CN115261342A - 一种伯克霍尔德氏菌bjq0011来源酯合成酶jfn94_18195、编码基因及其应用 - Google Patents

一种伯克霍尔德氏菌bjq0011来源酯合成酶jfn94_18195、编码基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种伯克霍尔德氏菌BJQ0011来源酯合成酶JFN94_18195及其编码基因与应用，属于生物基因工程技术领域。本发明公开的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia anthina)BJQ0011的酯合成酶JFN94_18195的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，具体公开了构建携带所述基因的大肠杆菌表达载体。同时还公开了所述的酯合成酶JFN94_18195在水相体系中催化合成白酒风味物质丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯中的应用。本发明首次提供了一种在水相体系中催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的酶和编码基因，在白酒酿造过程中生成白酒风味物质具有重要意义，为提升白酒的风味和品质提供参考。

Description

一种伯克霍尔德氏菌BJQ0011来源酯合成酶JFN94_18195、编 码基因及其应用
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种伯克霍尔德氏菌(Burkholderia anthina) BJQ0011来源酯合成酶JFN94_18195及其编码基因在水相体系中催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的应用。
背景技术
白酒中的主体物质是水和乙醇，约占白酒总量的98％，仅占白酒总量1％-3％的其它微量成分，却影响白酒的风味和品质。目前已有研究表明，白酒中的微量成分约有2000种，主要包括酯、酸、醇、醛、酮类等，其中酯类是白酒中的关键性风味物质。浓香型白酒是以己酸乙酯为主体复合香的白酒，越来越多的研究表明，丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等小分子脂肪酸乙酯对浓香型白酒的风味具有重要作用。由于此类风味物质的合成机制尚不明晰，且白酒的生产过程仍然延续传统的固态发酵过程，酿造体系复杂，导致酿造过程产酯生香慢，即此类小分子脂肪酸乙酯的合成效率低，导致高品质白酒生产效率低，制约产业发展。虽然通过添加化学香精或调香液可以提高白酒中酯的含量，但是此类化合物的添加影响了白酒的感官风味，与传统发酵产品相比香味不协调，刺激性更强，缺乏酿造酒“香气协调，绵柔净爽”的特点，产品品质受到了明显的影响。因此，明晰浓香型白酒中己酸乙酯等小分子脂肪酸乙酯的生成机制，有利于提升白酒的风味和品质。白酒发酵过程中存在大量微生物的生长代谢，其中微生物所产的酯合成酶可以催化白酒中的有机酸和乙醇合成相应的酯，有助于提升白酒风味。目前的研究表明，白酒来源的部分菌种具有催化酯合成的能力，包括细菌属的伯克霍尔德氏菌、血红鞘氨醇单胞菌，以及霉菌属的毛霉、根霉、多枝横梗霉、曲霉和红曲霉。然而，目前鲜有研究聚焦于微生物来源催化合成小分子脂肪酸乙酯的酯合成酶。因此，挖掘伯克霍尔德氏菌来源的具有催化合成己酸乙酯等小分子脂肪酸乙酯能力的酯合成酶，有助于丰富白酒微生物源酯合成功能酶资源，相关酶资源的深入研究对于保障白酒中关键风味酯类的稳定合成，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种伯克霍尔德氏菌(B.anthina)BJQ0011酯合成酶JFN94_18195 及其基因在水相体系中催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯中的应用。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开了一种伯克霍尔德氏菌(B.anthina)BJQ0011来源酯合成酶JFN94_18195，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还公开了一种伯克霍尔德氏菌(B.anthina)BJQ0011来源酯合成酶JFN94_18195 的编码基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还公开了一种含有上述伯克霍尔德氏菌(B.anthina)BJQ0011来源酯合成酶JFN94_18195基因的大肠杆菌表达载体，所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还公开了一种含有上述伯克霍尔德氏菌(B.anthina)BJQ0011来源酯合成酶 JFN94_18195，具有在白酒酿造的水相体系环境中催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的性能。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明利用生物基因工程技术，克隆获得伯克霍尔德氏菌(B.anthina)BJQ0011来源酯合成酶JFN94_18195基因，并构建含有该基因的大肠杆菌表达载体，将该重组质粒转入大肠杆菌中，经过IPTG诱导表达获得该酶，并在水相体系环境中检测其催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的性能。实验结果表明，在大肠杆菌中诱导表达的酯合成酶JFN94_18195的粗酶制剂，可以在含有1M乙醇和0.01M丁酸、戊酸、己酸、辛酸和癸酸的水相体系中催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，产量分别为10.99±2.30、32.46±3.92、78.32±5.48、175.69±19.47、110.90±1.13mg/L。
