CN113174377B

CN113174377B - 羰基还原酶、突变体及其在制备地尔硫卓中间体中的应用

Info

Publication number: CN113174377B
Application number: CN202110466282.4A
Authority: CN
Inventors: 潘江; 陈铖; 许建和; 陈琦
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2022-11-25
Anticipated expiration: 2041-04-28
Also published as: CN113174377A

Abstract

本发明涉及羰基还原酶、突变体及其在制备地尔硫卓中间体中的应用，具体涉及来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的羰基还原酶及其稳定性显著提高的突变体，其编码核酸，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂不对称还原制备手性羟基化合物，特别是在生产心血管药物地尔硫卓手性中间体(2R,3S)‑对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[(2R,3S)‑MPGM]方面的应用。与制备(2R,3S)‑MPGM的其他方法(包括化学法或脂肪酶水解拆分法等)相比，应用本发明所公开的酶及其技术方法，具有理论收率高达100％、反应条件温和、环境友好、操作简便、易于放大等优点，在地尔硫卓等药物中间体的生产中具有很好的应用前景。

Description

羰基还原酶、突变体及其在制备地尔硫卓中间体中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种来源于近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)的羰基还原酶及其稳定性显著提高的突变体，其编码核酸，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂不对称还原制备手性羟基化合物，特别是在生产心血管药物地尔硫卓手性中间体(2R,3S)-MPGM方面的应用。

背景技术

心血管药物地尔硫卓(diltiazem)是20世纪70年代开发的苯并硫氮卓类钙离子通道阻滞剂，属于非二氢吡啶类钙离子拮抗剂，用于治疗室上性心律失常、变异型心绞痛、老年性高血压等疾病。最初由日本田辺公司研发，并于七十年代初在日本首先上市，后相继以地尔硫卓、硫氮卓酮等名称在美国、法国、西班牙等国上市，目前已在世界上100多个国家作为抗心绞痛药、降压药用于临床。2007年天津田边制药有限公司的合心爽(盐酸地尔硫卓片)广泛用于国内高血压患者的治疗，因其降压机制明确、服用方便、安全性高、副作用小等特点受到国内众多高血压患者及家庭的一致好评。

地尔硫卓中间体(2R,3S)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[(2R,3S)-MPGM]的合成是生产地尔硫卓原料药的核心技术。对于该中间体，目前合成方法主要有拆分法和不对称合成法，其中生物酶法拆分已实现工业化。

1993年，日本田辺公司通过对700多株微生物进行筛选，发现了一种来自粘质沙雷氏菌的脂肪酶能够高效催化水解(2S,3R)-MPGM，在甲苯-水两相体系中，底物MPGM浓度达到1mol/L(208g/L)，转化率约为50％时，剩余(2R,3S)-MPGM的光学纯度能够达至99％，酶促拆分的对映选择率(E)达135(Journal of Fermentation and Bioengineering,1993,75:93-98)。其他课题组同样也筛选到一些高对映选择性的水解酶。Gentile等人用柱状假丝酵母脂肪酶在两相体系中催化拆分MPGM，发现有机溶剂的种类对于反应的效果具有显著的影响。用环己烷作为两相的有机溶剂反应效果最好，底物浓度为20g/L时，反应1.5h后，(2R,3S)-MPGM产率为35％，ee值达96％以上(Journal of Organic Chemistry,1992,32:94-95)。2004年，郜莉等人从100多株不同微生物菌株中同样筛选得到一株粘质沙雷氏菌，其所产胞外脂肪酶能够高选择性催化拆分MPGM，对映选择率大于100(Journal of IndustrialMicrobiology and Biotechnology,2004,31:525-530)。尽管酶促拆分法合成步骤较短，能够获得高光学纯度的(2R,3S)-MPGM，但是该法的理论收率最高仅为50％，而且拆分产生的水解产物因自发分解而难以回收利用，因此大幅度增加了地尔硫卓生产过程的原料成本和环境排放。

(2R,3S)-MPGM的不对称合成法相较于拆分法，具有理论收率达100％的明显优势。目前的研究路线主要从3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯出发，经过氯化、不对称还原、环氧化等步骤合成(2R,3S)-MPGM。该路线中的核心步骤是底物1a的不对称还原。虽然还原产物2a具有两个手性中心，但考虑到分子内环氧化反应S_N2的反应机理，终产物(2R,3S)-MPGM的形成仅和还原产物2a的(S)-构型羟基有关，故而一般只需关注(3S)-2a的产生情况。

