CN104342416B - 含有一个或几个点突变的洛伐他汀酰基转移酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,所述突变体在SEQ ID NO.1的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含选自N45R、A110P、S145N、Q230M、L293M、L379M中的任意二至六个氨基酸突变。本发明还涉及编码所述突变体的核酸,相关表达载体和宿主细胞以及所述突变体合成辛伐他汀的用途。
Description
技术领域
本发明涉及药物生产领域,具体涉及辛伐他汀生产及其生产用酶,更具体涉及洛伐他汀酰基转移酶及其在辛伐他汀生产中的应用。
背景技术
辛伐他汀是目前国内外最畅销的降脂药之一,可用于控制血液中胆固醇含量及预防心血管疾病,其药理作用是作为竞争性抑制剂抑制胆固醇合成的限速酶:3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性,从而降低胆固醇的生物合成。作为洛伐他汀的半合成衍生物,与相同剂量的洛伐他汀相比,辛伐他汀可以更有效地降低血清中的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。
正是由于辛伐他汀具有重要医学意义,许多科研院所及药企开始专注于从洛伐他汀到辛伐他汀的多步反应的研究中,如PCT专利WO2005066150中,使用以水解洛伐他汀的C8酯产生三元醇莫那可林酸开始,接着选择性甲硅烷基化C13醇,用二甲基丁酰氯酯化C8醇并去保护产生辛伐他汀酸:
但近来由于对环境保护的倡导及绿色化学概念的提出,使人们把研究目光从能耗大并且毒性大的化学法生产辛伐他汀逐步重新转向能耗低毒性低的酶法生产。
WO9426920研究了使用脂肪酶和酯酶作为酯化剂去合成辛伐他汀,但是由于区域选择性酯化的要求使得必须进行其他醇基的保护,导致总产量的降低。因此,找到能够选择性酰化莫那可林酸的特效酶制剂对于有效合成辛伐他汀起到至关重要的作用。
US2009191602 (A1)报道了土曲霉的洛伐他汀生物合成的基因簇,该基因簇编码的一个46KDa的蛋白质(SEQ ID NO.1),即洛伐他汀酰基转移酶(LovD),它可将酰基硫酯的酰基基团区域选择性酰基化莫那可林酸C8羟基,为生物合成辛伐他汀的有效酶制剂:
目前虽然研究人员经分离纯化并克隆表达出天然存在的LovD,但天然存在的LovD仍有很多方面不尽如人意,如酰化酶活的效率不高等问题。高雪研究了LovD的86、12、190、275、26、161等位点的定点突变,其突变体有效的改进LovD的活性,温度稳定性以及可溶性(Gao Xue; Xie Xinkai等,Directed evolution and structural characterization ofa simvastatin synthase,Chemistry & biology,2009,16(10):1064~1074)。Xie Xinkai等对LovD的突变体C40A/C60N在E.coli YT2中表达进行了研究(Xie Xinkai; PashkovInna等, Rational improvement of simvastatin synthase solubility inEscherichia coli leads to higher whole-cell biocatalytic activity,Biotechnology and bioengineering,2009,102(1):20~28)。WO2011041231(A1)中以4,9,26,28,35,40等20多个位点作为可选突变位点,得到了比单个突变提高的酰化酶活性的突变体。WO2011044496(A2)中变体LovD多肽包含在下列氨基酸残基位置处的某氨基酸取代:A10、D12、K26、A86、A190、H161、K227、G275、V334或L361。华东理工的朱丽平为提高E.coliBL21菌株中的酰基转移酶LovD的表达,从多个方面对发酵培养基和发酵条件进行优化,同优化前使用LB培养基相比,其酶活提高了将近5倍。
对LovD中的某些位点氨基酸进行定点突变能够提高酰化酶活的效率,然而,LovD的酰化酶活效率仍存在提高的空间,且LovD的大肠杆菌发酵单位低,后处理较为复杂,且存在易被噬菌体感染等不足。因而, 利用分子生物学手段对洛伐他汀酰基转移酶进行必要的改造的基础上进行异源高效表达,是促进工业化生产洛伐他汀酰基转移酶的有效途径。
发明内容