本发明通过在大肠杆菌中诱导表达酯合成酶JFN94_18195以开展对其在水相体系环境中催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的功能研究，为解析和发展白酒酿造工艺提供参考。
附图说明
图1为酯合成酶JFN94_18195编码基因的PCR扩增结果
图2为酯合成酶JFN94_18195编码基因的诱导表达结果
图3为酯合成酶JFN94_18195催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯气相色谱的原始图谱
图4为酯合成酶JFN94_18195催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的定量计算结果
具体实施方式
下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。下述实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。
实施例1 酯合成酶JFN94_18195编码基因的克隆
1.1伯克霍尔德氏菌的培养
在无菌操作条件下，将伯克霍尔德氏菌BJQ0011接种于含有100mL发酵培养基的300mL 三角瓶中，在30±1℃条件下，200±10rpm振荡培养48h。所述的发酵培养基，其组成为高粱 5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NH4HSO41.0g/L、K2HPO41.0g/L、MgSO40.8g/L、橄榄油10.0mL/L，调节pH至7.0，115℃高压灭菌20min。
1.2伯克霍尔德氏菌基因组DNA的提取
对培养48h的伯克霍尔德氏菌进行取样，采用BIOMIGA细菌DNA提取试剂盒提取总DNA。具体步骤如下：
(1)将细菌培养物在LB培养基中过夜培养。
(2)取1-2mL细菌培养物移至1.5mL或者2.0mL离心管中，室温条件下，12000rpm 离心1min，弃去培养基。
(3)加入100μL TE Buffer，涡流悬浮菌泥。
(4)加入10μL Lysozyme，37℃孵育10min。
(5)加入100μL BTL Buffer和20μL Proteinase K溶液，涡旋混匀。在55℃条件下振荡培养，时间不超过1h。
(6)加入5μL RNaseA，颠倒混匀，室温培养5min。10000rpm离心2min，将上清液转移至新的1.5mL离心管。
(7)加入220μL BDL Buffer，涡旋混匀，65℃条件下培养10min。
(8)加入220μL 100％乙醇，最大转速涡旋20s。
(9)转移混合液至带有收集管的吸附柱中(包括可能生成的任何沉淀)。室温条件下， 10000rpm离心1min，弃去滤液。将吸附柱置于新的2mL离心管中。
(10)加入500μL HBC Buffer，室温条件下10000rpm离心1min。弃去滤液并重复使用收集管。
(11)加入700μL DNA Wash Buffer，室温条件下10000rpm离心1min。弃去滤液并重复使用收集管。
(12)重复步骤(11)。
(13)室温条件下，13000rpm离心2min，去除残留的乙醇。
(14)将吸附柱放入新的1.5mL nuclease-free收集管中，加入50-100μL的DEPC-treated ddH2O，室温放置3-5min，10000rpm离心1min洗脱DNA。提取获得的DNA可直接用于后续实验或者-20℃条件下存放。
1.3酯合成酶JFN94_18195的编码基因的克隆
通过PCR扩增伯克霍尔德氏菌来源的酯合成酶JFN94_18195的编码基因。引物序列如下：
正向引物P1F：5′-TAAGAAGGAGATATACCATGATGGAGACGAACGTAACCG-3′
反向引物P1R：5′-GGTGGTGCTCGAGTGCGATGCTCTTCGCGATATCCGC-3′
PCR反应体系如表1所示。
表1 酯合成酶JFN94_18195编码基因扩增的PCR反应体系
Figure RE-GSB0000199075780000031
Figure RE-GSB0000199075780000041
PCR反应程序如表2所示。
表2 酯合成酶JFN94_18195编码基因扩增的PCR反应程序
Figure RE-GSB0000199075780000042
基因扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示。
实施例2 构建表达酯合成酶JFN94_18195的大肠杆菌工程菌株
2.1 pET-28a(+)载体的线性化
设计引物通过PCR进行pET-28a(+)载体的线性化。引物序列如下：
正向引物P2F：5′-CTGAGATCCGGCTGCTAA-3′
反向引物P2R：5′-ACTTCCTCTTGGCACCAGGCCGCTGCT-3′
PCR反应体系如表3所示。