1993年，Kenji Matsuki等在-78℃下，通过一自制还原剂，实现1a C₃位羰基的选择性还原，转化率为76％，但产物中(3S)-2a的含量最高仅为88％。所得产物在甲醇钠作用下进行环化，继而得到所需的(2R,3S)-MPGM(Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1993,41:643-648)。2003年，Jean-Pierre Genêt等人以同样的路线，通过钌催化剂显著提高从羰基底物到羟基产物的反应选择性，(3S)-2a的含量达到95％以上，转化率为68％(Synthesis,2003,15:2405-2409)。化学不对称还原合成的步骤较短，能够突破拆分法最高理论收率为50％的限制，具有较好的工业应用前景；但也存在需要使用昂贵手性助剂、高温高压和反应时间长等问题。

生物还原酶法以其绿色环保而得到广泛关注。1993年，日本田辺公司的TakejiShibatani等人发现诸多微生物可有效催化化合物1a还原生成(3S)-2a，这些微生物包括Rhodotorula glutinis IFO 0389、Arthrobacter protophormiae IFO 12128、Streptomyces olivochromogenes IFO 3178等。其中，Arthrobacter protophormiaeIFO12128和Rhodotorula glutinis IFO 0389能够高选择性地还原化合物1a，两者产生的(3S)-2a的含量均在99％，但是两种微生物的活性极低，24小时内，8.3mmol/L底物的转化率分别为13％和1.7％(US005204248A)。1995年，Takuo Nishida等人通过微生物筛选，获得了一株绿色木霉(Trichoderma viride OUT 4642)，其选择性同样较高，但由于野生菌中未知酶系的存在，副产物较多，产物分离得率仅为7％(Biocatalysis and Biotransformation,1995,12:205-214)。因此，现有酶法还原制备地尔硫卓合成中间体的技术存在菌体培养周期长，酶促转化底物上载量低、反应耗时、转化率低等问题，极大地限制了酶法不对称合成的应用，需要挖掘性能优越的新型羰基还原酶来满足高底物浓度、高催化反应效率、高产率并且操作简单的工业化需求。

发明内容

本发明针对现阶段地尔硫卓原料单耗高、产品收率低等问题，通过基因挖掘与蛋白质工程改造，提供一种来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的羰基还原酶及其稳定性显著提高的突变体，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，并应用该重组羰基还原酶高效催化合成(3S)-2a，继而通过环氧化反应合成光学纯的(2R,3S)-MPGM。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面：提供了一种羰基还原酶，命名为CpKR。所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述羰基还原酶可以高选择性还原化合物1a(2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯)。

本发明利用生物信息学手段分析预测可能对化合物1a具有明显还原活性的羰基还原酶，并将其基因分选出来进行克隆表达，构建重组大肠杆菌。通过测定重组表达的羰基还原酶对化合物1a的活性及选择性，对一系列候选的羰基还原酶进行筛选，最终获得催化性能较佳，选择性较高的羰基还原酶，其来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)。所述近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)来自中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏号CGMCC No.2.4312)。

本发明第二方面：提供了上述羰基还原酶的编码核酸。所述羰基还原酶来自近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)。

羰基还原酶的编码核酸具体制备方法包括：以近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)的基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)获得编码所述羰基还原酶CpKR的完整核酸分子。其中涉及的合成引物，包括上游引物和下游引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

上游引物：5’-CCGGAATTCATGTCATCAGAAACTGTTG-3’；

下游引物：5’-CCGCTCGAGTTACACCAACTGCTTAATAG-3’。

其中，上游引物下划线部分为EcoR I酶切位点，下游引物下划线部分为Xho I酶切位点。

所述羰基还原酶CpKR全长基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，全长为1026个核苷酸碱基。其编码序列(CDS)从第一个碱基开始至1026个碱基结束，起始子为ATG，终止子为TAA，无内含子，该基因编码蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明第三方面，提供多种羰基还原酶突变体，也可称之为重组羰基还原酶。

本发明对所述羰基还原酶CpKR的氨基酸序列进行了分子改造，提供了多种羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体是在如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代一个或是几个氨基酸形成的稳定性提高的衍生蛋白质，选择如下氨基酸序列对应的蛋白质：

(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸；

(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第169位的亮氨酸替换为苯丙氨酸；

(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第120位的缬氨酸替换为丙氨酸；

(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第181位的苏氨酸替换为异亮氨酸；

(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第151位的天冬酰胺替换为苏氨酸，第185位的酪氨酸替换为苯丙氨酸；

(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第137位的缬氨酸替换为异亮氨酸，第337位的异亮氨酸替换为缬氨酸；

(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第137位的缬氨酸替换为异亮氨酸，第169位的亮氨酸替换为苯丙氨酸，第337位的异亮氨酸替换为缬氨酸；

(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第120位的缬氨酸替换为丙氨酸，第169位的亮氨酸替换为苯丙氨酸；

(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第120位的缬氨酸替换为丙氨酸，第181位的苏氨酸替换为异亮氨酸；