本发明涉及新的洛伐他汀酰基转移酶(LovD)突变体,编码所述突变体的核酸,相关表达载体和宿主细胞以及所述突变体合成辛伐他汀的用途。本发明的LovD突变体的酰化酶活相比野生型有了较大的提高,原料利用率有了很大提升,降低了成本,减少了能耗和环境污染。本发明同时提供了一种洛伐他汀酰基转移酶的毕赤酵母表达系统,为解决大肠发酵后处理较为复杂,特别是在气候条件、温度湿度等方面也较为敏感,易噬菌体感染等问题,提供一种新的方法。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含选自N45R、A110P、S145N、Q230M、L293M、L379M中的任意一至六个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含N45R氨基酸突变,以及选自A110P、S145N、Q230M、L293M、L379M中的任意一至五个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含A110P氨基酸突变,以及选自N45R、S145N、Q230M、L293M、L379M中的任意一至五个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含S145N氨基酸突变,以及选自N45R、A110P、Q230M、L293M、L379M中的任意一至五个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含Q230M氨基酸突变,以及选自N45R、A110P、S145N、L293M、L379M中的任意一至五个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含L293M氨基酸突变,以及选自N45R、A110P、S145N、Q230M、L379M中的任意一至五个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含L379M氨基酸突变,以及选自N45R、A110P、S145N、Q230M、L293M中的任意一至五个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含N45R、S145N氨基酸突变,以及选自A110P、Q230M、L293M、L379M中的任意一至四个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含A110P、S145N氨基酸突变,以及选自N45R、Q230M、L293M、L379M中的任意一至四个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含N45R、S145N、Q230M氨基酸突变,以及选自A110P、L293M、L379M中的任意一至三个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含S145N、L293M氨基酸突变,以及选自N45R、A110P、Q230M、L379M中的任意一至四个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含A110P、S145N、L293M氨基酸突变,以及选自N45R、Q230M、L379M中的任意一至三个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含S145N、Q230M、L293M氨基酸突变,以及选自N45R、A110P、L379M中的任意一至三个氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含S145N、L379M氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含N45R、S145N、L379M氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含N45R、S145N、L293M氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含N45R、S145N、L293M氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含N45R、A110P、S145N、L293M氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含N45R、A110P、S145N、Q230M氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含A110P、S145N、Q230M、L293M、L379M氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其在SEQ IDNO.1 的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列基础上包含N45R、A110P、S145N、Q230M、L293M、L379M氨基酸突变。
在一个实施方案中,本发明提供了编码本文所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体的核酸,且所述核酸包括根据简并性编码本文所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体的核酸。编码SEQ ID NO.1 所述的洛伐他汀酰基转移酶野生型的一种形式的核苷酸序列如SEQ IDNO.2 中所述。