表3 线性化载体pET-28a(+)的PCR反应体系
Figure RE-GSB0000199075780000043
PCR反应程序如表4所示。
表4 线性化载体pET-28a(+)的PCR反应程序
Figure RE-GSB0000199075780000044
Figure RE-GSB0000199075780000051
PCR产物纯化后，用于载体构建。
2.2载体构建
利用
Figure RE-GSB0000199075780000053
One Step Cloning Kit进行载体构建。引物设计原则：通过在引物5′端引入线性化载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5′和3′末端分别带有和线性化载体两末端对应的完全一致的序列(15-20bp)。基于此原则设计基因扩增的引物进行重组反应，于冰水浴中配制如下反应体系。连接反应体系如表5所示。
表5 连接反应体系
Figure RE-GSB0000199075780000052
体系配制完成后，用移液器轻柔吹吸混匀各组分。置于37±1℃条件下反应30min后，立即移至冰水浴中冷却5min。
2.3大肠杆菌的遗传转化
取5μL冷却反应液，加入至50μL大肠杆菌感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，冰上放置30min。42℃热激45-90秒，冰水浴孵育2min。加入600μL的LB液体培养基，37±1℃振荡培养60min使菌株充分复苏。取100μL菌液均匀涂布在含有适量卡那霉素的LB培养基平板上。将平板倒置，于37±1℃过夜培养。所述LB培养基配方：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0g/L，调节pH为7.0，固体培养基需添加2％的琼脂粉，121℃高压灭菌20min。
实施例3 酯合成酶JFN94_18195的粗酶液在水相体系中催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的能力检测
3.1酯合成酶JFN94_18195的诱导表达
挑取经验证正确的转化子，转接至含有适量卡那霉素的LB液体培养基中，37±1℃过夜培养，以1％(v/v)的接种量接种于含有50mL LB培养基的300mL三角瓶中，37±1℃，200±10 rpm培养3h，加入诱导剂IPTG(终浓度为0.5mM)，25±1℃，200±10rpm培养20h。
3.2酯合成酶JFN94_18195的粗酶液制备
大肠杆菌诱导表达后13000rpm离心5min收集菌体，用pH 7.5的0.05M Tris-HCl缓冲液悬浮洗涤菌体2次，然后悬浮菌体。超声波细胞破碎仪破细胞，13000rpm离心5min，上清液作为粗酶液，首先通过SDS-PAGE检测目标蛋白的表达水平(图2)，然后进行酯合成酶JFN94_18195在水相体系中催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的能力进行检测。
3.3 JFN94_18195的粗酶液催化酯合成性能的检测
10mL反应体系如下：
粗酶液，2mL；柠檬酸缓冲液(pH 4.0)，8mL(加入乙醇至1M)；丁酸、戊酸、己酸、辛酸和癸酸，终浓度均为10mM。37±1℃条件下，150±10rpm水浴振荡24h。用3mL正己烷进行萃取，通过气相色谱定量检测酯的合成量。
色谱柱为Agilent 19091N-213I。检测条件为40℃，保持5min；以8℃/min的速度升至 170℃，保持10min；以8℃/min的速度升至240℃，保持5min。进样量为1μL，不分流。载气为氮气，流速为1mL/min，检测器为FID。
结果证实，本发明构建的表达酯合成酶JFN94_18195的大肠杆菌工程菌产生的粗酶液具有在水相体系中催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的能力(图 3)，产量分别为10.99±2.30、32.46±3.92、78.32±5.48、175.69±19.47、110.90±1.13(图4)。
Figure ISA0000262873560000011
Figure ISA0000262873560000021
Figure ISA0000262873560000031

Claims (4)

1.一种来源于伯克霍尔德氏菌(Burkholderia anthina)BJQ0011的酯合成酶JFN94_18195，其特征在于，该酯合成酶JFN94_18195的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.由权利要求1所述的酯合成酶JFN94_18195基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
3.含有权利要求2所述基因的表达载体，其特征在于，该载体克隆区域核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
4.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌(B.anthina)酯合成酶JFN94_18195在水相体系中催化合成丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的应用。
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