(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第169位的亮氨酸替换为苯丙氨酸，第181位的苏氨酸替换为异亮氨酸；

(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第137位的缬氨酸替换为异亮氨酸，第169位的亮氨酸替换为苯丙氨酸，第181位的苏氨酸替换为异亮氨酸；

(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第169位的亮氨酸替换为苯丙氨酸，第181位的苏氨酸替换为异亮氨酸；

(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第169位的亮氨酸替换为丙氨酸，第181位的苏氨酸替换为异亮氨酸；

(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为组氨酸，第169位的亮氨酸替换为丙氨酸，第181位的苏氨酸替换为异亮氨酸；

(15)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第120位的缬氨酸替换为丙氨酸，第169位的亮氨酸替换为丙氨酸；

(16)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸，第120位的缬氨酸替换为丙氨酸，第169位的亮氨酸替换为苯丙氨酸，第181位的苏氨酸替换为异亮氨酸。

SEQ ID No.1的同系物也指启动子突变体。所述羰基还原酶基因的启动子可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或是缺少而改变，通过改变启动子的序列或是使用不同来源的更有效启动子能够提高所述羰基还原酶的表达水平，但这些改变对酶的功能没有负面影响。

本发明第四方面，还提供了一种分离的核酸，所述的核酸是编码所述羰基还原酶突变体的核酸分子。

本发明第五方面，还提供了包含所述羰基还原酶CpKR或其突变体核酸序列的重组表达载体。

所述的重组表达载体为通过本领域常规的方法将所述羰基还原酶CpKR或其突变体核酸克隆到各种表达载体上而获得。所述的表达载体包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、噬菌体或是病毒载体等，优选载体为质粒pET28a。

优选重组表达载体可通过以下示例方式获得：将空载质粒pET28a与通过PCR扩增所得的CpKR或其突变体基因的DNA片段分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，回收上述酶切后的羰基还原酶片段及空载质粒，利用T4 DNA连接酶连接，构建用于大肠杆菌表达的含有所述羰基还原酶或其突变体基因的重组表达载体，如pET28a-CpKR。

本发明第六方面，还提供了一种包含所述羰基还原酶基因或所述羰基还原酶突变体基因或其重组表达载体的重组表达转化体。

所述重组表达转化体可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。

所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所携带的羰基还原酶CpKR或其突变体的基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选的为：大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将所述重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的重组表达转化体。例如，将重组表达载体pET28a-CpKR转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-CpKR。

本发明第七方面，还提供了所述重组羰基还原酶或其突变体的制备方法。

本发明所述重组羰基还原酶或其突变体的制备方法较佳地为：培养如上所述的重组表达转化体，分离获得重组表达的羰基还原酶。其中所述的培养重组表达转化体所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明所述重组羰基还原酶的培养基。所述培养基优选LB培养基，其配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同，按本领域常规知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并生产所述的重组羰基还原酶即可。

重组表达转化体培养的具体操作可按本领域常规操作进行。优选的，将本发明所述的重组大肠杆菌，例如E.coli BL21(DE3)/pET28a-CpKR，接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.5～1.0(优选0.6)时，加入终浓度为0.1～1.0mmol/L(优选0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行产酶诱导，在16℃继续培养24h，即可高效表达本发明所述的羰基还原酶。培养结束后，离心收集沉淀的菌体细胞，即为重组表达转化体的静息细胞；将所得细胞悬浮于磷酸钾缓冲液(KPB,100mmol/L,pH 6.0)中，超声破碎，破碎液离心，收集上淸液，即可获得所述重组羰基还原酶的酶液。

酶的比活力检测：利用紫外分光光度计检测NADPH在340nm处吸收值的变化。标准测活体系：1ml反应液中包含970μL的磷酸钾缓冲液(KPB,100mmol/L,pH 6.0)，10μL底物2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯1a(80mmol/L，溶解于二甲基亚砜中)，10μL辅酶NADPH(10mmol/L，溶解于水中)和10μL孵育后的酶液，反应温度为30℃。根据下式计算得到酶活力：

酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×l)

式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)对应于上述条件下每分钟催化lμmol NADPH氧化所需的酶量。

本发明第八方面，还提供了羰基还原酶催化剂，其是以下形式中的任意一种：

(1)培养所述重组表达转化体，分离含有羰基还原酶的转化体细胞；

(2)对含有所述羰基还原酶的转化体细胞进行破碎，获得含有所述羰基还原酶的细胞破碎液；

(3)将含有所述羰基还原酶的细胞破碎液冷冻干燥而得到的冻干酶粉；

(4)将含有所述羰基还原酶的转化体细胞冷冻干燥而得到的冻干细胞；

(5)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的羰基还原酶或其突变体。

本发明第九方面，还提供了上述羰基还原酶催化剂催化多种羰基化合物不对称还原，制备手性羟基化合物的应用。

优选地，提供了上述羰基还原酶催化剂在催化合成心血管药物地尔硫卓中间体(2R,3S)-3-(4-甲氧苯基)缩水甘油酸甲酯[(2R,3S)-MPGM]或其手性前体(3S)-2-氯-3-羟基-3-(4-甲氧基苯基)丙酸甲酯[(3S)-2a，包括(2R,3S)-2a和(2S,3S)-2a]的应用。