在一个实施方案中,本发明提供了编码本文所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体的核酸的表达载体。可以采用的表达载体包括所有含有必须表达元件的载体,优选酵母表达载体,如pAO815、pPIC3.5K、pPIC 9K等,进一步优选pPIC 9K表达载体。本发明所要保护的突变LovD基因的可采用载体不仅限于举例载体。
在实际生产过程中,大肠杆菌作为发酵宿主菌存在噬菌体污染的风险,本发明的发明人为了规避这一风险,尝试在真核表达系统中发酵LovD。本发明的发明人通过大量试验,检测不同真核表达载体中LovD的传代稳定性、表达量等发酵关键因素,综合考量其后处理过程,选择了pAO815、pPIC9K作为表达载体,优选pPIC 9K表达载体。
在一个实施方案中,本发明提供了宿主细胞,其包含编码本文所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体的核酸的表达载体。宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞,优选真核细胞。原核细胞优选选自细菌、放线菌等,更优选大肠杆菌(Escherichia coli),更进一步优选大肠杆菌BL21(DE3)。真核细胞优选选自酵母细胞,更优选巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),更进一步优选巴斯德毕赤酵母GS115。所述表达载体可通过转化、转染或侵染等本领域公知方式导入宿主细胞。
在一个实施方案中,本发明提供了本文所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体用于催化的莫那可林酸和α-二甲基丁酰基-S-丙酸甲酯(DMB-S-MMP)反应合成辛伐他汀酸的用途。
在一个实施方案中,本发明提供了合成辛伐他汀酸的方法,其采用本文所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体催化莫那可林酸和α-二甲基丁酰基-S-丙酸甲酯(DMB-S-MMP)反应合成辛伐他汀酸。
除非本文另有定义,本发明使用的相关科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且,除非上下文有其它规定,单数形式的术语应当包括复数,而复数形式的术语应当包括单数。通常,与本文所述的分子生物学、酶学及细胞生物学相关使用的命名以及技术,是本领域众所周知且普遍使用的那些。除非另有说明,下面的术语应当理解为具有下述含义:如本文所用,“洛伐他汀酰基转移酶野生型”指土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸野生型。洛伐他汀酰基转移酶野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 中所述,其一种形式的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 中所述,且包括根据简并性编码SEQ ID NO.1 所述的洛伐他汀酰基转移酶野生型的核苷酸序列。
如本文所用,“洛伐他汀酰基转移酶突变体”包含野生型多肽内的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失和/或添加,和/或野生型多肽中的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的置换。本文所用的“野生型”氨基酸序列包含自然出现的氨基酸序列。本文所用的“洛伐他汀酰基转移酶突变体”的具体突变的含义如下:N45R为第45位氨基酸由N突变为R、A110P为第110位氨基酸由A突变为P、S145N为第145位氨基酸由S突变为N、Q230M为第230位氨基酸由Q突变为M、L293M为第293位氨基酸由L突变为M、L379M为第379位氨基酸由L突变为M(氨基酸名称和缩写见表1)。
表1:氨基酸名称和缩写
如本文所用,“宿主细胞”是指包含本发明的核酸的表达载体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如细菌、放线菌,或者真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地,宿主细胞是酵母,包括酶生产领域常用的酵母;更优选巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris);特别优选巴斯德毕赤酵母GS115。
如本文所用,“表达”是指源于本发明的核酸分子(通常为DNA 分子)经转录为mRNA而翻译成多肽的过程。
如本文所用,“ATCC ”指美国典型培养物保藏中心,是位于Virginia,USA 的微生物保藏中心。
如本文所用,“转化率”指原料转化成产物的摩尔百分比。具体地,如本文所用,“莫那可林酸的转化率”计算如下:[反应前莫那可林酸的摩尔数-反应后的莫那可林酸/(反应前莫那可林酸的摩尔数)]×100%。
