其中所述试剂是氢氧化铵。
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101490271A (zh) * | 2006-05-24 | 2009-07-22 | 加利福尼亚大学董事会 | 制备辛伐他汀和相关化合物的方法和材料 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4444784A (en) | 1980-08-05 | 1984-04-24 | Merck & Co., Inc. | Antihypercholesterolemic compounds |
US4582915A (en) | 1983-10-11 | 1986-04-15 | Merck & Co., Inc. | Process for C-methylation of 2-methylbutyrates |
US4820850A (en) | 1987-07-10 | 1989-04-11 | Merck & Co., Inc. | Process for α-C-alkylation of the 8-acyl group on mevinolin and analogs thereof |
WO1993023547A1 (en) * | 1992-05-15 | 1993-11-25 | Syntex Pharmaceuticals International Limited | ENZYMATIC PROCESS FOR PRODUCTION OF S-6-METHOXY-α-METHYL-2-NAPHTHALENEACETIC ACID |
FR2704451B1 (fr) | 1993-04-30 | 1995-06-30 | Oreal | Procédé de désodorisation d'une formulation contenant au moins un composé porteur d'un groupe thiol et formulation désodorisée ainsi obtenue. |
US5420024A (en) | 1993-05-11 | 1995-05-30 | Merck & Co., Inc. | Process for synthesis of acylated HMG-CoA reductase inhibitors from a lactone diol precursor using Candida cylindracea |
US5393893A (en) | 1993-11-08 | 1995-02-28 | Apotex, Inc. | Process for producing simvastatin and analogs thereof |
US5763653A (en) | 1997-03-13 | 1998-06-09 | Ranbaxy Laboratories, Ltd. | Key intermediates in the manufacture of simvastatin |
US5763646A (en) | 1997-03-13 | 1998-06-09 | Ranbaxy Laboratories, Ltd. | Process for manufacturing simvastatin from lovastatin or mevinolinic acid |
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NO991045L (no) | 1998-03-05 | 1999-09-06 | Synthon Bv | FremgangsmÕte ved fremstilling av simvastatin og/eller dets derivater |
US6063919A (en) * | 1998-08-14 | 2000-05-16 | Keystone Biomedical, Inc. | Process for the synthesis of exochelins |
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US20070129437A1 (en) * | 2005-12-06 | 2007-06-07 | Ferenc Korodi | Process for preparing simvastatin and intermediates thereof |
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US20090191602A1 (en) * | 2006-05-24 | 2009-07-30 | Yi Tang | Methods and Materials for Making Simvastatin and Related Compounds |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Rational improvement of simvastatin synthase solubility in Escherichia coli leads to higher whole-cell biocatalytic activity;Xinkai Xie;《Biotechnology and Bioengineering》;20080618;第102卷(第1期);20–28 * |
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