其中所述羰基化合物选自具有如下结构式的化合物：

以重组羰基还原酶CpKR及其突变体催化底物1a制备(3S)-2a，进而可以通过(3S)-2a的环化反应制得光学纯的地尔硫卓合成中间体(2R,3S)-MPGM为例，来说明其合成路线，如下所示：

本发明羰基还原酶催化剂，对上述羰基化合物进行还原反应，可按照下述的示例方法进行：

在NADPH的存在下，在所述羰基还原酶催化剂(羰基还原酶或重组羰基还原酶)的作用下，催化所述羰基化合物不对称还原，制得相应的手性羟基化合物，同时将辅酶NADPH氧化成NADP+。

优选地，为了进行辅酶NADP⁺的循环再生，向反应体系中额外添加葡萄糖和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(制备方法参见：Journal of Industrial Microbiology andBiotechnology,2011,38:633-641)。葡萄糖脱氢酶的活力单位上载可以与所述重组羰基还原酶相等或者高于所述重组羰基还原酶。

优选地，所述反应条件为：在pH 5.0-7.0的缓冲盐溶液中进行，底物的浓度为25～100mmol/L，葡萄糖与底物的摩尔比为1.0～1.5，NADP⁺添加量为0.2-0.5mmol/L。所述羰基还原酶的酶活单位(U)定义为每分钟催化1μmol相应底物转化生成产物所需的酶量。根据所采用的反应体系，所述羰基还原酶用量为30～80U/mmol羰基化合物。所述磷酸盐缓冲液可以是本领域常规的任何磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠(钾)缓冲液，只要其pH范围在5.0-7.0即可。缓冲液的浓度可以为0.05-0.2mol/L，优选为0.1mol/L。所述还原反应的温度可以是20-40℃，优选30℃。反应过程中，间歇取样测定反应转化率，反应时间以底物完全转化或反应转化率停止增长的时间为准，一般为1-24h。反应转化率及异构体选择性采用手性高效液相色谱法进行分析。

待不对称反应结束后，反应液用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、异丙醚或甲基叔丁基醚等进行萃取，重复萃取两次，合并萃取液，无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏除去有机溶剂即得高纯度羟基产物。

与现有技术相比，本发明具有显著优势：

本发明的重组羰基还原酶CpKR及其突变体可高效催化底物1a C₃位羰基的不对称还原。最优突变体可催化100mmol/L的底物，转化率高于99％，还原产物(3S)-2a的含量达99％，同时时空产率达至46g L^-1d^-1，代表目前生物不对称还原合成(3S)-2a的最高生产力。通过(3S)-2a的环化反应可制得光学纯的地尔硫卓合成中间体(2R,3S)-MPGM，两步总收率达到76％，远高于现行脂肪酶法拆分的实际收率(≈40％)。本发明羰基还原酶法突破了脂肪酶法理论收率仅为50％的严重限制，具有原料消耗少、产物收率高，反应条件温和、对环境友好等显著优点，有利于实现(2R,3S)-MPGM的高效、低成本生产，适宜于工业化应用。

与制备(2R,3S)-MPGM的其他方法相比，包括化学法或脂肪酶水解拆分法等，应用本发明所公开的酶及其技术方法，具有理论收率高达100％、反应条件温和、环境友好、操作简便、易于放大等优点，在地尔硫卓等药物中间体的生产中具有很好的应用前景。

具体实施方式

本发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案和技术效果进行清楚、完整地描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下列实施例中的材料来源为：

近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏号CGMCC No.2.4312)。

表达质粒pET28a购买自Novagen公司。

大肠杆菌E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶EcoR I、Xho I和Dpn I均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。