如本文所用,“包含”在本发明的说明书和权利要求中指“包括但不限于”。
本发明的洛伐他汀酰基转移酶突变体可以高效催化莫那可林酸和α-二甲基丁酰基-S-丙酸甲酯(DMB-S-MMP)反应合成辛伐他汀酸,在相同条件下,其比野生菌株的转化率提高了近10倍,使得原料利用率有了很大提升,降低了成本,减少了能耗和环境污染。其酵母胞外表达菌株,可引导LovD酶分泌于发酵液上清,而毕赤酵母自身分泌蛋白极少,这样大大简化了菌株的后处理过程,节约了发酵产酶环节的原料、人员及时间成本。
附图说明
图1 为LovD的PCR 产物图。图中M 为核酸标记物(Trans 2K Marker),从上到下分别为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp;1 为LovD的PCR 扩增条带,与预测大小一致。
图2 为pPIC 9k-LovD酶切鉴定图。图中M 为核酸标记物(Trans 1K Marker),从上到下分别为10000、8000、6000、5000、4000、3000、2000、1000bp;1为用EcoR I 、Not I双酶切酶切产物,从上到下分子量大小分别约为9300和1200bp,与预测大小一致,载体构建成功。
图3 为pAO815-LovD酶切鉴定图。图中M 为核酸标记物(Trans 1K Marker),从上到下分别为10000、8000、6000、5000、4000、3000、2000、1000bp;1为EcoR I单酶切的产物,从上到下分子量大小分别约为7700和1200bp,与预测大小一致,载体构建成功。
图4 为胞外表达重组酵母菌pPic9k-LovDm16和胞内表达重组酵母菌pAO815-LovDm16的酶活。
图5 为LovD突变体16 催化莫那可林酸合成 Simvastatin 的HPLC图,具体为LovD重组巴斯德毕赤酵母发酵粗酶液催化辛伐他汀合成HPLC 图,其中LovD催化反应45h后,莫那可林酸的转化率达到了96%以上。
图6为LovD突变体14催化莫那可林酸合成 Simvastatin 的HPLC图,具体为LovD重组巴斯德毕赤酵母发酵粗酶液催化辛伐他汀合成HPLC 图,其中LovD催化反应45h后,莫那可林酸的转化率达到了96%以上。
序列说明
SEQ ID NO.1 野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列
MGSIIDAAAAADPVVLMETAFRKAVKSRQIPGAVIMARDCSGNLNYTRCFGARTVRRDECNQLPPLQVDTPCRLASATKLLTTIMALQCMERGLVDLDETVDRLLPDLSAMPVLEGFDDAGNARLRERRGKITLRHLLTHTSGLSYVFLHPLLREYMAQGHLQSAEKFGIQSRLAPPAVNDPGAEWIYGANLDWAGKLVERATGLDLEQYLQENICAPLGITDMTFKLQQRPDMLARRADQTHRNSADGRLRYDDSVYFRADGEECFGGQGVFSGPGSYMKVLHSLLKRDGLLLQPQTVDLMFQPALEPRLEEQMNQHMDASPHINYGGPMPMVLRRSFGLGGIIALEDLDGENWRRKGSLTFGGGPNIVWQIDPKAGLCTLAFFQLEPWNDPVCRDLTRTFEHAIYAQYQQG
SEQ ID NO.2野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶核苷酸序列
ATGGGTTCTATCATTGATGCGGCTGCGGCCGCGGACCCGGTGGTTCTGATGGAAACGGCTTTCCGTAAAGCGGTTAAAAGCCGCCAGATTCCGGGTGCTGTTATTATGGCGCGTGATTGTAGTGGTAACCTGAACTACACTCGCTGTTTCGGCGCACGCACTGTGCGTCGCGACGAGTGCAATCAATTACCACCGCTGCAGGTGGATACACCATGTCGTCTGGCAAGCGCTACTAAATTACTGACCACGATTATGGCACTGCAGTGCATGGAACGCGGCCTGGTAGACTTGGATGAAACTGTTGACCGCCTGCTGCCGGACCTGAGCGCGATGCCGGTGCTGGAAGGCTTTGATGATGCCGGCAACGCCCGTCTGCGCGAACGCCGTGGTAAAATTACGTTACGCCATCTGCTGACACACACCAGCGGTCTGTCGTACGTCTTCCTGCATCCGCTGCTGCGCGAGTATATGGCCCAGGGTCATTTGCAGAGCGCTGAGAAGTTTGGCATTCAGTCTCGTCTGGCGCCGCCAGCTGTTAATGATCCAGGCGCGGAATGGATTTATGGCGCTAATCTGGACTGGGCAGGCAAATTAGTGGAACGCGCAACGGGCTTGGACCTGGAACAGTACTTGCAGGAGAACATTTGCGCGCCGCTGGGCATCACTGATATGACGTTCAAACTGCAGCAGCGTCCGGATATGCTGGCACGTCGTGCCGACCAGACCCACCGCAACTCCGCGGATGGTCGTCTGCGCTATGATGACTCTGTGTATTTTCGCGCGGACGGTGAAGAGTGTTTCGGGGGCCAGGGCGTGTTCAGCGGTCCAGGCAGTTACATGAAGGTTCTGCACTCTCTGCTGAAACGTGACGGCCTGTTGCTGCAGCCACAAACCGTGGATCTGATGTTCCAGCCGGCGCTGGAACCGCGCTTGGAAGAACAAATGAACCAGCATATGGACGCGTCGCCGCACATCAACTATGGCGGTCCAATGCCTATGGTCCTGCGTCGCAGCTTCGGCCTGGGTGGTATCATTGCACTGGAGGATCTGGATGGTGAGAACTGGCGTCGTAAAGGCTCGCTGACGTTTGGTGGCGGTCCAAACATTGTTTGGCAGATTGACCCGAAAGCGGGTCTGTGTACTTTAGCCTTTTTCCAGCTGGAACCGTGGAACGACCCGGTGTGTCGTGACCTGACTCGCACCTTTGAGCACGCGATCTATGCACAGTATCAACAGGGCTAA。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的具体说明,不应对本发明的范围构成限制。
缩写含义如下:“min ”表示分钟,“s”表示秒,“U”表示酶活单位,“mM”表示毫摩尔每升,“M”表示摩尔每升,“rpm”表示转每分钟,“mol ”表示摩尔,“µg”表示微克,“mg”表示毫克,“g”表示克,“µL”表示微升,“mL”表示毫升,“bp”表示碱基对。
实施例中,未注明具体条件的实验方法,通常按常规条件,如《分子克隆实验指南》(J. 萨姆布鲁克,D. W. 拉塞尔著,黄培堂,汪嘉玺,朱厚础,等译. 第3 版,北京:科学出版社,2002)及毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒(Invitrogen)中所述的方法进行。
下述实施例利用基因工程技术,根据含有洛伐他汀酰基转移酶活性的野生型土曲霉(A.terreus)的基因组,全基因合成洛伐他汀酰基转移酶野生型基因序列,通过定点突变技术对该基因进行改造,并将该LovD突变体基因克隆到表达载体,并将相应的表达质粒转化到相应的宿主菌。在大肠杆菌宿主表达系统,小试反应筛选出在相同条件下具有高转化率的LovD 突变体,然后构建巴斯德毕赤酵母GS115 表达系统,以提高酶产量及酶活,同时使用优选LovD突变体大规模生产辛伐他汀酸,结果显示,所述LovD突变体催化莫那可林酸和DMB-S-MMP反应合成辛伐他汀酸,在相同条件下,其比野生菌株的转化率提高了近10倍。
实施例1:洛伐他汀酰基转移酶突变体编码基因的构建、原核表达及功能鉴定。
1.引物设计将GeneBank 上野生型土曲霉(A.terreus)来源的洛伐他汀酰基转移酶(LovD)为基因序列,全基因合成该序列,并设计引物。
用于在原核表达载体pET-21d 克隆的引物序列为:引物P1:5’-CATGCCATGGGTTCTATCATTGATGCGGC -3’(带下划线的碱基为Nco I识别位点);引物5’-CCCAAGCTTTTAGCCCTGTTGATACTGT -3’(带下划线的碱基为Hind III识别位点);该对引物扩增出的LovD基因序列如SEQ ID NO.2 所示,其编码的洛伐他汀酰基转移酶蛋白具有SEQ IDNO.1 所示的氨基酸序列。
定点突变引物:
N45R-P1:5’- GTAACCTGAGATACACTCGCTGTTTC -3’
N45R-P2:5’-GAAACAGCGAGTGTATCTCAGGTTAC -3’
A110P-P1:5’-CCGGACCTGAGCCCGATGCCGGTGCTGGAAG -3’
A110P-P2:5’-CTTCCAGCACCGGCATCGGGCTCAGGTCCG -3’
S145N-P1:5’-ACCAGCGGTCTGAACTACGTCTTCCTGCA -3’
S145N-P2;5’-ACCAGCGGTCTGAACTACGTCTTCCTGCA -3’
Q230M-P1:5’-CAAACTGCAGATGCGTCCGGATATGCTG -3’
Q230M-P2:5’-CAGCATATCCGGACGCATCTGCAGTTTG -3’
L293M-P1:5’-GAAACGTGACGGCCTGATGCTGCAGCCACAAACC -3’
L293M-P2:5’-GGTTTGTGGCTGCAGCATCAGGCCGTCACGTTTC -3’
L379M-P1:5’-GGTCCAATGCCTATGGTCATGCGTCGCAGCTTCGGC -3’
L379M-P2:5’-GCCGAAGCTGCGACGCATGACCATAGGCATTGGACC-3’。