除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照试剂盒的商品说明书。

实施例1羰基还原酶CpKR的基因克隆

采用酚氯仿抽提法获取保藏编号为CGMCC No.2.4312的近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)基因组。将保藏编号为CGMCC No.2.4312的近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)接种到200mL YM培养基(配方为：蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L，牛肉膏3g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 10g/L)中，30℃培养48h，取100mL菌液，于8,000rpm下离心10min，收集菌体，用20mL生理盐水洗涤，重复两次，然后用20mL生理盐水重悬菌体。悬浮菌液中加入1mL溶菌酶液(50mg/mL)，37℃水浴恒温1h；加入1.6mL的十二烷基磺酸钠溶液(10％,w/v)，160μL蛋白酶K(20mg/mL)，55℃水浴保温，直到悬浮液变清。加入1/3体积的饱和NaCl溶液，振荡混匀至溶液变浑浊，然后高速离心10min，弃去细胞碎片。用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)反复萃取，直到两相界面上看不到蛋白质时停止。吸取萃取之后的水相上清液，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后置于-20℃，低温析出DNA，离心弃去上清，用75％的乙醇洗涤沉淀DNA，室温干燥，最后加入20μL的TE缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,pH 8.0)溶解基因组DNA。

根据羰基还原酶CpKR的开放阅读框，设计上、下游引物：

上游引物，其序列见SEQ ID No.3，具体为：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGTCATCAGAAACTGTTG-3’

下游引物，其序列见SEQ ID No.4，具体为：

上游引物：5’-CCGCTCGAGTTACACCAACTGCTTAATAG-3’

以上述所得的近平滑假丝酵母基因组为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×TaqPCR MasterMix 25μl，上游引物和下游引物(10ng/μl)各2.5μl，基因组DNA(100ng/μl)1μl和ddH₂O 19μl。PCR扩增程序为：94℃预变性10分钟后进行32次如下循环：94℃变性1分钟，55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，最后72℃保温10min。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后，用DNA回收试剂盒回收目的片段。经过DNA测序后，该目的片段全长1026bp，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2羰基还原酶CpKR重组表达质粒和重组表达转化体的制备

使用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别对上述所得羰基还原酶DNA片段及空载质粒pET28a进行双酶切，并对各自酶切片段进行电泳分离，收集相应的DNA片段。使用T4 DNA连接酶将回收的DNA片段与质粒pET28a片段进行连接，两者的摩尔浓度比为5:1，于16℃过夜连接。将连接产物全部转化到E.coli DH5α中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，37℃培养12h。用无菌黄枪头挑选若干单克隆至相应含有50μg/mL卡那霉素的LB试管中，37℃振荡培养12h，提取相应质粒后通过测序验证即可得到重组质粒pET28a-CpKR。将相应质粒进一步转化至E.coli BL21(DE3)，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-CpKR。

实施例3羰基还原酶CpKR突变体构建

采用共义分析的方法构建羰基还原酶CpKR的突变库：以CpKR蛋白序列为探针进行序列联配，优取嗜热来源的同源性在30％以上的不同蛋白序列。通过ClustalX2序列比对及Espript的共义分析，挑选出一系列的非保守残基进行单点突变，通过设计相应的突变引物，以质粒pET28a-CpKR作为模板，用高保真聚合酶PrimeSTAR进行PCR扩增。PCR反应条件如下：总体积为20μL的PCR反应体系中，加入模板0.5～20ng，10μL 2×PrimeSTAR(Premix)，一对突变引物(10μM)各0.4μL，加灭菌蒸馏水至20μL。PCR反应程序：(1)98℃变性10秒，(2)55℃退火5秒，(3)72℃延伸90秒，步骤(1)～(3)共进行30个循环，4℃保存PCR产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后加入限制性内切酶Dpn I在37℃消化2h。将消化产物转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑至含有50μg/mL卡那霉素的LB试管中，37℃振荡培养12h，然后转接至100ml摇瓶中放大培养。突变体经DNA测序验证后，对酶蛋白进行蛋白纯化，所纯化蛋白在40℃孵育4h，通过检测残余活力筛选较优突变体。

表1提供本发明公开的具有相关活性且稳定性提高的羰基还原酶CpKR突变体的列表。在下表中，序列标号分别指表1后面的一系列序列，在稳定性(特指40℃下突变体的半衰期)列表中，与母本CpKR相比，一个加号“+”表示突变体蛋白稳定性提高了1-10倍；两个加号“++”表示突变体蛋白稳定性提高10-100倍；三个加号“+++”表示突变体蛋白稳定性提高100-1000倍；

表1.羰基还原酶CpKR突变体序列和相应稳定性改进列表

^a此处稳定性特指40℃时母本及突变体的半衰期。

所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列是如下序列中的一种：

(15)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第24位的缬氨酸替换为亮氨酸，第114位的丙氨酸替换为缬氨酸第120位的缬氨酸替换为丙氨酸，第169位的亮氨酸替换为丙氨酸；

实施例4重组羰基还原酶CpKR及其突变体的诱导表达及纯化

将实施例2中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-CpKR接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12h，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有100mL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)的500mL三角烧瓶中，37℃、180rpm振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度0.2mmoL/L的IPTG进行诱导，16℃诱导24小时后，将培养液以8000rpm转速离心，收集细胞沉淀，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞，将其冷冻干燥，制得冻干细胞，其比活力为10mU/mg DCW。