用于在酵母胞内表达载体pPic9k克隆的引物序列为:引物P3 :5’-CCTGAATTCATGGGTTCTATCATTGA -3’(带下划线的碱基为EcoRI识别位点);引物P4:5’-CCTGCGGCCGCTTAGCCCTGTTGATACTGT -3’(带下划线的碱基为Not I 识别位点);
用于在酵母胞内表达载体pAO815 克隆的引物序列为:引物P5 :5’- CCTGAATTCATGGGTTCTATCATTGA -3’ (带下划线的碱基为EcoR I识别位点);引物P6:5’-CCTGAATTCTTAGCCCTGTTGATACTGT-3’(带下划线的碱基为EcoR I识别位点)。
引物由南京金斯瑞公司合成,然后用无菌水溶解。
2. LovD基因原核表达
分别以P1、P2为引物,质粒PUC 57-LovD(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)为模板,扩增LovD基因,其中PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、dNTP溶液均由TaKaRa公司购得。
PCR反应体系为:
10×Buffer(Mg2+) 5μL
dNTP(2.5mM each) 4μL
引物P1(10μM) 2μL
引物P2(10μM) 2μL
模板 2μL
ddH2O 34.5μL
Pyrobest DNA polymerase 0.5μL
总体积 50μL
PCR反应条件为:先95℃ 4 min;然后95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,共28个循环;再72℃ 10 min。
将PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果如图1 所示,扩增到一条1200 bp左右的条带,大小与预测结果一致。回收该PCR产物片段,利用限制性内切酶Nco I和HindIII将PCR扩增产物连接入大肠杆菌表达载体pET-21d(购自invitrogen公司)中相应的位点,得到重组表达质粒pET21d-LovD,将重组表达质粒转化到感受态E.coli Top10(购自全式金公司)中,然后在含氨苄抗性(50μg/mL)LB平板培养基上筛选阳性克隆,在相应引物的引导下,用菌落PCR的方法验证筛选的阳性克隆(转化子),将阳性克隆送Invitrogen公司测序。将测序正确的阳性转化子转入E.coli BL21(DE3)(购自全式金公司)中。将E.coli BL21(DE3)(pET21d-LovD)置于LB液体培养基中37℃、200rpm震荡培养,至菌密度OD600为1.2左右时,加入1mM的 IPTG于20℃ 诱导12小时,表达洛伐他汀酰基转移酶。
3. 基因定点突变试剂盒是利用含有需要突变的位点的引物,通过Pfu 高保真酶对从常规大肠杆菌中提取的甲基化质粒作为模板进行环扩增形成带缺刻的开环质粒,之后用DpnI消化甲基化模板质粒,将扩增的带缺刻的开环质粒转入大肠杆菌,即可形成带有突变的闭环质粒。
利用Stratagene公司的基因定点突变试剂盒(QuickChange XL Site-directedMutagenesis kit)对洛伐他汀酰基转移酶基因进行N45R定点突变。
PCR反应体系为:
10×Buffer 2.5μL
Quick solution 1.5μL
dNTP 2μL
模板 1μL
N45R-P1 1μL
N45R-P2 1μL
ddH2O 15.5μL
Pfu Tubo 0.5μL
总体积 25μL
PCR反应条件为:先95℃ 1 min;然后95℃ 50 s,60℃ 50s,68℃ 8 min,共20个循环;再68℃ 10 min。PCR产物加入0.5μL DpnI消化1h后转化大肠杆菌,菌落PCR检测并送Invitrogen公司测序。
依上述方法进行N45R、A110P、S145N、Q230M、L293M、L379M单点突变,分别以获得的单点突变的LovD基因为模板,按照上述方法,进行二次突变,获得任意两点突变的LovD突变体基因,并以此方法进行三点突变、四点突变、五点突变、六次突变,获得的突变体如下表2。
表2:LovD突变体及对应突变位点
分别进行菌体培养和诱导表达LovD突变体。
4. 大肠杆菌中LovD突变体的粗酶粉的制备
将经过IPTG诱导的菌液离心去上清,湿细胞重悬于磷酸盐缓冲液中,并用超声细胞破碎仪以200W的功率超声20分钟,超声后,将样品在10000rpm离心20分钟,离心上清作为粗酶液。
5. LovD功能鉴定及筛选
转化率:[反应前莫那可林酸的摩尔数-反应后的莫那可林酸/(反应前莫那可林酸的摩尔数)]×100%。
实施例中反应体系为5mL,内含 4mg/mL的莫那可林酸、0.008%(V/V)的DMB-S-MMP及1mL的粗酶液,最后以pH 8.5的400mM三乙醇胺缓冲溶液补足。在室温磁力搅拌反应条件下反应30 min,然后取100μL加入900μL的磷酸二氢钾-乙腈溶液,进行HPLC检测。酶活定义为在室温、pH 8.5的条件下,每分钟催化生成1μg辛伐他汀所需的酶量为一个单位 (1U)。
如表3 所示,LovD突变体的催化活性均高于野生型LovD,尤其是突变体12、14、16、18。
表3:野生型LovD及其突变体原核表达的酶活
实施例2:洛伐他汀酰基转移酶(LovD)编码基因的毕赤酵母的重组质粒构建及表达。
分别构建突变体12、14、16、18 的酵母表达载体并转化巴斯德毕赤酵母细胞,以下以突变体16进行阐述,其它突变体的构建方法相同。将突变体12、14、16、18分别命名为LovDm12、LovDm14、LovDm16、LovDm18。
1. LovD突变体真核表达
分别以P3、P4和P5、P6为引物,以突变体16(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)为模板,扩增含酵母表达载体pPic9k 和pAO815酶切位点的LovD突变体16(LovDm16)基因,其中PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、dNTP溶液均由TaKaRa公司购得。
PCR反应体系为:
10×Buffer(Mg2+) 5μL
dNTP(2.5mM each) 4μL
引物P1(10μM) 2μL
引物P2(10μM) 2μL
模板 2μL
ddH2O 34.5μL
Pyrobest DNA polymerase 0.5μL
总体积 50μL
PCR反应条件为:先95℃ 4 min;然后95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,共28个循环;再72℃ 10 min。
分别将PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳,结果表明都扩增到一条1200 bp左右的条带,大小与预测结果一致(附图2、附图3)。切下目的条带,用回收试剂盒回收该PCR产物片段。
将回收的PCR产物与表达质粒pPic9k用限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ双酶切,将回收的PCR产物与表达质粒pAO815用EcoR Ⅰ单酶切,用T4连接酶将表达载体与酶切产物连接,转化到感受态大肠杆菌Top10中,然后在含氨苄抗性(50μg/mL)LB平板培养基上筛选阳性克隆,利用相应引物用菌落PCR的方法及酶切重组质粒验证,琼脂糖电泳均可见1200 bp左右的条带。将酶切质粒正确的菌株送上海英俊生物技术公司测序,测序结果正确,即得到重组表达载体pPic9k-LovDm16和pAO815-LovD m16。
突变体12、14、18亦按照上述方法构建成功,测序正确。
2. 洛伐他汀酰基转移酶的毕赤酵母转化及鉴定
将E.coli TOP10(pPic9k-LovDm16)和E.coli TOP10(pAO815-LovDm16)置于LB液体培养基中37℃、200转震荡培养过夜,中提重组质粒。利用SalI线性化重组质粒。
分别将线性化的重组质粒pPic9k-LovD及pAO815-LovD转化酵母细胞。巴斯德毕赤酵母GS115 感受态细胞(invitrogen 公司)的制备:将Pichia GS115 单菌落挑入YPD 培养基中活化,活化的Pichia GS115 按0.5%的接种量接入50 mL YPD 培养基中培养至对数期,离心获得的菌体用20mL 无菌水洗2 次,再用20mL无菌1 M 山梨醇洗2 次,加入1mL山梨醇重悬菌体获得巴斯德毕赤酵母GS115 感受态细胞。将线性化pPic9k-LovD和pAO815-LovD加入80 μL Pichia GS115感受态细胞中冰浴5分钟,1500 V,5 ms 电击转化后加入800 μL山梨醇将细胞洗至EP管中,28℃温育2h后,离心,涂MD平板培养至长出菌落后,划线分离出单菌落。将单菌落挑入无菌水中加入适量Lyticase(sigma)后37℃温育1h消化细胞壁,取部分消化产物为模板,片段引物作为鉴定引物,进行PCR,检测阳性克隆。
3. 重组毕赤酵母菌的摇瓶诱导表达
分别各挑选8株阳性重组菌挑入2mL的YPD液体培养基活化2天后,以1%的接种量转接入30mL的BMGY(pH8.0)液体培养基中,200 rpm培养,28 ℃过夜培养,每隔24 h补加1%甲醇,诱导72h后,收集菌液,用于酶活测定。
4. 表达LovD突变体粗酶液的制备
以突变体16为例,其它突变体的构建方法相同。
pPic9k-LovDm16 胞外表达重组菌粗酶液制备:取2mL发酵菌液12000rpm、离心10min,收集上清用于酶活测定。
pAO815-LovDm16胞内表达重组菌粗酶液的制备:取2mL发酵菌液离心收集菌体,菌体用1mL的pH为8.5,0.05 mol/L的磷酸钠缓冲液重悬,加入适量的酸洗玻璃珠震荡破碎20min后,离心上清作为粗酶液。
各重组子的酶活情况见表4及附图4。
表4 各突变体重组子的酶活(U/L)
可见,pPic9K载体具有高效可调控启动子AOX(醇氧化酶),通过甲醇诱导,可有效表达LovD突变体,酶活大于同样条件下pAO815载体表达得到的LovD突变体酶活,同时pPic9K表达载体属于分泌型载体,具有α-因子前导信号序列,可引导LovD酶分泌于发酵液上清,而毕赤酵母自身分泌蛋白极少,十分有利于LovD的分离和纯化。