将所得的静息细胞悬浮于100mL的磷酸钾缓冲液(l00 mmol/L,pH 6.0)中，冰水浴中进行超声破碎，离心收集上清液，即为重组羰基还原酶CpKR的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组羰基还原酶CpKR以可溶的形式存在。将获得的CpKR粗酶液进行冷冻干燥，制得重组羰基还原酶CpKR的粗酶粉，比活力为40mU/mg。

纯化实验全部使用镍亲和自装柱完成，纯化过程中使用的缓冲液为：A液：50mmol/L KPB,500mmol/L NaCl,10mmol/L咪唑,2mmol/Lβ-巯基乙醇,pH 7.4；B液：50mmol/L KPB,500mmol/L NaCl,500mmol/L咪唑,2mmol/Lβ-巯基乙醇,pH7.4；C液：50mmol/L KPB,150mmol/L NaCl,1mmol/L DTT,pH 7.4。纯化方法如下：

1、将上述得到的静息细胞用A液重悬后超声破碎，破碎后的粗酶液用低温高速离心机在4℃离心，12000rpm离心30min，离心后的破碎上清液暂时保存在4℃冰箱或冷库中；

2、Ni柱(床层体积2ml)用5～10倍柱体积的A液预先平衡；

3、保存的破碎上清液经滤膜过滤后上样(上样量10ml)；

4、上样完成后用5～10倍柱体积的A和B混合液(10％B液)洗去杂蛋白；

5、用2个柱体积的B液洗脱目的蛋白并收集；

6、将收集的目的蛋白用10kDa的超滤管进行离心浓缩，浓缩到0.5mL时添加5mL的C液再次浓缩超滤；重复3-4次降低咪唑浓度实现置换，最终浓缩至0.5mL即可得CpKR纯酶，其比活力为490mU/mg；

7、所得纯酶用液氮速冻后，置于-80℃冷冻保藏即可。

羰基还原酶CpKR突变体的诱导表达、纯化方式与上述方法一致。特别的，CpKR_M15冻干细胞比活力为11mU/mg DCW，冻干酶粉比活力为43mU/mg，纯酶比活力为510mU/mg。

实施例5重组羰基还原酶CpKR及其突变体的半衰期测定

用实施例4所述C液将实施例4中所得的纯化蛋白稀释至3mg/ml，然后将稀释后的纯酶置于40℃水浴锅中进行孵育，间隔一定时间取出少量酶液，室温静置5min后按照标准测活体系测定蛋白残余活力，利用一级失活方程计算半衰期。一级失活方程Ln(V/V₀)＝-k_dt；半衰期(t_1/2)＝0.693/k_d；k_d，失活速率常数；其中V为孵育不同时间时的酶比活力，即为该时间点的残余活力，V₀为酶的初始比活力。

实施例6温度对CpKR及CpKR_M15稳定性的影响

将CpKR及CpKR_M15纯化蛋白分别稀释至3mg/ml，然后将稀释后的纯酶放于30～45℃水浴中进行孵育，间隔一定时间取出少量酶液，室温静置5min后按照标准测活体系测定蛋白残余活力，利用一级失活方程计算半衰期。一级失活方程ln(V/V₀)＝-k_dt；半衰期(t_1/2)＝0.693/k_d；k_d为失活速率常数；V为孵育不同时间时的酶比活力，即为该时间点的酶残余活力，V₀为初始时酶的比活力。CpKR及CpKR_M15在不同温度下半衰期的差异如表2所示，优选酶促反应的温度范围为30～45℃。

表2.温度对CpKR及CpKR_M15稳定性的影响

实施例7pH对羰基还原酶CpKR及CpKR_M15稳定性的影响

在pH 6～8的范围内测定pH对重组羰基还原酶CpKR及CpKR_M15稳定性的影响，缓冲液为磷酸钾缓冲液(pH 6.0～8.0)。利用不同pH的缓冲液将CpKR及CpKR_M15纯化蛋白分别稀释至3mg/ml，然后将稀释后的纯酶置于40℃水浴中进行孵育，间隔一定时间取出少量酶液，室温静置5min后测定酶活力，利用一级失活方程计算半衰期。结果如表3所示，优选酶促反应的pH为pH 6.0。

表3.pH对CpKR及CpKR_M15稳定性的影响

实施例8重组羰基还原酶CpKR_M15的底物特异性

通过检测该酶对于不同种类潜手性酮底物(其结构如表4所示)的催化活力来探究该酶的底物特异性，其活力检测条件与对于底物1a的活力检测条件相同。

表4.CpKR_M15对于不同种类潜手性酮的催化活力

实施例9冻干酶粉催化还原25mmol/L的底物1a

在含有25mmol/L底物1a(6.05g/L)和30mmol/L葡萄糖(5.40g/L)的10mL的磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH 6.0)中，加入2U/ml如实例4所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-CpKR_M15)的冻干酶粉，2U/ml葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉以及0.5mmol/L的NAPD⁺。磁力搅拌下于30℃进行反应，通过自动电位滴定仪控制流加0.5mol/L的碳酸钾溶液使pH控制在6.0。反应1小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用高效液相分析测得：底物转化率为99％，(3S)-2a含量为99％。