实施例3 重组毕赤酵母菌的发酵罐表达及功效实验。
分别以筛选到高酶活的胞外表达重组子pPic9k-LovDm16 菌株3#、pPic9k-LovDm14 菌株1#为出发菌株,接种到150mL的YPD液体培养基28 ℃过夜培养,制成种子液,然后以5%的接种量,接入3L的BMGY(PH8.0)液体培养基(5L发酵罐),以氨水、甲醇作为补料,培养125h后,pPic9k-LovDm16 菌株3#酶活达到了266000U/L、pPic9k-LovDm14 菌株1#酶活达到了254000U/L。
实施例4 洛伐他汀酰基转移酶的功效实验。
1. 发酵罐表达LovD酶冻干粉的制备
分别收集实施例3得到的发酵罐菌体pPic9k-LovDm16 菌株3#、pPic9k-LovDm14菌株1#,以12000rpm、离心10min,收集上清,后用10K膜超滤浓缩,将浓缩后的上清冻干,制成冻干粉,用于辛伐他汀合成实验。
2. 洛伐他汀酰基转移酶催化辛伐他汀合成
将莫那可林酸溶于pH8.5的400mM三乙醇胺缓冲溶液中,终浓度为60mg/mL,待其完全溶解后,分别加入两个菌株的发酵冻干粉,使其酶浓度达到7mg/mL,搅拌10min后,再加入一定量的活性炭搅拌5 min。加入侧链DMB-S-MMP,其终浓度为0.044%(V/V), HPLC检测辛伐他汀的生成,45h后,莫那可林酸的转化率均可达95%左右(参见附图5、附图6)。
Claims (16)
1.一种洛伐他汀酰基转移酶突变体,其特征在于,所述突变体与SEQ ID NO.1的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列相比,存在S145N突变,同时存在选自N45R、A110P、Q230M、L293M、L379M中的任意1至5个氨基酸突变。
2.如权利要求1所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体,其特征在于,所述突变体与SEQ IDNO.1的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列相比,存在N45R、S145N氨基酸突变,以及存在选自A110P、Q230M、L293M、L379M中的任意1至4个氨基酸突变。
3.如权利要求1所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体,其特征在于,所述突变体与SEQ IDNO.1的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列相比,存在S145N、L293M氨基酸突变,以及存在选自N45R、A110P、Q230M、L379M中的任意1至4个氨基酸突变。
4.如权利要求1所述的突变体洛伐他汀酰基转移酶突变体,其特征在于,所述突变体与SEQ ID NO.1的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列相比,存在N45R、S145N、L293M氨基酸突变,以及存在选自A110P、Q230M、L379M中的任意1至3个氨基酸突变。
5.如权利要求1所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体,其特征在于,所述突变体与SEQ IDNO.1的野生型土曲霉(A.terreus)酰基转移酶氨基酸序列相比,存在N45R、A110P、S145N、L293M氨基酸突变,以及存在选自Q230M、L379M中的任意1至2个氨基酸突变。
6.一种编码权利要求1~5任一项所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体的核酸。
7.一种包含权利要求6所述的核酸的表达载体。
8.根据权利要求7的表达载体,其特征在于,所述表达载体为真核细胞表达载体。
9.根据权利要求8的表达载体,其特征在于,所述表达载体为pPIC 9K表达载体。
10.一种包含权利要求7-9任一项所述的表达载体的宿主细胞。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为真核细胞。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为酵母细胞。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母GS115。
15.权利要求1~5任一项所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体用于催化莫那可林酸和α-二甲基丁酰基-S-丙酸甲酯反应合成辛伐他汀酸的用途。
16.一种合成辛伐他汀的方法,其特征在于,采用权利要求1~5任一项所述的洛伐他汀酰基转移酶突变体催化莫那可林酸和α-二甲基丁酰基-S-丙酸甲酯反应合成辛伐他汀酸。
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