实施例10冻干酶粉催化还原50mmol/L的底物1a

在含有50mM底物1a(12.1g/L)和60mM葡萄糖(10.8g/L)的10mL的磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH 6.0)中，加入2U/ml如实例6所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-CpKR_M15)的冻干酶粉，2U/ml葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉以及0.2mmol/L的NAPD⁺。磁力搅拌下于30℃进行反应，通过自动电位滴定仪控制流加0.5mol/L的碳酸钾溶液使pH控制在6.0。反应4小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用高效液相分析测得：底物转化率为99％，(3S)-2a含量为99％。

实施例11冻干酶粉催化还原100mmol/L的底物1a

在含有100mM底物1a(24.2g/L)和125mM葡萄糖(22.5g/L)的10mL的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 6.0)中，加入3U/ml如实例4所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-CpKR_M15)的冻干酶粉，3U/ml葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉以及0.2mmol/L的NAPD⁺。磁力搅拌下于30℃进行反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钾溶液使pH控制在6.0。反应12小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用高效液相分析测得：底物转化率为99％，(3S)-2a含量为99％。

实施例12冻干酶粉催化制备产物(3S)-2a

在含有100mM底物1a(24.2g/L)和125mM葡萄糖(22.5g/L)的60mL的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 6.0)中，加入3U/ml如实例4所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-CpKR_M15)的冻干酶粉，3U/ml葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉以及0.2mmol/L的NAPD⁺。磁力搅拌下于30℃进行反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钾溶液使pH控制在6.0。反应12小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，后经减压蒸馏除去乙酸乙酯，得羟基产物粗品(3S)-2a 1.38g，分离得率为94.4％。

实施例13(3S)-2a环氧化合成(2R,3S)-MPGM

在氮气保护下于100mL圆底烧瓶中加入含有实施例12所得产物(3S)-2a(1.38g,5.63mmol)的甲醇溶液30mL，后于0℃下缓慢滴加含有甲醇钠(0.319g,5.9mmol)的甲醇溶液20ml，0℃反应2h后，使用饱和NH₄Cl淬灭反应，等体积甲基叔丁基醚萃取，无水硫酸钠干燥后减压蒸馏得黄色油状液体，快速柱分离(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)得950mg白色固体产物(2R,3S)-MPGM，分离得率为81％，液相色谱分析纯度为97％，ee值为99.0％。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 羰基还原酶、突变体及其在制备地尔硫卓中间体中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> 近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)

<400> 1

atgtcatcag aaactgttgt attcgtcagt ggtgctactg gattcattgc tcaacaaatt 60

gtcaaaaccg tgcttgaagc tggttacaaa actatcggct cagtgagatc agaggaaaaa 120

ggaaagtact taaaatcatt gatcgagtct gctggactca attctaatct tttcaattat 180

gtcattgtga aggacattgg agccaaaggt gcatttaacg aagctttgca agcccatccg 240

gaggtgacag tgtttttaca cactgcatct cctgctacat ttgaaattca tgatgttgag 300

aaggaattgt taaaaccggc cattgagggt accattaatg cacttaacgc agttaccgtg 360

tatggtaaaa acgttcaaag ggttgtcatc acatcgtctt atgctgcggt tgctggtttt 420

gcaaatttgg ctacgcctgg taaagaagta aatgaagaat cgtggaaccc aatcacatac 480

gagcaggctt tggaaaatcc ctttcttggt tacattggat caaagaaact cgctgaaaag 540

actgtatgga actacatcga agaaaagaag ccaaaatggg atgtcacttt tgtgaatcct 600

gcatttgtat tgggaccaca agcttttgcc gttagagaca agtccaagtt gaacgcatca 660

aatgaaatca tcaacagtct cttgactgca aacaagacaa aagtggagcc tcaacaattt 720

gttggatact ttattgatgt cagagatgtc gcaaaagccc atctcattgc ttttgagaag 780

aatgaaactg tgggccagag attgcttttg gcaaatgcac ctttttcctc cgctgggatc 840

ttggacatta ttgaaaaaga tttccctaat ttgaaatctg agttaccaaa gttggataag 900

tcaaaatctc caaagtttga ggaaactgaa agtgtcgtaa acaatgaaaa gacgagaagg 960

attttgggtt tcaaattcat tgatttgaaa aagtcggttg atgacactat taagcagttg 1020

gtgtaa 1026

<210> 2

<211> 341

<212> PRT

<213> 近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)

<400> 2

Met Ser Ser Glu Thr Val Val Phe Val Ser Gly Ala Thr Gly Phe Ile

1 5 10 15

Ala Gln Gln Ile Val Lys Thr Val Leu Glu Ala Gly Tyr Lys Thr Ile

20 25 30

Gly Ser Val Arg Ser Glu Glu Lys Gly Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Glu Ser Ala Gly Leu Asn Ser Asn Leu Phe Asn Tyr Val Ile Val Lys

50 55 60

Asp Ile Gly Ala Lys Gly Ala Phe Asn Glu Ala Leu Gln Ala His Pro

65 70 75 80

Glu Val Thr Val Phe Leu His Thr Ala Ser Pro Ala Thr Phe Glu Ile

85 90 95

His Asp Val Glu Lys Glu Leu Leu Lys Pro Ala Ile Glu Gly Thr Ile

100 105 110

Asn Ala Leu Asn Ala Val Thr Val Tyr Gly Lys Asn Val Gln Arg Val

115 120 125

Val Ile Thr Ser Ser Tyr Ala Ala Val Ala Gly Phe Ala Asn Leu Ala

130 135 140

Thr Pro Gly Lys Glu Val Asn Glu Glu Ser Trp Asn Pro Ile Thr Tyr

145 150 155 160

Glu Gln Ala Leu Glu Asn Pro Phe Leu Gly Tyr Ile Gly Ser Lys Lys

165 170 175

Leu Ala Glu Lys Thr Val Trp Asn Tyr Ile Glu Glu Lys Lys Pro Lys

180 185 190

Trp Asp Val Thr Phe Val Asn Pro Ala Phe Val Leu Gly Pro Gln Ala

195 200 205

Phe Ala Val Arg Asp Lys Ser Lys Leu Asn Ala Ser Asn Glu Ile Ile

210 215 220

Asn Ser Leu Leu Thr Ala Asn Lys Thr Lys Val Glu Pro Gln Gln Phe

225 230 235 240

Val Gly Tyr Phe Ile Asp Val Arg Asp Val Ala Lys Ala His Leu Ile

245 250 255

Ala Phe Glu Lys Asn Glu Thr Val Gly Gln Arg Leu Leu Leu Ala Asn

260 265 270

Ala Pro Phe Ser Ser Ala Gly Ile Leu Asp Ile Ile Glu Lys Asp Phe

275 280 285

Pro Asn Leu Lys Ser Glu Leu Pro Lys Leu Asp Lys Ser Lys Ser Pro

290 295 300

Lys Phe Glu Glu Thr Glu Ser Val Val Asn Asn Glu Lys Thr Arg Arg

305 310 315 320

Ile Leu Gly Phe Lys Phe Ile Asp Leu Lys Lys Ser Val Asp Asp Thr

325 330 335

Ile Lys Gln Leu Val

340

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggaattca tgtcatcaga aactgttg 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagt tacaccaact gcttaatag 29

Claims

1.一种羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶选自氨基酸序列如下的蛋白质：

2.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸是编码如权利要求1所述羰基还原酶的核酸分子。

3.一种重组表达载体，其特征在于，其包含如权利要求2所述的核酸序列。

4.一种重组表达转化体，其特征在于，其包含如权利要求3所述的重组表达载体。

5.一种羰基还原酶催化剂，其特征在于，其是以下形式中的任意一种：

(1)培养如权利要求4所述重组表达转化体，分离含有如权利要求1所述羰基还原酶的转化体细胞；

(2)对含有如权利要求1所述羰基还原酶的转化体细胞进行破碎，获得含有如权利要求1所述羰基还原酶的细胞破碎液；

(3)将含有如权利要求1所述羰基还原酶的细胞破碎液冷冻干燥而得到的冻干酶粉；

(4)将含有如权利要求1所述羰基还原酶的转化体细胞冷冻干燥而得到的冻干细胞。

6.如权利要求1所述羰基还原酶或如权利要求5所述羰基还原酶催化剂催化多种羰基化合物不对称还原，制备手性羟基化合物的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的羰基化合物选择具有如下结构的化合物：

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述羰基还原酶催化羰基化合物不对称还原的反应在NADPH的存在下进行，其中NADPH可以通过葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖和NADP⁺转化反应生成。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述羰基化合物的浓度为25～100mmol/L，所述羰基还原酶的用量为30～80U/mmol羰基化合物，反应温度30～40℃，pH 5.0～7.0。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的羰基化合物选择2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯，并利用2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯的不对称还原产物制备光学纯的地尔硫卓中间体(2R,3S)-MPGM。